JP2022137029A - ＣｐＧ減少第ＶＩＩＩ因子変種、組成物並びに止血障害の処置のための方法及び使用 - Google Patents

ＣｐＧ減少第ＶＩＩＩ因子変種、組成物並びに止血障害の処置のための方法及び使用 Download PDF

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Abstract

【課題】ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸変種及びその使用方法を提供する。【解決手段】特定の配列と９２％以上の配列同一性を有する、Ｂドメインの欠失を有する第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をコードする核酸変種を提供する。特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種は、細胞によってより効率的に発現され、細胞によって野生型第ＶＩＩＩ因子タンパク質よりも増加したレベルで分泌され、野生型第ＶＩＩＩ因子タンパク質よりも高い発現及び／若しくは活性を示し、又はウイルスベクターに、より効率的にパッケージングされる。【選択図】図８

Description

[0002]本発明は、組換え凝固因子の産生及び止血異常に関連する医学的障害の処置の分野に関する。より詳細には、本発明は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質をコードする核酸変種（ｖａｒｉａｎｔ）（配列）であって、任意選択で、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質と比較して増加した転写及び／又は発現及び／又は活性を実現する核酸変種（配列）を提供する。
[0003]本発明が属する技術の現状を説明するために、いくつかの刊行物及び特許文献が本明細書全体にわたり引用されている。これらの引用のそれぞれは、その全体が示されているかのように参照により本明細書に組み込まれている。
[0004]血友病は、世界中で男性５，０００人中１人に存在するＸ連鎖出血障害である。凝固因子のレベルを正常値の１％のほんの上に増加させることを目標とする治療は、重度の疾患表現型の実質的な改善を伴う。血友病Ｂ（ＨＢ）に対するＡＡＶ媒介遺伝子導入についての最近の臨床試験により、治療レベルの第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の持続性長期発現が実証されたが、ＡＡＶカプシドに対する抗ＡＡＶ免疫応答が原因でＡＡＶベクターの用量が限定されるおそれがあることが立証された。これらのデータは血友病Ｂに関するものであるのに対し、全ての血友病の８０％は、ＦＶＩＩＩ欠乏が原因の血友病Ａ（ＨＡ）である。
[0005]この疾患に対する現在の処置は、第ＶＩＩＩ因子タンパク質の頻繁な注入を必要とするタンパク質補充療法である。患者がそのような頻繁なタンパク質処置をもはや必要としないように、第ＶＩＩＩ因子の治療的発現レベルを持続的に達成することが直ちに必要である。実際に、第ＶＩＩＩ因子の連続的な発現は、出血エピソードを予防すると予想され、タンパク質に対して免疫寛容が樹立されることを確実にする可能性がある。
[0006]要約すると、ＨＡに対する遺伝子療法は、（１）ヒトＦＶＩＩＩ（ｈＦＶＩＩＩ）の固有の性質が、類似のサイズの他のタンパク質と比較して発現を困難にしている、（２）ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡの比較的大きなサイズ及び配列特異的効果が再配列と相関し、これがＡＡＶ産生を妨げる、及び（３）タンパク質療法に応答して抗ＦＶＩＩＩ抗体（インヒビター）が高い率で形成し、それが重症（＜１％ ＦＶＩＩＩ）ＨＡ患者の２５～３０％に発生するという３つの異なる難問を突きつけている。
[0007]本発明により、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質をコードするシトシン－グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）減少核酸変種が提供される。そのようなＣｐＧ減少核酸変種は、ＦＶＩＩＩをコードする野生型核酸と異なり、例えば、任意選択でＦＶＩＩＩ Ｂドメインを全体又は部分的に欠如するヒトＦＶＩＩＩタンパク質をコードし得る。そのようなＣｐＧ減少核酸変種には、ＦＶＩＩＩ－ＣＯ３（配列番号２１）などのコドン最適化されたＦＶＩＩＩ核酸と比較して、細胞に移入したときに増加した発現（例えば１～５倍に増加した発現）を示し、増加したＦＶＩＩＩタンパク質の分泌をもたらすことによって、増加した活性をもたらす変種が含まれる。
[0008]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ Ｂドメインの全体又は部分的な欠失を有する又は有さないＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種は、哺乳動物においてＦＶＩＩＩの増加した発現及びＦＶＩＩＩタンパク質の増加した産生を与えることができるだけでなく、ＦＶＩＩＩタンパク質の増加した循環レベルにより遺伝子導入に関連して増加した有効性を実現し、有益な治療結果のための止血を達成する。
[0009]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩをコードする核酸変種は、ＦＶＩＩＩをコードする野生型核酸と比較して減少したＣｐＧ含量を有する。ある特定の実施形態では、核酸変種は、ＦＶＩＩＩをコードする野生型核酸（配列番号１９）よりも少なくとも１０個少ないＣｐＧを有する。ある特定の実施形態では、核酸変種は、４つ以下のＣｐＧ；３つ以下のＣｐＧ；２つ以下のＣｐＧ；又は１つ以下のＣｐＧを有する。ある特定の実施形態では、核酸変種は、最大で４つのＣｐＧ；３つのＣｐＧ；２つのＣｐＧ；又は１つのＣｐＧを有する。ある特定の実施形態では、核酸変種は、ＣｐＧを有さない。
[0010]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩをコードする核酸変種は、ＦＶＩＩＩをコードする野生型核酸と比較して減少したＣｐＧ含量を有し、そのようなＣｐＧ減少核酸変種は、配列番号１～１８のうちのいずれかと９０％以上の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、ＣｐＧ減少核酸変種は、配列番号１～１８のうちのいずれかと９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれを超える配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、ＣｐＧ減少核酸変種は、配列番号１～１８のうちのいずれかと９０～９５％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、ＣｐＧ減少核酸変種は、配列番号１～１８のうちのいずれかと９５％～１００％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種は、配列番号１～１８のうちのいずれかに示される。
[0011]ある特定の実施形態では、ＣｐＧ減少核酸変種は、ＦＶＩＩＩ変種Ｖ３（配列番号２０）及び／又はＦＶＩＩＩ変種ＣＯ３（配列番号２１）と異なる。
[0012]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸変種は、野生型ＦＶＩＩＩ又はＢドメインの欠失を含む野生型ＦＶＩＩＩと比較して高い発現を実現する及び／又はすぐれた生物学的活性を示す（例えば、血漿レベル若しくは凝固アッセイ、又はＦＶＩＩＩアッセイ若しくはＦＶＩＩＩ欠乏モデルにおける出血減少よって判定したとき）。
[0013]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸変種は、野生型ヒトＦＶＩＩＩ核酸又はＢドメインの欠失を含む野生型ヒトＦＶＩＩＩと少なくとも７５％同一である。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸変種は、野生型ヒトＦＶＩＩＩ核酸又はＢドメインの欠失を含む野生型ヒトＦＶＩＩＩ核酸と約７５～９５％同一（例えば、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％同一）である。
[0014]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸変種は、ヒトなどの哺乳動物である。ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするそのような哺乳動物ＣｐＧ減少核酸変種には、ヒト野生型ＦＶＩＩＩ又はＢドメインの欠失を含むヒト野生型ＦＶＩＩＩに基づくことができるヒト型が含まれる。
[0015]本発明により、本明細書記載のＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸変種を含むベクター及び発現ベクターも提供される。特定の実施形態では、ベクター又は発現ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、プラスミド、又はレンチウイルスベクターを含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８ ＡＡＶなどのＡＡＶ血清型又はＡＡＶ偽型を含む。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、配列番号１～１８のうちのいずれか、又は配列番号２３若しくは２４を含む。
[0016]ある特定の実施形態では、発現制御エレメントは、構成的若しくは調節可能制御エレメント、又は組織特異的発現制御エレメント若しくはプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、発現制御エレメントは、肝臓において発現を付与するエレメントを含む。ある特定の実施形態では、発現制御エレメントは、ＴＴＲプロモーター又は配列番号２２などの変異型ＴＴＲプロモーターを含む。さらに特定の態様では、発現制御エレメントは、その全体が参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ公報である国際公開第２０１６／１６８７２８号（米国特許出願第６２／１４８，６９６号；同第６２／２０２，１３３号；及び同第６２／２１２，６３４号）に示されるプロモーターを含む。
[0017]本発明により、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸変種を含むウイルスベクター、又はＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸変種を含むベクター若しくは発現ベクターがさらに提供される。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、プラスミド、又はレンチウイルスベクターを含む。
[0018]ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型又はＩＴＲ血清型と異なるＡＡＶカプシド血清型を含むＡＡＶ偽型を含む。追加的な特定の態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８ ＡＡＶ血清型のうちのいずれかと７５％以上の配列同一性（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％など）を有するＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３カプシド配列を含む。
[0019]発現ベクターは、追加的な構成成分又はエレメントを含み得る。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターなどの発現ベクターは、イントロン、発現制御エレメント、１つ若しくは複数のＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４若しくはＡＡＶ－２ｉ８ ＡＡＶ血清型、又はその組合せのうちのいずれか）、フィラーポリヌクレオチド配列及び／又はポリＡシグナルをさらに含む。ある特定の実施形態では、イントロンは、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種内にあるか、若しくはそれに隣接し、及び／又は発現制御エレメントは、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種に作動可能に連結し、及び／又はＡＡＶ ＩＴＲ（複数可）は、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種の５’若しくは３’末端に隣接し、及び／又はフィラーポリヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種の５’若しくは３’末端に隣接する。
[0020]特定の実施形態では、発現制御エレメントは、構成的若しくは調節可能制御エレメント、又は組織特異的発現制御エレメント若しくはプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、発現制御エレメントは、肝臓において発現を付与するエレメントを含む（例えば、ＴＴＲプロモーター又は変異型ＴＴＲプロモーター）。
[0021]本発明により、本明細書に示されるＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸変種を含む宿主細胞が追加的に提供される。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸変種又はＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸変種を含む発現ベクターを含む。ある特定の実施形態では、そのような宿主細胞は、核酸変種によってコードされるＦＶＩＩＩタンパク質を産生し、産生されたＦＶＩＩＩタンパク質が回収される。細胞によって産生され、任意選択で単離及び／又は精製されたそのようなＦＶＩＩＩタンパク質を、対象に投与することができる。
[0022]本発明により、本明細書に示されるＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種、ベクター及び発現ベクターを含む組成物が、なお追加的に提供される。特定の実施形態では、医薬組成物は、生物学的に適合性の担体又は賦形剤中にベクター、発現ベクター、又はウイルス若しくはＡＡＶベクターを含む。そのような医薬組成物は、任意選択で空の（例えば、ＦＶＩＩＩをコードする核酸変種を含むベクターゲノムを欠如する）カプシドＡＡＶを含む。追加的な特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸変種、ベクター、発現ベクター、又はウイルス若しくはＡＡＶベクターは、リポソームに封入される、又はリン脂質若しくはミセルと混合される。
[0023]本発明により、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸変種を哺乳動物又は哺乳動物細胞に送達又は移入するための方法がなおさらに提供される。一態様では、方法は、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸変種を含むベクター、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸変種を含む発現ベクター、又はＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸変種を含むウイルス若しくはＡＡＶベクターを、哺乳動物又は哺乳動物細胞に投与するか、又はそれと接触させることにより、核酸配列を哺乳動物又は哺乳動物細胞に送達又は移入するステップを含む。そのような方法は、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸変種を培養哺乳動物細胞又は対象（例えば患者）に導入する。
[0024]本発明の方法は、ＦＶＩＩＩを必要とするヒト（このヒトは、不十分な量のＦＶＩＩＩタンパク質、又は欠陥若しくは異常ＦＶＩＩＩタンパク質を産生する）などの哺乳動物対象（例えば患者）を処置するステップも含む。一態様では、ＦＶＩＩＩを必要とする哺乳動物を処置する方法は、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種、又はＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含むベクター；又はＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含む発現ベクター、又はＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含むウイルス若しくはＡＡＶベクターを提供するステップ；及び核酸変種によってコードされるＦＶＩＩＩが哺乳動物対象において発現されるように、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種、又はＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含むベクター、又はＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含む発現ベクター、又はＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含むウイルス若しくはＡＡＶベクターの量を、哺乳動物対象に投与するステップを含む。
[0025]別の実施形態では、止血関連障害の処置を必要とする患者（例えば、この患者は、不十分な量のＦＶＩＩＩタンパク質、又は欠陥若しくは異常ＦＶＩＩＩタンパク質を産生する）においてこれを処置するための方法は、生物学的に許容される担体中のＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種、又はＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含むベクター、又はＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含む発現ベクター、又はＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含むウイルス若しくはＡＡＶベクターの治療有効量を患者に投与するステップを含む。
[0026]本発明の方法のある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩは、哺乳動物に有益効果若しくは治療効果を有するレベルで、及び／又は哺乳動物の細胞、組織若しくは器官において発現される。そのような実施形態は、肝臓などの組織又は器官への、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種の導入を含む。そのような実施形態は、分泌細胞へのＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種の導入も含む。そのような実施形態は、内分泌細胞又は内皮細胞へのＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種の導入をさらに含む。そのような実施形態は、肝細胞、類洞内皮細胞、巨核球、血小板又は造血幹細胞へのＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種の導入を追加的に含む。
[0027]ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種、又はＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含むベクター、又はＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含む発現ベクター、又はＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含むウイルス若しくはＡＡＶベクターの投与（例えば送達）の候補となる対象（例えば患者）及び哺乳動物（例えばヒト）には、血友病Ａ、フォンウィルブランド病及び外傷に関連する出血、傷害、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝固障害、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）又は過剰抗凝固処置障害などの障害を有する又は有するリスクがある対象及び哺乳動物が含まれる。
[0028]ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種、又はＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含むベクター、又はＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含む発現ベクター、又はＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含むウイルス若しくはＡＡＶベクターの投与（例えば送達）の候補となる対象（例えば患者）及び哺乳動物（例えばヒト）には、ＡＡＶ抗体血清陰性の対象及び哺乳動物、並びにＡＡＶ抗体を有する又はそれを発生するリスクのある対象及び哺乳動物が含まれる。そのような対象（例えば患者）及び哺乳動物（例えばヒト）は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ－Ｒｈ１０又はＡＡＶ－Ｒｈ７４血清型について血清陰性又は血清陽性の可能性がある。
[0029]したがって、本発明の組成物及び方法は、前記哺乳動物又は前記患者に空のカプシドＡＡＶを投与するステップをさらに含む。特定の実施形態では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－Ｒｈ１０及び／又はＡＡＶ－Ｒｈ７４血清型の空のカプシドが、哺乳動物又は患者にさらに投与される。
[0030]本発明による投与（例えば送達）の方法は、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏの、任意の様式の接触又は送達を含む。特定の実施形態では、投与（例えば送達）は、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、腔内、挿管、又は経カテーテルである。
[0031]本発明は、投薬を評価し変種の免疫原性を監視するために、ヒトＦＶＩＩＩに対して寛容な小型及び大型動物モデルにおいてＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を試験するための方法も提供する。動物モデルの使用は、ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤを用いたタンパク質補充療法を現在受けており、抗ｈＦＶＩＩＩ抗体応答の証拠を有さないヒトであって、そのような変種に対する免疫応答を発生する可能性が高いヒトの評価を可能にする設定を実現する。
図１は、１８種の異なるクローン（それぞれ配列番号１～１８に対応するＸ０１～Ｘ１８）及びＦＶＩＩＩ－ＣＯ３（配列番号２１）に関するプラスミド５０μｇの水力学的尾静脈（ＨＴＶ）注射の２４時間後のヒトＦＶＩＩＩ（ｈＦＶＩＩＩ）レベルを示す図である。 図２Ａ－２Ｃは、ＦＶＩＩＩ（Ａ）ＣＯ３（配列番号２１）、Ｘ０９（配列番号９）、Ｘ１２（配列番号１２）及びＸ１６（配列番号１６）；（Ｂ）ＣＯ３（配列番号２１）、Ｘ０１（配列番号１）及びＸ１１（配列番号１１）；又は（Ｃ）ＣＯ３（配列番号２１）、Ｘ０７（配列番号７）及びＸ１０（配列番号１０）をＡＡＶベクターで投与後の血友病Ａ／ＣＤ４－／－マウスにおけるＦＶＩＩＩのレベルを示す図である。 図３Ａ－３Ｂは、ビヒクル（丸）、４×１０１０（四角）、８×１０１０（三角）、又は１．６×１０１１ｖｇ／マウス（逆三角）のいずれかのＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩを静脈内投与後、８７日にわたるＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの血漿中のｈＦＶＩＩＩ抗原のレベルをｎｇ／ｍｌ（Ｂ）又は総抗原に対する％（Ｃ）で示す図である。線は、各コホートにおけるｈＦＶＩＩＩの平均±ＳＤを表す。ヒトＦＶＩＩＩ血漿レベルをＥＬＩＳＡによってアッセイし、１５０ｎｇ／ｍｌが活性１００％に等しいと仮定して、ＦＶＩＩＩ（ｎｇ／ｍｌ）を正常ＦＶＩＩＩレベルに対する％に変換した。 図３Ｃは、ｘ軸の各時点で、左から右にビヒクル、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩの４×１０１０、８×１０１０又は１．６×１０１１ｖｇ／マウスで示すいずれかを静脈内投与後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの血漿中のＤ－ダイマーレベルを示す図である。棒線は、各コホートにおけるマウスの平均±ＳＤを表す。Ｄ－ダイマーレベルをＥＬＩＳＡによってアッセイした。 ＮＨＰの試験計画を示す図である。 図５Ａ－５Ｄは、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５を２×１０１２（Ａ）、５×１０１２（Ｂ）又は１×１０１３ｖｇ／ｋｇ（Ｃ）のいずれかで静脈内投与後のＮＨＰにおけるｈＦＶＩＩＩの抗原レベルを示す図である。線は、個別の動物を表す。ヒトＦＶＩＩＩの血漿レベルをＥＬＩＳＡによってアッセイした。これらのレベルは、試験の間に同じ動物群に対する連続採決によって得られた、繰り返し測定した値を表す（各コホートあたり動物ｎ＝２～３匹）。ビヒクル処置動物から測定されたヒトＦＶＩＩＩレベルを合計３つのグラフに白丸として示す。ε＝ＦＶＩＩＩに対するインヒビターの発生 図６Ａ－６Ｃは、ＮＨＰにおける２×１０１２（Ａ）、５×１０１２（Ｂ）又は１×１０１３ｖｇ／ｋｇ（Ｃ）のＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５でのＡＬＴレベルを示す図である。 図７Ａ－７Ｃは、ＮＨＰにおけるＤ－ダイマーレベルを示す図である。ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５を２×１０１２（Ａ）、５×１０１２（Ｂ）又は１×１０１３ｖｇ／ｋｇ（Ｃ）のいずれかで静脈内投与後のＮＨＰの血漿中Ｄ－ダイマー抗原濃度。点線は、ヒトにおけるＤ－ダイマーの正常上限である５００ｎｇ／ｍｌを示す。 ３つの用量のＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５におけるＦＶＩＩＩレベルのデータの要約を示す。 図９Ａ－９Ｄは、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３カプシド）－ｈＦＶＩＩＩを２×１０１２（Ａ）、６×１０１２（Ｂ）又は２×１０１３（ｖｇ／ｋｇ）（Ｃ）のいずれかで静脈内投与後のカニクイザル血漿中のｈＦＶＩＩＩのレベルを示す図である。線は、個別の動物を表す。ｈＦＶＩＩＩの血漿レベルをＥＬＩＳＡによってアッセイし、試験の間に同じ動物群に対する連続採血によって得られた、繰り返し測定した値を表す（各コホートあたり動物ｎ＝３匹）。溶媒処置動物において測定されたヒトＦＶＩＩＩレベルを白丸として示す（ｎ＝２）。ε＝各個別の動物においてＦＶＩＩＩに対するインヒビターの発生が検出された時間。 ＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３カプシド）－ｈＦＶＩＩＩを用いて達成されたＦＶＩＩＩレベルと、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８カプシドを有するＡＡＶベクターにより送達されたＦＶＩＩＩの報告レベルとの比較を示す図である。ＡＡＶ５：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｍａｒｉｎ．ｃｏｍ／ｐｄｆ／ＢｉｏＭａｒｉｎ＿Ｒ＆Ｄ＿Ｄａｙ＿４＿２０＿２０１６．ｐｄｆ、スライド１６。ＡＡＶ８：ＭｃＩｎｔｏｓｈ Ｊら、Ｂｌｏｏｄ ２０１３；１２１（１７）：３３３５～４４。 非ヒト霊長類の、主に腎臓、脾臓及び肝臓におけるＡＡＶ－ＳＰＫ（配列番号２８）及びＡＡＶ－ＬＫ０３（配列番号２７）（各組織について３本目の棒線）の組織分布を示す図である。 マウスにＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５を全身投与した後の肝臓及び脾臓のＦＶＩＩＩの発現を示す図である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏで分析したＡＡＶ－ＬＫ０３カプシドの形質導入効率を示す図である。Ｘ軸は、カニクイザル（左側の縦棒線）、ヒト（右側の縦棒線）である。 図１４Ａ－１４Ｂは、ＡＡＶ投与後のウサギにおけるｈＦＩＸの血漿中濃度を示す図である。ウサギに、ｈＦＩＸベクターＡＡＶ－ＳＰＫ又はＡＡＶ－ＬＫ０３の静脈内注射を、（Ａ）１×１０１２ｖｇ／ｋｇ（低用量、ｎ＝４）又は（Ｂ）１×１０１３ｖｇ／ｋｇ（高用量、ｎ＝３～５）の用量で行った。両側マン－ホイットニー検定を使用して群間でヒトＦＩＸレベルを比較した。有意差は観察されなかった。注射の誤りが原因で低用量コホートにおける動物５及び１５を解析から除外した。動物９及び１０は、ヒトＦＩＸに対する中和抗体を発生したので、これらの動物もグラフから除外した。 図１５Ａ－１５Ｂは、ヒトＦＩＸ（抗ＦＩＸ）の抗体形成の時間経過を示す図である。ウサギに、ｈＦＩＸベクターＡＡＶ－ＳＰＫ又はＡＡＶ－ＬＫ０３の静脈内注射を（Ａ）１×１０１２ｖｇ／ｋｇ（低用量、ｎ＝４）又は（Ｂ）１×１０１３ｖｇ／ｋｇ（高用量、ｎ＝３～５）の用量で行った。各個別の動物についてデータを示す。
[0048]ＦＶＩＩＩをコードする野生型核酸と異なる、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種が本明細書において開示される。ＦＶＩＩＩをコードするそのようなＣｐＧ減少核酸変種は、細胞及び／又は動物において増加したレベルで発現することができ、細胞及び／又は動物は、今度は増加したＦＶＩＩＩタンパク質レベルをｉｎ ｖｉｖｏで実現することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでより大きい生物学的活性を与えることができる、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種も開示される。ＦＶＩＩＩをコードする例示的なＣｐＧ減少核酸変種は、以下：１）細胞及び／又は動物における増加した発現；２）増加した活性；並びに３）野生型ｈＦＶＩＩＩよりも低いＡＡＶ用量での治療効果のうちの１つ又は複数を示すことができる。
[0049]用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む核酸、オリゴヌクレオチドのうちの全ての形態を表すために、本明細書において互換的に使用される。ポリヌクレオチドには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ、並びにスプライスされた又はスプライスされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及び阻害性ＤＮＡ又はＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、小型若しくは低分子ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小型若しくは低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ）が含まれる。ポリヌクレオチドには、天然に存在する、合成、及び意図的に改変又は変更されたポリヌクレオチド（例えば、変種核酸）が含まれる。ポリヌクレオチドは、１本鎖、２本鎖、又は３本鎖、直鎖又は環状の可能性があり、任意の長さの可能性がある。ポリヌクレオチドを話題にするにあたり、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造は、５’から３’方向に配列を提供するという慣例に従って本明細書に記載される場合がある。
[0050]本明細書に使用される用語「改変する」又は「変種」及びその文法的変形は、核酸、ポリペプチド又はその部分配列が、参照配列から逸脱していることを意味する。したがって、改変された配列及び変種配列は、参照配列と同じ、より大きい又はより小さい、発現、活性又は機能を実質的に有し得るが、参照配列の部分的な活性又は機能を少なくとも保持する。改変又は変種の特定の例は、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種である。
[0051]「核酸」又は「ポリヌクレオチド」変種は、野生型と比較して遺伝的に変更されている、改変された配列を表す。配列は、コードされるタンパク質配列を変更せずに遺伝的に改変することができる。或いは、配列は、変種タンパク質をコードするように遺伝的に改変される場合がある。核酸又はポリヌクレオチド変種は、野生型タンパク質配列などの参照配列と少なくとも部分的な配列同一性をまだ保持するタンパク質をコードするようにコドン改変され、及び変種タンパク質もコードするようにコドン改変された組合せ配列も表す可能性がある。例えば、そのような核酸変種のいくつかのコドンが、それによってコードされるタンパク質（ＦＶＩＩＩ）のアミノ酸を変更しないように変えられ、今度は、それによってコードされるタンパク質（ＦＶＩＩＩ）のアミノ酸が変わるように核酸変種のいくつかのコドンが変えられる。
[0052]用語「変種第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）」は、未改変の野生型ＦＶＩＩＩ（例えば配列番号１９）又はＦＶＩＩＩ－ＢＤＤと比較して遺伝的に変更されている改変ＦＶＩＩＩを表す。そのような変種は、「第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をコードする核酸変種」と呼ぶことができる。変種の特定の例は、ＦＶＩＩＩ又はＦＶＩＩＩ－ＢＤＤタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸である。用語「変種」は、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸を参照するとき毎に出現する必要はない。同様に、用語「ＣｐＧ減少核酸」又は類似の用語から用語「変種」が省略される場合があるが、「ＣｐＧ減少核酸」への言及は、遺伝学的レベルでの変種を含むことが意図される。
[0053]減少したＣｐＧ含量を有するＦＶＩＩＩ構築物は、ＣｐＧ含量が減少していない野生型ＦＶＩＩＩ又はＦＶＩＩＩ－ＢＤＤと比較して改善を示す可能性があり、コードされるＦＶＩＩＩ又はＦＶＩＩＩ－ＢＤＤタンパク質にアミノ酸変化を招くような改変を核酸に加えずに実際に改善を示す可能性がある。発現を比較する場合、ＣｐＧ減少核酸が、Ｂドメインを保持するＦＶＩＩＩタンパク質をコードするならば、それを野生型ＦＶＩＩＩの発現と比較することが適切であり、ＣｐＧ減少核酸が、Ｂドメインを有さないＦＶＩＩＩタンパク質をコードするならば、それはＢドメインの欠失も有する野生型ＦＶＩＩＩの発現と比較される。
[0054]「変種第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）」は、改変ＦＶＩＩＩタンパク質が野生型ＦＶＩＩＩと比較してアミノ酸の変更を有するように改変されたＦＶＩＩＩタンパク質も意味することができる。今回も、活性及び／又は安定性を比較する場合、コードされる変種ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメインを保持するならば、変種ＦＶＩＩＩタンパク質を野生型ＦＶＩＩＩと比較することが適切であり、コードされる変種ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメインの欠失を有するならば、変種ＦＶＩＩＩタンパク質は、Ｂドメインの欠失も有する野生型ＦＶＩＩＩと比較される。
[0055]変種ＦＶＩＩＩは、Ｂドメインの一部を含む可能性がある。したがって、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、Ｂドメインの一部を含む。ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤにおいてＢドメインの大部分が概して欠失している。
[0056]変種ＦＶＩＩＩは、ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ（配列番号２９）として示される「ＳＱ」配列を含み得る。ＳＱを有するそのような変種ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ／ＳＱ）は、概してＢＤＤを有し、例えば、ＢＤの少なくとも全て又は一部分が欠失している。ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤなどの変種ＦＶＩＩＩは、「ＳＱ」配列の全て又は一部分、すなわち、配列番号２９の全て又は一部分を有し得る。したがって、例えば、ＳＱ配列（ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ、配列番号２９）を有する変種ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、アミノ酸配列ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲの全て又は一部だけを有し得る。例えば、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３個のアミノ酸残基を含む可能性がある。したがって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３個の内部欠失及び１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３個のアミノ末端又はカルボキシ末端の欠失を有するＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲが、本明細書記載の変種ＦＶＩＩＩタンパク質に含まれる。
[0057]「核酸」又は「ポリヌクレオチド」配列によってコードされる「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」には、天然に存在する野生型タンパク質の場合のような完全長天然由来（ＦＶＩＩＩ）配列が含まれるだけでなく、機能的部分配列、改変形態又は配列変種が天然由来完全長タンパク質の機能性をある程度保持する限り、そのような部分配列、改変形態又は変種が含まれる。例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸は、本明細書に記載のようなＢドメインの欠失を有し、凝固機能を保持し得る。本発明の方法及び使用において、核酸配列によってコードされるそのようなポリペプチド、タンパク質及びペプチドは、処置される哺乳動物において欠陥がある、又は発現が不十分若しくは欠乏している内因性タンパク質と同一である可能性があるが、その必要があるわけではない。
[0058]改変の非限定的な例は、１つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸の置換（例えば、１～３、３～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～４０、４０～５０、５０～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～５００、５００～７５０、７５０～８５０又はそれを超えるヌクレオチド又は残基）を含む。核酸改変の例は、ＣｐＧ減少である。ある特定の実施形態では、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質などのＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸は、ヒト第ＦＶＩＩＩ因子をコードする野生型配列と比較して１０個以下少ないＣｐＧ；又はヒト第ＦＶＩＩＩ因子をコードする野生型配列と比較して５つ以下少ないＣｐＧ；又はＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸において５つ以下のＣｐＧを有する。
[0059]アミノ酸改変の例は、参照配列、例えばＢドメインの欠失を有するＦＶＩＩＩなどのＦＶＩＩＩの保存的アミノ酸置換又は欠失（例えば、部分配列又は断片）である。特定の実施形態では、改変配列又は変種配列は、未改変の配列の機能又は活性の少なくとも一部分を保持する。
[0060]ＦＶＩＩＩ及び本明細書開示のＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸の他の哺乳動物形態を含む、タンパク質をコードする核酸の全ての哺乳動物形態及び非哺乳動物形態が、公知又は未知のどちらでも、明示的に含まれる。したがって、本発明は、非哺乳動物、ヒト以外の哺乳動物、及びヒト由来の遺伝子及びタンパク質であって、ＦＶＩＩＩ（例えばヒト）遺伝子及び本明細書記載のタンパク質と実質的に同様に機能する遺伝子及びタンパク質を含む。
[0061]用語「ベクター」は、核酸の挿入又は組込みによって操作できる小型担体核酸分子、プラスミド、ウイルス（例えばＡＡＶベクター）、又は他の溶媒を表す。そのようなベクターを、遺伝子操作のために使用して（すなわち「クローニングベクター」）、ポリヌクレオチドを細胞に導入／移入して、挿入されたポリヌクレオチドを細胞内で転写又は翻訳させることができる。「発現ベクター」は、宿主細胞における発現に必要とされる必要な調節領域を有する遺伝子又は核酸配列を含む専門化されたベクターである。ベクターの核酸配列は、一般的に、細胞内で増殖するための複製起点を少なくとも含み、異種ポリヌクレオチド配列、発現制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー）、イントロン、ＩＴＲ（複数可）、選択マーカー（例えば抗生物質耐性）、ポリアデニル化シグナルなどの追加的なエレメントを任意選択で含む。
[0062]ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを含む１つ又は複数の核酸エレメントに由来する又は基づく。特定のウイルスベクターには、レンチウイルス、偽型レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのパルボウイルスベクターが含まれる。ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸を含むベクターも提供される。
[0063]組換えウイルスベクター、例えばレンチウイルス又はパルボウイルス（例えばＡＡＶ）ベクターなどのベクターの修飾語並びに組換えポリヌクレオチド及びポリペプチドなどの配列の修飾語としての用語「組換え」は、組成物が自然界に一般的に存在しないやり方で操作された（すなわち加工された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ））ことを意味する。ＡＡＶベクターなどの組換えベクターの特定の例は、野生型ウイルス（例えばＡＡＶ）のゲノムに通常は存在しないポリヌクレオチドがウイルスゲノムに挿入された場合である。組換えポリヌクレオチドの例は、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸が、この遺伝子がウイルス（例えばＡＡＶ）のゲノム内で通常関連する５’、３’及び／又はイントロン領域を有して又は有さずに、ベクター内にクローニングされる場合である。用語「組換え」は、本明細書において必ずしもウイルスベクター及びＡＡＶベクターなどのベクター並びにポリヌクレオチドなどの配列を参照して使用されるわけではないものの、そのようないかなる省略があったとしても、ポリヌクレオチドを含む組換え形態が、明示的に含まれる。
[0064]組換えウイルス「ベクター」又は「ＡＡＶベクター」は、分子的方法を使用してウイルス（例えばＡＡＶ）から野生型ゲノムを除去すること、及びＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸などの非天然由来の核酸により置換することによって、ＡＡＶなどのウイルスの野生型ゲノムから生じる。概して、ＡＡＶについてＡＡＶゲノムの一方又は両方の末端逆位反復（ＩＴＲ）配列はＡＡＶベクター中に保持される。「組換え」ウイルスベクター（例えばＡＡＶ）は、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸などのウイルス（例えばＡＡＶ）のゲノム核酸に関して、ウイルスゲノムの全て又は一部分が非天然由来の配列により置換されているので、ウイルス（例えばＡＡＶ）のゲノムと区別される。したがって、非天然由来の配列の組込みは、ウイルスベクター（例えばＡＡＶ）を「組換え」ベクターとして定義し、ＡＡＶの場合、組換えベクターを「ｒＡＡＶベクター」と称することができる。
[0065]続いて細胞をｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで感染させる（形質導入する）ために、組換えベクター（例えば、レンチウイルス、パルボウイルス、ＡＡＶ）配列を、パッケージングすることができ、これは、本明細書において「粒子」と称される。組換えベクター配列が、ＡＡＶ粒子内にカプシド封入（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｅｄ）又はパッケージングされている場合、粒子は、「ｒＡＡＶ」とも呼ばれる可能性がある。そのような粒子は、ベクターゲノムをカプシド封入又はパッケージングしているタンパク質を含む。特定の例は、ウイルスエンベロープタンパク質を含み、ＡＡＶの場合、カプシドタンパク質を含む。
[0066]ベクターの「ゲノム」は、最終的にパッケージング又はカプシド封入されてウイルス（例えばＡＡＶ）粒子を形成する組換えプラスミド配列の部分を表す。組換えベクターを構築又は製造するために組換えプラスミドが使用される場合、ベクターゲノムは、組換えプラスミドのベクターゲノム配列に対応しない「プラスミド」部分を含まない。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は、「プラスミド骨格」と呼ばれ、プラスミド骨格は、増殖及び組換えウイルスの産生に必要な工程であるプラスミドのクローニング及び増幅に重要であるが、それ自体はウイルス（例えばＡＡＶ）粒子にパッケージングもカプシド封入もされない。したがって、ベクターの「ゲノム」は、ウイルス（例えばＡＡＶ）によってパッケージング又はカプシド封入される核酸を表す。
[0067]「導入遺伝子」は、細胞又は生物に導入することが意図される核酸又は導入された核酸を好都合に表すために本明細書において使用される。導入遺伝子は、ポリペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子（例えば、第ＶＩＩＩ因子をコードするＣｐＧ減少核酸）などの任意の核酸を含む。
[0068]導入遺伝子を有する細胞において、導入遺伝子は、ＡＡＶなどのベクター、細胞の「形質導入」又は「形質移入」によって導入／移入されている。用語「形質導入する」及び「形質移入する」は、細胞又は宿主生物への核酸などの分子の導入を表す。導入遺伝子は、レシピエント細胞のゲノム核酸に組み込まれる場合又は組み込まれない場合がある。導入された核酸は、レシピエント細胞又は生物の核酸（ゲノムＤＮＡ）に組み込まれるようになると、細胞又は生物中に安定的に維持され、レシピエント細胞又は生物の後代細胞又は生物にさらに移行又は遺伝することができる。最後に、導入された核酸は、レシピエント細胞又は宿主生物の染色体外に、又は単に一過性に存在する場合がある。
[0069]「形質導入細胞」は、導入遺伝子が導入されている細胞である。したがって、「形質導入」細胞（例えば、細胞又は組織又は器官細胞などの哺乳動物において）は、外因性分子、例えば、細胞への核酸（例えば導入遺伝子）の組込み後の細胞における遺伝的変化を意味する。したがって、「形質導入」細胞は、外因性核酸が導入されている細胞又はその後代である。細胞（複数可）が増殖し、導入されたタンパク質が発現し、又は核酸が転写することができる。遺伝子療法の使用及び方法のために、形質導入細胞が対象内にある可能性がある。
[0070]「発現制御エレメント」は、作動可能に連結されている核酸の発現に影響する核酸配列（複数可）を表す。制御エレメントは、プロモーター及びエンハンサーなどの、本明細書に示される発現制御エレメントを含む。ＡＡＶベクターを含むベクター配列は、１つ又は複数の「発現制御エレメント」を含む可能性がある。そのようなエレメントは、適正な異種ポリヌクレオチドの転写、及び適切ならば翻訳（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンのためのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのフレーム内翻訳を許すための遺伝子の正しいリーディングフレームの維持及び終止コドンなど）を容易にするために概して含められる。そのようなエレメントは、概してシス作用性であり、「シス作用」エレメントと呼ばれるが、トランスでも作用し得る。
[0071]発現制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージの安定性などのレベルであることができる。転写をモジュレートする発現制御エレメントは、転写された核酸の５’末端（すなわち「上流」）の概して近位にある。発現制御エレメントは、転写された配列の３’末端（すなわち「下流」）又は転写物内（例えばイントロン中）に位置する可能性もある。発現制御エレメントは、転写された配列に隣接して、又は（例えば、ポリヌクレオチドから１～１０、１０～２５、２５～５０、５０～１００、１００～５００個、若しくはこれ超のヌクレオチド）離れて、しかもかなり離れて位置する可能性がある。しかし、ＡＡＶベクターなどのある特定のベクターの長さ制限のために、発現制御エレメントは、転写された核酸から概して１～１０００ヌクレオチド以内にある。
[0072]機能的には、作動可能に連結されている核酸の発現は、エレメントが核酸の転写及び適宜に転写物の翻訳をモジュレートするように、エレメント（例えばプロモーター）によって少なくとも部分的に制御可能である。発現制御エレメントの特定の例は、転写された配列、例えばＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸の５’に通常位置するプロモーターである。プロモーターは、作動可能に連結されている核酸から発現される量を、プロモーターが存在しない場合に発現される量と比較して概して増加させる。
[0073]本明細書に使用される「エンハンサー」は、異種ポリヌクレオチドに隣接して位置する配列を表すことができる。エンハンサーエレメントは、概してプロモーターエレメントの上流に位置するだけでなく、機能も果たし、配列（例えば、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸）の下流又は内部に位置する可能性がある。したがって、エンハンサーエレメントは、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸から１００塩基対、２００塩基対、又は３００塩基対以上、上流又は下流に位置する可能性がある。エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントによって与えられる発現よりも作動可能に連結されている核酸の発現を概して増加させる。
[0074]発現構築物は、特定の細胞又は組織型における発現を推進するように役立つ調節エレメントを含む場合がある。発現制御エレメント（例えばプロモーター）には、本明細書において「組織特異的発現制御エレメント／プロモーター」と呼ばれる、特定の組織又は細胞型において活性なものが含まれる。組織特異的発現制御エレメントは、特異的な細胞又は組織（例えば肝臓）において概して活性である。発現制御エレメントは、特異的な細胞、組織又は器官型に特有の転写活性化因子タンパク質又は他の転写調節因子によって認識されるので、特定の細胞、組織又は器官において概して活性である。そのような調節エレメントは、当業者に公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９９２）参照）。
[0075]組織特異的調節エレメントの本発明の発現構築物への組込みは、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸の発現のための少なくとも部分的な組織向性を実現する。肝臓において活性なプロモーターの例は、とりわけ、ＴＴＲプロモーター、ヒトアルファ１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター；アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：５１２４～３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１００２～９（１９９６）；アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．、７：１５０３～１４（１９９６）］である。肝臓において活性なエンハンサーの例は、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）ＨＣＲ－１及びＨＣＲ－２である（Ａｌｌａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：２９１１３～１９（１９９７）。
[0076]発現制御エレメントには、ポリヌクレオチドの発現を多数の異なる細胞型において推進することができる遍在性又は雑多なプロモーター／エンハンサーも含まれる。そのようなエレメントには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター／エンハンサー配列及び多様な哺乳動物細胞型において活性なその他のウイルスプロモーター／エンハンサー、又は自然界に存在しない合成エレメント（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１：５２１～５３０（１９８５）参照）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、細胞質β－アクチンプロモーター及びホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが非限定的に含まれる。
[0077]発現制御エレメントは、調節可能な方法で、言い換えれば、シグナル又は刺激が、作動可能に連結されている異種ポリヌクレオチドの発現を増加又は減少させる方法で、発現を付与することもできる。シグナル又は刺激に応答して作動可能に連結されているポリヌクレオチドの発現を増加させる調節可能エレメントは、「誘導性エレメント」（すなわちシグナルによって誘導される）とも呼ばれる。特定の例には、ホルモン（例えばステロイド）誘導性プロモーターが非限定的に含まれる。そのようなエレメントによって付与される増加又は減少の量は、存在するシグナル又は刺激の量に概して比例し、シグナル又は刺激の量が大きいほど、発現における増加又は減少は大きい。特定の非限定的な例には、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）（ＭＴ）プロモーター；ステロイドホルモン誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター；Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（国際公開第９８／１００８８号）；テトラサイクリン抑制系（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７～５５５１（１９９２））；テトラサイクリン誘導系（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６８：１７６６～１７６９（１９９５）；Ｈａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５１２～５１８（１９９８）も参照されたい）；ＲＵ４８６誘導系（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２３９～２４３（１９９７）及びＷａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：４３２～４４１（１９９７）］；及びラパマイシン誘導系（Ｍａｇａｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８６５～２８７２（１９９７）；Ｒｉｖｅｒａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２：１０２８～１０３２（１９９６））が含まれる。これに関連して有用であり得る他の調節可能制御エレメントは、特異的生理状態、例えば、温度、急性期、発生によって調節される制御エレメントである。
[0078]発現制御エレメントには、異種ポリヌクレオチドのための天然由来エレメント（複数可）も含まれる。異種ポリヌクレオチドの発現が天然由来発現を模倣すべきであると望まれる場合、天然由来制御エレメント（例えばプロモーター）が使用される場合がある。異種ポリヌクレオチドの発現が、時間的若しくは発生的に、又は組織特異的に、又は特異的転写刺激に応答して、調節されるべき場合、天然由来エレメントを使用することができる。イントロン、ポリアデニル化部位又はコザックコンセンサス配列などの他の天然由来の発現制御エレメントを使用することもできる。
[0079]用語「作動可能に連結されている」は、コード配列の発現に必要な調節配列が、コード配列の発現をもたらすように、コード配列に対して適切な位置に置かれることを意味する。まさにこの定義が、発現ベクターへのコード配列及び転写制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、及び終止エレメント）の配置に適用されるときがある。この定義は、第１及び第２の核酸分子の核酸配列の配置にも適用されるときがあり、その際、雑種核酸分子が生成する。
[0080]核酸と作動可能に連結している発現制御エレメントの例では、この関係は、制御エレメントが核酸の発現をモジュレートするような関係である。より詳細には、例えば２つのＤＮＡ配列が作動可能に連結されていることは、ＤＮＡ配列の少なくとも一方が他方の配列に対して生理学的効果を発揮することが可能な関係で、２つのＤＮＡが（シス又はトランスに）配置されることを意味する。
[0081]したがって、ベクターのための追加的なエレメントには、発現制御（例えばプロモーター／エンハンサー）エレメント、転写終止シグナル若しくは終止コドン、ＡＡＶ ＩＴＲ配列の１つ若しくは複数のコピーなどの配列に隣接する５’若しくは３’非翻訳領域（例えばポリアデニル化（ポリＡ）配列）、又はイントロンが非限定的に含まれる。
[0082]さらに、エレメントには、例えばパッケージングを改善し、混入している核酸の存在を減少させるための、例えばフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列が含まれる。ＡＡＶベクターは、一般的に約４ｋｂ～約５．２ｋｂ、又はそれよりもやや大きいサイズ範囲を有するＤＮＡ挿入物を概して受け入れる。したがって、より短い配列については、ウイルス粒子へのＡＡＶベクターのパッケージングに許容されるウイルスゲノム配列の通常のサイズ近く又はそのサイズに長さを調整するために、スタッファー又はフィラーが包含される。様々な実施形態では、フィラー／スタッファー核酸配列は、核酸の非翻訳（タンパク質非コード）セグメントである。４．７Ｋｂ未満の核酸配列について、フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列は、配列と組み合わせた（例えばベクターに挿入された）ときに、約３．０～５．５Ｋｂの間、又は約４．０～５．０Ｋｂの間、又は約４．３～４．８Ｋｂの間の合計長を有する長さを有する。
[0083]イントロンは、ウイルス粒子へのＡＡＶベクターのパッケージング長を達成するためのフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列としても機能することができる。フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列として機能するイントロン及びイントロン断片は、発現も高めることができる。
[0084]語句「止血関連障害」は、血友病Ａ、阻害抗体を有する血友病Ａ患者、第ＶＩＩ、第ＶＩＩＩ、第ＩＸ及び第Ｘ、第ＸＩ、第Ｖ、第ＸＩＩ、第ＩＩ凝固因子、フォンウィルブランド因子の欠損症、複合ＦＶ／ＦＶＩＩＩ欠損症、ビタミンＫエポキシド還元酵素Ｃ１欠損症、ガンマ－カルボキシラーゼ欠損症などの出血障害；外傷に関連する出血、傷害、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝固障害、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）；ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖、ワルファリン、小分子抗血栓剤（すなわちＦＸａインヒビター）に関連する過剰抗凝固；並びにベルナール・スーリエ症候群、グランツマン血小板無力症、及び貯蔵プール欠乏症などの血小板障害を表す。
[0085]組成物の修飾語として使用される場合の用語「単離された」は、組成物がヒトの手によって作られた、又は組成物が自然に存在するｉｎ ｖｉｖｏ環境から完全若しくは少なくとも部分的に分離されたことを意味する。一般的に、単離された組成物は、自然界において普通は関連する１つ又は複数の物質、例えば１つ又は複数のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜を実質的に含まない。
[0086]本発明の核酸に関連して、用語「単離された」は、起源である生物の天然に存在するゲノム（ゲノムＤＮＡ）において核酸分子と（５’及び３’方向で）直接隣り合う１つ又は複数の配列から分離された核酸分子を表す。例えば、「単離された核酸」は、プラスミド若しくはウイルスベクターなどのベクターに挿入された、又は原核生物若しくは真核生物のＤＮＡに組み込まれた、ＤＮＡ又はｃＤＮＡを含み得る。
[0087]本発明のＲＮＡ分子に関する用語「単離された」は、上に定義された、単離されたＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子を主に表す。或いは、この用語は、自然状態で（すなわち、細胞又は組織において）関連するＲＮＡ分子から十分に分離されている結果、「実質的に純粋な」形態（用語「実質的に純粋」は、下に定義される）で存在するＲＮＡ分子を表す場合がある。
[0088]タンパク質に関連する用語「単離されたタンパク質」又は「単離及び精製されたタンパク質」が本明細書において使用されるときがある。この用語は、単離された核酸分子の発現によって産生されるタンパク質を主に表す。或いは、この用語は、「実質的に純粋な」形態で存在するように、自然に関連する他のタンパク質から十分に分離されているタンパク質を表す場合がある。
[0089]用語「単離された」は、ヒトの手によって産生される組合せ、例えば、組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）配列又はベクターゲノムをパッケージング若しくはカプシド封入しているウイルス粒子及び医薬製剤を除外しない。用語「単離された」は、雑種／キメラ、マルチマー／オリゴマー、改変（例えば、リン酸化、グリコシル化、脂質化）若しくは誘導形態、又はヒトの手によって産生される宿主細胞において発現される形態などの、組成物の代替的な物理的形態も除外しない。
[0090]用語「実質的に純粋」は、目的の化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）を少なくとも５０～６０重量％含む調製物を表す。調製物は、目的の化合物を少なくとも７５重量％又は約９０～９９重量％含む可能性がある。純度は、目的の化合物に適切な方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）によって測定される。
[0091]特定のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を表す場合の語句「から本質的になる」は、与えられた配列番号の性質を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列の参照に使用される場合、この語句は、この配列自体並びにこの配列の基本的な特徴及び新規な特徴に影響しない分子改変を含む。
[0092]本明細書に使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、プライマー及びプローブを表し、３つ超などの、２つ以上のリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドから構成される核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、様々な要因及びオリゴヌクレオチドが使用される特定の適用に依存する。
[0093]本明細書に使用される用語「プローブ」は、プローブと相補的な配列を有する核酸とアニール又は特異的にハイブリダイズすることができる、精製された制限酵素消化物中のように自然に存在するか又は合成的に産生されたかのいずれかの、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド又はＲＮＡ若しくはＤＮＡのいずれかの核酸を表す。プローブは、１本鎖又は２本鎖のいずれかであり得る。プローブの正確な長さは、温度、プローブの起源及び使用方法を含む多数の要因に依存する。例えば、診断適用のために、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプローブは、１５～２５個又はそれ超のヌクレオチドを概して含み、とはいえ、より少ないヌクレオチドを含む場合がある。
[0094]本明細書におけるプローブは、特定の標的核酸配列の異なる鎖と「実質的に」相補的であるように選択される。これは、予定された条件のセットの下で、プローブが、それぞれの標的鎖と「特異的にハイブリダイズ」又はアニールできるように十分に相補的でなければならないことを意味する。したがって、プローブ配列は、標的の正確な相補的配列を反映する必要がない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片が、プローブの５’又は３’末端に結合しており、プローブ配列の残りが標的鎖と相補的である可能性がある。或いは、プローブ配列が標的核酸配列と特異的にアニールするために十分な相補性を標的核酸配列に対して有するという条件で、非相補的塩基又はより長い配列をプローブ内に分散させることができる。
[0095]用語「特異的にハイブリダイズする」は、２つの１本鎖核酸分子の間の会合を表し、これらの核酸分子は、当技術分野において一般的に使用される、予め決定された条件でそのようなハイブリダイゼーションを可能にするのに足る、十分に相補的な配列である（「実質的に相補的」と呼ばれるときもある）。特に、この用語は、オリゴヌクレオチドと非相補的配列の１本鎖核酸とのハイブリダイゼーションを実質的に除外した、オリゴヌクレオチドと本発明の１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列とのハイブリダイゼーションを表す。
[0096]本明細書に使用される用語「プライマー」は、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかで、１本鎖又は２本鎖のいずれかで、生物系由来、制限酵素消化による生成、又は合成的産生のいずれかのオリゴヌクレオチドであって、適正な環境に置かれると、鋳型依存性核酸合成の開始因子として機能的に作用することができるオリゴヌクレオチドを表す。適切な核酸鋳型、核酸の適切なヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適切な補因子並びに適切な温度及びｐＨなどの条件を提示されると、プライマーは、ポリメラーゼの作用又は類似の活性によるヌクレオチドの付加によってその３’末端で伸長されて、プライマー伸長産物をもたらすことができる。
[0097]プライマーは、特定の条件及び適用の要件に応じて長さが変動する場合がある。例えば診断適用では、オリゴヌクレオチドプライマーは、概して１５～２５ヌクレオチド長以上である。プライマーは、所望の伸長産物の合成をプライミングするのに、言い換えると、プライマーの３’ヒドロキシル部分をポリメラーゼ又は類似の酵素による合成開始に使用するために適切な近位にもたらすのに十分なように所望の鋳型鎖とアニールできるのに、十分な相補的を所望の鋳型に対してもたなければならない。プライマー配列が所望の鋳型の正確な相補体である必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド配列は、その他が相補的なプライマーの５’末端に結合している場合がある。或いは、プライマー配列が、所望の鋳型鎖の配列と、伸長産物の合成のための鋳型－プライマー複合体を機能的に供給するのに十分な相補性を有するという条件で、非相補的塩基がオリゴヌクレオチドプライマー配列内に分散している場合がある。
[0098]用語「同一性」、「相同性」及びその文法的変形は、参照される２つ以上の主体が「アライメントされた配列」である場合、これらの主体が同じであることを意味する。したがって、例として、２つのポリペプチド配列が同一の場合、それらは、少なくとも参照された領域又は部分で同じアミノ酸配列を有する。２つのポリヌクレオチド配列が同一の場合、それらは、少なくとも参照された領域又は部分で同じポリヌクレオチド配列を有する。同一性は、所定の配列範囲（領域又はドメイン）に及ぶ可能性がある。同一性の「範囲」又は「領域」は、参照された同じ２つ以上の主体の一部を表す。したがって、２つのタンパク質配列又は核酸配列が１つ又は複数の配列範囲又は領域にわたり同一である場合、それらの配列は、その領域で同一性を共有する。「アライメントされた」配列は、参照配列と比較して欠落又は付加した塩基又はアミノ酸（ギャップ）に対する修正を多くの場合に含む、複数のポリヌクレオチド配列又はタンパク質（アミノ酸）配列を表す。
[0099]同一性は、配列の全長又は一部にわたり広がる可能性がある。ある特定の実施形態では、同一率を共有する配列の長さは、２、３、４、５つ又はこれ超の連続する核酸又はアミノ酸、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個などの連続する核酸又はアミノ酸である。追加的な実施形態では、同一性を共有する配列の長さは、２１個以上の連続する核酸又はアミノ酸、例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個などの連続する核酸又はアミノ酸である。さらなる実施形態では、同一性を共有する配列の長さは、４１個以上の連続する核酸又はアミノ酸、例えば４２、４３、４４、４５、４５、４７、４８、４９、５０個などの連続する核酸又はアミノ酸である。なおさらなる実施形態では、同一性を共有する配列の長さは、５０個以上の連続する核酸又はアミノ酸、例えば、５０～５５、５５～６０、６０～６５、６５～７０、７０～７５、７５～８０、８０～８５、８５～９０、９０～９５、９５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～５００、５００～１，０００個などの連続する核酸又はアミノ酸である。
[0100]本明細書に示すように、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種は、野生型と異なるが、Ｂドメインを有する又は有さない野生型ＦＶＩＩＩタンパク質と配列同一性を示し得る。ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種において、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸は、ヌクレオチド配列レベルで野生型ＦＶＩＩＩをコードする核酸と典型的には少なくとも約７０％同一、より典型的には約７５％同一、いっそうより典型的には約８０％～８５％同一である。したがって、例えばＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸は、ＦＶＩＩＩをコードする野生型遺伝子と、又は相互に、すなわち本明細書に示すようにＸ０１対Ｘ０２、Ｘ０３対Ｘ０４などで７５％～８５％の同一性を有する可能性がある。
[0101]変種ＦＶＩＩＩタンパク質などの変種は、アミノ酸配列レベルで、少なくとも約７０％同一、より典型的には約７５％同一、又は８０％同一、いっそうより典型的には約８５の同一性、又は９０％以上の同一性である。他の実施形態では、変種ＦＶＩＩＩタンパク質などの変種は、参照配列、例えばＢドメインを有する又は有さない野生型ＦＶＩＩＩタンパク質と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はこれ超の同一性を有する。
[0102]ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸）がＢドメインを保持する場合に同一性を判定するには、野生型ＦＶＩＩＩとの同一性を比較することが適切である。ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸）がＢドメインの欠失を有する場合、Ｂドメインの欠失も有する野生型ＦＶＩＩＩとの同一性を比較することが適切である。
[0103]用語「相同な」又は「相同性」は、２つ以上の参照される主体が所与の領域又は部分にわたり少なくとも部分的な同一性を共有することを意味する。相同性又は同一性の「範囲、領域又はドメイン」は、２つ以上の参照される主体の一部が、相同性を共有する又は同じであることを意味する。したがって、２つの配列が１つ又は複数の配列領域にわたり同一の場合、これらの配列は、これらの領域において同一性を共有する。「実質的な相同性」は、分子が構造又は機能的に保存されていることにより、分子が、参照分子又は相同性を共有する参照分子の関連／対応する領域若しくは部分の構造又は機能（例えば生物学的機能又は活性）のうちの１つ又は複数の少なくとも部分的な構造又は機能を有する又は有すると予測されることを意味する。
[0104]２つの配列の間の同一性（相同性）の程度又は「同一率」は、コンピュータープログラム及び／又は数学的アルゴリズムを使用して確認することができる。本発明のために、核酸配列の比較は、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐから入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅバージョン９．１を使用して行われる。便宜上、そのプログラムによって特定化されるデフォルトのパラメーター（ギャップ生成ペナルティ＝１２、ギャップ伸長ペナルティ＝４）が、配列同一性を比較するための本明細書における使用のために意図される。或いは、デフォルトのパラメーターを用いたギャップ付きアライメントを使用する、米国立生物工学情報センター（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／のワールドワイドウェブ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３～４１０から見出される）によって提供されているＢｌａｓｔｎ ２．０プログラムを、核酸配列の間及びアミノ酸配列の間の同一性及び類似性のレベルを判定するために使用することができる。ポリペプチド配列の比較のために、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムが、ＰＡＭ１００、ＰＡＭ２５０、ＢＬＯＳＵＭ６２又はＢＬＯＳＵＭ５０などのスコアリングと組み合わせて概して使用される。同一性の程度を定量するためにＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）並びにＳＳＥＡＲＣＨ配列比較プログラムも使用される（Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１３２：１８５（２０００）；及びＳｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５（１９８１））。ドローネーに基づくトポロジーマッピングを用いてタンパク質の構造類似性を定量するためのプログラムも開発されている（Ｂｏｓｔｉｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．３０４：３２０（２００３））。
[0105]ＦＶＩＩＩをコードする本発明のＣｐＧ減少核酸変種を含む核酸分子、発現ベクター（例えば、ベクターゲノム）、プラスミドは、組換えＤＮＡ技法を使用して調製することができる。ヌクレオチド配列情報の入手性は、本発明の単離された核酸分子の調製を様々な手段により可能にする。例えば、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種は、様々な標準的なクローニング、組換えＤＮＡ技法、細胞発現経由、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳及び化学合成技法を使用して製造することができる。ポリヌクレオチドの純度は、配列決定、ゲル電気泳動などにより決定することができる。例えば、核酸は、ハイブリダイゼーション又はコンピュータベースのデータベーススクリーニング技法を使用して単離することができる。そのような技法には、（１）相同ヌクレオチド配列を検出するためのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーとプローブとのハイブリダイゼーション；（２）共通の構造特徴を有するポリペプチドを検出するための、例えば発現ライブラリーを使用した、抗体スクリーニング；（３）目的の核酸配列とアニールすることができるプライマーを使用したゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；（４）関連配列についての配列データベースのコンピュータ検索；及び（５）サブトラクション核酸ライブラリーの差次的スクリーニングが非限定的に含まれる。
[0106]本発明の核酸は、任意の好都合なクローニングベクターにＤＮＡとして維持され得る。一実施形態では、クローンは、適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞中で増殖されるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）などのプラスミドクローニング／発現ベクター中で維持される。或いは、核酸は、哺乳動物細胞における発現に適切なベクターに維持され得る。翻訳後改変が凝固機能に影響する場合、核酸分子を哺乳動物細胞において発現させることができる。
[0107]ＦＶＩＩＩをコードする本発明のＣｐＧ減少核酸変種には、１本鎖又は２本鎖であり得るｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、及びその断片が含まれる。したがって、本発明は、本発明の核酸の少なくとも１つの配列とハイブリダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡのセンス又はアンチセンス鎖）を提供する。そのようなオリゴヌクレオチドは、ＦＶＩＩＩの発現を検出するためのプローブとして有用である。
[0108]Ｂドメインを欠失し、任意選択でアミノ酸置換、欠失又は付加を有する本発明のＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種は、公知の方法により様々なやり方で調製することができる。タンパク質は、操作ＦＶＩＩＩを発現する適切な起源、例えば形質転換細菌又は動物の培養細胞若しくは組織から免疫アフィニティー精製により精製され得る。
[0109]ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種の入手性は、当技術分野において公知のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現方法を使用したＦＶＩＩＩの産生を可能にする。例えば、ｃＤＮＡ又は遺伝子を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用のｐＳＰ６４又はｐＳＰ６５などの適切なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ベクターにクローニングし、続いてコムギ胚芽又はウサギ網状赤血球溶解液などの適切な無細胞翻訳系で無細胞翻訳を行うことができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳系は、例えばＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）又はＢＲＬ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から市販されている。
[0110]或いは、適切な原核又は真核発現系における発現によって、より大量のＦＶＩＩＩを産生させることができる。例えば、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を、例えば、大腸菌などの細菌細胞又はベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、ＣＨＯ又はＨｅｌａ細胞などの哺乳動物細胞株における発現に適合したプラスミドベクターに挿入することができる。或いは、ＦＶＩＩＩを含むタグ付き融合タンパク質を生成させることができる。そのようなＦＶＩＩＩタグ付き融合タンパク質は、正しいコドンリーディングフレーム内で、大腸菌などの細菌細胞又は非限定的に酵母及び哺乳動物細胞などの真核細胞における発現に適合したプラスミドベクターに挿入された所望のポリペプチドの一部又は全てをコードするヌクレオチド配列に連結されたＤＮＡ分子の部分又は全てによってコードされる。
[0111]本明細書記載のベクターなどのベクターは、宿主細胞においてコードされるタンパク質の発現を許すようなやり方で位置する宿主細胞中のＤＮＡの発現に必要な調節エレメントを任意選択で含む。発現に必要なそのような調節エレメントには、本明細書記載及び当業者に公知のプロモーター配列、エンハンサー配列及び転写開始配列が非限定的に含まれる。
[0112]組換え原核又は真核系における遺伝子発現によって産生される、ＣｐＧ減少核酸変種によってコードされるＦＶＩＩＩは、当業界に公知の方法によって精製することができる。実施形態では、組換えタンパク質が発現され、その後、周囲の培地から容易に精製されるように宿主細胞から分泌される、市販の発現／分泌系を使用することができる。発現／分泌ベクターが使用されない場合、代替的なアプローチは、組換えタンパク質と特異的に結合する抗体を用いた免疫学的相互作用又はＮ末端若しくはＣ末端で６～８つのヒスチジン残基でタグ付けされた組換えタンパク質の単離のためのニッケルカラムによるなどのアフィニティー分離により組換えタンパク質を精製するステップを伴う。代替的なタグは、ＦＬＡＧエピトープ、ＧＳＴ又はヘマグルチニンエピトープを含む場合がある。そのような方法は、当業者によって一般的に使用されている。
[0113]前記方法によって調製されるＦＶＩＩＩタンパク質は、標準的な手順により分析することができる。例えば、そのようなタンパク質を、公知の方法により変更された凝固性質について評価することができる。
[0114]したがって、本発明は、（開示された）ポリペプチドを製造する方法であって、ポリペプチド（一般的に核酸）をコードする核酸からの発現を含む方法も提供する。この方法は、そのようなベクターを含む宿主細胞を、ポリペプチドの産生を引き起こす又は可能にする適切な条件で培養することによって好都合に達成することができる。ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系で産生させることもできる。
[0115]本発明の方法及び使用は、核酸（導入遺伝子）を分裂中の細胞及び／又は非分裂状態の細胞を含む宿主細胞に送達（形質導入）するステップを含む。本発明の核酸、組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）、方法、使用及び医薬製剤は、タンパク質をそれを必要とする対象に処置方法として送達、投与又は供給する方法に追加的に有用である。このようにして、核酸が転写され、タンパク質が対象においてｉｎ ｖｉｖｏ産生され得る。対象は、タンパク質の欠損症を有するので、又は対象におけるタンパク質産生が処置方法若しくはその他としていくらかの治療効果を付与し得るので、そのタンパク質から利益を得る又はそれを必要とする可能性がある。
[0116]レンチウイルス又はパルボウイルスベクター（例えばＡＡＶ）配列を含むベクター、組換えウイルス粒子、方法及び使用は、ＦＶＩＩＩ欠損症又は異常と関連する１つ又は複数の症状を処置又は改善するための生物学的効果を有する、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を送達するために使用することができる。組換えレンチウイルス又はパルボウイルスベクター（例えばＡＡＶ）の配列、プラスミド、組換えウイルス粒子、方法及び使用は、ＦＶＩＩＩ欠損症又は異常を伴う又はそれを原因とする様々な病状のための治療法を提供するために使用することができる。
[0117]本発明の核酸、ベクター、発現ベクター（例えばｒＡＡＶ）、及び組換えウイルス粒子、方法及び使用は、遺伝病、例えばＦＶＩＩＩ欠損症の処置を可能にする。欠損状態の疾患について、遺伝子導入を使用して、補充療法用に罹患組織に正常な遺伝子をもたらすため及びアンチセンス変異を使用して動物疾患モデルを作出するために使用することができる。不均衡な病状に関して、遺伝子導入を使用してモデル系において病状を創造し、次にその病状と対抗するためにこのモデル系を使用することができよう。欠損症を修正するために核酸配列の部位特異的組込みを使用することも可能である。
[0118]特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種は、例えば血液凝固カスケードをモジュレートする治療剤及び／若しくは予防剤（タンパク質若しくは核酸）又は遺伝子における導入遺伝子として使用することができる。例えば、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種は、野生型ＦＶＩＩＩと類似の凝固活性、又は野生型ＦＶＩＩと比較して変更された凝固活性を有し得る。細胞に基づく戦略は、血友病Ａ患者におけるＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種の連続発現を可能にする。本明細書に開示するように、ＦＶＩＩＩ分子（核酸及びタンパク質）のある特定の改変が、核酸レベルで増加した発現、増加した凝固活性を招き、それにより止血を効果的に改善する。
[0119]ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を、本発明による様々な目的のために使用することができる。一態様では、血液凝固をモジュレートするために核酸送達溶媒（すなわち発現ベクター）が提供され、その際、発現ベクターは、本明細書記載のＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含む。ＦＶＩＩＩをコードする発現ベクターの患者への投与は、凝固カスケードを変更するように作用するＦＶＩＩＩタンパク質の発現を招く。本発明により、本明細書記載のＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＣｐＧ減少核酸変種又は機能的断片の発現は、止血を強める。
[0120]本発明の追加的な実施形態では、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含むウイルスベクターの投与のための組成物及び方法が提供される。一態様では、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含む発現ベクターは、ウイルスベクターである。
[0121]ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含む発現ベクターは、単独で、又は止血をモジュレートするために有用な他の分子と組み合わせて、投与され得る。本発明により、ベクター、発現ベクター又は治療剤の組合せを患者に単独で、又は薬学的に許容される又は生物学的に適合性の組成物として投与することができる。
[0122]ＡＡＶ血清型及びその変種を含むレンチウイルス及びパルボウイルスベクターなどのウイルスベクターは、細胞がコードされているタンパク質を発現するように、タンパク質をコードする核酸を細胞にｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ送達するための手段を与える。ＡＡＶは、細胞に浸透して核酸／遺伝物質を導入することができることにより、核酸／遺伝物質が細胞中に安定に維持され得るので、遺伝子療法ベクターとして有用である。加えて、これらのウイルスは、例えば核酸／遺伝物質を特定の部位に導入することができる。ＡＡＶはヒトに病原性の疾患と関連しないので、ＡＡＶベクターは、実質的なＡＡＶの病原性又は疾患を引き起こさずに、異種ポリヌクレオチド配列（例えば、治療用タンパク質及び治療剤）をヒト患者に送達することができる。
[0123]本発明に使用され得るウイルスベクターには、複数の血清型のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＡＡＶ－１～ＡＡＶ－１２及びその他）及び雑種／キメラＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター及び偽型レンチウイルスベクター（例えば、エボラウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、及びネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ））、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター（組織特異的プロモーター／エンハンサーを有する又は有さない）、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、非ウイルス性ベクター及びその他が非限定的に含まれる。
[0124]ＡＡＶ及びレンチウイルス粒子は、効果的な遺伝子送達のための媒体として有利なように使用することができる。そのようなビリオンは、分裂中の細胞及び非分裂状態の細胞についての向性を含む、そのような適用に望ましいいくつかの特徴を有する。これらのベクターに関する初期の臨床経験も持続毒性がないことを実証し、免疫応答は最小限又は検出不能であった。ＡＡＶは、受容体介在性エンドサイトーシス又はトランスサイトーシスによりｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで多種多様な細胞型に感染することが公知である。網膜上皮、肝臓、骨格筋、気道、脳、関節及び造血幹細胞を標的化するこれらのベクター系は、ヒトにおいて試験されている。例えばプラスミドＤＮＡ又はミニサークルに基づく非ウイルス性ベクターも、ＦＶＩＩＩをコードするベクターとして大型遺伝子用の適切な遺伝子導入ベクターである。
[0125]例えば、所望の遺伝子の複数のコピーを供給することでその遺伝子の産物のより大きな量を供給することができるベクターを導入することが望ましい場合がある。改良されたＡＡＶベクター及びレンチウイルスベクター並びにこれらのベクターを産生させるための方法は、フィラデルフィア小児病院で臨床等級のベクターの産生のために使用されている技法であるＷｒｉｇｈｔ Ｊ．Ｆ．（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０：６９８～７０６、２００９）を含む、いくつかの参考文献、特許、及び特許出願に詳細に記載されている。レンチウイルスベクターは、ＣＨＯＰでも産生させることができ、他のベクターは、ＮＨＬＢＩ遺伝子療法資源プログラム（ＧＴＲＰ）－レンチウイルスベクター生産中核研究室（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｒｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によりレンチウイルスベクター生産中核研究室を経由して入手可能である。
[0126]したがって、本発明の様々な実施形態では、ベクターには、アデノウイルスベクターなどのレンチウイルスベクター又はパルボウイルスベクターが含まれる。特定の実施形態では、組換えベクターは、パルボウイルスベクターである。パルボウイルスは、１本鎖ＤＮＡゲノムを有する小型ウイルスである。「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科である。
[0127]したがって、本発明は、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含むウイルスベクターを提供する。例えば、組換えＡＡＶベクターは、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含むことができ、その際、コードされるＦＶＩＩＩタンパク質は、任意選択でＢドメインの欠失を有する。したがって、対象（例えば哺乳動物）へのベクターの送達又は投与は、哺乳動物（例えばヒト）などの対象にＦＶＩＩＩを供給する。
[0128]ベクターの直接送達又はヒト細胞のｅｘ－ｖｉｖｏ形質導入に続く体内注入は、ＦＶＩＩＩの発現を招き、それにより、止血に対して有益な治療効果を発揮する。本明細書記載の本発明の第ＶＩＩＩ因子に関連して、そのような投与は凝固促進活性を高める。
[0129]ＡＡＶベクター及びレンチウイルスベクターは、発病に関連するウイルス遺伝子を概して含まない。そのようなベクターは、野生型ＡＡＶ遺伝子のうちの１つ又は複数、例えばｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を概して全体又は部分的に欠失しているが、組換えベクターの救済、複製、及びＡＡＶベクター粒子へのパッケージングに必要ならば、少なくとも１つの機能的隣接ＩＴＲ配列を保持する。例えば、ベクターの不可欠な部分、例えば、それぞれＩＴＲ及びＬＴＲエレメントだけが含まれる。したがって、ＡＡＶベクターゲノムは、複製及びパッケージングのためにシスで必要な配列（例えば機能的ＩＴＲ配列）を含む。
[0130]組換えＡＡＶベクター並びにその方法及び使用は、任意のウイルス株又は血清型を含む。非限定的な例として、組換えＡＡＶベクターは、例えばＡＡＶ－１、－２、－３、－４、－５、－６、－７、－８、－９、－１０、－１１、－１２、－ｒｈ７４、－ｒｈ１０又はＡＡＶ－２ｉ８などの任意のＡＡＶゲノムに基づく可能性がある。そのようなベクターは、同じ株又は血清型（又は亜群若しくは変種）に基づく可能性があり、又は相互に異なる可能性がある。非限定的な例として、１つの血清型ゲノムに基づく組換えＡＡＶベクターは、ベクターをパッケージングするカプシドタンパク質のうちの１つ又は複数と同一である可能性がある。加えて、組換えＡＡＶベクターのゲノムは、ベクターをパッケージングするＡＡＶカプシドタンパク質のうちの１つ又は複数と異なるＡＡＶ（例えばＡＡＶ２）血清型のゲノムに基づく可能性がある。例えば、ＡＡＶベクターのゲノムは、ＡＡＶ２に基づく可能性がある一方で、３つのカプシドタンパク質のうちの少なくとも１つは、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４若しくはＡＡＶ－２ｉ８又はその変種である可能性がある。
[0131]特定の実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターには、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ－２ｉ８、並びに例えば国際公開第２０１３／１５８８７９号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３７１７０）、国際公開第２０１５／０１３３１３号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４７６７０）及び米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号（米国特許第９，１６９，２９９号は、ＬＫ０１、ＬＫ０２、ＬＫ０３などを開示している）に示されるようなその変種（例えば、アミノ酸の挿入、付加、置換及び欠失などのカプシド変種）が含まれる。
[0132]ＡＡＶ変種には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ－２ｉ８カプシドの変種及びキメラが含まれる。したがって、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含む（カプシド封入又はパッケージングする）ＡＡＶベクター及びＡＡＶ変種（例えばカプシド変種）が提供される。
[0133]ＡＡＶ及びＡＡＶ変種（例えばカプシド変種）の血清型（例えばＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列）は、例えば、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１２、Ｒｈ７４又はＲｈ１０を含む他のＡＡＶ血清型と異なる（例えば、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１２、Ｒｈ７４又はＲｈ１０血清型のうちのいずれかのＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列と異なる）場合又は異ならない場合がある。
[0134]本明細書に使用される用語「血清型」は、他のＡＡＶ血清型と血清学的に異なるカプシドを有するＡＡＶを表すために使用される特質である。血清学的特徴は、別のＡＡＶと比較して、抗体とあるＡＡＶとの間の交差反応性の欠如に基づき判定される。そのような交差反応性の差は、通常、カプシドタンパク質の配列／抗原決定基の差が原因である（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列の差が原因）。カプシド変種を含むＡＡＶ変種が参照ＡＡＶ又は他のＡＡＶ血清型と血清学的に異ならない場合がある可能性にもかかわらず、それらは、参照血清型又は他のＡＡＶ血清型と比較して少なくとも１つのヌクレオチド又はアミノ酸残基が異なる。
[0135]伝統的な定義において、血清型は、対象となるウイルスが、中和活性について全ての既存の特徴付けられた血清型に特異的な血清に対して試験され、対象となるウイルスを中和する抗体が見出されなかったことを意味する。より多くの天然に存在するウイルス単離株が発見され、及び／又はカプシド変異体が生成されるので、現在存在する血清型のうちのいずれかと血清学的な差がある場合又はない場合がある。したがって、新しいウイルス（例えばＡＡＶ）が血清学的な差を有さない場合、この新しいウイルス（例えばＡＡＶ）は、対応する血清型の亜群又は変種である。カプシド配列の改変を有する変異型ウイルスに対して、それらのウイルスが血清型の伝統的な定義に従い別の血清型であるかを判定するための中和活性についての血清学的試験が、多くの場合にまだ行われていない。したがって、便宜上、及び繰り返しを避けるために、用語「血清型」は、血清学的に異なるウイルス（例えばＡＡＶ）と、所与の血清型の亜群又は変種に含まれ得る、血清学的に異ならないウイルス（例えばＡＡＶ）との両方を広く表す。
[0136]したがって、ＡＡＶベクターは、特定の血清型に特徴的な遺伝子／タンパク質配列と同一の遺伝子／タンパク質配列を含む。本明細書に使用される「ＡＡＶ１と関係するＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ１を含む１つ又は複数のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列と実質的な配列同一性を有する１つ又は複数のＡＡＶタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列）を表す。同じように、「ＡＡＶ８と関係するＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ８を含む１つ又は複数のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列と実質的な配列同一性を有する１つ又は複数のＡＡＶタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列）を表す。「ＡＡＶ－Ｒｈ７４と関係するＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ－Ｒｈ７４を含む１つ又は複数のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列と実質的な配列同一性を有する１つ又は複数のＡＡＶタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列）を表す。別の血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８と関係したそのようなＡＡＶベクターは、したがって、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ－２ｉ８からの１つ又は複数の異なる配列を有することができるが、１つ若しくは複数の遺伝子及び／若しくはタンパク質と実質的な配列同一性を示すことができ、並びに／又はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４若しくはＡＡＶ－２ｉ８の１つ若しくは複数の機能的特徴（例えば細胞／組織向性など）を有することができる。非限定的なＡＡＶ変種の例には、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３のうちのいずれかのカプシド変種が含まれる。
[0137]様々な例示的な実施形態では、参照血清型と関係するＡＡＶベクターは、１つ又は複数のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８と少なくとも８０％以上（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％など）同一の配列（例えば、ＩＴＲ、又はＶＰ１、ＶＰ２、及び／若しくはＶＰ３配列など）を含む又はそれからなる、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又はその部分配列を有する。
[0138]本発明の組成物、方法及び使用は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、又はＡＡＶ－２ｉ８などの参照ＡＡＶ血清型と１００％未満の配列同一性を示すが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８の遺伝子又はタンパク質などの、公知のＡＡＶ遺伝子又はタンパク質と異なり、同一ではないＡＡＶ配列（ポリペプチド及びヌクレオチド）、及びその部分配列を含む。一態様では、ＡＡＶポリペプチド又はその部分配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８などの任意の参照ＡＡＶ配列又はその部分配列と少なくとも７５％以上同一、例えば、８０％、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％などの、最大で１００％同一の配列（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３カプシド又はＩＴＲ）を含む又はそれからなる。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ変種は、１、２、３、４、５、５～１０、１０～１５、１５～２０個又はこれ超のアミノ酸置換を有する。
[0139]ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８及び変種に関係する雑種及びキメラ配列を含む組換えＡＡＶベクターは、当業者に公知の組換え技法を使用して、１つ又は複数の機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する１つ又は複数の核酸配列（導入遺伝子）を含むように構築することができる。
[0140]本発明の一態様では、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種、ベクター又は発現ベクターは、生物学的に適合性の担体に入れた注入を介して、例えば静脈内注射を介して患者に投与され得る。分子の安定性を増加させるために、本発明のＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種、ベクター及び発現ベクターを、任意選択でリポソームに封入する又は他のリン脂質若しくはミセルと混合することができる。本発明のＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種、ベクター及び発現ベクターは、単独で又は止血をモジュレートすることが公知の他の薬剤（例えば第Ｖ因子、第Ｖａ因子又はその誘導体）と組み合わせて投与される場合がある。
[0141]ＦＶＩＩＩを送達するために適切な組成物は、患者の状態及び血行力学的状況を非限定的に含む多様な生理学的変数を考慮して医師によって決定され得る。異なる適用に十分にふさわしい多様な組成物及び投与経路は、当技術分野において周知であり、本明細書に後述される。
[0142]本発明のＦＶＩＩＩをコードする本発明のＣｐＧ減少核酸変種、ベクター及び発現ベクターの発現によって産生される精製ＦＶＩＩＩタンパク質を含有する調製物は、生理学的に許容されるマトリックスを含有し、医薬調製物として製剤化することができる。調製物は、実質的に公知の従来技術の方法を使用して製剤化することができ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２などの塩並びにグリシン及び／又はリシンなどのアミノ酸を含有する緩衝液とｐＨ６～８の範囲で混合することができる。ＦＶＩＩＩを含有する精製調製物は、必要になるまで最終溶液の形態又は凍結乾燥若しくは冷凍された形態で貯蔵することができる。
[0143]調製物は、凍結乾燥された形態で貯蔵することができ、適切な再構成溶液を使用して、見た目が透明な溶液へと溶解される。或いは、本発明による調製物は、液体調製物又は冷凍された液体として入手可能にすることもできる。本発明による調製物は、任意選択で、特に安定な可能性があり、すなわち、投与又は送達の前に溶解した形態で長時間放置させることができる。
[0144]本発明による調製物は、一成分調製物の形態で又は多成分調製物の形態で他の因子と組み合わせて、ＦＶＩＩＩ活性を有する医薬調製物として入手可能にすることができる。精製タンパク質を医薬調製物に加工する前に、精製タンパク質は、従来の品質管理に供され、治療用提示形態に形作られる。特に、組換え製造の間に、精製調製物が、細胞性核酸及びＥＰ０７１４９８７記載の発現ベクターなどの発現ベクター由来の核酸が不在かどうか試験される。
[0145]医薬タンパク質調製物は、３０～１００ＩＵ／ｋｇの間（１Ｉ．Ｕは１００ｎｇ／ｍｌである）の投薬量で１日１回の注射又は最大３回／日、数日間として使用され得る。患者は、出血して診察室を訪れたときに直ちに処置され得る。或いは、患者は、８～１２時間毎のＦＶＩＩＩのボーラス注入、又は十分な改善が観察されたならば１日１回の注入を受ける場合がある。
[0146]したがって、本発明の核酸、ベクター、組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）、及び組換えウイルス粒子並びに他の組成物、薬剤、薬物、生物製剤（タンパク質）を医薬組成物に組み込むことができる。そのような医薬組成物は、とりわけ、対象へのｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ投与及び送達に有用である。
[0147]特定の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤も含有する。そのような賦形剤には、組成物の投与を受けている個体に有害な免疫応答をそれ自体で誘導しない医薬品であって、過度の毒性なしに投与できる任意の医薬品が含まれる。
[0148]本明細書に使用される用語「薬学的に許容される」及び「生理学的に許容される」は、１つ又は複数の投与経路、ｉｎ ｖｉｖｏ送達又は接触に適切な、気体、液体若しくは固体の生物学的に許容される製剤、又はその混合物を意味する。「薬学的に許容される」又は「生理学的に許容される」組成物は、生物学的又は他の点で望ましくないわけではない物質であり、例えば、この物質は、実質的な望ましくない生物学的作用を引き起こさずに対象に投与することができる。したがって、そのような医薬組成物は、例えば核酸、ベクター、ウイルス粒子又はタンパク質を対象に投与することに使用することができる。
[0149]薬学的に許容される賦形剤には、水、塩類溶液、グリセロール、糖及びエタノールなどの液体が非限定的に含まれる。その中に、薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸の塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩も含まれ得る。追加的に、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が、そのような溶媒中に存在し得る。
[0150]医薬組成物は、塩として供給される場合があり、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを非限定的に含む多数の酸と形成させることができる。塩は、対応する遊離塩基形態よりも水性溶媒又は他のプロトン溶媒中で溶解性が高い傾向にある。他の場合に、調製物は、使用前に緩衝液と混ぜ合わされる、以下：１～５０ｍＭヒスチジン、０．１％～２％スクロース、及び２～７％マンニトールのうちのいずれか又は全てをｐＨ４．５～５．５の範囲で含有し得る、凍結乾燥粉末であり得る。
[0151]医薬組成物は、医薬の投与又はｉｎ ｖｉｖｏ接触若しくは送達に適合性の溶媒（水性又は非水性）、溶液（水性又は非水性）、乳液（例えば、水中油型又は油中水型）、懸濁液、シロップ、エリキシル剤、分散媒及び懸濁媒、コーティング剤、等張化剤及び吸収促進又は遅延剤を含む。水性及び非水性の溶媒、溶液及び懸濁液は、懸濁化剤及び粘稠化剤を含む場合がある。そのような薬学的に許容される担体は、錠剤（コーティングされた又はコーティングされていない）、カプセル剤（硬又は軟）、マイクロビーズ、粉末、顆粒及び結晶を含む。補足的な活性化合物（例えば保存料、抗細菌剤、抗ウイルス剤及び抗真菌剤）も組成物に組み込むことができる。
[0152]医薬組成物は、本明細書に示される又は当業者に公知の特定の投与又は送達経路と適合するように製剤化することができる。したがって、医薬組成物は、様々な経路による投与に適切な担体、希釈剤、又は賦形剤を含む。
[0153]非経口投与に適切な組成物は、活性化合物の水性及び非水性溶液、懸濁液又は乳液を含み、その調製物は、概して無菌であり、意図されるレシピエントの血液と等張である可能性がある。非限定的な実例となる例には、水、緩衝塩類溶液、ハンクス液、リンゲル液、デキストロース、フルクトース、エタノール、動物油、植物油又は合成油が含まれる。水性懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含有する場合がある。
[0154]追加的に、活性化合物の懸濁液を、適切な油性懸濁注射液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。懸濁液は、高濃縮溶液の調製を可能にするために化合物の溶解度を増加させる適切な安定化剤又は薬剤も任意選択で含有し得る。
[0155]共溶媒及びアジュバントを製剤に添加することができる。共溶媒の非限定的な例は、ヒドロキシル基又は他の極性基、例えば、イソプロピルアルコールなどのアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリコールエーテルなどのグリコール；グリセロール；ポリオキシエチレンアルコール及びポリオキシエチレン脂肪酸エステルを含有する。アジュバントには、例えば、ダイズレシチン及びオレイン酸などの界面活性剤；ソルビタントリオレエートなどのソルビタンエステル；並びにポリビニルピロリドンが含まれる。
[0156]医薬組成物が調製された後、医薬組成物を適切な容器に入れ、処置のためのラベルを付けることができる。ＦＶＩＩＩ含有ベクター又はポリペプチドの投与のために、そのようなラベル付けは、投与の量、頻度、及び方法を含む。
[0157]本発明の組成物、方法及び使用に適切な医薬組成物及び送達系は、当技術分野において公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００３）２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ；Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ（１９９６）１２版、Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ、ＮＪ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（１９９３）、Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、Ｐａ．；Ａｎｓｅｌ及びＳｔｏｋｌｏｓａ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（２００１）１１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ；並びにＰｏｚｎａｎｓｋｙら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９８０）、Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ編、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｎ．Ｙ．、２５３～３１５頁を参照されたい）。
[0158]本発明は、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を細胞又は動物に導入するための方法も提供する。特定の実施形態では、本発明は、止血をモジュレートするための方法を提供する。一態様では、方法は、個体においてＦＶＩＩＩポリペプチドが発現される条件での、個体（患者又は哺乳動物などの対象）とＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含む核酸送達ビヒクル（例えばＡＡＶベクター）との接触又は個体への核酸送達ビヒクルの投与を含む。別の実施形態では、方法は、個体においてＦＶＩＩＩポリペプチドが発現される条件で、個体（患者又は哺乳動物などの対象）の細胞に、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含む核酸送達ビヒクル（例えばＡＡＶベクター）を用意するステップを含む。
[0159]前記から、欠損した、不十分な又は異常な血液凝固と関連する障害の処置に、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を使用できることが分かる。
[0160]ベクター、組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）、及び組換えウイルス粒子を含むＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種の組成物を、それを必要とする対象に十分又は有効量で投与することができ、本発明の方法及び使用を実現することができる。「有効量」又は「十分量」は、単回又は複数回で、単独で又は１つ若しくは複数の他の組成物（薬物などの治療剤若しくは免疫抑制剤）、処置、プロトコール、若しくは治療レジメン剤と組み合わせて、任意の期間（長期又は短期）の検出可能な応答、対象における予想される若しくは所望の結果又は対象への利益を任意の測定可能若しくは検出可能な程度又は任意の期間（例えば、数分、数時間、数日、数ヶ月、数年、又は治癒）与える量を表す。
[0161]用量は、変動することがあり、処置が向けられる疾患の種類、発生、進行、重症度、頻度、持続期間、又は確率、所望の臨床エンドポイント、対象の以前又は同時の処置、全身の健康状態、年齢、性別、人種又は免疫能及び当業者に理解される他の要因に依存する可能性がある。投与の量、回数、頻度又は持続期間は、処置又は治療の任意の有害副作用、合併症又は他のリスク因子及び対象の状態により示されるように、比例的に増加又は減少する場合がある。当業者は、治療又は予防的利益を実現するために十分な量を与えるために必要な投薬量及びタイミングに影響し得る要因を認識している。
[0162]治療効果を達成するための用量、例えば、ベクターゲノム／キログラム体重（ｖｇ／ｋｇ）としての用量は、投与経路、治療効果を達成するために必要な異種ポリヌクレオチドの発現レベル、処置される特異的疾患、ウイルスベクターに対する任意の宿主免疫応答、異種ポリヌクレオチド又は発現産物（タンパク質）に対する宿主免疫応答、及び発現されるタンパク質の安定性を非限定的に含む、いくつかの要因に基づいて変動する。当業者は、前述の要因及び他の要因に基づき、特定の疾患又は障害を有する患者を処置するためのｒＡＡＶ／ベクターゲノムの用量範囲を決定することができる。一般的に、治療効果を達成するための用量は、対象の体重キログラムあたり、少なくとも１×１０８個以上、例えば、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３又は１×１０１４個以上のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の範囲である。マウスにおいて１×１０１０～１×１０１１、及びイヌにおいて１×１０１２～１×１０１３の範囲のＡＡＶ用量が有効であった。
[0163]血友病Ｂを例として用いると、一般的に言うと、治療効果を達成するためには、血正常な個体に見出される血液凝固因子濃度の１％よりも大きい因子濃度が、重症の疾患表現型を中等度に変えるのに必要であると考えられている。重症表現型は、関節損傷及び生死に関わる出血によって特徴付けられる。中等度の疾患表現型を軽症に転換するには、正常の５％よりも大きい血液凝固因子濃度が必要と考えられている。正常なヒトにおけるＦＶＩＩＩレベルは約１５０～２００ｎｇ／ｍｌ血漿であるが、例えば活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）凝固一段アッセイによって決定された機能的凝固のために、それ未満（例えば約１００～１５０ｎｇ／ｍｌの範囲）又はそれ超（例えば約２００～３００ｎｇ／ｍｌの範囲）でまだ正常と考えられる場合がある。したがって、治療効果は、対象／ヒトにおけるＦＶＩＩＩの合計量が、正常な対象／ヒトに存在するＦＶＩＩＩの１％、例えば、１００～３００ｎｇ／ｍｌの１％よりも大きいようなＦＶＩＩＩの発現によって達成することができる。
[0164]そのような血友病対象を処置することに関して、所望の治療効果を達成するために典型的な用量は、対象の体重キログラムあたり、少なくとも１×１０１０個のベクターゲノム（ｖｇ）／（ｖｇ／ｋｇ）、又は対象の体重ｋｇあたり約１×１０１０～１×１０１１ｖｇの間、又は対象の体重ｋｇあたり約１×１０１１～１×１０１２ｖｇの間、又は対象の体重ｋｇあたり約１×１０１２～１×１０１３ｖｇの間である。ＡＡＶベクターの用量は、ＦＶＩＩＩ又はＡＡＶベクターに対して実質的な免疫応答がないように、概して用量スペクトルの下端のレベルであり得る。
[0165]処置についての（例えば、改善する又は治療的利益若しくは改善を実現するための）「有効量」又は「十分量」の用量は、疾患の進行又は悪化を縮小、軽減、阻害、抑制、限定又は制御することが申し分のない結果であるものの、疾患の１つ、複数又は全ての有害症状、転帰又は合併症、例えば疾患によって起こる又は疾患と関連する、１つ又は複数の有害症状、障害、病気、病状、又は合併症に対する応答を測定可能な程度実現するために概して有効である。
[0166]有効量又は十分量は、単回投与で与えられる可能性があるが、その必要はなく、複数回投与を要する場合があり、単独で又は別の組成物（例えば薬剤）、処置、プロトコール若しくは治療レジメンと組み合わせて投与される可能性があるが、その必要はない。例えば、量は、対象の必要、処置される疾患又は処置の副作用（もしもあれば）の種類、状態及び重症度によって示される通り比例的に増加され得る。加えて、有効量又は十分量は、第２の組成物（例えば、別の薬物又は薬剤）、処置、プロトコール又は治療レジメンなしで単回又は複数回の用量で与えられたときに有効又は十分である必要はない。それは、所与の対象において有効又は十分と考えられるために、そのような用量を超過する追加的な用量、量若しくは持続期間、又は追加的な組成物（例えば、薬物若しくは薬剤）、処置、プロトコール若しくは治療レジメンが、含められる場合があるからである。有効と考えられる量には、凝固障害（例えば血友病Ａ）の処置のための組換え凝固因子タンパク質（例えばＦＶＩＩＩ）の投与などの別の処置、治療レジメン又はプロトコールの使用の減少を招く量も含まれる。
[0167]したがって本発明の方法及び使用には、とりわけ、別の化合物、薬剤、薬物、治療レジメン、処置プロトコール、工程、又は治療薬の必要性又は使用の減少を招く方法及び使用も含まれる。例えば、血液凝固疾患に関して、所与の対象において欠乏した又は欠陥のある（異常若しくは変異型）内因性凝固因子を補充するための組換え凝固因子タンパク質の用量の頻度低下若しくは減少又は投与の消失がその対象においてあるならば、本発明の方法又は使用は治療的利益を有する。したがって、本発明により、別の処置又は治療法の必要性又は使用を減少させる方法及び使用が提供される。
[0168]有効量又は十分量は、所与の群又は集団において処置されたあらゆる対象にも、処置された対象の大部分にも有効である必要がない。有効量又は十分量は、群又は一般集団ではなく、特定の対象において有効又は十分であることを意味する。そのような方法に典型的なように、一部の対象は、所与の処置方法又は使用に対してより大きな応答、又はより小さな応答若しくは無応答を示す。
[0169]用語「改善する」は、対象の疾患若しくはその症状又は基礎をなす細胞応答における検出可能又は測定可能な改善を意味する。検出可能又は測定可能な改善には、疾患又は疾患によって起こる若しくは疾患と関連する合併症の発生、頻度、重症度、進行、又は持続期間における主観的又は客観的な低下、減少、阻害、抑制、限定又は制御、或いは疾患の症状又は基礎をなす原因又は疾患の転帰における改善、又は疾患の後退が含まれる。ＨｅｍＡについて、有効量は、例えば対象における急性出血エピソードの頻度若しくは重症度を減少させる量、又は例えば凝固アッセイによって測定される凝固時間を減少させる量である。
[0170]したがって、本発明の医薬組成物には、意図される治療目的を達成するための有効量で活性成分が含有される組成物が含まれる。本発明に提供される技法及び指導を用いて治療有効用量を決定することは、熟練の医師の能力の範囲内に十分に収まる。
[0171]治療用量は、数ある要因の中で、対象の年齢及び全身状態、異常血液凝固表現型の重症度、並びにＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種の発現レベルを調節している制御配列の強さに依存する。したがって、ヒトにおける治療有効量は、ベクターに基づくＦＶＩＩＩ処置に対する個別の患者の応答に基づき医師によって決定され得る比較的広い範囲内に収まる。そのような用量は、単独、又は免疫抑制剤若しくは免疫抑制薬との組合せである可能性がある。
[0172]医薬組成物などの組成物は、生物学的に活性なタンパク質（例えばＣｐＧ減少核酸変種によってコードされる第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ））の産生を可能にするように、或いは遺伝子若しくは細胞に基づく治療法又は患者若しくはドナーの細胞のｅｘ－ｖｉｖｏ改変によってＦＶＩＩＩ導入遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ連続発現を誘導することによって、対象に送達することができる。特定の実施形態では、レシピエントが治療有効量のＦＶＩＩＩポリペプチドを産生できるようにするために十分な遺伝物質を含む医薬組成物が、対象における止血に影響を及ぼすことができる。
[0173]組成物は、単独で投与される場合がある。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種、ベクター、発現ベクター／組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）、又は組換えウイルス粒子は、免疫抑制剤なしで治療効果を実現する。ＦＶＩＩＩの治療効果は、任意選択で、免疫抑制剤を投与されずに、例えば２～４、４～６、６～８、８～１０、１０～１４、１４～２０、２０～２５、２５～３０、又は３０～５０日以上、例えば５０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００日又はそれ超の期間持続する。したがって、ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種、ベクター、発現ベクター／組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）、又は組換えウイルス粒子は、免疫抑制剤をある期間投与されずに治療効果を実現する。
[0174]組成物は、少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせて投与される場合がある。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種、ベクター、発現ベクター／組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）、又は組換えウイルス粒子は、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種、ベクター、発現ベクター／組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）、又は組換えウイルス粒子を投与する前、実質的に同時又は後に、１つ又は複数の免疫抑制剤と共に投与される。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種、ベクター、発現ベクター／組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）、又は組換えウイルス粒子は、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種、ベクター、発現ベクター／組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）、又は組換えウイルス粒子を投与してしばらくしてから、例えばＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種、ベクター、発現ベクター／組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）、若しくは組換えウイルス粒子を投与した１～１２、１２～２４若しくは２４～４８時間後に、又は２～４、４～６、６～８、８～１０、１０～１４、１４～２０、２０～２５、２５～３０、３０～５０日後、若しくは５０日超後に、１つ又は複数の免疫抑制剤と共に投与される。免疫抑制剤のそのような投与は、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種、ベクター、発現ベクター／組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）、又は組換えウイルス粒子を投与してから最初の発現レベルの後にしばらくの期間、例えば２０～２５、２５～３０、３０～５０、５０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００日又は２００日超の期間、ＦＶＩＩＩに減少があれば、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種、ベクター、発現ベクター／組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）、又は組換えウイルス粒子を投与してから、しばらくの期間が経った後である。
[0175]ある特定の実施形態では、免疫抑制剤は抗炎症剤である。ある特定の実施形態では、免疫抑制剤はステロイドである。ある特定の実施形態では、免疫抑制剤は、シクロスポリン（例えばシクロスポリンＡ）、ミコフェノレート、リツキシマブ又はその誘導体である。追加的な特定の薬剤には、安定化化合物が含まれる。
[0176]組成物は、非限定的に、塩類溶液、緩衝塩類溶液、デキストロース、及び水を含む、任意の無菌で生体適合性の医薬担体に入れて投与され得る。組成物は、患者に単独で、又は止血に影響を及ぼす他の薬剤（例えば補因子）と組み合わせて投与され得る。
[0177]単独又は他の薬剤と組み合わせた第ＶＩＩＩ因子を、本明細書記載の適切な生物学的担体に入れて、患者に投与又は患者と接触又は患者に直接注入することができる。ＦＶＩＩＩポリペプチドの予防及び／又は治療有効レベルを達成し、任意選択である期間維持するために、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含む本発明のベクター及び発現ベクターは、多様な手段によって患者に投与することができる。当業者は、特定の患者の治療的処置のためにＦＶＩＩＩをコードする本発明の発現ベクターを使用するための特異的なプロトコールを容易に決定することができる。
[0178]アデノウイルスベクターの生成及び患者への投与のためのプロトコールは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，９９８，２０５号；同第６，２２８，６４６号；同第６，０９３，６９９号；同第６，１００，２４２号；並びに国際特許出願である国際公開第９４／１７８１０号及び同第９４／２３７４４号に記載されている。ＣｐＧ減少核酸変種によってコードされる第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を、それを必要とする患者に送達するために、特に例えばＡＡＶベクターが採用される。
[0179]本発明のＡＡＶベクターにより送達されるＣｐＧ減少核酸変種によってコードされる第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、公知の任意の手段によって患者に投与することができる。
[0180]本発明の方法及び使用には、全身的、領域的若しくは局所的な、又は任意の経路による、例えば注射若しくは注入による送達及び投与が含まれる。医薬組成物のｉｎ ｖｉｖｏ送達は、対流強化（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ－ｅｎｈａｎｃｅｄ）送達などの他の送達方法が構想されているものの、従来のシリンジを使用する注射を介して一般的に達成することができる（例えば、米国特許第５，７２０，７２０号を参照されたい）。例えば、組成物は、皮下、表皮、皮内、髄腔内、眼窩内、粘膜内、腹腔内、静脈内、胸膜内、動脈内、経口、肝内、経門脈、又は筋肉内に送達される可能性がある。他の投与様式は、経口及び肺投与、坐剤、並びに経皮適用を含む。血液凝固障害を有する患者の処置を専門とする臨床家は、患者の状態及び処置の目的（例えば、強化又は減少した血液凝固）を非限定的に含むいくつかの基準に基づき、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を含むアデノウイルス随伴ベクターの投与のための最適な経路を決定することができる。
[0181]本発明の方法及び使用は、所望の治療的、有益、追加的、相乗又は相補的な活性又は効果を有する任意の化合物、薬剤、薬物、処置又は他の治療レジメン若しくはプロトコールと組み合わせることができる。例示的な組合せ組成物及び処置は、生物製剤（タンパク質）、薬剤（例えば免疫抑制剤）及び薬物などの第２の活性物質を含む。そのような生物製剤（タンパク質）、薬剤、薬物、処置及び治療法は、本発明の任意の他の方法又は使用、例えばＨｅｍＡなどの血液凝固疾患について対象を処置する治療方法の前に、実質的に同時期に、又は後に投与又は実施することができる。
[0182]化合物、薬剤、薬物、処置又は他の治療レジメン若しくはプロトコールは、組合せ組成物として投与することができ、或いは核酸、ベクター、組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）、又は組換えウイルス粒子の送達又は投与と別々に、例えば同時発生的又は順次又は連続的に（前に若しくは後に）投与することができる。したがって、本発明は、本発明の方法又は使用が、本明細書に示される又は当業者に公知の、任意の化合物、薬剤、薬物、治療レジメン、処置プロトコール、工程、治療薬又は組成物と組み合わせられている組合せを提供する。化合物、薬剤、薬物、治療レジメン、処置プロトコール、工程、治療薬又は組成物は、本発明の核酸、ベクター、組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）、又は組換えウイルス粒子を対象に投与する前、実質的に同時期に、又は後に投与又は実施することができる。
[0183]本発明は、ヒト及び獣医学適用を含む動物に有用である。したがって、適切な対象には、ヒト及び非ヒト哺乳動物などの哺乳動物が含まれる。用語「対象」は、動物、概してヒト、非ヒト霊長類（類人猿、テナガザル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、マカク）、家畜動物（イヌ及びネコ）、農用動物（ニワトリ及びアヒルなどの家禽、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、並びに実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）などの哺乳動物を表す。ヒト対象には、胎児、新生児、乳児、少年及び成人対象が含まれる。対象には、動物疾患モデル、例えばＨｅｍＡ及び当業者に公知のその他などの血液凝固疾患のマウス及び他の動物モデルが含まれる。
[0184]本発明による処置に適切な対象には、機能的遺伝子産物（例えばＦＶＩＩＩタンパク質）の不十分な量を有する若しくは産生するリスクがある対象、又はその欠損症を有する対象、又は疾患に繋がるおそれがある異常、部分機能的若しくは非機能的遺伝子産物（例えばＦＶＩＩＩタンパク質）を産生する対象が含まれる。本発明による処置に適切な対象には、疾患に繋がる異常又は欠陥（変異型）遺伝子産物（タンパク質）を有する又は産生するリスクがあることにより、異常又は欠陥（変異型）遺伝子産物（タンパク質）の量、発現又は機能を減少させることが、疾患の処置に繋がる、又は１つ若しくは複数の症状を減少させる、又は疾患を改善する、対象も含まれる。したがって、標的対象には、血友病（例えば血友病Ａ）などの異常な、不十分な又は不在の血液凝固因子産生を有する対象が含まれる。
[0185]免疫応答、例えばＡＡＶに対する抗体について対象を試験することができる。したがって、候補となる血友病対象を本発明の方法による処置の前にスクリーニングすることができる。対象は、処置後にＡＡＶに対する抗体について試験することができ、任意選択で処置後のある期間に監視することもできる。抗体を発生している対象を免疫抑制剤で処置することができ、又は１つ若しくは複数の追加的な量のＡＡＶベクターを投与することができる。
[0186]本発明による処置に適切な対象には、ＡＡＶに対する抗体を有する又は産生するリスクがある対象も含まれる。ＡＡＶベクターは、いくつかの技法を用いてそのような対象に投与又は送達することができる。例えば、空のカプシドＡＡＶ（すなわちＦＶＩＩＩ核酸を欠如するＡＡＶ）は、対象におけるＡＡＶ抗体と結合することによって、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種を有するＡＡＶベクターに対象の細胞を形質転換させるように送達することができる。空のカプシドＡＡＶの投与量は、特定の対象において産生されたＡＡＶ抗体の量に基づき較正することができる。空のカプシドは、任意のＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８である可能性がある。
[0187]或いは又は追加的に、ＡＡＶベクターは、直接筋肉内注射（例えば、筋肉の１つ又は複数の遅筋線維）によって送達することができる。別の代替では、大腿動脈に導入したカテーテルを使用して、肝動脈を介して肝臓にＡＡＶベクターを送達することができる。ＡＡＶベクターを肝臓に直接送達することによって血流及びＡＡＶ抗体をバイパスするために内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）などの非外科的手段も採用することができる。顎下腺管などの他の管系も、抗ＡＡＶ抗体を発生している又はそれが予め存在している対象にＡＡＶベクターを送達するための入口として使用することができる。
[0188]対象への投与又はｉｎ ｖｉｖｏ送達は、疾患によって起こる又は疾患と関連する有害な症状、状態、合併症などの発生前に行うことができる。例えば、スクリーニング（例えば、遺伝的）を使用して、そのような対象を本発明の組成物、方法及び使用のための候補として特定することができる。したがって、そのような対象には、機能的遺伝子産物（例えばＦＶＩＩＩタンパク質）の不十分な量若しくは欠損症について陽性とスクリーニングされた対象、又は異常、部分機能的若しくは非機能的遺伝子産物（例えばＦＶＩＩＩタンパク質）を産生する対象が含まれる。
[0189]本明細書に開示されるような本発明の方法及び使用による対象への投与又はｉｎ ｖｉｖｏ送達は、対象が処置の標的となる疾患を有すると特定された後、対象が疾患の１つ若しくは複数の症状を有する後、又は対象が疾患の１つ若しくは複数の症状を有さないにもかかわらず、スクリーニングされ、本明細書記載のように陽性と特定された後、１～２、２～４、４～１２、１２～２４又は２４～７２時間以内に実施される可能性がある。もちろん、本発明の方法及び使用は、対象が処置の標的となる疾患を有すると特定された、対象が疾患の１つ若しくは複数の症状を有する、又は対象がスクリーニングされ、本明細書記載のように陽性と特定された、１～７、７～１４、１４～２１、２１～４８又はこれ超の日、月又は年後に実施することができる。
[0190]本明細書に使用される「ユニット投薬形態」は、処置されるべき対象にとってユニット投薬量として適した物理的に別個のユニットであって、各ユニットが、任意選択で医薬担体（賦形剤、希釈剤、ビヒクル又は充填剤）と関連して予定された量を含有し、各ユニットが１回又は複数回投与されたとき、所望の効果（例えば予防又は治療効果）を生じると計算されるユニットを表す。ユニット投薬形態は、例えばアンプル及びバイアル内にある場合があり、液体組成物、又はフリーズドライ若しくは凍結乾燥状態の組成物；例えばｉｎ ｖｉｖｏ投与又は送達前に添加することができる無菌液体担体を含み得る。個別のユニット投薬形態は、多回投与キット又は容器に含まれる可能性がある。組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）配列、組換えウイルス粒子、及びその医薬組成物は、投与の容易さ及び投薬量の均一性のために単回投与又は多回投与ユニット投薬形態にパッケージすることができる。
[0191]対象が本発明の方法による処置に適切であるかを判定するために、そのような対象をＦＶＩＩＩの量又はＦＶＩＩＩの活性について試験することができる。候補となる血友病対象を、本発明の方法による処置の前にＦＶＩＩＩの量又は活性について試験することができる。対象を、本発明の方法による処置の後にＦＶＩＩＩの量又はＦＶＩＩＩの活性について試験することができる。そのような処置された対象を、処置の後にＦＶＩＩＩの量又はＦＶＩＩＩの活性について定期的に、例えば１～４週間毎又は１～６ヶ月毎に監視することができる。
[0192]有害応答のために、又は対象が本発明の方法による処置に適切であるかを判定するために、１つ又は複数の肝臓酵素についてそのような対象を試験することができる。したがって、本発明の方法による処置の前に、候補となる血友病対象を１つ又は複数の肝臓酵素の量についてスクリーニングすることができる。本発明の方法による処置の後に、１つ又は複数の肝臓酵素の量について対象を試験することもできる。そのような処置された対象を処置の後に肝臓酵素の上昇について定期的に、例えば１～４週間毎又は１～６ヶ月毎に監視することができる。
[0193]例示的な肝臓酵素には、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）が含まれるが、肝臓の損傷を示す他の酵素も監視することができる。循環中のこれらの酵素の正常レベルは、それを超えると酵素レベルが上昇していると考えられる、したがって肝臓の損傷を示す、上限レベルを有する範囲として概して定義される。正常範囲は、一部はアッセイを行う臨床検査室によって使用される標準物質に依存する。
[0194]対象が処置に適格若しくは応答性であるか決定するために、及び／又は応答の量若しくは持続期間を決定するために、出血エピソードについてそのような対象を監視することができる。対象が追加的な処置、例えば後続のＡＡＶベクターの投与又は免疫抑制剤の投与、又はより頻度の高い監視を必要とするかどうかを判定するためにそのような対象を出血エピソードについて監視することができる。したがって、本発明の方法による処置の前及び後に出血エピソードについて血友病対象を監視することができる。本発明の方法による処置の途中又は後に出血エピソードの頻度及び重症度についても対象を試験することができる。
[0195]本発明は、包装材及びその中の１つ又は複数の構成成分を有するキットを提供する。キットは、構成成分の説明又はその中の構成成分のｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、若しくはｅｘ ｖｉｖｏ使用のための説明書を含むラベル又は添付文書を概して含む。キットは、そのような構成成分の集合、例えば核酸、組換えベクター、ウイルス（例えばＡＡＶ）ベクター、又はウイルス粒子、及び任意選択で別の化合物、薬剤、薬物又は組成物などの第２の活性物質を含有する可能性がある。
[0196]キットは、キットの１つ又は複数の構成成分を収容している物理的構造を表す。包装材は、構成成分を無菌に維持することができ、そのような目的のために通常使用される材料（例えば紙、段ボール、ガラス、プラスチック、フィルム、アンプル、バイアル、チューブなど）でできている可能性がある。
[0197]ラベル又は添付文書は、その中の１つ又は複数の構成成分の特定情報、用量、作用機序、薬物動態及び薬力学を含む、活性成分（複数可）の臨床薬理学を含む可能性がある。ラベル又は添付文書は、製造者、ロット番号、製造場所及び日付、有効期限を特定する情報を含む可能性がある。ラベル又は添付文書は、製造者の情報、ロット番号、製造者の場所及び日付を特定する情報を含む可能性がある。ラベル又は添付文書は、キットの構成成分が使用され得る疾患に関する情報を含む可能性がある。ラベル又は添付文書は、臨床家又は対象が方法、使用、又は処置プロトコール又は治療レジメンにおいてキットの構成成分のうちの１つ又は複数を使用するための説明書を含む可能性がある。説明書は、投薬量、頻度又は持続期間、及び本明細書記載の方法、使用、処置プロトコール又は予防若しくは治療レジメンのうちのいずれかを実施するための説明書を含む可能性がある。
[0198]ラベル又は添付文書は、構成成分が予防的又は治療的利益などを供給し得る任意の利益に関する情報を含む可能性がある。ラベル又は添付文書は、特定の組成物を使用することが不適切と予想される状況に関する対象又は臨床家への警告などの、潜在的な有害副作用、合併症又は反応に関する情報を含む可能性がある。有害副作用又は合併症は、対象が組成物と不適合性であるおそれのある１つ若しくは複数の他の投薬を受けた、将来受ける若しくは現在受けている場合、又は対象が組成物と不適合性と予想される別の処置プロトコール若しくは治療レジメンを受けた、将来受ける若しくは現在受けている場合にも発生するおそれがあり、したがって、説明書は、そのような不適合性に関する情報を含む可能性がある。
[0199]ラベル又は添付文書は、構成成分、キット若しくは包装材（例えば箱）と分離している若しくは貼り付いている、又はキットの構成成分が入ったアンプル、チューブ若しくはバイアルに付属している、「印刷物」、例えば紙若しくは厚紙を含む。ラベル又は添付文書は、バーコードが印刷されたラベル、ディスク、ＣＤ－又はＤＶＤ－ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤなどの光ディスク、ＭＰ３、磁気テープ、又はＲＡＭ及びＲＯＭなどの電気記憶媒体、又は磁気／光記憶媒体、ＦＬＡＳＨ媒体若しくはメモリー式カードなどのこれらのハイブリッドなどのコンピュータ可読媒体を追加的に含み得る。
[0200]特に規定しない限り、本明細書に使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の技術者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書記載の方法及び材料と類似又は等価の方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができるものの、適切な方法及び材料が本明細書に記載されている。
[0201]本明細書において引用される全ての特許、特許出願、刊行物、及び他の参考文献、ＧｅｎＢａｎｋ引用情報及びＡＴＣＣ引用情報は、その全体が参照により組み込まれている。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が優先されるものとする。
[0202]本発明の生物学的分子に関する様々な用語は、本明細書上記並びに本明細書及び特許請求の範囲全体にも使用されている。
[0203]本明細書開示の特徴のうちの全てを任意の組合せで組み合わせることができる。本明細書に開示された各特徴を、同じ、等価、又は類似の目的に役立っている代替的な特徴によって置き換えることができる。したがって、特に明示的に述べない限り、開示された特徴（例えばＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種、ベクター、プラスミド、発現／組換えベクター（例えばｒＡＡＶ）配列、又は組換えウイルス粒子）は、等価又は類似の特徴の部類の例である。
[0204]本明細書に使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば「核酸」への言及は、複数のそのような核酸を含み、「ベクター」への言及は複数のそのようなベクターを含み、「ウイルス」又は「粒子」への言及は、複数のそのようなウイルス／粒子を含む。
[0205]本明細書に使用される全ての数値又は数値範囲は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、そのような範囲内の整数及び範囲内の値又は整数の分数を含む。したがって、例証すると、８０％以上の同一性への言及は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％等、及び８１．１％、８１．２％、８１．３％、８１．４％、８１．５％等、８２．１％、８２．２％、８２．３％、８２．４％、８２．５％等などを含む。
[0206]超（より大きい）又は未満を付けた整数への言及は、参照の数よりもそれぞれ大きい又は小さい任意の数を含む。したがって、例えば、１００未満への言及は、９９、９８、９７等からはるばる数字１までを含み；１０未満は、９、８、７等からはるばる数字１までを含む。
[0207]本明細書に使用される、全ての数値又は範囲は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、そのような範囲内の値及び整数の分数並びにそのような範囲内の整数の分数を含む。したがって、例証すると、１～１０などの数値範囲への言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、及び１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等などを含む。したがって範囲１～５０への言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０などから、最大５０以下、及び１．１、１．２、１．３、１．４、１．５など、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５などを含む。
[0208]一連の範囲への言及は、系列内の異なる範囲の境界の値を組み合わせた範囲を含む。したがって、一連の範囲への言及を例証すると、例えば１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～４００、４００～５００、５００～７５０、７５０～８５０は、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～６０、１０～７０、１０～８０、２０～４０、２０～５０、２０～６０、２０～７０、２０～８０、２０～９０、５０～７５、５０～１００、５０～１５０、５０～２００、５０～２５０、１００～２００、１００～２５０、１００～３００、１００～３５０、１００～４００、１００～５００、１５０～２５０、１５０～３００、１５０～３５０、１５０～４００、１５０～４５０、１５０～５００等の範囲を含む。
[0209]本発明は、多数の実施形態及び態様を記載するために肯定的な言い回しを用いて本明細書において一般的に開示されている。本発明は、詳細には、物質若しくは材料、方法、ステップ及び条件、プロトコール、又は手順などの特定の主題が完全又は部分的に除外される実施形態も含む。例えば、本発明のある特定の実施形態又は態様では、物質及び／又は方法のステップが除外される。したがって、本発明は、本発明が含まないものに関して本明細書において一般的に表現されないが、本発明において明示的には除外されていない態様であっても、本明細書において開示されている。
[0210]本発明のいくつかの実施形態が説明されてきた。しかし、当業者は、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに本発明の様々な変更及び改変を行って様々な使用及び条件に適応させることができる。したがって、以下の実施例は、請求された本発明の範囲を何らかの方法で限定することではなく、例証することを意図するものである。
実施例１
[0211]血友病を処置するための遺伝子療法に使用するための遺伝子構築物が本明細書において開示される。加えて、これらの第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子構築物は、投与用に組換えＦＶＩＩＩタンパク質を産生するためのタンパク質発現系の設定にｉｎ ｖｉｔｒｏで有用であり得る。各遺伝子構築物は、発現制御（例えばプロモーター）エレメント、第ＶＩＩＩ因子遺伝子及びイントロン、ＩＴＲ、終止コドン、ポリＡシグナルなどの遺伝子の発現に必要な他の調節特徴のうちの１つ又は複数を任意選択で含む可能性がある。
実施例２
ＣｐＧ減少第ＶＩＩＩ因子のＤＮＡ配列及びある特定のベクター構築物、プラスミド構築物及びＡＡＶベクター産生細胞株
[0212]ＦＶＩＩＩをコードする１８種の異なるＣｐＧ減少核酸変種（配列番号１～１８）を産生させ、発現アッセイで評価した。変異型トランスサイレチン（ＴＴＲｍｕｔ）プロモーター（配列番号２２）を用いてＣｐＧ減少ヒトＦＶＩＩＩのｃＤＮＡ構築物を生成させた。
[0213]ＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１発現カセットは、ＣｐＧ減少ＦＶＩＩＩ－Ｘ０７核酸配列及びパッケージング用のＬＫ０３カプシドを有する。ＬＫ０３カプシドは、非病原性の自然複製欠損１本鎖ＤＮＡウイルスであるＡＡＶ３と実質的な相同性を有する。
[0214]パッケージングプラスミドｐＬＫ０３は、ＡＡＶ２ ｐ５プロモーターの制御下のＡＡＶ２ Ｒｅｐ及びＡＡＶ－ＬＫ０３ Ｃａｐ遺伝子、細菌複製起点並びに細菌細胞にカナマイシン耐性を付与する遺伝子を有する７，４８４ｂｐのプラスミド構築物である。この構築物では、野生型又は偽野生型ＡＡＶ種が形成する潜在性を減少させるため及びベクターの収量を上げるために、ｐ５ ｒｅｐプロモーターが、ｃａｐ遺伝子の３’に移動されている。
[0215]遺伝子導入用にクローニングされたＤＮＡは、ＡＡＶ－ＬＫ０３カプシドに１本鎖ゲノムとしてパッケージングされた、肝臓特異的プロモーターの制御下でヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ｈＦＶＩＩＩ）をコードする遺伝子発現カセットである。この発現プラスミドを、ｐＡＡＶ－ＴＴＲｍｕｔ－ｈＦＶＩＩＩ－Ｘ０７と呼ぶ。ＴＴＲプロモーターに４つの点変異を導入することによって発現プラスミドを改変し、コード領域を最適化してヒトＦＶＩＩＩの発現を増加させた。ＡＡＶ発現カセットは、以下のエレメントを含有する：
ＡＡＶ２ ＩＴＲ
トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター：野生型プロモーターと比較して遺伝子発現を増加させる４つの点変異を有する肝臓特異的トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター（Ｃｏｓｔａら、１９９１）
合成イントロン：ヒト伸長因子ＥＦ－１アルファ遺伝子由来
ＦＶＩＩＩコード配列：Ｂドメインを欠失しコドン最適化されたヒトＦＶＩＩＩのコード配列。
ウサギベータグロビンポリＡシグナル配列（Ｌｅｖｉｔｔら、１９８９）。
ＡＡＶ２ ＩＴＲ
[0216]ヒト胎児腎臓２９３細胞に形質移入するために３つのＤＮＡプラスミド構築物を使用して、ヘルパーウイルスフリー工程によってＳＰＫ－８０１１ベクターを産生させる（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら、１９９８）：
遺伝子カセット（ｈＦＶＩＩＩコード配列及び関連する調節エレメント）をプラスミドにクローニングして、ベクタープラスミドｐＡＡＶ－ＴＴＲｍｕｔ－ｈＦＶＩＩＩ－Ｘ０７を与える。
ウイルスＩＴＲを欠如するＡＡＶウイルスゲノム（ｒｅｐ及びｃａｐ）をプラスミドにクローニングして、ＡＡＶパッケージングプラスミドｐＬＫ０３を与え、ＡＡＶベクターのパッケージングのために必要なＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ－ＬＫ０３ ｃａｐ遺伝子をトランスで用意する。非相同組み換えによる複製適格なＡＡＶの形成を防止するために、ｒｅｐ遺伝子用のウイルスプロモーター（ｐ５）をプラスミドに再配置した。
アデノウイルス－２からの３つの遺伝子を第３のプラスミド（ｐＣＣＶＣ－ＡＤ２ＨＰ）にクローニングし、ベクター産生に必要なヘルパーウイルス遺伝子を用意する。プラスミドｐＣＣＶＣ－ＡＤ２ＨＰｖ２は、ＡＡＶベクターの複製及びカプシド封入に必要な「ヘルパー」機能を与えるために３種のアデノウイルス遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡのＲＮＡを有する１１，８３２ｂｐのプラスミド構築物である。プラスミドｐＣＣＶＣ－ＡＤ２ＨＰｖ２は、ｐＣＣＶＣ－ＡＤ２ＨＰの誘導体であり、このプラスミドでは、ＡｍｐＲ遺伝子及びｐＵＣ ｏｒｉ配列の一部を含む１８８２ｂｐのＤｒｄＩ－ＤｒｄＩ制限断片が除去されて、ＫａｎＲ遺伝子全体及びｐＵＣ ｏｒｉ配列の一部を含む、プラスミドｐＡＡＶ２－ｈＲＰＥ６５ｖ２由来のＤｒｄＩ－ＤｒｄＩ断片により置換されている。
[0217]ＡＡＶベクター産生のために使用される細胞基材は、初代ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ）２９３の派生細胞である。ＨＥＫ２９３細胞株は、剪断されたヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）ＤＮＡによって形質転換された永久株である（Ｇｒａｈａｍら、１９７７）。ワーキング細胞バンクは、フィラデルフィア小児病院（ＣＨＯＰ）の細胞分子治療センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（ＣＣＭＴ））からの特徴付け済みＨＥＫ２９３マスター細胞バンクから得られたものである。
実施例３
マウスにおけるＡＡＶ－ｈＦＶＩＩＩベクターの検討。
[0218]ＦＶＩＩＩ導入遺伝子構築物（ｈＦＶＩＩＩ）をアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにパッケージングし、マウスに送達した。簡潔には、８～１０週齢の血友病Ａ／ＣＤ４－／－マウス、４匹の群にＡＡＶ－ｈＦＶＩＩＩベクター４×１０１２ｖｇ／ｋｇを注射した。正常マウスにおいて生成するＦＶＩＩＩに対する阻害抗体がＦＶＩＩＩの発現の長期分析を妨害するので、ＦＶＩＩＩの血漿レベルの定量を可能にするために免疫不全マウスを使用した。
[0219]ＦＶＩＩＩの発現レベルを決定したが、いくつかの場合で、発現レベルは、ｈＦＶＩＩＩをコードするＣＯ３配列（配列番号２１）によってもたらされる発現よりも高かった。図２に示すように、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５を含むベクターは、参照ＡＡＶ－ＣＯ３ベクターと比較して高いｈＦＶＩＩＩレベルを発現した。このデータは、ＤＮＡ配列のいくつかが、ＦＶＩＩＩをコードするコドン最適化配列（ＣＯ３、配列番号２１）よりも高いレベルのＦＶＩＩＩを発現したことを驚くことに明らかにしている。
[0220]ＡＡＶ－ＬＫ０３－ｈＦＶＩＩＩ（ＡＡＶ－ＬＫ０３－ｈＦＶＩＩＩ及びＳＰＫ－８０１１とも呼ばれる）ではなくＡＡＶ－Ｓｐａｒｋ８００５（ＳＰＫ－８００５とも呼ばれる）をこの試験に使用して、マウス肝細胞の効率的な形質導入（すなわち；ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子の発現）を確実にした。したがって、ＡＡＶ－ＬＫ０３カプシドの安全性ではなく、ｈＦＶＩＩＩの持続的発現の安全性を検討するためにこの試験を計画した。
[0221]それぞれ約５～２５、２５～７５、及び５０～１５０％のｈＦＶＩＩＩ抗原レベルを生成するために３用量のＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩを使用した（４×１０１０、８×１０１０、１．６×１０１１ｖｇ／マウス；マウス体重２５ｇに基づき約１．６×１０１２、３．２×１０１２、６．４×１０１２ｖｇ／ｋｇ）。この試験は、３５０匹の雄性ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（表１）を含み、この試験を２つの下位試験：主試験（ｎ＝２７０）及び生物分析試験（ｎ＝８０）に分けた。主試験では、マウス６０匹をビヒクル又は３つの用量のベクターのうちの１つ（４×１０１０、８×１０１０、１．６×１０１１ｖｇ／マウス）で処置した。マウス１０匹を２９／３０日目の臨床化学評価のために使用し、１０匹を血液検査のために使用し、残りの動物１０匹に凝固評価を行った。これらのマウス３０匹を２９又は３０日目に屠殺した。ビヒクル又は３つのベクター用量のうちの１つのいずれかで処置されたマウス３０匹のもう一方の群を８７日目の時点で同様に取り扱い、８７日目に屠殺した。終了時に、主試験の全ての動物に肉眼的病理観察を行い、１時点あたり１０匹の動物／コホートに総合的病理組織検査を行った（血液検査のサブセット）。バックグラウンド対照の臨床病理測定のためにナイーブマウス３０匹の別のコホートを使用した。
[0222]生物分析試験では、マウス２０匹にビヒクル又は３つのベクター用量のうちの１つを注射した。試験物の注射前並びに１５、３０、６０、及び８７日目に連続的にこれらの動物から採血した。各試料について収集された、予定された血漿体積は、ｈＦＶＩＩＩ抗原及びＤ－ダイマーレベルの両方の決定のために十分なはずであった。しかし、不十分な血漿体積の収集のために、最後の時点を除く全ての時点で個別のマウス血漿で１回だけのアッセイを行った。したがって、ｈＦＶＩＩＩ抗原の循環レベルについて検討したマウスもあれば、Ｄ－ダイマーレベルについて検討したマウスもあった。Ｄ－ダイマーＥＬＩＳＡ（最小２０ｕＬ）よりもｈＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡ（最小５０ｕＬ）を行う方が多量の血漿を必要とするので、収集された血漿の体積により選ばれるアッセイが決まった。
Figure 2022137029000002
[0223]血漿ＦＶＩＩＩ抗原レベル：図３Ａ～３Ｂに示すように、８７日にわたりｈＦＶＩＩＩ抗原の循環レベルにおける用量－反応を観察した。低用量のベクター（４×１０１０ｖｇ／マウス）では、平均ｈＦＶＩＩＩレベル６４±４９ｎｇ／ｍｌが注射の６０日後に見られ、中用量及び高用量でそれぞれ１１５±６０ｎｇ／ｍｌ及び２７３＋／５８ｎｇ／ｍｌが見られた。これらの抗原レベルは、正常ｈＦＶＩＩＩ抗原の４３、７７、及び１８２％に相当する（１５０ｎｇ／ｍＬは１００％と等しい）。したがって、止血が正常なＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、それぞれ３つの用量レベルで合計（マウス＋ヒト）ＦＶＩＩＩレベル１４３％、１７７％及び２８２％が予想される。したがって、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩを使用したとき、免疫欠損マウスの血漿からｈＦＶＩＩＩの持続的で超生理的なレベルが観察されたが、この結果は、この試験をｈＦＶＩＩＩの長期発現の安全性を評価するために適切なものにしている。
[0224]Ｄ－ダイマーレベル：止血が正常であるが、免疫が不全のマウスにおけるｈＦＶＩＩＩの持続性発現による血栓形成の潜在性を評価するために、Ｄ－ダイマー抗原レベルを測定した。ナイーブマウス５０匹の間のＤ－ダイマーの投与前平均レベルは８．８±２．９ｎｇ／ｍｌであった。図３Ｃのデータは、４つの用量コホートにおける平均Ｄ－ダイマーレベルを表す。５つの時点全てでコホート間のＤ－ダイマーレベルに統計的な差はなかった（一元配置ＡＮＯＶＡのｐ＝０．４６）。このマウス系統において、正常の１９４％の高さのレベル（３０日目）で少なくとも８７日間というｈＦＶＩＩＩの持続性発現は、Ｄ－ダイマーのレベル上昇と関連しないと結論した。
[0225]臨床解剖病理検査：早期に安楽死された又はこの試験の経過中に死亡しているのが見つかった動物は９匹であった（主試験６匹及び生物分析試験３匹）。
[0226]主試験の動物６匹を組織病理学的に検討し、ビヒクル対照を注射したマウス１匹を含むこれらのマウス６匹のうちの４匹から悪性リンパ腫が観察された。（群１の動物７７２９、群３の動物７８７１、群３の動物７８８０、及び群３の動物７８７４）。腫瘍所見の生物学的重要性は不明確と考えられた。対照群との個別の群比較の統計的有意性はありそうにないと考えられた。胸腺リンパ腫の高い自然頻度並びに脾臓及びリンパ節の腫瘍性拡大がこの系統に発生することが知られている（Ｐｒｏｃｈａｚｋａ、Ｇａｓｋｉｎｓ、Ｓｈｕｌｔｚ、及びＬｅｉｔｅｒ、１９９２）。
[0227]試験物に関係する非腫瘍性所見は、これらのマウス６匹に存在しなかった。観察された顕微鏡所見は、偶発と考えられ、この系統及び齢のマウスで通常観察される性質のものであり、並びに／又は対照及び処置後の動物において類似の発生率及び重症度であったので、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩの投与と関係しないと考えられた。
[0228]主試験に含まれる残りのマウス２３４匹は、計画された時点まで生存した。試験全体でマウスから有害観察所見又はＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩ関連臨床観察所見は見られなかった。痂皮形成、脱毛又は薄毛（ｔｈｉｎ ｃｏｖｅｒ）及び曲がった尾という全ての臨床観察所見は、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩの投与と無関係と考えた。それは、これらの観察所見が、このマウス種に一般的であり、及び／又は群横断的に発生したからである。体重及び体重増加は用量群の間で同様であり、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩの投与によって影響されなかった。３２日目から試験完了までに群４の平均体重が一見有意に（ｐ＜０．０５又はｐ＜０．０１）減少したことは、２９／３０日目の安楽死後の群の体重の再分布に起因すると考えられ（群１と比べてより体重の大きい一部の動物が安楽死された）、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩの投与と関係しなかった。群４のマウスは、試験全体にわたりその他の群と同様に体重が増加した。平均体重又は体重増加における全ての他の有意差（ｐ＜０．０５又はｐ＜０．０１）は、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩと関係すると考えられなかった。それは、増加及び減少は用量に依存せずに散発し、マウスの体重における通常の変動に関係すると考えられたからである。
[0229]主試験の動物に関して臨床病理検査を行った。１時点あたり１０匹のマウス／コホートに関して臨床化学検査のパラメーターを分析した（２９／３０日目及び８７日目）。別の群の１０匹のマウス／コホートに凝固評価を行い、血液検査の測定を１０匹のマウス／コホートのその他の群に行った。肉眼病理検査を全ての動物に行い、血液検査の評価のために利用したマウス１０匹の群に組織病理検査を行った。２９／３０日目及び８７日目の安楽死時点のいずれからのマウスに血液検査又は臨床化学検査のパラメーターにＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩに関係する変化はなかった。一般的に、対照値と比較して血液検査及び臨床化学検査のパラメーターに有意差（ｐ＜０．０５又はｐ＜０．０１）が存在した場合、これらの差は、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩと関係しなかった。それは、対応するパラメーターが影響されず、観察所見が用量依存的ではなかったからである。臨床化学検査及び血液検査のパラメーターにおける全ての変化は散発性であり、単一の動物に起因すると考えられ、実験動物に一般に観察される変化強度であり、及び／又はナイーブな動物について評価された臨床病理検査のパラメーター内に収まる。
[0230]ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩを投与されたマウスに凝固パラメーターの変化が観察された。平均ａＰＴＴの用量依存的な減少が２９／３０日の時点で観察され、群３及び４の値は、対照値と有意に異なった（ｐ＜０．０５又はｐ＜０．０１）。８７日目の時点で対照群と比較して全てのＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩ群で平均ａＰＴＴ値の有意な減少（ｐ＜０．０１）も観察された。２９／３０日目及び８７日目に対照群と比較してＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩ群で平均プロトロンビン時間の減少も観察されたが、この減少は、２９／３０日目の群２及び３並びに８７日目の群４についてのみ統計的に有意であった（ｐ＜０．０５又はｐ＜０．０１）。平均フィブリノーゲン値は、試験全体にわたり用量群間で類似していた。これらの作用は、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩの薬理作用に関係すると考えられ、有害とは考えられない。図３Ａ～３Ｃに示し、上に述べるように、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩを注射された全てのマウスはｈＦＶＩＩＩ抗原を発現したので、超生理的レベルの総ＦＶＩＩＩがこれらの止血正常マウスの血漿中に循環していると予測される。これらのレベルは、減少したａＰＴＴ及びプロトロンビン時間などの凝固パラメーターに効果を及ぼすと予想される。
[0231]主試験のマウス１２０匹（３０匹／コホート）の群を試験の２９又は３０日目に屠殺した。これらのマウスに関してＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩに関係する肉眼病理観察は行わなかった。器官重量の分析から、心臓及び腎臓の絶対重量が２９日目に屠殺された１０匹の対照動物とベクターを注射された動物との間で異なったことが明らかとなったが、これは、３０日目に屠殺された１０匹の対照動物とベクターを注射された動物との間では観察されなかったので、この所見の重要性は不明である。２９日目に観察された心臓及び腎臓の絶対重量（及び脳重量に対するパーセントとしてのこれらの重量）における統計的に有意な増加と顕微鏡的に相関するものはなかった。さらに、体重のパーセントとしての心臓及び腎臓重量は、対照と有意差がなかった。群２の動物では肺の平均絶対重量に有意な増加があったが、用量依存性がなかったので、これは偶発と考えられ、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩと無関係であった。２９／３０日目に他の器官重量変化を認めなかった。
[0232]２９／３０日目に組織病理分析を行ったとき、腫瘍所見を有する動物が５匹いた。細気管支肺胞腺癌が群２の動物１匹（７８２４）に観察された。悪性リンパ腫が群２の動物１匹（７８３８）、群３の動物１匹（７８８５）、及び群４の動物１匹（７９４１）に観察された。群４の動物１匹（７９４２）の胃に腺腫が観察された。群１では腫瘍所見は観察されなかった。腫瘍所見の生物学的重要性は、不明確と考えられる。個別の群と対照群との比較の統計的有意性は、ありそうにない。しかし、２９／３０日目に、処置動物においてのみ腫瘍所見が観察されたことは注目に値する。同様の齢のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスに関する歴史的対照データが不在であるので、これらの腫瘍所見は不確定である。
[0233]試験物に関係する非腫瘍性顕微鏡所見を認めた。観察された顕微鏡所見は、マウスのこの系統及び齢に通常観察される性質の偶発と考えられ、並びに／又は対照動物及び処置動物において類似の発生率及び重症度であったので、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩの投与と無関係と考えられた。
[0234]主試験マウス１２０匹（３０匹／コホート）の別の群を注射の８７日後に屠殺し、類似の方法で分析した。ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩに関係すると考えられる肉眼的病理観察所見は見られなかったが、マウス４匹に病変が観察された（組織分析しなかった拡大した胸腺１匹、悪性リンパ腫と相関した拡大した胸腺１匹、組織分析しなかった拡大した脾臓１匹、変色した精巣１匹）。２９／３０日目に観察されたものと対照的に、減少した心臓重量、増加しなかった体重が観察された。加えて、肝臓重量の減少が見られた。心臓重量の統計的に有意な変化は小さく、用量とはっきりとは関係しなかった。肝臓の絶対重量における統計的に有意な変化は小さく、体重及び脳重量に対する肝臓重量は、群間で類似していた。したがって、わずかな変化は偶発であり、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩの投与と無関係と解釈された。８７日目に他の器官重量の変化は認められなかった。
[0235]注射の８７日後にマウスで行われた組織病理検査により、腫瘍所見を有する動物４匹が特定された。群２の動物１匹（７８０８）並びに群３の動物３匹（７８６８、７８６９及び７８７０）に悪性リンパ腫が観察された。群１から腫瘍所見は観察されなかった。腫瘍所見の生物学的重要性は、不明確と考えられた。個別の群と対照群との比較の統計的有意性はありそうにない。しかし、処置動物に８７日目にのみ腫瘍所見が観察されたことは注目すべきである。類似の齢のＮＯＤ ＳＣＩＤマウスについて歴史的対照データが不在であるので、これらの腫瘍所見は不確定である。
[0236]非腫瘍性変化に関して、試験物に無関係な顕微鏡的所見が認められた。観察された顕微鏡的所見は、マウスのこの系統及び齢に通常観察される性質の偶発と考えられ、並びに／又は対照及び処置動物において類似の発生率であったので、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩの投与と無関係と考えられた。
[0237]結論：用量４×１０１０、８×１０１０、若しくは１．６×１０１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩ又は対照品の雄性ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの静脈内注射による単回投与は、忍容性良好であった。ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩは、試験物関連死、有害臨床観察所見又は体重の変化を全く招かなかった。２９／３０日目又は８７日目の雄性マウスにおいて器官重量、血液検査又は凝固パラメーターに毒性学的に重要な差はなく、処置に関係する肉眼病理所見又は組織病理所見もなかった。両方の安楽死時点で観察された平均ａＰＴＴ及びプロトロンビン時間の減少は、これらの止血正常なマウスにおいて発現したＦＶＩＩＩの超生理的レベルと関係すると考えられ、有害ではなかった。主試験（末期検討）の中で、ベクターを注射されたマウス６０匹のうちの９匹、言い換えると動物の１５％に悪性腫瘍が観察された。これらのマウス９匹のうちの７匹はリンパ腫を有し、リンパ腫は、リンパ節に最も一般的に見られた。この免疫不全マウス系統は、リンパ腫の自然発生頻度が高いことが知られており（Ｐｒｏｃｈａｚｋａら、１９９２）、寿命はわずか８．５ヶ月である。したがって、この試験に見られる腫瘍の頻度が、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩの投与と関係することはありそうにない。この試験の目的は、ｈＦＶＩＩＩの持続性発現の安全性を約３ヶ月にわたり検討することであった。この試験は、ＡＡＶ－ＳＰＫカプシドを検討するように計画されなかった。ＡＡＶ－ＳＰＫ及び免疫不全マウス系統を使用して、ｈＦＶＩＩＩの高レベル発現を確実にした。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへのＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５－ｈＦＶＩＩＩの投与は、ｈＦＶＩＩＩの持続性で高いレベルを招いた。したがって、この試験は、ｈＦＶＩＩＩの長期発現の安全性を評価するために適切であった。
実施例４
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５及びＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３カプシド、ＦＶＩＩＩ－Ｘ０７（配列番号７））ベクターの検討。
[0238]マウスにおける結果に基づき、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにパッケージングされたＦＶＩＩＩ導入遺伝子構築物を非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に送達した。
[0239]簡潔には、雄性カニクイザルにおける投与量決定試験でＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５又はＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３カプシド）の単回静脈内注入を実施した。ｈＦＶＩＩＩの発現を８週間にわたり検討した。それぞれの動物群及び用量レベルを図４に示す。
[0240]ＮＨＰは、較正済み注入ポンプを使用して伏在静脈を介した静脈内注入を約３０分にわたり受けた。マカクをＡＡＶカプシドに対する中和抗体について予備スクリーニングした。処置後の動物全ては、最初、ベクター投与前に＜１：３力価を有すると判定された。低い力価であっても全身送達後に肝臓細胞によるベクター取込みを阻害するので、これは、肝臓形質導入の成功を確実にするために行った（Ｊｉａｎｇら、２００６）。全ての動物は、遺伝子導入の前もＦＶＩＩＩに対する中和抗体の存在が陰性であった。
[0241]カニクイザルの内因性ＦＶＩＩＩを検出しないヒト特異的ＥＬＩＳＡによってｈＦＶＩＩＩの血漿レベルを測定した。この試験の全ての動物は、中用量コホートのマカク１匹を除き、ベクター送達後にｈＦＶＩＩＩを発現する。ヒト第ＶＩＩＩ因子の抗原レベルは、ベクター投与の約１～２週間後にピークに達した。遺伝子導入の１週間後に、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５ ２×１０１２ｖｇ／ｋｇを形質導入されたＮＨＰは、１３．２±３％（平均±平均の標準誤差）のｈＦＶＩＩＩ抗原レベルを発現した。遺伝子導入の１週間後に、次の処置コホート（５×１０１２ｖｇ／ｋｇ）で動物３匹のうちの２匹の平均ｈＦＶＩＩＩレベルは２７±０．２％であった。そのコホートの３匹目のマカクからは、どの時点でもヒトＦＶＩＩＩを検出することができなかった。ベースラインの血漿試料を再試験すると、この動物は、実際のところ抗ＡＡＶ抗体の存在が陽性で、最初に決定された力価＜１：３が不正確であったと判定された。最後に、最高試験用量１×１０１３ｖｇ／ｋｇで、ＡＡＶ注入後にピークｈＦＶＩＩＩ抗原レベル５４．１±１５．６％が観察された。
[0242]ヒトＦＩＸを発現しているＮＨＰにおける試験によって予期されたように、ヒトＦＶＩＩＩの発現は、約４週間で動物の約３分の１において減少した。これは、これらのマカク３匹でｈＦＶＩＩＩに対する阻害抗体が出現したことに一致する（図５に記号εで目印を付ける）。ｈＦＶＩＩＩに対する種特異的抗体の発生は、非ヒト霊長類において以前に記載されており、ヒト導入遺伝子産物と内因性カニクイザルＦＶＩＩＩとの間のいくつかのアミノ酸残基の差が原因で、起こる可能性がある（ＭｃＩｎｔｏｓｈ、Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ １２１：３３３５～４４（２０１３））。
[0243]ヒトＦＶＩＩＩの連続発現による潜在的血栓形成を評価するために、この試験におけるＤ－ダイマー抗原レベルを測定した。カニクイザルにおけるＤ－ダイマー抗原レベルの臨床的関連性又は正常値でさえ関係する報告は乏しいことに留意すべきであり、参考として、ヒトにおけるＤ－ダイマーの正常範囲は５００ｎｇ／ｍｌ未満である。動物は内因性カニクイザルＦＶＩＩＩを発現するので、肝臓遺伝子導入の結果としてのｈＦＶＩＩＩ産生は、ＦＶＩＩＩ活性の超生理的レベルを招く。
[0244]５×１０１２ｖｇ／ｋｇの用量を与えられたが、ヒトＦＶＩＩＩを発現しなかった動物は、ＡＡＶ注入の２週間後にピーク８６３ｎｇ／ｍｌを有した。残りの動物は、ベースライン値と比較してＤ－ダイマー抗原レベルに有意な増加を全く示さなかった。まとめると、これらの結果は、これらの試験で目標とされたレベルでのヒトＦＶＩＩＩの発現は、血栓症のリスク増加と関連しないことを示唆している。
[0245]ベクター投与の４週間後に、ベクターに関係する変化は明白ではなかった。肝機能検査は正常値を示し、小さな変動を有したが、この変動は、大部分の場合に投薬前に存在したので、ベクター用量とは無関係に見えた（図６）。
[0246]最大５週間のＤ－ダイマーレベルを図７に示す。高用量コホートの動物１匹は、循環ヒトＦＶＩＩＩが約１００％のピークに達したベクター投与１週間後に、Ｄ－ダイマーレベルの小さい（５７７ｎｇ／ｍｌ）一過性上昇を有し、Ｄ－ダイマーレベルは、１回上昇したこの測定の後に急速に正常に戻った。注目すべきは、Ｄ－ダイマーレベルとｈＦＶＩＩＩ抗原レベルとの間に相関はなかった（図７、下欄）。
[0247]ＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３カプシド）ベクターについて、カニクイザルの３つのコホート（ｎ＝３）を漸増する用量のＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３カプシド）（２×１０１２、６×１０１２及び２×１０１３（ｖｇ／ｋｇ）；図４）で処置した。臨床観察所見、体重、臨床病理検査（臨床化学検査、血液検査、凝固、尿検査）について動物を監視した。加えて、試験全体にわたりｈＦＶＩＩＩ抗原レベル、ＦＶＩＩＩ阻害抗体及びＤ－ダイマーレベルを評価した。
[0248]ｈＦＶＩＩＩ抗原のデータを図９に示す。平均ｈＦＶＩＩＩ抗原レベルは、約２～３週間でピークに達し、１５０ｎｇ／ｍｌを正常ｈＦＶＩＩＩ抗原レベル１００％として用いて、低用量コホートでは２２．３±６．２％のｈＦＶＩＩＩが見られ、中及び高用量コホートではそれぞれ６１．６±１５．７％及び１５３±５８．１％が観察された（図９Ａ～９Ｄ）。したがって、ＬＫ０３ ＡＡＶカプシド血清型は、マウス肝臓とは異なり、ｉｎ ｖｉｖｏでＮＨＰ肝細胞に効率的に形質導入される。
[0249]ＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３カプシド）で達成されたＦＶＩＩＩの発現レベルを、ＦＶＩＩＩの送達用のＡＡＶ５及びＡＡＶ８カプシドに基づくＡＡＶベクターで達成されたＦＶＩＩＩの報告レベルと比較した。比較により、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３カプシド）で達したＦＶＩＩＩのレベルが、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８カプシドを有するＡＡＶベクターにより送達されたＦＶＩＩＩの報告レベルよりも大きかったことが明らかとなった（図１０）。
[0250]ＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３カプシド）を２×１０１２、６×１０１２又は２×１０１３ｖｇ／ｋｇのいずれか投与した後に、カニクイザルの血漿中のｈＦＶＩＩＩに対する液性応答を測定した。動物を抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧ抗体についてベースライン及び表示の時点でＥＬＩＳＡにより評価した。
[0251]遺伝子導入のすぐ後に観察された治療的ｈＦＶＩＩＩレベルにかかわらず、大部分の動物においてレベルは約４週間で減少し始めた。これは、別のＡＡＶ－ｈＦＶＩＩＩベクターを使用した以前の試験と矛盾せず、抗ｈＦＶＩＩＩ抗体の増加と相関した。他の人々も、ＮＨＰの肝臓にＡＡＶ－ｈＦＶＩＩＩを遺伝子導入後に抗ＦＶＩＩＩ抗体の生成を観察した（ＭｃＩｎｔｏｓｈ、Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ １２１：３３３５～４４（２０１３））。
実施例５
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＡＡＶ－ＬＫ０３カプシドの生体内分布
[0252]非ＧＬＰ試験で非ヒト霊長類におけるＡＡＶ－ＬＫ０３カプシドの生体内分布を検討した。ヒト第ＩＸ凝固因子をコードするＡＡＶ－ＬＫ０３－カプシド封入ベクター（ＡＡＶ－ＬＫ０３－ｈＦＩＸ）の静脈内投与は、２つの主要標的組織が肝臓及び脾臓であることを示した（図１１）。脾臓向性は、ＡＡＶ－ＬＫ０３の独特な特徴ではない。例えば、いくつかの肝臓指向性遺伝子療法治験（例えばＮＣＴ０２３９６３４２、ＮＣＴ０２０８２８６０、ＮＣＴ０２５７６７９５）で使用され、強力な安全性記録を作ったＡＡＶ５カプシドは、非ヒト霊長類の肝臓を標的化するよりも高くないにしても同じ有効性で脾臓を標的化する（Ｐａｎｅｄａら、２０１３）。ＳＰＫ－８０１１発現カセットは、肝臓特異的と考えられるマウストランスサイレチン又はＴＴＲプロモーターを使用している（Ｃｏｓｔａ、１９９１）。プロモーターの肝臓特異性をさらに支援するために、ＰＣＲに基づく発現分析で、ＳＰＫ－８０１１と同じ発現カセットをパッケージングした別のＡＡＶベクター（すなわちＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５）の投与後にマウスの肝臓及び脾臓におけるベクター由来のＦＶＩＩＩ発現を測定した。図１２に示すように、脾臓におけるヒトＦＶＩＩＩの発現は、肝細胞由来の発現と比較して数桁小さい。
[0253]血友病Ｂ用のいくつか（ＮＣＴ０２３９６３４２、ＮＣＴ０１６２０８０１、ＮＣＴ０００７６５５７、ＮＣＴ０２４８４０９２、ＮＣＴ０２６１８９１５、ＮＣＴ００９７９２３８、ＮＣＴ０１６８７６０８）及び血友病Ａ用の１つ（ＮＣＴ０２５７６７９５）を含む他のＡＡＶベクターを使用した試験が行われてきたものの、これは、ＡＡＶ－ＬＫ０３を使用した最初の臨床試験である。ユニバーシティカレッジロンドンと共同でセントジュード小児研究病院（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）によって行われた試験は、コドン最適化ヒト第ＩＸ因子ｃＤＮＡをコードする自己相補的ゲノムを有するＡＡＶ８ベクターであるｓｃＡＡＶ２／８－ＬＰ１－ｈＦＩＸｃｏを利用した。ベクターの投与を受けた対象１０人は、中央値３．２年にわたり１～６％という安定な第ＩＸ因子レベルを有し、全ての参加者で、予防的因子補充の使用が中断又は減少した（Ｎａｔｈｗａｎｉら、２０１４）。血友病Ａのための臨床試験は、ヒトＦＶＩＩＩをコードするＡＡＶ５カプシド封入ベクター（ＮＣＴ０２５７６７９５）を使用した。２０１６年に発表された予備的データは、数人の対象において遺伝子導入後のＦＶＩＩＩ活性増加が、最大１６週間の経過観察で２～６０％の範囲であることを実証している。（ＢｉｏＭａｒｉｎ、２０１６年４月）
実施例６
ｉｎ ｖｉｔｒｏ設定で分析されたＡＡＶ－ＬＫ０３カプシドの形質導入効率
[0254]カニクイザル及びヒト起源の初代肝細胞にルシフェラーゼを発現しているＡＡＶ－ＬＫ０３ベクターを、ベクターゲノム５００～６２，５００個／細胞の範囲の４つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。形質導入の７２時間後に、ルシフェラーゼの発現を分析した。
[0255]ＡＡＶ－ＬＫ０３カプシドは、培養ヒト肝細胞の形質導入に有意に高い効率を独特に示した。図１３に示す代表例では、ＬＫ０３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ非ヒト霊長類肝細胞と比較してヒト肝細胞への形質導入に約５倍の効率を示した。重要なことに、これらの結果は、複数のＭＯＩ及び反復試験にわたり一致する。
実施例７
ベクターをコードする配列の生殖細胞系伝播の評価
[0256]ベクターがコードする配列の生殖細胞系伝播の潜在性の評価は、遺伝子導入戦略の臨床変換に重要である。以下を目標としてこの試験を計画した：（１）精液へのＡＡＶ－ＳＰＫとＡＡＶ－ＬＫ０３との播種を検討するため及びベクターの消失動態を判定するため；並びに（２）ウサギへのＡＡＶ投与が成功したことを保証するため（これは、血漿中のヒト第ＩＸ因子抗原及び抗ＦＩＸ抗体の分析によって確認された）。
[0257]この試験において、精液への２種のベクターカプシド、すなわちＡＡＶ－ＳＰＫ及びＡＡＶ－ＬＫ０３のベクターの播種を分析するためにウサギモデルを使用した（表２）。精液へのＡＡＶ－ＳＰＫの播種は、用量依存的動態及び時間依存的動態の両方を示し、より高い用量が精液中でより高いレベルのベクター配列をより長い時間示した。動態は、ＡＡＶ８ベクターで以前に見られたものと非常に類似していた（Ｆａｖａｒｏ Ｐら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：１０２２～１０３０（２００９））。対照的に、ＡＡＶ－ＬＫ０３ベクターでは精液への播種が限られていた。ＡＡＶ－ＬＫ０３から発現したｈＦＩＸのレベルがＡＡＶ－ＳＰＫベクターで見られたレベルと類似している又はより高く、肝臓由来のｈＦＩＸ発現を媒介する能力を遺伝子導入の代替指標として使うことができるので、この原因が、ＡＡＶ－ＬＫ０３を注射されたマウスにおいて全般的ベクター曝露がより低いからだというのは、ありそうにない。
Figure 2022137029000003
方法
[0258]動物及びベクター：ニュージーランドホワイト種ウサギをＣｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｄｅｎｖｅｒ、ＰＡ）から入手し、６月齢のとき、フィラデルフィア小児病院ベクターコアで産生されたＡＡＶベクターで処置した。試験品及び対照品を辺縁耳静脈経由で投与した。
[0259]精液の収集：Ａｒｇｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ）の研究者が開発した人工膣（ＡＶ）を精液収集のために使用した。ＡＶにコンドームを内張りし、その先端を除去し、収集チューブを繋ぎ、ＡＶに温水（５５℃）を満たした。試情雌シカによって刺激された熟練の雄シカから精液試料を得た。注射前並びに注射の１、２、４、６、８、及び１０週間後及び３～８ヶ月後に試料を収集した。検証済みリアルタイム定量ＰＣＲアッセイを使用するベクターコピー数分析のために精液試料をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｅｎｏ、ＮＶ）に発送した。
[0260]血液試料の収集：ＡＡＶ投与前及び複数の時点（注射前、注射の１週間及び１～６ヶ月後）に内側耳介動脈又は辺縁耳静脈穿刺によって血液を収集した。収集後、各試料を氷上に置き、血漿に加工し、試験委託者に発送するまで－８０℃の冷凍庫で保存し、試験委託者のところでも、アッセイを行うまで試料を－８０℃の冷凍庫で保存した。
[0261]ヒト第ＩＸ因子のレベル：サンドイッチ形式ＦＩＸ ＥＬＩＳＡキット（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＦＩＸ：ＥＩＡ）を以下のように使用してウサギ血漿中のヒトＦＩＸ（ｈＦＩＸ）タンパク質のレベルを定量した：最初に、マイクロタイタープレートのウェルを、ｈＦＩＸを認識し内因性ウサギＦＩＸ（１：１０００希釈）と交差反応しない捕捉抗体で被覆した。ヒトｈＦＩＸ濃度が既知の参照血漿を希釈して標準曲線を作成した（最高標準［５００ｎｇ／ｍｌ］を７．８ｎｇ／ｍｌまで系列希釈した）。予想される濃度に応じて試料血漿を希釈することにより、吸光度の値が標準曲線の範囲に収まるようにした。ウェルに試料を添加後、プレートを室温で９０分間インキュベートし、次に３回洗浄した。ｈＦＩＸに対するホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合二次抗体をプレートに添加して、捕捉後のＦＩＸ（１：１００希釈）と結合させた。プレートを洗浄して未結合の複合抗体を除去した後、１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３４０２８）と共にインキュベートしてからペルオキシダーゼ活性を測定した。１Ｍ硫酸で反応を停止させ、吸光度の設定４５０ｎｍでＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２ｅマイクロプレートリーダーを用いて読み取った。得られた吸光度の値は、試料中に存在するｈＦＩＸの濃度と比例する。
[0262]抗ｈＦＩＸ抗体レベル：抗ｈＦＩＸアッセイは、概念的及び方法論的に上記ｈＦＩＸ ＥＬＩＳＡと類似である。手短に言えば、プレートに１μｇ／ｍｌ組換えｈＦＩＸ（Ｂｅｎｅｆｉｘ、Ｗｙｅｔｈ）を被覆した。血漿試料のインキュベーション後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ複合抗体（ＳＩＧＭＡ、Ａ４９１４）を検出のために使用する。ベースラインの読み取り値の２倍のＩｇＧレベルを有する試料を陽性と考えた。
結果
精液へのベクターの播種
[0263]ニュージーランド種ウサギに、ＡｐｏＥ／ｈＡＡＴ肝臓特異的プロモーターの制御下でｈＦＩＸを発現しているＡＡＶ－ＳＰＫ又はＡＡＶ－ＬＫ０３（ｎ＝５／群）ベクターを２つの用量：１×１０１２ｖｇ／ｋｇ（低用量）又は１×１０１３ｖｇ／ｋｇ（高用量）で注射した。注射前並びに注射の１、２、４、６、８、及び１０週間後及び３～８ヶ月後に全てのウサギからの精液試料を得た。精液試料からゲノムＤＮＡを精製し、ｈＦＩＸ配列の存在について定量ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ－ＰＣＲ）アッセイを使用して分析した。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｅｎｏ、ＮＶ）が検証済みアッセイを開発した。精液試料が定量下限（ＬＬＯＱ）（約２００ｎｇ／反応で１０コピー／反応又は５０コピー／μｇ）を上回る、検出可能なｈＦＩＸレベルを有したならば、その精液試料を陽性と考えた。少なくとも連続する３つの時点でｈＦＩＸベクター配列が陰性であったウサギからの精液試料は、それ以上分析しなかった。
[0264]ベクターを注射された動物及びビヒクルを注射された動物全てからの処置前精液ＤＮＡは、ｈＦＩＸ配列陰性であった。低用量のＡＡＶ－ＳＰＫ－ｈＦＩＸ（１×１０１２ｖｇ／ｋｇ）を注射されたウサギからの精液は、１～４週間目に低レベルを有した動物３匹（最大３１５１コピー／μｇ ＤＮＡ又は約１×１０－２コピー／ハプロイドゲノム）を除き一般的にｈＦＩＸ配列陰性であった、４週間よりも後に収集された試料はどれもベクター配列陽性ではなかった（表３）。高用量のＡＡＶ－ＳＰＫ－ｈＦＩＸ（１×１０１３ｖｇ／ｋｇ）で、より高いレベルのベクターが存在し（最大１７８，３５２コピー／μｇ ＤＮＡ又は０．５９コピー／ハプロイドゲノム）、動物５匹の中で、より長い時間、最大５ヶ月が消失にかかった（表３）。動物１匹（１週間目）を除き、低用量のＡＡＶ－ＬＫ０３－ｈＦＩＸで処置されたウサギは、精液へのｈＦＩＸ配列の播種を示さなかった（表３）。加えて、１０倍の用量で精液への非常に少ないベクター播種が観察され、動物３匹は全ての時点でｈＦＩＸ配列を全く欠如しており、動物２匹は２週間目で低レベルを示した（最大：３９２コピー／μｇ ＤＮＡ又は１．３×１０－３コピー／ハプロイドゲノム）が、その後の時点では示さなかった（表３）。ビヒクルを注射された動物２匹のうち、１匹は、１週間目（５６コピー／μｇ ＤＮＡ）及び５ヶ月目（９６コピー／μｇ ＤＮＡ）に偽性の所見を有した。これらの値はＬＬＯＱに近く、精液収集又はＤＮＡ調製ステップでの汚染を表している可能性が最も高い。
Figure 2022137029000004
血漿中ヒトＦＩＸ抗原レベル
[0265]上記動物からの血漿試料中の循環ｈＦＩＸレベルを表示の時点で測定した（図１４Ａ～１４Ｂ及び表４）。
Figure 2022137029000005
[0266]低用量コホートでは、循環ｈＦＩＸレベルによって測定したとき、ＡＡＶ－ＳＰＫと比べてＡＡＶ－ＬＫ０３ベクターの方が強力なベクターであるように見えた。ＡＡＶ－ＬＫ０３又はＡＡＶ－ＳＰＫを用いた処置の６ヶ月後に、平均ｈＦＩＸレベルは、それぞれ５５２±２１７ｎｇ／ｍｌ対１６４±４５ｎｇ／ｍｌであった（図１４Ａ）。しかし、おそらく動物の数が限られていたために、この差は統計的有意性に達しなかった。興味深いことに、ＡＡＶ－ＳＰＫベクターを投与した７日後にｈＦＩＸの発現は検出されなかったが、一方で同じ時点でＡＡＶ－ＬＫ０３から強い発現が観察された。動物のうちの２匹（ウサギ＃５及び＃１５）において、バックグラウンドをかろうじて超えて検出可能であった低いｈＦＩＸレベルは、注射の失敗に起因すると考えられ得る。これらの動物を解析から排除しても統計的有意性の欠如は変わらなかった。
[0267]２種のカプシドは、高用量で試験したときに等しい効力であるように見えた。詳細には、１×１０１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＬＫ０３又はＡＡＶ－ＳＰＫを用いた処置の６ヶ月後に、平均ｈＦＩＸレベルは、それぞれ２２２６±８６８ｎｇ／ｍｌ対２０５２±９０９ｎｇ／ｍｌであった（図１４Ｂ）。注目すべきは、ＡＡＶ－ＳＰＫ群では２つの異なるｈＦＩＸコード配列が使用された。すなわち、動物３匹がＡＡＶ－ＳＰＫ－ｈＦＩＸ．Ｃ１６の投与を受け、動物２匹がＡＡＶ－ＳＰＫ－ｈＦＩＸ．Ｃ１９－Ｐａｄｕａ（ＰＤ）で処置された。ｈＦＩＸ．Ｃ１６導入遺伝子とｈＦＩＸ．Ｃ１９－ＰＤ導入遺伝子との間の主な差異は、後者がコドン最適化されており、高い比活性のｈＦＩＸ変種をコードすることであり、この変種は、タンパク質の生物学的活性に影響するがＥＬＩＳＡによって測定される抗原レベルに影響しない。
抗ＦＩＸ抗体
[0268]他の人々による報告に基づき、約２０～４０％の動物がヒトＦＩＸベクターに対する抗体を発生すると予期された（Ｆａｖａｒｏ Ｐら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：１０２２～１０３０（２００９））。図１５Ａ～１５Ｂ並びに表５Ａ及び５Ｂにこの試験における抗ＡＡＶ ＩｇＧレベルをまとめる。興味深いことに、低用量のＡＡＶ－ＬＫ０３で処置された動物５匹のうちの３匹が、ベクター投与の１ヶ月後にヒトＦＩＸ抗体陽性であったが、ＩｇＧレベルは時間と共に減少し、動物１匹だけが試験の終わりにかろうじてベースラインレベルの２倍であった（表５Ｂ）。この群のウサギにおける抗ＦＩＸ ＩｇＧの出現及び将来的な消失の動態は、２８日目に観察されたｈＦＩＸレベルの激しい減少とよく相関しており、それに、循環ｈＦＩＸの「リバウンド」が続いた（図１４Ａ）。また、ＡＡＶ－ＳＰＫ－ｈＦＩＸ．Ｃ１９－Ｐａｄｕａで処置された動物２匹におけるｈＦＩＸに対する高い抗体力価は、これらのウサギ２匹における低い発現レベルを説明している可能性がある。
Figure 2022137029000006
Figure 2022137029000007
結論
[0269]精液へのＡＡＶ－ＳＰＫ及びＡＡＶ－ＬＫ０３ベクターの播種を、最大８ヶ月にわたる検証済みアッセイを用いて定量した。高いベクター用量の投与から１週間後に全部で５匹のウサギの精液からＡＡＶ－ＳＰＫベクター配列を検出した。１０週間目までに大部分の動物から配列は消失し、最後に検出された陽性試料が発生したのは５ヶ月目であった。これは、同じベクター用量でウサギに投与されたＡＡＶ８ベクターの時間経過と類似している（Ｆａｖａｒｏ Ｐら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：１０２２～１０３０（２００９））。対照的に、高用量のＡＡＶ－ＬＫ０３の後に、このベクターの非常に限られた分布が観察され、５匹の動物のうちの３匹はどの時点でも精液中にベクター配列を示さなかった。ウサギにおけるＡＡＶ－ＬＫ０３の全般的曝露がより低いために、精液へのベクターの播種がより低いというのは、ありそうになかった。ウサギに各ＡＡＶベクターがうまく注射されたという確認は、遺伝子導入についての代替指標であるｈＦＩＸの血漿レベルを測定することによって実証された。この試験における高用量（１×１０１３ｖｇ／ｋｇ）で、ＡＡＶ－ＬＫ０３及びＡＡＶ－ＳＰＫを注射された動物においてｈＦＩＸの類似の循環レベルが観察されたが、これは、これらのベクターが肝臓遺伝子導入を仲介するのに等しい効力であることを実証している。
[0270]ｈＦＩＸ導入遺伝子を発現しているＡＡＶ２及びＡＡＶ８ベクターの生殖細胞系伝播を検討する試験と一致して、動物のうち何匹かは、おそらくウサギとヒト第ＩＸ因子との間のアミノ酸の相違のために、抗ｈＦＩＸ抗体を発生する。
[0271]これらの結果は、ＡＡＶベクターの生殖細胞系伝播の潜在性に関する現在のデータ本体に追加するものである。ＡＡＶ－ＳＰＫは、以前に研究された血清型であるＡＡＶ２及びＡＡＶ８ベクターと類似のパターンを有する（Ｆａｖａｒｏ Ｐら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：１０２２～１０３０（２００９））。言い換えれば、精液へのＡＡＶベクター配列の用量依存性播種があり、この播種は時間と共に完全に消失する。しかし、ＡＡＶ－ＬＫ０３は、非常に少ないベクターが精液に分布する点でＡＡＶ２、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ－ＳＰＫと異なり、このベクターカプシドを遺伝毒性に関して他のカプシドよりも潜在的に安全にしている。
実施例８
ＡＡＶ－ＦＶＩＩＩの単回ＩＶ注入の安全性及び動態を決定するために臨床試験を行う。ＡＡＶベクターのために使用されるＡＡＶカプシドは、良好な安全性及び有効性、任意選択でベクター注入の１～３ヶ月後に用量約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ以上で臨床的に意味のあるＦＶＩＩＩ活性レベルを達成する能力、並びにＡＡＶ８よりも約１０％低いＡＡＶカプシドに対する交差反応性中和抗体（Ａｂ）の保有率を有したことが前臨床試験で示されている。代表的な臨床試験の計画は、表６に示す通りであり得る。
Figure 2022137029000008
Figure 2022137029000009
実施例９
ＴＴＲプロモーター
[0272]トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターの特徴付けは、当初、Ｃｏｓｔａ及びＧｒａｙｓｏｎ １９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９（１５）：４１３９～４１４５に記載された。ＴＴＲプロモーター配列は、ＴＡＴＴＴＧＴＧＴＡＧからＴＡＴＴＧＡＣＴＴＡＧに改変された配列であった。
４つのヌクレオチド変異を有するＴＴＲプロモーター（ＴＴＲｍｕｔ）、配列番号２２
GTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCTAGGCAAGGTTCATATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCT
実施例１０
導入遺伝子構築物及び例示的なＡＡＶカプシドをコードするＣｐＧ減少ＦＶＩＩＩ
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種Ｘ０１（配列番号１）
atgcagattg agctgtctac ctgcttcttc ctgtgcctgctgaggttctg cttctctgct
accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctgggattacatgca gtctgacctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggtttccc cccagggtgcccaagagctt ccccttcaat
acctctgtgg tgtataagaa gaccctgttt gtggagttcactgatcatct gttcaacatt
gctaaaccca ggcccccctg gatggggctg ctgggccctaccatccaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tgatcactct gaagaacatg gctagccatcctgtgtctct gcatgctgtg
ggggtgagct actggaaggc ttctgagggg gctgagtatgatgatcagac tagccagagg
gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggctctcacacctatgtctg gcaggtgctg
aaggagaatg gccccatggc ctctgatcct ctgtgtctgacctatagcta cctgagccat
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggccctgctggt gtgtagggag
gggagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagttcattctgct gtttgctgtg
tttgatgagg gcaagagctg gcattctgaa accaagaacagcctgatgca ggacagggat
gctgcctctg ctagggcctg gcccaagatg cacactgtgaatgggtatgt caataggtct
ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tgggatgggc
accacccctg aggtgcacag catctttctg gagggccacaccttcctggt gaggaatcac
agacaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctgactgcccagac cctgctgatg
gacctgggcc agtttctgct gttctgccac atctctagccaccagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggactc ctgccctgag gagccccagctgaggatgaa gaataatgag
gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgagatggatgtggt gagatttgat
gatgacaatt ctcccagctt cattcagatc aggtctgtggccaagaagca tcccaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gactgggactatgcccccct ggtgctggcc
cctgatgaca ggagctataa gagccagtac ctgaataatggcccccagag gattgggagg
aagtataaga aggtgaggtt catggcctat actgatgaaaccttcaagac cagagaggcc
atccagcatg agtctgggat cctggggccc ctgctgtatggggaggtggg ggacaccctg
ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccctacaacatctaccctca tggcatcact
gatgtgaggc ctctgtacag cagaaggctg cccaagggggtgaagcatct gaaggacttc
cccattctgc ctggggagat tttcaagtac aagtggactgtgactgtgga ggatggccca
accaagtctg accctaggtg cctgactagg tactacagcagctttgtgaa tatggagagg
gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgctacaaggagtc tgtggatcag
aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttctctgt gtttgatgag
aacaggagct ggtacctgac tgagaacatt cagaggtttctgcccaaccc tgctggggtg
cagctggagg accctgaatt ccaggcctct aacatcatgcacagcattaa tggctatgtg
tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctactggta cattctgagc
attggggccc agactgactt cctgtctgtg ttcttctctggctacacctt taagcacaag
atggtgtatg aggataccct gaccctgttt cctttctctggggagactgt gttcatgagc
atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgccacaactctgacttcag gaacaggggg
atgactgctc tgctgaaggt gagcagctgt gataagaacactggggacta ctatgaggac
agctatgagg acatctctgc ctatctgctg agcaagaataatgctattga gcccaggagc
ttctctcaga acccccctgt gctgaagagg caccagagggagatcaccag aactactctg
cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gacaccatctctgtggagat gaagaaggag
gattttgata tttatgatga ggatgaaaac cagagccccaggagctttca gaagaagact
aggcactatt tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgtc ttctagcccc
catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc tctgtgccccagttcaagaa ggtggtgttc
caggagttca ctgatggcag cttcactcag cccctgtacaggggggagct gaatgagcac
ctggggctgc tgggccctta tatcagggct gaggtggaggataacatcat ggtgaccttc
aggaaccagg ccagcaggcc ctacagcttc tactctagcctgatcagcta tgaggaggac
cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagcccaatgagac caagacttat
ttctggaagg tgcagcacca tatggccccc accaaggatgagtttgattg caaagcctgg
gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcactctgggctgat tggccccctg
ctggtgtgcc acaccaacac tctgaaccct gcccatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag actaagagctggtacttcac tgagaacatg
gagaggaact gcagggcccc ctgcaatatc cagatggaggaccccacctt taaggaaaat
tataggtttc atgccattaa tggctacatc atggacaccctgcctggcct ggtgatggcc
caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatgggcagcaatgagaa cattcacagc
atccacttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggccctg
tataatctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgctgcccagcaa ggctggcatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctggcatgagcac cctgttcctg
gtgtattcta acaagtgtca gacccccctg ggcatggcctctggccatat cagggacttc
cagatcactg cctctggcca gtatgggcag tgggcccccaagctggccag gctgcattac
tctggcagca tcaatgcctg gagcaccaag gagccattcagctggattaa ggtggacctg
ctggctccaa tgattatcca tggcatcaag acccagggggccaggcagaa gtttagcagc
ctgtacatct ctcagtttat catcatgtac tctctggatggcaaaaagtg gcagacctac
aggggcaatt ctactggcac tctgatggtg ttctttggcaatgtggacag ctctgggatc
aagcacaaca tctttaaccc ccctatcatt gccaggtacattaggctgca ccccacccat
tacagcatca ggagcaccct gaggatggag ctgatgggctgtgatctgaa cagctgcagc
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ttcaccaata tgtttgccac ctggagcccc agcaaggccaggctgcacct gcagggcagg
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aagaccatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtgaagagcctgct gactagcatg
tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatggccatcagtggac cctgttcttc
cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aatcaggacagcttcacccc tgtggtgaac
agcctggacc cccccctgct gaccagatac ctgaggatccacccccagag ctgggtgcat
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggg tgtgaggcccaggacctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種Ｘ０２（配列番号２）
atgcagattg agctgtctac ctgctttttc ctgtgtctgctgaggttctg cttctctgcc
actaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgtcttgggattacatgca gtctgatctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggtttcct cccagggtgcccaagtcttt ccccttcaat
acctctgtgg tgtataagaa gaccctgttt gtggagtttactgatcacct gttcaacatt
gccaagccca ggcccccttg gatgggcctg ctggggcccaccatccaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tgatcaccct gaagaacatg gcctctcaccctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgaccagac cagccagagg
gagaaggagg atgataaggt gttccctggg gggagccacacttatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg gcccaatggc ctctgatccc ctgtgcctgacctattctta cctgagccat
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
ggctctctgg ctaaggagaa gacccagacc ctgcacaagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg ggaagagctg gcactctgag accaagaacagcctgatgca ggacagggat
gctgcctctg ccagggcctg gcccaaaatg cacactgtgaatggctatgt gaataggagc
ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtattggcatgtgat tggcatgggc
accacccctg aggtgcactc tatcttcctg gagggccatactttcctggt gaggaatcat
aggcaggcca gcctggagat tagccccatt acctttctgactgcccagac cctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttttgccac atcagctctcaccagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggatag ctgccctgag gagccccagctgaggatgaa gaacaatgag
gaggctgagg attatgatga tgatctgact gattctgaaatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaata gcccctcttt catccagatc aggtctgtggccaagaagca tcctaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gactgggactatgctcccct ggtgctggcc
cctgatgaca ggtcttacaa gagccagtac ctgaacaatggcccccagag aattgggagg
aagtataaga aggtgagatt catggcttac actgatgagaccttcaagac tagggaggcc
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ctgatcatct tcaagaacca ggcctctagg ccctacaatatttaccccca tgggatcact
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cccatcctgc ctggggagat cttcaagtat aagtggactgtgactgtgga agatggcccc
accaagtctg accctaggtg cctgaccagg tactactcttcttttgtgaa catggagagg
gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgctacaaggagtc tgtggaccag
agggggaacc agattatgtc tgacaagagg aatgtgattctgttctctgt gtttgatgag
aacaggagct ggtatctgac tgagaacatc cagaggttcctgcccaatcc tgctggggtg
cagctggagg accctgagtt ccaggccagc aacatcatgcacagcatcaa tgggtatgtg
tttgattctc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctactggta catcctgagc
attggggctc agactgattt cctgtctgtg ttcttttctggctacacctt taagcataag
atggtgtatg aggacactct gaccctgttt cccttctctggggagactgt gtttatgagc
atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgccacaactctgatttcag gaacaggggc
atgactgctc tgctgaaggt gtcttcttgt gacaagaacactggggacta ttatgaggac
agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaacaatgctattga gcccagatct
ttcagccaga acccccctgt gctgaagagg caccagagggagatcactag gaccaccctg
cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gacactatctctgtggagat gaagaaggag
gactttgata tctatgatga ggatgagaac cagtctcccaggagcttcca gaaaaagacc
aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgtc ttctagcccc
catgtgctga ggaacagggc ccagtctggg tctgtgccccagttcaagaa ggtggtgttc
caggagttca ctgatgggag cttcacccag cctctgtacaggggggagct gaatgagcac
ctggggctgc tgggccctta tattagggct gaggtggaggacaacatcat ggtgactttc
aggaatcagg cctctaggcc ctatagcttc tacagctctctgatcagcta tgaggaggat
cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagcccaatgagac caagacctac
ttctggaagg tgcagcacca catggctcct accaaggatgagtttgactg caaggcctgg
gcctactttt ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcactctggcctgat tggccccctg
ctggtgtgtc ataccaacac cctgaaccct gcccatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag accaagagctggtactttac tgagaacatg
gagaggaatt gcagagcccc ttgcaacatc cagatggaggacccaacctt caaagagaac
tacaggttcc atgccatcaa tgggtacatc atggacaccctgcctggcct ggtgatggct
caggaccaga ggatcaggtg gtatctgctg agcatgggcagcaatgagaa tatccatagc
attcacttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggccctg
tataacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgctgccaagcaa ggctgggatt
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctggcatgtctac cctgttcctg
gtgtactcca ataagtgcca gacccccctg ggcatggcctctggccacat cagggacttc
cagatcactg cctctggcca gtatgggcag tgggccccaaagctggccag gctgcactat
tctgggagca tcaatgcttg gagcaccaag gagcctttcagctggattaa ggtggatctg
ctggccccca tgatcattca tggcatcaaa acccagggggctagacagaa gttttctagc
ctgtacatca gccagttcat catcatgtac agcctggatggcaagaagtg gcagacttac
aggggcaata gcactggcac cctgatggtg ttttttggcaatgtggacag ctctggcatc
aagcacaaca tctttaaccc ccccattatt gccaggtatatcaggctgca tcccacccac
tattctatta ggtctactct gagaatggag ctgatgggctgtgacctgaa cagctgtagc
atgcccctgg ggatggagag caaggctatc tctgatgcccagatcactgc cagctcttat
ttcaccaata tgtttgccac ctggtctccc tctaaggccaggctgcacct gcagggcagg
agcaatgctt ggaggcccca ggtgaataac cccaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aagaccatga aggtgactgg ggtgactacc cagggggtgaagtctctgct gactagcatg
tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatgggcatcagtggac tctgttcttc
cagaatggca aggtgaaggt cttccagggg aaccaggatagcttcactcc tgtggtgaac
tctctggacc cccccctgct gactaggtat ctgaggatccacccccagag ctgggtgcac
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggacctgta ttga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種Ｘ０３（配列番号３）
atgcagattg aactgtctac ttgtttcttc ctgtgcctgctgaggttttg cttctctgct
actaggaggt actatctggg ggctgtggag ctgtcttgggactatatgca gtctgacctg
ggggagctgc ctgtggatgc taggtttccc cccagggtgcccaagagctt cccctttaac
acctctgtgg tgtataagaa gactctgttt gtggagttcactgaccatct gttcaacatt
gccaagccaa ggcccccctg gatgggcctg ctgggccccaccatccaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tgattactct gaagaacatg gccagccatcctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgtctt actggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgaccagac ctctcagagg
gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggctctcatacctatgtgtg gcaggtcctg
aaggagaatg ggcccatggc ctctgacccc ctgtgcctgacctactctta tctgtctcat
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
ggcagcctgg ctaaggagaa gacccagact ctgcacaagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg gcaagagctg gcactctgag accaagaacagcctgatgca ggacagggat
gctgcctctg ctagggcctg gcccaagatg cacactgtgaatgggtatgt gaacaggagc
ctgccaggcc tgattggctg ccataggaag tctgtgtattggcatgtgat tgggatgggg
actacccctg aggtccacag cattttcctg gaggggcatacctttctggt gaggaaccac
aggcaggcct ctctggagat ctctcccatt actttcctgactgcccagac cctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagcagccaccagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggatag ctgccctgag gagccccagctgaggatgaa aaacaatgag
gaggctgagg attatgatga tgacctgact gattctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgataaca gccccagctt catccagatt aggtctgtggccaagaagca tcccaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggactatgctcctct ggtgctggcc
cctgatgaca ggagctacaa gagccagtac ctgaataatggcccccagag gattggcagg
aagtataaga aggtgaggtt catggcctac actgatgagacctttaagac cagggaggcc
atccagcatg aatctgggat cctgggcccc ctgctgtatggggaggtggg ggacaccctg
ctgattatct ttaagaacca ggctagcagg ccctacaacatttaccccca tggcattact
gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cccaagggggtgaagcacct gaaggatttc
cccattctgc ctggggagat ctttaagtac aaatggactgtgactgtgga ggatggccct
actaagtctg atcccaggtg tctgaccaga tactacagcagctttgtgaa tatggagagg
gacctggctt ctggcctgat tggccccctg ctgatctgctacaaggagtc tgtggaccag
aggggcaatc agattatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttctctgt gtttgatgag
aacagaagct ggtacctgac tgagaacatc cagaggttcctgcccaaccc tgctggggtg
cagctggagg accctgagtt ccaggctagc aatatcatgcacagcattaa tggctatgtg
tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctattggta cattctgagc
attggggccc agactgattt cctgtctgtg ttcttttctggctacacctt caagcacaag
atggtgtatg aggatactct gaccctgttt cccttctctggggagactgt gttcatgagc
atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgtcacaactctgacttcag gaacaggggc
atgactgccc tgctgaaggt gagctcttgt gataagaacactggggacta ctatgaggac
tcttatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaacaatgctattga gcccaggagc
ttctctcaga atccccctgt gctgaagagg catcagagggagatcactag gactaccctg
cagtctgacc aggaagagat tgactatgat gacaccatctctgtggaaat gaagaaggag
gactttgata tctatgatga ggatgaaaac cagagccccaggagcttcca gaagaagacc
aggcattact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatgggatgag ctcttctccc
catgtgctga ggaatagggc tcagtctggc tctgtcccacagttcaagaa ggtggtgttt
caggagttca ctgatggcag cttcactcag cccctgtacaggggggagct gaatgagcat
ctgggcctgc tggggcccta catcagggct gaggtggaggataacattat ggtgactttc
aggaaccagg cctctaggcc ctacagcttc tacagcagcctgatcagcta tgaggaggac
cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagcccaatgagac taagacctat
ttctggaagg tgcagcatca catggctccc actaaagatgagtttgactg caaggcctgg
gcctacttct ctgatgtgga tctggagaag gatgtgcattctgggctgat tggccctctg
ctggtctgcc atactaacac cctgaatcct gcccatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tctttaccat ctttgatgag accaagtcttggtacttcac tgagaacatg
gagaggaact gcagggcccc ctgtaacatc cagatggaggaccccacctt taaggagaac
tacaggttcc atgccatcaa tggctacatc atggacactctgcctggcct ggtgatggcc
caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg tctatgggctctaatgagaa cattcattct
atccacttct ctggccatgt gtttactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggccctg
tacaatctgt accctggggt gtttgaaact gtggagatgctgccctctaa ggctggcatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggaacac ctgcatgctggcatgagcac cctgttcctg
gtctatagca ataagtgcca gacccccctg gggatggcctctgggcatat cagagacttc
cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggcccccaagctggccag gctgcactac
tctggcagca ttaatgcctg gagcaccaag gagcccttctcttggatcaa ggtggacctg
ctggctccca tgatcatcca tgggatcaag acccagggggccaggcagaa gttcagcagc
ctgtacatct ctcagttcat catcatgtac tctctggatggcaagaagtg gcagacctac
aggggcaata gcactgggac cctgatggtg ttctttgggaatgtggacag ctctggcatc
aagcacaata tcttcaaccc ccccatcatt gccaggtacatcagactgca ccccactcat
tacagcatca ggagcactct gaggatggag ctgatgggctgtgacctgaa tagctgctct
atgcccctgg gcatggagag caaggccatt tctgatgcccagattactgc ctcttcttac
ttcactaata tgtttgccac ctggagcccc agcaaggccaggctgcatct gcaggggagg
agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aagactatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtgaagagcctgct gaccagcatg
tatgtgaagg agttcctgat ctcttctagc caggatgggcaccagtggac cctgtttttc
cagaatggga aggtgaaggt gtttcagggc aatcaggacagctttactcc tgtggtgaac
agcctggacc cccccctgct gactaggtac ctgaggattcacccccagag ctgggtgcac
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggatctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種Ｘ０４（配列番号４）
atgcagattg agctgtctac ctgcttcttt ctgtgcctgctgaggttctg tttctctgcc
actaggaggt attatctggg ggctgtggag ctgtcctgggactacatgca gtctgatctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggttccct cccagggtgcccaagtcttt ccctttcaat
acctctgtgg tgtacaagaa gactctgttt gtggagtttactgatcacct gtttaacatt
gccaagccca ggcccccctg gatggggctg ctgggccccaccatccaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tgattactct gaagaatatg gcttctcaccctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgaccagac cagccagagg
gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccacacttatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg gcccaatggc ctctgacccc ctgtgcctgacctacagcta tctgagccat
gtggatctgg tgaaggatct gaactctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
ggctctctgg ccaaggagaa gactcagact ctgcacaagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg gcaagagctg gcactctgag accaagaactctctgatgca ggatagggat
gctgcttctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtgaatgggtatgt gaataggagc
ctgcctgggc tgattgggtg tcacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tggcatgggc
accactcctg aggtgcacag catctttctg gagggccacacttttctggt gaggaatcac
aggcaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctgactgcccagac cctgctgatg
gatctgggcc agttcctgct gttttgccat atcagcagccatcagcatga tgggatggag
gcttatgtga aggtggactc ttgccctgag gagcctcagctgaggatgaa gaataatgaa
gaggctgagg actatgatga tgatctgact gactctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaaca gccccagctt tatccagatt aggtctgtggccaagaagca ccccaagacc
tgggtgcatt acattgctgc tgaggaagag gattgggactatgcccccct ggtgctggcc
cctgatgaca ggagctacaa gtctcagtac ctgaacaatggccctcagag gattggcagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcttac actgatgagaccttcaagac cagggaggcc
attcagcatg aatctgggat cctgggcccc ctgctgtatggggaggtggg ggacaccctg
ctgattattt tcaagaacca ggccagcagg ccctacaacatttatcctca tggcattact
gatgtgagac ccctgtacag caggaggctg cctaagggggtgaagcacct gaaggacttc
cccatcctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactgtgactgtgga ggatggcccc
actaagtctg accccaggtg cctgactagg tactactccagctttgtgaa catggagagg
gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgctacaaggagtc tgtggatcag
aggggcaacc agatcatgtc tgacaagaga aatgtgatcctgttctctgt gtttgatgag
aataggtctt ggtacctgac tgagaacatc cagaggtttctgcctaatcc tgctggggtg
cagctggagg atcctgagtt ccaggcctct aacattatgcacagcatcaa tgggtatgtg
tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctactggta catcctgagc
attggggccc agactgactt tctgtctgtg ttcttctctggctacacctt taagcataag
atggtgtatg aggacaccct gactctgttc cccttctctggggagactgt gttcatgagc
atggagaacc caggcctgtg gatcctgggc tgccacaactctgatttcag gaataggggc
atgactgccc tgctgaaggt gagcagctgt gataagaacactggggacta ttatgaggat
agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaacaatgccattga gcccaggagc
ttcagccaga atcctcctgt gctgaagagg caccagagggagatcaccag gaccaccctg
cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacactatctctgtggagat gaagaaggag
gactttgaca tctatgatga ggatgagaat cagagccccaggagcttcca gaagaagact
agacactact ttattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgag ctcttctccc
catgtgctga gaaacagggc ccagtctggc tctgtgccccagttcaagaa ggtggtcttc
caggagttca ctgatggctc tttcacccag cctctgtatagaggggagct gaatgagcac
ctgggcctgc tgggccctta catcagggct gaggtggaggacaatatcat ggtgaccttc
aggaaccagg ctagcaggcc ctactctttc tacagcagcctgatcagcta tgaggaggac
cagaggcagg gggctgagcc taggaagaat tttgtgaagcccaatgagac caagacctac
ttctggaagg tgcagcacca catggctccc actaaggatgagtttgactg caaggcctgg
gcctactttt ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcattctggcctgat tggccccctg
ctggtctgcc acaccaatac tctgaaccct gctcatgggagacaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag accaagtcctggtactttac tgagaacatg
gagaggaatt gcagggcccc ttgcaacatc cagatggaggaccccacctt caaggaaaat
tataggttcc atgccatcaa tggctacatc atggacaccctgcctggcct ggtgatggcc
caggaccaga ggatcaggtg gtatctgctg tctatgggctctaatgagaa catccacagc
atccatttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtataa gatggctctg
tacaacctgt accctggggt ctttgagact gtggagatgctgcccagcaa ggctggcatt
tggagggtgg agtgcctgat tggggaacac ctgcatgctgggatgagcac cctgttcctg
gtgtactcta acaagtgcca gaccccactg ggcatggcttctggccacat cagggatttc
cagattactg cctctggcca gtatggccag tgggctcccaagctggctag gctgcactac
tctgggagca tcaatgcctg gtctactaag gagcctttctcttggatcaa agtggacctg
ctggccccta tgatcatcca tgggatcaag actcagggggccaggcagaa gttcagcagc
ctgtacatct ctcagttcat cattatgtac agcctggatggcaagaagtg gcagacctac
aggggcaaca gcactggcac cctgatggtg ttctttgggaatgtggacag ctctgggatt
aagcacaaca tctttaaccc ccccatcatt gccaggtatatcaggctgca ccctacccac
tacagcatta ggagcaccct gaggatggag ctgatgggctgtgacctgaa cagctgcagc
atgcccctgg ggatggagag caaggccatt tctgatgctcagatcactgc ttctagctac
ttcactaaca tgtttgccac ctggtctccc agcaaggctagactgcacct gcaggggagg
agcaatgcct ggaggcccca ggtgaataat cccaaggagtggctgcaggt ggatttccag
aaaaccatga aggtgactgg ggtgactacc cagggggtgaagtctctgct gaccagcatg
tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatgggcatcagtggac cctgttcttt
cagaatggga aggtgaaggt gtttcagggc aatcaggacagcttcacccc tgtggtgaac
agcctggacc cccccctgct gaccaggtac ctgaggatccacccccagag ctgggtgcat
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggacctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種Ｘ０５（配列番号５）
atgcagattg agctgtctac ttgcttcttc ctgtgcctgctgaggttctg cttctctgcc
actaggaggt attacctggg ggctgtggag ctgagctgggactatatgca gtctgacctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggtttcct cccagggtgcctaagagctt ccccttcaac
acctctgtgg tgtacaagaa gactctgttt gtggagtttactgatcatct gttcaacatt
gccaagccca ggcctccttg gatggggctg ctgggccccaccatccaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tgattaccct gaagaatatg gccagccatcctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgagct attggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgatcagac tagccagagg
gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg gggagccatacctatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg gccccatggc ctctgaccct ctgtgcctgacttatagcta cctgagccat
gtggatctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
ggcagcctgg ccaaggagaa gactcagacc ctgcacaagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg ggaagtcctg gcactctgag actaagaacagcctgatgca ggatagggat
gctgcttctg ccagggcctg gcctaagatg cacactgtgaatggctatgt gaataggagc
ctgcctggcc tgattggctg ccataggaag tctgtgtactggcatgtgat tgggatgggc
accacccctg aggtgcactc tattttcctg gagggccatactttcctggt gaggaaccat
aggcaggcca gcctggagat cagccccatc actttcctgactgcccagac tctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagcagccatcagcatga tggcatggag
gcttatgtga aggtggacag ctgccctgag gagcctcagctgaggatgaa gaataatgag
gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaact ctccctcttt catccagatc aggtctgtggccaagaagca ccctaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggactatgcccccct ggtgctggcc
ccagatgaca ggagctacaa gtcccagtac ctgaacaatggcccccagag gattggcagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcttat actgatgagactttcaagac cagggaggcc
atccagcatg agtctggcat cctgggccct ctgctgtatggggaggtggg ggacaccctg
ctgattatct tcaagaacca ggcttctagg ccctacaatatctaccctca tggcatcact
gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cccaagggggtgaagcatct gaaggatttc
cccatcctgc ctggggagat ctttaagtat aagtggactgtgactgtgga ggatggcccc
actaagtctg accccaggtg cctgaccagg tattacagcagctttgtgaa catggagagg
gatctggctt ctgggctgat tggccccctg ctgatctgctacaaggagtc tgtggaccag
aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttctctgt gtttgatgag
aataggagct ggtacctgac tgagaacatc cagaggtttctgcccaatcc tgctggggtg
cagctggagg atcctgagtt tcaggcctct aatatcatgcacagcatcaa tggctatgtg
tttgactctc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctattggta catcctgagc
attggggccc agactgactt tctgtctgtg tttttttctggctacacctt caagcacaag
atggtgtatg aggatactct gactctgttc cctttttctggggagactgt gttcatgtct
atggagaacc ctgggctgtg gattctgggc tgccacaattctgacttcag gaacagaggc
atgactgctc tgctgaaggt gagcagctgt gacaagaacactggggacta ctatgaggac
tcttatgagg acatttctgc ctacctgctg agcaagaacaatgccattga gcccagaagc
ttttctcaga acccccctgt gctgaagagg caccagagggagatcaccag gaccaccctg
cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gatactatttctgtggagat gaagaaggag
gactttgaca tctatgatga ggatgagaac cagagccccaggtctttcca gaagaagact
aggcactact ttattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatgggatgtc tagctctcct
catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc tctgtgccccagtttaaaaa ggtggtgttc
caggaattca ctgatggcag ctttacccag cctctgtacaggggggagct gaatgagcac
ctggggctgc tggggcctta cattagggct gaggtggaggacaacatcat ggtgaccttc
aggaatcagg ccagcaggcc ctactctttc tacagcagcctgatctctta tgaggaggac
cagaggcagg gggctgaacc caggaagaac tttgtgaagcccaatgagac caagacctac
ttctggaagg tgcagcacca catggctccc accaaggatgagtttgattg caaggcctgg
gcttacttct ctgatgtgga tctggagaag gatgtgcactctgggctgat tggccccctg
ctggtgtgcc acaccaacac tctgaaccct gcccatggcagacaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tcttcactat ctttgatgag actaagagctggtacttcac tgagaacatg
gagaggaatt gcagggcccc ttgcaacatc cagatggaggaccccacctt taaggagaac
tacaggtttc atgccattaa tggctacatc atggacaccctgcctggcct ggtgatggcc
caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg tctatggggagcaatgagaa catccacagc
attcacttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggccctg
tacaacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgctgcccagcaa ggctgggatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctgggatgagcac cctgttcctg
gtgtatagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcctctggccacat cagagacttt
cagattactg cctctggcca gtatgggcag tgggcccccaagctggccag gctgcactat
tctggctcta ttaatgcctg gagcactaag gagcccttcagctggattaa ggtggacctg
ctggctccca tgatcatcca tggcatcaag actcagggggccaggcagaa gttctcttct
ctgtacatca gccagttcat tatcatgtac tccctggatggcaagaagtg gcagacctat
aggggcaaca gcactggcac cctgatggtg ttctttgggaatgtggacag ctctggcatc
aagcataata tcttcaatcc ccccatcatt gctaggtacatcaggctgca ccccacccac
tactctatta ggtctaccct gaggatggag ctgatgggctgtgacctgaa cagctgcagc
atgcctctgg gcatggagag caaagccatc tctgatgcccagatcactgc cagcagctac
tttaccaaca tgtttgctac ttggagcccc agcaaggccaggctgcacct gcaggggagg
tctaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aagactatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtgaagagcctgct gacctctatg
tatgtgaagg agttcctgat tagcagcagc caggatggccaccagtggac cctgtttttc
cagaatggga aggtgaaggt gtttcagggg aaccaggacagcttcactcc tgtggtgaac
tctctggacc cccccctgct gaccaggtat ctgaggatccaccctcagag ctgggtgcac
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggacctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種Ｘ０６（配列番号６）
atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgctgaggttttg cttctctgcc
accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctgggattacatgca gtctgacctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggttccct cccagggtgcccaagtcttt ccccttcaac
acttctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagtttactgaccacct gttcaacatt
gccaagccca ggcctccctg gatgggcctg ctgggccccaccattcaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tcatcaccct gaaaaatatg gctagccaccctgtgtctct gcatgctgtg
ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgaccagac tagccagagg
gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccacacttatgtgtg gcaggtgctg
aaagagaatg gccccatggc ttctgatccc ctgtgtctgacctatagcta cctgagccat
gtggatctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
ggcagcctgg ctaaggagaa gacccagacc ctgcataagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg gcaagagctg gcactctgag actaagaacagcctgatgca ggatagggat
gctgcttctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtgaatgggtatgt gaacaggagc
ctgcctggcc tgattggctg ccataggaag tctgtctattggcatgtgat tggcatgggc
actactcctg aggtgcacag catctttctg gagggccacaccttcctggt gaggaaccac
aggcaggcca gcctggagat ctctcccatc actttcctgactgctcagac cctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttctgtcac atctctagccaccagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggatag ctgccctgag gaaccccagctgaggatgaa gaacaatgag
gaggctgagg attatgatga tgatctgact gattctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaatt ctcctagctt cattcagatc agatctgtggccaaaaagca tcctaagact
tgggtgcatt atattgctgc tgaggaggag gattgggattatgcccccct ggtgctggct
cctgatgata ggagctacaa gtctcagtac ctgaataatgggccccagag gattggcagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgagaccttcaagac cagggaggcc
attcagcatg agtctgggat tctggggccc ctgctgtatggggaggtggg ggataccctg
ctgatcattt tcaagaacca ggccagcagg ccctacaacatctaccccca tgggattact
gatgtgaggc ccctgtactc taggaggctg cctaagggggtgaagcacct gaaggatttt
cctatcctgc ctggggaaat cttcaagtac aagtggactgtgactgtgga ggatggcccc
actaagtctg atcccaggtg tctgaccagg tattatagctcttttgtgaa catggagagg
gatctggcct ctgggctgat tggccctctg ctgatctgctacaaggagtc tgtggaccag
aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttctctgt gtttgatgag
aacaggagct ggtatctgac tgagaacatc cagaggtttctgcccaatcc tgctggggtg
cagctggagg atcctgagtt ccaggctagc aacatcatgcacagcatcaa tgggtatgtg
tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgtctg catgaggtggcctactggta tatcctgtct
attggggccc agactgactt cctgtctgtg tttttttctgggtatacttt taagcacaag
atggtgtatg aggacaccct gactctgttc cccttctctggggagactgt gtttatgagc
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atgactgccc tgctgaaggt gagcagctgt gataagaatactggggacta ctatgaggac
tcttatgagg acatttctgc ctatctgctg tctaagaacaatgccattga acccaggagc
ttctctcaga acccccctgt gctgaagagg caccagagggaaatcaccag aactactctg
cagtctgatc aggaggaaat tgactatgat gacactatttctgtggagat gaagaaggag
gactttgaca tctatgatga ggatgagaac cagagcccaaggagcttcca gaagaagact
aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgag cagcagcccc
catgtgctga gaaacagggc ccagtctggg tctgtgccccagttcaagaa ggtggtgttc
caggagttca ctgatgggag cttcacccag cccctgtataggggggagct gaatgagcac
ctgggcctgc tgggccccta tattagggct gaggtggaggacaacatcat ggtgaccttc
aggaatcagg cctctaggcc ctacagcttc tacagcagcctgattagcta tgaggaggat
cagaggcagg gggctgaacc caggaagaac tttgtgaagcccaatgagac caagacctat
ttctggaagg tgcagcatca catggccccc accaaggatgagtttgactg caaggcctgg
gcctacttct ctgatgtgga tctggagaag gatgtgcactctggcctgat tggccccctg
ctggtgtgcc acaccaacac cctgaaccct gctcatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag actaagtcttggtacttcac tgagaatatg
gagaggaatt gcagggcccc ctgcaatatt cagatggaagaccccacctt caaggagaat
tacaggttcc atgccattaa tggctacatc atggataccctgcctggcct ggtgatggcc
caggatcaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatgggcagcaatgagaa catccactct
atccacttct ctggccatgt gtttactgtg aggaagaaggaggagtataa gatggccctg
tacaacctgt accctggggt ctttgagact gtggagatgctgccttctaa ggctggcatt
tggagggtgg agtgcctgat tggggaacac ctgcatgctggcatgtctac cctgttcctg
gtgtacagca ataagtgcca gacccccctg ggcatggcctctgggcatat cagggatttc
cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggccccaaagctggctag gctgcactac
tctgggagca tcaatgcctg gagcactaag gagcccttcagctggatcaa ggtggacctg
ctggccccca tgattatcca tgggattaag actcagggggccaggcagaa gttcagcagc
ctgtacatca gccagttcat tatcatgtac agcctggatggcaagaagtg gcagacctat
aggggcaact ctactgggac cctgatggtg ttctttgggaatgtggatag ctctgggatc
aagcacaata tcttcaaccc ccccatcatt gccaggtatatcaggctgca ccccacccac
tacagcatta ggtctaccct gaggatggag ctgatgggctgtgatctgaa cagctgtagc
atgcctctgg gcatggagtc taaggccatt tctgatgcccagattactgc tagcagctac
ttcaccaaca tgtttgccac ctggtctccc agcaaggccaggctgcatct gcagggcagg
tctaatgctt ggaggcccca ggtgaacaac ccaaaggagtggctgcaggt ggatttccag
aagactatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtgaagtctctgct gacctctatg
tatgtgaagg agttcctgat ctctagcagc caggatggccatcagtggac cctgttcttc
cagaatggca aggtgaaagt gttccagggc aatcaggatagcttcactcc agtggtgaac
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cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggacctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種Ｘ０７（配列番号７）
atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgtctgctgaggttctg cttctctgcc
accaggaggt attacctggg ggctgtggag ctgagctgggactatatgca gtctgacctg
ggggagctgc ctgtggatgc taggttcccc cccagggtgcccaagagctt cccctttaac
acttctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttcactgaccacct gttcaacatt
gccaagccca ggcccccctg gatggggctg ctggggcccaccatccaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccaccctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgagct actggaaggc ttctgagggg gctgagtatgatgaccagac tagccagagg
gagaaggagg atgacaaggt gtttcctggg ggcagccatacctatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg gccccatggc ctctgacccc ctgtgcctgacctacagcta cctgtctcat
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggctctgctggt gtgtagggag
ggcagcctgg ctaaggaaaa gacccagacc ctgcataagtttatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg gcaagagctg gcactctgag accaagaacagcctgatgca ggatagggat
gctgcctctg ccagggcttg gcctaagatg cacactgtgaatgggtatgt gaataggagc
ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tgggatgggc
accacccctg aggtccatag catcttcctg gagggccacactttcctggt gaggaaccac
agacaggcct ctctggagat ctctcccatc accttcctgactgctcagac tctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttttgccat attagcagccaccagcatga tgggatggag
gcctatgtga aggtggatag ctgccctgag gagcctcagctgaggatgaa gaacaatgag
gaggctgaag actatgatga tgacctgact gattctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaata gccccagctt cattcagatc aggtctgtggccaagaaaca ccccaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaggaagag gactgggactatgctcccct ggtgctggcc
cctgatgata ggtcttataa gagccagtac ctgaacaatgggccccagag gattggcagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgaaaccttcaaaac cagggaggcc
attcagcatg agtctggcat cctgggccct ctgctgtatggggaggtggg ggacaccctg
ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccctacaacatctatcctca tggcatcact
gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cccaagggggtgaagcacct gaaagacttc
cccatcctgc ctggggagat ctttaagtat aagtggactgtgactgtgga ggatggccct
accaagtctg accccaggtg tctgaccagg tactattctagctttgtgaa catggagagg
gacctggcct ctggcctgat tgggcccctg ctgatctgctacaaggagtc tgtggaccag
aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttttctgt gtttgatgag
aataggagct ggtacctgac tgagaacatc cagaggtttctgcccaatcc tgctggggtg
cagctggagg atcctgagtt ccaggccagc aatatcatgcatagcatcaa tggctatgtg
tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctactggta catcctgagc
attggggccc agactgactt tctgtctgtg ttcttttctggctatacctt caagcacaag
atggtgtatg aggataccct gaccctgttc cccttctctggggagactgt gttcatgagc
atggagaatc ctgggctgtg gatcctgggg tgccacaactctgattttag gaacaggggg
atgactgccc tgctgaaggt gtctagctgt gataagaacactggggacta ctatgaggac
agctatgagg acatttctgc ttatctgctg tctaagaataatgccattga gcccagaagc
ttcagccaga atccccctgt gctgaagaga catcagagggagatcaccag aactaccctg
cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacactatctctgtggagat gaagaaggag
gactttgaca tctatgatga ggatgagaat cagtctcccaggagctttca gaagaagacc
agacattact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgag ctctagccct
catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc tctgtgccccagttcaagaa ggtggtgttc
caggaattca ctgatggcag cttcacccag cccctgtacaggggggagct gaatgagcac
ctgggcctgc tggggcctta tatcagggct gaggtggaggataatattat ggtgactttc
aggaaccagg ccagcaggcc ctactctttc tatagcagcctgatctctta tgaggaggat
cagaggcagg gggctgagcc taggaagaac tttgtgaagcccaatgagac taagacctac
ttctggaagg tccagcacca catggcccct accaaggatgagtttgactg caaggcctgg
gcctatttct ctgatgtgga tctggagaag gatgtccattctgggctgat tggccccctg
ctggtgtgcc acactaacac tctgaatcct gcccatggcaggcaggtgac tgtccaggag
tttgccctgt tcttcactat ctttgatgag accaagagctggtactttac tgagaacatg
gagaggaact gcagagctcc ttgcaatatt cagatggaggaccccacctt caaggagaat
tacaggttcc atgccattaa tgggtacatc atggacaccctgcctggcct ggtgatggct
caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatgggctctaatgagaa tatccacagc
atccacttct ctgggcatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggctctg
tataatctgt accctggggt gtttgaaact gtggagatgctgccctctaa ggctggcatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctggcatgagcac cctgttcctg
gtgtacagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcctctggccacat cagggacttc
cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggcccccaagctggccag gctgcactat
tctggcagca tcaatgcctg gagcaccaag gagcccttcagctggatcaa ggtggacctg
ctggccccca tgatcattca tggcatcaag acccagggggccaggcagaa gttcagctct
ctgtacatct ctcagttcat catcatgtac tctctggatgggaagaagtg gcagacctac
aggggcaaca gcactggcac cctgatggtg ttctttgggaatgtggactc ttctggcatc
aagcacaaca tcttcaatcc ccccatcatt gctaggtatattaggctgca tcccacccac
tacagcatca ggtctaccct gaggatggag ctgatgggctgtgacctgaa ctcttgcagc
atgcccctgg gcatggagtc taaggccatc tctgatgcccagattactgc cagcagctac
ttcaccaaca tgtttgccac ctggagcccc tctaaggccaggctgcatct gcaggggagg
agcaatgcct ggaggcctca ggtgaacaac cccaaggagtggctgcaggt ggatttccag
aagaccatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtcaagagcctgct gaccagcatg
tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatggccaccagtggac tctgttcttt
cagaatggga aggtgaaggt gtttcagggc aatcaggactctttcacccc tgtggtgaac
agcctggacc cccccctgct gaccagatac ctgaggatccacccccagtc ttgggtgcat
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggctcaggatctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種Ｘ０８（配列番号８）
atgcagattg agctgagcac ttgctttttt ctgtgcctgctgaggttttg tttttctgcc
accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctgggactatatgca gtctgatctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggttcccc cccagggtgcccaagtcttt tcccttcaac
acctctgtgg tgtataagaa gaccctgttt gtggagttcactgaccacct gttcaacatt
gctaagccta ggcccccctg gatgggcctg ctgggccctaccattcaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccatcctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtctctt actggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgaccagac cagccagaga
gagaaggagg atgacaaggt cttccctggg ggctctcacacctatgtgtg gcaggtgctg
aaggaaaatg gccccatggc ctctgacccc ctgtgcctgacctacagcta tctgagccat
gtggatctgg tgaaggacct gaattctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagtttatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg gcaagtcttg gcactctgag actaagaacagcctgatgca ggacagggat
gctgcctctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtgaatggctatgt gaacaggagc
ctgcctgggc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tggcatgggc
accacccctg aggtgcacag catcttcctg gaaggccacactttcctggt gaggaaccat
aggcaggcca gcctggagat cagccctatc accttcctgactgcccagac cctgctgatg
gatctggggc agttcctgct gttctgccac atctctagccaccagcatga tgggatggag
gcctatgtga aggtggacag ctgcccagag gagcctcagctgaggatgaa aaacaatgaa
gaggctgagg attatgatga tgatctgact gactctgagatggatgtggt gagatttgat
gatgacaata gccctagctt tattcagatc aggtctgtggctaagaagca ccccaagacc
tgggtgcatt acattgctgc tgaggaggag gactgggattatgctcctct ggtgctggcc
cctgatgata ggagctacaa gagccagtac ctgaataatggccctcagag gattggcagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcttac actgatgagaccttcaagac tagggaggcc
atccagcatg agtctgggat cctggggccc ctgctgtatggggaggtggg ggacaccctg
ctgatcatct tcaagaacca ggctagcagg ccttacaacatctatcccca tgggatcact
gatgtgagac ctctgtacag caggaggctg cccaagggggtcaagcatct gaaagacttc
cccatcctgc ctggggagat ctttaagtat aagtggactgtgactgtgga ggatgggccc
accaagtctg accccaggtg cctgaccagg tattacagcagctttgtgaa catggagagg
gatctggcct ctgggctgat tggccccctg ctgatctgttacaaggaatc tgtggatcag
aggggcaatc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttctctgt gtttgatgag
aataggtctt ggtacctgac tgaaaacatc cagaggttcctgcccaaccc tgctggggtc
cagctggagg atcctgagtt ccaggctagc aacatcatgcacagcatcaa tgggtatgtg
tttgatagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctactggta catcctgtct
attggggccc agactgactt cctgtctgtg ttcttttctggctacacctt caagcacaag
atggtgtatg aggacaccct gaccctgttc cccttctctggggagactgt ctttatgagc
atggagaacc ctgggctgtg gatcctgggc tgccacaactctgatttcag gaataggggc
atgactgctc tgctgaaggt gagctcttgt gacaagaacactggggatta ctatgaggac
agctatgagg acatttctgc ctacctgctg agcaagaacaatgccattga gcctaggagc
tttagccaga atcctcctgt cctgaagagg caccagagggagatcaccag gaccaccctg
cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gataccatctctgtggagat gaagaaggag
gactttgaca tctatgatga ggatgagaat cagtctcccaggagcttcca gaagaagacc
aggcactatt tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgag cagctctcct
catgtgctga ggaatagggc tcagtctggc tctgtgccccagttcaagaa agtggtgttt
caggagttca ctgatggctc tttcacccag cctctgtataggggggagct gaatgagcac
ctggggctgc tgggccccta tatcagggct gaggtggaggataacatcat ggtgaccttc
aggaaccagg cctctaggcc ctacagcttc tatagcagcctgatcagcta tgaggaggac
cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagcccaatgagac caagacttac
ttctggaagg tgcagcatca catggccccc accaaggatgagtttgactg taaggcctgg
gcctacttct ctgatgtgga tctggagaag gatgtgcactctggcctgat tggccccctg
ctggtgtgcc ataccaatac tctgaaccct gctcatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgctctgt tcttcactat ctttgatgag accaagtcttggtatttcac tgagaatatg
gagaggaact gcagggcccc ctgcaacatc cagatggaggaccccacctt taaggagaac
tataggtttc atgccatcaa tggctacatc atggacaccctgcctggcct ggtgatggcc
caggatcaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatggggtctaatgagaa catccacagc
atccacttct ctggccatgt gtttactgtg agaaagaaggaggagtacaa gatggctctg
tacaatctgt accctggggt ctttgagact gtggagatgctgcctagcaa ggctgggatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggaacat ctgcatgctgggatgtctac tctgttcctg
gtgtacagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcttctggccatat cagggacttt
cagattactg cctctgggca gtatggccag tgggcccccaagctggctag gctgcattat
tctggcagca tcaatgcctg gtctactaag gagcccttcagctggatcaa ggtggatctg
ctggccccca tgatcatcca tggcatcaag acccagggggccaggcagaa gtttagctct
ctgtacatta gccagttcat catcatgtac agcctggatgggaagaagtg gcagacctac
aggggcaatt ctactggcac cctgatggtg ttctttggcaatgtggacag ctctggcatc
aagcacaaca tctttaaccc ccctatcatt gctaggtacatcaggctgca tcccacccat
tacagcatca ggagcaccct gaggatggag ctgatgggctgtgacctgaa ctcttgcagc
atgcccctgg gcatggagag caaggccatt tctgatgcccagattactgc cagcagctac
ttcactaaca tgtttgccac ctggtctccc agcaaggccaggctgcacct gcagggcagg
agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagtggctgcaggt ggatttccag
aagaccatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtgaagagcctgct gactagcatg
tatgtgaagg agttcctgat cagctctagc caggatggccaccagtggac tctgtttttc
cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aaccaggactctttcactcc tgtggtgaac
agcctggacc cccccctgct gaccaggtat ctgaggattcacccccagtc ttgggtgcat
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggatctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種Ｘ０９（配列番号９）
atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgtctgctgagattttg cttttctgcc
actaggaggt attacctggg ggctgtggag ctgtcttgggactacatgca gtctgatctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggttccca cctagggtgcctaagagctt tcccttcaat
acctctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttcactgaccacct gttcaacatt
gccaagccta ggcccccctg gatgggcctg ctgggccctaccatccaggc tgaagtgtat
gacactgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccaccctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgtctt actggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgatcagac cagccagagg
gagaaggaag atgacaaggt gttccctggg ggcagccacacctatgtctg gcaggtgctg
aaggagaatg gccccatggc ctctgatccc ctgtgcctgacctactctta cctgagccat
gtggacctgg tgaaggatct gaattctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcataagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgaag ggaagagctg gcactctgag actaagaacagcctgatgca ggacagggat
gctgcttctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtgaatggctatgt gaatagaagc
ctgcctggcc tgattgggtg ccacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tgggatgggc
actacccctg aggtgcatag catcttcctg gaaggccataccttcctggt gaggaatcat
aggcaggctt ctctggaaat ttctcccatc actttcctgactgctcagac cctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagctctcaccagcatga tgggatggag
gcctatgtga aggtggacag ctgtcctgag gagccccagctgaggatgaa gaacaatgag
gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgagatggatgtggt caggtttgat
gatgacaata gcccctcttt catccagatc aggtctgtggccaagaagca ccccaagact
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggattatgcccctct ggtgctggcc
cctgatgaca ggagctataa gtctcagtac ctgaataatggcccccagag gattgggagg
aagtataaga aggtgaggtt tatggcctac actgatgagaccttcaagac cagggaggcc
atccagcatg agtctggcat cctgggcccc ctgctgtatggggaggtggg ggataccctg
ctgatcatct tcaagaacca ggcctctagg ccctacaatatctaccctca tggcatcact
gatgtgagac ccctgtatag caggaggctg cctaagggggtgaagcacct gaaggacttc
cccatcctgc ctggggagat cttcaagtat aagtggactgtgactgtgga ggatggcccc
accaagtctg accccaggtg cctgaccagg tattacagctcttttgtgaa catggagagg
gatctggcct ctgggctgat tggcccactg ctgatctgctacaaggagtc tgtggatcag
aggggcaatc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttttctgt gtttgatgaa
aataggtctt ggtatctgac tgagaacatc cagaggtttctgcccaatcc tgctggggtg
cagctggagg atcctgagtt tcaggcctct aatatcatgcattctatcaa tggctatgtg
tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctactggta catcctgagc
attggggctc agactgactt cctgtctgtg ttcttttctggctatacttt caagcacaag
atggtgtatg aggacactct gaccctgttc cccttctctggggagactgt gttcatgtct
atggaaaatc ctgggctgtg gattctgggc tgccacaattctgacttcag gaataggggg
atgactgccc tgctgaaggt gtctagctgt gataagaacactggggatta ctatgaggac
tcttatgaag atatctctgc ctatctgctg agcaagaacaatgccattga gcccaggagc
ttcagccaga acccccctgt gctgaagagg caccagagggagatcaccag gaccactctg
cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacactatctctgtggagat gaagaaggag
gattttgaca tttatgatga ggatgagaac cagtctcccaggagcttcca gaagaagacc
aggcattact ttattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatgggatgag cagctctcct
catgtgctga ggaacagggc ccagtctggg tctgtgccccagttcaagaa ggtggtgttc
caggagttca ctgatgggag cttcacccag cccctgtataggggggagct gaatgagcac
ctgggcctgc tgggccccta catcagggct gaggtggaggataatatcat ggtgaccttc
aggaaccagg ctagcaggcc ttacagcttt tacagcagcctgatctctta tgaagaagac
cagaggcagg gggctgagcc caggaagaat tttgtgaagcctaatgagac caagacttat
ttttggaagg tgcagcatca catggctcct accaaggatgagtttgactg caaggcctgg
gcctactttt ctgatgtgga tctggagaag gatgtgcactctggcctgat tggccctctg
ctggtgtgcc atactaacac tctgaaccct gcccatgggaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tcttcactat ttttgatgag accaagtcttggtatttcac tgagaacatg
gagaggaact gcagggctcc ctgcaacatc cagatggaagaccccacctt caaggagaac
tataggttcc atgccatcaa tgggtacatc atggataccctgcctggcct ggtgatggcc
caggatcaga ggattaggtg gtatctgctg agcatgggctctaatgagaa catccacagc
atccatttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggctctg
tacaacctgt atcctggggt gtttgagact gtggagatgctgcccagcaa ggctggcatc
tggagggtgg aatgcctgat tggggagcac ctgcatgctggcatgagcac tctgttcctg
gtgtatagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcctctggccatat cagggatttc
cagatcactg cttctggcca gtatggccag tgggcccccaagctggccag gctgcactat
tctggcagca tcaatgcctg gagcactaag gagcctttttcttggatcaa ggtggacctg
ctggccccta tgattattca tggcatcaag acccagggggccaggcagaa gttctctagc
ctgtacatct ctcagttcat cattatgtat agcctggatggcaagaagtg gcagacctac
aggggcaata gcactggcac cctgatggtg ttttttgggaatgtggactc ttctgggatc
aagcacaaca tctttaaccc ccccatcatt gccaggtatattaggctgca ccccacccac
tacagcatca ggagcaccct gaggatggag ctgatgggctgtgatctgaa ttcttgctct
atgcccctgg gcatggagag caaggccatc tctgatgcccagatcactgc cagctcttac
ttcaccaaca tgtttgccac ctggtctcct agcaaggccaggctgcatct gcagggcagg
agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aagaccatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtgaagagcctgct gacctctatg
tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatggccaccagtggac tctgttcttc
cagaatggga aggtgaaggt gttccagggc aaccaggatagctttacccc tgtggtgaac
agcctggacc ctcctctgct gaccagatac ctgaggatccatcctcagag ctgggtgcac
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggatctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種Ｘ１０（配列番号１０）
atgcagattg agctgagcac ttgcttcttc ctgtgcctgctgaggttctg cttttctgct
actaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctgggattacatgca gtctgacctg
ggggagctgc cagtggatgc caggttcccc cccagggtgcccaagtcttt tcctttcaac
acctctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttcactgaccacct gttcaacatt
gccaagccca ggcccccctg gatggggctg ctggggcccaccatccaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tgattaccct gaagaacatg gctagccaccctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgagct attggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgatcagac cagccagagg
gaaaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccatacttatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg ggcccatggc ctctgacccc ctgtgcctgacttacagcta tctgagccat
gtggacctgg tgaaggatct gaactctggc ctgattggggctctgctggt gtgcagggag
ggcagcctgg ctaaggagaa gactcagact ctgcataagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgaag gcaagagctg gcactctgag accaagaactctctgatgca ggatagggat
gctgcctctg ccagggcttg gcccaagatg cacactgtgaatggctatgt gaacaggagc
ctgcctggcc tgattgggtg ccacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tggcatgggc
accacccctg aggtgcacag cattttcctg gagggccacaccttcctggt gaggaatcac
aggcaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctgactgcccagac cctgctgatg
gacctggggc agtttctgct gttctgccac atcagcagccatcagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggactc ttgccctgag gagccccagctgaggatgaa gaacaatgag
gaggctgagg attatgatga tgacctgact gactctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaata gccccagctt catccagatt aggtctgtggccaagaagca ccctaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggattatgcccccct ggtgctggct
cctgatgaca ggtcttataa gagccagtac ctgaacaatgggccccagag gattggcagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcttac actgatgagaccttcaagac tagggaggcc
atccagcatg agtctggcat cctgggcccc ctgctgtatggggaggtggg ggataccctg
ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccctacaacatttaccctca tggcatcact
gatgtgaggc ccctgtacag caggagactg cccaagggggtgaagcacct gaaggatttt
cccattctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactgtgactgtgga ggatggcccc
accaagtctg atcccaggtg cctgactagg tactactcttcttttgtgaa tatggagagg
gatctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgctacaaggagtc tgtggaccag
aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttctctgt gtttgatgag
aataggagct ggtacctgac tgagaatatc cagaggttcctgcctaatcc tgctggggtc
cagctggagg atcctgagtt ccaggctagc aacattatgcacagcatcaa tggctatgtg
tttgattctc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcttactggta catcctgtct
attggggccc agactgattt cctgtctgtg ttcttctctggctacacttt caagcataag
atggtgtatg aggataccct gaccctgttc cccttctctggggagactgt gttcatgtct
atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgtcataactctgacttcag aaacaggggc
atgactgccc tgctgaaggt gagcagctgt gacaagaacactggggacta ctatgaggac
agctatgagg atatctctgc ttatctgctg agcaagaataatgccattga gcccaggagc
ttcagccaga acccccctgt gctgaagagg caccagagggagatcactag gactaccctg
cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacaccatctctgtggagat gaagaaggag
gactttgaca tctatgatga ggatgagaac cagtcccccaggtctttcca gaagaagacc
aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgag ctctagcccc
catgtgctga ggaacagggc tcagtctggc tctgtgccccagttcaagaa ggtggtcttc
caggagttca ctgatggctc ttttacccag cctctgtacagaggggagct gaatgagcac
ctgggcctgc tgggccccta catcagggct gaggtggaggataatatcat ggtgaccttc
agaaaccagg cctctaggcc ctacagcttc tacagcagcctgatctctta tgaggaggat
cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagcccaatgagac caagacctac
ttctggaagg tgcagcacca tatggcccct actaaggatgagtttgactg caaggcctgg
gcttattttt ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcactctgggctgat tggccccctg
ctggtgtgcc acaccaacac cctgaaccct gcccatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tcttcactat ctttgatgag accaagagctggtacttcac tgagaacatg
gagagaaatt gtagggctcc ctgcaatatc cagatggaggaccccacctt caaagaaaat
tacagattcc atgccatcaa tgggtacatc atggataccctgcctgggct ggtgatggct
caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatggggtctaatgagaa catccactct
atccatttct ctggccatgt gttcactgtg agaaagaaggaggagtataa gatggctctg
tacaacctgt acccaggggt gtttgagact gtggaaatgctgcccagcaa agctgggatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctggcatgtctac cctgttcctg
gtgtacagca acaagtgcca gactcccctg ggcatggcctctgggcacat cagggatttt
cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggcccccaagctggccag gctgcactac
tctggcagca ttaatgcttg gagcactaag gagcccttcagctggatcaa ggtggatctg
ctggccccca tgatcatcca tggcatcaag acccagggggccaggcagaa gttctctagc
ctgtacattt ctcagttcat catcatgtac agcctggatgggaagaagtg gcagacctac
agggggaaca gcactgggac cctgatggtg ttctttggcaatgtggatag ctctggcatc
aagcacaata tcttcaatcc ccccattatt gccaggtacattaggctgca tcctactcac
tactctatta ggagcaccct gaggatggag ctgatggggtgtgacctgaa cagctgttct
atgcccctgg gcatggagtc taaggctatc tctgatgcccagatcactgc cagcagctac
ttcactaata tgtttgccac ctggagccct agcaaggccagactgcacct gcagggcagg
agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aagaccatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtgaagagcctgct gaccagcatg
tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatggccaccagtggac cctgttcttc
cagaatggga aggtgaaggt gttccagggc aaccaggactctttcacccc tgtggtgaac
agcctggatc ctcccctgct gaccaggtac ctgaggatccacccccagag ctgggtgcac
cagattgctc tgaggatgga agtgctgggc tgtgaggcccaggatctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種Ｘ１１（配列番号１１）
atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgctgaggttttg cttctctgct
accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctgggactatatgca gtctgacctg
ggggagctgc ctgtggatgc taggttccct cccagggtgcccaagagctt cccctttaat
acctctgtgg tgtacaagaa aaccctgttt gtggagttcactgaccatct gttcaacatt
gccaagccca ggcccccttg gatgggcctg ctgggccccaccattcaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tcattaccct gaagaacatg gcttctcaccctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgaccagac cagccagagg
gagaaggagg atgataaggt gttccctggg ggcagccacacctatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg gccccatggc ctctgatccc ctgtgcctgacctactctta tctgtctcat
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggctctgctggt gtgcagggag
ggctctctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagtttattctgct gtttgctgtc
tttgatgagg gcaagagctg gcattctgag accaagaacagcctgatgca ggacagggat
gctgcctctg ccagggcctg gcccaaaatg cacactgtgaatggctatgt gaacaggagc
ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tggcatgggc
accacccctg aggtgcacag catcttcctg gagggccacacctttctggt gaggaatcac
aggcaggcca gcctggagat tagccccatc accttcctgactgcccagac cctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagcagccaccagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggatag ctgccctgag gagccccagctgaggatgaa aaacaatgag
gaggctgagg attatgatga tgacctgact gactctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaata gccccagctt tattcagatt aggtctgtggctaagaagca ccccaagact
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggactatgcccctct ggtcctggcc
cctgatgata ggtcttacaa gagccagtat ctgaacaatggcccccagag gattggcagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgagacctttaagac cagggaggcc
attcagcatg agtctgggat cctgggcccc ctgctgtatggggaggtggg ggacactctg
ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccttataacatctaccctca tgggatcact
gatgtgaggc ccctgtactc tagaaggctg cccaagggggtcaagcacct gaaggatttt
cccatcctgc ctggggagat tttcaagtac aagtggactgtgactgtgga ggatggcccc
accaagtctg accctaggtg cctgaccagg tactacagctcttttgtgaa catggagagg
gacctggcct ctggcctgat tggccctctg ctgatttgctacaaggagtc tgtggaccag
aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttttctgt gtttgatgag
aacaggtctt ggtacctgac tgagaacatc cagaggttcctgcctaaccc agctggggtg
cagctggagg atcctgagtt ccaggccagc aatattatgcatagcattaa tggctatgtg
tttgatagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctactggta catcctgagc
attggggccc agactgactt tctgtctgtg ttcttctctggctacacctt caagcataag
atggtgtatg aggacaccct gactctgttc cctttttctggggagactgt gtttatgagc
atggagaatc ctggcctgtg gatcctgggc tgccataattctgacttcag gaacaggggc
atgactgccc tgctgaaagt gagcagctgt gacaagaatactggggacta ctatgaagac
agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaacaatgccattga gcccaggagc
ttcagccaga accccccagt gctgaagagg caccagagagagatcaccag gactaccctg
cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gacaccatttctgtggagat gaagaaggag
gactttgaca tttatgatga ggatgagaat cagagccccaggagcttcca gaagaagact
aggcactatt ttattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgag cagctctccc
catgtgctga ggaatagggc ccagtctggc tctgtgcctcagttcaagaa ggtggtgttc
caggagttca ctgatggcag ctttacccag cccctgtataggggggagct gaatgagcac
ctgggcctgc tgggccccta tatcagggct gaggtggaggacaatattat ggtgaccttt
aggaaccagg ccagcaggcc ctactctttc tatagcagcctgatcagcta tgaggaggac
cagaggcagg gggctgagcc caggaagaat tttgtgaagcctaatgagac caagacctac
ttctggaagg tgcagcatca catggccccc accaaggatgagtttgactg caaggcttgg
gcctatttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcactctggcctgat tggccccctg
ctggtgtgcc acactaacac tctgaatcct gcccatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag accaagagctggtacttcac tgagaacatg
gagaggaact gcagggcccc ctgcaacatc cagatggaggatcccacctt caaggagaac
tacaggtttc atgccatcaa tggctacatc atggacactctgcctggcct ggtgatggcc
caggatcaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatgggctctaatgagaa tatccatagc
atccacttct ctggccatgt gttcactgtc aggaagaaggaggagtacaa gatggctctg
tataatctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgctgcccagcaa ggctggcatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctgggatgagcac cctgtttctg
gtgtactcta acaagtgcca gacccccctg ggcatggcctctgggcacat cagggatttc
cagatcactg cttctggcca gtatggccag tgggcccccaagctggccag gctgcactac
tctggcagca tcaatgcctg gtctaccaag gagcccttttcttggattaa ggtggacctg
ctggccccca tgatcatcca tggcatcaag acccagggggccaggcagaa gttcagcagc
ctgtacatca gccagttcat catcatgtac agcctggatggcaaaaagtg gcagacctac
aggggcaata gcactgggac tctgatggtg ttctttggcaatgtggacag ctctgggatc
aagcacaata tcttcaaccc tcccatcatt gctaggtacatcaggctgca ccccacccac
tatagcatca ggtctaccct gaggatggag ctgatgggctgtgacctgaa ctcttgcagc
atgcccctgg gcatggagtc caaagctatc tctgatgcccagattactgc cagcagctac
ttcaccaaca tgtttgccac ctggtctccc tctaaggccaggctgcacct gcagggcagg
agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaat cccaaggagtggctgcaggt ggatttccag
aaaactatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtgaagtctctgct gaccagcatg
tatgtgaagg agttcctgat ctcttctagc caggatggccaccagtggac tctgttcttc
cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aaccaggacagcttcacccc tgtggtgaac
tctctggatc cccccctgct gaccaggtac ctgaggattcatccccagag ctgggtgcac
cagattgctc tgagaatgga ggtgctgggg tgtgaggctcaggacctgta ttga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種Ｘ１２（配列番号１２）
atgcagattg agctgtctac ttgttttttt ctgtgcctgctgaggttctg cttctctgcc
accaggaggt attacctggg ggctgtggag ctgagctgggattacatgca gtctgatctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggttcccc cccagggtgcccaagagctt ccccttcaac
acctctgtgg tgtataagaa gaccctgttt gtggagttcactgatcatct gtttaacatt
gccaagccca ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccaactatccaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tcatcaccct gaagaatatg gccagccatcctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgaccagac cagccagagg
gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccacacctatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg gccccatggc ctctgacccc ctgtgcctgacttatagcta cctgtctcat
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggccctgctggt ctgtagggaa
ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagtttattctgct gtttgctgtg
tttgatgaag gcaagagctg gcactctgag accaagaattctctgatgca ggatagggat
gctgcctctg ccagggcctg gcccaagatg catactgtgaatggctatgt gaacagaagc
ctgcctggcc tgattggctg ccataggaag tctgtgtattggcatgtgat tgggatgggc
actacccctg aagtgcacag cattttcctg gagggccacactttcctggt gaggaaccac
aggcaggcct ctctggagat cagccccatt actttcctgactgcccagac cctgctgatg
gatctgggcc agttcctgct gttctgccac atctctagccaccagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggacag ctgccctgag gagccccagctgaggatgaa gaataatgag
gaggctgagg attatgatga tgacctgact gactctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgataata gccccagctt catccagatc aggtctgtggccaagaagca tcccaagacc
tgggtgcact atattgctgc tgaagaggag gactgggactatgcccctct ggtgctggct
cctgatgaca ggagctataa gagccagtat ctgaacaatgggccccagag gattgggagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgagacctttaagac cagggaggcc
atccagcatg agtctggcat tctggggccc ctgctgtatggggaggtggg ggacactctg
ctgatcattt tcaagaacca ggccagcagg ccctacaatatttaccccca tggcatcact
gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cccaagggggtgaagcacct gaaggacttc
cccatcctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactgtgactgtgga ggatggccct
accaagtctg accctaggtg tctgactagg tactacagcagctttgtgaa catggagaga
gacctggctt ctggcctgat tggccccctg ctgatctgctacaaggagtc tgtggatcag
aggggcaacc agattatgtc tgataagagg aatgtcatcctgttctctgt gtttgatgag
aacaggagct ggtatctgac tgagaacatt cagaggttcctgcccaaccc tgctggggtg
cagctggagg accctgagtt ccaggccagc aacatcatgcattctattaa tggctatgtg
tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctactggta catcctgagc
attggggccc agactgactt tctgtctgtg tttttctctgggtacacctt caagcacaag
atggtctatg aggacaccct gaccctgttc cccttttctggggaaactgt gtttatgagc
atggagaacc ctgggctgtg gatcctgggc tgccacaactctgactttag gaataggggc
atgactgccc tgctgaaggt gagcagctgt gacaagaatactggggatta ctatgaggac
agctatgagg atatctctgc ctacctgctg agcaagaacaatgccattga gcctaggagc
ttcagccaga acccccctgt gctgaagagg caccagagggagatcaccag gaccaccctg
cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacaccatctctgtggagat gaagaaggag
gactttgata tttatgatga ggatgagaac cagagccccaggagcttcca gaagaagacc
aggcactatt tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgag ctctagcccc
catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc tctgtgccccagttcaagaa ggtggtgttc
caggaattta ctgatggcag ctttacccag cccctgtacagaggggagct gaatgagcac
ctgggcctgc tgggccccta catcagggct gaggtggaggataatatcat ggtgaccttt
aggaaccagg cctctaggcc ctattctttt tacagcagcctgatcagcta tgaggaggac
cagaggcagg gggctgagcc taggaagaac tttgtgaagcccaatgagac caagacctac
ttttggaaag tgcagcacca catggccccc actaaggatgagtttgattg caaggcctgg
gcctatttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcactctggcctgat tggccccctg
ctggtgtgcc acaccaacac tctgaaccct gcccatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tctttaccat ctttgatgag actaagagctggtatttcac tgagaacatg
gagaggaact gcagagcccc ttgcaacatc cagatggaggaccctacctt caaggagaac
tataggttcc atgccatcaa tgggtacatc atggataccctgcctggcct ggtgatggct
caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatggggagcaatgagaa cattcatagc
atccacttct ctgggcatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtataa gatggccctg
tacaacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgctgcccagcaa ggctggcatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctggcatgagcac tctgttcctg
gtgtacagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcctctggccacat cagggacttc
cagattactg cctctgggca gtatgggcag tgggcccccaagctggccag gctgcactac
tctgggtcta tcaatgcttg gagcaccaag gagcctttcagctggatcaa ggtggatctg
ctggccccca tgatcattca tgggatcaag acccagggggccaggcagaa gttcagcagc
ctgtatattt ctcagttcat catcatgtat tctctggatggcaaaaagtg gcagacctat
agagggaaca gcactgggac cctgatggtg ttttttggcaatgtggatag ctctggcatc
aagcacaata tcttcaaccc ccccattatt gccaggtacatcaggctgca ccccacccac
tactctatca ggagcaccct gaggatggag ctgatgggctgtgatctgaa cagctgctct
atgcctctgg ggatggaaag caaggccatc tctgatgcccagatcactgc cagcagctat
ttcaccaata tgtttgccac ttggagccct agcaaggctaggctgcatct gcagggcagg
tctaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aagactatga aagtgactgg ggtgaccacc cagggggtgaaaagcctgct gaccagcatg
tatgtgaagg agttcctgat tagcagcagc caggatggccaccagtggac cctgttcttc
cagaatggga aggtgaaggt gtttcagggc aatcaggatagcttcacccc agtggtgaac
agcctggacc cccccctgct gaccaggtac ctgaggatccacccccagag ctgggtgcac
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggatctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種Ｘ１３（配列番号１３）
atgcagattg agctgagcac ctgctttttc ctgtgcctgctgaggttctg cttctctgct
accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgtcttgggattacatgca gtctgacctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggtttccc cccagggtgcccaagtcttt cccctttaac
acctctgtgg tgtataagaa gactctgttt gtggagttcactgatcacct gttcaatatt
gccaagccca ggcccccttg gatgggcctg ctgggccccactatccaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tcatcaccct gaagaacatg gccagccaccctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgaccagac cagccagagg
gagaaggagg atgacaaggt gttcccaggg gggtctcacacttatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg ggcccatggc ctctgaccct ctgtgcctgacttatagcta cctgtctcat
gtggatctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
gggagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg ggaagagctg gcactctgag accaagaatagcctgatgca ggacagggat
gctgcttctg ctagggcctg gcctaagatg cacactgtgaatggctatgt gaacaggagc
ctgcctggcc tgattgggtg tcacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tggcatgggg
actactccag aagtgcacag catcttcctg gaggggcacaccttcctggt gaggaatcac
aggcaggcca gcctggagat ttctcccatc actttcctgactgcccagac cctgctgatg
gatctggggc agttcctgct gttctgccac atcagcagccatcagcatga tgggatggag
gcctatgtga aggtggacag ctgccctgag gagcctcagctgaggatgaa gaacaatgag
gaggctgagg actatgatga tgatctgact gactctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaact ctcccagctt catccagatc aggtctgtggccaagaagca ccccaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggattatgctcccct ggtgctggct
cctgatgata ggagctacaa gagccagtat ctgaataatgggccccagag gattggcagg
aagtataaga aggtgaggtt catggcctac actgatgagacctttaagac cagggaggct
attcagcatg agtctggcat cctgggcccc ctgctgtatggggaggtggg ggacaccctg
ctgatcattt tcaagaacca ggccagcagg ccctataacatctatcccca tgggatcact
gatgtgaggc ccctgtactc taggaggctg cccaagggggtcaagcacct gaaggacttc
cccatcctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactgtgactgtgga ggatggcccc
actaagtctg accccaggtg cctgactagg tactacagcagctttgtgaa catggagaga
gatctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgctacaaagagtc tgtggatcag
aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttctctgt gtttgatgag
aacagaagct ggtacctgac tgagaacatt cagaggtttctgcccaaccc tgctggggtc
cagctggagg accctgagtt tcaggccagc aacatcatgcacagcatcaa tgggtatgtg
tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctactggta tatcctgagc
attggggccc agactgattt cctgtctgtg ttcttctctggctacacttt caagcacaag
atggtgtatg aggataccct gaccctgttc cctttctctggggaaactgt gttcatgagc
atggagaacc ctgggctgtg gatcctgggg tgccacaattctgatttcag gaacagaggc
atgactgctc tgctgaaggt gtctagctgt gacaagaacactggggacta ctatgaggac
agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaacaatgctattga acccaggtct
ttcagccaga acccccctgt gctgaagagg caccagagggagatcactag gaccaccctg
cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacaccatctctgtggagat gaagaaggag
gactttgaca tctatgatga ggatgagaat cagtctcccaggagcttcca gaagaagact
aggcattact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgag ctctagccct
catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc tctgtgccccagttcaagaa ggtggtgttt
caggagttca ctgatggcag cttcacccag cccctgtacaggggggagct gaatgagcat
ctgggcctgc tgggccccta catcagggct gaggtggaggacaacatcat ggtgaccttc
agaaatcagg ctagcaggcc ctacagcttc tacagcagcctgatctctta tgaggaggac
cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagcccaatgagac caagacctat
ttctggaagg tgcagcacca catggccccc accaaggatgagtttgattg caaggcctgg
gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcattctgggctgat tggccctctg
ctggtgtgcc acaccaacac cctgaatcct gcccatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tctttactat ctttgatgag accaagtcttggtattttac tgagaacatg
gagaggaact gcagggcccc ctgcaacatc cagatggaggaccccacctt caaggagaac
tacagattcc atgccatcaa tggctacatt atggacactctgcctggcct ggtgatggcc
caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg tctatgggcagcaatgagaa cattcactct
atccacttct ctgggcatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggccctg
tacaacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgctgcctagcaa ggctgggatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctggcatgtctac cctgttcctg
gtgtacagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcctctggccacat cagagatttt
cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggctcctaagctggccag gctgcactac
tctggcagca tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttagctggatcaa ggtggacctg
ctggccccca tgatcatcca tggcatcaag actcagggggccaggcagaa gttctctagc
ctgtacatta gccagttcat catcatgtat agcctggatggcaagaagtg gcagacctac
aggggcaaca gcactgggac cctgatggtg ttctttgggaatgtggacag ctctgggatc
aagcacaata tcttcaaccc ccccattatt gccaggtatattaggctgca ccccactcac
tacagcatta ggagcaccct gaggatggag ctgatgggctgtgatctgaa cagctgcagc
atgcccctgg gcatggagtc taaggccatc tctgatgcccagatcactgc cagctcttac
ttcaccaaca tgtttgccac ttggagcccc agcaaggccaggctgcacct gcagggcagg
agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagtggctgcaggt ggatttccag
aagactatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtgaagagcctgct gactagcatg
tatgtgaagg agttcctgat cagctctagc caggatggccaccagtggac cctgttcttt
cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aaccaggactctttcacccc tgtggtgaat
tctctggacc ctcccctgct gactaggtat ctgaggattcatccccagag ctgggtgcat
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggacctgta ttga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種Ｘ１４（配列番号１４）
atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgctgaggttttg cttttctgcc
actaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgtcttgggattacatgca gtctgacctg
ggggagctgc cagtggatgc caggttcccc ccaagggtgcccaagtcttt tcccttcaat
acctctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagtttactgatcatct gtttaacatt
gccaagccca ggcccccctg gatggggctg ctgggccccaccatccaggc tgaggtgtat
gatactgtgg tgattaccct gaagaatatg gccagccatcctgtgtctct gcatgctgtg
ggggtgtctt attggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgatcagac cagccagagg
gagaaggagg atgataaggt gttccctggg ggctctcacacctatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg ggcctatggc ctctgaccca ctgtgcctgacttacagcta tctgagccat
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggg ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
ggcagcctgg ccaaggagaa gactcagacc ctgcacaagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg gcaagtcttg gcactctgag accaagaacagcctgatgca ggatagggat
gctgcctctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtgaatggctatgt gaacaggtct
ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tggcatgggc
accacccctg aggtgcatag cattttcctg gagggccacaccttcctggt gaggaaccac
aggcaggcta gcctggagat cagccccatc actttcctgactgcccagac cctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atctctagccaccagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggactc ttgtcctgag gagccccagctgaggatgaa gaacaatgag
gaggctgagg attatgatga tgatctgact gattctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaaca gcccctcttt catccagatc aggtctgtggccaagaagca ccccaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggattatgcccccct ggtgctggcc
cctgatgaca ggagctataa gtctcagtac ctgaacaatggcccccagag aattggcagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcctat actgatgagaccttcaaaac cagggaggcc
attcagcatg agtctggcat cctggggccc ctgctgtatggggaggtggg ggacaccctg
ctgatcatct tcaagaacca ggctagcagg ccttacaacatctaccccca tgggatcact
gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cctaagggggtgaagcacct gaaggacttt
cccattctgc ctggggagat cttcaagtat aagtggactgtgactgtgga ggatgggccc
accaagtctg accccaggtg cctgactagg tactactctagctttgtgaa catggagagg
gacctggcct ctgggctgat tggccccctg ctgatctgttacaaggagtc tgtggaccag
aggggcaacc agatcatgtc tgataagagg aatgtgatcctgttctctgt gtttgatgag
aacaggagct ggtacctgac tgagaacatc cagagattcctgcccaaccc tgctggggtg
cagctggagg atcctgagtt ccaggccagc aacatcatgcattctatcaa tgggtatgtg
tttgatagcc tgcagctgtc tgtgtgtctg catgaggtggcctactggta cattctgagc
attggggccc agactgactt cctgtctgtg ttcttctctggctacacttt caaacacaag
atggtgtatg aggacaccct gaccctgttc cccttctctggggagactgt gtttatgagc
atggagaacc ctgggctgtg gattctgggc tgccacaactctgacttcag aaacaggggc
atgactgccc tgctgaaggt gtcttcttgt gataagaacactggggacta ttatgaagac
agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaataatgctattga gcccaggtct
ttctctcaga acccccctgt gctgaagagg caccagagggagatcaccag gaccaccctg
cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacactatttctgtggagat gaagaaggaa
gactttgata tctatgatga ggatgagaac cagagccctaggagcttcca gaagaagact
aggcattact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgag cagcagcccc
catgtgctga ggaatagggc tcagtctggc tctgtgcctcagttcaagaa ggtggtgttc
caggaattca ctgatggcag cttcactcag cccctgtacaggggggagct gaatgagcac
ctggggctgc tgggccctta catcagggct gaggtggaggacaatatcat ggtgaccttt
aggaaccagg cctctaggcc ttacagcttc tactctagcctgatctctta tgaagaggac
cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagcccaatgagac taagacttac
ttctggaagg tgcagcacca catggctccc accaaggatgagtttgactg caaggcttgg
gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcactctgggctgat tgggcccctg
ctggtgtgcc acactaacac tctgaatcct gcccatggcagacaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tttttaccat ctttgatgag actaagtcttggtacttcac tgagaacatg
gagaggaact gcagggcccc ctgcaacatc cagatggaggatcccacctt caaggagaac
tacaggtttc atgccatcaa tggctacatc atggacaccctgcctggcct ggtgatggct
caggaccaga ggattaggtg gtatctgctg agcatgggcagcaatgagaa tatccactct
atccacttct ctgggcatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggccctg
tataacctgt atcctggggt gtttgagact gtggagatgctgcccagcaa ggctggcatc
tggagagtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctggcatgagcac tctgtttctg
gtgtatagca acaagtgtca gacccctctg ggcatggcctctgggcacat tagggacttt
cagatcactg cttctggcca gtatgggcag tgggctcccaagctggccag gctgcactat
tctggcagca ttaatgcctg gagcaccaag gagcctttcagctggatcaa ggtggacctg
ctggccccca tgatcatcca tgggatcaag acccagggggctaggcagaa gttcagcagc
ctgtacatca gccagtttat catcatgtat tctctggatggcaagaagtg gcagacctac
aggggcaatt ctactggcac tctgatggtg ttctttgggaatgtggatag ctctgggatc
aagcataata tcttcaatcc ccccattatt gctaggtatatcaggctgca ccccacccac
tatagcatca ggagcaccct gaggatggag ctgatggggtgtgacctgaa cagctgcagc
atgcccctgg gcatggagag caaggctatt tctgatgcccagatcactgc cagcagctac
tttactaata tgtttgccac ctggagcccc agcaaggccagactgcacct gcagggcagg
tctaatgcct ggaggcctca ggtgaataac cccaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aaaaccatga aggtgactgg ggtgactacc cagggggtgaagtctctgct gaccagcatg
tatgtgaagg agttcctgat ctcttctagc caggatggccaccagtggac cctgttcttt
cagaatggga aggtgaaggt cttccagggc aaccaggatagcttcacccc tgtggtgaat
agcctggatc ctcctctgct gaccaggtat ctgaggatccacccccagag ctgggtgcat
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggctcaggacctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種Ｘ１５（配列番号１５）
atgcagattg agctgagcac ctgtttcttc ctgtgcctgctgaggttctg tttctctgcc
actaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctgggactatatgca gtctgacctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggttcccc cccagggtgcctaagagctt ccccttcaat
acttctgtgg tgtacaagaa gactctgttt gtggagtttactgaccacct gttcaacatt
gctaagccca ggcctccctg gatggggctg ctgggccccaccatccaggc tgaggtgtat
gatactgtgg tgattaccct gaagaacatg gcctctcatccagtgagcct gcatgctgtg
ggggtgagct actggaaggc ctctgaaggg gctgagtatgatgaccagac cagccagagg
gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccacacctatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg gcccaatggc ctctgacccc ctgtgcctgacttatagcta cctgagccat
gtggatctgg tgaaggacct gaattctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagagag
ggctctctgg ctaaggagaa gacccagact ctgcacaagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg gcaagagctg gcactctgag actaagaatagcctgatgca ggacagggat
gctgcttctg ccagggcctg gcccaagatg catactgtgaatggctatgt gaacaggagc
ctgcctggcc tgattggctg tcacaggaaa tctgtctactggcatgtgat tgggatgggc
actacccctg aggtgcactc tatcttcctg gagggccataccttcctggt gaggaaccac
aggcaggcca gcctggagat ctctcccatt accttcctgactgcccagac cctgctgatg
gatctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagcagccaccagcatga tgggatggag
gcttatgtga aggtggatag ctgccctgag gagccccagctgaggatgaa gaacaatgag
gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaact ctcccagctt tattcagatc aggtctgtggctaagaagca ccccaagact
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gactgggactatgcccctct ggtgctggct
cctgatgaca ggtcttacaa gtctcagtac ctgaataatggccctcagag gattggcagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgagaccttcaagac cagggaggcc
atccagcatg agtctggcat cctgggcccc ctgctgtatggggaggtggg ggataccctg
ctgatcatct tcaagaatca ggccagcagg ccctacaacatctaccccca tggcatcact
gatgtgaggc cactgtacag caggaggctg cccaagggggtgaagcatct gaaggacttc
cccattctgc ctggggagat cttcaagtac aaatggactgtgactgtgga ggatggccct
accaagtctg accccaggtg tctgaccagg tactacagcagctttgtgaa tatggagagg
gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgctacaaggagtc tgtggaccag
aggggcaatc agatcatgtc tgataagagg aatgtgattctgttctctgt gtttgatgag
aacaggagct ggtacctgac tgagaacatc cagaggttcctgcccaatcc tgctggggtg
cagctggagg accctgagtt ccaggccagc aatatcatgcacagcatcaa tggctatgtc
tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcttactggta tattctgagc
attggggccc agactgattt cctgtctgtg ttcttttctggctatacctt taagcacaag
atggtgtatg aggacaccct gaccctgttc cccttctctggggagactgt gttcatgtct
atggagaacc ctgggctgtg gatcctgggc tgccacaactctgacttcag gaacaggggg
atgactgccc tgctgaaggt gtctagctgt gataagaacactggggacta ttatgaggac
agctatgagg acatctctgc ttacctgctg agcaagaacaatgccattga gcccaggtct
ttcagccaga atccccctgt gctgaagagg catcagagggagatcaccag gaccaccctg
cagtctgatc aggaggagat tgattatgat gacactatctctgtggaaat gaagaaggag
gactttgaca tctatgatga ggatgagaac cagagccccaggagcttcca gaagaagacc
aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggattatggcatgag cagctctccc
catgtgctga ggaacagagc ccagtctggc tctgtgcctcagttcaagaa ggtggtcttc
caggagttca ctgatggctc tttcacccag cccctgtacaggggggagct gaatgagcac
ctgggcctgc tggggcccta cattagggct gaggtggaggataacatcat ggtgactttc
agaaaccagg ccagcaggcc ttacagcttt tactcttctctgattagcta tgaggaggat
cagaggcagg gggctgagcc taggaagaac tttgtgaagcccaatgagac caagacctat
ttctggaagg tgcagcacca catggctccc actaaggatgagtttgactg caaggcttgg
gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcactctggcctgat tgggcccctg
ctggtgtgcc acaccaacac cctgaaccct gcccatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag actaagagctggtacttcac tgagaacatg
gagaggaact gcagggcccc ctgcaacatc cagatggaggaccccacctt caaggagaat
tacaggttcc atgccatcaa tggctacatt atggacaccctgcctggcct ggtgatggcc
caggatcaga ggatcaggtg gtatctgctg agcatgggctctaatgagaa catccacagc
atccacttct ctggccatgt gtttactgtg aggaagaaggaggaatacaa gatggctctg
tataacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgctgcccagcaa ggctgggatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctgggatgagcac cctgttcctg
gtgtatagca ataagtgcca gacccccctg ggcatggcttctggccacat cagggatttc
cagatcactg cttctggcca gtatggccag tgggctcccaagctggctag gctgcattac
tctgggtcta tcaatgcctg gagcactaag gagcccttcagctggatcaa ggtggacctg
ctggccccca tgatcattca tggcatcaag acccagggggctaggcagaa gttcagcagc
ctgtacatca gccagttcat cattatgtac agcctggatggcaagaagtg gcagacttac
aggggcaata gcactgggac tctgatggtg ttctttggcaatgtggactc ttctggcatc
aagcacaaca tcttcaaccc tcccatcatt gccaggtacattaggctgca ccctacccac
tactctatca ggagcaccct gaggatggag ctgatggggtgtgatctgaa ctcttgcagc
atgcctctgg gcatggaaag caaagccatc tctgatgcccagatcactgc ctctagctat
ttcaccaata tgtttgccac ctggagccct agcaaggccaggctgcacct gcagggcaga
tctaatgcct ggaggcccca ggtgaacaat cccaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aagaccatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtgaagagcctgct gactagcatg
tatgtgaagg agttcctgat ctcttctagc caggatggccaccagtggac cctgttcttc
cagaatggca aggtgaaagt gttccagggc aaccaggatagcttcactcc tgtggtgaac
tctctggacc ctcccctgct gactaggtac ctgaggattcatccccagag ctgggtgcac
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggatctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種Ｘ１６（配列番号１６）
atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgctgaggttctg cttctctgcc
accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgtcttgggactatatgca gtctgacctg
ggggagctgc cagtggatgc caggttcccc cccagggtgcccaagagctt tcctttcaac
acttctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttcactgaccacct gttcaatatt
gctaagccca ggccaccctg gatgggcctg ctgggccctaccattcaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tgattactct gaagaatatg gccagccaccctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgtctt actggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgatcagac ttctcagagg
gagaaggagg atgataaggt gttccctggg ggctctcacacttatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg gccccatggc ttctgatcca ctgtgcctgacctactctta cctgagccat
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcataagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg ggaagagctg gcactctgag accaagaattctctgatgca ggacagggat
gctgcctctg ccagggcctg gcctaagatg cacactgtgaatggctatgt gaacaggtct
ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tggcatgggc
actacccctg aggtgcacag cattttcctg gagggccacaccttcctggt caggaaccat
aggcaggcct ctctggagat cagccccatc actttcctgactgcccagac cctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttctgccac attagcagccaccagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggactc ttgccctgag gagccccagctgaggatgaa gaacaatgag
gaagctgagg attatgatga tgacctgact gactctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaaca gccccagctt catccagatc aggtctgtggccaagaagca ccccaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggactatgctcccct ggtgctggct
cctgatgata ggagctacaa gtctcagtac ctgaataatggcccccagag gattggcagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgagaccttcaagac cagagaggct
atccagcatg agtctgggat cctggggccc ctgctgtatggggaggtggg ggacaccctg
ctgatcatct tcaagaacca ggccagcaga ccctacaacatctaccccca tgggatcact
gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cctaagggggtgaagcacct gaaggacttc
cccatcctgc ctggggagat cttcaagtat aagtggactgtgactgtgga ggatgggccc
accaagtctg accctaggtg cctgactagg tactactctagctttgtgaa catggagagg
gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatttgctacaaggagtc tgtggatcag
aggggcaatc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttctctgt gtttgatgag
aataggtctt ggtacctgac tgagaacatc cagaggttcctgcctaatcc tgctggggtg
cagctggagg accctgagtt tcaggccagc aacatcatgcacagcatcaa tggctatgtg
tttgactctc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcttactggta tatcctgagc
attggggctc agactgactt cctgtctgtg ttcttttctggctacacttt taagcacaag
atggtgtatg aggacaccct gaccctgttc cccttttctggggagactgt gttcatgtct
atggagaacc ctgggctgtg gattctgggc tgtcacaactctgacttcag aaacaggggc
atgactgccc tgctgaaggt gtctagctgt gacaagaatactggggacta ctatgaggac
agctatgagg acatttctgc ctatctgctg agcaagaacaatgccattga gcccaggagc
ttttctcaga atccccctgt gctgaagagg caccagagagagatcaccag gaccactctg
cagtctgatc aggaggagat tgattatgat gacactatctctgtggagat gaagaaagag
gactttgata tctatgatga ggatgagaat cagtctcccaggagcttcca gaagaagact
agacactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgag ctctagccct
catgtgctga ggaacagggc ccagtctggg tctgtgccccagttcaagaa ggtggtgttc
caggagttca ctgatggcag ctttacccag cccctgtataggggggagct gaatgagcat
ctgggcctgc tgggccccta tattagggct gaagtggaggacaacatcat ggtgaccttt
aggaaccagg ccagcaggcc ctacagcttt tacagcagcctgattagcta tgaggaggat
cagagacagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagcccaatgagac caagacctac
ttctggaagg tgcagcacca catggcccct accaaggatgagtttgactg caaggcctgg
gcttacttct ctgatgtgga cctggagaaa gatgtgcactctggcctgat tgggcccctg
ctggtgtgcc acaccaacac cctgaaccct gcccatgggaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt ttttcaccat ctttgatgag accaagagctggtacttcac tgagaacatg
gagaggaact gcagggcccc ctgtaacatc cagatggaggatcctacttt caaggagaac
tacaggttcc atgccattaa tgggtacatc atggacaccctgcctgggct ggtgatggcc
caggatcaga ggattaggtg gtatctgctg tctatgggctctaatgagaa catccactct
atccacttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggccctg
tacaacctgt accctggggt gtttgaaact gtggagatgctgccctctaa agctgggatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctggcatgagcac cctgttcctg
gtgtacagca ataagtgcca gactcccctg ggcatggcttctgggcacat cagggatttc
cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggcccccaagctggctag gctgcactac
tctggcagca tcaatgcctg gagcaccaag gagcccttctcttggattaa ggtggacctg
ctggctccca tgatcattca tggcatcaag acccagggggccaggcagaa gttttctagc
ctgtatatta gccagttcat catcatgtat agcctggatgggaagaagtg gcagacctac
agggggaata gcactggcac cctgatggtg ttttttggcaatgtggattc ttctggcatc
aagcataaca tcttcaatcc ccctatcatt gccaggtacattaggctgca tcccacccat
tactctatca ggagcaccct gaggatggag ctgatggggtgtgatctgaa cagctgtagc
atgcccctgg gcatggagtc caaggctatc tctgatgcccagatcactgc cagcagctac
ttcaccaaca tgtttgccac ctggagcccc agcaaggccaggctgcacct gcagggcagg
tctaatgcct ggaggcccca ggtgaacaat cccaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aagactatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtgaagagcctgct gaccagcatg
tatgtgaagg agttcctgat ctcttctagc caggatgggcatcagtggac cctgtttttt
cagaatggca aagtgaaggt gtttcagggg aatcaggacagctttacccc tgtggtgaac
agcctggatc ctcctctgct gactagatac ctgaggatccacccccagag ctgggtccac
cagattgctc tgaggatgga ggtgctgggg tgtgaggctcaggacctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種Ｘ１７（配列番号１７）
atgcagattg agctgagcac ctgcttcttt ctgtgcctgctgaggttctg cttctctgcc
accaggaggt actacctggg ggctgtggaa ctgagctgggactatatgca gtctgacctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggttcccc cccagggtgcccaagtcttt cccctttaac
acttctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagtttactgaccacct gttcaatatt
gccaagccca ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccaaccatccaggc tgaggtgtat
gatactgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccaccctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgagct attggaaggc ttctgagggg gctgagtatgatgaccagac tagccagagg
gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg gggtctcatacctatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg gccccatggc ctctgacccc ctgtgcctgacctattctta cctgagccat
gtggacctgg tcaaggacct gaactctggc ctgattggggctctgctggt gtgcagggag
ggcagcctgg ccaaggagaa gactcagact ctgcataagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg gcaagagctg gcactctgag accaagaactctctgatgca ggatagggat
gctgcctctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtgaatggctatgt gaataggtct
ctgcctggcc tgattggctg ccataggaag tctgtgtactggcatgtgat tggcatgggc
actacccctg aggtgcactc tatcttcctg gaggggcacaccttcctggt gaggaaccac
aggcaggcca gcctggagat ctctcccatc accttcctgactgcccagac tctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttctgccat atcagcagccaccagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggacag ctgcccagag gaaccccagctgaggatgaa gaacaatgag
gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaaca gccccagctt tattcagatc aggtctgtggccaagaagca ccccaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gactgggattatgcccccct ggtgctggcc
cctgatgaca ggtcttacaa gtctcagtac ctgaacaatggcccccagag gattgggagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgagaccttcaagac cagggaggcc
atccagcatg agtctggcat cctggggccc ctgctgtatggggaggtggg ggataccctg
ctgattatct tcaagaacca ggctagcagg ccctataacatctaccccca tggcattact
gatgtgaggc ccctgtactc taggagactg cccaagggggtgaagcacct gaaagacttc
cccatcctgc ctggggagat cttcaagtat aagtggactgtgactgtgga ggatggcccc
actaagtctg accccaggtg cctgaccagg tattacagcagctttgtgaa tatggagagg
gatctggctt ctggcctgat tgggcctctg ctgatttgctacaaggagtc tgtggatcag
agggggaacc agattatgtc tgacaagagg aatgtgattctgttctctgt gtttgatgag
aacaggagct ggtacctgac tgagaatatc cagaggttcctgcctaatcc tgctggggtg
cagctggagg accctgagtt ccaggctagc aacattatgcacagcatcaa tggctatgtg
tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcttactggta cattctgtct
attggggccc agactgactt cctgtctgtg ttcttctctggctacacctt caagcacaag
atggtgtatg aggacactct gaccctgttc cccttctctggggagactgt gttcatgagc
atggagaatc ctgggctgtg gattctgggg tgccacaactctgatttcag gaacaggggc
atgactgccc tgctgaaggt gagcagctgt gacaagaacactggggatta ttatgaggac
agctatgagg acatttctgc ctacctgctg agcaagaacaatgccattga gcctaggagc
ttcagccaga atccccctgt gctgaagaga caccagagggagatcactag gaccactctg
cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacaccatttctgtggagat gaagaaggag
gactttgata tttatgatga ggatgagaac cagagccccagaagcttcca gaagaagacc
aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggattatggcatgtc ttctagcccc
catgtgctga ggaacagggc tcagtctggc tctgtgcctcagttcaagaa ggtggtgttc
caggagttca ctgatgggag cttcacccag cctctgtacaggggggagct gaatgaacat
ctgggcctgc tggggcccta catcagggct gaggtggaggataatatcat ggtgactttc
aggaatcagg cctctaggcc ctacagcttc tactctagcctgatcagcta tgaggaggac
cagaggcagg gggctgagcc taggaagaat tttgtgaaacccaatgagac caagacctac
ttttggaagg tgcagcacca catggcccct accaaggatgagtttgactg taaggcctgg
gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcattctgggctgat tggccccctg
ctggtgtgcc acaccaacac cctgaaccct gcccatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag actaagagctggtatttcac tgagaacatg
gagaggaact gtagggctcc ctgcaacatc cagatggaggatccaacttt caaggagaac
tacaggttcc atgccatcaa tggctacatc atggacaccctgcctggcct ggtgatggcc
caggaccaga ggattaggtg gtacctgctg agcatgggctctaatgagaa catccactct
atccacttct ctggccatgt gtttactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggctctg
tacaacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgctgcctagcaa ggctggcatt
tggagagtgg agtgtctgat tggggagcac ctgcatgctgggatgtctac cctgttcctg
gtgtactcta acaagtgcca gacccccctg gggatggcttctgggcacat cagagatttt
cagattactg cttctgggca gtatggccag tgggctcccaagctggccag actgcattac
tctggctcta ttaatgcttg gagcaccaag gagcctttcagctggatcaa ggtggacctg
ctggctccca tgatcatcca tggcattaag actcagggggctaggcagaa gttcagcagc
ctgtatattt ctcagtttat tatcatgtat tctctggatggcaagaagtg gcagacttac
aggggcaaca gcactggcac cctgatggtg ttctttggcaatgtggacag ctctgggatc
aagcataaca tcttcaaccc ccccattatt gccaggtacatcaggctgca ccccacccac
tattctatca ggagcactct gaggatggag ctgatggggtgtgacctgaa cagctgctct
atgcccctgg gcatggagag caaggccatc tctgatgcccagatcactgc cagctcttat
ttcaccaaca tgtttgccac ctggagcccc agcaaggccaggctgcacct gcagggcaga
agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaat cctaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aagactatga aggtgactgg ggtgactacc cagggggtgaagagcctgct gaccagcatg
tatgtgaagg agttcctgat tagcagcagc caggatgggcatcagtggac cctgttcttc
cagaatggga aggtgaaggt gttccagggc aatcaggacagcttcacccc tgtggtgaac
agcctggacc cccccctgct gaccaggtac ctgaggatccatccccagag ctgggtgcac
cagattgctc tgagaatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggacctgta ttga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧ減少核酸変種Ｘ１８（配列番号１８）
atgcagattg agctgtctac ctgttttttt ctgtgcctgctgaggttctg cttctctgct
accaggaggt attatctggg ggctgtggag ctgagctgggactacatgca gtctgacctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggtttcct cccagggtgcctaagagctt ccccttcaac
acctctgtgg tgtacaagaa gactctgttt gtggagttcactgaccacct gttcaacatt
gccaagccca ggcccccctg gatggggctg ctgggccccactatccaggc tgaggtgtat
gatactgtgg tgattaccct gaagaacatg gcctctcaccctgtgtctct gcatgctgtg
ggggtgagct actggaaggc ttctgagggg gctgaatatgatgatcagac ctctcagagg
gagaaggagg atgacaaggt gtttcctggg ggcagccacacctatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg ggcccatggc ctctgatccc ctgtgcctgacctacagcta cctgagccat
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
ggcagcctgg ccaaggaaaa gacccagacc ctgcataagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg gcaagtcttg gcactctgag accaagaacagcctgatgca ggacagggat
gctgcctctg ctagggcctg gcccaagatg cacactgtgaatgggtatgt gaacagatct
ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tggcatgggg
accacccctg aggtgcatag catcttcctg gaggggcacaccttcctggt gagaaatcat
aggcaggcca gcctggagat tagccccatc accttcctgactgcccagac cctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atttctagccaccagcatga tggcatggag
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gaggctgagg attatgatga tgatctgact gactctgagatggatgtggt gaggtttgat
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gacctggctt ctggcctgat tggccccctg ctgatctgctacaaggaatc tgtggaccag
aggggcaacc agattatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttttctgt gtttgatgag
aataggagct ggtatctgac tgagaacatc cagaggttcctgcccaatcc tgctggggtg
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tttgactctc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctattggta catcctgagc
attggggccc agactgactt cctgtctgtg ttcttctctggctacacctt caagcacaag
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gaaaggaatt gcagggctcc ctgcaacatc cagatggaggaccccacctt caaggagaac
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caggatcaga ggattaggtg gtatctgctg agcatgggcagcaatgagaa catccacagc
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tacaatctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgctgcccagcaa ggctgggatc
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gtgtactcta acaagtgcca gactcccctg ggcatggcctctgggcacat cagggacttc
cagatcactg cctctgggca gtatggccag tgggcccctaagctggctag gctgcattac
tctggcagca tcaatgcctg gagcaccaag gagcccttcagctggatcaa ggtggacctg
ctggccccta tgatcatcca tggcatcaag acccagggggccagacagaa gttctcttct
ctgtacatct ctcagttcat catcatgtac tctctggatggcaagaagtg gcagacctac
agggggaatt ctactggcac tctgatggtg ttctttgggaatgtggatag ctctgggatc
aagcataata ttttcaaccc ccccattatt gctaggtacatcaggctgca cccaacccac
tactctatta ggtctaccct gaggatggag ctgatgggctgtgacctgaa ctcttgtagc
atgcccctgg gcatggagag caaggctatc tctgatgcccagatcactgc cagcagctac
tttaccaaca tgtttgctac ttggagcccc agcaaggccaggctgcacct gcagggcagg
agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagtggctgcaggt ggattttcag
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agcctggacc cccccctgct gaccaggtac ctgaggatccatccccagag ctgggtgcac
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaagcccaggacctgta ctga
野生型第ＶＩＩＩ因子－ＢＤＤ ｃＤＮＡ（配列番号１９）
ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTTTGCGATTCTG CTTTAGTGCC
ACCAGAAGAT ACTACCTGGG TGCAGTGGAA CTGTCATGGGACTATATGCA AAGTGATCTC
GGTGAGCTGC CTGTGGACGC AAGATTTCCT CCTAGAGTGCCAAAATCTTT TCCATTCAAC
ACCTCAGTCG TGTACAAAAA GACTCTGTTT GTAGAATTCACGGATCACCT TTTCAACATC
GCTAAGCCAA GGCCACCCTG GATGGGTCTG CTAGGTCCTACCATCCAGGC TGAGGTTTAT
GATACAGTGG TCATTACACT TAAGAACATG GCTTCCCATCCTGTCAGTCT TCATGCTGTT
GGTGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCTGAATATGATGATCAGAC CAGTCAAAGG
GAGAAAGAAG ATGATAAAGT CTTCCCTGGT GGAAGCCATACATATGTCTG GCAGGTCCTG
AAAGAGAATG GTCCAATGGC CTCTGACCCA CTGTGCCTTACCTACTCATA TCTTTCTCAT
GTGGACCTGG TAAAAGACTT GAATTCAGGC CTCATTGGAGCCCTACTAGT ATGTAGAGAA
GGGAGTCTGG CCAAGGAAAA GACACAGACC TTGCACAAATTTATACTACT TTTTGCTGTA
TTTGATGAAG GGAAAAGTTG GCACTCAGAA ACAAAGAACTCCTTGATGCA GGATAGGGAT
GCTGCATCTG CTCGGGCCTG GCCTAAAATG CACACAGTCAATGGTTATGT AAACAGGTCT
CTGCCAGGTC TGATTGGATG CCACAGGAAA TCAGTCTATTGGCATGTGAT TGGAATGGGC
ACCACTCCTG AAGTGCACTC AATATTCCTC GAAGGTCACACATTTCTTGT GAGGAACCAT
CGCCAGGCGT CCTTGGAAAT CTCGCCAATA ACTTTCCTTACTGCTCAAAC ACTCTTGATG
GACCTTGGAC AGTTTCTACT GTTTTGTCAT ATCTCTTCCCACCAACATGA TGGCATGGAA
GCTTATGTCA AAGTAGACAG CTGTCCAGAG GAACCCCAACTACGAATGAA AAATAATGAA
GAAGCGGAAG ACTATGATGA TGATCTTACT GATTCTGAAATGGATGTGGT CAGGTTTGAT
GATGACAACT CTCCTTCCTT TATCCAAATT CGCTCAGTTGCCAAGAAGCA TCCTAAAACT
TGGGTACATT ACATTGCTGC TGAAGAGGAG GACTGGGACTATGCTCCCTT AGTCCTCGCC
CCCGATGACA GAAGTTATAA AAGTCAATAT TTGAACAATGGCCCTCAGCG GATTGGTAGG
AAGTACAAAA AAGTCCGATT TATGGCATAC ACAGATGAAACCTTTAAGAC TCGTGAAGCT
ATTCAGCATG AATCAGGAAT CTTGGGACCT TTACTTTATGGGGAAGTTGG AGACACACTG
TTGATTATAT TTAAGAATCA AGCAAGCAGA CCATATAACATCTACCCTCA CGGAATCACT
GATGTCCGTC CTTTGTATTC AAGGAGATTA CCAAAAGGTGTAAAACATTT GAAGGATTTT
CCAATTCTGC CAGGAGAAAT ATTCAAATAT AAATGGACAGTGACTGTAGA AGATGGGCCA
ACTAAATCAG ATCCTCGGTG CCTGACCCGC TATTACTCTAGTTTCGTTAA TATGGAGAGA
GATCTAGCTT CAGGACTCAT TGGCCCTCTC CTCATCTGCTACAAAGAATC TGTAGATCAA
AGAGGAAACC AGATAATGTC AGACAAGAGG AATGTCATCCTGTTTTCTGT ATTTGATGAG
AACCGAAGCT GGTACCTCAC AGAGAATATA CAACGCTTTCTCCCCAATCC AGCTGGAGTG
CAGCTTGAGG ATCCAGAGTT CCAAGCCTCC AACATCATGCACAGCATCAA TGGCTATGTT
TTTGATAGTT TGCAGTTGTC AGTTTGTTTG CATGAGGTGGCATACTGGTA CATTCTAAGC
ATTGGAGCAC AGACTGACTT CCTTTCTGTC TTCTTCTCTGGATATACCTT CAAACACAAA
ATGGTCTATG AAGACACACT CACCCTATTC CCATTCTCAGGAGAAACTGT CTTCATGTCG
ATGGAAAACC CAGGTCTATG GATTCTGGGG TGCCACAACTCAGACTTTCG GAACAGAGGC
ATGACCGCCT TACTGAAGGT TTCTAGTTGT GACAAGAACACTGGTGATTA TTACGAGGAC
AGTTATGAAG ATATTTCAGC ATACTTGCTG AGTAAAAACAATGCCATTGA ACCAAGAAGC
TTCTCCCAAA ACCCACCAGT CTTGAAACGC CATCAACGGGAAATAACTCG TACTACTCTT
CAGTCAGATC AAGAGGAAAT TGACTATGAT GATACCATATCAGTTGAAAT GAAGAAGGAA
GATTTTGACA TTTATGATGA GGATGAAAAT CAGAGCCCCCGCAGCTTTCA AAAGAAAACA
CGACACTATT TTATTGCTGC AGTGGAGAGG CTCTGGGATTATGGGATGAG TAGCTCCCCA
CATGTTCTAA GAAACAGGGC TCAGAGTGGC AGTGTCCCTCAGTTCAAGAA AGTTGTTTTC
CAGGAATTTA CTGATGGCTC CTTTACTCAG CCCTTATACCGTGGAGAACT AAATGAACAT
TTGGGACTCC TGGGGCCATA TATAAGAGCA GAAGTTGAAGATAATATCAT GGTAACTTTC
AGAAATCAGG CCTCTCGTCC CTATTCCTTC TATTCTAGCCTTATTTCTTA TGAGGAAGAT
CAGAGGCAAG GAGCAGAACC TAGAAAAAAC TTTGTCAAGCCTAATGAAAC CAAAACTTAC
TTTTGGAAAG TGCAACATCA TATGGCACCC ACTAAAGATGAGTTTGACTG CAAAGCCTGG
GCTTATTTCT CTGATGTTGA CCTGGAAAAA GATGTGCACTCAGGCCTGAT TGGACCCCTT
CTGGTCTGCC ACACTAACAC ACTGAACCCT GCTCATGGGAGACAAGTGAC AGTACAGGAA
TTTGCTCTGT TTTTCACCAT CTTTGATGAG ACCAAAAGCTGGTACTTCAC TGAAAATATG
GAAAGAAACT GCAGGGCTCC CTGCAATATC CAGATGGAAGATCCCACTTT TAAAGAGAAT
TATCGCTTCC ATGCAATCAA TGGCTACATA ATGGATACACTACCTGGCTT AGTAATGGCT
CAGGATCAAA GGATTCGATG GTATCTGCTC AGCATGGGCAGCAATGAAAA CATCCATTCT
ATTCATTTCA GTGGACATGT GTTCACCGTA CGAAAAAAAGAGGAGTATAA AATGGCACTG
TACAATCTCT ATCCAGGTGT TTTTGAGACA GTGGAAATGTTACCATCCAA AGCTGGAATT
TGGCGGGTGG AATGCCTTAT TGGCGAGCAT CTACATGCTGGGATGAGCAC ACTTTTTCTG
GTGTACAGCA ATAAGTGTCA GACTCCCCTG GGAATGGCTTCTGGACACAT TAGAGATTTT
CAGATTACAG CTTCAGGACA ATATGGACAG TGGGCCCCAAAGCTGGCCAG ACTTCATTAT
TCCGGATCAA TCAATGCCTG GAGCACCAAG GAGCCCTTTTCTTGGATCAA GGTGGATCTG
TTGGCACCAA TGATTATTCA CGGCATCAAG ACCCAGGGTGCCCGTCAGAA GTTCTCCAGC
CTCTACATCT CTCAGTTTAT CATCATGTAT AGTCTTGATGGGAAGAAGTG GCAGACTTAT
CGAGGAAATT CCACTGGAAC CTTAATGGTC TTCTTTGGCAATGTGGATTC ATCTGGGATA
AAACACAATA TTTTTAACCC TCCAATTATT GCTCGATACATCCGTTTGCA CCCAACTCAT
TATAGCATTC GCAGCACTCT TCGCATGGAG TTGATGGGCTGTGATTTAAA TAGTTGCAGC
ATGCCATTGG GAATGGAGAG TAAAGCAATA TCAGATGCACAGATTACTGC TTCATCCTAC
TTTACCAATA TGTTTGCCAC CTGGTCTCCT TCAAAAGCTCGACTTCACCT CCAAGGGAGG
AGTAATGCCT GGAGACCTCA GGTGAATAAT CCAAAAGAGTGGCTGCAAGT GGACTTCCAG
AAGACAATGA AAGTCACAGG AGTAACTACT CAGGGAGTAAAATCTCTGCT TACCAGCATG
TATGTGAAGG AGTTCCTCAT CTCCAGCAGT CAAGATGGCCATCAGTGGAC TCTCTTTTTT
CAGAATGGCA AAGTAAAGGT TTTTCAGGGA AATCAAGACTCCTTCACACC TGTGGTGAAC
TCTCTAGACC CACCGTTACT GACTCGCTAC CTTCGAATTCACCCCCAGAG TTGGGTGCAC
CAGATTGCCC TGAGGATGGA GGTTCTGGGC TGCGAGGCACAGGACCTCTA CTGA
Ｖ３第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ（配列番号２０）
ATGCAGATTGAGCTGAGCACCTGCTTCTTCCTGTGCCTGCTGAGGTTCTGCTTCTCTGCCACCAGGAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAGCTGAGCTGGGACTACATGCAGTCTGACCTGGGGGAGCTGCCTGTGGATGCCAGGTTCCCCCCCAGAGTGCCCAAGAGCTTCCCCTTCAACACCTCTGTGGTGTACAAGAAGACCCTGTTTGTGGAGTTCACTGACCACCTGTTCAACATTGCCAAGCCCAGGCCCCCCTGGATGGGCCTGCTGGGCCCCACCATCCAGGCTGAGGTGTATGACACTGTGGTGATCACCCTGAAGAACATGGCCAGCCACCCTGTGAGCCTGCATGCTGTGGGGGTGAGCTACTGGAAGGCCTCTGAGGGGGCTGAGTATGATGACCAGACCAGCCAGAGGGAGAAGGAGGATGACAAGGTGTTCCCTGGGGGCAGCCACACCTATGTGTGGCAGGTGCTGAAGGAGAATGGCCCCATGGCCTCTGACCCCCTGTGCCTGACCTACAGCTACCTGAGCCATGTGGACCTGGTGAAGGACCTGAACTCTGGCCTGATTGGGGCCCTGCTGGTGTGCAGGGAGGGCAGCCTGGCCAAGGAGAAGACCCAGACCCTGCACAAGTTCATCCTGCTGTTTGCTGTGTTTGATGAGGGCAAGAGCTGGCACTCTGAAACCAAGAACAGCCTGATGCAGGACAGGGATGCTGCCTCTGCCAGGGCCTGGCCCAAGATGCACACTGTGAATGGCTATGTGAACAGGAGCCTGCCTGGCCTGATTGGCTGCCACAGGAAGTCTGTGTACTGGCATGTGATTGGCATGGGCACCACCCCTGAGGTGCACAGCATCTTCCTGGAGGGCCACACCTTCCTGGTCAGGAACCACAGGCAGGCCAGCCTGGAGATCAGCCCCATCACCTTCCTGACTGCCCAGACCCTGCTGATGGACCTGGGCCAGTTCCTGCTGTTCTGCCACATCAGCAGCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTATGTGAAGGTGGACAGCTGCCCTGAGGAGCCCCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAGGCTGAGGACTATGATGATGACCTGACTGACTCTGAGATGGATGTGGTGAGGTTTGATGATGACAACAGCCCCAGCTTCATCCAGATCAGGTCTGTGGCCAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTACATTGCTGCTGAGGAGGAGGACTGGGACTATGCCCCCCTGGTGCTGGCCCCTGATGACAGGAGCTACAAGAGCCAGTACCTGAACAATGGCCCCCAGAGGATTGGCAGGAAGTACAAGAAGGTCAGGTTCATGGCCTACACTGATGAAACCTTCAAGACCAGGGAGGCCATCCAGCATGAGTCTGGCATCCTGGGCCCCCTGCTGTATGGGGAGGTGGGGGACACCCTGCTGATCATCTTCAAGAACCAGGCCAGCAGGCCCTACAACATCTACCCCCATGGCATCACTGATGTGAGGCCCCTGTACAGCAGGAGGCTGCCCAAGGGGGTGAAGCACCTGAAGGACTTCCCCATCCTGCCTGGGGAGATCTTCAAGTACAAGTGGACTGTGACTGTGGAGGATGGCCCCACCAAGTCTGACCCCAGGTGCCTGACCAGATACTACAGCAGCTTTGTGAACATGGAGAGGGACCTGGCCTCTGGCCTGATTGGCCCCCTGCTGATCTGCTACAAGGAGTCTGTGGACCAGAGGGGCAACCAGATCATGTCTGACAAGAGGAATGTGATCCTGTTCTCTGTGTTTGATGAGAACAGGAGCTGGTACCTGACTGAGAACATCCAGAGGTTCCTGCCCAACCCTGCTGGGGTGCAGCTGGAGGACCCTGAGTTCCAGGCCAGCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTGTTTGACAGCCTGCAGCTGTCTGTGTGCCTGCATGAGGTGGCCTACTGGTACATCCTGAGCATTGGGGCCCAGACTGACTTCCTGTCTGTGTTCTTCTCTGGCTACACCTTCAAGCACAAGATGGTGTATGAGGACACCCTGACCCTGTTCCCCTTCTCTGGGGAGACTGTGTTCATGAGCATGGAGAACCCTGGCCTGTGGATTCTGGGCTGCCACAACTCTGACTTCAGGAACAGGGGCATGACTGCCCTGCTGAAAGTCTCCAGCTGTGACAAGAACACTGGGGACTACTATGAGGACAGCTATGAGGACATCTCTGCCTACCTGCTGAGCAAGAACAATGCCATTGAGCCCAGGAGCTTCAGCCAGAACAGCAGGCACCCCAGCACCAGGCAGAAGCAGTTCAATGCCACCACCATCCCTGAGAATGACATAGAGAAGACAGACCCATGGTTTGCCCACCGGACCCCCATGCCCAAGATCCAGAATGTGAGCAGCTCTGACCTGCTGATGCTGCTGAGGCAGAGCCCCACCCCCCATGGCCTGAGCCTGTCTGACCTGCAGGAGGCCAAGTATGAAACCTTCTCTGATGACCCCAGCCCTGGGGCCATTGACAGCAACAACAGCCTGTCTGAGATGACCCACTTCAGGCCCCAGCTGCACCACTCTGGGGACATGGTGTTCACCCCTGAGTCTGGCCTGCAGCTGAGGCTGAATGAGAAGCTGGGCACCACTGCTGCCACTGAGCTGAAGAAGCTGGACTTCAAAGTCTCCAGCACCAGCAACAACCTGATCAGCACCATCCCCTCTGACAACCTGGCTGCTGGCACTGACAACACCAGCAGCCTGGGCCCCCCCAGCATGCCTGTGCACTATGACAGCCAGCTGGACACCACCCTGTTTGGCAAGAAGAGCAGCCCCCTGACTGAGTCTGGGGGCCCCCTGAGCCTGTCTGAGGAGAACAATGACAGCAAGCTGCTGGAGTCTGGCCTGATGAACAGCCAGGAGAGCAGCTGGGGCAAGAATGTGAGCACCAGGAGCTTCCAGAAGAAGACCAGGCACTACTTCATTGCTGCTGTGGAGAGGCTGTGGGACTATGGCATGAGCAGCAGCCCCCATGTGCTGAGGAACAGGGCCCAGTCTGGCTCTGTGCCCCAGTTCAAGAAGGTGGTGTTCCAGGAGTTCACTGATGGCAGCTTCACCCAGCCCCTGTACAGAGGGGAGCTGAATGAGCACCTGGGCCTGCTGGGCCCCTACATCAGGGCTGAGGTGGAGGACAACATCATGGTGACCTTCAGGAACCAGGCCAGCAGGCCCTACAGCTTCTACAGCAGCCTGATCAGCTATGAGGAGGACCAGAGGCAGGGGGCTGAGCCCAGGAAGAACTTTGTGAAGCCCAATGAAACCAAGACCTACTTCTGGAAGGTGCAGCACCACATGGCCCCCACCAAGGATGAGTTTGACTGCAAGGCCTGGGCCTACTTCTCTGATGTGGACCTGGAGAAGGATGTGCACTCTGGCCTGATTGGCCCCCTGCTGGTGTGCCACACCAACACCCTGAACCCTGCCCATGGCAGGCAGGTGACTGTGCAGGAGTTTGCCCTGTTCTTCACCATCTTTGATGAAACCAAGAGCTGGTACTTCACTGAGAACATGGAGAGGAACTGCAGGGCCCCCTGCAACATCCAGATGGAGGACCCCACCTTCAAGGAGAACTACAGGTTCCATGCCATCAATGGCTACATCATGGACACCCTGCCTGGCCTGGTGATGGCCCAGGACCAGAGGATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGCAGCAATGAGAACATCCACAGCATCCACTTCTCTGGCCATGTGTTCACTGTGAGGAAGAAGGAGGAGTACAAGATGGCCCTGTACAACCTGTACCCTGGGGTGTTTGAGACTGTGGAGATGCTGCCCAGCAAGGCTGGCATCTGGAGGGTGGAGTGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCTGGCATGAGCACCCTGTTCCTGGTGTACAGCAACAAGTGCCAGACCCCCCTGGGCATGGCCTCTGGCCACATCAGGGACTTCCAGATCACTGCCTCTGGCCAGTATGGCCAGTGGGCCCCCAAGCTGGCCAGGCTGCACTACTCTGGCAGCATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTCAGCTGGATCAAGGTGGACCTGCTGGCCCCCATGATCATCCATGGCATCAAGACCCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCAGCAGCCTGTACATCAGCCAGTTCATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAGTGGCAGACCTACAGGGGCAACAGCACTGGCACCCTGATGGTGTTCTTTGGCAATGTGGACAGCTCTGGCATCAAGCACAACATCTTCAACCCCCCCATCATTGCCAGATACATCAGGCTGCACCCCACCCACTACAGCATCAGGAGCACCCTGAGGATGGAGCTGATGGGCTGTGACCTGAACAGCTGCAGCATGCCCCTGGGCATGGAGAGCAAGGCCATCTCTGATGCCCAGATCACTGCCAGCAGCTACTTCACCAACATGTTTGCCACCTGGAGCCCCAGCAAGGCCAGGCTGCACCTGCAGGGCAGGAGCAATGCCTGGAGGCCCCAGGTCAACAACCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTGGACTTCCAGAAGACCATGAAGGTGACTGGGGTGACCACCCAGGGGGTGAAGAGCCTGCTGACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTGATCAGCAGCAGCCAGGATGGCCACCAGTGGACCCTGTTCTTCCAGAATGGCAAGGTGAAGGTGTTCCAGGGCAACCAGGACAGCTTCACCCCTGTGGTGAACAGCCTGGACCCCCCCCTGCTGACCAGATACCTGAGGATTCACCCCCAGAGCTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTGCTGGGCTGTGAGGCCCAGGACCTGTACTGA
ＣＯ３第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ（配列番号２１）
atgcagattg agctgtcaac ttgctttttc ctgtgcctgctgagattttg tttttccgct
actagaagat actacctggg ggctgtggaa ctgtcttgggattacatgca gagtgacctg
ggagagctgc cagtggacgc acgatttcca cctagagtccctaaatcatt ccccttcaac
accagcgtgg tctataagaa aacactgttc gtggagtttactgatcacct gttcaacatc
gctaagcctc ggccaccctg gatgggactg ctgggaccaacaatccaggc agaggtgtac
gacaccgtgg tcattacact gaaaaacatg gcctcacaccccgtgagcct gcatgctgtg
ggcgtcagct actggaaggc ttccgaaggg gcagagtatgacgatcagac ttcccagaga
gaaaaagagg acgataaggt gtttcctggc gggtctcatacctatgtgtg gcaggtcctg
aaagagaatg gccccatggc ttccgaccct ctgtgcctgacctactctta tctgagtcac
gtggacctgg tcaaggatct gaacagcgga ctgatcggagcactgctggt gtgtagggaa
gggagcctgg ctaaggagaa aacccagaca ctgcataagttcattctgct gttcgccgtg
tttgacgaag gaaaatcatg gcacagcgag acaaagaatagtctgatgca ggaccgggat
gccgcttcag ccagagcttg gcccaaaatg cacactgtgaacggctacgt caatcgctca
ctgcctggac tgatcggctg ccaccgaaag agcgtgtattggcatgtcat cggaatgggc
accacacctg aagtgcactc cattttcctg gaggggcatacctttctggt ccgcaaccac
cgacaggcct ccctggagat ctctccaatt accttcctgacagctcagac tctgctgatg
gatctgggac agttcctgct gttttgccac atcagctcccaccagcatga tggcatggag
gcctacgtga aagtggacag ctgtcccgag gaacctcagctgaggatgaa gaacaatgag
gaagctgaag actatgacga tgacctgacc gactccgagatggatgtggt ccgattcgat
gacgataaca gcccctcctt tatccagatt agatctgtggccaagaaaca ccctaagaca
tgggtccatt acatcgcagc cgaggaagag gactgggattatgcaccact ggtgctggca
ccagacgatc gatcctacaa atctcagtat ctgaacaatggaccacagcg gattggcaga
aagtacaaga aagtgaggtt catggcttat accgatgaaaccttcaagac tcgcgaagca
atccagcacg agagcgggat tctgggacca ctgctgtacggagaagtggg ggacaccctg
ctgatcattt ttaagaacca ggccagcagg ccttacaatatctatccaca tggaattaca
gatgtgcgcc ctctgtacag ccggagactg ccaaagggcgtcaaacacct gaaggacttc
ccaatcctgc ccggggaaat ttttaagtat aaatggactgtcaccgtcga ggatggcccc
actaagagcg accctaggtg cctgacccgc tactattctagtttcgtgaa tatggaaagg
gatctggcca gcggactgat cggcccactg ctgatttgttacaaagagag cgtggatcag
agaggcaacc agatcatgtc cgacaagagg aatgtgattctgttcagtgt ctttgacgaa
aaccggtcat ggtatctgac cgagaacatc cagagattcctgcctaatcc agccggagtg
cagctggaag atcctgagtt tcaggcttct aacatcatgcatagtattaa tggctacgtg
ttcgacagtc tgcagctgtc agtgtgtctg cacgaggtcgcttactggta tatcctgagc
attggagcac agacagattt cctgagcgtg ttcttttccggctacacttt taagcataaa
atggtgtatg aggacacact gactctgttc cccttcagcggcgaaaccgt gtttatgtcc
atggagaatc ccgggctgtg gatcctggga tgccacaacagcgatttcag gaatcgcggg
atgactgccc tgctgaaagt gtcaagctgt gacaagaacaccggagacta ctatgaagat
tcatacgagg acatcagcgc atatctgctg tccaaaaacaatgccattga acccaggtct
tttagtcaga atcctccagt gctgaagagg caccagcgcgagatcacccg cactaccctg
cagagtgatc aggaagagat cgactacgac gatacaatttctgtggaaat gaagaaagag
gacttcgata tctatgacga agatgagaac cagagtcctcgatcattcca gaagaaaacc
cggcattact ttattgctgc agtggagcgc ctgtgggattatggcatgtc ctctagtcct
cacgtgctgc gaaatcgggc ccagtcaggg agcgtcccacagttcaagaa agtggtcttc
caggagttta cagacggatc ctttactcag ccactgtaccggggcgaact gaacgagcac
ctggggctgc tgggacccta tatcagagct gaagtggaggataacattat ggtcaccttc
agaaatcagg catctaggcc ttacagtttt tattcaagcctgatctctta cgaagaggac
cagaggcagg gagcagaacc acgaaaaaac ttcgtgaagcctaatgagac caaaacatac
ttttggaagg tgcagcacca tatggcccca acaaaagacgaattcgattg caaggcatgg
gcctattttt ctgacgtgga tctggagaag gacgtccacagtggcctgat cgggccactg
ctggtgtgtc atactaacac cctgaatccc gcacacggcaggcaggtcac tgtccaggaa
ttcgccctgt tctttaccat ctttgatgag acaaaaagctggtacttcac cgaaaacatg
gagcgaaatt gccgggctcc atgtaatatt cagatggaagaccccacatt caaggagaac
taccgctttc atgccatcaa tgggtatatt atggatactctgcccggact ggtcatggct
caggaccaga gaatcaggtg gtacctgctg agcatggggtccaacgagaa tatccactca
attcatttca gcggacacgt gtttactgtc cggaagaaagaagagtataa aatggccctg
tacaacctgt atcccggcgt gttcgaaacc gtcgagatgctgcctagcaa ggcagggatc
tggagagtgg aatgcctgat tggggagcac ctgcatgccggaatgtctac cctgtttctg
gtgtacagta ataagtgtca gacacccctg gggatggcttccggacatat ccgggatttc
cagattaccg catctggaca gtacggccag tgggcccctaagctggctag actgcactat
tccgggtcta tcaacgcttg gtccacaaaa gagcctttctcttggattaa ggtggacctg
ctggcaccaa tgatcattca tggcatcaaa actcagggggccaggcagaa gttctcctct
ctgtacatct cacagtttat catcatgtac agcctggatggcaagaaatg gcagacatac
cgcggcaata gcacagggac tctgatggtg ttctttggcaacgtggacag ttcagggatc
aagcacaaca ttttcaatcc ccctatcatt gctagatacatcaggctgca cccaacccat
tattctattc gaagtacact gcggatggaa ctgatggggtgcgatctgaa cagttgttca
atgcccctgg gaatggagtc caaggcaatc tctgacgcccagattaccgc tagctcctac
ttcactaata tgtttgctac ctggagcccc tccaaagcacgactgcatct gcagggacga
agcaacgcat ggcgaccaca ggtgaacaat cccaaggagtggctgcaggt cgattttcag
aaaactatga aggtgaccgg agtcacaact cagggcgtgaaaagtctgct gacctcaatg
tacgtcaagg agttcctgat ctctagttca caggacggccaccagtggac actgttcttt
cagaacggaa aggtgaaagt cttccagggc aatcaggattcctttacacc tgtggtcaac
tctctggacc cacccctgct gactcgctac ctgcgaatccacccacagtc ctgggtgcat
cagattgcac tgagaatgga agtcctgggc tgcgaggcccaggacctgta ttga
変異型ＴＴＲプロモーター（ＴＴＲｍｕｔ）、合成イントロン、ＣｐＧ減少第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ、ポリＡ及びＩＴＲを含む完全長カセット（配列番号２３）
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgcccgggcaaag cccgggcgtc
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagcgcgcagagag ggagtggcca
actccatcac taggggttcc tacgcgtgtc tgtctgcacatttcgtagag cgagtgttcc
gatactctaa tctccctagg caaggttcat attgacttaggttacttatt ctccttttgt
tgactaagtc aataatcaga atcagcaggt ttggagtcagcttggcaggg atcagcagcc
tgggttggaa ggagggggta taaaagcccc ttcaccaggagaagccgtca cacagatcca
caagctcctg ctagcaggta agtgccgtgt gtggttcccgcgggcctggc ctctttacgg
gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactg acactgacatccactttttc tttttctcca
caggtttaaa cgccaccatg cagattgagc tgagcacctgcttcttcctg tgtctgctga
ggttctgctt ctctgccacc aggaggtatt acctgggggctgtggagctg agctgggact
atatgcagtc tgacctgggg gagctgcctg tggatgctaggttccccccc agggtgccca
agagcttccc ctttaacact tctgtggtgt acaagaagaccctgtttgtg gagttcactg
accacctgtt caacattgcc aagcccaggc ccccctggatggggctgctg gggcccacca
tccaggctga ggtgtatgac actgtggtga tcaccctgaagaacatggcc agccaccctg
tgagcctgca tgctgtgggg gtgagctact ggaaggcttctgagggggct gagtatgatg
accagactag ccagagggag aaggaggatg acaaggtgtttcctgggggc agccatacct
atgtgtggca ggtgctgaag gagaatggcc ccatggcctctgaccccctg tgcctgacct
acagctacct gtctcatgtg gacctggtga aggacctgaactctggcctg attggggctc
tgctggtgtg tagggagggc agcctggcta aggaaaagacccagaccctg cataagttta
tcctgctgtt tgctgtgttt gatgagggca agagctggcactctgagacc aagaacagcc
tgatgcagga tagggatgct gcctctgcca gggcttggcctaagatgcac actgtgaatg
ggtatgtgaa taggagcctg cctggcctga ttggctgccacaggaagtct gtgtactggc
atgtgattgg gatgggcacc acccctgagg tccatagcatcttcctggag ggccacactt
tcctggtgag gaaccacaga caggcctctc tggagatctctcccatcacc ttcctgactg
ctcagactct gctgatggac ctgggccagt tcctgctgttttgccatatt agcagccacc
agcatgatgg gatggaggcc tatgtgaagg tggatagctgccctgaggag cctcagctga
ggatgaagaa caatgaggag gctgaagact atgatgatgacctgactgat tctgagatgg
atgtggtgag gtttgatgat gacaatagcc ccagcttcattcagatcagg tctgtggcca
agaaacaccc caagacctgg gtgcactaca ttgctgctgaggaagaggac tgggactatg
ctcccctggt gctggcccct gatgataggt cttataagagccagtacctg aacaatgggc
cccagaggat tggcaggaag tacaagaagg tgaggttcatggcctacact gatgaaacct
tcaaaaccag ggaggccatt cagcatgagt ctggcatcctgggccctctg ctgtatgggg
aggtggggga caccctgctg atcatcttca agaaccaggccagcaggccc tacaacatct
atcctcatgg catcactgat gtgaggcccc tgtacagcaggaggctgccc aagggggtga
agcacctgaa agacttcccc atcctgcctg gggagatctttaagtataag tggactgtga
ctgtggagga tggccctacc aagtctgacc ccaggtgtctgaccaggtac tattctagct
ttgtgaacat ggagagggac ctggcctctg gcctgattgggcccctgctg atctgctaca
aggagtctgt ggaccagagg ggcaaccaga tcatgtctgacaagaggaat gtgatcctgt
tttctgtgtt tgatgagaat aggagctggt acctgactgagaacatccag aggtttctgc
ccaatcctgc tggggtgcag ctggaggatc ctgagttccaggccagcaat atcatgcata
gcatcaatgg ctatgtgttt gacagcctgc agctgtctgtgtgcctgcat gaggtggcct
actggtacat cctgagcatt ggggcccaga ctgactttctgtctgtgttc ttttctggct
ataccttcaa gcacaagatg gtgtatgagg ataccctgaccctgttcccc ttctctgggg
agactgtgtt catgagcatg gagaatcctg ggctgtggatcctggggtgc cacaactctg
attttaggaa cagggggatg actgccctgc tgaaggtgtctagctgtgat aagaacactg
gggactacta tgaggacagc tatgaggaca tttctgcttatctgctgtct aagaataatg
ccattgagcc cagaagcttc agccagaatc cccctgtgctgaagagacat cagagggaga
tcaccagaac taccctgcag tctgatcagg aggagattgactatgatgac actatctctg
tggagatgaa gaaggaggac tttgacatct atgatgaggatgagaatcag tctcccagga
gctttcagaa gaagaccaga cattacttca ttgctgctgtggagaggctg tgggactatg
gcatgagctc tagccctcat gtgctgagga acagggcccagtctggctct gtgccccagt
tcaagaaggt ggtgttccag gaattcactg atggcagcttcacccagccc ctgtacaggg
gggagctgaa tgagcacctg ggcctgctgg ggccttatatcagggctgag gtggaggata
atattatggt gactttcagg aaccaggcca gcaggccctactctttctat agcagcctga
tctcttatga ggaggatcag aggcaggggg ctgagcctaggaagaacttt gtgaagccca
atgagactaa gacctacttc tggaaggtcc agcaccacatggcccctacc aaggatgagt
ttgactgcaa ggcctgggcc tatttctctg atgtggatctggagaaggat gtccattctg
ggctgattgg ccccctgctg gtgtgccaca ctaacactctgaatcctgcc catggcaggc
aggtgactgt ccaggagttt gccctgttct tcactatctttgatgagacc aagagctggt
actttactga gaacatggag aggaactgca gagctccttgcaatattcag atggaggacc
ccaccttcaa ggagaattac aggttccatg ccattaatgggtacatcatg gacaccctgc
ctggcctggt gatggctcag gaccagagga tcaggtggtacctgctgagc atgggctcta
atgagaatat ccacagcatc cacttctctg ggcatgtgttcactgtgagg aagaaggagg
agtacaagat ggctctgtat aatctgtacc ctggggtgtttgaaactgtg gagatgctgc
cctctaaggc tggcatctgg agggtggagt gcctgattggggagcacctg catgctggca
tgagcaccct gttcctggtg tacagcaaca agtgccagacccccctgggc atggcctctg
gccacatcag ggacttccag atcactgcct ctggccagtatggccagtgg gcccccaagc
tggccaggct gcactattct ggcagcatca atgcctggagcaccaaggag cccttcagct
ggatcaaggt ggacctgctg gcccccatga tcattcatggcatcaagacc cagggggcca
ggcagaagtt cagctctctg tacatctctc agttcatcatcatgtactct ctggatggga
agaagtggca gacctacagg ggcaacagca ctggcaccctgatggtgttc tttgggaatg
tggactcttc tggcatcaag cacaacatct tcaatccccccatcattgct aggtatatta
ggctgcatcc cacccactac agcatcaggt ctaccctgaggatggagctg atgggctgtg
acctgaactc ttgcagcatg cccctgggca tggagtctaaggccatctct gatgcccaga
ttactgccag cagctacttc accaacatgt ttgccacctggagcccctct aaggccaggc
tgcatctgca ggggaggagc aatgcctgga ggcctcaggtgaacaacccc aaggagtggc
tgcaggtgga tttccagaag accatgaagg tgactggggtgaccacccag ggggtcaaga
gcctgctgac cagcatgtat gtgaaggagt tcctgatcagcagcagccag gatggccacc
agtggactct gttctttcag aatgggaagg tgaaggtgtttcagggcaat caggactctt
tcacccctgt ggtgaacagc ctggaccccc ccctgctgaccagatacctg aggatccacc
cccagtcttg ggtgcatcag attgccctga ggatggaggtgctgggctgt gaggctcagg
atctgtactg agcggccgca ataaaagatc agagctctagagatctgtgt gttggttttt
tgtgtaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctctctgcgcgctc gctcgctcac
tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggctttgcccgggcgg cctcagtgag
cgagcgagcg cgcagctgcc tgcagg
変異型ＴＴＲプロモーター（ＴＴＲｍｕｔ）、合成イントロン、ＣｐＧ減少第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ、ポリＡ及びＩＴＲを含む完全長プラスミド（配列番号２４）
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgcccgggcaaag cccgggcgtc
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagcgcgcagagag ggagtggcca
actccatcac taggggttcc tacgcgtgtc tgtctgcacatttcgtagag cgagtgttcc
gatactctaa tctccctagg caaggttcat attgacttaggttacttatt ctccttttgt
tgactaagtc aataatcaga atcagcaggt ttggagtcagcttggcaggg atcagcagcc
tgggttggaa ggagggggta taaaagcccc ttcaccaggagaagccgtca cacagatcca
caagctcctg ctagcaggta agtgccgtgt gtggttcccgcgggcctggc ctctttacgg
gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactg acactgacatccactttttc tttttctcca
caggtttaaa cgccaccatg cagattgagc tgagcacctgcttcttcctg tgtctgctga
ggttctgctt ctctgccacc aggaggtatt acctgggggctgtggagctg agctgggact
atatgcagtc tgacctgggg gagctgcctg tggatgctaggttccccccc agggtgccca
agagcttccc ctttaacact tctgtggtgt acaagaagaccctgtttgtg gagttcactg
accacctgtt caacattgcc aagcccaggc ccccctggatggggctgctg gggcccacca
tccaggctga ggtgtatgac actgtggtga tcaccctgaagaacatggcc agccaccctg
tgagcctgca tgctgtgggg gtgagctact ggaaggcttctgagggggct gagtatgatg
accagactag ccagagggag aaggaggatg acaaggtgtttcctgggggc agccatacct
atgtgtggca ggtgctgaag gagaatggcc ccatggcctctgaccccctg tgcctgacct
acagctacct gtctcatgtg gacctggtga aggacctgaactctggcctg attggggctc
tgctggtgtg tagggagggc agcctggcta aggaaaagacccagaccctg cataagttta
tcctgctgtt tgctgtgttt gatgagggca agagctggcactctgagacc aagaacagcc
tgatgcagga tagggatgct gcctctgcca gggcttggcctaagatgcac actgtgaatg
ggtatgtgaa taggagcctg cctggcctga ttggctgccacaggaagtct gtgtactggc
atgtgattgg gatgggcacc acccctgagg tccatagcatcttcctggag ggccacactt
tcctggtgag gaaccacaga caggcctctc tggagatctctcccatcacc ttcctgactg
ctcagactct gctgatggac ctgggccagt tcctgctgttttgccatatt agcagccacc
agcatgatgg gatggaggcc tatgtgaagg tggatagctgccctgaggag cctcagctga
ggatgaagaa caatgaggag gctgaagact atgatgatgacctgactgat tctgagatgg
atgtggtgag gtttgatgat gacaatagcc ccagcttcattcagatcagg tctgtggcca
agaaacaccc caagacctgg gtgcactaca ttgctgctgaggaagaggac tgggactatg
ctcccctggt gctggcccct gatgataggt cttataagagccagtacctg aacaatgggc
cccagaggat tggcaggaag tacaagaagg tgaggttcatggcctacact gatgaaacct
tcaaaaccag ggaggccatt cagcatgagt ctggcatcctgggccctctg ctgtatgggg
aggtggggga caccctgctg atcatcttca agaaccaggccagcaggccc tacaacatct
atcctcatgg catcactgat gtgaggcccc tgtacagcaggaggctgccc aagggggtga
agcacctgaa agacttcccc atcctgcctg gggagatctttaagtataag tggactgtga
ctgtggagga tggccctacc aagtctgacc ccaggtgtctgaccaggtac tattctagct
ttgtgaacat ggagagggac ctggcctctg gcctgattgggcccctgctg atctgctaca
aggagtctgt ggaccagagg ggcaaccaga tcatgtctgacaagaggaat gtgatcctgt
tttctgtgtt tgatgagaat aggagctggt acctgactgagaacatccag aggtttctgc
ccaatcctgc tggggtgcag ctggaggatc ctgagttccaggccagcaat atcatgcata
gcatcaatgg ctatgtgttt gacagcctgc agctgtctgtgtgcctgcat gaggtggcct
actggtacat cctgagcatt ggggcccaga ctgactttctgtctgtgttc ttttctggct
ataccttcaa gcacaagatg gtgtatgagg ataccctgaccctgttcccc ttctctgggg
agactgtgtt catgagcatg gagaatcctg ggctgtggatcctggggtgc cacaactctg
attttaggaa cagggggatg actgccctgc tgaaggtgtctagctgtgat aagaacactg
gggactacta tgaggacagc tatgaggaca tttctgcttatctgctgtct aagaataatg
ccattgagcc cagaagcttc agccagaatc cccctgtgctgaagagacat cagagggaga
tcaccagaac taccctgcag tctgatcagg aggagattgactatgatgac actatctctg
tggagatgaa gaaggaggac tttgacatct atgatgaggatgagaatcag tctcccagga
gctttcagaa gaagaccaga cattacttca ttgctgctgtggagaggctg tgggactatg
gcatgagctc tagccctcat gtgctgagga acagggcccagtctggctct gtgccccagt
tcaagaaggt ggtgttccag gaattcactg atggcagcttcacccagccc ctgtacaggg
gggagctgaa tgagcacctg ggcctgctgg ggccttatatcagggctgag gtggaggata
atattatggt gactttcagg aaccaggcca gcaggccctactctttctat agcagcctga
tctcttatga ggaggatcag aggcaggggg ctgagcctaggaagaacttt gtgaagccca
atgagactaa gacctacttc tggaaggtcc agcaccacatggcccctacc aaggatgagt
ttgactgcaa ggcctgggcc tatttctctg atgtggatctggagaaggat gtccattctg
ggctgattgg ccccctgctg gtgtgccaca ctaacactctgaatcctgcc catggcaggc
aggtgactgt ccaggagttt gccctgttct tcactatctttgatgagacc aagagctggt
actttactga gaacatggag aggaactgca gagctccttgcaatattcag atggaggacc
ccaccttcaa ggagaattac aggttccatg ccattaatgggtacatcatg gacaccctgc
ctggcctggt gatggctcag gaccagagga tcaggtggtacctgctgagc atgggctcta
atgagaatat ccacagcatc cacttctctg ggcatgtgttcactgtgagg aagaaggagg
agtacaagat ggctctgtat aatctgtacc ctggggtgtttgaaactgtg gagatgctgc
cctctaaggc tggcatctgg agggtggagt gcctgattggggagcacctg catgctggca
tgagcaccct gttcctggtg tacagcaaca agtgccagacccccctgggc atggcctctg
gccacatcag ggacttccag atcactgcct ctggccagtatggccagtgg gcccccaagc
tggccaggct gcactattct ggcagcatca atgcctggagcaccaaggag cccttcagct
ggatcaaggt ggacctgctg gcccccatga tcattcatggcatcaagacc cagggggcca
ggcagaagtt cagctctctg tacatctctc agttcatcatcatgtactct ctggatggga
agaagtggca gacctacagg ggcaacagca ctggcaccctgatggtgttc tttgggaatg
tggactcttc tggcatcaag cacaacatct tcaatccccccatcattgct aggtatatta
ggctgcatcc cacccactac agcatcaggt ctaccctgaggatggagctg atgggctgtg
acctgaactc ttgcagcatg cccctgggca tggagtctaaggccatctct gatgcccaga
ttactgccag cagctacttc accaacatgt ttgccacctggagcccctct aaggccaggc
tgcatctgca ggggaggagc aatgcctgga ggcctcaggtgaacaacccc aaggagtggc
tgcaggtgga tttccagaag accatgaagg tgactggggtgaccacccag ggggtcaaga
gcctgctgac cagcatgtat gtgaaggagt tcctgatcagcagcagccag gatggccacc
agtggactct gttctttcag aatgggaagg tgaaggtgtttcagggcaat caggactctt
tcacccctgt ggtgaacagc ctggaccccc ccctgctgaccagatacctg aggatccacc
cccagtcttg ggtgcatcag attgccctga ggatggaggtgctgggctgt gaggctcagg
atctgtactg agcggccgca ataaaagatc agagctctagagatctgtgt gttggttttt
tgtgtaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctctctgcgcgctc gctcgctcac
tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggctttgcccgggcgg cctcagtgag
cgagcgagcg cgcagctgcc tgcaggggca gcttgaaggaaatactaagg caaaggtact
gcaagtgctc gcaacattcg cttatgcgga ttattgccgtagtgccgcga cgccgggggc
aagatgcaga gattgccatg gtacaggccg tgcggttgatattgccaaaa cagagctgtg
ggggagagtt gtcgagaaag agtgcggaag atgcaaaggcgtcggctatt caaggatgcc
agcaagcgca gcatatcgcg ctgtgacgat gctaatcccaaaccttaccc aacccacctg
gtcacgcact gttaagccgc tgtatgacgc tctggtggtgcaatgccaca aagaagagtc
aatcgcagac aacattttga atgcggtcac acgttagcagcatgattgcc acggatggca
acatattaac ggcatgatat tgacttattg aataaaattgggtaaatttg actcaacgat
gggttaattc gctcgttgtg gtagtgagat gaaaagaggcggcgcttact accgattccg
cctagttggt cacttcgacg tatcgtctgg aactccaaccatcgcaggca gagaggtctg
caaaatgcaa tcccgaaaca gttcgcaggt aatagttagagcctgcataa cggtttcggg
attttttata tctgcacaac aggtaagagc attgagtcgataatcgtgaa gagtcggcga
gcctggttag ccagtgctct ttccgttgtg ctgaattaagcgaataccgg aagcagaacc
ggatcaccaa atgcgtacag gcgtcatcgc cgcccagcaacagcacaacc caaactgagc
cgtagccact gtctgtcctg aattcattag taatagttacgctgcggcct tttacacatg
accttcgtga aagcgggtgg caggaggtcg cgctaacaacctcctgccgt tttgcccgtg
catatcggtc acgaacaaat ctgattacta aacacagtagcctggatttg ttctatcagt
aatcgacctt attcctaatt aaatagagca aatccccttattgggggtaa gacatgaaga
tgccagaaaa acatgacctg ttggccgcca ttctcgcggcaaaggaacaa ggcatcgggg
caatccttgc gtttgcaatg gcgtaccttc gcggcagatataatggcggt gcgtttacaa
aaacagtaat cgacgcaacg atgtgcgcca ttatcgcctagttcattcgt gaccttctcg
acttcgccgg actaagtagc aatctcgctt atataacgagcgtgtttatc ggctacatcg
gtactgactc gattggttcg cttatcaaac gcttcgctgctaaaaaagcc ggagtagaag
atggtagaaa tcaataatca acgtaaggcg ttcctcgatatgctggcgtg gtcggaggga
actgataacg gacgtcagaa aaccagaaat catggttatgacgtcattgt aggcggagag
ctatttactg attactccga tcaccctcgc aaacttgtcacgctaaaccc aaaactcaaa
tcaacaggcg ccggacgcta ccagcttctt tcccgttggtgggatgccta ccgcaagcag
cttggcctga aagacttctc tccgaaaagt caggacgctgtggcattgca gcagattaag
gagcgtggcg ctttacctat gattgatcgt ggtgatatccgtcaggcaat cgaccgttgc
agcaatatct gggcttcact gccgggcgct ggttatggtcagttcgagca taaggctgac
agcctgattg caaaattcaa agaagcgggc ggaacggtcagagagattga tgtatgagca
gagtcaccgc gattatctcc gctctggtta tctgcatcatcgtctgcctg tcatgggctg
ttaatcatta ccgtgataac gccattacct acaaagcccagcgcgacaaa aatgccagag
aactgaagct ggcgaacgcg gcaattactg acatgcagatgcgtcagcgt gatgttgctg
cgctcgatgc aaaatacacg aaggagttag ctgatgctaaagctgaaaat gatgctctgc
gtgatgatgt tgccgctggt cgtcgtcggt tgcacatcaaagcagtctgt cagtcagtgc
gtgaagccac caccgcctcc ggcgtggata atgcagcctccccccgactg gcagacaccg
ctgaacggga ttatttcacc ctcagagaga ggctgatcactatgcaaaaa caactggaag
gaacccagaa gtatattaat gagcagtgca gatagagttgcccatatcga tgggcaactc
atgcaattat tgtgagcaat acacacgcgc ttccagcggagtataaatgc ctaaagtaat
aaaaccgagc aatccattta cgaatgtttg ctgggtttctgttttaacaa cattttctgc
gccgccacaa attttggctg catcgacagt tttcttctgcccaattccag aaacgaagaa
atgatgggtg atggtttcct ttggtgctac tgctgccggtttgttttgaa cagtaaacgt
ctgttgagca catcctgtaa taagcagggc cagcgcagtagcgagtagca tttttttcat
ggtgttattc ccgatgcttt ttgaagttcg cagaatcgtatgtgtagaaa attaaacaaa
ccctaaacaa tgagttgaaa tttcatattg ttaatatttattaatgtatg tcaggtgcga
tgaatcgtca ttgtattccc ggattaacta tgtccacagccctgacgggg aacttctctg
cgggagtgtc cgggaataat taaaacgatg cacacagggtttagcgcgta cacgtattgc
attatgccaa cgccccggtg ctgacacgga agaaaccggacgttatgatt tagcgtggaa
agatttgtgt agtgttctga atgctctcag taaatagtaatgaattatca aaggtatagt
aatatctttt atgttcatgg atatttgtaa cccatcggaaaactcctgct ttagcaagat
tttccctgta ttgctgaaat gtgatttctc ttgatttcaacctatcatag gacgtttcta
taagatgcgt gtttcttgag aatttaacat ttacaacctttttaagtcct tttattaaca
cggtgttatc gttttctaac acgatgtgaa tattatctgtggctagatag taaatataat
gtgagacgtt gtgacgtttt agttcagaat aaaacaattcacagtctaaa tcttttcgca
cttgatcgaa tatttcttta aaaatggcaa cctgagccattggtaaaacc ttccatgtga
tacgagggcg cgtagtttgc attatcgttt ttatcgtttcaatctggtct gacctccttg
tgttttgttg atgatttatg tcaaatatta ggaatgttttcacttaatag tattggttgc
gtaacaaagt gcggtcctgc tggcattctg gagggaaatacaaccgacag atgtatgtaa
ggccaacgtg ctcaaatctt catacagaaa gatttgaagtaatattttaa ccgctagatg
aagagcaagc gcatggagcg acaaaatgaa taaagaacaatctgctgatg atccctccgt
ggatctgatt cgtgtaaaaa atatgcttaa tagcaccatttctatgagtt accctgatgt
tgtaattgca tgtatagaac ataaggtgtc tctggaagcattcagagcaa ttgaggcagc
gttggtgaag cacgataata atatgaagga ttattccctggtggttgact gatcaccata
actgctaatc attcaaacta tttagtctgt gacagagccaacacgcagtc tgtcactgtc
aggaaagtgg taaaactgca actcaattac tgcaatgccctcgtaattaa gtgaatttac
aatatcgtcc tgttcggagg gaagaacgcg ggatgttcattcttcatcac ttttaattga
tgtatatgct ctcttttctg acgttagtct ccgacggcaggcttcaatga cccaggctga
gaaattcccg gacccttttt gctcaagagc gatgttaatttgttcaatca tttggttagg
aaagcggatg ttgcgggttg ttgttctgcg ggttctgttcttcgttgaca tgaggttgcc
ccgtattcag tgtcgctgat ttgtattgtc tgaagttgtttttacgttaa gttgatgcag
atcaattaat acgatacctg cgtcataatt gattatttgacgtggtttga tggcctccac
gcacgttgtg atatgtagat gataatcatt atcactttacgggtcctttc cggtgatccg
acaggttacg gggcggcgac ctgcctgatg cggtattttctccttacgca tctgtgcggt
atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgccctgtagcggc gcattaagcg
cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacacttgccagcgcc ttagcgcccg
ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgccggctttccc cgtcaagctc
taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgctttacggcacctc gaccccaaaa
aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgccctgatagacg gtttttcgcc
ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactcttgttccaaact ggaacaacac
tcaactctat ctcgggctat tcttttgatt tagacctgcaggcatgcaag cttggcactg
gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcgttacccaact taatcgcctt
gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaagaggcccgcac cgatcgccct
tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgcgatttattcaacaaagc cgccgtcccg
tcaagtcagc gtaatgctct gccagtgtta caaccaattaaccaattctg attagaaaaa
ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt attcatatcaggattatcaa taccatattt
ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga aaactcaccgaggcagttcc ataggatggc
aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac tcgtccaacatcaatacaac ctattaattt
cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga gaaatcaccatgagtgacga ctgaatccgg
tgagaatggc aaaagcttat gcatttcttt ccagacttgttcaacaggcc agccattacg
ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa accgttattcattcgtgatt gcgcctgagc
gagacgaaat acgcgatcgc tgttaaaagg acaattacaaacaggaatcg aatgcaaccg
gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat attttcacctgaatcaggat attcttctaa
tacctggaat gctgttttcc cggggatcgc agtggtgagtaaccatgcat catcaggagt
acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg cataaattccgtcagccagt ttagtctgac
catctcatct gtaacatcat tggcaacgct acctttgccatgtttcagaa acaactctgg
cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat tgtcgcacctgattgcccga cattatcgcg
agcccattta tacccatata aatcagcatc catgttggaatttaatcgcg gcttcgagca
agacgtttcc cgttgaatat ggctcataac accccttgtattactgttta tgtaagcaga
cagttttatt gttcatgatg atatattttt atcttgtgcaatgtaacatc agagattttg
agacacaacg tggctttgtt gaataaatcg aacttttgctgagttgaagg atcagatcac
gcatcttccc gacaacgcag accgttccgt ggcaaagcaaaagttcaaaa tcaccaactg
gtccacctac aacaaagctc tcatcaaccg tggctccctcactttctggc tggatgatgg
ggcgattcag gcctggtatg agtcagcaac accttcttcacgaggcagac ctctcgacgg
agttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaaggatcttcttga gatccttttt
ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccaccgctaccagcg gtggtttgtt
tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaactggcttcagc agagcgcaga
taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggccaccacttcaag aactctgtag
caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagtggctgctgcc agtggcgata
agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttaccggataaggcg cagcggtcgg
gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcgaacgacctac accgaactga
gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcccgaagggaga aaggcggaca
ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcacgagggagctt ccagggggaa
acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacctctgacttgag cgtcgatttt
tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgccagcaacgcg gcctttttac
ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgt
Ｘ０１～Ｘ１８核酸配列によってコードされるＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ［ＳＱ配列は太字／下線付き］（配列番号２５）
MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
ＢＤＤを有する野生型ＦＶＩＩＩ（配列番号２６）
MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
ＡＡＶ－ＬＫ０３ ＶＰ１カプシド（配列番号２７）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL
ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５及びＡＡＶ－ＳＰＫ－ｈＦＩＸに使用されたＡＡＶ－ＳＰＫ ＶＰ１カプシド（配列番号２８）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL
Figure 2022137029000010
使用した特定の定義／略語
ＢＤＤ：Ｂドメイン（ＢＤ）の全て又は少なくとも一部を欠失
ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ：Ｂドメインを欠失したＦＶＩＩＩ
ＳＱ：ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ（配列番号２９）
ＦＶＩＩＩ／ＳＱ：ＳＱを有するＦＶＩＩＩ
ＦＶＩＩＩＸ０１－Ｘ１８：それぞれ配列番号１～１８に示されるＣｐＧ減少ＦＶＩＩＩをコードする核酸変種
ＴＴＲｍｕｔ：ＴＡｍＧＴＧＴＡＧからＴＡＴＴＧＡＣＴＴＡＧへの４つの変異を有するＴＴＲプロモーター
ＣＯ３：配列番号２１に示されるコドン最適化されたＦＶＩＩＩ核酸変種
ＮＨＰ：非ヒト霊長類
ＡＬＴ：アラニンアミノトランスフェラーゼ
Ｄ－ダイマー：血餅の分解からのタンパク質断片
ＳＰＫ－８００５：ＡＡＶカプシド（配列番号２８）＋ＴＴＲｍｕｔ－ｈＦＶＩＩＩ－Ｘ０７；ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５とも呼ばれる
ＳＰＫ－８０１１：ＡＡＶ ＬＫ０３カプシド（配列番号２７）＋ＴＴＲｍｕｔ－ｈＦＶＩＩＩ－Ｘ０７；ＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１とも呼ばれる
[0273]本発明の実施形態のうちのいくつかを説明し、上に詳細に例示したが、本発明がそのような実施形態に限定されることを意図するわけではない。以下の特許請求の範囲に示されるような本発明の範囲及び精神から逸脱せずに、これらの実施形態に様々な改変を行うことができる。
［関連出願］
[0001]本特許出願は、２０１５年１０月３０日に出願された米国特許出願第６２／２４９，００１号、２０１６年５月４日に出願された同第６２／３３１，８７２号、２０１６年６月１３日に出願された同第６２／３４９，５３２号、及び２０１６年７月１日に出願された同第６２／３５７，８７４号の利益を主張し、これらの出願のうちの全ては、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれている。

Claims (106)

  1. 配列番号７と９２％以上の配列同一性を有する、Ｂドメインの欠失を有する第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をコードする核酸変種。
  2. 配列番号７と９３％以上の配列同一性を有する、請求項１に記載の核酸変種。
  3. 配列番号７と９４％以上の配列同一性を有する、請求項１に記載の核酸変種。
  4. 配列番号７と９５％以上の配列同一性を有する、請求項１に記載の核酸変種。
  5. 配列番号７と９５％～１００％の配列同一性を有する、請求項１に記載の核酸変種。
  6. ２０個以下、１５個以下、又は１０個以下のシトシン－グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を有する、請求項１に記載の核酸変種。
  7. ５つ以下のシトシン－グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を有する、請求項１に記載の核酸変種。
  8. 記載なし。
  9. ４、３、２、１又は０個のシトシン－グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を有する、請求項１に記載の核酸変種。
  10. 配列ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ（配列番号２９）の１つ若しくは複数のアミノ酸の欠失、又は配列ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ全体の欠失を有する配列番号２５をコードする、請求項１に記載の核酸変種。
  11. 配列番号２５をコードする、請求項１に記載の核酸変種。
  12. 配列番号１９よりも少ないシトシン－グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を有する、Ｂドメインの欠失を有する第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）（ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸変種。
  13. 前記ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤが哺乳動物性である、請求項１２に記載の核酸変種。
  14. ２つ以下のシトシン－グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を有する、Ｂドメインの欠失を有するヒト第ＶＩＩＩ因子（ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸変種。
  15. １つのシトシン－グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を有する、請求項１４に記載の核酸変種。
  16. シトシン－グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を有さない、請求項１４に記載の核酸変種。
  17. コードされるＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤが、配列番号１９によってコードされるｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤと同一である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の核酸変種。
  18. ＦＶＩＩＩ－Ｖ３（配列番号２０）及びＣＯ３（配列番号２１）と異なる、請求項１～１７のいずれか一項に記載の核酸変種。
  19. 配列ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ（配列番号２９）の１つ若しくは複数のアミノ酸の欠失、又は配列ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ全体の欠失を有する配列番号２５をコードする、請求項１～１８のいずれか一項に記載の核酸変種。
  20. 配列番号２５をコードする、請求項１～１８のいずれか一項に記載の核酸変種。
  21. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸変種を含むベクター。
  22. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸変種を含む発現ベクター。
  23. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、プラスミド、又はレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項２２に記載の発現ベクター。
  24. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型又はＡＡＶ偽型を含み、前記ＡＡＶ偽型が、ＩＴＲ血清型と異なるＡＡＶカプシド血清型を含む、請求項２３に記載の発現ベクター。
  25. イントロン、発現制御エレメント、１つ若しくは複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位反復配列（ＩＴＲ）及び／又はフィラーポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２３又は２４に記載の発現ベクター。
  26. イントロンが、核酸変種内にあるか、又はそれに隣接する、請求項２５に記載の発現ベクター。
  27. 発現制御エレメントが、核酸変種に作動可能に連結されている、請求項２５に記載の発現ベクター。
  28. ＡＡＶ ＩＴＲ（複数可）が、核酸変種の５’又は３’末端に隣接する、請求項２５に記載の発現ベクター。
  29. フィラーポリヌクレオチド配列が、核酸変種の５’又は３’末端に隣接する、請求項２５に記載の発現ベクター。
  30. イントロン、発現制御エレメント、１つ若しくは複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位反復配列（ＩＴＲ）及び／又はフィラーポリヌクレオチド配列が、減少したシトシン－グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を有するように改変されている、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  31. イントロン、発現制御エレメント、１つ若しくは複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位反復配列（ＩＴＲ）及び／又はフィラーポリヌクレオチド配列が、２０個以下、１５個以下、１０個以下、５つ以下又は０個のシトシン－グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を有するように改変されている、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  32. 発現制御エレメントが、構成的若しくは調節可能制御エレメント、又は組織特異的発現制御エレメント若しくはプロモーターを含む、請求項２５、２７、３０及び３１のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  33. 発現制御エレメントが、肝臓における発現を付与するエレメントを含む、請求項２５、２７、３０及び３１のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  34. 発現制御エレメントが、ＴＴＲプロモーター又は変異型ＴＴＲプロモーターを含む、請求項２５、２７、３０及び３１のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  35. 変異型ＴＴＲプロモーターが、配列番号２２を含む、請求項３４に記載の発現ベクター。
  36. ＩＴＲが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４若しくはＡＡＶ－２ｉ８ ＡＡＶ血清型、又はその組合せのうちのいずれかの１つ又は複数のＩＴＲを含む、請求項２５～３５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  37. 配列番号２３に示されるＩＴＲ、プロモーター、ポリＡシグナル及び／又はイントロン配列を含む、請求項２４～３０のいずれか一項に記載の発現ベクター。
  38. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸変種又は請求項２５～３７のいずれか一項に記載の発現ベクターを含むＡＡＶベクター。
  39. 改変若しくは変種ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシド配列、又は野生型ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２及び／若しくはＶＰ３カプシド配列を含む、請求項３８に記載のＡＡＶベクター。
  40. ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８ ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３配列と９０％以上の配列同一性を有する改変又は変種ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３カプシド配列を含む、請求項３８に記載のＡＡＶベクター。
  41. ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８ ＡＡＶ血清型のうちのいずれかから選択されるＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３カプシド配列を含む、請求項３８に記載のＡＡＶベクター。
  42. ＬＫ０３カプシド（配列番号２７）と９０％以上の配列同一性を有するカプシドを含む、請求項３８に記載のＡＡＶベクター。
  43. ＳＰＫカプシド（配列番号２８）と９０％以上の配列同一性を有するカプシドを含む、請求項３８に記載のＡＡＶベクター。
  44. ＬＫ０３カプシド（配列番号２７）を含む、請求項３８に記載のＡＡＶベクター。
  45. ＳＰＫカプシド（配列番号２８）を含む、請求項３８に記載のＡＡＶベクター。
  46. 配列番号７の核酸変種及びＬＫ０３カプシド配列（配列番号２７）を含む、請求項３８に記載のＡＡＶベクター。
  47. 配列番号７の核酸変種及びＳＰＫカプシド（配列番号２８）を含む、請求項３８に記載のＡＡＶベクター。
  48. 核酸変種と、配列番号２３における変異型ＴＴＲプロモーター（ＴＴＲｍｕｔ）、合成イントロン、ポリＡ及びＩＴＲのうちの１つ又は複数とを含む、請求項３８に記載のＡＡＶベクター。
  49. 核酸変種と、配列番号２３における変異型ＴＴＲプロモーター（ＴＴＲｍｕｔ）、合成イントロン、ポリＡ及びＩＴＲのうちの１つ又は複数と、ＬＫ０３カプシド配列（配列番号２７）又はＳＰＫカプシド（配列番号２８）とを含む、請求項３８に記載のＡＡＶベクター。
  50. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸変種又は請求項２１～３７のいずれか一項に記載のベクター若しくは発現ベクターを含む、宿主細胞。
  51. 前記核酸変種によってコードされるＦＶＩＩＩを発現している、請求項５０に記載の宿主細胞。
  52. 請求項３８～４９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む宿主細胞。
  53. 請求項３８～４９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを産生している、請求項５２に記載の宿主細胞。
  54. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸変種、請求項２１～３７のいずれか一項に記載のベクター若しくは発現ベクター、又は請求項３８～４９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを、生物学的に適合性の担体又は賦形剤中に含む医薬組成物。
  55. リポソームに封入された、又はリン脂質若しくはミセルと混合された、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸変種、請求項２１～３７のいずれか一項に記載のベクター若しくは発現ベクター、又は請求項３８～４９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  56. 空のカプシドＡＡＶをさらに含む、請求項５４又は５５に記載の医薬組成物。
  57. ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及び／又はＡＡＶ－Ｒｈ７４血清型の空のカプシドをさらに含む、請求項５４又は５５に記載の医薬組成物。
  58. 投与されたＡＡＶベクターと同じ血清型の空のカプシドＡＡＶをさらに含む、請求項５４又は５５に記載の医薬組成物。
  59. 空のカプシドがＬＫ０３カプシド（配列番号２７）又はＳＰＫカプシド（配列番号２８）である、請求項５４又は５５に記載の医薬組成物。
  60. 前記空のカプシドと前記ＡＡＶベクターとの比が、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、又は１０：１である、請求項５６～５９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  61. 哺乳動物又は哺乳動物細胞に核酸配列を送達又は移入するための方法であって、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸変種、請求項２１～３７のいずれか一項に記載のベクター若しくは発現ベクター、又は請求項３８～４９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを、前記哺乳動物又は哺乳動物細胞に投与するか、又はそれと接触させることにより、核酸配列を哺乳動物又は哺乳動物細胞に送達又は移入するステップを含む、方法。
  62. 第ＶＩＩＩ因子を必要とする哺乳動物を処置する方法であって、
    （ａ）請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸変種、請求項２１～３７のいずれか一項に記載のベクター若しくは発現ベクター、又は請求項３８～４９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを提供するステップ；及び
    （ｂ）請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸変種、請求項２１～３７のいずれか一項に記載のベクター若しくは発現ベクター、又は請求項３８～４９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターの量を、哺乳動物に投与するステップであって、前記第ＶＩＩＩ因子が哺乳動物において発現される、ステップ
    を含む、方法。
  63. 核酸変種によってコードされる前記第ＶＩＩＩ因子が、前記哺乳動物の細胞、組織又は器官に発現される、請求項６１又は６２に記載の方法。
  64. 細胞が分泌細胞を含む、請求項６３に記載の方法。
  65. 細胞が、内分泌細胞又は内皮細胞を含む、請求項６３に記載の方法。
  66. 細胞が、肝細胞、類洞内皮細胞、巨核球、血小板又は造血幹細胞を含む、請求項６３に記載の方法。
  67. 前記哺乳動物の組織又は器官が、肝臓を含む、請求項６３に記載の方法。
  68. 哺乳動物が、不十分な量の第ＶＩＩＩ因子タンパク質、又は欠陥若しくは異常第ＶＩＩＩ因子タンパク質を産生する、請求項６１～６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 哺乳動物が、血友病Ａを有する、請求項６１～６７のいずれか一項に記載の方法。
  70. 核酸変種によってコードされる第ＶＩＩＩ因子が、哺乳動物に有益効果又は治療効果を有するレベルで発現される、請求項６１～６７のいずれか一項に記載の方法。
  71. 止血関連障害を、それを必要とする患者において処置するための方法であって、生物学的に許容される担体中の、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸変種、請求項２１～３７のいずれか一項に記載のベクター若しくは発現ベクター、又は請求項３８～４９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターの治療有効量を患者に投与するステップを含む、方法。
  72. 前記哺乳動物又は前記患者が、血友病Ａ、フォンウィルブランド病及び外傷に関連する出血、傷害、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝固障害、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）並びに過剰抗凝固処置障害からなる群から選択される障害を有する、請求項６１、６２又は７１に記載の方法。
  73. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸変種、請求項２１～３７のいずれか一項に記載のベクター若しくは発現ベクター、又は請求項３８～４９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターが、前記哺乳動物又は前記患者に、静脈内で、動脈内で、筋肉内で、皮下で、腔内で、又は挿管により、又は経カテーテルで送達される、請求項６１～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. ＦＶＩＩＩが、血栓症のリスクを実質的に増加させないレベルで発現される、請求項６１～７２のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記血栓症のリスクが、フィブリン分解産物を測定することによって判定される、請求項７４に記載の方法。
  76. ＦＶＩＩＩが、血友病Ａを有さない対象において見出されるＦＶＩＩＩのレベルの１％よりも大きいレベルで発現される、請求項６１～７２のいずれか一項に記載の方法。
  77. ＦＶＩＩＩが、血友病Ａを有さない対象において見出されるＦＶＩＩＩのレベルの３％よりも大きいレベルで発現される、請求項６１～７２のいずれか一項に記載の方法。
  78. ＦＶＩＩＩの活性が、少なくとも１、２、３若しくは４週間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくは１１ヶ月間、又は少なくとも１年間検出可能である、請求項６１～７２のいずれか一項に記載の方法。
  79. ＦＶＩＩＩが、血友病Ａを有さない対象において見出されるＦＶＩＩＩのレベルの１％又は３％よりも大きいレベルで、少なくとも１、２、３若しくは４週間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくは１１ヶ月間、又は少なくとも１年間発現される、請求項６１～７２のいずれか一項に記載の方法。
  80. ＦＶＩＩＩが、治療効果を有するレベルで少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３若しくは１４日間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３若しくは１４週間、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３若しくは１４ヶ月間発現される、請求項６１～７２のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記ＦＶＩＩＩが、哺乳動物又は患者において、約２０％のＦＶＩＩＩ活性又は２０％よりも大きい活性のレベルで、少なくとも連続して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３若しくは１４日間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３若しくは１４週間、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３若しくは１４ヶ月間存在する、請求項６１～７２のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記ＦＶＩＩＩが、正常ＦＶＩＩＩレベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、又は５０％のレベルで発現される、請求項６１～７２のいずれか一項に記載の方法。
  83. ＡＡＶベクターが、哺乳動物又は患者のキログラムあたり１×１０１２個のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）未満の用量で投与され、前記ＦＶＩＩＩが、哺乳動物又は患者において、約２０％の活性若しくは２０％よりも大きい活性のレベルで、少なくとも連続して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３若しくは１４日間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３若しくは１４週間、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３若しくは１４ヶ月間産生される、請求項６１～７２のいずれか一項に記載の方法。
  84. ＡＡＶベクターが、哺乳動物又は患者のキログラムあたり約５×１０１１個のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の用量で投与され、前記ＦＶＩＩＩが、哺乳動物又は患者において、約２０％の活性又は２０％よりも大きい活性のレベルで少なくとも連続して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３若しくは１４日間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３若しくは１４週間、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３若しくは１４ヶ月間産生される、請求項６１～７２のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記哺乳動物又は前記患者がヒトである、請求項６１～８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記哺乳動物、前記患者又は前記ヒトが、ＡＡＶについて血清陽性又は血清陰性である、請求項６１～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. ＡＡＶの空のカプシドを前記哺乳動物又は前記患者に投与するステップをさらに含む、請求項６１～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及び／又はＡＡＶ－Ｒｈ７４血清型の空のカプシドを投与するステップをさらに含む、請求項６１～８６のいずれか一項に記載の方法。
  89. 投与されたＡＡＶベクターと同じ血清型の空のカプシドＡＡＶを投与するステップをさらに含む、請求項６１～８６のいずれか一項に記載の方法。
  90. 空のカプシドが、ＬＫ０３カプシド（配列番号２７）又はＳＰＫカプシド（配列番号２８）である、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記空のカプシドと前記ＡＡＶベクターとの比が、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、又は１０：１である、請求項８７～９０のいずれか一項に記載の方法。
  92. 免疫抑制剤を投与するステップをさらに含む、請求項６１～９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. ＡＡＶベクターが投与された後に免疫抑制剤を投与するステップをさらに含む、請求項６１～９１のいずれか一項に記載の方法。
  94. ＡＡＶベクターが投与された後、１時間以内から最大４５日までの期間に免疫抑制剤を投与するステップをさらに含む、請求項６１～９１のいずれか一項に記載の方法。
  95. 免疫抑制剤が、ステロイド、シクロスポリン（例えばシクロスポリンＡ）、ミコフェノレート、リツキシマブ又はその誘導体を含む、請求項９２～９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. ＡＡＶベクターが、哺乳動物又は患者の体重キログラムあたり約１×１０８～約１×１０１４個のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の範囲で投与される、請求項６１～９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. ＡＡＶベクターが、哺乳動物又は患者の体重キログラムあたり約１×１０９～約１×１０１３個のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の範囲で投与される、請求項６１～９５のいずれか一項に記載の方法。
  98. ＡＡＶベクターが、哺乳動物又は患者の体重キログラムあたり約１×１０１０～約１×１０１２個のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の範囲で投与される、請求項６１～９５のいずれか一項に記載の方法。
  99. ＡＡＶベクターが、哺乳動物又は患者の体重キログラムあたり約１×１０１１～約１×１０１２個のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の範囲で投与される、請求項６１～９５のいずれか一項に記載の方法。
  100. ＡＡＶベクターが、哺乳動物又は患者の体重キログラムあたり約１×１０１２～約１×１０１３個のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の範囲で投与される、請求項６１～９５のいずれか一項に記載の方法。
  101. ＡＡＶベクターが、哺乳動物又は患者の体重キログラムあたり約１×１０１３～約１×１０１４個のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の範囲で投与される、請求項６１～９５のいずれか一項に記載の方法。
  102. ＡＡＶベクターが、哺乳動物又は患者の体重キログラムあたり約５×１０１１～約１×１０１２個のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の範囲で投与される、請求項６１～９５のいずれか一項に記載の方法。
  103. ＡＡＶベクターが、哺乳動物又は患者の体重キログラムあたり約５×１０１１個のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の用量で投与される、請求項６１～９５のいずれか一項に記載の方法。
  104. ＡＡＶ抗体、ＡＡＶに対する免疫応答、ＦＶＩＩＩ抗体、ＦＶＩＩＩに対する免疫応答の存在若しくは量、ＦＶＩＩＩの量、ＦＶＩＩＩの活性レベル、１つ若しくは複数の肝臓酵素の量若しくはレベル又は出血エピソードの頻度及び／若しくは重症度若しくは持続時間について哺乳動物を分析又は監視するステップをさらに含む、請求項６１～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. ＦＶＩＩＩタンパク質を産生する方法であって、細胞において、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸変種、又は請求項２１～３７のいずれか一項に記載のベクター若しくは発現ベクターを発現させるステップ、及び細胞によって産生された前記ＦＶＩＩＩタンパク質を回収するステップを含む、方法。
  106. 細胞によって産生された前記ＦＶＩＩＩタンパク質を精製又は単離するステップをさらに含む、請求項１０５に記載の方法。

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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201508026D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Capsid
US10799566B2 (en) 2015-06-23 2020-10-13 The Children's Hospital Of Philadelphia Modified factor IX, and compositions, methods and uses for gene transfer to cells, organs, and tissues
US11584780B2 (en) 2016-07-26 2023-02-21 Biomarin Pharmaceutical Inc. Adeno-associated virus capsid proteins
KR20200066289A (ko) * 2017-08-01 2020-06-09 스파크 테라퓨틱스, 인코포레이티드 인자 viii (fviii) 유전자 요법 방법
SG11202000764RA (en) * 2017-08-09 2020-02-27 Bioverativ Therapeutics Inc Nucleic acid molecules and uses thereof
KR101952102B1 (ko) * 2017-12-07 2019-02-26 주식회사 지앤피바이오사이언스 단백질 발현량이 증대된 인자 ⅷ 변이체 발현벡터
KR20210008501A (ko) 2018-05-09 2021-01-22 바이오마린 파머수티컬 인크. 페닐케톤뇨증을 치료하는 방법
EP3794112A1 (en) 2018-05-14 2021-03-24 BioMarin Pharmaceutical Inc. Stable expression of aav vectors in juvenile subjects
TW202005978A (zh) 2018-05-14 2020-02-01 美商拜奧馬林製藥公司 新穎肝靶向腺相關病毒載體
US10842885B2 (en) 2018-08-20 2020-11-24 Ucl Business Ltd Factor IX encoding nucleotides
AU2019325688A1 (en) * 2018-08-24 2021-03-18 Spark Therapeutics, Inc. Optimized promoter sequences, intron-free expression constructs and methods of use
GB201900702D0 (en) * 2019-01-18 2019-03-06 Univ Bristol Therapy
AU2020221340A1 (en) 2019-02-15 2021-09-16 Bayer Healthcare Llc Gene editing for hemophilia A with improved Factor VIII expression
SG11202109850SA (en) * 2019-03-13 2021-10-28 Generation Bio Co Non-viral dna vectors and uses thereof for expressing fviii therapeutics
JP2023501262A (ja) * 2019-11-01 2023-01-18 フリーライン セラピューティクス リミテッド 転写調節エレメント
WO2023036054A2 (en) * 2021-09-08 2023-03-16 Inspirar Limited Composition and method for treating hemophilia
WO2023211316A1 (en) * 2022-04-28 2023-11-02 Joint Stock Company "Biocad" Codon-optimized nucleic acid encoding the fviii-bdd
WO2024050039A2 (en) * 2022-08-31 2024-03-07 Hydrogene Therapeutics, Inc. Methods and compositions for hydrodynamic gene delivery
CN115948408A (zh) * 2022-09-23 2023-04-11 上海信致医药科技有限公司 改进的人凝血因子viii基因表达盒及其应用

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6818439B1 (en) 1994-12-30 2004-11-16 Chiron Corporation Methods for administration of recombinant gene delivery vehicles for treatment of hemophilia and other disorders
US6458563B1 (en) * 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
US20020065236A1 (en) 1998-09-09 2002-05-30 Yew Nelson S. CpG reduced plasmids and viral vectors
US20060099685A1 (en) 1999-04-15 2006-05-11 Yallop Christopher A Recombinant expression of factor VIII in human cells
DE60042171D1 (de) * 1999-12-24 2009-06-18 Chemo Sero Therapeut Res Inst Faktor viii oder von willebrand faktor zur behandlung von thrombopathie assoziierenden hämorrhagischen erkrankungen
US6770744B2 (en) * 2000-09-19 2004-08-03 Emory University Modified factor VIII
DE102004037611B4 (de) * 2004-08-03 2013-10-02 Geneart Ag Induzierbare Genexpression
GB0908515D0 (en) 2009-05-18 2009-06-24 Apitope Technology Bristol Ltd Peptide
GB0911870D0 (en) 2009-07-08 2009-08-19 Ucl Business Plc Optimised coding sequence and promoter
ES2722209T3 (es) 2011-07-08 2019-08-08 Bioverativ Therapeutics Inc Polipéptidos quiméricos e híbridos del Factor VIII, y métodos de uso de los mismos
CA2864126A1 (en) * 2012-02-15 2013-08-22 Biogen Idec Ma Inc. Recombinant factor viii proteins
US20140271550A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Constructs and Methods for Delivering Molecules via Viral Vectors with Blunted Innate Immune Responses
DK3024498T3 (da) * 2013-07-22 2020-03-02 Childrens Hospital Philadelphia Aav-variant og sammensætninger, fremgangsmåder og anvendelser til genoverførsel til celler, organer og væv
CN112538501A (zh) * 2013-09-12 2021-03-23 生物马林药物股份有限公司 腺相关病毒因子viii载体
WO2015054439A2 (en) * 2013-10-08 2015-04-16 Haplomics, Inc. Hybrid factor viii polypeptides for use to treat hemophilia a
GB201403684D0 (en) * 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
JP2018506261A (ja) * 2014-08-13 2018-03-08 ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィアＴｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ 止血疾患を治療するための変異因子ｖｉｉｉのゲノム組込及び発現のための改良された発現カセット
BR112018008519A2 (pt) 2015-10-28 2018-11-06 Sangamo Therapeutics Inc construtos específicos de fígado, cassetes de expressão de fator viii e métodos de uso dos mesmos
KR20200066289A (ko) 2017-08-01 2020-06-09 스파크 테라퓨틱스, 인코포레이티드 인자 viii (fviii) 유전자 요법 방법

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