JP2022523038A - 遺伝子置換及び抗炎症を介したデュシェンヌ型筋ジストロフィーに対する一段階遺伝子療法 - Google Patents

遺伝子置換及び抗炎症を介したデュシェンヌ型筋ジストロフィーに対する一段階遺伝子療法 Download PDF

Info

Publication number
JP2022523038A
JP2022523038A JP2021542570A JP2021542570A JP2022523038A JP 2022523038 A JP2022523038 A JP 2022523038A JP 2021542570 A JP2021542570 A JP 2021542570A JP 2021542570 A JP2021542570 A JP 2021542570A JP 2022523038 A JP2022523038 A JP 2022523038A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gene
seq
promoter
sequence
muscle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021542570A
Other languages
English (en)
Inventor
ワン、ビン
フ、フレディ
Original Assignee
ユニバーシティ オブ ピッツバーグ －オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ユニバーシティ オブ ピッツバーグ －オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション filed Critical ユニバーシティ オブ ピッツバーグ －オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション
Publication of JP2022523038A publication Critical patent/JP2022523038A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4707—Muscular dystrophy
    • C07K14/4708—Duchenne dystrophy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/122—Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Abstract

一実施形態では、本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、心筋組織及び骨格筋組織においてミニジストロフィン遺伝子及びＮＦ－κＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡ遺伝子の両方を発現させるためのカセットを含むデュアルカセット遺伝子ビヒクルであって、当該ミニジストロフィン遺伝子が、筋肉特異的第１のプロモータ及び改変Ｍｃｋｅｎ（ＭＣＫ）エンハンサを含むコンストラクトに作動可能に連結されており、当該ＮＦ－κＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡ遺伝子が、第２のプロモータの制御下にある遺伝子ビヒクルを提供する。また、このような遺伝子ビヒクルを含む医薬組成物、及びこのような遺伝子送達ビヒクル及び医薬組成物を使用するデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を回復させる方法も提供される。【選択図】図６Ａ

Description

関連出願の相互参照
この特許出願は、参照により援用される、２０１９年２月２日出願の米国仮特許出願第６２／８００，４８４号の恩典を主張する。
配列表
本明細書と同時に提出されるヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により本明細書に援用される。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、ジストロフィン遺伝子の変異に起因する致死性のＸ連鎖遺伝性疾患である。ＤＭＤは、最も一般的な遺伝性筋疾患である。ＤＭＤ患者における若年死亡の主因は、心不全である。炎症は、進行性筋変性におけるＤＭＤの二次病態メカニズムであるが、ＮＦ－κＢ（ＮＦ－κＢ）を阻害すると、ＤＭＤマウスにおいて筋肉の炎症が減少し、筋病理が回復し、筋肉の生理機能が改善する（非特許文献１及び２）。
遺伝子療法をベースとする遺伝子置換は、ＤＭＤの治療法となる可能性がある（非特許文献３）が、ＤＭＤには未だ治療法がない。ＮＦ－κＢシグナル伝達のアップレギュレーションによって引き起こされる慢性炎症は、ＤＭＤ遺伝子療法の課題である（非特許文献４）。ＣＭＶプロモータなどのユニバーサルプロモータは、筋肉遺伝子療法において望まれない毒性及び免疫応答を引き起こすことが多い。従って、特定の筋肉を標的とする遺伝子送達系が、ＤＭＤの臨床試験の安全性にとって重要である（非特許文献５）。更に、鬱血性心不全がＤＭＤから生じる主な合併症であると記載されていることに鑑みれば、ＤＭＤ療法のためにミニジストロフィンを筋肉特異的に発現させると、骨格筋及び心筋の両方でミニジストロフィンがロバストに発現するはずである。
ｓｈＲＮＡ技術を介してＮＦ－κＢを減少させると、ｍｄｘマウスにおけるこのような病理過程が回復することが実証されている（非特許文献６）。また、ミニジストロフィン及びＮＦ－κＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡをそれぞれ保有する２つの組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターをＤＭＤマウスモデルに同時に注射したとき、ＮＦ－κＢの減少を介してミニジストロフィンの発現が顕著に増加することが他の予備的な結果によって示されている。しかし、２種類のＡＡＶの注射は、多くの用途において、複雑すぎて臨床には適用できない。
従って、骨格筋及び心筋の両方にミニジストロフィン遺伝子及びＮＦ－κＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡの両方を導入するためのより実用的なビヒクルが望まれている。
Qing Yang, et al. Gene Ther. 2012, 19:1196-1204, PubMed PMID: 22278411. Xi Yin, et al. Muscle Nerve. 2017, 56:759-767. Bing Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 2000, 97(25):13714-13719, PMID: 11095710. Mendell, et al., N. Engl. J. Med. 2010 Oct 7;363(15):1429-37. Bing Wang, et al., Gene Ther., 2008, 15:1489-1499, PMID: 18563184. Qing Yang, et al. Gene Ther. 2012, 19:1196-1204, PubMed PMID: 22278411.
一実施形態では、本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、心筋組織及び骨格筋組織においてミニジストロフィン遺伝子及びＮＦ－κＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡ遺伝子の両方を発現させるためのカセットを含むデュアルカセット遺伝子ビヒクルであって、当該ミニジストロフィン遺伝子が、筋肉特異的第１のプロモータ及び改変Ｍｃｋｅｎ（ＭＣＫ）エンハンサを含むコンストラクトに作動可能に連結されており、当該ＮＦ－κＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡ遺伝子が、第２のプロモータの制御下にある遺伝子ビヒクルを提供する。また、このような遺伝子ビヒクルを含む医薬組成物、並びにこのような遺伝子送達ビヒクル及び医薬組成物を使用するデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を回復させる方法も提供される。
同様の技術は存在しない。ＤＭＤにおけるアップレギュレーションしたＮＦ－ｋＢ経路は、下流の病態形成において鍵となる役割を果たしているだけでなく（Ａｃｈａｒｙｙａ ２００７Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ）、ジストロフィン遺伝子置換の効率にも明らかに影響を与える（Ｊａｙａｎｄｈａｒａｎ，２０１１ ＰＮＡＳ）。デュアル治療遺伝子療法ストラテジは革新的であり、単一のミニジストロフィン置換よりも多くの利益を有するはずである。
図１、パネルＡは、シングルカセット及びデュアルカセットのＡＡＶコンストラクトの模式図を示す。図１、パネルＢは、心臓組織で試験したジストロフィンのウェスタンブロットを示す。図１、パネルＣは、心臓及び肝臓の組織におけるジストロフィンの免疫蛍光（ＩＦ）染色を示す。図１、パネルＤは、デュアルカセットＡＡＶ及びシングルカセットＡＡＶの処理によって全身処理されたｍｄｘ／ｕｔｒｎ－／－マウス由来の心臓組織、骨格筋組織（ＤＩＡは横隔膜であり、ＧＡＳは腓腹筋であり、ＴＡは前脛骨筋である）、及び肝臓組織におけるミニジストロフィンのＩＦ染色を示す。ミニジストロフィンは、シングルホモ及びデュアルホモの両群において、心臓、横隔膜、ＧＡＳ、及びＴＡの筋肉において発現に成功した。更に、肝臓組織ではミニジストロフィンは発現せず、このことは、組織特異性を示す。図１、パネルＥは、異なる種類の組織におけるミニジストロフィン陽性細胞比を示すグラフである。心臓及びＤＩＡの組織では、シングルホモ群とデュアルホモ群との間に差はなかった。しかし、ＧＡＳ及びＴＡの筋肉では、デュアルホモ群でミニジストロフィンがはるかにより多く発現していた。（＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を意味する） 図２、パネルＡは、腓腹筋におけるＣＤ６８、ＣＤ４、ＣＤ８、及びｐ－Ｐ６５のＩＦ染色を示す。図２、パネルＢは、心筋及び腓腹筋におけるｐ－Ｐ６５のＩＦ染色を示す。ＷＴ：野生型、デュアルホモ：デュアルカセットＡＡＶで処理したｄＫＯホモ、シングルホモ：シングルカセットＡＡＶで処理したｄＫＯホモ、Ｃｔホモ：未処理のｄＫＯホモ。倍率：２００倍。（＊は、ｐ＜０．０５を意味し、＊＊は、ｐ＜０．０１を意味し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を意味し、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を意味する） 図３、パネルＡは、実施例２で述べたトランスジェニック及びノックダウンマウスの特徴を表す。図３、パネルＢは、２月齢のＧＡＳ筋肉におけるジストロフィン及びｐ－Ｐ６５の発現のウェスタンブロット分析を示す。図３、パネルＣは、同齢のＧＡＳ筋肉で行ったジストロフィン及びβ－サルコグリカンのヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色及びＩＦ染色を示す。 図４Ａは、２月齢のトランスジェニック及びノックダウンマウスの腓腹筋におけるｍＩｇＧ、ＣＤ６８、ＣＤ４、及びＣＤ８のマッソン三色染色及びＩＦ染色を示す。図４Ｂは、ＣＤ６８、ＣＤ４、及びＣＤ８が異なるトランスジェニック及びノックダウンマウス群間で有意差を示したことを明らかにする、統計解析を提示する。＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊ｐ＜０．０００１。図４Ｃは、ｒＡＡＶで処理した心筋及び／又は腓腹筋におけるＣＤ８、ＣＤ４、及びＣＤ６８のＩＦ染色の結果を示す（心筋組織にはＣＤ８陽性はほとんど存在しない）。下方パネルにおけるグラフにおいて、Ｙ軸は、ビジュアルフレームごとの陽性細胞数である。シングルホモは、Ｃｔホモ群よりも免疫細胞浸潤が少なく、デュアルホモは、シングルホモ群よりも少ない。（ｎ＝３、＊は、ｐ＜０．０５を意味し、＊＊は、ｐ＜０．０１を意味し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を意味し、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を意味する）。図４Ｄは、ＡＡＶで処理したマウスの健康全般を示し、（１）はＷＴを示し、（２）はデュアルホモを示し、（３）はシングルホモを示し、（４）はＣｔホモを示す。０～２００ＨＺの周波数での１月齢及び２月齢における筋機能を上段のグラフに示す。１月齢及び２月齢における異なる群の体重を下段のグラフに示す（＊は、ｐ＜０．０５を意味し、＊＊は、ｐ＜０．０１を意味し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を意味し、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を意味する）。 図５Ａは、本発明の実施形態を表すベクター模式図である：ベクターｐＡＡＶ－Ｍ１ｐ６５ＥｎｓｙｎＯｐｔｉ３９７８（配列番号１）及びｐＡＡＶ－Ｍ２ｐ６５ＥｎｓｙｎＯｐｔｉ３９７８（配列番号２３）。図５Ｂは、ｐＡＡＶ－Ｍ１ｐ６５ＥｎｓｙｎＯｐｔｉ３９７８及びｐＡＡＶ－Ｍ２ｐ６５ＥｎｓｙｎＯｐｔｉ３９７８のベクター内の特定の遺伝要素の位置を表で示す。 図６Ａは、本発明の実施形態を表すベクター模式図である：ベクターｐＡＡＶ－Ｍ１ｐ６５ＥｎｓｙｎＯｐｔｉ３８３７（配列番号２５）及びｐＡＡＶ－Ｍ２ｐ６５ＥｎｓｙｎＯｐｔｉ３８３７（配列番号２６）。図６Ｂは、ｐＡＡＶ－Ｍ１ｐ６５ＥｎｓｙｎＯｐｔｉ３８３７及びｐＡＡＶ－Ｍ２ｐ６５ＥｎｓｙｎＯｐｔｉ３８３７のベクター内の特定の遺伝要素の位置を表で示す。
一実施形態では、本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、心筋組織及び骨格筋組織においてミニジストロフィン遺伝子及びＮＦ－κＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡ遺伝子の両方を発現させるためのカセットを含むデュアルカセット遺伝子ビヒクルであって、当該ミニジストロフィン遺伝子が、筋肉特異的第１のプロモータ及び改変Ｍｃｋｅｎ（ＭＣＫ）プロモータエンハンサを含むコンストラクトに作動可能に連結されており、当該ＮＦ－κＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡ遺伝子が、第２のプロモータに作動可能に連結されている遺伝子ビヒクルを提供する。
ＡＡＶベクターは、当業者に公知であるものなどの、遺伝子療法ベクターとして使用するのに好適なＡＡＶの任意の株に由来していてよい。純粋に、例えば、親ＡＡＶ株は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、又はＡＡＶ９であってよいが、他の株を使用することもできる。
本発明の状況における例示的なＡＡＶベクター（又はそれから当業者がウイルス配列を理解するようなものをコードしているベクターを作製するためのプラスミド）は、ＡＡＶ－Ｍ１ｐ６５ＥｎｓｙｎＯｐｔｉ３９７８又はＡＡＶ－Ｍ２ｐ６５ＥｎｓｙｎＯｐｔｉ３９７８（このようなベクターを作製するためのプラスミドを含む）として本明細書に記載される。本発明の状況で使用するためのこれら例示的なＡＡＶの配列は、ＡＡＶ－Ｍ１ｐ６５ＥｎｓｙｎＯｐｔｉ３９７８である配列番号１；ＡＡＶ－Ｍ２ｐ６５ＥｎｓｙｎＯｐｔｉ３９７８である配列番号２３；ＡＡＶ－Ｍ１ｐ６５ＥｎｓｙｎＯｐｔｉ３８３７である配列番号２５；及びＡＡＶ－Ｍ２ｐ６５ＥｎｓｙｎＯｐｔｉ３８３７である配列番号２６の配列を含む。
ＡＡＶ－Ｍ２ｐ６５ＥｎｓｙｎＯｐｔｉ３９７８は、配列番号１中に存在するｍ１ｐ６５をコードしている配列（ｔｇｔｇｔｃｃａｔｔｇｔｃｔｃａｃｔｃｃｔｃｇａｇｇａｇｔｇａｇａｃａａｔｇｇａｃａｃａｔｔｔｔｔｔｔ（配列番号１７））の代わりに、ｂｐ１７０１～１７５１に配列ａｇｔｃｃｃｔｇｔｃｔｇｃａｃｃｔｇｔｃｔｃｇａｇａｃａｇｇｔｇｃａｇａｃａｇｇｇａｃｔｔｔｔｔｔｔｔ（ｍ２ｐ６５ ｓｈＲＮＡをコード、配列番号２２を含む点でＡＡＶ－Ｍ１ｐ６５ＥｎｓｙｎＯｐｔｉ３９７８と異なる。
同様に、ＡＡＶ－Ｍ２ｐ６５ＥｎｓｙｎＯｐｔｉ３８３７は、配列番号２５中に存在するｍ１ｐ６５をコードしている配列（ｔｇｔｇｔｃｃａｔｔｇｔｃｔｃａｃｔｃｃｔｃｇａｇｇａｇｔｇａｇａｃａａｔｇｇａｃａｃａｔｔｔｔｔｔｔ（配列番号１７））の代わりに、ｂｐ１７０１～１７５１に配列ａｇｔｃｃｃｔｇｔｃｔｇｃａｃｃｔｇｔｃｔｃｇａｇａｃａｇｇｔｇｃａｇａｃａｇｇｇａｃｔｔｔｔｔｔｔｔ（ｍ２ｐ６５ ｓｈＲＮＡをコード、配列番号２２を含む点でＡＡＶ－Ｍ１ｐ６５ＥｎｓｙｎＯｐｔｉ３８３７と異なる。
前述の通り、本発明の状況で使用するためのＡＡＶは、心筋及び骨格筋においてミニジストロフィン遺伝子を発現させるためのカセットを含む。好ましくは、ミニジストロフィン遺伝子は、ヒトのコドンに最適化されている。例えば、５つのロッド（１、２、２２、２３、２４）及び３つのヒンジ（１、３、４）、並びにＣＲドメインを含む、ヒト最適化ミニジストロフィン遺伝子は、ＤＭＤ動物モデルの治療、及びヒトの臨床試験、そして、最終的にはＣＤＭの治療に使用することができる。例えば、Ｋｏｒｎｅｇａｙ ＪＮ，ｅｔ ａｌ．．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１０，１８（８）：１５０１－１５０８，ＰＭＩＤ：２０５１７２９８（全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。１つのこのようなヒト最適化ミニジストロフィン（マイクロジストロフィンとも呼ばれる）の配列は、ｏｐｔｉ－ＤｙｓΔ３９７８（３９７８塩基対を含む）であり、配列番号２に記載されている：
ａｔｇｇｔｇｔｇｇｔｇｇｇａｇｇａａｇｔｇｇａｇｇａｃｔｇｃｔａｃｇａｇａｇａｇａｇｇａｃｇｔｇｃａｇａａｇａａａａｃｃｔｔｃａｃｃａａｇｔｇｇｇｔｇａａｃｇｃｃｃａｇｔｔｃａｇｃａａｇｔｔｃｇｇｃａａｇｃａｇｃａｃａｔｃｇａｇａａｃｃｔｇｔｔｃａｇｃｇａｃｃｔｇｃａｇｇａｔｇｇｃａｇｇａｇａｃｔｇｃｔｇｇａｃｃｔｇｃｔｇｇａｇｇｇｃｃｔｇａｃｃｇｇｃｃａｇａａｇｃｔｇｃｃｃａａｇｇａｇａａｇｇｇｃａｇｃａｃｃａｇａｇｔｇｃａｃｇｃｃｃｔｇａａｃａａｃｇｔｇａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇａｇａｇｔｇｃｔｇｃａｇａａｃａａｃａａｃｇｔｇｇａｃｃｔｇｇｔｇａａｃａｔｃｇｇｃａｇｃａｃｃｇａｃａｔｃｇｔｇｇａｃｇｇｃａａｃｃａｃａａｇｃｔｇａｃｃｃｔｇｇｇｃｃｔｇａｔｃｔｇｇａａｃａｔｃａｔｃｃｔｇｃａｃｔｇｇｃａｇｇｔｇａａｇａａｃｇｔｇａｔｇａａｇａａｃａｔｃａｔｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｃａｇｃａｇａｃｃａａｃａｇｃｇａｇａａｇａｔｃｃｔｇｃｔｇａｇｃｔｇｇｇｔｇａｇｇｃａｇａｇｃａｃｃａｇａａａｃｔａｃｃｃｃｃａｇｇｔｇａａｃｇｔｇａｔｃａａｃｔｔｃａｃｃａｃｃｔｃｃｔｇｇａｇｃｇａｃｇｇｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇａａｃｇｃｃｃｔｇａｔｃｃａｃａｇｃｃａｃａｇａｃｃｃｇａｃｃｔｇｔｔｃｇａｃｔｇｇａａｃａｇｃｇｔｇｇｔｇｔｇｔｃａｇｃａｇａｇｃｇｃｃａｃｃｃａｇａｇａｃｔｇｇａｇｃａｃｇｃｃｔｔｃａａｃａｔｃｇｃｃａｇａｔａｃｃａｇｃｔｇｇｇｃａｔｃｇａｇａａｇｃｔｇｃｔｇｇａｃｃｃｃｇａｇｇａｃｇｔｇｇａｃａｃｃａｃｃｔａｃｃｃｃｇａｃａａｇａａａａｇｃａｔｃｃｔｃａｔｇｔａｃａｔｔａｃｃａｇｃｃｔｇｔｔｃｃａｇｇｔｇｃｔｇｃｃｃｃａｇｃａｇｇｔｇｔｃｃａｔｃｇａｇｇｃｃａｔｃｃａｇｇａａｇｔｇｇａａａｔｇｃｔｇｃｃｃａｇｇｃｃｃｃｃｃａａａｇｔｇａｃｃａａｇｇａｇｇａｇｃａｃｔｔｃｃａｇｃｔｇｃａｃｃａｃｃａｇａｔｇｃａｃｔａｃａｇｃｃａｇｃａｇａｔｃａｃａｇｔｇａｇｃｃｔｇｇｃｃｃａｇｇｇｃｔａｔｇａｇａｇａａｃｃａｇｃａｇｃｃｃｃａａｇｃｃｃａｇａｔｔｃａａｇａｇｃｔａｃｇｃｃｔａｃａｃｃｃａｇｇｃｃｇｃｃｔａｃｇｔｇａｃｃａｃｃｔｃｃｇａｃｃｃｃａｃｃａｇａａｇｃｃｃｃｔｔｃｃｃｃａｇｃｃａｇｃａｃｃｔｇｇａｇｇｃｃｃｃｃｇａｇｇａｃａａｇａｇｃｔｔｃｇｇｃａｇｃａｇｃｃｔｇａｔｇｇａｇａｇｃｇａａｇｔｇａａｃｃｔｇｇａｃａｇａｔａｃｃａｇａｃｃｇｃｃｃｔｇｇａｇｇａａｇｔｇｃｔｇｔｃｃｔｇｇｃｔｇｃｔｇａｇｃｇｃｃｇａｇｇａｃａｃｃｃｔｇｃａｇｇｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇａｔｃａｇｃａａｃｇａｃｇｔｇｇａａｇｔｇｇｔｇａａｇｇａｃｃａｇｔｔｃｃａｃａｃｃｃａｃｇａｇｇｇｃｔａｃａｔｇａｔｇｇａｔｃｔｇａｃｃｇｃｃｃａｃｃａｇｇｇｃａｇａｇｔｇｇｇｃａａｔａｔｃｃｔｇｃａｇｃｔｇｇｇｃａｇｃａａｇｃｔｇａｔｃｇｇｃａｃｃｇｇｃａａｇｃｔｇａｇｃｇａｇｇａｃｇａｇｇａｇａｃｃｇａａｇｔｇｃａｇｇａｇｃａｇａｔｇａａｃｃｔｇｃｔｇａａｃａｇｃａｇａｔｇｇｇａｇｔｇｃｃｔｇａｇａｇｔｇｇｃｃａｇｃａｔｇｇａｇａａｇｃａｇａｇｃａａｃｃｔｇｃａｃａｇａｇｔｇｃｔｇａｔｇｇａｃｃｔｇｃａｇａａｃｃａｇａａｇｃｔｇａａｇｇａｇｃｔｇａａｃｇａｃｔｇｇｃｔｇａｃｃａａｇａｃｃｇａｇｇａｇｃｇｇａｃｃａｇａａａｇａｔｇｇａｇｇａｇｇａｇｃｃｃｃｔｇｇｇｃｃｃｃｇａｃｃｔｇｇａｇｇａｃｃｔｇａａｇａｇａｃａｇｇｔｇｃａｇｃａｇｃａｃａａａｇｔｇｃｔｇｃａｇｇａｇｇａｃｃｔｇｇａｇｃａｇｇａｇｃａｇｇｔｇｃｇｃｇｔｇａａｃａｇｃｃｔｇａｃｃｃａｃａｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｃｇｔｇｇａｃｇａｇａｇｃａｇｃｇｇｃｇａｃｃａｃｇｃｃａｃａｇｃｃｇｃｃｃｔｇｇａａｇａｇｃａｇｃｔｇａａａｇｔｇｃｔｇｇｇｃｇａｃａｇａｔｇｇｇｃｃａａｔａｔｔｔｇｔａｇｇｔｇｇａｃｃｇａｇｇａｃａｇａｔｇｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇｃａｇｇａｃｃａｇｃｃｃｇａｃｃｔｇｇｃｃｃｃｔｇｇｃｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｃｇｇｃｇｃｃａｇｃｃｃｃａｃｃｃａｇａｃｃｇｔｇａｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｃｃａｇｃｃｃｇｔｇｇｔｇａｃａａａｇｇａｇａｃｃｇｃｃａｔｃａｇｃａａｇｃｔｇｇａｇａｔｇｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇａｔｇｃｔｇｇａａｇｔｇｃｃｃａｃｃｃａｃｃｇｃｃｔｇｃｔｃｃａｇｃａｇｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇａｃｃｔｇｇａｇａａｇｔｔｃｃｔｇｇｃｃｔｇｇｃｔｇａｃｃｇａｇｇｃｃｇａａａｃｃａｃｃｇｃｃａａｔｇｔｇｃｔｃｃａｇｇａｃｇｃｃａｃｔａｇａａａｇｇａｇａｇｇｃｔｇｃｔｇｇａｇｇａｃａｇｃａａｇｇｇｃｇｔｇａａａｇａｇｃｔｇａｔｇａａｇｃａｇｔｇｇｃａｇｇａｔｃｔｇｃａｇｇｇｃｇａａａｔｃｇａｇｇｃｃｃａｃａｃｃｇａｃｇｔｇｔａｃｃａｃａａｃｃｔｇｇａｃｇａｇａａｃａｇｃｃａｇａａｇａｔｔｃｔｇａｇｇａｇｃｃｔｇｇａｇｇｇｃａｇｃｇａｃｇａｃｇｃｃｇｔｃｃｔｇｃｔｃｃａｇａｇｇａｇｇｃｔｇｇａｃａａｃａｔｇａａｃｔｔｃａａｇｔｇｇａｇｃｇａｇｃｔｇｃｇｇａａｇａａｇａｇｃｃｔｇａａｃａｔｃｃｇｇａｇｃｃａｃｃｔｇｇａａｇｃｃａｇｃａｇｃｇａｃｃａｇｔｇｇａａｇａｇａｃｔｇｃａｃｃｔｇａｇｃｃｔｇｃａｇｇａｇｃｔｇｃｔｇｇｔｇｔｇｇｃｔｇｃａｇｃｔｇａａｇｇａｃｇａｃｇａｇｃｔｇａｇｃａｇａｃａｇｇｃｃｃｃｃａｔｃｇｇｃｇｇｃｇａｃｔｔｃｃｃｃｇｃｃｇｔｇｃａｇａａｇｃａｇａａｃｇａｃｇｔｇｃａｃｃｇｇｇｃｃｔｔｃａａｇａｇｇｇａｇｃｔｇａａａａｃｃａａｇｇａａｃｃｃｇｔｇａｔｃａｔｇａｇｃａｃｃｃｔｇｇａｇａｃａｇｔｇｃｇｇａｔｃｔｔｃｃｔｇａｃｃｇａｇｃａｇｃｃｃｃｔｇｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｇａａｇｃｔｇｔａｃｃａｇｇａｇｃｃｃａｇａｇａｇｃｔｇｃｃｃｃｃｃｇａｇｇａｇａｇａｇｃｃｃａｇａａｃｇｔｇａｃｃａｇｇｃｔｇｃｔｇａｇａａａｇｃａｇｇｃｃｇａｇｇａａｇｔｇａａｔａｃｃｇａｇｔｇｇｇａｇａａｇｃｔｇａａｔｃｔｇｃａｃａｇｃｇｃｃｇａｃｔｇｇｃａｇａｇａａａｇａｔｃｇａｃｇａｇａｃｃｃｔｇｇａｇａｇａｃｔｃｃａｇｇａａｃｔｇｃａｇｇａａｇｃｃａｃｃｇａｃｇａｇｃｔｇｇａｃｃｔｇａａｇｃｔｇａｇａｃａｇｇｃｃｇａａｇｔｇａｔｃａａｇｇｇｃａｇｃｔｇｇｃａｇｃｃｔｇｔｇｇｇｃｇａｔｃｔｇｃｔｇａｔｃｇａｃｔｃｃｃｔｇｃａｇｇａｔｃａｃｃｔｇｇａｇａａａｇｔｇａａｇｇｃｃｃｔｇｃｇｇｇｇｃｇａｇａｔｃｇｃｃｃｃｃｃｔｇａａｇｇａｇａａｔｇｔｇａｇｃｃａｃｇｔｇａａｃｇａｃｃｔｇｇｃｃａｇａｃａｇｃｔｇａｃｃａｃｃｃｔｇｇｇｃａｔｃｃａｇｃｔｇａｇｃｃｃｃｔａｃａａｃｃｔｇａｇｃａｃａｃｔｇｇａｇｇａｔｃｔｇａａｃａｃｃｃｇｇｔｇｇａａａｃｔｇｃｔｇｃａｇｇｔｇｇｃｃｇｔｇｇａｇｇａｔａｇａｇｔｇａｇｇｃａｇｃｔｇｃａｃｇａａｇｃｃｃａｃａｇａｇａｃｔｔｃｇｇｃｃｃｔｇｃｃｔｃｃｃａｇｃａｃｔｔｃｃｔｇａｇｃａｃｃａｇｃｇｔｇｃａｇｇｇｃｃｃｃｔｇｇｇａｇａｇａｇｃｃａｔｃｔｃｃｃｃｃａａｃａａａｇｔｇｃｃｃｔａｃｔａｃａｔｃａａｃｃａｃｇａｇａｃｃｃａｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔｇｇｇａｃｃａｃｃｃｔａａｇａｔｇａｃｃｇａｇｃｔｇｔａｔｃａｇａｇｃｃｔｇｇｃｃｇａｃｃｔｇａａｃａａｔｇｔｇｃｇｇｔｔｃａｇｃｇｃｃｔａｃａｇａａｃｃｇｃｃａｔｇａａｇｃｔｇｃｇｇａｇａｃｔｇｃａｇａａｇｇｃｃｃｔｇｔｇｃｃｔｇｇａｔｃｔｇｃｔｇａｇｃｃｔｇａｇｃｇｃｃｇｃｃｔｇｃｇａｃｇｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃａｃａａｃｃｔｇａａｇｃａｇａａｔｇａｃｃａｇｃｃｃａｔｇｇａｃａｔｃｃｔｇｃａｇａｔｃａｔｃａａｃｔｇｃｃｔｇａｃｃａｃａａｔｃｔａｃｇａｃｃｇｇｃｔｇｇａａｃａｇｇａｇｃａｃａａｃａａｃｃｔｇｇｔｇａａｔｇｔｇｃｃｃｃｔｇｔｇｃｇｔｇｇａｃａｔｇｔｇｃｃｔｇａａｔｔｇｇｃｔｇｃｔｇａａｃｇｔｇｔａｃｇａｃａｃｃｇｇｃａｇｇａｃｃｇｇｃａｇａａｔｃｃｇｃｇｔｇｃｔｇａｇｃｔｔｃａａｇａｃｃｇｇｃａｔｃａｔｃａｇｃｃｔｇｔｇｃａａｇｇｃｃｃａｃｃｔｇｇａｇｇａｔａａｇｔａｃｃｇｃｔａｃｃｔｇｔｔｃａａｇｃａｇｇｔｇｇｃｃａｇｃａｇｃａｃｃｇｇｃｔｔｃｔｇｃｇａｔｃａｇａｇｇａｇａｃｔｇｇｇｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃａｃｇａｔａｇｃａｔｃｃａｇａｔｃｃｃｔａｇｇｃａｇｃｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｇｃｃａｇｃｔｔｔｇｇｃｇｇｃａｇｃａａｃａｔｃｇａｇｃｃｃｔｃｔｇｔｇａｇｇａｇｃｔｇｃｔｔｃｃａｇｔｔｃｇｃｃａａｃａａｃａａｇｃｃｃｇａｇａｔｃｇａｇｇｃｃｇｃｃｃｔｇｔｔｃｃｔｇｇａｃｔｇｇａｔｇａｇｇｃｔｇｇａｇｃｃｔｃａｇａｇｃａｔｇｇｔｇｔｇｇｃｔｇｃｃｔｇｔｇｃｔｇｃａｃａｇａｇｔｇｇｃｃｇｃｃｇｃｃｇａｇａｃｃｇｃｃａａｇｃａｃｃａｇｇｃｃａａｇｔｇｃａａｔａｔｃｔｇｃａａｇｇａｇｔｇｃｃｃｃａｔｃａｔｃｇｇｃｔｔｃｃｇｇｔａｃａｇｇａｇｃｃｔｇａａｇｃａｃｔｔｃａａｃｔａｃｇａｃａｔｃｔｇｃｃａｇａｇｃｔｇｃｔｔｔｔｔｃａｇｃｇｇｃａｇａｇｔｇｇｃｃａａｇｇｇｃｃａｃａａａａｔｇｃａｃｔａｃｃｃｃａｔｇｇｔｇｇａｇｔａｃｔｇｃａｃｃｃｃｃａｃｃａｃｃｔｃｃｇｇｃｇａｇｇａｔｇｔｇａｇａｇａｃｔｔｃｇｃｃａａａｇｔｇｃｔｇａａｇａａｔａａｇｔｔｃｃｇｇａｃｃａａｇｃｇｇｔａｃｔｔｔｇｃｃａａｇｃａｃｃｃｃａｇｇａｔｇｇｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃｇｔｇｃａｇａｃｃｇｔｇｃｔｇｇａａｇｇｃｇａｃａａｃａｔｇｇａｇａｃｃｔｇａ。この配列は、配列番号１及び配列番号２３内に塩基対２３６５～６３４２として含まれている。
配列番号２内に、ヒト最適化ミニジストロフィンの以下のドメインを同定することができる。ヒト最適化ミニジストロフィン遺伝子のコード配列内におけるこれらヌクレオチドの位置を、図５Ｂに示す。
ヒトジストロフィンのＮ末端（７５６塩基対）；配列番号３：
ａｔｇｇｔｇｔｇｇｔｇｇｇａｇｇａａｇｔｇｇａｇｇａｃｔｇｃｔａｃｇａｇａｇａｇａｇｇａｃｇｔｇｃａｇａａｇａａａａｃｃｔｔｃａｃｃａａｇｔｇｇｇｔｇａａｃｇｃｃｃａｇｔｔｃａｇｃａａｇｔｔｃｇｇｃａａｇｃａｇｃａｃａｔｃｇａｇａａｃｃｔｇｔｔｃａｇｃｇａｃｃｔｇｃａｇｇａｔｇｇｃａｇｇａｇａｃｔｇｃｔｇｇａｃｃｔｇｃｔｇｇａｇｇｇｃｃｔｇａｃｃｇｇｃｃａｇａａｇｃｔｇｃｃｃａａｇｇａｇａａｇｇｇｃａｇｃａｃｃａｇａｇｔｇｃａｃｇｃｃｃｔｇａａｃａａｃｇｔｇａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇａｇａｇｔｇｃｔｇｃａｇａａｃａａｃａａｃｇｔｇｇａｃｃｔｇｇｔｇａａｃａｔｃｇｇｃａｇｃａｃｃｇａｃａｔｃｇｔｇｇａｃｇｇｃａａｃｃａｃａａｇｃｔｇａｃｃｃｔｇｇｇｃｃｔｇａｔｃｔｇｇａａｃａｔｃａｔｃｃｔｇｃａｃｔｇｇｃａｇｇｔｇａａｇａａｃｇｔｇａｔｇａａｇａａｃａｔｃａｔｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｃａｇｃａｇａｃｃａａｃａｇｃｇａｇａａｇａｔｃｃｔｇｃｔｇａｇｃｔｇｇｇｔｇａｇｇｃａｇａｇｃａｃｃａｇａａａｃｔａｃｃｃｃｃａｇｇｔｇａａｃｇｔｇａｔｃａａｃｔｔｃａｃｃａｃｃｔｃｃｔｇｇａｇｃｇａｃｇｇｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇａａｃｇｃｃｃｔｇａｔｃｃａｃａｇｃｃａｃａｇａｃｃｃｇａｃｃｔｇｔｔｃｇａｃｔｇｇａａｃａｇｃｇｔｇｇｔｇｔｇｔｃａｇｃａｇａｇｃｇｃｃａｃｃｃａｇａｇａｃｔｇｇａｇｃａｃｇｃｃｔｔｃａａｃａｔｃｇｃｃａｇａｔａｃｃａｇｃｔｇｇｇｃａｔｃｇａｇａａｇｃｔｇｃｔｇｇａｃｃｃｃｇａｇｇａｃｇｔｇｇａｃａｃｃａｃｃｔａｃｃｃｃｇａｃａａｇａａａａｇｃａｔｃｃｔｃａｔｇｔａｃａｔｔａｃｃａｇｃｃｔｇｔｔｃｃａｇｇｔｇｃｔｇｃｃｃｃａｇｃａｇｇｔｇｔｃｃａｔｃｇａｇｇｃｃａｔｃｃａｇｇａａｇｔｇｇａａ；
ヒンジ１（２２５塩基対）；配列番号４：
ａｔｇｃｔｇｃｃｃａｇｇｃｃｃｃｃｃａａａｇｔｇａｃｃａａｇｇａｇｇａｇｃａｃｔｔｃｃａｇｃｔｇｃａｃｃａｃｃａｇａｔｇｃａｃｔａｃａｇｃｃａｇｃａｇａｔｃａｃａｇｔｇａｇｃｃｔｇｇｃｃｃａｇｇｇｃｔａｔｇａｇａｇａａｃｃａｇｃａｇｃｃｃｃａａｇｃｃｃａｇａｔｔｃａａｇａｇｃｔａｃｇｃｃｔａｃａｃｃｃａｇｇｃｃｇｃｃｔａｃｇｔｇａｃｃａｃｃｔｃｃｇａｃｃｃｃａｃｃａｇａａｇｃｃｃｃｔｔｃｃｃｃａｇｃｃａｇｃａｃｃｔｇｇａｇｇｃｃｃｃｃｇａｇｇａｃ；
ロッド１（３３３塩基対）；配列番号５：
ａｇｃｇａａｇｔｇａａｃｃｔｇｇａｃａｇａｔａｃｃａｇａｃｃｇｃｃｃｔｇｇａｇｇａａｇｔｇｃｔｇｔｃｃｔｇｇｃｔｇｃｔｇａｇｃｇｃｃｇａｇｇａｃａｃｃｃｔｇｃａｇｇｃｃｃａｇｇｇｃｇａｇａｔｃａｇｃａａｃｇａｃｇｔｇｇａａｇｔｇｇｔｇａａｇｇａｃｃａｇｔｔｃｃａｃａｃｃｃａｃｇａｇｇｇｃｔａｃａｔｇａｔｇｇａｔｃｔｇａｃｃｇｃｃｃａｃｃａｇｇｇｃａｇａｇｔｇｇｇｃａａｔａｔｃｃｔｇｃａｇｃｔｇｇｇｃａｇｃａａｇｃｔｇａｔｃｇｇｃａｃｃｇｇｃａａｇｃｔｇａｇｃｇａｇｇａｃｇａｇｇａｇａｃｃｇａａｇｔｇｃａｇｇａｇｃａｇａｔｇａａｃｃｔｇｃｔｇａａｃａｇｃａｇａｔｇｇｇａｇｔｇｃｃｔｇａｇａｇｔｇｇｃｃａｇｃａｔｇｇａｇａａｇｃａｇａｇｃａａｃｃｔｇｃａｃａｇａ；
ロッド２（３２７塩基対）；配列番号６：
ｇｔｇｃｔｇａｔｇｇａｃｃｔｇｃａｇａａｃｃａｇａａｇｃｔｇａａｇｇａｇｃｔｇａａｃｇａｃｔｇｇｃｔｇａｃｃａａｇａｃｃｇａｇｇａｇｃｇｇａｃｃａｇａａａｇａｔｇｇａｇｇａｇｇａｇｃｃｃｃｔｇｇｇｃｃｃｃｇａｃｃｔｇｇａｇｇａｃｃｔｇａａｇａｇａｃａｇｇｔｇｃａｇｃａｇｃａｃａａａｇｔｇｃｔｇｃａｇｇａｇｇａｃｃｔｇｇａｇｃａｇｇａｇｃａｇｇｔｇｃｇｃｇｔｇａａｃａｇｃｃｔｇａｃｃｃａｃａｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｃｇｔｇｇａｃｇａｇａｇｃａｇｃｇｇｃｇａｃｃａｃｇｃｃａｃａｇｃｃｇｃｃｃｔｇｇａａｇａｇｃａｇｃｔｇａａａｇｔｇｃｔｇｇｇｃｇａｃａｇａｔｇｇｇｃｃａａｔａｔｔｔｇｔａｇｇｔｇｇａｃｃｇａｇｇａｃａｇａｔｇｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇｃａｇｇａｃ；
ヒンジ３（１４１塩基対）；配列番号７：
ｃａｇｃｃｃｇａｃｃｔｇｇｃｃｃｃｔｇｇｃｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｃｇｇｃｇｃｃａｇｃｃｃｃａｃｃｃａｇａｃｃｇｔｇａｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｃｃａｇｃｃｃｇｔｇｇｔｇａｃａａａｇｇａｇａｃｃｇｃｃａｔｃａｇｃａａｇｃｔｇｇａｇａｔｇｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇａｔｇｃｔｇｇａａｇｔｇｃｃｃ；
ロッド２２（３４８塩基対）；配列番号８；
ａｃｃｃａｃｃｇｃｃｔｇｃｔｃｃａｇｃａｇｔｔｃｃｃｃｃｔｇｇａｃｃｔｇｇａｇａａｇｔｔｃｃｔｇｇｃｃｔｇｇｃｔｇａｃｃｇａｇｇｃｃｇａａａｃｃａｃｃｇｃｃａａｔｇｔｇｃｔｃｃａｇｇａｃｇｃｃａｃｔａｇａａａｇｇａｇａｇｇｃｔｇｃｔｇｇａｇｇａｃａｇｃａａｇｇｇｃｇｔｇａａａｇａｇｃｔｇａｔｇａａｇｃａｇｔｇｇｃａｇｇａｔｃｔｇｃａｇｇｇｃｇａａａｔｃｇａｇｇｃｃｃａｃａｃｃｇａｃｇｔｇｔａｃｃａｃａａｃｃｔｇｇａｃｇａｇａａｃａｇｃｃａｇａａｇａｔｔｃｔｇａｇｇａｇｃｃｔｇｇａｇｇｇｃａｇｃｇａｃｇａｃｇｃｃｇｔｃｃｔｇｃｔｃｃａｇａｇｇａｇｇｃｔｇｇａｃａａｃａｔｇａａｃｔｔｃａａｇｔｇｇａｇｃｇａｇｃｔｇｃｇｇａａｇａａｇａｇｃｃｔｇａａｃａｔｃｃｇｇａｇｃｃａｃｃｔｇｇａａｇｃｃ；
ロッド２３（３８７塩基対）；配列番号９：
ａｇｃａｇｃｇａｃｃａｇｔｇｇａａｇａｇａｃｔｇｃａｃｃｔｇａｇｃｃｔｇｃａｇｇａｇｃｔｇｃｔｇｇｔｇｔｇｇｃｔｇｃａｇｃｔｇａａｇｇａｃｇａｃｇａｇｃｔｇａｇｃａｇａｃａｇｇｃｃｃｃｃａｔｃｇｇｃｇｇｃｇａｃｔｔｃｃｃｃｇｃｃｇｔｇｃａｇａａｇｃａｇａａｃｇａｃｇｔｇｃａｃｃｇｇｇｃｃｔｔｃａａｇａｇｇｇａｇｃｔｇａａａａｃｃａａｇｇａａｃｃｃｇｔｇａｔｃａｔｇａｇｃａｃｃｃｔｇｇａｇａｃａｇｔｇｃｇｇａｔｃｔｔｃｃｔｇａｃｃｇａｇｃａｇｃｃｃｃｔｇｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｇａａｇｃｔｇｔａｃｃａｇｇａｇｃｃｃａｇａｇａｇｃｔｇｃｃｃｃｃｃｇａｇｇａｇａｇａｇｃｃｃａｇａａｃｇｔｇａｃｃａｇｇｃｔｇｃｔｇａｇａａａｇｃａｇｇｃｃｇａｇｇａａｇｔｇａａｔａｃｃｇａｇｔｇｇｇａｇａａｇｃｔｇａａｔｃｔｇｃａｃａｇｃｇｃｃｇａｃｔｇｇｃａｇａｇａａａｇａｔｃｇａｃｇａｇ；
ロッド２４（３２７塩基対）；配列番号１０：
ａｃｃｃｔｇｇａｇａｇａｃｔｃｃａｇｇａａｃｔｇｃａｇｇａａｇｃｃａｃｃｇａｃｇａｇｃｔｇｇａｃｃｔｇａａｇｃｔｇａｇａｃａｇｇｃｃｇａａｇｔｇａｔｃａａｇｇｇｃａｇｃｔｇｇｃａｇｃｃｔｇｔｇｇｇｃｇａｔｃｔｇｃｔｇａｔｃｇａｃｔｃｃｃｔｇｃａｇｇａｔｃａｃｃｔｇｇａｇａａａｇｔｇａａｇｇｃｃｃｔｇｃｇｇｇｇｃｇａｇａｔｃｇｃｃｃｃｃｃｔｇａａｇｇａｇａａｔｇｔｇａｇｃｃａｃｇｔｇａａｃｇａｃｃｔｇｇｃｃａｇａｃａｇｃｔｇａｃｃａｃｃｃｔｇｇｇｃａｔｃｃａｇｃｔｇａｇｃｃｃｃｔａｃａａｃｃｔｇａｇｃａｃａｃｔｇｇａｇｇａｔｃｔｇａａｃａｃｃｃｇｇｔｇｇａａａｃｔｇｃｔｇｃａｇｇｔｇｇｃｃｇｔｇｇａｇｇａｔａｇａｇｔｇａｇｇｃａｇｃｔｇｃａｃｇａａ；
ヒンジ４（２１６塩基対）；配列番号１１：
ｇｃｃｃａｃａｇａｇａｃｔｔｃｇｇｃｃｃｔｇｃｃｔｃｃｃａｇｃａｃｔｔｃｃｔｇａｇｃａｃｃａｇｃｇｔｇｃａｇｇｇｃｃｃｃｔｇｇｇａｇａｇａｇｃｃａｔｃｔｃｃｃｃｃａａｃａａａｇｔｇｃｃｃｔａｃｔａｃａｔｃａａｃｃａｃｇａｇａｃｃｃａｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔｇｇｇａｃｃａｃｃｃｔａａｇａｔｇａｃｃｇａｇｃｔｇｔａｔｃａｇａｇｃｃｔｇｇｃｃｇａｃｃｔｇａａｃａａｔｇｔｇｃｇｇｔｔｃａｇｃｇｃｃｔａｃａｇａａｃｃｇｃｃａｔｇａａｇｃｔｇ；
システインリッチ（ＣＲ）ドメイン（８８８塩基対）；配列番号１２：
ｃｇｇａｇａｃｔｇｃａｇａａｇｇｃｃｃｔｇｔｇｃｃｔｇｇａｔｃｔｇｃｔｇａｇｃｃｔｇａｇｃｇｃｃｇｃｃｔｇｃｇａｃｇｃｃｃｔｇｇａｃｃａｇｃａｃａａｃｃｔｇａａｇｃａｇａａｔｇａｃｃａｇｃｃｃａｔｇｇａｃａｔｃｃｔｇｃａｇａｔｃａｔｃａａｃｔｇｃｃｔｇａｃｃａｃａａｔｃｔａｃｇａｃｃｇｇｃｔｇｇａａｃａｇｇａｇｃａｃａａｃａａｃｃｔｇｇｔｇａａｔｇｔｇｃｃｃｃｔｇｔｇｃｇｔｇｇａｃａｔｇｔｇｃｃｔｇａａｔｔｇｇｃｔｇｃｔｇａａｃｇｔｇｔａｃｇａｃａｃｃｇｇｃａｇｇａｃｃｇｇｃａｇａａｔｃｃｇｃｇｔｇｃｔｇａｇｃｔｔｃａａｇａｃｃｇｇｃａｔｃａｔｃａｇｃｃｔｇｔｇｃａａｇｇｃｃｃａｃｃｔｇｇａｇｇａｔａａｇｔａｃｃｇｃｔａｃｃｔｇｔｔｃａａｇｃａｇｇｔｇｇｃｃａｇｃａｇｃａｃｃｇｇｃｔｔｃｔｇｃｇａｔｃａｇａｇｇａｇａｃｔｇｇｇｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃａｃｇａｔａｇｃａｔｃｃａｇａｔｃｃｃｔａｇｇｃａｇｃｔｇｇｇｃｇａａｇｔｇｇｃｃａｇｃｔｔｔｇｇｃｇｇｃａｇｃａａｃａｔｃｇａｇｃｃｃｔｃｔｇｔｇａｇｇａｇｃｔｇｃｔｔｃｃａｇｔｔｃｇｃｃａａｃａａｃａａｇｃｃｃｇａｇａｔｃｇａｇｇｃｃｇｃｃｃｔｇｔｔｃｃｔｇｇａｃｔｇｇａｔｇａｇｇｃｔｇｇａｇｃｃｔｃａｇａｇｃａｔｇｇｔｇｔｇｇｃｔｇｃｃｔｇｔｇｃｔｇｃａｃａｇａｇｔｇｇｃｃｇｃｃｇｃｃｇａｇａｃｃｇｃｃａａｇｃａｃｃａｇｇｃｃａａｇｔｇｃａａｔａｔｃｔｇｃａａｇｇａｇｔｇｃｃｃｃａｔｃａｔｃｇｇｃｔｔｃｃｇｇｔａｃａｇｇａｇｃｃｔｇａａｇｃａｃｔｔｃａａｃｔａｃｇａｃａｔｃｔｇｃｃａｇａｇｃｔｇｃｔｔｔｔｔｃａｇｃｇｇｃａｇａｇｔｇｇｃｃａａｇｇｇｃｃａｃａａａａｔｇｃａｃｔａｃｃｃｃａｔｇｇｔｇｇａｇｔａｃｔｇｃａｃｃｃｃｃａｃｃａｃｃｔｃｃｇｇｃｇａｇｇａｔｇｔｇａｇａｇａｃｔｔｃｇｃｃａａａｇｔｇｃｔｇａａｇａａｔａａｇｔｔｃｃｇｇａｃｃａａｇｃｇｇｔａｃｔｔｔｇｃｃａａｇｃａｃｃｃｃａｇｇａｔｇｇｇｃｔａｃｃｔｇｃｃｃｇｔｇｃａｇａｃｃｇｔｇｃｔｇｇａａｇｇｃｇａｃａａｃａｔｇｇａｇａｃｃ；及び
終止コドン（３塩基対）；配列番号１３：ｔｇａ
従って、本発明の状況で使用するための好適なヒト最適化ミニジストロフィン遺伝子は、配列番号２を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、又は、からなっていてもよく、そして、配列番号３～１３のいずれかからなる配列の群から選択される配列によって表されるドメインを含んでいてよいが、このようなドメイン（複数可）は、このような配列を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、又は、からなっていてもよい。無論、ヒト最適化ミニジストロフィン遺伝子が配列番号２～１３の機能的バリアントを含んでいてもよいことは明らかであろう。機能的バリアントとは、この状況では、コードされている遺伝子産物が参照のコードされている分子の機能を保持している限り、所与の配列のバリアントを使用できることを示す。従って、本発明の状況では、好適なヒト最適化ミニジストロフィンをコードさせるために、配列番号２～１３のいずれかに由来する配列バリアントを使用することができる。このようなバリアントは、配列番号２～１３のうちの１つ以上に対して約７５％～約９９％、例えば、配列番号２～１３のうちの１つ以上に対して少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を保持することによって、本明細書に記載する例示的な配列と異なり得る。
本発明で使用するためのより小さなサイズの他のミニジストロフィン（マイクロジストロフィン）としては、Ｎ末端、５つのロッド（ロッド１、２、２２、２３、２４）、２つのヒンジ（ヒンジ１及び４）、及びシステインリッチドメインを含有するミニジストロフィン遺伝子（ヒト又はイヌ）、例えば、ｈΔＤｙｓ３８４９及びｈＯｐｔｉΔＤｙｓ３８３７が挙げられる。ｈＯｐｔｉΔＤｙｓ３８３７は、（ｉ）ｈＯｐｔｉΔＤｙｓ３８３７がコドン最適化されており、（ｉｉ）完全なエクソン７９のうちの１２塩基が除去されている点で、ｈΔＤｙｓ３８４９とは異なる。必須の機能ドメインは、同一である。３８３７塩基対を含むｈＯｐｔｉΔＤｙｓ３８３７（ｏｐｔｉ－ＤｙｓΔ３８３７とも呼ばれる）の配列は、配列番号２７に記載されている。この配列は、配列番号２５及び２６内に塩基対２３６５～６２０１として含まれている（図６Ｂ）。例示的なミニジストロフィンは、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９７（２５）：１３７１４－１３７１９（２０００），ＰＭＩＤ １１０９５７１０；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５（１５）：１０９９－１１０６（２００８），ＰＭＩＤ １８４３２２７７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５（２２）：１４８９－１４９９（２００８），ＰＭＩＤ １８５６３１８４；Ｒｏｍｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｕｓｃｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ，２７（１）：５３－６７（２００６），ＰＭＩＤ １６４９６２２５；及びＫｏｐｐａｎａｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（１１）：１３５５－１３６２（２０１０），ＰＭＩＤ ２０５３５２１７に記載されており、これらは全て参照により援用される。
従って、本発明の状況で使用するための好適なヒト最適化ミニジストロフィン遺伝子は、配列番号２７を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、又は、からなっていてもよく、そして、配列番号３～６及び８～１３のいずれかからなる配列の群から選択される配列によって表されるドメインを含んでいてよいが、このようなドメイン（複数可）は、このような配列を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、又は、からなっていてもよい。無論、ヒト最適化ミニジストロフィン遺伝子が配列番号３～６、８～１３、及び２７の機能的バリアントを含んでいてもよいことは明らかであろう。このようなバリアントは、配列番号３～６、８～１３、及び２７のうちの１つ以上に対して約７５％～約９９％、例えば、配列番号３～６、８～１３、及び２７のうちの１つ以上に対して少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を保持することによって、本明細書に記載する例示的な配列と異なり得る。
前述の通り、本発明の状況において有用なＡＡＶの中で、心筋及び骨格筋においてミニジストロフィン遺伝子を発現させるためのカセットは、筋肉特異的第１のプロモータ及び改変ＭＣＫプロモータエンハンサを含む。このカセットの中で、ミニジストロフィン遺伝子は、ミニジストロフィンの発現が筋肉特異的第１のプロモータ及び改変ＭＣＫプロモータエンハンサの制御下にあるように、筋肉特異的第１のプロモータ及び改変ＭＣＫプロモータエンハンサに作動可能に連結されている。
本発明の状況で使用するために、筋肉特異的な発現を可能にする改変筋肉ＭＣＫプロモータエンハンサ。好ましくは、改変筋肉ＭＣＫプロモータエンハンサ、ＭＣＫプロモータの切断バージョン、これは、ＡＡＶゲノムのサイズ制限に鑑みて有用である。１つの好ましい（ｐｒｏｆｆｅｒｅｄ）改変筋肉ＭＣＫプロモータエンハンサについては、筋肉特異的シスエレメントに加えて、ｍｅｆ－２、ｒｉｇｈｔ ｅ－ｂｏｘ（ｍｅｆ１）、及びａ／ｔリッチエレメントを、２つのｒｉｇｈｔ ｅ－ｂｏｘ及び１つのｓ５改変領域を含む、分化した筋肉における組織特異性のためのエンハンサ領域において維持することができる。Ｂｉｎｇ Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２００８，１５：１４８９－１４９９．ＰＭＩＤ：１８５６３１８４を参照されたい（全体が参照により本明細書に援用される）。１つの好ましい改変筋肉ＭＣＫプロモータエンハンサの配列（２１６塩基対を含む）は、配列番号１（図５Ｂ）、配列番号２３（図５Ｂ）、配列番号２５（図６Ｂ）、及び配列番号２６（図６Ｂ）のヌクレオチド１７５７～１９７２に記載されており、配列番号１４によって表される：
ｃｃａｃｔａｃｇｇｇｔｃｔａｇｇｃｔｇｃｃｃａｔｇｔａａｇｇａｇｇｃａａｇｇｃｃｔｇｇｇｇａｃａｃｃｃｇａｇａｔｇｃｃｔｇｇｔｔａｔａａｔｔａａｃｃｃｃａａｃａｃｃｔｇｃｔｇｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃａａｃａｃｃｔｇｃｔｇｃｃｔｇａｇｃｃｔｇａｇｃｇｇｔｔａｃｃｃｃａｃｃｃｃｇｇｔｇｃｃｔｇｇｇｔｃｔｔａｇｇｃｔｃｔｇｔａｃａｃｃａｔｇｇａｇｇａｇａａｇｃｔｃｇｃｔｃｔａａａａａｔａａｃｃｃｔｇｔｃｃｃｔｇｇｔｇｇａｔｃｃｃｃｔ。
従って、本発明の状況で使用するための好適な改変筋肉ＭＣＫプロモータエンハンサは、配列番号１４を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、又は、からなっていてもよい。無論、改変筋肉ＭＣＫプロモータが配列番号１４の機能的バリアントを含んでいてもよいことは明らかであろう。機能的バリアントとは、この状況では、バリアントが参照配列の機能を保持している限り、所与の配列のバリアントを使用できることを示す。従って、配列番号１４由来の配列バリアントを、本発明の状況において、改変筋肉ＭＣＫプロモータエンハンサとして使用することができる。このようなバリアントは、配列番号１４に対して約７５％～約９９％の配列同一性、例えば、配列番号１４に対して少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を保持することによって、本明細書に記載する例示的な配列と異なり得る。
本発明の状況で使用するために、筋肉特異的第１のプロモータは、筋肉特異的な発現を可能にする。１つの好ましい改変筋肉特異的第１のプロモータは、合成プロモータ（Ｓｙｎ）であり、これは、筋肉特異的なシスエレメントに加えて、ＭＥＦ－２及びｒｉｇｈｔ ｅ－ｂｏｘを含む。Ｂｉｎｇ Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２００８，１５：１４８９－１４９９．ＰＭＩＤ：１８５６３１８４を参照されたい（全体が参照により本明細書に援用される）。１つの好ましい筋肉特異的第１のプロモータの配列（３１７塩基対を含む）は、配列番号１（図５Ｂ）、配列番号２３（図５Ｂ）、配列番号２５（図６Ｂ）、及び配列番号２６（図６Ｂ）のヌクレオチド１９７３～２２８９に記載されており、配列番号１５によって表される：
ｇｃａｔｇｃｇｇｃｃｇｔｃｃｇｃｃｃｔｃｇｇｃａｃｃａｔｔｃｃｔｃａｃｇａｃａｃｃｇａａａｔａｔｇｇｃｇａｃｇｇｇｔｇａｇｇａａｔｇｇｔｇｇｇｇａｇｔｔａｔｔｔｔｔａｇａｇｃｇｇｔｇａｇｇａａｔｇｇｔｇｇｇｃａｇｇｃａｇｃａｇｇｔｇｔｔｇｇｇｇｇａｇｔｔａｔｔｔｔｔａｇａｇｃｇｇｇｇａｇｔｔａｔｔｔｔｔａｇａｇｃｇｇｔｇａｇｇａａｔｇｇｔｇｇａｃａｃｃｇａａａｔａｔｇｇｃｇａｃｇｇｇｔｇａｇｇａａｔｇｇｔｇｃｃｇｔｃｇｃｃａｔａｔｔｔｇｇｇｔｇｔｃｃｃｇｔｃｃｇｃｃｃｔｃｇｇｃｃｇｇｇｇｃｃｇｃａｔｔｃｃｔｇｇｇｇｇｃｃｇｇｇｃｇｇｔｇｃｔｃｃｃｇｃｃｃｇｃｃｔｃｇａｔａａａａｇｇｃｔｃｃｇｇｇｇｃｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｃｃａｃ。
従って、本発明の状況で使用するための好適な筋肉特異的第１のプロモータは、配列番号１５を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、又は、からなっていてもよい。無論、筋肉特異的第１のプロモータが配列番号１５の機能的バリアントを含んでいてもよいことは明らかであろう。機能的バリアントとは、この状況では、バリアントが参照配列の機能を保持している限り、所与の配列のバリアントを使用できることを示す。従って、配列番号１５由来の配列バリアントを、本発明の状況において、筋肉特異的第１のプロモータとして使用することができる。このようなバリアントは、配列番号１５に対して約７５％～約９９％の配列同一性、例えば、配列番号１５に対して少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を保持することによって、本明細書に記載する例示的な配列と異なり得る。
また、心筋及び骨格筋でミニジストロフィン遺伝子を発現させるためのカセットは、ミニジストロフィン遺伝子の発現を高めるための他の所望のエレメントを含有していてもよい。例えば、配列番号１に記載の例示的なＡＡＶ配列は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（ＧＣＣＡＣＣ（配列番号１６））を含み、これは、ミニジストロフィン遺伝子の翻訳のエンハンサとして機能する。Ｂｉｎｇ Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９，２７：４，４２１－４２，．ＰＭＩＤ：１８９７３２３４を参照されたい（全体が参照により本明細書に援用される）。
前述の通り、本発明の状況で使用するためのＡＡＶは、ＮＦ－κＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡ遺伝子が第２のプロモータに作動可能に連結されているカセットを含む。マウスＮＦ－кＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡカセットは、ＮＦ－кＢ／ｐ６５のサブユニット６５を特異的にサイレンシングする。Ｑｉｎｇ Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１２，１９：１１９６－１２０４，ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２２２７８４１１を参照されたい（全体が参照により本明細書に援用される）。理論に束縛されるものではないが、ＮＦ－кＢ／ｐ６５のサブユニット６５を特異的にサイレンシングすると、炎症が減少し、ミニジストロフィン遺伝子の発現をよりロバストにすることができると考えられる。マウス特異的ＮＦ－кＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡは、５１塩基対を含み、配列番号１（図５Ｂ）及び配列番号２５（図６Ｂ）のヌクレオチド１７０１～１７５１に含まれる。その配列は、ｔｇｔｇｔｃｃａｔｔｇｔｃｔｃａｃｔｃｃｔｃｇａｇｇａｇｔｇａｇａｃａａｔｇｇａｃａｃａｔｔｔｔｔｔｔ（配列番号１７）である。別のマウス特異的ＮＦ－кＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡは、５１塩基対を含み、配列番号２３（図５Ｂ）及び配列番号２６（図６Ｂ）のヌクレオチド１７０１～１７５１に含まれる。その配列は、ａｇｔｃｃｃｔｇｔｃｔｇｃａｃｃｔｇｔｃｔｃｇａｇａｃａｇｇｔｇｃａｇａｃａｇｇｇａｃｔｔｔｔｔｔｔｔ（配列番号２２）である。更に、ヒト臨床試験又はＤＭＤの治療における使用については、好ましくはヒトＮＦ－κＢ配列に基づくｓｈＲＮＡ配列を使用する。ＮＦ－ｋＢを阻害してヒト滑膜細胞における炎症性サイトカインを誘導するための（ＲＥＬ１０９６（ｇａｔｔｇａｇｇａｇａａａｃｇｔａａａｔｔ 配列番号２４）と命名されたヒトｓｉＲＮＡオリゴ配列（Ｌｅｅ，Ｕｉ Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐ（２００８）３５：２９１－２９８（全体が参照により本明細書に援用される））、及びその癌細胞における構成的又は腫瘍壊死因子誘導性のＮＦ－ｋＢの阻害（Ｊｕｔｏｏｒｕ，Ｉｎｄｉｒａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１０），２８５：２５３３２－２５３４４（全体が参照により本明細書に援用される））は、当業者に公知である。
従って、本発明の状況で使用するための好適なＮＦ－κＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡは、配列番号１７、配列番号２２、又は配列番号２４を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、又は、からなっていてもよい。無論、ＮＦ－κＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡが配列番号１７又は配列番号２２の機能的バリアントを含んでいてもよいことは明らかであろう。機能的バリアントとは、この状況では、バリアントが参照配列の機能を保持している限り、所与の配列のバリアントを使用できることを示す。従って、配列番号１７、配列番号２２、又は配列番号２４の配列バリアントを使用してよく、これは、本発明の状況において阻害する。このようなバリアントは、配列番号１７に対して約７５％～約９９％の配列同一性、例えば、配列番号１７、配列番号２２、又は配列番号２４に対して少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を保持することによって、本明細書に記載する例示的な配列と異なり得る。
前述の通り、ＮＦ－κＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡは、第２のプロモータ（の転写制御下で）に作動可能に連結される。この目的のために好ましいプロモータは、Ｕ６プロモータであり、最も好ましいのはヒトＵ６プロモータである。Ｑｉｎｇ Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１２，１９：１１９６－１２０４，ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２２２７８４１１を参照されたい（全体が参照により本明細書に援用される）。ヒトＵ６プロモータの配列は、２４１塩基対を含み、配列番号１（図５Ｂ）、配列番号２３（図５Ｂ）、配列番号２５（図６Ｂ）、及び配列番号２６（図６Ｂ）のヌクレオチド１４５２～１６９２に含まれる。その配列は（配列番号１８）である：
ｇａｇｇｇｃｃｔａｔｔｔｃｃｃａｔｇａｔｔｃｃｔｔｃａｔａｔｔｔｇｃａｔａｔａｃｇａｔａｃａａｇｇｃｔｇｔｔａｇａｇａｇａｔａａｔｔａｇａａｔｔａａｔｔｔｇａｃｔｇｔａａａｃａｃａａａｇａｔａｔｔａｇｔａｃａａａａｔａｃｇｔｇａｃｇｔａｇａａａｇｔａａｔａａｔｔｔｃｔｔｇｇｇｔａｇｔｔｔｇｃａｇｔｔｔｔａａａａｔｔａｔｇｔｔｔｔａａａａｔｇｇａｃｔａｔｃａｔａｔｇｃｔｔａｃｃｇｔａａｃｔｔｇａａａｇｔａｔｔｔｃｇａｔｔｔｃｔｔｇｇｃｔｔｔａｔａｔａｔｃｔｔｇｔｇｇａａａｇｇａｃ。
従って、本発明の状況で使用するための好適な第２のプロモータは、配列番号１８を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、又は、からなっていてもよい。無論、第２のプロモータ、配列番号１８の機能的バリアントは明らかであろう。機能的バリアントとは、この状況では、バリアントが参照配列の機能を保持している限り、所与の配列のバリアントを使用できることを示す。従って、配列番号１８由来の配列バリアントを、本発明の状況において、第２のプロモータとして使用することができる。このようなバリアントは、配列番号１８に対して約７５％～約９９％の配列同一性、例えば、配列番号１８に対して少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を保持することによって、本明細書に記載する例示的な配列と異なり得る。
更に、ＮＦ－κＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡの発現を駆動するためにＵ６プロモータを使用することができるが、第２プロモータとして他のプロモータを好適に使用することもできる。多くのプロモータは、当業者に公知である。好ましくは、κＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡの発現を駆動するために作動可能に連結されたプロモータは、免疫細胞及びジストロフィー筋細胞の両方で活性を有していなければならない。幾つかの好適なプロモータの例は、ヒトのＨ１及びＵ６などのポリメラーゼＩＩＩプロモータである。
心筋組織及び骨格筋組織でミニジストロフィン遺伝子及びＮＦ－κＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡ遺伝子の両方を発現させるためのデュアルカセットとは別に、本発明の状況で使用するためのＡＡＶは他の要素を含んでいてもよい。例えば、５’及び３’の逆位末端配列（ＩＴＲ）は、ゲノムをベクターパッケージにパッケージングするのを容易にする。Ｘｉａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８；７２（３）：２２２４－３２．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：９４９９０８０を参照されたい（全体が参照により本明細書に援用される）。このような３’及び５’のＩＴＲの配列は、当業者に公知であるが、例としては以下が挙げられる：
ｔｔｇｇｃｃａｃｔｃｃｃｔｃｔｇｃｇｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇａｇｇｃｃｇｇｇｃｇａｃｃａａａｇｇｔｃｇｃｃａｃｇｃｃｇｇｇｃｔｔｔｇｃｃｇｇｃｇｇｃｃｔｃａｇｃｇａｇｃｇｃａｇａｇｔｇｇｃｃａａｃｔｃａｃｔａｇｇｔｔｃｃｔ（配列番号１９－５’ＩＴＲ及び）
ａｇｇａａｃｃｃｃｔａｇｔｇａｔｇｇａｇｔｔｇｇｃｃａｃｔｃｔｇｃｇｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇａｇｇｃｃｇｃｃｇｇｇｃａａａｇｃｃｇｇｃｇｔｃｇｇｇｃｇａｃｃｔｔｔｇｇｔｃｇｃｃｇｇｃｃｔｃａｇｔｇｃｇａｇｃｇｃａｇａｇａｇｔｇｇｃｃａａ（配列番号２０－３’ＩＴＲ）。更に、ポリ（Ａ）シグナル配列を含めると、ベクターからの遺伝子発現を高めることができる。Ｂｉｎｇ Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．，２０００，９７（２５）：１３７１４－１３７１９，ＰＭＩＤ：１１０９５７１０を参照されたい（全体が参照により本明細書に援用される）。ポリＡ配列は、当業者に周知であるが、１つの好適なポリ（Ａ）の非限定的な例は、ｔｃｇａｇｇｃｃｔａａｔａａａｇａｇｃｔｃａｇａｔｇｃａｔｃｇａｔｃａｇａｇｔｇｔｇｔｔｇｇｔｔｔｔｔｔｇｔｇｔｇａｇａ（配列番号２１）である。配列番号１、２３、２５、及び２６内のこれらの配列の位置は、図５Ｂ及び６Ｂに示されている）。含めるための他の有用な遺伝要素としては、抗生物質、例えばアンピシリンに対する耐性を付与する遺伝子が挙げられ、これは、ウイルスパッケージング細胞の培養中に、ウイルスの力価を高めるために感染細胞を選択するために一般的に使用される。
本発明の状況で心筋組織及び骨格筋組織においてミニジストロフィン遺伝子及びＮＦ－κＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡ遺伝子の両方を発現させるためのカセットを含むデュアルカセット遺伝子ビヒクルとして使用するためのＡＡＶは、当業者に公知の標準的な分子及び細胞の技術によって作製することができる。例えば、デュアルカセット及び他のＡＡＶ配列を含むプラスミドは、標準的な分子技術によって遺伝子操作することができる。次いで、このプラスミドを使用して、例えば、好適なパッケージング細胞株（ＨＥＫ ２９３細胞又はＨＥＫ ２９３Ｔ細胞などであるが、他の細胞株を使用することもできる）にそれをトランスフェクトすることによってウイルスベクターを作製することができる。形質転換体は、例えば、ＡＡＶベクターのゲノムが耐性を付与する化合物（例えば、アンピシリン）に培養物を曝露することにより、集団から選択することができる。細胞がＡＡＶパッケージを生成したら、（例えば、ＣｓＣｌ勾配を使用するか、又は当業者に公知の他の方法を介して）精製することができる。その後、保存（例えば、凍結保存）してもよく、使用のために製剤化してもよい。
実施形態では、本発明は、心筋組織及び骨格筋組織においてミニジストロフィン遺伝子及びＮＦ－κＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡ遺伝子の両方を発現させるためのカセットを含む本発明の遺伝子ビヒクル（本明細書に記載のＡＡＶ）と、薬学的に許容し得る担体と、を含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容し得る担体は、当業者に公知の任意の担体を含み得る。組成物の担体は、ベクターに好適な任意の担体であってよい。担体は、典型的には液体であり、注射用に製剤化されるが、固体であってもよく、液体成分と固体成分との組み合わせであってもよい。担体は、望ましくは、薬学的に許容し得る（例えば、生理学的又は薬理学的に許容し得る）担体（例えば、賦形剤又は希釈剤）である。薬学的に許容し得る担体は、周知であり、容易に入手することができる。担体の選択は、少なくとも部分的には、具体的なベクター及び組成物を投与するために使用される具体的な方法によって決定される。
組成物は、特に組成物及び／又はその最終用途の安定性を高めるために、任意の他の好適な成分を更に含んでいてもよい。従って、本発明の組成物の広範な好適な製剤が存在する。以下の製剤及び方法は単なる例示であり、決して限定するものではない。
非経口投与に好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を意図するレシピエントの血液又は他の組織と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性の等張無菌注射液；並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存剤を含み得る水性及び非水性の無菌懸濁液を含む。製剤は、アンプル及びバイアルなどの単位用量又は多用量用の密閉容器で提示することができ、そして、使用直前に注射用の無菌液体賦形剤、例えば水を添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。
更に、組成物は、追加の治療剤又は生物学的活性剤を含んでいてもよい。例えば、特定の適応症の治療において有用な治療因子が存在することがある。イブプロフェン又はステロイドなどの炎症を制御する因子を組成物の一部として、ベクターのインビボ投与に関連する腫脹及び炎症、並びに生理学的苦痛を低減することができる。ベクター自体に対する又は障害に関連する任意の免疫応答を低減するために、組成物方法と共に免疫系抑制剤を投与してもよい。代替的に、疾患に対する身体の天然の防御をアップレギュレーションするために、免疫賦活剤を組成物に含めてもよい。抗生物質、すなわち、殺微生物剤及び殺真菌剤を存在させて、遺伝子移入手順及び他の障害に関連する感染のリスクを低減することができる。
実施形態では、本発明は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を回復させる方法であって、本明細書に記載の遺伝子ビヒクル（ＡＡＶ）又は医薬組成物を、ＤＭＤに罹患しているか又はＤＭＤを発症するリスクのある患者又は被験体に、ＤＭＤを回復させる量及び位置で投与することを含む方法を提供する。この状況では、患者又は被験体は、典型的には、ヒト（例えば、ＤＭＤに罹患しており、ＤＭＤに対する治療を受けている患者、又は臨床試験の被験体）である。しかし、この方法は、遺伝子発現を評価するための非ヒト動物又はＤＭＤの動物モデルにも適用することができる。このような非ヒト動物は、典型的には、実験室での研究に一般的に使用されるもの（例えば、マウス、ラット、イヌ、非ヒト霊長類など）である。
方法の実施において、遺伝子ビヒクル又は医薬組成物は、典型的には、非経口（例えば、腹腔内、静脈内、筋肉内など）注射によって投与される。しかし、治療を行う医師によって、又は、臨床試験のプロトコルのために、他の送達経路が適しており、使用されることもある。
本発明の方法の実施において送達するウイルス粒子の量は、医師又は研究所の研究者が決定することができ、被験体の大きさ又は被験体若しくは又は患者の種に依存し得る。しかし、心筋及び骨格筋に感染して、本発明の遺伝子ビヒクル内のデュアルカセットから発現するのに十分な遺伝子ビヒクル（ＡＡＶ）を送達しなければならない。実験室での研究では、以下の実施例で報告する通り、１０１１個のＡＡＶゲノムを腹腔内に注射したが、これよりも幾分少ない量で十分な場合もある。しかし、ヒトの患者又は被験体の場合は、より多数のＡＡＶゲノムが必要又は望ましい場合がある。例えば、本発明の方法の実行においては、少なくとも１０８個のＡＡＶゲノム、又は少なくとも１０９個のＡＡＶゲノム、又は少なくとも１０１０個のＡＡＶゲノム、又は少なくとも１０１１個のＡＡＶゲノム、又は少なくとも少なくとも１０１２個のＡＡＶゲノム、又は少なくとも１０１３個のＡＡＶゲノム、又は少なくとも１０１４個のＡＡＶゲノム（又は、少なくとも「約」このような数のＡＡＶゲノムを使用してよい。患者又は被験体に投与するＡＡＶゲノムの上限は、医薬組成物をどの程度濃縮して製剤化できるかにもよるが、１０２０個以下のＡＡＶゲノム、又は１０１９個以下のＡＡＶゲノム、又は１０１８個以下のＡＡＶゲノム、又は１０１７個以下のＡＡＶゲノム、又は１０１６個以下のＡＡＶゲノム、又は１０２０個以下のＡＡＶゲノム（又は「約」このような数のＡＡＶゲノム以下）を好適に投与することができる。より多い又は少ない量のＡＡＶゲノムの量を使用してもよく；最終的には医師、研究所の研究者、又は臨床試験のプロトコルによって用量が決定される。典型的な用量は、２×１０１０～１×１０１１ウイルスゲノム／ｋｇ（患者の身体）である（Ｄｕａｎ，ＤＳ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１８，２６：２３３７－２３５６、表４を参照されたい（全体が参照により本明細書に援用される）。
以下の実施例は、本発明を更に説明するが、無論、いかなる方法でもその範囲を限定すると解釈されるべきではない。
以下の実施例では、改変ＭＣＫエンハンサ（Ｍｃｋｅｎ）と、ヒトコドン最適化ミニジストロフィン遺伝子を駆動する筋肉特異的合成プロモータ（Ｓｙｎ）とを有するこのようなデュアルカセットＡＡＶベクター（Ｗａｎｇ，２００８ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ及びＫｏｒｎｅｇａｙ，２０１０ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）を作製した。これにより、心筋における高レベルの発現によって実証される通り、重症ＤＭＤマウスモデルであるジストロフィン／ユートロフィンダブルノックアウト（ｄｙｓ－／－：ｕｔｒｏ－／－、ｄＫＯホモ）マウスの全身の筋肉においてミニジストロフィン遺伝子が効率的かつ特異的に発現することが保証された。また、このようなデュアル治療アプローチは、特にこの重症ＤＭＤモデルの骨格筋において、慢性炎症を効率的に阻害した。
次に、Ｔｇ．ｄＫＯ－ｈｅｔ（ｄｙｓ－／－：ｕｔｒｏ＋／－）．ｐ６５＋／－マウスを交雑することを通して、Ｔｇ．ｄＫＯ－ｈｏｍｏ．ｐ６５＋／＋及びＴｇ．ｄＫＯ－ｈｏｍｏ．ｐ６５＋／－のマウスの両方が得られた。また、重症ＤＭＤモデルにおいてトランスジェニックヒトミニジストロフィン遺伝子を伴うＮＦ－κＢのｐ６５サブユニットの遺伝子破壊（ｐ６５＋／－）から得られる相乗的な治療効果が有益であり、毒性もないことが観察された。
まとめると、筋肉特異的にジストロフィン遺伝子を発現させるためのコンパクトプロモータと、抗炎症のためのＮＦ－κＢの特異的ｓｈＲＮＡとを含有するデュアルカセットを有する新規ＡＡＶベクターは、ＤＭＤ遺伝子療法の治療効率及び安全性を高めることができる。
実施例１
この実施例では、改変ＭＣＫエンハンサ（Ｍｃｋｅｎ）及びヒトコドン最適化ミニジストロフィン遺伝子を駆動する筋肉特異的合成プロモータ（Ｓｙｎ）の設計を介したデュアルカセットＡＡＶベクターの最適化を示す（Ｗａｎｇ，２００８及びＫｏｒｎｅｇａｙ，２０１０）。これにより、重症ＤＭＤモデルマウスの全身の筋肉、特に心筋において、ミニジストロフィン遺伝子が効率的かつ特異的に発現することが保証された。また、このようなデュアル治療アプローチは、特に骨格筋において、慢性炎症を効率的に阻害した。
方法
この研究では、全ての系統のマウスについてＩＡＣＵＣプロトコルが承認された。野生型（ＷＴ、Ｃ５７／ＢＬ１０）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ジストロフィン／ユートロフィンダブルノックアウト（ｄｙｓ－／－：ｕｔｒｏ－／－、ｄＫＯホモ）マウスは、ヘテロ接合ジストロフィン／ユートロフィンダブルノックアウトマウス（ｄｙｓ－／－：ｕｔｒｏ＋／－）の繁殖を通じたインハウスコロニーに由来していた。図１、パネルＡに示す通り、Ｎ末端、５つのロッド（１、２、２２、２３、２４）、３つのヒンジ（１、３、４）、及びＣＲ末端を含むコンピュータでコドン最適化されたミニジストロフィン遺伝子を単一のＡＡＶベクターにクローニングし、ＭＣＫ改変エンハンサ調節筋肉合成プロモータによって駆動した、ミニジストロフィンＡＡＶベクターのシングルカセットを作製した。公開されている機能的マウスＮＦ－κＢ／ｐ６５ ｍＲＮＡ配列（Ｙａｎｇ，２０１２）に基づいて、Ｕ６プロモータによって駆動されるマウスｐ６５／ｓｈＲＮＡの２つのバージョン（ｍ１及びｍ２）を設計し、それぞれシングルカセットｐＡＡＶ（ｓｓ）－Ｍｃｋｅｎ－Ｓｙｎ－ｈＯｐｔｉＤｙｓ３９７８（Ｋｏｒｎｅｇａｙ，２０１０）にクローニングした。ＣｓＣｌ勾配超遠心分離法を通してプラスミドを精製した。１つのこのようなプラスミドであるｐＡＡＶ－Ｍ１ｐ６５ＥｎｓｙｎＯｐｔｉ３９７８は、図５Ａ及び５Ｂに模式的に描かれており、その配列は配列番号１に記載されている。
ＡＡＶ９ベクターを２９３細胞にコトランスフェクションすることによってパッケージングし、Ｙａｎｇ，２０１２に従って２回のＣｓＣｌ勾配超遠心分離法によって精製した。５日齢のｄＫＯホモの仔に５０μＬ（１×１０１１個のウイルスゲノム粒子）のウイルスを単回Ｉ．Ｐ．注射し、８週齢において心筋及び骨格筋、並びに肝臓組織のクライオスタット切片を分析した。ヒトジストロフィン（ロッド１及び２）、リン酸化ＮＦ－κＢ／ｐ６５（＃８２４２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＣＤ４（ＢＤ５５０２８０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ８（ａｂ２２３７８、Ａｂｃａｍ）、ＣＤ６８（＃９９３６、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＣｏｌＩＶ（ａｂ６５８６、Ａｂｃａｍ）に対する抗体による免疫蛍光（ＩＦ）染色に、切片を適用した。また、核をＤＡＰＩで染色した（青色）。２００倍の倍率で画像を撮影した。
結果
図１、パネルＢに示す通り、心筋をウエスタンブロットアッセイで試験したところ、ＷＴマウスでは完全長ジストロフィン（４５０ｋＤａ）、シングルカセットベクター又はデュアルカセットベクターのいずれかで処理したｄＫＯホモマウスではミニジストロフィン（１５０ｋＤａ）の効率的な発現が観察された。また、肝臓組織ではジストロフィンが発現しないことによって実証される通り、心臓及び骨格筋組織（横隔膜、腓腹筋、及び前脛骨筋）における筋肉を標的とした遺伝子送達の特異性が、ジストロフィンのＩＦ染色により確認された（図１、パネルＣ及びＤ）。シングルカセットベクターで処理したマウスとデュアルカセットベクターで処理したマウスとの間で、心臓及び横隔膜の組織におけるジストロフィン陽性細胞比に差はなかった（図１、パネルＥ）。しかし、デュアルカセットベクターで処理したマウスでは、腓腹筋及び前脛骨筋においてミニジストロフィンがはるかに多く発現していた（図１、パネルＥ）。
この結果は、デュアルカセットＡＡＶベクターによって処理した骨格筋において炎症が減少することを実証し、このことは、ジストロフィン遺伝子置換と抗炎症とを組み合わせた単一のＡＡＶベクターによって相乗効果を得ることができることを示す。
腓腹筋（ＧＡＳ）をｐ－Ｐ６５によってＩＦ染色して、免疫細胞の浸潤を評価するために活性型ＮＦ－κＢ、ＣＤ４、及びＣＤ８のレベルを求め、炎症性マクロファージを検出するためにＣＤ６８のレベルを求めた。図２Ａに示す通り、デュアルカセットＡＡＶで処理したＧＡＳ筋は、シングルカセットＡＡＶによる処理と比較して、ＮＦ－κＢの減少を介してＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ６８などの炎症マーカーがより少ないことを表した。ＷＴ ＧＡＳは、筋肉において炎症を示さなかった。しかし、ｄＫＯホモマウスの非処理ＧＡＳは、顕著な炎症を有していた。図２Ｂは、心臓及びＧＡＳの筋肉におけるｐ－Ｐ６５のＩＦ染色を示す。心臓組織では、全ての群において陽性細胞はほとんど存在しない。しかし、ＧＡＳ筋では、デュアルホモ群が、シングルホモ群及び未処理ホモマウス群（Ｃｔ－ホモ）よりもはるかに少ないｐ－Ｐ６５を示した。
これら結果から、デュアルカセットＡＡＶによって処理した骨格筋では、シングルカセットＡＡＶ又は未処理と比較して、観察される活性型ＮＦ－κＢ（ｐ－Ｐ６５）が顕著に減少することを実証する。ｍｄｘ／ｕｔｒｎ－／－マウスの骨格筋とは異なり、心筋では、マウスをデュアルカセットＡＡＶで処理したか、シングルカセットＡＡＶで処理したか、未処理であるかにかかわらず、活性型ＮＦ－κＢ（ｐ－Ｐ６５）に著しい差は存在しなかった。
考察
単一のＡＡＶビヒクルを介したＮＦ－κＢの阻害を組み合わせた筋肉を標的とする遺伝子置換の全身有効性について調べたところ、コンピュータでコドン最適化されたヒトミニジストロフィンの効率的な発現と、全身の筋肉における炎症の抑制が裏付けられた。これら結果は、筋肉特異的にジストロフィン遺伝子を発現させるためのコンパクトプロモータと、抗炎症のためのＮＦ－κＢの特異的ｓｈＲＮＡとを含有するデュアルカセットを有する新規ＡＡＶベクターが、臨床試験又はその他におけるＤＭＤ遺伝子療法の治療効率及び安全性を高めることができることを実証する。
実施例２
この実施例は、重症ＤＭＤマウスモデル（ｄｙｓ－／－：ｕｔｒｏ－／－、ｄＫＯホモ）においてトランスジェニックヒトミニジストロフィン遺伝子を伴うＮＦ－κＢのｐ６５サブユニットの遺伝子破壊（ｐ６５＋／－）から得られる相乗的な治療効果が有益であり得ることを実証する。
方法
この研究では、全ての系統のマウスについてＩＡＣＵＣプロトコルが承認された。野生型（ＷＴ、Ｃ５７／ＢＬ１０）及びｍｄｘ（ｄｙｓ－／－）のマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ｍｄｘ．ｐ６５＋／－及びヒトミニジストロフィン（ＤｙｓΔ３９９０）．ｍｄｘ（Ｔｇ．ｍｄｘ）マウス（Ｙｉｎ，２０１７及びＷａｎｇ，２０００）は、インハウスコロニーに由来していた。Ｔｇ．ｄＫＯ－ｈｅｔ（ｄｙｓ－／－：ｕｔｒｏ＋／－）．ｐ６５＋／－マウスを交雑することを通して、Ｔｇ．ｄＫＯ－ｈｏｍｏ．ｐ６５＋／＋及びＴｇ．ｄＫＯ－ｈｏｍｏ．ｐ６５＋／－のマウスの両方が得られた（図３、パネルＡ）。
２月齢のマウスの腓腹筋（ＧＡＳ）を用いてクライオスタット切片を調製した。切片を、ヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色及びマッソン三色染色に適用した。また、ヒトジストロフィン（ロッド１及び２）、β－サルコグリカン（ＮＣＬ－ａ－ＳＡＲＣ、Ｌｅｉｃａ）、リン酸化ＮＦ－κＢ／ｐ６５（ｐ－Ｐ６５）（＃８２４２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＣＤ６８（＃９９３６、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＣＤ４（ＢＤ５５０２８０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ８（ａｂ２２３７８、Ａｂｃａｍ）、ＣｏｌＩＶ（ａｂ６５８６、Ａｂｃａｍ）、及びマウスＩｇＧ（ｍＩｇＧ）（Ｃ２１８１、Ｓｉｇｍａ）に対する抗体を使用することによって免疫蛍光（ＩＦ）染色も実施した。核はＤＡＰＩで染色した。２００倍の倍率で画像を撮影した。内因性対照としてＧＡＰＤＨに対する抗体を用いたウェスタンブロット分析により、タンパク質の発現を検出した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェアを用いて統計解析を実施した。全ての結果を平均±ＳＥＭ（１群あたりｎ≧４）として与える。Ｐ値が＜０．０５の場合、差が統計的に有意であるとみなした。
結果
図３、パネルＢに示す通り、ＷＴマウスでは完全長ジストロフィン（４５０ｋＤａ）、又はＴｇマウスではミニジストロフィン（１５０ｋＤａ）の高レベルの発現が検出された。リン酸化ＮＦ－κＢ（６５ｋＤａ）は、ｐ６５ノックアウトバックグランドで著しく減少することが判明した（Ｔｇ．ｄＫＯ－ｈｏｍｏ．ｐ６５＋／＋対Ｔｇ．ｄＫＯ－ｈｏｍｏ．ｐ６５＋／－；ｄＫＯ－ｈｏｍｏ．ｐ６５＋／＋対ｄＫＯ－ｈｏｍｏ．ｐ６５＋／－）。図３、パネルＣにおいて、ミニジストロフィントランスジェニックＤＭＤマウスではジストロフィン又はジストロフィン関連タンパク質（β－サルコグリカン）も高レベルでみられ、これに伴い、Ｈ＆Ｅ染色において筋肉細胞の形態が改善されていた。
更に、ｍＩｇＧ、ＣＤ６８、ＣＤ４、及びＣＤ８のマッソン三色染色及びＩＦ染色を適用して、筋肉の線維化、壊死、及び炎症を分析した。図４Ａの結果は、ｐ６５ノックダウンを有するバックグラウンド、特にＴｇ．ｄＫＯ－ｈｏｍｏ．ｐ６５＋／－対Ｔｇ．ｄＫＯ－ｈｏｍｏ．ｐ６５＋／＋では、細胞形態が改善し、線維化、壊死、及び炎症が減少したことを実証し、これは、ＮＦ－κＢ／ｐ６５サブユニットの遺伝子破壊が炎症レベルを低下させ得ることを示す。
図４Ｂに示す通り、２月齢のＧＡＳ筋におけるＣＤ６８、ＣＤ４、及びＣＤ８のＩＦ染色からの統計解析（Ｔｇ．ｄＫＯ－ｈｏｍｏ．ｐ６５＋／＋対Ｔｇ．ｄＫＯ－ｈｏｍｏ．ｐ６５＋／－；ｄＫＯ－ｈｏｍｏ．ｐ６５＋／＋対ｄＫＯ－ｈｏｍｏ．ｐ６５＋／－）は、ｐ６５サブユニットの遺伝子が減少することによって、１群あたり合計２００個を超える細胞からカウントした線維化、壊死、及び免疫細胞の浸潤のレベルを有意に低下させ得ることを実証した。ＷＴマウスでは炎症は観察されず、未処理のｄＫＯホモＧＡＳ筋は、ｍｄｘマウスと比較して高いレベルの炎症を示し（図４Ａ及び４Ｂ）、これは、先行する知見（Ｍｕ，２０１５）と一致している。
図４Ｃに示す通り、ｍｄｘ／ｕｔｒｎ－／－マウスの骨格筋とは異なり、心筋では、マウスをデュアルカセットＡＡＶで処理したか、シングルカセットＡＡＶで処理したか、未処理であるかにかかわらず、ＣＤ６８＋マクロファージに著しい差は存在しなかった。対照的に、デュアルカセットＡＡＶで処理した骨格筋では、シングルカセットＡＡＶと比較して、観察されるＣＤ４＋及びＣＤ８＋の免疫細胞並びにＣＤ６８＋マクロファージが顕著に減少した。
図４Ｄは、デュアルカセットＡＡＶ及びシングルカセットＡＡＶの処理によって全身処理されたｍｄｘ／ｕｔｒｎ－／－マウスの健康全般及び筋機能の比較を示す。１月齢及び２月齢の筋機能を０～２００ＨＺの周波数で試験した場合、両処理群とも１月齢の２００ＨＺでは有意に改善したが、デュアルカセットＡＡＶ処理とシングルカセットＡＡＶ処理とを比較したときに差はなかった。しかし、デュアルカセットＡＡＶ処理は、２月齢などの遅い月齢の２００ＨＺでシングルカセットＡＡＶと比較して相乗効果を示した。
追加的に、デュアルカセットＡＡＶ処理では体重の改善の早期（１月齢）発生が観察され、デュアルカセットＡＡＶ及びシングルカセットＡＡＶの処理によって処理したｍｄｘ／ｕｔｒｎ－／－マウスの体重の改善は、２月齢で観察された。
考察
この実施例は、重症ＤＭＤマウスモデルにおいてトランスジェニック及びＮＦ－κＢ／ｐ６５ノックダウンにおける遺伝子置換及び抗炎症の有効性を実証する。この結果から、ｄＫＯホモマウスのバックグラウンドでＮＦ－ｋＢ／ｐ６５のノックアウトを伴ってミニジストロフィンを発現させると、筋肉の形態を回復させ、線維化、壊死、及び炎症を減少させることができることが明らかになる。これら結果は、ＮＦ－κＢの遺伝子を減少させることで、大型動物及び臨床試験におけるミニジストロフィン遺伝子療法の有効性が高まる可能性があることを示唆しており、これは、ジストロフィン遺伝子置換及び抗炎症の組み合わせを通じたＤＭＤ患者に対する遺伝子療法への応用に光を当てるものである。
本明細書に引用した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参照文献は、各参照文献が個々にかつ具体的に参照によって援用されると示されており、その全体が本明細書に記載されているかのように、参照によって本明細書に援用される。これらは、以下の参照文献を含むが、これらに限定されるものではない：
・ Ａｃｈａｒｙｙａ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００７，Ａｐｒ．；１１７（４）：８８９－９０１
・ Ｂｉｎｇ Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９，２７：４，４２１－４２，．ＰＭＩＤ：１８９７３２３４
・ Ｂｉｎｇ Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２００８，１５：１４８９－１４９９，ＰＭＩＤ：１８５６３１８４，
・ Ｂｉｎｇ Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．，２０００，９７（２５）：１３７１４－１３７１９，ＰＭＩＤ：１１０９５７１０，
・ Ｄｕａｎ，ＤＳ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１８，２６：２３３７－２３５６，
・ Ｌｅｅ，Ｕｉ Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ，．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐ（２００８）３５：２９１－２９８
・ Ｊａｙａｎｄｈａｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），２０１１，Ｍａｒ．１；１０８（９）：３７４３－８，
・ Ｊｕｔｏｏｒｕ，Ｉｎｄｉｒａ ｅｔ ａｌ．．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１０），２８５：２５３３２－２５３４４
・ Ｋｏｒｎｅｇａｙ ＪＮ，ｅｔ ａｌ．．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１０，１８（８）：１５０１－ １５０８，ＰＭＩＤ：２０５１７２９８，
・ Ｍｅｎｄｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１０ Ｏｃｔ ７；３６３（１５）：１４２９－３７，
・ Ｑｉｎｇ Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１２，１９：１１９６－１２０４，ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２２２７８４１１，
・ Ｙｉｎｇ Ｔａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０，１７：１４７６－１４８３，ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２０７２０５７５，
・ Ｘｉ Ｙｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ．２０１７，５６：７５９－７６７，
・ Ｘｉａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８；７２（３）：２２２４－３２．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：９４９９０８０，ａｎｄ
・ Ｘｉａｏｄｏｎｇ Ｍｕ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０１５，２４：２９２３－２９３７．
本発明の説明に関連して（特に以下の特許請求の範囲に関連して）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ」、並びに類似の参照対象の使用は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、単数形及び複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。１つ以上の項目のリストの後の用語「少なくとも１つ」の使用（例えば、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」）は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、列挙される項目から選択される１つの項目（Ａ又はＢ）又は列挙される項目のうちの２つ以上の任意の組み合わせ（Ａ及びＢ）を意味すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に断らない限り、オープンエンドな用語である（すなわち、「含むがこれらに限定されない」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において他の指定がない限り、単に、範囲内の各別個の値を個々に参照する省略法として機能することを意図し、各別個の値が、本明細書に個々に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書に提供される任意の及び全ての例又は例示的な表現（例えば、「など」）の使用は、特に主張しない限り、単に本発明をより深く解明することを意図し、本発明の範囲の限定を提起するものではない。明細書中の表現はいずれも、任意の請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。
本発明の好ましい実施形態は、本発明を実施するための本発明者らに公知の最良の形態を含む、本明細書に記載される。好ましい実施形態の変形は、前述の記載を読んだときに当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形を適宜使用すると予想し、そして、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されているのとは別の方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、準拠法によって認められている通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙される発明主題の全ての変形及び等価物を含む。更に、その全ての可能な変形における上記要素の任意の組み合わせは、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、本発明によって包含される。

Claims (16)

  1. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、心筋組織及び骨格筋組織においてミニジストロフィン遺伝子及びＮＦ－κＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡ遺伝子の両方を発現させるためのカセットを含むデュアルカセット遺伝子ビヒクルであって、前記ミニジストロフィン遺伝子が、筋肉特異的第１のプロモータ及び改変Ｍｃｋｅｎ（ＭＣＫ）プロモータエンハンサを含むコンストラクトに作動可能に連結されており、前記ＮＦ－κＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡ遺伝子が、第２のプロモータの制御下にある遺伝子ビヒクル。
  2. 配列番号１又は配列番号２３の配列を含む、請求項１に記載の遺伝子ビヒクル。
  3. 前記ミニジストロフィン遺伝子が、配列番号２～１３のいずれかの配列又はその機能的バリアントを含む、請求項１又は２に記載の遺伝子ビヒクル。
  4. 配列番号２５又は配列番号２６の配列を含む、請求項１に記載の遺伝子ビヒクル。
  5. 前記ミニジストロフィン遺伝子が、配列番号３～６、８～１３、及び２７のいずれかの配列又はその機能的バリアントを含む、請求項１又は４に記載の遺伝子ビヒクル。
  6. 前記改変ＭＣＫプロモータエンハンサが、配列番号１４の配列又はその機能的バリアントを含む、請求項１～５のいずれかに記載の遺伝子ビヒクル。
  7. 前記筋肉特異的第１のプロモータが、Ｓｙｎである、請求項１～５のいずれかに記載の遺伝子ビヒクル。
  8. 前記筋肉特異的第１のプロモータが、配列番号１５の配列又はその機能的バリアントを含む、請求項１～７のいずれかに記載の遺伝子ビヒクル。
  9. 前記第２のプロモータが、Ｕ６プロモータである、請求項１～８のいずれかに記載の遺伝子ビヒクル。
  10. 前記第２のプロモータが、配列番号１８の配列又はその機能的バリアントを含む、請求項１～９のいずれかに記載の遺伝子ビヒクル。
  11. 前記ＮＦ－κＢ／ｐ６５－ｓｈＲＮＡが、配列番号１７、配列番号２２、又は配列番号２４の配列を含む、請求項１～１０のいずれかに記載の遺伝子ビヒクル。
  12. 請求項１～１１のいずれかに記載の遺伝子ビヒクルと、薬学的に許容し得る担体と、を含む医薬組成物。
  13. 注射用に製剤化される、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を回復させる方法であって、請求項１～１１のいずれかに記載の遺伝子ビヒクル又は請求項１２若しくは１３に記載の医薬組成物を、ＤＭＤに罹患しているか又はＤＭＤを発症するリスクのある患者又は被験体に、ＤＭＤを回復させる量及び位置で投与することを含む方法。
  15. 前記遺伝子ビヒクル又は前記医薬組成物を腹腔内注射によって投与する、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記患者が、ＤＭＤに罹患している、請求項１４又は１５に記載の方法。
JP2021542570A 2019-02-02 2020-02-03 遺伝子置換及び抗炎症を介したデュシェンヌ型筋ジストロフィーに対する一段階遺伝子療法 Pending JP2022523038A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962800484P 2019-02-02 2019-02-02
US62/800,484 2019-02-02
PCT/US2020/016410 WO2020160542A1 (en) 2019-02-02 2020-02-03 One-step gene therapy for duchenne muscular dystrophy via gene replacement and anti-inflammation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2022523038A true JP2022523038A (ja) 2022-04-21

Family

ID=71841302

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021542570A Pending JP2022523038A (ja) 2019-02-02 2020-02-03 遺伝子置換及び抗炎症を介したデュシェンヌ型筋ジストロフィーに対する一段階遺伝子療法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20220136005A1 (ja)
EP (1) EP3918081A4 (ja)
JP (1) JP2022523038A (ja)
CN (1) CN113710809A (ja)
AU (1) AU2020216501A1 (ja)
CA (1) CA3146364A1 (ja)
IL (1) IL285129A (ja)
WO (1) WO2020160542A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023248251A1 (en) * 2022-06-24 2023-12-28 Indian Institute Of Technology Kanpur An optimized aav vector for gene therapy of muscular dystrophy

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7266458B2 (en) * 2000-03-06 2007-09-04 Bioseek, Inc. BioMAP analysis

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020160542A1 (en) 2020-08-06
EP3918081A1 (en) 2021-12-08
EP3918081A4 (en) 2022-11-02
IL285129A (en) 2021-09-30
AU2020216501A1 (en) 2021-09-16
CA3146364A1 (en) 2020-08-06
US20220136005A1 (en) 2022-05-05
CN113710809A (zh) 2021-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Duan Micro-dystrophin gene therapy goes systemic in Duchenne muscular dystrophy patients
ES2744565T3 (es) Tratamiento de la hiperbilirrubinemia
ES2768763T3 (es) Vectores rAAV mejorados y métodos para la transducción de fotorreceptores y células EPR
Salabarria et al. Advancements in AAV-mediated gene therapy for Pompe disease
AU2019439673A1 (en) Peptide-modified hybrid recombinant adeno-associated virus serotype between AAV9 and AAVrh74 with reduced liver tropism and increased muscle transduction
US11903985B2 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
TW201840850A (zh) 腺相關病毒載體遞送肌肉特異性微小肌縮蛋白以治療肌肉萎縮症
WO2015124546A1 (en) Aav vectors for the treatment of ischemic and non-ischemic heart disease
JP7106534B2 (ja) メチル－ｃｐｇ結合タンパク質２をコードする組換えアデノ随伴ウイルスの髄腔内送達
JP2022531809A (ja) ＡＴＰａｓｅ媒介性疾患の処置のための組成物および方法
EP4142800A1 (en) Use of a synthetic aav capsid for gene therapy of muscle and central nervous system disorders
JP2022523038A (ja) 遺伝子置換及び抗炎症を介したデュシェンヌ型筋ジストロフィーに対する一段階遺伝子療法
JP2021520811A (ja) ヘキソサミニダーゼアルファおよびベータサブユニットをコードしているバイシストロニックａａｖベクターならびにその使用
WO2023108159A1 (en) Methods and compositions for treating bag-3 related cardiomyopathy with a viral vector
US20230310654A1 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
EP3570896B1 (en) Compositions for reducing sarcolipin expression and preventing and treating muscular dystrophy and cardiomyopathy and methods of use
JPWO2020172490A5 (ja)
WO2024020574A2 (en) Auf1 gene therapy for limb girdle muscular dystrophy
JP2024515623A (ja) 髄腔内送達によってピット・ホプキンス症候群を治療するためのメチル－ｃｐｇ結合タンパク質２をコードする組換えアデノ随伴ウイルス
AU2022313258A1 (en) Auf1 combination therapies for treatment of muscle degenerative disease
JP2023542950A (ja) α－シヌクレインの凝集を阻害するための組成物及び方法
Blankinship Advances in recombinant adeno-associated virus technology and implications for the treatment of Duchenne muscular dystrophy

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20211008

RD01 Notification of change of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426

Effective date: 20211008

RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20211008