BR112020001979A2 - métodos de terapia genética do fator viii (fviii) - Google Patents

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Abstract

são divulgados métodos de uso de vetores que compreendem ácido nucleico e variantes de ácido nucleico que codificam proteína fviii. em modalidades particulares, um método de tratamento de um ser humano com hemofilia a inclui administrar um vetor de vírus adenoassociado recombinante (raav) compreendendo um ácido nucleico que codifica o fator viii (fviii) ou variante de ácido nucleico que codifica o fator viii (fviii) com uma deleção do domínio b (hfviii-bdd). em alguns aspectos, uma variante de ácido nucleico tem 95% ou mais de identidade em relação à seq id no:7 e/ou uma variante de ácido nucleico tem não mais que 2 dinucleotídeos citosina-guanina (cpgs). em outros aspectos, um vetor de raav é administrado ao ser humano em uma dose menor que cerca de 6x1012 genomas vetoriais por quilograma (vg/kg).

Description

“MÉTODOS DE TERAPIA GENÉTICA DO FATOR VIII (FVIII)” PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório nº US 62/540.053, depositado em 1 de agosto de 2017; Pedido de Patente Provisório nº US 62/583.890, depositado em 9 de novembro de 2017; Pedido de Patente Provisório nº US 62/596.535, depositado em 8 de dezembro de 2017; e Pedido de Patente Provisório nº US 62/596.670, depositado em 8 de dezembro de 2017. O conteúdo completo dos pedidos mencionados acima está incorporado no presente documento por referência, incluindo todos os textos, tabelas e desenhos.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] Esta invenção refere-se aos campos de produção de fator de coagulação recombinante e do tratamento de distúrbios médicos associados a hemostasia anômala. Mais particularmente, a invenção fornece métodos para administração de um ácido nucleico que codifica a proteína do Fator VIII (FVIII), e métodos de tratamento da hemofilia A. Introdução
[0003] Inúmeras publicações e documentos de patente são citados ao longo do relatório descritivo a fim de descrever o estado da técnica ao qual esta invenção pertence. Cada uma dessas citações está incorporada no presente documento por referência como se estivesse estabelecida por completo.
[0004] A hemofilia é um distúrbio hemorrágico ligado ao X presente em 1 em 5.000 homens em todo o mundo. As terapias destinadas a aumentar os níveis do fator de coagulação logo acima de 1% do normal estão associadas a uma melhora substancial do fenótipo grave da doença. Ensaios clínicos recentes para transferência de genes mediados por AAV para hemofilia B (HB) demonstraram expressão sustentada a longo prazo dos níveis terapêuticos do fator IX (FIX), mas estabeleceram que a dose do vetor AAV pode ser limitante devido a respostas imunes anti-AAV ao Capsídeo AAV. Embora esses dados estejam relacionados à hemofilia B, 80% de toda a hemofilia é devida à deficiência de FVIII, a hemofilia A (HA).
[0005] O tratamento atual para esta doença é a terapia de reposição proteica que requer infusão frequente da proteína do fator VIII. Existe uma necessidade imediata de atingir níveis terapêuticos sustentados de expressão do fator VIII, para que os pacientes não precisem mais de tratamentos com proteínas tão frequentes. De fato, a expressão contínua do fator VIII impediria episódios hemorrágicos e pode garantir que a tolerância imunológica à proteína seja estabelecida.
SUMÁRIO
[0006] De acordo com a invenção, os métodos de tratamento de um ser humano com hemofilia A ou necessitado do Fator VIII (FVIII) são fornecidos. Em uma modalidade, um método inclui a administração de um vetor de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) em que o genoma vetorial compreende uma variante de ácido nucleico que codifica o Fator VIII (FVIII) com uma deleção do domínio B (hFVIII-BDD), em que a variante de ácido nucleico tem 95% ou mais de identidade em relação à SEQ ID NO:7. Em outra modalidade, um método inclui a administração de um vetor de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) em que o genoma vetorial compreende uma variante de ácido nucleico que codifica o Fator VIII (FVIII) com uma deleção do domínio B (hFVIII-BDD), em que a variante de ácido nucleico tem não mais que 2 dinucleotídeos citosina-guanina (CpGs).
[0007] Em uma modalidade adicional, um método de tratamento de um ser humano com hemofilia A ou necessitado do Fator VIII (FVIII) inclui a administração de um vetor de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) em que o genoma vetorial compreende um ácido nucleico que codifica o Fator VIII (FVIII) ou que codifica o Fator VIII (FVIII) com uma deleção do domínio B (hFVIII-BDD), em que a dose de vetor de rAAV administrada ao ser humano é menor que 6x1012 genomas vetoriais por quilograma (gv/kg).
[0008] As modalidades dos métodos e usos incluem administrar ao ser humano uma dose de vetor de rAAV entre cerca de 1x109 a cerca de 1x1014 gv/kg, inclusive.
[0009] As modalidades dos métodos e usos incluem administrar ao ser humano uma dose de vetor de rAAV entre cerca de 1x1010 a cerca de 6x1013 gv/kg, inclusive.
[0010] As modalidades dos métodos e usos incluem administrar ao ser humano uma dose de vetor de rAAV entre cerca de 1x1010 a cerca de 1x1013 gv/kg, inclusive.
[0011] As modalidades dos métodos e usos incluem administrar ao ser humano uma dose de vetor de rAAV entre cerca de 1x1010 a cerca de 6x1012 gv/kg, inclusive.
[0012] As modalidades dos métodos e usos incluem administrar ao ser humano uma dose de vetor de rAAV entre cerca de 1x1010 a cerca de 5x1012 gv/kg, inclusive.
[0013] O método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a dose de vetor de rAAV administrada ao ser humano está entre cerca de 1x1011 a cerca de 1x1012 gv/kg, inclusive.
[0014] As modalidades dos métodos e usos incluem administrar ao ser humano uma dose de vetor de rAAV entre cerca de 2x1011 a cerca de 9x1011 gv/kg, inclusive.
[0015] As modalidades dos métodos e usos incluem administrar ao ser humano uma dose de vetor de rAAV entre cerca de 3x1011 a cerca de 8x1012 gv/kg, inclusive.
[0016] 12. O método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a dose de vetor de rAAV administrada ao ser humano está entre cerca de 3x1011 a cerca de 7x1012 gv/kg, inclusive.
[0017] As modalidades dos métodos e usos incluem administrar ao ser humano uma dose de vetor de rAAV entre cerca de 3x1011 a cerca de 6x1012 gv/kg, inclusive.
[0018] As modalidades dos métodos e usos incluem administrar ao ser humano uma dose de vetor de rAAV entre cerca de 4x1011 a cerca de 6x1012 gv/kg, inclusive.
[0019] As modalidades dos métodos e usos incluem administrar ao ser humano uma dose de vetor de rAAV entre cerca de 5x1011 gv/kg ou cerca de 1x1012 gv/kg.
[0020] As modalidades dos métodos e usos incluem fornecer uma quantidade de FVIII ou hFVIII-BDD maior que a esperada em seres humanos com base nos dados obtidos de estudos com primatas não humanos administrados com o vetor de rAAV. As quantidades de FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, por exemplo, podem ser maiores que as previstas com base em uma curva de regressão linear derivada de estudos com primatas não humanos administrados com o vetor de rAAV.
[0021] Em determinadas modalidades, a quantidade de FVIII ou hFVIII- BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, é maior que a prevista com base nos dados obtidos de estudos com primatas não humanos administrados com o vetor de rAAV.
[0022] Em determinadas modalidades, a quantidade de FVIII ou hFVIII- BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, é 1 a 4 vezes maior que a expressão prevista com base em uma curva de regressão linear derivada de estudos com primatas não humanos administrados com o vetor de rAAV.
[0023] Em determinadas modalidades, a quantidade de FVIII ou hFVIII- BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, é 2 a 4 vezes maior que a prevista com base em uma curva de regressão linear derivada de estudos com primatas não humanos administrados com o vetor de rAAV.
[0024] Em determinadas modalidades, a quantidade de FVIII ou hFVIII- BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, é 2 a 3 vezes maior que a prevista com base em uma curva de regressão linear derivada de estudos com primatas não humanos administrados com o vetor de rAAV.
[0025] Em determinadas modalidades, a quantidade de FVIII ou hFVIII- BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, é 1 a 2 vezes maior que a prevista com base em uma curva de regressão linear derivada de estudos com primatas não humanos administrados com o vetor de rAAV.
[0026] Os primatas não humanos incluem o gênero da Macaca. Em uma modalidade particular, um primata não humano é um macaco cinomolgo (Macaca fascicularis).
[0027] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por um período de tempo que fornece um aprimoramento de curto, médio ou longo prazo na hemostasia. Em determinadas modalidades, o período de tempo é tal que nenhuma proteína de FVIII suplementar ou proteína de FVIII recombinante precise ser administrada ao ser humano a fim de manter a hemostasia.
[0028] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por pelo menos cerca de 14 dias após a administração do vetor de rAAV.
[0029] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por pelo menos cerca de 21 dias após a administração do vetor de rAAV.
[0030] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por pelo menos cerca de 28 dias após a administração do vetor de rAAV.
[0031] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por pelo menos cerca de 35 dias após a administração do vetor de rAAV.
[0032] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por pelo menos cerca de 42 dias após a administração do vetor de rAAV.
[0033] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por pelo menos cerca de 49 dias após a administração do vetor de rAAV.
[0034] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por pelo menos cerca de 56 dias após a administração do vetor de rAAV.
[0035] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por pelo menos cerca de 63 dias após a administração do vetor de rAAV.
[0036] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por pelo menos cerca de 70 dias após a administração do vetor de rAAV.
[0037] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por pelo menos cerca de 77 dias após a administração do vetor de rAAV.
[0038] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por pelo menos cerca de 84 dias após a administração do vetor de rAAV.
[0039] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por pelo menos cerca de 91 dias após a administração do vetor de rAAV.
[0040] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por pelo menos cerca de 98 dias após a administração do vetor de rAAV.
[0041] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por pelo menos cerca de 105 dias após a administração do vetor de rAAV.
[0042] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por pelo menos cerca de 112 dias após a administração do vetor de rAAV.
[0043] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por pelo menos cerca de 4 meses após a administração do vetor de rAAV.
[0044] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por pelo menos cerca de 154 dias.
[0045] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por pelo menos cerca de 210 dias.
[0046] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por pelo menos cerca de 6 meses após a administração do vetor de rAAV.
[0047] Em determinadas modalidades, o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso por pelo menos cerca de 12 meses após a administração do vetor de rAAV.
[0048] O FVIII ou hFVIII-BDD pode ser expresso em determinadas quantidades por um período de tempo após a administração do vetor de rAAV. Em determinadas modalidades, a quantidade é tal que exista FVIII ou hFVIII-BDD detectável ou uma quantidade de FVIII ou hFVIII-BDD que forneça um benefício terapêutico.
[0049] Em determinadas modalidades, a quantidade de FVIII ou hFVIII- BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, é cerca de 3% ou mais em 14 ou mais dias após a administração do vetor de rAAV, é cerca de 4% ou mais em 21 ou mais dias após a administração do vetor de rAAV, é cerca de 5% ou mais em 21 ou mais dias após a administração do vetor de rAAV, é cerca de 6% ou mais em 21 ou mais dias após a administração do vetor de rAAV, é cerca de 7% ou mais em 21 ou mais dias após a administração do vetor de rAAV, é cerca de 8% ou mais em 28 ou mais dias após a administração do vetor de rAAV, é cerca de 9% ou mais em 28 ou mais dias após a administração do vetor de rAAV, é cerca de 10% ou mais em 35 ou mais dias após a administração do vetor de rAAV, é cerca de 11% ou mais em 35 ou mais dias após a administração do vetor de rAAV, é cerca de 12% ou mais em 35 ou mais dias após a administração do vetor de rAAV.
[0050] Em determinadas modalidades, a quantidade de FVIII ou hFVIII- BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, tem uma média ao longo de um período contínuo de 14 dias de cerca de 10% ou mais.
[0051] Em determinadas modalidades, a quantidade de FVIII ou hFVIII- BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, tem uma média ao longo de um período contínuo de 4 semanas de cerca de 10% ou mais.
[0052] Em determinadas modalidades, a quantidade de FVIII ou hFVIII- BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, tem uma média ao longo de um período contínuo de 8 semanas de cerca de 10% ou mais.
[0053] Em determinadas modalidades, a quantidade de FVIII ou hFVIII- BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, tem uma média ao longo de um período contínuo de 12 semanas de cerca de 10% ou mais.
[0054] Em determinadas modalidades, a quantidade de FVIII ou hFVIII- BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, tem uma média ao longo de um período contínuo de 16 semanas de cerca de 10% ou mais.
[0055] Em determinadas modalidades, a quantidade de FVIII ou hFVIII- BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, tem uma média ao longo de um período contínuo de 6 meses de cerca de 10% ou mais.
[0056] Em determinadas modalidades, a quantidade de FVIII ou hFVIII- BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, tem uma média ao longo de um período continuo de 7 meses de cerca de 10% ou mais.
[0057] Em determinadas modalidades, a quantidade de FVIII ou hFVIII- BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, tem uma média ao longo de um período contínuo de 14 dias de cerca de 12% ou mais.
[0058] Em determinadas modalidades, a quantidade de FVIII ou hFVIII- BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, tem uma média de cerca de 12% a cerca de 100% por um período contínuo de 4 semanas, por um período contínuo de 8 semanas, por um período contínuo de 12 semanas, por um período contínuo de 16 semanas, por um período contínuo de 6 meses, por um período contínuo de 7 meses ou por um período contínuo de 1 ano.
[0059] Em determinadas modalidades, a quantidade de FVIII ou hFVIII- BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, tem uma média de cerca de 20% a cerca de 80% por um período contínuo de 4 semanas, por um período contínuo de 8 semanas, por um período contínuo de 12 semanas, por um período contínuo de 16 semanas, por um período contínuo de 6 meses, ou por um período contínuo de 1 ano.
[0060] A expressão de FVIII em estado estacionário também pode ser alcançada após um determinado período de tempo, por exemplo, 4 a 6, 6 a 8 ou 6 a 12 semanas ou mais, por exemplo, 6 a 12 meses ou até mesmo anos após a administração do vetor de rAAV.
[0061] Em determinadas modalidades, FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em um estado estacionário em que a atividade de FVIII não varia em mais do que 5 a 50% ao longo de 4, 6, 8 ou 12 semanas ou meses.
[0062] Em determinadas modalidades, FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em um estado estacionário em que a atividade de FVIII não varia em mais do que 25 a 100% ao longo de 4, 6, 8 ou 12 semanas ou meses.
[0063] O vetor de rAAV pode ser administrado em doses esperadas para fornecer a expressão de FVIII em determinadas quantidades e por determinados períodos de tempo para fornecer expressão sustentada após a administração.
[0064] Em determinadas modalidades, o vetor de rAAV é administrado em uma dose entre cerca de 1x109 a cerca de 1x1014 gv/kg inclusive ao ser humano, e FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano human em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
[0065] Em determinadas modalidades, o vetor de rAAV é administrado em uma dose entre cerca de 5x109 a cerca de 6x1013 gv/kg inclusive ao ser humano, e FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
[0066] Em determinadas modalidades, o vetor de rAAV é administrado em uma dose entre cerca de 1x1010 a cerca de 6x1013 gv/kg inclusive ao ser humano, e FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
[0067] Em determinadas modalidades, o vetor de rAAV é administrado em uma dose entre cerca de 1x1010 a cerca de 1x1013 gv/kg inclusive ao ser humano, e FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
[0068] Em determinadas modalidades, o vetor de rAAV é administrado em uma dose entre cerca de 1x1010 a cerca de 6x1012 gv/kg inclusive ao ser humano, e FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
[0069] Em determinadas modalidades, o vetor de rAAV é administrado em uma dose menor que 6x1012 gv/kg ao ser humano, e FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
[0070] Em determinadas modalidades, o vetor de rAAV é administrado em uma dose de cerca de 1x1010 a cerca de 5x1012 gv/kg, inclusive ao ser humano, e FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
[0071] Em determinadas modalidades, o vetor de rAAV é administrado em uma dose de cerca de 1x1011 a cerca de 1x1012 gv/kg, inclusive ao ser humano, e FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
[0072] Em determinadas modalidades, o vetor de rAAV é administrado em uma dose de cerca de 2x1011 a cerca de 9x1011 gv/kg, inclusive ao ser humano, e FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
[0073] Em determinadas modalidades, o vetor de rAAV é administrado em uma dose de cerca de 3x1011 a cerca de 8x1012 gv/kg, inclusive ao ser humano, e FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
[0074] Em determinadas modalidades, o vetor de rAAV é administrado em uma dose de cerca de 3x1011 a cerca de 7x1012 gv/kg, inclusive ao ser humano, e FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
[0075] Em determinadas modalidades, o vetor de rAAV é administrado em uma dose de cerca de 3x1011 a cerca de 6x1012 gv/kg, inclusive ao ser humano, e FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
[0076] Em determinadas modalidades, o vetor de rAAV é administrado em uma dose de cerca de 4x1011 a cerca de 6x1012 gv/kg, inclusive ao ser humano, e FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
[0077] Em determinadas modalidades, o vetor de rAAV é administrado em uma dose de cerca de 5x1011 gv/kg ou cerca de 1x1012 gv/kg e FVIII ou hFVIII- BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
[0078] Os seres humanos de acordo com os métodos e usos incluem aqueles que são soronegativos ou não têm anticorpos AAV detectáveis.
[0079] Em determinadas modalidades, os anticorpos AAV no ser humano não são detectados antes da administração do vetor de rAAV ou em que o dito ser humano é soronegativo para AAV.
[0080] Em determinadas modalidades, os anticorpos AAV contra o FVIII ou hFVIII-BDD não são detectados por pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou meses ou mais após a administração do vetor de rAAV.
[0081] Em determinadas modalidades, os anticorpos AAV contra o vetor de rAAV não são detectados por pelo menos cerca de 14 dias, ou por pelo menos cerca de 21 dias, ou por pelo menos cerca de 28 dias, ou por pelo menos cerca de 35 dias, ou por pelo menos cerca de 42 dias, ou por pelo menos cerca de 49 dias, ou por pelo menos cerca de 56 dias, ou por pelo menos cerca de 63 dias, ou por pelo menos cerca de 70 dias, ou por pelo menos cerca de 77 dias, ou por pelo menos cerca de 84 dias, ou por pelo menos cerca de 91 dias, ou por pelo menos cerca de 98 dias, ou por pelo menos cerca de 105 dias, ou por pelo menos cerca de 112 dias, após a administração do vetor de rAAV.
[0082] Os seres humanos de acordo com os métodos e usos incluem aqueles que têm anticorpos AAV detectáveis.
[0083] Em determinadas modalidades, os anticorpos AAV no ser humano estão em ou menos de cerca de 1:5 antes da administração do vetor de rAAV.
[0084] Em determinadas modalidades, os anticorpos AAV no ser humano estão em ou menos de cerca de 1:3 antes da administração do vetor de rAAV.
[0085] Em determinados métodos e usos, um ser humano administrado com o vetor de rAAV não produz uma resposta imune mediada por célula contra o vetor de rAAV.
[0086] Em determinadas modalidades, o ser humano administrado com o vetor de rAAV não produz uma resposta imune mediada por célula contra o vetor de rAAV por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
[0087] Em determinadas modalidades, o ser humano administrado com o vetor de rAAV não desenvolve uma resposta imune humoral contra o vetor de rAAV suficiente para diminuir ou bloquear o efeito terapêutico de FVIII ou hFVIII- BDD.
[0088] Em determinadas modalidades, o ser humano administrado com o vetor de rAAV não produz anticorpos detectáveis contra o vetor de rAAV por pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 meses após a administração do vetor de rAAV.
[0089] Em determinadas modalidades, o ser humano administrado com o vetor de rAAV não é administrado com um agente imunossupressivo antes, durante e/ou após a administração do vetor de rAAV.
[0090] Em determinadas modalidades, o ser humano administrado com o vetor de rAAV FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é alcançado sem administração de um agente imunossupressivo.
[0091] No caso de uma resposta pré-existente ou uma resposta imune que se desenvolve após a administração do vetor de rAAV, um ser humano pode ser administrado com um agente imunossupressivo antes ou após a administração do vetor de rAAV.
[0092] Em determinadas modalidades, um método ou uso inclui administração de um agente imunossupressivo antes da administração do vetor de rAAV.
[0093] Em determinadas modalidades, um método ou uso inclui administração de um agente imunossupressivo após a administração do vetor de rAAV.
[0094] Em determinadas modalidades, um agente imunossupressivo é administrado por um período de tempo dentro de 1 hora a até 45 dias após o vetor de rAAV ser administrado.
[0095] Em determinadas modalidades, um agente imunossupressivo compreende um esteroide, ciclosporina (por exemplo, ciclosporina A), micofenolato, Rituximabe ou um derivado dos mesmos.
[0096] Em determinadas modalidades, variantes de ácido nucleico têm 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou mais de identidade de sequência em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs:1-18. Em determinadas modalidades, as variantes de ácido nucleico têm 90 a 95% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs:1-18. Em determinadas modalidades, as variantes de ácido nucleico têm 95% a 100% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs:1-18.
[0097] Em determinadas modalidades, a variante de ácido nucleico que codifica FVIII ou hFVIII-BDD tem um teor de CpG reduzido em comparação com o ácido nucleico do tipo selvagem que codifica FVIII. Em determinadas modalidades, a variante de ácido nucleico tem pelo menos 20 menos CpGs do que o ácido nucleico do tipo selvagem que codifica FVIII (SEQ ID NO:19). Em determinadas modalidades, a variante de ácido nucleico tem não mais do que 10 CpGs, tem não mais do que 9 CpGs, tem não mais do que 8 CpGs, tem não mais do que 7 CpGs, tem não mais do que 6 CPGs, tem não mais do que 5 CpGs, tem não mais do que 4 CpGs; tem não mais do que 3 CpGs; tem não mais do que 2 CpGs; ou tem não mais do que 1 CpG. Em determinadas modalidades, a variante de ácido nucleico tem no máximo 4 CpGs; 3 CpGs; 2 CpGs; ou 1 CpG. Em determinadas modalidades, a variante de ácido nucleico não tem nenhum CpG.
[0098] Em determinadas modalidades, a variante de ácido nucleico que codifica FVIII ou hFVIII-BDD tem um teor de CpG reduzido em comparação com o ácido nucleico do tipo selvagem que codifica FVIII, e tais variantes de ácido nucleico de Cpg reduzido têm 90% ou mais de identidade de sequência em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs:1-18. Em determinadas modalidades, variantes de ácido nucleico de Cpg reduzido têm 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou mais de identidade de sequência em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs:1-18. Em determinadas modalidades, variantes de ácido nucleico de Cpg reduzido têm 90-95% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs:1-18. Em determinadas modalidades, variantes de ácido nucleico de Cpg reduzido têm 95% -100% de identidade de sequência em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs:1-18. Em determinadas modalidades, variantes de ácido nucleico com CpG reduzido que codificam FVIII são estabelecidas em qualquer uma das SEQ ID NOs:1-18.
[0099] Em determinadas modalidades, variantes de ácido nucleico que codificam proteína de FVIII ou hFVIII-BDD são pelo menos 75% idênticas ao ácido nucleico de FVIII humano do tipo selvagem ou ácido nucleico de FVIII humano do tipo selvagem que compreende uma deleção do domínio B. Em determinadas modalidades, variantes de ácido nucleico que codificam proteína de FVIII são cerca de 75 a 95% idênticas (por exemplo, cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% idênticas) ao ácido nucleico de FVIII humano do tipo selvagem ou ácido nucleico de FVIII humano do tipo selvagem que compreende uma deleção do domínio B.
[0100] Em determinadas modalidades, os ácidos nucleicos e variantes que codificam proteína de FVIII são mamíferos, como humanos. Esses ácidos nucleicos e variantes de ácido nucleico que codificam proteína de FVIII mamíferos incluem formas humanas, que podem ser baseadas em FVIII humano do tipo selvagem ou FVIII humano do tipo selvagem que compreende uma deleção do domínio B.
[0101] Em determinadas modalidades, um vetor do vírus adenoassociado recombinante (sAAV) compreende um vetor de AAV que compreende um sorotipo AAV ou um pseudotipo AAV, como AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 ou AAV-2i8 AAV. Em determinadas modalidades, um vetor de rAAV que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs:1-18, ou que compreende SEQ ID NO: 23 ou 24.
[0102] Em determinadas modalidades, um elemento de controle de expressão compreende um elemento de controle constitutivo ou regulável, ou um promotor ou elemento de controle de expressão tecido-específico. Em determinadas modalidades, um elemento de controle de expressão compreende um elemento que confere expressão no fígado. Em determinadas modalidades, um elemento de controle de expressão compreende um promotor de TTR ou promotor de TTR mutante, como SEQ ID NO:22. Em aspectos particulares adicionais, um elemento de controle de expressão compreende um promotor estabelecido nas publicações de PCT WO 2016/168728 (USSN 62/148.696; 62/202.133; e 62/212.634), que estão aqui incorporadas por referência em sua totalidade.
[0103] Em determinadas modalidades, um vetor de rAAV compreende um sorotipo de AAV ou um pseudotipo de AAV que compreende um sorotipo de capsídeo de AAV diferente de um sorotipo de ITR. Em modalidades adicionais, um vetor de rAAV compreende uma sequência de capsídeos VP1, VP2 e/ou VP3 que tem 75% ou mais de identidade de sequência (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, etc.) em relação a qualquer um dos sorotipos de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 ou AAV-2i8 AAV.
[0104] Em determinadas modalidades, um vetor de rAAV compreende uma sequência de capsídeos de VP1, VP2 e/ou VP3 que tem 75% ou mais de identidade de sequência (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, etc.) em relação a qualquer SEQ ID NO:27 ou SEQ ID NO:28. Em determinadas modalidades, um vetor de rAAV compreende um capsídeo de VP1, VP2 e/ou VP3 100% idêntico à SEQ ID NO:27 ou SEQ ID NO:28.
[0105] Em determinadas modalidades, um vetor de rAAV inclui ainda um íntron, um elemento de controle de expressão, uma ou mais repetições terminais invertidas de AAV (ITRs) (por exemplo, qualquer um de: sorotipos de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 ou AAV-2i8 AAV, ou uma combinação dos mesmos), uma sequência de polinucleotídeos de carga e/ou de sinal poli A.
[0106] Em determinadas modalidades, um íntron está dentro ou flanqueia um ácido nucleico ou variante de ácido nucleico que codifica FVIII ou hFVIII-BDD, e/ou um elemento de controle de expressão é ligado operacionalmente a um ácido nucleico ou variante de ácido nucleico que codifica FVIII ou hFVIII-BDD, e/ou uma ITR(s) de AAV flanqueia a terminação 5’ ou 3’ do ácido nucleico ou variante de ácido nucleico que codifica FVIII, e/ou uma sequência de polinucleotídeos de carga flanqueia a terminação 5’ ou 3’ de um ácido nucleico ou variante de ácido nucleico que codifica FVIII ou hFVIII-BDD.
[0107] Em modalidades particulares, um elemento de controle de expressão compreende um elemento de controle constitutivo ou regulável, ou um promotor ou elemento de controle de expressão tecido-específico. Em determinadas modalidades, um elemento de controle de expressão compreende um elemento que confere expressão no fígado (por exemplo, um promotor de TTR ou promotor de TTR mutante).
[0108] Em determinadas modalidades, um rAAV compreende uma composição farmacêutica. Tais composições farmacêuticas opcionalmente incluem AAV de capsídeo vazio (por exemplo, ausência de genoma vetorial que compreende ácido nucleico ou variante de ácido nucleico que codifica FVIII ou hFVIII-BDD).
[0109] Em determinadas modalidades, um ácido nucleico ou variante de ácido nucleico que codifica proteína de FVIII ou hFVIII-BDD, vetores, vetores de expressão ou vírus ou vetores de AAV são encapsulados em um lipossoma ou misturados com fosfolipídeos ou micelas.
[0110] Os métodos da invenção também incluem tratar indivíduos mamíferos (por exemplo, seres humanos) como seres humanos em necessidade de FVIII (o ser humano produz uma quantidade insuficiente proteína de FVIII, ou uma proteína de FVIII defeituosa ou anormal) ou que tem hemofilia A.
[0111] Em uma modalidade, um ser humano produz uma quantidade insuficiente de proteína de FVIII, ou uma proteína de FVIII defeituosa ou anormal. Em outra modalidade, um ser humano tem hemofilia A branda, moderada ou severa.
[0112] Em determinadas modalidades, FVIII ou hFVIII-BDD expresso por meio de um vetor de rAAV administrado é expresso em níveis com um efeito benéfico ou terapêutico no mamífero.
[0113] Os indivíduos candidatos (por exemplo, um paciente) e mamíferos (por exemplo, seres humanos) para administração (por exemplo, entrega) de um rAAV que compreende um ácido nucleico ou variante de ácido nucleico que codifica FVIII ou hFVIII-BDD incluem aqueles que têm ou aqueles com risco de ter um distúrbio como: hemofilia A, doenças de von Willebrand e sangramento associado a trauma, lesão, trombose, trombocitopenia, acidente vascular cerebral, coagulopatia, coagulação intravascular disseminada (DIC) ou distúrbio do tratamento por excesso de anticoagulação.
[0114] Os indivíduos candidatos (por exemplo, um paciente) e mamíferos (por exemplo, seres humanos) para administração (por exemplo, entrega) de um ácido nucleico ou variante de ácido nucleico que codifica FVIII incluem aqueles soronegativos para anticorpos AAV, bem como aqueles com (soropositivo) ou aqueles em risco de desenvolver anticorpos AAV. Esses indivíduos (por exemplo, um paciente) e mamíferos (por exemplo, seres humanos) podem ser soronegativos ou soropositivos para um sorotipo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV-Rh10 ou AAV-Rh74.
[0115] Em determinadas modalidades, o capsídeo vazio do sorotipo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV-12, AAV-Rh10 e/ou AAV-Rh74 é ainda administrado ao mamífero ou paciente sozinho ou em combinação com um vetor de rAAV que compreende um ácido nucleico ou variante de ácido nucleico que codifica FVIII.
[0116] Os métodos de administração (por exemplo, entrega) de acordo com a invenção incluem qualquer modo de contato ou entrega, ex vivo ou in vivo. Em modalidades particulares, a administração (por exemplo, entrega) é: intravenosa, intra-arterial, intramuscular, subcutânea, intracavitária, intubação ou via cateter.
[0117] Em determinadas modalidades, FVIII ou hFVIII-BDD é expressão em níveis sem aumentar substancialmente o risco de trombose.
[0118] Em determinadas modalidades, o risco de trombose é determinado pela medição de produtos de degradação de fibrina.
[0119] Em determinadas modalidades, a atividade do FVIII ou hFVIII- BDD é detectável pelo menos 1, 2, 3 ou 4 semanas, ou pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 meses, ou pelo menos 1 ano no ser humano.
[0120] Em determinadas modalidades, um ser humano é adicionalmente analisado ou monitorado para um ou mais dos seguintes: a presença ou quantidade de anticorpos AAV, uma resposta imune contra anticorpos AAV, FVIII ou hFVIII-BDD, uma resposta imune contra quantidades de FVIII ou hFVIII-BDD, FVIII ou hFVIII-BDD, atividade de FVIII ou hFVIII-BDD, quantidades ou níveis de uma ou mais enzimas hepáticas ou frequência, e/ou severidade ou duração de episódios hemorrágicos.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0121] A Figura 1 mostra projeto do estudo da NHP.
[0122] As Figuras 2A-2C mostram níveis de antígeno hFVIII em NHPs após administração intravenosa de 2×1012 (A), 5×1012 (B) ou 1×1013 gv/kg (C) de AAV-SPK-8005. As linhas representam animais individuais. Os níveis plasmáticos de FVIII humano foram analisados por ELISA e representam medições repetidas, obtidas por sangramento em série, no mesmo grupo de animais durante o curso do estudo (n = 2 a 3 animais por coorte). Os níveis de FVIII humano medidos em animais tratados com veículo são mostrados em quadrados abertos nos três gráficos. ε =Desenvolvimento de inibidores contra FVIII.
[0123] As Figuras 3A-3C mostram níveis de ALT em NHPs, a 21012 (A), 51012 (B) ou 11013 gv/kg (C) de AAV-SPK-8005.
[0124] As Figuras 4A-4C mostram níveis de D-dímero nas NHPs. Concentração de antígeno D-dímero no plasma de NHPs após administração intravenosa de 2×1012 (A), 5×1012 (B) ou 1×1013 gv/kg (C) de AAV-SPK-8005. A linha pontilhada indica 500 ng/ml, o limite superior do normal para dímeros D em humanos.
[0125] A Figura 5 mostra um resumo de dados de níveis de FVIII nas três doses de AAV-SPK-8005.
[0126] As Figuras 6A-6D mostram níveis de hFVIII no plasma de macacos cinomolgos após a administração intravenosa de 21012 (A), 61012 (B) ou
21013 (gv/kg) (C) de AAV-SPK-8011(capsídeo LK03)-hFVIII (estudo piloto). As linhas representam animais individuais. Os níveis plasmáticos de hFVIII foram analisados por ELISA e representam medições repetidas, obtidas por sangramento em série, no mesmo grupo de animais durante o curso do estudo (n=3 animais por coorte). Os níveis de FVIII humano medidos em animais tratados com veículo são mostrados em quadrados abertos (n=2). ε = Tempo em que o desenvolvimento de inibidores contra o FVIII foi detectado em cada animal.
[0127] A Figura 7 mostra níveis de expressão de FVIII humano em macacos cinomolgos após administração de SPK-8011. Estudo piloto (quadrados) e estudo BPL (círculos).
[0128] A Figura 8 mostra uma comparação dos níveis de FVIII alcançados com AAV-SPK-8011 (capsídeo LK03)-hFVIII com os níveis relatados de FVIII entregues por meio de vetores AAV com capsídeos AAV5 e AAV8. http://www.biomarin.com/pdf/BioMarin_R&D_Day_4_20_2016.pdf, slide 16. AAV8: McIntosh J et al. Blood 2013; 121 (17): 3335-44.
[0129] A Figura 9 mostra a biodistribuição de tecidos de AAV-SPK (SEQ ID NO:28) e AAV-LK03 (SEQ ID NO:27) em primatas não humanos, predominantemente no rim, baço e fígado (3ª barra para cada tecido).
[0130] A Figura 10 mostra expressão hepática e esplênica de FVIII após administração sistêmica de AAV-SPK-8005 em camundongos.
[0131] A Figura 11 mostra a eficiência de transdução do capsídeo AAV-LK03 analisado in vitro. Eixo geométrico X, cinomolgo (barra vertical esquerda), humano (barra vertical direita).
[0132] A Figura 12 mostra que os níveis de expressão de FVIII humano em macacos cinomolgos após a administração de SPK-8011 seguem uma resposta linear à dose. Os painéis A e B mostram doses de SPK-8011 em escala linear, enquanto os painéis C e D usam um eixo geométrico X logarítmico.
[0133] A Figura 13 mostra a análise da regressão linear usando dados apenas das coortes de doses baixas e médias. Os painéis A e B mostram doses de
SPK-8011 em escala linear, enquanto os painéis C e D usam um eixo geométrico X logarítmico.
[0134] A Figura 14 mostra a atividade de FVIII em 3 indivíduos humanos infundidos com o vetor AAV-LK03 (FVIII). Os indivíduos 1 e 2 (diamante, círculo) foram infundidos com 5x1011 gv/kg do vetor AAV-LK03 (FVIII). O indivíduo 3 (triângulo) foi infundido com 1x1012 gv/kg do vetor AAV-LK03 (FVIII).
[0135] A Figura 15 mostra a expressão estendida da atividade do FVIII em níveis terapêuticos nos mesmos indivíduos humanos (Indivíduos 1 e 2, Figura 14) infundidos com o vetor AAV-LK03 (FVIII). Os indivíduos 1 e 2 (círculo, quadrado) foram infundidos com 5x1011 gv/kg do vetor AAV-LK03 (FVIII).
[0136] A Figura 16 mostra 10 indivíduos humanos (indivíduos 1-10) exibindo níveis terapêuticos de FVIII. O indivíduo 1 infundiu FVIII após extração dentária de emergência na semana 6 após a infusão. O FVIII registrou pouco depois 19% do nível de atividade; excluídos deste gráfico devido à proximidade da infusão de FVIII. A atividade de FVIII refere-se a valores de FVIII: C de laboratórios locais.
[0137] A Figura 17 mostra níveis terapêuticos de FVIII no Indivíduo 1 infundido com vetor AAV-LK03 (FVIII) 5x1011 gv/kg. O gráfico inferior mostra os resultados do ensaio do ponto imunossorvente ligado à enzima interferon-γ (ELISPOT) em relação à reação das células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) do indivíduo aos peptídeos do capsídeo do AAV (barra sólida) e peptídeos do FVIII (círculo aberto). Os resultados são mostrados como o número de unidades formadoras de pontos (SFU) por 1 milhão de PBMCs; valores acima de 50 SFU ou acima do controle médio (linha pontilhada) por um fator de três são considerados positivos.
[0138] A Figura 18 mostra níveis terapêuticos de FVIII no Indivíduo 2 com infusão de 5x1011 gv/kg do vetor AAV-LK03 (FVIII). O gráfico inferior mostra os resultados do ensaio ELISPOT do interferon-γ em relação à reação dos PBMCs do indivíduo aos peptídeos de capsídeo do AAV (barra sólida) e peptídeos do FVIII (círculo aberto). Os resultados são mostrados como o número de SFU por 1 milhão de PBMCs; valores acima de 50 SFU ou acima do controle médio (linha pontilhada) por um fator de três são considerados positivos.
[0139] A Figura 19 mostra níveis terapêuticos de FVIII no Indivíduo 3, infundidos com 1x1012 gv/kg do vetor AAV-LK03 (FVIII). O gráfico inferior mostra os resultados do ensaio ELISPOT do interferon-γ em relação à reação dos PBMCs do indivíduo aos peptídeos de capsídeo do AAV (barra sólida) e peptídeos do FVIII (círculo aberto). Os resultados são mostrados como o número de SFU por 1 milhão de PBMCs; valores acima de 50 SFU ou acima do controle médio (linha pontilhada) por um fator de três são considerados positivos.
[0140] A Figura 20 mostra níveis terapêuticos de FVIII no Indivíduo 4 infundidos com 1x1012 gv/kg do vetor AAV-LK03 (FVIII). O gráfico inferior mostra os resultados do ensaio ELISPOT do interferon-γ em relação à reação dos PBMCs do indivíduo aos peptídeos de capsídeo do AAV (barra sólida) e peptídeos do FVIII (círculo aberto). Os resultados são mostrados como o número de SFU por 1 milhão de PBMCs; valores acima de 50 SFU ou acima do controle médio (linha pontilhada) por um fator de três são considerados positivos.
[0141] A Figura 21 mostra níveis terapêuticos de FVIII no Indivíduo 5, infundidos com 2×1012 gv/kg do vetor A10-LK03 (FVIII). O gráfico inferior mostra os resultados do ensaio ELISPOT do interferon-γ em relação à reação dos PBMCs do indivíduo aos peptídeos de capsídeo do AAV (barra sólida) e peptídeos do FVIII (círculo aberto). Os resultados são mostrados como o número de SFU por 1 milhão de PBMCs; valores acima de 50 SFU ou acima do controle médio (linha pontilhada) por um fator de três são considerados positivos.
[0142] A Figura 22 mostra níveis terapêuticos de FVIII no Indivíduo 6, infundidos com 1x1012 gv/kg do vetor AAV-LK03 (FVIII). O gráfico inferior mostra os resultados do ensaio ELISPOT do interferon-γ em relação à reação dos PBMCs do indivíduo aos peptídeos de capsídeo do AAV (barra sólida) e peptídeos do FVIII (círculo aberto). Os resultados são mostrados como o número de SFU por 1 milhão de PBMCs; valores acima de 50 SFU ou acima do controle médio (linha pontilhada) por um fator de três são considerados positivos.
[0143] A Figura 23 mostra níveis terapêuticos de FVIII no Indivíduo 7, infundidos com 2×1012 gv/kg do vetor AAV-LK03 (FVIII). O gráfico inferior mostra os resultados do ensaio ELISPOT do interferon-γ em relação à reação dos PBMCs do indivíduo aos peptídeos de capsídeo do AAV (barra sólida) e peptídeos do FVIII (círculo aberto). Os resultados são mostrados como o número de SFU por 1 milhão de PBMCs; valores acima de 50 SFU ou acima do controle médio (linha pontilhada) por um fator de três são considerados positivos.
[0144] A Figura 24 mostra níveis terapêuticos de FVIII no Indivíduo 8, infundido com 2x1012 gv/kg do vetor A10-LK03 (FVIII) de. O gráfico inferior mostra os resultados do ensaio ELISPOT do interferon-γ em relação à reação dos PBMCs do indivíduo aos peptídeos de capsídeo do AAV (barra sólida) e peptídeos do FVIII (círculo aberto). Os resultados são mostrados como o número de SFU por 1 milhão de PBMCs; valores acima de 50 SFU ou acima do controle médio (linha pontilhada) por um fator de três são considerados positivos.
[0145] A Figura 25 mostra níveis terapêuticos de FVIII no Indivíduo 9, infundidos com 2×1012 gv/kg do vetor A10-LK03 (FVIII). O gráfico inferior mostra os resultados do ensaio ELISPOT do interferon-γ em relação à reação dos PBMCs do indivíduo aos peptídeos de capsídeo do AAV (barra sólida) e peptídeos do FVIII (círculo aberto). Os resultados são mostrados como o número de SFU por 1 milhão de PBMCs; valores acima de 50 SFU ou acima do controle médio (linha pontilhada) por um fator de três são considerados positivos.
[0146] A Figura 26 mostra níveis terapêuticos de FVIII no Indivíduo 10 infundido com AAV-LK03 (FVIII) do vetor de 2x1012 gv/kg. O gráfico inferior mostra os resultados do ensaio ELISPOT do interferon-γ em relação à reação dos PBMCs do indivíduo aos peptídeos de capsídeo do AAV (barra sólida) e peptídeos do FVIII (círculo aberto). Os resultados são mostrados como o número de SFU por 1 milhão de PBMCs; valores acima de 50 SFU ou acima do controle médio (linha pontilhada) por um fator de três são considerados positivos.
[0147] A Figura 27 mostra níveis terapêuticos de FVIII no Indivíduo 11, 12 infundido com 2x10 gv/kg do vetor A10-LK03 (FVIII). O gráfico inferior mostra os resultados do ensaio ELISPOT do interferon-γ em relação à reação dos PBMCs do indivíduo aos peptídeos de capsídeo do AAV (barra sólida) e peptídeos do FVIII (círculo aberto). Os resultados são mostrados como o número de SFU por 1 milhão de PBMCs; valores acima de 50 SFU ou acima do controle médio (linha pontilhada) por um fator de três são considerados positivos.
[0148] A Figura 28 mostra níveis terapêuticos de FVIII no Indivíduo 12 12 infundido com 2x10 gv/kg do vetor AAV-LK03 (FVIII). O gráfico inferior mostra os resultados do ensaio ELISPOT do interferon-γ em relação à reação dos PBMCs do indivíduo aos peptídeos de capsídeo do AAV (barra sólida) e peptídeos do FVIII (círculo aberto). Os resultados são mostrados como o número de SFU por 1 milhão de PBMCs; valores acima de 50 SFU ou acima do controle médio (linha pontilhada) por um fator de três são considerados positivos.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0149] São aqui divulgados métodos de tratamento de um ser humano com hemofilia A ou com necessidade do Fator VIII (FVIII). Tais métodos podem ser alcançados usando os vetores de rAAV com um genoma compreendendo ácido nucleico ou variantes de ácido nucleico que codificam FVIII ou hFVIII-BDD, que pode ser expresso em células e/ou seres humanos, que por sua vez podem fornecer aumento dos níveis da proteína FVIII ou hFVIII-BDD in vivo. Exemplos de variantes de ácido nucleico que codificam FVIII ou hFVIII-BDD podem ter CpGs reduzidas em comparação com um FVIII ou hFVIII-BDD mamífero de tipo selvagem de referência (por exemplo, humano) e/ou menos de 100% de identidade de sequência em relação a um FVIII ou hFVIII-BDD mamífero do tipo selvagem de referência (por exemplo, humano). Esses métodos também podem ser alcançados pela administração de uma quantidade de dose de vetor de rAAV menor que 6x10 12 genomas vetoriais por quilograma de vrAAV (gv/kg). Os vetores de rAAV administrados em quantidades de doses inferiores a 6x10 12 genomas vetoriais por quilograma de vrAAV (gv/kg) podem compreender um genoma vetorial que compreende um ácido nucleico ou uma variante do ácido nucleico que codifica FVIII ou hFVIII-BDD.3.
[0150] Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico" são usados aqui de forma intercambiável para se referir a todas as formas de ácido nucleico, oligonucleotídeos, incluindo ácido desoxirribidonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). Os polinucleotídeos incluem DNA genômico, cDNA e DNA antissenso, e mRNA spliced ou sem splicing, tRNA de rRNA e DNA ou RNA inibidor (RNAi, por exemplo, (sh)RNA em gancho de cabelo pequeno ou curto, microRNA (miRNA), (si)RNA interferente pequeno ou curto, RNA trans-splicing ou RNA antissenso). Os polinucleotídeos incluem polinucleotídeos de ocorrência natural, sintéticos e intencionalmente modificados ou alterados (por exemplo, variante de ácido nucleico). Os polinucleotídeos podem ser únicos, duplos, triplex, lineares ou circulares e podem ter qualquer comprimento. Ao discutir polinucleotídeos, uma sequência ou estrutura de um polinucleotídeo específico pode ser aqui descrita de acordo com a convenção de fornecer a sequência na direção 5' para 3'.
[0151] Como usado aqui, os termos "modificar" ou "variante" e variações gramaticais dos mesmos, significam que um ácido nucleico, polipeptídeo ou subsequência dos mesmos se desvia de uma sequência de referência. Sequências modificadas e variantes podem, portanto, ter substancialmente a mesma, maior ou menor expressão, atividade ou função que uma sequência de referência, mas, pelo menos, retêm atividade ou função parcial da sequência de referência. Um exemplo particular de modificação ou variante é uma variante de ácido nucleico reduzida em CpG que codifica FVIII.
[0152] Uma variante de "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo" refere-se a uma sequência modificada que foi geneticamente alterada em comparação com o tipo selvagem. A sequência pode ser modificada geneticamente sem alterar a sequência da proteína codificada. Alternativamente, a sequência pode ser geneticamente modificada para codificar uma proteína variante. Uma variante de ácido nucleico ou polinucleotídeo também pode se referir a uma sequência de combinação que foi modificada por códon para codificar uma proteína que ainda retém pelo menos uma identidade de sequência parcial em relação a uma sequência de referência, como a sequência de proteínas de tipo selvagem, e também foi modificada por códon para codificar uma proteína variante. Por exemplo, alguns códons dessa variante de ácido nucleico serão alterados sem alterar os aminoácidos da proteína (FVIII) codificada por esse meio, e alguns códons da variante de ácido nucleico serão alterados, o que, por sua vez, altera os aminoácidos da proteína (FVIII) codificada desse modo.
[0153] O termo "Fator VIII (FVIII) variante" refere-se a um FVIII modificado que foi geneticamente alterado em comparação com o FVIII de tipo selvagem não modificado (por exemplo, SEQ ID NO: 19) ou FVIII-BDD. Essa variante pode ser referida como uma "variante de ácido nucleico que codifica o Fator VIII (FVIII)". Um exemplo particular de uma variante é um ácido nucleico reduzido em CpG que codifica a proteína FVIII ou FVIII-BDD. O termo "variante" não precisa aparecer em cada instância de uma referência feita ao ácido nucleico reduzido em CpG que codifica FVIII. Da mesma forma, o termo "ácido nucleico reduzido em CpG" ou semelhante pode omitir o termo "variante", mas pretende-se que a referência a "ácido nucleico reduzido em CpG" inclua variantes no nível genético.
[0154] Os construtos de FVIII e hFVIII-BDD com teor de CpG reduzido podem exibir melhorias em comparação com o FVIII ou FVIII-BDD de tipo selvagem no qual o teor de CpG não foi reduzido e o fazem sem modificações no ácido nucleico que resultam em alterações de aminoácidos à proteína FVIII ou FVIII-BDD codificada. Ao comparar a expressão, se o ácido nucleico com CpG reduzido codifica uma proteína FVIII que retém o domínio B, é apropriado compará-lo à expressão do FVIII do tipo selvagem; e se o ácido nucleico de CpG reduzido codifica uma proteína FVIII sem um domínio B, ele é comparado à expressão do FVIII do tipo selvagem que também possui uma deleção do domínio B.
[0155] Uma "variante Fator VIII (FVIII)" também pode significar uma proteína FVIII modificada, de modo que a proteína modificada tenha uma alteração de aminoácidos em comparação com o FVIII de tipo selvagem. Novamente, ao comparar a atividade e/ou a estabilidade, se a proteína FVIII variante codificada reter o domínio B, é apropriado compará-la ao FVIII do tipo selvagem; e se a proteína FVIII variante codificada tiver uma deleção do domínio B, ela será comparada com o FVIII do tipo selvagem que também possui uma deleção do domínio B.
[0156] Um FVIII variante pode incluir uma porção do domínio B. Assim, o FVIII-BDD inclui uma porção do domínio B. Normalmente, no FVIII-BDD, a maior parte do domínio B é deletada.
[0157] Um FVIII variante pode incluir uma sequência "SQ" estabelecida como SFSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO: 29). Normalmente, essa variante FVIII com um SQ (FVIII/SQ) tem um BDD, por exemplo, pelo menos toda ou parte do BD é excluída. O FVIII variante, como FVIII-BDD, pode ter toda ou parte da sequência "SQ", isto é, tudo ou parte da SEQ ID NO: 29. Assim, por exemplo, um FVIII-BDD variante com uma sequência SQ (SFSQNPPVLKRHQR, SEQ ID NO: 29) pode ter toda ou apenas uma porção da sequência de aminoácidos SFSQNPPVLKRHQR. Por exemplo, o FVIII-BDD pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 resíduos de aminoácidos de SFSQNPPVLKRHQR incluídos. Assim, SFSQNPPVLKRHQR com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 deleções internas, bem como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 deleções de aminoácidos carboxi-terminais estão incluídas nas proteínas de FVIII variante aqui estabelecidas.
[0158] Os "polipeptídeos", "proteínas" e "peptídeos" codificados pelas sequências de "ácidos nucleicos" ou de "polinucleotídeos", incluem sequências nativas de comprimento total (FVIII), como ocorre com proteínas do tipo selvagem que ocorrem naturalmente, como subsequências funcionais, formas modificadas ou variantes de sequência, desde que a subsequência, forma ou variante modificada retenha algum grau de funcionalidade da proteína nativa de comprimento total. Por exemplo, um ácido nucleico reduzido em CpG que codifique a proteína FVIII ou hFVIII-BDD pode ter uma deleção do domínio B, conforme estabelecido aqui, e reter a função de coagulação. Nos métodos e usos da invenção, esses polipeptídeos, proteínas e peptídeos codificados por sequências de ácidos nucleicos podem ser, mas não são, idênticos à proteína endógena defeituosa, ou cuja expressão é insuficiente ou deficiente no mamífero tratado.
[0159] Exemplos não limitativos de modificações incluem uma ou mais substituições de nucleotídeos ou aminoácidos (por exemplo, 1-3, 3-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, por exemplo 30-40, 40-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-500, 500-750, 750-850 ou mais nucleotídeos ou resíduos). Um exemplo de modificação de ácido nucleico é a redução de CpG. Em determinadas modalidades, um ácido nucleico reduzido em CpG que codifica FVIII, como a proteína FVIII humana, tem 10 ou menos CpGs em comparação com a sequência do tipo selvagem que codifica o Fator FVIII humano; 5 ou menos CpGs em comparação com a sequência do tipo selvagem que codifica o Fator FVIII humano; ou não mais do que 5 CpGs no ácido nucleico reduzido em CpG que codifica o FVIII.
[0160] Um exemplo de uma modificação de aminoácido é uma substituição conservadora de aminoácidos ou uma deleção (por exemplo, subsequências ou fragmentos) de uma sequência de referência, por exemplo, FVIII, como FVIII com uma deleção no domínio B. Em particular, uma sequência modificada ou variante retém pelo menos parte de uma função ou atividade de sequência não modificada.
[0161] Todas as formas de proteínas codificantes de ácido nucleico de mamíferos e não mamíferos, incluindo outras formas mamíferas do ácido nucleico reduzido em CpG que codifica FVIII e hFVIII-BDD aqui divulgadas são expressamente incluídas, conhecidas ou desconhecidas. Assim, a invenção inclui genes e proteínas de não mamíferos, mamíferos que não humanos e seres humanos, cujos genes e proteínas funcionam de maneira substancialmente semelhante aos genes e proteínas do FVIII (por exemplo, humanos) aqui descritos.
[0162] O termo "vetor" refere-se a uma pequena molécula de ácido nucleico carreadora, um plasmídeo, vírus (por exemplo, vetor AAV) ou outro veículo que pode ser manipulado por inserção ou incorporação de um ácido nucleico. Esses vetores podem ser usados para manipulação genética (isto é, “vetores de clonagem”), para introduzir/transferir polinucleotídeos para as células e para transcrever ou traduzir o polinucleotídeo inserido nas células. Um "vetor de expressão" é um vetor especializado que contém um gene ou sequência de ácidos nucleicos com as regiões reguladoras necessárias para a expressão em uma célula hospedeira. Uma sequência de ácidos nucleicos de vetor geralmente contém pelo menos uma origem de replicação para propagação em uma célula e opcionalmente elementos adicionais, como uma sequência polinucleotídica heteróloga, elemento de controle de expressão (por exemplo, um promotor, intensificador), entrada, ITR(s), marcador selecionável (por exemplo, resistência a antibióticos), sinal de poliadenilação.
[0163] Um vetor viral é derivado de ou com base em um ou mais elementos ácido nucleico que compreendem um genoma viral. Os vetores virais particulares incluem vetores de lentivírus, lentivírus pseudo-tipados e parvovírus, como vetores de vírus adeno-associado (AAV).
[0164] O termo "recombinante", como um modificador de vetor, como vetores virais recombinantes, por exemplo, vetores de lentivírus ou parvovírus (por exemplo, AAV), bem como um modificador de sequências, como polinucleotídeos e polipeptídeos recombinantes, significa que as composições foram manipuladas (isto é, manipuladas) de uma maneira que geralmente não ocorre na natureza. Um exemplo particular de um vetor recombinante, como um vetor AAV, seria onde um polinucleotídeo que não está normalmente presente no genoma viral do tipo selvagem (por exemplo, AAV) é inserido no genoma viral. Um exemplo de um polinucleotídeo recombinante seria o local onde um ácido nucleico reduzido em CpG que codifica uma proteína FVIII ou hFVIII-BDD é clonado em um vetor, com ou sem regiões 5', 3' e/ou íntron que o gene normalmente está associado ao vírus (por exemplo, AAV) genoma. Embora o termo "recombinante" nem sempre seja usado aqui em referência a vetores, como vetores virais e AAV, bem como sequências como polinucleotídeos, formas recombinantes incluindo polinucleotídeos, são expressamente incluídas apesar de qualquer omissão.
[0165] Um "vetor" ou "vetor AAV" viral recombinante é derivado do genoma do tipo selvagem de um vírus, como o AAV, usando métodos moleculares para remover o genoma do tipo selvagem do vírus (por exemplo, AAV) e substituindo por um ácido nucleico não nativo, como um ácido nucleico reduzido em
CpG que codifica FVIII. Tipicamente, para o AAV, uma ou ambas as sequências de repetição terminal invertida (ITR) do genoma do AAV são retidas no vetor AAV. Um vetor viral "recombinante" (por exemplo, AAV) é diferenciado de um genoma viral (por exemplo, AAV), já que toda ou parte do genoma viral foi substituída por uma sequência não nativa em relação ao viral (por exemplo, AAV) ácido nucleico genômico, como um ácido nucleico reduzido em CpG que codifica FVIII ou hFVIII- BDD. A incorporação de uma sequência não nativa define, portanto, o vetor viral (por exemplo, AAV) como um vetor "recombinante", que no caso do AAV pode ser chamado de "vetor de rAAV".
[0166] Uma sequência de vetor recombinante (por exemplo, lentivírus, parvovírus, AAV) pode ser empacotada - aqui referida como uma "partícula" para infecção subsequente (transdução) de uma célula, ex vivo, in vitro ou in vivo. Quando uma sequência de vetor recombinante é encapsidada ou empacotada em uma partícula de AAV, a partícula também pode ser chamada de "rAAV". Essas partículas incluem proteínas que encapsidam ou empacotam o genoma vetorial. Exemplos particulares incluem proteínas do envelope viral e, no caso do AAV, proteínas capsídicas.
[0167] Um vetor "genoma" refere-se à porção da sequência do plasmídeo recombinante que é finalmente empacotada ou encapsidada para formar uma partícula viral (por exemplo, AAV). Nos casos em que plasmídeos recombinantes são usados para construir ou fabricar vetores recombinantes, o genoma vetorial não inclui a porção do "plasmídeo" que não corresponde ao genoma vetorial sequência do plasmídeo recombinante. Essa porção não genoma vetorial do plasmídeo recombinante é referida como "esqueleto plasmídico", importante para a clonagem e amplificação do plasmídeo, um processo necessário para a propagação e produção de vírus recombinantes, mas que não é empacotado ou encapsulado nas partículas de vírus (por exemplo, AAV). Assim, um vetor "genoma" refere-se ácido nucleico que é empacotado ou encapsidado pelo vírus (por exemplo, AAV).
[0168] Um "transgene" é usado aqui para se referir convenientemente a um ácido nucleico que se destina ou foi introduzido em uma célula ou organismo. Os transgenes incluem qualquer ácido nucleico, como um gene que codifica um polipeptídeo ou proteína (por exemplo, um ácido nucleico reduzido em CpG que codifica FVIII ou hFVIII-BDD).
[0169] Em uma célula que possui um transgene, o transgene foi introduzido/transferido por meio de vetor, como AAV, "transdução" ou "transfecção" da célula. Os termos "transduzir" e "transfectar" se referem à introdução de uma molécula como um ácido nucleico em uma célula ou organismo hospedeiro. O transgene pode não estar integrado no ácido nucleico genômico da célula receptora. Se um ácido nucleico introduzido se integrar ao ácido nucleico (DNA genômico) da célula ou organismo receptor, ele pode ser mantido de forma estável nessa célula ou organismo e posteriormente transmitido para ou herdado pelas células descendentes ou organismos da célula ou organismo receptor. Finalmente, o ácido nucleico introduzido pode existir na célula receptora ou no organismo hospedeiro extracromossômica, ou apenas transitoriamente.
[0170] Uma "célula transduzida" é uma célula na qual o transgene foi introduzido. Por conseguinte, uma célula "transduzida" (por exemplo, em um mamífero, como uma célula ou tecido ou célula de órgão), significa uma alteração genética em uma célula após a incorporação de uma molécula exógena, por exemplo, um ácido nucleico (por exemplo, um transgene) na célula. Assim, uma célula "transduzida" é uma célula na qual, ou uma descendência dela, na qual um ácido nucleico exógeno foi introduzido. As células podem ser propagadas e a proteína introduzida expressa, ou ácido nucleico transcrito. Para usos e métodos de terapia genética, uma célula transduzida pode estar em um indivíduo.
[0171] Um "elemento de controle de expressão" refere-se a sequência (s) de ácidos nucleicos que influenciam a expressão de um ácido nucleico operacionalmente ligado. Elementos de controle, incluindo o elemento de controle de expressores, conforme estabelecido neste documento, como promotores e aprimoradores, Sequências de vetores incluindo vetores AAV podem incluir um ou mais "elemento de controle de expressores". Normalmente, esses elementos são incluídos para facilitar a transcrição adequada de polinucleotídeos heterólogos e se tradução apropriada (por exemplo, um promotor, intensificador, sinal de junção para íntrons, manutenção da estrutura de leitura correta do gene para permitir a tradução dentro da estrutura do mRNA e, para os códons, etc.). Esses elementos normalmente agem em cis, chamado de "efeito cis", mas também podem atuar em trans.
[0172] O controle de expressão pode estar no nível de transcrição, tradução, emenda, estabilidade de mensagens, etc. Normalmente, um elemento de controle de expressão que modula a transcrição é justaposto perto da extremidade 5' (isto é, "a montante") de um ácido nucleico transcrito. Os elementos de controle de expressão também podem estar localizados na extremidade 3 '(isto é, "a jusante") da sequência transcrita ou dentro da transcrição (por exemplo, em um íntron). Os elementos de controle de expressão podem estar localizados adjacentes a ou a uma distância da sequência transcrita (por exemplo, 1-10, 10-25, 25-50, 50- 100, 100 a 500, ou mais nucleotídeos do polinucleotídeo), até a distâncias consideráveis. No entanto, devido às limitações de comprimento de certos vetores, como os vetores AAV, o elemento de controle de expressão normalmente estará entre 1 e 1000 nucleotídeos do ácido nucleico transcrito.
[0173] Funcionalmente, a expressão do ácido nucleico operacionalmente ligado é pelo menos parcialmente controlável pelo elemento (por exemplo, promotor), de modo que o elemento module a transcrição do ácido nucleico e, conforme apropriado, a tradução da transcrição. Um exemplo específico de um elemento de controle de expressão é um promotor, que geralmente está localizado a 5 'da sequência transcrita por exemplo, um ácido nucleico reduzido em CpG que codifica FVIII ou hFVIII-BDD. Um promotor normalmente aumenta uma quantidade expressa do ácido nucleico operacionalmente ligado em comparação com uma quantidade expressa quando não existe promotor.
[0174] Um "intensificador", como aqui utilizado, pode se referir a uma sequência que está localizada adjacente ao polinucleotídeo heterólogo. Os elementos intensificadores normalmente estão localizados a montante de um elemento promotor, mas também funcionam e podem estar localizados a jusante de uma sequência (por exemplo, um ácido nucleico reduzido em CpG que codifica FVIII ou hFVIII-BDD). Portanto, um elemento intensificador pode ser localizado 100 pares de bases, 200 pares de bases, ou 300 ou mais pares de bases a montante ou a jusante de um ácido nucleico reduzido em CpG que codifica FVIII. Os elementos potenciadores aumentam tipicamente expressos de um ácido nucleico operacionalmente ligado acima da expressão proporcionada por um elemento promotor.
[0175] Um construto de expressão pode compreender elementos reguladores que servem para direcionar a expressão em uma célula ou tipo de tecido específico. Os elementos de controle de expressão (por exemplo, promotores) incluem aqueles ativos em um tipo específico de tecido ou célula, referidos aqui como "elementos de controle de expressão de tecido aplicável/promotores". Os elementos de controle de expressão tecido-específicos são tipicamente ativos em célula ou tecido-específico (por exemplo, fígado). Os elementos de controle da expressão são tipicamente ativos em determinadas células, tecidos ou órgãos, porque são reconhecidos pelas proteínas ativadoras da transcrição ou por outros reguladores da transcrição, que são exclusivos de uma célula, tecido ou tipo de órgão específico. Esses elementos reguladores são conhecidos dos indivíduos versados na técnica (consulte, por exemplo, Sambrook et al. (1989) e Ausubel et al. (1992)).
[0176] A incorporação de elementos reguladores específicos de tecido nos construtos de expressão da invenção fornece, pelo menos, um tropismo tecidual parcial para a expressão de um ácido nucleico reduzido em CpG que codifica FVIII ou hFVIII-BDD. Exemplos de promotores que são ativos no fígado são o promotor TTR, promotor alfa 1-antitripsina humana (hAAT); albumina, Miyatake, et al. J. Virol., 71: 5124-32 (1997); promotor do núcleo do vírus da hepatite B, Sandig et al., Gene Ther. 3: 1002-9 (1996); alfa-fetoproteína (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene. Ther., 7: 1503-14 (1996)], entre outros. Um exemplo de um intensificador ativo no fígado é a apolipoproteína E (apoE) HCR-1 e HCR-2 (Allan et al., J. Biol. Chem., 272: 29113- 19 (1997)).
[0177] Os elementos de controle da expressão também incluem promotores/intensificadores ubíquos ou promíscuos que são capazes de direcionar a expressão de um polinucleotídeo em muitos tipos diferentes de células. Tais elementos incluem, entre outros, as sequências promotoras/intensificadoras imediatas de citomegalovírus (CMV), as sequências promotoras/intensificadoras do vírus Rous sarcoma virus (RSV) e outros promotores/intensificadores virais ativos em uma variedade de tipos de células de mamíferos, ou sintéticos elementos que não estão presentes na natureza (ver, por exemplo, Boshart et al., Cell, 41: 521-530 (1985)), o promotor SV40, o promotor dihidrofolato redutase, o promotor da β-actina citoplasmática e o promotor da fosfoglicerol cinase (PGK).
[0178] Os elementos de controle de expressão também podem conferir expressão de uma maneira que é regulável, isto é, um sinal ou estímulo aumenta ou diminui a expressão do polinucleotídeo heterólogo operacionalmente ligado. Um elemento regulável que aumenta a expressão do polinucleotídeo operacionalmente ligado em resposta a um sinal ou estímulos também é referido como um "elemento indutível" (isto é, é induzido por um sinal). Exemplos particulares incluem, mas não estão limitados a, um promotor induzível por hormônio (por exemplo, esteroide). Normalmente, uma quantidade de aumento ou diminuição conferida por esses elementos é proporcional a uma quantidade de sinal ou estímulos presentes; quanto maior a quantidade de sinal ou estímulos, maior o aumento ou a diminuição da expressão. Exemplos particulares não limitativos incluem o promotor de metalotionina (MT) de ovelha induzível por zinco; o promotor do vírus do tumor mamário do rato induzido por hormônio esteroide (MMTV); o sistema promotor da polimerase T7 (WO 98/10088); o sistema repressível para tetraciclina (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551 (1992)); o sistema indutível à tetraciclina (Gossen, et al., Science. 268: 1766-1769 (1995); ver também Harvey, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 512-518 (1998); o sistema induzível por RU486 (Wang, et al., Nat. Biotech. 15: 239-243 (1997) e Wang, et al., Gene Ther. 4: 432-441 (1997)]; e o sistema indutível por rapamicina (Magari, et al., J. Clin. Invest. 100: 2865-2872 (1997); Rivera, et al., Nat. Medicine. 2: 1028-1032 (1996)). Outros elementos de controle reguláveis que podem ser úteis neste contexto, são aqueles que são regulados por um estado fisiológico específico, por exemplo, temperatura, fase aguda, desenvolvimento.
[0179] Os elementos de controle da expressão também incluem os elementos nativos do polinucleotídeo heterólogo. Um elemento de controle nativo (por exemplo, promotor) pode ser usado quando se deseja que a expressão do polinucleotídeo heterólogo imite a expressão nativa. O elemento nativo pode ser utilizado quando a expressão do polinucleotídeo heterólogo deve ser regulada temporalmente ou no desenvolvimento, ou de uma maneira tecido-específica, ou em resposta a estímulos transcricionais específicos. Outros elementos de controle de expressão nativos, como íntrons, locais de poliadenilação ou seqüências de consenso de Kozak, também podem ser usados.
[0180] O termo "operacionalmente ligado" significa que as sequências reguladoras necessárias para a expressão de uma sequência de codificação são colocadas nas posições apropriadas em relação à sequência de codificação, a fim de efetuar a expressão da sequência de codificação. Essa mesma definição é às vezes aplicada ao arranjo de sequências de codificação e elementos de controle de transcrição (por exemplo, promotores, aprimoradores e elementos de terminação) em um vetor de expressão. Essa definição também é algumas vezes aplicada ao arranjo de sequências ácido nucleico de uma primeira e uma segunda molécula ácido nucleico, em que uma molécula ácido nucleico híbrida é gerada.
[0181] No exemplo de um elemento de controle de expressão em ligação operável com um ácido nucleico, a relação é tal que o elemento de controle modula a expressão de ácido nucleico. Mais especificamente, por exemplo, duas sequências de DNA operacionalmente ligadas significam que os dois DNAs estão dispostos (cis ou trans) em uma relação que pelo menos uma das seqüências de DNA é capaz de exercer um efeito fisiológico sobre a outra sequência.
[0182] Assim, elementos adicionais para vetores incluem, sem limitação, um elemento de controle de expressão (por exemplo, promotor/intensificador), um sinal de terminação de transcrição ou códon de parada, regiões não traduzidas 5' ou 3' (por exemplo, poliadenilação (poliA) sequências) que flanqueiam uma sequência, como uma ou mais cópias de uma sequência ITR de AAV ou um íntron.
[0183] Outros elementos incluem, por exemplo, sequências de polinucleotídeo de enchimento ou de enchimento, por exemplo, para melhorar a embalagem e reduzir a presença de ácido nucleico contaminante. Os vetores AAV normalmente aceitam inserções de DNA com uma faixa de tamanho que geralmente é de cerca de 4 kb a cerca de 5,2 kb, ou um pouco mais. Assim, para seqüências mais curtas, a inclusão de um stuffer ou filler para ajustar o comprimento para perto ou no tamanho normal da sequência genômica do vírus aceitável para a embalagem do vetor AAV na partícula do vírus. Em várias modalidades, uma sequência nucleotídica de enchimento/stuffer é um segmento não traduzido (codificação não proteica) do ácido nucleico. Para uma sequência de ácido nucleico inferior a 4,7 Kb, a sequência de preenchimento ou polinucleotídeo tem um comprimento que, quando combinada (por exemplo, inserida em um vetor), com a sequência tem um comprimento total entre cerca de 3,0 a 5,5 KB ou entre cerca de 4,0 a 5,0 Kb, ou entre 4,3 a 4,8 Kb.
[0184] Um íntron também pode funcionar como uma sequência polinucleotídica de carga ou de enchimento, a fim de obter um comprimento para o empacotamento do vetor AAV em uma partícula de vírus. Os íntrons e fragmentos de íntron que funcionam como uma sequência polinucleotídica de enchimento ou stuffer também podem melhorar a expressão.
[0185] A frase "distúrbio relacionado à hemostasia" refere-se a distúrbios hemorrágicos, como pacientes com hemofilia A, hemofilia A com anticorpos inibidores, deficiências nos fatores de coagulação, VII, VIII, IX e X, XI, V, XII, II, fator de von Willebrand , deficiência combinada de FV/FVIII, deficiência de vitamina K epóxido redutase C1, deficiência de gama-carboxilase; sangramento associado a trauma, lesão, trombose, trombocitopenia, acidente vascular cerebral, coagulopatia, coagulação intravascular disseminada (CID); sobre-anticoagulação associada a heparina, heparina de baixo peso molecular, pentassacarídeo, varfarina, antitrombóticos de pequenas moléculas (inibidores da FXa); e distúrbios plaquetários, como síndrome de Bernard Soulier, trombastastemia de Glanzman e deficiência de pool de armazenamento.
[0186] O termo "isolado", quando usado como um modificador de uma composição, significa que as composições são feitas pela mão do homem ou são separadas, completamente ou pelo menos em parte, do seu ambiente in vivo que ocorre naturalmente. Geralmente, as composições isoladas são substancialmente livres de um ou mais materiais com os quais normalmente se associam na natureza, por exemplo, uma ou mais proteínas, ácido nucleico, lipídeos, carboidratos, membrana celular.
[0187] Com referência a ácidos nucleicos da invenção, o termo "isolado" refere-se a uma molécula de ácido nucleico separada de uma ou mais sequências com as quais é imediatamente contígua (nas direções 5' e 3') no genoma de ocorrência natural (DNA genômico) do organismo de onde se origina. Por exemplo, o "ácido nucleico isolado" pode compreender uma molécula de DNA ou cDNA inserida em um vetor, como um vetor de plasmídeo ou vírus, ou integrada no DNA de um procarionte ou eucarionte.
[0188] No que diz respeito às moléculas de RNA da invenção, o termo "isolado" refere-se principalmente a uma molécula de RNA codificada por uma molécula de DNA isolada, como definido acima. Como alternativa, o termo pode se referir a uma molécula de RNA que tenha sido suficientemente separada das moléculas de RNA com as quais estaria associada em seu estado natural (isto é, nas células ou tecidos), de modo que exista na forma "substancialmente pura" (o termo "substancialmente puro" é definido abaixo).
[0189] Com relação à proteína, o termo "proteína isolada" ou "proteína isolada e purificada" é algumas vezes usado aqui. Este termo refere-se principalmente a uma proteína produzida pela expressão de uma molécula de ácido nucleico isolada. Alternativamente, este termo pode se referir a uma proteína que foi suficientemente separada de outras proteínas com as quais estaria naturalmente associada, de modo a existir na forma "substancialmente pura".
[0190] O termo "isolado" não exclui combinações produzidas pela mão do homem, por exemplo, uma sequência de vetor recombinante (por exemplo, rAAV), partícula de vírus que empacota ou encapsida um genoma vetorial e uma formulação farmacêutica. O termo "isolado" também não exclui formas físicas alternativas da composição, como híbridos/quimeras, multímeros/oligômeros, modificações (por exemplo, fosforilação, glicosilação, lipidação) ou formas derivatizadas, ou formas expressas em células hospedeiras produzidas pela mão do homem.
[0191] O termo "substancialmente puro" refere-se a uma preparação compreendendo pelo menos 50 a 60% em peso do composto de interesse (por exemplo, ácido nucleico, oligonucleotídeo, proteína, etc.). A preparação pode compreender pelo menos 75% em peso, ou cerca de 90 a 99% em peso, do composto de interesse. A pureza é medida por métodos apropriados para o composto de interesse (por exemplo, métodos cromatográficos, eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, análise por HPLC e similares).
[0192] A frase "consistindo essencialmente em" quando se refere a uma sequência nucleotídica particular ou sequência de aminoácidos significa uma sequência com as propriedades de uma dada SEQ ID NO. Por exemplo, quando usada em referência a uma sequência de aminoácidos, a frase inclui a sequência em si e modificações moleculares que não afetariam as características básicas e novas da sequência.
[0193] O termo "oligonucleotídeo", como aqui utilizado, refere-se a iniciadores e sondas, e é definido como uma molécula de ácido nucleico composta por dois ou mais ribossomos desoxirribonucleotídeos, como mais de três. O tamanho exato do oligonucleotídeo dependerá de vários fatores e da aplicação específica para a qual o oligonucleotídeo é usado.
[0194] O termo "sonda", conforme aqui utilizado, refere-se a um oligonucleotídeo, polinucleotídeo ou ácido nucleico, RNA ou DNA, que ocorre naturalmente como em uma digestão enzimática de restrição purificada ou produzido sinteticamente, que é capaz de emparelhar com ou especificamente hibridizar com um ácido nucleico com sequências complementares à sonda. Uma sonda pode ser de fita simples ou fita dupla. O comprimento exato da sonda dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, fonte da sonda e método de uso. Por exemplo, para aplicações de diagnóstico, dependendo da complexidade da sequência-alvo, a sonda oligonucleotídica normalmente contém 15 a 25 ou mais nucleotídeos, embora possa conter menos nucleotídeos.
[0195] As sondas no presente documento são selecionadas para serem "substancialmente" complementares a diferentes cadeias de uma determinada sequência-alvo de ácidos nucleicos. Isso significa que as sondas devem ser suficientemente complementares para poder "hibridar especificamente" ou recozer com suas respectivas fitas-alvo sob um conjunto de condições predeterminadas. Portanto, a sequência de sonda não precisa refletir a sequência complementar exata do alvo. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeo não complementar pode ser anexado à extremidade 5' ou 3' da sonda, com o restante da sequência da sonda sendo complementar à fita-alvo. Alternativamente, bases não complementares ou sequências mais longas podem ser intercaladas na sonda, desde que a sequência da sonda tenha complementaridade suficiente com a sequência do ácido nucleico alvo para recozer especificamente com a sonda.
[0196] O termo "hibridizar especificamente" refere-se à associação entre duas moléculas de ácido nucleico de cadeia simples de sequência suficientemente complementar para permitir tal hibridação sob condições pré- determinadas geralmente usadas na técnica (algumas vezes denominadas "substancialmente complementares"). Em particular, o termo refere-se à hibridação de um oligonucleotídeo com uma sequência substancialmente complementar contida em uma molécula de DNA ou RNA de fita simples da invenção, à deleção substancial de hibridação do oligonucleotídeo com ácido nucleico de fita simples de sequência não complementar.
[0197] O termo "iniciador", como aqui utilizado, refere-se a um oligonucleotídeo, RNA ou DNA, de fita simples ou dupla, derivado de um sistema biológico gerado pela digestão com enzimas de restrição ou produzido sinteticamente que, quando colocado no ambiente apropriado, é capaz de atuar funcionalmente como um iniciador da síntese ácido nucleico dependente do modelo. Quando apresentado com um modelo de ácido nucleico apropriado, precursores de nucleosídeo trifosfato adequados de ácidos nucleicos, uma enzima polimerase, cofatores adequados e condições como temperatura e pH adequados, o iniciador pode ser estendido em seu terminal 3' pela adição de nucleotídeos pela ação de uma polimerase ou atividade similar para produzir um produto de extensão do iniciador.
[0198] O iniciador pode variar em comprimento, dependendo das condições e requisitos particulares da aplicação. Por exemplo, em aplicações de diagnóstico, o iniciador oligonucleotídico tem tipicamente 15 a 25 ou mais nucleotídeos de comprimento. O iniciador deve ter complementaridade suficiente com o modelo desejado para iniciar a síntese do produto de extensão desejado, ou seja, para poder emparelhar com o fio modelo desejado de uma maneira suficiente para fornecer a fração hidroxila 3' do iniciador em justaposição apropriada para uso no início da síntese por uma polimerase ou enzima similar. Não é necessário que a sequência do iniciador represente um complemento exato do modelo desejado. Por exemplo, uma sequência nucleotídica não complementar pode ser ligada à extremidade 5' de um iniciador de outra forma complementar. Alternativamente, bases não complementares podem ser intercaladas no interior da sequência do oligonucleotídeo, desde que a sequência do iniciador tenha complementaridade suficiente com a sequência da fita modelo desejada para fornecer funcionalmente um complexo modelo-iniciador para a síntese do produto de extensão.
[0199] O termo “identidade”, “homologia” e suas variações gramaticais significam que duas ou mais entidades referenciadas são iguais, quando são sequências “alinhadas”. Assim, a título de exemplo, quando duas sequências polipeptídicas são idênticas, elas têm a mesma sequência de aminoácidos, pelo menos dentro da região ou porção referenciada. Onde duas sequências polinucleotídicas são idênticas, elas têm a mesma sequência polinucleotídica, pelo menos dentro da região ou porção referenciada. A identidade pode estar sobre uma área definida (região ou domínio) da sequência. Uma “área” ou “região” de identidade refere-se a uma parte de duas ou mais entidades referenciadas iguais. Assim, onde duas sequências de proteínas ou ácidos nucleicos são idênticas em uma ou mais áreas ou regiões de sequência, elas compartilham identidade dentro dessa região. Uma sequência "alinhada" refere-se a várias seqüências de polinucleotídeos ou proteínas (aminoácidos), geralmente contendo correções para bases ausentes ou adicionais ou aminoácidos (lacunas) em comparação com uma sequência de referência.
[0200] A identidade pode se estender por todo o comprimento ou uma parte da sequência. Em determinadas modalidades, o comprimento da sequência que compartilha a identidade percentual é 2, 3, 4, 5 ou mais ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos, por exemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc., ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos. Em modalidades adicionais, o comprimento da identidade de compartilhamento de sequência é 21 ou mais ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos, por exemplo, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, etc., ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos. Em outras modalidades, o comprimento da identidade de compartilhamento de sequência é 41 ou mais ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos, por exemplo, 42, 43, 44, 45, 45, 47, 48, 49, 50, etc., ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos. Em outras modalidades ainda, o comprimento da identidade de compartilhamento de sequência é 50 ou mais ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos, por exemplo, 50 a 55, 55 a 60, 60 a 65, 65 a 70, 70 a 75, 75 a 80, 80 a 85, 85 a 90, 90 a 95, 95 a 100, 100 a 150, 150 a 200, 200 a 250, 250 a 300, 300 a 500, 500 a 1.000, etc., ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos.
[0201] Como estabelecido neste documento, variantes de ácidos nucleicos, como variantes reduzidas de CpG que codificam FVIII ou hFVIII-BDD, serão distintas do tipo selvagem, mas podem exibir identidade de sequência com a proteína FVIII do tipo selvagem com, ou sem domínio B. Em variantes de ácido nucleico reduzidas em CpG que codificam FVIII ou hFVIII-BDD, no nível da sequência de nucleotídeos, um ácido nucleico reduzido em CpG que codifica FVIII ou hFVIII-BDD será tipicamente pelo menos cerca de 70% idêntico, mais tipicamente cerca de 75% idêntico, ainda mais tipicamente cerca de 80% a 85% idêntico ao FVIII do tipo selvagem que codifica o ácido nucleico. Assim, por exemplo, um ácido nucleico reduzido em CpG que codifica FVIII ou hFVIII-BDD pode ter 75% a 85% de identidade em relação ao gene codificador de FVIII de tipo selvagem, ou entre si, isto é, X01 versus X02, X03 versus X04, etc., conforme estabelecido aqui.
[0202] No nível de sequência de aminoácidos, uma variante como uma proteína FVIII ou hFVIII-BDD variante será pelo menos cerca de 70% idêntica, mais tipicamente cerca de 75% idêntica ou 80% idêntica, ainda mais tipicamente cerca de 85 de identidade, 90% ou mais de identidade. Em outras modalidades, uma variante como uma proteína FVIII ou hFVIII-BDD variante tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade a uma sequência de referência, por exemplo, proteína FVIII de tipo selvagem com ou sem domínio B.
[0203] Para determinar a identidade, se o FVIII (por exemplo, ácido nucleico reduzido em CpG que codifica o FVIII) retém o domínio B, é apropriado comparar a identidade com o FVIII do tipo selvagem. Se o FVIII (por exemplo, ácido nucleico reduzido em CpG que codifica hFVIII-BDD) possui uma deleção do domínio B, é apropriado comparar a identidade com o FVIII do tipo selvagem que também possui uma deleção do domínio B.
[0204] Os termos "homólogo" ou "homologia" significam que duas ou mais entidades referenciadas compartilham pelo menos uma identidade parcial sobre uma determinada região ou porção. “Áreas, regiões ou domínios” de homologia ou identidade significam que uma porção de duas ou mais entidades referenciadas compartilham homologia ou são as mesmas. Assim, onde duas sequências são idênticas em uma ou mais regiões de sequência, elas compartilham identidade nessas regiões. “Homologia substancial” significa que uma molécula é estruturalmente ou funcionalmente conservada, de modo que se prevê que ela tenha pelo menos estrutura parcial ou função de uma ou mais estruturas ou funções (por exemplo, uma função ou atividade biológica) da referência molécula, ou região relevante/correspondente ou porção da molécula de referência com a qual compartilha homologia.
[0205] A extensão da identidade (homologia) ou "identidade percentual" entre duas seqüências pode ser verificada usando um programa de computador e/ou algoritmo matemático. Para os fins desta invenção, as comparações de sequências de ácidos nucleicos são realizadas usando o GCG Wisconsin Package versão 9.1, disponível no Genetics Computer Group em Madison, Wisconsin. Por conveniência, os parâmetros padrão (penalidade de criação de gap = 12, penalidade de extensão de gap = 4) especificados por esse programa devem ser usados aqui para comparar a identidade de sequência. Como alternativa, o programa Blastn 2.0 fornecido pelo National Center for Biotechnology Information (encontrado na rede mundial de computadores em ncbi.nlm.nih.gov/blast/; Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215: 403-410) usando um alinhamento entre os parâmetros padrão pode ser usado para determinar o nível de identidade e semelhança entre as sequências de ácidos nucleicos e as sequências de aminoácidos. Para comparações de sequência de polipeptídeos, um algoritmo BLASTP é normalmente usado em combinação com uma matriz de pontuação, como PAM100, PAM 250, BLOSUM 62 ou BLOSUM 50. Os programas de comparação FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) e SSEARCH também são usados para quantificar a extensão da identidade (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132: 185 (2000); e Smith et al., J. Mol. Biol. 147: 195 (1981)). Programas para quantificar a similaridade estrutural de proteínas usando o mapeamento topológico baseado em Delaunay também foram desenvolvidos (Bostick et al., Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (2003)).
[0206] As moléculas de ácido nucleico, vetores de expressão (por exemplo, genoma vetorials), plasmídeos, incluindo ácido nucleico e variante de ácido nucleico que codifica FVIII ou hFVIII-BDD da invenção podem ser preparados usando a técnica de DNA recombinante. A disponibilidade de informações de sequência de nucleotídeos permite a preparação de moléculas de ácido nucleica isoladas da invenção por vários meios. Por exemplo, as variantes de ácido nucleico reduzidas em CpG que codificam FVIII ou hFVIII-BDD podem ser feitas usando várias clonagens padrão, tecnologia de DNA recombinante, via expressão celular ou tradução in vitro e técnicas de síntese química. A pureza dos polinucleotídeos pode ser determinada por sequenciamento, eletroforese em gel e similares. Por exemplo, ácidos nucleicos podem ser isolados usando hibridação ou técnicas de triagem de banco de dados baseadas em computador. Tais técnicas incluem, mas não estão limitadas a: (1) hibridação de bibliotecas de DNA ou cDNA genômico com sondas para detectar sequências nucleotídicas homólogas; (2) triagem de anticorpos para detectar polipeptídeos com características estruturais compartilhadas, por exemplo, usando uma biblioteca de expressão; (3) reação em cadeia da polimerase (PCR) no DNA ou cDNA genômico, usando iniciadores capazes de emparelhar com uma sequência de ácidos nucleicos de interesse; (4) pesquisas em computador de bancos de dados de sequência para sequências relacionadas; e (5) triagem diferencial de uma biblioteca de ácido nucleico subtraída.
[0207] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser mantidos como DNA em qualquer vetor de clonagem conveniente. Em uma modalidade, os clones são mantidos em um vetor de clonagem/expressão de plasmídeo, tal como pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), que é propagado em uma célula hospedeira adequada de E. coli. Alternativamente, o ácido nucleico pode ser mantido no vetor adequado para expressão em células de mamíferos. Nos casos em que a modificação pós-traducional afeta a função de coagulação, a molécula de ácido nucleico pode ser expressa em células de mamíferos.
[0208] Os ácidos nucleicos e variantes de ácidos nucleicos que codificam FVIII ou hFVIII-BDD incluem cDNA, DNA genômico, RNA e seus fragmentos, que podem ser de fita simples ou dupla. Assim, esta invenção fornece oligonucleotídeos (fitas sentido ou antissentido do DNA ou RNA) tendo sequências capazes de hibridar com pelo menos uma sequência de um ácido nucleico da invenção. Tais oligonucleotídeos são úteis como sondas para detectar a expressão de FVIII ou hFVIII-BDD.
[0209] Os vetores como os aqui descritos (rAAV) opcionalmente compreendem elementos reguladores necessários para a expressão do DNA na célula hospedeira posicionada de maneira a permitir a expressão da proteína codificada na célula hospedeira. Tais elementos reguladores necessários para a expressão incluem, mas não estão limitados a, sequências promotoras, sequências potenciadoras e sequências de iniciação da transcrição, como aqui estabelecido e conhecido pelo indivíduo versado na técnica.
[0210] Os métodos e usos da invenção incluem a entrega (transdução) de ácido nucleico (transgene) nas células hospedeiras, incluindo a divisão de células que não se dividem. Os ácidos nucleicos, vetor de rAAV, métodos, utilizações e formulações farmacêuticas da invenção são adicionalmente úteis em um método de entrega, administração ou fornecimento de um FVIII ou hFVIII-BDD a um indivíduo em necessidade, como método de tratamento. Dessa maneira, o ácido nucleico é transcrito e a proteína pode ser produzida in vivo em um indivíduo. O indivíduo pode se beneficiar ou precisar do FVIII ou hFVIII-BDD porque o indivíduo tem uma deficiência de FVIII, ou porque a produção de FVIII no indivíduo pode conferir algum efeito terapêutico, como método de tratamento ou de outra forma.
[0211] Os vetores de rAAV compreendendo um genoma com um ácido nucleico ou variante de ácido nucleico que codifica FVIII ou hFVIII-BDD permite o tratamento de doenças genéticas, por exemplo, uma deficiência de FVIII. Para doenças do estado de deficiência, a transferência gênica pode ser usada para trazer um gene normal aos tecidos afetados para terapia de substituição, bem como para criar modelos animais para a doença usando mutações antissentido. Para estados de doença desequilibrados, a transferência de genes pode ser usada para criar um estado de doença em um sistema modelo, que pode ser usado em esforços para combater o estado de doença. Também é possível o uso da integração específica do local de sequências de ácidos nucleicos para corrigir defeitos.
[0212] Em modalidades particulares, os vetores de rAAV compreendendo um genoma com um ácido nucleico ou variante de ácido nucleico que codifica FVIII ou hFVIII-BDD podem ser usados, por exemplo, como agentes terapêuticos e/ou profiláticos (proteína ou ácido nucleico) que modulam a cascata de coagulação do sangue ou como um transgene no gene. Por exemplo, um FVIII ou hFVIII-BDD codificado pode ter atividade de coagulação semelhante ao FVIII do tipo selvagem ou atividade de coagulação alterada em comparação com o FVII do tipo selvagem. Estratégias baseadas em células permitem a expressão contínua de FVIII ou hFVIII-BDD em pacientes com hemofilia A. Conforme divulgado neste documento, certas modificações das moléculas de FVIII (ácido nucleico e proteína) resultam em aumento da expressão no nível do ácido nucleico, aumento da atividade de coagulação, melhorando efetivamente a hemostasia.
[0213] A administração de vetores de rAAV que codificam FVIII ou hFVIII-BDD a um paciente resulta na expressão da proteína FVIII ou hFVIII-BDD que serve para alterar a cascata de coagulação. De acordo com a invenção, a expressão da proteína FVIII ou hFVIII-BDD, conforme descrito aqui, ou um fragmento funcional, aumenta a hemostasia.
[0214] Os vetores de rAAV podem ser administrados sozinhos ou em combinação com outras moléculas úteis para modular a hemostasia. De acordo com a invenção, os vetores de rAAV ou uma combinação de agentes terapêuticos pode ser administrada apenas ao paciente ou em composições farmaceuticamente aceitáveis ou biologicamente compatíveis.
[0215] Os “vírus adenoassociados” (AAV) estão na família dos parvovírus. Os AAV são vírus úteis como vetores de terapia genética, pois podem penetrar nas células e introduzir ácido nucleico/material genético, de modo que o ácido nucleico/material genético possa ser mantido de maneira estável nas células.
Além disso, esses vírus podem introduzir ácido nucleico/material genético em locais específicos, por exemplo. Como o AAV não está associado à doença patogênica em humanos, os vetores de rAAV são capazes de fornecer sequências polinucleotídicas heterólogas (por exemplo, proteínas e agentes terapêuticos) a pacientes humanos sem causar patogênese ou doença substancial do AAV.
[0216] Os vetores de rAAV possuem uma série de características desejáveis para tais aplicações, incluindo tropismo para células que se dividem e que não se dividem. A experiência clínica precoce com esses vetores também não demonstrou toxicidade sustentada e a resposta imune foi mínima ou indetectável. Sabe-se que os AAV infectam uma ampla variedade de tipos de células in vivo e in vitro por endocitose mediada por receptores ou por transcitose. Esses sistemas vetoriais foram testados em seres humanos visando epitélio da retina, fígado, músculo esquelético, vias aéreas, cérebro, articulações e células-tronco hematopoiéticas.
[0217] Pode ser desejável introduzir um vetor de rAAV que possa fornecer, por exemplo, várias cópias de um gene desejado e, portanto, maiores quantidades do produto desse gene. O vetor de rAAVs e os métodos aprimorados para a produção desses vetores foram descritos em detalhes em várias referências, patentes e pedidos de patente, incluindo: Wright JF (Hum Gene Ther 20: 698-706, 2009), uma tecnologia usada para a produção de vetor de grau clínico no Hospital Infantil da Filadélfia.
[0218] Por conseguinte, a invenção fornece métodos para a entrega de FVIII ou hFVIII-BDD por meio de um vetor de rAAV. Por exemplo, um vetor AAV recombinante pode incluir um ácido nucleico codificador de FVIII, em que a proteína FVIII codificada opcionalmente tem a deleção do domínio B. A entrega ou administração do vetor de rAAV a um indivíduo (por exemplo, mamífero), portanto, fornece FVIII a um indivíduo como um mamífero (por exemplo, ser humano).
[0219] A entrega direta de vetores ou transdução ex vivo de células humanas seguida de infusão no corpo resultará na expressão de FVIII ou hFVIII- BDD, exercendo assim um efeito terapêutico benéfico na hemostasia. No contexto do Fator VIII da invenção aqui descrito, essa administração aumenta a atividade de pró-coagulação.
[0220] Os vetores de AAV normalmente não incluem genes virais associados à patogênese. Esses vetores normalmente têm um ou mais genes AAV do tipo selvagem deletados no todo ou em parte, por exemplo, genes representativos e/ou cap, mas retêm pelo menos uma sequência de ITRs de flanqueamento funcional, conforme necessário para o resgate, replicação e empacotamento do vetor recombinante em uma partícula de vetor AAV. Por exemplo, apenas as partes essenciais do vetor, por exemplo, os elementos ITR, respectivamente, estão incluídos. Um genoma vetorial do AAV incluiria, portanto, sequências necessárias em cis para replicação e empacotamento (por exemplo, sequências ITRs funcionais).
[0221] O vetor AAV recombinante, bem como métodos e usos do mesmo, incluem qualquer cepa ou sorotipo viral. Como um exemplo não limitativo, um vetor AAV recombinante pode ser baseado em qualquer genoma de AAV, como AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, - 10, -11, -12, -rh74, -rh10 ou AAV-2i8, por exemplo. Esses vetores podem ser baseados na mesma cepa ou sorotipo (ou subgrupo ou variante) ou serem diferentes um do outro. Como um exemplo não limitativo, um vetor AAV recombinante baseado em um genoma de sorotipo pode ser idêntico a uma ou mais das proteínas capsídeo que empacotam o vetor. Além disso, um genoma vetorial de AAV recombinante pode ser baseado em um genoma de sorotipo de AAV (por exemplo, AAV2) distinto de uma ou mais proteínas capsídicas de AAV que empacotam o vetor. Por exemplo, o genoma vetorial de AAV pode ser baseado no AAV2, enquanto que pelo menos uma das três proteínas capsídicas poderia ser um AAV1, AAV3, AAV4, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 ou AAV-2i8 ou sua variante, por exemplo.
[0222] Em modalidades particulares, os vetores de vírus adeno- associados (AAV) incluem AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 e AAV-2i8, bem como variantes (por exemplo, variantes de capsídeo, como inserções, adições, substituições e deleções de aminoácidos), por exemplo, como estabelecido no documento WO 2013/158879 (Pedido Internacional PCT/US2013/037170), WO 2015/013313 (Pedido Internacional PCT/US2014/047670) e US 2013/0059732 (Patente nº US 9.169.299, divulga LK01, LK02, LK03, etc.).
[0223] As variantes de AAV incluem variantes e quimeras de capsídeo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 e AAV-2i8. Consequentemente, vetores de AAV e variantes de AAV (por exemplo, variantes de capsídeo) que incluem (encapsidam ou empacotam) ácido nucleico ou variante de ácido nucleico que codifica FVIII ou hFVIII-BDD.
[0224] Os sorotipos de variantes de AAV e AAV (por exemplo, variantes de capsídeo) (por exemplo, sequências VP1, VP2 e/ou VP3) podem ou não ser diferentes de outros sorotipos de AAV, incluindo, por exemplo, AAV1- AAV12, Rh74 ou Rh10 (por exemplo, distinto das sequências VP1, VP2 e/ou VP3 de qualquer um dos sorotipos AAV1-AAV12, Rh74 ou Rh10).
[0225] Como aqui utilizado, o termo "sorotipo" é uma distinção usada para se referir a um AAV que possui um capsídeo que é sorologicamente distinto de outros sorotipos de AAV. A distinção sorológica é determinada com base na falta de reatividade cruzada entre anticorpos para um AAV em comparação com outro AAV. Tais diferenças de reatividade cruzada são geralmente devidas a diferenças nas seqüências de proteínas capsídicas/determinantes antigênicos (por exemplo, devido a diferenças de sequência VP1, VP2 e/ou VP3 de sorotipos de AAV). Apesar da possibilidade de que as variantes de AAV, incluindo variantes de capsídeo, não sejam sorologicamente distintas de um AAV de referência ou outro sorotipo de AAV, diferem em pelo menos um resíduo de nucleotídeo ou aminoácido em comparação com a referência ou outro sorotipo de AAV.
[0226] De acordo com a definição tradicional, um sorotipo significa que o vírus de interesse foi testado contra soro específico para todos os sorotipos existentes e caracterizados para atividade neutralizante e não foram encontrados anticorpos que neutralizem o vírus de interesse. À medida que os isolados de vírus de ocorrência mais natural são revelados e/ou mutantes de capsídeo gerados, pode ou não haver diferenças sorológicas com qualquer um dos sorotipos atualmente existentes. Assim, nos casos em que o novo vírus (por exemplo, AAV) não possui diferença sorológica, esse novo vírus (por exemplo, AAV) seria um subgrupo ou variante do sorotipo correspondente. Em muitos casos, o teste sorológico para atividade neutralizante ainda não foi realizado em vírus mutantes com modificações de capsídeo sequência para determinar se são de outro sorotipo, de acordo com a definição tradicional de sorotipo. Consequentemente, por uma questão de conveniência e para evitar repetições, o termo “sorotipo” se refere amplamente a vírus serologicamente distintos (por exemplo, AAV) e a vírus (por exemplo, AAV) que não são sorologicamente distintos e podem estar dentro de um subgrupo ou uma variante de um determinado sorotipo.
[0227] Os vetores de AAV, portanto, incluem sequências de genes/proteínas idênticas às sequências de genes/proteínas características de um sorotipo específico. Como usado aqui, um "vetor AAV relacionado a AAV1" refere-se a uma ou mais proteínas AAV (por exemplo, sequências VP1, VP2 e/ou VP3) que possuem identidade de sequência substancial a uma ou mais sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos que compreendem AAV1. Analogamente, um "vetor AAV relacionado a AAV8" refere-se a uma ou mais proteínas AAV (por exemplo, sequências VP1, VP2 e/ou VP3) que possuem identidade de sequência substancial a uma ou mais sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos que compreendem AAV8. Um "vetor AAV relacionado a AAV-Rh74" refere-se a uma ou mais proteínas AAV (por exemplo, sequências VP1, VP2 e/ou VP3) que possuem identidade de sequência substancial a uma ou mais polinucleotídeos ou sequências polipeptídicas que compreendem AAV-Rh74. Tais vetores de AAV relacionados a outro sorotipo, por exemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 ou AAV-2i8, podem, portanto, ter um ou mais distintos sequências de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 e AAV-2i8, mas podem exibir identidade de sequência substancial para um ou mais genes e/ou proteínas, e/ou têm uma ou mais características funcionais de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 ou AAV-2i8 (por exemplo, célula/tropismo tecidual). Exemplos de variantes não limitativas do AAV incluem variantes capsídicas de qualquer um dos VP1, VP2 e/ou VP3.
[0228] Em várias modalidades exemplificadoras, um vetor AAV relacionado a um sorotipo de referência tem um polinucleotídeo, polipeptídeo ou subsequência do mesmo que inclui ou consiste em uma sequência pelo menos 80% ou mais (por exemplo, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, etc.) idêntica a um ou mais AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 ou AAV-2i8 (por exemplo, como sequências ITR, VTR, VP1, VP2 e/ou VP3).
[0229] Composições, métodos e usos da invenção incluem sequências AAV (polipeptídeos e nucleotídeos) e subsequências das mesmas que exibem menos de 100% de identidade de sequência em relação a um sorotipo AAV de referência, como AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, ou AAV-2i8, mas são distintos e não são idênticos aos genes ou proteínas conhecidos de AAV, como AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 , AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 ou AAV- 2i8, genes ou proteínas, etc. Em uma modalidade, um polipeptídeo AAV ou sua subsequência inclui ou consiste em uma sequência pelo menos 75% ou mais idêntica, por exemplo: 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, etc., até 100% idêntica a qualquer sequência de AAV de referência ou subsequência da mesma, como AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 ou AAV-2i8 (por exemplo, capsídeo ou ITR de VP1, VP2 e/ou VP3). Em determinadas modalidades, uma variante do AAV tem 1, 2, 3, 4, 5, 5-10, 10-15, 15-20 ou mais substituições de aminoácidos.
[0230] Os vetores AAV recombinantes, incluindo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 ou
AAV-2i8 e sequências variantes, relacionadas, híbridas e quiméricas, podem ser construídos usando técnicas recombinantes conhecidas pelo indivíduo versado na técnica, para incluir uma ou mais sequências de ácido nucleico (transgenes) flanqueadas com uma ou mais sequências de ITR de AAV funcionais.
[0231] Em uma modalidade da invenção, o vetor de rAAV que compreende um ácido nucleico ou variante que codifica FVIII ou hFVIII-BDD, pode ser administrado a um paciente por infusão em um transportador biologicamente compatível, por exemplo, por injeção intravenosa. Os vetores de rAAV podem opcionalmente ser encapsidados em lipossomas ou misturados com outras micelas fosfolipídicas para aumentar a estabilidade da molécula.
[0232] De acordo com a invenção, os vetores de rAAV podem ser administrados sozinhos ou em combinação com outros agentes conhecidos por modular a hemostasia (por exemplo, Fator V, Fator Va ou seus derivados).
[0233] Consequentemente, os vetores de rAAV e outras composições, agentes, fármacos, produtos biológicos (proteínas) podem ser incorporados nas composições farmacêuticas. Tais composições farmacêuticas são úteis para, entre outras coisas, administração e entrega a um indivíduo in vivo ou ex vivo.
[0234] Em modalidades particulares, as composições farmacêuticas também contêm um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Tais excipientes incluem qualquer agente farmacêutico que não induza uma resposta imune prejudicial ao indivíduo que recebe a composição e que possa ser administrado sem toxicidade indevida.
[0235] Como aqui utilizado, o termo "farmaceuticamente aceitável" e "fisiologicamente aceitável" significa uma formulação biologicamente aceitável, gasosa, líquida ou sólida, ou mistura dos mesmos, que é adequada para uma ou mais vias de administração, entrega ou contato in vivo. Uma composição "farmaceuticamente aceitável" ou "fisiologicamente aceitável" é um material que não é biologicamente ou de outro modo indesejável, por exemplo, o material pode ser administrado a um indivíduo sem causar efeitos biológicos indesejáveis substanciais. Assim, essa composição farmacêutica pode ser usada, por exemplo,
na administração de um ácido nucleico, vetor, partícula viral ou proteína a um indivíduo.
[0236] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, líquidos como água, solução salina, glicerol, açúcares e etanol. Os sais farmaceuticamente aceitáveis também podem ser incluídos nos mesmos, por exemplo, sais de ácidos minerais, tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos e similares; e os sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos e similares. Além disso, substâncias auxiliares, como agentes umectantes ou emulsificantes, substâncias tampão de pH e similares, podem estar presentes nesses veículos.
[0237] A composição farmacêutica pode ser fornecida como um sal e pode ser formada com muitos ácidos, incluindo, mas não se limitando a, cloridrato, sulfúrico, acético, lático, tartárico, málico, succínico, etc. Os sais tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos ou outros solventes protônicos que não sejam as formas de base livre correspondentes. Em outros casos, uma preparação pode ser um pó liofilizado que pode conter qualquer um dos seguintes itens: 1 a 50 mM de histidina, 0,1% a 2% de sacarose e 2 a 7% de manitol, a uma faixa de pH de 4,5 a 5,5, que é combinado com o tampão antes do uso.
[0238] As composições farmacêuticas incluem solventes (aquosos ou não aquosos), soluções (aquosas ou não aquosas), emulsões (por exemplo, óleo em água ou água em óleo), suspensões, xaropes, elixires, meios de dispersão e suspensão, revestimentos isotônicos e agentes promotores de absorção ou retardadores, compatíveis com a administração farmacêutica ou contato ou entrega in vivo. Solventes, soluções e suspensões aquosas e não aquosas podem incluir agentes de suspensão e espessantes. Tais veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem comprimidos (revestidos ou não revestidos), cápsulas (duras ou moles), microesferas, pó, grânulos e cristais. Compostos ativos suplementares (por exemplo, conservantes, antibacterianos, antivirais e antifúngicos) também podem ser incorporados nas composições.
[0239] As composições farmacêuticas podem ser formuladas para serem compatíveis com uma via de administração ou entrega específica, conforme estabelecido aqui ou conhecido por um indivíduo versado na técnica. Assim, as composições farmacêuticas incluem transportadores, diluentes ou excipientes adequados para administração por várias vias.
[0240] As composições adequadas para administração parentérica compreendem soluções aquosas e não aquosas, suspensões ou emulsões do composto ativo, cujas preparações são tipicamente estéreis e podem ser isotônicas com o sangue do receptor pretendido. Exemplos ilustrativos não limitativos incluem água, solução salina tamponada, solução de Hanks, solução de Ringer, dextrose, frutose, etanol, óleo animal, vegetal ou sintético. As suspensões aquosas de injeção podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano.
[0241] Além disso, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção de óleo apropriadas. Os solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos gordos, como óleo de gergelim, ou ésteres sintéticos de ácidos graxos, como oleato de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.
[0242] Podem ser adicionados cossolventes e adjuvantes à formulação. Exemplos não limitativos de cossolventes contêm grupos hidroxila ou outros grupos polares, por exemplo, álcoois, como álcool isopropílico; glicóis, tais como propileno glicol, polietilenoglicol, polipropileno glicol, éter glicol; glicerol; álcoois de polioxietileno e ésteres de ácidos graxos de polioxietileno. Os adjuvantes incluem, por exemplo, tensoativos como lecitina de soja e ácido oleico; ésteres de sorbitano, tais como trioleato de sorbitano; e polivinilpirrolidona.
[0243] Depois de preparadas as composições farmacêuticas, elas podem ser colocadas em um recipiente apropriado e rotuladas para tratamento. Essa rotulagem pode incluir quantidade, frequência e método de administração.
[0244] As composições farmacêuticas e sistemas de entrega apropriados para as composições, métodos e usos da invenção são conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12a ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel e Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11a ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD; and Poznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., páginas 253-315).
[0245] Uma "quantidade eficaz" ou "quantidade suficiente" refere-se a uma quantidade que fornece, em doses únicas ou múltiplas, isoladamente ou em combinação, com uma ou mais composições (agentes terapêuticos ou imunossupressores, como um medicamento), tratamentos, protocolos, agentes de regimes terapêuticos, uma resposta detectável de qualquer duração (longo ou curto prazo), um resultado esperado ou desejado em benefício de um indivíduo de qualquer grau mensurável ou detectável ou por qualquer período de tempo (por exemplo, por minutos, horas, dias, meses, anos ou curado).
[0246] As doses podem variar e dependem do tipo, início, progressão, gravidade, frequência, duração ou probabilidade da doença à qual o tratamento é direcionado, o desfecho clínico desejado, tratamentos anteriores ou simultâneos, saúde geral, idade, sexo, raça ou competência imunológica do indivíduo e outros fatores que serão apreciados pelo perito na arte. A quantidade, número, frequência ou duração da dose pode ser proporcionalmente aumentada ou reduzida, conforme indicado por efeitos colaterais adversos, complicações ou outros fatores de risco do tratamento ou terapia e do status do indivíduo. O indivíduo versado apreciará os fatores que podem influenciar a dosagem e o tempo necessário para fornecer uma quantidade suficiente para fornecer um benefício terapêutico ou profilático.
[0247] A dose para atingir um efeito terapêutico, por exemplo, a dose em genomas vetoriais/por quilograma de peso corporal (gv/kg), variará com base em vários fatores, incluindo, mas não se limitando a: via de administração, o nível da expressão de polinucleotídeo heterólogo necessária para obter um efeito terapêutico, a doença específica tratada, qualquer resposta do hospedeiro imune ao vetor viral, uma resposta do hospedeiro imune ao polinucleotídeo heterólogo ou produto de expressão (proteína) e a estabilidade da proteína expressa. Um versado na técnica pode determinar um intervalo de doses de rAAV/genoma vetorial para tratar um paciente com uma doença ou distúrbio específico com base nos fatores mencionados acima, além de outros fatores.
[0248] Geralmente, as doses variam de pelo menos 1x108, ou mais, por exemplo, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013 ou 1x1014, ou mais, genomas vetoriais por quilograma (gv/kg) do peso do indivíduo, para obter um efeito terapêutico. A dose de AAV na faixa de 1x1010 a 1x1011 em camundongos e 1x1012 a 1x1013 em cães tem sido eficaz. As doses podem ser menores, por exemplo, uma dose menor que 6x1012 genomas vetoriais por quilograma (gv/kg). Mais particularmente, uma dose de 5x10 11 gv/kg ou 1x1012 gv/kg.
[0249] Usando a hemofilia B como exemplo, de um modo geral, acredita-se que, para alcançar um efeito terapêutico, é necessária uma concentração de fator de coagulação sanguínea superior a 1% da concentração de fator encontrada em um indivíduo normal para alterar um fenótipo de doença grave a moderado. Um fenótipo grave é caracterizado por danos nas articulações e sangramentos com risco de vida. Para converter um fenótipo de doença moderado em um leve, acredita-se que seja necessária uma concentração de fator de coagulação sanguínea superior a 5% do normal.
[0250] Os níveis de FVIII em humanos normais são de cerca de 150 a 200 ng/ml de plasma, mas podem ser menores (por exemplo, faixa de cerca de 100 a 150 ng/ml) ou mais (por exemplo, faixa de cerca de 200 a 300 ng/ml) e ainda considerado normal devido ao funcionamento da coagulação, conforme determinado, por exemplo, por um ensaio de coagulação em um estágio de tempo parcial de tromboplastina ativado (aPTT). Assim, um efeito terapêutico pode ser alcançado pela expressão de FVIII ou hFVIII-BDD, de modo que a quantidade total de FVIII no indivíduo/humano seja superior a 1% do FVIII presente em indivíduos normais/humanos, por exemplo, 1% de 100 a 300 ng/ml.
[0251] As doses dos vetores de rAAV podem estar em um nível, tipicamente na extremidade inferior do espectro da dose, de modo que não exista uma resposta imune substancial contra o vetor FVIII ou AAV. Mais particularmente, uma dose de no mínimo 6x10 12 gv/kg, como cerca de 5x1011 a cerca de 5x1012 gv/kg, ou mais particularmente, cerca de 5x10 11 gv/kg ou cerca de 1x1012 gv/kg.
[0252] As doses de uma "quantidade eficaz" ou "quantidade suficiente" para tratamento (por exemplo, para melhorar ou proporcionar um benefício terapêutico ou melhoria) geralmente são eficazes para fornecer uma resposta a um, vários ou todos os sintomas adversos, conseqüências ou complicações da doença, um ou mais sintomas adversos, distúrbios, doenças, patologias, ou complicações, por exemplo, causadas por ou associadas à doença, em uma extensão mensurável, embora diminuam, reduzam, inibam, suprimam, limitem ou controlem a progressão O agravamento da doença é um resultado satisfatório.
[0253] Uma quantidade eficaz ou uma quantidade suficiente pode, mas não precisa ser fornecida, em uma única administração, pode exigir várias administrações e, mas não pode ser, administrada sozinha ou em combinação com outra composição (por exemplo, agente), tratamento, protocolo ou regime terapêutico. Por exemplo, a quantidade pode ser proporcionalmente aumentada, conforme indicado pela necessidade do indivíduo, tipo, status e gravidade da doença tratada ou efeitos colaterais (se houver) do tratamento. Além disso, uma quantidade eficaz ou suficiente não precisa ser eficaz ou suficiente se administrada em doses únicas ou múltiplas sem uma segunda composição (por exemplo, outro medicamento ou agente), tratamento, protocolo ou regime terapêutico, uma vez que doses adicionais, quantidades ou a duração acima e além dessas doses, ou composições adicionais (por exemplo, drogas ou agentes), tratamentos, protocolos ou regimes terapêuticos podem ser incluídos para serem considerados eficazes ou suficientes em um determinado indivíduo. Os valores considerados eficazes também incluem valores que resultam na redução do uso de outro tratamento, regime terapêutico ou protocolo, como administração de proteína recombinante do fator de coagulação (por exemplo, FVIII) para tratamento de um distúrbio de coagulação (por exemplo, hemofilia A).
[0254] Consequentemente, métodos e usos da invenção também incluem, entre outras coisas, métodos e usos que resultam em uma necessidade reduzida ou uso de outro composto, agente, medicamento, regime terapêutico, protocolo de tratamento, processo ou solução. Por exemplo, para uma doença de coagulação sanguínea, um método ou uso da invenção tem um benefício terapêutico se em um determinado indivíduo uma dose menos frequente ou reduzida ou eliminação da administração de uma proteína do fator de coagulação recombinante para suplementar a deficiência ou a deficiência (anormal fator de coagulação endógena ou mutante) no indivíduo. Assim, são fornecidos acordos de acordo com a invenção, métodos e usos da necessidade de redução ou uso de outro tratamento ou terapia.
[0255] Uma quantidade eficaz ou suficiente não precisa ser efetiva em todos os indivíduos tratados, nem na maioria dos indivíduos tratados em um determinado grupo ou população. Uma quantia efetiva ou uma quantia suficiente significa efetividade ou suficiência em um determinado assunto, não em um grupo ou na população em geral. Como é típico para tais métodos, alguns indivíduos exibirão uma resposta maior, ou menos ou nenhuma resposta a um determinado tratamento.
[0256] O termo "melhoria" significa uma melhoria detectável ou mensurável na doença de um indivíduo ou sintoma da mesma, ou uma resposta celular subjacente. Uma melhoria detectável ou mensurável inclui uma redução subjetiva ou objetiva, redução, inibição, supressão, limite ou controle da ocorrência, frequência, gravidade, progressão ou duração da doença, ou complicação causada por ou associada à doença ou uma melhoria em um sintoma ou uma causa subjacente ou uma conseqüência da doença, ou uma reversão da doença. Para HemA, uma quantidade eficaz seria uma quantidade que reduz a frequência ou a gravidade dos episódios de sangramento agudo em um indivíduo, por exemplo, ou uma quantidade que reduz o tempo de coagulação, conforme medido por um ensaio de coagulação, por exemplo.
[0257] Por conseguinte, as composições farmacêuticas da invenção incluem composições em que os ingredientes ativos estão contidos em uma quantidade eficaz para atingir o objetivo terapêutico pretendido. A determinação de uma dose terapeuticamente eficaz está dentro da capacidade de um médico especialista, usando as técnicas e orientações fornecidas na invenção.
[0258] As doses terapêuticas dependerão, entre outros fatores, da idade e do estado geral do indivíduo, da gravidade do fenótipo de coagulação sanguínea anormal e da força das sequências de controle que regulam os níveis de expressão do FVIII. Assim, uma quantidade terapeuticamente eficaz em humanos cairá em uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada por um médico com base na resposta de um paciente individual ao tratamento com FVIII baseado em vetor. Essas doses podem estar sozinhas ou em combinação com um agente imunossupressor ou medicamento.
[0259] As composições como composições farmacêuticas podem ser entregues a um indivíduo, de modo a permitir a produção do Fator VIII (FVIII). Em uma modalidade específica, composições farmacêuticas compreendendo material genético suficiente para permitir que um receptor produza uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo FVIII pode influenciar a hemostasia no indivíduo.
[0260] As composições podem ser administradas sozinhas. Em determinadas configurações, uma partícula recombinante de AAV fornece um efeito terapêutico sem um agente imunossupressor. O efeito terapêutico do FVIII opcionalmente é sustentado por um período de tempo, por exemplo, 2 a 4, 4 a 6, 6 a 8, 8 a 10, 10 a 14, 14 a 20, 20 a 25, 25 a 30, ou 30 a 50 dias ou mais, por exemplo, 50 a 75, 75 a 100, 100 a 150, 150 a 200 dias ou mais sem administração de um agente imunossupressivo. Por conseguinte, em certas modalidades, a partícula do vírus rAAV de CpG fornece um efeito terapêutico sem administração de um agente imunossupressor por um período de tempo.
[0261] As composições podem ser administradas em combinação com pelo menos um outro agente. Em comparação, o vetor de rAAV é administrado em conjunto com um ou mais agentes imunossupressores antes, substancialmente ao mesmo tempo ou após a administração de um vetor de rAAV. Em determinadas configurações, por exemplo, 1 a 12, 12 a 24 ou 24 a 48 horas, ou 2 a 4, 4 a 6, 6 a 8, 8 a 10, 10 a 14, 14 a 20, 20 a 25, 25 a 30, 30 a 50, ou mais de 50 dias após a administração do vetor de rAAV. Essa administração de agente imunossupressivo após um período de tempo após a administração do vetor de rAAV, se houver uma diminuição no FVIII após os níveis de expressão iniciais para um período de tempo, por exemplo, 20 a 25, 25 a 30, 30 a 50, 50 a 75, 75 a 100, 100 a 150, 150 a 200 ou mais de 200 dias após o vetor de rAAV.
[0262] Em determinadas modalidades, um agente imunossupressor é um agente anti-inflamatório. Em determinadas configurações, um agente imunossupressor é um esteroide. Em determinadas modalidades, um agente imunossupressor é a ciclosporina (por exemplo, ciclosporina A), micofenolato, rituximabe ou um derivado do mesmo. Agentes particulares adicionais incluem um composto estabilizador.
[0263] As composições podem ser administradas em qualquer veículo farmacêutico estéril e biocompatível, incluindo, entre outros, solução salina, solução salina tamponada, dextrose e água. As composições podem ser administradas a um paciente sozinho, ou em combinação com outros agentes (por exemplo, cofatores) que influenciam a hemostasia.
[0264] Os protocolos para a geração de vetores adenovirais e administração a pacientes foram descritos nas Patentes nos US 5.998.205;
6.228.646; 6.093.699; 6.100.242; e Pedidos de Patente Internacional nos WO 94/17810 e WO 94/23744, que são aqui incorporados por referência na sua totalidade. Em particular, por exemplo, os vetores de AAV são empregados para fornecer o Fator VIII (FVIII) codificado por variantes de ácido nucleico reduzidas em CpG a um paciente com necessidade do mesmo.
[0265] Os métodos e usos da invenção incluem entrega e administração sistêmica, regional ou localmente, ou por qualquer via, por exemplo, por injeção ou infusão. A entrega das composições farmacêuticas in vivo pode geralmente ser realizada por injeção usando uma seringa convencional, embora outros métodos de entrega, como entrega com convecção aumentada, estejam previstos (ver por exemplo, Patente US 5.720.720). Por exemplo, as composições podem ser entregues por via subcutânea, epidérmica, intradérmica, intratecal, intraorbital, intramucosal, intraperitoneal, intravenosa, intrapleural, intra-arterial, oral, intra-hepética, através da veia porta, ou intramuscularmente. Outros modos de administração incluem administração oral e pulmonar, supositórios e aplicações transdérmicas. Um clínico especializado no tratamento de pacientes com distúrbios da coagulação sanguínea pode determinar a via ideal para a administração dos vetores associados aos adenovirais com base em vários critérios, incluindo, entre outros: a condição do paciente e a finalidade do tratamento (por exemplo, coagulação sanguínea aumentada ou reduzida).
[0266] Os métodos e usos da invenção podem ser combinados com qualquer composto, agente, medicamento, tratamento ou outro regime terapêutico ou protocolo que possua uma atividade ou efeito terapêutico, benéfico, aditivo, sinérgico ou complementar desejado. Exemplos de composições e tratamentos combinados incluem segundos ativos, como produtos biológicos (proteínas), agentes (por exemplo, agente imunossupressivo) e medicamentos. Esses produtos biológicos (proteínas), agentes, drogas, tratamentos e terapias podem ser administrados ou realizados antes, substancialmente de forma contemporânea ou após qualquer outro método ou uso da invenção, por exemplo, um método terapêutico de tratamento de um indivíduo para uma doença de coagulação do sangue como HemA.
[0267] O composto, agente, medicamento, tratamento ou outro regime terapêutico ou protocolo podem ser administrados como uma composição combinada, ou administrados separadamente, como simultaneamente ou em série ou sequencialmente (antes de seguir) a entrega ou administração de um ácido nucleico, vetor, vetor recombinante (por exemplo, rAAV) ou partícula de vírus recombinante. A invenção, portanto, fornece combinações nas quais um método ou uso da invenção está em combinação com qualquer composto, agente, medicamento, regime terapêutico, protocolo de tratamento, processo, remédio ou composição, estabelecido aqui ou conhecido por um indivíduo versado na técnica. O composto, agente, medicamento, regime terapêutico, protocolo de tratamento, processo, remédio ou composição pode ser administrado ou realizado antes, substancialmente de forma contemporânea, após a administração de um ácido nucleico, vetor, vetor recombinante (por exemplo, rAAV) ou recombinante partícula viral da invenção, a um indivíduo.
[0268] A invenção é útil em animais, incluindo aplicações médicas humanas e veterinárias. Os indivíduos adequados incluem, portanto, mamíferos, como seres humanos, bem como mamíferos não humanos. O termo "indivíduo" refere-se a um animal, tipicamente um mamífero, como seres humanos, primata não humanos (macacos, gibões, gorilas, chimpanzés, orangotangos, macacos), um animal doméstico (cães e gatos), um animal de fazenda (aves como como galinhas e patos, cavalos, vacas, cabras, ovelhas, porcos) e animais experimentais (camundongo, rato, coelho, cobaia). Assuntos humanos incluem assuntos fetais, neonatais, infantis, juvenis e adultos. Os assuntos incluem modelos de doenças animais, por exemplo, camundongos e outros modelos animais de doenças da coagulação do sangue, como HemA e outros conhecidos pelos versados na técnica.
[0269] Os indivíduos apropriados para o tratamento de acordo com a invenção incluem aqueles que correm o risco de produzir uma quantidade insuficiente ou têm uma deficiência em um produto genético funcional (por exemplo, proteína FVIII), ou produzem um produto genético anormal, parcialmente funcional ou não funcional (por exemplo, proteína FVIII), que pode levar à doença. Os indivíduos apropriados para o tratamento de acordo com a invenção também incluem aqueles que correm o risco de produzir um produto genético (proteína) anormal ou defeituoso (mutante) que leva a uma doença que reduz quantidades, expressão ou função do aberrante ou defeituoso O produto (proteína) (mutante) do gene levaria ao tratamento da doença, ou reduziria um ou mais sintomas ou melhoraria a doença. Os indivíduos-alvo, portanto, incluem indivíduos com produção de fator de coagulação sanguínea aberrante, insuficiente ou ausente, como hemofílicos (por exemplo, hemofilia A).
[0270] Os indivíduos podem ser testados para uma resposta imune, por exemplo, anticorpos contra o AAV. Os indivíduos candidatos a henofilia podem, portanto, ser escassos antes do tratamento, de acordo com um método da invenção. Os indivíduos também podem ser testados quanto a anticorpos contra o AAV após o tratamento e opcionalmente monitorados por um período de tempo após o tratamento. Os indivíduos que desenvolvem anticorpos podem ser tratados com um agente imunossupressor, ou podem ser administradas uma ou mais quantidades adicionais do vetor AAV.
[0271] Os indivíduos apropriados para o tratamento de acordo com a invenção também incluem aqueles com risco de produzir anticorpos contra o AAV. Os vetores de rAAV podem ser administrados ou entregues a esses indivíduos usando várias técnicas. Por exemplo, o AAV de capsídeo vazio (isto é, AAV sem um ácido nucleico do FVIII) pode ser entregue para se ligar ao AAV no indivíduo, permitindo, assim, que o vetor AAV contenha ácido nucleico ou variante de ácido nucleico que codifica FVIII e FVIII-BDD para transformar células do indivíduo.
[0272] A razão de capsídeos vazios para o vetor de rAAV pode ser entre 2:1 e cerca de 50:1, ou entre 2:1 e cerca de 25:1 ou entre 2:1 e aproximadamente de 20:1, entre 2:1 e 15:1, ou entre 2:1 e 10:1. As razões também podem ser cerca de 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 ou 10:1.
[0273] As quantidades de AAV de capsídeo vazio para administrar podem ser calibradas com base na quantidade (título) de AAV produzido em um indivíduo em particular. O capsídeo vazio pode ser de qualquer sorotipo AAV, por exemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 ou AAV-2i8.
[0274] Alternativamente, ou adicionalmente, o vetor AAV pode ser administrado por injeção intramuscular direta (por exemplo, uma ou mais fibras de contração lenta de um músculo). Em outra alternativa, um cateter introduzido na artéria femoral pode ser usado para fornecer vetores de AAV ao fígado via artéria hepática. Também podem ser utilizados meios não cirúrgicos, como a colangiopancreatografia endoscópica retrógrada (CPRE), para entregar vetores de AAV diretamente no fígado, evitando assim a corrente sanguínea e o AAV. Outros sistemas ductais, como os ductos da glândula submandibular, também podem ser usados como portais para a entrega de vetores de AAV para um indivíduo que desenvolve ou tem anticorpos anti-AAV pré-existentes.
[0275] A administração ou entrega in vivo a um indivíduo pode ser realizada antes do desenvolvimento de um sintoma, condição, complicação, etc., adverso causado por ou associado à doença. Por exemplo, uma tela (por exemplo, genética) pode ser usada para identificar indivíduos como candidatos a composições, métodos e usos de invenção. Tais indivíduos incluem, portanto, aqueles selecionados como positivos para uma quantidade insuficiente ou uma deficiência em um produto genético funcional (por exemplo, proteína FVIII), ou que produzem um produto genético aberrante, parcialmente funcional ou não funcional (por exemplo, proteína FVIII).
[0276] A administração ou entrega in vivo a um indivíduo de acordo com os métodos e usos da invenção, conforme divulgado neste documento, pode ser praticada dentro de 1-2, 2-4, 4-12, 12-24 ou 24-72 horas após uma o indivíduo foi identificado como tendo a doença direcionada para tratamento, tem um ou mais sintomas da doença, foi rastreado e é identificado como positivo, conforme estabelecido aqui, mesmo que o indivíduo não tenha um ou mais sintomas da doença. Obviamente, os métodos e usos da invenção podem ser praticados 1 a 7, 7 a 14, 14 a 21, 21 a 48 ou mais dias, meses ou anos após um indivíduo ter sido identificado como tendo a doença direcionada para o tratamento, tendo um ou mais sintomas da doença, ou tendo sido triado e identificado como positivo, conforme aqui estabelecido.
[0277] Uma "forma de dosagem unitária", conforme aqui utilizada, refere-se a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para o indivíduo a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada opcionalmente em associação com um veículo farmacêutico (excipiente, diluente, veículo ou agente de enchimento) que, quando administrado em uma ou mais doses, é calculado para produzir o efeito desejado (por exemplo, efeito profilático ou terapêutico). As formas de dosagem unitária podem estar dentro, por exemplo, de ampolas e frascos, que podem incluir uma composição líquida, ou uma composição em estado liofilizado ou liofilizado; um veículo líquido estéril, por exemplo, pode ser adicionado antes da administração ou entrega in vivo. As formas de dosagem unitária individuais podem ser incluídas em kits ou recipientes de doses múltiplas. Sequências de vetores recombinantes (por exemplo, rAAV), partículas de vírus recombinantes e composições farmacêuticas podem ser empacotadas em forma de dosagem unitária única ou múltipla para facilitar a administração e uniformidade da dosagem.
[0278] Os indivíduos podem ser testados quanto às quantidades de FVIII e FVIII-BDD ou atividade de FVIII e FVIII-BDD para determinar se esses indivíduos são apropriados para tratamento de acordo com um método da invenção. Os indivíduos candidatos para hemofilia podem ser testados quanto às quantidades ou atividade de FVIII e FVIII-BDD antes do tratamento, de acordo com um método da invenção. Os indivíduos também podem ser testados quanto à quantidade de atividade de FVIII e FVIII-BDD ou FVIII e FVIII-BDD após o tratamento, de acordo com um método da invenção. Esses indivíduos tratados podem ser monitorados após o tratamento das quantidades de FVIII e FVIII-BDD ou atividade de FVIII e FVIII-BDD, periodicamente, por exemplo, a cada 1 a 4 semanas ou 1 a 6 meses.
[0279] Os indivíduos podem ser testados para uma ou mais enzimas hepáticas em busca de uma resposta adversa ou para determinar se esses indivíduos são apropriados para o tratamento de acordo com um método da invenção. Os indivíduos candidatos para hemofilia podem, portanto, ser triados quanto a quantidades de uma ou mais enzimas hepáticas antes do tratamento, de acordo com um método da invenção. Os indivíduos também podem ser testados para quantidades de uma ou mais enzimas hepáticas após o tratamento, de acordo com um método da invenção. Esses indivíduos tratados podem ser monitorados após o tratamento de enzimas hepáticas elevadas, periodicamente, por exemplo, a cada 1 a 4 semanas ou 1 a 6 meses.
[0280] As enzimas hepáticas exemplificadoras incluem alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e lactato desidrogenase (LDH), mas outras enzimas indicativas de dano hepático também podem ser monitoradas. Um nível normal dessas enzimas na circulação é tipicamente definido como um intervalo que tem um nível superior, acima do qual o nível da enzima é considerado elevado e, portanto, indicativo de lesão hepática. Uma faixa normal depende em parte dos padrões utilizados pelo laboratório clínico que conduz o teste.
[0281] Os indivíduos podem ser monitorados quanto a episódios de sangramento para determinar se esses indivíduos são elegíveis para responder ao tratamento, e/ou a quantidade ou a duração da resposta. Os indivíduos podem ser monitorados quanto a episódios de sangramento para determinar se esses indivíduos precisam de um tratamento adicional, por exemplo, uma administração subsequente do vetor AAV ou administração de um agente imunossupressor ou monitoramento mais frequente. Os indivíduos hemofílicos podem, portanto, ser monitorados quanto a epsiodoes hemorrágicos antes e após o tratamento, de acordo com um método da invenção. Os indivíduos também podem ser testados quanto à frequência e gravidade dos episódios de sangramento durante ou após o tratamento, de acordo com um método da invenção.
[0282] A invenção fornece kits com material de embalagem e um ou mais componentes no mesmo. Um kit inclui tipicamente uma etiqueta ou bula, incluindo uma descrição dos componentes ou instruções para uso in vitro, in vivo ou ex vivo, dos componentes nele contidos. Um kit pode conter uma coleção desses componentes, por exemplo, um ácido nucleico, vetor recombinante, vetor de vírus (por exemplo, AAV) ou partícula de vírus e opcionalmente um segundo ativo, como outro composto, agente, medicamento ou composição.
[0283] Um kit refere-se a uma estrutura física que abriga um ou mais componentes do kit. O material de embalagem pode manter os componentes esterilmente e pode ser feito de material comumente usado para esses fins (por exemplo, papel, fibra de papelão ondulado, vidro, plástico, papel alumínio, ampolas, ampolas, frascos, tubos, etc.).
[0284] As etiquetas ou inserções podem incluir informações de identificação de um ou mais componentes, quantidades de doses, farmacologia clínica do ingrediente ativo (ou ingredientes ativos), incluindo mecanismo de ação, farmacocinética e farmacodinâmica. As etiquetas ou inserções podem incluir informações que identificam o fabricante, números de lote, local e data de fabricação, datas de validade. As etiquetas ou inserções podem incluir informações que identificam as informações do fabricante, números de lote, localização e data do fabricante. As etiquetas ou inserções podem incluir informações sobre uma doença para a qual um componente do kit pode ser usado. As etiquetas ou inserções podem incluir instruções para o clínico ou paciente sobre o uso de um ou mais componentes do kit em um método, uso ou protocolo de tratamento ou regime terapêutico. As instruções podem incluir quantidades de dosagem, frequência ou duração e instruções para praticar qualquer um dos métodos, usos, protocolos de tratamento ou regimes profiláticos ou terapêuticos descritos aqui.
[0285] As etiquetas ou inserções podem incluir informações sobre qualquer benefício que um componente possa proporcionar, como um benefício profilático ou terapêutico. Etiquetas ou bulas podem incluir informações sobre possíveis efeitos colaterais adversos, complicações ou reações, como avisos ao paciente ou ao médico sobre situações em que não seria apropriado usar uma composição específica. Efeitos colaterais adversos ou complicações também podem ocorrer quando o paciente está tomando um ou mais medicamentos incompatíveis com a composição, ou o paciente está passando por outro protocolo de tratamento ou regime terapêutico que seria incompatível com a composição e, portanto, as instruções podem incluir informações sobre essas incompatibilidades.
[0286] As etiquetas ou inserções incluem “material impresso”, por exemplo, papel ou papelão, ou separado ou afixado a um componente, um kit ou material de embalagem (por exemplo, uma caixa) ou anexado a uma ampola, tubo ou frasco contendo um componente do kit. As etiquetas ou inserções podem incluir adicionalmente um meio legível por computador, como uma etiqueta impressa com código de barras, um disco, um disco óptico como CD ou DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, fita magnética ou uma mídia de armazenamento elétrico, como RAM e ROM ou híbridos, como mídia de armazenamento magnético/óptico, mídia FLASH ou cartões do tipo memória.
[0287] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é comumente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou no teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos aqui.
[0288] Todas as patentes, pedidos de patente, publicações e outras referências, citações de GenBank e ATCC citadas aqui são incorporadas por referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o relatório descritivo, incluindo definições, controlará.
[0289] Vários termos relacionados às moléculas biológicas da invenção são usados acima e também em todo o relatório descritivo e reivindicações.
[0290] Todos os recursos divulgados neste documento podem ser combinados em qualquer combinação. Cada recurso divulgado no relatório descritivo pode ser substituído por um recurso alternativo que serve a uma mesma finalidade, equivalente ou similar. Assim, a menos que expressamente indicado de outra forma, os recursos divulgados (por exemplo, variantes de ácido nucleico reduzidas em CpG que codificam FVIII, vetor, plasmídeo, expressão/sequência de vetores recombinantes (por exemplo, rAAV) ou partícula de vírus recombinante) são um exemplo de um gênero de recursos equivalentes ou similares.
[0291] Como usadas neste documento, as formas singulares "um/uma", "e" e "o/a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um ácido nucleico" inclui uma pluralidade de tais ácidos nucleicos, a referência a "um vetor" inclui uma pluralidade de tais vetores e a referência a "um vírus" ou "partícula" inclui uma pluralidade de tais vírus/partículas.
[0292] Conforme usado neste documento, todos os valores numéricos ou intervalos numéricos incluem números inteiros dentro desses intervalos e frações dos valores ou números inteiros dentro dos intervalos, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, para ilustrar, a referência a 80% ou mais de identidade inclui 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% etc., bem como 81,1%, 81,2%, 81,3%, 81,4%, 81,5% etc., 82,1%, 82,2%, 82,3%, 82,4%, 82,5%, etc., e assim por diante.
[0293] A referência a um número inteiro com mais (maior) ou menor que inclui qualquer número maior ou menor que o número de referência, respectivamente. Assim, por exemplo, uma referência a menos de 100 inclui 99, 98, 97, etc., até o número um (1); e menos de 10, inclui 9, 8, 7, etc., até o número um (1).
[0294] Conforme usado neste documento, todos os valores ou intervalos numéricos incluem frações dos valores e números inteiros dentro desses intervalos e frações dos números inteiros dentro desses intervalos, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, para ilustrar, a referência a um intervalo numérico, como 1 a 10, inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, além de 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, etc., e assim por diante. A referência a um intervalo de 1 a 50 inclui, portanto, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc., até e inclusive 50, bem como 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, etc., 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, etc., e assim por diante.
[0295] A referência a uma série de faixas inclui faixas que combinam os valores dos limites de diferentes intervalos dentro da série. Assim, para ilustrar a referência a uma série de faixas, por exemplo, de 1 a 10, 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40,
40 a 50, 50 a 60, 60 a 75, 75 a 100, 100 a 150 , 150 a 200, 200 a 250, 250 a 300, 300 a 400, 400 a 500, 500 a 750, 750 a 850, inclui faixas de 1 a 20, 1 a 30, 1 a 40, 1 a 50, 1 a 60, 10 a 30, 10 a 40, 10 a 50, 10 a 60, 10 a 70, 10 a 80, 20 a 40, 20 a 50, 20 a 60, 20 a 70, 20 a 80, 20 a 90, 50 a 75, 50 a 100, 50 a 150, 50 a 200, 50 a 250, 100 a 200, 100 a 250, 100 a 300, 100 a 350, 100 a 400, 100 a 500, 150 a 250, 150 a 300, 150 a 350, 150 a 400, 150 a 450, 150 a 500, etc.
[0296] A invenção é geralmente divulgada aqui usando linguagem afirmativa para descrever as inúmeras modalidades e aspectos. A invenção também inclui especificamente modalidades nas quais um determinado assunto é excluído, no todo ou em parte, como substâncias ou materiais, etapas e condições do método, protocolos ou procedimentos. Por exemplo, em certas modalidades ou aspectos da invenção, as etapas de materiais e/ou métodos são excluídas. Assim, mesmo que a invenção geralmente não seja expressa aqui em termos do que a invenção não inclui, aspectos que não sejam expressamente excluídos na invenção são, no entanto, aqui divulgados.
[0297] Várias modalidades da invenção foram descritas. No entanto, um versado na técnica, sem se afastar do espírito e escopo da invenção, pode fazer várias alterações e modificações na invenção para adaptá-la a vários usos e condições. Consequentemente, os exemplos a seguir pretendem ilustrar, mas não limitar, o escopo da invenção reivindicada de qualquer forma. EXEMPLO 1 Sequência de DNA do fator VIII reduzido em CpG e determinados construtos de vetor, construtos de plasmídeo e linhagens celulares produtoras do vetor de AAV.
[0298] 18 diferentes variantes de ácido nucleico reduzido em CpG que codificam FVIII (SEQ ID NOs: 1-18) foram produzidas e avaliadas em ensaios de expressão. Os construtos de cDNA de FVIII humano reduzidos em CpG foram gerados com um promotor de transtirretina mutante (TTRmut) (SEQ ID NO: 22).
[0299] O cassete de expressão AAV-SPK-8011 tem a sequência de ácido nucleico FVIII-X07 reduzida em CpG e o capsídeo LK03 para empacotamento.
O capsídeo LK03 possui homologia substancial com o AAV3, um vírus de DNA de fita simples, não patogênico e com deficiência de replicação natural.
[0300] O plasmídeo de empacotamento pLK03 é um construto de plasmídeo de 7.484 pb que transporta os genes AAV2 Rep e AAV-LK03 Cap sob o controle do promotor AAV2 p5, origem bacteriana da replicação e gene que confere resistência à canamicina nas células bacterianas. Nesse construto, o promotor de p5 rep foi movido 3' do gene cap para reduzir o potencial de formação de espécies AAV de tipo selvagem ou pseudo-selvagem e aumentar o rendimento do vetor.
[0301] O DNA clonado para transferência de genes é um cassete de expressão gênica, empacotado no capsídeo AAV-LK03 como um genoma de fita simples, codificando o fator VIII de coagulação humana (hFVIII) sob controle de um promotor específico do fígado. O plasmídeo de expressão é referido como pAAV- TTRmut-hFVIII-X07. Foi modificado pela introdução de mutações de 4 pontos no promotor TTR, e a região codificante otimizada para aumentar a expressão do FVIII humano. O cassete de expressão do AAV contém os seguintes elementos:  ITR de AAV2  Promotor de transtirretina (TTR): Um promotor de transtirretina (TTR) específico do fígado com mutações de 4 pontos que aumentam a expressão gênica em comparação com o promotor de tipo selvagem (Costa et al. 1991)  Ítron sintético: Derivado do gene alfa do fator de alongamento humano EF-1  Sequência de codificação do FVIII: sequência de codificação do FVIII humano deletada do domínio B, otimizada por códon.  Sequência de sinal poli A de beta globina de coelho (Levitt et al. 1989).  ITR de AAV2
[0302] Três construtos de plasmídeo de DNA são usados para transfectar 293 células de rim de embrião humano para produzir o vetor SPK-8011 por um processo livre de vírus auxiliar (Matsushita et al. 1998):
 O cassete genético (sequência de codificação de hFVIII e elementos reguladores associados) é clonado em um plasmídeo para fornecer o plasmídeo vetorial, pAAV-TTRmut-hFVIII-X07.  O genoma viral do AAV (rep e cap) sem as ITRs virais é clonado em um plasmídeo para fornecer o plasmídeo de empacotamento do AAV, pLK03, fornecendo os genes de cap AAV2 rep e AAV-LK03 necessários em trans para o empacotamento do vetor AAV. O promotor viral (p5) para o gene rep foi realocado no plasmídeo para evitar a formação de AAV competente para replicação por recombinação não homóloga.  Três genes do adenovírus-2 são clonados em um terceiro plasmídeo (pCCVC-AD2HP), fornecendo os genes do vírus auxiliar necessários para a produção do vetor. O plasmídeo pCCVC-AD2HPv2 é uma construção plasmídica de
11.832 pb que transporta três genes de adenovírus, E2A, E4 e os RNAs VA para fornecer funções “auxiliares” necessárias para replicação e encapsidação do vetor AAV. O plasmídeo pCCVC-AD2HPv2 é um derivado do pCCVC-AD2HP no qual o fragmento de restrição DrdI–DrdI 1882bp contendo o gene AmpR e parte da sequência de pUC ori foi removido e substituído pelo fragmento DrdI-DrdI do plasmídeo pAAV2-hRPE65v2 contendo todo o fragmento Gene KanR e parte da sequência ori da pUC.
[0303] O substrato celular usado para a produção do vetor AAV é um derivado das células renais embrionárias humanas primárias (HEK) 293. A linhagem celular HEK293 é uma linhagem permanente transformada pelo DNA de adenovírus humano de cisalhamento tipo 5 (Ad5) (Graham et al. 1977). O Banco de Células de Trabalho é derivado de um banco de células principais HEK293 caracterizado do Centro de Terapia Celular e Molecular (CCMT) do Hospital Infantil da Filadélfia (CHOP). EXEMPLO 2 Avaliação de vetores AAV-SPK-8005 e AAV-SPK-8011(capsídeo LK03, FVIII-X07 (SEQ ID NO:7)) em primatas não humanos (NHPs).
[0304] Construtos de transgene de FVIII empacotados em vetores virais adenoassociados (AAV) foram entregues a primata não humanos (NHPs). Um estudo piloto e um estudo BPL foram realizados.
[0305] Em resumo, foi realizado um estudo de variação de dose em macacos machos cinomolgos administrados com uma infusão intravenosa única de AAV-SPK-8005 ou AAV-SPK-8011 (capsídeo LK03). A expressão de hFVIII foi avaliada ao longo de 8 semanas. Os grupos de animais e os níveis de dose de cada vetor (estudo piloto) são mostrados na Figura 1.
[0306] Os NHPs receberam uma infusão intravenosa através da veia safena usando uma bomba de infusão calibrada por aproximadamente 30 minutos. Os macacos foram pré-selecionados para anticorpos neutralizantes contra o capsídeo do AAV. Todos os animais tratados foram inicialmente determinados como tendo uma titulação <1:3 antes da administração do vetor. Isso foi feito para garantir a transdução hepática bem-sucedida, pois mesmo os títulos baixos inibem a captação do vetor pelas células hepáticas após o parto sistêmico (Jiang et al. 2006). Todos os animais também foram negativos quanto à presença de anticorpos neutralizantes contra o FVIII antes da transferência do gene.
[0307] Os níveis plasmáticos de hFVIII foram medidos por um ELISA específico para humanos que não detecta o FVIII endógeno de cinomolgos. Todos os animais do estudo, com exceção de um macaco na coorte de dose média, expressam hFVIII após a entrega do vetor. Os níveis de antígeno de fator VIII humano atingiram o pico em cerca de 1 a 2 semanas após a administração do vetor. Uma semana após a transferência do gene, os NHPs transduzidos com 2x1012 gv/kg de AAV-SPK-8005 expressaram níveis de antígeno hFVIII de 13,2 ± 3% (média ± erro padrão da média). Uma semana após a transferência do gene, os níveis médios de hFVIII em dois dos três animais na próxima coorte de tratamento (5x1012 gv/kg) foram de 27 ± 0,2%. O FVIII humano não pôde ser detectado no terceiro macaco nessa coorte a qualquer momento. Após o re-teste das amostras de plasma da linha de base, foi determinado que esse animal era de fato positivo para a presença de AAV antibloqueio e que a titulação inicialmente determinada de <1:3 estava incorreta. Finalmente, na dose mais alta testada de 1x1013 gv/kg, foram observados picos de níveis de antígeno hFVIII de 54,1 ± 15,6% após a infusão de AAV.
[0308] A expressão humana de FVIII diminuiu em aproximadamente um terço dos animais por volta da semana 4, concomitantemente com o aparecimento de anticorpos inibidores de hFVIII nesses três macacos (rotulados com um símbolo ε na Figura 2). O desenvolvimento de anticorpos específicos da espécie para o hFVIII tem sido previamente documentado em primatas não humanos, e é provavelmente devido a diferenças em vários resíduos de aminoácidos entre o produto do transgene humano e o cinomolgos endógeno FVIII (McIntosh, J. et al., Blood 121: 3335-44 (2013)).
[0309] Para avaliar o potencial de trombogênese devido à expressão contínua de FVIII humano, os níveis de antígeno do dímero D foram medidos neste estudo. Deve-se notar que os relatórios sobre a relevância clínica ou mesmo os valores normais dos níveis de antígeno do dímero D em macacos cinomolgos são escassos; como referência, o intervalo normal para os dímeros D em seres humanos é inferior a 500 ng/ml. Como os animais expressam o cinomolgos endógeno FVIII, a produção de hFVIII como resultado da transferência de genes hepáticos resultará em níveis suprafisiológicos da atividade do FVIII.
[0310] O animal recebeu uma dose de 5x1012 gv/kg, mas não expressou o FVIII humano, teve um pico de 863 ng/ml duas semanas após a infusão de AAV. O restante dos animais não apresentou aumento significativo nos níveis de antígeno do dímero D em comparação com os valores basais. Tomados em conjunto, esses resultados sugerem que a expressão do FVIII humano, nos níveis visados neste estudo, não está associada a um risco aumentado de trombose.
[0311] Quatro semanas após a administração do vetor, nenhuma alteração relacionada ao vetor foi aparente. Os testes de função hepática mostraram valores normais, com pequenas flutuações que pareciam não estar relacionadas à dose do vetor, pois estavam presentes antes da dosagem na maioria dos casos (Figura 3).
[0312] Os níveis do dímero D até a semana 5 são mostrados na Figura
4. Um animal na coorte de alta dose apresentou uma elevação transitória leve (577 ng/ml) nos níveis do dímero D uma semana após a administração do vetor, quando circulava humano O FVIII atingiu um pico de cerca de 100%; os níveis do dímero D voltaram rapidamente ao normal após esta única medição de elevação. Notavelmente, não houve correlação entre os níveis do dímero D e os níveis de antígeno hFVIII (Figura 4, painéis inferiores).
[0313] Para o vetor AAV-SPK-8011 (LK03 capsídeo) em um estudo piloto, três coortes de macacos cinomolgis (n = 3) foram tratadas com doses crescentes de AAV-SPK-8011 (capsídeo LK03) (2x1012, 6x1012 e 2x1013 (gv/kg); Figura 1). Em um estudo de BPL, foram utilizadas doses do vetor 3x10 12, 6x1012 e 2x1013 gv/kg (AAV-SPK-8011 (capsídeo LK03)).
[0314] Foram utilizados um total de 11 NHPs em cada estudo. O estudo piloto teve um período de observação de 10 semanas na ausência de imunossupressão. Isto foi seguido por uma fase de imunossupressão de 12 semanas, que foi incorporada para erradicar os anticorpos anti-hFVIII que foram gerados durante as 10 semanas iniciais do estudo. Posteriormente, os animais foram seguidos por mais 20 semanas.
[0315] Os animais foram monitorados quanto a observações clínicas, patologia clínica dos pesos corporais (química clínica, hematologia, coagulação, exame de urina). Além disso, os níveis de antígeno hFVIII, anticorpos inibidores de FVIII e níveis de dímero D foram avaliados ao longo do estudo.
[0316] Os dados do estudo piloto do antígeno hFVIII são mostrados na Figura 6. Os níveis médios de antígeno hFVIII atingiram o pico na semana 2-3, com 22,3 ± 6,2% de hFVIII na coorte de baixa dose e 61,6 ± 15,7% e 153 ± 58,1% observados nas coortes de dose média e alta, respectivamente, usando 150 ng/ml como nível de antígeno hFVIII 100% normal (Figuras 6A-6D).
[0317] No estudo de toxicologia das BPL, a transferência de genes hepáticos por infusão de SPK-8011 por veias periféricas também levou à expressão de hFVIII em todos os animais. Na dose baixa de 3x10 12 gv/kg, os níveis de antígeno hFVIII variaram de 5 a 40% do normal, com um nível de pico médio por volta da semana 2 após a administração do AAV de 20,3 ± 11% (média ± SEM). Os níveis médios de antígeno hFVIII na coorte 6x10 12 gv/kg foram 40,7 ± 4% da normal.
[0318] Assim, o sorotipo LK03 de capsídeo de AAV transduz eficientemente hepatócitos de NHP in vivo, ao contrário do fígado de camundongo. Apesar dos níveis terapêuticos de hFVIII observados logo após a transferência de genes, na maioria dos animais os níveis começaram a declinar por volta da semana
4.
[0319] A resposta humoral a hFVIII no plasma de macacos cinomolgos foi medida após a administração de AAV-SPK-8011 (capsídeo LK03). Os animais foram avaliados quanto a anticorpos anti-hFVIII IgG por ELISA na linha de base e nos momentos indicados.
[0320] A maioria dos animais tratados com vetores nos estudos piloto e das BPL desenvolveu anticorpos neutralizantes anti-FVIII, um resultado esperado com base em estudos pré-clínicos de macacos cinomolgos, bem como em relatórios de outros (McIntosh, J. et al., 121: 3335-44 (2013)). Anticorpos neutralizantes contra a proteína FVIII humana, que normalmente aparece a partir de três semanas após a infusão de AAV em macacos, impedem a detecção do antígeno hFVIII circulante. Como resultado, os picos de níveis de antígeno hFVIII por volta das semanas 2-3 (isto é, antes do aparecimento de anticorpos inibidores contra hFVIII) podem ser usados para estimar a dose de vetor inicial adequada em indivíduos humanos. As curvas dose-resposta de SPK-8011 nos estudos piloto e de NHO das BPL são mostradas na Figura 7.
[0321] Os níveis de expressão de FVIII atingidos com AAV-SPK-8011 (capsídeo LK03) foram comparados com os níveis relatados de FVIII atingidos com vetores AAV baseados em capsídeo AAV5 e AAV8 para entrega de FVIII. Uma comparação revelou que os níveis de FVIII alcançados com o AAV-SPK-8011 (capsídeo LK03) foram maiores que os níveis relatados de FVIII entregues por meio de vetores AAV com capsídeos AAV5 e AAV8 (Figura 8). EXEMPLO 3
Biodistribuição de capsídeo AAV-LK03 em primatas não humanos (NHPs).
[0322] A biodistribuição do capsídeo AAV-LK03 em primata não humanos foi avaliada em um estudo sem BPL. A administração intravenosa de um vetor encapsidado por AAV-LK03 que codifica o fator IX de coagulação humana (AAV-LK03-hFIX) mostrou que os dois principais tecidos alvo são o fígado e o baço (Figura 9). O tropismo esplênico não é uma característica única do AAV-LK03. Por exemplo, o capsídeo AAV5, que tem sido usado em vários ensaios de terapia genética direcionada ao fígado (por exemplo, NCT02396342, NCT02082860, NCT02576795) com um forte registro de segurança, tem como alvo o baço com a mesma eficácia, se não maior, do que o fígado de primata não humanos (Paneda et al. 2013). O cassete de expressão SPK-8011 usa o promotor transtiretina ou TTR de camundongo, que é considerado específico do fígado (Costa, 1991). Para apoiar ainda mais a natureza específica do fígado do promotor, uma análise de expressão baseada em PCR mediu a expressão de FVIII derivada de vetor nos fígados e baços de camundongos após a administração de um vetor AAV diferente que empacota o mesmo cassete de expressão que SPK-8011 (isto é, AAV-SPK-8005). Como mostrado na Figura 10, a expressão humana de FVIII no baço é várias ordens de magnitude mais baixa em comparação com a derivada de hepatócitos.
[0323] Esse é o primeiro estudo clínico a usar AAV-LK03, embora tenham sido realizados estudos usando outros vetores de AAV, incluindo vários para hemofilia B (NCT02396342, NCT01620801 NCT00076557, NCT02484092, NCT02618915, NCT00979238, NCT01687258) e um para hemofilia B (NCT02396342, NCT01620801). Um estudo conduzido pelo Hospital de Pesquisa St. Jude Children em colaboração com a University College London utilizou um vetor AAV8 contendo um genoma autocomplementar que codifica um cDNA do fator IX humano otimizado por códon, scAAV2/8-LP1-hFIXco. Dez indivíduos que receberam o vetor tiveram níveis estáveis de fator IX de 1 a 6% por uma mediana de 3,2 anos e todos os participantes interromperam ou reduziram o uso de reposição profilática de fatores (Nathwani et al. 2014). Um estudo clínico para hemofilia A utilizou um vetor encapsidado por AAV5 que codifica FVIII humano (NCT02576795). Os dados preliminares apresentados em 2016 demonstram aumentos na atividade do FVIII após a transferência de genes em vários indivíduos, variando de 2 a 60% com acompanhamento de até 16 semanas (BioMarin, abril de 2016). EXEMPLO 4 Eficiência de transdução de capsídeo AAV-LK03 analisada em uma configuração in vitro.
[0324] Os hepatócitos primários do macaco cynomolgus e de origem humana foram transduzidos com um vetor AAV-LK03 expressando luciferase em quatro diferentes multiplicidades de infecção (MOI) variando de 500 a 62.500 genomas vetoriais por célula. Setenta e duas horas após a transdução, a expressão da luciferase foi analisada.
[0325] O capsídeo AAV-LK03 demonstrou exclusivamente uma eficiência significativamente maior na transdução de hepatócitos humanos em cultura. No exemplo representativo mostrado na Figura 11, o LK03 demonstrou uma eficiência aproximadamente 5 vezes maior na transdução de hepatócitos humanos em comparação com hepatócitos primata não humano in vitro. É importante ressaltar que esses resultados são consistentes em vários MOIs e replicam estudos. EXEMPLO 5 Cálculos de doses em ensaios clínicos em humanos
[0326] Com base nos níveis de hFVIII observados em primata não humanos (NHPs), foi determinada uma estimativa dos níveis esperados de FVIII na dose inicial proposta de 5x10 11 gv/kg em humanos. Uma vez que lotes de vetores diferentes podem ter eficácia de transdução hepática ligeiramente diferente, os dados dos estudos piloto e de toxicologia do GLP NHP foram usados para interpolar uma faixa de concentrações de FVIII após a administração de 5x10 11 gv/kg. Para esta análise, foi utilizado um modelo de regressão linear (Figura 12), isto é, a relação entre a dose de AAV e os níveis de expressão de hFVIII resultantes não foi significativamente diferente da linearidade (Tabela 2). Tabela 2
Piloto BPL Valores de melhor ajuste 6,099e-012 ± 7,962e- 5,170e-012 ± 6,421e- Inclinação 013 013 Interceptação em Y quando X=0.0 0 0 Interceptação em X quando Y=0.0 0 0 1/inclinação 1,64E+11 1,934E+11 Intervalos de confiança de 95% 4,346e-012 a 7,851e- 3,756e-012 a 6,583e- Inclinação 012 012 Qualidade de ajuste Sy.x 28,93 15,29 A inclinação é significativamente não zero? t 7,66 8,051 DF 11 11 Valor P < 0,0001 < 0,0001 Desvio de zero? Significativo Significativo Dados Números de valores de X 4 4 Número máximo de réplicas de Y 3 3 Número total de valores 12 12 Número de valores ausentes 3 3 Execuções de teste Pontos acima da linha 2 2 Pontos abaixo da linha 1 1 Número de execuções 2 2 valor P (execuções de teste) 0,6667 0,6667 Desvio da linearidade Não Significativo Não Significativo Y = 6,099e-012*X - Y = 5,170e-012*X - Equação 0,0 0,0
[0327] Utilizando o modelo de regressão linear mostrado acima, estimou-se que os níveis médios de FVIII ao infundir SPK-8011 na dose de 5x1011 gv/kg seriam de cerca de 2,6% a 3,0% do normal. No entanto, essa curva de regressão linear parece subestimar os valores reais observados em animais com doses baixas e médias quando a equação na Tabela 2 é usada para calcular novamente os valores de expressão esperados de FVIII em 2x10 12 gv/kg, 3x10 12 gv/kg e 6x1012 gv/kg (Tabela 3).
Tabela 3 Piloto BPL FVIII FVIII Interpolad FVIII FVIII Interpolad (Interpolado (Real o versus (Interpolado (Real o versus Dose ) ) real (%) Dose ) ) real (%) 2E+1 2 12,2 22,3 54,8 3E+12 15,5 20,3 76,4 6E+1 2 36,6 61,6 59,4 6E+12 31,0 40,7 76,2 2E+1 1,2E+1 3 122,0 113,5 107,5 3 62,0 56,0 110,8
[0328] É possível que a expressão de hFVIII possa seguir uma resposta linear à dose em certas doses de vetor, enquanto atinge a saturação à medida que a carga do vetor AAV é aumentada. A coorte de dose alta foi removida da análise anterior, a curva de regressão linear recalculada e reavaliada os níveis de expressão previstos de hFVIII em uma dose SPK-8011 de 5x1011 gv/kg determinada (Tabela 4 e Figura 13). Tabela 4 Piloto BLP Valores de melhor ajuste 6,099e-012 ± 7,962e- 5,170e-012 ± 6,421e- Inclinação 013 013 Interceptação em Y quando X=0.0 0 0 Interceptação em X quando Y=0.0 0 0 1/inclinação 1,64E+11 1,934E+11 Intervalos de confiança de 95% 4,346e-012 to 7,851e- 3,756e-012 to 6,583e- Inclinação 012 012 Qualidade de ajuste Sy.x 28,93 15,29 A inclinação é significativamente não zero? t 7,66 8,051 DF 11 11 Valor P < 0,0001 < 0,0001 Desvio de zero? Significativo Significativo Dados Número de valores X 4 4 Número máximo de réplicas de Y 3 3 Número total de valores 12 12
Número de valores ausentes 12 12 Execuções de teste Pontos acima da linha 2 2 Pontos abaixo da linha 1 1 Número de execuções 2 2 Valor P (execuções de teste) 0,6667 0,6667 Desvio da linearidade Não Significativo Não Significativo’ Equação Y = 6,099e-012*X - 0,0 Y = 5,170e-012*X - 0,0
[0329] Com as curvas de regressão linear mostradas na Figura 13, os níveis médios de FVIII ao infundir SPK-8011 na dose de 5x1011 gv/kg foram estimados em aproximadamente entre 3,4% e 5,2% do normal. EXEMPLO 6 Projeto de ensaio clínico humano
[0330] Eligibilidade  Idades elegíveis para estudo: 18 anos ou mais (adulto, sênior)  Sexo elegível para estudo: masculino  Aceita Voluntários Saudáveis: Não
[0331] Critérios: Critérios de Inclusão:  Homens com idade igual ou superior a 18 anos  Diagnóstico confirmado de hemofilia A, como evidenciado pelo histórico médico com níveis plasmáticos de atividade do FVIII ≤ 2% do normal  Receberam >150 dias de exposição (DEs) a concentrados do FVIII ou crioprecipitados  Ocorreu mais de 10 eventos hemorrágicos nos últimos 12 meses apenas se estiver recebendo terapia sob demanda e com nível basal de FVIII 1-2% do normal  Não tem histórico prévio de reação alérgica a qualquer produto FVIII  Não possui inibidor mensurável contra o inibidor do fator VIII, avaliado pelo laboratório central e não possui histórico prévio de inibidores da proteína FVIII  Concorda em usar métodos contraceptivos confiáveis
[0332] Critérios: Critérios de Exclusão:  Evidência de hepatite B ou C ativa  Atualmente em terapia antiviral para hepatite B ou C  Tem doença hepática subjacente significativa  Ter evidência sorológica* de HIV-1 ou HIV-2 com contagens de CD4 ≤200/mm3 (* participantes que são HIV+ e estáveis com contagens de CD4 >200/mm3 e carga viral indetectável são elegíveis para se inscrever)  Possuem anticorpos detectáveis reativos com o capsídeo AAV- Spark200  Participou de um estudo de transferência de genes nas últimas 52 semanas ou de um ensaio clínico com um produto sob investigação nas últimas 12 semanas EXEMPLO 7 Níveis de FVIII previstos em doses diferentes de AAV-SPK- 8011(capsídeo LK03)-hFVIII
[0333] O estudo clínico NCT03003533 (“Um estudo de transferência de genes para hemofilia A”) é o primeiro uso em humanos do capsídeo do AAV conhecido como LK03 (SEQ ID NO: 27). Estudos em primatas não humanos mostram que doses crescentes de AAV-SPK-8011 (capsídeo LK03)-hFVIII resultam em níveis crescentes de FVIII humano circulante de maneira dependente da dose que, pelo menos para algumas faixas de doses, não parece se desviar significativamente da linearidade. Os níveis médios de FVIII no estado estacionário (± erro padrão da média) na primeira coorte foram aproximadamente 11,7 ± 2,3% do normal. Dado o n de dois participantes nessa coorte de doses, é difícil prever se a variabilidade relativamente baixa nos níveis de FVIII observada será mantida à medida que mais participantes forem incluídos no estudo.
[0334] Experiência recente usando os vetores de rAAV para mediar a expressão de um fator de coagulação no fígado, usando o produto experimental rAAV-FIX para o tratamento da hemofilia B (NCT02484092), pode ser uma referência útil para estimar a variabilidade em uma coorte maior de indivíduos.
A expressão de FIX no estado estacionário foi atingida 12 semanas após a infusão do vetor rAAV-FIX, resultando em uma atividade média de FIX (FIX:C) de aproximadamente 33%. É importante ressaltar que os níveis mais altos de FIX:C estavam em torno de 79% (indivíduo 9) e os níveis mais baixos estavam em torno de 14% (indivíduo 7). É importante notar que a interpretação da potência do vetor no indivíduo 7 foi confundida pela ocorrência de uma resposta imune contra o capsídeo do vetor rAAV-FIX, que resultou em perda parcial da expressão do FIX antes que um curto ciclo de esteroides fosse iniciado.
O indivíduo 6, no entanto, no qual nenhuma resposta imune celular foi detectada, apresentava níveis de estado estacionário de aproximadamente 18%. Assim, a diferença entre os níveis mais alto e mais baixo de FIX:C no estudo NCT02484092 foi de aproximadamente 4 vezes.
Outros ensaios clínicos de AAV para o tratamento da hemofilia mostraram variabilidade significativamente maior.
Pasi et al. (2017) Thromb Haemost. 117 (3): 508-518. A Tabela 5 mostra os níveis médios previstos de FVIII em diferentes doses de AAV-SPK-8011 (capsídeo LK03)-hFVIII, assumindo uma resposta dose-linear.
A variabilidade observada no estudo da hemofilia B foi usada como uma abordagem conservadora para estimar a variabilidade no estudo da hemofilia A.
Tabela 5 Expressor Média Expressor Dose mais estimada mais alto (gv/kg) baixo * estimado estimado 5,00E+11 6 12 24 1,00E+12 12 24 48 2,00E+12 24 48 96 4,00E+12 48 96 192 6,00E+12 96 192 384 * Média real observada na coorte 5x1011 gv/kg.
EXEMPLO 8 Resultados do ensaio clínico humano
[0335] Um estudo de aumento de dose foi realizado em doze homens com hemofilia A grave (N = 11) ou moderadamente grave (N = 1) A. Os indivíduos tinham idades entre 18 e 52 anos. Antes da terapia genética, 8 dos 12 indivíduos foram tratados com profilaxia e 4 dos 12 indivíduos com tratamento episódico. Os indivíduos foram inscritos em uma das três coortes de dosagem e infundidos com SPK-8011 (AAV-hFVIII, LK03 capsídeo) na dose de 5x1011 gv/kg (N = 2, Indivíduos 1 e 2), 1x1012 gv/kg (N = 3, Indivíduos 3, 4 e 6), ou 2x1012 gv/kg (N = 7, Indivíduos 5 e 7 a 12).
[0336] As Figuras 14 a 28 mostram os dados do estudo de resposta à dose dos 12 indivíduos humanos que administraram as três doses diferentes de AAV-SPK-8011 (capsídeo LK03)-hFVIII. Os valores da atividade do FVIII determinados nos indivíduos são relativos a 100% de FVIII no plasma normal. Tipicamente, o plasma é reunido a partir de um grande número (digamos 50 ou 100) de voluntários normais e a atividade do FVIII nesse "plasma combinado normal" é definida como 100%. As diluições deste plasma são usadas para fazer uma curva padrão da atividade do FVIII versus qualquer ensaio usado para determinar os níveis de FIX. Essa curva padrão é então usada para definir a quantidade ou porcentagem (%) de FVIII em uma amostra de paciente usando o mesmo ensaio.
[0337] Todas as doses de vetores levaram à expressão de níveis de FVIII suficientes para evitar sangramentos e permitir a interrupção da profilaxia. Nos 12 indivíduos em 3 doses, houve uma redução de 97% na taxa de sangramento anualizada (ABR) e uma redução de 97% na taxa de infusão anualizada. Os dados indicam que a cinética geral mostra um aumento gradual para um platô sustentado de FVIII.
[0338] Na primeira coorte de doses, os níveis de FVIII são de 14% e 15%, às 66 e 51 semanas, sem eventos hemorrágicos, sem níveis elevados de transaminase e sem uso de esteroides. A expressão de FVIII permaneceu estável durante o período de observação. Os dados dessa coorte de baixa dose indicam que mesmo níveis modestos de FVIII na faixa de 15% podem ser adequados para evitar sangramentos durante um período de acompanhamento de até 66 semanas.
[0339] Na segunda coorte de doses, os níveis de FVIII são 9%, 26% e 17% nas 33, 46 e 31 semanas após a infusão. O primeiro indivíduo nesta coorte de doses (Sujeito 3) administrou uma dose única de concentrado de fator para um sangramento articular espontâneo no dia 159 e o segundo nesta coorte de doses (Sujeito 4) recebeu várias infusões para um sangramento traumático a partir do dia
195. Esses dois indivíduos receberam um curso de redução gradual de esteroides, instituído 12 e 7 semanas após a infusão do vetor, desencadeado por um declínio nos níveis de FVIII, com consequente estabilização dos níveis de FVIII. O terceiro indivíduo nessa coorte de doses (indivíduo 6) não teve sangramento e não recebeu infusões de fatores, nem os esteroides receberam.
[0340] Na terceira coorte de doses (N = 7), cinco dos sete indivíduos atualmente apresentam níveis de FVIII ≥12%, com uma faixa de 16 a 49%; para esses indivíduos, o nível médio de FVIII iniciando 12 semanas após a infusão de vetores é de 30% e a mediana é de 22%. Nenhum sangramento foi relatado entre esses indivíduos, começando 4 semanas após a infusão vetorial.
[0341] Separadamente, cinco dos 7 na dose do vetor AAV-LK03 (FVIII) de 2x1012 gv/kg receberam um curso de esteroides, iniciado em momentos variando de 6 a 11 semanas após a infusão do vetor, por um ou mais dos o seguinte: níveis decrescentes de FVIII, aumento da ALT acima da linha de base do indivíduo ou ELISPOTs de IFN- elevados para capsídeo do AAV. O início dos esteroides foi associado à redução da ALT na faixa normal e à extinção do sinal ELISPOT em todos os casos; dois dos sete indivíduos apresentaram sucesso limitado na estabilização dos níveis de FVIII, que caíram para <5%, possivelmente devido à resposta imune. Para um deles, nenhum sangramento foi relatado durante 12 semanas de acompanhamento; o outro tem quatro sangramentos durante 37 semanas de observação.
[0342] No geral, foi observado um perfil de segurança favorável, com apenas dois indivíduos experimentando elevação da ALT acima do limite superior do normal. Noventa e um por cento (91%) dos indivíduos até o momento apresentaram um ABR de ±1 desde a infusão de vetores. Todos os indivíduos experimentaram um aumento nos níveis de FVIII após a infusão de vetores, mas o sucesso limitado na prevenção de declínios nos níveis de FVIII em dois indivíduos sugere que a adição de esteróides profiláticos pode ser justificada.
[0343] Com base nos níveis de hFVIII observados em não NHPs, e levando em consideração que diferentes lotes de vetores podem ter potência ligeiramente diferente, estimou-se que os níveis médios de FVIII em humanos infundidos com SPK-8011 na dose de 5x1011 gv/kg podem estar em torno de 3,4% a 5,8%, assumindo uma extrapolação linear. A atividade de FVIII no primeiro indivíduo atingiu o platô em aproximadamente 9,15 ± 0,53% do normal e 13,50 ± 0,50% no segundo indivíduo. Assim, a atividade média do FVIII na coorte de baixa dose foi de aproximadamente 11,3%, o que é 2 a 4 vezes maior que o esperado com base em estudos em primatas não humanos.
[0344] A diferença substancial de 2 a 4 vezes (dependendo da curva de regressão linear usada) na coorte de baixa dose entre os níveis previstos de FVIII com base em estudos pré-clínicos usando espécies filogeneticamente próximas, como macacos, e os resultados reais em seres humanos destaca as limitações dos modelos animais atuais na determinação de doses de vetores de AAV para seres humanos. Os dados que indicam que havia uma atividade FVIII muito maior em humanos do que o previsto com base na atividade FVIII em NHPs administrados AAV-SPK-8011 (capsídeo LK03)-hFVIII não eram esperados.
[0345] Embora não exista um modelo pré-clínico universal para determinar a dosagem de AAV em humanos, a experiência anterior em primata não humanos usando os vetores de AAV2, AAV8 e AAV-Spk para mediar a expressão derivada do fígado do fator IX de coagulação indica que os macacos são bons, mas preditor não perfeito da eficácia do vetor AAV em humanos. Mais recentemente, camundongos "humanizados" quiméricos com fígado parcialmente repovoado com hepatócitos humanos tornaram-se uma ferramenta valiosa para determinar a eficácia da transdução hepática de diferentes capsídeos virais. Dois estudos independentes foram relatados que mediram a transdução em hepatócitos humanos, aproveitando esse modelo de camundongo. Foi relatado que uma diferença de aproximadamente 10 vezes na porcentagem de hepatócitos humanos transduzidos entre LK03 e AAV8 (43,3 ± 11% e 3,6 ± 1,1% com infusão de vetor LK03 e AAV8, respectivamente, foi observada (Lisowski L, et al. Nature 506: 382-6 (2014)).
[0346] Em suma, a infusão de SPK-8011 em 12 pacientes com Hemofilia A grave ou moderadamente grave resultou em atividade segura, durável e dependente da dose de FVIII associada a uma redução de 97% no PEATE e 97% no uso de FVIII recombinante por um período de até 66 semanas após a transferência genética. EXEMPLO 9 Promotor de TTR
[0347] A caracterização do promotor de transtirretina (TTR) foi originalmente descrita em Costa e Grayson 1991, Nucleic Acids Research 19 (15): 4139-4145. A sequência do promotor TTR foi uma sequência modificada, de TATTTGTGTAG para TATTGACTTAG. Promotor de TTR com mutação de 4 nucleotídeos (TTRmut), SEQ ID NO:22
GTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTC CCTAGGCAAGGTTCATATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGT CAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTG GGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAG
ATCCACAAGCTCCT EXEMPLO 10 Construtos de transgene que codifica FVII reduzido em CpG e capsídeos de AAV exemplificadores. Variante X01 de ácido nucleico reduzida em CpG que codifica FVIII (SEQ ID NO:1) atgcagattg agctgtctac ctgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgct accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctggg attacatgca gtctgacctg ggggagctgc ctgtggatgc caggtttccc cccagggtgc ccaagagctt ccccttcaat acctctgtgg tgtataagaa gaccctgttt gtggagttca ctgatcatct gttcaacatt gctaaaccca ggcccccctg gatggggctg ctgggcccta ccatccaggc tgaggtgtat gacactgtgg tgatcactct gaagaacatg gctagccatc ctgtgtctct gcatgctgtg ggggtgagct actggaaggc ttctgagggg gctgagtatg atgatcagac tagccagagg gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggctctcaca cctatgtctg gcaggtgctg aaggagaatg gccccatggc ctctgatcct ctgtgtctga cctatagcta cctgagccat gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgtagggag gggagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagt tcattctgct gtttgctgtg tttgatgagg gcaagagctg gcattctgaa accaagaaca gcctgatgca ggacagggat gctgcctctg ctagggcctg gcccaagatg cacactgtga atgggtatgt caataggtct ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtact ggcatgtgat tgggatgggc accacccctg aggtgcacag catctttctg gagggccaca ccttcctggt gaggaatcac agacaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctga ctgcccagac cctgctgatg gacctgggcc agtttctgct gttctgccac atctctagcc accagcatga tggcatggag gcctatgtga aggtggactc ctgccctgag gagccccagc tgaggatgaa gaataatgag gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgaga tggatgtggt gagatttgat gatgacaatt ctcccagctt cattcagatc aggtctgtgg ccaagaagca tcccaagacc tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gactgggact atgcccccct ggtgctggcc cctgatgaca ggagctataa gagccagtac ctgaataatg gcccccagag gattgggagg aagtataaga aggtgaggtt catggcctat actgatgaaa ccttcaagac cagagaggcc atccagcatg agtctgggat cctggggccc ctgctgtatg gggaggtggg ggacaccctg ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccctacaaca tctaccctca tggcatcact gatgtgaggc ctctgtacag cagaaggctg cccaaggggg tgaagcatct gaaggacttc cccattctgc ctggggagat tttcaagtac aagtggactg tgactgtgga ggatggccca accaagtctg accctaggtg cctgactagg tactacagca gctttgtgaa tatggagagg gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgct acaaggagtc tgtggatcag aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcc tgttctctgt gtttgatgag aacaggagct ggtacctgac tgagaacatt cagaggtttc tgcccaaccc tgctggggtg cagctggagg accctgaatt ccaggcctct aacatcatgc acagcattaa tggctatgtg tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cctactggta cattctgagc attggggccc agactgactt cctgtctgtg ttcttctctg gctacacctt taagcacaag atggtgtatg aggataccct gaccctgttt cctttctctg gggagactgt gttcatgagc atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgccacaact ctgacttcag gaacaggggg atgactgctc tgctgaaggt gagcagctgt gataagaaca ctggggacta ctatgaggac agctatgagg acatctctgc ctatctgctg agcaagaata atgctattga gcccaggagc ttctctcaga acccccctgt gctgaagagg caccagaggg agatcaccag aactactctg cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gacaccatct ctgtggagat gaagaaggag gattttgata tttatgatga ggatgaaaac cagagcccca ggagctttca gaagaagact aggcactatt tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgtc ttctagcccc catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc tctgtgcccc agttcaagaa ggtggtgttc caggagttca ctgatggcag cttcactcag cccctgtaca ggggggagct gaatgagcac ctggggctgc tgggccctta tatcagggct gaggtggagg ataacatcat ggtgaccttc aggaaccagg ccagcaggcc ctacagcttc tactctagcc tgatcagcta tgaggaggac cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagc ccaatgagac caagacttat ttctggaagg tgcagcacca tatggccccc accaaggatg agtttgattg caaagcctgg gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcact ctgggctgat tggccccctg ctggtgtgcc acaccaacac tctgaaccct gcccatggca ggcaggtgac tgtgcaggag tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag actaagagct ggtacttcac tgagaacatg gagaggaact gcagggcccc ctgcaatatc cagatggagg accccacctt taaggaaaat tataggtttc atgccattaa tggctacatc atggacaccc tgcctggcct ggtgatggcc caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatgggca gcaatgagaa cattcacagc atccacttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaagg aggagtacaa gatggccctg tataatctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgc tgcccagcaa ggctggcatc tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctg gcatgagcac cctgttcctg gtgtattcta acaagtgtca gacccccctg ggcatggcct ctggccatat cagggacttc cagatcactg cctctggcca gtatgggcag tgggccccca agctggccag gctgcattac tctggcagca tcaatgcctg gagcaccaag gagccattca gctggattaa ggtggacctg ctggctccaa tgattatcca tggcatcaag acccaggggg ccaggcagaa gtttagcagc ctgtacatct ctcagtttat catcatgtac tctctggatg gcaaaaagtg gcagacctac aggggcaatt ctactggcac tctgatggtg ttctttggca atgtggacag ctctgggatc aagcacaaca tctttaaccc ccctatcatt gccaggtaca ttaggctgca ccccacccat tacagcatca ggagcaccct gaggatggag ctgatgggct gtgatctgaa cagctgcagc atgcccctgg gcatggagag caaggctatc tctgatgccc agattactgc cagcagctac ttcaccaata tgtttgccac ctggagcccc agcaaggcca ggctgcacct gcagggcagg tctaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag aagaccatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtga agagcctgct gactagcatg tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatggcc atcagtggac cctgttcttc cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aatcaggaca gcttcacccc tgtggtgaac agcctggacc cccccctgct gaccagatac ctgaggatcc acccccagag ctgggtgcat cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggg tgtgaggccc aggacctgta ctga
Variante X02 de ácido nucleico reduzida em CpG que codifica FVIII (SEQ ID NO:2) atgcagattg agctgtctac ctgctttttc ctgtgtctgc tgaggttctg cttctctgcc actaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgtcttggg attacatgca gtctgatctg ggggagctgc ctgtggatgc caggtttcct cccagggtgc ccaagtcttt ccccttcaat acctctgtgg tgtataagaa gaccctgttt gtggagttta ctgatcacct gttcaacatt gccaagccca ggcccccttg gatgggcctg ctggggccca ccatccaggc tgaggtgtat gacactgtgg tgatcaccct gaagaacatg gcctctcacc ctgtgagcct gcatgctgtg ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgaccagac cagccagagg gagaaggagg atgataaggt gttccctggg gggagccaca cttatgtgtg gcaggtgctg aaggagaatg gcccaatggc ctctgatccc ctgtgcctga cctattctta cctgagccat gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag ggctctctgg ctaaggagaa gacccagacc ctgcacaagt tcatcctgct gtttgctgtg tttgatgagg ggaagagctg gcactctgag accaagaaca gcctgatgca ggacagggat gctgcctctg ccagggcctg gcccaaaatg cacactgtga atggctatgt gaataggagc ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtatt ggcatgtgat tggcatgggc accacccctg aggtgcactc tatcttcctg gagggccata ctttcctggt gaggaatcat aggcaggcca gcctggagat tagccccatt acctttctga ctgcccagac cctgctgatg gacctgggcc agttcctgct gttttgccac atcagctctc accagcatga tggcatggag gcctatgtga aggtggatag ctgccctgag gagccccagc tgaggatgaa gaacaatgag gaggctgagg attatgatga tgatctgact gattctgaaa tggatgtggt gaggtttgat gatgacaata gcccctcttt catccagatc aggtctgtgg ccaagaagca tcctaagacc tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gactgggact atgctcccct ggtgctggcc cctgatgaca ggtcttacaa gagccagtac ctgaacaatg gcccccagag aattgggagg aagtataaga aggtgagatt catggcttac actgatgaga ccttcaagac tagggaggcc atccagcatg agtctggcat tctgggcccc ctgctgtatg gggaggtggg ggacaccctg ctgatcatct tcaagaacca ggcctctagg ccctacaata tttaccccca tgggatcact gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cctaaggggg tgaagcatct gaaggacttc cccatcctgc ctggggagat cttcaagtat aagtggactg tgactgtgga agatggcccc accaagtctg accctaggtg cctgaccagg tactactctt cttttgtgaa catggagagg gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgct acaaggagtc tgtggaccag agggggaacc agattatgtc tgacaagagg aatgtgattc tgttctctgt gtttgatgag aacaggagct ggtatctgac tgagaacatc cagaggttcc tgcccaatcc tgctggggtg cagctggagg accctgagtt ccaggccagc aacatcatgc acagcatcaa tgggtatgtg tttgattctc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cctactggta catcctgagc attggggctc agactgattt cctgtctgtg ttcttttctg gctacacctt taagcataag atggtgtatg aggacactct gaccctgttt cccttctctg gggagactgt gtttatgagc atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgccacaact ctgatttcag gaacaggggc atgactgctc tgctgaaggt gtcttcttgt gacaagaaca ctggggacta ttatgaggac agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaaca atgctattga gcccagatct ttcagccaga acccccctgt gctgaagagg caccagaggg agatcactag gaccaccctg cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gacactatct ctgtggagat gaagaaggag gactttgata tctatgatga ggatgagaac cagtctccca ggagcttcca gaaaaagacc aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgtc ttctagcccc catgtgctga ggaacagggc ccagtctggg tctgtgcccc agttcaagaa ggtggtgttc caggagttca ctgatgggag cttcacccag cctctgtaca ggggggagct gaatgagcac ctggggctgc tgggccctta tattagggct gaggtggagg acaacatcat ggtgactttc aggaatcagg cctctaggcc ctatagcttc tacagctctc tgatcagcta tgaggaggat cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagc ccaatgagac caagacctac ttctggaagg tgcagcacca catggctcct accaaggatg agtttgactg caaggcctgg gcctactttt ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcact ctggcctgat tggccccctg ctggtgtgtc ataccaacac cctgaaccct gcccatggca ggcaggtgac tgtgcaggag tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag accaagagct ggtactttac tgagaacatg gagaggaatt gcagagcccc ttgcaacatc cagatggagg acccaacctt caaagagaac tacaggttcc atgccatcaa tgggtacatc atggacaccc tgcctggcct ggtgatggct caggaccaga ggatcaggtg gtatctgctg agcatgggca gcaatgagaa tatccatagc attcacttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaagg aggagtacaa gatggccctg tataacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgc tgccaagcaa ggctgggatt tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctg gcatgtctac cctgttcctg gtgtactcca ataagtgcca gacccccctg ggcatggcct ctggccacat cagggacttc cagatcactg cctctggcca gtatgggcag tgggccccaa agctggccag gctgcactat tctgggagca tcaatgcttg gagcaccaag gagcctttca gctggattaa ggtggatctg ctggccccca tgatcattca tggcatcaaa acccaggggg ctagacagaa gttttctagc ctgtacatca gccagttcat catcatgtac agcctggatg gcaagaagtg gcagacttac aggggcaata gcactggcac cctgatggtg ttttttggca atgtggacag ctctggcatc aagcacaaca tctttaaccc ccccattatt gccaggtata tcaggctgca tcccacccac tattctatta ggtctactct gagaatggag ctgatgggct gtgacctgaa cagctgtagc atgcccctgg ggatggagag caaggctatc tctgatgccc agatcactgc cagctcttat ttcaccaata tgtttgccac ctggtctccc tctaaggcca ggctgcacct gcagggcagg agcaatgctt ggaggcccca ggtgaataac cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag aagaccatga aggtgactgg ggtgactacc cagggggtga agtctctgct gactagcatg tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatgggc atcagtggac tctgttcttc cagaatggca aggtgaaggt cttccagggg aaccaggata gcttcactcc tgtggtgaac tctctggacc cccccctgct gactaggtat ctgaggatcc acccccagag ctgggtgcac cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggccc aggacctgta ttga
Variante X03 de ácido nucleico reduzida em CpG que codifica FVIII (SEQ ID NO:3)
atgcagattg aactgtctac ttgtttcttc ctgtgcctgc tgaggttttg cttctctgct actaggaggt actatctggg ggctgtggag ctgtcttggg actatatgca gtctgacctg ggggagctgc ctgtggatgc taggtttccc cccagggtgc ccaagagctt cccctttaac acctctgtgg tgtataagaa gactctgttt gtggagttca ctgaccatct gttcaacatt gccaagccaa ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccca ccatccaggc tgaggtgtat gacactgtgg tgattactct gaagaacatg gccagccatc ctgtgagcct gcatgctgtg ggggtgtctt actggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgaccagac ctctcagagg gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggctctcata cctatgtgtg gcaggtcctg aaggagaatg ggcccatggc ctctgacccc ctgtgcctga cctactctta tctgtctcat gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag ggcagcctgg ctaaggagaa gacccagact ctgcacaagt tcatcctgct gtttgctgtg tttgatgagg gcaagagctg gcactctgag accaagaaca gcctgatgca ggacagggat gctgcctctg ctagggcctg gcccaagatg cacactgtga atgggtatgt gaacaggagc ctgccaggcc tgattggctg ccataggaag tctgtgtatt ggcatgtgat tgggatgggg actacccctg aggtccacag cattttcctg gaggggcata cctttctggt gaggaaccac aggcaggcct ctctggagat ctctcccatt actttcctga ctgcccagac cctgctgatg gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagcagcc accagcatga tggcatggag gcctatgtga aggtggatag ctgccctgag gagccccagc tgaggatgaa aaacaatgag gaggctgagg attatgatga tgacctgact gattctgaga tggatgtggt gaggtttgat gatgataaca gccccagctt catccagatt aggtctgtgg ccaagaagca tcccaagacc tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggact atgctcctct ggtgctggcc cctgatgaca ggagctacaa gagccagtac ctgaataatg gcccccagag gattggcagg aagtataaga aggtgaggtt catggcctac actgatgaga cctttaagac cagggaggcc atccagcatg aatctgggat cctgggcccc ctgctgtatg gggaggtggg ggacaccctg ctgattatct ttaagaacca ggctagcagg ccctacaaca tttaccccca tggcattact gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cccaaggggg tgaagcacct gaaggatttc cccattctgc ctggggagat ctttaagtac aaatggactg tgactgtgga ggatggccct actaagtctg atcccaggtg tctgaccaga tactacagca gctttgtgaa tatggagagg gacctggctt ctggcctgat tggccccctg ctgatctgct acaaggagtc tgtggaccag aggggcaatc agattatgtc tgacaagagg aatgtgatcc tgttctctgt gtttgatgag aacagaagct ggtacctgac tgagaacatc cagaggttcc tgcccaaccc tgctggggtg cagctggagg accctgagtt ccaggctagc aatatcatgc acagcattaa tggctatgtg tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cctattggta cattctgagc attggggccc agactgattt cctgtctgtg ttcttttctg gctacacctt caagcacaag atggtgtatg aggatactct gaccctgttt cccttctctg gggagactgt gttcatgagc atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgtcacaact ctgacttcag gaacaggggc atgactgccc tgctgaaggt gagctcttgt gataagaaca ctggggacta ctatgaggac tcttatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaaca atgctattga gcccaggagc ttctctcaga atccccctgt gctgaagagg catcagaggg agatcactag gactaccctg cagtctgacc aggaagagat tgactatgat gacaccatct ctgtggaaat gaagaaggag gactttgata tctatgatga ggatgaaaac cagagcccca ggagcttcca gaagaagacc aggcattact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atgggatgag ctcttctccc catgtgctga ggaatagggc tcagtctggc tctgtcccac agttcaagaa ggtggtgttt caggagttca ctgatggcag cttcactcag cccctgtaca ggggggagct gaatgagcat ctgggcctgc tggggcccta catcagggct gaggtggagg ataacattat ggtgactttc aggaaccagg cctctaggcc ctacagcttc tacagcagcc tgatcagcta tgaggaggac cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagc ccaatgagac taagacctat ttctggaagg tgcagcatca catggctccc actaaagatg agtttgactg caaggcctgg gcctacttct ctgatgtgga tctggagaag gatgtgcatt ctgggctgat tggccctctg ctggtctgcc atactaacac cctgaatcct gcccatggca ggcaggtgac tgtgcaggag tttgccctgt tctttaccat ctttgatgag accaagtctt ggtacttcac tgagaacatg gagaggaact gcagggcccc ctgtaacatc cagatggagg accccacctt taaggagaac tacaggttcc atgccatcaa tggctacatc atggacactc tgcctggcct ggtgatggcc caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg tctatgggct ctaatgagaa cattcattct atccacttct ctggccatgt gtttactgtg aggaagaagg aggagtacaa gatggccctg tacaatctgt accctggggt gtttgaaact gtggagatgc tgccctctaa ggctggcatc tggagggtgg agtgcctgat tggggaacac ctgcatgctg gcatgagcac cctgttcctg gtctatagca ataagtgcca gacccccctg gggatggcct ctgggcatat cagagacttc cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggccccca agctggccag gctgcactac tctggcagca ttaatgcctg gagcaccaag gagcccttct cttggatcaa ggtggacctg ctggctccca tgatcatcca tgggatcaag acccaggggg ccaggcagaa gttcagcagc ctgtacatct ctcagttcat catcatgtac tctctggatg gcaagaagtg gcagacctac aggggcaata gcactgggac cctgatggtg ttctttggga atgtggacag ctctggcatc aagcacaata tcttcaaccc ccccatcatt gccaggtaca tcagactgca ccccactcat tacagcatca ggagcactct gaggatggag ctgatgggct gtgacctgaa tagctgctct atgcccctgg gcatggagag caaggccatt tctgatgccc agattactgc ctcttcttac ttcactaata tgtttgccac ctggagcccc agcaaggcca ggctgcatct gcaggggagg agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag aagactatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtga agagcctgct gaccagcatg tatgtgaagg agttcctgat ctcttctagc caggatgggc accagtggac cctgtttttc cagaatggga aggtgaaggt gtttcagggc aatcaggaca gctttactcc tgtggtgaac agcctggacc cccccctgct gactaggtac ctgaggattc acccccagag ctgggtgcac cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggccc aggatctgta ctga
Variante X04 de ácido nucleico reduzida em CpG que codifica FVIII (SEQ ID NO:4) atgcagattg agctgtctac ctgcttcttt ctgtgcctgc tgaggttctg tttctctgcc actaggaggt attatctggg ggctgtggag ctgtcctggg actacatgca gtctgatctg ggggagctgc ctgtggatgc caggttccct cccagggtgc ccaagtcttt ccctttcaat acctctgtgg tgtacaagaa gactctgttt gtggagttta ctgatcacct gtttaacatt gccaagccca ggcccccctg gatggggctg ctgggcccca ccatccaggc tgaggtgtat gacactgtgg tgattactct gaagaatatg gcttctcacc ctgtgagcct gcatgctgtg ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgaccagac cagccagagg gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccaca cttatgtgtg gcaggtgctg aaggagaatg gcccaatggc ctctgacccc ctgtgcctga cctacagcta tctgagccat gtggatctgg tgaaggatct gaactctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag ggctctctgg ccaaggagaa gactcagact ctgcacaagt tcatcctgct gtttgctgtg tttgatgagg gcaagagctg gcactctgag accaagaact ctctgatgca ggatagggat gctgcttctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtga atgggtatgt gaataggagc ctgcctgggc tgattgggtg tcacaggaag tctgtgtact ggcatgtgat tggcatgggc accactcctg aggtgcacag catctttctg gagggccaca cttttctggt gaggaatcac aggcaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctga ctgcccagac cctgctgatg gatctgggcc agttcctgct gttttgccat atcagcagcc atcagcatga tgggatggag gcttatgtga aggtggactc ttgccctgag gagcctcagc tgaggatgaa gaataatgaa gaggctgagg actatgatga tgatctgact gactctgaga tggatgtggt gaggtttgat gatgacaaca gccccagctt tatccagatt aggtctgtgg ccaagaagca ccccaagacc tgggtgcatt acattgctgc tgaggaagag gattgggact atgcccccct ggtgctggcc cctgatgaca ggagctacaa gtctcagtac ctgaacaatg gccctcagag gattggcagg aagtacaaga aggtgaggtt catggcttac actgatgaga ccttcaagac cagggaggcc attcagcatg aatctgggat cctgggcccc ctgctgtatg gggaggtggg ggacaccctg ctgattattt tcaagaacca ggccagcagg ccctacaaca tttatcctca tggcattact gatgtgagac ccctgtacag caggaggctg cctaaggggg tgaagcacct gaaggacttc cccatcctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactg tgactgtgga ggatggcccc actaagtctg accccaggtg cctgactagg tactactcca gctttgtgaa catggagagg gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgct acaaggagtc tgtggatcag aggggcaacc agatcatgtc tgacaagaga aatgtgatcc tgttctctgt gtttgatgag aataggtctt ggtacctgac tgagaacatc cagaggtttc tgcctaatcc tgctggggtg cagctggagg atcctgagtt ccaggcctct aacattatgc acagcatcaa tgggtatgtg tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cctactggta catcctgagc attggggccc agactgactt tctgtctgtg ttcttctctg gctacacctt taagcataag atggtgtatg aggacaccct gactctgttc cccttctctg gggagactgt gttcatgagc atggagaacc caggcctgtg gatcctgggc tgccacaact ctgatttcag gaataggggc atgactgccc tgctgaaggt gagcagctgt gataagaaca ctggggacta ttatgaggat agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaaca atgccattga gcccaggagc ttcagccaga atcctcctgt gctgaagagg caccagaggg agatcaccag gaccaccctg cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacactatct ctgtggagat gaagaaggag gactttgaca tctatgatga ggatgagaat cagagcccca ggagcttcca gaagaagact agacactact ttattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgag ctcttctccc catgtgctga gaaacagggc ccagtctggc tctgtgcccc agttcaagaa ggtggtcttc caggagttca ctgatggctc tttcacccag cctctgtata gaggggagct gaatgagcac ctgggcctgc tgggccctta catcagggct gaggtggagg acaatatcat ggtgaccttc aggaaccagg ctagcaggcc ctactctttc tacagcagcc tgatcagcta tgaggaggac cagaggcagg gggctgagcc taggaagaat tttgtgaagc ccaatgagac caagacctac ttctggaagg tgcagcacca catggctccc actaaggatg agtttgactg caaggcctgg gcctactttt ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcatt ctggcctgat tggccccctg ctggtctgcc acaccaatac tctgaaccct gctcatggga gacaggtgac tgtgcaggag tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag accaagtcct ggtactttac tgagaacatg gagaggaatt gcagggcccc ttgcaacatc cagatggagg accccacctt caaggaaaat tataggttcc atgccatcaa tggctacatc atggacaccc tgcctggcct ggtgatggcc caggaccaga ggatcaggtg gtatctgctg tctatgggct ctaatgagaa catccacagc atccatttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaagg aggagtataa gatggctctg tacaacctgt accctggggt ctttgagact gtggagatgc tgcccagcaa ggctggcatt tggagggtgg agtgcctgat tggggaacac ctgcatgctg ggatgagcac cctgttcctg gtgtactcta acaagtgcca gaccccactg ggcatggctt ctggccacat cagggatttc cagattactg cctctggcca gtatggccag tgggctccca agctggctag gctgcactac tctgggagca tcaatgcctg gtctactaag gagcctttct cttggatcaa agtggacctg ctggccccta tgatcatcca tgggatcaag actcaggggg ccaggcagaa gttcagcagc ctgtacatct ctcagttcat cattatgtac agcctggatg gcaagaagtg gcagacctac aggggcaaca gcactggcac cctgatggtg ttctttggga atgtggacag ctctgggatt aagcacaaca tctttaaccc ccccatcatt gccaggtata tcaggctgca ccctacccac tacagcatta ggagcaccct gaggatggag ctgatgggct gtgacctgaa cagctgcagc atgcccctgg ggatggagag caaggccatt tctgatgctc agatcactgc ttctagctac ttcactaaca tgtttgccac ctggtctccc agcaaggcta gactgcacct gcaggggagg agcaatgcct ggaggcccca ggtgaataat cccaaggagt ggctgcaggt ggatttccag aaaaccatga aggtgactgg ggtgactacc cagggggtga agtctctgct gaccagcatg tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatgggc atcagtggac cctgttcttt cagaatggga aggtgaaggt gtttcagggc aatcaggaca gcttcacccc tgtggtgaac agcctggacc cccccctgct gaccaggtac ctgaggatcc acccccagag ctgggtgcat cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggccc aggacctgta ctga
Variante X05 de ácido nucleico reduzida em CpG que codifica FVIII (SEQ ID NO:5) atgcagattg agctgtctac ttgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgcc actaggaggt attacctggg ggctgtggag ctgagctggg actatatgca gtctgacctg ggggagctgc ctgtggatgc caggtttcct cccagggtgc ctaagagctt ccccttcaac acctctgtgg tgtacaagaa gactctgttt gtggagttta ctgatcatct gttcaacatt gccaagccca ggcctccttg gatggggctg ctgggcccca ccatccaggc tgaggtgtat gacactgtgg tgattaccct gaagaatatg gccagccatc ctgtgagcct gcatgctgtg ggggtgagct attggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgatcagac tagccagagg gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg gggagccata cctatgtgtg gcaggtgctg aaggagaatg gccccatggc ctctgaccct ctgtgcctga cttatagcta cctgagccat gtggatctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag ggcagcctgg ccaaggagaa gactcagacc ctgcacaagt tcatcctgct gtttgctgtg tttgatgagg ggaagtcctg gcactctgag actaagaaca gcctgatgca ggatagggat gctgcttctg ccagggcctg gcctaagatg cacactgtga atggctatgt gaataggagc ctgcctggcc tgattggctg ccataggaag tctgtgtact ggcatgtgat tgggatgggc accacccctg aggtgcactc tattttcctg gagggccata ctttcctggt gaggaaccat aggcaggcca gcctggagat cagccccatc actttcctga ctgcccagac tctgctgatg gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagcagcc atcagcatga tggcatggag gcttatgtga aggtggacag ctgccctgag gagcctcagc tgaggatgaa gaataatgag gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgaga tggatgtggt gaggtttgat gatgacaact ctccctcttt catccagatc aggtctgtgg ccaagaagca ccctaagacc tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggact atgcccccct ggtgctggcc ccagatgaca ggagctacaa gtcccagtac ctgaacaatg gcccccagag gattggcagg aagtacaaga aggtgaggtt catggcttat actgatgaga ctttcaagac cagggaggcc atccagcatg agtctggcat cctgggccct ctgctgtatg gggaggtggg ggacaccctg ctgattatct tcaagaacca ggcttctagg ccctacaata tctaccctca tggcatcact gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cccaaggggg tgaagcatct gaaggatttc cccatcctgc ctggggagat ctttaagtat aagtggactg tgactgtgga ggatggcccc actaagtctg accccaggtg cctgaccagg tattacagca gctttgtgaa catggagagg gatctggctt ctgggctgat tggccccctg ctgatctgct acaaggagtc tgtggaccag aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcc tgttctctgt gtttgatgag aataggagct ggtacctgac tgagaacatc cagaggtttc tgcccaatcc tgctggggtg cagctggagg atcctgagtt tcaggcctct aatatcatgc acagcatcaa tggctatgtg tttgactctc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cctattggta catcctgagc attggggccc agactgactt tctgtctgtg tttttttctg gctacacctt caagcacaag atggtgtatg aggatactct gactctgttc cctttttctg gggagactgt gttcatgtct atggagaacc ctgggctgtg gattctgggc tgccacaatt ctgacttcag gaacagaggc atgactgctc tgctgaaggt gagcagctgt gacaagaaca ctggggacta ctatgaggac tcttatgagg acatttctgc ctacctgctg agcaagaaca atgccattga gcccagaagc ttttctcaga acccccctgt gctgaagagg caccagaggg agatcaccag gaccaccctg cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gatactattt ctgtggagat gaagaaggag gactttgaca tctatgatga ggatgagaac cagagcccca ggtctttcca gaagaagact aggcactact ttattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atgggatgtc tagctctcct catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc tctgtgcccc agtttaaaaa ggtggtgttc caggaattca ctgatggcag ctttacccag cctctgtaca ggggggagct gaatgagcac ctggggctgc tggggcctta cattagggct gaggtggagg acaacatcat ggtgaccttc aggaatcagg ccagcaggcc ctactctttc tacagcagcc tgatctctta tgaggaggac cagaggcagg gggctgaacc caggaagaac tttgtgaagc ccaatgagac caagacctac ttctggaagg tgcagcacca catggctccc accaaggatg agtttgattg caaggcctgg gcttacttct ctgatgtgga tctggagaag gatgtgcact ctgggctgat tggccccctg ctggtgtgcc acaccaacac tctgaaccct gcccatggca gacaggtgac tgtgcaggag tttgccctgt tcttcactat ctttgatgag actaagagct ggtacttcac tgagaacatg gagaggaatt gcagggcccc ttgcaacatc cagatggagg accccacctt taaggagaac tacaggtttc atgccattaa tggctacatc atggacaccc tgcctggcct ggtgatggcc caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg tctatgggga gcaatgagaa catccacagc attcacttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaagg aggagtacaa gatggccctg tacaacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgc tgcccagcaa ggctgggatc tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctg ggatgagcac cctgttcctg gtgtatagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcct ctggccacat cagagacttt cagattactg cctctggcca gtatgggcag tgggccccca agctggccag gctgcactat tctggctcta ttaatgcctg gagcactaag gagcccttca gctggattaa ggtggacctg ctggctccca tgatcatcca tggcatcaag actcaggggg ccaggcagaa gttctcttct ctgtacatca gccagttcat tatcatgtac tccctggatg gcaagaagtg gcagacctat aggggcaaca gcactggcac cctgatggtg ttctttggga atgtggacag ctctggcatc aagcataata tcttcaatcc ccccatcatt gctaggtaca tcaggctgca ccccacccac tactctatta ggtctaccct gaggatggag ctgatgggct gtgacctgaa cagctgcagc atgcctctgg gcatggagag caaagccatc tctgatgccc agatcactgc cagcagctac tttaccaaca tgtttgctac ttggagcccc agcaaggcca ggctgcacct gcaggggagg tctaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag aagactatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtga agagcctgct gacctctatg tatgtgaagg agttcctgat tagcagcagc caggatggcc accagtggac cctgtttttc cagaatggga aggtgaaggt gtttcagggg aaccaggaca gcttcactcc tgtggtgaac tctctggacc cccccctgct gaccaggtat ctgaggatcc accctcagag ctgggtgcac cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggccc aggacctgta ctga
Variante X06 de ácido nucleico reduzida em CpG que codifica FVIII (SEQ ID NO:6) atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttttg cttctctgcc accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctggg attacatgca gtctgacctg ggggagctgc ctgtggatgc caggttccct cccagggtgc ccaagtcttt ccccttcaac acttctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttta ctgaccacct gttcaacatt gccaagccca ggcctccctg gatgggcctg ctgggcccca ccattcaggc tgaggtgtat gacactgtgg tcatcaccct gaaaaatatg gctagccacc ctgtgtctct gcatgctgtg ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgaccagac tagccagagg gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccaca cttatgtgtg gcaggtgctg aaagagaatg gccccatggc ttctgatccc ctgtgtctga cctatagcta cctgagccat gtggatctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag ggcagcctgg ctaaggagaa gacccagacc ctgcataagt tcatcctgct gtttgctgtg tttgatgagg gcaagagctg gcactctgag actaagaaca gcctgatgca ggatagggat gctgcttctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtga atgggtatgt gaacaggagc ctgcctggcc tgattggctg ccataggaag tctgtctatt ggcatgtgat tggcatgggc actactcctg aggtgcacag catctttctg gagggccaca ccttcctggt gaggaaccac aggcaggcca gcctggagat ctctcccatc actttcctga ctgctcagac cctgctgatg gacctgggcc agttcctgct gttctgtcac atctctagcc accagcatga tggcatggag gcctatgtga aggtggatag ctgccctgag gaaccccagc tgaggatgaa gaacaatgag gaggctgagg attatgatga tgatctgact gattctgaga tggatgtggt gaggtttgat gatgacaatt ctcctagctt cattcagatc agatctgtgg ccaaaaagca tcctaagact tgggtgcatt atattgctgc tgaggaggag gattgggatt atgcccccct ggtgctggct cctgatgata ggagctacaa gtctcagtac ctgaataatg ggccccagag gattggcagg aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgaga ccttcaagac cagggaggcc attcagcatg agtctgggat tctggggccc ctgctgtatg gggaggtggg ggataccctg ctgatcattt tcaagaacca ggccagcagg ccctacaaca tctaccccca tgggattact gatgtgaggc ccctgtactc taggaggctg cctaaggggg tgaagcacct gaaggatttt cctatcctgc ctggggaaat cttcaagtac aagtggactg tgactgtgga ggatggcccc actaagtctg atcccaggtg tctgaccagg tattatagct cttttgtgaa catggagagg gatctggcct ctgggctgat tggccctctg ctgatctgct acaaggagtc tgtggaccag aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcc tgttctctgt gtttgatgag aacaggagct ggtatctgac tgagaacatc cagaggtttc tgcccaatcc tgctggggtg cagctggagg atcctgagtt ccaggctagc aacatcatgc acagcatcaa tgggtatgtg tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgtctg catgaggtgg cctactggta tatcctgtct attggggccc agactgactt cctgtctgtg tttttttctg ggtatacttt taagcacaag atggtgtatg aggacaccct gactctgttc cccttctctg gggagactgt gtttatgagc atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgccacaatt ctgacttcag gaataggggg atgactgccc tgctgaaggt gagcagctgt gataagaata ctggggacta ctatgaggac tcttatgagg acatttctgc ctatctgctg tctaagaaca atgccattga acccaggagc ttctctcaga acccccctgt gctgaagagg caccagaggg aaatcaccag aactactctg cagtctgatc aggaggaaat tgactatgat gacactattt ctgtggagat gaagaaggag gactttgaca tctatgatga ggatgagaac cagagcccaa ggagcttcca gaagaagact aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgag cagcagcccc catgtgctga gaaacagggc ccagtctggg tctgtgcccc agttcaagaa ggtggtgttc caggagttca ctgatgggag cttcacccag cccctgtata ggggggagct gaatgagcac ctgggcctgc tgggccccta tattagggct gaggtggagg acaacatcat ggtgaccttc aggaatcagg cctctaggcc ctacagcttc tacagcagcc tgattagcta tgaggaggat cagaggcagg gggctgaacc caggaagaac tttgtgaagc ccaatgagac caagacctat ttctggaagg tgcagcatca catggccccc accaaggatg agtttgactg caaggcctgg gcctacttct ctgatgtgga tctggagaag gatgtgcact ctggcctgat tggccccctg ctggtgtgcc acaccaacac cctgaaccct gctcatggca ggcaggtgac tgtgcaggag tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag actaagtctt ggtacttcac tgagaatatg gagaggaatt gcagggcccc ctgcaatatt cagatggaag accccacctt caaggagaat tacaggttcc atgccattaa tggctacatc atggataccc tgcctggcct ggtgatggcc caggatcaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatgggca gcaatgagaa catccactct atccacttct ctggccatgt gtttactgtg aggaagaagg aggagtataa gatggccctg tacaacctgt accctggggt ctttgagact gtggagatgc tgccttctaa ggctggcatt tggagggtgg agtgcctgat tggggaacac ctgcatgctg gcatgtctac cctgttcctg gtgtacagca ataagtgcca gacccccctg ggcatggcct ctgggcatat cagggatttc cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggccccaa agctggctag gctgcactac tctgggagca tcaatgcctg gagcactaag gagcccttca gctggatcaa ggtggacctg ctggccccca tgattatcca tgggattaag actcaggggg ccaggcagaa gttcagcagc ctgtacatca gccagttcat tatcatgtac agcctggatg gcaagaagtg gcagacctat aggggcaact ctactgggac cctgatggtg ttctttggga atgtggatag ctctgggatc aagcacaata tcttcaaccc ccccatcatt gccaggtata tcaggctgca ccccacccac tacagcatta ggtctaccct gaggatggag ctgatgggct gtgatctgaa cagctgtagc atgcctctgg gcatggagtc taaggccatt tctgatgccc agattactgc tagcagctac ttcaccaaca tgtttgccac ctggtctccc agcaaggcca ggctgcatct gcagggcagg tctaatgctt ggaggcccca ggtgaacaac ccaaaggagt ggctgcaggt ggatttccag aagactatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtga agtctctgct gacctctatg tatgtgaagg agttcctgat ctctagcagc caggatggcc atcagtggac cctgttcttc cagaatggca aggtgaaagt gttccagggc aatcaggata gcttcactcc agtggtgaac agcctggatc cccctctgct gactaggtac ctgaggatcc acccccagag ctgggtgcac cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggccc aggacctgta ctga
Variante X07 de ácido nucleico reduzida em CpG que codifica FVIII (SEQ ID NO:7) atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgtctgc tgaggttctg cttctctgcc accaggaggt attacctggg ggctgtggag ctgagctggg actatatgca gtctgacctg ggggagctgc ctgtggatgc taggttcccc cccagggtgc ccaagagctt cccctttaac acttctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttca ctgaccacct gttcaacatt gccaagccca ggcccccctg gatggggctg ctggggccca ccatccaggc tgaggtgtat gacactgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccacc ctgtgagcct gcatgctgtg ggggtgagct actggaaggc ttctgagggg gctgagtatg atgaccagac tagccagagg gagaaggagg atgacaaggt gtttcctggg ggcagccata cctatgtgtg gcaggtgctg aaggagaatg gccccatggc ctctgacccc ctgtgcctga cctacagcta cctgtctcat gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ctctgctggt gtgtagggag ggcagcctgg ctaaggaaaa gacccagacc ctgcataagt ttatcctgct gtttgctgtg tttgatgagg gcaagagctg gcactctgag accaagaaca gcctgatgca ggatagggat gctgcctctg ccagggcttg gcctaagatg cacactgtga atgggtatgt gaataggagc ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtact ggcatgtgat tgggatgggc accacccctg aggtccatag catcttcctg gagggccaca ctttcctggt gaggaaccac agacaggcct ctctggagat ctctcccatc accttcctga ctgctcagac tctgctgatg gacctgggcc agttcctgct gttttgccat attagcagcc accagcatga tgggatggag gcctatgtga aggtggatag ctgccctgag gagcctcagc tgaggatgaa gaacaatgag gaggctgaag actatgatga tgacctgact gattctgaga tggatgtggt gaggtttgat gatgacaata gccccagctt cattcagatc aggtctgtgg ccaagaaaca ccccaagacc tgggtgcact acattgctgc tgaggaagag gactgggact atgctcccct ggtgctggcc cctgatgata ggtcttataa gagccagtac ctgaacaatg ggccccagag gattggcagg aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgaaa ccttcaaaac cagggaggcc attcagcatg agtctggcat cctgggccct ctgctgtatg gggaggtggg ggacaccctg ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccctacaaca tctatcctca tggcatcact gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cccaaggggg tgaagcacct gaaagacttc cccatcctgc ctggggagat ctttaagtat aagtggactg tgactgtgga ggatggccct accaagtctg accccaggtg tctgaccagg tactattcta gctttgtgaa catggagagg gacctggcct ctggcctgat tgggcccctg ctgatctgct acaaggagtc tgtggaccag aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcc tgttttctgt gtttgatgag aataggagct ggtacctgac tgagaacatc cagaggtttc tgcccaatcc tgctggggtg cagctggagg atcctgagtt ccaggccagc aatatcatgc atagcatcaa tggctatgtg tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cctactggta catcctgagc attggggccc agactgactt tctgtctgtg ttcttttctg gctatacctt caagcacaag atggtgtatg aggataccct gaccctgttc cccttctctg gggagactgt gttcatgagc atggagaatc ctgggctgtg gatcctgggg tgccacaact ctgattttag gaacaggggg atgactgccc tgctgaaggt gtctagctgt gataagaaca ctggggacta ctatgaggac agctatgagg acatttctgc ttatctgctg tctaagaata atgccattga gcccagaagc ttcagccaga atccccctgt gctgaagaga catcagaggg agatcaccag aactaccctg cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacactatct ctgtggagat gaagaaggag gactttgaca tctatgatga ggatgagaat cagtctccca ggagctttca gaagaagacc agacattact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgag ctctagccct catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc tctgtgcccc agttcaagaa ggtggtgttc caggaattca ctgatggcag cttcacccag cccctgtaca ggggggagct gaatgagcac ctgggcctgc tggggcctta tatcagggct gaggtggagg ataatattat ggtgactttc aggaaccagg ccagcaggcc ctactctttc tatagcagcc tgatctctta tgaggaggat cagaggcagg gggctgagcc taggaagaac tttgtgaagc ccaatgagac taagacctac ttctggaagg tccagcacca catggcccct accaaggatg agtttgactg caaggcctgg gcctatttct ctgatgtgga tctggagaag gatgtccatt ctgggctgat tggccccctg ctggtgtgcc acactaacac tctgaatcct gcccatggca ggcaggtgac tgtccaggag tttgccctgt tcttcactat ctttgatgag accaagagct ggtactttac tgagaacatg gagaggaact gcagagctcc ttgcaatatt cagatggagg accccacctt caaggagaat tacaggttcc atgccattaa tgggtacatc atggacaccc tgcctggcct ggtgatggct caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatgggct ctaatgagaa tatccacagc atccacttct ctgggcatgt gttcactgtg aggaagaagg aggagtacaa gatggctctg tataatctgt accctggggt gtttgaaact gtggagatgc tgccctctaa ggctggcatc tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctg gcatgagcac cctgttcctg gtgtacagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcct ctggccacat cagggacttc cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggccccca agctggccag gctgcactat tctggcagca tcaatgcctg gagcaccaag gagcccttca gctggatcaa ggtggacctg ctggccccca tgatcattca tggcatcaag acccaggggg ccaggcagaa gttcagctct ctgtacatct ctcagttcat catcatgtac tctctggatg ggaagaagtg gcagacctac aggggcaaca gcactggcac cctgatggtg ttctttggga atgtggactc ttctggcatc aagcacaaca tcttcaatcc ccccatcatt gctaggtata ttaggctgca tcccacccac tacagcatca ggtctaccct gaggatggag ctgatgggct gtgacctgaa ctcttgcagc atgcccctgg gcatggagtc taaggccatc tctgatgccc agattactgc cagcagctac ttcaccaaca tgtttgccac ctggagcccc tctaaggcca ggctgcatct gcaggggagg agcaatgcct ggaggcctca ggtgaacaac cccaaggagt ggctgcaggt ggatttccag aagaccatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtca agagcctgct gaccagcatg tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatggcc accagtggac tctgttcttt cagaatggga aggtgaaggt gtttcagggc aatcaggact ctttcacccc tgtggtgaac agcctggacc cccccctgct gaccagatac ctgaggatcc acccccagtc ttgggtgcat cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggctc aggatctgta ctga
Variante X08 de ácido nucleico reduzida em CpG que codifica FVIII (SEQ ID NO:8) atgcagattg agctgagcac ttgctttttt ctgtgcctgc tgaggttttg tttttctgcc accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctggg actatatgca gtctgatctg ggggagctgc ctgtggatgc caggttcccc cccagggtgc ccaagtcttt tcccttcaac acctctgtgg tgtataagaa gaccctgttt gtggagttca ctgaccacct gttcaacatt gctaagccta ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccta ccattcaggc tgaggtgtat gacactgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccatc ctgtgagcct gcatgctgtg ggggtctctt actggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgaccagac cagccagaga gagaaggagg atgacaaggt cttccctggg ggctctcaca cctatgtgtg gcaggtgctg aaggaaaatg gccccatggc ctctgacccc ctgtgcctga cctacagcta tctgagccat gtggatctgg tgaaggacct gaattctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagt ttatcctgct gtttgctgtg tttgatgagg gcaagtcttg gcactctgag actaagaaca gcctgatgca ggacagggat gctgcctctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtga atggctatgt gaacaggagc ctgcctgggc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtact ggcatgtgat tggcatgggc accacccctg aggtgcacag catcttcctg gaaggccaca ctttcctggt gaggaaccat aggcaggcca gcctggagat cagccctatc accttcctga ctgcccagac cctgctgatg gatctggggc agttcctgct gttctgccac atctctagcc accagcatga tgggatggag gcctatgtga aggtggacag ctgcccagag gagcctcagc tgaggatgaa aaacaatgaa gaggctgagg attatgatga tgatctgact gactctgaga tggatgtggt gagatttgat gatgacaata gccctagctt tattcagatc aggtctgtgg ctaagaagca ccccaagacc tgggtgcatt acattgctgc tgaggaggag gactgggatt atgctcctct ggtgctggcc cctgatgata ggagctacaa gagccagtac ctgaataatg gccctcagag gattggcagg aagtacaaga aggtgaggtt catggcttac actgatgaga ccttcaagac tagggaggcc atccagcatg agtctgggat cctggggccc ctgctgtatg gggaggtggg ggacaccctg ctgatcatct tcaagaacca ggctagcagg ccttacaaca tctatcccca tgggatcact gatgtgagac ctctgtacag caggaggctg cccaaggggg tcaagcatct gaaagacttc cccatcctgc ctggggagat ctttaagtat aagtggactg tgactgtgga ggatgggccc accaagtctg accccaggtg cctgaccagg tattacagca gctttgtgaa catggagagg gatctggcct ctgggctgat tggccccctg ctgatctgtt acaaggaatc tgtggatcag aggggcaatc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcc tgttctctgt gtttgatgag aataggtctt ggtacctgac tgaaaacatc cagaggttcc tgcccaaccc tgctggggtc cagctggagg atcctgagtt ccaggctagc aacatcatgc acagcatcaa tgggtatgtg tttgatagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cctactggta catcctgtct attggggccc agactgactt cctgtctgtg ttcttttctg gctacacctt caagcacaag atggtgtatg aggacaccct gaccctgttc cccttctctg gggagactgt ctttatgagc atggagaacc ctgggctgtg gatcctgggc tgccacaact ctgatttcag gaataggggc atgactgctc tgctgaaggt gagctcttgt gacaagaaca ctggggatta ctatgaggac agctatgagg acatttctgc ctacctgctg agcaagaaca atgccattga gcctaggagc tttagccaga atcctcctgt cctgaagagg caccagaggg agatcaccag gaccaccctg cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gataccatct ctgtggagat gaagaaggag gactttgaca tctatgatga ggatgagaat cagtctccca ggagcttcca gaagaagacc aggcactatt tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgag cagctctcct catgtgctga ggaatagggc tcagtctggc tctgtgcccc agttcaagaa agtggtgttt caggagttca ctgatggctc tttcacccag cctctgtata ggggggagct gaatgagcac ctggggctgc tgggccccta tatcagggct gaggtggagg ataacatcat ggtgaccttc aggaaccagg cctctaggcc ctacagcttc tatagcagcc tgatcagcta tgaggaggac cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagc ccaatgagac caagacttac ttctggaagg tgcagcatca catggccccc accaaggatg agtttgactg taaggcctgg gcctacttct ctgatgtgga tctggagaag gatgtgcact ctggcctgat tggccccctg ctggtgtgcc ataccaatac tctgaaccct gctcatggca ggcaggtgac tgtgcaggag tttgctctgt tcttcactat ctttgatgag accaagtctt ggtatttcac tgagaatatg gagaggaact gcagggcccc ctgcaacatc cagatggagg accccacctt taaggagaac tataggtttc atgccatcaa tggctacatc atggacaccc tgcctggcct ggtgatggcc caggatcaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatggggt ctaatgagaa catccacagc atccacttct ctggccatgt gtttactgtg agaaagaagg aggagtacaa gatggctctg tacaatctgt accctggggt ctttgagact gtggagatgc tgcctagcaa ggctgggatc tggagggtgg agtgcctgat tggggaacat ctgcatgctg ggatgtctac tctgttcctg gtgtacagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggctt ctggccatat cagggacttt cagattactg cctctgggca gtatggccag tgggccccca agctggctag gctgcattat tctggcagca tcaatgcctg gtctactaag gagcccttca gctggatcaa ggtggatctg ctggccccca tgatcatcca tggcatcaag acccaggggg ccaggcagaa gtttagctct ctgtacatta gccagttcat catcatgtac agcctggatg ggaagaagtg gcagacctac aggggcaatt ctactggcac cctgatggtg ttctttggca atgtggacag ctctggcatc aagcacaaca tctttaaccc ccctatcatt gctaggtaca tcaggctgca tcccacccat tacagcatca ggagcaccct gaggatggag ctgatgggct gtgacctgaa ctcttgcagc atgcccctgg gcatggagag caaggccatt tctgatgccc agattactgc cagcagctac ttcactaaca tgtttgccac ctggtctccc agcaaggcca ggctgcacct gcagggcagg agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagt ggctgcaggt ggatttccag aagaccatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtga agagcctgct gactagcatg tatgtgaagg agttcctgat cagctctagc caggatggcc accagtggac tctgtttttc cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aaccaggact ctttcactcc tgtggtgaac agcctggacc cccccctgct gaccaggtat ctgaggattc acccccagtc ttgggtgcat cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggccc aggatctgta ctga
Variante X09 de ácido nucleico reduzida em CpG que codifica FVIII (SEQ ID NO:9) atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgtctgc tgagattttg cttttctgcc actaggaggt attacctggg ggctgtggag ctgtcttggg actacatgca gtctgatctg ggggagctgc ctgtggatgc caggttccca cctagggtgc ctaagagctt tcccttcaat acctctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttca ctgaccacct gttcaacatt gccaagccta ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccta ccatccaggc tgaagtgtat gacactgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccacc ctgtgagcct gcatgctgtg ggggtgtctt actggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgatcagac cagccagagg gagaaggaag atgacaaggt gttccctggg ggcagccaca cctatgtctg gcaggtgctg aaggagaatg gccccatggc ctctgatccc ctgtgcctga cctactctta cctgagccat gtggacctgg tgaaggatct gaattctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcataagt tcatcctgct gtttgctgtg tttgatgaag ggaagagctg gcactctgag actaagaaca gcctgatgca ggacagggat gctgcttctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtga atggctatgt gaatagaagc ctgcctggcc tgattgggtg ccacaggaag tctgtgtact ggcatgtgat tgggatgggc actacccctg aggtgcatag catcttcctg gaaggccata ccttcctggt gaggaatcat aggcaggctt ctctggaaat ttctcccatc actttcctga ctgctcagac cctgctgatg gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagctctc accagcatga tgggatggag gcctatgtga aggtggacag ctgtcctgag gagccccagc tgaggatgaa gaacaatgag gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgaga tggatgtggt caggtttgat gatgacaata gcccctcttt catccagatc aggtctgtgg ccaagaagca ccccaagact tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggatt atgcccctct ggtgctggcc cctgatgaca ggagctataa gtctcagtac ctgaataatg gcccccagag gattgggagg aagtataaga aggtgaggtt tatggcctac actgatgaga ccttcaagac cagggaggcc atccagcatg agtctggcat cctgggcccc ctgctgtatg gggaggtggg ggataccctg ctgatcatct tcaagaacca ggcctctagg ccctacaata tctaccctca tggcatcact gatgtgagac ccctgtatag caggaggctg cctaaggggg tgaagcacct gaaggacttc cccatcctgc ctggggagat cttcaagtat aagtggactg tgactgtgga ggatggcccc accaagtctg accccaggtg cctgaccagg tattacagct cttttgtgaa catggagagg gatctggcct ctgggctgat tggcccactg ctgatctgct acaaggagtc tgtggatcag aggggcaatc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcc tgttttctgt gtttgatgaa aataggtctt ggtatctgac tgagaacatc cagaggtttc tgcccaatcc tgctggggtg cagctggagg atcctgagtt tcaggcctct aatatcatgc attctatcaa tggctatgtg tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cctactggta catcctgagc attggggctc agactgactt cctgtctgtg ttcttttctg gctatacttt caagcacaag atggtgtatg aggacactct gaccctgttc cccttctctg gggagactgt gttcatgtct atggaaaatc ctgggctgtg gattctgggc tgccacaatt ctgacttcag gaataggggg atgactgccc tgctgaaggt gtctagctgt gataagaaca ctggggatta ctatgaggac tcttatgaag atatctctgc ctatctgctg agcaagaaca atgccattga gcccaggagc ttcagccaga acccccctgt gctgaagagg caccagaggg agatcaccag gaccactctg cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacactatct ctgtggagat gaagaaggag gattttgaca tttatgatga ggatgagaac cagtctccca ggagcttcca gaagaagacc aggcattact ttattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atgggatgag cagctctcct catgtgctga ggaacagggc ccagtctggg tctgtgcccc agttcaagaa ggtggtgttc caggagttca ctgatgggag cttcacccag cccctgtata ggggggagct gaatgagcac ctgggcctgc tgggccccta catcagggct gaggtggagg ataatatcat ggtgaccttc aggaaccagg ctagcaggcc ttacagcttt tacagcagcc tgatctctta tgaagaagac cagaggcagg gggctgagcc caggaagaat tttgtgaagc ctaatgagac caagacttat ttttggaagg tgcagcatca catggctcct accaaggatg agtttgactg caaggcctgg gcctactttt ctgatgtgga tctggagaag gatgtgcact ctggcctgat tggccctctg ctggtgtgcc atactaacac tctgaaccct gcccatggga ggcaggtgac tgtgcaggag tttgccctgt tcttcactat ttttgatgag accaagtctt ggtatttcac tgagaacatg gagaggaact gcagggctcc ctgcaacatc cagatggaag accccacctt caaggagaac tataggttcc atgccatcaa tgggtacatc atggataccc tgcctggcct ggtgatggcc caggatcaga ggattaggtg gtatctgctg agcatgggct ctaatgagaa catccacagc atccatttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaagg aggagtacaa gatggctctg tacaacctgt atcctggggt gtttgagact gtggagatgc tgcccagcaa ggctggcatc tggagggtgg aatgcctgat tggggagcac ctgcatgctg gcatgagcac tctgttcctg gtgtatagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcct ctggccatat cagggatttc cagatcactg cttctggcca gtatggccag tgggccccca agctggccag gctgcactat tctggcagca tcaatgcctg gagcactaag gagccttttt cttggatcaa ggtggacctg ctggccccta tgattattca tggcatcaag acccaggggg ccaggcagaa gttctctagc ctgtacatct ctcagttcat cattatgtat agcctggatg gcaagaagtg gcagacctac aggggcaata gcactggcac cctgatggtg ttttttggga atgtggactc ttctgggatc aagcacaaca tctttaaccc ccccatcatt gccaggtata ttaggctgca ccccacccac tacagcatca ggagcaccct gaggatggag ctgatgggct gtgatctgaa ttcttgctct atgcccctgg gcatggagag caaggccatc tctgatgccc agatcactgc cagctcttac ttcaccaaca tgtttgccac ctggtctcct agcaaggcca ggctgcatct gcagggcagg agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag aagaccatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtga agagcctgct gacctctatg tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatggcc accagtggac tctgttcttc cagaatggga aggtgaaggt gttccagggc aaccaggata gctttacccc tgtggtgaac agcctggacc ctcctctgct gaccagatac ctgaggatcc atcctcagag ctgggtgcac cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggccc aggatctgta ctga
Variante X10 de ácido nucleico reduzida em CpG que codifica FVIII (SEQ ID NO:10) atgcagattg agctgagcac ttgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttctg cttttctgct actaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctggg attacatgca gtctgacctg ggggagctgc cagtggatgc caggttcccc cccagggtgc ccaagtcttt tcctttcaac acctctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttca ctgaccacct gttcaacatt gccaagccca ggcccccctg gatggggctg ctggggccca ccatccaggc tgaggtgtat gacactgtgg tgattaccct gaagaacatg gctagccacc ctgtgagcct gcatgctgtg ggggtgagct attggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgatcagac cagccagagg gaaaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccata cttatgtgtg gcaggtgctg aaggagaatg ggcccatggc ctctgacccc ctgtgcctga cttacagcta tctgagccat gtggacctgg tgaaggatct gaactctggc ctgattgggg ctctgctggt gtgcagggag ggcagcctgg ctaaggagaa gactcagact ctgcataagt tcatcctgct gtttgctgtg tttgatgaag gcaagagctg gcactctgag accaagaact ctctgatgca ggatagggat gctgcctctg ccagggcttg gcccaagatg cacactgtga atggctatgt gaacaggagc ctgcctggcc tgattgggtg ccacaggaag tctgtgtact ggcatgtgat tggcatgggc accacccctg aggtgcacag cattttcctg gagggccaca ccttcctggt gaggaatcac aggcaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctga ctgcccagac cctgctgatg gacctggggc agtttctgct gttctgccac atcagcagcc atcagcatga tggcatggag gcctatgtga aggtggactc ttgccctgag gagccccagc tgaggatgaa gaacaatgag gaggctgagg attatgatga tgacctgact gactctgaga tggatgtggt gaggtttgat gatgacaata gccccagctt catccagatt aggtctgtgg ccaagaagca ccctaagacc tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggatt atgcccccct ggtgctggct cctgatgaca ggtcttataa gagccagtac ctgaacaatg ggccccagag gattggcagg aagtacaaga aggtgaggtt catggcttac actgatgaga ccttcaagac tagggaggcc atccagcatg agtctggcat cctgggcccc ctgctgtatg gggaggtggg ggataccctg ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccctacaaca tttaccctca tggcatcact gatgtgaggc ccctgtacag caggagactg cccaaggggg tgaagcacct gaaggatttt cccattctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactg tgactgtgga ggatggcccc accaagtctg atcccaggtg cctgactagg tactactctt cttttgtgaa tatggagagg gatctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgct acaaggagtc tgtggaccag aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcc tgttctctgt gtttgatgag aataggagct ggtacctgac tgagaatatc cagaggttcc tgcctaatcc tgctggggtc cagctggagg atcctgagtt ccaggctagc aacattatgc acagcatcaa tggctatgtg tttgattctc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cttactggta catcctgtct attggggccc agactgattt cctgtctgtg ttcttctctg gctacacttt caagcataag atggtgtatg aggataccct gaccctgttc cccttctctg gggagactgt gttcatgtct atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgtcataact ctgacttcag aaacaggggc atgactgccc tgctgaaggt gagcagctgt gacaagaaca ctggggacta ctatgaggac agctatgagg atatctctgc ttatctgctg agcaagaata atgccattga gcccaggagc ttcagccaga acccccctgt gctgaagagg caccagaggg agatcactag gactaccctg cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacaccatct ctgtggagat gaagaaggag gactttgaca tctatgatga ggatgagaac cagtccccca ggtctttcca gaagaagacc aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgag ctctagcccc catgtgctga ggaacagggc tcagtctggc tctgtgcccc agttcaagaa ggtggtcttc caggagttca ctgatggctc ttttacccag cctctgtaca gaggggagct gaatgagcac ctgggcctgc tgggccccta catcagggct gaggtggagg ataatatcat ggtgaccttc agaaaccagg cctctaggcc ctacagcttc tacagcagcc tgatctctta tgaggaggat cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagc ccaatgagac caagacctac ttctggaagg tgcagcacca tatggcccct actaaggatg agtttgactg caaggcctgg gcttattttt ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcact ctgggctgat tggccccctg ctggtgtgcc acaccaacac cctgaaccct gcccatggca ggcaggtgac tgtgcaggag tttgccctgt tcttcactat ctttgatgag accaagagct ggtacttcac tgagaacatg gagagaaatt gtagggctcc ctgcaatatc cagatggagg accccacctt caaagaaaat tacagattcc atgccatcaa tgggtacatc atggataccc tgcctgggct ggtgatggct caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatggggt ctaatgagaa catccactct atccatttct ctggccatgt gttcactgtg agaaagaagg aggagtataa gatggctctg tacaacctgt acccaggggt gtttgagact gtggaaatgc tgcccagcaa agctgggatc tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctg gcatgtctac cctgttcctg gtgtacagca acaagtgcca gactcccctg ggcatggcct ctgggcacat cagggatttt cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggccccca agctggccag gctgcactac tctggcagca ttaatgcttg gagcactaag gagcccttca gctggatcaa ggtggatctg ctggccccca tgatcatcca tggcatcaag acccaggggg ccaggcagaa gttctctagc ctgtacattt ctcagttcat catcatgtac agcctggatg ggaagaagtg gcagacctac agggggaaca gcactgggac cctgatggtg ttctttggca atgtggatag ctctggcatc aagcacaata tcttcaatcc ccccattatt gccaggtaca ttaggctgca tcctactcac tactctatta ggagcaccct gaggatggag ctgatggggt gtgacctgaa cagctgttct atgcccctgg gcatggagtc taaggctatc tctgatgccc agatcactgc cagcagctac ttcactaata tgtttgccac ctggagccct agcaaggcca gactgcacct gcagggcagg agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag aagaccatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtga agagcctgct gaccagcatg tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatggcc accagtggac cctgttcttc cagaatggga aggtgaaggt gttccagggc aaccaggact ctttcacccc tgtggtgaac agcctggatc ctcccctgct gaccaggtac ctgaggatcc acccccagag ctgggtgcac cagattgctc tgaggatgga agtgctgggc tgtgaggccc aggatctgta ctga
Variante X11 de ácido nucleico reduzida em CpG que codifica FVIII (SEQ ID NO:11) atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttttg cttctctgct accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctggg actatatgca gtctgacctg ggggagctgc ctgtggatgc taggttccct cccagggtgc ccaagagctt cccctttaat acctctgtgg tgtacaagaa aaccctgttt gtggagttca ctgaccatct gttcaacatt gccaagccca ggcccccttg gatgggcctg ctgggcccca ccattcaggc tgaggtgtat gacactgtgg tcattaccct gaagaacatg gcttctcacc ctgtgagcct gcatgctgtg ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgaccagac cagccagagg gagaaggagg atgataaggt gttccctggg ggcagccaca cctatgtgtg gcaggtgctg aaggagaatg gccccatggc ctctgatccc ctgtgcctga cctactctta tctgtctcat gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ctctgctggt gtgcagggag ggctctctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagt ttattctgct gtttgctgtc tttgatgagg gcaagagctg gcattctgag accaagaaca gcctgatgca ggacagggat gctgcctctg ccagggcctg gcccaaaatg cacactgtga atggctatgt gaacaggagc ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtact ggcatgtgat tggcatgggc accacccctg aggtgcacag catcttcctg gagggccaca cctttctggt gaggaatcac aggcaggcca gcctggagat tagccccatc accttcctga ctgcccagac cctgctgatg gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagcagcc accagcatga tggcatggag gcctatgtga aggtggatag ctgccctgag gagccccagc tgaggatgaa aaacaatgag gaggctgagg attatgatga tgacctgact gactctgaga tggatgtggt gaggtttgat gatgacaata gccccagctt tattcagatt aggtctgtgg ctaagaagca ccccaagact tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggact atgcccctct ggtcctggcc cctgatgata ggtcttacaa gagccagtat ctgaacaatg gcccccagag gattggcagg aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgaga cctttaagac cagggaggcc attcagcatg agtctgggat cctgggcccc ctgctgtatg gggaggtggg ggacactctg ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccttataaca tctaccctca tgggatcact gatgtgaggc ccctgtactc tagaaggctg cccaaggggg tcaagcacct gaaggatttt cccatcctgc ctggggagat tttcaagtac aagtggactg tgactgtgga ggatggcccc accaagtctg accctaggtg cctgaccagg tactacagct cttttgtgaa catggagagg gacctggcct ctggcctgat tggccctctg ctgatttgct acaaggagtc tgtggaccag aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcc tgttttctgt gtttgatgag aacaggtctt ggtacctgac tgagaacatc cagaggttcc tgcctaaccc agctggggtg cagctggagg atcctgagtt ccaggccagc aatattatgc atagcattaa tggctatgtg tttgatagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cctactggta catcctgagc attggggccc agactgactt tctgtctgtg ttcttctctg gctacacctt caagcataag atggtgtatg aggacaccct gactctgttc cctttttctg gggagactgt gtttatgagc atggagaatc ctggcctgtg gatcctgggc tgccataatt ctgacttcag gaacaggggc atgactgccc tgctgaaagt gagcagctgt gacaagaata ctggggacta ctatgaagac agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaaca atgccattga gcccaggagc ttcagccaga accccccagt gctgaagagg caccagagag agatcaccag gactaccctg cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gacaccattt ctgtggagat gaagaaggag gactttgaca tttatgatga ggatgagaat cagagcccca ggagcttcca gaagaagact aggcactatt ttattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgag cagctctccc catgtgctga ggaatagggc ccagtctggc tctgtgcctc agttcaagaa ggtggtgttc caggagttca ctgatggcag ctttacccag cccctgtata ggggggagct gaatgagcac ctgggcctgc tgggccccta tatcagggct gaggtggagg acaatattat ggtgaccttt aggaaccagg ccagcaggcc ctactctttc tatagcagcc tgatcagcta tgaggaggac cagaggcagg gggctgagcc caggaagaat tttgtgaagc ctaatgagac caagacctac ttctggaagg tgcagcatca catggccccc accaaggatg agtttgactg caaggcttgg gcctatttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcact ctggcctgat tggccccctg ctggtgtgcc acactaacac tctgaatcct gcccatggca ggcaggtgac tgtgcaggag tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag accaagagct ggtacttcac tgagaacatg gagaggaact gcagggcccc ctgcaacatc cagatggagg atcccacctt caaggagaac tacaggtttc atgccatcaa tggctacatc atggacactc tgcctggcct ggtgatggcc caggatcaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatgggct ctaatgagaa tatccatagc atccacttct ctggccatgt gttcactgtc aggaagaagg aggagtacaa gatggctctg tataatctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgc tgcccagcaa ggctggcatc tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctg ggatgagcac cctgtttctg gtgtactcta acaagtgcca gacccccctg ggcatggcct ctgggcacat cagggatttc cagatcactg cttctggcca gtatggccag tgggccccca agctggccag gctgcactac tctggcagca tcaatgcctg gtctaccaag gagccctttt cttggattaa ggtggacctg ctggccccca tgatcatcca tggcatcaag acccaggggg ccaggcagaa gttcagcagc ctgtacatca gccagttcat catcatgtac agcctggatg gcaaaaagtg gcagacctac aggggcaata gcactgggac tctgatggtg ttctttggca atgtggacag ctctgggatc aagcacaata tcttcaaccc tcccatcatt gctaggtaca tcaggctgca ccccacccac tatagcatca ggtctaccct gaggatggag ctgatgggct gtgacctgaa ctcttgcagc atgcccctgg gcatggagtc caaagctatc tctgatgccc agattactgc cagcagctac ttcaccaaca tgtttgccac ctggtctccc tctaaggcca ggctgcacct gcagggcagg agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaat cccaaggagt ggctgcaggt ggatttccag aaaactatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtga agtctctgct gaccagcatg tatgtgaagg agttcctgat ctcttctagc caggatggcc accagtggac tctgttcttc cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aaccaggaca gcttcacccc tgtggtgaac tctctggatc cccccctgct gaccaggtac ctgaggattc atccccagag ctgggtgcac cagattgctc tgagaatgga ggtgctgggg tgtgaggctc aggacctgta ttga
Variante X12 de ácido nucleico reduzida em CpG que codifica FVIII (SEQ ID NO:12) atgcagattg agctgtctac ttgttttttt ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgcc accaggaggt attacctggg ggctgtggag ctgagctggg attacatgca gtctgatctg ggggagctgc ctgtggatgc caggttcccc cccagggtgc ccaagagctt ccccttcaac acctctgtgg tgtataagaa gaccctgttt gtggagttca ctgatcatct gtttaacatt gccaagccca ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccaa ctatccaggc tgaggtgtat gacactgtgg tcatcaccct gaagaatatg gccagccatc ctgtgagcct gcatgctgtg ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgaccagac cagccagagg gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccaca cctatgtgtg gcaggtgctg aaggagaatg gccccatggc ctctgacccc ctgtgcctga cttatagcta cctgtctcat gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ccctgctggt ctgtagggaa ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagt ttattctgct gtttgctgtg tttgatgaag gcaagagctg gcactctgag accaagaatt ctctgatgca ggatagggat gctgcctctg ccagggcctg gcccaagatg catactgtga atggctatgt gaacagaagc ctgcctggcc tgattggctg ccataggaag tctgtgtatt ggcatgtgat tgggatgggc actacccctg aagtgcacag cattttcctg gagggccaca ctttcctggt gaggaaccac aggcaggcct ctctggagat cagccccatt actttcctga ctgcccagac cctgctgatg gatctgggcc agttcctgct gttctgccac atctctagcc accagcatga tggcatggag gcctatgtga aggtggacag ctgccctgag gagccccagc tgaggatgaa gaataatgag gaggctgagg attatgatga tgacctgact gactctgaga tggatgtggt gaggtttgat gatgataata gccccagctt catccagatc aggtctgtgg ccaagaagca tcccaagacc tgggtgcact atattgctgc tgaagaggag gactgggact atgcccctct ggtgctggct cctgatgaca ggagctataa gagccagtat ctgaacaatg ggccccagag gattgggagg aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgaga cctttaagac cagggaggcc atccagcatg agtctggcat tctggggccc ctgctgtatg gggaggtggg ggacactctg ctgatcattt tcaagaacca ggccagcagg ccctacaata tttaccccca tggcatcact gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cccaaggggg tgaagcacct gaaggacttc cccatcctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactg tgactgtgga ggatggccct accaagtctg accctaggtg tctgactagg tactacagca gctttgtgaa catggagaga gacctggctt ctggcctgat tggccccctg ctgatctgct acaaggagtc tgtggatcag aggggcaacc agattatgtc tgataagagg aatgtcatcc tgttctctgt gtttgatgag aacaggagct ggtatctgac tgagaacatt cagaggttcc tgcccaaccc tgctggggtg cagctggagg accctgagtt ccaggccagc aacatcatgc attctattaa tggctatgtg tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cctactggta catcctgagc attggggccc agactgactt tctgtctgtg tttttctctg ggtacacctt caagcacaag atggtctatg aggacaccct gaccctgttc cccttttctg gggaaactgt gtttatgagc atggagaacc ctgggctgtg gatcctgggc tgccacaact ctgactttag gaataggggc atgactgccc tgctgaaggt gagcagctgt gacaagaata ctggggatta ctatgaggac agctatgagg atatctctgc ctacctgctg agcaagaaca atgccattga gcctaggagc ttcagccaga acccccctgt gctgaagagg caccagaggg agatcaccag gaccaccctg cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacaccatct ctgtggagat gaagaaggag gactttgata tttatgatga ggatgagaac cagagcccca ggagcttcca gaagaagacc aggcactatt tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgag ctctagcccc catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc tctgtgcccc agttcaagaa ggtggtgttc caggaattta ctgatggcag ctttacccag cccctgtaca gaggggagct gaatgagcac ctgggcctgc tgggccccta catcagggct gaggtggagg ataatatcat ggtgaccttt aggaaccagg cctctaggcc ctattctttt tacagcagcc tgatcagcta tgaggaggac cagaggcagg gggctgagcc taggaagaac tttgtgaagc ccaatgagac caagacctac ttttggaaag tgcagcacca catggccccc actaaggatg agtttgattg caaggcctgg gcctatttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcact ctggcctgat tggccccctg ctggtgtgcc acaccaacac tctgaaccct gcccatggca ggcaggtgac tgtgcaggag tttgccctgt tctttaccat ctttgatgag actaagagct ggtatttcac tgagaacatg gagaggaact gcagagcccc ttgcaacatc cagatggagg accctacctt caaggagaac tataggttcc atgccatcaa tgggtacatc atggataccc tgcctggcct ggtgatggct caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatgggga gcaatgagaa cattcatagc atccacttct ctgggcatgt gttcactgtg aggaagaagg aggagtataa gatggccctg tacaacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgc tgcccagcaa ggctggcatc tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctg gcatgagcac tctgttcctg gtgtacagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcct ctggccacat cagggacttc cagattactg cctctgggca gtatgggcag tgggccccca agctggccag gctgcactac tctgggtcta tcaatgcttg gagcaccaag gagcctttca gctggatcaa ggtggatctg ctggccccca tgatcattca tgggatcaag acccaggggg ccaggcagaa gttcagcagc ctgtatattt ctcagttcat catcatgtat tctctggatg gcaaaaagtg gcagacctat agagggaaca gcactgggac cctgatggtg ttttttggca atgtggatag ctctggcatc aagcacaata tcttcaaccc ccccattatt gccaggtaca tcaggctgca ccccacccac tactctatca ggagcaccct gaggatggag ctgatgggct gtgatctgaa cagctgctct atgcctctgg ggatggaaag caaggccatc tctgatgccc agatcactgc cagcagctat ttcaccaata tgtttgccac ttggagccct agcaaggcta ggctgcatct gcagggcagg tctaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag aagactatga aagtgactgg ggtgaccacc cagggggtga aaagcctgct gaccagcatg tatgtgaagg agttcctgat tagcagcagc caggatggcc accagtggac cctgttcttc cagaatggga aggtgaaggt gtttcagggc aatcaggata gcttcacccc agtggtgaac agcctggacc cccccctgct gaccaggtac ctgaggatcc acccccagag ctgggtgcac cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggccc aggatctgta ctga
Variante X13 de ácido nucleico reduzida em CpG que codifica FVIII (SEQ ID NO:13) atgcagattg agctgagcac ctgctttttc ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgct accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgtcttggg attacatgca gtctgacctg ggggagctgc ctgtggatgc caggtttccc cccagggtgc ccaagtcttt cccctttaac acctctgtgg tgtataagaa gactctgttt gtggagttca ctgatcacct gttcaatatt gccaagccca ggcccccttg gatgggcctg ctgggcccca ctatccaggc tgaggtgtat gacactgtgg tcatcaccct gaagaacatg gccagccacc ctgtgagcct gcatgctgtg ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgaccagac cagccagagg gagaaggagg atgacaaggt gttcccaggg gggtctcaca cttatgtgtg gcaggtgctg aaggagaatg ggcccatggc ctctgaccct ctgtgcctga cttatagcta cctgtctcat gtggatctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag gggagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagt tcatcctgct gtttgctgtg tttgatgagg ggaagagctg gcactctgag accaagaata gcctgatgca ggacagggat gctgcttctg ctagggcctg gcctaagatg cacactgtga atggctatgt gaacaggagc ctgcctggcc tgattgggtg tcacaggaag tctgtgtact ggcatgtgat tggcatgggg actactccag aagtgcacag catcttcctg gaggggcaca ccttcctggt gaggaatcac aggcaggcca gcctggagat ttctcccatc actttcctga ctgcccagac cctgctgatg gatctggggc agttcctgct gttctgccac atcagcagcc atcagcatga tgggatggag gcctatgtga aggtggacag ctgccctgag gagcctcagc tgaggatgaa gaacaatgag gaggctgagg actatgatga tgatctgact gactctgaga tggatgtggt gaggtttgat gatgacaact ctcccagctt catccagatc aggtctgtgg ccaagaagca ccccaagacc tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggatt atgctcccct ggtgctggct cctgatgata ggagctacaa gagccagtat ctgaataatg ggccccagag gattggcagg aagtataaga aggtgaggtt catggcctac actgatgaga cctttaagac cagggaggct attcagcatg agtctggcat cctgggcccc ctgctgtatg gggaggtggg ggacaccctg ctgatcattt tcaagaacca ggccagcagg ccctataaca tctatcccca tgggatcact gatgtgaggc ccctgtactc taggaggctg cccaaggggg tcaagcacct gaaggacttc cccatcctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactg tgactgtgga ggatggcccc actaagtctg accccaggtg cctgactagg tactacagca gctttgtgaa catggagaga gatctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgct acaaagagtc tgtggatcag aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcc tgttctctgt gtttgatgag aacagaagct ggtacctgac tgagaacatt cagaggtttc tgcccaaccc tgctggggtc cagctggagg accctgagtt tcaggccagc aacatcatgc acagcatcaa tgggtatgtg tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cctactggta tatcctgagc attggggccc agactgattt cctgtctgtg ttcttctctg gctacacttt caagcacaag atggtgtatg aggataccct gaccctgttc cctttctctg gggaaactgt gttcatgagc atggagaacc ctgggctgtg gatcctgggg tgccacaatt ctgatttcag gaacagaggc atgactgctc tgctgaaggt gtctagctgt gacaagaaca ctggggacta ctatgaggac agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaaca atgctattga acccaggtct ttcagccaga acccccctgt gctgaagagg caccagaggg agatcactag gaccaccctg cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacaccatct ctgtggagat gaagaaggag gactttgaca tctatgatga ggatgagaat cagtctccca ggagcttcca gaagaagact aggcattact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgag ctctagccct catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc tctgtgcccc agttcaagaa ggtggtgttt caggagttca ctgatggcag cttcacccag cccctgtaca ggggggagct gaatgagcat ctgggcctgc tgggccccta catcagggct gaggtggagg acaacatcat ggtgaccttc agaaatcagg ctagcaggcc ctacagcttc tacagcagcc tgatctctta tgaggaggac cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagc ccaatgagac caagacctat ttctggaagg tgcagcacca catggccccc accaaggatg agtttgattg caaggcctgg gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcatt ctgggctgat tggccctctg ctggtgtgcc acaccaacac cctgaatcct gcccatggca ggcaggtgac tgtgcaggag tttgccctgt tctttactat ctttgatgag accaagtctt ggtattttac tgagaacatg gagaggaact gcagggcccc ctgcaacatc cagatggagg accccacctt caaggagaac tacagattcc atgccatcaa tggctacatt atggacactc tgcctggcct ggtgatggcc caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg tctatgggca gcaatgagaa cattcactct atccacttct ctgggcatgt gttcactgtg aggaagaagg aggagtacaa gatggccctg tacaacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgc tgcctagcaa ggctgggatc tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctg gcatgtctac cctgttcctg gtgtacagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcct ctggccacat cagagatttt cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggctccta agctggccag gctgcactac tctggcagca tcaatgcctg gagcaccaag gagcccttta gctggatcaa ggtggacctg ctggccccca tgatcatcca tggcatcaag actcaggggg ccaggcagaa gttctctagc ctgtacatta gccagttcat catcatgtat agcctggatg gcaagaagtg gcagacctac aggggcaaca gcactgggac cctgatggtg ttctttggga atgtggacag ctctgggatc aagcacaata tcttcaaccc ccccattatt gccaggtata ttaggctgca ccccactcac tacagcatta ggagcaccct gaggatggag ctgatgggct gtgatctgaa cagctgcagc atgcccctgg gcatggagtc taaggccatc tctgatgccc agatcactgc cagctcttac ttcaccaaca tgtttgccac ttggagcccc agcaaggcca ggctgcacct gcagggcagg agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagt ggctgcaggt ggatttccag aagactatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtga agagcctgct gactagcatg tatgtgaagg agttcctgat cagctctagc caggatggcc accagtggac cctgttcttt cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aaccaggact ctttcacccc tgtggtgaat tctctggacc ctcccctgct gactaggtat ctgaggattc atccccagag ctgggtgcat cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggccc aggacctgta ttga
Variante X14 de ácido nucleico reduzida em CpG que codifica FVIII (SEQ ID NO:14) atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttttg cttttctgcc actaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgtcttggg attacatgca gtctgacctg ggggagctgc cagtggatgc caggttcccc ccaagggtgc ccaagtcttt tcccttcaat acctctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttta ctgatcatct gtttaacatt gccaagccca ggcccccctg gatggggctg ctgggcccca ccatccaggc tgaggtgtat gatactgtgg tgattaccct gaagaatatg gccagccatc ctgtgtctct gcatgctgtg ggggtgtctt attggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgatcagac cagccagagg gagaaggagg atgataaggt gttccctggg ggctctcaca cctatgtgtg gcaggtgctg aaggagaatg ggcctatggc ctctgaccca ctgtgcctga cttacagcta tctgagccat gtggacctgg tgaaggacct gaactctggg ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag ggcagcctgg ccaaggagaa gactcagacc ctgcacaagt tcatcctgct gtttgctgtg tttgatgagg gcaagtcttg gcactctgag accaagaaca gcctgatgca ggatagggat gctgcctctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtga atggctatgt gaacaggtct ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtact ggcatgtgat tggcatgggc accacccctg aggtgcatag cattttcctg gagggccaca ccttcctggt gaggaaccac aggcaggcta gcctggagat cagccccatc actttcctga ctgcccagac cctgctgatg gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atctctagcc accagcatga tggcatggag gcctatgtga aggtggactc ttgtcctgag gagccccagc tgaggatgaa gaacaatgag gaggctgagg attatgatga tgatctgact gattctgaga tggatgtggt gaggtttgat gatgacaaca gcccctcttt catccagatc aggtctgtgg ccaagaagca ccccaagacc tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggatt atgcccccct ggtgctggcc cctgatgaca ggagctataa gtctcagtac ctgaacaatg gcccccagag aattggcagg aagtacaaga aggtgaggtt catggcctat actgatgaga ccttcaaaac cagggaggcc attcagcatg agtctggcat cctggggccc ctgctgtatg gggaggtggg ggacaccctg ctgatcatct tcaagaacca ggctagcagg ccttacaaca tctaccccca tgggatcact gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cctaaggggg tgaagcacct gaaggacttt cccattctgc ctggggagat cttcaagtat aagtggactg tgactgtgga ggatgggccc accaagtctg accccaggtg cctgactagg tactactcta gctttgtgaa catggagagg gacctggcct ctgggctgat tggccccctg ctgatctgtt acaaggagtc tgtggaccag aggggcaacc agatcatgtc tgataagagg aatgtgatcc tgttctctgt gtttgatgag aacaggagct ggtacctgac tgagaacatc cagagattcc tgcccaaccc tgctggggtg cagctggagg atcctgagtt ccaggccagc aacatcatgc attctatcaa tgggtatgtg tttgatagcc tgcagctgtc tgtgtgtctg catgaggtgg cctactggta cattctgagc attggggccc agactgactt cctgtctgtg ttcttctctg gctacacttt caaacacaag atggtgtatg aggacaccct gaccctgttc cccttctctg gggagactgt gtttatgagc atggagaacc ctgggctgtg gattctgggc tgccacaact ctgacttcag aaacaggggc atgactgccc tgctgaaggt gtcttcttgt gataagaaca ctggggacta ttatgaagac agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaata atgctattga gcccaggtct ttctctcaga acccccctgt gctgaagagg caccagaggg agatcaccag gaccaccctg cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacactattt ctgtggagat gaagaaggaa gactttgata tctatgatga ggatgagaac cagagcccta ggagcttcca gaagaagact aggcattact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgag cagcagcccc catgtgctga ggaatagggc tcagtctggc tctgtgcctc agttcaagaa ggtggtgttc caggaattca ctgatggcag cttcactcag cccctgtaca ggggggagct gaatgagcac ctggggctgc tgggccctta catcagggct gaggtggagg acaatatcat ggtgaccttt aggaaccagg cctctaggcc ttacagcttc tactctagcc tgatctctta tgaagaggac cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagc ccaatgagac taagacttac ttctggaagg tgcagcacca catggctccc accaaggatg agtttgactg caaggcttgg gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcact ctgggctgat tgggcccctg ctggtgtgcc acactaacac tctgaatcct gcccatggca gacaggtgac tgtgcaggag tttgccctgt tttttaccat ctttgatgag actaagtctt ggtacttcac tgagaacatg gagaggaact gcagggcccc ctgcaacatc cagatggagg atcccacctt caaggagaac tacaggtttc atgccatcaa tggctacatc atggacaccc tgcctggcct ggtgatggct caggaccaga ggattaggtg gtatctgctg agcatgggca gcaatgagaa tatccactct atccacttct ctgggcatgt gttcactgtg aggaagaagg aggagtacaa gatggccctg tataacctgt atcctggggt gtttgagact gtggagatgc tgcccagcaa ggctggcatc tggagagtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctg gcatgagcac tctgtttctg gtgtatagca acaagtgtca gacccctctg ggcatggcct ctgggcacat tagggacttt cagatcactg cttctggcca gtatgggcag tgggctccca agctggccag gctgcactat tctggcagca ttaatgcctg gagcaccaag gagcctttca gctggatcaa ggtggacctg ctggccccca tgatcatcca tgggatcaag acccaggggg ctaggcagaa gttcagcagc ctgtacatca gccagtttat catcatgtat tctctggatg gcaagaagtg gcagacctac aggggcaatt ctactggcac tctgatggtg ttctttggga atgtggatag ctctgggatc aagcataata tcttcaatcc ccccattatt gctaggtata tcaggctgca ccccacccac tatagcatca ggagcaccct gaggatggag ctgatggggt gtgacctgaa cagctgcagc atgcccctgg gcatggagag caaggctatt tctgatgccc agatcactgc cagcagctac tttactaata tgtttgccac ctggagcccc agcaaggcca gactgcacct gcagggcagg tctaatgcct ggaggcctca ggtgaataac cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag aaaaccatga aggtgactgg ggtgactacc cagggggtga agtctctgct gaccagcatg tatgtgaagg agttcctgat ctcttctagc caggatggcc accagtggac cctgttcttt cagaatggga aggtgaaggt cttccagggc aaccaggata gcttcacccc tgtggtgaat agcctggatc ctcctctgct gaccaggtat ctgaggatcc acccccagag ctgggtgcat cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggctc aggacctgta ctga
Variante X15 de ácido nucleico reduzida em CpG que codifica FVIII (SEQ ID NO:15) atgcagattg agctgagcac ctgtttcttc ctgtgcctgc tgaggttctg tttctctgcc actaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctggg actatatgca gtctgacctg ggggagctgc ctgtggatgc caggttcccc cccagggtgc ctaagagctt ccccttcaat acttctgtgg tgtacaagaa gactctgttt gtggagttta ctgaccacct gttcaacatt gctaagccca ggcctccctg gatggggctg ctgggcccca ccatccaggc tgaggtgtat gatactgtgg tgattaccct gaagaacatg gcctctcatc cagtgagcct gcatgctgtg ggggtgagct actggaaggc ctctgaaggg gctgagtatg atgaccagac cagccagagg gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccaca cctatgtgtg gcaggtgctg aaggagaatg gcccaatggc ctctgacccc ctgtgcctga cttatagcta cctgagccat gtggatctgg tgaaggacct gaattctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgcagagag ggctctctgg ctaaggagaa gacccagact ctgcacaagt tcatcctgct gtttgctgtg tttgatgagg gcaagagctg gcactctgag actaagaata gcctgatgca ggacagggat gctgcttctg ccagggcctg gcccaagatg catactgtga atggctatgt gaacaggagc ctgcctggcc tgattggctg tcacaggaaa tctgtctact ggcatgtgat tgggatgggc actacccctg aggtgcactc tatcttcctg gagggccata ccttcctggt gaggaaccac aggcaggcca gcctggagat ctctcccatt accttcctga ctgcccagac cctgctgatg gatctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagcagcc accagcatga tgggatggag gcttatgtga aggtggatag ctgccctgag gagccccagc tgaggatgaa gaacaatgag gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgaga tggatgtggt gaggtttgat gatgacaact ctcccagctt tattcagatc aggtctgtgg ctaagaagca ccccaagact tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gactgggact atgcccctct ggtgctggct cctgatgaca ggtcttacaa gtctcagtac ctgaataatg gccctcagag gattggcagg aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgaga ccttcaagac cagggaggcc atccagcatg agtctggcat cctgggcccc ctgctgtatg gggaggtggg ggataccctg ctgatcatct tcaagaatca ggccagcagg ccctacaaca tctaccccca tggcatcact gatgtgaggc cactgtacag caggaggctg cccaaggggg tgaagcatct gaaggacttc cccattctgc ctggggagat cttcaagtac aaatggactg tgactgtgga ggatggccct accaagtctg accccaggtg tctgaccagg tactacagca gctttgtgaa tatggagagg gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgct acaaggagtc tgtggaccag aggggcaatc agatcatgtc tgataagagg aatgtgattc tgttctctgt gtttgatgag aacaggagct ggtacctgac tgagaacatc cagaggttcc tgcccaatcc tgctggggtg cagctggagg accctgagtt ccaggccagc aatatcatgc acagcatcaa tggctatgtc tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cttactggta tattctgagc attggggccc agactgattt cctgtctgtg ttcttttctg gctatacctt taagcacaag atggtgtatg aggacaccct gaccctgttc cccttctctg gggagactgt gttcatgtct atggagaacc ctgggctgtg gatcctgggc tgccacaact ctgacttcag gaacaggggg atgactgccc tgctgaaggt gtctagctgt gataagaaca ctggggacta ttatgaggac agctatgagg acatctctgc ttacctgctg agcaagaaca atgccattga gcccaggtct ttcagccaga atccccctgt gctgaagagg catcagaggg agatcaccag gaccaccctg cagtctgatc aggaggagat tgattatgat gacactatct ctgtggaaat gaagaaggag gactttgaca tctatgatga ggatgagaac cagagcccca ggagcttcca gaagaagacc aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggatt atggcatgag cagctctccc catgtgctga ggaacagagc ccagtctggc tctgtgcctc agttcaagaa ggtggtcttc caggagttca ctgatggctc tttcacccag cccctgtaca ggggggagct gaatgagcac ctgggcctgc tggggcccta cattagggct gaggtggagg ataacatcat ggtgactttc agaaaccagg ccagcaggcc ttacagcttt tactcttctc tgattagcta tgaggaggat cagaggcagg gggctgagcc taggaagaac tttgtgaagc ccaatgagac caagacctat ttctggaagg tgcagcacca catggctccc actaaggatg agtttgactg caaggcttgg gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcact ctggcctgat tgggcccctg ctggtgtgcc acaccaacac cctgaaccct gcccatggca ggcaggtgac tgtgcaggag tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag actaagagct ggtacttcac tgagaacatg gagaggaact gcagggcccc ctgcaacatc cagatggagg accccacctt caaggagaat tacaggttcc atgccatcaa tggctacatt atggacaccc tgcctggcct ggtgatggcc caggatcaga ggatcaggtg gtatctgctg agcatgggct ctaatgagaa catccacagc atccacttct ctggccatgt gtttactgtg aggaagaagg aggaatacaa gatggctctg tataacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgc tgcccagcaa ggctgggatc tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctg ggatgagcac cctgttcctg gtgtatagca ataagtgcca gacccccctg ggcatggctt ctggccacat cagggatttc cagatcactg cttctggcca gtatggccag tgggctccca agctggctag gctgcattac tctgggtcta tcaatgcctg gagcactaag gagcccttca gctggatcaa ggtggacctg ctggccccca tgatcattca tggcatcaag acccaggggg ctaggcagaa gttcagcagc ctgtacatca gccagttcat cattatgtac agcctggatg gcaagaagtg gcagacttac aggggcaata gcactgggac tctgatggtg ttctttggca atgtggactc ttctggcatc aagcacaaca tcttcaaccc tcccatcatt gccaggtaca ttaggctgca ccctacccac tactctatca ggagcaccct gaggatggag ctgatggggt gtgatctgaa ctcttgcagc atgcctctgg gcatggaaag caaagccatc tctgatgccc agatcactgc ctctagctat ttcaccaata tgtttgccac ctggagccct agcaaggcca ggctgcacct gcagggcaga tctaatgcct ggaggcccca ggtgaacaat cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag aagaccatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtga agagcctgct gactagcatg tatgtgaagg agttcctgat ctcttctagc caggatggcc accagtggac cctgttcttc cagaatggca aggtgaaagt gttccagggc aaccaggata gcttcactcc tgtggtgaac tctctggacc ctcccctgct gactaggtac ctgaggattc atccccagag ctgggtgcac cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggccc aggatctgta ctga
Variante X16 de ácido nucleico reduzida em CpG que codifica FVIII (SEQ ID NO:16) atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgcc accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgtcttggg actatatgca gtctgacctg ggggagctgc cagtggatgc caggttcccc cccagggtgc ccaagagctt tcctttcaac acttctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttca ctgaccacct gttcaatatt gctaagccca ggccaccctg gatgggcctg ctgggcccta ccattcaggc tgaggtgtat gacactgtgg tgattactct gaagaatatg gccagccacc ctgtgagcct gcatgctgtg ggggtgtctt actggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgatcagac ttctcagagg gagaaggagg atgataaggt gttccctggg ggctctcaca cttatgtgtg gcaggtgctg aaggagaatg gccccatggc ttctgatcca ctgtgcctga cctactctta cctgagccat gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcataagt tcatcctgct gtttgctgtg tttgatgagg ggaagagctg gcactctgag accaagaatt ctctgatgca ggacagggat gctgcctctg ccagggcctg gcctaagatg cacactgtga atggctatgt gaacaggtct ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtact ggcatgtgat tggcatgggc actacccctg aggtgcacag cattttcctg gagggccaca ccttcctggt caggaaccat aggcaggcct ctctggagat cagccccatc actttcctga ctgcccagac cctgctgatg gacctgggcc agttcctgct gttctgccac attagcagcc accagcatga tggcatggag gcctatgtga aggtggactc ttgccctgag gagccccagc tgaggatgaa gaacaatgag gaagctgagg attatgatga tgacctgact gactctgaga tggatgtggt gaggtttgat gatgacaaca gccccagctt catccagatc aggtctgtgg ccaagaagca ccccaagacc tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggact atgctcccct ggtgctggct cctgatgata ggagctacaa gtctcagtac ctgaataatg gcccccagag gattggcagg aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgaga ccttcaagac cagagaggct atccagcatg agtctgggat cctggggccc ctgctgtatg gggaggtggg ggacaccctg ctgatcatct tcaagaacca ggccagcaga ccctacaaca tctaccccca tgggatcact gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cctaaggggg tgaagcacct gaaggacttc cccatcctgc ctggggagat cttcaagtat aagtggactg tgactgtgga ggatgggccc accaagtctg accctaggtg cctgactagg tactactcta gctttgtgaa catggagagg gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatttgct acaaggagtc tgtggatcag aggggcaatc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcc tgttctctgt gtttgatgag aataggtctt ggtacctgac tgagaacatc cagaggttcc tgcctaatcc tgctggggtg cagctggagg accctgagtt tcaggccagc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtg tttgactctc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cttactggta tatcctgagc attggggctc agactgactt cctgtctgtg ttcttttctg gctacacttt taagcacaag atggtgtatg aggacaccct gaccctgttc cccttttctg gggagactgt gttcatgtct atggagaacc ctgggctgtg gattctgggc tgtcacaact ctgacttcag aaacaggggc atgactgccc tgctgaaggt gtctagctgt gacaagaata ctggggacta ctatgaggac agctatgagg acatttctgc ctatctgctg agcaagaaca atgccattga gcccaggagc ttttctcaga atccccctgt gctgaagagg caccagagag agatcaccag gaccactctg cagtctgatc aggaggagat tgattatgat gacactatct ctgtggagat gaagaaagag gactttgata tctatgatga ggatgagaat cagtctccca ggagcttcca gaagaagact agacactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgag ctctagccct catgtgctga ggaacagggc ccagtctggg tctgtgcccc agttcaagaa ggtggtgttc caggagttca ctgatggcag ctttacccag cccctgtata ggggggagct gaatgagcat ctgggcctgc tgggccccta tattagggct gaagtggagg acaacatcat ggtgaccttt aggaaccagg ccagcaggcc ctacagcttt tacagcagcc tgattagcta tgaggaggat cagagacagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagc ccaatgagac caagacctac ttctggaagg tgcagcacca catggcccct accaaggatg agtttgactg caaggcctgg gcttacttct ctgatgtgga cctggagaaa gatgtgcact ctggcctgat tgggcccctg ctggtgtgcc acaccaacac cctgaaccct gcccatggga ggcaggtgac tgtgcaggag tttgccctgt ttttcaccat ctttgatgag accaagagct ggtacttcac tgagaacatg gagaggaact gcagggcccc ctgtaacatc cagatggagg atcctacttt caaggagaac tacaggttcc atgccattaa tgggtacatc atggacaccc tgcctgggct ggtgatggcc caggatcaga ggattaggtg gtatctgctg tctatgggct ctaatgagaa catccactct atccacttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaagg aggagtacaa gatggccctg tacaacctgt accctggggt gtttgaaact gtggagatgc tgccctctaa agctgggatc tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctg gcatgagcac cctgttcctg gtgtacagca ataagtgcca gactcccctg ggcatggctt ctgggcacat cagggatttc cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggccccca agctggctag gctgcactac tctggcagca tcaatgcctg gagcaccaag gagcccttct cttggattaa ggtggacctg ctggctccca tgatcattca tggcatcaag acccaggggg ccaggcagaa gttttctagc ctgtatatta gccagttcat catcatgtat agcctggatg ggaagaagtg gcagacctac agggggaata gcactggcac cctgatggtg ttttttggca atgtggattc ttctggcatc aagcataaca tcttcaatcc ccctatcatt gccaggtaca ttaggctgca tcccacccat tactctatca ggagcaccct gaggatggag ctgatggggt gtgatctgaa cagctgtagc atgcccctgg gcatggagtc caaggctatc tctgatgccc agatcactgc cagcagctac ttcaccaaca tgtttgccac ctggagcccc agcaaggcca ggctgcacct gcagggcagg tctaatgcct ggaggcccca ggtgaacaat cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag aagactatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtga agagcctgct gaccagcatg tatgtgaagg agttcctgat ctcttctagc caggatgggc atcagtggac cctgtttttt cagaatggca aagtgaaggt gtttcagggg aatcaggaca gctttacccc tgtggtgaac agcctggatc ctcctctgct gactagatac ctgaggatcc acccccagag ctgggtccac cagattgctc tgaggatgga ggtgctgggg tgtgaggctc aggacctgta ctga
Variante X17 de ácido nucleico reduzida em CpG que codifica FVIII (SEQ ID NO:17) atgcagattg agctgagcac ctgcttcttt ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgcc accaggaggt actacctggg ggctgtggaa ctgagctggg actatatgca gtctgacctg ggggagctgc ctgtggatgc caggttcccc cccagggtgc ccaagtcttt cccctttaac acttctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttta ctgaccacct gttcaatatt gccaagccca ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccaa ccatccaggc tgaggtgtat gatactgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccacc ctgtgagcct gcatgctgtg ggggtgagct attggaaggc ttctgagggg gctgagtatg atgaccagac tagccagagg gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg gggtctcata cctatgtgtg gcaggtgctg aaggagaatg gccccatggc ctctgacccc ctgtgcctga cctattctta cctgagccat gtggacctgg tcaaggacct gaactctggc ctgattgggg ctctgctggt gtgcagggag ggcagcctgg ccaaggagaa gactcagact ctgcataagt tcatcctgct gtttgctgtg tttgatgagg gcaagagctg gcactctgag accaagaact ctctgatgca ggatagggat gctgcctctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtga atggctatgt gaataggtct ctgcctggcc tgattggctg ccataggaag tctgtgtact ggcatgtgat tggcatgggc actacccctg aggtgcactc tatcttcctg gaggggcaca ccttcctggt gaggaaccac aggcaggcca gcctggagat ctctcccatc accttcctga ctgcccagac tctgctgatg gacctgggcc agttcctgct gttctgccat atcagcagcc accagcatga tggcatggag gcctatgtga aggtggacag ctgcccagag gaaccccagc tgaggatgaa gaacaatgag gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgaga tggatgtggt gaggtttgat gatgacaaca gccccagctt tattcagatc aggtctgtgg ccaagaagca ccccaagacc tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gactgggatt atgcccccct ggtgctggcc cctgatgaca ggtcttacaa gtctcagtac ctgaacaatg gcccccagag gattgggagg aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgaga ccttcaagac cagggaggcc atccagcatg agtctggcat cctggggccc ctgctgtatg gggaggtggg ggataccctg ctgattatct tcaagaacca ggctagcagg ccctataaca tctaccccca tggcattact gatgtgaggc ccctgtactc taggagactg cccaaggggg tgaagcacct gaaagacttc cccatcctgc ctggggagat cttcaagtat aagtggactg tgactgtgga ggatggcccc actaagtctg accccaggtg cctgaccagg tattacagca gctttgtgaa tatggagagg gatctggctt ctggcctgat tgggcctctg ctgatttgct acaaggagtc tgtggatcag agggggaacc agattatgtc tgacaagagg aatgtgattc tgttctctgt gtttgatgag aacaggagct ggtacctgac tgagaatatc cagaggttcc tgcctaatcc tgctggggtg cagctggagg accctgagtt ccaggctagc aacattatgc acagcatcaa tggctatgtg tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cttactggta cattctgtct attggggccc agactgactt cctgtctgtg ttcttctctg gctacacctt caagcacaag atggtgtatg aggacactct gaccctgttc cccttctctg gggagactgt gttcatgagc atggagaatc ctgggctgtg gattctgggg tgccacaact ctgatttcag gaacaggggc atgactgccc tgctgaaggt gagcagctgt gacaagaaca ctggggatta ttatgaggac agctatgagg acatttctgc ctacctgctg agcaagaaca atgccattga gcctaggagc ttcagccaga atccccctgt gctgaagaga caccagaggg agatcactag gaccactctg cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacaccattt ctgtggagat gaagaaggag gactttgata tttatgatga ggatgagaac cagagcccca gaagcttcca gaagaagacc aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggatt atggcatgtc ttctagcccc catgtgctga ggaacagggc tcagtctggc tctgtgcctc agttcaagaa ggtggtgttc caggagttca ctgatgggag cttcacccag cctctgtaca ggggggagct gaatgaacat ctgggcctgc tggggcccta catcagggct gaggtggagg ataatatcat ggtgactttc aggaatcagg cctctaggcc ctacagcttc tactctagcc tgatcagcta tgaggaggac cagaggcagg gggctgagcc taggaagaat tttgtgaaac ccaatgagac caagacctac ttttggaagg tgcagcacca catggcccct accaaggatg agtttgactg taaggcctgg gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcatt ctgggctgat tggccccctg ctggtgtgcc acaccaacac cctgaaccct gcccatggca ggcaggtgac tgtgcaggag tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag actaagagct ggtatttcac tgagaacatg gagaggaact gtagggctcc ctgcaacatc cagatggagg atccaacttt caaggagaac tacaggttcc atgccatcaa tggctacatc atggacaccc tgcctggcct ggtgatggcc caggaccaga ggattaggtg gtacctgctg agcatgggct ctaatgagaa catccactct atccacttct ctggccatgt gtttactgtg aggaagaagg aggagtacaa gatggctctg tacaacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgc tgcctagcaa ggctggcatt tggagagtgg agtgtctgat tggggagcac ctgcatgctg ggatgtctac cctgttcctg gtgtactcta acaagtgcca gacccccctg gggatggctt ctgggcacat cagagatttt cagattactg cttctgggca gtatggccag tgggctccca agctggccag actgcattac tctggctcta ttaatgcttg gagcaccaag gagcctttca gctggatcaa ggtggacctg ctggctccca tgatcatcca tggcattaag actcaggggg ctaggcagaa gttcagcagc ctgtatattt ctcagtttat tatcatgtat tctctggatg gcaagaagtg gcagacttac aggggcaaca gcactggcac cctgatggtg ttctttggca atgtggacag ctctgggatc aagcataaca tcttcaaccc ccccattatt gccaggtaca tcaggctgca ccccacccac tattctatca ggagcactct gaggatggag ctgatggggt gtgacctgaa cagctgctct atgcccctgg gcatggagag caaggccatc tctgatgccc agatcactgc cagctcttat ttcaccaaca tgtttgccac ctggagcccc agcaaggcca ggctgcacct gcagggcaga agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaat cctaaggagt ggctgcaggt ggacttccag aagactatga aggtgactgg ggtgactacc cagggggtga agagcctgct gaccagcatg tatgtgaagg agttcctgat tagcagcagc caggatgggc atcagtggac cctgttcttc cagaatggga aggtgaaggt gttccagggc aatcaggaca gcttcacccc tgtggtgaac agcctggacc cccccctgct gaccaggtac ctgaggatcc atccccagag ctgggtgcac cagattgctc tgagaatgga ggtgctgggc tgtgaggccc aggacctgta ttga
Variante X18 de ácido nucleico reduzida em CpG que codifica FVIII (SEQ ID NO:18)
atgcagattg agctgtctac ctgttttttt ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgct accaggaggt attatctggg ggctgtggag ctgagctggg actacatgca gtctgacctg ggggagctgc ctgtggatgc caggtttcct cccagggtgc ctaagagctt ccccttcaac acctctgtgg tgtacaagaa gactctgttt gtggagttca ctgaccacct gttcaacatt gccaagccca ggcccccctg gatggggctg ctgggcccca ctatccaggc tgaggtgtat gatactgtgg tgattaccct gaagaacatg gcctctcacc ctgtgtctct gcatgctgtg ggggtgagct actggaaggc ttctgagggg gctgaatatg atgatcagac ctctcagagg gagaaggagg atgacaaggt gtttcctggg ggcagccaca cctatgtgtg gcaggtgctg aaggagaatg ggcccatggc ctctgatccc ctgtgcctga cctacagcta cctgagccat gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag ggcagcctgg ccaaggaaaa gacccagacc ctgcataagt tcatcctgct gtttgctgtg tttgatgagg gcaagtcttg gcactctgag accaagaaca gcctgatgca ggacagggat gctgcctctg ctagggcctg gcccaagatg cacactgtga atgggtatgt gaacagatct ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtact ggcatgtgat tggcatgggg accacccctg aggtgcatag catcttcctg gaggggcaca ccttcctggt gagaaatcat aggcaggcca gcctggagat tagccccatc accttcctga ctgcccagac cctgctgatg gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atttctagcc accagcatga tggcatggag gcctatgtga aggtggatag ctgccctgaa gagccccagc tgaggatgaa gaacaatgag gaggctgagg attatgatga tgatctgact gactctgaga tggatgtggt gaggtttgat gatgacaaca gccccagctt catccagatc aggtctgtgg ccaagaagca ccctaagacc tgggtgcact acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgcccccct ggtgctggcc ccagatgaca ggtcttacaa gagccagtac ctgaataatg gcccccagag gattgggagg aagtataaga aagtgaggtt catggcttac actgatgaga cctttaagac tagggaggcc attcagcatg agtctgggat tctgggccct ctgctgtatg gggaggtggg ggacaccctg ctgatcattt tcaagaacca ggccagcagg ccctataata tttatcccca tgggattact gatgtcaggc ccctgtacag caggaggctg cctaaggggg tgaagcacct gaaggacttc cccattctgc ctggggagat cttcaagtat aagtggactg tgactgtgga ggatggcccc accaagtctg atcctaggtg cctgaccagg tactatagca gctttgtgaa catggagagg gacctggctt ctggcctgat tggccccctg ctgatctgct acaaggaatc tgtggaccag aggggcaacc agattatgtc tgacaagagg aatgtgatcc tgttttctgt gtttgatgag aataggagct ggtatctgac tgagaacatc cagaggttcc tgcccaatcc tgctggggtg cagctggagg accctgagtt ccaggcttct aacatcatgc atagcatcaa tgggtatgtg tttgactctc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cctattggta catcctgagc attggggccc agactgactt cctgtctgtg ttcttctctg gctacacctt caagcacaag atggtgtatg aggacaccct gaccctgttc cctttctctg gggagactgt gttcatgagc atggagaacc ctggcctgtg gattctgggc tgccataatt ctgacttcag aaacaggggc atgactgctc tgctgaaggt gagcagctgt gacaagaata ctggggacta ctatgaggac tcttatgagg atatttctgc ctacctgctg agcaagaaca atgctattga gcccaggagc ttcagccaga acccccctgt cctgaagagg catcagaggg agatcactag gaccaccctg cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacactatct ctgtggaaat gaagaaggag gactttgata tctatgatga ggatgagaac cagagcccca ggtctttcca gaagaagacc aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgtc tagcagcccc catgtgctga ggaacagagc ccagtctggc tctgtgcccc agttcaagaa ggtggtgttt caggagttca ctgatgggag cttcactcag cccctgtata ggggggagct gaatgagcat ctgggcctgc tggggcccta catcagggct gaggtggagg ataacatcat ggtgaccttc aggaaccagg ccagcaggcc ctactctttc tactcttctc tgatcagcta tgaggaggat cagaggcagg gggctgagcc taggaagaac tttgtcaagc ctaatgagac taagacctac ttttggaagg tgcagcacca catggctccc actaaggatg agtttgattg caaggcctgg gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcact ctggcctgat tggccccctg ctggtgtgtc acaccaatac cctgaaccct gcccatggca ggcaggtcac tgtgcaggag tttgccctgt ttttcactat ctttgatgag actaagtctt ggtacttcac tgagaacatg gaaaggaatt gcagggctcc ctgcaacatc cagatggagg accccacctt caaggagaac tacaggtttc atgccatcaa tggctacatc atggacaccc tgcctggcct ggtgatggct caggatcaga ggattaggtg gtatctgctg agcatgggca gcaatgagaa catccacagc atccactttt ctggccatgt gttcactgtg aggaagaagg aggagtacaa gatggctctg tacaatctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgc tgcccagcaa ggctgggatc tggagggtgg agtgcctgat tggggaacac ctgcatgctg gcatgtctac cctgttcctg gtgtactcta acaagtgcca gactcccctg ggcatggcct ctgggcacat cagggacttc cagatcactg cctctgggca gtatggccag tgggccccta agctggctag gctgcattac tctggcagca tcaatgcctg gagcaccaag gagcccttca gctggatcaa ggtggacctg ctggccccta tgatcatcca tggcatcaag acccaggggg ccagacagaa gttctcttct ctgtacatct ctcagttcat catcatgtac tctctggatg gcaagaagtg gcagacctac agggggaatt ctactggcac tctgatggtg ttctttggga atgtggatag ctctgggatc aagcataata ttttcaaccc ccccattatt gctaggtaca tcaggctgca cccaacccac tactctatta ggtctaccct gaggatggag ctgatgggct gtgacctgaa ctcttgtagc atgcccctgg gcatggagag caaggctatc tctgatgccc agatcactgc cagcagctac tttaccaaca tgtttgctac ttggagcccc agcaaggcca ggctgcacct gcagggcagg agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagt ggctgcaggt ggattttcag aagaccatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtga aaagcctgct gactagcatg tatgtgaagg agtttctgat cagcagctct caggatggcc atcagtggac cctgttcttc cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aaccaggata gcttcacccc tgtggtgaat agcctggacc cccccctgct gaccaggtac ctgaggatcc atccccagag ctgggtgcac cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaagccc aggacctgta ctga cDNA do fator VIII-BD do tipo selvagem (SEQ ID NO:19)
ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG CTTTAGTGCC ACCAGAAGAT ACTACCTGGG TGCAGTGGAA CTGTCATGGG ACTATATGCA AAGTGATCTC GGTGAGCTGC CTGTGGACGC AAGATTTCCT CCTAGAGTGC CAAAATCTTT TCCATTCAAC ACCTCAGTCG TGTACAAAAA GACTCTGTTT GTAGAATTCA CGGATCACCT TTTCAACATC GCTAAGCCAA GGCCACCCTG GATGGGTCTG CTAGGTCCTA CCATCCAGGC TGAGGTTTAT GATACAGTGG TCATTACACT TAAGAACATG GCTTCCCATC CTGTCAGTCT TCATGCTGTT GGTGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCTGAATATG ATGATCAGAC CAGTCAAAGG GAGAAAGAAG ATGATAAAGT CTTCCCTGGT GGAAGCCATA CATATGTCTG GCAGGTCCTG AAAGAGAATG GTCCAATGGC CTCTGACCCA CTGTGCCTTA CCTACTCATA TCTTTCTCAT GTGGACCTGG TAAAAGACTT GAATTCAGGC CTCATTGGAG CCCTACTAGT ATGTAGAGAA GGGAGTCTGG CCAAGGAAAA GACACAGACC TTGCACAAAT TTATACTACT TTTTGCTGTA TTTGATGAAG GGAAAAGTTG GCACTCAGAA ACAAAGAACT CCTTGATGCA GGATAGGGAT GCTGCATCTG CTCGGGCCTG GCCTAAAATG CACACAGTCA ATGGTTATGT AAACAGGTCT CTGCCAGGTC TGATTGGATG CCACAGGAAA TCAGTCTATT GGCATGTGAT TGGAATGGGC ACCACTCCTG AAGTGCACTC AATATTCCTC GAAGGTCACA CATTTCTTGT GAGGAACCAT CGCCAGGCGT CCTTGGAAAT CTCGCCAATA ACTTTCCTTA CTGCTCAAAC ACTCTTGATG GACCTTGGAC AGTTTCTACT GTTTTGTCAT ATCTCTTCCC ACCAACATGA TGGCATGGAA GCTTATGTCA AAGTAGACAG CTGTCCAGAG GAACCCCAAC TACGAATGAA AAATAATGAA GAAGCGGAAG ACTATGATGA TGATCTTACT GATTCTGAAA TGGATGTGGT CAGGTTTGAT GATGACAACT CTCCTTCCTT TATCCAAATT CGCTCAGTTG CCAAGAAGCA TCCTAAAACT TGGGTACATT ACATTGCTGC TGAAGAGGAG GACTGGGACT ATGCTCCCTT AGTCCTCGCC CCCGATGACA GAAGTTATAA AAGTCAATAT TTGAACAATG GCCCTCAGCG GATTGGTAGG AAGTACAAAA AAGTCCGATT TATGGCATAC ACAGATGAAA CCTTTAAGAC TCGTGAAGCT ATTCAGCATG AATCAGGAAT CTTGGGACCT TTACTTTATG GGGAAGTTGG AGACACACTG TTGATTATAT TTAAGAATCA AGCAAGCAGA CCATATAACA TCTACCCTCA CGGAATCACT GATGTCCGTC CTTTGTATTC AAGGAGATTA CCAAAAGGTG TAAAACATTT GAAGGATTTT CCAATTCTGC CAGGAGAAAT ATTCAAATAT AAATGGACAG TGACTGTAGA AGATGGGCCA ACTAAATCAG ATCCTCGGTG CCTGACCCGC TATTACTCTA GTTTCGTTAA TATGGAGAGA GATCTAGCTT CAGGACTCAT TGGCCCTCTC CTCATCTGCT ACAAAGAATC TGTAGATCAA AGAGGAAACC AGATAATGTC AGACAAGAGG AATGTCATCC TGTTTTCTGT ATTTGATGAG AACCGAAGCT GGTACCTCAC AGAGAATATA CAACGCTTTC TCCCCAATCC AGCTGGAGTG CAGCTTGAGG ATCCAGAGTT CCAAGCCTCC AACATCATGC ACAGCATCAA TGGCTATGTT TTTGATAGTT TGCAGTTGTC AGTTTGTTTG CATGAGGTGG CATACTGGTA CATTCTAAGC ATTGGAGCAC AGACTGACTT CCTTTCTGTC TTCTTCTCTG GATATACCTT CAAACACAAA ATGGTCTATG AAGACACACT CACCCTATTC CCATTCTCAG GAGAAACTGT CTTCATGTCG ATGGAAAACC CAGGTCTATG GATTCTGGGG TGCCACAACT CAGACTTTCG GAACAGAGGC ATGACCGCCT TACTGAAGGT TTCTAGTTGT GACAAGAACA CTGGTGATTA TTACGAGGAC AGTTATGAAG ATATTTCAGC ATACTTGCTG AGTAAAAACA ATGCCATTGA ACCAAGAAGC TTCTCCCAAA ACCCACCAGT CTTGAAACGC CATCAACGGG AAATAACTCG TACTACTCTT CAGTCAGATC AAGAGGAAAT TGACTATGAT GATACCATAT CAGTTGAAAT GAAGAAGGAA GATTTTGACA TTTATGATGA GGATGAAAAT CAGAGCCCCC GCAGCTTTCA AAAGAAAACA CGACACTATT TTATTGCTGC AGTGGAGAGG CTCTGGGATT ATGGGATGAG TAGCTCCCCA CATGTTCTAA GAAACAGGGC TCAGAGTGGC AGTGTCCCTC AGTTCAAGAA AGTTGTTTTC CAGGAATTTA CTGATGGCTC CTTTACTCAG CCCTTATACC GTGGAGAACT AAATGAACAT TTGGGACTCC TGGGGCCATA TATAAGAGCA GAAGTTGAAG ATAATATCAT GGTAACTTTC AGAAATCAGG CCTCTCGTCC CTATTCCTTC TATTCTAGCC TTATTTCTTA TGAGGAAGAT CAGAGGCAAG GAGCAGAACC TAGAAAAAAC TTTGTCAAGC CTAATGAAAC CAAAACTTAC TTTTGGAAAG TGCAACATCA TATGGCACCC ACTAAAGATG AGTTTGACTG CAAAGCCTGG GCTTATTTCT CTGATGTTGA CCTGGAAAAA GATGTGCACT CAGGCCTGAT TGGACCCCTT CTGGTCTGCC ACACTAACAC ACTGAACCCT GCTCATGGGA GACAAGTGAC AGTACAGGAA TTTGCTCTGT TTTTCACCAT CTTTGATGAG ACCAAAAGCT GGTACTTCAC TGAAAATATG GAAAGAAACT GCAGGGCTCC CTGCAATATC CAGATGGAAG ATCCCACTTT TAAAGAGAAT TATCGCTTCC ATGCAATCAA TGGCTACATA ATGGATACAC TACCTGGCTT AGTAATGGCT CAGGATCAAA GGATTCGATG GTATCTGCTC AGCATGGGCA GCAATGAAAA CATCCATTCT ATTCATTTCA GTGGACATGT GTTCACCGTA CGAAAAAAAG AGGAGTATAA AATGGCACTG TACAATCTCT ATCCAGGTGT TTTTGAGACA GTGGAAATGT TACCATCCAA AGCTGGAATT TGGCGGGTGG AATGCCTTAT TGGCGAGCAT CTACATGCTG GGATGAGCAC ACTTTTTCTG GTGTACAGCA ATAAGTGTCA GACTCCCCTG GGAATGGCTT CTGGACACAT TAGAGATTTT CAGATTACAG CTTCAGGACA ATATGGACAG TGGGCCCCAA AGCTGGCCAG ACTTCATTAT TCCGGATCAA TCAATGCCTG GAGCACCAAG GAGCCCTTTT CTTGGATCAA GGTGGATCTG TTGGCACCAA TGATTATTCA CGGCATCAAG ACCCAGGGTG CCCGTCAGAA GTTCTCCAGC CTCTACATCT CTCAGTTTAT CATCATGTAT AGTCTTGATG GGAAGAAGTG GCAGACTTAT CGAGGAAATT CCACTGGAAC CTTAATGGTC TTCTTTGGCA ATGTGGATTC ATCTGGGATA AAACACAATA TTTTTAACCC TCCAATTATT GCTCGATACA TCCGTTTGCA CCCAACTCAT TATAGCATTC GCAGCACTCT TCGCATGGAG TTGATGGGCT GTGATTTAAA TAGTTGCAGC ATGCCATTGG GAATGGAGAG TAAAGCAATA TCAGATGCAC AGATTACTGC TTCATCCTAC TTTACCAATA TGTTTGCCAC CTGGTCTCCT TCAAAAGCTC GACTTCACCT CCAAGGGAGG AGTAATGCCT GGAGACCTCA GGTGAATAAT CCAAAAGAGT GGCTGCAAGT GGACTTCCAG AAGACAATGA AAGTCACAGG AGTAACTACT CAGGGAGTAA AATCTCTGCT TACCAGCATG TATGTGAAGG AGTTCCTCAT CTCCAGCAGT CAAGATGGCC ATCAGTGGAC TCTCTTTTTT CAGAATGGCA AAGTAAAGGT TTTTCAGGGA AATCAAGACT CCTTCACACC TGTGGTGAAC TCTCTAGACC CACCGTTACT GACTCGCTAC CTTCGAATTC ACCCCCAGAG TTGGGTGCAC CAGATTGCCC TGAGGATGGA GGTTCTGGGC TGCGAGGCAC
AGGACCTCTA CTGA cDNA do fator fator VIII V3 (SEQ ID NO:20)
ATGCAGATTGAGCTGAGCACCTGCTTCTTCCTGTGCCTGCTGAGGTT CTGCTTCTCTGCCACCAGGAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAGCTGAGCTGGG ACTACATGCAGTCTGACCTGGGGGAGCTGCCTGTGGATGCCAGGTTCCCCCCC AGAGTGCCCAAGAGCTTCCCCTTCAACACCTCTGTGGTGTACAAGAAGACCCT GTTTGTGGAGTTCACTGACCACCTGTTCAACATTGCCAAGCCCAGGCCCCCCT GGATGGGCCTGCTGGGCCCCACCATCCAGGCTGAGGTGTATGACACTGTGGT GATCACCCTGAAGAACATGGCCAGCCACCCTGTGAGCCTGCATGCTGTGGGGG TGAGCTACTGGAAGGCCTCTGAGGGGGCTGAGTATGATGACCAGACCAGCCAG AGGGAGAAGGAGGATGACAAGGTGTTCCCTGGGGGCAGCCACACCTATGTGT GGCAGGTGCTGAAGGAGAATGGCCCCATGGCCTCTGACCCCCTGTGCCTGAC CTACAGCTACCTGAGCCATGTGGACCTGGTGAAGGACCTGAACTCTGGCCTGA TTGGGGCCCTGCTGGTGTGCAGGGAGGGCAGCCTGGCCAAGGAGAAGACCCA GACCCTGCACAAGTTCATCCTGCTGTTTGCTGTGTTTGATGAGGGCAAGAGCTG GCACTCTGAAACCAAGAACAGCCTGATGCAGGACAGGGATGCTGCCTCTGCCA GGGCCTGGCCCAAGATGCACACTGTGAATGGCTATGTGAACAGGAGCCTGCCT GGCCTGATTGGCTGCCACAGGAAGTCTGTGTACTGGCATGTGATTGGCATGGG CACCACCCCTGAGGTGCACAGCATCTTCCTGGAGGGCCACACCTTCCTGGTCA GGAACCACAGGCAGGCCAGCCTGGAGATCAGCCCCATCACCTTCCTGACTGCC CAGACCCTGCTGATGGACCTGGGCCAGTTCCTGCTGTTCTGCCACATCAGCAG CCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTATGTGAAGGTGGACAGCTGCCCTGAG GAGCCCCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAGGCTGAGGACTATGATGATGA CCTGACTGACTCTGAGATGGATGTGGTGAGGTTTGATGATGACAACAGCCCCA GCTTCATCCAGATCAGGTCTGTGGCCAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCAC TACATTGCTGCTGAGGAGGAGGACTGGGACTATGCCCCCCTGGTGCTGGCCCC TGATGACAGGAGCTACAAGAGCCAGTACCTGAACAATGGCCCCCAGAGGATTG GCAGGAAGTACAAGAAGGTCAGGTTCATGGCCTACACTGATGAAACCTTCAAGA CCAGGGAGGCCATCCAGCATGAGTCTGGCATCCTGGGCCCCCTGCTGTATGG GGAGGTGGGGGACACCCTGCTGATCATCTTCAAGAACCAGGCCAGCAGGCCC TACAACATCTACCCCCATGGCATCACTGATGTGAGGCCCCTGTACAGCAGGAG GCTGCCCAAGGGGGTGAAGCACCTGAAGGACTTCCCCATCCTGCCTGGGGAG ATCTTCAAGTACAAGTGGACTGTGACTGTGGAGGATGGCCCCACCAAGTCTGA CCCCAGGTGCCTGACCAGATACTACAGCAGCTTTGTGAACATGGAGAGGGACC TGGCCTCTGGCCTGATTGGCCCCCTGCTGATCTGCTACAAGGAGTCTGTGGAC CAGAGGGGCAACCAGATCATGTCTGACAAGAGGAATGTGATCCTGTTCTCTGT GTTTGATGAGAACAGGAGCTGGTACCTGACTGAGAACATCCAGAGGTTCCTGC CCAACCCTGCTGGGGTGCAGCTGGAGGACCCTGAGTTCCAGGCCAGCAACAT CATGCACAGCATCAATGGCTATGTGTTTGACAGCCTGCAGCTGTCTGTGTGCCT GCATGAGGTGGCCTACTGGTACATCCTGAGCATTGGGGCCCAGACTGACTTCC TGTCTGTGTTCTTCTCTGGCTACACCTTCAAGCACAAGATGGTGTATGAGGACA CCCTGACCCTGTTCCCCTTCTCTGGGGAGACTGTGTTCATGAGCATGGAGAAC CCTGGCCTGTGGATTCTGGGCTGCCACAACTCTGACTTCAGGAACAGGGGCAT GACTGCCCTGCTGAAAGTCTCCAGCTGTGACAAGAACACTGGGGACTACTATG AGGACAGCTATGAGGACATCTCTGCCTACCTGCTGAGCAAGAACAATGCCATTG AGCCCAGGAGCTTCAGCCAGAACAGCAGGCACCCCAGCACCAGGCAGAAGCA GTTCAATGCCACCACCATCCCTGAGAATGACATAGAGAAGACAGACCCATGGTT TGCCCACCGGACCCCCATGCCCAAGATCCAGAATGTGAGCAGCTCTGACCTGC TGATGCTGCTGAGGCAGAGCCCCACCCCCCATGGCCTGAGCCTGTCTGACCTG CAGGAGGCCAAGTATGAAACCTTCTCTGATGACCCCAGCCCTGGGGCCATTGA CAGCAACAACAGCCTGTCTGAGATGACCCACTTCAGGCCCCAGCTGCACCACT CTGGGGACATGGTGTTCACCCCTGAGTCTGGCCTGCAGCTGAGGCTGAATGAG AAGCTGGGCACCACTGCTGCCACTGAGCTGAAGAAGCTGGACTTCAAAGTCTC CAGCACCAGCAACAACCTGATCAGCACCATCCCCTCTGACAACCTGGCTGCTG GCACTGACAACACCAGCAGCCTGGGCCCCCCCAGCATGCCTGTGCACTATGAC AGCCAGCTGGACACCACCCTGTTTGGCAAGAAGAGCAGCCCCCTGACTGAGTC TGGGGGCCCCCTGAGCCTGTCTGAGGAGAACAATGACAGCAAGCTGCTGGAG TCTGGCCTGATGAACAGCCAGGAGAGCAGCTGGGGCAAGAATGTGAGCACCA GGAGCTTCCAGAAGAAGACCAGGCACTACTTCATTGCTGCTGTGGAGAGGCTG TGGGACTATGGCATGAGCAGCAGCCCCCATGTGCTGAGGAACAGGGCCCAGT CTGGCTCTGTGCCCCAGTTCAAGAAGGTGGTGTTCCAGGAGTTCACTGATGGC AGCTTCACCCAGCCCCTGTACAGAGGGGAGCTGAATGAGCACCTGGGCCTGCT GGGCCCCTACATCAGGGCTGAGGTGGAGGACAACATCATGGTGACCTTCAGGA ACCAGGCCAGCAGGCCCTACAGCTTCTACAGCAGCCTGATCAGCTATGAGGAG GACCAGAGGCAGGGGGCTGAGCCCAGGAAGAACTTTGTGAAGCCCAATGAAA CCAAGACCTACTTCTGGAAGGTGCAGCACCACATGGCCCCCACCAAGGATGAG TTTGACTGCAAGGCCTGGGCCTACTTCTCTGATGTGGACCTGGAGAAGGATGT GCACTCTGGCCTGATTGGCCCCCTGCTGGTGTGCCACACCAACACCCTGAACC CTGCCCATGGCAGGCAGGTGACTGTGCAGGAGTTTGCCCTGTTCTTCACCATC TTTGATGAAACCAAGAGCTGGTACTTCACTGAGAACATGGAGAGGAACTGCAG GGCCCCCTGCAACATCCAGATGGAGGACCCCACCTTCAAGGAGAACTACAGGT TCCATGCCATCAATGGCTACATCATGGACACCCTGCCTGGCCTGGTGATGGCC CAGGACCAGAGGATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGCAGCAATGAGAACAT CCACAGCATCCACTTCTCTGGCCATGTGTTCACTGTGAGGAAGAAGGAGGAGT ACAAGATGGCCCTGTACAACCTGTACCCTGGGGTGTTTGAGACTGTGGAGATG CTGCCCAGCAAGGCTGGCATCTGGAGGGTGGAGTGCCTGATTGGGGAGCACC TGCATGCTGGCATGAGCACCCTGTTCCTGGTGTACAGCAACAAGTGCCAGACC CCCCTGGGCATGGCCTCTGGCCACATCAGGGACTTCCAGATCACTGCCTCTGG CCAGTATGGCCAGTGGGCCCCCAAGCTGGCCAGGCTGCACTACTCTGGCAGC ATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTCAGCTGGATCAAGGTGGACCTGCT GGCCCCCATGATCATCCATGGCATCAAGACCCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCA GCAGCCTGTACATCAGCCAGTTCATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAGT GGCAGACCTACAGGGGCAACAGCACTGGCACCCTGATGGTGTTCTTTGGCAAT GTGGACAGCTCTGGCATCAAGCACAACATCTTCAACCCCCCCATCATTGCCAGA TACATCAGGCTGCACCCCACCCACTACAGCATCAGGAGCACCCTGAGGATGGA GCTGATGGGCTGTGACCTGAACAGCTGCAGCATGCCCCTGGGCATGGAGAGC AAGGCCATCTCTGATGCCCAGATCACTGCCAGCAGCTACTTCACCAACATGTTT GCCACCTGGAGCCCCAGCAAGGCCAGGCTGCACCTGCAGGGCAGGAGCAATG CCTGGAGGCCCCAGGTCAACAACCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTGGACTTCCA GAAGACCATGAAGGTGACTGGGGTGACCACCCAGGGGGTGAAGAGCCTGCTG ACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTGATCAGCAGCAGCCAGGATGGCCACCA GTGGACCCTGTTCTTCCAGAATGGCAAGGTGAAGGTGTTCCAGGGCAACCAGG ACAGCTTCACCCCTGTGGTGAACAGCCTGGACCCCCCCCTGCTGACCAGATAC CTGAGGATTCACCCCCAGAGCTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGT
GCTGGGCTGTGAGGCCCAGGACCTGTACTGA cDNA do fator VIII CO3 (SEQ ID NO:21) atgcagattg agctgtcaac ttgctttttc ctgtgcctgc tgagattttg tttttccgct actagaagat actacctggg ggctgtggaa ctgtcttggg attacatgca gagtgacctg ggagagctgc cagtggacgc acgatttcca cctagagtcc ctaaatcatt ccccttcaac accagcgtgg tctataagaa aacactgttc gtggagttta ctgatcacct gttcaacatc gctaagcctc ggccaccctg gatgggactg ctgggaccaa caatccaggc agaggtgtac gacaccgtgg tcattacact gaaaaacatg gcctcacacc ccgtgagcct gcatgctgtg ggcgtcagct actggaaggc ttccgaaggg gcagagtatg acgatcagac ttcccagaga gaaaaagagg acgataaggt gtttcctggc gggtctcata cctatgtgtg gcaggtcctg aaagagaatg gccccatggc ttccgaccct ctgtgcctga cctactctta tctgagtcac gtggacctgg tcaaggatct gaacagcgga ctgatcggag cactgctggt gtgtagggaa gggagcctgg ctaaggagaa aacccagaca ctgcataagt tcattctgct gttcgccgtg tttgacgaag gaaaatcatg gcacagcgag acaaagaata gtctgatgca ggaccgggat gccgcttcag ccagagcttg gcccaaaatg cacactgtga acggctacgt caatcgctca ctgcctggac tgatcggctg ccaccgaaag agcgtgtatt ggcatgtcat cggaatgggc accacacctg aagtgcactc cattttcctg gaggggcata cctttctggt ccgcaaccac cgacaggcct ccctggagat ctctccaatt accttcctga cagctcagac tctgctgatg gatctgggac agttcctgct gttttgccac atcagctccc accagcatga tggcatggag gcctacgtga aagtggacag ctgtcccgag gaacctcagc tgaggatgaa gaacaatgag gaagctgaag actatgacga tgacctgacc gactccgaga tggatgtggt ccgattcgat gacgataaca gcccctcctt tatccagatt agatctgtgg ccaagaaaca ccctaagaca tgggtccatt acatcgcagc cgaggaagag gactgggatt atgcaccact ggtgctggca ccagacgatc gatcctacaa atctcagtat ctgaacaatg gaccacagcg gattggcaga aagtacaaga aagtgaggtt catggcttat accgatgaaa ccttcaagac tcgcgaagca atccagcacg agagcgggat tctgggacca ctgctgtacg gagaagtggg ggacaccctg ctgatcattt ttaagaacca ggccagcagg ccttacaata tctatccaca tggaattaca gatgtgcgcc ctctgtacag ccggagactg ccaaagggcg tcaaacacct gaaggacttc ccaatcctgc ccggggaaat ttttaagtat aaatggactg tcaccgtcga ggatggcccc actaagagcg accctaggtg cctgacccgc tactattcta gtttcgtgaa tatggaaagg gatctggcca gcggactgat cggcccactg ctgatttgtt acaaagagag cgtggatcag agaggcaacc agatcatgtc cgacaagagg aatgtgattc tgttcagtgt ctttgacgaa aaccggtcat ggtatctgac cgagaacatc cagagattcc tgcctaatcc agccggagtg cagctggaag atcctgagtt tcaggcttct aacatcatgc atagtattaa tggctacgtg ttcgacagtc tgcagctgtc agtgtgtctg cacgaggtcg cttactggta tatcctgagc attggagcac agacagattt cctgagcgtg ttcttttccg gctacacttt taagcataaa atggtgtatg aggacacact gactctgttc cccttcagcg gcgaaaccgt gtttatgtcc atggagaatc ccgggctgtg gatcctggga tgccacaaca gcgatttcag gaatcgcggg atgactgccc tgctgaaagt gtcaagctgt gacaagaaca ccggagacta ctatgaagat tcatacgagg acatcagcgc atatctgctg tccaaaaaca atgccattga acccaggtct tttagtcaga atcctccagt gctgaagagg caccagcgcg agatcacccg cactaccctg cagagtgatc aggaagagat cgactacgac gatacaattt ctgtggaaat gaagaaagag gacttcgata tctatgacga agatgagaac cagagtcctc gatcattcca gaagaaaacc cggcattact ttattgctgc agtggagcgc ctgtgggatt atggcatgtc ctctagtcct cacgtgctgc gaaatcgggc ccagtcaggg agcgtcccac agttcaagaa agtggtcttc caggagttta cagacggatc ctttactcag ccactgtacc ggggcgaact gaacgagcac ctggggctgc tgggacccta tatcagagct gaagtggagg ataacattat ggtcaccttc agaaatcagg catctaggcc ttacagtttt tattcaagcc tgatctctta cgaagaggac cagaggcagg gagcagaacc acgaaaaaac ttcgtgaagc ctaatgagac caaaacatac ttttggaagg tgcagcacca tatggcccca acaaaagacg aattcgattg caaggcatgg gcctattttt ctgacgtgga tctggagaag gacgtccaca gtggcctgat cgggccactg ctggtgtgtc atactaacac cctgaatccc gcacacggca ggcaggtcac tgtccaggaa ttcgccctgt tctttaccat ctttgatgag acaaaaagct ggtacttcac cgaaaacatg gagcgaaatt gccgggctcc atgtaatatt cagatggaag accccacatt caaggagaac taccgctttc atgccatcaa tgggtatatt atggatactc tgcccggact ggtcatggct caggaccaga gaatcaggtg gtacctgctg agcatggggt ccaacgagaa tatccactca attcatttca gcggacacgt gtttactgtc cggaagaaag aagagtataa aatggccctg tacaacctgt atcccggcgt gttcgaaacc gtcgagatgc tgcctagcaa ggcagggatc tggagagtgg aatgcctgat tggggagcac ctgcatgccg gaatgtctac cctgtttctg gtgtacagta ataagtgtca gacacccctg gggatggctt ccggacatat ccgggatttc cagattaccg catctggaca gtacggccag tgggccccta agctggctag actgcactat tccgggtcta tcaacgcttg gtccacaaaa gagcctttct cttggattaa ggtggacctg ctggcaccaa tgatcattca tggcatcaaa actcaggggg ccaggcagaa gttctcctct ctgtacatct cacagtttat catcatgtac agcctggatg gcaagaaatg gcagacatac cgcggcaata gcacagggac tctgatggtg ttctttggca acgtggacag ttcagggatc aagcacaaca ttttcaatcc ccctatcatt gctagataca tcaggctgca cccaacccat tattctattc gaagtacact gcggatggaa ctgatggggt gcgatctgaa cagttgttca atgcccctgg gaatggagtc caaggcaatc tctgacgccc agattaccgc tagctcctac ttcactaata tgtttgctac ctggagcccc tccaaagcac gactgcatct gcagggacga agcaacgcat ggcgaccaca ggtgaacaat cccaaggagt ggctgcaggt cgattttcag aaaactatga aggtgaccgg agtcacaact cagggcgtga aaagtctgct gacctcaatg tacgtcaagg agttcctgat ctctagttca caggacggcc accagtggac actgttcttt cagaacggaa aggtgaaagt cttccagggc aatcaggatt cctttacacc tgtggtcaac tctctggacc cacccctgct gactcgctac ctgcgaatcc acccacagtc ctgggtgcat cagattgcac tgagaatgga agtcctgggc tgcgaggccc aggacctgta ttga
Cassete de comprimento total incluindo promotor de TTR mutado (TTRmut), íntron sintético, cDNA de fator VIII reduzido em CpG, poli A e ITRs (SEQ ID NO:23) cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc tacgcgtgtc tgtctgcaca tttcgtagag cgagtgttcc gatactctaa tctccctagg caaggttcat attgacttag gttacttatt ctccttttgt tgactaagtc aataatcaga atcagcaggt ttggagtcag cttggcaggg atcagcagcc tgggttggaa ggagggggta taaaagcccc ttcaccagga gaagccgtca cacagatcca caagctcctg ctagcaggta agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactg acactgacat ccactttttc tttttctcca caggtttaaa cgccaccatg cagattgagc tgagcacctg cttcttcctg tgtctgctga ggttctgctt ctctgccacc aggaggtatt acctgggggc tgtggagctg agctgggact atatgcagtc tgacctgggg gagctgcctg tggatgctag gttccccccc agggtgccca agagcttccc ctttaacact tctgtggtgt acaagaagac cctgtttgtg gagttcactg accacctgtt caacattgcc aagcccaggc ccccctggat 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Plasmídeo de comprimento total incluindo promotor de TTR mutado (TTRmut), íntron sintético, cDNA de fator VIII reduzido em CpG, poli A e ITRs (SEQ ID NO:24) cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc tacgcgtgtc tgtctgcaca tttcgtagag cgagtgttcc gatactctaa tctccctagg caaggttcat attgacttag gttacttatt ctccttttgt tgactaagtc aataatcaga atcagcaggt ttggagtcag cttggcaggg atcagcagcc tgggttggaa ggagggggta taaaagcccc ttcaccagga gaagccgtca cacagatcca caagctcctg ctagcaggta agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactg acactgacat ccactttttc tttttctcca caggtttaaa cgccaccatg cagattgagc tgagcacctg cttcttcctg tgtctgctga ggttctgctt ctctgccacc aggaggtatt acctgggggc tgtggagctg agctgggact atatgcagtc tgacctgggg gagctgcctg tggatgctag gttccccccc agggtgccca agagcttccc ctttaacact tctgtggtgt acaagaagac cctgtttgtg gagttcactg accacctgtt caacattgcc aagcccaggc ccccctggat 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tctgtggcca agaaacaccc caagacctgg gtgcactaca ttgctgctga ggaagaggac tgggactatg ctcccctggt gctggcccct gatgataggt cttataagag ccagtacctg aacaatgggc cccagaggat tggcaggaag tacaagaagg tgaggttcat ggcctacact gatgaaacct tcaaaaccag ggaggccatt cagcatgagt ctggcatcct gggccctctg ctgtatgggg aggtggggga caccctgctg atcatcttca agaaccaggc cagcaggccc tacaacatct atcctcatgg catcactgat gtgaggcccc tgtacagcag gaggctgccc aagggggtga agcacctgaa agacttcccc atcctgcctg gggagatctt taagtataag tggactgtga ctgtggagga tggccctacc aagtctgacc ccaggtgtct gaccaggtac tattctagct ttgtgaacat ggagagggac ctggcctctg gcctgattgg gcccctgctg atctgctaca aggagtctgt ggaccagagg ggcaaccaga tcatgtctga caagaggaat gtgatcctgt tttctgtgtt tgatgagaat aggagctggt acctgactga gaacatccag aggtttctgc ccaatcctgc tggggtgcag ctggaggatc ctgagttcca ggccagcaat atcatgcata gcatcaatgg ctatgtgttt gacagcctgc agctgtctgt gtgcctgcat gaggtggcct actggtacat cctgagcatt ggggcccaga ctgactttct gtctgtgttc ttttctggct ataccttcaa gcacaagatg gtgtatgagg ataccctgac cctgttcccc ttctctgggg 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ccaggagttt gccctgttct tcactatctt tgatgagacc aagagctggt actttactga gaacatggag aggaactgca gagctccttg caatattcag atggaggacc ccaccttcaa ggagaattac aggttccatg ccattaatgg gtacatcatg gacaccctgc ctggcctggt gatggctcag gaccagagga tcaggtggta cctgctgagc atgggctcta atgagaatat ccacagcatc cacttctctg ggcatgtgtt cactgtgagg aagaaggagg agtacaagat ggctctgtat aatctgtacc ctggggtgtt tgaaactgtg gagatgctgc cctctaaggc tggcatctgg agggtggagt gcctgattgg ggagcacctg catgctggca tgagcaccct gttcctggtg tacagcaaca agtgccagac ccccctgggc atggcctctg gccacatcag ggacttccag atcactgcct ctggccagta tggccagtgg gcccccaagc tggccaggct gcactattct ggcagcatca atgcctggag caccaaggag cccttcagct ggatcaaggt ggacctgctg gcccccatga tcattcatgg catcaagacc cagggggcca ggcagaagtt cagctctctg tacatctctc agttcatcat catgtactct ctggatggga agaagtggca gacctacagg ggcaacagca ctggcaccct gatggtgttc tttgggaatg tggactcttc tggcatcaag cacaacatct tcaatccccc catcattgct aggtatatta ggctgcatcc cacccactac agcatcaggt ctaccctgag gatggagctg atgggctgtg acctgaactc ttgcagcatg cccctgggca tggagtctaa ggccatctct gatgcccaga ttactgccag cagctacttc accaacatgt ttgccacctg gagcccctct aaggccaggc tgcatctgca ggggaggagc aatgcctgga ggcctcaggt gaacaacccc aaggagtggc tgcaggtgga tttccagaag accatgaagg tgactggggt gaccacccag ggggtcaaga gcctgctgac cagcatgtat gtgaaggagt tcctgatcag cagcagccag gatggccacc agtggactct gttctttcag aatgggaagg tgaaggtgtt tcagggcaat caggactctt tcacccctgt ggtgaacagc ctggaccccc ccctgctgac cagatacctg aggatccacc cccagtcttg ggtgcatcag attgccctga ggatggaggt gctgggctgt gaggctcagg atctgtactg agcggccgca ataaaagatc agagctctag agatctgtgt gttggttttt tgtgtaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagctgcc tgcaggggca gcttgaagga aatactaagg caaaggtact gcaagtgctc gcaacattcg cttatgcgga ttattgccgt agtgccgcga cgccgggggc aagatgcaga gattgccatg gtacaggccg tgcggttgat attgccaaaa cagagctgtg ggggagagtt gtcgagaaag agtgcggaag atgcaaaggc gtcggctatt caaggatgcc agcaagcgca gcatatcgcg ctgtgacgat gctaatccca aaccttaccc aacccacctg gtcacgcact gttaagccgc tgtatgacgc tctggtggtg caatgccaca aagaagagtc aatcgcagac aacattttga atgcggtcac acgttagcag catgattgcc acggatggca acatattaac ggcatgatat tgacttattg aataaaattg ggtaaatttg actcaacgat gggttaattc gctcgttgtg gtagtgagat gaaaagaggc ggcgcttact accgattccg cctagttggt cacttcgacg tatcgtctgg aactccaacc atcgcaggca gagaggtctg caaaatgcaa tcccgaaaca gttcgcaggt aatagttaga gcctgcataa cggtttcggg attttttata tctgcacaac aggtaagagc attgagtcga taatcgtgaa gagtcggcga gcctggttag ccagtgctct ttccgttgtg ctgaattaag cgaataccgg aagcagaacc ggatcaccaa atgcgtacag gcgtcatcgc cgcccagcaa cagcacaacc caaactgagc cgtagccact gtctgtcctg aattcattag taatagttac gctgcggcct tttacacatg accttcgtga aagcgggtgg caggaggtcg cgctaacaac ctcctgccgt tttgcccgtg catatcggtc acgaacaaat ctgattacta aacacagtag cctggatttg ttctatcagt aatcgacctt attcctaatt aaatagagca aatcccctta ttgggggtaa gacatgaaga tgccagaaaa acatgacctg ttggccgcca ttctcgcggc aaaggaacaa ggcatcgggg caatccttgc gtttgcaatg gcgtaccttc gcggcagata taatggcggt gcgtttacaa aaacagtaat cgacgcaacg atgtgcgcca ttatcgccta gttcattcgt gaccttctcg acttcgccgg actaagtagc aatctcgctt atataacgag cgtgtttatc ggctacatcg gtactgactc gattggttcg cttatcaaac gcttcgctgc taaaaaagcc ggagtagaag atggtagaaa tcaataatca acgtaaggcg ttcctcgata tgctggcgtg gtcggaggga actgataacg gacgtcagaa aaccagaaat catggttatg acgtcattgt aggcggagag ctatttactg attactccga tcaccctcgc aaacttgtca cgctaaaccc aaaactcaaa tcaacaggcg ccggacgcta ccagcttctt tcccgttggt gggatgccta ccgcaagcag cttggcctga aagacttctc tccgaaaagt caggacgctg tggcattgca gcagattaag gagcgtggcg ctttacctat gattgatcgt ggtgatatcc gtcaggcaat cgaccgttgc agcaatatct gggcttcact gccgggcgct ggttatggtc agttcgagca taaggctgac agcctgattg caaaattcaa agaagcgggc ggaacggtca gagagattga tgtatgagca gagtcaccgc gattatctcc gctctggtta tctgcatcat cgtctgcctg tcatgggctg ttaatcatta ccgtgataac gccattacct acaaagccca gcgcgacaaa aatgccagag aactgaagct ggcgaacgcg gcaattactg acatgcagat gcgtcagcgt gatgttgctg cgctcgatgc aaaatacacg aaggagttag ctgatgctaa agctgaaaat gatgctctgc gtgatgatgt tgccgctggt cgtcgtcggt tgcacatcaa agcagtctgt cagtcagtgc gtgaagccac caccgcctcc ggcgtggata atgcagcctc cccccgactg gcagacaccg ctgaacggga ttatttcacc ctcagagaga ggctgatcac tatgcaaaaa caactggaag gaacccagaa gtatattaat gagcagtgca gatagagttg cccatatcga tgggcaactc atgcaattat tgtgagcaat acacacgcgc ttccagcgga gtataaatgc ctaaagtaat aaaaccgagc aatccattta cgaatgtttg ctgggtttct gttttaacaa cattttctgc gccgccacaa attttggctg catcgacagt tttcttctgc ccaattccag aaacgaagaa atgatgggtg atggtttcct ttggtgctac tgctgccggt ttgttttgaa cagtaaacgt ctgttgagca catcctgtaa taagcagggc cagcgcagta gcgagtagca tttttttcat ggtgttattc ccgatgcttt ttgaagttcg cagaatcgta tgtgtagaaa attaaacaaa ccctaaacaa tgagttgaaa tttcatattg ttaatattta ttaatgtatg tcaggtgcga tgaatcgtca ttgtattccc ggattaacta tgtccacagc cctgacgggg aacttctctg cgggagtgtc cgggaataat taaaacgatg cacacagggt ttagcgcgta cacgtattgc attatgccaa cgccccggtg ctgacacgga agaaaccgga cgttatgatt tagcgtggaa agatttgtgt agtgttctga atgctctcag taaatagtaa tgaattatca aaggtatagt aatatctttt atgttcatgg atatttgtaa cccatcggaa aactcctgct ttagcaagat tttccctgta ttgctgaaat gtgatttctc ttgatttcaa cctatcatag gacgtttcta taagatgcgt gtttcttgag aatttaacat ttacaacctt tttaagtcct tttattaaca cggtgttatc gttttctaac acgatgtgaa tattatctgt ggctagatag taaatataat gtgagacgtt gtgacgtttt agttcagaat aaaacaattc acagtctaaa tcttttcgca cttgatcgaa tatttcttta aaaatggcaa cctgagccat tggtaaaacc ttccatgtga tacgagggcg cgtagtttgc attatcgttt ttatcgtttc aatctggtct gacctccttg tgttttgttg atgatttatg tcaaatatta ggaatgtttt cacttaatag tattggttgc gtaacaaagt gcggtcctgc tggcattctg gagggaaata caaccgacag atgtatgtaa ggccaacgtg ctcaaatctt catacagaaa gatttgaagt aatattttaa ccgctagatg aagagcaagc gcatggagcg acaaaatgaa taaagaacaa tctgctgatg atccctccgt ggatctgatt cgtgtaaaaa atatgcttaa tagcaccatt tctatgagtt accctgatgt tgtaattgca tgtatagaac ataaggtgtc tctggaagca ttcagagcaa ttgaggcagc gttggtgaag cacgataata atatgaagga ttattccctg gtggttgact gatcaccata actgctaatc attcaaacta tttagtctgt gacagagcca acacgcagtc tgtcactgtc aggaaagtgg taaaactgca actcaattac tgcaatgccc tcgtaattaa gtgaatttac aatatcgtcc tgttcggagg gaagaacgcg ggatgttcat tcttcatcac ttttaattga tgtatatgct ctcttttctg acgttagtct ccgacggcag gcttcaatga cccaggctga gaaattcccg gacccttttt gctcaagagc gatgttaatt tgttcaatca tttggttagg aaagcggatg ttgcgggttg ttgttctgcg ggttctgttc ttcgttgaca tgaggttgcc ccgtattcag tgtcgctgat ttgtattgtc tgaagttgtt tttacgttaa gttgatgcag atcaattaat acgatacctg cgtcataatt gattatttga cgtggtttga tggcctccac gcacgttgtg atatgtagat gataatcatt atcactttac gggtcctttc cggtgatccg acaggttacg gggcggcgac ctgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ttagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaactctat ctcgggctat tcttttgatt tagacctgca ggcatgcaag cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgcgatttat tcaacaaagc cgccgtcccg tcaagtcagc gtaatgctct gccagtgtta caaccaatta accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagcttat gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcgc tgttaaaagg acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg gcttcgagca agacgtttcc cgttgaatat ggctcataac accccttgta ttactgttta tgtaagcaga cagttttatt gttcatgatg atatattttt atcttgtgca atgtaacatc agagattttg agacacaacg tggctttgtt gaataaatcg aacttttgct gagttgaagg atcagatcac gcatcttccc gacaacgcag accgttccgt ggcaaagcaa aagttcaaaa tcaccaactg gtccacctac aacaaagctc tcatcaaccg tggctccctc actttctggc tggatgatgg ggcgattcag gcctggtatg agtcagcaac accttcttca cgaggcagac ctctcgacgg agttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgt FVIII-BDD codificado por sequências de ácidos nucleicos X01-X18. Sequência SQ negrito/sublinhada (SEQ ID NO:25)
MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARF PPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITL KNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLK ENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFA VFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVY WHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHI SSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSP SFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRK YKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGIT DVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVN MERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFL PNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVF FSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLK VSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKRHQREITRTTLQSD QEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSS PHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDN IMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAP TKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTI FDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQD QRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKA GIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPK LARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLD GKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMEL MGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRP QVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQ
NGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY FVIII do tipo selvagem com BDD (SEQ ID NO:26)
MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARF PPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITL KNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLK ENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFA VFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVY WHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHI SSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSP SFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRK YKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGIT DVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVN MERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFL PNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVF FSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLK VSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPEN DIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDP SPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDF KVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESG GPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDN ALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIH DRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLF LPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGE FTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQI HTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFS KKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEET ELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQA NRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKK NNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPK VHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATES SAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAI AAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDD TISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRA QSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQ ASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCK AWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSW YFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLL SMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLI GEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSG SINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTY RGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNS CSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKE WLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVF
QGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY Capsídeo AAV-LK03 VP1 (SEQ ID NO:27)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVL PGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQ ERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSS SGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAP MADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQS GASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQ VKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQY GYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSL DRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYR QQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHG NLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTV NDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKN TPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNK
SVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL Capsídeo AAV-SPK VP1 (SEQ ID NO:28) usado em AAV-SPK-8005 e AAV-SPK-hFIX
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVL PGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQ ERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDS STGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGA PMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNG TSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKL FNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIP QYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQ SLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCY RQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSS GVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIV GAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQIL IKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNY YKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL
Matriz de Identidade Percentual de Vetores hFVIII (WT, CO3, X09, X02, X06, X08, X15, X05, X18, X14, X01, X12, X04, X11, X07, X03, X16, X13, X17 e X10) hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFV
II II II II II II II II II II II II II II II II II II II III WT CO3 X09 X02 X06 X08 X15 X05 X18 X14 X01 X12 X04 X11 X07 X03 X16 X13 X17 X10 hFVIII 77,2 79,5 79,1 79,3 79,2 79,3 79,1 79 79,6 79,6 79,4 79,4 79,4 79,2 79,4 79,1 79 79,6 79,3
WT hFVIII 77,2 81,9 81,9 81,5 81,3 81,6 81,6 81,2 81,4 81,1 81,1 81,3 81,7 81,8 81,6 81,9 81,8 82,1 82,2 CO3 hFVIII 79,5 81,9 91,5 91,4 91,8 92 91,8 91 91,4 91,5 91,5 91,7 91,7 92,2 91,5 92,1 91,8 91,1 91,6 X09 hFVIII 79,1 81,9 91,5 91,4 91,3 92 92,1 92,2 91,7 92 91,9 91,9 92 91,5 91 91,5 92,3 91,9 92,1 X02 hFVIII 79,3 81,5 91,4 91,4 91,8 91,9 91,8 91,5 91,8 92,3 91,7 91,8 92 91,5 91,4 91,7 92,4 91,6 91,8 X06 hFVIII 79,2 81,3 91,8 91,3 91,8 91,8 91,5 91,5 91,8 92,2 91,5 92,3 92,5 92 91,7 91,4 92,3 91,6 91,9 X08 hFVIII 79,3 81,6 92 92 91,9 91,8 92,2 91,6 91,7 92,3 92,1 92,2 92,5 92 92,1 92,2 92,3 92,5 92 X15 hFVIII 79,1 81,6 91,8 92,1 91,8 91,5 92,2 92,5 91,9 92,7 92,4 92,1 91,5 92,1 91,6 91,7 92,3 91,9 92 X05 hFVIII 79 81,2 91 92,2 91,5 91,5 91,6 92,5 91,6 93 92,1 91,5 91,8 91,7 91,4 91,1 91,8 91,8 92 X18 hFVIII 79,6 81,4 91,4 91,7 91,8 91,8 91,7 91,9 91,6 93 92 91,6 91,8 91,3 91,8 92,3 92,2 91,8 92 X14 hFVIII 79,6 81,1 91,5 92 92,3 92,2 92,3 92,7 93 93 93,4 92,3 92,5 92,6 92,5 92,2 92,6 92,4 92,1 X01 hFVIII 79,4 81,1 91,5 91,9 91,7 91,5 92,1 92,4 92,1 92 93,4 92 92 92,4 92,4 91,7 92,4 92,6 92,6 X12 hFVIII 79,4 81,3 91,7 91,9 91,8 92,3 92,2 92,1 91,5 91,6 92,3 92 92,6 92 91,5 91,5 92 91,9 92,5 X04 hFVIII 79,4 81,7 91,7 92 92 92,5 92,5 91,5 91,8 91,8 92,5 92 92,6 92,6 92 91,9 92,3 91,8 91,9 X11 hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFVI hFV
II II II II II II II II II II II II II II II II II II II III WT CO3 X09 X02 X06 X08 X15 X05 X18 X14 X01 X12 X04 X11 X07 X03 X16 X13 X17 X10 hFVIII 79,2 81,8 92,2 91,5 91,5 92 92 92,1 91,7 91,3 92,6 92,4 92 92,6 92,1 92 92,4 91,9 92,7 X07 hFVIII 79,4 81,6 91,5 91 91,4 91,7 92,1 91,6 91,4 91,8 92,5 92,4 91,5 92 92,1 92 92,7 92,1 91,6 X03 hFVIII 79,1 81,9 92,1 91,5 91,7 91,4 92,2 91,7 91,1 92,3 92,2 91,7 91,5 91,9 92 92 92,4 92 92,8 X16 hFVIII 79 81,8 91,8 92,3 92,4 92,3 92,3 92,3 91,8 92,2 92,6 92,4 92 92,3 92,4 92,7 92,4 92,4 92,8 X13 hFVIII 79,6 82,1 91,1 91,9 91,6 91,6 92,5 91,9 91,8 91,8 92,4 92,6 91,9 91,8 91,9 92,1 92 92,4 92,9 X17 hFVIII 79,3 82,2 91,6 92,1 91,8 91,9 92 92 92 92 92,1 92,6 92,5 91,9 92,7 91,6 92,8 92,8 92,9 X10
Determinadas Definições/Abreviações Usadas BDD: todo ou pelo menos parte do domínio B (BD) deletada FVIII-BDD: FVIII com deleção do domínio B SQ: SFSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO: 29) FVIII/SQ: FVIII com SQ FVIIIX01-X18: CpG reduziu o FVIII que codifica variantes de ácido nucleico, estabelecidas como SEQ ID NOs: 1-18, respectivamente. TTRmut: promotor TTR com 4 mutações, de TAmGTGTAG a
TATTGACTTAG CO3: variante de ácido nucleico FVIII otimizado para codão, estabelecido como SEQ ID NO: 21 NHP: Primata não humano ALT: Alanina aminotransferase D-dímero: um fragmento de proteína resultante da quebra de um coágulo sanguíneo SPK-8005: capsídeo AAV (SEQ ID NO: 28) + TTRmut-hFVIII-X07; também conhecido como AAV-SPK-8005 SPK-8011: capsídeo AAV LK03 (SEQ ID NO: 27) + TTRmut- hFVIII-X07; também conhecido como AAV-SPK-8011
[0348] Embora algumas das modalidades da invenção tenham sido descritas e exemplificadas especificamente acima, não se pretende que a invenção seja limitada a tais modalidades. Várias modificações podem ser feitas sem sair do escopo e espírito da invenção, conforme estabelecido nas reivindicações a seguir.

Claims (140)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para tratar um ser humano com hemofilia A caracterizado pelo fato de que compreende administrar um vetor de vírus adenoassociado recombinante (rAAV) em que o genoma vetorial compreende a variante de ácido nucleico que codifica o Fator VIII (FVIII) que tem uma deleção do domínio B (hFVIII-BDD), em que a variante de ácido nucleico tem 95% ou mais de identidade em relação à SEQ ID NO:7.
2. Método para tratar um ser humano com hemofilia A caracterizado pelo fato de que compreende administrar um vetor de vírus adenoassociado recombinante (rAAV), em que o genoma vetorial compreende uma variante de ácido nucleico que codifica o Fator VIII (FVIII) que tem uma deleção do domínio B (hFVIII-BDD), em que a variante de ácido nucleico tem não mais que 2 dinucleotídeos citosina-guanina (CpGs).
3. Método para tratar um ser humano com hemofilia A caracterizado pelo fato de que compreende administrar um vetor de vírus adenoassociado recombinante (rAAV), em que o genoma vetorial compreende um ácido nucleico que codifica o Fator VIII (FVIII) ou codifica o Fator VIII (FVIII) que tem uma deleção do domínio B (hFVIII-BDD), em que a dose de vetor de rAAV administrada ao ser humano é menor que 6x1012 genomas vetoriais por quilograma (vg/kg).
4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a dose de vetor de rAAV administrada ao ser humano está entre cerca de 1x109 a cerca de 1x1014 vg/kg, inclusive.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a dose de vetor de rAAV administrada ao ser humano está entre cerca de 1x1010 a cerca de 6x1013 vg/kg, inclusive.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a dose de vetor de rAAV administrada ao ser humano está entre cerca de 1x1010 a cerca de 1x1013 vg/kg, inclusive.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a dose de vetor de rAAV administrada ao ser humano está entre cerca de 1x1010 a cerca de 6x1012 vg/kg, inclusive.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a dose de vetor de rAAV administrada ao ser humano está entre cerca de 1x1010 a cerca de 5x1012 vg/kg, inclusive.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a dose de vetor de rAAV administrada ao ser humano está entre cerca de 1x1011 a cerca de 1x1012 vg/kg, inclusive.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a dose de vetor de rAAV administrada ao ser humano está entre cerca de 2x1011 a cerca de 9x1011 vg/kg, inclusive.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a dose de vetor de rAAV administrada ao ser humano está entre cerca de 3x1011 a cerca de 8x1012 vg/kg, inclusive.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a dose de vetor de rAAV administrada ao ser humano está entre cerca de 3x1011 a cerca de 7x1012 vg/kg, inclusive.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a dose de vetor de rAAV administrada ao ser humano está entre cerca de 3x1011 a cerca de 6x1012 vg/kg, inclusive.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a dose de vetor de rAAV administrada ao ser humano está entre cerca de 4x1011 a cerca de 6x1012 vg/kg, inclusive.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a dose de vetor de rAAV administrada ao ser humano é cerca de 5x1011 vg/kg ou cerca de 1x1012 vg/kg.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a quantidade de FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, é maior que a prevista com base nos dados obtidos de estudos com primatas não humanos administrados com o vetor de rAAV.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a quantidade de FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, é 1 a 4 vezes maior que a expressão prevista com base em uma curva de regressão linear derivada de estudos com primatas não humanos administrados com o vetor de rAAV.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a quantidade de FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, é 2 a 4 vezes maior que a prevista com base em uma curva de regressão linear derivada de estudos com primatas não humanos administrados com o vetor de rAAV.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a quantidade de FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, é 2 a 3 vezes maior que a prevista com base em uma curva de regressão linear derivada de estudos com primatas não humanos administrados com o vetor de rAAV.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a quantidade de FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, é 1 a 2 vezes maior que a prevista com base em uma curva de regressão linear derivada de estudos com primatas não humanos administrados com o vetor de rAAV.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, caracterizado pelo fato de que o primata não humano é um macaco cinomolgo (Macaca fascicularis).
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a quantidade de FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, é cerca de 3% ou mais em 14 ou mais dias após a administração do vetor de rAAV, é cerca de 4% ou mais em 21 ou mais dias após a administração do vetor de rAAV, é cerca de 5% ou mais em 21 ou mais dias após a administração do vetor de rAAV, é cerca de 6% ou mais em 21 ou mais dias após a administração do vetor de rAAV, é cerca de 7% ou mais em 21 ou mais dias após a administração do vetor de rAAV, é cerca de 8% ou mais em 28 ou mais dias após a administração do vetor de rAAV, é cerca de 9% ou mais em 28 ou mais dias após a administração do vetor de rAAV, é cerca de 10% ou mais em 35 ou mais dias após a administração do vetor de rAAV, é cerca de 11% ou mais em 35 ou mais dias após a administração do vetor de rAAV, é cerca de 12% ou mais em 35 ou mais dias após a administração do vetor de rAAV.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a quantidade de FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, tem uma média de cerca de 10% ou mais ao longo de um período contínuo de 14 dias.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a quantidade de FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, tem uma média de cerca de 10% ou mais ao longo de um período contínuo de 4 semanas.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a quantidade de FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, tem uma média de cerca de 10% ou mais ao longo de um período contínuo de 8 semanas.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a quantidade de FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, tem uma média de cerca de 10% ou mais ao longo de um período contínuo de 12 semanas.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a quantidade de FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, tem uma média de cerca de 10% ou mais ao longo de um período contínuo de 16 semanas.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a quantidade de FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, tem uma média de cerca de 10% ou mais ao longo de um período contínuo de 6 meses.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a quantidade de FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, tem uma média de cerca de 12% ou mais ao longo de um período contínuo de 14 dias.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a quantidade de FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, tem uma média de cerca de 12% a cerca de 100% por um período contínuo de 4 semanas, por um período contínuo de 8 semanas, por um período contínuo de 12 semanas, por um período contínuo de 16 semanas, por um período contínuo de 6 meses ou por um período contínuo de 1 ano.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a quantidade de FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano, como refletido pela atividade de coagulação, tem uma média de cerca de 20% a cerca de 80% por um período contínuo de 4 semanas, por um período contínuo de 8 semanas, por um período contínuo de 12 semanas, por um período contínuo de 16 semanas, por um período contínuo de 6 meses ou por um período contínuo de 1 ano.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é por um período de pelo menos cerca de 14 dias após a administração do vetor de rAAV.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é por um período de pelo menos cerca de 21 dias após a administração do vetor de rAAV.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é por um período de pelo menos cerca de 28 dias após a administração do vetor de rAAV.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é por um período de pelo menos cerca de 35 dias após a administração do vetor de rAAV.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é por um período de pelo menos cerca de 42 dias após a administração do vetor de rAAV.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é por um período de pelo menos cerca de 49 dias após a administração do vetor de rAAV.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é por um período de pelo menos cerca de 56 dias após a administração do vetor de rAAV.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é por um período de pelo menos cerca de 63 dias após a administração do vetor de rAAV.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é por um período de pelo menos cerca de 70 dias após a administração do vetor de rAAV.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é por um período de pelo menos cerca de 77 dias após a administração do vetor de rAAV.
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é por um período de pelo menos cerca de 84 dias após a administração do vetor de rAAV.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é por um período de pelo menos cerca de 91 dias após a administração do vetor de rAAV.
44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é por um período de pelo menos cerca de 98 dias após a administração do vetor de rAAV.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é por um período de pelo menos cerca de 105 dias após a administração do vetor de rAAV.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é por um período de pelo menos cerca de 112 dias após a administração do vetor de rAAV.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é por um período de pelo menos cerca de 4 meses após a administração do vetor de rAAV.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é por um período de pelo menos cerca de 6 meses após a administração do vetor de rAAV.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é por um período de pelo menos cerca de 7 meses após a administração do vetor de rAAV.
50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é por um período de pelo menos cerca de 12 meses após a administração do vetor de rAAV.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4 a 50, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV é administrado em uma dose entre cerca de 1x109 a cerca de 1x1014 vg/kg inclusive ao ser humano, e o dito FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4 a 50, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV é administrado em uma dose entre cerca de 5x109 a cerca de 6x1013 vg/kg inclusive ao ser humano, e o dito FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4 a 50, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV é administrado em uma dose entre cerca de 1x1010 a cerca de 6x1013 vg/kg inclusive ao ser humano, e o dito FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4 a 50, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV é administrado em uma dose entre cerca de 1x1010 a cerca de 1x1013 vg/kg inclusive ao ser humano, e o dito FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4 a 50, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV é administrado em uma dose entre cerca de 1x1010 a cerca de 6x1012 vg/kg inclusive ao ser humano, e o dito FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV é administrado em uma dose menor que 6x1012 vg/kg ao ser humano, e o dito FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV é administrado em uma dose de cerca de 1x1010 a cerca de 5x1012 vg/kg, inclusive ao ser humano, e o dito FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV é administrado em uma dose de cerca de 1x1011 a cerca de 1x1012 vg/kg, inclusive ao ser humano, e o dito FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV é administrado em uma dose de cerca de 2x1011 a cerca de 9x1011 vg/kg, inclusive ao ser humano, e o dito FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV é administrado em uma dose de cerca de 3x1011 a cerca de 8x1012 vg/kg, inclusive ao ser humano, e o dito FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV é administrado em uma dose de cerca de 3x1011 a cerca de 7x1012 vg/kg, inclusive ao ser humano, e o dito FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV é administrado em uma dose de cerca de 3x1011 a cerca de 6x1012 vg/kg, inclusive ao ser humano, e o dito FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV é administrado em uma dose de cerca de 4x1011 a cerca de 6x1012 vg/kg, inclusive ao ser humano, e o dito FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV é administrado em uma dose de cerca de 5x1011 vg/kg ou cerca de 1x1012 vg/kg e o dito FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em níveis na média de cerca de 12% a cerca de 100% de atividade por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias, semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
65. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em um estado estacionário em que a atividade não varia em mais de 5 a 50% ao longo de 4, 6, 8 ou 12 semanas ou meses.
66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD é produzido no ser humano em um estado estacionário em que a atividade não varia em mais de 25 a 100% ao longo de 4, 6, 8 ou 12 semanas ou meses.
67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 66, caracterizado pelo fato de que os anticorpos AAV no ser humano não são detectados antes da administração do vetor de rAAV ou em que o dito ser humano é soronegativo para AAV.
68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 66, caracterizado pelo fato de que os anticorpos AAV no ser humano estão em ou menos de 1:5 antes da administração do vetor de rAAV.
69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 66, caracterizado pelo fato de que os anticorpos AAV no ser humano estão em ou menos de 1:3 antes da administração do vetor de rAAV.
70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 66, caracterizado pelo fato de que o dito ser humano não produz anticorpos detectáveis contra o FVIII ou hFVIII-BDD por pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou meses ou mais após a administração do vetor de rAAV.
71. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 66, caracterizado pelo fato de que o ser humano não produz anticorpos detectáveis contra o vetor de rAAV por pelo menos cerca de 14 dias, ou por pelo menos cerca de 21 dias, ou por pelo menos cerca de 28 dias, ou por pelo menos cerca de 35 dias, ou por pelo menos cerca de 42 dias, ou por pelo menos cerca de 49 dias, ou por pelo menos cerca de 56 dias, ou por pelo menos cerca de 63 dias, ou por pelo menos cerca de 70 dias, ou por pelo menos cerca de 77 dias, ou por pelo menos cerca de 84 dias, ou por pelo menos cerca de 91 dias, ou por pelo menos cerca de 98 dias, ou por pelo menos cerca de 105 dias, ou por pelo menos cerca de 112 dias, ou por pelo menos cerca de 154 dias, ou por pelo menos cerca de 168 dias, ou por pelo menos cerca de 182 dias, ou por pelo menos cerca de 196 dias, ou por pelo menos cerca de 210 dias, após a administração do vetor de rAAV.
72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 71, caracterizado pelo fato de que o dito ser humano não produz uma resposta imune mediada por célula contra o vetor de rAAV por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 semanas ou meses contínuos após a administração do vetor de rAAV.
73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 72, caracterizado pelo fato de que o ser humano não desenvolve uma resposta imune humoral contra o vetor de rAAV suficiente para reduzir ou bloquear o efeito terapêutico de FVIII ou hFVIII-BDD.
74. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 73, caracterizado pelo fato de que o ser humano não produz anticorpos detectáveis contra o vetor de rAAV por pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 meses após a administração do vetor de rAAV.
75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 74, caracterizado pelo fato de que o ser humano não é administrado com um agente imunossupressivo antes, durante e/ou após a administração do vetor de rAAV.
76. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 75, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD expresso no ser humano é alcançado sem administração de um agente imunossupressivo.
77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 75, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar um agente imunossupressivo.
78. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 76, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar um agente imunossupressivo após o vetor de rAAV ser administrado.
79. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 75, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar um agente imunossupressivo de um período de tempo dentro de 1 hora a até 45 dias após o vetor de rAAV ser administrado.
80. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 75 a 79, caracterizado pelo fato de que o agente imunossupressivo compreende um esteroide, ciclosporina (por exemplo, ciclosporina A), micofenolato, Rituximabe ou um derivado do mesmo.
81. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 80, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico ou variante de ácido nucleico tem 96% ou mais de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:7.
82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 80, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico ou variante de ácido nucleico tem 95% a 100% de identidade de sequência em relação à SEQ ID NO:7.
83. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 82, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico ou variante de ácido nucleico tem 20 ou menos, 15 ou menos ou 10 ou menos dinucleotídeos citosina-guanina (CpGs).
84. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 82, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico ou variante de ácido nucleico tem não mais do que 5 dinucleotídeos citosina- guanina (CpGs).
85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 82, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico ou variante de ácido nucleico tem 4, 3, 2, 1 ou 0 dinucleotídeos citosina-guanina (CpGs).
86. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 82, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico ou variante de ácido nucleico tem 1 dinucleotídeo citosina-guanina (CpG).
87. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 86, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico ou variante de ácido nucleico codifica SEQ ID NO:25 com uma deleção de um ou mais aminoácidos da sequência SFSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO:29), ou uma deleção de toda a sequência SFSQNPPVLKRHQR.
88. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 86, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico ou variante de ácido nucleico codifica SEQ ID NO:25.
89. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 86, caracterizado pelo fato de que o hFVIII-BDD é idêntico ao hFVIII-BDD codificado pela SEQ ID NO:19.
90. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 86, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico ou variante de ácido nucleico codifica SEQ ID NO:25 com uma deleção de um ou mais aminoácidos da sequência SFSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO:29), ou uma deleção de toda a sequência SFSQNPPVLKRHQR.
91. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 90, caracterizado pelo fato de que o dito vetor de rAAV compreende um sorotipo de AAV ou um pseudotipo de AAV, em que o dito pseudotipo de AAV compreende um sorotipo de capsídeo de AAV diferente de um sorotipo de ITR.
92. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 91, caracterizado pelo fato de que o genoma vetorial compreende ainda um íntron, um elemento de controle de expressão, uma ou mais repetições terminais invertidas de vírus adenoassociado (AAV) (ITRs) e/ou uma sequência de polinucleotídeos de carga.
93. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o íntron está dentro ou flanqueia a variante de ácido nucleico.
94. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o elemento de controle de expressão está operacionalmente ligado à variante de ácido nucleico.
95. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que a ITR (ou ITRs) de AAV flanqueia a terminação 5’ ou 3’ da variante de ácido nucleico.
96. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que a sequência de polinucleotídeos de carga flanqueia a terminação 5’ ou 3’ da variante de ácido nucleico.
97. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o íntron, elemento de controle de expressão, uma ou mais repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adenoassociado (AAV) e/ou uma sequência de polinucleotídeos de carga foram modificados para terem dinucleotídeos citosina-guanina (CpGs) reduzidos.
98. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o íntron, elemento de controle de expressão, uma ou mais repetições terminais invertidas de vírus adenoassociado (AAV)
(ITRs) e/ou uma sequência de polinucleotídeos de carga foram modificados para terem 20 ou menos, 15 ou menos, 10 ou menos, 5 ou menos ou 0 dinucleotídeos citosina-guanina (CpGs).
99. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o elemento de controle de expressão compreende um elemento de controle constitutivo ou regulável, ou um promotor ou elemento de controle de expressão tecido-específico.
100. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o elemento de controle de expressão compreende um elemento que confere expressão no fígado.
101. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o elemento de controle de expressão compreende um promotor de TTR ou promotor de TTR mutante.
102. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracterizado pelo fato de que o promotor de TTR mutante compreende SEQ ID NO:22.
103. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracterizado pelo fato de que a ITR compreende uma ou mais ITRs de qualquer um dentre: sorotipos de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 ou AAV-2i8 AAV, ou uma combinação dos mesmos.
104. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 103, caracterizado pelo fato de que o genoma vetorial compreende uma ITR, um promotor, uma sequência de sinais poliA e/ou íntrons estabelecida na SEQ ID NO:23.
105. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV compreende uma sequência de capsídeo de AAV VP1, VP2 e/ou VP3 variante ou modificada, ou sequência de capsídeo de AAV VP1, VP2 e/ou VP3 do tipo selvagem.
106. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 105, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV compreende uma sequência de capsídeo de AAV VP1, VP2 e/ou VP3 variante ou modificada com 90% ou mais de identidade em relação às sequências de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 ou AAV-2i8 VP1, VP2 e/ou VP3.
107. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 105, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV compreende uma sequência de capsídeo de VP1, VP2 ou VP3 selecionada a partir de: sorotipos de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 ou AAV-2i8 AAV.
108. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV compreende um capsídeo com 90% ou mais de identidade de sequência em relação ao capsídeo LK03 (SEQ ID NO:27).
109. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV compreende um capsídeo com 90% ou mais de identidade de sequência em relação ao capsídeo SPK (SEQ ID NO:28).
110. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV compreende o capsídeo LK03 (SEQ ID NO:27).
111. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV compreende o capsídeo SPK (SEQ ID NO:28).
112. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV compreende a variante de ácido nucleico SEQ ID NO:7 e a sequência de capsídeo LK03 (SEQ ID NO:27).
113. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV compreende a variante de ácido nucleico SEQ ID NO:7 e o capsídeo SPK (SEQ ID NO:28).
114. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 113, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV compreende a variante de ácido nucleico e um ou mais dentre um promotor de TTR mutado (TTRmut), íntron sintético, poli A e ITR na SEQ ID NO:23.
115. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 113, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV compreende a variante de ácido nucleico e um ou mais dentre um promotor de TTR mutado (TTRmut), íntron sintético, poli A e ITR na SEQ ID NO:23 e sequência de capsídeo LK03 (SEQ ID NO:27) ou capsídeo SPK (SEQ ID NO:28).
116. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 115, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV compreende uma composição farmacêutica.
117. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica compreende um carreador ou excipiente biologicamente compatível.
118. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 117, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV é encapsulado em um lipossoma ou misturado com fosfolipídeos ou micelas.
119. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 118, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar AAV de capsídeo vazio, opcionalmente em que o AAV de capsídeo vazio é administrado com o vetor de rAAV.
120. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 118, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar capsídeo vazio de sorotipo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e/ou AAV-Rh74.
121. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 118, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar AAV de capsídeo vazio do mesmo sorotipo que o vetor de AAV administrado.
122. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 118, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar capsídeo vazio com um capsídeo LK03 (SEQ ID NO:27) ou um capsídeo SPK (SEQ ID NO:28).
123. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 118 a 122, caracterizado pelo fato de que a razão entre os ditos capsídeos vazios e o dito vetor de rAAV está entre cerca de 2:1 a cerca de 50:1.
124. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 118 a 122, caracterizado pelo fato de que a razão entre os ditos capsídeos vazios e o dito vetor de rAAV está entre cerca de 2:1 a cerca de 25:1.
125. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 118 a 122, caracterizado pelo fato de que a razão entre os ditos capsídeos vazios e o dito vetor de rAAV está entre cerca de 2:1 a cerca de 20:1.
126. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 118 a 122, caracterizado pelo fato de que a razão entre os ditos capsídeos vazios e o dito vetor de rAAV está entre cerca de 2:1 a cerca de 15:1.
127. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 118 a 122, caracterizado pelo fato de que a razão entre os ditos capsídeos vazios e o dito vetor de rAAV está entre cerca de 2:1 a cerca de 10:1.
128. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 118 a 122, caracterizado pelo fato de que a razão entre os ditos capsídeos vazios e o dito vetor de rAAV é cerca de 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, ou 10:1.
129. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 128, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD codificado pela variante de ácido nucleico é expresso em uma célula, tecido ou órgão do dito mamífero.
130. Método, de acordo com a reivindicação 129, caracterizado pelo fato de que a célula compreende uma célula secretora.
131. Método, de acordo com a reivindicação 129, caracterizado pelo fato de que a célula compreende uma célula endócrina ou uma célula endotelial.
132. Método, de acordo com a reivindicação 129, caracterizado pelo fato de que a célula compreende um hepatócito, uma célula sinusoidal endotelial, um megacariócito, uma célula-tronco plaquetária ou hematopoiética.
133. Método, de acordo com a reivindicação 129, caracterizado pelo fato de que o tecido ou órgão do dito mamífero compreende fígado.
134. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 133, caracterizado pelo fato de que o vetor de rAAV é entregue ao dito ser humano por via intravenosa, intra-arterial, intramuscular, subcutânea, intracavidade, por intubação ou por cateter.
135. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 134, caracterizado pelo fato de que o FVIII ou hFVIII-BDD é expresso em níveis sem risco de trombose substancialmente aumentado.
136. Método, de acordo com a reivindicação 135, caracterizado pelo fato de que o dito risco de trombose é determinado pela medição de produtos de degradação de fibrina.
137. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 136, caracterizado pelo fato de que a atividade do FVIII ou hFVIII-BDD é detectável por pelo menos 1, 2, 3 ou 4 semanas, ou pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 meses, ou pelo menos 1 ano.
138. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 137, caracterizado pelo fato de que o ser humano não apresenta sangramentos espontâneos por pelo menos 1, 2, 3 ou 4 semanas, ou pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 meses, ou pelo menos 1 ano.
139. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 138, caracterizado pelo fato de que o ser humano não requer profilaxia com proteína FVIII por pelo menos 1, 2, 3 ou 4 semanas, ou pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 meses, ou pelo menos 1 ano.
140. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 139, caracterizado pelo fato de que compreende ainda analisar ou monitorar o ser humano para a presença ou quantidade de anticorpos AAV, uma resposta imune contra anticorpos AAV, FVIII ou hFVIII- BDD, uma resposta imune contra quantidades de FVIII ou hFVIII-BDD, FVIII ou hFVIII-BDD, atividade de FVIII ou hFVIII-BDD, quantidades ou níveis de uma ou mais enzimas hepáticas ou frequência e/ou gravidade ou duração dos episódios hemorrágicos.
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