CN116801902A

CN116801902A - 具有膜结合白细胞介素15的肿瘤浸润淋巴细胞及其用途

Info

Publication number: CN116801902A
Application number: CN202280010378.2A
Authority: CN
Inventors: K·佩德罗; J·A·斯托勒; J·泰尔穆伦; R·布尔加; M·卡塔尔; M·奥尔斯; J·H·柴查; S·苏巴马尼安
Original assignee: Obsidian Therapeutics Inc
Current assignee: Obsidian Therapeutics Inc
Priority date: 2021-01-19
Filing date: 2022-01-18
Publication date: 2023-09-22
Also published as: CN116887855A

Abstract

本文提供了被工程化成表达膜结合白细胞介素15(mbIL15)的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。该mbIL15TIL可以在不使用外源性白细胞介素2(IL2)的情况下使用快速扩增方案在体外扩增，并且可以在不伴随使用外源性细胞因子如IL2的情况下被用于过继细胞疗法。该TIL可以被进一步工程化成使得该mbIL15可操作地连接至一个或多个药物响应结构域(DRD)，该药物响应结构域是可以在DRD与配体结合后调节IL15的丰度和/或活性的多肽。本文还提供了用于制备经修饰的TIL的组分以及用于制备和使用该经修饰的TIL的方法。

Description

具有膜结合白细胞介素15的肿瘤浸润淋巴细胞及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年1月19日提交的美国临时申请号63/139,305；2021年2月24日提交的美国临时申请号63/153,367；2021年7月27日提交的美国临时申请号63/226,114；2021年9月14日提交的美国临时申请号63/244,166的优先权，这些临时申请的全部内容特此通过引用并入用于所有目的。

背景技术

实体肿瘤对有效的过继细胞疗法(ACT)的开发提出了重大挑战。例如，靶向单一肿瘤抗原可能导致抗原丢失或更具攻击性的克隆复发。此外，将治疗细胞浸润到实体肿瘤中可被证明具有挑战性，并且即使该细胞浸润到肿瘤中，由于免疫压制机制，肿瘤微环境也可能不适宜生存。已提出使用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的ACT作为解决这些问题的治疗方式(至少对于某些实体肿瘤而言)。例如，TIL包括具有多个T细胞受体(TCR)克隆的T细胞，并且因此能够更好地识别多种肿瘤抗原，并且从而解决肿瘤异质性问题。此外，TIL识别肿瘤特异性抗原和肿瘤新抗原，从而使它们能够靶向与周围健康组织在抗原上不同的肿瘤。

为了用作细胞疗法，使用肿瘤活检物或手术去除的肿瘤样品从受试者的肿瘤部位制备TIL。然后，在诸如白细胞介素2(IL2)的刺激物和诸如外周血单核细胞(PBMC)的饲养细胞的存在下在体外对TIL进行刺激和扩增。扩增后，将TIL输回到患者中，并且并行施用IL2。然而，IL2显示出剂量依赖性毒性，该剂量依赖性毒性可以在多个器官系统(最重要的是心脏、肺、肾脏和中枢神经系统)中表现出来。IL2毒性最常见的表现是导致低血容量状态和血管外空间的液体积聚的毛细血管渗漏综合征。大量患者不能耐受辅助IL2治疗，并且因此不得不被排除在TIL治疗之外。需要在该领域进行改进，以使使用TIL的ACT成为一种安全且更有效的癌症治疗方法。

发明内容

本公开涉及被修饰(即，被工程化)成表达膜结合白细胞介素15(mbIL15)的TIL。可以在不存在外源细胞因子(如白细胞介素2(IL2))的情况下在体外或体内对经修饰的TIL进行扩增。与TIL免疫疗法伴随地或者在TIL免疫疗法之后对癌症患者进行的IL2全身施用常常会对已经身体虚弱的患者造成毒性。许多患者在施用IL2后出现严重的、危及生命的副作用，包括低血压和毛细血管渗漏综合征引起的休克。具有低剂量伴随IL2的TIL疗法不如在更高的剂量下有效。因此，本文所述的经修饰的TIL可用于对患有癌症的受试者的毒性小于需要使用外源性IL2的当前治疗方案的治疗方案。

TIL可以被进一步工程化成使得mbIL15可操作地连接至一个或多个药物响应结构域(DRD)。该DRD是在与配体结合后可以调节有效载荷(如mbIL15)的丰度和/或活性的多肽。多个DRD(例如串联的)可以调节单个有效载荷。一个或多个DRD可操作地连接到mbIL15，使得DRD与有效量的配体在适当条件下的相互作用导致有效载荷的生物活性的改变。

还提供了经修饰的TIL的群体。多个TIL任选地包括已经历扩增的经修饰的TIL的亚群体。因此，本文还提供了被工程化成表达mbIL15的经扩增的TIL，该mbIL15任选地可操作地连接至DRD。本文还公开了经扩增的TIL的群体。扩增后，TIL的群体在缺乏饲养细胞的培养物中存活超过5天、超过10天或超过15天，即使在不存在外源细胞因子的情况下也是如此。类似地，TIL的群体在没有施用外源细胞因子的情况下在体内存活。由于诸如IL2的外源细胞因子会导致TIL更加耗尽，因此经修饰的TIL在体内和体外的扩增会产生更有效的TIL的群体。

与未经扩增的TIL的对照群体中CD8+细胞和CD4+细胞的比例相比，经扩增的TIL的群体具有更高比例的CD8+细胞和更低比例的CD4+细胞。因此，经扩增的TIL的群体的CD4:CD8比率低于未经扩增的TIL的对照群体的CD4:CD8比率。此外，经扩增的mbIL15 TIL群体中的CD4 T_reg细胞的比例与在工程化和REP中的扩增之前REP前TIL中CD4 T_reg细胞的比例相比较低。与未经扩增的TIL对照群体中PD1+细胞的比例相比，经扩增的TIL群体也具有更小比例的PD1+细胞。与未经扩增的TIL对照群体中产生肿瘤坏死因子α(TNFα)和干扰素γ(IFNγ)的TIL比例相比，如本文所述的经扩增的TIL群体具有更大比例的产生肿瘤坏死因子α(TNFα)和干扰素γ(IFNγ)二者的细胞。

本文还描述了TIL的混合群体，其包含未经修饰的TIL的亚群体和包含任选地可操作地连接到DRD的mbIL15的经修饰的TIL的亚群体。经修饰的TIL的亚群体在存在K562饲养细胞、41BB配体(41BBL)和白细胞介素21(IL21，分泌的或与K562饲养细胞膜结合的)的情况下扩增，并且比在K562饲养细胞、41BBL和IL21存在的情况下未工程化(即未经修饰的)TIL的亚群体扩增得更多。经工程化(即经修饰的)TIL的亚群体的这种优先扩增发生在不存在外源性细胞因子(如IL2)的情况下。

制备被工程成表达mbIL15的TIL的方法包括用载体转导TIL，其中该载体包含编码IL15的第一核酸序列和编码跨膜结构域的第二核酸序列。用于转导TIL的载体可以是病毒载体，诸如γ-逆转录病毒载体或慢病毒载体，更具体地，长臂猿白血病病毒(GALV)假型γ-逆转录病毒载体或狒狒内源性逆转录病毒包膜(BaEV)假型慢病毒载体。因此，本文提供了包含编码IL15的第一核酸序列和编码跨膜结构域的第二核酸序列的GALV假型逆转录病毒载体或BaEV假型慢病毒载体。在第一和第二核酸表达后，跨膜结构域起到将IL15锚定至细胞膜或细胞膜内(任选地通过接头或铰链与IL15连接)的作用。

还提供了包含本文所述的任何TIL或TIL的群体以及药物载剂的药物组合物。任何TIL、任何TIL的群体，或它们的任何药物组合物可以作为治疗癌症的方法施用给患有癌症的受体受试者。该方法任选进一步包括向受体受试者施用第二剂，其中该第二剂是结合至与mbIL15可操作地连接的DRD的配体。在施用有效量的配体并且配体与DRD结合后，mbIL15在受试者中的生物活性增加。无论有或没有与mbIL15可操作地连接的DRD，该治疗方法都不需要向受试者施用外源细胞因子，诸如IL2。该治疗方法任选地包括从肿瘤分离一个或多个TIL并将表达mbIL15的核酸引入到该一个或多个TIL中。该TIL可以从受体受试者的肿瘤或从供体受试者分离，其中供体受试者不是受体受试者。从供体受试者的肿瘤分离的TIL可以被选择成使得从供体分离的TIL包含对受体受试者的肿瘤中存在的一种或多种癌抗原具有特异性的T细胞受体(TCR)。任选地，该方法还包括选择与受体受试者HLA匹配的供体受试者。在本文所述的治疗方法中，任选地在施用TIL之前对受体受试者进行淋巴细胞耗竭。

所鉴定的实施方案仅是示例性的并且因此是非限制性的。本发明的一个或多个非限制性实施方案的细节将在附图和以下说明中阐述。在考虑了本公开之后，本发明的其他实施方案对于本领域的普通技术人员来说应该是显而易见的。

附图简述

图1示出了新鲜肿瘤消化物和3周REP前TIL培养后CD45+细胞(左)和CD45+细胞内CD3+T细胞(右)的频率。

图2示出了在转导后第5天通过流式细胞术测量的IL15-293构建体在两个黑色素瘤TIL供体中的转导效率。

图3A-3B示出了表达mbIL15的TIL的抗原和IL2非依赖性扩增和存活。图3A示出用组成型mbIL15或GFP转导并在存在或不存在6000IU/mL IL2的情况下在REP中扩增12天的TIL供体006细胞(TIL 006)。图3B示出了用组成型mbIL15(在不存在IL2的情况下在REP中扩增)或GFP(在存6000IU/mL IL2的情况下在REP中扩增)转导，并在存在和不存在6000IU/mLIL2的情况下在14天抗原非依赖性存活测定中进行计数的TIL 006。

图4示出快速扩增方案(REP)后的抗原非依赖性TIL扩增。REP后，将未工程化TIL和mbIL15工程化TIL(组成型或调节型mbIL15)与或不与外源性IL2或乙酰唑胺(ACZ)一起铺板，并且每3天收获新孔以评估细胞计数和表型。

图5示出了抗原依赖性环境中的TIL扩增。在快速扩增方案(REP)后，在存在和不存在外源性IL2、乙酰唑胺或媒介物(DMSO)的TIL：肿瘤共培养测定中，将未工程化TIL和经mbIL15工程化TIL与HLA匹配的丝裂霉素C处理的黑色素瘤细胞一起铺板，每3天收获孔以评估细胞计数和表型。

图6A-B示出快速扩增方案(REP)后TIL的肿瘤反应性。图6A示出TIL 006和TIL005，它们都用调节型mbIL15和未工程化对照转导，并与HLA匹配的丝裂霉素C处理的黑色素瘤细胞共培养24小时。通过MSD测定法测量上清液中的IFNγ。图6B示出共培养中TIL的细胞毒性，其由荧光素酶标记的HLA匹配的黑色素瘤系的发光损失来度量。

图7A-B示出输注到动物体内进行体内过继细胞疗法实验之前的TIL扩增和转导效率。图7A示出了用于体内过继细胞转移(ACT)的未工程化TIL和经mbIL15工程化TIL的TIL供体006的细胞扩增。图7B示出了快速扩增方案(REP)后的转导效率；评估未工程化TIL和经mbIL15工程化TIL的IL15和IL15RaFc表达作为转导效率的量度。

图8A-C示出了用于体内过继细胞疗法实验的TIL计数和IL15表达的分析。图8A示出了通过流式细胞术从外周血样中对过继转移的未工程化TIL和经mbIL15工程化TIL的计数。TIL在下颌下静脉血样中被鉴定为活的人CD3+鼠CD45-细胞。图8B和图8C示出ACT后14天或53天分离的脾和骨髓样品的TIL计数(hCD3+mCD45-)和IL15表达(IL15+IL15RaFc+)。

图9显示乙酰唑胺(ACZ)对冷冻保存的调节型mbIL15 TIL中IL15表达和信号传导的调节以剂量依赖性方式发生。将来自四名患者(患者1-4)的调节型mbIL15 TIL解冻并且在无ACZ培养基中静置24小时，然后在0.1、1、2.5、5、10、25、100μM ACZ中调节18小时。然后收集调节型mbIL15 TIL，并使用基于磷酸化流式细胞术的测定法分析该mbIL15 TIL的IL15表达和信号传导。图9A示出了作为CD3+细胞百分比的IL15+TIL的频率。图9B-9E示出了每个患者的结果：在这里，在IL15+上对细胞进一步门控，然后计算每个pSTAT5(空心正方形)和pS6(实心圆形)的几何平均荧光强度。示出的值是相对于媒介物对照设置的。N＝4个人类供体。

图10示出了患者1-4中pSTAT5和pS6的平均荧光强度(MFI)。图10A示出了pSTAT5的MFI。图10B示出了pS6的MFI。

图11显示组成型mbIL15表达和ACZ对调节型mbIL15 TIL的调节参与IL15信号传导通路。在这里，将来自患者1-3的未工程化TIL和调节型mbIL15 TIL解冻并且在无ACZ培养基中静置24小时，然后用IL2或ACZ调节18小时。然后收集细胞并使用基于磷酸化流式细胞术的测定法分析该细胞的IL15表达和信号传导。在活细胞上对未工程化TIL和调节型mbIL15TIL+媒介物进行门控，随后对单线态进行门控，随后对CD3+进行门控。在IL15+染色上进一步对组成型IL15 TIL和调节型mbIL15 TIL+ACZ条件进行门控。计算每个pSTAT5和pS6的几何平均荧光强度。N＝3个人类供体。

图12示出在不存在外源性细胞因子的情况下经调节型mbIL5修饰的TIL比未工程化TIL+IL2表现出更大的多功能性。将未工程化TIL和调节型mbIL15 TIL解冻并且在无ACZ培养基中静置24小时；接下来，用以下浓度的IL2：20、200、1000和6000IU/mL IL2，或媒介物处理未工程化TIL；并用以下浓度的ACZ：0.1、1、5、10、25、100μM ACZ，或媒介物处理调节型mbIL15 TIL。处理时间为18小时。在布雷菲尔丁A和莫能菌素存在下用PMA和离子霉素刺激细胞6小时。未经刺激的TIL用作对照(数据未示出)。刺激后，使用基于流式细胞术的测定法分析细胞中IL15和细胞内TNFα和IFNγ的表达。在活细胞上对TIL进行门控，随后对单线态进行门控，随后对CD3+进行门控，并且另外在IL15+上对调节型mbIL15 TIL进行门控。图12A示出了具有IL2的未工程化TIL，以及具有ACZ的调节型mbIL15 TIL的TNFα和IFNγ双阳性群体。图12B示出了调节型mbIL15 TIL培养物中的IL15表达。图12C示出了对选定IL2(200IU/mL)和ACZ(25μM)剂量的比较。

图13示出了患者来源的异种移植物(PDX)功效模型的结果。在快速扩增方案(REP)结束时，将未工程化TIL和调节型mbIL15 TIL(+/-乙酰唑胺(ACZ))过继转移到荷有人黑色素瘤PDX的小鼠中。评价平均肿瘤体积(+/-SEM)。图13A示出过继细胞转移(ACT)后几天给定治疗的平均肿瘤体积。图13B示出ACT后几天无TIL(左上)；未工程化TIL+IL2(右上)；调节型mbIL15 TIL+媒介物(左下)；和调节型mbIL15TIL+ACZ(右下)的肿瘤体积。在这里，调节型mbIL15 TIL+ACZ表现出与未工程化TIL+IL2相比显著优越的抗肿瘤功效(*p<0.05；Mann UWhitney)。

图14示出了SK-MEL-1异种移植癌症模型的结果。在快速扩增方案(REP)结束时，将未工程化TIL和调节型mbIL15 TIL(+/-乙酰唑胺(ACZ))过继转移到荷有SK-MEL-1肿瘤的小鼠中。评价平均肿瘤体积(+/-SEM)。图14A示出过继细胞转移(ACT)后几天给定治疗的平均肿瘤体积。图14B示出ACT后几天无TIL(左上)；未工程化TIL+IL2(右上)；调节型mbIL15 TIL+媒介物(左下)；和调节型mbIL15TIL+ACZ(右下)的肿瘤体积。在这里，调节型mbIL15 TIL+ACZ表现出与未工程化TIL+IL2相比显著优越的抗肿瘤功效(*p<0.05；Mann U Whitney)。

图15显示调节型mbIL15 TIL在体外实现了增强的MHC-I依赖性的针对黑色素瘤的细胞毒性。在这里，未工程化TIL和调节型mbIL15 TIL在快速扩增方案(REP)结束时被冷冻保存。将冷冻保存的TIL解冻并且在无细胞因子条件下静置过夜，并然后以1:1和5:1效应物与靶标(TIL:黑色素瘤)的比率与Cell Trace Violet标记的黑色素瘤细胞(SK-MEL-1)共培养。为了控制MHC-1依赖性细胞毒性，在测定前用80μg/mL HLAABC MHC封闭性抗体预处理黑色素瘤细胞2小时。共培养3小时后，通过流式细胞术评价SK-MEL-1细胞的细胞内切割的半胱天冬酶3(一种不可逆地致力于细胞死亡的标记物)的表达。将定量切割的半胱天冬酶3针对单独靶细胞(自发或背景释放)作归一化。条形图示出当与来自6名个体患者的TIL共培养时切割的半胱天冬酶3在靶肿瘤细胞上的表达。

图16是显示当在存在IL21和41BBL介导的共刺激的情况下用K562饲养细胞产生mbIL15 TIL(组成型)时REP中发生最大TIL扩增的图。

图17是显示当用表达膜结合IL21和41BBL的汇集PBMC饲养细胞或K562饲养细胞产生未工程化TIL时，REP中发生最大TIL扩增的图。

图18显示，当用K562饲养细胞产生具有mbIL15(组成型)的TIL并使其接受IL21和41BBL介导的共刺激时，REP中发生最大IL15+TIL扩增。从左到右示出第8、11、15和18天的饲养细胞结果：PBMC饲养细胞、K562亲代饲养细胞、K562+41BBL、具有重组人IL21的K562+41BBL饲养细胞、K562+mbIL21饲养细胞、K562+41BBL+mbIL21饲养细胞。

图19是显示在用K562饲养细胞产生并接受IL21和41BBL介导的共刺激的mbIL15TIL(组成型)中通过REP方法富集IL15表达的图。

图20是显示在存在IL21和41BBL介导的共刺激的情况下用K562饲养细胞产生的经扩增的具有mbIL15的TIL在整个REP中具有降低的CD4:CD8比率的图。因此，与用汇集的PBMC饲养细胞、未经修饰的K562饲养细胞或在不存在IL21的情况下表达41BBL的K562饲养细胞产生的经扩增的具有mbIL15的TIL相比，在存在K562饲养细胞以及IL21和41BBL刺激的情况下扩增的具有mbIL15的TIL富集CD8+细胞毒性效应细胞。从左到右示出第8、11、15和18天的CD4:CD8比率：PBMC饲养细胞、K562亲代饲养细胞、K562+41BBL、具有重组人IL21的K562+41BBL饲养细胞、K562+mbIL21饲养细胞、K562+41BBL+mbIL21饲养细胞。

图21是显示与用PBMC饲养细胞或未经修饰的K562饲养细胞产生的mbIL15 TIL相比，用表达mbIL21和41BBL的K562喂养细胞产生的经扩增的mbIL15 TIL中TNFα+干扰素γ+细胞的百分比更高的图。TNFα+干扰素γ+TIL的较高百分比表明用表达mbIL21和41BBL的K562饲养细胞产生的经扩增的mbIL15 TIL中的多功能性增强。

图22是示出用PBMC饲养细胞、未经修饰的K562饲养细胞、仅表达mb41BBL的K562饲养细胞、仅表达mbIL21的K562饲养细胞、表达41BBL和mbIL21的K562饲养细胞以及在重组人IL21存在下表达41BBL的K562饲养细胞产生的mbIL15 TIL的10天存活测定结果的图。与用未经修饰或被修饰成独立地表达mbIL21或41BBL的PBMC饲养细胞或K562饲养细胞产生的mbIL15 TIL相比，用K562饲养细胞产生并接受IL21和41BBL介导的共刺激的经扩增的mbIL15TIL显示出改善的REP后抗原非依赖性存活。

图23示出了在PBMC饲养细胞、K562饲养细胞、K562+mbIL21饲养细胞、K562+41BBL饲养细胞、K562+41BBL+mbIL21饲养细胞，或K562+41BBL+rhIL21饲养细胞下扩展的未工程化TIL和mbIL15TIL中TCRVβ亚家族的相对比例。经扩增的mbIL15 TIL和未工程化TIL保持多样化的亚家族分布，无论饲养细胞或条件如何。

图24示出了如在未经扩增的TIL，以及用PBMC饲养细胞、K562亲代饲养细胞、K562+41BBL饲养细胞、具有重组人IL21的K562+41BBL饲养细胞、K562+mbIL21饲养细胞，和K562+41BBL+mbI L21饲养细胞产生的经扩增的TIL中从左到右在活CD3+细胞上经受门控的mbIL15 TIL的表面上的PD1的表达。PD1表达在未经扩增的mbIL15 TIL中最高，并且在存在41BBL和IL21介导的信号传导的情况下下mbIL15 TIL的扩增产生具有接近基线的PD1表达的TIL。

图25示出了将REP前TIL(如实施例1所述)与工程化mbIL15TIL(如实施例3所述)进行比较的表型。如实施例13所述，使用针对CD3、CD4、CD8和PD1的抗体通过流式细胞术对REP前和REP后TIL进行表型分析。如图25A所示，与来自相同TIL供体的相应REP前TIL相比，REP后mbIL15 TIL的CD8+T细胞频率更高，以及CD4+T细胞频率更低。在图25B中，REP后mbIL15TIL表达的PD1水平低于来自相同TIL供体的相应REP前TIL。图25C示出了在被鉴定为作为CD4+被门控并且进一步被分类为CD25和FoxP3双阳性细胞的CD3+T细胞的mbIL15 TIL中调节性T细胞群体的百分比。与工程化步骤之前的REP前TIL相比，mbIL15 TIL具有降低比例的调节性T细胞。

图26示出了如通过流式细胞术确定的保守的黑色素瘤相关抗原MART-1和gp100在A375黑色素瘤细胞系和患者来源的异种移植物(PDX)细胞(PDX163A，如实施例11中所述)上的表达。

图27示出了衍生自HLA与PDX 163A匹配的四个不同TIL供体的mbIL15 TIL中MART-1四聚体阳性TIL和gp100四聚体阳性TIL的百分比。四聚体阳性群体表明TIL含有通过HLA:A2:01基因座对相应的黑色素瘤相关抗原具有反应性的细胞中的一部分。如图30所描绘，在PDX功效研究中利用了用*表示的供体。

图28示出用于准确地预测对PDX有反应的TIL供体的TIL：肿瘤细胞共培养后的干扰素γ(IFNγ)产量。该体外测定表明，TIL供体006、39A和41A是响应于PDX产生最高量IFNγ的供体，这从而支持了它们作为供体来检查体内功效的候选资格，如实施例15所述。

图29是示出用表达可操作地连接到CA2 DRD和CA2配体ACZ的mbIL15的经扩增的TIL处理的示例性黑色素瘤患者来源的异种移植物模型的示意图。

图30显示根据图29中所示的治疗范例的患者来源的异种移植物模型的治疗导致与用未工程化TIL和伴随IL2治疗进行的治疗相比优越的抗肿瘤功效。在快速扩增方案(REP)结束时，将未工程化TIL和调节型mbIL15 TIL(+/-乙酰唑胺(ACZ))过继转移到荷有人黑色素瘤PDX的小鼠中。评价平均肿瘤体积(+/-SEM)。

图31A-B示出表达可操作地连接到CA2 DRD的mbIL15的TIL显示出比未工程化TIL+IL2显著更多的肿瘤内浸润。图31A是对人CD3进行免疫组织化学染色的肿瘤切片的显微照片，其显示出用未工程化TIL和IL2处理的动物、在存在和不存在CA2配体ACZ的情况下用表达可操作地连接到CA2 DRD的mbIL15的TIL处理的动物中TIL的肿瘤内浸润。图31B是显示基质+肿瘤、仅基质和仅肿瘤中TIL数目的图。

具体实施方式

目前用于扩增TIL的方法需要基于白细胞介素2(IL2)的TIL扩增(快速扩增方案前或REP前)和随后的快速扩增方案(REP)。在REP前阶段，TIL与外源性IL2一起培养，并且在解剖的肿瘤组织块中存在肿瘤抗原。因此，REP前在不存在饲养细胞的情况下需要IL2。REP步骤通常需要添加饲养细胞以支持快速TIL扩增。REP饲养细胞和TIL刺激物通常是经辐照的外周血单核细胞(PBMC)、高剂量的IL2，以及任选的抗CD3抗体(OKT3)。然而，REP期间，IL2倾向于耗尽TIL，导致TIL产物的效力降低。在使用当前方法的离体REP之后，将经扩增的TIL与IL2一起施用于患者，IL2可以在TIL施用之前、期间和/或之后给予，从而再次将TIL推向耗尽。目前用于TIL疗法的一般方案要求在TIL输注的同一天或第二天开始施用高剂量IL2。例如，高剂量IL2方案可以由以下组成：每8小时静脉推注一次直至耐受，最多14剂，休息9天，以及再重复14剂。其他IL2方案可由每28天重复一次持续最多四个周期的四天IL2施用周期或持续长达21天的聚乙二醇化IL2方案组成。

除了促进TIL的耗尽外，高剂量的IL2可引起癌症患者的严重副作用，并且往往不能被那些需要ACT的患者所耐受。本发明组合物和方法提供了一种TIL疗法，其任选地在TIL施用之前、期间或之后不需要施用外源性细胞因子，诸如白细胞介素(如IL2)。换句话说，使用本发明方法，不需要伴随的利用TIL输注的白细胞介素疗法。例如，受试者任选地不需要在TIL输注之前，或者在TIL输注后5天、7天、10天、14天、21天或28天施用外源性IL2。类似地，本发明方法消除了输注经修饰的IL2或其他经修饰的细胞因子(诸如经修饰的IL7或IL15)的需要。例如，经修饰的白细胞介素可以是IL2、IL7或IL15的突变体或片段，该突变体或片段保留了IL2、IL7或IL15的一个或多个功能，但对某些受体(诸如可以促进CD4+Treg细胞增殖的受体)具有降低的结合(例如，通过具有降低的亲和力)。

如本文所用的扩增是指数目或量的增加。当本文在提及TIL的群体或亚群体时使用术语扩增时，该术语是指REP之后的细胞群体。该经扩增群体的大小(即REP后的TIL的数目)大于未经扩增的群体(即，REP前TIL的数目或在导致细胞没有功能性扩增的不成功的REP之后TIL的数目)。当术语扩增在提及细胞(诸如经扩增的TIL)时使用时，它是已经历导致TIL群体的功能性扩增的REP(即具有饲养细胞和选定刺激因子的培养物)并且是该REP的产物或结果的细胞。因此，如本文所用，经扩增的TIL是在导致功能性扩增的REP下培养的TIL(例如，已被修饰成表达mbIL15的TIL)的后代。类似地，如本文中使用的未经扩增的TIL是指尚未经历REP中的功能性扩增的TIL。然而，此种未经扩增的TIL可能已经经历了最初的IL2 REP前步骤或导致细胞没有功能性扩增的失败的REP。

如本文所用，术语扩增可以被定量地使用，例如扩增得更多、扩增得更少、更大的扩增、更少的扩增等。此类相对术语通常是指群体或亚群体中TIL的数目相较于不同的群体或亚群体(例如，经修饰的TIL的扩增相较于未经修饰的TIL的扩增)的更大或更小的增加倍数。因此，例如，经修饰的TIL的亚群体与未经修饰的TIL相比的更大扩增意味着经修饰的TIL相较于未经修饰的TIL的更大的增加倍数，诸如1.5倍相较于1.25倍增加、2倍增加相较于1.5倍增加、5倍增加相较于2倍增加、10倍增加相较于5倍增加、40倍增加相较于10倍增加等。

经修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)

本文描述的TIL被工程化成表达mbIL15。因此，该TIL包含编码IL15的外源性核酸序列，编码跨膜结构域的外源性核酸，以及任选的编码接头、铰链和/或前导序列的外源性核酸。IL15通常不表达为膜结合分子，因此，为了表达mbIL15，IL15必须与跨膜结构域(例如跨膜蛋白或跨膜蛋白的一部分)缔合。如本文所用的IL15是指IL15多肽(例如，UniProtKB-P40933(IL15_HUMAN))。在一个实施方案中，IL15有效载荷包含表2中提供的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)或与SEQ ID NO:12具有至少85％、90％、95％或99％同一性的多肽，该多肽保留了一个或多个IL15功能(例如，促进经修饰的TIL的体内扩增，促进T和NK细胞的细胞毒性)。

可从中选择跨膜结构域和/或铰链区用于将IL15拴连至膜的示例性跨膜蛋白包括MHC1、CD8、B7-1、CD4、CD28、CTLA-4、PD-1、人IgG4，或IL15受体亚基(例如IL15αR)。IL15可以直接连接到跨膜结构域，或可以经由接头和/或铰链连接。

许多接头序列(接头)是本领域已知的。接头包括但不限于GS接头、GSG接头和GGSG接头。这些接头是亚基的一次或多次重复。因此，GS接头是GS_n接头，其中n是为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高的数字。类似地，GSG接头是GS_n接头，其中n是为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高的数字。GGSG接头是GGSG_n接头，其中n是为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高的数字。接头选择和接头长度可能会影响IL15有效载荷的活性水平(即，在不存在配体的情况下的基本活性)，并且特定的接头和长度可被选择为最大化导通状态(例如，最大活性水平)，同时维持低基础活性水平和配体(例如，药物)响应性。

作为又一个例子，特定铰链可以允许构象变化，并且从而影响配体响应性，并且因此被选择为产生足够的动态范围以获得所需范围的有效载荷丰度和生物活性(即，对应于配体从零或最小饱和到最大饱和的变化的可接受的有效载荷活性范围)。

铰链序列是促进连接组分之间的柔性的氨基酸的短序列。铰链序列可以是衍生自或获自任何合适的分子的任何合适的序列。铰链序列可以衍生自全部或部分免疫球蛋白(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)铰链区域，即落在免疫球蛋白的CH1和CH2结构域之间的序列(例如，IgG4 Fc铰链)，或1型膜蛋白的细胞外区域(诸如CD8αCD4、CD28和CD7)，该细胞外区域可以是野生型序列或其衍生物。一些铰链区域包含免疫球蛋白CH3结构域，或CH3结构域和CH2结构域二者。在一些实施方案中，铰链衍生自跨膜结构域。

本文所述的经修饰的TIL还任选地包含编码细胞内/细胞质或跨膜尾部的外源性核酸序列。任选地，细胞内/细胞质或跨膜尾部是B7.1、CD8、CD40L、LIGHT或NKG2C细胞内尾部。

本文所述的经修饰的TIL还任选地包含编码信号序列(前导序列)的外源性核酸序列。示例性前导序列包括MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC(SEQ ID NO:10)、MDWTWILFLVAAATRVHS(IgEss；SEQ ID NO:58)、MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEA(天然IL15 LS；SEQ ID NO:59)、MGLVRRGARAGPRMPRGWTALCLLSLLPSGFMA(CD34：SEQ ID NO:60)。

此外，某些TIL还包含编码DRD的外源性核酸序列。IL15对T细胞和NK细胞增殖很重要，但持续暴露于高水平的IL15可能导致这些细胞在体内耗尽，这会降低表达IL15的TIL的功效。因此，在某些实施方案中，使DRD可操作地连接到mbIL15以在TIL免疫疗法期间提供IL15活性的调节。

药物响应结构域(DRD)是调节有效载荷的表达或活性水平的多肽。虽然被称为药物响应结构域，但DRD对其有响应的配体不一定是批准的小分子或生物“药物。”更具体地说，DRD与配体相互作用，使得当DRD可操作性连接至有效载荷时，它赋予对有效载荷的特征(例如，活性或丰度)的配体依赖性可逆调节。美国专利号9,487,787和10,137,180；美国公布号：2019/0192691、2020/0101142、2020/0172879、2021/0069248；以及美国专利申请号：17,251,635；和17/288,373(其中每一篇的内容特此通过引用整体并入本文)提供了根据本公开的DRD(及其配对配体)的实例。适合于根据本公开使用的这些和其他示例DRD中的某些也提供在本专利说明书的其他地方中。DRD例如可以选自FKBP(SEQ ID NO:4)、ecDHFR(SEQID NO:1)、hDHFR(SEQ ID NO:2)、ER(SEQ ID NO:9)、PDE5全长(SEQ ID NO:6)、PDE5配体结合结构域(SEQ ID NO:5)和CA2(SEQ ID NO:7)，或前述中的任一者的维持DRD功能的部分，或与SEQ ID NO:1、2、4、5、6、7或9具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，或其DRD功能部分。例如，FKBP、ecDHFR、hDHFR、ER、PDE5和CA2的氨基酸序列中的一个或多个突变(包括截短、取代和缺失)可能有利于进一步使DRD不稳定。合适的DRD(其可被称为不稳定结构域或配体结合结构域)也是本领域已知的。例如，参见WO2018/161000；WO2018/231759；WO2019/241315；US8,173,792；US8,530,636；WO2018/237323；WO2017/181119；US2017/0114346；US2019/0300864；WO2017/156238；Miyazaki等人,J Am Chem So c,134:3942(2012)；Banaszynski等人(2006)Cell 126:995-1004；Sta nkunas,K.等人(2003)Mol.Cell 12:1615-1624；Banaszynski等人(2008)Nat.Med.14:1123-1127；Iwamoto等人(2010)Chem.Biol.17:981-988；Armstrong等人(2007)Nat.Methods 4:1007-1009；Madeira da Silva等人(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.USA106:7583-7588；Pru ett-Miller等人(2009)PLoS Genet.5:e1000376；以及Feng等人(2015)Elife 4:e10606，其中每一篇的内容均特此通过引用整体并入。

无意受到理论的限制，DRD被认为是不稳定的多肽，该多肽在其相应的稳定配体(也称为配对配体或配体)不存在的情况下降解，但它的稳定性通过与稳定配体结合而得到挽救。由于该配体与DRD的结合是可逆的，因此后来该配体的去除会导致DRD展开，变得不稳定，并最终被泛素-蛋白酶体系统(“UPS”)标记为用于降解。因此，据信，当DRD可操作地连接到诸如mbIL15的有效载荷时，整个构建体(即DRD加IL15)本身就会被UPS变得不稳定和降解。然而，在配对配体的存在下，构建体得以稳定化并且mbIL15有效载荷仍然可用。进一步地，据信DRD稳定性的条件性性质允许从稳定的蛋白质快速且无干扰地切换到不稳定的UPS底物，并且可以促进有效载荷活性水平的调节或调控，和/或有效载荷活性水平的调控。

因为有效载荷的丰度和可用性与有效载荷的活性相关，所以出于本公开的目的，术语丰度、可用性、活性以及短语丰度和/或活性(以及类似的丰度水平、可用性水平、活性水平，以及丰度和/或活性水平)在本公开全文中可互换地使用，并且通常被称为活性，除非另有明确说明或在上下文中无意义。进一步地，丰度或可用性的测量值被用作活性水平的代替物(proxy)，并且可以在本文中用于反映活性水平。因此，在存在有效量配体的情况下有效载荷的丰度或可用性与不存在配体的情况相比的变化任选地用作用于测量活性水平变化的代替物。

本文描述了许多DRD，但是本领域技术人员可以鉴定出另外的DRD。例如，可以使用文库筛选和结构引导工程化(structure-guided engineering)来鉴定DRD，以选择在不存在配体的情况下具有足够的不稳定性，而在存在配体的情况下具有足够的稳定性的最佳DRD变体。通过用突变DRD候选物转导细胞(例如Jurkat细胞)，可以使用随机诱变筛选产生变体文库。为了产生富集的文库，然后通过测试报告基因在一系列配体浓度下的表达来选择具有所需特征(低基础活性/表达和高动态范围)的细胞。然后产生单细胞克隆并对其进行表征以鉴定候选DRD。DRD能够影响其可操作地连接至的有效载荷的特征，例如丰度或活性水平。进一步地，一个或多个DRD与配体相互作用以提供对有效载荷的特征的配体依赖性可逆调节。本文所述的DRD对配对的配体具有响应性。任选地，DRD对作为小分子药物的配对配体(诸如FDA批准的小分子)有响应。然而，本领域技术人员可以选择DRD及其配对配体来满足系统的特定需求。本文所述的稳定配体及其用于特定DRD的用途的实例显示在表1和2012年3月33日提交的美国专利号9,487,787、2013年9月6日提交的美国专利号10,137,180、2018年6月12日提交的PCT申请号PCT/US2018/037005、2019年6月12日提交的PCT申请号PCT/US2019/036654、2019年10月23日提交的PCT申请号PCT/US2019/057698、2020年3月6日提交的PCT申请号PCT/US2020/021596和2019年9月2日提交的美国申请号16/558,224中，所有前述申请的公开内容全部通过引用并入文中。

表1.DRD和示例性配体的列表

任选地，本公开的DRD可以衍生自人碳酸酐酶2(hCA2)，其是金属酶超家族碳酸酐酶的成员。本公开的DRD可以衍生自CA2的氨基酸1-260(Uniprot ID:P00918)(SEQ ID NO:7)。任选地，该DRD衍生自包含亲代CA2序列的氨基酸2-260的CA2(例如，氨基酸2-260)。这在本文中称为CA2 M1del突变(CA2；SEQ ID NO:55)。任选地，本公开的DRD包括人碳酸酐酶2的区域或整个人碳酸酐酶2，并且还包括相对于选自M1del、L156H和S56N的全长序列的一个或多个突变。任选地，DRD选自由SEQ ID NO:7、26、55、56和57组成的群组。

例如，经修饰的TIL可以包含核酸，该核酸编码位于IL15多肽组分的C端的跨膜结构域和位于该跨膜结构域的C端的细胞内尾部。

表2中显示了经修饰的TIL的构建体和构建体组分的非限制性实例。指定为OT-IL15-292的构建体包括来自N端的信号序列、IL15、(GS)₁₅接头、铰链区、跨膜区和细胞内尾部。指定为OT-IL15-293的构建体包括位于C端处的DRD(具体地，CA2 DRD(M1del，L156H))。

表2：构建体和构建体组分的实例

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为了创建可操作地连接到可用足够的动态范围(即，对应于配体从零到最大饱和的变化的可接受的活性范围)调节的DRD的膜拴连细胞因子(如IL15)，多肽任选地从N端起包括有效载荷(IL15)、接头、铰链、跨膜区、尾部和DRD。尾部和/或接头以及尾部和接头长度可能会影响在不存在配体的情况下的活性水平，并且在一些实施方案中，特定的尾部和/或接头和长度被选择为最大化导通状态(例如，最大活性水平)，同时维持低基础活性水平和配体响应性。特定的铰链可以允许构象变化，并且从而在足够的动态范围内影响配体响应性。

如本文所述的表达mbIL15的经修饰的TIL具有许多优点。首先，经修饰的TIL可以在饲养细胞(诸如表达41BBL和IL21(任选地，mbIL21)的K562饲养细胞)存在下在体外扩增。值得注意的是，在REP前阶段之后，经修饰的TIL可以在不存在外源性细胞因子的情况下在体外扩增，并且经扩增的TIL被激活并且可以在没有施用外源性细胞因子(如IL2)的情况下在体内进一步扩增。

包含多个经修饰的TIL的TIL群体可以包括已经历扩增(即，利用饲养细胞和刺激分子(诸如IL21和41BBL)的REP)的TIL的亚群体。经扩增的TIL展现出许多优点。例如，已经历REP的经扩增的TIL能够在缺乏饲养细胞的培养物中存活。更具体地说，在不存在外源性细胞因子(例如，白细胞介素如IL2)的情况下，被工程化成表达mbIL15的TIL可以比未工程化细胞存活更长时间。被工程化成表达可操作地连接到DRD的mbIL15的TIL在存在配体但不存在外源性细胞因子的情况下比未工程化TIL更好地存活。此外，与未经扩增的TIL的对照群体相比，经扩增的TIL群体显示出某些TIL的优先扩增以及因此更少或更多的TIL的亚型。如本文使用的未经扩增的TIL的对照群体是指与经扩增的TIL类似地被修饰但未经历REP的TIL。

经扩增的TIL群体例如与未经扩增的TIL的对照群体相比具有更高比例的CD8+细胞，更小比例的CD4+细胞和更低的CD4+:CD8+比率。CD8+TIL被认为是通过释放细胞毒性分子和细胞因子杀死癌细胞的关键参与者，并且肿瘤中CD8+TIL数目与CD4+TIL数目的比较(即CD4+：CD8+比率)已被发现与积极结果相关。

此外，在某些实施方案中，经扩增的TIL群体中的CD4 T_reg细胞的比例与未经扩增的TIL的对照群体中T_reg细胞的比例相比较低。CD4 T_reg细胞通过压制免疫反应在免疫耐受和免疫稳态中起作用。因此，在免疫疗法中需要较低比例的T_reg细胞，例如使用TIL的ACT。

经扩增的TIL群体也显示出更少的经耗尽TIL和更多的多功能TIL。与未经扩增的TIL对照群体中PD1+细胞的比例相比，经扩增的TIL群体具有更小比例的PD1+细胞。此外，与未经扩增的TIL对照群体中产生肿瘤坏死因子α(TNFα)和干扰素γ(IFNγ)的TIL比例相比，经扩增的TIL群体具有更大比例的产生TNFα和IFNγ二者的细胞。

本文提供了TIL的混合群体，其包含未经修饰的TIL的亚群体和包含任选地可操作地连接到DRD的mbIL15的经修饰的TIL的亚群体。经修饰的TIL的亚群体在表达41BBL和IL21(例如mbIL21)的K562饲养细胞的存在下扩增。在表达41BBL和IL21的K562饲养细胞的存在下，经修饰的TIL的亚群体比未工程化TIL的亚群体扩增得更多。经修饰的TIL的这种优先扩增发生在REP期间不存在外源性IL2的情况下。

制备经修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法

可以使用本领域已知的方法从肿瘤或其活检物中分离TIL。例如，使肿瘤碎片(例如，1-5mm大小)经受酶消化(例如，胶原酶(0.5-5mg/mL)、DNA酶，或透明质酸酶)或机械解离。将经解离的细胞在细胞培养基中在与其他细胞相比有利于TIL增殖的条件下(即在IL2存在的情况下)孵育。此阶段是REP前阶段。在REP前阶段，可将细胞在2000-8000IU/mL IL2(例如6000IU/ml)存在下以及任选地在灭活的人AB血清存在下培养(例如，3至28天)。在一些实施方案中，将细胞培养一段时间，通常为3至28天。在一些实施方案中，将此REP前细胞群体培养7至21天。

可以冷冻保存REP前TIL。冷冻保存的细胞在激活前被解冻和静置。可以使用例如板结合的OKT3、可溶性OKT3、共刺激抗体(例如针对CD28或41BB的抗体)+OKT3、结合到珠粒的抗CD3和抗CD28抗体或者片段等来激活细胞。激活步骤可以是1-2天或更长时间。激活后，然后通过用具有编码IL15的第一核酸序列和编码跨膜结构域的第二核酸序列的载体转导一个或多个TIL，将该一个或多个TIL工程化成表达膜结合白细胞介素15(mbIL15)。任选地，载体还包括一个或多个编码信号肽、接头、铰链、细胞内尾部或DRD的核酸序列。载体可以以许多方式被配置来获得所需的mbIL15。示例性核酸构建体包含分别具有和不具有DRD的编码OT-IL15-293和OT-IL15-292的核酸序列。因此，载体任选地包含SEQ ID NO:29、31、53或54。载体包含或编码另外的元件，诸如启动子序列和其他调节性元件(增强子、翻译控制元件(例如IRES)和控制半衰期的元件)。载体任选地包含或可以包含编码控制翻译的元件(例如，IRES、WPRE等)的核酸序列。

载体可以选自病毒载体、质粒、粘粒和人工染色体。例如，载体可以是病毒载体，诸如慢病毒载体或逆转录病毒载体。例如，病毒载体可以是包含编码IL15的核酸和编码跨膜结构域的核酸的狒狒包膜假型慢病毒载体。表达后，IL15与跨膜结构域缔合，并且被跨膜结构域结合到膜上。

载体任选地通过非病毒方法(诸如针头、电穿孔、声致孔、水穿孔、化学载剂(诸如无机颗粒(例如磷酸钙、二氧化硅、金))和/或化学方法)转移到细胞中。在一些实施方案中，合成或天然可生物降解剂被用于递送诸如阳离子脂质、脂质纳米乳液、纳米颗粒、基于肽的载体或基于聚合物的载体。

编码IL15的核酸可以是基因组核酸或非基因组核酸。也就是说，用于递送编码IL15的核酸的递送系统可以被整合到TIL的基因组中，或者可以是非整合的(即游离体)或使用RNA载体作为RNA转移到细胞质中。

包含mbIL15的TIL在REP阶段(例如，5-21天或其间的任何量，包括7-14天)扩增。如实施例中进一步描述的，被修饰为表达IL15的TIL在K562饲养细胞以及41BBL和IL21存在下扩增。在某些实施方案中，K562饲养细胞被工程化成表达41BBL和IL21，该IL21可以是膜结合IL21(mbIL21)。这种扩增mbIL15 TIL的方法减少或消除了REP期间对外源细胞因子(例如IL2、IL7或IL15)的需要。在一些实施方案中，经修饰的TIL与被修饰成表达mbIL21和41BBL的K562细胞以1:1至100:1、1:1至50:1、1:1至20:1、1:1至10:1，或2:1至5:1(TIL:饲养细胞)的比率一起培养。

在饲养细胞被用于本发明方法中之前，首先使它们变得无复制能力。处理饲养细胞的各种手段是本领域已知的。此类方法包括辐照(例如，用伽马或X射线)、丝裂霉素-C处理、电脉冲、温和化学固定(例如，用甲醛或戊二醛)或用自杀基因转导饲养细胞。在一些实施方案中，饲养细胞是人细胞。例如，辐照可以是在例如由铯源或X射线源递送的25-300Gy下。

在饲养细胞上扩增后，任选地从饲养细胞中分离出TIL。如本文所用，术语分离并不意味着暗示TIL完全不含其他组分，诸如饲养细胞，只是暗示TIL相对不含饲养细胞。

本文提供了一种制备包含mbIL15的TIL、TIL的群体或TIL的亚群体的方法。还提供了编码mbIL15的核酸序列、包含编码mbIL15的核酸序列的载体、被修饰成表达41BBL和IL21的无复制能力的K562饲养细胞，以及通过本文所述方法制备的TIL。

药物组合物

本文提供了适用于ACT的药物组合物。该药物组合物可包含TIL，诸如经扩增的TIL，以及药学上可接受的载剂。该药物组合物中TIL的群体任选地是TIL的混合群体，该混合群体包含经修饰的TIL(例如，被工程化成表达IL15的TIL)和未经修饰的TIL(即，未经转导或未工程化的TIL)的亚群体。

术语载剂意指这样的化合物、组合物、物质或结构，该化合物、组合物、物质或结构在与化合物或细胞组合时有助于或促进该化合物或细胞的制备、储存、施用、递送、有效性、选择性或任何其他特征以达到该化合物或细胞的预期用途或目的。例如，载剂可以被选择为最小化TIL的任何降解，并最小化受试者中的任何不良副作用。此类药学上可接受的载剂包括无菌生物相容性药物载剂，包括但不限于盐水、缓冲盐水、人工脑脊髓液、右旋糖和水。所谓药学上可接受的意指在生物学上或其他方面不是不期望的材料，该材料可连同TIL或TIL群体一起施用于个体，而不会引起不可接受的生物学效应或与TIL以有害方式相互作用。

任选地，该药物组合物还包含冷冻保护剂(冷冻保存剂)。如果TIL被冷冻以备将来使用，此种冷冻保护剂可起到防止不可接受的细胞裂解或损伤的作用。冷冻保护剂是本领域已知的。此种冷冻保护剂可以选自甘油、乙二醇、丙二醇或二甲基亚砜(DMSO)。

本文所述的药物组合物任选地还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂(例如，人血清白蛋白或聚合物材料(例如，PEG))。

本公开的组合物可以以任何适合于递送的方式配制。该TIL可以以纳米颗粒、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微球、类脂质(lipidoid)、脂质复合物、脂质体、聚合物、碳水化合物(包括单糖)、阳离子脂质或它们的组合施用。

尽管本文提供的药物组合物的描述主要是针对适合施用于人类的药物组合物，但本领域技术人员将理解，此类组合物通常适用于施用于任何其他动物，例如，非人类哺乳动物。考虑施用该药物组合物的受试者包括但不限于农业动物，诸如牛、马、鸡和猪；家畜，如猫、狗；或研究动物，如小鼠、大鼠、兔子、狗和非人类灵长类动物。

治疗方法

本文提供了通过向受试者(即，受体受试者)施用表达mbIL15的经修饰的TIL或其群体(包括经扩增的TIL的群体或亚群体)或它们的药物组合物来治疗受试者中的癌症的方法。该癌症可以是，但不限于，黑色素瘤、葡萄膜(眼)黑色素瘤、宫颈癌、卵巢癌、头颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、膀胱癌、乳腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、中枢神经系统癌、胃肠道癌(例如，结直肠癌)。

迄今为止的TIL疗法都需要与TIL的施用同时以及在TIL的施用之后进行的高剂量IL2的伴随施用。但与利用TIL的常规治疗不同，本发明方法不需要施用IL2。相反，经修饰的TIL通过表达mbIL15而提供了充足的细胞因子来源来刺激TIL的增殖和活性。

该治疗癌症的方法还可以包括如本文所述从肿瘤中分离一个或多个TIL，以及将表达mbIL15的核酸引入到该一个或多个TIL中。该TIL可以分离自受体受试者(自体来源)的肿瘤。该TIL所分离自的肿瘤可以是原发性肿瘤或转移性肿瘤。因此，如果来自活检物或部分原发性肿瘤的TIL被冷冻保存，则它们可以在以后被解冻并且被用于治疗所产生的转移性肿瘤或不同的原发性肿瘤。可替代地，该TIL可以分离自来自供体(同种异体来源)的肿瘤，其中该供体受试者不是受体受试者。分离自待治疗的同一肿瘤的TIL所具有的优点是具有与该肿瘤相同的新抗原和异质性。分离自同一受试者的不同肿瘤或分离自供体受试者的肿瘤的TIL可以通过本领域已知的方法(诸如TCR的四聚体染色)被选择用于与受体受试者的肿瘤中存在的癌症抗原反应。如果TIL分离自供体受试者，则该方法还可以包括选择与受体受试者HLA匹配的供体受试者，从而减少移植物抗宿主响应。

TIL可以从作为初始步骤的肿瘤样品手术切除、组织活检、穿刺活检或其它手段获得。然后如本文所述对TIL进行转导，然后对该TIL进行离体扩增以提供更大的细胞群体以用于ACT。

经修饰的TIL的施用可以包括从约1000个细胞/注射到多达约100亿个细胞/注射的量，诸如2×10¹¹个细胞/注射、1×10¹¹个细胞/注射、1×10¹⁰个细胞/注射、1×10⁹个细胞/注射、1×10⁸个细胞/注射、1×10⁷个细胞/注射、5×10⁷个细胞/注射、1×10⁶个细胞/注射、5×10⁶个细胞/注射、1×10⁵个细胞/注射、5×10⁵个细胞/注射、1×10⁴个细胞/注射、5×10⁴个细胞/注射、1×10³个细胞/注射、5×10³个细胞/注射，或该数字中任何两个数字之间的任何范围(端点包括在内)。任选地，将约1×10⁸至约1×10¹¹个细胞施用给受试者。

本公开的TIL可以通过任何合适的途径施用。在一些实施方案中，该TIL通过静脉输注、动脉内输注、腹膜内、鞘内、淋巴管内施用。在一些实施方案中，该TIL通过静脉内或动脉内输注施用。任选地，该TIL被局部施用，例如，直接施用到肿瘤或供应肿瘤的血管中。

该TIL可以以单剂量施用，但在某些情况下可以以多剂量施用。

治疗方法还可以包括在施用TIL之前对受体受试者进行淋巴细胞耗竭(lymphodepletion)。对人类和小鼠黑色素瘤模型的研究表明，淋巴细胞耗竭会耗竭阴性调节性细胞，包括调节性T细胞(T_reg)细胞和可压制T细胞增殖的外周髓系来源的压制性细胞。因此，淋巴细胞耗竭有助于过继转移的TIL的增殖。淋巴细胞耗竭调理方案包括，例如，在过继转移TIL之前，用全身辐照和/或淋巴细胞耗竭剂对受体受试者进行预处理。这种预调理通过消除T_reg细胞以及去除正常细胞借以与新输注的TIL竞争的潜在细胞因子积储(cytokine sink)而使TIL能够扩增。

淋巴细胞耗竭剂的一个实例是氟达拉滨(例如，剂量为0.5μg/ml-10μg/ml)。在一些实施方案中，氟达拉滨在TIL:施用之前以每天1μg/ml的浓度施用1-7天。在一些实施方案中，氟达拉滨以10mg/kg/天、15mg/kg/天、20mg/kg/天、25mg/kg/天、30mg/kg/天、35mg/kg/天、40mg/kg/天或45mg/kg/天的剂量施用。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天施用2-7天。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天施用4-5天。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗以25mg/kg/天施用4-5天。

在一些实施方案中，施用环磷酰胺以提供浓度为0.5μg/mL-10μg/mL的呈其活性形式的马磷酰胺。在一些实施方案中，在TIL施用前，施用环磷酰胺以提供每天1μg/mL浓度的马磷酰胺，持续1-7天。在一些实施方案中，环磷酰胺以50mg/m²/天、75mg/m²/天、100mg/m²/天、150mg/m²/天、175mg/m²/天、200mg/m²/天、225mg/m²/天、250mg/m²/天、275mg/m²/天或300mg/m²/天的剂量施用。在一些实施方案中，环磷酰胺是静脉内(i.v.)施用的。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗以35mg/kg/天静脉施用2-7天。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗以250mg/m²/天静脉施用4-5天。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗以250mg/m²/天静脉施用4天。

在某些实施方案中，淋巴细胞耗竭包括施用淋巴细胞耗竭剂的组合，例如60mg/kg的环磷酰胺2天和25mg/m²的氟达拉滨5天，或250mg/m²/天的环磷酰胺4天和25mg/m²的氟达拉滨4天。

如果TIL表达的IL15可操作地连接到DRD，则该方法还可以包括向受体受试者施用有效地增加TIL的IL15活性的量的与DRD结合的第二剂(配体)。可以使用为受试者提供选定量的IL15活性的给药方案施用配体。配体可以被递送以在受试者中实现连续或间歇的IL15活性。对受试者给药的频率和持续时间的确定由本领域技术人员通过考虑例如以下来确定：当期望更多的IL15活性时，提供更高的配体剂量或更长的配体施用持续时间，以及当期望较少的活性时，减少或消除配体施用。配体施用的剂量和持续时间以及IL15的所产生的活性还被选择为避免受试者中不可接受的副作用或毒性。因此，受试者被施用有效量的配体以获得有效量的IL15。术语有效量被定义为产生期望生理响应所需的任何量。用于施用配体的有效量和时间表可以由本领域技术人员根据所产生的IL15的量、IL15的活性，或根据IL15活性的效果的一个或多个迹象凭经验确定。配体施用的范围在从零到饱和剂量的范围内，并且所得IL15活性在从不存在配体的情况下的基础水平到存在饱和量配体的情况下的最大水平。在一些实施方案中，该方法包括使细胞与选定量的配体接触，其中该选定量的配体产生选定的IL15有效载荷活性水平。在某些实施方案中，该方法包括可替代地使细胞与不同选定量的配体接触，以实现范围为从基础水平到最大水平的不同选定活性水平。任选地具有足够的动态范围，其允许期望的配体剂量响应和伴随的有效载荷活性范围(例如，对于给定的配体和有效载荷，关断状态和最大有效载荷活性的差异的范围将由配体的至少10倍范围引起)。这种足够的动态范围使得能够进行微调并且使得剂量响应曲线不会不可接受的陡峭。

配体可以被递送以实现连续或间歇的IL15有效载荷活性。连续的有效载荷活性可以是基本上一致的活性水平，或者可以调控活性水平。关断状态和导通状态之间的间歇活性包括在关断状态和基本上一致的导通状态之间，或者在关断状态和变化的导通状态活性水平之间调控活性。当需要更高的IL15有效载荷活性时，施用更高剂量或更长施用持续时间的配体，而当需要更少的活性时，选择减少或消除配体剂量。配体施用的剂量或频率以及所产生的IL15有效载荷的量和活性不应大到引起不可接受的不良副作用，并且将会随着患者的年龄、患者的一般状况、性别，正在治疗的癌症类型、癌症的程度以及治疗方案中是否包括其他治疗剂而变化。对于给定类别的配体的适当剂量可见于文献中的指南。

在一些实施方案中，被修饰成具有mbIL15或具有可调节mbIL15(即可操作地连接到DRD的mbIL15)的TIL可以与一种或多种免疫检查点调节剂组合施用。检查点抑制剂包括靶向PD-1或抑制PD-1与PD-L1结合的抗体，包括但不限于纳武单抗(BMS-936558，Bristol-Myers Squibb；)、派姆单抗(lambrolizumab、MK03475或MK-3475，Merck；)、人源化抗PD-1抗体JS001(上海君实)、单克隆抗PD-1抗体TSR-042(Tesaro,Inc.)、匹地利珠单抗(抗PD-1mAb CT-011，Medivation)、抗PD-1单克隆抗体BGB-A317(BeiGene)和/或抗PD-1抗体SHR-1210(上海恒瑞)、人单克隆抗体REGN2810(Regeneron)、人单克隆抗体MDX-1106(Bristol-Myers Squibb)和/或人源化抗PD-1IgG4抗体PDR001(诺华)。

任选地监测受试者的治疗结果。因此，例如，可以检测样品中恶性细胞的数目、样品中循环的肿瘤DNA，或成像时实体肿瘤的大小。如果达到期望的终点(例如，显示癌症的成功治疗)，则可以减少或停用配体以减少或消除IL15。同样，如果受试者因IL15发生细胞因子风暴、过敏反应或其他不良影响，则可以减少或停用配体。

定义

术语约和近似，当用于指代可测量值诸如量、浓度、剂量、时间、温度、活性、水平、数目、频率、百分比、尺寸、大小、重量、位置、长度等时，意在解释由于实验误差引起的变化，该变化可涵盖具体指定的量、浓度、剂量、时间、温度、活性、水平、数目、频率、百分比、尺寸、大小、重量、位置、长度等的±15％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。所有测量值或数值都被隐式地理解为被单词约修饰，即使该测量值或数值未被单词约明确地修饰。在术语约和近似与参考多肽内区域的位所或位置结合使用的情况下，这些术语涵盖±最多20个氨基酸残基、±最多15个氨基酸残基、±最多10个氨基酸残基、±最多5个氨基酸残基、±最多4个氨基酸残基、±最多3个氨基酸残基、±最多2个氨基酸残基，或甚至±1个氨基酸残基的变化。

如本文所用，可操作地连接意指，在存在配对的配体的情况下，DRD直接或间接地连接至IL15，以便改变IL15的可测量特征(例如，使IL15的活性水平相较于在不存在配对的配体的情况下的活性水平发生改变)。在一些实施方案中，在存在有效量配体的情况下测量的IL15的量和/或活性的水平与在不存在配体的情况下测量的表达或活性的水平相比增加。配体的有效量意指观察到IL15的量或活性的测量值增加所需的配体的量。在一些实施方案中，有效量不会大到产生不可接受的毒性或脱靶效应。任选地，可测量的特征是治疗结果、样品中有效载荷的量，或有效载荷的生物活性水平(测量有效载荷的量可以作为该生物活性水平的代替物)。

除非上下文中另有明确说明或无意义，否则无论在何处使用连接或结合等短语，都应理解为遵循直接或间接短语。因此，对连接到mbIL15、结合至mbIL15或与mbIL15缔合的DRD的提及意味着在每种情况下，DRD直接或间接连接到IL15。

如本文所用，术语TIL的存活率与TIL的持续存在率是可互换使用的。存活率是根据TIL的持续存在的作用确定的。

如本文所用，扩增用于指在功能性REP期间发生的细胞数目的功能性增加。功能性REP导致为治疗用途提供足够的细胞数目的经扩增的细胞群体。另一方面，不成功的REP将导致细胞数目没有功能性倍数增加。未经扩增的细胞包括REP前细胞和与经扩增的细胞群体相比未经历REP中的功能性扩增的细胞。非功能性扩增包括经扩增的细胞群体的10％或更少的扩增。例如，可以将在给定时间段内扩增100倍的TIL群体与仅扩增10倍或更少的未经扩增的群体进行比较。因此，如本文所用，经扩增的细胞或经扩增的细胞群体是指经历了功能性REP的细胞或细胞群体。未经扩增的细胞或细胞群体是指在REP前或者在未能导致细胞群体的功能性扩增的REP之后的细胞或细胞群体。例如，某些经修饰的TIL将在改良K562饲养细胞上扩增，但在PBMC上的倍数扩增将小于在改良K562饲养细胞上的倍数扩增的10％。因此，未经扩增的TIL可以是REP前的经修饰的TIL，或在PBMC上REP后的经修饰的TIL。

术语同一性如本领域所知，是指两个或多个序列之间的关系，如通过比较这些序列来确定的。在本领域，同一性还意指序列之间的序列相关性程度，如通过两个或多个残基(氨基酸或核酸)的串之间的匹配数目所确定。同一性度量两个或更多个序列之间同一的匹配的百分比，这些序列具有由特定数学模型或计算机程序(即算法)解决的空位比对(如果有的话)。相关序列的同一性可以通过已知方法轻易计算。这些方法包括但不限于以下中描述的那些：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,编辑,Oxford UniversityPress,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,编辑,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,第1部分,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,编辑,Humana Press,New Jersey,1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,编辑,M.Stockton Press,New York,1991；以及Carillo等人,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)。通常，本公开的特定多核苷酸或多肽的变体将与该特定参考多核苷酸或多肽具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％序列同一性，如通过本文描述和本领域技术人员已知的序列比对程序和参数来确定。此类比对工具包括BLAST套件的工具(Stephen F.Altschul,ThomasL.Madren,Alejandro A.Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,和DavidJ.Lipman(1997),"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of proteindatabase search programs",Nucleic Acids Res.25:3389-3402。)

如本文所用的术语饲养细胞是指诸如通过将生长或存活因子分泌到细胞培养物中或者将生长或存活因子呈递在饲养细胞膜上来支持TIL在培养物中的扩增的细胞。在一些实施方案中，饲养细胞生长受阻(即无复制能力)。

如本文所用，受试者和患者是同义使用的，并且不意味着限于人类受试者或患者。

如本文所用的治疗是指癌症的一种或多种体征或症状的减轻或延迟。例如，疾病的可测量参数的至少10％的有利变化，优选至少20％、30％、40％、50％或更高的有利变化可以指示有效治疗。因此，可以例如通过测量疾病进展、疾病缓解、症状严重程度、疼痛减轻、生活质量、维持治疗效果所需的药物剂量、疾病标记物的水平，或适合于正在被治疗或被靶向以进行治疗的给定疾病的任何其他可测量参数来评估治疗的功效或疾病的改善。关于本公开组合物的施用，用于治疗癌症的有效量表明以临床上适当的方式进行的施用对至少统计学显著性的分数的患者产生有益效果，例如症状的改善、治愈、疾病负荷的减少、肿瘤质量或细胞数目的减少、寿命的延长、生活质量的改善，或其他被熟悉治疗特定类型癌症的医生普遍认为是积极的效果。

在给定范围的情况下，端点被包括在内。此外，应当理解，除非另有说明或根据上下文和本领域普通技术人员的理解以其他方式显而易见，否则表示为范围的值可以在本公开的不同实施方案中采用所陈述范围内的任何特定值或子范围，达到该范围下限的单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。

本公开的一个或多个实施方案的细节阐述于说明书和附图中。应当理解，可以利用其他实施方案并且可在不脱离本公开范围的情况下作出结构或方法变化。换言之，描述了说明性实施方案和方面。但是应理解，在任何此种实际实施方案的开发中，可以作出诸多特定于实施方式的决定以达成开发者的具体目标(诸如遵守临床相关约束)，该具体目标从一个实施方式到另一个实施方式可能将有所变化。此外，应了解，这种开发努力可能是复杂的且耗时的，但是仍将是受益于本公开的本领域一般技术人员的常规任务。

本文引用的出版物以及它们引用的材料据此通过引用明确地整体并入。

以下实施例意在进一步说明本文所述方法和组合物的某些方面，而非意在限制权利要求的范围。

实施例

实施例1：从患者肿瘤样品中分离和扩增TIL(REP前培养物)

黑色素瘤和头颈部肿瘤样品是从合作人类组织网络(Cooperative Human TissueNetwork)获得。将肿瘤样品在Hanks平衡盐溶液(HB SS)缓冲液中切成1-3mm片段，并且将片段以1个片段/孔放置在多孔板中的含有6000IU/mL IL2(Peprotech)和0.1mg/mL Normocin(I nvivoGen)的2mL TIL培养基(补充有GlutaMAX(Thermo Fisher)、1％青霉素/链霉素、1mM丙酮酸钠、1％HEPES、50μM 2-巯基乙醇(I nvitrogen)和10％热灭活人AB血清(ValleyBio)的RPMI-1640)中。从第5天开始，用含有IL2的新鲜培养基替换一半的培养基，并当细胞在3周的持续时间内汇合时，将细胞分到多个孔或烧瓶中。这种培养方法被称为快速扩增方案前(REP前)。在REP前之后，将TIL等分，在细胞冷冻培养基(Bambanker，Bulldog Bio或Cryostor-10，STEMC ELL Technologies)中冷冻，并在液氮中长期储存。

为了确定REP前培养前后的T细胞频率变化，在REP前培养之前用胶原酶和DNase I消化一部分肿瘤片段以产生单细胞悬浮液，并且将其与REP前培养后获得的细胞进行比较。使用荧光染料缀合的抗CD45和抗CD3抗体通过流式细胞术分析T细胞的频率。如图1所示，培养前肿瘤细胞悬浮液中近一半的细胞(44.29±21.67％)是CD45+，其中只有近似40％(约39.85±23.69％)是CD3+T细胞。在IL2存在下培养(REP前)3周后，大多数细胞为CD45+(90.35±7.28％)(表明造血细胞富集)和CD3+(80.64±15.19％)(表明T细胞富集)。

来自其他人类肿瘤类型(包括黑色素瘤肿瘤和来自乳腺、肺、肾、子宫内膜、肝、胰腺和卵巢的恶性肿瘤)的TIL以与上面描述的方式相同的方式分离。

实施例2：表达膜结合IL21和4-1BBL的K562细胞的产生

膜结合IL21和4-1BBL载体构建体组装

IL21-41BBL-001插入物包含编码前导序列、膜结合IL21(mbIL 21)、P2A序列和4-1BBL的核酸序列。mbIL21核酸序列按顺序编码IL21序列、IgG铰链、IgG4链、CD4跨膜结构域和甘氨酸-丝氨酸(G S)接头(见表3)。包含IL21-41BBL-001插入物的OT-IL21-41BBL-001使用标准分子生物学技术在pELNS载体(第三代自灭活慢病毒表达载体)中构建。将基因片段(Gblocks)插入到pELNS载体中，并且使用G ibson assembly(NEBuilder Hifi)将该基因片段置于EF1a启动子的控制下。将组装的质粒转化到大肠杆菌(NEB稳定)中以进行扩增，并且在进行病毒生产之前确认序列。

表3：mbIL 21-41BBL构建体的组分

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表3给出了本文公开的mbIL21-41BBL构建体的结构域的核酸和氨基酸序列。OT-IL12-(241-262)和OT-CD19-IL12-(297-316,319-332)质粒各自使用标准分子生物学技术在pELNS载体(第三代自灭活慢病毒表达载体)中构建。编码IL12、甘氨酸-丝氨酸接头、各种铰链、跨膜结构域和细胞质尾部的基因片段(Gblocks或串DNA)购自IntegratedDNATechnologies或Thermo-fisher scientific。将该基因片段插入到pELNS载体中，并且使用Gibson组装(NEBuilder Hifi)将该基因片段置于EF1a启动子的控制下。将组装的质粒转化到大肠杆菌(NEB稳定)中以进行扩增，并在进行病毒生产之前确认序列。

OTLV-IL21-41BBL-001慢病毒生产

在转染当天，将HEK293T细胞在总体积为20mL的生长培养基(Dulbecco'sModified Eagle培养基(DMEM)、5％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素)中以15x 10⁶个细胞/瓶接种在胶原包被的组织培养瓶中。转染前一小时，将生长培养基用经温热的SFM4Transfx-293替换。在具有OT-IL21-41BBL-001和包装质粒pRSV.Rev、pMDLg/pRRE和pMD2.G(Addgene#122590)的Opti-MEM培养基中使用Lipofectamine 3000转染试剂和P3000增强试剂转染细胞。转染后6-8小时(hr)用SFM4Transfx-293替换培养基。转染后24小时收获含有OTLV-IL21-41BBL-001的上清液，添加新鲜培养基，并在转染后48小时再次收获上清液。过滤病毒上清液以去除碎片，并通过在4℃下以25,000g超速离心2小时对该上清液进行浓缩。将OTLV-IL21-41BBL-001慢病毒重悬、等分并储存在-80℃。

用OTLV-IL21-41BBL-001慢病毒转导K562细胞

将K562细胞在含有具有2mM L-谷氨酰胺和10％ FBS的RPMI-1640(完全RPMI，Thermo Fisher)的生长培养基中培养。在转染当天，将K562细胞在500μL K562细胞生长培养基中以1.5x 10⁵个细胞/孔的密度接种在多孔板中。用OTLV-IL21-41BBL-001慢病毒转导细胞，然后将该细胞在32℃下以800g离心1小时。将细胞孵育24-48小时，并且然后使用抗体eFluor 780(Thermo Fisher，1:1000)、4-1BBL藻红蛋白(1:50)和IL21别藻蓝蛋白(1:50)通过流式细胞术评估该细胞的IL21和4-1BBL的生存力(viability)和表达。将经转导的K562细胞在完全RPMI中扩增17天，随后进行等分，使用细胞冷冻培养基(Bambanker,BulldogBio)冷冻，并长期储存在液氮中。这些经转导的K562在本文件中称为K562-IL21-41BBL。

在将K562-IL21-41BBL细胞用作TIL REP方法中的饲养细胞之前，对该细胞进行辐照或用丝裂霉素C处理该细胞。对于辐照，从新鲜细胞培养物中获取K562-IL21-41BBL细胞，将该细胞离心并且以5-20x 10⁶个细胞/mL重悬于完全RPMI中。将经重悬的细胞在X射线辐照器中暴露于50-200Gy，然后洗涤该细胞并且将该细胞以3x 10⁶个细胞/mL重悬，以立即用于REP方法。对于丝裂霉素C处理，将该细胞解冻、离心并以5x 10⁶个细胞/mL重悬于TIL培养基中。将10μg/mL丝裂霉素C添加到该细胞中，并且将该细胞在37℃下孵育30分钟。然后将该细胞用50mL TIL培养基洗涤3次，并且以3x 10⁶个细胞/mL重悬，以立即用于REP方法。

实施例3.用慢病毒载体转导TIL

IL15载体构建体组装

OT-IL15-292和OT-IL15-293(以下序列)各自使用标准分子生物学技术在pELNS载体(第三代自灭活慢病毒表达载体)中构建。编码经密码子优化的IL15、GS接头、B7-1铰链、跨膜结构域和细胞质尾部的基因片段(Gblocks)购自Integrated DNATechnologies,Inc.(IDT,Coralville,Iowa)。将该基因片段插入到pELNS载体中，并且使用Gibson组装(NEBuilder Hifi)将该基因片段置于EF1a启动子的控制下。将组装的质粒转化到大肠杆菌(NEB稳定)中以进行扩增，并在进行病毒生产之前确认序列。

表1和表2(上文提供)给出了本文公开的组成型mbIL15构建体(OT-IL15-292)和ACZ调节型mbIL15构建体(OT-IL15-293)的组分的核酸和氨基酸序列。构建体OT-IL15-293包含表1中标记为CA2(M1del、L156H)的不稳定结构域。

表2(如上提供)还给出了本文公开的组成型IL15(IL15-292)和ACZ调节型IL15(IL15-293)构建体的核酸和氨基酸序列。

BaEV假型慢病毒生产

将HEK293T细胞接种在胶原包被的组织培养板上，直至70％汇合。使用Lipofectamine 3000转染试剂和P3000增强试剂(Thermo Fisher)在Opti-MEM培养基(Thermo Fisher)中用携带组成型(IL15-292)或调节型(IL15-293)IL15构建体的pELNS转移载体以及包装质粒pRSV.Rev(Addgene#12253)、pMDLg/pRRE(Addgene#12251)和OT-BaEVg-002(SEQ ID NO:XX)转染细胞。转染后6-8小时(hr)用无血清培养基(SFM4Transfx-293,Cytiva)替换培养基。转染后24小时收获含有病毒的上清液，添加新鲜培养基，并在转染后48小时再次收获上清液。过滤病毒上清液以去除碎片并通过低速超速离心对该上清液进行浓缩。将病毒重悬，等分并储存在-80℃。

快速扩增方案(REP)和使用BaEV假型慢病毒载体转导TIL

从如实施例1中所述的那样制备的头颈部肿瘤样品产生的TIL在REP前培养中3周后被工程化。将TIL解冻并且在具有6000IU/mL人IL2的TIL培养基中静置过夜。然后将TIL在24孔板中以3:1珠粒与TIL比率用抗CD3/CD28珠粒(Dynabeads，Thermo Fisher)，或用3μg/mL的板结合的OKT3(超LEAF纯化的抗人CD3抗体，Bio legend)，及6000IU/mL人IL2激活24小时。使用RetroNectin(30μg/mL)在4℃下包被96孔非包被细胞培养板过夜。第二天，去除Retr oNectin，用2％的在PBS中的牛血清白蛋白(BSA)封闭板，然后用P BS洗涤板。将如上所述的那样制备的BaEV假型慢病毒上清液在TI L培养基中稀释，并且对于1-4TU/细胞的MOI，以每孔100-200μL的总体积加入。将含有病毒载体的板在32℃下以1400g离心2小时，然后去除上清液。去除上清液后，每孔转移了1.5x 10⁵个激活的TIL和0-6000IU/mL IL2，并在37℃下孵育过夜。细胞在未添加病毒的情况下被类似地加工，并用作阴性对照(“未工程化”)。转导后24小时，将TIL在总共16-40mL TIL培养基(补充有GlutaMAX(T hermoFisher)、1％青霉素/链霉素、1mM丙酮酸钠、1％HEPES、50μM 2-巯基乙醇(Invitrogen)和10％热灭活人AB血清(Valley Bio)的R PMI-1640)中转移到6M GREX孔板(Wilson Wolf)中。将如实施例2中所描述的用41BBL和mbIL21转导的经辐照或经丝裂霉素-C处理的K562饲养细胞以2:1或5:1的K562与TIL比率加入到培养物中。用调节型mbIL15构建体转导的TIL接受25μM乙酰唑胺(SelleckCh em)，而未经转导的TIL接受6000IU/mL IL2。使细胞在GREX板中生长14天以进行“快速扩增方案”或REP，并根据需要添加或替换培养基。在扩增期间，将每个GREX孔重悬并充分混合，并取等分试样进行细胞计数(Cellaca细胞计数器，Nexcelom)和流式细胞术染色。使用抗体CD3-BUV395(BD)、CD56-BV711(Biolegend)、CD4-BV605(Biolegend)、CD8-Alexa Fluor 700(Biolegend)、IL15-DyL650(LakePharma，内部缀合)、IL15RaFc-Biotin(ACRO Biosystems)与二级链霉亲和素-BV421(Biolegend)和可固定生存力染料eFluor 780(Thermo Fisher)对样品进行染色。将样品在BD Fortessa流式细胞仪上运行，并使用Flow Jo V10.7.1进行分析。转导效率由活的CD3阳性细胞的群体内IL15-DyL650和IL15RaFc-Biotin双阳性染色细胞的百分比确定(图2)。

用包含如本文所述的编码mbIL15的核酸序列的慢病毒转导的TIL在随后的实施例中可称为“mbIL15 TIL”。用包含编码调节型mbIL15(如OT-IL15-293)的核酸序列的慢病毒转导的TIL在随后的实施例中也可称为“调节型mbIL15 TIL”。用包含编码组成型mbIL15(如OT-IL15-292)的核酸序列的慢病毒转导的TIL在随后的实施例中也可称为“组成型mbIL15TIL”。

实施例4.快速扩增方案中的TIL扩增

如上文实施例1-3中所述的那样产生TIL和饲养细胞。简而言之，在REP前培养中3周后，将冷冻保存的TIL解冻并且在存在6000I U/mL人IL2的情况下静置过夜。然后用抗CD3/CD28 Dynabeads或在OKT3包被的多孔板上激活TIL 24小时，在此之后该TIL用组成型mbIL15(OT-IL15-292)或GFP(OT-EGFP-001)慢病毒载体转导或作为未工程化条件而未被修饰。转导后24小时，将TIL用K562-IL21-41BBL饲养细胞(2:1的饲养细胞:TIL比率)在GREX6M孔板(Wils on Wolf)中扩增，该GREX 6M孔板中具有添加到未工程化TIL以及实验“+IL2”条件中的6000IU/mL I-2。使细胞在GREX板中生长12天以进行“快速扩增方案”或REP，并根据需要添加或替换培养基。在转导后第5、8和12天，将每个GREX孔重悬。取等分试样，以用于使用抗体CD3-BUV395(BD)、CD56-BV711(Biolegend)、CD4-BV 605(Biolegend)、CD8-AlexaFluor 700(Biolegend)、IL15-DyL650(L akePharma，内部缀合)、IL15RaFc-Biotin(ACROBiosystems)与二级链霉亲和素-BV421(Biolegend)和可固定生存力染料eFluor 780(Thermo Fisher)进行流式细胞术染色，以如实施例3中所述的那样量化IL15+或GFP+细胞的数目。表达GFP的TIL需要外源性IL2才能在R EP中扩增，而表达组成型mb-IL15的TIL在不存在IL2的情况下扩增(图3A)。

实施例5.抗原非依赖性环境中的扩增和存活

接下来，评估REP后TIL在体外抗原非依赖性存活测定的背景下持续存在或扩增的能力。REP扩增12天后，将在不存在细胞因子的情况下扩增的经mbIL15转导的细胞和在存在6000IU/mL IL2的情况下扩增的GFP细胞去珠粒、洗涤并且在不存在细胞因子的情况下静置过夜。第二天，将TIL在添加有或未添加有IL2(6000IU/mL，Peprotech)的TIL培养基中以5x10⁵个细胞/孔接种在48孔板中。每两天分裂细胞或加入培养基，总持续时间为10天。每两天还取等分试样进行流式细胞术染色，并如实施例3所述的那样定量IL15+或GFP+细胞的数目。组成型mbIL15 TIL在14天存活测定期间在存在或不存在外源性IL2的情况下都扩增，而GFP TIL需要IL2进行扩增(图3B)。

在一项包括表达调节型mbIL15的TIL的新研究中，如上文实施例1-3所述的那样产生TIL和饲养细胞。简而言之，在REP前培养中3周后，将冷冻保存的TIL解冻并且在存在6000IU/mL人IL2的情况下静置过夜。然后用抗CD3/CD28 Dynabeads或在OKT3包被的多孔板上激活TIL 24小时，在此之后该TIL用组成型mbIL15(OT-IL15-292)或调节型mbIL15(OT-IL15-293)慢病毒载体转导或未被工程化。转导后24小时，将TIL用K562-IL21-41BBL饲养细胞(5:1的饲养细胞:TIL比率)在GREX 6M孔板(Wilson Wolf)中扩增，该GREX 6M孔板中具有添加到UT TIL中的6000IU/mL IL2，以及添加到mbIL15 TIL中的25μM乙酰唑胺(SelleckChem)。扩增14天后，将TIL分离并且在添加有或未添加有IL2(200IU/mL，Peprotech)或乙酰唑胺(25μM，SelleckChem)的TIL培养基中以5x 10⁵个细胞/孔接种在多孔板中。收获整个孔以用于通过细胞计数(Celleca细胞计数器，Nexelom)分析细胞扩增以及通过流式细胞术(BD Fortessa)分析表型，并且每3天加入新鲜的细胞因子/配体。如4图所示，在此测定的15天过程中，未工程化TIL在不存在任何外源性细胞因子的情况下不会扩增(扩增0.07±0.03倍)，但在存在外源性IL2(200IU/mL)的情况下能够扩增高于20倍(扩增27.8±0.25倍)。相比之下，经修饰的TIL在未添加任何外源性细胞因子的情况下显著扩增；15天后，组成型mbIL15 TIL扩增八倍(扩增8.28±1.9倍)，并且被给予了25μM乙酰唑胺的调节型mbIL15 TIL扩增十七倍(扩增17.3±0.82倍)。在未添加乙酰唑胺的情况下调节型mbIL15 TIL的扩增比在存在配体的情况下的扩增低四倍(扩增4.52±0.48倍)，这突出了乙酰唑胺在调节调节型mbIL15 TIL的存活中的作用。

实施例6.抗原依赖性环境中的扩增和存活

如上文实施例1-3中所述的那样产生TIL和饲养细胞。简而言之，在REP前培养中3周后，将冷冻保存的TIL解冻并且在存在6000IU/mL人IL2的情况下静置过夜。然后用抗CD3/CD28 Dynabeads或在OKT3包被的多孔板上激活TIL 24小时，在此之后该TIL用调节型mbIL15(OT-IL15-293)慢病毒载体转导或未被工程化。转导后24小时，将TIL用K562-IL21-41BBL饲养细胞(5:1的饲养细胞:TIL比率)在GREX 6M孔板(Wilson Wolf)中扩增，该GREX6M孔板中具有添加到UT TIL中的6000IU/mL IL2，以及添加到调节型mbIL15 TIL中的25μM乙酰唑胺(SelleckChem)。扩增14天后，将TIL冷冻保存在Bambanker冷冻培养基(BulldogBio)中。在较晚的时候，将冷冻保存的TIL解冻并且在具有200IU/mL IL2的TIL培养基(未工程化TIL)或具有25μM乙酰唑胺的TIL培养基(调节型mbIL15 TIL)中静置。静置过夜后，在TIL:肿瘤共培养测定中将TIL以1:1的比率与经丝裂霉素C处理的黑色素瘤细胞一起在添加有或未添加有IL2(200IU/mL，Peprotech)或乙酰唑胺(25μM，SelleckChem)的TIL培养基中接种在多孔板中，并且该测定持续总共27天。包括乙酰唑胺的仅媒介物对照，将同一体积的DMSO添加到媒介物对照组中。黑色素瘤细胞来自用嘌呤霉素依赖性荧光素酶载体修饰的A375细胞系(ATCC)，并且如上(实施例3)所述用10μg/mL丝裂霉素C进行处理以防止这些肿瘤细胞增殖。每3天，混合此共培养测定的孔并分离出等分试样以用于通过细胞计数(Celleca细胞计数器，Nexelom)分析细胞扩增以及通过流式细胞术(BD Fortessa)分析表型。每3天添加在TIL培养基中的新鲜的经丝裂霉素C处理的A375黑色素瘤细胞以及新鲜的细胞因子/配体。如图5所示，用乙酰唑胺调节的调节型mbIL15 TIL建立了稳定的扩增动力学，并且即使在这种抗原依赖性环境中(其中慢性刺激应迅速耗尽TIL并减少细胞计数)，经转导的TIL仍然持续存在。在测定中，未工程化TIL在不存在任何外源性细胞因子的情况下不会扩增(从第1天到第27天扩增0.46±0.02倍)，但在存在外源性IL2(200IU/mL)的情况下能够扩增高于25倍(从第1天到第27天扩增25.4±4.06倍)。相比之下，经修饰的TIL在未添加任何外源性细胞因子的情况下扩增，并且明显地，在被给予了25μM乙酰唑胺的调节型mbIL15 TIL扩增12倍(从第1天到第27天扩增12.2±0.10倍)。在未添加乙酰唑胺(仅媒介物对照)的情况下，调节型mbIL15 TIL的扩增比在存在配体的情况下的扩增低四倍(从第1天到第27天扩增2.68±0.42倍)，这突出了乙酰唑胺在调节调节型mbIL15 TIL的存活中的作用。

实施例7.新鲜的REP后TIL的肿瘤反应性

如实施例1-3中所描述的那样产生来自两个黑素瘤供体的TIL。简而言之，在REP前培养中3周后，将冷冻保存的TIL解冻并且在存在6000IU/mL人IL2的情况下静置过夜。然后用抗CD3/CD28Dynabeads或在OKT3包被的多孔板上激活TIL 24小时，在此之后该TIL用调节型mbIL15(OT-IL15-293)慢病毒载体转导或未被工程化。转导后24小时，将TIL用K562-IL21-41BBL饲养细胞(5:1的饲养细胞:TIL比率)在GREX 6M孔板(Wilson Wolf)中扩增，该GREX 6M孔板中具有添加到未工程化TIL中的6000IU/mL IL2，以及添加到mbIL15 TIL中的25μM乙酰唑胺(SelleckChem)。扩增14天后，收获TIL，将其去珠粒并且在存在和不存在IL2和乙酰唑胺的情况下静置过夜。将表达荧光素酶的黑色素瘤细胞系A375-FLuc-Puro(ATCC)以5x 10⁶个细胞/mL重悬于TIL培养基中。向细胞中加入10μg/mL丝裂霉素-C，然后将细胞在37℃下孵育30分钟。然后将细胞用50mL TIL培养基洗涤3次。将每孔1x 10⁵个A375细胞添加到96孔平底组织培养物处理板中。在一些孔中，加入80μg/mL HLA-ABC(Biolegend)封闭性抗体以封闭靶细胞上的MHC I类。以1:1或3:1的TIL:A375比率添加过夜静置的TIL，每孔总体积为200μL。在48小时的时间点，保存每个孔中的上清液，并通过MSD测定IFNγ的浓度。按照制造商的方案，使用CellTiterGlo发光细胞生存力测定(Promega)分析肿瘤细胞的裂解。裂解百分比计算为共培养孔中的发光减去背景荧光除以仅A375对照孔中的发光减去背景荧光。用IL2培养的未经转导TIL和在不存在IL2的情况下在REP中扩增的调节型mbIL15 TIL在与A375黑色素瘤系共培养时都产生与单独TIL相比增加的IFNγ(图6A)。此外，在共培养条件下存在肿瘤细胞的特异性裂解，其由靶细胞系的发光的减少来度量(图6B)。特异性裂解百分比和IFNγ产量在与MHC I类封闭性抗体共培养条件下均降低，这表明TIL对该肿瘤细胞系的细胞毒性依赖于MHC I类。这个结果在两个黑色素瘤供体中重复出现。

实施例8.mbIL15 TIL在不存在IL2的情况下在体内长期持续存在

如上文实施例1-3中所述的那样产生来自一个供体的TIL和饲养细胞。简而言之，在REP前培养中3周后，将冷冻保存的TIL解冻并且在存在6000IU/mL人IL2的情况下静置过夜。然后用抗CD3/CD28 Dynabeads激活TIL 24小时，在此之后该TIL用组成型mbIL15(OT-IL15-292)或调节型mbIL15(OT-IL15-293)慢病毒载体转导或未被工程化。转导后24小时，将TIL用K562-IL21-41BBL饲养细胞(5:1的饲养细胞:TIL比率)在GREX 6M孔板(WilsonWolf)中扩增，该GREX 6M孔板中具有添加到未工程化TIL中的6000IU/mL IL2，以及添加到mbIL15 TIL中的25μM乙酰唑胺(SelleckChem)。扩增14天后，收获TIL，将其去珠粒并且对其作准备以用于过继细胞转移。未工程化TIL扩增612倍，组成型mbIL5 TIL扩增1080倍，并且调节型mbIL15 TIL扩增450倍(图7A)。

NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠购自Jackson Labor atories。在存在或不存在外源性IL2(Proleukin)，或临床级乙酰唑胺或媒介物的情况下，给6至8周龄的雌性小鼠全身输注10x 10⁶个T IL/小鼠，如表4中所述。

表4：体内组给药

在过继细胞疗法当天评估TIL的IL15表达，经组成型mbIL15转导的TIL表现出比经调节型mbIL15转导的TIL(23.6±1.1％IL15+IL15RaFc+)略高的mbIL15转导水平(30.2±0.46％IL15+IL15RaFc+)，但是这两个经转导的群体对于过继细胞转移都是可接受的(图7B)。通过流式细胞术评估IL15表达或转导效率；将细胞与Fc Block一起孵育，并首先用与DyL650缀合的IL15(Lake Pharma，内部缀合)和生物素化IL15RaFc(ACROBiosystems)染色。在室温下在黑暗中孵育25分钟后，将细胞在FACS缓冲液中洗涤、离心并重悬于含有与BV421(Biolegend)缀合的链霉亲和素的FACS缓冲液中。在4℃下在黑暗中孵育20分钟后，将细胞在FACS缓冲液中洗涤，离心，重悬于FA CS缓冲液中，并将样品在BD Fortessa流式细胞仪上运行。使用Flo wJo V10.7.1进行分析。

在过继细胞疗法后的第7、14、21、32、39、46和53天，经由下颌下静脉收集在含EDTA的管中分离75μL全身血液并对其进行加工以用于TIL计数。血液样品接受1-3mL的ACK裂解缓冲液(Gibco)，并且被孵育10-20分钟以裂解红细胞(RBC)。RBC裂解后，将样品通过70μm细胞过滤器过滤，离心并重悬于FACS缓冲液中。分离每个样品的等分试样以用于细胞计数的分析(Celleca细胞计数器，Nexelom)，并且其余部分被用于通过流式细胞术(BD Fortessa)进行表型评估。对于表型评估，将血液样品用对CD3(BD)、小鼠CD45、CD25(BD)、FoxP3、CD4、CD8、IL15(Lake Pharma，内部缀合)、KLRG1、CD127、CD45RA、CD45RO、CD95、CD69、CCR7、CD56和生物素化IL15RaFc(ACROBiosystems)特异性的抗体染色。将抗体与FITC、PE、PE-Cy5、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、DyL650、APC-Cy7、BUV395、BUV737、BV421、BV510、BV605、BV711或BV786(抗人抗体，全部来自Biolegend，除非另有标识)缀合。此外，所有样品均包含生存力染料(e780可固定生存力染料，Invitrogen)。将样品在BD Fortessa流式细胞仪上运行，并使用Flow Jo V10.7.1进行分析。为了在整个研究中计数TIL，将TIL作为活细胞，随后作为淋巴细胞，随后作为人CD3+和小鼠CD45-细胞进行门控。如图8A中可以看出，未工程化TIL在体内迅速下降，到输注后第53天达到检测不到的水平。接受外源性IL2的未工程化TIL表现得更好，但到输注后第53天持续存在率较低，其中量化的TIL为0.64±0.17％。相比之下，到输注后第53天，很明显经转导的TIL在全身上保持在可检测的水平，其中组成型mbI15 TIL为5.73±1.2％。并且调节型mbIL15 TIL+ACZ为10.2±2.0％。乙酰唑胺的体内调节作用很明显，因为到输注后第53天调节型mbIL15 TIL+媒介物几乎检测不到，为2.94±0.36％。

在过继细胞疗法后第14天和第53天，处死每实验组的5只动物的队列以进行最终收集。从这些动物中经由心脏穿刺收集200μL全身血液，分离脾脏，并且从1个股骨中提取骨髓。如上所述的那样加工血液。脾脏通过70μm细胞过滤器进行机械破坏，接受ACK裂解3分钟以裂解RBC，并且再次通过70μm细胞过滤器被收集。通过一个股骨冲洗骨髓(BM)，并通过70μm细胞过滤器收集该骨髓。分离每个经加工的组织悬浮液的等分试样以分析细胞计数(Celleca细胞计数器，Nexelom)，其余部分被用于通过流式细胞术(BD Fortessa)进行表型评估。对于表型评估，将样品用对CD3(BD)、小鼠CD45、CD25(BD)、FoxP3、CD4、CD8、IL15(LakePharma)、KLRG1、CD127、CD45RA、CD45RO、CD95、CD69、CCR7、CD56和生物素化IL15RaFc(ACROBiosystems)特异性的抗体染色。将抗体与FITC、PE、PE-Cy5、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、DyL650、APC-Cy7、BUV395、BUV737、BV421、BV510、BV605、BV711或BV786(抗人抗体，全部来自Biolegend，除非另有标识)缀合。此外，所有样品均包含生存力染料(e780可固定生存力染料，Invitrogen)。将样品在BD Fortessa流式细胞仪上运行，并使用Flow Jo V10.7.1进行分析。为了在整个研究中计数TIL，将TIL作为活细胞，随后作为淋巴细胞，随后作为人CD3+和小鼠CD45-细胞进行门控。如图8B和图8C所示，在输注后第14天和第53天，在外周淋巴器官中鉴定出高水平的经转导的TIL，并且经ACZ处理的调节型mbIL15 TIL表现出比它们的经媒介物处理的对应物显著更高的持续存在率(p<0.005)。

表5示出了本文所述的各种构建体的病毒载体序列。

表5：病毒载体序列

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实施例9.利用TIL逆转录病毒转染的快速扩增方案

与实施例1类似地制备REP前TIL。简言之，黑色素瘤和头颈部肿瘤样品获自合作人类组织网络。将肿瘤样品在Hanks平衡盐溶液(H BSS)缓冲液中切成1-3mm片段，并将片段以1-10个片段/烧瓶放置在Grex容器中的含有6000IU/mL IL2(Peprotech)、10ug.mL 41BB抗体(Creative BioLabs)、30ng/mL CD3抗体(OKT3，Biolegend)和0.1mg/mL Normocin(InvivoGen)的TIL培养基(补充有GlutaMAX(Th ermo Fisher)、1％青霉素/链霉素、1mM丙酮酸钠、1％HEPES、50μM 2-巯基乙醇(Invitrogen)和10％热灭活人AB血清(Valley Bio)的R PMI-1640)中。当确定营养物耗竭时，约每3-4天对容器进行常规喂食。这种培养方法被称为快速扩增方案前(REP前)。在REP前之后，将TIL等分，在细胞冷冻培养基(Bambanker，Bulldog Bio或Cryost or-10，STEMCELL Technologies)中冷冻，并在液氮中长期储存。

将这些REP前TIL解冻并且在具有6000IU/mL人IL2的TIL培养基中静置过夜。然后在包被有3ug/mL OKT3(Ultra-LEAF纯化抗人CD3抗体，Biolegend)和6000IU/mL人IL2的24孔板中激活TIL 24小时。使用RetroNectin(30μg/mL)在4℃下包被24孔非组织培养细胞培养板过夜。第二天，去除RetroNectin，用2％的在PBS中的牛血清白蛋白(BSA)封闭板，然后用PBS洗涤板。由稳定的生产细胞系制备长臂猿白血病病毒(GALV)假型γ逆转录病毒载体(其中mbIL15-CA2DRD表达处于衍生自鼠白血病病毒LTR的启动子的控制下)上清液。将逆转录病毒载体上清液在TIL培养基中稀释，并以每孔500μL的总体积加入，使MOI为约16-80。将含有病毒载体的板在32℃下以1400×g离心2小时，并然后去除上清液。去除上清液后，每孔转移1.0x 10⁶个激活的TIL和100IU/mL IL2，并在37℃下孵育过夜。细胞在未添加病毒的情况下被类似地加工，并用作阴性对照(“未工程化”)。转导后24小时，将5x 10⁵个TIL在每孔总共60mL TIL培养基(补充有GlutaMAX(Thermo Fisher)、1％青霉素/链霉素、1mM丙酮酸钠、1％HEPES、50μM 2-巯基乙醇(Invitrogen)和10％热灭活人AB血清(Valley Biomed)的RPMI-1640)中转移到6M GREX孔板(Wilson Wolf)的每个孔中。将经辐照的K562饲养细胞(用4-1BBL和mbIL21转导并在100Gy下辐照)或经辐照的PBMC饲养细胞(在25Gy下辐照)解冻并分别以50:1的K562:TIL比率或200:1的PBMC:TIL的比率加入到培养物中。用调节型mbIL15构建体转导的TIL接受25μM乙酰唑胺(SelleckChem)，而未经转导的TIL接受6000IU/mL IL2。使细胞在GREX板中生长14天以进行“快速扩增方案”或REP，并根据需要添加或替换培养基。

实施例10.经调节型mbIL15修饰的TIL：信号传导和多功能性

ACZ以剂量依赖性方式调节调节型mbIL15 TIL中的IL15表达和信号传导。

与实施例1-3和9的方法类似地制备REP前TIL，并且如实施例1-3和9所述的那样相应地产生未工程化TIL和mbIL15 TIL。IL15信号传导通路的参与导致包括转录因子蛋白STAT5和核糖体蛋白S6在内的下游信号转导蛋白的磷酸化。为了证明经ACZ调节的mbIL15表达导致调节型mbIL15 TIL中的IL15信号传导，如下采用基于磷酸化流式细胞术的测定：将从四个人类供体(患者1-4)获得的冷冻保存的调节型mbIL15 TIL解冻，然后在无ACZ培养基中静置24小时。接下来，在一系列浓度(包括0.1、1、2.5、5、10、25、100μM)的ACZ以及媒介物对照的存在下，将调节型mbIL15 TIL调节18小时。然后收集调节型mbIL15 TIL以进行染色和FACS分析。

简言之，使用针对CD3、CD4、CD8、IL15和活/死标记物的抗体对细胞进行染色。然后将细胞固定在2％甲醛(BD Cytofix)中，并使用基于甲醇的缓冲液(BD Phospho Perm IIIBuffer)透化，之后用对磷酸化STAT5(Biolegend)和S6(Cell Signaling Technology)特异性的抗体染色。在BD Symphony上获取细胞并使用FlowJo软件对该细胞进行分析。

随着ACZ浓度的增加，mbIL15的表达也增加，在约10-25μM的ACZ下达到稳定水平。图9A。类似地，pSTAT5和pS6的染色强度随着调节型mbIL15 TIL中ACZ浓度的更高(其指示IL15信号传导程度更高)而增加。这些结果表明ACZ和IL15表达与信号传导之间存在剂量依赖性关系。图9B-E和图10。

组成型mbIL15表达和调节型mbIL15 TIL的ACZ调节参与IL15信号传导通路

为了比较IL15表达的不同策略，使用组成型地表达mbIL15的TIL和调节型mbIL15TIL。将来自三个人类供体的冷冻保存的未工程化TIL、组成型mbIL15 TIL和调节型mbIL15TIL解冻，并然后在无ACZ培养基中静置24小时。接下来，如下将前述TIL在培养基中调节18小时：(1)将200IU/mL的IL2(Peprotech)添加到未工程化TIL中；以及(2)将25μM ACZ添加到调节型mbIL15 TIL培养物中。添加媒介物以控制条件。18小时处理后，使用针对CD3、CD4、CD8、IL15和活/死标记物的抗体对细胞进行染色。然后，将细胞固定在2％甲醛(BDCytofix)中，并使用基于甲醇的缓冲液(BD Phospho Perm III Buffer)透化，之后用对磷酸化STAT5(Biolegend)和S6(Cell Signaling Technology)特异的抗体染色。在BDFortessa上获取细胞并使用FlowJo软件对该细胞进行分析。

如图11所示，IL2与IL15共享重叠的信号传导通路，包括通过STAT5和S6的信号传导。与相应的媒介物条件相比，与IL2一起培养的未工程化TIL显示出信号传导通路的参与增加。图11。同样，与调节型mbIL15 TIL+媒介物对照相比，组成型mbIL15表达和调节型mbIL15 TIL+ACZ都显示出STAT5和S6的磷酸化增加。图11。

调节型mbIL15 TIL比未工程化TIL+IL2展现出更大的多功能性

多功能T细胞具有响应刺激同时产生多个效应分子的能力。此外，多功能性与T细胞功效相关。为了比较未工程化TIL与调节型mbIL15 TIL的多功能性，将冷冻保存的细胞解冻并且在不含IL2和ACZ的培养基中静置24小时。接下来，如下进行细胞的调节：在一系列浓度的IL2(20、200、1000和6000IU/mL，或媒介物)存在下将未工程化TIL调节18小时；在ACZ(0.1、1、5、10、25、100μM ACZ，或媒介物)存在下将调节型mbIL15 TIL调节18小时。然后，在布雷菲德菌素A(Biolegend)和莫能菌素(Life Technologies Corporation)存在下，用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)和离子霉素(Biolegend)刺激细胞6小时。使用未经刺激的未工程化TIL和未经刺激的调节型mbIL15 TIL作为对照。刺激后，收集细胞以进行染色和FACS分析。

简言之，使用针对CD3、CD4、CD8、IL15的抗体和生存力染料对细胞进行染色。然后，对细胞进行甲醛固定和透化(BD Cytofix/Cy toperm试剂盒)，然后使用针对TNFα和IFNγ的抗体(Biolegend)进行染色。在BD Fortessa上获取细胞并使用FlowJo软件对该细胞进行分析。对TNFα和IFNγ的表达呈双阳性的细胞被认为是多功能的。

如图12所示，虽然所有培养条件都含有一些多功能群体，但调节型mbIL15 TIL中的多功能性随着ACZ浓度的更高而增加。图12A、12B。此外，调节型mbIL15 TIL比来自同一供体的未工程化TIL+IL2更具多功能性。图12A、12C。表达mbIL15的调节型mbIL15 TIL的百分比也显示出与ACZ剂量的剂量响应关系。

实施例11.调节型IL15 TIL的体内功效

PDX163A功效

从获自肿瘤库(合作人类组织网络：CHTN)的新鲜原发性黑色素瘤样品(患者肿瘤编号M1200163A)创建患者来源的异种移植物(PDX)模型。使用NSG雌性小鼠(杰克逊实验室；目录号000557)建立小鼠模型。一旦建立了模型，就将冷冻保存的肿瘤切片无菌地植入到异氟烷麻醉的免疫受损小鼠(NSG雌性小鼠；杰克逊实验室；目录号000557)中。允许肿瘤生长到近似1000mm³-2000mm³，然后处死小鼠。无菌地收集肿瘤，将其切成约100mg切片，并然后植入到更大的小鼠队列中，允许该小鼠生长13天。13天后，测量肿瘤并将其随机分组(50mm³ -100mm³)到相应的治疗组中。第二天，静脉引入1000万(10M)个TIL。根据上面描述的快速扩增方案(REP)产生TIL。

治疗组如下：(1)用IL2给药的未工程化TIL；和(2)用乙酰唑胺(ACZ)给药的调节型mbIL15 TIL。对接受未工程化TIL的小鼠每天两次给药50,000国际单位(IU)的IL2，持续5天。在整个研究中，用调节型mbIL15 TIL治疗的小鼠每天接受媒介物或200mg/kg乙酰唑胺(ACZ)。每周两次收集肿瘤和体重。

图13显示了患者来源的异种移植物(PDX)模型的结果。在快速扩增方案(REP)结束时，将未工程化TIL和调节型mbIL15 TIL(+/-乙酰唑胺(ACZ))过继转移到荷有人黑色素瘤PDX的小鼠中。评价平均肿瘤体积(+/-SEM)。图13A示出过继细胞转移(ACT)后几天给定治疗的平均肿瘤体积。图13B示出ACT后几天无TIL(左上)；未工程化TIL+IL2(右上)；调节型mbIL15 TIL+媒介物(左下)；和调节型mbIL15TIL+ACZ(右下)的肿瘤体积。如图13所示，调节型mbIL15 TIL+ACZ表现出与未工程化TIL+IL2相比显著优越的抗肿瘤功效。

SK-MEL-1功效

创建了SK-MEL-1异种移植癌症模型来评价本发明的调节型mbIL15 TIL。使用从患有广泛且快速进展的恶性黑色素瘤(ATCC目录号HTB-67)的患者的胸导管获得的细胞创建模型。NSG雌性小鼠(杰克逊实验室；目录号000557)是用于接受癌细胞的小鼠。简而言之，将低传代细胞解冻并使其生长到维持能生存的亚汇合培养物的规模。在注射当天，对细胞进行计数，将其洗涤并以30x10⁶个细胞/mL的浓度重悬于无菌PBS中(3⁶个细胞/100μL注射)。每只小鼠接受使用含有27号¹/₂英寸针头的BD结核菌素注射器在剃光的右胁腹皮下注射的100μL细胞。允许肿瘤生长9天，然后对其进行测量并将其随机分组(50mm³–100mm³)到它们相应的治疗组中。第二天，静脉引入1000万(10M)个TIL。根据上面描述的快速扩增方案(REP)产生TIL。

图14示出了SK-MEL-1异种移植癌症模型的结果。在快速扩增方案(REP)结束时，将未工程化TIL和调节型mbIL15 TIL(+/-乙酰唑胺(ACZ))过继转移到荷有SK-MEL-1肿瘤的小鼠中。评价平均肿瘤体积(+/-SEM)。图14A示出过继细胞转移(ACT)后几天给定治疗的平均肿瘤体积。图14B示出ACT后几天无TIL(左上)；未工程化TIL+IL2(右上)；调节型mbIL15 TIL+媒介物(左下)；和调节型mbIL15TIL+ACZ(右下)的肿瘤体积。如图14所示，结果表明，调节型mbIL15TIL+ACZ表现出与未工程化TIL+IL2相比显著优越的抗肿瘤功效。

实施例12.调节型mbIL15 TIL的体外细胞毒性

与实施例1-3和9的方法类似地制备REP前TIL，并且根据实施例1-3和9的方法产生未工程化TIL和mbIL15 TIL。为了评价调节型mbIL15 TIL的抗肿瘤细胞毒性潜力，使用HLA匹配的肿瘤细胞系SK-MEL-1(ATCC)和六种不同的患者TIL样品进行肿瘤-TIL共培养测定。也使用PDX细胞建立了同一的实验。被评价的患者TIL样品是经扩增的未工程化TIL，或经扩增的调节型mbIL15 TIL。根据上述REP方案(实施例1-9)创建调节型mbIL15 TIL，然后将其冷冻保存。然后将来自六名患者的未工程化TIL和调节型mbIL15 TIL解冻，计数，并且在补充有以下中的任一者的培养基中以7.5x 10⁵个细胞/mL的细胞密度静置24小时：用于未工程化TIL的+/-6000IU/mL IL2，或媒介物(DMSO)；或用于调节型mbIL15 TIL的25μM ACZ。第二天，根据制造商的方案，从体外培养物中收获HLA匹配的SK-MEL-1细胞，并且将该细胞用Cell Trace Far Red标记。此外，从新鲜或冷冻保存的块中获得PDX细胞，并根据制造商的方案用Gentle MACs(Miltenyi)消化该细胞。

然后将TIL以5:1和1:1(TIL效应物:肿瘤靶标)比率与标记的黑色素瘤细胞一起在上面列出的相同的经补充(supplemented)的IL2或ACZ条件下在存在或不存在MHC I类封闭性试剂的情况下共培养(肿瘤细胞单独与80μg/mL抗人HLAABC一起培养2小时，之后与TIL一起共培养)。包括单独未标记和标记的黑色素瘤细胞的额外对照，以评估共培养系统中的背景半胱天冬酶-3活性。将这种TIL-肿瘤细胞共培养物孵育3小时，然后将细胞固定，透化并且针对细胞内裂解的半胱天冬酶-3(肿瘤细胞内不可逆地致力于细胞死亡的标记物)进行染色。

在BD Fortessa流式细胞仪上采集样品，使用Flow Jo V10.7.1进行分析，其中细胞毒性由活的Cell Trace Far Red阳性细胞群体内裂解的半胱天冬酶-3的染色呈阳性的细胞的百分比(减去背景半胱天冬酶-3阳性)来确定。

如图15所示，在这种对TIL肿瘤对的抗肿瘤细胞毒性的评估中，与未工程化TIL+IL2相比，调节型mbIL15 TIL在所有6个供体中表现出优越的抗肿瘤细胞毒性活性。图15。

实施例13：用不同饲养细胞产生未工程化TIL和mbIL15 TIL

如实施例1和9中所述的那样制备从肿瘤样品产生的REP前TIL。将REP前TIL解冻并且在具有6000IU/mL人IL2(Peprotech)的TIL培养基(补充有GlutaMAX(Thermo Fisher)、1％ HEPES、50μM2-巯基乙醇(Invitrogen)和10％热灭活人AB血清(Valley Bio)的RPMI-1640)中静置48小时。然后将TIL在包被有3μg/抗CD3(OKT3，Miltenyi Biotec)和6000IU/mL可溶性人IL2的24孔NUNC板中激活24小时。使用RetroNectin(30μg/mL)在4℃下包被24孔非包被细胞培养板过夜。第二天，去除RetroNectin，用2.5％的在PBS中的人血清白蛋白(HSA)封闭板，然后用PBS洗涤板。将如实施例9中所述的那样制备的BaEV假型慢病毒上清液在TIL培养基中稀释并加入到每个孔中以达到0.01-0.6的MOI。将含有病毒载体的板在32℃下以1400g离心2小时，然后去除上清液。去除上清液后，每孔转移1x 10⁶个激活的TIL和0-100IU/mL IL2，并在37℃下孵育过夜。在TIL培养基中未添加病毒的情况下对细胞进行类似加工，并且将该细胞用作阴性对照(“未工程化”)。转导后24小时，将TIL转移到6M GREX烧瓶(Wilson Wolf)中共40mL TIL REP培养基(如上所述的50％TIL培养基，50％AIM-V培养基(Gibco))中。将增殖受损的(经辐照或经丝裂霉素C处理的)饲养细胞(汇集的PBMC、未经修饰的K562饲养细胞、被修饰成表达膜结合IL21的K562、被修饰成表达41BBL的K562、被修饰成表达41BBL和膜结合IL21的K562)以50:1的K562与TIL比率加入到培养物中。指定接受外源性IL21的组被给予50ng/mL重组人IL21。用调节型mbIL15构建体转导的TIL接受25μM乙酰唑胺(Hikma)，并且未工程化TIL接受3000IU/mL IL2。使细胞在GREX板中生长14天以进行“快速扩增方案”或REP，并根据需要添加培养基。

REP中TIL扩增的评价

在扩增期间定期地将每个GREX孔重悬并充分混合，并取等分试样以用于使用吖啶橙/碘化丙啶生存力染料(Cellaca细胞计数器，Nexcelom)和流式细胞术染色进行细胞计数。使用抗体CD3-BUV395(BD)、CD56-BV711(Biolegend)、CD4-BV605(Biolegend)、CD8-Alexa Fluor 700(Biolegend)、IL15RaFc-Biotin(ACRO Biosystems)与二级链霉亲和素-BV421(Biolegend)和可固定生存力染料eFluor 780(Thermo Fisher)对样品进行染色。在BD Symphony流式细胞仪上运行样品，并使用Flow Jo V10.7.1进行分析。

通过在整个REP的特定时间点获得能生存的总细胞计数来确定总TIL扩增。图16显示对于mbIL15 TIL，使用K562饲养细胞并接受IL-21和41BBL介导的共刺激导致REP和PBMC饲养细胞以及不具有41BBL的K562饲养细胞中的最大细胞扩增仅支持REP中次优水平的TIL扩增。相比之下，尽管未工程化TIL在使用任何所述饲养细胞时在存在IL2的情况下都得到扩增，但PBMC饲养细胞促进了REP中未工程化TIL的最大扩增。

IL15表达由活的CD3阳性CD56阴性细胞群体内BV421-链霉亲和素的染色呈阳性的细胞百分比确定。在用K562饲养细胞产生并接受IL-21和41BBL介导的共刺激的mbIL15 TIL中，mbIL15+TIL的频率通过REP方法增加，这表明经mbIL15转导的子集在工程化TIL细胞培养物中富集(图18)。同样，当使用K562饲养细胞在存在IL-21和41BBL介导的共刺激的情况下产生组成型或调节型mbIL15+TIL时，REP中mbIL15+TIL发生最大扩增(图19)。

CD4:CD8比率由(活的CD3阳性CD56阴性细胞中的)CD4染色呈阳性的细胞的百分比与(活的CD3阳性CD56阴性细胞中的)CD8染色呈阳性的细胞的百分比的比率来确定。用K562饲养细胞产生并接受IL-21和41BBL介导的共刺激的经扩增的mbIL15 TIL富集CD8+细胞毒性效应细胞，如由它们在整个REP中CD4:CD8比率降低所指示的(图20)。相比之下，用汇集的PBMC饲养细胞、未经修饰的K562饲养细胞或单独表达41BBL的K562饲养细胞产生的mbIL15TIL的CD4:CD8比率在REP期间没有降低。

为了评价多功能性，按照制造商的方案，将REP结束时的未工程化TIL和mbIL15TIL与Immunocult CD3/CD28刺激物(Stem Cel l Technologies)在96孔组织培养物处理的圆底板中共培养。孵育1小时后，加入1000x转运抑制剂(来自eBiosciences的Monensin、来自B iolegend的布雷菲德菌素A)，并将共培养物在37℃下再孵育5小时。孵育后，使用上面描述的抗体对样品进行染色，然后使用Cytofix/Cy toperm试剂(BD Biosciences)对该样品进行固定和透化。使用针对IL2-BV737(BD)、IFNγ-FITC(Biolegend)、穿孔素-PerCPCy5.5(Biolegen d)、TNFα-PECF594(Biolegend)、颗粒酶B-Alexa Fluor 700(Biolegen d)的抗体进行细胞内染色。在BD Symphony流式细胞仪上运行样品，并使用FlowJo V10.7.1进行分析。多功能性被确定为活淋巴细胞中TNFα和IFNγ双阳性细胞的百分比。与用PBMC饲养细胞或未经修饰的K562饲养细胞产生的mbIL15 TIL相比，用表达膜结合IL-21和41BBL的K562饲养细胞产生的mbIL15 TIL在REP结束时表现出增强的多功能性(图21)。

抗原非依赖性存活测定中体外TIL持续存在率的评价

在抗原非依赖性存活测定中评估了REP后TIL的体外持续存在率。在REP结束时，将未工程化TIL和mbIL15 TIL在无补充物(supplement-free)条件下静置24小时。第二天，将未工程化细胞在不具有细胞因子支持物(cytokine support)或具有6000IU/mL IL2的24孔GREX板中以1x 10⁶个细胞/孔一式两份培养，并且将mbIL15 TIL以相同的密度与25μM ACZ或同一的体积的媒介物(DMSO)一起培养。在第0天，每孔取样100μL以进行如上所述通过细胞计数和用抗体染色执行的TIL计数和表型表征。在第4天，重悬细胞，去除500μL细胞，并向每个孔中加入500μL培养基+处理剂(treatment)以使培养体积达到1000μL。在第6天，重悬细胞，取样100μL等分试样并进行表型分析，去除400μL细胞，并向每个孔中加入500μL培养基+处理剂以使培养体积达到1000μL。在第8天，重悬细胞，去除500μL细胞，并向每个孔中加入500μL培养基+处理剂以使培养体积达到1000μL。在第10天，重悬细胞，取样100μL等分试样并进行表型分析，然后终止培养。在BD Symphony流式细胞仪上运行样品，并使用Flow JoV10.7.1进行分析。与用PBMC饲养细胞或未经修饰或独立表达mbIL-21和41BBL的K562饲养细胞产生的mbIL15 TIL相比，用K562饲养细胞产生并接受IL-21和41BBL介导的共刺激的经扩增的mbIL15 TIL在10天存活测定中表现出更高的持续存在率(图22)。

TCR多样性评估

为了测量TCRVβ亚家族多样性，按照制造商的方案，使用Beta Mark TCR Vbeta库试剂盒(Beckman Coulter)对REP结束时的未工程化TIL和mbIL15 TIL进行流式细胞术染色。在BD Symphony流式细胞仪上运行样品并使用Flow Jo V10.7.1进行分析，并通过评价每个亚家族的阳性百分比并将数据显示为所有覆盖的亚家族的总和来评估TCRVβ亚家族分布。无论用于在REP中扩增的饲养细胞如何，未工程化和mbIL15 TIL都维持了多样化的TCRVβ亚家族分布(图23)。

在具有41BBL和IL21介导的信号传导的mbIL15 TIL中的PD1表达

为评价TIL耗尽水平，确定PD1表达。使用抗体CD3-BUV395(BD)、CD56-BV711(Biolegend)、CD4-BV605(Biolegend)、CD8-Alexa Fluor 700(Biolegend)、PD1-PECy7(Biolegend)、CD25-BUV737(Biolegend)、IL15RaFc-Biotin(ACRO Biosystems)与二级链霉亲和素-BV421(Biolegend)和可固定生存力染料eFluor 780(Thermo Fisher)对样品进行染色。对于细胞内染色，首先用上面列出的表面抗体对细胞进行染色，然后使用BDCytofix/Cytoperm制造商的方案固定并透化细胞。然后使用抗体FoxP3-FITC(Biolegend)对经透化细胞进行染色，并在BD Symphony流式细胞仪上运行样品并使用Flow Jo V10.7.1进行分析。PD1表达由活的CD3阳性CD56阴性细胞群体内PD1染色呈阳性的细胞百分比确定。如图25所示，PD1表达在未经扩增的mbIL15 TIL中最高，并且具有41BBL和IL21介导的信号传导的mbIL15 TIL的扩增产生具有接近基线的PD1表达的TIL。

实施例14：在工程化和扩增期间mbIL15 TIL的表型与REP前TIL相比的变化(CD8+、CD4+、PD1+和调节性T细胞的频率)

进行表型分析以比较REP前TIL(如实施例1所述)与工程化mbIL15 TIL(如实施例3所述)。如实施例13所述，使用针对CD3、CD4、CD8和PD1的抗体通过流式细胞术对REP前和REP后TIL进行表型分析。如图25A所示，与来自相同TIL供体的相应REP前TIL相比，REP后mbIL15TIL的CD8+T细胞频率更高，以及CD4+T细胞频率更低，这与来自实施例13的图20中所示的结果一致。如实施例13中所讨论和评价的，CD8+T细胞的这种增加反映了细胞毒性效应细胞的增加。同样，如图25B所示，REP后mbIL15 TIL表达的PD1水平低于来自相同TIL供体的相应REP前TIL，这与来自实施例13的图24中所示的结果一致。

为了检测TIL的经扩增群体中的调节性T细胞(T_reg细胞)，使用抗体CD3-BUV395(BD)、CD56-BV711(Biolegend)、CD4-BV605(Biol egend)、CD8-Alexa Fluor 700(Biolegend)、PD1-PECy7(Biolegend)、CD25-BUV737(Biologend)、IL15RaFc-Biotin(ACROBiosystems)与二级链霉亲和素-BV421(Biolegend)和可固定生存力染料eFluor 780(Thermo Fisher)对样品进行染色。对于细胞内染色，首先用上面列出的表面抗体对细胞进行染色，然后使用BD Cytofix/Cytoperm制造商的方案固定并透化细胞。然后使用抗体FoxP3-FITC(Biolegend)对经透化细胞进行染色，并在BD Fortessa流式细胞仪上运行样品并使用Flo w Jo V10.7.1进行分析。调节性T细胞被鉴定为CD3+T细胞，其作为CD4+被门控，并且进一步被分类为CD25和FoxP3双阳性细胞。如图25C所示，在工程化步骤之前，与REP前TIL相比，经扩增的mbIL15 TIL具有降低比例的调节性T细胞。

实施例15：患者来源的异种移植物(PDX)模型和使用工程化TIL进行的治疗

建立患者来源的异种移植物(PDX)模型

如实施例11所述，从肿瘤库获得的新鲜原发性黑色素瘤样品创建患者来源的异种移植物(PDX)模型(PDX163A)。一旦建立了模型，就将冷冻保存的肿瘤切片无菌植入到异氟烷麻醉的免疫受损的小鼠中。肿瘤生长到近似1000mm³ -2000mm³时被安乐死，并且将肿瘤连续传代到后续动物中以维持PDX肿瘤生长并建立动物队列进行功效研究(如下所述)。

还使用流式细胞术评估了从荷瘤动物切除的PDX163A肿瘤的共有黑色素瘤肿瘤抗原的表达。为了评价黑色素瘤细胞上保守的黑色素瘤抗原水平，通过流式细胞术测定本文所述的黑色素瘤细胞系A375和黑色素瘤PDX。新鲜获得或从冷冻保存获得来自如实施例11所述的黑色素瘤PDX的肿瘤块，并且将该肿瘤块根据制造商的方案用GentleMAC(Miltenyi)消化，以便获得能生存的单细胞悬浮液。将样品用Fc封闭性试剂封闭，并且使用针对MART-1(Biolegend)、gp100(Biolegend)的抗体和可固定生存力染料eFluor 780(Thermo Fisher)染色。在BD Symphony流式细胞仪上运行样品，并使用Flow Jo V10.7.1进行分析。表达黑色素瘤相关抗原的肿瘤细胞的频率由活细胞群体内MART-1或gp100染色呈阳性的细胞百分比确定。图26显示保守的黑色素瘤相关抗原MART-1和gp100均在如本实施例(下文)所述选择用于TIL功效建模的PDX肿瘤上表达。

对用于同种异体功效建模的供体的选择

如实施例1-3或9所述的那样产生来自八个黑色素瘤供体的TIL。简而言之，在REP前培养中3周后，将冷冻保存的TIL解冻并且在存在6000IU/mL人IL2的情况下静置过夜。然后用抗CD3/CD28Dynabeads或在OKT3包被的多孔板上激活TIL 24小时，在此之后该TIL用调节型mbIL15载体转导或未被工程化。转导后24小时，将TIL用K562-IL21-41BBL饲养细胞在GREX 6M孔板(Wilson Wolf)中扩增，该GREX 6M孔板中具有添加到未工程化TIL中的6000IU/mL IL2，以及添加到mbIL15 TIL中的25μM乙酰唑胺(SelleckChem或Hikma)。扩增14天后，收获TIL，将其去珠粒并且在存在和不存在IL2和乙酰唑胺的情况下静置过夜。

使用四聚体染色确定哪些TIL供体对共有黑色素瘤抗原MART-1和gp100具有反应性。为了评价抗原反应性TIL的水平，进行了流式细胞术以检查四聚体反应细胞的频率。用Fc封闭性试剂封闭样品，并使用抗体CD3-BUV395(BD)、CD4-BV605(Biolegend)、CD8-Alex aFluor 700(Biolegend)、HLA-A2:01-MART-1四聚体(MBL Internati onal)、HLA-A2:01-gp100(MBL International)、IL15RaFc-Biotin(AC RO Biosystems)与二级链霉亲和素-BV421(Biolegend)和可固定生存力染料eFluor 780(Thermo Fisher)对样品进行染色。在BD Sympho ny流式细胞仪上运行样品，并使用Flow Jo V10.7.1进行分析。抗原反应性TIL的频率由活的CD3阳性CD8阳性细胞群体内两种四聚体中的每种四聚体的染色独立地呈阳性的细胞百分比确定。如图27所示，所有四个测试的供体都表现出对MART-1抗原的反应性，并且测试的四个供体中的三个表现出对gp100抗原的反应性。四聚体阳性群体表明TIL含有通过HLA:A2:01基因座对相应的黑色素瘤相关抗原具有反应性的细胞中的一部分。在图27中，在PDX功效研究中利用了用*表示的供体，如该实施例(下文)中所描绘。

新鲜获得或从冷冻保存获得来自如实施例11所述的黑色素瘤PDX的肿瘤块，并将肿瘤块根据制造商的方案用GentleMAC(Miltenyi)消化，以获得能生存的单细胞悬浮液。然后将PDX细胞以5x 10⁶个细胞/mL重悬于TIL培养基中。向细胞中加入10μg/mL丝裂霉素-C，然后将该细胞在37℃下孵育30分钟。然后将该细胞用50mL TIL培养基洗涤3次。将每孔1x10⁵个PDX细胞添加到96孔平底组织培养物处理的板中。在一些孔中，加入80μg/mL HLA-ABC(Biolegend)封闭性抗体以封闭靶细胞上的MHC I类。以1:1的TIL:PDX比率添加过夜静置的TIL，每孔总体积为200μL。作为阳性对照，将TIL与PMA/离子霉素以1:1000共培养，这将引发最大的IFNγ分泌。作为阴性对照，TIL在不存在任何额外试剂或细胞的情况下进行共培养，并被鉴定为“未经刺激的”TIL。在24小时的时间点，保存每个孔中的上清液，并通过MSD测定IFNγ的浓度。

图28显示TIL：肿瘤细胞共培养后的干扰素γ(IFNγ)产量可用于准确地预测对PDX肿瘤有反应的TIL供体。该体外测定表明，TIL供体006、39A和41A是响应于PDX产生最高量IFNγ的供体，这从而支持了它们作为供体来检查体内功效的候选资格，如该实施例(下文)中所描述。

使用患者来源的异种移植物(PDX)模型进行TIL功效研究

将来自PDx荷瘤小鼠的肿瘤(如上所述的那样被传代)无菌收集，切片成约100mg切片，并然后植入到更大的小鼠队列中，允许该小鼠生长13天，然后对该小鼠进行测量并且将其随机分组(50mm³至100mm³)到它们的相应的治疗组。第二天，静脉引入10M个TIL。接受未工程化TIL的小鼠每天被给予600,000国际单位(IU)IL2，持续4天。在整个研究中，接受mbIL15产品(其中mbIL15可操作地连接到CA2)的小鼠每天接受200mg/kg乙酰唑胺(ACZ)。每周两次收集肿瘤和体重。治疗范例如图29所示。如图30所示，与未工程化TIL+IL2相比，工程化TIL+ACZ表现出优越的抗肿瘤效果。此外，工程化TIL(特别是在ACZ存在下)显示出更好的肿瘤浸润(如图31A所示)和基质和肿瘤区室的数目更多(如图31B所示)。

序列表

<110> 黑曜石疗法公司(Obsidian Therapeutics, Inc.)

<120> 具有膜结合白细胞介素15的肿瘤浸润淋巴细胞及其用途

<130> 108407-1291325 (022WO1)

<150> 63/153,367

<151> 2021-02-24

<150> 63/139,305

<151> 2021-01-19

<150> 63/226,114

<151> 2021-07-27

<150> 63/244,166

<151> 2021-09-14

<160> 60

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 159

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(E. coli)

<400> 1

Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met

1 5 10 15

Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys

20 25 30

Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu

35 40 45

Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser

50 55 60

Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu

65 70 75 80

Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly

85 90 95

Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu

100 105 110

Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr

115 120 125

Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp

130 135 140

Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Cys Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg

145 150 155

<210> 2

<211> 187

<212> PRT

<213> 智人(Homo Sapiens)

<400> 2

Met Val Gly Ser Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly

1 5 10 15

Ile Gly Lys Asn Gly Asp Leu Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Phe

20 25 30

Arg Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln

35 40 45

Asn Leu Val Ile Met Gly Lys Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys

50 55 60

Asn Arg Pro Leu Lys Gly Arg Ile Asn Leu Val Leu Ser Arg Glu Leu

65 70 75 80

Lys Glu Pro Pro Gln Gly Ala His Phe Leu Ser Arg Ser Leu Asp Asp

85 90 95

Ala Leu Lys Leu Thr Glu Gln Pro Glu Leu Ala Asn Lys Val Asp Met

100 105 110

Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Lys Glu Ala Met Asn His

115 120 125

Pro Gly His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Asp Phe Glu

130 135 140

Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Glu Lys Tyr Lys Leu Leu

145 150 155 160

Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile

165 170 175

Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn Asp

180 185

<210> 3

<211> 3919

<212> DNA

<213> 智人(Homo Sapiens)

<400> 3

agtcccagac agaacctact atgtgcggcg gcagctgggg cgggaaggcg ggagctgggg 60

gcgctggggg cgctgcggcc gctgcggccg ctgcagccgc tgcagcgcca gggtccacct 120

ggtcggctgc acctgtggag gaggaggtgg atttcaggct tcccgtagac tggaagaatc 180

ggctcaaaac cgcttgcctc gcaggggctg agctggaggc agcgaggccg cccgacgcag 240

gcttccggcg agacatggca gggcaaggat ggcagcccgg cggcagggcc tggcgaggag 300

cgcgagcccg cggccgcagt tcccaggcgt ctgcgggcgc gagcacgccg cgaccctgcg 360

tgcgccgggg cgggggggcg gggcctcgcc tgcacaaatg gggacgaggg gggcggggcg 420

gccacaattt cgcgccaaac ttgaccgcgc gttctgctgt aacgagcggg ctcggaggtc 480

ctcccgctgc tgtcatggtt ggttcgctaa actgcatcgt cgctgtgtcc cagaacatgg 540

gcatcggcaa gaacggggac ctgccctggc caccgctcag gaatgaattc agatatttcc 600

agagaatgac cacaacctct tcagtagaag gtaaacagaa tctggtgatt atgggtaaga 660

agacctggtt ctccattcct gagaagaatc gacctttaaa gggtagaatt aatttagttc 720

tcagcagaga actcaaggaa cctccacaag gagctcattt tctttccaga agtctagatg 780

atgccttaaa acttactgaa caaccagaat tagcaaataa agtagacatg gtctggatag 840

ttggtggcag ttctgtttat aaggaagcca tgaatcaccc aggccatctt aaactatttg 900

tgacaaggat catgcaagac tttgaaagtg acacgttttt tccagaaatt gatttggaga 960

aatataaact tctgccagaa tacccaggtg ttctctctga tgtccaggag gagaaaggca 1020

ttaagtacaa atttgaagta tatgagaaga atgattaata tgaaggtgtt ttctagttta 1080

agttgttccc cctccctctg aaaaaagtat gtatttttac attagaaaag gttttttgtt 1140

gactttagat ctataattat ttctaagcaa ctagttttta ttccccacta ctcttgtctc 1200

tatcagatac catttatgag acattcttgc tataactaag tgcttctcca agaccccaac 1260

tgagtcccca gcacctgcta cagtgagctg ccattccaca cccatcacat gtggcactct 1320

tgccagtcct tgacattgtc gggcttttca catgttggta atatttatta aagatgaaga 1380

tccacatacc cttcaactga gcagtttcac tagtggaaat accaaaagct tcctacgtgt 1440

atatccagag gtttgtagat aaatgttgcc accttgtttg taacagtgaa aaattgaaaa 1500

caacctggaa gtccagtgat gggaaaatga gtatgtttct gtcttagatt ggggaaccca 1560

aagcagattg caagactgaa atttcagtga aagcagtgta tttgctaggt cataccagaa 1620

atcatcaatt gaggtacgga gaaactgaac tgagaaggta agaaaagcaa tttaaagtca 1680

gcgagcaggt tctcattgat aacaagctcc atactgctga gatacaggga aatggagggg 1740

ggaaagctgg agtattgatc ccgcccccct ccttggttgt cagctccctg tcctgtgtgt 1800

gggcggaaca tagtccagct gctctatagc aagtctcagg tgtttgcagt aagaagctgc 1860

tggcatgcac gggaacagtg aatgccaaac acttaaagca attcgatgtt taagtatgta 1920

agttcttttt tttttagaca gcgtttcgct cttgttgccc aggctagcat gcaatggtgt 1980

gacctcggct tactgcaacc tccgccttcc cagattcaag cgattctcct gcctcaggct 2040

cccaagtagc taggaccagg tgcgcgccac cacgcccggc taatttttgt attttgtatt 2100

tttagtagag atggggtttc accatgttgg tcaggctagt ctcgaactcg tgaccgcaag 2160

cgattcaccc acctcagcct cccaaagtgc tgggattacc ggcttgagcc accacacccg 2220

gcacatcttc attcttttta tgtagtaaaa agtataaggc cacacatggt ttatttgaag 2280

tattttataa tttaaaaaaa tacagaagca ggaaaaccaa ttataagttc aagtgaggga 2340

tgatggttgc ttgaaccaaa gggttgcatg tagtaagaaa ttgtgattta agatatattt 2400

taaagttata agtagcagga tattctgatg gagtttgact ttggttttgg gcccagggag 2460

tttcagatgc ctttgagaaa tgaatgaagt agagagaaaa taaaagaaaa accagccagg 2520

cacagtggct cacacctgta atcccagcgc tttgggaggc taaggcaggc agatcacttg 2580

agaccagctt gggcaacatg gcaaagcccc atctctacaa aaaacacaaa aattagctgg 2640

gcattgtggc gcacacctgt attcccatct agtcaggaag ctgagatgga agaattaatt 2700

gagcccacga gttcaaggct gcagtgagtc gtgattgtgc cactgcactc cagccggggt 2760

gacagaagag accttgtctc gaaaaggaat ctgaaaacaa tggaaccatg ccttcataat 2820

tctagaaagt tattttcaac tgataaatct atattcaccc aaataatcaa gggtgaaggt 2880

aaaataatac atttttagac aagcaaagac tcaggggtta cctccatgtg ccctttttag 2940

ggaagctgtt ggagaaaata ctccagcaaa atgaaggagt acacaaacca gagaatgaca 3000

tgaatccagc aaataggatc caacacaggc aatattccag ctatggagct agctttaaaa 3060

aggaacagta aaaatattaa tcggttagct gggtggaatg gcccatgcct gtagtcccag 3120

ctactcagga ggctcagcag caggacgact tgagcccaag agttccagac cagcctggcc 3180

accttagtga gatcccttct cttaaaaata ataacttatt gccagatttg gggcatttgg 3240

aaagaagttc attgaagata aagcaaaagt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa caaggggaaa 3300

gggttggtta ggcaatcatt ctagggcaga aagaagtaca ggataggaag agcataatac 3360

actgtttttc tcaacaagga gcagtatgta cacagtcata atgatgtgac tgcttagccc 3420

ctaaatatgg taactactct gggacaatat gggaggaaaa gtgaagattg tgatggtgta 3480

agagctaaat cctcatctgt catatccaga aatcactata taatatataa taatgaaatg 3540

actaagttat gtgaggaaaa aaacagaaga cattgctaaa agagttaaaa gtcattgctc 3600

tggagaatta ggagggatgg ggcaggggac tgttaggatg cattataaac tgaaaagcct 3660

ttttaaaatt ttatgtatta atatatgcat tcacttgaaa aactaaaaaa aaacaataat 3720

ttggaaaaac ccatgaaggt aactaacgga aggaaaaact aagagaatga aaagtatttg 3780

cctctggaaa gaacaactgg caggactgtt gttttcattg taagactttt ggagccattt 3840

aattgtactt aaccattttc atctatttct ttaataagaa caattccatc ttaataaaga 3900

gttacacttg ttaataagt 3919

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人(Homo Sapiens)

<400> 4

Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro

1 5 10 15

Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp

20 25 30

Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe

35 40 45

Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala

50 55 60

Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr

65 70 75 80

Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr

85 90 95

Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu

100 105

<210> 5

<211> 327

<212> PRT

<213> 智人(Homo Sapiens)

<400> 5

Met Glu Glu Thr Arg Glu Leu Gln Ser Leu Ala Ala Ala Val Val Pro

1 5 10 15

Ser Ala Gln Thr Leu Lys Ile Thr Asp Phe Ser Phe Ser Asp Phe Glu

20 25 30

Leu Ser Asp Leu Glu Thr Ala Leu Cys Thr Ile Arg Met Phe Thr Asp

35 40 45

Leu Asn Leu Val Gln Asn Phe Gln Met Lys His Glu Val Leu Cys Arg

50 55 60

Trp Ile Leu Ser Val Lys Lys Asn Tyr Arg Lys Asn Val Ala Tyr His

65 70 75 80

Asn Trp Arg His Ala Phe Asn Thr Ala Gln Cys Met Phe Ala Ala Leu

85 90 95

Lys Ala Gly Lys Ile Gln Asn Lys Leu Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala

100 105 110

Leu Leu Ile Ala Ala Leu Ser His Asp Leu Asp His Arg Gly Val Asn

115 120 125

Asn Ser Tyr Ile Gln Arg Ser Glu His Pro Leu Ala Gln Leu Tyr Cys

130 135 140

His Ser Ile Met Glu His His His Phe Asp Gln Cys Leu Met Ile Leu

145 150 155 160

Asn Ser Pro Gly Asn Gln Ile Leu Ser Gly Leu Ser Ile Glu Glu Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Leu Lys Ile Ile Lys Gln Ala Ile Leu Ala Thr Asp Leu

180 185 190

Ala Leu Tyr Ile Lys Arg Arg Gly Glu Phe Phe Glu Leu Ile Arg Lys

195 200 205

Asn Gln Phe Asn Leu Glu Asp Pro His Gln Lys Glu Leu Phe Leu Ala

210 215 220

Met Leu Met Thr Ala Cys Asp Leu Ser Ala Ile Thr Lys Pro Trp Pro

225 230 235 240

Ile Gln Gln Arg Ile Ala Glu Leu Val Ala Thr Glu Phe Phe Asp Gln

245 250 255

Gly Asp Arg Glu Arg Lys Glu Leu Asn Ile Glu Pro Thr Asp Leu Met

260 265 270

Asn Arg Glu Lys Lys Asn Lys Ile Pro Ser Met Gln Val Gly Phe Ile

275 280 285

Asp Ala Ile Cys Leu Gln Leu Tyr Glu Ala Leu Thr His Val Ser Glu

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Asp Cys Phe Pro Leu Leu Asp Gly Cys Arg Lys Asn Arg Gln Lys Trp

305 310 315 320

Gln Ala Leu Ala Glu Gln Gln

325

<210> 6

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<212> PRT

<213> 智人(Homo Sapiens)

<400> 6

Met Glu Arg Ala Gly Pro Ser Phe Gly Gln Gln Arg Gln Gln Gln Gln

1 5 10 15

Pro Gln Gln Gln Lys Gln Gln Gln Arg Asp Gln Asp Ser Val Glu Ala

20 25 30

Trp Leu Asp Asp His Trp Asp Phe Thr Phe Ser Tyr Phe Val Arg Lys

35 40 45

Ala Thr Arg Glu Met Val Asn Ala Trp Phe Ala Glu Arg Val His Thr

50 55 60

Ile Pro Val Cys Lys Glu Gly Ile Arg Gly His Thr Glu Ser Cys Ser

65 70 75 80

Cys Pro Leu Gln Gln Ser Pro Arg Ala Asp Asn Ser Ala Pro Gly Thr

85 90 95

Pro Thr Arg Lys Ile Ser Ala Ser Glu Phe Asp Arg Pro Leu Arg Pro

100 105 110

Ile Val Val Lys Asp Ser Glu Gly Thr Val Ser Phe Leu Ser Asp Ser

115 120 125

Glu Lys Lys Glu Gln Met Pro Leu Thr Pro Pro Arg Phe Asp His Asp

130 135 140

Glu Gly Asp Gln Cys Ser Arg Leu Leu Glu Leu Val Lys Asp Ile Ser

145 150 155 160

Ser His Leu Asp Val Thr Ala Leu Cys His Lys Ile Phe Leu His Ile

165 170 175

His Gly Leu Ile Ser Ala Asp Arg Tyr Ser Leu Phe Leu Val Cys Glu

180 185 190

Asp Ser Ser Asn Asp Lys Phe Leu Ile Ser Arg Leu Phe Asp Val Ala

195 200 205

Glu Gly Ser Thr Leu Glu Glu Val Ser Asn Asn Cys Ile Arg Leu Glu

210 215 220

Trp Asn Lys Gly Ile Val Gly His Val Ala Ala Leu Gly Glu Pro Leu

225 230 235 240

Asn Ile Lys Asp Ala Tyr Glu Asp Pro Arg Phe Asn Ala Glu Val Asp

245 250 255

Gln Ile Thr Gly Tyr Lys Thr Gln Ser Ile Leu Cys Met Pro Ile Lys

260 265 270

Asn His Arg Glu Glu Val Val Gly Val Ala Gln Ala Ile Asn Lys Lys

275 280 285

Ser Gly Asn Gly Gly Thr Phe Thr Glu Lys Asp Glu Lys Asp Phe Ala

290 295 300

Ala Tyr Leu Ala Phe Cys Gly Ile Val Leu His Asn Ala Gln Leu Tyr

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Glu Thr Ser Leu Leu Glu Asn Lys Arg Asn Gln Val Leu Leu Asp Leu

325 330 335

Ala Ser Leu Ile Phe Glu Glu Gln Gln Ser Leu Glu Val Ile Leu Lys

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Lys Ile Ala Ala Thr Ile Ile Ser Phe Met Gln Val Gln Lys Cys Thr

355 360 365

Ile Phe Ile Val Asp Glu Asp Cys Ser Asp Ser Phe Ser Ser Val Phe

370 375 380

His Met Glu Cys Glu Glu Leu Glu Lys Ser Ser Asp Thr Leu Thr Arg

385 390 395 400

Glu His Asp Ala Asn Lys Ile Asn Tyr Met Tyr Ala Gln Tyr Val Lys

405 410 415

Asn Thr Met Glu Pro Leu Asn Ile Pro Asp Val Ser Lys Asp Lys Arg

420 425 430

Phe Pro Trp Thr Thr Glu Asn Thr Gly Asn Val Asn Gln Gln Cys Ile

435 440 445

Arg Ser Leu Leu Cys Thr Pro Ile Lys Asn Gly Lys Lys Asn Lys Val

450 455 460

Ile Gly Val Cys Gln Leu Val Asn Lys Met Glu Glu Asn Thr Gly Lys

465 470 475 480

Val Lys Pro Phe Asn Arg Asn Asp Glu Gln Phe Leu Glu Ala Phe Val

485 490 495

Ile Phe Cys Gly Leu Gly Ile Gln Asn Thr Gln Met Tyr Glu Ala Val

500 505 510

Glu Arg Ala Met Ala Lys Gln Met Val Thr Leu Glu Val Leu Ser Tyr

515 520 525

His Ala Ser Ala Ala Glu Glu Glu Thr Arg Glu Leu Gln Ser Leu Ala

530 535 540

Ala Ala Val Val Pro Ser Ala Gln Thr Leu Lys Ile Thr Asp Phe Ser

545 550 555 560

Phe Ser Asp Phe Glu Leu Ser Asp Leu Glu Thr Ala Leu Cys Thr Ile

565 570 575

Arg Met Phe Thr Asp Leu Asn Leu Val Gln Asn Phe Gln Met Lys His

580 585 590

Glu Val Leu Cys Arg Trp Ile Leu Ser Val Lys Lys Asn Tyr Arg Lys

595 600 605

Asn Val Ala Tyr His Asn Trp Arg His Ala Phe Asn Thr Ala Gln Cys

610 615 620

Met Phe Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys Ile Gln Asn Lys Leu Thr Asp

625 630 635 640

Leu Glu Ile Leu Ala Leu Leu Ile Ala Ala Leu Ser His Asp Leu Asp

645 650 655

His Arg Gly Val Asn Asn Ser Tyr Ile Gln Arg Ser Glu His Pro Leu

660 665 670

Ala Gln Leu Tyr Cys His Ser Ile Met Glu His His His Phe Asp Gln

675 680 685

Cys Leu Met Ile Leu Asn Ser Pro Gly Asn Gln Ile Leu Ser Gly Leu

690 695 700

Ser Ile Glu Glu Tyr Lys Thr Thr Leu Lys Ile Ile Lys Gln Ala Ile

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Leu Ala Thr Asp Leu Ala Leu Tyr Ile Lys Arg Arg Gly Glu Phe Phe

725 730 735

Glu Leu Ile Arg Lys Asn Gln Phe Asn Leu Glu Asp Pro His Gln Lys

740 745 750

Glu Leu Phe Leu Ala Met Leu Met Thr Ala Cys Asp Leu Ser Ala Ile

755 760 765

Thr Lys Pro Trp Pro Ile Gln Gln Arg Ile Ala Glu Leu Val Ala Thr

770 775 780

Glu Phe Phe Asp Gln Gly Asp Arg Glu Arg Lys Glu Leu Asn Ile Glu

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Pro Thr Asp Leu Met Asn Arg Glu Lys Lys Asn Lys Ile Pro Ser Met

805 810 815

Gln Val Gly Phe Ile Asp Ala Ile Cys Leu Gln Leu Tyr Glu Ala Leu

820 825 830

Thr His Val Ser Glu Asp Cys Phe Pro Leu Leu Asp Gly Cys Arg Lys

835 840 845

Asn Arg Gln Lys Trp Gln Ala Leu Ala Glu Gln Gln Glu Lys Met Leu

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Ile Asn Gly Glu Ser Gly Gln Ala Lys Arg Asn

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<210> 7

<211> 260

<212> PRT

<213> 智人(Homo Sapiens)

<400> 7

Met Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp

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His Lys Asp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp

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Ile Asp Thr His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser

35 40 45

Val Ser Tyr Asp Gln Ala Thr Ser Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His

50 55 60

Ala Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys

65 70 75 80

Gly Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His

85 90 95

Trp Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys

100 105 110

Lys Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Thr Lys Tyr Gly

115 120 125

Asp Phe Gly Lys Ala Val Gln Gln Pro Asp Gly Leu Ala Val Leu Gly

130 135 140

Ile Phe Leu Lys Val Gly Ser Ala Lys Pro Gly Leu Gln Lys Val Val

145 150 155 160

Asp Val Leu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr

165 170 175

Asn Phe Asp Pro Arg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr

180 185 190

Tyr Pro Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp

195 200 205

Ile Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys

210 215 220

Phe Arg Lys Leu Asn Phe Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met

225 230 235 240

Val Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys

245 250 255

Ala Ser Phe Lys

260

<210> 8

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<212> DNA

<213> 智人(Homo Sapiens)

<400> 8

acacagtgca ggcgcccaag ccgccgccgc cagatcggtg ccgattcctg ccctgccccg 60

accgccagcg cgaccatgtc ccatcactgg gggtacggca aacacaacgg acctgagcac 120

tggcataagg acttccccat cccctgtctg tttcctatga tcaagcaact tccctgagga 180

tcctcaacaa tggtcatgct ttcaacgtgg agtttgatga ctctcaggac aaagcagtgc 240

tcaagggagg acccctggat ggcacttaca gattgattca gtttcacttt cactggggtt 300

cacttgatgg acaaggttca gagcatactg tggataaaaa gaaatatgct gcagaacttc 360

acttggttca ctggaacacc aaatatgggg attttgggaa agctgtgcag caacctgatg 420

gactggccgt tctaggtatt tttttgaagg ttggcagcgc taaaccgggc cttcagaaag 480

ttgttgatgt gctggattcc attaaaacaa agggcaagag tgctgacttc actaacttcg 540

atcctcgtgg cctccttcct gaatccttgg attactggac ctacccaggc tcactgacca 600

cccctcctct tctggaatgt gtgacctgga ttgtgctcaa ggaacccatc agcgtcagca 660

gcgagcaggt gttgaaattc cgtaaactta acttcaatgg ggagggtgaa cccgaagaac 720

tgatggtgga caactggcgc ccagctcagc cactgaagaa caggcaaatc aaagcttcct 780

tcaaataaga tggtcccata gtctgtatcc aaataatgaa tcttcgggtg tttcccttta 840

gctaagcaca gatctacctt ggtgatttgg accctggttg ctttgtgtct agttttctag 900

acccttcatc tcttacttga tagacttact aataaaatgt gaagactaga ccaattgtca 960

tgcttgacac aactgctgtg gctggttggt gctttgttta tggtagtagt ttttctgtaa 1020

cacagaatat aggataagaa ataagaataa agtaccttga ctttgttcac agcatgtagg 1080

gtgatgagca ctcacaattg ttgactaaaa tgctgctttt aaaacatagg aaagtagaat 1140

ggttgagtgc aaatccatag cacaagataa attgagctag ttaaggcaaa tcaggtaaaa 1200

tagtcatgat tctatgtaat gtaaaccaga aaaaataaat gttcatgatt tcaagatgtt 1260

atattaaaga aaaactttaa aaattattat atatttatag caaagttatc ttaaatatga 1320

attctgttgt aatttaatga cttttgaatt acagagatat aaatgaagta ttatctgtaa 1380

aaattgttat aattagagtt gtgatacaga gtatatttcc attcagacaa tatatcataa 1440

cttaataaat attgtatttt agatatattc tctaataaaa ttcagaattc ta 1492

<210> 9

<211> 595

<212> PRT

<213> 智人(Homo Sapiens)

<400> 9

Met Thr Met Thr Leu His Thr Lys Ala Ser Gly Met Ala Leu Leu His

1 5 10 15

Gln Ile Gln Gly Asn Glu Leu Glu Pro Leu Asn Arg Pro Gln Leu Lys

20 25 30

Ile Pro Leu Glu Arg Pro Leu Gly Glu Val Tyr Leu Asp Ser Ser Lys

35 40 45

Pro Ala Val Tyr Asn Tyr Pro Glu Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Asn Ala

50 55 60

Ala Ala Ala Ala Asn Ala Gln Val Tyr Gly Gln Thr Gly Leu Pro Tyr

65 70 75 80

Gly Pro Gly Ser Glu Ala Ala Ala Phe Gly Ser Asn Gly Leu Gly Gly

85 90 95

Phe Pro Pro Leu Asn Ser Val Ser Pro Ser Pro Leu Met Leu Leu His

100 105 110

Pro Pro Pro Gln Leu Ser Pro Phe Leu Gln Pro His Gly Gln Gln Val

115 120 125

Pro Tyr Tyr Leu Glu Asn Glu Pro Ser Gly Tyr Thr Val Arg Glu Ala

130 135 140

Gly Pro Pro Ala Phe Tyr Arg Pro Asn Ser Asp Asn Arg Arg Gln Gly

145 150 155 160

Gly Arg Glu Arg Leu Ala Ser Thr Asn Asp Lys Gly Ser Met Ala Met

165 170 175

Glu Ser Ala Lys Glu Thr Arg Tyr Cys Ala Val Cys Asn Asp Tyr Ala

180 185 190

Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser Cys Glu Gly Cys Lys Ala Phe

195 200 205

Phe Lys Arg Ser Ile Gln Gly His Asn Asp Tyr Met Cys Pro Ala Thr

210 215 220

Asn Gln Cys Thr Ile Asp Lys Asn Arg Arg Lys Ser Cys Gln Ala Cys

225 230 235 240

Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly Met Met Lys Gly Gly Ile Arg

245 250 255

Lys Asp Arg Arg Gly Gly Arg Met Leu Lys His Lys Arg Gln Arg Asp

260 265 270

Asp Gly Glu Gly Arg Gly Glu Val Gly Ser Ala Gly Asp Met Arg Ala

275 280 285

Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys Arg Ser Lys Lys Asn

290 295 300

Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu

305 310 315 320

Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro

325 330 335

Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg

340 345 350

Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val

355 360 365

Asp Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu

370 375 380

Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly

385 390 395 400

Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys

405 410 415

Cys Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser

420 425 430

Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu

435 440 445

Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser

450 455 460

Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp

465 470 475 480

Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr

485 490 495

Leu Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser

500 505 510

His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Gly Met Glu His Leu Tyr Ser Met

515 520 525

Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu

530 535 540

Asp Ala His Arg Leu His Ala Pro Thr Ser Arg Gly Gly Ala Ser Val

545 550 555 560

Glu Glu Thr Asp Gln Ser His Leu Ala Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ser

565 570 575

His Ser Leu Gln Lys Tyr Tyr Ile Thr Gly Glu Ala Glu Gly Phe Pro

580 585 590

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595

<210> 10

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 10

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Ser Gly Ala Arg Cys

20

<210> 11

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 11

atggacatgc gggtgcctgc acaacttctg ggcctgctgt tgttgtggct gtctggagcc 60

cggtgt 66

<210> 12

<211> 114

<212> PRT

<213> 智人(Homo Sapiens)

<400> 12

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1 5 10 15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

20 25 30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

35 40 45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

50 55 60

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65 70 75 80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

85 90 95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

100 105 110

Thr Ser

<210> 13

<211> 342

<212> DNA

<213> 智人(Homo Sapiens)

<400> 13

aattgggtaa atgttatcag tgatctcaag aagatagagg atctcatcca gtccatgcat 60

attgatgcca cgctgtacac agaaagcgat gtgcatccta gctgtaaggt gacagcgatg 120

aagtgttttc ttttggagct gcaggtaatt agtcttgagt ccggcgatgc cagcattcat 180

gataccgtag aaaacttgat tatcctggcc aacaattctc tgtcctcaaa cggaaacgta 240

accgagagcg gttgtaaaga atgtgaagaa ctggaagaaa agaacatcaa ggagtttctg 300

caatcattcg ttcacatcgt acaaatgttc ataaatacgt ca 342

<210> 14

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 14

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

20 25 30

<210> 15

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 15

ggatctggtt ctggttccgg aagtggatct ggttcagggt ccggtagtgg atctgggtca 60

ggaagtggaa gcggtagtgg gtctggatct 90

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 16

Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

1 5

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 17

aaacaagagc actttcctga taac 24

<210> 18

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(ARtificial SEquence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 18

Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe

1 5 10 15

Val Ile Cys Cys Leu

20

<210> 19

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 19

ctgttgccga gctgggcgat tacgcttatc agtgtaaacg gcatctttgt aatatgctgt 60

ctg 63

<210> 20

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 20

Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg

1 5 10 15

Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val

20 25

<210> 21

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 21

acctactgct tcgcaccaag gtgccgggag agaaggagaa atgaaagact gagaagggag 60

agcgtgagac ctgtg 75

<210> 22

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 22

Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Ala Arg Asn Glu Arg

1 5 10 15

Leu Arg Arg Glu Thr Val Arg Pro Val

20 25

<210> 23

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 23

acctactgct tcgcaccaag gtgccgggag agagcaagaa atgaaagact gagaagggag 60

accgtgagac ctgtg 75

<210> 24

<211> 2

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial SEquence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 24

Gly Ser

1

<210> 25

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 25

ggatcc 6

<210> 26

<211> 208

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 26

Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp His

1 5 10 15

Lys Asp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp Ile

20 25 30

Asp Thr His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser Val

35 40 45

Ser Tyr Asp Gln Ala Thr Ser Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His Ala

50 55 60

Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys Gly

65 70 75 80

Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His Trp

85 90 95

Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys Asp

100 105 110

Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr Asn Phe Asp Pro

115 120 125

Arg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr Tyr Pro Gly Ser

130 135 140

Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp Ile Val Leu Lys

145 150 155 160

Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys Phe Arg Lys Leu

165 170 175

Asn Phe Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met Val Asp Asn Trp

180 185 190

Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys Ala Ser Phe Lys

195 200 205

<210> 27

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 27

tcccatcact gggggtacgg caaacacaac ggacctgagc actggcataa ggacttcccc 60

attgccaagg gagagcgcca gtcccctgtt gacatcgaca ctcatacagc caagtatgac 120

ccttccctga agcccctgtc tgtttcctat gatcaagcaa cttccctgag aatcctcaac 180

aatggtcatg ctttcaacgt ggagtttgat gactctcagg acaaagcagt gctcaaggga 240

ggacccctgg atggcactta cagattgatt cagtttcact ttcactgggg ttcacttgat 300

ggacaaggtt cagagcatac tgtggataaa aagaaatatg ctgcagaact tcacttggtt 360

cactggaaca ccaaatatgg ggattttggg aaagctgtgc agcaacctga tggactggcc 420

gttctaggta tttttttgaa ggttggcagc gctaaaccgg gccatcagaa agttgttgat 480

gtgctggatt ccattaaaac aaagggcaag agtgctgact tcactaactt cgatcctcgt 540

ggcctccttc ctgaatccct ggattactgg acctacccag gctcactgac cacccctcct 600

cttctggaat gtgtgacctg gattgtgctc aaggaaccca tcagcgtcag cagcgagcag 660

gtgttgaaat tccgtaaact taacttcaat ggggagggtg aacccgaaga actgatggtg 720

gacaactggc gcccagctca gccactgaag aacaggcaaa tcaaagcttc cttcaaa 777

<210> 28

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 28

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys

20 25 30

Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr

35 40 45

Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys

50 55 60

Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser

65 70 75 80

Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu

85 90 95

Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu

100 105 110

Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile

115 120 125

Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

130 135 140

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

145 150 155 160

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Leu Leu

165 170 175

Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile

180 185 190

Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg

195 200 205

Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val Gly Ser

210 215 220

<210> 29

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 29

atggacatgc gggtgcctgc acaacttctg ggcctgctgt tgttgtggct gtctggagcc 60

cggtgtaatt gggtaaatgt tatcagtgat ctcaagaaga tagaggatct catccagtcc 120

atgcatattg atgccacgct gtacacagaa agcgatgtgc atcctagctg taaggtgaca 180

gcgatgaagt gttttctttt ggagctgcag gtaattagtc ttgagtccgg cgatgccagc 240

attcatgata ccgtagaaaa cttgattatc ctggccaaca attctctgtc ctcaaacgga 300

aacgtaaccg agagcggttg taaagaatgt gaagaactgg aagaaaagaa catcaaggag 360

tttctgcaat cattcgttca catcgtacaa atgttcataa atacgtcagg atctggttct 420

ggttccggaa gtggatctgg ttcagggtcc ggtagtggat ctgggtcagg aagtggaagc 480

ggtagtgggt ctggatctaa acaagagcac tttcctgata acctgttgcc gagctgggcg 540

attacgctta tcagtgtaaa cggcatcttt gtaatatgct gtctgaccta ctgcttcgca 600

ccaaggtgcc gggagagaag gagaaatgaa agactgagaa gggagagcgt gagacctgtg 660

ggatcc 666

<210> 30

<211> 430

<212> PRT

<213> 人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 30

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys

20 25 30

Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr

35 40 45

Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys

50 55 60

Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser

65 70 75 80

Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu

85 90 95

Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu

100 105 110

Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile

115 120 125

Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

130 135 140

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

145 150 155 160

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Leu Leu

165 170 175

Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile

180 185 190

Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg

195 200 205

Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val Gly Ser Ser His

210 215 220

His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp His Lys Asp

225 230 235 240

Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp Ile Asp Thr

245 250 255

His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser Val Ser Tyr

260 265 270

Asp Gln Ala Thr Ser Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His Ala Phe Asn

275 280 285

Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys Gly Gly Pro

290 295 300

Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His Trp Gly Ser

305 310 315 320

Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys Asp Ser Ile

325 330 335

Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr Asn Phe Asp Pro Arg Gly

340 345 350

Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr Tyr Pro Gly Ser Leu Thr

355 360 365

Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp Ile Val Leu Lys Glu Pro

370 375 380

Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys Phe Arg Lys Leu Asn Phe

385 390 395 400

Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met Val Asp Asn Trp Arg Pro

405 410 415

Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys Ala Ser Phe Lys

420 425 430

<210> 31

<211> 1443

<212> DNA

<213> 人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 31

atggacatgc gggtgcctgc acaacttctg ggcctgctgt tgttgtggct gtctggagcc 60

cggtgtaatt gggtaaatgt tatcagtgat ctcaagaaga tagaggatct catccagtcc 120

atgcatattg atgccacgct gtacacagaa agcgatgtgc atcctagctg taaggtgaca 180

gcgatgaagt gttttctttt ggagctgcag gtaattagtc ttgagtccgg cgatgccagc 240

attcatgata ccgtagaaaa cttgattatc ctggccaaca attctctgtc ctcaaacgga 300

aacgtaaccg agagcggttg taaagaatgt gaagaactgg aagaaaagaa catcaaggag 360

tttctgcaat cattcgttca catcgtacaa atgttcataa atacgtcagg atctggttct 420

ggttccggaa gtggatctgg ttcagggtcc ggtagtggat ctgggtcagg aagtggaagc 480

ggtagtgggt ctggatctaa acaagagcac tttcctgata acctgttgcc gagctgggcg 540

attacgctta tcagtgtaaa cggcatcttt gtaatatgct gtctgaccta ctgcttcgca 600

ccaaggtgcc gggagagaag gagaaatgaa agactgagaa gggagagcgt gagacctgtg 660

ggatcctccc atcactgggg gtacggcaaa cacaacggac ctgagcactg gcataaggac 720

ttccccattg ccaagggaga gcgccagtcc cctgttgaca tcgacactca tacagccaag 780

tatgaccctt ccctgaagcc cctgtctgtt tcctatgatc aagcaacttc cctgagaatc 840

ctcaacaatg gtcatgcttt caacgtggag tttgatgact ctcaggacaa agcagtgctc 900

aagggaggac ccctggatgg cacttacaga ttgattcagt ttcactttca ctggggttca 960

cttgatggac aaggttcaga gcatactgtg gataaaaaga aatatgctgc agaacttcac 1020

ttggttcact ggaacaccaa atatggggat tttgggaaag ctgtgcagca acctgatgga 1080

ctggccgttc taggtatttt tttgaaggtt ggcagcgcta aaccgggcca tcagaaagtt 1140

gttgatgtgc tggattccat taaaacaaag ggcaagagtg ctgacttcac taacttcgat 1200

cctcgtggcc tccttcctga atccctggat tactggacct acccaggctc actgaccacc 1260

cctcctcttc tggaatgtgt gacctggatt gtgctcaagg aacccatcag cgtcagcagc 1320

gagcaggtgt tgaaattccg taaacttaac ttcaatgggg agggtgaacc cgaagaactg 1380

atggtggaca actggcgccc agctcagcca ctgaagaaca ggcaaatcaa agcttccttc 1440

aaa 1443

<210> 32

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 32

atgtggctgc agtctctgct cctcttgggg actgtcgcct gttctatttc a 51

<210> 33

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 33

Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile

1 5 10 15

Ser

<210> 34

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 34

caaggacagg atcgacatat gattcggatg cgccaactga tagatatagt cgatcaactc 60

aagaattatg tgaatgactt ggtccctgag tttctgccgg ctccagagga cgttgaaaca 120

aactgtgaat ggtcagcgtt ttcatgtttt caaaaggcac agctcaagtc cgccaataca 180

ggcaataacg agcggattat aaatgtctca attaaaaagc tcaagcgcaa acccccttca 240

acgaatgctg gtcgccgcca gaaacacagg ttgacctgtc cctcctgtga ctcatacgag 300

aagaaacctc ccaaggaatt tctcgaacgc tttaagtcac tcttgcagaa gatgattcat 360

cagcacttga gtagccggac acatggttca gaggatagt 399

<210> 35

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 35

Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile

1 5 10 15

Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu

20 25 30

Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser

35 40 45

Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu

50 55 60

Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser

65 70 75 80

Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys

85 90 95

Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys

100 105 110

Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His

115 120 125

Gly Ser Glu Asp Ser

130

<210> 36

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 36

gagtctaagt atggcccacc gtgtcccccc tgccca 36

<210> 37

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 37

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 38

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 38

gcacctgagt tcctcggagg cccctctgta ttcctgtttc ccccaaagcc caaggatact 60

cttatgatct cacgcactcc ggaagtaacc tgcgtggtgg tggatgtgag tcaggaagac 120

cccgaagtcc agtttaattg gtacgtggac ggggttgagg tacataacgc caaaacgaaa 180

cctcgggagg agcaattcaa ttccacttac cgggttgtat cagtcctgac tgtactgcat 240

caagattggc tcaacgggaa agagtacaag tgtaaggtta gtaataaagg gctgccgtct 300

agtattgaga aaacgatcag taaggctaaa gggcagccaa gagagccaca agtatatacc 360

ctgccaccct ctcaggagga gatgactaaa aaccaagtgt cactgacctg ccttgttaag 420

ggtttttacc catctgatat agcagtagag tgggaatcca atggacagcc agagaacaat 480

tataagacta cacctcccgt ccttgatagt gacggctcct tcttcttgta ttctcgactt 540

acagttgata agtcccgctg gcaggagggt aatgtcttta gctgcagtgt aatgcacgaa 600

gctcttcata atcactacac acaaaaatca ttgagcctgt ctctgggaaa g 651

<210> 39

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 39

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215

<210> 40

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 40

atggccttga ttgtgctcgg cggagttgca ggcctgctcc tttttattgg actcggaata 60

tttttc 66

<210> 41

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 41

Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile

1 5 10 15

Gly Leu Gly Ile Phe Phe

20

<210> 42

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 42

ggatctgga 9

<210> 43

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(ARtificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 43

Gly Ser Gly

1

<210> 44

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 44

gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacct 57

<210> 45

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 45

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 46

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 46

atggagtacg ctagtgatgc gtccttggac cccgaggcgc catggccacc ggccccgcga 60

gctcgagcct gtcgagtgct gccatgggct ctggtcgctg ggttgctcct ccttctgctt 120

ttggccgcgg cttgtgcagt gtttcttgct tgcccgtggg cagttagcgg tgctcgcgca 180

tctcccggaa gcgcggcgag tcctcgactc agggaaggtc cggagctgag cccagatgac 240

cccgccggtt tgctggacct ccgccaagga atgttcgctc aactcgttgc gcaaaacgta 300

cttcttatag acggccctct tagttggtac agtgacccag gattggctgg cgttagtttg 360

acaggcggac tcagttacaa ggaggatact aaggaactgg tagtcgctaa ggctggggta 420

tactacgtgt tctttcaact cgaactgaga agggtggttg cgggagaagg atctggaagt 480

gtatctctcg ccctgcacct ccaacccctc agaagtgccg ccggagcggc cgcccttgcc 540

cttactgtcg acctgccccc ggcttcttca gaagcgcgaa atagtgcatt cggcttccag 600

gggcgccttt tgcacttgag cgctggacag cgcctcgggg tccacctcca cacggaagcg 660

cgggcgaggc acgcttggca actcacacaa ggtgcgacgg ttctcggctt gtttagggtt 720

acgcctgaga taccggctgg cctcccatct ccaagatccg ag 762

<210> 47

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 47

Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro

1 5 10 15

Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val

20 25 30

Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe

35 40 45

Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser

50 55 60

Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp

65 70 75 80

Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val

85 90 95

Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp

100 105 110

Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu

115 120 125

Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe

130 135 140

Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser

145 150 155 160

Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala

165 170 175

Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala

180 185 190

Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala

195 200 205

Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His

210 215 220

Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val

225 230 235 240

Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

245 250

<210> 48

<211> 3

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 48

taa 3

<210> 49

<211> 2040

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 49

atgtggctgc agtctctgct cctcttgggg actgtcgcct gttctatttc acaaggacag 60

gatcgacata tgattcggat gcgccaactg atagatatag tcgatcaact caagaattat 120

gtgaatgact tggtccctga gtttctgccg gctccagagg acgttgaaac aaactgtgaa 180

tggtcagcgt tttcatgttt tcaaaaggca cagctcaagt ccgccaatac aggcaataac 240

gagcggatta taaatgtctc aattaaaaag ctcaagcgca aacccccttc aacgaatgct 300

ggtcgccgcc agaaacacag gttgacctgt ccctcctgtg actcatacga gaagaaacct 360

cccaaggaat ttctcgaacg ctttaagtca ctcttgcaga agatgattca tcagcacttg 420

agtagccgga cacatggttc agaggatagt gagtctaagt atggcccacc gtgtcccccc 480

tgcccagcac ctgagttcct cggaggcccc tctgtattcc tgtttccccc aaagcccaag 540

gatactctta tgatctcacg cactccggaa gtaacctgcg tggtggtgga tgtgagtcag 600

gaagaccccg aagtccagtt taattggtac gtggacgggg ttgaggtaca taacgccaaa 660

acgaaacctc gggaggagca attcaattcc acttaccggg ttgtatcagt cctgactgta 720

ctgcatcaag attggctcaa cgggaaagag tacaagtgta aggttagtaa taaagggctg 780

ccgtctagta ttgagaaaac gatcagtaag gctaaagggc agccaagaga gccacaagta 840

tataccctgc caccctctca ggaggagatg actaaaaacc aagtgtcact gacctgcctt 900

gttaagggtt tttacccatc tgatatagca gtagagtggg aatccaatgg acagccagag 960

aacaattata agactacacc tcccgtcctt gatagtgacg gctccttctt cttgtattct 1020

cgacttacag ttgataagtc ccgctggcag gagggtaatg tctttagctg cagtgtaatg 1080

cacgaagctc ttcataatca ctacacacaa aaatcattga gcctgtctct gggaaagatg 1140

gccttgattg tgctcggcgg agttgcaggc ctgctccttt ttattggact cggaatattt 1200

ttcggatctg gagctactaa cttcagcctg ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac 1260

cctggaccta tggagtacgc tagtgatgcg tccttggacc ccgaggcgcc atggccaccg 1320

gccccgcgag ctcgagcctg tcgagtgctg ccatgggctc tggtcgctgg gttgctcctc 1380

cttctgcttt tggccgcggc ttgtgcagtg tttcttgctt gcccgtgggc agttagcggt 1440

gctcgcgcat ctcccggaag cgcggcgagt cctcgactca gggaaggtcc ggagctgagc 1500

ccagatgacc ccgccggttt gctggacctc cgccaaggaa tgttcgctca actcgttgcg 1560

caaaacgtac ttcttataga cggccctctt agttggtaca gtgacccagg attggctggc 1620

gttagtttga caggcggact cagttacaag gaggatacta aggaactggt agtcgctaag 1680

gctggggtat actacgtgtt ctttcaactc gaactgagaa gggtggttgc gggagaagga 1740

tctggaagtg tatctctcgc cctgcacctc caacccctca gaagtgccgc cggagcggcc 1800

gcccttgccc ttactgtcga cctgcccccg gcttcttcag aagcgcgaaa tagtgcattc 1860

ggcttccagg ggcgcctttt gcacttgagc gctggacagc gcctcggggt ccacctccac 1920

acggaagcgc gggcgaggca cgcttggcaa ctcacacaag gtgcgacggt tctcggcttg 1980

tttagggtta cgcctgagat accggctggc ctcccatctc caagatccga gggatcctaa 2040

<210> 50

<211> 679

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 50

Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile

1 5 10 15

Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp

20 25 30

Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe

35 40 45

Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe

50 55 60

Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn

65 70 75 80

Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro

85 90 95

Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser

100 105 110

Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe

115 120 125

Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr

130 135 140

His Gly Ser Glu Asp Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

145 150 155 160

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

165 170 175

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

180 185 190

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

195 200 205

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

210 215 220

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

225 230 235 240

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

245 250 255

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

260 265 270

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

275 280 285

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

290 295 300

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

305 310 315 320

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

325 330 335

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

340 345 350

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

355 360 365

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Ala Leu Ile Val

370 375 380

Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe

385 390 395 400

Phe Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp

405 410 415

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu

420 425 430

Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg

435 440 445

Val Leu Pro Trp Ala Leu Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu

450 455 460

Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly

465 470 475 480

Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly

485 490 495

Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln

500 505 510

Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly

515 520 525

Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr

530 535 540

Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys

545 550 555 560

Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val

565 570 575

Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro

580 585 590

Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu

595 600 605

Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly

610 615 620

Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His

625 630 635 640

Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr

645 650 655

Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro

660 665 670

Ser Pro Arg Ser Glu Gly Ser

675

<210> 51

<211> 9772

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 51

gcgcgctcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa 60

cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc 120

accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggacgc gccctgtagc 180

ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc 240

gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt 300

ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac 360

ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag 420

acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa 480

actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg 540

atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac 600

aaaatattaa cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 660

tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 720

aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 780

ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 840

aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 900

acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 960

ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 1020

gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 1080

atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 1140

acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 1200

tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 1260

ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 1320

aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 1380

aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 1440

ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 1500

atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 1560

aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 1620

accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 1680

tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 1740

tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 1800

tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 1860

cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 1920

caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 1980

cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 2040

cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 2100

gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 2160

acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 2220

atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 2280

cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 2340

gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 2400

tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg 2460

tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg 2520

agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc 2580

ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg 2640

gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac 2700

actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag 2760

gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc gcgcaattaa ccctcactaa agggaacaaa 2820

agctggagct gcaagcttaa tgtagtctta tgcaatactc ttgtagtctt gcaacatggt 2880

aacgatgagt tagcaacatg ccttacaagg agagaaaaag caccgtgcat gccgattggt 2940

ggaagtaagg tggtacgatc gtgccttatt aggaaggcaa cagacgggtc tgacatggat 3000

tggacgaacc actgaattgc cgcattgcag agatattgta tttaagtgcc tagctcgata 3060

cataaacggg tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg 3120

gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg 3180

tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat 3240

ctctagcagt ggcgcccgaa cagggacttg aaagcgaaag ggaaaccaga ggagctctct 3300

cgacgcagga ctcggcttgc tgaagcgcgc acggcaagag gcgaggggcg gcgactggtg 3360

agtacgccaa aaattttgac tagcggaggc tagaaggaga gagatgggtg cgagagcgtc 3420

agtattaagc gggggagaat tagatcgcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga 3480

aagaaaaaat ataaattaaa acatatagta tgggcaagca gggagctaga acgattcgca 3540

gttaatcctg gcctgttaga aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa 3600

ccatcccttc agacaggatc agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc 3660

tattgtgtgc atcaaaggat agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag 3720

gaagagcaaa acaaaagtaa gaccaccgca cagcaagcgg ccgctgatct tcagacctgg 3780

aggaggagat atgagggaca attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat 3840

tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag 3900

agcagtggga ataggagctt tgttccttgg gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg 3960

cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca 4020

gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg 4080

gggcatcaag cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca 4140

gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa actcatttgc accactgctg tgccttggaa 4200

tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca gatttggaat cacacgacct ggatggagtg 4260

ggacagagaa attaacaatt acacaagctt aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa 4320

ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa 4380

ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta ttcataatga tagtaggagg 4440

cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt actttctata gtgaatagag ttaggcaggg 4500

atattcacca ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg aggggacccg acaggcccga 4560

aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg 4620

atctcgacgg tatcgattag actgtagccc aggaatatgg cagctagatt gtacacattt 4680

agaaggaaaa gttatcttgg tagcagttca tgtagccagt ggatatatag aagcagaagt 4740

aattccagca gagacagggc aagaaacagc atacttcctc ttaaaattag caggaagatg 4800

gccagtaaaa acagtacata cagacaatgg cagcaatttc accagtacta cagttaaggc 4860

cgcctgttgg tgggcgggga tcaagcagga atttggcatt ccctacaatc cccaaagtca 4920

aggagtaata gaatctatga ataaagaatt aaagaaaatt ataggacagg taagagatca 4980

ggctgaacat cttaagacag cagtacaaat ggcagtattc atccacaatt ttaaaagaaa 5040

aggggggatt ggggggtaca gtgcagggga aagaatagta gacataatag caacagacat 5100

acaaactaaa gaattacaaa aacaaattac aaaaattcaa aattttcggg tttattacag 5160

ggacagcaga gatccagttt ggctgcattg atcacgtgag gctccggtgc ccgtcagtgg 5220

gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc 5280

ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc 5340

ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt 5400

tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct 5460

ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta cttccacctg gctgcagtac 5520

gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct 5580

taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc ctgggcgctg gggccgccgc 5640

gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt 5700

taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg 5760

ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt 5820

gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga 5880

cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc 5940

gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg 6000

ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg 6060

gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt 6120

gactccactg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt agttctcgag cttttggagt 6180

acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg 6240

gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt 6300

tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag tggttcaaag tttttttctt 6360

ccatttcagg tgtcgtgatc tagaggatca ctagtaccat gtggctgcag tctctgctcc 6420

tcttggggac tgtcgcctgt tctatttcac aaggacagga tcgacatatg attcggatgc 6480

gccaactgat agatatagtc gatcaactca agaattatgt gaatgacttg gtccctgagt 6540

ttctgccggc tccagaggac gttgaaacaa actgtgaatg gtcagcgttt tcatgttttc 6600

aaaaggcaca gctcaagtcc gccaatacag gcaataacga gcggattata aatgtctcaa 6660

ttaaaaagct caagcgcaaa cccccttcaa cgaatgctgg tcgccgccag aaacacaggt 6720

tgacctgtcc ctcctgtgac tcatacgaga agaaacctcc caaggaattt ctcgaacgct 6780

ttaagtcact cttgcagaag atgattcatc agcacttgag tagccggaca catggttcag 6840

aggatagtga gtctaagtat ggcccaccgt gtcccccctg cccagcacct gagttcctcg 6900

gaggcccctc tgtattcctg tttcccccaa agcccaagga tactcttatg atctcacgca 6960

ctccggaagt aacctgcgtg gtggtggatg tgagtcagga agaccccgaa gtccagttta 7020

attggtacgt ggacggggtt gaggtacata acgccaaaac gaaacctcgg gaggagcaat 7080

tcaattccac ttaccgggtt gtatcagtcc tgactgtact gcatcaagat tggctcaacg 7140

ggaaagagta caagtgtaag gttagtaata aagggctgcc gtctagtatt gagaaaacga 7200

tcagtaaggc taaagggcag ccaagagagc cacaagtata taccctgcca ccctctcagg 7260

aggagatgac taaaaaccaa gtgtcactga cctgccttgt taagggtttt tacccatctg 7320

atatagcagt agagtgggaa tccaatggac agccagagaa caattataag actacacctc 7380

ccgtccttga tagtgacggc tccttcttct tgtattctcg acttacagtt gataagtccc 7440

gctggcagga gggtaatgtc tttagctgca gtgtaatgca cgaagctctt cataatcact 7500

acacacaaaa atcattgagc ctgtctctgg gaaagatggc cttgattgtg ctcggcggag 7560

ttgcaggcct gctccttttt attggactcg gaatattttt cggatctgga gctactaact 7620

tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg gagtacgcta 7680

gtgatgcgtc cttggacccc gaggcgccat ggccaccggc cccgcgagct cgagcctgtc 7740

gagtgctgcc atgggctctg gtcgctgggt tgctcctcct tctgcttttg gccgcggctt 7800

gtgcagtgtt tcttgcttgc ccgtgggcag ttagcggtgc tcgcgcatct cccggaagcg 7860

cggcgagtcc tcgactcagg gaaggtccgg agctgagccc agatgacccc gccggtttgc 7920

tggacctccg ccaaggaatg ttcgctcaac tcgttgcgca aaacgtactt cttatagacg 7980

gccctcttag ttggtacagt gacccaggat tggctggcgt tagtttgaca ggcggactca 8040

gttacaagga ggatactaag gaactggtag tcgctaaggc tggggtatac tacgtgttct 8100

ttcaactcga actgagaagg gtggttgcgg gagaaggatc tggaagtgta tctctcgccc 8160

tgcacctcca acccctcaga agtgccgccg gagcggccgc ccttgccctt actgtcgacc 8220

tgcccccggc ttcttcagaa gcgcgaaata gtgcattcgg cttccagggg cgccttttgc 8280

acttgagcgc tggacagcgc ctcggggtcc acctccacac ggaagcgcgg gcgaggcacg 8340

cttggcaact cacacaaggt gcgacggttc tcggcttgtt tagggttacg cctgagatac 8400

cggctggcct cccatctcca agatccgagg gatcctaaat cgggctagcg tcgacaatca 8460

acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg ttgctccttt 8520

tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc 8580

tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc 8640

cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggttg 8700

gggcattgcc accacctgtc agctcctttc cgggactttc gctttccccc tccctattgc 8760

cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg acaggggctc ggctgttggg 8820

cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa gctgacgtcc tttccatggc tgctcgcctg 8880

tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc cttctgctac gtcccttcgg ccctcaatcc 8940

agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct 9000

tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc ccgcctggaa ttcgagctcg 9060

gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggca gctgtagatc ttagccactt tttaaaagaa 9120

aaggggggac tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt 9180

actgggtctc tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac 9240

ccactgctta agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg 9300

ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct 9360

agcagtagta gttcatgtca tcttattatt cagtatttat aacttgcaaa gaaatgaata 9420

tcagagagtg agaggaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc 9480

atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa 9540

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<210> 52

<211> 8436

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 52

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<400> 53

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gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac ccacacaaag 3600

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gtccaggcac ctcgattagt tctcgtgctt ttggagtacg tcgtctttag gttgggggga 3720

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ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt gagtttggat cttggttcat 3840

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ctttgggccg cctccccgcc tggaattcga gctcggtacc tttaagacca atgacttaca 5220

aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc 5280

actcccaacg aagacaagat ctgctttttg cttgtactgg gtctctctgg ttagaccaga 5340

tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct 5400

tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat 5460

ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tagtagttca tgtcatctta 5520

ttattcagta tttataactt gcaaagaaat gaatatcaga gagtgagagg aacttgttta 5580

ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 5640

ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct 5700

ggctctagct atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg 5760

actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa 5820

gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcgtc gagacgtacc caattcgccc 5880

tatagtgagt cgtattacgc gcgctcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa 5940

aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt 6000

aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa 6060

tggcgcgacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc 6120

gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt 6180

ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc 6240

cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt 6300

agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt 6360

aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt 6420

gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa 6480

aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa tttcccaggt ggcacttttc 6540

ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 6600

cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga 6660

gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt 6720

ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag 6780

tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag 6840

aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta 6900

ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg 6960

agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca 7020

gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag 7080

gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc 7140

gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg 7200

tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 7260

ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 7320

cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg 7380

gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 7440

cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 7500

tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 7560

aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 7620

aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 7680

gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 7740

cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 7800

ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc 7860

accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 7920

tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 7980

cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 8040

gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 8100

ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 8160

cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 8220

tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 8280

ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 8340

ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcc 8384

<210> 54

<211> 9161

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 54

tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 60

gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 120

taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 180

aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 240

atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 300

tacgccaagc gcgcaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctggagct gcaagcttaa 360

tgtagtctta tgcaatactc ttgtagtctt gcaacatggt aacgatgagt tagcaacatg 420

ccttacaagg agagaaaaag caccgtgcat gccgattggt ggaagtaagg tggtacgatc 480

gtgccttatt aggaaggcaa cagacgggtc tgacatggat tggacgaacc actgaattgc 540

cgcattgcag agatattgta tttaagtgcc tagctcgata caataaacgg gtctctctgg 600

ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 660

caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 720

aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 780

acagggacct gaaagcgaaa gggaaaccag agctctctcg acgcaggact cggcttgctg 840

aagcgcgcac ggcaagaggc gaggggcggc gactggtgag tacgccaaaa attttgacta 900

gcggaggcta gaaggagaga gatgggtgcg agagcgtcag tattaagcgg gggagaatta 960

gatcgcgatg ggaaaaaatt cggttaaggc cagggggaaa gaaaaaatat aaattaaaac 1020

atatagtatg ggcaagcagg gagctagaac gattcgcagt taatcctggc ctgttagaaa 1080

catcagaagg ctgtagacaa atactgggac agctacaacc atcccttcag acaggatcag 1140

aagaacttag atcattatat aatacagtag caaccctcta ttgtgtgcat caaaggatag 1200

agataaaaga caccaaggaa gctttagaca agatagagga agagcaaaac aaaagtaaga 1260

ccaccgcaca gcaagcggcc gctgatcttc agacctggag gaggagatat gagggacaat 1320

tggagaagtg aattatataa atataaagta gtaaaaattg aaccattagg agtagcaccc 1380

accaaggcaa agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg 1440

ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcctcaat gacgctgacg 1500

gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct 1560

attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca 1620

agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc 1680

tctggaaaac tcatttgcac cactgctgtg ccttggaatg ctagttggag taataaatct 1740

ctggaacaga ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 1800

caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 1860

aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 1920

tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 1980

ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 2040

cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa gaaggtggag 2100

agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc tcgacggtat cgattagact 2160

gtagcccagg aatatggcag ctagattgta cacatttaga aggaaaagtt atcttggtag 2220

cagttcatgt agccagtgga tatatagaag cagaagtaat tccagcagag acagggcaag 2280

aaacagcata cttcctctta aaattagcag gaagatggcc agtaaaaaca gtacatacag 2340

acaatggcag caatttcacc agtactacag ttaaggccgc ctgttggtgg gcggggatca 2400

agcaggaatt tggcattccc tacaatcccc aaagtcaagg agtaatagaa tctatgaata 2460

aagaattaaa gaaaattata ggacaggtaa gagatcaggc tgaacatctt aagacagcag 2520

tacaaatggc agtattcatc cacaatttta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg 2580

caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac 2640

aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt attacaggga cagcagagat ccagtttggc 2700

tgcatacgcg tcgtgaggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt 2760

ccccgagaag ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg 2820

ggtaaactgg gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga 2880

accgtatata agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag 2940

aacacaggta agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc 3000

ttgcgtgcct tgaattactt ccacctggct gcagtacgtg attcttgatc ccgagcttcg 3060

ggttggaagt gggtgggaga gttcgaggcc ttgcgcttaa ggagcccctt cgcctcgtgc 3120

ttgagttgag gcctggcctg ggcgctgggg ccgccgcgtg cgaatctggt ggcaccttcg 3180

cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct agccatttaa aatttttgat gacctgctgc 3240

gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc caagatctgc acactggtat 3300

ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg tcccagcgca catgttcggc 3360

gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg gggtagtctc aagctggccg 3420

gcctgctctg gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc ccgccctggg cggcaaggct 3480

ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg cttcccggcc ctgctgcagg 3540

gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac ccacacaaag 3600

gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac tccactgagt accgggcgcc 3660

gtccaggcac ctcgattagt tctcgtgctt ttggagtacg tcgtctttag gttgggggga 3720

ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag ttaggccagc 3780

ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt gagtttggat cttggttcat 3840

tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca tttcaggtgt cgtgagctag 3900

actagtacca tggacatgcg ggtgcctgca caacttctgg gcctgctgtt gttgtggctg 3960

tctggagccc ggtgtaattg ggtaaatgtt atcagtgatc tcaagaagat agaggatctc 4020

atccagtcca tgcatattga tgccacgctg tacacagaaa gcgatgtgca tcctagctgt 4080

aaggtgacag cgatgaagtg ttttcttttg gagctgcagg taattagtct tgagtccggc 4140

gatgccagca ttcatgatac cgtagaaaac ttgattatcc tggccaacaa ttctctgtcc 4200

tcaaacggaa acgtaaccga gagcggttgt aaagaatgtg aagaactgga agaaaagaac 4260

atcaaggagt ttctgcaatc attcgttcac atcgtacaaa tgttcataaa tacgtcagga 4320

tctggttctg gttccggaag tggatctggt tcagggtccg gtagtggatc tgggtcagga 4380

agtggaagcg gtagtgggtc tggatctaaa caagagcact ttcctgataa cctgttgccg 4440

agctgggcga ttacgcttat cagtgtaaac ggcatctttg taatatgctg tctgacctac 4500

tgcttcgcac caaggtgccg ggagagaagg agaaatgaaa gactgagaag ggagagcgtg 4560

agacctgtgg gatcctccca tcactggggg tacggcaaac acaacggacc tgagcactgg 4620

cataaggact tccccattgc caagggagag cgccagtccc ctgttgacat cgacactcat 4680

acagccaagt atgacccttc cctgaagccc ctgtctgttt cctatgatca agcaacttcc 4740

ctgagaatcc tcaacaatgg tcatgctttc aacgtggagt ttgatgactc tcaggacaaa 4800

gcagtgctca agggaggacc cctggatggc acttacagat tgattcagtt tcactttcac 4860

tggggttcac ttgatggaca aggttcagag catactgtgg ataaaaagaa atatgctgca 4920

gaacttcact tggttcactg gaacaccaaa tatggggatt ttgggaaagc tgtgcagcaa 4980

cctgatggac tggccgttct aggtattttt ttgaaggttg gcagcgctaa accgggccat 5040

cagaaagttg ttgatgtgct ggattccatt aaaacaaagg gcaagagtgc tgacttcact 5100

aacttcgatc ctcgtggcct ccttcctgaa tccctggatt actggaccta cccaggctca 5160

ctgaccaccc ctcctcttct ggaatgtgtg acctggattg tgctcaagga acccatcagc 5220

gtcagcagcg agcaggtgtt gaaattccgt aaacttaact tcaatgggga gggtgaaccc 5280

gaagaactga tggtggacaa ctggcgccca gctcagccac tgaagaacag gcaaatcaaa 5340

gcttccttca aataagctag cgtcgacaat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga 5400

ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg 5460

cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc 5520

tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc 5580

actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt 5640

tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt 5700

gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg 5760

aagctgacgt cctttccatg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg 5820

tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg 5880

ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt 5940

tgggccgcct ccccgcctgg aattcgagct cggtaccttt aagaccaatg acttacaagg 6000

cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact 6060

cccaacgaag acaagatctg ctttttgctt gtactgggtc tctctggtta gaccagatct 6120

gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc 6180

cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc 6240

tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtag tagttcatgt catcttatta 6300

ttcagtattt ataacttgca aagaaatgaa tatcagagag tgagaggaac ttgtttattg 6360

cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 6420

tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctggc 6480

tctagctatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact 6540

aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta 6600

gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcgtcgag acgtacccaa ttcgccctat 6660

agtgagtcgt attacgcgcg ctcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac 6720

cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat 6780

agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg 6840

cgcgacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg 6900

accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc 6960

gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga 7020

tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt 7080

gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat 7140

agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat 7200

ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa 7260

tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt cccaggtggc acttttcggg 7320

gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc 7380

tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta 7440

ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg 7500

ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg 7560

gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac 7620

gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg 7680

acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt 7740

actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg 7800

ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac 7860

cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt 7920

gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag 7980

caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc 8040

aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc 8100

ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta 8160

tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg 8220

ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga 8280

ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 8340

ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 8400

tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 8460

cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 8520

taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 8580

gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc 8640

acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 8700

ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 8760

ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 8820

cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 8880

aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 8940

gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 9000

gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 9060

gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc 9120

ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc c 9161

<210> 55

<211> 259

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 55

Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp His

1 5 10 15

Lys Asp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp Ile

20 25 30

Asp Thr His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser Val

35 40 45

Ser Tyr Asp Gln Ala Thr Ser Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His Ala

50 55 60

Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys Gly

65 70 75 80

Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His Trp

85 90 95

Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys Lys

100 105 110

Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Thr Lys Tyr Gly Asp

115 120 125

Phe Gly Lys Ala Val Gln Gln Pro Asp Gly Leu Ala Val Leu Gly Ile

130 135 140

Phe Leu Lys Val Gly Ser Ala Lys Pro Gly Leu Gln Lys Val Val Asp

145 150 155 160

Val Leu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr Asn

165 170 175

Phe Asp Pro Arg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr Tyr

180 185 190

Pro Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp Ile

195 200 205

Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys Phe

210 215 220

Arg Lys Leu Asn Phe Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met Val

225 230 235 240

Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys Ala

245 250 255

Ser Phe Lys

<210> 56

<211> 260

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 56

Met Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp

1 5 10 15

His Lys Asp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp

20 25 30

Ile Asp Thr His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser

35 40 45

Val Ser Tyr Asp Gln Ala Thr Asn Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His

50 55 60

Ala Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys

65 70 75 80

Gly Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His

85 90 95

Trp Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys

100 105 110

Lys Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Thr Lys Tyr Gly

115 120 125

Asp Phe Gly Lys Ala Val Gln Gln Pro Asp Gly Leu Ala Val Leu Gly

130 135 140

Ile Phe Leu Lys Val Gly Ser Ala Lys Pro Gly Leu Gln Lys Val Val

145 150 155 160

Asp Val Leu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr

165 170 175

Asn Phe Asp Pro Arg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr

180 185 190

Tyr Pro Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp

195 200 205

Ile Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys

210 215 220

Phe Arg Lys Leu Asn Phe Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met

225 230 235 240

Val Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys

245 250 255

Ala Ser Phe Lys

260

<210> 57

<211> 259

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 57

Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp His

1 5 10 15

Lys Asp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp Ile

20 25 30

Asp Thr His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser Val

35 40 45

Ser Tyr Asp Gln Ala Thr Asn Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His Ala

50 55 60

Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys Gly

65 70 75 80

Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His Trp

85 90 95

Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys Lys

100 105 110

Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Thr Lys Tyr Gly Asp

115 120 125

Phe Gly Lys Ala Val Gln Gln Pro Asp Gly Leu Ala Val Leu Gly Ile

130 135 140

Phe Leu Lys Val Gly Ser Ala Lys Pro Gly Leu Gln Lys Val Val Asp

145 150 155 160

Val Leu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr Asn

165 170 175

Phe Asp Pro Arg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr Tyr

180 185 190

Pro Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp Ile

195 200 205

Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys Phe

210 215 220

Arg Lys Leu Asn Phe Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met Val

225 230 235 240

Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys Ala

245 250 255

Ser Phe Lys

<210> 58

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 58

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser

<210> 59

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 59

Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr

1 5 10 15

Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His

20 25 30

Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala

35 40 45

<210> 60

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 60

Met Gly Leu Val Arg Arg Gly Ala Arg Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg

1 5 10 15

Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser Gly Phe Met

20 25 30

Ala

Claims

1.一种肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其被工程化成表达膜结合白细胞介素15(mbIL15)。

2.如权利要求1所述的TIL，其中所述mbIL15可操作地连接到药物响应结构域。

3.如权利要求1或2所述的TIL，其中所述TIL可以在不存在外源细胞因子的情况下扩增。

4.如权利要求3所述的TIL，其中所述外源细胞因子是IL2。

5.TIL的群体，其包含多个权利要求1-4中任一项所述的TIL。

6.如权利要求5所述的TIL群体，其中所述TIL的至少一个亚群体已经经历了扩增。

7.一种经扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其被工程化成表达膜结合白细胞介素15(mbIL15)。

8.如权利要求7所述的经扩增的TIL，其中所述mbIL15可操作地连接到药物响应结构域(DRD)。

9.经扩增的TIL的群体，其包含多个权利要求7或8所述的TIL。

10.如权利要求9所述的经扩增的TIL的群体，其中与未经扩增的TIL的对照群体中CD8+细胞的比例相比，所述经扩增的TIL的群体具有更大比例的CD8+细胞。

11.如权利要求9-10中任一项所述的经扩增的TIL的群体，其中与未经扩增的TIL的对照群体中CD4+细胞的比例相比，经扩增的TIL的群体具有更小比例的CD4+细胞。

12.如权利要求9所述的经扩增的TIL的群体，其中所述经扩增的TIL的群体的CD8:CD4比率大于未经扩增的TIL的对照群体的CD8:CD4比率。

13.如权利要求9中任一项所述的经扩增的TIL的群体，其中与未经扩增的TIL的对照群体中PD1+细胞的比例相比，所述经扩增的TIL的群体具有更小比例的PD1+细胞。

14.如权利要求9-13中任一项所述的经扩增的TIL的群体，其中与未经扩增的TIL的对照群体中产生肿瘤坏死因子α(TNFα)和干扰素γ(IFNγ)的TIL比例相比，所述经扩增的TIL的群体具有更大比例的产生肿瘤坏死因子α(TNFα)和干扰素γ(IFNγ)二者的细胞。

15.TIL的混合群体，其包括

(a)未经修饰的TIL的亚群体，和

(b)包含膜结合IL15(mbIL15)的经修饰的TIL的亚群体。

16.如权利要求15所述的TIL的混合群体，其中所述mbIL15可操作地连接至药物响应结构域。

17.如权利要求15或16所述的TIL的混合群体，其中所述经修饰的TIL的亚群体在K562饲养细胞、41BBL和IL21存在下扩增。

18.如权利要求17所述的TIL的混合群体，其中在K562饲养细胞、41BBL和IL21存在下，经修饰的TIL的亚群体比未经转导的TIL的亚群体扩增得更多。

19.如权利要求17或18所述的TIL的混合群体，其中所述经修饰的TIL的亚群体的扩增在不存在白细胞介素2(IL2)的情况下发生。

20.一种制备被工程化成表达膜结合白细胞介素15(mbIL15)的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括用载体转导所述TIL，其中所述载体包含编码IL15的第一核酸序列和编码跨膜结构域的第二核酸序列。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述载体是病毒载体。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述载体是慢病毒载体。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述慢病毒载体是狒狒内源性逆转录病毒包膜(BaEV)假型慢病毒载体。

24.如权利要求21所述的方法，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述逆转录病毒载体是长臂猿白血病病毒(GALV)包膜假型γ-逆转录病毒载体。

26.一种狒狒内源性逆转录病毒包膜(BaEV)假型慢病毒载体，其包含编码IL15的第一核酸序列和编码跨膜结构域的第二核酸序列。

27.一种长臂猿白血病病毒(GALV)包膜假型γ逆转录病毒载体，其包含编码IL15的第一核酸序列和编码跨膜结构域的第二核酸序列。

28.一种药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的TIL、权利要求5或6所述的TIL的群体、权利要求7或8所述的经扩增的TIL、权利要求9-14中任一项所述的经扩增的TIL的群体，或权利要求15-19中任一项所述的TIL的混合群体。

29.一种治疗患有癌症的受体受试者的方法，其包括向所述受体受试者施用权利要求1-4中任一项所述的TIL、权利要求5或6所述的TIL的群体、权利要求7或8所述的经扩增的TIL、权利要求9-14中任一项所述的经扩增的TIL的群体、权利要求15-19中任一项所述的TIL的混合群体，或权利要求28所述的药物组合物。

30.如权利要求29所述的方法，其进一步包括向所述受体受试者施用配体，其中所述配体结合至与mbIL15可操作地连接的药物响应结构域(DRD)。

31.如权利要求29或30所述的方法，其中不向所述受体受试者施用IL2。

32.如权利要求29-31中任一项所述的方法，其进一步包括从肿瘤分离一个或多个TIL并将表达IL15的核酸引入到所述一个或多个TIL中。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述TIL分离自所述受体受试者的肿瘤。

34.如权利要求32所述的方法，其中所述TIL分离自来自供体受试者的肿瘤，其中所述供体受试者不是所述受体受试者。

35.如权利要求34所述的方法，其中分离自所述供体受试者的所述肿瘤的所述TIL包含对所述受体受试者的所述肿瘤中存在的癌症抗原具有特异性的一个或多个T细胞受体(TCR)。

36.如权利要求34或35所述的方法，其进一步包括选择与所述受体受试者HLA匹配的供体受试者。

37.如权利要求29-36中任一项所述的方法，其中在施用所述TIL之前对所述受体受试者进行淋巴细胞耗竭。