KR20180090795A - CpG 감소된 인자 VIII 변이체, 조성물 및 지혈 장애의 치료를 위한 방법 및 용도 - Google Patents

CpG 감소된 인자 VIII 변이체, 조성물 및 지혈 장애의 치료를 위한 방법 및 용도 Download PDF

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자비에 안구엘라
샘 센-아이 센
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스파크 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

FVIII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체 및 이의 사용 방법이 기재된다. 특정 구체예에서, FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체는 세포에 의해 더욱 효율적으로 발현되거나, 야생형 인자 VIII 단백질에 비해 세포에 의해 증가된 수준으로 분비되거나, 야생형 인자 VIII 단백질에 비해 증가된 발현 및/또는 활성을 나타내거나 바이러스 벡터 내로 더욱 효율적으로 패키징된다.

Description

CpG 감소된 인자 VIII 변이체, 조성물 및 지혈 장애의 치료를 위한 방법 및 용도
관련 출원
본 특허 출원은 2015년 10월 30일 출원된 미국 특허 출원 번호 62/249,001, 2016년 5월 4일 출원된 출원 번호 62/331,872, 2016년 6월 13일 출원된 출원 번호 62/349,532, 및 2016년 7월 1일 출원된 출원 번호 62/357,874의 이익을 청구하며, 이들 출원 모두는 그 전체가 본원에 참고로 분명히 인용된다.
발명의 분야
본 발명은 재조합 응고 인자 생성 및 이상 지혈과 관련된 의학적 장애의 치료 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 인자 VIII (FVIII) 단백질을 인코딩하는 핵산 변이체(서열)를 제공하며, 이 변이체는 야생형 FVIII 단백질에 비해 증가된 전사 및/또는 발현, 및/또는 활성을 임의로 제공한다.
도입
본 발명이 속하는 기술 수준을 기술하기 위해 본 명세서 전반에 걸쳐 여러 간행물 및 특허 문헌이 인용된다. 이들 각 인용문헌은 전체가 제시된 것과 같이 참고로 본원에 인용된다.
혈우병은 전세계적으로 5,000명의 남성 중 한 명에게 존재하는 X-관련 출혈 장애이다. 단지 정상의 1%를 초과하는 응고 인자 수준 증가를 목적으로 하는 치료법은 중증 질환 표현형의 실질적인 개선과 관련된다. 혈우병 B(HB)에 대한 AAV-매개된 유전자 전이에 대한 최근의 임상 시험은 치료학적 수준의 인자 IX(FIX)의 지속된 장기간 발현을 입증하였으나, AAV 벡터 용량은 AAV 캡시드에 대한 항-AAV 면역 반응으로 인해 제한될 수 있음이 확립되었다. 이들 데이터는 혈우병 B와 관련되어 있는 반면, 모든 혈우병의 80%는 FVIII 결핍 즉, 혈우병 A(HA)로 인한 것이다.
이러한 질환에 대한 현재 치료법은 인자 VIII 단백질의 빈번한 주입을 필요로 하는 단백질 대체 요법이다. 환자가 더 이상 이러한 빈번한 단백질 치료를 필요로 하지 않도록 지속된 치료학적 수준의 인자 VIII 발현을 달성하기 위한 즉각적인 요구가 있다. 실제로, 연속적인 인자 VIII 발현은 출혈 사건을 예방할 것이며 단백질에 대한 면역 내성이 확립됨을 보장할 수 있다.
요약하면, HA에 대한 유전자 요법은 3개의 뚜렷한 도전과제를 제시한다: (1) 인간 FVIII(hFVIII)의 본질적 특성은 유사한 크기의 다른 단백질에 비해 발현을 어렵게하며, (2) 큰 크기의 FVIII cDNA 및 서열 특이적 효과는 AAV 생성을 방해하는 재배열과 관련이 있으며, (3) 중증 (<1% FVIII) HA 환자의 25-30%에서 발생하는 단백질 요법에 대한 반응에서 높은 비율의 항-FVIII 항체(억제제) 형성.
개요
본 발명에 따르면, 인자 VIII(FVIII) 단백질을 인코딩하는 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG) 감소된 핵산 변이체가 제공된다. 이러한 CpG 감소된 핵산 변이체는 FVIII을 인코딩하는 야생형 핵산과 구별되며, 예를 들어, FVIII B 도메인 전부 또는 일부가 선택적으로 결핍된 인간 FVIII 단백질을 인코딩할 수 있다. 이러한 CpG 감소된 핵산 변이체는 세포에 전이될 경우 코돈-최적화된 FVIII 핵산 예컨대, FVIII-CO3(SEQ ID NO:21)와 비교하여 증가된 발현 (예를 들어, 1-5배 증가된 발현)을 나타내어, 증가된 FVIII 단백질 분비, 이에 따라 증가된 활성을 유도하는 변이체를 포함한다.
특정 구체예에서, FVIII B 도메인의 전부 또는 일부가 결실되거나 결실되지 않은 FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체는 포유동물에서 FVIII의 증가된 발현, FVIII 단백질의 증가된 생성을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, FVIII 단백질의 증가된 순환 수준에 의한 유전자 전이와 관련하여 증가된 효율을 제공하고 유익한 치료 결과에 대한 지혈을 달성한다.
특정 구체예에서, FVIII을 인코딩하는 핵산 변이체는 FVIII을 인코딩하는 야생형 핵산과 비교하여 감소된 CpG 함량을 갖는다. 특정 구체예에서, 핵산 변이체는 FVIII를 인코딩하는 야생형 핵산(SEQ ID NO:19)보다 적어도 10개 적은 CpG를 갖는다. 특정 구체예에서, 핵산 변이체는 4개 이하의 CpG를 갖거나; 3개 이하의 CpG를 갖거나; 2개 이하의 CpG를 갖거나; 1개 이하의 CpG를 갖는다. 특정 구체예에서, 핵산 변이체는 최대 4개 CpG; 3개 CpG; 2개 CpG; 또는 1개 CpG를 갖는다. 특정 구체예에서, 핵산 변이체는 CpG를 갖지 않는다.
특정 구체예에서, FVIII을 인코딩하는 핵산 변이체는 FVIII을 인코딩하는 야생형 핵산과 비교하여 감소된 CpG 함량을 가지며, 이러한 CpG 감소된 핵산 변이체는 SEQ ID NO:1-18 중 임의의 서열에 대해 90% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는다. 특정 구체예에서, CpG 감소된 핵산 변이체는 SEQ ID NO:1-18 중 임의의 서열에 대해 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는다. 특정 구체예에서, CpG 감소된 핵산 변이체는 SEQ ID NO:1-18 중 임의의 서열에 대해 90-95% 서열 동일성을 갖는다. 특정 구체예에서, CpG 감소된 핵산 변이체는 SEQ ID NO:1-18 중 임의의 서열에 대해 95%-100% 서열 동일성을 갖는다. 특정 구체예에서, CpG 감소된 핵산 변이체를 인코딩하는 FVIII는 SEQ ID NO:1-18 중 임의의 서열에 제시된다.
특정 구체예에서, CpG 감소된 핵산 변이체는 FVIII변이체 V3(SEQ ID NO:20)와 구별되고/거나 FVIII 변이체 CO3(SEQ ID NO:21)와 구별된다.
특정 구체예에서, FVIII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체는 야생형 FVIII와 비교하여 또는 B 도메인이 결실된 야생형 FVIII와 비교하여 더 큰 발현을 제공하고/거나 탁월한 생물학적 활성을 나타낸다 (예를 들어, FVIII 검정 또는 FVIII 결핍 모델에서 응고 검정 또는 감소된 출혈 또는 혈장수준에 의해 결정됨).
특정 구체예에서, FVIII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체는 야생형 인간 FVIII 핵산 또는 B 도메인이 결실된 야생형 인간 FVIII 핵산과 적어도 75% 동일하다. 특정 구체예에서, FVIII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체는 야생형 인간 FVIII 핵산 또는 B 도메인이 결실된 야생형 인간 FVIII 핵산과 약 75-95% 동일(예를 들어, 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 동일)하다.
특정 구체예에서, FVIII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체는 포유동물 예컨대, 인간이다. FVIII 단백질을 인코딩하는 이러한 포유동물 CpG 감소된 핵산 변이체는 인간 야생형 FVIII 또는 B 도메인이 결실된 인간 야생형 FVIII을 기반으로 할 수 있는 인간 형태를 포함한다.
본 발명에 따르면, 본원에 제시된 FVIII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 벡터 및 발현 벡터가 또한, 제공된다. 특정 구체예에서, 벡터 또는 발현 벡터는 아데노바이러스-관련 바이러스(AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 플라스미드, 또는 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 특정 구체예에서, AAV 벡터는 AAV 혈청형 또는 AAV 위형 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 AAV를 포함한다. 특정 구체예에서, 발현 벡터는 SEQ ID NO:1-18 중 임의의 서열을 포함하거나, SEQ ID NO:23 또는 24를 포함한다.
특정 구체예에서, 발현 조절 요소는 항시적 또는 조절가능한 조절 요소, 또는 조직-특이적 발현 조절 요소 또는 프로모터를 포함한다. 특정 구체예에서, 발현 조절 요소는 간에서 발현을 부여하는 요소를 포함한다. 특정 구체예에서, 발현 조절 요소는 TTR 프로모터 또는 변이 TTR 프로모터 예컨대, SEQ ID NO:22를 포함한다. 추가의 특정 양태에서, 발현 조절 요소는 PCT 공개 WO 2016/168728 (USSN 62/148,696; 62/202,133; 및 62/212,634)에 제시된 프로모터를 포함하며, 상기는 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
본 발명에 따르면, FVIII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 또는 FVIII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는 바이러스 벡터가 추가로 제공된다. 특정 구체예에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 플라스미드, 또는 렌티바이러스 벡터를 포함한다.
특정 구체예에서, AAV 벡터는 ITR 혈청형과 상이한 AAV 캡시드 혈청형을 포함하는 AAV 혈청형 또는 AAV 위형을 포함한다. 추가의 특정 양태에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 AAV 혈청형 중 임의의 혈청형에 대해 75% 또는 그 초과의 서열 동일성 (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 등)을 갖는 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 서열을 포함한다.
발현 벡터는 추가의 구성요소 또는 요소를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, AAV 벡터와 같은 발현 벡터는 인트론, 발현 조절 요소, 하나 이상의 AAV 역방위 말단 반복 (ITR) (예를 들어, 임의의 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 , AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 AAV 혈청 형, 또는 이들의 조합물), 필러(filler) 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 폴리 A 신호를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 인트론은 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체 내부에 또는 측면에 인접하여 위치하고/거나 발현 조절 요소는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체에 작동가능하게 연결되고/거나 AAV ITR(들)은 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체의 5' 또는 3' 말단에 측면 인접하고/거나 필러 폴리뉴클레오티드 서열은 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체의 5' 또는 3' 말단에 측면 인접한다.
특정 구체예에서, 발현 조절 요소는 항시적 또는 조절가능한 조절 요소, 또는 조직-특이적 발현 조절 요소 또는 프로모터를 포함한다. 특정 구체예에서, 발현 조절 요소는 간에서의 발현을 부여하는 요소(예를 들어, TTR 프로모터 또는 변이 TTR 프로모터)를 포함한다.
본 발명에 따르면, 본원에 제시된 FVIII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 숙주 세포가 추가로 제공된다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 FVIII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체 또는 FVIII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 특정 구체예에서, 이러한 숙주 세포는 핵산 변이체에 의해 인코딩된 FVIII 단백질을 생성하고, 생성된 FVIII 단백질이 회수된다. 세포에 의해 생성되고, 선택적으로 분리되고/거나 정제된 이러한 FVIII 단백질이 대상체에 투여될 수 있다.
본 발명에 따르면, 본원에 제시된 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 벡터 및 발현 벡터를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다. 특정 구체예에서, 약학적 조성물은 생물학적으로 양립가능한 담체 또는 부형제 중의 벡터, 발현 벡터, 또는 바이러스 또는 AAV 벡터를 포함한다. 이러한 약학적 조성물은 빈 캡시드 AAV (예를 들어, 핵산 변이체를 인코딩하는 FVIII를 포함하는 벡터 게놈 결여)를 임의로 포함한다. 추가의 특정 구체예에서, FVIII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 벡터, 발현 벡터, 또는 바이러스 또는 AAV 벡터는 리포솜에 캡슐화되거나 당지질 또는 미셀과 혼합된다.
본 발명에 따르면, FVIII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포유동물 또는 포유동물 세포로 전달 또는 전이시키는 방법이 추가로 제공된다. 한 구체예에서, 방법은 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, FVIII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 벡터, FVIII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 발현 벡터, 또는 FVIII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 바이러스 또는 AAV 벡터를 포유동물 또는 포유동물 세포에 투여하거나 이와 접촉시켜, 핵산 서열을 포유동물 또는 포유동물 세포 내로 전달 또는 전이시키는 것을 포함한다. 이러한 방법은 배양물 또는 대상체 (예를 들어, 환자)중의 포유동물 세포에 FVIII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 도입한다.
본 발명의 방법은 또한, FVII가 필요한 인간과 같은 포유동물 대상체 (예를 들어, 환자)를 치료하는 것을 포함한다 (인간은 불충분한 양의 FVIII 단백질, 또는 결함 또는 이상 FVIII 단백질을 생성한다). 한 구체예에서, FVIII가 필요한 포유동물을 치료하는 방법은 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 또는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 벡터; 또는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 발현 벡터, 또는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 바이러스 또는 AAV 벡터를 제공하고; 소정량의 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 또는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 벡터, 또는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 발현 벡터, 또는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 바이러스 또는 AAV 벡터를 포유동물 대상체에 투여하여 핵산 변이체에 의해 인코딩된 FVIII를 포유동물 대상체에서 발현시키는 것을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 지혈 관련 장애의 치료가 필요한 환자(예를 들어, 환자는 불충분한 양의 FVIII 단백질, 또는 결함 또는 이상 FVIII 단백질을 생성함)에서 지혈 관련 장애의 치료 방법은 생물학적으로 허용되는 담체 중의 치료적 유효량의 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 또는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 벡터, 또는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 발현 벡터, 또는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 바이러스 또는 AAV 벡터를 환자에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 구체예에서, FVIII은 포유동물에 유익한 효과 또는 치료적 효과를 갖는 수준으로 발현되며; 및/또는 FVIII은 포유동물의 세포, 조직 또는 기관에서 발현된다. 이러한 구체예는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 조직 또는 기관 예컨대, 간에 도입하는 것을 포함한다. 이러한 구체예는 또한, FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 분비 세포에 도입하는 것을 포함한다. 이러한 구체예는 또한, FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 내분비 세포 또는 내피 세포에 도입하는 것을 포함한다. 이러한 구체예는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 간세포, 굴형 내피 세포, 거대핵세포, 혈소판 또는 조혈 줄기 세포로 도입시키는 것을 추가로 포함한다.
FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 또는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 벡터, 또는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 발현 벡터, 또는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 바이러스 또는 AAV 벡터의 투여(예를 들어, 전달)를 위한 후보 대상체(예를 들어, 환자) 및 포유동물(예를 들어, 인간)은 혈우병 A, 폰빌레브란트병 및 외상 관련 출혈, 상해, 혈전증, 혈소판감소증, 뇌졸중, 응고병, 파종혈관내응고(DIC) 또는 과다-항응고 치료 장애와 같은 장애를 갖거나 가질 위험이 있는 대상을 포함한다.
FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 또는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 벡터, 또는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 발현 벡터, 또는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 바이러스 또는 AAV 벡터의 투여(예를 들어, 전달)를 위한 후보 대상체(예를 들어, 환자) 및 포유동물(예를 들어, 인간)은 AAV 항체에 대한 혈청-음성인 대상체는 물론 AAV 항체를 갖거나 발생시킬 위험이 있는 대상체를 포함한다. 이러한 대상체(예를 들어, 환자) 및 포유동물(예를 들어, 인간)은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV-Rh10 또는 AAV-Rh74 혈청형에 대해 혈청-양성 또는 혈청-음성일 수 있다.
따라서, 본 발명의 조성물 및 방법은 상기 포유동물 또는 상기 환자에 빈 캡시드 AAV를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV-12, AAV-Rh10 및/또는 AAV-Rh74 혈청형의 빈 캡시드가 포유동물 또는 환자에 추가로 투여된다.
본 발명에 따른 투여(예를 들어, 전달) 방법은 생체외 또는 생체내에서 임의의 접촉 또는 전달 모드를 포함한다. 특정 구체예에서, 투여(예를 들어, 전달)는 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 강내, 삽관법에 의해 또는 카테터를 통해서이다.
본 발명은 또한, 투여를 평가하고 변이체의 면역원성을 모니터링하기 위해 인간 FVIII에 내성인 크고 작은 동물 모델에서 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 시험하는 방법을 제공한다. 동물 모델의 사용은 항-hFVIII 항체 반응의 입증 없이 hFVIII-BDD로의 단백질 대체 요법으로 최근 처리된 인간으로서, 이러한 변이체에 대한 면역 반응을 일으킬 가능성이 있는 인간의 평가를 허용하는 환경을 제공한다.
도 1은 18개 상이한 클론 (SEQ ID NO:1-18에 대해 각각 상응하는 X01-X18) 및 FVIII-CO3(SEQ ID NO:21)에 있어서 50 μg 플라스미드의 유체역학적 꼬리 정맥(HTV) 주입 후 24시간에서 인간 FVIII(hFVIII) 수준을 보여준다.
도 2A-2C는 FVIII (A) CO3 (SEQ ID NO:21), X09 (SEQ ID NO:9), X12 (SEQ ID NO:12) 및 X16 (SEQ ID NO:16); (B) CO3 (SEQ ID NO:21), X01 (SEQ ID NO:1) 및 X11 (SEQ ID NO:11); 또는 (C) CO3 (SEQ ID NO:21), X07 (SEQ ID NO:7) 및 X10 (SEQ ID NO:10)의 AAV 벡터 투여 후 혈우병 A/CD4-/- 마우스에서 FVIII 수준을 보여준다.
도 3A-3B는 87일의 과정에 걸쳐 비히클(원형), 4x1010 (사각형), 8x1010 (삼각형), 또는 1.6x1011 vg/마우스 (역삼각형)의 AAV-SPK-8005-hFVIII의 정맥내 투여 후 NOD/SCID 마우스의 혈장 중 hFVIII 항원 (ng/ml)의 수준(B) 또는 총 항원 %(C)를 보여준다. 라인은 각 코호트에서 hFVIII 평균 ± SD를 나타낸다. 인간 FVIII 혈장 수준은 ELISA에 의해 검정되었으며, 150 ng/ml가 100% 활성에 대응한다는 가정하에 ng/ml FVIII를 % 정상 FVIII 수준으로 전환시켰다.
도 3C는 각 시점 x-축에서 왼쪽에서 오른쪽으로 예시된 바와 같이 비히클, 4x1010, 8x1010 또는 1.6x1011 vg/마우스의 AAV-SPK-8005-hFVIII의 정맥내 투여 후 NOD/SCID 마우스의 혈장 중 D-다이머의 수준을 보여준다. 막대는 각 코호트에서 마우스의 평균 ± SD 마우스를 나타낸다. D-다이머 수준은 ELISA에 의해 검정되었다.
도 4는 NHP 연구 설계를 보여준다.
도 5A-5D는 2x1012 (A), 5x1012 (B) 또는 1x1013 vg/kg (C)의 AAV-SPK-8005의 정맥내 투여 후 NHP 중 hFVIII 항원 수준을 보여준다. 라인은 개별 동물을 나타낸다. 인간 FVIII 혈장 수준은 ELISA에 의해 검정하였고, 연구 과정 동안 동일한 군의 동물에 대해 연속 출혈에 의해 얻어진 반복된 측정치를 나타낸다 (코호트 당 n = 2-3 동물). 비히클-처리된 동물에서 측정된 인간 FVIII 수준은 세 그래프 모두에서 빈 사각형으로 나타낸다.
ε = FVIII에 대한 억제제의 개발.
도 6A-6C는 2x1012 (A), 5x1012 (B) 또는 1x1013 vg/kg (C)의 AAV-SPK-8005의 NHP 중 ALT 수준을 보여준다.
도 7A-7C는 NHP 중의 D-다이머 수준을 보여준다. 2x1012 (A), 5x1012 (B) 또는 1x1013 vg/kg (C)의 AAV-SPK-8005의 정맥내 투여 후 NHP의 혈장 중 D-다이머 항원 농도. 점선은 인간에서 D-다이머에 대한 정상의 상한치인 500 ng/ml를 나타낸다.
도 8은 AAV-SPK-8005의 3회 투여에서 FVIII 수준의 데이터 요약을 나타낸다.
도 9A-9D는 2x1012 (A), 6x1012 (B) 또는 2x1013 (vg/kg) (C))의 AAV-SPK-8011(LK03 캡시드)-hFVIII의 정맥내 투여 후 사이노몰거스 마카크의 혈장 중 hFVIII 수준을 나타낸다. 라인은 개별 동물을 나타낸다. hFVIII 혈장 수준은 ELISA에 의해 검정하였고, 연구 과정 동안 동일한 군의 동물에 대해 연속 출혈에 의해 얻어진 반복된 측정치를 나타낸다 (코호트 당 n = 3 동물). 비히클-처리된 동물에서 측정된 인간 FVIII 수준은 빈 사각형으로 나타낸다 (n=2). ε= FVIII에 대한 억제제의 발생이 각 개별 동물에서 검출된 시간.
도 10은 AAV5 및 AAV8 캡시드를 갖는 AAV 벡터에 의해 전달된 FVIII의 보고된 수준 대비 AAV-SPK-8011 (LK03 캡시드)-hFVIII로 달성된 FVIII 수준의 비교를 나타낸다. AAV5: http://www.biomarin.com/pdf/BioMarin_R&D_Day_4_20_2016.pdf, 슬라이드 16. AAV8: McIntosh J et al. Blood 2013; 121(17):3335-44.
도 11은 비인간 영장류의 주로 신장, 비장 및 간에서의 AAV-SPK (SEQ ID NO:28) 및 AAV-LK03 (SEQ ID NO: 27) 조직 생체분포를 보여준다(각 조직에 대해 3번째 막대).
도 12는 마우스에 AAV-SPK-8005의 전신 투여 후 간 및 비장 FVIII 발현을 나타낸다.
도 13은 시험관내에서 분석된 AAV-LK03 캡시드의 형질도입 효율을 나타낸다. X 축, 사이노몰거스 (왼쪽 수직 막대), 인간 (오른쪽 수직 막대).
도 14A-14B는 AAV 투여 후 토끼에서 hFIX의 혈장 농도를 나타낸다. 토끼는 (A) 1x1012 vg/kg (저용량, n = 4) 또는 (B) 1x1013 vg/kg (고농도, n = 3-5)의 투여량으로 hFIX 벡터 AAV-SPK 또는 AAV-LK03을 정맥내 주입으로 투여받았다. 군 간의 인간 FIX 수준은 2-테일드 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 비교하였다. 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 저용량 코호트에서 동물 5 및 15는 잘못된 주입으로 인해 분석에서 제외되었다. 동물 9 및 10은 또한 이들이 인간 FIX에 대한 중화 항체를 발생시켰기 때문에 그래프에서 제외시켰다.
도 15A-15B는 인간 FIX에 대한 항체 형성(항-FIX)의 시간 경과를 나타낸다. 토끼는 (A) 1x1012 vg/kg (저용량, n = 4) 또는 (B) 1x1013 vg/kg (고농도, n = 3-5)의 투여량으로 hFIX 벡터 AAV-SPK 또는 AAV-LK03을 정맥내 주입으로 투여받았다. 데이터는 각 개별 동물에 대한 나타낸다.
FVIII를 인코딩하는 야생형 핵산과 구별되는, FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체가 본원에 기재된다. FVIII를 인코딩하는 이러한 CpG 감소된 핵산 변이체는 세포 및/또는 동물에서 증가된 수준으로 발현될 수 있으며, 이어서 생체내에서 증가된 FVIII 단백질 수준을 제공할 수 있다. 또한, 시험관내 및/또는 생체내에서 더 큰 생물학적 활성을 제공할 수 있는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체가 또한 기재된다. 예시적인 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체는 하기 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: 1) 세포 및/또는 동물에서 증가된 발현; 2) 증가된 활성; 및 3) 야생형 hFVIII보다 더 낮은 AAV 용량에서의 치료적 효과.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 본원에서 상호교환적으로 사용되어 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는, 모든 형태의 핵산, 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA, cDNA 및 안티센스 DNA, 및 스플라이싱되거나 스플라이싱되지 않은 mRNA, rRNA tRNA 및 억제 DNA 또는 RNA(RNAi, 예를 들어, 작거나 짧은 헤어핀(sh)RNA, 마이크로RNA(miRNA), 작거나 짧은 간섭(si)RNA, 트랜스-스플라이싱 RNA, 또는 안티센스 RNA)를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 천연 발생, 합성, 및 의도적으로 변형되거나 변경된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 변이 핵산)를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 단일, 이중 또는 삼중의 선형 또는 원형일 수 있고, 임의의 길이일 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 논의함에 있어서, 특정 폴리뉴클레오티드의 서열 또는 구조는 서열을 5'에서 3' 방향으로 제공하는 관례에 따라 본원에서 기술될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "변형시키다" 또는 "변이체" 및 이의 문법적 파생어는 핵산, 폴리펩티드 또는 이의 서브서열이 기준 서열에서 벗어남을 의미한다. 그러므로, 변형된 및 변이 서열은 실질적으로 기준 서열과 동일하거나, 기준 서열에 비해 더 크거나 적은 발현, 활성 또는 기능을 가질 수 있지만, 적어도 기준 서열의 부분 활성 또는 기능을 보유한다. 변형 또는 변이체의 특정 예는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체이다.
"핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 변이체는 야생형과 비교하여 유전자 변경된 변형된 서열을 지칭한다. 서열은 인코딩된 단백질 서열을 변경하지 않고 유전자 변형될 수 있다. 대안적으로, 서열은 변이 단백질을 인코딩하도록 유전자 변형될 수 있다. 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 변이체는 또한, 기준 서열 예컨대, 야생형 단백질 서열과 적어도 부분적 서열 동일성을 여전히 보유하는 단백질을 인코딩하도록 코돈 변형되고, 또한 변이 단백질을 인코딩하도록 코돈-변형된 조합 서열을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 이러한 핵산 변이체의 일부 코돈은 이에 의해 인코딩된 단백질(FVIII)의 아미노산을 변경시키지 않으면서 변화될 것이며, 핵산 변이체의 일부 코돈이 변화될 것이며 이에 의해 인코딩된 단백질(FVIII)의 아미노산을 결과적으로 변화시킬 것이다.
용어 "변이 인자 VIII(FVIII)"는 비변형된 야생형 FVIII(예를 들어, SEQ ID NO:19) 또는 FVIII-BDD와 비교하여 유전자 변경된 변형된 FVIII를 나타낸다. 이러한 변이체는 "인자 VIII(FVIII)를 인코딩하는 핵산 변이체"로서 지칭될 수 있다. 변이체의 특정 예는 FVIII 또는 FVIII-BDD 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산이다. 용어 "변이체"는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산에 대해 이루어진 참조의 각 경우에 나타날 필요는 없다. 마찬가지로, 용어 "CpG 감소된 핵산" 또는 기타 등등은 용어 "변이체"를 생략할 수 있지만, "CpG 감소된 핵산"에 대한 언급은 유전자 수준에서의 변이체를 포함하는 것으로 의도된다.
감소된 CpG 함량을 갖는 FVIII 작제물은 CpG 함량이 감소되지 않은 야생형 FVIII 또는 FVIII-BDD와 비교하여 개선을 나타낼 수 있으나, 인코딩된 FVIII 또는 FVIII-BDD 단백질에 대한 아미노산 변화를 유도하는 핵산에 대한 변형 없이 그렇게 될 수 있다. 발현을 비교할 때, CpG 감소된 핵산이 B-도메인을 보유하는 FVIII 단백질을 인코딩하는 경우, 이를 야생형 FVIII 발현과 비교하는 것이 적절하며; CpG 감소된 핵산이 B-도메인이 없는 FVIII 단백질을 인코딩하는 경우, 또한 B-도메인이 결실된 야생형 FVIII의 발현과 비교된다.
또한, "변이 인자 VIII(FVIII)"는 변형된 단백질이 야생형 FVIII와 비교하여 아미노산 변경되도록 변형된 FVIII 단백질을 의미할 수 있다. 또한, 활성 및/또는 안전성을 비교할 때, 인코딩된 변이 FVIII 단백질이 B-도메인을 보유하는 경우, 이를 야생형 FVIII과 비교하는 것이 적합하며; 인코딩된 변이 FVIII 단백질이 B-도메인 결실된 경우, 이는 또한 B-도메인 결실된 야생형 FVIII과 비교된다.
변이 FVIII은 B-도메인의 일부를 포함할 수 있다. 따라서, FVIII-BDD는 B-도메인의 일부를 포함한다. 전형적으로, FVIII-BDD에서 B-도메인 대부분이 결실된다.
변이 FVIII는 SFSQNPPVLKRHQR(SEQ ID NO: 29)로 제시된 "SQ"서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, SQ를 갖는 그러한 변이 FVIII(FVIII/SQ)는 BDD를 가지며, 예를 들어, BD의 적어도 일부 또는 전부가 결실된다. FVIII-BDD와 같은 변이 FVIII는 "SQ"서열의 전부 또는 일부, 즉 SEQ ID NO: 29의 전부 또는 일부를 가질 수 있다. 따라서, 예를 들어, SQ 서열 (SFSQNPPVLKRHQR, SEQ ID NO: 29)을 갖는 변이 FVIII-BDD는 아미노산 서열 SFSQNPPVLKRHQR의 전부 또는 단지 일부를 가질 수 있다. 예를 들어, FVIII-BDD는 포함된 SFSQNPPVLKRHQR의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 따라서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 내부 결실뿐만 아니라 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 아미노- 또는 카르복시 말단이 결실된 SFSQNPPVLKRHQR은 본원에 제시된 변이 FVIII 단백질에 포함된다.
"핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 서열에 의해 인코딩된 "폴리펩티드," "단백질" 및 "펩티드"는 자연 발생 야생형 단백질로서의 전장 천연(FVIII) 서열은 물론 기능성 서브서열, 변형된 형태 또는 서열 변이체 (서브서열, 변형된 형태 또는 변이체가 천연 전장 단백질의 기능성을 어느 정도 보유하는 한)를 포함한다. 예를 들어, FVIII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산은 본원에 제시된 B-도메인이 결실될 수 있으며, 응고 기능을 보유할 수 있다. 본 발명의 방법 및 용도에서, 핵산 서열에 의해 인코딩된 이러한 폴리펩티드, 단백질 및 펩티드는 결함이 있거나, 처리된 포유동물에서 이의 발현이 불충분하거나 부족한 내인성 단백질과 동일할 수 있지만 반드시 동일할 필요는 없다.
변형의 비-제한적 예는 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 치환을 포함한다 (예를 들어, 1-3, 3-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40, 49-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-500, 500-750, 750-850 또는 그 초과의 뉴클레오티드 또는 잔기). 핵산 변형의 예는 CpG 감소이다. 특정 구체예에서, 인간 FVIII 단백질과 같은 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산은 인간 인자 FVIII를 인코딩하는 야생형 서열과 비교하여 10개 또는 그 미만의 CpG를 갖거나; 인간 인자 FVIII를 인코딩하는 야생형 서열과 비교하여 5개 또는 그 미만의 CpG를 갖거나; FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산에 5개 이하의 CpG를 갖는다.
아미노산 변형의 예로는 기준 서열 예를 들어, FVIII의 보존적 아미노산 치환 또는 결실(예를 들어, 서브서열 또는 단편) 예컨대, B-도메인 결실된 FVIII이 있다. 특정 구체예에서, 변형된 또는 변이 서열은 비변형된 서열의 기능 또는 활성의 적어도 일부를 보유한다.
본원에 기재된 FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 및 FVIII 단백질의 다른 포유동물 형태를 포함하는, 공지되거나 비공지되어 있는 단백질을 인코딩하는 핵산의 모든 포유동물 및 비-포유동물 형태가 명시적으로 포함된다. 따라서, 본 발명은 비-포유동물, 인간 이외의 포유동물, 및 인간으로부터의 유전자 및 단백질을 포함하며, 이러한 유전자 및 단백질은 본원에 기술된 FVIII(예를 들어, 인간) 유전자 및 단백질과 실질적으로 유사한 방식으로 기능한다.
용어 "벡터"는 핵산의 삽입 또는 혼입에 의해 조작될 수 있는 작은 담체 핵산 분자, 플라스미드, 바이러스(예를 들어, AAV 벡터), 또는 그 밖의 비히클을 나타낸다. 이러한 벡터는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입/전달하고, 세포에서 삽입된 폴리뉴클레오티드를 전사 또는 번역하기 위한 유전자 조작 (즉, "클로닝 벡터")에 사용될 수 있다. "발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현하는데 요구되는 필요한 조절 영역을 갖는 유전자 또는 핵산 서열을 함유하는 특정화된 벡터이다. 벡터 핵산 서열은 일반적으로 적어도 세포에서의 증식을 위한 복제 기점, 및 임의로 추가의 요소, 예컨대, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열, 발현 조절 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서), 인트론, ITR(들), 선택가능한 마커(예를 들어, 항생제 내성), 폴리아데닐화 신호를 함유한다.
바이러스 벡터는 바이러스 게놈을 포함하는 하나 이상의 핵산 요소로부터 유래되거나 이를 기반으로 한다. 특정 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 슈도형 렌티바이러스 및 파보-바이러스 벡터, 예컨대 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함한다. 또한, FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다.
재조합 바이러스 예를 들어, 렌티- 또는 파보-바이러스(예를 들어, AAV) 벡터와 같은 벡터의 수식어는 물론 재조합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드와 같은 서열의 수식어로서 용어 "재조합"은 조성물이 일반적으로 자연적으로 발생하지 않는 형태로 조작(즉, 공학처리)되었음을 의미한다. AAV 벡터와 같은 재조합 벡터의 특정 예는 야생형 바이러스(예를 들어, AAV) 게놈에 일반적으로 존재하지 않는 폴리뉴클레오티드가 바이러스 게놈 내에 삽입되는 경우일 것이다. 재조합 폴리뉴클레오티드의 예는, FVIII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산이 바이러스(예를 들어, AAV) 게놈 내에 정상적으로 유전자가 결합되어 있는 5', 3' 및/또는 인트론 영역이 있거나 없는 벡터에 클로닝되는 경우일 것이다. 용어 "재조합"이 벡터 예컨대, 바이러스 및 AAV 벡터, 뿐만 아니라 서열 예컨대, 폴리뉴클레오티드와 관련하여 본원에서 항상 사용되는 것은 아니지만, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 형태는 임의의 이러한 생략에도 불구하고 명시적으로 포함된다.
재조합 바이러스 "벡터" 또는 "AAV 벡터"는 예컨대, 바이러스(예를 들어, AAV)로부터 야생형 게놈을 제거하기 위한 분자 방법을 이용하고 FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산과 같은 비-천연 핵산으로 대체함으로써, 바이러스 예컨대, AAV의 야생형 게놈으로부터 유래된다. 전형적으로, AAV에 있어서, AAV 게놈의 역방위 말단 반복(ITR) 서열들 중 하나 또는 둘 모두가 AAV 벡터에 보유된다. "재조합" 바이러스 벡터(예를 들어, AAV)는, 바이러스 게놈 전부 또는 일부가 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산과 같은 바이러스(예를 들어, AAV) 게놈 핵산에 대해 비-천연 서열로 대체되었기 때문에, 바이러스(예를 들어, AAV) 게놈과는 구별된다. 따라서, 비-천연 서열의 혼입은 "재조합" 벡터로서 바이러스 벡터(예를 들어, AAV)를 규정하며, AAV의 경우에 "rAAV 벡터"로서 언급될 수 있다.
재조합 벡터(예를 들어, 렌티-, 파보-, AAV) 서열은 패키징될 수 있으며, 이는 본원에서 세포, 생체외, 시험관내 또는 생체내에서의 후속 감염(형질도입)을 위한 "입자"로서 지칭된다. 재조합 벡터 서열이 AAV 입자내로 캡시드화(encapsidate)되거나 패키징되는 경우에, 입자는 또한, "rAAV"로서 지칭될 수 있다. 이러한 입자는 벡터 게놈을 캡시드화하거나 패키징하는 단백질을 포함한다. 특정 예는 바이러스 외피 단백질, 및 AAV의 경우에, 캡시드 단백질을 포함한다.
벡터 "게놈"은 바이러스(예를 들어, AAV) 입자를 형성시키기 위해 최종적으로 패키징되거나 캡시드화된 재조합 플라스미드 서열의 일부를 지칭한다. 재조합 벡터를 작제하거나 제작하는데 재조합 플라스미드가 사용되는 경우, 벡터 게놈은 재조합 플라스미드의 벡터 게놈 서열에 상응하지 않는 "플라스미드"의 일부를 포함하지 않는다. 재조합 플라스미드의 이러한 비-벡터 게놈 부분은 "플라스미드 백본"으로서 지칭되는데, 이는 증식 및 재조합 바이러스 생산을 위해 필요한 과정인 플라스미드의 클로닝 및 증폭을 위해서는 중요하지만, 그 자체는 바이러스(예를 들어, AAV) 입자내로 패키징되거나 캡시드화되지 않는다. 따라서, 벡터 "게놈"은 바이러스(예를 들어, AAV)에 의해 패키징되거나 캡시드화되는 핵산을 지칭한다.
"전이유전자"는 본원에서 편리하게, 세포 또는 유기체에 도입되도록 의도되거나 도입된 핵산을 지칭하기 위해 사용된다. 전이유전자는 임의의 핵산, 예컨대, 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 유전자(예를 들어, 인자 FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산)를 포함한다.
전이유전자를 갖는 세포에서, 전이유전자는 벡터 예컨대, AAV에 의해, 세포의 "형질도입" 또는 "형질감염"에 의해 도입/전이되었다. 용어 "형질도입하다" 및 "형질감염하다"는 세포 또는 숙주 유기체에 핵산과 같은 분자의 도입을 지칭한다. 전이유전자는 수용체 세포의 게놈 핵산 내로 통합될 수 있거나 통합되지 않을 수 있다. 도입된 핵산이 수용체 세포 또는 유기체의 핵산(게놈 DNA)에 통합되는 경우에, 이는 그러한 세포 또는 유기체에서 안정적으로 유지될 수 있고, 추가로 수용체 세포 또는 유기체의 자손 세포 또는 유기체 쪽으로 진행되거나 이에 의해 유전될 수 있다. 마지막으로, 도입된 핵산은 수용체 세포 또는 숙주 유기체에 염색체외적으로 또는 단지 일시적으로 존재할 수 있다.
"형질도입된 세포"는 전이유전자가 도입된 세포이다. 따라서, "형질도입된" 세포(예를 들어, 포유동물에서, 예컨대, 세포 또는 조직 또는 장기 세포)는 세포에 외인성 분자, 예를 들어, 핵산(예를 들어, 전이유전자)의 도입 후 세포에서의 유전자 변화를 의미한다. 이에 따라, "형질도입된" 세포는 외인성 핵산이 도입된 세포, 또는 이의 자손이다. 세포(들)는 증식될 수 있고, 도입된 단백질이 발현될 수 있거나, 핵산이 전사될 수 있다. 유전자 요법 사용 및 방법에 있어서, 형질도입된 세포는 대상체에 존재할 수 있다.
"발현 조절 요소"는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현에 영향을 주는 핵산 서열(들)을 지칭한다. 조절 요소는 프로모터 및 인핸서와 같은 본원에 제시된 발현 조절 요소를 포함한다. AAV 벡터를 포함하는 벡터 서열은 하나 이상의 "발현 조절 요소"를 포함할 수 있다. 전형적으로, 이러한 요소는 적절한 이종성 폴리뉴클레오티드 전사 및 적절한 경우에, 번역(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인트론을 위한 스플라이싱 신호, mRNA의 인-프레임 번역을 허용하는 유전자의 정확한 해독틀의 유지, 및 정지 코돈, 등)을 촉진시키기 위해 포함된다. 이러한 요소는 전형적으로, 시스로 작용하며, 이는 "시스 작용하는" 요소로서 언급되며, 그러나, 또한 트랜스로 작용할 수도 있다.
발현 조절은 전사, 번역, 스플라이싱, 메세지 안정성 등의 수준에서 이루어질 수 있다. 전형적으로, 전사를 조절하는 발현 조절 요소는 전사된 핵산의 5' 말단(즉, "업스트림") 부근에 나란히 놓인다. 발현 조절 요소는 또한, 전사된 서열의 3' 말단(즉, "다운스트림")에 또는 전사물 내에(예를 들어, 인트론에) 위치할 수 있다. 발현 조절 요소는 전사된 서열에 인접하거나 떨어져서 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드로부터 1-10, 10-25, 25-50, 50-100, 100-500개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드), 또는 심지어 상당한 거리에 위치할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 특정 벡터, 예를 들어, AAV 벡터의 길이 제한으로 인하여, 발현 조절 요소는 전형적으로, 전사된 핵산으로부터 1 내지 1000개의 뉴클레오티드 내에 존재할 것이다.
기능적으로, 작동적으로 연결된 핵산의 발현은, 요소가 핵산의 전사, 및 적절한 경우에, 전사물의 번역을 조절하도록, 요소(예를 들어, 프로모터)에 의해 적어도 부분적으로 조절가능하다. 발현 조절 요소의 특정 예는 일반적으로 전사된 서열 예를 들어, FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산의 5'에 위치한 프로모터이다. 프로모터는 전형적으로, 프로모터가 존재하지 않을 때 발현되는 양과 비교하여 작동가능하게 연결된 핵산으로부터 발현되는 양을 증가시킨다.
본원에 사용되는 "인핸서"는 이종성 폴리뉴클레오티드에 인접하여 위치하는 서열을 지칭할 수 있다. 인핸서 요소는 전형적으로 프로모터 요소의 업스트림에 위치하고 또한 기능하며, 서열(예를 들어, FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산)의 내부에 또는 이의 다운스트림에 위치할 수 있다. 따라서, 인핸서 요소는 FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산의 100개 염기쌍, 200개 염기쌍, 또는 300개 이상의 염기쌍 업스트림 또는 다운스트림에 위치할 수 있다. 인핸서 요소는 전형적으로 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 프로모터 요소에 의해 제공된 발현보다 높게 증가시킨다.
발현 작제물은 특정 세포 또는 조직 유형에서 발현을 유도하도록 작용하는 조절 요소를 포함할 수 있다. 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터)는 특정 조직 또는 세포 유형에서 활성인 것을 포함하는데, 이는 본원에서 "조직-특이적 발현 조절 요소/프로모터"로서 언급된다. 조직-특이적 발현 조절 요소는 전형적으로, 특이적 세포 또는 조직(예를 들어, 간)에서 활성이다. 발현 조절 요소는 전형적으로, 특정 세포, 조직 또는 기관에서 활성인데, 이들이 특이적 세포, 조직 또는 기관 유형에 대해 유일한 전사 활성인자 단백질, 또는 전사의 다른 조절인자에 의해 인식되기 때문이다. 이러한 조절 요소는 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (1989) and Ausubel et al. (1992)] 참조).
본 발명의 발현 작제물에서 조직 특이적 조절 요소의 혼입은 FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산의 발현에 대한 적어도 부분적인 조직 향성을 제공한다. 간에서 활성인 프로모터의 예로는 특히 TTR 프로모터, 인간 알파 1-항트립신(hAAT) 프로모터; 알부민 (Miyatake, et al. J. Virol., 71:5124-32 (1997)); B형 간염 바이러스 코어 프로머터(Sandig, et al., Gene Ther. 3:1002-9 (1996)); 알파-태아단백질(AFP)(Arbuthnot, et al., Hum. Gene. Ther., 7:1503-14 (1996))이 있다. 간에서 활성인 인핸서의 예는 아포지질단백질 E(apoE) HCR-1 및 HCR-2이다[Allan et al., J. Biol. Chem., 272:29113-19 (1997)].
발현 조절 요소는 또한, 많은 상이한 세포 유형에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도할 수 있는 아주 흔하거나 불규칙한 프로모터/인핸서를 포함한다. 이러한 요소는 사이토메갈로바이러스(CMV) 급초기 프로모터/인핸서 서열, 로우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터/인핸서 서열 및 다양한 포유동물 세포 유형에서 활성인 다른 바이러스 프로모터/인핸서, 또는 자연에 존재하지 않는 합성 요소[예를 들어, 문헌 [Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)] 참조], SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, 세포질 β액틴 프로모터 및 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
발현 조절 요소는 또한, 조절가능한 방식으로 발현을 제공할 수 있으며, 즉, 신호 또는 자극은 작동적으로 연결된 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키거나 감소시킨다. 신호 또는 자극에 반응하여 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 조절가능한 요소는 또한, "유도성 요소"(즉, 신호에 의해 유도됨)로서 지칭된다. 특정 예는, 호르몬(예를 들어, 스테로이드) 유도성 프로모터를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 전형적으로, 이러한 요소에 의해 부여되는 증가 또는 감소의 양은 존재하는 신호 또는 자극의 양에 비례하며; 신호 또는 자극의 양이 클수록, 발현이 더욱 크게 감소하거나 증가한다. 특정한 비제한적인 예는 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터; 스테로이드 호르몬-유도성 마우스 포유동물 종양 바이러스(MMTV) 프로모터; T7 폴리머라제 프로모터 시스템(WO 98/10088); 테트라사이클린-억제계[Gossen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)]; 테트라사이클린-유도성 시스템[Gossen, et al., Science. 268:1766-1769 (1995); 또한, Harvey, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512-518 (1998)]; RU486-유도성 시스템[Wang, et al., Nat. Biotech. 15:239-243 (1997) 및 Wang, et al., Gene Ther. 4:432-441 (1997)]; 및 라파마이신-유도성 시스템[Magari, et al., J. Clin. Invest. 100:2865-2872 (1997); Rivera, et al., Nat. Medicine. 2:1028-1032 (1996)]을 포함한다. 본 상황에서 유용할 수 있는 다른 조절가능한 조절 요소는 특정 생리학적 상태, 예를 들어, 온도, 급성기(acute phase), 발달에 의해 조절되는 것이다.
발현 조절 요소는 또한, 이종성 폴리뉴클레오티드를 위한 천연 요소(들)를 포함한다. 천연 조절 요소(예를 들어, 프로모터)는, 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현이 천연 발현을 모방하는 것이 요망될 때 사용될 수 있다. 천연 요소는, 이종성 폴리뉴클레오티드의 발현이 일시적으로 또는 점진적으로, 또는 조직-특이적 방식으로, 또는 특이적 전사 자극에 반응하여 조절하고자 할 때 사용될 수 있다. 다른 천연 발현 조절 요소, 예를 들어, 인트론, 폴리아데닐화 부위 또는 Kozak 공통 서열이 또한 사용될 수 있다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 코딩 서열의 발현에 필요한 조절 서열이 코딩 서열에 대한 적절한 위치에 배치되어 코딩 서열의 발현을 수행함을 의미한다. 이러한 동일한 정의는 때때로 발현 벡터에서 코딩 서열 및 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서 및 종결 요소)의 정렬에 적용된다. 이 정의는 때로는 또한 하이브리드 핵산 분자가 생성되는 제1 및 제2 핵산 분자의 핵산 서열의 정렬에도 적용된다.
핵산과 작동가능하게 연결된 발현 조절 요소의 예에서, 조절 요소가 핵산의 발현을 조절하게 하는 상관관계가 있다. 더욱 특히, 예를 들어, 작동적으로 연결된 2개의 DNA 서열은, DNA 서열 중 적어도 하나가 나머지 다른 서열에 대한 생리학적 효과를 발휘할 수 있는 관계로 2개의 DNA가 정렬(시스 또는 트랜스)됨을 의미한다.
따라서, 벡터에 대한 부가적인 요소는 비제한적으로, 발현 조절(예를 들어, 프로모터/인핸서) 요소, 전사 종결 신호 또는 정지 코돈, AAV ITR 서열 중 하나 이상의 복사체와 같은 서열에 측면 인접한 5' 또는 3' 비번역 영역(예를 들어, 폴리아데닐화 (폴리A) 서열), 또는 인트론을 포함한다.
추가의 요소는 예를 들어, 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하여 예를 들어, 패키징을 개선하거나 오염 핵산의 존재를 감소시킨다. 전형적으로, AAV 벡터는 일반적으로 약 4kb 내지 약 5.2kb, 또는 약간 더 큰 크기 범위를 갖는 DNA의 삽입물을 수용한다. 따라서, 보다 짧은 서열에 있어서, 스터퍼 또는 필러의 포함은 바이러스 입자 내로의 AAV 벡터 패키징을 위해 허용되는 바이러스 게놈 서열의 정상적인 크기 또는 이에 가까운 크기로 길이를 조정하기 위한 것이다. 다양한 구체예에서, 필러/스터퍼 핵산 서열은 핵산의 비번역된(비-단백질 인코딩) 세그먼트이다. 4.7 Kb 미만인 핵산 서열에 있어서, 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 서열과 합쳐질 때(예를 들어, 벡터 내에 삽입될 때) 전체 길이가 약 3.0-5.5Kb, 또는 약 4.0-5.0Kb, 또는 약 4.3-4.8Kb가 되는 길이를 갖는다.
인트론이 또한, 바이러스 입자내로의 AAV 벡터 패키징을 위한 길이를 달성하기 위해 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열로서 기능할 수 있다. 필러 또는 스터퍼 폴리 뉴클레오티드 서열로서 기능하는 인트론 및 인트론 단편도 또한 발현을 증진시킬 수 있다.
문구 "조혈 관련 장애"는 출혈 장애 예컨대, 혈우병 A, 억제 항체를 갖는 혈우병 A 환자, 응고 인자, VII, VIII, IX 및 X, XI, V, XII, II, 폰 빌레브란트 인자 결피증, 합친 FV/FVIII 결핍증, 비타민 K 에폭시드 리덕타제 C1 결핍증, 감마-카르복실라제 결핍증; 외상, 상해, 혈전증, 혈소판 감소증, 뇌졸중, 응고병증, 파종혈관내 응고(DIC); 헤파린, 저분자량 헤파린, 펜타사카라이드, 와파린, 소분자 항혈전제(즉, FXa 억제제)와 관련된 과다-항응고; 및 혈소판 장애 예컨대, 베르나르 술리에 증후군, 글리만츠 혈소판기능저하증, 및 저장조병을 나타낸다.
용어 "단리된"은 조성물의 수식어로서 사용될 때, 조성물이 수동으로 제조되거나, 자연적으로 발생하는 생체내 환경으로부터 완전히 또는 적어도 부분적으로 분리되는 것을 의미한다. 일반적으로, 단리된 조성물에는 대개 실제로 관련되는 하나 이상의 물질, 예를 들어, 하나 이상의 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물, 세포막이 실질적으로 존재하지 않는다.
본 발명의 핵산과 관련하여, 용어 "단리된"은 게놈의 기원이 되는 유기체의 자연 발생 게놈(게놈 DNA)에 바로 인접한(5' 및 3' 방향) 하나 이상의 서열로부터 분리되는 핵산 분자를 지칭한다. 예를 들어, "단리된 핵산"은 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터 내에 삽입되거나 원핵 생물 또는 진핵 생물의 DNA에 통합된 DNA 또는 cDNA 분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 RNA 분자와 관련하여, 용어 "단리된"은 주로 상기 정의된 바와 같은 단리된 DNA 분자에 의해 인코딩되는 RNA 분자를 지칭한다. 대안적으로, 이 용어는 "실질적으로 순수한" 형태로 존재할 수 있도록 자연 상태 (즉, 세포 또는 조직)와 연관되어 있는 RNA 분자로부터 충분히 분리된 RNA 분자를 지칭할 수 있다 (용어 "실질적으로 순수한"은 하기에 정의됨).
단백질과 관련하여, 때로는 용어 "딘리된 단백질" 또는 "단리되고 정제된 단백질"이 본원에 사용된다. 이 용어는 주로 단리된 핵산 분자의 발현에 의해 생성된 단백질을 지칭한다. 대안적으로, 이 용어는 "실질적으로 순수한" 형태로 존재하도록 자연적으로 연관되어 있는 다른 단백질로부터 충분히 분리된 단백질을 지칭할 수 있다.
용어 "단리된"은 인간에 의해 생산된 조합물 예를 들어, 재조합 벡터(예를 들어, rAAV) 서열, 또는 벡터 게놈을 패키징하거나 캡시드화시키는 바이러스 입자 및 약학적 제형을 배제하지 않는다. 용어 "단리된"은 또한, 하이브리드/키메라, 멀티머/올리고머, 변형(예를 들어, 인산화, 글리코실화, 지질화) 또는 유도체화 형태, 또는 인간에 의해 생산된 숙주 세포에서 발현되는 형태와 같은 조성물의 대체 물리적 형태를 배제하지 않는다.
용어 "실질적으로 순수한"은 관심 화합물(예를 들어, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 단백질 등)을 적어도 50-60 중량% 포함하는 제조물을 지칭한다. 제조물은 적어도 75 중량%, 또는 약 90-99 중량%의 관심 화합물을 포함할 수 있다. 순도는 관심 화합물에 적합한 방법(예를 들어, 크로마토그래피 방법, 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, HPLC 분석 및 기타 등등)에 의해 측정된다.
특정 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열에 있어서 문구 "본질적으로 구성되는"은 해당 SEQ ID NO의 특성을 갖는 서열을 의미한다. 예를 들어, 아미노산 서열과 관련하여 사용되는 경우, 그 문구는 서열 자체 및 서열의 기본 및 신규한 특성에 영향을 미치지 않는 분자 변형을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 프라이머 및 프로브를 지칭하며, 2개 이상, 예컨대, 3개 초과의 리보- 또는 데옥시리보뉴클레오티드로 구성된 핵산 분자로서 정의된다. 올리고뉴클레오티드의 정확한 크기는 다양한 인자 및 올리고뉴클레오티드가 사용되는 특정 적용분야에 의존될 것이다.
본원에 사용된 용어 "프로브"는 정제된 제한 효소 분해에서와 같이 자연 발생적이거나 합성으로 생성되던지 프로브에 상보적인 서열을 갖는 핵산에 특이적으로 하이브리다이징되거나 이와 어닐링될 수 있는 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 즉, RNA 또는 DNA를 지칭한다. 프로브는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 프로브의 정확한 길이는 온도, 프로브 공급원 및 사용 방법을 포함하는 많은 요소에 의존적일 것이다. 예를 들어, 진단 적용의 경우, 표적 서열의 복잡성에 따라, 올리고뉴클레오티드 프로브는 전형적으로 15-25개 또는 그 초과의 뉴클레오티드를 함유하며, 그러나, 더 적은 뉴클레오티드를 함유할 수도 있다.
본원의 프로브는 특정 표적 핵산 서열의 상이한 가닥에 "실질적으로" 상보적인 것으로 선택된다. 이는 프로브가 일련의 사전-결정된 조건하에서 이들의 각 표적 가닥과 "특이적으로 하이브리드화" 또는 어닐링할 수 있도록 충분히 상보적이어야 함을 의미한다. 따라서, 프로브 서열은 표적의 정확한 상보적 서열을 반영할 필요는 없다. 예를 들어, 비-상보적인 뉴클레오티드 단편이 프로브의 5' 또는 3' 말단에 부착될 수 있으며, 프로브 서열의 나머지는 표적 가닥에 상보적이다. 대안적으로, 비-상보적 염기 또는 더 긴 서열이 프로브내에 삽입될 수 있으며, 단 프로브 서열은 표적 핵산 서열과 충분한 상보성을 지녀 이들과 특이적으로 어닐링된다.
용어 "특이적으로 하이브리드화"는 당해 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 사전-결정된 조건하에서 이러한 하이브리드화를 허용하기에 충분히 상보적인 서열의 2개의 단일-가닥 핵산 분자 간의 결합을 나타낸다(때때로 "실질적으로 상보적"으로 불림). 특히, 이 용어는 본 발명의 단일-가닥 DNA 또는 RNA 분자 내에 함유된 실질적으로 상보적인 서열과의 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화를 나타내며, 비-상보적 서열의 단일-가닥 핵산을 갖는 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화는 실질적으로 배제한다.
본원에 사용된 용어 "프라이머"는 제한 효소 분해에 의해 생성되거나 합성적으로 생성된, 생물학적 시스템으로부터 유래된 단일-가닥 또는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드, RNA 또는 DNA를 지칭하며, 이는 적절한 환경에 놓이게 되는 경우, 주형-의존적 핵산 합성의 개시제로서 기능적으로 작용할 수 있는 있다. 적당한 핵산 주형, 핵산의 적합한 뉴클레오시드 트리포스페이트 전구체, 폴리머라제 효소, 적합한 보조인자 및 조건 예컨대, 적합한 온도 및 pH가 제공되는 경우, 프라이머는 폴리머라제 또는 유사한 활성의 작용에 의한 뉴클레오티드의 부가에 의해 이의 3' 말단에서 연장되어 프라이머 연장 생성물을 생성할 수 있다.
프라이머는 특정 조건 및 적용 요건에 따라 길이가 다양할 수 있다. 예를 들어, 진단 적용에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 전형적으로, 15-25개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이이다. 프라이머는 요망되는 주형에 충분히 상보적이어서 요망되는 연장 생성물의 합성을 프라이밍해야 하며 즉, 폴리머라제 또는 유사한 효소에 의한 합성 개시에 사용하기 위해 프라이머의 3' 하이드록실 모이어티를 적절한 병치로 제공하기에 충분한 방식으로 요망되는 주형 가닥과 어닐링할 수 있어야 한다. 프라이머 서열이 요망되는 주형의 정확한 상보성을 제공할 필요는 없다. 예를 들어, 비-상보적 뉴클레오티드 서열은 다른 상보적 프라이머의 5' 말단에 부착될 수 있다. 대안적으로, 비-상보적 염기는 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 내부에 산재될 수 있으며, 단 프라이머 서열은 요망되는 주형 가닥의 서열과의 충분한 상보성을 가져서 연장 생성물의 합성을 위한 주형-프라이머 복합체를 기능적으로 제공한다.
용어 "동일성," "상동성" 및 이들의 문법적 파생어는, 2개 또는 그 초과의 언급된 실체가 "정렬된" 서열일 때, 이들이 동일함을 의미한다. 따라서, 예로서, 2개의 폴리펩티드 서열이 동일한 경우, 이들은 적어도 언급된 영역 또는 부분 내에서 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 2개의 폴리뉴클레오티드 서열이 동일한 경우, 이들은 적어도 언급된 영역 또는 부분 내에서 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다. 동일성은 서열의 규정된 구역(영역 또는 도메인)에 걸쳐 존재할 수 있다. 동일성의 "부위" 또는 "영역"은 동일한 2개 또는 그 초과의 언급된 실체의 일부를 지칭한다. 이에 따라, 2개의 단백질 또는 핵산 서열이 하나 이상의 서열 부위 또는 영역에 걸쳐 동일한 경우에, 이들은 그러한 영역 내에서 동일성을 공유한다. "정렬된" 서열은 기준 서열과 비교하여 종종 결손 또는 추가적인 염기 또는 아미노산(갭)에 대한 교정된 다수의 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 (아미노산) 서열을 지칭한다.
동일성은 서열의 전체 길이 또는 일부에 걸쳐 연장될 수 있다. 특정 구체예에서, 동일성 퍼센트를 공유하는 서열의 길이는 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 연속 핵산 또는 아미노산, 예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 등의 연속 핵산 또는 아미노산이다. 추가적인 구체예에서, 동일성을 공유하는 서열의 길이는 21개 또는 그 초과의 연속 핵산 또는 아미노산, 예를 들어, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40개, 등의 연속 핵산 또는 아미노산이다. 추가의 구체예에서, 동일성을 공유하는 서열의 길이는 41개 또는 그 초과의 연속 핵산 또는 아미노산, 예를 들어, 42, 43, 44, 45, 45, 47, 48, 49, 50개 등의 연속 핵산 또는 아미노산이다. 또한 추가의 구체예에서, 동일성을 공유하는 서열의 길이는 50개 또는 그 초과의 연속 핵산 또는 아미노산, 예를 들어, 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75, 75-80, 80-85, 85-90, 90-95, 95-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-500, 500-1,000개 등의 연속 핵산 또는 아미노산이다.
본원에 제시된 바와 같이, FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체는 야생형과 구별될 것이나, B-도메인을 갖거나 갖지 않는 야생형 FVIII 단백질과 서열 동일성을 나타낼 수 있다. FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체에서, 뉴클레오티드 서열 수준에서, FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산은 야생형 FVIII 인코딩 핵산에 대해 전형적으로, 적어도 약 70% 동일성, 더욱 전형적으로, 약 75% 동일성, 심지어 더욱 전형적으로 약 80%-85% 동일성을 가질 것이다. 따라서, FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산은 본원에 제시된 바와 같은 야생형 FVIII 인코딩 유전자에 대해, 또는 서로에 대해 즉, X01 대 X02, X03 대 X04 등에 대해 75%-85% 동일성을 가질 수 있다.
아미노산 서열 수준에서, 변이체 예컨대, 변이 FVIII 단백질은 적어도 약 70% 동일성, 더욱 전형적으로, 약 75% 동일성, 또는 80% 동일성, 더욱 더 전형적으로, 약 85% 동일성, 또는 90% 또는 그 초과의 동일성을 가질 것이다. 다른 구체예에서, 변이체 예컨대, 변이 FVIII 단백질은 기준 서열 예를 들어, B-도메인을 갖거나 갖지 않는 야생형 FVIII 단백질에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성을 갖는다.
동일성을 결정하기 위해, FVIII(FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산)이 B-도메인을 보유하는 경우, 야생형 FVII와의 동일성을 비교하는 것이 적절하다. FVIII(FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산)이 B-도메인 결실된 경우, 또한 B-도메인이 결실된 야생형 FVII와의 동일성을 비교하는 것이 적절하다.
용어 "상동" 또는 "상동성"은 2개 또는 그 초과의 언급된 실체가 제공된 영역 또는 부분에 걸쳐 적어도 일부 동일성을 공유함을 의미한다. 상동성 또는 동일성의 "부위, 영역 또는 도메인"은 둘 또는 그 초과의 언급된 실체의 일부가 상동성을 공유하거나 동일함을 의미한다. 이에 따라, 2개의 서열이 하나 이상의 서열 영역에 걸쳐 동일한 경우에, 이러한 것들은 이러한 영역에서 동일성을 공유한다. "실질적인 상동성"은 기준 분자, 또는 상동성을 공유하는 기준 분자의 관련/상응하는 영역 또는 부분의 구조 또는 기능(예를 들어, 생물학적 기능 또는 활성) 중 하나 이상의 적어도 일부 구조 또는 기능을 갖거나 갖는 것으로 예측되도록, 분자가 구조적으로 또는 기능적으로 보존됨을 의미한다.
두 서열 간의 동일성(상동성) 또는 "동일성 퍼센트"의 정도는 컴퓨터 프로그램 및/또는 수학적 알고리즘을 사용하여 확인될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 핵산 서열의 비교는 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)으로부터 이용가능한 GCG 위스콘신 패키지 버전 9.1을 사용하여 수행된다. 편의상, 그런 프로그램에 의해 지정된 디폴트 매개변수 (갭 생성 패널티 = 12, 갭 연장 패널티 = 4)는 서열 동일성을 비교하기 위해 본원에 사용하기 위한 것이다. 대안적으로, 디폴트 매개변수를 갖는 갭핑된 정렬을 사용하는 네셔널 센터 퍼 바이오테크놀러지 인포메이션(National Center for Biotechnology Information)(ncbi.nlm.nih.gov/blast/의 월드 와이드 웹에서 발견됨; Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215:403-410)에서 제공하는 Blastn 2.0 프로그램은 핵산 서열과 아미노산 서열 간의 동일성과 유사성 수준을 측정하는데 사용될 수 있다. 폴리펩티드 서열 비교에 있어서, BLASTP 알고리즘은 전형적으로 PAM100, PAM 250, BLOSUM 62 또는 BLOSUM 50과 같은 스코어 매트릭스와 함께 이용된다. FASTA (예를 들어, FASTA2 및 FASTA3) 및 SSEARCH 서열 비교 프로그램이 또한 동일성의 정도를 정량화하는데 이용된다 (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132:185 (2000); and Smith et al., J. Mol. Biol. 147:195 (1981)). Delaunay 기반 토폴로지 매핑을 사용하여 단백질 구조 유사성을 정량화하는 프로그램도 개발되었다 (Bostick et al., Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (2003)).
본 발명의 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 핵산 분자, 발현 벡터(예를 들어, 벡터 게놈), 플라스미드는 재조합 DNA 기술 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 뉴클레오티드 서열 정보의 이용 가능성은 다양한 수단에 의해 본 발명의 단리된 핵산 분자의 제조를 가능하게 한다. 예를 들어, FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체는 다양한 표준 클로닝, 재조합 DNA 기술을 이용하여, 세포 발현 또는 시험관내 번역을 통해 그리고 화학 합성 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 순도는 시퀀싱, 겔 전기영동 및 기타 등등을 통해 측정될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 하이브리디제이션 또는 컴퓨터-기반 데이터베이스 스크리닝 기술을 이용하여 단리될 수 있다. 그러한 기술은 비제한적으로 하기를 포함한다: (1) 상동 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 프로브와 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리의 하이브리디제이션; (2) 예를 들어, 발현 라이브러리를 사용하여 공유 구조적 특징을 갖는 폴리펩티드를 검출하는 항체 스크리닝; (3) 관심 핵산 서열에 어닐링될 수 있는 프라이머를 사용하는 게놈 DNA 또는 cDNA상의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR); (4) 관련 서열에 대한 서열 데이터베이스의 컴퓨터 검색; 및 (5) 감산된 핵산 라이브러리의 차별적 스크리닝.
본 발명의 핵산은 임의의 편리한 클로닝 벡터에서 DNA로서 유지될 수 있다. 한 구체예에서, 클론은 적합한 E. 콜라이 숙주 세포에서 증식되는, 플라스미드 클로닝/발현 벡터, 예컨대 pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA)에서 유지된다. 대안적으로, 핵산은 포유동물 세포에서 발현에 적합한 벡터에 유지될 수 있다. 번역 후 변형이 응고 기능에 영향을 미치는 경우, 핵산 분자는 포유류 세포에서 발현될 수 있다.
본 발명의 FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체는 단일- 또는 이중-가닥일 수 있는 cDNA, 게놈 DNA, RNA 및 이들의 단편을 포함한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산의 적어도 하나의 서열과 하이브리드화할 수 있는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(DNA 또는 RNA의 센스 또는 안티센스 가닥)를 제공한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 FVIII 발현을 검출하기 위한 프로브로서 유용하다.
임의로 아미노산 치환, 결실 또는 첨가되고, B-도메인이 결실된 본 발명의 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체는 공지된 방법에 따라 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 단백질은 공학처리된 FVIII를 발현하는 적당한 공급원 예를 들어, 형질전환된 박테리아 또는 동물 배양 세포 또는 조직으로부터 면역-친화성 정제에 의해 정제될 수 있다.
FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체의 이용가능성은 당업계에 공지된 시험관내 발현 방법을 이용하여 FVIII의 생성을 가능하게 한다. 예를 들어, cDNA 또는 유전자는 시험관내 전사를 위한 pSP64 또는 pSP65와 같은 적절한 시험관내 전사 벡터에 클로닝된 다음 밀 배아 또는 토끼 망상적혈구 용해물과 같은 적합한 세포-비함유 번역 시스템에서 세포-비함유 번역될 수 있다. 시험관내 전사 및 번역 시스템은 예를 들어, 프로메가 바이오테크(Promega Biotech, Madison, Wisconsin) 또는 BRL(Rockville, Maryland)에서 상업적으로 입수가능하다.
대안적으로, 더 많은 양의 FVIII는 적합한 원핵생물 또는 진핵생물 발현 시스템에서 발현에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 세포 예컨대, E. 콜라이 또는 포유동물 세포주 예컨대, 베이비 햄스터 신장(BHK), CHO 또는 Hela 세포에서 발현에 적합한 플라스미드 벡터 내로 FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체가 삽입될 수 있다. 대안적으로, FVIII를 포함하는 태깅된 융합 단백질이 생성될 수 있다. 이러한 FVIII-태깅된 융합 단백질은 박테리아 세포 예컨대, E. 콜라이 또는 진핵 세포 예컨대, 비제한적으로, 효모 및 포유동물 세포에서 발현에 적합한 플라스미드 벡터 내로 삽입되는 요망되는 폴리펩티드 태그의 일부 또는 전부를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 교정된 코돈 해독 틀에서 리게이팅되는 DNA 분자의 일부 또는 전부에 의해 인코딩된다.
본원에 기술된 것과 같은 벡터는 숙주 세포에서 인코딩된 단백질의 발현을 허용하는 방식으로 위치하는 숙주 세포에서 DNA의 발현에 필요한 조절 요소를 임의로 포함한다. 발현에 필요한 이러한 조절 요소는 본원에 기재되고 당업자에게 공지된 바와 같은 프로모터 서열, 인핸서 서열 및 전사 개시 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
재조합 원핵 또는 진핵 시스템에서 유전자 발현에 의해 생성된 CpG 감소된 핵산 변이체에 의해 인코딩된 FVIII는 당업계에 공지된 방법에 따라 정제될 수 있다. 구체예에서, 시중에서 입수가능한 발현/분비 시스템이 사용될 수 있으며, 이에 의해 재조합 단백질이 발현되며 그 후에, 숙주 세포로부터 분비되어 주위 배지로부터 용이하게 정제된다. 발현/분비 벡터가 사용되지 않는다면, 대안적인 접근법은 N-말단 또는 C-말단에서 6-8개 히스티딘 잔기로 태깅된 재조합 단백질의 단리를 위해 재조합 단백질 또는 니켈 칼럼에 특이적으로 결합하는 항체와의 면역학적 상호 작용과 같은 친화성 분리에 의해 재조합 단백질을 정제하는 것을 포함한다. 대안적 태그는 FLAG 에피토프, GST 또는 헤마글루티닌 에피토프를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 숙련된 전문가에 의해 일반적으로 이용된다.
상기 언급된 방법에 의해 제조된 FVIII 단백질은 표준 절차에 따라 분석될 수 있다. 예를 들어, 이러한 단백질은 공지된 방법에 따라 변경된 응고 특성에 대해 평가될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한, 폴리펩티드(기재된 바와 같은)를 제조하는 방법으로서, 폴리펩티드(일반적으로 핵산)를 인코딩하는 핵산으로부터의 발현을 포함하는 방법을 제공한다. 이는 폴리펩티드의 생성을 초래하거나 허용하는 적절한 조건하에 이러한 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양함으로써 편리하게 달성될 수 있다. 폴리펩티드는 또한, 시험관내 시스템에서 생성될 수 있다.
본 발명의 방법 및 용도는 분열 및/또는 비-분열 세포를 포함하는 숙주 세포 내로 핵산(전이유전자)을 전달(형질도입)하는 것을 포함한다. 본 발명의 핵산, 재조합 벡터(예를 들어, rAAV), 방법, 용도 및 약학적 제형은 치료 방법으로서 이를 필요로 하는 대상체에 단백질을 전달, 투여 또는 제공하는 방법에 추가적으로 유용하다. 이러한 방식으로, 핵산이 전사되고, 단백질이 대상체에서 생체내 생성될 수 있다. 대상체가 단백질 결핍증을 가지고 있기 때문에, 또는 대상체에서 단백질 생성이 치료 방법 또는 다른 방법으로서 일부 치료 효과를 부여할 수 있기 때문에, 대상체는 단백질의 도움을 받을 수 있거나 이를 필요로 할 수 있다.
렌티- 또는 파보-바이러스 벡터(예를 들어, AAV) 서열을 포함하는 벡터, 재조합 바이러스 입자, 방법 및 용도는 생물학적 효과를 갖는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 전달하는데 사용되어 FVIII 결핍증 또는 이상과 관련된 하나 이상의 증상을 치료하거나 개선시킬 수 있다. 재조합 렌티- 또는 파보-바이러스 벡터(예를 들어, AAV) 서열, 플라스미드, 재조합 바이러스 입자, 방법 및 용도는 FVIII 결핍증 또는 이상을 포함하거나 이로 인한 다양한 질환 상태에 대한 치료법을 제공하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 핵산, 벡터, 발현 벡터(예를 들어, rAAV), 및 재조합 바이러스 입자, 방법 및 용도는 유전자 질환 예를 들어, FVIII 결핍증의 치료를 허용한다. 결핍 상태 질환의 경우, 유전자 전달은 대체 요법을 위해 감염된 조직에 정상 유전자를 이동시킬 뿐만 아니라 안티센스 돌연변이를 이용하여 질병에 대한 동물 모델을 만드는데 이용될 수 있다. 불균형의 질병 상태에 있어서, 유전자 전달은 모델 시스템에서 질병 상태를 발생시키는데 이용될 수 있으며, 이는 이어서 질병 상태에 대항하기 위한 노력으로 이용될 수 있다. 결함을 교정하기 위해 핵산 서열의 부위-특이적 통합이 또한 이용 가능하다.
특정 구체예에서, FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체는 예를 들어, 유전자에서 전이유전자로서 또는 혈액 응고 캐스케이드를 조절하는 치료제 및/또는 예방제(단백질 또는 핵산)로서 사용될 수 있다. 예를 들어, FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체는 야생형 FVIII과 유사한 응고 활성을 가질 수 있거나, 야생형 FVII과 비교하여 변경된 응고 활성을 가질 수 있다. 세포 기반 전략은 혈우병 A 환자에서 FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체의 연속 발현을 허용한다. 본원에 기재된 바와 같이, FVIII 분자(핵산 및 단백질)의 특정 변형은 핵산 수준의 증가된 발현, 증가된 응고 활성을 유도하며 이에 의해 지혈을 효과적으로 개선시킨다.
FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체는 본 발명에 따른 다양한 목적에 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 혈액 응고를 조절하기 위한 핵산 전달 비히클(즉, 발현 벡터)이 제공되며, 이때 발현 벡터는 본원에 기술된 바와 같은 FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함한다. 환자로의 FVIII-인코딩 발현 벡터의 투여는 FVIII 단백질 발현을 유도시키며 이는 응고 캐스케이드를 변경시키는 역할을 한다. 본 발명에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 FVII 단백질을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체 또는 기능성 단편의 발현은 지혈을 증가시킨다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 조성물 및 방법은 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 바이러스 벡터의 투여를 위해 제공된다. 한 구체예에서, FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 발현 벡터는 바이러스 벡터이다.
FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 발현 벡터는 단독으로 또는 지혈 조절에 유용한 다른 분자와 조합되어 투여될 수 있다. 본 발명에 따르면, 벡터, 발현 벡터 또는 치료제의 조합물이 단독으로 또는 약학적으로 허용되거나 생물학적으로 적합한 조성물 중에서 환자에 투여될 수 있다.
AAV 혈청형 및 이의 변이체를 포함하는 렌티- 및 파보-바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터는 핵산을 생체외, 시험관내 및 생체내에서 세포에 전달하기 위한 수단을 제공하며, 이는 세포가 인코딩된 단백질을 발현하도록 단백질을 인코딩한다. AAV는 유전자 요법 벡터로서 유용한 바이러스인데, 이들은 세포를 침투하여 핵산/유전자 물질을 도입시켜 핵산/유전자 물질이 세포에서 안정적으로 유지될 수 있기 때문이다. 또한, 이들 바이러스는 핵산/유전자 물질을 예를 들어, 특정 부위 내로 도입시킬 수 있다. AAV는 인간에서 병원성 질환과 관련이 없기 때문에, AAV 벡터는 실질적인 AAV 발병기전 또는 질병을 초래하지 않으면서 인간 환자에 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 치료학적 단백질 및 제제)을 전달할 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 바이러스 벡터는 비제한적으로, 다중 혈청형의 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터(예를 들어, AAV-1 내지 AAV-12 및 기타 등등) 및 하이브리드/키메라 AAV 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 슈도형 렌티바이러스 벡터(예를 들어, 에볼라 바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 및 고양이과 면역결핍 바이러스(FIV)), 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터(조직 특이적 프로모터/인핸서 함유 또는 비함유), 백시니아 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터 및 기타 등등을 포함한다.
AAV 및 렌티바이러스 입자는 효과적인 유전자 절단을 위한 비히클로서 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 비리온은 분열 및 비-분열 세포에 대한 향성을 포함하는, 이러한 적용을 위한 많은 바람직한 특징을 갖는다. 이들 벡터로 인한 초기 임상 경험은 또한 지속되는 독성을 나타내지 않았고 면역 반응은 미미하거나 감지할 수 없었다. AAV는 수용체-매개된 엔도사이토시스 또는 트랜스사이토시스에 의해 생체 내 및 시험관 내에서 다양한 세포 유형을 감염시키는 것으로 알려져 있다. 망막 상피, 간, 골격근, 기도, 뇌, 관절 및 조혈 줄기 세포를 표적으로 하는 이들 벡터 시스템이 인간에서 평가되었다. 비-바이러스 벡터, 예를 들어, 플라스미드 DNA 또는 미니서클을 기반으로 하는 비-바이러스 벡터가 또한 FVIII를 인코딩하는 것으로서 큰 유전자에 대한 적합한 유전자 전달 벡터이다.
예를 들어, 요망되는 유전자의 다중 복사체를 제공하여 따라서, 더 많은 양의 그러한 유전자의 생성물을 제공할 수 있는 벡터를 도입시키는 것이 바람직할 수 있다. 이들 벡터를 생산하기 위한 개선된 AAV 및 렌티바이러스 벡터 및 방법은 필라델피아 아동 병원의 임상 등급 벡터의 생산에 사용되는 기법으로서 문헌 [Wright J.F. (Hum Gene Ther 20:698-706, 2009)]을 포함하는 많은 참고문헌, 특허 및 특허 출원에 상세하게 기술되어 있다. 렌티바이러스 벡터는 또한, CHOP에서 생산될 수 있으며, 기타 벡터는 NHLBI 유전자 요법 리소스 프로그램 (GTRP:NHLBI Gene Therapy Resource Program) - 렌티바이러스 벡터 생산 코어 라보라토리(Lentivirus Vector Production Core Laboratory)에 의한 렌티바이러스 벡터 생산 코어 라보라토리를 통해 입수가능하다.
따라서, 본 발명의 다양한 구체예에서, 벡터는 렌티- 또는 파보-바이러스 벡터 예컨대, 아데노-바이러스 벡터를 포함한다. 특정 구체예에서, 재조합 벡터는 파보바이러스 벡터이다. 파보바이러스는 단일-가닥 DNA 게놈을 갖는 작은 바이러스이다. "아데노-관련 바이러스"(AAV)는 파보바이러스 계열에 속한다.
따라서, 본 발명은 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다. 예를 들어, 재조합 AAV 벡터는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함할 수 있으며, 여기서 인코딩된 FVIII 단백질은 임의로 B-도메인이 결실된다. 따라서, 대상체(예를 들어, 포유동물)로의 벡터 전달 또는 투여는 포유동물(예를 들어, 인간)과 같은 대상체에게 FVIII를 제공한다.
벡터의 직접 전달 또는 인간 세포의 생체외 형질도입 후 신체 내로의 주입은 FVIII 발현을 일으켜 지혈에 유익한 치료적 효과를 나타낼 것이다. 본 발명에 있어서 본원에 기술된 인자 VIII 예컨대, 투여는 응혈촉진 활성을 향상시킨다.
AAV 벡터 및 렌티바이러스 벡터는 발병과 관련된 바이러스 유전자를 전형적으로 포함하지 않는다. 이러한 벡터는 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 하나 이상의 야생형 AAV 유전자 예를 들어, rep 및/또는 cap 유전자를 가지나, 필요에 따라 AAV 벡터 입자 내로의 재조합 벡터의 구출, 복제 및 패키징을 위한 적어도 하나의 기능성 측면인접 ITR 서열을 보유한다. 예를 들어, 단지 벡터의 필수 부분만 예를 들어, 각각 ITR 및 LTR 요소만 포함된다. 따라서, AAV 벡터 게놈은 복제 및 패키징을 위해 시스에서 요구되는 서열(예를 들어, 기능성 ITR 서열)을 포함할 것이다.
재조합 AAV 벡터는 물론 이의 방법 및 용도는 임의의 바이러스 균주 또는 혈청형을 포함한다. 비제한적 예로서, 재조합 AAV 벡터는 예를 들어, AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -rh74, -rh10 또는 AAV-2i8과 같은 임의의 AAV 게놈을 기반으로 할 수 있다. 이러한 벡터는 동일한 균주 또는 혈청형 (또는 하위군 또는 변이체)를 기반으로 할 수 있거나, 서로 상이할 수 있다. 비제한적 예로서, 하나의 혈청형 게놈을 기반으로 하는 재조합 AAV 벡터는 벡터를 패키징하는 캡시드 단백질 중 하나 이상과 동일할 수 있다. 또한, 재조합 AAV 벡터 게놈은 벡터를 패키징하는 AAV 캡시드 단백질 중 하나 이상과 구별되는 AAV(예를 들어, AAV2) 혈청형 게놈을 기반으로 할 수 있다. 예를 들어, AAV 벡터 게놈은 AAV2를 기반으로 할 수 있는 반면, 3개의 캡시드 단백질 중 적어도 하나는 예를 들어, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 또는 이의 변이체일 수 있다.
특정 구체예에서, 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터는 WO 2013/158879 (국제 출원 PCT/US2013/037170), WO 2015/013313 (국제 출원 PCT/US2014/047670) 및 미국 2013/0059732 (미국 특허 번호 9,169,299, LK01, LK02, LK03, 등을 기재함)에 제시된 바와 같이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 및 AAV-2i8은 물론 이의 변이체 (예를 들어, 캡시드 변이체, 예컨대, 아미노산 삽입, 첨가, 치환 및 결실)를 포함한다.
AAV 변이체는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 및 AAV-2i8 캡시드의 변이체 및 키메라를 포함한다. 따라서, FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 (캡시드화시키거나 패키징시키는) AAV 벡터 및 AAV 변이체(예를 들어, 캡시드 변이체)가 제공된다.
AAV 및 AAV 변이체(예를 들어, 캡시드 변이체) 혈청형(예를 들어, VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열)은 예를 들어, AAV1-AAV12, Rh74 또는 Rh10을 포함하는 다른 AAV 혈청형과 구별(예를 들어, 임의의 AAV1-AAV12, Rh74 또는 Rh10 혈청형의 VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열과 구별)될 수 있거나 없다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "혈청형"은 다른 AAV 혈청형과 혈청학적으로 구별되는 캡시드를 갖는 AAV를 지칭하는데 사용되는 구별법이다. 혈청학적 특이성은 다른 AAV와 비교하여 하나의 AAV에 대한 항체들 간의 교차 반응성의 결여에 기초하여 결정된다. 이러한 교차-반응성 차이는 일반적으로 캡시드 단백질 서열/항원 결정인자의 차이 (예를 들어, AAV 혈청형의 VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열 차이)로 인한 것이다. 캡시드 변이체를 포함하는 AAV 변이체가 기준 AAV 또는 다른 AAV 혈청형과 혈청학적으로 구별되지 않을 수 있음에도 불구하고, 이들은 기준 또는 다른 AAV 혈청형과 비교하여 적어도 하나의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기에 의해 구별된다.
전통적인 정의하에, 혈청형은, 관심 바이러스가 중화 활성을 위한 모든 존재하는 특성 규명된 혈청형에 대해 특이적인 혈청에 대하여 평가되며, 어떠한 항체도 관심 바이러스를 중화시키는 것으로 밝혀지지 않았음을 의미한다. 보다 자연적으로 발생하는 바이러스 분리균이 발견되고/거나 캡시드 돌연변이체가 발생하기 때문에, 현재 존재하는 임의의 혈청형과 혈청학적으로 차이가 있을 수 있거나 없다. 따라서, 새로운 바이러스(예를 들어, AAV)가 혈청학적 차이를 갖지 않는 경우, 이러한 새로운 바이러스(예를 들어, AAV)는 상응하는 혈청형의 하위군 또는 변이체일 것이다. 그러나, 많은 경우에, 중화 활성에 대한 혈청 검사는 이들이 혈청형의 전통적인 정의에 따라 다른 혈청형인지의 여부를 결정하기 위해 캡시드 서열 변형을 갖는 돌연변이 바이러스에서 수행되어야 한다. 따라서, 편의와 반복을 피하기 위해 용어 "혈청형"은 광범위하게는 혈청학적으로 구별되는 바이러스(예를 들어, AAV)는 물론 주어진 혈청형의 하위군 또는 변이체에 속할 수 있는 혈청학적으로 구별되지 않는 바이러스(예를 들어, AAV) 둘 모두를 지칭한다.
따라서, AAV 벡터는 특정 혈청형에 대한 유전자/단백질 서열 특징과 동일한 유전자/단백질 서열을 포함한다. 본원에서 사용되는 "AAV1과 관련된 AAV 벡터"는 AAV1을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 AAV 단백질(예를 들어, VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열)을 나타낸다. 유사하게, "AAV8과 관련된 AAV 벡터"는 AAV8을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 AAV 단백질(예를 들어, VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열)을 나타낸다. "AAV-Rh74와 관련된 AAV 벡터"는 AAV-Rh74를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 AAV 단백질(예를 들어, VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열)을 나타낸다. 따라서, 또 다른 혈청형, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8과 관련된 상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 및 AAV-2i8로부터의 하나 이상의 구별되는 서열을 가질 수 있으나, 하나 이상의 유전자 및/또는 단백질과 실질적인 서열 동일성을 나타낼 수 있고/있거나 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8의 하나 이상의 기능성 특징(예를 들어, 세포/조직 향성)을 가질 수 있다. 예시적인 비제한적인 AAV 변이체는 임의의 VP1, VP2 및/또는 VP3의 캡시드 변이체를 포함한다.
다양한 예시적인 구체예에서, 참조 혈청형과 관련된 AAV 벡터는 하나 이상의 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8(예를 들어, ITR, 또는 VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열)과 적어도 80% 또는 그 초과(예를 들어, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등)로 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 이들의 서브서열을 갖는다.
본 발명의 조성물, 방법 및 용도는 기준 AAV 혈청형 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, 또는 AAV-2i8과 100% 미만의 서열 동일성을 나타내나, 공지된 AAV 유전자 또는 단백질 예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8, 유전자 또는 단백질 등과 구별되고 동일하지 않은 AAV 서열(폴리펩티드 및 뉴클레오티드), 및 이의 서브서열을 포함한다. 한 구체예에서, AAV 폴리펩티드 또는 이의 서브서열은 임의의 참조 AAV 서열 또는 이의 서브서열, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8(예를 들어, VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 또는 ITR)과 적어도 75% 또는 그 초과로 동일한, 예를 들어, 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등, 100% 이하로 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 특정 구체예에서, AAV 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 5-10, 10-15, 15-20 또는 그 초과의 아미노산 치환을 갖는다.
AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 및 변이체, 관련 하이브리드 및 키메라 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터는 당업자에게 공지된 재조합 기술을 이용하여 하나 이상의 기능성 AAV ITR 서열이 측면인접된 하나 이상의 핵산 서열(전이유전자)을 포함하도록 작제될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 벡터 또는 발현 벡터는 예를 들어, 정맥내 주사를 통해 생물학적으로 양립가능한 담체에서의 주입을 통해 환자에 투여될 수 있다. 본 발명의 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 벡터 및 발현 벡터는 임의로 리포솜 내로 캡슐화될 수 있거나 기타 인지질 또는 미셀과 혼합되어 분자의 안정성을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 벡터 및 발현 벡터는 지혈을 조절하는 것으로 공지된 다른 제제(예를 들어, 인자 V, 인자 Va 또는 이들의 유도체)와 혼합되어 또는 단독으로 투여될 수 있다.
FVIII을 전달하기 위한 적절한 조성물은 비제한적으로, 환자의 상태 및 혈역학적 상태를 포함하는 다양한 생리학적 변수를 고려하여 의료 종사자에 의해 결정될 수 있다. 다양한 적용분야 및 투여 경로에 매우 적합한 다양한 조성물이 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있으며 하기 기술되어 있다.
본 발명의 FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산의 발현에 의해 생성된 정제된 FVIII 단백질, 벡터 및 발현 벡터를 함유하는 제조물은 생리학적으로 허용되는 기질을 함유하며, 약학적 제조물로서 제형화될 수 있다. 제조물은 실질적으로 공지된 종래 방법을 이용하여 제형화될 수 있으며, 이는 염 예컨대, NaCl, CaCl2, 및 아미노산 예컨대, 글리신 및/또는 리신을 함유하는 완충제와 6 내지 8의 pH 범위에서 혼합될 수 있다. 필요할 때까지, FVIII을 함유하는 정제된 제조물은 동결건조되거나 동결된 형태로 또는 완결된 용액의 형태로 저장될 수 있다.
제조물은 동결건조된 형태로 보관될 수 있으며 적절한 재구성 용액을 사용하여 시각적으로 투명한 용액으로 용해된다. 대안적으로, 본 발명에 따른 제조물은 또한 동결되는 액체 또는 액체 제조물로서 사용가능할 수 있다. 본 발명에 따른 제조물은 임의로 특히 안정적일 수 있으며, 즉, 투여 또는 전달 전에 연장된 시간 동안 용해된 형태로 유지될 수 있다.
본 발명에 따른 제조물은 1-구성요소 제조물의 형태로 또는 다중-구성요소 제조물의 형태로 다른 인자와 조합되어 FVIII 활성을 갖는 약학적 제조물로서 사용가능할 수 있다. 정제된 단백질을 약학적 제조물로 가공하기 전에, 정제된 단백질은 통상적인 품질 관리로 처리되고 치료학적 제시 형태로 제조된다. 특히, 재조합 제조 동안, 정제된 제조물은 EP 0 714 987에 기술된 바와 같이 발현 벡터로부터 유래된 핵산은 물론 세포 핵산의 부재하에 시험된다.
약학적 단백질 제조물은 수일 동안 1일 1회 주입 또는 3회 이하/일로 30-100 IU/kg (1 I.U는 100 ng/ml임)의 투여량으로 사용될 수 있다. 환자는 출혈로 병원에서 프리젠테이션 즉시 치료될 수 있다. 대안적으로, 환자에 FVIII를 매 8 내지 12시간마다 볼루스 주입할 수 있거나, 충분한 개선이 관찰되는 경우, 1일 1회 주입된다.
따라서, 본 발명의 핵산, 벡터, 재조합 벡터(예를 들어, rAAV), 및 재조합 바이러스 입자 및 기타 조성물, 제제, 약물, 생물제제(단백질)는 약학적 조성물 내로 혼입될 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 특히, 생체내 또는 생체외에서 대상체로의 투여 및 전달에 유용하다.
특정 구체예에서, 약학적 조성물은 또한, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유한다. 이러한 부형제는 자체가 조성물을 수용하는 개체에 해로운 면역 반응을 유도하지 않으며, 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 약제를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는" 및 "생리학적으로 허용되는"은 투여, 생체 내 전달 또는 접촉 중 하나 이상의 경로에 적합한 생물학적으로 허용되는 제형, 기체, 액체 또는 고체, 또는 이들의 혼합을 의미한다. "약학적으로 허용되는" 또는 "생리학적으로 허용되는" 조성물은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 물질이 아니며, 예를 들어, 상기 물질은 실질적인 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기시키지 않고 대상체에 투여될 수 있다. 따라서, 이러한 약학적 조성물은 예를 들어, 대상체로 핵산, 벡터, 바이러스 입자 또는 단백질을 투여하는데 사용될 수 있다.
약학적으로 허용되는 부형제는 비제한적으로 액체 예컨대, 물, 염수, 글리세롤, 당 및 에탄올을 포함한다. 여기에 약학적으로 허용되는 염, 예를 들어, 염산염, 브롬화 수소산염, 인산염, 황산염 등과 같은 무기산 염; 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등과 같은 유기산의 염이 또한 포함될 수 있다. 부가적으로, 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질이 이러한 비히클에 존재할 수 있다.
약학적 조성물은 염으로서 제공될 수 있고, 비제한적으로, 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 포함하는 많은 산과 함께 형성될 수 있다. 염은 상응하는 자유 염기 형태에서보다 수성 또는 다른 양성자 용매에 더욱 용해성을 띠는 경향이 있다. 다른 경우, 제조물은 4.5 내지 5.5의 pH 범위에서 1-50 mM 히스티딘, 0.1%-2% 수크로스, 및 2-7% 만니톨 중 임의의 것 또는 모두를 함유할 수 있는, 사용 전에 완충제와 조합되는 동결건조된 분말일 수 있다.
약학적 조성물은 약학적 투여 또는 생체 내 접촉 또는 전달과 양립되는 용매(수성 또는 비수성), 용액(수성 또는 비수성), 에멀젼(예를 들어, 수중유 또는 유중수), 현탁액, 시럽, 엘릭서, 분산액 및 현탁 매질, 코팅, 등장성 및 흡수 촉진 또는 지연 작용제를 포함한다. 수성 및 비수성 용매, 용액 및 현탁액은 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 정제(코팅되거나 코팅되지 않음), 캡슐(경질 또는 연질), 마이크로비드, 분말, 과립 및 결정을 포함한다. 보조 활성 화합물(예를 들어, 보존제, 항박테리아제, 항바이러스제 및 항진균제)이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
약학적 조성물은 본원에 기재되거나 당업자에게 공지된 투여 또는 전달의 특정 경로와 양립되도록 제형화될 수 있다. 따라서, 약학적 조성물은 다양한 경로에 의한 투여에 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함한다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 활성 화합물의 수성 및 비수성 용액, 현탁액 또는 에멀젼을 포함하며, 여기서 제조물은 전형적으로 멸균 제조물이며, 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 될 수 있다. 비제한적인 예시적인 예는 물, 완충된 염수, 행크 용액, 링거액, 덱스트로스, 프룩토스, 에탄올, 동물성, 식물성 또는 합성 오일을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다.
또한, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 오일 주입 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방 오일 예컨대, 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르 예컨대, 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜을 포함한다. 임의로 현탁액은 또한, 고도로 농축된 용액의 제조를 허용하기 위해 화합물의 용해도를 증가시키는 적합한 안정화제 또는 제제를 함유할 수 있다.
공용매 및 애쥬번트가 제형에 첨가될 수 있다. 공용매의 비제한적인 예는 하이드록실기 또는 다른 극성 기, 예를 들어, 알코올, 예를 들어, 이소프로필 알코올; 글리콜, 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 글리콜 에테르; 글리세롤; 폴리옥시에틸렌 알코올 및 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르를 함유한다. 애쥬번트는, 예를 들어, 계면활성제, 예를 들어, 콩 레시틴 및 올레산; 소르비탄 에스테르, 예를 들어, 소르비탄 트리올레에이트; 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다.
약학적 조성물이 제조된 후, 이들을 적절한 용기에 넣고 치료를 위해 라벨링될 수 있다. FVIII-함유 벡터 또는 폴리펩티드의 투여의 경우, 그러한 라벨링에는 용량, 빈도 및 투여 방법이 포함될 것이다.
본 발명의 조성물, 방법 및 용도에 적합한 약학적 조성물 및 전달 시스템은 당 분야에 공지되어 있다(예를 들어, Remington : The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD; 및 Poznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., pp. 253-315 참조).
본 발명은 또한 FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 세포 또는 동물 내로 도입시키기 위한 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 지혈을 조절하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 방법은 FVIII 폴리펩티드가 개체에서 발현되는 조건하에서 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 핵산 전달 비히클(예를 들어, AAV 벡터)과 개체(환자 또는 대상체 예컨대, 포유동물)의 접촉 또는 투여를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 방법은 FVIII 폴리펩티드가 개체에서 발현되는 조건하에서 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 핵산 전달 비히클(예를 들어, AAV 벡터)과 개체(환자 또는 대상체 예컨대, 포유동물)의 세포를 제공하는 것을 포함한다.
상기로부터, FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체는 결핍, 불충분 또는 이상 혈액 응고와 관련된 장애의 치료에 사용될 수 있음을 알 수 있다.
벡터, 재조합 벡터(예를 들어, rAAV), 및 재조합 바이러스 입자를 포함하는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체의 조성물이 투여될 수 있으며, 본 발명의 방법 및 용도가 이를 필요로 하는 대상체에 충분하거나 유효한 양으로 제공될 수 있다. "유효량" 또는 "충분한 양"은 단일 용량 또는 다수 용량으로 단독으로 또는 하나 이상의 다른 조성물(치료제 또는 면역억제제 예를 들어, 약물), 치료, 프로토콜, 또는 치료 요법제와 함께 임의의 기간(장기 또는 단기)의 검출 가능한 반응, 임의의 기간(예를 들어, 수분, 수시간, 수일, 수개월, 수년 동안, 또는 치유까지) 동안 또는 임의의 측정 가능하거나 검출 가능한 정도로 대상체에서의 예상되거나 요망되는 결과 또는 상기 대상체에 대한 이점을 제공하는 양을 나타낸다.
용량은 다양할 수 있고, 치료가 유도되는 질병의 유형, 발생, 진행, 중증도, 빈도, 기간, 또는 가능성, 요망되는 임상 종점, 이전 또는 동시 치료, 대상체의 전반적 건강, 연령, 성별, 인종 또는 면역학적 능력 및 당업자에 의해 인지될 다른 인자에 좌우된다. 치료 또는 요법의 임의의 유해한 부작용, 합병증 또는 다른 위험 인자 및 대상체의 상태에 의해 표시되는 바에 따라 용량, 수, 빈도 또는 기간이 비례적으로 증가되거나 감소될 수 있다. 당업자는 치료적 또는 예방적 이점을 제공하기에 충분한 양을 제공하는데 필요한 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있는 인자를 인지할 것이다.
치료 효과를 달성하기 위한 용량, 예를 들어, 벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/kg)의 용량은 비제한적으로 투여 경로, 치료 효과를 달성하는데 필요한 이종성 폴리뉴클레오티드 발현의 수준, 치료되는 특정 질병, 바이러스 벡터에 대한 임의의 숙주 면역 반응, 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 발현 생성물(단백질)에 대한 숙주 면역 반응, 및 발현된 단백질의 안정성을 포함하는 여러 인자를 기초로 하여 다양할 것이다. 당업자는 상기 언급된 인자 뿐만 아니라 다른 인자를 기초로 하여 특정 질환 또는 장애를 갖는 환자를 치료하기 위한 rAAV/벡터 게놈 용량 범위를 결정할 수 있다. 일반적으로, 용량은 치료학적 효과를 달성하기 위해 적어도 1x108, 또는 그 초과 예를 들어, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013 또는 1x1014 또는 그 초과의, 대상체 체중의 킬로그램 당 벡터 게놈 (vg/kg)의 범위일 것이다. 마우스에서는 1x1010-1x1011, 및 개에서는 1x1012-1x1013 범위의 AAV 용량이 효과적이었다.
일반적으로 말해서 예로서 혈우병 B를 이용하는 경우, 치료학적 효과를 달성하기 위해, 정상적인 개체에서 발견된 혈액 응고 인자 농도의 1%를 초과하는 혈액 응고 인자 농도가 중증 질환 표현형을 중등도 표현형으로 변화시키는데 필요한 것으로 여겨진다. 중증 표현형은 관절 손상 및 생명을 위협하는 출혈을 특징으로 한다. 중등도 질환 표현형을 경증 표현형으로 전환시키기 위해, 정상의 5%를 초과하는 혈액 응고 인자 농도가 필요한 것으로 여겨진다. 정상 인간의 FVIII 수준은 약 150-200 ng/ml 혈장이지만, 더 적거나 (예를 들어, 약 100-150 ng/ml의 범위) 또는 더 클 수 있는데 (예를 들어, 약 200-300 ng/ml의 범위), 이는 예를 들어, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 1-단계 응고 검정에 의해 측정되는 기능적 응고로 인해 여전히 정상인 것으로 간주된다. 따라서, 치료 효과는 대상체/인간 중의 FVIII의 총 양이 정상 대상체/인간에 존재하는 FVIII의 1% 예를 들어, 100-300 ng/ml의 1%를 초과하게 하는 FVIII의 발현에 의해 달성될 수 있다.
이러한 혈우병 대상체를 치료하는데 있어서, 요망되는 치료 효과를 달성하는데 전형적인 용량은 대상체의 중량의 킬로그램당 적어도 1x1010 벡터 게놈(vg) (vg/kg), 또는 약 1x1010 내지 1x1011 vg/대상체의 중량 kg, 또는 약 1x1011 내지 1x1012 vg/대상체의 중량 kg, 또는 약 1x1012 내지 1x1013 vg/대상체의 중량 kg이다. AAV 벡터 용량은 FVIII 또는 AAV 벡터에 대한 실질적인 면역 반응이 존재하지 않게 하는 수준 전형적으로, 용량 스펙트럼의 하위 말단일 수 있다.
치료(예를 들어, 개선시키거나 치료 이점 또는 개선을 제공함)를 위한 "유효량" 또는 "충분한 양"의 용량은 전형적으로 질병의 하나, 다수 또는 전부의 유해한 증상, 결과 또는 합병증, 예를 들어, 질병에 의해 야기되거나 질병과 관련된 하나 이상의 유해한 증상, 장애, 질환, 병리, 또는 합병증에 대한 반응을 측정 가능한 정도로 제공하기에 효과적이며, 그러나 질병의 진행 또는 악화를 감소시키거나, 축소시키거나, 저해하거나, 억제하거나, 제한하거나, 조절하는 것도 만족스러운 결과이다.
유효량 또는 충분한 양은 단일 투여로 제공될 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없으며 다수의 투여를 필요로 할 수 있고, 단독으로 또는 또 다른 조성물(예를 들어, 작용제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법과 조합하여 투여될 수 있으나, 반드시 그럴 필요는 없다. 예를 들어, 양은 대상체의 필요, 치료되는 질병의 유형, 상태 및 중증도 또는 질병의 부작용(존재시)에 의해 표시되는 바에 따라 비례적으로 증가될 수 있다. 또한, 유효량 또는 충분한 양은 제2 조성물(예를 들어, 또 다른 약물 또는 작용제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법 없이 단일 또는 다수 용량으로 제공되는 경우 효과적이거나 충분할 필요는 없는데, 해당 대상체에서 효과적이거나 충분한 것으로 여겨지기 위해 추가 용량, 상기 용량을 초과하거나 상기 용량 미만의 양 또는 기간, 또는 추가의 조성물(예를 들어, 약물 또는 작용제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법이 포함될 수 있기 때문이다. 효과적인 것으로 여겨지는 양은 또한 응고 장애(예를 들어, 혈우병 A)의 치료를 위한 또 다른 치료, 치료 요법 또는 프로토콜, 예를 들어, 재조합 응고 인자 단백질(예를 들어, FVIII)의 투여의 이용 감소를 발생시키는 양을 또한, 포함한다.
따라서, 또한, 본 발명의 방법 및 사용은 특히 또 다른 화합물, 제제, 약물, 치료 요법, 치료 프로토콜, 과정 또는 치료제의 감소된 필요 또는 사용을 유도하는 방법 및 사용을 포함한다. 예를 들어, 혈액 응고 질병에 있어서, 본 발명의 방법 또는 사용은 대상체에서 결핍되거나 결함이 있는(비정상 또는 돌연변이체) 내인성 응고 인자를 보충하기 위한 재조합 응고 인자 단백질의 투여의 덜한 빈도 또는 감소된 용량 또는 제거가 해당 대상체에서 존재한 경우에 치료 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명에 따르면, 또 다른 치료 또는 요법의 필요 또는 사용을 감소시키는 방법 및 용도가 제공된다.
유효량 또는 충분한 양은 치료되는 각각의 대상체 및 모든 대상체, 또는 해당 그룹 또는 집단 내의 치료 대상체 대부분에서 효과적일 필요는 없다. 유효량 또는 충분한 양은 그룹 또는 전체 집단이 아니라 특정 대상체에서의 유효성 또는 충분성을 의미한다. 상기 방법에 대해 통상적인 바와 같이, 일부 대상체는 해당 치료 방법 또는 용도에 대한 더 큰 반응 또는 덜한 반응을 나타내거나 반응을 나타내지 않을 것이다.
용어 "개선시키다"는 대상체의 질병 또는 이의 증상, 또는 기초 세포 반응에서의 검출 가능하거나 측정 가능한 개선을 의미한다. 검출 가능하거나 측정 가능한 개선은 질병, 또는 질병에 의해 야기되거나 질병과 관련된 합병증의 발생, 빈도, 중증도, 진행, 또는 기간에서의 주관적 또는 객관적 감소, 축소, 저해, 억제, 제한 또는 조절, 또는 질병의 증상 또는 기초 원인 또는 결과에서의 개선, 또는 질병의 역전을 포함한다. HemA에 있어서, 유효량은 예를 들어, 응고 검정에 의해 측정되는 바와 같이, 응고 시간을 감소시키는 양, 또는 예를 들어, 대상체에서 급성 출혈 에피소드의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 양일 것이다.
따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 성분이 의도된 치료 목적을 달성하기에 유효한 양으로 함유된 조성물을 포함한다. 치료학적 유효량을 결정하는 것은 본 발명에서 제공되는 기술 및 지침을 사용하여 숙련된 의료 종사자의 능력 범위 내에 있다.
치료 용량은 다른 요인들 중에서도 대상체의 연령 및 일반적인 상태, 이상 혈액 응고 표현형의 중증도, 및 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체의 발현 수준을 조절하는 조절 서열의 강도에 좌우될 것이다. 따라서, 인간에서의 치료학적 유효량은 벡터-기반 FVIII 처리에 대한 개별 환자의 반응을 기반으로 하여 의료 종사자에 의해 결정될 수 있는 상대적으로 광범위한 범위에 속할 것이다. 이러한 용량은 단독으로 또는 면역억제제 또는 약물과 조합되어 존재할 수 있다.
약학적 조성물과 같은 조성물은 생물학적 활성 단백질(예를 들어, CpG 감소된 핵산 변이체에 의해 인코딩된 인자 VIII(FVIII))의 생성을 가능하게 하도록 또는 유전자- 또는 세포-기반 요법에 의해 생체내에서 FVIII 전이유전자의 연속 발현을 유도함으로써 또는 환자 또는 공여체의 세포의 생체외 변형에 의해 대상체에 전달될 수 있다. 특정 구체예에서, 수령체가 치료학적 유효량의 FVIII 폴리펩티드를 생성하게 하기에 충분한 유전자 물질을 포함하는 약학적 조성물은 대상체에서 지혈에 영향을 끼칠 수 있다.
조성물은 단독으로 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 벡터, 발현 벡터/재조합 벡터(예를 들어, rAAV), 또는 재조합 바이러스 입자는 면역억제제 없이 치료 효과를 제공한다. FVIII의 치료 효과는 면역억제제의 투여 없이 소정의 기간 예를 들어, 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-14, 14-20, 20-25, 25-30, 또는 30-50일 또는 그 초과, 예를 들어, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200일 또는 그 초과 동안 지속된다. 따라서, 특정 구체예에서, FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 벡터, 발현 벡터/재조합 벡터(예를 들어, rAAV), 또는 재조합 바이러스 입자는 소정 기간 동안 면역억제제 투여없이 치료 효과를 제공한다.
조성물은 적어도 하나의 다른 제제와 조합되어 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 벡터, 발현 벡터/재조합 벡터(예를 들어, rAAV) 또는 재조합 바이러스 입자는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 벡터, 발현 벡터/재조합 벡터(예를 들어, rAAV), 또는 재조합 바이러스 입자를 투여하기 전에, 실질적으로 이와 동시에 또는 투여 후에 하나 이상의 면역억제제와 조합되어 투여된다. 특정 구체예에서, FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 벡터, 발현 벡터/재조합 벡터(예를 들어, rAAV), 또는 재조합 바이러스 입자는 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 벡터, 발현 벡터/재조합 벡터(예를 들어, rAAV), 또는 재조합 바이러스 입자를 투여한 후 소정의 기간 후에, 예를 들어, FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 벡터, 발현 벡터/재조합 벡터(예를 들어, rAAV), 또는 재조합 바이러스 입자 투여 후 1-12, 12-24 또는 24-48시간, 또는 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-14, 14-20, 20-25, 25-30, 30-50, 또는 50일 초과에서 하나 이상의 면역억제제와 조합되어 투여된다. FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 벡터, 발현 벡터/재조합 벡터(예를 들어, rAAV), 또는 재조합 바이러스 입자를 투여한 후 소정의 기간 예를 들어, 20-25, 25-30, 30-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200 또는 200일 초과 동안 초기 발현 수준 후에 FVIII가 감소되는 경우, FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 벡터, 발현 벡터/재조합 벡터(예를 들어, rAAV), 또는 재조합 바이러스 입자를 투여한 후 소정 기간 후 면역억제제가 투여된다.
특정 구체예에서, 면역 억제제는 항염증제이다. 특정 구체예에서, 면역 억제제는 스테로이드이다. 특정 구체예에서, 면역억제제는 사이클로스포린(예를 들어, 사이클로스포린 A), 마이코페놀레이트, 리툭시맵 또는 이들의 유도체이다. 추가의 특정 제제는 안정화 화합물을 포함한다.
조성물은 비제한적으로, 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 및 물을 포함하는 임의의 멸균의 생체적합성 약학적 담체 중에 투여될 수 있다. 조성물은 환자에 단독으로 또는 지혈에 영향을 미치는 다른 제제(예를 들어, 보조-인자)와 조합되어 투여될 수 있다.
단독의 또는 다른 제제와 조합된 인자 VIII은 본원에 기술된 바와 같은 적절한 생물학적 담체 중에서 환자에 투여될 수 있거나 환자와 접촉되거나 직접 주입될 수 있다. FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 본 발명의 벡터 및 발현 벡터는 FVIII 폴리펩티드의 예방학적 및/또는 치료학적 효과 수준을 소정 기간 동안 달성하거나 임의로 유지하기 위해 다양한 수단에 의해 환자에 투여될 수 있다. 당업자는 특정 환자의 치료학적 처리를 위한 본 발명의 FVIII 인코딩 발현 벡터를 사용하는 특정 프로토콜을 용이하게 결정할 수 있다.
아데노바이러스 벡터를 생성하고 환자에게 투여하기 위한 프로토콜은 미국 특허 번호 5,998,205; 6,228,646; 6,093,699; 6,100,242; 및 국제 특허 출원 WO 94/17810 및 WO 94/23744 (이들의 전체는 본원에 참고로 인용됨)에 기재되어 있다. 특히, 예를 들어, AAV 벡터는 CpG 감소된 핵산 변이체에 의해 인코딩되는 인자 VIII(FVIII)를 이를 필요로하는 환자에게 전달하기 위해 사용된다.
본 발명의 AAV 벡터에 의해 전달된 CpG 감소된 핵산 변이체에 의해 인코딩되는 인자 VIII(FVIII)는 공지된 임의의 수단에 의해 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 방법 및 용도는 전신적, 영역적 또는 국소적, 또는 임의의 경로에 의한, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 전달 및 투여를 포함한다. 생체 내에서 약학적 조성물의 전달은 일반적으로 통상적인 주사기를 사용하여 주입을 통해 달성될 수 있으며, 기타 전달 방법 예컨대, 대류-증강된 전달이 고안된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,720,720 참조). 예를 들어, 조성물은 피하, 표피, 진피, 수막강내, 안와내, 점막내, 복강내, 정맥내, 흉강내, 경구, 간내, 문맥 경유, 또는 근육내로 전달될 수 있다. 다른 투여 방식은 경구 및 폐 투여, 좌약 및 경피 적용을 포함한다. 혈액 응고 장애를 갖는 환자의 치료에 전문화된 임상의는 비제한적으로, 환자의 상태 및 치료 목적(예를 들어, 증가되거나 감소된 혈액 응고)을 포함하는 많은 기준에 기초하여 FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 포함하는 아데노바이러스-관련 벡터의 투여를 위한 최적의 경로를 결정할 수 있다.
본 발명의 방법 및 용도는 요망되는 치료적, 유익한, 가산적, 상승작용적 또는 상보적 활성 또는 효과를 갖는 임의의 화합물, 제제, 약물, 치료제 또는 기타 치료 요법 또는 프로토콜과 조합될 수 있다. 예시적인 조합 조성물 및 치료제는 제 2의 활성제, 예컨대, 생물제제(단백질), 제제(예를 들어, 면역억제제) 및 약물을 포함한다. 그러한 생물제제 (단백질), 제제, 약물, 치료 및 요법은 본 발명의 임의의 다른 방법 또는 용도, 예를 들어, 혈액 응고 질환 예컨대, HemA에 대해 대상체를 치료하는 치료 방법 전에, 실질적으로 이와 동시에 또는 그 후에 투여되거나 수행될 수 있다.
화합물, 제제, 약물, 치료 또는 기타 치료 요법 또는 프로토콜은 조합 조성물로서 투여될 수 있거나, 핵산, 벡터, 재조합 벡터(예를 들어, rAAV) 또는 재조합 바이러스 입자의 전달 또는 투여와 별도로, 예컨대, 동시에 또는 연속적으로 또는 순차적으로 (전 또는 후에) 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 방법 또는 용도가 본원에 기재되거나 당업자에게 공지된 임의의 화합물, 제제, 약물, 치료 요법, 치료 프로토콜, 과정, 치료제 또는 조성물과 병행된다. 화합물, 제제, 약물, 치료 요법, 치료 프로토콜, 과정, 치료제 또는 조성물은 본 발명의 핵산, 벡터, 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV) 또는 재조합 바이러스 입자의 대상체로의 투여 전, 실질적으로 이와 동시에 또는 그 후에 투여되거나 수행될 수 있다.
본 발명은 인간을 포함하는 동물 및 수의학 적용에서 유용하다. 따라서, 적합한 대상체는 포유동물, 예컨대, 인간은 물론 비-인간 포유동물을 포함한다. 용어 "대상체"는 동물, 전형적으로, 포유동물, 예컨대, 인간, 비-인간 영장류 (유인원, 긴팔원숭이, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 마카크), 애완 동물 (개 및 고양이), 가축 (가금류, 예컨대, 닭 및 오리, 말, 소, 염소, 양, 돼지) 및 실험용 동물 (마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그)를 지칭한다. 인간 대상체는 태아, 신생아, 유아, 청소년 및 성인 대상체를 포함한다. 대상체는 동물 질환 모델, 예를 들어, 혈액 응고 질환 예컨대, HemA 및 당업자에게 공지된 기타 질환의 마우스 및 기타 동물 모델을 포함한다.
본 발명에 따른 치료에 적합한 대상체는 기능성 유전자 생성물(예를 들어, FVIII 단백질)이 결핍되거나 이들을 불충분한 양으로 갖거나 생성할 위험성이 있는 대상체, 또는 질환으로 이어질 수 있는 비정상적인 부분적인 기능성 또는 비-기능성 유전자 생성물(예를 들어, FVIII 단백질)을 생성시키는 대상체를 포함한다. 본 발명에 따른 치료에 적합한 대상체는 또한 질환으로 이어지는 비정상 또는 결손 (돌연변이) 유전자 생성물(단백질)을 갖거나 이를 생성할 위험성이 있어서 비정상 또는 결손 (돌연변이) 유전자 생성물(단백질)의 양, 발현 또는 기능의 감소가 질환 치료를 유도하거나 하나 이상의 증상을 감소시키거나 질환을 완화시키는 대상체를 포함한다. 따라서, 표적 대상체는 혈우병(예를 들어, 혈우병 A)과 같은 혈액 응고 인자 생성이 비정상적이거나, 불충분하거나, 생성시키지 않는 대상체를 포함한다.
대상체는 면역 반응 예를 들어, AAV에 대한 항체에 대해 시험될 수 있다. 따라서, 후보 혈우병 환자는 본 발명의 방법에 따른 치료 전에 스크리닝될 수 있다. 대상체는 또한, 치료 후 AAV에 대한 항체에 대해 시험되고, 임의로 치료 후 소정의 기간 동안 모니터링될 수 있다. 항체를 발생시키는 대상체는 면역억제제로 처리될 수 있거나 하나 이상의 추가량의 AAV 벡터가 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 치료에 적합한 대상체는 AAV에 대한 항체를 갖거나 항체를 생성할 위험이 있는 대상체를 포함한다. AAV 벡터는 수개의 기법을 사용하여 이러한 대상체에 투여되거나 전달될 수 있다. 예를 들어, 빈 캡시드 AAV(즉, FVIII 핵산이 결여된 AAV)를 전달하여 대상체의 AAV 항체에 결합시킴으로써 FVIII를 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체를 보유하는 AAV 벡터가 대상체의 세포를 형질전환시키게 할 수 있다. 투여할 빈 캡시드 AAV의 양은 환자 대상체에서 생성된 AAV 항체의 양에 기초하여 수정될 수 있다. 빈 캡시드는 임의의 AAV 혈청형, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8일 수 있다.
대안으로 또는 이에 추가하여, AAV 벡터는 직접적인 근육내 주사(예를 들어, 근육의 하나 이상의 지근 섬유)에 의해 전달될 수 있다. 또 다른 대안에서, 대퇴동맥내로 도입되는 카테터는 간동맥을 통해 간으로 AAV 벡터를 전달하는데 사용될 수 있다. 내시경역행담췌관조영 (ERCP)과 같이 비외과적 수단이 또한, AAV 벡터를 간으로 직접 전달함으로써 혈류 및 AAV 항체를 우회하는데 사용될 수 있다. 기타 관 시스템, 예컨대, 턱밑샘의 관이 또한 이미 존재하는 항-AVV 항체를 갖거나 이를 발생시키는 대상체로 AAV 벡터를 전달하기 위한 문으로서 사용될 수 있다.
대상체로의 투여 또는 생체내 전달은 질환에 의해 초래되거나 질환과 관련된 해로운 증상, 병태, 합병증 등의 발생 전에 수행될 수 있다. 예를 들어, 스크린 (예를 들어, 유전학용)은 본 발명의 조성물, 방법 및 용도를 위한 후보로서 이러한 대상체를 확인하는데 이용될 수 있다. 따라서, 이러한 대상체는 기능성 유전자 생성물(예를 들어, FVIII 단백질)에서 불충분한 양 또는 결핍에 대해 양성으로 스크리닝된 대상체, 또는 비정상적인 부분적 기능성 또는 비기능성 유전자 생성물(예를 들어, FVIII 단백질)을 생성시키는 대상체를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법 및 용도에 따른 대상체로의 투여 또는 생체내 전달은 대상체가 치료에 표적화된 질환을 갖는 것으로 확인되거나, 질환의 하나 이상의 증상을 갖거나, 심지어 대상체가 질환의 하나 이상의 증상을 갖지 않더라도 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝되고 양성으로서 확인된 후 1-2, 2-4, 4-12, 12-24 또는 24-72 시간내에 실시될 수 있다. 물론, 본 발명의 방법 및 용도는 대상체가 치료에 표적화된 질환을 갖는 것으로 확인되거나, 질환의 하나 이상의 증상을 갖거나, 본원에서 기재된 바와 같이 스크리닝되고 양성으로서 확인된 후 1-7, 7-14, 14-21, 21-48 또는 그 초과의 일, 개월 또는 년째에 실시될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "단위 투여량 형태"는 치료하고자 하는 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적당한 물리적으로 구분된 단위를 지칭하고; 각각의 단위는, 임의로, 하나 이상의 용량으로 투여되는 경우에 요망되는 효과 (예를 들어, 예방 또는 치료 효과)를 생성시키도록 계산된 약학적 담체 (부형제, 희석제, 비히클 또는 충전제)와 함께 소정량을 함유한다. 단위 투여량 형태는, 예를 들어, 냉동-건조된 또는 동결건조된 상태의 조성물 또는 액체 조성물을 포함할 수 있는 예를 들어, 앰플 및 바이알내에 있을 수 있으며; 예를 들어, 멸균 액체 담체는 생체내 투여 또는 전달 전에 첨가될 수 있다. 개별 단위 투여량 형태는 다중-용량 키트 또는 컨테이너에 포함될 수 있다. 따라서, 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV) 서열, 재조합 바이러스 입자, 및 이의 약학적 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단일 또는 다중 단위 투여량 형태로 패키징될 수 있다.
대상체는 FVIII 양 또는 FVIII 활성에 대해 시험되어 이러한 대상체가 본 발명의 방법에 따른 치료에 적절한지의 여부를 결정할 수 있다. 후보 혈우병 대상체는 본 발명의 방법에 따른 치료 전에 FVIII 양 또는 활성에 대해 시험될 수 있다. 대상체는 또한, 본 발명의 방법에 따른 치료 후에 FVIII의 양 또는 FVIII 활성에 대해 시험될 수 있다. 이러한 처리된 대상체는 FVIII 양 또는 FVIII 활성에 대한 처리 후, 주기적으로 예를 들어, 1-4주 또는 1-6개월 마다 모니터링될 수 있다.
대상체는 이러한 대상체가 본 발명의 방법에 따른 치료에 적절한지의 여부를 결정하기 위해 또는 유해 반응에 대한 하나 이상의 간 효소에 대해 시험될 수 있다. 따라서, 후보 혈우병 대상체는 본 발명의 방법에 따른 치료 전에 하나 이상의 간 효소의 양에 대해 스크리닝될 수 있다. 대상체는 또한, 본 발명의 방법에 따른 처리 후에 하나 이상의 간 효소의 양에 대해 시험될 수 있다. 이러한 처리된 대상체는 증가된 간 효소에 대한 처리 후, 주기적으로 예를 들어, 1-4주 또는 1-6개월 마다 모니터링될 수 있다.
예시적인 간 효소는 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST), 및 락테이트 데하이드로게나제(LDH)를 포함하나, 간 손상을 나타내는 다른 효소가 또한 모니터링될 수 있다. 순환에서 이들 효소의 정상 수준은 전형적으로 상위 수준을 갖는 범위로서 규정되는데, 그러한 상위 수준 위는 효소 수준이 상승한 것으로 간주되며 따라서 간 손상을 나타낸다. 정상 범위는 검정을 수행하는 임상 실험실에 의해 사용되는 표준에 부분적으로 의존적이다.
대상체는 이러한 대상체가 치료에 대해 적격인지 또는 치료에 반응하는 지의 여부, 및/또는 반응성의 양 또는 기간을 결정하기 위해 출혈 에피소드에 대해 모니터링될 수 있다. 대상체는 이러한 대상체가 추가적인 치료 예를 들어, 후속 AAV 벡터 투여 또는 면역억제제의 투여, 또는 더욱 빈번한 모니터링이 필요한지의 여부를 결정하기 위해 출혈 에피소드에 대해 모니터링될 수 있다. 따라서, 혈우병 대상체는 본 발명의 방법에 따른 처리 전 및 후에 출혈 에피소드에 대해 모니터링될 수 있다. 대상체는 또한, 본 발명의 방법에 따른 처리 동안 또는 후에 출혈 에피소드의 빈도 및 중증도에 대해 평가될 수 있다.
본 발명은 패키징 물질 및 내포된 하나 이상의 성분들을 갖는 키트를 제공한다. 키트는 전형적으로, 성분들의 설명 또는 내포된 성분들의 시험관내, 생체내 또는 생체외 사용을 위한 설명서를 포함하는 라벨 또는 패키징 삽입물을 포함한다. 키트는 상기 성분들, 예를 들어, 핵산, 재조합 벡터, 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터, 또는 바이러스 입자 및 임의로 제2 활성제 예컨대, 또 다른 화합물, 제제, 약물 또는 조성물의 수집물을 함유할 수 있다.
키트는 키트의 하나 이상의 성분들을 수용한 물리적 구조물을 지칭한다. 패키징 물질은 성분들을 멸균으로 유지시킬 수 있으며, 이러한 목적을 위해 흔히 사용되는 재료(예를 들어, 종이, 골판지, 유리, 플라스틱, 호일, 앰플, 바이알, 튜브 등)로 제조될 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 내포된 하나 이상의 성분들의 식별 정보, 용량, 작용 메카니즘을 포함하는 활성 성분(들)의 임상적 약리학, 약동학 및 약역학을 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 제조업체, 로트 번호, 제조 장소 및 날짜, 유통 기한을 확인시켜주는 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 제조업체 정보, 로트 번호, 제조업체 위치 및 날짜를 확인시켜주는 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 키트 성분이 사용될 수 있는 질환에 대한 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 방법, 용도, 또는 치료 프로토콜 또는 치료 요법에서 키트 성분중 하나 이상을 사용하기 위한 임상의 또는 대상체를 위한 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 본원에 기술된 방법, 용도, 치료 프로토콜 또는 예방 또는 치료 요법중 임의의 것을 실시하기 위한 설명, 투여량, 빈도 또는 기간을 포함할 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 예방 또는 치료 이점과 같이 성분이 제공할 수 있는 임의의 이점에 대한 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 잠재적인 해로운 부작용, 합병증 또는 반응에 대한 정보, 예컨대, 특정 조성물을 사용하는데 적합하지 않을 상황에 관한 대상체 또는 임상의를 위한 경고를 포함할 수 있다. 해로운 부작용 또는 합병증이 또한, 대상체가 본 조성물과 양립가능하지 않을 수 있는 하나 이상의 다른 약제를 섭취했거나, 섭취할 예정이거나, 현재 섭취 중인 경우, 또는 대상체가 조성물과 양립가능하지 않을 또 다른 치료 프로토콜 또는 치료 요법을 받았거나, 받을 예정이거나, 현재 받는 중인 경우에 발생할 수 있으며, 따라서, 설명서는 이러한 부적합에 대한 정보를 포함할 수 있다.
라벨 또는 삽입물은, 성분, 키트 또는 패키징 물질 (예를 들어, 박스)에 부착되거나 분리되거나, 키트 성분을 함유하는 앰플, 튜브 또는 바이알에 부착된 "인쇄된 물질" 예를 들어, 종이 또는 판지를 포함한다. 라벨 또는 삽입물은 추가적으로 컴퓨터 판독가능한 매체, 예컨대, 바-코드 인쇄된 라벨, 디스크, 광학 디스크 예컨대, CD- 또는 DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, 자석 테이프, 또는 전기 저장 매체, 예컨대, RAM 및 ROM, 또는 이들의 하이브리드, 예컨대, 자석/광 저장 매체, FLASH 매체 또는 메모리 타입 카드를 포함할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 당해 기술분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 방법 및 재료와 유사하거나 동일한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 이용될 수 있으나, 적합한 방법들 및 재료들이 본원에 기술되어 있다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 간행물, 및 기타 참조문헌, GenBank 인용 및 ATCC 인용은 이들의 전체가 참조로 통합된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 기준이 될 것이다.
본 발명의 생물학적 분자에 관한 다양한 용어가 상기 및 또한 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 사용된다.
본원에 개시된 특징들 모두는 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특징은 동일하거나, 동등하거나, 유사한 목적으로 작용하는 대안적인 특징에 의해 대체될 수 있다. 이와 같이, 달리 명확히 명시되지 않는 한, 개시된 특징들(예를 들어, FVIII을 인코딩하는 CpG 감소된 핵산 변이체, 벡터, 플라스미드, 발현/재조합 벡터(예를 들어, rAAV) 서열, 또는 재조합 바이러스 입자)은 동등하거나 유사한 부류의 특징들의 부류의 예이다.
본원에 사용되는 단수 형태("a", "and" 및 "the")는 문맥에서 달리 분명하게 지시되지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "핵산"에 대한 언급은 복수의 그러한 핵산들을 포함하며, "벡터"에 대한 언급은 복수의 그러한 벡터들을 포함하며, "바이러스" 또는 "입자"에 대한 언급은 복수의 그러한 바이러스들/입자들을 포함한다.
본원에 사용되는 모든 수치 값 또는 수치 범위는 문맥에서 달리 분명하게 지시되지 않는 한 그러한 범위 내의 정수 및 범위 내의 값의 소수 또는 정수를 포함한다. 따라서, 예시하자면, 80% 이상의 동일성에 대한 언급은 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 등뿐만 아니라 81.1%, 81.2%, 81.3%, 81.4%, 81.5% 등, 82.1%, 82.2%, 82.3%, 82.4%, 82.5% 등, 및 기타 등등을 포함한다.
초과 (이상) 또는 미만을 갖는 정수에 대한 언급은 각각 언급된 수보다 큰 또는 작은 임의의 수를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 100 미만에 대한 언급은 99, 98, 97 등, 숫자 일 (1)까지 낮은 모든 수를 포함하며; 10 미만은 9, 8, 7 등등, 숫자 일 (1)까지 낮은 모든 수를 포함한다.
본원에 사용되는 모든 수치 값 또는 범위는 문맥에서 달리 분명하게 지시되지 않는 한 그러한 범위 내의 값의 소수 및 정수 및 그러한 범위 내의 정수의 소수를 포함한다. 따라서, 예시하자면, 수치 범위에 대한 언급, 예컨대, 1-10은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10뿐만 아니라, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 등, 및 기타 등등을 포함한다. 따라서, 1-50의 범위에 대한 언급은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 등, 및 50을 포함하는 50 이하 뿐만 아니라, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 등, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5 등, 및 기타 등등을 포함한다.
일련 범위에 대한 언급은 일련 내의 상이한 범위의 경계 값을 합한 범위를 포함한다. 따라서, 예시하자면, 예를 들어, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-850의 일련의 범위에 대한 언급은 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 1-60, 10-30, 10-40, 10-50, 10-60, 10-70, 10-80, 20-40, 20-50, 20-60, 20-70, 20-80, 20-90, 50-75, 50-100, 50-150, 50-200, 50-250, 100-200, 100-250, 100-300, 100-350, 100-400, 100-500, 150-250, 150-300, 150-350, 150-400, 150-450, 150-500 등의 범위를 포함한다.
본 발명은 일반적으로 다수의 구체예 및 양태를 기술하기 위해 긍정의 언어를 사용하여 본원에서 개시되었다. 또한, 본 발명은 특히 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜 또는 절차와 같이 특정 주제가 전부 또는 일부 배제된 구체예를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 특정 구체예 또는 양태에서, 재료 및/또는 방법 단계가 배제된다. 따라서, 본 발명에는 본 발명이 무엇을 포함하지 않는지에 대해 본원에 일반적으로 나타나 있지 않지만, 그럼에도 불구하고, 본 발명에 명확하게 배제되지 않은 양태들은 본원에서 개시된다.
본 발명의 많은 구체예가 기술되어 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 당업자는 다양한 용도 및 조건에 맞춰 본 발명의 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 하기 실시예는 예시하고자 의도된 것이며, 어떠한 방식으로 청구된 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1.
본원에는 혈우병을 치료하기 위한 유전자 요법에 사용하기 위한 유전자 작제물이 기재되어 있다. 또한, 이러한 인자 VIII (FVIII) 인코딩 유전자 작제물은 투여를 위한 재조합 FVIII 단백질을 생산하기 위해서 단백질 발현 시스템의 설정시 시험관내에서 유용할 수 있다. 각 유전자 작제물은 발현 조절(예를 들어, 프로모터) 요소, 인자 VIII 유전자, 및 유전자 발현에 필요한 다른 조절 특징부 예컨대, 인트론, ITR, 정지 코돈, 폴리 A 신호 등등 중 하나 이상을 임의로 포함할 수 있다.
실시예 2
CpG 감소된 인자 VIII DNA 서열 및 특정 벡터 작제물 , 플라스미드 작제물 및 AAV 벡터 생산 세포주.
FVIII을 인코딩하는 18개의 상이한 CpG 감소된 핵산 변이체(SEQ ID NO:1-18)를 생성시키고 발현 검정으로 평가하였다. 돌연변이 트랜스티레틴(TTRmut) 프로모터(SEQ ID NO:22)를 갖는 CpG 감소된 인간 FVIII cDNA 작제물을 생성시켰다.
AAV-SPK-8011 발현 카세트는 CpG 감소된 FVIII-X07 핵산 서열 및 패키징용 LK03 캡시드를 갖는다. LK03 캡시드는 AAV3에 대해 실질적으로 상동성인 비-병원성의 자연 복제 결핍 단일-가닥 DNA 바이러스를 갖는다.
패키징 플라스미드 pLK03은 AAV2 p5 프로모터의 조절하의 AAV2 Rep 및 AAV-LK03 Cap 유전자, 박테리아 복제 기점 및 박테리아 세포에서 카나마이신에 대한 내성을 부여하는 유전자를 수반하는 7,484bp 플라스미드 작제물이다. 이러한 작제물에서, p5 rep 프로모터는 야생형 또는 슈도 야생형 AAV 종의 형성 가능성을 감소시키고 벡터의 수율을 증가시키기 위해 cap 유전자의 3'로 이동시켰다.
유전자 전이를 위해 클로닝된 DNA는 간-특이적 프로모터의 조절하에 인간 응고 인자 VIII(hFVIII)을 인코딩하는, 단일-가닥 게놈으로서의 AAV-LK03 캡시드로 패키징된 유전자 발현 카세트이다. 발현 플라스미드는 pAAV-TTRmut-hFVIII-X07로서 지칭된다. 이는 인간 FVIII 발현을 증가시키기 위해 최적화된 코딩 영역, 및 TTR 프로모터에서 4개의 점 돌연변이를 도입함으로써 변형시켰다. AAV 발현 카세트는 하기 요소를 함유한다:
·AAV2 ITR
·트랜스티레틴(TTR) 프로모터: 야생형 프로모터와 비교하여 유전자 발현을 증가시키는 4개의 점 돌연변이를 갖는 간-특이적 트랜스티레틴(TTR) 프로모터 (Costa et al. 1991)
·합성 인트론: 인간 신장 인자 EF-1 알파 유전자로부터 유래됨
·FVIII 코딩 서열: B-도메인 결실되고 코돈-최적화된 인간 FVIII 코딩 서열.
·토끼 베타 글로빈 폴리 A 신호 서열(Levitt et al. 1989).
·AAV2 ITR
3개의 DNA 플라스미드 작제물을 사용하여 인간 배아 신장 293 세포를 형질감염시켜 헬퍼 바이러스-비함유 공정에 의해 SPK-8011 벡터를 생성시켰다(Matsushita et al. 1998):
·유전자 카세트(hFVIII 코딩 서열 및 관련 조절 요소)를 플라스미드 내로 클로닝시켜 벡터 플라스미드 pAAV-TTRmut-hFVIII-X07을 제공하였다.
·바이러스 ITR이 결여된 AAV 바이러스 게놈(rep 및 cap)을 플라스미드 내로 클로닝시켜 AAV 패키징 플라스미드 pLK03을 제공하였으며, 이는 AAV 벡터 패키징을 위한 트랜스에서 필요한 AAV2 rep 및 AAV-LK03 cap 유전자를 제공한다. rep 유전자를 위한 바이러스 프로모터(p5)를 비-상동성 재조합에 의한 복제 경쟁 AAV가 형성되는 것을 방지하기 위해 플라스미드에 재배치하였다.
·아데노바이러스-2로부터의 3개 유전자를 제3 플라스미드(pCCVC-AD2HP) 내로 클로닝시켜, 벡터 생성에 필요한 헬퍼 바이러스 유전자를 제공하였다. 플라스미드 pCCVC-AD2HPv2는 3개의 아데노바이러스 유전자 E2A, E4 및 VA RNA를 운반하여 AAV 벡터의 복제 및 캡시드화에 필요한 '헬퍼' 기능을 제공하는 11,832 bp 플라스미드 작제물이다. 플라스미드 pCCVC-AD2HPv2는, AmpR 유전자 및 pUC ori 서열의 일부를 함유하는 DrdI-DrdI 1882bp 제한 단편이 제거되고 전체 KanR 유전자 및 pUC ori 서열의 일부를 함유하는 플라스미드 pAAV2-hRPE65v2로부터의 DrdI-DrdI 단편으로 대체된 pCCVC-AD2HP의 유도체이다.
AAV 벡터 생산에 사용되는 세포 기질은 기본 인간 배아 신장 세포(HEK) 293의 유도체이다. HEK293 세포주는 전단된 인간 아데노바이러스 유형 5(Ad5) DNA에 의해 변형된 영구적인 세포주이다(Graham et al., 1977). Working Cell Bank는 필라델피아 아동 병원(CHOP)의 세포 및 분자 치료학 센터(CCMT)의 특성 규명된 HEK293 Master Cell Bank에서 유래되었다.
실시예 3
마우스에서의 AAV - hFVIII 벡터의 평가.
FVIII 전이유전자 작제물(hFVIII)을 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터 내로 패키징시키고 마우스에 전달하였다. 간단히 말해, 8-10주령의 4마리 혈우병 A/CD4-/- 마우스의 군에 4x1012 vg/kg의 AAV-hFVIII 벡터를 주입하였다. 면역결핍 마우스를 사용하여 FVIII 혈장 수준의 정량화를 가능하게 하였는데, 정상 마우스에서 생성되는 FVIII에 대한 억제 항체는 FVIII 발현의 장기간 분석을 방해하기 때문이다.
FVIII 발현 수준을 측정하였으며, 이는 몇몇 경우에 hFVIII을 인코딩하는 CO3 서열(SEQ ID NO:21)에 의해 제공된 발현보다 높았다. 도 2에 도시된 바와 같이, AAV-SPK-8005를 포함하는 벡터는 기준 AAV-CO3 벡터와 비교하여 더 높은 hFVIII 수준을 발현하였다. 데이터는 놀랍게도, 수개의 DNA 서열이 FVIII을 인코딩하는 코돈-최적화된 서열(CO3, SEQ ID NO:21)보다 더 높은 수준의 FVIII을 발현하였음을 드러냈다.
AAV-LK03-hFVIII(또한 AAV-LK03-hFVIII 및 SPK-8011로도 명명됨)보다는 AAV-Spark8005(또한 SPK-8005로 명명됨)를 마우스 간세포의 효율적인 형질도입(즉, hFVIII 전이유전자 발현)을 보장하기 위해 본 연구에 사용하였다. 따라서, 본 연구는 AAV-LK03 캡시드의 안정성이 아니라, 지속된 hFVIII 발현의 안정성을 평가하기 위해 고안되었다.
3개 용량의 사용된 AAV-SPK-8005-hFVIII (4x1010, 8x1010, 1.6x1011 vg/마우스; 대략 1.6x1012, 3.2x1012, 6.4x1012 vg/kg, 25g의 마우스 체중을 기준으로 함)을 각각 약 5-25, 25-75, 및 50-150% hFVIII 항원 수준을 발생시키도록 선택하였다. 이 연구는 350마리의 수컷 NOD/SCID 마우스(표 1)를 포함하며, 2개의 하위-연구로 나누었다: 주요 연구(n=270) 및 생분석 연구(n=80). 주요 연구에서, 60마리 마우스를 비히클 또는 벡터(4x1010, 8x1010, 1.6x1011 vg/마우스)의 3가지 용량 중 하나로 처리하였다. 10마리 마우스를 임상 화학의 29/30일 평가에 사용하고, 10마리는 혈액학에 사용하고, 나머지 10마리 동물에 대해서는 응고 평가를 수행하였다. 이들 30마리 마우스를 29 또는 30일에 희생시켰다. 비히클 또는 3개 벡터 용량 중 하나로 처리된 30마리 마우스의 다른 군을 87일 시점에서 유사하게 취급하였고, 이들을 87일에 희생시켰다. 종결시, 주요 연구에서의 모든 동물에 대한 육안적 병리학 관찰을 수행하고, 종합적 조직병리는 시점 당 10마리 동물/코호트에 대해 수행하였다 (혈액학 서브세트). 30마리의 나이브 마우스의 또 다른 코호트는 배경 대조군 임상 병리 측정에 사용하였다.
생분석 연구에서, 20마리 마우스에 비히클 또는 3가지 벡터 용량 중 하나를 주입하였다. 이들 동물들을 시험 물품 주입 전에 15일, 30일, 60일 및 87일에 연속적으로 출혈시켰다. 각 샘플에 대해 수집된 혈장의 의도된 용적은 hFVIII 항원 및 D-다이머 수준 둘 모두의 측정에 충분하였다. 그러나, 불충분한 혈장 부피 수집으로 인해, 종결 시점을 제외하고는 모든 시점에서 개별 마우스 혈장에 대해 단지 단일 검정만이 수행되었다. 따라서, 몇몇 마우스는 hFVIII 항원 순환 수준에 대해 평가되었으며, 다른 마우스는 D-다이머 마우스 수준에 대해 평가되었다. D-다이머 ELISA(최소 20 uL)보다 hFVIII ELISA(최소 50 uL)를 수행하는데 더 많은 혈장이 요구되기 때문에, 검정 선택은 수집된 혈장 용적에 따라 결정되었다.
표 1: 마우스 연구 디자인
Figure pct00001
a. 연구 15, 30, 60 및 87일에 사전 용량으로 모든 마우스로부터의 혈액을 수집하였다.
b. 혈액을 총 30마리 마우스로부터 수집하였다 (임상 병리 평가 당 10마리의 나이브 마우스). 배경 대조군 수준에 대한 임상 병리-주요 연구.
c. AAV-SPK-8005-hFVIII은 또한 SPK-8005로 명명됨.
na = 적용 불가능.
혈장 FVIII 항원 수준: 도 3A-3B에 나타낸 바와 같이, 87일 과정에 걸쳐 hFVIII 항원의 순환 수준에서 용량-반응이 관찰되었다. 저용량 벡터(4x1010 vg/마우스)에서, 64+/-49 ng/ml의 평균 hFVIII 수준이 주입 후 60일에 관찰되었으며, 115+/-60 ng/ml 및 273+/58 ng/ml가 각각 중간 용량 및 고용량에서 관찰되었다. 이들 항원 수준은 정상 hFVIII 항원의 43, 77 및 182%를 나타낸다 (150 ng/mL은 100%에 해당함). 따라서, 지혈 정상인 NOD/SCID 마우스에서, 각각 세 용량 수준에서 143%, 177% 및 282%의 총 (마우스+인간) FVIII 수준이 예상될 것이다. 따라서, AAV-SPK-8005-hFVIII를 사용하여, 면역 결핍 마우스의 혈장에서 지속적이고 과생리적인 수준의 hFVIII이 관찰되었으며, 이는 이러한 연구를 hFVIII의 장기간 발현의 안전성 평가에 적합하게 하였다.
D- 다이머 수준: 지혈 정상이나 면역결핍된 마우스에서 hFVIII의 지속적인 발현으로 인한 혈전형성 가능성을 평가하기 위해, D-다이머 항원 수준을 측정하였다. 50마리 나이브 마우스 중 D-다이머의 평균 투여전 수준은 8.8 +/- 2.9 ng/ml이었다. 도 3c의 데이터는 4가지 용량 코호트에서 평균 D-다이머 수준을 나타낸다. 모든 5개 시점에서 코호트 간의 D-다이머 수준에서의 통계적 차이는 존재하지 않았다 (1 방법 ANOVA p=0.46). 수준들에서 hFVIII의 지속된 발현은 정상의 194% 만큼 높았으며(30일), 적어도 87일 동안 이러한 계통의 마우스에서 D-다이머의 증가된 수준과 관련이 없는 것으로 결론지었다.
임상 및 해부학적 병리학: 이 연구 과정 동안 조기에 안락사되었거나 죽은 것으로 발견된 동물이 9마리였다 (6가지 주요 연구 및 3가지 생분석 연구).
6마리 주요 연구 동물을 조직병리학적으로 평가하고, 한 마리의 비히클 대조군-주입된 마우스를 포함하는 이들 6마리 마우스 중 4마리에서 악성 림프종이 관찰되었다. (군 1 동물 7729마리, 군 3 동물 7871마리, 군 3 동물 7880마리, 및 군 3 동물 7874마리). 신생물 발견의 생물학적 중요성은 모호한 것으로 간주되었다. 대조군에 대한 개별 군 비교의 통계학적 유의성은 거의 없는 것으로 간주되었다. 흉선 림프종의 높은 자발적 빈도는 물론 비장 및 림프절의 신생물 확대가 이러한 계통에서 발생하는 것으로 알려져 있다 (Prochazka, Gaskins, Shultz, & Leiter, 1992).
이러한 6마리 마우스에는 시험 물품과 관련된 비-신생물 소견이 없었다. 관찰된 현미경 소견은 부수적이며, 이러한 계통 및 연령의 마우스에서 흔히 관찰되는 성질인 것으로 간주되었고/거나, 대조군 및 처리된 동물에서 유사한 발병율 및 중증도를 가지며, 따라서 AAV-SPK-8005-hFVIII의 투여와 무관한 것으로 간주되었다.
주요 연구에 포함된 나머지 234마리 마우스는 예정된 시점까지 생존하였다. 연구 전반에 걸쳐 마우스에서 해로운 또는 AAV-SPK-8005-hFVIII-관련 임상 관찰은 발생하지 않았다. 옴 형성, 모피 손실 또는 얇은 덮개 및 구부러진 꼬리의 모든 임상 관찰은 AAV-SPK-8005-hFVIII의 투여와 관련이 없는 것으로 간주되었는데, 왜냐하면 이러한 관찰은 이러한 마우스 종에서 일반적이고/거나 군 전반에 걸쳐 발생하기 때문이다. 체중 및 체중 증가는 용량 군들에서 유사하였으며, AAV-SPK-8005-hFVIII의 투여에 의해 영향을 받지 않았다. 32일부터 연구 완료까지 군 4의 평균 체중의 명백한 유의한 (p<0.05 또는 p<0.01) 감소는 29/30일 안락사 후 군 체중의 재분배에 기인하였으며 (군1과 비교하여 군 4에서 일부 더 무거운 동물을 안락사시킴), AAV-SPK-8005-hFVIII 투여와 관련이 없었다. 군 4 마우스는 연구 전반에 걸쳐 다른 군과 유사한 방식으로 체중이 증가하였다. 평균 체중 또는 체중 증가의 모든 다른 유의한 (p<0.05 또는 p<0.01) 차이는 AAV-SPK-8005-hFVIII와 관련되지 않았는데, 왜냐하면 이러한 증가 및 감소는 마우스 체중에서 용량 비의존적으로 산발적이었으며 마우스 체중의 정상적인 변동과 관련이 있는 것으로 간주되었기 때문이다.
임상 병리학은 주요 연구 동물에서 수행하였다. 임상 화학 변수는 시점 당 10마리 마우스/코호트(29/30일 및 87일)에 대해 분석하였다. 응고 평가는 10마리 마우스/코호트의 또 다른 군에서 수행하였으며, 혈액학적 측정은 10마리 마우스/코호트의 다른 군에서 수행하였다. 육안 병리는 모든 동물에 수행하였으며, 조직병리는 혈액 평가를 위해 사용된 10마리 마우스의 군에서 수행하였다. 29/30일 및 87일 안락사 시점의 어느 하나의 마우스에서 혈액학 또는 임상 화학 변수의 AAV-SPK-8005-hFVIII-관련 변화는 없었다. 일반적으로, 대조군 값과 비교하여 혈액학 및 임상 화학 변수에서의 유의한 (p<0.05 or p<0.01) 차이가 존재하는 경우, 차이는 AAV-SPK-8005-hFVIII와 관련되지 않았는데, 왜냐하면 해당 변수는 영향을 받지 않았으며 관찰은 용량-의존적이지 않았기 때문이다. 임상 화학 및 혈액학 변수에서의 모든 변화는 산발적이고/거나, 단일 동물에 기인한 것이고/거나, 실험실 동물에서 보통 관찰되는 변화 정도이고/거나 나이브 동물에 대해 평가된 임상 병리 변수에 속한다.
응고 변수 변화가 AAV-SPK-8005-hFVIII 투여된 마우스에서 관찰되었다. 평균 aPTT의 용량-의존적 감소가 29/30일 시점에서 관찰되었으며, 군 3 및 4 값은 대조군 값과 유의하게 (p<0.05 또는 p<0.01) 상이하였다. 평균 aPTT 값의 유의한 (p<0.01) 감소가 또한 87일 시점에서 대조군과 비교하여 모든 AAV-SPK-8005-hFVIII 군에서 관찰되었다. 대조군과 비교하여 감소된 평균 프로트롬빈 시간이 또한 29/30일 및 87일에 AAV-SPK-8005-hFVIII 군에서 관찰되었으나, 이러한 감소는 단지 29/30일에서는 군 2 및 3에 있어서 및 87일에는 군 4에 있어서 통계학적으로 유의하였다 (p<0.05 또는 p<0.01). 평균 피브리노겐 값은 연구 전반에 걸쳐 용량 군 간에 유사하였다. 이러한 효과는 AAV-SPK-8005-hFVIII의 약리학적 효과와 관련되는 것으로 간주되며, 부작용으로 간주되지 않았다. 도 3A-3C에 도시되고 상기 논의된 바와 같이, AAV-SPK-8005-hFVIII 주입된 모든 마우스는 hFVIII 항원을 발현하였으며, 따라서 총 FVIII의 상계생리학적 수준이 이러한 지혈 정상 마우스의 혈장에서 순환하는 것으로 예측된다. 이러한 수준은 응고 변수 예컨대, 감소된 aPTT 및 프로트롬빈 시간에 대한 효과를 가질 것으로 예측될 것이다.
120마리 주요 연구 마우스 (30/코호트) 군을 연구 29 또는 30일에 희생시켰다. AAV-SPK-8005-hFVIII와 관련된 육안적 병리 관찰은 이들 마우스에서 이루어지지 않았다. 기관 중량의 분석은 29일에 희생된 10마리 대조군 및 벡터-주입된 동물 사이에 심장 및 신장의 절대 중량이 상이함을 나타냈으며; 그러나, 이는 30일에 희색된 10마리 대조군 및 벡터-주입된 동물에서는 관찰되지 않았으며, 따라서 이러한 발명의 유의성은 불분명하다. 29일에 관찰된 심장 및 신장 절대 중량 (및 이러한 중량은 뇌 중량의 퍼센트로 나타냄)의 통계학적으로 유의한 증가와 현미경적 상호관계가 없었다. 게다가, 체중의 퍼센트로서의 심장 및 신장 중량은 대조군과 유의하게 차이나지 않았다. 군 2 동물에서 평균 절대 폐 중량에는 유의한 증가가 있었으나, 이는 산발적이며 AAV-SPK-8005-hFVIII와 관련되지 않은 것으로 간주되었는데, 왜냐하면 이는 용량 의존적이지 않았기 때문이다. 29/30일에 다른 기관 중량 변화가 관찰되지 않았다.
29/30일에서 조직병리학적 분석시, 신생물이 발견된 동물이 5마리였다. 세기관지폐포 선종은 1마리 군 2 동물(7824)에서 관찰되었다. 악성 림프종이 1마리 군 2 동물(7838), 1마리 군 3 동물(7885), 및 1마리 군 4 동물(7941)에서 관찰되었다. 선종은 1마리 군 4 동물(7942)의 위에서 관찰되었다. 군 1에서는 신생물 발견이 관찰되지 않았다. 신생물 발견의 생물학적 유의성은 모호한 것으로 간주된다. 대조군대비 개별 군 비교의 통계학적 유의성은 거의 없다. 그러나, 신생물 발견은 29/30일에서 처리된 동물에서만 관찰됨이 주목할 만하다. 유사한 연령의 NOD SCID 마우스에 있어서 과거 대조군 데이타의 부재시, 이러한 신생물 발견은 결정적이지 않다.
시험 물품-관련 비-신생물 현미경 발견은 관찰되지 않았다. 관찰된 현미경 소견은 부수적이며, 이러한 계통 및 연령의 마우스에서 흔히 관찰되는 성질인 것으로 간주되었고/거나, 대조군 및 처리된 동물에서 유사한 발병율 및 중증도를 가지며, 따라서 AAV-SPK-8005-hFVIII의 투여와 무관한 것으로 간주되었다.
또 다른 군의 120마리 주요 연구 마우스(30/코호트)를 주입 후 87일에 희생시키고 유사한 방식으로 분석하였다. AAV-SPK-8005-hFVIII와 관련된 것으로 간주된 육안의 병리학적 관찰이 보여지지 않았으나, 4마리 마우스에서 병변이 관찰되었다 (조직학적으로 분석되지 않은 하나의 커진 흉선, 악성 림프종과 관련된 하나의 커진 흉선, 조직학적으로 분석되지 않은 하나의 커진 비장, 하나의 탈색된 고환). 29/30일에 관찰된 것과 대조적으로, 감소된 심장 중량, 증가되지 않은 중량이 관찰되었다. 또한, 간 중량 감소가 관찰되었다. 통계학적으로 유의한 심장 중량 변화는 적었으며 용량과 명백하게 관련되지 않았다. 절대 간 중량에서의 통계학적으로 유의한 변화는 적었으며, 체중 및 뇌 중량에 대한 간 중량은 군 간에 비슷하였다. 따라서, 약간의 변화는 우발적이며 AAV-SPK-8005-hFVIII와 무관한 것으로 해석되었다. 87일에 다른 기관 중량 변화가 관찰되지 않았다.
주입 후 87일에 마우스에서 수행된 조직병리에 의해 신생물이 발견된 4마리 동물을 확인하였다. 악성 림프종이 1마리 군 2 동물(7808) 및 3마리 군 3 동물(7868, 7869 및 7870)에서 관찰되었다. 군 1에서 신생물 발견이 관찰되지 않았다. 신생물 발견의 생물학적 중요성은 모호한 것으로 간주된다. 대조군 대비 개별 군 비교의 통계학적 유의성은 거의 없다. 그러나, 신생물 발견은 87일에서 처리된 동물에서만 관찰됨이 주목할 만하다. 유사한 연령의 NOD SCID 마우스에 있어서 과거 대조군 데이타의 부재시, 이러한 신생물 발견은 결정적이지 않다.
비-신생물 변화와 관련하여, 시험 물품-관련된 현미경 소견이 관찰되지 않았다. 관찰된 현미경 소견은 부수적이며, 이러한 계통 및 연령의 마우스에서 흔히 관찰되는 성질인 것으로 간주되었고/거나, 대조군 및 처리된 동물에서 유사한 발병율을 가지며, 따라서 AAV-SPK-8005-hFVIII의 투여와 무관한 것으로 간주되었다.
결론: 4x1010, 8x1010, 또는 1.6 x1011 vg/마우스 투여량의 AAV-SPK-8005-hFVIII, 또는 대조군 물품의 수컷 NOD/SCID 마우스로의 정맥내 주입에 의한 단일 투여를 잘 견뎌냈다. AAV-SPK-8005-hFVIII는 어떠한 시험 물품과 관련된 사망률, 불리한 임상적 관찰 또는 체중의 변화를 초래하지 않았다. 29/30일 또는 87일에 수컷 마우스에서 기관 중량, 혈액학 또는 응고 변수의 독물학적으로 중요한 차이 및 치료-관련된 육안의 병리학적 또는 조직병리학적 소견이 존재하지 않았다. 두 안락사 시점 모두에서 관찰된 평균 aPTT 및 프로트롬빈 시간의 감소는 이러한 지혈 정상 마우스에서 발현되는 상계생리학적 수준의 FVIII와 관련된 것으로 간주되었으며, 부작용은 아니다. 주요 연구(말단 평가)에서 60마리 벡터-주입된 마우스 중 9마리 또는 15%의 동물에서 악성종양이 관찰되었다. 이러한 9마리 마우스 중 7마리는 림프종을 가지며, 이는 림프절에서 가장 흔하게 관찰되었다. 이러한 면역결핍 마우스 계열은 높은 자발적 빈도의 림프종을 가지며(Prochazka et al., 1992), 단지 8.5개월의 수명을 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 연구에서 관찰된 종양의 빈도는 AAV-SPK-8005-hFVIII 투여와 관련이 없는 것으로 보인다. 이 연구의 목적은 약 3개월의 과정에 걸쳐 hFVIII의 지속된 발현의 안전성을 평가하기 위한 것이었다. 이는 AAV-SPK 캡시드를 평가하도록 설계되지 않았다. AAV-SPK 및 면역결핍 마우스 계통을 hFVIII의 높은 발현 수준을 보장하는데 사용하였다. NOD/SCID 마우스로의 AAV-SPK-8005-hFVIII의 투여는 hFVIII의 지속되고 높은 수준을 유도하였다. 따라서, 이 연구는 hFVIII의 장기간 발현의 안전성을 평가하는데 적절하였다.
실시예 4
비-인간 영장류( NHP )에서 AAV - SPK -8005 및 AAV - SPK -8011(LK03 캡시드, FVIII-X07 ( SEQ ID NO:7 )) 벡터의 평가
마우스의 결과에 근거하여, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터 내로 패키징된 FVIII 전이유전자 작제물을 비-인간 영장류(NHP)에 전달하였다.
간략하게는, AAV-SPK-8005 또는 AAV-SPK-8011(LK03 캡시드)이 단일 정맥내 주입으로 투여된 수컷 사이노몰거스 마카크에서 용량-범위 연구. hFVIII의 발현은 8주에 걸쳐 평가되었다. 동물 군 및 각각의 투여량 수준은 도 4에 도시되어 있다.
교정된 주입 펌프를 사용하여 복재 정맥을 통해 정맥내 주입으로 약 30분에 걸쳐 NHP에 투여하였다. AAV 캡시드에 대한 중화 항체에 대해서 마카크를 사전검사하였다. 모든 처리된 동물은 처음에는 벡터 투여 전 <1:3 역가를 갖는 것으로 측정되었다. 낮은 역가라도 전신 전달 후 간 세포에 의한 벡터 흡수를 억제하기 때문에 이는 성공적인 간 형질도입을 보장하기 위해 수행되었다 (Jiang et al. 2006). 모든 동물은 또한, 유전자 전달 전에 FVIII에 대한 중화 항체의 존재에 대해 음성이었다.
hFVIII의 혈장 수준을 사이노몰거스 내인성 FVIII을 검출하지 않는 인간-특이적 ELISA에 의해 측정하였다. 중간 용량 코호트의 1마리 마카크를 제외한 본 연구의 모든 동물은 벡터 전달 후 hFVIII을 발현하였다. 인간 인자 VIII 항원 수준은 벡터 투여 후 약 1-2주에 최고조에 달하였다. 유전자 전달 후 1주에, 2x1012 vg/kg의 AAV-SPK-8005가 형질도입된 NHP는 13.2 ± 3%(평균 ± 평균의 표준 오차)의 hFVIII 항원 수준을 발현하였다. 유전자 절단 후 1주에, 다음 처리 코호트 (5x1012 vg/kg)의 3마리 동물 중 2마리에서 평균 hFVIII 수준은 27±0.2%이었다. 인간 FVIII은 어느 시점에서도 이러한 코호트의 세 번째 마카크에서는 검출될 수 없었다. 기저선 혈장 샘플의 재-시험시, 이 동물은 실제로 항-AAV 항체의 존재에 대해 양성이며, <1:3의 초기 결정된 역가가 부정확한 것으로 결정되었다. 최종적으로, 1x1013 vg/kg의 가장 높은 시험된 용량에서, 54.1±15.6%의 피크 hFVIII 항원 수준이 AAV 주입 후 관찰되었다.
인간 FIX를 발현하는 NHP에서의 연구에 의해 예상되는 바와 같이, 약 4주에 동물의 약 3분의 1에서 인간 FVIII 발현이 감소되었으며, 이러한 3마리 마카크에서 hFVIII에 대한 억제제 항체의 출현이 수반되었다 (도 5에서 ε 심볼로 표시됨). hFVIII에 대한 종-특이적 항체의 발달은 비-인간 영장류에서 이전에 보고되었으며, 이는 아마도 인간 전이유전자 생성물과 내인성 사이노몰거스 FVIII 간에 몇몇개의 아미노산 잔기 차이로 인한 것으로 보인다(McIntosh, J. et al., Blood 121:3335-44 (2013)).
인간 FVIII의 연속 발현으로 인한 잠재적 혈전형성을 평가하기 위해, D-다이머 항원 수준을 본 연구에서 측정하였다. 사이노몰거스 마카크에서 D-다이머 항원 수준의 임상적 관련성 또는 심지어 정상적인 값에 대한 보고서가 부족함을 주지해야 한다; 참조로서, 인간에서 D-다이머에 대한 정상 범위는 500 ng/ml 미만이다. 동물이 내인성 사이노몰거스 FVIII을 발현하기 때문에, 간 유전자 전이의 결과로서 hFVIII의 생성은 상계생리학적 수준의 FVIII 활성을 초래할 것이다.
5x1012 vg/kg으로 투여되었으나 인간 FVIII을 발현하지 않은 동물은 AAV 주입 후 2주에 863 ng/ml의 피크를 가졌다. 나머지 동물은 기저선 값과 비교하여 D-다이머 항원 수준에서의 어떠한 유의한 증가도 나타내지 않았다. 종합하면, 이러한 결과는 본 연구에서 표적화된 수준의 인간 FVIII의 발현이 혈전증의 증가된 위험과 관련이 없음을 시사한다.
벡터 투여 후 4주째에, 벡터-관련된 변화가 분명하지 않았다. 간 기능 시험은 정상 값을 보여주었으나, 벡터 용량과 관련되지 않은 것으로 보이는 작은 변동을 갖는데, 이들은 대부분의 경우에 투여 전에 존재하였기 때문이다(도 6).
5주까지의 D-다이머 수준은 도 7에 도시되어 있다. 순환하는 인간 FVIII이 약 100%에서 피크에 도달할 때, 고용량 코호트에서 1마리 동물은 벡터 투여 후 1주째에 D-다이머의 약간(577 ng/ml)의 일시적 증가를 가졌으며; D-다이머 수준은 이러한 단일의 상승 측정 후 정상으로 빠르게 돌아왔다. 특히, D-다이머 수준과 hFVIII 항원 수준 간에서 상관관계가 없었다(도 7, 하단 패널).
AAV-SPK-8011 (LK03 캡시드) 벡터의 경우, 3개 코호트의 사이노몰거스 마카크(n=3)를 AAV-SPK-8011 (LK03 캡시드)의 용량을 증가하면서 처리하였다 (2x1012, 6x1012 및 2x1013 (vg/kg);도 4). 동물을 임상 관찰, 체중 임상 병리(임상 화학, 혈액학, 응고, 요검사)에 대해 모니터링하였다. 또한, hFVIII 항원 수준, FVIII 억제 항체 및 D-다이머 수준을 연구 전반에 걸쳐 평가하였다.
hFVIII 항원 데이터는 도 9에 도시되어 있다. 평균 hFVIII 항원 수준이 약 2-3주에 피크를 나타내었는데, 100% 정상 hFVIII 항원 수준으로서 150 ng/ml을 사용하여 저용량의 코호트에서는 22.3±6.2% hFVIII이 관찰되고, 중간 용량 및 고용량 코호트에서는 61.6±15.7% 및 153±58.1%가 관찰되었다 (도 9A-9D). 따라서, LK03 AAV 캡시드 혈청형은 생체내에서 마우스 간과 달리 NHP 간세포를 효율적으로 형질도입시켰다.
AAV-SPK-8011(LK03 캡시드)로 획득된 FVIII 발현 수준들을 FVIII 전달을 위한 AAV5 및 AAV8 캡시드 기반 AAV 벡터로 획득된 보고된 FVIII 수준과 비교하였다. 비교는 AAV-SPK-8011 (LK03 캡시드)로 달성된 FVIII 수준이 AAV5 및 AAV8 캡시드를 갖는 AAV 벡터에 의해 전달된 FVIII의 보고된 수준 보다 더 큼을 나타냈다(도 10).
사이노몰거스 마카크의 혈장 중 hFVIII에 대한 체액 반응을 2x1012, 6x1012 또는 2x1013 vg/kg의 AAV-SPK-8011(LK03 캡시드)의 투여 후 측정하였다. 동물을 기저선 및 지시된 시점에서 ELISA에 의해 항-hFVIII IgG 항체에 대해 평가하였다.
유전자 전달 직 후 관찰된 치료적 hFVIII 수준에도 불구하고, 대부분의 동물에서, 수준이 약 4주 정도 감소하기 시작하였다. 이는 또 다른 AAV-hFVIII 벡터를 사용한 이전 연구와 일관되고, 항-hFVIII 항체의 증가와 관련이 있다. NHP에서 간 AAV-hFVIII 유전자 전달 후 항-FVIII 항체의 생성은 다른 사람에 의해서도 관찰되었다(McIntosh, J. et al., Blood 121:3335-44 (2013)).
실시예 5
비-인간 영장류( NHP )에서 AAV -LK03 캡시드의 생체분포.
비-인간 영장류에서 AAV-LK03 캡시드의 생체분포를 비-GLP 연구에서 평가하였다. 인간 응고 인자 IX (AAV-LK03-hFIX)를 인코딩하는 AAV-LK03-캡슐화된 벡터의 정맥내 투여는 2개의 주요 표적 조직이 간 및 비장임을 보여 주었다(도 11). 비장 향성은 AAV-LK03의 독특한 특징은 아니다. 예를 들어, 강력한 안전성 기록을 갖는 수개의 간-지시된 유전자 요법 시험(예를 들어, NCT02396342, NCT02082860, NCT02576795)에 사용된 AAV5 캡시드는 비-인간 영장류의 간을 표적으로 하는 것보다 효능이 높지 않는 경우, 동일하게 비장을 표적으로 한다(Paneda et al. 2013). SPK-8011 발현 카세트는 간-특이적인 것으로 간주되는 마우스 트랜스티레틴 또는 TTR 프로모터를 사용한다 (Costa, 1991). 프로모터의 간-특이적 특성을 추가로 지지하기 위해, PCR-기반 발현 분석은 SPK-8011 (즉, AAV-SPK-8005)과 동일한 발현 카세트를 패키징하는 상이한 AAV 벡터의 투여 후 마우스의 간 및 비장에서 벡터-유래된 FVIII 발현을 측정하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, 비장에서 인간 FVIII 발현은 간세포로부터 유래된 것과 비교하여 수십배 더 낮다.
이는 AAV-LK03을 사용한 첫 임상 연구였으며, 그러나, 혈우병 B에 대한 수개의 벡터(NCT02396342, NCT01620801 NCT00076557, NCT02484092, NCT02618915, NCT00979238, NCT01687608)와 혈우병 A 에 대한 하나의 벡터(NCT02576795)를 포함하는 다른 AAV 벡터를 사용하여 연구가 진행되었다. 유니버시티 칼리지 런던(University College London)과 공동으로 세인트 쥬드 칠드런스 리서치 하스피털(St. Jude Children 's Research Hospital)에서 수행한 연구는 코돈 최적화된 인간 인자 IX cDNA인 scAAV2/8-LP1-hFIXco를 인코딩하는 자가-상보적 게놈을 수반하는 AAV8 벡터를 활용하였다. 벡터를 투여받은 10명의 대상체는 3.2년의 중간값을 통해 1-6%의 안정한 인자 IX 수준을 가졌으며, 모든 참가자는 예방적 요인 대체 사용을 중단하거나 감소시켰다(Nathwani et al. 2014). 혈우병 A에 대한 임상 연구는 인간 FVIII을 인코딩하는 AAV5 캡시드화된 벡터(NCT02576795)를 사용하였다. 2016년에 제시된 예비 데이터는 여러 명의 대상체에서 유전자 전달 후 2-60% 범위의 FVIII 활성 증가를 입증하였으며, 최대 16주까지 추적 조사하였다(BioMarin, April 2016).
실시예 6
시험관내 설정에서 분석된 AAV -LK03 캡시드의 유전자도입 효율.
사이노몰거스 마카크 및 인간 기원으로부터의 일차 간세포를 세포 당 500 내지 62,500개 벡터 게놈 범위의 4개의 상이한 감염 다중도(MOI)에서 루시퍼라제를 발현하는 AAV-LK03 벡터로 형질도입시켰다. 형질도입 후 72시간에, 루시퍼라제 발현을 분석하였다.
AAV-LK03 캡시드가 유일하게 배양물에서 인간 간세포를 형질도입시키는데 있어서 현저하게 높은 효율을 나타냈다. 도 13에 도시된 대표적인 예에서, LK03은 시험관내에서 비-인간 영장류 간세포와 비교하여 인간 간세포를 형질도입시키는데 있어서 약 5배 더 높은 효율을 입증하였다. 중요하게는, 이러한 결과는 다중 MOI 및 복제 연구에 걸쳐 일관된다.
실시예 7
벡터-인코딩된 서열의 생식선 전이의 평가.
벡터-인코딩된 서열의 생식선 전이 가능성에 대한 평가는 유전자 전달 전략의 임상 번역에 중요하다. 이러한 연구를 하기 목적으로 설계되었다: (1) AAV-SPK 및 AAV-LK03의 정액으로의 확산을 평가하고 벡터 제거의 동태를 평가하기 위해; 및 (2) 토끼로의 AAV 투여가 성공적이었음을 보장하기 위해(이는 혈장에서 인간 인자 IX 항원 및 항-FIX 항체의 분석에 의해 확인됨).
본 연구에서, 2개의 벡터 캡시드 즉, AAV-SPK 및 AAV-LK03의 정액으로의 벡터 확산을 분석하기 위해 토끼 모델을 사용하였다 (표 2). 정액으로의 AAV-SPK의 확산은 용량 및 시간에 모두 의존적인 동태를 보여주었으며, 더 높은 용량은 장기간 동안 정액에서 벡터 서열의 증가된 수준을 보여준다. 동태는 AAV8 벡터로 이전에 관찰된 것과 매우 유사하였다(Favaro P, et al., Molecular Therapy 17:1022-1030 (2009)). 대조적으로, AAV-LK03 벡터를 사용하면 정액으로의 확산이 제한적으로 발생하였다. 이는 AAV-LK03 주입된 마우스에서 더 낮은 전반적 벡터 노출로 인한 것으로 보이지는 않는데, 왜냐하면 AAV-LK03으로부터 노출된 hFIX의 수준은 AAV-SPK 벡터로 관찰된 것과 유사하거나 더 높기 때문이며, 간-유래된 hFIX 발현을 매개하는 능력은 유전자 전이를 위한 대용으로 이용될 수 있다.
표 2: 연구 설계
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* 2개의 상이한 hFIX 코딩 서열을 AAV-SPK 코호트에 사용하였으며, 즉 3마리 동물에는 AAV-SPK-hFIX.C16을 투여하고, 2마리 동물은 AAV-SPK-hFIX.C19-Padua (PD)로 처리하였다. 본 연구의 주요 목표는 2개의 신규한 AAV 캡시드의 생식선 전이를 평가하기 위한 것이기 때문에, 이는 허용가능한 것으로 간주되었다. hFIX.C16 및 hFIX.C19-Padua 전이유전자 간의 주요 차이는 후자가 코돈-최적화되고 높은 특이적 활성 hFIX 변이체를 인코딩한다는 점이다.
방법
동물 및 벡터 : 뉴질랜드 흰 토끼는 코밴스 리서치 프로덕츠(Covance Research Products, Denver, PA)에서 획득하였으며, 필라델피아 벡터 코어(Philadelphia Vector Core)의 칠드런 하스피털에서 생산된 AAV 벡터로 6월령에서 처리하였다. 시험 및 대조군 물품은 귀 가장자리 정맥을 통해 투여하였다.
정액 수집 : 아르구스 리써치 랩, 인크.(Argus Research Lab, Inc.) (Horsham, PA)의 연구원에 의해 개발된 인공 질(AV)을 사용하여 정액을 수집하였다. 팁이 제거되고 수집 튜브가 부가된 콘돔으로 AV를 라이닝시키고, AV를 온수(55℃)로 채웠다. 정액 샘플은 티저 도우(teaser doe)에 의해 자극된 프랙티스드 벅(practiced buck)로부터 얻었다. 샘플을 주사 전 및 주사 후 1, 2, 4, 6, 8, 및 10주 및 3-8개월에 수집하였다. 정액 샘플을 검증된 실시간 정량 PCR 검정법을 이용하여 벡터 복사체 수를 분석하기 위해 찰스 리버 라보라토리스(Charles River Laboratories) (Reno, NV)로 운송하였다.
혈액 샘플 수집 : 혈액을 AAV 투여 전 및 다중 시점 (주사 전, 주사 후 1주 및 1-6개월)에서 내측 귓바퀴 동맥 또는 가장자리 귀 정맥 천자에 의해 수집하였다. 각 샘플을 수집 후 얼음에 놓고 혈장 처리하고 Sponsor로 운송될 때까지 -80℃냉동고에서 보관하였으며, Sponsor에서는 검정을 수행할 때 까지 또한, -80℃ 냉동고에서 보관하였다.
인간 인자 IX 수준: 토끼 혈장 중 인간 FIX(hFIX) 단백질의 수준을 하기와 같이 샌드위치-스타일 FIX ELISA 키트(Affinity Biologicals, FIX:EIA)를 사용하여 정량화하였다: 먼저, 미세적정 플레이트의 웰을, hFIX를 인식하나 내인성 토끼 FIX(1:1000 희석)와 교차-반응하지 않은 포획 항체로 코팅시켰다. 공지된 인간 hFIX 농도를 갖는 기준 혈장을 희석하여 표준 곡선을 생성시켰다 (최고 표준 [500 ng/ml]을 7.8 ng/ml로 연속으로 희석하였다). 샘플 혈장을 흡광도 값이 표준 곡선 범위 내에 있도록 예측된 농도에 따라 희석하였다. 샘플을 웰에 첨가한 후, 플레이트를 90분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 그 후 3회 세척하였다. hFIX에 대한 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-컨쥬게이팅된 2차 항체를 플레이트에 첨가하여 포획된 FIX에 결합시켰다 (1:100 희석). 비결합된 컨쥬게이팅된 항체를 제거하기 위해 플레이트를 세척한 후, 퍼옥시다제 활성을 1-Step Ultra TMB Substrate (Thermo Scientific, 카탈로그 번호 34028)와 인큐베이션한 후 측정하였다. 반응을 1M 황산으로 중단시키고 450nm의 흡광도 설정시 SpectraMax M2e 마이크로플레이트 판독기에서 판독하였다. 얻어진 흡광도 값은 샘플에 존재하는 hFIX의 농도에 비례하였다.
항- hFIX 항체 수준 : 항-hFIX 검정은 상기 설명된 hFIX ELISA와 개념적 및 방법론적으로 유사하였다. 요약하면, 플레이트를 1 μg/ml의 재조합 hFIX(Benefix, Wyeth)로 코팅하였다. 혈장 샘플의 인큐베이션 후, 염소 항-토끼 IgG HRP-컨쥬게이팅된 항체(SIGMA, A4914)를 검출에 사용하였다. 기저선 측정보다 2-배 높은 IgG 수준을 갖는 샘플은 양성으로 간주되었다.
결과
정액으로의 벡터 확산
뉴질랜드 토끼에 ApoE/hAAT 간-특이적 프로모터의 조절하에 hFIX를 발현하는 AAV-SPK 또는 AAV-LK03 (군 당 n = 5)을 두 용량으로 주입하였다: 1x1012 vg/kg (저용량) 또는 1x1013 vg/kg (고용량). 모든 토끼로부터의 정액 샘플을 주사 전 및 주사 후 1, 2, 4, 6, 8, 및 10주 및 3-8개월에 획득하였다. 게놈 DNA를 정액 샘플로부터 정제하고 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(Q-PCR) 검정을 이용하여 hFIX 서열의 존재에 대해 분석하였다. 검증된 검정은 찰스 리버 라보라토리스(Charles River Laboratories)(Reno, NV)에 의해 개발되었다. 정액 샘플은 이들이 정량화 하한치(LLOQ) (약 200 ng/반응에서 10 복사체/반응 또는 50 복사체/μg)를 초과하는 검출가능한 hFIX 수준을 갖는 경우 양성으로 간주되었다. 적어도 3개의 연속된 시점에서 hFIX 벡터 서열에 대해 음성인 토끼로부터의 정액 샘플은 더 이상 분석되지 않았다.
모든 벡터 및 비히클-주입된 동물로부터의 전처리 정액 DNA는 hFIX 서열에 대해 음성이었다. 저용량의 AAV-SPK-hFIX (1x1012 vg/kg)가 주입된 토끼로부터의 정액은 일반적으로 hFIX 서열에 대해 음성이었으며, 단 1-4주에서 낮은 수준을 갖는 3마리 동물은 제외된다 (최대 3151 복사체/μg DNA 또는 ~ 1x10-2 복사체/반수체 게놈). 4주 이후 수집된 샘플은 벡터 서열에 대해 양성이 아니었다 (표 3). AAV-SPK-hFIX (1x1013 vg/kg))의 높은 용량에서 더 높은 수준의 벡터가 존재하였고 (최대 178,352 복사체/μg DNA 또는 0.59 복사체/반수체 게놈), 5마리 동물 간에 최대 5개월로 제거되는데 오래 걸렸다(표 3). 한 마리 동물(1주)를 제외하고, 저용량의 AAV-LK03-hFIX로 처리된 토끼는 hFIX 서열의 정액으로의 확산을 보여주지 않았다(표 3). 또한, 정액으로의 매우 적은 벡터 확산이 10-배 더 높은 용량에서 관찰되었으며, 3마리 동물은 모든 시점에서 어떠한 hFIX 서열도 결여되어 있었으며, 2마리 동물은 2주에서 낮은 수준을 나타냈으나(최대: 392 복사체/ug DNA 또는 1.3x(10-3 복사체/반수체 게놈), 나중 시점에서는 그렇지 않았다(표 3). 2마리 비히믈-주입된 동물중, 한 마리는 1주째(56 복사체/ug DNA) 및 5개월(96 복사체/μg DNA)에서 거짓 소견을 가졌다. 이들 값은 LLOQ 근처이며, 아마도 정액 수집 또는 DNA 준비 단계에서의 오염을 나타낸다.
표 3: 시간에 따른 AAV-SPK 및 AAV-LK03 투여 후 토끼 정액에서 hFIX DNA 서열의 검출.
Figure pct00003
5마리 중 양성 정액 샘플을 갖는 동물의 수.
W=주; M=개월; Ndt=결정되지 않음.
혈장 인간 FIX 항원 수준
순환 hFIX 수준을 표시된 시점에서 상기 기술된 동물로부터 혈장 샘플에서 측정하였다(도 14A-14B 및 표 4).
표 4: 벡터 투여 후 인간 FIX 발현 수준 (ng/ml)
Figure pct00004
Figure pct00005
ND = 검출되지 않음
저용량 코호트에서, AAV-LK03 벡터는 순환 hFIX 수준에 의해 측정할 경우, AAV-SPK와 비교하여 더욱 강력한 벡터인 것으로 나타났다. AAV-LK03 또는 AAV-SPK로 처리한 후 6개월째에, 평균 hFIX 수준은 각각 552±217 ng/ml 대 164±45 ng/ml였다(도 14A). 그러나, 이러한 차이는 아마도 제한된 수의 동물로 인해 통계학적 유의성에 도달하지 못하였다. 흥비롭게도, hFIX 발현은 AAV-SPK 벡터 투여 후 7일째에 검출되지 않은 반면, AAV-LK03으로부터 유래된 강력한 발현이 동일한 시점에서 관찰되었다. 배경 위로 거의 검출할 수 없는 동물 중 두 마리(토끼 #5 및 #15)에서 낮은 hFIX 수준은 실패된 주입으로 인한 것을 수 있다. 분석으로부터 이러한 동물 제거도 통계학적 유의성 결여를 변화시키지 못하였다.
2개의 캡시드는 고용량에서 시험할 경우 동등하게 효능이 있는 것으로 나타났다. 특히, 1x1013 vg/kg의 AAV-LK03 또는 AAV-SPK로의 처리 후 6개월에 평균 hFIX 수준은 각각 2226±868 ng/ml 대 2052±909 ng/ml(도 14b)였다. 중요한 2개의 상이한 hFIX 코딩 서열을 AAV-SPK 군에 사용하였으며, 즉 3마리 동물에는 AAV-SPK-hFIX.C16을 투여하고, 2마리 동물은 AAV-SPK-hFIX.C19-Padua(PD)로 처리하였다. hFIX.C16 및 hFIX.C19-PD 전이유전자간의 주요 차이는 후자가 코돈-최적화되고 높은 특이적 활성 hFIX 변이체를 인코딩한다는 점이며, 이는 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치나, 항원 수준에는 그렇지 않다.
항-FIX 항체
다른 사람에 의한 보고에 따르면, 동물의 약 20-40%는 인간 FIX 벡터에 대한 항체를 발생시킬 것으로 예상되었다(Favaro P, et al., Molecular Therapy 17:1022-1030 (2009)). 도 15A-15B 및 표 5A 및 5B는 본 연구에서 항-AAV IgG 수준을 요약한다. 흥미롭게도, 저용량의 AAV-LK03으로 처리된 5마리 동물 중 3마리는 벡터 투여 후 1개월째에 인간 FIX 항체에 대해 양성이었으나, IgG 수준이 시간이 지남에 따라 감소하였으며, 단지 1마리 동물만이 연구 말기에 기저선 수준의 거의 2배가 되었다(표 5b). 이 군의 토끼에서 항-FIX IgG 출현 및 이후의 제거의 동태는 28일째에 관찰된 hFIX 수준에서 급락에 이어서 순환 hFIX에서의 "리바운드"와 매우 관련되어 있다 (도 14A). 또한, AAV-SPK-hFIX.C19-Padua로 처리된 2마리의 동물에서 hFIX에 대한 높은 항체가 이 두 토끼의 낮은 발현 수준을 설명할 수 있다.
표 5A: 개별 AAV-주입된 토끼에서 인간 FIX에 대한 항체 형성(IgG, ng/ml)의 요약
Figure pct00006
N/A, 이용불가능함
표 5B: 시간 경과에 따른 항-hFIX 항체에 대한 양성 군 당 토끼의 수
Figure pct00007
결론
AAV-SPK 및 AAV-LK03 벡터의 정액으로의 확산은 최대 8개월의 과정에 걸쳐 유효성 검정을 사용하여 정량화하였다. AAV-SPK 벡터 서열은 고용량 벡터의 투여 후 1주째에 모든 5마리 토끼의 정액에서 검출되었다. 대부분의 동물은 10주까지 서열을 제거하였으며, 마지막으로 검출된 양성 샘플은 5개월째에 발생하였다. 이는 동일한 용량 벡터로 토끼에 투여된 AAV8 벡터의 시간 경과와 유사하였다(Favaro P, et al., Molecular Therapy 17:1022-1030 (2009)). 대조적으로, 매우 제한된 AAV-LK03의 분포는 고용량의 이러한 벡터 후 관찰되었으며, 5마리 동물 중 3마리는 어느 시점에서도 정액 중 벡터 서열을 나타내지 않았다. 정액으로의 벡터의 더 낮은 확산은 토끼에서 AAV-LK03의 더 낮은 전반적인 노출로 인한 것 같지 않다. 토끼에 각 AAV가 성공적으로 주입되었는지 확인하는 것은 유전자 전달의 대용물로서 hFIX 혈장 수준을 측정함으로써 입증되었다. 본 연구에서의 고용량(1x1013 vg/kg)에서, hFIX의 유사한 순환 수준이 AAV-LK03 및 AAV-SPK로 주입된 동물에서 관찰되었으며, 이는 벡터가 간 유전자 전달을 매개하는데 동등하게 효능이 있음을 입증한다.
hFIX 전이유전자를 발현하는 AAV2 및 AAV8의 생식선 전달을 평가하는 연구와 일관되게, 일부 동물은 항-hFIX 항체를 발생시키며, 이는 아마도 토끼 및 인간 인자 IX 간의 아미노산 차이로 인한 것으로 보인다.
이러한 결과는 AAV 벡터의 생식선 전이 가능성에 대한 현재 데이터 본문에 추가된다. AAV-SPK는 이전에 조사된 혈청형, AAV2 및 AAV8 벡터와 유사한 패턴을 갖는다(Favaro P, et al., Molecular Therapy 17:1022-1030 (2009)). 즉, AAV 벡터 서열의 정액으로의 용량 의존적 확산이 있으며, 시간 경과에 따라 완전하게 제거된다. 그러나, AAV-LK03은 벡터가 정액으로 거의 분포되지 않는다는 점에서 AAV2, AAV8, 및 AAV-SPK와 상이하며, 이는 잠재적으로 유전독성에 있어서 나머지보다 이러한 벡터 캡시드를 더 안전하게 한다.
실시예 8
AAV-FVIII의 단일 IV 주입의 안전성과 동태를 결정하기 위해 임상 연구를 수행할 것이다. AAV 벡터용으로 사용될 AAV 캡시드는 임상 연구에서 양호한 안전성 및 효능, 임의로 벡터 주입 1-3개월 후 1x1012 vg/kg 또는 그 초과의 용량에서 임상학적으로 관련된 FVIII 활성 수준을 달성하는 능력; 및 AAV8보다 대략 10% 덜 흔한 AAV 캡시드에 대한 중화 항체(Ab)와의 교차 반응을 가짐을 보여줄 것이다. 대표적인 임상 연구의 설계는 표 6에 도시된 바와 같을 수 있다.
표 6: AAV-FVIII 임상 연구 설계
Figure pct00008
Figure pct00009
실시예 9
TTR 프로모터
트랜스티레틴(TTR) 프로모터의 특성 규명은 원래 문헌 [Costa and Grayson 1991, Nucleic Acids Research 19(15):4139-4145]에 기술되어 있다. TTR 프로모터 서열은 TATTTGTGTAG에서 TATTGACTTAG로의 변형된 서열이었다.
4개의 뉴클레오티드 변이( TTRmut )를 갖는 TTR 프로모터 , SEQ ID NO:22
Figure pct00010
Figure pct00011
실시예 10
CpG 감소된 FVIII 엔코딩 전이유전자 작제물 및 예시적 AAV 캡시드
FVIII 인코딩 CpG 감소된 핵산 변이체 X01 ( SEQ ID NO:1 )
Figure pct00012
Figure pct00013
FVIII 인코딩 CpG 감소된 핵산 변이체 X02( SEQ ID NO:2 )
Figure pct00014
Figure pct00015
FVIII 인코딩 CpG 감소된 핵산 변이체 X03(SEQ ID NO:3)
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
FVIII 인코딩 CpG 감소된 핵산 변이체 X04(SEQ ID NO:4)
Figure pct00019
Figure pct00020
FVIII 인코딩 CpG 감소된 핵산 변이체 X05(SEQ ID NO:5)
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
FVIII 인코딩 CpG 감소된 핵산 변이체 X06( SEQ ID NO:6 )
Figure pct00024
Figure pct00025
FVIII 인코딩 CpG 감소된 핵산 변이체 X07( SEQ ID NO:7 )
Figure pct00027
FVIII 인코딩 CpG 감소된 핵산 변이체 X08( SEQ ID NO:8 )
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
FVIII 인코딩 CpG 감소된 핵산 변이체 X09( SEQ ID NO:9 )
Figure pct00031
Figure pct00032
FVIII 인코딩 CpG 감소된 핵산 변이체 X10( SEQ ID NO:10 )
Figure pct00033
Figure pct00034
FVIII 인코딩 CpG 감소된 핵산 변이체 X11( SEQ ID NO:11 )
Figure pct00035
Figure pct00036
FVIII 인코딩 CpG 감소된 핵산 변이체 X12 ( SEQ ID NO:12 )
Figure pct00037
_
Figure pct00038
FVIII 인코딩 CpG 감소된 핵산 변이체 X13 ( SEQ ID NO:13 )
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
FVIII 인코딩 CpG 감소된 핵산 변이체 X14( SEQ ID NO:14 )
Figure pct00042
Figure pct00043
FVIII 인코딩 CpG 감소된 핵산 변이체 X15( SEQ ID NO:15 )
Figure pct00044
Figure pct00045
FVIII 인코딩 CpG 감소된 핵산 변이체 X16( SEQ ID NO:16 )
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
FVIII 인코딩 CpG 감소된 핵산 변이체 X17( SEQ ID NO:17 )
Figure pct00049
Figure pct00050
FVIII 인코딩 CpG 감소된 핵산 변이체 X18( SEQ ID NO:18 )
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
야생형 인자 VIII- BDD cDNA ( SEQ ID NO:19 )
Figure pct00054
Figure pct00055
V3 인자 VIII cDNA ( SEQ ID NO:20 )
Figure pct00056
Figure pct00057
CO3 인자 VIII cDNA ( SEQ ID NO:21 )
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
변이된 TTR 프로모터( TTRmut ), 합성 인트론 , CpG 감소된 인자 VIII cDNA, 폴리 A 및 ITR을 포함하는 전장 카세트 ( SEQ ID NO: 23)
Figure pct00061
Figure pct00062
변이된 TTR 프로모터( TTRmut ), 합성 인트론 , CpG 감소된 인자 VIII cDNA, 폴리 A 및 ITR을 포함하는 전장 플라스미드 (SEQ ID NO: 24)
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
X01-X18 핵산 서열에 의해 인코딩된 FVIII - BDD . SQ 서열 굵은 체/밑줄 ( SEQ ID NO: 25)
Figure pct00068
BDD를 지닌 야생형 FVIII ( SEQ ID NO: 26)
Figure pct00069
AAV -LK03 VP1 캡시드 ( SEQ ID NO: 27)
Figure pct00070
Figure pct00071
AAV - SPK -8005 및 AAV - SPK - hFIX에 사용된 AAV - SPK VP1 캡시드 ( SEQ ID NO: 28)
Figure pct00072
hFVIII 벡터(WT, CO3, X09, X02, X06, X08, X15, X05, X18, X14, X01, X12, X04, X11, X07, X03, X16, X13, X17 및 X10)의 동일성 기질 퍼센트
Figure pct00073
특정 정의/사용된 약어
BDD: 결실된 B 도메인(BD)의 적어도 일부 또는 전부
FVIII-BDD: B 도메인 결실된 FVIII
SQ: SFSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO:29)
FVIII/SQ: SQ를 갖는 FVIII
FVIIIX01-X18: 각각 SEQ ID NO:1-18로서 제시된, CpG 감소된 FVIII 엔코딩 핵산 변이체.
TTRmut: TAmGTGTAG부터 TATTGACTTAG로의 4개의 돌연변이를 갖는 TTR 프로모터
CO3: SEQ ID NO: 21로 제시된, 코돈 최적화된 FVIII 핵산 변이체
NHP: 비 인간 영장류
ALT: 알라닌 아미노트랜스퍼라제
D-다이머: 혈전이 파괴된 단백질 단편
SPK-8005: AAV 캡시드(SEQ ID NO:28) + TTRmut-hFVIII-X07; AAV-SPK-8005로도 불림
SPK-8011: AAV LK03 캡시드 (SEQ ID NO:27) + TTRmut-hFVIII-X07; AAV-SPK-8011로도 불림
본 발명의 특정 구체예들이 상술되고 구체적으로 예시되었지만, 본 발명은 이러한 구체예에 한정되는 것은 아니다. 다음의 청구 범위에 설명된 바와 같이, 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> SPARK THERAPEUTICS, INC. ANGUELA, Xavier <120> CpG REDUCED FACTOR VIII VARIANTS, COMPOSITIONS AND METHODS AND USES FOR TREATMENT OF HEMOSTASIS DISORDERS <130> 23637-449036 <140> PCT/US2016/59793 <141> 2016-10-31 <150> 62/249,001 <151> 2016-10-30 <150> 62/331,872 <151> 2016-05-04 <150> 62/349,532 <151> 2016-06-13 <150> 62/357,874 <151> 2016-07-01 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4374 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: FVIII Nucleic Acid <400> 1 atgcagattg agctgtctac ctgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgct 60 accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctggg attacatgca gtctgacctg 120 ggggagctgc ctgtggatgc caggtttccc cccagggtgc ccaagagctt ccccttcaat 180 acctctgtgg tgtataagaa gaccctgttt gtggagttca ctgatcatct gttcaacatt 240 gctaaaccca ggcccccctg gatggggctg ctgggcccta ccatccaggc tgaggtgtat 300 gacactgtgg tgatcactct gaagaacatg gctagccatc ctgtgtctct gcatgctgtg 360 ggggtgagct actggaaggc ttctgagggg gctgagtatg atgatcagac tagccagagg 420 gagaaggagg atgacaaggt 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cagctggagg accctgagtt ccaggccagc aacatcatgc acagcatcaa tgggtatgtg 1920 tttgattctc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cctactggta catcctgagc 1980 attggggctc agactgattt cctgtctgtg ttcttttctg gctacacctt taagcataag 2040 atggtgtatg aggacactct gaccctgttt cccttctctg gggagactgt gtttatgagc 2100 atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgccacaact ctgatttcag gaacaggggc 2160 atgactgctc tgctgaaggt gtcttcttgt gacaagaaca ctggggacta ttatgaggac 2220 agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaaca atgctattga gcccagatct 2280 ttcagccaga acccccctgt gctgaagagg caccagaggg agatcactag gaccaccctg 2340 cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gacactatct ctgtggagat gaagaaggag 2400 gactttgata tctatgatga ggatgagaac cagtctccca ggagcttcca gaaaaagacc 2460 aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgtc ttctagcccc 2520 catgtgctga ggaacagggc ccagtctggg tctgtgcccc agttcaagaa ggtggtgttc 2580 caggagttca ctgatgggag cttcacccag cctctgtaca ggggggagct gaatgagcac 2640 ctggggctgc tgggccctta tattagggct gaggtggagg acaacatcat ggtgactttc 2700 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gtggagttta ctgatcatct gttcaacatt 240 gccaagccca ggcctccttg gatggggctg ctgggcccca ccatccaggc tgaggtgtat 300 gacactgtgg tgattaccct gaagaatatg gccagccatc ctgtgagcct gcatgctgtg 360 ggggtgagct attggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgatcagac tagccagagg 420 gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg gggagccata cctatgtgtg gcaggtgctg 480 aaggagaatg gccccatggc ctctgaccct ctgtgcctga cttatagcta cctgagccat 540 gtggatctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag 600 ggcagcctgg ccaaggagaa gactcagacc ctgcacaagt tcatcctgct gtttgctgtg 660 tttgatgagg ggaagtcctg gcactctgag actaagaaca gcctgatgca ggatagggat 720 gctgcttctg ccagggcctg gcctaagatg cacactgtga atggctatgt gaataggagc 780 ctgcctggcc tgattggctg ccataggaag tctgtgtact ggcatgtgat tgggatgggc 840 accacccctg aggtgcactc tattttcctg gagggccata ctttcctggt gaggaaccat 900 aggcaggcca gcctggagat cagccccatc actttcctga ctgcccagac tctgctgatg 960 gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagcagcc atcagcatga tggcatggag 1020 gcttatgtga aggtggacag ctgccctgag gagcctcagc 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: FVIII Nucleic Acid <400> 6 atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttttg cttctctgcc 60 accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctggg attacatgca gtctgacctg 120 ggggagctgc ctgtggatgc caggttccct cccagggtgc ccaagtcttt ccccttcaac 180 acttctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttta ctgaccacct gttcaacatt 240 gccaagccca ggcctccctg gatgggcctg ctgggcccca ccattcaggc tgaggtgtat 300 gacactgtgg tcatcaccct gaaaaatatg gctagccacc ctgtgtctct gcatgctgtg 360 ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgaccagac tagccagagg 420 gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccaca cttatgtgtg gcaggtgctg 480 aaagagaatg gccccatggc ttctgatccc ctgtgtctga cctatagcta cctgagccat 540 gtggatctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag 600 ggcagcctgg ctaaggagaa gacccagacc ctgcataagt tcatcctgct gtttgctgtg 660 tttgatgagg gcaagagctg gcactctgag actaagaaca gcctgatgca ggatagggat 720 gctgcttctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtga atgggtatgt gaacaggagc 780 ctgcctggcc 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ccattcaggc tgaggtgtat 300 gacactgtgg tcattaccct gaagaacatg gcttctcacc ctgtgagcct gcatgctgtg 360 ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgaccagac cagccagagg 420 gagaaggagg atgataaggt gttccctggg ggcagccaca cctatgtgtg gcaggtgctg 480 aaggagaatg gccccatggc ctctgatccc ctgtgcctga cctactctta tctgtctcat 540 gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ctctgctggt gtgcagggag 600 ggctctctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagt ttattctgct gtttgctgtc 660 tttgatgagg gcaagagctg gcattctgag accaagaaca gcctgatgca ggacagggat 720 gctgcctctg ccagggcctg gcccaaaatg cacactgtga atggctatgt gaacaggagc 780 ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtact ggcatgtgat tggcatgggc 840 accacccctg aggtgcacag catcttcctg gagggccaca cctttctggt gaggaatcac 900 aggcaggcca gcctggagat tagccccatc accttcctga ctgcccagac cctgctgatg 960 gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagcagcc accagcatga tggcatggag 1020 gcctatgtga aggtggatag ctgccctgag gagccccagc tgaggatgaa aaacaatgag 1080 gaggctgagg attatgatga tgacctgact gactctgaga tggatgtggt 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atgcagattg agctgtctac ttgttttttt ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgcc 60 accaggaggt attacctggg ggctgtggag ctgagctggg attacatgca gtctgatctg 120 ggggagctgc ctgtggatgc caggttcccc cccagggtgc ccaagagctt ccccttcaac 180 acctctgtgg tgtataagaa gaccctgttt gtggagttca ctgatcatct gtttaacatt 240 gccaagccca ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccaa ctatccaggc tgaggtgtat 300 gacactgtgg tcatcaccct gaagaatatg gccagccatc ctgtgagcct gcatgctgtg 360 ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgaccagac cagccagagg 420 gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccaca cctatgtgtg gcaggtgctg 480 aaggagaatg gccccatggc ctctgacccc ctgtgcctga cttatagcta cctgtctcat 540 gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ccctgctggt ctgtagggaa 600 ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagt ttattctgct gtttgctgtg 660 tttgatgaag gcaagagctg gcactctgag accaagaatt ctctgatgca ggatagggat 720 gctgcctctg ccagggcctg gcccaagatg catactgtga atggctatgt gaacagaagc 780 ctgcctggcc tgattggctg ccataggaag tctgtgtatt ggcatgtgat tgggatgggc 840 actacccctg aagtgcacag 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tggccccctg ctgatctgct acaaggagtc tgtggatcag 1740 aggggcaacc agattatgtc tgataagagg aatgtcatcc tgttctctgt gtttgatgag 1800 aacaggagct ggtatctgac tgagaacatt cagaggttcc tgcccaaccc tgctggggtg 1860 cagctggagg accctgagtt ccaggccagc aacatcatgc attctattaa tggctatgtg 1920 tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cctactggta catcctgagc 1980 attggggccc agactgactt tctgtctgtg tttttctctg ggtacacctt caagcacaag 2040 atggtctatg aggacaccct gaccctgttc cccttttctg gggaaactgt gtttatgagc 2100 atggagaacc ctgggctgtg gatcctgggc tgccacaact ctgactttag gaataggggc 2160 atgactgccc tgctgaaggt gagcagctgt gacaagaata ctggggatta ctatgaggac 2220 agctatgagg atatctctgc ctacctgctg agcaagaaca atgccattga gcctaggagc 2280 ttcagccaga acccccctgt gctgaagagg caccagaggg agatcaccag gaccaccctg 2340 cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacaccatct ctgtggagat gaagaaggag 2400 gactttgata tttatgatga ggatgagaac cagagcccca ggagcttcca gaagaagacc 2460 aggcactatt tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgag ctctagcccc 2520 catgtgctga ggaacagggc 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1440 ctgatcattt tcaagaacca ggccagcagg ccctataaca tctatcccca tgggatcact 1500 gatgtgaggc ccctgtactc taggaggctg cccaaggggg tcaagcacct gaaggacttc 1560 cccatcctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactg tgactgtgga ggatggcccc 1620 actaagtctg accccaggtg cctgactagg tactacagca gctttgtgaa catggagaga 1680 gatctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgct acaaagagtc tgtggatcag 1740 aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcc tgttctctgt gtttgatgag 1800 aacagaagct ggtacctgac tgagaacatt cagaggtttc tgcccaaccc tgctggggtc 1860 cagctggagg accctgagtt tcaggccagc aacatcatgc acagcatcaa tgggtatgtg 1920 tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cctactggta tatcctgagc 1980 attggggccc agactgattt cctgtctgtg ttcttctctg gctacacttt caagcacaag 2040 atggtgtatg aggataccct gaccctgttc cctttctctg gggaaactgt gttcatgagc 2100 atggagaacc ctgggctgtg gatcctgggg tgccacaatt ctgatttcag gaacagaggc 2160 atgactgctc tgctgaaggt gtctagctgt gacaagaaca ctggggacta ctatgaggac 2220 agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaaca atgctattga acccaggtct 2280 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aggggcaatc agatcatgtc tgataagagg aatgtgattc tgttctctgt gtttgatgag 1800 aacaggagct ggtacctgac tgagaacatc cagaggttcc tgcccaatcc tgctggggtg 1860 cagctggagg accctgagtt ccaggccagc aatatcatgc acagcatcaa tggctatgtc 1920 tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cttactggta tattctgagc 1980 attggggccc agactgattt cctgtctgtg ttcttttctg gctatacctt taagcacaag 2040 atggtgtatg aggacaccct gaccctgttc cccttctctg gggagactgt gttcatgtct 2100 atggagaacc ctgggctgtg gatcctgggc tgccacaact ctgacttcag gaacaggggg 2160 atgactgccc tgctgaaggt gtctagctgt gataagaaca ctggggacta ttatgaggac 2220 agctatgagg acatctctgc ttacctgctg agcaagaaca atgccattga gcccaggtct 2280 ttcagccaga atccccctgt gctgaagagg catcagaggg agatcaccag gaccaccctg 2340 cagtctgatc aggaggagat tgattatgat gacactatct ctgtggaaat gaagaaggag 2400 gactttgaca tctatgatga ggatgagaac cagagcccca ggagcttcca gaagaagacc 2460 aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggatt atggcatgag cagctctccc 2520 catgtgctga ggaacagagc ccagtctggc tctgtgcctc agttcaagaa ggtggtcttc 2580 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ggctgcacct gcagggcagg 4020 tctaatgcct ggaggcccca ggtgaacaat cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag 4080 aagactatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtga agagcctgct gaccagcatg 4140 tatgtgaagg agttcctgat ctcttctagc caggatgggc atcagtggac cctgtttttt 4200 cagaatggca aagtgaaggt gtttcagggg aatcaggaca gctttacccc tgtggtgaac 4260 agcctggatc ctcctctgct gactagatac ctgaggatcc acccccagag ctgggtccac 4320 cagattgctc tgaggatgga ggtgctgggg tgtgaggctc aggacctgta ctga 4374 <210> 17 <211> 4374 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: FVIII Nucleic Acid <400> 17 atgcagattg agctgagcac ctgcttcttt ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgcc 60 accaggaggt actacctggg ggctgtggaa ctgagctggg actatatgca gtctgacctg 120 ggggagctgc ctgtggatgc caggttcccc cccagggtgc ccaagtcttt cccctttaac 180 acttctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttta ctgaccacct gttcaatatt 240 gccaagccca ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccaa ccatccaggc tgaggtgtat 300 gatactgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccacc ctgtgagcct gcatgctgtg 360 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ctgggcacat cagggacttc 3480 cagatcactg cctctgggca gtatggccag tgggccccta agctggctag gctgcattac 3540 tctggcagca tcaatgcctg gagcaccaag gagcccttca gctggatcaa ggtggacctg 3600 ctggccccta tgatcatcca tggcatcaag acccaggggg ccagacagaa gttctcttct 3660 ctgtacatct ctcagttcat catcatgtac tctctggatg gcaagaagtg gcagacctac 3720 agggggaatt ctactggcac tctgatggtg ttctttggga atgtggatag ctctgggatc 3780 aagcataata ttttcaaccc ccccattatt gctaggtaca tcaggctgca cccaacccac 3840 tactctatta ggtctaccct gaggatggag ctgatgggct gtgacctgaa ctcttgtagc 3900 atgcccctgg gcatggagag caaggctatc tctgatgccc agatcactgc cagcagctac 3960 tttaccaaca tgtttgctac ttggagcccc agcaaggcca ggctgcacct gcagggcagg 4020 agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagt ggctgcaggt ggattttcag 4080 aagaccatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtga aaagcctgct gactagcatg 4140 tatgtgaagg agtttctgat cagcagctct caggatggcc atcagtggac cctgttcttc 4200 cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aaccaggata gcttcacccc tgtggtgaat 4260 agcctggacc cccccctgct gaccaggtac ctgaggatcc 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ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560 ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620 actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680 gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740 agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800 aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860 cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920 tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980 attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040 atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100 atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160 atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220 agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280 ttctcccaaa acccaccagt cttgaaacgc catcaacggg aaataactcg tactactctt 2340 cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa 2400 gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca 2460 cgacactatt ttattgctgc agtggagagg ctctgggatt atgggatgag tagctcccca 2520 catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc 2580 caggaattta ctgatggctc ctttactcag cccttatacc gtggagaact aaatgaacat 2640 ttgggactcc tggggccata tataagagca gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc 2700 agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc tattctagcc ttatttctta tgaggaagat 2760 cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac 2820 ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg 2880 gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa gatgtgcact caggcctgat tggacccctt 2940 ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa 3000 tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg 3060 gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat 3120 tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct 3180 caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaatgaaaa catccattct 3240 attcatttca gtggacatgt gttcaccgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg 3300 tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt 3360 tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat ctacatgctg ggatgagcac actttttctg 3420 gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt 3480 cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat 3540 tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg 3600 ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc 3660 ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat 3720 cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata 3780 aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat 3840 tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc 3900 atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac 3960 tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg 4020 agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag 4080 aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg 4140 tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt 4200 cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac 4260 tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac 4320 cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta ctga 4374 <210> 20 <211> 4890 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: FVIII Nucleic Acid <400> 20 atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgcc 60 accaggagat actacctggg ggctgtggag ctgagctggg actacatgca gtctgacctg 120 ggggagctgc ctgtggatgc caggttcccc cccagagtgc ccaagagctt ccccttcaac 180 acctctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttca ctgaccacct gttcaacatt 240 gccaagccca ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccca ccatccaggc tgaggtgtat 300 gacactgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccacc ctgtgagcct gcatgctgtg 360 ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgaccagac cagccagagg 420 gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccaca cctatgtgtg gcaggtgctg 480 aaggagaatg gccccatggc ctctgacccc ctgtgcctga cctacagcta cctgagccat 540 gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag 600 ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagt tcatcctgct gtttgctgtg 660 tttgatgagg gcaagagctg gcactctgaa accaagaaca gcctgatgca ggacagggat 720 gctgcctctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtga atggctatgt gaacaggagc 780 ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtact ggcatgtgat tggcatgggc 840 accacccctg aggtgcacag catcttcctg gagggccaca ccttcctggt caggaaccac 900 aggcaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctga ctgcccagac cctgctgatg 960 gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagcagcc accagcatga tggcatggag 1020 gcctatgtga aggtggacag ctgccctgag gagccccagc tgaggatgaa gaacaatgag 1080 gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgaga tggatgtggt gaggtttgat 1140 gatgacaaca gccccagctt catccagatc aggtctgtgg ccaagaagca ccccaagacc 1200 tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gactgggact 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gggagactgt gttcatgagc 2100 atggagaacc ctggcctgtg gattctgggc tgccacaact ctgacttcag gaacaggggc 2160 atgactgccc tgctgaaagt ctccagctgt gacaagaaca ctggggacta ctatgaggac 2220 agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaaca atgccattga gcccaggagc 2280 ttcagccaga acagcaggca ccccagcacc aggcagaagc agttcaatgc caccaccatc 2340 cctgagaatg acatagagaa gacagaccca tggtttgccc accggacccc catgcccaag 2400 atccagaatg tgagcagctc tgacctgctg atgctgctga ggcagagccc caccccccat 2460 ggcctgagcc tgtctgacct gcaggaggcc aagtatgaaa ccttctctga tgaccccagc 2520 cctggggcca ttgacagcaa caacagcctg tctgagatga cccacttcag gccccagctg 2580 caccactctg gggacatggt gttcacccct gagtctggcc tgcagctgag gctgaatgag 2640 aagctgggca ccactgctgc cactgagctg aagaagctgg acttcaaagt ctccagcacc 2700 agcaacaacc tgatcagcac catcccctct gacaacctgg ctgctggcac tgacaacacc 2760 agcagcctgg gcccccccag catgcctgtg cactatgaca gccagctgga caccaccctg 2820 tttggcaaga agagcagccc cctgactgag tctgggggcc ccctgagcct gtctgaggag 2880 aacaatgaca gcaagctgct ggagtctggc ctgatgaaca 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acttctctgg ccatgtgttc 3780 actgtgagga agaaggagga gtacaagatg gccctgtaca acctgtaccc tggggtgttt 3840 gagactgtgg agatgctgcc cagcaaggct ggcatctgga gggtggagtg cctgattggg 3900 gagcacctgc atgctggcat gagcaccctg ttcctggtgt acagcaacaa gtgccagacc 3960 cccctgggca tggcctctgg ccacatcagg gacttccaga tcactgcctc tggccagtat 4020 ggccagtggg cccccaagct ggccaggctg cactactctg gcagcatcaa tgcctggagc 4080 accaaggagc ccttcagctg gatcaaggtg gacctgctgg cccccatgat catccatggc 4140 atcaagaccc agggggccag gcagaagttc agcagcctgt acatcagcca gttcatcatc 4200 atgtacagcc tggatggcaa gaagtggcag acctacaggg gcaacagcac tggcaccctg 4260 atggtgttct ttggcaatgt ggacagctct ggcatcaagc acaacatctt caaccccccc 4320 atcattgcca gatacatcag gctgcacccc acccactaca gcatcaggag caccctgagg 4380 atggagctga tgggctgtga cctgaacagc tgcagcatgc ccctgggcat ggagagcaag 4440 gccatctctg atgcccagat cactgccagc agctacttca ccaacatgtt tgccacctgg 4500 agccccagca aggccaggct gcacctgcag ggcaggagca atgcctggag gccccaggtc 4560 aacaacccca aggagtggct gcaggtggac ttccagaaga 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ctgaacaatg gaccacagcg gattggcaga 1320 aagtacaaga aagtgaggtt catggcttat accgatgaaa ccttcaagac tcgcgaagca 1380 atccagcacg agagcgggat tctgggacca ctgctgtacg gagaagtggg ggacaccctg 1440 ctgatcattt ttaagaacca ggccagcagg ccttacaata tctatccaca tggaattaca 1500 gatgtgcgcc ctctgtacag ccggagactg ccaaagggcg tcaaacacct gaaggacttc 1560 ccaatcctgc ccggggaaat ttttaagtat aaatggactg tcaccgtcga ggatggcccc 1620 actaagagcg accctaggtg cctgacccgc tactattcta gtttcgtgaa tatggaaagg 1680 gatctggcca gcggactgat cggcccactg ctgatttgtt acaaagagag cgtggatcag 1740 agaggcaacc agatcatgtc cgacaagagg aatgtgattc tgttcagtgt ctttgacgaa 1800 aaccggtcat ggtatctgac cgagaacatc cagagattcc tgcctaatcc agccggagtg 1860 cagctggaag atcctgagtt tcaggcttct aacatcatgc atagtattaa tggctacgtg 1920 ttcgacagtc tgcagctgtc agtgtgtctg cacgaggtcg cttactggta tatcctgagc 1980 attggagcac agacagattt cctgagcgtg ttcttttccg gctacacttt taagcataaa 2040 atggtgtatg aggacacact gactctgttc cccttcagcg gcgaaaccgt gtttatgtcc 2100 atggagaatc ccgggctgtg gatcctggga 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gcacacggca ggcaggtcac tgtccaggaa 3000 ttcgccctgt tctttaccat ctttgatgag acaaaaagct ggtacttcac cgaaaacatg 3060 gagcgaaatt gccgggctcc atgtaatatt cagatggaag accccacatt caaggagaac 3120 taccgctttc atgccatcaa tgggtatatt atggatactc tgcccggact ggtcatggct 3180 caggaccaga gaatcaggtg gtacctgctg agcatggggt ccaacgagaa tatccactca 3240 attcatttca gcggacacgt gtttactgtc cggaagaaag aagagtataa aatggccctg 3300 tacaacctgt atcccggcgt gttcgaaacc gtcgagatgc tgcctagcaa ggcagggatc 3360 tggagagtgg aatgcctgat tggggagcac ctgcatgccg gaatgtctac cctgtttctg 3420 gtgtacagta ataagtgtca gacacccctg gggatggctt ccggacatat ccgggatttc 3480 cagattaccg catctggaca gtacggccag tgggccccta agctggctag actgcactat 3540 tccgggtcta tcaacgcttg gtccacaaaa gagcctttct cttggattaa ggtggacctg 3600 ctggcaccaa tgatcattca tggcatcaaa actcaggggg ccaggcagaa gttctcctct 3660 ctgtacatct cacagtttat catcatgtac agcctggatg gcaagaaatg gcagacatac 3720 cgcggcaata gcacagggac tctgatggtg ttctttggca acgtggacag ttcagggatc 3780 aagcacaaca ttttcaatcc ccctatcatt 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180 cccttcacca ggagaagccg tcacacagat ccacaagctc ct 222 <210> 23 <211> 5066 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Expression Cassette <400> 23 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tacgcgtgtc tgtctgcaca tttcgtagag cgagtgttcc 180 gatactctaa tctccctagg caaggttcat attgacttag gttacttatt ctccttttgt 240 tgactaagtc aataatcaga atcagcaggt ttggagtcag cttggcaggg atcagcagcc 300 tgggttggaa ggagggggta taaaagcccc ttcaccagga gaagccgtca cacagatcca 360 caagctcctg ctagcaggta agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg 420 gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactg acactgacat ccactttttc tttttctcca 480 caggtttaaa cgccaccatg cagattgagc tgagcacctg cttcttcctg tgtctgctga 540 ggttctgctt ctctgccacc aggaggtatt acctgggggc tgtggagctg agctgggact 600 atatgcagtc tgacctgggg gagctgcctg tggatgctag gttccccccc agggtgccca 660 agagcttccc ctttaacact tctgtggtgt acaagaagac cctgtttgtg gagttcactg 720 accacctgtt caacattgcc aagcccaggc ccccctggat ggggctgctg gggcccacca 780 tccaggctga ggtgtatgac actgtggtga tcaccctgaa gaacatggcc agccaccctg 840 tgagcctgca tgctgtgggg gtgagctact ggaaggcttc tgagggggct gagtatgatg 900 accagactag ccagagggag aaggaggatg acaaggtgtt tcctgggggc agccatacct 960 atgtgtggca ggtgctgaag gagaatggcc ccatggcctc tgaccccctg tgcctgacct 1020 acagctacct gtctcatgtg gacctggtga aggacctgaa ctctggcctg attggggctc 1080 tgctggtgtg tagggagggc agcctggcta aggaaaagac ccagaccctg cataagttta 1140 tcctgctgtt tgctgtgttt gatgagggca agagctggca ctctgagacc aagaacagcc 1200 tgatgcagga tagggatgct gcctctgcca gggcttggcc taagatgcac actgtgaatg 1260 ggtatgtgaa taggagcctg cctggcctga ttggctgcca caggaagtct gtgtactggc 1320 atgtgattgg gatgggcacc acccctgagg tccatagcat cttcctggag ggccacactt 1380 tcctggtgag gaaccacaga caggcctctc tggagatctc tcccatcacc ttcctgactg 1440 ctcagactct gctgatggac ctgggccagt tcctgctgtt ttgccatatt agcagccacc 1500 agcatgatgg gatggaggcc tatgtgaagg tggatagctg ccctgaggag cctcagctga 1560 ggatgaagaa caatgaggag gctgaagact atgatgatga cctgactgat tctgagatgg 1620 atgtggtgag gtttgatgat gacaatagcc ccagcttcat tcagatcagg tctgtggcca 1680 agaaacaccc caagacctgg gtgcactaca ttgctgctga ggaagaggac tgggactatg 1740 ctcccctggt gctggcccct gatgataggt cttataagag ccagtacctg aacaatgggc 1800 cccagaggat tggcaggaag tacaagaagg tgaggttcat ggcctacact gatgaaacct 1860 tcaaaaccag ggaggccatt cagcatgagt ctggcatcct gggccctctg ctgtatgggg 1920 aggtggggga caccctgctg atcatcttca agaaccaggc cagcaggccc tacaacatct 1980 atcctcatgg catcactgat gtgaggcccc tgtacagcag gaggctgccc aagggggtga 2040 agcacctgaa agacttcccc atcctgcctg gggagatctt taagtataag tggactgtga 2100 ctgtggagga tggccctacc aagtctgacc ccaggtgtct gaccaggtac tattctagct 2160 ttgtgaacat ggagagggac ctggcctctg gcctgattgg gcccctgctg atctgctaca 2220 aggagtctgt ggaccagagg ggcaaccaga tcatgtctga caagaggaat gtgatcctgt 2280 tttctgtgtt tgatgagaat aggagctggt acctgactga gaacatccag aggtttctgc 2340 ccaatcctgc tggggtgcag ctggaggatc ctgagttcca ggccagcaat 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gttggttttt 4920 tgtgtaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac 4980 tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag 5040 cgagcgagcg cgcagctgcc tgcagg 5066 <210> 24 <211> 11976 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Plasmid <400> 24 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tacgcgtgtc tgtctgcaca tttcgtagag cgagtgttcc 180 gatactctaa tctccctagg caaggttcat attgacttag gttacttatt ctccttttgt 240 tgactaagtc aataatcaga atcagcaggt ttggagtcag cttggcaggg atcagcagcc 300 tgggttggaa ggagggggta taaaagcccc ttcaccagga gaagccgtca cacagatcca 360 caagctcctg ctagcaggta agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg 420 gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactg acactgacat ccactttttc tttttctcca 480 caggtttaaa cgccaccatg cagattgagc tgagcacctg cttcttcctg tgtctgctga 540 ggttctgctt ctctgccacc aggaggtatt acctgggggc tgtggagctg agctgggact 600 atatgcagtc tgacctgggg gagctgcctg tggatgctag gttccccccc agggtgccca 660 agagcttccc ctttaacact tctgtggtgt acaagaagac cctgtttgtg gagttcactg 720 accacctgtt caacattgcc aagcccaggc ccccctggat ggggctgctg gggcccacca 780 tccaggctga ggtgtatgac actgtggtga tcaccctgaa gaacatggcc agccaccctg 840 tgagcctgca tgctgtgggg gtgagctact ggaaggcttc tgagggggct gagtatgatg 900 accagactag ccagagggag aaggaggatg acaaggtgtt tcctgggggc agccatacct 960 atgtgtggca ggtgctgaag gagaatggcc ccatggcctc tgaccccctg tgcctgacct 1020 acagctacct gtctcatgtg gacctggtga aggacctgaa ctctggcctg attggggctc 1080 tgctggtgtg tagggagggc agcctggcta aggaaaagac ccagaccctg cataagttta 1140 tcctgctgtt tgctgtgttt gatgagggca agagctggca ctctgagacc aagaacagcc 1200 tgatgcagga tagggatgct gcctctgcca gggcttggcc taagatgcac actgtgaatg 1260 ggtatgtgaa taggagcctg cctggcctga ttggctgcca caggaagtct gtgtactggc 1320 atgtgattgg gatgggcacc acccctgagg tccatagcat cttcctggag ggccacactt 1380 tcctggtgag gaaccacaga caggcctctc tggagatctc tcccatcacc ttcctgactg 1440 ctcagactct gctgatggac ctgggccagt tcctgctgtt ttgccatatt agcagccacc 1500 agcatgatgg gatggaggcc tatgtgaagg tggatagctg ccctgaggag cctcagctga 1560 ggatgaagaa caatgaggag gctgaagact atgatgatga cctgactgat tctgagatgg 1620 atgtggtgag gtttgatgat gacaatagcc ccagcttcat tcagatcagg tctgtggcca 1680 agaaacaccc caagacctgg gtgcactaca ttgctgctga ggaagaggac tgggactatg 1740 ctcccctggt gctggcccct gatgataggt cttataagag ccagtacctg aacaatgggc 1800 cccagaggat tggcaggaag tacaagaagg tgaggttcat ggcctacact gatgaaacct 1860 tcaaaaccag ggaggccatt cagcatgagt ctggcatcct gggccctctg ctgtatgggg 1920 aggtggggga caccctgctg atcatcttca agaaccaggc cagcaggccc tacaacatct 1980 atcctcatgg catcactgat gtgaggcccc tgtacagcag gaggctgccc aagggggtga 2040 agcacctgaa agacttcccc atcctgcctg gggagatctt taagtataag tggactgtga 2100 ctgtggagga tggccctacc aagtctgacc ccaggtgtct gaccaggtac tattctagct 2160 ttgtgaacat ggagagggac ctggcctctg gcctgattgg gcccctgctg atctgctaca 2220 aggagtctgt ggaccagagg ggcaaccaga tcatgtctga caagaggaat gtgatcctgt 2280 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Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His 1865 1870 1875 Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln 1880 1885 1890 Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp 1895 1900 1905 Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn 1910 1915 1920 Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His 1925 1930 1935 Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met 1940 1945 1950 Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser 1955 1960 1965 Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr 1970 1975 1980 Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr 1985 1990 1995 Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly 2000 2005 2010 Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly 2015 2020 2025 Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro 2030 2035 2040 Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala 2045 2050 2055 Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His 2060 2065 2070 Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser 2075 2080 2085 Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile 2090 2095 2100 Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser 2105 2110 2115 Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr 2120 2125 2130 Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn 2135 2140 2145 Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile 2150 2155 2160 Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg 2165 2170 2175 Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys 2180 2185 2190 Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln 2195 2200 2205 Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser 2210 2215 2220 Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp 2225 2230 2235 Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe 2240 2245 2250 Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys 2255 2260 2265 Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser 2270 2275 2280 Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys 2285 2290 2295 Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val 2300 2305 2310 Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His 2315 2320 2325 Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu 2330 2335 2340 Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr 2345 2350 <210> 27 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: AAV Capsid <400> 27 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr 435 440 445 Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser 450 455 460 Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro 465 470 475 480 Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln 565 570 575 Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr 580 585 590 Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu 725 730 735 <210> 28 <211> 738 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: AAV Capsid <400> 28 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Ser Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 145 150 155 160 Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 165 170 175 Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro 180 185 190 Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly 195 200 205 Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser 210 215 220 Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 225 230 235 240 Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 245 250 255 Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp 260 265 270 Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn 275 280 285 Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn 290 295 300 Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn 305 310 315 320 Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala 325 330 335 Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln 340 345 350 Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe 355 360 365 Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn 370 375 380 Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr 385 390 395 400 Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr 405 410 415 Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser 420 425 430 Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu 435 440 445 Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu 450 455 460 Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp 465 470 475 480 Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser 485 490 495 Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His 500 505 510 Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr 515 520 525 His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met 530 535 540 Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val 545 550 555 560 Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr 565 570 575 Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala 580 585 590 Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val 595 600 605 Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile 610 615 620 Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe 625 630 635 640 Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val 645 650 655 Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe 660 665 670 Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu 675 680 685 Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr 690 695 700 Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu 705 710 715 720 Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 725 730 735 Asn Leu <210> 29 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: FVIII Peptide <400> 29 Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg 1 5 10

Claims (105)

  1. B 도메인이 결실된 인자 VIII(FVIII)을 인코딩하는 핵산 변이체로서, 핵산 변이체가 SEQ ID NO:7에 대해 92% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 핵산 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 핵산 변이체가 SEQ ID NO:7에 대해 93% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 핵산 변이체.
  3. 제1항에 있어서, 핵산 변이체가 SEQ ID NO:7에 대해 94% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 핵산 변이체.
  4. 제1항에 있어서, 핵산 변이체가 SEQ ID NO:7에 대해 95% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 핵산 변이체.
  5. 제1항에 있어서, 핵산 변이체가 SEQ ID NO:7에 대해 95%-100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 변이체.
  6. 제1항에 있어서, 핵산 변이체가 20개 또는 그 미만, 15개 또는 그 미만, 또는 10개 또는 그 미만의 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 갖는 핵산 변이체.
  7. 제1항에 있어서, 핵산 변이체가 5개 이하의 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 갖는 핵산 변이체.
  8. 제1항에 있어서, 핵산 변이체가 4, 3, 2, 1 또는 0개의 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 갖는 핵산 변이체.
  9. 제1항에 있어서, 핵산 변이체가 서열 SFSQNPPVLKRHQR(SEQ ID NO:29) 중 하나 이상의 아미노산이 결실되거나 전체 서열 SFSQNPPVLKRHQR이 결실된 SEQ ID NO:25를 인코딩하는 핵산 변이체.
  10. 제1항에 있어서, 핵산 변이체가 SEQ ID NO:25를 인코딩하는 핵산 변이체.
  11. B 도메인이 결실된 인자 VIII(FVIII) (FVIII-BDD)을 인코딩하는 핵산 변이체로서, 핵산 변이체가 SEQ ID NO:19보다 적은 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 갖는 핵산 변이체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 FVIII-BDD가 포유동물의 FVIII-BDD인 핵산 변이체.
  13. B 도메인이 결실된 인간 인자 VIII(hFVIII-BDD)을 인코딩하는 핵산 변이체로서, 핵산 변이체가 2개 이하의 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 갖는 핵산 변이체.
  14. 제13항에 있어서, 핵산 변이체가 1개의 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 갖는 핵산 변이체.
  15. 제13항에 있어서, 핵산 변이체가 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 갖지 않는 핵산 변이체.
  16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 인코딩된 FVIII-BDD 또는 hFVIII-BDD가 SEQ ID NO:19에 의해 인코딩된 hFVIII-BDD와 동일한 핵산 변이체.
  17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 핵산 변이체가 FVIII-V3(SEQ ID NO:20) 및 CO3(SEQ ID NO:21)과 구별되는 핵산 변이체.
  18. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 핵산 변이체가 서열 SFSQNPPVLKRHQR(SEQ ID NO:29) 중 하나 이상의 아미노산이 결실되거나 전체 서열 SFSQNPPVLKRHQR이 결실된 SEQ ID NO:25를 인코딩하는 핵산 변이체.
  19. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 핵산 변이체가 SEQ ID NO:25를 인코딩하는 핵산 변이체.
  20. 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항의 핵산 변이체를 포함하는 벡터.
  21. 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항의 핵산 변이체를 포함하는 발현 벡터.
  22. 제21항에 있어서, 아데노바이러스-관련 바이러스(AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 플라스미드, 또는 렌티바이러스 벡터로 구성된 군으로부터 선택된 발현 벡터.
  23. 제22항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 AAV 혈청형 또는 AAV 위형을 포함하며, 상기 AAV 위형은 ITR 혈청형과 상이한 AAV 캡시드 혈청형을 포함하는 발현 벡터.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 인트론, 발현 조절 요소, 하나 이상의 아데노-관련 바이러스(AAV) 역방위 말단 반복(ITR) 및/또는 필러(filler) 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 발현 벡터.
  25. 제24항에 있어서, 인트론이 핵산 변이체 내부에 또는 측면에 인접하여 존재하는 발현 벡터.
  26. 제24항에 있어서, 발현 조절 요소가 핵산 변이체에 작동가능하게 연결된 발현 벡터.
  27. 제24항에 있어서, AAV ITR(들)이 핵산 변이체의 5' 또는 3' 말단에 측면 인접한 발현 벡터.
  28. 제24항에 있어서, 필러 폴리뉴클레오티드 서열이 핵산 변이체의 5' 또는 3' 말단에 측면 인접한 발현 벡터.
  29. 제24항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 인트론, 발현 조절 요소, 하나 이상의 아데노-관련 바이러스(AAV) 역방위 말단 반복(ITR) 및/또는 필러 폴리뉴클레오티드 서열이 감소된 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 갖도록 변형된 발현 벡터.
  30. 제24항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 인트론, 발현 조절 요소, 하나 이상의 아데노-관련 바이러스(AAV) 역방위 말단 반복(ITR) 및/또는 필러 폴리뉴클레오티드 서열이 20개 또는 그 미만, 15개 또는 그 미만, 10개 또는 그 미만, 5개 또는 그 미만 또는 0개의 시토신-구아닌 디뉴클레오티드(CpG)를 갖도록 변형된 발현 벡터.
  31. 제24항, 제26항, 제29항 또는 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 발현 조절 요소가 항시적 또는 조절가능한 조절 요소, 또는 조직-특이적 발현 조절 요소 또는 프로모터를 포함하는 발현 벡터.
  32. 제24항, 제26항, 제29항 또는 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 발현 조절 요소가 간에서의 발현을 부여하는 요소를 포함하는 발현 벡터.
  33. 제24항, 제26항, 제29항 또는 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 발현 조절 요소가 TTR 프로모터 또는 변이 TTR 프로모터를 포함하는 발현 벡터.
  34. 제33항에 있어서, 변이 TTR 프로모터가 SEQ ID NO:22를 포함하는 발현 벡터.
  35. 제24항 내지 제34항 중의 어느 한 항에 있어서, ITR이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 AAV 혈청형, 또는 이들의 조합물 중 임의의 혈청형의 하나 이상의 ITR을 포함하는 발현 벡터.
  36. 제23항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 벡터가 SEQ ID NO:23에 제시된 ITR, 프로모터, 폴리A 신호 및/또는 인트론 서열을 포함하는 발현 벡터.
  37. 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항의 핵산 변이체 또는 제24항 내지 제36항 중의 어느 한 항의 발현 벡터를 포함하는 AAV 벡터.
  38. 제37항에 있어서, AAV 벡터가 변형된 또는 변이 AAV VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 서열, 또는 야생형 AAV VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 서열을 포함하는 AAV 벡터.
  39. 제37항에 있어서, AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열에 대해 90% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 변형된 또는 변이 AAV VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 서열을 포함하는 AAV 벡터.
  40. 제37항에 있어서, AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8 AAV 혈청형 중 임의의 혈청형으로부터 선택된 VP1, VP2 또는 VP3 캡시드 서열을 포함하는 AAV 벡터.
  41. 제37항에 있어서, AAV 벡터가 LK03 캡시드(SEQ ID NO:27)에 대해 90% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 캡시드를 포함하는 AAV 벡터.
  42. 제37항에 있어서, AAV 벡터가 SPK 캡시드(SEQ ID NO:28)에 대해 90% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 캡시드를 포함하는 AAV 벡터.
  43. 제37항에 있어서, AAV 벡터가 LK03 캡시드(SEQ ID NO:27)를 포함하는 AAV 벡터.
  44. 제37항에 있어서, AAV 벡터가 SPK 캡시드(SEQ ID NO:28)를 포함하는 AAV 벡터.
  45. 제37항에 있어서, AAV 벡터가 핵산 변이체 SEQ ID NO:7 및 LK03 캡시드 서열(SEQ ID NO:27)을 포함하는 AAV 벡터.
  46. 제37항에 있어서, AAV 벡터가 핵산 변이체 SEQ ID NO:7 및 SPK 캡시드(SEQ ID NO:28)을 포함하는 AAV 벡터.
  47. 제37항에 있어서, AAV 벡터가 핵산 변이체, 및 SEQ ID NO:23의 변이 TTR 프로모터(TTRmut), 합성 인트론, 폴리 A 및 ITR 중 하나 이상을 포함하는 AAV 벡터.
  48. 제37항에 있어서, AAV 벡터가 핵산 변이체, 및 SEQ ID NO:23의 변이 TTR 프로모터(TTRmut), 합성 인트론, 폴리 A 및 ITR, 및 LK03 캡시드 서열(SEQ ID NO:27)중 하나 이상 또는 SPK 캡시드(SEQ ID NO:28)를 포함하는 AAV 벡터.
  49. 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항의 핵산 변이체 또는 제20항 내지 제36항 중의 어느 한 항의 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  50. 제49항에 있어서, 상기 숙주 세포가 상기 핵산 변이체에 의해 인코딩된 FVIII을 발현하는 숙주 세포.
  51. 제37항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 AAV 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  52. 제51항에 있어서, 상기 숙주 세포가 제37항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 AAV 벡터를 생성하는 숙주 세포.
  53. 생물학적으로 양립가능한 담체 또는 부형제 중의 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항의 핵산 변이체, 제20항 내지 제36항 중의 어느 한 항의 벡터 또는 발현 벡터, 또는 제37항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 AAV 벡터를 포함하는 약학적 조성물.
  54. 리포솜 내에 캡슐화되거나 인지질 또는 미셀과 혼합된 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항의 핵산 변이체, 제20항 내지 제36항 중의 어느 한 항의 벡터 또는 발현 벡터, 또는 제37항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 AAV 벡터.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 빈 캡시드 AAV를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  56. 제53항 또는 제54항에 있어서, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 또는 AAV-Rh74 혈청형의 빈 캡시드를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  57. 제53항 또는 제54항에 있어서, 투여된 AAV 벡터와 동일한 혈청형의 빈 캡시드 AAV를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  58. 제53항 또는 제54항에 있어서, 빈 캡시드가 LK03 캡시드(SEQ ID NO:27) 또는 SPK 캡시드(SEQ ID NO:28)인 약학적 조성물.
  59. 제55항 내지 제58항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 빈 캡시드 대 상기 AAV 벡터의 비율이 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 또는 10:1인 약학적 조성물.
  60. 포유동물 또는 포유동물 세포에 핵산 서열을 전달하거나 이동시키기 위한 방법으로서, 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항의 핵산 변이체, 제20항 내지 제36항 중의 어느 한 항의 벡터 또는 발현 벡터, 또는 제37항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 AAV 벡터를 상기 포유동물 또는 포유동물 세포에 투여하거나 이와 접촉시켜 핵산 서열을 포유동물 또는 포유동물 세포에 전달하거나 이동시키는 것을 포함하는 방법.
  61. 인자 VIII를 필요로 하는 포유동물을 처리하는 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항의 핵산 변이체, 제20항 내지 제36항 중의 어느 한 항의 벡터 또는 발현 벡터, 또는 제37항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 AAV 벡터를 제공하는 단계; 및
    (b) 소정량의 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항의 핵산 변이체, 제20항 내지 제36항 중의 어느 한 항의 벡터 또는 발현 벡터, 또는 제37항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 AAV 벡터를 포유동물에 투여하는 단계로서, 상기 인자 VIII이 포유동물에서 발현되는 단계를 포함하는 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 핵산 변이체에 의해 인코딩된 상기 인자 VIII이 상기 포유동물의 세포, 조직 또는 기관에서 발현되는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 세포가 분비 세포를 포함하는 방법.
  64. 제62항에 있어서, 세포가 내분비 세포 또는 내피 세포를 포함하는 방법.
  65. 제62항에 있어서, 세포가 간세포, 굴형 내피 세포, 거대핵세포, 혈소판 또는 조혈 줄기 세포를 포함하는 방법.
  66. 제62항에 있어서, 상기 포유동물의 조직 또는 기관이 간을 포함하는 방법.
  67. 제60항 내지 제66항 중의 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 불충분한 양의 인자 VIII 단백질, 또는 결함 또는 이상 인자 VIII 단백질을 생성하는 방법.
  68. 제60항 내지 제66항 중의 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 혈우병 A를 갖는 방법.
  69. 제60항 내지 제66항 중의 어느 한 항에 있어서, 핵산 변이체에 의해 인코딩된 인자 VIII이 포유 동물에게 유익한 효과 또는 치료 효과를 갖는 수준으로 발현되는 방법.
  70. 생물학적으로 허용되는 담체 중의 치료적 유효량의 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항의 핵산 변이체, 제20항 내지 제36항 중의 어느 한 항의 벡터 또는 발현 벡터, 또는 제37항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 AAV 벡터를 환자에 투여하는 것을 포함하여, 지혈 관련 장애의 치료가 필요한 환자에서 이를 치료하는 방법.
  71. 제60항, 제61항 또는 제70항에 있어서, 상기 포유동물 또는 상기 환자가 혈우병 A, 폰빌레브란트병 및 외상 관련 출혈, 상해, 혈전증, 혈소판 감소증, 뇌졸중, 응고병증, 파종혈관내응고(DIC) 및 과잉-항응고 치료 장애(over-anticoagulation treatment disorder)로 구성된 군으로부터 선택되는 장애를 갖는 방법.
  72. 제60항 내지 제71항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항의 핵산 변이체, 제20항 내지 제36항 중의 어느 한 항의 벡터 또는 발현 벡터, 또는 제37항 내지 제48항 중의 어느 한 항의 AAV 벡터가 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 강내, 또는 삽관법에 의해, 또는 카테터를 통해 상기 포유동물 또는 상기 환자에 전달되는 방법.
  73. 제60항 내지 제71항 중의 어느 한 항에 있어서, FVIII가 혈전증의 위험을 실질적으로 증가시키지 않는 수준에서 발현되는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 혈전증 위험이 피브린 분해 생성물을 측정함으로써 결정되는 방법.
  75. 제60항 내지 제71항 중의 어느 한 항에 있어서, FVIII이 혈우병 A를 갖지 않는 대상체에서 발견된 FVIII 수준의 1%보다 높은 수준으로 발현되는 방법.
  76. 제60항 내지 제71항 중의 어느 한 항에 있어서, FVIII이 혈우병 A를 갖지 않는 대상체에서 발견된 FVIII의 수준의 3%보다 높은 수준으로 발현되는 방법.
  77. 제60항 내지 제71항 중의 어느 한 항에 있어서, FVIII의 활성이 적어도 1, 2, 3 또는 4주, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개월, 또는 적어도 1년 동안 검출가능한 방법.
  78. 제60항 내지 제71항 중의 어느 한 항에 있어서, FVIII이 혈우병 A를 가지지 않은 대상체에서 발견된 FVIII 수준의 1% 또는 3%보다 높은 수준으로 적어도 1, 2, 3 또는 4주, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개월 또는 적어도 1년 동안 발현되는 방법.
  79. 제60항 내지 제71항 중의 어느 한 항에 있어서, FVIII이 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 치료 효과를 갖는 수준으로 발현되는 방법.
  80. 제60항 내지 제71항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII이 적어도 연속된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 약 20% 또는 20% 초과의 FVIII 활성 수준으로 포유 동물 또는 환자에 존재하는 방법.
  81. 제60항 내지 제71항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII이 정상 FVIII 수준의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 또는 50% 이상의 수준으로 발현되는 방법.
  82. 제60항 내지 제71항 중의 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터가 포유동물 또는 환자의 킬로그램 당 1x1012 미만의 벡터 게놈 (vg/kg)의 용량으로 투여되며, 상기 FVIII이 적어도 연속된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 약 20% 또는 20% 초과의 활성 수준으로 포유 동물 또는 환자에서 생성되는 방법.
  83. 제60항 내지 제71항 중의 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터가 포유동물 또는 환자의 킬로그램 당 약 5x1011의 벡터 게놈 (vg/kg)의 용량으로 투여되며, 상기 FVIII이 적어도 연속된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 주 또는 개월 동안 약 20% 또는 20% 초과의 활성 수준으로 포유 동물 또는 환자에서 생성되는 방법.
  84. 제60항 내지 제83항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 또는 상기 환자가 인간인 방법.
  85. 제60항 내지 제84항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물, 상기 환자 또는 상기 인간이 AAV에 대한 혈청-양성 또는 혈청-음성인 방법.
  86. 제60항 내지 제85항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 또는 상기 환자에 AAV 빈 캡시드를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  87. 제60항 내지 제85항 중의 어느 한 항에 있어서, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및/또는 AAV-Rh74 혈청형의 빈 캡시드를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  88. 제60항 내지 제85항 중의 어느 한 항에 있어서, 투여된 AAV 벡터와 동일한 혈청형의 빈 캡시드 AAV를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  89. 제88항에 있어서, 빈 캡시드가 LK03 캡시드(SEQ ID NO:27) 또는 SPK 캡시드(SEQ ID NO:28)인 방법.
  90. 제86항 내지 제89항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 빈 캡시드 대 상기 AAV 벡터의 비율이 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 또는 10:1인 방법.
  91. 제60항 내지 제90항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  92. 제60항 내지 제90항 중의 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터가 투여된 후 면역억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  93. 제60항 내지 제90항 중의 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터가 투여된 후 1시간 내지 최대 45일 이내의 기간에 면역억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  94. 제91항 내지 제93항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역억제제가 스테로이드, 사이클로스포린(예를 들어, 사이클로스포린 A), 마이코페놀레이트, 리툭시맵(Rituximab) 또는 이의 유도체를 포함하는 방법.
  95. 제60항 내지 제94항 중의 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터가 포유동물 또는 환자의 체중의 킬로그램 당 약 1x108 내지 약 1x1014 벡터 게놈(vg/kg)의 범위로 투여되는 방법.
  96. 제60항 내지 제94항 중의 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터가 포유동물 또는 환자의 체중의 킬로그램 당 약 1x109 내지 약 1x1013 벡터 게놈(vg/kg)의 범위로 투여되는 방법.
  97. 제60항 내지 제94항 중의 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터가 포유동물 또는 환자의 체중의 킬로그램 당 약 1x1010 내지 약 1x1012 벡터 게놈(vg/kg)의 범위로 투여되는 방법.
  98. 제60항 내지 제94항 중의 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터가 포유동물 또는 환자의 체중의 킬로그램 당 약 1x1011 내지 약 1x1012 벡터 게놈(vg/kg)의 범위로 투여되는 방법.
  99. 제60항 내지 제94항 중의 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터가 포유동물 또는 환자의 체중의 킬로그램 당 약 1x1012 내지 약 1x1013 벡터 게놈(vg/kg)의 범위로 투여되는 방법.
  100. 제60항 내지 제94항 중의 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터가 포유동물 또는 환자의 체중의 킬로그램 당 약 1x1013 내지 약 1x1014 벡터 게놈(vg/kg)의 범위로 투여되는 방법.
  101. 제60항 내지 제94항 중의 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터가 포유동물 또는 환자의 체중의 킬로그램 당 약 5x1011 내지 약 1x1012 벡터 게놈(vg/kg)의 범위로 투여되는 방법.
  102. 제60항 내지 제94항 중의 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터가 포유동물 또는 환자의 체중의 킬로그램 당 약 5x1011 벡터 게놈(vg/kg)의 용량으로 투여되는 방법.
  103. 제60항 내지 제102항 중의 어느 한 항에 있어서, AAV 항체의 존재 또는 양, AAV에 대한 면역 반응, FVIII 항체, FVIII에 대한 면역 반응, FVIII 양, FVIII 활성 수준, 하나 이상의 간 효소의 양 또는 수준 또는 출혈 사건의 빈도, 및/또는 중증도 또는 기간에 대해 포유동물을 분석하거나 모니터링하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  104. 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 청구된 바와 같은 핵산 변이체, 또는 제20항 내지 제36항 중의 어느 한 항의 벡터 또는 발현 벡터를 세포에서 발현시키고, 세포에 의해 생성된 상기 FVIII 단백질을 회수하는 것을 포함하여, FVIII 단백질을 생성하는 방법.
  105. 제104항에 있어서, 세포에 의해 생성된 상기 FVIII 단백질을 정제하거나 분리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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