KR20190130591A - 근이영양증을 치료하기 위한 근육 특이적 마이크로-디스트로핀의 아데노-관련 바이러스 벡터 전달 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 마이크로-디스트로핀 유전자를 발현하는 유전자 요법 벡터, 예컨대, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 및 횡격막 및 심장 근육을 포함하는 골격근에서 마이크로-디스트로핀을 발현하고 근이영양증을 앓고 있는 대상체의 근육 섬유를 손상으로부터 보호하고, 근육 강도를 증가시키며, 섬유증을 감소하고/하거나 예방하기 위해 이러한 벡터를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

근이영양증을 치료하기 위한 근육 특이적 마이크로-디스트로핀의 아데노-관련 바이러스 벡터 전달

본 출원은 2017년 3월 17일자로 출원된 미국 가특허출원 제62/473,148호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용된다.

전자적으로 제출된 자료의 참조에 의한 통합

이 출원은 개시내용의 별도 부분으로서, 컴퓨터-판독가능한 형태의 서열 목록을 포함하며, 이는 그 전체가 참조로 원용되며, 다음과 같이 식별된다: 파일명: 51475_Seqlisting.txt; 크기: 29,519바이트; 2018년 3월 13일 생성됨.

발명의 분야

본 발명은 소형화된 인간 마이크로-디스트로핀 유전자를 발현하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터와 같은 유전자 요법 벡터, 및 이들 벡터를 사용하여 횡격막 및 심장 근육을 포함하는 골격근에서 마이크로-디스트로핀을 발현하고, 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 손상으로부터 근육 섬유를 보호하고, 근육 강도를 증가시키고, 섬유증을 감소시키고/시키거나 예방하는 방법을 제공한다.

운동 및 호흡과 같은 일상 활동 및 전신 대사를 위한 근육량 및 강도의 중요성은 분명하다. 근육 기능의 결함은, 근육 약화 및 소모를 특징으로 하며 삶의 질에 심각한 영향을 미치는 근이영양증(MD: muscular dystrophy)을 생성한다. 가장 잘 특성화된 MD는 디스트로핀-관련 단백질 복합체(DAPC: dystrophin-associated protein complex)의 구성원을 코딩하는 유전자의 돌연변이로부터 기인한다. 이러한 MD는 DAPC에 의한 근형질막-세포 골격 계류의 손실과 관련된 막 취약성으로부터 기인한다. 듀시엔형 근이영양증(DMD: Duchenne Muscular Dystrophy)은 5000명 신생아 남아 중 1명에게 영향을 미치는 가장 파괴적인 근육 질환 중 하나이다.

DMD는 DMD 유전자에서의 돌연변이에 의해 유발되어 mRNA의 감소와 디스트로핀인 디스트로핀-관련 단백질 복합체(DAPC)와 관련된 427kD 근형질막 단백질의 부재로 이어진다(Hoffman et al., Cell 51(6):919-28, 1987). DAPC는 액틴 결합 단백질인 디스트로핀과 라미닌-결합 단백질인 알파-디스트로글리칸을 통한 세포외 기질(ECM)과 세포골격 사이에 구조적 연결(link)을 형성하는 근육 근형질막에서 다중 단백질로 구성된다. 이들 구조적 연결은 수축 동안 근육 세포막을 안정화시키고 수축-유발 손상을 보호하는 역할을 한다. 디스트로핀 손실과 함께, 막 취약성은 근형질막이 찢어지고 칼슘이 유입되어, 칼슘-활성화된 프로테아제와 분절성 섬유 괴사를 촉발한다(Straub et al., Curr Opin. Neurol. 10(2): 168-75, 1997). 이러한 근육 변성 및 재생의 비조절된 사이클은 궁극적으로 근육 줄기 세포 집단을 고갈시켜(Sacco et al., Cell, 2010. 143(7): p. 1059-71; Wallace et al., Annu Rev Physiol, 2009. 71: p. 37-57), 진행성 근육 약화, 근내막 염증, 및 섬유화 흉터를 초래한다.

디스트로핀 또는 마이크로-디스트로핀으로부터 막 안정화 없이, DMD는 조직 손상 및 회복의 비조절된 사이클을 나타내며, 궁극적으로 손실된 근육 섬유를 연결 조직 증식을 통해 섬유성 흉터 조직으로 대체할 것이다. 섬유증은 콜라겐과 엘라스틴을 포함하는 ECM 기질 단백질의 과도한 침착(deposit)을 특징으로 한다. ECM 단백질은 스트레스와 염증에 반응하는 활성화된 섬유아세포에 의해 방출되는 TGFβ와 같은 사이토카인으로부터 주로 생성된다. DMD의 주요 병리학적 특징이 근섬유 변성 및 괴사이지만, 병리학적 결과로서 섬유증은 동일한 부정적 영향을 갖는다. 섬유성 조직의 과잉 생성은 근육 재생을 제한하고 DMD 환자의 진행성 근육 약화에 기여한다. 한 연구에서, 초기 DMD 근육 생검에서의 섬유증의 존재는 10년 추적 관찰에서 불량한 운동 결과와 높은 상관 관계가 있었다(Desguerre et al., J Neuropathol Exp Neurol, 2009. 68(7): p. 762-7). 이들 결과는 섬유증을 DMD 근육 기능장애의 주요 원인으로서 지적하고, 명백한 섬유증 이전에 초기 개입의 필요성을 강조한다.

아데노-관련 바이러스(AAV)는 복제-결함 파르보바이러스이고, 이의 단일 가닥 DNA 게놈은 145 뉴클레오티드 역위 말단 반복(ITR)을 포함하여 길이가 약 4.7kb이다. AAV에 다수의 혈청형이 존재한다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, AAV 혈청형 2(AAV2) 게놈의 뉴클레오티드 서열은 문헌(Ruffing et al., J Gen Virol, 75: 3385-3392 (1994))에 의해 보정된 바와 같은 문헌(Srivastava et al., J Virol, 45: 555-564 (1983))에 제시된다. 다른 예로서, AAV-1의 완전한 게놈은 GenBank 승인 번호 NC_002077로 제공되고; AAV-3의 완전한 게놈은 GenBank 승인 번호 NC_1829로 제공되고; AAV-4의 완전한 게놈은 GenBank 승인 번호 NC_001829로 제공되고; AAV-5 게놈은 GenBank 승인 번호 AF085716으로 제공되고; AAV-6의 완전한 게놈은 GenBank 승인 번호 NC_00 1862로 제공되고; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부는 각각 GenBank 승인 번호 AX753246 및 AX753249로 제공되고(또한 AAV-8에 관련해 미국특허 제7,282,199호 및 제7,790,449호 참조); AAV-9 게놈은 문헌(Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004))에 제공되고; AAV-10 게놈은 문헌(Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006))에 제공되고; AAV-11 게놈은 문헌(Virology, 330(2): 375-383 (2004))에 제공된다. AAVrh.74 혈청형의 클로닝은 문헌(Rodino-Klapac., et al. Journal of translational medicine 5, 45 (2007))에 기술된다. 바이러스 DNA 복제(rep), 캡시드화/패키징 및 숙주 세포 염색체 통합을 지시하는 시스-작용 서열은 ITR 내에 함유된다. 3개의 AAV 프로모터(이들의 상대적 맵(map) 위치에 대해 p5, p19 및 p40으로 명명됨)는 rep 및 cap 유전자를 코딩하는 2개의 AAV 내부 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 발현을 구동한다. 단일 AAV 인트론(예컨대, AAV2 뉴클레오티드 2107 및 2227에서)의 차별적 스플라이싱(differential splicing)과 커플링(coupling)된 2개의 rep 프로모터(p5 및 p19)는, rep 유전자로부터 4개의 rep 단백질(rep 78, rep 68, rep 52 및 rep 40)의 생성을 초래한다. Rep 단백질은 궁극적으로 바이러스 게놈을 복제할 책임이 있는 여러 가지 효소 특성을 보유한다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되고, 이는 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 코딩한다. 선택적 스플라이싱(alternative splicing) 및 비-컨센서스 번역 개시 부위(non-consensus translational start site)는 3개의 관련 캡시드 단백질의 생성을 담당한다. 단일 컨센서스 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 맵 위치 95에 위치한다. AAV의 생존 사이클 및 유전학은 문헌(Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992))에서 검토된다.

AAV는, 예를 들어, 유전자 요법에서, 외래 DNA를 세포에 전달하기 위한 벡터로서 매력적이도록 하는 독특한 특징을 갖는다. 배양액 내 세포의 AAV 감염은 비세포변성이며, 인간 및 다른 동물의 자연 감염은 침묵성이며 무증상성이다. 또한, AAV는 많은 포유동물의 세포를 감염시켜 생체 내에서 많은 상이한 조직의 표적화 가능성을 허용한다. 또한, AAV는 서서히 분열 및 비분열 세포를 형질도입하며, 이들 세포의 생존 기간 동안 본질적으로 전사 활성 핵 에피솜(염색체외 요소)으로서 유지할 수 있다. AAV 프로바이러스 게놈은 플라스미드내 클로닝된 DNA로서 감염성이며, 이는 재조합 게놈의 제작을 실현가능하도록 한다. 또한, AAV 복제, 게놈 캡슐화 및 통합을 지시하는 신호가 AAV 게놈의 ITR 내에 함유되기 때문에, (복제 및 구조적 캡시드 단백질, rep-cap를 코딩하는) 게놈의 내부 약 4.3kb의 일부 또는 모두가 프로모터, 관심 있는 DNA 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 유전자 카세트와 같은 외래 DNA로 대체될 수 있다. rep 및 cap 단백질은 트랜스(in trans)로 제공될 수 있다. AAV의 또 다른 유의한 특징은, 이가 극도로 안정적이고 원기 왕성한 바이러스라는 것이다. 이는 아데노바이러스를 불활성화하기 위해 사용된 조건(수시간 동안 56℃ 내지 65℃)을 쉽게 견디어, AAV의 저온 보존을 덜 중요하게 만든다. AAV는 심지어 동결건조시킬 수 있다. 최종적으로, AAV-감염된 세포는 중복감염(superinfection)에 내성이 없다.

다수의 연구가 근육에서 장기간(> 1.5년) 재조합 AAV-매개 단백질 발현을 입증하였다. 문헌(Clark et al., Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997); Kessler et al., Proc Nat. Acad Sc. USA, 93: 14082-14087 (1996); 및 Xiao et al., J Virol, 70: 8098-8108 (1996))을 참조한다. 또한, 문헌(Chao et al., Mol Ther, 2:619-623 (2000) 및 Chao et al., Mol Ther, 4:217-222 (2001))을 참조한다. 또한, 근육이 고도로 혈관화되기 때문에, 재조합 AAV 형질도입은 문헌(Herzog et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997) 및 Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921-13926 (1997))에 기술된 바와 같이 근육내 주사 후 전신 순환에서 트랜스진(transgene) 생성물의 출현을 초래하였다. 또한, 문헌(Lewis et al., J Virol, 76: 8769-8775 (2002))은 골격 근섬유가 올바른 항체 글리코실화, 접힘(folding) 및 분비를 위한 필요한 세포 인자를 보유하여 근육이 분비된 단백질 치료제의 안정한 발현을 가능하게 함을 나타낸다는 것을 입증하였다.

DMD 및 다른 근이영양증을 앓고 있는 환자의 기능적 개선은 질환의 초기 단계에서 유전자 복원을 필요로 한다. DMD를 앓는 환자에서 근육 강도를 증가시키고, 근육 손상으로부터 보호하는 치료법에 대한 필요성이 있다.

본 발명은 근육 섬유를 손상으로부터 보호하고, 근육 강도를 증가시키며, 섬유증을 감소하고/하거나 예방하기 위해, 횡격막 및 심장 근육을 포함하는 골격근에 마이크로-디스트로핀 유전자를 발현하는 유전자 요법 벡터, 예컨대, AAV에 관한 것이다.

본 발명은 DMD에서 관찰된 유전자 결함을 해결하기 위해 마이크로-디스트로핀을 전달하기 위해 유전자 요법 벡터를 사용하여 근력을 증가시키고/시키거나 근육량을 증가시키는 요법 및 접근법을 제공한다. 실시예 2에 도시된 바와 같이, 마이크로-디스트로핀 유전자 요법을 포함하는 치료는 생체 내에서 더 큰 근력을 유발하였다. 또한, 근육내 및 전신적으로 마이크로-디스트로핀 유전자 요법의 전달은 생체 내에서 마우스 모델에서 근육으로 디스트로핀의 전달을 보여준다.

일 실시양태에서, 본 발명은 근육 특이적 조절 요소 뉴클레오티드 서열, 및 마이크로-디스트로핀 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV 벡터를 제공한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 기능성 마이크로-디스트로핀 단백질을 코딩하되, 뉴클레오티드는 서열번호 1과 예컨대, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% 또는 89%, 보다 전형적으로 90% 이상, 91%, 92%, 93% 또는 94% 이상, 보다 더 전형적으로 95% 이상, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성이며, 단백질은 마이크로-디스트로핀 활성을 유지한다. 마이크로-디스트로핀 단백질은 근육 수축 동안 근육막에 안정성을 제공하는데, 예컨대, 마이크로-디스트로핀은 근육 수축 동안 충격 흡수제로서 작용한다.

본 발명은 또한 rAAV 벡터를 제공하는데, 여기서 뉴클레오티드 서열은 엄격한 조건 하에서 서열번호 1의 핵산 서열 또는 이의 상보체에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 기능성 마이크로-디스트로핀 단백질을 코딩하고, 기능성 마이크로-디스트로핀 단백질을 코딩한다.

일 실시양태에서, rAAV 벡터는 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀으로 지칭되는 비-복제, 재조합 아데노-관련 바이러스(AAV)이다. 이 벡터 게놈은 MHCK7 프로모터/인핸서의 조절 하에서 모두, AAV2 역위 말단 반복(ITR), 마이크로-디스트로핀, SV40 인트론(SD/SA) 및 합성 폴리아데닐화(Poly A) 신호를 포함하여 유전자 발현에 필요한 최소 요소를 함유한다. 벡터 게놈 및 발현 카세트의 개략도는 도 1에 도시된다(오류! 참조 소스를 찾을 수 없음). AAVrh74 혈청형은 IV 투여 후 골격 및 심장 근육에서 효율적인 유전자 전달을 달성하기 위해 사용될 수 있다.

용어 "엄격한"은 일반적으로 당업계에서 엄격한 것으로 이해되는 조건을 지칭하기 위해 사용된다. 하이브리드화 엄격성은 온도, 이온 강도 및 포름아미드와 같은 변성제의 농도에 의해 주로 측정된다. 하이브리드화 및 세척을 위한 엄격한 조건의 예는 65 내지 68℃에서 0.015M 소듐 클로라이드, 0.0015M 소듐 시트레이트, 또는 42℃에서 0.015M 소듐 클로라이드, 0.0015M 소듐 시트레이트 및 50% 포름아미드이다. 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989))을 참조한다. 보다 엄격한 조건(예컨대, 고온, 낮은 이온 강도, 높은 포름아미드 또는 다른 변성제)도 또한 사용될 수 있으나, 하이브리드화 속도가 영향을 받을 것이다. 데옥시올리고뉴클레오티드의 하이브리드화가 관련되는 경우에, 추가의 예시적인 엄격한 하이브리드화 조건은 37℃(14-염기 올리고용), 48℃(17-염기 올리고용), 55℃(20-염기 올리고용), 및 60℃(23-염기 올리고용)에서 6x SSC 0.05% 소듐 피로포스페이트에서의 세척을 포함한다.

다른 약제가 비특이적 및/또는 배경 하이브리드화를 감소시킬 목적으로 하이브리드화 및 세척 완충제에 포함될 수 있다. 다른 적합한 약제가 또한 사용될 수 있지만, 예는 0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% 폴리비닐-피롤리돈, 0.1% 소듐 피로포스페이트, 0.1% 소듐 도데실설페이트, NaDodSO4, (SDS), 피콜, 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 초음파 처리된 연어 정자 DNA (또는 다른 비상보성 DNA) 및 덱스트란 설페이트이다. 이러한 첨가제의 농도 및 종류는 실질적으로 하이브리드화 조건의 엄격성에 영향을 미치지 않고 변경될 수 있다. 하이브리드화 실험은 일반적으로 pH 6.8 내지 7.4에서 수행되나, 전형적인 이온 강도 조건하에서, 하이브리드화 속도는 거의 pH에 무관하다. 문헌(Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Ch. 4, IRL Press Limited (Oxford, England))을 참조한다. 하이브리드화 조건은 이러한 변수들을 수용하고 상이한 서열 관련성의 DNA가 하이브리드를 형성하도록 하기 위해 당업자에 의해 조정될 수 있다.

용어 "근육 특이적 조절 요소"는 근육 조직에서의 발현에 특이적인 코딩 서열의 발현을 조절하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이들 조절 요소는 인핸서 및 프로모터를 포함한다. 본 발명은 근육 특이적 조절 요소 MCKH7 프로모터, MCK 프로모터 및 MCK 인핸서를 포함하는 작제물을 제공한다.

용어 "작동 가능하게 연결된"은 조절 요소 뉴클레오티드 서열, 예컨대, 프로모터 뉴클레오티드 서열의 포지셔닝(positioning)을 지칭하며, 상기 조절 요소에 의해 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 부여한다.

일 양태에서, 본 발명은, 근육-특이적 조절 요소가 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 근세포-특이적 인핸서 결합 인자(MEF), 근육 크레아틴 키나아제(MCK), 절단된(truncated) MCK(tMCK), 미오신 중쇄(MHC), 하이브리드 α-미오신 중쇄 인핸서-/MCK 인핸서-프로모터(MHCK7), C5-12, 뮤린 크레아틴 키나아제 인핸서 요소, 골격 속근 트로포닌 C 유전자 요소, 지근 심장 트로포닌 C 유전자 요소, 지근 트로포닌 i 유전자 요소, 저산소증-유발성 핵 인자, 스테로이드-유발성 요소 또는 글리코코르티코이드 반응 요소(GRE)인, rAAV 벡터를 제공한다.

예를 들어, 근육 특이적 조절 요소는 MHCK7 프로모터 뉴클레오티드 서열 서열번호 2이거나, 근육 특이적 조절 요소는 MCK 뉴클레오티드 서열 서열번호 4이다. 또한, 본 발명의 임의의 rAAV 벡터에서, 근육 특이적 조절 요소 뉴클레오티드 서열, 예컨대, MHCK7 또는 MCK 뉴클레오티드 서열은 마이크로-디스트로핀 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 예를 들어, MHCK7 프로모터 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)은 도 1 또는 도 10에 제공된 작제물(서열번호 3)에 제시된 바와 같이 인간 마이크로-디스트로핀 코딩 서열(서열번호 1)에 작동 가능하게 연결되어있다. 다른 실시예에서, MCK 프로모터 (서열번호 4)는 도 7 또는 도 11에 제공된 작제물(서열번호 5)에 제시된 바와 같이 인간 마이크로-디스트로핀 코딩 서열 (서열번호 1)에 작동 가능하게 연결된다. 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 서열번호 1 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV 벡터를 제공한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 서열번호 3 또는 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV 벡터를 제공한다. 예를 들어, rAAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀 벡터는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 도 10에 도시되어 있다. 이 rAAV 벡터는 MHCK7 프로모터, 키메라 인트론 서열, 인간 마이크로-디스트로핀 유전자에 대한 코딩 서열, 폴리 A, 암피실린 내성 및 pBR322 오리진(origin) 또는 복제를 갖는 pGEX 플라스미드 골격을 포함한다.

본 발명은 서열번호 1의 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 3의 MHCK7 프로모터 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 제공한다. 이 rAAV 벡터는 AAV 혈청형 AAVrh.74이다.

본 발명은 또한 서열번호 3의 pAAV.MHCK7.마이크로-디스트로핀 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 제공한다. 이 rAAV 벡터는 AAV 혈청형 AAVrh.74이다.

본 발명의 rAAV 벡터는 임의의 AAV 혈청형, 예컨대, 혈청형 AAVrh.74, AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 또는 AAV13일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 임의의 rAAV 벡터를 포함하는 약학 조성물 (또는 때때로 본원에서 단순히 "조성물"이라고 지칭함)을 제공한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 rAAV 벡터로 형질감염된 세포를 배양하고 형질감염된 세포의 상청액으로부터 rAAV 입자를 회수하는 것을 포함하는 rAAV 벡터 입자의 생성 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 임의의 재조합 AAV 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 제공한다.

본 발명은 인간 마이크로-디스트로핀을 발현하는, 치료적 유효량의 본 발명의 임의의 재조합 AAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는 근이영양증의 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 서열번호 1의 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 MHCK7 프로모터 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 치료적 유효량의 재조합 AAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는 근이영양증의 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 서열번호 3의 pAAV.MHCK7.마이크로-디스트로핀 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함하는 치료적 유효량의 재조합 AAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는 근이영양증의 치료 방법을 제공한다.

"섬유증"은 골격근, 심장 근육, 간, 폐, 신장 및 췌장을 포함하는, 손상시 조직에서의, 세포 외 기질(ECM) 성분의 과도하거나 비조절된 침착 및 비정상적인 수선 과정을 지칭한다. 침착되는 ECM 성분은 피브로넥틴 및 콜라겐, 예컨대, 콜라겐 1, 콜라겐 2 또는 콜라겐 3을 포함한다.

본 발명은 또한 치료적 유효량의 본 발명의 임의의 재조합 AAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 섬유증을 감소 또는 예방하는 방법을 제공한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 재조합 AAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 섬유증을 예방하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 임의의 rAAV, 예컨대, 섬유증이 대상체에서 관찰되기 전에 투여된 인간 마이크로-디스트로핀 단백질을 발현하는 본 발명의 rAAV는 섬유증을 예방하기 위해 근이영양증을 앓고 있는 대상체에 투여될 수 있다. 또한, 인간 마이크로-디스트로핀 유전자를 발현하는 본 발명의 rAAV는 섬유증이 발생할 위험이 있는 대상체, 예컨대, 근이영양증, 예컨대, DMD를 앓고 있거나 진단된 사람들에 투여될 수 있다. 본 발명의 rAAV는 이들 대상체에서 새로운 섬유증을 예방하기 위해 근이영양증을 앓고 있는 대상체에 투여될 수 있다.

본 발명은 대상체에서 섬유증이 관찰되기 전에 본 발명의 임의의 AAV 벡터를 투여하는 것을 고려한다. 또한, 본 발명의 rAAV는 섬유증이 발생할 위험이 있는 대상체, 예컨대, 근이영양증, 예컨대, DMD을 앓고 있거나 진단된 사람들에 투여될 수 있다. 본 발명의 rAAV는 이들 대상체에서 새로운 섬유증을 예방하기 위해 이미 섬유증이 발생한 근이영양증을 앓고 있는 대상체에 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 인간 마이크로-디스트로핀 유전자를 발현하는 본 발명의 치료적 유효량의 rAAV 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 근력 및/또는 근육량을 증가시키는 방법을 제공한다. 이들 방법은 마이크로-디스트로핀을 투여하는 rAAV를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은, 섬유증이 대상체에서 관찰되기 전 또는 근력이 감소되기 전 또는 근육량이 감소되기 전에 DMD로 진단된 환자에게 본 발명의 임의의 AAV 벡터를 투여하는 것을 고려한다.

본 발명은 또한 이들 대상체에서 새로운 섬유증을 예방하거나 이들 환자에서 섬유증을 감소시키기 위해, 이미 섬유증이 발생한, 근이영양증을 앓고 있는 대상체에 본 발명의 AAV를 투여하는 것을 고려한다. 본 발명은 또한 추가의 손상으로부터 근육을 보호하기 위해, 이미 근력이 감소되거나 근육량이 감소된, 근이영양증을 앓고 있는 환자에 본 발명의 임의의 rAAV를 투여하는 것을 제공한다.

본 발명의 임의의 방법에서, 대상체는 DMD와 같은 근이영양증 또는 임의의 다른 디스트로핀-관련 근이영양증을 앓고 있을 수 있다.

다른 양태에서, 마이크로-디스트로핀 단백질을 발현하는 rAAV 벡터는 MHCK7 또는 MCK 이외의 근육-특이적 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 마이크로-디스트로핀 유전자의 코딩 서열을 포함한다. 예를 들어, 여기서 근육-특이적 조절 요소는 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 근세포-특이적 인핸서 결합 인자 MEF, tMCK(절단된 MCK), 미오신 중쇄(MHC), C5-12(합성 프로모터), 뮤린 크레아틴 키나아제 인핸서 요소, 골격 속근 트로포닌 C 유전자 요소, 지근 심장 트로포닌 C 유전자 요소, 지근 트로포닌 I 유전자 요소, 하이포지아(hypozia)-유발성 핵 인자, 스테로이드-유발성 요소 또는 글리코코르티코이드 반응 요소(GRE)이다.

본 발명의 임의의 방법에서, rAAV 벡터 또는 조성물은 근육내 주사 또는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 임의의 방법에서, rAAV 벡터 또는 조성물은 전신 투여될 수 있다. 예를 들어, rAAV 벡터 또는 조성물은 주사, 주입 또는 이식에 의해 비경 구 투여될 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 rAAV 벡터를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 섬유증을 감소시키기 위한 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 근이영양증을 앓고 있는 환자에서 섬유증을 예방하기 위한 본 발명의 임의의 재조합 AAV 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 근이영양증을 치료하기 위한 본 발명의 임의의 재조합 AAV 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 근이영양증의 치료를 위해 서열번호 1의 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 MHCK7 프로모터 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 근이영양증의 치료를 위해 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 pAAV.MHCK7.마이크로-디스트로핀 작제물을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 근력 및/또는 근육량을 증가시키기 위한 본 발명의 임의의 rAAV 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 근이영양증의 치료를 위한 본 발명의 임의의 rAAV 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 근육내 주사 또는 정맥내 주사를 위해 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 전신 투여, 예컨대, 주사, 주입 또는 이식에 의한 비경구 투여를 위해 제형화된다.

또한, 임의의 조성물은 근이영양증, 예컨대, DMD 또는 다른 디스트로핀 관련 근이영양증을 앓고 있는 대상체에 투여하기 위해 제형화될 수 있다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 섬유증을 감소시키기 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 임의의 rAAV 벡터의 용도를 제공한다. 예를 들어, 필요로 하는 대상체는 근이영양증, 예컨대, DMD 또는 다른 디스트로핀 관련 근이영양증을 앓고 있을 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 섬유증을 예방하기 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 rAAV 벡터의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 근력 및/또는 근육량을 증가시키기 위한 약제의 제조에 본 발명의 재조합 AAV 벡터를의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 근이영양증의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 rAAV 벡터의 용도를 제공한다.

본 발명은 근이영양증의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 서열번호 1의 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 MHCK7 프로모터 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터의 용도를 제공한다.

본 발명은 근이영양증의 치료를 위한 서열번호 3의 pAAV.MHCK7.마이크로-디스트로핀 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터의 용도를 제공한다.

본 발명의 임의의 용도에서, 약제는 근육내 주사 또는 정맥내 주사를 위해 제형화될 수 있다. 또한, 본 발명의 임의의 용도에서, 약제는 전신 투여, 예컨대, 주사, 주입 또는 이식에 의해 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다.

임의의 약제는 근이영양증, 예컨대, DMD 또는 다른 디스트로핀 관련 근이영양증을 앓고 있는 대상체에 투여를 위해 제조될 수 있다.

도 1은 pAAV.MHCK7.마이크로-디스트로핀 작제물을 도해한다. 이 작제물에서, cDNA 발현 카세트는 AAV2 역위 말단 반복 서열(ITR)의 측면에 있다. 작제물은 인-프레임 로드 결실(R4-R23)을 특징으로 하며, 힌지(hinge) 1, 2 및 4(H₁, H₂ 및 H₄) 및 시스테인 풍부 도메인(cysteine rich domain)은 138kDa 단백질을 생성하는 상태로 유지된다. 마이크로-디스트로핀 단백질(3579bp)의 발현은 MHCK7 프로모터(795bp)에 의해 유도된다. 인트론 및 5' UTR은 플라스미드 pCMVß(Clontech)로부터 유래된다. 마이크로-디스트로핀 카세트는 ATG 시작 바로 앞에 컨센서스 코작 (Kozak) 및 mRNA 종결을 위한 작은 53bp 합성 폴리 A 신호를 갖는다. 인간 마이크로-디스트로핀 카세트는 문헌(Harper et al. (Nature Medicine 8, 253-261 (2002)))에 의해 이전에 기술된 바와 같은 (R4-R23/Δ71-78) 도메인을 함유한다.
도 2는 AAVrh74.MHCK7 작제물의 근육내 전달 후 디스트로핀 단백질 발현을 나타낸다. mdx 마우스의 전경골근 근육에 1 x 10¹¹ vg (그룹 당 n=5)를 주사하였다. 6주 후, 근육을 수확하고, 디스트로핀을 위한 N-말단 항체 및 헤마톡실린 및 에오신 염색법으로 디스트로핀 발현에 대해 염색하였다.
도 3a-3c는 AAVrh74.MHCK7 작제물의 근육내 주사 후 골격근력 측정 및 마이크로-디스트로핀 발현의 정량을 제공한다. (A) mdx 마우스의 전경골근 근육에 AAVrh74.MHCK7 작제물로 1 x 10¹¹ vg (n=5)를 주사하였다. 6주 후 전경골근 근육을 수확하고 생체 내에서 힘 측정을 수행하였다. 투여된 코호트는 미처리된 mdx 대조군보다 유의하게 더 큰 힘 생성을 갖는다.
도 4a-4c는 AAVrh.74.MHCK7.마이크로-dys 작제물의 전신 투여 후 골격, 횡격막 및 심장 근육 섬유의 광범위한 형질도입을 나타낸다. (A) Mdx 마우스는 12주 처리 후 6x10¹² vg (2 x 10 ¹⁴ vg/kg)의 AAVrh.74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 꼬리 정맥을 통해 6주령에 전신 처리하였다. (B) 마이크로-디스트로핀의 염색은 각 조직에서 마이크로-디스트로핀을 발현하는 근육 섬유의 백분율의 정량을 나타낸다. (C) 저용량 및 (계획된 임상) 고용량에서의 횡격막에서 측정된 특이적 힘을 도시한다. 저용량에서는 유의한 차이가 보이지 않았다; 그러나 고용량에서는 유의한 개선이 있었다.
도 5는 AAVrh.74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 작제물의 전신 전달 후 디스트로핀 단백질 발현을 나타낸다. Mdx 마우스(n=5)는 6 x 10¹²vg의 AAVrh.74.MHCK7.마이크로-디스트로핀으로 꼬리 정맥을 통해 6주령에 전신 처리하였다. 12주의 처리 후, 모든 근육을 수확하고, 디스트로핀 및 DAPC 성분의 복원에 대해 염색하였다(베타-사르코글리칸으로 도시됨).
도 6a-6d는 AAVrh.74.MHCK7의 독성/안전성을 나타낸다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 다음 근육 조직에서 수행하여 독성을 분석하였다: 전경골근(TA), 비복근(GAS), 사두근(QD), 요근(PSO), 삼두근(TRI) 및 횡격막(DIA)(도 6a). 독성은 나타나지 않았다. 효능의 지표로서, 중심에 위치한 핵(CN)을 갖는 근육 섬유의 갯수를 정량하였다(도 6b). CN은 근육 변성 및 재생의 사이클을 나타내므로, CN의 감소는 처리 효과를 나타낸다. (도 6c)는 처리시 섬유의 총 갯수가 변하지 않음을 나타낸다. 크레아틴 키나아제의 양은 고용량에서 개선을 나타내는 (D)에서 제공된다. 차이를 찾기 위해 독립적인 t-검정을 사용하였다(p<.05); 데이터는 평균± 표준오차로 보고된다.
도 7은 pAAV.MCK.마이크로-디스트로핀 플라스미드 작제물을 도해한다.
도 8은 rAAVrh74.MCK.마이크로-디스트로핀 (인간) 역가(potency) 검정의 결과를 제공한다. mdx 마우스의 전경골근 근육에 3 x 10⁹, 3 x 10¹⁰, 또는 1 x 10¹¹ vg (그룹 당 n=3)으로 주사되었다. 4주 후에 근육을 수확하고 N-말단 Dys3 항체로 디스트로핀 발현에 대해 염색하였다. 3 x 10⁹ vg에서 매우 적은 발현 (효과 수준 없음) 및 1 x 10¹¹ vg에서 89% 발현으로 발현과 용량 사이에 선형 상관 관계가 있었다.
도 9a-9c는 인간 마이크로-디스트로핀이 힘 생성 및 손상으로 유도된 편심 수축으로부터 보호를 개선한다는 것을 나타낸다. (A) 장지신근(EDL) 및 TA에서의 디스트로핀 단백질 면역 염색은 대퇴 동맥을 통한 rAAVrh.74-MCK-마이크로-디스트로핀 (인간) 주사 후 mdx 근섬유에서의 발현을 도시한다. 모의-감염된(mock-infected) 근육을 동일한 방식으로 염색하고 노출을 시간 매칭(matching)시켰다. (B) rAAVrh.74-MCK-마이크로-디스트로핀은 모의-처리된 mdx 근육에 비해 정상화된 특이적 힘을 유의하게 증가시켰다(P<0.05 vs. mdx). (C) rAAVrh.74-MCK-마이크로-dys (인간)으로 감염된 mdx 근육을 모의-감염된 반대측 mdx EDL 근육 및 WT (WT C57Bl/10) EDL 근육을, 유전자 전달 후 12주 후에 반복 편심 수축 동안에 힘 강하에 대해 비교하였다. rAAVrh.74-MCK-마이크로디스트로핀(마이크로-dys) 처리는 모의-처리된 mdx 근육과 비교하여 힘의 손실에 대해 유의하게 보호되었다(P<0.001 vs. mdx). 오류는 SEM이다.
도 10은 핵산 서열(서열번호 3 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀)을 제공한다.
도 11은 핵산 서열(서열번호 5) rAAVrh74.MCK.마이크로-디스트로핀을 제공한다.
도 12a-12b는 비인간 영장류에서 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 전신 전달에 대한 면역학적 반응을 제공한다. (A) AAV 캡시드 및 마이크로-디스트로핀 펩티드 풀에 대한 ELISpot 반응. ConA는 양성 대조군이며, DMSO는 음성 대조군이다. AAVrh74에 대한 3개의 풀 및 마이크로-디스트로핀에 특이적인 4 개의 펩티드 풀이 있었다. (B) 벡터 캡시드에 대한 순환 중화 항체의 ELISA 양성 역가(titer). 격주로 영장류로부터 혈청을 단리하고 항체 역가에 대해 분석하였다. 보고된 역가는 반응 비율이 2 이상인 마지막 희석에 해당한다.
도 13a-b는 AAVrh74.MHCK7.마이크로디스트로핀의 붉은털 원숭이에서의 전신 전달을 나타낸다. 좌측 근육에서의 항-FLAG 면역형광 염색은 강력한 마이크로-디스트로핀 발현을 나타냈다.
도 14는 트랜스진 발현에 대한 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 전신 처리의 효과를 나타낸다. 심장, 횡격막, 요근 및 전경골근(TA)에서 N-말단 디스트로핀 항체를 사용하여 마이크로-디스트로핀에 대한 면역형광 염색은 주사 후 3개월에 중용량(6e12 vg; 2e14 vg/kg) 및 고용량(1.2e13 vg; 6e14 vg/kg) 처리된 동물에서의 강력한 발현을 나타낸다. 20배 이미지가 도시된다.
도 15는 트랜스진 발현에 대한 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 이용한 전신 처리의 효과를 나타낸다. 비복근, 사두근, 삼두근 및 둔근에서 N-말단 디스트로핀 항체를 사용한 마이크로-디스트로핀에 대한 면역형광 염색은 주사 후 3개월에 중용량(6e12 vg; 2e14 vg/kg) 및 고용량(1.2e13 vg; 6e14 vg/kg) 처리된 동물에서의 강력한 발현을 나타낸다. 20배 이미지가 도시된다.
도 16은 근육 병리에 대한 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 이용한 전신 처리의 효과를 나타낸다. (A) C57BL/6 WT, mdx 및 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 처리된 마우스(중용량-2e14vg/kg; 고용량-6e14vg/kg)로부터의 횡격막, 전경골근, 비복근, 및 사두근 근육의 H&E 염색, (B) 평균 섬유 크기의 정량은 모든 조직에 걸친 섬유 크기의 정상화를 나타냈다. ****p<0.001, 일원 분산 분석; 데이터는 평균± 표준오차로 보고된다. 20배 이미지가 도시된다.
도 17은 근육 병리에 대한 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 이용한 전신 처리의 효과를 나타낸다. (A) C57BL/6 WT, mdx 및 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 처리된 마우스(중용량-2e14vg/kg; 고용량-6e14vg/kg)로부터의 삼두근, 둔근 및 요근의 H&E 염색, (B) 평균 섬유 크기의 정량은 용량 의존적 방식으로 더 큰 섬유를 나타냈다. ****p<0.001, 일원 분산 분석(ANOVA); 데이터는 평균± 표준오차로 보고된다. 20배 이미지가 도시된다.
도 18은 중심핵 생성에 대한 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 이용한 전신 처리의 효과를 나타낸다. 투여량 단계적 증가(dose escalation)는 모든 골격근과 횡격막의 중심핵 생성 감소를 도해한다. 차이를 찾기 위해 이원 분산 분석을 사용하였다(p<0.05). 데이터는 평균± 표준오차로 보고된다.
도 19는 콜라겐 침착에 대한 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 이용한 전신 처리의 효과를 나타낸다. 투여량 단계적 증가는 횡격막에서 콜라겐 축적(%)의 감소를 도해한다. *p<0.05, 일원 분산 분석; 데이터는 평균± 표준오차로 보고된다. 20배 이미지가 도시된다.
도 20은 횡격막에서의 힘 결함의 보정을 나타낸다. 3개월 또는 6개월의 처리 후, 횡격막 근육 스트립(strip)을 수확하여 특이적 힘을 측정하였다(단면적으로 정상화됨). 처리는 힘을 WT 수준으로 회복시켰다. *p<0.05. 일원 분산 분석을 사용하여, mdx-LR 마우스와의 차이를 측정하였다.
도 21은 TA에서의 힘 결함의 보정을 나타낸다. (A) 3-6 개월의 처리 후 TA 근육을 수확하여 (좌측 및 우측 모두) 특이적 힘을 측정하였다(TA 중량으로 정상화됨). 처리는 힘을 WT 수준으로 회복시켰다. (B) 처리는 편심 수축의 엄격한 프로토콜 후 TA 근육을 피로로부터 구했다. *p<0.05. 일원 분산 분석을 사용하여, mdx-LR 마우스와의 차이를 측정하였다.
도 22는 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 IV 전달 후 3개의 mdx 마우스로부터 다양한 조직에서 평균 vg 카피수의 분포를 제공한다.
도 23은 ssAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 전신 주사된 마우스 및 연령 매칭 대조군 그룹의 혈청 화학은 분석된 모든 화학에 걸친 정상 값을 나타내는 독립적인 CRO (Charles River Laboratories)에 의해 분석되었다. 유일한 비정상적인 값은 처리로 정상화된 MDX 비히클 처리된 동물 [MDX-LR (젖산 링거)]에서 나타난 상승된 AST 및 ALT였다. AST와 ALT는 DMD에서 상승하는 것으로 공지된다. ALT = 알라닌 아미노트랜스퍼라아제, ALP/K = 알칼라인 포스파타아제, AST = 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제, BUN = 혈액 우레아 질소, B/C = 혈액 대 크레아티닌 비율, CREAT = 크레아틴, GLU = 글루코스, TP = 총 단백질, TBIL = 총 빌리루빈, DBIL = 정확한(direct) 빌리루빈
도 24는 전신 주사된 mdx 마우스에서 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀으로부터의 근육 및 기관에 대한 생체 분포 웨스턴 블랏을 제공한다.
도 25는 pNLREP2-Caprh74 AAV 헬퍼 플라스미드 맵을 제공한다.
도 26은 Ad 헬퍼 플라스미드 pHELP를 제공한다.

본 발명은 인간 마이크로-디스트로핀을 과발현하는 유전자 요법 벡터, 예컨대, rAAV 벡터 및 근이영양증 환자에서 섬유증을 감소시키고 예방하는 방법을 제공한다. DMD 진단 초기에 취한 근육 생검은 탁월한 연결 조직 증식을 나타낸다. 근육섬유증은 여러 면에서 유해하다. 이는 연결 조직 장벽을 통해 내분비 영양소의 정상적인 이동을 감소시키며, 혈류을 감소시키며, 혈관-유래 영양 구성성분의 근육을 빼앗으며, 사지 구축을 통한 보행의 조기 손실에 기능적으로 기여한다. 시간이 지남에 따라, 근육에서 현저한 섬유증의 결과로서 치료 난제가 증가한다. 이는 연속적인 시점에서 연결 조직 증식을 비교하는 근육 생검에서 관찰될 수 있다. 이 과정은 계속해서 악화되어 특히 휠체어-의존 환자에서 보행을 감소시키고 통제 불능에 이르게 한다.

섬유증을 감소시키기 위한 병행 접근법 없이, 엑손 스키핑(exon skipping), 종결 코돈 리드-쓰루(stop-codon read-through), 또는 유전자 대체 요법의 이점이 완전히 달성될 가능성이 낮다. 심지어 소분자 또는 단백질 대체 전략도 근육섬유증을 감소시키기 위한 접근법 없이 실패할 수 있다. AAV.마이크로-디스트로핀으로 치료된 기존의 섬유증을 갖는 늙은 mdx 마우스에서의 이전 연구는 본 발명자들이 완전한 기능 복원을 달성할 수 없음을 입증하였다(Liu, M., et al., Mol Ther 11, 245-256 (2005)). 또한 DMD 심근병증의 진행은 심실 벽에서 흉터와 섬유증을 동반하는 것으로 알려져 있다.

본원에 사용된 용어 "AAV"는 아데노-관련 바이러스의 표준 약어이다. 아데노-관련 바이러스는 특정 기능이 공동 감염성 헬퍼 바이러스에 의해 제공되는 세포에서만 성장하는 단일 가닥 DNA 파르보바이러스이다. 특성화된 AAV의 13개의 혈청형이 존재한다. AAV의 일반적인 정보 및 검토는, 예를 들어, 문헌(Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169-228, 및 Berns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York))에서 찾을 수 있다. 그러나, 다양한 혈청형이 심지어 유전자 수준에서 구조적으로, 및 기능적으로 매우 밀접하게 관련되어 있다는 것이 익히 공지되어 있기 때문에, 이러한 동일한 원칙이 추가의 AAV 혈청형에 적용가능할 것으로 완전히 예상된다. (예를 들어, 문헌(Blacklowe, 1988, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; 및 Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974))을 참조한다). 예를 들어, 모든 AAV 혈청형은 상동성 rep 유전자에 의해 매개되는 매우 유사한 복제 성질을 명백히 나타내고, 모두 AAV2에서 발현된 것들과 같은 3개의 관련 캡시드 단백질을 보유한다. 관련성의 정도는 게놈의 길이에 따르는 혈청형 사이에 광범위한 교차-하이브리드화를 나타내는 이형접합자 분석(heteroduplex analysis) 및 "역위 말단 반복 서열"(ITR)에 상응하는 말단에서 유사한 자기-어닐링 분절의 존재에 의해 추가로 시사된다. 유사한 감염 패턴은 또한 각 혈청형의 복제 기능이 유사한 규제 조절하에 있음을 시사한다.

본원에 사용된 "AAV 벡터"는 AAV 말단 반복 서열(ITR)의 측면에 위치하는 하나 이상의 관심 있는 폴리뉴클레오티드 (또는 트랜스진)를 포함하는 벡터를 지칭한다. 이러한 AAV 벡터는, rep 및 cap 유전자 산물을 코딩하고 발현하는 벡터로 형질감염된 숙주 세포에 존재할 때, 복제되고 감염성 바이러스 입자 내로 패키징될 수 있다.

"AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 벡터 입자"는 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 폴리뉴클레오티드 AAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 입자가 이종성 폴리뉴클레오티드(즉, 포유동물 세포로 전달되는 트랜스진과 같은 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 경우, 이는 전형적으로 "AAV 벡터 입자" 또는 간단히 "AAV 벡터"로서 지칭된다. 따라서, AAV 벡터 입자의 생산은 반드시 AAV 벡터의 생산을 포함하는데, 이는 이러한 벡터가 AAV 벡터 입자에 함유되어 있기 때문이다.

AAV

본 발명의 재조합 AAV 게놈은 본 발명의 핵산 분자 및 핵산 분자의 측면에 위치한 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. rAAV 게놈내 AAV DNA는, AAV 혈청형 AAVrh.74, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12 및 AAV-13을 포함하나 이에 제한되지 않는, 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로터 기원할 수 있다. 슈도타입화된(pseudotyped) rAAV의 생산은, 예를 들어, WO 01/83692에 개시되어 있다. 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들어, 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV 또한 고려된다. 예를 들어, 문헌(Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014))을 참조한다. 배경 섹션에 언급된 바와 같이, 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지되어 있다. 골격근 특이적 발현을 촉진시키기 위해, AAV1, AAV6, AAV8 또는 AAVrh.74가 사용될 수 있다.

본 발명의 DNA 플라스미드는 본 발명의 rAAV 게놈을 포함한다. DNA 플라스미드는 rAAV 게놈을 감염성 바이러스 입자로 조립하기 위해 AAV의 헬퍼 바이러스(예컨대, 아데노바이러스, E1-결실된 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스)로 감염시킬 수 있는 세포로 전달된다. 패키징될 AAV 게놈, rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능이 세포에 제공되는 rAAV 입자를 생산하는 기술은 당업계에서 표준이다. rAAV의 생산은 다음 성분들이 단일 세포(본원에서 패키징 세포로서 표시됨) 내에 존재한다는 것을 필요로 한다: rAAV 게놈, rAAV 게놈으로부터 분리된(즉, 이에 없는) AAV rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능. AAV rep 및 cap 유전자는 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 기원할 수 있으며, AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAVrh.74, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12 및 AAV-13을 포함하나 이에 제한되지 않는, rAAV 게놈 ITR과 상이한 AAV 혈청형으로부터 기원할 수 있다. 슈도타입화된 rAAV의 생산은, 예를 들어, WO 01/83692에 개시되어 있으며, 이는 전체가 본원에 참고로 원용된다.

패키징 세포를 생성하는 방법은 AAV 입자 생산에 필요한 성분 모두를 안정하게 발현시키는 세포주를 생성하는 것이다. 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자가 결여된 rAAV 게놈, rAAV 게놈으로부터 분리된 AAV rep 및 cap 유전자, 및 선택가능한 마커, 예컨대, 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 플라스미드 (또는 다중 플라스미드)는 세포의 게놈으로 통합된다. AAV 게놈은 GC 테일링(Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유하는 합성 링커의 첨가(Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73) 또는 직접적인 블런트 말단 결찰(Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666)과 같은 절차에 의해 세균 플라스미드에 도입되었다. 이어서, 패키징 세포주는 아데노바이러스와 같은 헬퍼 바이러스로 감염된다. 이 방법의 이점은 세포가 선택 가능하고, rAAV의 대규모 생산에 적합하다는 것이다. 적합한 방법의 다른 예는 rAAV 게놈 및/또는 rep 및 cap 유전자를 패키징 세포 내로 도입하기 위해 플라스미드 이외의 아데노바이러스 또는 바쿨로바이러스를 사용한다.

일반적인 rAAV 생산 원리는, 예를 들어, 문헌(Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; 및 Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129)에서 검토된다. 다양한 접근법은 문헌(Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); and Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989); 미국특허 제5,173,414호; WO 95/13365 및 상응하는 미국특허 제5,658.776호; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. Vaccine 13:1244-1250 (1995); Paul et al. Human Gene Therapy 4:609-615 (1993); Clark et al. Gene Therapy 3:1124-1132 (1996); 미국특허 제5,786,211호; 미국특허 제5,871,982호; 및 미국특허 제6,258,595호)에 기술되어 있다. 전술한 문서들은 rAAV 생산과 관련된 문서의 단락을 특별히 강조하면서 이의 전문이 본원에 참고로 원용된다.

따라서, 본 발명은 감염성 rAAV를 생성하는 패키징 세포를 제공한다. 일 실시양태에서, 패키징 세포는 안정하게 형질전환된 암 세포, 예컨대, HeLa 세포, 293 세포 및 PerC.6 세포(동족체 293 라인)일 수 있다. 다른 실시양태에서, 패키징 세포는 형질전환된 암 세포가 아닌 세포, 예컨대, 낮은 통과 293 세포(아데노바이러스의 E1로 형질전환된 인간 태아 신장 세포), MRC-5 세포(인간 태아 섬유아세포), WI-38 세포(인간 태아 섬유아세포), 베로 세포(원숭이 신장 세포) 및 FRhL-2 세포(붉은털 원숭이 태아 폐 세포)이다.

본 발명의 재조합 AAV(즉, 감염성 캡시드화된 rAAV 입자)는 rAAV 게놈을 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 두 rAAV의 게놈은 AAV rep 및 cap DNA가 없는데, 즉, 게놈의 ITR 사이에는 AAV rep 또는 cap DNA가 결여된다. 본 발명의 핵산 분자를 포함하도록 구성될 수 있는 rAAV의 예는 이의 전문이 본원에 참고로 원용된 국제 특허출원 제PCT/US2012/047999호(WO 2013/016352)에 기재되어 있다.

예시적인 실시양태에서, AAV 벡터 플라스미드 pAAV.MHCK7.마이크로-디스트로핀, pNLRep2-Caprh74 및 pHelp, pAAV를 사용하여 3중 형질감염 방법(Xiao et al. , J Virol 72, 2224-2232 (1998)에 의해 생성된 인베이톤(inveiton)의 재조합 AAV 벡터는 AAV2 역위 말단 반복 서열(ITR)의 측면에 위치한 마이크로-디스트로핀 유전자 발현 카세트를 함유한다. AAVrh74 비리온 내로 캡슐화되는 것이 바로 이 서열이다. 플라스미드는 유전자 발현을 유도하기 위해 마이크로-디스트로핀 서열 및 MHCK7 인핸서 및 근육 특이적 프로모터의 코어 프로모터 요소를 함유한다. 발현 카세트는 또한 고수준 유전자 발현을 촉진하기 위해 SV40 인트론 (SD/SA)을 함유하고, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호는 효율적인 전사 종결을 위해 사용된다.

pNLREP2-Caprh74는 혈청형 rh74로부터 4개의 야생형 AAV2 rep 단백질 및 3개의 야생형 AAV VP 캡시드 단백질을 코딩하는 AAV 헬퍼 플라스미드이다. pNLREP2-Caprh74 플라스미드의 개략적 맵은 도 25에 도시된다.

pHELP 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드는 11,635bp이고, 응용 바이로믹스 (Applied Viromics)로부터 입수하였다. 플라스미드는 AAV 복제에 중요한 아데노바이러스 게놈 영역, 즉 E2A, E4ORF6 및 VA RNA를 함유한다(아데노바이러스 E1 기능은 293 세포에 의해 제공됨). 이 플라스미드에 존재하는 아데노바이러스 서열은 아데노바이러스 게놈의 ~ 40%만을 나타내며, 아데노바이러스 말단 반복과 같은 복제에 중요한 시스 요소를 함유하지 않는다. 따라서, 감염성 아데노 바이러스는 이러한 생성 시스템으로부터 생성될 것으로 예상되지 않는다. pHELP 플라스미드의 개략적 맵은 도 26에 도시되어 있다.

rAVV는 컬럼 크로마토그래피 또는 염화세슘 구배와 같은 당업계의 표준 방법에 의해 정제될 수 있다. 헬퍼 바이러스로부터 rAAV 벡터를 정제하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌(Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp and Clark, Methods Mol. Med., 69 427-443 (2002); 미국특허 제6,566,118호 및 WO 98/09657)에 개시되어 있는 방법을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 rAAV를 포함하는 조성물을 고려한다. 본 발명의 조성물은 rAAV 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 조성물은 또한 다른 성분, 예컨대, 희석제 및 보조제를 포함할 수 있다. 허용 가능한 담체, 희석제 및 보조제는 수용자에게 무독성이고, 바람직하게는 사용된 투여량 및 농도에서 불활성이며, 완충제 및 계면활성제, 예컨대, 플루로닉스를 포함한다.

본 발명의 방법에서 투여되는 rAAV의 역가는, 예를 들어, 특정 rAAV, 투여 방식, 치료 목적, 개체, 및 표적화될 세포 유형(들)에 따라 달라지고, 당업계의 표준 방법에 의해 측정될 수 있다. rAAV의 역가는 ml 당 약 1x10⁶, 약 1x10⁷, 약 1x10⁸, 약 1x10⁹, 약 1x10¹⁰, 약 1x10¹¹, 약 1x10¹², 약 1x10¹³ 내지 약 1x10¹⁴ 이상의 DNase 내성 입자(DRP)의 범위일 수 있다. 투여량은 또한 바이러스 게놈(vg)의 단위로 표현될 수 있다.

생체 내에서 또는 생체 외에서 표적 세포를 rAAV로 형질도입하는 방법은 본 발명에 의해 고려된다. 생체 내에서 방법은 본 발명의 rAAV를 포함하는 조성물의 유효량 또는 유효한 다중 용량을 이를 필요로 하는 동물(인간 포함)에게 투여하는 단계를 포함한다. 용량이 장애/질환의 발병 전에 투여된다면, 투여는 예방적이다. 용량이 장애/질환의 발병 후에 투여된다면, 투여는 치료적이다. 본 발명의 실시양태에서, 유효량은 치료되는 장애/질환 상태와 관련된 적어도 하나의 증상을 완화 (제거 또는 감소)시키고/시키거나, 장애/질환 상태로의 진행을 늦추거나 예방하고/하거나, 장애/질환 상태의 진행을 늦추거나 예방하고/하거나, 질환의 정도를 감소시키고/시키거나, 질환의 (부분적 또는 전체적) 경감을 야기하고/하거나 생존을 연장시키는 용량이다. 본 발명의 방법으로 예방 또는 치료하기 위해 고려되는 질환의 예는 DMD이다.

병용 요법(combination therapy) 또한 본 발명에 의해 고려된다. 본원에 사용된 병용은 동시 처리 및 연속 치료 둘 다를 포함한다. 신규한 요법과의 병용과 같이, 본 발명의 방법과 표준 의학적 치료(예컨대, 코르티코스테로이드)의 병용이 구체적으로 고려된다.

조성물의 유효량의 투여는, 근육내, 비경구, 정맥내, 경구, 구강, 비강, 폐, 두개내, 골내, 안구내, 직장 또는 질을 포함하나, 이에 제한되지 않는 당업계의 표준 경로에 의해서일 수 있다. 본 발명의 rAAV의 AAV 성분(특히, AAV ITR 및 캡시드 단백질)의 투여 경로(들) 및 혈청형(들)은, 치료될 감염 및/또는 질환 상태 및 마이크로-디스트로핀 단백질을 발현할 표적 세포/조직(들)을 고려하여 당업자에 의해 선택되고/되거나 매칭될 수 있다.

본 발명은 유효량의 rAAV 및 본 발명의 조성물의 국소 투여 및 전신 투여를 제공한다. 예를 들어, 전신 투여는 순환계에 투여되어 전신이 영향을 받는다. 전신 투여는 위장관을 통한 흡수와 같은 장 투여 및 주사, 주입 또는 이식을 통한 비경구 투여를 포함한다.

특히, 본 발명의 rAAV의 실제 투여는 rAAV 재조합 벡터를 동물의 표적 조직으로 전송할 임의의 물리적 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 본 발명에 따른 투여는 근육으로의 주사 및 혈류로의 주사를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 포스페이트 완충 식염수에 rAAV를 간단하게 재현탁하는 것은 근육 조직 발현에 유용한 비히클을 제공하기에 충분한 것으로 입증되었고, (비록 DNA를 분해하는 조성물은 rAAV를 사용하는 정상적인 방식에서 회피되어야 하지만) 담체 또는 rAAV와 동시 투여될 수 있는 다른 성분에 대한 공지된 제한은 없다. rAAV의 캡시드 단백질은 rAAV가 관심 있는 특정 표적 조직, 예컨대, 근육에 표적화되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, WO 02/053703을 참조하며, 이의 개시내용은 본원에 참조로 원용된다. 약학 조성물은 주사 가능한 제형으로서 또는 국부 제형으로서 제조되어, 경피 수송에 의해 근육으로 전달될 수 있다. 근육내 주사 및 경피 수송 둘 다를 위한 다수의 제형이 이전에 개발되었고, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. rAAV는 투여 및 취급을 용이하게 하기 위한 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 사용될 수 있다.

본원에 개시된 방법에서 투여되는 rAAV의 용량은, 예를 들어, 특정 rAAV, 투여 방식, 치료 목적, 개체, 및 표적화될 세포 유형(들)에 따라 달라질 것이고, 당업계의 표준 방법에 의해 측정될 수 있다. 투여된 각각의 rAAV의 역가는 ml 당 약 1x10⁶, 약 1x10⁷, 약 1x10⁸, 약 1x10⁹, 약 1x10¹⁰, 약 1x10¹¹, 약 1x10¹², 약 1x10¹³, 약 1x10¹⁴, 또는 약 1x10¹⁵ 이상의 DNase 내성 입자(DRP)의 범위일 수 있다. 투여량은 또한 바이러스 게놈(vg)의 단위로 표현될 수 있다(즉, 각각 1x10⁷ vg, 1x10⁸ vg, 1x10⁹ vg, 1x10¹⁰ vg, 1x10¹¹ vg, 1x10¹² vg, 1x10¹³ vg, 1x10¹⁴ vg, 1x10¹⁵). 투여량은 또한 체중 킬로그램(kg) 당 바이러스 게놈(vg)의 단위로 표현될 수 있다(즉, 각각 1x10¹⁰ vg/kg, 1x10¹¹ vg/kg, 1x10¹² vg/kg, 1x10¹³ vg/kg, 1x10¹⁴ vg/kg, 1x10¹⁵ vg/kg). AAV를 적정하는 방법은 문헌(Clark et al., Hum. Gene Ther., 10: 1031-1039 (1999))에 기술되어 있다.

특히, 본 발명의 rAAV의 실제 투여는 rAAV 재조합 벡터를 동물의 표적 조직으로 전송할 임의의 물리적 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 본 발명에 따른 투여는 근육으로의 주사 및 혈류로의 주사를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 포스페이트 완충 식염수에 rAAV를 간단하게 재현탁하는 것은 근육 조직 발현에 유용한 비히클을 제공하기에 충분한 것으로 입증되었고, (비록 DNA를 분해하는 조성물은 rAAV를 사용하는 정상적인 방식에서 회피되어야 하지만) 담체 또는 rAAV와 동시 투여될 수 있는 다른 성분에 대한 공지된 제한은 없다. rAAV의 캡시드 단백질은 rAAV가 관심 있는 특정 표적 조직, 예컨대, 근육에 표적화되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, WO 02/053703을 참조하며, 이의 개시내용은 본원에 참조로 원용된다. 약학 조성물은 주사 가능한 제형으로서 또는 국부 제형으로서 제조되어, 경피 수송에 의해 근육으로 전달될 수 있다. 근육내 주사 및 경피 수송 둘 다를 위한 다수의 제형이 이전에 개발되었고, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. rAAV는 투여 및 취급을 용이하게 하기 위한 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 사용될 수 있다.

근육내 주사를 위해, 보조제, 예를 들어, 참깨유 또는 땅콩유 또는 수성 프로필렌 글리콜 중의 용액 뿐만 아니라 멸균 수용액이 사용될 수 있다. 이러한 수용액은 원하는 경우, 완충될 수 있고, 액체 희석제는 먼저 식염수 또는 글루코스로 등장성이 된다. 유리산(DNA는 산성 포스페이트기를 함유한다) 또는 약리학적으로 허용 가능한 염으로서 rAAV의 용액은 계면활성제, 예컨대, 하이드록스프로필셀룰로오스(hydroxpropylcellulose)와 적합하게 혼합된 물 중에서 제조될 수 있다. rAAV의 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 중 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 통상적 조건 하에서 이들 제제는 미생물의 성장을 예방하기 위한 방부제를 함유한다. 이와 관련하여, 사용된 멸균 수성 매질은 모두 당업자에게 익히 공지된 표준 기술에 의해 용이하게 수득할 수 있다.

주사 가능한 용도에 적합한 약학 담체, 희석제 또는 부형제는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 멸균성이어야 하고, 용이한 주사기능(syringability)이 존재하는 정도로 유동성이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정적이어야 하고, 미생물, 예컨대, 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대, 레시틴의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 유도될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 약제, 예를 들어, 당 또는 소듐 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 연장 흡수는 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 유도될 수 있다.

멸균 주사 가능한 용액은, 필요할 경우 rAAV를 상기 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매에 필요량으로 혼입한 다음, 필터 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 멸균된 활성 성분을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말 및 이의 이전 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 추가의 원하는 성분을 생산하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.

rAAV을 이용한 형질도입은 또한 생체 외에서 수행될 수 있다. 일 실시양태에서, 원하는 표적 근육 세포를 대상체로부터 제거하고, rAAV로 형질 도입하고 대상체에 재도입한다. 대안적으로, 동종 또는 이종 근육 세포는 이들 세포가 대상체에서 부적절한 면역 반응을 생성하지 않는 경우에 사용될 수 있다.

형질도입 및 형질도입된 세포의 대상체로의 재도입에 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일 실시양태에서, 세포는 rAAV를, 예컨대, 적합한 매질 중에서 근육 세포와 결합시키고, 서던 블롯 및/또는 PCR과 같은 통상적인 기술을 사용하여 관심 있는 DNA를 보유하는 세포를 스크리닝하거나 선택가능한 마커를 사용함으로써 생체 외에서 형질도입시킬 수 있다. 이어서, 형질도입된 세포는 약학 조성물로 제형화될 수 있고, 조성물은 다양한 기술, 예컨대, 근육내, 정맥내, 피하 및 복강내 주사에 의해 또는, 예컨대, 카테터를 사용하여 평활근 및 심근 내로 주사에 의해 대상체에 도입된다.

본 발명의 rAAV로 세포를 형질도입하면 마이크로-디스트로핀 단백질의 지속적인 발현을 초래한다. 따라서, 본 발명은 마이크로-디스트로핀 단백질을 발현하는 rAAV를 동물, 바람직하게는 인간에게 투여하고/전달하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 형질도입 조직(조직, 예컨대, 근육, 기관, 예컨대, 간 및 뇌, 및 샘, 예컨대, 침샘을 포함하나, 이에 제한되지 않음)을 본 발명의 하나 이상의 rAAV로 형질 도입함을 포함한다. 형질도입은 조직 특이적 조절 요소를 포함하는 유전자 카세트로 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시양태는 액틴 및 미오신 유전자 계열로부터, 예컨대, myoD 유전자 계열[Weintraub et al., Science, 251: 761-766 (1991) 참조], 근세포 특이적 인핸서 결합 인자 MEF-2[Cserjesi and Olson, Mol Cell Biol 11: 4854-4862 (1991)], 인간 골격 액틴 유전자로부터 유래된 조절 요소[Muscat et al., Mol Cell Biol, 7: 4089-4099 (1987)], 심장 액틴 유전자, 근육 크레아틴 키나아제 서열 요소[Johnson et al., Mol Cell Biol, 9:3393-3399 (1989) 참조] 및 뮤린 크레아틴 키나아제 인핸서(mCK) 요소, 골격 속근 트로포닌 C 유전자, 지근 심장 트로포닌 C 유전자 및 지근 트로포닌 I 유전자로부터 유래된 조절 요소; 저산소증 유발성 핵 인자(Semenza et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 5680-5684 (1991)), 글루코코르티코이드 반응 요소(GRE)를 포함하는 스테로이드-유발성 요소 및 프로모터[Mader and White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607 (1993) 참조], 및 다른 조절 요소로부터 유래된 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는 근육 특이적 조절 요소에 의해 지시된 근육 세포 및 근육 조직을 형질도입하는 방법을 제공한다.

근육 조직은 생체 내에서 DNA 전달을 위한 매력적인 표적인데, 이는 중요한 기관이 아니고 접근하기 용이하기 때문이다. 본 발명은 형질도입된 근섬유로부터 마이크로디스트로핀의 지속적인 발현을 고려한다.

"근육 세포" 또는 "근육 조직"이란, 임의의 종류의 근육(예를 들어, 예컨대, 소화관, 방광, 혈관 또는 심장 조직으로부터의 골격근 및 평활근)으로부터 유래된 세포 또는 세포 그룹을 의미한다. 이러한 근육 세포는 예컨대, 근육아세포, 근세포, 근관세포, 심근세포 및 심근아세포로 분화되거나 분화되지 않을 수 있다.

용어 "형질도입"은 수용체 세포에 의한 마이크로-디스트로핀의 발현을 초래하는 본 발명의 복제-결핍 rAAV를 통해 생체 내에서 또는 생체 외에서 수용체 세포로 마이크로-디스트로핀의 코딩 영역의 투여/전달을 지칭하는데 사용된다.

따라서, 본 발명은 마이크로-디스트로핀을 코딩하는 유효량 (또는 본질적으로 동시에 투여된 용량 또는 간격으로 주어진 용량)을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 방법을 제공한다.

실시예

실시예 1

pAAV.MHCK7.마이크로-디스트로핀 작제물의 생성

pAAV.MHCK7.마이크로-디스트로핀 플라스미드는 AAV2 역위 말단 반복 서열 (ITR)의 측면에 위치한 인간 마이크로-디스트로핀 cDNA 발현 카세트를 함유한다 (도 1 참조). 마이크로-디스트로핀 작제물은 인-프레임 로드 결실(R4-R23)을 특징으로 하는 반면, 힌지 1, 2 및 4 및 시스테인 풍부 도메인은 138kDa 단백질을 생성하는 상태로 유지된다. 마이크로-디스트로핀 단백질(3579bp)의 발현은 MHCK7 프로모터(795bp)에 의해 유도되었다. 플라스미드는 MCK 프로모터를 제거하고 MHCK7 프로모터를 삽입함으로써 pAAV.MCK.마이크로-디스트로핀 플라스미드로부터 구축되었다. 코어 프로모터 후에, 효율적인 전사 개시를 위해 (비번역된) 53bp 내인성 마우스 MCK Exon1이 존재하고, 이어서 SV40 후기 16S/19S 스플라이스 신호(97bp) 및 작은 5' UTR(61bp)이 뒤따른다. 인트론 및 5' UTR은 플라스미드 pCMVß(Clontech)로부터 유래된다. 마이크로-디스트로핀 카세트는 ATG 시작 바로 앞에 컨센서스 코작(Kozak) 및 mRNA 종결을 위한 작은 53bp 합성 폴리 A 신호를 갖는다. 인간 마이크로-디스트로핀 카세트는 문헌(Harper et al.(Nature Medicine 8, 253-261 (2002)))에 의해 이전에 기술된 바와 같이 (R4-R23/Δ71-78) 도메인을 함유한다. 상보적 DNA는 인간 용도에 대해 최적화된 코돈이며, 진스크립트(GenScript) (Piscataway, NJ)에 의해 합성되었다(Mol Ther 18, 109-117 (2010)). 이 벡터에 포함된 유일한 바이러스 서열은 역위 말단 반복이며, 바이러스 DNA 복제 및 패키징 모두에 필요하다. 마이크로-디스트로핀 카세트는 mRNA 종결을 위해 작은 53bp 합성 폴리 A 신호를 갖는다.

이전의 연구는 MHCK7 프로모터 (Salva et al. Mol Ther 15, 320-329(2007)) 및 골격, 횡격막 및 심장 근육 발현을 달성하는 AAVrh74 (Sondergaard et al. Annals of clinical and Transl Neurology 2 , 256-270 (2015))를 사용하여 심장 발현을 입증하였다. 도 1의 작제물의 서열은 AAVrh.74 비리온 내로 캡슐화되었다. AAVrh.74 혈청형의 분자 클론은 붉은털 원숭이 림프절로부터 클로닝되었으며, 문헌(Rodino-Klapac et al. Journal of Translational medicine 5, 45 (2007))에 기술된다.

표 1은 플라스미드 pAAV.MHCK7.마이크로-디스트로핀(서열번호 3)의 분자 특징을 나타낸다.

실시예 2

rAAV.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 이용한 근육내 발현 연구

근육내 주사에 의해 인간 마이크로-디스트로핀 작제물(rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀; 실시예 1에 기술됨)을 사용하여 발현 연구를 수행하였다. mdx 마우스(디스트로핀을 발현하지 않는 자연발생 Dmd^mdx 돌연변이 마우스)의 전경골근 근육에 1 x 10¹¹ vg의 카세트(그룹 당 n=5)를 주사하였다. 6주 후, 근육을 수확하고, 디스트로핀을 위한 N-말단 항체 및 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색법으로 디스트로핀(Dys3) 발현에 대해 염색하였다. 도 2는 미처리된 근육과 비교하여 1 x 10¹¹ vg 용량을 사용한 경우, 확산 유전자 발현 및 중심에 위치한 핵의 감소를 보여준다. 또한, 마이크로-디스트로핀 작제물로 처리한 후에, 평균 섬유/프레임의 증가와 함께 중심핵 생성의 감소가 관찰되었다. rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 작제물의 발현 수준은 약 73%로 정량되었다.

마이크로-디스트로핀 위치 및 발현 수준을 측정하는 것 외에, 골격근력은 카세트의 근육내 주사 후에 측정되었다. pAAV.MHCK7.마이크로-디스트로핀 작제물의 근육내 발현은 미처리된 대조군과 비교하여 유의하게 더 큰 절대적 및 특이적적 힘 생성을 초래하였다(도 3a 및 3b).

실시예 3

mdx 마우스에 rAAVrh.74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 전신 전달

mdx 마우스의 코호트는 6주령에 2 x10¹² vg (8x10¹³ vg/kg) 또는 고용량 (계획된 임상 용량) 6 x10¹² vg (2x10¹⁴ vg/kg)의 rAAVrh.74.MHCK7.마이크로-디스트로핀으로 꼬리 정맥을 통해 주사되었다. 12주의 처리 후, 모든 근육을 수확하고, 디스트로핀 및 DAPC 성분의 복원에 대해 염색하였다. (꼬리 정맥) 전신 주사된 마우스는 모든 근육에 걸쳐 디스트로핀의 높은 수준의 염색을 나타냈다. 도 4a는 6x10¹² vg (2 x 10 ¹⁴ vg/kg) 전신 투여 후 골격, 횡격막 및 심장 근육 섬유의 광범위한 형질도입을 나타낸다. 도 4b는 각 조직에서 마이크로-디스트로핀을 발현하는 근육 섬유의 백분율의 정량을 나타낸다. 마지막으로 횡격막은 기능 개선에 대해 테스트되었다(도 4c). 저용량에서는 유의한 차이가 보이지 않았다; 그러나 고용량에서는 유의한 개선이 있었다. 중요하게도, 도 5는 마이크로-디스트로핀 전달 후 DAPC의 다른 성분이 완전히 복원되었음을 입증한다. 베타-사르코글리칸(B-SG)이 도시된다.

AAVrh.74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 독성/안전성은 표 2에 따라 mdx 마우스의 꼬리 정맥에 정맥내(i.v.) 주사를 통해 벡터를 투여함으로 평가되었다. 다음을 포함하는 분석된 임의의 근육 조직의 독성의 증거가 없었다: 전경골근(TA), 비복근(GAS), 사두근(QD), 요근(PSO), 삼두근(TRI) 및 횡격막(DIA)(도 6A 및 도 6B). 중심에 위치한 핵의 갯수는 고용량 6x10¹² vg (2 x 10¹⁴ vg/kg)에서 감소하엿다. 역사적으로, 미치료된 연령 매칭된 mdx 마우스에서 골격근의 중심핵 생성은 평균 ~80%이다. 최종적으로, 작은 샘플 크기(n=3)로부터의 예비 데이터는 고용량 처리 된 마우스(D)의 혈청에서 감소된 수준의 CK 방출(U/L)을 입증한다. 차이를 찾기 위해 독립적인 t-검정을 사용하였다(p<.05); 데이터는 평균± 표준오차로 보고된다.

표 2. 마우스에서 rAAVrh.74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 독성/안전성 연구 개요

실시예 4

pAAV.MCK.마이크로-디스트로핀 작제물의 생성

pAAV.MCK.마이크로-디스트로핀 플라스미드는 코돈 최적화된 인간 마이크로-디스트로핀 cDNA 서열을 구동하는 MCK 발현 카세트를 AAV 클로닝 벡터 psub201에 삽입함으로써 구축되었다(Samulski et al., J. Virol. 61(10):3096-3101). 근육-특이적 유전자 발현을 유도하기 위해 근육-특이적 조절 요소가 작제물에 포함되었다. 이 조절 요소는 351bp MCK 코어 프로모터 (중심부 쪽의(proximal))에 융합된 마우스 MCK 코어 인핸서 (206bp)를 포함하였다. 코어 프로모터 후, 작제물은 효율적인 전사 개시를 위해 (비번역된) 53bp 내인성 마우스 MCK Exon1을 포함하고, 이어서 SV40 후기 16S/19S 스플라이스 신호(97bp) 및 작은 5' UTR(61bp)이 뒤따른다. 인트론 및 5' UTR은 플라스미드 pCMVß(Clontech)로부터 유래된다. 마이크로-디스트로핀 카세트는 ATG 시작 바로 앞에 컨센서스 코작 및 mRNA 종결을 위한 작은 53bp 합성 폴리 A 신호를 갖는다. 인간 마이크로-디스트로핀 카세트는 문헌(Harper et al. Nat. Med. 8(3):253-61, 2002)에 의해 이전에 기술된 바와 같이 (R4-R23/Δ71-78) 도메인을 함유한다.

pAAV.MCK.마이크로-디스트로핀 플라스미드는 AAV2 역위 말단 반복 서열(ITR)의 측면에 위치한 인간 마이크로-디스트로핀 cDNA 발현 카세트를 함유하였다(도 7 참조). 이 서열은 AAVrh.74 비리온 내로 캡슐화되었다. AAVrh.74 혈청형의 분자 클론은 붉은털 원숭이 림프절로부터 클로닝되었으며, 문헌(Rodino-Klapac et al. Journal of Tran. Med. 45 (2007))에 기술된다.

실시예 5

rAAV.MCK.마이크로-디스트로핀을 이용한 효능 및 용량 분석

발현 연구는 근육내 주사에 의해 인간 마이크로-디스트로핀 작제물(rAAV.MCK.마이크로-디스트로핀; 실시예 1에 기술됨)을 사용하여 수행되었다. mdx 마우스(디스트로핀을 발현하지 않는 자연발생 Dmd^mdx 돌연변이 마우스)의 전경골근(TA)에 3 x 10⁹, 3 x 10¹⁰, or 1 x 10¹¹ vg (그룹 당 n=3)를 주사하였다. 4주 후에 근육을 수확하고, N-말단 Dys3에 특이적인 항체 및 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색법을 사용하여 디스트로핀 발현에 대해 염색하였다. 도 8은 3 x 10⁹ vg에서 매우 적은 발현 (효과 수준 없음) 및 1 x 10¹¹ vg에서 89% 발현으로 발현과 용량 사이의 선형 상관 관계를 보여준다.

실시예 6

mdx 마우스에 rAAV.MCK.마이크로-디스트로핀의 혈관 전달

단리된 사지 관류 모델(Rodino-Klapac et al., J. Trans. Med. 5(45): 1-11, 2007)을 사용하여, mdx 마우스(n=10)에 대퇴 동맥을 통해 1 x 10¹¹ vg의 rAAVrh.74.MCK.마이크로-디스트로핀을 주사하고, 수행된 결과 분석을 수행하였다. 유전자 전달 3개월 후, 하지 근육을 수확하고, 효능 연구는 힘, 및 손상으로 유도된 편심 수축에 대한 저항 모두에서 유의한 개선을 입증하였다(도 9).

장지신근(EDL) 근육 및 TA 근육에서 디스트로핀 단백질 면역염색은 rAAVrh.74-MCK-마이크로-디스트로핀 처리 후 mdx 근섬유에서의 발현을 나타낸다 (도 9a). 모의-감염된 근육을 동일한 방식으로 염색하고, 노출을 시간 매칭시켰다. 도 9b는 rAAVrh.74-MCK-마이크로-디스트로핀이 모의-처리된 mdx 근육에 비해 정상화된 특이적 힘을 유의하게 증가시켰음을 입증한다(P<0.05 vs. mdx). 또한, rAAVrh.74-MCK-마이크로-디스트로핀 (인간)으로 감염된 mdx 근육은, 유전자 전달 후 12주 후에 반복 편심 수축 동안에 힘 강하에 대해 모의-감염된 반대측 mdx EDL 근육(파란색) 및 야생형(WT C57Bl/10) EDL 근육과 비교되었다(도 9c). rAAVrh.74-MCK-마이크로디스트로핀(마이크로-dys) 처리는 모의-처리된 mdx 근육과 비교하여 힘의 손실에 대해 유의하게 보호되는 것으로 밝혀졌다(P<0.001 vs. mdx).

실시예 7

영장류 연구

마우스에서 전임상 발견을 임상 패러다임에 적용하기 위해, 비인간 영장류 (NHP)를 추후 임상 시험에 대한 안전성 및 효능을 평가하기 위해 전신 투여하였다. 요측피정맥을 통해 정맥내로 전달된 2x10¹⁴ vg 총 용량의 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀.FLAG의 효과를 비인간 영장류에서 연구하였다. 이 용량은 마우스에 제공된 전신 용량에 (동물 중량을 기준으로) 비례하고, 마우스에 제공된 중용량 (6.0x10¹² vg 총 용량)에 상응하였다.

효소-연결된 면역흡착 스팟 검정(ELISpot) 분석을 포함하는 기본 화학 및 면역학적 연구는 항-AAV 항체 역가 뿐만 아니라 AAVrh.74 캡시드 및 마이크로-디스트로핀에 대한 T 세포를 측정하기 위해 수행되었다. 3개의 펩티드 풀은 각각 18개의 아미노산 길이면서 11개의 잔기로 중첩된 34-36개의 펩티드를 함유하는 AAVrh.74 캡시드 단백질(Genemed Synthesis, San Antonio, TX)에 사용되었다. 각각 18개 아미노산 길이면서 11개의 잔기로 중첩된 마이크로-디스트로핀.FLAG 단백질(Genemed Synthesis)을 포함하는 4개의 펩타이드 풀. 콘카나발린 A(ConA)(Sigma, 1μg/mL)는 양성 대조군으로서, 0.25% 디메틸 설폭사이드(DMSO)는 음성 대조군으로 작용하였다. 이들 연구는 전체 연구 동안 2주 마다 반복되었다. 처리 후 3개월에, 동물을 안락사시켜, 완전 조직 부검을 수득하였다. 면역학적 검정은 ELISpot에 의한 캡시드 또는 트랜스진에 대한 임의의 예상치 못한 반응을 나타내지 않았고 (도 12a), ELISA에 의한 AAVrh74 캡시드에 대한 예상치 못한 항체 반응을 나타내지 않았다(도 12b).

또한, 모든 완전한 혈구 계수 및 화학 패널은 하기 표 3에 도시된 바와 같이, 간 효소의 약간의 상승을 나타내며, 이는 개입 또는 처리 필요 없이 기준선으로 다시 정상화되었다.

표 3

연구 기간 동안 내내 다른 예상치 못한 화학 값은 없었다. 마지막으로, 모든 골격근의 완전한 분석은 FLAG 특이적 항체를 이용한 면역형광 염색 및 디스트로핀에 대한 마우스 모노클로날 항체를 이용한 웨스턴 블랏 검출을 통해 근육 섬유에서 광범위한 발현을 입증하였다(도 14a, 도 14b).

데이터는 함께 AAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀.FLAG의 전신 전달이 비인간 영장류의 모든 골격근에 걸쳐 광범위한 발현으로 안전성 및 효능을 확립했음을 입증한다.

실시예 8

효능을 입증하기 위한 전임상 연구

전임상 연구는 mdx 마우스에서 골격근 및 심장 근육 결함을 치료하는데 있어서 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 전신 전달의 효능을 입증하기 위해 수행되었다. 실시예 1에 기술된 바와 같은 근육 및 심장 특이적 프로모터 MHCK7에 의해 구동된 코돈 최적화된 인간 마이크로 디스트로핀 트랜스진을 함유하는 AAVrh74 벡터를 이 연구에 사용하였다.

mdx(디스트로핀 널(null)) 마우스에서 꼬리 정맥을 통한 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 전신 주사는 용량 반응 연구에 사용되었다. 이 연구의 결과는 mdx 마우스에서의 전신 주사가 용량 의존 방식으로 사지 및 횡격막에서 측정된 조직학적 및 기능적 결과를 정상화하는데 효과적임을 입증하였다. 또한, 면허가 있는 수의학 병리학자에 의한 공식적인 조직 병리학적 검토 후 유의한 벡터 관련 독성은 보고되지 않았다.

본 연구를 위한 벡터는 연구 등급 조건 하에서 HEK293 세포의 3중-형질감염 방법을 이용하여 전국 어린이 병원 바이러스 벡터 코어에 의해 생성되었다. 생산 후 벡터의 특성은 수퍼코일된 표준을 사용한 qPCR에 의한 역가 측정, 내독소 수준 측정(EU/mL) 및 무균 평가를 포함하였다. 생성된 벡터를 SDS-PAGE로 분석하여 예상 rAAV와의 밴딩 패턴 일관성을 확인하였다. 벡터는 마이크로디스트로핀 작제물, 발현을 유도하는 근육 특이적 MHCK7 프로모터, 컨센서스 코작 서열(CCACC), SV40 키메라 인트론, 합성 폴리아데닐화 부위(53bp)(도 1)를 함유하는 플라스미드를 사용하여 생성되었다. 마이크로디스트로핀 발현 카세트는 골격 및 심장 조직의 향상된 형질도입을 위해 AAVrh74 벡터 내에 패키징된 AAV2 ITR 사이에서 클로닝되었다.

rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 시험 물품의 효능 측정은 벡터를 mdx 마우스 내에 근육내 주사를 수행함으로써 달성되었다. 야생형 마우스는 양성 대조군으로서 작용하고, 멸균 젖산 링거를 mdx 마우스 내로의 주사는 음성 대조군으로서 작용한다.

표 4: rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 연구 설계의 개요

표 4에 지시된 동물은 전신 전달을 위해 꼬리 정맥 주사로 지시된 나이 (4-5주령)에 투여되었다. 근육내 주사로 정확한 투여를 수행하기 위해, 동물은 이소플루란 흡입에 의해 간단히 마취되었다. 하부의 뒷다리의 전경골근 근육 내에 직접 주사하여 용량을 투여하였다. 전신 전달을 이용한 정확한 투여를 위해 마취는 필요하지 않았다. 꼬리 정맥을 통한 맥관계에 의해 용량을 투여하였다. 전체 벡터 용량을 용기에 정확하게 침착시키도록 주의를 기울였다. 투여를 수행한 후, 자발적 움직임이 회복될 때까지 동물을 가열 패드에 두고, 이후에 케이지로 돌려보냈다. 각 동물에 대한 관찰은 전체 연구 기간 동안 매주 수행되었다.

표 4에 열거된 바와 같은 적절한 연령에서, 마우스는 케타민/자일라진(Ketamine/Xylazine) 혼합물(200mg/kg/20mg/kg)로 과다투여되었다. 혈액은 심장 천자를 통해 수집되었고, 전혈은 완전한 혈구 계수(CBC) 분석을 위해 보냈고, 혈청은 혈청 화학이 Charles Rivers Laboratory에 의해 분석될 때까지 -80℃에서 저장 하였다. 이어서 조직을 수집하여, 독립적인 수의학 병리학자 및 사내 분석을 위해 보냈다.

1x10¹¹ vg 총 용량으로 디스트로핀 널 마우스에 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 근육내 전달은 주사된 TA 근육에서 디스트로핀의 ~70% 발현을 초래하였다. 벡터 투여 마우스의 면역형광 이미징은 마이크로-디스트로핀 유전자의 발현을 확인하였다.

rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀으로 전신 처리 후 디스트로핀 발현의 복원

rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 시험 물품의 효능 측정은 저, 중 및 고 용량 (2.0x10¹² vg 총 용량; 6.0x10¹² vg 총 용량; 1.2x10¹³ vg 총 용량)으로 투여량 단계적 증가를 사용하여 mdx 마우스 (유전자형: C57BL/10ScSn-Dmd ^mdx /J)에서 전신 주사를 수행함으로써, 주사 후 3개월 및 6개월 시점에 전신 전달될 때 트랜스 진 발현 및 벡터의 효능을 평가하였다. 마우스는 4-5주령에 주사되고, 완전 부검은 주사 후 3개월 및 6개월에 수행되었다. 그룹 당 평균 동물 중량을 기준으로, 이 용량은 동일하다: 8x10¹³ vg/kg, 2x10¹⁴ vg/kg 및 6x10¹⁴ vg/kg.

동일한 부피의 젖산 링거의 주사는 음성 대조군으로서 사용되었다. C57BL/6 마우스에 동일한 부피의 젖산 링거 주사는 양성 대조군으로 사용되었다. 안전성은 WT 마우스에서 6.0 x10¹² vg 총 용량의 용량으로 전신 주사를 수행함으로써 측정되었다(WT TX-중용량 그룹으로 표시됨). 골격근 전경골근(TA), 비복근(GAS), 사두근(QUAD), 둔근(GLUT), 요근, 삼두근(TRI), 횡격막(DIA) 및 심장의 면역형광 염색은 디스트로핀의 복원 및 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 바이러스 벡터의 효능을 보장한다.

골격근(TA, QUAD, GLUT, TRI)을 분석을 위해 심장 및 횡격막과 함께 추출하였다. 독성 및 생물 분포 연구를 위해 장기를 제거하였다. 마이크로-디스트로핀 트랜스진 발현은 3-6개월 처리 후에도 높게 유지되었다. 이는 개선된 근육 조직병리학 및 표적 장기 이외의 유해작용(adverse effect) 없이 개선된 기능을 수반했다.

rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 전신 처리된 mdx 마우스에서 이영양성 표현형의 전환

골격근, 횡격막 및 심장의 헤마톡실린 & 에오신(H&E) 염색을 수행하여, rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 2x10¹² vg 총 용량(저용량; n=1), 6x10¹² vg 총 용량 (중용량; n=8) 및 1.2x10¹³ vg 총 용량 (고용량; n=8)으로 전신 주사 한 후 주사 12주 후 안락사를 수행하여, 각각의 용량에 대해 이영양성 병리의 전환 및 개선을 측정하였다. 주사 후 24 주에, 중용량(6x10¹² vg 총 용량)으로 처리된 동물의 제 2 코호트를 디스트로핀 병리의 전환 및 개선에 대해 평가하였다(n=5).

인간 마이크로-디스트로핀 단백질에 대한 면역형광 염색을 이용하여 마이크로-디스트로핀 벡터가 주사된 모든 디스트로핀 널 마우스의 6개의 골격근(TA, GAS, QUAD, GLUT, 요근, TRI)의 좌우 양쪽 모두 뿐만 아니라 횡격막 및 심장에서 마이크로-디스트로핀 트랜스진 발현을 측정하였다. 이는 디스트로핀의 복원을 측정하고, 주사 12주 후 안락사를 수행하여, 각각의 용량에 대해 총 2x10¹² vg 총 용량 (저용량; n=2), 6x10¹² vg 총 용량 (중용량; n=8) 및 1.2x10¹³ vg 총 용량 (고용량; n=8)에서의 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 바이러스 벡터의 효능을 보장하기 위해 수행되었다.

발현 및 형질도입 효율을 평가하기 위해, 모든 3가지 투여 코호트 및 각각의 근육의 좌측 및 우측 모두로부터의 이미징을 정량에 이용하였다. 각각의 근육에서 4개의 20배 이미지를 찍었고, 각 근육에 대한 평균 백분율 형질도입을 나타내는 각 이미지에 대해 마이크로-디스트로핀 양성 섬유의 백분율을 측정하였다. 도 14 및 15는 중용량 (6x10¹² vg; 2x10¹⁴vg/kg) 및 고용량 (1.2x10¹³ vg; 6x10¹⁴vg/kg)으로부터 처리 된 마우스로부터의 대표적인 이미지를 제시한다. 젖산 링거를 주사하고 연령 매칭된 디스트로핀 널 마우스를 음성 대조군에 포함시키고, 젖산 링거를 주사 한 야생형 마우스를 양성 대조군에 포함시켰다. 심장은 분석된 모든 동물에서 ≥75%를 나타냈다.

미처리된 동물로부터의 근육은 지방 침윤, 중심핵 생성, 섬유증 및 괴사의 병소 영역을 포함하는 광범위한 근병증을 나타냈다. 도 16 및 도 17에서의 H&E 염색은 정상 WT 마우스와 비교할 때 디스트로핀 널 마우스에서 이영양성 표현형 및 중용량(6x10¹² vg; 2x10¹⁴ vg/kg) 또는 고용량 (1.2x10¹³ vg; 6x10¹⁴ vg/kg)에서의 치료 후 근육 병리의 개선을 예시한다. 조직학적 파라미터의 정량은 용량 의존적 방식으로 모든 근육에서 처리된 마우스에서 중심핵 생성(도 18)의 감소 및 평균 섬유 직경(도 16 및 17)의 정상화를 입증하였다. 시리우스 레드 염색은 미처리된 (mdx LR) 코호트에 비해 중용량 및 고용량 코호트 모두에서 횡경막의 콜라겐 침착 감소를 입증하였다(도 19).

rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀으로 전신 치료의 기능 평가

마이크로-디스트로핀 유전자 전달이 질환의 근육에 기능적 강도 이점을 제공하는지 여부를 측정하기 위해, mdx 마우스, WT 마우스 및 3회 용량 수준으로 벡터 투여된 마우스로부터 횡경막 및 전경골근 둘 다의 기능적 특성을 평가하였다. 투여량 단계적 증가는 저용량(8x10¹³ vg/kg), 중용량(2x10¹⁴ vg/kg) 및 고용량(6x10¹⁴ vg/kg)을 포함하였다. 특이적 힘의 엑스-비보(ex-vivo) 평가 및 TA에서의 편심 수축 후 힘 출력의 감소를 이용한 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 이용한 전신 처리의 기능적 평가는 6x10¹² vg 총 용량(중용량)의 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀으로 전신 주사된 동물에서 주사 후 24주에 실시되었다. 또한, 동일한 동물에서 횡격막의 특이적 힘 출력을 평가하였다.

이전 도면에 요약된 바와 같이, 조직 병리학은 중용량 및 고용량에서 중심핵 생성, 콜라겐 침착 및 섬유 크기가 개선된 보다 정상화된 환경을 나타냈다. rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 꼬리 정맥 전달은 횡격막에서 특이적 힘 출력을 단계적으로 개선을 유발했다(중용량 그룹에서 176.9 mN/mm² 대 고용량 그룹에서 227.78 mN/mm²). 또한, 장기간 치료된 코호트는 (중용량 2x10¹⁴ vg/kg) 주사 6개월 후 마우스를 나타내고, 횡격막 출력 장기간(176.9 mN/mm² vs 194.9 mN/mm²)에 편차가 없었다(도 20).

또한, WT 마우스와 비교하여 mdx 마우스에서 전경골근 근육의 기능적 결함이 관찰되었다. Mdx 마우스는 WT 마우스(171.3 mN/mm² vs. 291.65 mN/mm²)와 비교하여 힘 출력이 50% 감소 및 편심 수축에 따른 힘의 더 큰 손실(mdx에서 32% 손실; WT에서 5% 손실)을 나타냈다. 중용량 수준의 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 전신 전달은, 전경골근 근육에서 65.5% 디스트로핀 및 235.4 mN/mm2로 개선된 특이적 힘 출력의 복원을 야기하였고, 단지 25%의 힘 감소로 반복된 편심 수축 손상으로부터 근육을 보호하였다(도 21). WT 중용량 그룹은 벡터 처리 후 독성의 부재 및 기능적 결과 측정의 유지를 입증하기 위해 야생형 처리된 코호트를 나타낸다.

요약

근육내 주사에 의한 생체 역가의 초기 입증 후, 골격근, 횡격막 및 심장을 형질도입하면서 혈관 전달을 통해 마이크로-디스트로핀의 유사하거나 증가된 복원이 달성되었다. 이 효능은 염증의 감소, 보다 적은 변성 섬유, 전경골근 및 횡경막의 편심 수축을 방지함으로써 기능적 회복을 개선함으로써 용량 의존적 방식으로 이영양성 특성의 전환을 나타냈다. 벡터의 기능적 이점은 횡격막 및 TA의 힘 생성에서 야생형 수준으로의 단계적 개선을 포함한다.

실시예 9

rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 이용한 전신 처리의 독성 및 생체 분포

rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 전신 주사가 제공된 mdx 마우스로부터의 기관 및 조직을 실시간 정량적 PCR을 위해 수집하여, 벡터 DNA의 특이적 서열을 검출하였다. 수집된 모든 기관 및 조직으로부터 추출된 단백질을 웨스턴 블랏에서 수행하여, 표적 외 기관에서 마이크로-디스트로핀을 검출하였다.

시험 물품은 3가지 용량 수준으로 제공되었다: 4-5 주령의 정맥내 경로에 의해, 저용량 (2 x 10¹² vg; 8 x 10¹³ vg/kg), 중용량 (6 x 10¹² vg; 8 x 10¹⁴ vg/kg) 및 고용량 (1.2 x 10¹³ vg; 6 x 10¹⁴ vg/kg). 벡터의 안전성을 평가하기 위해, H&E 염색을 근육 조직 및 이전에 기술된 동일한 마우스 코호트로부터 수확된 모든 주요 기관의 동결 절단(cryosection)을 수행하였다. 또한, 중용량에서 벡터로 전신 처리된 C57BL6 WT 마우스로부터의 기관 및 근육이 포함되었다. 젖산 링거 처리된 mdx 및 WT 마우스를 조직 병리학 분석에 포함시켰다. 이 섹션은 제3자의, 면허가 있는 수의학 병리학자에 의해 독성에 대해 공식적으로 검토되었으며, 임의의 마우스로부터의 임의의 샘플에서 유해작용이 관찰되지 않았다';결과는 아래에 요약되어 있습니다.

그룹 세부 사항 및 연구 설계는 하기 4에 도시되어 있다.

표 5: rAAVrh74.MHCK7.마이크로 디스트로핀 안전성 연구 설계

벡터 형질도입된 조직의 조직병리학적 검토

rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 IV 주사는 검사된 임의의 골격근의 근섬유에 임의의 미세한 변화도 유발하지 않았다. 또한, 조직학적으로 평가된 임의의 조직에서도 치료 관련 병변이 보이지 않았다. 언급된 임의의 변화는 처리된 마우스 및 대조군 마우스 둘 다에서 관찰되었고, 부수적인 발견으로 간주되었다. 종합하면, 이들 데이터는 이 시험 물품이 시험 대상체에 의해 잘 용인된다는 것을 나타낸다. 또한, 연령-매칭된 미처리된 mdx 마우스로부터의 기준 표본과 비교하여, rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 투여는 처리된 mdx 마우스에서 근섬유 위축을 감소시켰으며, 따라서 시험 물품이 mdx의 결핍과 관련된 근병증의 정도를 개선할 수 있음을 보여준다.

벡터로 전신 치료된 질환이 있는 mdx 마우스의 검토에 더하여, rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀을 mdx 마우스의 상기 연구에서 확립된 최소 유효 용량(MED)과 동일한 용량, 6x10¹² vg 총 용량(2x10¹⁴ vg/kg)으로 5개의 C57BL/6 WT 마우스에 전신 전달하였다. 이는 건강한 WT 마우스에서 시험 물품의 정맥내 전달 연구를 통해 임의의 유해작용이 단지 치료로 인해 발생하는 경우 더욱 명확하게 측정될 수 있다. 여기서 다시, 심장과 함께 횡격막을 포함한 다양한 골격근과 5개의 다른 장기가 수확되었고, 각 조직의 H&E 섹션은 독립적인 수의학 병리학자에 의해 공식적으로 검토되었다.

벡터 게놈 생체 분포

시험 물품-특이적 DNA 서열의 존재는 실시간 정량 PCR 검정(qPCR)을 사용하여 검사하였다. 용량 수준 당 3개의 벡터 투여된 mdx 동물로부터 수집된 조직 샘플에 대해 생체 분포 분석을 수행하였다. 양성 신호는 100개의 단일 가닥 DNA 카피수/㎍ 검출된 게놈 DNA 이상이었다. 조직을 부검에서 수확하고, MHCK7 프로모터의 서열에 특이적인 벡터 특이적 프라이머 프로브 세트를 사용하였다. 도 22 및 하기 표 6은 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 주사된 마우스로부터 각 조직 샘플에서 검출된 벡터 게놈 카피수를 도시한다.

표 6: 용량 수준 당 3개의 벡터 투여된 mdx 마우스로부터의 기관 및 근육에서의 벡터 게놈 카피 수. 값은 vg/μg 게놈 DNA로 표시된다.

rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀 전사체는 모든 수집된 조직에서 다양한 수준으로 검출되었다. 예상한 바와 같이, 골격근과 심장에서 가장 높은 수준이 나타났다. 생식선, 폐, 신장 및 비장에서 최저 수준이 검출되었다. 이들 데이터는 시험 물품이 벡터 투여 마우스의 모든 조사된 조직으로 효율적으로 전달되었음을 나타낸다.

상기 qPCR 결과가 나타내는 바와 같이, rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀의 정맥내 전달은 대부분의 조직에서 다양한 수준으로 벡터 전사체의 분포를 초래하였으며, 간, 심장 및 사두근 근육(중용량) 및 간, 심장 및 비복근 근육(고용량)에서 최고 수준이 발생하였다. 따라서, 이 연구 부분의 목적은 근육 특이적 MHCK7 프로모터의 기능성을 보장하기 위해 이들 조직에서 인간 마이크로-디스트로핀 트랜스진의 단백질 발현을 측정하는 것이었다. 웨스턴 블랏팅을 사용하여 조직 샘플에서 마이크로-디스트로핀 발현을 검출하였다.

단백질 발현 및 벡터 생체 분포는 또한 qPCR 및 웨스턴 블랏팅을 사용하여 평가되었고(도 23), 이들 데이터는 오프 사이트 기관에서의 벡터의 정상 수준 및 고용량 처리된 간에서 마이크로-디스트로핀 단백질의 최소 검출을 나타낸다. 이러한 결과는 간에서 병리학자에 의해 측정된 바와 같이 독성이 없는 것과 상관 관계가 있었다. 또한, 혈청 화학은 독립적인 CRO(Charles River Laboratories)에 의해 분석되어 분석된 모든 화학에 대한 정상 값을 나타낸다. 간 효소 AST에는 3개의 비정상 값이 있었고, 그 중 2개는 mdx-LR 그룹에서, 그 중 1개는 중용량 그룹에서 나타났다(도 23). 동물의 서브 세트는 크레아틴 키나아제 분석(CK)을 받았으나, 샘플은 생리학적 평가 전후에 분석되었다. 혈청의 분석은 시험 물품 전달 후 독성의 결여를 입증한다.

마이크로-디스트로핀 단백질 발현은 모든 골격근 샘플 뿐만 아니라 심장 샘플에서 다양한 양으로 관찰되었다(도 24). 그러나, 간에서 고용량 코호트에서 최소 단백질이 검출되었다. 이는 양성 결과로 여겨지며 간에서의 존재는 간의 평활근에서의 발현 때문일 수 있다. 중요하게도, 간에서 독립적인 병리학자 보고서에 의해 표시되는 유해한 조직 병리학적 효과는 없었다.

요약

조직 병리학적 검토는 mdx-LR 코호트가 평가된 모든 7개의 골격근 및 심장의 우심실 벽에 영향을 미치는 광범위한 근병증을 나타내는 것으로 결론지었다. 조직 병리학적 검토의 주요 발견은 뚜렷하고 광범위한 근섬유 위축(정상 근섬유 크기의 30-75%), 최소 내지 약한 단핵 세포 염증, 증가된 간질 공간 및 증가된 세포질 미네랄 침착을 포함하였다. 횡격막은 단핵 세포 침윤 및 근섬유 위축에서 가장 현저한 변화를 나타냈다. 심장은 심실 심근에서 최소의 단핵 세포 축적의 작은 병소를 나타냈다. 벡터 투여 코호트는 모든 골격 조직 및 심장에서 실질적으로 감소된 근병증을 갖는다. 조직 병리학적 발견에서의 감소는 고용량 그룹이 실질적으로 더 적은 변성 및 염증을 갖는 용량 의존 방식이었다. WT 처리된 코호트 및 벡터 투여된 mdx 코호트에서 기록된 바와 같이 rAAVrh74.MHCK7.마이크로-디스트로핀으로의 벡터 처리로 인한 유해작용은 없었다. 처리에 상관없이, mdx 및 WT 마우스의 간 및 폐에서 부수적인 발견이 있었으며, 여기서 마우스는 간세포 세포질의 약한 액포화를 나타냈다. 따라서, 시험 물품은 안전하고 효과적이며, 보호 효과는 용량 의존적이었다.

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Claims (40)

1. 재조합 AAV 벡터로서, 근육 특이적 조절 요소 뉴클레오티드 서열, 및 마이크로-디스트로핀 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
2. 제1항에 있어서, 상기 마이크로-디스트로핀 단백질을 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열은,
   a) 상기 뉴클레오티드 서열 서열번호 1과 적어도 85% 동일하고 기능성 마이크로-디스트로핀 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는
   b) 서열번호 1의 상기 뉴클레오티드 서열
   을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 근육 특이적 조절 요소가 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 근세포-특이적 인핸서 결합 인자(MEF), 근육 크레아틴 키나아제(MCK), 절단된(truncated) MCK(tMCK), 미오신 중쇄(MHC), 하이브리드 α-미오신 중쇄 인핸서-/MCK 인핸서-프로모터(MHCK7), C5-12, 뮤린 크레아틴 키나아제 인핸서 요소, 골격 속근 트로포닌 c 유전자 요소, 지근 심장 트로포닌 c 유전자 요소, 지근 트로포닌 i 유전자 요소, 저산소증-유발성 핵 인자, 스테로이드-유발성 요소, 또는 글리코코르티코이드 반응 요소(GRE)인, 재조합 AAV 벡터.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근육 특이적 조절 요소가 근육 크레아틴 키나아제(MCK) 또는 하이브리드 α-미오신 중쇄 인핸서-/MCK 인핸서-프로모터(MHCK7)인, 재조합 AAV 벡터.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근육 특이적 조절 요소가 상기 뉴클레오티드 서열 서열번호 4를 포함하는 근육 크레아틴 키나아제(MCK) 또는 상기 뉴클레오티드 서열 서열번호 2를 포함하는 하이브리드 α-미오신 중쇄 인핸서-/MCK 인핸서-프로모터(MHCK7)인, 재조합 AAV 벡터.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 3의 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
8. 서열번호 1의 상기 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 상기 MHCK7 프로모터 서열을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
9. 서열번호 3의 pAAV.MHCK7.마이크로-디스트로핀 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 및 4의 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
11. 제1항 내지 제5항 또는 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 5의 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 혈청형 AAVrh.74, AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 또는 AAV13의 것인, 재조합 AAV 벡터.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근육 특이적 조절 요소 뉴클레오티드 서열이 상기 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되는, 재조합 AAV 벡터.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 조성물.
15. 치료적 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터 또는 제14항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 근이영양증을 앓고 있는 대상체의 근력 및/또는 근육량을 증가시키는 방법.
16. 치료적 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터 또는 제14항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 근이영양증을 앓고 있는 대상체의 섬유증을 감소시키거나 예방하는 방법.
17. 치료적 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터 또는 제14항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 근이영양증을 치료하는 방법.
18. 서열번호 1의 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 MHCK7 프로모터 뉴클레오티드 서열을 포함하는 치료적 유효량의 재조합 AAV 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 근이영양증을 치료하는 방법.
19. 서열번호 3의 pAAV.MHCK7.마이크로-디스트로핀 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함하는 치료적 유효량의 재조합 AAV 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 근이영양증을 치료하는 방법.
20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근이영양증은 듀시엔형 근이영양증(Duchenne Muscular Dystrophy)인, 방법.
21. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터 또는 상기 조성물이 근육내 주사 또는 정맥내 주사에 의해 투여되는, 방법.
22. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터 또는 상기 조성물이 전신으로 투여되는, 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터 또는 상기 조성물이 주사, 주입 또는 이식에 의해 비경구적으로 투여되는, 방법.
24. 근이영양증을 앓고 있는 대상체의 근력 또는 근육량을 증가시키기 위해 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터를 포함하는, 조성물.
25. 근이영양증을 치료하기 위해 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터를 포함하는, 조성물.
26. 근이영양증을 치료하기 위해 서열번호 1의 상기 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 상기 MHCK7 프로모터 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 포함하는, 조성물.
27. 근이영양증을 치료하기 위해 서열번호 3의 pAAV.MHCK7.마이크로-디스트로핀 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 포함하는, 조성물.
28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근이영양증은 듀시엔형 근이영양증인, 조성물.
29. 근육내 주사 또는 정맥내 주사를 위해 제형화된 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항의 조성물.
30. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터 또는 상기 조성물은 전신으로 투여되는, 방법.
31. 제30항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터 또는 상기 조성물은 주사, 주입 또는 이식에 의해 비경구적으로 투여되는, 방법.
32. 근이영양증을 앓고 있는 대상체의 근력 또는 근육량을 증가시키기 위한 약제를 제조하기 위해 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터 또는 제14항의 조성물의 용도.
33. 근이영양증을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위해 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터 또는 제14항의 조성물의 용도.
34. 근이영양증을 앓고 있는 대상체의 섬유증을 감소시키거나 예방하기 위한 약제를 제조하기 위해 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터 또는 제14항의 조성물의 용도.
35. 근이영양증을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위해, 서열번호 1의 상기 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 2의 상기 MHCK7 프로모터 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 AAV 벡터의 용도.
36. 근이영양증을 치료하기 위해 서열번호 3의 pAAV.MHCK7.마이크로-디스트로핀 작제물 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 AAV 벡터의 용도.
37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근이영양증이 듀시엔형 근이영양증인, 용도.
38. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제는 근육내 주사 또는 정맥내 주사를 위해 제형화되는, 용도.
39. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제는 전신 전달을 위해 제형화되는, 용도.
40. 제39항에 있어서, 상기 약제는 주사, 주입 또는 이식에 의해 비경구 투여하기 위해 제형화되는, 용도.

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