KR102649707B1 - 근이영양증을 치료하기 위한 마이크로-디스트로핀의 아데노-관련 바이러스 벡터 전달 - Google Patents

근이영양증을 치료하기 위한 마이크로-디스트로핀의 아데노-관련 바이러스 벡터 전달 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제조된 인간 마이크로-디스트로핀 유전자를 포함하는 재조합 AAV 벡터 및 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 섬유증을 감소 또는 예방하기 위해 재조합 벡터를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

근이영양증을 치료하기 위한 마이크로-디스트로핀의 아데노-관련 바이러스 벡터 전달
본원은 2016년 4월 15일자로 출원된 미국 가출원 제62/323,163호 및 2017년 3월 17일자로 출원된 미국 가출원 제62/473,253호에 대한 우선권 이득을 주장하며 상기 특허 둘 다는 전체가 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 소형화된 인간 마이크로-디스트로핀 유전자를 발형하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터와 같은 유전자 요법 벡터, 및 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 섬유증을 감소시키고 예방하기 위해 이들 벡터를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 손상으로부터 금육 섬유를 보호하고 근력을 증가시키는 병용 유전자 치료 방법을 제공한다.
운동 및 호흡과 같은 일상 활동 및 전신 대사를 위한 근육량 및 강도의 중요성은 분명하다. 근육 기능의 결핍은 근육 약화 및 소모를 특징으로 하며 삶의 질에 심각한 영향을 미치는 근이영양증(MD: muscular dystrophies)을 생성한다. 가장 잘 특성화된 MD는 디스트로핀 관련 단백질 복합체(DAPC: dystrophin-associated protein complex)의 구성원을 암호화하는 유전자의 돌연변이로부터 기인한다. 이러한 MD는 DAPC에 의한 근형질막-세포골격 계류의 손실과 관련된 막 취약성으로부터 기인한다. 듀시엔형 근이영양증(DMD: Duchenne Muscular Dystropy)은 5000명 신생아 남아에게 영향을 미치는 가장 파괴적인 근육 질환 중 하나이다.
본 출원은 DMD에 대한 치료법을 개발하기 위한 두 가지 해독 접근법을 포함한다. 섬유화 침윤(fibrotic infiltration)은 DMD에서 극심하며 임의의 잠재적 요법에 중요한 장애물이다. 유전자 대체만이 DMD를 가진 아주 어린 아이들에게 이미 존재하는 섬유증의 심각성으로 인해 방해 받는다는 것을 고려하는 것도 중요하다. 사실, 4-5세 사이의 일반적인 진단 나이에 근육 생검은 매우 현저한 수준의 섬유증을 보인다.
DMD는 DMD 유전자에서의 돌연변이에 의해 유발되어 mRNA의 감소와 디스트로핀인 디스트로핀-관련 단백질 복합체(DAPC)와 관련된 427 kD 근형질막 단백질의 부재로 이어진다(Hoffman et al., Cell 51(6):919-28, 1987). DAPC는 액틴 결합 단백질인 디스트로핀과 라미닌-결합 단백질인 알파-디스트로글리칸을 통한 세포외 기질(ECM)과 세포골격 사이에 구조적 연결을 형성하는 근육 근초에서 다중 단백질로 구성된다. 이들 구조적 연결은 수축 동안 근육 세포막을 안정화시키고 수축-유발 손상을 보호한다. 디스트로핀 손실과 함께, 막 취약성은 근형질막이 찢어지고 칼슘이 유입되어 칼슘-활성화된 프로테아제와 분절성 섬유 괴사를 촉발한다(Straub et al., Curr Opin. Neurol. 10(2): 168-75, 1997). 이러한 조절되지 않은 근육 변성과 재생 사이클은 궁극적으로 근육 줄기 세포 집단을 고갈시켜(Sacco et al., Cell, 2010. 143(7): p. 1059-71; Wallace et al., Annu Rev Physiol, 2009. 71: p. 37-57), 진행성 근육 약화, 근내막 염증, 및 섬유화 흉터를 초래한다.
디스트로핀 또는 마이크로-디스트로핀으로부터 막 안정화 없이, DMD는 조절되지 않는 조직 손상 및 회복 사이클을 나타내며 궁극적으로 손실된 근육 섬유를 연결 조직 증식을 통한 섬유화 반응 조직으로 대체할 것이다. 섬유증은 콜라겐과 엘라스틴을 포함한 ECM 기질 단백질의 과도한 축적을 특징으로 한다. ECM 단백질은 스트레스와 염증에 반응하는 활성화된 섬유아세포에 의해 방출되는 TGFβ와 같은 사이토카인으로부터 주로 생산된다. DMD의 주요 병리학적 특징이 근섬유 변성과 괴사이지만, 병리학적 결과로서 섬유증은 동일한 반향을 갖는다. 섬유화 조직의 과잉 생산은 근육 재생을 제한하고 DMD 환자의 진행성 근육 약화에 기여한다 한 연구에서, 초기 DMD 근육 생검에서의 섬유증의 존재는 10년 추적 관찰에서 불량한 운동 결과와 높은 상관 관계가 있었다(Desguerre et al., J Neuropathol Exp Neurol, 2009. 68(7): p. 762-7). 이들 결과는 섬유증을 DMD 근육 기능장애의 주요 원인으로서 지적하고 섬유화 조직을 감소시키는 요법을 개발할 필요성을 강조한다. mdx 마우스에서 시험된 대부분의 항-섬유화 요법은 TGFβ 경로의 억제를 통한 섬유화 사이토카인 신호전달을 차단하는 작용을 한다. 마이크로RNA(miRNA)는 mRNA의 3' UTR 내에서 염기와 짝을 지어 해독을 억제하거나 mRNA 분해를 촉진함으로써 전사 후 수준에서 유전자 사일렁싱을 중재하는 ~22개 뉴클레오타이드의 단일 가닥 RNA이다. miRNA의 5' 말단에서 7 bp의 씨드 서열은 miRNA를 표적으로 한다; 부가적인 인식은 표적화 서열의 나머지 뿐만 아니라 이의 2차 구조에 의해 제공된다. MiRNA는 근육 질환 병리학에서 중요한 역학을 하며 문제의 근이영양증의 유형에 독특하게 의존하는 발현 프로파일을 나타낸다(Eisenberg et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(43): p. 17016-21). 점차 커지고 있는 실제 증거는 miRNA가 심장, 간, 신장, 및 폐를 포함한 많은 기관에서 섬유화 과정에 관여한다는 것을 시사한다(Jiang et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(43): p. 17016-21). 최근에, miR-29의 하향-조절은 심장 섬유증에 기여하는 것으로 나타났으며(Cacchiarelli et al., Cell Metab, 2010. 12(4): p. 341-51), miR-29의 감소된 발현은 유전적으로 인간 DMD 환자 근육과 관련되었다(Eisenberg et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(43): p. 17016-2). miR-29 계열은 2개의 바이시스트론성(bicistronic) miRNA 클러스터로부터 발현된 3개의 계열 구성원으로 이루어진다. MiR-29a는 miR-29b와 동시발현되고(miR-29b-1); miR-29c는 miR-29b의 제2 카피와 동시발현된다(miR-29b-2). miR-29 계열은 보존된 씨드 서열을 공유하며, miR-29a와 miR-29b 각각은 miR-29c로부터 하나의 염기만이 다르다. 또한, mdx 마우스 근육 내로의 miR-29 플라스미드(miR-29a 및 miR-29b-1의 클러스터)의 전기천공은 ECM 성분, 콜라겐 및 엘라스틴의 발현 수준을 감소시켰고 치료후 25일 내에 근육 절편에서 콜라겐 침착을 강하게 감소시켰다(Cacchiarelli et al., Cell Metab, 2010. 12(4): p. 341-51).
아데노-관련 바이러스(AAV)는 복제-결핍 파보바이러스이고, 이의 단일 가닥 DNA 게놈은 145 뉴클레오타이드 역전된 말단 반복(ITR)을 포함하여 길이가 약 4.7 kb이다. AAV의 여러 혈청형이 존재한다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, AAV 혈청형 2(AAV2) 게놈의 뉴클레오타이드 서열은 문헌(Ruffing et al., J Gen Virol, 75: 3385-3392 (1994))에 의해 보정된 바와 같은 문헌(Srivastava et al., J Virol, 45: 555-564 (1983))에 제시된다. 다른 예로서, AAV-1의 완전한 게놈은 GenBank 승인 번호 NC_002077로 제공되고; AAV-3의 완전한 게놈은 GenBank 승인 번호 NC_1829로 제공되고; AAV-4의 완전한 게놈은 GenBank 승인 번호 NC_001829로 제공되고; AAV-5 게놈은 GenBank 승인 번호 AF085716으로 제공되고; AAV-6의 완전한 게놈은 GenBank 승인 번호 NC_00 1862로 제공되고; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부는 각각 GenBank 승인 번호 AX753246 및 AX753249로 제공되고(또한 AAV-8에 관해 미국 특허 제7,282,199호 및 제7,790,449호 참조); AAV-9 게놈은 문헌(Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004))에 제공되고; AAV-10 게놈은 문헌(Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006))에 제공되고; AAV-11 게놈은 문헌(Virology, 330(2): 375-383 (2004))에 제공된다. AAV rh.74 혈청형은 문헌(Rodino-Klapac et al. J. Trans. Med. 5: 45 (2007))에 기재된다. 바이러스 DNA 복제(rep), 캡시드화/패키징 및 숙주 세포 염색체 통합을 지시하는 시스-작용 서열은 ITR 내에 함유된다. 3개의 AAV 프로모터(이들의 상대적 지도 위치에 대해 p5, p19 및 p40으로 명명됨)는 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 두 개의 AAV 내부 개방 판독 프레임의 발현을 구동한다. 단일 AAV 인트론(예를 들어, AAV2 뉴클레오타이드 2107 및 2227에서)의 차별적 스플라이싱과 결합된 두 개의 rep 프로모터(p5 및 p19)는 rep 유전자로부터 4개의 rep 단백질(rep 78, rep 68, rep 52 및 rep 40)의 생산을 초래한다. Rep 단백질은 궁극적으로 바이러스 게놈을 복제할 책임이 있는 여러 가지 효소 특성을 보유한다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되고, 이는 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 암호화한다. 대안적인스 플라이싱 및 비-컨센서스 해독 개시 부위는 3개의 관련 캡시드 단백질의 생산을 담당한다. 단일 컨센서스 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 지도 위치 95에 위치한다. AAV의 라이프 사이클 및 유전학은 문헌(Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992))에서 검토된다.
AAV는, 예를 들어, 유전자 요법에서, 외래 DNA를 세포에 전달하기 위한 벡터로서 매력적이도록 하는 독특한 특징을 갖는다. 배양물내 세포의 AAV 감염은 비세포변성이며, 인간 및 다른 동물의 자연 감염은 조용하며 무증상성이다. 또한, AAV는 많은 포유동물의 세포를 감염시켜 생체내에서 많은 상이한 조직의 표적화 가능성을 허용한다. 또한, AAV는 서서히 분열 및 비분열 세포를 형질도입하며, 이들 세포의 생존 기간 동안 본질적으로 전사 활성 핵 에피솜(염색체외 요소)으로서 유지할 수 있다. AAV 프로바이러스 게놈은, 재조합 게놈의 작제를 가능하게 하여 플라스미드내 클로닝된 DNA로서 감염성이다. 또한, AAV 복제, 게놈 캡슐화 및 통합을 지시하는 신호가 AAV 게놈의 ITR 내에 포함되기 때문에, (복제 및 구조적 캡시드 단백질, rep-cap를 암호화하는) 게놈의 내부 약 4.3 kb의 일부 또는 모두가 프로모터, 관심 있는 DNA 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 유전자 카세트와 같은 외래 DNA로 대체될 수 있다. rep 및 cap 단백질은 트랜스로 제공될 수 있다. AAV의 또 다른 중요한 특징은, 그것이 극도고 안정적이고 원기 왕성한 바이러스라는 것이다. 이는 아데노바이러스를 불활성화하는데 사용된 조건(수시간 동안 56 내지 65℃)을 쉽게 견디어 AAV의 저온 보존을 덜 위험하게 한다. AAV는 심지어 동결건조시킬 수 있다. 최종적으로, AAV-감염된 세포는 중복감염에 내성이 없다.
다수의 연구가 근육에서 장기간(> 1.5년) 재조합 AAV-매개된 단백질 발현을 입증하였다. 문헌(Clark et al., Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997); Kessler et al., Proc Nat. Acad Sc. USA, 93: 14082-14087 (1996); and Xiao et al., J Virol, 70: 8098-8108 (1996))을 참조한다. 또한, 문헌(Chao et al., Mol Ther, 2:619-623 (2000) and Chao et al., Mol Ther, 4:217-222 (2001))을 참조한다. 또한, 근육이 고도로 혈관화되기 때문에, 재조합 AAV 형질도입은 문헌(Herzog et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997) and Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921-13926 (1997))에 기재된 바와 같이 근육내 주사 후 전신 순환에서 유전자 도입 생성물의 출현을 초래하였다. 또한, 문헌(Lewis et al., J Virol, 76: 8769-8775 (2002))은 골격 근섬유가 올바른 항체 글리코실화, 폴딩 및 분비에 필요한 세포 인자를 보유하여 근육이 분비된 단백질 치료제의 안정한 발현을 가능하게 함을 나타낸다는 것을 부여주었다.
DMD 및 다른 근이영양증을 앓고 있는 환자의 기능적 향상은 유전자 회복과 섬유증의 감소 둘 다를 필요로 한다. DMD 및 다른 근이영양증의 보다 효과적인 치료를 위해 유전자 회복 방법과 쌍을 이룰 수 있는 섬유증을 감소시키는 방법이 필요하다. miR29는 잠재적인 유전자 조절인자이며 근육섬유증을 감소시키기 위한 이상적인 후보이다.
본 발명은 마이크로RNA miR29를 전달함으로써 연결 조직(콜라겐 1, 콜라겐 3 및 피브로넥틴)을 전달함으로써 세가지 주요 성분을 직접적으로 감소시키는 유전자 치료 방법에 관한 것이다. 이 시스템에서, miR29는 콜라겐 및 피브로넥틴 유전자의 3' UTR에 결합하여 발현을 하향 조절한다. 본 발명은 유전자 요법 벡터, 예를 들어, 마이크로RNA miR29의 가이드 가닥을 발현하는 AAV 및 근육에 miR29를 전달하여 섬유증을 감소 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, DMD에서 관찰되는 유전자 결함을 다루기 위해 마이크로-디스트로핀과 함께 섬유증을 억제하기 위해 유전자 요법 벡터 전달체 miR-29를 사용하여 섬유증을 감소시키고 예방하는 병용 요법 및 접근법을 제공한다. 실시예 5-7에 나타낸 바와 같이, 병용 치료는 섬유증의 큰 감소, 근육 크기 증가 및 근육힘 증가를 초래하였다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 miR-29를 발현하는 rAAV 벡터를 제공한다. 예를 들어, rAAV 벡터는 서열번호 3의 miR-29c 표적 가이드 가닥, 서열번호 4의 miR-29c 가이드 가닥 및 천연 miR-30 골격 및 스템 루프(서열번호 5)를 포함하는 뉴클레오타이드 서열과 같은 miR29c를 발현하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. miR-30 골격에서 miR-29c cDNA를 포함하는 예시적인 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2로 제시된다(도 1).
본 발명의 예시적인 rAAV는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 pAAV.CMV.Mir29C이며; 여기서, CMV는 프로모터는 뉴클레오타이드 120-526에 걸쳐 있고, EF1a 인트론은 뉴클레오타이드 927-1087 및 뉴클레오타이드 1380-1854에 걸쳐 있고, miR-29c의 가이드 가닥은 뉴클레오타이드 1257-1284에 걸쳐 있고, 1차 씨드 서열을 갖는 shRNA-miR29-c는 뉴클레오타이드 1088-1375에 걸쳐 있고, 폴리 A 서열은 뉴클레오타이드 1896-2091에 걸쳐 있다. 하나의 양상에서, 본 발명의 rAAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAVrh.74, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 또는 AAV13이다.
본 발명의 또 다른 예시적인 rAAV는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 pAAV.MHC.Mir29C이며; 여기서, MCK 인핸서는 뉴클레오타이드 190-395에 걸쳐 있고, MHC 프로모터는 뉴클레오타이드 396-753에 걸쳐 있고, EF1a 인트론은 뉴클레오타이드 1155-1315 및 뉴클레오타이드 1609-2083에 걸쳐 있고, miR-29c의 가이드 가닥은 뉴클레오타이드 1487-1512에 걸쳐 있고, 1차 씨드 서열을 갖는 shRNA-miR29-c는 뉴클레오타이드 1316-1608에 걸쳐 있고, 폴리 A 서열은 뉴클레오타이드 2094-2146에 걸쳐 있다. 하나의 양상에서, 본 발명의 rAAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAVrh.74, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 또는 AAV13이다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 rAAV 벡터는 근육-특이적 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 근육-특이적 조절 요소는 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 근세포-특이적 인핸서 결합 인자 MEF, 근육 크레아틴 키나제(MCK), tMCK(절단된 MCK), 미오신 중쇄(MHC), C5-12(합성 프로모터), 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서 요소, 골격 속근(fast-twitch) 트로포닌 C 유전자 요소, 지근(slow-twitch) 심장 트로포닌 C 유전자 요소, 지근 트로포닌 I 유전자 요소, 저산소증-유발성 핵 인자, 스테로이드-유발성 요소 또는 글리코코르티코이드 반응 요소(GRE)이다.
예를 들어, 본 발명의 임의의 rAAV 벡터는 서열번호 10의 MCK 인핸서 뉴클레오타이드 서열 및/또는 서열번호 11의 MCK 프로모터 서열을 포함하는 근육-특이적 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 rAAV 벡터를 포함하는 약제학적 조성물 (또는 때로는 본원에서 간단히 "조성물"로 지칭됨)을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 형질감염됨 세포를 본 발명의 임의의 rAAV 벡터로 배양하는 단계 및 형질감염된 세포의 상등액으로부터 rAAV 입자를 회수하는 단계를 포함하여, rAAV 벡터 입자를 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 임의의 재조합 AAV를 포함하는 바이러스 입자를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 miR-29를 발현하는 본 발명의 임의의 rAAV 벡터의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 섬유증을 감소시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 임의의 rAAV는 섬유증을 감소시키기 위해, 특히 대상체의 골격 근육 또는 심근에서 섬유증을 감소시키기 위해 근이영양증을 앓고 있는 대상체에게 투여된다. 이들 방법은 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
"섬유증"은 골격근, 심근, 간, 폐, 신장, 및 췌장을 포함한 손상시 조직에서 세포외 기질(ECM: extracellular matrix) 성분 및 비정상적 회복의 과도한 또는 조절되지 않은 침착을 지칭한다. 침착되는 ECM 성분은 피브로넥틴 및 콜라겐, 예를 들어, 콜라겐 1, 콜라겐 2 또는 콜라겐 3을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 miR-29를 발현하는 본 발명의 임의의 재조합 AAV 벡터의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 섬유증을 예방하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 임의의 rAAV는 섬유증을 예방하기 위해 근이영양증을 앓고 있는 대상체에게 투여되며, 예를 들어, miR-29를 발현하는 본 발명의 rAAV는 대상체에서 섬유증이 관찰되기 전에 투여된다. 또한, miR-29를 발현하는 본 발명의 rAAV는 섬유증 발병 위험이 있는 대상체, 예상 들어, 근이영양증, 예를 들어, DMD를 앓고 있거나 이를 진단받은 대상체에게 투여된다. 본 발명의 rAAV는 이들 대상체에서 새로운 섬유증을 예방하기 위해 근이영양증을 앓고 있는 대상체에게 투여된다. 이들 방법은 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 miR-29를 발현하는 본 발명의 임의의 rAAV 벡터의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하여, 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 근육힘 및/또는 근육량을 증가시키는 방법을 제공한다. 이들 방법은 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
용어 "병용 요법" 및 "병용 치료"는 miR-29를 발현하는 본 발명의 rAAV 벡터 및 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV 벡터의 투여를 지칭한다.
본 발명의 임의의 방법에서, 대상체는 근이영양증, 예를 들어, DMD, 베커(Becker) 근이영양증 또는 임의의 다른 디스트로핀-관련 근이영양증을 앓고 있을 수 있다. 또한, 본 발명의 임의의 방법에서, 대상체는 디스트로핀병증을 앓고 있을 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 마이크로-디스트로핀 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 제공한다. 본 발명은 a) 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85% 동일성을 갖고 기능성 마이크로-디스트로핀 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, b) 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열, 또는 c) 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 rAAV를 제공한다.
본 발명의 마이크로-디스트로핀을 발현하는 예시적인 rAAV는 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 pAAV.mck.마이크로-디스트로핀이며 도 10 및 11에 나타낸다. 이 rAAV 벡터는 MCK 프로모터, 키메라 인트론 서열, 마이크로-디스트로핀 유전자에 대한 암호화 서열, 폴리A, 암피실린 내성 및 pBR322 오리진 또는 복제를 갖는 pGEX 플라스미드 골격을 포함한다. 하나의 양상에서, 본 발명의 재조합 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAVrh.74, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 또는 AAV13이다.
본 발명은 서열번호 8과 예를 들어 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%, 보다 전형적으로 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 및 보다 더 전형적으로 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성인, 마이크로-디스트로핀 단백질을 암호화하는 rAAV 벡터를 제공하며, 여기서, 단백질은 마이크로-디스트로핀 활성을 유지한다. 마이크로-디스트로핀 단백질은 근육 수축 동안 근육막에 안정성을 제공하는데, 예를 들어, 마이크로-디스트로핀은 근육 수축 동안 충격 흡수제로서 작용한다.
본 발명은 서열번호 7과 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%, 보다 전형적으로 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 및 심지어 보다 전형적으로 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가지며 기능성 마이크로-디스트로핀 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV 벡터를 제공한다.
본 발명은 엄격한 조건하에 서열번호 7의 핵산서열 또는 이의 상보체에 하이브리드화하고, 기능성 마이크로-디스트로핀 단백질을 암호화하는, 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV 벡터를 제공한다.
용어 "엄격한"은 일반적으로 당업계에서 엄격한 것으로 이해되는 조건을 지칭하기 위해 사용된다. 하이브리드화 엄격성은 온도, 이온 강도 및 포름아미드와 같은 변성제의 농도에 의해 주로 결정된다. 하이브리드화 및 세척을 위한 엄격한 조건의 예는 65 내지 68 ℃에서 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산나트륨 또는 42 ℃에서 0.015M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산나트륨 및 50% 포름아미드이다. 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989))을 참조한다. 더욱 엄격한 조건(예를 들어, 고온, 낮은 이온 강도, 높은 포름아미드 또는 다른 변성제)도 또한 사용될 수 있지만, 하이브리드화 속도가 영향을 받는다. 데옥시올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화가 관련되는 경우에, 추가의 예시적인 엄격한 하이브리드화 조건은 37℃(14-염기 올리고용), 48 ℃(17-염기 올리고용), 55 ℃(20-염기 올리고용), 및 60℃(23-염기 올리고용)에서 6x SSC 0.05% 피로인산나트륨에서의 세척을 포함한다.
다른 제제가 비특이적 및/또는 배경 하이브리드화를 감소시킬 목적으로 하이브리드화 및 세척 완충제에 포함될 수 있다. 다른 적합한 제제가 또한 사용될 수 있지만, 예는 0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% 폴리비닐-피롤리돈, 0.1% 피로인산나트륨, 0.1% 도데실황산나트륨, NaDodSO4, (SDS), 피콜, 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 초음파 처리된 연어 정자 DNA (또는 다른 비상보성 DNA) 및 덱스트란 설페이트이다. 이러한 첨가제의 농도 및 종류는 실질적으로 하이브리드화 조건의 엄격성에 영향을 미치지 않고 변경될 수 있다. 하이브리드화 실험은 일반적으로 pH 6.8-7.4에서 수행되지만, 전형적인 이온 강도 조건하에서, 하이브리드화 속도는 거의 pH에 무관하다. 문헌(Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Ch. 4, IRL Press Limited (Oxford, England))을 참조한다. 하이브리드화 조건은 이러한 변수들을 수용하고 상이한 서열 관련성의 DNA가 하이브리드를 형성하도록 하기 위해 당업자에 의해 조정될 수 있다.
또 다른 양상에서, 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV 벡터는 근육-특이적 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 마이크로-디스트로핀 유전자에 작동 가능하게 연결된 암호화 서열을 포함한다. 예를 들어, 근육-특이적 조절 요소는 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 근세포-특이적 인핸서 결합 인자 MEF, 근육 크레아틴 키나제(MCK), tMCK(절단된 MCK), 미오신 중쇄(MHC), C5-12(합성 프로모터), 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서 요소, 골격 속근 트로포닌 C 유전자 요소, 지근 심장 트로포닌 C 유전자 요소, 지근 트로포닌 I 유전자 요소, 저산소증-유발성 핵 인자, 스테로이드-유발성 요소 또는 글리코코르티코이드 반응 요소(GRE)이다.
또한, 본 발명은 서열번호 10 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 근육-특이적 조절 요소를 포함하는 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 rAAV 벡터를 포함하는 약제학적 조성물 (또는 때로는 본원에서 간단히 "조성물"로 지칭됨)을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 rAAV 벡터로 형질감염된 세포를 배양하는 단계 및 형질감염된 세포의 상등액으로부터 rAAV 입자를 회수하는 단계를 포함하는, rAAV 벡터 입자의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 임의의 재조합 AAV 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 제공한다.
본 발명은 또한 숙주 세포를 본 발명의 마이크로-디스트로핀을 발현하는 재조합 AAV 벡터로 감염시키는 단계 및 숙수 세포에서 기능성 마이크로-디스트로핀 단백질을 발현하는 단계를 포함하는, 기능성 마이크로-디스트로핀 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 마이크로-디스트로핀을 발현하는 본 발명의 임의의 rAAV 벡터의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 섬유증을 감소시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 임의의 rAAV는 섬유증을 감소시키기 위해, 특히 대상체의 골격 근육 또는 심근에서 섬유증을 감소시키기 위해 근이영양증 또는 디스트로핀병증을 앓고 있는 대상체에게 투여된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 마이크로-디스트로핀을 발현하는 본 발명의 임의의 재조합 AAV 벡터의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 섬유증을 예방하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 임의의 rAAV는 섬유증을 예방하기 위해 근이영양증 또는 디스트로핀병증을 앓고 있는 대상체에게 투여되며, 예를 들어, 마이크로-디스트로핀을 발현하는 본 발명의 rAAV는 대상체에서 섬유증이 관찰되기 전에 투여된다. 또한, 마이크로-디스트로핀을 발현하는 본 발명의 rAAV는 섬유증 발병 위험이 있는 대상체, 예상 들어, 디스트로핀병증 또는 근이영양증, 예를 들어, DMD 또는 베커 근이영양증을 앓고 있거나 이를 진단받은 대상체에게 투여된다. 본 발명의 rAAV는 이들 대상체에서 새로운 섬유증을 예방하기 위해 디스트로핀병증 또는 디스트로핀병증 근이영양증을 앓고 있는 대상체에게 투여된다.
본 발명은 또한 miR-29를 발현하는 본 발명의 임의의 rAAV 벡터의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하여, 근이영양증 또는 디스트로핀병증을 앓고 있는 대상체에서 근육힘 및/또는 근육량을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 miR-29를 발현하는 rAAV를 투여하는 단계를 포함하는 상기 방법 중 임의의 것은 본원에 기재된 마이크로-디스트로핀을 발현하는 임의의 rAAV를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 용어 "병용 요법" 및 "병용 치료"는 miR-29를 발현하는 본 발명의 rAAV 벡터 및 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV 벡터의 투여를 지칭한다.
miR-29를 발현하는 rAAV 벡터 및 마이크로-디스트로핀 단백질을 발현하는 rAAV 벡터를 투여하는 방법에서, 이들 rAAV 벡터는 동시에 투여될 수 있거나, 마이크로-디스트로핀 단백질을 발현하는 rAAV 직전에 투여되는 miR29를 발현하는 rAAV 벡터와 연속적으로 투여될 수 있거나, 마이크로-디스트로핀 단백질을 발현하는 rAAV 직후에 투여되는 miR29를 발현하는 rAAV 벡터와 연속적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 방법은 마이크로-디스트로핀 단백질을 발현하는 AAV 벡터가 miR-29를 발현하는 rAAV를 투여한 후 약 1 내지 5시간 또는 5 내지 12시간 또는 12 내지 15시간 또는 15 내지 24시간 내에 투여되는 방법으로 수행되거나, 또는 본 발명의 방법은 마이크로-디스트로핀 단백질을 발현하는 AAV 벡터가 miR-29를 발현하는 rAAV를 투여하기 전에 약 1 내지 5시간 또는 5 내지 12시간 또는 12 내지 15시간 또는 15 내지 24시간 내에 투여되는 방법으로 수행된다. 대안적으로, 본 발명의 방법은 마이크로-디스트로핀 단백질을 발현하는 AAV 벡터가 miR-29를 발현하는 rAAV를 투여한 후 약 1 내지 6 또는 12 또는 24시간 내에 투여되는 방식으로 수행되거나, 또는 본 발명의 방법은 마이크로-디스트로핀 단백질을 발현하는 AAV 벡터가 miR-29를 발현하는 rAAV를 투여하기 전에 약 1 또는 6 또는 12 또는 24시간 내에 투여되는 방법으로 수행된다.
본 발명은, 섬유증이 대상체에서 관찰되기 전에, 또는 근육힘이 대상체에서 감소되기 전에, 또는 근육량이 대상체에서 감소되기 전에, DMD 또는 베커 근이영양증과 같은 디스트로핀병증 또는 근이영양증을 진단받은 환자에게 본 발명의 임의의 AAV 벡터를 투여하는 것을 고려한다.
본 발명은 또한 이들 대상체에서 새로운 섬유증을 예방하기 위해 이미 섬유증이 발병되었던, DMD 또는 베커 근이영양증과 같은 디스트로핀병증 또는 근이영양증을 앓고 있는 대상체에게 본 발명의 임의의 rAAV를 투여하는 것을 고려한다. 본 발명은 또한 추가 손상으로부터 근육을 보호하기 위해, 이미 근육힘이 감소되거나 근육량이 감소된 근이영양증을 앓고 있는 환자에게 본 발명의 임의의 rAAV를 투여하는 것을 제공한다.
본 발명의 임의의 방법에서, rAAV 벡터는 근육내 주사 또는 정맥내 주사에 의해 투여된다.
또한, 본 발명의 임의의 방법에서, rAAV 벡터 또는 조성물은 전신 투여된다. 예를 들어, rAAV 벡터 또는 조성물은 주사, 주입 또는 이식에 의해 비경구 투여된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 섬유증을 감소시키기 위해, miR29를 발현하는 임의의 rAAV 벡터 또는 마이크로-디스트로핀을 발현하는 임의의 rAAV 벡터를 포함하거나, miR-29를 발현하는 rAAV 벡터와 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV 벡터 둘 다를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 DMD 또는 베커 근이영양증과 같은 디스트로핀병증 또는 근이영양증을 앓는 환자에서 섬유증을 예방하기 위해, miR29를 발현하는 임의의 재조합 AAV 벡터 또는 마이크로-디스트로핀을 발현하는 임의의 rAAV 벡터를 포함하거나, miR-29를 발현하는 rAAV 벡터와 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV 벡터 둘 다를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 DMD 또는 베커 근이영양증과 같은 디스트로핀병증 또는 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 근육힘 및/또는 근육량을 증가시키기 위해, miR29를 발현하는 본 발명의 임의의 rAAV 벡터 또는 마이크로-디스트로핀 단백질을 발현하는 임의의 rAAV 벡터를 포함하거나, miR-29를 발현하는 rAAV 벡터와 마이크로-디스트로핀 단백질을 발현하는 rAAV 벡터 둘 다를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 DMD 또는 베커 근이영양증과 같은 디스트로핀병증 또는 근이영양증을 치료하기 위해, miR29를 발현하는 본 발명의 임의의 rAAV 벡터 또는 마이크로-디스트로핀 단백질을 발현하는 임의의 rAAV 벡터를 포함하거나, miR-29를 발현하는 rAAV 벡터와 마이크로-디스트로핀 단백질을 발현하는 rAAV 벡터 둘 다를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 근육내 주사 또는 정맥내 주사를 위해 제형화된다. 본 발명의 조성물은 또한 주사, 주입 또는 이식에 의한 비경구 투여와 같은 전신 투여를 위해 제형화된다. 또한, 임의의 조성물은 DMD, 베커 근이영양증 또는 임의의 다른 디스트로핀 관련된 근이영양증과 같은 디스트로핀병증 또는 근이영양증을 앓고 있는 대상체에게 투여하기 위해 제형화된다.
추가의 구현예에서, 본 발명은, 이를 필요로 하는 대상체에서 섬유증을 감소시키기 위한 약제를 제조하기 위한, miR29를 발현하는 본 발명의 임의의 rAAV 벡터 또는 마이크로-디스트로핀을 발현하는 임의의 rAAV 벡터 또는 miR-29를 발현하는 rAAV 벡터와 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV 벡터 둘 다를 포함하는 용도를 제공한다. 예를 들어, 대상체는 DMD, 베커 근이영양증 또는 임의의 다른 디스트로핀 관련된 근이영양증과 같은 디스트로핀병증 또는 근이영양증을 앓고 있을 필요가 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은, 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 섬유증을 예방하기 위한 약제를 제조하기 위한, miR29를 발현하는 본 발명의 임의의 rAAV 벡터 또는 마이크로-디스트로핀을 발현하는 임의의 rAAV 벡터 또는 miR-29를 발현하는 rAAV 벡터와 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV 벡터 둘 다를 포함하는 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은, 디스트로핀병증 또는 근이영양증, 예를 들어, DMD 또는 베커 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 근력 및/또는 근육략을 증가시키기 위한 약제를 제조하기 위한, miR29를 발현하는 본 발명의 재조합 rAAV 벡터 또는 마이크로-디스트로핀을 발현하는 임의의 rAAV 벡터 또는 miR-29를 발현하는 rAAV 벡터와 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV 벡터 둘 다를 포함하는 용도를 제공한다.
본 발명은, 섬유증이 대상체에서 관찰되기 전에, 또는 근육힘이 대상체에서 감소되기 전에, 또는 근육량이 대상체에서 감소되기 전에, DMD를 진단받은 환자에게 투여하기 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명의 임의의 AAV 벡터의 용도를 고려한다.
본 발명은 또한 이들 대상체에서 새로운 섬유증을 예방하기 위해 이미 섬유증이 발병되었던, 근이영양증을 앓고 있는 대상체에게 본 발명의 임의의 rAAV를 투여하기 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명의 임의의 AAV 벡터의 용도를 고려한다. 본 발명은 또한 추가 손상으로부터 근육을 보호하기 위해, 이미 근육힘이 감소되거나 근육량이 감소된 근이영양증을 앓고 있는 환자에게 본 발명의 임의의 rAAV를 투여함을 제공한다.
본 발명은 또한 근이영양증 치료용 약제를 제조하기 위한, miR29를발현하는 본 발명의 rAAV 벡터 또는 마이크로-디스트로핀을 발현하는 임의의 rAAV 벡터 또는 miR-29를 발현하는 rAAV 벡터와 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV 벡터 둘 다를 포함하는 용도를 제공한다.
본 발명의 임의의 용도에서, 약제는 근육내 주사를 위해 제형화된다. 또한, 임의의 약제는 DMD 또는 임의의 다른 디스트로핀 관련된 근이영양증과 같은 근이영양증을 앓고 있는 대상체에세 투여하기 위해 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 임의의 약제는, miR-29를 발현하는 rAAV와 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV 벡터가 동시에 투여되거나, 마이크로-디스트로핀 을 발현하는 rAAV 직전에 투여되는 miR29를 발현하는 rAAV 벡터와 연속적으로 투여되거나, 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV 직후에 투여되는 miR29를 발현하는 rAAV 벡터와 연속적으로 투여되는 병용 요법일 수 있다. 대안적으로, 약제는 miR-29를 발현하는 rAAV를 투여한 후에 약 1 내지 5시간 내에 투여되는 마이크로-디스트로핀 발현 AAV 벡터의 투여를 포함하거나, 약제는 miR-29를 발현하는 rAAV를 투여하기 전에 약 1 내지 5시간 내에 투여되는 마이크로-디스트로핀을 발현하는 AAV 벡터를 포함한다.
도 1은 rAAV 벡터 scAAVCrh.74.CMV.miR29c 및 천연 miR-30 골격내 miR-29c의 뉴클레오타이드 서열 및 예측된 헤어핀 구조의 뉴클레오타이드 서열의 도식을 제공한다.
도 2a 내지 2c는 근육으로의 miR-29c의 주사가 근육 전체의 콜라겐을 감소시키고 miR-29c 발현을 회복시킴을 나타낸다.
도 3a 내지 3c는 miR-29c의 주사가 절대적 근육힘(패널 A)과 특이적 근육힘(패널 B)을 향상시키지만 수축-유발된 손상(패널 C)을 보호하지 않음을 입증한다.
도 4a 내지 4c는 전이유전자 전달의 효능을 측정하기 위한 근육 섬유 발현 마이크로-디스트로핀의 수를 나타낸다.
도 5a 내지 5c 마이크로-디스트로핀과 함께 miR-29c의 동시-전달이 콜라겐 발현(패널 A) 및 섬유증-유발된 디스트로핀 발현을 감소시킴을 입증한다.
도 6a 내지 6d는 콜라겐 1 알파(패널 A), 콜라겐 3 알파(패널 B), 피브로넥틴(패널 C) 및 TGF-β(패널 D)에 의해 측정된 바와 같이, mdx/utrn+/- 마우스에서 miR-29c/마이크로-디스트로핀의 근육내 주사가 세포외 기질(ECM)을 억제함을 나타낸다.
도 7a 내지 7c는 miR-29c 증가된 절대적 힘(패널 A), 정규화된 특이적 힘(패널 B) 및 근육에서 수축-유발 손상으로부터 추가된 보호(패널 C)의 근육내 주사를 입증한다.
도 8은 miR-29c/μ-dys 조합이 3개월령으로 처리된 마우스에서 근육 크기를 증가시키는 것을 나타낸다. 콜라겐을 염색하는 피크로시리우스 레드(picrosirius Red)로 염색된 처리된 및 미처리된 mdx/utrn+/- 비복근 근육의 절편을 보여준다. 섬유화 영역은 분홍색이며 손상되지 않은 근육은 녹색이다. 거시적인 수준에서, miR-29c/μ-dys 조합은 섬유증을 감소시키고 총 단면적을 증가시킨다.
도 9a 내지 9f는 마이크로-디스트로핀과 함께 동시-전달된 miR-29c로 처리하면 단독으로 주사된 것에 비해 주사된 비복근의 총 중량의 증가(패널 A), 평균 섬유 크기 증가에서의 증가(패널 B), 근육의 단면적의 증가(패널 D; 주사되지 않음: 24.6 대 miR-29c: 26.3 대 마이크로-dys: 26.6 대 마이크로-dys/miR-29c: 33.1) 및 근육 섬유 수의 증가(패널 E)로 나타낸 바와 같이 근육 비대 및 증식이 증가되지만 단위 면적당 근육 섬유의 수가 영향을 미치지 않음(패널 F)을 입증한다. 패널 C는 mdx/utrn+/- 대조군과 miR-29c/μ-dys 처리된 mdx/utrn+/-를 비교하며, 평균 직경이 25.96에서 30.97μm로 증가하였다.
도 10a 내지 10g는 AAV.miR-29c/마이크로-디스트로핀 병용 요법의 조기 치료가 섬유증 및 ECM 발현을 감소시키는데 보다 효과적임을 입증한다. 패널 A는 4 내지 5주령으로 주사된 마우스의 야생형, 주사하지 않은, AAV.miR-29c, AAV.마이크로-디스트로핀 및 AAV.miR-29c/AAV.마이크로-디스트로핀의 피크로시리우스 레드 염색을 보여준다. 패널 B는 동시-처리된 근육이 주사되지 않은 GAS 근육에 비해 콜라겐에 51.1% 감소했음을 보여주는 피크로시리우스 레드 염색의 정량화를 제공한다. 패널 C는 qRT-PCR이 처리된 코호트에서 miR-29c 전사체 수준의 증가를 확인한다는 것을 입증한다. 반-정량적 qRT-PCR은 대측성 사지에 비해 AAV.miR-29c/AAV.마이크로-디스트로핀 처리된 근육에서 콜라겐 I 및 III(패널 d, e), fbn(패널 f) 및 TGF-β1(패널 g) 수준의 현저한 감소를 나타내며 각각의 단일 치료학적 오차 막대, SEM은 n=5(scAAVrh.74.CMV.miR-29c), n=5(scAAVrh.74.CMV.miR-29c/ssAAVrh.74.MCK.마이크로-디스트로핀), n=6(ssAAVrh.74.MCK.마이크로-디스트로핀), n=9(mdx/utrn+/- 마우스). 일원 ANOVA(*p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001)
도 11은 조기 병용 요법이 힘을 복원하고 수축-유발 손상을 보호함을 입증한다. 모든 세가지 처리 주사된 GAS 근육에서 경직성 수축 후 절대적 힘(패널 A) 및 정규화된 특이적 힘(패널 b) 측정은, 미처리된 mdx/utrn+/- 근육(패널 C)에 비해 현저히 증가하였다. 이어서, 반복적 편심 수축 후 힘의 손실로 근육을 평가하였다. 단지 miR-29c/마이크로-디스트로핀과 마이크로-디스트로핀 단독으로 동시-처리된 마우스는 미처리된 mdx/utrn +＼- 근육에 비해 힘의 손실로부터 보호됨을 보였다(청색). 분산의 2원 분석은 쇠퇴 곡선 오차 막대에서 유의성을 입증하는데, SEM은 n=5(rAAVrh.74.CMV.miR-29c), n=6(rAAVrh.74.CMV.miR-29c/rAAVrh.74.MCK.마이크로-디스트로핀), n=5(rAAVrh.74.MCK.마이크로-디스트로핀), n=15(mdx/utrn+/- 마우스). 일원 ANOVA (*p<0.05,**p<0.01, *** p<0.001, ****p<0.0001).
도 12는 1개월 월령으로 처리된 마우스에서 miR-29c/마이크로-디스트로핀 병용 처리가 근육 크기를 증가시킴을 나타낸다. 처리된 및 미처리된 mdx/utrn+/- GAS 근육을 절개하고 피크로시리우스 레드로 염색하여 콜라겐을 염색하였다. 섬유화 영역은 분홍색이며 손상되지 않은 근육은 녹색이다. 거시적인 수준에서, miR-29c/마이크로-디스트로핀 조합은 섬유증을 감소시키고 총 단면적을 증가시킨다.
도 13a 내지 13g는 AAV.MCK.miR-29c/마이크로-디스트로핀 병용 요법의 조기 치료(4 내지 5주에서)가 섬유증 및 ECM 발현을 감소시키는데 보다 효과적임을 입증한다. 패널 A는 주사 후 12주 째에 취한 4 내지 5주령에서 주사된 마우스의 주사되지 않은 및 AAV.MCK.miR-29c/AAV.MCK.마이크로-디스트로핀의 피크로시리우스 레드 염색을 제공한다. 원래 배율, x20 패널 B는 피크로시리우스 레드 염색의 정량화를 제공하는데 이는 동시-처리된 근육이 미처리된 GAS 근육에 비해 콜라겐이 50.9 % 감소함을 입증한다. 패널 C는 처리된 코호트에서 miR-29c 전사체 수준의 증가를 확인하는 qRT-PCR을 제공한다. 반-정량적 qRT-PCR은 대측성 사지 요법에 비해 AAV.MCK.miR-29c/AAV.마이크로-디스트로핀 처리된 근육에서 콜라겐 1A(Col1A; 패널 D) 및 콜라겐 3A(Col3A; 패널 E), 피브로넥틴(Fbn; 패널 F) 및 Tgfβ1(패널 G) 수준에서 현저한 감소를 보여준다. (*p<0.05,****p<0.0001).
도 14a 내지 14g는 AAV.MCK.miR-29c/마이크로-디스트로핀 병용 요법으로 후반 치료(12주에서의 치료)가 섬유증 및 ECM 발현을 감소시키는데 효과적임을 입증한다. 패널 A는 주사 12주 후 미처리, AAV.MCK.miR-29c 및 AAV.MCK.miR-29c/AAV.마이크로-디스트로핀의 피크로시리우스 레드 염색을 제공한다. 원래 배율, x20 패널 B는 피크로시리우스 레드 염색의 정량화를 제공하는데 이는 동시-처리된 근육이 미처리된 GAS 근육에 비해 콜라겐이 30.3% 감소함을 입증한다. 패널 C는 처리된 코호트에서 miR-29c 전사체 수준의 증가를 확인하는 qRT-PCR을 제공한다. 반-정량적 qRT-PCR은 대측성 사지에 비해 AAV.MCK.miR-29c/AAV.마이크로-디스트로핀 처리된 근육에서 콜라겐 1A(Col1A; 패널 D), 콜라겐 3A(Col3A; 패널 E), 피브로넥틴(Fbn; 패널 F) 및 Tgfβ1(패널 G) 수준에서 현저한 감소를 보여준다. 일원 ANOVA. 모든 데이터는 평균±SEM을 나타낸다. (** p<0.01, ****p<0.0001).
도 15a 내지 15c는 조기 병용 요법(4 내지 5주에서 치료)이 힘을 복원하고 수축-유발 손상으로부터 보호됨을 입증한다. 경직성 수축 후 MCK.miR-29c/마이크로-디스트로핀 주사된 GAS 근육에서 절대적 힘(패널 A) 및 정규화된 특이적 힘(패널 B) 측정은 미처리된 mdx/utrn+/- 근육에 비해 현저히 증가하였다. (C) 이어서, 반복적 편심 수축 후 힘의 손실로 근육을 평가하였다. miR-29c/마이크로-디스트로핀과 마이크로-디스트로핀 단독으로 동시-처리된 마우스는 미처리된 mdx/utrn +＼- 근육에 비해 힘의 손실로부터 보호됨을 보였다(적색). 이원 ANOVA. 모든 데이터는 평균±SEM을 나타낸다. (****p<0.0001).
도 16a 내지 16c는 후반 병용 요법이 힘을 복원하고 수축-유발 손상을 보호함을 입증한다. 경직성 수축 후 rAAV.MCK.miR-29c 및 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV 주사된 GAS 근육에서 절대적 힘(패널 A) 및 정규화된 특이적 힘(패널 B) 측정은 미처리된 mdx/utrn+/- 근육에 비해 현저히 증가하였다. 이어서, 패널 C에서, 반복적 편심 수축 후 힘의 손실로 근육을 평가하였다. 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV.MCK.miR-29c/rAAV로 동시-처리된 마우스는 미처리된 mdx/utrn +＼- 근육에 비해 힘의 손실로부터 보호됨을 보였다(적색). 이원 ANOVA. 모든 데이터는 평균±SEM을 나타낸다. (**p<0.01, ****p<0.0001).
도 17a 내지 17d는 병용 치료가 주사 3개월 후 근육 비대를 증가시킴을 입증한다. 패널 A는 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV와 동시-전달된 rAAV.MCK.miR-29c는 GAS의 총 중량을 증가시키는데 실패했음을 입증한다. 패널 B는 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV.MCK.miR-29c/rAAV 병용 처리가 평균 섬유 크기 증가를 유도한다는 것을 입증한다. mdx/utrn+/- 대조군과 miR-29c/마이크로-디스트로핀으로 처리된 mdx/utrn+/-와 비교하면, 평균 직경이 28.96에서 36.03μm로 증가하였다. 패널 C는 동시-전달이 야생형 섬유 크기 분포로의 쉬프트를 나타냈왔다. 패널 D는 miR-29c/마이크로-디스트로핀 병용 처리에서 mm2당 근육 섬유의 수는 미처리된 마우스 및 야생형보다 현저히 낮음을 제공하였다(***p<0.01, ****p<0.0001).
도 18a 내지 18b는 miR-29c(뉴클레오타이드 1257-1284) 및 천연 mi-30 골격(뉴클레오타이드 1088-1375)의 성숙 가이드 가닥을 포함하는 예시적인 rAAV 벡터의 핵산 서열(서열번호 1 pAAV.CMV.Mir29C)을 제공한다. 작제물은 또한 CMV 프로모터(뉴클레오타이드 120-526), 뉴클레오타이드 927-1087 및 1380-1854에서 2개의 EF1a 인트론 및 뉴클레오타이드 1896-2091에서 polA를 포함한다.
도 19는 rAAV 벡터 pAAV.MCK.마이크로-디스트로핀의 도식을 제공한다.
도 20a 내지 20d는 예시적인 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV 벡터의 핵산 서열(서열번호 9; pAAV.MCK.마이크로-디스트로핀)을 제공한다.
도 21a 내지 21d는 인간 마이크로-디스트로핀 뉴클레오타이드 서열(서열번호 7)의 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
도 22는 miR-29c(뉴클레오타이드 1487-1512) 및 천연 mi-30 골격(뉴클레오타이드s 1088-1375)의 성숙 가이드 가닥을 포함하는 예시적인 rAAV 벡터의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 12 pAAV.MCK.Mir29C)을 제공한다. 작제물은 또한 MCK 인핸서(뉴클레오타이드 190-395), MCK 프로모터(뉴클레오타이드 396-753), 뉴클레오타이드 1155-1315 및 1609-2083에서 2개의 EF1a 인트론 및 뉴클레오타이드 2094-2148에서 polA를 포함한다.
본 발명은 유전자 요법 벡터, 예를 들어, miR-29 microRNA를 발현하는 rAAV 벡터 및 근이영양증 환자에서 섬유증을 감소 및 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 DMD 환자에서 결실된 마이크로-디스트로핀을 발현하는 유전자 요법 벡터와 함께 miR-29를 발현하는 유전자 요법 벡터를 투여함을 포함하여, 병용 유전자 치료 방법을 제공한다.
DMD 진단 초기에 취한 근육 생검은 탁월한 연결 조직 증식을 나타낸다. 근육섬유증은 여러 면에서 유해하다. 이는 연결 조직 장벽을 통해 내분비 영양소의 정상적인 이동을 감소시키며, 혈류을 감소시키며, 혈관-유발 영향 성분의 근육을 빼앗으며, 사지 구축을 통한 보행의 조기 손실에 기능적으로 기여한다. 시간이 지남에 따라, 근육에서 현저한 섬유증의 결과로서 치료 난제가 증가한다. 이것은 연속적인 시점에서 연결 조직 증식을 비교하는 근육 생검에서 관찰될 수 있다. 이 과정은 계속해서 악화되어 특히 휠체어-의존 환자에서 보행을 감소시키고 통제 불능에 이르게 한다.
섬유증을 감소시키기 위한 병행 접근법 없이, 엑손 스키핑(exon skipping), 종결 코돈 리드-쓰루(stop-codon read-through), 또는 유전자 대체 요법의 이점이 완전히 달성될 것 같지는 않다. 심지어 소분자 또는 단백질 대체 전략도 근육섬유증을 감소시키기 위한 접근법 없이 실패할 수 있다. AAV.마이크로-디스트로핀으로 치료한 기존의 섬유증을 갖는 늙은 mdx 마우스에서의 이전 연구는 본 발명자들이 완전한 기능 회복을 달성할 수 없음을 입증하였다(Human molecular genetics 22, 4929-4937 (2013)). 또한 DMD 심근병증의 진행은 심실 벽에서 흉터와 섬유증을 동반하는 것으로 알려져 있다. 마이크로-RNA 전달은 특히, 면역 장벽이 없고 상대적으로 전달이 용이하기 때문에 혁신적이다. 마이크로-RNA는 작기 (~200 bp) 때문에 유전적 결함을 교정하거나 우회하기 위한 치료용 카세트와 함께 패키징될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "AAV"는 아데노-관련 바이러스의 표준 약어이다. 아데노-관련 바이러스는 특정 기능이 공동 감염성 헬퍼 바이러스에 의해서 제공되는 세포에서만 성장하는 단일 가닥 DNA 파로바이러스이다. 특성화된 AAV의 13개의 혈청형이 존재한다. AAV의 일반적인 정보 및 검토는, 예를 들어, 문헌(Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169-228, and Berns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York))에서 찾을 수 있다. 그러나, 다양한 혈청형이 심지어 유전자 수준에서 구조적으로, 그리고 기능적으로 매우 밀접하게 관련되어 있다는 것이 익히 공지되어 있기 때문에, 이러한 동일한 원칙이 추가의 AAV 혈청형에 적용가능 할 것으로 완전 예상된다. (예를 들어, 문헌(Blacklowe, 1988, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; and Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974))을 참조한다). 예를 들어, 모든 AAV 혈청형은 상동성 rep 유전자에 의해 매개되는 매우 유사한 복제 성질을 나타내고, 모두 AAV2에서 발현된 것들과 같은 3개의 관련된 캡시드 단백질을 보유한다. 관련성의 정도는 게놈의 길이에 따르는 혈청형 사이에 광범위한 교차-하이브리드화를 나타내는 이형접합자 분석(heteroduplex analysis) 및 "역전된 말단 반복 서열"(ITR)에 상응하는 말단에서 유사한 자기-어닐링 분절의 존재에 의해 추가로 시사된다. 유사한 감염 패턴은 또한 각 혈청형의 복제 기능이 유사한 규제 조절하에 있음을 시사한다.
본원에 사용된 "AAV 벡터"는 AAV 말단 반복 서열(ITR)에 의해 플랭킹된 하나 이상의 관심 있는 폴리뉴클레오타이드 (또는 전이유전자)를 포함하는 벡터를 지칭한다. 이러한 AAV 벡터는 복제되고 rep 및 cap 유전자 산물을 암호화하고 발현하는 벡터로 형질감염된 숙주 세포에 존재할 때 감염성 바이러스 입자 내로 패키징될 수 있다.
"AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 폴리뉴클레오타이드 AAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 입자가 이종성 폴리뉴클레오타이드(즉, 포유동물 세포로 전달되는 전이유전자와 같은 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오타이드)를 포함하는 경우, 이는 전형적으로 "AAV 벡터 입자" 또는 간단히 "AAV 벡터"로서 지칭된다. 따라서, AAV 벡터 입자의 생산은 반드시 AAV 벡터의 생산을 포함하는데, 이는 이러한 벡터가 AAV 벡터 입자에 함유되어 있기 때문이다.
AAV
본 발명의 재조합 AAV 게놈은 본 발명의 핵산 분자 및 핵산 분자에 플랭킹된 하나 이상의 AAV ITR를 포함한다. rAAV 게놈내 AAV DNA는, AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12 및 AAV-13을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로터 기원할 수 있다. 슈도타입화된 rAAV의 생산은, 예를 들어, WO 01/83692에 개시되어 있다. 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들어, 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV 또한 고려된다. 예를 들어, 문헌(Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014))을 참조한다. 상기 배경 섹션에 언급된 바와 같이, 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오타이드 서열은 당업계에 공지되어 있다. 골격 근육 특이적 발현을 촉진시키기 위해, AAV1, AAV6, AAV8 또는 AAVrh.74가 사용될 수 있다.
본 발명의 DNA 플라스미드는 본 발명의 rAAV 게놈을 포함한다. DNA 플라스미드는 rAAV 게놈을 감염성 바이러스 입자로 조립하기 위한 AAV의 헬퍼 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 E1-결실된 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스)로 감염시킬 수 있는 세포로 전달된다. 패키징될 AAV 게놈, rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능이 세포에 제공되는 rAAV 입자를 생산하는 기술은 당업계에서 표준이다. rAAV의 생산은 다음 성분들이 단일 세포(본원에서 패키징 세포로서 표시됨) 내에 존재한다는 것을 필요로 한다: rAAV 게놈, rAAV 게놈으로부터 분리된(즉, 이에 없는) AAV rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능. AAV rep 및 cap 유전자는 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 기원할 수 있으며, AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAVrh.74, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12 및 AAV-13을 포함하지만 이에 제한되지 않는 rAAV 게놈 ITR과 상이한 AAV 혈청형으로부터 기원할 수 있다. 슈도타입화된 rAAV의 생산은, 예를 들어, 전체가 본원에 참고로 포함된 WO 01/83692에 개시되어 있다.
패키징 세포를 생성하는 방법은 AAV 입자 생산에 필요한 성분 모두를 안정하게 발현시키는 세포주를 생성하는 것이다. 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자가 결여된 rAAV 게놈, rAAV 게놈으로부터 분리된 AAV rep 및 cap 유전자, 및 선택가능한 마커, 예를 들어, 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 플라스미드 (또는 다중 플라스미드)는 세포의 게놈으로 통합된다. AAV 게놈은 GC 테일링(Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유하는 합성 링커의 첨가(Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73) 또는 직접적인 블런트 말단 결찰(Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666)과 같은 절차에 의해 세균 플라스미드에 도입되었다. 이어서, 패키징 세포주는 아데노 바이러스와 같은 헬퍼 바이러스로 감염된다. 이 방법의 이점은 세포가 선택 가능하고, rAAV의 대규모 생산에 적합하다는 것이다. 적합한 방법의 다른 예는 rAAV 게놈 및/또는 rep 및 cap 유전자를 패키징 세포로 도입하기 위해 플라스미드 이외의 아데노 바이러스 또는 바쿨로 바이러스를 사용한다.
일반적인 rAAV 생산 원리는, 예를 들어, 문헌(Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; 및 Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129)에서 검토된다. 다양한 접근법은 문헌(Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al, J. Virol., 62:1963 (1988); and Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828); 미국 특허 제5,173,414호; WO 95/13365 및 상응하는 미국 특허 제5,658.776호; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132; 미국 특허 제5,786,211호; 미국 특허 제5,871,982호; 및 미국 특허 제6,258,595호)에 기재되어 있다. 상기 문서들은 rAAV 생산과 관련된 문서의 단락을 특별히 강조하면서 이들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
따라서, 본 발명은 감염성 rAAV를 생성하는 패키징 세포를 제공한다. 하나의 구현예에서, 패키징 세포는 안정하게 형질전환된 암 세포, 예를 들어, HeLa 세포, 293 세포 및 PerC.6 세포(동족체 293 라인)일 수 있다. 다른 구현예에서, 패키징 세포는 형질전환된 암 세포가 아닌 세포, 예를 들어, 낮은 계대 293 세포(아데노 바이러스의 E1로 형질전환된 인간 태아 신장 세포), MRC-5 세포(인간 태아 섬유아세포), WI-38 세포(인간 태아 섬유아세포), 베로 세포(원숭이 신장 세포) 및 FRHL-2 세포(레서스 태아 폐 세포)이다
본 발명의 재조합 AAV(즉, 감염성 캡시드화된 rAAV 입자)는 rAAV 게놈을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 두 rAAV의 게놈은 lack AAV rep 및 cap DNA가 없는데, 즉, 게놈의 ITR 사이에는 AAV rep 또는 cap DNA가 없다. 본 발명의 핵산 분자를 포함하도록 구성될 수 있는 rAAV의 예는 이의 전문이 본원에 참고로 포함된 국제 특허 출원 제PCT/US2012/047999호(WO 2013/016352)에 기재되어 있다.
rAVV는 컬럼 크로마토그래피 또는 염화세슘 구배와 같은 당해 기술 분야의 표준 방법에 의해 정제될 수 있다. 헬퍼 바이러스로부터 rAAV 벡터를 정제하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌(Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp and Clark, Methods Mol. Med., 69 427-443 (2002); 미국 특허 제6,566,118호 및 WO 98/09657)에 개시되어 있는 방법을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 rAAV를 포함하는 조성물을 고려한다. 본 발명의 조성물은 rAAV 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 조성물은 또한 다른 성분, 예를 들어, 희석제 및 보조제를 포함할 수 있다. 허용되는 담체, 희석제 및 보조제는 수용자에게 무독성이고, 바람직하게는 사용된 투여량 및 농도에서 불활성이며, 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 또는 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산; 저분자량 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 당 알콜, 예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예를 들어, 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어, Tween, 플루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
본 발명의 방법에서 투여되는 rAAV의 역가는, 예를 들어, 특정 rAAV, 투여 방식, 치료 목적, 개체, 및 표적화될 세포 유형(들)에 따라 달라지고, 당업계의 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. rAAV의 역가는 ml당 약 1×106, 약 1×107, 약 1×108, 약 1×109, 약 1×1010, 약 1×1011, 약 1×1012, 약 1×1013 내지 약 1×1014 이상의 DNase 내성 입자(DRP)의 범위일 수 있다. 투여량은 또한 바이러스 게놈(vg)의 단위로 표현될 수 있다.
생체내 또는 시험관내에서 표적 세포를 rAAV로 형질도입하는 방법은 본 발명에 의해 고려된다. 생체내 방법은 본 발명의 rAAV를 포함하는 조성물의 유효량 또는 유효한 다중 투여량을 이를 필요로 하는 동물(인간 포함)에게 투여하는 단계를 포함한다. 투여량이 질환/장애의 발병 전에 투여된다면, 투여는 예방적이다. 투여량이 질환/장애의 발병 후에 투여된다면, 투여는 치료적이다. 본 발명의 구현예에서, 유효량은 치료되는 장애/질환 상태와 관련된 적어도 하나의 증상을 완화 (제거 또는 감소)시키고/시키거나, 장애/질환 상태로의 진행을 늦추거나 예방하고/하거나, 장애/질환 상태의 진행을 늦추거나 예방하고/하거나, 질환의 정도를 감소시키고/시키거나, 질환을 경감 (부분 또는 전체)시키고/시키거나 생존을 연장시키는 투여량이다. 본 발명의 방법으로 예방 또는 치료하기 위해 고려되는 질환의 예는 FSHD이다.
병용 요법 또한 본 발명에 의해 고려된다. 본원에 사용된 조합은 동시 처리 및 연속 치료 둘 다를 포함한다. 신규한 요법과의 조합과 같이, 본 발명의 방법과 표준 의학적 치료(예를 들어, 코르티코스테로이드)의 조합이 구체적으로 고려된다.
조성물의 유효량의 투여는, 근육내, 비경구, 정맥내, 경구, 구강, 비강, 폐, 두개내, 골내, 안구내, 직장 또는 질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 당업계의 표준 경로에 의해서일 수 있다. 본 발명의 rAAV의 AAV 성분(특히, AAV ITR 및 캡시드 단백질)의 투여 경로(들) 및 혈청형(들)은 치료될 감염 및/또는 질환 상태 및 miR-29 miRNA 및/또는 마이크로-디스트로핀을 발현할 표적 세포/조직(들)을 고려하여 당업자에 의해 선택되고/되거나 매칭될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 병용 요법을 포함하여 유효량의 rAAV 및 본 발명의 조성물의 국소 투여 및 전신 투여를 제공한다. 예를 들어, 전신 투여는 순환계에 투여되어 전신이 영향을 받는다. 전신 투여는 위장관을 통한 흡수와 같은 장 투여 및 주사, 주입 또는 이식을 통한 비경구 투여를 포함한다.
특히, 본 발명의 rAAV의 실제 투여는 rAAV 재조합 벡터를 동물의 표적 조직으로 전송하는 임의의 물리적 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 본 발명에 따르는 투여는 근육, 혈류로의 주사 및/또는 간으로의 직접 주사를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 포스페이트 완충 식염수에 rAAV를 간단하게 재현탁하는 것은 근육 조직 발현에 유용한 소포를 제공하기에 충분한 것으로 입증되었고, 담체 또는 rAAV와 동시 투여될 수 있는 다른 성분에 대한 공지된 제한은 없다(비록 DNA를 분해하는 조성물은 rAAV를 사용하는 정상적인 방식에서 회피되어야 하지만). rAAV의 캡시드 단백질은 rAAV가 관심 있는 특정 표적 조직, 예를 들어, 근육에 표적화되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, WO 02/053703을 참조하고, 이 개시내용은 본원에 참조로 인용된다. 약제학적 조성물은 주사가능한 제형으로서 또는 경피 수송에 의해 근육으로 전달되는 국소 제형으로서 제조될 수 있다. 근육내 주사 및 경피 수송 둘 다를 위한 다수의 제형이 이전에 개발되었고, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. rAAV는 투여 및 취급을 용이하게 하기 위한 임의의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 사용될 수 있다.
본원에 개시된 발명에서 투여되는 rAAV의 투여량은, 예를 들어, 특정 rAAV, 투여 방식, 치료 목적, 개체, 및 표적화될 세포 유형(들)에 따라 달라지고, 당업계의 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. 투여되는 각각의 rAAV의 역가는 ml당 약 1×106, 약 1×107, 약 1×108, 약 1×109, 약 1×1010, 약 1×1011, 약 1×1012, 약 1×1013, 약 1×1014, 또는 약 1×1015 이상의 DNase 내성 입자(DRP)의 범위일 수 있다. 투여량은 또한 바이러스 게놈(vg)의 단위로 표현될 수 있다(즉, 각각 1×107 vg, 1×108 vg, 1×109 vg, 1×1010 vg, 1×1011 vg, 1×1012 vg, 1×1013 vg, 1×1014 vg, 1×1015). 투여량은 또한 체중 킬로그램(kg)당 바이러스 게놈(vg)의 단위로 표현될 수 있다(즉, 각각 1×1010 vg/kg, 1×1011 vg/kg, 1×1012 vg/kg, 1×1013 vg/kg, 1×1014 vg/kg, 1×1015 vg/kg). AAV를 적정하는 방법은 문헌(Clark et al., Hum. Gene Ther., 10: 1031-1039 (1999))에 기재되어 있다.
특히, 본 발명의 rAAV의 실제 투여는 rAAV 재조합 벡터를 동물의 표적 조직으로 전송하는 임의의 물리적 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 본 발명에 따르는 투여는 근육, 혈류로의 주사 및/또는 간으로의 직접 주사를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 포스페이트 완충 식염수에 rAAV를 간단하게 재현탁하는 것은 근육 조직 발현에 유용한 소포를 제공하기에 충분한 것으로 입증되었고, 담체 또는 rAAV와 동시 투여될 수 있는 다른 성분에 대한 공지된 제한은 없다(비록 DNA를 분해하는 조성물은 rAAV를 사용하는 정상적인 방식에서 회피되어야 하지만). rAAV의 캡시드 단백질은 rAAV가 관심 있는 특정 표적 조직, 예를 들어, 근육에 표적화되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, WO 02/053703을 참조하고, 이 개시내용은 본원에 참조로 인용된다. 약제학적 조성물은 주사가능한 제형으로서 또는 경피 수송에 의해 근육으로 전달되는 국소 제형으로서 제조될 수 있다. 근육내 주사와 경피 수송 둘 다를 위한 다수의 제형이 이전에 개발되었고, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. rAAV는 투여 및 취급을 용이하게 하기 위한 임의의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 사용될 수 있다.
근육내 주사를 위해, 보조제, 예를 들어, 참깨유 또는 땅콩유 또는 수성 프로필렌 글리콜 중의 용액 뿐만 아니라 멸균 수용액이 사용될 수 있다. 이러한 수용액은 경우에 따라 완충될 수 있고, 액체 희석제는 먼저 식염수 또는 글루코스로 등장성이 된다. 유리산(DNA는 산성 포스페이트 그룹을 함유한다) 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서 rAAV의 용액은 계면활성제, 예를 들어, 하이드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 물 중에서 제조될 수 있다. rAAV의 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 중 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 통상적 조건하에 이들 제제는 미생물의 성장을 예방하기 위한 방부제를 함유한다. 이와 관련하여, 사용된 멸균 수성 매질은 모두 당업자에게 익히 공지된 표준 기술에 의해 용이하게 수득할 수 있다.
주사 가능한 사용에 적합한 약제학적 담체, 희석제 또는 부형제는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 멸균성이어야 하고, 용이한 주입가능성이 존재하는 정도로 유동성이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에 안정해야 하고, 미생물, 예를 들어, 세균 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예를 들어, 레시틴의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 유도될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 연장 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 유도될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 rAAV를 필요할 경우 상기 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적합한 용매에 필요량으로 도입한 다음, 필터 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 멸균된 활성 성분을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말 및 이의 이전 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 추가의 목적 성분을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.
rAAV에 의한 형질도입은 또한 시험관내에서 수행될 수 있다. 하나의 구현예에서, 목적하는 표적 근육 세포를 대상체로부터 제거하고, rAAV로 형질 도입하고 대상체에 재도입한다. 대안적으로, 동종 또는 이종 근육 세포는 이들 세포가 대상체에서 부적절한 면역 반응을 생성하지 않는 경우에 사용될 수 있다.
형질도입 및 형질도입된 세포의 대상체로의 재도입에 적합한 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 하나의 구현예에서, 세포는 rAAV를, 예를 들어, 적합한 매질 중에서 근육 세포와 결합시키고, 서던 블롯 및 PCR과 같은 통상적인 기술을 사용하여 관심 있는 DNA를 보유하는 세포를 스크리닝하거나 선택가능한 마커를 사용함으로써 시험관내에서 형질도입할 수 있다. 이어서, 형질도입된 세포는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있고, 조성물은 다양한 기술, 예를 들어, 근육내, 정맥내, 피하 및 복강내 주사에 의해 또는, 예를 들어, 카테터를 사용하여 평활근 및 심근 내로 주사에 의해 대상체에게 도입된다.
본 발명의 rAAV로 세포를 형질도입하면 miR-29 또는 마이크로-디스트로핀의 지속적인 발현을 초래한다. 따라서, 본 발명은 miR-29 및/또는 마이크로-디스트로핀을 발현시키는 rAAV를 동물, 바람직하게는 인간에게 투여하고/전달하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 형질도입 조직(조직, 예를 들어, 근육, 기관, 예를 들어, 간 및 뇌, 및 샘, 예를 들어, 침샘을 포함하지만, 이에 제한되지 않음)을 본 발명의 하나 이상의 rAAV로 형질 도입함을 포함한다. 형질도입은 조직 특이적 조절 요소를 포함하는 유전자 카세트로 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 하나의 구현예는 액틴 및 미요신 유전자 계열로부터, 예를 들어, myoD 유전자 계열[참조: Weintraub et al., Science, 251: 761-766 (1991)], 근세포 특이적 인핸서 결합 인자 MEF-2[Cserjesi and Olson, Mol Cell Biol 11: 4854-4862 (1991)], 인간 골격 액틴 유전자로부터 유래된 조절 요소[Muscat et al., Mol Cell Biol, 7: 4089-4099 (1987)], 심장 액틴 유전자, 근육 크레아틴 키나제 서열 요소[참조: Johnson et al., Mol Cell Biol, 9:3393-3399 (1989)] 및 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서(mCK) 요소, 골격 속근 트로포닌 C 유전자, 지근 심장 트로포닌 C 유전자 및 지근 트로포닌 I 유전자로부터 유도된 조절 요소; 저산소증 유발성 핵 인자(Semenza et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 5680-5684 (1991)), 글루코코르티코이드 반응 요소(GRE)를 포함하는 스테로이드-유발성 요소 및 프로모터[참조: Mader and White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607 (1993)], 및 다른 조절 요소로부터 유래된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 근육 특이적 조절 요소에 의해 지시된 근육 세포 및 근육 조직을 형질도입하는 방법을 제공한다.
근육 조직은 생체내 DNA 전달을 위한 매력적인 표적인데, 이는 중요한 기관이 아니고 접근하기 쉽기 때문이다. 본 발명은 형질도입된 근섬유로부터 miRNA의 지속적인 발현을 고려한다.
"근육 세포" 또는 "근육 조직"이란, 임의의 종류의 근육(예를 들어, 소화관, 방광, 혈관 또는 심장 조직으로부터의 골격근 및 평활근)으로부터 유래된 세포 또는 세포 그룹을 의미한다. 이러한 근육 세포는 근육아세포, 근세포, 근육대롱세포, 심근세포 및 심근아세포와 같이 분화되거나 분화되지 않을 수 있다.
용어 "형질도입"은 수용체 세포에 의한 miR29 또는 마이크로-디스트로핀의 발현을 초래하는 본 발명의 복제-결핍 rAAV를 통해 생체내 또는 시험관내에서 수용체 세포로 miiR29 가이드 가닥 또는 마이크로-디스트로핀의 암호화 영역의 투여/전달을 지칭하는데 사용된다.
따라서, 본 발명은 miR29 및/또는 마이크로-디스트로핀을 암호화하는 유효량 (또는 투여량, 본질적으로 동시에 투여되거나 간격으로 주어진 투여량)의 rAAV를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 방법을 제공한다.
실시예
실시예 1
듀시엔형 근이영양증 모델의 확인
mdx 마우스는 DMD 병인을 연구하기 위한 편리하지만 불안정한 동물 모델을 제공한다. 이 모델은 유트로핀 유전자 (mdx:utrn+/-)의 이종접합성 녹아웃을 가진 mdx 마우스의 잡종으로, 증가된 섬유증을 나타내며 인간 DMD의 병리학을 보다 충실하게 반복한다. Mdx 마우스는 비교적 약한 표현형과 거의 정상 수명을 초래하는 DMD의 엑손 23에 난센스 돌연변이를 갖는다. 3주령까지, mdx 마우스의 횡경막과 사지 근육은 근내막 염증의 징후을 보인다. 이들 증상은 마우스가 성인기에 도달한 후 사지 근육에서 진정되지만 횡경막 근육에서의 염증은 계속해서 점차 악화된다. 텔로머라제가 없는 mdx 마우스에서, 근이영양증은 연령에 따라 점차 악화된다; 유트로핀이 없는 mdx 마우스(DKO)는 조기 발병 근육약화, 중증 섬유증, 및 조기 사망을 갖는 인간 DMD의 보다 특징적인 표현형을 갖는다. 디스트로핀의 상염색체 파라로그인 유트로핀은, 이중 KO(디스트로핀 + 유트로핀)에서 mdx 마우스에서 디스트로핀의 부재를 보충할 수 있는 고도의 서열 상동성을 공유한다; 조기 사망을 갖는 중증 표현형이 관찰된다. DKO 마우스의 조기 사망은 염증 및 섬유증의 진행을 배제하지만, mdx:utrn+/- 마우스는 DKO보다 현저한 섬유증 정도와 긴 생존기간을 나타내는 인간 질환과 유사한 모델을 제시하여 제안된 해독 연구에 대한 더 우수한 모델을 제공한다. 최근의 보고서는 DMD와 관련하여 섬유증을 연구하기 위한 이상적인 모델로서 mdx:utrn+/- 마우스의 사용을 확인한다. 현재 연구에서, 시리우스 레드 염색으로 측정된 증가된 섬유증은 증가된 콜라겐 전사체 수준 및 감소된 mir29c 수준을 동반하였다.
실시예 2
miR29의 DMD 마우스로의 전달은 섬유증을 감소시킨다
예비 연구는 인간 DMD 환자와 mdx/utrn +/- 마우스에서 콜라겐에 대한 시리우스 레드 염색에서의 현저한 증가 및 miR-29c 수준의 감소가 있음을 입증하였다. 근육 특이적 AAV 벡터를 사용한 miR-29의 유전자 전달은 잠재적으로 안전하고 효율적이다. 본원에서 rAAVrh.74.CMV.miR29c로 지칭되는 rAAV 벡터를 생성하기 위해, 22 뉴클레오타이드 miR29c 서열(표적 가닥 서열번호 3 및 가이드 가닥 서열번호 4)은 CMV 프로모터에 의해 구동되는 miR-30 스캐폴드에 클로닝하였다. 발현 카세트(서열번호 2)를 자가-상보적 AAV 플라스미드에 클로닝하고 근육에서 잘 발현하는 것으로 알려진 혈청형인 AAVrh.74를 사용하여 패키징하였다. miR-29c cDNA는 miR-30 골격에서 miR-29c 표적(센스) 가닥, miR-30 스템 루프 및 miR-29c 가이드(안티센스) 가닥을 함유하는 커스텀 프라이머를 사용하여 합성되었다. miR-29c 서열의 3개 염기가 변형되었다. 이어서, 이 서열을 CMV 프로모터 및 폴리A 서열에 의해 구동되는 플라스미드를 함유하는 자가-상보적 AAV ITR에 클로닝하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, pAAV.CMV.miR29C 플라스미드는 AAV2 역전된 말단 반복 서열(ITR)에 의해 플랭킹된 miR-30 스템 루프 골격에서 mir29c cDNA를 함유한다. AAVrh.74 비리온으로 캡시드화된 것은 이 서열이다. 또한, miR-29c 표적 서열내 몇개의 뉴클레오타이드는 shRNA-miR(luc)에서와 같이 이 부위에서 왓슨-크릭 페어링(Watson-crick pairing)을 모방하도록 변경되었다. ShRNA-luc 디자인에 따라, 헤어핀은 그 길이에 걸쳐 완벽하게 상보적이어야 한다. 또한, 패신저 가닥에 대한 변화가 많을 수록, 스템을 통해 miRNA를 인식할 수 있는 miR-29 프로세싱을 조절하는 임의의 내인성 기전을 제거할 가능성이 높다. 가이드 가닥의 19번째 염기는 천연 mi-29c 서열의 절단 부위에 선행하는 뉴클레오타이드를 모방하기 위해 시토신으로 변형되고 다른 가닥에 대한 상응하는 염기는 페어링을 보존하기 위해 변화되었다.
유전자 요법 벡터 scrAAVrh.74.CMV.miR29c(1×1011 vgs)를 3개월령 mdx/utrn+/- 마우스의 대퇴사두근에 주사하였다. 대퇴사두근을 시리우스 레드 염색에 의해 주사 3개월 후 분석하고, 문헌: Nevo et al. (PloS One, 6: e18049 (2011))에 의해 기재된 바와 같은 NIH 이미지 소프트웨어 의해 분석하였다. MiR29c, 콜라겐 및 엘라스틴 수준은 RT-PCR에 의해 정량화하였다. miR-29c를 젊은 mdx/utrn +/- 마우스에 전달하면 6개월령 mdx/utrn+/- 마우스(주사 후 3개월)의 대퇴사두근에서 mir-29c 수준이 현저히 증가하고 시리우스 레드 염색에서 현저히 감소한다. RT-PCR로 평가할 때 치료된 근육에서 콜라겐과 엘라스틴 수준이 감소하였다.
mdx/utrn+/- 마우스 및 디스트로핀-결핍 환자에서 증가된 섬유화 및 감소된 miR29 발현의 입증은 마우스 모델이 인간 질환을 대표하는 것으로 확인된다. 항-섬유증 요법으로서 AAV-전달된 miR29를 사용하는 초기 결과는 시리우스 레드 염색 및 콜라겐 및 엘라스틴 수준 감소와 함께 현저한 유리한 효과가 있는 것을 시사하며 이는 섬유증에 중요한 기여를 한다.
실시예 3
MiR-29c의 주사는 콜라겐을 감소시키고 miR-29c를 회복시킨다
rAAVrh.74.CMV.MiR-29c에 섬유증을 감소시킬 수 있는지를 결정하기 위해, 12주령 mdx/utrn +＼- 마우스는 rAAVrh.74.CMV.MiR-29c의 근육내 주사를 5x1011 vgs로 왼쪽 비복근(GAS) 근육에 투여받았다. 마우스를 주사후 12주 째에 분석하였다. 피크로시리우스 레드 염색은 미처리된 대측성 mdx/utrn +/- GAS 근육에 비해 GAS 근육 전체에 걸친 콜라겐 염색에서 현저한 감소를 나타내었다(도 2a). 피크로시리우스 레드 염색의 정량화는 처리된 근육이 미처리된 근육(처리된- 23.3%±1.3 대 미처리된-29.5% ±0.7)(도 2b)에 비해 콜라겐이 18.3% 감소됨을 보여준다. 치료된 근육에서 miR-29c의 과발현을 확인하기 위해, 총 RNA를 24주령 WT, miR-29c 처리된 및 mdx/utrn+/- 마우스로부터의 GAS 근육으로부터 추출하고, miR-29c 발현에 대한 정량적 역전사-PCR(qRT-PCR) 분석을 실시하였다. 결과는 미처리된 마우스에 비해 처리된 마우스의 GAS 근육에서 miR-29c가 현저히 증가되었음을 보여주었다(도 2d).
실시예 4
MiR-29c는 절대적 및 특이적 근육힘을 향상시키지만 수축-유발 손상을 보호하지 않는다.
섬유증이 근육 기능에 영향을 미칠 것을 알면서, 본 발명자는 MiR-29c의 발현을 증가시킴에 의한 섬유증 감소가 수축-유발 손상으로부터 mdx/utrn+/- 근육을 보호하고 전체적인 힘을 증가시키는지 여부를 시험하기를 원했다. rAAVrh.74.CMV.MiR-29c로 처리한 mdx/utrn+/- 마우스로부터의 비복근 근육의 기능적 성질을 평가하였다. 주사 12후 후에 생체내 힘 측정을 수행하기 위해 GAS를 단리시켰다.
GAS 절차는 횡복근 근육 생리학을 분석하기 위해 문헌(Hakim et al., (Methods Mol Biol. 709: 75-89, 2011))에 열거된 프로토콜을 따르지만 GAS에 조정하였다. 간단히, 마우스를 케타민/자일라진 혼합물을 사용하여 마취시켰다. 뒷다리 피부를 제거하여 GAS 근육과 아킬레스 힘줄(Achilles tendon)에 노출시켰다. 원위 힘줄을 절단하고 이중 스퀘어 매듭(square knot)을 가능한 근육에 가까운 4-0 봉합으로 상기 힘줄 주위에 묶고 또 다른 제2 이중 스퀘어 매듭은 제1 매듭 바로 옆에 묶은 다음 힘즐을 절단하였다. 노출된 근육을 계속해서 염수로 적셨다. 이어서, 마우수를 열 조절 플랫폼으로 옮기고 37 ℃에서 유지하였다. 무릎을 슬개골 힘줄을 통해 바늘로 플랫폼에 고정시키고, 힘 변환기(Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada)의 수평 팔에 힘줄을 봉합하고, 발을 테이프로 고정시켰다. GAS 근육 수축은 양극성 백금 전극을 통해 좌골 신경을 자극함으로써 유도되었다. 일단 근육이 안정화되면, 최적의 길이는 최대 경련 힘이 달성될 때까지 근육을 증분 스트레칭함으로써 결정되었다. 3분의 휴식 기간 후에, GAS는 50, 100, 150, 및 200 Hz에서 자극되어, 최대 경련 힘을 결정하기 위해 각 자극 사이에 1분의 휴식 기간을 허용하였다. 근육 길이를 측정하였다. 5분의 휴식 후에, 수축-유발 손상에 대한 GAS 근육의 민감성을 평가하였다. 500 ms의 자극 후에, 근육은 최적의 길이의 10% 만큼 길어졌다. 이것은 700 ms 동안 150 Hz에서 근육을 자극하는 것으로 구성된다. 자극 후에, 근육은 최적의 길이로 되돌아 갔다. 사이클은 총 5회 사이클 동안 5분 반복하였었다. 특이적 힘은 최대 경련 힘을 GAS 근육 단면적으로 나누어 계산되었다. 편심 수축 후에, 마우스를 이어서 안락사시킨 다음, GAS 근육을 분석을 위해 절개하고, 칭량하고 동결시켰다.
각 GAS를 일련의 반복된 편심 수축시켰다. 각 수축과 제1 수축의 힘 비를 비교함으로써, 제5 수축 후 미처리된 근육은 처리된 0.50±0.04(p = 0.0001)에 비해 0.56±0.05로 감소함을 보였다. 주사된 그룹은 WT 대조군에 비해 보호 정도가 약간 감소하여 0.92±0.02로 감소하였음을 보여주었다(도 3c). 이 데이터는 miR-29c의 발현을 증가켜 섬유증을 감소시키면 절대적 힘 및 특이적 힘 둘 다에서 증가하지만 수축-유발 손상으로부터 근육을 현저하게 보호하지 못한다는 것을 보여준다.
rAAVrh.74.MiR-29c 처리된 GAS 근육은 미처리된 mdx/utrn+/- GAS 근육(rAAV.miR-29c- 2277 ±161.7 대 mdx/utrn+/- 미처리된- 1722± 145.7; 도 3a)과 비교했을 때 절대적 힘에서의 현저한 개선, 및 또한 미처리된 GAS 근육(rAAV.miR-29c- 204.7±11.7 대 mdx/utrn+/- 미처리된- 151.6±14.5; 도 3b)과 비교했을 때 rAAVrh.74.miR-29c 처리된 GAS 근육은 특이적 개선을 보여주었다. 힘은 야생형 대조군(rAAV.miR-29c- 204.7±11.7 대 야생형- 312.0±34.1)과 비교했을 때 여전히 현저히 감소하였다.
실시예 5
마이크로-디스트로핀과의 동시-전달은 섬유증을 더 감소시킨다
miR-29c/마이크로-디스트로핀과 조합된 유전자 요법 접근법이 섬유증을 감소시키는데 보다 유익한지를 결정하기 위해, 12주령 mdx/utrn +＼- 마우스는 rAAVrh.74.CMV.MiR-29c의 근육내 주사를 5x1011 vgs로 왼쪽 비복근 근육에 투여받았다. 하기 유전자 요법 벡터는 3개월령 mdx/utrn+/- 마우스인 DMD 마우스 모델의 왼쪽 비복근(GAS) 근육으로 근육 주사(IM)에 의해 투여되었다: scAAVrh.74.CMV.miR-29c 단독, rAAVrh.74.MCK.마이크로-디스트로핀과 동시 전달된, 및 rAAVrh.74.MCK.마이크로-디스트로핀 단독.
pAAV.MCK.마이크로-디스트로핀 플라스미드는 도 10에 나타낸 바와 같이 AAV2 역전된 말단 반복 서열(ITR)에 의해 플랭킹된 인간 마이크로-디스트로핀 cDNA 발현 카세트를 함유한다. AAVrh.74 비리온으로 캡시드화된 것은 이 서열이다. pAAV.MCK.마이크로-디스트로핀 플라스미드는 문헌(Rodino-Klapac et al. (Mol Ther. 2010 Jan;18(1):109-17))에 기재된 바와 같이 코돈 최적화된 인간 마이크로-디스트로핀 cDNA 서열을 구동하는 MCK 발현 카세트를 AAV 클로닝 벡터에 삽입함으로써 구성되었다. MCK 프로모터/인핸서 서열은 근육-특이적 유전자 발현을 유도하기 위해 사용되었으며 351 bp MCK 코어 프로모터(근위)에 융합된 마우스 MCK 코어 인핸서(206 bp)로 구성된다. 코어 프로모터 후, 53 bp 내인성 마우스 MCK 엑손1(해독되지 않음)은 효율적인 전사 개시를 위해 존재하며 이어서 SV40 후기 16S/19S 스플라이스 신호(97 bp) 및 작은 5'UTR(61 bp)이 있다. 　인트론 및 5' UTR은 플라스미드 pCMVβ(Clontech)로부터 유도된다. 　마이크로-디스트로핀 카세트는 ATG 개시 직전에 컨센서스 코작(Kozak)을 가지며 mRNA 종결을 위해 작은 53 bp 합성 폴리A 신호를 갖는다. 인간 마이크로-디스트로핀 카세트는 (R4-R23/△71-78) 도메인을 함유한다. 상보적 DNA는 인간 사용을 위해 코돈 최적화되고 GenScript (Piscataway, NJ)에 의해 합성되었다.
마우스를 주사 12 및 24주 후에 분석하였다. 먼저, 마이크로-디스트로핀을 발현하는 근육 섬유의 수를 사용하여 전이유전자 전달의 효능을 평가하였고 각 그룹에서 발현된 유사한 수준의 마이크로-디스트로핀을 확인하였다. 본 발명자들은 마이크로-디스트로핀은 miR-29c/마이크로-디스트로핀 병용 요법(75.03±1.91%)에 비해 마이크로-디스트로핀 단독(71.85±2.25%)으로 처리한 코호트 간에 차이가 없음을 발견하였다(도 4).
GAS 근육은 시리우스 레드 염색 및 이미지를 이용한 후속적 정량화에 의해 콜라겐 축적을 평가하기 위해 주사 12개월 후 분석하였다. 추가의 결과에는 miR-29c 및 콜라겐 전사체 수준, GAS 근육에서의 힘 측정, 섬유 직경 측정 및 근육재생에 관련된 단백질(MyoD, 미오게닌)에 대한 웨스턴 블랏 분석이 포함되었다. 섬유증의 양은 피크로시리우스 레드 염색에 의해 분석하였으며, 이는 미처리된 대측성 mdx/utrn+/- GAS 근육 또는 마이크로-디스트로핀 단독에 비해 모든 처리된 그룹(도 5a)에서 GAS 근육 전체에 걸쳐 콜라겐 염색에서의 현저한 감소를 나타냈다. 피크로시리우스 레드 염색의 정량화는 미처리된 근육(처리된- 17.47%±0.75 대 미처리된-29.5% ±0.7)에 비해 동시 처리된 근육이 콜라겐이 40.8% 감소됨을 보여준다(도 5b). miR-29c의 발현을 확인하기 위해, qRT-PCR이 GAS 근육에서 수행되었으며 모든 치료 그룹은 미처리된 근육에 비해 miR-29c에서 증가했다(도 5c).
DMD 조직과 유사하게, mdx/utrn+/- 근육에서 miR-29c 수준의 현저한 감소가 관찰되었는데, 이는 피크로시리우스 레드 염색에 의해 측정된 증가된 섬유증과 상관이 있었다. scAAV.miR-29c 단독으로 3개월 처리한 후에, GAS 근육에서 섬유증(처리된-23.5%±1.3 대 미처리된-27.8% ±0.6)의 현저한 감소가 있었다. 마이크로-디스트로핀과 동시 전달되는 경우, 피크로시리우스 레드 염색에 의해 콜라겐의 추가의 감소(41%)가 관찰되었다(병용 치료: 17.47%±0.75 대 미처리됨: 29.5% ±0.7) (p<0.0001) (도 5b). miR-29의 발현을 확인하기 위해, qRT-PCR은 GAS 근육에서 수행되었으며 모든 처리 그룹은 미처리된 근육에 비해 miR-29c에서 증가했다(도 5b).
주사 후 24주 째에, 결과는 주사 12주 후에 관찰된 것과 유사하였다. 미처리된 근육(병용 치료: 16.5±1.23 대 비처리됨: 31.07±0.93; p<0.0001)에 비해 피크로시리우스 레드 염색으로 콜라겐이 47% 감소했으며 miR-29c 전사체 수준이 동시 증가했다.
피크로시리우스 레드 염색에 의해 관찰된 콜라겐의 감소를 추가로 검증하기 위해, qRT-PCR은 근육에서 수행하여 Col1A, Col3A 및 또한 또 다른 ECM 성분인 피브로넥틴(Fbn)의 전사체 수준을 정량화하였다. qRT-PCR 분석은 각 처리 후에 Col1A 및 Col3A의 감소를 발견했지만, 마이크로-디스트로핀과 miR-29c 둘 다로 처리한 코호트만이 현저한 감소를 보였다(도 6a 및 6b). 분석 결과는 Fbn이 동시 처리된 코호트에서만 현저하게 감소되었음을 보였다(도. 6c).
TGF-β1은 이전에, 섬유화 캐스케이드의 개시에 역할을 하는 것으로 여겨지는 영양장애 근육에서 상향 조절되는 것을 보였다. TGF-β1은 miR-29c를 하향 조절하는 것으로 알려진 사전-섬유화 사이토카인이며, 콜라겐 및 근육 섬유조직성장에서의 증가와 함께 근육아세포를 근섬유아세포로 전환시키는 데 책임이 있다. qRT-PCR 분석은 동시 처리된 근육이 주사되지 않은 근육 및 단독 처리에 비해 TGF-β1의 수준이 현저히 낮았음을 보인다(도 6d). 주사 후 6개월 째에, 동시 처리된 근육은 계속하여 감소된 Col1A, Col3A, Fbn 및 TGF-β1 수준을 보이지만, 여기서, miR-29 및 마이크로-디스트로핀 단독 그룹에서만 Col1A mRNA 수준의 약간의 감소만이 관찰되었다.
미처리된 사지에 비해 miR-29c 단독으로 처리된 근육에서 특이적 힘 및 절대적 힘에서의 증가가 관찰되었는데, 이는 마이크로-디스트로핀과 조합될 때 야생형과 현저하게 차이가 있지 않은 절대적 힘 및 특이적 힘을 초래하였다. 본 발명자들은 또한 동시 치료된 이들 근육에서 비복근 중량이 현저히 증가하는 것을 관찰하였다.
항-섬유화 요법으로서 rAAV.miR-29c를 사용하는 초기 결과는 섬유증의 주요 원인인 콜라겐 수준에서의 감소와 함께 유익한 효과가 있음을 시사한다. 또한, 마이크로-디스트로핀과 조합하여 막 안정성을 향상시켰을 때 miR29는 정규화된 근육힘을 조절한다.
실시예 6
절대적 힘에서의 추가의 증가 및 수축-유발 손상으로부터의 추가의 보호
miR-29-처리된 근육은 보통이지만 절대적 및 특이적 힘에서 현저한 증가를 갖는다는 것을 알면서, miR-29c 과발현과 마이크로-디스트로핀 유전자 대체의 병용 요법이 근육 기능에 미치는 영향을 조사하였다. 주사 12주 후에, 생체내 힘 측정을 수행한 GAS를 단리시켰다. 상기 실시예 2에 기재된 rAAVrh.74.MiR-29c 벡터 및 rAAV.
동시 처리된 rAAVrh.74.MiR-29c 및 마이크로-Dys를 발현하는 rAAV 처리된 GAS 근육은 미처리된 mdx/utrn+/- GAS 근육과 비교했을 때 절대적 힘에서 현저한 개선을 보였고(동시 처리된- 3582.4±79.4 nM 대 mdx/utrn+/- 미처리된- 1722± 145.7 nM 대 야생형- 3005±167.3 nM) (도 7), 또한 미처리된 GAS 근육과 비교했을 때 rAAVrh.74.miR-29c/마이크로-dys 처리된 GAS 근육에서 정규화된 특이적 힘에서 특이적 개선을 보였다(동시 처리된 마우스- 244.2±6.6 nM/mm2 대 mdx/utrn+/- 미처리된- 151.6±14.5 nM/mm2 대 312.0±34.1 nM/mm2) (도 7). 절대적 힘과 특이적 힘 둘 다는 야생형 대조군과 현저히 상이하지 않았다.
각 GAS를 일련의 반복된 편심 수축시켰다. 각 수축과 제1 수축의 힘 비를 비교함으로써, 제5 수축 후 미처리된 근육은 동시 처리된 0.66±0.04(p = 0.0001)에 비해 0.54± 0.06로 감소함을 보였으며 이는 마이크로-디스트로핀 단독이 또한 0.66±0.04로 감소하기 때문에 마이크로-디스트로핀에 기여할 수 있다. 처리된 그룹은 0.92±0.02로 감소된 야생형보다 여전히 현저히 낮았다(도 7c). 주사 후 24주 째에 유사한 결과를 보였다. 이 데이터는 섬유증 및 유전자 대체를 감소시켜 절대적 힘과 특이적 힘 둘 다가 증가하고 수축-유발된 손상으로부터 근육을 현저히 보호한다는 것을 보여준다.
실시예 7
병용 치료는 근육비대 및 증식을 증가시킨다
마이크로-디스트로핀과 동시 전달된 MiR-29c는 3개월령의 단독 주사된 것에 비해 주사된 비복근의 총 중량을 증가시켰다(도 8, 도 9a). 증가된 근육량의 원인을 조사하기 위해, 근섬유 직경을 측정한다. miR-29c/μ-dys 병용 치료는 평균 섬유 크기에서의 증가를 보였다. mdx/utrn+/- 대조군과 miR-29c/μ-dys 처리된 mdx/utrn+/-를 비교하면, 평균 직경은 25.96에서 30.97 μm로 증가하였다(도 9b). 동시-전달은 야생형 섬유 크기 분포로의 쉬프트를 나타냈다(도 9c). 평균 섬유 크기가 증가했지만 총 근육량에서의 ~30% 증가를 설명하지는 않는다. 근육의 총 단면적 또한 측정되었다. 모든 그룹으로부터의 비복근 근육을 전체 슬라이드 스캔하고 총 면적을 측정하였다. 마이크로-dys/miR-29c로 동시 처리된 근육은 미처리 및 처리 단독에 비해 단면적이 현저히 증가하였다(미주사됨: 24.6 대 miR-29c: 26.3 대 마이크로-dys: 26.6 대 마이크로-dys/miR-29c: 33.1) (도 8, 도 9d).
miR-29c는 myoD/Pax7/미오게닌 경로에서 역할을 한다고 보고되었으며, miR-29c가 근원성 계통에서 분화하기 위해 위성 세포(근육 줄기 세포)의 재생 및 활성화에 영향을 줄 수 있다고 가정하였다. 이를 시험하기 위해, 전체 슬라이드 스캔 이미지로부터 총 근육 섬유의 수를 계산하였다. miR-29c/μ-dys 병용 치료 후 근육 섬유의 수가 증가하였다(도 9e). 마지막으로, mdx/utrn+/- 마우스에서 근육 섬유 직경이 다수의 작은 섬유 및 일부 비대 섬유와 이질적이라는 것을 감안하면, 단위 면적당 섬유의 수(세포/mm2)가 치료에 영향을 미치는지 여부를 결정하였다. miR-29c/μ-dys 병용 치료는 야생형과 차이가 없었다(도 9f).
실시예 8
병용 조기 치료는 섬유증을 예방한다
DMD에 대한 예방 요법으로서 조합 miR-29c 및 마이크로-디스트로핀의 잠재적 중용성을 고려하여, 젊은 mdx/utrn+/- 마우스의 코호트를 4주령에서 처리하였다. 본원에 기재된 다른 그룹과 동일한 파라다임을 사용하여, GAS의 근육내 주사에 의한 섬유증 예방에 대한 효능을 비교하기 위해 하기 처리를 비교하였다: 동일 투여량으로 scAAVrh.74.CMV.miR-29c 단독, ssAAVrh74.MCK.마이크로-디스트로핀 + scAAVrh.74.CMV.miR-29c 병용 요법, 또는 ssAAVrh74.MCK.마이크로-디스트로핀 단독. 주사 12주 후에 마우스를 부검하였다. 미처리된 대측성 mdx/utrn +/- GAS 근육에 비해 모든 처리된 그룹에서 GAS 근육 전체에 걸쳐 콜라겐 염색의 현저한 감소가 관찰되었다(도 10a). 피크로시리우스 레드 염색의 정량화는 마이크로-디스트로핀/miR-29c로 동시 처리된 근육이 미처리된 근육에 비해 콜라겐이 51% 감소하였음을 보였으며(처리된- 11.32%± 1.18 대 미처리된-23.15% ±0.90) (p<0.0001) (도 10), qRT-PCR은 병용 요법 후 Col1A, Col3A, Fbn 및 TGF-β1 감소를 확인하였다(도 10d 및 10e).
실시예 9
조기 병용 요법은 후반 치료보다 우수하게 힘을 회복하고 수축-유발 손상으로부터 보호한다
생체내 힘 측정은 실시예 8에 기재된 바와 같이 병용 요법으로 조기 치료한 마우스의 GAS에 대해 수행하였다. 4주령 mdx/utrn+/- 마우스에서, miR-29c/마이크로-디스트로핀을 사용한 동시 처리는 미처리된 mdx/utrn+/- 마우스와 비교했을 때 절대적 힘에서 현저한 상승한 보였고, 야생형과 차이가 없었다(동시 처리된: 2908± 129.5 mN 대 미처리된: 1639.4± 116.9 mN 대 야생형: 3369.73± 154.1 mN). 특이적 힘은 또한 병용 요법 후 야생형 수준으로 정규화되었다(동시 처리된 338.9±22.34 mN/mm2 대 비처리된 184.3±13.42 mN/mm2 대 WT 364.3±7.79 mN/mm2) (도 11a 및 11b 및 12).
다음으로, 각 GAS를 일련의 반복된 편심 수축시켰다. 각 수축과 제5 수축의 힘 비를 비교함으로써, 미처리된 근육은 동시 처리된 0.82± 0.04(p ≤ 0.0001)에 비해 0.53±0.04로 감소하였다. 병용 치료 그룹은 야생형보다 약간 낮았지만 현저한 차이는 없었으며, 이는 0.93±0.01로 감소하였다(도 11c). 이들 데이터는 섬유증 및 유전자 대체를 감소시켜 절대적 힘과 특이적 힘 둘 다에서 증가하고 수축-유발된 손상으로부터 근육을 현저히 보호한다는 것을 보여준다.
이들 실험은 신생아시기에 유전자 대체가 시작되어야 함을 시사한다. 신생아시기의 DMD와 다른 근이영양증을 식별하는 방향으로 분명히 노력하고 있다. 오하이오 신생아 선별 연구(Ohio Newborn Screening Study)는 동일한 건조 혈반에서 DNA를 확인하면서 바이오마커(>2000 U/L)로서 CK 7 Neurol을 사용하여 신생아에서 DMD 식별할 수 있는 잠재력을 보여준다(Mendell et al., Ann. Neurol. 71: 304-313, 2012). 이 방법론은 현재 미국(PPMD May 16, 2016: Next Steps with Newborn Screening)의 다른 주들로 그리고 다른 나라, 특히 영국(UK National Screening Committee)과 중국(Perkin ElmerTM launches screening in China)으로 확대되고 있다.
miR-29는 또한 심장, 폐 및 간 섬유증에 대한 치료 방법으로서 가능성을 보여주었다. 마우스와 인간에서의 심근경색은 miR-29 하향 조절과 관련된다. 루이즈 등(Rooij et al.)(Proc. Natl. Acad. Sci, USA 105:13027-13032, 2008)은 섬유아세포를 miR-29b 모사체에 노출시켜 콜라겐 전사체를 감소시킴으로써 심장 섬유증에 대한 임상 해독에 대한 경로를 제공함을 보여주었다. 후속 연구는 블레오마이신-유발된 폐섬유증 마우스 모델에서, miR-29b.14의 슬리핑 뷰티(SB: Sleeping Beauty) 전이인자 시스템계 전달을 사용하여 섬유증의 약화가 달성될 수 있음음 보여주었다. 현재, miR-29b 모사체는 건강한 지원자의 임상 1상 안전-내성 국소 피내 시험에 있다(miRagen TherapeuticsTM MRG-201). 올리고뉴클레오타이드의 반감기와 관련된 반복 투여를 필요로 하는 miR-29 올리고뉴클레오타이드 전달과 비교하여, AAV 유전자 요법은 잠재적으로 단일-전달 유전자 전달을 제공할 수 있다.
실시예 10
miR-29 및 마이크로-디스트로핀의 근육 특이적 발현으로 처리하여 섬유증 및 ECM 발현을 감소시킨다
miR29c 서열 및 근육 특이적 프로모터 MCK를 포함하는 AAV 벡터 또한 생성되어 마이크로-디스트로핀을 발현하는 AAV 벡터와의 병용 요법으로서 시험하였다. 본원에서 rAAV.MCK.miR29c로 지칭되는 rAAV 벡터를 생성하기 위해, 22 뉴클레오타이드 miR29c 서열(표적 가닥 서열번호 3 및 가이드 가닥 서열번호 4)은 MCK 프로모터(서열번호 11)에 의해 구동되는 miR-30 스캐폴드에 클로닝하였다. 발현 카세트(서열번호 12)를 단일 가닥 AAV 플라스미드에 클로닝하고 근육에서 잘 발현하는 것으로 알려진 혈청형인 AAVrh.74를 사용하여 패키징하였다. miR-29c cDNA는 miR-30 골격에서 miR-29c 표적(센스) 가닥, miR-30 스템 루프 및 miR-29c 가이드(안티센스) 가닥을 함유하는 커스텀 프라이머를 사용하여 합성되었다. miR-29c 서열의 3개 염기가 변형되었다. 이어서, 이 서열을 MCK 프로모터 및 폴리A 서열에 의해 구동되는 플라스미드를 함유하는 단일 가닥 AAV ITR에 클로닝하였다.
pAAV.MCK.miR29C 플라스미드는 AAV2 역전된 말단 반복 서열(ITR)에 의해 플랭킹된 miR-30 스템 루프 골격에서 mir29c cDNA를 함유한다. AAVrh.74 비리온으로 캡시드화된 것은 이 서열이다. 또한, miR-29c 표적 서열내 몇개의 뉴클레오타이드는 shRNA-miR(luc)에서와 같이 이 부위에서 왓슨-크릭 페어링을 모방하도록 변경되었다. ShRNA-luc 디자인에 따라, 헤어핀은 그 길이 전체에 걸쳐 완벽하게 상보적이어야 한다. 또한, 패신저 가닥에 대한 변화가 많을 수록, 스템을 통해 miRNA를 인식할 수 있는 miR-29 프로세싱을 조절하는 임의의 내인성 기전을 제거할 가능성이 높다. 가이드 가닥의 19번째 염기는 천연 mi-29c 서열의 절단 부위에 선행하는 뉴클레오타이드를 모방하기 위해 시토신으로 변형되고 다른 가닥에 대한 상응하는 염기는 페어링을 보존하기 위해 변화되었다.
AAV.MCK.miR-29c/마이크로-디스트로핀 병용 요법의 조기 치료는 섬유증 및 ECM 발현을 감소시키는데 보다 효과적이었다. 4-5주령 mdx/utrn +＼- 마우스는 실시예 5에 기재된 바와 같이 rAAVrh.74.MCK.MiR-29c 및 rAAVrh74.MCK.마이크로-디스트로핀의 근육내 주사를 5x1011 vgs로 왼쪽 비복근 근육에 투여받았다. 주사 12주 후에 근육을 수거하였다. 미주사된 및 rAAV.MCK.miR-29c/rAAV.MCK.마이크로-디스트로핀의 병용 요법으로 주사된 마우스로부터 수거한 근육의 피크로시리우스 레드 염색은, 동시 처리된 근육이 미처리된 GAS 근육에 비해 콜라겐이 50.9% 감소했음을 보여주었다(참조: 도 13a 및 13b). qRT-PCR은 처리된 코호트에서 miR-29c 전사체 수준의 증가를 확인하였다(도 13c). 반-정량적 qRT-PCR은 대측성 사지 요법에 비해 AAV.MCK.miR-29c/AAV.마이크로-디스트로핀 처리된 근육에서 콜라겐 A1 및 콜라겐 3A(도 13d, 13e), 피브로넥틴(도 13f) 및 Tgfβ1(도 13g) 수준이 현저히 감소함을 보여주었다. (*p<0.05,****p<0.0001). AAV.MCK.miR-29c/마이크로-디스트로핀 병용 요법의 후반 치료는 섬유증 및 ECM 발현을 감소시키는데 효과적이다. 3개월령 mdx/utrn +＼- 마우스는 실시예 5에 기재된 바와 같이 rAAVrh.74.MCK.MiR-29c 및 rAAVrh.74.MCK.마이크로-디스트로핀의 근육내 주사를 5x1011 vgs로 왼쪽 비복근 근육에 투여받았다. 주사 12주 후에 근육을 수거하였다. 미처리된, AAV.MCK.miR-29c 및 AAV.MCK.miR-29c/AAV.마이크로-디스트로핀 처리된 근육의 피크로시리우스 레드 염색은, 미처리된 GAS 근육에 비해 콜라겐이 30.3% 감소했음을 보여주었다(참조: 도 14a 및 14b). qRT-PCR은 처리된 코호트에서 miR-29c 전사체 수준의 증가를 확인하였다(도 14c). 반-정량적 qRT-PCR은 대측성 사지에 비해 AAV.miR-29c/AAV.마이크로-디스트로핀 처리된 근육에서 콜라겐 1A 및 콜라겐 3A(도 14d, 14e), 피브로넥틴(도 14f) 및 Tgfβ1(도 14g) 수준이 현저히 감소함을 보여준다. 모든 데이터는 평균±SEM을 나타낸다. (** p<0.01, ****p<0.0001).
실시예 11
조기 병용 요법은 후반 치료보다 우수하게 힘을 회복하고 수축-유발 손상으로부터 보호한다
생체내 힘 측정은 실시예 8 및 9에 기재된 바와 같이 miR-29 및 마이크로-디스트로핀의 근육-특이적 발현으로 조기 치료한 마우스의 GAS에 대해 수행하였다. 4주령 mdx/utrn+/- 마우스에서, rAAV.MCK.miR-29c/및 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV를 사용한 동시 처리는, 미처리된 mdx/utrn+/- 마우스와 비교했을 때 절대적 힘에서 현저한 향상을 보였고, 야생형과 차이가 없었다(도 15a). 특이적 힘은 또한 병용 요법 후 야생형 수준으로 정규화되었다(도 15b).
실시예 9에 기재된 바와 같이 반복적 편심 수축 후 힘의 손실로 근육을 평가하였다. rAAV.MCK.miR-29c/rAAV.MCK.마이크로-디스트로핀으로 동시 처리 및 rAAV.MCK.마이크로-디스트로핀 단독 처리한 마우스는 미처리된 mdx/utrn +＼- 근육에 비해 힘의 손실로부터 보호됨을 보였다(도 15c).
12주령 mdx/utrn+/- 마우스에서, rAAV.MCK.miR-29c/및 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV를 사용하는 동시 처리는 수축-유발된 손상에 비해 힘을 회복하고 수축-유발 손상에 대해 보호하였다(도 16a). 경직성 수축 후 rAAV.MCK.miR-29c 및 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV 주사된 GAS 근육에서 절대적 힘(도 16a) 및 정규화된 특이적 힘(도 16b) 측정은 미처리된 mdx/utrn+/- 근육에 비해 현저히 증가하였다. 이후, 실시예 9에 기재된 바와 같이 반복적 편심 수축 후 힘의 손실로 근육을 평가하였다. MCK.miR-29c/마이크로-디스트로핀으로 동시 처리된 마우스는 미처리된 mdx/utrn +＼- 근육에 비해 힘의 손실로부터 보호됨을 보였다(도 16c). 이들 데이터는 섬유증 및 유전자 대체를 감소시켜 절대적 힘과 특이적 힘 둘 다가 증가하고 수축-유발된 손상으로부터 근육을 현저히 보호한다는 것을 보여준다.
실시예 12
조기 병용 치료는 근육비대 및 증식을 증가시킨다
rAAV.MCK.miR-29와 마이크로-디스트로핀을 발현하는 rAAV의 동시-전달은 주사 후 3개월 째에 단독 1회 주사에 비해 주사된 비복근의 총 중량을 증가시키지 않았다(도 17a). 근섬유 직경을 또한 측정하였다. miR-29c/마이크로-디스트로핀 병용 치료는 평균 섬유 크기가 증가함을 입증하였다. mdx/utrn+/- 대조군과 mdx/utrn+/-로 처리된 miR-29c/마이크로-디스트로핀을 비교하면, 평균 직경은 28.96에서 36.03 μm로 증가하였다(도 17b). 동시-전달은 야생형 섬유 크기 분포로의 쉬프트를 나타냈다(도 17c). miR-29c/마이크로-디스트로핀 병용 치료에서 mm2 당 근육 섬유의 수는 미처리된 마우스 및 야생형보다 현저히 적었다(도 17d; ***p<0.01, ****p<0.0001).
참조문헌
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1440 Thr Lys Thr Glu Glu Arg Thr Arg Lys Met Glu Glu Glu Pro Leu Gly 465 470 475 480 ccc gac ctg gag gat ctg aag aga cag gtg cag cag cat aag gtg ctg 1488 Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys Arg Gln Val Gln Gln His Lys Val Leu 485 490 495 cag gag gat ctg gaa cag gag cag gtg cgg gtg aac tcc ctg aca cat 1536 Gln Glu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Val Arg Val Asn Ser Leu Thr His 500 505 510 atg gtg gtg gtg gtg gac gaa tct agt gga gat cac gcc acc gcc gcc 1584 Met Val Val Val Val Asp Glu Ser Ser Gly Asp His Ala Thr Ala Ala 515 520 525 ctg gag gaa cag ctg aag gtg ctg ggg gac cgg tgg gcc aac att tgc 1632 Leu Glu Glu Gln Leu Lys Val Leu Gly Asp Arg Trp Ala Asn Ile Cys 530 535 540 cgg tgg acc gag gac agg tgg gtg ctg ctg cag gac atc ctg ctg aaa 1680 Arg Trp Thr Glu Asp Arg Trp Val Leu Leu Gln Asp Ile Leu Leu Lys 545 550 555 560 tgg cag agg ctg acc gag gag cag tgt ctg ttt agt gct tgg ctg agc 1728 Trp Gln Arg Leu Thr Glu Glu Gln Cys Leu Phe Ser Ala Trp Leu Ser 565 570 575 gag aaa gag gac gcc gtg aac aag atc cac aca acc ggc ttt aag gat 1776 Glu Lys Glu Asp Ala Val Asn Lys Ile His Thr Thr Gly Phe Lys Asp 580 585 590 cag aac gaa atg ctg tct agc ctg cag aaa ctg gct gtg ctg aag gcc 1824 Gln Asn Glu Met Leu Ser Ser Leu Gln Lys Leu Ala Val Leu Lys Ala 595 600 605 gat ctg gag aaa aag aag cag agc atg ggc aaa ctg tat agc ctg aaa 1872 Asp Leu Glu Lys Lys Lys Gln Ser Met Gly Lys Leu Tyr Ser Leu Lys 610 615 620 cag gac ctg ctg agc acc ctg aag aac aag agc gtg acc cag aag aca 1920 Gln Asp Leu Leu Ser Thr Leu Lys Asn Lys Ser Val Thr Gln Lys Thr 625 630 635 640 gaa gcc tgg ctg gat aac ttt gcc cgc tgc tgg gac aac ctg gtg cag 1968 Glu Ala Trp Leu Asp Asn Phe Ala Arg Cys Trp Asp Asn Leu Val Gln 645 650 655 aaa ctg gag aaa agt aca gct cag atc tct cag gct gtg acc aca acc 2016 Lys Leu Glu Lys Ser Thr Ala Gln Ile Ser Gln Ala Val Thr Thr Thr 660 665 670 cag cct agc ctg acc cag aca acc gtg atg gaa acc gtg acc acc gtg 2064 Gln Pro Ser Leu Thr Gln Thr Thr Val Met Glu Thr Val Thr Thr Val 675 680 685 aca acc cgc gaa cag atc ctg gtg aaa cat gcc cag gaa gag ctg cca 2112 Thr Thr Arg Glu Gln Ile Leu Val Lys His Ala Gln Glu Glu Leu Pro 690 695 700 cct cca cct ccc cag aag aag aga acc ctg gag cgg ctg cag gag ctg 2160 Pro Pro Pro Pro Gln Lys Lys Arg Thr Leu Glu Arg Leu Gln Glu Leu 705 710 715 720 cag gaa gcc act gac gaa ctg gac ctg aag ctg agg cag gcc gaa gtg 2208 Gln Glu Ala Thr Asp Glu Leu Asp Leu Lys Leu Arg Gln Ala Glu Val 725 730 735 att aag ggg tct tgg cag cct gtg ggc gat ctg ctg att gat tcc ctg 2256 Ile Lys Gly Ser Trp Gln Pro Val Gly Asp Leu Leu Ile Asp Ser Leu 740 745 750 cag gac cac ctg gaa aag gtg aag gct ctg aga ggc gaa att gct cca 2304 Gln Asp His Leu Glu Lys Val Lys Ala Leu Arg Gly Glu Ile Ala Pro 755 760 765 ctg aag gag aac gtg agt cat gtg aac gat ctg gct aga cag ctg aca 2352 Leu Lys Glu Asn Val Ser His Val Asn Asp Leu Ala Arg Gln Leu Thr 770 775 780 aca ctg ggc atc cag ctg agc cca tac aat ctg agc aca ctg gag gac 2400 Thr Leu Gly Ile Gln Leu Ser Pro Tyr Asn Leu Ser Thr Leu Glu Asp 785 790 795 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<223> pAAV.MCK.miR26C Sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(9) <223> n is a, c, g, t or u <220> <221> enhancer <222> (190)..(395) <223> MCK enhancer <220> <221> promoter <222> (396)..(753) <223> MCK promoter <220> <221> misc_feature <222> (1316)..(1608) <223> shRNA-miR29-c with primary seed sequence <220> <221> misc_feature <222> (1487)..(1512) <223> miR-29c <220> <221> misc_feature <222> (2094)..(2146) <223> SV40 PolyA <220> <221> misc_feature <222> (2326)..(2331) <223> n is a, c, g, t or u <400> 12 ctgnnnnnng cgcgctcgct cgctcactga ggccgcccgg gcaaagcccg ggcgtcgggc 60 gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc 120 catcactagg ggttccttgt agttaatgat taacccgcca tgctaattat ctacgtagcc 180 atgtctagac agccactatg ggtctaggct gcccatgtaa ggaggcaagg cctggggaca 240 cccgagatgc ctggttataa ttaacccaga catgtggctg ctcccccccc ccaacacctg 300 ctgcctgagc ctcaccccca ccccggtgcc tgggtcttag gctctgtaca ccatggagga 360 gaagctcgct ctaaaaataa ccctgtccct ggtgggctgt gggggactga gggcaggctg 420 taacaggctt gggggccagg gcttatacgt gcctgggact cccaaagtat tactgttcca 480 tgttcccggc gaagggccag ctgtcccccg ccagctagac tcagcactta gtttaggaac 540 cagtgagcaa gtcagccctt ggggcagccc atacaaggcc atggggctgg gcaagctgca 600 cgcctgggtc cggggtgggc acggtgcccg ggcaacgagc tgaaagctca tctgctctca 660 ggggcccctc cctggggaca gcccctcctg gctagtcaca ccctgtaggc tcctctatat 720 aacccagggg cacaggggct gcccccgggt caccaccacc tccacagcac agacagacac 780 tcaggagcca gccagccagg taagtttagt ctttttgtct tttatttcag gtcccggatc 840 cggtggtggt gcaaatcaaa gaactgctcc tcagtggatg ttgcctttac ttctaggcct 900 gtacggaagt gttacttctg ctctaaaagc tgcggaattg tacccgccta gaggatccgg 960 tactcgagga actgaaaaac cagaaagtta actggtaagt ttagtctttt tgtcttttat 1020 ttcaggtccc ggatccggtg gtggtgcaaa tcaaagaact gctcctcagt ggatgttgcc 1080 tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta aaagctgcgg aattgtaccc 1140 ggggccgatc caccggtctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg 1200 tgtgtggttc ccgcgggcgg cgacggggcc cgtgcgtccc agcgcacatg ttcggcgagg 1260 cggggcctgc 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ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 3000 gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 3060 tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt 3120 tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 3180 ttaacaaaat attaacgttt acaatttaaa tatttgctta tacaatcttc ctgtttttgg 3240 ggcttttctg attatcaacc ggggtacata tgattgacat gctagtttta cgattaccgt 3300 tcatcgattc tcttgtttgc tccagactct caggcaatga cctgatagcc tttgtagaga 3360 cctctcaaaa atagctaccc tctccggcat gaatttatca gctagaacgg ttgaatatca 3420 tattgatggt gatttgactg tctccggcct ttctcacccg tttgaatctt tacctacaca 3480 ttactcaggc attgcattta aaatatatga gggttctaaa aatttttatc cttgcgttga 3540 aataaaggct tctcccgcaa aagtattaca gggtcataat gtttttggta caaccgattt 3600 agctttatgc tctgaggctt tattgcttaa ttttgctaat tctttgcctt gcctgtatga 3660 tttattggat gttggaagtt cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt 3720 tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag 3780 ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc 3840 gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca 3900 tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc 3960 atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc 4020 cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc 4080 tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc 4140 gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg 4200 gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat 4260 ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc 4320 acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa 4380 ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa 4440 aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt 4500 gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct 4560 tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat 4620 gaagccatac 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ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 5520 agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 5580 aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 5640 aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 5700 ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 5760 cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat 5820 tctgtggata accgtattac cgggtttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg 5880 accgagcgca gcgagtcagt gagcgaccaa gcggaagagc 5920

Claims (24)

  1. 5'에서 3' 방향으로 역전된 말단 반복(ITR), 근육-특이적 조절 요소, 키메라 인트론 서열, 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열, 폴리 A 테일, 및 ITR을 포함하는 재조합 AAV(adeno-associated virus)rh74 벡터.
  2. 청구항 1에 있어서, 근육-특이적 조절 요소가 서열번호 10 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 재조합 AAVrh74 벡터.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열 및 상기 근육-특이적 조절 요소 사이에 키메라 인트론 서열을 추가로 포함하고, 여기서 키메라 인트론 서열이 서열번호 9의 뉴클레오타이드 844-993으로 제시된 것인 재조합 AAVrh74 벡터.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열의 폴리 A 테일 3'을 추가로 포함하고, 여기서 상기 폴리 A 테일의 서열이 서열번호 9의 뉴클레오타이드 4585 내지 4640으로 제시된 것인 재조합 AAVrh74 벡터.
  5. 청구항 1, 2 및 4 중 어느 한 항의 재조합 AAVrh74 벡터를 포함하는, 근이영양증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 근이영양증을 치료하기 위한 조성물.
  6. 청구항 1, 2 및 4 중 어느 한 항의 재조합 AAVrh74 벡터를 포함하는, 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 섬유증을 감소 또는 예방하기 위한 조성물.
  7. 청구항 1, 2 및 4 중 어느 한 항의 재조합 AAVrh74 벡터를 포함하는, 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 근육힘을 증가시키기 위한 조성물.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 대상체에서 섬유증이 관찰되기 전에 또는 상기 대상체에서 근육힘이 감소되기 전에 또는 상기 대상체에서 근육량이 감소되기 전에 투여되는 조성물.
  9. 청구항 5에 있어서, 상기 대상체가 듀시엔형(Duchenne) 근이영양증 또는 베커(Becker) 근이영양을 앓고 있는 것인 조성물.
  10. 청구항 5에 있어서, 근육내 투여, 정맥내 주사, 비경구 투여 또는 전신 투여를 위해 제형화되는 조성물.
  11. 청구항 1, 2 및 4 중 어느 한 항의 재조합 AAVrh74 벡터로 단리된 숙주 세포를 감염시키는 단계 및 상기 숙주 세포에서 기능성 마이크로-디스트로핀 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는, 기능성 마이크로-디스트로핀 단백질을 제조하는 방법.
  12. 청구항 3의 재조합 AAVrh74 벡터를 포함하는, 근이영양증을 치료하기 위한 조성물.
  13. 청구항 3의 재조합 AAVrh74 벡터를 포함하는, 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 섬유증을 감소 또는 예방하기 위한 조성물.
  14. 청구항 3의 재조합 AAVrh74 벡터를 포함하는, 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 근육힘을 증가시키기 위한 조성물.
  15. 청구항 6에 있어서, 상기 대상체에서 섬유증이 관찰되기 전에 또는 상기 대상체에서 근육힘이 감소되기 전에 또는 상기 대상체에서 근육량이 감소되기 전에 투여되는 조성물.
  16. 청구항 6에 있어서, 상기 대상체가 듀시엔형 근이영양증 또는 베커 근이영양을 앓고 있는 것인 조성물.
  17. 청구항 6에 있어서, 근육내 투여, 정맥내 주사, 비경구 투여 또는 전신 투여를 위해 제형화되는 조성물.
  18. 청구항 7에 있어서, 상기 대상체에서 섬유증이 관찰되기 전에 또는 상기 대상체에서 근육힘이 감소되기 전에 또는 상기 대상체에서 근육량이 감소되기 전에 투여되는 조성물.
  19. 청구항 7에 있어서, 상기 대상체가 듀시엔형 근이영양증 또는 베커 근이영양을 앓고 있는 것인 조성물.
  20. 청구항 7에 있어서, 근육내 투여, 정맥내 주사, 비경구 투여 또는 전신 투여를 위해 제형화되는 조성물.
  21. 삭제
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