CN113226352A - 最优化启动子序列、无内含子的表达结构及使用方法 - Google Patents

最优化启动子序列、无内含子的表达结构及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了表达盒。在某些实施方案中，表达盒包含(a)与SEQ IDNO:2‑67中的任一者的序列至少90％相同的调节元件，以及(b)编码具有B结构域缺失的因子VIII蛋白(FVIII‑BDD)的核酸序列，其中该(a)的核酸序列与SEQ ID NO:77的序列至少90％相同，其中该调节元件可操作地连接至该核酸序列，且其中在该调节元件与编码FVIII‑BDD的该核酸序列之间不存在内含子，或其中未翻译的核酸的不超过0‑107个核苷酸在该调节元件与编码FVIII‑BDD的该核酸序列之间。在某些实施方案中，表达盒含有使CpG在相同位置处经CpT、CpA、TpG或ApG取代的序列元件或具有CpG减少的核酸序列。

Description

最优化启动子序列、无内含子的表达结构及使用方法
相关申请
本申请要求2018年8月24日提交的美国临时专利申请No.62/722,547、2018年8月30日提交的美国临时专利申请No.62/725,096、以及2018年12月21日提交的美国临时专利申请No.62/784,116的优先权。上述申请的全部内容(包括所有文本、表格、序列表和附图)通过引用并入本文。
背景技术
基因疗法在涉及例如归因于基因缺乏或缺陷而丧失蛋白功能或活性或需要遏制异常蛋白的表达的蛋白的异常功能或活性的治疗应用中显示极大前景。转基因表达、驱动转基因表达的增强子和启动子功能的改善将增强基因疗法治疗应用。本发明尤其解决该需求。
发明内容
根据本发明，提供了包含编码具有B结构域缺失的因子VIII蛋白(FVIII-BDD)的核酸序列的表达盒。
在某些实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:1的序列至少98％相同的序列，与SEQ ID NO:1的序列至少99％相同，包含SEQ ID NO:1的序列，或由SEQ ID NO:1的序列组成。
在某些实施方案中，表达盒包含可操作地连接至编码具有B结构域缺失的因子VIII蛋白(FVIII-BDD)的核酸序列的调节元件，其中在该调节元件与该核酸序列之间不存在内含子，并且其中表达盒包含与SEQ ID NO:1的序列至少91％相同的序列。
在某些实施方案中，表达盒包含(a)与SEQ ID NO:2-67中的任一者的序列至少90％相同的调节元件，以及(b)编码具有B结构域缺失的因子VIII蛋白(FVIII-BDD)的核酸序列，其中(a)的核酸序列与SEQ ID NO:77的序列至少90％相同，并且其中调节元件可操作地连接至核酸序列，并且其中在调节元件与编码FVIII-BDD的核酸序列之间不存在内含子。
在某些实施方案中，表达盒包含(a)与SEQ ID NO:2-67中的任一者的序列至少90％相同的调节元件，以及(b)编码具有B结构域缺失的因子VIII蛋白(FVIII-BDD)的核酸序列，其中核酸序列与SEQ ID NO:77的序列至少90％相同，并且其中调节元件可操作地连接至核酸序列，并且其中未翻译的核酸的不超过0-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-105、106或107个核苷酸在调节元件与编码FVIII-BDD的核酸序列之间。
在某些实施方案中，表达盒中的调节元件包含与SEQ ID NO:2-67中的任一者至少95％相同的核苷酸序列。
在某些实施方案中，表达盒中的调节元件具有与SEQ ID NO:4-21或24-67中的任一者的序列中所阐述的相同总数目的减少的CpG。
在某些实施方案中，表达盒中的调节元件包含SEQ ID NO:2-21或24-67中的任一者的序列，其使CpG在与SEQ ID NO:4-21或24-67中的任一者的序列中所阐述的相同的位置处被取代成CpT、CpA、TpG或ApG。
在某些实施方案中，表达盒中的核酸序列在与来自在调节元件与核酸序列之间具有(a)内含子或(b)未翻译的核酸的108个或更多个核苷酸的表达盒的表达相比时呈现更高的表达。
在某些实施方案中，表达盒中的经编码的FVIII-BDD与来自在调节元件与核酸序列之间具有(a)内含子或(b)未翻译的核酸的108个或更多个核苷酸的表达盒的表达相比呈现更大的生物活性。
在某些实施方案中，生物活性通过凝固检定或FVIII检定或FVIII缺乏模型中的减少出血来测定。
在某些实施方案中，表达盒在与包装在调节元件与核酸序列之间具有(a)内含子或(b)未翻译的核酸的108个或更多个核苷酸的表达盒相比时更有效地包装至AAV载体中。
根据本发明，提供了调节元件(启动子)的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)减少的核酸序列。示例性的启动子包括TTR(甲状腺素转运蛋白基因)启动子和ApoE/hAAT(人类载脂蛋白E基因/人类α-1抗胰蛋白酶基因)启动子。示例性启动子还包括血纤维蛋白原γ链基因(FGG)启动子、白蛋白启动子及血清淀粉样蛋白A1基因(SAA1)启动子。示例性启动子进一步包括稠合至hAAT启动子、FGG启动子、白蛋白启动子和/或SAA1启动子中的一或多者(产生杂合启动子或启动子嵌合体)的TTR启动子。
CpG减少的核酸调节元件包括在转移至细胞中时与非CpG减少的调节元件相比呈现经改变的基因表达水平的变体。在某些实施方案中，CpG减少的调节元件可提供转基因或异源核酸(诸如编码诸如血液凝固因子(例如，FVIII)的蛋白的转基因)在哺乳动物中的经增加的表达，以及在基因转移的内容背景中通过增加诸如血液凝固因子之类的蛋白的循环水平，且实现止血以获得有益治疗结果来提供经增加的疗效。
在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQ ID NO:2、3、22和23中的任一者)少至少1个。
在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQ ID NO:2、3、22和23中的任一者)少至少2个。
在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQ ID NO:2、3、22和23中的任一者)少至少3个。
在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQ ID NO:2、3、22和23中的任一者)少至少4个。
在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQ ID NO:22和23中的任一者)少至少5个。
在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQ ID NO:22和23中的任一者)少至少6个。
在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQ ID NO:22和23中的任一者)少至少7个。
在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQ ID NO:22和23中的任一者)少至少8个。
在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQ ID NO:22和23中的任一者)少至少9个。
在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQ ID NO:22和23中的任一者)少至少10个。
在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQ ID NO:22和23中的任一者)少至少11个。
在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQ ID NO:22和23中的任一者)少至少12个。
在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQ ID NO:22和23中的任一者)少至少13个。
在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQ ID NO:22和23中的任一者)少至少14个。
在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQ ID NO:22和23中的任一者)少至少15个。
在某些实施方案中，核酸序列具有的CpG比野生型非CpG减少的调节元件(例如，SEQ ID NO:22和23中的任一者)少至少16个。
在某些实施方案中，核酸序列具有不超过16个的CpG；具有不超过15个的CpG；具有不超过14个的CpG；具有不超过13个的CpG；具有不超过12个的CpG；具有不超过11个的CpG；具有不超过10个的CpG；具有不超过9个的CpG；具有不超过8个的CpG；具有不超过7个的CpG；具有不超过6个的CpG；具有不超过5个的CpG；具有不超过4个的CpG；具有不超过3个的CpG；具有不超过2个的CpG；或具有不超过1个的CpG。
在某些实施方案中，核酸序列具有至多15个CpG；14个CpG；13个CpG；12个CpG；11个CpG；10个CpG；9个CpG；8个CpG；7个CpG；6个CpG；5个CpG；4个CpG；3个CpG；2个CpG；或1个CpG。在某些实施方案中，核酸序列不具有CpG。
在某些实施方案中，包含SEQ ID NO:22或23的核酸序列经修饰成具有15个或更少的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)；14个或更少的CpG；13个或更少的CpG；12个或更少的CpG；11个或更少的CpG；10个或更少的CpG；9个或更少的CpG；8个或更少的CpG；7个或更少的CpG；6个或更少的CpG；5个或更少的CpG；4个或更少的CpG；3个或更少的CpG；2个或更少的CpG；或1个或0个CpG。在某些实施方案中，SEQ ID NO:2、3、22和23中的任一者中的核酸序列经修饰成具有0个CpG。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:2、3、22和23中的任一者中的核酸序列被修饰以使得各CpG位点中的C经修饰成T，任选地排除C/EBP位点中的C。
在某些实施方案中，除了第一个CpG位点保持未被修饰之外，SEQ ID NO:2、3、22和23中的任一者中的核酸序列被修饰以使得各CpG位点中的C被修饰成T，任选地排除C/EBP位点中的C。
在某些实施方案中，除了第二个CpG位点保持未被修饰之外，SEQ ID NO:2、3、22和23中的任一者中的核酸序列被修饰以使得各CpG位点中的C被修饰成T，任选地排除C/EBP位点中的C。
在某些实施方案中，除了第三个CpG位点保持未被修饰之外，SEQ ID NO:2、3、22和23中的任一者中的核酸序列被修饰以使得各CpG位点中的C被修饰成T，任选地排除C/EBP位点中的C。
在某些实施方案中，除了第四个CpG位点保持未被修饰之外，SEQ ID NO:2、3、22和23中的任一者中的核酸序列被修饰以使得各CpG位点中的C被修饰成T，任选地排除C/EBP位点中的C。
在某些实施方案中，除了第五个CpG位点保持未被修饰之外，SEQ ID NO:22和23中的任一者中的核酸序列被修饰以使得各CpG位点中的C被修饰成T，任选地排除C/EBP位点中的C。
在某些实施方案中，除了第六个CpG位点保持未被修饰之外，SEQ ID NO:22和23中的任一者中的核酸序列被修饰以使得各CpG位点中的C被修饰成T，任选地排除C/EBP位点中的C。
在某些实施方案中，除了第七个CpG位点保持未被修饰之外，SEQ ID NO:22和23中的任一者中的核酸序列被修饰以使得各CpG位点中的C被修饰成T。
在某些实施方案中，除了第八个CpG位点保持未被修饰之外，SEQ ID NO:22和23中的任一者中的核酸序列被修饰以使得各CpG位点中的C被修饰成T，任选地排除C/EBP位点中的C。
在某些实施方案中，除了第九个CpG位点保持未被修饰之外，SEQ ID NO:22和23中的任一者中的核酸序列被修饰以使得各CpG位点中的C被修饰成T，任选地排除C/EBP位点中的C。
在某些实施方案中，除了第十个CpG位点保持未被修饰之外，SEQ ID NO:22和23中的任一者中的核酸序列被修饰以使得各CpG位点中的C被修饰成T，任选地排除C/EBP位点中的C。
在某些实施方案中，除了第十一个CpG位点保持未被修饰之外，SEQ ID NO:22和23中的任一者中的核酸序列被修饰以使得各CpG位点中的C被修饰成T，任选地排除C/EBP位点中的C。
在某些实施方案中，除了第十二个CpG位点保持未被修饰之外，SEQ ID NO:22和23中的任一者中的核酸序列被修饰以使得各CpG位点中的C被修饰成T，任选地排除C/EBP位点中的C。
在某些实施方案中，除了第十三个CpG位点保持未被修饰之外，SEQ ID NO:22和23中的任一者中的核酸序列被修饰以使得各CpG位点中的C被修饰成T，任选地排除C/EBP位点中的C。
在某些实施方案中，除了第十四个CpG位点保持未被修饰之外，SEQ ID NO:22和23中的任一者中的核酸序列被修饰以使得各CpG位点中的C被修饰成T，任选地排除C/EBP位点中的C。
在某些实施方案中，除了第十五个CpG位点保持未被修饰之外，SEQ ID NO:22和23中的任一者中的核酸序列被修饰以使得各CpG位点中的C被修饰成T，任选地排除C/EBP位点中的C。
在某些实施方案中，除了第十六个CpG位点保持未被修饰之外，SEQ ID NO:22和23中的任一者中的核酸序列被修饰以使得各CpG位点中的C被修饰成T，任选地排除C/EBP位点中的C。
在某些实施方案中，修饰核酸序列以使得来自SEQ ID NO:2、3、22和23中的任一者中的5’端的至少第1个CpG被修饰成不是CpG。
在某些实施方案中，修饰核酸序列以使得来自SEQ ID NO:2、3、22和23中的任一者中的5’端的至少第2个CpG被修饰成不是CpG。
在某些实施方案中，修饰核酸序列以使得来自SEQ ID NO:2、3、22和23中的任一者中的5’端的至少第3个CpG被修饰成不是CpG。
在某些实施方案中，修饰核酸序列以使得来自SEQ ID NO:2、3、22和23中的任一者中的5’端的至少第4个CpG被修饰成不是CpG。
在某些实施方案中，修饰核酸序列以使得来自SEQ ID NO:22和23中的任一者中的5’端的至少第5个CpG被修饰成不是CpG。
在某些实施方案中，修饰核酸序列以使得来自SEQ ID NO:22和23中的任一者中的5’端的至少第6个CpG被修饰成不是CpG。
在某些实施方案中，修饰核酸序列以使得来自SEQ ID NO:22和23中的任一者中的5’端的至少第7个CpG被修饰成不是CpG。
在某些实施方案中，修饰核酸序列以使得来自SEQ ID NO:22和23中的任一者中的5’端的至少第8个CpG被修饰成不是CpG。
在某些实施方案中，修饰核酸序列以使得来自SEQ ID NO:22和23中的任一者中的5’端的至少第9个CpG被修饰成不是CpG。
在某些实施方案中，修饰核酸序列以使得来自SEQ ID NO:22和23中的任一者中的5’端的至少第10个CpG被修饰成不是CpG。
在某些实施方案中，修饰核酸序列以使得来自SEQ ID NO:22和23中的任一者中的5’端的至少第11个CpG被修饰成不是CpG。
在某些实施方案中，修饰核酸序列以使得来自SEQ ID NO:22和23中的任一者中的5’端的至少第12个CpG被修饰成不是CpG。
在某些实施方案中，修饰核酸序列以使得来自SEQ ID NO:22和23中的任一者中的5’端的至少第13个CpG被修饰成不是CpG。
在某些实施方案中，修饰核酸序列以使得来自SEQ ID NO:22和23中的任一者中的5’端的至少第14个CpG被修饰成不是CpG。
在某些实施方案中，修饰核酸序列以使得来自SEQ ID NO:22和23中的任一者中的5’端的至少第15个CpG被修饰成不是CpG。
在某些实施方案中，修饰核酸序列以使得来自SEQ ID NO:22和23中的任一者中的5’端的至少第16个CpG被修饰成不是CpG。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:2、3、22和23中的任一者中的一或多个CpG的胞嘧啶被修饰成胸腺嘧啶。在某些实施方案中，SEQ ID NO:2、3、22和23中的任一者中的一或多个CpG的胞嘧啶被修饰成腺嘌呤。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:2、3、22和23中的任一者中的核酸序列被修饰以使得一或多个CpG中的C被删除。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:2、3、22和23中的任一者中的核酸序列被修饰以使得一或多个CpG中的G被删除。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:2、3、22和23中的任一者中的核酸序列被修饰以使得一或多个CpG中的C和G被删除。
示例性的CpG减少的TTR启动子阐述于SEQ ID NO:4-13中。
示例性的CpG减少的杂合启动子阐述于SEQ ID NO:14-21中.
示例性的CpG减少的ApoE/hAAT启动子阐述于SEQ ID NO:24-67中。
在某些实施方案中，包含稠合至hAAT启动子、和/或FGG启动子、和/或白蛋白启动子、和/或SAA1启动子中的至少一者的全部或一部分的TTR启动子的全部或一部分的杂合启动子中的一或多个CpG的胞嘧啶被修饰成胸腺嘧啶(C T)或腺嘌呤(G A)。TTR启动子可以任何5’3’定向稠合至前述启动子中的任一者或组合。
在某些实施方案中，杂合启动子具有5’3’定向、TTR/hAAT或hAAT/TTR。在某些实施方案中，杂合启动子具有5’3’定向、TTR/FGG或FGG/TTR。在某些实施方案中，杂合启动子具有5’3’定向、TTR/hAAT/白蛋白或hAAT/TTR/白蛋白或白蛋白/TTR/hAAT或TTR/白蛋白/hAAT、hAAT/白蛋白/TTR或白蛋白/hAAT/TTR等。
在某些实施方案中，杂合启动子具有5’3’定向、TTR/FGG/白蛋白或hAAT/TTR/FGG或FGG/TTR/hAAT或TTR/FGG/hAAT等。
在某些实施方案中，杂合启动子具有稠合至hAAT启动子、FGG启动子、白蛋白启动子及SAA1启动子中的所有4种的全部或一部分的TTR启动子。TTR启动子可以任何5’3’定向且以任何启动子顺序稠合至前述启动子的全部或一部分。
在某些实施方案中，本发明的核酸序列或多核苷酸(诸如CpG减少的核酸序列)可操作地连接至转基因。
在某些实施方案中，本发明的核酸序列或多核苷酸(诸如如本文所阐述的经修饰SEQ ID NO:2、3、22或23)可操作地连接至转基因。
在某些实施方案中，本发明的核酸序列或多核苷酸(诸如如本文所阐述的经修饰SEQ ID NO:2、3、22或23)对可操作地连接的转基因赋予转录，该转录在由未修饰的SEQ IDNO:2、3、22或23赋予的转录的约5-100％内，或在由未修饰的SEQ ID NO:2、3、22或23赋予的转录的约50％内，或在由未修饰的SEQ ID NO:2、3、22或23赋予的转录的约25-50％内。
在某些实施方案中，诸如如本文所阐述的经修饰SEQ ID NO:2、3、22或23的核酸序列或多核苷酸定位在转基因的5’处。
在某些实施方案中，转基因编码血液凝结或凝固蛋白。
在某些实施方案中，转基因编码因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VII(FVII)或蛋白C。
在某些实施方案中，转基因编码具有与SEQ ID NO:68的序列至少95％相同的序列的因子VIII。
在某些实施方案中，转基因被转录成抑制性RNA。在某些实施例中，抑制性RNA包含反义RNA、微RNA(miRNA)或小干扰RNA(siRNA)。
在某些实施方案中，转基因编码在肝脏细胞中表达且分泌于全身循环中的治疗蛋白。
在某些实施方案中，治疗蛋白治疗或预防神经退化性或中枢神经系统(CNS)疾病。
在某些实施方案中，治疗蛋白为保护性ApoE同工型。
在某些实施方案中，治疗蛋白为ApoEε2同工型。
在某些实施方案中，治疗蛋白治疗或预防自体免疫疾病或过敏性疾病。
在某些实施方案中，治疗蛋白为包含非所需抗原和驱动从细胞分泌该治疗蛋白的前导序列的融合蛋白。
在某些实施方案中，非所需抗原为髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)细胞外结构域或其片段。
在某些实施方案中，表达盒包含可操作地连接至转基因的本发明的核酸序列或多核苷酸，诸如如本文所阐述的经修饰的SEQ ID NO:2、3、22或23，其中核酸序列或多核苷酸被定位在转基因的5’端的上游，且任选地其中存在定位于核酸序列或多核苷酸与转基因的5’端之间的未转译的核酸序列的不超过0-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-105、106或107个的核苷酸。
在某些实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:4-21或24-67中的任一者的序列具有95％或更大序列一致性的第一核苷酸序列，其中经定位于第二核苷酸序列的5’端的上游的第一核苷酸序列与SEQ ID NO:77的序列具有95％或更大序列一致性，且任选地其中存在定位于第一核苷酸序列与第二核苷酸序列的5’端之间的未翻译的核酸序列的不超过0-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-105、106或107个的核苷酸。
在某些实施方案中，表达盒包含SEQ ID NO:1的序列或与SEQ ID NO:1的序列具有至少98％序列一致性的多核苷酸。
在某些实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少99％序列一致性的多核苷酸。
在某些实施方案中，表达盒基本上由SEQ ID NO:1组成。
在某些实施方案中，转基因或第二核苷酸序列包含编码具有B结构域缺失的因子VIII(FVIII)(FVIII-BDD)的核酸序列，且该核酸序列编码具有FVIII血液凝结活性且与SEQID NO:68的序列具有至少90％序列一致性的FVII-BDD蛋白。
在某些实施方案中，转基因或第二核苷酸序列包含编码具有B结构域缺失的因子VIII(FVIII)(FVIII-BDD)的核酸序列，且该核酸序列与SEQ ID NO:77的序列具有90％或更大序列一致性且编码具有FVIII血液凝结活性的蛋白。
在某些实施方案中，未翻译的核酸序列不是内含子或无内含子。
在某些实施方案中，第一核苷酸序列包含与SEQ ID NO:4-21或24-67中的任一者至少95％相同的核酸序列。
在某些实施方案中，第一核苷酸序列包含与SEQ ID NO:4-21或24-67中的任一者的序列至少95％相同的核酸序列，且具有与SEQ ID NO:4-21或24-67中的任一者的序列中所阐述的相同总数目的减少的CpG。
在某些实施方案中，第一核苷酸序列包含与SEQ ID NO:4-21或24-67中的任一者的序列至少95％相同且CpG已在与SEQ ID NO:4-21或24-67中的任一者的序列中所阐述相同的位置处被取代成CpT、CpA、TpG或ApG的核酸序列。
在某些实施方案中，第二核苷酸序列在与来自在第一核苷酸序列与第二核苷酸序列的5’端之间具有108个或更多个核苷酸的多核苷酸的表达相比时呈现更高的表达。
在某些实施方案中，第二核苷酸序列在与来自在第一核苷酸序列与第二核苷酸序列的5’端之间具有108个或更多个核苷酸的多核苷酸的表达相比时呈现更大生物活性。
在某些实施方案中，生物活性通过凝固检定或在FVIII检定或FVIII缺乏模型中的减少的出血来确定。
在某些实施方案中，第二核苷酸序列在与包装在第一核苷酸序列与第二核苷酸序列的5’端之间具有108个或更多个核苷酸的多核苷酸相比时更有效地包装至AAV载体中。
在某些实施方案中，腺相关病毒(AAV)载体包含如本文中所阐述的核酸序列或多核苷酸或表达盒。
在某些实施方案中，AAV载体包含以下一或多者：a)AAV衣壳；以及b)一或多个AAV反向末端重复序列(ITR)，其中AAV ITR侧接核酸序列、多核苷酸和/或转基因的5’或3’末端。
在某些实施方案中，AAV载体进一步包含定位于侧接5’或3’ITR内的内含子。
在某些实施方案中，内含子或一或多个ITR被修饰成具有减少的CpG。
在某些实施方案中，AAV衣壳血清型包含与AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV-2i8、SEQ ID NO:91或SEQ IDNO:92VP1、VP2和/或VP3序列具有90％或更高序列一致性的经修饰或变异的AAV VP1、VP2和/或VP3衣壳；或与AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV-2i8、SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92VP1、VP2和/或VP3序列具有95％或更高序列一致性的衣壳；或与AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV-2i8、SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92VP1、VP2和/或VP3序列具有100％序列一致性的衣壳。
在某些实施方案中，ITR包含以下任一者的一或多个ITR：AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10或Rh74 AAV血清型或其组合。
在某些实施方案中，AAV载体进一步包含ITR、聚腺苷酸化(polyA)信号和/或内含子序列。
在某些实施方案中，如本文中所阐述的AAV载体是任何医药组合物。
在某些实施方案中，医药组合物包含生物兼容性载剂或赋形剂。
在某些实施方案中，医药组合物进一步包含空AAV衣壳。
在某些实施方案中，组合物或医药组合物包含在约100:1-50:1、约50:1-25:1、约25:1-10:1、约10:1-1:1、约1:1-1:10、约1:10-1:25、约1:25-1:50或约1:50-1:100内或之间的空AAV衣壳比AAV载体的比率。
在某些实施方案中，组合物或医药组合物中的空AAV衣壳比AAV载体的比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
在某些实施方案中，本文中所阐述的组合物或医药组合物进一步包含表面活性剂。
在某些实施方案中，提供治疗对基因疗法有需要的人类的方法。
在某些实施方案中，人类需要血液凝结或凝固因子。
在某些实施方案中，治疗人类的方法包括(a)提供如本文所阐述的表达盒、如本文所阐述的多核苷酸、如本文所阐述的AAV载体或、如本文中所阐述的医药组合物；以及(b)向人类施用一定量的表达盒、多核苷酸、AAV载体或医药组合物，其中血液凝结或凝固因子在人类中表达。
在某些实施方案中，人类患有A型或B型血友病。
在某些实施方案中，AAV载体经静脉内、动脉内、腔室内、粘膜内或经由导管向人类施用。
在某些实施方案中，血液凝结或凝固因子在施用之后以增加的水平表达。
在某些实施方案中，血液凝结或凝固因子以大于在不需要血液凝结或凝固因子的人类中发现的血液凝结或凝固因子的水平的1％表达。
在某些实施方案中，血液凝结或凝固因子以在不需要血液凝结或凝固因子的人类中发现的血液凝结或凝固因子的水平的约1％-40％表达。
在某些实施方案中，血液凝结或凝固因子以在不需要血液凝结或凝固因子的人类中发现的血液凝结或凝固因子的水平的约5％-30％表达。
在某些实施方案中，AAV载体以约1×108至约1×1014个载体基因组/千克(vg/kg)人类体重的范围施用。
附图说明
图1展示标记为“CpG1”至“CpG22”的CpG减少的ApoE/hAAT调节元件hFIX编码结构的流体动力递送后24小时，小鼠血浆中通过活性检定来测量的人类因子IX(hFIX)水平。SEQID NO:24-67分别对应于含有或不含有限制酶位点的调节元件CpG1-ApoE/hAAT至CpG22-ApoE/hAAT，且在实施例13中进一步描述。hFIX水平以含有非CpG减少的ApoE/hAAT(SEQ IDNO:23)的参考质粒的倍数表示。
图2显示标记为“CpG1”至“CpG5”的CpG减少的TTRm启动子hFVIII编码结构的流体动力递送后24小时，小鼠血浆中通过ELISA检定来测量的人类因子VIII(hFVIII)抗原水平。SEQ ID NO:4-21分别对应于具有或不具有侧接限制酶位点的启动子CpG1-TTRm至CpG5-TTRm，且在实施例13中进一步描述。水平以正常人类血浆FVIII的百分比表示，其中100％＝150ng/mL。“TTRm”是指含有非CpG减少的TTRm启动子(SEQ ID NO:3)的hFVIII编码结构。
图3显示标记为“Hybrid 6”至“Hybrid 9”的CpG减少的杂合启动子hFVIII编码结构的流体动力递送后24小时，小鼠血浆中通过ELISA检定来测量的hFVIII抗原水平。SEQ IDNO:14-21分别对应于CpG减少的启动子Hybrid 6至Hybrid 9。水平以正常人类血浆FVIII的百分比表示，其中100％＝150ng/mL。“TTRm”是指含有非CpG减少的TTRm启动子(SEQ ID NO:3)的hFVIII编码结构。
图4显示了呈6.4e11载体基因组(vg)/kg的剂量的AAV衣壳化非CpG减少(TTRm)和CpG减少的Hybrid 6、7、8和9启动子hFVIII结构的递送后2、4和8周，小鼠血浆中通过ELISA检定来测量的hFVIII抗原水准。水平以正常人类血浆FVIII的百分比表示，其中100％＝150ng/mL。
图5显示了呈2.56e11、6.4e11及1.6e12vg/kg的剂量范围的AAV衣壳化非CpG减少(TTRm-hFVIII)、Hybrid 7及Hybrid 9启动子hFVIII结构的递送后8周，小鼠血浆中通过ELISA检定来测量的hFVIII抗原水平。水平以正常人类血浆FVIII的百分比表示，其中100％＝150ng/mL。
图6显示了在以6.4e11vg/kg的剂量静脉内施用AAV衣壳化非CpG减少(TTRm-hFVIII)、Hybrid 7和Hybrid 9启动子hFVIII结构之后8周，小鼠肝脏、大脑、睾丸、脾脏及肾脏中的hFVIII mRNA的表达。在除肝脏外的任何组织中未观测到hFVIII RNA，从而表明激活子的肝脏特异性性质。自左至右分别针对TTRm-hFVIII、Hybrid7-hFVIII和Hybrid9-hFVIII显示了肝脏、大脑、睾丸、脾脏和肾脏的结果组。
图7显示了称为“AAV-WINT”(TTRm-内含子-hFVIII-BDD)的具有内含子的表达盒与称为“AAV-INTL”(无内含子的TTRm-hFVIII-BDD:SEQ ID NO:1)的不具有内含子的表达盒的示意性比较。AAV-WINT具有位于TTRm启动子与编码B结构域缺失的人类因子VIII(hFVIII-BDD)的转基因之间的合成内含子(SEQ ID NO:93)，其不存在于AAV-INTL中。编码hFVIII-BDD的这些盒中的经密码子优化的核酸序列阐述于SEQ ID NO:77中。
图8显示了如通过对来自研究#1的6.4e9 vg/小鼠剂量的小鼠血浆样本执行的ELISA检测的hFVIII水平。结果为各治疗组中的动物(n＝5)的平均值。误差条表示标准偏差。
图9显示了如通过对来自研究#1的1.6e10 vg/小鼠剂量的小鼠血浆样本执行的ELISA检测的hFVIII水平。结果为各治疗组中的动物(TTRm hFVIII，n＝4:无内含子的TTRmhFVIII，n＝5)的平均值。误差条表示标准偏差。
图10显示了如通过对来自研究#2的小鼠血浆样本执行的ELISA检测的hFVIII水平。结果为各治疗组中的动物(n＝10)的平均值。误差条表示标准偏差。
图11显示了如通过对来自研究#1的非人类灵长类(NHP)血浆样本执行的ELISA检测的hFVIII水平。显示了来自低剂量(2e12Vg/kg)第1组(AAV-WINT，具有方框的线，n＝2)和第2组(AAV-INTL，SEQ ID NO:1，具有三角形的线，n＝3)的个体猴的结果。归因于在给药前8天样本中观测到的针对AAV的阳性中和抗体而去除来自一个低剂量AAV-WINT的动物P0001。
图12显示了如通过对来自研究#1的NHP血浆样本执行的ELISA检测的hFVIII水平。显示了高剂量(6e12vg/kg)第3组(AAV-WINT，具有方框的线，n＝2)和第4组(AAV-INTL，SEQID NO:1，具有三角形的线，n＝3)中的个体猴的结果。归因于在治疗时未观测到hFVIII表达而去除一个来自高剂量AAV-WINT的动物P0101。
图13显示了如通过对来自研究#2的NHP血浆样本执行的ELISA检测的hFVIII水平。显示了AAV-WINT(具有方框的线，n＝5)和AAV-INTL(SEQ ID NO:1，具有三角形的线，n＝5)的2e12vg/kg剂量下的个体猴的结果。
图14显示了在三个不同感染多重性(MOI)下的基于细胞的载体效能检定的结果。细胞上清液通过Chromogenix CoatestSP4来评定hFVIII活性且为两次重复检定的两个生物复制品(biological replicates)的平均值。误差条表示标准差。“AAV-WINT”和“AAV-INTL”为原始未经稀释的病毒储备瓶，而“AAV-WINT剂量”和“AAV-INTL剂量”指示经稀释以用于输注的材料。
图15显示了来自图14的重新绘制为各MOI的倍数变化相对于AAV-WINT的结果。
图16显示了在三个不同MOI下的活体外基于细胞的载体效能检定中的载体效能的评估。细胞上清液通过Chromogenix Coatest SP4来评定hFVIII活性且为两次重复检定的两个生物复制品的平均值。误差条表示标准偏差。AAV-WINT和AAV-INTL(SEQ ID NO:1)为来自两个不同批次的原始病毒储备瓶。
图17显示了从经mTTR-内含子-hFVIII-BDD和mTTR-hFVIII-BDD(SEQ ID NO:1)的独立质粒DNA制剂(prep)转染的Huh7细胞上清液通过Chromogenix Coatest SP4检定的表达盒的活体外hFVIII水平的比较。个体数据点显示了为实心圆，其中各条柱表示两次重复检定的两个生物复制品(n＝2)的平均值。误差条表示标准偏差。
图18显示了用5×1011vg/kg的在LK03 AAV载体(SEQ ID NO:91)中衣壳化的AAV-INTL hFVIII表达盒(SEQ ID NO:1)(在本文中称为LK03-INTL hFVIII-BDD)输注的4名人类受试者(参与者1(圆圈)、2(方形)、3(三角形)和4(菱形))中的每日FVIII活性水平。
图19显示了用5×1011vg/kg的LK03-INTL hFVIII-BDD输注的4名人类受试者(参与者1(圆圈)、2(方形)、3(三角形)和4(菱形))中的FVIII活性水平的每周平均值。
图20显示了用5×1011vg/kg的LK03-INTL hFVIII-BDD输注的4名人类受试者(参与者1(圆圈)、2(方形)、3(三角形)和4(菱形))中的FVIII活性水平的四周模块平均值。
具体实施方式
本文中公开了用于因子VIII(FVIII)及具有缺失B结构域的FVIII(FVIII-BBD)(例如，人类FVIII(hFVIII)和人类FVIII-BDD(hFVIII-BDD))的表达的无内含子表达盒。研究人员已报导，表达盒中包括内含子(包括在AAV递送载体中)可有助于增加转基因表达(Huanget al.,1990,Nucl.Acid Res.,18:937-947；Choi et al.,2014,Mol.Brain,7:17；Powellet al.,2015,Discov.Med.,19:49-57；Lu et al.,2017,Hum.Gene Ther.,28:125-134)。出人意料地，如本文中所公开的，内含子的部分或完全去除使得AAV载体效能及转基因(在此情况下，因子VIII)表达水平在细胞培养物、小鼠和非人类灵长类动物中增加。“无内含子”表达盒设计是用于治疗诸如A型血友病之类的血液凝固病症的载体的改进，且可在较低载体剂量下提供疗效，除减少诸如成本和时间之类的制造障碍之外，还潜在地向患者安全性和结果提供益处。
本文还公开了与参考野生型哺乳动物(例如人类)序列相比具有减少的CpG和/或与参考野生型哺乳动物(例如人类)序列具有小于100％的序列一致性的核酸序列。具有减少的CpG的核酸序列包括一或多种以下启动子：TTR启动子、ApoE/hAAT启动子、FGG启动子、白蛋白启动子和SAA1启动子。具有减少的CPG的核酸序列包括TTR启动子与至少一或多种以下启动子的融合物或杂合体：ApoE/hAAT启动子、FGG启动子、白蛋白启动子及SAA1启动子。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文可互换使用，是指所有形式的核酸，寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。多核苷酸包括基因组DNA，cDNA和反义DNA，以及剪接或未剪接的mRNA，rRNA tRNA和抑制性DNA或RNA(RNAi，例如，小或短发夹(sh)RNA，微小RNA(miRNA)，小或短干扰(si)RNA，反式剪接RNA或反义RNA)。多核苷酸包括天然存在的、合成的和有意修饰或改变的多核苷酸(例如，变体核酸)。多核苷酸可以是单、双或三链，线性或环状，并且可以具有任何长度。在讨论多核苷酸时，本文中可以根据在5’至3’方向上提供序列的惯例描述特定多核苷酸的序列或结构。
如本文所用，术语“修饰”或“变体”及其语法变化是指核酸，多肽或其不同于参考序列的子序列(subsequence)。因而经修饰及变体序列可具有与参考序列相比实质上相同、更高或更低的表达、活性或功能，但至少保留参考序列的部分活性或功能。修饰或变体的特定实施例为CPG减少的TTR启动子、ApoE/hAAT启动子、FGG启动子、白蛋白启动子及SAA1启动子。
“核酸”或“多核苷酸”变体是指与野生型相比已经基因改变的经修饰序列。核酸或多核苷酸变体可指代已经密码子修饰但仍保留与诸如野生型序列之类的参考序列至少部分序列一致性的序列。编码蛋白的核酸或多核苷酸可经基因修饰而不改变所编码蛋白序列。替代地，序列可经基因修饰以编码变体蛋白。举例而言，该核酸变体的一些密码子将改变(例如CpG减少)而不改变由此编码的蛋白的氨基酸。
含有具有减少的CpG含量的启动子的表达载体与CpG含量尚未减少的启动子相比可表现出改进。在比较表达时，将CpG减少的启动子与野生型或非CpG减少的启动子进行比较。
术语“变体”或“经修饰”不需要在参考本文中的CpG减少的核酸序列的每种情况下出现。同样，术语“CpG减少的核酸”或其类似者可省略术语“变体”或“经修饰”，但意指，参考的“CpG减少的核酸”包括在基因水平的变体。
变体的特定实施例为CpG减少的核酸。CpG减少可通过将C或G核苷酸改变成不同核苷酸(诸如将C改变成T或将G改变成A)来实现。CpG减少也可以通过删除C核苷酸或删除G核苷酸或删除C和G核苷酸两者来实现。
“变体或经修饰”的FVIII是指与未修饰的野生型FVIII或FVIII-BDD(SEQ ID NO:68)相比已经基因改变的FVIII或FVIII-BDD。该变体可称为“编码因子VIII(FVIII)的核酸变体”。
“变体因子VIII(FVIII)”也可以是指修饰的FVIII蛋白，使得与野生型FVIII相比，修饰的蛋白具有氨基酸改变。在比较活性和/或稳定性时，如果编码的变体FVIII蛋白保留了B结构域，则将其与野生型FVIII进行比较是合适的；并且如果编码的变体FVIII蛋白具有B结构域缺失，则将其与也具有B结构域缺失的野生型FVIII进行比较。
变体FVIII可包含B结构域的一部分。因此，FVIII-BDD包括B结构域的一部分。通常，在FVIII-BDD中，大多数B结构域都被删除。
变体FVIII可包含表示如SFSQNPPVLKRHQR(SEQ ID NO:69)所示的“SQ”序列。通常，具有SQ的这种变体FVIII(FVIII/SQ)具有BDD，例如，删除了BD的至少全部或部分。变体FVIII，例如FVIII-BDD可以具有“SQ”序列的全部或部分，即SEQ ID NO:69的全部或部分。因此，例如，具有SQ序列(SFSQNPPVLKRHQR，SEQ ID NO:69)的变体FVIII-BDD可以具有全部或仅部分的氨基酸序列SFSQNPPVLKRHQR。例如，FVIII-BDD可以具有SFSQNPPVLKRHQR(包括在内)的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸残基。因此，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个内部缺失以及1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基-或羧基末端缺失的SFSQNPPVLKRHQR被包含在如本文所述的变体FVIII蛋白。
由“核酸”或“多核苷酸”序列编码的“多肽”、“蛋白”和“肽”包括全长天然序列，(与天然存在的野生型蛋白一样)，以及功能子序列、修饰形式或序列变体，只要所述子序列、修饰形式或变体保留了天然全长蛋白的一定程度的功能即可。例如，编码FVIII蛋白的核酸(例如，CpG减少的核酸)可具有如本文所述的B结构域缺失并保留凝固功能。在本发明的方法和用途中，由所述核酸序列编码的此类多肽、蛋白和肽可以但不必须与在治疗的哺乳动物中有缺陷或表达不足或缺乏的内源蛋白相同。
举例而言，且不限于，修饰包括一或多个核苷酸或氨基酸取代(例如1-3、3-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-500、500-750、750-850个或更多个核苷酸或残基)。如本文中所阐述的，核酸修饰的实施例是CpG减少。
氨基酸修饰的实施例是保守氨基酸取代或例如FVIII之类的参考序列的删除(例如，子序列或片段)，诸如具有B结构域缺失的FVIII。在某些实施方案中，经修饰或变体序列保留未修饰序列的功能或活性的至少部分。
明确地包括已知或未知的所有哺乳动物及非哺乳动物形式的核酸，其包括本文中其他哺乳动物形式的CpG减少的启动子。
术语“载体”是指可通过插入或掺入核酸来操控的小载剂核酸分子、质粒、病毒(例如，AAV)或其他溶媒。载体可用于基因操控(即，“克隆载体”)以将多核苷酸引入/转移至细胞和/或器官中且转录或翻译细胞中所插入的多核苷酸。“表达载体”是含有具有在宿主细胞中表达所需的必需调节区的基因或核酸序列的载体。载体核酸序列一般含有用于在细胞中繁殖的至少一复制起点及任选的额外元件，诸如异源核酸序列、表达控制元件(例如，启动子、增强子)、内含子、反向末端重复序列(ITR)、任选的可选标记物、聚腺苷酸化信号。
如本文中所公开的，不含内含子的载体与具有合成内含子的相同载体相比表现出优良特性。因此，本发明提供包含可操作地连接至调节元件的转基因的表达盒，其中调节元件(例如，如本文中所阐述的CpG减少的启动子)被定位在转基因的5’端上游，且其中在调节元件与转基因的5’端之间存在未翻译的核酸序列的不超过0-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-105、106或107个的核苷酸。
本发明还提供了包含与SEQ ID NO:2-67中的任一者的序列具有95％或更大序列一致性的第一核苷酸序列的表达盒，其中第一核苷酸序列被定位在与SEQ ID NO:77的序列具有95％或更大序列一致性的第二核苷酸序列的5’端上游，且其中未翻译的核酸序列的不超过0-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-105、106或107个的核苷酸在第一核苷酸序列与第二核苷酸序列的5’端之间。
本发明另外提供了包含与SEQ ID NO:2-67中的任一者的序列具有95％或更大序列一致性的第一核苷酸序列的表达盒，其中第一核苷酸序列被定位在与SEQ ID NO:71-88中的任何一者的序列具有95％或更大序列一致性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更大序列一致性)的第二核苷酸序列的5’端上游，且其中未翻译的核酸序列的不超过0-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-105、106或107个的核苷酸在第一核苷酸序列与第二核苷酸序列的5’端之间。
本发明进一步提供具有定位于调节元件与转基因之间的未翻译(非编码)的核酸的表达盒，其中未翻译的核酸并非内含子。该表达盒可称为无内含子盒。
内含子是具有允许细胞机构在RNA成熟为mRNA的过程期间剪接出未翻译的核苷酸序列的供体位点和剪接受体位点的序列。如本文中所使用的，“无内含子”是指缺乏供体和剪接受体位点的未翻译的核酸序列，但不意指未翻译的核酸序列不含其他位点，诸如限制酶识别/裂解位点、Kozak序列、转录因子识别/结合位点。换言之，无内含子不意指核酸序列完全不含任何未翻译的核酸序列。
AAV载体衍生自腺相关病毒。AAV载体适于用作基因疗法载体，这是因为其可穿透细胞且引入核酸/基因物质以使得核酸/基因物质可稳定地维持在细胞中。因为AAV不与人类的病原性疾病相关联，所以AAV载体能够将异源核酸序列(例如，编码治疗蛋白及抑制性RNA的异源核酸序列)递送至人类患者而不造成实质AAV发病机制或疾病。
作为载体的修饰语(诸如重组型AAV(rAAV)载体)以及序列的修饰语(诸如重组型多核苷酸及多肽)的术语“重组型”意指组合物已以一般不存在于自然界中的方式被操控(即，经工程改造)。重组型AAV载体的特定实施例将是：其中将通常在野生型AAV基因组(异源序列)中不存在的核酸插入病毒基因组内。实施例将是：其中将编码治疗蛋白或多核苷酸序列的核酸(例如，基因)克隆至载体中，该载体含有或不含有基因在AAV基因组内通常所缔合的5’、3’和/或内含子区域。尽管参考AAV载体以及诸如多核苷酸之类的序列时，本文中并未始终使用术语“重组型”，但尽管有任何此类省略，包括AAV载体、多核苷酸等的重组型形式也明确地包括在内。
“rAAV载体”通过使用分子方法以去除野生型AAV基因组的全部或一部分且经诸如编码治疗蛋白或多核苷酸序列之类的核酸的非天然(异源)核酸置换而衍生自野生型AAV基因组。通常，针对rAAV载体，保留AAV基因组的一种或两种反向末端重复(ITR)序列。因为相对于AAV基因组核酸，AAV基因组的全部或一部分已经非天然序列置换，诸如经编码治疗蛋白或多核苷酸序列的异源核酸置换，所以rAAV区别于AAV基因组。因此，掺入非天然(异源)序列将AAV定义为“重组型”AAV载体，其可称为“rAAV载体”。
重组型AAV载体序列可包装-在本文中称为“颗粒”-以用于离体、活体外或活体内细胞的后续感染(转导)。在重组型载体序列衣壳化或包装至AAV颗粒中的情况下，颗粒也可称为“rAAV”或“rAAV颗粒”或“rAAV病毒粒子”。这种rAAV、rAAV颗粒及rAAV病毒粒子包括衣壳化或包装载体基因组的蛋白。在AAV的情况下，特定实施例包括衣壳蛋白。
“载体基因组”或方便地缩写为“vg”是指最终经包装或衣壳化以形成rAAV颗粒的重组型质粒序列的部分。在重组型质粒用于构建或制造重组型AAV载体的情况下，AAV载体基因组不包括不对应于重组型质粒的载体基因组序列的“质粒”的部分。重组型质粒的该非载体基因组部分称为对于质粒的克隆及扩增至关重要的“质粒主链”，其为繁殖及重组型AAV载体产生所需的过程，但自身不包装或衣壳化至rAAV颗粒中。因此，“载体基因组”是指由rAAV包装或衣壳化的核酸。
“AAV辅助功能”是指可经表达以提供AAV基因产物及AAV载体的经AAV衍生编码序列(蛋白)，该AAV基因产物以及AAV载体继而反式作用以用于生产性AAV复制和包装。因此，AAV辅助功能包括主要AAV开放阅读框架(ORF)rep和cap两者。已显示了Rep表达产物具有许多功能，尤其包括：DNA复制的AAV起点的识别、结合和切口(nicking)；DNA解螺旋酶活性；以及AAV(或其他异源)启动子的转录调节。Cap表达产物(衣壳)提供必需的包装功能。AAV辅助功能用于补充AAV载体基因组中缺失的反式AAV功能。
举例而言，“AAV辅助结构”一般是指包括提供从AAV载体删除的AAV功能的核苷酸序列的核酸序列，该AAV载体将用于产生转导AVV载体以用于通过基因疗法向受试者递送所关注的核酸序列。AAV辅助结构通常用于提供AAV rep和/或cap基因的短暂表达以补充AAV载体复制以及衣壳化必需的缺失AAV功能。辅助结构一般缺乏AAV ITR且可既不复制也不包装自身。AAV辅助结构可呈质粒、噬菌体、转座子、黏粒、病毒或病毒粒子的形式。已经描述大量AAV辅助结构，诸如编码Rep和Cap表达产物的质粒pAAV/Ad和pIM29+45(参见例如Samulski et al.(1989)J.Virol.63:3822-3828；以及McCarty et al.(1991)J.Virol.65:2936-2945)。已经描述编码Rep和/或Cap表达产物的大量其他载体(参见例如美国专利No.5,139,941和No.6,376,237)。
术语“辅助功能”是指AAV复制所依赖的非AAV衍生的病毒和/或细胞功能。术语包括在AAV复制中所需要的蛋白和RNA，其包括涉及AAV基因转录的活化、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、Cap表达产物的合成以及AAV衣壳包装的部分。基于病毒的辅助功能可衍生自已知辅助病毒(诸如腺病毒、疱疹病毒(除1型单纯疱疹病毒以外)及牛痘病毒)中的任一者。
“辅助功能载体”一般是指包括提供辅助功能的多核苷酸序列的核酸分子。这些序列可在辅助功能载体上，且经转染至适合宿主细胞中。辅助功能载体能够支持在宿主细胞中的rAAV病毒粒子产生。辅助功能载体可呈质粒、噬菌体、转座子或黏粒的形式。另外，针对辅助功能，不需要腺病毒基因的完全补充。举例而言，已经报导不能进行DNA复制及后期基因合成的腺病毒突变体准许用于AAV复制(Ito et al.,(1970)J.Gen.Virol.9:243；Ishibashi et al.,(1971)Virology 45:317)。类似地，已经显示了E2B和E3区域内的突变体支持AAV复制，从而指示E2B和E3区域很可能不涉及提供辅助功能(Carter et al.,(1983)Virology 126:505)。在E1区域中为缺陷性的或具有被删除E4区域的腺病毒不能支持AAV复制。因此，E1A和E4区域直接地或间接地呈现为AAV复制所必需(Laughlin et al.,(1982)J.Virol.41:868；Janik et al.,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1925；Carteret al.,(1983)Virology126:505)。其他经表征的腺病毒突变体包括：E1B(Laughlin etal.(1982),见上文；Janik et al.,(1981),见上文；Ostrove et al.,(1980)Virology104:502)；E2A(Handa et al.,(1975)J.Gen.Virol.29:239；Strauss et al.,(1976)J.Virol.17:140；Myers et al.,(1980)J.Virol.35:665；Jay et al.,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2927；Myers et al.,(1981)J.Biol.Chem.256:567)；E2B(Carter,Adeno-Associated Virus Helper Functions,in I CRC Handbook ofParvoviruses(P.Tijssen ed.,1990))；E3(Carter et al.,(1983),见上文)；及E4(Carteret al.,(1983),见上文；Carter(1995))。由在E1B编码区域中具有突变的腺病毒提供的辅助功能的研究已产生冲突结果，但E1B55k可以是AAV病毒粒子产生所需要的，而E1B19k则不是所需要的(Samulski et al.,(1988)J.Virol.62:206-210)。另外，国际公开WO 97/17458和Matshushita et al.,(1998)Gene Therapy 5:938-945描述了编码各种腺病毒基因的辅助功能载体。示例性辅助功能载体包含腺病毒VA RNA编码区、腺病毒E4ORF6编码区、腺病毒E2A 72kD编码区、腺病毒E1A编码区及不含完整ElB55k编码区的腺病毒E1B区域。这些辅助功能载体描述于例如国际公开No.WO 01/83797中。
如本文中所使用，术语“血清型”是一种区别，其用于指具有衣壳的AAV在血清学上不同于其他AAV血清型。血清区别性是基于与另一AAV相比，抗体与一种AAV之间缺乏交叉反应性来确定的。交叉反应性差异通常归因于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的差异(例如归因于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)。
在传统定义下，血清型是指目标病毒已经针对所有现有和特征性血清型的血清进行中和活性测试，并且未发现能中和目标病毒的抗体。由于更多天然存在的病毒分离株的发现和/或衣壳突变体的产生，因此与任何目前存在的血清型可能存在血清学差异，也可能没有血清学差异。因此，在新病毒(例如，AAV)没有血清学差异的情况下，该新病毒(例如，AAV)将是相应血清型的亚群或变体。在许多情况下，尚未对具有衣壳序列修饰的突变病毒进行中和活性的血清学测试，以根据传统的血清型定义确定它们是否属于另一种血清型。因此，为方便起见和避免重复，术语“血清型”广义上既是指血清学上不同的病毒(例如AAV)，也是指可能在给定血清型的亚群或变体内的血清学上不同的病毒(例如AAV)。
rAAV载体包括任何病毒株或血清型。例如，并且不限于，rAAV载体基因组或颗粒(衣壳，诸如VP1、VP2和/或VP3)可基于任何AAV血清型，例如诸如AAV-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-rh74、-rh10或AAV-2i8。这些载体可基于相同病毒株或血清型(或亚群或变体)，或彼此不同。例如，并且不限于，基于一种血清型基因组的rAAV质粒或载体基因组或颗粒(衣壳)可与包装载体的衣壳蛋白中的一或多者一致。另外，rAAV质粒或载体基因组可基于不同于包装载体基因组的衣壳蛋白中的一或多者的AAV血清型基因组，在此情况下三种衣壳蛋白中的至少一者可以是不同的AAV血清型，例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10、AAV-2i8、LK03(SEQID NO:91)、SPK(SEQ ID NO:92)或其变体。更具体而言，rAAV2载体基因组可包含除来自不同血清型的衣壳外的AAV2 ITR，诸如例如AAV1、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10、AAV-2i8、LK03(SEQ ID NO:91)、SPK(SEQ ID NO:92)或其变体。因此，rAAV载体包括与特定血清型以及也称为假型的混合血清型的基因/蛋白序列特性相同的基因/蛋白序列。
在某些实施方案中，rAAV载体包括与一或多个AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10、AAV-2i8、LK03(SEQ IDNO:91)、SPK(SEQ ID NO:92)衣壳蛋白(VP1、VP2和/或VP3序列)至少70％或更多(例如，75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等)一致的衣壳序列或由该衣壳序列组成。在某些实施方案中，rAAV载体包括与一或多个AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74或-rh10ITR至少70％或更多(例如，75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等)一致的序列或由该序列组成。
在某些实施方案中，rAAV载体包括其AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74和AAV-2i8变体(例如，ITR和衣壳变体，诸如氨基酸插入、添加、取代和删除)，例如，如WO 2013/158879(国际申请PCT/US 2013/037170)、WO 2015/013313(国际申请案PCT/US2014/047670)和US 2013/0059732(美国申请No.13/594,773，公开LK01、LK02、LK03(SEQ ID NO:91)等)中所阐述的。
rAAV(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10、AAV-2i8、LK03(SEQ ID NO:91)、SPK(SEQ ID NO:92)和变体、杂合体及嵌合序列)可使用本领域技术人员已知的重组型技术构建成包括侧接有一或多个功能性AAV ITR序列的一或多个异源多核苷酸序列(转基因)。根据急救、复制以及将重组型载体包装至rAAV载体颗粒中的需要，这种AAV载体通常保留至少一种功能性侧接ITR序列。因此，rAAV载体基因组将包括对于复制和包装而言顺式需要的序列(例如，功能性ITR序列)。
如本文中所使用的，词组“真实(bona fide)AAV载体”或“真实rAAV载体”是指包含能够感染目标细胞的异源核酸的AAV载体。该词组排除空AAV载体(无异源核酸)及不含完全插入物(例如，异源核酸片段)的AAV载体或含有宿主细胞核酸的那些AAV载体。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换地使用以指所有形式的核酸、寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
核酸包括基因组DNA、cDNA和反义DNA、以及剪接或未剪接mRNA、rRNA tRNA和抑制性DNA或RNA(RNAi，例如小或短发夹(sh)RNA、微RNA(miRNA)、小或短干扰(si)RNA、反式剪接RNA或反义RNA)。
核酸包括天然存在、合成以及有意修饰或改变的多核苷酸。核酸可以是单链、双链或三链，线性或环状，且可具有任何长度。在论述核酸时，特定多核苷酸的序列或结构可在本文中根据在5’至3’方向上提供序列的惯例描述。
“异源”核酸序列是指为了将多核苷酸通过载体介导转移/递送至细胞中的目的而插入至AAV质粒或载体中的多核苷酸。异源核酸序列不同于AAV核酸，即相对于AAV核酸而为非天然的。一旦转移/递送至细胞中，则可表达(例如，若适宜，转录及翻译)包含于载体内的异源核酸序列。替代地，不需要表达含于载体内的在细胞中的被转移/递送的异源多核苷酸。尽管参考核酸序列及多核苷酸时本文中并未始终使用术语“异源”，但即使在修饰语“异源”不存在的情况下，提及的核酸序列或多核苷酸也意指包括异源核酸序列及多核苷酸，尽管有省略也如此。
“转基因”在本文中用于方便地指代拟进入或已引入至细胞或生物体中的核酸。转基因包括任何核酸，诸如编码治疗蛋白或多核苷酸序列的异源核酸。术语转基因及异源核酸/多核苷酸序列在本文中可互换地使用。
在具有转基因的细胞中，转基因已通过质粒或AAV载体引入/转移，“转导”或“转染”细胞。术语“转导”和“转染”是指将诸如核酸之类的分子引入至生物体的宿主细胞(例如，HEK293)或细胞或器官中。转基因可或可不整合至受体细胞的基因组核酸中。
“核酸”、“多核苷酸”、“异源核酸”、“转基因”和“CpG减少的核酸序列”包括全长序列以及功能性子序列，只要子序列保留全长序列的一些功能度即可。核酸、多核苷酸、异源核酸、转基因和CpG减少的核酸序列。
由诸如异源核酸序列之类的“核酸序列”编码的“多肽”、“蛋白”和“肽”包括如同天然存在的蛋白的全长序列以及功能性子序列、修饰形式或序列变体，只要子序列、修饰形式或变体保留全长蛋白的一些官能度即可。由核酸序列编码的这样的多肽、蛋白和肽可能但不必与内源蛋白一致，该内源蛋白是缺陷性的或其表达不足或在经治疗的哺乳动物中缺乏。
举例而言，“宿主细胞”指示可用作或已经用作AAV载体质粒、AAV辅助结构、辅助功能载体或其他转移DNA的受体的微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。术语包括已转染的原始细胞的子代。因此，“宿主细胞”一般是指已经外源性DNA序列转染的细胞。应理解，单一亲本细胞的子代可因为天然、偶发或故意突变而不一定与原始亲本细胞具有完全相同的形态或基因组或总DNA补体。示例性的宿主细胞包括人类胚胎肾(HEK)细胞，诸如HEK293。
“经转导的细胞”为已引入转基因的细胞。因此，“经转导”细胞意指在将外源性分子(例如核酸(例如，转基因))掺入至细胞中之后细胞中的基因变化。因此，“经转导”细胞为已引入外源核酸的细胞或其子代。这些细胞可被繁殖(被培养)，且所引入蛋白可被表达或核酸可被转录，或诸如rAAV之类的载体可由细胞产生。针对基因疗法使用及方法，经转导细胞可包含器官或组织且进而可以在受试者内。
如本文中所使用的，提及细胞的术语“稳定”或“稳定整合”意指诸如可选标记物或异源核酸序列之类的核酸序列、或质粒或载体已(例如，通过同源重组、非同源末端连接、转染等)插入至染色体中，或在染色体外维持在受体细胞或宿主生物体中，且已保留在染色体中或在染色体外维持一段时间。
“细胞系”是指能够在适当培养条件下活体外连续或长期生长并分裂的细胞群。细胞系可能但不必要是从单一祖细胞衍生的克隆群。在细胞系中，自发或经诱导的变化可在这种克隆群的储存或转移期间以及在组织培养的长期传代期间出现在核型中。因此，衍生自细胞系的子代细胞可不与上代细胞或培养物精确地一致。适用于本发明纯化方法的示例性细胞系是HEK293。
“表达控制元件”是指影响可操作连接的核酸的表达的核酸序列。控制元件包括如本文中所阐述的表达控制元件，诸如启动子及增强子。rAAV载体可包括一或多个“表达控制元件”。通常，包括这种元件以促进恰当的异源多核苷酸转录以及(如果合适的话)翻译(例如，启动子、增强子、内含子的剪接信号、准许mRNA的框内翻译的基因的恰当阅读框架的维持及终止密码子等中的一或多者)。这种元件通常顺式起作用，称为“顺式作用”元件，但也可反式起作用。
表达控制可在转录、翻译、剪接、消息稳定性等层面实现。通常，调节转录的表达控制元件并置(juxtaposed)于经转录的核酸的5’端(即，“上游”)附近。表达控制元件也可位于经转录序列的3’端(即“下游”)处或转录物内(例如内含子中)。表达控制元件(例如，CpG减少的TTR、ApoE/hAAT、FGG、白蛋白和SAA1启动子以及其融合物/杂合体)可定位成邻近于经转录的序列或定位于远离经转录的序列一定距离(例如，距多核苷酸1-10、10-25、25-50、50-100、100至500个或更多个核苷酸)处，甚至定位于距5’或3’端相当的距离处。然而，由于rAAV载体的长度限制，表达控制元件将通常在距经转录核酸的1至1000个核苷酸内。
在功能上，可操作连接的核酸的表达可通过元件(例如，启动子、增强子等)至少部分地控制以使得元件调节核酸的转录以及(视情况)转录物的翻译。表达控制元件的特定实施例为启动子，其通常位于经转录序列的5’处。启动子与在不存在启动子时所表达的量(如果存在)相比通常增加来自可操作连接的核酸的表达。
启动子的实施例包括TTR以及ApoE/hAAT启动子，其包括CpG减少的版本以及本文中所公开的杂合形式的TTR启动子。启动子的其他实施例包括ApoE/hAAT、FGG、白蛋白以及SAA1启动子，其包括CpG减少的版本及其杂合形式。
如本文中所使用的“增强子”可指代定位成邻近于诸如异源核酸序列的核酸序列的序列。增强子元件通常位于启动子元件的上游(5’)而且起作用，并且也可位于序列的下游(3’)或序列内。从而，增强子元件可位于上游或下游，例如，在如可选标记物和/或编码治疗蛋白或多核苷酸序列的异源核酸的100个碱基对、200个碱基对或300个或更多个碱基对内。增强子元件通常增加可操作连接的核酸的表达高于启动子元件所提供的表达。
术语“可操作地连接”意指核酸序列的表达所必需的调节序列相对于序列置放于适当的位置中以实现核酸序列的表达。该同一定义有时应用于表达载体(例如，rAAV载体)中的核酸序列和转录控制元件(例如，启动子、增强子以及终止组件)的配置。
在表达控制元件可操作地连接于核酸的实施例中，该关系使得控制元件调节核酸的表达。更具体地，例如，可操作地连接的两种DNA序列意指两种DNA以使得两种DNA序列中的至少一种能够对另一种序列发挥调节作用的关系布置(顺式或反式)。
因此，载体的额外元件包括(但不限于)表达控制(例如，启动子/增强子)元件、转录终止信号或终止密码子、侧接诸如AAV ITR序列的一或多个复制品之类的序列(例如，异源序列)的5’或3’非翻译区域(例如，聚腺苷酸化(polyA)序列、或内含子。
其他元件包括例如填充物(filler)或填充片段(stuffer)多核苷酸序列，例如以改善包装且减少杂质核酸的存在。AAV载体通常接受大小范围一般为约4kb至约5.2kb或略多的DNA的插入。因此，对于较短序列，包括填充片段或填充物以便将长度调整至接近或为包装至rAAV颗粒中的载体可接受的病毒基因组序列的正常大小。在某些实施方案中，填充物/填充片段核酸序列为核酸的未翻译(非蛋白编码)片段。对于小于4.7Kb的核酸序列，填充物或填充片段多核苷酸序列具有在与序列合并(例如，插入至载体中)时总长度介于约3.0-5.5Kb之间或约4.0-5.0Kb之间或约4.3-4.8Kb之间的长度。
在野生型异源核酸或转基因太大而不能包装于AAV载体颗粒内时，异源核酸可以经修饰、片段化或截短形式提供以用于包装在AAV载体中以及通过AAV载体递送，以使得最终提供功能蛋白或核酸产物，诸如治疗蛋白或核酸产物。
在某些实施方案中，编码蛋白(例如，治疗蛋白)的异源核酸将以经修饰或截短形式提供，或异源核酸将以多个结构提供，由分离及多个AAV载体递送。
在某些实施方案中，异源核酸提供为维持所编码的蛋白(例如，治疗蛋白)的功能的经截短的变体，包括去除功能所不必要的部分，以使得编码异源多核苷酸的大小减小以用于包装在AAV载体中。
在某些实施方案中，异源核酸将被提供在分裂的AAV载体中，这种分裂的AAV载体各自提供编码蛋白(例如，治疗蛋白)的不同部分的核酸，由此递送在细胞中组装且起作用的蛋白(例如，治疗蛋白)的多个部分。
在某些实施方案中，异源核酸通过双AAV载体使用重叠、反式剪接或杂合反式剪接双载体技术提供。在某些实施方案中，使用合并于细胞中的两种重叠AAV载体以产生完全表达盒，从其表达全长蛋白(例如，治疗蛋白)。
术语“一致性”、“同源性”及其语法变化形式意指两个或更多个所提及的实体是“比对”序列时它们是相同的。因此，举例而言，在两个多肽序列相同时，其至少在所提及的区域或部分内具有相同氨基酸序列。在两个多核苷酸序列相同时，其至少在所提及的区域或部分内具有相同的多核苷酸序列。一致性可在序列的经定义区(区域或结构域)内。一致性的“区”或“区域”是指相同的两个或更多个所提及的实体的一部分。因此，在两个蛋白或核酸序列在一或多个序列区或区域内相同时，其在该区域内共享一致性。“比对”序列是指多个多核苷酸或蛋白(氨基酸)序列，其与参考序列相比通常含有对缺失或额外碱基或氨基酸(缺口)的校正。
一致性可在序列的整个长度或一部分内延伸。在某些实施方案中，共享一致性百分比的序列的长度为2、3、4、5个或更多个相邻核酸或氨基酸，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等相邻核酸或氨基酸。在某些实施方案中，共享一致性的序列的长度为21个或更多个相邻核酸或氨基酸，例如，21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个等相邻核酸或氨基酸。在某些实施方案中，共享一致性的序列的长度为41个或更多个相邻核酸或氨基酸，例如，42、43、44、45、46、47、48、49、50个等相邻核酸或氨基酸。在某些实施方案中，共享一致性的序列的长度为50个或更多个相邻核酸或氨基酸，例如，50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-500、500-1,000个等相邻核酸或氨基酸。
如本文中所阐述的，诸如包括其杂合形式的CpG减少的启动子的核酸变体将不同于野生型但可呈现与野生型启动子的序列一致性。包括其杂合形式的CpG减少的启动子中，在核苷酸序列水平下，CpG减少的激活子将通常与野生型激活子为至少约70％相同、更通常至少约75％相同、甚至更通常约80％-90％相同。举例而言，CpG减少的启动子可与野生型启动子具有70％-99％一致性。因此，CpG减少的启动子可与野生型启动子具有70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-99％、75％-99％一致性。
在氨基酸序列水平下，诸如变体FVIII或hFVIII-BDD蛋白之类的变体将与参考序列至少约70％相同、更通常约75％相同或约80％相同、甚至更通常约85％相同或约90％或更多的相同。在某些实施方案中，诸如变体FVIII或hFVIII-BDD蛋白之类的变体与例如，含或不含B结构域的野生型FVIII蛋白的参考序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多一致性。
术语“同源”或“同源性”意指两个或更多个所提及的实体在给定区域或部分内共享至少部分一致性。具有同源性或一致性的“区、区域或结构域”意指两个或更多个所提及的实体的一部分共享同源性或为相同的。因此，当两个序列在一或多个序列区域内相同时，其在这些区域中共享一致性。“实质同源性”意指分子在结构上或在功能上保守，以使得其具有或经预测具有参考分子或与其共享同源性的参考分子的相关/对应区域或部分的结构或功能(例如，生物功能或活性)中的一或多者的至少部分结构或功能。
两个序列之间的一致性(同源性)的程度或“一致性百分比”可使用计算机程序和/或数学算法确定。出于本发明的目的，核酸序列的比较使用可购自the Genetics ComputerGroup(Madison,Wisconsin)的9.1版GCG Wisconsin Package执行。为方便起见，通过该程序指定的默认参数(缺口形成罚分＝12，缺口扩展罚分＝4)意图在本文中用于比较序列一致性。替代地，使用具有默认参数的缺口比对的由国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)(可在万维网ncbi.nlm.nih.gov/blast/找到；Altschul et al.,1990,J Mol Biol 215:403-410)提供的Blastn 2.0程序可用于测定核酸序列与氨基酸序列之间的一致性及类似性程度。对于多肽序列比较，BLASTP算法通常与计分矩阵组合使用，诸如PAM100、PAM250、BLOSUM62或BLOSUM50。FASTA((例如，FASTA2及FASTA3)及SSEARCH序列比较程序也用于定量一致性程度(Pearson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)；Pearson,Methods Mol Biol.132:185(2000)；以及Smith et al.,J.Mol.Biol.147:195(1981))。也已开发用于使用基于Delaunay的拓朴绘图来定量蛋白结构类似性的程序(Bostick et al.,Biochem Biophys Res Commun.304:320(2003))。
在某些实施方案中，“治疗蛋白”为可缓解或减少由细胞或受试者中的蛋白的不足量、不存在或缺乏引起的症状的肽或蛋白。由转基因编码的“治疗”蛋白可给受试者带来益处，例如，以校正遗传缺陷、以校正基因(表达或功能损失)缺乏等。
例如，且不限于，根据本发明适用于编码基因产物(例如，治疗蛋白)的异源核酸包括可用于治疗包括(但不限于)以下的疾病或病症的那些异源核酸：“止血”或血液凝固(出血)病症，诸如A型血友病，具有抑制性抗体的A型血友病患者，B型血友病，具有抑制性抗体的B型血友病，任何血液凝结因子：VII、VIII、IX、X、XI、V、XII、II、冯威里氏因子(vonWillebrand factor)的缺乏，合并型FV/FVIII缺乏，地中海贫血，维生素K环氧化物还原酶C1缺乏，γ-羧化酶缺乏；贫血；与外伤、损伤相关联的出血、血栓、血小板减少症、中风、凝血病、弥散性血管内凝血(DIC)；与肝素、低分子量肝素、五碳醣、杀鼠灵(warfarin)、小分子抗血栓药(即，FXa抑制剂)相关联的过度抗凝血；以及血小板病症，诸如伯纳德苏利耶综合征(Bernard Soulier syndrome)、血小板无力症(Glanz mannthrom basthenia)以及贮积池缺乏(storage pool deficiency)。在某些实施方案中，受试者患有血液凝固病症。在某些实施方案中，受试者患有A型血友病、具有抑制性抗体的A型血友病、B型血友病、具有抑制性抗体的B型血友病，以下任何凝血因子的缺乏：VII、VIII、IX、X、XI、V、XII、II、冯威里氏因子，或合并型FV/FVIII缺乏、地中海贫血、维生素K环氧化物还原酶C1缺乏或γ-羧化酶缺乏。
在某些实施方案中，受试者患有包括例如(但不限于)以下的疾病或病症：肺病(例如，囊肿性纤维化)、出血病症(例如，含或不含抑制剂的A型血友病或B型血友病)、地中海贫血、血液病症(例如，贫血)、神经退化性病症(例如，阿尔兹海默氏症(Alzheimer'sdisease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、肌肉萎缩性侧索硬化(ALS))、神经病症(例如，癫痫症)、溶酶体贮积病(例如，天冬氨酰糖尿症、巴顿病(Batten disease)、2型晚期婴儿型神经元蜡样脂褐质沉积症(CLN2)、胱氨酸症、法布里病(Fabry disease)、I、II及III型高歇氏病(Gaucher disease)、II型肝糖贮积病(庞培氏病(Pompe disease))、III型肝糖贮积病(GSDIII；柯氏病(Cori disease))；单唾液酸神经节苷脂2(GM2)-I型神经节苷脂贮积病(泰-萨克斯病(Tay Sachs disease))、GM2-II型神经节苷脂贮积病(山多夫氏病(Sandhoff disease))、I型黏脂贮积症(I和II型唾液腺病)、II型黏脂贮积症(I-细胞疾病)、III型黏脂贮积症(假贺勒病(pseudo-Hurlerdisease))以及IV型黏脂贮积症、黏多糖贮积病(贺勒病及变化形式、亨特(Hunter)、A、B、C、D型圣菲利波(Sanfilippo)、A和B型莫奎(Morquio)、马洛特-加龙省-拉米及斯利疾病(Maroteaux-Lamy and Sly disease))、A/B、C1及C2型尼曼-匹克病(Niemann-Pickdisease)、以及I和II型辛德勒病(Schindler disease))、发炎性病症(例如，遗传性血管性水肿(HAE))、铜或铁积聚病症(例如，威尔森氏(Wilson’s)或门克斯(Menkes)病)、溶酶体酸脂肪酶缺乏症、癌症、1型或2型糖尿病、腺苷脱胺酶缺乏症、代谢疾病或病症(例如，糖原贮积病、甲基丙二酸血症、鸟氨酸转氨甲酰酶(transcarbamylase)缺乏症、低磷酸酶症(hypophosphatsia)、极长链酰基-CoA去氢酶缺乏症(VLCAD)、半乳糖血症)、自体免疫疾病(例如，多发性硬化症、I型糖尿病、乳糜泻、视神经脊髓炎(NM0)、免疫血小板减少症(ITP)、特发性血小板减少性紫癜)、艾迪森氏病(Addison'sdisease)、重症肌无力)、实体器官(例如，大脑、肝脏、肾脏、心脏)疾病或感染性病毒(例如，乙型和丙型肝炎、人类免疫缺乏病毒(HIV)等)、细菌性或真菌性疾病。
在某些实施方案中，受试者患有影响或发源于中枢神经系统(CNS)的疾病。在某些实施方案中，疾病为神经退化性疾病。在某些实施方案中，CNS或神经退化性疾病为阿尔兹海默氏症、亨廷顿氏病、ALS、遗传性痉挛性半身麻痹、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩、肯尼迪氏病(Kennedy's disease)、多谷氨酰胺重复疾病或帕金森氏病。在某些实施方案中，CNS或神经退化性疾病为多谷氨酰胺重复疾病。在某些实施方案中，多谷氨酰胺重复疾病为脊髓小脑失调(SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7或SCA17)。
载脂蛋白E(ApoE)为涉及脂质转运及脑损伤修复的主要胆固醇载剂。其表明，人类ApoE同工型有差异地影响活体内类淀粉-β(Aβ)的清除或合成。ApoE的epsilon4(ε4)等位基因与阿尔兹海默氏症(AD)风险增加相关联，且ApoEε2等位基因的存在似乎减小AD风险且为保护性ApoE同工型。如本文中所使用，术语“保护性ApoE同工型”是指减少阿尔兹海默氏症的一或多个症状或适应症(例如，身体、生理、生物化学、组织学、行为)的ApoE同工型。保护性ApoE同工型还指可将阿尔兹海默氏症风险降低至少5％(诸如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多)的ApoE同工型。
在某些实施方案中，本发明提供通过向受试者的非CNS细胞、器官或组织(例如，不向脑脊髓液(CSF)或大脑)递送或施用来将保护性ApoE同工型(例如，ApoEε2)递送至受试者(例如，哺乳动物)的CNS的方法。
在某些实施方案中，包含AAV衣壳蛋白的rAAV颗粒及包含编码保护性ApoE同工型(例如，ApoEε2)的核酸的载体以有效转导受试者(例如，哺乳动物)内的非CNS细胞(例如，肝脏细胞)的方式插入在成对的AAV反向末端重复序列(ITR)之间，以使得非CNS细胞(例如，肝脏细胞)将保护性ApoE同工型分泌至受试者的全身循环(血管结构或血管)中。循环中的保护性ApoE同工型穿过血脑障壁且进入CNS(例如，脑脊髓液(CSF)或大脑，诸如脑实质)。
在某些实施方案中，本发明提供编码在肝脏或肝脏细胞中表达的保护性ApoE同工型(例如，ApoEε2)的载体、表达盒或核酸。
在某些实施方案中，异源核酸编码选自由以下组成的群组的蛋白：胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、促卵泡激素(FSH)、促黄体素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、血管生长抑制素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、促红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维母细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维母细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、转变生长因子α(TGFα)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)、TGFβ、激活素、抑制素、骨形态形成蛋白(BMP)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素NT-3及NT4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、神经营养因子、凝集素、轴突引导因子-1和轴突引导因子-2、肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白(ephrin)、头蛋白(noggin)、音蚂因子(sonic hedgehog)和酪氨酸羟化酶。
在某些实施方案中，异源核酸编码选自由以下组成的群组的蛋白：血小板生成素(TPO)、白介素(IL1至IL-36)、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α及β、干扰素α、β及γ、干细胞因子、flk-2/flt3配体、IgG、IgM、IgA、IgD及IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、I类和II类MHC分子。
在某些实施方案中，异源核酸编码CFTR(囊肿性纤维化跨膜调节因子蛋白)、血液凝结(凝固)因子、(因子XIII、因子IX、因子VIII、因子X、因子VII、因子VIIa、蛋白C等)、功能获得型血液凝结因子、抗体、视网膜色素上皮特异性65kDa蛋白(RPE65)、促红细胞生成素、LDL受体、脂蛋白脂肪酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、β-球蛋白、α-球蛋白、血影蛋白、α-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶(ADA)、金属转运蛋白(ATP7A或ATP7)、磺酰胺酶、涉及溶酶体贮积病的酶(ARSA)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、β-25葡萄糖脑苷酶、鞘磷脂酶、溶酶体己糖醛酸酶脱氢酶、分支链酮酸去氢酶、激素、生长因子、类胰岛素生长因子1或2、血小板衍生的生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3及-4、脑源性神经营养因子、神经胶质衍生的生长因子、转变生长因子α和β、细胞介素、α-干扰素、β-干扰素、干扰素-γ、白介素-2、白介素-4、白介素12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素、自杀基因产物、单纯疱疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素、细胞色素P450、脱氧胞苷激酶、肿瘤坏死因子、药物抗性蛋白、肿瘤抑制剂蛋白(例如，p53、Rb、Wt-1、NF1、逢希伯-林道(Von Hippel-Lindau，VHL)、结肠腺瘤息肉病(APC))、具有免疫调节属性的肽、耐受性或免疫原性肽或蛋白Tregitope或hCDRl、胰岛素、葡糖激酶、鸟苷酸环化酶2D(LCA-GUCY2D)、Rab护航蛋白1(无脉络膜)、LCA5(LCA-lebercilin)、鸟氨酸酮酸氨基转移酶(回旋形萎缩)、视网膜劈裂素1(x性联视网膜劈裂症)、USH1C(阿瑟氏综合征(Usher's Syndrome)1C)、X连锁性色素性视网膜炎GTP酶(XLRP)、MERTK(AR形式的RP：色素性视网膜炎)、DFNB1(接合素26耳聋)、ACHM 2、3和4(色盲)、PKD-1或PKD-2(多囊性肾病)、TPP1、CLN2、硫酸酯酶、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸酯转移酶、组织蛋白酶A、GM2-AP、尼曼-匹克Cl(NPC1)、VPC2、鞘脂激活蛋白、用于基因组编辑的一或多个锌指核酸酶以及用作基因组编辑的修复模板的一或多个供体序列。
在某些实施方案中，由异源核酸编码的蛋白包含基因编辑核酸酶。在某些实施方案中，基因编辑核酸酶包含锌指核酸酶(ZFN)或转录活化子类效应物核酸酶(TALEN)。在某些实施方案中，基因编辑核酸酶包含功能性II型CRISPR-Cas9。
可与本发明一起使用且可任选地在肝脏或肝脏细胞(例如，肝细胞)中表达并提供益处的编码基因产物(例如，治疗蛋白)的其他异源核酸包括例如(但不限于)：用于治疗庞培氏病的GAA(酸性α-葡糖苷酶)；用于治疗威尔森氏病的ATP7B(铜转运ATPase2)：用于治疗法布里病的α-半乳糖苷酶(GLA)；用于治疗1型瓜氨酸血症的ASS1(精氨酸琥珀酸盐合成酶)；用于治疗1型高歇氏病的P-葡萄糖脑苷酶；用于治疗泰-萨克斯病的β-己醣胺酶A:用于治疗遗传性血管性水肿(HAE)的SERPING1(C1蛋白酶抑制剂；C1酯酶抑制剂(C1EI))；用于治疗I型肝糖贮积病(GSDI)的葡萄糖-6-磷酸酶；用于治疗III型肝糖贮积病(GSD III；柯氏病)的肝糖去分支酶(GDE)；用于治疗尼曼匹克病的尼曼-匹克C1蛋白(NPC细胞内胆固醇转运体1；NPC1)；用于治疗贫血的促红细胞生成素(EPO)；用于治疗各种免疫病症、病毒感染及癌症的干扰素-α、干扰素-β及干扰素-γ；用于治疗各种发炎性疾病或免疫缺陷的白介素(IL)，包括IL-1至IL-36中的任一者及对应受体；用于治疗免疫病症的趋化因子，包括趋化因子(C-X-C基序)配体5(CXCL5)；用于治疗诸如克罗恩氏病(Crohn's disease)的免疫病症的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；用于治疗各种人类发炎性疾病的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；用于治疗各种人类发炎性疾病的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；用于治疗上皮组织损伤的角质细胞生长因子(KGF)；用于治疗反复流产、HIV相关的并发症及胰岛素抗性的趋化因子，诸如单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)；用于治疗各种免疫病症的肿瘤坏死因子(TNF)及受体；用于治疗肺气肿或慢性阻塞性肺病(COPD)的α1-抗胰蛋白酶：用于治疗黏多糖病I(MPS I)的α-L-艾杜糖醛酸酶(iduronidase)；用于治疗OTC缺乏的鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)；用于治疗苯酮尿症(PKU)的苯丙氨酸羟化酶(PAH)或苯丙氨酸氨解离酶(PAL)；用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症的脂蛋白脂肪酶；用于治疗载脂蛋白(Apo)A-I缺乏症的载脂蛋白；用于治疗家族性高胆固醇血症(FH)的低密度脂蛋白受体(LDL-R)；用于治疗低白蛋白血症的白蛋白；卵磷脂胆固醇转酰酶(LCAT)；氨甲酰基合成酶I；精氨酸琥珀酸盐合成酶；精氨酸琥珀酸盐解离酶；精氨酸酶；反丁烯二酰基乙酰乙酸盐水解酶(fumarylacetoacetatehydrolase)；胆色素原脱氨酶；用于治疗高膀氨酸尿症的胱硫醚P-合成酶；分支链酮酸去羧酶；异戊酰基-CoA去氢酶；丙酰基CoA羧化酶；甲基丙二酰基-CoA突变酶；戊二酰基CoA去氢酶：胰岛素；丙酮酸盐羧化酶；肝磷酸化酶；磷酸化酶激酶；甘氨酸去羧酶；H-蛋白；T-蛋白；囊肿性纤维化跨膜调节因子(CFTR)；用于治疗斯特格氏病(Stargardt disease)的ATP-结合盒、亚家族A(ABC1)、成员4(ABCA4)；以及肌缩蛋白。
在某些实施方案中，受试者患有自体免疫疾病或病症(例如，多发性硬化症、抗MAG周边神经病变、1型糖尿病、格雷夫氏病(Graves'disease)、类风湿性关节炎、蛋白聚糖诱发的关节炎(PGIA)或重症肌无力)；过敏或过敏性疾病。
成熟髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)与双脂质层相关联。MOG的特征在于IgV类细胞外结构域、单旁路跨膜蛋白、膜相关联的结构域及细胞质尾区。细胞外IgV类结构域在本文中指示为微型MOG(mMOG)。MOG主要在少突胶质细胞的膜中发现且对髓鞘的最终组成贡献很小。对MOG的自身免疫反应与多发性硬化症的出现与病源学有关联。
在某些实施方案中，治疗蛋白为包含非所需抗原及用于细胞分泌的前导序列的融合蛋白。
在某些实施方案中，治疗蛋白为包含MOG细胞外结构域或其片段以及用于细胞分泌的前导序列的融合蛋白。
在某些实施方案中，表达盒包含可操作地连接至编码融合蛋白的核酸的调节元件，该融合蛋白包含非所需抗原以及用于细胞分泌的前导序列。
在某些实施方案中，非所需抗原包含自身抗原、自体抗原或与自身抗原或自体抗原具有结构类似性或序列一致性的蛋白或肽。在某些实施方案中，与自身抗原或自体抗原具有结构类似性或序列一致性的蛋白或肽为微生物蛋白或肽。在某些实施方案中，非所需抗原包含过敏原。
在某些实施方案中，过敏原包含植物、昆虫或动物过敏原。在某些实施方案中，非所需抗原包含髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)或其子序列。
在某些实施方案中，MOG缺乏其跨膜结构域的全部或一部分。在某些实施方案中，MOG包含成熟MOG的氨基酸1-117或由其组成。在某些实施方案中，MOG子序列为其细胞外结构域子序列或其跨膜结构域子序列。在某些实施方案中，MOG包含成熟MOG的氨基酸35-55、118-132、181-195或186-200或由其组成。在某些实施方案中，MOG包含成熟MOG的氨基酸1-20、11-30、21-40、31-50等或由其组成。
在某些实施方案中，本发明提供遏制、减少或抑制哺乳动物内对非所需抗原的细胞介导或抗体介导的免疫反应的方法。在某一实施方案中，方法包括提供如本文中所阐述的表达盒、颗粒或医药组合物或LNP组合物；以及向哺乳动物施用一定量的表达盒、颗粒、医药组合物或LNP组合物，其中融合蛋白在哺乳动物中表达足以遏制、减少或抑制对非所需抗原的细胞介导或抗体介导的免疫反应。
在某些实施方案中，本发明提供在哺乳动物内诱发对非所需抗原的耐受性的方法。在某些实施方案中，方法包括提供如本文中所阐述的表达盒、颗粒或医药组合物或LNP组合物；以及向哺乳动物施用一定量的表达盒、颗粒、医药或LNP组合物，其中融合蛋白在哺乳动物中表达足以诱发对非所需抗原的耐受性。
在某些实施方案中，本发明提供治疗需要融合蛋白的受试者(例如人类)的方法。在某些实施方案中，方法包括提供如本文中所阐述的表达盒、颗粒或医药组合物或LNP组合物；以及向受试者(例如人类)施用一定量的表达盒、颗粒、医药或LNP组合物，其中融合蛋白在受试者(例如人类)内表达。
在某些实施方案中，受试者(例如人类)患有自体免疫疾病或病症。在某些实施方案中，受试者(例如人类)患有过敏或过敏性疾病或病症。
在某些实施方案中，受试者(例如人类)患有多发性硬化症、抗MAG周边神经病变、1型糖尿病、格雷夫氏病、类风湿性关节炎、蛋白聚糖诱发的关节炎(PGIA)或重症肌无力。
如本文中所使用，“非所需抗原”为能够诱发、提供、增强和/或刺激针对抗原自身或包括抗原的全部或一部分的蛋白的免疫耐受性且/或遏制、抑制、减少和/或减轻针对抗原自身或包括抗原的全部或一部分的蛋白的免疫反应的自身抗原或自体抗原。如本文中所使用的非所需抗原还包括可诱发、提供、增强和/或刺激针对过敏原的免疫耐受性的过敏原或过敏原性抗原以及遏制、抑制、减少和/或减轻针对过敏原或包括过敏原的实体的免疫反应的过敏原以及过敏原性抗原。
如本文中所阐述的非所需抗原还包括同种抗原或移植抗原或微量组织兼容抗原，其在其移植至受试者中之后可导致细胞、组织或器官的排斥反应。受试者通常将经移植细胞、组织或器官识别为外来细胞、组织或器官且出现针对细胞、组织或器官的免疫反应。因此，本发明方法是针对预防或减少细胞、组织或器官在移植至受试者中之后的排斥反应。
尽管不希望受任何理论或特定机制束缚，但相信，非所需抗原通过与T调节细胞(Tregs)结合或使其活化来起作用，由此预防、遏制、抑制、减少、减轻或以其他方式下调免疫反应。与Tregs的该结合或其活化又可导致针对自身抗原或自体抗原的免疫耐受化。
如本文中所使用的，“前导”序列为在连接至蛋白时提供或促进从细胞(该蛋白在该细胞中表达)分泌连接蛋白的氨基酸序列。如本文中所使用的前导序列也可称为分泌序列。这种前导及分泌序列意在提供或促进细胞分泌，但如果其连接至具有可预防蛋白分泌的信号序列的蛋白，则可能不始终促进分泌。
在某些实施方案中，非所需抗原包含自体免疫疾病蛋白或其子序列。自体免疫疾病蛋白包括贡献于自体免疫疾病的起始和/或进展的任何抗原(诸如蛋白、其子序列或肽)。因为来自另一生物体的蛋白的序列或结构模仿自身抗原或自体抗原，所以这种自体免疫疾病蛋白可衍生自其他生物体，诸如微生物。
在某些实施方案中，自体免疫疾病蛋白为髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG，例如，用于多发性硬化症)、髓鞘碱性蛋白(MBP，例如，用于多发性硬化症)、蛋白脂质蛋白(PLP，例如，用于多发性硬化症)、髓鞘相关联的糖蛋白(MAG，例如，用于抗MAG周边神经病变)、胰岛素(例如，用于1型糖尿病)、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化次单位相关的蛋白(IGRP，例如，用于1型糖尿病)、前胰岛素原(例如，用于1型糖尿病)、谷氨酸脱羧酶(GAD，例如，用于1型糖尿病)、酪氨酸磷酸酶类自体抗原(例如，用于1型糖尿病)、胰岛素瘤抗原-2(例如，用于1型糖尿病)、胰岛细胞抗原(例如，用于1型糖尿病)；甲状腺刺激激素(TSH)受体(例如，用于格雷夫氏病)、促甲状腺激素受体(例如，用于格雷夫氏病)、硫酸软骨素蛋白聚糖1(例如，用于类风湿性关节炎)、CD4+T细胞抗原决定基(例如，GRVRVNSAY)，(例如，用于蛋白聚糖诱发的关节炎(PGIA)或类风湿性关节炎)或乙酰胆碱受体(例如，用于重症肌无力)。
在某些实施方案中，自体免疫疾病蛋白为哺乳动物髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)或其子序列。在一些实施方案中，自体免疫疾病蛋白为人类蛋白，诸如人类髓鞘碱性蛋白(MBP)、人类蛋白脂质蛋白(PLP)、人类髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)或其子序列。
根据本发明适用于编码基因产物的其他异源核酸包括例如(但不限于)报导子(reporter)或可检测标记物，诸如荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、增强型GFP、增强型YFP、光活化GFP、香菇珊瑚(Discosomaspecies)荧光蛋白(dsRed)、mFruit、mCherry、TagRFP、eqFP611、可光切换荧光蛋白(例如Dronpa及EosFP)、氯霉素乙酰基转移酶、Halo标签融合蛋白、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶以及β-半乳糖苷酶。
在某些实施方案中，异源核酸包含抑制性DNA或编码抑制性RNA(RNAi)。抑制性RNA的实施例包括例如(但不限于)小或短发夹(sh)RNA、微RNA(miRNA)、小或短干扰(si)RNA、反式剪接RNA及反义RNA。
在某些实施方案中，异源核酸编码抑制性核酸。在某些实施方案中，抑制性核酸选自由以下组成的群组：siRNA、反义分子、miRNA、RNAi、核糖核酸酶和shRNA。在某些实施方案中，抑制性核酸与基因、基因的转录物或与选自由以下组成的群组的多核苷酸重复疾病相关联的基因的转录物结合：亨廷顿蛋白(huntingtin，HTT)基因、与齿状核红核苍白球路易体萎缩症(atrophin1，ATN1)相关联的基因、脊髓延髓肌肉萎缩的X染色体上的雄激素受体、人类Ataxin-1、-2、-3及-7、Cav2.1P/Q压敏钙通道(CACNA1A)、TATA-结合蛋白、Ataxin 8相对链(ATXN8OS)、脊髓小脑失调(1、2、3、6、7、8、12、17型)中的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A55 kDa调节亚单位Bβ同工型、X脆性综合征中的FMR1(X脆性智力迟钝1)、X脆性相关联的震颤/失调综合征中的FMR1(X脆性智力迟钝1)、XE脆性智力迟钝中的FMR1(X脆性智力迟钝2)或AF4/FMR2家族成员2；肌强直性营养不良中的肌强直蛋白激酶(MT-PK)；弗里德希氏共济失调(Friedreich's ataxia)中的共济蛋白；肌肉萎缩性侧索硬化中的超氧化歧化酶1(SOD1)基因的突变体；涉及帕金森氏病和/或阿尔兹海默氏症的发病机制的基因；载脂蛋白B(APOB)及9型前蛋白转换酶枯草杆菌蛋白酶/kexin(PCSK9)，高胆固醇血症；HIV Tat，HIV感染中的转录基因的人类免疫缺乏病毒转活化剂；HIV TAR，HIV感染中的人类免疫缺乏病毒转活化剂反应元件基因；HIV感染中的C-C趋化因子受体(CCR5)；RSV感染中的劳斯(Rous)肉瘤病毒(RSV)核衣壳蛋白、丙型肝炎病毒感染中的肝脏特异性微RNA(miR-122)；p53、急性肾损伤或肾脏移植中的移植功能延迟(delayed graft function kidney transplant)或肾损伤急性肾衰竭；晚期复发或转移性实体恶性肿瘤中的蛋白激酶N3(PKN3)；LMP2，LMP2也称为9型蛋白酶体亚单位β(PSMB9)、转移性黑素瘤；LMP7，也称为8型蛋白酶体亚单位β(PSMB8)、转移性黑素瘤；MECL1，也称为10型蛋白酶体亚单位β(PSMB10)、转移性黑素瘤；实体肿瘤中的血管内皮生长因子(VEGF)；实体肿瘤中的驱动蛋白轴蛋白、慢性骨髓白血病中的细胞凋亡抑制剂B细胞CLL/淋巴瘤(BCL-2)；实体肿瘤中的核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)；实体肿瘤中的弗林蛋白酶(Furin)；肝脏肿瘤中的保罗类激酶(polo-like kinase)1(PLK1)、丙型肝炎感染中的二酰基甘油酰基转移酶1(DGAT1)、家族性腺瘤性息肉病中的β-连环蛋白；β2肾上腺素激导性受体、青光眼；糖尿病黄斑水肿(DME)或年龄相关黄斑变性中的RTP801/Reddl，也称为DNA破坏诱发性转录物4蛋白；年龄相关黄斑变性或脉络膜新生血管中的血管内皮生长因子受体I(VEGFR1)、非动脉炎缺血视神经病变中的凋亡蛋白酶2；先天性甲肥厚中的角蛋白6A N17K突变蛋白；流感感染中的A型流感病毒基因组/基因序列：SARS感染中的重度急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒基因组/基因序列；呼吸道融合性病毒感染中的呼吸道融合性病毒基因组/基因序列；埃博拉(Ebola)感染中的埃博拉纤丝病毒基因组/基因序列；乙型和丙型肝炎感染中的乙型和丙型肝炎病毒基因组/基因序列；HSV感染中的单纯疱疹病毒(HSV)基因组/基因序列、柯萨奇病毒(coxsackievirus)B3感染中的柯萨奇病毒B3基因组/基因序列；原发性肌张力障碍中的基因(等位基因特异性沉默)类耐扭蛋白(torsin)A(TOR1A)的病原性等位基因的沉默、在移植中具有特异性的泛I类(pan-class I)和HLA-等位基因；以及常染色体显性遗传性色素性视网膜炎(adRP)中的突变视紫红质基因(RHO)。
核酸分子、载体(诸如克隆、表达载体(例如，载体基因组))以及质粒可使用重组型DNA技术方法来制备。核苷酸序列信息的可用性使得能够通过多种方式制备核酸分子。举例而言，包含载体或质粒的异源核酸可使用各种标准克隆、重组型DNA技术经由细胞表达或活体外翻译以及化学合成技术来制得。多核苷酸的纯度可经由定序、凝胶电泳及其类似方法测定。举例而言，核酸可使用杂交或基于计算机的数据库筛检技术来分离。这种技术包括(但不限于)：(1)使基因组DNA或cDNA库与探针杂交以检测同源核苷酸序列；(2)抗体筛检以检测具有共享结构特征的多肽，例如使用表达文库；(3)使用能够退火至所关注核酸序列的引物在基因组DNA或cDNA上进行聚合酶链式反应(PCR)；(4)计算机检索相关序列的序列数据库；以及(5)差异筛检减去的核酸库。
本发明的核酸可维持为任何适宜克隆载体中的DNA。在某些实施方案中，克隆维持在诸如pBluescript或pBluescriptII(Stratagene，LaJolla，CA)之类的质粒克隆/表达载体中，其在适合的大肠杆菌(E.coli)宿主细胞中繁殖。可替代地，核酸可维持在适用于在哺乳动物细胞中表达的载体中。
现有技术中已知用于产生rAAV病毒粒子的方法包括例如使用AAV载体以及AAV辅助序列的转染与使用一或多种AAV辅助病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒或牛痘病毒)的共感染结合或使用重组型AAV载体、AAV辅助载体以及辅助功能载体的转染。用于产生rAAV病毒粒子的方法描述于例如(且不限于)美国专利No.6,001,650以及No.6,004,797中。在重组型rAAV载体产生(即，载体在细胞培养物系统中的产生)之后，rAAV病毒粒子可获自宿主细胞以及细胞培养物上清液并且如本文中所阐述纯化。
用于测定含有转基因的rAAV载体的感染效价的方法为此项技术中已知的(参见例如Zhen et al.,(2004)Hum.Gene Ther.(2004)15:709)。已知用于检定具有经包装基因组的空衣壳及AAV载体颗粒的方法(参见例如Grimm et al.,Gene Therapy(1999)6:1322-1330；Sommer et al.,Molec.Ther.(2003)7:122-128)。
为测定降解/变性衣壳，经纯化的rAAV可经受SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，该凝胶电泳由能够分离三种衣壳蛋白的任何凝胶组成，例如梯度凝胶，随后运作凝胶直至将样本分离为止，且将凝胶印迹至尼龙或硝化纤维膜上。抗AAV衣壳抗体随后用作与变性衣壳蛋白结合的第一抗体(参见例如Wobus et al.,J.Virol.(2000)74:9281-9293)。与第一抗体结合的第二抗体含有用于检测第一抗体的构件。半定量地检测第一抗体与第二抗体之间的结合以测定衣壳的量。
rAAV载体以及其他组合物、试剂、药物、生物制剂(蛋白)可掺入至医药组合物中。这种医药组合物尤其适用于向受试者活体内或离体施用及递送。
术语“分离的”当用作组合物的修饰语时，是指所述组合物是由人工制备的，或者与它们的天然存在的体内环境完全或至少部分地分离。通常，分离的组合物基本上不含它们通常与自然界相关的一种或多种材料，例如一种或多种蛋白，核酸，脂质，碳水化合物，细胞膜。
关于蛋白，本文有时使用术语“分离的蛋白”或“分离和纯化的蛋白”。该术语主要是指通过表达核酸分子产生的蛋白。替代地，该术语可以指已经与天然与其缔合的其他蛋白充分分离的蛋白，从而以“基本上纯的”形式存在。
术语“分离的”不排除文中的组合物或人工制备的制品(combination)，例如，rAAV和/或药物制剂。术语“分离的”也不排除组合物的替代物理形式，例如杂合体/嵌合体，多聚体/低聚物，修饰(例如，磷酸化，糖基化，脂化)或衍生化形式，或在人工制备的宿主细胞中表达的形式。
术语“基本上纯的”是指包含至少50-60wt％的目标化合物(例如，核酸、寡核苷酸、蛋白等)的制剂。该制剂可包含至少75wt％，或约90-99wt％的目标化合物。通过适用于目标化合物的方法(例如色谱法，琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，HPLC分析等)来测定纯度。
当提及特定核苷酸序列或氨基酸序列时，短语“基本上由...组成”是指具有给定序列的特性的序列。例如，当参考核酸或氨基酸序列时，该短语包括该序列本身和不会影响该序列的基本和新颖特征的分子修饰。
在特定的实施方案中，医药组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。此类赋形剂包括本身不会诱导对接受该组合物的受试者有害的免疫应答，并且可以在没有过度毒性的情况下给药的任何药剂。
如本文所用，术语“医药学上可接受的”和“生理学上可接受的”是指适合于一种或多种施用、体内递送或接触途径的生物学上可接受的制剂，其气态、液体或固体或混合物。“医药学上可接受的”或“生理上可接受的”组合物为不是生物学上或其他方面不期望的物质，例如，可以将该物质施用于受试者而不会引起实质的不期望的生物学作用。因此，这样的医药组合物可以在例如向受试者施用核酸、载体、病毒颗粒或蛋白质方面使用。
药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体，例如水、盐水、甘油、糖和乙醇。药学上可接受的盐也可以包括在其中，例如，无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸的盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，在这类溶媒(vehicle)中可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲物质等。
医药组合物可以作为盐提供，并且可以利用许多酸形成，酸包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐相比于相应的游离碱形式倾向于更易溶于水或其他质子溶剂。在其他情况下，制剂可以是冻干粉末，其可以包含以下任意一种或全部：pH范围为4.5至5.5的1-50mM组氨酸，0.1％-2％蔗糖和2-7％甘露醇，在使用前与缓冲液组合使用。
医药组合物包括溶剂(含水或非水的)，溶液(含水或非水的)，乳剂(例如水包油或油包水)，混悬剂，糖浆，酏剂(elixir)，分散剂和混悬介质，包衣，等渗和吸收促进或延迟剂，其与药物施用或体内接触或递送相容。含水和非水溶剂，溶液和混悬液可包括混悬剂和增稠剂。此类药学上可接受的载体包括片剂(包衣的或未包衣的)，胶囊(硬或软的)，微珠，粉末，颗粒和晶体。补充的活性化合物(例如防腐剂、抗菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂)也可以掺入组合物中。
可以将医药组合物配制成与本文所述或本领域技术人员已知的特定施用或递送途径相容。因此，医药组合物包括适合通过各种途径给药的载体、稀释剂或赋形剂。
适合于肠胃外施用的组合物包含活性化合物的水性及非水性溶液、悬浮液或乳液，这些制剂通常为无菌的且可与预期接受者的血液等渗。说明性实施例包括例如(但不限于)水、缓冲盐水、汉克氏溶液(Hanks'solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖、果糖、乙醇、动物油、植物油或合成油。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液的黏度的物质，诸如(例如)但不限于羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或聚葡萄糖。
另外，活性化合物的悬浮液可视需要制备成油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或溶媒包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酸酯；或脂质体。任选地，悬浮液也可含有合适的稳定剂或增加化合物的溶解性以允许制备高度浓缩溶液的试剂。
助溶剂及佐剂可添加至制剂中，这些助溶剂的实施例包括例如(但不限于)含有羟基或其他极性基团的助溶剂，例如，醇，诸如异丙醇；二醇，诸如丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、二醇醚；甘油；聚氧乙烯醇和聚氧乙烯脂肪酸酯。佐剂的实施例包括例如(但不限于)表面活性剂，例如大豆卵磷脂和油酸；和脱水山梨糖醇酯，例如脱水山梨糖醇三油酸酯；和聚乙烯吡咯烷酮。
在制备医药组合物后，可将其置放于适当容器中且标记用于治疗。这种标记可包括施用的量、频率及方法。
适用于本发明的组合物、所述方法和用途的医药组合物和递送系统是本领域已知的(参见，例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy(2003)20th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA；Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)18thed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA；TheMerck Index(1996)12th ed.,MerckPublishing Group,Whitehouse,NJ；Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms(1993),Technonic PublishingCo.,Inc.,Lancaster,Pa.；Ansel and Stoklosa,Pharmaceutical Calculations(2001)11th ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD；和Poznansky et al.,Drug Delivery Systems(1980),R.L.Juliano,ed.,Oxford,N.Y.,pp.253-315)。
在某些实施方案中，本发明的核酸、多核苷酸及表达盒经由AAV载体颗粒递送或施用。在某些实施方案中，本发明的核酸、多核苷酸及表达盒可经由其他类型的病毒颗粒(包括反转录病毒、腺病毒、辅助依赖型腺病毒、杂合腺病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)、牛痘病毒及人类巨细胞病毒颗粒)递送或施用。
在某些实施方案中，本发明的核酸、多核苷酸以及表达盒使用非病毒递送系统递送或施用。非病毒递送系统包括例如化学方法，诸如脂质体、纳米颗粒、脂质纳米颗粒、聚合物、微米颗粒、微胶囊、微胞或细胞外囊泡；以及物理方法，诸如基因枪、电穿孔、颗粒轰击、超声采用及磁转染。
在某些实施方案中，本发明的核酸、多核苷酸及表达盒以裸DNA、微环、转座子或封端的线性双链体DNA的形式递送。
在某些实施方案中，本发明的核酸、多核苷酸及表达盒以进一步使用脂质体、纳米颗粒、脂质纳米颗粒、聚合物、微米颗粒、微胶囊、微胞或细胞外囊泡包封或复合的AAV载体颗粒或其他病毒颗粒形式递送或施用。
“脂质纳米颗粒”或“LNP”是指基于脂质的囊泡，其适用于递送AAV且具有纳米级尺寸，即约10nm至约1000nm或约50至约500nm或约75至约127nm。不受理论束缚，相信LNP在自免疫系统部分或完全屏蔽的情况下提供核酸、多核苷酸、表达盒或AAV载体。屏蔽使得能在向组织或细胞递送核酸、多核苷酸、表达盒或AAV载体的同时避免诱发活体内针对核酸、多核苷酸、表达盒或AAV载体的实质性免疫反应。屏蔽也可使得能重复给药而不诱发活体内(例如，诸如人类的受试者内)针对核酸、多核苷酸、表达载体或AAV载体的实质性免疫反应。屏蔽还可提高或增加活体内递送效率。
AAV的pl(等电点)在约6至约6.5的范围内。因此，AAV表面携带有少量负电荷。因而，对于LNP而言，包含诸如(例如)氨基脂质的阳离子脂质可以是有益的。示例性的氨基脂质已描述于美国专利No.9,352,042,9,220,683、No.9,186,325、No.9,139,554、No.9,126,966 9,018,187、No.8,999,351、No.8,722,082、No.8,642,076、No.8,569,256、No.8,466,122、和No.7,745,651以及美国专利公开No.2016/0213785、No.2016/0199485、No.2015/0265708、No.2014/0288146、No.2013/0123338、No.2013/0116307、No.2013/0064894、No.2012/0172411、和No.2010/0117125
术语“阳离子脂质”及“氨基脂质”在本文中可互换地使用以包括具有一个、二个、三个或更多个脂肪酸或脂肪烷基链以及pH可滴定氨基(例如，烷基氨基或二烷基氨基)的那些脂质及其盐。阳离子脂质通常在低于阳离子脂质的pKa的pH下质子化(即带正电)且在高于PKa的pH下为实质上中性的。阳离子脂质也可以是可滴定阳离子脂质。在某些实施方案中，阳离子脂质包含：可质子化三级胺(例如，pH可滴定)基团；C18烷基链，其中各烷基链独立地具有0至3个(例如，0、1、2或3个)双键；以及头基与烷基链之间的醚键、酯键或缩酮键。
阳离子脂质可包括(但不限于)1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二-γ-亚油氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-γ-亚麻氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(γ-DLenDMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-C2-DMA，也称为DLin-C2K-DMA、XTC2和C2K)、2,2-二亚油基-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-DMA)、二亚油酰基甲基-3-二甲氨基丙酸酯(DLin-M-C2-DMA，也称为MC2)、4-(二甲氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-M-C3-DMA，也称为MC3)、其盐及其混合物。其他阳离子脂质还包括(但不限于)1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、2,2-二亚油基-4-(3-二甲氨基丙基)--二氧杂环戊烷(DLin-K-C3-DMA)、2,2-二亚油基-4-(3-二甲氨基丁基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-C4-DMA)、DLen-C2K-DMA、γ-DLen-C2K-DMA以及(DLin-MP-DMA)(也称为1-B11)。
还有的其他阳离子脂质可包括(但不限于)2,2-二亚油基-5-二甲氨基甲基-[1,3]-二恶烷(DLin-K6-DMA)、2,2-二亚油基-4-N-甲基哌嗪并-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-MPZ)、1,2-二亚油基氨甲酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油基氧基-3-(二甲氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧基-3-吗啉基丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油氧基-3-三甲基氨基丙烷氯盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代基-3-(2-N,N-二甲氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N-(l-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(l-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、3-(N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、2,3-二油烯基氧基-N-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA)、二十八烷基酰胺基甘胺酰基精胺(DOGS)、3-二甲氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(顺，顺-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3’-氧杂戊烯氧基)-3-二甲基-1-(顺,顺-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苯甲胺(DMOBA)、1,2-N,N'-二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)、1,2-N,N'-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLincarbDAP)、地塞米松(dexamethasone)-精胺(DS)和二取代的精胺(D2S)或其混合物。
可使用多种市售阳离子脂质制剂，诸如
Figure BDA0003035841550000501
(包括DOTMA和DOPE，可购自GIBCO/BRL)以及
Figure BDA0003035841550000502
(包含DOSPA和DOPE，可购自GIBCO/BRL)。
在某些实施方案中，阳离子脂质可以约10重量％的LNP至约85重量％的脂质纳米颗粒或约50重量％的LNP至约75重量％的LNP的量存在。
固醇可赋予LNP流动性。如本文中所使用的，“固醇”是指植物(植物固醇)或动物(动物固醇)来源的任何天然存在的固醇以及非天然存在的合成固醇，其都通过类固醇A-环的3-位置处的羟基的存在表征。固醇可以是常规用于脂质体、脂质囊泡或脂质颗粒制剂的领域的任何固醇，最通常为胆固醇。植物固醇可包括菜油固醇、谷固醇以及豆固醇。固醇还包括经固醇修饰的脂质，诸如美国专利申请案公开2011/0177156中所描述的脂质。在某些实施方案中，固醇可以约5重量％的LNP至约50重量％的脂质纳米颗粒或约10重量％的LNP至约25重量％的LNP的量存在。
LNP可包含中性脂质。中性脂质可包含在生理pH下以不带电或中性两性离子形式存在的任何脂质物质。这种脂质包括(但不限于)二酰基磷脂酰胆碱(diacylphosphatidylcholine)、二酰基磷脂酰乙醇胺(diacylphosphatidylethanolamine)、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。对中性脂质的选择一般通过尤其考虑粒度和必要稳定性来进行指导。在某些实施方案中，中性脂质组分可以是具有两个酰基的脂质(例如，二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺)。
具有不同链长和饱和度的多种酰基链基团的脂质是可用的，或可通过公知技术分离或合成。在某些实施方案中，可使用含有饱和脂肪酸且碳链长度介于C14至C22的范围内的脂质。在某些实施方案中，使用具有单或二不饱和脂肪酸且碳链长度介于C14至C22的范围内的脂质。另外，可使用具有饱和与不饱和脂肪酸链的混合物的脂质。示例性的中性脂质包括(但不限于)1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰基-乙醇胺(DOPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)或任何相关磷脂酰胆碱。中性脂质也可由鞘磷脂、二氢鞘磷脂或具有其他头基的磷脂(诸如丝氨酸和肌醇)构成。
在某些实施方案中，中性脂质可以约0.1重量％的脂质纳米颗粒至约75重量％的LNP或约5重量％的LNP至约15重量％的LNP的量存在。
LNP包封的核酸、表达盒以及AAV载体可掺入至医药组合物(例如医药学上可接受的载剂或赋形剂)中。这种医药组合物尤其适用于活体内或离体向受试者施用及递送LNP包封的酸、表达盒及AAV载体。
LNP制剂可与额外组分合并，所述额外组分可包括例如(但不限于)聚乙二醇(PEG)及固醇。
术语“PEG”是指聚乙二醇，一种具有两个末端羟基的乙烯PEG重复单元的线性可溶于水的聚合物。PEG根据其分子量分类；例如PEG 2000具有约2,000道尔顿的平均分子量，且PEG 5000具有约5,000道尔顿的平均分子量。PEG可购自Sigma Chemical Co.及其他公司，且包括例如(但不限于)以下功能性PEG：单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇-丁二酸酯(MePEG-S)、单甲氧基聚乙二醇-丁二酸丁二酰亚胺酯(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、单甲氧基聚乙二醇-三氟乙磺酸酯(MePEG-TRES)以及单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。
在某些实施方案中，PEG可以是具有约550至约10,000道尔顿的平均分子量的聚乙二醇且任选地经烷基、烷氧基、酰基或芳基取代。在某些实施方案中，PEG可在末端羟基位置处经甲基取代。在某些实施方案中，PEG可具有约750至约5,000道尔顿、或约1,000至约5,000道尔顿、或约1,500至约3,000道尔顿、或约2,000道尔顿或约750道尔顿的平均分子量。PEG可任选地经烷基、烷氧基、酰基或芳基取代。在某些实施方案中，末端羟基可经甲氧基或甲基取代。
经PEG修饰的脂质包括例如(但不限于)美国专利No.8,936,942和No.7,803,397中所描述的PEG-二烷氧基丙基共轭物(PEG-DAA)。适用的经PEG修饰的脂质(或脂质-聚氧化乙烯共轭物)可具有多个“锚定”脂质部分以将PEG部分固定于脂质囊泡的表面上。合适的经PEG修饰的脂质的实施例包括例如(但不限于)经PEG修饰的磷脂酰乙醇胺以及磷脂酸、美国专利No.5,820,873中所描述的PEG-神经酰胺共轭物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、经PEG修饰的二烷基胺和经PEG修饰的二酰基氧基丙-3-胺。在某些实施方案中，经PEG修饰的脂质可以是经PEG修饰的二酰基甘油和二烷基甘油。在某些实施方案中，PEG可呈约0.5重量％的LNP至约20重量％的LNP或约5重量％的LNP至约15重量％的LNP的量。
此外，LNP可以是经PEG修饰的以及经固醇修饰的LNP。与额外组分合并的LNP可以是相同的或单独的LNP。换言之，相同的LNP可经PEG修饰和固醇修饰，或可替代地，第一LNP可经PEG修饰且第二LNP可经固醇修饰。任选地，可合并第一和第二经修饰的LNP。
在某些实施方案中，在包封之前，LNP可具有在约10nm至500nm或约50nm至约200nm或75nm至约125nm的范围内的大小。在某些实施方案中，LNP包封的核酸、表达载体或AAV载体可具有在约10nm至500nm的范围内的大小。
“有效量”或“足够量”是指一定数量，其以单剂量或多剂量，单独或与一种或多种其他组合物(治疗或免疫抑制剂，例如药物(如泼尼松))、治疗、试验方案或治疗方案药剂组合，在受试者中或向受试者提供任何持续时间(长期或短期)的可检测到的反应，提供任何可测量或可检测的程度或任何持续时间内(例如，数分钟、数小时、数天、数月、数年或已治愈)预期或期望的结果或益处。
剂量可以变化并且取决于治疗所针对的疾病的类型，发作，进展，严重程度，频率，持续时间或可能性，期望的临床终点，受试者的既往或同时治疗、总体健康、年龄、性别、种族或免疫能力以及本领域技术人员应理解的其他因素。剂量，数量，频率或持续时间可按比例增加或减少，如治疗或疗法的任何不良副作用、并发症或其他危险因素以及受试者的状况所指示。本领域技术人员将理解可影响提供足以提供治疗或预防益处的量所需的剂量和时序的因素。
获得治疗效果的剂量，例如以载体基因组/千克体重(vg/kg)表示的剂量，将基于若干个因素而变化，这些因素包括但不限于：给药途径，达到治疗效果所需的异源多核苷酸表达的水平，治疗的特定疾病，对病毒载体的任何宿主免疫应答，对异源多核苷酸或表达产物(蛋白质)的宿主免疫应答以及表达的蛋白质的稳定性。本领域技术人员可以基于上述因素以及其他因素来确定用于治疗患有特定疾病或病症的患者的rAAV/载体基因组剂量范围。
通常，剂量将在至少1×108或更高的载体基因组/千克受试者体重(vg/kg)的范围内(例如1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013或1×1014或更高的载体基因组/千克受试者体重(vg/kg))，以达到治疗效果。小鼠的AAV剂量在1×1010-1×1011vg/kg范围内有效，狗的AAV剂量在1×1012-1×1013vg/kg范围内有效。剂量可以更少，例如剂量为小于6×1012个载体基因组/千克(vg/kg)。更特别地，约1×1011vg/kg至约5×1012vg/kg、或约5×1011vg/kg至约2×1012vg/kg或约5×1011vg/kg至约1×1012vg/kg的剂量。
针对庞培氏病(Pompe disease)，有效量将为例如抑制或减少肝糖产生或积聚、增强或增加肝糖降解或去除、减少受试者的身体组织中的溶酶体改变或提高受试者的肌肉张力和/或肌肉强度和/或呼吸道功能的GAA量。举例而言，有效量可通过利用来自血浆的成肌细胞确定GAA摄入动力学来测定。约141-147nM的成肌细胞GAA摄入比率(K摄入)可呈现为有效的(参见例如e.g.,Maga et al.,J.Biol.Chem.2012)。在动物模型中，大于约1,000nmol/hr/mL(例如，约1,000至约2,000nmol/hr/mL)的血浆中的GAA活性水平已经观测到在治疗学上是有效的。
以血友病B为例，通常来说，认为为了达到治疗效果，需要凝血因子浓度大于正常受试者中发现的凝血因子浓度的1％，以改变重症的疾病表型为中度疾病表型。严重的表型以关节损伤和威胁生命的出血为特征。为了将中度疾病表型转化为轻度疾病表型，相信需要大于正常值的5％的凝血因子浓度。
A和B型血友病的诊断和疾病严重程度分类分别基于因子VIII和因子IX活性检定的结果。用于评定因子活性的两种主要检定为基于活化部分凝血活酶时间(aPTT)的一段检定(OSA)和使用基于因子Xa的酶促发色团基质反应的二段发色基质检定(CSA)。这种检定为此项技术中所公知且进一步描述在Adcock et al.,2018,Int.J.Lab.Hem.,40:621-629中。
在正常人类中FVIII含量为约150-200ng/mL血浆，但可以更少(例如，约100-150ng/mL的范围)或更多(例如，约200-300ng/mL的范围)且如例如通过aPTT一段凝固检定所测定的归因于功能性凝固，仍视为正常。因此，治疗作用可通过FVIII或hFVIII-BDD的表达来实现以使得受试者/人类中的FVIII的总量大于正常受试者/人类中存在的FVIII的1％，例如，100-300ng/mL的1％。
rAAV载体的剂量可以处于一定水平，通常在剂量谱的较低端，从而没有针对FVIII或AAV载体的实质性免疫应答。更特别地，剂量高达但小于6×1012vg/kg，例如约5×1011至约5×1012vg/kg，或更特别地，约5×1011vg/kg或约1×1012vg/kg。
在某些实施方案中，rAAV载体剂量呈递送安全且有效量的FVIII且向患有具有抗FVIII的抑制性抗体的A型血友病(具有抑制剂的A型血友病)的受试者提供治疗效益的含量。
用于治疗(例如，改善或提供治疗益处或改进)的“有效量”或“足够量”的剂量通常有效地提供可测量程度的针对一种、多种或所有不良症状，疾病的后果或并发症，一种或多种例如由疾病引起或与之相关的不良症状、病症、疾病、病状或并发症的反应，虽然疾病的进展或恶化的降低、减少、抑制、制止、限制或控制是令人满意的结果。
有效量或足够的量可以但不必在单次给药中提供，可以需要多次给药，并且可以但不必单独给药或与另一种组合物(例如药剂)、治疗、试验方案或治疗方案组合给药。例如，该量可以根据受试者的需要，所治疗疾病的类型，状态和严重性或治疗的副作用(如果有的话)所指示来按比例增加。另外，如果以单剂量或多剂量施用而没有第二种组合物(例如另一种药物或药剂)、治疗、试验方案或治疗方案，则有效量或足够的量不必有效或充足，因为可以包括大于或超过所述剂量的额外的剂量、数量或持续时间，或额外的组合物(例如，药物或药剂)，治疗，试验方案或治疗方案，以便被认为在给定的受试者中有效或足够。认为有效的量还包括导致减少使用另一种治疗、治疗方案或试验方案(例如施用用于治疗凝血障碍(例如，血友病A或具有抗FVIII的抑制性抗体的A型血友病，也称为具有抑制剂的A型血友病)的重组凝血因子蛋白(例如，FVIII))的量。
因此，本发明的方法和用途还包括其中导致减少对另一种化合物、药剂、药物、治疗方案、治疗试验方案、方法或疗法的需要或使用的方法和用途。例如，对于血液凝固疾病，如果在给定的受试者中为补充该受试者中缺乏或有缺陷的(异常或突变的)内源性凝血因子而施用重组凝固因子蛋白的频率较少或剂量减少或消除施用，则本发明的方法或用途具有治疗益处。因此，根据本发明，提供了减少另一种治疗或疗法的需求或使用的方法和用途。
有效量或足够量不必对每个治疗的受试者有效，也不必对在给定的群组或群体中大多数治疗的受试者有效。有效量或足够量是指在特定受试者而非群组或普遍群体中有效或充分。如此类方法的典型情况，一些受试者对给定的治疗方法或用途表现出更大的反应，或更少或没有反应。
术语“改善”是指受试者的疾病或其症状或潜在的细胞反应的可检测或可测量的改善。可检测或可测量的改善包括主观或客观上减少，降低、抑制、制止、限制或控制疾病的发生、频率、严重程度、进展或持续时间、或由疾病引起或与之相关的并发症、或改善疾病的症状、根本病因或后果、或疾病的逆转。对于血友病A，有效量将是例如减少受试者中急性出血发作的频率或严重性的量，或例如减少通过例如凝血检定测量的凝血时间的量。
因此，本发明的医药组合物包括其中包含有效量的活性成分以实现预期的治疗目的的组合物。使用本发明提供的技术和指导，确定治疗有效剂量完全在熟练医师的能力范围内。
治疗剂量将取决于，除其他因素外，受试者的年龄和一般状况，异常表型的严重性以及调节表达水平的控制序列的强度。因此，对人类的治疗有效量将落入一个相对宽的范围内，该范围可以由医师根据单个患者对基于载体的治疗的反应来确定。这样的剂量可以是单独的或与免疫抑制剂或药物组合。
可向受试者递送诸如医药组合物之类的组合物，以便允许转基因表达及任选地所编码蛋白的产生。在某些实施方案中，医药组合物包含足够的遗传物质以使得接受者能够产生治疗有效量的血液凝固因子来影响受试者的止血。
所述组合物可以单独施用。在某些实施方案中，重组AAV颗粒在没有免疫抑制剂的情况下提供治疗效果。治疗效果可选地持续一段时间，例如2-4、4-6、6-8、8-10、10-14、14-20、20-25、25-30或30-50天或更长时间，例如50-75天，75-100天，100-150天，150-200天或更长时间，而无需施用免疫抑制剂。因此，在某些实施方案中，rAAV病毒颗粒提供治疗效果而无需在一段时间内施用免疫抑制剂。
本发明的所述组合物可以与至少一种其他惰性或治疗剂组合施用。在某些实施方案中，在施用rAAV载体之前、实质上同时或之后，将rAAV载体与一种或多种免疫抑制剂联合施用。在某些实施方案中，在施用rAAV载体后例如1-12、12-24或24-48小时，或2-4、4-6、6-8、8-10、10-14、14-20、20-25、25-30、30-50或超过50天。如果rAAV载体之后，在初始表达水平一段时间(例如20-25、25-30、30-50、50-75、75-100、100-150、150-200或超过200天)后所编码的蛋白表达降低，则在施用rAAV载体之后一段时间后，施用免疫抑制剂。
在某些实施方案中，免疫抑制剂是抗炎剂。在某些实施方案中，免疫抑制剂是类固醇。在某些实施方案中，免疫抑制剂为泼尼松、环孢灵(cyclosporine)(例如，环孢灵A)、霉酚酸酯、利妥昔单抗(rituximab)、雷帕霉素或其衍生物。在某些实施方案中，试剂包括稳定化合物。可根据本发明使用的其他免疫抑制剂包括例如(但不限于)B细胞靶向抗体，例如，利妥昔单抗；蛋白酶体抑制剂，例如，硼替佐米(bortezomib)；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂，例如，雷帕霉素；酪氨酸激酶抑制剂，例如，依鲁替尼(ibrutinib)；B细胞活化因子(BAFF)抑制剂；以及诱发增殖的配体(APRIL)抑制剂。
组合物可在任何无菌、生物兼容性医药载剂(包括(但不限于)盐水、缓冲盐水、右旋糖及水)中施用。组合物可单独或与影响止血的其他试剂(例如，辅因子)组合向患者施用。
本发明的方法和用途包括全身地、区域性地或局部地或通过任何途径，例如但不限于通过注射或输注，进行递送和给药。药物组合物在体内的递送通常可以通过使用常规注射器的注射来完成，尽管设想了其他递送方法，例如对流增强给药(参见例如美国专利号5,720,720)。例如，组合物可以通过皮下、表皮、皮内、鞘内、眶内、粘膜内、腹膜内、静脉内、胸膜内、动脉内、口服、肝内、经由门静脉内或肌内递送。其他给药方式包括口服和肺部给药，栓剂和透皮施加。举例而言，专门治疗患有血液凝结或凝固因子病症患者的临床医师可以根据许多标准(包括但不限于：患者的状况和治疗目的(例如，增加GAA、增强或减少血液凝结等))，确定施用腺病毒相关载体的最佳途径。
根据本发明的治疗方法包括组合疗法，所述组合疗法包括额外使用任何化合物、试剂、药物、治疗或其他治疗疗法或具有期望的治疗、有益、累加、协同或互补活性或作用的方案中的一或多者。示例性的组合组合物和治疗包括例如(但不限于)第二活性剂，诸如生物制剂(蛋白)、试剂(例如，免疫抑制剂)及药物。这种生物制剂(蛋白)、试剂、药物、治疗及疗法可在根据本发明的任何其他治疗方法之前、实质上同时或之后施用或执行，该任何其他治疗方法例如治疗受试者的诸如庞培氏的溶酶体贮积病的治疗方法或治疗受试者的诸如HemA或HemB的血液凝固疾病的治疗方法。
化合物、试剂、药物、治疗或其他治疗疗法或方案可作为组合组合物施用，或与递送或施用核酸、载体、重组型载体(例如，rAAV)或重组型病毒颗粒(之前或之后)分开地(诸如并行地或连续或按顺序)施用。本发明因此提供根据本发明的治疗方法与任何化合物、试剂、药物、治疗疗法、治疗方案、过程、治疗物或组合物组合的组合，如本文所述或本领域技术人员已知的。化合物、试剂、药物、治疗疗法、治疗方案、过程、治疗物或组合物可在施用根据本发明向患者或受试者施用的核酸、载体、重组型载体(例如，rAAV)或重组型病毒颗粒之前、实质上同时或之后施用或执行。
本发明可用于人类和兽医医学应用。因此，合适的受试者包括哺乳动物，例如人类，以及非人类哺乳动物。术语“受试者”是指动物，通常是哺乳动物，例如人，非人灵长类动物(猿，长臂猿，大猩猩(gorilla)，黑猩猩(chimpanzee)，猩猩(orangutan)，猕猴)，家畜(狗和猫)，农场动物(家禽，例如鸡和鸭，马，牛，山羊，绵羊，猪)和实验动物(小鼠，大鼠，兔子，豚鼠)。人类受试者包括胎儿，新生儿，婴儿，少年和成人受试者。受试者包括动物疾病模型，例如小鼠和血液凝固疾病(例如HemA和本领域技术人员已知的其他疾病)的其他动物模型。
适用于根据本发明的治疗的受试者包括具有或处于产生不足量的或具有不足的功能基因产物(例如GAA或血液凝固因子，诸如FVIII或FIX)的风险，或产生可能导致疾病的异常的、部分功能或非功能的基因产物(例如，GAA或血液凝固因子，诸如FVIII或FIX)的那些受试者。适用于根据本发明的治疗的受试者还包括那些具有或处于产生导致疾病的异常或缺陷(突变)基因产物(蛋白)的风险的受试者，使得降低该异常或缺陷(突变)基因产物(蛋白)的数量、表达或功能将导致疾病的治疗，或减轻一种或多种症状或改善疾病。例如，目标受试者包括凝血因子产生异常、不足或缺乏的受试者，例如血友病患者(例如，A型血友病或B型血友病)；或具有异常、不足或不存在GAA产生的受试者，诸如患有庞培氏病的受试者。
受试者包括不具有抗AAV的可检测中和抗体的那些受试者。受试者还包括具有抗AAV的中和抗体的那些受试者。这样的受试者可具有抗AAV的低效价中和抗体。
可测试受试者的免疫反应，例如，抗AAV的抗体。可在根据本发明的方法治疗之前筛查候选受试者(例如，血友病或庞培氏病受试者)。还可在治疗后测试受试者的抗AAV抗体，且任选地在治疗后监测一段时间。出现抗体的受试者可用免疫抑制剂(例如，泼尼松)治疗或可施用一或多个额外量的AAV载体。
对于与AAV结合的抗体而言视为阴性的受试者具有小于1:1的效价。具有与AAV结合的抗体的受试者可具有大于1:1但小于1:5的效价。受试者也可以具有等于或大于1:5的AAV抗体效价。举例而言，这种抗体效价可通过对来自受试者的血液、血浆或血清(或其他体液)样本执行连续稀释来计算，且如通过基于活体外细胞的检定中的报导基因活性测量，样本抑制AAV转导50％或更多的第一稀释度被报告为抗体效价。
降低(克服)或避免在全身性基因转移中对AAV的体液免疫的策略包括施用较高载体剂量，使用AAV空衣壳作为诱饵以吸收抗AAV抗体，施用免疫抑制药物以减小、降低、抑制、预防或根除对AAV的体液免疫反应，改变AAV衣壳血清型或将AAV衣壳工程改造成较少受中和抗体影响，使用血浆交换循环以吸收抗AAV免疫球蛋白，由此降低抗AAV抗体效价，使用诸如气囊导管的递送技术随后进行盐水冲洗(Mingozzi et al.,2013,Blood,122:23-36)以及免疫吸收(美国专利申请案公开案US 2018/0169273 A1)。
适用于根据本发明的治疗的受试者还包括具有或处于产生抗AAV抗体的风险的那些受试者。可以使用若干种技术将rAAV载体施用或递送给此类受试者。例如，空衣壳AAV(即，缺乏转基因的AAV)可以被递送以与受试者中的AAV抗体结合，从而允许带有核酸或核酸变体的AAV载体转化该受试者的细胞。
空衣壳与rAAV载体的比例可以在约2：1至约50：1之间，或在约2：1至约25：1之间，或在约2：1至约20：1之间，或在约2：1至约15：1之间，或在约2：1至约10：1之间。比例也可以是约2：1，3：1，4：1，5：1，6：1，7：1，8：1，9：1或10：1。
可以基于在特定受试者中产生的AAV抗体的量(效价)来校准要施用的空衣壳AAV的量。空衣壳可以是任何AAV血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV-2i8、LK03(SEQ ID NO:91)、SPK(SEQ IDNO:92)。
作为替代或补充，可以通过直接肌内注射(例如，一条或多条肌肉的慢肌纤维)递送AAV载体。在另一替代方案中，引入股动脉的导管可用于将AAV载体经由肝动脉递送至肝脏。还可以采用非手术方式，例如内窥镜逆行胰胆管造影术(ERCP)，将AAV载体直接递送至肝脏，从而绕过血液和AAV抗体。其他导管系统，例如下颌下腺的导管，也可用作将AAV载体递送至已发展或具有预先存在的抗AAV抗体的受试者的端口。
可以在由疾病引起或与疾病相关的不良症状，病状，并发症等发生之前进行给药或体内递送至受试者。例如，可以使用筛选(例如遗传)来将这样的受试者识别为本发明组合物、方法和用途的候选者。因此，这样的受试者包括针对功能基因产物(例如，血液凝固因子)数量不足或缺乏呈阳性而筛选的那些受试者，或产生异常、部分功能或非功能基因产物(例如，血液凝固因子)的受试者。
可以在受试者已被鉴定为患有治疗目标疾病，或具有该疾病的一种或多种症状，或即使该受试者不具有一种或多种疾病症状但如本文所述已经被筛选并鉴定为阳性之后1-2、2-4、4-12、12-24或24-72小时内实施根据本文公开的本发明的所述方法和用途的向受试者的施用或体内递送。当然，可以在受试者已被鉴定为患有治疗目标疾病、或具有该疾病的一种或多种症状、或如本文所述已经被筛选并鉴定为阳性之后1-7、7-14、14-21、21-48或更多天，数月或数年实施本发明的方法和用途。
如本文所使用的，“单位剂型”(unit dosage form)是指适于作为用于待治疗受试者的单位剂量的物理上独立(discrete)的单元；每个单元含有任选地与药物载体(赋形剂、稀释剂、溶媒或填充剂)相关的预定数量，其在以一或多个剂量施用时，被计算为产生预期的效果(例如预防或治疗效果)。单位剂型可以在例如安瓿(ampule)和小瓶内，其可以包括液体组合物，或处于冷冻干燥或冻干状态的组合物；无菌液体载体，例如，可以在体内给药或递送之前添加。个体单位剂型可包含在多剂量试剂盒(kit)或容器中。重组载体(例如，rAAV)序列，重组病毒颗粒及其药物组合物可以包装为单一单位剂型或多单位剂型，以易于施用和使剂量均匀。
可测试受试者的相关基因产物(例如，GAA或血液凝固因子，诸如FVIII或FIX)的蛋白或活性水平以确定这些受试者是否适合于根据本发明的方法治疗。举例而言，可在根据本发明的方法治疗之前测试候选A型血友病受试者的FVIII量或活性；可在根据本发明治疗之前测试候选庞培氏受试者的GAA量或活性。还可在根据本发明的方法治疗之后测试受试者的FVIII或GAA蛋白量或活性。可在治疗之后周期性地(例如，每1-4周、1-6个月或1、2、3、4、5年或更多年)监测这样治疗的受试者的血液凝固活性(针对HemA)或GAA活性(针对庞培氏)。
可测试受试者的一或多种肝酶的不良反应或以确定这些受试者是否适合于根据本发明的方法治疗。举例而言，可在根据本发明的方法治疗之前筛检候选血友病或庞培氏受试者的一或多种肝酶的量。还可在根据本发明的方法治疗之后测试受试者的一或多种肝酶的量。可在升高的肝酶的治疗之后周期性地(例如，每1-4周或1-6个月)监测这样治疗的受试者。
示例性的肝酶包括丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)以及乳酸脱氢酶(LDH)，但也可监测指示肝脏损伤的其他酶。循环中的这些酶的正常含量通常定义为具有上限含量的范围，高于该范围，将酶含量视为升高，且因此指示肝脏损伤。正常范围部分取决于进行检定的临床实验室所用的标准。
在某些实施方案中，可监测患有出血病症的受试者的出血发作以确定这样的受试者是否符合根据本发明的治疗条件或对该治疗有反应，和/或反应的量或持续时间。可监测受试者的出血发作以确定这样的受试者是否需要额外治疗，例如，后续AAV载体施用或免疫抑制剂的施用，或更频繁监测。可在根据本发明的方法治疗之前和之后监测血友病受试者的出血发作。还可在根据本发明的方法治疗期间或之后测试受试者的出血发作的频率以及严重程度。
在某些实施方案中，患有庞培氏病或需要GAA的受试者可通过多种测试、检定及功能性评定监测以展现、测量和/或评定GAA的疗效，进而确定这样的受试者是否符合治疗条件或对该治疗有反应或需要根据本发明的额外治疗。
本发明提供了其中具有包装材料和一种或多种组分的试剂盒。试剂盒通常包括标签或包装插页，该标签或包装插页包括组分的描述或其中的组分在体外、体内或离体使用的说明。试剂盒可包含此类组分(例如核酸，重组载体，病毒(例如，AAV)载体或病毒颗粒)以及任选的第二活性物质(例如另一种化合物、试剂、药物或组合物)的集合。
试剂盒是指容纳试剂盒的一个或多个组分的物理结构。包装材料可以无菌地保持组分，并且可以由通常用于这种目的的材料(例如，纸、波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)制成。
标签或插页可包括其中的一种或多种组分的识别信息、剂量、有效成分的临床药理，该临床药理包括作用机理、药代动力学和药效学。标签或插页可以包含标识制造商、批号、制造地点和日期、有效期的信息。标签或插页可包含标识制造商信息、批号、制造商地址和日期的信息。标签或插页可包含有关可能使用试剂盒组分的疾病的信息。标签或插页可包括针对临床医生或受试者在方法、用途或治疗设计方案或治疗方案中使用一种或多种试剂盒组分的说明。所述说明可以包括剂量、频率或持续时间，以及用于实施本文所述的任何方法、用途、治疗设计方案或预防或治疗方案的说明书。
标签或插页可包括关于组分可提供的任何益处(例如预防或治疗益处)的信息。标签或插页可以包括有关潜在的不良副作用，并发症或反应的信息，例如关于不适用于特定组合物的情况而对受试者或临床医生的警告信息。当受试者已经、将要或正在服用一种或多种可能与所述组合物不相容的其他药物时，或者当受试者已经、将要或正在接受另一种可能与所述组合物不相容的治疗设计方案或治疗方案时，也可能发生不良的副作用或并发症，因此，所述说明中可包含有关此类不相容的信息。
标签或插页包括“印刷品”，例如纸或纸板，或单独或附着于组分、试剂盒或包装材料(例如盒子)，或附于包含试剂盒组分的安瓿、试管或小瓶。标签或插页可以额外包括计算机可读介质，例如条形码打印的标签，磁盘，光盘(例如CD-或DVD-ROM/RAM，DVD，MP3，磁带)或电子存储介质，例如RAM和ROM或它们的混合体，例如磁/光存储介质，FLASH介质或存储类型卡。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实施或测试中，但是本文描述了合适的方法和材料。
本文引用的所有专利、专利申请、出版物和其他参考文献，GenBank引用和ATCC引用均通过引用整体并入本文。如有冲突，将以说明书(包括定义)为准。
上文以及整个说明书和权利要求书中使用了与本发明的生物分子有关的各种术语。
本文公开的所有特征可以以任何组合进行组合。说明书中公开的每个特征可以由具有相同、等同或相似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则公开的特征(例如，CpG减少的)核酸、载体、质粒、表达/重组型载体(例如，rAAV)序列或重组型病毒颗粒为等效或类似特征的类别的实例。
如本文使用的，单数形式的“一”，“一个(and)”和“该”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一个核酸”包括多个这样的核酸，提及“一个载体”包括多个这样的载体，并且提及“一种病毒”或“颗粒”包括多种这样的病毒/颗粒。
如本文所使用的，除非上下文另外明确指出，否则所有数值或数值范围均包括该范围内的整数以及该范围内该数值或整数的分数。因此，举例来说，提及80％或更高的同一性，包括81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％等，以及81.1％，81.2％，81.3％，81.4％，81.5％等，82.1％，82.2％，82.3％，82.4％，82.5％等，依此类推。
提及大于(大于)或小于整数时分别包括大于或小于该参考数字的任何数字。因此，例如，提及小于100时包括99、98、97等，一直到数字1(1)；并且提及小于10时包括9、8、7等，一直到数字1(1)。
如本文所使用的，除非上下文另外明确指出，否则所有数值或范围均包括在该范围内的数值和整数的分数以及在该范围内的整数的分数。因此，举例来说，提及的数值范围(例如1-10)包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等等，依此类推。因此，提及1-50的范围时包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等，最多不超过50，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等，依此类推。
提及一系列范围时包括组合该系列内不同范围的边界的值的范围。因此，对一系列范围的提及示例是，例如1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-850，包括1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、50-75、50-100、50-150、50-200、50-250、100-200、100-250、100-300、100-350、100-400、100-500、150-250、150-300、150-350、150-400、150-450、150-500等。
本文一般使用肯定性语言来公开本发明，以描述本发明的众多实施方案。本发明还具体包括其中全部或部分地排除特定主题的实施方案，特定主题为例如物质或材料，方法步骤和条件，设计方案或程序。例如，在本发明的某些实施方案中，排除了材料和/或方法步骤。因此，即使本发明在本文中通常并未就本发明不包括的内容进行表述，但是本文中公开了未在本发明中明确排除的方面。
已经描述了本发明的多个实施方案。然而，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可以对本发明进行各种改变和修饰以使其适应各种用途和条件。因此，以下实施例旨在说明而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：方法
NHP血浆的hFVIII ELISA：将96孔盘涂布有人类特异性FVIII抗体隔夜、经洗涤且在与稀释NHP研究受试者血浆样本一起培育之前封闭。通过培育具有连续稀释的重组型B结构域缺失的hFVIII、
Figure BDA0003035841550000641
(Pfizer)的额外孔来产生标准曲线。盘经洗涤且随后与生物素化人类特异性FVIII检测抗体一起培育。盘与辣根过氧化酶(HRP)共轭的抗生蛋白链菌素一起培育，用TMB基质处理，且在微板读取器上读出以确定在450nm下的吸收。
小鼠血浆的hFVIII ELISA：基本上如上文所描述针对NHP执行小鼠血浆的hFVIIIELISA；然而，所利用的捕捉及检测抗体不同。
用于测量编码人类FVIII转基因的AAV载体的效能的基于细胞的检定：将Huh7细胞以5×104个细胞/孔接种在48孔盘中隔夜。研究后，以DMEM+10％FBS+青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺制备呈10倍剂量曲线(MOI范围介于1×106-1×103)的剩余未经稀释储备载体以及经稀释用于给药的载体。现有培养基自Huh7细胞中经去除且用含有病毒颗粒的培养基置换。细胞维持在37℃及5％CO2下72小时，且将上清液收集及储存于-80℃下的低滞留微量滴定盘中，直至检定hFVIII活性为止。上清液利用具有通过将重组型B结构域缺失的hFVIII、
Figure BDA0003035841550000651
(Pfizer)稀释至细胞生长培养基中所产生的标准曲线的
Figure BDA0003035841550000652
SP4因子VHI(Chromogenix)来检定。
用于测量编码人类FVIII转基因的质粒的蛋白表达效率的基于细胞的检定：将Huh7细胞以DMEM+10％FBS+青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺以5×104个细胞/孔接种于48孔盘中隔夜。质粒使用Plasmid Giga Kit(Qiagen)制备且使用Polyethylenimine(PEI)Max以250ng/孔转染至细胞中。细胞维持在37℃及5％CO2下72小时，且将上清液收集并且储存于-80℃下的低滞留微量滴定盘中，直至检定hFVIII活性为止。上清液利用具有通过将重组型B结构域缺失的hFVIII、
Figure BDA0003035841550000653
(Pfizer)稀释至细胞生长培养基中所产生的标准曲线的
Figure BDA0003035841550000654
SP4因子VIII(Chromogenix)来检定。
实施例2
FIX结构调节元件单元(SEQ ID NO:22和23)由载脂蛋白E(ApoE)基因的321bp内含子以及人类α-1抗胰蛋白酶(hAAT)基因的397bp启动子构成。总体而言，此单元含有16个CpG。
CpG减少的启动子的设计
CpG位点的胞嘧啶或鸟嘌呤取决于共有序列(consensus sequences)而改变。如果未发现潜在转录因子结合位点，则CpG二核苷酸的胞嘧啶(C)经胸腺嘧啶(T)置换。由此，维持嘧啶-嘌呤结构。在一些情况下，删除C核苷酸或整个CpG二核苷酸，且在一些情况下，CpG二核苷酸的鸟嘌呤(G)经丙氨酸(A)或C置换。
使用该策略，基于ApoE/hAAT调节元件产生22个不同序列。下文在SEQ ID NO:24-67中说明含有或不含有5’和3’侧接限制酶位点的序列。
克隆
不同启动子经合成且克隆在编码hFIX的经密码子优化的序列(SEQ ID NO:94)的上游。
小鼠研究
人类α-1抗胰蛋白酶(hAAT)基因启动子的效能通过在8周大雄性野生型C57BL/6小鼠(Jackson Laboratories)中的质粒结构的流体动力递送来评定。在质粒施用之后24小时经由颌下血液收集来以肝素收集非禁食血浆样本。将血浆放置于冰上且储存于-80℃下，直至分析为止。所有动物研究根据机构指导原则以及审批通过的方案执行。
效能研究
所收集的血浆用于评估hFIX转基因表达。
人类FIX的活性水平通过活化部分凝血活酶时间(aPTT)检定来测量。aPTT检定通过将样本血浆以1:1:1体积比率与人类FIX缺乏血浆(George King Bio-Medical,Inc.)以及aPTT反应剂(Trinity Biotech)混合，随后在37℃下进行180秒培育期来执行。凝血通过添加25mM氯化钙引发。凝块形成的时间使用Start 4凝血仪器(Diagnostica Stago)来测量。用汇集的正常血浆(George King Bio-Medical,Inc.)以TBS pH 7.4(48μL+192μL)的1:5稀释液随后以系列1:2稀释液(120μL+120μL)开始来产生标准曲线。人类标准曲线用于计算在AAV载体施用之后第17周时的各样本的活性；还测量两只未经治疗小鼠中的活性。未经治疗小鼠中的FIX活性经平均化且随后从治疗样本中减去以计算归因于外源性FIX蛋白的额外(即，人类)活性。数据显示于图1中。
实施例3
FVIII结构调节元件单元(SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3)由225bp TTR启动子构成。总体而言，此单元含有4个CpG。
CpG减少的TTR启动子的设计
CpG位点的胞嘧啶或鸟嘌呤根据共有序列而改变。如果未发现潜在结合位点，则CpG二核苷酸的胞嘧啶经胸腺嘧啶置换。由此，维持嘧啶-嘌呤结构。使用该策略，基于TTRm(SEQ ID NO:3)调节元件产生5个新颖序列。在SEQ ID NO:4-13中说明含有或不含有限制酶位点的CpG减少的TTR序列。
设计另一组四种不同的较短TTR杂合启动子。计算机模拟(in silico)评定五种不同肝脏特异性启动子的天然基因的转录起始位点(TSS)的1000个核苷酸内的推定转录因子结合位点的存在。随后，通过自原始天然启动子挑选特异性区域并且以串联方式组装这些特异性区域来组装TTR杂合启动子。下文在SEQ ID NO:14-21中说明含有或不含有限制酶位点的TTR杂合序列。
克隆
不同启动子经合成及克隆在编码hFVIII-BDD的经密码子优化的核苷酸序列(SEQID NO:77)的上游。
小鼠研究
最初通过在8周大雄性野生型C57BL/6小鼠(Jackson laboratories)中的流体动力递送来评定TTR启动子的效能。在质粒施用之后24小时经由颌下血液收集来以肝素收集非禁食血浆样本。将血浆放置于冰上并且储存于-80℃下，直至分析为止。针对AAV递送研究，弃去前0.5mL血液，且剩余样本收集在EDTA中，且经处理成血浆。所有动物研究根据机构指导原则以及审批通过的方案执行。
鼠类血浆中的hFVIII抗原含量
鼠类血浆中的hFVIII转基因产物的含量如下使用夹层式ELISA来量化：第一，将微量滴定盘的各孔涂布有抗hFVIII捕捉抗体(Green Mountain Antibodies，稀释至2μg/mL)。第二天，将盘洗涤四次且在室温下封闭(6％BSA，0.2％Tween 20于PBS中)30分钟。汇集的鼠类血浆外加已知浓度的重组型B结构域缺失的hFVIII(XYNTHA
Figure BDA0003035841550000671
)并且连续稀释(1:2)以产生范围介于300ng/mL至2.34ng/mL的8点标准曲线。检定的量化限制为4.8ng/mL。制备三种含量的质量对照样本且包括于各盘上以评定检定效能。在将样本添加至各孔之后，将盘在37℃下培育1小时且随后洗涤四次。在室温下将生物素化抗hFVIII检测抗体(Green Mountain Antibodies，稀释至1μg/mL)添加至盘中1小时以与捕捉hFVIII蛋白结合。在洗涤之后，在室温下将呈1：5000稀释的过氧化酶共轭的抗生蛋白链菌素反应剂(Thermo Fisher Scientific)添加至盘中30分钟以与生物素化抗hFVIII抗体结合。在洗涤盘以去除未结合的共轭抗体之后，在用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺基质(TMB)在室温下进行15分钟培育之后显示过氧化酶活性。用TMB停止溶液停止反应，且针对光学密度(OD)通过吸收盘读取器来读取盘。所获得的吸收值与血浆样本中存在的hFVIII浓度成比例。数据显示了于图2-5中。
RNA分离以及qPCR
大脑、睾丸、肾脏、脾脏及肝脏小鼠组织经收集、用DPBS冲洗、切割/捣碎成多个微小碎片，且将约30mg用于RNA分离，如试剂盒方案(RNeasy加通用迷你试剂盒，Qiagen)中所描述的来执行。RNA浓度使用Nanodrop 2000仪器来测量，且将样本在无核酸酶中稀释至150ng/gL。DNase治疗根据制造商说明书使用无Turbo DNA试剂盒(Invitrogen)来完成。对于cDNA反应，如High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(ABI)中所引导的来使用200ng RNA。将cDNA样本稀释5倍，且将20ng cDNA用于PCR反应。定量实时PCR使用以下来执行：正向引物：5’-TGAGGAGGCTGAAGACTATGA-3’(SEQ ID NO:95)；反向引物：5’-CCACAGACCTGATCTGAATGAA-3’(SEQ ID NO:96)；以及探针：5’-56-FAM-TGGATGTGG/ZEN/TGAGGTTTGATGATGACA-3IABkFQ-3’(SEQ ID NO:97)。鼠类actB(Integrated DNATechnologies)基因充当用于归一化的管家基因。资料显示了于图6中。
实施例4
因子VIII表达通过改变有助于转基因表达的表达盒内的组件来增加。表达AAV载体的B结构域缺失的hFVIII的无内含子版本(AAV-INTL)被制得且与含内含子版本(AAV-WINT)相比较。除了AAV-WINT hFVIII具有定位于TTRm启动子与编码B结构域缺失人类因子VIII的转基因之间的合成内含子(SEQ ID NO:93)之外(图7)，AAV-INTL hFVIII表达盒(SEQID NO:1)含有与AAV-WINT hFVIII表达盒相同的组件。
实施例5：小鼠中的效能
为了评估在哺乳动物中无内含子盒(无内含子的TTRm hFVIII；SEQ ID NO:1)相对于具有内含子的盒(TTRm hFVIII)的效能，将大约8周龄的雄性C57BL/6小鼠(JacksonLaboratories)在横向尾部静脉中以6.4e9或1.6el0vg/小鼠的剂量静脉内注射AAV衣壳化盒。血浆在若干时间点收集，如所指示的(图8及9)，且通过hFVIII ELISA评定循环hFVIII含量。
hFVIII含量的判定显示了，无内含子的TTRm hFVIII的效能相对于TTRm hFVIII(具有内含子)呈现显著增加(图8和9)，且该作用在所测试的剂量和时间点处皆可见(研究#1)。这些结果在后一研究(研究#2)(各群组中的10只小鼠用1.6el0 vg/小鼠剂量)中重复(图10)。研究#2确认，无内含子的TTRm hFVIII(AAV-INTL)比含有合成内含子的载体(AAV-WINT)更有效，且这些差异持续至少8周。
实施例6：NHP中的效能，研究1
在NHP中比较AAV-INTL和AAV-WINT的AAV载体效能(研究#1)。将年龄介于24与50个月之间、体重介于2-6kg之间且对AAV中和抗体呈阴性的12只雄性食蟹猕猴(食蟹猴(Macacafascicularis))分成4个随机组且基于表1中所显示了的剂量组用单一剂量的AAV-WINT或AAV-INTL静脉内注射。随后，每周获得血浆样本以确定循环hFVIII含量。
表1.来自NHP研究的组名和剂量水平
群组# 动物数目(雄性) 剂量水平(vg/kg) 剂量浓度(vg/kg)
1(AAV-WINT低) 3 2.0×10<sup>12</sup> 2.0×10<sup>11</sup>
2(AAV-WINT高) 3 6.0×10<sup>12</sup> 6.0×10<sup>11</sup>
3(AAV-INTL低) 3 2.0×10<sup>12</sup> 2.0×10<sup>11</sup>
4(AAV-INTL高) 3 6.0×10<sup>12</sup> 6.0×10<sup>11</sup>
用AAV-WINT或AAV-INTL给药的猴血浆中的hFVIII含量在整个8周研究中以每周一次间隔通过ELISA来测定。在此研究中测试的任一剂量下，2e12vg/kg(图11)或6e12vg/kg(图12)，不论时间点，观测到循环hFVIII的含量基于峰值循环值增加2至4倍。如所预期的，我们在治疗后2-3周观测到表达降低，从而指示出现针对BDD hFVIII的抑制性抗体。第一研究的结果表明，在NHP中AAV-INTL相对于AAV-WINT显示增加的效能。
实施例7：NHP中的效能，研究2
在NHP中进行第二研究(研究#2)以确认AAV-INTL相对于AAV-WINT增加的载体效能。将年龄介于24与50个月之间、体重介于2-6kg之间且对AAV中和抗体呈阴性的十只雄性食蟹猕猴(食蟹猴)分成2个随机组，并且用单一剂量(2e12vg/kg)的AAV-WINT或AAV-INTL静脉内注射。随后，每周获得血浆样本以确定循环hFVIII含量。
用AAV-WINT或AAV-INTL给药的猕猴血浆中的hFVIII含量在整个8周研究中以每周一次间隔通过ELISA来测定。在该研究中测试的剂量下，2e12vg/kg，不论时间点，观测到循环hFVIII含量基于峰值循环值增加4至7倍(图13)。如先前在NHP中看到的，归因于针对BDDhFVIII的抑制性抗体的出现，观测到在治疗后2-3周转基因的表达降低。研究#2的结果确认，在NHP中AAV-INTL相对于AAV-WINT显示了增加的效能。
实施例8：载体效能的判定
为确认恰当载体以恰当浓度给药至NHP的各群组中，剂量制剂效价通过qPCR来测定，且储备载体中的合成内含子的存在或不存在通过允许区别AAV-WINT与AAV-INTL的基因分型PCR检定来检定。为直接评定未经稀释储备载体和2e12vg/kg剂量制剂两者的载体效能，利用基于细胞的效能检定。
人类肝脏细胞用连续稀释的载体转导，且效能通过利用hFVIII活性检定(Chromogenix Coatest SP4)评估上清液中的分泌的BDD hFVIII来测定。在所有MOI下，AAV-INTL相对于AAV-WINT呈现增加的效能(图14)。值得注意，储备病毒和稀释制剂在载体组内显示了类似效能，从而进一步确认恰当地制备2e12vg/kg组中的剂量制剂的效价。另外，在各MOI下，在与AAV-WINT相比时，AAV-INTL显示效能大致增加4倍(图15)。这些值与NHP研究1和2中所观测到的AAV-INTL的效能增加一致。
实施例9：批次比较
第一和第二NHP研究使用不同批次的AAV-WINT和AAV-INTL载体。为评定不同批次中的载体效能是否相当，效能使用活体外检定来测量(图16)。这些比较的结果显示了，批量之间的变化极小，且AAV-INTL仍类似地比AAV-WINT有效约4至5倍。
实施例10：表达盒效率的判定
为探究活体内效能增加的机制，测定在不存在病毒转导的情况下的转录效率。人类肝脏细胞系用含有表达盒的质粒转染，所述表达盒分别构成AAV-WINT和AAV-INTL、TTRm-内含子-BDD-hFVIII和无内含子的TTRm-BDD-hFVIII(SEQ ID NO:1)。通过人类FVIII活性检定(Chromogenix Coatest SP4)来检定来自这些细胞的上清液的hFVIII含量。
TTRm-内含子-BDD-hFVIII的三种独立DNA制剂与无内含子TTRm-BDD-hFVIII(SEQID NO:1)的两种独立DNA制剂的比较显示类似的hFVIII含量，以及在去除内含子时朝向减少表达的趋势(图17)。尽管不希望受任何理论束缚，但数据表明非转录机制正驱动AAV-INTL的效能增加超过AAV-WINT。
实施例11：资料论述
在等效剂量下，AAV-INTL在细胞培养物、小鼠和NHP模型中相比于AAV-WINT呈现BDD-hFVIII的增加的效能以及表达。在机制上，增加的效能不明显地归因于来自表达盒的FVIII转基因的增加转录，反而可能归因于增加的病毒包装效率或替代机制。这些结果指示，无内含子表达盒在人类临床试验中可具有增加的效能，且对患者安全性和疗效提供益处。
实施例12：人类临床试验结果
在患有A型血友病的四名男性(N＝4)中执行单一剂量研究，概述于表4中。所有四名参与者以5×1011vg/kg的剂量接受衣壳化于LK03 AAV载体(SEQ ID NO:91)中的AAV-INTLhFVIII-BDD表达盒(SEQ ID NO:1)的单一输注，其在本文中称为“LK03-INTL hFVIII-BDD”。
表4.
Figure BDA0003035841550000711
发现LK03-INTL hFVIII-BDD载体在所有四名参与者中驱动FVIII表达(图18-19)。
实施例13：序列
表2.SEQ ID NO及描述
Figure BDA0003035841550000721
Figure BDA0003035841550000731
Figure BDA0003035841550000741
Figure BDA0003035841550000751
AAV-INTL表达盒的整个核酸序列(5’ITR、TTRm、hFVIII-BDD、PolyA以及3’ITR)(SEQ ID NO:1)以及图例(表3)：
cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgtcgacgtgtctgtctgcacatttcgtagagcgagtgttccgatactctaatctccctaggcaaggttcatattgacttaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttggagtcagcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggagggggtataaaagccccttcaccaggagaagccgtcacacagatccacaagctcctgctagcgtttaaacgccaccatgcagattgagctgagcacctgcttcttcctgtgtctgctgaggttctgcttctctgccaccaggaggtattacctgggggctgtggagctgagctgggactatatgcagtctgacctgggggagctgcctgtggatgctaggttcccccccagggtgcccaagagcttcccctttaacacttctgtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagttcactgaccacctgttcaacattgccaagcccaggcccccctggatggggctgctggggcccaccatccaggctgaggtgtatgacactgtggtgatcaccctgaagaacatggccagccaccctgtgagcctgcatgctgtgggggtgagctactggaaggcttctgagggggctgagtatgatgaccagactagccagagggagaaggaggatgacaaggtgtttcctgggggcagccatacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggccccatggcctctgaccccctgtgcctgacctacagctacctgtctcatgtggacctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggctctgctggtgtgtagggagggcagcctggctaaggaaaagacccagaccctgcataagtttatcctgctgtttgctgtgtttgatgagggcaagagctggcactctgagaccaagaacagcctgatgcaggatagggatgctgcctctgccagggcttggcctaagatgcacactgtgaatgggtatgtgaataggagcctgcctggcctgattggctgccacaggaagtctgtgtactggcatgtgattgggatgggcaccacccctgaggtccatagcatcttcctggagggccacactttcctggtgaggaaccacagacaggcctctctggagatctctcccatcaccttcctgactgctcagactctgctgatggacctgggccagttcctgctgttttgccatattagcagccaccagcatgatgggatggaggcctatgtgaaggtggatagctgccctgaggagcctcagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaagactatgatgatgacctgactgattctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaatagccccagcttcattcagatcaggtctgtggccaagaaacaccccaagacctgggtgcactacattgctgctgaggaagaggactgggactatgctcccctggtgctggcccctgatgataggtcttataagagccagtacctgaacaatgggccccagaggattggcaggaagtacaagaaggtgaggttcatggcctacactgatgaaaccttcaaaaccagggaggccattcagcatgagtctggcatcctgggccctctgctgtatggggaggtgggggacaccctgctgatcatcttcaagaaccaggccagcaggccctacaacatctatcctcatggcatcactgatgtgaggcccctgtacagcaggaggctgcccaagggggtgaagcacctgaaagacttccccatcctgcctggggagatctttaagtataagtggactgtgactgtggaggatggccctaccaagtctgaccccaggtgtctgaccaggtactattctagctttgtgaacatggagagggacctggcctctggcctgattgggcccctgctgatctgctacaaggagtctgtggaccagaggggcaaccagatcatgtctgacaagaggaatgtgatcctgttttctgtgtttgatgagaataggagctggtacctgactgagaacatccagaggtttctgcccaatcctgctggggtgcagctggaggatcctgagttccaggccagcaatatcatgcatagcatcaatggctatgtgtttgacagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctactggtacatcctgagcattggggcccagactgactttctgtctgtgttcttttctggctataccttcaagcacaagatggtgtatgaggataccctgaccctgttccccttctctggggagactgtgttcatgagcatggagaatcctgggctgtggatcctggggtgccacaactctgattttaggaacagggggatgactgccctgctgaaggtgtctagctgtgataagaacactggggactactatgaggacagctatgaggacatttctgcttatctgctgtctaagaataatgccattgagcccagaagcttcagccagaatccccctgtgctgaagagacatcagagggagatcaccagaactaccctgcagtctgatcaggaggagattgactatgatgacactatctctgtggagatgaagaaggaggactttgacatctatgatgaggatgagaatcagtctcccaggagctttcagaagaagaccagacattacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgagctctagccctcatgtgctgaggaacagggcccagtctggctctgtgccccagttcaagaaggtggtgttccaggaattcactgatggcagcttcacccagcccctgtacaggggggagctgaatgagcacctgggcctgctggggccttatatcagggctgaggtggaggataatattatggtgactttcaggaaccaggccagcaggccctactctttctatagcagcctgatctcttatgaggaggatcagaggcagggggctgagcctaggaagaactttgtgaagcccaatgagactaagacctacttctggaaggtccagcaccacatggcccctaccaaggatgagtttgactgcaaggcctgggcctatttctctgatgtggatctggagaaggatgtccattctgggctgattggccccctgctggtgtgccacactaacactctgaatcctgcccatggcaggcaggtgactgtccaggagtttgccctgttcttcactatctttgatgagaccaagagctggtactttactgagaacatggagaggaactgcagagctccttgcaatattcagatggaggaccccaccttcaaggagaattacaggttccatgccattaatgggtacatcatggacaccctgcctggcctggtgatggctcaggaccagaggatcaggtggtacctgctgagcatgggctctaatgagaatatccacagcatccacttctctgggcatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggctctgtataatctgtaccctggggtgtttgaaactgtggagatgctgccctctaaggctggcatctggagggtggagtgcctgattggggagcacctgcatgctggcatgagcaccctgttcctggtgtacagcaacaagtgccagacccccctgggcatggcctctggccacatcagggacttccagatcactgcctctggccagtatggccagtgggcccccaagctggccaggctgcactattctggcagcatcaatgcctggagcaccaaggagcccttcagctggatcaaggtggacctgctggcccccatgatcattcatggcatcaagacccagggggccaggcagaagttcagctctctgtacatctctcagttcatcatcatgtactctctggatgggaagaagtggcagacctacaggggcaacagcactggcaccctgatggtgttctttgggaatgtggactcttctggcatcaagcacaacatcttcaatccccccatcattgctaggtatattaggctgcatcccacccactacagcatcaggtctaccctgaggatggagctgatgggctgtgacctgaactcttgcagcatgcccctgggcatggagtctaaggccatctctgatgcccagattactgccagcagctacttcaccaacatgtttgccacctggagcccctctaaggccaggctgcatctgcaggggaggagcaatgcctggaggcctcaggtgaacaaccccaaggagtggctgcaggtggatttccagaagaccatgaaggtgactggggtgaccacccagggggtcaagagcctgctgaccagcatgtatgtgaaggagttcctgatcagcagcagccaggatggccaccagtggactctgttctttcagaatgggaaggtgaaggtgtttcagggcaatcaggactctttcacccctgtggtgaacagcctggacccccccctgctgaccagatacctgaggatccacccccagtcttgggtgcatcagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaggctcaggatctgtactgagcggccgcaataaaagatcagagctctagagatctgtgtgttggttttttgtgtaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcagg
表3.SEQ ID NO:1的特征
Figure BDA0003035841550000761
野生型TTR启动子(SEQ ID NO:2)。下文4个加下划线的核苷酸在突变的TTR启动子(SEQ ID NO:3)中改变。
gtgtctgtctgcacatttcgtagagcgagtgttccgatactctaatctccctaggcaaggttcatatttgtgtaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttggagtcagcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggagggggtataaaagccccttcaccaggagaagccgtcacacagatccacaagctcctg
突变的TTR启动子(4个核苷酸改变；加下划线)“TTRm”(SEQ ID NO:3):
gtgtctgtctgcacatttcgtagagcgagtgttccgatactctaatctccctaggcaaggttcatattgacttaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttggagtcagcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggagggggtataaaagccccttcaccaggagaagccgtcacacagatccacaagctcctg
CpG1-TTRm的核酸序列(SEQ ID NO:4)。在CpG1中，对于所有四个CpG而言，各C改变成T(加双下划线)。在将序列克隆至FVIII表达盒中时，MluI(acgcgt)及PmeI(gtttaaac)限制位点分别在5’及3’端处。SEQ ID NO:5为具有此等限制酶位点的CpG1-TTRm(加下划线)。
SEQ ID NO:4:
Figure BDA0003035841550000771
SEQ ID NO:5:
Figure BDA0003035841550000772
CpG2-TTRm的核酸序列(SEQ ID NO:6)。在CpG2中，在第二、第三和第四个CpG中，C改变成T(加双下划线)。在将序列克隆至FVIII表达盒中时，MluI(acgcgt)和PmeI(gtttaaac)限制位点分别在5’及3’端处。SEQ ID NO:7为具有这些限制酶位点的CpG2-TTRm(加下划线)。
SEQ ID NO:6:
Figure BDA0003035841550000773
SEQ ID NO:7:
Figure BDA0003035841550000774
CpG3-TTRm的核酸序列(SEQ ID NO:8)。在CpG3中，在第一、第三和第四个CpG中，C改变成T(加双下划线)。在将序列克隆至FVIII表达盒中时，MluI(acgcgt)和PmeI(gtttaaac)限制位点分别在5’和3’端处。SEQ ID NO:9为具有这些限制酶位点的CpG3-TTRm(加下划线)。
SEQ ID NO:8:
Figure BDA0003035841550000781
SEQ ID NO:9:
Figure BDA0003035841550000782
CpG4-TTRm的核酸序列(SEQ ID NO:10)。在CpG4中，在第一、第二及第四个CpG中，C改变成T(加双下划线)。在将序列克隆至FVIII表达盒中时，MluI(acgcgt)和PmeI(gtttaaac)限制位点分别在5’及3’端处。SEQ ID NO:11为具有这些限制酶位点的CpG4-TTRm(加下划线)。
SEQ ID NO:10:
Figure BDA0003035841550000783
SEQ ID NO:11:
Figure BDA0003035841550000784
CpG5-TTRm的核酸序列(SEQ ID NO:12)。在CpG5中，在第一、第二和第三个CpG中，C改变成T(加双下划线)。在将序列克隆至FVIII表达盒中时，MluI(acgcgt)和PmeI(gtttaaac)限制位点分别在5’和3’端处。SEQ ID NO:13为具有这些限制酶位点的CpG5-TTRm(加下划线)。
SEQ ID NO:12:
Figure BDA0003035841550000785
SEQ ID NO:13:
Figure BDA0003035841550000786
Hybrid6启动子(TTR/hAAT/白蛋白杂合体)的核酸序列(SEQ ID NO:14)。在单一CpG二核苷酸中，G改变成A(加双下划线)。在将序列克隆至FVIII表达盒中时，MluI(acgcg)和PmeI(gtttaaac)限制位点分别在5’和3’端处。(斜体＝TTR，下划线＝白蛋白，粗体＝hAAT。)SEQ ID NO:15为具有这些限制酶位点的Hybrid6启动子。
Figure BDA0003035841550000791
Hybrid7启动子(TTR/hAAT杂合体)的核酸序列(SEQ ID NO:16)。在两个CpG二核苷酸中，C改变成T(加双下划线)。在将序列克隆至FVIII表达盒中时，MluI(acgcg)和PmeI(gtttaaac)限制位点分别在5’和3’端处。(斜体＝TTR，粗体＝hAAT。)SEQ ID NO:17为具有这些限制酶位点的Hybrid7启动子。
Figure BDA0003035841550000792
Hybrid8启动子(TTR/FGG(血纤维蛋白原γ链基因启动子)/白蛋白启动子杂合体)的核酸序列(SEQ ID NO:18)。在单一CpG二核苷酸中，G改变成A(加双下划线)。在将序列克隆至FVIII表达盒中时，MluI(acgcgt)和PmeI(gtttaaac)限制位点分别在5’和3’端处。(底线＝白蛋白，加下划线斜体＝FGG，斜体＝TTR。)SEQ ID NO:19为具有这些限制酶位点的Hybrid8启动子。
Figure BDA0003035841550000795
Hybrid9启动子(TTR/FGG/hAAT/SAAl杂合体)的核酸序列(SEQ ID NO:20)。在所有三个CpG二核苷酸中，C改变成T(加双下划线)。在将序列克隆至FVIII表达盒中时，MluI(acgcgt)和PmeI(tttaaac)限制位点分别在5’和3’端处。(斜体＝TTR，粗体＝hAAT，加下划线斜体＝FGG，加下划线粗体＝SAA1。)SEQ ID NO:21为具有这些限制酶位点的Hybrid9启动子。
Figure BDA0003035841550000793
非CpG减少的ApoE/hAAT调节元件的核酸序列(SEQ ID NO:22)。序列含有CpG的总数(加双下划线)。C/EBP(CCAAT/增强子-结合蛋白)位点加下划线。
Figure BDA0003035841550000794
Figure BDA0003035841550000801
在5’和3’端处通过Apal限制位点侧接的非CpG减少的ApoE/hAAT调节单元的核酸序列(SEQ ID NO:23)。序列含有总共16个CpG(加双下划线)。在将序列克隆至FIX表达盒中时，使用ApaI限制位点。
Figure BDA0003035841550000802
CpG1-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:24)。除在G改变成A的第七个CpG中之外，各C改变成T。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:25为具有这些限制酶位点的CpG1-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000803
CpG2-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:26)。除保留第一个CpG无改变且在第七个CpG中G改变成A之外，各C改变成T。不变的“c”呈粗体形式。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点分别在5’和3’端处。SEQ ID NO:27为具有这些限制酶位点的CpG2-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000804
CpG3-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:28)。除保留第二个CpG无改变且在第七个CpG中G改变成A之外，各C改变成T。不变的“c”呈粗体形式。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:29为具有这些限制酶位点的CpG3-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000811
CpG4-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:30)。除保留第三个CpG无改变且在第七个CpG中G改变成A之外，各C改变成T。不变的“c”呈粗体形式。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:31为具有这些限制酶位点的CpG4-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000812
CpG5-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:32)。除保留第四个CpG无改变且在第七个CpG中G改变成A之外，各C改变成T。不变的CpG(第四个)呈粗体形式。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:33为具有这些限制酶位点的CpG5-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000813
CpG6-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:34)。除保留第五个CpG无改变且在第七个CpG中G改变成A之外，各C改变成T。不变的CpG(第五个)呈粗体形式。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:35为具有这些限制酶位点的CpG6-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000814
CpG7-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:36)。除保留第六个CpG无改变且在第七个CpG中G改变成A之外，各C改变成T。不变的CpG(第六个)呈粗体形式。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:37为具有这些限制酶位点的CpG7-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000821
CpG8-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:38)。除保留第七个位点无改变之外，各C改变成T。不变的CpG(第七个)呈粗体形式。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:39为具有这些限制酶位点的CpG8-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000822
CpG9-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:40)。除保留第八个CpG无改变且在第七个CpG中G改变成A之外，各C改变成T。不变的CpG(第八个)呈粗体形式。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:41为具有这些限制酶位点的CpG9-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000823
CpG10-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:42)。除保留第九个CpG无改变且在第七个CpG中G改变成A之外，各C改变成T。不变的CpG(第九个)呈粗体形式。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:43为具有这些限制酶位点的CpG10-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000824
CpGll-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:44)。除保留第十个CpG无改变且在第七个CpG中G改变成A之外，各C改变成T。不变的CpG(第十个)呈粗体形式。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:45为具有这些限制酶位点的CpG11-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000831
CpG12-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:46)。除保留第十一个CpG无改变且在第七个CpG中G改变成A之外，各C改变成T。不变的CpG(第十一个)呈粗体形式。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:47为具有这些限制酶位点的CpG12-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000832
CpG13-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:48)。除保留第十二个CpG无改变且在第七个CpG中G改变成A之外，各C改变成T。不变的CpG(第十二个)呈粗体形式。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:49为具有这些限制酶位点的CpG13-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000833
CpG14-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:50)。除保留第十三个CpG无改变且在第七个CpG中G改变成A之外，各C改变成T。不变的CpG(第十三个)呈粗体形式。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:51为具有这些限制酶位点的CpG14-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000834
CpG15-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:52)。除保留第十四个CpG无改变且在第七个CpG中G改变成A之外，各C改变成T。不变的CpG(第十四个)呈粗体形式。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:53为具有这些限制酶位点的CpG15-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000841
CpG16-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:54)。除保留第十五个CpG无改变且在第七个CpG中G改变成A之外，各C改变成T。不变的CpG(第十五个)呈粗体形式。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:55为具有这些限制酶位点的CpG16-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000842
CpG17-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:56)。除保留第十六个CpG无改变且在第七个CpG中G改变成A之外，各C改变成T。不变的CpG(第十六个)呈粗体形式。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:57为具有这些限制酶位点的CpG17-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000843
CpG18-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:58)。去除第五、第七、第八、第十和第十一个CpG的C，且对于剩余CpG而言，C改变成T。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:59为具有这些限制酶位点的CpG18-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000844
CpG19-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:60)。在第一至第五和第八至第十一个CpG中，C改变成T，且去除第七个CpG的C。所有剩余CpG(第六和第十二至第十六个)不变(粗体)。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:61为具有这些限制酶位点的CpG19-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000851
CpG20-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:62)。不含推定转录因子结合位点的区域的多个删除的结果。在唯一剩余CpG(SEQ ID NO:22的第七个CpG)中G改变成A。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:63为具有这些限制酶位点的CpG20-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000852
CpG21-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:64)。除G分别改变成C及A的第五和第六个CpG之外，在所有CpG中C改变成T。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:65为具有这些限制酶位点的CpG21-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000853
CpG22-ApoE/hAAT的核酸序列(SEQ ID NO:66)。除保留第五个CpG无改变(粗体)且在第六个CpG中将G改变成A之外，在所有CpG中C改变成T。在将序列克隆至FIX表达盒中时，ApaI限制位点在5’和3’端处。SEQ ID NO:67为具有这些限制酶位点的CpG22-ApoE/hAAT(加下划线)。
Figure BDA0003035841550000854
FVIII-BDD的氨基酸序列(SQ序列粗体/加下划线)(SEQ ID NO:68)。
Figure BDA0003035841550000855
Figure BDA0003035841550000861
SQ序列(SEQ ID NO:69).
SFSQNPPVLKRHQR
野生型FVIII-BDD cDNA(SEQ ID NO:70).
atgcaaatagagctctccacctgcttctttctgtgccttttgcgattctgctttagtgccaccagaagatactacctgggtgcagtggaactgtcatgggactatatgcaaagtgatctcggtgagctgcctgtggacgcaagatttcctcctagagtgccaaaatcttttccattcaacacctcagtcgtgtacaaaaagactctgtttgtagaattcacggatcaccttttcaacatcgctaagccaaggccaccctggatgggtctgctaggtcctaccatccaggctgaggtttatgatacagtggtcattacacttaagaacatggcttcccatcctgtcagtcttcatgctgttggtgtatcctactggaaagcttctgagggagctgaatatgatgatcagaccagtcaaagggagaaagaagatgataaagtcttccctggtggaagccatacatatgtctggcaggtcctgaaagagaatggtccaatggcctctgacccactgtgccttacctactcatatctttctcatgtggacctggtaaaagacttgaattcaggcctcattggagccctactagtatgtagagaagggagtctggccaaggaaaagacacagaccttgcacaaatttatactactttttgctgtatttgatgaagggaaaagttggcactcagaaacaaagaactccttgatgcaggatagggatgctgcatctgctcgggcctggcctaaaatgcacacagtcaatggttatgtaaacaggtctctgccaggtctgattggatgccacaggaaatcagtctattggcatgtgattggaatgggcaccactcctgaagtgcactcaatattcctcgaaggtcacacatttcttgtgaggaaccatcgccaggcgtccttggaaatctcgccaataactttccttactgctcaaacactcttgatggaccttggacagtttctactgttttgtcatatctcttcccaccaacatgatggcatggaagcttatgtcaaagtagacagctgtccagaggaaccccaactacgaatgaaaaataatgaagaagcggaagactatgatgatgatcttactgattctgaaatggatgtggtcaggtttgatgatgacaactctccttcctttatccaaattcgctcagttgccaagaagcatcctaaaacttgggtacattacattgctgctgaagaggaggactgggactatgctcccttagtcctcgcccccgatgacagaagttataaaagtcaatatttgaacaatggccctcagcggattggtaggaagtacaaaaaagtccgatttatggcatacacagatgaaacctttaagactcgtgaagctattcagcatgaatcaggaatcttgggacctttactttatggggaagttggagacacactgttgattatatttaagaatcaagcaagcagaccatataacatctaccctcacggaatcactgatgtccgtcctttgtattcaaggagattaccaaaaggtgtaaaacatttgaaggattttccaattctgccaggagaaatattcaaatataaatggacagtgactgtagaagatgggccaactaaatcagatcctcggtgcctgacccgctattactctagtttcgttaatatggagagagatctagcttcaggactcattggccctctcctcatctgctacaaagaatctgtagatcaaagaggaaaccagataatgtcagacaagaggaatgtcatcctgttttctgtatttgatgagaaccgaagctggtacctcacagagaatatacaacgctttctccccaatccagctggagtgcagcttgaggatccagagttccaagcctccaacatcatgcacagcatcaatggctatgtttttgatagtttgcagttgtcagtttgtttgcatgaggtggcatactggtacattctaagcattggagcacagactgacttcctttctgtcttcttctctggatataccttcaaacacaaaatggtctatgaagacacactcaccctattcccattctcaggagaaactgtcttcatgtcgatggaaaacccaggtctatggattctggggtgccacaactcagactttcggaacagaggcatgaccgccttactgaaggtttctagttgtgacaagaacactggtgattattacgaggacagttatgaagatatttcagcatacttgctgagtaaaaacaatgccattgaaccaagaagcttctcccaaaacccaccagtcttgaaacgccatcaacgggaaataactcgtactactcttcagtcagatcaagaggaaattgactatgatgataccatatcagttgaaatgaagaaggaagattttgacatttatgatgaggatgaaaatcagagcccccgcagctttcaaaagaaaacacgacactattttattgctgcagtggagaggctctgggattatgggatgagtagctccccacatgttctaagaaacagggctcagagtggcagtgtccctcagttcaagaaagttgttttccaggaatttactgatggctcctttactcagcccttataccgtggagaactaaatgaacatttgggactcctggggccatatataagagcagaagttgaagataatatcatggtaactttcagaaatcaggcctctcgtccctattccttctattctagccttatttcttatgaggaagatcagaggcaaggagcagaacctagaaaaaactttgtcaagcctaatgaaaccaaaacttacttttggaaagtgcaacatcatatggcacccactaaagatgagtttgactgcaaagcctgggcttatttctctgatgttgacctggaaaaagatgtgcactcaggcctgattggaccccttctggtctgccacactaacacactgaaccctgctcatgggagacaagtgacagtacaggaatttgctctgtttttcaccatctttgatgagaccaaaagctggtacttcactgaaaatatggaaagaaactgcagggctccctgcaatatccagatggaagatcccacttttaaagagaattatcgcttccatgcaatcaatggctacataatggatacactacctggcttagtaatggctcaggatcaaaggattcgatggtatctgctcagcatgggcagcaatgaaaacatccattctattcatttcagtggacatgtgttcaccgtacgaaaaaaagaggagtataaaatggcactgtacaatctctatccaggtgtttttgagacagtggaaatgttaccatccaaagctggaatttggcgggtggaatgccttattggcgagcatctacatgctgggatgagcacactttttctggtgtacagcaataagtgtcagactcccctgggaatggcttctggacacattagagattttcagattacagcttcaggacaatatggacagtgggccccaaagctggccagacttcattattccggatcaatcaatgcctggagcaccaaggagcccttttcttggatcaaggtggatctgttggcaccaatgattattcacggcatcaagacccagggtgcccgtcagaagttctccagcctctacatctctcagtttatcatcatgtatagtcttgatgggaagaagtggcagacttatcgaggaaattccactggaaccttaatggtcttctttggcaatgtggattcatctgggataaaacacaatatttttaaccctccaattattgctcgatacatccgtttgcacccaactcattatagcattcgcagcactcttcgcatggagttgatgggctgtgatttaaatagttgcagcatgccattgggaatggagagtaaagcaatatcagatgcacagattactgcttcatcctactttaccaatatgtttgccacctggtctccttcaaaagctcgacttcacctccaagggaggagtaatgcctggagacctcaggtgaataatccaaaagagtggctgcaagtggacttccagaagacaatgaaagtcacaggagtaactactcagggagtaaaatctctgcttaccagcatgtatgtgaaggagttcctcatctccagcagtcaagatggccatcagtggactctcttttttcagaatggcaaagtaaaggtttttcagggaaatcaagactccttcacacctgtggtgaactctctagacccaccgttactgactcgctaccttcgaattcacccccagagttgggtgcaccagattgccctgaggatggaggttctgggctgcgaggcacaggacctctactga
编码FVIII-BDD的CpG减少的核酸变体(SEQ ID NO:71)
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accaggaggtactacctgggggctgtggagctgagctgggattacatgcagtctgacctg
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gctaaacccaggcccccctggatggggctgctgggccctaccatccaggctgaggtgtat
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aaggagaatggccccatggcctctgatcctctgtgtctgacctatagctacctgagccat
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编码FVIII-BDD的CpG减少的核酸变体(SEQ ID NO:72)
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编码FVIII-BDD的CpG减少的核酸变体(SEQ ID NO:73)
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编码FVIII-BDD的CpG减少的核酸变体(SEQ ID NO:74)
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编码FVIII-BDD的CpG减少的核酸变体(SEQ ID NO:75)
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编码FVIII-BDD的CpG减少的核酸变体(SEQ ID NO:76)
atgcagattgagctgagcacctgcttcttcctgtgcctgctgaggttttgcttctctgccaccaggaggtactacctgggggctgtggagctgagctgggattacatgcagtctgacctgggggagctgcctgtggatgccaggttccctcccagggtgcccaagtctttccccttcaacacttctgtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagtttactgaccacctgttcaacattgccaagcccaggcctccctggatgggcctgctgggccccaccattcaggctgaggtgtatgacactgtggtcatcaccctgaaaaatatggctagccaccctgtgtctctgcatgctgtgggggtgagctactggaaggcctctgagggggctgagtatgatgaccagactagccagagggagaaggaggatgacaaggtgttccctgggggcagccacacttatgtgtggcaggtgctgaaagagaatggccccatggcttctgatcccctgtgtctgacctatagctacctgagccatgtggatctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggccctgctggtgtgcagggagggcagcctggctaaggagaagacccagaccctgcataagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatgagggcaagagctggcactctgagactaagaacagcctgatgcaggatagggatgctgcttctgccagggcctggcccaagatgcacactgtgaatgggtatgtgaacaggagcctgcctggcctgattggctgccataggaagtctgtctattggcatgtgattggcatgggcactactcctgaggtgcacagcatctttctggagggccacaccttcctggtgaggaaccacaggcaggccagcctggagatctctcccatcactttcctgactgctcagaccctgctgatggacctgggccagttcctgctgttctgtcacatctctagccaccagcatgatggcatggaggcctatgtgaaggtggatagctgccctgaggaaccccagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaggattatgatgatgatctgactgattctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaattctcctagcttcattcagatcagatctgtggccaaaaagcatcctaagacttgggtgcattatattgctgctgaggaggaggattgggattatgcccccctggtgctggctcctgatgataggagctacaagtctcagtacctgaataatgggccccagaggattggcaggaagtacaagaaggtgaggttcatggcctacactgatgagaccttcaagaccagggaggccattcagcatgagtctgggattctggggcccctgctgtatggggaggtgggggataccctgctgatcattttcaagaaccaggccagcaggccctacaacatctacccccatgggattactgatgtgaggcccctgtactctaggaggctgcctaagggggtgaagcacctgaaggattttcctatcctgcctggggaaatcttcaagtacaagtggactgtgactgtggaggatggccccactaagtctgatcccaggtgtctgaccaggtattatagctcttttgtgaacatggagagggatctggcctctgggctgattggccctctgctgatctgctacaaggagtctgtggaccagaggggcaaccagatcatgtctgacaagaggaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgagaacaggagctggtatctgactgagaacatccagaggtttctgcccaatcctgctggggtgcagctggaggatcctgagttccaggctagcaacatcatgcacagcatcaatgggtatgtgtttgacagcctgcagctgtctgtgtgtctgcatgaggtggcctactggtatatcctgtctattggggcccagactgacttcctgtctgtgtttttttctgggtatacttttaagcacaagatggtgtatgaggacaccctgactctgttccccttctctggggagactgtgtttatgagcatggagaaccctggcctgtggatcctgggctgccacaattctgacttcaggaatagggggatgactgccctgctgaaggtgagcagctgtgataagaatactggggactactatgaggactcttatgaggacatttctgcctatctgctgtctaagaacaatgccattgaacccaggagcttctctcagaacccccctgtgctgaagaggcaccagagggaaatcaccagaactactctgcagtctgatcaggaggaaattgactatgatgacactatttctgtggagatgaagaaggaggactttgacatctatgatgaggatgagaaccagagcccaaggagcttccagaagaagactaggcactacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgagcagcagcccccatgtgctgagaaacagggcccagtctgggtctgtgccccagttcaagaaggtggtgttccaggagttcactgatgggagcttcacccagcccctgtataggggggagctgaatgagcacctgggcctgctgggcccctatattagggctgaggtggaggacaacatcatggtgaccttcaggaatcaggcctctaggccctacagcttctacagcagcctgattagctatgaggaggatcagaggcagggggctgaacccaggaagaactttgtgaagcccaatgagaccaagacctatttctggaaggtgcagcatcacatggcccccaccaaggatgagtttgactgcaaggcctgggcctacttctctgatgtggatctggagaaggatgtgcactctggcctgattggccccctgctggtgtgccacaccaacaccctgaaccctgctcatggcaggcaggtgactgtgcaggagtttgccctgttcttcaccatctttgatgagactaagtcttggtacttcactgagaatatggagaggaattgcagggccccctgcaatattcagatggaagaccccaccttcaaggagaattacaggttccatgccattaatggctacatcatggataccctgcctggcctggtgatggcccaggatcagaggatcaggtggtacctgctgagcatgggcagcaatgagaacatccactctatccacttctctggccatgtgtttactgtgaggaagaaggaggagtataagatggccctgtacaacctgtaccctggggtctttgagactgtggagatgctgccttctaaggctggcatttggagggtggagtgcctgattggggaacacctgcatgctggcatgtctaccctgttcctggtgtacagcaataagtgccagacccccctgggcatggcctctgggcatatcagggatttccagatcactgcctctggccagtatggccagtgggccccaaagctggctaggctgcactactctgggagcatcaatgcctggagcactaaggagcccttcagctggatcaaggtggacctgctggcccccatgattatccatgggattaagactcagggggccaggcagaagttcagcagcctgtacatcagccagttcattatcatgtacagcctggatggcaagaagtggcagacctataggggcaactctactgggaccctgatggtgttctttgggaatgtggatagctctgggatcaagcacaatatcttcaacccccccatcattgccaggtatatcaggctgcaccccacccactacagcattaggtctaccctgaggatggagctgatgggctgtgatctgaacagctgtagcatgcctctgggcatggagtctaaggccatttctgatgcccagattactgctagcagctacttcaccaacatgtttgccacctggtctcccagcaaggccaggctgcatctgcagggcaggtctaatgcttggaggccccaggtgaacaacccaaaggagtggctgcaggtggatttccagaagactatgaaggtgactggggtgaccactcagggggtgaagtctctgctgacctctatgtatgtgaaggagttcctgatctctagcagccaggatggccatcagtggaccctgttcttccagaatggcaaggtgaaagtgttccagggcaatcaggatagcttcactccagtggtgaacagcctggatccccctctgctgactaggtacctgaggatccacccccagagctgggtgcaccagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaggcccaggacctgtactga
编码FVIII-BDD的CpG减少的核酸变体(SEQ ID NO:77).
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编码FVIII-BDD的CpG减少的核酸变体(SEQ ID NO:78)
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编码FVIII-BDD的CpG减少的核酸变体(SEQ ID NO:79)
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编码FVIII-BDD的CpG减少的核酸变体(SEQ ID NO:80)
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编码FVIII-BDD的CpG减少的核酸变体(SEQ ID NO:81)
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编码FVIII-BDD的CpG减少的核酸变体(SEQ ID NO:82)
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编码FVIII-BDD的CpG减少的核酸变体(SEQ ID NO:83)
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编码FVIII-BDD的CpG减少的核酸变体(SEQ ID NO:84)
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编码FVIII-BDD的CpG减少的核酸变体(SEQ ID NO:85)
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编码FVIII-BDD的CpG减少的核酸变体(SEQ ID NO:86)
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编码FVIII-BDD的CpG减少的核酸变体(SEQ ID NO:87)
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编码FVIII-BDD的CpG减少的核酸变体(SEQ ID NO:88)
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FVIII V3 cDNA(SEQ ID NO:89)
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FVIII CO3 cDNA(SEQ ID NO:90)
atgcagattgagctgtcaacttgctttttcctgtgcctgctgagattttgtttttccgctactagaagatactacctgggggctgtggaactgtcttgggattacatgcagagtgacctgggagagctgccagtggacgcacgatttccacctagagtccctaaatcattccccttcaacaccagcgtggtctataagaaaacactgttcgtggagtttactgatcacctgttcaacatcgctaagcctcggccaccctggatgggactgctgggaccaacaatccaggcagaggtgtacgacaccgtggtcattacactgaaaaacatggcctcacaccccgtgagcctgcatgctgtgggcgtcagctactggaaggcttccgaaggggcagagtatgacgatcagacttcccagagagaaaaagaggacgataaggtgtttcctggcgggtctcatacctatgtgtggcaggtcctgaaagagaatggccccatggcttccgaccctctgtgcctgacctactcttatctgagtcacgtggacctggtcaaggatctgaacagcggactgatcggagcactgctggtgtgtagggaagggagcctggctaaggagaaaacccagacactgcataagttcattctgctgttcgccgtgtttgacgaaggaaaatcatggcacagcgagacaaagaatagtctgatgcaggaccgggatgccgcttcagccagagcttggcccaaaatgcacactgtgaacggctacgtcaatcgctcactgcctggactgatcggctgccaccgaaagagcgtgtattggcatgtcatcggaatgggcaccacacctgaagtgcactccattttcctggaggggcatacctttctggtccgcaaccaccgacaggcctccctggagatctctccaattaccttcctgacagctcagactctgctgatggatctgggacagttcctgctgttttgccacatcagctcccaccagcatgatggcatggaggcctacgtgaaagtggacagctgtcccgaggaacctcagctgaggatgaagaacaatgaggaagctgaagactatgacgatgacctgaccgactccgagatggatgtggtccgattcgatgacgataacagcccctcctttatccagattagatctgtggccaagaaacaccctaagacatgggtccattacatcgcagccgaggaagaggactgggattatgcaccactggtgctggcaccagacgatcgatcctacaaatctcagtatctgaacaatggaccacagcggattggcagaaagtacaagaaagtgaggttcatggcttataccgatgaaaccttcaagactcgcgaagcaatccagcacgagagcgggattctgggaccactgctgtacggagaagtgggggacaccctgctgatcatttttaagaaccaggccagcaggccttacaatatctatccacatggaattacagatgtgcgccctctgtacagccggagactgccaaagggcgtcaaacacctgaaggacttcccaatcctgcccggggaaatttttaagtataaatggactgtcaccgtcgaggatggccccactaagagcgaccctaggtgcctgacccgctactattctagtttcgtgaatatggaaagggatctggccagcggactgatcggcccactgctgatttgttacaaagagagcgtggatcagagaggcaaccagatcatgtccgacaagaggaatgtgattctgttcagtgtctttgacgaaaaccggtcatggtatctgaccgagaacatccagagattcctgcctaatccagccggagtgcagctggaagatcctgagtttcaggcttctaacatcatgcatagtattaatggctacgtgttcgacagtctgcagctgtcagtgtgtctgcacgaggtcgcttactggtatatcctgagcattggagcacagacagatttcctgagcgtgttcttttccggctacacttttaagcataaaatggtgtatgaggacacactgactctgttccccttcagcggcgaaaccgtgtttatgtccatggagaatcccgggctgtggatcctgggatgccacaacagcgatttcaggaatcgcgggatgactgccctgctgaaagtgtcaagctgtgacaagaacaccggagactactatgaagattcatacgaggacatcagcgcatatctgctgtccaaaaacaatgccattgaacccaggtcttttagtcagaatcctccagtgctgaagaggcaccagcgcgagatcacccgcactaccctgcagagtgatcaggaagagatcgactacgacgatacaatttctgtggaaatgaagaaagaggacttcgatatctatgacgaagatgagaaccagagtcctcgatcattccagaagaaaacccggcattactttattgctgcagtggagcgcctgtgggattatggcatgtcctctagtcctcacgtgctgcgaaatcgggcccagtcagggagcgtcccacagttcaagaaagtggtcttccaggagtttacagacggatcctttactcagccactgtaccggggcgaactgaacgagcacctggggctgctgggaccctatatcagagctgaagtggaggataacattatggtcaccttcagaaatcaggcatctaggccttacagtttttattcaagcctgatctcttacgaagaggaccagaggcagggagcagaaccacgaaaaaacttcgtgaagcctaatgagaccaaaacatacttttggaaggtgcagcaccatatggccccaacaaaagacgaattcgattgcaaggcatgggcctatttttctgacgtggatctggagaaggacgtccacagtggcctgatcgggccactgctggtgtgtcatactaacaccctgaatcccgcacacggcaggcaggtcactgtccaggaattcgccctgttctttaccatctttgatgagacaaaaagctggtacttcaccgaaaacatggagcgaaattgccgggctccatgtaatattcagatggaagaccccacattcaaggagaactaccgctttcatgccatcaatgggtatattatggatactctgcccggactggtcatggctcaggaccagagaatcaggtggtacctgctgagcatggggtccaacgagaatatccactcaattcatttcagcggacacgtgtttactgtccggaagaaagaagagtataaaatggccctgtacaacctgtatcccggcgtgttcgaaaccgtcgagatgctgcctagcaaggcagggatctggagagtggaatgcctgattggggagcacctgcatgccggaatgtctaccctgtttctggtgtacagtaataagtgtcagacacccctggggatggcttccggacatatccgggatttccagattaccgcatctggacagtacggccagtgggcccctaagctggctagactgcactattccgggtctatcaacgcttggtccacaaaagagcctttctcttggattaaggtggacctgctggcaccaatgatcattcatggcatcaaaactcagggggccaggcagaagttctcctctctgtacatctcacagtttatcatcatgtacagcctggatggcaagaaatggcagacataccgcggcaatagcacagggactctgatggtgttctttggcaacgtggacagttcagggatcaagcacaacattttcaatccccctatcattgctagatacatcaggctgcacccaacccattattctattcgaagtacactgcggatggaactgatggggtgcgatctgaacagttgttcaatgcccctgggaatggagtccaaggcaatctctgacgcccagattaccgctagctcctacttcactaatatgtttgctacctggagcccctccaaagcacgactgcatctgcagggacgaagcaacgcatggcgaccacaggtgaacaatcccaaggagtggctgcaggtcgattttcagaaaactatgaaggtgaccggagtcacaactcagggcgtgaaaagtctgctgacctcaatgtacgtcaaggagttcctgatctctagttcacaggacggccaccagtggacactgttctttcagaacggaaaggtgaaagtcttccagggcaatcaggattcctttacacctgtggtcaactctctggacccacccctgctgactcgctacctgcgaatccacccacagtcctgggtgcatcagattgcactgagaatggaagtcctgggctgcgaggcccaggacctgtattga
AAV-LK03 VP1衣壳(SEQ ID NO:91)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL
AAV-SPK VP1衣壳(SEQ ID NO:92)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL
AAV-WINT中的内含子的核酸序列(SEQ ID NO:93)
AGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTGACACTGACATCCACTTTTTCTTTTTCTCCACAG
FIX(SEQ ID NO:94)
ATGCAGAGGGTGAACATGATCATGGCTGAGAGCCCTGGCCTGATCACCATCTGCCTGCTGGGCTACCTGCTGTCTGCTGAATGTACAGGTTTGTTTCCTTTTTTATAATACATTGAGTATGCTTGCCTTTTAGATATAGAAATATCTGATTCTGTCTTCTTCACTAAATTTTGATTACATGATTTGACAGCAATATTGAAGAGTCTAACAGCCAGCACCCAGGTTGGTAAGTACTGGTTCTTTGTTAGCTAGGTTTTCTTCTTCTTCACTTTTAAAACTAAATAGATGGACAATGCTTATGATGCAATAAGGTTTAATAAACACTGTTCAGTTCAGTATTTGGTCATGTAATTCCTGTTAAAAAACAGTCATCTCCTTGGTTTAAAAAAATTAAAAGTGGGAAAACAAAGAAATAGCAGAATATAGTGAAAAAAAATAACCACAGTATTTTTGTTTGGACTTACCACTTTGAAATCAAATTGGGAAACAAAAGCACAAACAGTGGCCTTATTTACACAAAAAGTCTGATTTTAAGATATGTGACAATTCAAGGTTTCAGAAGTATGTAAGGAGGTGTGTCTCTAATTTTTTAAATTATATATCTTCAATTTAAAGTTTTAGTTAAAACATAAAGATTAACCTTTCATTAGCAAGCTGTTAGTTATCACCAAAGCTTTTCATGGATTAGGAAAAAATCATTTTGTCTCTATCTCAAACATCTTGGAGTTGATATTTGGGGAAACACAATACTCAGTTGAGTTCCCTAGGGGAGAAAAGCAAGCTTAAGAATTGACACAAAGAGTAGGAAGTTAGCTATTGCAACATATATCACTTTGTTTTTTCACAACTACAGTGACTTTATTTATTTCCCAGAGGAAGGCATACAGGGAAGAAATTATCCCATTTGGACAAACAGCATGTTCTCACAGTAAGCACTTATCACACTTACTTGTCAACTTTCTAGAATCAAATCTAGTAGCTGACAGTACCAGGATCAGGGGTGCCAACCCTAAGCACCCCCAGAAAGCTGACTGGCCCTGTGGTTCCCACTCCAGACATGATGTCAGCTGTGAAATCCACCTCCCTGGACCATAATTAGGCTTCTGTTCTTCAGGAGACATTTGTTCAAAGTCATTTGGGCAACCATATTCTGAAAACAGCCCAGCCAGGGTGATGGATCACTTTGCAAAGATCCTCAATGAGCTATTTTCAAGTGATGACAAAGTGTGAAGTTAAGGGCTCATTTGAGAACTTTCTTTTTCATCCAAAGTAAATTCAAATATGATTAGAAATCTGACCTTTTATTACTGGAATTCTCTTGACTAAAAGTAAAATTGAATTTTAATTCCTAAATCTCCATGTGTATACAGTACTGTGGGAACATCACAGATTTTGGCTCCATGCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAGATTATTTGGATTAAAAACAAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTTCATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAAACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAGTTTTTCTTGATCATGAAAATGCCAACAAAATTCTGAATAGACCAAAGAGGTATAACTCTGGCAAGCTTGAAGAGTTTGTACAGGGGAATCTGGAGAGAGAGTGTATGGAAGAGAAGTGCAGCTTTGAGGAAGCCAGAGAAGTGTTTGAAAATACAGAGAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTGGATGGTGATCAATGTGAGAGCAATCCCTGCTTGAATGGGGGGAGCTGTAAAGATGATATCAACAGCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAGGGGAAAAACTGTGAGCTTGATGTGACCTGTAATATCAAGAATGGCAGGTGTGAGCAATTTTGCAAGAATTCTGCTGATAACAAAGTGGTCTGTAGCTGCACTGAGGGATATAGGCTGGCTGAAAACCAGAAGAGCTGTGAACCTGCAGTGCCTTTTCCCTGTGGGAGAGTGTCTGTGAGCCAAACCAGCAAGCTGACTAGGGCTGAAGCAGTCTTTCCTGATGTAGATTATGTGAATAGCACTGAGGCTGAGACAATCCTTGACAATATCACTCAGAGCACACAGAGCTTCAATGACTTCACCAGGGTGGTAGGAGGGGAGGATGCCAAGCCTGGGCAGTTCCCCTGGCAGGTAGTGCTCAATGGAAAAGTGGATGCCTTTTGTGGAGGTTCAATTGTAAATGAGAAGTGGATTGTGACTGCAGCCCACTGTGTGGAAACTGGAGTCAAGATTACTGTGGTGGCTGGAGAGCACAATATTGAGGAAACTGAGCACACTGAGCAGAAGAGGAATGTGATCAGGATTATCCCCCACCACAACTACAATGCTGCTATCAACAAGTACAACCATGACATTGCCCTCCTGGAACTGGATGAACCCCTGGTCTTGAACAGCTATGTGACACCCATCTGTATTGCTGATAAAGAGTACACCAACATCTTCTTGAAATTTGGGTCTGGATATGTGTCTGGCTGGGGCAGGGTGTTCCATAAAGGCAGGTCTGCCCTGGTATTGCAGTATTTGAGGGTGCCTCTGGTGGATAGAGCAACCTGCTTGCTGAGCACCAAGTTTACAATCTACAACAATATGTTCTGTGCAGGGTTCCATGAAGGTGGTAGAGACAGCTGCCAGGGAGATTCTGGGGGTCCCCATGTGACTGAGGTGGAGGGAACCAGCTTCCTGACTGGGATTATCAGCTGGGGTGAGGAGTGTGCTATGAAGGGAAAGTATGGGATCTACACAAAAGTATCCAGATATGTGAACTGGATTAAGGAGAAAACCAAGCTGACTTGA

Claims (104)

1.一种表达盒，其包含编码具有B结构域缺失的因子VIII蛋白(FVIII-BDD)的核酸序列，其中所述表达盒包含与SEQ ID NO:1的序列至少98％相同的序列。
2.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述表达盒包含与SEQ ID NO:1的序列至少99％相同的序列。
3.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述表达盒包含SEQ ID NO:1的序列。
4.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述表达盒由SEQ ID NO:1的序列组成。
5.一种表达盒，其包含能操作地连接至编码具有B结构域缺失的因子VIII蛋白(FVIII-BDD)的核酸序列的调节元件，其中在所述调节元件与所述核酸序列之间不存在内含子，并且其中所述表达盒包含与SEQ ID NO:1至少91％相同的序列。
6.一种表达盒，其包含：
a.调节元件，其与SEQ ID NO:2-67中的任一者的序列至少90％相同，以及
b.核酸序列，其编码具有B结构域缺失的因子VIII蛋白(FVIII-BDD)，所述核酸序列与SEQ ID NO:77的序列具有至少90％的一致性，
其中所述调节元件能操作地连接至所述核酸序列，且其中在所述调节元件与所述核酸序列之间不存在内含子。
7.一种表达盒，其包含：
a.调节元件，其与SEQ ID NO:2-67中的任一者的序列至少90％相同，以及
b.核酸序列，其编码具有B结构域缺失的因子VIII蛋白(FVIII-BDD)，所述核酸序列与SEQ ID NO:77的序列具有至少90％的一致性，
其中所述调节元件能操作地连接至所述核酸序列，且其中未翻译的核酸的不超过0-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-105、106或107个的核苷酸在所述调节元件与所述核酸序列之间。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的表达盒，其中所述调节元件包含与SEQ ID NO:2-67中的任一者至少95％相同的核苷酸序列。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的表达盒，其中所述调节元件具有与SEQ ID NO:4-21或24-67中的任一者的序列中所阐述的相同总数目的减少的CpG。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的表达盒，其中所述调节元件包含SEQ ID NO:2-21或24-67中的任一者的序列，其使CpG在与SEQ ID NO:4-21或24-67中的任一者的序列中所阐述的相同位置处被取代成CpT、CpA、TpG或ApG。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的表达盒，其中所述核酸序列在与来自在所述调节元件与所述核酸序列之间具有(a)内含子或(b)未翻译的核酸的108个或更多个核苷酸的表达盒的表达相比时呈现更大的表达。
12.根据权利要求5至11中任一项所述的表达盒，其中所述经编码的FVIII-BDD在与来自在所述调节元件与所述核酸序列之间具有(a)内含子或(b)未翻译的核酸的108个或更多个核苷酸的表达盒的表达相比时呈现更大的生物活性。
13.根据权利要求12所述的表达盒，其中生物活性通过凝固检定或FVIII检定或FVIII缺乏模型中的减少出血来测定。
14.根据权利要求5至13中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒在与包装在所述调节元件与所述核酸序列之间具有(a)内含子或(b)未翻译的核酸的108个或更多个核苷酸的表达盒相比时更有效地包装至AAV载体中。
15.一种核酸序列，其包含被修饰成具有较少胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的SEQ IDNO:2、3、22或23。
16.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少1个CpG的SEQ ID NO:2、3、22或23。
17.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少2个CpG的SEQ ID NO:2、3、22或23。
18.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少3个CpG的SEQ ID NO:2、3、22或23。
19.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少4个CpG的SEQ ID NO:2、3、22或23。
20.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少5个CpG的SEQ ID NO:22或23。
21.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少6个CpG的SEQ ID NO:22或23。
22.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少7个CpG的SEQ ID NO:22或23。
23.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少8个CpG的SEQ ID NO:22或23。
24.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少9个CpG的SEQ ID NO:22或23。
25.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少10个CpG的SEQ ID NO:22或23。
26.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少11个CpG的SEQ ID NO:22或23。
27.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少12个CpG的SEQ ID NO:22或23。
28.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少13个CpG的SEQ ID NO:22或23。
29.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少14个CpG的SEQ ID NO:22或23。
30.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少15个CpG的SEQ ID NO:22或23。
31.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有少16个CpG的SEQ ID NO:22或23。
32.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有1或0个CpG的SEQ ID NO:2、3、22或23。
33.根据权利要求15所述的核酸序列，其包含被修饰成具有0个CpG的SEQ ID NO:2、3、22或23。
34.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQ ID NO:2、3、22或23中的5’端的至少第一个CpG被修饰成不是CpG。
35.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQ ID NO:2、3、22或23中的5’端的至少第二个CpG被修饰成不是CpG。
36.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQ ID NO:2、3、22或23中的5’端的至少第三个CpG被修饰成不是CpG。
37.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQ ID NO:2、3、22或23中的5’端的至少第四个CpG被修饰成不是CpG。
38.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQ ID NO:22或23中的5’端的至少第五个CpG被修饰成不是CpG。
39.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQ ID NO:22或23中的5’端的至少第六个CpG被修饰成不是CpG。
40.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQ ID NO:22或23中的5’端的至少第七个CpG被修饰成不是CpG。
41.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQ ID NO:22或23中的5’端的至少第八个CpG被修饰成不是CpG。
42.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQ ID NO:22或23中的5’端的至少第九个CpG被修饰成不是CpG。
43.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQ ID NO:22或23中的5’端的至少第10个CpG被修饰成不是CpG。
44.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQ ID NO:22或23中的5’端的至少第11个CpG被修饰成不是CpG。
45.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQ ID NO:22或23中的5’端的至少第12个CpG被修饰成不是CpG。
46.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQ ID NO:22或23中的5’端的至少第13个CpG被修饰成不是CpG。
47.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQ ID NO:22或23中的5’端的至少第14个CpG被修饰成不是CpG。
48.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQ ID NO:22或23中的5’端的至少第15个CpG被修饰成不是CpG。
49.根据权利要求15至33中任一项所述的核酸序列，其中来自SEQ ID NO:22或23中的5’端的至少第16个CpG被修饰成不是CpG。
50.一种核酸序列，其与根据权利要求15至49中任一项所述的核酸序列的所述序列至少95％相同。
51.一种多核苷酸，其包含与具有或不具有5’和/或3’侧接5-7个核苷酸的SEQ ID NO:4-21或24-67中的任一者的序列至少95％相同的核酸序列。
52.一种多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:4-21或24-67中的任一者的序列至少95％相同且具有与SEQ ID NO:4-21或24-67中的任一者中所阐述的相同数目的减少的CpG的核酸序列。
53.一种多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:4-21或24-67中的任一者的序列至少95％相同且在与SEQ ID NO:4-21或24-67中的任一者中所阐述的相同的位置处具有减少的CpG的核酸序列。
54.根据权利要求15至53中任一项所述的核酸序列或多核苷酸，其中所述经修饰的SEQID NO:2、3、22或23使至少一个CpG中的G核苷酸经T或A核苷酸取代成CpT或CpA二核苷酸或使至少一个CpG中的C核苷酸经T或A核苷酸取代成TpG或ApG二核苷酸。
55.根据权利要求15至54中任一项所述的核酸序列或多核苷酸，其中来自所述经修饰的SEQ ID NO:22或23中的5’端的第七个CpG不使G核苷酸被取代。
56.根据权利要求15至54中任一项所述的核酸序列或多核苷酸，其中来自所述经修饰的SEQ ID NO:22或23中的5’端的第七个CpG使G核苷酸经T或A核苷酸取代成CpT或CpA二核苷酸。
57.根据权利要求15至54中任一项所述的核酸序列或多核苷酸，其中来自所述经修饰的SEQ ID NO:22或23中的5’端的第七个CpG使G核苷酸经T或A核苷酸取代成CpT或CpA二核苷酸，且所述经修饰的SEQ ID NO:22或23中的至少一个额外CpG二核苷酸使G经T核苷酸取代成所述经修饰的SEQ ID NO:22或23中的CpT二核苷酸。
58.根据权利要求15至54中任一项所述的核酸序列或多核苷酸，其中来自所述经修饰的SEQ ID NO:22或23中的5’端的第七个CpG使G核苷酸经T或A核苷酸取代成CpT或CpA二核苷酸，且所述经修饰的SEQ ID NO:22或23中的至少一个额外CpG二核苷酸使G经A核苷酸取代成所述经修饰的SEQ ID NO:22或23中的CpA二核苷酸。
59.根据权利要求15至54中任一项所述的核酸序列或多核苷酸，其中来自所述经修饰的SEQ ID NO:22或23中的5’端的第七个CpG使G核苷酸经T或A核苷酸取代成CpT或CpA二核苷酸，且所述经修饰的SEQ ID NO:22或23中的至少两个额外CpG使G经T核苷酸取代成所述经修饰的SEQ ID NO:22或23中的CpT二核苷酸。
60.根据权利要求15至54中任一项所述的核酸序列或多核苷酸，其中来自所述经修饰的SEQ ID NO:22或23中的5’端的第七个CpG使G核苷酸经T或A核苷酸取代成CpT或CpA二核苷酸，且所述经修饰的SEQ ID NO:22或23中的至少两个额外CpG使G经A核苷酸取代成所述经修饰的SEQ ID NO:22或23中的CpA二核苷酸。
61.根据权利要求15至60中任一项所述的核酸序列或多核苷酸，其中所述经修饰的SEQID NO:2、3、22或23使至少一个CpG中的G和/或C核苷酸删除。
62.根据权利要求15至61中任一项所述的核酸序列或多核苷酸，其能操作地连接至转基因。
63.根据权利要求15至61中任一项所述的核酸序列或多核苷酸，其中所述核酸序列或多核苷酸对能操作地连接的转基因赋予转录，所述转录在由未修饰的SEQ ID NO:2、3、22或23赋予的所述转录的约50％内。
64.根据权利要求15至61中任一项所述的核酸序列或多核苷酸，其中所述核酸序列或多核苷酸对能操作地连接的转基因赋予转录，所述转录在由未修饰的SEQ ID NO:2、3、22或23赋予的所述转录的约25-50％内。
65.根据权利要求15至61中任一项所述的核酸序列或多核苷酸，其中所述核酸序列或多核苷酸对能操作地连接的转基因赋予转录，所述转录在由未修饰的SEQ ID NO:2、3、22或23赋予的所述转录的约5-100％内。
66.一种表达盒，其包含转基因和根据权利要求15至61中任一项所述的核酸序列或多核苷酸。
67.根据权利要求66所述的表达盒，其中所述核酸序列或多核苷酸被定位在所述转基因的5’处。
68.根据权利要求66或67所述的表达盒，其中所述转基因编码在肝脏细胞中表达且分泌于全身循环中的治疗蛋白。
69.根据权利要求68所述的表达盒，其中所述治疗蛋白治疗或预防神经退化性或中枢神经系统(CNS)疾病。
70.根据权利要求69所述的表达盒，其中所述治疗蛋白为保护性ApoE同工型。
71.根据权利要求70所述的表达盒，其中所述治疗蛋白为ApoEε2同工型。
72.根据权利要求68所述的表达盒，其中所述治疗蛋白治疗或预防自体免疫疾病或过敏性疾病。
73.根据权利要求72所述的表达盒，其中所述治疗蛋白为包含非所需抗原以及驱动从细胞分泌所述治疗蛋白的前导序列的融合蛋白。
74.根据权利要求73所述的表达盒，其中所述非所需抗原为髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的细胞外结构域或其片段。
75.根据权利要求68所述的表达盒，其中所述治疗蛋白为血液凝结或凝固因子蛋白。
76.根据权利要求75所述的表达盒，其中所述血液凝结或凝固因子蛋白为因子IX(FIX)、因子VIII(FVIII)、因子VII(FVII)或蛋白C。
77.根据权利要求76所述的表达盒，其中所述因子VIII由与SEQ ID NO:68的序列至少95％相同的核酸序列编码。
78.根据权利要求68所述的表达盒，其中所述治疗蛋白为溶酶体贮积酶。
79.根据权利要求78所述的表达盒，其中所述溶酶体贮积酶为酸性α-葡糖苷酶(GAA)或α-半乳糖苷酶(GLA)。
80.根据权利要求68所述的表达盒，其中所述治疗蛋白治疗或预防发炎性疾病或病症。
81.根据权利要求68所述的表达盒，其中所述治疗蛋白治疗或预防遗传性血管性水肿(HAE)。
82.根据权利要求81所述的表达盒，其中所述治疗蛋白为C1酯酶抑制剂(C1EI)。
83.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含根据权利要求1至82中任一项所述的核酸序列或多核苷酸或表达盒。
84.根据权利要求83所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含以下中的一或多者：AAV衣壳：以及
一或多个AAV反向末端重复序列(ITR)，其中所述AAV ITR侧接所述核酸序列、所述多核苷酸和/或所述转基因的5’或3’末端。
85.根据权利要求84所述的AAV载体，其进一步包含定位于所述侧接5’或3’ITR内的内含子。
86.根据权利要求85所述的AAV载体，其中所述内含子或一或多个ITR中的至少一者被修饰成具有减少的CpG。
87.根据权利要求83至86中任一项所述的AAV载体，其中所述AAV衣壳血清型包含与AAV1,AAV2,AAV3,AAV3B,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAV11,Rh10,Rh74或AAV-2i8 VP1,VP2和/或VP3序列具有90％或更高序列一致性的经修饰或变体AAVVP1、VP2和/或VP3衣壳；或与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV-2i8、SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92VP1、VP2和/或VP3序列具有95％或更高序列一致性的衣壳；或与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74、AAV-2i8、SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92VP1、VP2和/或VP3序列具有100％序列一致性的衣壳。
88.根据权利要求83至87中任一项所述的AAV载体，其中所述ITR包含以下中的任一者的一或多个ITR：AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10或Rh74 AAV血清型或其组合。
89.根据权利要求83至88中任一项所述的AAV载体，其进一步包含ITR、polyA信号和/或内含子序列。
90.一种医药组合物，其在生物兼容性载剂或赋形剂中包含多个根据权利要求83至89中任一项所述的AAV载体。
91.根据权利要求90所述的医药组合物，其进一步包含空AAV衣壳。
92.根据权利要求91所述的医药组合物，其中所述空AAV衣壳与所述AAV载体的比率在约100:1-50:1、约50:1-25:1、约25:1-10:1、约10:1-1:1、约1:1-1:10、约1:10-1:25、约1:25-1:50或约1:50-1:100内或之间。
93.根据权利要求91所述的医药组合物，其中所述等空AAV衣壳与所述AAV载体的所述比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
94.根据权利要求90至93中任一项所述的医药组合物，其进一步包含表面活性剂。
95.一种治疗需要血液凝结或凝固因子的人类的方法，其包含：
提供根据权利要求1至14、66至68、75至77中任一项所述的表达盒、根据权利要求83至89中任一项所述的AAV载体或根据权利要求90至94中任一项所述的医药组合物；以及
向所述人类施用一定量的所述表达盒、多核苷酸、AAV载体或医药组合物，其中所述血液凝结或凝固因子在所述人类中表达。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述人类患有A型或B型血友病。
97.根据权利要求95所述的方法，其中所述AAV载体经静脉内、动脉内、腔室内、粘膜内或经由导管向所述人类施用。
98.根据权利要求95所述的方法，其中所述血液凝结或凝固因子以增加的水平表达。
99.根据权利要求95所述的方法，其中所述血液凝结或凝固因子以大于在不需要血液凝结或凝固因子的人类中发现的所述血液凝结或凝固因子的水平的1％表达。
100.根据权利要求95所述的方法，其中所述血液凝结或凝固因子以在不需要血液凝结或凝固因子的人类中发现的所述血液凝结或凝固因子的水平的约1％-40％表达。
101.根据权利要求95所述的方法，其中所述血液凝结或凝固因子以在不需要血液凝结或凝固因子的人类中发现的所述血液凝结或凝固因子的水平的约5％-30％表达。
102.根据权利要求95所述的方法，其中所述AAV载体以约1×108至约1×1014个载体基因组/千克(vg/kg)所述人类体重的范围施用。
103.根据权利要求95所述的方法，其中所述人类患有对因子VIII(FVIII)具有抑制性抗体的A型血友病。
104.一种治疗有需要的人类的对因子VIII(FVIII)具有抑制性抗体的A型血友病的方法，其包含：
提供根据权利要求1至14、66至68、75至77中任一项所述的表达盒、根据权利要求83至89中任一项所述的AAV载体或根据权利要求90至94中任一项所述的医药组合物；以及
向所述人类施用一定量的所述核酸、多核苷酸、表达盒、AAV载体或医药组合物，其中所述血液凝结或凝固因子为因子VIII(FVIII)且在所述人类中表达。
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