KR20200066289A - 인자 viii (fviii) 유전자 요법 방법 - Google Patents

인자 viii (fviii) 유전자 요법 방법 Download PDF

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스파크 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

FVIII 단백질을 인코딩하는 핵산 및 핵산 변이체를 포함하는 벡터를 사용하는 방법이 개시된다. 특정 구현예에서, 혈우병 A를 갖는 인간을 치료하는 방법은 인자 VIII(FVIII)를 인코딩하는 핵산 또는 B 도메인 결실을 갖는 인자 VIII(FVIII)(hFVIII-BDD)를 인코딩하는 핵산 변이체를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 핵산 변이체는 SEQ ID NO:7과 95% 이상의 동일성을 갖고/갖거나 핵산 변이체는 2개 이하의 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 갖는다. 다른 양태에서, rAAV 벡터는 킬로그램 당 약 6x1012개 미만의 벡터 유전체(vg/kg)의 용량으로 인간에게 투여된다.

Description

인자 VIII (FVIII) 유전자 요법 방법
관련 출원
본 특허 출원은 2017년 8월 1일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/540,053호; 2017년 11월 9일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/583,890호; 2017년 12월 8일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/596,535호; 및 2017년 12월 8일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/596,670호의 이익을 주장한다. 상기 출원의 전체 내용은 모든 본문, 표 및 도면을 포함하여 참조로서 본원에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 재조합 응고 인자 생성 및 이상 지혈과 관련된 의학적 장애의 치료 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인자 VIII(FVIII) 단백질을 인코딩하는 핵산을 투여하기 위한 방법, 및 혈우병 A 치료 방법을 제공한다.
서문
본 발명이 속하는 기술의 상태를 설명하기 위해 명세서 전체에 걸쳐 여러 간행물 및 특허 문헌이 인용된다. 이들 인용 각각은 전체적으로 제시된 바와 같이 본원에 참조로서 포함된다.
혈우병은 전 세계 5,000명의 남성 중 1명에 존재하는 X-연관 출혈 장애이다. 정상의 단지 1%를 초과하여 응고 인자 수준을 증가시키는 것을 목표로 하는 요법은 중증 질병 표현형의 실질적인 개선과 관련이 있다. 혈우병 B(HB)에 대한 AAV-매개 유전자 전달에 대한 최근의 임상 시험은 인자 IX(FIX)의 치료 수준의 지속된 장기간의 발현을 입증하였으나, AAV 벡터 용량은 AAV 캡시드에 대한 항-AAV 면역 반응으로 인해 제한될 수 있는 것으로 확립되었다. 이들 데이터는 혈우병 B와 관련이 있지만, 모든 혈우병의 80%는 FVIII 결핍인 혈우병 A(HA)에 기인한다.
상기 질병에 대한 현재의 치료는 인자 VIII 단백질의 빈번한 주입을 필요로 하는 단백질 대체 요법이다. 환자가 더 이상 상기 빈번한 단백질 치료를 필요로 하지 않도록 지속적인 치료 수준의 인자 VIII 발현을 달성할 즉각적인 필요가 있다. 실제로, 지속적인 인자 VIII 발현은 출혈 에피소드를 방지하고, 단백질에 대한 면역 내성이 확립되도록 보장할 수 있다.
개요
본 발명에 따르면, 혈우병 A를 갖거나 인자 VIII(FVIII)를 필요로 하는 인간을 치료하는 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 벡터 유전체는 B 도메인 결실을 갖는 인자 VIII(FVIII)(hFVIII-BDD)를 인코딩하는 핵산 변이체를 포함하고, 여기서 핵산 변이체는 SEQ ID NO:7과 95% 이상의 동일성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 벡터 유전체는 B 도메인 결실을 갖는 인자 VIII(FVIII)(hFVIII-BDD)를 인코딩하는 핵산 변이체를 포함하고, 여기서 핵산 변이체는 2개 이하의 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpGs)를 갖는다.
추가 구현예에서, 혈우병 A를 갖거나 인자 VIII(FVIII)를 필요로 하는 인간을 치료하는 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 벡터 유전체는 인자 VIII(FVIII)를 인코딩하거나 B 도메인 결실을 갖는 인자 VIII(FVIII)(hFVIII-BDD)를 인코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 인간에게 투여되는 rAAV 벡터의 용량은 킬로그램 당 6x1012 미만의 벡터 유전체(vg/kg)이다.
방법 및 용도의 구현예는 약 1x109 내지 약 1x1014 vg/kg의 용량의 rAAV 벡터를 인간에게 투여하는 것을 포함한다.
방법 및 용도의 구현예는 약 1x1010 내지 약 6x1013 vg/kg의 용량의 rAAV 벡터를 인간에게 투여하는 것을 포함한다.
방법 및 용도의 구현예는 약 1x1010 내지 약 1x1013 vg/kg의 용량의 rAAV 벡터를 인간에게 투여하는 것을 포함한다.
방법 및 용도의 구현예는 약 1x1010 내지 약 6x1012 vg/kg의 용량의 rAAV 벡터를 인간에게 투여하는 것을 포함한다.
방법 및 용도의 구현예는 약 1x1010 내지 약 5x1012 vg/kg의 용량의 rAAV 벡터를 인간에게 투여하는 것을 포함한다.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에게 투여되는 rAAV 벡터의 용량이 약 1x1011 내지 약 1x1012 vg/kg인 방법.
방법 및 용도의 구현예는 약 2x1011 내지 약 9x1011 vg/kg의 용량의 rAAV 벡터를 인간에게 투여하는 것을 포함한다.
방법 및 용도의 구현예는 약 3x1011 내지 약 8x1012 vg/kg의 용량의 rAAV 벡터를 인간에게 투여하는 것을 포함한다.
12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에게 투여되는 rAAV 벡터의 용량이 약 3x1011 내지 약 7x1012 vg/kg인 방법.
방법 및 용도의 구현예는 약 3x1011 내지 약 6x1012 vg/kg의 용량의 rAAV 벡터를 인간에게 투여하는 것을 포함한다.
방법 및 용도의 구현예는 약 4x1011 내지 약 6x1012 vg/kg의 용량의 rAAV 벡터를 인간에게 투여하는 것을 포함한다.
방법 및 용도의 구현예는 약 5x1011 vg/kg 또는 약 1x1012 vg/kg의 용량의 rAAV 벡터를 인간에게 투여하는 것을 포함한다.
방법 및 용도의 구현예는 rAAV 벡터가 투여된 비-인간 영장류 연구로부터 획득된 데이터를 기초로 하여 인간에서 예상량보다 큰 FVIII 또는 hFVIII-BDD를 제공하는 것을 포함한다. 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양은, 예를 들어, rAAV 벡터가 투여된 비-인간 영장류 연구로부터 유래된 선형 회귀 곡선을 기초로 하여 예측된 것보다 클 수 있다.
특정 구현예에서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양은 rAAV 벡터가 투여된 비-인간 영장류 연구로부터 획득된 데이터를 기초로 하여 예측된 것보다 크다.
특정 구현예에서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양은 rAAV 벡터가 투여된 비-인간 영장류 연구로부터 유래된 선형 회귀 곡선을 기초로 하여 예측된 발현보다 1-4배 더 크다.
특정 구현예에서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양은 rAAV 벡터가 투여된 비-인간 영장류 연구로부터 유래된 선형 회귀 곡선을 기초로 하여 예측된 것보다 2-4배 더 크다.
특정 구현예에서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양은 rAAV 벡터가 투여된 비-인간 영장류 연구로부터 유래된 선형 회귀 곡선을 기초로 하여 예측된 것보다 2-3배 더 크다.
특정 구현예에서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양은 rAAV 벡터가 투여된 비-인간 영장류 연구로부터 유래된 선형 회귀 곡선을 기초로 하여 예측된 것보다 1-2배 더 크다.
비-인간 영장류는 마카카 속을 포함한다. 특정 구현예에서, 비-인간 영장류는 시노몰로구스(cynomologus) 원숭이(마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis))이다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 지혈의 단기, 중기 또는 장기 개선을 제공하는 기간 동안 발현된다. 특정 구현예에서, 상기 기간은 지혈을 유지하기 위해 보충적 FVIII 단백질 또는 재조합 FVIII 단백질이 인간에 투여될 필요가 없도록 하는 기간이다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 14일 동안 발현된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 21일 동안 발현된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 28일 동안 발현된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 35일 동안 발현된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 42일 동안 발현된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 49일 동안 발현된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 56일 동안 발현된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 63일 동안 발현된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 70일 동안 발현된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 77일 동안 발현된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 84일 동안 발현된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 91일 동안 발현된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 98일 동안 발현된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 105일 동안 발현된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 112일 동안 발현된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 4개월 동안 발현된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 적어도 약 154일 동안 발현된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 적어도 약 210일 동안 발현된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 6개월 동안 발현된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 12개월 동안 발현된다.
FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 일정 기간 동안 특정량으로 발현될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기량은 검출 가능한 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 존재하거나 치료적 이점을 제공하는 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양이 되도록 하는 양이다.
특정 구현예에서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양은 rAAV 벡터 투여 후 14일 이상에서 약 3% 이상이고, rAAV 벡터 투여 후 21일 이상에서 약 4% 이상이고, rAAV 벡터 투여 후 21일 이상에서 약 5% 이상이고, rAAV 벡터 투여 후 21일 이상에서 약 6% 이상이고, rAAV 벡터 투여 후 21일 이상에서 약 7% 이상이고, rAAV 벡터 투여 후 28일 이상에서 약 8% 이상이고, rAAV 벡터 투여 후 28일 이상에서 약 9% 이상이고, rAAV 벡터 투여 후 35일 이상에서 약 10% 이상이고, rAAV 벡터 투여 후 35일 이상에서 약 11% 이상이고, rAAV 벡터 투여 후 35일 이상에서 약 12% 이상이다.
특정 구현예에서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양은 연속 14일 기간에 걸쳐 평균 약 10% 이상이다.
특정 구현예에서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양은 연속 4주 기간에 걸쳐 평균 약 10% 이상이다.
특정 구현예에서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양은 연속 8주 기간에 걸쳐 평균 약 10% 이상이다.
특정 구현예에서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양은 연속 12주 기간에 걸쳐 평균 약 10% 이상이다.
특정 구현예에서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양은 연속 16주 기간에 걸쳐 평균 약 10% 이상이다.
특정 구현예에서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양은 연속 6개월 기간에 걸쳐 평균 약 10% 이상이다.
특정 구현예에서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양은 연속 7개월 기간에 걸쳐 평균 약 10% 이상이다.
특정 구현예에서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양은 연속 14일 기간에 걸쳐 평균 약 12% 이상이다.
특정 구현예에서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양은 연속 4주 기간 동안, 연속 8주 기간 동안, 연속 12주 기간 동안, 연속 16주 기간 동안, 연속 6개월 기간 동안, 연속 7개월 기간 동안, 또는 연속 1년 기간 동안 평균 약 12% 내지 약 100%이다.
특정 구현예에서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양은 연속 4주 기간 동안, 연속 8주 기간 동안, 연속 12주 기간 동안, 연속 16주 기간 동안, 연속 6개월 기간 동안, 또는 연속 1년 기간 동안 평균 약 20% 내지 약 80%이다.
항정-상태 FVIII 발현은 또한 특정 기간 후, 예를 들어, rAAV 벡터 투여 후 4-6, 6-8 또는 6-12주 이상, 예를 들어, 6-12개월 또는 심지어 수년 후에 달성될 수 있다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 FVIII 활성이 4, 6, 8 또는 12주 또는 개월에 걸쳐 5-50%를 초과하는만큼 변하지 않는 항정 상태로 인간에서 생성된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 FVIII 활성이 4, 6, 8 또는 12주 또는 개월에 걸쳐 25-100%를 초과하는만큼 변하지 않는 항정 상태로 인간에서 생성된다.
rAAV 벡터는 투여 후 지속적인 발현을 제공하기 위해 특정량 및 특정 기간 동안 FVIII의 발현을 제공할 것으로 예상되는 용량으로 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터는 인간에게 약 1x109 내지 약 1x1014 vg/kg의 용량으로 투여되고, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성된다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터는 인간에게 약 5x109 내지 약 6x1013 vg/kg의 용량으로 투여되고, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성된다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터는 인간에게 약 1x1010 내지 약 6x1013 vg/kg의 용량으로 투여되고, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성된다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터는 인간에게 약 1x1010 내지 약 1x1013 vg/kg의 용량으로 투여되고, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성된다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터는 인간에게 약 1x1010 내지 약 6x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성된다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터는 인간에게 6x1012 vg/kg 미만의 용량으로 투여되고, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성된다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터는 인간에게 약 1x1010 내지 약 5x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성된다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터는 인간에게 약 1x1011 내지 약 1x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성된다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터는 인간에게 약 2x1011 내지 약 9x1011 vg/kg의 용량으로 투여되고, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성된다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터는 인간에게 약 3x1011 내지 약 8x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성된다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터는 인간에게 약 3x1011 내지 약 7x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성된다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터는 인간에게 약 3x1011 내지 약 6x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성된다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터는 인간에게 약 4x1011 내지 약 6x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성된다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터는 약 5x1011 vg/kg 또는 약 1x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성된다.
방법 및 용도에 따른 인간은 혈청 음성이거나 검출 가능한 AAV 항체를 갖지 않는 사람을 포함한다.
특정 구현예에서, 인간에서의 AAV 항체는 rAAV 벡터 투여 전에 검출되지 않거나, 상기 인간은 AAV에 대해 혈청 음성이다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD에 대한 AAV 항체는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11개월 또는 그 초과 동안 검출되지 않는다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터에 대한 AAV 항체는 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 14일 동안, 또는 적어도 약 21일 동안, 또는 적어도 약 28일 동안, 또는 적어도 약 35일 동안, 또는 적어도 약 42일 동안, 또는 적어도 약 49일 동안, 또는 적어도 약 56일 동안, 또는 적어도 약 63일 동안, 또는 적어도 약 70일 동안, 또는 적어도 약 77일 동안, 또는 적어도 약 84일 동안, 또는 적어도 약 91일 동안, 또는 적어도 약 98일 동안, 또는 적어도 약 105일 동안, 또는 적어도 약 112일 동안 검출되지 않는다.
방법 및 용도에 따른 인간은 검출 가능한 AAV 항체를 갖는 사람을 포함한다.
특정 구현예에서, 인간에서의 AAV 항체는 rAAV 벡터 투여 전에 약 1:5 이하로 존재한다.
특정 구현예에서, 인간에서의 AAV 항체는 rAAV 벡터 투여 전에 약 1:3 이하로 존재한다.
특정 방법 및 용도에서, rAAV 벡터가 투여된 인간은 rAAV 벡터에 대한 세포 매개 면역 반응을 생성하지 않는다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터가 투여된 인간은 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14주 또는 개월 동안 rAAV 벡터에 대한 세포 매개 면역 반응을 생성하지 않는다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터가 투여된 인간은 FVIII 또는 hFVIII-BDD 치료 효과를 감소시키거나 차단하기에 충분한 rAAV 벡터에 대한 체액성 면역 반응을 발생시키지 않는다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터가 투여된 인간은 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월 동안 rAAV 벡터에 대한 검출 가능한 항체를 생성하지 않는다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터가 투여된 인간은 rAAV 벡터 투여 전, 동안 및/또는 후에 면역억제제가 투여되지 않는다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터가 투여된 인간에서, 상기 인간에서 발현된 rAAV 벡터 FVIII 또는 hFVIII-BDD는 면역억제제를 투여하지 않고 달성된다.
미리 존재하거나 rAAV 벡터 투여 후 발생하는 면역 반응의 경우, rAAV 벡터 투여 전 또는 후에 면역억제제가 인간에게 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 방법 또는 용도는 rAAV 벡터의 투여 전에 면역억제제를 투여하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 방법 또는 용도는 rAAV 벡터의 투여 후에 면역억제제를 투여하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 면역억제제는 rAAV 벡터가 투여된 후 1시간 내지 최대 45일 내의 기간으로부터 투여된다.
특정 구현예에서, 면역억제제는 스테로이드, 사이클로스포린(예를 들어, 사이클로스포린 A), 미코페놀레이트, 리툭시맙 또는 이들의 유도체를 포함한다.
특정 구현예에서, 핵산 변이체는 SEQ ID NO:1-18 중 임의의 것과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, 핵산 변이체는 SEQ ID NO:1-18 중 임의의 것과 90-95%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, 핵산 변이체는 SEQ ID NO:1-18 중 임의의 것과 95-100%의 서열 동일성을 갖는다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 핵산 변이체는 FVIII를 인코딩하는 야생형 핵산에 비해 감소된 CpG 함량을 갖는다. 특정 구현예에서, 핵산 변이체는 FVIII(SEQ ID NO:19)를 인코딩하는 야생형 핵산보다 적어도 20개 적은 CpG를 갖는다. 특정 구현예에서, 핵산 변이체는 10개 이하의 CpG를 갖거나, 9개 이하의 CpG를 갖거나, 8개 이하의 CpG를 갖거나, 7개 이하의 CpG를 갖거나, 6개 이하의 CpG를 갖거나, 5개 이하의 CpG를 갖거나, 4개 이하의 CpG를 갖거나, 3개 이하의 CpG를 갖거나, 2개 이하의 CpG를 갖거나, 1개 이하의 CpG를 갖는다. 특정 구현예에서, 핵산 변이체는 최대 4개의 CpG, 3개의 CpG, 2개의 CpG, 또는 1개의 CpG를 갖는다. 특정 구현예에서, 핵산 변이체는 CpG를 갖지 않는다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 핵산 변이체는 FVIII를 인코딩하는 야생형 핵산에 비해 감소된 CpG 함량을 가지며, 상기 CpG 감소된 핵산 변이체는 SEQ ID NO:1-18 중 임의의 것과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, CpG 감소된 핵산 변이체는 SEQ ID NO:1-18 중 임의의 것과 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, CpG 감소된 핵산 변이체는 SEQ ID NO:1-18 중 임의의 것과 90-95%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, CpG 감소된 핵산 변이체는 SEQ ID NO:1-18 중 임의의 것과 95-100%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, FVIII 인코딩 CpG 감소된 핵산 변이체는 SEQ ID NO:1-18 중 임의의 것에 기재되어 있다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD 단백질을 인코딩하는 핵산 변이체는 야생형 인간 FVIII 핵산 또는 B 도메인 결실을 포함하는 야생형 인간 FVIII 핵산과 적어도 75% 동일하다. 특정 구현예에서, FVIII 단백질을 인코딩하는 핵산 변이체는 야생형 인간 FVIII 핵산 또는 B 도메인 결실을 포함하는 야생형 인간 FVIII 핵산과 약 75-95% 동일(예를 들어, 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 동일)하다.
특정 구현예에서, FVIII 단백질을 인코딩하는 핵산 및 변이체는 포유동물, 예를 들어, 인간 핵산 및 변이체이다. FVIII 단백질을 인코딩하는 상기 포유동물 핵산 및 핵산 변이체는 인간 야생형 FVIII 또는 B 도메인 결실을 포함하는 인간 야생형 FVIII를 기초로 할 수 있는 인간 형태를 포함한다.
특정 구현예에서, 재조합 아데노바이러스-관련 바이러스(sAAV) 벡터는 AAV 벡터를 포함하고, AAV 혈청형 또는 AAV 유사형(pseudotype), 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 AAV를 포함한다. 특정 구현예에서, rAAV 벡터는 SEQ ID No:1-18 중 임의의 것을 포함하거나, SEQ ID NO: 23 또는 24를 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 조절 요소는 항시적 또는 조절 가능한 조절 요소, 또는 조직-특이적 발현 조절 요소 또는 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 조절 요소는 간에서 발현을 부여하는 요소를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 조절 요소는 TTR 프로모터 또는 돌연변이체 TTR 프로모터, 예를 들어, SEQ ID NO:22를 포함한다. 추가 특정 양태에서, 발현 조절 요소는 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 PCT 공보 WO 2016/168728호(USSN 62/148,696호; 62/202,133호; 및 62/212,634호)에 제시된 프로모터를 포함한다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV 혈청형 또는 ITR 혈청형과 상이한 AAV 캡시드 혈청형을 포함하는 AAV 유사형을 포함한다. 추가 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 AAV 혈청형 중 임의의 것과 75% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 등)을 갖는 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터는 임의의 SEQ ID NO:27 또는 SEQ ID NO:28과 75% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 등)을 갖는 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, rAAV 벡터는 SEQ ID NO:27 또는 SEQ ID NO:28과 100% 동일한 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드를 포함한다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터는 인트론, 발현 조절 요소, 하나 이상의 AAV 역 말단 반복(ITR)(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 AAV 혈청형 중 임의의 것, 또는 이들의 조합물), 충전재 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 폴리 A 신호를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 인트론은 FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 핵산 또는 핵산 변이체 내에 있거나 측접하고/하거나, 발현 조절 요소는 FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 핵산 또는 핵산 변이체에 작동 가능하게 연결되고/되거나, AAV ITR(들)은 FVIII를 인코딩하는 핵산 또는 핵산 변이체의 5' 또는 3' 말단에 측접하고/하거나, 충전재 폴리뉴클레오티드 서열은 FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 핵산 또는 핵산 변이체의 5' 또는 3' 말단에 측접한다.
특정 구현예에서, 발현 조절 요소는 항시적 또는 조절 가능한 조절 요소, 또는 조직-특이적 발현 조절 요소 또는 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 조절 요소는 간에서 발현을 부여하는 요소(예를 들어, TTR 프로모터 또는 돌연변이체 TTR 프로모터)를 포함한다.
특정 구현예에서, rAAV는 약학적 조성물을 구성한다. 상기 약학적 조성물은 선택적으로 빈 캡시드 AAV(예를 들어, FVIII 또는 hFVIII-BDD 인코딩 핵산 또는 핵산 변이체를 포함하는 벡터 유전체가 결여됨)를 포함한다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD 단백질을 인코딩하는 핵산 또는 핵산 변이체, 벡터, 발현 벡터, 또는 바이러스 또는 AAV 벡터는 리포솜에 캡슐화되거나, 인지질 또는 마이셀과 혼합된다.
본 발명의 방법은 또한 FVIII를 필요로 하거나(불충분한 양의 FVIII 단백질 또는 결함이 있거나 이상이 있는 FVIII 단백질을 생성하는 인간), 혈우병 A를 갖는 인간과 같은 포유동물 대상체(예를 들어, 인간)를 치료하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 인간은 불충분한 양의 FVIII 단백질, 또는 결합이 있거나 이상이 있는 FVIII 단백질을 생성한다. 또 다른 구현예에서, 인간은 경증, 중등증 또는 중증 혈우병 A를 갖는다.
특정 구현예에서, 투여되는 rAAV 벡터를 통해 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD는 포유동물에 이로운 또는 치료적 효과를 갖는 수준으로 발현된다.
FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 핵산 또는 핵산 변이체를 포함하는 rAAV의 투여(예를 들어, 전달)를 위한 후보 대상체(예를 들어, 환자) 및 포유동물(예를 들어, 인간)은 혈우병 A, 폰 빌레브란트 질병 및 외상, 손상, 혈전증, 혈소판감소증, 뇌졸중, 응고병증, 파종성 혈관내 응고(DIC) 또는 과-항응고 치료 장애와 관련된 출혈과 같은 장애를 갖거나 가질 위험이 있는 대상체 및 포유동물을 포함한다.
FVIII를 인코딩하는 핵산 또는 핵산 변이체의 투여(예를 들어, 전달)를 위한 후보 대상체(예를 들어, 환자) 및 포유동물(예를 들어, 인간)은 AAV 항체에 대해 혈청 음성인 대상체 및 포유동물뿐만 아니라 AAV 항체를 갖거나(혈청 양성) AAV 항체가 발생할 위험이 있는 대상체 및 포유동물을 포함한다. 상기 대상체(예를 들어, 환자) 및 포유동물(예를 들어, 인간)은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV-Rh10 또는 AAV-Rh74 혈청형에 대해 혈청 음성이거나 혈청 양성일 수 있다.
특정 구현예에서, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV-12, AAV-Rh10 및/또는 AAV-Rh74 혈청형의 빈 캡시드는 단독으로 또는 FVIII를 인코딩하는 핵산 또는 핵산 변이체를 포함하는 rAAV 벡터와 조합하여 포유동물 또는 환자에 추가로 투여된다.
본 발명에 따른 투여(예를 들어, 전달) 방법은 생체 외 또는 생체 내 임의의 접촉 또는 전달 방식을 포함한다. 특정 구현예에서, 투여(예를 들어, 전달)는 정맥내, 동맥내, 근내, 피하, 공동내, 삽관에 의해, 또는 카테터를 통한 것이다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD는 혈전증의 위험을 실질적으로 증가시키지 않는 수준으로 발현된다.
특정 구현예에서, 혈전증 위험은 피브린 분해 생성물을 측정함으로써 결정된다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD의 활성은 인간에서 적어도 1, 2, 3 또는 4주, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개월, 또는 적어도 1년 동안 검출 가능하다.
특정 구현예에서, 인간은 AAV 항체의 존재 또는 양, AAV, FVIII 또는 hFVIII-BDD 항체에 대한 면역 반응, FVIII 또는 hFVIII-BDD에 대한 면역 반응, FVIII 또는 hFVIII-BDD 양, FVIII 또는 hFVIII-BDD 활성, 하나 이상의 간 효소의 양 또는 수준 또는 빈도, 및/또는 출혈 에피소드의 중증도 또는 지속기간 중 하나 이상에 대해 추가로 분석되거나 모니터링된다.
도 1은 NHP 연구 계획을 제시한다.
도 2A-2C는 2x1012 (A), 5x1012 (B) 또는 1x1013 vg/kg (C)의 AAV-SPK-8005의 정맥내 투여 후 NHP에서의 hFVIII 항원 수준을 제시한다. 선은 개별 동물을 나타낸다. 인간 FVIII 혈장 수준이 ELISA에 의해 검정되었고, 연구 과정 동안 동일한 동물 그룹에서 연속적인 출혈에 의해 획득된 반복 측정을 나타낸다(코호트 당 n=2-3 동물). 비히클 처리된 동물에서 측정된 인간 FVIII 수준은 3개 그래프 모두에서 속이 빈 사각형으로 제시된다.
ε = FVIII에 대한 억제제의 발생.
도 3A-3C는 2x1012 (A), 5x1012 (B) 또는 1x1013 vg/kg (C)의 AAV-SPK-8005에서 NHP에서의 ALT 수준을 제시한다.
도 4A-4C는 NHP에서의 D-이량체 수준을 제시한다. 2x1012 (A), 5x1012 (B) 또는 1x1013 vg/kg (C)의 AAV-SPK-8005의 정맥내 투여 후 NHP의 혈장에서의 D-이량체 항원 농도. 점선은 500 ng/ml를 나타내며, 이는 인간에서 D-이량체에 대한 정상의 상한이다.
도 5는 AAV-SPK-8005의 3회 용량에서의 FVIII 수준의 데이터 개요를 제시한다.
도 6A-6D는 2x1012 (A), 6x1012 (B) 또는 2x1013 (vg/kg) (C)의 AAV-SPK-8011(LK03 캡시드)-hFVIII의 정맥내 투여 후 시노몰구스 마카쿠의 혈장에서의 hFVIII의 수준을 제시한다(파일럿 연구). 선은 개별 동물을 나타낸다. hFVIII 혈장 수준이 ELISA에 의해 검정되었고, 연구 과정 동안 동일한 동물 그룹에서 연속적인 출혈에 의해 획득된 반복 측정을 나타낸다(코호트 당 n=3 동물). 비히클 처리된 동물에서 측정된 인간 FVIII 수준은 속이 빈 사각형으로 제시된다(n=2). ε = FVIII에 대한 억제제의 발생이 각각의 개별 동물에서 검출된 시간.
도 7은 SPK-8011의 투여 후 시노몰구스 마카쿠에서의 인간 FVIII 발현 수준을 제시한다. 파일럿 연구(사각형) 및 GLP 연구(원).
도 8은 AAV5 및 AAV8 캡시드를 갖는 AAV 벡터를 통해 전달된 FVIII의 보고된 수준에 대한 AAV-SPK-8011(LK03 캡시드)-hFVIII로 달성된 FVIII 수준의 비교를 제시한다. http://www.biomarin.com/pdf/BioMarin_R&D_Day_4_20_2016.pdf, slide 16. AAV8: McIntosh J et al. Blood 2013; 121(17):3335-44.
도 9는 비-인간 영장류, 주로 신장, 비장 및 간(각각의 조직에 대해 세 번째 막대)에서의 AAV-SPK(SEQ ID NO:28) 및 AAV-LK03(SEQ ID NO:27) 조직 생체분포를 제시한다.
도 10은 AAV-SPK-8005의 마우스로의 전신 투여 후 간 및 비장 FVIII 발현을 제시한다.
도 11은 시험관 내 분석된 AAV-LK03 캡시드의 형질도입 효율을 제시한다. X-축, 시노몰구스(좌측 세로 막대), 인간(우측 세로 막대).
도 12는 SPK-8011의 투여 후 시노몰구스 마카쿠에서의 인간 FVIII 발현 수준이 선형 용량 반응을 따르는 것을 제시한다. 패널 A 및 B는 선형 스케일로 SPK-8011 용량을 제시하는 반면, 패널 C 및 D는 대수 X 축을 사용한다.
도 13은 저용량 및 중간 용량 코호트의 데이터만 이용한 선형 회귀의 분석을 제시한다. 패널 A 및 B는 선형 스케일로 SPK-8011 용량을 제시하는 반면, 패널 C 및 D는 대수 X 축을 사용한다.
도 14는 AAV-LK03(FVIII) 벡터가 주입된 3명의 인간 대상체에서의 FVIII 활성을 제시한다. 대상체 1 및 2(다이아몬드, 원)에 5x1011 vg/kg의 AAV-LK03(FVIII) 벡터가 주입되었다. 대상체 3(삼각형)에 1x1012 vg/kg의 AAV-LK03(FVIII) 벡터가 주입되었다.
도 15는 AAV-LK03(FVIII) 벡터가 주입된 동일한 인간 대상체(대상체 1 및 2, 도 14)에서 치료 수준에서 FVIII 활성의 연장된 발현을 제시한다. 대상체 1 및 2(원, 사각형)에 5x1011 vg/kg의 AAV-LK03(FVIII) 벡터가 주입되었다.
도 16은 치료 수준의 FVIII를 나타내는 10명의 인간 대상체(대상체 1-10)를 제시한다. 대상체 1은 주입 후 6주에서 응급 치과 추출 후 FVIII를 주입하였다. 그 직후, FVIII는 19% 활성 수준을 기록하였고; FVIII 주입 근접성으로 인해 상기 차트에서 제외하였다. FVIII 활성은 지역 연구소로부터의 FVIII:C 값을 나타낸다.
도 17은 5x1011 vg/kg의 AAV-LK03(FVIII) 벡터가 주입된 대상체 1에서의 FVIII의 치료 수준을 제시한다. 하단 그래프는 AAV 캡시드 펩티드(속이 채워진 막대) 및 FVIII 펩티드(속이 빈 원)에 대한 대상체의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 반응에 관한 인터페론-γ 효소 결합 면역흡착 스폿(ELISPOT) 검정의 결과를 제시한다. 결과는 1백만 개의 PBMC 당 스폿 형성 단위(SFU)의 수로 제시되고; 50 SFU를 초과하거나, 중간 대조군(점선)보다 3배 위인 값이 양성으로 간주된다.
도 18은 5x1011 vg/kg의 AAV-LK03(FVIII) 벡터가 주입된 대상체 2에서의 FVIII의 치료 수준을 제시한다. 하단 그래프는 AAV 캡시드 펩티드(속이 채워진 막대) 및 FVIII 펩티드(속이 빈 원)에 대한 대상체의 PBMC의 반응에 관한 인터페론-γ ELISPOT 검정의 결과를 제시한다. 결과는 1백만 개의 PBMC당 SFU의 수로 제시되고; 50 SFU를 초과하거나, 중간 대조군(점선)보다 3배 위인 값이 양성으로 간주된다.
도 19는 1x1012 vg/kg의 AAV-LK03(FVIII) 벡터가 주입된 대상체 3에서의 FVIII의 치료 수준을 제시한다. 하단 그래프는 AAV 캡시드 펩티드(속이 채워진 막대) 및 FVIII 펩티드(속이 빈 원)에 대한 대상체의 PBMC의 반응에 관한 인터페론-γ ELISPOT 검정의 결과를 제시한다. 결과는 1백만 개의 PBMC당 SFU의 수로 제시되고; 50 SFU를 초과하거나, 중간 대조군(점선)보다 3배 위인 값이 양성으로 간주된다.
도 20은 1x1012 vg/kg의 AAV-LK03(FVIII) 벡터가 주입된 대상체 4에서의 FVIII의 치료 수준을 제시한다. 하단 그래프는 AAV 캡시드 펩티드(속이 채워진 막대) 및 FVIII 펩티드(속이 빈 원)에 대한 대상체의 PBMC의 반응에 관한 인터페론-γ ELISPOT 검정의 결과를 제시한다. 결과는 1백만 개의 PBMC당 SFU의 수로 제시되고; 50 SFU를 초과하거나, 중간 대조군(점선)보다 3배 위인 값이 양성으로 간주된다.
도 21은 2x1012 vg/kg의 AAV-LK03(FVIII) 벡터가 주입된 대상체 5에서의 FVIII의 치료 수준을 제시한다. 하단 그래프는 AAV 캡시드 펩티드(속이 채워진 막대) 및 FVIII 펩티드(속이 빈 원)에 대한 대상체의 PBMC의 반응에 관한 인터페론-γ ELISPOT 검정의 결과를 제시한다. 결과는 1백만 개의 PBMC당 SFU의 수로 제시되고; 50 SFU를 초과하거나, 중간 대조군(점선)보다 3배 위인 값이 양성으로 간주된다.
도 22는 1x1012 vg/kg의 AAV-LK03(FVIII) 벡터가 주입된 대상체 6에서의 FVIII의 치료 수준을 제시한다. 하단 그래프는 AAV 캡시드 펩티드(속이 채워진 막대) 및 FVIII 펩티드(속이 빈 원)에 대한 대상체의 PBMC의 반응에 관한 인터페론-γ ELISPOT 검정의 결과를 제시한다. 결과는 1백만 개의 PBMC당 SFU의 수로 제시되고; 50 SFU를 초과하거나, 중간 대조군(점선)보다 3배 위인 값이 양성으로 간주된다.
도 23은 2x1012 vg/kg의 AAV-LK03(FVIII) 벡터가 주입된 대상체 7에서의 FVIII의 치료 수준을 제시한다. 하단 그래프는 AAV 캡시드 펩티드(속이 채워진 막대) 및 FVIII 펩티드(속이 빈 원)에 대한 대상체의 PBMC의 반응에 관한 인터페론-γ ELISPOT 검정의 결과를 제시한다. 결과는 1백만 개의 PBMC당 SFU의 수로 제시되고; 50 SFU를 초과하거나, 중간 대조군(점선)보다 3배 위인 값이 양성으로 간주된다.
도 24는 2x1012 vg/kg의 AAV-LK03(FVIII) 벡터가 주입된 대상체 8에서의 FVIII의 치료 수준을 제시한다. 하단 그래프는 AAV 캡시드 펩티드(속이 채워진 막대) 및 FVIII 펩티드(속이 빈 원)에 대한 대상체의 PBMC의 반응에 관한 인터페론-γ ELISPOT 검정의 결과를 제시한다. 결과는 1백만 개의 PBMC당 SFU의 수로 제시되고; 50 SFU를 초과하거나, 중간 대조군(점선)보다 3배 위인 값이 양성으로 간주된다.
도 25는 2x1012 vg/kg의 AAV-LK03(FVIII) 벡터가 주입된 대상체 9에서의 FVIII의 치료 수준을 제시한다. 하단 그래프는 AAV 캡시드 펩티드(속이 채워진 막대) 및 FVIII 펩티드(속이 빈 원)에 대한 대상체의 PBMC의 반응에 관한 인터페론-γ ELISPOT 검정의 결과를 제시한다. 결과는 1백만 개의 PBMC당 SFU의 수로 제시되고; 50 SFU를 초과하거나, 중간 대조군(점선)보다 3배 위인 값이 양성으로 간주된다.
도 26은 2x1012 vg/kg의 AAV-LK03(FVIII) 벡터가 주입된 대상체 10에서의 FVIII의 치료 수준을 제시한다. 하단 그래프는 AAV 캡시드 펩티드(속이 채워진 막대) 및 FVIII 펩티드(속이 빈 원)에 대한 대상체의 PBMC의 반응에 관한 인터페론-γ ELISPOT 검정의 결과를 제시한다. 결과는 1백만 개의 PBMC당 SFU의 수로 제시되고; 50 SFU를 초과하거나, 중간 대조군(점선)보다 3배 위인 값이 양성으로 간주된다.
도 27은 2x1012 vg/kg의 AAV-LK03(FVIII) 벡터가 주입된 대상체 11에서의 FVIII의 치료 수준을 제시한다. 하단 그래프는 AAV 캡시드 펩티드(속이 채워진 막대) 및 FVIII 펩티드(속이 빈 원)에 대한 대상체의 PBMC의 반응에 관한 인터페론-γ ELISPOT 검정의 결과를 제시한다. 결과는 1백만 개의 PBMC당 SFU의 수로 제시되고; 50 SFU를 초과하거나, 중간 대조군(점선)보다 3배 위인 값이 양성으로 간주된다.
도 28은 2x1012 vg/kg의 AAV-LK03(FVIII) 벡터가 주입된 대상체 12에서의 FVIII의 치료 수준을 제시한다. 하단 그래프는 AAV 캡시드 펩티드(속이 채워진 막대) 및 FVIII 펩티드(속이 빈 원)에 대한 대상체의 PBMC의 반응에 관한 인터페론-γ ELISPOT 검정의 결과를 제시한다. 결과는 1백만 개의 PBMC당 SFU의 수로 제시되고; 50 SFU를 초과하거나, 중간 대조군(점선)보다 3배 위인 값이 양성으로 간주된다.
혈우병 A를 갖거나, 인자 VIII(FVIII)를 필요로 하는 인간을 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 상기 방법은 세포 및/또는 인간에서 발현될 수 있는 FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 핵산 또는 핵산 변이체를 포함하는 유전체를 갖는 rAAV 벡터를 이용하여 달성될 수 있으며, 이는 차례로 증가된 FVIII 또는 hFVIII-BDD 단백질 수준을 생체 내에서 제공할 수 있다. FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 예시적 핵산 변이체는 참조 야생형 포유동물(예를 들어, 인간) FVIII 또는 hFVIII-BDD와 비교하여 감소된 CpG 및/또는 참조 야생형 포유동물(예를 들어, 인간) FVIII 또는 hFVIII-BDD와 100% 미만의 서열 동일성을 가질 수 있다. 상기 방법은 또한 킬로그램 당 6x1012 미만의 vrAAV 벡터 유전체(vg/kg)의 rAAV 벡터 용량을 투여함으로써 달성될 수 있다. 킬로그램 당 6x1012 미만의 vrAAV 벡터 유전체(vg/kg)의 용량으로 투여된 rAAV 벡터는 FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 핵산 또는 핵산 변이체를 포함하는 벡터 유전체를 포함할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)를 포함하는 모든 형태의 핵산, 올리고뉴클레오티드를 나타내기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 폴리뉴클레오티드는 유전체 DNA, cDNA 및 안티센스 DNA, 및 스프라이싱 및 비스플라이싱 mRNA, rRNA, tRNA 및 억제성 DNA 또는 RNA(RNAi, 예를 들어, 작은 또는 짧은 헤어핀(sh)RNA, 마이크로RNA(miRNA), 작은 또는 짧은 간섭 (si)RNA, 트랜스-스플라이싱 RNA, 또는 안티센스 RNA)를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 천연 발생, 합성, 및 의도적으로 변형되거나 변경된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 변이체 핵산)를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 단일, 이중, 또는 삼중, 선형 또는 원형일 수 있고, 임의의 길이일 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 논의함에 있어서, 특정 폴리뉴클레오티드의 서열 또는 구조는 5'에서 3' 방향으로 서열을 제공하는 협약에 따라 본원에 기재될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "변형하다" 또는 "변이체" 및 이의 문법적 변형은 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 이의 하위서열이 참조 서열에서 벗어난다는 것을 의미한다. 따라서, 변형 및 변이체 서열은 참조 서열과 실질적으로 동일하거나, 더 크거나, 더 작은 발현, 활성 또는 기능을 가질 수 있으나, 적어도 참조 서열의 부분적 활성 또는 기능을 보유한다. 변형 또는 변이체의 특정 예는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체이다.
"핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 변이체는 야생형과 비교하여 유전적으로 변경된 변형된 서열을 나타낸다. 서열은 인코딩된 단백질 서열을 변경시키지 않고 유전적으로 변형될 수 있다. 대안적으로, 서열은 변이체 단백질을 인코딩하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 변이체는 또한 야생형 단백질 서열과 같은 참조 서열에 여전히 적어도 부분적인 서열 동일성을 보유하는 단백질을 인코딩하도록 코돈 변형되고, 또한 변이체 단백질을 인코딩하도록 코돈 변형된 조합 서열을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 상기 핵산 변이체의 일부 코돈은 이에 의해 인코딩된 단백질(FVIII)의 아미노산을 변경시키지 않고 변화될 것이고, 핵산 변이체의 일부 코돈은 변화되고, 이는 차례로 이에 의해 인코딩된 단백질(FVIII)의 아미노산을 변화시킬 것이다.
용어 "변이체 인자 VIII(FVIII)"는 변형되지 않은 야생형 FVIII(예를 들어, SEQ ID NO:19) 또는 FVIII-BDD와 비교하여 유전적으로 변경된 변형 FVIII를 나타낸다. 상기 변이체는 "인자 VIII(FVIII)를 인코딩하는 핵산 변이체"로 언급될 수 있다. 변이체의 특정 예는 FVIII 또는 FVIII-BDD 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산이다. 용어 "변이체"는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산에 대해 제조된 참조의 각각의 예에서 나타낼 필요는 없다. 마찬가지로, 용어 "CpG 감소된 핵산" 등은 용어 "변이체"를 생략할 수 있으나, "CpG 감소된 핵산"에 대한 언급은 유전적 수준에서의 변이체를 포함하는 것으로 의도된다.
감소된 CpG 함량을 갖는 FVIII 및 hFVIII-BDD 작제물은 CpG 함량이 감소되지 않은 야생형 FVIII 또는 FVIII-BDD와 비교하여 개선을 나타낼 수 있으며, 인코딩된 FVIII 또는 FVIII-BDD 단백질에 대한 아미노산 변화를 발생시키는 핵산에 대한 변형 없이 그렇게 한다. 발현을 비교하는 경우, CpG 감소된 핵산이 B-도메인을 보유하는 FVIII 단백질을 인코딩하는 경우, 이를 야생형 FVIII 발현과 비교하는 것이 적절하고; CpG 감소된 핵산이 B-도메인 없이 FVIII 단백질을 인코딩하는 경우, 이는 B-도메인 결실을 또한 갖는 야생형 FVIII의 발현과 비교된다.
"변이체 인자 VIII(FVIII)"는 또한 변형된 단백질이 야생형 FVIII와 비교하여 아미노산 변경을 갖도록 변형된 FVIII 단백질을 의미할 수 있다. 또한, 활성 및/또는 안정성을 비교하는 경우, 인코딩된 변이체 FVIII 단백질이 B-도메인을 보유하는 경우, 이를 야생형 FVIII와 비교하는 것이 적절하고; 인코딩된 변이체 FVIII 단백질이 B-도메인 결실을 갖는 경우, 이는 B-도메인을 결실을 또한 갖는 야생형 FVIII와 비교된다.
변이체 FVIII는 B-도메인의 일부를 포함할 수 있다. 따라서, FVIII-BDD는 B-도메인의 일부를 포함한다. 전형적으로, FVIII-BDD에서, 대부분의 B-도메인이 결실된다.
변이체 FVIII는 SFSQNPPVLKRHQR(SEQ ID NO:29)로 기재된 "SQ" 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, SQ를 갖는 상기 변이체 FVIII(FVIII/SQ)는 BDD를 가지며, 예를 들어, BD의 적어도 일부 또는 전부가 결실된다. FVIII-BDD와 같은 변이체 FVIII는 "SQ" 서열의 전부 또는 일부, 즉, SEQ ID NO:29의 전부 또는 일부를 가질 수 있다. 따라서, 예를 들어, SQ 서열을 갖는 변이체 FVIII-BDD(SFSQNPPVLKRHQR, SEQ ID NO:29)는 아미노산 서열 SFSQNPPVLKRHQR의 전부 또는 단지 일부를 가질 수 있다. 예를 들어, FVIII-BDD는 포함된 SFSQNPPVLKRHQR의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 따라서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 내부 결실뿐만 아니라 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 아미노- 또는 카르복시 말단 결실을 갖는 SFSQNPPVLKRHQR이 본원에 기재된 변이체 FVIII 단백질에 포함된다.
"핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 서열에 의해 인코딩된 "폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"는 천연 발생 야생형 단백질과 마찬가지로 전장 고유(FVIII) 서열뿐만 아니라 하위서열, 변형된 형태 또는 변이체가 고유 전장 단백질의 어느 정도의 기능성을 보유하는 한 기능적 하위서열, 변형된 형태 또는 서열 변이체를 포함한다. 예를 들어, FVIII 또는 hFVIII-BDD 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산은 본원에 기재된 바와 같은 B-도메인 결실을 가질 수 있고, 응고 기능을 보유할 수 있다. 본 발명의 방법 및 용도에서, 핵산 서열에 의해 인코딩된 상기 폴리펩티드, 단백질 및 펩티드는 처리된 포유동물에서 결함이 있거나, 발현이 불충분하거나, 부족한 내인성 단백질과 동일할 수 있으나, 동일할 필요는 없다.
변형의 비제한적인 예는 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 치환(예를 들어, 1-3, 3-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40, 40-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-500, 500-750, 750-850개 이상의 뉴클레오티드 또는 잔기)을 포함한다. 핵산 변형의 예는 CpG 감소이다. 특정 구현예에서, FVIII, 예를 들어, 인간 FVIII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산은 인간 인자 FVIII를 인코딩하는 야생형 서열과 비교하여 10개 이하의 CpG를 갖거나; 인간 인자 FVIII를 인코딩하는 야생형 서열과 비교하여 5개 이하의 CpG를 갖거나; FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산에서 5개 이하의 CpG를 갖는다.
아미노산 변형의 예는 참조 서열, 예를 들어, FVIII, 예를 들어, B-도메인 결실을 갖는 FVIII의 보존적 아미노산 치환 또는 결실(예를 들어, 하위서열 또는 단편)이다. 특정 구현예에서, 변형 또는 변이체 서열은 변형되지 않은 서열의 기능 또는 활성의 적어도 일부를 보유한다.
공지되거나 공지되지 않은 본원에 개시된 FVIII 및 hFVIII-BDD를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산의 다른 포유동물 형태를 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산의 모든 포유동물 및 비-포유동물 형태가 명백히 포함된다. 따라서, 본 발명은 비-포유동물, 인간이 아닌 포유동물 및 인간으로부터의 유전자 및 단백질을 포함하며, 상기 유전자 및 단백질은 본원에 기재된 FVIII(예를 들어, 인간) 유전자 및 단백질과 실질적으로 유사한 방식으로 기능한다.
용어 "벡터"는 핵산의 삽입 또는 혼입에 의해 조작될 수 있는 작은 담체 핵산 분자, 플라스미드, 바이러스(예를 들어, AAV 벡터), 또는 다른 비히클을 나타낸다. 상기 벡터는 유전자 조작(즉, "클로닝 벡터")을 위해, 세포에 폴리뉴클레오티드를 도입/전달하고, 세포 내에서 삽입된 폴리뉴클레오티드를 전사시키거나 번역시키기 위해 사용될 수 있다. "발현 벡터"는 숙주 세포에서의 발현에 요구되는 필요한 조절 영역을 갖는 유전자 또는 핵산 서열을 함유하는 전문화된 벡터이다. 벡터 핵산 서열은 일반적으로 적어도 세포에서의 증식을 위한 복제 기점 및 선택적으로 추가 요소, 예를 들어, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열, 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서), 인트론, ITR(들), 선택 가능한 마커(예를 들어, 항생제 내성), 아데닐중합체형성 신호를 함유한다.
바이러스 벡터는 바이러스 유전체를 포함하는 하나 이상의 핵산 요소로부터 유래되거나 이를 기초로 한다. 특정 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 슈도-타입 렌티바이러스 및 파보바이러스 벡터, 예를 들어, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함한다.
재조합 바이러스, 예를 들어, 렌티- 또는 파보바이러스(예를 들어, AAV) 벡터와 같은 벡터의 수식 어구, 뿐만 아니라 재조합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드와 같은 서열의 수식 어구로서의 용어 "재조합"은 조성물이 자연에서 일반적으로 발생하지 않는 방식으로 조작(즉, 공학처리)된 것을 의미한다. AAV 벡터와 같은 재조합 벡터의 특정 예는 야생형 바이러스(예를 들어, AAV) 유전체 내에 보통 존재하지 않는 폴리뉴클레오티드가 바이러스 유전체 내에 삽입되는 경우일 것이다. 재조합 폴리뉴클레오티드의 예는 FVIII 또는 hFVIII-BDD 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산이 유전자가 바이러스(예를 들어, AAV) 유전체 내에서 일반적으로 연관되는 5', 3' 및/또는 인트론 영역을 갖거나 갖지 않는 벡터로 클로닝되는 경우일 것이다. 용어 "재조합"은 바이러스 및 AAV 벡터와 같은 벡터뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드와 같은 서열과 관련하여 본원에서 항상 사용되지는 않지만, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 형태가 임의의 상기 누락에도 불구하고 명백히 포함된다.
재조합 바이러스 "벡터" 또는 "AAV 벡터"는 바이러스(예를 들어, AAV)로부터 야생형 유전체를 제거하는 분자 방법을 이용하고, FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산과 같은 비-고유 핵산으로 대체함으로써 AAV와 같은 바이러스의 야생형 유전체로부터 유래된다. 전형적으로, AAV에 대해, AAV 유전체의 하나 또는 둘 모두의 역 말단 반복(ITR) 서열이 AAV 벡터에서 유지된다. "재조합" 바이러스 벡터(예를 들어, AAV)는 바이러스(예를 들어, AAV) 유전체로부터 구별되는데, 이는 바이러스 유전체의 전부 또는 일부가 FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산과 같은 바이러스(예를 들어, AAV) 유전체 핵산과 관련하여 비-고유 서열로 대체되었기 때문이다. 따라서, 비-고유 서열의 혼입은 바이러스 벡터(예를 들어, AAV)를 "재조합" 벡터로 정의하며, 이러한 경우 AAV는 "rAAV 벡터"로 언급될 수 있다.
재조합 벡터(예를 들어, 렌티-, 파보-, AAV) 서열은 패키징될 수 있으며, 이는 생체 외, 시험관 내 또는 생체 내에서 세포의 이후의 감염(형질도입)을 위한 "입자"로 본원에서 언급된다. 재조합 벡터 서열이 AAV 입자로 캡시드화되거나 패키징되는 경우, 입자는 또한 "rAAV"로 언급될 수 있다. 상기 입자는 벡터 유전체를 캡시드화하거나 패키징하는 단백질을 포함한다. 특정 예로는 바이러스 외피 단백질, 및 AAC의 경우 캡시드 단백질을 포함한다.
벡터 "유전체"는 바이러스(예를 들어, AAV) 입자를 형성시키기 위해 궁극적으로 패키징되거나 캡시드화되는 재조합 플라스미드 서열의 일부를 나타낸다. 재조합 플라스미드가 재조합 벡터를 작제하거나 제조하기 위해 사용되는 경우, 벡터 유전체는 재조합 플라스미드의 벡터 유전체 서열에 해당하지 않는 "플라스미드"의 부분을 포함하지 않는다. 이러한 재조합 플라스미드의 비 벡터 유전체 부분은 "플라스미드 백본"으로 언급되며, 이는 증식 및 재조합 바이러스 생성에 필요하나, 바이러스(예를 들어, AAV) 입자로 자체 패키징되거나 캡시드화되지 않는 과정인 플라스미드의 클로닝 및 증폭에 중요하다. 따라서, 벡터 "유전체"는 바이러스(예를 들어, AAV)에 의해 패키징되거나 캡시드화되는 핵산을 나타낸다.
"트랜스진"은 본원에서 세포 또는 유기체로 의도되거나 도입된 핵산을 편리하게 나타내기 위해 사용된다. 트랜스진은 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 유전자(예를 들어, FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산)과 같은 임의의 핵산을 포함한다.
트랜스진을 갖는 세포에서, 트랜스진은 세포의 AAV, "형질도입" 또는 "형질감염"과 같이 벡터에 의해 도입/전달되었다. 용어 "형질도입시키다" 및 "형질감염시키다"는 핵산과 같은 분자의 세포 또는 숙주 유기체로의 도입을 나타낸다. 트랜스진은 수용자 세포의 유전체 핵산에 통합되거나 통합되지 않을 수 있다. 도입된 핵산이 수용자 세포 또는 유기체의 핵산(유전체 DNA)에 통합되면, 이는 상기 세포 또는 유기체 내에서 안정적으로 유지될 수 있고, 수용자 세포 또는 유기체의 자손 세포 또는 유기체에 추가로 전달되거나 유전될 수 있다. 최종적으로, 도입된 핵산은 수용자 세포 도는 숙주 유기체에서 염색체 외적으로 또는 단지 일시적으로 존재할 수 있다.
"형질도입된 세포"는 트랜스진이 도입된 세포이다. 따라서, "형질도입된" 세포(예를 들어, 포유동물에서, 예를 들어, 세포 또는 조직 또는 기관 세포)는 외인성 분자, 예를 들어, 핵산(예를 들어, 트랜스진)의 세포로의 혼입 후에 세포에서의 유전적 변화를 의미한다. 따라서, "형질도입된" 세포는 외인성 핵산이 도입된 세포 또는 이의 자손이다. 세포(들)는 증식되고, 도입된 단백질이 발현되거나, 핵산이 전사될 수 있다. 유전자 요법 용도 및 방법의 경우, 형질도입된 세포는 대상체에 존재할 수 있다.
"발현 조절 요소"는 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현에 영향을 미치는 핵산 서열(들)을 나타낸다. 프로모터 및 인핸서와 같은 본원에 기재된 바와 같은 발현 조절 요소를 포함하는 조절 요소, AAV 벡터를 포함하는 벡터 서열은 하나 이상의 "발현 조절 요소"를 포함할 수 있다. 전형적으로, 적절한 이종성 폴리뉴클레오티드 전사 및 적절한 경우 번역을 촉진하기 위해 상기 요소가 포함된다(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인트론에 대한 스플라이싱 신호, mRNA의 인-프레임(in-frame) 번역을 가능하게 하는 유전자의 정확한 판독 프레임의 유지 및 정지 코돈 등). 상기 요소는 전형적으로 "시스 작용" 요소로 언급되는 시스로 작용하나, 트랜스로도 작용할 수 있다.
발현 조절은 전사, 번역, 스플라이싱, 메시지 안정성 등의 수준으로 이루어질 수 있다. 전형적으로, 전사를 조절하는 발현 조절 요소는 전사되는 핵산의 5' 말단(즉, "업스트림") 근처에 병렬된다. 발현 조절 요소는 또한 전사되는 서열의 3' 말단(즉, "다운스트림") 또는 전사물 내(예를 들어, 인트론 내)에 위치될 수 있다. 발현 조절 요소는 전사되는 서열에 인접하거나, 심지어 상당한 거리로 전사되는 서열과 떨어진 거리(예를 들어, 폴리뉴클레오티드로부터 1-10, 10-25, 25-50, 50-100, 100 내지 500개 이상의 뉴클레오티드)에 위치될 수 있다. 그럼에도 불구하고, rAAV 벡터와 같은 특정 벡터의 길이 제한으로 인해, 발현 조절 요소는 전형적으로 전사되는 핵산으로부터 1 내지 1000개의 뉴클레오티드 내에 있을 것이다.
기능적으로, 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현은 요소(예를 들어, 프로모터)가 핵산의 전사 및 적절하게는 전사물의 번역을 조절하도록 요소에 의해 적어도 부분적으로 조절 가능하다. 발현 조절 요소의 특정 예는 일반적으로 전사되는 서열, 예를 들어, FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산의 5'에 위치되는 프로모터이다. 프로모터는 전형적으로 프로모터가 존재하지 않는 경우에 발현되는 양에 비해 작동 가능하게 연결된 핵산으로부터 발현되는 양을 증가시킨다.
본원에서 사용되는 "인핸서"는 이종성 폴리뉴클레오티드에 인접하여 위치되는 서열을 나타낼 수 있다. 인핸서 요소는 전형적으로 프로모터 요소의 업스트림에 위치하나 또한 기능하며, 서열(예를 들어, FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산)의 다운스트림 또는 서열 내에 위치할 수 있다. 그러므로, 인핸서 요소는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산의 업스트림 또는 다운스트림의 100개의 염기쌍, 200개의 염기쌍, 또는 300개 이상의 염기쌍에 위치할 수 있다. 인핸서 요소는 전형적으로 프로모터 요소에 의해 제공되는 발현 이상으로 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 증가시킨다.
발현 작제물은 특정 세포 또는 조직 유형에서 발현을 유도하는 역할을 하는 조절 요소를 포함할 수 있다. 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터)는 본원에서 "조직-특이적 발현 조절 요소/프로모터"로 언급되는 특정 조직 또는 세포 유형에서 활성인 것을 포함한다. 조직-특이적 발현 조절 요소는 전형적으로 특정 세포 또는 조직(예를 들어, 간)에서 활성이다. 발현 조절 요소는 전형적으로 특정 세포, 조직 또는 기관에서 활성인데, 이는 이들이 특정 세포, 조직 또는 기관 유형에 고유한 전사 활성제 단백질, 또는 전사 조절인자에 의해 인지되기 때문이다. 상기 조절 요소는 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (1989) 및 Ausubel et al. (1992)] 참조).
본 발명의 발현 작제물에서 조직 특이적 조절 요소의 혼입은 FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산의 발현을 위한 적어도 부분적 조직 향성을 제공한다. 간에서 활성인 프로모터의 예는 무엇보다도 TTR 프로모터, 인간 알파 1-항트립신(hAAT) 프로모터; 알부민, 문헌[Miyatake, et al. J. Virol ., 71:5124-32 (1997)]; B형 간염 바이러스 코어 프로모터, 문헌[Sandig, et al., Gene Ther . 3:1002-9 (1996)]; 알파-태아단백질(AFP), 문헌[Arbuthnot, et al., Hum. Gene. Ther., 7:1503-14 (1996)]이다. 간에서 활성인 인핸서의 예는 아포지질단백질 E(apoE) HCR-1 및 HCR-2이다(Allan et al., J. Biol . Chem ., 272:29113-19 (1997)).
발현 조절 요소는 또한 많은 상이한 세포 유형에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도할 수 있는 편재성 또는 뒤섞인(promiscuous) 프로모터/인핸서를 포함한다. 상기 요소는 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 프로모터/인핸서 서열, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터/인핸서 서열 및 다양한 포유동물 세포 유형에서 활성인 다른 바이러스 프로모터/인핸서, 또는 자연에 존재하지 않는 합성 요소(예를 들어, 문헌[Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)] 참조), SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, 세포질 β-액틴 프로모터 및 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
발현 조절 요소는 또한 조절 가능한 방식으로, 즉, 신호 또는 자극이 작동 가능하게 연결된 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키거나 감소시키는 방식으로 발현을 부여할 수 있다. 신호 또는 자극에 반응하여 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 조절 가능한 요소는 또한 "유도성 요소"(즉, 신호에 의해 유도됨)로 언급된다. 특정 예는 호르몬(예를 들어, 스테로이드) 유도성 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 전형적으로, 상기 요소에 의해 부여되는 증가 또는 감소의 양은 존재하는 신호 또는 자극의 양에 비례하고; 신호 또는 자극의 양이 클수록, 발현에서의 증가 또는 감소가 크다. 특정한 비제한적인 예는 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터; 스테로이드 호르몬-유도성 마우스 유암 바이러스(MMTV) 프로모터; T7 중합효소 프로모터 시스템(WO 98/10088); 테트라사이클린-억제성 시스템(Gossen, et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)); 테트라사이클린-유도성 시스템(Gossen, et al., Science. 268:1766-1769 (1995); 또한 문헌[Harvey, et al., Curr . Opin . Chem . Biol. 2:512-518 (1998)] 참조); RU486-유도성 시스템(Wang, et al., Nat. Biotech. 15:239-243 (1997) 및 Wang, et al., Gene Ther. 4:432-441 (1997)]; 및 라파마이신-유도성 시스템(Magari, et al., J. Clin . Invest. 100:2865-2872 (1997); Rivera, et al., Nat. Medicine. 2:1028-1032 (1996))을 포함한다. 이러한 상황에서 유용할 수 있는 다른 조절 가능한 조절 요소는 특정 생리학적 상태, 예를 들어, 온도, 급성기, 발달에 의해 조절되는 것이다.
발현 조절 요소는 또한 이종성 폴리뉴클레오티드에 대한 고유 요소(들)를 포함한다. 고유 조절 요소(예를 들어, 프로모터)는 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현이 고유 발현을 모방해야 하는 것이 요망되는 경우에 사용될 수 있다. 고유 요소는 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현이 시간적 또는 발달적으로, 또는 조직-특이적 방식으로, 또는 특정 전사 자극에 반응하여 조절되어야 하는 경우에 사용될 수 있다. 다른 고유 발현 조절 요소, 예를 들어, 인트론, 아데닐중합체형성 부위 또는 코작 컨센서스 서열이 또한 사용될 수 있다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 코딩 서열의 발현에 필요한 조절 서열이 코딩 서열의 발현을 달성하기 위해 코딩 서열에 대해 적절한 위치에 배치되는 것을 의미한다. 이러한 동일한 정의는 종종 발현 벡터에서 코딩 서열 및 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 및 종결 요소)의 배열에 적용된다. 이러한 정의는 또한 때때로 하이브리드 핵산 분자가 생성되는 제1 및 제2 핵산 분자의 핵산 서열의 배열에 적용된다.
핵산과 작동 가능하게 연결된 발현 조절 요소의 예에서, 조절 요소가 핵산의 발현을 조절하는 관계가 존재한다. 더욱 특히, 예를 들어, 작동 가능하게 연결된 2개의 DNA 서열은 2개의 DNA가 DNA 서열 중 적어도 하나가 다른 서열에 대해 생리학적 효과를 발휘할 수 있는 관계가 되도록 배열(시스 또는 트랜스)되는 것을 의미한다.
따라서, 벡터에 대한 추가 요소는 발현 조절(예를 들어, 프로모터/인핸서) 요소, 전사 종결 신호 또는 정지 코돈, 서열에 측접한 5' 또는 3' 비번역 영역(예를 들어, 아데닐중합체형성(폴리A) 서열), 예를 들어, AAV ITR 서열의 하나 이상의 카피, 또는 인트론을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
추가 요소는, 예를 들어, 패키징을 개선시키고, 오염 핵산의 존재를 감소시키기 위한, 예를 들어, 충전재(filler) 또는 스터퍼(stuffer) 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. AAV 벡터는 일반적으로 약 4 kb 내지 약 5.2 kb, 또는 약간 더 큰 크기 범위를 갖는 DNA의 삽입물을 전형적으로 수용한다. 따라서, 더 짧은 서열에 대해, 바이러스 입자로의 AAV 벡터 패키징에 대해 허용 가능한 바이러스 유전체 서열의 정상 크기이거나 이에 가까운 길이로 조절하기 위해 스터퍼 또는 충전재를 포함시킨다. 다양한 구현예에서, 충전재/스터퍼 핵산 서열은 핵산의 비번역(비-단백질 인코딩) 세그먼트이다. 4.7 Kb 미만의 핵산 서열에 대해, 충전재 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 서열과 조합(예를 들어, 벡터로 삽입)되는 경우에 약 3.0 내지 5.5Kb, 또는 약 4.0 내지 5.0Kb, 또는 약 4.3 내지 4.8Kb의 전체 길이를 갖는 길이를 갖는다.
인트론은 또한 바이러스 입자 내로의 AAV 벡터 패키징을 위한 길이를 달성하기 위해 충전재 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열로서 기능할 수 있다. 충전재 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열로서 기능하는 인트론 및 인트론 단편은 또한 발현을 향상시킬 수 있다.
어구 "지혈 관련 장애"는 출혈 장애, 예를 들어, 혈우병 A, 억제 항체, 응고 인자 VII, VIII, IX 및 X, XI, V, XII, II, 폰 빌레브란트 인자의 결핍, 조합된 FV/FVIII 결핍, 비타민 K 에폭시드 환원효소 C1 결핍, 감마-카르복실라제 결핍; 외상, 손상, 혈전증, 혈소판감소증, 뇌졸중, 응고병증, 파종성 혈관내 응고(DIC)와 관련된 출혈; 헤파린, 저분자량 헤파린, 오당류, 와파린, 소분자 항혈전제(즉, FXa 억제제)와 관련된 과-항응고; 및 혈소판 장애, 예를 들어, 버나드 슐리어 증후군(Bernard Soulier syndrome), 글란즈만 혈소판무력증(Glanzman thromblastemia), 및 저장 풀 결핍(storage pool deficiency)을 갖는 혈우병 A 환자를 나타낸다.
조성물의 수식어구로 사용되는 경우 용어 "분리된"은 조성물이 사람의 손에 의해 제조되거나, 자연적으로 발생하는 생체 내 환경으로부터 완전히 또는 적어도 부분적으로 분리됨을 의미한다. 일반적으로, 분리된 조성물은 이들이 일반적으로 자연적으로 관련하는 하나 이상의 물질, 예를 들어, 하나 이상의 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물, 세포막을 실질적으로 비함유한다.
본 발명의 핵산과 관련하여, 용어 "분리된"은 핵산 분자가 유래되는 유기체의 자연 발생 유전체(유전체 DNA)에서 바로 인접한(5' 및 3' 방향으로) 하나 이상의 서열로부터 분리된 핵산 분자를 나타낸다. 예를 들어, "분리된 핵산"은 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 삽입되거나, 원핵생물 또는 진핵생물의 DNA에 통합된 DNA 또는 cDNA 분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 RNA 분자와 관련하여, 용어 "분리된"은 주로 상기 정의된 바와 같이 분리된 DNA 분자에 의해 인코딩된 RNA 분자를 나타낸다. 대안적으로, 상기 용어는 "실질적으로 순수한" 형태(용어 "실질적으로 순수한"은 하기에 정의됨)로 존재하도록 고유 상태와 연관된(즉, 세포 또는 조직에서) RNA 분자로부터 충분히 분리된 RNA 분자를 나타낼 수 있다.
단백질과 관련하여, 용어 "분리된 단백질" 또는 "분리되고 정제된 단백질"이 때때로 본원에서 사용된다. 이러한 용어는 주로 분리된 핵산 분자의 발현에 의해 생성된 단백질을 나타낸다. 대안적으로, 상기 용어는 "실질적으로 순수한" 형태로 존재하기 위해 자연적으로 연관될 다른 단백질로부터 충분히 분리된 단백질을 나타낼 수 있다.
용어 "분리된"은 사람의 손에 의해 생성된 조합, 예를 들어, 재조합 벡터(예를 들어, rAAV) 서열, 또는 벡터 유전체 및 약학적 제형을 패키징하거나 캡시드화하는 바이러스 입자를 배제하지 않는다. 용어 "분리된"은 또한 하이브리드/키메라, 다량체/올리고머, 변형(예를 들어, 인산화, 당화, 지질화) 또는 유도체화된 형태, 또는 사람의 손에 의해 생성된 숙주 세포에서 발현된 형태와 같은 조성물의 대안적인 물리적 형태를 배제하지 않는다.
용어 "실질적으로 순수한"은 관심 화합물(예를 들어, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 단백질 등)을 적어도 50-60 중량%로 포함하는 제조물을 나타낸다. 제조물은 적어도 75 중량%, 또는 약 90-99 중량%의 관심 화합물을 포함할 수 있다. 순도는 관심 화합물에 적절한 방법(예를 들어, 크로마토그래피 방법, 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 젤 전기영동, HPLC 분석 등)에 의해 측정된다.
특정 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 언급하는 경우 어구 "~를 필수적으로 포함하는"은 제공된 SEQ ID NO의 특성을 갖는 서열을 의미한다. 예를 들어, 아미노산 서열과 관련하여 사용되는 경우, 상기 어구는 서열 자체 및 서열의 기본 및 신규 특징에 영향을 미치지 않는 분자 변형을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드"는 프라이머 및 프로브를 나타내고, 2개 이상의 리보- 또는 데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들어, 3개 초과로 구성된 핵산 분자로서 정의된다. 올리고뉴클레오티드의 정확한 크기는 다양한 인자 및 올리고뉴클레오티드가 사용되는 특정 적용에 의존할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "프로브"는 프로브와 상보적인 서열을 갖는 핵산과 함께 어닐링될 수 있거나 이에 특이적으로 하이브리드화될 수 있는, 정제된 제한 효소 분해물에서와 같이 자연 발생하거나 합성적으로 생성된 RNA 또는 DNA인 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 나타낸다. 프로브는 단일-가닥이거나 이중-가닥일 수 있다. 프로브의 정확한 길이는 온도, 프로브 공급원 및 사용 방법을 포함하는 많은 요인에 좌우될 것이다. 예를 들어, 진단 적용의 경우, 표적 서열의 복잡성에 따라, 올리고뉴클레오티드 프로브는 전형적으로 15-25개 이상의 뉴클레오티드를 함유하나, 이는 더 적은 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
본원의 프로브는 특정 표적 핵산 서열의 상이한 가닥에 "실질적으로" 상보적인 것으로 선택된다. 이는 프로브가 일련의 소정의 조건하에서 각각의 표적 가닥과 "특이적으로 하이브리드화"되거나 어닐링될 수 있도록 충분히 상보적이어야 하는 것을 의미한다. 따라서, 프로브 서열은 표적의 정확한 상보적 서열을 반영할 필요는 없다. 예를 들어, 비-상보적인 뉴클레오티드 단편은 프로브의 5' 또는 3' 말단에 부착될 수 있으며, 프로브 서열의 나머지는 표적 가닥에 상보적이다. 대안적으로, 프로브 서열이 표적 핵산과 특이적으로 어닐링되도록 표적 핵산의 서열과 충분한 상보성을 갖는 한, 비-상보적인 염기 또는 더 긴 서열이 프로브에 산재될 수 있다.
용어 "특이적으로 하이브리드화되는"은 당 분야에서 일반적으로 사용되는 소정의 조건하에서 상기 하이브리드화를 허용하는 충분히 상보적(때때로, "실질적으로 상보적인"으로 언급됨)인 서열의 2개의 단일 가닥 핵산 분자 사이의 연관을 나타낸다. 특히, 상기 용어는 본 발명의 단일-가닥 DNA 또는 RNA 분자 내에 함유된 실질적으로 상보적인 서열과 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화, 비-상보적 서열의 단일 가닥 핵산과 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화의 실질적 배제를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "프라이머"는 적절한 환경에 배치되는 경우 주형-의존성 핵산 합성의 개시제로서 기능적으로 작용할 수 있는 생물학적 시스템으로부터 유래되거나, 제한 효소 절단에 의해 생성되거나, 합성에 의해 생성된 단일-가닥 또는 이중-가닥의 RNA 또는 DNA인 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 적절한 핵산 주형, 핵산의 적합한 뉴클레오시드 트리포스페이트 전구체, 중합효소, 적합한 보조인자 및 적합한 온도 및 pH와 같은 조건이 제시되는 경우, 프라이머는 중합효소의 작용 또는 유사한 활성에 의한 뉴클레오티드의 첨가에 의해 이의 3' 말단에서 연장되어 프라이머 연장 생성물을 생성시킬 수 있다.
프라이머는 특정 조건 및 적용 요건에 따라 길이가 달라질 수 있다. 예를 들어, 진단 적용에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 전형적으로 15-25개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 프라이머는 원하는 연장 생성물의 합성을 프라이밍하기 위해, 즉, 중합효소 또는 유사한 효소에 의한 합성의 개시에서 사용하기 위해 적절한 근접위치에서 프라이머의 3' 하이드록실 모이어티를 제공하기에 충분한 방식으로 원하는 주형 가닥과 함께 어닐링될 수 있도록 원하는 주형과 충분한 상보성을 가져야 한다. 프라이머 서열이 원하는 주형의 정확한 상보체를 나타낼 필요는 없다. 예를 들어, 비-상보적 뉴클레오티드 서열은 다른 상보적 프라이머의 5' 말단에 부착될 수 있다. 대안적으로, 비-상보적 염기는 프라이머 서열이 원하는 주형 가닥의 서열과 충분한 상보성을 가져 연장 생성물의 합성을 위한 주형-프라이머 복합체를 기능적으로 제공하는 한 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 내에 산재될 수 있다.
용어 "동일성", "상동성" 및 이의 문법적 변형은 2개 이상의 언급된 존재물이 "정렬된" 서열일 때 동일한 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 2개의 폴리펩티드 서열이 동일한 경우, 이들은 적어도 언급된 영역 또는 부분 내에서 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 2개의 폴리뉴클레오티드 서열이 동일한 경우, 이들은 적어도 언급된 영역 또는 부분 내에서 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다. 동일성은 서열의 정의된 부위(영역 또는 도메인)에 걸쳐 존재할 수 있다. 동일성의 "부위" 또는 "영역"은 동일한 2개 이상의 언급된 존재물의 일부를 나타낸다. 따라서, 2개의 단백질 또는 핵산 서열이 하나 이상의 서열 부위 또는 영역에 걸쳐 동일한 경우, 이들은 그 영역 내에서 동일성을 공유한다. "정렬된" 서열은 참조 서열에 비해 누락되거나 추가의 염기 또는 아미노산(갭)에 대한 보정을 종종 함유하는 다수의 폴리뉴클레오티드 또는 단백질(아미노산) 서열을 나타낸다.
동일성은 서열의 전체 길이 또는 일부에 걸쳐 연장될 수 있다. 특정 구현예에서, 동일성 백분율을 공유하는 서열의 길이는 2, 3, 4, 5개 이상의 연속 핵산 또는 아미노산, 예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 등의 연속 핵산 또는 아미노산이다. 추가 구현예에서, 동일성을 공유하는 서열의 길이는 21개 이상의 연속 핵산 또는 아미노산, 예를 들어, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40개 등의 연속 핵산 또는 아미노산이다. 추가 구현예에서, 동일성을 공유하는 서열의 길이는 41개 이상의 연속 핵산 또는 아미노산, 예를 들어, 42, 43, 44, 45, 45, 47, 48, 49, 50개 등의 연속 핵산 또는 아미노산이다. 또 다른 추가 구현예에서, 서열 공유 동일성의 길이는 50개 이상의 연속 핵산 또는 아미노산, 예를 들어, 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75, 75-80, 80-85, 85-90, 90-95, 95-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-500, 500-1,000개 등의 연속 핵산 또는 아미노산이다.
본원에 기재된 바와 같이, FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 CpG 감소된 변이체와 같은 핵산 변이체는 야생형과 구별될 것이나, B-도메인을 갖거나 B-도메인을 갖지 않는 야생형 FVIII 단백질과 서열 동일성을 나타낼 수 있다. FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체에서, 뉴클레오티드 서열 수준에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산은 전형적으로 야생형 FVIII 인코딩 핵산과 적어도 약 70% 동일하고, 더욱 전형적으로 약 75% 동일하고, 더욱 더 전형적으로 약 80%-85% 동일할 것이다. 따라서, 예를 들어, FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산은 야생형 FVIII 인코딩 유전자, 또는 서로에 대해, 즉, 본원에 기재된 바와 같이 X01 대 X02, X03 대 X04 등에 대해 75%-85% 동일성을 가질 수 있다.
아미노산 서열 수준에서, 변이체 FVIII 또는 hFVIII-BDD 단백질과 같은 변이체는 적어도 약 70% 동일하거나, 더욱 전형적으로 약 75% 동일하거나, 80% 동일하거나, 더욱 더 전형적으로 약 85 동일하거나, 90% 이상 동일할 것이다. 다른 구현예에서, 변이체 FVIII 또는 hFVIII-BDD 단백질과 같은 변이체는 참조 서열, 예를 들어, B-도메인을 갖거나 B-도메인을 갖지 않는 야생형 FVIII 단백질과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성을 갖는다.
동일성을 결정하기 위해, FVIII(예를 들어, FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산)가 B-도메인을 보유하는 경우, 동일성을 야생형 FVIII와 비교하는 것이 적절하다. FVIII(예를 들어, hFVIII-BDD를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산)가 B-도메인 결실을 갖는 경우, B-도메인 결실을 또한 갖는 야생형 FVIII와 동일성을 비교하는 것이 적절하다.
용어 "상동성의" 또는 "상동성"은 2개 이상의 언급된 존재물이 제공된 영역 또는 부분에 걸쳐 적어도 부분적 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 상동성 또는 동일성의 "부위, 영역 또는 도메인"은 2개 이상의 언급된 존재물의 일부가 상동성을 공유하거나 동일한 것을 의미한다. 따라서, 2개의 서열이 하나 이상의 서열 영역에 걸쳐 동일한 경우, 이들은 이들 영역 내에서 동일성을 공유한다. "실질적인 상동성"은 분자가 상동성을 공유하는 참조 분자, 또는 참조 분자의 관련/상응 영역 또는 부분의 구조 또는 기능(예를 들어, 생물학적 기능 또는 활성) 중 하나 이상의 적어도 부분적 구조 또는 기능을 갖거나, 갖는 것이 예측되도록 구조적 또는 기능적으로 보존되는 것을 의미한다.
2개의 서열 사이의 동일성(상동성)의 정도 또는 "동일성 백분율"은 컴퓨터 프로그램 및/또는 수학적 알고리즘을 이용하여 확인될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 핵산 서열의 비교는 위스콘신 매디슨의 유전학 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)으로부터 이용 가능한 GCG 위스콘신 패키지 버전 9.1을 이용하여 수행된다. 편의를 위해, 상기 프로그램에 의해 지정된 디폴트 파라미터(갭 생성 페널티 = 12, 갭 확장 페널티 = 4)가 서열 동일성을 비교하기 위해 본원에서 사용되도록 의도된다. 대안적으로, 디폴트 파라미터를 갖는 갭 정렬을 이용하는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)(ncbi.nlm.nih.gov/blast/의 월드 와이드 웹; 문헌[Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215:403-410]에서 발견됨)에 의해 제공되는 Blastn 2.0 프로그램은 핵산 서열 및 아미노산 서열 사이의 동일성 및 유사성의 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 폴리펩티드 서열 비교를 위해, BLASTP 알고리즘은 전형적으로 PAM100, PAM 250, BLOSUM 62 또는 BLOSUM 50과 같은 스코어링 매트릭스와 조합하여 사용된다. FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3) 및 SSEARCH 서열 비교 프로그램이 또한 동일성의 정도를 정량하기 위해 사용된다(Pearson et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132:185 (2000); 및 Smith et al., J. Mol . Biol . 147:195 (1981)). 들로네(Delaunay)-기반 토폴로지 맵핑을 이용하여 단백질 구조 유사성을 정량하기 위한 프로그램이 또한 개발되었다(Bostick et al., Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (2003)).
본 발명의 FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 핵산 및 핵산 변이체를 포함하는 핵산 분자, 발현 벡터(예를 들어, 벡터 유전체), 플라스미드는 재조합 DNA 기술 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 뉴클레오티드 서열 정보의 이용 가능성은 다양한 수단에 의한 본 발명의 분리된 핵산 분자의 제조를 가능하게 한다. 예를 들어, FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체는 세포 발현 또는 시험관 내 번역 및 화학적 합성 기술을 통해 다양한 표준 클로닝, 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 순도는 시퀀싱, 젤 전기영동 등을 통해 결정될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 하이브리드화 또는 컴퓨터-기반 데이터베이스 스크리닝 기술을 이용하여 분리될 수 있다. 상기 기술은 (1) 상동성 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 프로브와 유전체 DNA 또는 cDNA 라이브러리의 하이브리드화; (2) 예를 들어, 발현 라이브러리를 이용하여 공유된 구조적 특징을 갖는 폴리펩티드를 검출하기 위한 항체 스크리닝; (3) 관심 핵산 서열에 어닐링할 수 있는 프라이머를 이용한 유전체 DNA 또는 cDNA에 대한 중합효소 연쇄 반응(PCR); (4) 관련 서열의 서열 데이터베이스의 컴퓨터 검색; 및 (5) 공제된 핵산 라이브러리의 차별적 스크리닝을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 핵산은 임의의 편리한 클로닝 벡터에서 DNA로서 유지될 수 있다. 일 구현예에서, 클론은 적합한 E. 콜리 숙주 세포에서 증식되는 플라스미드 클로닝/발현 벡터, 예를 들어, pBluescript(Stratagene, La Jolla, CA)에서 유지된다. 대안적으로, 핵산은 포유동물 세포에서의 발현에 적합한 벡터에 유지될 수 있다. 번역 후 변형이 응고 기능에 영향을 미치는 경우, 핵산 분자는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다.
FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 핵산 및 핵산 변이체는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있는 cDNA, 유전체 DNA, RNA 및 이들의 단편을 포함한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산의 적어도 하나의 서열과 하이브리드화될 수 있는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(DNA 또는 RNA의 센스 또는 안티센스 가닥)를 제공한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 FVIII 또는 hFVIII-BDD 발현을 검출하기 위한 프로브로서 유용하다.
본원에 기재된 것과 같은 벡터(rAAV)는 숙주 세포에서 인코딩된 단백질의 발현을 허용하는 방식으로 위치된 숙주 세포에서의 DNA의 발현에 필요한 조절 요소를 선택적으로 포함한다. 발현에 필요한 상기 조절 요소는 본원에 기재되고 당업자에게 공지된 프로모터 서열, 인핸서 서열 및 전사 개시 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 방법 및 용도는 숙주 세포, 예를 들어, 분열 및/또는 비-분열 세포로 핵산(트랜스진)을 전달(형질도입)하는 것을 포함한다. 본 발명의 핵산, rAAV 벡터, 방법, 용도 및 약학적 제형은 치료 방법으로서 FVIII 또는 hFVIII-BDD를 이를 필요로 하는 대상체에 전달하거나, 투여하거나, 제공하는 방법에서 추가로 유용하다. 이러한 방식으로, 핵산은 전사되고, 단백질은 대상체에서 생체 내에서 생성될 수 있다. 대상체는 FVIII 또는 hFVIII-BDD로부터 이익을 얻을 수 있거나 이를 필요로 할 수 있는데, 이는 대상체가 FVIII의 결핍을 갖거나, 대상체에서의 FVIII의 생성이 치료 방법으로서 또는 달리 일부 치료 효과를 부여할 수 있기 때문이다.
FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 핵산 또는 핵산 변이체를 갖는 유전체를 포함하는 rAAV 벡터는 유전학적 질병, 예를 들어, FVIII 결핍의 치료를 허용한다. 결핍 상태 질병의 경우, 유전자 전달을 사용하여 대체 요법을 위해 정상 유전자를 병에 걸린 조직으로 가져올 뿐만 아니라 안티센스 돌연변이를 이용하여 질병에 대한 동물 모델을 생성시키는 데 사용될 수 있다. 불균형 질병 상태인 경우, 유전자 전달을 사용하여 모델 시스템에서 질병 상태를 생성할 수 있으며, 이는 이후 질병 상태에 대응하기 위한 노력에 사용될 수 있다. 결함을 교정하기 위한 핵산 서열의 부위-특이적 통합의 사용이 또한 가능하다.
특정 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 핵산 또는 핵산 변이체를 갖는 유전체를 포함하는 rAAV 벡터는, 예를 들어, 혈액 응고 캐스케이드를 조절하는 치료제 및/또는 예방제(단백질 또는 핵산)로서 또는 유전자에서 트랜스진으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 인코딩된 FVIII 또는 hFVIII-BDD는 향생형 FVIII와 유사한 응고 활성, 또는 야생형 FVIII에 비해 변경된 응고 활성을 가질 수 있다. 세포 기반 전략은 혈우병 A 환자에서 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 지속적인 발현을 가능하게 한다. 본원에 개시된 바와 같이, FVIII 분자(핵산 및 단백질)의 특정 변형은 핵산 수준에서 증가된 발현, 증가된 응고 활성을 발생시켜 지혈을 효과적으로 개선시킨다.
환자로의 FVIII 또는 hFVIII-BDD-인코딩 rAAV 벡터의 투여는 응고 캐스케이드를 변경시키는 역할을 하는 FVIII 또는 hFVIII-BDD 단백질의 발현을 발생시킨다. 본 발명에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 FVIII 또는 hFVIII-BDD 단백질, 또는 기능적 단편의 발현은 지혈을 증가시킨다.
rAAV 벡터는 단독으로 또는 지혈을 조절하는 데 유용한 다른 분자와 함께 투여될 수 있다. 본 발명에 따르면, rAAV 벡터 또는 치료제의 조합은 환자에게 단독으로 또는 약학적으로 허용되거나 생물학적으로 상용성인 조성물로 투여될 수 있다.
"아데노-관련 바이러스"(AAV)는 파보바이러스 계열이다. AAV는 이들이 세포를 침투하고, 핵산/유전 물질을 도입시켜, 핵산/유전 물질이 세포에서 안정적으로 유지될 수 있으므로 유전 요법 벡터로서 유용한 바이러스이다. 또한, 이들 바이러스는 핵산/유전 물질을, 예를 들어, 특정 부위에 도입시킬 수 있다. AAV는 인간에서 병원성 질병과 관련되지 않으므로, rAAV 벡터는 실질적인 AAV 발병기전 또는 질병을 야기시키지 않고 인간 환자에 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 치료 단백질 및 제제)을 전달할 수 있다.
rAAV 벡터는 분열 및 비-분열 세포를 위한 향성을 포함하여 상기 적용에 대한 다수의 바람직한 특징을 갖는다. 이들 벡터에 대한 초기 임상 경험은 또한 지속된 독성이 없는 것을 나타내었으며, 면역 반응은 최소이거나 검출 가능하지 않았다. AAV는 수용체-매개 세포내이입 또는 트랜스사이토시스에 의해 생체 내 및 시험관 내에서 다양한 세포 유형을 감염시키는 것으로 공지되어 있다. 이들 벡터 시스템은 망막 상피, 간, 골격근, 기도, 뇌, 관절 및 조혈 줄기 세포를 표적으로 하여 인간에서 시험되었다.
예를 들어, 원하는 유전자의 다수의 카피 및 그로 인해 상기 유전자의 생성물의 더 많은 양을 제공할 수 있는 rAAV 벡터를 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 개선된 rAAV 벡터 및 이들 벡터를 생성시키기 위한 방법은 필라델피아 소아 병원에서 임상 등급 벡터의 생성에 사용되는 기술인 문헌[Wright J.F. (Hum Gene Ther 20:698-706, 2009)]을 포함하는 다수의 참고문헌, 특허 및 특허 출원에 상세히 기재되어 있다.
따라서, 본 발명은 rAAV 벡터를 통한 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 전달을 위한 vir 방법(virmethod)을 제공한다. 예를 들어, 재조합 AAV 벡터는 FVIII를 인코딩하는 핵산 변이체를 포함할 수 있으며, 여기서 인코딩된 FVIII 단백질은 선택적으로 B-도메인 결실을 갖는다. 따라서, 대상체(예를 들어, 포유동물)로의 rAAV 벡터 전달 또는 투여는 포유동물(예를 들어, 인간)과 같은 대상체에 FVIII를 제공한다.
벡터의 직접 전달 또는 인간 세포의 생체 외 형질도입 후 신체로의 주입은 FVIII 또는 hFVIII-BDD 발현을 발생시켜 지혈에 이로운 치료 효과를 발휘할 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 인자 VIII의 상황에서, 상기 투여는 응고-촉진 활성을 향상시킨다.
AAV 벡터는 전형적으로 발병기전과 관련된 바이러스 유전자를 포함하지 않는다. 상기 벡터는 전형적으로 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 하나 이상의 야생형 AAV 유전자, 예를 들어, rep 및/또는 cap 유전자를 가지나, 재조합 벡터의 구조, 복제, 및 AAV 벡터 입자로의 패키징에 필요한 적어도 하나의 기능성 측접 ITR 서열을 보유한다. 예를 들어, 벡터의 필수 부분, 예를 들어, ITR 요소만이 각각 포함된다. 따라서, AAV 벡터 유전체는 복제 및 패키징을 위해 시스(cis)로 필요한 서열(예를 들어, 기능성 ITR 서열)을 포함한다.
재조합 AAV 벡터뿐만 아니라 이의 방법 및 용도는 임의의 바이러스 균주 또는 혈청형을 포함한다. 비제한적인 예로서, 재조합 AAV 벡터는, 예를 들어, AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -rh74, -rh10 또는 AAV-2i8과 같은 임의의 AAV 유전체를 기초로 할 수 있다. 상기 벡터는 동일한 균주 또는 혈청형(또는 서브그룹 또는 변이체)을 기초로 할 수 있거나, 서로 상이할 수 있다. 비제한적인 예로서, 하나의 혈청형 유전체를 기초로 하는 재조합 AAV 벡터는 벡터를 패키징하는 캡시드 단백질 중 하나 이상과 동일할 수 있다. 또한, 재조합 AAV 벡터 유전체는 벡터를 패키징하는 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질과 구별되는 AAV(예를 들어, AAV2) 혈청형 유전체에 기초할 수 있다. 예를 들어, AAV 벡터 유전체는 AAV2에 기초할 수 있는 반면, 3개의 캡시드 단백질 중 적어도 하나는, 예를 들어, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 또는 이들의 변이체일 수 있다.
특정 구현예에서, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터는, 예를 들어, WO 2013/158879호(국제 출원 PCT/US2013/037170호), WO 2015/013313호(국제 출원 PCT/US2014/047670호) 및 US 2013/0059732호(미국 특허 번호 9,169,299호, LK01, LK02, LK03 등을 개시함)에 기재된 바와 같은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 및 AAV-2i8뿐만 아니라 이들의 변이체(예를 들어, 캡시드 변이체, 예를 들어, 아미노산 삽입, 첨가, 치환 및 결실)를 포함한다.
AAV 변이체는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 및 AAV-2i8 캡시드의 변이체 및 키메라를 포함한다. 따라서, FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 핵산 또는 핵산 변이체를 포함하는(캡시드화하거나 패키징하는) AAV 벡터 및 AAV 변이체(예를 들어, 캡시드 변이체).
AAV 및 AAV 변이체(예를 들어, 캡시드 변이체) 혈청형(예를 들어, VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열)은, 예를 들어, AAV1-AAV12, Rh74 또는 Rh10을 포함하는 다른 AAV 혈청형과 구별되거나 구별되지 않을 수 있다(예를 들어, AAV1-AAV12, Rh74 또는 Rh10 혈청형 중 임의의 것의 VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열과 구별됨).
본원에서 사용되는 용어 "혈청형"은 다른 AAV 혈청형과 혈청학적으로 구별되는 캡시드를 갖는 AAV를 나타내는데 사용되는 구별법이다. 혈청학적 특이성은 다른 AAV와 비교하여 하나의 AAV에 대한 항체 사이의 교차반응성의 결여를 기초로 하여 결정된다. 상기 교차반응성 차이는 일반적으로 캡시드 단백질 서열/항원 결정인자에서의 차이(예를 들어, AAV 혈청형의 VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열 차이로 인함)로 인한 것이다. 캡시드 변이체를 포함하는 AAV 변이체가 참조 AAV 또는 다른 AAV 혈청형과 혈청학적으로 구별되지 않을 수 있는 가능성에도 불구하고, 이들은 참조 또는 다른 AAV 혈청형과 비교하여 적어도 하나의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기에 의해 상이하다.
전통적 정의 하에서, 혈청형은 관심 바이러스가 중화 활성에 대해 모든 현존하고 특성규명된 혈청형에 특이적인 혈청에 대해 시험되었고, 관심 바이러스를 중화시키는 항체가 발견되지 않았음을 의미한다. 더 많은 자연 발생 바이러스 분리물이 발견되고/되거나 캡시드 돌연변이체가 생성됨에 따라, 현존하는 혈청형 중 임의의 혈청형과 혈청학적 차이가 있을 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 따라서, 새로운 바이러스(예를 들어, AAV)가 혈청학적 차이를 갖지 않는 경우, 이러한 새로운 바이러스(예를 들어, AAV)는 상응하는 혈청형의 서브그룹 또는 변이체일 것이다. 많은 경우에, 중화 활성에 대한 혈청학적 시험은 캡시드 서열 변형을 갖는 돌연변이체 바이러스가 전통적인 혈청형 정의에 따라 다른 혈청형인지 결정하기 위해 이들 돌연변이체 바이러스에 대해 아직 수행되지 않았다. 따라서, 편의성 및 반복 회피를 위해, 용어 "혈청형"은 혈청학적으로 구별되는 바이러스(예를 들어, AAV) 뿐만 아니라 제공된 혈청형의 서브그룹 또는 변이체 내에 존재할 수 있는 혈청학적으로 구별되지 않는 바이러스(예를 들어, AAV) 둘 모두를 광범위하게 나타낸다.
따라서, AAV 벡터는 특정 혈청형에 특징적인 유전자/단백질 서열과 동일한 유전자/단백질 서열을 포함한다. 본원에서 사용되는 "AAV1과 관련된 AAV 벡터"는 AAV1을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 AAV 단백질(예를 들어, VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열)을 나타낸다. 유사하게, "AAV8과 관련된 AAV 벡터"는 AAV8을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 AAV 단백질(예를 들어, VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열)을 나타낸다. "AAV-Rh74와 관련된 AAV 벡터"는 AAV-Rh74를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 AAV 단백질(예를 들어, VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열)을 나타낸다. 따라서, 또 다른 혈청형, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8과 관련된 상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 및 AAV-2i8로부터의 하나 이상의 별개의 서열을 가질 수 있으나, 하나 이상의 유전자 및/또는 단백질과 실질적인 서열 동일성을 나타낼 수 있고/있거나, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8의 하나 이상의 기능적 특징을 가질 수 있다(예를 들어, 세포/조직 향성). 예시적인 비제한적 AAV 변이체는 VP1, VP2, 및/또는 VP3 중 임의의 것의 캡시드 변이체를 포함한다.
다양한 예시적 구현예에서, 참조 혈청형과 관련된 AAV 벡터는 하나 이상의 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8(예를 들어, ITR, 또는 VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열)과 적어도 80% 또는 그 초과(예를 들어, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등)의 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 이들의 하위서열을 갖는다.
본 발명의 조성물, 방법 및 용도는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10 또는 AAV-2i8과 같은 참조 AAV 혈청형과 100% 미만의 서열 동일성을 나타내지만, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 유전자 또는 단백질 등과 같은 공지된 AAV 유전자 또는 단백질과 상이하고 동일하지 않은 AAV 서열(폴리펩티드 및 뉴클레오티드) 및 이의 하위서열을 포함한다. 일 구현예에서, AAV 폴리펩티드 또는 이의 하위서열은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8(예를 들어, VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 또는 ITR)과 같은 임의의 참조 AAV 서열 또는 이의 하위서열과 적어도 75% 또는 그 초과로 동일하고, 예를 들어, 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등, 및 최대 100% 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 특정 구현예에서, AAV 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 5-10, 10-15, 15-20개 이상의 아미노산 치환을 갖는다.
AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 및 관련된 변이체, 하이브리드 및 키메라 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터는 하나 이상의 기능적 AAV ITR 서열과 측접된 하나 이상의 핵산 서열(트랜스진)을 포함하도록 당업자에게 공지된 재조합 기술을 이용하여 작제될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, FVIII 또는 hFVIII-BDD를 인코딩하는 핵산 또는 변이체를 포함하는 rAAV 벡터는 생물학적으로 상용성인 담체에서의 주입, 예를 들어, 정맥내 주사를 통해 환자에 투여될 수 있다. rAAV 벡터는 분자의 안정성을 증가시키기 위해 선택적으로 리포솜으로 캡슐화되거나 다른 인지질 또는 마이셀과 혼합될 수 있다.
본 발명에 따르면, rAAV 벡터는 단독으로 또는 지혈을 조절하는 것으로 공지된 다른 제제(예를 들어, 인자 V, 인자 Va 또는 이들의 유도체)와 함께 투여될 수 있다.
따라서, rAAV 벡터 및 다른 조성물, 제제, 약물, 생물학적 제제(단백질)가 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 무엇보다도 생체 내 또는 생체 외에서 대상체에 투여 및 전달하는 데 유용하다.
특정 구현예에서, 약학적 조성물은 또한 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유한다. 상기 부형제는 조성물을 투여받는 개체에게 유해한 면역 반응을 자체적으로 유도하지 않고, 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 약학적 제제를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는" 및 "생리학적으로 허용되는"은 생물학적으로 허용되는 제형, 기체, 액체 또는 고체 또는 이들의 혼합물을 의미하며, 이는 하나 이상의 투여 경로, 생체 내 전달 또는 접촉에 적합하다. "약학적으로 허용되는" 또는 "생리학적으로 허용되는" 조성물은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않지 않은 물질이며, 예를 들어, 상기 물질은 실질적인 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하지 않으면서 대상체에 투여될 수 있다. 따라서, 상기 약학적 조성물은, 예를 들어, 대상체에 핵산, 벡터, 바이러스 입자 또는 단백질을 투여하는 데 사용될 수 있다.
약학적으로 허용되는 부형제는 액체, 예를 들어, 물, 염수, 글리세롤, 당 및 에탄올을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 약학적으로 허용되는 염은 또한, 예를 들어, 광산염, 예를 들어, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트, 설페이트 등; 및 유기산의 염, 예를 들어, 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등을 그 안에 포함할 수 있다. 또한, 보조 물질, 예를 들어, 습윤제 또는 에멀젼화제, pH 완충 물질 등이 이러한 비히클에 존재할 수 있다.
약학적 조성물은 염으로 제공될 수 있으며, 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 많은 산으로 형성될 수 있다. 염은 상응하는 자유 염기 형태보다 수성 또는 다른 양성자성 용매에 더 가용성인 경향이 있다. 다른 경우에, 제조물은 4.5 내지 5.5의 pH 범위의 1-50 mM 히스티딘, 0.1%-2% 수크로스, 및 2-7% 만니톨 중 임의의 것 또는 모두를 함유할 수 있는 동결건조된 분말일 수 있으며, 이는 사용 전에 완충액과 조합된다.
약학적 조성물은 약학적 투여 또는 생체 내 접촉 또는 전달과 상용성인 용매(수성 또는 비수성), 용액(수성 또는 비수성), 에멀젼(예를 들어, 수중유 또는 유중수), 현탁액, 시럽, 엘릭서, 분산액 및 현탁 매질, 코팅, 등장성 및 흡수 촉진 또는 지연제를 포함한다. 수성 및 비수성 용매, 용액 및 현탁액은 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 정제(코팅되거나 비코팅됨), 캡슐(경질 또는 연질), 마이크로비드, 분말, 과립 및 결정을 포함한다. 보충 활성 화합물(예를 들어, 보존제, 항균제, 항바이러스제 및 항진균제)이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
약학적 조성물은 본원에 기재되거나 당업자에게 공지된 바와 같이 특정 투여 또는 전달 경로와 상용되도록 제형화될 수 있다. 따라서, 약학적 조성물은 다양한 경로에 의한 투여에 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함한다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 활성 화합물의 수성 및 비수성 용액, 현탁액 또는 에멀젼을 포함하며, 상기 제조물은 전형적으로 멸균되고 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 될 수 있다. 비제한적인 예시적 예는 물, 완충 염수, 행크 용액, 링거액, 덱스트로스, 프룩토스, 에탄올, 동물, 식물성 또는 합성 오일을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다.
또한, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 오일 주입 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어, 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드, 또는 리포솜을 포함한다. 선택적으로, 현탁액은 또한 적합한 안정화제 또는 화합물의 용해도를 증가시켜 고도로 농축된 용액의 제조를 허용하는 제제를 함유할 수 있다.
공용매 및 애쥬번트가 제형에 첨가될 수 있다. 공용매의 비제한적인 예는 하이드록실기 또는 다른 극성 기, 예를 들어, 알콜, 예를 들어, 이소프로필 알콜; 글리콜, 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 글리콜 에테르; 글리세롤; 폴리옥시에틸렌 알콜 및 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르를 함유한다. 애쥬번트는, 예를 들어, 계면활성제, 예를 들어, 대두 레시틴 및 올레산; 소르비탄 에스테르, 예를 들어, 소르비탄 트리올레에이트; 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다.
약학적 조성물이 제조된 후, 이들은 적절한 용기에 넣고, 치료를 위해 라벨링될 수 있다. 상기 라벨링은 양, 빈도, 및 투여 방법을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물, 방법 및 용도에 적절한 약학적 조성물 및 전달 시스템은 당 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Remington : The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD; 및 Poznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., pp. 253-315] 참조).
"유효량" 또는 "충분한 양"은 단일 또는 다중 용량으로, 단독으로 또는 하나 이상의 다른 조성물(치료제 또는 면역억제제, 예를 들어, 약물), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법제와 조합하여 임의의 지속기간(장기 또는 장기)의 검출 가능한 반응, 임의의 지속 기간(예를 들어, 몇 분, 몇 시간, 수 일, 수 개월, 수년 또는 치료됨) 동안 임의의 측정 가능하거나 검출 가능한 정도의 대상체에서의 예상되거나 원하는 결과 또는 대상체에 대한 이점을 제공하는 양을 나타낸다.
용량은 상이할 수 있으며, 치료가 지시되는 질병의 유형, 발병, 진행, 중증도, 빈도, 지속 기간, 또는 확률, 원하는 임상 종점, 이전 또는 동시 치료, 대상체의 전반적 건강, 연령, 성별, 인종 또는 면역학적 적격성 및 당업자에 의해 인지될 다른 요인에 좌우될 수 있다. 임의의 불리한 부작용, 합병증 또는 치료 또는 요법의 다른 위험 인자 및 대상체의 상태에 의해 나타난 바와 같이, 용량, 수, 빈도 또는 지속기간은 비례적으로 증가되거나 감소될 수 있다. 당업자는 치료적 또는 예방적 이점을 제공하기에 충분한 양을 제공하는데 필요한 투여량 및 시기에 영향을 줄 수 있는 요인을 인지할 것이다.
치료 효과를 달성하기 위한 용량, 예를 들어, 체중 킬로그램 당 벡터 유전체(vg/kg)의 용량은 투여 경로, 치료 효과를 달성하는 데 필요한 이종성 폴리뉴클레오티드 발현의 수준, 치료되는 특정 질병, 바이러스 벡터에 대한 임의의 숙주 면역 반응, 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 발현 생성물(단백질)에 대한 숙주 면역 반응, 및 발현된 단백질의 안정성을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 여러 요인에 기초하여 상이할 것이다. 당업자는 상기 언급된 요인뿐만 아니라 다른 요인에 기초하여 특정 질병 또는 장애를 갖는 환자를 치료하기 위한 rAAV/벡터 유전체 용량 범위를 결정할 수 있다.
일반적으로, 용량은 치료 효과를 달성하기 위해 대상체의 체중 킬로그램 당 적어도 1 x 108개 또는 그 초과, 예를 들어, 1 x109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012, 1 x 1013 또는 1 x 1014개 이상의 벡터 유전체(vg/kg)의 범위일 것이다. 마우스에서 1 x 1010-1 x 1011, 및 개에서 1 x 1012-1 x 1013 범위의 AAV 용량이 효과적이었다. 용량은, 예를 들어, 킬로그램 당 6 x 1012개 미만의 벡터 유전체(vg/kg)의 용량일 수 있다. 보다 구체적으로, 5 x 1011 vg/kg 또는 1 x 1012 vg/kg의 용량.
예로서, 일반적으로 말하면, 혈우병 B를 이용하여, 치료 효과를 달성하기 위해, 정상 개체에서 발견되는 인자 농도의 1% 초과인 혈액 응고 인자 농도가 중증의 질병 표현형을 중등증의 것으로 변화시키는데 필요한 것으로 생각된다. 중증 표현형은 관절 손상 및 생명을 위협하는 출혈을 특징으로 한다. 중등증 질병 표현형을 경증의 것으로 전환시키기 위해, 정상의 5% 초과의 혈액 응고 인자 농도가 필요한 것으로 생각된다.
정상 인간의 FVIII 수준은 약 150-200 ng/ml 혈장이지만, 더 적거나(예를 들어, 약 100-150 ng/ml의 범위) 더 클 수 있고(예를 들어, 약 200-300 ng/ml의 범위), 이는, 예를 들어, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 1-단계 응고 검정에 의해 결정되는 기능적 응고로 인해 여전히 정상으로 간주된다. 따라서, 치료 효과는 대상체/인간에서의 FVIII의 전체량이 정상 대상체/인간에 존재하는 FVIII의 1%, 예를 들어, 100-300 ng/ml의 1% 초과이도록 하는 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 발현에 의해 달성될 수 있다.
rAAV 벡터 용량은 FVIII 또는 AAV 벡터에 대한 실질적인 면역 반응이 없도록 전형적으로 용량 스펙트럼의 하단에 있는 수준일 수 있다. 보다 구체적으로, 약 5x1011 내지 약 5x1012 vg/kg, 또는 보다 구체적으로 약 5x1011 vg/kg 또는 약 1x1012 vg/kg과 같은 최대 6x1012 vg/kg 미만의 용량.
비록 질병의 진행 또는 악화를 감소시키거나, 줄이거나, 억제하거나, 억누르거나, 제한하거나, 제어하는 것이 만족스러운 결과이지만, 치료를 위한 "유효량" 또는 "충분한 양"(예를 들어, 개선을 위하거나, 치료 이점 또는 개선을 제공하기 위함)의 용량은 전형적으로 질병의 하나, 다수 또는 모든 유해한 증상, 결과 또는 합병증, 하나 이상의 유해한 증상, 장애, 질병, 병리, 또는, 예를 들어, 질병에 의해 야기되거나 질병과 관련된 합병증에 대한 반응을 측정 가능한 정도로 제공하는데 효과적이다.
유효량 또는 충분한 양은 단일 투여로 제공될 수 있으나 반드시 필요하지는 않고, 다수의 투여를 필요로 할 수 있고, 단독으로 또는 또 다른 조성물(예를 들어, 제제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법과 함께 투여될 수 있으나 반드시 필요하지는 않을 수 있다. 예를 들어, 양은 대상체의 요구, 치료되는 질병의 유형, 상태 및 중증도 또는 치료의 부작용(존재시)에 의해 지시되는 바와 같이 비례적으로 증가될 수 있다. 또한, 유효량 또는 충분한 양은 제2 조성물(예를 들어, 또 다른 약물 또는 제제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법 없이 단일 또는 다중 용량으로 제공되는 경우 효과적이거나 충분할 필요는 없는데, 제공된 대상체에서 효과적이거나 충분한 것으로 간주되기 위해 상기 용량 이상의 추가 용량, 양 또는 지속기간, 또는 추가 조성물(예를 들어, 약물 또는 제제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법이 포함될 수 있기 때문이다. 효과적인 것으로 간주되는 양은 또한 응고 장애(예를 들어, 혈우병 A)의 치료를 위한 재조합 응고 인자 단백질(예를 들어, FVIII)의 투여와 같은 또 다른 치료, 치료 요법 또는 프로토콜의 사용의 감소를 발생시키는 양을 포함한다.
따라서, 본 발명의 방법 및 용도는 또한 무엇보다도 또 다른 화합물, 제제, 약물, 치료 요법, 치료 프로토콜, 과정 또는 치료법의 감소된 필요성 또는 사용을 발생시키는 방법 및 용도를 포함한다. 예를 들어, 혈액 응고 질병의 경우, 본 발명의 방법 또는 용도는 대상체에서 결핍이 있거나 결함이 있는(비정상 또는 돌연변이체) 내인성 응고 인자를 보충하기 위해 제공된 대상체에서 재조합 응고 인자 단백질의 덜 빈번하거나 감소된 용량 또는 투여의 제거가 존재하는 경우 치료 이점을 갖는다. 따라서, 본 발명에 따르면, 또 다른 치료 또는 요법의 필요성 또는 사용을 감소시키는 방법 및 용도가 제공된다.
유효량 또는 충분한 양은 치료되는 각각의 대상체 및 모든 대상체, 또는 제공된 그룹 또는 집단의 대다수의 치료되는 대상체에서 효과적일 필요는 없다. 유효량 또는 충분한 양은 그룹 또는 일반 집단이 아닌 특정 대상체에서의 효과 또는 충분함을 의미한다. 상기 방법에 대해 전형적인 바와 같이, 일부 대상체는 제공된 치료 방법 또는 용도에 대한 더 큰 반응, 또는 더 적은 반응 또는 무반응을 나타낼 것이다.
용어 "개선시키다"는 대상체의 질병 또는 이의 증상, 또는 근본적인 세포 반응에서 검출 가능하거나 측정 가능한 개선을 의미한다. 검출 가능하거나 측정 가능한 개선은 질병, 또는 질병에 의해 야기되거나 질병과 관련된 합병증의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 지속기간에서의 주관적 또는 객관적 축소, 감소, 저해, 억제, 제한 또는 제어, 또는 질병의 증상 또는 근본 원인 또는 결과에서의 개선, 또는 질병의 역전을 포함한다. HemA의 경우, 유효량은, 예를 들어, 대상체에서 급성 출혈 에피소드의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 양, 또는, 예를 들어, 응고 검정에 의해 측정되는 바와 같은 응고 시간을 감소시키는 양일 것이다.
따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 성분이 의도된 치료 목적을 달성하기 위해 유효량으로 함유된 조성물을 포함한다. 치료적으로 유효한 용량을 결정하는 것은 본 발명에 제공된 기술 및 지침을 이용하여 충분히 숙련된 의사의 능력 내에 있다.
치료 용량은 다른 요인 중에서 대상체의 연령 및 일반적 상태, 이상 혈액 응고 표현형의 중증도, 및 FVIII의 발현 수준을 조절하는 조절 서열의 강도에 좌우될 것이다. 따라서, 인간에서의 치료적 유효량은 벡터 기반 FVIII 치료에 대한 개별 환자의 반응에 기초하여 의사에 의해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것이다. 상기 용량은 단독이거나 면역억제제 또는 약물과 조합될 수 있다.
약학적 조성물과 같은 조성물은 인자 VIII(FVIII)의 생성을 가능하게 하도록 대상체에 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 수용자가 치료적 유효량의 FVIII 폴리펩티드를 생성할 수 있도록 충분한 유전 물질을 포함하는 약학적 조성물은 대상체의 지혈에 영향을 줄 수 있다.
조성물은 단독으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 재조합 AAV 입자는 면역억제제 없이 치료 효과를 제공한다. FVIII의 치료 효과는 선택적으로 면역억제제를 투여함이 없이 일정 기간, 예를 들어, 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-14, 14-20, 20-25, 25-30 또는 30-50일 이상, 예를 들어, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200일 이상 동안 지속된다. 따라서, 특정 구현예에서, CpG rAAV 바이러스 입자는 일정 기간 동안 면역억제제를 투여함이 없이 치료 효과를 제공한다.
조성물은 적어도 하나의 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, rAAV 벡터는 rAAV 벡터를 투여하기 전, 실질적으로 동시 또는 후에 하나 이상의 면역억제제와 함께 투여된다. 특정 구현예에서, 예를 들어, rAAV 벡터를 투여한 후 1-12, 12-24 또는 24-48시간, 또는 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-14, 14-20, 20-25, 25-30, 30-50일, 또는 50일 초과 후. 일정 기간 동안 초기 발현 수준 후, 예를 들어, rAAV 벡터 후 20-25, 25-30, 30-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200일 또는 200일 초과 후에 FVIII의 감소가 있는 경우, rAAV 벡터를 투여한 후 일정 지간 후에 면역억제제의 상기 투여.
특정 구현예에서, 면역억제제는 항염증제이다. 특정 구현예에서, 면역억제제는 스테로이드이다. 특정 구현예에서, 면역억제제는 사이클로스포린(예를 들어, 사이클로스포린 A), 미코페놀레이트, 리툭시맙 또는 이들의 유도체이다. 추가 특정 제제는 안정화 화합물을 포함한다.
조성물은 염수, 완충 염수, 덱스트로스 및 물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 멸균의 생체적합성 약학적 담체 중에서 투여될 수 있다. 조성물은 환자에게 단독으로 또는 지혈에 영향을 미치는 다른 제제(예를 들어, 보조 인자)와 함께 투여될 수 있다.
아데노바이러스 벡터의 생성 및 환자로의 투여를 위한 프로토콜은 미국 특허 번호 5,998,205호; 6,228,646호; 6,093,699호; 6,100,242호; 및 국제 특허 출원 번호 WO 94/17810호 및 WO 94/23744호에 기재되어 있으며, 이들은 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다. 특히, 예를 들어, AAV 벡터는 CpG 감소된 핵산 변이체에 의해 인코딩된 인자 VIII(FVIII)를 이를 필요로 하는 환자에게 전달하기 위해 이용된다.
본 발명의 방법 및 용도는 전신, 국부 또는 국소, 또는 임의의 경로, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 전달 및 투여를 포함한다. 생체 내 약학적 조성물의 전달은 일반적으로 통상적인 주사기를 이용한 주사를 통해 달성될 수 있지만, 대류-강화 전달과 같은 다른 전달 방법이 고려된다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,720,720호 참조). 예를 들어, 조성물은 피하, 표피, 피내, 경막내, 안와내, 점막내, 복막내, 정맥내, 흉막내, 동맥내, 경구, 간내, 문맥 경유, 또는 근내 전달될 수 있다. 다른 투여 방식은 경구 및 폐 투여, 좌약 및 경피 적용을 포함한다. 혈액 응고 장애를 갖는 환자의 치료를 전문으로 하는 임상의는 환자의 상태 및 치료 목적(예를 들어, 향상되거나 감소된 혈액 응고)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 기준에 기초하여 아데노바이러스-관련 벡터의 투여를 위한 최적 경로를 결정할 수 있다.
본 발명의 방법 및 용도는 원하는 치료적이거나, 이롭거나, 추가적이거나, 상승작용적이거나, 상보적인 활성 또는 효과를 갖는 임의의 화합물, 제제, 약물, 치료 또는 다른 치료 요법 또는 프로토콜과 조합될 수 있다. 예시적인 조합 조성물 및 치료는 제2 활성제, 예를 들어, 생물학적 제제(단백질), 제제(예를 들어, 면역억제제) 및 약물을 포함한다. 상기 생물학적 제제(단백질), 제제, 약물, 치료 및 요법은 본 발명의 임의의 다른 방법 또는 용도, 예를 들어, HemA와 같은 혈액 응고 질병에 대해 대상체를 치료하는 치료 방법 전, 실질적으로 동시 또는 후에 투여되거나 수행될 수 있다.
화합물, 제제, 약물, 치료 또는 다른 치료 요법 또는 프로토콜은 조합 조성물로서 투여되거나, 핵산, 벡터, 재조합 벡터(예를 들어, rAAV) 또는 재조합 바이러스 입자의 동시 또는 일련의 또는 순차적(전 또는 후) 전달 또는 투여와 같이 개별적으로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 방법 또는 용도가 본원에 기재되거나 당업자에게 공지된 임의의 화합물, 제제, 약물, 치료 요법, 치료 프로토콜, 공정, 치료제 또는 조성물과 조합된 조합을 제공한다. 화합물, 제제, 약물, 치료 요법, 치료 프로토콜, 공정, 치료제 또는 조성물은 본 발명의 핵산, 벡터, 재조합 벡터(예를 들어, rAAV) 또는 재조합 바이러스 입자의 대상체로의 투여 전, 실질적으로 동시에 또는 후에 투여되거나 수행될 수 있다.
본 발명은 인간 및 수의학 적용을 포함하는 동물에서 유용하다. 따라서, 적합한 대상체는 인간과 같은 포유동물뿐만 아니라 비-인간 포유동물을 포함한다. 용어 "대상체"는 동물, 전형적으로 포유동물, 예를 들어, 인간, 비-인간 영장류(유인원, 긴팔원숭이, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 마카쿠), 가축(개 및 고양이), 농장 동물(가금류, 예를 들어, 닭 및 오리, 말, 소, 염소, 양, 돼지) 및 실험 동물(마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그)를 나타낸다. 인간 대상체는 태아, 신생아, 유아, 청소년 및 성인 대상체를 포함한다. 대상체는 동물 질병 모델, 예를 들어, HemA와 같은 혈액 응고 질병의 마우스 및 다른 동물 모델 및 당업자에게 공지된 다른 동물 모델을 포함한다.
본 발명에 따른 치료에 적절한 대상체는 기능성 유전자 생성물(예를 들어, FVIII 단백질)의 불충분한 양을 갖거나 불충분한 양을 생성할 위험이 있거나, 이의 결핍을 갖거나, 비정상적, 부분적 기능성 또는 비-기능성 유전자 생성물(예를 들어, FVIII 단백질)을 생성하여 질병을 초래할 수 있는 대상체를 포함한다. 본 발명에 따른 치료에 적절한 대상체는 또한 질병을 발생시키는 비정상 또는 결함이 있는(돌연변이체) 유전자 생성물(단백질)을 갖거나 이를 생성할 위험이 있는 대상체를 포함하며, 비정상 또는 결함이 있는(돌연변이체) 유전자 생성물(단백질)의 양, 발현 또는 기능을 감소시키는 것은 질병의 치료를 발생시키거나, 하나 이상의 증상을 감소시키거나, 질병을 개선시킬 것이다. 따라서, 표적 대상체는 혈우병환자(예를 들어, 혈우병 A)와 같은 비정상이거나, 불충분하거나, 부재하는 혈액 응고 인자 생성을 갖는 대상체를 포함한다.
대상체는 면역 반응, 예를 들어, AAV에 대한 항체에 대해 시험될 수 있다. 따라서, 후보 혈우병 대상체는 본 발명의 방법에 따른 치료 전에 스크리닝될 수 있다. 대상체는 또한 치료 후 AAV에 대한 항체에 대해 시험될 수 있고, 선택적으로 치료 후 일정 기간 동안 모니터링될 수 있다. 항체를 발생시키는 대상체는 면역억제제로 처리될 수 있거나, 하나 이상의 추가량의 AAV 벡터가 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 치료에 적절한 대상체는 또한 AAV에 대항 항체를 갖거나 이를 생성할 위험이 있는 대상체를 포함한다. rAAV 벡터는 몇몇 기술을 이용하여 상기 대상체에 투여되거나 전달될 수 있다. 예를 들어, 빈 캡시드 AAV(즉, FVIII 핵산이 결여된 AAV)는 대상체에서 AAV 항체에 결합하도록 전달됨으로써 FVIII 및 FVIII-BDD를 인코딩하는 핵산 또는 핵산 변이체를 갖는 AAV 벡터가 대상체의 세포를 형질전환시키는 것을 가능하게 할 수 있다.
빈 캡시드 대 rAAV 벡터의 비율은 약 2:1 내지 약 50:1, 또는 약 2:1 내지 약 25:1, 또는 약 2:1 내지 약 20:1, 또는 약 2:1 내지 약 15:1, 또는 약 2:1 내지 약 10:1일 수 있다. 비율은 또한 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 또는 10:1일 수 있다.
투여할 빈 캡시드 AAV의 양은 특정 대상체에서 생성된 AAV 항체의 양(역가)을 기초로 하여 보정될 수 있다. 빈 캡시드는 임의의 AAV 혈청형, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8일 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, AAV 벡터는 직접 근내 주사(예를 들어, 근육의 하나 이상의 느린-연축 섬유)에 의해 전달될 수 있다. 또 다른 대안에서, 대퇴 동맥으로 도입된 카테터는 간 동맥을 통해 간으로 AAV 벡터를 전달하는 데 사용될 수 있다. 내시경 역행 담췌관 조영술(ERCP)과 같은 비-수술적 수단이 또한 이용되어 AAV 벡터를 간에 직접 전달함으로써 혈류 및 AAV 항체를 우회할 수 있다. 턱밑샘의 관과 같은 다른 관 시스템이 또한 기존 항-AAV 항체를 발생시키거나 이를 갖는 대상체에 AAV 벡터를 전달하기 위한 문으로서 사용될 수 있다.
대상체로의 투여 또는 생체 내 전달은 질병에 의해 야기되거나 이와 관련된 불리한 증상, 상태, 합병증 등의 발생 전에 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물, 방법 및 용도에 대한 후보로서 상기 대상체를 확인하기 위해 스크린(예를 들어, 유전학적)이 이용될 수 있다. 따라서, 상기 대상체는 기능성 유전자 생성물(예를 들어, FVIII 단백질)에서 불충분한 양 또는 결핍에 대해 양성으로 스크리닝되거나, 이상, 부분적 기능성 또는 비-기능성 유전자 생성물(예를 들어, FVIII 단백질)을 생성하는 대상체를 포함한다.
본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 방법 및 용도에 따른 대상체로의 투여 또는 생체 내 전달은 대상체가 치료를 위해 표적화된 질병을 갖는 것으로 확인되거나, 질병의 하나 이상의 증상을 갖거나, 대상체가 질병의 하나 이상의 증상을 갖지 않더라도 본원에 기재된 바와 같이 양성으로 스크리닝되거나 확인된 후 1-2, 2-4, 4-12, 12-24 또는 24-72시간 이내에 실시될 수 있다. 물론, 본 발명의 방법 및 용도는 대상체가 치료에 대해 표적화된 질병을 갖는 것으로 확인되거나, 질병의 하나 이상의 증상을 갖거나, 본원에 기재된 바와 같이 양성으로 스크리닝되고 확인된 후 1-7, 7-14, 14-21, 21-48 이상의 일, 개월 또는 년 동안 실시될 수 있다.
본원에서 사용되는 "단위 투여 형태"는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위; 하나 이상의 용량으로 투여되는 경우 원하는 효과(예를 들어, 예방 또는 치료 효과)를 생성하도록 계산되는 선택적으로 약학적 담체(부형제, 희석제, 비히클 또는 충전제)와 회합된 소정량을 함유하는 각각의 단위를 나타낸다. 단위 투여 형태는, 예를 들어, 액체 조성물, 또는 동결 건조되거나 동결건조된 상태의 조성물을 포함할 수 있는 앰풀 및 바이알 내에 존재할 수 있고; 예를 들어, 멸균 액체 담체가 생체 내 투여 또는 전달 전에 첨가될 수 있다. 개별 단위 투여 형태는 다중-용량 키트 또는 용기에 포함될 수 있다. 재조합 벡터(예를 들어, rAAV) 서열, 재조합 바이러스 입자 및 이의 약학적 조성물은 투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단일 또는 다중 단위 투여 형태로 패키징될 수 있다.
대상체는 FVIII 및 FVIII-BDD 양 또는 FVIII 및 FVIII-BDD 활성에 대해 시험되어 상기 대상체가 본 발명의 방법에 따른 치료에 적절한지의 여부를 결정할 수 있다. 후보 혈우병 대상체는 본 발명의 방법에 따른 치료 전에 FVIII 및 FVIII-BDD 양 또는 활성에 대해 시험될 수 있다. 대상체는 또한 본 발명의 방법에 따른 치료 후 FVIII 및 FVIII-BDD의 양 또는 FVIII 및 FVIII-BDD 활성에 대해 시험될 수 있다. 상기 치료된 대상체는 주기적으로, 예를 들어, 1-4주 또는 1-6개월 마다 FVIII 및 FVIII-BDD 양 또는 FVIII 및 FVIII-BDD 활성에 대해 치료 후에 모니터링될 수 있다.
대상체는 부작용에 대해, 또는 상기 대상체가 본 발명의 방법에 따른 치료에 적절한지의 여부를 결정하기 위해 하나 이상의 간 효소에 대해 시험될 수 있다. 따라서, 후보 혈우병 대상체는 본 발명의 방법에 따른 치료 전에 하나 이상의 간 효소의 양에 대해 스크리닝될 수 있다. 대상체는 또한 본 발명의 방법에 따른 치료 후 하나 이상의 간 효소의 양에 대해 시험될 수 있다. 상기 치료된 대상체는 주기적으로, 예를 들어, 1-4주 또는 1-6개월 마다 상승된 간 효소에 대해 치료 후에 모니터링될 수 있다.
예시적인 간 효소는 알라닌 아미노트랜스페라제(ALT), 아스파테이트 아미노트랜스페라제(AST) 및 락테이트 데하이드로게나제(LDH)를 포함하나, 간 손상을 나타내는 다른 효소가 또한 모니터링될 수 있다. 순환에서의 이들 효소의 정상 수준은 전형적으로 상위 수준을 갖는 범위로 정의되며, 이를 초과하는 효소 수준은 상승한 것으로 간주되어 이에 따라 간 손상을 나타낸다. 정상 범위는 검정을 수행하는 임상 실험실에서 사용되는 표준에 부분적으로 의존한다.
대상체는 출혈 에피소드에 대해 모니터링되어 상기 대상체가 치료에 적격이거나 치료에 반응하는지의 여부, 및/또는 반응의 양 또는 지속기간을 결정할 수 있다. 대상체는 출혈 에피소드에 대해 모니터링되어 상기 대상체가 추가 치료, 예를 들어, 후속 AAV 벡터 투여 또는 면역억제제의 투여, 또는 더욱 빈번한 모니터링을 필요로 하는지의 여부를 결정할 수 있다. 따라서, 혈우병 대상체는 본 발명의 방법에 따른 치료 전 및 후에 출혈 에피소드에 대해 모니터링될 수 있다. 대상체는 또한 본 발명의 방법에 따른 치료 동안 또는 후에 출혈 에피소드의 빈도 및 중증도에 대해 시험될 수 있다.
본 발명은 패키징 물질 및 그 안에 하나 이상의 구성요소를 갖는 키트를 제공한다. 키트는 전형적으로 그 안의 구성요소의 시험관 내, 생체 내, 또는 생체 외 사용을 위한 구성요소의 설명 또는 설명서를 포함하는 라벨 또는 패키징 삽입물을 포함한다. 키트는 상기 구성요소, 예를 들어, 핵산, 재조합 벡터, 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터, 또는 바이러스 입자 및 선택적으로 제2 활성물질, 예를 들어, 또 다른 화합물, 제제, 약물 또는 조성물의 수집물을 함유할 수 있다.
키트는 키트의 하나 이상의 구성요소를 수용하는 물리적 구조를 나타낸다. 패키징 물질은 구성요소를 멸균 상태로 유지할 수 있고, 상기 목적에 일반적으로 사용되는 물질(예를 들어, 종이, 골판지 섬유, 유리, 플라스틱, 호일, 앰풀, 바이알, 튜브 등)로 제조될 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 키트 내의 하나 이상의 구성요소, 용량, 작용 메커니즘, 약동학 및 약역학을 포함하는 활성 성분(들)의 임상 약리학의 확인 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 제조업체, 로트 번호, 제조 위치 및 날짜, 만료 날짜를 확인하는 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 제조업체 정보, 로트 번호, 제조업체 위치 및 날짜를 확인하는 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 키트 구성요소가 사용될 수 있는 질병에 대한 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 방법, 용도, 또는 치료 프로토콜 또는 치료 요법에서 키트 구성요소 중 하나 이상을 사용하기 위한 임상의 또는 대상체에 대한 지시사항을 포함할 수 있다. 설명서는 투여량, 빈도 또는 지속기간, 및 본원에 기재된 임의의 방법, 용도, 치료 프로토콜 또는 예방 또는 치료 요법을 실시하기 위한 지침을 포함할 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 예방적 또는 치료적 이점과 같은 구성요소가 제공할 수 있는 임의의 이점에 대한 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 특정 조성물을 사용하는 것이 적절하지 않은 상황에 관한 대상체 또는 임상의에 대한 경고와 같은 잠재적인 불리한 부작용, 합병증 또는 반응에 대한 정보를 포함할 수 있다. 대상체가 조성물과 양립할 수 없는 하나 이상의 다른 약물을 복용했거나, 복용할 것이거나, 현재 복용 중인 경우, 또는 대상체가 조성물과 양립하지 않을 또 다른 치료 프로토콜 또는 치료 요법을 받았거나, 받을 것이거나, 현재 받고 있는 경우에 불리한 부작용 또는 합병증이 또한 발생할 수 있으며, 따라서 설명서는 상기 비양립성에 관한 정보를 포함할 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 구성요소, 키트 또는 패킹 물질(예를 들어, 박스)와 별개이거나 이에 부착되거나, 키트 구성요소를 함유하는 앰풀, 튜브 또는 바이알에 부착된 "인쇄물", 예를 들어, 종이 또는 판지를 포함한다. 라벨 또는 삽입물은 컴퓨터 판독 가능한 매체, 예를 들어, 바코드 인쇄 라벨, 디스크, 광학 디스크, 예를 들어, CD- 또는 DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, 자기 테이프, 또는 전기 저장 매체, 예를 들어, RAM 및 ROM 또는 이들의 하이브리드, 예를 들어, 자기/광학 저장 매체, FLASH 매체 또는 메모리 유형 카드를 추가로 포함할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 이용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질이 본원에 기재된다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 간행물, 및 다른 참고문헌, GenBank 인용 및 ATCC 인용은 이들의 전체내용이 참조로서 포함된다. 상충의 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다.
본 발명의 생물학적 분자와 관련된 다양한 용어가 상기 및 또한 명세서 및 청구항 전체에 걸쳐 사용된다.
본원에 개시된 특징 모두는 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나, 동등하거나, 유사한 목적을 위한 대안적인 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명백히 언급되지 않는 한, 개시된 특징(예를 들어, FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 벡터, 플라스미드, 발현/재조합 벡터(예를 들어, rAAV) 서열, 또는 재조합 바이러스 입자)은 동등하거나 유사한 특징의 종류의 예이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "핵산"에 대한 언급은 복수의 상기 핵산을 포함하고, "벡터"에 대한 언급은 복수의 상기 벡터를 포함하고, "바이러스" 또는 "입자"에 대한 언급은 복수의 상기 바이러스/입자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 모든 수치 값 또는 수치 범위는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 상기 범위 내의 정수 및 범위 내의 값 또는 정수의 분수를 포함한다. 따라서, 예시를 위해, 80% 이상의 동일성에 대한 언급은 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 등, 뿐만 아니라 81.1%, 81.2%, 81.3%, 81.4%, 81.5% 등, 82.1%, 82.2%, 82.3%, 82.4%, 82.5% 등, 및 기타 등등을 포함한다.
초과(더 큰) 또는 미만을 갖는 정수에 대한 언급은 언급된 수보다 크거나 적은 임의의 수를 각각 포함한다. 따라서, 예를 들어, 100 미만의 언급은 숫자 1까지 줄곧 내려가는 99, 98, 97 등을 포함하며; 10 미만은 숫자 1까지 줄곧 내려가는 9, 8, 7 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 모든 수치 값 또는 범위는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 상기 범위 내의 값 및 정수의 분수 및 상기 범위 내의 정수의 분수를 포함한다. 따라서, 예시를 위해, 1-10과 같은 수치 범위에 대한 언급은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 뿐만 아니라 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 등, 및 기타 등등을 포함한다. 따라서, 1-50의 범위에 대한 언급은 50을 포함하여 50까지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 등, 뿐만 아니라 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 등, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5 등, 및 기타 등등을 포함한다.
일련의 범위에 대한 언급은 시리즈 내의 상이한 범위의 경계 값을 조합하는 범위를 포함한다. 따라서, 예시를 위해, 일련의 범위, 예를 들어, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-850의 범위에 대한 언급은 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 1-60, 10-30, 10-40, 10-50, 10-60, 10-70, 10-80, 20-40, 20-50, 20-60, 20-70, 20-80, 20-90, 50-75, 50-100, 50-150, 50-200, 50-250, 100-200, 100-250, 100-300, 100-350, 100-400, 100-500, 150-250, 150-300, 150-350, 150-400, 150-450, 150-500 등의 범위를 포함한다.
본 발명은 일반적으로 다수의 구현예 및 양태를 기재하기 위해 단언적 언어를 이용하여 본원에 개시된다. 본 발명은 또한 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜, 또는 절차와 같은 특정 주제가 전체적으로 또는 부분적으로 배제된 구현예를 특별히 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 특정 구현예 또는 양태에서, 재료 및/또는 방법 단계가 배제된다. 따라서, 비록 본 발명이 일반적으로 본 발명이 포함하지 않은 것과 관련하여 본원에서 표현되지 않더라도, 본 발명에서 명백히 배제되지 않는 양태가 본원에 개시된다.
본 발명의 다수의 구현예가 기재되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남이 없이 당업자는 본 발명을 다양한 용도 및 조건에 적합화시키기 위해 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 가할 수 있다. 따라서, 하기 실시예는 예시하기 위한 것으로, 어떠한 방식으로든 청구된 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
CpG 감소된 인자 VIII DNA 서열 및 특정 벡터 작제물 , 플라스미드 작제물 및 AAV 벡터 생성 세포주.
FVIII를 인코딩하는 18개의 상이한 CpG 감소된 핵산 변이체(SEQ ID NO:1-18)를 생성시키고, 발현 검정에서 평가하였다. 돌연변이체 트랜스티레틴(TTRmut) 프로모터를 갖는 CpG 감소된 인간 FVIII cDNA 작제물을 생성시켰다(SEQ ID NO:22).
AAV-SPK-8011 발현 카세트는 CpG 감소된 FVIII-X07 핵산 서열 및 패키징을 위한 LK03 캡시드를 갖는다. LK03 캡시드는 비-병원성의 천연의 복제 결함성인 단일-가닥 DNA 바이러스인 AAV3와 실질적으로 상동성을 갖는다.
패키징 플라스미드 pLK03은 AAV2 p5 프로모터의 제어 하에 있는 AAV2 Rep 및 AAV-LK03 Cap 유전자, 박테리아 복제 기점 및 박테리아 세포에서 카나마이신에 대한 내성을 부여하는 유전자를 갖는 7,484 bp의 플라스미드 작제물이다. 이러한 작제물에서, 야생형 또는 유사 야생형 AAV 종의 형성 잠재성을 감소시키고, 벡터의 수율을 증가시키기 위해 p5 rep 프로모터는 cap 유전자의 3'으로 이동되었다.
유전자 전달을 위한 클로닝된 DNA는 간-특이적 프로모터의 제어 하에서 인간 응고 인자 VIII(hFVIII)를 인코딩하는 단일-가닥 유전체로서 AAV-LK03 캡시드로 패키징된 유전자 발현 카세트이다. 발현 플라스미드는 pAAV-TTRmut-hFVIII-X07로 언급된다. 이는 TTR 프로모터에서 4 포인트 돌연변이의 도입에 의해 변형되었고, 코딩 영역은 인간 FVIII의 발현을 증가시키도록 최적화되었다. AAV 발현 카세트는 하기 요소를 함유한다:
● AAV2 ITR
● 트랜스티레틴(TTR) 프로모터: 야생형 프로모터와 비교하여 유전자 발현을 증가시키는 4 포인트 돌연변이를 갖는 간-특이적 트랜스티레틴(TTR) 프로모터 (Costa et al. 1991)
● 합성 인트론: 인간 신장 인자 EF-1 알파 유전자로부터 유래됨
● FVIII 코딩 서열: B-도메인 결실되고, 코돈-최적화된 인간 FVIII 코딩 서열.
● 토끼 베타 글로빈 폴리 A 신호 서열 (Levitt et al. 1989).
● AAV2 ITR
헬퍼 바이러스가 없는 과정에 의해 SPK-8011 벡터를 생성하기 위해 인간 배아 신장 293 세포를 형질감염시키기 위해 3개의 DNA 플라스미드 작제물이 사용된다(Matsushita et al. 1998):
● 유전자 카세트(hFVIII 코딩 서열 및 관련 조절 요소)는 플라스미드로 클로닝되어 벡터 플라스미드, pAAV-TTRmut-hFVIII-X07을 제공한다.
● 바이러스 ITR이 결여된 AAV 바이러스 유전체(rep 및 cap)는 플라스미드로 클로닝되어 AAV 패키징 플라스미드인 pLK03를 제공하여 AAV 벡터 패키징을 위한 트랜스(in trans)의 필요한 AAV2 rep 및 AAV-LK03 cap 유전자를 제공한다. rep 유전자에 대한 바이러스 프로모터(p5)를 비-상동성 재조합에 의한 복제 적격 AAV의 형성을 방지하기 위해 플라스미드에 재배치하였다.
● 아데노바이러스-2로부터의 3개의 유전자가 제3 플라스미드(pCCVC-AD2HP)로 클로닝되어 벡터 생성을 위한 필요한 헬퍼 바이러스 유전자를 제공한다. 플라스미드 pCCVC-AD2HPv2는 3개의 아데노바이러스 유전자인 E2A, E4 및 VA RNA를 가져, AAV 벡터의 복제 및 캡시드화에 필요한 '헬퍼' 기능을 제공하는 11,832 bp의 플라스미드 작제물이다. 플라스미드 pCCVC-AD2HPv2는 AmpR 유전자 및 pUC ori 서열의 일부를 함유하는 DrdI-DrdI 1882bp 제한 단편이 제거되고, 전체 KanR 유전자 및 pUC ori 서열의 일부를 함유하는 플라스미드 pAAV2-hRPE65v2로부터의 DrdI-DrdI 단편으로 대체된 pCCVC-AD2HP의 유도체이다.
AAV 벡터 생성에 사용되는 세포 기질은 1차 인간 배아 신장 세포(HEK) 293의 유도체이다. HEK293 세포주는 전단된 인간 아데노바이러스 유형 5(Ad5) DNA에 의해 형질전환된 영구 계통이다(Graham et al. 1977). Working Cell Bank는 필라델피아 소아 병원(The Children's Hospital of Philadelphia; CHOP)의 세포 및 분자 치료 센터(Center for Cellular and Molecular Therapeutics; CCMT)로부터의 특징적인 HEK293 Master Cell Bank로부터 유래된다.
실시예 2
비-인간 영장류( NHP )에서의 AAV - SPK -8005 및 AAV - SPK -8011(LK03 캡시드 , FVIII-X07 ( SEQ ID NO:7 )) 벡터의 평가.
아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터로 패키징된 FVIII 트랜스진 작제물을 비-인간 영장류(NHP)로 전달하였다. 파일럿 연구 및 GLP 연구 둘 모두를 수행하였다.
요약하면, AAV-SPK-8005 또는 AAV-SPK-8011(LK03 캡시드)의 단일 정맥 주입이 투여된 수컷 시노몰구스 마카쿠(cynomolgus macaque)에서의 용량-범위 연구를 수행하였다. hFVIII의 발현을 8주에 걸쳐 평가하였다. 각각의 벡터의 동물 그룹 및 용량 수준(파일럿 연구)이 도 1에 제시된다.
NHP는 대략 30분에 걸쳐 교정된 주입 펌프를 사용하여 복재 정맥을 통한 정맥내 주입을 받았다. 마카쿠를 AAV 캡시드에 대한 중화 항체에 대해 사전 스크리닝하였다. 모든 처리된 동물은 벡터 투여 전에 1:3 미만의 역가를 갖는 것으로 초기에 결정되었다. 이는 낮은 역가조차도 전신 전달 후 간 세포에 의한 벡터 흡수를 억제하므로 성공적인 간 형질도입을 보장하기 위해 수행되었다(Jiang et al. 2006). 모든 동물은 또한 유전자 전달 전에 FVIII에 대한 중화 항체의 존재에 대해 음성이었다.
hFVIII의 혈장 수준을 시노몰구스 내인성 FVIII를 검출하지 않는 인간-특이적 ELISA에 의해 측정하였다. 연구의 모든 동물은 중간 용량 코호트에서 하나의 마카쿠를 제외하고 벡터 전달 후에 hFVIII를 발현한다. 인간 인자 VIII 항원 수준은 벡터 투여 약 1-2주 후에 정점에 이르렀다. 유전자 전달 1주 후, 2 x 1012 vg/kg의 AAV-SPK-8005로 형질도입된 NHP는 13.2 ± 3%(평균 ± 평균의 표준 오차)의 hFVIII 항원 수준을 발현하였다. 유전자 전달 1주 후, 다음 처리 코호트(5 x 1012 vg/kg)에서 3마리의 동물 중 2마리에서의 평균 hFVIII 수준은 27 ± 0.2%였다. 인간 FVIII는 임의의 시점에서 상기 코호트의 세 번째 마카쿠에서 검출될 수 없었다. 기준선 혈장 샘플의 재시험시, 상기 동물이 항-AAV 항체의 존재에 대해 실제로 양성이고, 1:3 미만의 초기의 결정된 역가가 부정확하다는 것이 결정되었다. 최종적으로, 1 x 1013 vg/kg의 가장 높은 시험된 용량에서, AAV 주입 후 54.1 ± 15.6%의 피크 hFVIII 항원 수준이 관찰되었다.
인간 FVIII 발현은 약 4주에서 동물의 대략 1/3에서 감소하였고, 이들 3마리의 마카쿠에서 hFVIII에 대한 억제제 항체의 출현을 동반하였다(도 2에서 ε 기호로 표지됨). hFVIII에 대한 종-특이적 항체의 발생은 이전에 비-인간 영장류에서 기록되었으며, 인간 트랜스진 생성물과 내인성 시노몰구스 FVIII 사이의 여러 아미노산 잔기의 차이로 인한 것일 수 있다(McIntosh, J. et al., Blood 121:3335-44 (2013)).
인간 FVIII의 지속적인 발현으로 인한 잠재적인 혈전형성을 평가하기 위해, 본 연구에서 D-이량체 항원 수준을 측정하였다. 시노몰구스 마카쿠에서의 임상적 관련성 또는 심지어 D-이량체 항원 수준의 정상 값에 대한 보고가 드문 것이 인지되어야 하며; 참조로서, 인간에서의 D-이량체에 대한 정상 범위는 500 ng/ml 미만이다. 동물이 내인성 시노몰구스 FVIII를 발현하므로, 간 유전자 전달의 결과로서의 hFVIII의 생성은 FVIII 활성의 초생리학적 수준을 발생시킬 것이다.
5 x 1012 vg/kg으로 투여되었으나, 인간 FVIII를 발현하지 않은 동물은 AAV 주입 2주 후 863 ng/ml의 피크를 가졌다. 나머지 동물은 기준선 값과 비교하여 D-이량체 항원 수준에서 임의의 유의한 증가를 나타내지 않았다. 종합하면, 이들 결과는 본 연구에서 표적으로 하는 수준에서 인간 FVIII의 발현이 혈전증의 증가된 위험과 관련되지 않음을 시사한다.
벡터 투여 4주 후, 벡터 관련 변화는 명백하지 않았다. 간 기능 시험은 대부분의 경우 투여 이전에 존재했으므로 벡터 용량과 관련되지 않은 것으로 보이는 약간의 변동을 갖는 정상 값을 나타내었다(도 3).
5주까지의 D-이량체 수준이 도 4에 제시되어 있다. 고용량 코호트의 한 마리의 동물은 순환 인간 FVIII가 약 100%에서 정점에 이른 경우 벡터 투여 1주 후 D-이량체 수준에서 약간(577 ng/ml) 일시적으로 상승하였고; 이러한 단일 상승 측정 후에 D-이량체 수준은 신속히 정상으로 복귀하였다. 특히, D-이량체 수준과 hFVIII 항원 수준 사이에는 상관 관계가 없었다(도 4, 하부 패널).
파일럿 연구에서 AAV-SPK-8011(LK03 캡시드) 벡터의 경우, 3 코호트의 시노몰구스 마카쿠(n = 3)에 증가하는 용량의 AAV-SPK-8011(LK03 캡시드)(2 x 1012, 6 x 1012 및 2 x 1013(vg/kg); 도 1)를 처리하였다. GLP 연구에서, 3x1012, 6x1012 및 2x1013 vg/kg(AAV-SPK-8011(LK03 캡시드)) 용량의 벡터를 사용하였다.
각각의 연구에 전체 11개의 NHP를 사용하였다. 파일럿 연구는 면역억제의 부재하에서 10주의 관찰 기간을 가졌다. 이어서 12주의 면역억제 단계가 후속되었으며, 이는 연구의 초기 10주 동안 생성된 항-hFVIII 항체를 제거하기 위해 포함되었다. 이후, 동물을 추가 20주 동안 추적하였다.
동물을 임상 관찰, 체중 임상 병리(임상 화학, 혈액학, 응고, 소변검사)에 대해 모니터링하였다. 또한, hFVIII 항원 수준, FVIII 억제 항체 및 D-이량체 수준을 연구 전체에 걸쳐 평가하였다.
hFVIII 항원 파일럿 연구 데이터는 도 6에 제시되어 있다. 평균 hFVIII 항원 수준은 100% 정상 hFVIII 항원 수준으로서 150 ng/ml를 이용하여 저용량 코호트에서 관찰된 22.3 ± 6.2% hFVIII 및 중간 용량 및 고용량 코호트에서 각각 관찰된 61.6 ± 15.7% 및 153 ± 58.1%로 약 2-3에서 정점에 달했다(도 6A-6D).
GLP 독성학 연구에서, SPK-8011의 말초 정맥 주입을 통한 간 유전자 전달은 또한 모든 동물에서 hFVIII 발현을 초래하였다. 3x1012 vg/kg의 저용량에서, hFVIII 항원 수준은 정상의 5-40% 범위였으며, AAV 투여 약 2주 후 평균 피크 수준은 20.3 ± 11%(평균 ± SEM)였다. 6x1012 vg/kg 코호트에서의 평균 hFVIII 항원 수준은 정상의 40.7 ± 4%였다.
따라서, LK03 AAV 캡시드 혈청형은 마우스 간과 달리 생체 내에서 NHP 간세포를 효율적으로 형질도입시킨다. 유전자 전달 직후 관찰된 치료적 hFVIII 수준에도 불구하고, 대부분의 동물에서, 수준은 4주 주변에서 감소하기 시작했다.
시노몰구스 마카쿠의 혈장에서 hFVIII에 대한 체액 반응을 AAV-SPK-8011(LK03 캡시드)의 투여 후 측정하였다. 기준선 및 표시된 시점에서 ELISA에 의해 항-hFVIII IgG 항체에 대해 동물을 평가하였다.
파일럿 및 GLP 연구 둘 모두에서 벡터 처리된 동물 대부분은 전임상 시노몰구스 마카쿠 연구뿐만 아니라 다른 사람들에 의한 보고(McIntosh, J. et al., Blood 121:3335-44 (2013))에 기초한 예견된 결과인 항-FVIII 중화 항체를 발생시켰다. 마카쿠에서 AAV 주입 3주 후에 시작되는 것으로 전형적으로 보이는 인간 FVIII 단백질에 대한 중화 항체는 순환 hFVIII 항원의 검출을 배제한다. 결과로서, 2-3주 주변(즉, hFVIII에 대한 억제 항체의 출현 전)의 피크 hFVIII 항원 수준을 사용하여 인간 대상체에서 적절한 시작 벡터 용량을 추정할 수 있다. 파일럿 및 GLP NHP 연구에서 SPK-8011의 용량-반응 곡선이 도 7에 제시되어 있다.
AAV-SPK-8011(LK03 캡시드)로 달성된 FVIII 발현 수준을 FVIII의 전달을 위해 AAV5 및 AAV8 캡시드 기반 AAV 벡터로 달성된 FVIII의 보고된 수준과 비교하였다. 비교는 AAV-SPK-8011(LK03 캡시드)로 달성된 FVIII의 수준이 AAV5 및 AAV8 캡시드를 갖는 AAV 벡터를 통해 전달된 FVIII의 보고된 수준보다 크다는 것을 나타내었다(도 8).
실시예 3
비-인간 영장류(NHP)에서의 AAV-LK03 캡시드의 생체분포.
비-인간 영장류에서 AAV-LK03 캡시드의 생체분포를 비-GLP 연구에서 평가하였다. 인간 응고 인자 IX를 인코딩하는 AAV-LK03-캡시드화된 벡터(AAV-LK03-hFIX)의 정맥내 투여는 2개의 주요 표적 조직이 간 및 비장임을 나타내었다(도 9). 비장 향성은 AAV-LK03의 독특한 특징이 아니다. 예를 들어, 강한 안전성 기록을 갖는 여러 간-특이적 유전자 요법 시험(예를 들어, NCT02396342, NCT02082860, NCT02576795)에서 사용된 AAV5 캡시드는 비-인간 영장류의 간을 표적으로 하는 것과 동일하고 그렇지 않으면 더 큰 효능으로 비장을 표적으로 한다(Paneda et al. 2013). SPK-8011 발현 카세트는 간 특이적인 것으로 간주되는 마우스 트랜스티레틴 또는 TTR 프로모터를 사용한다(Costa, 1991). 프로모터의 간-특이적 특성을 추가로 지지하기 위해, PCR 기반 발현 분석은 SPK-8011과 동일한 발현 카세트(즉, AAV-SPK-8005)를 패키징하는 상이한 AAV 벡터의 투여 후 마우스의 간 및 비장에서 벡터 유래 FVIII 발현을 측정하였다. 도 10에 제시된 바와 같이, 비장에서의 인간 FVIII 발현은 간세포로부터 유래된 것과 비교하여 몇 자릿수 더 낮다.
혈우병 B에 대해 여러 개(NCT02396342, NCT01620801 NCT00076557, NCT02484092, NCT02618915, NCT00979238, NCT01687608) 및 혈우병 A에 대해 1개(NCT02576795)를 포함하는 다른 AAV 벡터를 이용하여 연구가 수행되었으나, 이는 AAV-LK03를 사용한 첫 번째 임상 연구이다. 유니버시티 칼리지 런던(University College London)과 협력한 St. 주드 칠드런스 리서치 병원(St. Jude Children's Research Hospital)에 의해 수행된 연구는 코돈 최적화된 인간 인자 IX cDNA, scAAV2/8-LP1-hFIXco를 인코딩하는 자가-상보적 유전체를 갖는 AAV8 벡터를 이용하였다. 벡터를 받은 10명의 대상체는 3.2년의 정중값을 통해 1-6%의 안정적인 인자 IX 수준을 가졌으며, 모든 참가자는 예방 인자 대체의 사용을 중단하거나 줄였다(Nathwani et al. 2014). 혈우병 A에 대한 임상 연구는 인간 FVIII(NCT02576795)를 인코딩하는 AAV5 캡시드화된 벡터를 사용하였다. 2016년에 제시된 예비 데이터는 여러 대상체에서의 유전자 전달 후 최대 16주의 추적 검사와 함께 2-60% 범위의 FVIII 활성에서의 증가를 입증한다(BioMarin, April 2016).
실시예 4
시험관 내 환경에서 분석된 AAV-LK03 캡시드의 형질도입 효율.
시노몰구스 마카쿠 및 인간 기원으로부터의 일차 간세포를 4개의 상이한 감염다중도(MOI)로 세포 당 500 내지 62,500개의 벡터 유전체 범위의 루시페라제를 발현하는 AAV-LK03 벡터로 형질도입시켰다. 형질도입 72시간 후, 루시페라제 발현을 분석하였다.
AAV-LK03 캡시드는 배양물에서 인간 간세포를 형질도입시키는 데 있어서 유의하게 높은 효율을 유일하게 입증하였다. 도 11에 제시된 대표적 예에서, LK03은 시험관 내 비-인간 영장류 간세포와 비교하여 인간 간세포를 형질도입시키는 데 있어서 약 5배 더 높은 효율을 입증하였다. 중요하게는, 이들 결과는 다수의 MOI 및 복제 연구에서 일관적이다.
실시예 5
인간 임상 시험 용량 계산
비-인간 영장류(NHP)에서 관찰된 hFVIII 수준에 기초하여, 인간에서 5x1011 vg/kg의 제안된 시작 용량에서 예상된 FVIII 수준의 추정치를 결정하였다. 상이한 벡터 로트는 약간 상이한 간 형질도입 효능을 가질 수 있으므로, 파일럿 및 GLP 독성학 NHP 연구 둘 모두로부터의 데이터를 사용하여 5x1011 vg/kg의 투여 후 FVIII 농도의 범위를 보간하였다. 상기 분석을 위해, 선형 회귀 모델(도 12), 즉, AAV 용량과 결과적인 hFVIII 발현 수준 사이의 관계가 사용된 선형성과 유의하게 벗어나는 것으로 밝혀지지 않았다(표 2).
표 2
Figure pct00001
상기 제시된 선형 회귀 모델을 이용하여, 5x1011 vg/kg의 용량의 SPK-8011을 주입하는 경우 평균 FVIII 수준은 정상의 약 2.6% 내지 3.0%일 것으로 추정되었다. 그러나, 이러한 선형 회귀 곡선은 표 2의 방정식이 사용되어 2x1012 vg/kg, 3x1012 vg/kg 및 6x1012 vg/kg의 예상 FVIII 발현 값을 역계산하는 경우 저용량 및 중간 용량 동물에서 관찰된 실제 값을 과소평가하는 것으로 보인다(표 3).
표 3
Figure pct00002
hFVIII 발현은 AAV 벡터 부하가 증가함에 따라 포화에 도달하면서 특정 벡터 용량에서 선형 용량 반응을 따를 수 있는 것이 가능하다. 고용량 코호트는 이전 분석으로부터 제거되었고, 선형 회귀 곡선은 결정된 5x1011 vg/kg의 SPK-8011 용량에서 예측된 hFVIII 발현 수준을 재계산하고 재평가하였다(표 4 및 도 13).
표 4
Figure pct00003
도 13에 제시된 선형 회귀 곡선으로, 5x1011 vg/kg의 용량으로 SPK-8011을 주입하는 경우 평균 FVIII 수준은 정상의 대략 3.4% 내지 5.2%인 것으로 추정되었다.
실시예 6
인간 임상 시험 계획
적격
● 연구에 적격인 연령: 18세 이상(성인, 노인)
● 연구에 적격인 성별: 남성
● 건강한 지원자 허용: 아니오
기준: 포함 기준:
● 18세 이상의 남성
● 정상의 2% 이하의 혈장 FVIII 활성 수준을 갖는 병력에 의해 입증된 혈우병 A의 진단 확인
● FVIII 농축액 또는 냉동침전물에 150일 초과의 노출일(ED)을 받음
● 온-디멘드(on-demand) 요법을 받고, 정상의 1-2%의 FVIII 기준선 수준을 갖는 경우에만 지난 12개월에 걸쳐 10회 초과의 출혈 사건을 경험함
● 임의의 FVIII 제품에 대한 알레르기 반응의 과거 이력이 없음
● 중앙 실험실에 의해 평가된 바와 같이 인자 VIII 억제제에 대해 측정 가능한 억제제가 없고, FVIII 단백질에 대한 억제제의 과거 이력이 없음
● 확실한 장벽 피임법 사용에 동의
기준: 제외 기준:
● 활동성 B형 또는 C형 간염의 증거
● 현재 B형 또는 C형 간염에 대한 항바이러스 요법을 받고 있음
● 유의한 근본적인 간 질환을 가짐
● 200/mm3 이하의 CD4 수를 갖는 HIV-1 또는 HIV-2의 혈청학적 증거*를 가짐(* 200/mm3 초과의 CD4 수 및 검출 가능하지 않은 바이러스 부하를 갖는 HIV+이고 안정적인 참가자는 등록에 자격이 있음)
● AAV-Spark200 캡시드와 반응성인 검출 가능한 항체를 가짐
● 지난 52주 이내에 유전자 전달 시험에 참여하거나, 지난 12주 이내에 연구 제품으로 임상 시험에 참여함
실시예 7
상이한 용량의 AAV - SPK -8011(LK03 캡시드 )- hFVIII에서의 예측 FVIII 수준
임상 연구 NCT03003533('혈우병 A에 대한 유전자 전달 연구')은 LK03(SEQ ID NO:27)으로 공지된 AAV 캡시드의 최초 인간 사용이다. 비-인간 영장류에서의 연구는 AAV-SPK-8011(LK03 캡시드)-hFVIII의 증가하는 용량이 적어도 일부 용량 범위에서 선형성으로부터 유의하게 벗어나는 것으로 보이지 않는 용량 의존적 방식으로 순환 인간 FVIII의 수준을 증가시키는 것을 제시한다. 첫 번째 코호트에서의 평균 항정 상태 FVIII 수준(± 평균의 표준 오차)은 정상의 약 11.7 ± 2.3%였다. 이러한 용량 코호트에서 2명의 참가자의 n을 고려하면, 더 많은 참가자가 연구에 포함됨에 따라 관찰된 FVIII 수준에서의 비교적 낮은 변동성이 유지될 지의 여부를 예측하기 어렵다.
혈우병 B의 치료를 위한 연구 제품 rAAV-FIX(NCT02484092)을 사용하여 간에서 응고 인자의 발현을 매개하기 위해 rAAV 벡터를 이용한 최근의 경험은 더 큰 코호트의 대상체에서의 변동성을 추정하기 위한 유용한 참조일 수 있다. 항정 상태 FIX 발현은 rAAV-FIX 벡터 주입 후 12주까지 도달하여, 대략 33%의 평균 FIX 활성(FIX:C)을 발생시켰다. 중요하게는, 가장 높은 수준의 FIX:C는 약 79%(대상체 9)였고, 가장 낮은 수준은 약 14%(대상체 7)였다. 주목할 점은, 대상체 7에서의 벡터 효능의 해석은 rAAV-FIX 벡터 캡시드에 대한 면역 반응의 발생에 의해 혼란스러웠고, 이는 짧은 과정의 스테로이드가 개시되기 전에 FIX 발현의 부분적 손실을 발생시켰다. 그러나, 세포성 면역 반응이 검출되지 않은 대상체 6은 대략 18%의 항정 상태 수준을 가졌다. 따라서, 연구 NCT02484092에서 가장 높은 FIX:C 수준과 가장 낮은 FIX:C 수준 사이의 차이는 대략 4배였다. 혈우병 치료를 위한 다른 AAV 임상 시험은 유의하게 더 높은 변동성을 나타내었다. 문헌[Pasi, et al. (2017) Thromb Haemost. 117(3):508-518]. 표 5는 선형 용량 반응을 가정하여 상이한 AAV-SPK-8011(LK03 캡시드)-hFVIII 용량에서 예측된 평균 FVIII 수준을 제시한다. 혈우병 B 연구에서 관찰된 변동성은 혈우병 A 시험에서의 변동성을 추정하기 위한 보수적인 접근법으로 사용되었다.
표 5
Figure pct00004
실시예 8
인간 임상 시험 결과
중증(N = 11) 또는 중등의 중증(N = 1) 혈우병 A를 가진 12명의 남성에서 용량 상승 연구를 수행하였다. 대상체는 18-52세 연령 범위였다. 유전자 요법 전에, 12명의 대상체 중 8명을 예방 치료로, 그리고 12명의 대상체 중 4명을 에피소드 치료로 관리하였다. 대상체를 3개의 투여 코호트 중 하나에 등록하고, 5 x 1011 vg/kg (N=2, 대상체 1 및 2), 1 x 1012 vg/kg (N=3, 대상체 3, 4 및 6), 또는 2 x 1012 vg/kg (N=7, 대상체 5 및 7 - 12)의 용량으로 SPK-8011(AAV-hFVIII, LK03 캡시드)을 주입하였다.
도 14-28은 3개의 상이한 용량의 AAV-SPK-8011(LK03 캡시드)-hFVIII를 투여한 12명의 인간 대상체의 용량 반응 연구 데이터를 제시한다. 대상체에서 결정된 FVIII 활성의 값은 정상 혈장에서의 100% FVIII에 비한 것이다. 전형적으로, 혈장은 많은 수(예: 50 또는 100)의 정상 지원자로부터 푸울링되며, 이러한 "정상 푸울링된 혈장"에서의 FVIII 활성은 100%로 정의된다. 이러한 혈장의 희석액은 FIX 수준을 결정하기 위해 사용되는 어떤 검정과도 비교하여 FVIII 활성의 표준 곡선을 만드는 데 사용된다. 이후, 이러한 표준 곡선은 동일한 검정을 이용하여 환자 샘플에서 FVIII의 양 또는 백분율(%)을 정의하는 데 사용된다.
모든 벡터 용량은 출혈을 예방하고 예방의 중단을 허용하기에 충분한 FVIII의 수준의 발현으로 이어졌다. 3개의 용량에서 12명의 대상체에 걸쳐, 연간 출혈률(ABR)이 97% 감소하고, 연간 주입률이 97% 감소하였다. 데이터는 전체 동역학이 FVIII의 지속적인 정점지속으로 점진적으로 증가함을 제시하는 것을 나타낸다.
첫 번째 용량 코호트에서, FVIII 수준은 출혈 사건, 상승된 트랜스아미나제 수준 및 스테로이드의 사용 없이 66 및 51주에서 14% 및 15%이다. FVIII 발현은 관찰 기간에 걸쳐 안정적으로 유지되었다. 이러한 저용량 코호트로부터의 데이터는 15% 범위의 소량의 FVIII 수준조차도 최대 66주의 추적 기간에 걸쳐 출혈을 예방하기에 적합할 수 있음을 나타낸다.
두 번째 용량 코호트에서, FVIII 수준은 주입 후 33, 46 및 31주에 9%, 26% 및 17%이다. 이러한 용량 코호트의 첫 번째 대상체(대상체 3)는 159일에 자발적인 관절 출혈에 대한 단일 용량의 인자 농축물을 주입하였고, 이러한 용량 코호트의 두 번째 대상체(대상체 4)는 195일에 시작된 외상성 출혈에 대해 다수의 주입을 받았다. 이들 대상체 둘 모두는 벡터 주입 후 12 및 7주째에 수행되는 FVIII 수준의 결과로서 발생된 안정화와 함께 FVIII 수준의 감소에 의해 촉발되는 테이퍼링 스테로이드의 과정을 받았다. 이러한 용량 코호트의 세 번째 대상체(대상체 6)는 출혈이 없었고, 인자 주입을 받지 않았거나 스테로이드가 제공되지 않았다.
세 번째 용량 코호트(N=7)에서, 7명의 대상체 중 5명은 현재 12% 이상의 FVIII 수준을 갖고, 16-49%의 범위이고; 이들 대상체에 대해, 벡터 주입 12주 후에 시작하는 평균 FVIII 수준은 30%이고, 중앙값은 22%이다. 벡터 주입 4주 후에 시작하여 이들 대상체에서 출혈은 보고되지 않았다.
별도로, 2x1012 vg/kg AAV-LK03 (FVIII) 벡터 용량의 7명 중 5명은 FVIII 수준 감소, 대상체 기준선 이상의 ALT 증가, 또는 AAV 캡시드에 대한 상승된 IFN-γ ELISPOT 중 하나 이상에 대해 벡터 주입 6 내지 11주 후 범위의 시점에서 시작하여 스테로이드 과정을 받았다. 스테로이드의 개시는 정상 범위로의 ALT의 감소와 관련되었고, 모든 경우에 ELISPOT 신호를 소멸시키는 것과 관련이 있었다; 7명 중 2명의 대상체는 FVIII 수준의 안정화에 제한된 성공을 나타내었고, 이는 가능하게는 면역 반응으로 인해 5% 미만으로 떨어졌다. 이들 중 1명의 경우, 12주의 추적 검사 전체에 걸쳐 출혈이 보고되지 않았고; 다른 1명은 37주의 관찰로 4번의 출혈이 있었다.
전반적으로, 유리한 안전성 프로파일이 관찰되었고, 2명의 대상체만이 정상의 상한 이상의 ALT 상승을 경험하였다. 현재까지 대상체의 91퍼센트(91%)가 벡터 주입 후 1 이하의 ABR을 경험하였다. 모든 대상체는 벡터 주입 후 FVIII 수준의 상승을 경험하였으나, 2명의 대상체에서 FVIII 수준의 감소를 예방하는 데 제한적인 성공은 예방 스테로이드의 첨가가 정당화될 수 있음을 시사한다.
비 NHP에서 관찰된 hFVIII 수준을 기초로 하고, 상이한 벡터 로트가 약간 상이한 효능을 가질 수 있다는 것을 고려하여, 5x1011 vg/kg의 용량으로 SPK-8011을 주입한 인간에서의 평균 FVIII 수준은 선형 외삽을 가정하여 대략적으로 약 3.4% - 5.8%일 수 있는 것으로 추정되었다. 첫 번째 대상체에서의 FVIII 활성은 정상의 대략 9.15 ± 0.53% 및 두 번째 대상체에서 13.50 ± 0.50%에서 정점지속되었다. 따라서, 저용량 코호트에서의 평균 FVIII 활성은 대략 11.3%였으며, 이는 비-인간 영장류에서의 연구에 기초한 예상보다 2-4배 더 높다.
마카쿠와 같은 계통발생학적으로 밀접한 종을 이용한 전임상 연구를 기초로 한 예측 FVIII 수준과 인간 대상체에서의 실제 결과 사이의 저용량 코호트에서의 실질적인 2-4배 차이(사용된 선형 회귀 곡선에 따름)는 인간에 대한 AAV 벡터 투여량을 결정하는 데 있어서 현재 동물 모델의 한계를 강조한다. AAV-SPK-8011(LK03 캡시드)-hFVIII를 투여한 NHP에서의 FVIII 활성을 기초로 하여 예측된 것보다 인간에서 훨씬 더 큰 FVIII 활성이 있다는 것을 나타내는 데이터는 예상되지 않았다.
인간에서 AAV 투여량을 결정하기 위한 보편적인 전임상 모델은 존재하지 않지만, 응고 인자 IX의 간 유래 발현을 매개하기 위해 AAV2, AAV8 및 AAV-Spk 벡터를 사용한 비-인간 영장류에서의 이전 경험은 마카쿠가 인간에서의 AAV 벡터 효능의 우수한 예측자이나 완벽한 예측자가 아님을 나타낸다. 보다 최근에, 인간 간세포로 부분적으로 재증식된 간을 갖는 키메라 "인간화" 마우스는 상이한 바이러스 캡시드의 간 형질도입 효능을 결정하는 가치 있는 도구가 되었다. 이러한 마우스 모델을 이용하는 인간 간세포에서의 형질도입을 측정하는 2개의 독립적 연구가 보고되었다. LK03와 AAV8 사이에서 형질도입된 인간 간세포의 백분율에서의 대략 10배 차이가 보고되었다(LK03 및 AAV8 벡터 주입으로 각각 43.3 ± 11% 및 3.6 ± 1.1%가 관찰되었다(Lisowski L, et al. Nature 506:382-6 (2014)).
요약하면, 중증 또는 중등의 중증의 혈우병 A를 갖는 12명의 환자에서의 SPK-8011의 주입은 유전자 전달 후 최대 66주의 기간 동안 ABR에서 97% 감소 및 재조합 FVIII 사용에서 97%와 관련된 안전하고, 내구성 있고, 용량 의존적인 FVIII 활성을 발생시켰다.
실시예 9
TTR 프로모터
트랜스티레틴(TTR) 프로모터의 특징은 본래 문헌[Costa and Grayson 1991, Nucleic Acids Research 19(15):4139-4145]에 기재되었다. TTR 프로모터 서열은 TATTTGTGTAG에서 TATTGACTTAG로 변형된 서열이었다.
4개의 뉴클레오티드 돌연변이를 갖는 TTR 프로모터( TTRmut ), SEQ ID NO:22
Figure pct00005
실시예 10
CpG 감소된 FVIII 인코딩 트랜스진 작제물 및 예시적 AAV 캡시드.
CpG 감소된 핵산 변이체 X01을 인코딩하는 FVIII (SEQ ID NO:1)
Figure pct00006
Figure pct00007
CpG 감소된 핵산 변이체 X02를 인코딩하는 FVIII (SEQ ID NO:2)
Figure pct00008
Figure pct00009
CpG 감소된 핵산 변이체 X03을 인코딩하는 FVIII (SEQ ID NO:3)
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
CpG 감소된 핵산 변이체 X04를 인코딩하는 FVIII (SEQ ID NO:4)
Figure pct00013
Figure pct00014
CpG 감소된 핵산 변이체 X05를 인코딩하는 FVIII (SEQ ID NO:5)
Figure pct00015
Figure pct00016
CpG 감소된 핵산 변이체 X06을 인코딩하는 FVIII (SEQ ID NO:6)
Figure pct00017
Figure pct00018
CpG 감소된 핵산 변이체 X07을 인코딩하는 FVIII (SEQ ID NO:7)
Figure pct00019
Figure pct00020
CpG 감소된 핵산 변이체 X08을 인코딩하는 FVIII (SEQ ID NO:8)
Figure pct00021
Figure pct00022
CpG 감소된 핵산 변이체 X09를 인코딩하는 FVIII (SEQ ID NO:9)
Figure pct00023
Figure pct00024
CpG 감소된 핵산 변이체 X10을 인코딩하는 FVIII (SEQ ID NO:10)
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
CpG 감소된 핵산 변이체 X11을 인코딩하는 FVIII (SEQ ID NO:11)
Figure pct00028
Figure pct00029
CpG 감소된 핵산 변이체 X12를 인코딩하는 FVIII (SEQ ID NO:12)
Figure pct00030
Figure pct00031
CpG 감소된 핵산 변이체 X13을 인코딩하는 FVIII (SEQ ID NO:13)
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
CpG 감소된 핵산 변이체 X14를 인코딩하는 FVIII (SEQ ID NO:14)
Figure pct00035
Figure pct00036
CpG 감소된 핵산 변이체 X15를 인코딩하는 FVIII (SEQ ID NO:15)
Figure pct00037
Figure pct00038
CpG 감소된 핵산 변이체 X16을 인코딩하는 FVIII (SEQ ID NO:16)
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
CpG 감소된 핵산 변이체 X17을 인코딩하는 FVIII (SEQ ID NO:17)
Figure pct00042
Figure pct00043
CpG 감소된 핵산 변이체 X18을 인코딩하는 FVIII ( SEQ ID NO:18 )
Figure pct00044
Figure pct00045
야생형 인자 VIII-BDD cDNA (SEQ ID NO:19)
Figure pct00046
Figure pct00047
V3 인자 VIII cDNA (SEQ ID NO:20)
Figure pct00048
Figure pct00049
CO3 인자 VIII cDNA (SEQ ID NO:21)
Figure pct00050
Figure pct00051
돌연변이된 TTR 프로모터( TTRmut ), 합성 인트론 , CpG 감소된 인자 VIII cDNA, 폴리 A 및 ITR을 포함하는 전장 카세트( SEQ ID NO:23)
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
돌연변이된 TTR 프로모터( TTRmut ), 합성 인트론 , CpG 감소된 인자 VIII cDNA, 폴리 A 및 ITR을 포함하는 전장 플라스미드 (SEQ ID NO:24)
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
X01-X18 핵산 서열에 의해 인코딩된 FVIII - BDD . 굵은 글씨/밑줄이 있는 SQ 서열 (SEQ ID NO:25)
Figure pct00059
BDD를 갖는 야생형 FVIII (SEQ ID NO:26)
Figure pct00060
AAV-LK03 VP1 캡시드 (SEQ ID NO:27)
Figure pct00061
AAV - SPK -8005 및 AAV - SPK - hFIX에서 사용된 AAV - SPK VP1 캡시드 ( SEQ ID NO:28)
Figure pct00062
hFVIII 벡터(WT, CO3, X09, X02, X06, X08, X15, X05, X18, X14, X01, X12, X04, X11, X07, X03, X16, X13, X17 및 X10)의 동일성 백분율 매트릭스
Figure pct00063
사용된 특정 정의/약어
BDD: B 도메인(BD)의 전부 또는 적어도 일부가 결실됨
FVIII-BDD: B 도메인 결실을 갖는 FVIII
SQ: SFSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO:29)
FVIII/SQ: SQ를 갖는 FVIII
FVIIIX01-X18: SEQ ID No:1-18에 각각 기재된 CpG 감소된 FVIII 인코딩 핵산 변이체.
TTRmut: TAmGTGTAG로부터 TATTGACTTAG로의 4개의 돌연변이를 갖는 TTR 프로모터
CO3: SEQ ID NO:21로 기재된 코돈 최적화된 FVIII 핵산 변이체
NHP: 비 인간 영장류
ALT: 알라닌 아미노트랜스페라제
D-이량체: 혈액 응고의 분해로부터의 단백질 단편
SPK-8005: AAV-SPK-8005로도 언급되는, AAV 캡시드(SEQ ID NO:28) + TTRmut-hFVIII-X07
SPK-8011: AAV-SPK-8011로도 언급되는 AAV LK03 캡시드(SEQ ID NO:27) + TTRmut-hFVIII-X07
본 발명의 특정 구현예가 상기 기재되고 구체적으로 예시되었으나, 본 발명이 상기 구현예로 제한되는 것으로 의도되지는 않는다. 하기 청구범위에 기재된 바와 같은 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어남이 없이 다양한 변형이 거기에 대해 이루어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> SPARK THERAPEUTICS, INC. ANGUELA , Xavier <120> FACTOR VIII (FVIII) GENE THERAPY METHODS <130> 023637-0460703 <140> PCT/US2018/044892 <141> 2018-08-01 <150> 62/540,053 <151> 2017-08-01 <150> 62/583,890 <151> 2017-11-09 <150> 62/596,535 <151> 2017-12-08 <150> 62/596,670 <151> 2017-12-08 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4374 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FVIII Variant <400> 1 atgcagattg agctgtctac ctgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgct 60 accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctggg attacatgca gtctgacctg 120 ggggagctgc ctgtggatgc caggtttccc cccagggtgc ccaagagctt ccccttcaat 180 acctctgtgg tgtataagaa gaccctgttt gtggagttca ctgatcatct gttcaacatt 240 gctaaaccca ggcccccctg gatggggctg ctgggcccta ccatccaggc tgaggtgtat 300 gacactgtgg tgatcactct gaagaacatg gctagccatc ctgtgtctct gcatgctgtg 360 ggggtgagct actggaaggc ttctgagggg gctgagtatg atgatcagac tagccagagg 420 gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggctctcaca cctatgtctg gcaggtgctg 480 aaggagaatg gccccatggc ctctgatcct ctgtgtctga cctatagcta cctgagccat 540 gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgtagggag 600 gggagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagt tcattctgct gtttgctgtg 660 tttgatgagg gcaagagctg gcattctgaa accaagaaca gcctgatgca ggacagggat 720 gctgcctctg ctagggcctg gcccaagatg cacactgtga atgggtatgt caataggtct 780 ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtact ggcatgtgat tgggatgggc 840 accacccctg aggtgcacag catctttctg gagggccaca ccttcctggt gaggaatcac 900 agacaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctga ctgcccagac cctgctgatg 960 gacctgggcc agtttctgct gttctgccac atctctagcc accagcatga tggcatggag 1020 gcctatgtga aggtggactc ctgccctgag gagccccagc tgaggatgaa gaataatgag 1080 gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgaga tggatgtggt gagatttgat 1140 gatgacaatt ctcccagctt cattcagatc aggtctgtgg ccaagaagca tcccaagacc 1200 tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gactgggact atgcccccct ggtgctggcc 1260 cctgatgaca ggagctataa gagccagtac ctgaataatg gcccccagag gattgggagg 1320 aagtataaga aggtgaggtt catggcctat actgatgaaa ccttcaagac cagagaggcc 1380 atccagcatg agtctgggat cctggggccc ctgctgtatg gggaggtggg ggacaccctg 1440 ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccctacaaca tctaccctca tggcatcact 1500 gatgtgaggc ctctgtacag cagaaggctg cccaaggggg tgaagcatct gaaggacttc 1560 cccattctgc ctggggagat tttcaagtac aagtggactg tgactgtgga ggatggccca 1620 accaagtctg accctaggtg cctgactagg tactacagca gctttgtgaa tatggagagg 1680 gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgct acaaggagtc tgtggatcag 1740 aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcc tgttctctgt gtttgatgag 1800 aacaggagct ggtacctgac tgagaacatt cagaggtttc tgcccaaccc tgctggggtg 1860 cagctggagg accctgaatt ccaggcctct aacatcatgc acagcattaa tggctatgtg 1920 tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cctactggta cattctgagc 1980 attggggccc agactgactt cctgtctgtg ttcttctctg gctacacctt taagcacaag 2040 atggtgtatg aggataccct gaccctgttt cctttctctg gggagactgt gttcatgagc 2100 atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgccacaact ctgacttcag gaacaggggg 2160 atgactgctc tgctgaaggt gagcagctgt gataagaaca ctggggacta ctatgaggac 2220 agctatgagg acatctctgc ctatctgctg agcaagaata atgctattga gcccaggagc 2280 ttctctcaga acccccctgt gctgaagagg caccagaggg agatcaccag aactactctg 2340 cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gacaccatct ctgtggagat gaagaaggag 2400 gattttgata tttatgatga ggatgaaaac cagagcccca ggagctttca gaagaagact 2460 aggcactatt tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgtc ttctagcccc 2520 catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc tctgtgcccc agttcaagaa ggtggtgttc 2580 caggagttca ctgatggcag cttcactcag cccctgtaca ggggggagct gaatgagcac 2640 ctggggctgc tgggccctta tatcagggct gaggtggagg ataacatcat ggtgaccttc 2700 aggaaccagg ccagcaggcc ctacagcttc tactctagcc tgatcagcta tgaggaggac 2760 cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagc ccaatgagac caagacttat 2820 ttctggaagg tgcagcacca tatggccccc accaaggatg agtttgattg caaagcctgg 2880 gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcact ctgggctgat tggccccctg 2940 ctggtgtgcc acaccaacac tctgaaccct gcccatggca ggcaggtgac tgtgcaggag 3000 tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag actaagagct ggtacttcac tgagaacatg 3060 gagaggaact gcagggcccc ctgcaatatc cagatggagg accccacctt taaggaaaat 3120 tataggtttc atgccattaa tggctacatc atggacaccc tgcctggcct ggtgatggcc 3180 caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatgggca gcaatgagaa cattcacagc 3240 atccacttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaagg aggagtacaa gatggccctg 3300 tataatctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgc tgcccagcaa ggctggcatc 3360 tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctg gcatgagcac cctgttcctg 3420 gtgtattcta acaagtgtca gacccccctg ggcatggcct ctggccatat cagggacttc 3480 cagatcactg cctctggcca gtatgggcag tgggccccca agctggccag gctgcattac 3540 tctggcagca tcaatgcctg gagcaccaag gagccattca gctggattaa ggtggacctg 3600 ctggctccaa tgattatcca tggcatcaag acccaggggg ccaggcagaa gtttagcagc 3660 ctgtacatct ctcagtttat catcatgtac tctctggatg gcaaaaagtg gcagacctac 3720 aggggcaatt ctactggcac tctgatggtg ttctttggca atgtggacag ctctgggatc 3780 aagcacaaca tctttaaccc ccctatcatt gccaggtaca ttaggctgca ccccacccat 3840 tacagcatca ggagcaccct gaggatggag ctgatgggct gtgatctgaa cagctgcagc 3900 atgcccctgg gcatggagag caaggctatc tctgatgccc agattactgc cagcagctac 3960 ttcaccaata tgtttgccac ctggagcccc agcaaggcca ggctgcacct gcagggcagg 4020 tctaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag 4080 aagaccatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtga agagcctgct gactagcatg 4140 tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatggcc atcagtggac cctgttcttc 4200 cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aatcaggaca gcttcacccc tgtggtgaac 4260 agcctggacc cccccctgct gaccagatac ctgaggatcc acccccagag ctgggtgcat 4320 cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggg tgtgaggccc aggacctgta ctga 4374 <210> 2 <211> 4374 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FVIII Variant <400> 2 atgcagattg agctgtctac ctgctttttc ctgtgtctgc tgaggttctg cttctctgcc 60 actaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgtcttggg attacatgca gtctgatctg 120 ggggagctgc ctgtggatgc caggtttcct cccagggtgc ccaagtcttt ccccttcaat 180 acctctgtgg tgtataagaa gaccctgttt gtggagttta ctgatcacct gttcaacatt 240 gccaagccca ggcccccttg gatgggcctg ctggggccca ccatccaggc tgaggtgtat 300 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gcccctcttt catccagatc aggtctgtgg ccaagaagca tcctaagacc 1200 tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gactgggact atgctcccct ggtgctggcc 1260 cctgatgaca ggtcttacaa gagccagtac ctgaacaatg gcccccagag aattgggagg 1320 aagtataaga aggtgagatt catggcttac actgatgaga ccttcaagac tagggaggcc 1380 atccagcatg agtctggcat tctgggcccc ctgctgtatg gggaggtggg ggacaccctg 1440 ctgatcatct tcaagaacca ggcctctagg ccctacaata tttaccccca tgggatcact 1500 gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cctaaggggg tgaagcatct gaaggacttc 1560 cccatcctgc ctggggagat cttcaagtat aagtggactg tgactgtgga agatggcccc 1620 accaagtctg accctaggtg cctgaccagg tactactctt cttttgtgaa catggagagg 1680 gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgct acaaggagtc tgtggaccag 1740 agggggaacc agattatgtc tgacaagagg aatgtgattc tgttctctgt gtttgatgag 1800 aacaggagct ggtatctgac tgagaacatc cagaggttcc tgcccaatcc tgctggggtg 1860 cagctggagg accctgagtt ccaggccagc aacatcatgc acagcatcaa tgggtatgtg 1920 tttgattctc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cctactggta catcctgagc 1980 attggggctc agactgattt cctgtctgtg ttcttttctg gctacacctt taagcataag 2040 atggtgtatg aggacactct gaccctgttt cccttctctg gggagactgt gtttatgagc 2100 atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgccacaact ctgatttcag gaacaggggc 2160 atgactgctc tgctgaaggt gtcttcttgt gacaagaaca ctggggacta ttatgaggac 2220 agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaaca atgctattga gcccagatct 2280 ttcagccaga acccccctgt gctgaagagg caccagaggg agatcactag gaccaccctg 2340 cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gacactatct ctgtggagat gaagaaggag 2400 gactttgata tctatgatga ggatgagaac cagtctccca ggagcttcca gaaaaagacc 2460 aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgtc ttctagcccc 2520 catgtgctga ggaacagggc ccagtctggg tctgtgcccc agttcaagaa ggtggtgttc 2580 caggagttca ctgatgggag cttcacccag cctctgtaca ggggggagct gaatgagcac 2640 ctggggctgc tgggccctta tattagggct gaggtggagg acaacatcat ggtgactttc 2700 aggaatcagg cctctaggcc ctatagcttc tacagctctc tgatcagcta tgaggaggat 2760 cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagc ccaatgagac caagacctac 2820 ttctggaagg tgcagcacca catggctcct accaaggatg agtttgactg caaggcctgg 2880 gcctactttt ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcact ctggcctgat tggccccctg 2940 ctggtgtgtc ataccaacac cctgaaccct gcccatggca ggcaggtgac tgtgcaggag 3000 tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag accaagagct ggtactttac tgagaacatg 3060 gagaggaatt gcagagcccc ttgcaacatc cagatggagg acccaacctt caaagagaac 3120 tacaggttcc atgccatcaa tgggtacatc atggacaccc tgcctggcct ggtgatggct 3180 caggaccaga ggatcaggtg gtatctgctg agcatgggca gcaatgagaa tatccatagc 3240 attcacttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaagg aggagtacaa gatggccctg 3300 tataacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgc tgccaagcaa ggctgggatt 3360 tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctg gcatgtctac cctgttcctg 3420 gtgtactcca ataagtgcca gacccccctg ggcatggcct ctggccacat cagggacttc 3480 cagatcactg cctctggcca gtatgggcag tgggccccaa agctggccag gctgcactat 3540 tctgggagca tcaatgcttg gagcaccaag gagcctttca gctggattaa ggtggatctg 3600 ctggccccca tgatcattca tggcatcaaa acccaggggg ctagacagaa gttttctagc 3660 ctgtacatca gccagttcat catcatgtac agcctggatg gcaagaagtg gcagacttac 3720 aggggcaata gcactggcac cctgatggtg ttttttggca atgtggacag ctctggcatc 3780 aagcacaaca tctttaaccc ccccattatt gccaggtata tcaggctgca tcccacccac 3840 tattctatta ggtctactct gagaatggag ctgatgggct gtgacctgaa cagctgtagc 3900 atgcccctgg ggatggagag caaggctatc tctgatgccc agatcactgc cagctcttat 3960 ttcaccaata tgtttgccac ctggtctccc tctaaggcca ggctgcacct gcagggcagg 4020 agcaatgctt ggaggcccca ggtgaataac cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag 4080 aagaccatga aggtgactgg ggtgactacc cagggggtga agtctctgct gactagcatg 4140 tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatgggc atcagtggac tctgttcttc 4200 cagaatggca aggtgaaggt cttccagggg aaccaggata gcttcactcc tgtggtgaac 4260 tctctggacc cccccctgct gactaggtat ctgaggatcc acccccagag ctgggtgcac 4320 cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggccc aggacctgta ttga 4374 <210> 3 <211> 4374 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FVIII Variant <400> 3 atgcagattg aactgtctac ttgtttcttc ctgtgcctgc tgaggttttg cttctctgct 60 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ctctggagat ctctcccatt actttcctga ctgcccagac cctgctgatg 960 gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagcagcc accagcatga tggcatggag 1020 gcctatgtga aggtggatag ctgccctgag gagccccagc tgaggatgaa aaacaatgag 1080 gaggctgagg attatgatga tgacctgact gattctgaga tggatgtggt gaggtttgat 1140 gatgataaca gccccagctt catccagatt aggtctgtgg ccaagaagca tcccaagacc 1200 tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggact atgctcctct ggtgctggcc 1260 cctgatgaca ggagctacaa gagccagtac ctgaataatg gcccccagag gattggcagg 1320 aagtataaga aggtgaggtt catggcctac actgatgaga cctttaagac cagggaggcc 1380 atccagcatg aatctgggat cctgggcccc ctgctgtatg gggaggtggg ggacaccctg 1440 ctgattatct ttaagaacca ggctagcagg ccctacaaca tttaccccca tggcattact 1500 gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cccaaggggg tgaagcacct gaaggatttc 1560 cccattctgc ctggggagat ctttaagtac aaatggactg tgactgtgga ggatggccct 1620 actaagtctg atcccaggtg tctgaccaga tactacagca gctttgtgaa tatggagagg 1680 gacctggctt ctggcctgat tggccccctg ctgatctgct acaaggagtc tgtggaccag 1740 aggggcaatc agattatgtc tgacaagagg aatgtgatcc tgttctctgt gtttgatgag 1800 aacagaagct ggtacctgac tgagaacatc cagaggttcc tgcccaaccc tgctggggtg 1860 cagctggagg accctgagtt ccaggctagc aatatcatgc acagcattaa tggctatgtg 1920 tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cctattggta cattctgagc 1980 attggggccc agactgattt cctgtctgtg ttcttttctg gctacacctt caagcacaag 2040 atggtgtatg aggatactct gaccctgttt cccttctctg gggagactgt gttcatgagc 2100 atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgtcacaact ctgacttcag gaacaggggc 2160 atgactgccc tgctgaaggt gagctcttgt gataagaaca ctggggacta ctatgaggac 2220 tcttatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaaca atgctattga gcccaggagc 2280 ttctctcaga atccccctgt gctgaagagg catcagaggg agatcactag gactaccctg 2340 cagtctgacc aggaagagat tgactatgat gacaccatct ctgtggaaat gaagaaggag 2400 gactttgata tctatgatga ggatgaaaac cagagcccca ggagcttcca gaagaagacc 2460 aggcattact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atgggatgag ctcttctccc 2520 catgtgctga ggaatagggc tcagtctggc tctgtcccac agttcaagaa ggtggtgttt 2580 caggagttca ctgatggcag cttcactcag cccctgtaca ggggggagct gaatgagcat 2640 ctgggcctgc tggggcccta catcagggct gaggtggagg ataacattat ggtgactttc 2700 aggaaccagg cctctaggcc ctacagcttc tacagcagcc tgatcagcta tgaggaggac 2760 cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagc ccaatgagac taagacctat 2820 ttctggaagg tgcagcatca catggctccc actaaagatg agtttgactg caaggcctgg 2880 gcctacttct ctgatgtgga tctggagaag gatgtgcatt ctgggctgat tggccctctg 2940 ctggtctgcc atactaacac cctgaatcct gcccatggca ggcaggtgac tgtgcaggag 3000 tttgccctgt tctttaccat ctttgatgag accaagtctt ggtacttcac tgagaacatg 3060 gagaggaact gcagggcccc ctgtaacatc cagatggagg accccacctt taaggagaac 3120 tacaggttcc atgccatcaa tggctacatc atggacactc tgcctggcct ggtgatggcc 3180 caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg tctatgggct ctaatgagaa cattcattct 3240 atccacttct ctggccatgt gtttactgtg aggaagaagg aggagtacaa gatggccctg 3300 tacaatctgt accctggggt gtttgaaact gtggagatgc tgccctctaa ggctggcatc 3360 tggagggtgg agtgcctgat tggggaacac ctgcatgctg gcatgagcac cctgttcctg 3420 gtctatagca ataagtgcca gacccccctg gggatggcct ctgggcatat cagagacttc 3480 cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggccccca agctggccag gctgcactac 3540 tctggcagca ttaatgcctg gagcaccaag gagcccttct cttggatcaa ggtggacctg 3600 ctggctccca tgatcatcca tgggatcaag acccaggggg ccaggcagaa gttcagcagc 3660 ctgtacatct ctcagttcat catcatgtac tctctggatg gcaagaagtg gcagacctac 3720 aggggcaata gcactgggac cctgatggtg ttctttggga atgtggacag ctctggcatc 3780 aagcacaata tcttcaaccc ccccatcatt gccaggtaca tcagactgca ccccactcat 3840 tacagcatca ggagcactct gaggatggag ctgatgggct gtgacctgaa tagctgctct 3900 atgcccctgg gcatggagag caaggccatt tctgatgccc agattactgc ctcttcttac 3960 ttcactaata tgtttgccac ctggagcccc agcaaggcca ggctgcatct gcaggggagg 4020 agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag 4080 aagactatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtga agagcctgct gaccagcatg 4140 tatgtgaagg agttcctgat ctcttctagc caggatgggc accagtggac cctgtttttc 4200 cagaatggga aggtgaaggt gtttcagggc aatcaggaca gctttactcc tgtggtgaac 4260 agcctggacc 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1470 Asp Gln Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser 1475 1480 1485 Val Thr Tyr Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp 1490 1495 1500 Leu Pro Lys Thr Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His 1505 1510 1515 Ile Tyr Gln Lys Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser 1520 1525 1530 Pro Gly His Leu Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr 1535 1540 1545 Glu Gly Ala Ile Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val 1550 1555 1560 Pro Phe Leu Arg Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser 1565 1570 1575 Lys Leu Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln 1580 1585 1590 Ile Pro Lys Glu Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys 1595 1600 1605 Thr Ala Phe Lys Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys 1610 1615 1620 Glu Ser Asn His Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys 1625 1630 1635 Pro Glu Ile Glu Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg 1640 1645 1650 Leu Cys Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu 1655 1660 1665 Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr 1670 1675 1680 Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile 1685 1690 1695 Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys 1700 1705 1710 Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr 1715 1720 1725 Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser 1730 1735 1740 Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr 1745 1750 1755 Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu 1760 1765 1770 His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp 1775 1780 1785 Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser 1790 1795 1800 Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly 1805 1810 1815 Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr 1820 1825 1830 Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu 1835 1840 1845 Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu 1850 1855 1860 Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His 1865 1870 1875 Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln 1880 1885 1890 Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp 1895 1900 1905 Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn 1910 1915 1920 Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His 1925 1930 1935 Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met 1940 1945 1950 Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser 1955 1960 1965 Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr 1970 1975 1980 Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr 1985 1990 1995 Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly 2000 2005 2010 Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly 2015 2020 2025 Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro 2030 2035 2040 Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala 2045 2050 2055 Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His 2060 2065 2070 Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser 2075 2080 2085 Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile 2090 2095 2100 Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser 2105 2110 2115 Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr 2120 2125 2130 Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn 2135 2140 2145 Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile 2150 2155 2160 Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg 2165 2170 2175 Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys 2180 2185 2190 Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln 2195 2200 2205 Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser 2210 2215 2220 Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp 2225 2230 2235 Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe 2240 2245 2250 Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys 2255 2260 2265 Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser 2270 2275 2280 Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys 2285 2290 2295 Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val 2300 2305 2310 Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His 2315 2320 2325 Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu 2330 2335 2340 Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr 2345 2350 <210> 27 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV-LK03 VP1 capsid <400> 27 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr 435 440 445 Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser 450 455 460 Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro 465 470 475 480 Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln 565 570 575 Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr 580 585 590 Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu 725 730 735 <210> 28 <211> 738 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV-SPK VP1 capsid <400> 28 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Ser Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 145 150 155 160 Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 165 170 175 Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro 180 185 190 Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly 195 200 205 Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser 210 215 220 Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 225 230 235 240 Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 245 250 255 Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp 260 265 270 Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn 275 280 285 Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn 290 295 300 Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn 305 310 315 320 Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala 325 330 335 Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln 340 345 350 Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe 355 360 365 Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn 370 375 380 Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr 385 390 395 400 Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr 405 410 415 Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser 420 425 430 Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu 435 440 445 Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu 450 455 460 Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp 465 470 475 480 Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser 485 490 495 Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His 500 505 510 Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr 515 520 525 His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met 530 535 540 Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val 545 550 555 560 Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr 565 570 575 Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala 580 585 590 Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val 595 600 605 Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile 610 615 620 Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe 625 630 635 640 Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val 645 650 655 Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe 660 665 670 Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu 675 680 685 Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr 690 695 700 Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu 705 710 715 720 Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 725 730 735 Asn Leu <210> 29 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant FVIII-BDD <400> 29 Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg 1 5 10

Claims (140)

  1. 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 것을 포함하는 혈우병 A를 갖는 인간을 치료하는 방법으로서, 상기 벡터 유전체가 B 도메인 결실을 갖는 인자 VIII(FVIII)(hFVIII-BDD)를 인코딩하는 핵산 변이체를 포함하고, 상기 핵산 변이체가 SEQ ID NO:7과 95% 이상의 동일성을 갖는, 방법.
  2. 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 것을 포함하는 혈우병 A를 갖는 인간을 치료하는 방법으로서, 상기 벡터 유전체가 B 도메인 결실을 갖는 인자 VIII(FVIII)(hFVIII-BDD)를 인코딩하는 핵산 변이체를 포함하고, 상기 핵산 변이체가 2개 이하의 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 갖는, 방법.
  3. 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 것을 포함하는 혈우병 A를 갖는 인간을 치료하는 방법으로서, 상기 벡터 유전체가 인자 VIII(FVIII)를 인코딩하거나 B 도메인 결실을 갖는 인자 VIII(FVIII)(hFVIII-BDD)를 인코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 인간에게 투여되는 rAAV 벡터의 용량이 킬로그램 당 6x1012 미만의 벡터 유전체(vg/kg)인, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간에게 투여되는 rAAV 벡터의 용량이 약 1x109 내지 약 1x1014 vg/kg인 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간에게 투여되는 rAAV 벡터의 용량이 약 1x1010 내지 약 6x1013 vg/kg인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간에게 투여되는 rAAV 벡터의 용량이 약 1x1010 내지 약 1x1013 vg/kg인 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간에게 투여되는 rAAV 벡터의 용량이 약 1x1010 내지 약 6x1012 vg/kg인 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에게 투여되는 rAAV 벡터의 용량이 약 1x1010 내지 약 5x1012 vg/kg인 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에게 투여되는 rAAV 벡터의 용량이 약 1x1011 내지 약 1x1012 vg/kg인 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에게 투여되는 rAAV 벡터의 용량이 약 2x1011 내지 약 9x1011 vg/kg인 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에게 투여되는 rAAV 벡터의 용량이 약 3x1011 내지 약 8x1012 vg/kg인 방법.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에게 투여되는 rAAV 벡터의 용량이 약 3x1011 내지 약 7x1012 vg/kg인 방법.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에게 투여되는 rAAV 벡터의 용량이 약 3x1011 내지 약 6x1012 vg/kg인 방법.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에게 투여되는 rAAV 벡터의 용량이 약 4x1011 내지 약 6x1012 vg/kg인 방법.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에게 투여되는 rAAV 벡터의 용량이 약 5x1011 vg/kg 또는 약 1x1012 vg/kg인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양이 rAAV 벡터가 투여된 비-인간 영장류 연구로부터 획득된 데이터를 기초로 하여 예측된 것보다 큰 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양이 rAAV 벡터가 투여된 비-인간 영장류 연구로부터 유래된 선형 회귀 곡선을 기초로 하여 예측된 발현보다 1-4배 더 큰 방법.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양이 rAAV 벡터가 투여된 비-인간 영장류 연구로부터 유래된 선형 회귀 곡선을 기초로 하여 예측된 것보다 2-4배 더 큰 방법.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양이 rAAV 벡터가 투여된 비-인간 영장류 연구로부터 유래된 선형 회귀 곡선을 기초로 하여 예측된 것보다 2-3배 더 큰 방법.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양이 rAAV 벡터가 투여된 비-인간 영장류 연구로부터 유래된 선형 회귀 곡선을 기초로 하여 예측된 것보다 1-2배 더 큰 방법.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 비-인간 영장류가 시노몰로구스(cynomologus) 원숭이(마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis))인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양이 rAAV 벡터 투여 후 14일 이상에서 약 3% 이상이고, rAAV 벡터 투여 후 21일 이상에서 약 4% 이상이고, rAAV 벡터 투여 후 21일 이상에서 약 5% 이상이고, rAAV 벡터 투여 후 21일 이상에서 약 6% 이상이고, rAAV 벡터 투여 후 21일 이상에서 약 7% 이상이고, rAAV 벡터 투여 후 28일 이상에서 약 8% 이상이고, rAAV 벡터 투여 후 28일 이상에서 약 9% 이상이고, rAAV 벡터 투여 후 35일 이상에서 약 10% 이상이고, rAAV 벡터 투여 후 35일 이상에서 약 11% 이상이고, rAAV 벡터 투여 후 35일 이상에서 약 12% 이상인 방법.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양이 연속 14일의 기간에 걸쳐 평균 약 10% 이상인 방법.
  24. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양이 연속 4주의 기간에 걸쳐 평균 약 10% 이상인 방법.
  25. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양이 연속 8주의 기간에 걸쳐 평균 약 10% 이상인 방법.
  26. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양이 연속 12주의 기간에 걸쳐 평균 약 10% 이상인 방법.
  27. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양이 연속 16주의 기간에 걸쳐 평균 약 10% 이상인 방법.
  28. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양이 연속 6개월의 기간에 걸쳐 평균 약 10% 이상인 방법.
  29. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양이 연속 14일의 기간에 걸쳐 평균 약 12% 이상인 방법.
  30. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양이 연속 4주 기간 동안, 연속 8주 기간 동안, 연속 12주 기간 동안, 연속 16주 기간 동안, 연속 6개월 기간 동안, 또는 연속 1년 기간 동안 평균 약 12% 내지 약 100%인 방법.
  31. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 활성에 의해 반영되는, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD의 양이 연속 4주 기간 동안, 연속 8주 기간 동안, 연속 12주 기간 동안, 연속 16주 기간 동안, 연속 6개월 기간 동안, 또는 연속 1년 기간 동안 평균 약 20% 내지 약 80%인 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 14일의 기간 동안 존재하는 방법.
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 21일의 기간 동안 존재하는 방법.
  34. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 28일의 기간 동안 존재하는 방법.
  35. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 35일의 기간 동안 존재하는 방법.
  36. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 42일의 기간 동안 존재하는 방법.
  37. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 49일의 기간 동안 존재하는 방법.
  38. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 56일의 기간 동안 존재하는 방법.
  39. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 63일의 기간 동안 존재하는 방법.
  40. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 70일의 기간 동안 존재하는 방법.
  41. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 77일의 기간 동안 존재하는 방법.
  42. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 84일의 기간 동안 존재하는 방법.
  43. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 91일의 기간 동안 존재하는 방법.
  44. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 98일의 기간 동안 존재하는 방법.
  45. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 105일의 기간 동안 존재하는 방법.
  46. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 112일의 기간 동안 존재하는 방법.
  47. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 4개월의 기간 동안 존재하는 방법.
  48. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 6개월의 기간 동안 존재하는 방법.
  49. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 7개월의 기간 동안 존재하는 방법.
  50. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 12개월의 기간 동안 존재하는 방법.
  51. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 인간에게 약 1x109 내지 약 1x1014 vg/kg의 용량으로 투여되고, 상기 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성되는 방법.
  52. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 인간에게 약 5x109 내지 약 6x1013 vg/kg의 용량으로 투여되고, 상기 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성되는 방법.
  53. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 인간에게 약 1x1010 내지 약 6x1013 vg/kg의 용량으로 투여되고, 상기 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성되는 방법.
  54. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 인간에게 약 1x1010 내지 약 1x1013 vg/kg의 용량으로 투여되고, 상기 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성되는 방법.
  55. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 인간에게 약 1x1010 내지 약 6x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, 상기 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성되는 방법.
  56. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 인간에게 6x1012 vg/kg 미만의 용량으로 투여되고, 상기 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성되는 방법.
  57. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 인간에게 약 1x1010 내지 약 5x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, 상기 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성되는 방법.
  58. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 인간에게 약 1x1011 내지 약 1x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, 상기 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성되는 방법.
  59. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 인간에게 약 2x1011 내지 약 9x1011 vg/kg의 용량으로 투여되고, 상기 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성되는 방법.
  60. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 인간에게 약 3x1011 내지 약 8x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, 상기 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성되는 방법.
  61. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 인간에게 약 3x1011 내지 약 7x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, 상기 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성되는 방법.
  62. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 인간에게 약 3x1011 내지 약 6x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, 상기 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성되는 방법.
  63. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 인간에게 약 4x1011 내지 약 6x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, 상기 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성되는 방법.
  64. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 약 5x1011 vg/kg 또는 약 1x1012 vg/kg의 용량으로 투여되고, 상기 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 평균 약 12% 내지 약 100% 활성의 수준으로 인간에서 생성되는 방법.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, FVIII 또는 hFVIII-BDD가 활성이 4, 6, 8 또는 12주 또는 개월에 걸쳐 5-50%를 초과하는만큼 변하지 않는 항정 상태로 인간에서 생성되는 방법.
  66. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, FVIII 또는 hFVIII-BDD가 활성이 4, 6, 8 또는 12주 또는 개월에 걸쳐 25-100%를 초과하는만큼 변하지 않는 항정 상태로 인간에서 생성되는 방법.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서의 AAV 항체가 rAAV 벡터 투여 전에 검출되지 않거나, 상기 인간이 AAV에 대해 혈청 음성인 방법.
  68. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서의 AAV 항체가 rAAV 벡터 투여 전에 1:5 이하로 존재하는 방법.
  69. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서의 AAV 항체가 rAAV 벡터 투여 전에 1:3 이하로 존재하는 방법.
  70. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간이 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11개월 또는 그 초과 동안 FVIII 또는 hFVIII-BDD에 대해 검출 가능한 항체를 생성하지 않는 방법.
  71. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 14일 동안, 또는 적어도 약 21일 동안, 또는 적어도 약 28일 동안, 또는 적어도 약 35일 동안, 또는 적어도 약 42일 동안, 또는 적어도 약 49일 동안, 또는 적어도 약 56일 동안, 또는 적어도 약 63일 동안, 또는 적어도 약 70일 동안, 또는 적어도 약 77일 동안, 또는 적어도 약 84일 동안, 또는 적어도 약 91일 동안, 또는 적어도 약 98일 동안, 또는 적어도 약 105일 동안, 또는 적어도 약 112일 동안, 또는 적어도 약 154일 동안, 또는 적어도 약 168일 동안, 또는 적어도 약 182일 동안, 또는 적어도 약 196일 동안, 또는 적어도 약 210일 동안 rAAV 벡터에 대한 검출 가능한 항체를 생성하지 않는 방법.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간이 rAAV 벡터 투여 후 적어도 연속 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14주 또는 개월 동안 rAAV 벡터에 대한 세포 매개 면역 반응을 생성하지 않는 방법.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이 FVIII 또는 hFVIII-BDD 치료 효과를 감소시키거나 차단하기에 충분한 rAAV 벡터에 대한 체액성 면역 반응을 발생시키지 않는 방법.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이 rAAV 벡터 투여 후 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월 동안 rAAV 벡터에 대해 검출 가능한 항체를 생성하지 않는 방법.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에게 rAAV 벡터 투여 전, 동안 및/또는 후에 면역억제제가 투여되지 않는 방법.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 발현된 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 면역억제제를 투여하지 않고 달성되는 방법.
  77. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 면역억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  78. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 투여된 후 면역억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  79. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 투여된 후 1시간 내지 최대 45일 이내의 기간에 면역억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  80. 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 면역억제제가 스테로이드, 사이클로스포린(예를 들어, 사이클로스포린 A), 미코페놀레이트, 리툭시맙 또는 이들의 유도체를 포함하는 방법.
  81. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 또는 핵산 변이체가 SEQ ID NO:7과 96% 이상의 서열 동일성을 갖는 방법.
  82. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 또는 핵산 변이체가 SEQ ID NO:7과 95%-100%의 서열 동일성을 갖는 방법.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 또는 핵산 변이체가 20개 이하, 15개 이하, 또는 10개 이하의 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 갖는 방법.
  84. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 또는 핵산 변이체가 5개 이하의 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 갖는 방법.
  85. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 또는 핵산 변이체가 4, 3, 2, 1 또는 0개의 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 갖는 방법.
  86. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 또는 핵산 변이체가 1개의 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 갖는 방법.
  87. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 또는 핵산 변이체가 서열 SFSQNPPVLKRHQR(SEQ ID NO:29)의 하나 이상의 아미노산의 결실, 또는 전체 서열 SFSQNPPVLKRHQR의 결실을 갖는 SEQ ID NO:25를 인코딩하는 방법.
  88. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 또는 핵산 변이체가 SEQ ID NO:25를 인코딩하는 방법.
  89. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, hFVIII-BDD가 SEQ ID NO:19에 의해 인코딩된 hFVIII-BDD와 동일한 방법.
  90. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 또는 핵산 변이체가 서열 SFSQNPPVLKRHQR(SEQ ID NO:29)의 하나 이상의 아미노산의 결실, 또는 전체 서열 SFSQNPPVLKRHQR의 결실을 갖는 SEQ ID NO:25를 인코딩하는 방법.
  91. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 벡터가 AAV 혈청형 또는 AAV 유사형을 포함하고, 상기 AAV 유사형이 ITR 혈청형과 상이한 AAV 캡시드 혈청형을 포함하는 방법.
  92. 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 유전체가 인트론, 발현 조절 요소, 하나 이상의 아데노-관련 바이러스(AAV) 역 말단 반복(ITR) 및/또는 충전재 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 방법.
  93. 제92항에 있어서, 인트론이 핵산 변이체 내에 있거나 측접하는 방법.
  94. 제92항에 있어서, 발현 조절 요소가 핵산 변이체에 작동 가능하게 연결되는 방법.
  95. 제92항에 있어서, AAV ITR(들)이 핵산 변이체의 5' 또는 3' 말단에 측접하는 방법.
  96. 제92항에 있어서, 충전재 폴리뉴클레오티드 서열이 핵산 변이체의 5' 또는 3' 말단에 측접하는 방법.
  97. 제92항에 있어서, 인트론, 발현 조절 요소, 하나 이상의 아데노-관련 바이러스(AAV) 역 말단 반복(ITR) 및/또는 충전재 폴리뉴클레오티드 서열이 감소된 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 갖도록 변형된 방법.
  98. 제92항에 있어서, 인트론, 발현 조절 요소, 하나 이상의 아데노-관련 바이러스(AAV) 역 말단 반복(ITR) 및/또는 충전재 폴리뉴클레오티드 서열이 20개 이하, 15개 이하, 10개 이하, 5개 이하 또는 0개의 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 갖도록 변형된 방법.
  99. 제92항에 있어서, 발현 조절 요소가 항시적 또는 조절 가능한 조절 요소, 또는 조직-특이적 발현 조절 요소 또는 프로모터를 포함하는 방법.
  100. 제92항에 있어서, 발현 조절 요소가 간에서 발현을 부여하는 요소를 포함하는 방법.
  101. 제92항에 있어서, 발현 조절 요소가 TTR 프로모터 또는 돌연변이체 TTR 프로모터를 포함하는 방법.
  102. 제101항에 있어서, 돌연변이체 TTR 프로모터가 SEQ ID NO:22를 포함하는 방법.
  103. 제101항에 있어서, ITR이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 AAV 혈청형, 또는 이들의 조합 중 임의의 것의 하나 이상의 ITR을 포함하는 방법.
  104. 제1항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 유전체가 SEQ ID NO:23에 기재된 ITR, 프로모터, 폴리A 신호 및/또는 인트론 서열을 포함하는 방법.
  105. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 변형된 또는 변이체 AAV VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 서열, 또는 야생형 AAV VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 서열을 포함하는 방법.
  106. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 변형된 또는 변이체 AAV VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 서열을 포함하는 방법.
  107. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 AAV 혈청형 중 임의의 것으로부터 선택되는 VP1, VP2 또는 VP3 캡시드 서열을 포함하는 방법.
  108. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 LK03 캡시드(SEQ ID NO:27)와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 캡시드를 포함하는 방법.
  109. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 SPK 캡시드(SEQ ID NO:28)와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 캡시드를 포함하는 방법.
  110. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 LK03 캡시드(SEQ ID NO:27)를 포함하는 방법.
  111. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 SPK 캡시드(SEQ ID NO:28)를 포함하는 방법.
  112. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 핵산 변이체 SEQ ID NO:7 및 LK03 캡시드 서열(SEQ ID NO:27)을 포함하는 방법.
  113. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 핵산 변이체 SEQ ID NO:7 및 SPK 캡시드(SEQ ID NO:28)를 포함하는 방법.
  114. 제1항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 핵산 변이체 및 SEQ ID NO:23의 돌연변이된 TTR 프로모터(TTRmut), 합성 인트론, 폴리 A 및 ITR 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  115. 제1항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 핵산 변이체 및 SEQ ID NO:23의 돌연변이된 TTR 프로모터 (TTRmut), 합성 인트론, 폴리 A 및 ITR 중 하나 이상 및 LK03 캡시드 서열(SEQ ID NO:27) 또는 SPK 캡시드(SEQ ID NO:28)를 포함하는 방법.
  116. 제1항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 약학적 조성물을 구성하는 방법.
  117. 제116항에 있어서, 약학적 조성물이 생물학적으로 상용성인 담체 또는 부형제를 포함하는 방법.
  118. 제1항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 리포솜에 캡슐화되거나 인지질 또는 마이셀과 혼합되는 방법.
  119. 제1항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 빈 캡시드 AAV를 투여하는 것을 추가로 포함하고, 선택적으로 빈 캡시드 AAV가 rAAV 벡터와 함께 투여되는 방법.
  120. 제1항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및/또는 AAV-Rh74 혈청형의 빈 캡시드를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  121. 제1항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 투여되는 AAV 벡터와 동일한 혈청형의 빈 캡시드 AAV를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  122. 제1항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, LK03 캡시드(SEQ ID NO:27) 또는 SPK 캡시드(SEQ ID NO:28)를 갖는 빈 캡시드를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  123. 제118항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 빈 캡시드 대 상기 rAAV 벡터의 비율이 약 2:1 내지 약 50:1인 방법.
  124. 제118항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 빈 캡시드 대 상기 rAAV 벡터의 비율이 약 2:1 내지 약 25:1인 방법.
  125. 제118항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 빈 캡시드 대 상기 rAAV 벡터의 비율이 약 2:1 내지 약 20:1인 방법.
  126. 제118항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 빈 캡시드 대 상기 rAAV 벡터의 비율이 약 2:1 내지 약 15:1인 방법.
  127. 제118항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 빈 캡시드 대 상기 rAAV 벡터의 비율이 약 2:1 내지 약 10:1인 방법.
  128. 제118항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 빈 캡시드 대 상기 rAAV 벡터의 비율이 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1인 방법.
  129. 제1항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 변이체에 의해 인코딩되는 FVIII 또는 hFVIII-BDD가 상기 포유동물의 세포, 조직 또는 기관에서 발현되는 방법.
  130. 제129항에 있어서, 세포가 분비 세포를 포함하는 방법.
  131. 제129항에 있어서, 세포가 내분비 세포 또는 내피 세포를 포함하는 방법.
  132. 제129항에 있어서, 세포가 간세포, 굴모양 내피 세포, 거대핵세포, 혈소판 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 방법.
  133. 제129항에 있어서, 상기 포유동물의 조직 또는 기관이 간을 포함하는 방법.
  134. 제1항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 정맥내, 동맥내, 근내, 피하, 공동내, 또는 삽관에 의해, 또는 카테터를 통해 상기 인간에게 전달되는 방법.
  135. 제1항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, FVIII 또는 hFVIII-BDD가 혈전증의 위험을 실질적으로 증가시키지 않는 수준으로 발현되는 방법.
  136. 제135항에 있어서, 상기 혈전증 위험이 피브린 분해 생성물을 측정함으로써 결정되는 방법.
  137. 제1항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, FVIII 또는 hFVIII-BDD의 활성이 적어도 1, 2, 3 또는 4주, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개월, 또는 적어도 1년 동안 검출 가능한 방법.
  138. 제1항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이 적어도 1, 2, 3 또는 4주, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개월, 또는 적어도 1년 동안 자발적 출혈을 나타내지 않는 방법.
  139. 제1항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 인간이 적어도 1, 2, 3 또는 4주, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개월, 또는 적어도 1년 동안 FVIII 단백질 예방을 필요로 하지 않는 방법.
  140. 제1항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 항체의 존재 또는 양, AAV, FVIII 또는 hFVIII-BDD 항체에 대한 면역 반응, FVIII 또는 hFVIII-BDD에 대한 면역 반응, FVIII 또는 hFVIII-BDD 양, FVIII 또는 hFVIII-BDD 활성, 하나 이상의 간 효소의 양 또는 수준 또는 빈도, 및/또는 출혈 에피소드의 중증도 또는 지속기간에 대해 인간을 분석하거나 모니터링하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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