TW201840850A - 腺相關病毒載體遞送肌肉特異性微小肌縮蛋白以治療肌肉萎縮症 - Google Patents

腺相關病毒載體遞送肌肉特異性微小肌縮蛋白以治療肌肉萎縮症 Download PDF

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Abstract

本發明提供表現微型化人類微小肌縮蛋白基因之基因療法載體，諸如腺相關病毒(AAV)載體，及使用此等載體在包含隔膜及心肌肌肉之骨胳肌肉中表現微小肌縮蛋白，以及保護肌纖維免受損傷，提高肌肉力量及減少及/或預防患有肌肉萎縮症的個體中纖維化的方法。

Description

腺相關病毒載體遞送肌肉特異性微小肌縮蛋白以治療肌肉萎縮症
本發明提供表現微型化人類微小肌縮蛋白(micro-dystrophin)基因之基因療法載體，諸如腺相關病毒(AAV)載體，及使用此等載體在包含隔膜及心肌肌肉之骨胳肌肉中表現微小肌縮蛋白，以及保護肌纖維免受損傷，提高肌肉力量及減少及/或預防患有肌肉萎縮症的個體中纖維化的方法。
肌肉質量及力量對於每日活動，諸如行動及呼吸，及對於整個身體代謝的重要性不明確。肌肉功能缺陷產生肌肉營養不良(MD)，其特徵在於肌肉虛弱及消瘦且對生活品質具有嚴重影響。最明確表徵之MD由編碼肌縮蛋白相關蛋白質錯合物(DAPC)成員之基因的突變產生。此等MD由與DAPC繫栓之肌纖維膜-細胞骨架缺失相關的膜脆弱性產生。杜興氏肌肉萎縮症(Duchenne Muscular Dystrophy；DMD)為最具破壞性的肌肉疾病中的一者，其在5000個男性新生兒中影響1個。 DMD由導致mRNA減少的DMD基因突變及不存在肌縮蛋白引起，所述肌縮蛋白為一種與肌縮蛋白相關蛋白質錯合物(DAPC)相關的427 kD肌纖維膜蛋白質(Hoffman等人, Cell 51(6):919-28, 1987)。DAPC在肌肉肌纖維膜中包括多種蛋白質，其經由肌縮蛋白、肌動蛋白結合蛋白、α-肌營養不良蛋白聚糖(dystroglycan)、層黏連蛋白-結合蛋白在細胞外基質(ECM)及細胞骨架之間形成結構連接。此等結構連接用以使肌肉細胞膜在收縮期間穩定並且保護免受收縮誘發的損傷。在肌縮蛋白缺失之情況下，膜脆弱性引起肌纖維膜撕裂及鈣內流，觸發鈣活化蛋白酶及區段性纖維壞死(Straub等人,Curr Opin . Neurol . 10(2): 168-75, 1997)。肌肉變性及再生之此不可控循環最終耗盡肌肉幹細胞群體(Sacco等人,Cell , 2010. 143(7): 第1059-71頁；Wallace等人,Annu Rev Physiol , 2009. 71: 第37-57頁)，引起漸進性肌肉虛弱、肌內膜炎症及纖維化疤痕形成。 若不存在肌縮蛋白或微小肌縮蛋白對膜的穩定，DMD將顯現組織損傷及修復之不可控循環，最終經由結締組織增殖用纖維化疤組織替代損失肌纖維。纖維化之特徵在於過度沈積ECM基質蛋白，包含膠原蛋白及彈性蛋白。ECM蛋白質主要產生自諸如TGFβ之細胞激素，所述TGFβ藉由活化對應激及炎症作出反應之纖維母細胞而釋放。儘管DMD之主要病理特徵為肌纖維變性及壞死，但纖維化作為病理性後果具有相同影響。纖維化組織之過度產生限制肌肉再生且促進DMD患者之漸進性肌肉虛弱。在一個研究中，在10年隨訪時，初始DMD肌肉活檢體上存在纖維化與不良運動後果高度相關(Desguerre等人,J Neuropathol Exp Neurol , 2009. 68(7): 第762-7頁)。此等結果指出纖維化作為DMD肌肉功能障礙之主要貢獻者，且強調在明顯纖維化之前對及早干預的需要。 腺相關病毒(AAV)為複製缺乏細小病毒，其單股DNA基因組長度為約4.7 kb，包含145個核苷酸反向末端重複(ITR)。存在多種AAV之血清型。已知AAV血清型之基因組的核苷酸序列。舉例而言，AAV血清型2(AAV2)基因組之核苷酸序列呈現於如由Ruffing等人,J Gen Virol , 75: 3385-3392 (1994)修正之Srivastava等人,J Virol , 45: 555-564 (1983)中。作為其他實例，AAV-1之完整基因組提供於GenBank寄存編號NC_002077中；AAV-3之完整基因組提供於GenBank寄存編號NC_1829中；AAV-4之完整基因組提供於GenBank寄存編號NC_001829中；AAV-5基因組提供於GenBank寄存編號AF085716中；AAV-6之完整基因組提供於GenBank寄存編號NC_00 1862中；AAV-7及AAV-8基因組之至少部分分別提供於GenBank寄存編號AX753246及AX753249中(亦參見美國專利第7,282,199號及與AAV-8相關之第7,790,449號)；AAV-9基因組提供於Gao等人,J . Virol . , 78: 6381-6388 (2004)；AAV-10基因組提供於Mol . Ther . , 13(1): 67-76 (2006)；且AAV-11基因組提供於Virology , 330(2): 375-383 (2004)中。AAVrh.74血清型之複製描述於Rodino-Klapac.,等人Journal of translational medicine 5 , 45 (2007)中。引導病毒DNA複製(rep)、衣殼化/封裝及宿主細胞染色體整合之順效應序列含於ITR內。三種AAV啟動子(針對其相關映射位點命名為p5、p19及p40)驅動編碼兩個AAV內部開放閱讀框架之rep及cap基因的表現。與單個AAV內含子之差異性剪接偶合(例如在AAV2核苷酸2107及2227處)之兩種rep啟動子(p5及p19)引起由rep基因產生四種rep蛋白質(rep 78、rep 68、rep 52及rep 40)。rep蛋白質具有多個最終負責複製病毒基因組的酶促特性。cap基因自p40啟動子表現，且其編碼三種蛋白殼蛋白質VP1、VP2及VP3。替代性剪接及非共同轉譯啟動對產生三種相關蛋白殼蛋白質負責的位點。單個共同聚腺苷酸化位點位於AAV基因組之映射位置95處。AAV之生命週期及遺傳在Muzyczka,Current Topics in Microbiology and Immunology , 158: 97-129 (1992)中回顧。 AAV具有獨特特徵，使得其例如在基因療法中作為用於遞送外來DNA至細胞的載體具有吸引力。AAV在培養物中感染細胞為非細胞病變的，且對人類及其他動物之天然感染為沉默及無症狀的。此外，AAV感染多種哺乳動物細胞允許活體內靶向多種不同組織的可能性。此外，AAV緩慢轉導分裂細胞及非分裂細胞，且對於彼等細胞之生命週期可基本上保持為轉錄活性細胞核游離基因體(染色體外的元件)。AAV前病毒基因組作為質體中之純系化DNA具有感染性，其使得構築重組基因組變得可行。此外，由於引導AAV複製、基因組衣殼化及整合之信號含於AAV基因組之ITR內，因此固有大約4.3 kb之基因組(編碼複製及結構性蛋白殼蛋白質，rep-cap)中的一些或全部可經外來DNA替換，所述外來DNA諸如含有啟動子的基因卡匣，一種所關注的DNA及聚腺苷酸化信號。rep及cap蛋白質可反式提供。AAV之另一種顯著特徵在於其為極其穩定及充滿活力的病毒。其容易地承受用以滅活腺病毒(56℃至65℃持續數小時)的條件，使得AAV的低溫保藏不那麼重要。AAV甚至可凍乾。最後，經AAV感染之細胞對重複感染不具有抗性。 多項研究已展現肌肉中之長期(＞ 1.5年)重組AAV介導之蛋白質表現。參見Clark等人,Hum Gene Ther , 8: 659-669 (1997)；Kessler等人,Proc Nat . Acad Sc . USA , 93: 14082-14087 (1996)；及Xiao等人,J Virol , 70 : 8098-8108 (1996)。亦參見Chao等人,Mol Ther , 2:619-623 (2000)及Chao等人,Mol Ther ,4 :217-222 (2001)。此外，由於肌肉高度血管化，重組AAV轉導在肌肉內注射後導致全身循環中出現轉殖基因產物，如Herzog等人,Proc Natl Acad Sci USA ,94 : 5804-5809 (1997)及Murphy等人,Proc Natl Acad Sci USA ,94 : 13921-13926 (1997)中所描述。此外，Lewis等人,J Virol , 76 : 8769-8775 (2002)證實骨骼肌纖維具有正確抗體糖基化、摺疊及分泌所必需的細胞因子，表明肌肉能夠使經分泌蛋白質療法之表現穩定。 患有DMD及其他肌肉營養不良之患者的功能改善需要在疾病早期階段的基因修復。需要提高患有DMD之患者的肌肉力量及保護免受肌肉損傷的治療。
本發明係關於表現微小肌縮蛋白基因至包含隔膜及心肌肌肉之骨骼肌肉中的基因療法載體(例如AAV)，以保護肌纖維免受損傷、提高肌肉力量及減少及/或預防纖維化。 本發明提供使用基因療法載體遞送微小肌縮蛋白以解決DMD中所觀測之基因缺陷，提高肌肉力量及/或增加肌肉質量的療法及方法。如實例2中所示，用微小肌縮蛋白基因療法治療在活體內產生較大的肌肉力量。此外，肌內及全身性遞送微小肌縮蛋白基因療法展示活體內遞送肌縮蛋白至小鼠模型之肌肉。 在一個實施例中，本發明提供包括肌肉特異性控制元件核苷酸序列，及編碼微小肌縮蛋白之核苷酸序列的rAAV載體。舉例而言，核苷酸序列編碼功能性微小肌縮蛋白，其中核苷酸與SEQ ID NO: 1例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%、更通常至少90%、91%、92%、93%或94%且甚至更通常至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致，其中蛋白質保持微小肌縮蛋白活性。微小肌縮蛋白在肌肉收縮期間向肌肉膜提供穩定性，例如微小肌縮蛋白在肌肉收縮期間充當衝擊吸收器。 本發明亦提供其中核苷酸序列編碼功能性微小肌縮蛋白之rAAV載體，其包括在嚴格條件下雜交至SEQ ID NO: 1之核酸序列或其互補，且編碼功能性微小肌縮蛋白的核苷酸序列。 在一個實施例中，rAAV載體為非複製重組腺相關病毒(AAV)，稱為rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。此載體基因組含有極少基因表現所需的元件，包含AAV2反向末端重複(ITR)、微小肌縮蛋白、SV40內含子(SD/SA)及合成聚腺苷酸化(Poly A)信號，所有皆在MHCK7啟動子/強化子控制下。載體基因組及表現卡匣之示意圖展示於圖1中。AAVrh74血清型可用以在IV投與後實現有效的骨骼及心肌肌肉中的基因轉移。 術語「嚴格」用以指所屬領域中通常理解為嚴格的條件。雜交嚴格度大體上藉由溫度、離子強度及變性劑(諸如甲醯胺)的濃度測定。雜交及洗滌之嚴格條件之實例為65-68℃下0.015 M氯化鈉、0.0015 M檸檬酸鈉，或42℃下0.015 M氯化鈉、0.0015 M檸檬酸鈉及50%甲醯胺。參見Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989)。亦可使用更加嚴格的條件(諸如較高溫度、較低離子強度、較高甲醯胺或其他變性劑)，然而，雜交率將受影響。在有關其中脫氧寡核苷酸之雜交的情況下，其他例示性嚴格雜交條件包含在37℃(針對14鹼基寡核苷酸)、48℃(針對17鹼基寡核苷酸)、55℃(針對20鹼基寡核苷酸)及60℃(針對23鹼基寡核苷酸)下在6× SSC 0.05%焦磷酸鈉中洗滌。 出於減小非特異性及/或先前技術雜交之目的，雜交及洗滌緩衝液中可包含其他試劑。實例為0.1%牛血清白蛋白、0.1%聚乙烯基-吡咯啶酮、0.1%焦磷酸鈉、0.1%十二烷基硫酸鈉、NaDodSO4、(SDS)、菲科爾(ficoll)、鄧哈特溶液(Denhardt's solution)、音波處理鮭魚精子DNA(或其他非互補DNA)及硫酸葡聚糖，但亦可使用其他適合之試劑。可在不大體上影響雜交條件嚴格度的情況下改變此等添加劑的濃度及類型。雜交實驗通常在pH 6.8-7.4下進行，然而，在典型離子強度條件下，雜交率幾乎與pH無關。參見Anderson等人, Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach,第4章, IRL Press Limited (英格蘭牛津(Oxford, England))。雜交條件可由本領域中熟習此項技術者調整，以便適應此等變量且允許具有不同序列相關性的DNA形成雜合體。 術語「肌肉特異性控制元件」係指調節對肌肉組織中之表現具有特異性之編碼序列的表現的核苷酸序列。此等控制元件包含強化子及啟動子。本發明提供包括肌肉特異性控制元件MCKH7啟動子、MCK啟動子及MCK強化子之構築體。 術語「可操作地連接」係指調節元件核苷酸序列(例如啟動子核苷酸序列)之定位，以賦予所述調節元件表現所述核苷酸序列。 在一個態樣中，本發明提供rAAV載體，其中肌肉特異性控制元件為人類骨骼肌動蛋白基因元件、心肌肌動蛋白基因元件、肌細胞特異性強化子結合因子(MEF)、肌肉肌酸激酶(MCK)、截斷MCK(tMCK)、肌凝蛋白重鏈(MHC)、雜交α-肌凝蛋白重鏈強化子-/MCK強化子-啟動子(MHCK7)、C5-12、鼠類肌酸激酶強化子元件、骨骼快速抽動肌鈣蛋白c基因元件、緩慢抽動心肌肌鈣蛋白c基因元件、緩慢抽動肌鈣蛋白i基因元件、低氧誘導性核因子、類固醇誘導性元件或糖皮質激素反應元件(GRE)。 舉例而言，肌肉特異性控制元件為MHCK7啟動子核苷酸序列SEQ ID NO: 2，或肌肉特異性控制元件為MCK核苷酸序列SEQ ID NO: 4。另外，在本發明之rAAV載體中之任一者中，肌肉特異性控制元件核苷酸序列，例如MHCK7或MCK核苷酸序列，可操作地連接於編碼微小肌縮蛋白之核苷酸序列。舉例而言，MHCK7啟動子核苷酸序列(SEQ ID NO: 2)可操作地連接於人類微小肌縮蛋白編碼序列(SEQ ID NO: 1)，如圖1或圖10(SEQ ID NO: 3)中所提供之構築體中所陳述。在另一實例中，MCK啟動子(SEQ ID NO: 4)可操作地連接於人類微小肌縮蛋白編碼序列(SEQ ID NO: 1)，如圖7或圖11(SEQ ID NO: 5)中所提供之構築體中所陳述。在另一態樣中，本發明提供包括SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之核苷酸序列之rAAV載體。本發明亦提供包括SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 4之核苷酸序列之rAAV載體。 在另一態樣中，本發明提供包括SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5之核苷酸序列之rAAV載體。舉例而言，rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白載體包括SEQ ID NO: 3且展示於圖10中之核苷酸序列。此rAAV載體包括MHCK7啟動子、嵌合內含子序列、人類微小肌縮蛋白基因之編碼序列、polyA、具有pBR322源或複製之安比西林(ampicillin)抗性及pGEX質體主鏈。 本發明提供包括SEQ ID NO: 1之人類微小肌縮蛋白核苷酸序列及SEQ ID NO: 3之MHCK7啟動子核苷酸序列的重組AAV載體。此rAAV載體為AAV血清型AAVrh.74。 本發明亦提供包括SEQ ID NO: 3之pAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列之重組AAV載體。此rAAV載體為AAV血清型AAVrh.74。 本發明之rAAV載體可為任何AAV血清型，諸如血清型AAVrh.74、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13。 本發明亦提供包括本發明之rAAV載體中之任一者的醫藥組合物(或有時在本文中簡稱為「組合物」)。 在另一實施例中，本發明提供產生rAAV載體粒子之方法，其包括培養已用本發明之任何rAAV載體轉染之細胞及自經轉染細胞之清液層回收rAAV粒子。本發明亦提供包括本發明之重組AAV載體中之任一者的病毒粒子。 本發明提供治療肌肉萎縮症之方法，其包括投與治療有效量之表現人類微小肌縮蛋白之本發明之重組AAV載體中的任一者。 本發明提供治療肌肉萎縮症之方法，其包括投與治療有效量之重組AAV載體，所述重組AAV載體包括SEQ ID NO: 1之人類微小肌縮蛋白核苷酸序列及SEQ ID NO: 2之MHCK7啟動子核苷酸序列。 本發明亦提供治療肌肉萎縮症之方法，其包括投與治療有效量之包括SEQ ID NO: 3之pAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列的重組AAV載體。 「纖維化」係指組織在損傷時胞外基質(ECM)組分過度的或不受調控的沈積及異常修復過程，所述組織包含骨胳肌肉、心肌肌肉、肝、肺、腎臟及胰腺。沈積之ECM組分包含纖維結合蛋白及膠原蛋白，例如膠原蛋白1、膠原蛋白2或膠原蛋白3。 本發明亦提供減少或預防患有肌肉萎縮症之個體纖維化之方法，其包括投與治療有效量之本發明之任何重組AAV載體。 在另一實施例中，本發明提供在有需要之個體中預防纖維化之方法，其包括投與治療有效量之本發明之重組AAV載體。舉例而言，本發明之rAAV中之任一者可投與患有肌肉萎縮症之個體以預防纖維化，例如在個體中觀測到纖維化之前投與本發明之表現人類微小肌縮蛋白的rAAV。另外，本發明之表現人類微小肌縮蛋白基因之rAAV可投與處於罹患纖維化風險中之個體，諸如罹患或診斷患有肌肉萎縮症(例如DMD)的彼等者。本發明之rAAV可投與患有肌肉萎縮症之個體以便預防此等個體中出現新的纖維化。 本發明涵蓋在個體中觀測到纖維化之前投與本發明之AAV載體中之任一者。另外，本發明之rAAV可投與處於罹患纖維化風險中之個體，諸如罹患或診斷患有肌肉萎縮症(例如DMD)的彼等者。本發明之rAAV可投與患有已產生纖維化之肌肉萎縮症之個體，以便預防此等個體中產生新的纖維化。 本發明亦提供提高患有肌肉萎縮症之個體中肌肉力量及/或肌肉質量的方法，其包括投與治療有效量之本發明之表現人類微小肌縮蛋白基因的rAAV載體。此等方法可進一步包括投與表現微小肌縮蛋白之rAAV的步驟。 本發明涵蓋在個體中觀測到纖維化之前或在肌肉力量已減小之前或在肌肉質量已減小之前，向診斷患有DMD之患者投與本發明之AAV載體中之任一者。 本發明亦涵蓋向患有已產生纖維化之肌肉萎縮症之個體投與本發明之AAV，以便預防此等個體中產生新的纖維化或減少此等患者中的纖維化。本發明亦提供向患有肌肉力量已減小或肌肉質量減小之肌肉萎縮症的患者投與本發明之rAAV中之任一者，以便保護肌肉免受進一步損傷。 在本發明方法中之任一者中，個體可患有肌肉萎縮症，諸如DMD，或任何其他肌縮蛋白相關肌肉萎縮症。 在另一態樣中，表現微小肌縮蛋白之rAAV載體包括微小肌縮蛋白基因之編碼序列，其可操作地連接於除MHCK7或MCK以外的肌肉特異性控制元件。舉例而言，其中肌肉特異性控制元件為人類骨骼肌動蛋白基因元件、心肌肌動蛋白基因元件、肌細胞特異性強化子結合因子MEF、截斷MCK(tMCK)、肌凝蛋白重鏈(MHC)、C5-12(合成啟動子)、鼠類肌酸激酶強化子元件、骨骼快速抽動肌鈣蛋白C基因元件、緩慢抽動心肌肌鈣蛋白C基因元件、緩慢抽動肌鈣蛋白I基因元件、低氧誘導性核因子、類固醇誘導性元件或糖皮質激素反應元件(GRE)。 在本發明之方法中之任一者中，rAAV載體或組合物可藉由肌肉內注射或靜脈內注射投與。 另外，在本發明之方法中之任一者中，rAAV載體或組合物可全身性投與。舉例而言，rAAV載體或組合物可藉由注射、輸注或植入非經腸投與。 在另一實施例中，本發明提供包括本發明之rAAV載體中之任一者的組合物，其用於減少有需要之個體中的纖維化。 另外，本發明提供包括本發明之重組AAV載體中之任一者的組合物，其用於預防患有肌肉萎縮症之患者中的纖維化。 本發明提供包括本發明之重組AAV載體中之任一者的組合物，其用於治療肌肉萎縮症。 本發明提供包括重組AAV載體之組合物用於治療肌肉萎縮症，所述重組AAV載體包括SEQ ID NO: 1之人類微小肌縮蛋白核苷酸序列及SEQ ID NO: 2之MHCK7啟動子序列。 本發明提供包括重組AAV載體之組合物用於治療肌肉萎縮症，所述重組AAV載體包括含有SEQ ID NO: 3之核苷酸序列的pAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體。 本發明亦提供包括本發明之rAAV載體中之任一者的組合物，其用於提高患有肌肉萎縮症之個體的肌肉力量及/或肌肉質量。在另一實施例中，本發明提供包括本發明之rAAV載體中之任一者的組合物，其用於治療肌肉萎縮症。 本發明之組合物可經調配用於肌肉內注射或靜脈內注射。本發明之組合物亦調配用於全身投與，諸如藉由注射、輸注或植入非經腸投與。 另外，組合物中之任一者可經調配用於投與患有肌肉萎縮症之個體，所述肌肉萎縮症諸如DMD或任何其他肌縮蛋白相關肌肉萎縮症。 在另一實施例中，本發明提供本發明之rAAV載體中之任一者之用途，其用於製備供減少有需要之個體中的纖維化用的藥物。舉例而言，有需要之個體可患有肌肉萎縮症，諸如DMD或任何其他肌縮蛋白相關肌肉萎縮症。 在另一實施例中，本發明提供本發明之rAAV載體之用途，其用於製備預防患有肌肉萎縮症之個體中纖維化的藥物。 另外，本發明提供本發明之重組AAV載體之用途，其用於製備提高患有肌肉萎縮症之個體的肌肉力量及/或肌肉質量的藥物。 本發明亦提供本發明之rAAV載體之用途，其用於製備供治療肌肉萎縮症用的藥物。 本發明提供包括SEQ ID NO: 1之人類微小肌縮蛋白核苷酸序列及SEQ ID NO: 2之MHCK7啟動子核苷酸序列之重組AAV載體的用途，其用於製備供治療肌肉萎縮症用的藥物。 本發明提供包括SEQ ID NO: 3之pAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列之重組AAV載體的用途，其用於治療肌肉萎縮症。 在本發明之用途中之任一者中，藥物可經調配用於肌肉內注射或靜脈內注射。另外，在本發明之用途中之任一者中，藥物可經調配用於全身投與，諸如藉由注射、輸注或植入非經腸投與。 藥物中之任一者可經製備用於投與患有肌肉萎縮症之個體，所述肌肉萎縮症諸如DMD或任何其他肌縮蛋白相關肌肉萎縮症。
本申請案主張於2017年3月17日申請之美國臨時專利申請案第62/473,148號之優先權，其以全文引用的方式併入本文中。以引用的方式併入以電子方式提交的材料 本申請案含有呈電腦可讀形式之序列表作為本發明之獨立部分，其以全文引用的方式併入本文中且識別如下：檔案名：51475_Seqlisting.txt；大小：生成29,519位元組；2018年3月13日。 本發明提供過度表現人類微小肌縮蛋白之基因療法載體，例如rAAV載體，及減少及預防肌肉萎縮症患者中纖維化之方法。在診斷患有DMD最小年齡採集之肌肉活檢體展現顯著的結締組織增殖。肌肉纖維化以多種方式有害。其減少肌內膜營養素穿過結締組織障壁之正常運輸，減小血流量且剝奪肌肉來源於血管之營養組分，及功能上經由四肢攣縮促使早期無法步行。隨時間推移，由於肌肉中之明顯纖維化，治療難度倍增。此可在肌肉活檢體中在連續時間點比較結締組織增殖觀測到。過程持續加重，導致無法步行且加速失控，尤其在依賴輪椅之患者中。 在無早期治療，包含減少纖維化之並行方法的情況下，外顯子跳躍、終止密碼子通讀或基因替代療法之益處不大可能能夠不斷充分地實現。在沒有減少肌肉纖維化方法的情況下，即使小分子或蛋白質替代策略亦很可能失敗。在具有現有纖維化之老齡mdx小鼠中用AAV.微小肌縮蛋白治療之先前工作表明吾人不能實現完整的功能復原(Liu, M.,等人,Mol Ther 11, 245-256 (2005))。亦已知DMD心肌病之進展伴隨著疤痕形成及心室壁纖維化。 如本文所用，術語「AAV」為腺相關病毒之標準縮寫。腺相關病毒為僅在某些功能由共感染輔助病毒提供之細胞中生長之單股DNA小病毒。當前存在十三種已表徵之AAV之血清型。AAV之總體資訊及綜述可發現於例如Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses,第1卷, 第169-228頁，及Berns, 1990, Virology, 第1743-1764頁, Raven Press, (New York)中。然而，完全預期此等相同原理將適用於其他AAV血清型，因為熟知的是各種血清型在結構上及功能上相當緊密相關，甚至在基因層面上亦如此。(參見例如Blacklowe, 1988, 《小病毒及人類疾病(Parvoviruses and Human Disease)》之第165-174頁, J. R. Pattison編；及Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974))。舉例而言，所有AAV血清型表觀上展現極類似之由同源rep基因介導之複製特性；並且所有皆帶有三種相關蛋白殼蛋白質，諸如AAV2中表現之彼等者。相關性程度藉由沿基因組長度在血清型之間展現廣泛交叉雜交之異雙螺旋分析；及對應於「反向末端重複序列(ITR)」之末端處之類似自結合片段之存在進一步表明。類似感染性模式亦表明各血清型中之複製功能受到類似調節控制。 如本文所用之「AAV載體」係指包括一或多種所關注之聚核苷酸(或轉殖基因)之載體，所述聚核苷酸經由AAV末端重複序列(ITR)側接。此類AAV載體可複製及包裝至已經編碼及表現rep及cap基因產物之載體轉染的宿主細胞中之感染性病毒粒子(若存在)中。 「AAV病毒粒子(AAV virion/AAV viral particle)」或「AAV載體粒子」係指由至少一個AAV衣殼蛋白及衣殼化聚核苷酸AAV載體組成之病毒粒子。若粒子包含異源聚核苷酸(亦即除野生型AAV基因組，如待傳遞至哺乳動物細胞之轉殖基因以外的聚核苷酸)，則其通常稱為「AAV載體粒子」或簡稱為「AAV載體」。因此，AAV載體粒子之產生必定包括AAV載體之產生，因此載體含於AAV載體粒子內。AAV 本發明之重組AAV基因組包括本發明之核酸分子及一或多個側接核酸分子之AAV ITR。rAAV基因組中之AAV DNA可來自能衍生出重組病毒之任何AAV血清型，包含但不限於AAV血清型AAVrh.74、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12及AAV-13。假模式化rAAV之生成揭示於例如WO 01/83692中。亦設想其他類型之rAAV變異體，例如具有蛋白殼突變之rAAV。參見例如Marsic等人,Molecular Therapy , 22(11): 1900-1909 (2014)。如上文之先前技術部分中所述，各種AAV血清型之基因組之核苷酸序列在所屬領域中已知。為促進骨胳肌肉特異性表現，可使用AAV1、AAV6、AAV8或AAVrh.74。本發明之DNA質體包括本發明之rAAV基因組。將DNA質體轉移至容許經AAV之輔助病毒(例如腺病毒、E1缺失腺病毒或疱疹病毒)感染之細胞，用於rAAV基因組之總成進入感染性病毒粒子。產生rAAV粒子之技術在所屬領域中是標準的，其中待封裝之AAV基因組、rep及cap基因、及輔助病毒功能提供至細胞。rAAV之產生需要單個細胞(本文指示為封裝細胞)內存在以下組分：rAAV基因組、不同於rAAV基因組(亦即不在其中之)AAV rep及cap基因及輔助病毒功能。AAV rep及cap基因可來自能衍生出重組病毒之任何AAV血清型，且可來自與rAAV基因組ITR不同的AAV血清型，包含但不限於AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAVrh.74、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12及AAV-13。假模式化rAAV之生成揭示於例如WO 01/83692中，其以全文引用的方式併入本文中。 一種產生封裝細胞之方法為生成穩定表現AAV粒子產生所必需之所有組分的細胞株。舉例而言，將包括不含AAV rep及cap基因之rAAV基因組、不同於rAAV基因組之AAV rep及cap基因及可選標記(諸如新黴素抗性基因)之質體(或多個質體)整合於細胞基因組中。藉由諸如GC加尾(Samulski等人, 1982,Proc . Natl . Acad . S6 . USA , 79:2077-2081)、添加含有限制性核酸內切酶裂解位點之合成連接子(Laughlin等人, 1983, Gene, 23:65-73)之程序或藉由直接鈍末端接合(Senapathy及Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666)將AAV基因組引入至細菌質體中。封裝細胞株隨後經諸如腺病毒之輔助病毒感染。此方法之優勢為可選細胞且適用於大規模生產rAAV。適合之方法之其他實例採用腺病毒或桿狀病毒而非質體將rAAV基因組及/或rep及cap基因引入至封裝細胞中。rAAV生成之一般原理在例如Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539；及Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129中綜述。各種方法描述於Ratschin等人,Mol . Cell . Biol . 4:2072 (1984)；Hermonat等人,Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 81:6466 (1984)；Tratschin等人,Mo1 . Cell . Biol . 5:3251 (1985)；McLaughlin等人,J . Virol . , 62:1963 (1988)；及Lebkowski等人,Mol . Cell . Biol . , 7:349 (1988)。Samulski等人, J. Virol., 63:3822-3828 (1989)；美國專利第5,173,414號；WO 95/13365及相對應美國專利第5,658,776號；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人Vaccine 13:1244-1250 (1995)；Paul等人Human Gene Therapy 4:609-615 (1993)；Clark等人Gene Therapy 3:1124-1132 (1996)；美國專利第5,786,211號；美國專利第5,871,982號；及美國專利第6,258,595號。前述文獻在此以其全文引用之方式併入本文中，其中特定強調文獻中與rAAV生成相關之彼等部分。本發明因此提供產生感染性rAAV之封裝細胞。在一個實施例中封裝細胞可為穩定轉型癌細胞，諸如HeLa細胞、293細胞及PerC.6細胞(同源293株)。在另一實施例中，封裝細胞是不為經轉型癌細胞的細胞，諸如低傳代293細胞(經腺病毒之E1轉型之人類胚胎腎細胞)、MRC-5細胞(人類胚胎纖維母細胞)、WI-38細胞(人類胚胎纖維母細胞)、Vero細胞(猴腎細胞)及FRhL-2細胞(恆河猴胚胎肺細胞)。 本發明之重組AAV(亦即感染性衣殼化rAAV粒子)包括rAAV基因組。在例示性實施例中，兩個rAAV之基因組均缺乏AAV rep及cap DNA，亦即在基因組之ITR之間不存在AAV rep或cap DNA。可經構築以包括本發明之核酸分子之rAAV之實例陳述於國際專利申請案第PCT/US2012/047999號(WO 2013/016352)中，其以全文引用的方式併入本文中。 在一例示性實施例中，本發明之重組AAV載體藉由三重轉染方法(Xiao等人 ,J Virol 72 , 2224-2232 (1998))使用AAV載體質體pAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白、pNLRep2-Caprh74及pHelp製備，pAAV含有經AAV2反向末端重複序列(ITR)側接之微小肌縮蛋白基因表現卡匣。此序列衣殼化至AAVrh74病毒粒子中。質體含有微小肌縮蛋白序列及MHCK7強化子及肌肉特異性啟動子之核心啟動子元件以驅動基因表現。表現卡匣亦含有SV40內含子(SD/SA)以促進高水準基因表現，及牛生長激素聚腺苷酸化信號用於有效的轉譯終止。 pNLREP2-Caprh74為編碼來自血清型rh74之4種野生型AAV2 rep蛋白質及3種野生型AAV VP蛋白殼蛋白質的AAV輔助質體。pNLREP2-Caprh74質體之示意性映射展示於圖25中。 pHELP腺病毒輔助質體為11,635 bp且獲自Applied Viromics。質體含有對AAV複製至關重要之腺病毒基因組區，亦即E2A、E4ORF6及VA RNA(腺病毒E1功能由293細胞提供)。此質體中存在之腺病毒序列僅表示腺病毒基因組之約40%，且不含對於複製而言關鍵的順式元件，諸如腺病毒末端重複。因此，預期由此類生產系統不能生成感染性腺病毒。pHELP質體之示意性映射展示於圖26中。 rAAV可藉由所屬領域中之標準方法(諸如藉由管柱層析法或氯化銫梯度)純化。用於自輔助病毒純化rAAV載體之方法在所屬領域中已知，且包含例如Clark等人,Hum . Gene Ther . ,10 (6): 1031-1039 (1999)；Schenpp及Clark,Methods Mol . Med . ,69 427-443 (2002)；美國專利第6,566,118號及WO 98/09657中揭示之方法。在另一實施例中，本發明涵蓋包括本發明之rAAV之組合物。本發明之組合物包括rAAV及醫藥學上可接受之載劑。組合物亦可包括其他成分，諸如稀釋劑及佐劑。可接受之載劑、稀釋劑及佐劑對接受者無毒性且在所採用劑量及濃度下較佳為惰性，且包含緩衝劑及諸如普朗尼克(pluronics)之界面活性劑。 本發明之方法中待投與之rAAV之效價將視例如特定rAAV、投與模式、治療目標、個體及所靶向之細胞類型而變化，且可藉由所屬領域中之標準方法測定。rAAV之效價可在約1×106 、約1×107 、約1×108 、約1×109 、約1×1010 、約1×1011 、約1×1012 、約1×1013 至約1×1014 範圍內，或每ml更多耐脫氧核糖核酸酶粒子(DRP)。劑量亦可以病毒基因組之單位表示(vg)。本發明涵蓋用rAAV活體內或活體外轉導靶細胞之方法。活體內方法包括向有需要之動物(包含人類)投與有效劑量或有效多次劑量之包括本發明之rAAV的組合物的步驟。若劑量在罹患病症/疾病之前投與，則投與為預防性的。若劑量在罹患病症/疾病之後投與，則投與為治療性的。在本發明之實施例中，有效劑量為緩解(消除或減少)至少一種與所治療病症/疾病病況相關之症狀的劑量、減緩或預防病症/疾病病況進展的劑量、減緩或預防病症/疾病病況進展的劑量、減輕疾病程度的劑量、引起疾病緩解(局部或總體)的劑量及/或延長存活期的劑量。設想用本發明之方法預防或治療之疾病的實例為DMD。本發明亦涵蓋組合療法。如本文所用之組合包含同步治療及依序治療兩者。特定涵蓋本發明之方法與標準醫學治療(例如皮質類固醇)之組合作為與新穎療法的組合。 有效劑量之組合物之投與可藉由所屬領域中之標準途徑進行，所述標準途徑包含但不限於肌內、非經腸、靜脈內、經口、頰內、經鼻、經肺、顱內、骨內、眼內、經直腸或經陰道。本領域中熟習此項技術者考慮所治療之感染及/或疾病病況及欲表現微小肌縮蛋白之靶細胞/組織可選擇及/或匹配投與途徑及本發明之rAAV(尤其AAV ITR及衣殼蛋白)的AAV組分的血清型。 本發明提供局部投與及全身投與有效劑量之本發明之rAAV及組合物。舉例而言，全身投與為投與至循環系統中，使得整個身體受影響。全身投與包含經腸投與，諸如經由胃腸道吸收，及藉由注射、輸注或植入非經腸投與。 特定言之，實際投與本發明之rAAV可藉由使用任何將使rAAV重組載體轉移至動物的目標組織中的物理方法實現。根據本發明之投與包含但不限於注射至肌肉中及注射至血流中。已證明簡單地將rAAV再懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水中足以提供適用於肌肉組織表現之媒劑，且對於可與rAAV共投與之載劑或其他組分不存在已知限制(但在具有rAAV之正常方式中應避免降解DNA之組合物)。rAAV之蛋白殼蛋白質可經修飾，使得rAAV靶向所關注的特定目標組織，諸如肌肉。參見例如WO 02/053703，其揭示內容以引用之方式併入本文中。醫藥組合物可製備成可注射調配物或製備成待藉由經皮輸送遞送至肌肉中的局部調配物。先前已研發大量用於肌肉內注射及經皮輸送兩者之調配物，且可用於實踐本發明。出於投與及處置簡易性，rAAV可與任何醫藥學上可接受之載劑一起使用。 本文揭示之方法中待投與之rAAV之劑量將視例如特定rAAV、投與模式、治療目標、個體及所靶向之細胞類型而變化，且可藉由所屬領域中之標準方法測定。所投與各rAAV之效價可在約1×106 、約1×107 、約1×108 、約1×109 、約1×1010 、約1×1011 、約1×1012 、約1×1013 、1×1014 或至約1×1015 範圍內，或每ml更多耐脫氧核糖核酸酶粒子(DRP)。劑量亦可以病毒基因組之單位表示(vg)(亦即分別為1×107 vg、1×108 vg、1×109 vg、1×1010 vg、1×1011 vg、1×1012 vg、1×1013 vg、1×1014 vg、1×1015 )。劑量亦可以每公斤(kg)體重之病毒基因組之單位(vg)表示(亦即分別為1×1010 vg/kg、1×1011 vg/kg、1×1012 vg/kg、1×1013 vg/kg、1×1014 vg/kg、1×1015 vg/kg)。滴定AAV之方法描述於Clark等人,Hum . Gene Ther . ,10 : 1031-1039 (1999)中。特定言之，實際投與本發明之rAAV可藉由使用任何將使rAAV重組載體轉移至動物的目標組織中的物理方法實現。根據本發明之投與包含但不限於注射至肌肉中及注射至血流中。已證明簡單地將rAAV再懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水中足以提供適用於肌肉組織表現之媒劑，且對於可與rAAV共投與之載劑或其他組分不存在已知限制(但在具有rAAV之正常方式中應避免降解DNA之組合物)。rAAV之蛋白殼蛋白質可經修飾，使得rAAV靶向所關注的特定目標組織，諸如肌肉。參見例如WO 02/053703，其揭示內容以引用之方式併入本文中。醫藥組合物可製備成可注射調配物或製備成待藉由經皮輸送遞送至肌肉中的局部調配物。先前已研發大量用於肌肉內注射及經皮輸送兩者之調配物，且可用於實踐本發明。出於投與及處置簡易性，rAAV可與任何醫藥學上可接受之載劑一起使用。 出於肌肉內注射之目的，可採用在諸如芝麻或花生油之佐劑中或在水性丙二醇中之溶液，以及無菌水溶液。必要時，此類水溶液可經緩衝，且首先用生理鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等張。可在水中適合地與諸如羥基丙基纖維素之界面活性劑混合製備作為游離酸(DNA含有酸性磷酸根基)或藥理學上可接受之鹽的rAAV的溶液。亦可在甘油、液態聚乙二醇及其於油中之混合物中製備rAAV之分散液。在普通的儲存及使用條件下，此等製劑含有防腐劑以防止微生物生長。與此相關，所採用無菌水性介質所有皆可容易地藉由本領域中熟習此項技術者熟知之標準技術獲得。 適用於可注射使用之醫藥載劑、稀釋劑或賦形劑包含無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。在所有情況下，形式必須為無菌的且必須為流體，達到存在可容易注射性之程度。其在製造及儲存條件下必須為穩定的，且必須避免諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及其類似物)、其適合的混合物及植物油之溶劑或分散介質。恰當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。微生物作用之預防可藉由各種抗菌劑及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及其類似物來實現。在多數情況下，其將較佳包含等張劑(例如糖或氯化鈉)。可注射組合物之延長吸收可藉由使用延緩吸收之藥劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來實現。 無菌可注射溶液藉由以下製備：將所需量之rAAV視需要與上文列舉之各種其他成分一起併入適當溶劑中，隨後過濾滅菌。一般而言，藉由將各種滅菌活性成分併入含有鹼性分散介質及來自上文列舉之彼等成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，其自其預先無菌過濾溶液產生活性成分粉末加任何額外所需成分之粉末。 用rAAV轉導亦可在活體外進行。在一個實施例中，所需目標肌肉細胞自個體移出，經rAAV轉導且再引入至個體中。替代地，可使用同基因型或異種肌肉細胞，其中彼等細胞在個體中將不會產生不當的免疫反應。 用於轉導及將經轉導細胞再引入至個體中之適合之方法在所屬領域中已知。在一個實施例中，可在活體外，例如在適當媒劑中藉由組合rAAV與肌肉細胞來轉導細胞，且使用習知技術，諸如南方墨點及/或PCR，或藉由使用可選標記篩檢含有所關注的DNA的彼等細胞。經轉導細胞隨後可調配至醫藥組合物中，且組合物藉由各種技術引入至個體中，諸如藉由肌內、靜脈內、皮下及腹膜內注射，或使用例如導管藉由注射至平滑及心肌肌肉中。 細胞經本發明之rAAV轉導引起持續表現微小肌縮蛋白。本發明因此提供投與/遞送表現微小肌縮蛋白之rAAV至動物，較佳人類的方法。此等方法包含用本發明之一或多種rAAV轉導組織(包含但不限於組織，諸如肌肉；器官，諸如肝及腦；及腺體，諸如唾液腺)。轉導可藉由包括組織特異性控制元件之基因卡盒進行。舉例而言，本發明之一個實施例提供轉導由肌肉特異性控制元件引導之肌肉細胞及肌肉組織之方法，所述肌肉特異性控制元件包含但不限於衍生自肌動蛋白及肌凝蛋白基因家族之彼等者，諸如來自myoD基因家族(參見Weintraub等人,Science ,251 : 761-766 (1991))，肌細胞特異性強化子結合因子MEF-2(Cserjesi及Olson,Mol Cell Biol 11: 4854-4862 (1991))，衍生自人類骨骼肌動蛋白基因之控制元件(Muscat等人,Mol Cell Biol , 7: 4089-4099 (1987))，心肌肌動蛋白基因，肌肉肌酸激酶序列元件(參見Johnson 等人,Mol Cell Biol , 9:3393-3399 (1989))及鼠類肌酸激酶強化子(mCK)元件，衍生自骨骼快速抽動肌鈣蛋白C基因、緩慢抽動心肌肌鈣蛋白C基因及緩慢抽動肌鈣蛋白I基因之控制元件：低氧誘導性核因子(Semenza等人,Proc Natl Acad Sci USA ,88 : 5680-5684 (1991))，類固醇誘導性元件及包含糖皮質激素反應元件(GRE)之啟動子(參見Mader及White,Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 5603-5607 (1993))，及其他控制元件。 肌肉組織為活體內DNA遞送之誘人標靶，因為其不為生命器官且容易獲取。本發明涵蓋自經轉導肌纖維持續表現微小肌縮蛋白。 「肌肉細胞」或「肌肉組織」意謂來源於任何種類之肌肉(例如骨胳肌肉及平滑肌，例如來自消化道、膀胱、血管或心肌組織)之細胞或細胞群。此類肌肉細胞可為分化或未分化的，諸如成肌細胞、肌細胞、肌管、心肌細胞及成心肌細胞(cardiomyoblast)。 術語「轉導」用以指活體內或活體外經由本發明之複製缺陷型rAAV投與/遞送微小肌縮蛋白之編碼區至受體細胞，使得受體細胞表現微小肌縮蛋白。 因此，本發明提供向有需要之患者投與有效劑量(或基本上同時投與之多次劑量，或在一定間隔下提供之多次劑量)之編碼微小肌縮蛋白的rAAV的方法。實例 實例 1 生成 pAAV . MHCK7 . 微小肌縮蛋白構築體 pAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白質體含有經AAV2反向末端重複序列(ITR)側接之人類微小肌縮蛋白cDNA表現卡匣(參見圖1)。微小肌縮蛋白構築體之特徵在於框內桿缺失(R4-R23)，同時鉸鏈1、2及4及半胱胺酸富集結構域仍產生138 kDa蛋白質。微小肌縮蛋白(3579 bp)之表現由MHCK7啟動子(795 bp)引導。藉由移除MCK啟動子且插入MHCK7啟動子自pAAV.MCK.微小肌縮蛋白質體構築質體。在核心啟動子之後，存在53 bp內源性小鼠MCK 外顯子1(未轉譯)用於有效的轉譯起始，隨後SV40遲延16S/19S剪接信號(97 bp)及小5'UTR(61 bp)。內含子及5' UTR來源於質體pCMVβ(Clontech)。微小肌縮蛋白卡匣在ATG啟動正前方具有共同Kozak，及小的53 bp合成polyA信號用於mRNA終止。人類微小肌縮蛋白卡匣含有(R4-R23/Δ71-78)結構域，如由Harper等人(Nature Medicine 8 , 253-261 (2002))先前所描述。互補DNA為針對人類用途最佳化之密碼子且由GenScript(新澤西州皮斯卡塔威(Piscataway, NJ))(Mol Ther 18 , 109-117 (2010))合成。此載體中包含之唯一病毒序列為AAV2之反向末端重複，其為病毒DNA複製及封裝所需的。微小肌縮蛋白卡匣具有小的53 bp合成polyA信號用於mRNA終止。 先前研究已證實使用MHCK7啟動子(Salva等人Mol Ther 15 , 320-329 (2007))及AAVrh74之心肌表現實現骨骼、隔膜及心肌肌肉表現(Sondergaard等人Annals of clinical and Transl Neurology 2 , 256-270 (2015))，圖1之構築體之序列衣殼化至AAVrh.74病毒粒子中。AAVrh.74血清型之分子純系自恆河猴淋巴結選殖且描述於Rodino-Klapac等人Journal of Translational medicine 5 , 45 (2007)中。表 1 展示質體pAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白(SEQ ID NO: 3)之分子特徵 實例 2 使用 rAAV . MHCK7 . 微小肌縮蛋白之肌內表現研究 用人類微小肌縮蛋白構築體(rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白；描述於實例1中)藉由肌肉內注射進行表現研究。mdx小鼠(不表現肌縮蛋白之自發Dmdmdx 突變小鼠)之脛前肌肉注射有1 × 1011 vg之卡匣(n=5每組)。六週後收集肌肉且針對肌縮蛋白(Dys3)表現對肌縮蛋白染色N末端抗體，及蘇木精及曙紅(HE)染色。圖2展示分散基因表現及與未處理肌肉相比在1 × 1011 vg劑量之情況下居中位置核減少。此外，在用微小肌縮蛋白構築體處理後，觀測到隨著平均纖維/框架增加，中間成核減少。rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體之表現量定量為約73%。 除量測微小肌縮蛋白定位及表現量以外，在肌肉內注射卡匣之後量測骨胳肌肉力量。pAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體之肌內表現與未處理對照相比引起顯著較大的絕對及具體力量產生(分別為圖3A及圖3B)。實例 3 全身遞送 rAAVrh . 74 . MHCK7 . 微小肌縮蛋白至 mdx 小鼠 mdx小鼠群組在6週齡時經由尾部靜脈注射有2 ×1012 vg(8×1013 vg/kg)或高劑量(規劃臨床劑量)6 ×1012 vg(2×1014 vg/kg)之rAAVrh.74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在12週治療後，收集所有肌肉且針對肌縮蛋白及DAPC組分之恢復染色。全身性注射(尾部靜脈)小鼠在所有肌肉中展示高含量之肌縮蛋白染色。圖4A表示在6×1012 vg(2 × 1014 vg/kg)全身劑量之後骨骼、隔膜及心肌肌纖維的廣泛轉導。圖4B展示各組織中表現微小肌縮蛋白之肌纖維百分比的量化。最終測試隔膜之功能改良(圖4C)。在低劑量下不可見顯著差異；然而在高劑量下存在顯著提高。重要地，圖5表明在微小肌縮蛋白遞送之後，DAPC之其他組分完全恢復。展示β-肌聚糖蛋白(B-SG)。AAVrh.74.MHCK7.微小肌縮蛋白之毒理學/安全性藉由按照表2經由靜脈內(i.v.)注射投與載體至mdx小鼠之尾部靜脈來評估。在所分析肌肉組織中之任一者中不存在毒性跡象，所述肌肉組織包含：脛前(TA)、腓腸肌(GAS)、四頭肌(QD)、腰肌(PSO)、肱三頭肌(TRI)及隔膜(DIA)(圖6A及6B)。在高劑量6×1012 vg(2 × 1014 vg/kg)下居中位置核之數目減少。歷史上，未處理年齡匹配mdx小鼠中骨骼肌肉之中間成核平均約80%。最後，來自小樣品規模(n=3)之初始資料表明高劑量處理小鼠(D)中血清中之CK釋放量(U/L)減少。使用獨立t測試確定差異(p＜.05)；資料報導為平均值± SEM。 表2.rAAVrh.74.MHCK7.微小肌縮蛋白在小鼠中之毒理學/安全性研究之概述。 實例4 生成 pAAV . MCK . 微小肌縮蛋白構築體 pAAV.MCK.微小肌縮蛋白質體藉由將驅動密碼子最佳化人類微小肌縮蛋白cDNA序列之MCK表現卡匣插入至AAV選殖載體psub201中來構築(Samulski等人,J . Virol . 61(10):3096-3101)。構築體中包含肌肉特異性調節元件以驅動肌肉特異性基因表現。此調節元件包括融合於351 bp MCK核心啟動子(近端)之小鼠MCK核心強化子(206 bp)。在核心啟動子之後，構築體包括53 bp內源性小鼠MCK 外顯子1(未轉譯)用於有效的轉譯起始，隨後SV40遲延16S/19S剪接信號(97 bp)及小5'UTR(61 bp)。內含子及5' UTR來源於質體pCMVβ(Clontech)。微小肌縮蛋白卡匣在ATG啟動正前方具有共同Kozak，及小的53 bp合成polyA信號用於mRNA終止。人類微小肌縮蛋白卡匣含有如由Harper等人Nat . Med . 8(3):253-61, 2002先前所描述之(R4-R23/Δ71-78)結構域。 pAAV.MCK.微小肌縮蛋白質體含有經由AAV2反向末端重複序列(ITR)側接之人類微小肌縮蛋白cDNA表現卡匣(參見圖7)。此序列衣殼化至AAVrh.74病毒粒子中。AAVrh.74血清型之分子純系選殖於恆河猴淋巴結且描述於Rodino-Klapac等人Journal of Tran . Med . 45 (2007)中。實例 5 使用 rAAV . MCK . 微小肌縮蛋白之效能及劑量分析 用人類微小肌縮蛋白構築體(rAAV.MCK.微小肌縮蛋白；描述於實例1中)藉由肌肉內注射進行表現研究。mdx小鼠(不表現肌縮蛋白之自發Dmdmdx 突變小鼠)之脛前(TA)肌肉注射有3 × 109 、3 × 1010 或1 × 1011 vg(n=3每組)。四週後收集肌肉且針對肌縮蛋白表現使用對N末端Dys3具有特異性之抗體染色，及蘇木精及曙紅(HE)染色。圖8展示在表現與劑量之間存在線性相關，其中在3 × 109 vg下具有極少表現(無效應含量)，且在1 × 1011 vg下89%表現。實例 6 血管遞送 rAAV . MCK . 微小肌縮蛋白至 mdx 小鼠 使用經分離四肢灌注模型(Rodino-Klapac等人,J . Trans . Med . 5(45): 1-11, 2007)，mdx小鼠(n=10)經由股動脈注射有1 × 1011 vg之rAAVrh.74.MCK.微小肌縮蛋白，且進行所執行結果分析。基因轉移三個月後，收集下肢肌肉，且功效研究表明力量及對偏心收縮誘導之損傷的抗性顯著改良(圖9)。 伸趾長肌(EDL)肌肉及TA肌肉中之肌縮蛋白免疫染色展示在rAAVrh.74-MCK微小肌縮蛋白處理之後在mdx肌纖維中表現(圖9A)。模擬感染之肌肉以相同方式染色且暴露為時間匹配的。圖9B表明rAAVrh.74-MCK微小肌縮蛋白相對於模擬處理mdx肌肉顯著增加標準化具體力量(P＜0.05對比mdx)。另外，經rAAVrh.74-MCK微小肌縮蛋白(人類)感染之mdx肌肉在基因轉移12週後與模擬感染對側mdx EDL肌肉(藍色)及野生型(WT C57Bl/10)EDL肌肉比較在反覆偏心收縮期間的力量降低(圖9C)。已發現rAAVrh.74-MCK微小肌縮蛋白(Micro-dys)處理與模擬處理mdx肌肉相比顯著保護避免力量損失(P＜ 0.001對比mdx)。實例 7 靈長類動物研究 為了將小鼠中之臨床前發現應用於臨床範例，對非人類靈長類動物(NHP)全身性給藥以便評估未來臨床試驗之安全性及功效。在非人類靈長類動物中研究2×1014 vg總劑量之AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白.FLAG經由頭部靜脈經靜脈內遞送的效果。此劑量與提供至小鼠之全身性劑量成比例(基於動物重量)，且對應於提供至小鼠之中等劑量(6.0×1012 vg總劑量)。 進行基線化學物質及免疫研究，包含酶聯結免疫吸附劑斑點檢定(ELISpot)分析，以量測針對AAVrh.74蛋白殼及微小肌縮蛋白之T細胞以及抗AAV抗體效價。針對含有34-36個肽之AAVrh.74衣殼蛋白(Genemed Synthesis, San Antonio, TX)使用三個肽庫，各自長度18個胺基酸且重疊11個殘基。四個肽庫涵蓋微小肌縮蛋白.FLAG蛋白質(Genemed Synthesis)，各自長度18個胺基酸且重疊11個殘基。伴刀豆球蛋白A(ConA)(Sigma，1µg/mL)充當陽性對照且0.25%二甲亞碸(DMSO)作為陰性對照。此等研究每兩週重複整個研究。在處理後3個月時，處死動物以獲得完整組織屍檢。藉由ELISpot，免疫分析未展示任何出人意料的對蛋白殼或轉殖基因的反應(圖12A)，且藉由ELISA，無出人意料的對AAVrh74蛋白殼的抗體反應(圖12B)。 另外完整全血球計數及化學組展示肝酶類略微上升，其在無需干預或治療之情況下校正回至基線，如下文表3中所示。表 3 在整個研究持續時間中，不存在其他出人意料的化學值。最後，所有骨骼肌肉之完整分析表明，藉由用FLAG特異性抗體之免疫螢光染色及使用肌縮蛋白之小鼠單株抗體的西方墨點檢測，在肌纖維中廣泛表現(圖14A、14B)。 資料共同表明全身遞送AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白.FLAG確認安全性及功效，且在非人類靈長類動物所有骨骼肌肉中廣泛表現。實例 8 臨床前研究以證明功效 進行臨床前研究以證明全身遞送rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白在治療mdx小鼠中骨骼及心肌肌肉缺陷中的功效。含有密碼子最佳化人類微小肌縮蛋白轉殖基因之AAVrh74載體用於此研究，所述轉殖基因由如實例1中所描述之肌肉及心肌特異性啟動子MHCK7驅動。 經由尾部靜脈在mdx(無肌縮蛋白)小鼠中全身注射rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白用於劑量反應研究。此研究之結果表明mdx小鼠中全身注射以劑量依賴性方式有效作用於校正在四肢及隔膜中所量測的組織學及功能結果。另外，在正式病理組織學檢查之後，委員會認證之獸醫病理學家未報導顯著的載體相關毒性。 此研究之載體由全美兒童醫院病毒載體中心(Nationwide Children's Hospital Viral Vector Core)利用HEK293細胞之三重轉染方法在研究級條件下製備。製備之後載體的特徵化包含藉由qPCR用超螺旋標準測定效價、內毒素含量測定(EU/mL)及無菌評估。藉由SDS-PAGE分析所生成載體以驗證與所預期rAAV之結合型式穩定性。使用含有微小肌縮蛋白構築體、驅動表現之肌肉特異性MHCK7啟動子、共同Kozak序列(CCACC)、SV40嵌合內含子、合成聚腺苷酸化位點(53 bp)(圖1)之質體生成載體。微小肌縮蛋白表現卡匣在AAV2 ITR之間選殖，封裝至AAVrh74載體中用於增強轉導骨骼及心肌組織。 rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白測試製品之效能測定藉由進行肌內注射載體至mdx小鼠中來達成。野生型小鼠充當陽性對照，且注射無菌乳酸林格氏至mdx小鼠中充當陰性對照。 表4：rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白研究設計之概觀 表4中指定之動物在指定年齡下(4-5週齡)用尾部靜脈注射給藥，用於全身遞送。為進行藉由肌肉內注射之精確給藥，動物藉由異氟醚吸入劑簡單麻醉。藉由直接注射至下部後肢之脛前肌肉中投與劑量。在全身遞送之情況下精確給藥不需要麻醉。藉由血管結構經由尾部靜脈投與劑量。注意準確沈積整個載體劑量至血管中。在進行給藥後，將動物置於加熱墊上，直至恢復自發移動，且隨後返回至籠中。在整個研究持續時間中每週進行各動物之觀測。 在如表4中所列舉之適當年齡下，向小鼠提供過量氯胺酮/甲苯噻嗪混合物(200mg/kg/20mg/kg)。經由心臟穿孔收集血液，且輸送全血用於全血球計數(CBC)分析，且血清儲存在-80℃下直至由Charles Rivers實驗室分析血清化學物質。隨後收集組織且輸送用於由獨立獸醫組織病理學家且在內部分析。以1×1011 vg總劑量肌內遞送rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白至無肌縮蛋白之小鼠在所注射TA肌肉中引起肌縮蛋白約70%表現。給藥載體之小鼠的免疫螢光法成像確認微小肌縮蛋白基因表現。在用 rAAVrh74 . MHCK7 . 微小肌縮蛋白全身治療之後肌縮蛋白表現的恢復 rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白測試製品之功效測定藉由在mdx小鼠(基因型 ： C57BL / 10ScSn - Dmdmdx / J )中以低、中等及高劑量(2.0×1012 vg總劑量；6.0×1012 vg總劑量；1.2×1013 vg總劑量)使用劑量遞增進行全身注射來達成，以在注射後3及6個月時間點分析全身性遞送時之轉殖基因表現及載體的功效。對小鼠在4-5週齡時注射且在注射後3及6個月時進行完整屍檢。基於每組之平均動物重量，此等劑量等於：8×1013 vg/kg, 2×1014 vg/kg及6×1014 vg/kg。注射相同體積之乳酸林格氏充當陰性對照。注射相同體積之乳酸林格氏至C57BL/6小鼠中充當陽性對照。藉由以6.0 ×1012 vg總劑量(表示為WT TX-中等劑量組)之劑量在WT小鼠中進行全身注射來測定安全性。進行骨骼肌肉脛前(TA)、腓腸肌(GAS)、四頭肌(QUAD)、臀肌(GLUT)、腰肌、三頭肌(TRI)、隔膜(DIA)及心臟之免疫螢光染色以測定肌縮蛋白之恢復且確保rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白之病毒載體的功效。 提取骨骼肌肉(TA、QUAD、GLUT、TRI)以及心臟及隔膜用於分析。亦移出器官用於毒理學及生物分佈研究。微小肌縮蛋白轉殖基因表現在3-6個月處理之後保持高水準。此伴隨著改良的肌肉病理組織學及改良的功能，在偏離目標器官中無不利影響。rAAVrh74 . MHCK7 . 微小肌縮蛋白全身性治療之 mdx 小鼠中營養不良的表型的逆轉 進行骨骼肌肉、隔膜及心臟之蘇木精及曙紅(H&E)染色，以測定在以2×1012 vg總劑量(低劑量；n=1)、6×1012 vg總劑量(中等劑量；n=8)及1.2×1013 vg總劑量(高劑量；n=8)全身注射rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白之後營養不良的病理的逆轉及改良，針對各劑量在注射後12週安樂死。在注射後24週時，對第二組經中等劑量(6×1012 vg總劑量)處理之動物評估肌縮蛋白病理之逆轉及改良(n=5)。 在經微小肌縮蛋白載體注射之所有無肌縮蛋白小鼠中針對人類微小肌縮蛋白使用免疫螢光染色以測定六種骨骼肌肉(TA、GAS、QUAD、GLUT、腰肌、TRI)之左側及右側兩者中的微小肌縮蛋白轉殖基因表現，以及隔膜及心臟的微小肌縮蛋白轉殖基因表現。進行此染色以測定肌縮蛋白之恢復，且確保rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白之病毒載體在2×1012 vg總劑量(低劑量；n=2)、6×1012 vg總劑量(中等劑量；n=8)及1.2×1013 vg總劑量(高劑量；n=8)下的功效，針對各劑量在注射後12週安樂死。 為評估表現及轉導效率，採用來自所有三個給藥組及各肌肉之左側及右側兩者的影像用於量化。採集各肌肉之四張20X影像，且測定各影像之微小肌縮蛋白陽性纖維的百分比，產生各肌肉之平均轉導百分比。圖14及15呈現來自經處理小鼠之代表性影像，來自中等劑量(6×1012 vg；2×1014 vg/kg)及高劑量(1.2×1013 vg；6×1014 vg/kg)。包含注射有乳酸林格氏且年齡匹配之無肌縮蛋白小鼠用於陰性對照，且包含注射有乳酸林格氏之野生型小鼠用於陽性對照。在所有所分析動物中心臟展現≥ 75%。 來自未處理動物之肌肉展現普遍肌病變，包含脂肪滲透、中心成核、纖維化及局部區域壞死。圖16及圖17中之H&E染色說明當與正常WT小鼠相比時無肌縮蛋白小鼠中的此營養不良的表型，及在以中等劑量(6×1012 vg；2×1014 vg/kg)或高劑量(1.2×1013 vg；6×1014 vg/kg)處理之後肌肉病理的改良。組織學參數之量化展示在經處理小鼠中在所有肌肉中以劑量依賴性方式的中心成核的減少(圖18)及平均纖維直徑的標準化(圖16及17)。天狼星紅(Sirius Red)染色展現與未處理(mdx LR)組相比在中等及高劑量組兩者中隔膜中膠原蛋白沈積的減少(圖19)。用 rAAVrh74 . MHCK7 . 微小肌縮蛋白全身性治療之功能評估 為測定微小肌縮蛋白基因轉移是否向患病肌肉提供功能力量益處，評估來自mdx小鼠、WT小鼠及以三種劑量給藥載體之小鼠的隔膜及脛前兩者的功能特性。劑量遞增包含低劑量(8×1013 vg/kg)、中等劑量(2×1014 vg/kg)及高劑量(6×1014 vg/kg)。在注射後24週在以6×1012 vg總劑量(中等劑量)全身性注射rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白之動物中採用使用具體力量的離體評估及在TA中偏心收縮後力量輸出降低的用rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白全身性治療的功能評估。另外，在相同動物中評估隔膜中的具體力量輸出。 如先前圖式中所概述，病理組織學展現更加標準化的環境，其中在中等及高劑量下中心成核、膠原蛋白沈積及纖維尺寸改良。尾部靜脈遞送rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白在隔膜中引起具體力量輸出逐步改良(中等劑量組中176.9 mN/mm2 對比高劑量組中227.78 mN/mm2 )。另外，長期處理組呈現注射後6個月的小鼠(中等劑量2×1014 vg/kg)，且在長期隔膜力量輸出中不存在偏差(176.9 mN/mm2 對比194.9 mN/mm2 )(圖20)。 此外，與WT小鼠相比，在mdx小鼠中觀測到脛前肌肉功能缺陷。Mdx小鼠與WT小鼠相比展現力量輸出50%降低(171.3 mN/mm2 對比291.65 mN/mm2 )，且在偏心收縮後力量損失較大(mdx中32%損失；WT中5%損失)。全身遞送中等劑量水準之rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白在脛前肌肉中產生65.5%肌縮蛋白，且具體力量輸出恢復，其提高至235.4 mN/mm2，並保護肌肉免受反覆偏心收縮損害，其中力量僅降低25%(圖21)。WT中等劑量組表示野生型處理組，以便證明在載體治療後不存在毒性且維持功能結果量測值。總結 在藉由肌肉內注射初始論證生物潛能後，經由血管遞送實現微小肌縮蛋白可比的或增加的恢復，同時轉導骨骼肌肉、隔膜及心臟。藉由炎症減少、較少退化纖維及經由保護避免脛前及隔膜中的偏心收縮的改良的功能恢復，功效展現以劑量依賴性方式逆轉營養不良的特徵。載體之功能益處包含將隔膜及TA中之力量產生逐步提高至野生型層級。實例 9 用 rAAVrh74 . MHCK7 . 微小肌縮蛋白全身性治療之毒理學及生物分佈 收集來自提供全身注射rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白之mdx小鼠的器官及組織用於實時定量PCR，以偵測載體DNA的具體序列。自所有所收集器官及組織提取出的蛋白質在西方墨點上操作，以偵測偏離目標器官中的微小肌縮蛋白。 在4-5週齡時藉由靜脈內途徑以三種劑量提供測試製品：低(2 × 1012 vg；8 × 1013 vg/kg)、中等(6 × 1012 vg；8 × 1014 vg/kg)及高劑量(1.2 × 1013 vg；6 × 1014 vg/kg)。為分析載體安全性，對自上述相同小鼠組收集的肌肉組織及所有主要器官的冷凍切片進行H&E染色。亦包含來自用載體以中等劑量全身性治療的C57BL6 WT小鼠的器官及肌肉。亦包含經乳酸林格氏處理之mdx及WT小鼠用於病理組織學分析。此等切片由第三方委員會認證之獸醫病理學家正式審查毒性，且在來自小鼠中之任一者之任何樣品中未偵測到不利影響；結果概述於下文。 組細節及研究設計展示於下文4中。表 5 ： rAAVrh74 . MHCK7 . 微小肌縮蛋白安全性研究設計 載體轉導之組織的組織病理學審查 IV注射rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白在所檢測任何骨骼肌肉之肌纖維中未引起任何微觀變化。另外，在組織學評估之組織中之任一者中不可見處理相關的病變。所注意到的任何變化在處理及對照小鼠兩者中可見且認為其為偶然發現。綜合而言，此等資料指示測試個體對此測試製品具有良好耐受性。此外，相對於來自年齡匹配、未處理mdx小鼠之參考試樣，投與rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白減少經處理mdx小鼠中的肌纖維萎縮，因此表明測試製品可改善與mdx缺陷相關的肌病變的程度。 除審查用載體全身性治療之患病mdx小鼠以外，以與在上文mdx小鼠中之研究中確立的最低有效劑量(MED)一致的劑量6×1012 vg總劑量(2×1014 vg/kg)將rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白全身性遞送至五個C57BL/6 WT小鼠。若任何不利影響結果僅歸因於處理，則此允許在健康WT小鼠中靜脈內遞送測試製品之研究更加準確地測定。此處同樣地，收集包含隔膜之各種骨骼肌肉，以及心臟及五種其他器官，且由獨立獸醫病理學家正式審查各組織之H&E切片。載體基因組生物分佈 使用實時定量PCR分析(qPCR)檢測測試製品特異性DNA序列的存在。對自三個按照劑量含量給藥載體之mdx動物收集的組織樣品進行生物分佈分析。正信號為任何等於或大於100個單股DNA複本/µg所偵測基因體DNA。在屍檢時收集組織且採用對MHCK7啟動子之序列具有特異性之載體特異性引子探針組。圖22及下文之表6描繪在來自經注射rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白之小鼠的各組織樣品中偵測的載體基因組複本。表 6 ： 來自三個按照劑量含量給藥載體之 mdx 小鼠之器官及肌肉中的載體基因組複本數。值以 vg /µ g 基因組 DNA 展示。 在所有所收集組織中在不同層級下偵測rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白轉錄物。如所預期，在骨胳肌肉及心臟中可見最高含量。在生殖腺、肺、腎臟及脾中偵測到最低含量。此等資料指示測試製品有效遞送至給藥載體之小鼠的所有所研究組織中。 作為上文指示之qPCR結果，靜脈內遞送rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白在大部分組織中產生不同含量之載體轉錄物的分佈，其中在肝、心臟及四頭肌肌肉(中等劑量)及肝、心臟及腓腸肌肌肉(高劑量)中存在最高含量。因此，研究之此部分的目標為測定人類微小肌縮蛋白轉殖基因在此等組織中之蛋白質表現，且確保肌肉特異性MHCK7啟動子的功能。使用西方墨點法偵測組織樣品中之微小肌縮蛋白表現。 亦使用qPCR及西方墨點法(圖23)評估蛋白質表現及載體生物分佈，且此等資料在偏離部位器官中指示載體之正常含量，且在高劑量處理之肝中檢測到極少微小肌縮蛋白。此等結果與如病理學家在肝中測定之無毒性相關。另外，由獨立Charles River實驗室(CRO)分析血清化學物質，其在所分析所有化學物質中指示正常值。在肝酶AST中存在三個異常值，其中2個在mdx-LR組中呈現，且其中1個在中等劑量組中(圖23)。動物之子組經歷肌酸激酶分析(CK)，然而，在生理評估之前及之後分析樣品。對血清之分析證實在遞送測試製品後不具有毒性。 在所有骨胳肌肉樣品以及心臟樣品中觀測到不同量的微小肌縮蛋白表現(圖24)。然而，在高給藥組中在肝中偵測到極少蛋白質。認為此為良性結果，且可能肝中之存在歸因於在肝平滑肌中表現。重要地，獨立病理學家報導指示在肝中不存在不利的組織病理學效果。總結 病理組織學審查推斷出mdx-LR組展現分佈廣泛的肌病變，影響所評估所有七種骨骼肌肉以及心臟右心室壁。病理組織學審查之主要發現包含明顯及分佈廣泛的肌纖維萎縮(正常肌纖維尺寸之30-75%)、極少至輕度單核細胞炎症、間隙空間增加及細胞質礦物沈積增加。隔膜展現單核細胞滲透及肌纖維萎縮最顯著的變化。心臟展現在心室心肌中若干小病灶極少單核細胞積聚。給藥載體組大體上減少所有骨骼組織及心臟中的肌病變。組織病理學發現之減少呈劑量依賴性方式，其中高劑量組具有大體上較少變性及炎症。如WT處理組及給藥載體mdx組中所證明，歸因於用rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白之載體處理，不存在不利影響。在mdx及WT小鼠之肝及肺中存在偶然發現，與處理無關，其中小鼠展現肝細胞細胞質輕度空泡形成。因此，測試製品為安全、有效的，且保護作用為劑量依賴性的。參考文獻 1. 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圖 1 說明pAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體。在此構築體中，cDNA表現卡匣側接AAV2反向末端重複序列(ITR)。構築體之特徵在於框內桿缺失(R4-R23)，同時鉸鏈1、2及4(H1 、H2 及H4 )及半胱胺酸富集結構域仍產生138 kDa蛋白質。微小肌縮蛋白(3579 bp)之表現由MHCK7啟動子(795 bp)引導。內含子及5' UTR來源於質體pCMVβ(Clontech)。微小肌縮蛋白卡匣在ATG啟動正前方具有共同Kozak，及小的53 bp合成polyA信號用於mRNA終止。人類微小肌縮蛋白卡匣含有(R4-R23/Δ71-78)結構域，如由Harper等人(Nature Medicine 8, 253-261 (2002))先前所描述。圖 2 顯示肌內遞送AAVrh74.MHCK7構築體之後的肌縮蛋白表現。mdx小鼠之脛前肌肉注射有1 × 1011 vg(n=5每組)。六週後收集肌肉且針對肌縮蛋白表現對肌縮蛋白染色N末端抗體，及蘇木精及曙紅染色。圖 3A 至 3C 提供肌肉內注射AAVrh74.MHCK7構築體之後的骨胳肌肉力量量測及微小肌縮蛋白表現的量化。(A)mdx小鼠之脛前肌肉注射有1 × 1011 vg(n=5)AAVrh74.MHCK7構築體。六週後收集脛前肌肉且對其進行活體內力量量測。給藥組相比於未處理mdx對照具有顯著較大的力量產生。圖 4A 至 4C 顯示在全身投與AAVrh.74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體之後骨骼、隔膜及心肌肌纖維的廣泛轉導。(A)Mdx小鼠在6週齡時在12週治療後經由尾部靜脈用6×1012 vg(2 × 1014 vg/kg)之AAVrh.74.MHCK7.微小肌縮蛋白全身性治療。(B)針對微小肌縮蛋白之染色顯示各組織中表現微小肌縮蛋白之肌纖維的百分比量化。(C)展示在隔膜中在低及高(計劃臨床)劑量下量測的具體力量。在低劑量下不可見顯著差異；然而在高劑量下存在顯著提高。圖 5 顯示全身遞送AAVrh.74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體之後的肌縮蛋白表現。Mdx小鼠(n=5)在6週齡開始經由尾部靜脈用6 × 1012 vg之AAVrh.74.MHCK7.微小肌縮蛋白全身性治療。在處理12週後，收集所有肌肉且針對肌縮蛋白及DAPC組分之恢復染色(展示β-肌聚糖蛋白(beta-sarcoglycan))。圖 6A 至 6D 顯示AAVrh.74.MHCK7之毒理學/安全性。對以下肌肉組織進行蘇木精及曙紅(H&E)染色且分析毒性：脛前(TA)、腓腸肌(GAS)、四頭肌(QD)、腰肌(PSO)、肱三頭肌(TRI)及隔膜(DIA)(圖6A)。未注意到毒性。作為功效之指示，定量具有居中位置之核(CN)的肌纖維的數目(圖6B)。CN指示肌肉退化及再生之循環且因此CN減少表明治療效果。(圖6C)顯示纖維總數在處理之情況下不變。肌酸激酶的量提供於(D)中，在高劑量下展示改良。使用獨立t測試確定差異(p＜.05)；資料報導為平均值± SEM。圖 7 顯示pAAV.MCK.微小肌縮蛋白質體構築體。圖 8 提供rAAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白(人類)效能分析之結果。mdx小鼠之脛前肌肉注射有3 × 109 、3 × 1010 或1 × 1011 vg (n=3每組)。四週後收集肌肉且針對肌縮蛋白表現染色N末端Dys3抗體。在表現與劑量之間存在線性相關，在3 × 109 vg下具有極少表現(無效應含量)，且在1 × 1011 vg下89%表現。圖 9A 至 9C 顯示人類微小肌縮蛋白提高力量產生且保護免受偏心收縮誘導的損傷。(A)伸趾長肌(EDL)及TA中之肌縮蛋白免疫染色展示在經由股動脈注射rAAVrh.74-MCK微小肌縮蛋白(人類)之後mdx肌纖維中的表現。模擬感染之肌肉以相同方式染色且暴露為時間匹配的。(B)rAAVrh.74-MCK微小肌縮蛋白相對於模擬處理之mdx肌肉顯著提高標準化具體力量(P＜0.05對比mdx)。(C)在基因轉移後12週時，經rAAVrh.74-MCK微小肌縮蛋白(人類)感染之mdx肌肉與模擬感染之對側mdx EDL肌肉及WT(WT C57Bl/10)EDL肌肉比較在反覆偏心收縮期間的力量降低。rAAVrh.74-MCK微小肌縮蛋白(Micro-dys)處理與模擬處理mdx肌肉相比顯著保護避免力量損失(P＜ 0.001對比mdx)。誤差為SEM。圖 10 提供核酸序列(SEQ ID NO: 3 rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白)。圖 11 提供核酸序列(SEQ ID NO: 5)rAAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。圖 12A 至 12B 提供在非人類靈長類動物中全身遞送AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白之免疫反應。(A)ELISpot對AAV蛋白殼及微小肌縮蛋白肽庫起反應。ConA為陽性對照且DMSO為陰性對照。存在三個庫對應AAVrh74及四個肽庫對微小肌縮蛋白具有特異性。(B)循環中和抗體至載體蛋白殼之ELISA正效價。兩週一次自靈長類動物分離血清且分析抗體效價。所報導效價對應於反應比率≥ 2之最後稀釋。圖 13A 至 B 顯示恆河猴中全身遞送AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。左側肌肉中之抗FLAG免疫螢光染色表明穩固的微小肌縮蛋白表現。圖 14 顯示用rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白全身治療對轉殖基因表現之效果。使用N末端肌縮蛋白抗體在心臟、隔膜、腰肌及脛前(TA)針對微小肌縮蛋白之免疫螢光染色表明在注射後3個月，在中等劑量(6e12 vg；2e14 vg/kg)及高劑量(1.2e13 vg；6e14 vg/kg)處理動物中穩固表現。展示20×影像。圖 15 顯示用rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白全身治療對轉殖基因表現之效果。使用N末端肌縮蛋白抗體在腓腸肌、四頭肌、三頭肌及臀肌針對微小肌縮蛋白之免疫螢光染色表明在注射後3個月，在中等劑量(6e12 vg；2e14 vg/kg)及最高劑量(1.2e13 vg；6e14 vg/kg)處理動物中穩固表現。展示20×影像。圖 16 顯示用rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白全身治療對肌肉病理之效果。(A)來自C57BL/6 WT、mdx及rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白處理之小鼠(中等劑量-2e14vg/kg；高劑量-6e14vg/kg)之隔膜、脛前、腓腸肌及四頭肌肌肉的H&E染色，(B)平均纖維尺寸之定量顯示所有組織中纖維尺寸之標準化。****p＜0.001，單向ANOVA；資料報導為平均值± SEM。展示20×影像。圖 17 顯示用rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白全身治療對肌肉病理之效果。(A)來自C57BL/6 WT、mdx及rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白處理之小鼠(中等劑量-2e14vg/kg；高劑量-6e14vg/kg)之三頭肌、臀肌及腰肌肌肉的H&E染色，(B)平均纖維尺寸之定量以劑量依賴性方式顯示較大纖維。****p＜0.001，單向ANOVA；資料報導為平均值± SEM。展示20×影像。圖 18 顯示用rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白全身治療對中心成核之效果。劑量遞增示出所有骨骼肌肉及隔膜中中心成核減少。使用雙向ANOVA定位確定差異(p＜0.05)。資料報導為平均值± SEM。圖 19 顯示用rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白全身治療對膠原蛋白沈積之效果。劑量遞增示出隔膜中膠原蛋白聚積(%)減少。*p＜0.05，單向ANOVA；資料報導為平均值± SEM。展示20×影像。圖 20 顯示隔膜中力量缺陷之矯正。在治療3或6個月後，收集隔膜肌肉條以量測具體力量(針對橫截面積校正)。治療將力量恢復至WT層級。*p＜0.05。採用單向ANOVA測定與mdx-LR小鼠之差異。圖 21 顯示TA中力量缺陷之矯正。(A)在治療3至6個月後收集TA肌肉(左及右兩者)以量測具體力量(針對TA重量校正)。治療將力量恢復至WT層級。(B)在嚴格偏心收縮流程後，治療使TA肌肉自疲乏修復。*p＜0.05。採用單向ANOVA測定與mdx-LR小鼠之差異。圖 22 提供在IV遞送rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白後，平均vg複本在來自三個mdx小鼠之各種組織中的分佈。圖 23. 藉由獨立CRO(Charles River實驗室)分析ssAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白全身性注射之小鼠的血清化學物質及年齡匹配對照組血清化學物質，其在所分析所有化學物質中指示正常值。唯一異常值為MDX媒劑處理之動物[MDX-LR(乳酸林格氏(ringers))]中注意到的AST及ALT升高，其藉由治療標準化。已知AST及ALT在DMD中升高。ALT = 丙胺酸轉胺酶，ALP/K = 鹼性磷酸酶，AST = 天冬胺酸轉胺酶，BUN = 血液脲氮，B/C = 血液與肌酐比率，CREAT = 肌酸，GLU = 葡萄糖，TP = 總蛋白，TBIL = 總膽紅素，DBIL = 直接膽紅素圖 24 提供來自rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白全身性注射之mdx小鼠之肌肉及器官上的生物分佈蛋白質印跡。圖 25 提供pNLREP2-Caprh74 AAV輔助質體映射。圖 26 提供Ad輔助質體pHELP。

Claims (40)

  1. 一種重組AAV載體，其包括肌肉特異性控制元件核苷酸序列及編碼微小肌縮蛋白之核苷酸序列。
  2. 如請求項1之重組AAV載體，其中編碼所述微小肌縮蛋白的所述核苷酸序列包括 a)與核苷酸序列SEQ ID NO: 1至少85%一致且編碼功能性微小肌縮蛋白之核苷酸序列，或 b)SEQ ID NO: 1之核苷酸序列。
  3. 如請求項1或2之重組AAV載體，其中所述肌肉特異性控制元件為人類骨骼肌動蛋白基因元件、心肌肌動蛋白基因元件、肌細胞特異性強化子結合因子(MEF)、肌肉肌酸激酶(MCK)、截斷MCK(tMCK)、肌凝蛋白重鏈(MHC)、雜交α-肌凝蛋白重鏈強化子-/MCK強化子-啟動子(MHCK7)、C5-12、鼠類肌酸激酶強化子元件、骨骼快速抽動肌鈣蛋白c基因元件、緩慢抽動心肌肌鈣蛋白c基因元件、緩慢抽動肌鈣蛋白i基因元件、低氧誘導性核因子、類固醇誘導性元件或糖皮質激素反應元件(GRE)。
  4. 如請求項1至3中任一項之重組AAV載體，其中所述肌肉特異性控制元件為肌肉肌酸激酶(MCK)或雜交α-肌凝蛋白重鏈強化子-/MCK強化子-啟動子(MHCK7)。
  5. 如請求項1至4中任一項之重組AAV載體，其中所述肌肉特異性控制元件為包括核苷酸序列SEQ ID NO: 4之肌肉肌酸激酶(MCK)或包括核苷酸序列SEQ ID NO: 2之雜交α-肌凝蛋白重鏈強化子-/MCK強化子-啟動子(MHCK7)。
  6. 如請求項1至5中任一項之重組AAV載體，其包括SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之核苷酸序列。
  7. 如請求項1至6中任一項之重組AAV載體，其包括SEQ ID NO: 3之核苷酸序列。
  8. 一種重組AAV載體，其包括SEQ ID NO: 1之人類微小肌縮蛋白核苷酸序列及SEQ ID NO: 2之MHCK7啟動子序列。
  9. 一種重組AAV載體，其包括SEQ ID NO: 3之pAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。
  10. 如請求項1至5中任一項之重組AAV載體，其包括SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 4之核苷酸序列。
  11. 如請求項1至5或10中任一項之重組AAV載體，其包括SEQ ID NO: 5之核苷酸序列。
  12. 如請求項1至11中任一項之重組AAV載體，其中所述載體具有血清型AAVrh.74、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13。
  13. 如請求項1至12中任一項之重組AAV載體，其中所述肌肉特異性控制元件核苷酸序列可操作地連接於微小肌縮蛋白核苷酸序列。
  14. 一種包括如請求項1至13中任一項之重組AAV載體及醫藥學上可接受的載劑的組合物。
  15. 一種提高患有肌肉萎縮症之個體中肌肉力量或肌肉質量的方法，其包括投與治療有效量之如請求項1至13中任一項之重組AAV載體或如請求項14之組合物。
  16. 一種減少或預防患有肌肉萎縮症之個體中纖維化的方法，其包括投與治療有效量之如請求項1至13中任一項之重組AAV載體或如請求項14之組合物。
  17. 一種治療肌肉萎縮症之方法，其包括投與治療有效量之如請求項1至13中任一項之重組AAV載體或如請求項14之組合物。
  18. 一種治療肌肉萎縮症之方法，其包括投與治療有效量之包括SEQ ID NO: 1之人類微小肌縮蛋白核苷酸序列及SEQ ID NO: 2之MHCK7啟動子核苷酸序列的重組AAV載體。
  19. 一種治療肌肉萎縮症之方法，其包括投與治療有效量之包括SEQ ID NO: 3之pAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列的重組AAV載體。
  20. 如請求項15至19中任一項之方法，其中所述肌肉萎縮症為杜興氏肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy)。
  21. 如請求項15至19中任一項之方法，其中所述重組AAV載體或所述組合物藉由肌肉內注射或靜脈內注射投與。
  22. 如請求項15至19中任一項之方法，其中所述重組AAV載體或所述組合物全身性投與。
  23. 如請求項22之方法，其中所述重組AAV載體或所述組合物藉由注射、輸注或植入非經腸投與。
  24. 一種包括如請求項1至13中任一項之重組AAV載體的組合物，其用於提高患有肌肉萎縮症的個體的肌肉力量或肌肉質量。
  25. 一種包括如請求項1至13中任一項之重組AAV載體的組合物，其用於治療肌肉萎縮症。
  26. 一種組合物，其包括含有SEQ ID NO: 1之人類微小肌縮蛋白核苷酸序列及SEQ ID NO: 2之MHCK7啟動子序列的重組AAV載體，用於治療肌肉萎縮症。
  27. 一種組合物，其包括含有SEQ ID NO: 3之pAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列的重組AAV載體，用於治療肌肉萎縮症。
  28. 如請求項24至27中任一項之組合物，其中所述肌肉萎縮症為杜興氏肌肉萎縮症。
  29. 如請求項24至28中任一項之組合物，其經調配用於肌肉內注射或靜脈內注射。
  30. 如請求項24至28中任一項之方法，其中所述重組AAV載體或所述組合物全身性投與。
  31. 如請求項30之方法，其中所述重組AAV載體或所述組合物藉由注射、輸注或植入非經腸投與。
  32. 一種如請求項1至13中任一項之重組AAV載體或如請求項14之組合物的用途，其用於製備供提高患有肌肉萎縮症之個體的肌肉力量或肌肉質量用的藥物。
  33. 一種如請求項1至13中任一項之重組AAV載體或如請求項14之組合物的用途，其用於製備供治療肌肉萎縮症用的藥物。
  34. 一種如請求項1至13中任一項之重組AAV載體或如請求項14之組合物的用途，其用於製備供減少或預防患有肌肉萎縮症之個體的纖維化用的藥物。
  35. 一種包括SEQ ID NO: 1之人類微小肌縮蛋白核苷酸序列及SEQ ID NO: 2之MHCK7啟動子核苷酸序列的重組AAV載體的用途，其用於製備供治療肌肉萎縮症用的藥物。
  36. 一種包括SEQ ID NO: 3之pAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列的重組AAV載體的用途，其用於治療肌肉萎縮症。
  37. 如請求項32至36中任一項之用途，其中所述肌肉萎縮症為杜興氏肌肉萎縮症。
  38. 如請求項32至37中任一項之用途，其中所述藥物經調配用於肌內或靜脈內投與。
  39. 如請求項32至37中任一項之用途，其中所述藥物經調配用於全身遞送。
  40. 如請求項39之用途，其中所述藥物經調配用於藉由注射、輸注或植入非經腸投與。
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