CN113710809A - 通过基因置换和抗炎的针对杜氏肌营养不良的一步基因疗法 - Google Patents

通过基因置换和抗炎的针对杜氏肌营养不良的一步基因疗法 Download PDF

Info

Publication number
CN113710809A
CN113710809A CN202080025645.4A CN202080025645A CN113710809A CN 113710809 A CN113710809 A CN 113710809A CN 202080025645 A CN202080025645 A CN 202080025645A CN 113710809 A CN113710809 A CN 113710809A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
gene
sequence
vector
promoter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080025645.4A
Other languages
English (en)
Inventor
王冰
傅浩强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Pittsburgh
Original Assignee
University of Pittsburgh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Pittsburgh filed Critical University of Pittsburgh
Publication of CN113710809A publication Critical patent/CN113710809A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4707—Muscular dystrophy
    • C07K14/4708—Duchenne dystrophy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/122—Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

在一个实施方式中，本发明提供了一种双重表达盒基因载体，其包含用于在心肌组织和骨骼肌组织中表达迷你肌营养不良蛋白基因和NF‑κB/p65‑shRNA基因两者的表达盒，其是腺相关病毒(AAV)载体，其中所述迷你肌营养不良蛋白基因与包含肌肉特异性第一启动子和经修饰的Mcken(MCK)增强子的构建体可操作地连接，并且其中所述NF‑κB/p65‑shRNA基因是在第二启动子的控制下。还提供了包含此类基因载体的药物组合物和使用此类基因递送载体和药物组合物改善杜氏肌营养不良症(DMD)的方法。

Description

通过基因置换和抗炎的针对杜氏肌营养不良的一步基因疗法
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2019年02月02日提交的美国临时专利申请号62/800,484的权益，其通过引用并入本申请。
序列表
与本文同时提交的核苷酸/氨基酸序列表通过引用整体并入本文。
背景技术
杜氏肌营养不良症(DMD)是一种由肌营养不良蛋白基因突变引起的致命的X连锁遗传疾病。其是最常见的遗传性肌肉病症。心力衰竭是DMA患者过早死亡的主要原因。炎症是DMD在进行性肌肉变性中的次要病理机制，而NF-kappaB(NF-κB)的抑制可减轻DMD小鼠的肌肉炎症、改善肌肉病理并改善肌肉生理功能(Yang,2012和Yin,2017)。
基于基因治疗的基因置换是DMD的潜在治疗方法(Wang,2000)，但DMD尚无治愈的方法。由NF-κB信号转导上调引起的慢性炎症对DMD的基因疗法造成挑战(Mendell JR,2010The NEJM)。通用启动子如CMV启动子经常在肌肉基因治疗中引起不希望的毒性和免疫应答。因此，特定的肌肉靶向基因递送系统对于DMD临床试验的安全性很重要(Wang,2008)。此外，鉴于充血性心力衰竭是DMD引起的主要并发症，用于DMD治疗的肌肉特异性表达迷你肌营养不良蛋白应导致在骨骼肌和心肌中迷你肌营养不良蛋白的强烈表达。
已经证明通过shRNA技术减少NF-κB可以改善mdx小鼠的这种病理过程(Yang,2012)。其他初步结果还表明，当两种分别携带迷你肌营养不良蛋白和NF-κB/p65-shRNA的重组腺相关病毒(AAV)载体同时注射进入DMD小鼠模型中时，通过减少NF-κB显著增加迷你肌营养不良蛋白的表达。然而，两种AAV注射在很多应用中过于复杂而无法应用于临床。
因此，需要一种在骨骼肌和心肌中同时引入迷你肌营养不良蛋白基因和NF-κB/p65-shRNA的更实用的载体。
发明内容
在一个实施方式中，本发明提供了一种双重表达盒基因载体，其包含用于在心肌组织和骨骼肌组织中表达迷你肌营养不良蛋白基因和NF-κB/p65-shRNA基因两者的表达盒，其是腺相关病毒(AAV)载体，其中所述迷你肌营养不良蛋白基因与包含肌肉特异性第一启动子和经修饰的Mcken(MCK)增强子的构建体可操作地连接，并且其中所述NF-κB/p65-shRNA基因是在第二启动子的控制下。还提供了包含此类基因载体的药物组合物和使用此类基因递送载体和药物组合物改善杜氏肌营养不良症(DMD)的方法。
不存在类似的技术。在DMD中上调的NF-kB通路，不仅在下游发病机制中起关键作用(Acharyya 2007J Clin Invest)，而且还显著影响肌营养不良蛋白基因置换的效率(Jayandharan,2011PNAS)。双重治疗基因疗法策略是创新的，应该比单一的迷你肌营养不良蛋白置换有更多获益。
附图说明
图1A描述了单一和双重表达盒AAV构建体的示意图。图1B描述了在心脏组织中检测的肌营养不良蛋白的Western印迹。图1C描述了在心脏和肝脏组织中肌营养不良蛋白的免疫荧光(IF)染色。图1D描述了在来自使用双重表达盒AAV和单一表达盒AAV治疗全身性治疗的mdx/utrn-/-小鼠的心脏组织、骨骼肌组织(DIA是膈肌，GAS是腓肠肌，TA是胫骨前肌)和肝脏组织中迷你肌营养不良蛋白的IF染色。迷你肌营养不良蛋白在单一homo和双重homo组的心脏、膈肌、GAS和TA肌肉中均成功表达。此外，在肝脏组织中无迷你肌营养不良蛋白表达，表明其具有组织特异性。图1E是显示在不同类型组织中迷你肌营养不良蛋白阳性细胞比的图。在单一homo和双重homo组之间在心脏和DIA组织中不存在差异。但是，双重homo组在GAS和TA肌肉中具有高得多的迷你肌营养不良蛋白。(****平均值p<0.0001)
图2A描述了在腓肠肌中CD68、CD4、CD8和p-P65的IF染色。图2B描述了在心肌和腓肠肌中p-P65的IF染色。WT：野生型，双重同源：双重表达盒AAV治疗的dKO-homo，单一homo：单一表达盒AAV治疗的dKO-homo，Ct-homo：未经治疗的dKO-homo。放大倍数：200x。(*平均值p<0.05，**平均值p<0.01，***平均值p<0.001，****平均值p<0.0001)
图3A代表在实施例2中讨论的转基因和敲低小鼠的特征。图3B描述了在2月龄的GAS肌肉中肌营养不良蛋白和p-P65表达的Western印迹。图3C描述了在相同月龄的GAS肌肉中进行的肌营养不良蛋白和β-肌聚糖的苏木精和伊红(H&E)染色，以及IF染色。
图4A描述了在2月龄转基因和敲低小鼠的腓肠肌中mIgG、CD68、CD4和CD8的Masson三色染色和IF染色。图4B显示的统计分析表明，CD68、CD4和CD8在不同转基因和敲低小鼠的组之间显示出显着差异。*p<0.01，**p<0.001和***p<0.0001。图4C描述了在rAAV治疗的心肌和/或腓肠肌中CD8、CD4和CD68的IF染色结果(在心脏组织中几乎无CD8阳性)。在下图中，Y轴是每个视觉帧的阳性细胞数。单一homo具有比Ct homo组更少的免疫细胞浸润，以及双重homo具有比单一homo组更少的免疫细胞浸润。(n＝3，*平均值p<0.05，**平均值p<0.01，***平均值p<0.001，****平均值p<0.0001)。图4D描述了AAV治疗小鼠的总体健康状况，其中(1)表示WT，(2)表示双重homo，(3)表示单一homo和(4)表示Ct homo。上图显示了在1月龄和2月龄的肌肉功能，频率为0至200HZ。下图显示了在1月龄和2月龄不同组的体重(*平均值p<0.05，**平均值p<0.01，***平均值p<0.001，****平均值p<0.0001)。
图5A是表示本发明的实施方式的示意性载体图：载体pAAV-M1p65EnsynOpti3978(SEQ ID NO:1)和pAAV-M2p65EnsynOpti3978(SEQ ID NO:23)。图5B以图形方式显示了pAAV-M1p65EnsynOpti3978和pAAV-M2p65EnsynOpti3978载体内某些遗传元件的位置。
图6A是表示本发明的实施方式的示意性载体图：载体pAAV-M1p65EnsynOpti3837(SEQ ID NO:25)和pAAV-M2p65EnsynOpti3837(SEQ ID NO:26)。图6B以图形方式显示了pAAV-M1p65EnsynOpti3837和pAAV-M2p65EnsynOpti3837载体内某些遗传元件的位置。
具体实施方式
在一个实施方式中，本发明提供了一种双重表达盒基因载体，其包含用于在心肌组织和骨骼肌组织中表达迷你肌营养不良蛋白基因和NF-κB/p65-shRNA基因两者的表达盒，其是腺相关病毒(AAV)载体，其中所述迷你肌营养不良蛋白基因与包含肌肉特异性第一启动子和经修饰的Mcken(MCK)增强子的构建体可操作地连接，并且其中所述NF-κB/p65-shRNA基因是在第二启动子的控制下。
AAV载体可以源自任何适合用作基因治疗载体的AAV菌株，如本领域普通技术人员公知的。纯粹举例来说，亲本AAV毒株可以是AAV1、AAV2、AAV6或AAV9，但也可以使用其他毒株。
在本发明上下文中的示例性AAV载体(或用于产生编码载体的质粒，本领域技术人员从中可以理解病毒序列)在本文中描述为AAV-M1p65EnsynOpti3978或AAV-M2p65EnsynOpti3978(包括用于产生此类载体的质粒)。在本发明上下文中使用的这些示例性AAV的序列包含SEQ ID NO:1的序列，其是AAV-M1p65EnsynOpti3978；SEQ ID NO:23的序列，其是AAV-M2p65EnsynOpti3978；SEQ ID NO:25的序列，其是AAV-M1p65EnsynOpti3837；以及SEQ ID NO:26的序列，其是AAV-M2p65EnsynOpti3837。
AAV-M2p65EnsynOpti3978与AAV-M1p65EnsynOpti3978的不同之处在于，其包含序列agtccctgtctgcacctgtctcgagacaggtgcagacagggactttttttt(编码m2p65shRNA，在bp1701-1751的SEQ ID NO:22代替存在于SEQ ID NO:1中的编码m1p65的序列(tgtgtccattgtctcactcctcgaggagtgagacaatggacacattttttt(SEQ ID NO:17))。
类似地，AAV-M2p65EnsynOpti3837与AAV-M1p65EnsynOpti3837的不同之处在于，其包含序列agtccctgtctgcacctgtctcgagacaggtgcagacagggactttttttt(编码m2p65shRNA，在bp1701-1751的SEQ ID NO:22代替存在于SEQ ID NO:25中的编码m1p65的序列(tgtgtccattgtctcactcctcgaggagtgagacaatggacacattttttt(SEQ ID NO:17)))。
如所指出的，用于本发明上下文中的AAV包含用于在心肌和在骨骼肌中表达迷你肌营养不良蛋白基因的表达盒。优选地，迷你肌营养不良蛋白基因是人密码子优化的。例如，人优化的迷你肌营养不良蛋白基因，其包含5个棒状结构域(Rod)(1、2、22、23、24)和3个铰链结构域(Hinge)(1、3、4)，以及CR结构域，其可以用于治疗DMD动物模型和用于人临床试验以及最终用于治疗CDM。参见，例如，Kornegay JN等，Molecular Therapy.2010,18(8):1501-1508,PMID:20517298(其全部内容通过引用并入本文)。一个此类人优化的迷你肌营养不良蛋白(也称为微型肌营养不良蛋白)的序列是opti-DysΔ3978(包含3978个碱基对)并且如序列ID NO:2所示：
atggtgtggtgggaggaagtggaggactgctacgagagagaggacgtgcagaagaaaaccttcaccaagtgggtgaacgcccagttcagcaagttcggcaagcagcacatcgagaacctgttcagcgacctgcaggatggcaggagactgctggacctgctggagggcctgaccggccagaagctgcccaaggagaagggcagcaccagagtgcacgccctgaacaacgtgaacaaggccctgagagtgctgcagaacaacaacgtggacctggtgaacatcggcagcaccgacatcgtggacggcaaccacaagctgaccctgggcctgatctggaacatcatcctgcactggcaggtgaagaacgtgatgaagaacatcatggccggcctgcagcagaccaacagcgagaagatcctgctgagctgggtgaggcagagcaccagaaactacccccaggtgaacgtgatcaacttcaccacctcctggagcgacggcctggccctgaacgccctgatccacagccacagacccgacctgttcgactggaacagcgtggtgtgtcagcagagcgccacccagagactggagcacgccttcaacatcgccagataccagctgggcatcgagaagctgctggaccccgaggacgtggacaccacctaccccgacaagaaaagcatcctcatgtacattaccagcctgttccaggtgctgccccagcaggtgtccatcgaggccatccaggaagtggaaatgctgcccaggccccccaaagtgaccaaggaggagcacttccagctgcaccaccagatgcactacagccagcagatcacagtgagcctggcccagggctatgagagaaccagcagccccaagcccagattcaagagctacgcctacacccaggccgcctacgtgaccacctccgaccccaccagaagccccttccccagccagcacctggaggcccccgaggacaagagcttcggcagcagcctgatggagagcgaagtgaacctggacagataccagaccgccctggaggaagtgctgtcctggctgctgagcgccgaggacaccctgcaggcccagggcgagatcagcaacgacgtggaagtggtgaaggaccagttccacacccacgagggctacatgatggatctgaccgcccaccagggcagagtgggcaatatcctgcagctgggcagcaagctgatcggcaccggcaagctgagcgaggacgaggagaccgaagtgcaggagcagatgaacctgctgaacagcagatgggagtgcctgagagtggccagcatggagaagcagagcaacctgcacagagtgctgatggacctgcagaaccagaagctgaaggagctgaacgactggctgaccaagaccgaggagcggaccagaaagatggaggaggagcccctgggccccgacctggaggacctgaagagacaggtgcagcagcacaaagtgctgcaggaggacctggagcaggagcaggtgcgcgtgaacagcctgacccacatggtggtggtcgtggacgagagcagcggcgaccacgccacagccgccctggaagagcagctgaaagtgctgggcgacagatgggccaatatttgtaggtggaccgaggacagatgggtgctgctgcaggaccagcccgacctggcccctggcctgaccaccatcggcgccagccccacccagaccgtgaccctggtgacccagcccgtggtgacaaaggagaccgccatcagcaagctggagatgcccagctccctgatgctggaagtgcccacccaccgcctgctccagcagttccccctggacctggagaagttcctggcctggctgaccgaggccgaaaccaccgccaatgtgctccaggacgccactagaaaggagaggctgctggaggacagcaagggcgtgaaagagctgatgaagcagtggcaggatctgcagggcgaaatcgaggcccacaccgacgtgtaccacaacctggacgagaacagccagaagattctgaggagcctggagggcagcgacgacgccgtcctgctccagaggaggctggacaacatgaacttcaagtggagcgagctgcggaagaagagcctgaacatccggagccacctggaagccagcagcgaccagtggaagagactgcacctgagcctgcaggagctgctggtgtggctgcagctgaaggacgacgagctgagcagacaggcccccatcggcggcgacttccccgccgtgcagaagcagaacgacgtgcaccgggccttcaagagggagctgaaaaccaaggaacccgtgatcatgagcaccctggagacagtgcggatcttcctgaccgagcagcccctggagggactggagaagctgtaccaggagcccagagagctgccccccgaggagagagcccagaacgtgaccaggctgctgagaaagcaggccgaggaagtgaataccgagtgggagaagctgaatctgcacagcgccgactggcagagaaagatcgacgagaccctggagagactccaggaactgcaggaagccaccgacgagctggacctgaagctgagacaggccgaagtgatcaagggcagctggcagcctgtgggcgatctgctgatcgactccctgcaggatcacctggagaaagtgaaggccctgcggggcgagatcgcccccctgaaggagaatgtgagccacgtgaacgacctggccagacagctgaccaccctgggcatccagctgagcccctacaacctgagcacactggaggatctgaacacccggtggaaactgctgcaggtggccgtggaggatagagtgaggcagctgcacgaagcccacagagacttcggccctgcctcccagcacttcctgagcaccagcgtgcagggcccctgggagagagccatctcccccaacaaagtgccctactacatcaaccacgagacccagaccacctgctgggaccaccctaagatgaccgagctgtatcagagcctggccgacctgaacaatgtgcggttcagcgcctacagaaccgccatgaagctgcggagactgcagaaggccctgtgcctggatctgctgagcctgagcgccgcctgcgacgccctggaccagcacaacctgaagcagaatgaccagcccatggacatcctgcagatcatcaactgcctgaccacaatctacgaccggctggaacaggagcacaacaacctggtgaatgtgcccctgtgcgtggacatgtgcctgaattggctgctgaacgtgtacgacaccggcaggaccggcagaatccgcgtgctgagcttcaagaccggcatcatcagcctgtgcaaggcccacctggaggataagtaccgctacctgttcaagcaggtggccagcagcaccggcttctgcgatcagaggagactgggcctgctgctgcacgatagcatccagatccctaggcagctgggcgaagtggccagctttggcggcagcaacatcgagccctctgtgaggagctgcttccagttcgccaacaacaagcccgagatcgaggccgccctgttcctggactggatgaggctggagcctcagagcatggtgtggctgcctgtgctgcacagagtggccgccgccgagaccgccaagcaccaggccaagtgcaatatctgcaaggagtgccccatcatcggcttccggtacaggagcctgaagcacttcaactacgacatctgccagagctgctttttcagcggcagagtggccaagggccacaaaatgcactaccccatggtggagtactgcacccccaccacctccggcgaggatgtgagagacttcgccaaagtgctgaagaataagttccggaccaagcggtactttgccaagcaccccaggatgggctacctgcccgtgcagaccgtgctggaaggcgacaacatggagacctga。该序列作为碱基对2365-6342包含在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:23内。
在SEQ ID NO:2内，可以鉴定人优化的迷你肌营养不良蛋白的以下结构域。在针对人优化的迷你肌营养不良蛋白基因的编码序列内的其核苷酸位置如在图5B中所示：
人肌营养不良蛋白的N末端(756个碱基对)；SEQ ID NO:3：
atggtgtggtgggaggaagtggaggactgctacgagagagaggacgtgcagaagaaaaccttcaccaagtgggtgaacgcccagttcagcaagttcggcaagcagcacatcgagaacctgttcagcgacctgcaggatggcaggagactgctggacctgctggagggcctgaccggccagaagctgcccaaggagaagggcagcaccagagtgcacgccctgaacaacgtgaacaaggccctgagagtgctgcagaacaacaacgtggacctggtgaacatcggcagcaccgacatcgtggacggcaaccacaagctgaccctgggcctgatctggaacatcatcctgcactggcaggtgaagaacgtgatgaagaacatcatggccggcctgcagcagaccaacagcgagaagatcctgctgagctgggtgaggcagagcaccagaaactacccccaggtgaacgtgatcaacttcaccacctcctggagcgacggcctggccctgaacgccctgatccacagccacagacccgacctgttcgactggaacagcgtggtgtgtcagcagagcgccacccagagactggagcacgccttcaacatcgccagataccagctgggcatcgagaagctgctggaccccgaggacgtggacaccacctaccccgacaagaaaagcatcctcatgtacattaccagcctgttccaggtgctgccccagcaggtgtccatcgaggccatccaggaagtggaa；
铰链结构域1(225个碱基对)；SEQ ID NO:4：
atgctgcccaggccccccaaagtgaccaaggaggagcacttccagctgcaccaccagatgcactacagccagcagatcacagtgagcctggcccagggctatgagagaaccagcagccccaagcccagattcaagagctacgcctacacccaggccgcctacgtgaccacctccgaccccaccagaagccccttccccagccagcacctggaggcccccgaggac；
棒状结构域1(333个碱基对)；SEQ ID NO:5：
agcgaagtgaacctggacagataccagaccgccctggaggaagtgctgtcctggctgctgagcgccgaggacaccctgcaggcccagggcgagatcagcaacgacgtggaagtggtgaaggaccagttccacacccacgagggctacatgatggatctgaccgcccaccagggcagagtgggcaatatcctgcagctgggcagcaagctgatcggcaccggcaagctgagcgaggacgaggagaccgaagtgcaggagcagatgaacctgctgaacagcagatgggagtgcctgagagtggccagcatggagaagcagagcaacctgcacaga；
棒状结构域2(327个碱基对)；SEQ ID NO:6：
gtgctgatggacctgcagaaccagaagctgaaggagctgaacgactggctgaccaagaccgaggagcggaccagaaagatggaggaggagcccctgggccccgacctggaggacctgaagagacaggtgcagcagcacaaagtgctgcaggaggacctggagcaggagcaggtgcgcgtgaacagcctgacccacatggtggtggtcgtggacgagagcagcggcgaccacgccacagccgccctggaagagcagctgaaagtgctgggcgacagatgggccaatatttgtaggtggaccgaggacagatgggtgctgctgcaggac；
铰链结构域3(141个碱基对)；SEQ ID NO:7：
cagcccgacctggcccctggcctgaccaccatcggcgccagccccacccagaccgtgaccctggtgacccagcccgtggtgacaaaggagaccgccatcagcaagctggagatgcccagctccctgatgctggaagtgccc；
棒状结构域22(348个碱基对)；SEQ ID NO:8：
acccaccgcctgctccagcagttccccctggacctggagaagttcctggcctggctgaccgaggccgaaaccaccgccaatgtgctccaggacgccactagaaaggagaggctgctggaggacagcaagggcgtgaaagagctgatgaagcagtggcaggatctgcagggcgaaatcgaggcccacaccgacgtgtaccacaacctggacgagaacagccagaagattctgaggagcctggagggcagcgacgacgccgtcctgctccagaggaggctggacaacatgaacttcaagtggagcgagctgcggaagaagagcctgaacatccggagccacctggaagcc；
棒状结构域23(387个碱基对)；SEQ ID NO:9：
agcagcgaccagtggaagagactgcacctgagcctgcaggagctgctggtgtggctgcagctgaaggacgacgagctgagcagacaggcccccatcggcggcgacttccccgccgtgcagaagcagaacgacgtgcaccgggccttcaagagggagctgaaaaccaaggaacccgtgatcatgagcaccctggagacagtgcggatcttcctgaccgagcagcccctggagggactggagaagctgtaccaggagcccagagagctgccccccgaggagagagcccagaacgtgaccaggctgctgagaaagcaggccgaggaagtgaataccgagtgggagaagctgaatctgcacagcgccgactggcagagaaagatcgacgag；
棒状结构域24(327个碱基对)；SEQ ID NO:10：
accctggagagactccaggaactgcaggaagccaccgacgagctggacctgaagctgagacaggccgaagtgatcaagggcagctggcagcctgtgggcgatctgctgatcgactccctgcaggatcacctggagaaagtgaaggccctgcggggcgagatcgcccccctgaaggagaatgtgagccacgtgaacgacctggccagacagctgaccaccctgggcatccagctgagcccctacaacctgagcacactggaggatctgaacacccggtggaaactgctgcaggtggccgtggaggatagagtgaggcagctgcacgaa；
铰链结构域4(216个碱基对)；SEQ ID NO:11：
gcccacagagacttcggccctgcctcccagcacttcctgagcaccagcgtgcagggcccctgggagagagccatctcccccaacaaagtgccctactacatcaaccacgagacccagaccacctgctgggaccaccctaagatgaccgagctgtatcagagcctggccgacctgaacaatgtgcggttcagcgcctacagaaccgccatgaagctg；
富含半胱氨酸(CR)的结构域(888个碱基对)；SEQ ID NO:12：
cggagactgcagaaggccctgtgcctggatctgctgagcctgagcgccgcctgcgacgccctggaccagcacaacctgaagcagaatgaccagcccatggacatcctgcagatcatcaactgcctgaccacaatctacgaccggctggaacaggagcacaacaacctggtgaatgtgcccctgtgcgtggacatgtgcctgaattggctgctgaacgtgtacgacaccggcaggaccggcagaatccgcgtgctgagcttcaagaccggcatcatcagcctgtgcaaggcccacctggaggataagtaccgctacctgttcaagcaggtggccagcagcaccggcttctgcgatcagaggagactgggcctgctgctgcacgatagcatccagatccctaggcagctgggcgaagtggccagctttggcggcagcaacatcgagccctctgtgaggagctgcttccagttcgccaacaacaagcccgagatcgaggccgccctgttcctggactggatgaggctggagcctcagagcatggtgtggctgcctgtgctgcacagagtggccgccgccgagaccgccaagcaccaggccaagtgcaatatctgcaaggagtgccccatcatcggcttccggtacaggagcctgaagcacttcaactacgacatctgccagagctgctttttcagcggcagagtggccaagggccacaaaatgcactaccccatggtggagtactgcacccccaccacctccggcgaggatgtgagagacttcgccaaagtgctgaagaataagttccggaccaagcggtactttgccaagcaccccaggatgggctacctgcccgtgcagaccgtgctggaaggcgacaacatggagacc；and
终止密码子(3个碱基对)；SEQ ID NO:13:tga
因此，在本发明上下文中使用的适宜的人优化的迷你肌营养不良蛋白基因可以包含、基本上由或由SEQ ID NO:2组成，并且可以包含由选自以下的序列表示的结构域：由SEQID NO:3-13的任一个组成的序列，尽管一个或多个此类结构域可以包含、基本上包含或由此类序列组成。当然，显然人类优化的迷你肌营养不良蛋白基因可以包含SEQ ID NO:2-13的功能性变体。在此上下文中，功能性变体表示可以使用给定序列的变体，只要编码的基因产物保留参考编码分子的功能即可。因此，在本发明的上下文中，来自任何SEQ ID NO:2-13的序列变体可以用于编码适宜的人优化的迷你肌营养不良蛋白。此类变体可以与本文所示的示例性序列不同，通过保留与SEQ ID NO:2-13的一个或多个的约75％至约99％，如与SEQID NO:2-13的一个或多个的至少约75％，如至少约80％、或至少约90％、至少约95％或至少约99％的序列同一性。
在本发明中使用的具有更小尺寸的其他迷你肌营养不良蛋白(微型肌营养不良蛋白)包含迷你肌营养不良蛋白基因(人或犬科动物)，其包含N末端、5个棒状结构域(Rod 1、2、22、23、24)、2个铰链结构域(铰链1和4)和富含半胱氨酸的结构域，如hΔDys3849和hOptiΔDys3837。hOptiΔDys3837与hΔDys3849的不同之处在于(i)hOptiΔDys3837是密码子优化的和(ii)全外显子79的12个碱基已被去除。基本的功能性结构域是相同的。hOptiΔDys3837(也称为opti-DysΔ3837)的序列(其包含3837个碱基对)如SEQ ID NO:27中所示。该序列包含在SEQ ID NO:25和26内，作为碱基对2365-6201(图6B)。示例性迷你肌营养不良蛋白参见Wang等，PNAS USA,97(25):13714-13719(2000),PMID 11095710；Wang等，GeneTherapy,15(15):1099-1106(2008),PMID 18432277；Wang等，Gene Therapy,15(22):1489-1499(2008),PMID 18563184；Romesh等，Journal of Muscle Research andCellMotility,27(1):53-67(2006),PMID 16496225；和Koppanati等，Gene Therapy,17(11):1355-1362(2010),PMID 20535217，其均通过引用并入本文。
因此，在本发明上下文中使用的适宜的人优化的迷你肌营养不良蛋白基因可以包含、基本上由或由SEQ ID NO:27组成，并且可以包含由选自以下的序列表示的结构域：由SEQ ID NO:3-6和8-13的任一个组成的序列，尽管一个或多个此类结构域可以包含、基本上包含或由此类序列组成。当然，显然人优化的迷你肌营养不良蛋白基因可以包含SEQ IDNO:3-6、8-13和27的功能性变体。此类变体可以与本文所示的示例性序列不同，通过保留与SEQ ID NO:3-6、8-13和27的一个或多个的约75％至约99％，如与SEQ ID NO:3-6、8-13和27的一个或多个的至少约75％，如至少约80％、或至少约90％、至少约95％或至少约99％的序列同一性。
如上所述，在本发明上下文中使用的AAV内，用于在心肌和在骨骼肌中表达迷你肌营养不良蛋白基因的表达盒包含肌肉特异性第一启动子和经修饰的MCK启动子增强子。在该表达盒内，迷你肌营养不良蛋白基因可操作地连接至肌肉特异性第一启动子和经修饰的MCK启动子增强子，以使得迷你肌营养不良蛋白的表达在肌肉特异性第一启动子和经修饰的MCK启动子增强子的控制下。
为了在本发明的上下文中使用，经修饰的肌肉MCK启动子增强子，其允许肌肉特异性表达。优选地，经修饰的肌肉MCK启动增强子是MCK启动子的截短修饰，鉴于AAV基因组的大小限制这是有用的。对于提供的一种修饰的肌肉MCK启动子增强子，除了肌肉特异性顺式元件以外，针对在不同肌肉中的组织特异性，可以将mef-2、右e盒(mef1)和富含a/t的元件保留在增强子区域中，包括两个右e-盒和一个s5修饰区。参见Bing Wang等，Gene Ther.,2008,15:1489-1499.PMID:18563184(其全部内容通过引用并入本文)。一个优选的经修饰的肌肉MCK启动子增强子的序列(包含216个碱基对)如SEQ ID NO:1(图5B)、SEQ ID NO:23(图5B)、SEQ ID NO:25(图6B)和SEQ ID NO:26(图6B)的核苷酸1757-1972所示，并且由序列ID NO:14：
ccactacgggtctaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaaccccaacacctgctgcccccccccccccaacacctgctgcctgagcctgagcggttaccccaccccggtgcctgggtcttaggctctgtacaccatggaggagaagctcgctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccct表示。
因此，在本发明上下文中使用的适宜的经修饰的肌肉MCK启动子增强子可以包含、基本上由或由SEQ ID NO:14组成。当然，显然经修饰的肌肉MCK启动子可以包含SEQ ID NO:14的功能性变体。在此上下文中，功能性变体表示可以采用给定序列的变体，只要该变体保留参考序列的功能即可。因此，在本发明的上下文中，来自SEQ ID NO:14的序列变体可用作经修饰的肌肉MCK启动子增强子。此类变体可以与本文所示的示例性序列不同，通过保留与SEQ ID NO:14的约75％至约99％，如与SEQ ID NO:14的至少约75％，如至少约80％、或至少约90％、至少约95％或至少约99％的序列同一性。
为了在本发明的上下文中使用，肌肉特异性第一启动子允许肌肉特异性表达。一个优选的经修饰的肌肉特异性第一启动子是合成的启动子(Syn)，除了肌肉特异性顺式元件以外，其还包含MEF-2和右e盒。参见Bing Wang等，Gene Ther.,2008,15:1489-1499.PMID:18563184(其全部内容通过引用并入本文)。一个优选的肌肉特异性第一启动子的序列(包含317个碱基对)如SEQ ID NO:1(图5B)、SEQ ID NO:23(图5B)、SEQ ID NO:25(图6B)和SEQ ID NO:26(图6B)的核苷酸1973-2289所示，并由序列ID NO:15：
gcatgcggccgtccgccctcggcaccattcctcacgacaccgaaatatggcgacgggtgaggaatggtggggagttatttttagagcggtgaggaatggtgggcaggcagcaggtgttgggggagttatttttagagcggggagttatttttagagcggtgaggaatggtggacaccgaaatatggcgacgggtgaggaatggtgccgtcgccatatttgggtgtcccgtccgccctcggccggggccgcattcctgggggccgggcggtgctcccgcccgcctcgataaaaggctccggggccggcggcggcccac表示。
因此，在本发明上下文中使用的适宜的肌肉特异性第一启动子可以包含、基本上由或由SEQ ID NO:15组成。当然，显然肌肉特异性第一启动子可以包含SEQ ID NO:15的功能性变体。在此上下文中，功能性变体表示可以采用给定序列的变体，只要该变体保留参考序列的功能即可。因此，在本发明的上下文中，来自SEQ ID NO:15的序列变体可用作肌肉特异性第一启动子。此类变体可以与本文所示的示例性序列不同，通过保留与SEQ ID NO:15的约75％至约99％，如与SEQ ID NO:15的至少约75％，如至少约80％、或至少约90％、至少约95％或至少约99％的序列同一性。
用于在心肌和在骨骼肌中迷你肌营养不良蛋白基因表达的表达盒还可以包含用于增强迷你肌营养不良蛋白基因表达的其他所需的元件。例如，在SEQ ID NO:1中所示的示例性AAV序列包含Kozak共有序列(GCCACC(SEQ ID NO:16))，其作为用于迷你肌营养不良蛋白基因翻译的增强子。参见，Bing Wang等，Journal of Orthopaedic Research,2009,27:4,421-42,.PMID:18973234(其全部内容通过引用并入本文)。
如上所述，用于本发明上下文中的AAV包含其中NF-κB/p65-shRNA基因可操作地连接至第二启动子的表达盒。小鼠NF-кB/p65-shRNA表达盒特异性沉默NF-кB/p65的亚基65。参见Qing Yang等，Gene Ther.2012,19:1196-1204,PubMedPMID:22278411(其全部内容通过引用并入本文)。不受理论的束缚，据信NF-кB/p65的亚基65的特异性沉默降低炎症，其能够导致迷你肌营养不良蛋白基因更强大的表达。小鼠特异性NF-кB/p65-shRNA包含51个碱基对，并且包含在SEQ ID NO:1(图5B)和SEQ ID NO:25(图6B)的核苷酸1701-1751处。其序列是tgtgtccattgtctcactcctcgaggagtgagacaatggacacattttttt(SEQ ID NO:17)。另一个小鼠特异性NF-кB/p65-shRNA包含51个碱基对，并且包含在SEQ ID NO:23(图5B)和SEQ IDNO:26(图6B)的核苷酸1701-1751处。其序列是agtccctgtctgcacctgtctcgagacaggtgcagacagggactttttttt(SEQ ID NO:22)。此外，为了用于人类临床试验或治疗DMD，优选使用基于人NF-κB序列的shRNA序列。人siRNA寡核苷酸序列，命名为(REL1096(gattgaggagaaacgtaaatt SEQ ID NO:24))以抑制NF-kB诱导人滑膜细胞中的炎症因子(Lee,Ui Jin等，MolBiolRep(2008)35:291–298(其全部内容通过引用并入本文))并且其抑制癌细胞中组成型或肿瘤坏死因子诱导的NF-kB(Jutooru,Indira等，J.Biol.Chem.(2010),285:25332–25344(其全部内容通过引用并入本文))是普通技术人员公知的。
因此，在本发明上下文中使用的适宜的NF-κB/p65-shRNA可以包含、基本上由或由SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24组成。当然，显然NF-κB/p65-shRNA可以包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:22的功能性变体。在此上下文中，功能性变体表示可以采用给定序列的变体，只要该变体保留参考序列的功能即可。因此，可以使用来自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24的序列变体，其在本发明的上下文中进行抑制。此类变体可以与本文所示的示例性序列不同，通过保留与SEQ ID NO:17的约75％至约99％，如与SEQID NO:17、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24的至少约75％，如至少约80％、或至少约90％、至少约95％或至少约99％的序列同一性。
如上所述，NF-κB/p65-shRNA与第二启动子可操作地连接(在转录控制下)。用于本目的的优选启动子是U6启动子，最优选是人U6启动子。参见，Qing Yang等，GeneTher.2012,19:1196-1204,PubMed PMID:22278411(其全部内容通过引用并入本文)。人U6启动子的序列包含241个碱基对，并且包含在SEQ ID NO:1(图5B)、SEQ ID NO:23(图5B)、SEQ ID NO:25(图6B)和SEQ ID NO:26(图6B)的核苷酸1452-1692处。其序列(SEQ ID NO:18)是：
gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggac。
因此，在本发明上下文中使用的适宜的第二启动子可以包含、基本上由或由SEQID NO:18组成。当然，显然第二启动子SEQ ID NO:18的功能性变体。在此上下文中，功能性变体表示可以采用给定序列的变体，只要该变体保留参考序列的功能即可。因此，来自SEQID NO:18的序列变体可用作本发明上下文中的第二启动子。此类变体可以与本文所示的示例性序列不同，通过保留与SEQ ID NO:18的约75％至约99％，如与SEQ ID NO:18的至少约75％，如至少约80％、或至少约90％、至少约95％或至少约99％的序列同一性。
此外，虽然U6启动子可用于驱动NF-κB/p65-shRNA的表达，但其他启动子也可适宜地用作第二个启动子。很多启动子是本领域普通技术人员公知的。优选地，可操作地连接以驱动κB/p65-shRNA表达的启动子应该在免疫细胞和营养不良的肌肉细胞中都具有活性。一些适宜的启动子的实例是聚合酶III启动子，如人H1和U6。
除了用于在心肌组织和骨骼组织中表达迷你肌营养不良蛋白基因和NF-κB/p65-shRNA基因两者的双重表达盒以外，用于本发明上下文中的AAV可以包含其他元件。例如，5’和3’反向末端重复序列(ITR)有助于将基因组包装到载体包装中。参见，Xiao等，J.Virol.1998；72(3):2224-32.PubMedPMID:9499080(其全部内容通过引用并入本文)。此类3’和5’ITR的序列是本领域普通技术人员公知的，但是例如包括：
ttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct(SEQ ID NO:19–5’ITR和)
aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaa(SEQ ID NO:20–3’ITR)。
此外，包含poly(A)信号序列可以增强载体的基因表达。参见，Bing Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,2000,97(25):13714-13719,PMID:11095710(其全部内容通过引用并入本文)。PolyA序列是本领域普通技术人员众所周知的，但一个适宜poly(A)的非限制性实例是tcgaggcctaataaagagctcagatgcatcgatcagagtgtgttggttttttgtgtgaga(SEQ IDNO:21)。在图5B和6B中描述了SEQ ID NO:1、23、25和26内这些序列的位置。包括在内的其他有用的遗传元件包括赋予抗生素抗性的基因，如氨苄青霉素，其通常在病毒包装细胞的培养过程中用于选择受感染的细胞以增加病毒滴度。
在本发明的上下文中，作为双重表达盒基因载体使用的AAV可以通过本领域普通技术人员公知的标准分子和细胞技术产生，所述双重表达盒基因载体包含用于在心肌组织和骨骼肌组织中表达迷你肌营养不良蛋白基因和NF-κB/p65-shRNA基因两者的表达盒。例如，可以通过标准分子技术工程化的包含所述双重表达盒和其他AAV序列的质粒。然后，可以使用质粒来产生病毒载体，例如，通过将其转染到适宜的包装细胞系中(如HEK293细胞或HEK 293T细胞，但可以使用其他细胞系)。可以从群体中选择转化体，例如通过将培养物暴露于针对其AAV载体基因组赋予抗性的化合物(例如，氨苄青霉素)。一旦细胞产生了AAV包装，就可以对其进行纯化(例如，使用CsCl梯度或通过本领域普通技术人员公知的其他方法)。随后，可以将其储存(例如，冻存)或配制以供使用。
在一个实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的基因载体(本文所述的AAV)和药学上可接受的载剂，所述基因载体包含用于在心肌组织和骨骼肌组织中表达迷你肌营养不良蛋白基因和NF-κB/p65-shRNA基因两者的表达盒。药学上可接受的载剂可以包括本领域普通技术人员公知的任何载剂。组合物的载剂可以是针对载体的任何适宜载剂。载剂通常将是液体并配制用于注射，但是也可以是固体，或者液体和固体组分的组合。理想的载剂是药学上可接受(例如，生理学或药学上可接受)的载剂(例如，赋形剂或稀释剂)。药学上可接受的载剂是众所周知和容易获得的。载剂的选择将至少部分地由用于给予组合物的特定载剂和特定方法决定。
该组合物还可包含任何其他适宜的组分，特别是用于增强组合物和/或其最终用途的稳定性。因此，本发明的组合物有多种适宜的制剂。以下制剂和方法仅仅是示例性的，绝对不是限制性的。
适用于胃肠外施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液或其他组织等渗的溶质，以及水性和非水性无菌混悬剂，其可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封容器中，如安瓿和小瓶，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，只需在使用前立即添加无菌液体赋形剂，例如注射用水。
此外，组合物可以包含另外的治疗剂或生物活性剂。例如，可以存在用于治疗特定适应症的治疗因素。控制炎症的因素，如布洛芬或类固醇，可以是组合物的一部分，以减少与体内施用载体和生理不适相关的肿胀和炎症。免疫系统抑制剂可以与组合方法一起施用以减少对载体本身或与病症相关的任何免疫应答。或者，组合物中可包含免疫增强剂以上调身体对疾病的天然防御。可以存在抗生素(即，杀微生物剂和杀真菌剂)，以降低与基因转移程序和其他病症相关的感染风险。
在一个实施方式中，本发明还提供了一种用于改善杜氏肌营养不良症(DMD)的方法，所述方法包括将如本文所述的基因载体(AAV)或药物组合物以可改善DMD的量和位置施用给患有DMD或有发生DMD风险的患者或受试者。在这种情况下，患者或受试者通常是人(例如，患有并接受DMD治疗的患者或临床试验的受试者)。然而，该方法还可以应用于非人动物的基因表达评估或DMD动物模型的评估。此类非人动物通常是实验室研究中常用的动物(例如，小鼠、大鼠、狗、非人灵长类等)。
在实施该方法时，基因载体或药物组合物通常通过胃肠外(例如，腹腔内、静脉内、肌内等)注射施用。然而，其他递送途径可能适合并被治疗医师或临床试验方案采用。
在执行本发明的方法中递送的病毒颗粒的量可以由医师或实验室研究人员确定并且可以取决于受试者的体型或受试者或患者的物种。然而，应该递送足够的基因载体(AAV)以感染心脏和骨骼肌，以导致双重表达盒从本发明的基因载体表达。对于实验室研究，如在以下实施例中所报告的，腹腔注射1011个AAV基因组，尽管比这少一点可能就足够了。然而，对于人类患者或受试者，更高数量的AAV基因组可能是必需的或所需的。例如，在实施本发明方法时，可以使用至少108个AAV基因组、或至少109个AAV基因组、或至少1010个AAV基因组、或至少1011个AAV基因组、或至少1012个AAV基因组、或至少1013个AAV基因组、或至少1014个AAV基因组(或至少“约”此类数量的AAV基因组)。尽管施用于患者或受试者的AAV基因组的上限可能部分取决于药物组合物的配制浓度，但是施用高达1020个AAV基因组、或高达1019个AAV基因组、或高达1018个AAV基因组、或高达1017个AAV基因组、或高达1016个AAV基因组、或高达1020个AAV基因组(或高达“约”此类数量的AAV基因组)可能是适宜的。可以使用更多或更少数量的AAV基因组；剂量最终由医师、实验室研究人员或临床试验方案决定。通常的剂量是2x1010-1x1011个病毒基因组/kg(患者身体)(参见，DS,Mol.Ther.2018,26:2337-2356，表4，其全部内容通过引用并入本文)。
以下实施例进一步说明本发明，但当然不应被解释为以任何方式限制其范围。
实施例
在下述实施例中，产生了一个此类双重表达盒AAV载体，其具有驱动人密码子优化的迷你肌营养不良蛋白基因的经修饰的MCK增强子(Mcken)和肌肉特异性合成启动子(Syn)(Wang,2008 Gene Therapy，和Kornegay,2010 Molecular Therapy)。如通过在心肌中的高水平表达所证实的，这保证了在严重DMD小鼠模型的全身肌肉中迷你肌营养不良蛋白基因的有效和特异性表达，所述小鼠模型是肌营养不良蛋白/抗肌萎缩蛋白相关蛋白双重敲除(dys-/-:utro-/-,dKO-homo)小鼠。这种双重治疗方法还导致慢性炎症的有效抑制，特别是在这种严重DMD模型的骨骼肌中。
接下来，通过Tg.dKO-het(dys-/-:utro+/-).p65+/-小鼠的杂交，获得了Tg.dKO-homo.p65+/+和Tg.dKO-homo.p65+/-小鼠两者。还观察到，在严重DMD小鼠模型中，NF-κB的p65亚基(p65+/-)的遗传消融与转基因人迷你肌营养不良蛋白基因的协同治疗效果是有益的，且没有毒性。
总之，具有双重表达盒的新型AAV载体包含用于肌肉特异性肌营养不良蛋白基因表达的紧凑启动子和用于抗炎的NF-κB的特异性shRNA，其可以提高DMD基因疗法的治疗有效性和安全性。
实施例1
该实施例证明了通过设计驱动人密码子优化的迷你肌营养不良蛋白基因的经修饰的MCK增强子(Mcken)和肌肉特异性合成启动子(Syn)优化双重表达盒AAV载体(Wang,2008 and Kornegay,2010)。这确保在严重DMD小鼠模型的全身肌肉中，特别是在心肌中，迷你肌营养不良蛋白基因的有效和特异性表达。这种双重治疗方法还导致慢性炎症的有效抑制，特别是在骨骼肌中。
方法
在本研究中，IACUC方案被批准用于所有小鼠品系。野生型(WT,C57/BL10)小鼠购自Jackson Laboratory。肌营养不良蛋白/抗肌萎缩蛋白相关蛋白双重敲除(dys-/-:utro-/-,dKO-homo)小鼠来自通过杂合子肌营养不良蛋白/抗肌萎缩蛋白相关蛋白双重敲除小鼠(dys-/-:utro+/-)杂交的内部群体。如图1A所示，迷你肌营养不良蛋白AAV载体的单一表达盒的产生，即将由计算机密码子优化的迷你肌营养不良蛋白基因(包括N末端、5个棒状结构域(1、2、22、23、24)、3个铰链结构域(1、3、4)和CR末端)克隆进入单一AAV载体，并由MCK修饰的增强子调控的肌肉合成启动子驱动。基于已发表的功能性小鼠NF-κB/p65 mRNA序列(Yang,2012)，设计了两种形式(m1和m2)的由U6启动子驱动的小鼠p65/shRNA，并分别克隆至单一表达盒pAAV(ss)-Mcken-Syn-hOptiDys3978(Kornegay,2010)。通过CsCl梯度超速离心纯化质粒。一种这样的质粒pAAV-M1p65EnsynOpti3978示意性地描述在图5A和5B中，并且其序列如SEQ ID NO:1中所示。
根据Yang,2012，通过共转染在293细胞中包装AAV9载体，并通过两次CsCl梯度超速离心纯化。向5日龄的dKO-homo幼崽进行使用50μl(1x1011个病毒基因组颗粒)病毒的单次腹腔内注射，并在8周龄时分析心肌和骨骼肌以及肝脏组织的冰冻切片。将切片用于使用针对人肌营养不良蛋白(棒状结构域1&2)、磷酸化的NF-κB/p65(#8242,Cell Signaling)、CD4(BD550280,BD Biosciences)、CD8(ab22378,Abcam)、CD68(#9936,Cell Signaling)、ColIV(ab6586,Abcam)抗体的免疫荧光(IF)染色。还使用DAPI对细胞核染色(蓝色)。图像是在200X放大倍数下拍摄。
结果
如图1B所示，通过western印迹测定检测心肌，观察到在WT小鼠中全长肌营养不良蛋白(450kDa)以及在使用单一或双重表达盒载体治疗的dKO-homo小鼠中迷你肌营养不良蛋白(150kDa)的有效表达。肌营养不良蛋白的IF染色也证实了在心脏和骨骼肌组织(膈肌、腓肠肌和胫前肌)中肌肉靶向基因递送的特异性，如在肝组织中未表达肌营养不良蛋白所证实的(图1C和图1D)。在使用单一或双重表达盒载体治疗的小鼠之间在心脏和膈肌组织中肌营养不良蛋白阳性细胞比例没有差异(图1E)。但是，使用双重表达盒载体治疗的小鼠在腓肠肌和胫骨前肌中具有高得多的迷你肌营养不良蛋白表达(图1E)。
结果表明，双重表达盒AAV载体治疗的骨骼肌炎症减少，这表明单一AAV载体将抗肌营养不良蛋白基因置换与抗炎组合可以实现协同效应。
通过p-P65对腓肠肌(GAS)进行IF染色，以确定活性NF-κB、CD4和CD8的水平以评价免疫细胞浸润，以及CD68以检测炎性巨噬细胞。如在图2A中所示，与使用单一表达盒AAV治疗相比，使用双重表达盒AAV治疗的GAS肌肉通过减少NF-κB显示出较少的炎症标志物，如CD4、CD8和CD68。WT GAS在肌肉中未显示出炎症。然而，未治疗的dKO-homo的GAS具有显著的炎症。图2B显示了在心肌和GAS中p-P65的IF染色。在心脏组织中，在所有组中几乎无阳性细胞。但是，在GAS肌肉中，与单一-homo和未治疗homo小鼠(Ct-homo)组相比，双重-homo组显示出低的多的p-P65。
这些结果表明，与单一表达盒AAV治疗或无治疗相比，在通过双重表达盒AAV治疗的骨骼肌中观察到活性NF-κB(p-P65)的显著降低。与在mdx/utrn-/-小鼠的骨骼肌中不同的是，无论是使用双重表达盒AAV治疗还是单一表达盒AAV治疗或无治疗的小鼠中，在心肌组织中活性NF-κB(p-P65)无显著差异。
讨论
考察了通过单一AAV载体将肌肉靶向基因置换与NF-κB抑制组合的全身性作用，确保了在全身肌肉中计算机密码子优化的人迷你肌营养不良蛋白的充分表达和炎症降低。这些结果表明，具有双重表达盒的新型AAV载体可以增强在临床试验或其他方面中DMD基因疗法的治疗效率和安全性，所述双重表达盒包含用于肌肉特异性肌营养不良基因表达的紧凑启动子和用于抗炎的NF-κB的特异性shRNA。
实施例2
本实施例表明，在严重DMD小鼠模型(dys-/-:utro-/-,dKO-homo)中NF-κB(p65+/-)的p65亚基的基因消融与转基因人迷你肌营养不良蛋白基因的协同治疗作用可能是有益的。
方法
在本研究中，IACUC方案被批准用于所有小鼠品系。野生型(WT,C57/BL10)和mdx(dys-/-)小鼠购自Jackson Laboratory。mdx.p65+/-和人迷你肌营养不良蛋白(DysΔ3990).mdx(Tg.mdx)小鼠(Yin,2017和Wang,2000)来自内部群体。Tg.dKO-het(dys-/-:utro+/-).p65+/-小鼠杂交，获得了Tg.dKO-homo.p65+/+和Tg.dKO-homo.p65+/-小鼠两者(图3A)。
使用2月龄小鼠的腓肠肌(GAS)制备冰冻切片。将切片用于苏木素和伊红(H&E)以及Masson三色染色。还使用针对人肌营养不良蛋白(棒状结构域1&2)、β-肌聚糖(NCL-a-SARC,Leica)、磷酸化的NF-κB/p65(#8242,Cell Signaling)、CD68(#9936,CellSignaling)、CD4(BD550280,BD Biosciences)、CD8(ab22378,Abcam)、ColIV(ab6586,Abcam)和小鼠IgG(mIgG)(C2181,Sigma)抗体对切片进行免疫荧光(IF)染色。使用DAPI对细胞核染色。在200X放大倍数采集图像。通过Western印迹分析检测蛋白表达，使用针对GAPDH的抗体作为内参。使用GraphiPad Prism 7软件进行统计学分析。所有结果均以平均值±SD表示(每组n≥4)。当P值<0.05时，认为差异具有统计学显著性。
结果
如图3B中所示，检测到在WT中全长肌营养不良蛋白(450kDa)或在Tg小鼠中迷你肌营养不良蛋白(150kDa)的高水平表达。在p65敲除背景下(Tg.dKO-homo.p65+/+vs Tg.dKO-homo.p65+/-；dKO-homo.p65+/+vs dKO-homo.p65+/-)发现磷酸化NF-κB(65kDa)的显著降低。在图3C中，在迷你肌营养不良蛋白转基因DMD小鼠中还发现了高水平的肌营养不良蛋白或肌营养不良蛋白相关蛋白(β-肌聚糖)，以及在H&E染色中肌细胞形态的改善。
此外，将mIgG、CD68、CD4和CD8的Masson三色染色和IF染色应用于分析肌肉纤维化、坏死和炎症。在图4A中的结果表明在p65敲减背景下(特别是Tg.dKO-homo.p65+/-vsTg.dKO-homo.p65+/+)细胞形态改善，以及纤维化、坏死和炎症减少，表明NF-κB/p65亚基的基因消融能够降低炎症水平。
如图4B中所示，对在2月龄时GAS肌肉(Tg.dKO-homo.p65+/+vs Tg.dKO-homo.p65+/-；dKO-homo.p65+/+vs dKO-homo.p65+/-)中CD68,CD4and CD8的IF染色的统计学分析表明，从每组共计200个细胞计算得出，p65亚基的基因减少能够显著降低免疫细胞的纤维化、坏死和浸润水平。在WT小鼠中未观察到炎症，且与mdx小鼠相比未治疗的dKO-homo GAS肌肉显示出更高的炎症水平(图4A和4B)，这与此前观察到的结果一致(Mu,2015)。
如图4C中所示，与在mdx/utrn-/-小鼠中的骨骼肌不同的是，无论小鼠使用双重表达盒AAV或单一表达盒AAV治疗或未治疗，在心肌中CD68+巨噬细胞无显著性差异。。而相反的是，与单一表达盒AAV相比，在使用双重表达盒AAV治疗的骨骼肌中观察到CD4+和CD8+免疫细胞和CD68+巨噬细胞的显著减少。
图4D显示了通过双重表达盒AAV和单一表达盒AAV治疗的全身治疗mdx/utrn-/-小鼠总体健康状况和肌肉功能的比较。当在1月龄和2月龄时使用0至200Hz频率对肌肉功能检测时，在1月龄时在200Hz下这两个治疗组均显示出显著改善，但是双重表达盒AAV和单一表达盒AAV治疗相比无差异。然而，在晚龄(如2个月)时在200Hz下与单一表达盒AAV相比双重表达盒AAV治疗显示出协同作用。
此外，在双重表达盒AAV治疗组观察到早期出现(在1月龄)体重改善，并且在2月龄时观察到通过双重表达盒AAV和单一表达盒AAV治疗的mdx/utrn-/-小鼠的体重改善。
讨论
该实施例表明，在严重DMD小鼠模型中转基因和NF-κB/p65敲低的基因置换和抗炎作用的有效性。这些结果揭示了在dKO-homo小鼠背景下迷你肌营养不良蛋白表达与NF-kB/p65敲除一起能够改善肌肉形态，减少纤维化、化合物和炎症。这些结果意味着NF-κB的基因减少可能会增强其在大型动物和临床试验中迷你肌营养不良蛋白基因疗法的有效性，强调了可以将其用于通过肌营养不良蛋白基因置换与抗炎组合对DMD患者的基因疗法。
在此引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，都以相同的程度通过引用并入本文，就好像每个参考文献被单独地和具体地指示为通过引用并入并在此整体阐述一样。其中包括但不限于以下参考文献：
·Acharyya,et al.J.Clin.Invest.,2007,Apr.；117(4):889-901
·Bing Wang,et al.,Journal of Orthopaedic Research,2009,27:4,421-42,.PMID:18973234
·Bing Wang,et al.,Gene Ther.,2008,15:1489-1499,PMID:18563184,
·Bing Wang,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.,2000,97(25):13714-13719,PMID:11095710,
·Duan,DS,Mol.Ther.2018,26:2337-2356,
·Lee,Ui Jin et al,.Mol Biol Rep(2008)35:291–298
·Jayandharan,et al.,PNAS(USA),2011,Mar.1；108(9):3743-8,
·Jutooru,Indira et al..J.Biol.Chem.(2010),285:25332–25344
·Kornegay JN,et al..Molecular Therapy.2010,18(8):1501-1508,PMID:20517298,
·Mendell,et al.,N.Engl.J.Med.2010 Oct 7；363(15):1429-37,
·Qing Yang,et al.Gene Ther.2012,19:1196-1204,PubMedPMID:22278411,
·Ying Tang,et al.Gene Ther.2010,17:1476-1483,PubMed PMID:20720575,
·Xi Yin,et al.Muscle Nerve.2017,56:759-767,
·Xiao,et al.,J.Virol.1998；72(3):2224-32.PubMed PMID:9499080，和
·Xiaodong Mu,et al.Human Mol.Genet.2015,24:2923-2937。
在描述本发明的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)，术语“一个(a)”和“一种(an)”和“所述(the)”和“至少一个”以及类似指代的使用应被解释为涵盖以下两个方面：单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。使用术语“至少一个”后跟一个或多个项目的列表(例如，“A和B中的至少一个”)应被解释为表示从所列项目(A或B)中选择的一个项目或者两个或多个所列项目(A和B)的任何组合，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，否则术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”应被解释为开放式术语(即，意为“包括但不限于”)。除非本文另有说明，否则本文中对值范围的引用仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且将每个单独值并入说明书中，就好像其在本文中单独引用一样。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法都可以任何合适的顺序进行。除非另有声明，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明而不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
本文描述了本发明的优选实施方式，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。通过阅读上述描述，那些优选实施方式的变化对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。发明人期望技术人员适当地采用这种变化，并且发明人打算以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括在适用法律允许的情况下所附权利要求中记载的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素的所有可能变化形式的任何组合。
序列表
<110> 联邦高等教育系统-匹兹堡大学
<120> 通过基因置换和抗炎的针对杜氏肌营养不良的一步基因疗法
<130> 747154
<160> 27
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 9249
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
aattcccatc atcaataata taccttattt tggattgaag ccaatatgat aatgaggggg 60
tggagtttgt gacgtggcgc ggggcgtggg aacggggcgg gtgacgtagt agtctctaga 120
ggtccccagc gaccttgacg ggcatctgcc cggcatttct gacagctttg tgaactgggt 180
ggccgagaag gaatgggagt tgccgccaga ttctgacatg gatctgaatc tgattgagca 240
ggcacccctg accgtggccg agaagctgca tcgctggcgt aatagcgaag aggcccgcac 300
cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggaattcca gacgattgag 360
cgtcaaaatg taggtatttc catgagcgtt tttcctgttg caatggctgg cggtaatatt 420
gttctggata ttaccagcaa ggccgatagt ttgagttctt ctactcaggc aagtgatgtt 480
attactaatc aaagaagtat tgcgacaacg gttaatttgc gtgatggaca gactctttta 540
ctcggtggcc tcactgatta taaaaacact tctcaggatt ctggcgtacc gttcctgtct 600
aaaatccctt taatcggcct cctgtttagc tcccgctctg attctaacga ggaaagcacg 660
ttatacgtgc tcgtcaaagc aaccatagta cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc 720
gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc 780
tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa 840
tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact 900
tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt 960
gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa 1020
ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt 1080
aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac 1140
aatttaaata tttgcttata caatcttcct gtttttgggg cttttctgat tatcaaccgg 1200
ggtacatatg attgacatgc tagttttacg attaccgttc atcgcctgca gggggggggg 1260
ggggggggtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa 1320
aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag 1380
agggagtggc caactccatc actaggggtt cctagatctg aattcgagct tgccacgcat 1440
gcgggcagga agagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 1500
ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 1560
cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 1620
tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 1680
tgtggaaagg acgaggatcc tgtgtccatt gtctcactcc tcgaggagtg agacaatgga 1740
cacatttttt tgaattccac tacgggtcta ggctgcccat gtaaggaggc aaggcctggg 1800
gacacccgag atgcctggtt ataattaacc ccaacacctg ctgccccccc ccccccaaca 1860
cctgctgcct gagcctgagc ggttacccca ccccggtgcc tgggtcttag gctctgtaca 1920
ccatggagga gaagctcgct ctaaaaataa ccctgtccct ggtggatccc ctgcatgcgg 1980
ccgtccgccc tcggcaccat tcctcacgac accgaaatat ggcgacgggt gaggaatggt 2040
ggggagttat ttttagagcg gtgaggaatg gtgggcaggc agcaggtgtt gggggagtta 2100
tttttagagc ggggagttat ttttagagcg gtgaggaatg gtggacaccg aaatatggcg 2160
acgggtgagg aatggtgccg tcgccatatt tgggtgtccc gtccgccctc ggccggggcc 2220
gcattcctgg gggccgggcg gtgctcccgc ccgcctcgat aaaaggctcc ggggccggcg 2280
gcggcccact cgagacgttg taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta 2340
tagggcgaat tgggtaccgc caccatggtg tggtgggagg aagtggagga ctgctacgag 2400
agagaggacg tgcagaagaa aaccttcacc aagtgggtga acgcccagtt cagcaagttc 2460
ggcaagcagc acatcgagaa cctgttcagc gacctgcagg atggcaggag actgctggac 2520
ctgctggagg gcctgaccgg ccagaagctg cccaaggaga agggcagcac cagagtgcac 2580
gccctgaaca acgtgaacaa ggccctgaga gtgctgcaga acaacaacgt ggacctggtg 2640
aacatcggca gcaccgacat cgtggacggc aaccacaagc tgaccctggg cctgatctgg 2700
aacatcatcc tgcactggca ggtgaagaac gtgatgaaga acatcatggc cggcctgcag 2760
cagaccaaca gcgagaagat cctgctgagc tgggtgaggc agagcaccag aaactacccc 2820
caggtgaacg tgatcaactt caccacctcc tggagcgacg gcctggccct gaacgccctg 2880
atccacagcc acagacccga cctgttcgac tggaacagcg tggtgtgtca gcagagcgcc 2940
acccagagac tggagcacgc cttcaacatc gccagatacc agctgggcat cgagaagctg 3000
ctggaccccg aggacgtgga caccacctac cccgacaaga aaagcatcct catgtacatt 3060
accagcctgt tccaggtgct gccccagcag gtgtccatcg aggccatcca ggaagtggaa 3120
atgctgccca ggccccccaa agtgaccaag gaggagcact tccagctgca ccaccagatg 3180
cactacagcc agcagatcac agtgagcctg gcccagggct atgagagaac cagcagcccc 3240
aagcccagat tcaagagcta cgcctacacc caggccgcct acgtgaccac ctccgacccc 3300
accagaagcc ccttccccag ccagcacctg gaggcccccg aggacaagag cttcggcagc 3360
agcctgatgg agagcgaagt gaacctggac agataccaga ccgccctgga ggaagtgctg 3420
tcctggctgc tgagcgccga ggacaccctg caggcccagg gcgagatcag caacgacgtg 3480
gaagtggtga aggaccagtt ccacacccac gagggctaca tgatggatct gaccgcccac 3540
cagggcagag tgggcaatat cctgcagctg ggcagcaagc tgatcggcac cggcaagctg 3600
agcgaggacg aggagaccga agtgcaggag cagatgaacc tgctgaacag cagatgggag 3660
tgcctgagag tggccagcat ggagaagcag agcaacctgc acagagtgct gatggacctg 3720
cagaaccaga agctgaagga gctgaacgac tggctgacca agaccgagga gcggaccaga 3780
aagatggagg aggagcccct gggccccgac ctggaggacc tgaagagaca ggtgcagcag 3840
cacaaagtgc tgcaggagga cctggagcag gagcaggtgc gcgtgaacag cctgacccac 3900
atggtggtgg tcgtggacga gagcagcggc gaccacgcca cagccgccct ggaagagcag 3960
ctgaaagtgc tgggcgacag atgggccaat atttgtaggt ggaccgagga cagatgggtg 4020
ctgctgcagg accagcccga cctggcccct ggcctgacca ccatcggcgc cagccccacc 4080
cagaccgtga ccctggtgac ccagcccgtg gtgacaaagg agaccgccat cagcaagctg 4140
gagatgccca gctccctgat gctggaagtg cccacccacc gcctgctcca gcagttcccc 4200
ctggacctgg agaagttcct ggcctggctg accgaggccg aaaccaccgc caatgtgctc 4260
caggacgcca ctagaaagga gaggctgctg gaggacagca agggcgtgaa agagctgatg 4320
aagcagtggc aggatctgca gggcgaaatc gaggcccaca ccgacgtgta ccacaacctg 4380
gacgagaaca gccagaagat tctgaggagc ctggagggca gcgacgacgc cgtcctgctc 4440
cagaggaggc tggacaacat gaacttcaag tggagcgagc tgcggaagaa gagcctgaac 4500
atccggagcc acctggaagc cagcagcgac cagtggaaga gactgcacct gagcctgcag 4560
gagctgctgg tgtggctgca gctgaaggac gacgagctga gcagacaggc ccccatcggc 4620
ggcgacttcc ccgccgtgca gaagcagaac gacgtgcacc gggccttcaa gagggagctg 4680
aaaaccaagg aacccgtgat catgagcacc ctggagacag tgcggatctt cctgaccgag 4740
cagcccctgg agggactgga gaagctgtac caggagccca gagagctgcc ccccgaggag 4800
agagcccaga acgtgaccag gctgctgaga aagcaggccg aggaagtgaa taccgagtgg 4860
gagaagctga atctgcacag cgccgactgg cagagaaaga tcgacgagac cctggagaga 4920
ctccaggaac tgcaggaagc caccgacgag ctggacctga agctgagaca ggccgaagtg 4980
atcaagggca gctggcagcc tgtgggcgat ctgctgatcg actccctgca ggatcacctg 5040
gagaaagtga aggccctgcg gggcgagatc gcccccctga aggagaatgt gagccacgtg 5100
aacgacctgg ccagacagct gaccaccctg ggcatccagc tgagccccta caacctgagc 5160
acactggagg atctgaacac ccggtggaaa ctgctgcagg tggccgtgga ggatagagtg 5220
aggcagctgc acgaagccca cagagacttc ggccctgcct cccagcactt cctgagcacc 5280
agcgtgcagg gcccctggga gagagccatc tcccccaaca aagtgcccta ctacatcaac 5340
cacgagaccc agaccacctg ctgggaccac cctaagatga ccgagctgta tcagagcctg 5400
gccgacctga acaatgtgcg gttcagcgcc tacagaaccg ccatgaagct gcggagactg 5460
cagaaggccc tgtgcctgga tctgctgagc ctgagcgccg cctgcgacgc cctggaccag 5520
cacaacctga agcagaatga ccagcccatg gacatcctgc agatcatcaa ctgcctgacc 5580
acaatctacg accggctgga acaggagcac aacaacctgg tgaatgtgcc cctgtgcgtg 5640
gacatgtgcc tgaattggct gctgaacgtg tacgacaccg gcaggaccgg cagaatccgc 5700
gtgctgagct tcaagaccgg catcatcagc ctgtgcaagg cccacctgga ggataagtac 5760
cgctacctgt tcaagcaggt ggccagcagc accggcttct gcgatcagag gagactgggc 5820
ctgctgctgc acgatagcat ccagatccct aggcagctgg gcgaagtggc cagctttggc 5880
ggcagcaaca tcgagccctc tgtgaggagc tgcttccagt tcgccaacaa caagcccgag 5940
atcgaggccg ccctgttcct ggactggatg aggctggagc ctcagagcat ggtgtggctg 6000
cctgtgctgc acagagtggc cgccgccgag accgccaagc accaggccaa gtgcaatatc 6060
tgcaaggagt gccccatcat cggcttccgg tacaggagcc tgaagcactt caactacgac 6120
atctgccaga gctgcttttt cagcggcaga gtggccaagg gccacaaaat gcactacccc 6180
atggtggagt actgcacccc caccacctcc ggcgaggatg tgagagactt cgccaaagtg 6240
ctgaagaata agttccggac caagcggtac tttgccaagc accccaggat gggctacctg 6300
cccgtgcaga ccgtgctgga aggcgacaac atggagacct gatgaggagc tcgaggccta 6360
ataaagagct cagatgcatc gatcagagtg tgttggtttt ttgtgtgaga tctaggaacc 6420
cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg 6480
ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg 6540
cagagaggga gtggccaacc cccccccccc cccccctgca ggcgattctc ttgtttgctc 6600
cagactctca ggcaatgacc tgatagcctt tgtagagacc tctcaaaaat agctaccctc 6660
tccggcatga atttatcagc tagaacggtt gaatatcata ttgatggtga tttgactgtc 6720
tccggccttt ctcacccgtt tgaatcttta cctacacatt actcaggcat tgcatttaaa 6780
atatatgagg gttctaaaaa tttttatcct tgcgttgaaa taaaggcttc tcccgcaaaa 6840
gtattacagg gtcataatgt ttttggtaca accgatttag ctttatgctc tgaggcttta 6900
ttgcttaatt ttgctaattc tttgccttgc ctgtatgatt tattggatgt tggaattcct 6960
gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat ggtgcactct 7020
cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc 7080
tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt 7140
ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa 7200
gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac 7260
gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 7320
acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg 7380
aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc 7440
attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga 7500
tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga 7560
gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg 7620
cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc 7680
tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac 7740
agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact 7800
tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca 7860
tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg 7920
tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact 7980
acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg 8040
accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg 8100
tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat 8160
cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc 8220
tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat 8280
actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt 8340
tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc 8400
cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 8460
gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac 8520
tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt 8580
gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 8640
gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 8700
ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 8760
acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg 8820
agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt 8880
cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 8940
tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg 9000
gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc 9060
ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc 9120
ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag 9180
cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca 9240
ttaatgcag 9249
<210> 2
<211> 3978
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
atggtgtggt gggaggaagt ggaggactgc tacgagagag aggacgtgca gaagaaaacc 60
ttcaccaagt gggtgaacgc ccagttcagc aagttcggca agcagcacat cgagaacctg 120
ttcagcgacc tgcaggatgg caggagactg ctggacctgc tggagggcct gaccggccag 180
aagctgccca aggagaaggg cagcaccaga gtgcacgccc tgaacaacgt gaacaaggcc 240
ctgagagtgc tgcagaacaa caacgtggac ctggtgaaca tcggcagcac cgacatcgtg 300
gacggcaacc acaagctgac cctgggcctg atctggaaca tcatcctgca ctggcaggtg 360
aagaacgtga tgaagaacat catggccggc ctgcagcaga ccaacagcga gaagatcctg 420
ctgagctggg tgaggcagag caccagaaac tacccccagg tgaacgtgat caacttcacc 480
acctcctgga gcgacggcct ggccctgaac gccctgatcc acagccacag acccgacctg 540
ttcgactgga acagcgtggt gtgtcagcag agcgccaccc agagactgga gcacgccttc 600
aacatcgcca gataccagct gggcatcgag aagctgctgg accccgagga cgtggacacc 660
acctaccccg acaagaaaag catcctcatg tacattacca gcctgttcca ggtgctgccc 720
cagcaggtgt ccatcgaggc catccaggaa gtggaaatgc tgcccaggcc ccccaaagtg 780
accaaggagg agcacttcca gctgcaccac cagatgcact acagccagca gatcacagtg 840
agcctggccc agggctatga gagaaccagc agccccaagc ccagattcaa gagctacgcc 900
tacacccagg ccgcctacgt gaccacctcc gaccccacca gaagcccctt ccccagccag 960
cacctggagg cccccgagga caagagcttc ggcagcagcc tgatggagag cgaagtgaac 1020
ctggacagat accagaccgc cctggaggaa gtgctgtcct ggctgctgag cgccgaggac 1080
accctgcagg cccagggcga gatcagcaac gacgtggaag tggtgaagga ccagttccac 1140
acccacgagg gctacatgat ggatctgacc gcccaccagg gcagagtggg caatatcctg 1200
cagctgggca gcaagctgat cggcaccggc aagctgagcg aggacgagga gaccgaagtg 1260
caggagcaga tgaacctgct gaacagcaga tgggagtgcc tgagagtggc cagcatggag 1320
aagcagagca acctgcacag agtgctgatg gacctgcaga accagaagct gaaggagctg 1380
aacgactggc tgaccaagac cgaggagcgg accagaaaga tggaggagga gcccctgggc 1440
cccgacctgg aggacctgaa gagacaggtg cagcagcaca aagtgctgca ggaggacctg 1500
gagcaggagc aggtgcgcgt gaacagcctg acccacatgg tggtggtcgt ggacgagagc 1560
agcggcgacc acgccacagc cgccctggaa gagcagctga aagtgctggg cgacagatgg 1620
gccaatattt gtaggtggac cgaggacaga tgggtgctgc tgcaggacca gcccgacctg 1680
gcccctggcc tgaccaccat cggcgccagc cccacccaga ccgtgaccct ggtgacccag 1740
cccgtggtga caaaggagac cgccatcagc aagctggaga tgcccagctc cctgatgctg 1800
gaagtgccca cccaccgcct gctccagcag ttccccctgg acctggagaa gttcctggcc 1860
tggctgaccg aggccgaaac caccgccaat gtgctccagg acgccactag aaaggagagg 1920
ctgctggagg acagcaaggg cgtgaaagag ctgatgaagc agtggcagga tctgcagggc 1980
gaaatcgagg cccacaccga cgtgtaccac aacctggacg agaacagcca gaagattctg 2040
aggagcctgg agggcagcga cgacgccgtc ctgctccaga ggaggctgga caacatgaac 2100
ttcaagtgga gcgagctgcg gaagaagagc ctgaacatcc ggagccacct ggaagccagc 2160
agcgaccagt ggaagagact gcacctgagc ctgcaggagc tgctggtgtg gctgcagctg 2220
aaggacgacg agctgagcag acaggccccc atcggcggcg acttccccgc cgtgcagaag 2280
cagaacgacg tgcaccgggc cttcaagagg gagctgaaaa ccaaggaacc cgtgatcatg 2340
agcaccctgg agacagtgcg gatcttcctg accgagcagc ccctggaggg actggagaag 2400
ctgtaccagg agcccagaga gctgcccccc gaggagagag cccagaacgt gaccaggctg 2460
ctgagaaagc aggccgagga agtgaatacc gagtgggaga agctgaatct gcacagcgcc 2520
gactggcaga gaaagatcga cgagaccctg gagagactcc aggaactgca ggaagccacc 2580
gacgagctgg acctgaagct gagacaggcc gaagtgatca agggcagctg gcagcctgtg 2640
ggcgatctgc tgatcgactc cctgcaggat cacctggaga aagtgaaggc cctgcggggc 2700
gagatcgccc ccctgaagga gaatgtgagc cacgtgaacg acctggccag acagctgacc 2760
accctgggca tccagctgag cccctacaac ctgagcacac tggaggatct gaacacccgg 2820
tggaaactgc tgcaggtggc cgtggaggat agagtgaggc agctgcacga agcccacaga 2880
gacttcggcc ctgcctccca gcacttcctg agcaccagcg tgcagggccc ctgggagaga 2940
gccatctccc ccaacaaagt gccctactac atcaaccacg agacccagac cacctgctgg 3000
gaccacccta agatgaccga gctgtatcag agcctggccg acctgaacaa tgtgcggttc 3060
agcgcctaca gaaccgccat gaagctgcgg agactgcaga aggccctgtg cctggatctg 3120
ctgagcctga gcgccgcctg cgacgccctg gaccagcaca acctgaagca gaatgaccag 3180
cccatggaca tcctgcagat catcaactgc ctgaccacaa tctacgaccg gctggaacag 3240
gagcacaaca acctggtgaa tgtgcccctg tgcgtggaca tgtgcctgaa ttggctgctg 3300
aacgtgtacg acaccggcag gaccggcaga atccgcgtgc tgagcttcaa gaccggcatc 3360
atcagcctgt gcaaggccca cctggaggat aagtaccgct acctgttcaa gcaggtggcc 3420
agcagcaccg gcttctgcga tcagaggaga ctgggcctgc tgctgcacga tagcatccag 3480
atccctaggc agctgggcga agtggccagc tttggcggca gcaacatcga gccctctgtg 3540
aggagctgct tccagttcgc caacaacaag cccgagatcg aggccgccct gttcctggac 3600
tggatgaggc tggagcctca gagcatggtg tggctgcctg tgctgcacag agtggccgcc 3660
gccgagaccg ccaagcacca ggccaagtgc aatatctgca aggagtgccc catcatcggc 3720
ttccggtaca ggagcctgaa gcacttcaac tacgacatct gccagagctg ctttttcagc 3780
ggcagagtgg ccaagggcca caaaatgcac taccccatgg tggagtactg cacccccacc 3840
acctccggcg aggatgtgag agacttcgcc aaagtgctga agaataagtt ccggaccaag 3900
cggtactttg ccaagcaccc caggatgggc tacctgcccg tgcagaccgt gctggaaggc 3960
gacaacatgg agacctga 3978
<210> 3
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
atggtgtggt gggaggaagt ggaggactgc tacgagagag aggacgtgca gaagaaaacc 60
ttcaccaagt gggtgaacgc ccagttcagc aagttcggca agcagcacat cgagaacctg 120
ttcagcgacc tgcaggatgg caggagactg ctggacctgc tggagggcct gaccggccag 180
aagctgccca aggagaaggg cagcaccaga gtgcacgccc tgaacaacgt gaacaaggcc 240
ctgagagtgc tgcagaacaa caacgtggac ctggtgaaca tcggcagcac cgacatcgtg 300
gacggcaacc acaagctgac cctgggcctg atctggaaca tcatcctgca ctggcaggtg 360
aagaacgtga tgaagaacat catggccggc ctgcagcaga ccaacagcga gaagatcctg 420
ctgagctggg tgaggcagag caccagaaac tacccccagg tgaacgtgat caacttcacc 480
acctcctgga gcgacggcct ggccctgaac gccctgatcc acagccacag acccgacctg 540
ttcgactgga acagcgtggt gtgtcagcag agcgccaccc agagactgga gcacgccttc 600
aacatcgcca gataccagct gggcatcgag aagctgctgg accccgagga cgtggacacc 660
acctaccccg acaagaaaag catcctcatg tacattacca gcctgttcca ggtgctgccc 720
cagcaggtgt ccatcgaggc catccaggaa gtggaa 756
<210> 4
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
atgctgccca ggccccccaa agtgaccaag gaggagcact tccagctgca ccaccagatg 60
cactacagcc agcagatcac agtgagcctg gcccagggct atgagagaac cagcagcccc 120
aagcccagat tcaagagcta cgcctacacc caggccgcct acgtgaccac ctccgacccc 180
accagaagcc ccttccccag ccagcacctg gaggcccccg aggac 225
<210> 5
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
agcgaagtga acctggacag ataccagacc gccctggagg aagtgctgtc ctggctgctg 60
agcgccgagg acaccctgca ggcccagggc gagatcagca acgacgtgga agtggtgaag 120
gaccagttcc acacccacga gggctacatg atggatctga ccgcccacca gggcagagtg 180
ggcaatatcc tgcagctggg cagcaagctg atcggcaccg gcaagctgag cgaggacgag 240
gagaccgaag tgcaggagca gatgaacctg ctgaacagca gatgggagtg cctgagagtg 300
gccagcatgg agaagcagag caacctgcac aga 333
<210> 6
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
gtgctgatgg acctgcagaa ccagaagctg aaggagctga acgactggct gaccaagacc 60
gaggagcgga ccagaaagat ggaggaggag cccctgggcc ccgacctgga ggacctgaag 120
agacaggtgc agcagcacaa agtgctgcag gaggacctgg agcaggagca ggtgcgcgtg 180
aacagcctga cccacatggt ggtggtcgtg gacgagagca gcggcgacca cgccacagcc 240
gccctggaag agcagctgaa agtgctgggc gacagatggg ccaatatttg taggtggacc 300
gaggacagat gggtgctgct gcaggac 327
<210> 7
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
cagcccgacc tggcccctgg cctgaccacc atcggcgcca gccccaccca gaccgtgacc 60
ctggtgaccc agcccgtggt gacaaaggag accgccatca gcaagctgga gatgcccagc 120
tccctgatgc tggaagtgcc c 141
<210> 8
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
acccaccgcc tgctccagca gttccccctg gacctggaga agttcctggc ctggctgacc 60
gaggccgaaa ccaccgccaa tgtgctccag gacgccacta gaaaggagag gctgctggag 120
gacagcaagg gcgtgaaaga gctgatgaag cagtggcagg atctgcaggg cgaaatcgag 180
gcccacaccg acgtgtacca caacctggac gagaacagcc agaagattct gaggagcctg 240
gagggcagcg acgacgccgt cctgctccag aggaggctgg acaacatgaa cttcaagtgg 300
agcgagctgc ggaagaagag cctgaacatc cggagccacc tggaagcc 348
<210> 9
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
agcagcgacc agtggaagag actgcacctg agcctgcagg agctgctggt gtggctgcag 60
ctgaaggacg acgagctgag cagacaggcc cccatcggcg gcgacttccc cgccgtgcag 120
aagcagaacg acgtgcaccg ggccttcaag agggagctga aaaccaagga acccgtgatc 180
atgagcaccc tggagacagt gcggatcttc ctgaccgagc agcccctgga gggactggag 240
aagctgtacc aggagcccag agagctgccc cccgaggaga gagcccagaa cgtgaccagg 300
ctgctgagaa agcaggccga ggaagtgaat accgagtggg agaagctgaa tctgcacagc 360
gccgactggc agagaaagat cgacgag 387
<210> 10
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
accctggaga gactccagga actgcaggaa gccaccgacg agctggacct gaagctgaga 60
caggccgaag tgatcaaggg cagctggcag cctgtgggcg atctgctgat cgactccctg 120
caggatcacc tggagaaagt gaaggccctg cggggcgaga tcgcccccct gaaggagaat 180
gtgagccacg tgaacgacct ggccagacag ctgaccaccc tgggcatcca gctgagcccc 240
tacaacctga gcacactgga ggatctgaac acccggtgga aactgctgca ggtggccgtg 300
gaggatagag tgaggcagct gcacgaa 327
<210> 11
<211> 216
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
gcccacagag acttcggccc tgcctcccag cacttcctga gcaccagcgt gcagggcccc 60
tgggagagag ccatctcccc caacaaagtg ccctactaca tcaaccacga gacccagacc 120
acctgctggg accaccctaa gatgaccgag ctgtatcaga gcctggccga cctgaacaat 180
gtgcggttca gcgcctacag aaccgccatg aagctg 216
<210> 12
<211> 888
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
cggagactgc agaaggccct gtgcctggat ctgctgagcc tgagcgccgc ctgcgacgcc 60
ctggaccagc acaacctgaa gcagaatgac cagcccatgg acatcctgca gatcatcaac 120
tgcctgacca caatctacga ccggctggaa caggagcaca acaacctggt gaatgtgccc 180
ctgtgcgtgg acatgtgcct gaattggctg ctgaacgtgt acgacaccgg caggaccggc 240
agaatccgcg tgctgagctt caagaccggc atcatcagcc tgtgcaaggc ccacctggag 300
gataagtacc gctacctgtt caagcaggtg gccagcagca ccggcttctg cgatcagagg 360
agactgggcc tgctgctgca cgatagcatc cagatcccta ggcagctggg cgaagtggcc 420
agctttggcg gcagcaacat cgagccctct gtgaggagct gcttccagtt cgccaacaac 480
aagcccgaga tcgaggccgc cctgttcctg gactggatga ggctggagcc tcagagcatg 540
gtgtggctgc ctgtgctgca cagagtggcc gccgccgaga ccgccaagca ccaggccaag 600
tgcaatatct gcaaggagtg ccccatcatc ggcttccggt acaggagcct gaagcacttc 660
aactacgaca tctgccagag ctgctttttc agcggcagag tggccaaggg ccacaaaatg 720
cactacccca tggtggagta ctgcaccccc accacctccg gcgaggatgt gagagacttc 780
gccaaagtgc tgaagaataa gttccggacc aagcggtact ttgccaagca ccccaggatg 840
ggctacctgc ccgtgcagac cgtgctggaa ggcgacaaca tggagacc 888
<210> 13
<211> 3
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
tga 3
<210> 14
<211> 216
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
ccactacggg tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct 60
ggttataatt aaccccaaca cctgctgccc cccccccccc aacacctgct gcctgagcct 120
gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg tacaccatgg aggagaagct 180
cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtgga tcccct 216
<210> 15
<211> 317
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
gcatgcggcc gtccgccctc ggcaccattc ctcacgacac cgaaatatgg cgacgggtga 60
ggaatggtgg ggagttattt ttagagcggt gaggaatggt gggcaggcag caggtgttgg 120
gggagttatt tttagagcgg ggagttattt ttagagcggt gaggaatggt ggacaccgaa 180
atatggcgac gggtgaggaa tggtgccgtc gccatatttg ggtgtcccgt ccgccctcgg 240
ccggggccgc attcctgggg gccgggcggt gctcccgccc gcctcgataa aaggctccgg 300
ggccggcggc ggcccac 317
<210> 16
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
gccacc 6
<210> 17
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
tgtgtccatt gtctcactcc tcgaggagtg agacaatgga cacatttttt t 51
<210> 18
<211> 241
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
c 241
<210> 19
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcct 145
<210> 20
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
tcgaggccta ataaagagct cagatgcatc gatcagagtg tgttggtttt ttgtgtgaga 60
<210> 22
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
agtccctgtc tgcacctgtc tcgagacagg tgcagacagg gacttttttt t 51
<210> 23
<211> 9249
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
aattcccatc atcaataata taccttattt tggattgaag ccaatatgat aatgaggggg 60
tggagtttgt gacgtggcgc ggggcgtggg aacggggcgg gtgacgtagt agtctctaga 120
ggtccccagc gaccttgacg ggcatctgcc cggcatttct gacagctttg tgaactgggt 180
ggccgagaag gaatgggagt tgccgccaga ttctgacatg gatctgaatc tgattgagca 240
ggcacccctg accgtggccg agaagctgca tcgctggcgt aatagcgaag aggcccgcac 300
cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggaattcca gacgattgag 360
cgtcaaaatg taggtatttc catgagcgtt tttcctgttg caatggctgg cggtaatatt 420
gttctggata ttaccagcaa ggccgatagt ttgagttctt ctactcaggc aagtgatgtt 480
attactaatc aaagaagtat tgcgacaacg gttaatttgc gtgatggaca gactctttta 540
ctcggtggcc tcactgatta taaaaacact tctcaggatt ctggcgtacc gttcctgtct 600
aaaatccctt taatcggcct cctgtttagc tcccgctctg attctaacga ggaaagcacg 660
ttatacgtgc tcgtcaaagc aaccatagta cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc 720
gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc 780
tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa 840
tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact 900
tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt 960
gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa 1020
ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt 1080
aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac 1140
aatttaaata tttgcttata caatcttcct gtttttgggg cttttctgat tatcaaccgg 1200
ggtacatatg attgacatgc tagttttacg attaccgttc atcgcctgca gggggggggg 1260
ggggggggtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa 1320
aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag 1380
agggagtggc caactccatc actaggggtt cctagatctg aattcgagct tgccacgcat 1440
gcgggcagga agagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 1500
ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 1560
cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 1620
tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 1680
tgtggaaagg acgaggatcc agtccctgtc tgcacctgtc tcgagacagg tgcagacagg 1740
gacttttttt tgaattccac tacgggtcta ggctgcccat gtaaggaggc aaggcctggg 1800
gacacccgag atgcctggtt ataattaacc ccaacacctg ctgccccccc ccccccaaca 1860
cctgctgcct gagcctgagc ggttacccca ccccggtgcc tgggtcttag gctctgtaca 1920
ccatggagga gaagctcgct ctaaaaataa ccctgtccct ggtggatccc ctgcatgcgg 1980
ccgtccgccc tcggcaccat tcctcacgac accgaaatat ggcgacgggt gaggaatggt 2040
ggggagttat ttttagagcg gtgaggaatg gtgggcaggc agcaggtgtt gggggagtta 2100
tttttagagc ggggagttat ttttagagcg gtgaggaatg gtggacaccg aaatatggcg 2160
acgggtgagg aatggtgccg tcgccatatt tgggtgtccc gtccgccctc ggccggggcc 2220
gcattcctgg gggccgggcg gtgctcccgc ccgcctcgat aaaaggctcc ggggccggcg 2280
gcggcccact cgagacgttg taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta 2340
tagggcgaat tgggtaccgc caccatggtg tggtgggagg aagtggagga ctgctacgag 2400
agagaggacg tgcagaagaa aaccttcacc aagtgggtga acgcccagtt cagcaagttc 2460
ggcaagcagc acatcgagaa cctgttcagc gacctgcagg atggcaggag actgctggac 2520
ctgctggagg gcctgaccgg ccagaagctg cccaaggaga agggcagcac cagagtgcac 2580
gccctgaaca acgtgaacaa ggccctgaga gtgctgcaga acaacaacgt ggacctggtg 2640
aacatcggca gcaccgacat cgtggacggc aaccacaagc tgaccctggg cctgatctgg 2700
aacatcatcc tgcactggca ggtgaagaac gtgatgaaga acatcatggc cggcctgcag 2760
cagaccaaca gcgagaagat cctgctgagc tgggtgaggc agagcaccag aaactacccc 2820
caggtgaacg tgatcaactt caccacctcc tggagcgacg gcctggccct gaacgccctg 2880
atccacagcc acagacccga cctgttcgac tggaacagcg tggtgtgtca gcagagcgcc 2940
acccagagac tggagcacgc cttcaacatc gccagatacc agctgggcat cgagaagctg 3000
ctggaccccg aggacgtgga caccacctac cccgacaaga aaagcatcct catgtacatt 3060
accagcctgt tccaggtgct gccccagcag gtgtccatcg aggccatcca ggaagtggaa 3120
atgctgccca ggccccccaa agtgaccaag gaggagcact tccagctgca ccaccagatg 3180
cactacagcc agcagatcac agtgagcctg gcccagggct atgagagaac cagcagcccc 3240
aagcccagat tcaagagcta cgcctacacc caggccgcct acgtgaccac ctccgacccc 3300
accagaagcc ccttccccag ccagcacctg gaggcccccg aggacaagag cttcggcagc 3360
agcctgatgg agagcgaagt gaacctggac agataccaga ccgccctgga ggaagtgctg 3420
tcctggctgc tgagcgccga ggacaccctg caggcccagg gcgagatcag caacgacgtg 3480
gaagtggtga aggaccagtt ccacacccac gagggctaca tgatggatct gaccgcccac 3540
cagggcagag tgggcaatat cctgcagctg ggcagcaagc tgatcggcac cggcaagctg 3600
agcgaggacg aggagaccga agtgcaggag cagatgaacc tgctgaacag cagatgggag 3660
tgcctgagag tggccagcat ggagaagcag agcaacctgc acagagtgct gatggacctg 3720
cagaaccaga agctgaagga gctgaacgac tggctgacca agaccgagga gcggaccaga 3780
aagatggagg aggagcccct gggccccgac ctggaggacc tgaagagaca ggtgcagcag 3840
cacaaagtgc tgcaggagga cctggagcag gagcaggtgc gcgtgaacag cctgacccac 3900
atggtggtgg tcgtggacga gagcagcggc gaccacgcca cagccgccct ggaagagcag 3960
ctgaaagtgc tgggcgacag atgggccaat atttgtaggt ggaccgagga cagatgggtg 4020
ctgctgcagg accagcccga cctggcccct ggcctgacca ccatcggcgc cagccccacc 4080
cagaccgtga ccctggtgac ccagcccgtg gtgacaaagg agaccgccat cagcaagctg 4140
gagatgccca gctccctgat gctggaagtg cccacccacc gcctgctcca gcagttcccc 4200
ctggacctgg agaagttcct ggcctggctg accgaggccg aaaccaccgc caatgtgctc 4260
caggacgcca ctagaaagga gaggctgctg gaggacagca agggcgtgaa agagctgatg 4320
aagcagtggc aggatctgca gggcgaaatc gaggcccaca ccgacgtgta ccacaacctg 4380
gacgagaaca gccagaagat tctgaggagc ctggagggca gcgacgacgc cgtcctgctc 4440
cagaggaggc tggacaacat gaacttcaag tggagcgagc tgcggaagaa gagcctgaac 4500
atccggagcc acctggaagc cagcagcgac cagtggaaga gactgcacct gagcctgcag 4560
gagctgctgg tgtggctgca gctgaaggac gacgagctga gcagacaggc ccccatcggc 4620
ggcgacttcc ccgccgtgca gaagcagaac gacgtgcacc gggccttcaa gagggagctg 4680
aaaaccaagg aacccgtgat catgagcacc ctggagacag tgcggatctt cctgaccgag 4740
cagcccctgg agggactgga gaagctgtac caggagccca gagagctgcc ccccgaggag 4800
agagcccaga acgtgaccag gctgctgaga aagcaggccg aggaagtgaa taccgagtgg 4860
gagaagctga atctgcacag cgccgactgg cagagaaaga tcgacgagac cctggagaga 4920
ctccaggaac tgcaggaagc caccgacgag ctggacctga agctgagaca ggccgaagtg 4980
atcaagggca gctggcagcc tgtgggcgat ctgctgatcg actccctgca ggatcacctg 5040
gagaaagtga aggccctgcg gggcgagatc gcccccctga aggagaatgt gagccacgtg 5100
aacgacctgg ccagacagct gaccaccctg ggcatccagc tgagccccta caacctgagc 5160
acactggagg atctgaacac ccggtggaaa ctgctgcagg tggccgtgga ggatagagtg 5220
aggcagctgc acgaagccca cagagacttc ggccctgcct cccagcactt cctgagcacc 5280
agcgtgcagg gcccctggga gagagccatc tcccccaaca aagtgcccta ctacatcaac 5340
cacgagaccc agaccacctg ctgggaccac cctaagatga ccgagctgta tcagagcctg 5400
gccgacctga acaatgtgcg gttcagcgcc tacagaaccg ccatgaagct gcggagactg 5460
cagaaggccc tgtgcctgga tctgctgagc ctgagcgccg cctgcgacgc cctggaccag 5520
cacaacctga agcagaatga ccagcccatg gacatcctgc agatcatcaa ctgcctgacc 5580
acaatctacg accggctgga acaggagcac aacaacctgg tgaatgtgcc cctgtgcgtg 5640
gacatgtgcc tgaattggct gctgaacgtg tacgacaccg gcaggaccgg cagaatccgc 5700
gtgctgagct tcaagaccgg catcatcagc ctgtgcaagg cccacctgga ggataagtac 5760
cgctacctgt tcaagcaggt ggccagcagc accggcttct gcgatcagag gagactgggc 5820
ctgctgctgc acgatagcat ccagatccct aggcagctgg gcgaagtggc cagctttggc 5880
ggcagcaaca tcgagccctc tgtgaggagc tgcttccagt tcgccaacaa caagcccgag 5940
atcgaggccg ccctgttcct ggactggatg aggctggagc ctcagagcat ggtgtggctg 6000
cctgtgctgc acagagtggc cgccgccgag accgccaagc accaggccaa gtgcaatatc 6060
tgcaaggagt gccccatcat cggcttccgg tacaggagcc tgaagcactt caactacgac 6120
atctgccaga gctgcttttt cagcggcaga gtggccaagg gccacaaaat gcactacccc 6180
atggtggagt actgcacccc caccacctcc ggcgaggatg tgagagactt cgccaaagtg 6240
ctgaagaata agttccggac caagcggtac tttgccaagc accccaggat gggctacctg 6300
cccgtgcaga ccgtgctgga aggcgacaac atggagacct gatgaggagc tcgaggccta 6360
ataaagagct cagatgcatc gatcagagtg tgttggtttt ttgtgtgaga tctaggaacc 6420
cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg 6480
ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg 6540
cagagaggga gtggccaacc cccccccccc cccccctgca ggcgattctc ttgtttgctc 6600
cagactctca ggcaatgacc tgatagcctt tgtagagacc tctcaaaaat agctaccctc 6660
tccggcatga atttatcagc tagaacggtt gaatatcata ttgatggtga tttgactgtc 6720
tccggccttt ctcacccgtt tgaatcttta cctacacatt actcaggcat tgcatttaaa 6780
atatatgagg gttctaaaaa tttttatcct tgcgttgaaa taaaggcttc tcccgcaaaa 6840
gtattacagg gtcataatgt ttttggtaca accgatttag ctttatgctc tgaggcttta 6900
ttgcttaatt ttgctaattc tttgccttgc ctgtatgatt tattggatgt tggaattcct 6960
gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat ggtgcactct 7020
cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc 7080
tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt 7140
ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa 7200
gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac 7260
gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 7320
acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg 7380
aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc 7440
attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga 7500
tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga 7560
gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg 7620
cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc 7680
tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac 7740
agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact 7800
tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca 7860
tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg 7920
tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact 7980
acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg 8040
accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg 8100
tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat 8160
cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc 8220
tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat 8280
actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt 8340
tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc 8400
cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 8460
gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac 8520
tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt 8580
gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 8640
gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 8700
ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 8760
acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg 8820
agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt 8880
cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 8940
tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg 9000
gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc 9060
ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc 9120
ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag 9180
cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca 9240
ttaatgcag 9249
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
gattgaggag aaacgtaaat t 21
<210> 25
<211> 9108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
aattcccatc atcaataata taccttattt tggattgaag ccaatatgat aatgaggggg 60
tggagtttgt gacgtggcgc ggggcgtggg aacggggcgg gtgacgtagt agtctctaga 120
ggtccccagc gaccttgacg ggcatctgcc cggcatttct gacagctttg tgaactgggt 180
ggccgagaag gaatgggagt tgccgccaga ttctgacatg gatctgaatc tgattgagca 240
ggcacccctg accgtggccg agaagctgca tcgctggcgt aatagcgaag aggcccgcac 300
cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggaattcca gacgattgag 360
cgtcaaaatg taggtatttc catgagcgtt tttcctgttg caatggctgg cggtaatatt 420
gttctggata ttaccagcaa ggccgatagt ttgagttctt ctactcaggc aagtgatgtt 480
attactaatc aaagaagtat tgcgacaacg gttaatttgc gtgatggaca gactctttta 540
ctcggtggcc tcactgatta taaaaacact tctcaggatt ctggcgtacc gttcctgtct 600
aaaatccctt taatcggcct cctgtttagc tcccgctctg attctaacga ggaaagcacg 660
ttatacgtgc tcgtcaaagc aaccatagta cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc 720
gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc 780
tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa 840
tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact 900
tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt 960
gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa 1020
ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt 1080
aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac 1140
aatttaaata tttgcttata caatcttcct gtttttgggg cttttctgat tatcaaccgg 1200
ggtacatatg attgacatgc tagttttacg attaccgttc atcgcctgca gggggggggg 1260
ggggggggtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa 1320
aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag 1380
agggagtggc caactccatc actaggggtt cctagatctg aattcgagct tgccacgcat 1440
gcgggcagga agagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 1500
ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 1560
cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 1620
tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 1680
tgtggaaagg acgaggatcc tgtgtccatt gtctcactcc tcgaggagtg agacaatgga 1740
cacatttttt tgaattccac tacgggtcta ggctgcccat gtaaggaggc aaggcctggg 1800
gacacccgag atgcctggtt ataattaacc ccaacacctg ctgccccccc ccccccaaca 1860
cctgctgcct gagcctgagc ggttacccca ccccggtgcc tgggtcttag gctctgtaca 1920
ccatggagga gaagctcgct ctaaaaataa ccctgtccct ggtggatccc ctgcatgcgg 1980
ccgtccgccc tcggcaccat tcctcacgac accgaaatat ggcgacgggt gaggaatggt 2040
ggggagttat ttttagagcg gtgaggaatg gtgggcaggc agcaggtgtt gggggagtta 2100
tttttagagc ggggagttat ttttagagcg gtgaggaatg gtggacaccg aaatatggcg 2160
acgggtgagg aatggtgccg tcgccatatt tgggtgtccc gtccgccctc ggccggggcc 2220
gcattcctgg gggccgggcg gtgctcccgc ccgcctcgat aaaaggctcc ggggccggcg 2280
gcggcccact cgagacgttg taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta 2340
tagggcgaat tgggtaccgc caccatggtg tggtgggagg aagtggagga ctgctacgag 2400
agagaggacg tgcagaagaa aaccttcacc aagtgggtga acgcccagtt cagcaagttc 2460
ggcaagcagc acatcgagaa cctgttcagc gacctgcagg atggcaggag actgctggac 2520
ctgctggagg gcctgaccgg ccagaagctg cccaaggaga agggcagcac cagagtgcac 2580
gccctgaaca acgtgaacaa ggccctgaga gtgctgcaga acaacaacgt ggacctggtg 2640
aacatcggca gcaccgacat cgtggacggc aaccacaagc tgaccctggg cctgatctgg 2700
aacatcatcc tgcactggca ggtgaagaac gtgatgaaga acatcatggc cggcctgcag 2760
cagaccaaca gcgagaagat cctgctgagc tgggtgaggc agagcaccag aaactacccc 2820
caggtgaacg tgatcaactt caccacctcc tggagcgacg gcctggccct gaacgccctg 2880
atccacagcc acagacccga cctgttcgac tggaacagcg tggtgtgtca gcagagcgcc 2940
acccagagac tggagcacgc cttcaacatc gccagatacc agctgggcat cgagaagctg 3000
ctggaccccg aggacgtgga caccacctac cccgacaaga aaagcatcct catgtacatt 3060
accagcctgt tccaggtgct gccccagcag gtgtccatcg aggccatcca ggaagtggaa 3120
atgctgccca ggccccccaa agtgaccaag gaggagcact tccagctgca ccaccagatg 3180
cactacagcc agcagatcac agtgagcctg gcccagggct atgagagaac cagcagcccc 3240
aagcccagat tcaagagcta cgcctacacc caggccgcct acgtgaccac ctccgacccc 3300
accagaagcc ccttccccag ccagcacctg gaggcccccg aggacaagag cttcggcagc 3360
agcctgatgg agagcgaagt gaacctggac agataccaga ccgccctgga ggaagtgctg 3420
tcctggctgc tgagcgccga ggacaccctg caggcccagg gcgagatcag caacgacgtg 3480
gaagtggtga aggaccagtt ccacacccac gagggctaca tgatggatct gaccgcccac 3540
cagggcagag tgggcaatat cctgcagctg ggcagcaagc tgatcggcac cggcaagctg 3600
agcgaggacg aggagaccga agtgcaggag cagatgaacc tgctgaacag cagatgggag 3660
tgcctgagag tggccagcat ggagaagcag agcaacctgc acagagtgct gatggacctg 3720
cagaaccaga agctgaagga gctgaacgac tggctgacca agaccgagga gcggaccaga 3780
aagatggagg aggagcccct gggccccgac ctggaggacc tgaagagaca ggtgcagcag 3840
cacaaagtgc tgcaggagga cctggagcag gagcaggtgc gcgtgaacag cctgacccac 3900
atggtggtgg tcgtggacga gagcagcggc gaccacgcca cagccgccct ggaagagcag 3960
ctgaaagtgc tgggcgacag atgggccaat atttgtaggt ggaccgagga cagatgggtg 4020
ctgctgcagg acacccaccg cctgctccag cagttccccc tggacctgga gaagttcctg 4080
gcctggctga ccgaggccga aaccaccgcc aatgtgctcc aggacgccac tagaaaggag 4140
aggctgctgg aggacagcaa gggcgtgaaa gagctgatga agcagtggca ggatctgcag 4200
ggcgaaatcg aggcccacac cgacgtgtac cacaacctgg acgagaacag ccagaagatt 4260
ctgaggagcc tggagggcag cgacgacgcc gtcctgctcc agaggaggct ggacaacatg 4320
aacttcaagt ggagcgagct gcggaagaag agcctgaaca tccggagcca cctggaagcc 4380
agcagcgacc agtggaagag actgcacctg agcctgcagg agctgctggt gtggctgcag 4440
ctgaaggacg acgagctgag cagacaggcc cccatcggcg gcgacttccc cgccgtgcag 4500
aagcagaacg acgtgcaccg ggccttcaag agggagctga aaaccaagga acccgtgatc 4560
atgagcaccc tggagacagt gcggatcttc ctgaccgagc agcccctgga gggactggag 4620
aagctgtacc aggagcccag agagctgccc cccgaggaga gagcccagaa cgtgaccagg 4680
ctgctgagaa agcaggccga ggaagtgaat accgagtggg agaagctgaa tctgcacagc 4740
gccgactggc agagaaagat cgacgagacc ctggagagac tccaggaact gcaggaagcc 4800
accgacgagc tggacctgaa gctgagacag gccgaagtga tcaagggcag ctggcagcct 4860
gtgggcgatc tgctgatcga ctccctgcag gatcacctgg agaaagtgaa ggccctgcgg 4920
ggcgagatcg cccccctgaa ggagaatgtg agccacgtga acgacctggc cagacagctg 4980
accaccctgg gcatccagct gagcccctac aacctgagca cactggagga tctgaacacc 5040
cggtggaaac tgctgcaggt ggccgtggag gatagagtga ggcagctgca cgaagcccac 5100
agagacttcg gccctgcctc ccagcacttc ctgagcacca gcgtgcaggg cccctgggag 5160
agagccatct cccccaacaa agtgccctac tacatcaacc acgagaccca gaccacctgc 5220
tgggaccacc ctaagatgac cgagctgtat cagagcctgg ccgacctgaa caatgtgcgg 5280
ttcagcgcct acagaaccgc catgaagctg cggagactgc agaaggccct gtgcctggat 5340
ctgctgagcc tgagcgccgc ctgcgacgcc ctggaccagc acaacctgaa gcagaatgac 5400
cagcccatgg acatcctgca gatcatcaac tgcctgacca caatctacga ccggctggaa 5460
caggagcaca acaacctggt gaatgtgccc ctgtgcgtgg acatgtgcct gaattggctg 5520
ctgaacgtgt acgacaccgg caggaccggc agaatccgcg tgctgagctt caagaccggc 5580
atcatcagcc tgtgcaaggc ccacctggag gataagtacc gctacctgtt caagcaggtg 5640
gccagcagca ccggcttctg cgatcagagg agactgggcc tgctgctgca cgatagcatc 5700
cagatcccta ggcagctggg cgaagtggcc agctttggcg gcagcaacat cgagccctct 5760
gtgaggagct gcttccagtt cgccaacaac aagcccgaga tcgaggccgc cctgttcctg 5820
gactggatga ggctggagcc tcagagcatg gtgtggctgc ctgtgctgca cagagtggcc 5880
gccgccgaga ccgccaagca ccaggccaag tgcaatatct gcaaggagtg ccccatcatc 5940
ggcttccggt acaggagcct gaagcacttc aactacgaca tctgccagag ctgctttttc 6000
agcggcagag tggccaaggg ccacaaaatg cactacccca tggtggagta ctgcaccccc 6060
accacctccg gcgaggatgt gagagacttc gccaaagtgc tgaagaataa gttccggacc 6120
aagcggtact ttgccaagca ccccaggatg ggctacctgc ccgtgcagac cgtgctggaa 6180
ggcgacaaca tggagacctg atgaggagct cgaggcctaa taaagagctc agatgcatcg 6240
atcagagtgt gttggttttt tgtgtgagat ctaggaaccc ctagtgatgg agttggccac 6300
tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgcccgg gcaaagcccg ggcgtcgggc 6360
gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaaccc 6420
cccccccccc ccccctgcag gcgattctct tgtttgctcc agactctcag gcaatgacct 6480
gatagccttt gtagagacct ctcaaaaata gctaccctct ccggcatgaa tttatcagct 6540
agaacggttg aatatcatat tgatggtgat ttgactgtct ccggcctttc tcacccgttt 6600
gaatctttac ctacacatta ctcaggcatt gcatttaaaa tatatgaggg ttctaaaaat 6660
ttttatcctt gcgttgaaat aaaggcttct cccgcaaaag tattacaggg tcataatgtt 6720
tttggtacaa ccgatttagc tttatgctct gaggctttat tgcttaattt tgctaattct 6780
ttgccttgcc tgtatgattt attggatgtt ggaattcctg atgcggtatt ttctccttac 6840
gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc 6900
cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg 6960
tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca 7020
gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt 7080
tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg 7140
aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 7200
catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 7260
tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 7320
tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 7380
ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 7440
ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga 7500
cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 7560
ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 7620
tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 7680
gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 7740
ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc 7800
aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca 7860
acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 7920
tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat 7980
cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 8040
gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 8100
taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 8160
tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 8220
cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 8280
ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 8340
accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 8400
cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 8460
cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 8520
tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 8580
taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 8640
gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 8700
agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 8760
ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 8820
acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 8880
caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 8940
tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 9000
tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc 9060
aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcag 9108
<210> 26
<211> 9108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
aattcccatc atcaataata taccttattt tggattgaag ccaatatgat aatgaggggg 60
tggagtttgt gacgtggcgc ggggcgtggg aacggggcgg gtgacgtagt agtctctaga 120
ggtccccagc gaccttgacg ggcatctgcc cggcatttct gacagctttg tgaactgggt 180
ggccgagaag gaatgggagt tgccgccaga ttctgacatg gatctgaatc tgattgagca 240
ggcacccctg accgtggccg agaagctgca tcgctggcgt aatagcgaag aggcccgcac 300
cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggaattcca gacgattgag 360
cgtcaaaatg taggtatttc catgagcgtt tttcctgttg caatggctgg cggtaatatt 420
gttctggata ttaccagcaa ggccgatagt ttgagttctt ctactcaggc aagtgatgtt 480
attactaatc aaagaagtat tgcgacaacg gttaatttgc gtgatggaca gactctttta 540
ctcggtggcc tcactgatta taaaaacact tctcaggatt ctggcgtacc gttcctgtct 600
aaaatccctt taatcggcct cctgtttagc tcccgctctg attctaacga ggaaagcacg 660
ttatacgtgc tcgtcaaagc aaccatagta cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc 720
gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc 780
tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa 840
tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact 900
tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt 960
gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa 1020
ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt 1080
aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac 1140
aatttaaata tttgcttata caatcttcct gtttttgggg cttttctgat tatcaaccgg 1200
ggtacatatg attgacatgc tagttttacg attaccgttc atcgcctgca gggggggggg 1260
ggggggggtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa 1320
aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag 1380
agggagtggc caactccatc actaggggtt cctagatctg aattcgagct tgccacgcat 1440
gcgggcagga agagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 1500
ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 1560
cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 1620
tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 1680
tgtggaaagg acgaggatcc agtccctgtc tgcacctgtc tcgagacagg tgcagacagg 1740
gacttttttt tgaattccac tacgggtcta ggctgcccat gtaaggaggc aaggcctggg 1800
gacacccgag atgcctggtt ataattaacc ccaacacctg ctgccccccc ccccccaaca 1860
cctgctgcct gagcctgagc ggttacccca ccccggtgcc tgggtcttag gctctgtaca 1920
ccatggagga gaagctcgct ctaaaaataa ccctgtccct ggtggatccc ctgcatgcgg 1980
ccgtccgccc tcggcaccat tcctcacgac accgaaatat ggcgacgggt gaggaatggt 2040
ggggagttat ttttagagcg gtgaggaatg gtgggcaggc agcaggtgtt gggggagtta 2100
tttttagagc ggggagttat ttttagagcg gtgaggaatg gtggacaccg aaatatggcg 2160
acgggtgagg aatggtgccg tcgccatatt tgggtgtccc gtccgccctc ggccggggcc 2220
gcattcctgg gggccgggcg gtgctcccgc ccgcctcgat aaaaggctcc ggggccggcg 2280
gcggcccact cgagacgttg taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta 2340
tagggcgaat tgggtaccgc caccatggtg tggtgggagg aagtggagga ctgctacgag 2400
agagaggacg tgcagaagaa aaccttcacc aagtgggtga acgcccagtt cagcaagttc 2460
ggcaagcagc acatcgagaa cctgttcagc gacctgcagg atggcaggag actgctggac 2520
ctgctggagg gcctgaccgg ccagaagctg cccaaggaga agggcagcac cagagtgcac 2580
gccctgaaca acgtgaacaa ggccctgaga gtgctgcaga acaacaacgt ggacctggtg 2640
aacatcggca gcaccgacat cgtggacggc aaccacaagc tgaccctggg cctgatctgg 2700
aacatcatcc tgcactggca ggtgaagaac gtgatgaaga acatcatggc cggcctgcag 2760
cagaccaaca gcgagaagat cctgctgagc tgggtgaggc agagcaccag aaactacccc 2820
caggtgaacg tgatcaactt caccacctcc tggagcgacg gcctggccct gaacgccctg 2880
atccacagcc acagacccga cctgttcgac tggaacagcg tggtgtgtca gcagagcgcc 2940
acccagagac tggagcacgc cttcaacatc gccagatacc agctgggcat cgagaagctg 3000
ctggaccccg aggacgtgga caccacctac cccgacaaga aaagcatcct catgtacatt 3060
accagcctgt tccaggtgct gccccagcag gtgtccatcg aggccatcca ggaagtggaa 3120
atgctgccca ggccccccaa agtgaccaag gaggagcact tccagctgca ccaccagatg 3180
cactacagcc agcagatcac agtgagcctg gcccagggct atgagagaac cagcagcccc 3240
aagcccagat tcaagagcta cgcctacacc caggccgcct acgtgaccac ctccgacccc 3300
accagaagcc ccttccccag ccagcacctg gaggcccccg aggacaagag cttcggcagc 3360
agcctgatgg agagcgaagt gaacctggac agataccaga ccgccctgga ggaagtgctg 3420
tcctggctgc tgagcgccga ggacaccctg caggcccagg gcgagatcag caacgacgtg 3480
gaagtggtga aggaccagtt ccacacccac gagggctaca tgatggatct gaccgcccac 3540
cagggcagag tgggcaatat cctgcagctg ggcagcaagc tgatcggcac cggcaagctg 3600
agcgaggacg aggagaccga agtgcaggag cagatgaacc tgctgaacag cagatgggag 3660
tgcctgagag tggccagcat ggagaagcag agcaacctgc acagagtgct gatggacctg 3720
cagaaccaga agctgaagga gctgaacgac tggctgacca agaccgagga gcggaccaga 3780
aagatggagg aggagcccct gggccccgac ctggaggacc tgaagagaca ggtgcagcag 3840
cacaaagtgc tgcaggagga cctggagcag gagcaggtgc gcgtgaacag cctgacccac 3900
atggtggtgg tcgtggacga gagcagcggc gaccacgcca cagccgccct ggaagagcag 3960
ctgaaagtgc tgggcgacag atgggccaat atttgtaggt ggaccgagga cagatgggtg 4020
ctgctgcagg acacccaccg cctgctccag cagttccccc tggacctgga gaagttcctg 4080
gcctggctga ccgaggccga aaccaccgcc aatgtgctcc aggacgccac tagaaaggag 4140
aggctgctgg aggacagcaa gggcgtgaaa gagctgatga agcagtggca ggatctgcag 4200
ggcgaaatcg aggcccacac cgacgtgtac cacaacctgg acgagaacag ccagaagatt 4260
ctgaggagcc tggagggcag cgacgacgcc gtcctgctcc agaggaggct ggacaacatg 4320
aacttcaagt ggagcgagct gcggaagaag agcctgaaca tccggagcca cctggaagcc 4380
agcagcgacc agtggaagag actgcacctg agcctgcagg agctgctggt gtggctgcag 4440
ctgaaggacg acgagctgag cagacaggcc cccatcggcg gcgacttccc cgccgtgcag 4500
aagcagaacg acgtgcaccg ggccttcaag agggagctga aaaccaagga acccgtgatc 4560
atgagcaccc tggagacagt gcggatcttc ctgaccgagc agcccctgga gggactggag 4620
aagctgtacc aggagcccag agagctgccc cccgaggaga gagcccagaa cgtgaccagg 4680
ctgctgagaa agcaggccga ggaagtgaat accgagtggg agaagctgaa tctgcacagc 4740
gccgactggc agagaaagat cgacgagacc ctggagagac tccaggaact gcaggaagcc 4800
accgacgagc tggacctgaa gctgagacag gccgaagtga tcaagggcag ctggcagcct 4860
gtgggcgatc tgctgatcga ctccctgcag gatcacctgg agaaagtgaa ggccctgcgg 4920
ggcgagatcg cccccctgaa ggagaatgtg agccacgtga acgacctggc cagacagctg 4980
accaccctgg gcatccagct gagcccctac aacctgagca cactggagga tctgaacacc 5040
cggtggaaac tgctgcaggt ggccgtggag gatagagtga ggcagctgca cgaagcccac 5100
agagacttcg gccctgcctc ccagcacttc ctgagcacca gcgtgcaggg cccctgggag 5160
agagccatct cccccaacaa agtgccctac tacatcaacc acgagaccca gaccacctgc 5220
tgggaccacc ctaagatgac cgagctgtat cagagcctgg ccgacctgaa caatgtgcgg 5280
ttcagcgcct acagaaccgc catgaagctg cggagactgc agaaggccct gtgcctggat 5340
ctgctgagcc tgagcgccgc ctgcgacgcc ctggaccagc acaacctgaa gcagaatgac 5400
cagcccatgg acatcctgca gatcatcaac tgcctgacca caatctacga ccggctggaa 5460
caggagcaca acaacctggt gaatgtgccc ctgtgcgtgg acatgtgcct gaattggctg 5520
ctgaacgtgt acgacaccgg caggaccggc agaatccgcg tgctgagctt caagaccggc 5580
atcatcagcc tgtgcaaggc ccacctggag gataagtacc gctacctgtt caagcaggtg 5640
gccagcagca ccggcttctg cgatcagagg agactgggcc tgctgctgca cgatagcatc 5700
cagatcccta ggcagctggg cgaagtggcc agctttggcg gcagcaacat cgagccctct 5760
gtgaggagct gcttccagtt cgccaacaac aagcccgaga tcgaggccgc cctgttcctg 5820
gactggatga ggctggagcc tcagagcatg gtgtggctgc ctgtgctgca cagagtggcc 5880
gccgccgaga ccgccaagca ccaggccaag tgcaatatct gcaaggagtg ccccatcatc 5940
ggcttccggt acaggagcct gaagcacttc aactacgaca tctgccagag ctgctttttc 6000
agcggcagag tggccaaggg ccacaaaatg cactacccca tggtggagta ctgcaccccc 6060
accacctccg gcgaggatgt gagagacttc gccaaagtgc tgaagaataa gttccggacc 6120
aagcggtact ttgccaagca ccccaggatg ggctacctgc ccgtgcagac cgtgctggaa 6180
ggcgacaaca tggagacctg atgaggagct cgaggcctaa taaagagctc agatgcatcg 6240
atcagagtgt gttggttttt tgtgtgagat ctaggaaccc ctagtgatgg agttggccac 6300
tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgcccgg gcaaagcccg ggcgtcgggc 6360
gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaaccc 6420
cccccccccc ccccctgcag gcgattctct tgtttgctcc agactctcag gcaatgacct 6480
gatagccttt gtagagacct ctcaaaaata gctaccctct ccggcatgaa tttatcagct 6540
agaacggttg aatatcatat tgatggtgat ttgactgtct ccggcctttc tcacccgttt 6600
gaatctttac ctacacatta ctcaggcatt gcatttaaaa tatatgaggg ttctaaaaat 6660
ttttatcctt gcgttgaaat aaaggcttct cccgcaaaag tattacaggg tcataatgtt 6720
tttggtacaa ccgatttagc tttatgctct gaggctttat tgcttaattt tgctaattct 6780
ttgccttgcc tgtatgattt attggatgtt ggaattcctg atgcggtatt ttctccttac 6840
gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc 6900
cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg 6960
tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca 7020
gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt 7080
tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg 7140
aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 7200
catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 7260
tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 7320
tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 7380
ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 7440
ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga 7500
cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 7560
ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 7620
tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 7680
gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 7740
ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc 7800
aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca 7860
acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 7920
tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat 7980
cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 8040
gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 8100
taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 8160
tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 8220
cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 8280
ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 8340
accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 8400
cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 8460
cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 8520
tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 8580
taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 8640
gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 8700
agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 8760
ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 8820
acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 8880
caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 8940
tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 9000
tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc 9060
aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcag 9108
<210> 27
<211> 3837
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
atggtgtggt gggaggaagt ggaggactgc tacgagagag aggacgtgca gaagaaaacc 60
ttcaccaagt gggtgaacgc ccagttcagc aagttcggca agcagcacat cgagaacctg 120
ttcagcgacc tgcaggatgg caggagactg ctggacctgc tggagggcct gaccggccag 180
aagctgccca aggagaaggg cagcaccaga gtgcacgccc tgaacaacgt gaacaaggcc 240
ctgagagtgc tgcagaacaa caacgtggac ctggtgaaca tcggcagcac cgacatcgtg 300
gacggcaacc acaagctgac cctgggcctg atctggaaca tcatcctgca ctggcaggtg 360
aagaacgtga tgaagaacat catggccggc ctgcagcaga ccaacagcga gaagatcctg 420
ctgagctggg tgaggcagag caccagaaac tacccccagg tgaacgtgat caacttcacc 480
acctcctgga gcgacggcct ggccctgaac gccctgatcc acagccacag acccgacctg 540
ttcgactgga acagcgtggt gtgtcagcag agcgccaccc agagactgga gcacgccttc 600
aacatcgcca gataccagct gggcatcgag aagctgctgg accccgagga cgtggacacc 660
acctaccccg acaagaaaag catcctcatg tacattacca gcctgttcca ggtgctgccc 720
cagcaggtgt ccatcgaggc catccaggaa gtggaaatgc tgcccaggcc ccccaaagtg 780
accaaggagg agcacttcca gctgcaccac cagatgcact acagccagca gatcacagtg 840
agcctggccc agggctatga gagaaccagc agccccaagc ccagattcaa gagctacgcc 900
tacacccagg ccgcctacgt gaccacctcc gaccccacca gaagcccctt ccccagccag 960
cacctggagg cccccgagga caagagcttc ggcagcagcc tgatggagag cgaagtgaac 1020
ctggacagat accagaccgc cctggaggaa gtgctgtcct ggctgctgag cgccgaggac 1080
accctgcagg cccagggcga gatcagcaac gacgtggaag tggtgaagga ccagttccac 1140
acccacgagg gctacatgat ggatctgacc gcccaccagg gcagagtggg caatatcctg 1200
cagctgggca gcaagctgat cggcaccggc aagctgagcg aggacgagga gaccgaagtg 1260
caggagcaga tgaacctgct gaacagcaga tgggagtgcc tgagagtggc cagcatggag 1320
aagcagagca acctgcacag agtgctgatg gacctgcaga accagaagct gaaggagctg 1380
aacgactggc tgaccaagac cgaggagcgg accagaaaga tggaggagga gcccctgggc 1440
cccgacctgg aggacctgaa gagacaggtg cagcagcaca aagtgctgca ggaggacctg 1500
gagcaggagc aggtgcgcgt gaacagcctg acccacatgg tggtggtcgt ggacgagagc 1560
agcggcgacc acgccacagc cgccctggaa gagcagctga aagtgctggg cgacagatgg 1620
gccaatattt gtaggtggac cgaggacaga tgggtgctgc tgcaggacac ccaccgcctg 1680
ctccagcagt tccccctgga cctggagaag ttcctggcct ggctgaccga ggccgaaacc 1740
accgccaatg tgctccagga cgccactaga aaggagaggc tgctggagga cagcaagggc 1800
gtgaaagagc tgatgaagca gtggcaggat ctgcagggcg aaatcgaggc ccacaccgac 1860
gtgtaccaca acctggacga gaacagccag aagattctga ggagcctgga gggcagcgac 1920
gacgccgtcc tgctccagag gaggctggac aacatgaact tcaagtggag cgagctgcgg 1980
aagaagagcc tgaacatccg gagccacctg gaagccagca gcgaccagtg gaagagactg 2040
cacctgagcc tgcaggagct gctggtgtgg ctgcagctga aggacgacga gctgagcaga 2100
caggccccca tcggcggcga cttccccgcc gtgcagaagc agaacgacgt gcaccgggcc 2160
ttcaagaggg agctgaaaac caaggaaccc gtgatcatga gcaccctgga gacagtgcgg 2220
atcttcctga ccgagcagcc cctggaggga ctggagaagc tgtaccagga gcccagagag 2280
ctgccccccg aggagagagc ccagaacgtg accaggctgc tgagaaagca ggccgaggaa 2340
gtgaataccg agtgggagaa gctgaatctg cacagcgccg actggcagag aaagatcgac 2400
gagaccctgg agagactcca ggaactgcag gaagccaccg acgagctgga cctgaagctg 2460
agacaggccg aagtgatcaa gggcagctgg cagcctgtgg gcgatctgct gatcgactcc 2520
ctgcaggatc acctggagaa agtgaaggcc ctgcggggcg agatcgcccc cctgaaggag 2580
aatgtgagcc acgtgaacga cctggccaga cagctgacca ccctgggcat ccagctgagc 2640
ccctacaacc tgagcacact ggaggatctg aacacccggt ggaaactgct gcaggtggcc 2700
gtggaggata gagtgaggca gctgcacgaa gcccacagag acttcggccc tgcctcccag 2760
cacttcctga gcaccagcgt gcagggcccc tgggagagag ccatctcccc caacaaagtg 2820
ccctactaca tcaaccacga gacccagacc acctgctggg accaccctaa gatgaccgag 2880
ctgtatcaga gcctggccga cctgaacaat gtgcggttca gcgcctacag aaccgccatg 2940
aagctgcgga gactgcagaa ggccctgtgc ctggatctgc tgagcctgag cgccgcctgc 3000
gacgccctgg accagcacaa cctgaagcag aatgaccagc ccatggacat cctgcagatc 3060
atcaactgcc tgaccacaat ctacgaccgg ctggaacagg agcacaacaa cctggtgaat 3120
gtgcccctgt gcgtggacat gtgcctgaat tggctgctga acgtgtacga caccggcagg 3180
accggcagaa tccgcgtgct gagcttcaag accggcatca tcagcctgtg caaggcccac 3240
ctggaggata agtaccgcta cctgttcaag caggtggcca gcagcaccgg cttctgcgat 3300
cagaggagac tgggcctgct gctgcacgat agcatccaga tccctaggca gctgggcgaa 3360
gtggccagct ttggcggcag caacatcgag ccctctgtga ggagctgctt ccagttcgcc 3420
aacaacaagc ccgagatcga ggccgccctg ttcctggact ggatgaggct ggagcctcag 3480
agcatggtgt ggctgcctgt gctgcacaga gtggccgccg ccgagaccgc caagcaccag 3540
gccaagtgca atatctgcaa ggagtgcccc atcatcggct tccggtacag gagcctgaag 3600
cacttcaact acgacatctg ccagagctgc tttttcagcg gcagagtggc caagggccac 3660
aaaatgcact accccatggt ggagtactgc acccccacca cctccggcga ggatgtgaga 3720
gacttcgcca aagtgctgaa gaataagttc cggaccaagc ggtactttgc caagcacccc 3780
aggatgggct acctgcccgt gcagaccgtg ctggaaggcg acaacatgga gacctga 3837

Claims (16)

1.一种双重表达盒基因载体，其包含用于在心肌组织和骨骼肌组织中表达迷你肌营养不良蛋白基因和NF-κB/p65-shRNA基因两者的表达盒，其是腺相关病毒(AAV)载体，其中所述迷你肌营养不良蛋白基因与包含肌肉特异性第一启动子和经修饰的Mcken(MCK)增强子的构建体可操作地连接，并且其中所述NF-κB/p65-shRNA基因是在第二启动子的控制下。
2.根据权利要求1所述的基因载体，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:23的序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的基因载体，其中所述迷你肌营养不良蛋白基因包含SEQ ID NO:2-13任一项的序列或其功能性变体。
4.根据权利要求1所述的基因载体，其包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的序列。
5.根据权利要求1或权利要求4所述的基因载体，其中所述迷你肌营养不良蛋白基因包含SEQ ID NO:3-6、8-13和27任一项的序列或其功能性变体。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的基因载体，其中所述经修饰的MCK启动子增强子包含SEQ ID NO:14的序列或其功能性变体。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的基因载体，其中所述肌肉特异性第一启动子是Syn。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的基因载体，其中所述肌肉特异性第一启动子包含SEQ ID NO:15的序列或其功能性变体。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的基因载体，其中所述第二启动子是U6启动子。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的基因载体，其中所述第二启动子包含SEQ ID NO:18的序列或其功能性变体。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的基因载体，其中所述NF-κB/p65-shRNA包含SEQID NO:17、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24的序列。
12.一种药物组合物，其包含权利要求1-11中任一项所述的基因载体和药学上可接受的载体。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其被配制成用于注射。
14.一种用于改善杜氏肌营养不良症(DMD)的方法，所述方法包括将权利要求1-11中任一项所述的基因载体或者权利要求12或13所述的药物组合物以改善DMD的量和位置向患有DMD或处于发展成DMD风险的患者或受试者施用。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述基因载体或所述药物组合物是通过腹腔内注射施用的。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的方法，其中所述患者患有DMD。
CN202080025645.4A 2019-02-02 2020-02-03 通过基因置换和抗炎的针对杜氏肌营养不良的一步基因疗法 Pending CN113710809A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962800484P 2019-02-02 2019-02-02
US62/800,484 2019-02-02
PCT/US2020/016410 WO2020160542A1 (en) 2019-02-02 2020-02-03 One-step gene therapy for duchenne muscular dystrophy via gene replacement and anti-inflammation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113710809A true CN113710809A (zh) 2021-11-26

Family

ID=71841302

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080025645.4A Pending CN113710809A (zh) 2019-02-02 2020-02-03 通过基因置换和抗炎的针对杜氏肌营养不良的一步基因疗法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20220136005A1 (zh)
EP (1) EP3918081A4 (zh)
JP (1) JP2022523038A (zh)
CN (1) CN113710809A (zh)
AU (1) AU2020216501A1 (zh)
CA (1) CA3146364A1 (zh)
IL (1) IL285129A (zh)
WO (1) WO2020160542A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023248251A1 (en) * 2022-06-24 2023-12-28 Indian Institute Of Technology Kanpur An optimized aav vector for gene therapy of muscular dystrophy

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7266458B2 (en) * 2000-03-06 2007-09-04 Bioseek, Inc. BioMAP analysis

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020160542A1 (en) 2020-08-06
EP3918081A1 (en) 2021-12-08
EP3918081A4 (en) 2022-11-02
IL285129A (en) 2021-09-30
AU2020216501A1 (en) 2021-09-16
CA3146364A1 (en) 2020-08-06
US20220136005A1 (en) 2022-05-05
JP2022523038A (ja) 2022-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020201190B2 (en) Compositions useful in treatment of ornithine transcarbamylase (OTC) deficiency
KR102612367B1 (ko) G-단백질 커플화 수용체를 표적화하는 키메라 항원 수용체 및 그의 용도
CN110650975B (zh) 双顺反子嵌合抗原受体及其用途
RU2761632C2 (ru) Химерные антигенные рецепторы, нацеленные на антиген созревания в-клеток, и их применение
KR20220066914A (ko) 부정맥 유발성 우심실 심근병증의 유전자 요법 조성물 및 치료
CN114651003A (zh) 用于可调调节的ca2-il15融合蛋白
KR20210005179A (ko) 헤모글로빈-관련 돌연변이를 편집하기 위한 상동성-지정 복구 주형 설계 및 전달
CN117715660A (zh) 右心室致心律失常性心肌病的基因治疗组合物和治疗
CN112522271B (zh) 一种sgRNA及其应用
CN110177577A (zh) Sfasl的aav2介导的基因递送作为青光眼的神经保护疗法
KR20230133869A (ko) T 세포 및 종양 침윤성 림프구의 확장을 위한 조성물및 방법
CN112980885B (zh) 抗sars-cov-2中和抗体的表达载体
CN113710809A (zh) 通过基因置换和抗炎的针对杜氏肌营养不良的一步基因疗法
CN108939064B (zh) 基于重组减毒绵羊李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗
CN114008209A (zh) Aav介导的枫糖尿症(msud)基因疗法
CN110484565A (zh) 一种基于腺相关病毒载体改造的自杀基因系统及其应用
CN106755095A (zh) 靶向hbc二聚体形成的药物筛选细胞模型及其构建和应用
CN108159434B (zh) 一种基因载体及其用于治疗青光眼的基因治疗药物
CN112301058A (zh) 一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用
CN112342228B (zh) 表达抗vegf融合蛋白的aav病毒载体及其应用
AU2021209287B1 (en) Expression Vector for Anti-Sars-Cov-2 Neutralizing Antibodies
CN114250227A (zh) 用于高水平表达外源基因的表达载体
CN109735558B (zh) 一种重组car19-il24基因、慢病毒载体、car19-il24-t细胞及应用
CN115335523A (zh) 分子系统和使用该系统的疗法
KR101530278B1 (ko) 심근전환유전자 및 심혈관재생유전자를 포함하는 아데노부속바이러스를 유효성분으로 포함하는, 허혈성 심장질환 예방 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination