TW202012425A - 最適化啟動子序列、無內含子之表現構築體及使用方法 - Google Patents

最適化啟動子序列、無內含子之表現構築體及使用方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202012425A
TW202012425A TW108130505A TW108130505A TW202012425A TW 202012425 A TW202012425 A TW 202012425A TW 108130505 A TW108130505 A TW 108130505A TW 108130505 A TW108130505 A TW 108130505A TW 202012425 A TW202012425 A TW 202012425A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
nucleic acid
seq
acid sequence
cpg
modified
Prior art date
Application number
TW108130505A
Other languages
English (en)
Inventor
賽維爾 安格拉
利隆 埃爾庫比
Original Assignee
美商星火治療公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商星火治療公司 filed Critical 美商星火治療公司
Publication of TW202012425A publication Critical patent/TW202012425A/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8121—Serpins
    • C07K14/8125—Alpha-1-antitrypsin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本發明提供表現卡匣。在某些實施例中，表現卡匣包含(a)與SEQ ID NO:2-67中之任一者的序列至少90%一致之調節元件，及(b)編碼具有B域刪除之因子VIII蛋白(FVIII-BDD)的核酸序列，其中該(a)核酸序列與SEQ ID NO:77之序列至少90%一致，其中該調節元件可操作地連接至該核酸序列，且其中在該調節元件與編碼FVIII-BDD之該核酸序列之間不存在內含子，或其中未轉譯核酸之不超過0-107個核苷酸在該調節元件與編碼FVIII-BDD之該核酸序列之間。在某些實施例中，表現卡匣含有使CpG在相同位置處經CpT、CpA、TpG或ApG取代之序列元件或具有CpG減少之核酸序列。

Description

最適化啟動子序列、無內含子之表現構築體及使用方法
基因療法在涉及例如歸因於基因缺乏或缺陷而喪失蛋白質功能或活性或需要遏制異常蛋白質之表現的蛋白質之異常功能或活性之治療應用中展示極大前景。轉基因表現、驅動轉基因表現之強化子及啟動子功能之改善將增強基因療法治療應用。本發明尤其解決此需要。
根據本發明，提供包含編碼具有B域刪除之因子VIII蛋白(FVIII-BDD)之核酸序列的表現卡匣。
在某些實施例中，表現卡匣包含與SEQ ID NO:1之序列至少98%一致的序列，與SEQ ID NO:1之序列至少99%一致，包含SEQ ID NO:1之序列，或由SEQ ID NO:1之序列組成。
在某些實施例中，表現卡匣包含可操作地連接至編碼具有B域刪除之因子VIII蛋白(FVIII-BDD)之核酸序列的調節元件，其中在該調節元件與該核酸序列之間不存在內含子，並且其中表現卡匣包含與SEQ ID NO:1之序列至少91%一致之序列。
在某些實施例中，表現卡匣包含(a)與SEQ ID NO:2-67中之任一者的序列至少90%一致之調節元件，及(b)編碼具有B域刪除之因子VIII蛋白(FVIII-BDD)的核酸序列，其中(a)之核酸序列與SEQ ID NO:77之序列至少90%一致，並且其中調節元件可操作地連接至核酸序列，並且其中在調節元件與編碼FVIII-BDD之核酸序列之間不存在內含子。
在某些實施例中，表現卡匣包含(a)與SEQ ID NO:2-67中之任一者的序列至少90%一致之調節元件，及(b)編碼具有B域刪除之因子VIII蛋白(FVIII-BDD)的核酸序列，其中核酸序列與SEQ ID NO:77之序列至少90%一致，並且其中調節元件可操作地連接至核酸序列，並且其中未轉譯核酸之不超過0-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-105、106或107個核苷酸在調節元件與編碼FVIII-BDD的核酸序列之間。
在某些實施例中，表現卡匣中之調節元件包含與SEQ ID NO:2-67中之任一者至少95%一致的核苷酸序列。
在某些實施例中，表現卡匣中之調節元件具有與SEQ ID NO:4-21或24-67中之任一者之序列中所闡述相同總數目之減少CpG。
在某些實施例中，表現卡匣中之調節元件包含使CpG在與SEQ ID NO:4-21或24-67中之任一者之序列中所闡述相同的位置處經取代成CpT、CpA、TpG或ApG的SEQ ID NO:2-21或24-67中之任一者的序列。
在某些實施例中，表現卡匣中之核酸序列在與來自在調節元件與核酸序列之間具有(a)內含子或(b)未轉譯核酸之108個或更多個核苷酸的表現卡匣之表現相比時呈現更大表現。
在某些實施例中，表現卡匣中之經編碼FVIII-BDD與來自在調節元件與核酸序列之間具有(a)內含子或(b)未轉譯核酸之108個或更多個核苷酸的表現卡匣之表現相比呈現更大生物活性。
在某些實施例中，生物活性藉由凝固檢定或FVIII檢定或FVIII缺乏模型中之減少出血來測定。
在某些實施例中，表現卡匣在與封裝在調節元件與核酸序列之間具有(a)內含子或(b)未轉譯核酸之108個或更多個核苷酸的表現卡匣相比時更有效地封裝至AAV載體中。
根據本發明，提供調節元件(啟動子)之胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸(CpG)減少之核酸序列。例示性啟動子包括TTR (甲狀腺素轉運蛋白基因)啟動子及ApoE/hAAT (人類脂蛋白元E基因/人類α-1抗胰蛋白酶基因)啟動子。例示性啟動子亦包括血纖維蛋白原γ鏈基因(FGG)啟動子、白蛋白啟動子及血清類澱粉A1基因(SAA1)啟動子。例示性啟動子進一步包括稠合至hAAT啟動子、FGG啟動子、白蛋白啟動子及/或SAA1啟動子中之一或多者(產生雜合啟動子或啟動子嵌合體)的TTR啟動子。
CpG減少之核酸調節元件包括在轉移至細胞中時與非CpG減少之調節元件相比呈現經改變基因表現量的變異體。在某些實施例中，CpG減少之調節元件可提供轉基因或異源核酸(諸如編碼諸如血液凝固因子(例如，FVIII)的蛋白質之轉基因)在哺乳動物中之經增加表現，以及在基因轉移之內容背景中藉由增加諸如血液凝固因子之蛋白質的循環量，且實現止血以獲得有益治療結果以提供經增加療效。
在某些實施例中，核酸序列具有比野生型非CpG減少之調節元件(例如，SEQ ID NO:2、3、22及23中之任一者)少至少1個CpG。
在某些實施例中，核酸序列具有比野生型非CpG減少之調節元件(例如，SEQ ID NO:2、3、22及23中之任一者)少至少2個CpG。
在某些實施例中，核酸序列具有比野生型非CpG減少之調節元件(例如，SEQ ID NO:2、3、22及23中之任一者)少至少3個CpG。
在某些實施例中，核酸序列具有比野生型非CpG減少之調節元件(例如，SEQ ID NO:2、3、22及23中之任一者)少至少4個CpG。
在某些實施例中，核酸序列具有比野生型非CpG減少之調節元件(例如，SEQ ID NO:22及23中之任一者)少至少5個CpG。
在某些實施例中，核酸序列具有比野生型非CpG減少之調節元件(例如，SEQ ID NO:22及23中之任一者)少至少6個CpG。
在某些實施例中，核酸序列具有比野生型非CpG減少之調節元件(例如，SEQ ID NO:22及23中之任一者)少至少7個CpG。
在某些實施例中，核酸序列具有比野生型非CpG減少之調節元件(例如，SEQ ID NO:22及23中之任一者)少至少8個CpG。
在某些實施例中，核酸序列具有比野生型非CpG減少之調節元件(例如，SEQ ID NO:22及23中之任一者)少至少9個CpG。
在某些實施例中，核酸序列具有比野生型非CpG減少之調節元件(例如，SEQ ID NO:22及23中之任一者)少至少10個CpG。
在某些實施例中，核酸序列具有比野生型非CpG減少之調節元件(例如，SEQ ID NO:22及23中之任一者)少至少11個CpG。
在某些實施例中，核酸序列具有比野生型非CpG減少之調節元件(例如，SEQ ID NO:22及23中之任一者)少至少12個CpG。
在某些實施例中，核酸序列具有比野生型非CpG減少之調節元件(例如，SEQ ID NO:22及23中之任一者)少至少13個CpG。
在某些實施例中，核酸序列具有比野生型非CpG減少之調節元件(例如，SEQ ID NO:22及23中之任一者)少至少14個CpG。
在某些實施例中，核酸序列具有比野生型非CpG減少之調節元件(例如，SEQ ID NO:22及23中之任一者)少至少15個CpG。
在某些實施例中，核酸序列具有比野生型非CpG減少之調節元件(例如，SEQ ID NO:22及23中之任一者)少至少16個CpG。
在某些實施例中，核酸序列具有不超過16個CpG；具有不超過15個CpG；具有不超過14個CpG；具有不超過13個CpG；具有不超過12個CpG；具有不超過11個CpG；具有不超過10個CpG；具有不超過9個CpG；具有不超過8個CpG；具有不超過7個CpG；具有不超過6個CpG；具有不超過5個CpG；具有不超過4個CpG；具有不超過3個CpG；具有不超過2個CpG；或具有不超過1個CpG。
在某些實施例中，核酸序列具有至多15個CpG；14個CpG；13個CpG；12個CpG；11個CpG；10個CpG；9個CpG；8個CpG；7個CpG；6個CpG；5個CpG；4個CpG；3個CpG；2個CpG；或1個CpG。在某些實施例中，核酸序列不具有CpG。
在某些實施例中，包含SEQ ID NO:22或23之核酸序列經修飾成具有15個或更少個胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸(CpG)；14個或更少個CpG；13個或更少個CpG；12個或更少個CpG；11個或更少個CpG；10個或更少個CpG；9個或更少個CpG；8個或更少個CpG；7個或更少個CpG；6個或更少個CpG；5個或更少個CpG；4個或更少個CpG；3個或更少個CpG；2個或更少個CpG；或1個或0個CpG。在某些實施例中，SEQ ID NO:2、3、22及23中之任一者中之核酸序列經修飾成具有0個CpG。
在某些實施例中，SEQ ID NO:2、3、22及23中之任一者中之核酸序列經修飾以使得各CpG位點中之C經修飾成T，視情況排除C/EBP位點中之C。
在某些實施例中，除了第一個CpG位點保持未經修飾之外，SEQ ID NO:2、3、22及23中之任一者中的核酸序列經修飾以使得各CpG位點中之C經修飾成T，視情況排除C/EBP位點中的C。
在某些實施例中，除了第二個CpG位點保持未經修飾之外，SEQ ID NO:2、3、22及23中之任一者中的核酸序列經修飾以使得各CpG位點中之C經修飾成T，視情況排除C/EBP位點中的C。
在某些實施例中，除了第三個CpG位點保持未經修飾之外，SEQ ID NO:2、3、22及23中之任一者中的核酸序列經修飾以使得各CpG位點中之C經修飾成T，視情況排除C/EBP位點中的C。
在某些實施例中，除了第四個CpG位點保持未經修飾之外，SEQ ID NO:2、3、22及23中之任一者中的核酸序列經修飾以使得各CpG位點中之C經修飾成T，視情況排除C/EBP位點中的C。
在某些實施例中，除了第五個CpG位點保持未經修飾之外，SEQ ID NO:22及23中之任一者中的核酸序列經修飾以使得各CpG位點中之C經修飾成T，視情況排除C/EBP位點中的C。
在某些實施例中，除了第六個CpG位點保持未經修飾之外，SEQ ID NO:22及23中之任一者中的核酸序列經修飾以使得各CpG位點中之C經修飾成T，視情況排除C/EBP位點中的C。
在某些實施例中，除了第七個CpG位點保持未經修飾之外，SEQ ID NO:22及23中之任一者中的核酸序列經修飾以使得各CpG位點中之C經修飾成T。
在某些實施例中，除了第八個CpG位點保持未經修飾之外，SEQ ID NO:22及23中之任一者中的核酸序列經修飾以使得各CpG位點中之C經修飾成T，視情況排除C/EBP位點中的C。
在某些實施例中，除了第九個CpG位點保持未經修飾之外，SEQ ID NO:22及23中之任一者中的核酸序列經修飾以使得各CpG位點中之C經修飾成T，視情況排除C/EBP位點中的C。
在某些實施例中，除了第十個CpG位點保持未經修飾之外，SEQ ID NO:22及23中之任一者中的核酸序列經修飾以使得各CpG位點中之C經修飾成T，視情況排除C/EBP位點中的C。
在某些實施例中，除了第十一個CpG位點保持未經修飾之外，SEQ ID NO:22及23中之任一者中的核酸序列經修飾以使得各CpG位點中之C經修飾成T，視情況排除C/EBP位點中的C。
在某些實施例中，除了第十二個CpG位點保持未經修飾之外，SEQ ID NO:22及23中之任一者中的核酸序列經修飾以使得各CpG位點中之C經修飾成T，視情況排除C/EBP位點中的C。
在某些實施例中，除了第十三個CpG位點保持未經修飾之外，SEQ ID NO:22及23中之任一者中的核酸序列經修飾以使得各CpG位點中之C經修飾成T，視情況排除C/EBP位點中的C。
在某些實施例中，除了第十四個CpG位點保持未經修飾之外，SEQ ID NO:22及23中之任一者中的核酸序列經修飾以使得各CpG位點中之C經修飾成T，視情況排除C/EBP位點中的C。
在某些實施例中，除了第十五個CpG位點保持未經修飾之外，SEQ ID NO:22及23中之任一者中的核酸序列經修飾以使得各CpG位點中之C經修飾成T，視情況排除C/EBP位點中的C。
在某些實施例中，除了第十六個CpG位點保持未經修飾之外，SEQ ID NO:22及23中之任一者中的核酸序列經修飾以使得各CpG位點中之C經修飾成T，視情況排除C/EBP位點中的C。
在某些實施例中，核酸序列經修飾以使得來自SEQ ID NO:2、3、22及23中之任一者中的5'端之至少第1個CpG經修飾成不為CpG。
在某些實施例中，核酸序列經修飾以使得來自SEQ ID NO:2、3、22及23中之任一者中的5'端之至少第2個CpG經修飾成不為CpG。
在某些實施例中，核酸序列經修飾以使得來自SEQ ID NO:2、3、22及23中之任一者中的5'端之至少第3個CpG經修飾成不為CpG。
在某些實施例中，核酸序列經修飾以使得來自SEQ ID NO:2、3、22及23中之任一者中的5'端之至少第4個CpG經修飾成不為CpG。
在某些實施例中，核酸序列經修飾以使得來自SEQ ID NO:22及23中之任一者中的5'端之至少第5個CpG經修飾成不為CpG。
在某些實施例中，核酸序列經修飾以使得來自SEQ ID NO:22及23中之任一者中的5'端之至少第6個CpG經修飾成不為CpG。
在某些實施例中，核酸序列經修飾以使得來自SEQ ID NO:22及23中之任一者中的5'端之至少第7個CpG經修飾成不為CpG。
在某些實施例中，核酸序列經修飾以使得來自SEQ ID NO:22及23中之任一者中的5'端之至少第8個CpG經修飾成不為CpG。
在某些實施例中，核酸序列經修飾以使得來自SEQ ID NO:22及23中之任一者中的5'端之至少第9個CpG經修飾成不為CpG。
在某些實施例中，核酸序列經修飾以使得來自SEQ ID NO:22及23中之任一者中的5'端之至少第10個CpG經修飾成不為CpG。
在某些實施例中，核酸序列經修飾以使得來自SEQ ID NO:22及23中之任一者中的5'端之至少第11個CpG經修飾成不為CpG。
在某些實施例中，核酸序列經修飾以使得來自SEQ ID NO:22及23中之任一者中的5'端之至少第12個CpG經修飾成不為CpG。
在某些實施例中，核酸序列經修飾以使得來自SEQ ID NO:22及23中之任一者中的5'端之至少第13個CpG經修飾成不為CpG。
在某些實施例中，核酸序列經修飾以使得來自SEQ ID NO:22及23中之任一者中的5'端之至少第14個CpG經修飾成不為CpG。
在某些實施例中，核酸序列經修飾以使得來自SEQ ID NO:22及23中之任一者中的5'端之至少第15個CpG經修飾成不為CpG。
在某些實施例中，核酸序列經修飾以使得來自SEQ ID NO:22及23中之任一者中的5'端之至少第16個CpG經修飾成不為CpG。
在某些實施例中，SEQ ID NO:2、3、22及23中之任一者中的一或多個CpG之胞嘧啶經修飾成胸腺嘧啶。在某些實施例中，SEQ ID NO:2、3、22及23中之任一者中的一或多個CpG之胞嘧啶經修飾成腺嘌呤。
在某些實施例中，SEQ ID NO:2、3、22及23中之任一者中的核酸序列經修飾以使得一或多個CpG中之C經刪除。
在某些實施例中，SEQ ID NO:2、3、22及23中之任一者中的核酸序列經修飾以使得一或多個CpG中之G經刪除。
在某些實施例中，SEQ ID NO:2、3、22及23中之任一者中的核酸序列經修飾以使得一或多個CpG中之C及G經刪除。
例示性CpG減少之TTR啟動子闡述於SEQ ID NO:4-13中。
例示性CpG減少之雜合啟動子闡述於SEQ ID NO:14-21中。
例示性CpG減少之ApoE/hAAT啟動子闡述於SEQ ID NO:24-67中。
在某些實施例中，包含稠合至hAAT啟動子及/或FGG啟動子及/或白蛋白啟動子及/或SAA1啟動子中之至少一者之全部或一部分的TTR啟動子之全部或一部分之雜合啟動子中的一或多個CpG之胞嘧啶經修飾成胸腺嘧啶(CàT)或腺嘌呤(GàA)。TTR啟動子可以任一5' à 3'定向稠合至前述啟動子中之任一者或組合。
在某些實施例中，雜合啟動子具有5' à 3'定向，TTR/hAAT或hAAT/TTR。在某些實施例中，雜合啟動子具有5' à 3'定向，TTR/FGG或FGG/TTR。在某些實施例中，雜合啟動子具有5' à 3'定向，TTR/hAAT/白蛋白或hAAT/TTR/白蛋白或白蛋白/TTR/hAAT或TTR/白蛋白/hAAT、hAAT/白蛋白/TTR或白蛋白/hAAT/TTR等。
在某些實施例中，雜合啟動子具有5' à 3'定向，TTR/FGG/白蛋白或hAAT/TTR/FGG或FGG/TTR/hAAT或TTR/FGG/hAAT等。
在某些實施例中，雜合啟動子具有稠合至hAAT啟動子、FGG啟動子、白蛋白啟動子及SAA1啟動子中之所有4種之全部或一部分的TTR啟動子。TTR啟動子可以任一5' à 3'定向且以任一啟動子順序稠合至前述啟動子之全部或一部分。
在某些實施例中，本發明之核酸序列或聚核苷酸(諸如CpG減少之核酸序列)可操作地連接至轉基因。
在某些實施例中，本發明之核酸序列或聚核苷酸(諸如如本文所闡述之經修飾SEQ ID NO:2、3、22或23)可操作地連接至轉基因。
在某些實施例中，本發明之核酸序列或聚核苷酸(諸如如本文所闡述之經修飾SEQ ID NO:2、3、22或23)對可操作連接之轉基因賦予轉錄，該轉錄在由未修飾之SEQ ID NO:2、3、22或23賦予的轉錄之約5-100%內或在由未修飾之SEQ ID NO:2、3、22或23賦予的轉錄之約50%內或在由未修飾之SEQ ID NO:2、3、22或23賦予的轉錄之約25-50%內。
在某些實施例中，諸如如本文所闡述之經修飾SEQ ID NO:2、3、22或23的核酸序列或聚核苷酸定位在轉基因之5'處。
在某些實施例中，轉基因編碼血液凝結或凝固蛋白質。
在某些實施例中，轉基因編碼因子IX (FIX)、因子VIII (FVIII)、因子VII (FVII)或蛋白C。
在某些實施例中，轉基因編碼具有與SEQ ID NO:68之序列至少95%一致之序列的因子VIII。
在某些實施例中，轉基因經轉錄成抑制性RNA。在某些實施例中，抑制性RNA包含反義RNA、微RNA (miRNA)或小干擾RNA (siRNA)。
在某些實施例中，轉基因編碼在肝臟細胞中表現且分泌於全身循環中之治療蛋白。
在某些實施例中，治療蛋白治療或預防神經退化性或中樞神經系統(CNS)疾病。
在某些實施例中，治療蛋白為保護性ApoE同功異型物。
在某些實施例中，治療蛋白為ApoE ε2同功異型物。
在某些實施例中，治療蛋白治療或預防自體免疫疾病或過敏性疾病。
在某些實施例中，治療蛋白為包含非所需抗原及驅動自細胞分泌該治療蛋白之前導序列的融合蛋白質。
在某些實施例中，非所需抗原為髓鞘寡樹突神經膠質細胞糖蛋白(MOG)細胞外域或其片段。
在某些實施例中，表現卡匣包含可操作地連接至轉基因之本發明的核酸序列或聚核苷酸，諸如如本文所闡述之經修飾SEQ ID NO:2、3、22或23，其中核酸序列或聚核苷酸經定位在轉基因之5'端的上游，且視情況其中存在定位於核酸序列或聚核苷酸與轉基因之5'端之間的未轉譯核酸序列之不超過0-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-105、106或107個核苷酸。
在某些實施例中，表現卡匣包含與SEQ ID NO:4-21或24-67中之任一者的序列具有95%或更大序列一致性的第一核苷酸序列，其中經定位於第二核苷酸序列之5'端之上游的第一核苷酸序列與SEQ ID NO:77之序列具有95%或更大序列一致性，且視情況其中存在定位於第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之5'端之間的未轉譯核酸序列之不超過0-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-105、106或107個核苷酸。
在某些實施例中，表現卡匣包含SEQ ID NO:1之序列或與SEQ ID NO:1之序列具有至少98%序列一致性的聚核苷酸。
在某些實施例中，表現卡匣包含與SEQ ID NO:1之序列具有至少99%序列一致性的聚核苷酸。
在某些實施例中，表現卡匣基本上由SEQ ID NO:1組成。
在某些實施例中，轉基因或第二核苷酸序列包含編碼具有B域刪除之因子VIII (FVIII) (FVIII-BDD)的核酸序列，且該核酸序列編碼具有FVIII血液凝結活性且與SEQ ID NO:68之序列具有至少90%序列一致性的FVII-BDD蛋白質。
在某些實施例中，轉基因或第二核苷酸序列包含編碼具有B域刪除之因子VIII (FVIII) (FVIII-BDD)的核酸序列，且該核酸序列與SEQ ID NO:77之序列具有90%或更大序列一致性且編碼具有FVIII血液凝結活性的蛋白質。
在某些實施例中，未轉譯核酸序列不為內含子或無內含子。
在某些實施例中，第一核苷酸序列包含與SEQ ID NO:4-21或24-67中之任一者至少95%一致之核酸序列。
在某些實施例中，第一核苷酸序列包含與SEQ ID NO:4-21或24-67中之任一者的序列至少95%一致之核酸序列，且具有與SEQ ID NO:4-21或24-67中之任一者的序列中所闡述相同總數目之減少CpG。
在某些實施例中，第一核苷酸序列包含與SEQ ID NO:4-21或24-67中之任一者的序列至少95%一致且使CpG在與SEQ ID NO:4-21或24-67中之任一者的序列中所闡述相同之位置處經取代成CpT、CpA、TpG或ApG的核酸序列。
在某些實施例中，第二核苷酸序列在與來自在第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之5'端之間具有108個或更多個核苷酸之聚核苷酸的表現相比時呈現更大表現。
在某些實施例中，第二核苷酸序列在與來自在第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之5'端之間具有108個或更多個核苷酸之聚核苷酸的表現相比時呈現更大生物活性。
在某些實施例中，生物活性藉由凝固檢定或FVIII檢定或FVIII缺乏模型中之減少出血來測定。
在某些實施例中，第二核苷酸序列在與封裝在第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之5'端之間具有108個或更多個核苷酸的聚核苷酸相比時更有效地封裝至AAV載體中。
在某些實施例中，腺相關病毒(AAV)載體包含如本文中所闡述之核酸序列或聚核苷酸或表現卡匣。
在某些實施例中，AAV載體包含以下中之一或多者：a)AAV衣殼；及b)一或多個AAV反向末端重複序列(ITR)，其中AAV ITR側接核酸序列、聚核苷酸及/或轉基因之5'或3'末端。
在某些實施例中，AAV載體進一步包含定位於側接5'或3' ITR內之內含子。
在某些實施例中，內含子或一或多個ITR經修飾成具有減少之CpG。
在某些實施例中，AAV衣殼血清型包含與AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV-2i8、SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92 VP1、VP2及/或VP3序列具有90%或更高序列一致性之經修飾或變異AAV VP1、VP2及/或VP3衣殼；或與AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV-2i8、SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92 VP1、VP2及/或VP3序列具有95%或更高序列一致性之衣殼；或與AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV-2i8、SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92 VP1、VP2及/或VP3序列具有100%序列一致性之衣殼。
在某些實施例中，ITR包含以下中之任一者的一或多個ITR：AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10或Rh74 AAV血清型或其組合。
在某些實施例中，AAV載體進一步包含ITR、聚腺苷酸化(polyA)信號及/或內含子序列。
在某些實施例中，如本文中所闡述之AAV載體為任一醫藥組合物。
在某些實施例中，醫藥組合物包含生物相容性載劑或賦形劑。
在某些實施例中，醫藥組合物進一步包含空AAV衣殼。
在某些實施例中，組合物或醫藥組合物包含在約100:1-50:1、約50:1-25:1、約25:1-10:1、約10:1-1:1、約1:1-1:10、約1:10-1:25、約1:25-1:50或約1:50-1:100內或之間的空AAV衣殼與AAV載體之比率。
在某些實施例中，組合物或醫藥組合物中之空AAV衣殼與AAV載體之比率為約2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
在某些實施例中，本文中所闡述之組合物或醫藥組合物進一步包含界面活性劑。
在某些實施例中，提供治療需要基因療法之人類之方法。
在某些實施例中，人類需要血液凝結或凝固因子。
在某些實施例中，治療人類的方法包括(a)提供如本文所闡述之表現卡匣、如本文所闡述之聚核苷酸、如本文所闡述之AAV載體或如本文中所闡述之醫藥組合物；及(b)向人類投與一定量的表現卡匣、聚核苷酸、AAV載體或醫藥組合物，其中血液凝結或凝固因子在人類中表現。
在某些實施例中，人類患有A型或B型血友病。
在某些實施例中，AAV載體經靜脈內、動脈內、腔室內、黏膜內或經由導管向人類投與。
在某些實施例中，血液凝結或凝固因子在投與之後以增加之水準表現。
在某些實施例中，血液凝結或凝固因子以大於在不需要血液凝結或凝固因子之人類中發現的血液凝結或凝固因子之水準的1%表現。
在某些實施例中，血液凝結或凝固因子以在不需要血液凝結或凝固因子之人類中發現的血液凝結或凝固因子之水準的約1%-40%表現。
在某些實施例中，血液凝結或凝固因子以在不需要血液凝結或凝固因子之人類中發現的血液凝結或凝固因子之水準的約5%-30%表現。
在某些實施例中，AAV載體以約1 × 108 至約1 × 1014 個載體基因組/公斤(vg/kg)人類體重之範圍投與。
相關申請案 本申請案主張2018年8月24日申請之美國臨時專利申請案第62/722,547號、2018年8月30日申請之美國臨時專利申請案第62/725,096號及2018年12月21日申請之美國臨時專利申請案第62/784,116號的優先權。前述申請案之全部內容以引用的方式併入本文中，包括所有文本、圖表、序列表及圖式。
本文中揭示用於因子VIII (FVIII)及具有刪除B域之FVIII (FVIII-BBD) (例如，人類FVIII (hFVIII)及人類FVIII-BDD (hFVIII-BDD))的表現之無內含子表現卡匣。研究人員已報導，表現卡匣中包括內含子(包括在AAV遞送載體中)可有助於增加轉基因表現(Huang等人, 1990, Nucl. Acid Res., 18:937-947；Choi等人；2014, Mol. Brain, 7:17；Powell等人；2015, Discov. Med., 19:49-57；Lu等人；2017, Hum. Gene Ther., 28:125-134)。出人意料地，如本文中所揭示，內含子之部分或完全去除使得AAV載體效能及轉基因(在此情況下，因子VIII)表現量在細胞培養物、小鼠及非人類靈長類動物中增加。「無內含子」表現卡匣設計為用於治療諸如A型血友病之血液凝固病症的載體之改進，且可在較低載體劑量下提供療效，除減少諸如成本及時間的製造障礙之外，亦潛在地向患者安全性及結果提供益處。
本文亦揭示具有與參考野生型哺乳動物(例如人類)序列相比減少之CpG及/或與參考野生型哺乳動物(例如人類)序列小於100%之序列一致性的核酸序列。具有減少之CpG的核酸序列包括一或多種以下啟動子：TTR啟動子、ApoE/hAAT啟動子、FGG啟動子、白蛋白啟動子及SAA1啟動子。具有減少之CPG的核酸序列包括TTR啟動子與至少一或多種以下啟動子之融合物或雜合體：ApoE/hAAT啟動子、FGG啟動子、白蛋白啟動子及SAA1啟動子。
術語「聚核苷酸」及「核酸」在本文中可互換地使用以指所有形式之核酸、寡核苷酸，包括去氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)。聚核苷酸包括基因組DNA、cDNA及反義DNA、及剪接或未剪接mRNA、rRNA tRNA及抑制性DNA或RNA (RNAi，例如小或短髮夾(sh)RNA、微RNA (miRNA)、小或短干擾(si)RNA、反式剪接RNA或反義RNA)。聚核苷酸包括天然存在、合成及刻意修飾或改變的聚核苷酸(例如變異核酸)。聚核苷酸可為單螺旋體、雙螺旋體或三螺旋體，線性或環狀，且可具有任何長度。在論述聚核苷酸時，特定聚核苷酸之序列或結構可在本文中根據在5'至3'方向上提供序列之慣例描述。
如本文中所使用，術語「修飾」或「變異」及其語法變化形式意謂核酸、多肽或其子序列不同於參考序列。經修飾及變異序列可因而具有與參考序列相比實質上相同、更大或更少表現、活性或功能，但至少保留參考序列之部分活性或功能。修飾或變異之特定實例為CpG減少之TTR啟動子、ApoE/hAAT啟動子、FGG啟動子、白蛋白啟動子及SAA1啟動子。
「核酸」或「聚核苷酸」變異體係指與野生型相比已經基因改變之經修飾序列。核酸或聚核苷酸變異體可指代已經密碼子修飾但仍保留與諸如野生型序列之參考序列至少部分序列一致性的序列。編碼蛋白質之核酸或聚核苷酸可經基因修飾而不改變所編碼蛋白質序列。可替代地，序列可經基因修飾以編碼變異蛋白。舉例而言，此核酸變異體之一些密碼子將改變(例如CpG減少)而不改變由此編碼之蛋白質的胺基酸。
含有具有減少之CpG含量的啟動子之表達載體與CpG含量尚未減少之啟動子相比可表現出改進。在比較表現時，將CpG減少之啟動子與野生型或非CpG減少之啟動子進行比較。
術語「變異」或「經修飾」不需要在對本文中CpG減少之核酸序列做出的參考之各情況下出現。同樣，術語「CpG減少之核酸」或其類似者可省略術語「變異」或「經修飾」，但意欲指代「CpG減少之核酸」包括在基因水準處之變異體。
變異體之特定實例為CpG減少之核酸。CpG減少可藉由將C或G核苷酸改變成不同核苷酸(諸如將C改變成T或將G改變成A)來達成。CpG減少亦可藉由刪除C核苷酸或刪除G核苷酸或刪除C及G核苷酸兩者來達成。
「變異或經修飾」FVIII係指與未修飾之野生型FVIII或FVIII-BDD (SEQ ID NO:68)相比已經基因改變的FVIII或FVIII-BDD。此變異體可稱為「核酸變異編碼因子VIII (FVIII)」。
「變異因子VIII (FVIII)」亦可意謂經修飾FVIII蛋白質使得經修飾蛋白質與野生型FVIII相比具有胺基酸改變。在比較活性及/或穩定性時，若經編碼變異FVIII蛋白質保留B域，則適合將其與野生型FVIII進行比較；且若經編碼變異FVIII蛋白質具有B域刪除，則其與亦具有B域刪除之野生型FVIII相比較。
變異FVIII可包括B域之一部分。因此，FVIII-BDD包括B域之一部分。通常，在FVIII-BDD中，刪除大部分B域。
變異FVIII可包括闡述為SFSQNPPVLKRHQR之「SQ」序列(SEQ ID NO:69)。通常，具有SQ之此變異FVIII (FVIII/SQ)具有BDD，例如，刪除BD之至少全部或一部分。諸如FVIII-BDD之變異FVIII可具有「SQ」序列之全部或一部分，亦即SEQ ID NO:69之全部或一部分。因此，舉例而言，具有SQ序列(SFSQNPPVLKRHQR，SEQ ID NO:69)之變異FVIII-BDD可具有胺基酸序列SFSQNPPVLKRHQR之全部或僅一部分。舉例而言，FVIII-BDD可具有所包括之SFSQNPPVLKRHQR的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個胺基酸殘基。因此，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個內部刪除以及1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個胺基末端刪除或羧基末端刪除之SFSQNPPVLKRHQR包括於本文中所闡述之變異FVIII蛋白質中。
由「核酸」或「聚核苷酸」序列編碼之「多肽」、「蛋白質」及「肽」包括如同天然存在之野生型蛋白質的全長天然序列以及官能子序列、修飾形式或序列變異體，只要子序列、修飾形式或變異體保留天然全長蛋白質之一些功能度即可。舉例而言，編碼FVIII蛋白質之核酸(例如，CpG減少之核酸)可具有如本文中所闡述之B域刪除且保留凝固功能。在本發明之方法及用途中，由核酸序列編碼之此等多肽、蛋白質及肽可能但不必要與內源蛋白一致，該內源蛋白為缺陷性的或其表現不足或在經治療哺乳動物中缺乏。
舉例而言，且不限於，修飾包括一或多個核苷酸或胺基酸取代(例如，1-3、3-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-500、500-750、750-850個或更多個核苷酸或殘基)。如本文中所闡述，核酸修飾之實例為CpG減少。
胺基酸修飾之實例為保守胺基酸取代或例如FVIII 的參考序列之刪除(例如，子序列或片段)，諸如具有B域刪除之FVIII。在某些實施例中，經修飾或變異序列保留未修飾序列之功能或活性的至少部分。
明確地包括已知或未知的所有哺乳動物及非哺乳動物形式之核酸，包括本文中其他哺乳動物形式之CpG減少的啟動子。
術語「載體」係指可藉由插入或併入核酸來操控之小載劑核酸分子、質體、病毒(例如，AAV)或其他媒劑。載體可用於基因操控(亦即，「選殖載體」)以將聚核苷酸引入/轉移至細胞及/或器官中且轉錄或轉譯細胞中所插入之聚核苷酸。「表現載體」為含有具有在宿主細胞中表現所需的必需調節區之基因或核酸序列的載體。載體核酸序列一般含有用於在細胞中繁殖之至少一複製起點及視情況選用的額外元件，諸如異源核酸序列、表現控制元件(例如，啟動子、強化子)、內含子、反向末端重複序列(ITR)、視情況選用之可選標記物、聚腺苷酸化信號。
如本文中所揭示，不含內含子之載體與具有合成內含子之相同載體相比表現出優良特性。因此，本發明提供包含可操作地連接至調節元件之轉基因的表現卡匣，其中調節元件(例如，如本文中所闡述之CpG減少的啟動子)經定位在轉基因之5'端上游，且其中在調節元件與轉基因之5'端之間存在未轉譯核酸序列之不超過0-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-105、106或107個核苷酸。
本發明亦提供包含與SEQ ID NO:2-67中之任一者的序列具有95%或更大序列一致性的第一核苷酸序列之表現卡匣，其中第一核苷酸序列經定位在與SEQ ID NO:77之序列具有95%或更大序列一致性的第二核苷酸序列之5'端上游，且其中未轉譯核酸序列之不超過0-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-105、106或107個核苷酸在第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之5'端之間。
本發明另外提供包含與SEQ ID NO:2-67中之任一者的序列具有95%或更大序列一致性的第一核苷酸序列之表現卡匣，其中第一核苷酸序列經定位在與SEQ ID NO:71-88中之任一者的序列具有95%或更大序列一致性(例如，95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性)的第二核苷酸序列之5'端上游，且其中未轉譯核酸序列的不超過0-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-105、106或107個核苷酸在第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之5'端之間。
本發明進一步提供具有定位於調節元件與轉基因之間的未轉譯(非編碼)核酸之表現卡匣，其中未轉譯核酸並非內含子。此表現卡匣可稱為無內含子卡匣。
內含子為具有允許細胞機構在RNA成熟為mRNA之過程期間剪接出未轉譯核苷酸序列之供體位點及剪接受體位點的序列。如本文中所使用，「無內含子」係指缺乏供體及剪接受體位點之未轉譯核酸序列，但不意謂未轉譯核酸序列不含其他位點，諸如限制酶識別/裂解位點、Kozak序列、轉錄因子識別/結合位點。換言之，無內含子不意謂核酸序列完全不含任何未轉譯核酸序列。
AAV載體衍生自腺相關病毒。AAV載體適用作基因療法載體，此係因為其可穿透細胞且引入核酸/基因物質以使得核酸/基因物質可穩定地維持在細胞中。因為AAV不與人類之病原性疾病相關聯，所以AAV載體能夠將異源核酸序列(例如，編碼治療蛋白及抑制性RNA的異源核酸序列)遞送至人類患者而不造成實質AAV發病機制或疾病。
術語「重組型」，作為載體之修飾語，諸如重組型AAV (rAAV)載體，以及序列之修飾語，諸如重組型聚核苷酸及多肽，意謂組合物已以一般不存在於自然界中之方式操控(亦即，經工程改造)。重組型AAV載體之特定實例將為其中通常在野生型AAV基因組(異源序列)中不存在的核酸插入病毒基因組內。實例將為其中將編碼治療蛋白或多核苷酸序列之核酸(例如，基因)經選殖至載體中，含有或不含有基因在AAV基因組內通常相關聯之5'、3'及/或內含子區域。儘管參考AAV載體以及諸如聚核苷酸之序列，本文中並未始終使用術語「重組型」，但儘管有任何此類省略，包括AAV載體、聚核苷酸等之重組型形式亦明確地包括在內。
「rAAV載體」藉由使用分子方法以去除野生型AAV基因組之全部或一部分且經諸如編碼治療蛋白或聚核苷酸序列之核酸的非天然(異源)核酸置換而衍生自野生型AAV基因組。通常，針對rAAV載體，保留AAV基因組之一種或兩種反向末端重複(ITR)序列。因為相對於AAV基因組核酸，AAV基因組之全部或一部分已經非天然序列置換，諸如經編碼治療蛋白或聚核苷酸序列的異源核酸置換，所以rAAV區別於AAV基因組。因此，併入非天然(異源)序列將AAV定義為「重組型」AAV載體，其可稱為「rAAV載體」。
重組型AAV載體序列可封裝-在本文中稱為「顆粒」-以用於離體、活體外或活體內細胞之後續感染(轉導)。在重組型載體序列衣殼化或封裝至AAV顆粒中之情況下，顆粒亦可稱為「rAAV」或「rAAV顆粒」或「rAAV病毒粒子」。此等rAAV、rAAV顆粒及rAAV病毒粒子包括衣殼化或封裝載體基因組之蛋白質。在AAV之情況下，特定實例包括衣殼蛋白。
「載體基因組」或方便地縮寫為「vg」係指最終經封裝或衣殼化以形成rAAV顆粒之重組型質體序列的部分。在重組型質體用於構築或製造重組型AAV載體之情況下，AAV載體基因組不包括不對應於重組型質體之載體基因組序列的「質體」之部分。重組型質體之此非載體基因組部分稱為對於質體之選殖及擴增至關重要的「質體主鏈」，其為繁殖及重組型AAV載體產生所需之過程，但自身不封裝或衣殼化至rAAV顆粒中。因此，「載體基因組」係指由rAAV封裝或衣殼化之核酸。
「AAV輔助功能」係指可經表現以提供AAV基因產物及AAV載體之經AAV衍生寫碼序列(蛋白質)，該AAV基因產物及AAV載體繼而反式作用以用於產生性AAV複製及封裝。因此，AAV輔助功能包括主要AAV開放閱讀框架(ORF) rep及cap兩者。已展示Rep表現產物具有許多功能，尤其包括：DNA複製之AAV起點的識別、結合及切口(nicking)；DNA解螺旋酶活性；及AAV(或其他異源)啟動子之轉錄調節。Cap表現產物(衣殼)提供必需之封裝功能。AAV輔助功能用於補充AAV載體基因組中缺失的反式AAV功能。
舉例而言，「AAV輔助構築體」一般係指包括提供自AAV載體刪除之AAV功能的核苷酸序列之核酸序列，該AAV載體將用於產生轉導AVV載體以用於藉助於基因療法向個體遞送所關注的核酸序列。AAV輔助構築體通常用於提供AAV rep及/或cap基因之短暫表現以補充AAV載體複製及衣殼化必需之缺失AAV功能。輔助構築體一般缺乏AAV ITR且可皆不複製或封裝自身。AAV輔助構築體可呈質體、噬菌體、轉座子、黏質體、病毒或病毒粒子之形式。已經描述大量AAV輔助構築體，諸如編碼Rep及Cap表現產物之質體pAAV/Ad及pIM29+45 (參見例如Samulski等人(1989) J. Virol. 63:3822-3828；及McCarty等人(1991) J. Virol. 65:2936-2945)。已經描述編碼Rep及/或Cap表現產物之大量其他載體(參見例如美國專利第5,139,941號及第6,376,237號)。
術語「輔助功能」係指AAV複製所依賴之非AAV衍生之病毒及/或細胞功能。術語包括在AAV複製中所需要的蛋白質及RNA，包括涉及AAV基因轉錄之活化、階段特異性AAV mRNA剪接、AAV DNA複製、Cap表現產物之合成及AAV衣殼封裝的部分。基於病毒之輔助功能可衍生自已知輔助病毒(諸如腺病毒、疱疹病毒(除1型單純疱疹病毒以外)及痘瘡病毒)中之任一者。
「輔助功能載體」一般係指包括提供輔助功能之聚核苷酸序列的核酸分子。此等序列可在輔助功能載體上，且經轉染至適合宿主細胞中。輔助功能載體能夠支援在宿主細胞中之rAAV病毒粒子產生。輔助功能載體可呈質體、噬菌體、轉座子或黏質體之形式。另外，針對輔助功能，不需要腺病毒基因之完全補充。舉例而言，已經報導不能進行DNA複製及後期基因合成之腺病毒突變體准許用於AAV複製(Ito等人, (1970) J. Gen. Virol. 9:243；Ishibashi等人, (1971) Virology 45:317)。類似地，已經展示E2B及E3區域內之突變體支援AAV複製，從而指示E2B及E3區域很可能不涉及提供輔助功能(Carter等人, (1983) Virology 126:505)。在E1區域中為缺陷性的或具有經刪除E4區域之腺病毒不能支援AAV複製。因此，E1A及E4區域直接地或間接地呈現為AAV複製所必需(Laughlin等人, (1982) J. Virol. 41:868；Janik等人, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925；Carter等人, (1983) Virology 126:505)。其他經表徵腺病毒突變體包括：E1B (Laughlin等人(1982)，見上文；Janik等人, (1981)，見上文；Ostrove等人, (1980) Virology 104:502)；E2A (Handa等人, (1975) J. Gen. Virol. 29:239；Strauss等人, (1976) J. Virol. 17:140；Myers等人, (1980) J. Virol. 35:665；Jay等人, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927；Myers等人, (1981) J. Biol. Chem. 256:567)；E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions，在I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen ed., 1990)中)；E3 (Carter等人, (1983)，見上文)；及E4 (Carter等人, (1983)，見上文；Carter (1995))。由在E1B寫碼區域中具有突變之腺病毒提供的輔助功能之研究已產生衝突結果，但E1B55k可為AAV病毒粒子產生所需要的，而E1B19k則不係所需要的(Samulski等人, (1988) J. Virol. 62:206-210)。另外，國際公開案WO 97/17458及Matshushita等人, (1998) Gene Therapy 5:938-945描述了編碼各種腺病毒基因之輔助功能載體。例示性輔助功能載體包含腺病毒VA RNA寫碼區域、腺病毒E4 ORF6寫碼區域、腺病毒E2A 72 kD寫碼區域、腺病毒E1A寫碼區域及不含完整E1B55k寫碼區域之腺病毒E1B區域。此等輔助功能載體描述於例如國際公開案第WO 01/83797號中。
如本文中所使用，術語「血清型」為用以指具有衣殼之AAV在血清學上不同於其他AAV血清型的區別。血清區別性係基於與另一AAV相比抗體與一種AAV之間缺乏交叉反應性來確定的。交叉反應性差異通常歸因於衣殼蛋白序列/抗原決定子之差異(例如歸因於AAV血清型之VP1、VP2及/或VP3序列差異)。
在傳統定義下，血清型意謂已針對對所有現有及經表徵之血清型具有特異性之血清來測試所關注病毒的中和活性，且尚未發現中和所關注之病毒的抗體。由於發現更多天然存在之病毒分離株及/或產生衣殼突變體，可存在或可不存在與當前現有血清型中之任一者的血清學差異。因此，在新病毒(例如，AAV)不具有血清學差異之情況下，此新病毒(例如，AAV)將為對應血清型之亞群或變異體。在許多情況下，仍必須對具有衣殼序列修飾之突變病毒進行中和活性之血清學測試以根據血清型之傳統定義測定其是否具有另一血清型。因此，為方便起見且為避免重複，術語「血清型」廣泛地指代血清學上不同的病毒(例如，AAV)以及可能在給定血清型之亞群或變異體內的在血清學上並非不同的病毒(例如，AAV)。
rAAV載體包括任一病毒株或血清型。舉例而言，且非限制性地，rAAV載體基因組或顆粒(衣殼，諸如VP1、VP2及/或VP3)可基於任一AAV血清型，例如諸如AAV-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-rh74、-rh10或AAV-2i8。此等載體可基於相同病毒株或血清型(或亞群或變異體)，或彼此不同。舉例而言，且非限制性地，基於一種血清型基因組之rAAV質體或載體基因組或顆粒(衣殼)可與封裝載體的衣殼蛋白中之一或多者一致。另外，舉例而言，rAAV質體或載體基因組可基於不同於封裝載體基因組之衣殼蛋白中之一或多者的AAV血清型基因組，在此情況下三種衣殼蛋白中之至少一者可為不同AAV血清型，例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10、AAV-2i8、LK03 (SEQ ID NO:91)、SPK (SEQ ID NO:92)或其變異體。更具體言之，rAAV2載體基因組可包含除來自不同血清型之衣殼外的AAV2 ITR，諸如例如AAV1、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10、AAV-2i8、LK03 (SEQ ID NO:91)、SPK (SEQ ID NO:92)或其變異體。因此，rAAV載體包括與特定血清型以及亦稱為假型之混合血清型的基因/蛋白質序列特性一致之基因/蛋白質序列。
在某些實施例中，rAAV載體包括與一或多個AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10、AAV-2i8、LK03 (SEQ ID NO:91)、SPK (SEQ ID NO:92)衣殼蛋白(VP1、VP2及/或VP3序列)至少70%或更多(例如，75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等)一致的衣殼序列或由該衣殼序列組成。在某些實施例中，rAAV載體包括與一或多個AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74或-rh10 ITR至少70%或更多(例如，75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等)一致之序列或由該序列組成。
在某些實施例中，rAAV載體包括其AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74及AAV-2i8變異體(例如，ITR及衣殼變異體，諸如胺基酸插入、添加、取代及刪除)，例如，如WO 2013/158879 (國際申請案PCT/US2013/037170)、WO 2015/013313 (國際申請案PCT/US2014/047670)及US 2013/0059732 (美國申請案第13/594,773號，揭示LK01、LK02、LK03 (SEQ ID NO:91)等)中所闡述。
rAAV (諸如AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、-rh74、-rh10、AAV-2i8、LK03 (SEQ ID NO:91)、SPK (SEQ ID NO:92)及變異體、雜合體及嵌合序列)可使用熟習此項技術者已知之重組型技術構築成包括側接有一或多個功能性AAV ITR序列的一或多個異源聚核苷酸序列(轉基因)。視急救、複製及將重組型載體封裝至rAAV載體顆粒中所需要，此等AAV載體通常保留至少一種功能性側接ITR序列。因此，rAAV載體基因組將包括對於複製及封裝而言順式需要的序列(例如，功能性ITR序列)。
如本文中所使用，片語「真實(bona fide) AAV載體」或「真實rAAV載體」係指包含能夠感染目標細胞之異源核酸的AAV載體。片語排除空AAV載體(無異源核酸)及不含完全插入物(例如，異源核酸片段)之AAV載體或含有宿主細胞核酸的彼等AAV載體。
術語「核酸」及「聚核苷酸」在本文中可互換地使用以指所有形式之核酸、寡核苷酸，包括去氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)。
核酸包括基因組DNA、cDNA及反義DNA、及剪接或未剪接mRNA、rRNA tRNA及抑制性DNA或RNA (RNAi，例如小或短髮夾(sh)RNA、微RNA (miRNA)、小或短干擾(si)RNA、反式剪接RNA或反義RNA)。
核酸包括天然存在、合成及刻意修飾或改變的聚核苷酸。核酸可為單螺旋體、雙螺旋體或三螺旋體，線性或環狀，且可具有任何長度。在論述核酸時，特定聚核苷酸之序列或結構可在本文中根據在5'至3'方向上提供序列之慣例描述。
「異源」核酸序列係指出於將聚核苷酸載體介導轉移/遞送至細胞中之目的插入至AAV質體或載體中的聚核苷酸。異源核酸序列不同於AAV核酸，亦即相對於AAV核酸而為非天然的。一旦轉移/遞送至細胞中，則可表現(例如，若適宜，轉錄及轉譯)含於載體內之異源核酸序列。可替代地，不需要表現含於載體內之轉移/遞送於細胞中的異源聚核苷酸。儘管參考核酸序列及聚核苷酸時本文中並未始終使用術語「異源」，但儘管有省略，即使在修飾語「異源」不存在的情況下，提及核酸序列或聚核苷酸亦意欲包括異源核酸序列及聚核苷酸。
「轉基因」在本文中用於方便地指代意欲或已引入至細胞或生物體中之核酸。轉基因包括任何核酸，諸如編碼治療蛋白或聚核苷酸序列之異源核酸。術語轉基因及異源核酸/聚核苷酸序列在本文中可互換地使用。
在具有轉基因之細胞中，轉基因已藉助於質體或AAV載體引入/轉移，「轉導」或「轉染」細胞。術語「轉導」及「轉染」係指將諸如核酸之分子引入至生物體的宿主細胞(例如，HEK293)或細胞或器官中。轉基因可或可不整合至受體細胞之基因組核酸中。
「核酸」、「聚核苷酸」、「異源核酸」、「轉基因」及「CpG減少之核酸序列」包括全長序列以及功能性子序列，只要子序列保留全長序列的一些功能度即可。核酸、聚核苷酸、異源核酸、轉基因及CpG減少之核酸序列。
由諸如異源核酸序列之「核酸序列」編碼的「多肽」、「蛋白質」及「肽」包括如同天然存在蛋白質之全長序列以及功能性子序列、修飾形式或序列變異體，只要子序列、修飾形式或變異體保留全長蛋白質之一些功能度即可。由核酸序列編碼之此等多肽、蛋白質及肽可能但不必與內源蛋白一致，該內源蛋白為缺陷性的或其表現不足或在經治療哺乳動物中缺乏。
舉例而言，「宿主細胞」指示可用作或已經用作AAV載體質體、AAV輔助構築體、輔助功能載體或其他轉移DNA之受體的微生物、酵母細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞。術語包括已轉染之原始細胞之子代。因此，「宿主細胞」一般係指已經外源性DNA序列轉染之細胞。應理解，單一親本細胞之子代可歸因於天然、偶發或故意突變而不一定與原始親本細胞具有完全相同之形態或基因組或總DNA補體。例示性宿主細胞包括人類胚胎腎(HEK)細胞，諸如HEK293。
「經轉導之細胞」為已引入轉基因之細胞。因此，「經轉導」細胞意謂在將外源性分子(例如核酸(例如，轉基因))併入至細胞中之後細胞中的基因變化。因此，「經轉導」細胞為已引入外源核酸之細胞或其子代。該等細胞可經繁殖(經培養)，且所引入蛋白質可經表現或核酸可經轉錄，或諸如rAAV之載體可由細胞產生。針對基因療法使用及方法，經轉導細胞可包含器官或組織且又可在個體內。
如本文中所使用，提及細胞之術語「穩定」或「穩定整合」意謂諸如可選標記物或異源核酸序列之核酸序列或質體或載體已插入至染色體中(例如，藉由同源重組、非同源末端連接、轉染等)或染色體外地維持在受體細胞或宿主生物體中，且已保留在染色體中或染色體外地維持一段時間。
「細胞株」係指能夠在適當培養條件下活體外連續或長期生長並分裂的細胞群。細胞株可能但不必要為衍生自單一祖細胞之純系群。在細胞株中，自發或經誘導之變化可在此等純系群之儲存或轉移期間以及在組織培養之長期傳代期間出現在核型中。因此，衍生自細胞株之子代細胞可不與上代細胞或培養物精確地一致。適用於本發明純化方法之例示性細胞株為HEK293。
「表現控制元件」係指影響可操作連接之核酸之表現的核酸序列。控制元件包括如本文中所闡述之表現控制元件，諸如啟動子及強化子。rAAV載體可包括一或多個「表現控制元件」。通常，包括此等元件以促進恰當的異源聚核苷酸轉錄及(若適宜)轉譯(例如，啟動子、強化子、內含子之剪接信號、准許mRNA之框內轉譯之基因的恰當閱讀框架之維持及終止密碼子等中之一或多者)。此等元件通常順式起作用，稱為「順式作用」元件，但亦可反式起作用。
表現控制可在轉錄、轉譯、剪接、訊息穩定性等層面實現。通常，調節轉錄之表現控制元件並置於經轉錄核酸之5'端(亦即，「上游」)附近。表現控制元件亦可位於經轉錄序列之3'端(亦即「下游」)處或轉錄物內(例如內含子中)。表現控制元件(例如，CpG減少之TTR、ApoE/hAAT、FGG、白蛋白及SAA1啟動子以及其融合物/雜合體)可定位成鄰近於經轉錄序列或定位於經轉錄序列之一定距離(例如，距聚核苷酸1-10、10-25、25-50、50-100、100至500個或更多個核苷酸)處，甚至定位於距5'或3'端相當的距離處。然而，由於rAAV載體之長度限制，表現控制元件將通常在距經轉錄核酸的1至1000個核苷酸內。
在功能上，可操作連接之核酸的表現可藉由元件(例如，啟動子、強化子等)至少部分地控制以使得元件調節核酸之轉錄及(視需要)轉錄物的轉譯。表現控制元件之特定實例為啟動子，其通常位於經轉錄序列之5'處。啟動子與在不存在啟動子時所表現之量(若存在)相比通常增加來自可操作連接之核酸的表現。
啟動子之實例包括TTR及ApoE/hAAT啟動子，包括CpG減少之版本及本文中所揭示之雜合形式之TTR啟動子。啟動子之其他實例包括ApoE/hAAT、FGG、白蛋白及SAA1啟動子，包括CpG減少之版本及其雜合形式。
如本文中所使用之「強化子」可指代定位成鄰近於諸如異源核酸序列之核酸序列的序列。強化子元件通常位於啟動子元件之上游(5')而且起作用，且亦可位於序列之下游(3')或序列內。從而，強化子元件可位於上游或下游，例如，在如可選標記物及/或編碼治療蛋白或聚核苷酸序列的異源核酸之100個鹼基對、200個鹼基對或300個或更多個鹼基對內。強化子元件通常增加可操作連接之核酸之表現高於啟動子元件所提供之表現。
術語「可操作地連接」意謂核酸序列之表現所必需的調節序列相對於序列置放於適當的位置中以實現核酸序列之表現。此同一定義有時應用於表現載體(例如，rAAV載體)中之核酸序列及轉錄控制元件(例如，啟動子、強化子及終止元件)之配置。
在表現控制元件可操作地連接於核酸之實例中，該關係使得控制元件調節核酸之表現。更特定言之，舉例而言，可操作地連接之兩種DNA序列意謂兩種DNA以DNA序列中之至少一者能夠對另一序列發揮調節作用之此關係佈置(順式或反式)。
因此，載體之額外元件包括(但不限於)表現控制(例如，啟動子/強化子)元件、轉錄終止信號或終止密碼子、側接諸如AAV ITR序列的一或多個複本之序列(例如，異源序列)之5'或3'非轉譯區域(例如，聚腺苷酸化(polyA)序列)或內含子。
其他元件包括例如填充或填充片段(stuffer)聚核苷酸序列，例如以改善封裝且減少雜質核酸之存在。AAV載體通常接受大小範圍一般為約4 kb至約5.2 kb或略多之DNA的插入。因此，對於較短序列，包括填充片段或填充以便將長度調整至接近或為封裝至rAAV顆粒中之載體可接受的病毒基因組序列之正常大小。在某些實施例中，填充/填充片段核酸序列為核酸之未轉譯(非蛋白編碼)片段。對於小於4.7 kb之核酸序列，填充或填充片段聚核苷酸序列具有在與序列合併(例如，插入至載體中)時總長度介於約3.0-5.5 kb之間或約4.0-5.0 kb之間或約4.3-4.8 kb之間的長度。
在野生型異源核酸或轉基因太大而不能封裝於AAV載體顆粒內時，異源核酸可以經修飾、片段化或截短形式提供以用於封裝在AAV載體中及藉由AAV載體遞送，以使得最終提供功能蛋白或核酸產物，諸如治療蛋白或核酸產物。
在某些實施例中，編碼蛋白質(例如，治療蛋白)之異源核酸將以經修飾或截短形式提供，或異源核酸將以多個構築體提供，由分離及多個AAV載體遞送。
在某些實施例中，異源核酸提供為維持所編碼蛋白質(例如，治療蛋白)之功能的經截短變異體，包括去除功能所不必要的部分，以使得編碼異源聚核苷酸之大小減小以用於封裝在AAV載體中。
在某些實施例中，異源核酸將提供於經分解AAV載體中，該等經分解AAV載體各自提供編碼蛋白質(例如，治療蛋白)之不同部分之核酸，由此遞送在細胞中組裝且起作用的蛋白質(例如，治療蛋白)之多個部分。
在某些實施例中，異源核酸藉由雙AAV載體使用重疊、反式剪接或雜合反式剪接雙載體技術提供。在某些實施例中，使用合併於細胞中之兩種重疊AAV載體以產生完全表現卡匣，自其表現全長蛋白質(例如，治療蛋白)。
術語「一致性」、「同源性」及其語法變化形式意謂兩個或更多個所提及之實體在其為「比對」序列時相同。因此，藉助於實例，在兩個多肽序列相同時，其至少在所提及之區域或部分內具有相同胺基酸序列。在兩個聚核苷酸序列相同時，其至少在所提及之區域或部分內具有相同聚核苷酸序列。一致性可在序列之經定義區(區域或結構域)內。一致性之「區」或「區域」係指相同的兩個或更多個所提及之實體的一部分。因此，在兩個蛋白質或核酸序列在一或多個序列區或區域內相同時，其在該區域內共用一致性。「比對」序列係指多個聚核苷酸或蛋白質(胺基酸)序列，其與參考序列相比通常含有對缺失或額外鹼基或胺基酸(空隙)的校正。
一致性可在序列之整個長度或一部分內延伸。在某些實施例中，共用一致性百分比之序列之長度為2、3、4、5個或更多個相鄰核酸或胺基酸，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個等相鄰核酸或胺基酸。在某些實施例中，共用一致性之序列之長度為21個或更多個相鄰核酸或胺基酸，例如，21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40個等相鄰核酸或胺基酸。在某些實施例中，共用一致性之序列之長度為41個或更多個相鄰核酸或胺基酸，例如，42、43、44、45、46、47、48、49、50個等相鄰核酸或胺基酸。在某些實施例中，共用一致性之序列之長度為50個或更多個相鄰核酸或胺基酸，例如，50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-500、500-1,000個等相鄰核酸或胺基酸。
如本文中所闡述，諸如包括其雜合形式之CpG減少之啟動子的核酸變異體將不同於野生型但可呈現與野生型啟動子之序列一致性。包括其雜合形式之CpG減少之啟動子中，在核苷酸序列層面下，CpG減少之啟動子將通常與野生型啟動子為至少約70%一致、更通常至少約75%一致、甚至更通常約80%-90%一致。舉例而言，CpG減少之啟動子可與野生型啟動子具有70%-99%一致性。因此，CpG減少之啟動子可與野生型啟動子具有70-75%、75-80%、80-85%、85-90%、90-95%、95-99%、75%-99%一致性。
在胺基酸序列層面下，諸如變異體FVIII或hFVIII-BDD蛋白質之變異體將與參考序列為至少約70%一致、更通常約75%一致或約80%一致、甚至更通常約85%一致或約90%或更多一致。在某些實施例中，諸如變異體FVIII或hFVIII-BDD蛋白質之變異體與例如，含或不含B域之野生型FVIII蛋白質的參考序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致性。
術語「同源」或「同源性」意謂兩個或更多個所提及之實體在給定區域或部分內共用至少部分一致性。具有同源性或一致性之「區、區域或結構域」意謂兩個或更多個所提及之實體的一部分共用同源性或為相同的。因此，當兩個序列在一或多個序列區域內一致時，其在此等區域中共用一致性。「實質同源性」意謂分子在結構上或在功能上保守，以使得其具有或經預測具有參考分子或與其共用同源性之參考分子之相關/對應區域或部分之結構或功能(例如，生物功能或活性)中之一或多者的至少部分結構或功能。
兩個序列之間的一致性(同源性)之程度或「一致性百分比」可使用電腦程式及/或數學演算法確定。出於本發明之目的，核酸序列之比較使用可購自Madison, Wisconsin的the Genetics Computer Group之9.1版GCG Wisconsin Package執行。為方便起見，藉由彼程式指定之預設參數(空隙形成罰分= 12，空隙擴展罰分= 4)意欲在本文中用於比較序列一致性。替代地，使用具有預設參數之空隙比對的由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information) (見於全球資訊網ncbi.nlm.nih.gov/blast/上；Altschul等人, 1990, J Mol Biol 215:403-410)提供的Blastn 2.0程式可用於測定核酸序列與胺基酸序列之間的一致性及類似性程度。對於多肽序列比較，BLASTP演算法通常與計分矩陣組合使用，諸如PAM100、PAM 250、BLOSUM 62或BLOSUM 50。FASTA ((例如，FASTA2及FASTA3)及SSEARCH序列比較程式亦用於定量一致性程度(Pearson等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)；Pearson,Methods Mol Biol. 132:185 (2000)；及Smith等人,J. Mol. Biol. 147:195 (1981))。亦已開發用於使用基於Delaunay之拓樸繪圖來定量蛋白質結構類似性的程式(Bostick等人,Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (2003))。
在某些實施例中，「治療蛋白」為可緩解或減少由細胞或個體中之蛋白質的不足量、不存在或缺乏引起的症狀之肽或蛋白質。由轉基因編碼之「治療」蛋白質可給個體帶來益處，例如，以校正遺傳缺陷、以校正基因(表現或功能損失)缺乏等。
舉例而言，且非限制性地，根據本發明適用於編碼基因產物(例如，治療蛋白)之異源核酸包括可用於治療包括(但不限於)以下的疾病或病症之彼等異源核酸：「止血」或血液凝固(出血)病症，諸如A型血友病、具有抑制性抗體的A型血友病患者、B型血友病、具有抑制性抗體的B型血友病，以下任何血液凝結因子之缺乏：VII、VIII、IX、X、XI、V、XII、II、馮威里氏因子(von Willebrand factor)，合併型FV/FVIII缺乏、地中海貧血、維生素K環氧化物還原酶C1缺乏、γ羧化酶缺乏；貧血；與外傷、損傷相關聯的出血、血栓、血小板減少症、中風、凝血病、散播性血管內凝血(DIC)；與肝素、低分子量肝素、五碳醣、殺鼠靈(warfarin)、小分子抗血栓藥(亦即，FXa抑制劑)相關聯之過度抗凝血；及血小板病症，諸如伯納德蘇利耶症候群(Bernard Soulier syndrome)、血小板無力症(Glanzmann thrombasthenia)及貯積池缺乏(storage pool deficiency)。在某些實施例中，個體患有血液凝固病症。在某些實施例中，個體患有A型血友病、具有抑制性抗體之A型血友病、B型血友病、具有抑制性抗體之B型血友病，以下任何凝血因子的缺乏：VII、VIII、IX、X、XI、V、XII、II、馮威里氏因子，或合併型FV/FVIII缺乏、地中海貧血、維生素K環氧化物還原酶C1缺乏或γ羧化酶缺乏。
在某些實施例中，個體患有包括例如(但不限於)以下之疾病或病症：肺病(例如，囊腫性纖維化)、出血病症(例如，含或不含抑制劑之A型血友病或B型血友病)、地中海貧血、血液病症(例如，貧血)、神經退化性病症(例如，阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、肌肉萎縮性側索硬化(ALS))、神經病症(例如，癲癇症)、溶酶體貯積病(例如，天冬胺醯葡萄糖胺尿症、貝敦氏病(Batten disease)、2型遲發性嬰兒神經性類蠟脂褐質沈積症(CLN2)、胱胺酸症、法布立病(Fabry disease)、I、II及III型高歇氏病(Gaucher disease)、II型肝糖貯積病(龐培氏病(Pompe disease))、III型肝糖貯積病(GSDIII；柯氏病(Cori disease))；單唾液酸神經節苷脂2 (GM2)-I型神經節苷脂貯積病(泰-薩克斯病(Tay Sachs disease))、GM2-II型神經節苷脂貯積病(山多夫氏病(Sandhoff disease))、I型黏脂貯積症(I及II型唾液腺病)、II型黏脂貯積症(I-細胞疾病)、III型黏脂貯積症(假賀勒病(pseudo-Hurler disease))及IV型黏脂貯積症、黏多糖貯積病(賀勒病及變化形式、亨特(Hunter)、A、B、C、D型聖菲利波(Sanfilippo)、A及B型莫奎(Morquio)、馬洛特-拉米及斯利疾病(Maroteaux-Lamy and Sly disease))、A/B、C1及C2型尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease)、及I及II型辛德勒病(Schindler disease))、發炎性病症(例如，遺傳性血管性水腫(HAE))、銅或鐵積聚病症(例如，威爾森氏(Wilson's)或門克斯(Menkes)病)、溶酶體酸脂肪酶缺乏、癌症、1型或2型糖尿病、腺苷脫胺酶缺乏、代謝疾病或病症(例如，肝糖貯積病、甲基丙二酸酸血症、鳥胺酸轉胺甲醯酶(transcarbamylase)缺乏、低磷酸酶症(hypophosphatsia)、極長鏈醯基-CoA去氫酶缺乏(VLCAD)、半乳糖血症)、自體免疫疾病(例如，多發性硬化症、I型糖尿病、脂瀉病、視神經脊髓炎(NMO)、免疫血小板減少症(ITP)、特發性血小板減少性紫癜)、艾迪森氏病(Addison's disease)、重症肌無力)、實體器官(例如，大腦、肝臟、腎臟、心臟)疾病或感染性病毒(例如，B型及C型肝炎、人類免疫缺乏病毒(HIV)等)、細菌或真菌疾病。
在某些實施例中，個體患有影響或發源於中樞神經系統(CNS)之疾病。在某些實施例中，疾病為神經退化性疾病。在某些實施例中，CNS或神經退化性疾病為阿茲海默氏症、亨廷頓氏病、ALS、遺傳性痙攣性半身麻痹、原發性側索硬化、脊髓性肌萎縮、肯尼迪氏病(Kennedy's disease)、多麩醯胺酸重複疾病或帕金森氏病。在某些實施例中，CNS或神經退化性疾病為多麩醯胺酸重複疾病。在某些實施例中，多麩醯胺酸重複疾病為脊髓小腦失調(SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7或SCA17)。
脂蛋白元E (ApoE)為涉及脂質轉運及腦損傷修復之主要膽固醇載劑。其表明，人類ApoE同功異型物有差異地影響活體內類澱粉-β (Aβ)之清除或合成。ApoE之epsilon4 (ε4)對偶基因與阿茲海默氏症(AD)風險增加相關聯，且ApoE ε2對偶基因之存在似乎減小AD風險且為保護性ApoE同功異型物。如本文中所使用，術語「保護性ApoE同功異型物」係指減少阿茲海默氏症之一或多個症狀或適應症(例如，身體、生理、生物化學、組織學、行為)之ApoE同功異型物。保護性ApoE同功異型物亦指可將阿茲海默氏症風險降低至少5% (諸如10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多)之ApoE同功異型物。
在某些實施例中，本發明提供藉助於向個體之非CNS細胞、器官或組織(例如，不向腦脊髓液(CSF)或大腦)遞送或投與來將保護性ApoE同功異型物(例如，ApoE ε2)遞送至個體(例如，哺乳動物)之CNS的方法。
在某些實施例中，包含AAV衣殼蛋白之rAAV顆粒及包含編碼保護性ApoE同功異型物(例如，ApoE ε2)之核酸的載體以有效轉導個體(例如，哺乳動物)內之非CNS細胞(例如，肝臟細胞)的方式插入於一對AAV反向末端重複序列(ITR)之間，以使得非CNS細胞(例如，肝臟細胞)將保護性ApoE同功異型物分泌至個體之全身循環(血管結構或血管)中。循環中之保護性ApoE同功異型物穿過血腦障壁且進入CNS (例如，腦脊髓液(CSF)或大腦，諸如腦實質)。
在某些實施例中，本發明提供編碼在肝臟或肝臟細胞中表現之保護性ApoE同功異型物(例如，ApoE ε2)的載體、表現卡匣或核酸。
在某些實施例中，異源核酸編碼選自由以下組成之群的蛋白質：胰島素、升糖素、生長激素(GH)、副甲狀腺激素(PTH)、生長激素釋放因子(GRF)、濾泡刺激素(FSH)、促黃體素(LH)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、血管內皮生長因子(VEGF)、血管生成素、血管生長抑素、粒細胞群落刺激因子(GCSF)、紅血球生成素(EPO)、結締組織生長因子(CTGF)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)、表皮生長因子(EGF)、轉變生長因子α (TGFα)、血小板衍生之生長因子(PDGF)、胰島素生長因子I及II (IGF-I及IGF-II)、TGFβ、活化素、抑制素、骨骼形態形成蛋白質(BMP)、神經生長因子(NGF)、大腦衍生神經滋養因子(BDNF)、神經營養素NT-3及NT4/5、睫狀神經營養因子(CNTF)、膠細胞株衍生之神經營養因子(GDNF)、神經營養因子、集聚素、軸突引導因子-1及軸突引導因子-2、肝細胞生長因子(HGF)、肝配蛋白(ephrin)、頭蛋白(noggin)、音蝟因子(sonic hedgehog)及酪胺酸羥化酶。
在某些實施例中，異源核酸編碼選自由以下組成之群的蛋白質：血小板生成素(TPO)、介白素(IL1至IL-36)、單核球化學引誘劑蛋白質、白血病抑制因子、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子、Fas配位體、腫瘤壞死因子α及β、干擾素α、β及γ、幹細胞因子、flk-2/flt3配位體、IgG、IgM、IgA、IgD及IgE、嵌合免疫球蛋白、人類化抗體、單鏈抗體、T細胞受體、嵌合T細胞受體、單鏈T細胞受體、I類及II類MHC分子。
在某些實施例中，異源核酸編碼CFTR (囊腫性纖維化跨膜調節因子蛋白)、血液凝結(凝固)因子、(因子XIII、因子IX、因子VIII、因子X、因子VII、因子VIIa、蛋白C等)、功能獲得型血液凝結因子、抗體、視網膜色素上皮特異性65 kDa蛋白質(RPE65)、紅血球生成素、LDL受體、脂蛋白脂肪酶、鳥胺酸轉胺甲醯酶、β-血球蛋白、α-血球蛋白、血影蛋白、α-抗胰蛋白酶、腺苷脫胺酶(ADA)、金屬轉運體(ATP7A或ATP7)、硫酸醯胺酶、涉及溶酶體貯積病之酶(ARSA)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶、β-25葡萄糖腦苷酶、神經磷脂酶、溶酶體己醣胺酶、分支鏈酮酸去氫酶、激素、生長因子、類胰島素生長因子1或2、血小板衍生之生長因子、表皮生長因子、神經生長因子、神經營養因子-3及-4、大腦衍生之神經滋養因子、神經膠質衍生之生長因子、轉變生長因子α及β、細胞介素、α-干擾素、β-干擾素、干擾素-γ、介白素-2、介白素-4、介白素12、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子、淋巴毒素、自殺基因產物、單純疱疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脫胺酶、白喉毒素、細胞色素P450、去氧胞苷激酶、腫瘤壞死因子、藥物抗性蛋白質、腫瘤抑制劑蛋白(例如，p53、Rb、Wt-1、NF1、逢希伯-林道(Von Hippel-Lindau，VHL)、結腸腺瘤息肉病(APC))、具有免疫調節屬性之肽、耐受性或免疫原性肽或蛋白質Tregitope或hCDR1、胰島素、葡糖激酶、鳥苷酸環化酶2D (LCA-GUCY2D)、Rab護航蛋白質1 (無脈絡膜)、LCA 5 (LCA-lebercilin)、鳥胺酸酮酸胺基轉移酶(回旋形萎縮)、視網膜劈裂素1 (X性聯視網膜劈裂症)、USH1C (阿瑟氏症候群(Usher's Syndrome) 1C)、X性聯色素性視網膜炎GTP酶(XLRP)、MERTK (AR形式之RP：色素性視網膜炎)、DFNB1 (接合素26耳聾)、ACHM 2、3及4 (色盲)、PKD-1或PKD-2 (多囊性腎病)、TPP1、CLN2、硫酸酯酶、N-乙醯葡萄胺糖-1-磷酸酯轉移酶、組織蛋白酶A、GM2-AP、尼曼-匹克C1 (NPC1)、VPC2、鞘脂活化子蛋白質、用於基因組編輯之一或多個鋅指核酸酶及用作基因組編輯之修復模板的一或多個供體序列。
在某些實施例中，由異源核酸編碼之蛋白質包含基因編輯核酸酶。在某些實施例中，基因編輯核酸酶包含鋅指核酸酶(ZFN)或轉錄活化子類效應物核酸酶(TALEN)。在某些實施例中，基因編輯核酸酶包含功能性II型CRISPR-Cas9。
可與本發明一起使用且可視情況在肝臟或肝臟細胞(例如，肝細胞)中表現並提供益處之編碼基因產物(例如，治療蛋白)的其他異源核酸包括例如(但不限於)：用於治療龐培氏病之GAA (酸性α-葡糖苷酶)；用於治療威爾森氏病之ATP7B (銅轉運ATPase2)；用於治療法布立病的α-半乳糖苷酶(GLA)；用於治療1型瓜胺酸血症之ASS1 (精胺酸琥珀酸鹽合成酶)；用於治療1型高歇氏病之β-葡萄糖腦苷酶；用於治療泰-薩克斯病的β-己醣胺酶A；用於治療遺傳性血管性水腫(HAE)之SERPING1 (C1蛋白酶抑制劑；C1酯酶抑制劑(C1EI))；用於治療I型肝糖貯積病(GSDI)之葡萄糖-6-磷酸酶；用於治療III型肝糖貯積病(GSD III；柯氏病)的肝糖去分支酶(GDE)；用於治療尼曼匹克病之尼曼-匹克C1蛋白質(NPC細胞內膽固醇轉運體1；NPC1)；用於治療貧血的紅血球生成素(EPO)；用於治療各種免疫病症、病毒感染及癌症之干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ；用於治療各種發炎性疾病或免疫缺陷的介白素(IL)，包括IL-1至IL-36中之任一者及對應受體；用於治療免疫病症的趨化因子，包括趨化因子(C-X-C基序)配位體5 (CXCL5)；用於治療諸如克羅恩氏病(Crohn's disease)之免疫病症的顆粒球群落刺激因子(G-CSF)；用於治療各種人類發炎性疾病之顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)；用於治療各種人類發炎性疾病之巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)；用於治療上皮組織損傷的角質細胞生長因子(KGF)；用於治療反覆流產、HIV相關之併發症及胰島素抗性的趨化因子，諸如單核球化學引誘劑蛋白質-1 (MCP-1)；用於治療各種免疫病症之腫瘤壞死因子(TNF)及受體；用於治療肺氣腫或慢性阻塞性肺病(COPD)之α1-抗胰蛋白酶；用於治療黏多糖病I (MPS I)的α-L-艾杜糖醛酸酶(iduronidase)；用於治療OTC缺乏之鳥胺酸轉胺甲醯酶(OTC)；用於治療苯酮尿症(PKU)之苯丙胺酸羥化酶(PAH)或苯丙胺酸氨解離酶(PAL)；用於治療脂蛋白脂肪酶缺乏的脂蛋白脂肪酶；用於治療脂蛋白元(Apo) A-I缺乏之脂蛋白元；用於治療家族性高膽固醇血症(FH)之低密度脂蛋白受體(LDL-R)；用於治療低白蛋白血症的白蛋白；卵磷脂膽固醇轉醯酶(LCAT)；胺甲醯基合成酶I；精胺基琥珀酸鹽合成酶；精胺基琥珀酸鹽解離酶；精胺酸酶；反丁烯二醯基乙醯乙酸鹽水解酶；膽色素原脫胺酶；用於治療高膀胺酸尿症之胱硫醚β-合成酶；分支鏈酮酸去羧酶；異戊醯基-CoA去氫酶；丙醯基CoA羧化酶；甲基丙二醯基-CoA變位酶；戊二醯基CoA去氫酶；胰島素；丙酮酸鹽羧化酶；肝磷酸化酶；磷酸化酶激酶；甘胺酸去羧酶；H-蛋白質；T-蛋白質；囊腫性纖維化跨膜調節因子(CFTR)；用於治療斯特格氏病(Stargardt disease)的ATP-結合卡匣、亞家族A (ABC1)、成員4 (ABCA4)；及肌縮蛋白。
在某些實施例中，個體患有自體免疫疾病或病症(例如，多發性硬化症、抗MAG周邊神經病變、1型糖尿病、格雷夫氏病(Graves' disease)、類風濕性關節炎、蛋白聚糖誘發之關節炎(PGIA)或重症肌無力)；過敏或過敏性疾病。
成熟髓鞘寡樹突神經膠質細胞糖蛋白(MOG)與雙脂質層相關聯。MOG之特徵在於IgV類細胞外域、單旁路跨膜蛋白、膜相關聯之結構域及細胞質尾區。細胞外IgV類結構域在本文中指示為微型MOG (mMOG)。MOG主要在寡樹突細胞之膜中發現且對髓鞘之最終組成貢獻很小。對MOG之自身免疫反應與多發性硬化症之出現及病源學有關聯。
在某些實施例中，治療蛋白為包含非所需抗原及用於細胞分泌的前導序列之融合蛋白質。
在某些實施例中，治療蛋白為包含MOG細胞外域或其片段及用於細胞分泌之前導序列的融合蛋白質。
在某些實施例中，表現卡匣包含可操作地連接至編碼融合蛋白質之核酸的調節元件，該融合蛋白質包含非所需抗原及用於細胞分泌之前導序列。
在某些實施例中，非所需抗原包含自身抗原、自體抗原或與自身抗原或自體抗原具有結構類似性或序列一致性之蛋白質或肽。在某些實施例中，與自身抗原或自體抗原具有結構類似性或序列一致性之蛋白質或肽為微生物蛋白質或肽。在某些實施例中，非所需抗原包含過敏原。
在某些實施例中，過敏原包含植物、昆蟲或動物過敏原。在某些實施例中，非所需抗原包含髓鞘寡樹突神經膠質細胞糖蛋白(MOG)、髓鞘鹼性蛋白(MBP)、蛋白脂質蛋白(PLP)或其子序列。
在某些實施例中，MOG缺乏其跨膜結構域之全部或一部分。在某些實施例中，MOG包含成熟MOG之胺基酸1-117或由其組成。在某些實施例中，MOG子序列為其細胞外域子序列或其跨膜結構域子序列。在某些實施例中，MOG包含成熟MOG之胺基酸35-55、118-132、181-195或186-200或由其組成。在某些實施例中，MOG包含成熟MOG之胺基酸1-20、11-30、21-40、31-50等或由其組成。
在某些實施例中，本發明提供遏制、減少或抑制哺乳動物內對非所需抗原的細胞介導或抗體介導之免疫反應之方法。在某一實施例中，方法包括提供如本文中所闡述之表現卡匣、顆粒或醫藥組合物或LNP組合物；及向哺乳動物投與一定量之表現卡匣、顆粒、醫藥組合物或LNP組合物，其中融合蛋白質在哺乳動物中表現足以遏制、減少或抑制對非所需抗原之細胞介導或抗體介導之免疫反應。
在某些實施例中，本發明提供在哺乳動物內誘發對非所需抗原的耐受性之方法。在某些實施例中，方法包括提供如本文中所闡述之表現卡匣、顆粒或醫藥組合物或LNP組合物；及向哺乳動物投與一定量之表現卡匣、顆粒、醫藥或LNP組合物，其中融合蛋白質在哺乳動物中表現足以誘發對非所需抗原之耐受性。
在某些實施例中，本發明提供治療需要融合蛋白質之個體(例如人類)之方法。在某些實施例中，方法包括提供如本文中所闡述之表現卡匣、顆粒或醫藥組合物或LNP組合物；及向個體(例如人類)投與一定量之表現卡匣、顆粒、醫藥或LNP組合物，其中融合蛋白質在個體(例如人類)內表現。
在某些實施例中，個體(例如人類)患有自體免疫疾病或病症。在某些實施例中，個體(例如人類)患有過敏或過敏性疾病或病症。
在某些實施例中，個體(例如人類)患有多發性硬化症、抗MAG周邊神經病變、1型糖尿病、格雷夫氏病、類風濕性關節炎、蛋白聚糖誘發之關節炎(PGIA)或重症肌無力。
如本文中所使用，「非所需抗原」為能夠誘發、提供、增強及/或刺激針對抗原自身或包括抗原之全部或一部分的蛋白質之免疫耐受性且/或遏制、抑制、減少及/或減輕針對抗原自身或包括抗原之全部或一部分的蛋白質之免疫反應的自身抗原或自體抗原。如本文中所使用之非所需抗原亦包括可誘發、提供、增強及/或刺激針對過敏原之免疫耐受性的過敏原或過敏原性抗原以及遏制、抑制、減少及/或減輕針對過敏原或包括過敏原之實體的免疫反應之過敏原及過敏原性抗原。
如本文中所闡述之非所需抗原亦包括同種抗原或移植抗原或微量組織相容抗原，其在其移植至個體中之後可導致細胞、組織或器官的排斥反應。個體通常將經移植細胞、組織或器官識別為外來細胞、組織或器官且出現針對細胞、組織或器官的免疫反應。因此，本發明方法係針對預防或減少細胞、組織或器官在移植至個體中之後的排斥反應。
儘管不希望受任何理論或特定機制束縛，但咸信，非所需抗原藉由與T調節細胞(Tregs)結合或使其活化來起作用，由此預防、遏制、抑制、減少、減輕或以其他方式下調免疫反應。與Tregs之此結合或其活化又可導致針對自身抗原或自體抗原之免疫耐受化。
如本文中所使用，「前導」序列為在連接至蛋白質時提供或促進自表現其之細胞分泌連接蛋白質的胺基酸序列。如本文中所使用之前導序列亦可稱為分泌序列。此等前導及分泌序列意欲提供或促進細胞分泌，但若其連接至具有可預防蛋白質分泌的信號序列之蛋白質，則可能不始終促進分泌。
在某些實施例中，非所需抗原包含自體免疫疾病蛋白質或其子序列。自體免疫疾病蛋白質包括貢獻於自體免疫疾病之起始及/或進展之任何抗原(諸如蛋白質、其子序列或肽)。因為來自另一生物體之蛋白質的序列或結構模擬自身抗原或自體抗原，所以此等自體免疫疾病蛋白質可衍生自其他生物體，諸如微生物。
在某些實施例中，自體免疫疾病蛋白質為髓鞘寡樹突神經膠質細胞糖蛋白(MOG，例如，用於多發性硬化症)、髓鞘鹼性蛋白(MBP，例如，用於多發性硬化症)、蛋白脂質蛋白質(PLP，例如，用於多發性硬化症)、髓鞘相關聯之糖蛋白(MAG，例如，用於抗MAG周邊神經病變)、胰島素(例如，用於1型糖尿病)、胰島特異性葡萄糖-6-磷酸酶催化次單位相關的蛋白質(IGRP，例如，用於1型糖尿病)、前胰島素原(例如，用於1型糖尿病)、麩胺酸去羧酶(GAD，例如，用於1型糖尿病)、酪胺酸磷酸酶類自體抗原(例如，用於1型糖尿病)、胰島素瘤抗原-2 (例如，用於1型糖尿病)、胰島細胞抗原(例如，用於1型糖尿病)；甲狀腺刺激激素(TSH)受體(例如，用於格雷夫氏病)、促甲狀腺激素受體(例如，用於格雷夫氏病)、硫酸軟骨素蛋白聚糖1 (例如，用於類風濕性關節炎)、CD4+ T細胞抗原決定基(例如，GRVRVNSAY)，(例如，用於蛋白聚糖誘發之關節炎(PGIA)或類風濕性關節炎)或乙醯膽鹼受體(例如，用於重症肌無力)。
在某些實施例中，自體免疫疾病蛋白質為哺乳動物髓鞘寡樹突神經膠質細胞糖蛋白(MOG)、髓鞘鹼性蛋白(MBP)、蛋白脂質蛋白質(PLP)或其子序列。在一些實施例中，自體免疫疾病蛋白質為人類蛋白質，諸如人類髓鞘鹼性蛋白(MBP)、人類蛋白脂質蛋白質(PLP)、人類髓鞘寡樹突神經膠質細胞糖蛋白(MOG)或其子序列。
根據本發明適用於編碼基因產物的其他異源核酸包括例如(但不限於)報導子或可偵測標記物，諸如螢光素酶、綠色螢光蛋白質(GFP)、黃色螢光蛋白質(YFP)、藍色螢光蛋白質、青色螢光蛋白質、增強型GFP、增強型YFP、光活化GFP、香菇珊瑚(Discosoma species)螢光蛋白質(dsRed)、mFruit、mCherry、TagRFP、eqFP611、可光切換螢光蛋白質(例如Dronpa及EosFP)、氯黴素乙醯基轉移酶、Halo標籤融合蛋白質、鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶及β-半乳糖苷酶。
在某些實施例中，異源核酸包含抑制性DNA或編碼抑制性RNA (RNAi)。抑制性RNA之實例包括例如(但不限於)小或短髮夾(sh)RNA、微RNA (miRNA)、小或短干擾(si)RNA、反式剪接RNA及反義RNA。
在某些實施例中，異源核酸編碼抑制性核酸。在某些實施例中，抑制性核酸選自由以下組成之群：siRNA、反義分子、miRNA、RNAi、核糖核酸酶及shRNA。在某些實施例中，抑制性核酸與基因、基因之轉錄物或與選自由以下組成之群的聚核苷酸重複疾病相關聯之基因之轉錄物結合：亨廷頓蛋白(huntingtin，HTT)基因、與齒狀核紅核蒼白球丘腦下部萎縮(atrophin 1，ATN1)相關聯的基因、脊髓延髓肌肉萎縮之X染色體上的雄激素受體、人類Ataxin-1、-2、-3及-7、Cav 2.1 P/Q壓敏鈣通道(CACNA1A)、TATA-結合蛋白、Ataxin 8相對鏈(ATXN8OS)、脊髓小腦失調(1、2、3、6、7、8、12、17型)中之絲胺酸/蘇胺酸蛋白質磷酸酶2A 55 kDa調節亞單位B β同功異型物、X脆折症候群中的FMR1 (X脆折智力遲鈍1)、X脆折相關聯之震顫/失調症候群中之FMR1 (X脆折智力遲鈍1)、XE脆折智力遲鈍中之FMR1 (X脆折智力遲鈍2)或AF4/FMR2家族成員2；肌強直性營養不良中之肌強直蛋白激酶(MT-PK)；弗里德希氏共濟失調(Friedreich's ataxia)中的共濟蛋白；肌肉萎縮性側索硬化中之超氧化歧化酶1 (SOD1)基因之突變；涉及帕金森氏病及/或阿茲海默氏症的發病機制之基因；脂蛋白元B (APOB)及9型前蛋白轉換酶枯草桿菌蛋白酶/kexin (PCSK9)，高膽固醇血症；HIV Tat，HIV感染中之轉錄基因的人類免疫缺乏病毒轉活化劑；HIV TAR，HIV感染中之人類免疫缺乏病毒轉活化劑反應元件基因；HIV感染中的C-C趨化因子受體(CCR5)；RSV感染中之勞斯(Rous)肉瘤病毒(RSV)核衣殼蛋白、C型肝炎病毒感染中之肝臟特異性微RNA (miR-122)；p53、急性腎損傷或腎臟移植中的移植功能延遲(delayed graft function kidney transplant)或腎損傷急性腎衰竭；晚期復發或轉移性實體惡性腫瘤中的蛋白激酶N3 (PKN3)；LMP2，LMP2亦稱為9型蛋白酶體亞單位β (PSMB 9)、轉移性黑素瘤；LMP7，亦稱為8型蛋白酶體亞單位β (PSMB 8)、轉移性黑素瘤；MECL1，亦稱為10型蛋白酶體亞單位β (PSMB 10)、轉移性黑素瘤；實體腫瘤中之血管內皮生長因子(VEGF)；實體腫瘤中之驅動蛋白軸蛋白質、慢性骨髓白血病中的細胞凋亡抑制劑B細胞CLL/淋巴瘤(BCL-2)；實體腫瘤中之核糖核苷酸還原酶M2 (RRM2)；實體腫瘤中之弗林蛋白酶(Furin)；肝臟腫瘤中的保羅類激酶(polo-like kinase) 1 (PLK1)、C型肝炎感染中之二醯基甘油轉醯酶1 (DGAT1)、家族性腺瘤性息肉病中之β-連環蛋白；β2腎上腺素激導性受體、青光眼；糖尿病黃斑水腫(DME)或年齡相關黃斑變性中的RTP801/Redd1，亦稱為DNA破壞誘發性轉錄物4蛋白質；年齡相關黃斑變性或脈絡膜新生血管中之血管內皮生長因子受體I (VEGFR1)、非動脈炎缺血視神經病變中之凋亡蛋白酶2；先天性甲肥厚中之角蛋白6A N17K突變蛋白質；流感感染中的A型流感病毒基因組/基因序列；SARS感染中之重度急性呼吸道症候群(SARS)冠狀病毒基因組/基因序列；呼吸道融合性病毒感染中之呼吸道融合性病毒基因組/基因序列；埃博拉(Ebola)感染中的埃博拉纖絲病毒基因組/基因序列；B型及C型肝炎感染中之B型及C型肝炎病毒基因組/基因序列；HSV感染中之單純疱疹病毒(HSV)基因組/基因序列、柯薩奇病毒(coxsackievirus) B3感染中的柯薩奇病毒B3基因組/基因序列；原發性肌張力障礙中之基因(對偶基因特異性沉默)類耐扭蛋白(torsin) A (TOR1A)的病原性對偶基因之沉默、在移植中具有特異性的泛I類(pan-class I)及HLA-對偶基因；及常染色體顯性遺傳性色素性視網膜炎(adRP)中之突變視紫質基因(RHO)。
核酸分子、載體(諸如選殖、表現載體(例如，載體基因組))及質體可使用重組型DNA技術方法來製備。核苷酸序列資訊之可用性使得能夠藉由多種方式製備核酸分子。舉例而言，包含載體或質體之異源核酸可使用各種標準選殖、重組型DNA技術經由細胞表現或活體外轉譯及化學合成技術來製得。聚核苷酸之純度可經由定序、凝膠電泳及其類似方法測定。舉例而言，核酸可使用雜交或基於電腦之資料庫篩檢技術來分離。此等技術包括(但不限於)：(1)使基因組DNA或cDNA庫與探針雜交以偵測同源核苷酸序列；(2)抗體篩檢以偵測具有共用結構特徵之多肽，例如使用表現庫；(3)使用能夠黏接至所關注核酸序列之引子在基因組DNA或cDNA上進行聚合酶鏈反應(PCR)；(4)電腦檢索相關序列之序列資料庫；及(5)差分篩檢經減去核酸庫。
本發明之核酸可維持為任何適宜選殖載體中之DNA。在某些實施例中，純系維持在諸如pBluescript或pBluescript II (Stratagene, La Jolla, CA)之質體選殖/表現載體中，其在適合之大腸桿菌(E. coli )宿主細胞中繁殖。可替代地，核酸可維持在適用於在哺乳動物細胞中表現之載體中。
此項技術中已知用於產生rAAV病毒粒子的方法包括例如使用AAV載體及AAV輔助序列之轉染與使用一或多種AAV輔助病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒或痘瘡病毒)的共感染結合或使用重組型AAV載體、AAV輔助載體及輔助功能載體之轉染。用於產生rAAV病毒粒子之方法描述於例如(且不限於)美國專利第6,001,650號及第6,004,797號中。在重組型rAAV載體產生(亦即，載體在細胞培養物系統中之產生)之後，rAAV病毒粒子可獲自宿主細胞及細胞培養物上清液且如本文中所闡述純化。
用以測定含有轉基因之rAAV載體的感染效價之方法為此項技術中已知的(參見例如Zhen等人，(2004) Hum.Gene Ther. (2004) 15:709)。已知用於檢定具有經封裝基因組之空衣殼及AAV載體顆粒的方法(參見例如Grimm等人，Gene Therapy (1999) 6:1322-1330; Sommer等人，Molec.Ther. (2003) 7:122-128)。
為測定降解/變性衣殼，經純化rAAV可經受SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，該凝膠電泳由能夠分離三種衣殼蛋白之任何凝膠組成，例如梯度凝膠，隨後運作凝膠直至將樣本分離為止，且將凝膠印跡至耐綸或硝化纖維膜上。抗AAV衣殼抗體隨後用作與變性衣殼蛋白結合之初級抗體(參見例如Wobus等人，J. Virol. (2000) 74:9281-9293)。與初級抗體結合之二級抗體含有用於偵測初級抗體之構件。半定量地偵測初級抗體與二級抗體之間的結合以測定衣殼量。
rAAV載體及其他組合物、試劑、藥物、生物製劑(蛋白質)可併入至醫藥組合物中。此等醫藥組合物尤其適用於向個體活體內或離體投與及遞送。
術語「經分離」在用作組合物之修飾語時意謂組合物藉由人工製得或與其天然存在之活體內環境完全或至少部分地分離。一般而言，經分離之組合物實質上不含在自然界中通常與其相關聯的一或多種材料，例如一或多種蛋白質、核酸、脂質、碳水化合物、細胞膜。
相對於蛋白質，有時在本文中使用術語「經分離蛋白質」或「經分離及純化蛋白質」。此術語主要係指藉由核酸分子之表現產生的蛋白質。可替代地，此術語可指已經與其他蛋白質充分分離以便以「實質上純」形式存在的蛋白質，其與該等其他蛋白質天然地相關聯。
術語「經分離」不排除本文中之組合物或藉由人工產生之組合，例如rAAV及/或醫藥調配物。術語「經分離」亦不排除替代的物理形式之組合物，諸如雜合體/嵌合體、多聚物/寡聚物、修飾(例如，磷酸化、糖基化、脂質化)或衍生形式或在藉由人工產生的宿主細胞中表現之形式。
術語「實質上純」係指包含至少50-60重量%之所關注化合物(例如，核酸、寡核苷酸、蛋白質等)之製劑。製劑可包含至少75重量%或約90-99重量%之所關注化合物。藉由適當方法量測所關注化合物之純度(例如，層析方法、瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳、HPLC分析及其類似方法)。
片語「基本上由……組成」在參考特定核苷酸序列或胺基酸序列時意謂具有給定序列之屬性的序列。舉例而言，在參考核酸或胺基酸序列使用時，片語包括序列本身及將不影響序列之基本及新穎特性的分子修飾。
在某些實施例中，醫藥組合物亦含有醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。此等賦形劑包括自身不誘發有害於接受組合物之個體之免疫反應且可經投與而無異常毒性的任何醫藥劑。
如本文所使用，術語「醫藥學上可接受」及「生理學上可接受」意謂生物學上可接受之調配物、其氣態、液體或固體或混合物，其適用於一或多種投與、活體內遞送或接觸途徑。「醫藥學上可接受」或「生理學上可接受」之組合物為生物學上或其他方面無不當的材料，例如可向個體投與而不引起實質性非所需生物效應的材料。因此，此類醫藥組合物可例如用於向個體投與核酸、載體、病毒顆粒或蛋白質。
醫藥學上可接受之賦形劑包括(但不限於)液體，諸如水、鹽水、甘油、糖及乙醇。醫藥學上可接受之鹽亦可包括於其中，例如無機酸鹽，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽及其類似鹽；及有機酸鹽，諸如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽及其類似鹽。另外，諸如濕潤劑或乳化劑、pH緩衝物質及其類似物之輔助物質可存在於此等媒劑中。
醫藥組合物可以鹽形式提供，且可由多種酸形成，包括(但不限於)鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、丁二酸等。與對應游離鹼形式相比，鹽往往會更可溶於水性或其他質子溶劑中。在其他情況下，製劑可為凍乾粉劑，其可含有以下中之任一者或所有：pH範圍為4.5至5.5之1-50 mM組胺酸、0.1%-2%蔗糖及2-7%甘露糖醇，其在使用之前與緩衝液合併。
醫藥組合物包括與醫藥投與或活體內接觸或遞送兼容的溶劑(水性或非水性)、溶液(水性或非水性)、乳液(例如，水包油或油包水)、懸浮液、糖漿、酏劑、分散介質及懸浮介質、包衣、等張劑及吸收促進劑或延遲劑。水性及非水性溶劑、溶液及懸浮液可包括懸浮劑及增稠劑。此等醫藥學上可接受之載劑包括錠劑(有包衣或無包衣)、膠囊(硬的或軟的)、微珠、粉劑、顆粒劑及晶體。補充活性化合物(例如，防腐劑、抗細菌劑、抗病毒劑及抗真菌劑)亦可併入至組合物中。
如本文中所闡述或熟習此項技術者所知，可將醫藥組合物調配成與特定投與或遞送途徑相容。因此，醫藥組合物包括適用於藉由各種途徑投與的載劑、稀釋劑或賦形劑。
適合於非經腸投與之組合物包含活性化合物之水性及非水性溶液、懸浮液或乳液，該等製劑通常為無菌的且可與預期接受者之血液等張。說明性實例包括例如(但不限於)水、緩衝鹽水、漢克氏溶液(Hanks'solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖、果糖、乙醇、動物油、植物油或合成油。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液的黏度之物質，諸如(例如)但不限於羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或聚葡萄糖。
另外，活性化合物之懸浮液可視需要製備成油性注射懸浮液。適合親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三酸甘油酯；或脂質體。視情況，懸浮液亦可含有適合穩定劑或增加化合物之溶解性以允許製備高度濃縮溶液之試劑。
共溶劑及佐劑可添加至調配物中，該等共溶劑之實例包括例如(但不限於)含有羥基或其他極性基團之共溶劑，例如，醇，諸如異丙醇；二醇，諸如丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、二醇醚；甘油；聚環氧乙烷醇及聚環氧乙烷脂肪酸酯。佐劑之實例包括例如（但不限於）界面活性劑，諸如大豆卵磷脂及油酸；脫水山梨糖醇酯，諸如脫水山梨糖醇三油酸酯；及聚乙烯吡咯啶酮。
在製備醫藥組合物後，可將其置放於適當容器中且標記用於治療。此等標記可包括投與之量、頻率及方法。
適合於本發明之組合物、方法及用途之醫藥組合物及遞送系統為此項技術中已知的(參見例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy (2003)第20版, Mack Publishing Co., Easton, PA；Remington's Pharmaceutical Sciences (1990)第18版, Mack Publishing Co., Easton, PA；The Merck Index (1996)第12版, Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ；Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.；Ansel及Stoklosa,Pharmaceutical Calculations (2001)第11版, Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD；及Poznansky等人,Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano,編, Oxford, N.Y., 第253-315頁)。
在某些實施例中，本發明之核酸、聚核苷酸及表現卡匣經由AAV載體顆粒遞送或投與。在某些實施例中，本發明之核酸、聚核苷酸及表現卡匣可經由其他類型之病毒顆粒(包括反轉錄病毒、腺病毒、輔助依賴型腺病毒、雜合腺病毒、單純疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)、痘瘡病毒及人類細胞巨大病毒顆粒)遞送或投與。
在某些實施例中，本發明之核酸、聚核苷酸及表現卡匣使用非病毒遞送系統遞送或投與。非病毒遞送系統包括例如化學方法，諸如脂質體、奈米顆粒、脂質奈米顆粒、聚合物、微米顆粒、微膠囊、微胞或細胞外囊泡；及物理方法，諸如基因槍、電穿孔、顆粒轟擊、超音波採用及磁轉染。
在某些實施例中，本發明之核酸、聚核苷酸及表現卡匣以裸DNA、微環、轉座子或封端線性雙螺旋體DNA之形式遞送。
在某些實施例中，本發明之核酸、聚核苷酸及表現卡匣以進一步使用脂質體、奈米顆粒、脂質奈米顆粒、聚合物、微米顆粒、微膠囊、微胞或細胞外囊泡囊封或錯合之AAV載體顆粒或其他病毒顆粒形式遞送或投與。
「脂質奈米顆粒」或「LNP」係指基於脂質之囊泡，其適用於遞送AAV且具有奈米級尺寸，亦即約10 nm至約1000 nm或約50至約500 nm或約75至約127 nm。不受理論束縛，咸信LNP在自免疫系統部分或完全屏蔽之情況下提供核酸、聚核苷酸、表現卡匣或AAV載體。屏蔽允許向組織或細胞遞送核酸、聚核苷酸、表現卡匣或AAV載體同時避免誘發活體內針對核酸、聚核苷酸、表現卡匣或AAV載體的實質免疫反應。屏蔽亦可允許重複投與而不誘發活體內(例如，諸如人類之個體內)針對核酸、聚核苷酸、表現載體或AAV載體的實質免疫反應。屏蔽亦可提高或增加活體內遞送效率。
AAV之pI (等電點)在約6至約6.5的範圍內。因此，AAV表面攜帶有少量負電荷。因而，對於LNP而言，包含諸如(例如)胺基脂質之陽離子脂質可為有益的。例示性胺基脂質已描述於美國專利第9,352,042號、第9,220,683號、第9,186,325號、第9,139,554號、第9,126,966號、第9,018,187號、第8,999,351號、第8,722,082號、第8,642,076號、第8,569,256號、第8,466,122號及第7,745,651號及美國專利公開案第2016/0213785號、第2016/0199485號、第2015/0265708號、第2014/0288146號、第2013/0123338號、第2013/0116307號、第2013/0064894號、第2012/0172411號及第2010/0117125號中。
術語「陽離子脂質」及「胺基脂質」在本文中可互換地使用以包括具有一個、二個、三個或更多個脂肪酸或脂肪烷基鏈及pH可滴定胺基(例如，烷基胺基或二烷基胺基)之彼等脂質及其鹽。陽離子脂質通常在低於陽離子脂質之pKa之pH下質子化(亦即帶正電)且在高於pKa之pH下為實質上中性的。陽離子脂質亦可為可滴定陽離子脂質。在某些實施例中，陽離子脂質包含：可質子化三級胺(例如，pH可滴定)基團；C18烷基鏈，其中各烷基鏈獨立地具有0至3個(例如，0、1、2或3個)雙鍵；及頭基與烷基鏈之間的醚鍵、酯鍵或縮酮鍵。
陽離子脂質可包括(但不限於) 1,2-二亞油氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞麻氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-γ-亞麻氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(γ-DLenDMA)、2,2-二亞油基-4-(2-二甲胺基乙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-C2-DMA，亦稱為DLin-C2K-DMA、XTC2及C2K)、2,2-二亞油基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-DMA)、二亞油醯基甲基-3-二甲胺基丙酸酯(DLin-M-C2-DMA，亦稱為MC2)、4-(二甲胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31 Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-M-C3-DMA，亦稱為MC3)、其鹽及其混合物。其他陽離子脂質亦包括(但不限於) 1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DSDMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DODMA)、2,2-二亞油基-4-(3-二甲胺基丙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-C3-DMA)、2,2-二亞油基-4-(3-二甲胺基丁基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-C4-DMA)、DLen-C2K-DMA、γ-DLen-C2K-DMA及(DLin-MP-DMA) (亦稱為1-B11)。
又其他陽離子脂質可包括(但不限於) 2,2-二亞油基-5-二甲胺基甲基-[1,3]-二噁烷(DLin-K6-DMA)、2,2-二亞油基-4-N-甲基哌嗪并-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-MPZ)、1,2-二亞油基胺甲醯基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亞油基氧基-3-(二甲胺基)乙醯氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亞油基氧基-3-(N-嗎啉基)丙烷(DLin-MA)、1,2-二亞油醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亞油基硫基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亞油醯基-2-亞油氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亞油氧基-3-三甲基胺基丙烷氯鹽(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亞油醯基-3-三甲基胺基丙烷氯鹽(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亞油氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亞油基胺基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基胺基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亞油基側氧基-3-(2-N,N-二甲胺基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨(DODAC)、N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨(DDAB)、N-(1-(2,3-二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)、3-(N-(N',N'-二甲基胺基乙烷)-胺甲醯基)膽固醇(DC-Chol)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DMRIE)、2,3-二油烯基氧基-N-[2(精胺-甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙銨三氟乙酸鹽(DOSPA)、二十八烷基醯胺基甘胺醯基精胺(DOGS)、3-二甲胺基-2-(膽甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(順,順-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5'-(膽甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧雜戊烯氧基)-3-二甲基-1-(順,順-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苯甲胺(DMOBA)、1,2-N,N'-二油烯基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DOcarbDAP)、1,2-N,N'-二亞油基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLincarbDAP)、地塞米松(dexamethasone)-精胺(DS)及二取代精胺(D2S)或其混合物。
可使用多種市售陽離子脂質製劑，諸如LIPOFECTIN® (包括DOTMA及DOPE，可購自GIBCO/BRL)及LIPOFECTAMINE® (包含DOSPA及DOPE，可購自GIBCO/BRL)。
在某些實施例中，陽離子脂質可以約10重量%之LNP至約85重量%之脂質奈米顆粒或約50重量%的LNP至約75重量%之LNP之量存在。
固醇可賦予LNP流動性。如本文中所使用，「固醇」係指植物(植物固醇)或動物(動物固醇)來源之任何天然存在的固醇以及非天然存在之合成固醇，其皆藉由類固醇A-環之3-位置處的羥基之存在表徵。固醇可為習知用於脂質體、脂質囊泡或脂質顆粒製劑之領域的任何固醇，最常為膽固醇。植物固醇可包括菜油固醇、谷固醇及豆固醇。固醇亦包括經固醇修飾之脂質，諸如美國專利申請案公開案2011/0177156中所描述之脂質。在某些實施例中，固醇可以約5重量%之LNP至約50重量%之脂質奈米顆粒或約10重量%的LNP至約25重量%之LNP之量存在。
LNP可包含中性脂質。中性脂質可包含在生理pH下以不帶電或中性兩性離子形式存在之任何脂質物種。此等脂質包括(但不限於)二醯基磷脂醯膽鹼(diacylphosphatidylcholine)、二醯基磷脂醯乙醇胺(diacylphosphatidylethanolamine)、神經醯胺、鞘磷脂、二氫鞘磷脂、腦磷脂及腦苷脂。對中性脂質之選擇一般藉由尤其考慮粒度及必需穩定性來進行指導。在某些實施例中，中性脂質組分可為具有兩個醯基之脂質(例如，二醯基磷脂醯膽鹼及二醯基磷脂醯乙醇胺)。
具有不同鏈長及飽和度之多種醯基鏈基團之脂質為可用的，或可藉由熟知技術分離或合成。在某些實施例中，可使用含有飽和脂肪酸且碳鏈長度介於C14至C22之範圍內的脂質。在某些實施例中，使用具有單或二不飽和脂肪酸且碳鏈長度介於C14至C22之範圍內的脂質。另外，可使用具有飽和及不飽和脂肪酸鏈之混合物之脂質。例示性中性脂質包括(但不限於) 1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷脂醯基-乙醇胺(DOPE)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1-軟脂醯基-2-油醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(POPC)或任何相關磷脂醯膽鹼。中性脂質亦可由鞘磷脂、二氫鞘磷脂或具有其他頭基之磷脂(諸如絲胺酸及肌醇)構成。
在某些實施例中，中性脂質可以約0.1重量%之脂質奈米顆粒至約75重量%之LNP或約5重量%的LNP至約15重量%之LNP之量存在。
LNP囊封之核酸、表現卡匣及AAV載體可併入至醫藥組合物(例如醫藥學上可接受之載劑或賦形劑)中。此等醫藥組合物尤其適用於活體內或離體向個體投與及遞送LNP囊封之酸、表現卡匣及AAV載體。
LNP製劑可與額外組分合併，該等額外組分可包括例如(但不限於)聚乙二醇(PEG)及固醇。
術語「PEG」係指聚乙二醇，一種具有兩個末端羥基之乙烯PEG重複單元之線性可溶於水的聚合物。PEG根據其分子量分類；例如PEG 2000具有約2,000道爾頓之平均分子量，且PEG 5000具有約5,000道爾頓之平均分子量。PEG可購自Sigma Chemical Co.及其他公司，且包括例如(但不限於)以下功能性PEG：單甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、單甲氧基聚乙二醇-丁二酸酯(MePEG-S)、單甲氧基聚乙二醇-丁二酸丁二醯亞胺酯(MePEG-S-NHS)、單甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、單甲氧基聚乙二醇-三氟乙磺酸酯(MePEG-TRES)及單甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。
在某些實施例中，PEG可為具有約550至約10,000道爾頓之平均分子量的聚乙二醇且視情況經烷基、烷氧基、醯基或芳基取代。在某些實施例中，PEG可在末端羥基位置處經甲基取代。在某些實施例中，PEG可具有約750至約5,000道爾頓、或約1,000至約5,000道爾頓、或約1,500至約3,000道爾頓、或約2,000道爾頓或約750道爾頓之平均分子量。PEG可視情況經烷基、烷氧基、醯基或芳基取代。在某些實施例中，末端羥基可經甲氧基或甲基取代。
經PEG修飾之脂質包括例如(但不限於)美國專利第8,936,942號及第7,803,397號中所描述的PEG-二烷氧基丙基共軛物(PEG-DAA)。適用的經PEG修飾之脂質(或脂質-聚氧化乙烯共軛物)可具有多個「錨定」脂質部分以將PEG部分固定於脂質小泡之表面上。適合的經PEG修飾之脂質的實例包括例如(但不限於)經PEG修飾之磷脂醯乙醇胺及磷脂酸、美國專利第5,820,873號中所描述的PEG-神經醯胺共軛物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、經PEG修飾之二烷基胺及經PEG修飾之1,2-二醯基氧基丙-3-胺。在某些實施例中，經PEG修飾之脂質可為經PEG修飾之二醯基甘油及二烷基甘油。在某些實施例中，PEG可呈約0.5重量%之LNP至約20重量%之LNP或約5重量%的LNP至約15重量%之LNP之量。
此外，LNP可為經PEG修飾之及經固醇修飾之LNP。與額外組分合併之LNP可為相同的或單獨的LNP。換言之，相同LNP可經PEG修飾及固醇修飾，或可替代地，第一LNP可經PEG修飾且第二LNP可經固醇修飾。視情況，可合併第一及第二經修飾之LNP。
在某些實施例中，在囊封之前，LNP可具有在約10 nm至500 nm或約50 nm to至約200 nm或75 nm至約125 nm之範圍內的大小。在某些實施例中，LNP囊封之核酸、表現載體或AAV載體可具有在約10 nm至500 nm之範圍內的大小。
「有效量」或「足夠量」係指以單次或多次劑量單獨或與一或多種其他組合物(治療或免疫抑制劑，諸如藥物(如潑尼松(prednisone)))、治療、方案或治療療法試劑組合提供任何持續時間(長或短期)內之可偵測反應、任何可量測或可偵測程度或任何持續時間內(例如，數分鐘、數小時、數天、數月、數年或治癒期)的個體之預期或所要結果或對該個體的益處之量。
劑量可變化且取決於治療所針對之疾病之類型、發作、進展、嚴重程度、頻率、持續時間或機率、所要臨床終點、先前或同時治療，個體的一般健康狀況、年齡、性別、人種或免疫能力及熟習此項技術者將理解之其他因子。如由治療或療法之任何不良副作用、併發症或其他風險因子及個體之狀態所指示，劑量、數目、頻率或持續時間可按比例增加或減少。熟習此項技術者將瞭解可能影響提供足以提供治療效益或預防效益之量所需要的劑量及時序之因子。
用以達成治療作用之劑量，例如載體基因組/每公斤體重(vg/kg)之劑量將基於包括(但不限於)以下的若干因子變化：投與途徑、達成治療作用所需要之異源聚核苷酸表現量、所治療之特定疾病、對病毒載體的任何宿主免疫反應、對異源聚核苷酸或表現產物(蛋白質)之宿主免疫反應及所表現蛋白質之穩定性。熟習此項技術者可測定rAAV/載體基因組劑量範圍以基於前述因子以及其他因子治療患有特定疾病或病症之患者。
一般而言，劑量將介於至少1 × 108 或更多(例如，1 × 109 、1 × 1010 、1 × 1011 、1 × 1012 、1 × 1013 或1 × 1014 或更多)載體基因組/公斤(vg/kg)個體重量之範圍內，以達成治療作用。在小鼠中1 × 1010 - 1 × 1011 vg/kg及在狗中1 × 1012 - 1 × 1013 vg/kg之範圍內之AAV劑量已為有效的。劑量可更少，例如，小於6 × 1012 載體基因組/公斤(vg/kg)之劑量。更特定言之，約1 × 1011 vg/kg至約5 × 1012 vg/kg、或約5 × 1011 vg/kg至約2 × 1012 vg/kg或約5 × 1011 vg/kg至約1 × 1012 vg/kg的劑量。
針對龐培氏病，有效量將為例如抑制或減少肝糖產生或積聚、增強或增加肝糖降解或去除、減少個體之身體組織中之溶酶體改變或提高個體之肌肉張力及/或肌肉強度及/或呼吸道功能的GAA量。舉例而言，有效量可藉由利用來自血漿之肌母細胞確定GAA攝入動力學來測定。約141-147 nM之肌母細胞GAA攝入比率(K 攝入 )可呈現為有效的(參見例如Maga等人，J. Biol. Chem. 2012)。在動物模型中，大於約1,000 nmol/hr/mL (例如，約1,000至約2,000 nmol/hr/mL)的血漿中之GAA活性水準已經觀測為治療學上有效的。
使用B型血友病作為實例，一般言之，咸信為了達成治療作用，需要大於正常個體中發現的因子濃度的1%之血液凝結因子濃度以將重度疾病表型改變成中度疾病表型。重度表型之特徵在於關節損傷及危及生命之出血。為將中度疾病表型轉換成輕度疾病表型，咸信需要大於正常的5%的血液凝血因子濃度。
A及B型血友病之診斷及疾病嚴重程度分類分別基於因子VIII及因子IX活性檢定的結果。用於評定因子活性之兩種主要檢定為基於活化部分凝血活酶時間(aPTT)之一段檢定(OSA)及使用基於因子Xa的酶促發色團基質反應之二段發色基質檢定(CSA)。此等檢定為此項技術中所熟知且進一步描述在Adcock等人2018, Int. J. Lab. Hem., 40:621-629中。
在正常人類中FVIII含量為約150-200 ng/mL血漿，但可為更少(例如，約100-150 ng/mL之範圍)或更大(例如，約200-300 ng/mL的範圍)且如例如藉由aPTT一段凝固檢定所測定歸因於功能性凝固，仍視為正常。因此，治療作用可藉由FVIII或hFVIII-BDD之表現來達成以使得個體/人類中的FVIII之總量大於正常個體/人類中存在之FVIII的1%，例如，100-300 ng/mL的1%。
rAAV載體劑量可呈通常在劑量範圍之低端之含量，以使得不存在針對FVIII或AAV載體的實質免疫反應。更特定言之，至多但小於6 × 1012 vg/kg (諸如約5 × 1011 至約5 × 1012 vg/kg)或更特定言之約5 × 1011 vg/kg或約1 × 1012 vg/kg的劑量。
在某些實施例中，rAAV載體劑量呈遞送安全且有效量之FVIII且向患有具有抗FVIII之抑制性抗體的A型血友病(具有抑制劑之A型血友病)之個體提供治療效益的含量。
儘管減輕、減少、抑制、遏制、限制或控制疾病之進展或惡化為令人滿意的結果，但治療之「有效量」或「足夠量」(例如，用以改善或提供治療效益或好轉)之劑量通常有效地在可量測程度上提供對疾病之一種、多種或所有不良症狀、結果或併發症(例如由疾病引起或與疾病相關聯的一或多種不良症狀、病症、疾病、病變或併發症)的反應。
有效量或足夠量可以但無需以單次投與提供，可能需要多次投與，且可以但無需單獨或與另一組合物(例如，試劑)、治療、方案或治療療法組合投與。舉例而言，如由個體之需要、所治療疾病的類型、狀態及嚴重程度或治療之副作用(若存在)所指示，該量可按比例增加。另外，若以單次或多次劑量給出而無需第二組合物(例如，另一藥物或試劑)、治療、方案或治療療法，則有效量或足夠量無需為有效或足夠的，因為可包括高於及超過此等劑量之額外劑量、量或持續時間，或額外組合物(例如，藥物或試劑)、治療、方案或治療療法以便在給定個體中視為有效或足夠的。視為有效之量亦包括使得減少另一治療、治療療法或方案之使用(諸如投與重組型凝固因子蛋白質(例如，FVIII))以治療凝固病症(例如，A型血友病或具有抗FVIII之抑制性抗體的A型血友病，亦稱為具有抑制劑之A型血友病)的量。
因此，本發明之方法及用途亦尤其包括使得減少對另一化合物、試劑、藥物、治療療法、治療方案、過程或治療物之需要或使用的方法及用途。舉例而言，針對血液凝固疾病，若在給定個體中，不太頻繁或減少劑量或消除投與重組型凝固因子蛋白質以補充個體之缺乏或缺陷性(異常或突變)內源性凝固因子，則本發明之方法或用途具有治療效益。因此，根據本發明，提供減少對另一治療或療法之需要或使用的方法及用途。
有效量或足夠量既不需要在每一個所治療之個體中有效，亦不需要在給定群組或群體中之大部分治療個體中有效。有效量或足夠量意謂在特定個體而非群組或一般群體中有效或足夠。正如對此等方法而言為典型的，一些個體將表現出對給定治療方法或用途更大的反應或更小或無反應。
術語「改善」意謂個體之疾病或其症狀或根本細胞反應之可偵測或可量測好轉。可偵測或可量測好轉包括疾病或由疾病引起或與疾病相關聯之併發症之出現率、頻率、嚴重程度、進展或持續時間的主觀或客觀減小、減輕、抑制、遏制、限制或控制，或疾病之症狀或根本病因或結果好轉，或疾病之逆轉。對於HemA，有效量將為降低個體之急性出血發作的頻率或嚴重程度之量，例如減少凝固時間的量，如藉由例如凝固檢定所量測。
因此，本發明之醫藥組合物包括其中含有有效量的活性成分以達成所意欲之治療目的之組合物。測定治療學上地有效劑量在熟練的行醫者使用提供於本發明中之技術及指導的能力內。
治療劑量將尤其取決於個體之年齡和一般條件、異常表型之嚴重程度及調節表現量之控制序列之強度。因此，人類中之治療有效量將在可由行醫者基於個別患者對基於載體之治療的反應來測定之相對寬的範圍內。此等劑量可單獨或與免疫抑制劑或藥物組合。
可向個體遞送諸如醫藥組合物之組合物，以便允許轉基因表現及視情況所編碼蛋白質的產生。在某些實施例中，醫藥組合物包含足夠的遺傳物質以使得接受者能夠產生治療有效量之血液凝固因子來影響個體之止血。
可單獨投與組合物。在某些實施例中，重組型AAV顆粒在無免疫抑制劑之情況下提供治療作用。在不投與免疫抑制劑之情況下，治療作用視情況持續一段時間，例如2-4、4-6、6-8、8-10、10-14、14-20、20-25、25-30或30-50天或更久，例如50-75、75-100、100-150、150-200天或更久。因此，在某些實施例中，rAAV病毒顆粒在一段時間內在不投與免疫抑制劑之情況下提供治療作用。
本發明之組合物可與至少一種其他惰性或治療劑組合投與。在某些實施例中，在投與rAAV載體之前、實質上同時或之後，rAAV載體與一或多種免疫抑制劑結合投與。在某些實施例中，例如在投與rAAV載體之後1-12、12-24或24-48小時、或2-4、4-6、6-8、8-10、10-14、14-20、20-25、25-30、30-50或超過50天。若在初始表現量一段時間之後，例如rAAV載體之後20-25、25-30、30-50、50-75、75-100、100-150、150-200或超過200天後所編碼蛋白質表現減少，則在投與rAAV載體之後一段時間後如此投與免疫抑制劑。
在某些實施例中，免疫抑制劑為消炎劑。在某些實施例中，免疫抑制劑為類固醇。在某些實施例中，免疫抑制劑為潑尼松、環孢靈(cyclosporine) (例如，環孢靈A)、黴酚酸酯、利妥昔單抗(rituximab)、雷帕黴素或其衍生物。在某些實施例中，試劑包括穩定化合物。可根據本發明使用之其他免疫抑制劑包括例如(但不限於) B細胞靶向抗體，例如，利妥昔單抗；蛋白酶體抑制劑，例如，硼替佐米(bortezomib)；哺乳動物雷帕黴素靶蛋白(mTOR)抑制劑，例如，雷帕黴素；酪胺酸激酶抑制劑，例如，依魯替尼(ibrutinib)；B細胞活化因子(BAFF)抑制劑；及誘發增殖之配位體(APRIL)抑制劑。
組合物可在任何無菌、生物相容性醫藥載劑(包括(但不限於)鹽水、緩衝鹽水、右旋糖及水)中投與。組合物可單獨或與影響止血之其他試劑(例如，輔因子)組合向患者投與。
本發明之方法及用途包括全身性、區域性或局部地或藉由任何途徑(例如但不限於藉由注射或輸注)遞送且投與。活體內遞送醫藥組合物一般可經由使用習知針筒注射來完成，但可設想其他遞送方法(諸如對流增強之遞送) (參見例如美國專利第5,720,720號)。舉例而言，組合物可經皮下、經表皮、經皮內、經鞘內、經眶內、經黏膜內、經腹膜內、經靜脈內、經胸膜內、經動脈內、經口、經肝內、經由門靜脈或經肌肉內遞送。其他投與模式包括經口及經肺投與、栓劑及經皮施加。舉例而言，專門治療患有血液凝結或凝固因子病症患者的臨床醫師可基於多種準則確定投與腺病毒相關聯載體之最佳途徑，該等準則包括(但不限於)：患者之病況及治療目的(例如，增加GAA、增強或減少血液凝結等)。
根據本發明之治療方法包括組合療法，該等組合療法包括額外使用任何化合物、試劑、藥物、治療或其他治療療法或具有所要治療、有益、累加、協同或互補活性或作用的方案中之一或多者。例示性組合組合物及治療包括例如(但不限於)第二活性劑，諸如生物製劑(蛋白質)、試劑(例如，免疫抑制劑)及藥物。此等生物製劑(蛋白質)、試劑、藥物、治療及療法可在根據本發明之任何其他治療方法之前、實質上同時或之後投與或執行，該任何其他治療方法例如治療個體之諸如龐培氏之溶酶體貯積病的治療方法或治療個體之諸如HemA或HemB的血液凝固疾病的治療方法。
化合物、試劑、藥物、治療或其他治療療法或方案可作為組合組合物投與，或與遞送或投與核酸、載體、重組型載體(例如，rAAV)或重組型病毒顆粒(之前或之後)分開地(諸如並行地或連續或依序)投與。本發明因此提供根據本發明之治療方法與任何化合物、試劑、藥物、治療療法、治療方案、過程、治療物或組合物組合之組合，如本文中所闡述或熟習此項技術者所已知。化合物、試劑、藥物、治療療法、治療方案、過程、治療物或組合物可在投與根據本發明向患者或個體投與的核酸、載體、重組型載體(例如，rAAV)或重組型病毒顆粒之前、實質上同時或之後投與或執行。
本發明可用於人類及獸醫醫學應用中。適合之個體因此包括哺乳動物，諸如人類以及非人類哺乳動物。術語「個體」係指動物，通常為哺乳動物，諸如人類、非人類靈長類動物(猿、長臂猿、大猩猩、黑猩猩、紅毛猩猩、獼猴)、家畜(狗及貓)、農畜(諸如雞及鴨之家禽、馬、奶牛、山羊、綿羊、豬)及實驗動物(小鼠、大鼠、兔、天竺鼠)。人類個體包括胚胎、新生兒、嬰兒、青少年及成年人個體。個體包括動物疾病模型，例如諸如HemA及熟習此項技術者已知之其他血液凝固疾病的血液凝固疾病的小鼠及其他動物模型。
適合於根據本發明之治療的個體包括具有或處於產生不足量的風險下或具有功能性基因產物(例如，GAA或血液凝固因子，諸如FVIII或FIX)缺乏之彼等個體，或產生可導致疾病的異常的部分功能性或非功能性基因產物(例如，GAA或血液凝固因子，諸如FVIII或FIX)。適合於根據本發明之治療的個體亦包括具有或處於產生導致疾病之異常或缺陷性(突變)基因產物(蛋白質)的風險下以使得降低異常或缺陷性(突變)基因產物(蛋白質)的量、表現或功能將引起治療疾病或減少一或多種症狀或改善疾病的彼等個體。舉例而言，目標個體包括具有異常、不足或不存在血液凝固因子產生之個體，諸如血友病患者(例如，A型血友病或B型血友病)；或具有異常、不足或不存在GAA產生之個體，諸如患有龐培氏病的個體。
個體包括不具有抗AAV的可偵測中和抗體之彼等個體。個體亦包括具有抗AAV的中和抗體之彼等個體。此等個體可具有抗AAV之低效價中和抗體。
可測試個體之免疫反應，例如，抗AAV之抗體。可在根據本發明的方法治療之前篩檢候選個體(例如，血友病或龐培氏病個體)。亦可在治療後測試個體之抗AAV抗體，且視情況在治療後監測一段時間。出現抗體之個體可用免疫抑制劑(例如，潑尼松)治療或可投與一或多個額外量之AAV載體。
對於與AAV結合的抗體而言視為陰性之個體具有小於1:1之效價。具有與AAV結合之抗體的個體可具有大於1:1但小於1:5之效價。個體亦可具有等於或大於1:5的AAV抗體效價。舉例而言，此等抗體效價可藉由對來自個體之血液、血漿或血清(或其他體液)樣本執行連續稀釋來計算，且如藉由基於活體外細胞之檢定中之報導基因活性所量測，樣本抑制AAV轉導50%或更多之第一稀釋度報導為抗體效價。
降低(克服)或避免在全身性基因轉移中對AAV之體液免疫的策略包括投與較高載體劑量，使用AAV空衣殼作為誘餌以吸收抗AAV抗體，投與免疫抑制藥物以減小、降低、抑制、預防或根除對AAV之體液免疫反應，改變AAV衣殼血清型或將AAV衣殼工程改造成較少受中和抗體影響，使用血漿交換循環以吸收抗AAV免疫球蛋白，由此降低抗AAV抗體效價，使用諸如氣囊導管之遞送技術隨後進行鹽水沖洗(Mingozzi等人，2013, Blood, 122:23-36)及免疫吸收(美國專利申請案公開案US 2018/0169273 A1)。
適合於根據本發明治療之個體亦包括具有或處於產生抗AAV抗體之風險下的彼等個體。可使用若干技術向此等個體投與或遞送rAAV載體。舉例而言，可遞送空衣殼AAV (亦即，不含轉基因之AAV)以與個體中之AAV抗體結合，由此允許攜帶核酸或核酸變異體的AAV載體將個體之細胞轉型。
空衣殼與rAAV載體之比率可介於約2:1至約50:1之間、或介於約2:1至約25:1之間、或介於約2:1至約20:1之間、或介於約2:1至約15:1之間、或介於約2:1至約10:1之間。比率亦可為約2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
待投與之空衣殼AAV之量可基於特定個體中產生的AAV抗體之量(效價)來校準。空衣殼可具有任何AAV血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV-2i8、LK03 (SEQ ID NO:91)、SPK (SEQ ID NO:92)。
可替代地，或除此以外，可藉由直接肌肉內注射(例如，肌肉之一或多根緩慢抽動之纖維)遞送AAV載體。在另一替代方案中，引入股動脈中之導管可用於經由肝動脈向肝臟遞送AAV載體。亦可採用非手術方式，諸如內窺鏡逆行胰膽管造影(ERCP)以將AAV載體直接遞送至肝臟，由此繞過血流及AAV抗體。諸如頜下腺之導管之其他導管系統亦可用作端口以用於將AAV載體遞送至出現或具有先前存在的抗AAV抗體之個體中。
向個體投與或活體內遞送可在出現由疾病引起或與疾病相關聯之不良症狀、病況、併發症等之前執行。舉例而言，篩檢(例如，基因篩檢)可用於將此等個體識別為本發明組合物、方法及用途之候選者。因此，此等個體包括經篩檢對於功能性基因產物(例如，血液凝固因子)之不足量或缺乏而言為陽性或產生異常的部分功能性或非功能性基因產物(例如，血液凝固因子)的彼等個體。
根據如本文中所揭示之本發明的方法及用途向個體投與或活體內遞送可在個體已識別為患有治療靶向之疾病、具有疾病之一或多種症狀或即使個體不具有疾病之一或多種症狀亦已篩檢且識別為如本文中所闡述之陽性之後1-2、2-4、4-12、12-24或24-72小時內實踐。當然，本發明之方法及用途可在個體已經識別為患有治療靶向之疾病、具有疾病之一或多種症狀或已篩檢且識別為如本文中所闡述之陽性之後1-7、7-14、14-21、21-48天或更多天、數月或數年內實踐。
如本文中所使用之「單位劑型」係指適用作用於待治療個體之單位劑量的物理離散單位；各單位含有視情況與醫藥載劑(賦形劑、稀釋劑、媒劑或填充劑)相關之預定量，在以一或多次劑量投與時，該預定量經計算以產生所要作用(例如，防治或治療作用)。單位劑型可在例如安瓿及小瓶內，其可包括液體組合物或呈冷凍乾燥或凍乾狀態之組合物；無菌液體載劑，例如可在投與或活體內遞送之前添加。個別單位劑型可包括於多劑量套組或容器中。重組型載體(例如，rAAV)序列、重組型病毒顆粒及其醫藥組合物可經封裝於單一或多個單位劑型中以便於劑量之投與及均一性。
可測試個體之相關基因產物(例如，GAA或血液凝固因子，諸如FVIII或FIX)的蛋白質或活性水準以確定此等個體是否適合於根據本發明之方法治療。舉例而言，可在根據本發明之方法治療之前測試候選A型血友病個體之FVIII量或活性；可在根據本發明治療之前測試候選龐培氏個體之GAA量或活性。亦可在根據本發明之方法治療之後測試個體之FVIII或GAA蛋白量或活性。可在治療之後週期性地(例如，每1-4週、1-6個月或1、2、3、4、5年或更多年)監測此等治療個體之血液凝固活性(針對HemA)或GAA活性(針對龐培氏)。
可測試個體之一或多種肝臟酶的不良反應或以確定此等個體是否適合於根據本發明之方法治療。舉例而言，可在根據本發明之方法治療之前篩檢候選血友病或龐培氏個體之一或多種肝臟酶的量。亦可在根據本發明之方法治療之後測試個體之一或多種肝臟酶的量。可在升高之肝臟酶的治療之後週期性地(例如，每1-4週或1-6個月)監測此等治療個體。
例示性肝臟酶包括丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸胺基轉移酶(AST)及乳酸脫氫酶(LDH)，但亦可監測指示肝臟損傷之其他酶。循環中之此等酶之正常含量通常定義為具有上限含量之範圍，高於該範圍，將酶含量視為升高，且因此指示肝臟損傷。正常範圍部分取決於進行檢定之臨床實驗室所用的標準。
在某些實施例中，可監測患有出血病症之個體的出血發作以確定此等個體是否符合根據本發明之治療條件或對該治療有反應，及/或反應之量或持續時間。可監測個體之出血發作以確定此等個體是否需要額外治療，例如，後續AAV載體投與或免疫抑制劑之投與，或更頻繁監測。可在根據本發明之方法治療之前及之後監測血友病個體之出血發作。亦可在根據本發明之方法治療期間或之後測試個體的出血發作之頻率及嚴重程度。
在某些實施例中，患有龐培氏病或需要GAA之個體可藉由多種測試、檢定及功能性評定監測以展現、量測和/或評定GAA之療效，進而確定此等個體是否符合治療條件或對該治療有反應或需要根據本發明之額外治療。
本發明提供其中具有封裝材料及一或多種組分之套組。套組通常包括標籤或封裝插頁，其包括組分之描述或其中組分之活體外、活體內或離體使用說明書。套組可含有此等組分的集合，例如核酸、重組型載體、病毒(例如，AAV)載體或病毒顆粒及視情況第二活性劑(諸如另一化合物、試劑、藥物或組合物)。
套組係指容納套組之一或多種組分的實體結構。封裝材料可維持組分無菌，且可由常用於此等目的之材料(例如，紙、波紋狀纖維、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)製成。
標籤或插頁可包括其中之一或多種組分之識別資訊、給藥量、包括作用機制、藥物動力學及藥效學之活性成分之臨床藥理學。標籤或插頁可包括識別製造商、批號、製造地點及日期、過期日期之資訊。標籤或插頁可包括識別製造商資訊、批號、製造地點及日期的資訊。標籤或插頁可包括關於可使用套組組分之疾病的資訊。標籤或插頁可包括臨床醫師或個體在方法、用途或治療方案或治療療法中使用套組組分中之一或多者之說明書。說明書可包括用於實踐本文中所描述之方法、用途、治療方案或防治或治療療法中之任一者的劑量、頻率或持續時間及說明書。
標籤或插頁可包括關於組分可提供之任何益處之資訊，諸如防治或治療效益。標籤或插頁可包括關於潛在不良副作用、併發症或反應之資訊，諸如對個體或臨床醫師關於其將不適合於使用特定組合物之情況的警告。不良副作用或併發症亦可在個體具有、將或當前正服用可能與組合物不相容之一或多種其他藥物，或個體具有、將或當前正經歷將與組合物不相容之另一治療方案或治療療法時出現，且因此，說明書可包括關於此等不相容性的資訊。
標籤或插頁包括「印刷物」，例如，紙或卡紙板，其為單獨的或黏附至組分、套組或填料材料(例如盒)，或附接至含有套組組分的安瓿、管或小瓶。標籤或插頁可另外包括電腦可讀取媒體，諸如條形碼印刷標籤；磁碟；光碟，諸如CD-或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3、磁帶；或電儲存媒體，諸如RAM及ROM，或此等之混合，諸如磁性/光學儲存媒體、FLASH媒體或記憶型卡。
除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬之技術者通常所理解相同之含義。儘管與本文中所描述之方法及材料類似或等效之方法及材料可用於實踐或測試本發明，但在本文中描述適合方法及材料。
本文中引用的所有專利、專利申請案、公開案及其他參考文獻、GenBank引用文件及ATCC引用文件均以全文引用之方式併入。在有衝突之情況下，將以說明書(包括定義)為準。
上文且亦貫穿本說明書及申請專利範圍使用與本發明之生物分子相關之各種術語。
本文中所揭示之所有特徵可以任何組合合併。本說明書中所揭示之各特徵可經用於相同、等效或類似目的之替代性特徵置換。因此，除非另外明確說明，否則所揭示之特徵(例如，CpG減少之)核酸、載體、質體、表現/重組型載體(例如，rAAV)序列或重組型病毒顆粒為等效或類似特徵類的實例。
如本文中所使用，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此，例如，提及「核酸」包括複數個此等核酸，提及「載體」包括複數個此等載體，且提及「病毒」或「顆粒」包括複數個此等病毒/顆粒。
除非上下文另外明確指示，否則如本文中所使用，所有數值或數值範圍包括此等範圍內之整數及範圍內之值或整數的分數。因此，舉例而言，提及80%或更多一致性包括81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%等以及81.1%、81.2%、81.3%、81.4%、81.5%等，82.1%、82.2%、82.3%、82.4%、82.5%等，以此類推。
提及具有大於(高於)或小於之整數分別包括大於或小於參考數目之任何數目。因此，舉例而言，提及小於100包括99、98、97等一直降至數目一(1)；且小於10包括9、8、7等一直降至數目一(1)。
除非上下文另外明確指示，否則如本文中所使用，所有數值或範圍包括此等範圍內之值及整數的分數及此等範圍內之整數的分數。因此，舉例而言，提及諸如1-10之數值範圍包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，以此類推。因此，提及1-50之範圍包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等直至且包括50，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等，以此類推。
提及一系列範圍包括組合該系列內不同範圍邊界之值的範圍。因此，舉例而言，提及例如1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-850的一系列範圍包括1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、50-75、50-100、50-150、50-200、50-250、100-200、100-250、100-300、100-350、100-400、100-500、150-250、150-300、150-350、150-400、150-450、150-500等之範圍。
本文中使用肯定的語言描述本發明之多個實施例來大體揭示本發明。具體言之，本發明亦包括完全或部分排除諸如物質或材料、方法步驟及條件、方案或程序的特定主題之實施例。舉例而言，在本發明之某些實施例中，排除材料及/或方法步驟。因此，即使本文中未就本發明不包括的內容大體地表述本發明，本文中仍揭示了本發明中未明確排除的態樣。
已經描述本發明之大量實施例。然而，熟習此項技術者在不背離本發明之精神及範疇的情況下可對本發明作出各種改變及修改以使其適應各種用途及條件。因此，以下實例意欲說明而非以任何方式限制所主張之本發明之範疇。實例 實例 1 ：方法
NHP 血漿之 hFVIII ELISA ：將96孔盤塗佈有人類特異性FVIII抗體隔夜、經洗滌且在與稀釋NHP研究個體血漿樣本一起培育之前封閉。藉由培育具有連續稀釋之重組型B域刪除之hFVIII、Xyntha® (Pfizer)的額外孔來產生標準曲線。盤經洗滌且隨後與生物素化人類特異性FVIII偵測抗體一起培育。盤與辣根過氧化酶(HRP)共軛之抗生蛋白鏈菌素一起培育，用TMB基質處理，且在微板讀取器上讀出以確定在450 nm下的吸收。
小鼠血漿之 hFVIII ELISA ：基本上如上文所描述針對NHP執行小鼠血漿的hFVIII ELISA；然而，所利用之捕捉及偵測抗體不同。
用以量測編碼人類 FVIII 轉基因之 AAV 載體 之效能的基於細胞之檢定 ：將Huh7細胞以5 × 104 個細胞/孔接種在48孔盤中隔夜。研究後，以DMEM +10% FBS +青黴素/鏈黴素/L-麩醯胺酸製備呈10倍劑量曲線(MOI範圍介於1 × 106 - 1 × 103 )之剩餘未經稀釋儲備載體及經稀釋用於給藥的載體。現有培養基自Huh7細胞中經去除且用含有病毒顆粒之培養基置換。細胞維持在37℃及5% CO2 下72小時，且將上清液收集及儲存於-80℃下之低滯留微量滴定盤中，直至檢定hFVIII活性為止。上清液利用具有藉由將重組型B域刪除之hFVIII、Xyntha® (Pfizer)稀釋至細胞生長培養基中所產生之標準曲線的Coatest® SP4 因子VIII(Chromogenix)來檢定。
用以量測編碼人類 FVIII 轉基因之質體之蛋白質表現效率的基於細胞之檢定 ：將Huh7細胞以DMEM +10% FBS +青黴素/鏈黴素/L-麩醯胺酸以5 × 104 個細胞/孔接種於48孔盤中隔夜。質體使用Plasmid Giga Kit (Qiagen)製備且使用Polyethylenimine (PEI) Max以250 ng/孔轉染至細胞中。細胞維持在37℃及5% CO2 下72小時，且將上清液收集及儲存於-80℃下之低滯留微量滴定盤中，直至檢定hFVIII活性為止。上清液利用具有藉由將重組型B域刪除之hFVIII、Xyntha® (Pfizer)稀釋至細胞生長培養基中所產生之標準曲線的Coatest® SP4 因子VIII(Chromogenix)來檢定。 實例 2
FIX構築體調節元件單元(SEQ ID NO:22及23)由脂蛋白元E (ApoE)基因之321 bp內含子及人類α-1抗胰蛋白酶(hAAT)基因的397 bp啟動子構成。總體而言，此單元含有16個CpG。CpG 減少之啟動子的設計
CpG位點之胞嘧啶或鳥嘌呤取決於共有序列而改變。若未發現潛在轉錄因子結合位點，則CpG二核苷酸之胞嘧啶(C)經胸腺嘧啶(T)置換。藉此，維持嘧啶-嘌呤結構。在一些情況下，刪除C核苷酸或整個CpG二核苷酸，且在一些情況下，CpG二核苷酸之鳥嘌呤(G)經丙胺酸(A)或C置換。
使用此策略，基於ApoE/hAAT調節元件產生22個不同序列。下文在SEQ ID NO:24-67中說明含有或不含有5'及3'側接限制酶位點之序列。選殖
不同啟動子經合成且選殖在編碼hFIX的經密碼子最佳化之序列(SEQ ID NO:94)之上游。小鼠研究
人類α-1抗胰蛋白酶(hAAT)基因啟動子之效能藉由在8週大雄性野生型C57BL/6小鼠(Jackson Laboratories)中的質體構築體之流體動力遞送來評定。在質體投與之後24小時經由頜下血液收集來以肝素收集非禁食血漿樣本。將血漿置放於冰上且儲存於-80℃下，直至分析為止。所有動物研究根據機構指導原則及審批通過之方案執行。效能研究
所收集之血漿用於評估hFIX轉基因表現。
人類FIX的活性水準藉由活化部分凝血活酶時間(aPTT)檢定來量測。aPTT檢定藉由將樣本血漿以1:1:1體積比率與人類FIX缺乏血漿(George King Bio-Medical, Inc.)及aPTT反應劑(Trinity Biotech)混合，隨後在37℃下進行180秒培育期來執行。凝血藉由添加25 mM氯化鈣引發。凝塊形成之時間使用STart 4凝血儀器(Diagnostica Stago)來量測。用彙集之正常血漿(George King Bio-Medical, Inc.)以TBS pH 7.4 (48 μL + 192 μL)之1:5稀釋液隨後以系列1:2稀釋液(120 μL + 120 μL)開始來產生標準曲線。人類標準曲線用於計算在AAV載體投與之後第17週時的各樣本之活性；亦量測兩隻未經治療小鼠中之活性。未經治療小鼠中之FIX活性經平均化且隨後自治療樣本中減去以計算歸因於外源性FIX蛋白質的額外(亦即，人類)活性。資料展示於圖1中。實例 3
FVIII構築體調節元件單元(SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3)由225 bp TTR啟動子構成。總體而言，此單元含有4個CpG。CpG 減少之 TTR 啟動子的設計
CpG位點之胞嘧啶或鳥嘌呤取決於共有序列而改變。若未發現潛在結合位點，則CpG二核苷酸之胞嘧啶經胸腺嘧啶置換。藉此，維持嘧啶-嘌呤結構。使用此策略，基於TTRm (SEQ ID NO:3)調節元件產生5個新穎序列。在SEQ ID NO:4-13中說明含有或不含有限制酶位點的CpG減少之TTR序列。
設計另一組四種不同的較短TTR雜合啟動子。電子雜交評定五種不同肝臟特異性啟動子之天然基因的轉錄起始位點(TSS)之1000個核苷酸內之推定轉錄因子結合位點的存在。隨後，藉由自原始天然啟動子挑選特異性區域且以串聯方式組裝該等特異性區域來組裝TTR雜合啟動子。下文在SEQ ID NO:14-21中說明含有或不含有限制酶位點的TTR雜合序列。選殖
不同啟動子經合成及選殖在編碼hFVIII-BDD的經密碼子最佳化之核苷酸序列(SEQ ID NO:77)之上游。小鼠研究
最初藉由在8週大雄性野生型C57BL/6小鼠(Jackson laboratories)中之流體動力遞送來評定TTR啟動子的效能。在質體投與之後24小時經由頜下血液收集來以肝素收集非禁食血漿樣本。將血漿置放於冰上且儲存於-80℃下，直至分析為止。針對AAV遞送研究，棄去前0.5 mL血液，且剩餘樣本收集在EDTA中，且經處理成血漿。所有動物研究根據機構指導原則及審批通過之方案執行。鼠類血漿中之 hFVIII 抗原含量
鼠類血漿中之hFVIII轉基因產物的含量如下使用夾層式ELISA來量化：第一，將微量滴定盤之各孔塗佈有抗hFVIII捕捉抗體(Green Mountain Antibodies，稀釋至2 µg/mL)。第二天，將盤洗滌四次且在室溫下封閉(6% BSA，0.2% Tween 20於PBS中) 30分鐘。彙集之鼠類血漿外加已知濃度之重組型B域刪除之hFVIII (XYNTHA Solofuse®)且連續稀釋(1:2)以產生範圍介於300 ng/mL至2.34 ng/mL的8點標準曲線。檢定之量化限制為4.8 ng/mL。製備三種含量之品質對照樣本且包括於各盤上以評定檢定效能。在將樣本添加至各孔之後，將盤在37℃下培育1小時且隨後洗滌四次。在室溫下將生物素化抗hFVIII偵測抗體(Green Mountain Antibodies，稀釋至1 µg/mL)添加至盤中1小時以與捕捉hFVIII蛋白質結合。在洗滌之後，在室溫下將呈1:5000稀釋之過氧化酶共軛之抗生蛋白鏈菌素反應劑(Thermo Fisher Scientific)添加至盤中30分鐘以與生物素化抗hFVIII抗體結合。在洗滌盤以去除未結合共軛抗體之後，在用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺基質(TMB)在室溫下進行15分鐘培育之後顯露過氧化酶活性。用TMB停止溶液停止反應，且針對光學密度(OD)藉由吸收盤讀取器來讀取盤。所獲得的吸收值與血漿樣本中存在之hFVIII濃度成比例。資料展示於圖2-5中。RNA 分離及 qPCR
大腦、睪丸、腎臟、脾臟及肝臟小鼠組織經收集、用DPBS沖洗、切割/搗碎成多個微小碎片，且將約30 mg用於RNA分離，如套組方案(RNeasy加通用迷你套組，Qiagen)中所描述來執行。RNA濃度使用Nanodrop 2000儀器來量測，且將樣本在無核酸酶中稀釋至150 ng/µL。DNase治療根據製造商說明書使用無Turbo DNA套組(Invitrogen)來完成。對於cDNA反應，如High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (ABI)中所引導來使用200 ng RNA。將cDNA樣本稀釋5倍，且將20 ng cDNA用於PCR反應。定量即時PCR使用以下來執行：正向引子：5'-TGAGGAGGCTGAAGACTATGA-3' (SEQ ID NO:95)；反向引子：5'-CCACAGACCTGATCTGAATGAA-3' (SEQ ID NO:96)；及探針：5'-56-FAM-TGGATGTGG/ZEN/TGAGGTTTGATGATGACA-3IABkFQ-3' (SEQ ID NO:97)。鼠類actB (Integrated DNA Technologies)基因充當用於歸一化之管家基因。資料展示於圖6中。實例 4
因子VIII表現藉由改變有助於轉基因表現之表現卡匣內的元件來增加。表現AAV載體之B域刪除之hFVIII的無內含子版本 (AAV-INTL)經製得且與含內含子版本(AAV-WINT)相比較。除了AAV-WINT hFVIII具有定位於TTRm啟動子與編碼B域刪除人類因子VIII之轉基因之間的合成內含子(SEQ ID NO:93)之外(圖7)，AAV-INTL hFVIII表現卡匣(SEQ ID NO:1)含有與AAV-WINT hFVIII表現卡匣相同的元件。實例 5 ：小鼠中之效能
為評估在哺乳動物中無內含子卡匣(無內含子之TTRm hFVIII；SEQ ID NO:1)相對於具有內含子之卡匣(TTRm hFVIII)的效能，將大約8週齡的雄性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratories)在橫向尾部靜脈中以6.4e9或1.6e10 vg/小鼠之劑量靜脈內注射AAV衣殼化卡匣。血漿在若干時間點收集，如所指示(圖8及9)，且藉由hFVIII ELISA評定循環hFVIII含量。
hFVIII含量之判定展示，無內含子的TTRm hFVIII之效能相對於TTRm hFVIII(具有內含子)呈現顯著增加(圖8及9)，且此作用在所測試之劑量及時間點處皆可見(研究#1)。此等結果在後一研究(研究#2) (各群組中之10隻小鼠用1.6e10 vg/小鼠劑量)中重複(圖10)。研究#2確認，無內含子之TTRm hFVIII (AAV-INTL)比含有合成內含子的載體(AAV-WINT)更有效，且此等差異持續至少8週。實例 6 ： NHP 中之 效能 ， 研究 1
在NHP中比較AAV-INTL及AAV-WINT之AAV載體效能(研究#1)。將年齡介於24與50個月之間、體重介於2-6 kg之間且對AAV中和抗體呈陰性之12隻雄性食蟹獼猴(食蟹猴(Macaca fascicularis ))分成4個隨機組且基於表1中所展示之劑量組用單一劑量之AAV-WINT或AAV-INTL靜脈內注射。隨後，每週獲得血漿樣本以確定循環hFVIII含量。表 1 . 來 自 NHP 研究之 群組 名稱及劑量水準
Figure 108130505-A0304-0001
用AAV-WINT或AAV-INTL給藥之猴血漿中之hFVIII含量在整個8週研究中以每週一次間隔藉由ELISA來測定。在此研究中測試之任一劑量下，2e12 vg/kg (圖11)或6e12 vg/kg (圖12)，不論時間點，觀測到循環hFVIII之含量基於峰值循環值增加2至4倍。如所預期，吾等在治療後2-3週觀測到表現降低，從而指示出現針對BDD hFVIII之抑制性抗體。第一研究之結果表明，在NHP中AAV-INTL相對於AAV-WINT顯示增加之效能。實例 7 ： NHP 中之 效能 ， 研究 2
在NHP中進行第二研究(研究#2)以確認AAV-INTL相對於AAV-WINT增加的載體效能。將年齡介於24與50個月之間、體重介於2-6 kg之間且對AAV中和抗體呈陰性之十隻雄性食蟹獼猴(食蟹猴)分成2個隨機組且用單一劑量(2e12 vg/kg)之AAV-WINT或AAV-INTL靜脈內注射。隨後，每週獲得血漿樣本以確定循環hFVIII含量。
用AAV-WINT或AAV-INTL給藥之獼猴血漿中之hFVIII含量在整個8週研究中以每週一次間隔藉由ELISA來測定。在此研究中測試之劑量下，2e12 vg/kg，不論時間點，觀測到循環hFVIII含量基於峰值循環值增加4至7倍(圖13)。如先前見於NHP中，歸因於針對BDD hFVIII之抑制性抗體的出現，觀測到在治療後2-3週轉基因之表現降低。研究#2之結果確認，在NHP中AAV-INTL相對於AAV-WINT顯示增加之效能。實例 8 ：載體效能之判定
為確認恰當載體以恰當濃度給藥至NHP的各群組中，劑量調配物效價藉由qPCR來測定，且儲備載體中合成內含子之存在或不存在藉由允許區別AAV-WINT與AAV-INTL的基因分型PCR檢定來檢定。為直接評定未經稀釋儲備載體及2e12 vg/kg劑量調配物兩者之載體效能，利用基於細胞之效能檢定。
人類肝臟細胞株用連續稀釋之載體轉導，且效能藉由利用hFVIII活性檢定(Chromogenix Coatest SP4)評估上清液中之經分泌BDD hFVIII來測定。在所有MOI下，AAV-INTL相對於AAV-WINT呈現增加之效能(圖14)。值得注意地，儲備病毒及稀釋調配物在載體組內展示類似效能，從而進一步確認恰當地製備2e12 vg/kg組中之劑量調配物的效價。另外，在各MOI下，在與AAV-WINT相比時，AAV-INTL顯示效能大致增加4倍(圖15)。此等值與NHP研究1及2中所觀測到的AAV-INTL之效能增加一致。實例 9 ：批次比較
第一及第二NHP研究使用不同批次之AAV-WINT及AAV-INTL載體。為評定不同批次中之載體效能是否相當，效能使用活體外檢定來量測(圖16)。此等比較之結果展示，批料間變化極小，且AAV-INTL類似地仍比AAV-WINT有效約4至5倍。實例 10 ：表現卡匣效率之判定
為探究活體內效能增加之機制，測定在不存在病毒轉導的情況下之轉錄效率。人類肝臟細胞株經含有表現卡匣之質體轉染，該等表現卡匣分別構成AAV-WINT及AAV-INTL、TTRm-內含子-BDD-hFVIII及無內含子的TTRm-BDD-hFVIII (SEQ ID NO:1)。藉由人類FVIII活性檢定(Chromogenix Coatest SP4)來檢定來自此等細胞之上清液的hFVIII含量。
TTRm-內含子-BDD-hFVIII之三種獨立DNA製劑與無內含子TTRm-BDD-hFVIII (SEQ ID NO:1)之兩種獨立DNA製劑的比較顯示類似的hFVIII含量，以及在去除內含子時朝向減少表現的趨勢(圖17)。儘管不希望受任何理論束縛，但資料表明非轉錄機制正驅動AAV-INTL之效能增加超過AAV-WINT。實例 11 ：資料論述
在等效劑量下，AAV-INTL在細胞培養物、小鼠及NHP模型中呈現超過AAV-WINT的增加效能及BDD-hFVIII之表現。在機制上，增加之效能不明顯地歸因於來自表現卡匣之FVIII轉基因的增加轉錄，反而可能歸因於增加之病毒封裝效率或替代機制。此等結果指示，無內含子表現卡匣在人類臨床試驗中可具有增加之效能，且對患者安全性及療效提供益處。實例 12 ：人類臨床試驗結果
在患有A型血友病之四名男性(N = 4)中執行單一劑量研究，概述於表4中。所有四名參與者以5 × 1011 vg/kg之劑量接受衣殼化於LK03 AAV載體(SEQ ID NO:91)中之AAV-INTL hFVIII-BDD表現卡匣(SEQ ID NO:1)的單一輸注，本文中稱為「LK03-INTL hFVIII-BDD」。 表4.
Figure 108130505-A0304-0002
發現LK03-INTL hFVIII-BDD載體在所有四名參與者中驅動FVIII表現(圖18-19)。
實例 13 ： 序列 表2. SEQ ID NO及描述
Figure 108130505-A0304-0003
 AAV-INTL表現卡匣之整個核酸序列(5' ITR、TTRm、hFVIII-BDD、PolyA及3' ITR) (SEQ ID NO:1)及圖例(表3)：
Figure 02_image001
Figure 02_image003
Figure 02_image005
表3.SEQ ID NO:1之特徵
Figure 108130505-A0304-0004
 野生型TTR啟動子(SEQ ID NO:2)。下文4個加下劃線之核苷酸在突變之TTR啟動子(SEQ ID NO:3)中改變。
Figure 02_image007
突變之TTR啟動子(4個核苷酸改變；加下劃線)「TTRm」(SEQ ID NO:3)：
Figure 02_image009
CpG1-TTRm之核酸序列(SEQ ID NO:4)。在CpG1中，對於所有四個CpG而言，各C改變成T (加雙下劃線)。在將序列選殖至FVIII表現卡匣中時，MluI (acgcgt)及PmeI (gtttaaac)限制位點分別在5'及3'端處。SEQ ID NO:5為具有此等限制酶位點之CpG1-TTRm (加下劃線)。 SEQ ID NO:4：
Figure 02_image011
SEQ ID NO:5：
Figure 02_image013
CpG2-TTRm之核酸序列(SEQ ID NO:6)。在CpG2中，在第二、第三及第四個CpG中，C改變成T (加雙下劃線)。在將序列選殖至FVIII表現卡匣中時，MluI (acgcgt)及PmeI (gtttaaac)限制位點分別在5'及3'端處。SEQ ID NO:7為具有此等限制酶位點之CpG2-TTRm (加下劃線)。 SEQ ID NO:6：
Figure 02_image015
SEQ ID NO:7：
Figure 02_image017
CpG3-TTRm之核酸序列(SEQ ID NO:8)。在CpG3中，在第一、第三及第四個CpG中，C改變成T (加雙下劃線)。在將序列選殖至FVIII表現卡匣中時，MluI (acgcgt)及PmeI (gtttaaac)限制位點分別在5'及3'端處。SEQ ID NO:9為具有此等限制酶位點之CpG3-TTRm (加下劃線)。 SEQ ID NO:8：
Figure 02_image019
SEQ ID NO:9：
Figure 02_image021
CpG4-TTRm之核酸序列(SEQ ID NO:10)。在CpG4中，在第一、第二及第四個CpG中，C改變成T (加雙下劃線)。在將序列選殖至FVIII表現卡匣中時，MluI (acgcgt)及PmeI (gtttaaac)限制位點分別在5'及3'端處。SEQ ID NO:11為具有此等限制酶位點之CpG4-TTRm (加下劃線)。 SEQ ID NO:10：
Figure 02_image023
SEQ ID NO:11：
Figure 02_image025
CpG5-TTRm之核酸序列(SEQ ID NO:12)。在CpG5中，在第一、第二及第三個CpG中，C改變成T (加雙下劃線)。在將序列選殖至FVIII表現卡匣中時，MluI (acgcgt)及PmeI (gtttaaac)限制位點分別在5'及3'端處。SEQ ID NO:13為具有此等限制酶位點之CpG5-TTRm (加下劃線)。 SEQ ID NO:12：
Figure 02_image027
Figure 02_image029
SEQ ID NO:13：
Figure 02_image031
Hybrid6啟動子(TTR/hAAT/白蛋白雜合體)之核酸序列(SEQ ID NO:14)。在單一CpG二核苷酸中，G改變成A (加雙下劃線)。在將序列選殖至FVIII表現卡匣中時，MluI (acgcg)及PmeI (gtttaaac)限制位點分別在5'及3'端處。(斜體= TTR，下劃線=白蛋白，粗體= hAAT。)SEQ ID NO:15為具有此等限制酶位點之Hybrid6啟動子。
Figure 02_image033
Hybrid7啟動子(TTR/hAAT雜合體)之核酸序列(SEQ ID NO:16)。在兩個CpG二核苷酸中，C改變成T (加雙下劃線)。在將序列選殖至FVIII表現卡匣中時，MluI (acgcg)及PmeI (gtttaaac)限制位點分別在5'及3'端處。(斜體= TTR，粗體= hAAT。)SEQ ID NO:17為具有此等限制酶位點之Hybrid7啟動子。
Figure 02_image035
Hybrid8啟動子(TTR/FGG (血纖維蛋白原γ鏈基因啟動子)/白蛋白啟動子雜合體)之核酸序列(SEQ ID NO:18)。在單一CpG二核苷酸中，G改變成A (加雙下劃線)。在將序列選殖至FVIII表現卡匣中時，MluI (acgcgt)及PmeI (gtttaaac)限制位點分別在5'及3'端處。(底線=白蛋白，加下劃線斜體= FGG，斜體= TTR。)SEQ ID NO:19為具有此等限制酶位點之Hybrid8啟動子。
Figure 02_image037
Hybrid9啟動子(TTR/FGG/hAAT/SAA1雜合體)之核酸序列(SEQ ID NO:20)。在所有三個CpG二核苷酸中，C改變成T (加雙下劃線)。在將序列選殖至FVIII表現卡匣中時，MluI (acgcgt)及PmeI (tttaaac)限制位點分別在5'及3'端處。(斜體= TTR，粗體= hAAT，加下劃線斜體= FGG，加下劃線粗體= SAA1。)SEQ ID NO:21為具有此等限制酶位點之Hybrid9啟動子。
Figure 02_image039
非CpG減少之ApoE/hAAT調節元件的核酸序列(SEQ ID NO:22)。序列含有總共16個CpG (加雙下劃線)。C/EBP (CCAAT/強化子-結合蛋白)位點加下劃線。
Figure 02_image041
在5'及3'端處藉由ApaI限制位點側接之非CpG減少之ApoE/hAAT調節單元的核酸序列(SEQ ID NO:23)。序列含有總共16個CpG (加雙下劃線)。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，使用ApaI限制位點。
Figure 02_image043
CpG1-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:24)。除在G改變成A的第七個CpG中之外，各C改變成T。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:25為具有此等限制酶位點之CpG1-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image045
CpG2-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:26)。除保留第一個CpG無改變且在第七個CpG中G改變成A之外，各C改變成T。不變的「c」呈粗體形式。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點分別在5'及3'端處。SEQ ID NO:27為具有此等限制酶位點之CpG2-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image047
CpG3-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:28)。除保留第二個CpG無改變且在第七個CpG中G改變成A之外，各C改變成T。不變的「c」呈粗體形式。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:29為具有此等限制酶位點之CpG3-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image049
CpG4-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:30)。除保留第三個CpG無改變且在第七個CpG中G改變成A之外，各C改變成T。不變的「c」呈粗體形式。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:31為具有此等限制酶位點之CpG4-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image051
CpG5-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:32)。除保留第四個CpG無改變且在第七個CpG中G改變成A之外，各C改變成T。不變之CpG (第四個)呈粗體形式。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:33為具有此等限制酶位點之CpG5-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image053
CpG6-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:34)。除保留第五個CpG無改變且在第七個CpG中G改變成A之外，各C改變成T。不變之CpG (第五個)呈粗體形式。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:35為具有此等限制酶位點之CpG6-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image055
CpG7-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:36)。除保留第六個CpG無改變且在第七個CpG中G改變成A之外，各C改變成T。不變之CpG (第六個)呈粗體形式。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:37為具有此等限制酶位點之CpG7-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image057
CpG8-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:38)。除保留第七個位點無改變之外，各C改變成T。不變之CpG (第七個)呈粗體形式。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:39為具有此等限制酶位點之CpG8-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image059
CpG9-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:40)。除保留第八個CpG無改變且在第七個CpG中G改變成A之外，各C改變成T。不變之CpG (第八個)呈粗體形式。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:41為具有此等限制酶位點之CpG9-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image061
CpG10-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:42)。除保留第九個CpG無改變且在第七個CpG中G改變成A之外，各C改變成T。不變之CpG (第九個)呈粗體形式。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:43為具有此等限制酶位點之CpG10-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image063
CpG11-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:44)。除保留第十個CpG無改變且在第七個CpG中G改變成A之外，各C改變成T。不變之CpG (第十個)呈粗體形式。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:45為具有此等限制酶位點之CpG11-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image065
CpG12-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:46)。除保留第十一個CpG無改變且在第七個CpG中G改變成A之外，各C改變成T。不變之CpG (第十一個)呈粗體形式。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:47為具有此等限制酶位點之CpG12-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image067
CpG13-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:48)。除保留第十二個CpG無改變且在第七個CpG中G改變成A之外，各C改變成T。不變之CpG (第十二個)呈粗體形式。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:49為具有此等限制酶位點之CpG13-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image069
CpG14-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:50)。除保留第十三個CpG無改變且在第七個CpG中G改變成A之外，各C改變成T。不變之CpG (第十三個)呈粗體形式。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:51為具有此等限制酶位點之CpG14-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image071
CpG15-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:52)。除保留第十四個CpG無改變且在第七個CpG中G改變成A之外，各C改變成T。不變之CpG (第十四個)呈粗體形式。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:53為具有此等限制酶位點之CpG15-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image073
CpG16-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:54)。除保留第十五個CpG無改變且在第七個CpG中G改變成A之外，各C改變成T。不變之CpG (第十五個)呈粗體形式。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:55為具有此等限制酶位點之CpG16-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image075
CpG17-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:56)。除保留第十六個CpG無改變且在第七個CpG中G改變成A之外，各C改變成T。不變之CpG (第十六個)呈粗體形式。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:57為具有此等限制酶位點之CpG17-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image077
CpG18-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:58)。去除第五、第七、第八、第十及第十一個CpG之C，且對於剩餘CpG而言，C改變成T。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:59為具有此等限制酶位點之CpG18-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image079
CpG19-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:60)。在第一至第五及第八至第十一個CpG中，C改變成T，且去除第七個CpG之C。所有剩餘CpG (第六及第十二至第十六個)不變(粗體)。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:61為具有此等限制酶位點之CpG19-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image081
CpG20-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:62)。不含推定轉錄因子結合位點之區域的多個刪除之結果。在唯一剩餘CpG (SEQ ID NO:22之第七個CpG)中G改變成A。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:63為具有此等限制酶位點之CpG20-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image083
CpG21-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:64)。除G分別改變成C及A的第五及第六個CpG之外，在所有CpG中C改變成T。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:65為具有此等限制酶位點之CpG21-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image085
CpG22-ApoE/hAAT之核酸序列(SEQ ID NO:66)。除保留第五個CpG無改變(粗體)且在第六個CpG中將G改變成A之外，在所有CpG中C改變成T。在將序列選殖至FIX表現卡匣中時，ApaI限制位點在5'及3'端處。SEQ ID NO:67為具有此等限制酶位點之CpG22-ApoE/hAAT (加下劃線)。
Figure 02_image087
FVIII-BDD之胺基酸序列(SQ序列粗體/加下劃線) (SEQ ID NO:68)。
Figure 02_image089
SQ序列(SEQ ID NO:69)。
Figure 02_image091
野生型FVIII-BDD cDNA (SEQ ID NO:70)。
Figure 02_image093
Figure 02_image095
Figure 02_image097
編碼FVIII-BDD的CpG減少之核酸變異體(SEQ ID NO:71)
Figure 02_image099
Figure 02_image101
編碼FVIII-BDD的CpG減少之核酸變異體(SEQ ID NO:72)
Figure 02_image103
Figure 02_image105
Figure 02_image107
編碼FVIII-BDD的CpG減少之核酸變異體(SEQ ID NO:73)
Figure 02_image109
Figure 02_image111
編碼FVIII-BDD的CpG減少之核酸變異體(SEQ ID NO:74)
Figure 02_image113
Figure 02_image115
Figure 02_image117
編碼FVIII-BDD的CpG減少之核酸變異體(SEQ ID NO:75)
Figure 02_image119
Figure 02_image121
編碼FVIII-BDD的CpG減少之核酸變異體(SEQ ID NO:76)
Figure 02_image123
Figure 02_image125
Figure 02_image127
編碼FVIII-BDD的CpG減少之核酸變異體(SEQ ID NO:77)。
Figure 02_image129
Figure 02_image131
編碼FVIII-BDD的CpG減少之核酸變異體(SEQ ID NO:78)
Figure 02_image133
Figure 02_image135
Figure 02_image137
編碼FVIII-BDD的CpG減少之核酸變異體(SEQ ID NO:79)
Figure 02_image139
Figure 02_image141
編碼FVIII-BDD的CpG減少之核酸變異體(SEQ ID NO:80)
Figure 02_image143
Figure 02_image145
Figure 02_image147
編碼FVIII-BDD的CpG減少之核酸變異體(SEQ ID NO:81)
Figure 02_image149
Figure 02_image151
編碼FVIII-BDD的CpG減少之核酸變異體(SEQ ID NO:82)
Figure 02_image153
Figure 02_image155
Figure 02_image157
編碼FVIII-BDD的CpG減少之核酸變異體(SEQ ID NO:83)
Figure 02_image159
Figure 02_image161
編碼FVIII-BDD的CpG減少之核酸變異體(SEQ ID NO:84)
Figure 02_image163
Figure 02_image165
編碼FVIII-BDD的CpG減少之核酸變異體(SEQ ID NO:85)
Figure 02_image167
Figure 02_image169
編碼FVIII-BDD的CpG減少之核酸變異體(SEQ ID NO:86)
Figure 02_image171
Figure 02_image173
編碼FVIII-BDD的CpG減少之核酸變異體(SEQ ID NO:87)
Figure 02_image175
Figure 02_image177
Figure 02_image179
編碼FVIII-BDD的CpG減少之核酸變異體(SEQ ID NO:88)
Figure 02_image181
Figure 02_image183
FVIII V3 cDNA (SEQ ID NO:89)
Figure 02_image185
Figure 02_image187
Figure 02_image189
FVIII CO3 cDNA (SEQ ID NO:90)
Figure 02_image191
Figure 02_image193
AAV-LK03 VP1衣殼(SEQ ID NO:91)
Figure 02_image195
Figure 02_image197
AAV-SPK VP1衣殼(SEQ ID NO:92)
Figure 02_image199
AAV-WINT中之內含子的核酸序列(SEQ ID NO:93)
Figure 02_image201
FIX (SEQ ID NO:94)
Figure 02_image203
Figure 02_image205
圖 1 展示標記為「CpG1」至「CpG22」之CpG減少之ApoE/hAAT調節元件hFIX編碼構築體的流體動力遞送後24小時，小鼠血漿中藉由活性檢定來量測之人類因子IX (hFIX)水準。SEQ ID NO:24-67分別對應於含有或不含有限制酶位點之調節元件CpG1-ApoE/hAAT至CpG22-ApoE/hAAT，且在實例13中進一步描述。hFIX水準以含有非CpG減少之ApoE/hAAT (SEQ ID NO:23)之參考質體的倍數表示。
圖 2 展示標記為「CpG1」至「CpG5」之CpG減少之TTRm啟動子hFVIII編碼構築體的流體動力遞送後24小時，小鼠血漿中藉由ELISA檢定來量測之人類因子VIII (hFVIII)抗原水準。SEQ ID NO:4-21分別對應於具有或不具有側接限制酶位點之啟動子CpG1-TTRm至CpG5-TTRm，且在實例13中進一步描述。水準以正常人類血漿FVIII之百分比表示，其中100% = 150 ng/mL。「TTRm」係指含有非CpG減少之TTRm啟動子(SEQ ID NO:3)的hFVIII編碼構築體。
圖 3 展示標記為「Hybrid 6」至「Hybrid 9」之CpG減少之雜合啟動子hFVIII編碼構築體的流體動力遞送後24小時，小鼠血漿中藉由ELISA檢定來量測之hFVIII抗原水準。SEQ ID NO:14-21分別對應於CpG減少之啟動子Hybrid6至Hybrid9。水準以正常人類血漿FVIII之百分比表示，其中100% = 150 ng/mL。「TTRm」係指含有非CpG減少之TTRm啟動子(SEQ ID NO:3)的hFVIII編碼構築體。
圖 4 展示呈6.4e11載體基因組(vg)/kg之劑量的AAV衣殼化非CpG減少(TTRm)及CpG減少之Hybrid 6、7、8及9啟動子hFVIII構築體的遞送後2、4及8週，小鼠血漿中藉由ELISA檢定來量測之hFVIII抗原水準。水準以正常人類血漿FVIII之百分比表示，其中100% = 150 ng/mL。
圖 5 展示呈2.56e11、6.4e11及1.6e12 vg/kg之劑量範圍的AAV衣殼化非CpG減少(TTRm-hFVIII)、Hybrid 7及Hybrid 9啟動子hFVIII構築體之遞送後8週，小鼠血漿中藉由ELISA檢定來量測之hFVIII抗原水準。水準以正常人類血漿FVIII之百分比表示，其中100% = 150 ng/mL。
圖 6 展示在以6.4e11 vg/kg之劑量靜脈內投與AAV衣殼化非CpG減少(TTRm-hFVIII)、Hybrid 7及Hybrid 9啟動子hFVIII構築體之後8週，小鼠肝臟、大腦、睪丸、脾臟及腎臟中之hFVIII mRNA之表現。在除肝臟外之任何組織中未觀測到hFVIII RNA，從而表明啟動子之肝臟特異性性質。自左至右分別針對TTRm-hFVIII、Hybrid7-hFVIII及Hybrid9-hFVIII展示肝臟、大腦、睪丸、脾臟及腎臟的結果組。
圖 7 展示稱為「AAV-WINT」(TTRm-內含子-hFVIII-BDD)之具有內含子的表現卡匣與稱為「AAV-INTL」(無內含子之TTRm-hFVIII-BDD；SEQ ID NO:1)之不具有內含子之表現卡匣的示意性比較。AAV-WINT具有位於TTRm啟動子與編碼B域刪除之人類因子VIII (hFVIII-BDD)的轉基因之間的合成內含子(SEQ ID NO:93)，其不存在於AAV-INTL中。編碼hFVIII-BDD的此等卡匣中之經密碼子最佳化之核酸序列闡述於SEQ ID NO:77中。
圖 8 展示如藉由對來自研究#1之6.4e9 vg/小鼠劑量的小鼠血漿樣本執行的ELISA偵測之hFVIII水準。結果為各治療組中之動物(n=5)的平均值。誤差條表示標準差。
圖 9 展示如藉由對來自研究#1之1.6e10 vg/小鼠劑量的小鼠血漿樣本執行的ELISA偵測之hFVIII水準。結果為各治療組中之動物(TTRm hFVIII，n=4；無內含子之TTRm hFVIII，n=5)的平均值。誤差條表示標準差。
圖 10 展示如藉由對來自研究#2之小鼠血漿樣本執行的ELISA偵測之hFVIII水準。結果為各治療組中之動物(n=10)的平均值。誤差條表示標準差。
圖 11 展示如藉由對來自研究#1之非人類靈長類(NHP)血漿樣本執行的ELISA偵測之hFVIII水準。展示來自低劑量(2e12 vg/kg)第1組(AAV-WINT，具有方框的線，n=2)及第2組(AAV-INTL，SEQ ID NO:1，具有三角形的線，n=3)之個體猴的結果。歸因於在給藥前8天樣本中觀測到針對AAV之陽性中和抗體而去除一個來自低劑量AAV-WINT之動物P0001。
圖 12 展示如藉由對來自研究#1之NHP血漿樣本執行的ELISA偵測之hFVIII水準。展示高劑量(6e12 vg/kg)第3組(AAV-WINT，具有方框之線，n=2)及第4組(AAV-INTL，SEQ ID NO:1，具有三角形的線，n=3)中之個體猴的結果。歸因於在治療時未觀測到hFVIII表現而去除一個來自高劑量AAV-WINT之動物P0101。
圖 13 展示如藉由對來自研究#2之NHP血漿樣本執行的ELISA偵測之hFVIII水準。展示AAV-WINT (具有方框之線，n=5)及AAV-INTL (SEQ ID NO:1，具有三角形的線，n=5)之2e12 vg/kg劑量下的個體猴之結果。
圖 14 展示在三個不同感染多重性(MOI)下之基於細胞的載體效能檢定之結果。細胞上清液藉由Chromogenix Coatest SP4來評定hFVIII活性且為兩次重複檢定之兩個生物複本之平均值。誤差條表示標準差。「AAV-WINT」及「AAV-INTL」為原始未經稀釋之病毒儲備瓶，而「AAV-WINT劑量」及「AAV-INTL劑量」指示經稀釋以用於輸注的材料。
圖 15 展示來自圖14之重新繪製為各MOI之倍數變化相對於AAV-WINT的結果。
圖 16 展示在三個不同MOI下之活體外基於細胞的載體效能檢定中之載體效能的評估。細胞上清液藉由Chromogenix Coatest SP4來評定hFVIII活性且為兩次重複檢定之兩個生物複本之平均值。誤差條表示標準差。AAV-WINT及AAV-INTL (SEQ ID NO:1)為來自兩個不同批次的原始病毒儲備瓶。
圖 17 展示自經mTTR-內含子-hFVIII-BDD及mTTR-hFVIII-BDD (SEQ ID NO:1)之獨立質體DNA製劑(prep)轉染的Huh7細胞上清液藉由Chromogenix Coatest SP4檢定的表現卡匣之活體外hFVIII水準的比較。個體資料點展示為實心圓，其中各條柱表示兩次重複檢定之兩個生物複本(n=2)的平均值。誤差條表示標準差。
圖 18 展示用5 × 1011 vg/kg之在LK03 AAV載體(SEQ ID NO:91)中衣殼化之AAV-INTL hFVIII表現卡匣(SEQ ID NO:1) (在本文中稱為LK03-INTL hFVIII-BDD)輸注的4名人類個體(參與者1 (圓圈)、2(方形)、3 (三角形)及4 (菱形))中之每日FVIII活性水準。
圖 19 展示用5 × 1011 vg/kg之LK03-INTL hFVIII-BDD輸注之4名人類個體(參與者1 (圓圈)、2 (方形)、3 (三角形)及4 (菱形))中之FVIII活性水準的每週平均值。
圖 20 展示用5 × 1011 vg/kg之LK03-INTL hFVIII-BDD輸注之4名人類個體(參與者1 (圓圈)、2 (方形)、3 (三角形)及4 (菱形))中之FVIII活性水準的四周模塊平均值。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053
Figure 12_A0101_SEQ_0054
Figure 12_A0101_SEQ_0055
Figure 12_A0101_SEQ_0056
Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
Figure 12_A0101_SEQ_0059
Figure 12_A0101_SEQ_0060
Figure 12_A0101_SEQ_0061
Figure 12_A0101_SEQ_0062
Figure 12_A0101_SEQ_0063
Figure 12_A0101_SEQ_0064
Figure 12_A0101_SEQ_0065
Figure 12_A0101_SEQ_0066
Figure 12_A0101_SEQ_0067
Figure 12_A0101_SEQ_0068
Figure 12_A0101_SEQ_0069
Figure 12_A0101_SEQ_0070
Figure 12_A0101_SEQ_0071
Figure 12_A0101_SEQ_0072
Figure 12_A0101_SEQ_0073
Figure 12_A0101_SEQ_0074
Figure 12_A0101_SEQ_0075
Figure 12_A0101_SEQ_0076
Figure 12_A0101_SEQ_0077
Figure 12_A0101_SEQ_0078
Figure 12_A0101_SEQ_0079
Figure 12_A0101_SEQ_0080
Figure 12_A0101_SEQ_0081
Figure 12_A0101_SEQ_0082
Figure 12_A0101_SEQ_0083
Figure 12_A0101_SEQ_0084
Figure 12_A0101_SEQ_0085
Figure 12_A0101_SEQ_0086
Figure 12_A0101_SEQ_0087
Figure 12_A0101_SEQ_0088
Figure 12_A0101_SEQ_0089
Figure 12_A0101_SEQ_0090
Figure 12_A0101_SEQ_0091
Figure 12_A0101_SEQ_0092
Figure 12_A0101_SEQ_0093
Figure 12_A0101_SEQ_0094
Figure 12_A0101_SEQ_0095
Figure 12_A0101_SEQ_0096
Figure 12_A0101_SEQ_0097
Figure 12_A0101_SEQ_0098
Figure 12_A0101_SEQ_0099
Figure 12_A0101_SEQ_0100
Figure 12_A0101_SEQ_0101
Figure 12_A0101_SEQ_0102
Figure 12_A0101_SEQ_0103
Figure 12_A0101_SEQ_0104
Figure 12_A0101_SEQ_0105
Figure 12_A0101_SEQ_0106
Figure 12_A0101_SEQ_0107
Figure 12_A0101_SEQ_0108
Figure 12_A0101_SEQ_0109
Figure 12_A0101_SEQ_0110
Figure 12_A0101_SEQ_0111
Figure 12_A0101_SEQ_0112
Figure 12_A0101_SEQ_0113
Figure 12_A0101_SEQ_0114
Figure 12_A0101_SEQ_0115
Figure 12_A0101_SEQ_0116
Figure 12_A0101_SEQ_0117
Figure 12_A0101_SEQ_0118
Figure 12_A0101_SEQ_0119
Figure 12_A0101_SEQ_0120

Claims (104)

  1. 一種表現卡匣，其包含編碼具有B域刪除之因子VIII蛋白(FVIII-BDD)的核酸序列，其中該表現卡匣包含與SEQ ID NO:1之序列至少98%一致的序列。
  2. 如請求項1之表現卡匣，其中該表現卡匣包含與SEQ ID NO:1之序列至少99%一致的序列。
  3. 如請求項1之表現卡匣，其中該表現卡匣包含SEQ ID NO:1之序列。
  4. 如請求項1之表現卡匣，其中該表現卡匣由SEQ ID NO:1之序列組成。
  5. 一種表現卡匣，其包含可操作地連接至編碼具有B域刪除之因子VIII蛋白(FVIII-BDD)的核酸序列之調節元件，其中在該調節元件與該核酸序列之間不存在內含子，並且其中該表現卡匣包含與SEQ ID NO:1至少91%一致的序列。
  6. 一種表現卡匣，其包含 a. 調節元件，其與SEQ ID NO:2-67中之任一者的序列至少90%一致，及 b. 核酸序列，其編碼具有B域刪除之因子VIII蛋白(FVIII-BDD)，該核酸序列與SEQ ID NO:77之序列具有至少90%之一致性， 其中該調節元件可操作地連接至該核酸序列，且其中在該調節元件與該核酸序列之間不存在內含子。
  7. 一種表現卡匣，其包含 a. 調節元件，其與SEQ ID NO:2-67中之任一者的序列至少90%一致，及 b. 核酸序列，其編碼具有B域刪除之因子VIII蛋白(FVIII-BDD)，該核酸序列與SEQ ID NO:77之序列具有至少90%之一致性， 其中該調節元件可操作地連接至該核酸序列，且其中未轉譯核酸之不超過0-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-105、106或107個核苷酸在該調節元件與該核酸序列之間。
  8. 如請求項5至7中任一項之表現卡匣，其中該調節元件包含與SEQ ID NO:2-67中之任一者至少95%一致的核苷酸序列。
  9. 如請求項5至8中任一項之表現卡匣，其中該調節元件具有與SEQ ID NO:4-21或24-67中之任一者之序列中所闡述相同總數目之減少CpG。
  10. 如請求項5至9中任一項之表現卡匣，其中該調節元件包含使CpG在與SEQ ID NO:4-21或24-67中之任一者之序列中所闡述之相同位置處經取代成CpT、CpA、TpG或ApG的SEQ ID NO:2-21或24-67中之任一者之序列。
  11. 如請求項5至10中任一項之表現卡匣，其中該核酸序列在與來自在該調節元件與該核酸序列之間具有(a)內含子或(b)未轉譯核酸之108個或更多個核苷酸的表現卡匣之表現相比時呈現更大表現。
  12. 如請求項5至11中任一項之表現卡匣，其中該經編碼FVIII-BDD在與來自在該調節元件與該核酸序列之間具有(a)內含子或(b)未轉譯核酸之108個或更多個核苷酸的表現卡匣之表現相比時呈現更大生物活性。
  13. 如請求項12之表現卡匣，其中生物活性藉由凝固檢定或FVIII檢定或FVIII缺乏模型中之減少出血來測定。
  14. 如請求項5至13中任一項之表現卡匣，其中該表現卡匣在與封裝在該調節元件與該核酸序列之間具有(a)內含子或(b)未轉譯核酸之108個或更多個核苷酸的表現卡匣相比時更有效地封裝至AAV載體中。
  15. 一種核酸序列，其包含經修飾成具有較少胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸(CpG)之SEQ ID NO:2、3、22或23。
  16. 如請求項15之核酸序列，其包含經修飾成具有少1個CpG之SEQ ID NO:2、3、22或23。
  17. 如請求項15之核酸序列，其包含經修飾成具有少2個CpG之SEQ ID NO:2、3、22或23。
  18. 如請求項15之核酸序列，其包含經修飾成具有少3個CpG之SEQ ID NO:2、3、22或23。
  19. 如請求項15之核酸序列，其包含經修飾成具有少4個CpG之SEQ ID NO:2、3、22或23。
  20. 如請求項15之核酸序列，其包含經修飾成具有少5個CpG之SEQ ID NO:22或23。
  21. 如請求項15之核酸序列，其包含經修飾成具有少6個CpG之SEQ ID NO:22或23。
  22. 如請求項15之核酸序列，其包含經修飾成具有少7個CpG之SEQ ID NO:22或23。
  23. 如請求項15之核酸序列，其包含經修飾成具有少8個CpG之SEQ ID NO:22或23。
  24. 如請求項15之核酸序列，其包含經修飾成具有少9個CpG之SEQ ID NO:22或23。
  25. 如請求項15之核酸序列，其包含經修飾成具有少10個CpG之SEQ ID NO:22或23。
  26. 如請求項15之核酸序列，其包含經修飾成具有少11個CpG之SEQ ID NO:22或23。
  27. 如請求項15之核酸序列，其包含經修飾成具有少12個CpG之SEQ ID NO:22或23。
  28. 如請求項15之核酸序列，其包含經修飾成具有少13個CpG之SEQ ID NO:22或23。
  29. 如請求項15之核酸序列，其包含經修飾成具有少14個CpG之SEQ ID NO:22或23。
  30. 如請求項15之核酸序列，其包含經修飾成具有少15個CpG之SEQ ID NO:22或23。
  31. 如請求項15之核酸序列，其包含經修飾成具有少16個CpG之SEQ ID NO:22或23。
  32. 如請求項15之核酸序列，其包含經修飾成具有1或0個CpG之SEQ ID NO:2、3、22或23。
  33. 如請求項15之核酸序列，其包含經修飾成具有0個CpG之SEQ ID NO:2、3、22或23。
  34. 如請求項15至33中任一項之核酸序列，其中來自SEQ ID NO:2、3、22或23中之5'端的至少第一個CpG經修飾成不為CpG。
  35. 如請求項15至33中任一項之核酸序列，其中來自SEQ ID NO:2、3、22或23中之5'端的至少第二個CpG經修飾成不為CpG。
  36. 如請求項15至33中任一項之核酸序列，其中來自SEQ ID NO:2、3、22或23中之5'端的至少第三個CpG經修飾成不為CpG。
  37. 如請求項15至33中任一項之核酸序列，其中來自SEQ ID NO:2、3、22或23中之5'端的至少第四個CpG經修飾成不為CpG。
  38. 如請求項15至33中任一項之核酸序列，其中來自SEQ ID NO:22或23中之5'端的至少第五個CpG經修飾成不為CpG。
  39. 如請求項15至33中任一項之核酸序列，其中來自SEQ ID NO:22或23中之5'端的至少第六個CpG經修飾成不為CpG。
  40. 如請求項15至33中任一項之核酸序列，其中來自SEQ ID NO:22或23中之5'端的至少第七個CpG經修飾成不為CpG。
  41. 如請求項15至33中任一項之核酸序列，其中來自SEQ ID NO:22或23中之5'端的至少第八個CpG經修飾成不為CpG。
  42. 如請求項15至33中任一項之核酸序列，其中來自SEQ ID NO:22或23中之5'端的至少第九個CpG經修飾成不為CpG。
  43. 如請求項15至33中任一項之核酸序列，其中來自SEQ ID NO:22或23中之5'端的至少第10個CpG經修飾成不為CpG。
  44. 如請求項15至33中任一項之核酸序列，其中來自SEQ ID NO:22或23中之5'端的至少第11個CpG經修飾成不為CpG。
  45. 如請求項15至33中任一項之核酸序列，其中來自SEQ ID NO:22或23中之5'端的至少第12個CpG經修飾成不為CpG。
  46. 如請求項15至33中任一項之核酸序列，其中來自SEQ ID NO:22或23中之5'端的至少第13個CpG經修飾成不為CpG。
  47. 如請求項15至33中任一項之核酸序列，其中來自SEQ ID NO:22或23中之5'端的至少第14個CpG經修飾成不為CpG。
  48. 如請求項15至33中任一項之核酸序列，其中來自SEQ ID NO:22或23中之5'端的至少第15個CpG經修飾成不為CpG。
  49. 如請求項15至33中任一項之核酸序列，其中來自SEQ ID NO:22或23中之5'端的至少第16個CpG經修飾成不為CpG。
  50. 一種核酸序列，其與如請求項15至49中任一項之核酸序列的該序列至少95%一致。
  51. 一種聚核苷酸，其包含與具有或不具有5'及/或3'側接5-7個核苷酸的SEQ ID NO:4-21或24-67中之任一者的序列至少95%一致之核酸序列。
  52. 一種聚核苷酸，其包含與SEQ ID NO:4-21或24-67中之任一者的序列至少95%一致且具有與SEQ ID NO:4-21或24-67中之任一者中所闡述相同數目之減少CpG的核酸序列。
  53. 一種聚核苷酸，其包含與SEQ ID NO:4-21或24-67中之任一者的序列至少95%一致且在與SEQ ID NO:4-21或24-67中之任一者中所闡述相同的位置處具有減少CpG之核酸序列。
  54. 如請求項15至53中任一項之核酸序列或聚核苷酸，其中該經修飾之SEQ ID NO:2、3、22或23使至少一個CpG中之G核苷酸經T或A核苷酸取代成CpT或CpA二核苷酸或使至少一個CpG中的C核苷酸經T或A核苷酸取代成TpG或ApG二核苷酸。
  55. 如請求項15至54中任一項之核酸序列或聚核苷酸，其中來自該經修飾之SEQ ID NO:22或23中之5'端的第七個CpG不使G核苷酸經取代。
  56. 如請求項15至54中任一項之核酸序列或聚核苷酸，其中來自該經修飾之SEQ ID NO:22或23中之5'端的第七個CpG使G核苷酸經T或A核苷酸取代成CpT或CpA二核苷酸。
  57. 如請求項15至54中任一項之核酸序列或聚核苷酸，其中來自該經修飾之SEQ ID NO:22或23中之5'端的第七個CpG使G核苷酸經T或A核苷酸取代成CpT或CpA二核苷酸，且該經修飾之SEQ ID NO:22或23中之至少一個額外CpG二核苷酸使G經T核苷酸取代成該經修飾之SEQ ID NO:22或23中之CpT二核苷酸。
  58. 如請求項15至54中任一項之核酸序列或聚核苷酸，其中來自該經修飾之SEQ ID NO:22或23中之5'端的第七個CpG使G核苷酸經T或A核苷酸取代成CpT或CpA二核苷酸，且該經修飾之SEQ ID NO:22或23中之至少一個額外CpG二核苷酸使G經A核苷酸取代成該經修飾之SEQ ID NO:22或23中之CpA二核苷酸。
  59. 如請求項15至54中任一項之核酸序列或聚核苷酸，其中來自該經修飾之SEQ ID NO:22或23中之5'端的第七個CpG使G核苷酸經T或A核苷酸取代成CpT或CpA二核苷酸，且該經修飾之SEQ ID NO:22或23中之至少兩個額外CpG使G經T核苷酸取代成該經修飾之SEQ ID NO:22或23中之CpT二核苷酸。
  60. 如請求項15至54中任一項之核酸序列或聚核苷酸，其中來自該經修飾之SEQ ID NO:22或23中之5'端的第七個CpG使G核苷酸經T或A核苷酸取代成CpT或CpA二核苷酸，且該經修飾之SEQ ID NO:22或23中之至少兩個額外CpG使G經A核苷酸取代成該經修飾之SEQ ID NO:22或23中之CpA二核苷酸。
  61. 如請求項15至60中任一項之核酸序列或聚核苷酸，其中該經修飾之SEQ ID NO:2、3、22或23使至少一個CpG中之G及/或C核苷酸刪除。
  62. 如請求項15至61中任一項之核酸序列或聚核苷酸，其可操作地連接至轉基因。
  63. 如請求項15至61中任一項之核酸序列或聚核苷酸，其中該核酸序列或聚核苷酸對可操作連接之轉基因賦予轉錄，該轉錄在由未修飾之SEQ ID NO:2、3、22或23賦予的該轉錄之約50%內。
  64. 如請求項15至61中任一項之核酸序列或聚核苷酸，其中該核酸序列或聚核苷酸對可操作連接之轉基因賦予轉錄，該轉錄在由未修飾之SEQ ID NO:2、3、22或23賦予的該轉錄之約25-50%內。
  65. 如請求項15至61中任一項之核酸序列或聚核苷酸，其中該核酸序列或聚核苷酸對可操作連接之轉基因賦予轉錄，該轉錄在由未修飾之SEQ ID NO:2、3、22或23賦予的該轉錄之約5-100%內。
  66. 一種表現卡匣，其包含如請求項15至61中任一項之核酸序列或聚核苷酸及轉基因。
  67. 如請求項66之表現卡匣，其中該核酸序列或聚核苷酸經定位在該轉基因之5'處。
  68. 如請求項66或67之表現卡匣，其中該轉基因編碼在肝臟細胞中表現且分泌於全身循環中之治療蛋白。
  69. 如請求項68之表現卡匣，其中該治療蛋白治療或預防神經退化性或中樞神經系統(CNS)疾病。
  70. 如請求項69之表現卡匣，其中該治療蛋白為保護性ApoE同功異型物。
  71. 如請求項70之表現卡匣，其中該治療蛋白為ApoE ε2同功異型物。
  72. 如請求項68之表現卡匣，其中該治療蛋白治療或預防自體免疫疾病或過敏性疾病。
  73. 如請求項72之表現卡匣，其中該治療蛋白為包含非所需抗原及驅動自細胞分泌該治療蛋白之前導序列的融合蛋白質。
  74. 如請求項73之表現卡匣，其中該非所需抗原為髓鞘寡樹突神經膠質細胞糖蛋白(MOG)細胞外域或其片段。
  75. 如請求項68之表現卡匣，其中該治療蛋白為血液凝結或凝固因子蛋白質。
  76. 如請求項75之表現卡匣，其中該血液凝結或凝固因子蛋白質為因子IX (FIX)、因子VIII (FVIII)、因子VII (FVII)或蛋白C。
  77. 如請求項76之表現卡匣，其中該因子VIII由與SEQ ID NO:68之序列至少95%一致的核酸序列編碼。
  78. 如請求項68之表現卡匣，其中該治療蛋白為溶酶體貯積酶。
  79. 如請求項78之表現卡匣，其中該溶酶體貯積酶為酸性α-葡糖苷酶(GAA)或α-半乳糖苷酶(GLA)。
  80. 如請求項68之表現卡匣，其中該治療蛋白治療或預防發炎性疾病或病症。
  81. 如請求項68之表現卡匣，其中該治療蛋白治療或預防遺傳性血管性水腫(HAE)。
  82. 如請求項81之表現卡匣，其中該治療蛋白為C1酯酶抑制劑(C1EI)。
  83. 一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含如請求項1至82中任一項之核酸序列或聚核苷酸或表現卡匣。
  84. 如請求項83之AAV載體，其中該AAV載體包含以下中之一或多者： a)AAV衣殼；及 b)一或多個AAV反向末端重複序列(ITR)，其中該AAV ITR側接該核酸序列、該聚核苷酸及/或該轉基因之5'或3'末端。
  85. 如請求項84之AAV載體，其進一步包含定位於該側接5'或3' ITR內之內含子。
  86. 如請求項85之AAV載體，其中該內含子或一或多個ITR中之至少一者經修飾成具有減少的CpG。
  87. 如請求項83至86中任一項之AAV載體，其中該AAV衣殼血清型包含與AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8 VP1、VP2及/或VP3序列具有90%或更高序列一致性之經修飾或變異AAV VP1、VP2及/或VP3衣殼；或與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74、AAV-2i8、SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92 VP1、VP2及/或VP3序列具有95%或更高序列一致性之衣殼；或與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74、AAV-2i8、SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92 VP1、VP2及/或VP3序列具有100%序列一致性之衣殼。
  88. 如請求項83至87中任一項之AAV載體，其中該等ITR包含以下中之任一者的一或多個ITR：AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10或Rh74 AAV血清型或其組合。
  89. 如請求項83至88中任一項之AAV載體，其進一步包含ITR、聚腺苷酸化(polyA)信號及/或內含子序列。
  90. 一種醫藥組合物，其在生物相容性載劑或賦形劑中包含複數個如請求項83至89中任一項之AAV載體。
  91. 如請求項90之醫藥組合物，其進一步包含空AAV衣殼。
  92. 如請求項91之醫藥組合物，其中該等空AAV衣殼與該AAV載體之比率在約100:1-50:1、約50:1-25:1、約25:1-10:1、約10:1-1:1、約1:1-1:10、約1:10-1:25、約1:25-1:50或約1:50-1:100內或之間。
  93. 如請求項91之醫藥組合物，其中該等空AAV衣殼與該AAV載體之該比率為約2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
  94. 如請求項90至93中任一項之醫藥組合物，其進一步包含界面活性劑。
  95. 一種治療需要血液凝結或凝固因子之人類的方法，其包含： (a)提供如請求項1至14、66至68、75至77中任一項之表現卡匣、如請求項83至89中任一項之AAV載體或如請求項90至94中任一項之醫藥組合物；及 (b)向該人類投與一定量的該表現卡匣、聚核苷酸、AAV載體或醫藥組合物，其中該血液凝結或凝固因子在該人類中表現。
  96. 如請求項95之方法，其中該人類患有A型或B型血友病。
  97. 如請求項95之方法，其中該AAV載體經靜脈內、動脈內、腔室內、黏膜內或經由導管向該人類投與。
  98. 如請求項95之方法，其中該血液凝結或凝固因子以增加之水準表現。
  99. 如請求項95之方法，其中該血液凝結或凝固因子以大於在不需要血液凝結或凝固因子之人類中發現的該血液凝結或凝固因子之水準的1%表現。
  100. 如請求項95之方法，其中該血液凝結或凝固因子以在不需要血液凝結或凝固因子之人類中發現的該血液凝結或凝固因子之水準的約1%-40%表現。
  101. 如請求項95之方法，其中該血液凝結或凝固因子以在不需要血液凝結或凝固因子之人類中發現的該血液凝結或凝固因子之水準的約5%-30%表現。
  102. 如請求項95之方法，其中該AAV載體以約1 × 108 至約1 × 1014 個載體基因組/公斤(vg/kg)該人類體重之範圍投與。
  103. 如請求項95之方法，其中該人類患有對因子VIII (FVIII)具有抑制性抗體之A型血友病。
  104. 一種治療有需要之人類之對因子VIII (FVIII)具有抑制性抗體的A型血友病的方法，其包含： (a)提供如請求項1至14、66至68、75至77中任一項之表現卡匣、如請求項83至89中任一項之AAV載體或如請求項90至94中任一項之醫藥組合物；及 (b)向該人類投與一定量的該核酸、聚核苷酸、表現卡匣、AAV載體或醫藥組合物，其中該血液凝結或凝固因子為因子VIII (FVIII)且在該人類中表現。
TW108130505A 2018-08-24 2019-08-26 最適化啟動子序列、無內含子之表現構築體及使用方法 TW202012425A (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862722547P 2018-08-24 2018-08-24
US62/722,547 2018-08-24
US201862725096P 2018-08-30 2018-08-30
US62/725,096 2018-08-30
US201862784116P 2018-12-21 2018-12-21
US62/784,116 2018-12-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202012425A true TW202012425A (zh) 2020-04-01

Family

ID=69591143

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108130505A TW202012425A (zh) 2018-08-24 2019-08-26 最適化啟動子序列、無內含子之表現構築體及使用方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20220362408A1 (zh)
EP (1) EP3840775A4 (zh)
JP (1) JP2021533805A (zh)
CN (1) CN113226352A (zh)
AU (1) AU2019325688A1 (zh)
BR (1) BR112021003399A2 (zh)
CA (1) CA3111047A1 (zh)
MX (1) MX2021002198A (zh)
TW (1) TW202012425A (zh)
WO (1) WO2020041773A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4333906A1 (en) * 2021-05-07 2024-03-13 Generation Bio Co. Lyophilized non-viral dna vector compositions and uses thereof
CA3218132A1 (en) * 2021-05-07 2022-11-10 Phillip SAMAYOA Non-viral dna vectors for vaccine delivery
WO2023211316A1 (en) * 2022-04-28 2023-11-02 Joint Stock Company "Biocad" Codon-optimized nucleic acid encoding the fviii-bdd
CN115948408A (zh) * 2022-09-23 2023-04-11 上海信致医药科技有限公司 改进的人凝血因子viii基因表达盒及其应用
WO2024074143A1 (en) * 2022-10-08 2024-04-11 Lingyi Biotech Co., Ltd. Construct for enhancing gene expression

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020065236A1 (en) * 1998-09-09 2002-05-30 Yew Nelson S. CpG reduced plasmids and viral vectors
US20140271550A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Constructs and Methods for Delivering Molecules via Viral Vectors with Blunted Innate Immune Responses
US10799566B2 (en) * 2015-06-23 2020-10-13 The Children's Hospital Of Philadelphia Modified factor IX, and compositions, methods and uses for gene transfer to cells, organs, and tissues
BR112018006074A2 (pt) * 2015-09-24 2018-10-09 Biomarin Pharm Inc vetores de fator viii de vírus adeno-associado, partículas virais associadas e formulações terapêuticas compreendendo as mesmas
BR112018008519A2 (pt) * 2015-10-28 2018-11-06 Sangamo Therapeutics Inc construtos específicos de fígado, cassetes de expressão de fator viii e métodos de uso dos mesmos
PE20231949A1 (es) * 2015-10-30 2023-12-05 Spark Therapeutics Inc VARIANTES DEL FACTOR VIII REDUCIDO CON CpG, COMPOSICIONES Y METODOS Y USOS PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS DE LA HEMOSTASIA

Also Published As

Publication number Publication date
EP3840775A1 (en) 2021-06-30
US20220362408A1 (en) 2022-11-17
JP2021533805A (ja) 2021-12-09
CN113226352A (zh) 2021-08-06
MX2021002198A (es) 2021-07-15
AU2019325688A1 (en) 2021-03-18
BR112021003399A2 (pt) 2021-05-18
CA3111047A1 (en) 2020-02-27
WO2020041773A1 (en) 2020-02-27
EP3840775A4 (en) 2022-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW202012425A (zh) 最適化啟動子序列、無內含子之表現構築體及使用方法
JP2016517278A (ja) スタッファー／フィラーポリヌクレオチド配列を含むベクターおよびその使用方法
US20210363192A1 (en) Engineered aav capsids with increased tropism and aav vectors comprising the engineered capsids and methods of making and using same
US20210222141A1 (en) Codon-optimized acid alpha-glucosidase expression cassettes and methods of using same
US20240110201A1 (en) Compositions and Methods for Treating Hereditary Angioedema
EP4277988A1 (en) Compositions and methods for treating fabry disease
US20230040275A1 (en) Secretable protein induced immune tolerization and treatment of autoimmune, allergic and other diseases and disorders
US20240024507A1 (en) Novel compositions with tissue-specific targeting motifs and compositions containing same
US20230241247A1 (en) Compositions and methods for increasing or enhancing transduction of gene therapy vectors and for removing or reducing immunoglobulins
US20220184188A1 (en) Aav vector treatment methods for late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis type 2
CN116981770A (zh) 治疗法布里病的组合物和方法
CN117120076A (zh) 用于治疗遗传性血管性水肿的组合物和方法