CN113840918A - 优化的rag1缺陷基因疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新型表达盒、逆转录病毒质粒、载体、病毒粒子、组合物和重组细胞，其包含与密码子优化的重组激活(RAG1)转基因可操作连接的启动子。这些新型表达盒、逆转录病毒质粒、载体、病毒粒子、组合物和重组细胞适用于治疗由rag‑1基因编码的蛋白质的完全或部分功能丧失引起的疾病，如RAG缺陷型严重联合免疫缺陷症(RAG1‑SCID)、Omenn综合征(OS)、非典型SCID或联合免疫缺陷症(CID)。本发明还提供了相应的治疗方法。

Description

优化的RAG1缺陷基因疗法
技术领域
本发明提供了新型表达盒、逆转录病毒质粒、载体、病毒粒子、组合物和重组细胞，其包含与密码子优化重组激活(RAG1)转基因可操作地连接的启动子。这些新型表达盒、逆转录病毒质粒、载体、病毒粒子、组合物和重组细胞适用于治疗由RAG-1基因编码的蛋白质的完全或部分功能丧失引起的疾病，如RAG-缺陷型严重联合免疫缺陷症(RAG1-SCID)、Omenn综合征(OS)、非典型SCID或联合免疫缺陷症(CID)。还提供了相应的治疗方法。
背景技术
近年来，罕见遗传性免疫疾病的基因疗法已成为临床现实，尤其适用于严重联合免疫缺陷症(SCID)。例如，两种主要类型的SCID(ADA-SCID、X-SCID)已经通过基于自体干细胞的基因疗法而成功治疗。然而，对于最常见的SCID组群，具有潜在的重组缺陷的SCID(例如，RAG缺陷型SCID；也称为RAG-SCID)，由于所涉及基因的更高复杂性，这尚未发生。
RAG缺陷型SCID患者在RAG1或RAG2中存在突变，这是T细胞受体(TCR)和B细胞受体(BCR)基因组装所必需的。患病儿童通常会经历各种严重且危及生命的感染，包括肺炎、脑膜炎和败血症。通过同种异体干细胞移植(allo-SCT)，采用健康的未修饰同种异体干细胞替换患病骨髓是目前RAG-SCID的唯一疗法。尽管匹配SCT受者的总生存期令人满意，但代表大多数病例的失配SCT受者的结果明显更糟糕。
此外，约25％的移植患者发生移植物抗宿主病，这显著降低了发病率、免疫重建和移植相关死亡率方面的结果(Genery，2010)。因此，RAG-SCID(以及其他重组缺陷形式的T-SCID和B-SCID)的移植结果明显比使用B细胞的SCID(即，T-B+SCID)更差。综上所述，这些数据表明，目前唯一可用的治疗选择-allo-SCT-在治愈潜力和生存机会方面都存在重大限制，因此迫切需要基于自体干细胞遗传校正的新型改进策略。
尽管使用基于自体干细胞的基因疗法进行了成功的临床试验以治疗X-连锁SCID和ADA-SCID，但这些试验揭示了严重的副作用：淋巴增生性疾病/白血病的发展。在所有情况下，T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)都是作为用于递送治疗性基因的逆转录病毒载体插入诱变的直接结果而发生。在基因疗法的这一严重挫折之后，最近的工作表明，下一代载体，特别是病毒启动子/增强子序列受致失活的载体(自失活载体，或SIN载体)，显著降低了插入突变的发生率。
X-连锁SCID和ADA-SCID的最新临床试验表明，SIN慢病毒载体既安全又高效，从而促进了转基因造血干细胞的进一步临床开发。然而，与X-连锁SCID和ADA-SCID不同，使用基因疗法治疗RAG-SCID是出了名的困难。之前的尝试(Lagresle-Peyrou，2006)在临床前RAG1-/-模型中使用了γ逆转录病毒载体，该模型具有很高的插入突变风险。尽管RAG1γ逆转录病毒载体能够更容易地纠正缺陷，但SIN慢病毒载体最初导致治疗性RAG1基因表达不足，导致“泄漏性”SCID或Omenn样表型。由于治疗型基因的表达水平和转导效率存在差异，因此在该领域观察到了不一致的结果(van Til.，2014)。
仍存需要用于治疗RAG1缺陷型SCID和OS的新型改进策略。
发明内容
本发明人惊奇地发现了使用临床可接受的慢病毒基因疗法和密码子优化RAG1转基因序列在RAG缺陷型SCID的临床前模型中提供治疗效果的RAG1表达的最低阈值水平。
本发明人设计了具有驱动密码子优化RAG1基因表达的不同内部启动子的临床相关慢病毒SIN质粒。使用Rag1-/-小鼠作为RAG1-SCID的临床前模型评价各种质粒在低质粒拷贝数下的功效，本发明人观察到B和T细胞重建与RAG1表达直接相关。具有低RAG1表达的小鼠表现出差的免疫重建，而高RAG1表达却导致与接受野生型干细胞的小鼠相当的表型和功能性淋巴细胞重建。令人惊讶的是，用临床RAG1质粒转导并移植到NOD SCIDγ(NSG)小鼠中的RAG1-SCID患者CD34+细胞导致人B和T细胞发育完全恢复。连同有利的安全性数据，本发明人的结果为RAG1缺陷型SCID的人体临床试验提供了坚实的基础。
因此，本发明人提供了一种使用新型密码子优化RAG1转基因序列在RAG缺陷细胞中诱导和维持RAG1表达的治疗阈值水平的新系统。本发明人已经证实，当RAG1表达水平对于B细胞恢复是某些看家基因如ABL1至少三倍高(并且对于T细胞恢复是10倍高)时，观察到治疗效果(在体内B和T细胞重组方面)。因此，本文揭示了三倍高表达的最小阈值具有有益的治疗效果。本发明人首次证实，使用编码密码子优化RAG1转基因的低拷贝数逆转录病毒质粒可以实现这种水平的RAG1表达(即，在使用密码子优化RAG1转基因序列时，即使存在5个或更少整合到该细胞的基因组中的RAG1转基因拷贝(在表达盒的情况下)时，也能实现细胞中为ABL1至少三倍高的RAG1表达水平)。在上下文中，正如本领域内公知的是，“低拷贝数”是指以每个细胞5个或更少拷贝(即每个细胞5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、1个或更少、0.5个或更少、0.4个或更少、0.3个或更少、0.2个或更少等拷贝)的频率整合到靶细胞基因组中的质粒。使用低拷贝数质粒是有利的，因为它显著降低基因疗法期间插入诱变的发生率。有利的是，本发明人已经证实，利用低至每个细胞0.2的拷贝数可以获得有益效果。
本发明已经使用低拷贝数质粒，特别是包含pCCL骨架的自失活(SIN)慢病毒(LV)质粒进行了举例说明。该质粒是特别有利的，因为与其他LV骨架相比，它能够以更高的滴度(titre，滴定率)生产。然而，其他低拷贝数质粒也可以用于本发明的上下文中(因为它们同样提供显著降低插入诱变发生率的优势)。替代的低拷贝数质粒在本文别处进行详细描述。
本发明人已经证明了使用MND启动子的RAG1表达的必需阈值水平。令人惊讶的是，当MND启动子与密码子优化RAG1转基因可操作地连接时，体内从低拷贝数质粒获得的RAG1表达水平足以诱导B和T细胞重组。因此，本发明人已经确定，低拷贝数质粒、密码子优化RAG1转基因序列和强启动子如MND的组合足以在体内驱动RAG1表达至治疗水平。尽管本发明使用MND启动子进行了举例说明，但也可以使用诱导等效(或更高)RAG1表达水平的其他强启动子。例如，在其他系统中，已知CMV、RSV和CAG启动子会驱动所连接的转基因的高水平表达。既然已知治疗效果所需的RAG1表达阈值水平(正如本文首次提供)，则其他已知与MND等效的启动子(如CMV、RSV和CAG启动子等)也可以同样应用于本发明的环境中以达到预期的效果。因此，本发明涵盖此类启动子作为MND的替代物的用途。
本文提供的数据利用密码子优化RAG1序列作为可操作地连接至必需启动子(例如，MND；尽管也可以使用其他启动子，如CMV、RSV或CAG启动子)的RAG1转基因。正如本申请中其他地方的详细描述，使用密码子优化的RAG1序列是有利的，因为它会产生更高的病毒滴度，并能够提高RAG1蛋白的稳定性。因此，使用密码子优化的转基因序列有助于实现获得治疗效果所需的RAG表达最低阈值(即，即使在有5个或更少的RAG1转基因拷贝整合到细胞的基因组中时，在该细胞中为某些看家基因如ABL1至少三倍高的水平)。
在一方面中，提供了包含与RAG1转基因可操作地连接的启动子的表达盒，RAG1转基因包含SEQ ID NO:2的核酸序列，其在具有该表达盒整合至其基因组中的5个或更少表达拷贝的人CD34+造血干细胞中表达时，以该细胞中ABL1表达水平至少三倍高的水平产生表达产物。
合适的是，该启动子可以选自MND、CMV、RSV和CAG。
因此，本发明提供了包含与RAG1转基因可操作连接的启动子的表达盒，RAG1转基因包含SEQ ID NO:2的核酸序列，其中该启动子选自MND、CMV、RSV和CAG。在一个实例中，该RAG1转基因包含SEQ ID NO:4的核酸序列。合适的是，当该表达盒表达于其基因组中整合了该表达盒的5个或更少拷贝的人CD34+造血干细胞中时，以该细胞中的ABL1表达水平至少三倍高的水平产生表达产物。
合适的是，该RAG1转基因编码包含SEQ ID NO:1的序列的多肽。
合适的是，该RAG1转基因可以包含SEQ ID NO:4的核酸序列。
合适的是，该启动子可以是MND。
合适的是，该表达盒还可以包含编码土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)的核苷酸序列。
在一方面中，提供了包含本发明表达盒的逆转录病毒质粒。
合适的是，该质粒可以是自失活(SIN)慢病毒质粒。
合适的是，该质粒可以包含pCCL骨架。
合适的是，该质粒可以包含pCCL骨架、编码WPRE的核苷酸序列、MND启动子和包含SEQ ID NO:4的核酸序列的转基因。
合适的是，该质粒可以包含图9的序列。
在一方面中，提供了包含本发明表达盒的病毒粒子。
在一方面中，提供了一种组合物，其包含本发明的表达盒或本发明的质粒或本发明的病毒粒子以及药用佐剂、载体、赋形剂或稀释剂。
在一方面中，提供了包含本发明的表达盒的重组CD34+造血干细胞。
在一方面中，提供了一种产生重组CD34+造血干细胞的离体方法，该方法包括将细胞与本发明的质粒或本发明的病毒粒子在该表达盒由所述细胞引入并表达而生成重组CD34+造血干细胞的条件下进行接触。
在一方面中，提供了适用于疗法的本发明的表达盒、质粒、组合物、病毒粒子或重组细胞。
合适的是，该表达盒、载体、组合物、病毒粒子或重组细胞可以用于治疗RAG1缺陷型SCID、Omenn综合征(OS)、非典型SCID或联合免疫缺陷症(CID)。例如，该表达盒、载体、组合物、病毒粒子或重组细胞可以用于治疗RAG1缺陷型SCID或Omenn综合征(OS)。
在一方面中，提供了治疗受试者的方法，包括向有此需要的受试者给药治疗有效量的本发明的表达盒、质粒、组合物、病毒粒子或重组细胞。
合适的是，该受试者可能患有RAG1缺陷型SCID、Omenn综合征(OS)、非典型SCID或联合免疫缺陷症(CID)。例如，该受试者可能患有RAG1缺陷型SCID或Omenn综合征(OS)。
在一方面中，提供了一种在有此需要的受试者中治疗RAG1缺陷型SCID、Omenn综合征(OS)、非典型SCID或联合免疫缺陷症(CID)的方法，该方法包括以下步骤：
(i)从所述受试者中提取CD34+造血干细胞；
(ii)将来自(i)的所述细胞与本发明的病毒粒子或本发明的质粒接触；
(iii)将来自(ii)的所述细胞培养(incubate)一段时间；和
(iv)将来自(iii)的细胞引入所述受试者。
合适的是，该方法还可以包括在步骤(iv)之前向受试者给予化学疗法或其他调理方案的步骤。
附图说明
图1：确定最佳SIN LV质粒以恢复Rag1缺陷的免疫重建。A)测试了CCL骨架中携带不同启动子(Cbx3-MND、MND、PGK和UCOE启动子)的四种不同SIN LV质粒，以驱动RAG1的密码子优化版本的表达。B)代表性的FACS图显示了BM中B220hi+B细胞的恢复。C)SC移植后16周，PB(上图)中B细胞(B220hi+)的总数和BM(骨髓)(下图)中不同B细胞亚群的总数。图表代表每组2-3只小鼠的先导实验(pilot experiment，预实验)的平均值和标准偏差。(Mann-Withney检验，单尾，*p≤0,05)。D)具有不同构建体的胸腺重建(CD4相对于CD8)的代表性FACS图。E)移植后16周，PB(上图)中T细胞(CD3+TCRαβ+)的总数和胸腺中不同T细胞亚群的总数(下图)。图表代表每组2-3只小鼠的先导实验的平均值和标准偏差。(Mann-Withney检验，单尾，*p≤0,05)。
图2：免疫重建与RAG1表达和不同载体安全性的相关性。A)B220+细胞总数(右图)和B220+IgM+细胞总数(中图)与BM中c.o.RAG1表达的相关性。VCN(载体/质粒拷贝数)与免疫重建小鼠BM中的c.o.RAG1表达之间的相关性(左图，红色＝已实现免疫重建)。B)总胸腺细胞(右图)和DP细胞(中图)与胸腺中c.o.RAG1表达的相关性。免疫重建小鼠胸腺中VCN和c.o.RAG1表达之间的相关性(左图，红色＝实现免疫重建)。除一只小鼠外，其他所有小鼠都接受了免疫重建。只有极高RAG1水平，重建才较低/最小。所显示的数据代表3个独立体内实验(●、
Figure BDA0003331287760000061
◆：填充＝MND启动子；空心＝其他启动子)。每个点代表一只小鼠-除一只小鼠外，其他所有小鼠均获得免疫重建。C)对不同构建体进行IVIM测试以评价其安全性(模拟细胞作为阴性对照；RSF91γ逆转录病毒载体作为阳性对照)。数据显示了来自3个完整IVIM测试的结果。D)通过GeneScan的TCR Vβ库(repertoire)分析。对每组3只小鼠的脾细胞分析了总共24个Vβ家族。计算了不同构建体的所有家族的总分。E)显示了四个不同家族的GeneScan图的代表性样品(x-轴表示CDR3长度；y-轴表示径流产物(runoff product)的荧光强度)。
图3：采用临床级MND-c.o.Rag1载体对接受基因疗法SC的小鼠进行广泛的免疫重建。A)移植后24周，血液中B细胞重建(B220+IgM/IgD细胞_上图)和BM(B220+CD19+细胞_下图)中B细胞发育的代表性图。B)PB中B细胞(B220+CD11b/CD43-细胞)的总数。Mann-Withney检验(KO对照相对于MND-c.o.RAG1，单尾，*p<0,05；**p<0,01)。C)脾脏中未成熟(B220+CD93+细胞；左图)和成熟(B220+CD93-细胞；右图)的B细胞亚群分布。双向ANOVA检验；***p<0,001；****p<0,0001。D)移植后24周，血液中T细胞重建(CD3+TCRab+细胞；上图)和胸腺中T细胞发育(CD4相对于CD8细胞；下图)的代表性图。E)实验结束时(24周)PB中T细胞(CD3+TCRab+细胞)的总数。Mann-Withney检验(KO对照相对于MND-c.o.RAG1，单尾；*p<0,05；**p<0,01)。F)脾脏中的CD4(CD3+TCRab+CD4+；左图)和CD8(CD3+TCRab+CD8+；右图)T细胞亚群分布的初始(native)、效应子和中枢记忆亚群分布：移植后24周，PB中的初始细胞(CD44-CD62L+)、效应子记忆细胞(CD44+CD62L-)和中枢记忆细胞(CD44+CD62L+)。G)左图：肠系膜淋巴结(比例尺＝200μm)和脾脏(比例尺＝100μm；)的苏木精和伊红染色。R.脾组织中的代表性FoxP3染色(比例尺＝100μm)。来自一个WT对照、KO对照和1个MND-c.o.RAG1 GT的代表性图像。箭头表示生发中心的阳性FoxP3。
右图：通过苏木精和伊红染色(比例尺＝50μm)和细胞角蛋白染色(比例尺代表50μm)对胸腺重建进行的组织学分析。来自WT对照和MND-c.o.RAG1小鼠的代表性图像。
图4：Rag1基因疗法后的功能性Ig和TCR重排以及Ig类转换。A)GeneScan的TCR Vβ库分析。对来自3只WT对照、1只KO对照和8只MND-c.o.RAG1小鼠(未免疫和免疫)的脾细胞分析了总共24个Vβ家族。计算出所有家族的总分。显示了3个不同家族的GeneScan图的代表性样本(x-轴表示CDR3长度；y-轴表示径流产物的荧光强度)。B)通过ELISA定量血清中的总IgG和IgM。C)免疫小鼠血清中TNP-特异性IgG的定量。每个点代表一只小鼠中获得的值。单向ANOVA检验*p<0,05。
图5：临床级MND-co.oRag1载体的临床前安全性测试。A)通过qPCR对总共来自16个器官的DNA样品进行评价的免疫和非免疫器官中的载体生物分布。每个点代表来自一只小鼠的值。B)通过来自由Rag1-/-未转导的对照小鼠(模拟)和4个MND-c.o.RAG1小鼠(雄性未免疫/免疫的、雌性未免疫/免疫的)获得的BM的分离DNA的nrLAM-PCR进行的LV插入位点分析。凝胶分别揭示了3’LTR和5’LTR的线性扩增的结果(L＝1kb+标记)。C)与对照样品(模拟-MA、RSF91-MA、lv-SF-MA[带有SFFV启动子的慢病毒载体])的汇总分析(meta-analysis)数据相比，对照样品模拟或RSF91和测试载体MND-coRAG1的重新铺板频率(replating frequency)(RF)。将低于检测限(LOD；没有高于MTT-阈值的孔井的孔板)的数据点手动插入图中(由于y-轴的对数刻度)。在图表上方，显示了根据MTT-测试的阳性板(左数)和阴性板(右数)的比率。相对于模拟-MA或RSF91-MA的阳性和阴性测试发生率的差异通过采用Benjamini-Hochberg校正的Fisher精确检验进行分析(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；NS＝不显著)。如果高于LOD，则条形表示平均RF。
图6：在Rag1 SCID患者细胞中恢复的B和T细胞发育。A)小鼠被移植CD34+纯化的模拟转导细胞(65,000)或MND-CoRAG1转导细胞(65,000)。脾脏中人B细胞的代表性FACS图(CD13/33-CD19+CD20+细胞；上图)和B细胞总数(CD13/33-CD19+CD20+IgD/IgM细胞；下图)。B)PB中人T-细胞的代表性FACS图(CD3+TCRαβ+；上图)和T-细胞、CD4和CD8T细胞的总数(下图)。C)胸腺中的人T细胞发育：胸腺中不同T细胞亚群的代表性FACS图(CD4相对于CD8)和分布。D)通过ELISA对来自移植SCID对照CD34+细胞、SCID患者CD34+细胞和SCID MND-c.o.RAG1CD34+细胞的NSG小鼠的血清进行的总人IgM定量。E)使用TCRB+TCRG T-细胞克隆性测试对NSG胸腺(SCID患者和SCID MND-c.o.RAG1)的分离DNA进行的人TCR Vβ和Vγ库分析。(x-轴表示片段大小；y-轴表示径流产物的荧光强度)。F)通过nrLAM-PCR对从NSG SCID患者未转导细胞(模拟)和NSG SCID MND-c.o.RAG1小鼠获得的BM的分离DNA进行的LV插入位点分析。凝胶显示了来自5’LTR(L＝1kb+标记)的线性扩增的结果。来自独立实验的数据，每个条件的n＝1。
图7显示了在Rag1-/-小鼠模型中基因疗法后的免疫发育。A)在采用不同构建体(Cbx3-c.o.RAG1、MND-c.o.RAG1、PGK-c.o.RAG1和UCOE-c.o.RAG1)的SC移植后PB中随时间推移的B细胞(CD11b/CD43-B220+细胞；左图)和T细胞(CD3+TCRαβ+细胞；右图)的百分比。B)在采用临床MND-coRAG1批料的SC移植后PB中随时间推移的B细胞(CD11b/CD43-B220+细胞；左图)和T细胞(CD3+TCRαβ+细胞；右图)的百分比。C)在SC移植后20周，BM中的B细胞发育亚群分布(左图)和胸腺中的T细胞发育群分布(右图)。图表代表对照组的3只小鼠和基因疗法组的8只小鼠的平均值和标准偏差。D)用苏木精和伊红染色的肝脏(比例尺＝100μm)、肾脏(比例尺＝200μm)、肺(比例尺＝100μm)和BM(比例尺＝100μm)的组织学分析。来自WT对照、KO对照和MND-c.o.RAG1小鼠的代表性图像。E)通过ELISA对血清中的总IgE的定量。每个点代表在一只小鼠中获得的值。单向ANOVA检验*p<0,05。
图8显示了CD34+MND-c.o.RAG1移植后的人免疫重建。A)移植(每种条件下1只NSG小鼠)后24周，移植有CD34+SCID患者细胞和用MND-c.o.RAG1转导的CD34+SCID患者细胞的NSG小鼠的免疫器官中的人嵌合体(hCD45+/(hCD45+mCD45+)的百分比。B)移植期间外周血中随时间推移的人B细胞百分比(CD19+细胞/总hCD45+细胞)。C)移植期间PB中随时间推移的人T细胞发育(CD3+细胞/总hCD45+细胞)。D)移植后24周胸腺细胞的流式细胞术分析显示了通过不同阶段的T细胞发育。E)使用IgH+IgK B细胞克隆性测试对NSG BM(SCID患者和SCIDMND-c.o.RAG1)的分离DNA进行的人类IgH和IgK库分析。(x-轴表示片段大小；y-轴表示径流产物的荧光强度)。
图9显示了LV-MND-coRAG1的完整质粒序列。
图10显示了Rag1-/-小鼠模型中MND-c.o.RAG1基因疗法后皮肤和肠道(gut)的组织学分析。代表性图像取自WT对照、KO对照和MND-c.o.RAG1小鼠(未免疫的和免疫的)。对于皮肤，比例尺＝100μm，以及对于肠道，比例尺＝50μm)。样品用苏木精和伊红进行染色。
具体实施方式
本发明人采用与密码子优化RAG1转基因可操作地连接的不同内部启动子设计了临床相关的慢病毒SIN质粒，以确定获得体内治疗效果所需的RAG1表达的最小阈值。
使用Rag1-/-小鼠作为RAG1-SCID的临床前模型以评价具有密码子优化RAG1转基因的各种低拷贝数质粒的功效，本发明人观察到，B和T细胞重建与RAG1表达直接相关。具有低RAG1表达的小鼠表现出较差的免疫重建，而高RAG1表达导致与接受野生型干细胞的小鼠相当的表型和功能性淋巴细胞重建。令人惊讶的是，用临床RAG1质粒转导并移植到NSG小鼠中的RAG1-SCID患者CD34+细胞完全恢复了人B和T细胞发育。
为了便于理解本发明，以下定义了多个术语。
表达盒
本发明提供的表达盒包含与启动子可操作地连接的密码子优化RAG1转基因。RAG1转基因可以编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(人RAG1)、其同源物或其功能变体(例如，其保守氨基酸序列变体)。
术语“表达盒”是指包含一种或多种转录控制元件(例如，但不限于启动子、增强子和/或调节元件、聚腺苷酸化序列和内含子)的核酸分子，转录控制元件指导一个或多个所需的细胞类型、组织或器官中转基因的表达。本发明的表达盒是合成的核酸分子。
本文所用的术语“核酸”通常是指基本上由核苷酸组成的任何长度的寡聚物或聚合物(优选线性聚合物)。核苷酸单元通常包括杂环碱基、糖基和至少一个，例如，一个、两个或三个磷酸基团(phosphate group)，包括修饰或取代的磷酸基团。杂环碱基尤其可以包括嘌呤和嘧啶碱基，如腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，其广泛存在于天然存在的核酸、其他天然存在的碱基(例如，黄嘌呤、肌苷、次黄嘌呤)以及化学或生物化学修饰(例如，甲基化)、非天然或衍生的碱基。糖基团尤其可以包括戊糖(戊呋喃糖)基团，如优选天然存在的核酸中常见的核糖和/或2-脱氧核糖，或阿拉伯糖、2-脱氧阿拉伯糖、苏糖或己糖糖基团，以及修饰或取代的糖基团。本文所指的核酸可以包括天然存在的核苷酸、修饰的核苷酸或其混合物。修饰的核苷酸可以包括修饰的杂环碱基、修饰的糖部分、修饰的磷酸基团或其组合。可以引入磷酸基团或糖的修饰而提高稳定性、对酶促降解的抗性或一些其他有用的特性。术语“核酸”优选还包括DNA、RNA和DNA-RNA杂合分子，具体而言包括hnRNA、前-mRNA、mRNA、cDNA、基因组DNA、扩增产物、寡核苷酸和合成的(例如，化学合成的)DNA、RNA或DNA RNA杂合体。核酸可以是天然存在的，例如，存在于自然界或从自然界分离出；或可以是非天然存在的，例如，重组的，即通过重组DNA技术产生的，和/或部分或全部化学或生物化学合成的。“核酸”可以是双链的、部分双链的，或单链的。在单链的情况下，核酸可以是有义链或反义链。此外，核酸可以是环状或线性的。
表达盒可以包含DNA或RNA。
本文所用的术语“合成核酸”涉及自然界中不存在的核酸分子。
正如本文所用，术语“转基因”是指外源核酸序列，即具有表达盒内发现的其他元件(例如，转录控制元件如启动子等)的天然不存在的序列。在一个实例中，转基因是编码工业或药学上有用的化合物的基因，或编码所需性状的基因。在本发明的上下文中，所关注的转基因是RAG1转基因。
RAG1转基因：人RAG1及其同源物
因此，提供了一种表达盒，其包含与启动子可操作地连接的密码子优化RAG1转基因。
RAG1转基因是编码RAG1蛋白的核酸序列。为免生疑问，该转基因不必包括内源性RAG1的所有天然元件；例如，该转基因可以是RAG1的相应cDNA(即，没有内源性内含子等)。
正如本文所用，术语“重组酶激活基因-1(RAG1)”是指由RAG1基因编码的蛋白质。
RAG1和RAG2共同形成RAG复合体。RAG复合物是多蛋白复合物，其在VDJ重组期间介导DNA切割阶段。这种复合物能够通过在保守的重组信号序列(RSS)处切割DNA而使双链断裂。该RAG复合物识别编码抗体中重链和轻链恒定区的基因中V、D和J区侧翼的RSS。该复合物与RSS结合并在DNA上形成切口。这导致RSS的去除和V、D和J序列的最终结合。
RAG1被认为具有RAG复合物的大部分催化活性。RAG1蛋白是结合并切割DNA的组分，按照这种方式RAG1参与免疫球蛋白VDJ重组的激活。虽然RAG2似乎不具有任何核酸内切酶活性或DNA结合能力，但它起着辅助因子的作用。其主要功能是与RAG1相互作用并激活其核酸内切酶功能。
编码RAG1和RAG2的基因中的缺陷会导致多种疾病。与此一致的是，小鼠模型中的RAG1和RAG2缺失会损害T细胞和B细胞的成熟，并从免疫系统中功能性地删除成熟的T和B细胞。
在一个实例中，RAG1转基因包含编码人RAG1蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。可替代地，RAG1序列可以来自不同的物种，例如，猪、小鼠、大鼠、非人灵长类动物等。
人RAG1基因和蛋白质序列是已知的(参见，例如，唯一标识符：HGNC:HGNC:9831HΜGO Human Gene Nomenclature Committee related to Ensembl:ENSG00000166349 MIM:179615)。为便于参考，人RAG1蛋白序列提供于SEQ ID NO:1中。
小鼠RAG1基因和蛋白质序列是已知的(参见，例如，小鼠RAG1的唯一标识符包括：ENSMUST00000078494；ENSMUSP00000077584；ENSMUSG00000061311)。
大鼠RAG1基因和蛋白质序列是已知的(参见，例如，唯一标识符：Ensembl:ENSRNOG00000004630；ENSRNOT00000006115；ENSRNOP00000006115；ENSRNOG00000004630)。
RAG1蛋白：功能性变体
该RAG1转基因可以包含编码天然人、小鼠或大鼠等RAG1蛋白或其功能性变体(例如，人、小鼠或大鼠RAG1功能性变体)的核苷酸序列。功能性变体RAG1蛋白的一个实例是天然RAG1的保守氨基酸取代变体(即与人、小鼠或大鼠RAG1序列的天然序列仅通过一个或多个保守氨基酸取代而不同的序列)。
“功能性变体”保留了RAG1蛋白的功能能力。换句话说，功能性RAG1变体将能够通过在保守重组信号序列(RSS)处切割DNA而制成双链断裂。本领域技术人员很容易知道如何使用本领域已知的常规实验识别出具有这种活性的多肽。识别功能性RAG1多肽的合适实验总结如下。
能够使用功能性互补测试识别功能性RAG1蛋白序列。该测试可以使用下文实施例小节中描述的具有编码要测试的RAG1变体的RAG1转基因的慢病毒。Lin-骨髓细胞用作造血干细胞的来源，并用编码要测试的RAG1序列的重组慢病毒进行转导。这些细胞随后被移植到经调理的Rag1-/-小鼠中，并随后用于T细胞的发育。如果在8-12周后出现CD3+TCRαβ+T细胞的发育，且T细胞的数量至少为野生型干细胞的50％，则该序列被认为是成功的。
由本发明人实施的本领域技术人员常规遵循的合适RAG1活性试验总结如下：从C57BL/6野生型和C57BL/6Rag1-/-小鼠的股骨和胫骨获得鼠骨髓(BM)细胞。将所获得的骨头冲洗或压碎，将细胞通过0.7μm细胞过滤器(Falcon)，洗涤并存活冷冻。解冻后，使用小鼠谱系耗竭试剂盒(mouse lineage depletion kit)和AUTOMacs细胞分选仪(MiltenyiBiotech)分离谱系阴性细胞。谱系阴性细胞在含有青霉素/链霉素(Steptamycin)(5,000单位/5,000微克/毫升；Gibco)的StemSpam-SFEM中刺激过夜，并补充50ng/mL重组小鼠FMS-相关酪氨酸激酶3配体(rmFLT3L；R&Dsystems)，100ng/mL重组小鼠干细胞因子(rmSCF；R&D系统)和10ng/mL重组小鼠血小板生成素(rmTPO；R&D系统)。随后，使用4μg/ml硫酸蛋白胺(Sigma-Aldrich)并通过在800xg和32℃下自旋接种(spin-occulation，离心接种，悬菌接种)1小时，而对Rag1-/-细胞采用不同慢病毒进行转导。细胞在37℃、5％CO2下于补充有细胞因子的培养基中培养24小时。
在不含酚红(Gibco)的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)中将照模拟转导细胞(C57BL/6野生型细胞称为WT对照以及Rag1-/-细胞称为KO对照)和转导的Rag1-/-鼠细胞(高达5×105个细胞/小鼠)与支持性Rag1-/-脾细胞(3.106个细胞/小鼠)混合并通过尾静脉注射而移植到预调理的Rag1-/-受体小鼠中。受体小鼠(8-12周龄小鼠)在移植前24小时使用正电压X射线(8.08Gy)全身单剂量辐照24h或采用两次连续剂量的25mg/kg白消安(Sigma-Aldrich)(移植前48小时和24小时)进行调理。。
用于移植的小鼠保存于指定的无病原体部分中。移植后的前四个星期给小鼠喂食额外的DietGel恢复食品(Clear H2O)和含有0.07mg/mL多粘菌素B(Polymixin B)(BuphaUitgeest)、0.0875mg/mL环丙沙星(Bayer b.v.)和0.1mg/mL Amfotericine B(Bristol-Myers Squibb)的抗生性水，并每天监测其康乐状况。每4周通过尾静脉切口抽取小鼠的外周血(PB)直至实验结束。PB、胸腺、脾脏和BM获自CO2安乐死小鼠。
通过将器官挤压通过70μM细胞过滤器(BD Falcon)而制备脾脏的单细胞悬浮液，并且如前所述制备BM的单细胞悬浮液。使用NH4Cl(8.4g/L)/KHCO3(1g/L)溶液裂解脾脏的红细胞。对单细胞悬液进行计数并用表1中所列的抗体进行染色。简而言之，将细胞在4℃下黑暗中采用包括直接偶联抗体的抗体混合物溶液以FACS缓冲液(PBS pH 7.4、0.1％叠氮化物、0.2％BSA)的最佳工作溶液培养30min。用FACS缓冲液洗涤后，在4℃下用链霉亲和素缀合抗体溶液进行第二个30min培养步骤。在FACS-CantoII和LSR Fortessa X-20(BDBiosciences)上测量细胞，并使用FlowJO软件(Tree Star)分析数据。
以下列出了最佳组中使用的抗体。染色中至少包括CD3、CD4、CD8、TCRβ。
Figure BDA0003331287760000141
表1：最佳组中使用的抗体。
因此，RAG1多肽可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(或等效小鼠或大鼠RAG1序列)，或可以是其功能性变体(或功能性片段)。此类变体可以是SEQ ID NO:1(或等效小鼠或大鼠RAG1序列)的天然存在(例如，等位基因的)、合成的或合成改进的功能性变体。
功能性变体通常仅包含SEQ ID NO:1(或等效小鼠或大鼠RAG1序列)的一个或多个氨基酸的保守取代，或在蛋白质非关键区域的非关键氨基酸的取代、缺失或插入。SEQ IDNO:1(或等效小鼠或大鼠RAG1序列)的功能性变体因此可以是SEQ ID NO:1(或等效小鼠或大鼠RAG1序列)的保守氨基酸序列变体。
非功能性变体是SEQ ID NO:1(或等效小鼠或大鼠RAG1序列)不具有RAG1活性的氨基酸序列变体。非功能性变体通常包含SEQ ID NO:1(或等效小鼠或大鼠RAG1序列)的氨基酸序列的非保守取代、缺失、或插入或早熟短截(premature truncation)，或关键氨基酸或关键区域的取代、插入和缺失。用于识别功能性和非功能性变体(例如，功能性和非功能性等位基因变体)的方法是本领域普通技术人员熟知的。
Luigi D.Notarangelo,Min-Sung Kim,Jolan E.Walter&Yu Nee Lee NatureReviews Immunology volume 16，pages 234-246(2016)中提供了RAG1中关键和非关键氨基酸的总结。因此，本领域技术人员将能够容易地识别出可以被取代的氨基酸，以提供SEQID NO:1(或等效小鼠或大鼠RAG1序列)的功能性变体(或功能性片段)，如保守氨基酸序列变体。
功能性变体可以包含与SEQ ID NO:1(或等效小鼠或大鼠RAG1序列)的氨基酸序列或其部分或片段具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。合适的是，同一性百分比能够计算为与参考序列(例如，SEQ ID NO:1)或其部分或片段的全长的同一性百分比。
在一个实例中，RAG1转基因编码包含SEQ ID NO:1的序列或其保守氨基酸序列变体的多肽。
正如本文所用，“天然存在的”多肽是指天然存在的氨基酸序列。
“非必需的”(或“非关键的”)氨基酸残基是能够从(例如，SEQ ID NO:1的序列的)野生型序列改变而不废除或更优选基本不改变生物活性的残基，而“必需的”(或“关键的”)氨基酸残基会导致这种变化。例如，保守的氨基酸残基预计特别不易改变，除了结构域的疏水核内的氨基酸残基通常能够被具有近似等效疏水性的其他残基替换，这不会显著改变活性。
“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基代替的取代。在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有以下的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支化侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，蛋白质中的非必需(或非关键)氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替换。或者，在另一个实施方式中，能够随机引入突变，并且能够针对生物活性筛选所得的突变体，以识别出保留活性的突变体。
与天然的人、小鼠或大鼠RAG1(如上使用唯一标识符标识的)相比，RAG1的保守氨基酸取代变体可以具有至少一个(例如，两个或更少、三个或更少、四个或更少、五个或更少、六个或更少、七个或更少、八个或更少、九个或更少、十个或更少等)保守氨基酸取代。
RAG1转基因序列；核酸序列水平的变异
“RAG1转基因”是指编码功能性RAG1蛋白(例如，人、小鼠或大鼠RAG1，或其功能性变体如氨基酸取代变体)的任何核酸序列。
本文所描述的RAG1核苷酸序列是密码子优化的。正如本文所用，“密码子优化的”(或“c.o.”)是指相对于天然多核苷酸序列进行修饰的编码RAG1蛋白的多核苷酸序列，但不改变编码氨基酸序列。该术语在本领域中广为人知。多核苷酸序列的密码子优化能够导致提高细胞中RAG1蛋白的整体翻译效率/表达水平的多种影响。
例如：
1.对RNA二级结构的影响
由于mRNA 5’末端的二级结构影响翻译效率，因此mRNA上该区域的同义变化(synonymous change)能够对基因表达产生深远的影响。因此，非编码DNA区域中密码子的使用能够在RNA二级结构和下游蛋白质表达中发挥重要作用，这能够承受进一步的选择压力。具体而言，核糖体结合位点或起始密码子的强二级结构能够抑制翻译，并且5’端的mRNA折叠产生大量的蛋白质水平变化。
在这种情况下，RAG1核苷酸序列可以是密码子优化的，以包括更高的编码序列的GC含量。
2.对转录/基因表达的影响
异源基因表达用于许多生物技术应用，包括蛋白质生产和代谢工程。由于tRNA库在不同生物体之间有所不同，因此特定编码序列的转录和翻译速度在置于非天然环境中时可能不太有效。对于过表达的转基因，相应mRNA占总细胞RNA的很大百分比，并且沿着转录的稀有密码子的存在导致核糖体的使用效率低下并耗尽，并最终降低异源蛋白质生产的水平。然而，在特定宿主中使用针对tRNA库优化的密码子过度表达异源基因也可以导致氨基酸饥饿并改变tRNA库的平衡。这种调整密码子匹配宿主tRNA丰度的方法传统上已经用于表达异源基因。然而，优化异源表达的新策略会考虑全局核苷酸含量，如局部mRNA折叠、密码子对偏倚、密码子斜坡(codon ramp)或密码子相关性。
在一些内源性基因如与氨基酸饥饿相关的那些中还会看到特异化的密码子偏倚。例如，氨基酸生物合成酶优先使用不太适应正常tRNA丰度而具有在饥饿条件下适应tRNA库的密码子。因此，密码子的使用能够为特异性细胞条件下的合适基因表达引入额外的转录调控水平。
在这种情况下，可以对RAG1核苷酸序列进行密码子优化以包括去除替代剪接位点和隐蔽剪接位点，优化人tRNA的密码子使用。
3.对翻译延伸速度的影响
一般而言，对于高度表达的基因，翻译延伸速率沿着对tRNA库具有更高密码子适配的转录物更快，而沿着具有稀有密码子的转录物则更慢。密码子翻译速率和同源tRNA浓度之间的这种相关性提供了翻译延伸速率的额外调节，这能够为生物体提供几个优势。具体而言，密码子的使用能够允许对这些速率进行全局调节，而稀有密码子可能会以牺牲速度为代价提高翻译的准确性。
在这种情况下，可以对RAG1核苷酸序列进行密码子优化以包括人tRNA使用的优化密码子。
4.对蛋白质折叠的影响
体内蛋白质折叠是矢量的，使得蛋白质的N端离开正翻译的核糖体，并在其更多的C端区域之前变成溶剂暴露。因此，共翻译蛋白质折叠在其折叠轨迹中在新生多肽链上引入了几个空间和时间限制。由于mRNA翻译速率与蛋白质折叠相关，并且密码子适配与翻译延伸相关，因此假设序列水平上的操作可能是调节或改善蛋白质折叠的有效策略。几项研究表明，某些蛋白质由于局部mRNA结构发生翻译暂停，这可能是正确折叠所必需的。此外，已证明同义突变在新生蛋白质的折叠过程中具有重大后果，并且甚至能够改变酶的底物特异性。这些研究表明，密码子的使用影响多肽从核糖体中以载体形式出现的速度，这可能进一步影响整个可用结构空间中的蛋白质折叠途径。
任何密码子优化RAG1多核苷酸序列，无论密码子的优化方式，都包括于本文中。
本发明人对人RAG1 cDNA序列的分析揭示了改进DNA序列而不影响氨基酸序列的几种可能性，因为天然RAG1基因中存在许多稀有密码子。大多数这些密码子被更常用的智人基因密码子所取代。GC含量也会增加以增强mRNA的稳定性。最后，去除可能负面影响表达的21个顺式作用基序(原核抑制基序、剪接供体位点、polyA位点和RNA不稳定性基序)。没有对氨基酸序列进行任何改变，这使在蛋白质水平进行的调节机制能够正常发挥作用。
在一个非限制性实例中，RAG1密码子优化的转基因可以编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列并包含SEQ ID NO:2的核酸序列。换言之，RAG1转基因可以编码人RAG1蛋白(SEQ IDNO:1)，同时由于(至少)RAG1催化结构域的密码子优化而具有不同于天然RAG1核酸序列(SEQ ID NO:3)的核酸序列。SEQ ID NO:2中所示的核酸序列是人RAG1的核心催化结构域序列，其显示了在密码子优化期间哪些核酸发生了变化。本发明人已经证实，RAG1的密码子优化有益于RAG1转基因的最佳表达。有利的是，本文为RAG1催化结构域(SEQ ID NO:2)提供的密码子优化序列不会不利地影响RAG1催化结构域功能，这对RAG1活性至关重要。因此，它为RAG1转基因的密码子优化变体提供了良好的碱基序列。因此，RAG1转基因的密码子优化变体可以包括SEQ ID NO:2中所示的密码子优化催化结构域，而在RAG1转基因的其他区域中可以可选地进行额外的密码子优化。
因此，为免生疑问，RAG1核酸序列可以与SEQ ID NO:3的天然RAG1序列至少在催化结构域(在RAG1转基因序列的其他区域进行可选的密码子优化)中不同，而同时仍编码功能性RAG1多肽，如SEQ ID NO:1所示的多肽。
本发明人成功使用的密码子优化人RAG1转基因的序列如SEQ ID NO:4所示。因此，在一个实例中，提供了一种表达盒，其包含与启动子可操作地连接的SEQ ID NO:4的RAG1转基因。合适的启动子在下文中讨论。
正如本文所描述，RAG1转基因与表达盒内的启动子可操作地连接。正如本文所用，术语“可操作地连接”、“可操作地连接”或等效表达都是指各种核酸元件相对于彼此的排列，使得所述元件在功能上连接并且能够以预期的方式彼此相互作用。此类元件可以包括但不限于启动子、增强子和/或调控元件、聚腺苷酸化序列、一个或多个内含子和/或外显子以及待表达的所关注基因的编码序列。当正确定向或可操作地连接时，核酸序列元件共同作用而调节彼此的活性，并最终可以影响表达产物的表达水平。通过调节是指增加、减少或维持特定元件的活性水平。每个元件相对于其他元件的位置可以依照每个元件的5’末端和3’末端进行表示，并且任何具体元件之间的距离可以通过元件之间插入的核苷酸(即间隔序列)，或碱基对的数量表示。正如本领域技术人员所理解的，可操作地连接暗示功能性活动，并且不一定与自然位置连接相关。
正如本文所用，“间隔区序列”或“间隔子”是分隔两个功能性核酸序列的核酸序列。它基本上能够具有任何序列，只要它不妨碍功能性核酸序列按需要发挥功能。通常而言，它是非功能性的，因为它仅存在以将相邻的功能性核酸序列彼此隔开。
正如本文所用，术语“启动子”是指通常位于待转录核酸序列上游的核酸序列。启动子通常是转录发生所必需的，即它启动转录。启动子允许正确激活或抑制在其控制下的编码序列的转录。启动子通常包含被多个转录因子(TF)识别和结合的特异性序列。TF与启动子序列结合并导致RNA聚合酶的募集，RNA聚合酶是从基因编码区合成RNA的酶。许多启动子是本领域已知的。
本文所描述的启动子可以描述为“强启动子”，因为它们驱动细胞中可操作连接的转基因的高水平表达。通常而言，启动子驱动可操作连接的RAG1转基因在细胞中的表达，使得细胞中RAG1转基因的表达产物处于以下水平：是看家基因(例如，ABL1)在细胞(例如，重组人CD34+造血干细胞)中的相应表达产物的至少x倍高。在此上下文中，“x倍高”包括是细胞(例如，重组人CD34+造血干细胞)中的看家基因(例如，ABL1)的相应表达产物的至少2倍高、至少3倍高、至少4倍高、至少5倍高、至少6倍高、至少7倍高、至少8倍高、至少9倍高和至少10倍高。本领域技术人员显而易见的是，“表达产物”涵盖转基因的表达期间产生的所有产物，而因此涵盖转基因的mRNA(转录物)以及蛋白质。用于测量细胞中表达产物水平的方法是本领域众所周知的。例如，转基因的表达产物可以以转录物(mRNA)或蛋白质水平进行测量。
任何已知的mRNA检测方法都可以用于检测样品中的mRNA水平。例如，使用Southern或Northern印迹分析、聚合酶链反应或探针阵列可以检测样品中特定mRNA的水平。在一个实施方式中，样品可以与能够特异性杂合特定mRNA的核酸分子(即，探针，如标记探针)接触。
可替代地，样品中特定mRNA的水平可以通过核酸扩增，例如，通过rtPCR、连接酶链式反应、自持序列复制、转录扩增或任何其他核酸扩增方法，然后使用本领域已知的技术检测所扩增的分子进行评估。
任何已知的蛋白质检测方法可以用于检测样品中的蛋白质水平。通常而言，蛋白质检测方法包括将选择性结合蛋白质的试剂或抗体与样品接触以确定样品中特定蛋白质的水平。优选试剂或抗体进行标记，例如，采用可检测标记物标记。合适的抗体可以是多克隆或单克隆的。抗体片段如Fab或F(ab')2都可以使用。正如本文所用，术语“标记的”是指通过将可检测物质偶联(即，物理连接)至探针或抗体直接标记探针或抗体，以及通过与可检测物质反应间接标记探针或抗体。
样品中特定蛋白质生物标志物的水平可以通过本领域已知的技术如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫沉淀、免疫荧光、酶免疫测试法(EIA)、放射免疫测试法(RIA)、蛋白质印迹分析法和侧向流动装置(LFD)，利用对蛋白质生物标志物具有特异性的膜结合抗体进行测定。可替代地，使用质谱法能够检测和定量样品中特定生物标志物蛋白质的水平。这样的方法在本领域中是常规的。
表达产物的水平可以通过与样品(例如，组成型表达的mRNA或蛋白质)中看家基因的水平进行比较而标准化(normalize，归一化)。合适的看家基因是ABL1，但也可以使用其他基因。这种标准化允许将一个样品中的表达水平与另一个样品或来自不同来源的样品进行比较。
有利的是，当存在5个或更少表达盒拷贝整合到细胞基因组中时，本文所述的启动子驱动所需的转基因表达水平(即，是细胞(例如，重组人CD34+造血干细胞)中看家基因(例如，ABL1)的相应表达产物的至少2倍高、至少3倍高、至少4倍高、至少5倍高、至少6倍高、至少7倍高、至少8倍高、至少9倍高或至少10倍高。
换句话说，即使启动子在低拷贝数质粒的质粒内时，本文所述的启动子也可以驱动所需的RAG1转基因表达水平。术语低拷贝数质粒在本领域内是众所周知的(并用于描述以每个细胞5个或更少拷贝(即每个细胞5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、1个或更少、0.5个或更少、0.4个或更少、0.3个或更少、0.2个或更少等)的频率整合到基因组中的载体)。参见例如：
1.Poletti V,Charrier S,Corre G,Gjata B,Vignaud A,Zhang F,Rothe M,Schambach A,Gaspar HB,Thrasher AJ,Mavilio F.“Preclinical Development of aLentiviral Vector for Gene Therapy of X-Linked Severe CombinedImmunodeficiency.”Mol Ther Methods Clin Dev.2018Mar10；9:257-269.doi:10.1016/j.omtm.2018.03.002.eCollection 2018Jun 15.PubMed PMID:29707600；PubMed CentralPMCID:PMC5918176.
2.Siler U,Paruzynski A,Holtgreve-Grez H,Kuzmenko E,Koehl U,Renner ED,Alhan C,de Loosdrecht AA,
Figure BDA0003331287760000211
J,Pfluger T,Tchinda J,Schmugge M,Jauch A,Naundorf S,Kühlcke K,Notheis G,Güngor T,Kalle CV,Schmidt M,Grez M,Seger R,Reichenbach J.“Successful Combination of Sequential Gene Therapy and RescueAllo-HSCT in Two Children with X-CGD-Importance of Timing.”Curr GeneTher.2015；15(4):416-27.PubMed PMID:25981636.
3.Greene MR,Lockey T,Mehta PK,Kim YS,Eldridge PW,Gray JT,SorrentinoBP.“Transduction of human CD34+repopulating cells with a self-inactivatinglentiviral vector for SCID-X1 produced at clinical scale by a stable cellline.”Hum Gene Ther Methods.2012Oct；23(5):297-308.doi:10.1089/hgtb.2012.150.Epub 2012Nov 7.PubMed PMID:23075105；PubMed Central PMCID:PMC373213.
本领域技术人员可以使用常规方法容易地确定出合适的启动子。例如，在本文提供的质粒骨架(pCCL)内，所关注的潜在启动子可以可操作地连接至本文提供的密码子优化RAG1核酸序列(SEQ ID NO:4)，并且所得质粒可以引入本文描述的RAG-SCID的Rag1-/-小鼠临床前模型。然后，能够如下文实施例部分所述测定RAG1表达产物水平，并与本文所述的ABL1水平进行比较。如果RAG1表达水平是ABL1水平的至少三倍(例如，十倍)高，则所测试的启动子被认为是适合本发明的，因此落入要求保护的本发明的范围内。能够用于测试所关注的潜在启动子的方法的详细解释可以从以下实施例部分找到。替代/补充方法也是本领域技术人员已知的。
通过Q-PCR在CD34+细胞中测试治疗性RAG1基因的表达，能够最容易测试出启动子的强度。作为参考，在同一测试中使用了看家基因如ABL1。两种表达水平之间的比率是启动子强度的直接量度。
Q-PCR采用WPRE、c.o.RAG1、ABL1为靶标用于定量分析mRNA表达。来自单细胞悬浮液的总RNA使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)进行纯化，并使用Superscript III试剂盒(Invitrogen)逆转录成cDNA。使用GeneElute Mammalian Genomic DNA试剂盒(Sigma-Aldrich)从单细胞悬液中提取基因组DNA。Dneasy Blood and Tissue Kit(Qiagen)用于从小鼠器官和组织中分离出基因组DNA。通过将c.o.RAG1标准化为ABL1基因的表达，测定出cDNA样品上转基因表达水平。使用TaqMan Universal Master Mix II(Thermofisher)与来自Universal Probe Library(Roche)的指定基因的特异性探针组合进行qPCR。使用的引物和探针列于表2中。PCR反应在StepOnePlus实时PCR系统(Thermofisher)上进行。所有样品应该一式三份运行。能够使用的示例性引物有：
Figure BDA0003331287760000221
表2：引物
例如，合适的启动子包括MND、CMV、RSV和CAG。这些启动子是众所周知的；参见，例如，Daniela Zychlinski,Axel Schambach,Ute Modlich,Tobias Maetzig,Johann Meyer,Elke Grassman,Anjali Mishra,Christopher Baum,“Physiological Promoters Reducethe Genotoxic Risk of Integrating Gene Vectors”,Molecular Therapy,Volume 16,Issue 4,2008,Pages 718-725,ISSN 1525-0016,https://doi.org/10.1038/mt.2008.5；Astrakhan A,Sather BD,Ryu BY,Khim S,Singh S,Humblet-Baron S,Ochs HD,Miao CH,Rawlings DJ.“Ubiquitous high-level gene expression in hematopoietic lineagesprovides effective lentiviral gene therapy of murine Wiskott-Aldrichsyndrome.”Blood.2012May 10；119(19):4395-407.doi:10.1182/blood-2011-03-340711；Yaguchi M,Ohashi Y,Tsubota T,Sato A,Koyano KW,Wang N,Miyashita Y."Characterization of the properties of seven promoters in the motor cortex ofrats and monkeys after lentiviral vector-mediated gene transfer."Hum GeneTher Methods.2013Dec；24(6):333-44.doi:10.1089/hgtb.2012.238.
MND启动子可以由唯一标识符进行通用标识：GenBank：LZ103461.1。其序列在本文中也显示为SEQ ID NO:5。类似地，CMV启动子可以通过唯一标识符进行通用标识：GenBank：AB902850.1(ncl 1114-1493)；RSV启动子可以由唯一标识符进行通用标识：GenBank：GM964660.1；并且CAG CMV早期增强子/鸡β-肌动蛋白[CAG]启动子可以通过唯一标识符进行通用识别：pubmed/11144964。
因此，在一个实例中，提供了包含与MND启动子可操作连接的RAG1转基因的表达盒。在该实施例中，当启动子为MND时，RAG1转基因可以是人RAG1转基因的密码子优化版本(如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中所示，其中该转基因编码SEQ ID NO:1的蛋白质，但不具有SEQ ID NO:3的天然RAG1核酸序列)。有利的是，RAG1转基因的表达产物(当与MND启动子可操作地连接并且在细胞(例如，重组人CD34+造血干细胞)中表达时)处于以下水平：是细胞中看家基因(例如，ABL1)的至少三倍高。当表达盒以低拷贝数存在于细胞中，如当有5个或更少拷贝的表达盒整合到细胞的基因组中(并且RAG1转基因的表达产物(当与MND启动子可操作地连接并在细胞(例如，重组人CD34+造血干细胞)中表达时)仍处于细胞中看家基因(如ABL1)至少三倍高的水平)时，这尤其有利。
在另一个实例中，提供了包含与CMV启动子可操作连接的RAG1转基因的表达盒。在该实施例中，当启动子为CMV时，RAG1转基因可以是人RAG1转基因或其密码子优化版本(如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中所示，其中转基因编码SEQ ID NO:1的蛋白质，但不具有SEQID NO:3的天然RAG1核酸序列)。有利的是，RAG1转基因的表达产物(当与CMV启动子可操作地连接并且当在细胞(例如，重组人CD34+造血干细胞)中表达时)处于细胞中看家基因(例如，ABL1)至少三倍高的水平。当表达盒以低拷贝数存在于细胞中，如当有5个或更少拷贝的表达盒整合到细胞的基因组中(并且RAG1转基因的表达产物(当可操作地连接到CMV启动子并在细胞(例如，重组人CD34+造血干细胞)中表达时)仍处于细胞中看家基因(如，ABL1)至少三倍高的水平)时，这尤其有利的。
还提供了包含与RSV启动子可操作连接的RAG1转基因的表达盒。在这个实例中，当启动子是RSV时，RAG1转基因可以是人RAG1转基因的密码子优化版本(如SEQ ID NO:2或SEQID NO:4中所示，其中该转基因编码SEQ ID NO:1的蛋白质，但不具有SEQ ID NO:3的天然RAG1核酸序列)。有利的是，RAG1转基因的表达产物(当与RSV启动子可操作地连接并且当在细胞(例如，重组人CD34+造血干细胞)中表达时)仍处于细胞中看家基因(例如，ABL1)至少三倍高的水平。当表达盒以低拷贝数存在于细胞中，如当有5个或更少拷贝的表达盒整合到细胞的基因组中(并且RAG1转基因的表达产物(当与RSV启动子可操作地连接并在细胞(例如，重组人CD34+造血干细胞)中表达时)仍处于细胞中看家基因(如，ABL1)至少三倍高的水平)时，这尤其有利。
还提供了包含与CAG启动子可操作连接的RAG1转基因的表达盒。在这个实例中，当启动子是CAG时，RAG1转基因可以是人RAG1转基因的密码子优化版本(如SEQ ID NO:2或SEQID NO:4中所示，其中该转基因编码SEQ ID NO:1的蛋白质，但不具有SEQ ID NO:3的天然RAG1核酸序列)。有利的是，RAG1转基因的表达产物(当与CAG启动子可操作地连接并且当在细胞(例如，重组人CD34+造血干细胞)中表达时)处于细胞中看家基因(例如，ABL1)至少三倍高的水平。当表达盒以低拷贝数存在于细胞中，如当有5个或更少拷贝的表达盒整合到细胞的基因组中(并且RAG1转基因的表达产物(当与CAG启动子可操作地连接并在细胞(例如，重组人CD34+造血干细胞)中表达时)仍处于细胞中看家基因(如，ABL1)至少三倍高的水平)时，这尤其有利。
正如本文所述，RAG1转基因的表达产物(当与启动子可操作地连接并且在细胞中表达时)有利地处于细胞中看家基因(如，ABL1)至少三倍高的水平。当表达盒以低拷贝数存在于细胞中，如当有5个或更少拷贝的表达盒整合到细胞的基因组中(并且RAG1转基因的表达产物(当可操作地连接至启动子时并且在细胞中表达时)仍然处于细胞中看家基因(例如，ABL1)至少三倍高的水平)时，这是尤其有利的。在整个描述中，示例性细胞作为重组人CD34+造血干细胞提供。然而，具有整合到其基因组中的表达盒的任何细胞都同样相关，例如如造血祖细胞，包括作为非限制性实例的HSC(例如，CD34+HSC)、白细胞、患者特异性诱导多能干细胞(iPSC)或间充质干细胞，。
Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(ABL1)基因通常用作对照基因，以标准化或比较细胞、样品或实验之间转基因的表达水平。这是因为ABL1的基因转录水平在正常样本和白血病样本之间没有显著性差异(Beillard et al.，2003)。因此，ABL1能够用于标准化或比较对RAG1转基因表达产物获得的表达水平(例如，细胞中的RAG1转录物或蛋白质水平)。测量ABL1并将其与所关注的表达产物进行比较的方法在本领域中是众所周知的，并且在本文其他地方进行描述。
表达盒中还可以包括其他的元件以优化所需转基因的表达。
例如，该表达盒可以包含以下元件的任何组合，或实际上所有以下元件的组合，其序列是本领域熟知的；
Figure BDA0003331287760000251
Figure BDA0003331287760000261
表3：用于表达盒的附加元件
在一个实例中，提供了一种表达盒，其包含与启动子可操作地连接的RAG1转基因，其中该表达盒还包含编码土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)的核苷酸序列。WPRE的序列是本领域众所周知的；参见，例如，Zanta-Boussif MA,Charrier S,Brice-Ouzet A,Martin S,Opolon P,Thrasher AJ,Hope TJ,Galy A.“Validation of a mutatedPRE sequence allowing high and sustained transgene expression whileabrogating WHV-X protein synthesis:application to the gene therapy of WAS.”Gene Ther.2009May；16(5):605-19.doi:10.1038/gt.2009.3。
换言之，该表达盒可以包含与MND启动子可操作连接的RAG1转基因，其中表达盒还包含编码土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)的核苷酸序列。在一个实例中，表达盒可以包含与MND启动子可操作地连接的(人)RAG1转基因(或其密码子优化序列)，其中该表达盒还包含编码土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)的核苷酸序列。人RAG 1的密码子优化序列的实例在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中示出。
在另一个实例中，表达盒可以包含与CMV启动子可操作连接的RAG1转基因，其中表达盒还包含编码土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)的核苷酸序列。在一个实例中，表达盒可包含与CMV启动子可操作连接的(人)RAG1转基因(或其密码子优化序列)，其中表达盒还包含编码土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)的核苷酸序列。人RAG 1的密码子优化序列的实例在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中示出。
在另一个实例中，表达盒可包含与RSV启动子可操作连接的RAG1转基因，其中表达盒还包含编码土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)的核苷酸序列。在一个实例中，表达盒可以包含与RSV启动子可操作地连接的(人)RAG1转基因(或其密码子优化序列)，其中表达盒还包含编码土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)的核苷酸序列。人RAG 1的密码子优化序列的实例示于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中。
在另一个实例中，表达盒可包含与CAG启动子可操作连接的RAG1转基因，其中表达盒还包含编码土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)的核苷酸序列。在一个实例中，表达盒可包含与CAG启动子可操作地连接的(人)RAG1转基因(或其密码子优化的序列)，其中表达盒还包含编码土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)的核苷酸序列。人RAG 1的密码子优化序列的实例在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中示出。
有利的是，RAG1转基因的表达产物(当与合适的启动子可操作地连接时并且当在细胞(例如，重组人CD34+造血干细胞)中表达时)处于细胞中看家基因(例如，ABL1)至少三倍高的水平。当表达盒以低拷贝数存在于细胞中，如当有5个或更少拷贝的表达盒整合到细胞的基因组中(并且RAG1转基因的表达产物(当可操作地连接到合适启动子并在细胞(例如，重组人CD34+造血干细胞)中表达时)仍处于细胞中看家基因(例如，ABL1)至少三倍高的水平)时，这尤其有利。
逆转录病毒质粒
本文提供了一种逆转录病毒质粒。该逆转录病毒质粒也称为转移质粒。
逆转录病毒质粒包含表达盒，该表达盒包含与启动子可操作连接的RAG1转基因。合适的RAG1转基因在本文别处进行描述。例如，RAG1转基因可以是人RAG1转基因。人RAG1转基因是密码子优化的，正如本文别处所述(参见，例如，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4)。
本文提供了合适的启动子。正如本文别处所述，本文所述的启动子驱动细胞中可操作连接的转基因的高水平表达。有利的是，即使当表达盒是低拷贝数逆转录病毒质粒的部分时，这些启动子也可以驱动RAG1转基因的所需表达水平。例如，本文所述的启动子能够驱动可操作连接的RAG1转基因在细胞中的表达，使得细胞中RAG1转基因的表达产物处于细胞(例如，重组人CD34+造血干细胞)中看家基因(例如，ABL1)相应表达产物至少x倍高的水平。在此上下文中，“x倍高”包括细胞(例如重组人CD34+造血干细胞)中看家基因(例如，ABL1)的相应表达产物的至少2倍高、至少3倍高、至少4倍高、至少5倍高、至少6倍高、至少7倍高、至少8倍高、至少9倍高、至少10倍高。
逆转录病毒质粒可包含本文所述的任何表达盒。例如，逆转录病毒质粒可以包含表达盒，表达盒包含与MND启动子可操作地连接的RAG1转基因。此类表达盒在本文别处详细描述。
在另一个实例中，逆转录病毒质粒可以包含表达盒，该表达盒包含与CMV启动子可操作地连接的RAG1转基因。在另一个实例中，逆转录病毒质粒可以包含表达盒，该表达盒包含与CAG启动子可操作地连接的RAG1转基因。在另一个实例中，逆转录病毒质粒可以包含含有与RSV启动子可操作地连接的RAG1转基因的表达盒。此类表达盒在本文别处进行详细描述。
除非另有具体说明，否则术语“质粒”和“载体”在本文中可互换使用。
术语“载体”是本领域众所周知的，并且是指核酸分子，例如，本文所述的表达盒可以插入的DNA或RNA。载体用于将所插入的核酸分子(在这种情况下是包含RAG1转基因和可操作连接的启动子的表达盒)转运到合适的宿主细胞中。载体通常包含允许转录插入的核酸分子并且优选将转录物翻译成多肽的所有必需元件。载体通常包含所有必需的元件，使得一旦载体进入宿主细胞，该载体就能够独立于宿主染色体DNA或与宿主染色体DNA同时进行复制；可以产生载体及其插入的核酸分子的几个拷贝。载体可以是附加型载体(即不整合到宿主细胞基因组中的载体)，或可以是整合到宿主细胞基因组中的载体。载体可以是非病毒或病毒载体。非病毒载体包括但不限于质粒载体(例如，pMA-RQ、pUC载体、bluescript载体(pBS)和pBR322或其衍生物，它们没有细菌序列(小环))转座子基的载体(例如，PiggyBac(PB)载体或Sleeping Beauty(SB)载体)等。较大的载体如人工染色体(细菌(BAC)、酵母(YAC)或人(HAC))可以用于容纳更大的插入体。病毒载体源自病毒，并且包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、腺病毒、疱疹病毒、肝炎病毒载体等。通常但非必要，病毒载体是复制缺陷型的，因为它们已经失去了在给定细胞中繁殖的能力，由于复制所必需的病毒基因已从该病毒载体中敲除。然而，一些病毒载体也能够适应在给定细胞例如如癌细胞中特异性复制，并且通常用于触发(癌)细胞特异性(肿瘤)溶解。病毒体是包含病毒和非病毒元件的载体的非限制性实例，特别是它们将脂质体与灭活HIV或流感病毒组合。另一个实例包括与阳离子脂质混合的病毒质粒。
术语“逆转录病毒质粒”在本领域中也是众所周知的，并且如本文所用是指源自称为逆转录病毒的RNA病毒的质粒。逆转录病毒具有将其基因组的一个或多个拷贝插入宿主细胞基因组中的能力。γ逆转录病毒和慢病毒质粒对于基因治疗目的很有吸引力。它们已经被修饰和开发，以通过转移的质粒基因组的染色体整合来介导处理的细胞的稳定遗传修饰。该技术可以用于研究目的以及旨在长期校正如干细胞和祖细胞中的遗传缺陷的临床基因疗法。针对各种靶细胞已经设计出具有趋向性的逆转录病毒质粒颗粒。迄今为止，γ逆转录病毒和慢病毒质粒已用于300多项临床试验，解决了各种疾病的治疗选项。
在一个实例中，本文所述的逆转录病毒质粒是慢病毒质粒。可以使用的替代逆转录病毒质粒包括MFG和MSCV。
逆转录病毒质粒可以是自失活(SIN)慢病毒质粒。SIN慢病毒质粒是有用的，因为使病毒启动子/增强子序列无活性，以显著降低插入诱变的发生率。
在一个实例中，SIN慢病毒质粒包含pCCL骨架。pCCL骨架在本领域中是众所周知的，并且是有利的，因为它是第三代LV质粒，其允许以高滴度生产病毒粒子，并容许使病毒粒子上清液浓度达到临床应用所需的更高滴度。替代的SIN慢病毒质粒包括pRRL、pRLL和pCLL。这些都是包含嵌合劳斯(Rous)肉瘤病毒(RSV)-HIV或CMV-HIV 5'LTR和质粒骨架的慢病毒转移质粒，其中猿病毒40多聚腺苷酸化和(无增强子)复制序列起点已包含于HIV 3'LTR下游，替换大部分从HIV整合位点剩余的人类序列。在pRRL中，来自RSV U3区的增强子和启动子(相对于转录起始位点的核苷酸-233至-1；GenBank登记号J02342)连接到HIV-1LTR的R区。在pRLL中，RSV增强子(核苷酸-233至-50)序列连接到HIV-1的启动子区(从相对于转录起始位点的位置-78)。在pCCL中，CMV的增强子和启动子(相对于转录起始位点的核苷酸-673至-1；GenBank登记号K03104)连接于HIV-1的R区。在pCLL中，CMV增强子(核苷酸-673至-220)连接至HIV-1的启动子区(位置-78)。
因此，作为一个实例，逆转录病毒质粒可以包含1)包含可操作地连接至MND启动子的RAG1转基因(例如，可以如本文所述进行密码子优化的人RAG1；参见SEQ ID NO:2或SEQID NO:4)的表达盒，和2)SIN慢病毒骨架，例如，具有pCCL骨架。
在另一实例中，逆转录病毒质粒可以包含：1)包含可操作地连接至CMV启动子的RAG1转基因(例如，可以如本文所述进行密码子优化的人RAG1；参见SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4)的表达盒和2)SIN慢病毒骨架，例如具有pCCL骨架。
在另一实例中，逆转录病毒质粒可包含：1)包含可操作地连接至RSV启动子的RAG1转基因(例如，可如本文所述进行密码子优化的人RAG1；参见SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4)的表达盒，和2)SIN慢病毒骨架，例如，具有pCCL骨架。
在另一个实例中，逆转录病毒质粒可以包含：1)包含与CAG启动子可操作地连接的RAG1转基因(例如，可如本文所述进行密码子优化的人RAG1；参见SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4)的表达盒，和2)SIN慢病毒骨架，例如，具有pCCL骨架。
正如本文别处所述，本文提供的表达盒还可以具有额外的元件，例如，编码土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)的核苷酸序列。
例如，逆转录病毒质粒可以包含图9的序列。
组合物
还提供了一种组合物，其包含本文所述的表达盒、质粒或病毒粒子以及药用赋形剂、佐剂、稀释剂和/或载体。该组合物通常可以含有药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体、补充免疫增效剂如佐剂和细胞因子以及可选的其他治疗剂或化合物。
正如本文所用，“药用”是指在生物学上或其他方面并非是不合乎需要的材料，即该材料可以与所选择的结合蛋白一起给予个体而不引起任何不良生物学效应或不以有害方式与任何包含它的药物组合物的其他成分相互作用。
赋形剂是与活性成分(例如，表达盒、质粒或病毒粒子)一起配制的天然或合成物质，包括用于扩大制剂或赋予最终剂型中的活性成分治疗增强如促进药物吸收或溶解的目的。赋形剂也能够用于制造过程，以辅助处理相关活性物质，如通过促进粉末流动性或不粘特性，以及辅助体外稳定性，如在预期保质期内防止变性。药用赋形剂是本领域内公知的。因此，本领域普通技术人员可容易确定出合适的赋形剂。例如，合适的药用赋形剂包括水、盐水、葡萄糖水溶液、甘油、乙醇等。
佐剂是改变制剂中其他药剂作用的药理学和/或免疫学药剂。药用佐剂是本领域内众所周知的。因此，本领域普通技术人员可容易确定出合适的佐剂。
稀释剂是稀释试剂。药用稀释剂是本领域内公知的。因此，本领域的普通技术人员可容易确定出合适的稀释剂。
载体在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且与该制剂的其他成分相容。术语“载体”表示天然或合成的有机或无机成分，活性成分与其组合而有利于应用。药用载体是本领域内公知的。因此，本领域的普通技术人员可容易确定出合适的载体。
病毒粒子生产
逆转录病毒质粒，例如，本文所述的慢病毒质粒，可以用于产生病毒粒子。为了提高病毒粒子的安全性，病毒粒子生产所需的组件划分为多种质粒(第二代系统为三个，第三代系统为四个)。两个系统的组件如下：
·编码您所关注的插入体的慢病毒转移质粒。转基因序列的两侧是长末端重复(LTR)序列，这有利于将转移质粒序列整合到宿主基因组中。通常而言，在病毒转导时整合到宿主基因组中的是LTR之间并包括LTR的序列。许多慢病毒转移质粒都基于HIV-1病毒。出于安全原因，转移质粒都无法复制，并且可能在3'LTR中包含额外的缺失，这使病毒在整合后自我灭活(SIN)。
·包装质粒(可以是一个或两个质粒)
·包膜质粒
在一个实例中，本文使用了SIN慢病毒质粒，因为它们被认为对于基因疗法应用是更安全的。
要考虑和优化的最重要组件是包含表达盒的转移质粒。第二代慢病毒质粒会利用病毒LTR启动子进行基因表达，而第三代转移质粒则利用杂合LTR启动子。转移质粒内还可以包含额外或专用启动子：例如，U6启动子包含于pSico质粒中以驱动shRNA表达。转移质粒中能够包含的其他特征包括：基于Tet或Cre的调节和荧光融合或报告子。
第三代系统以几个关键方式进一步改善第二代的安全性。首先，包装系统分为两种质粒：一种编码Rev以及一种编码Gag和Pol。其次，通过添加与转移质粒上的异源启动子融合的嵌合5'LTR，将Tat从第3代系统中消除。从该启动子表达转基因不再依赖于Tat反式激活。第三代转移质粒能够通过第二代或第三代包装系统包装。
生产转基因逆转录病毒(例如，慢病毒)病毒粒子的方法是本领域内众所周知的(例如，如Pike-Overzet，Leukemia，2011的方案)。简言之，将3-4个质粒转染到A293T细胞中：在更换培养基和短暂的培养期后，去除含有病毒粒子的上清液并储存或离心以浓缩病毒粒子。然后，能够使用粗制或浓缩的病毒粒子转导所关注的细胞。然后，可以确定病毒滴度。
因此，本文还提供了病毒粒子，其包括包含与启动子可操作地连接的RAG1转基因的表达盒。合适的表达盒组件在本文别处描述。
为免生疑问，病毒粒子内存在的表达盒将包含RNA核酸序列。例如，存在于病毒粒子内的表达盒可以包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中任一个的RNA等效序列。
本申请中的“转染”泛指任何专门将核酸引入细胞的过程，并涵盖病毒和非病毒载体的引入，并且包括转化、转导等术语和过程。实例包括但不限于：采用病毒载体的转染；采用质粒载体的转化；电穿孔(Fromm et al.(1986)Nature 319:791-3)；脂质转染(lipofection)(Feigner et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7)；显微注射(Mueller et al.(1978)Cell15:579-85)；农杆菌属介导的转移(Fraley et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7)；直接DNA摄取；晶须介导的转化；和微粒轰击(microprojectile bombardment)(Klein et al.(1987)Nature 327:70)。
疗法
本文提供了治疗没有功能性Rag1基因或RAG1蛋白的患者的方法。例如，本文提供了用于治疗患有RAG1缺陷型严重联合免疫缺陷症(RAG1-SCID)或Omenn综合征的患者的方法。人RAG1的功能完全丧失导致人严重的免疫缺陷。因此，通常在婴儿期会发现没有RAG1蛋白功能性Rag1基因的患者。
本文提供的方法也用于治疗RAG1蛋白中具有至少一个突变的患者。换言之，该方法用于治疗由RAG1蛋白中至少一个突变引起的疾病。这些疾病的特征在于患者功能性RAG1的部分丧失，即患者可能具有亚形(hypomorphic，次形态)RAG1变体。由于RAG1变体能够保留部分重组活性，因此由亚形RAG1变体引起的疾病比由RAG1功能完全丧失引起的疾病以较慢速度恶化。因此，与亚形RAG1相关的疾病中危及生命的并发症可能在几年内不会出现。所述疾病通常诊断不足，但可能比RAG1-SCID或OS更常见。原发性免疫缺陷患者的下一代测序工作揭示了许多亚形RAG1突变，对此目前临床上没有治愈性治疗。事实上，迄今为止，已经对71个RAG1变体进行了功能分析。与亚形RAG1变体相关的表型是与肉芽肿和/或自身免疫(CID-G/A)的联合免疫缺陷。RAG1缺陷能够通过重组活性的体外定量进行测量。通过本文描述的方法能够治疗的亚形RAG1变体引起疾病的实例是非典型SCID或联合免疫缺陷症(CID)。CID是一组以导致减少的免疫组库(repertoire)的亚形RAG1突变为特征的疾病。
本文提供的方法在治疗患有RAG1缺陷型严重联合免疫缺陷症(RAG1-SCID)或Omenn综合征的患者时特别有用。然而，如上所述，它们也可以用于治疗患有非典型SCID或联合免疫缺陷症(CID)的患者。因此，虽然本发明主要是在RAG1-SCID或Omenn综合征的背景下进行描述，但本发明的所有这些方面同样适用于非典型SCID或联合免疫缺陷症(CID)。
该方法可以包括基于离体细胞的疗法。用于此类方法的合适方法学是本领域内公知的；参见，例如：“Improving Lentiviral Transduction of CD34+Hematopoietic Stemand Progenitor Cells”April 2018Human Gene Therapy Methods 29(2)DOI:10.1089/hgtb.2017.085；或PLoS One.2009Jul 30；4(7):e6461.doi:10.1371/journal.pone.0006461.“Towards a clinically relevant lentiviral transductionprotocol for primary human CD34 hematopoietic stem/progenitor cells.”Millington M1,Arndt A,Boyd M,Applegate T,Shen S。
例如，从患者中可以分离出造血祖细胞如HSC(例如，CD34+HSC)。进行该分离的方法在本文别处描述。这些细胞的基因组能够通过使用本文所述的表达盒、质粒、病毒粒子或组合物和方法进行改变。然后，可以将重组细胞移植回患者体内。
术语“造血祖细胞”和“造血干细胞”是指产生所有血细胞类型的干细胞谱系的细胞，包括红细胞(红细胞或红血细胞(RBC))、髓细胞(单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞/血小板和树突细胞)和淋巴(T细胞、B细胞、NK细胞)。
合适的是，造血祖细胞如HSC表达造血祖细胞特征的至少一种以下细胞表面标志物：CD34+、CD59+、Thyl/CD90+、CD381o/-和C-kit/CDI 17+。最优选造血祖细胞是CD34+HSC。
HSC是基因疗法的重要靶标，因为它们提供校正细胞的长期来源。HSC产生血细胞的髓系和淋巴系。成熟的血细胞具有有限的寿命，并且必须在整个生命过程中不断更换。可以通过自我更新补充的多能HSC群体的增殖和分化不断产生血细胞。骨髓(BM)是人类造血的主要部位，也是造血干细胞和祖细胞(HSPC)的良好来源。在外周血(PB)中能够发现少量HSPC。在某些适应症或治疗中，它们的数量增加。经过各阶段而成熟的HSC的后代(产生多潜能和谱系定向的祖细胞，包括产生表达RAG1 B的淋巴祖细胞和T细胞祖细胞)是需要RAG1活性的两个细胞群，因此它们能够在重排之前的阶段进行转染，但校正祖细胞具有继续成为校正细胞来源的优势。
因此，该方法可以包括产生重组CD34+造血干细胞的离体方法，该方法包括在表达盒引入并由细胞表达以产生重组CD34+造血干细胞的条件下使CD34+造血干细胞与本文所述的病毒粒子接触。正如本文所用，“表达盒引入并由细胞表达以产生重组CD34+造血干细胞的条件”可以包括在适当培养基和生长因子存在下培养该细胞，然后用本文所述的慢病毒粒子培养。可选地，可以包括纤维连接蛋白(retronectin)、硫酸蛋白胺(proteaminesulphate)或其他促进病毒转导的化合物(转导增强剂)。
在一个实例中，从患者血液或骨髓中分离出CD34+细胞，在GMP级条件下用培养基和生长因子离体培养，接着采用慢病毒粒子连同纤维连接蛋白、硫酸蛋白胺或其他促进病毒转导的化合物(转导增强剂)进行额外培养。额外培养以及有时是病毒的第二次“打击”都可以包括在内。在培养期结束时，可以收获细胞并收集于静脉注射袋中以提供于患者(或在液氮中冷冻直至需要，随后解冻和静脉注射)。
术语“重组”细胞是指包含至少一个整合表达盒的细胞。
因此，本文还提供了包含表达盒的重组CD34+造血干细胞，表达盒包含与启动子(其细节在本文别处描述)可操作地连接的RAG1转基因。有利的是，当本文所述的启动子与本文所述的转基因组合使用时，即使在使用低拷贝数逆转录病毒质粒时也达到了所需的转基因表达水平。换言之，当有5或更少拷贝的表达盒整合到重组人CD34+造血干细胞的基因组中时，使用本文所述的表达盒、质粒和病毒粒子，所得的重组CD34+造血干细胞中RAG1转基因的表达产物处于该细胞中ABL1至少三倍高的水平。
有利的是，表达盒中启动子和RAG1转基因的组合将上述每种细胞类型中的RAG1表达驱动至治疗的最低阈值水平(由于所用启动子的性质；即(即使只有5个或更少拷贝的表达盒整合到该细胞的基因组中，换言之，当使用低拷贝数质粒时)它们驱动转基因的表达使转基因的表达产物的水平是该细胞中看家基因(例如，ABL1)的至少三倍高)。
因此，在一个实例中，提供了一种治疗受试者中RAG1缺陷型SCID或OS的方法，该方法包括以下步骤：
(i)从受试者中提取CD34+造血干细胞；
(ii)将来自(i)的细胞与本文所述的病毒粒子接触；
(iii)将来自(ii)的细胞培养一段时间，优选12-84h，更加优选12-72h；和
(iv)将来自(iii)的细胞放回需要治疗的受试者中。
从受试者的骨髓可以进行组织或流体的活检或穿刺(aspirate)以提取CD34+造血干细胞。活检或抽吸可以根据本领域已知的任何方法进行。例如，在骨髓穿刺中，使用大针进入骨盆骨收集骨髓。
通过本领域已知的任何方法可以由活检或穿刺提取造血祖细胞。例如，使用
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Cell Selection System(Miltenyi Biotec)可以富集CD34+细胞。CD34+细胞也可以在无血清培养基(例如，CellGrow SCGM培养基、CellGenix)中用细胞因子(例如，SCF、rhTPO、rhFLT3)进行弱刺激。
然后，可以使用本领域公知的方法使细胞与病毒粒子接触并一起培养一段合适的时间。
在将重组细胞移植回患者内之前，可能需要清除骨髓龛(nich)。目前的方法依赖于放射和/或化学疗法。因此，该方法可以可选地包括在步骤(iv)之前向受试者给予化学疗法的步骤。合适的化学疗法方案是本领域技术人员众所周知的。
然而，由于放射和/或化学疗法的局限性和不利影响，已经并且正在开发更安全的调理方案，如通过针对造血细胞表面标志物例如CD17、c-kit等的抗体或抗体毒素缀合物对骨髓细胞进行的免疫耗竭。这样的方法也可以构成本文描述的方法的部分。
然后，该方法包括将细胞由此放回到需要治疗的受试者中的步骤。这在本文中也称为将重组细胞移植回患者内。该移植步骤可以使用本领域已知的任何移植方法完成。例如，可以将重组细胞直接注射到患者的血液中或以其他方式给予患者。
通过将表达盒引入源自有此需要的患者并因此在免疫学上与有此需要的患者完全匹配的自体细胞中，可以产生能够安全地重新引入患者中的细胞，并有效地产生将会有效改善与患者疾病相关的一种或多种临床状况的细胞群。
上面提供的实例是指HSC。然而，可替代地，从患者分离出的白细胞也能够用于上述疗法。
可以创建患者特异性诱导多能干细胞(iPSC)。然后，通过使用本文描述的表达盒、质粒、病毒粒子或组合物和方法可以改变这些iPS细胞的基因组。然后，可以将iPSC分化成造血祖细胞或白细胞。最后，可以将造血祖细胞或白细胞植入患者内。
可替代地，将间充质干细胞从患者中分离出来，并能够用于上述疗法。
离体细胞疗法的一个优点是可以在给药前对治疗剂进行综合分析。此外，在植入之前，能够分离或富集特定细胞群，包括克隆群。
还描述了一种基于体内疗法的方法。在该方法中，使用本文所述的材料和方法校正患者中细胞的染色体DNA。合适的是，该细胞是白细胞、骨髓细胞、造血祖细胞、HSC或HSCCD34+细胞。
尽管血细胞是离体治疗和疗法的有吸引力的靶标，但递送效率的提高可能允许直接在体内递送至HSC和/或其他B和T细胞祖细胞，如CD34+细胞。理想情况下，该表达盒的靶向和引入将针对相关细胞。
体内基因疗法的一个优点是易于治疗性生产和给药。相同的治疗方法和疗法将有可能用于治疗不只一个患者，例如，具有相同或相似基因型或等位基因的多个患者。相比之下，离体细胞疗法通常需要使用患者自己的细胞，这些细胞要进行分离、处理并返回给同一患者。
用于重组细胞的药用载体
将重组细胞给予本文设想的受试者的离体方法包括使用包含重组细胞的治疗组合物。
治疗组合物包含生理上可耐受的载体和重组细胞组合物，以及可选的至少一种作为活性成分溶解或分散于其中的本文所述的额外生物活性剂。合适的是，除非如此需要，否则当出于治疗目的给予哺乳动物或人类患者时，该治疗组合物基本上不是免疫原性的。
一般而言，作为具有药用载体的悬浮液给予本文所述的重组细胞。本领域技术人员将认识到，用于细胞组合物的药用载体将不包括其量会显著干扰待递送至受试者的细胞的活力的缓冲剂、化合物、冷冻保存剂、防腐剂或其他试剂。包含重组细胞的配制品能够包括例如允许维持细胞膜完整性的渗透缓冲液，和在给药时维持细胞活力或增强植入的可选营养物。此类配制品和悬浮液对于本领域技术人员是已知的，和/或可以使用常规实验调整而用于祖细胞，如本文中所述。
重组细胞组合物也能够进行乳化或作为脂质体组合物的形式存在，条件是该乳化方案不会不利地影响细胞活力。重组细胞和任何其他活性成分能够与其量适合用于本文所述的治疗方法并与活性成分相容的药用赋形剂混合。
包含于重组细胞组合物中的其他试剂能够包括其中组分的药用盐。药用盐包括酸加成盐(与多肽的游离氨基基团形成)，其与无机酸如例如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等形成。与游离羧基形成的盐也能够衍生自无机碱如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁(ferric hydroxide)，以及有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
生理上可耐受的载体在本领域内是公知的。示例性的液体载体是除活性成分和水之外不包含物质的无菌水溶液，或包含缓冲剂如生理pH值的磷酸钠、生理盐水或这两者，如磷酸盐缓冲盐水。更进一步地，水性载体能够包含多于一种缓冲盐，以及诸如氯化钠和氯化钾、葡萄糖、聚乙二醇和其他溶质的盐。除了排除水之外，液体组合物还能够包含液相。这种附加液相的实例是甘油、植物油如棉籽油和水-油乳液。重组细胞组合物中使用的有效治疗特定疾病或病症的活性化合物的量将取决于该疾病或病症的性质，并能够通过标准临床技术确定。
重组细胞的给药&功效
术语“给药”、“引入”和“移植”在通过导致将所引入的细胞至少部分定域于所需位置如受伤或修复的位置使得产生所需效果的方法或途径将重组细胞例如HPSC细胞植入受试者中的背景下是可互换使用的。可以通过导致递送至受试者的所需位置而在该位置上至少部分所植入的细胞或细胞组件保持活力的任何合适途径给予重组细胞例如HPSC细胞。给予受试者后细胞的活力期可以短至数小时，例如，二十四小时，至数天，至长达数年，或甚至达患者的寿命，即长期移植。例如，在本文所述的一些实施方式中，通过全身给药途径如腹膜内或静脉内途径给予有效量的生肌祖细胞。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指需要对其诊断、处理或治疗的任何受试者。出于本公开的目的，受试者可以是灵长类动物，优选人，或其他哺乳动物如狗、猫、马、猪、山羊或牛等。
当预防性提供时，可以在SCID和/或Omenn综合征的任何症状之前，例如，在α/βT-细胞淋巴细胞随着γ/δT-细胞扩增的发展、严重巨细胞病毒(CMV)感染、自身免疫、皮肤慢性炎症、嗜酸性粒细胞增多、生长迟缓、淋巴结肿大、脾肿大、腹泻和肝脏肿大之前，将本文所述的重组细胞给予受试者。因此，造血祖细胞群的预防性给予用于预防SCID和/或Omenn综合征。
当治疗性提供时，在SCID和/或Omenn综合征的症状或病征出现时(或之后)，例如，在疾病发作时提供HPSC。
合适地，根据本文所述的方法给予的HPSC群包含获自一个或多个供体的同种异体HPSC。“同种异体”是指HPSC或包含获自同一物种的一个或多个不同供体的HPSC的生物样品，其中一个或多个基因座的基因是不相同的。例如，给予受试者的HPSC群能够源自一个或多个不相关的供体受试者，或源自一个或多个不同的兄弟姐妹。合适地，能够使用同基因造血祖细胞群，如获自基因相同的动物或获自同卵双胞胎的那些。或者，HPSC是自体细胞；即，从受试者获得或分离出并给予同一受试者的HPSC，即供体和受体是相同的。
术语“有效量”是指预防或减轻至少一种或多种SCID和/或Omenn综合征的体征或症状所需的重组细胞群或其后代的量，并且涉及组合物提供所需效果例如治疗患有SCID和/或Omenn综合征的受试者的充足用量。因此，术语“治疗有效量”是指重组细胞或包含重组细胞的组合物在给予典型受试者如患有SCID和/或Omenn综合征或具有患上SCID和/或Omenn综合征风险的受试者时足以促进具体效果的量。有效量还将包括足以预防或延迟疾病症状的发展、改变疾病症状的进程(例如但不限于减缓疾病症状的进展)或逆转疾病的症状的量。应当理解的是，对于任何给定的情况，合适的“有效量”可以由本领域普通技术人员使用常规实验确定。
合适的是，有效量的HPSC包括至少102HPSC、至少5×102HPSC、至少103HPSC、至少5×103HPSC、至少104HPSC、至少5×104HPSC、至少105HPSC、至少2×105HPSC、至少3×105HPSC，至少4×105HPSC、至少5×105HPSC、至少6×105HPSC，至少7×105HPSC、至少8×105HPSC、至少9×105HPSC、至少1×106HPSC、至少2×106HPSC、至少3×106HPSC、至少4×106HPSC、至少5×106HPSC、至少6×106HPSC、至少7×106HPSC、至少8×106HPSC、至少9×106HPSC或其倍数。该HPSC来自一个或多个供体，或获自自体源。合适的是，本文所述的HPSC在给予有此需要的受试者之前在培养物中进行扩增。
“给药”是指通过导致细胞组合物至少部分定位于所需位点的方法或途径将HPSC组合物递送于受试者中。能够通过在受试者中产生有效治疗的任何合适途径给予细胞组合物，即给药导致向受试者的所需位置的递送，在该位置上递送至少一部分组合物，即在一段时间内至少1×104个细胞会递送至所需的位置。给药方式包括注射、输注、滴注或摄入。“注射”包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。在一些实施方式中，该途径是静脉内。对于细胞的递送，能够通过注射或输注进行给药。
合适的是，细胞进行全身给药。短语“全身给药”、“系统性给药”、“外周给药”和“外周性给药”是指祖细胞群给药，使得其进入受试者的循环系统，因此经历新陈代谢等过程，不是直接进入靶位点、组织或器官，。
用于治疗SCID和/或Omenn综合征的组合物的功效能够由熟练的临床医生确定。如果疾病的任何一种或多种体征或症状以有益的方式改变，则治疗被认为是“有效的”。例如，当CD34+细胞中所关注的功能性RAG1蛋白的水平处于合适的看家基因(例如，ABL1)水平的至少三倍高的水平时，则该治疗被认为是有效的。疗效也能够通过住院或对医疗干预的需要而评价的个体未能恶化(例如，疾病的进展受阻或至少减缓)进行衡量。测量这些指标的方法在本领域技术人员是已知的和/或在本文中进行了描述。治疗包括对个体或动物(一些非限制性实例包括人或哺乳动物)的疾病的任何治疗，并且包括：(1)抑制疾病，例如，阻止或减缓症状的进展；(2)缓解疾病，例如，使症状消退；和(3)预防或减少症状发展的可能性。
根据本公开的治疗通过增加个体中功能性RAG1的量而改善与SCID和/或Omenn综合征相关的一个或多个症状。通常与SCID和/或Omenn综合征相关的早期体征包括例如α/βT-细胞淋巴细胞随着γ/δT-细胞扩增的发展、严重巨细胞病毒(CMV)感染、自身免疫、皮肤慢性炎症、嗜酸性粒细胞增多症、发育不良、淋巴结肿大、脾肿大、腹泻和肝脏肿大。
试剂盒
本文还提供了用于实施本发明方法的试剂盒。试剂盒可以包括一个或多个本发明的表达盒、本发明的质粒或本发明的病毒粒子，和/或实施本发明方法的实施方式所必需的任何核酸或蛋白质分子，或其任何组合。合适的是，试剂盒可以包含试剂和/或用于重组和/或稀释质粒的试剂。合适的是，试剂盒的组件可以处于单独容器中，或组合于单个容器中。
合适的是，如上所述的试剂盒还包含一种或多种其他试剂，其中此类其他试剂选自缓冲液、用于将多肽或多核苷酸引入细胞的缓冲液、洗涤缓冲液、对照试剂等。缓冲液能够是稳定缓冲液、重构缓冲液、稀释缓冲液等。
除了上述组件之外，试剂盒还能够包括使用试剂盒的组件实践该方法的说明书。实践该方法的说明书通常会记录于合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷于基材上，如纸或塑料等。说明书可以作为包装插入物存在于试剂盒中，存在于试剂盒或其组件的容器的标签中(即，与包装或子包装相关)等。说明书能够作为电子存储数据文件存在于合适的计算机可读存储介质上，例如，CD-ROM、磁盘、闪存驱动器等。在某些情况下，试剂盒中不存在实际说明书，而可以提供远程来源(例如，通过互联网)获取说明书的方法。该实施方式的实例是包括可以查看说明书的网络地址和/或可以从其下载说明书的网络地址的试剂盒。与说明书一样，这种用于获得说明书的方式能够记录于合适的基底上。
通用定义
正如本文所用，“互补”或“互补性”是指两个核酸序列的沃森-克里克(Waston-Crick)碱基配对。例如，序列5'-AGT-3'与互补序列3'-TCA-5'结合。两个核酸序列之间的互补性可以是“部分的”，其中只有一些碱基与其互补物结合，或当序列中的每个碱基都与其互补碱基结合时，互补性可以是完整的。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂合的效率和强度具有显著影响。
术语“杂合”是指在杂合过程中两个至少部分互补的核苷酸序列的退火。为了允许杂合发生，互补核酸分子通常进行热或化学变性以将双链解链成两条单链和/或从单链核酸去除发夹(hairpins)或其他二级结构。杂合的严格性受条件如温度、盐浓度和杂合缓冲液组成的影响。常规杂合条件描述于例如Sambrook(2001)Molecular Cloning:a labmanual,3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press,CSH,New York中，但熟练的技术人员会理解的是，能够在已知或预期同源性的功能和/或核酸序列的长度中设计许多不同的杂合条件。杂合的高严格条件包括高温和/或低钠/盐浓度(盐包括，例如，NaCl和柠檬酸钠中的钠)和/或在杂合缓冲液中包含的甲酰胺和/或降低化合物如作为杂合缓冲液中的SDS(十二烷基硫酸钠去污剂)的浓度和/或从杂合缓冲液中去除化合物如硫酸葡聚糖或聚乙二醇(促进分子云集)。作为非限制性实例，用于严格杂合的代表性盐和温度条件是：1xSSC，65℃下0.5％SDS。缩写SSC是指用于核酸杂合溶液的缓冲液。一升20×(20倍浓缩物)SSC缓冲原液(pH 7.0)含有175.3g氯化钠和88.2g柠檬酸钠。完成杂合的代表性时间为12小时。
术语“同一性”和“相同的”等是指两个聚合分子之间，例如，两个核酸分子之间，如两个DNA分子之间的序列相似性。例如，使用Altschul et al.1990(J Mol Biol 215:403-10)最初描述的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)，如文献Tatusova andMadden 1999(FEMS Microbiol Lett 174:247-250)描述的“Blast 2sequences”算法，可以进行序列比对和序列同一性测定。
用于比较的比对序列的方法是本领域内公知的。各种程序和比对算法描述于例如：Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins and Sharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins and Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang et al.(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson et al.(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana et al.(1999)FEMS Microbiol.Lett.174:247-50中。序列比对方法和同源性计算法的详细细节能够在例如Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10中找到。
国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)的Basic Local Alignment Search Tool(BLASTTM；Altschul et al.(1990)能够从多个来源获得，包括国家生物技术信息中心(Bethesda,MD)和互联网，用于与多个序列分析程序联合使用。如何使用该程序确定序列同一性的描述能够获自互联网上BLASTTM的“help”部分。对于核酸序列的比较，可以采用使用默认参数的BLASTTM(Blastn)程序的“Blast2sequences”功能。当通过该方法评价时，与参考序列具有甚至更大相似性的核酸序列将显示出序列同一性百分比增加。通常而言，序列同一性百分比在整个序列长度内进行计算。
例如，通过采用以下评分参数的Needleman-Wunsch算法，适当找到全局最优比对：匹配分数：+2，错配分数：-3；空位惩罚：空位开放5，空位扩展2。所得最优全局比对的同一性百分比通过比对碱基数与比对总长度的比率乘以100进行适当计算，其中比对长度包括匹配和错配。
虽然本文详细讨论了本发明的各种实施方式的制备和使用，但应当理解的是，本发明提供了许多能够在各种特定环境中实现的可适用发明概念。本文讨论的具体实施方式仅用于举例说明制备和使用本发明的具体方式，并非限制本发明的范围。
除非另有说明，否则本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术都属于本领域的技术范畴。这些技术在文献中有充分的解释。参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,USA)；Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Third Edition,(Sambrook et al,2001,Cold Spring Harbor,NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.,1984)；U.S.Pat.No.4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(Harries and Higginseds.1984)；Transcription and Translation(Hames and Higgins eds.1984)；Cultureof Animal Cells(Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press,1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；theseries,Methods in Enzymology(Abelson and Simon,eds.-in-chief,Academic Press,Inc.,New York),specifically,Vols.154and 155(Wu et al.eds.)and Vol.185,"GeneExpression Technology"(Goeddel,ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(Miller and Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；ImmunochemicalMethods in Cell and Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook of Experimental Immunology,Vols.I-IV(Weir andBlackwell,eds.,1986)；和Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。
本文定义的术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。如“一”、“一个”和“该”之类的术语并非旨在仅指单个实体，而是包括可以用于举例说明的具体实例的一般类别。本文中的术语用于描述本发明的具体实施方式，但它们的使用并不限制本发明，除非在权利要求中进行了概述。
实施例
结果
MND启动子作为校正Rag1缺陷的最佳载体。
在该项目开始时，本发明人在CCL骨架中构建了四种不同的SIN LV质粒，并测试了之前已用于其他临床试验的四种不同的启动子：PGK(磷酸甘油酸激酶)、MND(骨髓增殖性肉瘤病毒增强子，阴性对照区删除，dl587rev引物结合位点取代)，染色质重塑元件(UCOE)，和UCOE与MND的组合(Cbx-MND)用于驱动RAG1密码子优化版本的表达(图1A)。重组慢病毒通过将转移载体与GAG-Pol、REV和包膜(VSV-G)质粒一起转染产生，并随后用于转导来自Rag1缺陷小鼠的谱系阴性BM细胞。Rag1 KO小鼠移植有野生型(WT)干细胞、模拟转导Rag1 KO干细胞或使用四种不同启动子的基因疗法治疗的干细胞。每4周对小鼠采血并在16周后处死，然后通过流式细胞术和Q-PCR广泛分析病毒拷贝数(VCN)、WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)和治疗基因RAG1的表达(图7A)。为了反映这四种载体的已知启动子强度，在初始实验中产生广泛的RAG1表达。在4个月后，或如果它们在该时间之前表现出疾病征兆并通过流式细胞术分析了免疫器官，小鼠被处死。在用wt干细胞处理的小鼠和MND-coRAG1处理的基因疗法小鼠以及偶尔在具有Cbx3-MND元件的小鼠中观察到BM中IgM+B220+B细胞(图1B)的恢复，但其中使用PGK或UCOE启动子的小鼠(图1B、C)则没有观察到。如预期的，模拟转导Rag1KO干细胞并未恢复B细胞发育，其中细胞在前B细胞阶段被阻断。
我们接着使用(在其他标记物中)CD4和CD8分析了胸腺的T细胞表达。使用wt和MND-c.o.RAG1细胞观察到具有全谱DP和SP发育阶段的合适T细胞发育，但在使用的任何其他启动子中均未观察到(图1D、E)。
在低c.o.RAG1表达组中，本发明人发现许多小鼠(9只中有4只)出现皮疹，而高c.o.RAG1表达组的动物以及接受野生型细胞或未校正RAG1敲除细胞的动物没有显示出任何健康问题。
为了更好地了解所使用的各种启动子的功效，本发明人分析了RAG1表达与BM中产生的B细胞(图2A)和胸腺中的T细胞的数量(图2B)之间的关系，因为这些是RAG基因活跃的两个主要淋巴器官。对于B细胞发育，BM中RAG1表达和B220+细胞之间存在明显的线性相关性，高达看家基因水平的10倍。对于T细胞，本发明人观察到存在最小c.o.RAG1表达的阈值，大约是看家对照水平的10倍。用具有低于此阈值的c.o.RAG1表达的干细胞重建的小鼠几乎没有重建胸腺T细胞发育。
除了功效之外，安全性是基因疗法载体临床使用的一个重要方面。作为额外的选择标准，本发明人使用IVIM测试法，这是目前公认的病毒载体安全性标准。已经证实所有四种载体的插入诱变事件频率均是经典RSF91γ-逆转录病毒载体的至少50倍低(图2C)，并且只有UCOE载体的再接种效率明显低于其他三种启动子。
最后，本发明人检查了基因疗法治疗小鼠中产生的TCRβ库的多样性和标绘克隆性(plot clonality)(图2D)。本发明人对24个不同的Vb基因使用了GeneScan分析并计算了累积复杂性评分。而且，正如代表性图中以及由最高分所示，MND启动子的表现与wt处理小鼠一样好。
因此，本发明人推断，pCCL-MND-c.o.RAG1 LV载体是最佳载体选择，并着手将载体制成GMP品级。以下描述的所有实验均使用此临床级载体进行，以进行进一步的临床前测试。
对Rag1-/-小鼠的pCCL-MND-coRAG1 LV载体的广泛临床前测试。
用MND载体、阳性(wt干细胞)和阴性对照(模拟转导Rag1-/-干细胞)处理的8只Rag1-/-小鼠的初步分析证实了外周(PB)和BM中的B细胞重建良好(图3A)，虽然数量仍然低于用wt干细胞处理的小鼠(图3B和图7B)，这可能是由于部分阻止了从源自用水平不足的c.o.RAG1转导而支持完整Ig重排(图7C)的前B到未成熟B细胞阶段的发育。或者，残留的pro和pre B细胞能够通过占据重要的发育龛而抑制B细胞的发育。然而，基因治疗小鼠在脾脏中显示出相同比例的未成熟和成熟B细胞亚群(图3C)。在T细胞部位上，大多数GT小鼠显示出接近完全正常胸腺T细胞发育，胸腺细胞数量几乎正常(图3D和图7C)，虽然外周T细胞数量恢复至正常水平的～30％(图3E)，幼稚CD4和CD8T细胞的比例略低，效应子记忆亚群增加(图3F)，这很可能是由于从胸腺流出的初始T细胞的稳态增殖所致。除了通过流式细胞术分析初级和次级免疫器官外，本发明人还通过组织学分析检查了免疫系统的恢复。脾脏、淋巴结和胸腺在GT后显示出非常正常的结构(图3G)，与用wt干细胞处理的小鼠相当，并且与用模拟转导Rag1-/-细胞处理的阴性对照小鼠完全不同。重要的是，在用MND-coRAG1基因疗法治疗的小鼠中也观察到将T细胞引导到CD4+调节性T细胞谱系(T reg)中的FoxP3表达的恢复(图3G)。
Rag1基因疗法后免疫的功能重建
接着，本发明人测试了发育的T细胞和B细胞是否具有多样化库并且是否能够组装针对T细胞依赖性新抗原的免疫应答。GeneScan分析显示了多样化的TCR Vb库，这在免疫前比用wt干细胞重建的小鼠稍微简单一些(图4A)，但免疫后免疫库没有统计学差异。还检查了总IgM、IgG和IgE水平(图4B和图7E)，并且在GT治疗的小鼠中其接近正常水平。本发明人使用TNP-KLH作为T细胞特异性抗原并测量TNP特异性IgG抗体的产生，从而研究所开发的T细胞和B细胞是否能够在主动免疫反应中协同作用。用wt干细胞处理的小鼠和用GT处理的小鼠之间血清中的TNP特异性IgG水平相似(图4C)。
当各个检查TCR Vb家族时，表明MNDCoRAG1构建体提供了与采用多克隆TCR Vb家族并且没有干扰的TCR Vb使用或寡克隆扩增的WT对照更具可比性的重排模式(如在其他构建体中观察到的)。重要的是，利用临床MND-coRAG1批次，在免疫前后，所处理的小鼠的免疫多样性与WT对照小鼠相当。重要的是，虽然CID小鼠模型对B细胞依赖性T细胞抗原具有缺陷反应，但本发明人的TNP-KLH免疫MND-c.o.RAG1基因疗法小鼠能够成功地对B细胞依赖性T细胞抗原产生与对照小鼠相当水平的免疫反应，这表明接受基因疗法治疗的小鼠不存在CID表型，而是能够克服这种免疫缺陷表型。
载体的临床前安全性测试
根据监管机构的要求，由外部各方测试临床级载体是否存在可复制病毒(RCL)。该载体在两个独立的测试中都测试为阴性(数据未示出)。通常需要的其他安全性测试包括载体的体内生物分布、载体插入位点的检查(尤其是对可能的克隆生长)和插入诱变测试，如IVIM。
本发明人检查了所有GT治疗小鼠的大量灌注器官上的载体分布(图5A)。灌注用于去除大部分血细胞，其中白细胞应该携带该载体。正如预期的那样，鉴于对c.o.RAG1转导细胞的阳性选择，在胸腺中发现了高VCN，其次是其他免疫器官，脾脏、骨髓、淋巴结和外周血。除了胃和肺中的一些罕见阳性，所有其他器官都具有非常低的信号，这可能是由于灌注不完全，或罕见的个别小鼠的持续感染(图7D，表4)。
器官 免疫表型 病理学 载体生物分布
肾上腺 x
脑 x x
盲肠 x
结肠 x
十二指肠 x
腓肠肌 x x
生殖腺 x x
头-眼 x
心脏 x x
回肠 x
空肠 x x
肾脏 x x
肢(前后肢) x x x
肝 x x
肺 x x
淋巴结(髂) x
淋巴结(腰椎) x
淋巴结(肠系膜) x
淋巴结(骶骨) x
淋巴结(下颌下) x
胰腺 x x
直肠 x
皮肤 x
脊髓 x
脾 x x x
胸骨 x
胃 x x
胸腺 x x x
膀胱 x x
表4：用于小鼠尸检、FAC分析和载体生物分布的器官列表
重要的是，每只小鼠29个不同器官的组织学切片的病理学检查并未显示出用MNDCoRAG1基因疗法治疗的小鼠有任何异常。Omenn综合征(OS)和非典型SCID模型最典型性的病理是具有红皮病、皮肤浸润、嗜酸性粒细胞增多的严重表型。本发明人对用MNDCoRAG1基因疗法载体治疗的小鼠进行了广泛的病理学，并未检测到OS/非典型SCID特征。实际上，在图7D中，显示了肺和肝脏的病理学，并且显示出像WT治疗小鼠一样的正常表型，没有异常T细胞浸润。本发明人还检查了皮肤和小肠，以支持用MND-c.o.RAG1载体治疗的小鼠没有表现出OS或非典型SCID的表型。总之，所有组中均不存在皮肤病的临床症状(不存在溃疡、结痂、发红、脱发)(图10)。除此此外，所有组的皮肤组织学分析证实，MND-c.o.RAG1治疗小鼠中不存在Omenn样综合征的标志，如严重脱发、皮肤红皮病、由皮肤中淋巴细胞和嗜酸性粒细胞组成的致密皮肤炎症。本发明人对小肠(十二指肠、空肠和回肠)和大肠(盲肠和直肠)进行了大量取样；其中也不存在类似于Omenn样综合征的严重炎症浸润。
接着，本发明人使用nrLAM-PCR检查病毒插入位点(图5B)，一种能够将克隆插入体检测为离散条带(其随后能够根据需要测序)的敏感技术(Gabriel wt al.，2014)。本发明人总是发现一条指示多克隆造血功能的条带涂片，除了一些次要条带外，几乎没有寡克隆性的迹象。本发明人推断，没有存在载体诱导克隆选择的证据。这与其他人在HSC中使用SINLV载体的结果一致。
还使用IVIM测试法测试了临床MND-c.o.RAG1的安全性。临床载体在不同独立实验中没有显示出克隆生长，这接近模拟转导细胞的结果(图5C)。这比研究级载体更好，大概是由于更高的纯度导致更好的功能滴度，这导致副作用更少。
RAG1 SCID患者细胞中恢复的B和T细胞发育
本发明人之前已经示出，将来自SCID患者的BM CD34+细胞移植于NSG小鼠中对确定T细胞发育在人SCID中的何处受滞提供信息。这个相同模型也应该适合作为具有患者细胞的临床前功效模型。因此，本发明人从RAG1-SCID患者的冷冻保存BM细胞中纯化出CD34+细胞。患者是亚形的，有一些残留B细胞，但没有T细胞。本发明人用模拟转导或MND-c.o.RAG1转导CD34+细胞移植白消安调理小鼠，并随着时间推移跟踪T和B细胞发育。人类细胞植入类似于移植基因疗法处理的细胞和模拟转导细胞的小鼠之间，这表明基因疗法不影响人细胞的植入。正如预期的那样，在模拟转导的人源化小鼠中观察到B细胞，但GT处理的CD34+细胞的脾脏发现了更高数量的B细胞(图6A和图8B)。存在的B细胞也证实了多克隆Ig重排(图8E)和所产生的免疫球蛋白，因为在小鼠的血清中能够检测到人IgM(图6D)，存在GT之后出现更多多克隆库的趋势。
值得注意的是，虽然在移植了模拟转导RAG1-SCID细胞的小鼠中没有T细胞发育，但基因疗法小鼠却显示出明显可检测的T细胞发育(图6B和图8C)。处死小鼠后，本发明人还检查了它们的胸腺。由于患者是亚形的，本发明人观察到存在一些T细胞发育阶段，包括所有DN、ISP和早期CD3-DP阶段(图6C)。然而，没有细胞是CD3+，并且既没有晚期CD3+DP胸腺细胞，也没有任何SP胸腺细胞，这表明TCRα的重排尤其受到这种RAG1突变的影响。最后，本发明人通过基因扫描(Gene Scan)分析检查了TCRB和TCRG重排。由于材料非常有限，因此无法分析所有可能的Vg和Vb基因，但对于TCRG，在基因疗法治疗组中，所选择的基因片段在框架重排中表现出更多，而仅在GT组中对于TCRB，能够检测到重排(图6E)。脾细胞上的nRLAM_PCR揭示出多克隆模式，没有克隆优势的迹象(图6F)。
讨论
RAG1-SCID患者在TCR和BCR的基因组装中受到阻碍。受影响的儿童通常会经历各种严重的危及生命的感染。用健康的未修饰同种异体干细胞替换受影响的骨髓是目前RAG1-SCID的唯一疗法。尽管匹配供体SCT的总生存期令人满意，但代表大多数病例的错配供体SCT的结果明显更差。此外，约25％的同种异体SCT治疗患者发展为移植物抗宿主病，这显著损害发病率、免疫重建和移植相关死亡率方面的结果(Gennary et al.)。此外，RAG-SCID(和其他重组缺陷形式的T-B-SCID)的移植结果明显比采用B细胞的SCID(即T-B+SCID)更差(Gennery et al.)。
基因校正的自体HSC移植消除了与同种异体干细胞移植(GvHD和排异)相关的风险，而因此将为缺乏匹配供体的患者提供有价值的替代方案。采用LV或RV SIN载体对X-SCID的基因疗法已经证明是成功的，并且没有以前在使用γ-逆转录病毒载体时观察到的异种毒性问题(与所获得的体细胞突变组合的插入突变导致SCID-X1患者基因疗法后的白血病发生。Howe SJ,Mansour MR,Schwarzwaelder K,Bartholomae C,Hubank M,KempskiH,Brugman MH,Pike-Overzet K,Chatters SJ,de Ridder D,Gilmour KC,Adams S,Thornhill SI,Parsley KL,Staal FJ,Gale RE,Linch DC,Bayford J,Brown L,Quaye M,Kinnon C,Ancliff P,Webb DK,Schmidt M,von Kalle C,Gaspar HB,Thrasher AJ.J ClinInvest.2008Sep；118(9):3143-50)。对于ADA-SCID，RV载体(目前以名称Strimvelis作为批准的疗法上市)和LV载体均显示出优异的临床结果，这与匹配供体的HSCT可相媲美，这综述于以下文献中：Morgan,R.A.,Gray,D.,Lomova,A.,and Kohn,D.B.(2017).HematopoieticStem Cell Gene Therapy:Progress and Lessons Learned.Cell stem cell 21,574-590。
与X-连接SCID和ADA-SCID不同，开发RAG-SCID的基因疗法是中所周知困难的。之前的尝试(Lagresle-Peyrou et al.，2008)在临床前Rag1-/-模型中使用了γ逆转录病毒载体，该载体具有很高的插入突变风险。尽管Rag1γ逆转录病毒载体能够更容易校正缺陷，但SIN慢病毒载体最初导致治疗性RAG1基因表达不足，导致“泄漏”SCID或Omenn样表型。在此，本发明人示出了在低VCN下能够获得持久的功能性免疫重建。本发明人还示出，人RAG1缺陷能够在患者细胞中进行功能性恢复，提供了成功临床实施所需的重要附加功效数据。
在我们的研究中，选择了使用MND启动子的SIN LV载体，因为这种相当强的启动子在我们的临床前模型中最有效。MND启动子以前已用于ADA-SCID和肾上腺脑白质营养不良(Adrenoleukodystrophy)(ALD)的基因疗法试验，但没有任何关于插入突变的报道。此外，我们的临床前安全数据表明，MND-coRAG1载体相对安全。本发明人已经发现，使用MND-coRAG1的SIN LV载体能够在没有任何严重异常或组织学病理学的情况下恢复免疫力，因此该载体具有校正广泛范围的RAG1介导疾病的能力。
临床试验表明，ADA-SCID和X-连锁SCID基因疗法导致显著的临床益处，并显著降低医疗保健相关的成本。本发明人期望从我们治疗RAG1-SCID患者的方法中获得类似的受益，因为它将减少(不匹配的)同种异体移植的次优结果，这通常与给予免疫球蛋白的需要有关，并治疗感染性和GvHD相关的并发症。
材料和方法
小鼠
C57BL/6Rag1-/-小鼠最初获自Jackson Laboratory(USA)。C57BL/6野生型小鼠和NOD.Cg-PrkdcSCID Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠购自Charles River(法国)。饲养小鼠并将其保持于Leiden University Medical Center(LUMC)的动物设施中。所有动物实验均经荷兰中央动物实验委员会(Dutch Central Commission for Animal experimentation)(Centrale Commissie Dierproeven,CCD)批准。
慢病毒载体和载体生产
RAG1基因序列按照Pike-Overzet et al(2011)所述进行优化，导致90％的密码子适配于智人基因的密码子偏好。此外，GC含量从48％提高到61％，并且顺式作用基序的数量从21减少到0。所优化的RAG1序列由GeneArt(Regensburg，Germany)合成。密码子优化RAG1(c.o.RAG1)克隆到自失活慢病毒pCCL质粒中，产生Cbx3.MND.coRAG1(以下简称：Cbx3-c.o.RAG1)、pCCL-MND-c.o.RAG1(以下简称：MND-c.o.RAG1)、pCCL-PGK-c.o.RAG1(以下简称：PGK-c.o.RAG1)和pCCL-UCOE-c.o.RAG1(以下简称：UCOE-c.o.RAG1)。对该转基因进行DNA测序，以验证基因转移构建体。用于慢病毒生产的辅助质粒pMDLg/pRRE、pRSV-Rev和pMD2.VSVG由L.Naldini(San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy，Milan，Italy)友情提供(Dull et al.，1998)。通过PlasmidFactory(Bielefeld，Germany)获得大规模的辅助质粒制剂。
使用X-tremeGene HP DNA转染试剂(Sigma-Aldrich)，采用转移和辅助质粒对293T细胞进行瞬时转染。转染后24小时、30小时和48小时收获慢病毒，通过0.22μm孔过滤器(Whatmann)过滤并储存于-80℃。汇合的慢病毒上清液通过超速离心(Beckman OptimaTMLE-80K，转子SW32Ti)以10.000rpm在4℃真空下浓缩16小时。将颗粒再悬浮于StemSpan无血清扩增培养基(SFEM；Stemcell Technologies Inc)中并等分以避免多次冻/融循环。由于没有合适的抗RAG1抗体可用，因此本发明人使用qPCR确定病毒滴度，这如后续所述。临床GMP级载体由在鼠Rag1缺陷骨髓细胞、人CD34+细胞上进行测试和验证的Batavia Biosciences(Leiden，Netherlands)生成，等分于200ml小瓶中并在-80℃下储存直至使用。
鼠谱系阴性骨髓细胞和人CD34+细胞的转导
从C57BL/6野生型和C57BL/6Rag1-/-小鼠的股骨和胫骨获得鼠骨髓(BM)细胞。将所获得的骨头冲洗或压碎，细胞通过0.7μm细胞过滤器(Falcon)，洗涤并存活冷冻。解冻后，使用小鼠谱系耗竭试剂盒和AUTOMacs细胞分选仪(Miltenyi Biotech)分离出谱系阴性细胞。谱系阴性细胞在含有青霉素/链霉素(steptamycin)(5,000单位/5,000μg/ml；Gibco)的StemSpam-SFEM中刺激过夜，并补充50ng/mL重组小鼠FMS相关酪氨酸激酶3配体(rmFLT3L；R&D systems)，100ng/mL重组小鼠干细胞因子(rmSCF；R&D systems)和10ng/mL重组小鼠血小板生成素(thrombopoietin)(rmTPO；R&D systems)。随后使用4μg/mL硫酸蛋白胺(Sigma-Aldrich)并通过在800xg和32℃下自旋接种1小时用不同慢病毒转导Rag1-/-细胞。细胞在37℃、5％CO2条件下在补充有细胞因子的培养基中培养24h。
根据Leiden University Medical Center的Medical Ethical Committee和IRB指南，从诊断为SCID的儿童中获得人骨髓。该患者是复合杂合子，是以下确证的突变：RAG1等位基因1C 256-257缺失AA，等位基因2C1677G>T。单核细胞通过Ficoll梯度离心分离，在胎牛血清(Grenier Bio-one)/10％DMSO(Sigma-Aldrich)中冷冻并储存于液氮中。解冻后，使用CD34 MicroBead UltraPure试剂盒(Milteny Biotec)分离出人CD34+细胞。富集的CD34+细胞在不含庆大霉素(Gentamycin)和酚红(phenolred)(Lonza)的X-VIVO15-1％人白蛋白(200g/L；Sanquin)-补充300ng/ml huSCF(Milteny Biotec)、100ng/ml huTPO(Milteny Biotec)、300ng/ml huFlt3L(Milteny Biotec)和10ng/ml huIL3(MiltenyBiotec)的Pen/Strep培养基中刺激过夜。如前所述，细胞在含有4μg/mL硫酸蛋白胺的X-VIVO-15完全培养基中转导并培养24小时。
Rag1-/-和NSG小鼠的移植
将对照模拟转导细胞(C57BL/6野生型细胞称为WT对照以及Rag1-/-细胞称为KO对照)和转导的Rag1-/-鼠细胞(高达5×105个细胞/小鼠)与支持性Rag1-/-脾细胞(3.106个细胞/小鼠)在不含酚红(Gibco)的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)中混合并通过尾静脉注射移植到预调理的Rag1-/-受体小鼠中。受体小鼠(8-12周龄小鼠)在移植前24小时使用正电压X-射线(8.08Gy)的全身单次辐照或采用连续两剂量的25mg/kg白消安(Sigma-Aldrich)(移植前48小时和24小时)进行调理。过夜培养后，将60.000-70.000个人CD34+细胞再悬浮于不含酚红(Gibco)的(IMDM)中，并静脉内移植到白消安预调理的NSG受体小鼠(5周龄小鼠，如所述的白消安调理)。用于移植的小鼠保持于指定的无病原体部分中。移植后的前四个星期给小鼠喂食额外的DietGel恢复食品(Clear H2O)和含有0.07mg/mL多粘菌素B(Bupha Uitgeest)、0.0875mg/mL环丙沙星(Bayer b.v.)和0.1mg/mL Amfotericine B(Bristol-Myers Squibb)的抗生性水，并每天监测其康乐状况。每4周通过尾静脉切口从小鼠抽取外周血(PB)直至实验结束。从CO2安乐死的小鼠获取PB、胸腺、脾脏和BM。
免疫
在实验结束前4周，用合成TNP-KLH抗原对小鼠进行免疫。腹膜内注射(i.p.)100μg在50％Imject Alum(Thermo Scientific)中的TNP-KLH(Biosearch Technologies Inc.)。3周后，对小鼠腹膜内加强注射在PBS中的100μg TNP-KLH。在加强注射前和加强注射后1周收集血清。
流式细胞术
来自胸腺和脾脏的单细胞悬液通过70μM细胞过滤器(BD Falcon)挤压器官制备，并且如前所述制备来自BM的单细胞悬浮液。使用NH4Cl(8.4g/L)/KHCO3(1g/L)溶液裂解来自PB和脾脏的红细胞。对单细胞悬浮液进行计数并用表1中列出的抗体进行染色。
简言之，细胞在4℃下黑暗中用包括直接缀合抗体的FACS缓冲液(PBS pH 7.4，0.1％叠氮化物，0.2％BSA)中最佳工作溶液的抗体混合物溶液培养30min。用FACS缓冲液洗涤后，在4℃下用链霉亲和素缀合的抗体溶液进行第二个30分钟培养步骤。必要时，使用7AAD(BD Biosciences)作为活力染料。在FACS-CantoII和LSR Fortessa X-20(BDBiosciences)上测量细胞，并使用FlowJO软件(Tree Star)分析数据。
通过RT-qPCR测定载体拷贝数(VCN)和c.o.Rag1表达
qPCR使用WPRE、c.o.RAG1、ABL1和PTBP2作为靶标用于对基因组慢病毒RNA、原病毒DNA拷贝和转基因mRNA表达进行定量分析。使用Rneasy Mini试剂盒(Qiagen)纯化来自单细胞悬浮液的总RNA，并使用Superscript III试剂盒(Invitrogen)将其逆转录成cDNA。使用GeneElute Mammalian Genomic DNA试剂盒(Sigma-Aldrich)从单细胞悬浮液中提取基因组DNA。Dneasy Blood和Tissue Kit(Qiagen)用于从小鼠器官和组织中分离出基因组DNA。通过检测WPRE和PTBP2，确定DNA样品的VCN。通过将c.o.RAG1标准化为ABL1基因的表达，确定出cDNA样品上的转基因表达水平。使用TaqMan Universal Master Mix II(Thermofisher)联合Universal Probe Library(Roche)的指定基因的特异性探针进行qPCR。所使用的引物和探针列于表5和5中。PCR反应在StepOnePlus Real-Time PCR系统(Thermofisher)上进行。所有样品一式三份进行。
Figure BDA0003331287760000541
表5：用于测定VCN和c.o.RAG1表达的引物和探针列表
Figure BDA0003331287760000542
Figure BDA0003331287760000551
Figure BDA0003331287760000561
表6：用于库分析(鼠)的引物和探针列表
血清免疫球蛋白定量
鼠IgG、IgM、IgE、TNP特异性IgG和人IgM通过夹心酶联免疫吸附测试(ELISA)进行测定。NUNC Maxisop板(Thermo Scientific)涂上未标记抗小鼠IgG、IgM(11E10)、IgE抗体(SouthernBiotech)或未标记抗人IgM抗体(Jackson Immuno Research实验室，由Dr.Karahan,LUMC友情提供)。为了检测TNP特异性IgG，将板涂上合成TNP-KLH(BiosearchTechnologies Inc.)。在室温(RT)下用1％BSA/PBS(小鼠)或2％BSA/0.025吐温/PBS(人)阻断1小时，随后将所获得血清的系列稀释液在室温下培养3小时。洗涤后，将板用生物素缀合抗小鼠IgG、IgM、IgE(SouthernBiotec)或抗人IgM(Novex life technology，由Dr.Karahan,LUMC友情提供)在室温下培养30分钟。为了检测，将板用链霉亲和素辣根过氧化物酶(Jackson Immuno Research laboratories)在室温下培养30分钟，随后将叠氮基-双-乙基苯并噻唑啉磺酸(ABTS，Sigma-Aldrich)用作底物。使用Bio-Rad iMark酶标仪和MPM 6软件(Bio-Rad)在415nm波长处采集数据。通过使用纯化的IgG、IgM、IgE蛋白(SouthernBiotech)和人参考血清(Bethyl Laboratories，由Dr.Karahan友情提供，LUMC)作为标准物计算出抗体浓度。
库分析
从鼠脾细胞中纯化出总RNA并如前所述将其逆转录成cDNA。鼠T细胞库的GeneScan分析程序改编自(Pannetier et al.，1993)。使用FAM标记的C基因片段特异性引物连同24个TCR Vβ特异性引物扩增cDNA(见表6。GeneScanTM500ROXTM(ThermoFisher)用作内部尺寸标准。标记的PCR产物在用于片段分析的ABI
Figure BDA0003331287760000571
Genetic Analyzer(AppliedBiosystems)上进行。原始光谱数据由ScoreSpec进行分析、可视化和评分，ScoreSpec是一种用于估计免疫多样性的新型光谱类型分析算法(Cordes et al.，manuscript inpreparation)。ScoreSpec对各自光谱类型峰模式的整体(高斯)峰分布；各峰形状进行识别和评分，同时校正框架外TCR转录。分数范围为0(未检测到峰时)到100(针对不同TCR库)。
对来自BM和胸腺的DNA样本分析NSG小鼠中产生的人免疫球蛋白和T细胞受体库(如前所述提取DNA)。使用EuroClonality/BOMED-2多重PCR方案(van Dongen et al.，2003)分析重排。IgH、IgK、TCRβ和TCRγ重排的扩增分别按照IGH+IGK B细胞克隆性测试(InvivoScribe)和TCRB+TCRG T细胞克隆性测试(InvivoScribe)说明书进行。通过使用用于片段分析的ABI-3730仪(Applied Biosystems)的差示荧光检测分析PCR产物。使用ScoreSpec对输出文件进行可视化和分析。
非限制性线性扩增介导的PCR(nrLAM-PCR)
正如由(Gabriel et al.,2014)；Schmidt M.et al(2014)J.Vis.Exp.(88)，e51543所描述的，通过nrLAM-PCR在鼠骨髓DNA样品上分析慢病毒插入位点。
体外永生化试验(immortalization assay)(IVIM)
按照由(Modlich et al.，2006年)；Baum et al.(2006)Blood108:2545-2553先前所述定量病毒载体(Cbx3-c.o.RAG1、MND-c.o.RAG1、PGK-c.o.RAG1、UCOE-c.o.RAG1)的基因毒性潜力。
大体病理学(Gross pathology，总病理学)和组织病理学
实施完整尸检，收集器官进行宏观和微观检查(收集器官的列表X)。用于大体病理学和组织病理学分析的要检查器官的选择遵循适用的欧洲和国际指南(EMEA1995，WHO2005)(WHO，2005)。对于大体病理学，检查了身体外表面、孔口、胸腹和腔室(分析的器官列于表4中)。
为了组织病理学检查，将器官在4％中性缓冲福尔马林中固定24小时并进行石蜡包埋，根据标准程序(Bancroft and Gamble，2008)对5μm切片进行苏木精和伊红(HE)以及免疫组织化学染色。所有载玻片均由欧洲委员会认证的病理学家(ECVP)进行盲检。
统计分析
使用GraphPad Prism6(GraphPad Software)计算统计数据并生成图表。通过标准的单尾Mann-WithneyU-检验或ANOVA检验确定统计学显著性(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001)。
序列
SEQ ID NO:1：RAG1人蛋白质序列(1043aa)
Figure BDA0003331287760000581
SEQ ID NO:2：编码人RAG1催化结构域的密码子优化核酸序列
Figure BDA0003331287760000582
SEQ ID NO:3：RAG1 cDNA序列
Figure BDA0003331287760000591
SEQ ID NO:4：密码子优化RAG1 DNA序列
Figure BDA0003331287760000601
Figure BDA0003331287760000611
SEQ ID NO:5：MND启动子序列
Figure BDA0003331287760000612
SEQ ID NO:6：引物
Figure BDA0003331287760000613
SEQ ID NO:7：引物
Figure BDA0003331287760000614
SEQ ID NO:8：探针
Figure BDA0003331287760000615
SEQ ID NO:9：引物
Figure BDA0003331287760000621
SEQ ID NO:10：引物
Figure BDA0003331287760000622
SEQ ID NO:11：探针
Figure BDA0003331287760000623
对于SEQ ID NO:12-43，参见表5和6；和图9。
参考文献列表
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Figure BDA0003331287760000631
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WHO(2005).WHO guidelines on nonclinical evaluation of vaccines,W.H.Organization,ed.(Tech Rep Ser),pp.31-63.
序列表
<110> 莱顿大学医学中心附属莱顿教学医院 (Academisch Ziekenhuis Leiden(h.o.d.n. LUMC))
<120> 优化的RAG1缺陷基因疗法
<130> P267488NL
<140> 2022714
<141> 2019-03-11
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1043
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Ala Ala Ser Phe Pro Pro Thr Leu Gly Leu Ser Ser Ala Pro Asp
1 5 10 15
Glu Ile Gln His Pro His Ile Lys Phe Ser Glu Trp Lys Phe Lys Leu
20 25 30
Phe Arg Val Arg Ser Phe Glu Lys Thr Pro Glu Glu Ala Gln Lys Glu
35 40 45
Lys Lys Asp Ser Phe Glu Gly Lys Pro Ser Leu Glu Gln Ser Pro Ala
50 55 60
Val Leu Asp Lys Ala Asp Gly Gln Lys Pro Val Pro Thr Gln Pro Leu
65 70 75 80
Leu Lys Ala His Pro Lys Phe Ser Lys Lys Phe His Asp Asn Glu Lys
85 90 95
Ala Arg Gly Lys Ala Ile His Gln Ala Asn Leu Arg His Leu Cys Arg
100 105 110
Ile Cys Gly Asn Ser Phe Arg Ala Asp Glu His Asn Arg Arg Tyr Pro
115 120 125
Val His Gly Pro Val Asp Gly Lys Thr Leu Gly Leu Leu Arg Lys Lys
130 135 140
Glu Lys Arg Ala Thr Ser Trp Pro Asp Leu Ile Ala Lys Val Phe Arg
145 150 155 160
Ile Asp Val Lys Ala Asp Val Asp Ser Ile His Pro Thr Glu Phe Cys
165 170 175
His Asn Cys Trp Ser Ile Met His Arg Lys Phe Ser Ser Ala Pro Cys
180 185 190
Glu Val Tyr Phe Pro Arg Asn Val Thr Met Glu Trp His Pro His Thr
195 200 205
Pro Ser Cys Asp Ile Cys Asn Thr Ala Arg Arg Gly Leu Lys Arg Lys
210 215 220
Ser Leu Gln Pro Asn Leu Gln Leu Ser Lys Lys Leu Lys Thr Val Leu
225 230 235 240
Asp Gln Ala Arg Gln Ala Arg Gln His Lys Arg Arg Ala Gln Ala Arg
245 250 255
Ile Ser Ser Lys Asp Val Met Lys Lys Ile Ala Asn Cys Ser Lys Ile
260 265 270
His Leu Ser Thr Lys Leu Leu Ala Val Asp Phe Pro Glu His Phe Val
275 280 285
Lys Ser Ile Ser Cys Gln Ile Cys Glu His Ile Leu Ala Asp Pro Val
290 295 300
Glu Thr Asn Cys Lys His Val Phe Cys Arg Val Cys Ile Leu Arg Cys
305 310 315 320
Leu Lys Val Met Gly Ser Tyr Cys Pro Ser Cys Arg Tyr Pro Cys Phe
325 330 335
Pro Thr Asp Leu Glu Ser Pro Val Lys Ser Phe Leu Ser Val Leu Asn
340 345 350
Ser Leu Met Val Lys Cys Pro Ala Lys Glu Cys Asn Glu Glu Val Ser
355 360 365
Leu Glu Lys Tyr Asn His His Ile Ser Ser His Lys Glu Ser Lys Glu
370 375 380
Ile Phe Val His Ile Asn Lys Gly Gly Arg Pro Arg Gln His Leu Leu
385 390 395 400
Ser Leu Thr Arg Arg Ala Gln Lys His Arg Leu Arg Glu Leu Lys Leu
405 410 415
Gln Val Lys Ala Phe Ala Asp Lys Glu Glu Gly Gly Asp Val Lys Ser
420 425 430
Val Cys Met Thr Leu Phe Leu Leu Ala Leu Arg Ala Arg Asn Glu His
435 440 445
Arg Gln Ala Asp Glu Leu Glu Ala Ile Met Gln Gly Lys Gly Ser Gly
450 455 460
Leu Gln Pro Ala Val Cys Leu Ala Ile Arg Val Asn Thr Phe Leu Ser
465 470 475 480
Cys Ser Gln Tyr His Lys Met Tyr Arg Thr Val Lys Ala Ile Thr Gly
485 490 495
Arg Gln Ile Phe Gln Pro Leu His Ala Leu Arg Asn Ala Glu Lys Val
500 505 510
Leu Leu Pro Gly Tyr His His Phe Glu Trp Gln Pro Pro Leu Lys Asn
515 520 525
Val Ser Ser Ser Thr Asp Val Gly Ile Ile Asp Gly Leu Ser Gly Leu
530 535 540
Ser Ser Ser Val Asp Asp Tyr Pro Val Asp Thr Ile Ala Lys Arg Phe
545 550 555 560
Arg Tyr Asp Ser Ala Leu Val Ser Ala Leu Met Asp Met Glu Glu Asp
565 570 575
Ile Leu Glu Gly Met Arg Ser Gln Asp Leu Asp Asp Tyr Leu Asn Gly
580 585 590
Pro Phe Thr Val Val Val Lys Glu Ser Cys Asp Gly Met Gly Asp Val
595 600 605
Ser Glu Lys His Gly Ser Gly Pro Val Val Pro Glu Lys Ala Val Arg
610 615 620
Phe Ser Phe Thr Ile Met Lys Ile Thr Ile Ala His Ser Ser Gln Asn
625 630 635 640
Val Lys Val Phe Glu Glu Ala Lys Pro Asn Ser Glu Leu Cys Cys Lys
645 650 655
Pro Leu Cys Leu Met Leu Ala Asp Glu Ser Asp His Glu Thr Leu Thr
660 665 670
Ala Ile Leu Ser Pro Leu Ile Ala Glu Arg Glu Ala Met Lys Ser Ser
675 680 685
Glu Leu Met Leu Glu Leu Gly Gly Ile Leu Arg Thr Phe Lys Phe Ile
690 695 700
Phe Arg Gly Thr Gly Tyr Asp Glu Lys Leu Val Arg Glu Val Glu Gly
705 710 715 720
Leu Glu Ala Ser Gly Ser Val Tyr Ile Cys Thr Leu Cys Asp Ala Thr
725 730 735
Arg Leu Glu Ala Ser Gln Asn Leu Val Phe His Ser Ile Thr Arg Ser
740 745 750
His Ala Glu Asn Leu Glu Arg Tyr Glu Val Trp Arg Ser Asn Pro Tyr
755 760 765
His Glu Ser Val Glu Glu Leu Arg Asp Arg Val Lys Gly Val Ser Ala
770 775 780
Lys Pro Phe Ile Glu Thr Val Pro Ser Ile Asp Ala Leu His Cys Asp
785 790 795 800
Ile Gly Asn Ala Ala Glu Phe Tyr Lys Ile Phe Gln Leu Glu Ile Gly
805 810 815
Glu Val Tyr Lys Asn Pro Asn Ala Ser Lys Glu Glu Arg Lys Arg Trp
820 825 830
Gln Ala Thr Leu Asp Lys His Leu Arg Lys Lys Met Asn Leu Lys Pro
835 840 845
Ile Met Arg Met Asn Gly Asn Phe Ala Arg Lys Leu Met Thr Lys Glu
850 855 860
Thr Val Asp Ala Val Cys Glu Leu Ile Pro Ser Glu Glu Arg His Glu
865 870 875 880
Ala Leu Arg Glu Leu Met Asp Leu Tyr Leu Lys Met Lys Pro Val Trp
885 890 895
Arg Ser Ser Cys Pro Ala Lys Glu Cys Pro Glu Ser Leu Cys Gln Tyr
900 905 910
Ser Phe Asn Ser Gln Arg Phe Ala Glu Leu Leu Ser Thr Lys Phe Lys
915 920 925
Tyr Arg Tyr Glu Gly Lys Ile Thr Asn Tyr Phe His Lys Thr Leu Ala
930 935 940
His Val Pro Glu Ile Ile Glu Arg Asp Gly Ser Ile Gly Ala Trp Ala
945 950 955 960
Ser Glu Gly Asn Glu Ser Gly Asn Lys Leu Phe Arg Arg Phe Arg Lys
965 970 975
Met Asn Ala Arg Gln Ser Lys Cys Tyr Glu Met Glu Asp Val Leu Lys
980 985 990
His His Trp Leu Tyr Thr Ser Lys Tyr Leu Gln Lys Phe Met Asn Ala
995 1000 1005
His Asn Ala Leu Lys Thr Ser Gly Phe Thr Met Asn Pro Gln Ala
1010 1015 1020
Ser Leu Gly Asp Pro Leu Gly Ile Glu Asp Ser Leu Glu Ser Gln
1025 1030 1035
Asp Ser Met Glu Phe
1040
<210> 2
<211> 1051
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码人RAG1催化结构域的密码子优化核酸序列
<400> 2
caagggcggc agaccccggc agcacctgct gtccctgacc agacgggccc agaagcaccg 60
gctgcgggag ctgaagctcc aggtcaaggc cttcgccgac aaagaggaag gcggcgacgt 120
caagagcgtg tgcatgaccc tgtttctgct ggccctgcgg gccaggaacg agcaccggca 180
ggccgatgag ctggaagcca tcatgcaggg caagggcagc ggcctccagc ctgccgtgtg 240
cctggccatc cgggtgaaca cctttctgag ctgtagccag taccacaaga tgtaccggac 300
cgtgaaggcc atcaccggca gacagatctt ccagcctctg cacgccctgc ggaacgccga 360
gaaggtgctg ctgcccggct accaccactt cgagtggcag ccccccctga agaacgtgag 420
cagcagcacc gacgtgggca tcatcgacgg cctgagcggc ctgtccagca gcgtggacga 480
ctaccctgtg gacaccatcg ccaagcggtt cagatacgac agcgccctgg tgtccgccct 540
gatggacatg gaagaggaca tcctggaagg catgcggagc caggacctgg acgattacct 600
gaacggcccc ttcaccgtgg tggtgaaaga gtcctgcgac ggcatgggcg acgtgagcga 660
gaagcacggc agcggccctg tggtgcccga gaaggccgtg cggttcagct tcaccatcat 720
gaagatcacc atcgcccaca gcagccagaa cgtgaaggtg ttcgaggaag ccaagcccaa 780
cagcgagctg tgctgcaagc ccctgtgcct gatgctggcc gacgagagcg accacgagac 840
cctgaccgcc atcctgagcc ccctgatcgc cgagcgggag gccatgaaga gcagcgaact 900
gatgctggaa ctgggcggca tcctgaggac cttcaagttc atcttccggg gcaccggcta 960
cgacgagaag ctggtccggg aggtggaggg cctggaagcc agcggcagcg tgtacatctg 1020
caccctgtgc gacgccaccc ggctggaagc c 1051
<210> 3
<211> 3132
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> RAG1 cDNA序列
<400> 3
atggcagcct ctttcccacc caccttggga ctcagttctg ccccagatga aattcagcac 60
ccacatatta aattttcaga atggaaattt aagctgttcc gggtgagatc ctttgaaaag 120
acacctgaag aagctcaaaa ggaaaagaag gattcctttg aggggaaacc ctctctggag 180
caatctccag cagtcctgga caaggctgat ggtcagaagc cagtcccaac tcagccattg 240
ttaaaagccc accctaagtt ttcaaagaaa tttcacgaca acgagaaagc aagaggcaaa 300
gcgatccatc aagccaacct tcgacatctc tgccgcatct gtgggaattc ttttagagct 360
gatgagcaca acaggagata tccagtccat ggtcctgtgg atggtaaaac cctaggcctt 420
ttacgaaaga aggaaaagag agctacttcc tggccggacc tcattgccaa ggttttccgg 480
atcgatgtga aggcagatgt tgactcgatc caccccactg agttctgcca taactgctgg 540
agcatcatgc acaggaagtt tagcagtgcc ccatgtgagg tttacttccc gaggaacgtg 600
accatggagt ggcaccccca cacaccatcc tgtgacatct gcaacactgc ccgtcgggga 660
ctcaagagga agagtcttca gccaaacttg cagctcagca aaaaactcaa aactgtgctt 720
gaccaagcaa gacaagcccg tcagcgcaag agaagagctc aggcaaggat cagcagcaag 780
gatgtcatga agaagatcgc caactgcagt aagatacatc ttagtaccaa gctccttgca 840
gtggacttcc cagagcactt tgtgaaatcc atctcctgcc agatctgtga acacattctg 900
gctgaccctg tggagaccaa ctgtaagcat gtcttttgcc gggtctgcat tctcagatgc 960
ctcaaagtca tgggcagcta ttgtccctct tgccgatatc catgcttccc tactgacctg 1020
gagagtccag tgaagtcctt tctgagcgtc ttgaattccc tgatggtgaa atgtccagca 1080
aaagagtgca atgaggaggt cagtttggaa aaatataatc accacatctc aagtcacaag 1140
gaatcaaaag agatttttgt gcacattaat aaagggggcc ggccccgcca acatcttctg 1200
tcgctgactc ggagagctca gaagcaccgg ctgagggagc tcaagctgca agtcaaagcc 1260
tttgctgaca aagaagaagg tggagatgtg aagtccgtgt gcatgacctt gttcctgctg 1320
gctctgaggg cgaggaatga gcacaggcaa gctgatgagc tggaggccat catgcaggga 1380
aagggctctg gcctgcagcc agctgtttgc ttggccatcc gtgtcaacac cttcctcagc 1440
tgcagtcagt accacaagat gtacaggact gtgaaagcca tcacagggag acagattttt 1500
cagcctttgc atgcccttcg gaatgctgag aaggtacttc tgccaggcta ccaccacttt 1560
gagtggcagc cacctctgaa gaatgtgtct tccagcactg atgttggcat tattgatggg 1620
ctgtctggac tatcatcctc tgtggatgat tacccagtgg acaccattgc aaagaggttc 1680
cgctatgatt cagctttggt gtctgctttg atggacatgg aagaagacat cttggaaggc 1740
atgagatccc aagaccttga tgattacctg aatggcccct tcactgtggt ggtgaaggag 1800
tcttgtgatg gaatgggaga cgtgagtgag aagcatggga gtgggcctgt agttccagaa 1860
aaggcagtcc gtttttcatt cacaatcatg aaaattacta ttgcccacag ctctcagaat 1920
gtgaaagtat ttgaagaagc caaacctaac tctgaactgt gttgcaagcc attgtgcctt 1980
atgctggcag atgagtctga ccacgagacg ctgactgcca tcctgagtcc tctcattgct 2040
gagagggagg ccatgaagag cagtgaatta atgcttgagc tgggaggcat tctccggact 2100
ttcaagttca tcttcagggg caccggctat gatgaaaaac ttgtgcggga agtggaaggc 2160
ctcgaggctt ctggctcagt ctacatttgt actctttgtg atgccacccg tctggaagcc 2220
tctcaaaatc ttgtcttcca ctctataacc agaagccatg ctgagaacct ggaacgttat 2280
gaggtctggc gttccaaccc ttaccatgag tctgtggaag aactgcggga tcgggtgaaa 2340
ggggtctcag ctaaaccttt cattgagaca gtcccttcca tagatgcact ccactgtgac 2400
attggcaatg cagctgagtt ctacaagatc ttccagctag agatagggga agtgtataag 2460
aatcccaatg cttccaaaga ggaaaggaaa aggtggcagg ccacactgga caagcatctc 2520
cggaagaaga tgaacctcaa accaatcatg aggatgaatg gcaactttgc caggaagctc 2580
atgaccaaag agactgtgga tgcagtttgt gagttaattc cttccgagga gaggcacgag 2640
gctctgaggg agctgatgga tctttacctg aagatgaaac cagtatggcg atcatcatgc 2700
cctgctaaag agtgcccaga atccctctgc cagtacagtt tcaattcaca gcgttttgct 2760
gagctccttt ctacgaagtt caagtatagg tatgagggaa aaatcaccaa ttattttcac 2820
aaaaccctgg cccatgttcc tgaaattatt gagagggatg gctccattgg ggcatgggca 2880
agtgagggaa atgagtctgg taacaaactg tttaggcgct tccggaaaat gaatgccagg 2940
cagtccaaat gctatgagat ggaagatgtc ctgaaacacc actggttgta cacctccaaa 3000
tacctccaga agtttatgaa tgctcataat gcattaaaaa cctctgggtt taccatgaac 3060
cctcaggcaa gcttagggga cccattaggc atagaggact ctctggaaag ccaagattca 3120
atggaatttt aa 3132
<210> 4
<211> 3132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化RAG1 DNA序列
<400> 4
atggccgcca gcttcccccc taccctgggc ctgagcagcg cccctgacga gatccagcac 60
ccccacatca agttcagcga gtggaagttc aagctgttca gagtgcggag cttcgagaaa 120
acccccgagg aagcccagaa agagaagaag gacagcttcg agggcaagcc cagcctggaa 180
cagagccctg ccgtgctgga caaggccgac ggccagaaac ccgtgcccac ccagcccctg 240
ctgaaggccc accccaagtt cagcaagaag ttccacgaca acgagaaggc caggggcaag 300
gccatccacc aggccaacct gcggcacctg tgccggatct gcggcaacag cttccgggcc 360
gacgagcaca accggcgcta ccccgtgcac ggccccgtgg acggcaagac actgggcctg 420
ctgcggaaga aagagaaacg ggccacctcc tggcccgacc tgatcgccaa ggtgttccgg 480
atcgacgtga aggccgacgt ggacagcatc caccccaccg agttctgcca caactgctgg 540
tccatcatgc accggaagtt cagctccgcc ccctgcgagg tgtacttccc ccggaacgtg 600
accatggaat ggcaccctca cacccccagc tgcgacatct gcaacaccgc cagacggggc 660
ctgaagcgga agagcctcca gcccaacctc cagctgtcca agaaactgaa aaccgtgctg 720
gatcaggccc ggcaggccag gcagcggaag cggagagccc aggcccggat cagcagcaag 780
gacgtgatga agaagatcgc caactgtagc aagatccacc tgagcaccaa gctgctggcc 840
gtggacttcc ccgagcactt cgtgaagagc atcagctgcc agatctgcga gcacatcctg 900
gccgaccccg tggagaccaa ctgcaagcac gtgttctgta gagtgtgcat cctgcggtgc 960
ctgaaagtga tgggcagcta ctgccccagc tgtagatacc cctgcttccc caccgacctg 1020
gaaagccccg tgaagagctt cctgagcgtg ctgaacagcc tgatggtgaa gtgccccgcc 1080
aaagagtgca acgaggaagt cagcctggaa aagtacaacc accacatcag cagccacaaa 1140
gagagcaaag aaatcttcgt ccacatcaac aagggcggca gaccccggca gcacctgctg 1200
tccctgacca gacgggccca gaagcaccgg ctgcgggagc tgaagctcca ggtcaaggcc 1260
ttcgccgaca aagaggaagg cggcgacgtc aagagcgtgt gcatgaccct gtttctgctg 1320
gccctgcggg ccaggaacga gcaccggcag gccgatgagc tggaagccat catgcagggc 1380
aagggcagcg gcctccagcc tgccgtgtgc ctggccatcc gggtgaacac ctttctgagc 1440
tgtagccagt accacaagat gtaccggacc gtgaaggcca tcaccggcag acagatcttc 1500
cagcctctgc acgccctgcg gaacgccgag aaggtgctgc tgcccggcta ccaccacttc 1560
gagtggcagc cccccctgaa gaacgtgagc agcagcaccg acgtgggcat catcgacggc 1620
ctgagcggcc tgtccagcag cgtggacgac taccctgtgg acaccatcgc caagcggttc 1680
agatacgaca gcgccctggt gtccgccctg atggacatgg aagaggacat cctggaaggc 1740
atgcggagcc aggacctgga cgattacctg aacggcccct tcaccgtggt ggtgaaagag 1800
tcctgcgacg gcatgggcga cgtgagcgag aagcacggca gcggccctgt ggtgcccgag 1860
aaggccgtgc ggttcagctt caccatcatg aagatcacca tcgcccacag cagccagaac 1920
gtgaaggtgt tcgaggaagc caagcccaac agcgagctgt gctgcaagcc cctgtgcctg 1980
atgctggccg acgagagcga ccacgagacc ctgaccgcca tcctgagccc cctgatcgcc 2040
gagcgggagg ccatgaagag cagcgaactg atgctggaac tgggcggcat cctgaggacc 2100
ttcaagttca tcttccgggg caccggctac gacgagaagc tggtccggga ggtggagggc 2160
ctggaagcca gcggcagcgt gtacatctgc accctgtgcg acgccacccg gctggaagcc 2220
tcccagaacc tggtgttcca cagcatcacc agaagccacg ccgagaacct ggaaagatac 2280
gaagtgtggc ggagcaaccc ctaccacgag agcgtggagg aactgcggga ccgggtcaag 2340
ggcgtgagcg ccaagccctt catcgagacc gtgcccagca tcgacgccct gcactgcgat 2400
atcggcaacg ccgccgagtt ctacaagatc tttcagctgg aaatcgggga ggtgtacaag 2460
aaccccaacg ccagcaaaga ggaacggaag cgctggcagg ccaccctgga caagcacctg 2520
aggaagaaaa tgaacctgaa gcccatcatg cggatgaacg gcaacttcgc tcggaagctg 2580
atgaccaaag aaaccgtgga cgccgtgtgc gagctgatcc ccagcgagga acggcacgag 2640
gccctgcgcg agctgatgga cctgtacctg aagatgaagc ccgtgtggag aagcagctgt 2700
cctgccaaag aatgccccga gagcctgtgc cagtacagct tcaacagcca gcggttcgcc 2760
gagctgctgt ccaccaagtt caagtaccgc tacgagggca agatcaccaa ctacttccac 2820
aagaccctgg cccacgtgcc cgagatcatc gagcgggacg gcagcatcgg cgcctgggcc 2880
agcgagggca acgagagcgg caacaagctg ttccggcggt tcagaaagat gaatgccagg 2940
cagagcaagt gctacgagat ggaagatgtg ctgaagcacc actggctgta caccagcaag 3000
tacctccaga aattcatgaa cgcccacaac gccctgaaaa ccagcggctt caccatgaac 3060
ccccaggcca gcctgggcga ccctctgggc atcgaggact ccctggaatc ccaggacagc 3120
atggaattct ga 3132
<210> 5
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MND 启动子序列
<400> 5
tttatttagt ctccagaaaa aggggggaat gaaagacccc acctgtaggt ttggcaagct 60
aggatcaagg ttaggaacag agagacagca gaatatgggc caaacaggat atctgtggta 120
agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagttggaa cagcagaata tgggccaaac 180
aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag 240
atgcggtccc gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag 300
gacctgaaat gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt 360
tcgcgcgctt ctgctccccg agctcaataa aagagccca 399
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
tggagataac actctaagca taactaaagg t 31
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>引物
<400> 7
gatgtagttg cttgggaccc a 21
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> FAM
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> TAMRA
<400> 8
ccatttttgg tttgggcttc acaccatt 28
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
caactgcaag cacgtgttct g 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
gcagtagctg cccatcactt t 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> FAM
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> TAMRA
<400> 11
agagtgtgca tcctgcggtg cct 23
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物- PTBP2
<400> 12
tctccattcc ctatgttcat gc 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物- PTBP2
<400> 13
gttcccgcag aatggtgagg tg 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 - PTBP2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> JOE
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> BHQ1
<400> 14
atgttcctcg gaccaacttg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 - WPRE
<400> 15
gaggagttgt ggcccgttgt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 反向引物 - WPRE
<400> 16
tgacaggtgg tggcaatgcc 20
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针- WPRE
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 6FAM
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> BHQ1
<400> 17
ctgtgtttgc tgacgcaac 19
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb1 正向引物
<400> 18
ctgaatgccc agacagctcc aagc 24
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb2 正向引物
<400> 19
tcactgatac ggagctgagg c 21
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> mVb3.1正向引物
<400> 20
ccttgcagcc tagaaattca gt 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb4 正向引物
<400> 21
gcctcaagtc gcttccaacc tc 22
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb5.1正向引物
<400> 22
cattatgata aaatggagag agat 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb5.2正向引物
<400> 23
aaggtggaga gagacaaagg attc 24
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb5.3正向引物
<400> 24
agaaaggaaa cctgcctggt t 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb6 正向引物
<400> 25
ctctcactgt gacatctgcc c 21
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb7 正向引物
<400> 26
tacagggtct cacggaagaa gc 22
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb8.1正向引物
<400> 27
cattactcat atgtcgctga c 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb8.2正向引物
<400> 28
cattattcat atggtgctgg c 21
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb8.3正向引物
<400> 29
tgctggcaac cttcgaatag ga 22
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb9正向引物
<400> 30
tctctctaca ttggctctgc aggc 24
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mvb10正向引物
<400> 31
atcaagtctg tagagccgga gga 23
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mvb11正向引物
<400> 32
gcactcaact ctgaagatcc agagc 25
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb12正向引物
<400> 33
gatggtgggg ctttcaagga tc 22
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb13正向引物
<400> 34
aggcctaaag gaactaactc ccac 24
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb14正向引物
<400> 35
acgaccaatt catcctaagc ac 22
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb15正向引物
<400> 36
cccatcagtc atcccaactt atcc 24
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb16正向引物
<400> 37
cactctgaaa atccaaccca c 21
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb17正向引物
<400> 38
agtgttcctc gaactcacag 20
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb18正向引物
<400> 39
cagccggcca aacctaacat tctc 24
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb19正向引物
<400> 40
ctgctaagaa accatgtacc a 21
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mVb20正向引物
<400> 41
tctgcagcct gggaatcaga a 21
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> muTCB1-FAM反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> FAM
<400> 42
cttgggtgga gtcacatttc tc 22
<210> 43
<211> 10111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pCCL.MND.coRAG1质粒
<400> 43
ccattgcata cgttgtatcc atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaaca 60
ttaccgccat gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca 120
ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct 180
ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta 240
acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac 300
ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt 360
aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag 420
tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat 480
gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat 540
gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc 600
ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt 660
ttagtgaacc ggggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac 720
tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg 780
cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga 840
aaatctctag cagtggcgcc cgaacaggga cttgaaagcg aaagggaaac cagaggagct 900
ctctcgacgc aggactcggc ttgctgaagc gcgcacggca agaggcgagg ggcggcgact 960
ggtgagtacg ccaaaaattt tgactagcgg aggctagaag gagagagatg ggtgcgagag 1020
cgtcagtatt aagcggggga gaattagatc gcgatgggaa aaaattcggt taaggccagg 1080
gggaaagaaa aaatataaat taaaacatat agtatgggca agcagggagc tagaacgatt 1140
cgcagttaat cctggcctgt tagaaacatc agaaggctgt agacaaatac tgggacagct 1200
acaaccatcc cttcagacag gatcagaaga acttagatca ttatataata cagtagcaac 1260
cctctattgt gtgcatcaaa ggatagagat aaaagacacc aaggaagctt tagacaagat 1320
agaggaagag caaaacaaaa gtaagaccac cgcacagcaa gcggccgctg atcttcagac 1380
ctggaggagg agatatgagg gacaattgga gaagtgaatt atataaatat aaagtagtaa 1440
aaattgaacc attaggagta gcacccacca aggcaaagag aagagtggtg cagagagaaa 1500
aaagagcagt gggaatagga gctttgttcc ttgggttctt gggagcagca ggaagcacta 1560
tgggcgcagc gtcaatgacg ctgacggtac aggccagaca attattgtct ggtatagtgc 1620
agcagcagaa caatttgctg agggctattg aggcgcaaca gcatctgttg caactcacag 1680
tctggggcat caagcagctc caggcaagaa tcctggctgt ggaaagatac ctaaaggatc 1740
aacagctcct ggggatttgg ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact gctgtgcctt 1800
ggaatgctag ttggagtaat aaatctctgg aacagatttg gaatcacacg acctggatgg 1860
agtgggacag agaaattaac aattacacaa gcttaataca ctccttaatt gaagaatcgc 1920
aaaaccagca agaaaagaat gaacaagaat tattggaatt agataaatgg gcaagtttgt 1980
ggaattggtt taacataaca aattggctgt ggtatataaa attattcata atgatagtag 2040
gaggcttggt aggtttaaga atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc 2100
agggatattc accattatcg tttcagaccc acctcccaac cccgagggga cccgacaggc 2160
ccgaaggaat agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga 2220
acggatctcg acggtatcgg ttaactttta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg 2280
caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac 2340
aaattacaaa aattcaaaat tttatcgatc acgagactag cctcgacgcg tagcctcgag 2400
ctagcggtac cgatcaaggt taggaacaga gagacaggag aatatgggcc aaacaggata 2460
tctgtggtaa gcagttcctg ccccggctca gggccaagaa cagttggaac agcagaatat 2520
gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc aagaacagat 2580
ggtccccaga tgcggtcccg ccctcagcag tttctagaga accatcagat gtttccaggg 2640
tgccccaagg acctgaaatg accctgtgcc ttatttgaac taaccaatca gttcgcttct 2700
cgcttctgtt cgcgcgcttc tgctccccga gctcaataaa agagcccaca acccctcact 2760
cggcgcgcca gtcctccgat agactgcgtc gcccgggatc caccggtgcc accatggccg 2820
ccagcttccc ccctaccctg ggcctgagca gcgcccctga cgagatccag cacccccaca 2880
tcaagttcag cgagtggaag ttcaagctgt tcagagtgcg gagcttcgag aaaacccccg 2940
aggaagccca gaaagagaag aaggacagct tcgagggcaa gcccagcctg gaacagagcc 3000
ctgccgtgct ggacaaggcc gacggccaga aacccgtgcc cacccagccc ctgctgaagg 3060
cccaccccaa gttcagcaag aagttccacg acaacgagaa ggccaggggc aaggccatcc 3120
accaggccaa cctgcggcac ctgtgccgga tctgcggcaa cagcttccgg gccgacgagc 3180
acaaccggcg ctaccccgtg cacggccccg tggacggcaa gacactgggc ctgctgcgga 3240
agaaagagaa acgggccacc tcctggcccg acctgatcgc caaggtgttc cggatcgacg 3300
tgaaggccga cgtggacagc atccacccca ccgagttctg ccacaactgc tggtccatca 3360
tgcaccggaa gttcagctcc gccccctgcg aggtgtactt cccccggaac gtgaccatgg 3420
aatggcaccc tcacaccccc agctgcgaca tctgcaacac cgccagacgg ggcctgaagc 3480
ggaagagcct ccagcccaac ctccagctgt ccaagaaact gaaaaccgtg ctggatcagg 3540
cccggcaggc caggcagcgg aagcggagag cccaggcccg gatcagcagc aaggacgtga 3600
tgaagaagat cgccaactgt agcaagatcc acctgagcac caagctgctg gccgtggact 3660
tccccgagca cttcgtgaag agcatcagct gccagatctg cgagcacatc ctggccgacc 3720
ccgtggagac caactgcaag cacgtgttct gtagagtgtg catcctgcgg tgcctgaaag 3780
tgatgggcag ctactgcccc agctgtagat acccctgctt ccccaccgac ctggaaagcc 3840
ccgtgaagag cttcctgagc gtgctgaaca gcctgatggt gaagtgcccc gccaaagagt 3900
gcaacgagga agtcagcctg gaaaagtaca accaccacat cagcagccac aaagagagca 3960
aagaaatctt cgtccacatc aacaagggcg gcagaccccg gcagcacctg ctgtccctga 4020
ccagacgggc ccagaagcac cggctgcggg agctgaagct ccaggtcaag gccttcgccg 4080
acaaagagga aggcggcgac gtcaagagcg tgtgcatgac cctgtttctg ctggccctgc 4140
gggccaggaa cgagcaccgg caggccgatg agctggaagc catcatgcag ggcaagggca 4200
gcggcctcca gcctgccgtg tgcctggcca tccgggtgaa cacctttctg agctgtagcc 4260
agtaccacaa gatgtaccgg accgtgaagg ccatcaccgg cagacagatc ttccagcctc 4320
tgcacgccct gcggaacgcc gagaaggtgc tgctgcccgg ctaccaccac ttcgagtggc 4380
agccccccct gaagaacgtg agcagcagca ccgacgtggg catcatcgac ggcctgagcg 4440
gcctgtccag cagcgtggac gactaccctg tggacaccat cgccaagcgg ttcagatacg 4500
acagcgccct ggtgtccgcc ctgatggaca tggaagagga catcctggaa ggcatgcgga 4560
gccaggacct ggacgattac ctgaacggcc ccttcaccgt ggtggtgaaa gagtcctgcg 4620
acggcatggg cgacgtgagc gagaagcacg gcagcggccc tgtggtgccc gagaaggccg 4680
tgcggttcag cttcaccatc atgaagatca ccatcgccca cagcagccag aacgtgaagg 4740
tgttcgagga agccaagccc aacagcgagc tgtgctgcaa gcccctgtgc ctgatgctgg 4800
ccgacgagag cgaccacgag accctgaccg ccatcctgag ccccctgatc gccgagcggg 4860
aggccatgaa gagcagcgaa ctgatgctgg aactgggcgg catcctgagg accttcaagt 4920
tcatcttccg gggcaccggc tacgacgaga agctggtccg ggaggtggag ggcctggaag 4980
ccagcggcag cgtgtacatc tgcaccctgt gcgacgccac ccggctggaa gcctcccaga 5040
acctggtgtt ccacagcatc accagaagcc acgccgagaa cctggaaaga tacgaagtgt 5100
ggcggagcaa cccctaccac gagagcgtgg aggaactgcg ggaccgggtc aagggcgtga 5160
gcgccaagcc cttcatcgag accgtgccca gcatcgacgc cctgcactgc gatatcggca 5220
acgccgccga gttctacaag atctttcagc tggaaatcgg ggaggtgtac aagaacccca 5280
acgccagcaa agaggaacgg aagcgctggc aggccaccct ggacaagcac ctgaggaaga 5340
aaatgaacct gaagcccatc atgcggatga acggcaactt cgctcggaag ctgatgacca 5400
aagaaaccgt ggacgccgtg tgcgagctga tccccagcga ggaacggcac gaggccctgc 5460
gcgagctgat ggacctgtac ctgaagatga agcccgtgtg gagaagcagc tgtcctgcca 5520
aagaatgccc cgagagcctg tgccagtaca gcttcaacag ccagcggttc gccgagctgc 5580
tgtccaccaa gttcaagtac cgctacgagg gcaagatcac caactacttc cacaagaccc 5640
tggcccacgt gcccgagatc atcgagcggg acggcagcat cggcgcctgg gccagcgagg 5700
gcaacgagag cggcaacaag ctgttccggc ggttcagaaa gatgaatgcc aggcagagca 5760
agtgctacga gatggaagat gtgctgaagc accactggct gtacaccagc aagtacctcc 5820
agaaattcat gaacgcccac aacgccctga aaaccagcgg cttcaccatg aacccccagg 5880
ccagcctggg cgaccctctg ggcatcgagg actccctgga atcccaggac agcatggaat 5940
tctgatgagt cgacaatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc 6000
ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg 6060
ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc 6120
tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg 6180
acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg 6240
ctttccccct ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga 6300
caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaaa tcatcgtcct 6360
ttccttggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg 6420
tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc 6480
ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc 6540
cgcctggaat tcgagctcgg tacctttaag accaatgact tacaaggcag ctgtagatct 6600
tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc aacgaagaca 6660
agatctgctt tttgcttgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag cctgggagct 6720
ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca 6780
agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag agatccctca gaccctttta 6840
gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtagtag ttcatgtcat cttattattc agtatttata 6900
acttgcaaag aaatgaatat cagagagtga gaggaacttg tttattgcag cttataatgg 6960
ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc 7020
tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggctct agctatcccg 7080
cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat 7140
ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc 7200
cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctagggacgt acccaattcg ccctatagtg 7260
agtcgtatta cgcgcgctca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg 7320
gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg 7380
aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatgggacg 7440
cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta 7500
cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt 7560
tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg 7620
ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat 7680
cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac 7740
tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag 7800
ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg 7860
cgaattttaa caaaatatta acgcttacaa tttaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg 7920
cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca 7980
ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt 8040
ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga 8100
aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga 8160
actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat 8220
gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca 8280
agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt 8340
cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac 8400
catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct 8460
aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga 8520
gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac 8580
aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat 8640
agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg 8700
ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc 8760
actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc 8820
aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg 8880
gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta 8940
atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg 9000
tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga 9060
tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt 9120
ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag 9180
agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa 9240
ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag 9300
tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca 9360
gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac 9420
cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa 9480
ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc 9540
agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg 9600
tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc 9660
ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc 9720
ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag 9780
ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa 9840
accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga 9900
ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc 9960
ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca 10020
atttcacaca ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag cgcgcaatta accctcacta 10080
aagggaacaa aagctggagc tgcaagcttg g 10111
<210> 44
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pCCL.MND.coRAG1质粒的β内酰胺酶
<400> 44
Met Ser Ile Gln His Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala
1 5 10 15
Phe Cys Leu Pro Val Phe Ala His Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys
20 25 30
Asp Ala Glu Asp Gln Leu Gly Ala Arg Val Gly Tyr Ile Glu Leu Asp
35 40 45
Leu Asn Ser Gly Lys Ile Leu Glu Ser Phe Arg Pro Glu Glu Arg Phe
50 55 60
Pro Met Met Ser Thr Phe Lys Val Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Ser
65 70 75 80
Arg Ile Asp Ala Gly Gln Glu Gln Leu Gly Arg Arg Ile His Tyr Ser
85 90 95
Gln Asn Asp Leu Val Glu Tyr Ser Pro Val Thr Glu Lys His Leu Thr
100 105 110
Asp Gly Met Thr Val Arg Glu Leu Cys Ser Ala Ala Ile Thr Met Ser
115 120 125
Asp Asn Thr Ala Ala Asn Leu Leu Leu Thr Thr Ile Gly Gly Pro Lys
130 135 140
Glu Leu Thr Ala Phe Leu His Asn Met Gly Asp His Val Thr Arg Leu
145 150 155 160
Asp Arg Trp Glu Pro Glu Leu Asn Glu Ala Ile Pro Asn Asp Glu Arg
165 170 175
Asp Thr Thr Met Pro Val Ala Met Ala Thr Thr Leu Arg Lys Leu Leu
180 185 190
Thr Gly Glu Leu Leu Thr Leu Ala Ser Arg Gln Gln Leu Ile Asp Trp
195 200 205
Met Glu Ala Asp Lys Val Ala Gly Pro Leu Leu Arg Ser Ala Leu Pro
210 215 220
Ala Gly Trp Phe Ile Ala Asp Lys Ser Gly Ala Gly Glu Arg Gly Ser
225 230 235 240
Arg Gly Ile Ile Ala Ala Leu Gly Pro Asp Gly Lys Pro Ser Arg Ile
245 250 255
Val Val Ile Tyr Thr Thr Gly Ser Gln Ala Thr Met Asp Glu Arg Asn
260 265 270
Arg Gln Ile Ala Glu Ile Gly Ala Ser Leu Ile Lys His Trp
275 280 285

Claims (20)

1.一种表达盒，包含与RAG1转基因可操作地连接的启动子，所述RAG1转基因包含SEQID NO:2的核酸序列，其中所述启动子选自MND、CMV、RSV和CAG。
2.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述RAG1转基因包含SEQ ID NO:4的核酸序列。
3.根据权利要求1所述的表达盒，其中当所述表达盒在其基因组中整合有5个或更少的所述表达盒的拷贝的人CD34+造血干细胞中表达时，产生处于所述细胞中ABL1表达水平的至少三倍高的水平的表达产物。
4.根据前述权利要求中任一项所述的表达盒，其中所述启动子是MND。
5.根据前述权利要求中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒还包含编码土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)的核苷酸序列。
6.一种逆转录病毒质粒，包含前述权利要求中任一项所述的表达盒。
7.根据权利要求6所述的质粒，其中所述质粒是自失活(SIN)慢病毒质粒。
8.根据权利要求7所述的质粒，其中所述质粒包含pCCL骨架。
9.根据权利要求6-8所述的质粒，其中所述质粒包含pCCL骨架、编码WPRE的核苷酸序列、MND启动子和包含SEQ ID NO:4的核酸序列的转基因。
10.一种病毒粒子，包含权利要求1-5中任一项所述的表达盒。
11.一种组合物，包含权利要求1-5中任一项所述的表达盒或权利要求6-9中任一项所述的质粒或根据权利要求10所述的病毒粒子，以及药用佐剂、载体、赋形剂或稀释剂。
12.一种重组CD34+造血干细胞，包含权利要求1-5中任一项所述的表达盒。
13.一种产生重组CD34+造血干细胞的离体方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求6-9中任一项所述的质粒或权利要求10所述的病毒粒子在所述表达盒引入所述细胞并由所述细胞表达以产生重组CD34+造血干细胞的条件下接触。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的表达盒、质粒、组合物、病毒粒子或重组细胞，用于在疗法中使用。
15.根据权利要求14所述的用于使用的表达盒、质粒、组合物、病毒粒子或重组细胞，其中所述表达盒、载体、组合物、病毒粒子或重组细胞用于在治疗RAG1缺陷型SCID、Omenn综合征(OS)、非典型SCID或联合免疫缺陷症(CID)中使用。
16.一种治疗受试者的方法，包括给予有此需要的受试者治疗有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的表达盒、质粒、组合物、病毒粒子或重组细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述受试者患有RAG1缺陷型SCID、Omenn综合征(OS)、非典型SCID或联合免疫缺陷症(CID)。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述SCID是RAG1缺陷型SCID。
19.一种治疗有此需要的受试者中RAG1缺陷型SCID、Omenn综合征(OS)、非典型SCID或联合免疫缺陷症(CID)的方法，包括以下步骤：
(i)从所述受试者中提取CD34+造血干细胞；
(ii)使来自(i)的所述细胞与根据权利要求10所述的病毒粒子或根据权利要求6-9所述的质粒接触；
(iii)将来自(ii)的所述细胞培养一段时间；和
(iv)将来自(iii)的所述细胞引入所述受试者中。
20.根据权利要求19所述的方法，还包括在步骤(iv)之前给予所述受试者化学疗法或其他调理方案的步骤。
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