BR112021003399A2 - sequências de promotores otimizadas, construtos de expressão livres de íntron e métodos de uso - Google Patents

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BR112021003399A2
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Xavier Anguela
Liron ELKOUBY
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Spark Therapeutics, Inc.
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Abstract

A invenção fornece cassetes de expressão. Em certas modalidades, um cassete de expressão compreende (a) um elemento regulador pelo menos 90% idêntico à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs:2-67, e (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína do Fator VIII tendo uma deleção do domínio B (FVIII-BDD), onde a sequência de ácido nucleico (a) é pelo menos 90% idêntica à sequência da SEQ ID NO:77, onde o elemento regulador está operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico e onde nenhum íntron está presente entre o elemento regulador e a sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD, ou onde não mais que 0 ? 107 nucleotídeos de ácido nucleico não traduzido estão entre o elemento regulador e a sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD. Em certas modalidades, os cassetes de expressão contêm elementos de sequência tendo CpG(s) substituído(s) por CpT, CpA, TpG ou ApG na(s) mesma(s) posição(ões) ou têm sequências de ácido nucleico reduzidas de CpG.

Description

“SEQUÊNCIAS DE PROMOTORES OTIMIZADAS, CONSTRUTOS DE EXPRESSÃO LIVRES DE ÍNTRON E MÉTODOS DE USO” PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório dos EUA de nº 62/722.547, depositado em 24 de agosto de 2018, do Pedido de Patente Provisório dos EUA de nº 62/725.096, depositado em 30 de agosto de 2018, e do Pedido de Patente Provisório dos EUA de nº 62/784.116, depositado em 21 de dezembro de 2018. Todo o conteúdo dos pedidos anteriores é incorporado neste documento por referência, incluindo todos os textos, tabelas, listagens de sequência e figuras.
INTRODUÇÃO
[0002] A terapia genética mostra grande promessa em aplicações terapêuticas envolvendo perda da função ou atividade da proteína, por exemplo, devido a uma deficiência ou defeito genético, ou da função ou atividade aberrante de uma proteína na qual se deseja suprimir a expressão da proteína aberrante. Melhorias na expressão do transgene, função intensificadora e promotora que conduzem a expressão do transgene irão intensificar as aplicações terapêuticas da terapia genética. A presente invenção aborda, inter alia, essa necessidade.
DESCRIÇÃO RESUMIDA
[0003] De acordo com a presente invenção, são fornecidos cassetes de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína do Fator VIII tendo uma deleção do domínio B (FVIII- BDD).
[0004] Em certas modalidades, o cassete de expressão compreende uma sequência pelo menos 98% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 1, pelo menos 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 1, compreende a sequência da SEQ ID NO: 1, ou consiste na sequência da SEQ ID NO: 1.
[0005] Em certas modalidades, o cassete de expressão compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína do Fator VIII tendo uma deleção do domínio B (FVIII-BDD), em que nenhum íntron está presente entre o elemento regulador e a sequência de ácido nucleico, e em que o cassete de expressão compreende uma sequência pelo menos 91% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 1.
[0006] Em certas modalidades, o cassete de expressão compreende (a) um elemento regulador pelo menos 90% idêntico à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2-67, e (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína do Fator VIII tendo uma deleção do domínio B (FVIII-BDD), em que a sequência de ácido nucleico (a) é pelo menos 90% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 77, e em que o elemento regulador está operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico e em que nenhum íntron está presente entre o elemento regulador e a sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD.
[0007] Em certas modalidades, o cassete de expressão compreende (a) um elemento regulador pelo menos 90% idêntico à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2-67, e (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína do Fator VIII tendo uma deleção do domínio B (FVIII-BDD), em que a sequência de ácido nucleico é pelo menos 90% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 77, e em que o elemento regulador está operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico e em que não mais que 0 – 5, 5 – 10, 10 – 15, 15 – 20, 20 – 25, 25 – 30, 30 – 35, 35 – 40, 40 – 45, 45 – 50, 50 – 55, 55 – 60, 60 – 65, 65 – 70, 70 – 75, 75 – 80, 80 – 85, 85 – 90, 90 – 95, 95 – 100, 100 – 105, 106 ou 107 nucleotídeos de ácido nucleico não traduzido estão entre o elemento regulador e a sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD.
[0008] Em certas modalidades, o elemento regulador no cassete de expressão compreende uma sequência de nucleotídeos pelo menos 95% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 2-67.
[0009] Em certas modalidades, o elemento regulador no cassete de expressão tem o mesmo número total de CpGs reduzidos conforme estabelecido na sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs:4-21 ou 24-67.
[0010] Em certas modalidades, o elemento regulador no cassete de expressão compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2- 21 ou 24-67 tendo CpG(s) substituído(s) por CpT, CpA, TpG ou ApG na(s) mesma(s) posição(oes) conforme estabelecido na sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs:4-21 ou 24-67.
[0011] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico no cassete de expressão exibe maior expressão quando comparada à expressão de um cassete de expressão tendo (a) um íntron, ou (b) 108 ou mais nucleotídeos de ácido nucleico não traduzido, entre o elemento regulador e a sequência de ácido nucleico.
[0012] Em certas modalidades, o FVIII-BDD codificado no cassete de expressão exibe maior atividade biológica em comparação à expressão de um cassete de expressão tendo (a) um íntron, ou (b) 108 ou mais nucleotídeos de ácido nucleico não traduzido, entre o elemento regulador e a sequência de ácido nucleico.
[0013] Em certas modalidades, a atividade biológica é determinada por um ensaio de coagulação ou sangramento reduzido em um ensaio de FVIII ou modelo de deficiência de FVIII.
[0014] Em certas modalidades, o cassete de expressão é mais eficientemente empacotado em um vetor de AAV quando comparado ao empacotamento de um cassete de expressão tendo (a) um íntron, ou (b) 108 ou mais nucleotídeos de ácido nucleico não traduzido, entre o elemento regulador e o sequência de ácido nucleico.
[0015] De acordo com a presente invenção, são fornecidas sequências de ácido nucleico reduzidas de dinucleotídeo citosina-guanina (CpG) de elementos reguladores (promotores). Promotores exemplares incluem o promotor TTR (gene da transtirretina) e promotor ApoE/hAAT (gene da apolipoproteína E humana/gene da antitripsina alfa-1 humana). Promotores exemplares também incluem o promotor do gene da cadeia gama do fibrinogênio (FGG), o promotor da albumina e o promotor do gene A1 da amiloide sérica (SAA1). Promotores exemplares incluem ainda o promotor TTR fundido a um ou mais de um promotor hAAT, promotor FGG, promotor da albumina e/ou promotor SAA1 que resulta em um promotor híbrido ou uma quimera promotora.
[0016] Os elementos reguladores de ácido nucleico reduzidos de CpG incluem variantes que exibem níveis de expressão genética alterados em comparação aos elementos reguladores não reduzidos de CpG quando transferidos para as células. Em certas modalidades, os elementos reguladores reduzidos de CpG podem fornecer expressão aumentada de um transgene ou ácido nucleico heterólogo, tal como um transgene que codifica uma proteína, tal como um fator de coagulação sanguínea (por exemplo, FVIII), em um mamífero, bem como fornecer eficácia aumentada no contexto da transferência genética pelo aumento dos níveis circulantes da proteína, tal como um fator de coagulação sanguínea, e obtenção de hemostasia para resultados terapêuticos benéficos.
[0017] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico tem pelo menos 1 CpG a menos do que um elemento regulador não reduzido de CpG do tipo selvagem (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 22 e 23).
[0018] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico tem pelo menos 2 CpGs a menos do que um elemento regulador não reduzido de CpG do tipo selvagem (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 22 e 23).
[0019] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico tem pelo menos 3 CpGs a menos do que um elemento regulador não reduzido de CpG do tipo selvagem (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 22 e 23).
[0020] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico tem pelo menos 4 CpGs a menos do que um elemento regulador não reduzido de CpG do tipo selvagem (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 22 e 23).
[0021] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico tem pelo menos 5 CpGs a menos do que um elemento regulador não reduzido de CpG do tipo selvagem (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23).
[0022] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico tem pelo menos 6 CpGs a menos do que um elemento regulador não reduzido de CpG do tipo selvagem (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23).
[0023] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico tem pelo menos 7 CpGs a menos do que um elemento regulador não reduzido de CpG do tipo selvagem (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23).
[0024] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico tem pelo menos 8 CpGs a menos do que um elemento regulador não reduzido de CpG do tipo selvagem (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23).
[0025] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico tem pelo menos 9 CpGs a menos do que um elemento regulador não reduzido de CpG do tipo selvagem (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23).
[0026] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico tem pelo menos 10 CpGs a menos do que um elemento regulador não reduzido de CpG do tipo selvagem (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23).
[0027] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico tem pelo menos 11 CpGs a menos do que um elemento regulador não reduzido de CpG do tipo selvagem (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e
23).
[0028] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico tem pelo menos 12 CpGs a menos do que um elemento regulador não reduzido de CpG do tipo selvagem (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23).
[0029] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico tem pelo menos 13 CpGs a menos do que um elemento regulador não reduzido de CpG do tipo selvagem (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23).
[0030] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico tem pelo menos 14 CpGs a menos do que um elemento regulador não reduzido de CpG do tipo selvagem (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23).
[0031] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico tem pelo menos 15 CpGs a menos do que um elemento regulador não reduzido de CpG do tipo selvagem (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23).
[0032] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico tem pelo menos 16 CpGs a menos do que um elemento regulador não reduzido de CpG do tipo selvagem (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23).
[0033] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico não tem mais que 16 CpGs; não tem mais que 15 CpGs; não tem mais que 14 CpGs; não tem mais que 13 CpGs; não tem mais de 12 CpG; não tem mais que 11 CpGs; não tem mais que 10 CpGs; não tem mais que 9 CpGs; não tem mais que 8 CpGs; não tem mais que 7 CpGs; não tem mais que 6 CpGs; não tem mais que 5 CpGs; não tem mais que 4 CpGs; não tem mais que 3 CpGs; não tem mais que 2 CpGs; ou não tem mais que 1 CpG.
[0034] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico tem no máximo 15 CpGs; 14 CpGs; 13 CpGs; 12 CpGs; 11 CpG; 10 CpGs; 9
CpGs; 8 CpGs; 7 CpGs; 6 CpGs; 5 CpGs; 4 CpGs; 3 CpGs; 2 CpGs; ou 1 CpG. Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico não tem CpGs.
[0035] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico compreendendo a SEQ ID NO:22 ou 23 é modificada para ter 15 dinucleotídeos citosina-guanina (CpGs) ou menos; 14 CpGs ou menos; 13 CpGs ou menos; 12 CpGs ou menos; 11 CpGs ou menos; 10 CpGs ou menos; 9 CpGs ou menos; 8 CpGs ou menos; 7 CpGs ou menos; 6 CpGs ou menos; 5 CpGs ou menos; 4 CpGs ou menos; 3 CpGs ou menos; 2 CpGs ou menos; ou 1 ou 0 CpG. Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 22 e 23 é modificada para ter 0 CpG.
[0036] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 22 e 23 é modificada de tal modo que o C em cada sítio do CpG seja modificado para um T, opcionalmente excluindo o C no sítio do C/EBP.
[0037] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 22 e 23 é modificada de tal modo que o C em cada sítio do CpG seja modificado para um T, opcionalmente excluindo o C no sítio do C/EBP, exceto que o primeiro sítio do CpG não foi modificado.
[0038] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 22 e 23 é modificada de tal modo que o C em cada sítio do CpG seja modificado para um T, opcionalmente excluindo o C no sítio do C/EBP, exceto que o segundo sítio do CpG não foi modificado.
[0039] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 22 e 23 é modificada de tal modo que o C em cada sítio do CpG seja modificado para um T, opcionalmente excluindo o C no sítio do C/EBP, exceto que o terceiro sítio do CpG não foi modificado.
[0040] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 22 e 23 é modificada de tal modo que o C em cada sítio do CpG seja modificado para um T, opcionalmente excluindo o C no sítio do C/EBP, exceto que o quarto sítio do CpG não foi modificado.
[0041] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 é modificada de tal modo que o C em cada sítio do CpG seja modificado para um T, opcionalmente excluindo o C no sítio do C/EBP, exceto que o quinto sítio do CpG não foi modificado.
[0042] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 é modificada de tal modo que o C em cada sítio do CpG seja modificado para um T, opcionalmente excluindo o C no sítio do C/EBP, exceto que o sexto sítio do CpG não foi modificado.
[0043] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 é modificada de tal modo que o C em cada sítio do CpG seja modificado para um T, exceto que o sétimo sítio do CpG não é modificado.
[0044] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 é modificada de tal modo que o C em cada sítio do CpG seja modificado para um T, opcionalmente excluindo o C no sítio do C/EBP, exceto que o oitavo sítio do CpG não foi modificado.
[0045] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 é modificada de tal modo que o C em cada sítio do CpG seja modificado para um T, opcionalmente excluindo o C no sítio do C/EBP, exceto que o nono sítio do CpG não foi modificado.
[0046] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 é modificada de tal modo que o C em cada sítio do CpG seja modificado para um T, opcionalmente excluindo o C no sítio do C/EBP, exceto que o décimo sítio do CpG não foi modificado.
[0047] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 é modificada de tal modo que o C em cada sítio do CpG seja modificado para um T, opcionalmente excluindo o C no sítio do C/EBP, exceto que o décimo primeiro sítio do CpG não foi modificado.
[0048] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 é modificada de tal modo que o C em cada sítio do CpG seja modificado para um T, opcionalmente excluindo o C no sítio do C/EBP, exceto que o décimo segundo sítio do CpG não foi modificado.
[0049] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 é modificada de tal modo que o C em cada sítio do CpG seja modificado para um T, opcionalmente excluindo o C no sítio do C/EBP, exceto que o décimo terceiro sítio do CpG não foi modificado.
[0050] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 é modificada de tal modo que o C em cada sítio do CpG seja modificado para um T, opcionalmente excluindo o C no sítio do C/EBP, exceto que o décimo quarto sítio do CpG não foi modificado.
[0051] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 é modificada de tal modo que o C em cada sítio do CpG seja modificado para um T, opcionalmente excluindo o C no sítio do C/EBP, exceto que o décimo quinto sítio do CpG não foi modificado.
[0052] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 é modificada de tal modo que o C em cada sítio do CpG seja modificado para um T, opcionalmente excluindo o C no sítio do C/EBP, exceto que o décimo sexto sítio do CpG não foi modificado.
[0053] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico é modificada de tal modo que pelo menos o 1º CpG da extremidade 5' em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 22 e 23 seja modificado para não ser CpG.
[0054] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico é modificada de tal modo que pelo menos o 2º CpG da extremidade 5' em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 22 e 23 seja modificado para não ser CpG.
[0055] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico é modificada de tal modo que pelo menos o 3º CpG da extremidade 5' em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 22 e 23 seja modificado para não ser CpG.
[0056] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico é modificada de tal modo que pelo menos o 4º CpG da extremidade 5' em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 22 e 23 seja modificado para não ser CpG.
[0057] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico é modificada de tal modo que pelo menos o 5º CpG da extremidade 5' em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 seja modificado para não ser CpG.
[0058] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico é modificada de tal modo que pelo menos o 6º CpG da extremidade 5' em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 seja modificado para não ser CpG.
[0059] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico é modificada de tal modo que pelo menos o 7º CpG da extremidade 5' em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 seja modificado para não ser CpG.
[0060] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico é modificada de tal modo que pelo menos o 8º CpG da extremidade 5' em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 seja modificado para não ser CpG.
[0061] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico é modificada de tal modo que pelo menos o 9º CpG da extremidade 5' em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 seja modificado para não ser CpG.
[0062] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico é modificada de tal modo que pelo menos o 10º CpG da extremidade 5' em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 seja modificado para não ser CpG.
[0063] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico é modificada de tal modo que pelo menos o 11º CpG da extremidade 5' em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 seja modificado para não ser CpG.
[0064] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico é modificada de tal modo que pelo menos o 12º CpG da extremidade 5' em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 seja modificado para não ser CpG.
[0065] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico é modificada de tal modo que pelo menos o 13º CpG da extremidade 5' em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 seja modificado para não ser CpG.
[0066] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico é modificada de tal modo que pelo menos o 14º CpG da extremidade 5' em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 seja modificado para não ser CpG.
[0067] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico é modificada de tal modo que pelo menos o 15º CpG da extremidade 5' em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 seja modificado para não ser CpG.
[0068] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico é modificada de tal modo que pelo menos o 16º CpG da extremidade 5' em qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 e 23 seja modificado para não ser CpG.
[0069] Em certas modalidades, a citosina de um ou mais CpGs em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 22 e 23 é modificada para uma timina. Em certas modalidades, a citosina de um ou mais CpGs em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 22 e 23 é modificada para adenina.
[0070] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 22 e 23 é modificada de tal modo que o C em um ou mais CpGs seja deletado.
[0071] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 22 e 23 é modificada de tal modo que o G em um ou mais CpGs seja deletado.
[0072] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 3, 22 e 23 é modificada de tal modo que C e G em um ou mais CpGs sejam deletados.
[0073] Promotores TTR reduzidos de CpG exemplares são estabelecidos nas SEQ ID NOs: 4 - 13.
[0074] Promotores híbridos reduzidos de CpG exemplares são estabelecidos nas SEQ ID NOs: 14-21.
[0075] Promotores ApoE/hAAT reduzidos de CpG exemplares são estabelecidos nas SEQ ID NOs: 24-67.
[0076] Em certas modalidades, a citosina de um ou mais CpGs em um promotor híbrido, compreendendo todo ou uma porção do promotor TTR fundido a todo ou uma porção de pelo menos um do promotor hAAT, e/ou do promotor FGG, e/ou do promotor da albumina, e/ou o promotor SAA1, é modificada para uma timina (CT) ou uma adenina (GA). O promotor TTR pode ser fundido a qualquer um ou uma combinação dos promotores anteriores em qualquer orientação 3'  5'.
[0077] Em certas modalidades, um promotor híbrido tem uma orientação 3'  5', TTR/hAAT ou hAAT/TTR. Em certas modalidades, um promotor híbrido tem uma orientação 3'  5', TTR/FGG ou FGG/TTR. Em certas modalidades, um promotor híbrido tem uma orientação 3'  5', TTR/hAAT/albumina ou hAAT/TTR/albumina ou albumina/TTR/hAAT ou TTR/albumina/hAAT, hAAT/albumina/TTR ou albumina/hAAT/TTR, etc.
[0078] Em certas modalidades, um promotor híbrido tem uma orientação 3'  5', TTR/FGG/albumina ou hAAT/TTR/FGG ou FGG/TTR/hAAT ou TTR/FGG/hAAT, etc.
[0079] Em certas modalidades, um promotor híbrido tem um promotor TTR fundido a todos ou uma porção de todos os 4 do promotor hAAT, do promotor FGG, do promotor da albumina e do promotor SAA1. O promotor TTR pode ser fundido a todos ou a uma porção dos promotores anteriores em qualquer orientação 3'  5' e em qualquer ordem do promotor.
[0080] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo da presente invenção, tal como uma sequência de ácido nucleico reduzida de CPG, está operacionalmente ligada a um transgene.
[0081] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo da presente invenção, tal como SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 modificada, conforme estabelecido neste documento, está operacionalmente ligada ao transgene.
[0082] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo da presente invenção, tal como SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 modificada, conforme estabelecido neste documento, confere a transcrição em um transgene operacionalmente ligado que está dentro de cerca de 5-100% da transcrição conferida pela SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 não modificada, ou que está dentro de cerca de 50% da transcrição conferida pela SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 não modificada, ou que está dentro de cerca de 25-50% da transcrição conferida pela SEQ ID NO: 2, 3, 22 ou 2 não modificada.
[0083] Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo, tal como a SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 modificada, conforme estabelecido neste documento, está posicionada a 5' de um transgene.
[0084] Em certas modalidades, um transgene codifica uma proteína de coagulação sanguínea ou do fator de coagulação.
[0085] Em certas modalidades, um transgene codifica Fator IX (FIX), Fator VIII (FVIII), Fator VII (FVII) ou Proteína C.
[0086] Em certas modalidades, um transgene codifica o Fator VIII tendo uma sequência pelo menos 95% idêntica à sequência da SEQ ID NO:
68.
[0087] Em certas modalidades, um transgene é transcrito em um RNA inibitório. Em certas modalidades, um RNA inibitório compreende RNA antissenso, um microRNA (miRNA) ou um pequeno RNA interferente (siRNA).
[0088] Em certas modalidades, um transgene codifica uma proteína terapêutica que é expressa nas células do fígado e segregada na circulação sistêmica.
[0089] Em certas modalidades, a proteína terapêutica trata ou previne uma doença neurodegenerativa ou do sistema nervoso central (SNC).
[0090] Em certas modalidades, a proteína terapêutica é uma isoforma ApoE protetora.
[0091] Em certas modalidades, a proteína terapêutica é a isoforma ApoE ε2.
[0092] Em certas modalidades, a proteína terapêutica trata ou previne uma doença autoimune ou doença alérgica.
[0093] Em certas modalidades, a proteína terapêutica é uma proteína de fusão que compreende um antígeno indesejado e uma sequência líder que conduz a secreção da referida proteína terapêutica a partir da célula.
[0094] Em certas modalidades, o antígeno indesejado é o domínio extracelular da glicoproteína da mielina do oligodendrócito (MOG) ou um fragmento da mesma.
[0095] Em certas modalidades, um cassete de expressão compreende uma sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo da presente invenção, tal como uma SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 modificada, conforme estabelecido neste documento, operacionalmente ligados a um transgene, nos quais a sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo estão posicionados a montante da extremidade 5' do transgene e, opcionalmente, em que não há mais que 0 – 5, 5 – 10, 10 – 15, 15 – 20, 20 – 25, 25 – 30, 30 – 35, 35 – 40, 40 – 45, 45 – 50, 50 – 55, 55 – 60, 60 – 65, 65 – 70, 70 – 75, 75 – 80, 80 – 85, 85 – 90, 90 – 95, 95 – 100, 100 – 105, 106 ou 107 nucleotídeos da sequência de ácido nucleico não traduzida posicionada entre a sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo e a extremidade 5' do transgene.
[0096] Em certas modalidades, um cassete de expressão compreende uma primeira sequência de nucleotídeos tendo 95% ou mais de identidade de sequência à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs:4-21 ou 24-67, em que a primeira sequência de nucleotídeos posicionada a montante da extremidade 5' de uma segunda sequência de nucleotídeos tem 95% ou mais de identidade de sequência à sequência da SEQ ID NO:77 e, opcionalmente, em que não há mais que 0 – 5, 5 – 10, 10 – 15, 15 – 20, 20 – 25, 25 – 30, 30 – 35, 35 – 40, 40 – 45, 45 – 50, 50 – 55, 55 – 60, 60 – 65, 65 – 70, 70 – 75, 75 – 80, 80 – 85, 85 – 90, 90 – 95, 95 – 100, 100 – 105, 106 ou 107 nucleotídeos da sequência de ácido nucleico não traduzida posicionada entre a primeira sequência de nucleotídeos e a extremidade 5' da segunda sequência de nucleotídeos.
[0097] Em certas modalidades, o cassete de expressão compreende a sequência da SEQ ID NO: 1 ou um polinucleotídeo tendo pelo menos 98% de identidade de sequência à sequência da SEQ ID NO: 1.
[0098] Em certas modalidades, o cassete de expressão compreende um polinucleotídeo tendo pelo menos 99% de identidade de sequência à sequência da SEQ ID NO: 1.
[0099] Em certas modalidades, o cassete de expressão consiste essencialmente na SEQ ID NO: 1.
[0100] Em certas modalidades, o transgene ou a segunda sequência de nucleotídeos compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica o Fator VIII (FVIII) tendo uma deleção do domínio B (FVIII-BDD) e a sequência de ácido nucleico codifica uma proteína FVII-BDD com atividade de coagulação sanguínea de FVIII e tendo pelo menos 90% de identidade de sequência à sequência da SEQ ID NO: 68.
[0101] Em certas modalidades, o transgene ou a segunda sequência de nucleotídeos compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica o Fator VIII (FVIII) tendo uma deleção do domínio B (FVIII-BDD) e a sequência de ácido nucleico tem 90% ou mais de identidade de sequência à sequência da SEQ ID NO: 77 e codifica uma proteína tendo atividade de coagulação sanguínea de FVIII.
[0102] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico não traduzida não é um íntron ou é livre de íntrons.
[0103] Em certas modalidades, a primeira sequência de nucleotídeos compreende uma sequência de ácido nucleico pelo menos 95% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 4-21 ou 24-67.
[0104] Em certas modalidades, a primeira sequência de nucleotídeos compreende uma sequência de ácido nucleico pelo menos 95% idêntica à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4-21 ou 24-67, e tem o mesmo número total de CpGs reduzidos conforme estabelecido no sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4-21 ou 24-67.
[0105] Em certas modalidades, a primeira sequência de nucleotídeos compreende uma sequência de ácido nucleico pelo menos 95%
idêntica à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4-21 ou 24-67, e tendo CpG(s) substituído(s) para ser(em) CpT, CpA, TpG, ou ApG na(s) mesma(s) posição(ões) conforme estabelecido na sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4-21 ou 24-67.
[0106] Em certas modalidades, a segunda sequência de nucleotídeos exibe maior expressão quando comparada à expressão de um polinucleotídeo tendo 108 ou mais nucleotídeos entre a primeira sequência de nucleotídeos e a extremidade 5' da segunda sequência de nucleotídeos.
[0107] Em certas modalidades, a segunda sequência de nucleotídeos exibe maior atividade biológica quando comparada à expressão de um polinucleotídeo tendo 108 ou mais nucleotídeos entre a primeira sequência de nucleotídeos e a extremidade 5' da segunda sequência de nucleotídeos.
[0108] Em certas modalidades, a atividade biológica é determinada por um ensaio de coagulação ou sangramento reduzido em um ensaio de FVIII ou modelo de deficiência de FVIII.
[0109] Em certas modalidades, a segunda sequência de nucleotídeos é mais eficientemente empacotada em um vetor de AAV quando comparada ao empacotamento de um polinucleotídeo tendo 108 ou mais nucleotídeos entre a primeira sequência de nucleotídeos e a extremidade 5' da segunda sequência de nucleotídeos.
[0110] Em certas modalidades, um vetor de vírus adeno- associado (AAV) compreende a sequência de ácido nucleico, ou polinucleotídeo ou cassete de expressão, conforme estabelecido neste documento.
[0111] Em certas modalidades, o vetor de AAV compreende um ou mais de: a) um capsídeo de AAV; e b) uma ou mais repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV, em que as ITRs de AAV flanqueiam o terminal 5' ou 3' da sequência de ácido nucleico, do polinucleotídeo e/ou do transgene.
[0112] Em certas modalidades, o vetor de AAV compreende ainda um íntron posicionado dentro da ITR que flanqueia 5' ou 3'.
[0113] Em certas modalidades, o íntron ou uma ou mais ITRs são modificados para terem CpGs reduzidos.
[0114] Em certas modalidades, o sorotipo do capsídeo de AAV compreende um capsídeo de AAV VP1, VP2 e/ou VP3 modificado ou variante tendo 90% ou mais de identidade de sequência às sequências de VP1, VP2 e/ou VP3 da SEQ ID NO: 91 ou SEQ ID NO: 92 de AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV-2i8, ou um capsídeo tendo 95% ou mais de identidade de sequência às sequências de VP1, VP2 e/ou VP3 da SEQ ID NO: 91 ou SEQ ID NO: 92 de AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV-2i8, ou um capsídeo tendo 100% de identidade de sequência às sequências de VP1, VP2 e/ou VP3 da SEQ ID NO: 91 ou SEQ ID NO: 92 de AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV- 2i8.
[0115] Em certas modalidades, as ITRs compreendem uma ou mais ITRs de qualquer um de: sorotipos de AVV AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10 ou Rh74, ou um combinação dos mesmos.
[0116] Em certas modalidades, o vetor de AAV compreende ainda uma ITR, um sinal poliA e/ou sequência de íntron.
[0117] Em certas modalidades, os vetores de AAV, conforme estabelecido neste documento, são qualquer composição farmacêutica.
[0118] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica compreende um transportador ou excipiente biologicamente compatível.
[0119] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica compreende ainda capsídeos de AAV vazios.
[0120] Em certas modalidades, uma composição ou uma composição farmacêutica compreende uma razão de capsídeos de AAV vazios para vetores de AAV dentro ou entre cerca de 100:1-50:1, de cerca de 50:1- 25:1, de cerca de 25:1-10:1, de cerca de 10:1-1:1, de cerca de 1:1-1:10, de cerca de 1:10-1:25, de cerca de 1:25-1:50, ou de cerca de 1:50-1:100.
[0121] Em certas modalidades, a razão dos capsídeos de AAV vazios para os vetores de AAV em uma composição ou composição farmacêutica é de cerca de 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 ou 10:1.
[0122] Em certas modalidades, uma composição ou composição farmacêutica estabelecida neste documento compreende ainda um surfactante.
[0123] Em certas modalidades, são fornecidos métodos para tratar um ser humano em necessidade de terapia genética.
[0124] Em certas modalidades, o humano está em necessidade de uma coagulação sanguínea ou fator de coagulação.
[0125] Em certas modalidades, um método para tratar um humano inclui (a) fornecer um cassete de expressão conforme estabelecido neste documento, um polinucleotídeo conforme estabelecido neste documento, um vetor de AAV conforme estabelecido neste documento ou uma composição farmacêutica conforme estabelecida neste documento; e (b) administrar uma quantidade do cassete de expressão, polinucleotídeo, vetor de AAV ou composição farmacêutica ao humano, em que a coagulação sanguínea ou fator de coagulação são expressos no humano.
[0126] Em certas modalidades, o humano tem hemofilia A ou B.
[0127] Em certas modalidades, o vetor de AAV é administrado ao ser humano por via intravenosa, intra-arterial, intra-cavitária, intramucosa ou por meio de um cateter.
[0128] Em certas modalidades, a coagulação sanguínea ou fator de coagulação são expressos em níveis aumentados após a administração.
[0129] Em certas modalidades, a coagulação sanguínea ou fator de coagulação são expressos em mais de 1% dos níveis de coagulação sanguínea ou fator de coagulação encontrados em um humano que está em necessidade de coagulação sanguínea ou fator de coagulação.
[0130] Em certas modalidades, a coagulação sanguínea ou fator de coagulação são expressos em cerca de 1% -40% dos níveis de coagulação sanguínea ou fator de coagulação encontrados em um ser humano que não está em necessidade de coagulação sanguínea ou fator de coagulação.
[0131] Em certas modalidades, a coagulação sanguínea ou fator de coagulação são expressos em cerca de 5% -30% dos níveis de coagulação sanguínea ou fator de coagulação encontrados em um ser humano que não está em necessidade de coagulação sanguínea ou fator de coagulação.
[0132] Em certas modalidades, o vetor de AAV é administrado em uma faixa de cerca de 1X108 a cerca de 1X1014 genomas de vetor por quilograma (vg/kg) do peso do humano.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0133] A Figura 1 mostra os níveis do Fator IX humano (hFIX), medidos por um ensaio de atividade, no plasma de camundongos 24 horas após a liberação hidrodinâmica de construtos que codificam hFIX do elemento regulador ApoE/hAAT reduzido de CpG, rotulados como "CpG1" a "CpG22". As SEQ ID NOs: 24-67 correspondem aos elementos reguladores CpG1- ApoE/hAAT a CpG22-ApoE/hAAT, respectivamente, com e sem sítios de enzima de restrição, e são adicionalmente descritas no Exemplo 13. Os níveis de hFIX são apresentados como vezes de um plasmídeo de referência contendo ApoE/hAAT não reduzido de CpG (SEQ ID NO: 23).
[0134] A Figura 2 mostra os níveis de antígeno do fator VIII humano (hFVIII), medidos por um ensaio ELISA, no plasma de camundongos 24 horas após a liberação hidrodinâmica de construtos que codificam hFVIII do promotor TTRm reduzido de CpG, rotulados como "CpG1" a "CpG5". As SEQ ID NOs: 4-21 correspondem aos promotores CpG1-TTRm a CpG5-TTRm, respectivamente, com e sem flanqueamento de sítios de enzima de restrição, e são descritas adicionalmente no Exemplo 13. Os níveis são apresentados como porcentagem do FVIII normal do plasma humano, onde 100% = 150 ng/mL. "TTRm" refere-se a um construto que codifica hFVIII contendo um promotor TTRm não reduzido de CpG (SEQ ID NO: 3).
[0135] A Figura 3 mostra os níveis de antígeno hFVIII, medidos por um ensaio ELISA, no plasma de camundongos 24 horas após a liberação hidrodinâmica de construtos que codificam hFVIII do promotor híbrido reduzido de CpG, rotulados como "Hybrid6" a "Hybrid9". As SEQ ID NOs: 14-21 correspondem a Hybrid6 a Hybrid9 de promotores reduzidos de CpG, respectivamente. Os níveis são apresentados como porcentagem do FVIII normal do plasma humano, onde 100% = 150 ng/mL. "TTRm" refere-se ao construto que codifica hFVIII contendo um promotor TTRm não reduzido de CpG (SEQ ID NO: 3).
[0136] A Figura 4 mostra os níveis de antígeno hFVIII, medidos por um ensaio ELISA, no plasma de camundongos 2, 4 e 8 semanas após a liberação de construtos de hFVIII de promotor Hybrid 6, 7, 8 e 9 reduzido de CpG e não reduzido de CpG encapsidado com AAV, a uma dose de genomas de vetor de 6,4e11 (vg)/kg. Os níveis são apresentados como porcentagem do FVIII normal do plasma humano, onde 100% = 150 ng/mL.
[0137] A Figura 5 mostra os níveis de antígeno hFVIII medidos por um ensaio ELISA, no plasma de camundongos 8 semanas após a liberação de construtos de hFVIII de promotor Hybrid 7 e Hybrid 9 não reduzido de CpG (TTRm-hFVIII) encapsidado com AAV, a uma faixa de dosagem de 2,56e11, 6,4e11 e 1,6e12 vg/kg. Os níveis são apresentados como porcentagem do FVIII normal do plasma humano, onde 100% = 150 ng/mL.
[0138] A Figura 6 mostra a expressão de mRNA de hFVIII no fígado, cérebro, testículos, baço e rim de camundongos 8 semanas após a administração intravenosa de construtos de hFVIII de promotor Hybrid 7 e Hybrid 9 não reduzido de CpG (TTRm-hFVIII) encapsidado com AAV a uma dose de 6,4e11 vg/kg. Nenhum RNA de hFVIII foi observado em qualquer outro tecido além do fígado, demonstrando a natureza específica do fígado dos promotores. Grupos de resultados para fígado, cérebro, testículos, baço e rim são mostrados da esquerda para a direita para TTRm-hFVIII, Hybrid7-hFVIII e
Hybrid9-hFVIII, respectivamente.
[0139] A Figura 7 mostra uma comparação esquemática de um cassete de expressão com um íntron, referido como "AAV-WINT" (TTRm- íntron-hFVIII-BDD) e um cassete de expressão sem um íntron, referido como "AAV-INTL" (TTRm- hFVIII-BDD livre de íntron; SEQ ID NO: 1). AAV-WINT tem um íntron sintético (SEQ ID NO: 93) localizado entre um promotor TTRm e um transgene que codifica o Fator VIII humano deletado do domínio B (hFVIII- BDD), que não está presente em AAV-INTL. A sequência de ácido nucleico otimizada por códons nesses cassetes que codificam hFVIII-BDD é estabelecida na SEQ ID NO: 77.
[0140] A Figura 8 mostra os níveis de hFVIII detectados por ELISA realizado em amostras de plasma de camundongo para a dosagem de 6,4e9 vg/camundongo do estudo #1. Os resultados são a média dos animais em cada grupo de tratamento (n=5). As barras de erro representam o desvio padrão.
[0141] A Figura 9 mostra os níveis de hFVIII detectados por ELISA realizado em amostras de plasma de camundongo para a dosagem de 1,6e10 vg/camundongo do estudo #1. Os resultados são a média dos animais em cada grupo de tratamento (TTRm hFVIII, n=4; TTRm hFVIII livre de íntron, n=5). As barras de erro representam o desvio padrão.
[0142] A Figura 10 mostra os níveis de hFVIII detectados por ELISA realizado em amostras de plasma de camundongo do estudo #2. Os resultados são a média dos animais em cada grupo de tratamento (n=10). As barras de erro representam o desvio padrão.
[0143] A Figura 11 mostra os níveis de hFVIII detectados por ELISA realizado em amostras de plasma de primata não humano (PNH) do estudo #1. Resultados de macacos individuais em dose baixa (2e12 vg/kg) grupo 1 (AAV-WINT, linhas com caixas, n=2) e grupo 2 (AAV-INTL, SEQ ID NO: 1, linhas com triângulos, n=3) são mostrados. Um animal, P0001, de AAV- WINT de dose baixa foi removido devido a anticorpos neutralizantes positivos para AAV observados na amostra pré-dose no dia 8.
[0144] A Figura 12 mostra os níveis de hFVIII detectados por ELISA realizado em amostras de plasma de PNH do estudo #1. Resultados de macacos individuais em dose alta (6e12 vg/kg) grupo 3 (AAV-WINT, linhas com caixas, n=2) e grupo 4 (AAV-INTL, SEQ ID NO: 1, linhas com triângulos, n=3) são mostrados. Um animal, P0101, de AAV-WINT de alta dose foi removido devido a nenhuma expressão de hFVIII observada durante o tratamento.
[0145] A Figura 13 mostra os níveis de hFVIII detectados por ELISA realizado em amostras de plasma de PNHs do estudo #2. Os resultados de macacos individuais na dose de 2e12 vg/kg para AAV-WINT (linhas com caixas, n=5) e AAV-INTL, (SEQ ID NO: 1, linhas com triângulos, n=5) são mostrados.
[0146] A Figura 14 mostra os resultados de um ensaio de potência de vetor baseado em células em três diferentes multiplicidades de infecção (MOI). Os sobrenadantes celulares foram avaliados quanto à atividade de hFVIII por Chromogenix Coatest SP4 e são a média de duas réplicas biológicas testadas em duplicata. As barras de erro representam o desvio padrão. “AAV-WINT” e “AAV-INTL” são frascos estoque originais não diluídos de vírus, enquanto “Dosagem AAV-WINT” e “Dosagem AAV-INTL” indicam materiais diluídos para infusão.
[0147] A Figura 15 mostra os resultados da Figura 14 representados novamente como alteração da dobra versus AAV-WINT para cada MOI.
[0148] A Figura 16 mostra uma avaliação da potência de vetor em um ensaio de potência de vetor baseado em células in vitro em três MOIs diferentes. Os sobrenadantes celulares foram avaliados quanto à atividade de hFVIII por Chromogenix Coatest SP4 e são a média de duas réplicas biológicas testadas em duplicata. As barras de erro representam o desvio padrão. AAV- WINT e AAV-INTL (SEQ ID NO: 1) são frascos estoque originais de vírus de dois lotes diferentes.
[0149] A Figura 17 mostra uma comparação de cassetes de expressão para níveis de hFVIII in vitro, testados por Chromogenix Coatest SP4 de sobrenadantes de células Huh7 transfectadas com preparações de DNA de plasmídeo independentes (prep) de mTTR-íntron-hFVIII-BDD e mTTR- hFVIII-BDD (SEQ ID NO: 1). Os pontos de dados individuais são mostrados como círculos preenchidos, com cada barra representando a média de duas réplicas biológicas (n=2) testadas em duplicata. As barras de erro representam o desvio padrão.
[0150] A Figura 18 mostra os níveis diários da atividade de FVIII em 4 indivíduos humanos (participante 1 (círculo), 2 (quadrado), 3 (triângulo) e 4 (diamante)) infundidos com 5x1011 vg/kg de cassete de expressão de hFVIII AAV-INTL (SEQ ID NO: 1) encapsidado no vetor de AAV LK03 (SEQ ID NO: 91), referido neste documento como hFVIII-BDD LK03-INTL.
[0151] A Figura 19 mostra as médias semanais de níveis da atividade de FVIII em 4 indivíduos humanos (participante 1 (círculo), 2 (quadrados), 3 (triângulo) e 4 (diamante)) infundidos com 5x1011 vg/kg de hFVIII-BDD LK03-INTL.
[0152] A Figura 20 mostra as médias em bloco de quatro semanas dos níveis da atividade de FVIII em 4 indivíduos humanos (participante 1 (círculo), 2 (quadrado), 3 (triângulo) e 4 (diamante)) infundidos com 5x1011 vg/kg de hFVIII-BDD LK03-INTL.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0153] São divulgados neste documento cassetes de expressão livres de íntron para a expressão do Fator VIII (FVIII) e FVIII tendo um domínio B (FVIII-BBD) deletado (por exemplo, FVIII humano (hFVIII) e FVIII-BDD humano (hFVIII-BDD)). Os investigadores relataram que a inclusão de um íntron em um cassete de expressão, incluindo em vetores de liberação de AAV, pode contribuir para uma expressão do transgene aumentada (Huang et al., 1990, Nucl. Acid Res., 18:937-947; Choi et al., 2014, Mol. Brain, 7:17; Powell et al., 2015, Discov. Med., 19:49-57; Lu et al., 2017, Hum. Gene Ther., 28:125-
134). Surpreendentemente, conforme divulgado neste documento, a remoção parcial ou completa de um íntron levou ao aumento dos níveis da potência do vetor de AAV e da expressão do transgene (neste caso, Fator VIII) em cultura de células, camundongos e primatas não humanos. O projeto do cassete de expressão "livre de íntrons" é uma melhoria em vetores para o tratamento de distúrbios de coagulação sanguínea, tais como hemofilia A, e pode fornecer eficácia em doses de vetor mais baixas, potencialmente oferecendo benefícios à segurança do paciente e resultados, além de diminuir as barreiras para fabricação, tais como custos e tempo.
[0154] Também são divulgadas neste documento sequências de ácido nucleico tendo CpGs reduzidos em comparação a uma sequência de referência de mamífero do tipo selvagem (por exemplo, humano) e/ou com menos de 100% de identidade de sequência a uma sequência de referência de mamífero do tipo selvagem (por exemplo, humano). As sequências de ácido nucleico tendo CpGs reduzidos incluem um ou mais dos seguintes promotores: promotor TTR, promotor ApoE/hAAT, promotor FGG, promotor da albumina e promotor SAA1. As sequências de ácido nucleico tendo CPGs reduzidos incluem fusões ou híbridos do promotor TTR e pelo menos um ou mais dos seguintes promotores: promotor ApoE/hAAT, promotor FGG, promotor da albumina e promotor SAA1.
[0155] Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico" são usados de forma intercambiável neste documento para referirem-se a todas as formas de ácido nucleico, oligonucleotídeos, incluindo ácido desoxirribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). Os polinucleotídeos incluem DNA genômico, cDNA e DNA antissenso, e mRNA emendado (spliced) ou não, tRNA rRNA e DNA ou RNA inibitório (RNAi, por exemplo, RNA(sh) em gancho de cabelo curto ou pequeno, microRNA (miRNA), RNA(si) interferente pequeno ou curto, RNA de trans-splicing ou RNA antissenso. Os polinucleotídeos incluem polinucleotídeos de ocorrência natural, sintéticos e intencionalmente modificados ou alterados (por exemplo, ácido nucleico variante). Os polinucleotídeos podem ser simples,
duplos ou triplex, lineares ou circulares e podem ter qualquer comprimento. Ao discutir polinucleotídeos, uma sequência ou estrutura de um polinucleotídeo particular pode ser descrita neste documento de acordo com a convenção de fornecer a sequência na direção 5' a 3'.
[0156] Conforme usado neste documento, os termos "modificado(a)" ou "variante" e variações gramaticais dos mesmos significam que um ácido nucleico, polipeptídeo ou subsequência dos mesmos se desviam de uma sequência de referência. As sequências modificadas e variantes podem, portanto, ter substancialmente a mesma, maior ou menor expressão, atividade ou função do que uma sequência de referência, mas pelo menos reter a atividade ou função parcial da sequência de referência. Exemplos particulares de uma modificação ou variante são um promotor TTR reduzido de CpG, promotor ApoE/hAAT, promotor FGG, promotor da albumina e promotor SAA1.
[0157] Uma variante de "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo" refere-se a uma sequência modificada que foi geneticamente alterada em comparação ao tipo selvagem. Uma variante de ácido nucleico ou polinucleotídeo pode referir-se a uma sequência que foi modificada por códons, mas ainda retém pelo menos a identidade de sequência parcial a uma sequência de referência, tal como sequência do tipo selvagem. Um ácido nucleico ou polinucleotídeo que codifica uma proteína pode ser geneticamente modificado sem alterar a sequência da proteína codificada. Alternativamente, a sequência pode ser geneticamente modificada para codificar uma proteína variante. Por exemplo, alguns códons de tal variante de ácido nucleico serão alterados (por exemplo, reduzidos de CpG) sem alterar os aminoácidos da proteína codificada por eles.
[0158] Os vetores de expressão com promotores tendo teor de CpG reduzido podem exibir melhorias em comparação aos promotores nos quais o teor de CpG não foi reduzido. Ao comparar a expressão, um promotor reduzido de CpG é comparado a um promotor do tipo selvagem ou não reduzido de CpG.
[0159] O termo "variante" ou "modificado(a)" não precisa aparecer em cada caso de uma referência feita à sequência de ácido nucleico reduzida de CpG neste documento. Da mesma forma, o termo "ácido nucleico reduzido de CpG" ou similar pode omitir o termo "variante" ou "modificado(a)", mas pretende-se que a referência a "ácido nucleico reduzido de CpG" inclua variantes no nível genético.
[0160] Um exemplo particular de uma variante é um ácido nucleico reduzido de CpG. A redução de CpG pode ser alcançada alterando o nucleotídeo C ou G para um nucleotídeo diferente, tal como alterando um C para um T ou alterando um G para um A. A redução de CpG também pode ser alcançada deletando um nucleotídeo C ou deletando um nucleotídeo, ou deletando ambos os nucleotídeos C e G.
[0161] Um FVIII "variante ou modificado" refere-se a um FVIII ou FVIII-BDD que foi geneticamente alterado em comparação ao FVIII ou FVIII- BDD do tipo selvagem não modificado (SEQ ID NO: 68). Tal uma variante pode ser referida como uma "variante de ácido nucleico que codifica o Fator VIII (FVIII)".
[0162] Um "fator VIII (FVIII) variante" também pode significar uma proteína FVIII modificada de tal modo que a proteína modificada tenha uma alteração de aminoácido em comparação ao FVIII do tipo selvagem. Ao comparar a atividade e/ou estabilidade, se a proteína FVIII codificada variante retém o domínio B, é apropriado compará-la com o FVIII do tipo selvagem; e se a proteína FVIII codificada variante tiver uma deleção do domínio B, ela é comparada ao FVIII do tipo selvagem que também tem uma deleção do domínio B.
[0163] Um FVIII variante pode incluir uma porção do domínio B. Assim, FVIII-BDD inclui uma porção do domínio B. Normalmente, no FVIII- BDD, a maior parte do domínio B é deletada.
[0164] Um FVIII variante pode incluir uma sequência "SQ"
estabelecida como SFSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO: 69). Normalmente, tal FVIII variante com uma SQ (FVIII/SQ) tem um BDD, por exemplo, pelo menos todo ou parte do BD é deletado. A variante FVIII, tal como FVIII-BDD, pode ter toda ou parte da sequência "SQ", ou seja, toda ou parte da SEQ ID NO: 69. Assim, por exemplo, um FVIII-BDD variante com uma sequência SQ (SFSQNPPVLKRHQR, SEQ ID NO: 69) pode ter toda ou somente uma parte da sequência de aminoácidos SFSQNPPVLKRHQR. Por exemplo, FVIII-BDD pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 resíduos de aminoácidos de SFSQNPPVLKRHQR incluídos. Assim, SFSQNPPVLKRHQR com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 deleções internas, bem como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 deleções do terminal amino ou carbóxi está incluída nas proteínas FVIII variantes estabelecidas neste documento.
[0165] Os "polipeptídeos", "proteínas" e "peptídeos" codificados pelas sequências de "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo" incluem sequências nativas de comprimento total, como com proteínas do tipo selvagem de ocorrência natural, bem como subsequências funcionais, formas modificadas ou variantes de sequência, desde que a subsequência, a forma modificada ou a variante retenham algum grau de funcionalidade da proteína nativa de comprimento total. Por exemplo, um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico reduzido CpG) que codifica a proteína FVIII pode ter uma deleção do domínio B conforme estabelecido neste documento e reter a função de coagulação. Em métodos e usos da presente invenção, tais polipeptídeos, proteínas e peptídeos codificados pelas sequências de ácido nucleico podem, mas não necessitam, ser idênticos à proteína endógena que é defeituosa, ou cuja expressão é insuficiente ou deficiente no mamífero tratado.
[0166] Por exemplo, e sem limitação, as modificações incluem uma ou mais substituições de nucleotídeos ou aminoácidos (por exemplo, 1-3, 3-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40, 40-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-500, 500-750, 750-850 ou mais nucleotídeos ou resíduos). Conforme estabelecido neste documento, um exemplo de uma modificação de ácido nucleico é a redução de CpG.
[0167] Um exemplo de uma modificação de aminoácido é uma substituição conservativa de aminoácido ou uma deleção (por exemplo, subsequências ou fragmentos) de uma sequência de referência, por exemplo, FVIII, tal como FVIII com uma deleção do domínio B. Em certas modalidades, uma sequência modificada ou variante retém pelo menos parte de uma função ou atividade da sequência não modificada.
[0168] Todas as formas de ácidos nucleicos de mamíferos e não mamíferos, incluindo outras formas de mamíferos dos promotores reduzidos de CpG neste documento, são expressamente incluídas, conhecidas ou desconhecidas.
[0169] O termo "vetor" refere-se a uma pequena molécula de ácido nucleico transportadora, um plasmídeo, vírus (por exemplo, AAV) ou outro veículo que pode ser manipulado por inserção ou incorporação de um ácido nucleico. Os vetores podem ser usados para manipulação genética (ou seja, "vetores de clonagem"), para introduzir/transferir polinucleotídeos em células e/ou órgãos e para transcrever ou traduzir o polinucleotídeo inserido em células. Um "vetor de expressão" é um vetor que contém um gene ou sequência de ácido nucleico com as regiões reguladoras necessárias para a expressão em uma célula hospedeira. Uma sequência de ácido nucleico de vetor geralmente contém pelo menos uma origem de replicação para propagação em uma célula e, opcionalmente, elementos adicionais, tais como uma sequência de ácido nucleico heteróloga, elemento de controle de expressão (por exemplo, um promotor, intensificador), íntron, repetição(ões) terminal(is) invertida(s) (ITRs), marcador selecionável opcional, sinal de poliadenilação.
[0170] Conforme divulgado neste documento, um vetor sem um íntron exibiu características superiores em comparação ao mesmo vetor com um íntron sintético. Por conseguinte, a presente invenção fornece cassetes de expressão compreendendo um transgene operacionalmente ligado a um elemento regulador, em que o elemento regulador (por exemplo, um promotor reduzido de CpG conforme estabelecido neste documento) está posicionado a montante da extremidade 5' do transgene e em que há não são mais que 0 – 5, 5 – 10, 10 – 15, 15 – 20, 20 – 25, 25 – 30, 30 – 35, 35 – 40, 40 – 45, 45 – 50, 50 – 55, 55 – 60, 60 – 65, 65 – 70, 70 – 75, 75 – 80, 80 – 85, 85 – 90, 90 – 95, 95 – 100, 100 – 105, 106 ou 107 nucleotídeos da sequência de ácido nucleico não traduzida entre o elemento regulador e a extremidade 5' do transgene.
[0171] A presente invenção também fornece cassetes de expressão compreendendo uma primeira sequência de nucleotídeos tendo 95% ou mais de identidade de sequência à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2-67, em que a primeira sequência de nucleotídeos está posicionada a montante da extremidade 5' de uma segunda sequência de nucleotídeos tendo 95% ou mais de identidade de sequência à sequência da SEQ ID NO: 77, e em que não mais que 0 – 5, 5 – 10, 10 – 15, 15 – 20, 20 – 25, 25 – 30, 30 – 35, 35 – 40, 40 – 45, 45 – 50, 50 – 55, 55 – 60, 60 – 65, 65 – 70, 70 – 75, 75 – 80, 80 – 85, 85 – 90, 90 – 95, 95 – 100, 100 – 105, 106 ou 107 nucleotídeos da sequência de ácido nucleico não traduzida estão entre a primeira sequência de nucleotídeos e a extremidade 5' da segunda sequência de nucleotídeos.
[0172] A presente invenção fornece adicionalmente cassetes de expressão compreendendo uma primeira sequência de nucleotídeos tendo 95% ou mais de identidade de sequência à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2-67, em que a primeira sequência de nucleotídeos está posicionada a montante da extremidade 5' de uma segunda sequência de nucleotídeos tendo 95% ou mais de identidade de sequência (por exemplo, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência) à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 71 – 88, e em que não mais que 0 – 5, 5 – 10, 10 – 15, 15 – 20, 20 – 25, 25 – 30, 30 – 35, 35 – 40, 40 – 45, 45 – 50, 50 – 55, 55 – 60, 60 – 65, 65 – 70, 70 – 75, 75 – 80, 80 – 85, 85 – 90, 90 – 95, 95 – 100, 100 – 105, 106 ou 107 nucleotídeos da sequência de ácido nucleico não traduzida estão entre a primeira sequência de nucleotídeos e a extremidade 5' da segunda sequência de nucleotídeos.
[0173] A presente invenção fornece ainda cassetes de expressão com um ácido nucleico não traduzido (não codificante) posicionado entre um elemento regulador e um transgene, em que o ácido nucleico não traduzido não é um íntron. Tal cassete de expressão pode ser referido como um cassete livre de íntrons.
[0174] Um íntron é uma sequência com um sítio doador e um sítio aceitador de splice que permite que a maquinaria celular emende a sequência de nucleotídeos não traduzida durante o processo de maturação do RNA em mRNA. Conforme usado neste documento, "livre de íntrons" refere-se a uma sequência de ácido nucleico não traduzida que carece de sítios doadores e aceitadores de splice, mas não significa que a sequência de ácido nucleico não traduzida é desprovida de outros sítios, tais como sítios de reconhecimento/clivagem de enzimas de restrição, sequências de Kozak, sítios de reconhecimento/ligação do fator de transcrição. Em outras palavras, livre íntrons não significa que a sequência de ácido nucleico é completamente desprovida de qualquer sequência de ácido nucleico não traduzida.
[0175] Um vetor de AAV é derivado de vírus adeno-associado. Os vetores de AAV são úteis como vetores de terapia genética conforme eles podem penetrar células e introduzir ácido nucleico/material genético de modo que o ácido nucleico/material genético possa ser mantido de forma estável nas células. Como o AAV não está associado a doenças patogênicas em humanos, os vetores de AAV são capazes de liberar sequências de ácido nucleico heterólogas (por exemplo, que codificam proteínas terapêuticas e RNA inibitório) a pacientes humanos sem causar patogênese ou doença substancial de AAV.
[0176] O termo "recombinante", como um modificador de um vetor, tal como um vetor de AAV recombinante (rAAV), bem como um modificador de sequências, tais como polinucleotídeos e polipeptídeos recombinantes, significa que as composições foram manipuladas (ou seja, projetadas) em uma maneira que geralmente não ocorre na natureza. Um exemplo particular de um vetor de AAV recombinante seria quando um ácido nucleico que não está normalmente presente no genoma de AAV do tipo selvagem (sequência heteróloga) é inserido dentro do genoma viral. Um exemplo seria quando um ácido nucleico (por exemplo, gene) que codifica uma proteína terapêutica ou sequência de polinucleotídeos é clonado em um vetor, com ou sem 5', 3' e/ou regiões de íntron que o gene está normalmente associado dentro do genoma de AAV. Embora o termo "recombinante" nem sempre seja usado neste documento em referência a um vetor de AAV, bem como sequências, tais como polinucleotídeos, formas recombinantes, incluindo vetores de AAV, polinucleotídeos, etc., são expressamente incluídas apesar de qualquer tal omissão.
[0177] Um "vetor de rAAV" é derivado do genoma do tipo selvagem de AAV usando métodos moleculares para remover todo ou parte do genoma de AAV do tipo selvagem e substituindo por um ácido nucleico não nativo (heterólogo), tal como um ácido nucleico que codifica uma proteína terapêutica ou sequência de polinucleotídeos. Normalmente, para um vetor de rAAV, uma ou ambas as sequências de repetição terminal invertida (ITR) do genoma de AAV são retidas. Um rAAV é distinto de um genoma de AAV, uma vez que todo ou parte do genoma de AAV foi substituído por uma sequência não nativa em relação ao ácido nucleico genômico de AAV, tal como com um ácido nucleico heterólogo que codifica uma proteína terapêutica ou sequência de polinucleotídeos. A incorporação de uma sequência não nativa (heteróloga), portanto, define o AAV como um vetor de AAV "recombinante", que pode ser referido como um "vetor de rAAV".
[0178] Uma sequência de vetor de AAV recombinante pode ser empacotada - referida neste documento como uma "partícula" para infecção subsequente (transdução) de uma célula, ex vivo, in vitro ou in vivo. Quando uma sequência de vetor recombinante é encapsidada ou empacotada em uma partícula de AAV, a partícula também pode ser referida como um "rAAV" ou "partícula de rAAV" ou "vírion de rAAV". Tais rAAV, partículas de rAAV e vírions de rAAV incluem proteínas que encapsidam ou empacotam o genoma de vetor. Exemplos particulares incluem, no caso de AAV, proteínas de capsídeo.
[0179] Um "genoma de vetor" ou convenientemente abreviado como "vg" refere-se à porção da sequência de plasmídeo recombinante que é finalmente empacotada ou encapsidada para formar uma partícula de rAAV. Nos casos em que plasmídeos recombinantes são usados para construir ou fabricar vetores de AAV recombinantes, o genoma de vetor de AAV não inclui a porção do "plasmídeo" que não corresponde à sequência de genoma de vetor do plasmídeo recombinante. Essa porção de genoma não vetorial do plasmídeo recombinante é referida como a "estrutura do plasmídeo", que é importante para a clonagem e amplificação do plasmídeo, um processo que é necessário para a propagação e produção do vetor de AAV recombinante, mas não é empacotado ou encapsidado em partículas de rAAV. Assim, um "genoma de vetor" refere-se ao ácido nucleico que é empacotado ou encapsidado por rAAV.
[0180] "Funções auxiliares de AAV" referem-se a sequências de codificação derivadas de AAV (proteínas) que podem ser expressas para fornecer produtos de genes de AAV e vetores de AAV que, por sua vez, funcionam em trans para replicação e empacotamento de AAV produtivos. Assim, as funções auxiliares de AAV incluem as principais fases de leitura aberta (ORFs) de AAV, rep e cap. Foi demonstrado que os produtos de expressão Rep possuem muitas funções, incluindo, entre outras: reconhecimento, ligação e corte da origem de AAV da replicação de DNA; atividade de DNA helicase; e modulação da transcrição de promotores AAV (ou outros heterólogos). Os produtos de expressão Cap (capsídeos) fornecem funções de empacotamento necessárias. As funções auxiliares de AAV são usadas para complementar as funções de AAV em trans que estão faltando nos genomas de vetores de AAV.
[0181] Um "construto auxiliar de AAV" refere-se geralmente a uma sequência de ácido nucleico que inclui sequências de nucleotídeos que fornecem funções de AAV deletadas de um vetor de AAV que deve ser usado para produzir um vetor de AVV de transdução para liberação de uma sequência de ácido nucleico de interesse, por meio de terapia genética a um indivíduo, por exemplo. Os construtos auxiliares de AAV são comumente usados para fornecer expressão transitória de genes rep e/ou cap de AAV para complementar as funções de AAV ausentes que são necessárias para a replicação e encapsidação do vetor de AAV. Os construtos auxiliares geralmente carecem de ITRs de AAV e não podem se replicar nem empacotar. Os construtos auxiliares de AAV podem estar na forma de um plasmídeo, fago, transposon, cosmídeo, vírus ou vírion. Vários construtos auxiliares de AAV foram descritos, tais como plasmídeos pAAV/Ad e pIM29 + 45 que codificam produtos de expressão Rep e Cap (vide, por exemplo, Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; e McCarty et al. (1991) J. Virol. 65: 2936-2945). Vários outros vetores foram descritos que codificam produtos de expressão Rep e/ou Cap (vide, por exemplo, patentes dos EUA de nºs 5.139.941 e 6.376.237).
[0182] O termo "funções acessórias" refere-se a funções virais e/ou celulares não derivadas de AAV das quais AAV é dependente para replicação. O termo inclui proteínas e RNAs que são necessários na replicação de AAV, incluindo frações envolvidas na ativação da transcrição do gene de AAV, splicing de mRNA de AAV específico de estágio, replicação de DNA de AAV, síntese de produtos de expressão Cap e empacotamento de capsídeo de AAV. As funções acessórias de base viral podem ser derivadas de qualquer um dos vírus auxiliares conhecidos, tais como adenovírus, herpesvírus (diferente do vírus do herpes simplex do tipo 1) e vírus vaccinia.
[0183] Um "vetor de função acessória" refere-se geralmente a uma molécula de ácido nucleico que inclui sequências de polinucleotídeos que fornecem funções acessórias. Tais sequências podem estar em um vetor de função acessória e transfectadas em uma célula hospedeira adequada. O vetor de função acessória é capaz de suportar a produção de vírion de rAAV na célula hospedeira.
Os vetores de função acessória podem estar na forma de um plasmídeo, fago, transposon ou cosmídeo.
Além disso, o complemento total de genes de adenovírus não é necessário para funções acessórias.
Por exemplo, adenovírus mutantes incapazes de replicação de DNA e síntese tardia de genes foram relatados como permissivos para a replicação de AAV (Ito et al., (1970) J.
Gen.
Virol. 9:243; Ishibashi et al., (1971) Virology 45:317). Da mesma forma, mutantes nas regiões E2B e E3 mostraram suportar a replicação de AAV, indicando que as regiões E2B e E3 provavelmente não estão envolvidas no fornecimento de funções acessórias (Carter et al., (1983) Virology 126:505). Os adenovírus defeituosos na região E1, ou tendo uma região E4 deletada, são incapazes de suportar a replicação de AAV.
Assim, as regiões E1A e E4 parecem necessárias para a replicação de AAV, direta ou indiretamente (Laughlin et al., (1982) J.
Virol. 41: 868; Janik et al., (1981) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 78:1925; Carter et al., (1983) Virology 126:505). Outros mutantes de adenovírus caracterizados incluem: E1B (Laughlin et al. (1982), supra; Janik et al., (1981), supra; Ostrove et al., (1980) Virology 104: 502); E2A (Handa et al., (1975) J.
Gen.
Virol. 29:239; Strauss et al., (1976) J.
Virol. 17:140; Myers et al., (1980) J.
Virol. 35:665; Jay et al., (1981) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 78:2927; Myers et al., (1981) J.
Biol.
Chem. 256: 567); E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, em I CRC Handbook of Parvoviruses (P.
Tijssen ed., 1990)); E3 (Carter et al., (1983), supra); e E4 (Carter et al., (1983), supra; Carter (1995)). Estudos das funções acessórias fornecidas por adenovírus tendo mutações na região de codificação E1B produziram resultados conflitantes, mas E1B55k pode ser necessário para a produção de vírion de AAV, enquanto E1B19k não é (Samulski et al., (1988) J.
Virol. 62: 206 -210). Além disso, a Publicação Internacional WO 97/17458 e Matshushita et al., (1998) Gene Therapy 5:938-945, descrevem vetores de função acessória que codificam vários genes de adenovírus.
Os vetores de função acessória exemplares compreendem uma região de codificação de adenovírus de RNA do VA, uma região de codificação de adenovírus E4 ORF6, uma região de codificação de adenovírus E2A 72 kD, uma região de codificação de adenovírus E1A e uma região de adenovírus E1B sem uma região de codificação de E1B55k intacta. Tais vetores de função acessória são descritos, por exemplo, na Publicação Internacional de nº WO 01/83797.
[0184] Conforme usado neste documento, o termo "sorotipo" é uma distinção usada para referir-se a um AAV tendo um capsídeo que é sorologicamente distinto de outros sorotipos AAV. A distinção sorológica é determinada com base na falta de reatividade cruzada entre anticorpos para um AAV em comparação com outro AAV. As diferenças de reatividade cruzada são geralmente devidas a diferenças nas sequências da proteína do capsídeo/determinantes antigênicos (por exemplo, devido às diferenças das sequência VP1, VP2 e/ou VP3 dos sorotipos AAV).
[0185] De acordo com a definição tradicional, um sorotipo significa que o vírus de interesse foi testado contra soro específico para todos os sorotipos existentes e caracterizados para atividade neutralizante e nenhum anticorpo foi encontrado para neutralizar o vírus de interesse. À medida que mais isolados de vírus de ocorrência natural são descobertos e/ou mutantes de capsídeo são gerados, pode ou não haver diferenças sorológicas com qualquer um dos sorotipos atualmente existentes. Assim, nos casos em que o novo vírus (por exemplo, AAV) não tem diferença sorológica, esse novo vírus (por exemplo, AAV) seria um subgrupo ou variante do sorotipo correspondente. Em muitos casos, o teste de sorologia para atividade neutralizante ainda precisa ser realizado em vírus mutantes com modificações na sequência de capsídeo para determinar se eles são de outro sorotipo de acordo com a definição tradicional de sorotipo. Consequentemente, por uma questão de conveniência e para evitar a repetição, o termo "sorotipo" refere-se amplamente a vírus sorologicamente distintos (por exemplo, AAV), bem como vírus (por exemplo, AAV) que não são sorologicamente distintos que podem estar dentro de um subgrupo ou uma variante de um determinado sorotipo.
[0186] Os vetores de rAAV incluem qualquer cepa ou sorotipo viral. Por exemplo, e sem limitação, um genoma ou partícula de vetor de rAAV (capsídeo, tal como VP1, VP2 e/ou VP3) pode ser baseado em qualquer sorotipo AAV, tal como AAV-1, -2, -3, -4, - 5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -rh74, - rh10 ou AAV-2i8, por exemplo. Tais vetores podem ser baseados no mesmo tipo de cepa ou sorotipo (ou subgrupo ou variante), ou ser diferentes uns dos outros. Por exemplo, e sem limitação, um plasmídeo de rAAV ou genoma de vetor ou partícula (capsídeo) com base em um genoma de sorotipo pode ser idêntico a uma ou mais das proteínas de capsídeo que empacotam o vetor. Além disso, um plasmídeo de rAAV ou genoma de vetor pode ser baseado em um genoma de sorotipo AAV distinto de uma ou mais das proteínas de capsídeo que empacotam o genoma de vetor, caso em que pelo menos uma das três proteínas de capsídeo pode ser um sorotipo AAV diferente por exemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, -rh74, -rh10, AAV-2i8, LK03 (SEQ ID NO: 91), SPK (SEQ ID NO: 92), ou variante dos mesmos, por exemplo. Mais especificamente, um genoma de vetor de rAAV2 pode compreender ITRs de AAV2, mas capsídeos de um sorotipo diferente, tal como AAV1, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, -rh74, -rh10, AAV-2i8, LK03 (SEQ ID NO: 91), SPK (SEQ ID NO: 92) ou variante dos mesmos, por exemplo. Consequentemente, os vetores de rAAV incluem sequências de gene/proteína idênticas às sequências de gene/proteína características de um sorotipo particular, bem como sorotipos mistos também referidos como pseudotipos.
[0187] Em certas modalidades, um vetor de rAAV inclui ou consiste em uma sequência de capsídeo pelo menos 70% ou mais (por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, etc.) idêntica a um ou mais de proteínas de capsídeo (sequências VP1, VP2 e/ou VP3) AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, -rh74, -rh10, AAV-2i8, LK03 (SEQ ID NO: 91), SPK
(SEQ ID NO: 92). Em certas modalidades, um vetor de rAAV inclui ou consiste em uma sequência pelo menos 70% ou mais (por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5 %, etc.) idêntica a uma ou mais ITR(s) de AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, -rh74 ou -rh10.
[0188] Em certas modalidades, os vetores de rAAV incluem variantes de AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74 e AAV-2i8 dos mesmos (por exemplo, variantes de ITR e capsídeo, tais como inserções, adições, substituições e deleções de aminoácidos), por exemplo, conforme estabelecido em WO 2013/158879 (Pedido Internacional PCT/US2013/037170), WO 2015/013313 (Pedido Internacional PCT/US2014/047670) e US 2013/0059732 (Pedido dos EUA de nº 13/594.773, que divulga LK01, LK02, LK03 (SEQ ID NO: 91), etc.).
[0189] rAAV, tal como AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, -rh74, -rh10, AAV-2i8, LK03 (SEQ ID NO: 91), SPK (SEQ ID NO: 92) e variantes, híbridos e sequências quiméricas podem ser construídas usando técnicas recombinantes que são conhecidas pelo técnico no assunto, para incluir uma ou mais sequências de polinucleotídeos heterólogas (transgenes) flanqueadas com uma ou mais sequências de ITR de AAV funcionais. Tais vetores de AAV normalmente retêm pelo menos uma sequência de ITR funcionais flanqueadoras, conforme necessário para o resgate, replicação e empacotamento do vetor recombinante em uma partícula de vetor de rAAV. Um genoma de vetor de rAAV incluiria, portanto, sequências necessárias em cis para replicação e empacotamento (por exemplo, sequências de ITR funcionais).
[0190] Conforme usado neste documento, a frase "vetor de AAV genuíno" ou "vetor de rAAV genuíno" refere-se a vetores de AAV compreendendo um ácido nucleico heterólogo que é capaz de infectar células alvo. A frase exclui vetores de AAV vazios (sem ácido nucleico heterólogo) e vetores de AAV sem inserções completas (por exemplo, fragmentos de ácido nucleico heterólogos) ou aqueles vetores de AAV contendo ácidos nucleicos de célula hospedeira.
[0191] Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" são usados de forma intercambiável neste documento para referirem-se a todas as formas de ácido nucleico, oligonucleotídeos, incluindo ácido desoxirribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA).
[0192] Os ácidos nucleicos incluem DNA genômico, cDNA e DNA antissenso, e mRNA emendado (spliced) ou não, tRNA rRNA e DNA ou RNA inibitório (RNAi, por exemplo, RNA(sh) em gancho de cabelo curto ou pequeno, microRNA (miRNA), RNA(si) interferente pequeno ou curto, RNA de trans- splicing ou RNA antissenso.
[0193] Os ácidos nucleicos incluem polinucleotídeos de ocorrência natural, sintéticos e intencionalmente modificados ou alterados. Os ácidos nucleicos podem ser simples, duplos ou triplos, lineares ou circulares e podem ter qualquer comprimento. Ao discutir os ácidos nucleicos, uma sequência ou estrutura de um polinucleotídeo particular pode ser descrita neste documento de acordo com a convenção de fornecer a sequência na direção 5' a 3'.
[0194] Uma sequência de ácido nucleico "heteróloga" refere-se a um polinucleotídeo inserido em um plasmídeo de AAV ou vetor para fins de transferência/liberação mediada por vetor do polinucleotídeo em uma célula. As sequências de ácido nucleico heterólogas são distintas do ácido nucleico de AAV, isto é, não são nativas em relação ao ácido nucleico de AAV. Uma vez transferida/liberada na célula, uma sequência de ácido nucleico heteróloga, contida no vetor, pode ser expressa (por exemplo, transcrita e traduzida, se apropriado). Alternativamente, um polinucleotídeo heterólogo transferido/liberado em uma célula, contido no vetor, não precisa ser expresso. Embora o termo "heterólogo" nem sempre seja usado neste documento em referência a sequências de ácido nucleico e polinucleotídeos, a referência a uma sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo, mesmo na ausência do modificador "heterólogo", pretende incluir sequências de ácido nucleico heterólogas e polinucleotídeos, apesar da omissão.
[0195] Um "transgene" é usado neste documento para referir-se convenientemente a um ácido nucleico que se destina ou foi introduzido em uma célula ou organismo. Os transgenes incluem qualquer ácido nucleico, tal como um ácido nucleico heterólogo que codifica uma proteína terapêutica ou sequência de polinucleotídeos. Os termos "transgene" e "sequências de ácido nucleico/polinucleotídeo heterólogas" são usados neste documento indistintamente.
[0196] Em uma célula tendo um transgene, o transgene foi introduzido/transferido por meio de um plasmídeo ou vetor de AAV, "transdução" ou "transfecção" da célula. Os termos "transduzir" e "transfectar" referem-se à introdução de uma molécula, tal como um ácido nucleico em uma célula hospedeira (por exemplo, HEK293) ou células ou órgão de um organismo. O transgene pode ou não ser integrado ao ácido nucleico genômico da célula receptora.
[0197] Os "ácidos nucleicos", "polinucleotídeos", "ácidos nucleicos heterólogos", "transgenes" e "sequências de ácido nucleico reduzidas de CpG" incluem sequências de comprimento total, bem como subsequências funcionais, desde que a subsequência retenha algum grau de funcionalidade da sequência de comprimento total. Ácidos nucleicos, polinucleotídeos, ácidos nucleicos heterólogos, transgenes e sequências de ácido nucleico reduzidas de CpG.
[0198] Os "polipeptídeos", "proteínas" e "peptídeos" codificados pela "sequência de ácido nucleico", tal como uma sequência de ácido nucleico heteróloga, incluem sequências de comprimento total, como com proteínas de ocorrência natural, bem como subsequências funcionais, formas modificadas ou variantes de sequência contanto que a subsequência, forma modificada ou variante retenham algum grau de funcionalidade da proteína de comprimento total. Tais polipeptídeos, proteínas e peptídeos codificados pelas sequências de ácido nucleico podem ser, mas não precisam ser, idênticos à proteína endógena que é defeituosa, ou cuja expressão é insuficiente ou deficiente no mamífero tratado.
[0199] Uma "célula hospedeira" denota, por exemplo, micro- organismos, células de levedura, células de inseto e células de mamíferos, que podem ser, ou foram, usadas como recipientes de um plasmídeo de vetor de AAV, construto auxiliar AAV, um vetor de função acessória ou outro DNA de transferência. O termo inclui a progênie da célula original que foi transfectada. Assim, uma "célula hospedeira" geralmente refere-se a uma célula que foi transfectada com uma sequência de DNA exógena. Entende-se que a progênie de uma única célula parental pode não ser necessariamente completamente idêntica em morfologia ou em complemento de DNA genômico ou total como o progenitor original, devido a mutação natural, acidental ou deliberada. Células hospedeiras exemplares incluem células de rim embrionário humano (HEK), tais como HEK293.
[0200] Uma “célula transduzida” é uma célula na qual um transgene foi introduzido. Consequentemente, uma célula "transduzida" significa uma mudança genética em uma célula após a incorporação de uma molécula exógena, por exemplo, um ácido nucleico (por exemplo, um transgene) na célula. Assim, uma célula "transduzida" é uma célula, ou uma progênie da mesma, na qual um ácido nucleico exógeno foi introduzido. A(s) célula(s) pode(m) ser propagada(s) (cultivada(s)) e a proteína introduzida expressa ou transcrita por ácido nucleico, ou vetor, tal como rAAV, produzido pela célula. Para usos e métodos de terapia genética, uma célula transduzida pode compreender um órgão ou tecido e, por sua vez, pode estar em um indivíduo.
[0201] Conforme usado neste documento, os termos "estável" em referência a uma célula ou "integrado(a) de forma estável" significam que as sequências de ácido nucleico, tais como um marcador selecionável ou sequência de ácido nucleico heteróloga, ou plasmídeo ou vetor foram inseridos em um cromossomo (por exemplo, por recombinação homóloga, junção de extremidade não homóloga, transfecção, etc.) ou são mantidos na célula receptora ou organismo hospedeiro de forma extracromossal, e permaneceram no cromossomo ou são mantidos de forma extracromossal por um período de tempo.
[0202] Uma "linhagem celular" refere-se a uma população de células capazes de crescimento e divisão contínuos ou prolongados in vitro sob condições de cultura apropriadas. As linhagens celulares podem, mas não precisam ser, populações clonais derivadas de uma única célula progenitora. Em linhagens celulares, alterações espontâneas ou induzidas podem ocorrer no cariótipo durante o armazenamento ou transferência de tais populações clonais, bem como durante a passagem prolongada em cultura de tecidos. Assim, as células descendentes derivadas da linhagem celular podem não ser precisamente idênticas às células ou culturas ancestrais. Uma linhagem celular exemplar aplicável aos métodos de purificação da presente invenção é HEK293.
[0203] Um "elemento de controle de expressão" refere-se a sequência(s) de ácido nucleico que influenciam a expressão de um ácido nucleico operacionalmente ligado. Elementos de controle, incluindo elementos de controle de expressão, conforme estabelecido neste documento, tais como promotores e intensificadores. Os vetores de rAAV podem incluir um ou mais "elementos de controle de expressão". Normalmente, tais elementos são incluídos para facilitar a transcrição de polinucleotídeo heterólogo adequado e, se apropriado, tradução (por exemplo, um ou mais de um promotor, intensificador, sinal de splicing para íntrons, manutenção da fase de leitura correta do gene para permitir a tradução em fase do mRNA e códons de parada, etc.). Tais elementos normalmente agem em cis, referido como um elemento de "ação cis", mas também podem agir em trans.
[0204] O controle de expressão pode ser efetuado no nível de transcrição, tradução, splicing, estabilidade de mensagem, etc. Normalmente, um elemento de controle de expressão que modula a transcrição é justaposto perto da extremidade 5' (ou seja, "a montante") de um ácido nucleico transcrito. Os elementos de controle de expressão também podem estar localizados na extremidade 3 '(ou seja, “a jusante”) da sequência transcrita ou dentro do transcrito (por exemplo, em um íntron). Elementos de controle de expressão (por exemplo, promotores TTR, ApoE/hAAT, FGG, da albumina e SAA1 reduzidos de CpG, bem como fusões/híbridos dos mesmos) podem estar localizados adjacentes ou a uma distância longe da sequência transcrita (por exemplo, 1-10, 10-25, 25-50, 50-100, 100 a 500 ou mais nucleotídeos do polinucleotídeo), mesmo a distâncias consideráveis da extremidade 5' ou 3'. No entanto, devido às limitações de comprimento dos vetores de rAAV, os elementos de controle de expressão estarão normalmente dentro de 1 a 1000 nucleotídeos do ácido nucleico transcrito.
[0205] Funcionalmente, a expressão do ácido nucleico operacionalmente ligado é pelo menos em parte controlável pelo elemento (por exemplo, promotor, intensificador, etc.) de tal modo que o elemento modula a transcrição do ácido nucleico e, conforme apropriado, a tradução do transcrito. Um exemplo específico de um elemento de controle de expressão é um promotor, que geralmente está localizado a 5' da sequência transcrita. Um promotor normalmente aumenta a expressão do ácido nucleico operacionalmente ligado em comparação a uma quantidade (se houver) expressa quando nenhum promotor existe.
[0206] Exemplos de promotores incluem promotores TTR e ApoE/hAAT, incluindo versões reduzidas de CpG e formas híbridas do promotor TTR divulgadas neste documento. Outros exemplos de promotores incluem promotores ApoE/hAAT, FGG, da albumina e SAA1 incluindo versões reduzidas de CpG e formas híbridas dos mesmos.
[0207] Um "intensificador", conforme usado neste documento,
pode referir-se a uma sequência que está localizada adjacente à sequência de ácido nucleico, tal como uma sequência de ácido nucleico heteróloga. Elementos estimuladores estão normalmente localizados a montante (5') de um elemento promotor, mas também funcionam e podem estar localizados a jusante (3') de ou dentro de uma sequência. Assim, um elemento intensificador pode estar localizado a montante ou a jusante, por exemplo, dentro de 100 pares de bases, 200 pares de bases ou 300 ou mais pares de bases como marcador selecionável e/ou um ácido nucleico heterólogo que codifica uma proteína terapêutica ou sequência de polinucleotídeos. Elementos estimuladores normalmente aumentam a expressão de um ácido nucleico operacionalmente ligado acima da expressão proporcionada por um elemento promotor.
[0208] O termo "operacionalmente ligado" significa que as sequências regulatórias necessárias para a expressão de uma sequência de ácido nucleico são colocadas nas posições apropriadas em relação à sequência de modo a efetuar a expressão da sequência de ácido nucleico. Essa mesma definição é algumas vezes aplicada ao arranjo de sequências de ácido nucleico e elementos de controle de transcrição (por exemplo, promotores, intensificadores e elementos de terminação) em um vetor de expressão, por exemplo, vetor de rAAV.
[0209] No exemplo de um elemento de controle de expressão em ligação operável com um ácido nucleico, a relação é tal que o elemento de controle modula a expressão do ácido nucleico. Mais especificamente, por exemplo, duas sequências de DNA operacionalmente ligadas significam que os dois DNAs estão dispostos (cis ou trans) em tal relação que pelo menos uma das sequências de DNA é capaz de exercer um efeito modulador sobre a outra sequência.
[0210] Consequentemente, elementos adicionais para vetores incluem, sem limitação, um elemento de controle de expressão (por exemplo, promotor/intensificador), um sinal de terminação de transcrição ou códon de terminação, regiões não traduzidas 5' ou 3' (por exemplo, sequências de poliadenilação (poliA)) que flanqueiam um sequência (por exemplo, sequência heteróloga), tal como uma ou mais cópias de uma sequência AAV ITR ou um íntron.
[0211] Outros elementos incluem, por exemplo, sequências de polinucleotídeos de recheio ou enchimento, por exemplo, para melhorar o empacotamento e reduzir a presença de ácido nucleico contaminante. Os vetores de AAV normalmente aceitam inserções de DNA tendo uma faixa de tamanho que é geralmente de cerca de 4 kb a cerca de 5,2 kb, ou ligeiramente mais. Assim, para sequências mais curtas, a inclusão de um recheio ou enchimento para ajustar o comprimento para próximo ou no tamanho normal da sequência genômica do vírus aceitável para empacotamento do vetor em uma partícula de rAAV. Em certas modalidades, uma sequência de ácido nucleico de enchimento/recheio é um segmento não traduzido (não codificado por proteína) de ácido nucleico. Para uma sequência de ácido nucleico inferior a 4,7 Kb, a sequência de polinucleotídeos de enchimento ou recheio tem um comprimento que, quando combinado (por exemplo, inserido em um vetor) com a sequência, tem um comprimento total entre cerca de 3,0-5,5 KB, ou entre cerca de 4,0-5,0 Kb, ou entre cerca de 4,3-4,8 Kb.
[0212] Quando um ácido nucleico ou transgene heterólogo do tipo selvagem é muito grande para ser empacotado dentro de uma partícula de vetor de AAV, o ácido nucleico heterólogo pode ser fornecido na forma modificada, fragmentada ou truncada para empacotamento e liberação por um vetor de AAV, de tal modo que uma proteína funcional ou produto de ácido nucleico, tal como uma proteína terapêutica ou produto de ácido nucleico, são finalmente fornecidos.
[0213] Em certas modalidades, o ácido nucleico heterólogo que codifica uma proteína (por exemplo, proteína terapêutica) é fornecido em formas modificadas ou truncadas ou o ácido nucleico heterólogo é fornecido em múltiplos construtos, liberados por vetores de AAV separados e múltiplos.
[0214] Em certas modalidades, o ácido nucleico heterólogo é fornecido como uma variante truncada que mantém a funcionalidade da proteína codificada (por exemplo, proteína terapêutica), incluindo a remoção de porções desnecessárias para a função, de tal modo que o polinucleotídeo heterólogo codificador seja reduzido em tamanho para empacotamento em um vetor de AAV.
[0215] Em certas modalidades, o ácido nucleico heterólogo é fornecido em vetores de AAV divididos, cada um fornecendo ácido nucleico que codifica diferentes porções de uma proteína (por exemplo, proteína terapêutica), liberando assim várias porções de uma proteína (por exemplo, proteína terapêutica) que se agrupam e funcionam na célula.
[0216] Em certas modalidades, o ácido nucleico heterólogo é fornecido por vetores de AAV duplos usando tecnologia de vetor duplo de sobreposição, trans-splicing ou trans-splicing híbrida. Em certas modalidades, dois vetores de AAV sobrepostos são usados, os quais se combinam na célula para gerar um cassete de expressão completo, a partir do qual uma proteína de comprimento total (por exemplo, proteína terapêutica) é expressa.
[0217] Os termos "identidade", "homologia" e variações gramaticais dos mesmos significam que duas ou mais entidades referenciadas são as mesmas, quando são sequências "alinhadas". Assim, a título de exemplo, quando duas sequências de polipeptídeos são idênticas, elas têm a mesma sequência de aminoácidos, pelo menos dentro da região ou porção referenciada. Quando duas sequências de polipeptídeos são idênticas, elas têm a mesma sequência de polinucleotídeos, pelo menos dentro da região ou porção referenciada. A identidade pode estar em uma área definida (região ou domínio) da sequência. Uma “área” ou “região” de identidade refere-se a uma parte de duas ou mais entidades referenciadas que são as mesmas. Assim, quando duas proteínas ou sequências de ácido nucleico são idênticas em uma ou mais áreas ou regiões de sequência, elas compartilham identidade dentro dessa região. Uma sequência "alinhada" refere-se a múltiplas sequências de polinucleotídeos ou proteínas (aminoácidos), muitas vezes contendo correções para bases ou aminoácidos (lacunas) ausentes ou adicionais em comparação a uma sequência de referência.
[0218] A identidade pode se estender por todo o comprimento ou por uma porção da sequência. Em certas modalidades, o comprimento da sequência que compartilha a porcentagem de identidade é 2, 3, 4, 5 ou mais ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos, por exemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc. ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos. Em certas modalidades, o comprimento da identidade de compartilhamento de sequência é de 21 ou mais ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos, por exemplo, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, etc., ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos. Em certas modalidades, o comprimento da identidade de compartilhamento de sequência é 41 ou mais ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos, por exemplo, 42, 43, 44, 45, 45, 47, 48, 49, 50, etc., ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos. Em certas modalidades, o comprimento da identidade de compartilhamento de sequência é de 50 ou mais ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos, por exemplo, 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75, 75-80, 80- 85, 85-90, 90-95, 95- 100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-500, 500-1.000, etc., ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos.
[0219] Conforme estabelecido neste documento, as variantes de ácido nucleico, tais como promotores reduzidos de CpG, incluindo formas híbridas dos mesmos, serão distintas do tipo selvagem, mas podem exibir identidade de sequência com promotores do tipo selvagem. Em promotores reduzidos de CpG incluindo formas híbridas dos mesmos, ao nível da sequência de nucleotídeos, um promotor reduzido de CpG será normalmente pelo menos cerca de 70% idêntico, mais normalmente pelo menos cerca de 75% idêntico, ainda mais normalmente cerca de 80%-90% idêntico ao promotor do tipo selvagem. Por exemplo, um promotor reduzido de CpG pode ter 70- 99% de identidade ao promotor do tipo selvagem. Consequentemente, um promotor reduzido de CpG pode ter 70 – 75%, 75 – 80%, 80 – 85%, 85 – 90%, 90 – 95%, 95 – 99%, 75% – 99% de identidade ao promotor do tipo selvagem.
[0220] No nível da sequência de aminoácidos, uma variante tal como uma variante FVIII ou proteína hFVIII-BDD será pelo menos cerca de 70% idêntica, mais normalmente cerca de 75% idêntica ou cerca de 80% idêntica, ainda mais normalmente cerca de 85% idêntica, ou cerca de 90% ou mais idêntica a uma sequência de referência. Em certas modalidades, uma variante, tal como uma variante FVIII ou proteína hFVIII-BDD tem pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade a uma sequência de referência, por exemplo, proteína FVIII do tipo selvagem com ou sem domínio B.
[0221] Os termos "homólogo(a)" ou "homologia" significam que duas ou mais entidades referenciadas compartilham pelo menos identidade parcial sobre uma determinada região ou porção. “Áreas, regiões ou domínios” de homologia ou identidade significam que uma porção de duas ou mais entidades referenciadas compartilham homologia ou são as mesmas. Assim, onde duas sequências são idênticas em uma ou mais regiões de sequência, elas compartilham identidade nessas regiões. "Homologia substancial" significa que uma molécula é estruturalmente ou funcionalmente conservada de tal modo que tenha ou prevê-se que tenha pelo menos uma estrutura ou função parcial de uma ou mais das estruturas ou funções (por exemplo, uma função ou atividade biológica) da molécula de referência, ou região ou porção relevante/correspondente da molécula de referência com a qual compartilha homologia.
[0222] A extensão da identidade (homologia) ou "porcentagem de identidade" entre duas sequências pode ser verificada usando um programa de computador e/ou algoritmo matemático. Para os fins desta invenção, as comparações das sequências de ácido nucleico são realizadas usando o GCG Wisconsin Package versão 9.1, disponível pelo Genetics Computer Group em Madison, Wisconsin. Por conveniência, os parâmetros padrão (penalidade de criação de lacuna = 12, penalidade de extensão de lacuna = 4) especificados por esse programa destinam-se a ser usados neste documento para comparar a identidade de sequência. Alternativamente, o programa Blastn 2.0, fornecido pelo National Center for Biotechnology Information (encontrado na Internet em ncbi.nlm.nih.gov/blast/; Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215: 403-410), usando um alinhamento com lacunas com parâmetros padrão, pode ser usado para determinar o nível de identidade e similaridade entre as sequências de ácido nucleico e sequências de aminoácidos. Para comparações de sequências de polipeptídeos, um algoritmo BLASTP é normalmente usado em combinação com uma matriz de pontuação, tal como PAM100, PAM 250, BLOSUM 62 ou BLOSUM 50. Os programas de comparação de sequências FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) e SSEARCH também são usados para quantificar a extensão da identidade (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132:185 (2000); and Smith et al., J. Mol. Biol. 147:195 (1981)). Programas para quantificar a similaridade estrutural da proteína usando mapeamento topológico baseado em Delaunay também foram desenvolvidos (Bostick et al., Biochem Biophys Res Commun. 304: 320 (2003)).
[0223] Uma "proteína terapêutica", em certas modalidades, é um peptídeo ou proteína que pode aliviar ou reduzir os sintomas que resultam de uma quantidade insuficiente, ausência ou defeito em uma proteína em uma célula ou indivíduo. Uma proteína "terapêutica" codificada por um transgene pode conferir um benefício a um indivíduo, por exemplo, para corrigir um defeito genético, para corrigir uma deficiência de gene (perda de expressão ou função), etc.
[0224] Por exemplo, e sem limitação, ácidos nucleicos heterólogos que codificam produtos de gene (por exemplo, proteínas terapêuticas) úteis de acordo com a presente invenção incluem aqueles que podem ser usados no tratamento de uma doença ou distúrbio incluindo, mas não se limitando a, "hemostasia" ou distúrbios de coagulação sanguínea
(sangramento), tais como hemofilia A, pacientes com hemofilia A com anticorpos inibidores, hemofilia B, hemofilia B com anticorpos inibidores, uma deficiência em qualquer fator de coagulação sanguínea: VII, VIII, IX, X, XI, V, XII, II, fator de von Willebrand, deficiência combinada do FV/FVIII, talassemia, deficiência da vitamina K epóxido redutase C1, deficiência de gama- carboxilase; anemia; sangramento associado a trauma, lesão, trombose, trombocitopenia, acidente vascular cerebral, coagulopatia, coagulação intravascular disseminada (DIC); superanticoagulação associada a heparina, heparina de baixo peso molecular, pentassacarídeo, varfarina, antitrombóticos de pequenas moléculas (ou seja, inibidores de FXa); e distúrbios plaquetários, tais como, síndrome de Bernard Soulier, trombastenia de Glanzmann e deficiência do estoque plaquetário. Em certas modalidades, um indivíduo tem um distúrbio de coagulação sanguínea. Em certas modalidades, um indivíduo tem hemofilia A, hemofilia A com anticorpos inibidores, hemofilia B, hemofilia B com anticorpos inibidores, uma deficiência em qualquer fator de coagulação: VII, VIII, IX, X, XI, V, XII, II, fator de von Willebrand, ou uma deficiência combinada do FV/FVIII, talassemia, deficiência da vitamina K epóxido redutase C1 ou deficiência de gama-carboxilase.
[0225] Em certas modalidades, um indivíduo tem uma doença ou distúrbio incluindo, por exemplo e sem limitação, uma doença pulmonar (por exemplo, fibrose cística), um distúrbio de sangramento (por exemplo, hemofilia A ou hemofilia B com ou sem inibidores), talassemia, um sangue distúrbio (por exemplo, anemia), um distúrbio neurodegenerativo (por exemplo, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica (ELA)), um distúrbio neurológico (por exemplo, epilepsia), uma doença de depósito lisossômico (por exemplo, aspartilglucosaminúria, doença de Batten, lipofuscinose ceróide neuronal infantil tardia tipo 2 (CLN2), cistinose, doença de Fabry, doença de Gaucher tipos I, II e III, doença do armazenamento de glicogênio II (doença de Pompe), doença do armazenamento de glicogênio III (GSDIII; doença de Cori); gangliosidose tipo I do gangliosídio monossialico 2 (GM2)(doença de Tay Sachs), gangliosidose tipo II do GM2 (doença de Sandhoff), mucolipidoses tipos I (sialidose tipo I e II), II (doença das células I), III (doença de pseudo-Hurler) e IV, doenças do armazenamento de mucopolissacarídeos (doença de Hurler e variantes, Hunter, Sanfilippo Tipos A, B, C, D, Morquio Tipos A e B, doenças de Maroteaux-Lamy e Sly), doença de Niemann-Pick tipos A/B, C1 e C2 e doença de Schindler tipos I e II), uma doença inflamatória (por exemplo, angioedema hereditário (HAE)), um distúrbio de acúmulo de cobre ou ferro (por exemplo, doença de Wilson ou Menkes), deficiência de lipase ácida lisossomal, câncer, diabetes tipo 1 ou 2, deficiência de adenosina desaminase, uma doença ou distúrbio metabólico (por exemplo, doenças do armazenamento de glicogênio, acidemia metilmalônica, deficiência de ornitina transcarbamilase, hipofosfatia, deficiência de acil-CoA desidrogenase de cadeia muito longa (VLCAD), galactosemia), uma doença autoimune (por exemplo, esclerose múltipla, diabetes tipo I, doença celíaca, neuromielite óptica (NMO), trombocitopenia imune ((ITP); púrpura trombocitopênica idiopática), púrpura trombocitopênica idiopática), doença de Addison, miastenia gravis), uma doença de órgãos sólidos (por exemplo, cérebro, fígado, rim, coração), ou um vírus infeccioso (por exemplo, hepatite B e C, vírus da imunodeficiência humana (HIV), etc.), doença bacteriana ou fúngica.
[0226] Em certas modalidades, um indivíduo tem uma doença que afeta ou se origina no sistema nervoso central (SNC). Em certas modalidades, a doença é uma doença neurodegenerativa. Em certas modalidades, a doença neurodegenerativa ou do SNC é doença de Alzheimer, doença de Huntington, ELA, hemiplegia espástica hereditária, esclerose lateral primária, atrofia muscular espinhal, doença de Kennedy, uma doença de repetição de poliglutamina ou doença de Parkinson. Em certas modalidades, a doença neurodegenerativa ou do SNC é uma doença de repetição de poliglutamina. Em certas modalidades, a doença de repetição de poliglutamina é uma ataxia espinocerebelar (SCA1, SCA2, SCA3, SCA6, SCA7 ou SCA17).
[0227] A apolipoproteína E (ApoE) é um importante transportador de colesterol envolvido no transporte de lipídios e no reparo de lesões cerebrais. É sugerido que as isoformas ApoE humanas afetam diferencialmente a eliminação ou síntese de β-amiloide (Αβ) in vivo. O alelo epsilon4 (ε4) da ApoE está associado ao aumento do risco de doença de Alzheimer (DA), e a presença do alelo ApoE ε2 parece diminuir o risco de DA e é uma isoforma protetora da ApoE. Conforme usado neste documento, o termo "isoforma ApoE protetora" refere-se a isoformas ApoE que diminuem um ou mais sintomas ou indicações da doença de Alzheimer (por exemplo, físico, fisiológico, bioquímico, histológico, comportamental). Uma isoforma ApoE protetora também refere-se a isoformas ApoE que podem reduzir o risco de doença de Alzheimer em pelo menos 5%, tal como 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais.
[0228] Em certas modalidades, a invenção fornece um método de liberação de uma isoforma ApoE protetora (por exemplo, ApoE ε2) ao SNC de um indivíduo (por exemplo, mamífero), por meio de liberação ou administração a uma célula, órgão ou tecido que não são do SNC (por exemplo, não para o líquido cefalorraquidiano (LCR) ou cérebro) do indivíduo.
[0229] Em certas modalidades, uma partícula de rAAV compreendendo uma proteína de capsídeo de AAV e um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma isoforma ApoE protetora (por exemplo, ApoE ε2) são inseridos entre um par de repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV de uma maneira eficaz para transduzir células que não são do SNC (por exemplo, células do fígado) em um indivíduo (por exemplo, mamífero), de tal modo que as células que não são do SNC (por exemplo, células do fígado) secretem a isoforma ApoE protetora para a circulação sistêmica (vasculatura ou vasos sanguíneos) do indivíduo. A isoforma ApoE protetora na circulação atravessa a barreira hematoencefálica e entra no SNC (por exemplo, líquido cefalorraquidiano (LCR) ou cérebro, tal como o parênquima cerebral).
[0230] Em certas modalidades, a presente invenção fornece um vetor, cassete de expressão ou ácido nucleico que codificam uma isoforma ApoE protetora (por exemplo, ApoE ε2) que é expressa no fígado ou em células hepáticas.
[0231] Em certas modalidades, o ácido nucleico heterólogo codifica uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em insulina, glucagon, hormônio do crescimento (GH), hormônio da paratireóide (PTH), fator de liberação do hormônio do crescimento (GRF), hormônio folículo estimulante (FSH), hormônio luteinizante (LH), gonadotrofina coriônica humana (hCG), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), angiopoietinas, angiostatina, fator estimulador de colônias de granulócitos (GCSF), eritropoietina (EPO), fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF), fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF), fator de crescimento de fibroblasto ácido (aFGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento transformante α (TGFα), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fatores de crescimento de insulina I e II (IGF-I e IGF-II), TGF-β, ativinas, inibinas, proteína morfogênica óssea (BMP), fator de crescimento nervoso (NGF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), neurotrofinas NT-3 e NT4/5, fator neurotrófico ciliar (CNTF), fator neurotrófico derivado da linhagem celular glial (GDNF), neurturina, agrina, netrina-1 e netrina-2, fator de crescimento de hepatócitos (HGF), efrinas, noguina, sonic hedgehog e tirosina hidroxilase.
[0232] Em certas modalidades, o ácido nucleico heterólogo codifica uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em trombopoietina (TPO), interleucinas (IL1 a IL-36), proteína quimioatraente de monócitos, fator inibidor de leucemia, fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos, ligante Fas, fatores de necrose tumoral α e β, interferons α, β e γ, fator de células-tronco, ligante flk-2/flt3, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, imunoglobulinas quiméricas, anticorpos humanizados, anticorpos de cadeia única, receptores de células T, receptores de células T quiméricos, receptores de células T de cadeia simples, moléculas de MHC de classe I e classe II.
[0233] Em certas modalidades, o ácido nucleico heterólogo codifica CFTR (proteína reguladora da transmembrana da fibrose cística), um fator de coagulação sanguínea (coagulação) (Fator XIII, Fator IX, Fator VIII, Fator X, Fator VII, Fator VIIa, proteína C, etc.), um fator de coagulação sanguínea de ganho de função, um anticorpo, proteína específica do epitélio pigmentar da retina de 65 kDa (RPE65), eritropoietina, receptor de LDL, lipoproteína lipase, ornitina transcarbamilase, β-globina, α-globina, espectrina, α-antitripsina, adenosina desaminase (ADA), um transportador de metal (ATP7A ou ATP7), sulfamidase, uma enzima envolvida na doença do armazenamento lisossomal (ARSA), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase, β-25 glucocerebrosidase, esfingomielinase, hexosaminidase lisossomal, cetoácido desidrogenase de cadeia ramificada, um hormônio, um fator de crescimento semelhante à insulina 1 ou 2, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento do nervo, fator neurotrófico -3 e -4, fator neurotrófico derivado do cérebro, fator de crescimento derivado da glia, fator de crescimento transformador α e β, uma citocina, α-interferon, β-interferon, interferon-γ, interleucina-2, interleucina-4, interleucina 12, fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos, linfotoxina, um produto de gene suicida, timidina quinase do vírus herpes simplex, citosina desaminase, toxina da difteria, citocromo P450, desoxicitidina quinase, fator de necrose tumoral, uma proteína de resistência a fármacos, uma proteína supressora de tumor (por exemplo, p53, Rb, Wt-1, NF1, Von Hippel – Lindau (VHL), polipose adenomatosa coli (APC)), um peptídeo com propriedades imunomoduladoras, um peptídeo tolerogênico ou imunogênico ou proteína Tregitope ou hCDR1, insulina, glucoquinase, guanilato ciclase 2D (LCA-GUCY2D), proteína 1 da escolta de Rab (coroideremia), LCA 5 (LCA-lebercilina), ornitina cetoácido aminotransferase (atrofia giratória), retinosquisina 1 (retinosquisina ligada ao X), USH1C (Síndrome de Usher 1C), GTPase da retinite pigmentosa ligada ao
X (XLRP), RPTK (formas RP de: retinite pigmentosa), DFNB1 (surdez da conexina 26), ACHM 2, 3 e 4 (acromatopsia), PKD-1 ou PKD-2 (doença renal policística), TPP1, CLN2, uma sulfatase, N-acetilglucosamina-1-fosfato transferase, catepsina A, GM2 -AP, Niemann-Pick C1 (NPC1), VPC2, uma proteína ativadora de esfingolipídio, uma ou mais nuclease de dedo de zinco para edição de genoma e uma ou mais sequências de doador usadas como modelos de reparo para edição de genoma.
[0234] Em certas modalidades, a proteína codificada pelo ácido nucleico heterólogo compreende uma nuclease de edição de gene. Em certas modalidades, a nuclease de edição de genes compreende uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) ou uma nuclease efetora semelhante ao ativador de transcrição (TALEN). Em certas modalidades, a nuclease de edição de gene compreende um CRISPR-Cas9 Tipo II funcional.
[0235] Outros ácidos nucleicos heterólogos que codificam produtos de gene (por exemplo, proteínas terapêuticas), que podem ser usados com a presente invenção e que podem ser opcionalmente expressos em células do fígado (por exemplo, por exemplo, hepatócitos) e fornecer um benefício, incluem, por exemplo e sem limitação: GAA (alfa-glucosidase ácida) para o tratamento da doença de Pompe; ATP7B (ATPase2 do transporte de cobre) para o tratamento da doença de Wilson; alfa-galactosidase (GLA) para o tratamento da doença de Fabry; ASS1 (arginosuccinato sintase) para o tratamento de citrulinemia tipo 1; beta-glucocerebrosidase para o tratamento da doença de Gaucher tipo 1; beta-hexosaminidase A para o tratamento da doença de Tay Sachs; SERPING1 (inibidor da protease C1; inibidor da esterase C1 (C1EI)) para o tratamento de angioedema hereditário (HAE); glicose-6-fosfatase para o tratamento de doença do armazenamento de glicogênio tipo I (GSDI); enzima de desramificação de glicogênio (GDE) para o tratamento de doença do armazenamento de glicogênio tipo III (GSD III; doença de cori); proteína Niemann-Pick C1 (transportador intracelular de colesterol NPC 1; NPC1) para o tratamento da doença de Niemann-Pick;
eritropoietina (EPO) para tratamento de anemia; interferon-alfa, interferon-beta e interferon-gama para o tratamento de vários distúrbios imunológicos, infecções virais e câncer; uma interleucina (IL), incluindo qualquer uma de IL-1 a IL-36, e receptores correspondentes, para o tratamento de várias doenças inflamatórias ou imunodeficiências; uma quimiocina, incluindo o ligante 5 de quimiocina (motivo C-X-C) (CXCL5) para o tratamento de distúrbios imunológicos; fator estimulador de colônia de granulócitos (G-CSF) para o tratamento de distúrbios imunológicos, tais como doença de Crohn; fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) para o tratamento de várias doenças inflamatórias humanas; fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) para o tratamento de várias doenças inflamatórias humanas; fator de crescimento de queratinócitos (KGF) para o tratamento de danos ao tecido epitelial; quimiocinas, tais como a proteína-1 quimioatraente de monócitos (MCP-1) para o tratamento de aborto espontâneo recorrente, complicações relacionadas ao HIV e resistência à insulina; fator de necrose tumoral (TNF) e receptores para o tratamento de vários distúrbios imunológicos; alfa1-antitripsina para tratamento de enfisema ou doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC); alfa-L-iduronidase para o tratamento da mucopolissacaridose I (MPS I); ornitina transcarbamoilase (OTC) para o tratamento da deficiência de OTC; fenilalanina hidroxilase (PAH) ou fenilalanina amônia-liase (PAL) para o tratamento de fenilcetonúria (PKU); lipase de lipoproteína para tratamento da deficiência de lipase de lipoproteína; apolipoproteínas para o tratamento da deficiência de apolipoproteína (Apo) A-I; receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL-R) para tratamento de hipercolesterolemia familiar (FH); albumina para tratamento de hipoalbuminemia; lecitina colesterol aciltransferase (LCAT); carbamoil sintetase I; argininosuccinato sintetase; argininosuccinato liase; arginase; fumarilacetoacetato hidrolase; porfobilinogênio desaminase; cistationina beta- sintase, para tratamento da homocistinúria; cetoácido descarboxilase de cadeia ramificada; isovaleril-CoA desidrogenase; propionil CoA carboxilase;
metilmalonil-CoA mutase; glutaril-CoA desidrogenase; insulina; piruvato carboxilase; fosforilase hepática; fosforilase quinase; glicina descarboxilase; proteína H; proteína T; regulador transmembranar de fibrose cística (CFTR); cassete de ligação a ATP, subfamília A (ABC1), membro 4 (ABCA4) para o tratamento da doença de Stargardt; e distrofina.
[0236] Em certas modalidades, um indivíduo tem uma doença ou distúrbio autoimune (por exemplo, esclerose múltipla, neuropatia periférica anti- MAG, diabetes tipo 1, doença de Graves, artrite reumatóide, artrite induzida por proteoglicano (PGIA) ou miastenia gravis); uma alergia ou doença alérgica.
[0237] A glicoproteína de oligodendrócito de mielina (MOG) madura está associada à camada bilipídica. MOG é caracterizada por um domínio extracelular semelhante a IgV, uma proteína transmembranar de bypass único, um domínio associado à membrana e uma cauda citoplasmática. O domínio extracelular semelhante a IgV é denotado neste documento como mini-MOG (mMOG). MOG é encontrada predominantemente nas membranas dos oligodendrócitos e contribui com uma pequena quantidade para a composição final da mielina. As respostas autoimunes à MOG estão implicadas no desenvolvimento e na etiologia da esclerose múltipla.
[0238] Em certas modalidades, a proteína terapêutica é uma proteína de fusão que compreende um antígeno indesejado e uma sequência líder para a secreção celular.
[0239] Em certas modalidades, a proteína terapêutica é uma proteína de fusão que compreende o domínio extracelular de MOG, ou um fragmento do mesmo, e uma sequência líder para a secreção celular.
[0240] Em certas modalidades, um cassete de expressão compreende um elemento regulador operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão compreendendo um antígeno indesejado e uma sequência líder para secreção celular.
[0241] Em certas modalidades, o antígeno indesejado compreende um antígeno próprio, autoantígeno ou proteína ou peptídeo que têm similaridade estrutural ou identidade de sequência ao antígeno próprio ou autoantígeno. Em certas modalidades, a proteína ou peptídeo que têm semelhança estrutural ou identidade de sequência ao antígeno próprio ou o autoantígeno são uma proteína ou peptídeo microbianos. Em certas modalidades, o antígeno indesejado compreende um alérgeno.
[0242] Em certas modalidades, o alérgeno compreende um alérgeno de planta, inseto ou animal. Em certas modalidades, o antígeno indesejado compreende uma glicoproteína de oligodendrócito de mielina (MOG), proteína básica de mielina (MBP), proteína proteolipídica (PLP) ou subsequência das mesmas.
[0243] Em certas modalidades, a MOG carece de todo ou parte de seu domínio transmembranar. Em certas modalidades, a MOG compreende ou consiste nos aminoácidos 1 - 117 de MOG madura. Em certas modalidades, a subsequência de MOG é uma subsequência de seu domínio extracelular ou uma subsequência de seu domínio transmembranar. Em certas modalidades, a MOG compreende ou consiste nos aminoácidos 35 - 55, 118 - 132, 181 - 195 ou 186 - 200 de MOG madura. Em certas modalidades, a MOG compreende ou consiste nos aminoácidos 1 - 20, 11 - 30, 21 - 40, 31 - 50, etc. de MOG madura.
[0244] Em certas modalidades, a presente invenção fornece métodos para suprimir, reduzir ou inibir uma resposta imune mediada por células ou mediada por anticorpos a um antígeno indesejado em um mamífero. Em certa modalidade, um método inclui fornecer um cassete de expressão, partícula ou composição farmacêutica ou composição de LNP conforme estabelecido neste documento; e administrar uma quantidade do cassete de expressão, partícula, composição farmacêutica ou composição de LNP ao mamífero, em que a proteína de fusão é expressa no mamífero suficientemente para suprimir, reduzir ou inibir uma resposta imune mediada por células ou mediada por anticorpos ao antígeno indesejado.
[0245] Em certas modalidades, a presente invenção fornece métodos para induzir tolerância em um mamífero a um antígeno indesejado. Em certas modalidades, um método inclui fornecer um cassete de expressão, partícula ou composição farmacêutica ou composição de LNP conforme estabelecido neste documento; e administrar uma quantidade de cassete de expressão, partícula, composição farmacêutica ou de LNP ao mamífero, em que a proteína de fusão é expressa no mamífero suficientemente para induzir tolerância ao antígeno indesejado.
[0246] Em certas modalidades, a presente invenção fornece métodos para tratar um indivíduo (por exemplo, humano) em necessidade de uma proteína de fusão. Em certas modalidades, um método inclui fornecer um cassete de expressão, partícula ou composição farmacêutica ou composição de LNP conforme estabelecido neste documento; e administrar uma quantidade da cassete de expressão, partícula, composição farmacêutica ou de LNP ao indivíduo (por exemplo, humano), em que a proteína de fusão é expressa no indivíduo (por exemplo, humano).
[0247] Em certas modalidades, o indivíduo (por exemplo, humano) tem uma doença ou distúrbio autoimune. Em certas modalidades, o indivíduo (por exemplo, humano) tem uma alergia ou doença ou distúrbio alérgico.
[0248] Em certas modalidades, o indivíduo (por exemplo, humano) tem esclerose múltipla, neuropatia periférica anti-MAG, diabetes tipo 1, doença de Graves, artrite reumatóide, artrite induzida por proteoglicano (PGIA) ou miastenia gravis.
[0249] Conforme usado neste documento, um "antígeno indesejado" é um antígeno próprio ou autoantígeno que é capaz de induzir, fornecer, intensificar e/ou estimular a tolerância imunológica contra o próprio antígeno ou uma proteína que inclui todo ou uma porção do antígeno e/ou que suprime, inibe, reduz e/ou diminui uma resposta imune dirigida ao próprio antígeno ou a uma proteína que inclui todo ou uma porção do antígeno. Um antígeno indesejado, conforme usado neste documento, também inclui alérgenos ou antígenos alergênicos que podem induzir, fornecer, intensificar e/ou estimular a tolerância imunológica contra o alérgeno, bem como alérgenos e antígenos alergênicos que suprimem, inibem, reduzem e/ou diminuem uma resposta imune dirigida ao alérgeno ou uma entidade que inclui o alérgeno.
[0250] Os antígenos indesejados, conforme estabelecido neste documento, também incluem antígenos alogênicos ou antígenos de transplante ou antígenos de histocompatibilidade menores que podem levar à rejeição de uma célula, tecido ou órgão após seu transplante em um indivíduo. O indivíduo normalmente reconhece a célula, tecido ou órgão transplantado como estranho e desenvolve uma resposta imune contra a célula, tecido ou órgão. Consequentemente, os métodos da invenção são direcionados para prevenir ou reduzir a rejeição de uma célula, tecido ou órgão após o transplante em um indivíduo.
[0251] Embora não desejando ser limitado por qualquer teoria ou mecanismo particular, acredita-se que as funções do antígeno indesejado, ligando-se a ou ativando células T reguladoras (Tregs), evitam, suprimem, inibem, reduzem, diminuem ou de outra forma regulam negativamente uma resposta imune. Essa ligação a ou ativação de Tregs, por sua vez, pode levar à tolarização imunológica contra o antígeno próprio ou autoantígeno.
[0252] Conforme usado neste documento, uma sequência "líder" é uma sequência de aminoácidos que, quando ligada a uma proteína, fornece ou facilita a secreção da proteína ligada da célula em que ela é expressa. Uma sequência líder, conforme usada neste documento, também pode ser referida como uma sequência de secreção. Tais sequências líder e de secreção destinam-se a fornecer ou facilitar a secreção celular, mas nem sempre podem facilitar a secreção se estiverem ligadas a uma proteína que tem uma sequência sinal que pode impedir a secreção da proteína.
[0253] Em certas modalidades, um antígeno indesejado compreende uma proteína de doença autoimune ou uma subsequência da mesma. Uma proteína de doença autoimune inclui qualquer antígeno (tal como uma proteína, subsequência da mesma ou um peptídeo) que contribui para o início e/ou progressão de uma doença autoimune. Tais proteínas de doenças autoimunes podem ser derivadas de outros organismos, tais como micro- organismos, porque a sequência ou estrutura das proteínas de outros organismos mimetizam o antígeno próprio ou autoantígeno.
[0254] Em certas modalidades, uma proteína de doença autoimune é glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG, por exemplo, para esclerose múltipla), proteína básica de mielina (MBP, por exemplo, para esclerose múltipla), proteína proteolipídica (PLP, por exemplo, para esclerose múltipla), glicoproteína associada à mielina (MAG, por exemplo, para neuropatia periférica anti-MAG), insulina (por exemplo, para diabetes tipo 1), proteína relacionada à subunidade catalítica de glicose-6-fosfatase específica de ilhotas (IGRP, por exemplo, para tipo 1 diabetes), pré-pró-insulina (por exemplo, para diabetes tipo 1), descarboxilase glutâmica (GAD, por exemplo, para diabetes tipo 1), tirosina fosfatase como autoantígeno (por exemplo, para diabetes tipo 1), antígeno 2 do insulinoma (por exemplo, para diabetes tipo 1), antígeno de células da ilhota (por exemplo, para diabetes tipo 1); receptor do hormônio estimulador da tireoide (TSH) (por exemplo, para doença de Graves), receptor de tireotropina (por exemplo, para doença de Graves), sulfato de condroitina proteoglicano 1 (por exemplo, para artrite reumatóide), epítopo de células T CD4+ (por exemplo, GRVRVNSAY), por exemplo, para artrite induzida por proteoglicano (PGIA) ou artrite reumatóide), ou receptor de acetilcolina (por exemplo, para miastenia gravis).
[0255] Em certas modalidades, uma proteína de doença autoimune é uma glicoproteína de oligodendrócito de mielina (MOG) de mamífero, proteína de base de mielina (MBP), proteína proteolipídica (PLP) ou uma subsequência das mesmas. Em algumas modalidades, uma proteína de doença autoimune é uma proteína humana, tal como a proteína de base de mielina humana (MBP), uma proteína proteolipídica (PLP) humana, uma glicoproteína de oligodendrócito de mielina (MOG) humana ou uma subsequência das mesmas.
[0256] Outros ácidos nucleicos heterólogos que codificam produtos de gene úteis de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo e sem limitação, repórteres ou marcadores detectáveis, tais como luciferase, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente azul, proteína fluorescente ciano, GFP aprimorada, YFP aprimorada, GFP fotoativável, proteína fluorescente de espécies de Discosoma (dsRed), mFruits, mCherry, TagRFPs, eqFP611, proteínas fluorescentes fotoativáveis (por exemplo Dronpa e EosFP), proteína de cloranfenicol acetiltransferase, proteína de fusão Halo-tag, fosfatase alcalina, peroxidase de rábano e beta-galactosidase.
[0257] Em certas modalidades, os ácidos nucleicos heterólogos compreendem DNA inibitório ou codificam RNA inibitório (RNAi). Exemplos de RNA inibitório incluem, por exemplo e sem limitação, RNA(sh) pequeno ou curto do gancho de cabelo, microRNA (miRNA), RNA(si) pequeno ou curto de interferência, RNA de trans-splicing e RNA antissenso.
[0258] Em certas modalidades, o ácido nucleico heterólogo codifica um ácido nucleico inibitório. Em certas modalidades, o ácido nucleico inibitório é selecionado a partir do grupo que consiste em um siRNA, uma molécula antissenso, miRNA, RNAi, uma ribozima e um shRNA. Em certas modalidades, o ácido nucleico inibitório se liga a um gene, um transcrito de um gene ou um transcrito de um gene associado a uma doença de repetição de polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em um gene huntingtina (HTT), um gene associado à atrofia dentatorubropallidoluysiana (atrofina 1, ATN1), receptor de andrógeno no cromossomo X na atrofia muscular espinobulbar, Ataxina-1, -2, -3 e -7 humana, canal de cálcio dependente de voltagem Cav2.1 tipo P/Q (CACNA1A), proteína de ligação ao TATA, fita oposta de Ataxina 8 (ATXN8OS), isoforma beta da subunidade B regulatória de 55 kDa da proteínas serina/treonina fosfatases 2A na ataxia espinocerebelar (tipo 1, 2, 3, 6, 7, 8, 12 17), FMR1 (retardo mental do X frágil 1)
na síndrome do X frágil, FMR1 (retardo mental do X frágil 1) na síndrome de tremor/ataxia associada ao X frágil, FMR1 (retardo mental do X frágil 2) ou membro 2 da família AF4/FMR2 no retardo mental do XE frágil; miotonina- proteína quinase (MT-PK) na distrofia miotônica; Frataxina na ataxia de Friedreich; um mutante do gene da superóxido dismutase 1 (SOD1) na esclerose lateral amiotrófica; um gene envolvido na patogênese da doença de Parkinson e/ou doença de Alzheimer; apolipoproteína B (APOB) e pró-proteína convertase subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), hipercolesterolemia; HIV Tat, transativador do gene de transcrição do vírus da imunodeficiência humana, na infecção por HIV; HIV TAR, HIV TAR, gene do elemento de resposta do transativador do vírus da imunodeficiência humana, na infecção por HIV; receptor de quimiocina C-C (CCR5) na infecção por HIV; proteína do nucleocapsídeo do vírus do sarcoma de Rous (RSV) na infecção por RSV, microRNA específico do fígado (miR-122) na infecção pelo vírus da hepatite C; p53, lesão renal aguda ou transplante de rim com função de enxerto retardada ou lesão renal, insuficiência renal aguda; proteína quinase N3 (PKN3) em malignidades sólidas recorrentes ou metastáticas antecipadas; LMP2, LMP2 também conhecido como subunidade beta do proteassoma tipo 9 (PSMB 9), melanoma metastático; LMP7, também conhecido como subunidade beta do proteassoma tipo 8 (PSMB 8), melanoma metastático; MECL1 também conhecido como subunidade do proteassoma beta tipo 10 (PSMB 10), melanoma metastático; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) em tumores sólidos; proteína cinesina do fuso em tumores sólidos, CLL/linfoma de células B supressor de apoptose (BCL-2) em leucemia mieloide crônica; ribonucleotídeo redutase M2 (RRM2) em tumores sólidos; CLL/linfoma de células B supressor de apoptose (BCL-2) em leucemia mieloide crônica; ribonucleotídeo redutase M2 (RRM2) em tumores sólidos; Furin em tumores sólidos; quinase 1 do tipo polo (PLK1) em tumores hepáticos, diacilglicerol aciltransferase 1 (DGAT1) em infecção por hepatite C, beta-catenina em polipose adenomatosa familiar; receptor beta2 adrenérgico, glaucoma;
RTP801/Redd1 também conhecido como proteína transcrita 4 induzível por danos no DNA, no edema macular diabético (DME) ou degeneração macular relacionada à idade; receptor I do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR1) na degeneração macular relacionada à idade ou neovascularização coroidal, caspase 2 na neuropatia óptica isquêmica não arterítica; proteína mutante N17K da queratina 6A na paquioníquia congênita; sequências de genoma/gene do vírus influenza A na infecção por influenza; sequências de genoma/gene do coronavírus na síndrome respiratória aguda grave (SARS) na infecção por SARS; sequências de genoma/gene do vírus sincicial respiratório na infecção pelo vírus sincicial respiratório; sequências de genoma/gene do filovírus Ebola na infecção por Ebola; sequências de genoma/gene dos vírus da hepatite B e C na infecção por hepatite B e C; sequências de genoma/gene do vírus herpes simplex (HSV) na infecção por HSV, sequências de genoma/gene do coxsackievirus B3 na infecção pelo coxsackievirus B3; silenciamento de um alelo patogênico de um gene (silenciamento específico do alelo) tipo a torsina A (TOR1A) na distonia primária, pan-classe I e alelo HLA específico em transplante; e gene da rodopsina mutante (RHO) na retinite pigmentar hereditária autossômica dominante (adRP).
[0259] As moléculas de ácido nucleico, vetores, tais como clonagem, vetores de expressão (por exemplo, genomas de vetor) e plasmídeos podem ser preparados usando métodos de tecnologia de DNA recombinante. A disponibilidade de informações de sequência de nucleotídeos permite a preparação de moléculas de ácido nucleico por uma variedade de meios. Por exemplo, um ácido nucleico heterólogo compreendendo um vetor ou plasmídeo pode ser feito usando várias técnicas de clonagem padrão, tecnologia de DNA recombinante, por meio de expressão celular ou tradução in vitro e técnicas de síntese química. A pureza dos polinucleotídeos pode ser determinada por meio de sequenciamento, eletroforese em gel e similares. Por exemplo, os ácidos nucleicos podem ser isolados usando hibridização ou técnicas de triagem de banco de dados baseadas em computador. Tais técnicas incluem, mas não estão limitadas a: (1) hibridização de DNA genômico ou bibliotecas de cDNA com sondas para detectar sequências de nucleotídeos homólogas; (2) triagem de anticorpos para detectar polipeptídeos com características estruturais partilhadas, por exemplo, usando uma biblioteca de expressão; (3) reação em cadeia da polimerase (PCR) em DNA genômico ou cDNA usando iniciadores capazes de emparelhar a uma sequência de ácido nucleico de interesse; (4) pesquisas de computador em bancos de dados de sequência para sequências relacionadas; e (5) triagem diferencial de uma biblioteca de ácido nucleico subtraída.
[0260] Os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser mantidos como DNA em qualquer vetor de clonagem conveniente. Em certas modalidades, os clones são mantidos em um vetor de clonagem/expressão de plasmídeo, tal como pBluescript ou pBluescript II (Stratagene, La Jolla, CA), que é propagado em uma célula hospedeira de E. coli adequada. Alternativamente, os ácidos nucleicos podem ser mantidos em um vetor adequado para expressão em células de mamífero.
[0261] Os métodos que são conhecidos na técnica para gerar vírions de rAAV incluem, por exemplo, transfecção usando o vetor de AAV e sequências auxiliares de AAV em conjunto com coinfecção com um ou mais vírus auxiliares de AAV (por exemplo, adenovírus, herpesvírus ou vírus vaccinia) ou transfecção com um vetor de AAV recombinante, um vetor auxiliar de AAV e um vetor de função acessória. Métodos para gerar vírions de rAAV são descritos, por exemplo e sem limitação, nas Patentes dos EUA de nºs
6.001.650 e 6.004.797. Após a produção de vetor de rAAV recombinante (ou seja, geração de vetor em sistemas de cultura de células), os vírions de rAAV podem ser obtidos a partir de células hospedeiras e sobrenadante de cultura de células e purificados conforme estabelecido neste documento.
[0262] Os métodos para determinar o título infeccioso do vetor de rAAV contendo um transgene são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Zhen et al., (2004) Hum. Gene Ther. (2004) 15:709). Métodos para testar capsídeos vazios e partículas de vetor de AAV com genomas empacotados são conhecidos (vide, por exemplo, Grimm et al., Gene Therapy (1999) 6:1322- 1330; Sommer et al., Molec. Ther. (2003) 7: 122-128).
[0263] Para determinar o capsídeo degradado/desnaturado, o rAAV purificado pode ser submetido a eletroforese em gel de SDS- poliacrilamida, consistindo em qualquer gel capaz de separar as três proteínas de capsídeo, por exemplo, um gel de gradiente, em seguida, executar o gel até a amostra ser separada e borrar o gel em membranas de náilon ou nitrocelulose. Os anticorpos do capsídeo de anti-AAV são então usados como anticorpos primários que se ligam a proteínas de capsídeo desnaturadas (vide, por exemplo, Wobus et al., J. Virol. (2000) 74: 9281-9293). Um anticorpo secundário que se liga ao anticorpo primário contém um meio para detectar o anticorpo primário. A ligação entre os anticorpos primários e secundários é detectada semiquantitativamente para determinar a quantidade de capsídeos.
[0264] Os vetores de rAAV e outras composições, agentes, fármacos, produtos biológicos (proteínas) podem ser incorporados em composições farmacêuticas. Tais composições farmacêuticas são úteis para, entre outras coisas, administração e liberção a um indivíduo in vivo ou ex vivo.
[0265] O termo "isolado", quando usado como um modificador de uma composição, significa que as composições são feitas pela mão do homem ou são separadas, completamente ou pelo menos em parte, de seu ambiente in vivo de ocorrência natural. Geralmente, as composições isoladas são substancialmente isentas de um ou mais materiais com os quais normalmente se associam na natureza, por exemplo, uma ou mais proteínas, ácidos nucleicos, lipídios, carboidratos, membrana celular.
[0266] No que diz respeito à proteína, o termo "proteína isolada" ou "proteína isolada e purificada" é algumas vezes usado neste documento. Este termo refere-se principalmente a uma proteína produzida pela expressão de uma molécula de ácido nucleico. Alternativamente, este termo pode referir- se a uma proteína que foi suficientemente separada de outras proteínas com as quais estaria naturalmente associada, de modo a existir na forma "substancialmente pura".
[0267] O termo "isolado" não exclui composições deste documento ou combinações produzidas manualmente pelo homem, por exemplo, um rAAV e/ou uma formulação farmacêutica. O termo "isolado" também não exclui formas físicas alternativas da composição, tais como híbridos/quimeras, multímeros/oligômeros, modificações (por exemplo, fosforilação, glicosilação, lipidação) ou formas derivatizadas, ou formas expressas em células hospedeiras produzidas manualmente pelo homem.
[0268] O termo "substancialmente puro" refere-se a uma preparação compreendendo pelo menos 50-60% em peso do composto de interesse (por exemplo, ácido nucleico, oligonucleotídeo, proteína, etc.). A preparação pode compreender pelo menos 75% em peso, ou cerca de 90-99% em peso, do composto de interesse. A pureza é medida por métodos apropriados para o composto de interesse (por exemplo, métodos cromatográficos, eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, análise por HPLC e similares).
[0269] A frase "consistindo essencialmente em", quando refere-se a uma sequência de nucleotídeos ou sequência de aminoácidos particular, significa uma sequência tendo as propriedades de uma determinada sequência. Por exemplo, quando usada em referência a um ácido nucleico ou uma sequência de aminoácidos, a frase inclui a sequência per se e modificações moleculares que não afetariam as características básicas e novas da sequência.
[0270] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas também contêm um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Tais excipientes incluem qualquer agente farmacêutico que por si só não induz uma resposta imune prejudicial ao indivíduo que recebe a composição e que pode ser administrado sem toxicidade indevida.
[0271] Conforme usado neste documento, o termo
"farmaceuticamente aceitável" e "fisiologicamente aceitável" significa uma formulação biologicamente aceitável, gasosa, líquida ou sólida, ou uma mistura da mesma, que é adequada para uma ou mais vias de administração, liberação in vivo ou contato. Uma composição "farmaceuticamente aceitável" ou "fisiologicamente aceitável" é um material que não é biologicamente ou de outra forma indesejável, por exemplo, o material pode ser administrado a um indivíduo sem causar efeitos biológicos indesejáveis substanciais. Assim, tal composição farmacêutica pode ser usada, por exemplo, na administração de um ácido nucleico, vetor, partícula viral ou proteína a um indivíduo.
[0272] Excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, líquidos, tais como água, solução salina, glicerol, açúcares e etanol. Sais farmaceuticamente aceitáveis também podem ser incluídos nos mesmos, por exemplo, sais de ácidos minerais, tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos e similares; e os sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos e similares. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsionantes, substâncias tampão de pH e similares, podem estar presentes em tais veículos.
[0273] A composição farmacêutica pode ser fornecida como um sal e pode ser formada com muitos ácidos, incluindo, mas não se limitando a, clorídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Os sais tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos ou outros solventes protônicos do que as formas de base livre correspondentes. Em outros casos, uma preparação pode ser um pó liofilizado que pode conter qualquer um ou todos os seguintes: 1-50 mM de histidina, 0,1% -2% de sacarose e 2-7% de manitol, em uma faixa de pH de 4,5 a 5,5, que é combinado com o buffer antes do uso.
[0274] As composições farmacêuticas incluem solventes (aquosos ou não- aquosos), soluções (aquosas ou não- aquosas), emulsões (por exemplo, óleo-em-água ou água-em-óleo), suspensões, xaropes, elixires,
meios de dispersão e suspensão, revestimentos, agentes isotônicos e promotores ou retardadores de absorção, compatíveis à administração farmacêutica ou contato ou liberação in vivo. Solventes, soluções e suspensões aquosos e não aquosos podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. Tais transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem comprimidos (revestidos ou não revestidos), cápsulas (duras ou moles), microesferas, pó, grânulos e cristais. Compostos ativos suplementares (por exemplo, conservantes, agentes antibacterianos, antivirais e antifúngicos) também podem ser incorporados às composições.
[0275] As composições farmacêuticas podem ser formuladas para serem compatíveis com uma via particular de administração ou liberação, conforme estabelecido neste documento ou conhecido por um técnico no assunto. Assim, as composições farmacêuticas incluem transportadores, diluentes ou excipientes adequados para administração por várias vias.
[0276] As composições adequadas para administração parentérica compreendem soluções, suspensões ou emulsões aquosas e não aquosas do composto ativo, cujas preparações são normalmente estéreis e podem ser isotônicas com o sangue do destinatário pretendido. Exemplos ilustrativos incluem, por exemplo, e sem limitação, água, solução salina tamponada, solução de Hanks, solução de Ringer, dextrose, frutose, etanol, óleos animais, vegetais ou sintéticos. As suspensões aquosas para injeção podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como, por exemplo, e sem limitação, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano.
[0277] Além disso, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção de óleo apropriadas. Os solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos, tais como óleo de gergelim, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, como oleato de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.
[0278] Podem ser adicionados cossolventes e adjuvantes à formulação, exemplos dos quais incluem, por exemplo, e sem limitação, cossolventes contendo grupos hidroxila ou outros grupos polares, por exemplo, álcoois, tais como álcool isopropílico; glicóis, tais como propilenoglicol, polietilenoglicol, polipropilenoglicol, éter de glicol; glicerol; álcoois de polioxietileno e ésteres de ácidos graxos de polioxietileno. Exemplos de adjuvantes incluem, por exemplo, e sem limitação, surfactantes, tais como lecitina de soja e ácido oleico; ésteres de sorbitano, tais como trioleato de sorbitano; e polivinilpirrolidona.
[0279] Após as composições farmacêuticas terem sido preparadas, elas podem ser colocadas em um recipiente apropriado e rotuladas para tratamento. Tal rótulo pode incluir quantidade, frequência e método de administração.
[0280] As composições farmacêuticas e sistemas de liberação apropriados para as composições, métodos e usos da presente invenção são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA;. Remington 's Pharmaceutical Sciences (1990) 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12a ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel e Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11a ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD; e Poznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, NY, pp. 253-315).
[0281] Em certas modalidades, os ácidos nucleicos, polinucleotídeos e cassetes de expressão da presente invenção são liberados ou administrados por meio de partículas de vetor de AAV. Em certas modalidades, os ácidos nucleicos, polinucleotídeos e cassetes de expressão da presente invenção podem ser liberados ou administrados por meio de outros tipos de partículas virais, incluindo partículas retrovirais, adenovirais, adenovirais dependente de ajudante, adenovirais híbridas, do vírus herpes simplex, lentivirais, do poxvírus, do vírus Epstein-Barr, do vírus vaccinia e do citomegalovírus humano.
[0282] Em certas modalidades, os ácidos nucleicos, polinucleotídeos e cassetes de expressão da presente invenção são liberados ou administrados com um sistema de liberação não viral. Os sistemas de liberação não virais incluem, por exemplo, métodos químicos, tais como lipossomas, nanopartículas, nanopartículas de lipídios, polímeros, micropartículas, microcápsulas, micelas ou vesículas extracelulares e métodos físicos, tais como arma de genes, eletroporação, bombardeio de partículas, uso de ultrassom e magnetofecção.
[0283] Em certas modalidades, os polinucleotídeos de ácidos nucleicos e cassetes de expressão da presente invenção são liberados como DNA nu, minicírculos, transposons ou DNA duplex linear de extremidade fechada.
[0284] Em certas modalidades, os ácidos nucleicos, polinucleotídeos e cassetes de expressão da presente invenção são liberados ou administrados em partículas de vetor de AAV, ou outras partículas virais, que são ainda encapsuladas ou complexadas com lipossomas, nanopartículas, nanopartículas de lipídios, polímeros, micropartículas, microcápsulas, micelas, ou vesículas extracelulares.
[0285] Uma "nanopartícula de lipídio" ou "LNP" refere-se a uma vesícula à base de lipídios útil para liberação de AAV e tendo dimensões em nanoescala, ou seja, de cerca de 10 nm a cerca de 1000 nm, ou de cerca de 50 a cerca de 500 nm, ou de cerca de 75 a cerca de 127 nm. Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que a LNP forneça o ácido nucleico, polinucleotídeos, cassete de expressão ou vetor de AAV com proteção parcial ou completa do sistema imunológico. A blindagem permite a liberação do ácido nucleico, polinucleotídeo, cassete de expressão ou vetor AAV a um tecido ou célula,
evitando induzir uma resposta imune substancial contra o ácido nucleico, polinucleotídeo, cassete de expressão ou vetor de AAV in vivo. A blindagem também pode permitir a administração repetida sem induzir uma resposta imune substancial contra o ácido nucleico, polinucleotídeo, vetor de expressão ou vetor de AAV in vivo (por exemplo, em um indivíduo, tal como um ser humano). A blindagem também pode melhorar ou aumentar a eficiência de liberação in vivo.
[0286] O pi (ponto isoelétrico) de AAV está em uma faixa de cerca de 6 a cerca de 6,5. Portanto, a superfície do AAV carrega uma leve carga negativa. Como tal, pode ser benéfico para a LNP compreender um lipídio catiônico, tal como, por exemplo, um amino lipídio. Amino lipídios exemplares foram descritos nas Patentes dos EUA de nºs 9.352.042, 9.220.683, 9.186.325,
9.139.554, 9.126.966, 9.018.187, 8.999.351, 8.722.082, 8.642.076, 8.569.256,
8.466.122 e 7.745.651 e nas Publicações de Patentes dos EUA 2016/0213785, 2016/0199485, 2015/0265708, 2014/0288146, 2013/0123338, 2013/0116307, 2013/0064894, 2012/0172411 e 2010/0117125.
[0287] Os termos "lipídio catiônico" e "amino lipídio" são usados de forma intercambiável neste documento para incluir aqueles lipídios e sais dos mesmos tendo um, dois, três ou mais ácidos graxos ou cadeias graxas de alquila e um grupo amino titulável por pH (por exemplo, um alquilamino ou grupo dialquilamino). O lipídio catiônico é normalmente protonado (isto é, carregado positivamente) a um pH abaixo do pKa do lipídio catiônico e é substancialmente neutro a um pH acima do pKa. Os lipídios catiônicos também podem ser lipídios catiônicos tituláveis. Em certas modalidades, os lipídios catiônicos compreendem: um grupo amina terciária protonável (por exemplo, titulável por pH); cadeias de alquila C18, em que cada cadeia de alquila independente tem 0 a 3 (por exemplo, 0, 1, 2 ou 3) ligações duplas; e ligações éter, éster ou cetal entre o grupo principal e as cadeias de alquila.
[0288] Os lipídios catiônicos podem incluir, sem limitação, 1,2- dilinoleilóxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinolenilóxi-N,N-
dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2-di-γ-linolenilóxi-N,N-dimetilaminopropano (γ-DLenDMA), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-K-C2- DMA, também conhecido como DLin-C2K-DMA, XTC2, e C2K), 2,2-dilinoleil-4- dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA), dilinoleilmetil-3- dimetilaminopropionato (DLin-M-C2-DMA, também conhecido como MC2), (6Z,9Z,28Z,31 Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4- (dimetilamino)butanoato (DLin-M-C3-DMA, também conhecido como MC3), sais dos mesmos, e misturas dos mesmos. Outros lipídios catiônicos também incluem, mas não estão limitados a, 1,2-disteariloxi-N,N-dimetil-3- aminopropano (DSDMA), 1,2-dioleilóxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DODMA), 2,2-dilinoleil-4-(3-dimetilaminopropil)-[1,3]-dioxolano (DLin-K-C3-DMA), 2,2- dilinoleil-4-(3-dimetilaminobutil)-[1,3]-dioxolano (DLin-K-C4-DMA), DLen-C2K- DMA, γ-DLen-C2K-DMA e (DLin-MP-DMA) (também conhecido como 1-B11).
[0289] Ainda outros lipídios catiônicos podem incluir, sem limitação, 2,2-dilinoleil-5-dimetilaminometil-[1,3]-dioxano (DLin-K6-DMA), 2,2- dilinoleil-4-N-metilpepiazino-[1,3]-dioxolano (DLin-K-MPZ), 1,2- dilinoleilcarbamoilóxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2-dilinoleióxi-3- (dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-dilinoleióxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-dilinoleiltio-3- dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1-linoleoil-2-linoleilóxi-3- dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal de cloreto de 1,2-dilinoleilóxi-3- trimetilaminopropano (DLin-TMA.Cl), sal de cloreto de 1,2-dilinoleoil-3- trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl), 1,2-dilinoleilóxi-3-(N- metilpiperazino)propano (DLin-MPZ), 3-(N,N-dilinoleilamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-dioleilamino)-1,2-propanodio (DOAP), 1,2-dilinoleiloxo-3-(2- N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), cloreto de N,N-dioleil-N,N- dimetilamônio (DODAC), cloreto de N-(1-(2,3-dioleilóxi)propil)-N,N,N- trimetilamônio (DOTMA), brometo de N,N-distearil-N,N-dimetilamônio (DDAB), cloreto de N-(1-(2,3-dioleoilóxi)propil)-N,N,N-trimetilamônio (DOTAP), 3-(N— (N′,N′-dimetilaminoetano)-carbamoil)colesterol (DC-Chol), brometo de N-(1,2-
dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietil amônio (DMRIE), 2,3-dioleilóxi-N- [2(espermina-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanamôniotrifluoroacetato (DOSPA), dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS), 3-dimetilamino-2-(colest-5- en-3-beta-oxibutan-4-óxi)-1-(cis,cis-9,12-octadecadienóxi)propano (CLinDMA), 2-[5′-(colest-5-en-3-beta-óxi)-3′-oxapentóxi)-3-dimetil-1-(cis,cis-9′,1-2′- octadecadienóxi)propano (CpLinDMA), N,N-dimetil-3,4-dioleiloxibenzilamina (DMOBA), 1,2-N,N′-dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropano (DOcarbDAP), 1,2- N,N′-dilinoleilcarbamil-3-dimetilaminopropano (DLincarbDAP), dexametasona espermina (DS) e espermina dissubstituída (D2S) ou misturas dos mesmos.
[0290] Uma série de preparações comerciais de lipídios catiônicos pode ser usada, tal como, LIPOFECTIN® (incluindo DOTMA e DOPE, disponível da GIBCO/BRL) e LIPOFECTAMINE® (compreendendo DOSPA e DOPE, disponível da GIBCO/BRL).
[0291] Em certas modalidades, o lipídio catiônico pode estar presente em uma quantidade de cerca de 10% em peso da LNP a cerca de 85% em peso da nanopartícula de lipídio, ou de cerca de 50% em peso da LNP a cerca de 75% em peso da LNP.
[0292] Os esteróis podem conferir fluidez à LNP. Conforme usado neste documento, "esterol" refere-se a qualquer esterol natural de origem vegetal (fitosteróis) ou animal (zoosteróis), bem como esteróis sintéticos não naturais, todos caracterizados pela presença de um grupo hidroxila na posição 3 do anel A do esteróide. O esterol pode ser qualquer esterol convencionalmente usado no campo da preparação de lipossomas, vesículas lipídicas ou partículas lipídicas, mais comumente colesterol. Os fitoesteróis podem incluir campesterol, sitosterol e estigmasterol. Os esteróis também incluem lipídios modificados com esterol, tais como os descritos na Publicação do Pedido de Patente dos EUA 2011/0177156. Em certas modalidades, um esterol pode estar presente em uma quantidade de cerca de 5% em peso da LNP a cerca de 50% em peso da nanopartícula de lipídio ou de cerca de 10% em peso da LNP a cerca de 25% em peso da LNP.
[0293] LNP pode compreender um lipídio neutro. Os lipídios neutros podem compreender qualquer espécie de lipídio que exista em uma forma zwitteriónica neutra ou não carregada a pH fisiológico. Tais lipídios incluem, sem limitação, diacilfosfatidilcolina, diacilfosfatidiletanolamina, ceramida, esfingomielina, di-hidroesfingomielina, cefalina e cerebrosídeos. A seleção de lipídios neutros é geralmente guiada pela consideração, inter alia, do tamanho da partícula e da estabilidade necessária. Em certas modalidades, o componente de lipídio neutro pode ser um lipídio tendo dois grupos acila (por exemplo, diacilfosfatidilcolina e diacilfosfatidiletanolamina).
[0294] Lipídios tendo uma variedade de grupos de cadeia acila de vários comprimentos de cadeia e grau de saturação estão disponíveis ou podem ser isolados ou sintetizados por técnicas bem conhecidas. Em certas modalidades, podem ser usados lipídios contendo ácidos graxos saturados com comprimentos de cadeia de carbono na faixa de C14 a C22. Em certas modalidades, são usados lipídios com ácidos graxos mono ou di-insaturados com comprimentos de cadeia de carbono na faixa de C14 a C22. Além disso, podem ser usados lipídios com misturas de cadeias de ácidos graxos saturados e insaturados. Lipídios neutros exemplares incluem, sem limitação, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidil-etanolamina (DOPE), 1,2-distearoil-sn-glicero- 3-fosfocolina (DSPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) ou qualquer fosfatidilcolina relacionada. Os lipídios neutros também podem ser compostos de esfingomielina, di-idroesfingomielina ou fosfolipídios com outros grupos de cabeça, tais como serina e inositol.
[0295] Em certas modalidades, o lipídio neutro pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0,1% em peso da nanopartícula de lipídio a cerca de 75% em peso da LNP, ou de cerca de 5% em peso da LNP a cerca de 15% em peso da LNP.
[0296] Ácidos nucleicos encapsulados em LNP, cassetes de expressão e vetor de AAV podem ser incorporados em composições farmacêuticas, por exemplo, um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Tais composições farmacêuticas são úteis para, entre outras coisas, administração e liberação de ácidos encapsulados em LNP, cassetes de expressão e vetor de AAV a um indivíduo in vivo ou ex vivo.
[0297] As preparações de LNP podem ser combinadas com componentes adicionais, que podem incluir, por exemplo, e sem limitação, polietilenoglicol (PEG) e esteróis.
[0298] O termo "PEG" refere-se a um polietilenoglicol, um polímero linear solúvel em água de unidades de repetição de PEG de etileno com dois grupos hidroxila terminais. Os PEGs são classificados por seus pesos moleculares; por exemplo, PEG 2000 tem um peso molecular médio de cerca de 2.000 daltons e PEG 5000 tem um peso molecular médio de cerca de 5.000 daltons. PEGs estão comercialmente disponíveis da Sigma Chemical Co. e outras empresas e incluem, por exemplo, e sem limitação, os seguintes PEGs funcionais: monometoxipolietilenoglicol (MePEG-OH), monometoxipolietilenoglicol-succinato (MePEG-S), monometoxipolietilenoglicol- succinimidil succinato MePEG-S-NHS), monometoxipolietilenoglicol-amina (MePEG-NH2), monometoxipolietilenoglicol-tresilato (MePEG-TRES) e monometoxipolietilenoglicol-imidazolil-carbonil (MePEG-IM).
[0299] Em certas modalidades, o PEG pode ser um polietilenoglicol com um peso molecular médio de cerca de 550 a cerca de
10.000 daltons e é opcionalmente substituído por alquila, alcóxi, acila ou arila. Em certas modalidades, o PEG pode ser substituído por metila na posição hidroxila terminal. Em certas modalidades, o PEG pode ter um peso molecular médio de cerca de 750 a cerca de 5.000 daltons, ou de cerca de 1.000 a cerca de 5.000 daltons, ou de cerca de 1.500 a cerca de 3.000 daltons ou de cerca de 2.000 daltons ou de cerca de 750 daltons. O PEG pode ser opcionalmente substituído por alquila, alcóxi, acila ou arila. Em certas modalidades, o grupo hidroxila terminal pode ser substituído por um grupo metóxi ou metila.
[0300] Os lipídios modificados com PEG incluem, por exemplo, e sem limitação, os conjugados de PEG-dialquiloxipropila (PEG-DAA) descritos nas Patentes dos EUA de nºs 8.936.942 e 7.803.397. Lipídios modificados por PEG (ou conjugados de lipídio-polioxietileno) que são úteis podem ter uma variedade de porções de lipídios de "ancoragem" para fixar a porção de PEG à superfície da vesícula lipídica. Exemplos de lipídios modificados por PEG adequados incluem, por exemplo, e sem limitação, fosfatidiletanolamina e ácido fosfatídico modificados por PEG, conjugados de PEG-ceramida (por exemplo, PEG-CerC14 ou PEG-CerC20) que são descritos na Patente dos EUA de nº
5.820.873, dialquilaminas modificadas por PEG e 1,2-diaciloxipropan-3-aminas modificadas por PEG. Em certas modalidades, o lipídio modificado por PEG pode ser diacilgliceróis e dialquilgliceróis modificados por PEG. Em certas modalidades, o PEG pode estar em uma quantidade de cerca de 0,5% em peso da LNP a cerca de 20% em peso da LNP, ou de cerca de 5% em peso da LNP a cerca de 15% em peso da LNP.
[0301] Além disso, a LNP pode ser uma LNP modificada por PEG e uma LNP modificada por esterol. As LNPs, combinadas com componentes adicionais, podem ser as mesmas ou LNPs separadas. Em outras palavras, a mesma LNP pode ser modificada por PEG e modificada por esterol ou, alternativamente, uma primeira LNP pode ser modificada por PEG e uma segunda LNP pode ser modificada por esterol. Opcionalmente, as primeira e segunda LNPs modificadas podem ser combinadas.
[0302] Em certas modalidades, antes do encapsulamento, as LNPs podem ter um tamanho na faixa de cerca de 10 nm a 500 nm, ou de cerca de 50 nm a cerca de 200 nm, ou de 75 nm a cerca de 125 nm. Em certas modalidades, o ácido nucleico encapsulado em LNP, o vetor de expressão ou o vetor de AAV podem ter um tamanho em uma faixa de cerca de 10 nm a 500 nm.
[0303] Uma "quantidade eficaz" ou "quantidade suficiente" refere- se a uma quantidade que fornece, em doses únicas ou múltiplas, sozinhas ou em combinação, com uma ou mais outras composições (agentes terapêuticos ou imunossupressores, tais como um fármaco como a prednisona),
tratamentos, protocolos, ou agentes de regimes terapêuticos, uma resposta detectável de qualquer duração de tempo (longo ou curto prazo), um resultado esperado ou desejado ou um benefício para um indivíduo de qualquer grau mensurável ou detectável ou por qualquer duração de tempo (por exemplo, por minutos, horas, dias, meses, anos ou curado).
[0304] As doses podem variar e dependem do tipo, início, progressão, gravidade, frequência, duração ou probabilidade da doença para a qual o tratamento é direcionado, o desfecho clínico desejado, tratamentos anteriores ou simultâneos, saúde geral, idade, sexo, raça ou competência imunológica do indivíduo e outros fatores que serão apreciados pelo técnico no assunto. A quantidade, número, frequência ou duração da dose pode ser proporcionalmente aumentada ou reduzida, conforme indicado por quaisquer efeitos colaterais adversos, complicações ou outros fatores de risco do tratamento ou terapia e do estado do indivíduo. O técnico no assunto apreciará os fatores que podem influenciar a dosagem e o tempo necessários para fornecer uma quantidade suficiente para fornecer um benefício terapêutico ou profilático.
[0305] A dose para alcançar um efeito terapêutico, por exemplo, a dose nos genomas de vetor/por quilograma de peso corporal (vg/kg), irá variar com base em vários fatores, incluindo, mas não se limitando a: via de administração, o nível de expressão de polinucleotídeo heterólogo necessário para alcançar um efeito terapêutico, a doença específica tratada, qualquer resposta imune do hospedeiro ao vetor viral, uma resposta imune do hospedeiro ao polinucleotídeo heterólogo ou produto de expressão (proteína) e a estabilidade da proteína expressa. Um técnico no assunto pode determinar uma faixa de dose de rAAV/genoma de vetor para tratar um paciente tendo uma doença ou distúrbio particular com base nos fatores acima mencionados, bem como outros fatores.
[0306] Geralmente, as doses variam de pelo menos 1108, ou mais, por exemplo, 1109, 11010, 11011, 11012, 11013 ou 11014, ou mais, genomas de vetor por quilograma (vg/kg) do peso do indivíduo, para alcançar um efeito terapêutico. A dose de AAV na faixa de 11010-11011 vg/kg em camundongos e 11012-11013vg/kg em cães foi eficaz. As doses podem ser menores, por exemplo, uma dose menor que 61012 genomas de vetor por quilograma (vg/kg). Mais particularmente, uma dose de cerca de 1x1011vg/kg a cerca de 5x1012vg/kg, ou de cerca de 5x1011vg/kg a cerca de 2x1012vg/kg, ou de cerca de 5x1011vg/kg a cerca de 1x1012vg/kg.
[0307] Para a doença de Pompe, uma quantidade eficaz seria uma quantidade de GAA que inibe ou reduz a produção ou acúmulo de glicogênio, aumenta ou intensifica a degradação ou remoção de glicogênio, reduz alterações lisossomais em tecidos do corpo de um indivíduo ou melhora o tônus muscular e/ou força muscular e/ou função respiratória em um indivíduo, por exemplo. As quantidades eficazes podem ser determinadas, por exemplo, averiguando a cinética da absorção de GAA pelos mioblastos do plasma. As taxas de absorção de GAA por mioblastos (absorção de K) de cerca de 141- 147 nM podem parecer eficazes (vide, por exemplo, Maga et al., J. Biol. Chem. 2012) Em modelos animais, os níveis de atividade de GAA no plasma de mais de cerca de 1.000 nmol/h/mL, por exemplo, cerca de 1.000 a cerca de 2.000 nmol/h/mL foram observados como terapeuticamente eficazes.
[0308] Usando a hemofilia B como um exemplo, em geral, acredita-se que, para alcançar um efeito terapêutico, uma concentração do fator de coagulação sanguínea maior que 1% da concentração do fator encontrada em um indivíduo normal é necessária para alterar um fenótipo de doença grave para um moderado. Um fenótipo grave é caracterizado por danos nas articulações e sangramentos com risco de vida. Para converter um fenótipo de doença moderada em um leve, acredita-se que uma concentração do fator de coagulação sanguínea maior que 5% do normal seja necessária.
[0309] O diagnóstico e a classificação da gravidade da doença para hemofilia A e B são baseados nos resultados dos ensaios de atividade do fator VIII e fator IX, respectivamente. Os dois ensaios principais usados para avaliar a atividade do fator são os ensaios de um estágio (OSAs), com base no tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT), e os ensaios de substrato cromogênico (CSAs) de dois estágios, que usam uma reação de substrato cromóforo enzimático baseada no fator Xa. Tais ensaios são bem conhecidos na técnica e são adicionalmente descritos em Adcock et al., 2018, Int. J. Lab. Hem., 40:621-629.
[0310] Os níveis de FVIII em humanos normais são cerca de 150- 200 ng/mL de plasma, mas podem ser menores (por exemplo, faixa de cerca de 100-150 ng/mL) ou maior (por exemplo, faixa de cerca de 200-300 ng/mL) e ainda considerados normal, devido à coagulação funcional conforme determinado, por exemplo, por um ensaio de coagulação aPTT de um estágio. Assim, um efeito terapêutico pode ser alcançado pela expressão de FVIII ou hFVIII-BDD de tal modo que a quantidade total de FVIII no indivíduo/humano seja maior que 1% do FVIII presente em indivíduos normais/humanos, por exemplo, 1% de 100-300 ng/mL.
[0311] As doses do vetor de rAAV podem estar em um nível, normalmente na extremidade inferior do espectro de dose, de tal modo que não haja uma resposta imune substancial contra o FVIII ou vetor de AAV. Mais particularmente, uma dose de até, mas inferior a 6x1012 vg/kg, tal como cerca de 5x1011 a cerca de 5x1012 vg/kg, ou mais particularmente, cerca de 5x1011 vg/kg ou cerca de 1x1012 vg/kg.
[0312] Em certas modalidades, a dose do vetor de rAAV está em um nível para liberar uma quantidade segura e eficaz de FVIII e fornecer benefício terapêutico a um indivíduo com hemofilia A com anticorpos inibidores contra FVIII (hemofilia A com inibidores).
[0313] As doses de uma "quantidade eficaz" ou "quantidade suficiente" para o tratamento (por exemplo, para melhorar ou fornecer um benefício terapêutico ou melhora) normalmente são eficazes para fornecer uma resposta a um, vários ou todos os sintomas adversos, consequências ou complicações da doença, um ou mais sintomas adversos, distúrbios, doenças, patologias ou complicações, por exemplo, causados por ou associados à doença, em uma extensão mensurável, embora diminuir, reduzir, inibir, suprimir, limitar ou controlar a progressão ou agravamento da doença seja um resultado satisfatório.
[0314] Uma quantidade eficaz ou uma quantidade suficiente pode, mas não precisa ser fornecida em uma única administração, pode exigir múltiplas administrações e, pode, mas não precisa ser, administrada sozinha ou em combinação com outra composição (por exemplo, agente), tratamento, protocolo ou regime terapêutico. Por exemplo, a quantidade pode ser aumentada proporcionalmente conforme indicado pela necessidade do indivíduo, tipo, status e gravidade da doença tratada ou efeitos colaterais (se houver) do tratamento. Além disso, uma quantidade eficaz ou uma quantidade suficiente não precisa ser eficaz ou suficiente se dada em doses únicas ou múltiplas sem uma segunda composição (por exemplo, outro fármaco ou agente), tratamento, protocolo ou regime terapêutico, uma vez que doses, quantidades ou duração adicionais acima e além dessas doses, ou composições adicionais (por exemplo, fármacos ou agentes), tratamentos, protocolos ou regimes terapêuticos podem ser incluídos a fim de serem considerados eficazes ou suficientes em um determinado indivíduo. As quantidades consideradas eficazes também incluem quantidades que resultam em uma redução do uso de outro tratamento, regime terapêutico ou protocolo, tal como a administração de proteína do fator de coagulação recombinante (por exemplo, FVIII) para o tratamento de um distúrbio de coagulação (por exemplo, hemofilia A ou hemofilia A com anticorpos inibidores contra FVIII, também conhecido como hemofilia A com inibidores).
[0315] Consequentemente, os métodos e usos da presente invenção também incluem, entre outras coisas, métodos e usos que resultam em uma necessidade reduzida ou uso de outro composto, agente, fármaco,
regime terapêutico, protocolo de tratamento, processo ou remédio. Por exemplo, para uma doença de coagulação sangúinea, um método ou uso da presente invenção tem um benefício terapêutico se em um determinado indivíduo uma dose menos frequente ou reduzida ou eliminação da administração de uma proteína do fator de coagulação recombinante para suplementar o fator de coagulação endógeno deficiente ou defeituoso (anormal ou mutante) no indivíduo. Assim, de acordo com a presente invenção, são fornecidos métodos e usos para reduzir a necessidade ou uso de outro tratamento ou terapia.
[0316] Uma quantidade eficaz ou uma quantidade suficiente não precisa ser eficaz em cada um dos indivíduos tratados, nem na maioria dos indivíduos tratados em um determinado grupo ou população. Uma quantidade eficaz ou uma quantidade suficiente significa eficácia ou suficiência em um determinado indivíduo, não em um grupo ou na população em geral. Como é típico para tais métodos, alguns indivíduos exibirão uma resposta maior, ou menor ou nenhuma resposta a um determinado método de tratamento ou uso.
[0317] O termo "melhorar" significa uma melhora detectável ou mensurável na doença de um indivíduo ou sintoma da mesma, ou uma resposta celular subjacente. Uma melhora detectável ou mensurável inclui uma diminuição subjetiva ou objetiva, redução, inibição, supressão, limite ou controle na ocorrência, frequência, gravidade, progressão ou duração da doença, ou complicação causada por ou associada à doença, ou uma melhora em um sintoma ou uma causa subjacente ou uma consequência da doença, ou uma reversão da doença. Para HemA, uma quantidade eficaz seria uma quantidade que reduz a frequência ou gravidade dos episódios de sangramento agudo em um indivíduo, por exemplo, ou uma quantidade que reduz o tempo de coagulação conforme medido por um ensaio de coagulação, por exemplo.
[0318] Consequentemente, as composições farmacêuticas da presente invenção incluem composições em que os ingredientes ativos estão contidos em uma quantidade eficaz para alcançar o propósito terapêutico pretendido. A determinação de uma dose terapeuticamente eficaz está bem dentro da capacidade de um médico especialista usando as técnicas e orientações fornecidas na presente invenção.
[0319] As doses terapêuticas dependerão, entre outros fatores, da idade e condição geral do indivíduo, da gravidade do fenótipo aberrante e da força das sequências de controle que regulam os níveis de expressão. Assim, uma quantidade terapeuticamente eficaz em humanos cairá em uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada por um médico com base na resposta de um paciente individual a um tratamento baseado em vetor. Tais doses podem ser isoladas ou em combinação com um agente imunossupressor ou fármaco.
[0320] As composições, tais como composições farmacêuticas, podem ser liberados a um indivíduo, de modo a permitir a expressão do transgene e, opcionalmente, a produção da proteína codificada. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas que compreendem material genético suficiente para permitir que um receptor produza uma quantidade terapeuticamente eficaz de um fator de coagulação sanguínea para influenciar a hemostasia no indivíduo.
[0321] As composições podem ser administradas sozinhas. Em certas modalidades, uma partícula de AAV recombinante fornece um efeito terapêutico sem um agente imunossupressor. O efeito terapêutico é opcionalmente sustentado por um período de tempo, por exemplo, 2-4, 4-6, 6- 8, 8-10, 10-14, 14-20, 20-25, 25-30 ou 30-50 dias ou mais, por exemplo, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200 dias ou mais sem administração de um agente imunossupressor. Consequentemente, em certas modalidades, a partícula de vírus rAAV fornece um efeito terapêutico sem a administração de um agente imunossupressor por um período de tempo.
[0322] As composições da presente invenção podem ser administradas em combinação com pelo menos um outro agente inerte ou terapêutico. Em certas modalidades, o vetor de rAAV é administrado em conjunto com um ou mais agentes imunossupressores antes, substancialmente ao mesmo tempo ou após a administração de um vetor de rAAV. Em certas modalidades, por exemplo, 1-12, 12-24 ou 24-48 horas, ou 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-14, 14-20, 20-25, 25- 30, 30-50 ou mais de 50 dias após a administração do vetor de rAAV. Tal administração de agentes imunossupressores após um período de tempo após a administração do vetor de rAAV, se houver uma diminuição na expressão da proteína codificada após os níveis de expressão iniciais por um período de tempo, por exemplo, 20-25, 25-30, 30-50, 50-75, 75- 100, 100-150, 150-200 ou mais de 200 dias após o vetor de rAAV.
[0323] Em certas modalidades, um agente imunossupressor é um agente anti-inflamatório. Em certas modalidades, um agente imunossupressor é um esteroide. Em certas modalidades, um agente imunossupressor é prednisona, ciclosporina (por exemplo, ciclosporina A), micofenolato, rituximabe, rapamicina ou um derivado dos mesmos. Em certas modalidades, os agentes incluem um composto estabilizador. Outros agentes imunossupressores que podem ser usados de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, e sem limitação, um anticorpo direcionado a células B, por exemplo, rituximabe; um inibidor de proteassoma, por exemplo, bortezomibe; um inibidor do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), por exemplo, rapamicina; um inibidor da tirosina quinase, por exemplo, ibrutinibe; um inibidor do fator de ativação de células B (BAFF); e um inibidor de um ligante indutor de proliferação (APRIL).
[0324] As composições podem ser administradas em qualquer transportador farmacêutico biocompatível estéril, incluindo, mas não se limitando a, solução salina, solução salina tamponada, dextrose e água. As composições podem ser administradas a um paciente sozinhas ou em combinação com outros agentes (por exemplo, cofatores) que influenciam a hemostasia.
[0325] Métodos e usos da presente invenção incluem liberação e administração sistemicamente, regionalmente ou localmente, ou por qualquer via, por exemplo, e sem limitação, por injeção ou infusão. A liberação das composições farmacêuticas in vivo pode geralmente ser realizada por meio de injeção usando uma seringa convencional, embora outros métodos de liberação, tal como a liberação intensificada por convecção sejam previstos (vide, por exemplo, Patente dos EUA de nº 5.720.720). Por exemplo, as composições podem ser liberadas por via subcutânea, epidérmica, intradérmica, intratecal, intraorbital, intramucosa, intraperitoneal, intravenosa, intrapleural, intra-arterial, oral, intra-hepática, intramuscular ou por meio da veia porta. Outros modos de administração incluem administração oral e pulmonar, supositórios e aplicações transdérmicas. Um clínico especializado no tratamento de pacientes com coagulação sanguínea ou distúrbios do fator de coagulação, por exemplo, pode determinar a via ideal para a administração dos vetores associados a adenovirais com base em uma série de critérios, incluindo, mas não se limitando a: a condição do paciente e a finalidade do tratamento (por exemplo, GAA aumentada, coagulação sanguínea intensificada ou reduzida etc.).
[0326] Métodos de tratamento de acordo com a presente invenção incluem terapias de combinação que incluem o uso adicional de um ou mais de qualquer composto, agente, fármaco, tratamento ou outro regime terapêutico ou protocolo tendo uma atividade ou efeito terapêuticos, benéficos, aditivos, sinérgicos ou complementares desejados. Composições e tratamentos de combinação exemplares incluem, por exemplo, e sem limitação, segundos ativos, tais como, biológicos (proteínas), agentes (por exemplo, agentes imunossupressores) e fármacos. Tais produtos biológicos (proteínas), agentes, fármacos, tratamentos e terapias podem ser administrados ou realizados antes, substancialmente contemporaneamente ou após qualquer outro método de tratamento de acordo com a presente invenção, por exemplo, um método terapêutico de tratamento de um indivíduo para uma doença do armazenamento lisossomal, tal como Pompe, ou um método terapêutico para tratar um indivíduo para uma doença de coagulação sanguínea, tal como
HemA ou HemB.
[0327] O composto, agente, fármaco, tratamento ou outro regime terapêutico ou protocolo podem ser administrados como uma composição de combinação, ou administrados separadamente, tal como simultaneamente ou em série ou sequencialmente, antes ou após da liberação ou administração de um ácido nucleico, vetor, vetor recombinante (por exemplo, rAAV) ou partícula de vírus recombinante. A presente invenção, portanto, fornece combinações nas quais um método de tratamento de acordo com a presente invenção está em uma combinação com qualquer composto, agente, fármaco, regime terapêutico, protocolo de tratamento, processo, remédio ou composição, estabelecidos neste documento ou conhecidos por um técnico no assunto. O composto, agente, fármaco, regime terapêutico, protocolo de tratamento, processo, remédio ou composição podem ser administrados ou realizados antes de, substancialmente ao mesmo tempo ou após a administração de um ácido nucleico, vetor, vetor recombinante (por exemplo, rAAV) ou partícula de vírus recombinante administrados a um paciente ou indivíduo de acordo com a presente invenção.
[0328] A presente invenção pode ser usada em aplicações médicas humanas e veterinárias. Os indivíduos adequados incluem, portanto, mamíferos, tais como humanos, bem como mamíferos não humanos. O termo "indivíduo" refere-se a um animal, normalmente um mamífero, tal como humanos, primatas não humanos (macacos, gibões, gorilas, chimpanzés, orangotangos), um animal doméstico (cães e gatos), um animal de fazenda (aves domésticas, tais como galinhas e patos, cavalos, vacas, cabras, ovelhas, porcos) e animais experimentais (camundongos, rato, coelho, porquinho-da- índia). Os indivíduos humanos incluem indivíduos fetais, neonatais, infantis, juvenis e adultos. Os indivíduos incluem modelos de doenças animais, por exemplo, camundongos e outros modelos animais de doenças de coagulação sanguínea, tais como HemA e outras conhecidas pelos técnicos no assunto.
[0329] Os indivíduos apropriados para o tratamento de acordo com a presente invenção incluem aqueles que têm ou estão em risco de produzir uma quantidade insuficiente ou têm uma deficiência em um produto de gene funcional (por exemplo, GAA ou um fator de coagulação sanguínea, tal como FVIII ou FIX), ou produzem um produto de gene aberrante, parcialmente funcional ou não funcional (por exemplo, GAA ou um fator de coagulação sanguínea, tal como FVIII ou FIX), que pode levar à doença. Os indivíduos apropriados para o tratamento de acordo com a presente invenção também incluem aqueles que têm ou estão em risco de produzir um produto de gene (proteína) aberrante ou defeituoso (mutante) que leva a uma doença tal que reduz as quantidades, expressão ou função do aberrante, ou produto de gene (proteína) defeituoso (mutante) que levaria ao tratamento da doença, ou reduziria um ou mais sintomas ou amenizaria a doença. Os indivíduos alvo, por exemplo, incluem indivíduos que têm produção aberrante, insuficiente ou ausente do fator de coagulação sanguínea, tais como hemofílicos (por exemplo, hemofilia A ou hemofilia B), ou indivíduos que têm produção aberrante, insuficiente ou ausente de GAA, tais como indivíduos com doença de Pompe.
[0330] Os indivíduos incluem aqueles sem anticorpos neutralizantes detectáveis contra AAV. Os indivíduos também incluem aqueles com anticorpos neutralizantes contra AAV. Tais indivíduos podem ter anticorpos neutralizantes de título baixo contra AAV.
[0331] Os indivíduos podem ser testados para uma resposta imune, por exemplo, anticorpos contra AAV. indivíduos candidatos (por exemplo, indivíduos com hemofilia ou doença de Pompe) podem ser rastreados antes do tratamento de acordo com um método da presente invenção. Os indivíduos também podem ser testados para anticorpos contra AAV após o tratamento e, opcionalmente, monitorados por um período de tempo após o tratamento. Os indivíduos que desenvolvem anticorpos podem ser tratados com um agente imunossupressor (por exemplo, prednisona) ou podem receber uma ou mais quantidades adicionais do vetor de AAV.
[0332] Os indivíduos considerados negativos para anticorpos que se ligam ao AAV têm um título menor que 1:1. Os indivíduos que têm anticorpos que se ligam ao AAV podem ter um título maior que 1:1, mas menor que 1:5. Os indivíduos também podem ter título de anticorpos AAV igual ou maior que 1:5. Esses títulos de anticorpos podem ser calculados, por exemplo, realizando diluições em série de uma amostra de sangue, plasma ou soro (ou outro fluido corporal) de um indivíduo e a primeira diluição, na qual a amostra inibe a transdução de AAV em 50% ou mais, conforme medido pela atividade repórter em um ensaio baseado em células in vitro, é relatada como o título de anticorpo.
[0333] As estratégias para reduzir (superar) ou evitar a imunidade humoral ao AAV na transferência sistêmica de genes incluem a administração de altas doses de vetor, o uso de capsídeos vazios de AAV como iscas para adsorver anticorpos anti-AAV, a administração de fármacos imunossupressores para diminuir, reduzir, inibir, prevenir ou erradicar a resposta imune humoral ao AAV, alterando o sorotipo do capsídeo de AAV ou manipulando o capsídeo de AAV para ser menos suscetível a anticorpos neutralizantes, o uso de ciclos de troca de plasma para adsorver imunoglobulinas anti-AAV, reduzindo assim o título de anticorpo anti-AAV, o uso de técnicas de liberação, tais como cateteres de balão, seguido de lavagem com solução salina (Mingozzi et al., 2013, Blood, 122: 23-36) e imunoadsorção (Publicação de Pedido de Patente dos EUA 2018/0169273 A1).
[0334] Os indivíduos apropriados para o tratamento de acordo com a presente invenção também incluem aqueles que têm ou estão em risco de produzir anticorpos contra AAV. Os vetores de rAAV podem ser administrados ou liberados a tais indivíduos usando várias técnicas. Por exemplo, o capsídeo de AAV vazio (ou seja, AAV sem um transgene) pode ser liberado para se ligar aos anticorpos AAV no indivíduo, permitindo assim que o vetor de AAV contendo ácido nucleico ou variante de ácido nucleico transforme células do indivíduo.
[0335] A razão de capsídeos vazios para o vetor de rAAV pode ser entre cerca de 2:1 a cerca de 50:1, ou entre cerca de 2:1 a cerca de 25:1, ou entre cerca de 2:1 a cerca de 20:1 ou entre cerca de 2:1 a cerca de 15:1, ou entre cerca de 2:1 a cerca de 10:1. As razões também podem ser cerca de 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 ou 10:1.
[0336] As quantidades de AAV do capsídeo vazio para administrar podem ser calibradas com base na quantidade (título) de anticorpos AAV produzidos em um indivíduo particular. O capsídeo vazio pode ser de qualquer sorotipo AAV, por exemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV-2i8, LK03 (SEQ ID NO: 91), SPK (SEQ ID NO: 92).
[0337] Alternativamente, ou em adição a, o vetor de AAV pode ser liberado por injeção intramuscular direta (por exemplo, uma ou mais fibras de contração lenta de um músculo). Em outra alternativa, um cateter introduzido na artéria femoral pode ser usado para liberar vetores de AAV ao fígado através da artéria hepática. Meios não cirúrgicos também podem ser empregados, tais como colangiopancreatografia retrógrada endoscópica (CPRE), para liberar vetores de AAV diretamente ao fígado, evitando assim a corrente sanguínea e os anticorpos AAV. Outros sistemas ductais, tais como os dutos da glândula submandibular, também podem ser usados como portais para a liberação de vetores de AAV em um indivíduo que desenvolve ou tem anticorpos anti-AAV preexistentes.
[0338] A administração ou liberação in vivo a um indivíduo pode ser realizada antes do desenvolvimento de um sintoma adverso, condição, complicação, etc., causado por ou associado à doença. Por exemplo, uma tela (por exemplo, genética) pode ser usada para identificar tais indivíduos como candidatos para composições, métodos e usos da invenção. Tais indivíduos, portanto, incluem aqueles selecionados como positivos para uma quantidade insuficiente ou deficiência em um produto de gene funcional (por exemplo, fator de coagulação sanguínea), ou que produzem um produto de gene aberrante,
parcialmente funcional ou não funcional (por exemplo, fator de coagulação sanguínea).
[0339] A administração ou liberação in vivo a um indivíduo de acordo com os métodos e usos da presente invenção, conforme divulgados neste documento, pode ser praticada dentro de 1-2, 2-4, 4-12, 12-24 ou 24-72 horas após um indivíduo ter sido identificado como tendo a doença direcionada para tratamento, tendo um ou mais sintomas da doença ou ter sido rastreado e identificado como positivo, conforme estabelecido neste documento, embora o indivíduo não tenha um ou mais sintomas da doença. Claro, os métodos e usos da presente invenção podem ser praticados 1-7, 7-14, 14-21, 21-48 ou mais dias, meses ou anos após um indivíduo ter sido identificado como tendo a doença direcionada para tratamento, tendo um ou mais sintomas da doença, ou ter sido rastreado e identificado como positivo, conforme estabelecido neste documento.
[0340] Uma "forma de dosagem unitária", conforme usada neste documento, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para o indivíduo a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada opcionalmente em associação com um transportador farmacêutico (excipiente, diluente, veículo ou agente de enchimento) que, quando administrada em uma ou mais doses, é calculada para produzir um efeito desejado (por exemplo, efeito profilático ou terapêutico). As formas de dosagem unitária podem estar dentro, por exemplo, de ampolas e frascos, que podem incluir uma composição líquida, ou uma composição em um estado seco por congelamento ou liofilizado; um transportador líquido estéril, por exemplo, pode ser adicionada antes da administração ou liberação in vivo. As formas de dosagem unitária individual podem ser incluídas em kits ou recipientes de múltiplas doses. Sequências de vetores recombinantes (por exemplo, rAAV), partículas de vírus recombinantes e composições farmacêuticas das mesmas podem ser embaladas em formas de dosagem unitária única ou múltipla para facilidade de administração e uniformidade de dosagem.
[0341] Os indivíduos podem ser testados quanto aos níveis de proteína ou atividade de um produto de gene relevante (por exemplo, GAA ou um fator de coagulação sanguínea, tal como FVIII ou FIX) para determinar se tais indivíduos são apropriados para o tratamento de acordo com um método da presente invenção. Por exemplo, indivíduos candidatos a hemofilia A podem ser testados para quantidades ou atividade de FVIIIantes do tratamento de acordo com um método da presente invenção; os indivíduos com doença de Pompe candidatos podem ser testados quanto às quantidades ou atividade de GAA antes do tratamento de acordo com a presente invenção. Os indivíduos também podem ser testados quanto às quantidades de proteína FVIII ou GAA ou atividade após o tratamento de acordo com um método da presente invenção. Tais indivíduos tratados podem ser monitorados após o tratamento para atividade de coagulação sanguínea (para HemA) ou para atividade de GAA (para Pompe), periodicamente, por exemplo, a cada 1-4 semanas, 1-6 meses, ou 1, 2, 3, 4, 5 ou mais anos.
[0342] Os indivíduos podem ser testados para uma ou mais enzimas hepáticas para uma resposta adversa ou para determinar se tais indivíduos são apropriados para o tratamento de acordo com um método da presente invenção. Por exemplo, indivíduos com hemofilia ou doença de Pompe candidatos podem ser rastreados para quantidades de uma ou mais enzimas hepáticas antes do tratamento de acordo com um método da presente invenção. Os indivíduos também podem ser testados para quantidades de uma ou mais enzimas hepáticas após o tratamento de acordo com um método da presente invenção. Tais indivíduos tratados podem ser monitorados após o tratamento para enzimas hepáticas elevadas, periodicamente, por exemplo, a cada 1-4 semanas ou 1-6 meses.
[0343] Enzimas hepáticas exemplares incluem alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e lactato desidrogenase (LDH), mas outras enzimas indicativas de lesão hepática também podem ser monitoradas. Um nível normal dessas enzimas na circulação é normalmente definido como uma faixa que tem um nível superior, acima do qual o nível da enzima é considerado elevado e, portanto, indicativo de lesão hepática. Uma faixa normal depende em parte dos padrões usados pelo laboratório clínico que realiza o ensaio.
[0344] Em certas modalidades, os indivíduos com distúrbios hemorrágicos podem ser monitorados quanto a episódios de sangramento para determinar se tais indivíduos são elegíveis ou respondem ao tratamento de acordo com a presente invenção e/ou a quantidade ou duração da capacidade de resposta. Os indivíduos podem ser monitorados quanto a episódios de sangramento para determinar se tais indivíduos precisam de um tratamento adicional, por exemplo, uma administração subsequente do vetor de AAV ou administração de um agente imunossupressor ou monitoramento mais frequente. indivíduos com hemofilia podem ser monitorados para episódios de sangramento antes e depois do tratamento de acordo com um método da presente invenção. Os vtambém podem ser testados quanto à frequência e gravidade dos episódios de sangramento durante ou após o tratamento de acordo com um método da presente invenção.
[0345] Em certas modalidades, os indivíduos com doença de Pompe ou em necessidade de GAA podem ser monitorados por uma variedade de testes, ensaios e avaliações funcionais para demonstrar, medir e/ou avaliar a eficácia da GAA, para determinar se tais indivíduos são elegíveis ou respondem ao tratamento, ou estão em necessidade de tratamento adicional, de acordo com a presente invenção.
[0346] A presente invenção fornece kits com material de embalagem e um ou mais componentes nele. Um kit inclui normalmente um rótulo ou bula incluindo uma descrição dos componentes ou instruções para uso in vitro, in vivo ou ex vivo dos componentes nele contidos. Um kit pode conter uma coleção de tais componentes, por exemplo, um ácido nucleico, vetor recombinante, vetor de vírus (por exemplo, AAV) ou partícula de vírus e,
opcionalmente, um segundo ativo, tal como outro composto, agente, fármaco ou composição.
[0347] Um kit refere-se a uma estrutura física que abriga um ou mais componentes do kit. O material de embalagem pode manter os componentes esterilizados e pode ser feito de material comumente usado para tais fins (por exemplo, papel, fibra corrugada, vidro, plástico, papel alumínio, ampolas, frascos, tubos, etc.).
[0348] Os rótulos ou bulas podem incluir informações de identificação de um ou mais componentes neles, quantidades de dose, farmacologia clínica do(s) ingrediente(s) ativo(s), incluindo mecanismo de ação, farmacocinética e farmacodinâmica. Os rótulos ou bulas podem incluir informações que identificam o fabricante, números de lote, local e data de fabricação, datas de validade. Os rótulos ou bulas podem incluir informações que identificam informações do fabricante, números de lote, localização e data do fabricante. Os rótulos ou bulas podem incluir informações sobre uma doença para a qual um componente do kit pode ser usado. Os rótulos ou bulas podem incluir instruções para o clínico ou indivíduo para usar um ou mais dos componentes do kit em um método, uso ou protocolo de tratamento ou regime terapêutico. As instruções podem incluir quantidades de dosagem, frequência ou duração e instruções para praticar qualquer um dos métodos, usos, protocolos de tratamento ou regimes profiláticos ou terapêuticos descritos neste documento.
[0349] Os rótulos ou bulas podem incluir informações sobre qualquer benefício que um componente possa fornecer, tal como um benefício profilático ou terapêutico. Os rótulos ou bulas podem incluir informações sobre potenciais efeitos colaterais adversos, complicações ou reações, tais como advertências ao indivíduo ou ao médico sobre situações em que não seria apropriado usar uma determinada composição. Efeitos colaterais adversos ou complicações também podem ocorrer quando o indivíduo está ou estará tomando um ou mais medicamentos que possam ser incompatíveis com a composição, ou o indivíduo está ou estará passando por outro protocolo de tratamento ou regime terapêutico que seria incompatível com a composição e, portanto, as instruções poderiam incluir informações sobre tais incompatibilidades.
[0350] Os rótulos ou bulas incluem “material impresso”, por exemplo, papel ou papelão, ou separado ou afixado a um componente, um kit ou material de embalagem (por exemplo, uma caixa), ou anexado a uma ampola, tubo ou frasco contendo um componente do kit. Os rótulos ou bulas podem incluir adicionalmente um meio legível por computador, tal como um rótulo impresso com código de barras, um disco, disco óptico, tal como CD ou DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, fita magnética ou uma mídia de armazenamento eletrônico, tal como RAM e ROM ou híbridos dos mesmos, tais como mídia de armazenamento magnético/óptico, mídia FLASH ou cartões tipo de memória.
[0351] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém técnico no assunto à qual a presente invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos neste documento.
[0352] Todas as patentes, pedidos de patentes, publicações e outras referências, citações do GenBank e citações da ATCC citados neste documento são incorporadas por referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o relatório descritivo, incluindo as definições, prevalecerá.
[0353] Vários termos relacionados às moléculas biológicas da presente invenção são usados acima e também ao longo do relatório descritivo e reivindicações.
[0354] Todos os recursos divulgados neste documento podem ser combinados em qualquer combinação. Cada recurso divulgado no relatório descritivo pode ser substituído por um recurso alternativo que serve a um propósito igual, equivalente ou semelhante. Assim, a menos que expressamente indicado de outra forma, as características divulgadas (por exemplo, ácidos nucleicos reduzidos de CpG, vetores, plasmídeos, expressões/vetores recombinantes (por exemplo, rAAV) sequências ou partículas de vírus recombinantes) são um exemplo de um gênero de características equivalentes ou semelhantes.
[0355] Conforme usado neste documento, as formas singulares "um(a)", "e" e "o(a)" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um ácido nucleico" inclui uma pluralidade de tais ácidos nucleicos, a referência a "um vetor" inclui uma pluralidade de tais vetores e a referência a "um vírus" ou "partícula" inclui uma pluralidade de tais vírus/partículas.
[0356] Conforme usado neste documento, todos os valores numéricos ou faixas numéricas incluem inteiros dentro de tais faixas e frações dos valores ou dos inteiros dentro de faixas, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, para ilustrar, a referência a 80% ou mais de identidade inclui 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, etc., bem como 81,1%, 81,2%, 81,3%, 81,4%, 81,5%, etc., 82,1%, 82,2%, 82,3%, 82,4%, 82,5%, etc., e assim por diante.
[0357] Referência a um número inteiro com mais (maior) ou menos que inclui qualquer número maior ou menor que o número de referência, respectivamente. Assim, por exemplo, uma referência a menos de 100 inclui 99, 98, 97, etc. até o número um (1); e menos de 10, inclui 9, 8, 7, etc. até o número um (1).
[0358] Conforme usado neste documento, todos os valores numéricos ou faixas incluem frações dos valores e inteiros dentro de tais faixas e frações dos inteiros dentro de tais faixas, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, para ilustrar, a referência a uma faixa numérica, tal como 1-10 inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, bem como 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, etc., e assim por diante. A referência a um faixa de 1-50, portanto, inclui 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc., até e incluindo 50, bem como 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, etc., 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, etc., e assim por diante.
[0359] A referência a uma série de faixas inclui faixas que combinam os valores dos limites de diferentes faixas dentro da série. Assim, para ilustrar a referência a uma série de faixas, por exemplo, de 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250- 300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-850, a referência inclui faixas de 1-20, 1- 30, 1-40, 1-50, 1- 60, 10-30, 10-40, 10-50, 10-60, 10-70, 10-80, 20-40, 20-50, 20-60, 20-70, 20-80, 20-90, 50-75, 50-100, 50-150, 50-200, 50-250, 100-200, 100-250, 100-300, 100-350, 100-400, 100-500, 150-250, 150- 300, 150-350, 150-400, 150-450, 150-500, etc.
[0360] A presente invenção é geralmente divulgada neste documento usando linguagem afirmativa para descrever as numerosas modalidades da presente invenção. A presente invenção também inclui especificamente modalidades nas quais um determinado assunto é excluído, em todo ou em parte, tais como substâncias ou materiais, etapas e condições do método, protocolos ou procedimentos. Por exemplo, em certas modalidades da presente invenção, os materiais e/ou etapas do método são excluídos. Assim, embora a presente invenção geralmente não seja expressa neste documento em termos do que a presente invenção não inclui, aspectos que não estão expressamente excluídos na presente invenção são, no entanto, divulgados aqui.
[0361] Uma série de modalidades da presente invenção foram descritas. No entanto, um técnico no assunto, sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção, pode fazer várias alterações e modificações na presente invenção para adaptá-la a vários usos e condições. Consequentemente, os seguintes exemplos pretendem ilustrar mas não limitar o âmbito da presente invenção reivindicado de qualquer forma.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1 : MÉTODOS
[0362] ELISA de hFVIII de plasma de PNH: placas de 96 poços foram revestidas com anticorpo FVIII específico para humanos durante a noite, lavadas e bloqueadas antes da incubação com amostras diluídas de plasma do indivíduo PNH do estudo. As curvas padrão foram geradas incubando poços adicionais com uma série de diluições de hFVIII deletado do domínio B recombinante, Xyntha® (Pfizer). As placas foram lavadas e subsequentemente incubadas com anticorpo de detecção FVIII específico humano biotinilado. As placas foram incubadas com estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano (HRP), tratadas com substrato TMB e lidas em um leitor de microplacas para determinar a absorbância a 450 nm.
[0363] ELISA de hFVIII de plasma de camundongo: ELISA de hFVIII de plasma de camundongo foi realizado essencialmente como descrito acima para PNHs; no entanto, os anticorpos de captura e detecção usados diferiram.
[0364] Ensaio à base de células para medir a potência de vetores de AAV que codificam transgenes de FVIII humanos: células Huh7 foram plaqueadas em placas de 48 poços a 5x104 células por poço durante a noite. Pós-estudo, o vetor estoque remanescente não diluído e o vetor diluído para dosagem foram preparados em uma curva de dose de 10 vezes (MOI variando de 1x106 - 1x103) em DMEM + FBS a 10% + penicilina/estreptomicina/L-glutamina. O meio existente foi removido das células Huh7 e substituído por meio contendo partículas de vírus. As células foram mantidas a 37 °C e 5% de CO 2 por 72 horas e os sobrenadantes foram coletados e armazenados em placas de microtitulação de baixa retenção a -80 °C até o ensaio de atividade do hFVIII. Os sobrenadantes foram ensaiados por Coatest® SP4 Fator VIII (Chromogenix) com uma curva padrão gerada diluindo hFVIII deletado do domínio B, Xyntha® (Pfizer), em meio de crescimento celular.
[0365] Ensaio baseado em células para medir a eficiência da expressão de proteína dos plasmídeos que codificam transgenes FVIII humanos: células Huh7 foram plaqueadas em placas de 48 poços a 5x104 células por poço durante a noite em DMEM + FBS a 10% + penicilina/estreptomicina/L-glutamina. Os plasmídeos foram preparados usando Plasmid Giga Kit (Qiagen) e transfectados em células a 250 ng por poço usando Polietilenimina (PEI) Máx. As células foram mantidas a 37 °C e 5% de CO 2 por 72 horas e os sobrenadantes foram coletados e armazenados em placas de microtitulação de baixa retenção a -80 °C até o ensaio de atividade do hFVIII. Os sobrenadantes foram ensaiados por Coatest® SP4 Fator VIII (Chromogenix) com uma curva padrão gerada diluindo hFVIII deletado do domínio B, Xyntha® (Pfizer), em meio de crescimento celular. EXEMPLO 2
[0366] A unidade do elemento regulador do construto FIX (SEQ ID NOs: 22 e 23) é composta por um íntron de 321 pb do gene da apolipoproteína E (ApoE) e um promotor de 397 pb do gene da alfa-1 antitripsina humana (hAAT). No geral, esta unidade contém 16 CpGs.
PROJETO DE PROMOTORES REDUZIDOS DE CPG
[0367] Tanto a citosina quanto a guanina dos sítios do CpG foram alteradas dependendo das sequências de consenso. Se nenhum sítio de ligação ao fator de transcrição potencial foi encontrado, a citosina (C) do dinucleotídeo CpG foi substituída por timina (T). Ao fazer isso, a estrutura da pirimidina-purina foi mantida. Em alguns casos, o nucleotídeo C ou todo o dinucleotídeo CpG foi deletado e, em alguns casos, a guanina (G) do dinucleotídeo CpG foi substituída por alanina (A) ou C.
[0368] Usando essa estratégia, 22 sequências diferentes foram geradas com base no elemento regulador ApoE/hAAT. As sequências são ilustradas, com e sem os sítios de enzimas de restrição flanqueadores a 5' e 3', nas SEQ ID NOs: 24-67 abaixo.
CLONAGEM
[0369] Os diferentes promotores foram sintetizados e clonados a montante de uma sequência otimizada por códons (SEQ ID NO: 94) que codifica hFIX.
ESTUDOS COM CAMUNDONGO
[0370] A potência do promotor do gene da alfa-1 antitripsina humana (hAAT) foi avaliada por liberação hidrodinâmica de construtos de plasmídeo em camundongos C57BL/6 machos de 8 semanas de idade do tipo selvagem (Jackson Laboratories). Amostras de plasma sem jejum foram coletadas em heparina, 24 horas após a administração do plasmídeo, por meio da coleta de sangue submandibular. O plasma foi colocado em gelo e armazenado a -80 °C até ser analisado. Todo o trabalho com animais foi realizado de acordo com as diretrizes institucionais e protocolos aprovados.
ESTUDO DA POTÊNCIA
[0371] O plasma coletado foi usado para avaliar a expressão do transgene hFIX.
[0372] Os níveis de atividade do FIX humano foram medidos pelo ensaio do tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT). O ensaio aPTT foi realizado misturando amostra de plasma em uma razão de volume de 1:1:1 com plasma humano deficiente em FIX (George King Bio-Medical, Inc.) e reagente aPTT (Trinity Biotech), seguido por um período de incubação de 180s a 37 °C. A coagulação foi iniciada pela adição de 25 mM de cloreto de cálcio. O tempo para a formação do coágulo foi medido usando um instrumento de coagulação STart 4 (Diagnostica Stago). Uma curva padrão foi gerada com plasma normal agrupado (George King Bio-Medical, Inc.) começando com uma diluição de 1:5 em TBS pH 7,4 (48 μL + 192 μL) seguido por diluições em série 1:2 (120 μL +120 μL). A curva padrão humana foi usada para calcular a atividade de cada amostra na semana 17 após a administração do vetor de AAV; a atividade em dois camundongos não tratados também foi medida. A atividade de FIX em camundongos não tratados foi calculada e então subtraída das amostras tratadas para calcular a atividade extra (ou seja, humana) devido à proteína FIX exógena. Os dados são mostrados na Figura 1.
EXEMPLO 3
[0373] A unidade do elemento regulador do construto FVIII (SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3) é composta por um promotor TTR de 225 pb. No geral, esta unidade contém 4 CpGs.
PROJETO DE PROMOTORES TTR REDUZIDOS DE CPG
[0374] Tanto a citosina quanto a guanina dos sítios do CpG foram alteradas dependendo das sequências de consenso. Se nenhum sítio de ligação potencial fosse encontrado, a citosina do dinucleotídeo CpG era substituída por timina. Ao fazer isso, a estrutura da pirimidina-purina foi mantida. Usando esta estratégia, 5 novas sequências foram geradas com base no elemento regulador TTRm (SEQ ID NO: 3). As sequências TTR reduzidas de CpG, com e sem sítios de enzima de restrição, são ilustradas nas SEQ ID NOs: 4-13.
[0375] Outro conjunto de quatro diferentes promotores TTR híbridos curtos foi projetado. Cinco diferentes promotores específicos do fígado foram avaliados in silico quanto à presença de sítios de ligação aos fatores de transcrição putativos em 1000 nucleotídeos do sítio de início de transcrição (TSS) para seus genes nativos. Posteriormente, os promotores TTR híbridos foram montados escolhendo regiões específicas dos promotores nativos originais e montando-os em tandem. As sequências de TTR híbridas, com e sem sítios de enzimas de restrição, são ilustradas nas SEQ ID NOs: 14-21 abaixo.
CLONAGEM
[0376] Os diferentes promotores foram sintetizados e clonados a montante de uma sequência de nucleotídeos otimizada por códons (SEQ ID NO: 77) que codifica hFVIII-BDD.
ESTUDOS COM CAMUNDONGO
[0377] A potência dos promotores TTR foi avaliada inicialmente por liberação hidrodinâmica em camundongos C57BL/6 machos de 8 semanas de idade do tipo selvagem (laboratórios Jackson). Amostras de plasma sem jejum foram coletadas em heparina 24 horas após a administração do plasmídeo por meio da coleta de sangue submandibular. O plasma foi colocado em gelo e armazenado a -80 °C até ser analisado. Para estudos de liberação de AAV, os primeiros 0,5 mL de sangue foram descartados e a amostra restante foi coletada em EDTA e processada em plasma. Todo o trabalho com animais foi realizado de acordo com as diretrizes institucionais e protocolos aprovados.
NÍVEIS DE ANTÍGENO HFVIII EM PLASMA MURINO
[0378] Os níveis do produto do transgene hFVIII no plasma murino foram quantificados usando ELISA tipo sanduíche da seguinte forma: primeiro, os poços de uma placa de microtitulação foram revestidos com um anticorpo de captura anti-hFVIII (Green Mountain Antibodies, diluído para 2 µg/mL). No dia seguinte, a placa foi lavada quatro vezes e bloqueada (6% de BSA, 0,2% de Tween 20 em PBS) por 30 minutos à temperatura ambiente. O plasma murino reunido foi enriquecido com uma concentração conhecida de hFVIII deletado do domínio B recombinante (XYNTHA Solofuse®) e foi diluído em série (1:2) para gerar uma curva padrão de 8 pontos variando de 300 ng/mL a 2,34 ng/mL. O limite de quantificação do ensaio é 4,8 ng/mL. Três níveis de amostras de controle de qualidade foram preparados e incluídos em cada placa para avaliar o desempenho do ensaio. Após adição das amostras aos poços, a placa foi incubada a 37 °C durante 1 hora e depois lavada quatro vezes. Um anticorpo de detecção anti-hFVIII biotinilado (Green Mountain Antibodies, diluído para 1 µg/mL) foi adicionado à placa durante 1 hora à temperatura ambiente para se ligar à proteína hFVIII capturada. Após a lavagem, um reagente de estreptavidina conjugado com peroxidase (Thermo Fisher Scientific) a uma diluição de 1:5000 foi adicionado à placa por 30 minutos à temperatura ambiente para se ligar ao anticorpo anti-hFVIII biotinilado. Após a lavagem da placa para remover o anticorpo conjugado não ligado, a atividade da peroxidase foi revelada após uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente com substrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). A reação foi interrompida com Stop Solution de TMB e a placa foi lida por um leitor de placas de absorbância para densidade óptica (DO). Os valores de absorbância obtidos são proporcionais à concentração de hFVIII presente na amostra de plasma. Os dados são mostrados nas Figuras 2-5.
ISOLAMENTO DE RNA E QPCR
[0379] Tecidos de cérebro, testículos, rim, baço e fígado de camundongo foram colhidos, enxaguados com DPBS, cortados/triturados em vários pedaços minúsculos e ~ 30 mg foram usados para isolamento de RNA, realizado conforme descrito no protocolo do kit (RNeasy Plus Mini Kit Universal, Qiagen). As concentrações de RNA foram medidas usando um instrumento Nanodrop 2000, e as amostras foram diluídas para 150 ng/µL sem nuclease. O tratamento com DNase foi feito usando o kit Turbo DNA Free (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Para a reação de cDNA, 200 ng de RNA foram usados conforme indicado no High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (ABI). As amostras de cDNA foram diluídas 5 vezes e 20 ng de cDNA foram usados na reação de PCR. PCR quantitativo em tempo real foi realizado usando o iniciador direto: 5'-TGAGGAGGCTGAAGACTATGA-3' (SEQ ID NO: 95), o iniciador reverso: 5'-CCACAGACCTGATCTGAATGAA-3' (SEQ ID NO: 96) e uma sonda: 5'-56-FAM- TGGATGTGG/ZEN/TGAGGTTTGATGATGACA-3IABkFQ-3' (SEQ ID NO: 97). O gene murino da actB (Integrated DNA Technologies) serviu como o gene de manutenção para a normalização. Os dados são mostrados na Figura 6. EXEMPLO 4
[0380] A expressão do Fator VIII foi aumentada pela alteração dos elementos dentro do cassete de expressão que contribuem para a expressão do transgene. Uma versão livre de íntrons de um vetor de AAV expressando hFVIII deletado do domínio B (AAV-INTL) foi feita e comparada com uma versão contendo íntrons (AAV-WINT). O cassete de expressão AAV-INTL hFVIII (SEQ ID NO: 1) contém os mesmos elementos que o cassete de expressão AAV-WINT hFVIII, exceto que AAV-WINT hFVIII tem um íntron sintético (SEQ ID NO: 93) posicionado entre um promotor TTRm e um transgene que codifica o Fator VIII humano deletado do domínio B (Figura 7). EXEMPLO 5: POTÊNCIA EM CAMUNDONGOS
[0381] Para avaliar a potência do cassete livre de íntrons (TTRm hFVIII livre de íntrons; SEQ ID NO: 1) versus o cassete com o íntron (TTRm hFVIII) em mamíferos, camundongos C57BL/6 machos (Jackson Laboratories) de aproximadamente 8 semanas de idade foram injetado por via intravenosa na veia lateral da cauda com cassetes encapsidados de AAV em dosagens de 6,4e9 ou 1,6e10 vg/camundongo. O plasma foi coletado em vários pontos de tempo, conforme indicado (Figuras 8 e 9), e avaliado quanto aos níveis de hFVIII circulante por ELISA de hFVIII.
[0382] A determinação dos níveis de hFVIII mostrou que TTRm hFVIII livre de íntrons exibiu um aumento significativo na potência versus TTRm hFVIII (com o íntron) (Figuras 8 e 9), e este efeito foi observado em ambas as doses e pontos de tempo testados (estudo #1). Estes resultados foram repetidos em um estudo subsequente, estudo #2, com a dose de 1,6e10 vg/camundongo com 10 camundongos em cada grupo (Figura 10). O estudo #2 confirmou que TTRm hFVIII livre de íntrons (AAV-INTL) foi mais potente do que o vetor contendo o íntron sintético (AAV-WINT), e que essas diferenças foram sustentadas por pelo menos 8 semanas. EXEMPLO 6: POTÊNCIA EM PNHS, ESTUDO 1
[0383] As potências do vetor de AAV de AAV-INTL e AAV-WINT foram comparadas em PNHs (estudo #1). 12 macacos cynomolgus machos (Macaca fascicularis) com idades entre 24 e 50 meses, com pesos entre 2-6 kg e negativos para anticorpos neutralizantes para AAV, foram divididos em 4 grupos randomizados e injetados por via intravenosa com uma única dose de AAV-WINT ou AAV-INTL com base nos grupos de dosagem mostrados na Tabela 1. Posteriormente, amostras de plasma foram obtidas semanalmente para determinar os níveis de hFVIII circulante.
TABELA 1. DESIGNAÇÃO DE GRUPO E NÍVEIS DE DOSAGEM
DO ESTUDO DE PNH Nº de Animais Nível da dose Concentração da Grupo # (Machos) (vg/kg) dose (vg/kg) 1 (AAV-WINT 3 2,0 x 1012 2,0 x 1011 baixo) 2 (AAV-WINT alto) 3 6,0 x 1012 6,0 x 1011 3 (AAV-INTL baixo) 3 2,0 x 1012 2,0 x 1011 4 (AAV-INTL alto) 3 6,0 x 1012 6,0 x 1011
[0384] Os níveis de hFVIII no plasma de macacos doseados tanto com AAV-WINT ou AAV-INTL foram determinados por ELISA em intervalos semanais ao longo do estudo de 8 semanas. Em qualquer dose testada neste estudo, 2e12 vg/kg (Figura 11) ou 6e12 vg/kg (Figura 12), um aumento nos níveis de hFVIII circulante de 2 a 4 vezes com base no valor circulante de pico, independentemente do ponto no tempo, foi observado. Como esperado, foi observada perda de expressão 2-3 semanas após o tratamento, indicando o desenvolvimento de anticorpos inibidores para BDD hFVIII. Os resultados do primeiro estudo demonstram que AAV-INTL apresenta maior potência em comparação ao AVV-WINT em PNHs. EXEMPLO 7: POTÊNCIA EM PNHS, ESTUDO 2
[0385] Um segundo estudo (estudo #2) foi realizado em PNHs para confirmar a potência aumentada do vetor de AAV-INTL versus AAV-WINT. Dez macacos cynomolgus machos (Macaca fascicularis) com idades entre 24 e 50 meses, com peso entre 2-6 kg e negativos para anticorpos neutralizantes para AAV, foram divididos em 2 grupos randomizados e injetados por via intravenosa com uma dose única (2e12 vg/kg) de AAV-WINT ou AAV-INTL. Posteriormente, amostras de plasma foram obtidas semanalmente para determinar os níveis de hFVIII circulante.
[0386] Os níveis de hFVIII no plasma de macacos doseados tanto com AAV-WINT ou AAV-INTL foram determinados por ELISA em intervalos semanais ao longo do estudo de 8 semanas. Na dose testada neste estudo, 2e12 vg/kg, foi observado um aumento nos níveis de hFVIII circulante de 4 a 7 vezes, com base no valor circulante de pico, independentemente do ponto no tempo (Figura 13). Como visto anteriormente em PNHs, foi observada perda de expressão do transgene 2-3 semanas após o tratamento, devido ao desenvolvimento de anticorpos inibidores para BDD hFVIII. Os resultados do estudo # 2 confirmaram que AAV-INTL apresenta maior potência em comparação ao AVV-WINT em PNHs. EXEMPLO 8: DETERMINAÇÃO DA POTÊNCIA DO VETOR
[0387] Para confirmar que o vetor correto, na concentração adequada, foi dosado em cada grupo de PNHs, os títulos da formulação de dosagem foram determinados por qPCR, e a presença ou ausência do íntron sintético em vetores estoque foi analisada por ensaios de genotipagem de PCR que permitem a diferenciação entre AAV-WINT e AAV-INTL. Para avaliar diretamente a potência do vetor de ambos os vetores estoque não diluídos e as formulações de dosagem de 2e12 vg/kg, foi usado um ensaio de potência baseado em células.
[0388] Uma linhagem celular de fígado humano foi transduzida com uma série de diluições do vetor, e a potência foi determinada avaliando BDD hFVIII secretado no sobrenadante por um ensaio da atividade de hFVIII (Chromogenix Coatest SP4). Em todos as MOI, AAV-INTL exibiu potência aumentada versus AAV-WINT (Figura 14). Notavelmente, o vírus estoque e as formulações de diluição mostraram potência semelhante dentro dos grupos de vetores, confirmando ainda que os títulos das formulações de dosagem no grupo de 2e12 vg/kg foram preparados adequadamente. Além disso, em cada MOI, quando comparado com AAV-WINT, AAV-INTL exibiu um aumento da potência de aproximadamente 4 vezes (Figura 15). Esses valores estão de acordo com o aumento da potência de AAV-INTL observada nos estudos de
PNH 1 e 2. EXEMPLO 9: COMPARAÇÃO DE LOTE
[0389] Os primeiro e segundo estudos de PNH usaram diferentes lotes de vetores de AAV-WINT e AAV-INTL. Para avaliar se a potência do vetor nos diferentes lotes era comparável, a potência foi medida usando um ensaio in vitro (Figura 16). Os resultados dessas comparações mostram que a variação de lote para lote foi mínima e que AAV-INTL permaneceu de forma semelhante cerca de 4 a 5 vezes mais potente do que AAV-WINT. EXEMPLO 10: DETERMINAÇÃO DA EFICIÊNCIA DO CASSETE
DE EXPRESSÃO
[0390] Para explorar o mecanismo de aumento da potência in vivo, a eficiência transcricional na ausência de transdução viral foi determinada. Uma linhagem celular de fígado humano foi transfectada com plasmídeos contendo os cassetes de expressão que constituem AAV-WINT e AAV-INTL, TTRm-íntron-BDD-hFVIII e TTRm-BDD-hFVIII livres de íntrons (SEQ ID NO: 1), respectivamente. Os sobrenadantes destas células foram testados quanto aos níveis de hFVIII por um ensaio de atividade de FVIII humano (Chromogenix Coatest SP4).
[0391] A comparação de três preparações de DNA independentes de TTRm-íntron-BDD-hFVIII e duas preparações independentes de DNA de TTRm-BDD-hFVIII livre de íntrons (SEQ ID NO: 1) exibiram níveis semelhantes de hFVIII, com uma tendência para a diminuição da expressão após a remoção de íntron (Figura 17). Embora não desejando ser limitado por nenhuma teoria, os dados sugerem que um mecanismo não transcricional está conduzindo o aumento da potência de AAV-INTL sobre AAV-WINT. EXEMPLO 11: DISCUSSÃO DE DADOS
[0392] Em doses equivalentes, AAV-INTL exibe potência e expressão aumentadas de BDD-hFVIII em modelos de cultura de células, camundongos e PNH, em relação ao AVV-WINT. Mecanicamente, a potência aumentada não foi aparentemente devido ao a transcrição aumentada do transgene FVIII do cassete de expressão e, em vez disso, talvez seja devido à eficiência do empacotamento viral ou mecanismos alternativos aumentados. Esses resultados indicam que os cassetes de expressão livres de íntrons podem ter potência aumentada em ensaios clínicos em humanos e fornecer benefícios para a segurança e eficácia do paciente. EXEMPLO 12: RESULTADOS DO ENSAIO CLÍNICO EM
HUMANOS
[0393] Um estudo de dose única foi realizado em quatro homens (n=4) com hemófila A, delineados na Tabela 4. Todos os quatro participantes receberam uma única infusão do cassete de expressão AAV-INTL hFVIII-BDD (SEQ ID NO: 1) encapsidado no vetor de AAV LK03 (SEQ ID NO: 91), referido neste documento como "LK03-INTL hFVIII-BDD," em uma dose de 5x1011 vg/kg. TABELA 4. Semanas de Idade Participante acompanhamento pós- (anos) infusão com vetor 1 840-09-601 28 21 2 840-02-601 18 17 3 840-02-602 63 9 4 840-10-601 63 5
[0394] Foi observado que o vetor LK03-INTL hFVIII-BDD dirigiu a expressão de FVIII em todos os quatro participantes (Figs. 18-19). EXEMPLO 13: SEQUÊNCIAS
TABELA 2. SEQ ID NOS E DESCRIÇÕES SEQ ID NO Descrição SEQ ID NO: 1 Sequência de ácido nucleico completa do cassete AAV- INTL (ITR de 5', TTRm, sequência de codificação de hFVIII-BDD (SEQ ID NO: 77), PoliA e 3'ITR). SEQ ID NO: 2 Sequência de ácido nucleico do promotor TTR do tipo selvagem.
SEQ ID NO: 3 Sequência de ácido nucleico do promotor TTR mutado "TTRm", tendo 4 alterações de nucleotídeos do tipo selvagem.
SEQ ID NO: 4 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG1-TTRm, em que cada C é alterado para T para todos os quatro CpGs.
SEQ ID NO: 5 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG1-TTRm, em que cada C é alterado para T para todos os quatro CpGs com sítios de enzima de restrição.
SEQ ID NO: 6 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG2-TTRm, em que C é alterado para T no segundo, terceiro e quarto CpG.
SEQ ID NO: 7 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG2-TTRm, em que C é alterado para T no segundo, terceiro e quarto CpG com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 8 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG3-TTRm, em que C é alterado para T no primeiro, terceiro e quarto CpG.
SEQ ID NO: 9 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG3-TTRm, em que C é alterado para T no primeiro, terceiro e quarto CpG com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO Descrição SEQ ID NO: 10 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG4-TTRm, em que C é alterado para T no primeiro, segundo e quarto CpG.
SEQ ID NO: 11 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG4-TTRm, em que C é alterado para T no primeiro, segundo e quarto CpG com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 12 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG5-TTRm, em que C é alterado para T no primeiro, segundo e terceiro CpG.
SEQ ID NO: 13 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG5-TTRm, em que C é alterado para T no primeiro, segundo e terceiro CpG com sítios de enzima de restrição.
SEQ ID NO: 14 Sequência de ácido nucleico do promotor Hybrid6. SEQ ID NO: 15 Sequência de ácido nucleico do promotor Hybrid6 com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 16 Sequência de ácido nucleico do promotor Hybrid7. SEQ ID NO: 17 Sequência de ácido nucleico do promotor Hybrid7 com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 18 Sequência de ácido nucleico do promotor Hybrid8. SEQ ID NO: 19 Sequência de ácido nucleico do promotor Hybrid8 com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 20 Sequência de ácido nucleico do promotor Hybrid9. SEQ ID NO: 21 Sequência de ácido nucleico do promotor Hybrid9 com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 22 Sequência de ácido nucleico do elemento regulador ApoE/hAAT não reduzido de CpG.
SEQ ID NO Descrição SEQ ID NO: 23 Sequência de ácido nucleico do elemento regulador ApoE/hAAT não reduzido de CpG com sítios de enzima de restrição de flanqueamento.
SEQ ID NO: 24 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG1- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 25 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG1- ApoE/hAAT com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 26 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG2- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 27 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG2- ApoE/hAAT com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 28 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG3- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 29 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG3- ApoE/hAAT com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 30 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG4- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 31 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG4- ApoE/hAAT com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 32 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG5- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 33 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG5- ApoE/hAAT com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 34 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG6- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 35 Sequência de ácido nucleico de CpG6-ApoE/hAAT com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO Descrição SEQ ID NO: 36 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG7- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 37 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG7- ApoE/hAAT com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 38 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG8- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 39 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG8- ApoE/hAAT com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 40 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG9- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 41 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG9- ApoE/hAAT com sítios de enzima de restrição.
SEQ ID NO: 42 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG10- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 43 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG10- ApoE/hAAT com sítios de enzima de restrição.
SEQ ID NO: 44 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG11- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 45 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG11- ApoE/hAAT com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 46 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG12- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 47 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG12- ApoE/hAAT com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 48 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG13- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 49 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG13- ApoE/hAAT com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO Descrição SEQ ID NO: 50 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG14- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 51 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG14- ApoE/hAAT com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 52 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG15- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 53 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG15- ApoE/hAAT com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 54 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG16- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 55 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG16- ApoE/hAAT com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 56 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG17- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 57 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG17- ApoE/hAAT com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 58 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG18- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 59 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG18- ApoE/hAAT com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 60 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG19- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 61 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG19- ApoE/hAAT com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 62 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG20- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 63 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG20- ApoE/hAAT com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO Descrição SEQ ID NO: 64 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG21- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 65 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG21- ApoE/hAAT com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 66 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG22- ApoE/hAAT.
SEQ ID NO: 67 Sequência de ácido nucleico do promotor CpG22- ApoE/hAAT com sítios de enzimas de restrição.
SEQ ID NO: 68 A sequência de aminoácidos de FVIII-BDD.
SEQ ID NO: 69 A sequência de aminoácidos de SFSQNPPVLKRHQR (“sequência SQ”). SEQ ID NO: 70 A sequência de ácido nucleico do tipo selvagem que codifica FVIII-BDD.
SEQ ID NO: 71 Sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD.
SEQ ID NO: 72 Sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD.
SEQ ID NO: 73 Sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD.
SEQ ID NO: 74 Sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD.
SEQ ID NO: 75 Sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD.
SEQ ID NO: 76 Sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD.
SEQ ID NO: 77 Sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD.
SEQ ID NO: 78 Sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD.
SEQ ID NO: 79 Sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD.
SEQ ID NO: 80 Sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD.
SEQ ID NO: 81 Sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD.
SEQ ID NO: 82 Sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD.
SEQ ID NO: 83 Sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD.
SEQ ID NO: 84 Sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD.
SEQ ID NO: 85 Sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD.
SEQ ID NO Descrição SEQ ID NO: 86 Sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD. SEQ ID NO: 87 Sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD. SEQ ID NO: 88 Sequência de ácido nucleico que codifica FVIII-BDD. SEQ ID NO: 89 cDNA que codifica FVIII-V3 SEQ ID NO: 90 cDNA que codifica FVIII-CO3 SEQ ID NO: 91 Proteína do capsídeo LK03 SEQ ID NO: 92 Proteína do capsídeo SPK SEQ ID NO: 93 Sequência de ácido nucleico do íntron no cassete AAV- WINT. SEQ ID NO: 94 Ácido nucleico que codifica FIX humano SEQ ID NO: 95 Iniciador direto SEQ ID NO: 96 Iniciador reverso SEQ ID NO: 97 Sonda
[0395] Sequência de ácido nucleico completa do cassete de expressão AAV-INTL (ITR de 5', TTRm, hFVIII-BDD, PoliA e ITR de 3') (SEQ ID NO: 1) e legenda (Tabela 3): cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgaccttt ggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct gtcgacgtgtctgtctgcacatttcgtagagcgagtgttccgatactctaatctccctaggcaaggttcatattgact taggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttggagtcagcttggcagggatcag cagcctgggttggaaggagggggtataaaagccccttcaccaggagaagccgtcacacagatccacaagc tcctgctagcgtttaaacgccaccatgcagattgagctgagcacctgcttcttcctgtgtctgctgaggttctgcttct ctgccaccaggaggtattacctgggggctgtggagctgagctgggactatatgcagtctgacctgggggagct gcctgtggatgctaggttcccccccagggtgcccaagagcttcccctttaacacttctgtggtgtacaagaagac cctgtttgtggagttcactgaccacctgttcaacattgccaagcccaggcccccctggatggggctgctggggc ccaccatccaggctgaggtgtatgacactgtggtgatcaccctgaagaacatggccagccaccctgtgagcct gcatgctgtgggggtgagctactggaaggcttctgagggggctgagtatgatgaccagactagccagaggg agaaggaggatgacaaggtgtttcctgggggcagccatacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggc cccatggcctctgaccccctgtgcctgacctacagctacctgtctcatgtggacctggtgaaggacctgaactct ggcctgattggggctctgctggtgtgtagggagggcagcctggctaaggaaaagacccagaccctgcataa gtttatcctgctgtttgctgtgtttgatgagggcaagagctggcactctgagaccaagaacagcctgatgcagga tagggatgctgcctctgccagggcttggcctaagatgcacactgtgaatgggtatgtgaataggagcctgcctg gcctgattggctgccacaggaagtctgtgtactggcatgtgattgggatgggcaccacccctgaggtccatagc atcttcctggagggccacactttcctggtgaggaaccacagacaggcctctctggagatctctcccatcaccttc ctgactgctcagactctgctgatggacctgggccagttcctgctgttttgccatattagcagccaccagcatgatg ggatggaggcctatgtgaaggtggatagctgccctgaggagcctcagctgaggatgaagaacaatgagga ggctgaagactatgatgatgacctgactgattctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaatagcccca gcttcattcagatcaggtctgtggccaagaaacaccccaagacctgggtgcactacattgctgctgaggaaga ggactgggactatgctcccctggtgctggcccctgatgataggtcttataagagccagtacctgaacaatgggc cccagaggattggcaggaagtacaagaaggtgaggttcatggcctacactgatgaaaccttcaaaaccagg 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gcagtctgatcaggaggagattgactatgatgacactatctctgtggagatgaagaaggaggactttgacatct atgatgaggatgagaatcagtctcccaggagctttcagaagaagaccagacattacttcattgctgctgtggag aggctgtgggactatggcatgagctctagccctcatgtgctgaggaacagggcccagtctggctctgtgcccc agttcaagaaggtggtgttccaggaattcactgatggcagcttcacccagcccctgtacaggggggagctga atgagcacctgggcctgctggggccttatatcagggctgaggtggaggataatattatggtgactttcaggaac caggccagcaggccctactctttctatagcagcctgatctcttatgaggaggatcagaggcagggggctgagc ctaggaagaactttgtgaagcccaatgagactaagacctacttctggaaggtccagcaccacatggccccta ccaaggatgagtttgactgcaaggcctgggcctatttctctgatgtggatctggagaaggatgtccattctgggct gattggccccctgctggtgtgccacactaacactctgaatcctgcccatggcaggcaggtgactgtccaggagt ttgccctgttcttcactatctttgatgagaccaagagctggtactttactgagaacatggagaggaactgcagag ctccttgcaatattcagatggaggaccccaccttcaaggagaattacaggttccatgccattaatgggtacatca tggacaccctgcctggcctggtgatggctcaggaccagaggatcaggtggtacctgctgagcatgggctctaa tgagaatatccacagcatccacttctctgggcatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggct ctgtataatctgtaccctggggtgtttgaaactgtggagatgctgccctctaaggctggcatctggagggtggagt gcctgattggggagcacctgcatgctggcatgagcaccctgttcctggtgtacagcaacaagtgccagacccc cctgggcatggcctctggccacatcagggacttccagatcactgcctctggccagtatggccagtgggccccc aagctggccaggctgcactattctggcagcatcaatgcctggagcaccaaggagcccttcagctggatcaag gtggacctgctggcccccatgatcattcatggcatcaagacccagggggccaggcagaagttcagctctctgt acatctctcagttcatcatcatgtactctctggatgggaagaagtggcagacctacaggggcaacagcactgg caccctgatggtgttctttgggaatgtggactcttctggcatcaagcacaacatcttcaatccccccatcattgcta ggtatattaggctgcatcccacccactacagcatcaggtctaccctgaggatggagctgatgggctgtgacctg aactcttgcagcatgcccctgggcatggagtctaaggccatctctgatgcccagattactgccagcagctacttc accaacatgtttgccacctggagcccctctaaggccaggctgcatctgcaggggaggagcaatgcctggag gcctcaggtgaacaaccccaaggagtggctgcaggtggatttccagaagaccatgaaggtgactggggtga ccacccagggggtcaagagcctgctgaccagcatgtatgtgaaggagttcctgatcagcagcagccaggat ggccaccagtggactctgttctttcagaatgggaaggtgaaggtgtttcagggcaatcaggactctttcacccct gtggtgaacagcctggacccccccctgctgaccagatacctgaggatccacccccagtcttgggtgcatcag attgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaggctcaggatctgtactgagcggccgcaataaaagatcag agctctagagatctgtgtgttggttttttgtgtaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctc gctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgag cgagcgagcgcgcagctgcctgcagg
TABELA 3. CARACTERÍSTICAS DA SEQ ID NO: 1 Nome Tipo Começo Fim ITR de 5' de AAV2 repetir região 1 141 Promotor TTRm promotor 148 372 hFVIII otimizado por códons sequência de 392 4,765 deletado do domínio B codificação Coelho beta-globina poliA sinal poliA 4,774 4,819 AAV2 de ITR 3' repetir região 4,820 4,960
[0396] Promotor TTR do tipo selvagem (SEQ ID NO: 2). Os 4 nucleotídeos sublinhados são alterados no promotor TTR mutado (SEQ ID NO: 3), abaixo. gtgtctgtctgcacatttcgtagagcgagtgttccgatactctaatctccctaggcaaggttcatatttgtgtaggtta cttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttgccccagccagtcagcttgggcgggggg acaagtacagcttgggcggggggacagtcagcttgggcggggggacagtactagcttgggcggggggaca gtacttaccttgggcgggggacagtacttaccttgggcggggggacagtcagcttgggtggggggacagtact acttgggcggggggacagtacagcttgggcggggggacagtacagcttgggcggggggaca
[0397] Promotor TTR mutado (alterações de 4 nucleotídeos; sublinhado) "TTRm" (SEQ ID NO: 3): gtgtctgtctgcacatttcgtagagcgagtgttccgatactctaatctccctaggcaaggttcatattgacttaggtt acttattctccttttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttggagccagccagccagcctactgatgt caataatcagaatcagcaggtttggagccagccagccagcctactgcaggggatcagccagcctactgcag gggatcagccagcctactgatgggggatcagccagcctactaggtggggatcagccagcctacttacgtggg gatcagccagcc
[0398] Sequência de ácido nucleico de CpG1-TTRm (SEQ ID NO: 4). Em CpG1, todo C é alterado para T para todos os quatro CpGs (sublinhado duplo). Os sítios de restrição MluI (acgcgt) e PmeI (gtttaaac) estão nas extremidades 5' e 3', respectivamente, quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FVIII. SEQ ID NO: 5 é CpG1-TTRm com esses sítios de enzima de restrição (sublinhado).
[0399] SEQ ID NO: 4: gtgtctgtctgcacattt tgtagagtgagtgttctgatactctaatctccctaggcaaggttcatat tgacttaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttggagtca gcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggag ggggtataaaagccccttcaccagg agaagctgtcacacagatccacaagctcctg
[0400] SEQ ID NO: 5: acgcgtgtctgtctgcacattt tgtagagt gagtgttctgatactctaatct ccctaggcaaggtt catattgacttaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttgg agtcagcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggag ggggtataaaagccccttcac caggagaagctgtcacacag atccacaagctcct gtttaaac
[0401] Sequência de ácido nucleico de CpG2-TTRm (SEQ ID NO: 6). Em CpG2, o C é alterado para T no segundo, terceiro e quarto CpG (sublinhado duplo). Os sítios de restrição MluI (acgcgt) e PmeI (gtttaaac) estão nas extremidades 5' e 3', respectivamente, quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FVIII. SEQ ID NO: 7 é CpG2-TTRm com esses sítios de enzima de restrição (sublinhado).
[0402] SEQ ID NO: 6: gtgtctgtctgcacattt cgtagagtgagtgt tctgatactctaatctccctaggcaaggttcatat tgacttaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttggagtca gcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggag ggggtataaaagccccttcaccagg agaagctgtcacacagatccacaagctcctg
[0403] SEQ ID NO: 7: acgcgtgtctgtctgcacattt cgtagagtgagtgttctgatactctaatctccctaggcaaggtt catattgacttaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttgg agtcagcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggag ggggtataaaagccccttcac caggagaagctgtcacacagatccacaagctcct gtttaaac
[0404] Sequência de ácido nucleico de CpG3-TTRm (SEQ ID NO: 8). Em CpG3, o C é alterado para T no primeiro, terceiro e quarto CpG (sublinhado duplo). Os sítios de restrição MluI (acgcgt) e PmeI (gtttaaac) estão nas extremidades 5' e 3', respectivamente, quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FVIII. SEQ ID NO: 9 é CpG3-TTRm com esses sítios de enzima de restrição (sublinhado).
[0405] SEQ ID NO: 8: gtgtctgtctgcacattt tgtagagcgagtgt tctgatactctaatctccctaggcaaggttcatat tgacttaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttggagtca gcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggag ggggtataaaagccccttcaccagg agaagctgtcacacagatccacaagctcctg
[0406] SEQ ID NO: 9: acgcgtgtctgtctgcacattt tgtagagcgagtgttctgatactctaatct ccctaggcaaggtt catattgacttaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttgg agtcagcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggag ggggtataaaagccccttcac caggagaagctgtcacacagatccacaagctcct gtttaaac
[0407] Sequência de ácido nucleico de CpG4-TTRm (SEQ ID NO: 10). Em CpG4, o C é alterado para T no primeiro, segundo e quarto CpG (sublinhado duplo). Os sítios de restrição MluI (acgcgt) e PmeI (gtttaaac) estão nas extremidades 5' e 3', respectivamente, quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FVIII. SEQ ID NO: 11 é CpG4-TTRm com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados).
[0408] SEQ ID NO: 10: gtgtctgtctgcacattt tgtagagtgagtgttccgatactctaatctccctaggcaaggttcatat tgacttaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttggagtca gcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggagggggta taaaagccccttcaccagg agaagctgtcacacagatccacaagctcctg
[0409] SEQ ID NO: 11: acgcgtgtctgtctgcacattt tgtagagt gagtgttccgatactctaatctccctaggcaaggtt catattgacttaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttgg agtcagcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggagggggtataaaagcccct tcac caggagaagctgtcacacagatccacaagctcct gtttaaac
[0410] Sequência de ácido nucleico de CpG5-TTRm (SEQ ID NO: 12). Em CpG5, o C é alterado para T no primeiro, segundo e terceiro CpG
(sublinhado duplo). Os sítios de restrição MluI (acgcgt) e PmeI (gtttaaac) estão nas extremidades 5' e 3', respectivamente, quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FVIII. SEQ ID NO: 13 é CpG5-TTRm com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados).
[0411] SEQ ID NO: 12: gtgtctgtctgcacattt tgtagagtgagtgttctgatactctaatctccctaggcaaggttcatat tgacttaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttggagtca gcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggag ggggtataaaagccccttcaccagg agaagccgtcacacagatccacaagctcctg
[0412] SEQ ID NO: 13: acgcgtgtctgtctgcacattt tgtagagt gagtgttctgatactctaatctccctaggcaaggtt catattgacttaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttgg agtcagcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggag ggggtataaaagccccttcac caggagaagccgtcacacagatccacaagctcct gtttaaac
[0413] Sequência de ácido nucleico do promotor Hybrid6 (híbrido de TTR/hAAT/albumina) (SEQ ID NO: 14). O G é alterado para A no único dinucleotídeo CpG (sublinhado duplo). Os sítios de restrição MluI (acgcg) e PmeI (gtttaaac) estão nas extremidades 5' e 3', respectivamente, quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FVIII. (Itálico = TTR, Sublinhado = albumina, Negrito = hAAT.) SEQ ID NO: 15 é o promotor Hybrid6 com esses sítios de enzima de restrição.
TAGGCAAGGTTCATATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGCCTGCTGAC CTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCA GATGAATTTTGTAATCAGTTCCCTTGAGTCATTAAAAAATATAAAACAAAG ATGAGTCTAGTTAATAATCTACAAT
[0414] Sequência de ácido nucleico do promotor Hybrid7 (híbrido TTR/hAAT) (SEQ ID NO: 16). O C é alterado para T em ambos os dinucleotídeos CpG (sublinhado duplo). Os sítios de restrição MluI (acgcg) e PmeI (gtttaaac) estão nas extremidades 5' e 3', respectivamente, quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FVIII. (Itálico = TTR, Negrito
= hAAT.) SEQ ID NO: 17 é o promotor Hybrid7 com esses sítios de enzima de restrição.
TAGGCAAGGTTCATATTGACTTAGGTTACTTATT CTCCTTTTGAT A ACTGGGGTG ACCTTGGTT AAT ATTCACCAGC AGAGTCAGCTTGG CAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAA TGAT AACTGGGGTGACCTTGGTTAAT ATTCACCAGCA
[0415] Sequência de ácido nucleico do promotor Hybrid8 (TTR/FGG (promotor do gene da cadeia gama do fribrinogênio)/promotor híbrido da albumina) (SEQ ID NO: 18). O G é alterado para A no único dinucleotídeo CpG (sublinhado duplo). Os sítios de restrição MluI (acgcgt) e PmeI (gtttaaac) estão nas extremidades 5' e 3', respectivamente, quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FVIII. (Sublinhado = albumina, Sublinhado itálico = FGG, Itálico = TTR.) SEQ ID NO: 19 é o promotor Hybrid8 com eses sítios de enzimas de restrição.
ACTCCCTTGAGTCATTAAAAAAATATATTTGGTAATTCATAAACCTTACAAAC ATTTACTTAACACTTACCATGAATTGGGTAATGTGCTCAATTGACTTAGGTT ACTTATTCTCCTTTTGAATTTTTTGGCAAGAATATTATGAATTTTGTAATCAG TTATAAAGGCAGCCAATGAAATACAAAGATGAGTCTAGTTAATAATCTACAA T
[0416] Sequência de ácido nucleico do promotor Hybrid9 (híbrido de TTR/FGG/hAAT/SAA1) (SEQ ID NO: 20). O C é alterado para T em todos os três dinucleotídeos CpG (híbrido). Sítios de restrição MluI (acgcgt) e PmeI (tttaaac) nas extremidades 5' e 3', respectivamente, quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FVIII. (Itálico = TTR, Negrito = hAAT, Sublinhado itálico = FGG, Sublinhado negrito = SAA1.) SEQ ID NO: 21 é o promotor Hybrid9 com esses sítios de enzimas de restrição.
TAGGCAAGGTTCATATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTGGGTGACTCA GATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCTGATAACTGGGGT GACCTTGGTTAATATTCACCAGCATTTTTGAGTCAATAATAATGTTAACTGA TCCCTAGGCTATAAAATAATAGTGTTAACTGATCCCTGTGCAGTGGTGTGA TTATAG
[0417] Sequência de ácido nucleico do elemento regulador ApoE/hAAT não reduzido de CpG (SEQ ID NO: 22). A sequência contém um total de CpGs (sublinhado duplo). O sítio do C/EBP (proteína de ligação CCAAT/enhancer) está sublinhado. atgccacctccaacatccact cgaccccttggaattt cggtggagaggagcagaggttgtcct ggcgtggtttaggtagtgtgagaggggtacc cggggatcttgctaccagtggaacagccact aaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagactgtct gact cacgccaccccctccaccttggacacagga cgctgtggtttctgagccaggtacaatgact c ctttcggtaagtgcagtggaagctgtacact gcccaggcaaag cgtccgggcagcgtaggc gggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctc cgataactggggtgac cttggttaatattcaccagcagcctcccc cgttgcccctctggatccactgcttaaata cggac gaggaca
[0418] Sequência de ácido nucleico da unidade reguladora ApoE/hAAT não reduzida de CpG flanqueada nas extremidades 5' e 3' por sítios de restrição ApaI (SEQ ID NO: 23). A sequência contém um total de 16 CpGs (sublinhado duplo). Os sítios de restrição ApaI foram usados quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. gggcccat gccacctccaacatccact cgaccccttggaattt cggtggagaggagcagag gttgtcctggcgtggtttaggtagtgt gagaggggt acc cggggatcttgctaccagtggaac agccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagact gtctgactcacgccaccccctccaccttggacacagga cgctgtggtttctgagccaggt aca atgactccttt cggtaagtgcagtggaagct gtacactgcccaggcaaag cgtccgggcagc gtaggc gggcgactcagatcccagccagt ggacttagcccctgtttgctcctc cgataactgg ggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccc cgttgcccctctggatccactgcttaaata cggacgaggacagggccc
[0419] Sequência de ácido nucleico de CpG1-ApoE/hAAT (SEQ ID NO: 24). Cada C mudou para T, exceto no sétimo CpG, onde G é alterado para A. Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 25 é
CpG1-ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados). gggcccat gccacctccaacatccact tgaccccttggaattt tggtggagaggagcagagg ttgtcctggtgtggtttaggtagtgtgagaggggtacc tggggatcttgctaccagtggaacag ccactaaggattctgcagtgagagca gagggccagct aagtggtactctcccagagact gtc tgactcatgccaccccctccaccttggacacagga t gctgtggtttctgagccaggtacaatg actcctttcagtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaag tgtctgggcagtgtag gtgggtgactcagatcccagccagt ggacttagcccctgtttgctcctc tgataactggggtga ccttggttaatattcaccagcagcctcccc t gttgcccctctggatccactgcttaaata tggat gaggaca gggccc
[0420] Sequência de ácido nucleico de CpG2-ApoE/hAAT (SEQ ID NO: 26). Cada C mudou para T, exceto ao deixar o primeiro CpG sem alteração, e G mudou para A no sétimo CpG. O “c” inalterado está em negrito. Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3', respectivamente, quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 27 é CpG2-ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados). gggcccat gccacctccaacatccact cgaccccttggaattt tggtggagaggagcagag gttgtcctggtgtggtttaggtagtgtgagaggggtacc tggggatcttgctaccagtggaaca gccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagactg tctgactcatgccaccccctccaccttggacacagga tgctgtggtttctgagccaggtacaat gactcctttcagtaagtgcagtggaagctgt acac tgcccaggcaaagtgtctgggcagtgta ggtgggtgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctc tgataactggggtg accttggttaatattcaccagcagcctcccc tgttgcccctctggatccactgcttaaata tgga tgaggacagggccc
[0421] Sequência de ácido nucleico de CpG3-ApoE/hAAT (SEQ ID NO: 28). Cada C mudou para T, exceto ao deixar o segundo CpG sem alteração, e G mudou para A no sétimo CpG. O “c” inalterado está em negrito. Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 29 é CpG3- ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados). gggcccat gccacctccaacatccact tgaccccttggaattt cggtggagaggagcaga ggttgtcctggtgtggtttaggtagt gtgagaggggt acc tggggatcttgctaccagtggaac agccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagact gtctgactcatgccaccccctccaccttggacacagga tgctgtggtttctgagccaggtaca atgactccttt cagtaagtgcagtggaagct gtacactgcccaggcaaag tgtctgggcagtg taggtgggtgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgc tcctctgataactgggg tgaccttggttaatattcaccagcagcctcccc tgttgcccctctggatccactgcttaaata tg gatgaggacagggccc
[0422] Sequência de ácido nucleico de CpG4-ApoE/hAAT (SEQ ID NO: 30). Cada C mudou para T, exceto ao deixar o terceiro CpG sem alteração, e G mudou para A no sétimo CpG. O “c” inalterado está em negrito. Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 31 é CpG4- ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhado). gggcccat gccacctccaacatccact tgaccccttggaattt tggtggagaggagcagagg ttgtcctggcgtggtttaggtagtgt gagaggggtacc tggggatcttgctaccagtggaacag ccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagct aagtggtactctcccagagact gtc tgactcatgccaccccctccaccttggacacagga t gctgtggtttctgagccaggtacaatg actcctttcagtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaag tgtctgggcagtgtag gtgggtgactcagatcccagccagt ggacttagcccctgtttgctcctc tgataactggggtga ccttggttaatattcaccagcagcctcccc t gttgcccctctggatccactgcttaaata tggat gaggaca gggccc
[0423] Sequência de ácido nucleico de CpG5-ApoE/hAAT (SEQ ID NO: 32). Cada C mudou para T, exceto ao deixar o quarto CpG sem alteração, e G mudou para A no sétimo CpG. O CpG inalterado (o quarto) está em negrito. Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 33 é CpG5-ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados). gggcccat gccacctccaacatccact tgaccccttggaattt tggtggagaggagcagagg ttgtcctggtgtggtttaggtagtgtgagaggggtacc cggggatcttgctaccagtggaaca gccactaaggattctgcagtgagagcagagggccag ctaagtggtactctcccagagactg tctgactcatgccaccccctccaccttggacacagga tgctgtggtttctgagccaggtacaat gactcctttcagtaagtgcagtggaagctgt acactgcccaggcaaag tgtctgggcagtgta ggtgggtgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctc tgataactggggtg accttggttaatattcaccagcagcctcccc tgttgcccctctggatccactgcttaaata tgga tgaggacagggccc
[0424] Sequência de ácido nucleico de CpG6-ApoE/hAAT (SEQ ID NO: 34). Todo C mudou para T, exceto ao deixar o quinto CpG sem alteração, e G mudou para A no sétimo CpG. O CpG inalterado (o quinto) está em negrito. Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 35 é CpG6-ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados). gggcccat gccacctccaacatccact tgaccccttggaattt tggtggagaggagcagagg ttgtcctggtgtggtttaggtagtgtgagaggggtacc tggggatcttgctaccagtggaacag ccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagct aagtggtactctcccagagact gtc tgactcacgccaccccctccaccttggacacagga tgctgtggtttctgagccaggtacaatg actcctttcagtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaag tgtctgggcagtgtag gtgggtgactcagatcccagccagt ggacttagcccctgtttgctcctc tgataactggggtga ccttggttaatattcaccagcagcctcccc t gttgcccctctggatccactgcttaaata tggat gaggaca gggccc
[0425] Sequência de ácido nucleico de CpG7-ApoE/hAAT (SEQ ID NO: 36). Todo C mudou para T, exceto ao deixar o sexto CpG sem alteração, e G mudou para A no sétimo CpG. O CpG inalterado (o sexto) está em negrito. Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 37 é CpG7-ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados). gggcccat gccacctccaacatccact tgaccccttggaattt tggtggagaggagcagagg ttgtcctggtgtggtttaggtagtgtgagaggggtacc tggggatcttgctaccagtggaacag ccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagct aagtggtactctcccagagact gtc tgactcatgccaccccctccaccttggacacagga cgctgtggtttctgagccaggtacaatg actcctttcagtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaag tgtctgggcagtgtag gtgggtgactcagatcccagccagt ggacttagcccctgtttgctcctc tgataactggggtga ccttggttaatattcaccagcagcctcccc t gttgcccctctggatccactgcttaaata tggat gaggaca gggccc
[0426] Sequência de ácido nucleico de CpG8-ApoE/hAAT (SEQ ID NO: 38). Todo C mudou para T, exceto ao deixar o sétimo sítio sem alteração. O CpG inalterado (o sétimo) está em negrito. Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 39 é CpG8-ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados). gggcccat gccacctccaacatccact tgaccccttggaattt tggtggagaggagcagagg ttgtcctggtgtggtttaggtagtgtgagaggggtacc tggggatcttgctaccagtggaacag ccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagct aagtggtactctcccagagact gtc tgactcatgccaccccctccaccttggacacagga t gctgtggtttctgagccaggtacaatg actcctttcggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaag tgtctgggcagtgta ggtgggtgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgc tcctctgataactggggtg accttggttaatattcaccagcagcctcccc tgttgcccctctggatccactgcttaaata tgga tgaggacagggccc
[0427] Sequência de ácido nucleico de CpG9-ApoE/hAAT (SEQ ID NO: 40). Cada C mudou para T, exceto ao deixar o oitavo CpG sem alteração, e G mudou para A no sétimo CpG. O CpG inalterado (o oitavo) está em negrito. Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 41 é CpG9-ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados). gggcccat gccacctccaacatccact tgaccccttggaattt tggtggagaggagcagagg ttgtcctggtgtggtttaggtagtgtgagaggggtacc tggggatcttgctaccagtggaacag ccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagct aagtggtactctcccagagact gtc tgactcatgccaccccctccaccttggacacagga t gctgtggtttctgagccaggtacaatg actcctttcagtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaag cgtctgggcagtgta ggtgggtgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctc tgataactggggtg accttggttaatattcaccagcagcctcccc tgttgcccctctggatccactgcttaaata tgga tgaggacagggccc
[0428] Sequência de ácido nucleico de CpG10-ApoE/hAAT (SEQ ID NO: 42). Cada C mudou para T, exceto ao deixar o nono SpG sem alteração, e G mudou para A no sétimo CpG. O CpG inalterado (o nono) está em negrito. Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 43 é CpG10-ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados). gggcccat gccacctccaacatccact tgaccccttggaattt tggtggagaggagcagagg ttgtcctggtgtggtttaggtagtgtgagaggggtacc tggggatcttgctaccagtggaac ag ccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagct aagtggtactctcccagagact gtc tgactcatgccaccccctccaccttggacacagga t gctgtggtttctgagccaggtacaatg actcctttcagtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaag tgtccgggcagtgta ggtgggtgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctc tgataactggggtg accttggttaatattcaccagcagcctcccc tgttgcccctctggatccactgcttaaata tgga tgaggacagggccc
[0429] Sequência de ácido nucleico de CpG11-ApoE/hAAT (SEQ ID NO: 44). Todo C mudou para T, exceto ao deixar o décimo CpG sem alteração, e G mudou para A no sétimo CpG. O CpG inalterado (o décimo) está em negrito. Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 45 é CpG11-ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados). gggcccat gccacctccaacatccact tgaccccttggaattt tggtggagaggagcagagg ttgtcctggtgtggtttaggtagtgtgagaggggtacc tggggatcttgctaccagtggaacag ccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagct aagtggtactctcccagagact gtc tgactcatgccaccccctccaccttggacacagga t gctgtggtttctgagccaggtacaatg actcctttcagtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaag tgtctgggcagcgta ggtgggtgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctc tgataactggggtg accttggttaatattcaccagcagcctcccc tgttgcccctctggatccactgcttaaata tgga tgaggacagggccc
[0430] Sequência de ácido nucleico de CpG12-ApoE/hAAT (SEQ
ID NO: 46). Todo C mudou para T, exceto ao deixar o décimo primeiro CpG sem alteração, e G mudou para A no sétimo CpG. O CpG inalterado (o décimo primeiro) está em negrito. Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 47 é CpG12-ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados). gggcccat gccacctccaacatccact tgaccccttggaattt tggtggagaggagcagagg ttgtcctggtgtggtttaggtagtgtgagaggggtacc tggggatcttgctaccagtggaacag ccactaaggat tctgcagtgagagcagagggccagct aagtggtactctcccagagact gtc tgactcatgccaccccctccaccttggacacagga t gctgtggtttctgagccaggtacaatg actcctttcagtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaag tgtctgggcagtgtag gcgggtgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctc tgataactggggtg accttggttaatattcaccagcagcctcccc tgttgcccctctggatccactgcttaaata tgga tgaggacagggccc
[0431] Sequência de ácido nucleico de CpG13-ApoE/hAAT (SEQ ID NO: 48). Todo C mudou para T, exceto ao deixar o décimo segundo CpG sem alteração, e G mudou para A no sétimo CpG. O CpG inalterado (o décimo segundo) está em negrito. Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 49 é CpG13-ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados). gggcccat gccacctccaacatccact tgaccccttggaattt tggtggagaggagcagagg ttgtcctggtgtggtttaggtagtgtgagaggggtacc tggggatcttgctaccagtggaacag ccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagct aagtggtactctcccagagact gtc tgactcatgccaccccctccaccttggacacagga t gctgtggtttctgagccagg tacaatg actcctttcagtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaag tgtctgggcagtgtag gtgggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctc tgataactggggtg accttggttaatattcaccagcagcctcccc tgttgcccctctggatccactgcttaaata tgga tgaggacagggccc
[0432] Sequência de ácido nucleico de CpG14-ApoE/hAAT (SEQ
ID NO: 50). Todo C mudou para T, exceto ao deixar o décimo terceiro CpG sem alteração, e G mudou para A no sétimo CpG. O CpG inalterado (o décimo terceiro) está em negrito. Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 51 é CpG14-ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados). gggcccat gccacctccaacatccact tgaccccttggaattt tggtggagaggagcagagg ttgtcctggtgtggtttaggtagtgtgagaggggtacc tggggatcttgctaccagtggaacag ccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagct aagtggtactctcccagagact gtc tgactcatgccaccccctccaccttggacacagga t gctgtggtttctgagccaggtacaatg actcctttcagtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaag tgtctgggcagtgtag gtgggtgactcagatcccagccagt ggacttagcccctgtttgctcctc cgataactggggtg accttggttaatattcaccagcagcctcccc tgttgcccctctggatccactgcttaaata tgga tgaggacagggccc
[0433] Sequência de ácido nucleico de CpG15-ApoE/hAAT (SEQ ID NO: 52). Cada C mudou para T, exceto ao deixar o décimo quarto CpG sem alteração, e G mudou para A no sétimo CpG. O CpG inalterado (o décimo quarto) está em negrito. Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 53 é CpG15-ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados). gggcccat gccacctccaacatccact tgaccccttggaattt tggtggagaggagcagagg ttgtcctggtgtggtttaggtagtgtgagaggggtacc tggggatcttgctaccagtggaacag ccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagct aagtggtactctcccagagact gtc tgactcatgccaccccctccaccttggacacagga t gctgtggtttctgagccaggtacaatg actcctttcagtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaag tgtctgggcagtgtag gtgggtgactcagatcccagccagt ggacttagcccctgtttgctcctc tgataactggggtga ccttggttaatattcaccagcagcctcccc cgttgcccctctggatccactgcttaaata tggat gaggaca gggccc
[0434] Sequência de ácido nucleico de CpG16-ApoE/hAAT (SEQ
ID NO: 54). Todo C mudou para T, exceto ao deixar o décimo quinto CpG sem alteração, e G mudou para A no sétimo CpG. O CpG inalterado (o décimo quinto) está em negrito. Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 55 é CpG16-ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados). gggcccat gccacctccaacatccact tgaccccttggaattt tggtggagaggagcagagg ttgtcctggtgtggtttaggtagtgtgagaggggtacc tggggatcttgctaccagtggaacag ccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagct aagtggtactctcccagagact gtc tgactcatgccaccccctccaccttggacacagga t gctgtggtttctgagccaggtacaatg actcctttcagtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaag tgtctgggcagtgtag gtgggtgactcagatcccagccagt ggacttagcccctgtttgctcctc tgataactggggtga ccttggttaatattcaccagcagcctcccc t gttgcccctctggatccactgcttaaata cg gat gaggaca gggccc
[0435] Sequência de ácido nucleico de CpG17-ApoE/hAAT (SEQ ID NO: 56). Todo C mudou para T, exceto ao deixar o décimo sexto CpG sem alteração, e G mudou para A no sétimo CpG. O CpG inalterado (décimo sexto) está em negrito. Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 57 é CpG17-ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados). gggcccat gccacctccaacatccact tgaccccttggaattt tggtggagaggagcagagg ttgtcctggtgtggtttaggtagtgtgagaggggtacc tggggatcttgctaccagtggaacag ccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagct aagtggtactctcccagagact gtc tgactcatgccaccccctccaccttggacacaggat gctgtggtttctgagccaggtacaatg actcctttcagtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaag tgtctgggcagtgtag gtgggtgactcagatcccagccagt ggacttagcccctgtttgctcctc tgataactggggtga ccttggttaatattcaccagcagcctcccc t gttgcccctctggatccactgcttaaata tggac gaggaca gggccc
[0436] Sequência de ácido nucleico de CpG18-ApoE/hAAT (SEQ
ID NO: 58). O C do quinto, sétimo, oitavo, décimo e décimo primeiro CpG é removido e C é alterado para T para os CpGs restantes. Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 59 é CpG18-ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados). gggcccat gccacctccaacatccact tgaccccttggaattt tggtggagaggagcagagg ttgtcctggtgtggtttaggtagtgtgagaggggtacc tggggatcttgctaccagtgga acag ccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagct aagtggtactctcccagagact gtc tgactcagccaccccctccaccttggacacagga t gctgtggtttctgagccaggtacaatga ctcctttggtaagtgcagtggaagct gtacactgcccaggcaaag gtctgggcag gtagggg gtgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctc tgataactggggtgacctt ggttaatattcaccagcagcctcccc tgttgcccctctggatccactgcttaaata tggatgag gacagggccc
[0437] Sequência de ácido nucleico de CpG19-ApoE/hAAT (SEQ ID NO: 60). C mudou para T no primeiro ao quinto e no oitavo até o décimo primeiro CpG, e o C do sétimo CpG foi removido. Todos os CpGs restantes (sexto e décimo segundo ao décimo sexto) permanecem inalterados (em negrito). Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 61 é CpG19-ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados). gggcccat gccacctccaacatccact tgaccccttggaattt tggtggagaggagcagagg ttgtcctggtgtggtttaggtagtgtgagaggggtacc tggggatcttgctaccagtggaacag ccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagct aagtggtactctcccagagact gtc tgactcatgccaccccctccaccttggacacagga cgctgtggtttctgagccaggtacaatg actcctttggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaag tgtctgggcagtgt agg tgggcgactcagatcccagccagtggact tagcccctgtttgctcctc cgataactggggtga ccttggttaatattcaccagcagcctcccc cgttgcccctctggatccactgcttaaata cgga cgaggacagggccc
[0438] Sequência de ácido nucleico de CpG20-ApoE/hAAT (SEQ ID NO: 62). Resultado de múltiplas deleções de regiões sem sítios de ligação aos fatores de transcrição putativos. G alterado para A no único CpG restante (o sétimo CpG da SEQ ID NO: 22). Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 63 é CpG20-ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados). gggcccat gccacctccaaggagcagaggtgatcttgctaccagtggaga gcagagggcc agctctcccagagactgtctgactcagccaccccctccaccttggacacaggaggtttctgag ccatcctttcagtaagtgcatgtacactgcccagctgggcagctcagatcccagccagtgga cttagcccctgtttgctcctctgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctgttg cccctctggatccactgcttaaa gggccc
[0439] Sequência de ácido nucleico de CpG21-ApoE/hAAT (SEQ ID NO: 64). C mudou para T em todos os CpGs, exceto no quinto e no sexto CpGs, onde G é alterado para C e A, respectivamente. Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 65 é CpG21-ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados). gggcccat gccacctccaacatccact tgaccccttggaattt tggtggagaggagcagagg ttgtcctggtgtggtttaggtagtgtgagaggggtacc tggggatcttgctaccagtggaacag ccactaaggattctgcagtgagag cagagggccagct aagtggtactctcccagagact gtc tgactcaccccaccccctccaccttggacacagga cactgtggtttctgagccaggtacaatg actccttttggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaag tgtctgggcagtgtag gtgggtgactcagatcccagccagt ggacttagcccctgtttgctcctc tgataactggggtga ccttggttaatattcaccagcagcctcc cct gttgcccctctggatccactgcttaaata tggat gaggaca gggccc
[0440] Sequência de ácido nucleico de CpG22-ApoE/hAAT (SEQ ID NO: 66). C mudou para T em todos os CpGs, exceto ao deixar o quinto CpG sem alteração (em negrito) e alterar G para A no sexto CpG. Os sítios de restrição ApaI estão nas extremidades 5' e 3' quando a sequência foi clonada no cassete de expressão de FIX. SEQ ID NO: 67 é CpG22-ApoE/hAAT com esses sítios de enzima de restrição (sublinhados).
gggcccat gccacctccaacatccact tgaccccttggaattt tggtggagaggagcagagg ttgtcctggtgtggtttaggtagtgtgagaggggtacc tggggatcttgctaccagtggaacag ccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagct aagtggtactctcccagagact gtc tgactcacgccaccccctccaccttggacacagga cactgtggtttctgagccaggtacaat gactccttttggtaagtgcagtggaagctgt acactgcccaggcaaag tgtctgggcagtgta ggtgggtgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctc tgataactggggtg accttggttaatattcaccagcagcctcccc tgttgcccctctggatccactgcttaaata tgga tgaggacagggccc
[0441] Sequência de aminoácidos de FVIII-BDD (sequência SQ em negrito/sublinhado) (SEQ ID NO: 68).
MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRV PKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITL KNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVW QVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQT LHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLP GLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQ TLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDD LTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAP DDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYG EVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKY KWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGN QIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSIN GYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFP FSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSY EDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVE MKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQ SGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFR NQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKD EFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFT IFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVM AQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVE MLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITAS GQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKF SSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYI RLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFAT WSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLL TSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTR YLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
[0442] Sequência SQ (SEQ ID NO: 69).
SFSQNPPVLKRHQR
[0443] CDNA de FVIII-BDD do tipo selvagem (SEQ ID NO: 70). atgcaaatagagctctccacctgcttctttctgtgccttttgcgattctgctttagtgccaccagaagatactacctg ggtgcagtggaactgtcatgggactatatgcaaagtgatctcggtgagctgcctgtggacgcaagatttcctcct agagtgccaaaatcttttccattcaacacctcagtcgtgtacaaaaagactctgtttgtagaattcacggatcacc ttttcaacatcgctaagccaaggccaccctggatgggtctgctaggtcctaccatccaggctgaggtttatgata cagtggtcattacacttaagaacatggcttcccatcctgtcagtcttcatgctgttggtgtatcctactggaaagctt ctgagggagctgaatatgatgatcagaccagtcaaagggagaaagaagatgataaagtcttccctggtgga agccatacatatgtctggcaggtcctgaaagagaatggtccaatggcctctgacccactgtgccttacctactc atatctttctcatgtggacctggtaaaagacttgaattcaggcctcattggagccctactagtatgtagagaaggg agtctggccaaggaaaagacacagaccttgcacaaatttatactactttttgctgtatttgatgaagggaaaagt tggcactcagaaacaaagaactccttgatgcaggatagggatgctgcatctgctcgggcctggcctaaaatgc acacagtcaatggttatgtaaacaggtctctgccaggtctgattggatgccacaggaaatcagtctattggcatg tgattggaatgggcaccactcctgaagtgcactcaatattcctcgaaggtcacacatttcttgtgaggaaccatc gccaggcgtccttggaaatctcgccaataactttccttactgctcaaacactcttgatggaccttggacagtttcta ctgttttgtcatatctcttcccaccaacatgatggcatggaagcttatgtcaaagtagacagctgtccagaggaac cccaactacgaatgaaaaataatgaagaagcggaagactatgatgatgatcttactgattctgaaatggatgt ggtcaggtttgatgatgacaactctccttcctttatccaaattcgctcagttgccaagaagcatcctaaaacttggg tacattacattgctgctgaagaggaggactgggactatgctcccttagtcctcgcccccgatgacagaagttata aaagtcaatatttgaacaatggccctcagcggattggtaggaagtacaaaaaagtccgatttatggcatacac agatgaaacctttaagactcgtgaagctattcagcatgaatcaggaatcttgggacctttactttatggggaagtt ggagacacactgttgattatatttaagaatcaagcaagcagaccatataacatctaccctcacggaatcactg atgtccgtcctttgtattcaaggagattaccaaaaggtgtaaaacatttgaaggattttccaattctgccaggaga aatattcaaatataaatggacagtgactgtagaagatgggccaactaaatcagatcctcggtgcctgacccgc tattactctagtttcgttaatatggagagagatctagcttcaggactcattggccctctcctcatctgctacaaagaa tctgtagatcaaagaggaaaccagataatgtcagacaagaggaatgtcatcctgttttctgtatttgatgagaac cgaagctggtacctcacagagaatatacaacgctttctccccaatccagctggagtgcagcttgaggatccag agttccaagcctccaacatcatgcacagcatcaatggctatgtttttgatagtttgcagttgtcagtttgtttgcatga ggtggcatactggtacattctaagcattggagcacagactgacttcctttctgtcttcttctctggatataccttcaaa cacaaaatggtctatgaagacacactcaccctattcccattctcaggagaaactgtcttcatgtcgatggaaaa cccaggtctatggattctggggtgccacaactcagactttcggaacagaggcatgaccgccttactgaaggttt ctagttgtgacaagaacactggtgattattacgaggacagttatgaagatatttcagcatacttgctgagtaaaa acaatgccattgaaccaagaagcttctcccaaaacccaccagtcttgaaacgccatcaacgggaaataactc gtactactcttcagtcagatcaagaggaaattgactatgatgataccatatcagttgaaatgaagaaggaagat tttgacatttatgatgaggatgaaaatcagagcccccgcagctttcaaaagaaaacacgacactattttattgct gcagtggagaggctctgggattatgggatgagtagctccccacatgttctaagaaacagggctcagagtggc agtgtccctcagttcaagaaagttgttttccaggaatttactgatggctcctttactcagcccttataccgtggagaa ctaaatgaacatttgggactcctggggccatatataagagcagaagttgaagataatatcatggtaactttcag aaatcaggcctctcgtccctattccttctattctagccttatttcttatgaggaagatcagaggcaaggagcagaa cctagaaaaaactttgtcaagcctaatgaaaccaaaacttacttttggaaagtgcaacatcatatggcacccac taaagatgagtttgactgcaaagcctgggcttatttctctgatgttgacctggaaaaagatgtgcactcaggcctg attggaccccttctggtctgccacactaacacactgaaccctgctcatgggagacaagtgacagtacaggaat ttgctctgtttttcaccatctttgatgagaccaaaagctggtacttcactgaaaatatggaaagaaactgcagggc tccctgcaatatccagatggaagatcccacttttaaagagaattatcgcttccatgcaatcaatggctacataatg gatacactacctggcttagtaatggctcaggatcaaaggattcgatggtatctgctcagcatgggcagcaatga aaacatccattctattcatttcagtggacatgtgttcaccgtacgaaaaaaagaggagtataaaatggcactgta caatctctatccaggtgtttttgagacagtggaaatgttaccatccaaagctggaatttggcgggtggaatgcctt attggcgagcatctacatgctgggatgagcacactttttctggtgtacagcaataagtgtcagactcccctggga atggcttctggacacattagagattttcagattacagcttcaggacaatatggacagtgggccccaaagctggc cagacttcattattccggatcaatcaatgcctggagcaccaaggagcccttttcttggatcaaggtggatctgttg gcaccaatgattattcacggcatcaagacccagggtgcccgtcagaagttctccagcctctacatctctcagttt atcatcatgtatagtcttgatgggaagaagtggcagacttatcgaggaaattccactggaaccttaatggtcttctt tggcaatgtggattcatctgggataaaacacaatatttttaaccctccaattattgctcgatacatccgtttgcaccc aactcattatagcattcgcagcactcttcgcatggagttgatgggctgtgatttaaatagttgcagcatgccattgg gaatggagagtaaagcaatatcagatgcacagattactgcttcatcctactttaccaatatgtttgccacctggtc tccttcaaaagctcgacttcacctccaagggaggagtaatgcctggagacctcaggtgaataatccaaaaga gtggctgcaagtggacttccagaagacaatgaaagtcacaggagtaactactcagggagtaaaatctctgctt accagcatgtatgtgaaggagttcctcatctccagcagtcaagatggccatcagtggactctcttttttcagaatg gcaaagtaaaggtttttcagggaaatcaagactccttcacacctgtggtgaactctctagacccaccgttactga ctcgctaccttcgaattcacccccagagttgggtgcaccagattgccctgaggatggaggttctgggctgcgag gcacaggacctctactga
[0444] FVIII-BDD que codifica a variante de ácido nucleico reduzidq de CpG (SEQ ID NO: 71) atgcagattgagctgtctacctgcttcttcctgtgcctgctgaggttctgcttctctgct accaggaggtactacctgggggctgtggagctgagctgggattacatgcagtctgacctg ggggagctgcctgtggatgccaggtttccccccagggtgcccaagagcttccccttcaat acctctgtggtgtataagaagaccctgtttgtggagttcactgatcatctgttcaacatt gctaaacccaggcccccctggatggggctgctgggccctaccatccaggctgaggtgtat gacactgtggtgatcactctgaagaacatggctagccatcctgtgtctctgcatgctgtg ggggtgagctactggaaggcttctgagggggctgagtatgatgatcagactagccagagg gagaaggaggatgacaaggtgttccctgggggctctcacacctatgtctggcaggtgctg aaggagaatggccccatggcctctgatcctctgtgtctgacctatagctacctgagccat gtggacctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggccctgctggtgtgtagggag gggagcctggccaaggagaagacccagaccctgcacaagttcattctgctgtttgctgtg tttgatgagggcaagagctggcattctgaaaccaagaacagcctgatgcaggacagggat gctgcctctgctagggcctggcccaagatgcacactgtgaatgggtatgtcaataggtct ctgcctggcctgattggctgccacaggaagtctgtgtactggcatgtgattgggatgggc accacccctgaggtgcacagcatctttctggagggccacaccttcctggtgaggaatcac agacaggccagcctggagatcagccccatcaccttcctgactgcccagaccctgctgatg gacctgggccagtttctgctgttctgccacatctctagccaccagcatgatggcatggag gcctatgtgaaggtggactcctgccctgaggagccccagctgaggatgaagaataatgag gaggctgaggactatgatgatgacctgactgactctgagatggatgtggtgagatttgat gatgacaattctcccagcttcattcagatcaggtctgtggccaagaagcatcccaagacc tgggtgcactacattgctgctgaggaggaggactgggactatgcccccctggtgctggcc cctgatgacaggagctataagagccagtacctgaataatggcccccagaggattgggagg aagtataagaaggtgaggttcatggcctatactgatgaaaccttcaagaccagagaggcc atccagcatgagtctgggatcctggggcccctgctgtatggggaggtgggggacaccctg ctgatcatcttcaagaaccaggccagcaggccctacaacatctaccctcatggcatcact gatgtgaggcctctgtacagcagaaggctgcccaagggggtgaagcatctgaaggacttc cccattctgcctggggagattttcaagtacaagtggactgtgactgtggaggatggccca accaagtctgaccctaggtgcctgactaggtactacagcagctttgtgaatatggagagg gacctggcctctggcctgattggccccctgctgatctgctacaaggagtctgtggatcag aggggcaaccagatcatgtctgacaagaggaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgag aacaggagctggtacctgactgagaacattcagaggtttctgcccaaccctgctggggtg cagctggaggaccctgaattccaggcctctaacatcatgcacagcattaatggctatgtg tttgacagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctactggtacattctgagc attggggcccagactgacttcctgtctgtgttcttctctggctacacctttaagcacaag atggtgtatgaggataccctgaccctgtttcctttctctggggagactgtgttcatgagc atggagaaccctggcctgtggatcctgggctgccacaactctgacttcaggaacaggggg atgactgctctgctgaaggtgagcagctgtgataagaacactggggactactatgaggac agctatgaggacatctctgcctatctgctgagcaagaataatgctattgagcccaggagc ttctctcagaacccccctgtgctgaagaggcaccagagggagatcaccagaactactctg cagtctgaccaggaggagattgactatgatgacaccatctctgtggagatgaagaaggag gattttgatatttatgatgaggatgaaaaccagagccccaggagctttcagaagaagact aggcactatttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgtcttctagcccc catgtgctgaggaacagggcccagtctggctctgtgccccagttcaagaaggtggtgttc caggagttcactgatggcagcttcactcagcccctgtacaggggggagctgaatgagcac ctggggctgctgggcccttatatcagggctgaggtggaggataacatcatggtgaccttc aggaaccaggccagcaggccctacagcttctactctagcctgatcagctatgaggaggac cagaggcagggggctgagcccaggaagaactttgtgaagcccaatgagaccaagacttat ttctggaaggtgcagcaccatatggcccccaccaaggatgagtttgattgcaaagcctgg gcctacttctctgatgtggacctggagaaggatgtgcactctgggctgattggccccctg ctggtgtgccacaccaacactctgaaccctgcccatggcaggcaggtgactgtgcaggag tttgccctgttcttcaccatctttgatgagactaagagctggtacttcactgagaacatg gagaggaactgcagggccccctgcaatatccagatggaggaccccacctttaaggaaaat tataggtttcatgccattaatggctacatcatggacaccctgcctggcctggtgatggcc caggaccagaggatcaggtggtacctgctgagcatgggcagcaatgagaacattcacagc atccacttctctggccatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggccctg tataatctgtaccctggggtgtttgagactgtggagatgctgcccagcaaggctggcatc tggagggtggagtgcctgattggggagcacctgcatgctggcatgagcaccctgttcctg gtgtattctaacaagtgtcagacccccctgggcatggcctctggccatatcagggacttc cagatcactgcctctggccagtatgggcagtgggcccccaagctggccaggctgcattac tctggcagcatcaatgcctggagcaccaaggagccattcagctggattaaggtggacctg ctggctccaatgattatccatggcatcaagacccagggggccaggcagaagtttagcagc ctgtacatctctcagtttatcatcatgtactctctggatggcaaaaagtggcagacctac aggggcaattctactggcactctgatggtgttctttggcaatgtggacagctctgggatc aagcacaacatctttaacccccctatcattgccaggtacattaggctgcaccccacccat tacagcatcaggagcaccctgaggatggagctgatgggctgtgatctgaacagctgcagc atgcccctgggcatggagagcaaggctatctctgatgcccagattactgccagcagctac ttcaccaatatgtttgccacctggagccccagcaaggccaggctgcacctgcagggcagg tctaatgcctggaggccccaggtgaacaaccccaaggagtggctgcaggtggacttccag aagaccatgaaggtgactggggtgaccacccagggggtgaagagcctgctgactagcatg tatgtgaaggagttcctgatcagcagcagccaggatggccatcagtggaccctgttcttc cagaatggcaaggtgaaggtgttccagggcaatcaggacagcttcacccctgtggtgaac agcctggacccccccctgctgaccagatacctgaggatccacccccagagctgggtgcat cagattgccctgaggatggaggtgctggggtgtgaggcccaggacctgtactga
[0445] FVIII-BDD que codifica a variante de ácido nucleico reduzido de CpG (SEQ ID NO: 72) atgcagattgagctgtctacctgctttttcctgtgtctgctgaggttctgcttctctgcc actaggaggtactacctgggggctgtggagctgtcttgggattacatgcagtctgatctg ggggagctgcctgtggatgccaggtttcctcccagggtgcccaagtctttccccttcaat acctctgtggtgtataagaagaccctgtttgtggagtttactgatcacctgttcaacatt gccaagcccaggcccccttggatgggcctgctggggcccaccatccaggctgaggtgtat gacactgtggtgatcaccctgaagaacatggcctctcaccctgtgagcctgcatgctgtg ggggtgagctactggaaggcctctgagggggctgagtatgatgaccagaccagccagagg gagaaggaggatgataaggtgttccctggggggagccacacttatgtgtggcaggtgctg aaggagaatggcccaatggcctctgatcccctgtgcctgacctattcttacctgagccat gtggacctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggccctgctggtgtgcagggag ggctctctggctaaggagaagacccagaccctgcacaagttcatcctgctgtttgctgtg tttgatgaggggaagagctggcactctgagaccaagaacagcctgatgcaggacagggat gctgcctctgccagggcctggcccaaaatgcacactgtgaatggctatgtgaataggagc ctgcctggcctgattggctgccacaggaagtctgtgtattggcatgtgattggcatgggc accacccctgaggtgcactctatcttcctggagggccatactttcctggtgaggaatcat aggcaggccagcctggagattagccccattacctttctgactgcccagaccctgctgatg gacctgggccagttcctgctgttttgccacatcagctctcaccagcatgatggcatggag gcctatgtgaaggtggatagctgccctgaggagccccagctgaggatgaagaacaatgag gaggctgaggattatgatgatgatctgactgattctgaaatggatgtggtgaggtttgat gatgacaatagcccctctttcatccagatcaggtctgtggccaagaagcatcctaagacc tgggtgcactacattgctgctgaggaggaggactgggactatgctcccctggtgctggcc cctgatgacaggtcttacaagagccagtacctgaacaatggcccccagagaattgggagg aagtataagaaggtgagattcatggcttacactgatgagaccttcaagactagggaggcc atccagcatgagtctggcattctgggccccctgctgtatggggaggtgggggacaccctg ctgatcatcttcaagaaccaggcctctaggccctacaatatttacccccatgggatcact gatgtgaggcccctgtacagcaggaggctgcctaagggggtgaagcatctgaaggacttc cccatcctgcctggggagatcttcaagtataagtggactgtgactgtggaagatggcccc accaagtctgaccctaggtgcctgaccaggtactactcttcttttgtgaacatggagagg gacctggcctctggcctgattggccccctgctgatctgctacaaggagtctgtggaccag agggggaaccagattatgtctgacaagaggaatgtgattctgttctctgtgtttgatgag aacaggagctggtatctgactgagaacatccagaggttcctgcccaatcctgctggggtg cagctggaggaccctgagttccaggccagcaacatcatgcacagcatcaatgggtatgtg tttgattctctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctactggtacatcctgagc attggggctcagactgatttcctgtctgtgttcttttctggctacacctttaagcataag atggtgtatgaggacactctgaccctgtttcccttctctggggagactgtgtttatgagc atggagaaccctggcctgtggatcctgggctgccacaactctgatttcaggaacaggggc atgactgctctgctgaaggtgtcttcttgtgacaagaacactggggactattatgaggac agctatgaggacatctctgcctacctgctgagcaagaacaatgctattgagcccagatct ttcagccagaacccccctgtgctgaagaggcaccagagggagatcactaggaccaccctg cagtctgaccaggaggagattgactatgatgacactatctctgtggagatgaagaaggag gactttgatatctatgatgaggatgagaaccagtctcccaggagcttccagaaaaagacc aggcactacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgtcttctagcccc catgtgctgaggaacagggcccagtctgggtctgtgccccagttcaagaaggtggtgttc caggagttcactgatgggagcttcacccagcctctgtacaggggggagctgaatgagcac ctggggctgctgggcccttatattagggctgaggtggaggacaacatcatggtgactttc aggaatcaggcctctaggccctatagcttctacagctctctgatcagctatgaggaggat cagaggcagggggctgagcccaggaagaactttgtgaagcccaatgagaccaagacctac ttctggaaggtgcagcaccacatggctcctaccaaggatgagtttgactgcaaggcctgg gcctacttttctgatgtggacctggagaaggatgtgcactctggcctgattggccccctg ctggtgtgtcataccaacaccctgaaccctgcccatggcaggcaggtgactgtgcaggag tttgccctgttcttcaccatctttgatgagaccaagagctggtactttactgagaacatg gagaggaattgcagagccccttgcaacatccagatggaggacccaaccttcaaagagaac tacaggttccatgccatcaatgggtacatcatggacaccctgcctggcctggtgatggct caggaccagaggatcaggtggtatctgctgagcatgggcagcaatgagaatatccatagc attcacttctctggccatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggccctg tataacctgtaccctggggtgtttgagactgtggagatgctgccaagcaaggctgggatt tggagggtggagtgcctgattggggagcacctgcatgctggcatgtctaccctgttcctg gtgtactccaataagtgccagacccccctgggcatggcctctggccacatcagggacttc cagatcactgcctctggccagtatgggcagtgggccccaaagctggccaggctgcactat tctgggagcatcaatgcttggagcaccaaggagcctttcagctggattaaggtggatctg ctggcccccatgatcattcatggcatcaaaacccagggggctagacagaagttttctagc ctgtacatcagccagttcatcatcatgtacagcctggatggcaagaagtggcagacttac aggggcaatagcactggcaccctgatggtgttttttggcaatgtggacagctctggcatc aagcacaacatctttaacccccccattattgccaggtatatcaggctgcatcccacccac tattctattaggtctactctgagaatggagctgatgggctgtgacctgaacagctgtagc atgcccctggggatggagagcaaggctatctctgatgcccagatcactgccagctcttat ttcaccaatatgtttgccacctggtctccctctaaggccaggctgcacctgcagggcagg agcaatgcttggaggccccaggtgaataaccccaaggagtggctgcaggtggacttccag aagaccatgaaggtgactggggtgactacccagggggtgaagtctctgctgactagcatg tatgtgaaggagttcctgatcagcagcagccaggatgggcatcagtggactctgttcttc cagaatggcaaggtgaaggtcttccaggggaaccaggatagcttcactcctgtggtgaac tctctggacccccccctgctgactaggtatctgaggatccacccccagagctgggtgcac cagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaggcccaggacctgtattga
[0446] FVIII-BDD que codifica a variante de ácido nucleico reduzido de CpG (SEQ ID NO: 73) atgcagattgaactgtctacttgtttcttcctgtgcctgctgaggttttgcttctctgct actaggaggtactatctgggggctgtggagctgtcttgggactatatgcagtctgacctg ggggagctgcctgtggatgctaggtttccccccagggtgcccaagagcttcccctttaac acctctgtggtgtataagaagactctgtttgtggagttcactgaccatctgttcaacatt gccaagccaaggcccccctggatgggcctgctgggccccaccatccaggctgaggtgtat gacactgtggtgattactctgaagaacatggccagccatcctgtgagcctgcatgctgtg ggggtgtcttactggaaggcctctgagggggctgagtatgatgaccagacctctcagagg gagaaggaggatgacaaggtgttccctgggggctctcatacctatgtgtggcaggtcctg aaggagaatgggcccatggcctctgaccccctgtgcctgacctactcttatctgtctcat gtggacctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggccctgctggtgtgcagggag ggcagcctggctaaggagaagacccagactctgcacaagttcatcctgctgtttgctgtg tttgatgagggcaagagctggcactctgagaccaagaacagcctgatgcaggacagggat gctgcctctgctagggcctggcccaagatgcacactgtgaatgggtatgtgaacaggagc ctgccaggcctgattggctgccataggaagtctgtgtattggcatgtgattgggatgggg actacccctgaggtccacagcattttcctggaggggcatacctttctggtgaggaaccac aggcaggcctctctggagatctctcccattactttcctgactgcccagaccctgctgatg gacctgggccagttcctgctgttctgccacatcagcagccaccagcatgatggcatggag gcctatgtgaaggtggatagctgccctgaggagccccagctgaggatgaaaaacaatgag gaggctgaggattatgatgatgacctgactgattctgagatggatgtggtgaggtttgat gatgataacagccccagcttcatccagattaggtctgtggccaagaagcatcccaagacc tgggtgcactacattgctgctgaggaggaggattgggactatgctcctctggtgctggcc cctgatgacaggagctacaagagccagtacctgaataatggcccccagaggattggcagg aagtataagaaggtgaggttcatggcctacactgatgagacctttaagaccagggaggcc atccagcatgaatctgggatcctgggccccctgctgtatggggaggtgggggacaccctg ctgattatctttaagaaccaggctagcaggccctacaacatttacccccatggcattact gatgtgaggcccctgtacagcaggaggctgcccaagggggtgaagcacctgaaggatttc cccattctgcctggggagatctttaagtacaaatggactgtgactgtggaggatggccct actaagtctgatcccaggtgtctgaccagatactacagcagctttgtgaatatggagagg gacctggcttctggcctgattggccccctgctgatctgctacaaggagtctgtggaccag aggggcaatcagattatgtctgacaagaggaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgag aacagaagctggtacctgactgagaacatccagaggttcctgcccaaccctgctggggtg cagctggaggaccctgagttccaggctagcaatatatcatgcacagcattaatggctatgtg tttgacagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctattggtacattctgagc attggggcccagactgatttcctgtctgtgttcttttctggctacaccttcaagcacaag atggtgtatgaggatactctgaccctgtttcccttctctggggagactgtgttcatgagc atggagaaccctggcctgtggatcctgggctgtcacaactctgacttcaggaacaggggc atgactgccctgctgaaggtgagctcttgtgataagaacactggggactactatgaggac tcttatgaggacatctctgcctacctgctgagcaagaacaatgctattgagcccaggagc ttctctcagaatccccctgtgctgaagaggcatcagagggagatcactaggactaccctg cagtctgaccaggaagagattgactatgatgacaccatctctgtggaaatgaagaaggag gactttgatatctatgatgaggatgaaaaccagagccccaggagcttccagaagaagacc aggcattacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatgggatgagctcttctccc catgtgctgaggaatagggctcagtctggctctgtcccacagttcaagaaggtggtgttt caggagttcactgatggcagcttcactcagcccctgtacaggggggagctgaatgagcat ctgggcctgctggggccctacatcagggctgaggtggaggataacattatggtgactttc aggaaccaggcctctaggccctacagcttctacagcagcctgatcagctatgaggaggac cagaggcaggggggctgagcccaggaagaactttgtgaagcccaatgagactaagacctat ttctggaaggtgcagcatcacatggctcccactaaagatgagtttgactgcaaggcctgg gcctacttctctgatgtggatctggagaaggatgtgcattctgggctgattggccctctg ctggtctgccatactaacaccctgaatcctgcccatggcaggcaggtgactgtgcaggag tttgccctgttctttaccatctttgatgagaccaagtcttggtacttcactgagaacatg gagaggaactgcagggccccctgtaacatccagatggaggaccccacctttaaggagaac tacaggttccatgccatcaatggctacatcatggacactctgcctggcctggtgatggcc caggaccagaggatcaggtggtacctgctgtctatgggctctaatgagaacattcattct atccacttctctggccatgtgtttactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggccctg tacaatctgtaccctggggtgtttgaaactgtggagatgctgccctctaaggctggcatc tggagggtggagtgcctgattggggaacacctgcatgctggcatgagcaccctgttcctg gtctatagcaataagtgccagacccccctggggatggcctctgggcatatcagagacttc cagatcactgcctctggccagtatggccagtgggcccccaagctggccaggctgcactac tctggcagcattaatgcctggagcaccaaggagcccttctcttggatcaaggtggacctg ctggctcccatgatcatccatgggatcaagacccagggggccaggcagaagttcagcagc ctgtacatctctcagttcatcatcatgtactctctggatggcaagaagtggcagacctac aggggcaatagcactgggaccctgatggtgttctttgggaatgtggacagctctggcatc aagcacaatatcttcaacccccccatcattgccaggtacatcagactgcaccccactcat tacagcatcaggagcactctgaggatggagctgatgggctgtgacctgaatagctgctct atgcccctgggcatggagagcaaggccatttctgatgcccagattactgcctcttcttac ttcactaatatgtttgccacctggagccccagcaaggccaggctgcatctgcaggggagg agcaatgcctggaggccccaggtgaacaaccccaaggagtggctgcaggtggacttccag aagactatgaaggtgactggggtgaccactcagggggtgaagagcctgctgaccagcatg tatgtgaaggagttcctgatctcttctagccaggatgggcaccagtggaccctgtttttc cagaatgggaaggtgaaggtgtttcagggcaatcaggacagctttactcctgtggtgaac agcctggacccccccctgctgactaggtacctgaggattcacccccagagctgggtgcac cagattgccctgaggatggaggtgctggggctgtgaggcccaggatctgtactga
[0447] FVIII-BDD que codifica a variante de ácido nucleico reduzido de CpG (SEQ ID NO: 74) atgcagattgagctgtctacctgcttctttctgtgcctgctgaggttctgtttctctgcc actaggaggtattatctgggggctgtggagctgtcctgggactacatgcagtctgatctg ggggagctgcctgtggatgccaggttccctcccagggtgcccaagtctttccctttcaat acctctgtggtgtacaagaagactctgtttgtggagtttactgatcacctgtttaacatt gccaagcccaggcccccctggatggggctgctgggccccaccatccaggctgaggtgtat gacactgtggtgattactctgaagaatatggcttctcaccctgtgagcctgcatgctgtg ggggtgagctactggaaggcctctgagggggctgagtatgatgaccagaccagccagagg gagaaggaggatgacaaggtgttccctgggggcagccacacttatgtgtggcaggtgctg aaggagaatggcccaatggcctctgaccccctgtgcctgacctacagctatctgagccat gtggatctggtgaaggatctgaactctggcctgattggggccctgctggtgtgcagggag ggctctctggccaaggagaagactcagactctgcacaagttcatcctgctgtttgctgtg tttgatgagggcaagagctggcactctgagaccaagaactctctgatgcaggatagggat gctgcttctgccagggcctggcccaagatgcacactgtgaatgggtatgtgaataggagc ctgcctgggctgattgggtgtcacaggaagtctgtgtactggcatgtgattggcatgggc accactcctgaggtgcacagcatctttctggagggccacacttttctggtgaggaatcac aggcaggccagcctggagatcagccccatcaccttcctgactgcccagaccctgctgatg gatctgggccagttcctgctgttttgccatatcagcagccatcagcatgatgggatggag gcttatgtgaaggtggactcttgccctgaggagcctcagctgaggatgaagaataatgaa gaggctgaggactatgatgatgatctgactgactctgagatggatgtggtgaggtttgat gatgacaacagccccagctttatccagattaggtctgtggccaagaagcaccccaagacc tgggtgcattacattgctgctgaggaagaggattgggactatgcccccctggtgctggcc cctgatgacaggagctacaagtctcagtacctgaacaatggccctcagaggattggcagg aagtacaagaaggtgaggttcatggcttacactgatgagaccttcaagaccagggaggcc attcagcatgaatctgggatcctgggccccctgctgtatggggaggtgggggacaccctg ctgattattttcaagaaccaggccagcaggccctacaacatttatcctcatggcattact gatgtgagacccctgtacagcaggaggctgcctaagggggtgaagcacctgaaggacttc cccatcctgcctggggagatcttcaagtacaagtggactgtgactgtggaggatggcccc actaagtctgaccccaggtgcctgactaggtactactccagctttgtgaacatggagagg gacctggcctctggcctgattggccccctgctgatctgctacaaggagtctgtggatcag aggggcaaccagatcatgtctgacaagagaaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgag aataggtcttggtacctgactgagaacatccagaggtttctgcctaatcctgctggggtg cagctggaggatcctgagttccaggcctctaacattatgcacagcatcaatgggtatgtg tttgacagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctactggtacatcctgagc attggggcccagactgactttctgtctgtgttcttctctggctacacctttaagcataag atggtgtatgaggacaccctgactctgttccccttctctggggagactgtgttcatgagc atggagaacccaggcctgtggatcctgggctgccacaactctgatttcaggaataggggc atgactgccctgctgaaggtgagcagctgtgataagaacactggggactattatgaggat agctatgaggacatctctgcctacctgctgagcaagaacaatgccattgagcccaggagc ttcagccagaatcctcctgtgctgaagaggcaccagagggagatcaccaggaccaccctg cagtctgatcaggaggagattgactatgatgacactatctctgtggagatgaagaaggag gactttgacatctatgatgaggatgagaatcagagccccaggagcttccagaagaagact agacactactttattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgagctcttctccc catgtgctgagaaacagggcccagtctggctctgtgccccagttcaagaaggtggtcttc caggagttcactgatggctctttcacccagcctctgtatagaggggagctgaatgagcac ctgggcctgctgggcccttacatcagggctgaggtggaggacaatatcatggtgaccttc aggaaccaggctagcaggccctactctttctacagcagcctgatcagctatgaggaggac cagaggcagggggctgagcctaggaagaattttgtgaagcccaatgagaccaagacctac ttctggaaggtgcagcaccacatggctcccactaaggatgagtttgactgcaaggcctgg gcctacttttctgatgtggacctggagaaggatgtgcattctggcctgattggccccctg ctggtctgccacaccaatactctgaaccctgctcatgggagacaggtgactgtgcaggag tttgccctgttcttcaccatctttgatgagaccaagtcctggtactttactgagaacatg gagaggaattgcagggccccttgcaacatccagatggaggaccccaccttcaaggaaaat tataggttccatgccatcaatggctacatcatggacaccctgcctggcctggtgatggcc caggaccagaggatcaggtggtatctgctgtctatgggctctaatgagaacatccacagc atccatttctctggccatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtataagatggctctg tacaacctgtaccctggggtctttgagactgtggagatgctgcccagcaaggctggcatt tggagggtggagtgcctgattggggaacacctgcatgctgggatgagcaccctgttcctg gtgtactctaacaagtgccagaccccactgggcatggcttctggccacatcagggatttc cagattactgcctctggccagtatggccagtgggctcccaagctggctaggctgcactac tctgggagcatcaatgcctggtctactaaggagcctttctcttggatcaaagtggacctg ctggcccctatgatcatccatgggatcaagactcagggggccaggcagaagttcagcagc ctgtacatctctcagttcatcattatgtacagcctggatggcaagaagtggcagacctac aggggcaacagcactggcaccctgatggtgttctttgggaatgtggacagctctgggatt aagcacaacatctttaacccccccatcattgccaggtatatcaggctgcaccctacccac tacagcattaggagcaccctgaggatggagctgatgggctgtgacctgaacagctgcagc atgcccctggggatggagagcaaggccatttctgatgctcagatcactgcttctagctac ttcactaacatgtttgccacctggtctcccagcaaggctagactgcacctgcaggggagg agcaatgcctggaggccccaggtgaataatcccaaggagtggctgcaggtggatttccag aaaaccatgaaggtgactggggtgactacccagggggtgaagtctctgctgaccagcatg tatgtgaaggagttcctgatcagcagcagccaggatgggcatcagtggaccctgttcttt cagaatgggaaggtgaaggtgtttcagggcaatcaggacagcttcacccctgtggtgaac agcctggacccccccctgctgaccaggtacctgaggatccacccccagagctgggtgcat cagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaggcccaggacctgtactga
[0448] FVIII-BDD que codifica a variante de ácido nucleico reduzido de CpG (SEQ ID NO: 75) atgcagattgagctgtctacttgcttcttcctgtgcctgctgaggttctgcttctctgcc actaggaggtattacctgggggctgtggagctgagctgggactatatgcagtctgacctg ggggagctgcctgtggatgccaggtttcctcccagggtgcctaagagcttccccttcaac acctctgtggtgtacaagaagactctgtttgtggagtttactgatcatctgttcaacatt gccaagcccaggcctccttggatggggctgctgggccccaccatccaggctgaggtgtat gacactgtggtgattaccctgaagaatatggccagccatcctgtgagcctgcatgctgtg ggggtgagctattggaaggcctctgagggggctgagtatgatgatcagactagccagagg gagaaggaggatgacaaggtgttccctggggggagccatacctatgtgtggcaggtgctg aaggagaatggccccatggcctctgaccctctgtgcctgacttatagctacctgagccat gtggatctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggccctgctggtgtgcagggag ggcagcctggccaaggagaagactcagaccctgcacaagttcatcctgctgtttgctgtg tttgatgaggggaagtcctggcactctgagactaagaacagcctgatgcaggatagggat gctgcttctgccagggcctggcctaagatgcacactgtgaatggctatgtgaataggagc ctgcctggcctgattggctgccataggaagtctgtgtactggcatgtgattgggatgggc accacccctgaggtgcactctattttcctggagggccatactttcctggtgaggaaccat aggcaggccagcctggagatcagccccatcactttcctgactgcccagactctgctgatg gacctgggccagttcctgctgttctgccacatcagcagccatcagcatgatggcatggag gcttatgtgaaggtggacagctgccctgaggagcctcagctgaggatgaagaataatgag gaggctgaggactatgatgatgacctgactgactctgagatggatgtggtgaggtttgat gatgacaactctccctctttcatccagatcaggtctgtggccaagaagcaccctaagacc tgggtgcactacattgctgctgaggaggaggattgggactatgcccccctggtgctggcc ccagatgacaggagctacaagtcccagtacctgaacaatggcccccagaggattggcagg aagtacaagaaggtgaggttcatggcttatactgatgagactttcaagaccagggaggcc atccagcatgagtctggcatcctgggccctctgctgtatggggaggtgggggacaccctg ctgattatcttcaagaaccaggcttctaggccctacaatatctaccctcatggcatcact gatgtgaggcccctgtacagcaggaggctgcccaagggggtgaagcatctgaaggatttc cccatcctgcctggggagatctttaagtataagtggactgtgactgtggaggatggcccc actaagtctgaccccaggtgcctgaccaggtattacagcagctttgtgaacatggagagg gatctggcttctgggctgattggccccctgctgatctgctacaaggagtctgtggaccag aggggcaaccagatcatgtctgacaagaggaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgag aataggagctggtacctgactgagaacatccagaggtttctgcccaatcctgctggggtg cagctggaggatcctgagtttcaggcctctaatatcatgcacagcatcaatggctatgtg tttgactctctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctattggtacatcctgagc attggggcccagactgactttctgtctgtgtttttttctggctacaccttcaagcacaag atggtgtatgaggatactctgactctgttccctttttctggggagactgtgttcatgtct atggagaaccctgggctgtggattctgggctgccacaattctgacttcaggaacagaggc atgactgctctgctgaaggtgagcagctgtgacaagaacactggggactactatgaggac tcttatgaggacatttctgcctacctgctgagcaagaacaatgccattgagcccagaagc ttttctcagaacccccctgtgctgaagaggcaccagagggagatcaccaggaccaccctg cagtctgaccaggaggagattgactatgatgatactatttctgtggagatgaagaaggag gactttgacatctatgatgaggatgagaaccagagccccaggtctttccagaagaagact aggcactactttattgctgctgtggagaggctgtgggactatgggatgtctagctctcct catgtgctgaggaacagggcccagtctggctctgtgccccagtttaaaaaggtggtgttc caggaattcactgatggcagctttacccagcctctgtacaggggggagctgaatgagcac ctggggctgctggggccttacattagggctgaggtggaggacaacatcatggtgaccttc aggaatcaggccagcaggccctactctttctacagcagcctgatctcttatgaggaggac cagaggcagggggctgaacccaggaagaactttgtgaagcccaatgagaccaagacctac ttctggaaggtgcagcaccacatggctcccaccaaggatgagtttgattgcaaggcctgg gcttacttctctgatgtggatctggagaaggatgtgcactctgggctgattggccccctg ctggtgtgccacaccaacactctgaaccctgcccatggcagacaggtgactgtgcaggag tttgccctgttcttcactatctttgatgagactaagagctggtacttcactgagaacatg gagaggaattgcagggccccttgcaacatccagatggaggaccccacctttaaggagaac tacaggtttcatgccattaatggctacatcatggacaccctgcctggcctggtgatggcc caggaccagaggatcaggtggtacctgctgtctatggggagcaatgagaacatccacagc attcacttctctggccatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggccctg tacaacctgtaccctggggtgtttgagactgtggagatgctgcccagcaaggctgggatc tggagggtggagtgcctgattggggagcacctgcatgctgggatgagcaccctgttcctg gtgtatagcaacaagtgccagacccccctgggcatggcctctggccacatcagagacttt cagattactgcctctggccagtatgggcagtgggcccccaagctggccaggctgcactat tctggctctattaatgcctggagcactaaggagcccttcagctggattaaggtggacctg ctggctcccatgatcatccatggcatcaagactcagggggccaggcagaagttctcttct ctgtacatcagccagttcattatcatgtactccctggatggcaagaagtggcagacctat aggggcaacagcactggcaccctgatggtgttctttgggaatgtggacagctctggcatc aagcataatatcttcaatccccccatcattgctaggtacatcaggctgcaccccacccac tactctattaggtctaccctgaggatggagctgatgggctgtgacctgaacagctgcagc atgcctctgggcatggagagcaaagccatctctgatgcccagatcactgccagcagctac tttaccaacatgtttgctacttggagccccagcaaggccaggctgcacctgcaggggagg tctaatgcctggaggccccaggtgaacaaccccaaggagtggctgcaggtggacttccag aagactatgaaggtgactggggtgaccacccagggggtgaagagcctgctgacctctatg tatgtgaaggagttcctgattagcagcagccaggatggccaccagtggaccctgtttttc cagaatgggaaggtgaaggtgtttcaggggaaccaggacagcttcactcctgtggtgaac tctctggacccccccctgctgaccaggtatctgaggatccaccctcagagctgggtgcac cagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaggcccaggacctgtactga
[0449] FVIII-BDD que codifica a variante de ácido nucleico reduzido de CpG (SEQ ID NO: 76) atgcagattgagctgagcacctgcttcttcctgtgcctgctgaggttttgcttctctgccaccaggaggtactacct gggggctgtggagctgagctgggattacatgcagtctgacctgggggagctgcctgtggatgccaggttccct cccagggtgcccaagtctttccccttcaacacttctgtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagtttactgacc acctgttcaacattgccaagcccaggcctccctggatgggcctgctgggccccaccattcaggctgaggtgtat gacactgtggtcatcaccctgaaaaatatggctagccaccctgtgtctctgcatgctgtgggggtgagctactgg aaggcctctgagggggctgagtatgatgaccagactagccagagggagaaggaggatgacaaggtgttcc ctgggggcagccacacttatgtgtggcaggtgctgaaagagaatggccccatggcttctgatcccctgtgtctg acctatagctacctgagccatgtggatctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggccctgctggtgtgc agggagggcagcctggctaaggagaagacccagaccctgcataagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatga gggcaagagctggcactctgagactaagaacagcctgatgcaggatagggatgctgcttctgccagggcct ggcccaagatgcacactgtgaatgggtatgtgaacaggagcctgcctggcctgattggctgccataggaagt ctgtctattggcatgtgattggcatgggcactactcctgaggtgcacagcatctttctggagggccacaccttcct ggtgaggaaccacaggcaggccagcctggagatctctcccatcactttcctgactgctcagaccctgctgatg gacctgggccagttcctgctgttctgtcacatctctagccaccagcatgatggcatggaggcctatgtgaaggtg gatagctgccctgaggaaccccagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaggattatgatgatgatct gactgattctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaattctcctagcttcattcagatcagatctgtggcca aaaagcatcctaagacttgggtgcattatattgctgctgaggaggaggattgggattatgcccccctggtgctgg ctcctgatgataggagctacaagtctcagtacctgaataatgggccccagaggattggcaggaagtacaaga aggtgaggttcatggcctacactgatgagaccttcaagaccagggaggccattcagcatgagtctgggattct ggggcccctgctgtatggggaggtgggggataccctgctgatcattttcaagaaccaggccagcaggcccta caacatctacccccatgggattactgatgtgaggcccctgtactctaggaggctgcctaagggggtgaagcac ctgaaggattttcctatcctgcctggggaaatcttcaagtacaagtggactgtgactgtggaggatggccccact aagtctgatcccaggtgtctgaccaggtattatagctcttttgtgaacatggagagggatctggcctctgggctga ttggccctctgctgatctgctacaaggagtctgtggaccagaggggcaaccagatcatgtctgacaagagga atgtgatcctgttctctgtgtttgatgagaacaggagctggtatctgactgagaacatccagaggtttctgcccaat cctgctggggtgcagctggaggatcctgagttccaggctagcaacatcatgcacagcatcaatgggtatgtgtt tgacagcctgcagctgtctgtgtgtctgcatgaggtggcctactggtatatcctgtctattggggcccagactgact tcctgtctgtgtttttttctgggtatacttttaagcacaagatggtgtatgaggacaccctgactctgttccccttctctg gggagactgtgtttatgagcatggagaaccctggcctgtggatcctgggctgccacaattctgacttcaggaat agggggatgactgccctgctgaaggtgagcagctgtgataagaatactggggactactatgaggactcttatg aggacatttctgcctatctgctgtctaagaacaatgccattgaacccaggagcttctctcagaacccccctgtgct gaagaggcaccagagggaaatcaccagaactactctgcagtctgatcaggaggaaattgactatgatgaca ctatttctgtggagatgaagaaggaggactttgacatctatgatgaggatgagaaccagagcccaaggagctt ccagaagaagactaggcactacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgagcagcagccc ccatgtgctgagaaacagggcccagtctgggtctgtgccccagttcaagaaggtggtgttccaggagttcactg atgggagcttcacccagcccctgtataggggggagctgaatgagcacctgggcctgctgggcccctatattag ggctgaggtggaggacaacatcatggtgaccttcaggaatcaggcctctaggccctacagcttctacagcag cctgattagctatgaggaggatcagaggcagggggctgaacccaggaagaactttgtgaagcccaatgaga ccaagacctatttctggaaggtgcagcatcacatggcccccaccaaggatgagtttgactgcaaggcctggg cctacttctctgatgtggatctggagaaggatgtgcactctggcctgattggccccctgctggtgtgccacacca acaccctgaaccctgctcatggcaggcaggtgactgtgcaggagtttgccctgttcttcaccatctttgatgaga ctaagtcttggtacttcactgagaatatggagaggaattgcagggccccctgcaatattcagatggaagaccc caccttcaaggagaattacaggttccatgccattaatggctacatcatggataccctgcctggcctggtgatggc ccaggatcagaggatcaggtggtacctgctgagcatgggcagcaatgagaacatccactctatccacttctct ggccatgtgtttactgtgaggaagaaggaggagtataagatggccctgtacaacctgtaccctggggtctttga gactgtggagatgctgccttctaaggctggcatttggagggtggagtgcctgattggggaacacctgcatgctg gcatgtctaccctgttcctggtgtacagcaataagtgccagacccccctgggcatggcctctgggcatatcagg gatttccagatcactgcctctggccagtatggccagtgggccccaaagctggctaggctgcactactctggga gcatcaatgcctggagcactaaggagcccttcagctggatcaaggtggacctgctggcccccatgattatcca tgggattaagactcagggggccaggcagaagttcagcagcctgtacatcagccagttcattatcatgtacagc ctggatggcaagaagtggcagacctataggggcaactctactgggaccctgatggtgttctttgggaatgtgga tagctctgggatcaagcacaatatcttcaacccccccatcattgccaggtatatcaggctgcaccccacccact acagcattaggtctaccctgaggatggagctgatgggctgtgatctgaacagctgtagcatgcctctgggcatg gagtctaaggccatttctgatgcccagattactgctagcagctacttcaccaacatgtttgccacctggtctccca gcaaggccaggctgcatctgcagggcaggtctaatgcttggaggccccaggtgaacaacccaaaggagtg gctgcaggtggatttccagaagactatgaaggtgactggggtgaccactcagggggtgaagtctctgctgacc tctatgtatgtgaaggagttcctgatctctagcagccaggatggccatcagtggaccctgttcttccagaatggca aggtgaaagtgttccagggcaatcaggatagcttcactccagtggtgaacagcctggatccccctctgctgact aggtacctgaggatccacccccagagctgggtgcaccagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgag gcccaggacctgtactga
[0450] FVIII-BDD que codifica a variante de ácido nucleico reduzido de CpG (SEQ ID NO: 77). atgcagattgagctgagcacctgcttcttcctgtgtctgctgaggttctgcttctctgccaccaggaggtattacctg ggggctgtggagctgagctgggactatatgcagtctgacctgggggagctgcctgtggatgctaggttcccccc cagggtgcccaagagcttcccctttaacacttctgtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagttcactgacca cctgttcaacattgccaagcccaggcccccctggatggggctgctggggcccaccatccaggctgaggtgtat gacactgtggtgatcaccctgaagaacatggccagccaccctgtgagcctgcatgctgtgggggtgagctact ggaaggcttctgagggggctgagtatgatgaccagactagccagagggagaaggaggatgacaaggtgttt cctgggggcagccatacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggccccatggcctctgaccccctgtgcc tgacctacagctacctgtctcatgtggacctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggctctgctggtgtg tagggagggcagcctggctaaggaaaagacccagaccctgcataagtttatcctgctgtttgctgtgtttgatga gggcaagagctggcactctgagaccaagaacagcctgatgcaggatagggatgctgcctctgccagggctt ggcctaagatgcacactgtgaatgggtatgtgaataggagcctgcctggcctgattggctgccacaggaagtc tgtgtactggcatgtgattgggatgggcaccacccctgaggtccatagcatcttcctggagggccacactttcct ggtgaggaaccacagacaggcctctctggagatctctcccatcaccttcctgactgctcagactctgctgatgg acctgggccagttcctgctgttttgccatattagcagccaccagcatgatgggatggaggcctatgtgaaggtg gatagctgccctgaggagcctcagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaagactatgatgatgacct gactgattctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaatagccccagcttcattcagatcaggtctgtggcc aagaaacaccccaagacctgggtgcactacattgctgctgaggaagaggactgggactatgctcccctggtg ctggcccctgatgataggtcttataagagccagtacctgaacaatgggccccagaggattggcaggaagtac aagaaggtgaggttcatggcctacactgatgaaaccttcaaaaccagggaggccattcagcatgagtctggc atcctgggccctctgctgtatggggaggtgggggacaccctgctgatcatcttcaagaaccaggccagcagg ccctacaacatctatcctcatggcatcactgatgtgaggcccctgtacagcaggaggctgcccaagggggtg aagcacctgaaagacttccccatcctgcctggggagatctttaagtataagtggactgtgactgtggaggatgg ccctaccaagtctgaccccaggtgtctgaccaggtactattctagctttgtgaacatggagagggacctggcct ctggcctgattgggcccctgctgatctgctacaaggagtctgtggaccagaggggcaaccagatcatgtctga caagaggaatgtgatcctgttttctgtgtttgatgagaataggagctggtacctgactgagaacatccagaggttt ctgcccaatcctgctggggtgcagctggaggatcctgagttccaggccagcaatatcatgcatagcatcaatg gctatgtgtttgacagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctactggtacatcctgagcattggggc ccagactgactttctgtctgtgttcttttctggctataccttcaagcacaagatggtgtatgaggataccctgaccct gttccccttctctggggagactgtgttcatgagcatggagaatcctgggctgtggatcctggggtgccacaactct gattttaggaacagggggatgactgccctgctgaaggtgtctagctgtgataagaacactggggactactatg aggacagctatgaggacatttctgcttatctgctgtctaagaataatgccattgagcccagaagcttcagccag aatccccctgtgctgaagagacatcagagggagatcaccagaactaccctgcagtctgatcaggaggagatt gactatgatgacactatctctgtggagatgaagaaggaggactttgacatctatgatgaggatgagaatcagtc tcccaggagctttcagaagaagaccagacattacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatga gctctagccctcatgtgctgaggaacagggcccagtctggctctgtgccccagttcaagaaggtggtgttccag gaattcactgatggcagcttcacccagcccctgtacaggggggagctgaatgagcacctgggcctgctgggg ccttatatcagggctgaggtggaggataatattatggtgactttcaggaaccaggccagcaggccctactctttc tatagcagcctgatctcttatgaggaggatcagaggcagggggctgagcctaggaagaactttgtgaagccc aatgagactaagacctacttctggaaggtccagcaccacatggcccctaccaaggatgagtttgactgcaag gcctgggcctatttctctgatgtggatctggagaaggatgtccattctgggctgattggccccctgctggtgtgcca cactaacactctgaatcctgcccatggcaggcaggtgactgtccaggagtttgccctgttcttcactatctttgatg agaccaagagctggtactttactgagaacatggagaggaactgcagagctccttgcaatattcagatggagg accccaccttcaaggagaattacaggttccatgccattaatgggtacatcatggacaccctgcctggcctggtg atggctcaggaccagaggatcaggtggtacctgctgagcatgggctctaatgagaatatccacagcatccact tctctgggcatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggctctgtataatctgtaccctggggtgt ttgaaactgtggagatgctgccctctaaggctggcatctggagggtggagtgcctgattggggagcacctgcat gctggcatgagcaccctgttcctggtgtacagcaacaagtgccagacccccctgggcatggcctctggccac atcagggacttccagatcactgcctctggccagtatggccagtgggcccccaagctggccaggctgcactatt ctggcagcatcaatgcctggagcaccaaggagcccttcagctggatcaaggtggacctgctggcccccatga tcattcatggcatcaagacccagggggccaggcagaagttcagctctctgtacatctctcagttcatcatcatgt actctctggatgggaagaagtggcagacctacaggggcaacagcactggcaccctgatggtgttctttggga atgtggactcttctggcatcaagcacaacatcttcaatccccccatcattgctaggtatattaggctgcatcccac ccactacagcatcaggtctaccctgaggatggagctgatgggctgtgacctgaactcttgcagcatgcccctg ggcatggagtctaaggccatctctgatgcccagattactgccagcagctacttcaccaacatgtttgccacctgg agcccctctaaggccaggctgcatctgcaggggaggagcaatgcctggaggcctcaggtgaacaacccca aggagtggctgcaggtggatttccagaagaccatgaaggtgactggggtgaccacccagggggtcaagag cctgctgaccagcatgtatgtgaaggagttcctgatcagcagcagccaggatggccaccagtggactctgttct ttcagaatgggaaggtgaaggtgtttcagggcaatcaggactctttcacccctgtggtgaacagcctggacccc cccctgctgaccagatacctgaggatccacccccagtcttgggtgcatcagattgccctgaggatggaggtgct gggctgtgaggctcaggatctgtactga
[0451] FVIII-BDD que codifica a variante de ácido nucleico reduzido de CpG (SEQ ID NO: 78) atgcagattgagctgagcacttgcttttttctgtgcctgctgaggttttgtttttctgccaccaggaggtactacctgg gggctgtggagctgagctgggactatatgcagtctgatctgggggagctgcctgtggatgccaggttccccccc agggtgcccaagtcttttcccttcaacacctctgtggtgtataagaagaccctgtttgtggagttcactgaccacct gttcaacattgctaagcctaggcccccctggatgggcctgctgggccctaccattcaggctgaggtgtatgaca ctgtggtgatcaccctgaagaacatggccagccatcctgtgagcctgcatgctgtgggggtctcttactggaag gcctctgagggggctgagtatgatgaccagaccagccagagagagaaggaggatgacaaggtcttccctg ggggctctcacacctatgtgtggcaggtgctgaaggaaaatggccccatggcctctgaccccctgtgcctgac ctacagctatctgagccatgtggatctggtgaaggacctgaattctggcctgattggggccctgctggtgtgcag ggagggcagcctggccaaggagaagacccagaccctgcacaagtttatcctgctgtttgctgtgtttgatgag ggcaagtcttggcactctgagactaagaacagcctgatgcaggacagggatgctgcctctgccagggcctgg cccaagatgcacactgtgaatggctatgtgaacaggagcctgcctgggctgattggctgccacaggaagtctg tgtactggcatgtgattggcatgggcaccacccctgaggtgcacagcatcttcctggaaggccacactttcctg gtgaggaaccataggcaggccagcctggagatcagccctatcaccttcctgactgcccagaccctgctgatg gatctggggcagttcctgctgttctgccacatctctagccaccagcatgatgggatggaggcctatgtgaaggtg gacagctgcccagaggagcctcagctgaggatgaaaaacaatgaagaggctgaggattatgatgatgatct gactgactctgagatggatgtggtgagatttgatgatgacaatagccctagctttattcagatcaggtctgtggct aagaagcaccccaagacctgggtgcattacattgctgctgaggaggaggactgggattatgctcctctggtgc tggcccctgatgataggagctacaagagccagtacctgaataatggccctcagaggattggcaggaagtac aagaaggtgaggttcatggcttacactgatgagaccttcaagactagggaggccatccagcatgagtctggg atcctggggcccctgctgtatggggaggtgggggacaccctgctgatcatcttcaagaaccaggctagcagg ccttacaacatctatccccatgggatcactgatgtgagacctctgtacagcaggaggctgcccaagggggtca agcatctgaaagacttccccatcctgcctggggagatctttaagtataagtggactgtgactgtggaggatggg cccaccaagtctgaccccaggtgcctgaccaggtattacagcagctttgtgaacatggagagggatctggcct ctgggctgattggccccctgctgatctgttacaaggaatctgtggatcagaggggcaatcagatcatgtctgac aagaggaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgagaataggtcttggtacctgactgaaaacatccagaggttcct gcccaaccctgctggggtccagctggaggatcctgagttccaggctagcaacatcatgcacagcatcaatgg gtatgtgtttgatagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctactggtacatcctgtctattggggccca gactgacttcctgtctgtgttcttttctggctacaccttcaagcacaagatggtgtatgaggacaccctgaccctgtt ccccttctctggggagactgtctttatgagcatggagaaccctgggctgtggatcctgggctgccacaactctga tttcaggaataggggcatgactgctctgctgaaggtgagctcttgtgacaagaacactggggattactatgagg acagctatgaggacatttctgcctacctgctgagcaagaacaatgccattgagcctaggagctttagccagaat cctcctgtcctgaagaggcaccagagggagatcaccaggaccaccctgcagtctgaccaggaggagattg actatgatgataccatctctgtggagatgaagaaggaggactttgacatctatgatgaggatgagaatcagtct cccaggagcttccagaagaagaccaggcactatttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatga gcagctctcctcatgtgctgaggaatagggctcagtctggctctgtgccccagttcaagaaagtggtgtttcagg agttcactgatggctctttcacccagcctctgtataggggggagctgaatgagcacctggggctgctgggcccc tatatcagggctgaggtggaggataacatcatggtgaccttcaggaaccaggcctctaggccctacagcttcta tagcagcctgatcagctatgaggaggaccagaggcagggggctgagcccaggaagaactttgtgaagccc aatgagaccaagacttacttctggaaggtgcagcatcacatggcccccaccaaggatgagtttgactgtaag gcctgggcctacttctctgatgtggatctggagaaggatgtgcactctggcctgattggccccctgctggtgtgcc ataccaatactctgaaccctgctcatggcaggcaggtgactgtgcaggagtttgctctgttcttcactatctttgatg agaccaagtcttggtatttcactgagaatatggagaggaactgcagggccccctgcaacatccagatggagg accccacctttaaggagaactataggtttcatgccatcaatggctacatcatggacaccctgcctggcctggtg atggcccaggatcagaggatcaggtggtacctgctgagcatggggtctaatgagaacatccacagcatccac ttctctggccatgtgtttactgtgagaaagaaggaggagtacaagatggctctgtacaatctgtaccctggggtct ttgagactgtggagatgctgcctagcaaggctgggatctggagggtggagtgcctgattggggaacatctgca tgctgggatgtctactctgttcctggtgtacagcaacaagtgccagacccccctgggcatggcttctggccatatc agggactttcagattactgcctctgggcagtatggccagtgggcccccaagctggctaggctgcattattctggc agcatcaatgcctggtctactaaggagcccttcagctggatcaaggtggatctgctggcccccatgatcatcca tggcatcaagacccagggggccaggcagaagtttagctctctgtacattagccagttcatcatcatgtacagcc tggatgggaagaagtggcagacctacaggggcaattctactggcaccctgatggtgttctttggcaatgtggac agctctggcatcaagcacaacatctttaacccccctatcattgctaggtacatcaggctgcatcccacccattac agcatcaggagcaccctgaggatggagctgatgggctgtgacctgaactcttgcagcatgcccctgggcatg gagagcaaggccatttctgatgcccagattactgccagcagctacttcactaacatgtttgccacctggtctccc agcaaggccaggctgcacctgcagggcaggagcaatgcctggaggccccaggtgaacaaccccaagga gtggctgcaggtggatttccagaagaccatgaaggtgactggggtgaccacccagggggtgaagagcctgc tgactagcatgtatgtgaaggagttcctgatcagctctagccaggatggccaccagtggactctgtttttccaga atggcaaggtgaaggtgttccagggcaaccaggactctttcactcctgtggtgaacagcctggacccccccct gctgaccaggtatctgaggattcacccccagtcttgggtgcatcagattgccctgaggatggaggtgctgggct gtgaggcccaggatctgtactga
[0452] FVIII-BDD que codifica a variante de ácido nucleico reduzido de CpG (SEQ ID NO: 79) atgcagattgagctgagcacctgcttcttcctgtgtctgctgagattttgcttttctgccactaggaggtattacctgg gggctgtggagctgtcttgggactacatgcagtctgatctgggggagctgcctgtggatgccaggttcccaccta gggtgcctaagagctttcccttcaatacctctgtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagttcactgaccacct gttcaacattgccaagcctaggcccccctggatgggcctgctgggccctaccatccaggctgaagtgtatgac actgtggtgatcaccctgaagaacatggccagccaccctgtgagcctgcatgctgtgggggtgtcttactggaa ggcctctgagggggctgagtatgatgatcagaccagccagagggagaaggaagatgacaaggtgttccctg ggggcagccacacctatgtctggcaggtgctgaaggagaatggccccatggcctctgatcccctgtgcctgac ctactcttacctgagccatgtggacctggtgaaggatctgaattctggcctgattggggccctgctggtgtgcagg gagggcagcctggccaaggagaagacccagaccctgcataagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatgaag ggaagagctggcactctgagactaagaacagcctgatgcaggacagggatgctgcttctgccagggcctgg cccaagatgcacactgtgaatggctatgtgaatagaagcctgcctggcctgattgggtgccacaggaagtctg tgtactggcatgtgattgggatgggcactacccctgaggtgcatagcatcttcctggaaggccataccttcctggt gaggaatcataggcaggcttctctggaaatttctcccatcactttcctgactgctcagaccctgctgatggacctg ggccagttcctgctgttctgccacatcagctctcaccagcatgatgggatggaggcctatgtgaaggtggacag ctgtcctgaggagccccagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaggactatgatgatgacctgactg actctgagatggatgtggtcaggtttgatgatgacaatagcccctctttcatccagatcaggtctgtggccaaga agcaccccaagacttgggtgcactacattgctgctgaggaggaggattgggattatgcccctctggtgctggcc cctgatgacaggagctataagtctcagtacctgaataatggcccccagaggattgggaggaagtataagaag gtgaggtttatggcctacactgatgagaccttcaagaccagggaggccatccagcatgagtctggcatcctgg gccccctgctgtatggggaggtgggggataccctgctgatcatcttcaagaaccaggcctctaggccctacaa tatctaccctcatggcatcactgatgtgagacccctgtatagcaggaggctgcctaagggggtgaagcacctg aaggacttccccatcctgcctggggagatcttcaagtataagtggactgtgactgtggaggatggccccacca agtctgaccccaggtgcctgaccaggtattacagctcttttgtgaacatggagagggatctggcctctgggctga ttggcccactgctgatctgctacaaggagtctgtggatcagaggggcaatcagatcatgtctgacaagaggaa tgtgatcctgttttctgtgtttgatgaaaataggtcttggtatctgactgagaacatccagaggtttctgcccaatcct gctggggtgcagctggaggatcctgagtttcaggcctctaatatcatgcattctatcaatggctatgtgtttgacag cctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctactggtacatcctgagcattggggctcagactgacttcctg tctgtgttcttttctggctatactttcaagcacaagatggtgtatgaggacactctgaccctgttccccttctctgggg agactgtgttcatgtctatggaaaatcctgggctgtggattctgggctgccacaattctgacttcaggaatagggg gatgactgccctgctgaaggtgtctagctgtgataagaacactggggattactatgaggactcttatgaagatat ctctgcctatctgctgagcaagaacaatgccattgagcccaggagcttcagccagaacccccctgtgctgaag aggcaccagagggagatcaccaggaccactctgcagtctgatcaggaggagattgactatgatgacactat ctctgtggagatgaagaaggaggattttgacatttatgatgaggatgagaaccagtctcccaggagcttccag aagaagaccaggcattactttattgctgctgtggagaggctgtgggactatgggatgagcagctctcctcatgtg ctgaggaacagggcccagtctgggtctgtgccccagttcaagaaggtggtgttccaggagttcactgatggga gcttcacccagcccctgtataggggggagctgaatgagcacctgggcctgctgggcccctacatcagggctg aggtggaggataatatcatggtgaccttcaggaaccaggctagcaggccttacagcttttacagcagcctgat ctcttatgaagaagaccagaggcagggggctgagcccaggaagaattttgtgaagcctaatgagaccaaga cttatttttggaaggtgcagcatcacatggctcctaccaaggatgagtttgactgcaaggcctgggcctacttttct gatgtggatctggagaaggatgtgcactctggcctgattggccctctgctggtgtgccatactaacactctgaac cctgcccatgggaggcaggtgactgtgcaggagtttgccctgttcttcactatttttgatgagaccaagtcttggta tttcactgagaacatggagaggaactgcagggctccctgcaacatccagatggaagaccccaccttcaagg agaactataggttccatgccatcaatgggtacatcatggataccctgcctggcctggtgatggcccaggatcag aggattaggtggtatctgctgagcatgggctctaatgagaacatccacagcatccatttctctggccatgtgttca ctgtgaggaagaaggaggagtacaagatggctctgtacaacctgtatcctggggtgtttgagactgtggagat gctgcccagcaaggctggcatctggagggtggaatgcctgattggggagcacctgcatgctggcatgagcac tctgttcctggtgtatagcaacaagtgccagacccccctgggcatggcctctggccatatcagggatttccagat cactgcttctggccagtatggccagtgggcccccaagctggccaggctgcactattctggcagcatcaatgcct ggagcactaaggagcctttttcttggatcaaggtggacctgctggcccctatgattattcatggcatcaagaccc agggggccaggcagaagttctctagcctgtacatctctcagttcatcattatgtatagcctggatggcaagaagt ggcagacctacaggggcaatagcactggcaccctgatggtgttttttgggaatgtggactcttctgggatcaag cacaacatctttaacccccccatcattgccaggtatattaggctgcaccccacccactacagcatcaggagca ccctgaggatggagctgatgggctgtgatctgaattcttgctctatgcccctgggcatggagagcaaggccatct ctgatgcccagatcactgccagctcttacttcaccaacatgtttgccacctggtctcctagcaaggccaggctgc atctgcagggcaggagcaatgcctggaggccccaggtgaacaaccccaaggagtggctgcaggtggactt ccagaagaccatgaaggtgactggggtgaccactcagggggtgaagagcctgctgacctctatgtatgtgaa ggagttcctgatcagcagcagccaggatggccaccagtggactctgttcttccagaatgggaaggtgaaggt gttccagggcaaccaggatagctttacccctgtggtgaacagcctggaccctcctctgctgaccagatacctga ggatccatcctcagagctgggtgcaccagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaggcccaggatct gtactga
[0453] FVIII-BDD que codifica a variante de ácido nucleico reduzido de CpG (SEQ ID NO: 80) atgcagattgagctgagcacttgcttcttcctgtgcctgctgaggttctgcttttctgctactaggaggtactacctgg gggctgtggagctgagctgggattacatgcagtctgacctgggggagctgccagtggatgccaggttcccccc cagggtgcccaagtcttttcctttcaacacctctgtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagttcactgaccac ctgttcaacattgccaagcccaggcccccctggatggggctgctggggcccaccatccaggctgaggtgtatg acactgtggtgattaccctgaagaacatggctagccaccctgtgagcctgcatgctgtgggggtgagctattgg aaggcctctgagggggctgagtatgatgatcagaccagccagagggaaaaggaggatgacaaggtgttcc ctgggggcagccatacttatgtgtggcaggtgctgaaggagaatgggcccatggcctctgaccccctgtgcct gacttacagctatctgagccatgtggacctggtgaaggatctgaactctggcctgattggggctctgctggtgtg cagggagggcagcctggctaaggagaagactcagactctgcataagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatga aggcaagagctggcactctgagaccaagaactctctgatgcaggatagggatgctgcctctgccagggcttg gcccaagatgcacactgtgaatggctatgtgaacaggagcctgcctggcctgattgggtgccacaggaagtct gtgtactggcatgtgattggcatgggcaccacccctgaggtgcacagcattttcctggagggccacaccttcct ggtgaggaatcacaggcaggccagcctggagatcagccccatcaccttcctgactgcccagaccctgctgat ggacctggggcagtttctgctgttctgccacatcagcagccatcagcatgatggcatggaggcctatgtgaagg tggactcttgccctgaggagccccagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaggattatgatgatgacc tgactgactctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaatagccccagcttcatccagattaggtctgtggc caagaagcaccctaagacctgggtgcactacattgctgctgaggaggaggattgggattatgcccccctggtg ctggctcctgatgacaggtcttataagagccagtacctgaacaatgggccccagaggattggcaggaagtac aagaaggtgaggttcatggcttacactgatgagaccttcaagactagggaggccatccagcatgagtctggc atcctgggccccctgctgtatggggaggtgggggataccctgctgatcatcttcaagaaccaggccagcagg ccctacaacatttaccctcatggcatcactgatgtgaggcccctgtacagcaggagactgcccaagggggtg aagcacctgaaggattttcccattctgcctggggagatcttcaagtacaagtggactgtgactgtggaggatgg ccccaccaagtctgatcccaggtgcctgactaggtactactcttcttttgtgaatatggagagggatctggcctct ggcctgattggccccctgctgatctgctacaaggagtctgtggaccagaggggcaaccagatcatgtctgaca agaggaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgagaataggagctggtacctgactgagaatatccagaggttcct gcctaatcctgctggggtccagctggaggatcctgagttccaggctagcaacattatgcacagcatcaatggct atgtgtttgattctctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcttactggtacatcctgtctattggggcccagac tgatttcctgtctgtgttcttctctggctacactttcaagcataagatggtgtatgaggataccctgaccctgttcccct tctctggggagactgtgttcatgtctatggagaaccctggcctgtggatcctgggctgtcataactctgacttcaga aacaggggcatgactgccctgctgaaggtgagcagctgtgacaagaacactggggactactatgaggaca gctatgaggatatctctgcttatctgctgagcaagaataatgccattgagcccaggagcttcagccagaacccc cctgtgctgaagaggcaccagagggagatcactaggactaccctgcagtctgatcaggaggagattgactat gatgacaccatctctgtggagatgaagaaggaggactttgacatctatgatgaggatgagaaccagtccccc aggtctttccagaagaagaccaggcactacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgagctc tagcccccatgtgctgaggaacagggctcagtctggctctgtgccccagttcaagaaggtggtcttccaggagt tcactgatggctcttttacccagcctctgtacagaggggagctgaatgagcacctgggcctgctgggcccctac atcagggctgaggtggaggataatatcatggtgaccttcagaaaccaggcctctaggccctacagcttctaca gcagcctgatctcttatgaggaggatcagaggcagggggctgagcccaggaagaactttgtgaagcccaat gagaccaagacctacttctggaaggtgcagcaccatatggcccctactaaggatgagtttgactgcaaggcct gggcttatttttctgatgtggacctggagaaggatgtgcactctgggctgattggccccctgctggtgtgccacac caacaccctgaaccctgcccatggcaggcaggtgactgtgcaggagtttgccctgttcttcactatctttgatga gaccaagagctggtacttcactgagaacatggagagaaattgtagggctccctgcaatatccagatggagga ccccaccttcaaagaaaattacagattccatgccatcaatgggtacatcatggataccctgcctgggctggtga tggctcaggaccagaggatcaggtggtacctgctgagcatggggtctaatgagaacatccactctatccatttct ctggccatgtgttcactgtgagaaagaaggaggagtataagatggctctgtacaacctgtacccaggggtgttt gagactgtggaaatgctgcccagcaaagctgggatctggagggtggagtgcctgattggggagcacctgcat gctggcatgtctaccctgttcctggtgtacagcaacaagtgccagactcccctgggcatggcctctgggcacat cagggattttcagatcactgcctctggccagtatggccagtgggcccccaagctggccaggctgcactactctg gcagcattaatgcttggagcactaaggagcccttcagctggatcaaggtggatctgctggcccccatgatcatc catggcatcaagacccagggggccaggcagaagttctctagcctgtacatttctcagttcatcatcatgtacag cctggatgggaagaagtggcagacctacagggggaacagcactgggaccctgatggtgttctttggcaatgt ggatagctctggcatcaagcacaatatcttcaatccccccattattgccaggtacattaggctgcatcctactcac tactctattaggagcaccctgaggatggagctgatggggtgtgacctgaacagctgttctatgcccctgggcat ggagtctaaggctatctctgatgcccagatcactgccagcagctacttcactaatatgtttgccacctggagccct agcaaggccagactgcacctgcagggcaggagcaatgcctggaggccccaggtgaacaaccccaagga gtggctgcaggtggacttccagaagaccatgaaggtgactggggtgaccactcagggggtgaagagcctgc tgaccagcatgtatgtgaaggagttcctgatcagcagcagccaggatggccaccagtggaccctgttcttcca gaatgggaaggtgaaggtgttccagggcaaccaggactctttcacccctgtggtgaacagcctggatcctccc ctgctgaccaggtacctgaggatccacccccagagctgggtgcaccagattgctctgaggatggaagtgctg ggctgtgaggcccaggatctgtactga
[0454] FVIII-BDD que codifica a variante de ácido nucleico reduzido de CpG (SEQ ID NO: 81) atgcagattgagctgagcacctgcttcttcctgtgcctgctgaggttttgcttctctgctaccaggaggtactacctg ggggctgtggagctgagctgggactatatgcagtctgacctgggggagctgcctgtggatgctaggttccctcc cagggtgcccaagagcttcccctttaatacctctgtggtgtacaagaaaaccctgtttgtggagttcactgaccat ctgttcaacattgccaagcccaggcccccttggatgggcctgctgggccccaccattcaggctgaggtgtatga cactgtggtcattaccctgaagaacatggcttctcaccctgtgagcctgcatgctgtgggggtgagctactggaa ggcctctgagggggctgagtatgatgaccagaccagccagagggagaaggaggatgataaggtgttccctg ggggcagccacacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggccccatggcctctgatcccctgtgcctga cctactcttatctgtctcatgtggacctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggctctgctggtgtgcagg gagggctctctggccaaggagaagacccagaccctgcacaagtttattctgctgtttgctgtctttgatgagggc aagagctggcattctgagaccaagaacagcctgatgcaggacagggatgctgcctctgccagggcctggcc caaaatgcacactgtgaatggctatgtgaacaggagcctgcctggcctgattggctgccacaggaagtctgtg tactggcatgtgattggcatgggcaccacccctgaggtgcacagcatcttcctggagggccacacctttctggt gaggaatcacaggcaggccagcctggagattagccccatcaccttcctgactgcccagaccctgctgatgga cctgggccagttcctgctgttctgccacatcagcagccaccagcatgatggcatggaggcctatgtgaaggtg gatagctgccctgaggagccccagctgaggatgaaaaacaatgaggaggctgaggattatgatgatgacct gactgactctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaatagccccagctttattcagattaggtctgtggct aagaagcaccccaagacttgggtgcactacattgctgctgaggaggaggattgggactatgcccctctggtcc tggcccctgatgataggtcttacaagagccagtatctgaacaatggcccccagaggattggcaggaagtaca agaaggtgaggttcatggcctacactgatgagacctttaagaccagggaggccattcagcatgagtctgggat cctgggccccctgctgtatggggaggtgggggacactctgctgatcatcttcaagaaccaggccagcaggcc ttataacatctaccctcatgggatcactgatgtgaggcccctgtactctagaaggctgcccaagggggtcaagc acctgaaggattttcccatcctgcctggggagattttcaagtacaagtggactgtgactgtggaggatggcccc accaagtctgaccctaggtgcctgaccaggtactacagctcttttgtgaacatggagagggacctggcctctgg cctgattggccctctgctgatttgctacaaggagtctgtggaccagaggggcaaccagatcatgtctgacaaga ggaatgtgatcctgttttctgtgtttgatgagaacaggtcttggtacctgactgagaacatccagaggttcctgcct aacccagctggggtgcagctggaggatcctgagttccaggccagcaatattatgcatagcattaatggctatgt gtttgatagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctactggtacatcctgagcattggggcccagact gactttctgtctgtgttcttctctggctacaccttcaagcataagatggtgtatgaggacaccctgactctgttcccttt ttctggggagactgtgtttatgagcatggagaatcctggcctgtggatcctgggctgccataattctgacttcagg aacaggggcatgactgccctgctgaaagtgagcagctgtgacaagaatactggggactactatgaagacag ctatgaggacatctctgcctacctgctgagcaagaacaatgccattgagcccaggagcttcagccagaaccc cccagtgctgaagaggcaccagagagagatcaccaggactaccctgcagtctgaccaggaggagattgac tatgatgacaccatttctgtggagatgaagaaggaggactttgacatttatgatgaggatgagaatcagagccc caggagcttccagaagaagactaggcactattttattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgagca gctctccccatgtgctgaggaatagggcccagtctggctctgtgcctcagttcaagaaggtggtgttccaggagt tcactgatggcagctttacccagcccctgtataggggggagctgaatgagcacctgggcctgctgggccccta tatcagggctgaggtggaggacaatattatggtgacctttaggaaccaggccagcaggccctactctttctata gcagcctgatcagctatgaggaggaccagaggcagggggctgagcccaggaagaattttgtgaagcctaat gagaccaagacctacttctggaaggtgcagcatcacatggcccccaccaaggatgagtttgactgcaaggct tgggcctatttctctgatgtggacctggagaaggatgtgcactctggcctgattggccccctgctggtgtgccaca ctaacactctgaatcctgcccatggcaggcaggtgactgtgcaggagtttgccctgttcttcaccatctttgatga gaccaagagctggtacttcactgagaacatggagaggaactgcagggccccctgcaacatccagatggag gatcccaccttcaaggagaactacaggtttcatgccatcaatggctacatcatggacactctgcctggcctggt gatggcccaggatcagaggatcaggtggtacctgctgagcatgggctctaatgagaatatccatagcatcca cttctctggccatgtgttcactgtcaggaagaaggaggagtacaagatggctctgtataatctgtaccctggggt gtttgagactgtggagatgctgcccagcaaggctggcatctggagggtggagtgcctgattggggagcacctg catgctgggatgagcaccctgtttctggtgtactctaacaagtgccagacccccctgggcatggcctctgggca catcagggatttccagatcactgcttctggccagtatggccagtgggcccccaagctggccaggctgcactact ctggcagcatcaatgcctggtctaccaaggagcccttttcttggattaaggtggacctgctggcccccatgatca tccatggcatcaagacccagggggccaggcagaagttcagcagcctgtacatcagccagttcatcatcatgt acagcctggatggcaaaaagtggcagacctacaggggcaatagcactgggactctgatggtgttctttggca atgtggacagctctgggatcaagcacaatatcttcaaccctcccatcattgctaggtacatcaggctgcacccc acccactatagcatcaggtctaccctgaggatggagctgatgggctgtgacctgaactcttgcagcatgcccct gggcatggagtccaaagctatctctgatgcccagattactgccagcagctacttcaccaacatgtttgccacctg gtctccctctaaggccaggctgcacctgcagggcaggagcaatgcctggaggccccaggtgaacaatccca aggagtggctgcaggtggatttccagaaaactatgaaggtgactggggtgaccacccagggggtgaagtctc tgctgaccagcatgtatgtgaaggagttcctgatctcttctagccaggatggccaccagtggactctgttcttcca gaatggcaaggtgaaggtgttccagggcaaccaggacagcttcacccctgtggtgaactctctggatccccc cctgctgaccaggtacctgaggattcatccccagagctgggtgcaccagattgctctgagaatggaggtgctg gggtgtgaggctcaggacctgtattga
[0455] FVIII-BDD que codifica a variante de ácido nucleico reduzido de CpG (SEQ ID NO: 82) atgcagattgagctgtctacttgtttttttctgtgcctgctgaggttctgcttctctgccaccaggaggtattacctggg ggctgtggagctgagctgggattacatgcagtctgatctgggggagctgcctgtggatgccaggttccccccca gggtgcccaagagcttccccttcaacacctctgtggtgtataagaagaccctgtttgtggagttcactgatcatct gtttaacattgccaagcccaggcccccctggatgggcctgctgggcccaactatccaggctgaggtgtatgac actgtggtcatcaccctgaagaatatggccagccatcctgtgagcctgcatgctgtgggggtgagctactggaa ggcctctgagggggctgagtatgatgaccagaccagccagagggagaaggaggatgacaaggtgttccct gggggcagccacacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggccccatggcctctgaccccctgtgcctg acttatagctacctgtctcatgtggacctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggccctgctggtctgta gggaaggcagcctggccaaggagaagacccagaccctgcacaagtttattctgctgtttgctgtgtttgatgaa ggcaagagctggcactctgagaccaagaattctctgatgcaggatagggatgctgcctctgccagggcctgg cccaagatgcatactgtgaatggctatgtgaacagaagcctgcctggcctgattggctgccataggaagtctgt gtattggcatgtgattgggatgggcactacccctgaagtgcacagcattttcctggagggccacactttcctggtg aggaaccacaggcaggcctctctggagatcagccccattactttcctgactgcccagaccctgctgatggatct gggccagttcctgctgttctgccacatctctagccaccagcatgatggcatggaggcctatgtgaaggtggaca gctgccctgaggagccccagctgaggatgaagaataatgaggaggctgaggattatgatgatgacctgactg actctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgataatagccccagcttcatccagatcaggtctgtggccaaga agcatcccaagacctgggtgcactatattgctgctgaagaggaggactgggactatgcccctctggtgctggct cctgatgacaggagctataagagccagtatctgaacaatgggccccagaggattgggaggaagtacaaga aggtgaggttcatggcctacactgatgagacctttaagaccagggaggccatccagcatgagtctggcattct ggggcccctgctgtatggggaggtgggggacactctgctgatcattttcaagaaccaggccagcaggcccta caatatttacccccatggcatcactgatgtgaggcccctgtacagcaggaggctgcccaagggggtgaagca cctgaaggacttccccatcctgcctggggagatcttcaagtacaagtggactgtgactgtggaggatggcccta ccaagtctgaccctaggtgtctgactaggtactacagcagctttgtgaacatggagagagacctggcttctggc ctgattggccccctgctgatctgctacaaggagtctgtggatcagaggggcaaccagattatgtctgataagag gaatgtcatcctgttctctgtgtttgatgagaacaggagctggtatctgactgagaacattcagaggttcctgccc aaccctgctggggtgcagctggaggaccctgagttccaggccagcaacatcatgcattctattaatggctatgt gtttgacagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctactggtacatcctgagcattggggcccagac tgactttctgtctgtgtttttctctgggtacaccttcaagcacaagatggtctatgaggacaccctgaccctgttcccc ttttctggggaaactgtgtttatgagcatggagaaccctgggctgtggatcctgggctgccacaactctgacttta ggaataggggcatgactgccctgctgaaggtgagcagctgtgacaagaatactggggattactatgaggac agctatgaggatatctctgcctacctgctgagcaagaacaatgccattgagcctaggagcttcagccagaacc cccctgtgctgaagaggcaccagagggagatcaccaggaccaccctgcagtctgatcaggaggagattga ctatgatgacaccatctctgtggagatgaagaaggaggactttgatatttatgatgaggatgagaaccagagc cccaggagcttccagaagaagaccaggcactatttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatga gctctagcccccatgtgctgaggaacagggcccagtctggctctgtgccccagttcaagaaggtggtgttcca ggaatttactgatggcagctttacccagcccctgtacagaggggagctgaatgagcacctgggcctgctgggc ccctacatcagggctgaggtggaggataatatcatggtgacctttaggaaccaggcctctaggccctattcttttt acagcagcctgatcagctatgaggaggaccagaggcagggggctgagcctaggaagaactttgtgaagcc caatgagaccaagacctacttttggaaagtgcagcaccacatggcccccactaaggatgagtttgattgcaag gcctgggcctatttctctgatgtggacctggagaaggatgtgcactctggcctgattggccccctgctggtgtgcc acaccaacactctgaaccctgcccatggcaggcaggtgactgtgcaggagtttgccctgttctttaccatctttga tgagactaagagctggtatttcactgagaacatggagaggaactgcagagccccttgcaacatccagatgga ggaccctaccttcaaggagaactataggttccatgccatcaatgggtacatcatggataccctgcctggcctgg tgatggctcaggaccagaggatcaggtggtacctgctgagcatggggagcaatgagaacattcatagcatcc acttctctgggcatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtataagatggccctgtacaacctgtaccctggg gtgtttgagactgtggagatgctgcccagcaaggctggcatctggagggtggagtgcctgattggggagcacc tgcatgctggcatgagcactctgttcctggtgtacagcaacaagtgccagacccccctgggcatggcctctggc cacatcagggacttccagattactgcctctgggcagtatgggcagtgggcccccaagctggccaggctgcact actctgggtctatcaatgcttggagcaccaaggagcctttcagctggatcaaggtggatctgctggcccccatg atcattcatgggatcaagacccagggggccaggcagaagttcagcagcctgtatatttctcagttcatcatcatg tattctctggatggcaaaaagtggcagacctatagagggaacagcactgggaccctgatggtgttttttggcaat gtggatagctctggcatcaagcacaatatcttcaacccccccattattgccaggtacatcaggctgcaccccac ccactactctatcaggagcaccctgaggatggagctgatgggctgtgatctgaacagctgctctatgcctctgg ggatggaaagcaaggccatctctgatgcccagatcactgccagcagctatttcaccaatatgtttgccacttgg agccctagcaaggctaggctgcatctgcagggcaggtctaatgcctggaggccccaggtgaacaacccca aggagtggctgcaggtggacttccagaagactatgaaagtgactggggtgaccacccagggggtgaaaag cctgctgaccagcatgtatgtgaaggagttcctgattagcagcagccaggatggccaccagtggaccctgttct tccagaatgggaaggtgaaggtgtttcagggcaatcaggatagcttcaccccagtggtgaacagcctggacc cccccctgctgaccaggtacctgaggatccacccccagagctgggtgcaccagattgccctgaggatggag gtgctgggctgtgaggcccaggatctgtactga
[0456] FVIII-BDD que codifica a variante de ácido nucleico reduzido de CpG (SEQ ID NO: 83) atgcagattgagctgagcacctgctttttcctgtgcctgctgaggttctgcttctctgctaccaggaggtactacctg ggggctgtggagctgtcttgggattacatgcagtctgacctgggggagctgcctgtggatgccaggtttcccccc agggtgcccaagtctttcccctttaacacctctgtggtgtataagaagactctgtttgtggagttcactgatcacctg ttcaatattgccaagcccaggcccccttggatgggcctgctgggccccactatccaggctgaggtgtatgacac tgtggtcatcaccctgaagaacatggccagccaccctgtgagcctgcatgctgtgggggtgagctactggaag gcctctgagggggctgagtatgatgaccagaccagccagagggagaaggaggatgacaaggtgttcccag gggggtctcacacttatgtgtggcaggtgctgaaggagaatgggcccatggcctctgaccctctgtgcctgactt atagctacctgtctcatgtggatctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggccctgctggtgtgcaggg aggggagcctggccaaggagaagacccagaccctgcacaagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatgaggg gaagagctggcactctgagaccaagaatagcctgatgcaggacagggatgctgcttctgctagggcctggcc taagatgcacactgtgaatggctatgtgaacaggagcctgcctggcctgattgggtgtcacaggaagtctgtgt actggcatgtgattggcatggggactactccagaagtgcacagcatcttcctggaggggcacaccttcctggtg aggaatcacaggcaggccagcctggagatttctcccatcactttcctgactgcccagaccctgctgatggatct ggggcagttcctgctgttctgccacatcagcagccatcagcatgatgggatggaggcctatgtgaaggtggac agctgccctgaggagcctcagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaggactatgatgatgatctgact gactctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaactctcccagcttcatccagatcaggtctgtggccaag aagcaccccaagacctgggtgcactacattgctgctgaggaggaggattgggattatgctcccctggtgctgg ctcctgatgataggagctacaagagccagtatctgaataatgggccccagaggattggcaggaagtataaga aggtgaggttcatggcctacactgatgagacctttaagaccagggaggctattcagcatgagtctggcatcctg ggccccctgctgtatggggaggtgggggacaccctgctgatcattttcaagaaccaggccagcaggccctat aacatctatccccatgggatcactgatgtgaggcccctgtactctaggaggctgcccaagggggtcaagcac ctgaaggacttccccatcctgcctggggagatcttcaagtacaagtggactgtgactgtggaggatggcccca ctaagtctgaccccaggtgcctgactaggtactacagcagctttgtgaacatggagagagatctggcctctggc ctgattggccccctgctgatctgctacaaagagtctgtggatcagaggggcaaccagatcatgtctgacaaga ggaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgagaacagaagctggtacctgactgagaacattcagaggtttctgcc caaccctgctggggtccagctggaggaccctgagtttcaggccagcaacatcatgcacagcatcaatgggta tgtgtttgacagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctactggtatatcctgagcattggggcccag actgatttcctgtctgtgttcttctctggctacactttcaagcacaagatggtgtatgaggataccctgaccctgttcc ctttctctggggaaactgtgttcatgagcatggagaaccctgggctgtggatcctggggtgccacaattctgattt caggaacagaggcatgactgctctgctgaaggtgtctagctgtgacaagaacactggggactactatgagga cagctatgaggacatctctgcctacctgctgagcaagaacaatgctattgaacccaggtctttcagccagaac ccccctgtgctgaagaggcaccagagggagatcactaggaccaccctgcagtctgatcaggaggagattga ctatgatgacaccatctctgtggagatgaagaaggaggactttgacatctatgatgaggatgagaatcagtctc ccaggagcttccagaagaagactaggcattacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgag ctctagccctcatgtgctgaggaacagggcccagtctggctctgtgccccagttcaagaaggtggtgtttcagg agttcactgatggcagcttcacccagcccctgtacaggggggagctgaatgagcatctgggcctgctgggcc cctacatcagggctgaggtggaggacaacatcatggtgaccttcagaaatcaggctagcaggccctacagct tctacagcagcctgatctcttatgaggaggaccagaggcagggggctgagcccaggaagaactttgtgaag cccaatgagaccaagacctatttctggaaggtgcagcaccacatggcccccaccaaggatgagtttgattgc aaggcctgggcctacttctctgatgtggacctggagaaggatgtgcattctgggctgattggccctctgctggtgt gccacaccaacaccctgaatcctgcccatggcaggcaggtgactgtgcaggagtttgccctgttctttactatctt tgatgagaccaagtcttggtattttactgagaacatggagaggaactgcagggccccctgcaacatccagatg gaggaccccaccttcaaggagaactacagattccatgccatcaatggctacattatggacactctgcctggcct ggtgatggcccaggaccagaggatcaggtggtacctgctgtctatgggcagcaatgagaacattcactctatc cacttctctgggcatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggccctgtacaacctgtaccctg gggtgtttgagactgtggagatgctgcctagcaaggctgggatctggagggtggagtgcctgattggggagca cctgcatgctggcatgtctaccctgttcctggtgtacagcaacaagtgccagacccccctgggcatggcctctg gccacatcagagattttcagatcactgcctctggccagtatggccagtgggctcctaagctggccaggctgcac tactctggcagcatcaatgcctggagcaccaaggagccctttagctggatcaaggtggacctgctggccccca tgatcatccatggcatcaagactcagggggccaggcagaagttctctagcctgtacattagccagttcatcatc atgtatagcctggatggcaagaagtggcagacctacaggggcaacagcactgggaccctgatggtgttctttg ggaatgtggacagctctgggatcaagcacaatatcttcaacccccccattattgccaggtatattaggctgcac cccactcactacagcattaggagcaccctgaggatggagctgatgggctgtgatctgaacagctgcagcatg cccctgggcatggagtctaaggccatctctgatgcccagatcactgccagctcttacttcaccaacatgtttgcc acttggagccccagcaaggccaggctgcacctgcagggcaggagcaatgcctggaggccccaggtgaac aaccccaaggagtggctgcaggtggatttccagaagactatgaaggtgactggggtgaccactcagggggt gaagagcctgctgactagcatgtatgtgaaggagttcctgatcagctctagccaggatggccaccagtggacc ctgttctttcagaatggcaaggtgaaggtgttccagggcaaccaggactctttcacccctgtggtgaattctctgg accctcccctgctgactaggtatctgaggattcatccccagagctgggtgcatcagattgccctgaggatggag gtgctgggctgtgaggcccaggacctgtattga
[0457] FVIII-BDD que codifica a variante de ácido nucleico reduzido de CpG (SEQ ID NO: 84) atgcagattgagctgagcacctgcttcttcctgtgcctgctgaggttttgcttttctgccactaggaggtactacctg ggggctgtggagctgtcttgggattacatgcagtctgacctgggggagctgccagtggatgccaggttcccccc aagggtgcccaagtcttttcccttcaatacctctgtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagtttactgatcatct gtttaacattgccaagcccaggcccccctggatggggctgctgggccccaccatccaggctgaggtgtatgat actgtggtgattaccctgaagaatatggccagccatcctgtgtctctgcatgctgtgggggtgtcttattggaagg cctctgagggggctgagtatgatgatcagaccagccagagggagaaggaggatgataaggtgttccctggg ggctctcacacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatgggcctatggcctctgacccactgtgcctgactta cagctatctgagccatgtggacctggtgaaggacctgaactctgggctgattggggccctgctggtgtgcagg gagggcagcctggccaaggagaagactcagaccctgcacaagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatgagg gcaagtcttggcactctgagaccaagaacagcctgatgcaggatagggatgctgcctctgccagggcctggc ccaagatgcacactgtgaatggctatgtgaacaggtctctgcctggcctgattggctgccacaggaagtctgtgt actggcatgtgattggcatgggcaccacccctgaggtgcatagcattttcctggagggccacaccttcctggtg aggaaccacaggcaggctagcctggagatcagccccatcactttcctgactgcccagaccctgctgatggac ctgggccagttcctgctgttctgccacatctctagccaccagcatgatggcatggaggcctatgtgaaggtgga ctcttgtcctgaggagccccagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaggattatgatgatgatctgact gattctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaacagcccctctttcatccagatcaggtctgtggccaag aagcaccccaagacctgggtgcactacattgctgctgaggaggaggattgggattatgcccccctggtgctgg cccctgatgacaggagctataagtctcagtacctgaacaatggcccccagagaattggcaggaagtacaag aaggtgaggttcatggcctatactgatgagaccttcaaaaccagggaggccattcagcatgagtctggcatcc tggggcccctgctgtatggggaggtgggggacaccctgctgatcatcttcaagaaccaggctagcaggcctta caacatctacccccatgggatcactgatgtgaggcccctgtacagcaggaggctgcctaagggggtgaagc acctgaaggactttcccattctgcctggggagatcttcaagtataagtggactgtgactgtggaggatgggccc accaagtctgaccccaggtgcctgactaggtactactctagctttgtgaacatggagagggacctggcctctgg gctgattggccccctgctgatctgttacaaggagtctgtggaccagaggggcaaccagatcatgtctgataag aggaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgagaacaggagctggtacctgactgagaacatccagagattcctg cccaaccctgctggggtgcagctggaggatcctgagttccaggccagcaacatcatgcattctatcaatgggt atgtgtttgatagcctgcagctgtctgtgtgtctgcatgaggtggcctactggtacattctgagcattggggcccag actgacttcctgtctgtgttcttctctggctacactttcaaacacaagatggtgtatgaggacaccctgaccctgttc cccttctctggggagactgtgtttatgagcatggagaaccctgggctgtggattctgggctgccacaactctgact tcagaaacaggggcatgactgccctgctgaaggtgtcttcttgtgataagaacactggggactattatgaagac agctatgaggacatctctgcctacctgctgagcaagaataatgctattgagcccaggtctttctctcagaacccc cctgtgctgaagaggcaccagagggagatcaccaggaccaccctgcagtctgatcaggaggagattgacta tgatgacactatttctgtggagatgaagaaggaagactttgatatctatgatgaggatgagaaccagagcccta ggagcttccagaagaagactaggcattacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgagcag cagcccccatgtgctgaggaatagggctcagtctggctctgtgcctcagttcaagaaggtggtgttccaggaatt cactgatggcagcttcactcagcccctgtacaggggggagctgaatgagcacctggggctgctgggccctta catcagggctgaggtggaggacaatatcatggtgacctttaggaaccaggcctctaggccttacagcttctact ctagcctgatctcttatgaagaggaccagaggcagggggctgagcccaggaagaactttgtgaagcccaat gagactaagacttacttctggaaggtgcagcaccacatggctcccaccaaggatgagtttgactgcaaggctt gggcctacttctctgatgtggacctggagaaggatgtgcactctgggctgattgggcccctgctggtgtgccaca ctaacactctgaatcctgcccatggcagacaggtgactgtgcaggagtttgccctgttttttaccatctttgatgag actaagtcttggtacttcactgagaacatggagaggaactgcagggccccctgcaacatccagatggaggat cccaccttcaaggagaactacaggtttcatgccatcaatggctacatcatggacaccctgcctggcctggtgat ggctcaggaccagaggattaggtggtatctgctgagcatgggcagcaatgagaatatccactctatccacttct ctgggcatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggccctgtataacctgtatcctggggtgttt gagactgtggagatgctgcccagcaaggctggcatctggagagtggagtgcctgattggggagcacctgcat gctggcatgagcactctgtttctggtgtatagcaacaagtgtcagacccctctgggcatggcctctgggcacatt agggactttcagatcactgcttctggccagtatgggcagtgggctcccaagctggccaggctgcactattctgg cagcattaatgcctggagcaccaaggagcctttcagctggatcaaggtggacctgctggcccccatgatcatc catgggatcaagacccagggggctaggcagaagttcagcagcctgtacatcagccagtttatcatcatgtattc tctggatggcaagaagtggcagacctacaggggcaattctactggcactctgatggtgttctttgggaatgtgga tagctctgggatcaagcataatatcttcaatccccccattattgctaggtatatcaggctgcaccccacccactat agcatcaggagcaccctgaggatggagctgatggggtgtgacctgaacagctgcagcatgcccctgggcat ggagagcaaggctatttctgatgcccagatcactgccagcagctactttactaatatgtttgccacctggagccc cagcaaggccagactgcacctgcagggcaggtctaatgcctggaggcctcaggtgaataaccccaaggag tggctgcaggtggacttccagaaaaccatgaaggtgactggggtgactacccagggggtgaagtctctgctg accagcatgtatgtgaaggagttcctgatctcttctagccaggatggccaccagtggaccctgttctttcagaatg ggaaggtgaaggtcttccagggcaaccaggatagcttcacccctgtggtgaatagcctggatcctcctctgctg accaggtatctgaggatccacccccagagctgggtgcatcagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtg aggctcaggacctgtactga
[0458] FVIII-BDD que codifica a variante de ácido nucleico reduzido de CpG (SEQ ID NO: 85) atgcagattgagctgagcacctgtttcttcctgtgcctgctgaggttctgtttctctgccactaggaggtactacctg ggggctgtggagctgagctgggactatatgcagtctgacctgggggagctgcctgtggatgccaggttccccc ccagggtgcctaagagcttccccttcaatacttctgtggtgtacaagaagactctgtttgtggagtttactgaccac ctgttcaacattgctaagcccaggcctccctggatggggctgctgggccccaccatccaggctgaggtgtatga tactgtggtgattaccctgaagaacatggcctctcatccagtgagcctgcatgctgtgggggtgagctactgga aggcctctgaaggggctgagtatgatgaccagaccagccagagggagaaggaggatgacaaggtgttccc tgggggcagccacacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggcccaatggcctctgaccccctgtgcct gacttatagctacctgagccatgtggatctggtgaaggacctgaattctggcctgattggggccctgctggtgtg cagagagggctctctggctaaggagaagacccagactctgcacaagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatga gggcaagagctggcactctgagactaagaatagcctgatgcaggacagggatgctgcttctgccagggcct ggcccaagatgcatactgtgaatggctatgtgaacaggagcctgcctggcctgattggctgtcacaggaaatc tgtctactggcatgtgattgggatgggcactacccctgaggtgcactctatcttcctggagggccataccttcctg gtgaggaaccacaggcaggccagcctggagatctctcccattaccttcctgactgcccagaccctgctgatgg atctgggccagttcctgctgttctgccacatcagcagccaccagcatgatgggatggaggcttatgtgaaggtg gatagctgccctgaggagccccagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaggactatgatgatgacct gactgactctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaactctcccagctttattcagatcaggtctgtggcta agaagcaccccaagacttgggtgcactacattgctgctgaggaggaggactgggactatgcccctctggtgct ggctcctgatgacaggtcttacaagtctcagtacctgaataatggccctcagaggattggcaggaagtacaag aaggtgaggttcatggcctacactgatgagaccttcaagaccagggaggccatccagcatgagtctggcatc ctgggccccctgctgtatggggaggtgggggataccctgctgatcatcttcaagaatcaggccagcaggccct acaacatctacccccatggcatcactgatgtgaggccactgtacagcaggaggctgcccaagggggtgaag catctgaaggacttccccattctgcctggggagatcttcaagtacaaatggactgtgactgtggaggatggccct accaagtctgaccccaggtgtctgaccaggtactacagcagctttgtgaatatggagagggacctggcctctg gcctgattggccccctgctgatctgctacaaggagtctgtggaccagaggggcaatcagatcatgtctgataag aggaatgtgattctgttctctgtgtttgatgagaacaggagctggtacctgactgagaacatccagaggttcctgc ccaatcctgctggggtgcagctggaggaccctgagttccaggccagcaatatcatgcacagcatcaatggct atgtctttgacagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcttactggtatattctgagcattggggcccag actgatttcctgtctgtgttcttttctggctatacctttaagcacaagatggtgtatgaggacaccctgaccctgttcc ccttctctggggagactgtgttcatgtctatggagaaccctgggctgtggatcctgggctgccacaactctgactt caggaacagggggatgactgccctgctgaaggtgtctagctgtgataagaacactggggactattatgagga cagctatgaggacatctctgcttacctgctgagcaagaacaatgccattgagcccaggtctttcagccagaatc cccctgtgctgaagaggcatcagagggagatcaccaggaccaccctgcagtctgatcaggaggagattgatt atgatgacactatctctgtggaaatgaagaaggaggactttgacatctatgatgaggatgagaaccagagcc ccaggagcttccagaagaagaccaggcactacttcattgctgctgtggagaggctgtgggattatggcatgag cagctctccccatgtgctgaggaacagagcccagtctggctctgtgcctcagttcaagaaggtggtcttccagg agttcactgatggctctttcacccagcccctgtacaggggggagctgaatgagcacctgggcctgctggggcc ctacattagggctgaggtggaggataacatcatggtgactttcagaaaccaggccagcaggccttacagctttt actcttctctgattagctatgaggaggatcagaggcagggggctgagcctaggaagaactttgtgaagcccaa tgagaccaagacctatttctggaaggtgcagcaccacatggctcccactaaggatgagtttgactgcaaggctt gggcctacttctctgatgtggacctggagaaggatgtgcactctggcctgattgggcccctgctggtgtgccaca ccaacaccctgaaccctgcccatggcaggcaggtgactgtgcaggagtttgccctgttcttcaccatctttgatg agactaagagctggtacttcactgagaacatggagaggaactgcagggccccctgcaacatccagatgga ggaccccaccttcaaggagaattacaggttccatgccatcaatggctacattatggacaccctgcctggcctgg tgatggcccaggatcagaggatcaggtggtatctgctgagcatgggctctaatgagaacatccacagcatcc acttctctggccatgtgtttactgtgaggaagaaggaggaatacaagatggctctgtataacctgtaccctgggg tgtttgagactgtggagatgctgcccagcaaggctgggatctggagggtggagtgcctgattggggagcacct gcatgctgggatgagcaccctgttcctggtgtatagcaataagtgccagacccccctgggcatggcttctggcc acatcagggatttccagatcactgcttctggccagtatggccagtgggctcccaagctggctaggctgcattact ctgggtctatcaatgcctggagcactaaggagcccttcagctggatcaaggtggacctgctggcccccatgat cattcatggcatcaagacccagggggctaggcagaagttcagcagcctgtacatcagccagttcatcattatgt acagcctggatggcaagaagtggcagacttacaggggcaatagcactgggactctgatggtgttctttggcaa tgtggactcttctggcatcaagcacaacatcttcaaccctcccatcattgccaggtacattaggctgcaccctac ccactactctatcaggagcaccctgaggatggagctgatggggtgtgatctgaactcttgcagcatgcctctgg gcatggaaagcaaagccatctctgatgcccagatcactgcctctagctatttcaccaatatgtttgccacctgga gccctagcaaggccaggctgcacctgcagggcagatctaatgcctggaggccccaggtgaacaatcccaa ggagtggctgcaggtggacttccagaagaccatgaaggtgactggggtgaccactcagggggtgaagagc ctgctgactagcatgtatgtgaaggagttcctgatctcttctagccaggatggccaccagtggaccctgttcttcc agaatggcaaggtgaaagtgttccagggcaaccaggatagcttcactcctgtggtgaactctctggaccctcc cctgctgactaggtacctgaggattcatccccagagctgggtgcaccagattgccctgaggatggaggtgctg ggctgtgaggcccaggatctgtactga
[0459] FVIII-BDD que codifica a variante de ácido nucleico reduzido de CpG (SEQ ID NO: 86) atgcagattgagctgagcacctgcttcttcctgtgcctgctgaggttctgcttctctgccaccaggaggtactacct gggggctgtggagctgtcttgggactatatgcagtctgacctgggggagctgccagtggatgccaggttccccc ccagggtgcccaagagctttcctttcaacacttctgtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagttcactgacca cctgttcaatattgctaagcccaggccaccctggatgggcctgctgggccctaccattcaggctgaggtgtatg acactgtggtgattactctgaagaatatggccagccaccctgtgagcctgcatgctgtgggggtgtcttactgga aggcctctgagggggctgagtatgatgatcagacttctcagagggagaaggaggatgataaggtgttccctg ggggctctcacacttatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggccccatggcttctgatccactgtgcctgacct actcttacctgagccatgtggacctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggccctgctggtgtgcagg gagggcagcctggccaaggagaagacccagaccctgcataagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatgagg ggaagagctggcactctgagaccaagaattctctgatgcaggacagggatgctgcctctgccagggcctggc ctaagatgcacactgtgaatggctatgtgaacaggtctctgcctggcctgattggctgccacaggaagtctgtgt actggcatgtgattggcatgggcactacccctgaggtgcacagcattttcctggagggccacaccttcctggtc aggaaccataggcaggcctctctggagatcagccccatcactttcctgactgcccagaccctgctgatggacc tgggccagttcctgctgttctgccacattagcagccaccagcatgatggcatggaggcctatgtgaaggtggac tcttgccctgaggagccccagctgaggatgaagaacaatgaggaagctgaggattatgatgatgacctgact gactctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaacagccccagcttcatccagatcaggtctgtggccaa gaagcaccccaagacctgggtgcactacattgctgctgaggaggaggattgggactatgctcccctggtgctg gctcctgatgataggagctacaagtctcagtacctgaataatggcccccagaggattggcaggaagtacaag aaggtgaggttcatggcctacactgatgagaccttcaagaccagagaggctatccagcatgagtctgggatc ctggggcccctgctgtatggggaggtgggggacaccctgctgatcatcttcaagaaccaggccagcagacc ctacaacatctacccccatgggatcactgatgtgaggcccctgtacagcaggaggctgcctaagggggtgaa gcacctgaaggacttccccatcctgcctggggagatcttcaagtataagtggactgtgactgtggaggatggg cccaccaagtctgaccctaggtgcctgactaggtactactctagctttgtgaacatggagagggacctggcctc tggcctgattggccccctgctgatttgctacaaggagtctgtggatcagaggggcaatcagatcatgtctgaca agaggaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgagaataggtcttggtacctgactgagaacatccagaggttcctg cctaatcctgctggggtgcagctggaggaccctgagtttcaggccagcaacatcatgcacagcatcaatggct atgtgtttgactctctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcttactggtatatcctgagcattggggctcaga ctgacttcctgtctgtgttcttttctggctacacttttaagcacaagatggtgtatgaggacaccctgaccctgttccc cttttctggggagactgtgttcatgtctatggagaaccctgggctgtggattctgggctgtcacaactctgacttca gaaacaggggcatgactgccctgctgaaggtgtctagctgtgacaagaatactggggactactatgaggaca gctatgaggacatttctgcctatctgctgagcaagaacaatgccattgagcccaggagcttttctcagaatcccc ctgtgctgaagaggcaccagagagagatcaccaggaccactctgcagtctgatcaggaggagattgattatg atgacactatctctgtggagatgaagaaagaggactttgatatctatgatgaggatgagaatcagtctcccagg agcttccagaagaagactagacactacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgagctctag ccctcatgtgctgaggaacagggcccagtctgggtctgtgccccagttcaagaaggtggtgttccaggagttca ctgatggcagctttacccagcccctgtataggggggagctgaatgagcatctgggcctgctgggcccctatatt agggctgaagtggaggacaacatcatggtgacctttaggaaccaggccagcaggccctacagcttttacagc agcctgattagctatgaggaggatcagagacagggggctgagcccaggaagaactttgtgaagcccaatga gaccaagacctacttctggaaggtgcagcaccacatggcccctaccaaggatgagtttgactgcaaggcctg ggcttacttctctgatgtggacctggagaaagatgtgcactctggcctgattgggcccctgctggtgtgccacac caacaccctgaaccctgcccatgggaggcaggtgactgtgcaggagtttgccctgtttttcaccatctttgatga gaccaagagctggtacttcactgagaacatggagaggaactgcagggccccctgtaacatccagatggag gatcctactttcaaggagaactacaggttccatgccattaatgggtacatcatggacaccctgcctgggctggtg atggcccaggatcagaggattaggtggtatctgctgtctatgggctctaatgagaacatccactctatccacttct ctggccatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggccctgtacaacctgtaccctggggtgttt gaaactgtggagatgctgccctctaaagctgggatctggagggtggagtgcctgattggggagcacctgcatg ctggcatgagcaccctgttcctggtgtacagcaataagtgccagactcccctgggcatggcttctgggcacatc agggatttccagatcactgcctctggccagtatggccagtgggcccccaagctggctaggctgcactactctgg cagcatcaatgcctggagcaccaaggagcccttctcttggattaaggtggacctgctggctcccatgatcattc atggcatcaagacccagggggccaggcagaagttttctagcctgtatattagccagttcatcatcatgtatagcc tggatgggaagaagtggcagacctacagggggaatagcactggcaccctgatggtgttttttggcaatgtgga ttcttctggcatcaagcataacatcttcaatccccctatcattgccaggtacattaggctgcatcccacccattact ctatcaggagcaccctgaggatggagctgatggggtgtgatctgaacagctgtagcatgcccctgggcatgg agtccaaggctatctctgatgcccagatcactgccagcagctacttcaccaacatgtttgccacctggagcccc agcaaggccaggctgcacctgcagggcaggtctaatgcctggaggccccaggtgaacaatcccaaggagt ggctgcaggtggacttccagaagactatgaaggtgactggggtgaccactcagggggtgaagagcctgctg accagcatgtatgtgaaggagttcctgatctcttctagccaggatgggcatcagtggaccctgttttttcagaatg gcaaagtgaaggtgtttcaggggaatcaggacagctttacccctgtggtgaacagcctggatcctcctctgctg actagatacctgaggatccacccccagagctgggtccaccagattgctctgaggatggaggtgctggggtgtg aggctcaggacctgtactga
[0460] FVIII-BDD que codifica a variante de ácido nucleico reduzido de CpG (SEQ ID NO: 87) atgcagattgagctgagcacctgcttctttctgtgcctgctgaggttctgcttctctgccaccaggaggtactacct gggggctgtggaactgagctgggactatatgcagtctgacctgggggagctgcctgtggatgccaggttcccc cccagggtgcccaagtctttcccctttaacacttctgtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagtttactgacca cctgttcaatattgccaagcccaggcccccctggatgggcctgctgggcccaaccatccaggctgaggtgtat gatactgtggtgatcaccctgaagaacatggccagccaccctgtgagcctgcatgctgtgggggtgagctattg gaaggcttctgagggggctgagtatgatgaccagactagccagagggagaaggaggatgacaaggtgttc cctggggggtctcatacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggccccatggcctctgaccccctgtgcct gacctattcttacctgagccatgtggacctggtcaaggacctgaactctggcctgattggggctctgctggtgtgc agggagggcagcctggccaaggagaagactcagactctgcataagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatga gggcaagagctggcactctgagaccaagaactctctgatgcaggatagggatgctgcctctgccagggcctg gcccaagatgcacactgtgaatggctatgtgaataggtctctgcctggcctgattggctgccataggaagtctgt gtactggcatgtgattggcatgggcactacccctgaggtgcactctatcttcctggaggggcacaccttcctggt gaggaaccacaggcaggccagcctggagatctctcccatcaccttcctgactgcccagactctgctgatgga cctgggccagttcctgctgttctgccatatcagcagccaccagcatgatggcatggaggcctatgtgaaggtgg acagctgcccagaggaaccccagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaggactatgatgatgacct gactgactctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaacagccccagctttattcagatcaggtctgtggc caagaagcaccccaagacctgggtgcactacattgctgctgaggaggaggactgggattatgcccccctggt gctggcccctgatgacaggtcttacaagtctcagtacctgaacaatggcccccagaggattgggaggaagta caagaaggtgaggttcatggcctacactgatgagaccttcaagaccagggaggccatccagcatgagtctg gcatcctggggcccctgctgtatggggaggtgggggataccctgctgattatcttcaagaaccaggctagcag gccctataacatctacccccatggcattactgatgtgaggcccctgtactctaggagactgcccaagggggtg aagcacctgaaagacttccccatcctgcctggggagatcttcaagtataagtggactgtgactgtggaggatg gccccactaagtctgaccccaggtgcctgaccaggtattacagcagctttgtgaatatggagagggatctggct tctggcctgattgggcctctgctgatttgctacaaggagtctgtggatcagagggggaaccagattatgtctgac aagaggaatgtgattctgttctctgtgtttgatgagaacaggagctggtacctgactgagaatatccagaggttc ctgcctaatcctgctggggtgcagctggaggaccctgagttccaggctagcaacattatgcacagcatcaatg gctatgtgtttgacagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcttactggtacattctgtctattggggccc agactgacttcctgtctgtgttcttctctggctacaccttcaagcacaagatggtgtatgaggacactctgaccctg ttccccttctctggggagactgtgttcatgagcatggagaatcctgggctgtggattctggggtgccacaactctg atttcaggaacaggggcatgactgccctgctgaaggtgagcagctgtgacaagaacactggggattattatga ggacagctatgaggacatttctgcctacctgctgagcaagaacaatgccattgagcctaggagcttcagccag aatccccctgtgctgaagagacaccagagggagatcactaggaccactctgcagtctgatcaggaggagatt gactatgatgacaccatttctgtggagatgaagaaggaggactttgatatttatgatgaggatgagaaccagag ccccagaagcttccagaagaagaccaggcactacttcattgctgctgtggagaggctgtgggattatggcatg tcttctagcccccatgtgctgaggaacagggctcagtctggctctgtgcctcagttcaagaaggtggtgttccag gagttcactgatgggagcttcacccagcctctgtacaggggggagctgaatgaacatctgggcctgctggggc cctacatcagggctgaggtggaggataatatcatggtgactttcaggaatcaggcctctaggccctacagcttct actctagcctgatcagctatgaggaggaccagaggcagggggctgagcctaggaagaattttgtgaaaccc aatgagaccaagacctacttttggaaggtgcagcaccacatggcccctaccaaggatgagtttgactgtaag gcctgggcctacttctctgatgtggacctggagaaggatgtgcattctgggctgattggccccctgctggtgtgcc acaccaacaccctgaaccctgcccatggcaggcaggtgactgtgcaggagtttgccctgttcttcaccatctttg atgagactaagagctggtatttcactgagaacatggagaggaactgtagggctccctgcaacatccagatgg aggatccaactttcaaggagaactacaggttccatgccatcaatggctacatcatggacaccctgcctggcct ggtgatggcccaggaccagaggattaggtggtacctgctgagcatgggctctaatgagaacatccactctatc cacttctctggccatgtgtttactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggctctgtacaacctgtaccctgg ggtgtttgagactgtggagatgctgcctagcaaggctggcatttggagagtggagtgtctgattggggagcacc tgcatgctgggatgtctaccctgttcctggtgtactctaacaagtgccagacccccctggggatggcttctgggc acatcagagattttcagattactgcttctgggcagtatggccagtgggctcccaagctggccagactgcattact ctggctctattaatgcttggagcaccaaggagcctttcagctggatcaaggtggacctgctggctcccatgatca tccatggcattaagactcagggggctaggcagaagttcagcagcctgtatatttctcagtttattatcatgtattctc tggatggcaagaagtggcagacttacaggggcaacagcactggcaccctgatggtgttctttggcaatgtgga cagctctgggatcaagcataacatcttcaacccccccattattgccaggtacatcaggctgcaccccacccact attctatcaggagcactctgaggatggagctgatggggtgtgacctgaacagctgctctatgcccctgggcatg gagagcaaggccatctctgatgcccagatcactgccagctcttatttcaccaacatgtttgccacctggagccc cagcaaggccaggctgcacctgcagggcagaagcaatgcctggaggccccaggtgaacaatcctaagga gtggctgcaggtggacttccagaagactatgaaggtgactggggtgactacccagggggtgaagagcctgct gaccagcatgtatgtgaaggagttcctgattagcagcagccaggatgggcatcagtggaccctgttcttccag aatgggaaggtgaaggtgttccagggcaatcaggacagcttcacccctgtggtgaacagcctggacccccc cctgctgaccaggtacctgaggatccatccccagagctgggtgcaccagattgctctgagaatggaggtgctg ggctgtgaggcccaggacctgtattga
[0461] FVIII-BDD que codifica a variante de ácido nucleico reduzido de CpG (SEQ ID NO: 88) atgcagattgagctgtctacctgtttttttctgtgcctgctgaggttctgcttctctgctaccaggaggtattatctggg ggctgtggagctgagctgggactacatgcagtctgacctgggggagctgcctgtggatgccaggtttcctccca gggtgcctaagagcttccccttcaacacctctgtggtgtacaagaagactctgtttgtggagttcactgaccacct gttcaacattgccaagcccaggcccccctggatggggctgctgggccccactatccaggctgaggtgtatgat actgtggtgattaccctgaagaacatggcctctcaccctgtgtctctgcatgctgtgggggtgagctactggaag gcttctgagggggctgaatatgatgatcagacctctcagagggagaaggaggatgacaaggtgtttcctggg ggcagccacacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatgggcccatggcctctgatcccctgtgcctgacct acagctacctgagccatgtggacctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggccctgctggtgtgcag ggagggcagcctggccaaggaaaagacccagaccctgcataagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatgag ggcaagtcttggcactctgagaccaagaacagcctgatgcaggacagggatgctgcctctgctagggcctgg cccaagatgcacactgtgaatgggtatgtgaacagatctctgcctggcctgattggctgccacaggaagtctgt gtactggcatgtgattggcatggggaccacccctgaggtgcatagcatcttcctggaggggcacaccttcctgg tgagaaatcataggcaggccagcctggagattagccccatcaccttcctgactgcccagaccctgctgatgga cctgggccagttcctgctgttctgccacatttctagccaccagcatgatggcatggaggcctatgtgaaggtgga tagctgccctgaagagccccagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgaggattatgatgatgatctgac tgactctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaacagccccagcttcatccagatcaggtctgtggcca agaagcaccctaagacctgggtgcactacattgctgctgaagaggaggactgggactatgcccccctggtgc tggccccagatgacaggtcttacaagagccagtacctgaataatggcccccagaggattgggaggaagtat aagaaagtgaggttcatggcttacactgatgagacctttaagactagggaggccattcagcatgagtctggga ttctgggccctctgctgtatggggaggtgggggacaccctgctgatcattttcaagaaccaggccagcaggcc ctataatatttatccccatgggattactgatgtcaggcccctgtacagcaggaggctgcctaagggggtgaagc acctgaaggacttccccattctgcctggggagatcttcaagtataagtggactgtgactgtggaggatggcccc accaagtctgatcctaggtgcctgaccaggtactatagcagctttgtgaacatggagagggacctggcttctgg cctgattggccccctgctgatctgctacaaggaatctgtggaccagaggggcaaccagattatgtctgacaag aggaatgtgatcctgttttctgtgtttgatgagaataggagctggtatctgactgagaacatccagaggttcctgcc caatcctgctggggtgcagctggaggaccctgagttccaggcttctaacatcatgcatagcatcaatgggtatgt gtttgactctctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcctattggtacatcctgagcattggggcccagactg acttcctgtctgtgttcttctctggctacaccttcaagcacaagatggtgtatgaggacaccctgaccctgttcccttt ctctggggagactgtgttcatgagcatggagaaccctggcctgtggattctgggctgccataattctgacttcag aaacaggggcatgactgctctgctgaaggtgagcagctgtgacaagaatactggggactactatgaggactc ttatgaggatatttctgcctacctgctgagcaagaacaatgctattgagcccaggagcttcagccagaaccccc ctgtcctgaagaggcatcagagggagatcactaggaccaccctgcagtctgatcaggaggagattgactatg atgacactatctctgtggaaatgaagaaggaggactttgatatctatgatgaggatgagaaccagagcccca ggtctttccagaagaagaccaggcactacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgtctagc agcccccatgtgctgaggaacagagcccagtctggctctgtgccccagttcaagaaggtggtgtttcaggagtt cactgatgggagcttcactcagcccctgtataggggggagctgaatgagcatctgggcctgctggggccctac atcagggctgaggtggaggataacatcatggtgaccttcaggaaccaggccagcaggccctactctttctact cttctctgatcagctatgaggaggatcagaggcagggggctgagcctaggaagaactttgtcaagcctaatga gactaagacctacttttggaaggtgcagcaccacatggctcccactaaggatgagtttgattgcaaggcctgg gcctacttctctgatgtggacctggagaaggatgtgcactctggcctgattggccccctgctggtgtgtcacacc aataccctgaaccctgcccatggcaggcaggtcactgtgcaggagtttgccctgtttttcactatctttgatgaga ctaagtcttggtacttcactgagaacatggaaaggaattgcagggctccctgcaacatccagatggaggaccc caccttcaaggagaactacaggtttcatgccatcaatggctacatcatggacaccctgcctggcctggtgatgg ctcaggatcagaggattaggtggtatctgctgagcatgggcagcaatgagaacatccacagcatccacttttct ggccatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggctctgtacaatctgtaccctggggtgtttga gactgtggagatgctgcccagcaaggctgggatctggagggtggagtgcctgattggggaacacctgcatgc tggcatgtctaccctgttcctggtgtactctaacaagtgccagactcccctgggcatggcctctgggcacatcag ggacttccagatcactgcctctgggcagtatggccagtgggcccctaagctggctaggctgcattactctggca gcatcaatgcctggagcaccaaggagcccttcagctggatcaaggtggacctgctggcccctatgatcatcca tggcatcaagacccagggggccagacagaagttctcttctctgtacatctctcagttcatcatcatgtactctctg gatggcaagaagtggcagacctacagggggaattctactggcactctgatggtgttctttgggaatgtggatag ctctgggatcaagcataatattttcaacccccccattattgctaggtacatcaggctgcacccaacccactactct attaggtctaccctgaggatggagctgatgggctgtgacctgaactcttgtagcatgcccctgggcatggagag caaggctatctctgatgcccagatcactgccagcagctactttaccaacatgtttgctacttggagccccagcaa ggccaggctgcacctgcagggcaggagcaatgcctggaggccccaggtgaacaaccccaaggagtggct gcaggtggattttcagaagaccatgaaggtgactggggtgaccactcagggggtgaaaagcctgctgactag catgtatgtgaaggagtttctgatcagcagctctcaggatggccatcagtggaccctgttcttccagaatggcaa ggtgaaggtgttccagggcaaccaggatagcttcacccctgtggtgaatagcctggacccccccctgctgacc aggtacctgaggatccatccccagagctgggtgcaccagattgccctgaggatggaggtgctgggctgtgaa gcccaggacctgtactga
[0462] CDNA de FVIII V3 (SEQ ID NO: 89) atgcagattgagctgagcacctgcttcttcctgtgcctgctgaggttctgcttctctgccaccaggagatactacct gggggctgtggagctgagctgggactacatgcagtctgacctgggggagctgcctgtggatgccaggttcccc cccagagtgcccaagagcttccccttcaacacctctgtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagttcactgac cacctgttcaacattgccaagcccaggcccccctggatgggcctgctgggccccaccatccaggctgaggtgt atgacactgtggtgatcaccctgaagaacatggccagccaccctgtgagcctgcatgctgtgggggtgagcta ctggaaggcctctgagggggctgagtatgatgaccagaccagccagagggagaaggaggatgacaaggt gttccctgggggcagccacacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggccccatggcctctgaccccctg tgcctgacctacagctacctgagccatgtggacctggtgaaggacctgaactctggcctgattggggccctgct ggtgtgcagggagggcagcctggccaaggagaagacccagaccctgcacaagttcatcctgctgtttgctgt gtttgatgagggcaagagctggcactctgaaaccaagaacagcctgatgcaggacagggatgctgcctctg ccagggcctggcccaagatgcacactgtgaatggctatgtgaacaggagcctgcctggcctgattggctgcc acaggaagtctgtgtactggcatgtgattggcatgggcaccacccctgaggtgcacagcatcttcctggaggg ccacaccttcctggtcaggaaccacaggcaggccagcctggagatcagccccatcaccttcctgactgccca gaccctgctgatggacctgggccagttcctgctgttctgccacatcagcagccaccagcatgatggcatggag gcctatgtgaaggtggacagctgccctgaggagccccagctgaggatgaagaacaatgaggaggctgagg actatgatgatgacctgactgactctgagatggatgtggtgaggtttgatgatgacaacagccccagcttcatcc agatcaggtctgtggccaagaagcaccccaagacctgggtgcactacattgctgctgaggaggaggactgg gactatgcccccctggtgctggcccctgatgacaggagctacaagagccagtacctgaacaatggccccca gaggattggcaggaagtacaagaaggtcaggttcatggcctacactgatgaaaccttcaagaccagggagg ccatccagcatgagtctggcatcctgggccccctgctgtatggggaggtgggggacaccctgctgatcatcttc aagaaccaggccagcaggccctacaacatctacccccatggcatcactgatgtgaggcccctgtacagcag gaggctgcccaagggggtgaagcacctgaaggacttccccatcctgcctggggagatcttcaagtacaagtg gactgtgactgtggaggatggccccaccaagtctgaccccaggtgcctgaccagatactacagcagctttgtg aacatggagagggacctggcctctggcctgattggccccctgctgatctgctacaaggagtctgtggaccaga ggggcaaccagatcatgtctgacaagaggaatgtgatcctgttctctgtgtttgatgagaacaggagctggtac ctgactgagaacatccagaggttcctgcccaaccctgctggggtgcagctggaggaccctgagttccaggcc agcaacatcatgcacagcatcaatggctatgtgtttgacagcctgcagctgtctgtgtgcctgcatgaggtggcc tactggtacatcctgagcattggggcccagactgacttcctgtctgtgttcttctctggctacaccttcaagcacaa gatggtgtatgaggacaccctgaccctgttccccttctctggggagactgtgttcatgagcatggagaaccctgg cctgtggattctgggctgccacaactctgacttcaggaacaggggcatgactgccctgctgaaagtctccagct gtgacaagaacactggggactactatgaggacagctatgaggacatctctgcctacctgctgagcaagaac aatgccattgagcccaggagcttcagccagaacagcaggcaccccagcaccaggcagaagcagttcaat gccaccaccatccctgagaatgacatagagaagacagacccatggtttgcccaccggacccccatgccca agatccagaatgtgagcagctctgacctgctgatgctgctgaggcagagccccaccccccatggcctgagcc tgtctgacctgcaggaggccaagtatgaaaccttctctgatgaccccagccctggggccattgacagcaaca acagcctgtctgagatgacccacttcaggccccagctgcaccactctggggacatggtgttcacccctgagtct ggcctgcagctgaggctgaatgagaagctgggcaccactgctgccactgagctgaagaagctggacttcaa agtctccagcaccagcaacaacctgatcagcaccatcccctctgacaacctggctgctggcactgacaacac cagcagcctgggcccccccagcatgcctgtgcactatgacagccagctggacaccaccctgtttggcaaga agagcagccccctgactgagtctgggggccccctgagcctgtctgaggagaacaatgacagcaagctgctg gagtctggcctgatgaacagccaggagagcagctggggcaagaatgtgagcaccaggagcttccagaag aagaccaggcactacttcattgctgctgtggagaggctgtgggactatggcatgagcagcagcccccatgtgc tgaggaacagggcccagtctggctctgtgccccagttcaagaaggtggtgttccaggagttcactgatggcag cttcacccagcccctgtacagaggggagctgaatgagcacctgggcctgctgggcccctacatcagggctga ggtggaggacaacatcatggtgaccttcaggaaccaggccagcaggccctacagcttctacagcagcctga tcagctatgaggaggaccagaggcagggggctgagcccaggaagaactttgtgaagcccaatgaaacca agacctacttctggaaggtgcagcaccacatggcccccaccaaggatgagtttgactgcaaggcctgggcct acttctctgatgtggacctggagaaggatgtgcactctggcctgattggccccctgctggtgtgccacaccaac accctgaaccctgcccatggcaggcaggtgactgtgcaggagtttgccctgttcttcaccatctttgatgaaacc aagagctggtacttcactgagaacatggagaggaactgcagggccccctgcaacatccagatggaggacc ccaccttcaaggagaactacaggttccatgccatcaatggctacatcatggacaccctgcctggcctggtgatg gcccaggaccagaggatcaggtggtacctgctgagcatgggcagcaatgagaacatccacagcatccactt ctctggccatgtgttcactgtgaggaagaaggaggagtacaagatggccctgtacaacctgtaccctggggtg tttgagactgtggagatgctgcccagcaaggctggcatctggagggtggagtgcctgattggggagcacctgc atgctggcatgagcaccctgttcctggtgtacagcaacaagtgccagacccccctgggcatggcctctggcca catcagggacttccagatcactgcctctggccagtatggccagtgggcccccaagctggccaggctgcacta ctctggcagcatcaatgcctggagcaccaaggagcccttcagctggatcaaggtggacctgctggcccccat gatcatccatggcatcaagacccagggggccaggcagaagttcagcagcctgtacatcagccagttcatcat catgtacagcctggatggcaagaagtggcagacctacaggggcaacagcactggcaccctgatggtgttcttt ggcaatgtggacagctctggcatcaagcacaacatcttcaacccccccatcattgccagatacatcaggctgc accccacccactacagcatcaggagcaccctgaggatggagctgatgggctgtgacctgaacagctgcagc atgcccctgggcatggagagcaaggccatctctgatgcccagatcactgccagcagctacttcaccaacatgt ttgccacctggagccccagcaaggccaggctgcacctgcagggcaggagcaatgcctggaggccccaggt caacaaccccaaggagtggctgcaggtggacttccagaagaccatgaaggtgactggggtgaccacccag ggggtgaagagcctgctgaccagcatgtatgtgaaggagttcctgatcagcagcagccaggatggccacca gtggaccctgttcttccagaatggcaaggtgaaggtgttccagggcaaccaggacagcttcacccctgtggtg aacagcctggacccccccctgctgaccagatacctgaggattcacccccagagctgggtgcaccagattgcc ctgaggatggaggtgctgggctgtgaggcccaggacctgtactga
[0463] CDNA de FVIII CO3 (SEQ ID NO: 90) atgcagattgagctgtcaacttgctttttcctgtgcctgctgagattttgtttttccgctactagaagatactacctggg ggctgtggaactgtcttgggattacatgcagagtgacctgggagagctgccagtggacgcacgatttccacct agagtccctaaatcattccccttcaacaccagcgtggtctataagaaaacactgttcgtggagtttactgatcac ctgttcaacatcgctaagcctcggccaccctggatgggactgctgggaccaacaatccaggcagaggtgtac gacaccgtggtcattacactgaaaaacatggcctcacaccccgtgagcctgcatgctgtgggcgtcagctact ggaaggcttccgaaggggcagagtatgacgatcagacttcccagagagaaaaagaggacgataaggtgtt tcctggcgggtctcatacctatgtgtggcaggtcctgaaagagaatggccccatggcttccgaccctctgtgcct gacctactcttatctgagtcacgtggacctggtcaaggatctgaacagcggactgatcggagcactgctggtgt gtagggaagggagcctggctaaggagaaaacccagacactgcataagttcattctgctgttcgccgtgtttga cgaaggaaaatcatggcacagcgagacaaagaatagtctgatgcaggaccgggatgccgcttcagccag agcttggcccaaaatgcacactgtgaacggctacgtcaatcgctcactgcctggactgatcggctgccaccga aagagcgtgtattggcatgtcatcggaatgggcaccacacctgaagtgcactccattttcctggaggggcatac ctttctggtccgcaaccaccgacaggcctccctggagatctctccaattaccttcctgacagctcagactctgctg atggatctgggacagttcctgctgttttgccacatcagctcccaccagcatgatggcatggaggcctacgtgaa agtggacagctgtcccgaggaacctcagctgaggatgaagaacaatgaggaagctgaagactatgacgat gacctgaccgactccgagatggatgtggtccgattcgatgacgataacagcccctcctttatccagattagatct gtggccaagaaacaccctaagacatgggtccattacatcgcagccgaggaagaggactgggattatgcacc actggtgctggcaccagacgatcgatcctacaaatctcagtatctgaacaatggaccacagcggattggcag aaagtacaagaaagtgaggttcatggcttataccgatgaaaccttcaagactcgcgaagcaatccagcacg agagcgggattctgggaccactgctgtacggagaagtgggggacaccctgctgatcatttttaagaaccagg ccagcaggccttacaatatctatccacatggaattacagatgtgcgccctctgtacagccggagactgccaaa gggcgtcaaacacctgaaggacttcccaatcctgcccggggaaatttttaagtataaatggactgtcaccgtcg aggatggccccactaagagcgaccctaggtgcctgacccgctactattctagtttcgtgaatatggaaagggat ctggccagcggactgatcggcccactgctgatttgttacaaagagagcgtggatcagagaggcaaccagatc atgtccgacaagaggaatgtgattctgttcagtgtctttgacgaaaaccggtcatggtatctgaccgagaacatc cagagattcctgcctaatccagccggagtgcagctggaagatcctgagtttcaggcttctaacatcatgcatagt attaatggctacgtgttcgacagtctgcagctgtcagtgtgtctgcacgaggtcgcttactggtatatcctgagcat tggagcacagacagatttcctgagcgtgttcttttccggctacacttttaagcataaaatggtgtatgaggacaca ctgactctgttccccttcagcggcgaaaccgtgtttatgtccatggagaatcccgggctgtggatcctgggatgc cacaacagcgatttcaggaatcgcgggatgactgccctgctgaaagtgtcaagctgtgacaagaacaccgg agactactatgaagattcatacgaggacatcagcgcatatctgctgtccaaaaacaatgccattgaacccagg tcttttagtcagaatcctccagtgctgaagaggcaccagcgcgagatcacccgcactaccctgcagagtgatc aggaagagatcgactacgacgatacaatttctgtggaaatgaagaaagaggacttcgatatctatgacgaag atgagaaccagagtcctcgatcattccagaagaaaacccggcattactttattgctgcagtggagcgcctgtgg gattatggcatgtcctctagtcctcacgtgctgcgaaatcgggcccagtcagggagcgtcccacagttcaaga aagtggtcttccaggagtttacagacggatcctttactcagccactgtaccggggcgaactgaacgagcacct ggggctgctgggaccctatatcagagctgaagtggaggataacattatggtcaccttcagaaatcaggcatct aggccttacagtttttattcaagcctgatctcttacgaagaggaccagaggcagggagcagaaccacgaaaa aacttcgtgaagcctaatgagaccaaaacatacttttggaaggtgcagcaccatatggccccaacaaaagac gaattcgattgcaaggcatgggcctatttttctgacgtggatctggagaaggacgtccacagtggcctgatcgg gccactgctggtgtgtcatactaacaccctgaatcccgcacacggcaggcaggtcactgtccaggaattcgcc ctgttctttaccatctttgatgagacaaaaagctggtacttcaccgaaaacatggagcgaaattgccgggctcca tgtaatattcagatggaagaccccacattcaaggagaactaccgctttcatgccatcaatgggtatattatggat actctgcccggactggtcatggctcaggaccagagaatcaggtggtacctgctgagcatggggtccaacgag aatatccactcaattcatttcagcggacacgtgtttactgtccggaagaaagaagagtataaaatggccctgta caacctgtatcccggcgtgttcgaaaccgtcgagatgctgcctagcaaggcagggatctggagagtggaatg cctgattggggagcacctgcatgccggaatgtctaccctgtttctggtgtacagtaataagtgtcagacacccct ggggatggcttccggacatatccgggatttccagattaccgcatctggacagtacggccagtgggcccctaag ctggctagactgcactattccgggtctatcaacgcttggtccacaaaagagcctttctcttggattaaggtggacc tgctggcaccaatgatcattcatggcatcaaaactcagggggccaggcagaagttctcctctctgtacatctca cagtttatcatcatgtacagcctggatggcaagaaatggcagacataccgcggcaatagcacagggactctg atggtgttctttggcaacgtggacagttcagggatcaagcacaacattttcaatccccctatcattgctagatacat caggctgcacccaacccattattctattcgaagtacactgcggatggaactgatggggtgcgatctgaacagtt gttcaatgcccctgggaatggagtccaaggcaatctctgacgcccagattaccgctagctcctacttcactaata tgtttgctacctggagcccctccaaagcacgactgcatctgcagggacgaagcaacgcatggcgaccacag gtgaacaatcccaaggagtggctgcaggtcgattttcagaaaactatgaaggtgaccggagtcacaactcag ggcgtgaaaagtctgctgacctcaatgtacgtcaaggagttcctgatctctagttcacaggacggccaccagtg gacactgttctttcagaacggaaaggtgaaagtcttccagggcaatcaggattcctttacacctgtggtcaactct ctggacccacccctgctgactcgctacctgcgaatccacccacagtcctgggtgcatcagattgcactgagaa tggaagtcctgggctgcgaggcccaggacctgtattga
[0464] Capsídeo de AAV-LK03 VP1 (SEQ ID NO: 91)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGY KYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQ ERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEP DSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMA SGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNN HLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWG FRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQ GCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQ FSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLF SQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNG RDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEI RTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGP IWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFI TQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSE PRPIGTRYLTRPL
[0465] Capsídeo de AAV-SPK VP1 (SEQ ID NO: 92)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGY KYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQ ERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRS PDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMA AGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNN HLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNN WGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSA HQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNF EFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLF SQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNG RDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEE EIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQ GPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLAS FITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYS EPRPIGTRYLTRNL
[0466] Sequência de ácido nucleico do íntron em AAV-WINT (SEQ ID NO: 93)
AGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTAT GGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTGACACTGACATCCACTTTTTCTTTTTCT CCACAG
[0467] FIX (SEQ ID NO: 94)
ATGCAGAGGGTGAACATGATCATGGCTGAGAGCCCTGGCCTGATCACCAT CTGCCTGCTGGGCTACCTGCTGTCTGCTGAATGTACAGGTTTGTTTCCTTT TTTATAATACATTGAGTATGCTTGCCTTTTAGATATAGAAATATCTGATTCTG TCTTCTTCACTAAATTTTGATTACATGATTTGACAGCAATATTGAAGAGTCTA ACAGCCAGCACCCAGGTTGGTAAGTACTGGTTCTTTGTTAGCTAGGTTTTC TTCTTCTTCACTTTTAAAACTAAATAGATGGACAATGCTTATGATGCAATAA GGTTTAATAAACACTGTTCAGTTCAGTATTTGGTCATGTAATTCCTGTTAAA AAACAGTCATCTCCTTGGTTTAAAAAAATTAAAAGTGGGAAAACAAAGAAAT AGCAGAATATAGTGAAAAAAAATAACCACAGTATTTTTGTTTGGACTTACCA CTTTGAAATCAAATTGGGAAACAAAAGCACAAACAGTGGCCTTATTTACAC AAAAAGTCTGATTTTAAGATATGTGACAATTCAAGGTTTCAGAAGTATGTAA GGAGGTGTGTCTCTAATTTTTTAAATTATATATCTTCAATTTAAAGTTTTAGT TAAAACATAAAGATTAACCTTTCATTAGCAAGCTGTTAGTTATCACCAAAGC TTTTCATGGATTAGGAAAAAATCATTTTGTCTCTATCTCAAACATCTTGGAG TTGATATTTGGGGAAACACAATACTCAGTTGAGTTCCCTAGGGGAGAAAAG CAAGCTTAAGAATTGACACAAAGAGTAGGAAGTTAGCTATTGCAACATATA TCACTTTGTTTTTTCACAACTACAGTGACTTTATTTATTTCCCAGAGGAAGG CATACAGGGAAGAAATTATCCCATTTGGACAAACAGCATGTTCTCACAGTA AGCACTTATCACACTTACTTGTCAACTTTCTAGAATCAAATCTAGTAGCTGA CAGTACCAGGATCAGGGGTGCCAACCCTAAGCACCCCCAGAAAGCTGACT GGCCCTGTGGTTCCCACTCCAGACATGATGTCAGCTGTGAAATCCACCTC CCTGGACCATAATTAGGCTTCTGTTCTTCAGGAGACATTTGTTCAAAGTCAT TTGGGCAACCATATTCTGAAAACAGCCCAGCCAGGGTGATGGATCACTTT GCAAAGATCCTCAATGAGCTATTTTCAAGTGATGACAAAGTGTGAAGTTAA GGGCTCATTTGAGAACTTTCTTTTTCATCCAAAGTAAATTCAAATATGATTA GAAATCTGACCTTTTATTACTGGAATTCTCTTGACTAAAAGTAAAATTGAATT TTAATTCCTAAATCTCCATGTGTATACAGTACTGTGGGAACATCACAGATTT TGGCTCCATGCCCTAAAGAGAAATTGGCTTTCAGATTATTTGGATTAAAAAC AAAGACTTTCTTAAGAGATGTAAAATTTTCATGATGTTTTCTTTTTTGCTAAA ACTAAAGAATTATTCTTTTACATTTCAGTTTTTCTTGATCATGAAAATGCCAA CAAAATTCTGAATAGACCAAAGAGGTATAACTCTGGCAAGCTTGAAGAGTT TGTACAGGGGAATCTGGAGAGAGAGTGTATGGAAGAGAAGTGCAGCTTTG AGGAAGCCAGAGAAGTGTTTGAAAATACAGAGAGAACAACTGAATTTTGGA AGCAGTATGTGGATGGTGATCAATGTGAGAGCAATCCCTGCTTGAATGGG GGGAGCTGTAAAGATGATATCAACAGCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGA TTTGAGGGGAAAAACTGTGAGCTTGATGTGACCTGTAATATCAAGAATGGC AGGTGTGAGCAATTTTGCAAGAATTCTGCTGATAACAAAGTGGTCTGTAGC TGCACTGAGGGATATAGGCTGGCTGAAAACCAGAAGAGCTGTGAACCTGC AGTGCCTTTTCCCTGTGGGAGAGTGTCTGTGAGCCAAACCAGCAAGCTGA CTAGGGCTGAAGCAGTCTTTCCTGATGTAGATTATGTGAATAGCACTGAGG CTGAGACAATCCTTGACAATATCACTCAGAGCACACAGAGCTTCAATGACT TCACCAGGGTGGTAGGAGGGGAGGATGCCAAGCCTGGGCAGTTCCCCTG GCAGGTAGTGCTCAATGGAAAAGTGGATGCCTTTTGTGGAGGTTCAATTGT AAATGAGAAGTGGATTGTGACTGCAGCCCACTGTGTGGAAACTGGAGTCA AGATTACTGTGGTGGCTGGAGAGCACAATATTGAGGAAACTGAGCACACT GAGCAGAAGAGGAATGTGATCAGGATTATCCCCCACCACAACTACAATGC TGCTATCAACAAGTACAACCATGACATTGCCCTCCTGGAACTGGATGAACC CCTGGTCTTGAACAGCTATGTGACACCCATCTGTATTGCTGATAAAGAGTA CACCAACATCTTCTTGAAATTTGGGTCTGGATATGTGTCTGGCTGGGGCAG GGTGTTCCATAAAGGCAGGTCTGCCCTGGTATTGCAGTATTTGAGGGTGC CTCTGGTGGATAGAGCAACCTGCTTGCTGAGCACCAAGTTTACAATCTACA ACAATATGTTCTGTGCAGGGTTCCATGAAGGTGGTAGAGACAGCTGCCAG GGAGATTCTGGGGGTCCCCATGTGACTGAGGTGGAGGGAACCAGCTTCC TGACTGGGATTATCAGCTGGGGTGAGGAGTGTGCTATGAAGGGAAAGTAT GGGATCTACACAAAAGTATCCAGATATGTGAACTGGATTAAGGAGAAAACC AAGCTGACTTGA

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. Cassete de expressão, caracterizado por compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína do Fator VIII tendo uma deleção do domínio B (FVIII-BDD), em que o referido cassete de expressão compreende uma sequência pelo menos 98% idêntica à sequência da SEQ ID NO:1.
2. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma sequência pelo menos 99% idêntica à sequência da SEQ ID NO:1.
3. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a sequência da SEQ ID NO:1.
4. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por consistir na sequência da SEQ ID NO:1.
5. Cassete de expressão, caracterizado por compreender um elemento regulador operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína do Fator VIII tendo uma deleção do domínio B (FVIII-BDD), em que nenhum íntron está presente entre o referido elemento regulador e a referida sequência de ácido nucleico, e em que o referido cassete de expressão compreende uma sequência pelo menos 91% idêntica à SEQ ID NO:1.
6. Cassete de expressão, caracterizado por compreender: a. um elemento regulador pelo menos 90% idêntico à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs:2-67, e b. uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína do Fator VIII tendo uma deleção do domínio B (FVIII-BDD), a referida sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 90% de identidade à sequência da SEQ ID NO:77, em que o referido elemento regulador está operacionalmente ligado à referida sequência de ácido nucleico e em que nenhum íntron está presente entre o referido elemento regulador e a referida sequência de ácido nucleico.
7. Cassete de expressão, caracterizado por compreender: a. um elemento regulador pelo menos 90% idêntico à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs:2-67, e b. uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína do Fator VIII tendo uma deleção do domínio B (FVIII-BDD), a referida sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 90% de identidade à sequência da SEQ ID NO:77, em que o referido elemento regulador está operacionalmente ligado à referida sequência de ácido nucleico, e em que não mais que 0 – 5, 5 – 10, 10 – 15, 15 – 20, 20 – 25, 25 – 30, 30 – 35, 35 – 40, 40 – 45, 45 – 50, 50 – 55, 55 – 60, 60 – 65, 65 – 70, 70 – 75, 75 – 80, 80 – 85, 85 – 90, 90 – 95, 95 – 100, 100 – 105, 106 ou 107 nucleotídeos de ácido nucleico não traduzido estão entre o referido elemento regulador e a referida sequência de ácido nucleico.
8. Cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo referido elemento regulador compreender uma sequência de nucleotídeos pelo menos 95% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs:2-67.
9. Cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo referido elemento regulador ter o mesmo número total de CpGs reduzidos conforme estabelecido na sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs:4-21 ou 24-67.
10. Cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9, caracterizado pelo referido elemento regulador compreender a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs:2-21 ou 24-67 tendo CpG(s) substituído(s) por CpT, CpA, TpG ou ApG na(s) mesma(s) posição(ões) conforme estabelecido na sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs:4-21 ou 24-67.
11. Cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizado pela referida sequência de ácido nucleico exibir maior expressão quando comparada à expressão de um cassete de expressão tendo (a) um íntron, ou (b) 108 ou mais nucleotídeos de ácido nucleico não traduzido, entre o referido elemento regulador e a referida sequência de ácido nucleico.
12. Cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 11, caracterizado pelo referido FVIII-BDD codificado exibir maior atividade biológica em comparação à expressão de um cassete de expressão tendo (a) um íntron, ou (b) 108 ou mais nucleotídeos de ácido nucleico não traduzido, entre o referido elemento regulador e a referida sequência de ácido nucleico.
13. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela atividade biológica ser determinada por um ensaio de coagulação ou sangramento reduzido em um ensaio de FVIII ou modelo de deficiência de FVIII.
14. Cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 13, caracterizado pelo referido cassete de expressão ser mais eficientemente empacotado em um vetor AAV quando comparado ao empacotamento de um cassete de expressão tendo (a) um íntron, ou (b) 108 ou mais nucleotídeos de ácido nucleico não traduzido, entre o referido elemento regulador e a referida sequência de ácido nucleico.
15. Sequência de ácido nucleico, caracterizada por compreender a SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 modificada para ter menos dinucleotídeos citosina- guanina (CpGs).
16. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender a SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 modificada para ter 1 CpG a menos.
17. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender a SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 modificada para ter 2 CpGs a menos.
18. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender a SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 modificada para ter 3 CpGs a menos.
19. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender a SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 modificada para ter 4 CpGs a menos.
20. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender a SEQ ID NO:22 ou 23 modificada para ter 5 CpGs a menos.
21. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender a SEQ ID NO:22 ou 23 modificada para ter 6 CpGs a menos.
22. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender a SEQ ID NO:22 ou 23 modificada para ter 7 CpGs a menos.
23. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender a SEQ ID NO:22 ou 23 modificada para ter 8 CpGs a menos.
24. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender a SEQ ID NO:22 ou 23 modificada para ter 9 CpGs a menos.
25. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender a SEQ ID NO:22 ou 23 modificada para ter 10 CpGs a menos.
26. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender a SEQ ID NO:22 ou 23 modificada para ter 11 CpGs a menos.
27. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender a SEQ ID NO:22 ou 23 modificada para ter 12 CpGs a menos.
28. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender a SEQ ID NO:22 ou 23 modificada para ter 13 CpGs a menos.
29. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender a SEQ ID NO:22 ou 23 modificada para ter 14 CpGs a menos.
30. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender a SEQ ID NO:22 ou 23 modificada para ter 15 CpGs a menos.
31. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender a SEQ ID NO:22 ou 23 modificada para ter 16 CpGs a menos.
32. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender a SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 modificada para ter 1 ou 0 CpG.
33. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender a SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 modificada para ter 0 CpG.
34. Sequência de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 33, caracterizada por pelo menos o primeiro CpG da extremidade 5' na SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 ser modificado para não ser CpG.
35. Sequência de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 33, caracterizada por pelo menos o segundo CpG da extremidade 5' na SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 ser modificado para não ser CpG.
36. Sequência de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 33, caracterizada por pelo menos o terceiro CpG da extremidade 5' na SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 ser modificado para não ser CpG.
37. Sequência de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 33, caracterizada por pelo menos o quarto CpG da extremidade 5' na SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 ser modificado para não ser CpG.
38. Sequência de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 33, caracterizada por pelo menos o quinto CpG da extremidade 5' na SEQ ID NO:22 ou 23 ser modificado para não ser CpG.
39. Sequência de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 33, caracterizada por pelo menos o sexto CpG da extremidade 5' na SEQ ID NO:22 ou 23 ser modificado para não ser CpG.
40. Sequência de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 33, caracterizada por pelo menos o sétimo CpG da extremidade 5' na SEQ ID NO:22 ou 23 ser modificado para não ser CpG.
41. Sequência de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 33, caracterizada por pelo menos o oitavo CpG da extremidade 5' na SEQ ID NO:22 ou 23 ser modificado para não ser CpG.
42. Sequência de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 33, caracterizada por pelo menos o nono CpG da extremidade 5' na SEQ ID NO:22 ou 23 ser modificado para não ser CpG.
43. Sequência de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 33, caracterizada por pelo menos o 10º CpG da extremidade 5' na SEQ ID NO:22 ou 23 ser modificado para não ser CpG.
44. Sequência de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 33, caracterizada por pelo menos o 11º CpG da extremidade 5' na SEQ ID NO:22 ou 23 ser modificado para não ser CpG.
45. Sequência de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 33, caracterizada por pelo menos o 12º CpG da extremidade 5' na SEQ ID NO:22 ou 23 ser modificado para não ser CpG.
46. Sequência de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 33, caracterizada por pelo menos o 13º CpG da extremidade 5' na SEQ ID NO:22 ou 23 ser modificado para não ser CpG.
47. Sequência de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 33, caracterizada por pelo menos o 14º CpG da extremidade 5' na SEQ ID NO:22 ou 23 ser modificado para não ser CpG.
48. Sequência de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 33, caracterizada por pelo menos o 15º CpG da extremidade 5' na SEQ ID NO:22 ou 23 ser modificado para não ser CpG.
49. Sequência de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 33, caracterizada por pelo menos o 16º CpG da extremidade 5' na SEQ ID NO:22 ou 23 ser modificado para não ser CpG.
50. Sequência de ácido nucleico, caracterizada por ser pelo menos 95% idêntica à sequência da sequência de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 15 a 49.
51. Polinucleotídeo, caracterizado por compreender uma sequência de ácido nucleico pelo menos 95% idêntica à sequência de qualquer qualquer uma das SEQ ID NOs:4-21 ou 24-67 com ou sem 5' e/ou 3' flanqueando 5-7 nucleotídeos.
52. Polinucleotídeo, caracterizado por compreender uma sequência de ácido nucleico pelo menos 95% idêntica à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs:4-21 ou 24-67, e tendo o mesmo número de CpGs reduzidos conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs:4-21 ou 24-67.
53. Polinucleotídeo, caracterizado por compreender uma sequência de ácido nucleico pelo menos 95% idêntica à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs:4-21 ou 24-67, e tendo CpG(s) reduzido(s) na(s) mesma(s) posição(ões) conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs:4-21 ou 24-67.
54. Sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 53, caracterizados pela referida SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 modificada ter o nucleotídeo G em pelo menos um CpG substituído com um nucleotídeo T ou A para ser um dinucleotídeo CpT ou CpA, ou ter o nucleotídeo C em pelo menos um CpG substituído com um nucleotídeo T ou A para ser um dinucleotídeo TpG ou ApG.
55. Sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 54, caracterizados pelo sétimo CpG da extremidade 5' na referida SEQ ID NO:22 ou 23 modificada não ter o nucleotídeo G substituído.
56. Sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 54, caracterizada pelo sétimo CpG da extremidade 5' na referida SEQ ID NO:22 ou 23 modificada ter o nucleotídeo G substituído com um nucleotídeo T ou A para ser um dinucleotídeo CpT ou CpA.
57. Sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 54, caracterizados pelo sétimo CpG da extremidade 5' na referida SEQ ID NO:22 ou 23 modificada ter o nucleotídeo G substituído com um nucleotídeo T ou A para ser um dinucleotídeo CpT ou CpA, e pelo menos um dinucleotídeo CpG adicional na referida SEQ ID NO:22 ou 23 modificada ter um nucleotídeo G substituído com um nucleotídeo T para ser um dinucleotídeo CpT na referida SEQ ID NO:22 ou 23 modificada.
58. Sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 54, caracterizados pelo sétimo CpG da extremidade 5' na referida SEQ ID NO:22 ou 23 modificada tem o nucleotídeo G substituído com um nucleotídeo T ou A para ser um dinucleotídeo CpT ou CpA, e pelo menos um dinucleotídeo CpG adicional na referida SEQ ID NO:22 ou 23 modificada ter um G substituído com um nucleotídeo A para ser um dinucleotídeo CpA na referida SEQ ID NO:22 ou 23 modificada.
59. Sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 54, caracterizados pelo sétimo CpG da extremidade 5' na referida SEQ ID NO:22 ou 23 modificada ter o nucleotídeo G substituído com um nucleotídeo T ou A para ser um dinucleotídeo CpT ou CpA, e pelo menos dois CpGs adicionais na referida SEQ ID NO:22 ou 23 modificada terem um nucleotídeo G substituído com um nucleotídeo T para ser um dinucleotídeo CpT na referida SEQ ID NO:22 ou 23 modificada.
60. Sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 54, caracterizados pelo sétimo CpG da extremidade 5' na referida SEQ ID NO:22 ou 23 modificada ter o nucleotídeo G substituído com um nucleotídeo T ou A para ser um dinucleotídeo CpT ou CpA, e pelo menos dois CpGs adicionais na referida SEQ ID NO:22 ou 23 modificada terem um nucleotídeo G substituído com um nucleotídeo A para ser um dinucleotídeo CpA na referida SEQ ID NO:22 ou 23 modificada.
61. Sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 60, caracterizados pela referida SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 modificada ter o nucleotídeo G e/ou C em pelo menos um CpG deletado.
62. Sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 61, caracterizados por serem operacionalmente ligados a um transgene.
63. Sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 61, caracterizados pela referida sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo conferir transcrição em um transgene operacionalmente ligado que está dentro de cerca de 50% da transcrição conferida pela SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 não modificada.
64. Sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 61, caracterizados pela referida sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo conferir transcrição em um transgene operacionalmente ligado que está dentro de cerca de 25-50% da transcrição conferida pela SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 não modificada.
65. Sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 61, caracterizados pela referida sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo conferir transcrição em um transgene operacionalmente ligado que está dentro de cerca de 5-100% da transcrição conferida pela SEQ ID NO:2, 3, 22 ou 23 não modificada.
66. Cassete de expressão, caracterizado por compreender a sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 15 a 61, e um transgene.
67. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 66,
caracterizado pela referida sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo estar posicionada a 5' do referido transgene.
68. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 66 ou 67, caracterizado pelo referido transgene codificar uma proteína terapêutica que é expressa nas células do fígado e segregada na circulação sistêmica.
69. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pela referida proteína terapêutica tratar ou prevenir uma doença neurodegenerativa ou do sistema nervoso central (SNC).
70. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pela referida proteína terapêutica ser uma isoforma ApoE protetora.
71. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pela referida proteína terapêutica ser a isoforma ApoE ε2.
72. Cassete de expressão da reivindicação 68, caracterizado pela referida proteína terapêutica tratar ou prevenir uma doença autoimune ou doença alérgica.
73. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pela referida proteína terapêutica ser uma proteína de fusão compreendendo um antígeno indesejado e uma sequência líder que conduz a secreção da referida proteína terapêutica a partir da célula.
74. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo referido antígeno indesejado ser o domínio extracelular da glicoproteína de oligodendrócito de mielina (MOG) ou um fragmento do mesmo.
75. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pela referida proteína terapêutica ser uma proteína de coagulação sanguínea ou do fator de coagulação.
76. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pela referida proteína de coagulação sanguínea ou do fator de coagulação ser Fator IX (FIX), Fator VIII (FVIII), Fator VII (FVII) ou Proteína C.
77. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 76,
caracterizado pelo referido Fator VIII ser codificado por uma sequência de ácido nucleico pelo menos 95% idêntica à sequência da SEQ ID NO:68.
78. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pela referida proteína terapêutica ser uma enzima de armazenamento lisossomal.
79. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pela referida enzima de armazenamento lisossomal ser alfa- glucosidase (GAA) ou alfa-galactosidase (GLA) ácidas.
80. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pela proteína terapêutica tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio inflamatório.
81. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pela referida proteína terapêutica tratar ou prevenir o angioedema hereditário (HAE).
82. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pela referida proteína terapêutica ser o inibidor de C1 esterase (C1EI).
83. Vetor de vírus adeno-associado (AAV), caracterizado por compreender a sequência de ácido nucleico, ou polinucleotídeo ou cassete de expressão, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 82.
84. Vetor de AAV, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado por compreender um ou mais de: a) um capsídeo de AAV; e b) uma ou mais repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV, em que a(s) referida(s) ITR(s) de AAV flanqueia(m) o terminal 5' ou 3' da referida sequência de ácido nucleico, referido polinucleotídeo e/ou referido transgene.
85. Vetor de AAV, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado por compreender ainda um íntron posicionado dentro da referida ITR que flanqueia 5' ou 3'.
86. Vetor de AAV, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado por pelo menos um dos referidos íntrons ou uma ou mais ITRs serem modificados para terem CpGs reduzidos.
87. Vetor de AAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 86, caracterizado pelo referido sorotipo de capsídeo de AAV compreender um capsídeo de AAV VP1, VP2 e/ou VP3 modificado ou variante tendo 90% ou mais de identidade de sequência à AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 ou sequências de AAV-2i8 VP1, VP2 e/ou VP3, ou um capsídeo tendo 95% ou mais de identidade de sequência às sequências de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV- 2i8, SEQ ID NO:91 ou de VP1, VP2 e/ou VP3 da SEQ ID NO:91 ou SEQ ID NO:92, ou um capsídeo tendo 100% de identidade de sequência ás sequências de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV-2i8, SEQ ID NO:91 ou de VP1, VP2 e/ou VP3 da SEQ ID NO:91 ou SEQ ID NO:92.
88. Vetor AAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 87, caracterizado pelo fato de que os referidos ITRs compreendem um ou mais ITRs de qualquer um de: AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10 ou Sorotipos Rh74 AAV, ou uma combinação dos mesmos.
89. Vetor de AAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 88, caracterizado por compreende ainda uma ITR, um sinal poliA e/ou sequência de íntron.
90. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender uma pluralidade de vetores de AAV, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 83 a 89, em um transportador ou excipiente biologicamente compatível.
91. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 90, caracterizada por compreender ainda capsídeos de AAV vazios.
92. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 91, caracterizada pela razão dos referidos capsídeos de AAV vazios para o referido vetor de AAV estar dentro ou entre cerca de 100:1-50:1, cerca de 50:1- 25:1, cerca de 25:1-10:1, cerca de 10:1-1:1, cerca de 1:1-1:10, cerca de 1:10- 1:25, cerca de 1:25-1:50, ou cerca de 1:50-1:100.
93. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 91, caracterizada pela razão dos referidos capsídeos de AAV vazios para o referido vetor de AAV ser de cerca de 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 ou 10:1.
94. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 90 a 93, caracterizada por compreender ainda um surfactante.
95. Método para tratar um humano em necessidade de coagulação sanguínea ou fator de coagulação, caracterizado por compreender: (a) fornecer o cassete de expressão, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, 66 a 68, 75 a 77, o vetor de AAV, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 83 a 89, ou a composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 90 a 94; e (b) administrar uma quantidade do referido cassete de expressão, polinucleotídeo, vetor de AAV ou composição farmacêutica ao referido humano, em que a referida coagulação sanguínea ou o referido fator de coagulação são expressos no referido humano.
96. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo referido humano ter hemofilia A ou B.
97. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo referido vetor de AAV ser administrado ao referido humano por via intravenosa, intra-arterial, intracavitária, intramucosa ou por meio de um cateter.
98. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pela referida coagulação sanguínea ou pelo referido fator de coagulação serem expressos em níveis aumentados.
99. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pela referida coagulação sanguínea ou pelo referido fator de coagulação serem expressos em mais que 1% dos níveis de coagulação sanguínea ou fator de coagulação encontrados em um ser humano que não necessita de coagulação sanguínea ou fator de coagulação.
100. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pela referida coagulação sanguínea ou pelo referido fator de coagulação serem expressos em cerca de 1%-40% dos níveis de coagulação sanguínea ou fator de coagulação encontrados em um ser humano que não necessita de coagulação sanguínea ou fator de coagulação.
101. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pela referida coagulação sanguínea ou pelo referido fator de coagulação serem expressos em cerca de 5%-30% dos níveis de coagulação sanguínea ou fator de coagulação encontrados em um ser humano que não necessita de coagulação sanguínea ou fator de coagulação.
102. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo referido vetor de AAV ser administrado em uma faixa de cerca de 1X108 a cerca de 1X1014 genomas de vetor por quilograma (vg/kg) do peso do referido humano.
103. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo referido humano ter hemofilia A com anticorpos inibidores para o Fator VIII (FVIII).
104. Método para tratar hemófila A com anticorpos inibidores do Fator VIII (FVIII) em um ser humano em necessidade do mesmo, caracterizado por compreender: (a) fornecer o cassete de expressão, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, 66 a 68, 75 a 77, o vetor de AAV, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 83 a 89, ou a composição farmacêutica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 90 a 94; e (b) administrar uma quantidade do referido ácido nucleico,
polinucleotídeo, cassete de expressão, vetor de AAV ou composição farmacêutica ao referido humano, em que a referida coagulação sanguínea ou o referido fator de coagulação são Fator VIII (FVIII) e são expressos no referido humano.
Vezes de um plasmídeo de referência F o ld o f r e fe r e n c e p la s m id , , , , , 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 2 .0 Petição 870210037191, de 23/04/2021, pág. 187/200 ig e n ( % h F V III a n thFVIII Antígeno ) (%) C p G 1 C p G 2 0 50 100 150 200 C p G 3
T T C p G 4
R m C p G 5 C C p G 6 p G C p G 9 1 C p G 1 0
C p C p G 1 1
G 1/12 2 C p G 1 2 Figura 2 Figura 1 C C p G 1 3 p
G 3 C p G 1 4 C p G 1 5
C p C p G 1 6
G 4 C p G 1 7 C C p G 1 8 p
G 5 C p G 1 9 C p G 2 0 C p G 2 1 C p G 2 2
Figura 3 200 e n ( % (%) hFVIII ) 150 F V III a n t ig hAntígeno 100 50 0 6 7 8 9 m d d d
T R ri ri ri ri d T b b b b y y y y
H H H H Figura 4 400 T TR m (%) ) H y b rid _ 6 ig e n ( % 300 h F V III a n thFVIII H y b rid _ 7 200 H y b rid _ 8 Antígeno H y b rid _ 9 100 0 0 2 4 6 8 10 W e e k s papós Semanas o s t daeliberação liv e ry h F V III a n t ig e n ( % ) Antígeno hFVIII (%) 0 200 400 600 800 0 Petição 870210037191, de 23/04/2021, pág. 189/200 Vezes F o ld 0 ,.0 0 ,.5 1 ,.0 1 ,.5
L 5 .0 iv B er Fígado T ra , 10 e in s 11 Cérebro S te p s l Testículos K ee id n Baçon L ey iRim v B er r D o s e (v g /k g ) 1 ,.0  1 0 Fígado T a e in 12 s Cérebro 3/12 S te Tecido p s l Figura 6 Figura 5 Testículos K ee id n Tecido T is s u e Baçon 1 .5 L ey iRim v B er , 10 Fígado T a r 12 e in s Cérebro S te p s l Testículos K ee id n Baçon e y Rim T T R m -h F V III H y b r id 9 _ h F V III H y b r id 7 _ h F V III
Figura 7 Íntron sintético
PoliA
PoliA
Figura 8 h F V III E L IS A
2 0 0 T T R m , h F V III (6 .4 E + 9 ) h F V III (% o f n o r m a l) (% de normal)
T T R m h F V I I I livre i n t r ode n l íntron , e s s (6 .4 E + 9 ) 1 5 0
1 0 0 hFVIII
5 0
0
0 2 4 6
Semanas W e e k s após P o s t aD dosagem o s in g
Figura 9 h F V III E L IS A
T T R m , h F V III (1 .6 0 E + 1 0 ) 4 0 0 h F V III (% o f n o r m a l) (% de normal)
T T R m h F V I I I livre i n t r ode n íntron , le s s ( 1 . 6 0 E + 1 0 )
3 0 0
2 0 0 hFVIII
1 0 0
0
0 2 4 6
Semanas W e e k s após P o s t a D dosagem o s in g
Figura 10 h F V III E L IS A
8 0 0 , normal)
T T R m h F V III (1 .6 0 E + 1 0 ) f n o r m a l)
T T R m h F V I I Ilivre i n t rde o níntron , le s s ( 1 . 6 0 E + 1 0 ) 6 0 0 hFVIII (% ode
4 0 0 h F V III (%
2 0 0
0
0 2 4 6 8 1 0
Semanas W e e k s após P o s t a D dosagem o s in g
Figura 11 h F V III E L IS A
100 A A V -W IN T 2 e 1 2 f nnormal) o r m a l)
80 A A V -IN T L 2 e 1 2
60 % ode F V III ((%
40 hhFVIII
20
0 0 5 10 15 20 25
Dias D a yapós s P o sat dosagem D o s in g
Figura 12 h F V III E L IS A
100 A A V -W IN T 6 e 1 2 f n normal) o r m a l)
80 A A V -IN T L 6 e 1 2
60 % ode F V III ( (%
40 hhFVIII
20
0 0 5 10 15 20 25
Dias D a yapós s P oa s tdosagem D o s in g
Figura 13 h F V III E L IS A 100 80 A A V - W IN T 2 e 1 2 f nnormal) 60 o r m a l) 40 A A V - IN T L 2 e 1 2 % ode 30 F V III ((% 20 hhFVIII 10
BQL 0 0 20 40 60 D ay Dia Figura 14 800 A A V - W IN T A A V -IN T L 600 h F V III ( n g /m l) Dosagem A A V -W IN de T DAAV-WINT o s in g 400 Dosagem A A V -IN T Lde D oAAV-INTL s in g 200 0 6 5 4 e e e 1 1 1
MOI
Figura 15 V - W IN T ) A Adobra 6 A A V - W IN T c h a n g e v sda versus AAV-WINT) A A V -IN T L l (fo ld(alteração 4 Dosagem A A V -W INde T DAAV-WINT o s in g Dosagem A A V -IN T Lde D AAV-INTL o s in g III n g /mng/ml 2 h F V hFVIII 0 6 5 4 e e e 1 1 1
MOI Figura 16 600 Lote A A V - W IN T L o t AA A A V -IN T L Lote L o t AA h F V III ( n g /m l) 400 Lote A A V - W IN T L o t BB A A V -IN T L LLote ot BB 200 0 6 5 4 e e e 1 1 1
MOI
Figura 17
150 h F V III ( n g /m l)
100
50
0
1 2 3 1 2 D N A P re p #
c/ íntron w /in tro n livre den le in tro íntron ss
T T R m -B D D h F V III pplasmídeo la s m id
Figura 18
50 r m anormal)
45 Participante P a r tic ip a n t 1 1 Participante P a r tic ip a n t 2 2 Participante P a r tic ip a n t 3 3 l)
40 n o de
Participante P a r tic ip a n t 4 4 VIIIo f(%
35 c t iv ity (% Central
30
25 r V III A a c t oFator
20 C e n tr a l F do Atividade
15
10
5
0 0 4 8 12 16 20 24
Semanas W e e kapós s a f t ear infusão de v e c to r in f u vetor s io n
Figura 19
50
Participante P a r tic ip a n t 1 1 r mnormal)
45 Participante P a r tic ip a n t 2 2 Participante P a r tic ip a n t 3 3 a l)
40 Participante P a r tic ip a n t 4 4 f n ode (% o(%
35 A c t iv ity VIII
30 o r V III Central
25 a c tFator
20 C e n tr a l Fdo
15 Atividade
10
5
0 0 4 8 12 16 20 24
Semanas W e e k s após a fte r a v einfusão c to r in f ude s iovetor n
Figura 20
50
Participante P a r tic ip a n t 1 1 r mnormal)
45 Participante P a r tic ip a n t 2 2 Participante P a r tic ip a n t 3 3 a l)
40 Participante P a r tic ip a n t 4 4 de f no (% o(%
35 A c t iv ity VIII
30 t o r V IIICentral
25 a c Fator
20 do C e n tr a l F
15 Atividade
10
5
0 0 4 8 12 16 20 24
Semanas W e e k s após a fte r a v einfusão c to r in f ude s iovetor n
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