CN113646004A - 用于治疗肌营养不良的组合疗法 - Google Patents

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Abstract

本文所述的本发明提供了基因治疗载体，如腺相关病毒(AAV)载体，所述载体共表达功能性蛋白质(如微型化的人微型肌营养不良蛋白基因产物)以及RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA)、反义序列、基因编辑酶的引导序列(如CRISPR/Cas9的sgRNA，或CRISPR/Cas12a的crRNA)和/或微小RNA的一个或多个另外的编码序列；以及使用所述载体治疗患有肌营养不良如DMD/BMD的受试者的方法。

Description

用于治疗肌营养不良的组合疗法
相关申请的引用
本申请要求2018年12月12日提交的美国临时专利申请号62/778,646的优先权和申请日的权益，所述临时专利申请的全部内容特此以引用的方式并入本文。
背景技术
肌营养不良(MD)是一组导致进行性无力和肌肉质量损失的疾病。在肌营养不良中，异常基因(突变型基因)不产生形成健康肌肉所需的功能性野生型蛋白质。
肌营养不良对受影响患者的生活质量具有严重致衰弱影响。杜氏型肌营养不良(DMD)是最具破坏性的肌肉疾病之一，每5,000名新生儿中就有1人受到影响。它是最典型的肌营养不良，由编码肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(DAPC)的成员的基因中的突变引起。这些MD由通过DAPC键结的肌纤维膜-细胞骨架的损失相关的膜脆性引起。
具体地，DMD由DMD基因中的突变引起，导致DMD mRNA的减少以及肌营养不良蛋白或功能性肌营养不良蛋白(一种与肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(DAPC)相关的427kDa肌纤维膜蛋白)的缺乏(Hoffman等人,Cell 51(6):919-928,1987)。DAPC由肌肉肌纤维膜处的多种蛋白质组成，所述蛋白质通过肌营养不良蛋白(一种肌动蛋白结合蛋白)和α-肌营养不良蛋白聚糖(一种层粘连蛋白结合蛋白)在细胞外基质(ECM)与细胞骨架之间形成结构连接。这些结构连接在收缩期间起到稳定肌细胞膜的作用，并且防止收缩诱导的损伤。
由于DMD基因突变所致的肌营养不良蛋白的损失破坏肌营养不良蛋白糖蛋白复合物，从而导致肌膜脆性增加。包括钙流入肌浆、蛋白酶和促炎性细胞因子的活化以及线粒体功能障碍在内的一系列事件导致进行性肌肉退化。此外，神经元一氧化氮合酶(nNOS)的置换促成组织缺血、氧化应激增加和修复失败。疾病进展的特征在于肌肉坏死、纤维化和脂肪组织替代增加，以及在随后的肌肉活检中观察到的更大程度的纤维大小变化。
积累的证据表明，细胞内Ca2+(Ca2+ i)的异常升高是引发并延长DMD的疾病进展的重要早期致病事件。肌质网/内质网Ca2+ATP酶(SERCA)泵的正常功能占从细胞溶质中除去Ca2+和适当肌肉收缩的>70％。因此，SERCA活性的降低一直被认为是DMD中Ca2+ i超负荷和肌肉功能障碍的主要原因。
目前尚无法治愈DMD。护理标准包括施用皮质类固醇(如泼尼松或地夫可特)以稳定肌肉强度和功能，延长独立步行，以及延缓脊柱侧凸和心肌病；双膦酸盐；以及地诺单抗和重组甲状旁腺激素。
随着基因疗法的出现，DMD治疗的研究和临床试验集中在基因替代或其他旨在至少部分恢复肌营养不良蛋白功能的遗传疗法上。这些包括提供肌营养不良蛋白基因的功能拷贝，如肌营养不良蛋白小基因；或通过外显子跳跃和无义突变抑制来修复缺陷型肌营养不良蛋白基因产物。
然而，由于肌营养不良蛋白突变引起的广泛影响，需要治疗与原发性肌营养不良蛋白突变相关的其他继发性症状。
例如，肌营养不良蛋白的损失导致肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(DAPC)的损失，其进而导致nNOS产生一氧化氮(NO)以及HDAC2的异常N-亚硝基化。这种异常的N-亚硝基化HDAC2从染色质解离，并释放对特定微小RNA级联的抑制，其进而导致一系列下游事件，如纤维化和氧化应激增加。
特别地，关于纤维化，随着肌营养不良蛋白损失，膜脆性导致肌纤维膜撕裂和钙流入，从而触发钙活化蛋白酶和节段性纤维坏死(Straub等人,Curr.Opin.Neurol.10(2):168-175,1997)。这种不受控制的肌肉变性和再生循环最终耗尽肌肉干细胞群体(Sacco等人,Cell 143(7):1059-1071,2010；Wallace等人,Annu Rev Physiol 71:37-57,2009)，从而导致进行性肌肉无力、肌内膜炎症和纤维化瘢痕形成。
在没有来自肌营养不良蛋白或微型肌营养不良蛋白的膜稳定的情况下，DMD将表现出不受控制的组织损伤和修复循环，并且最终通过结缔组织增殖用纤维化疤痕组织代替损失的肌肉纤维。
在DMD诊断的最早年龄(例如，介于4至5岁之间)进行的肌肉活检揭示显著结缔组织增生。肌肉纤维化以多种方式为有害的。它通过结缔组织屏障减少肌内膜营养物的正常转运，减少血流量并剥夺肌肉中血管来源的营养成分，并在功能上通过肢体挛缩导致早期失去行走能力。随着时间推移，由于肌肉明显纤维化，治疗挑战成倍增加。这可在比较连续时间点的结缔组织增生的肌肉活检中观察到。所述过程继续恶化，导致失去行走能力并加速失去控制，尤其是在依赖轮椅的患者中。
因此，纤维化浸润在DMD中很严重，并且是任何潜在治疗的重大障碍。在这方面，单独基因替代疗法通常受到纤维化严重程度的阻碍，已经存在于患有DMD的非常年幼的儿童中。
纤维化的特征在于ECM基质蛋白(包括胶原蛋白和弹性蛋白)的过度沉积。ECM蛋白主要由细胞因子(如由活化的成纤维细胞响应于压力和炎症而释放的TGF)产生。尽管DMD的主要病理特征是肌纤维变性和坏死，但作为病理结果的纤维化也有同样的影响。纤维化组织的过度产生限制肌肉再生并导致DMD患者的进行性肌无力。
在一项研究中，初始DMD肌肉活检中纤维化的存在与10年随访时的不良运动结果高度相关(Desguerre等人,J Neuropathol Exp Neurol 68(7):762-767,2009)。这些结果指出纤维化作为DMD肌肉功能障碍的主要促成因素，并强调需要开发减少纤维化组织的疗法。
已在mdx小鼠中进行了测试的大多数抗纤维化疗法通过抑制TGF途径来阻断纤维化细胞因子信号传导。
微小RNA(miRNA)是约22个核苷酸的单链RNA，其通过与mRNA的3'UTR内的碱基配对、抑制翻译或促进mRNA降解而在转录后水平下介导基因沉默。miRNA的5'端的7bp种子序列靶向miRNA；靶向序列的其余部分及其二级结构提供了额外的识别。MiRNA在肌肉疾病病理学中发挥重要作用，并表现出独特地依赖于所讨论的肌营养不良类型的表达谱(Eisenberg等人,Proc Natl Acad Sci U.S.A.104(43):17016-17021,2007)。越来越多的证据表明，miRNA参与包括心脏、肝脏、肾脏和肺在内的许多器官的纤维化过程(Jiang等人,Proc Natl Acad Sci U.S.A.104(43):17016-17021,2007)。
最近，miR-29的下调显示出导致心脏纤维化(Cacchiarelli等人,Cell Metab 12(4):341-351,2010)。降低的miR-29表达与人DMD患者肌肉遗传相关(Eisenberg等人,ProcNatl Acad Sci U.S.A.104(43):17016-17021,2007)。
miR-29家族由从两个双顺反子miRNA簇表达的三个家族成员组成。MiR-29a与miR-29b(miR-29b-l)共表达；miR-29c与miR-29b的第二拷贝(miR-29b-2)共表达。miR-29家族共享保守的种子序列，并且miR-29a和miR-29b各自与miR-29c仅相差一个碱基。此外，将miR-29质粒(miR-29a和miR-29b-l簇)电穿孔到mdx小鼠肌肉中降低了ECM组分、胶原蛋白和弹性蛋白的表达水平，并且在处理后25天内强烈减少了肌肉切片中的胶原蛋白沉积(Cacchiarelli等人,Cell Metab 12(4):341-351,2010)。
腺相关病毒(AAV)是复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组的长度是约4.7kb，包括145个核苷酸的反向末端重复序列(ITR)。
AAV具有独特的特征，所述特征使其成为有吸引力的用于将外来DNA递送至细胞的载体，例如在基因疗法中。培养中细胞的AAV感染是非细胞病变的，并且人和其他动物的自然感染是沉默且无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，从而允许在体内靶向许多不同组织的可能性。此外，AAV转导缓慢分裂和非分裂细胞，并且可作为转录活性核附加体(染色体外元件)在这些细胞的整个生命周期内持续存在。AAV原病毒基因组作为质粒中的克隆DNA具有感染性，这使得重组基因组的构建可行。此外，由于指导AAV复制、基因组衣壳化和整合的信号包含在AAV基因组的ITR中，因此一些或全部内部大约4.3kb的基因组(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可被外来DNA如含有启动子、目标DNA和聚腺苷酸化信号的基因盒替代。rep和cap蛋白可以反式提供。AAV的另一个显著特征是它是极其稳定和强大的病毒。它容易地耐受用于灭活腺病毒的条件(56℃至65℃持续数小时)，从而使AAV的冷藏变得不那么重要。AAV甚至可被冻干。最后，AAV感染的细胞对重复感染没有抵抗力。
多项研究表明，肌肉中存在长期(>1.5年)重组AAV介导的蛋白质表达。参见，Clark等人,Hum Gene Ther 8:659-669(1997)；Kessler等人,Proc Nat.Acad Sc.U.S.A.93:14082-14087(1996)；和Xiao等人,J Virol 70:8098-8108(1996)。还参见，Chao等人,MolTher 2:619-623(2000)和Chao等人,Mol Ther 4:217-222(2001)。此外，因为肌肉高度血管化，重组AAV转导导致在肌肉内注射后在体循环中出现转基因产物，如Herzog等人,ProcNatl Acad Sci U.S.A.94:5804-5809(1997)和Murphy等人,Proc Natl Acad SciU.S.A.94:13921-13926(1997)中所描述。此外，Lewis等人,J Virol 76:8769-8775(2002)证明骨骼肌纤维具有正确抗体糖基化、折叠和分泌所必需的细胞因子，从而表明肌肉能够稳定表达分泌的蛋白质治疗剂。
虽然使用AAV载体的基因疗法推动了对所述领域的重大投资，但商业化仍存在重大挑战。重组病毒载体产生被视为复杂，其中生产规模扩大被视为技术上的主要挑战并且是商业化的一大障碍。
具体而言，取决于治疗领域，所报告的基于AAV的病毒载体的临床剂量在每位患者1011至1014个基因组颗粒(载体基因组；vg)的范围内。因此，从更广泛的基因疗法开发角度来看，目前的规模扩大方法无法提供所需数量的剂量以允许后期(例如，II/III期)试验进展，从而延迟了基因疗法产品的开发。以下事实支持了这一点：大多数临床研究规模非常小，对<100名患者(并且在一些情况下<10名)进行，使用产生非常少量的产物的贴壁细胞转染过程。当后期开发所需的预测病毒量与当前的生产力(例如，来自单个10层细胞工厂的5×1011vg)进行比较时，真正的担忧是这种方法将达不到后期的材料要求以及甚至具有高剂量和小患者群组的超孤儿疾病的市场需求，更不用说更“标准”的基因疗法适应症。
正如Clement和Grieger在最近的综述文章中所述(Molecular Therapy-Methods&Clinical Development(2016)3,16002；doi:10.1038/mtm.2016.2)：“在临床环境中使用rAAV迫切需要能够产生大量高纯度rAAV颗粒的生产和纯化系统。典型的FDA批准的研究新药物包括广泛的毒理学、安全性、剂量和生物分布评估的临床前研究，载体要求通常达到1E15至1E16载体基因组范围。制造此类量，虽然技术上可行，但在使用当前生产系统时仍然代表令人难以置信的努力。”
对于希望系统地递送(而不是局部递送)的AAV载体来说，这个问题尤其严重。在最近的一篇文章中，Adamson-Small等人(Molecular Therapy-Methods&ClinicalDevelopment(2016)3,16031；doi:10.1038/mtm.2016.31)指出“载体产生和纯化方面的当前限制阻碍了临床候选载体的广泛实施，特别是当考虑全身施用时....这尤其适用于治疗遗传性遗传疾病，如肌营养不良，当可能需要全身基因转移时，通常依赖于高AAV剂量的全身给药。”事实上，针对肌营养不良的临床试验中对rAAV的研究已经通过肌内注射递送载体，这通常是由于缺乏大规模制造能力来产生支持全身施用所需的量。在组合疗法中全身递送两种AAV载体在产生足够数量的组合疗法所需的高质量AAV载体方面提出了甚至更大的挑战。
因此，患有DMD和其他肌营养不良的患者的功能改善需要基因恢复和减轻与许多次级级联(如纤维化)相关的症状。或者或此外，肌营养不良可能受益于同时靶向不同致病途径的治疗。需要减少此类次级级联症状(例如，纤维化)的方法，所述方法可与基因恢复方法配对以更有效地治疗DMD和其他肌营养不良。这种组合疗法还必须克服产生足够数量的基因疗法载体以将两种治疗组分递送至靶组织的重大临床和商业化挑战，特别是在基因疗法载体的全身递送的情况下。
发明内容
本文所述的发明提供了一种用于基因疗法的病毒载体，所述病毒载体包含同时编码第一多肽或第一RNA和第二多肽或第二RNA的多核苷酸序列。
例如，所述载体可同时编码第一治疗性蛋白和第二治疗性RNA。
然而，所述第一或第二RNA或两者可以是不产生蛋白质或多肽的非编码RNA。此类非编码RNA可以是微小RNA(miR)、shRNA(短发夹RNA)、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、长ncRNA如Xist和HOTAIR、反义RNA或其前体，优选具有治疗价值，例如与诸如癌症、自闭症、阿尔茨海默氏病、软骨毛发发育不全、听力损失和普拉德-威利综合征，尤其是包括DMD/BMD在内的各种类型的肌营养不良(MD)的疾病相关的那些。
此类非编码RNA也可以是CRISPR/Cas9蛋白的单个或多个引导RNA，或CRISPR/Cas12a(以前Cpf1)蛋白的CRISPR RNA(crRNA)。
因此，一方面，本发明提供了一种重组病毒载体，所述重组病毒载体包含：a)编码功能性目标基因或蛋白质(GOI)如有效治疗肌营养不良的功能性目标基因或蛋白质的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含3'-UTR编码区并且紧邻异源内含子序列的3'，所述异源内含子序列增强由所述多核苷酸编码的功能性蛋白质的表达；b)与所述多核苷酸可操作地连接并驱动所述多核苷酸的表达的控制元件(例如，肌肉特异性控制元件)；以及c)插入所述内含子序列或所述3'-UTR编码区中的一个或多个编码序列；其中所述一个或多个编码序列独立地编码：RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA)、反义序列、基因编辑酶的引导序列(如CRISPR/Cas9的单引导RNA(sgRNA)或CRISPR/Cas12a的acrRNA)、微小RNA(miRNA)和/或miRNA抑制剂。
在某些实施方案中，所述重组病毒载体是重组AAV(腺相关病毒)载体或重组慢病毒载体。
在相关方面，本发明提供了一种重组AAV(rAAV)载体，所述重组AAV(rAAV)载体包含：a)编码有效治疗肌营养不良的功能性蛋白质的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含3'-UTR编码区并且紧邻异源内含子序列的3'，所述异源内含子序列增强由所述多核苷酸编码的功能性蛋白质的表达；b)与所述多核苷酸可操作地连接并驱动所述多核苷酸的表达的肌肉特异性控制元件；以及c)插入所述内含子序列或所述3'-UTR编码区中的一个或多个编码序列；其中所述一个或多个编码序列独立地编码：RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA)、反义序列、微小RNA(miRNA)和/或miRNA抑制剂。
在一个特定实施方案中，本文所述的本发明提供了一种病毒载体，如重组AAV载体，所述病毒载体包含：a)编码功能性微型肌营养不良蛋白(例如，microD5)的肌营养不良蛋白微基因或小基因，其中所述肌营养不良蛋白微基因或小基因包含3'-UTR编码区并且紧邻异源内含子序列的3'，所述异源内含子序列增强所述肌营养不良蛋白微基因或小基因的表达；b)与所述肌营养不良蛋白微基因或小基因可操作地连接并驱动所述肌营养不良蛋白微基因或小基因的表达的肌肉特异性控制元件；以及c)插入所述内含子序列或所述3'-UTR编码区中的一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)编码序列；其中所述一个或多个编码序列独立地编码：RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA)、反义序列、微小RNA(miRNA)和/或miRNA抑制剂。
在某些实施方案中，所述功能性肌营养不良蛋白是microD5，和/或所述肌肉特异性控制元件/启动子是CK启动子。
本发明部分地基于出人意料的发现，即一个或多个编码序列可插入某些位置，如异源内含子中，而所述功能性蛋白质(如肌营养不良蛋白微基因或小基因产物)和一个或多个编码序列两者可在受感染的靶细胞(例如，肌肉细胞)内表达，与仅包含所述功能性蛋白质(如肌营养不良蛋白小基因产物)或仅包含一个或多个编码序列的类似载体构建体相比，表达没有显著降低。
在某些实施方案中，所述一个或多个编码序列插入所述3'-UTR编码区中，或在聚腺苷酸化(polyA)信号序列(例如，AATAAA)之后。
在某些实施方案中，在所述一个或多个编码序列存在下所述功能性GOI的表达基本上不受影响(例如，与没有插入所述一个或多个编码序列的其他方面相同的对照构建体相比)。
在某些实施方案中，在所述重组AAV(rAAV)载体中：a)所述多核苷酸是编码功能性5-血影蛋白样重复肌营养不良蛋白(例如microD5；如US10,479,821中所述，其以引用的方式并入本文)的肌营养不良蛋白小基因；和/或，b)所述肌肉特异性控制元件是与所述肌营养不良蛋白小基因可操作地连接并驱动所述肌营养不良蛋白小基因的表达的CK启动子。
在某些实施方案中，所述一个或多个编码序列包含诱导缺陷型肌营养不良蛋白的外显子的跳跃的外显子跳跃反义序列，如跳跃肌营养不良蛋白的外显子45-55或肌营养不良蛋白的外显子44、45、51和/或53中的任一个。
在某些实施方案中，所述微小RNA是miR-1、miR-133a、miR-29c、miR-30c和/或miR-206。例如，当所述微小RNA是miR-29c时，所述miR-29c任选地具有经修饰的侧翼主链序列，所述经修饰的侧翼主链序列增强针对靶序列设计的miR-29c的引导链的加工。所述经修饰的侧翼主链序列可来自或基于其他miR序列，如miR-30、-101、-155或-451。
在某些实施方案中，所述微小RNA在宿主细胞中的表达与所述微小RNA在所述宿主细胞中的内源表达相比上调至少约1.5至15倍(例如，约2至10倍、约1.4至2.8倍、约2至5倍、约5至10倍、约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或约15倍)。
在某些实施方案中，所述RNAi序列是针对肌脂蛋白(sarcolipin)(shSLN)的shRNA。
在某些实施方案中，所述一个或多个编码序列编码一种或多种相同或不同的针对肌脂蛋白(shSLN)的shRNA。
在某些实施方案中，所述shRNA使肌脂蛋白mRNA和/或肌脂蛋白蛋白质表达降低至少约50％。
在某些实施方案中，所述GOI是CRISPR/Cas9，并且所述引导序列是sgRNA；或者其中所述GOI是CRISPR/Cas12a，并且所述引导序列是crRNA。
在某些实施方案中，所述RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA)、所述反义序列、所述CRISPR/Cas9 sgRNA、所述CRISPR/Cas12a crRNA和/或所述微小RNA拮抗一种或多种靶基因的功能，所述靶基因如炎症基因、NF-κB信号传导途径的活化因子(例如，TNF-α、IL-1、IL-1β、IL-6、NF-κB的受体活化因子(RANK)和Toll样受体(TLR))、NF-κB、由NF-κB诱导的下游炎性细胞因子、组蛋白脱乙酰酶(例如，HDAC2)、TGF-β、结缔组织生长因子(CTGF)、胶原蛋白、弹性蛋白、细胞外基质的结构组分、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、肌肉生长抑制素、磷酸二酯酶-5(PED-5)或ACE、VEGF诱饵受体1型(VEGFR-1或Flt-1)和造血前列腺素D合酶(HPGDS)。
在某些实施方案中，在所述载体例如所述重组AAV(rAAV)载体中：a)所述多核苷酸编码功能性fukutin(FKTN)蛋白；和/或，b)所述一个或多个编码序列编码外显子跳跃反义序列，所述外显子跳跃反义序列恢复福山型先天性肌营养不良(FCMD)患者的缺陷型FKTN基因中的正确外显子10剪接。
在某些实施方案中，在所述载体例如所述重组AAV(rAAV)载体中：a)所述多核苷酸编码功能性LAMA2蛋白；和/或，b)所述一个或多个编码序列编码外显子跳跃反义序列，所述外显子跳跃反义序列恢复分区蛋白缺乏型先天性肌营养不良1A型(MDC1A)患者的缺陷型LAMA2基因的C末端G结构域(外显子45至64)、特别是G4和G5的表达。
在某些实施方案中，在所述载体例如所述重组AAV(rAAV)载体中：a)所述多核苷酸编码功能性DMPK蛋白或CLCN1基因；和/或，b)所述RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA)、所述反义序列或所述微小RNA(miRNA)靶向缺陷型DMPK基因中的突变转录物的扩增重复序列，或编码外显子跳跃反义序列，所述外显子跳跃反义序列导致DM1患者的CLCN1基因中的外显子7A的跳跃。
在某些实施方案中，在所述载体例如所述重组AAV(rAAV)载体中：a)所述多核苷酸编码功能性DYSF蛋白；和/或，b)一个或多个编码序列编码外显子跳跃反义序列，所述外显子跳跃反义序列导致dysferlin肌病(dysferlinopathy)(LGMD2B或MM)患者的缺陷型DYSF基因中的外显子32的跳跃。
在某些实施方案中，在所述载体例如所述重组AAV(rAAV)载体中：a)所述多核苷酸编码功能性SGCG蛋白；和/或，b)一个或多个编码序列编码外显子跳跃反义序列，所述外显子跳跃反义序列导致LGMD2C患者的缺陷型LGMD2C基因(例如，具有Δ-521T SGCG突变的基因)中的外显子4至7的跳跃。
在某些实施方案中，所述异源内含子编码序列是SEQ ID NO:1。
在某些实施方案中，所述一个或多个编码序列插入所述内含子序列中。
在某些实施方案中，所述功能性蛋白质的表达不受所述一个或多个编码序列的插入的不利影响。
在某些实施方案中，所述载体具有血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV 12或AAV 13。在某些实施方案中，所述载体是已知血清型的衍生物。在某些实施方案中，所述衍生物可表现出所需的组织特异性或向性、所需的免疫原性特征(例如，不受受试者的免疫系统的攻击)，或用于各种适应症的药物组合物或基因疗法的其他所希望的性质。
在某些实施方案中，所述肌肉特异性控制元件是人骨骼肌动蛋白基因元件、心脏肌动蛋白基因元件、肌细胞特异性增强子结合因子mef、肌肉肌酸激酶(MCK)、截短的MCK(tMCK)、肌球蛋白重链(MHC)、C5-12、鼠肌酸激酶增强子元件、骨骼快缩肌钙蛋白c基因元件、慢缩心脏肌钙蛋白c基因元件、慢缩肌钙蛋白i基因元件、缺氧诱导核因子、类固醇诱导元件或糖皮质激素应答元件(gre)。
在某些实施方案中，所述肌肉特异性控制元件包含WO2017/181015(以引用的方式并入本文)的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
本发明的另一方面提供了一种组合物，所述组合物包含任何载体，例如本发明的重组病毒(AAV)载体。
在某些实施方案中，所述组合物是还包含治疗相容的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
在某些实施方案中，所述治疗上可接受的载体、稀释剂或赋形剂是包含pH 6.0的10mM L-组氨酸、150mM氯化钠和1mM氯化镁的无菌水溶液。
在某些实施方案中，所述组合物呈约10mL具有至少1.6×1013个载体基因组的水溶液的剂型。
在某些实施方案中，所述组合物具有每毫升至少2×1012个载体基因组的效力。
本发明的另一方面提供了一种产生主题组合物的方法，所述方法包括在细胞中产生所述载体例如所述重组AAV载体，以及裂解所述细胞以获得所述载体。
在某些实施方案中，所述载体是AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV 12或AAV 13载体。
本发明的另一方面提供了一种治疗有需要的受试者的肌营养不良或抗肌萎缩蛋白病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的任一种重组载体，例如重组AAV载体，或本发明的任一种组合物。
在某些实施方案中，所述重组载体(例如所述重组AAV载体)或所述组合物通过肌内注射、静脉内注射、肠胃外施用或全身施用来施用。
在某些实施方案中，所述肌营养不良是杜氏肌营养不良或贝克尔肌营养不良。
在某些实施方案中，所述肌营养不良是杜氏肌营养不良、贝克尔肌营养不良、福山型先天性肌营养不良(FCMD)、dysferlin肌病、肌强直性肌营养不良和分区蛋白缺乏型先天性肌营养不良1A型、面肩肱型肌营养不良(FSHD)、先天性肌营养不良(CMD)或肢带型肌营养不良(LGMDR5或LGMD2C)。
本发明的另一方面提供了一种用于预防或治疗受试者的DMD或有关/相关疾病的药盒，所述药盒包含：一种或多种载体，例如，如本文所述的重组AAV，或如本文所述的组合物；使用说明(书面、印刷、电子/光学存储介质或在线)；和/或包装。在某些实施方案中，药盒还包括用于组合疗法的已知MD(例如DMD)治疗剂。
应理解，本文描述的任一个实施方案，包括仅在实施例或权利要求书中描述的实施方案，都可与本发明的任何一个或多个其他实施方案组合，除非这种组合被明确地放弃保护或不适当。
附图说明
图1示出示意图(未按比例)，所述示意图示出代表性重组病毒(例如慢病毒或AAV)载体，所述载体包含目标基因(GOI)，如如下文所述的微型肌营养不良蛋白、小型肌营养不良蛋白或肌营养不良蛋白小基因(例如，下文所述的5-血影蛋白样重复序列microD5肌营养不良蛋白)和两个ITR序列之间的非蛋白质编码RNA(ncRNA)如shRNA的一个或多个(即五个，如所示)另外的编码序列。额外的ncRNA(例如shRNA)编码序列可相同或不同，并且在此图中似乎在目标基因(GOI)编码区(例如微型肌营养不良蛋白编码序列)的5'异源内含子序列内，尽管所述另外的编码序列的位置不受此限制。也就是说，编码序列可位于AAV载体中的其他地方，如3'-UTR区内，或在异源内含子和3'-UTR区两者内。在AAV载体基因组转录后，产生包含GOI或肌营养不良蛋白小基因(例如microD5)mRNA和另外编码的序列作为融合RNA的预加工mRNA。在进一步加工后，GOI如肌营养不良蛋白小基因mRNA(作为抗DMD药物)和另外的编码序列如所示的shRNA被分离。
图2A示出重组病毒(例如，慢病毒或AAV)载体的一个具体实施方案，其中单个另外的微小RNA29c编码序列被插入到3’-UTR区中。转录和进一步加工导致产生微型肌营养不良蛋白的microD5(标记为“SGT-001”)mRNA，和功能性miR29c微小RNA。注意，在此说明性的非限制性实例中，TAG终止密码子、AATAAA polyA信号序列和miR-29c插入序列(其恰好是CA)全部加下划线。尽管在此说明中，miR29c编码序列被描述为插入polyA信号序列之后，但也可将其插入其他地方，如在polyA信号序列之前的成熟mRNA的3'-UTR区中。还参见12。
图2B示出重组病毒(例如，慢病毒或AAV)载体的另一个具体实施方案，其中单个另外的肌脂蛋白(SLN)shRNA编码序列(shSLN)被插入到异源内含子中。转录和进一步加工导致产生微型肌营养不良蛋白的microD5(标记为SGT-001)mRNA，和功能性肌脂蛋白shRNA。同样，shSLN的插入位置仅用于说明目的，并且可根据本公开将其插入别处，如在3'-UTR区中或在polyA信号序列之前或之后。
图3示出在被仅编码microD5(标记为SGT-001)微型肌营养不良蛋白的AAV载体(左)、还编码异源内含子中的微小RNA 29c(中间)的AAV载体以及还编码异源内含子中的肌脂蛋白shRNA的AAV载体(右)感染的细胞中，细胞核的DAPI染色和肌营养不良蛋白的免疫荧光染色。百分比值代表转染效率，或成功转染的细胞的百分比。
图4是示出编码肌脂蛋白-荧光素酶报告基因融合物的AAV载体的示意图。还示出针对肌脂蛋白的shRNA的靶标位置。
图5示出与通过仅表达microD5的AAV载体(“SGT001”)共转染的细胞相比，当通过表达microD5和shSLN两者的AAV载体(“SGT001+SLN”)共转染细胞时，C2C12细胞中肌脂蛋白-荧光素酶融合报告基因的表达降低86.8％。
图6A示出，与通过仅编码microD5的AAV载体(标记为“SGT-001”)转染的C2C12细胞相比，在通过编码microD5和shSLN的AAV载体(标记为“SGT001-shSLN”)转染的C2C12细胞中，C2C12细胞(转染后6天)中的内源性肌脂蛋白表达降低55％。
图6B示出内源性SLN表达的免疫荧光染色图像，基于其编译图6A中的数据。
图7示出C2C12细胞中shSLN(通过转染编码microD5肌营养不良蛋白和shSLN的AAV载体)的表达降低了内源性SLN的功能，使得再摄取至肌质网中的钙随时间过程受到影响。对照包括通过仅编码microD5肌营养不良蛋白而不含shSLN的AAV载体转染的细胞，以及未转染的细胞。Y轴上的相对荧光强度是基于钙探针Fluo-8的荧光强度的测量值。
图8A示出转染后一天(1d)，通过SGT-001-shSLN(编码microD5肌营养不良蛋白和shSLN两者的AAV载体)转染的C2C12细胞中的微型肌营养不良蛋白表达仅落后于通过SGT-001(编码microD5肌营养不良蛋白的AAV载体)转染的C2C12细胞的表达，即约20％水平，但microD5肌营养不良蛋白小基因表达到转染后第6天(6d)迅速赶上(在误差界限内)。
图8B示出转染后1天外源性microD5肌营养不良蛋白小基因表达的免疫荧光染色图像，基于其编译图8A中的数据。
图8C示出转染后6天外源性microD5肌营养不良蛋白小基因表达的免疫荧光染色图像，基于其编译图8A中的数据。
图9示出小鼠SLN的几种示例性shRNA设计。
图10示出小鼠(受试者)与人(查询)肌脂蛋白序列之间的核苷酸序列比较，以及小鼠或人特异性shRNA的可能shRNA设计，以及小鼠和人共有的shRNA。
图11示出编码肌营养不良蛋白小基因(microD5，标记为“SGT-001”)的AAV载体中的代表性位置可充当一个或多个编码序列如miR-29c编码序列(如所示)或针对SLN的shRNA的编码序列的插入点。具体地，可使用SGT-001小基因的内含子内的多个位置，但由于对肌营养不良蛋白小基因表达没有不利影响，一些位置(如Imir2)可能更优选。
图12是示出主题重组病毒(例如，慢病毒或AAV)载体的一个代表性和非限制性实施方案的示意图(未按比例)。在所示的这个具体实施方案中，控制元件是肌肉特异性启动子CK8，并且GOI是功能性DMD基因(微型肌营养不良蛋白或μDys)的型式。RNAi、miRNA等的编码序列可插入到载体中指示“转录物”的任何位置，例如，在GOI之前的内含子中、在3'-UTR区中或在polyA信号序列之后。从启动子产生的转录将产生初始融合转录物。
图13示出对于编码miR-29c的各种重组病毒(例如AAV)载体，miR-29c作为病毒载体(“单独”构建体)中的唯一编码序列或作为本公开的融合构建体(“融合”构建体)的一部分，人iPS来源的心肌细胞中的相对miR-29c表达水平变化(以相对于仅表达μDys的对照载体的倍数表示)。
图14示出对于编码miR-29c的各种重组AAV载体，miR-29c作为病毒载体(“单独”构建体)中的唯一编码序列或作为本公开的融合构建体(“融合”构建体)的一部分，分化的C2C12细胞或小鼠心肌细胞中miR-29c的相对表达水平。
图15示出通过本公开的shSLN-μDys融合构建体以及表达相同shSLN编码序列的几种单独构建体，小鼠SLN蛋白表达水平的约50％敲低(底行)。顶行是负载对照。
图16示出对于编码shSLN的各种重组AAV载体，shSLN作为病毒载体(“单独”)中的唯一编码序列或作为本公开的融合构建体(“融合”)的一部分，在分化的C2C12肌管或小鼠心肌细胞中siSLN(来自转录的shSLN的加工的siRNA产物)的相对表达水平。
图17示出编码shSLN的几种主题融合构建体在人iPS来源的心肌细胞中高达约90％的人SLN mRNA敲低。
图18示出人iPS来源的心肌细胞中几种Hum-shSLN-μDys融合构建体的归一化μDysmRNA水平。
图19是变性琼脂糖凝胶的图像，表明具有miR-29c编码序列的单独和融合构建体中的AAV基因组在很大程度上完整。
图20A至20C示出在AAV9载体中使用本发明的miR-29c-μDys融合构建体，分别在左腓肠肌(图20A)、膈肌(图20B)和左心室(图20C)中的约1.4至2.8倍miR-29c表达上调。
图21示出在使用miR-29c上调融合AAV9载体的腓肠肌中，在RNA和蛋白质水平下μDys表达没有降低。
图22示出相对于仅μDys AAV9，通过AAV9介导的shSLN-μDys融合构建体的表达，分别在膈肌、左腓肠肌(左胃)和心房中高达50％的mSLN mRNA下调。在舌中也观察到高达50％的mSLN mRNA下调(数据未示出)。
图23示出经由AAV9的shSLN-μDys融合构建体在膈肌中类似水平的μDys RNA/蛋白质表达。对于舌头和心房也获得了类似的结果(数据未示出)。
图24示出AAV9的miR-29c单独和miR-29c-μDys融合构建体降低血清CK水平。
图25示出AAV9的miR-29c单独和miR-29c-μDys融合构建体降低血清TIMP1水平。
图26示出腓肠肌中来自AAV9的几种miR-29c-μDys融合载体或AAV9的shSLN-μDys融合载体的miR-29c或shSLN载体的大致相似的生物分布。
图27示出对于miR-29c-μDys融合和shSLN-μDys融合对比μDys单独构建体，肝脏中AAV9载体的相似滴度。
图28示出基于它们对两种纤维化标志物基因的影响，膈肌中本发明的融合构建体相对于单独μDys构建体的额外益处。
图30示出基于miR-30E主链序列的代表性经修饰的miR-29c构建体的预测2D结构。
图31示出基于miR-101主链序列的代表性经修饰的miR-29c构建体的预测2D结构。
图32示出基于miR-451主链序列的代表性经修饰的miR-29c构建体的预测2D结构。
具体实施方式
在没有并行方法来治疗各种次级级联症状如纤维化和细胞内Ca2+异常升高的情况下，不可能完全实现外显子跳跃、终止密码子通读或基因替代疗法的益处。在没有减少此类次级级联事件(包括肌肉纤维化)的症状的方法的情况下，即使是小分子或蛋白质替代策略也可能失败。例如，在用AAV微型肌营养不良蛋白治疗的患有现有纤维化的老年mdx小鼠中的先前工作表明，不能实现完全功能恢复(Human molecular genetics 22:4929-4937,2013)。众所周知，DMD心肌病的进展伴随着心室壁的瘢痕形成和纤维化。
本发明部分涉及用于治疗患者的基因治疗方法，所述方法不仅通过提供替代功能性肌营养不良蛋白小基因来补偿肌营养不良蛋白及其功能的缺陷，而且在同一基因治疗载体中使用一个或多个另外的编码序列直接靶向一种或多种次级级联基因，从而在用于全身递送的一个紧凑载体中实现组合疗法。
实际上，本发明，特别是本发明的重组AAV(rAAV)载体，不限于治疗DMD。本发明适用于治疗其他基因有缺陷的肌营养不良。例如，本发明的重组AAV(rAAV)载体可提供功能性蛋白质和/或一个或多个编码序列(如非编码RNA，例如RNAi序列、反义RNA、miRNA)以治疗肌营养不良，其中所述功能蛋白为肌营养不良中的缺陷型基因产物提供野生型替代物，或者提供仍然可有效治疗肌营养不良的非野生型替代物(例如，5-血影蛋白样microD5肌营养不良蛋白小基因产物)。
因此，一方面，本发明提供了一种重组病毒载体，例如重组慢病毒或AAV(rAAV)载体，所述重组病毒载体包含：a)编码有效治疗需要治疗的患者/受试者/个体的肌营养不良的功能性蛋白质的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含3'-UTR编码区并且紧邻异源内含子序列的3'，所述异源内含子序列增强由所述多核苷酸编码的功能性蛋白质的表达，其中所述功能性蛋白质的相应野生型在肌营养不良中具有缺陷，或者其中所述功能性蛋白质虽然不是野生型，但仍能有效治疗肌营养不良；b)与所述多核苷酸可操作地连接并驱动所述多核苷酸的表达的控制元件(例如，肌肉特异性控制元件)；以及，c)插入所述内含子序列或所述3'-UTR编码区或所述功能性蛋白质的表达盒中的其他地方中的一个或多个编码序列；其中所述一个或多个编码序列独立地编码：RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA)、反义序列、微小RNA(miRNA)和/或miRNA抑制剂。
在相关方面，本文所述的本发明还可用作病毒载体，用于同时递送/表达基于酶的基因编辑系统的两种或更多种组分，例如能够在靶基因组位点/靶基因组序列处产生DNA双链断裂(DSB)的靶序列特异性(工程化)核酸酶，以及匹配(野生型或所需)靶基因组序列的供体或模板序列。这种系统有可能利用靶细胞内的内源性同源重组(HR)过程来在编辑中删除缺陷型/不需要的靶基因组序列，并在所需的靶基因组位置用野生型或其他所需的序列替代它。
例如，靶序列特异性(工程化)核酸酶可包括大范围核酸酶(如LAGLIDADG家族中的那些)及其识别独特靶基因组序列的变体；锌指核酸酶(ZFN)；转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)；和CRISPR/Cas基因编辑酶。
例如，在CRISPR/Cas的情况下，除了供体序列或除供体序列之外，主题载体还可同时递送具有用于靶向一个或多个靶序列的所需序列的一个或多个基因编辑引导序列，以及可由作为GOI的病毒载体编码的相容性编辑酶。这种病毒递送系统可用于将细胞、组织或生物体中出现的不需要的序列取代为所需的序列。CRISPR/Cas酶系统的一个实例是CRISPR/Cas9或CRISPR/Cas12a(以前Cpf1)，以及靶细胞的一个或多个所需的引导序列(例如，Cas9的单引导RNA或sgRNA，或Cas12a的crRNA)。Cas9包括野生型Cas9及其功能性变体。几种Cas9变体与微型肌营养不良蛋白基因的大小大致相同，并且可以是由本发明的病毒载体编码的功能性GOI。Cas12a甚至比Cas9更小，并且也可被编码为GOI。在某些实施方案中，由病毒构建体编码的Cas基因可以或可以不具有UTR和/或内含子元件。
在相关方面，本发明提供了用于离体或体内基因疗法中的重组慢病毒载体。在离体基因疗法中，将培养的宿主细胞在体外使用主题病毒载体进行转染以表达目标基因，然后移植到体内。体内基因疗法是将遗传物质插入靶向组织中的直接方法，并且转导发生在患者自身的细胞内。因此，本发明的慢病毒载体可包含：a)编码有效治疗需要治疗的患者/受试者/个体的肌营养不良的功能性蛋白质的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含3'-UTR编码区并且紧邻异源内含子序列的3'，所述异源内含子序列增强由所述多核苷酸编码的功能性蛋白质的表达，其中所述功能性蛋白质的相应野生型在肌营养不良中具有缺陷，或者其中所述功能性蛋白质虽然不是野生型，但仍能有效治疗肌营养不良；b)与所述多核苷酸可操作地连接并驱动所述多核苷酸的表达的控制元件(例如，肌肉特异性控制元件)；以及，c)插入所述内含子序列或所述3'-UTR编码区或表达盒中的其他地方中的一个或多个编码序列；其中所述一个或多个编码序列独立地编码：RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA)、反义序列、微小RNA(miRNA)和/或miRNA抑制剂。
如本文所用并且根据上下文，术语“融合”可具有不同含义，包括融合蛋白；融合RNA转录物，其中可能存在多于一个编码序列(如GOI的编码序列和插入/嵌入GOI的3-UTR区或内含子序列中的一种或多种RNAi剂等的编码序列)，以及融合构建体，其中病毒载体含有GOI和一种或多种RNAi剂等的编码序列。
在某些实施方案中，所述一个或多个编码序列插入所述3'-UTR编码区中，或在聚腺苷酸化(polyA)信号序列(例如，AATAAA)之后。
在某些实施方案中，功能性GOI的表达由于一个或多个编码序列的存在而被上调或下调(例如，与没有插入所述一个或多个编码序列的其他方面相同的对照构建体相比)。
在某些实施方案中，在所述一个或多个编码序列存在下所述功能性GOI的表达基本上不受影响(例如，与没有插入所述一个或多个编码序列的其他方面相同的对照构建体相比)。
如本文所用，“肌营养不良(MD)”包括一组特征在于由于干扰形成健康肌肉所需的野生型蛋白质的产生的异常基因或基因突变所致的进行性无力和肌肉质量损失的疾病。MD包括杜氏肌营养不良(DMD)；贝克尔肌营养不良(BMD)；先天性肌营养不良(CMD)，特别是具有鉴定的遗传突变的先天性肌营养不良，如下文所述的那些，包括福山型先天性肌营养不良(FCMD)和分区蛋白缺乏型先天性肌营养不良1A型(MDC1A)；dysferlin肌病(LGMD2B和Miyoshi肌病)；肌强直性肌营养不良；肢带型肌营养不良(LGMD)，如LGMD2C；以及面肩肱型肌营养不良(FSHD)。
如本文所用，“患者”、“受试者”和“个体”可互换使用以包括在主题方法中待治疗、诊断和/或获得生物样品的哺乳动物(例如，人)受试者。通常，受试者罹患或可能罹患DMD和本文所述的其他相关疾病，并且在一些实施方案中，DMD和相关心肌病和营养不良性心肌病。在一个特定实施方案中，受试者是人类儿童或青少年(例如，不超过18岁、15岁、12岁、10岁、8岁、5岁、3岁、1岁、6个月、3个月、1个月等)。在特定实施方案中，儿童或青少年是男性。在另一个特定实施方案中，受试者是成年人(例如≥18岁)，如成年男性。
全长肌营养不良蛋白基因是2.6mb，并且编码79个外显子。11.5-kb的编码序列转化成427-kD的蛋白质。肌营养不良蛋白可分为四个主要结构域，包括N末端结构域、杆状结构域、富含半胱氨酸的结构域和C末端结构域。杆状结构域可进一步分为24个血影蛋白样重复序列和四个铰链。
功能性“肌营养不良蛋白小基因”或“肌营养不良蛋白微基因”具有少于24个血影蛋白样重复序列和与基因治疗递送载体(腺病毒和慢病毒)相容的一个或多个铰链区，并且在US7001761、US6869777、US8501920、US7892824、US10479821和US10166272(全部以引用的方式并入本文)中进行了描述。
在一个实施方案中，肌营养不良是DMD或BMD，并且在重组AAV(rAAV)载体中：a)所述多核苷酸是编码功能性5-血影蛋白样重复序列肌营养不良蛋白(如microD5肌营养不良蛋白；如US10,479,821中所述，其以引用的方式并入本文)的肌营养不良蛋白小基因；和/或，b)所述肌肉特异性控制元件是与所述肌营养不良蛋白小基因可操作地连接并驱动所述肌营养不良蛋白小基因的表达的CK启动子。
如本文所用，“microD5”、“由SGT-001编码的微型肌营养不良蛋白小基因”或简称“SGT-001”是指特异性工程化的5-重复序列微型肌营养不良蛋白，其从N末端至C末端含有N末端肌动蛋白结合结构域、铰链区1(H1)、血影蛋白样重复序列R1、R16、R17、R23和R24、铰链区4(H4)和人全长肌营养不良蛋白的C末端肌营养不良蛋白聚糖结合结构域。US10,479,821和WO2016/115543(以引用的方式并入本文)中描述了这种5-重复序列微型肌营养不良蛋白和相关的肌营养不良蛋白小基因的蛋白质序列。
在某些实施方案中，关于例如特异性血影蛋白样重复序列和/或血影蛋白样重复序列的数量(例如，包含人肌营养不良蛋白的最少4、5或6个血影蛋白样重复序列，优选包括1、2或3个最N和/或最C末端重复序列)，肌营养不良蛋白小基因编码不同于microD5的功能性肌营养不良蛋白蛋白质。人肌营养不良蛋白的一个或多个血影蛋白样重复序列也可被来自肌营养不良蛋白相关蛋白质(utrophin)或血影蛋白的血影蛋白样重复序列取代。在某些实施方案中，肌营养不良蛋白小基因小于AAV病毒载体的5kb包装限制，优选不超过4.9kb、4.8kb、4.6kb、4.5kb、4.4kb、4.3kb、4.2kb、4.1kb或4kb。
在某些实施方案中，肌营养不良蛋白小基因编码例如与microD5具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％、更通常至少90％、91％、92％、93％或94％且甚至更通常至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的微型肌营养不良蛋白蛋白质，其中所述蛋白质保留微型肌营养不良蛋白活性。
在某些实施方案中，微型肌营养不良蛋白由与编码microD微型肌营养不良蛋白的多核苷酸序列具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％、更通常至少90％、91％、92％、93％或94％且甚至更通常至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列编码。多核苷酸任选地经密码子优化以在哺乳动物如人中表达。
在某些实施方案中，核苷酸序列在严格条件下与编码microD5微型肌营养不良蛋白或其补体的核酸序列杂交，并且编码功能性微型肌营养不良蛋白蛋白质。
术语“严格”用于指本领域通常理解为严格的条件。杂交严格度主要由温度、离子强度和变性剂(如甲酰胺)的浓度决定。杂交和洗涤的严格条件的实例是65℃至68℃下的0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠，或42℃下的0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺。参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold SpringHarbor Laboratory,(Cold Spring Harbor,N.Y.1989)。
也可使用更严格的条件(如更高的温度、更低的离子强度、更高的甲酰胺或其他变性剂)，但是，杂交速率将受到影响。在涉及脱氧寡核苷酸杂交的情况下，另外的示例性严格杂交条件包括在37℃(对于14个碱基的寡核苷酸)、48℃(对于17个碱基的寡核苷酸)、55℃(对于20个碱基的寡核苷酸)和60℃(对于23个碱基的寡核苷酸)下在6×SSC 0.05％焦磷酸钠中洗涤。
为了减少非特异性和/或背景杂交的目的，可在杂交和洗涤缓冲液中包括其他剂。实例是0.1％牛血清白蛋白、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％焦磷酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠、NaDodS04、(SDS)、ficoll、登哈特氏溶液、超声处理的鲑鱼精子DNA(或其他非互补DNA)以及硫酸葡聚糖，虽然也可使用其他合适的剂。这些添加剂的浓度和类型可改变，而不会显著影响杂交条件的严格性。杂交实验通常在pH 6.8至7.4下进行，然而，在典型离子强度条件下，杂交速率几乎与pH无关。参见Anderson等人,Nucleic Acid Hybridisation:APractical Approach,第4章,IRL Press Limited(Oxford,England)。本领域技术人员可调整杂交条件以适应这些变量并允许不同序列相关性的DNA形成杂合体。
另外的肌营养不良蛋白小基因序列可在例如US2017/0368198(以引用的方式并入本文)和WO 2017/181015(以引用的方式并入本文)的SEQ ID NO:7中找到。
在某些实施方案中，编码任何肌营养不良蛋白小基因如microD5的核苷酸序列可以是基于所公开的蛋白质序列的任一个。优选地，所述核苷酸序列经密码子优化以在人中表达。
微型肌营养不良蛋白在肌肉收缩期间为肌膜提供稳定性，例如，微型肌营养不良蛋白在肌肉收缩期间充当减震器。
在某些实施方案中，一个或多个编码序列中的至少一者靶向DMD中的次级级联基因之一。
例如，在某些实施方案中，一个或多个编码序列中的至少一者编码微小RNA，如miR-1、miR-133a、miR-29，特别是miR29c、miR-30c和/或miR-206。例如，miR-29c直接减少结缔组织的三种主要组分(例如，胶原蛋白1、胶原蛋白3和纤连蛋白)以减少纤维化。
如本文所用的“纤维化”是指细胞外基质(ECM)组分的过度或不受调控的沉积以及损伤后组织(包括骨骼肌、心肌、肝脏、肺、肾脏和胰腺)中的异常修复过程。沉积的ECM组分包括纤连蛋白和胶原蛋白，例如胶原蛋白1、胶原蛋白2或胶原蛋白3。
如本文所用，“miR-29”是指miR-29a、-29b或-29c中的一者。在某些实施方案中，miR-29是指miR-29c。
虽然不希望受任何特定理论的束缚，但据信表达的miR29(例如miR-29a、miR-29b或miR-29c)与胶原蛋白和纤连蛋白基因的3'UTR结合以下调这些靶基因的表达。
在另一个实施方案中，一个或多个编码序列中的至少一者编码RNAi序列，如针对肌脂蛋白(shSLN)的shRNA。一个或多个编码序列可编码相同或不同的针对肌脂蛋白(shSLN)的shRNA。在某些实施方案中，所述shRNA使肌脂蛋白mRNA和/或肌脂蛋白蛋白质表达降低至少约50％。
如本文所用，“肌脂蛋白(SLN)”、“肌脂蛋白蛋白质”、“SLN蛋白”、“肌脂蛋白多肽”和“SLN多肽”可互换使用以包括SLN基因的表达产物，如具有(MGINTRELFLNFTIVLITVILMWLLVRSYGY)(SEQ ID NO:l)的氨基酸序列、登录号NP_003054.1的天然人SLN蛋白。所述术语优选地是指人SLN。所述术语还可用于指与SEQ ID NO:1相差1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸或8个氨基酸的变体SLN蛋白，任选地差异在残基2至5、10、14、17、20和30，优选2至5和30内。所述术语还可用于指与SEQ ID NO:1在残基6至29相同或在残基6至29中相差至多1、2或3个保守取代，如L→I和/或I→V的SLN蛋白。任选地，变体SLN具有G30Q取代。变体展现天然SLN蛋白的功能活性，其可包括：SLN的磷酸化、去磷酸化、亚硝基化和/或泛素化，或与SERCA结合和/或通过例如从ATP水解中释放Ca2+转运或其在能量代谢和体重增加调控中的作用降低SERCA至肌内质网中钙输入速率。
如本文所用，“SLN基因”、“SLN多核苷酸”和“SLN核酸”可互换使用以包括天然人SLN编码核酸序列，例如天然人SLN基因(RefSeq登录号：NM_003063.2)，具有可转录SLNcDNA的序列的核酸；和/或前述的等位基因变体和同源物，如编码本文所述的任何变体SLN的多核苷酸。所述术语涵盖双链DNA、单链DNA和RNA。
在另一个实施方案中，主题载体的一个或多个另外的编码序列可靶向与由肌营养不良蛋白基因的损失引起的次级级联事件之一相关的任何其他基因，如炎症基因、NF-κB信号传导途径的活化因子(例如，TNF-α、IL-1、IL-1β、IL-6、NF-κB的受体活化因子(RANK)和Toll样受体(TLR))、NF-κB、由NF-κB诱导的下游炎性细胞因子、组蛋白脱乙酰酶(例如，HDAC2)、TGF-β、结缔组织生长因子(CTGF)、胶原蛋白、弹性蛋白、细胞外基质的结构组分、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、肌肉生长抑制素、磷酸二酯酶-5(PED-5)或ACE、VEGF诱饵受体1型(VEGFR-1或Flt-1)和造血前列腺素D合酶(HPGDS)。一个或多个另外的编码序列可以是RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA)、反义序列和/或拮抗上述靶基因的功能的微小RNA。
主题重组载体的设计可同时靶向一种或多种(例如，1、2、3、4、5种)这样的次级级联基因或途径，如SLN、微小RNA等。
例如，在某些实施方案中，主题载体的另外编码序列中的一者可以是RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA)或被设计用于下调SLN表达的反义序列，因此至少部分减轻了通过增加SERCA对钙的再摄取，营养不良肌肉中细胞内Ca2+的异常升高的次级缺陷。
在某些替代实施方案中，代替或除了靶向次级级联基因中的一者，一个或多个编码序列中的至少一者可以是诱导缺陷型内源性肌营养不良蛋白的外显子跳跃的外显子跳跃反义序列，如肌营养不良蛋白的外显子45至55或肌营养不良蛋白的外显子44、45、51和/或53中的任一者，从而进一步增强肌营养不良蛋白小基因(例如microD5)的治疗效果。如本文所用，“外显子跳跃”或“剪接转换”反义寡核苷酸(AON)是抗RNA酶-H的一种类型的反义序列，并且用于调节pre-mRNA剪接并校正pre-mRNA中的剪接缺陷。在反义介导的外显子跳跃治疗中，AON通常用于阻断特异性剪接信号并诱导某些外显子的特异性跳跃。这导致突变的转录物的阅读框的校正，从而可将其翻译成内部缺失但部分功能性蛋白质。
在一个具体方面，本发明提供了一种重组AAV(rAAV)载体，所述重组AAV(rAAV)载体编码肌营养不良蛋白小基因编码序列(如microD5/SGT-001)和用于靶向参与由肌营养不良蛋白功能的丧失导致的次级级联的一种或多种另外的靶基因的一个或多个另外的序列。此类构建体包含肌营养不良蛋白小基因和插入到肌营养不良蛋白小基因5'的异源内含子和/或肌营养不良蛋白小基因的3'-UTR区中的一个或多个另外的编码序列。
具体地，在一个方面，本发明提供了重组AAV(rAAV)载体，所述重组AAV(rAAV)载体包含：a)编码功能性微型肌营养不良蛋白的肌营养不良蛋白小基因，其中所述肌营养不良蛋白小基因包含3'-UTR编码区并且紧邻异源内含子序列的3'，所述异源内含子序列增强所述肌营养不良蛋白小基因的表达；b)与所述肌营养不良蛋白小基因可操作地连接并驱动所述肌营养不良蛋白小基因的表达的肌肉特异性控制元件；以及，c)插入所述内含子序列或所述3'-UTR编码区中的一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)编码序列；其中所述一个或多个编码序列独立地编码：RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA)、反义序列、微小RNA(miRNA)和/或miRNA抑制剂。
例如，所述rAAV载体可包含表达miR-29(例如，miR-29c)的多核苷酸序列，如包含miR-29c靶引导链(ACCGATTTCAAATGGTGCTAGA，WO2017/181015的SEQ ID NO:3或，以引用的方式并入本文)、miR-29c引导链(TCTAGCACCATTTGAAATCGGTTA，WO2017/181015的SEQ IDNO:4，以引用的方式并入本文)以及天然miR-30主链和茎环(GTGAAGCCACAGATG，WO2017/181015的SEQ ID NO:5，以引用的方式并入本文)的核苷酸序列。
在miR-30主链中包含miR-29c cDNA的示例性多核苷酸序列如WO2017/181015(以引用的方式并入本文)的SEQ ID NO:2和图1所示。
在某些实施方案中，微小RNA-29编码序列编码miR-29c。
在某些实施方案中，miR-29c任选地具有经修饰的侧翼主链序列，所述经修饰的侧翼主链序列增强针对靶序列设计的miR-29c的引导链的加工。例如，所述经修饰的侧翼主链序列可来自或基于miR-30(miR-30E)、-101、-155或-451的经修饰的侧翼主链序列。
在某些实施方案中，微小RNA是miR-1、miR-133a、miR-30c和/或miR-206。
在某些实施方案中，所述微小RNA在宿主细胞中的表达与所述微小RNA在所述宿主细胞中的内源表达相比上调至少约1.5至15倍(例如，约2至10倍、约1.4至2.8倍、约2至5倍、约5至10倍、约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或约15倍)。
在某些实施方案中，本发明的载体编码拮抗肌脂蛋白(SLN)的功能的反义序列或RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA等)。在某些实施方案中，本发明的载体编码拮抗肌脂蛋白(shSLN)的功能的shRNA。示例性shSLN序列包括图9和10中公开的那些(例如，图9中带下划线的序列和图10中突出显示的序列)。另外的示例性shSLN序列包括WO2018/136880(以引用的方式并入本文)中公开的SEQ ID NO:7至11。
本发明还部分涉及基因治疗载体，例如表达一个或多个编码序列和肌营养不良蛋白小基因的慢病毒或AAV，以及将所述基因治疗载体递送至肌肉以减轻和/或预防次级级联症状、同时恢复肌营养不良蛋白功能的方法。
在一个实施方案中，肌营养不良是与已知遗传缺陷相关的先天性肌营养不良(CMD)，如fukutin基因或FKRP(fukutin相关蛋白)基因。因此，在某些实施方案中，先天性肌营养不良是福山型先天性肌营养不良(FCMD)。
先天性肌营养不良(CMD)是一组在出生时或接近出生时变得明显的肌营养不良。在某些实施方案中，本发明的方法和rAAV可用于治疗CMD，尤其是具有基因的已知传缺陷的CMD，如肌联蛋白(伴有心肌病的CMD)；SEPN1(具有结蛋白包涵体的CMD，或具有(早期)脊柱强直的CMD)；整合素-α7(具有整合素α7突变的CMD)；整合素-α9(伴有关节过度松弛的CMD)；网蛋白(伴有家族性交界性大疱性表皮松解症的CMD)；fukutin(福山型CMD或MDDGA4)；fukutin相关蛋白(FKRP)(伴有肌肉肥大的CMD或MDC1C)；LARGE(MDC1D)；DOK7(伴有肌无力综合征的CMD)；核纤层蛋白A/C(伴有脊柱强直和核纤层蛋白A/C异常的CMD)；SBP2(伴有脊柱强直和硒蛋白缺乏症的CMD)；胆碱激酶β(伴有线粒体结构异常的CMD)；层粘连蛋白α2(分区蛋白缺乏型CMD或MDC1A)；POMGnT1(桑塔沃里肌肉-眼-脑疾病)；COLGA1、COL6A2或COL6A3(Ullrich CMD)；B3GNT1(沃克-沃伯格综合征：MDDGA型)；POMT1(沃克-沃伯格综合征：MDDGA1型)；POMT2(沃克-沃伯格综合征：MDDGA2型)；ISPD(MDDGA3、MDDGA4、MDDGB5、MDDGA6和MDDGA7)；GTDC2(MDDGA8)；TMEM5(MDDGA10)；B3GALNT2(MDDGA11)；或SGK196(MDDGA12)。
因此，本发明的慢病毒或rAAV载体可包含编码在CMD中有缺陷的任何野生型基因(如上文所列的那些)或其功能等效物的多核苷酸，以治疗有需要的受试者的CMD。一个或多个另外的编码序列可编码消除或修饰突变型CMD基因的RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA)、反义序列或微小RNA(miRNA)，或由于野生型基因功能的丧失而上调的次级级联基因。
例如，福山型先天性肌营养不良(FCMD)是由于突变型FKTN基因引起的，并且一个或多个另外的编码序列可编码外显子跳跃反义寡核苷酸，以恢复患者的缺陷型FKTN基因中的正确外显子10剪接。
在另一个实例中，先天性肌营养不良是由65-外显子LAMA2基因中的突变引起的分区蛋白缺乏型先天性肌营养不良1A型(MDC1A)。
因此，本发明的慢病毒或rAAV载体可包含编码功能性LAMA2蛋白的多核苷酸。一个或多个另外的编码序列可编码外显子跳跃反义序列，所述外显子跳跃反义序列导致C末端G结构域(外显子45至64)的表达恢复，特别是LAMA2的G4和G5对于介导与α-肌营养不良蛋白聚糖的相互作用最重要。例如，可跳跃突变型LAMA2基因的外显子4来治疗MDC1A。
在一个实施方案中，肌营养不良是肌强直性营养不良(DM)，如DM1或DM2。
因此，本发明的慢病毒或rAAV载体可包含编码DM1中有缺陷的功能性肌强直蛋白激酶(DMPK)蛋白或DM2中的功能性CCHC型锌指核酸结合蛋白基因(CNBP)蛋白的多核苷酸。一个或多个另外的编码序列可编码可用于靶向DMPK基因或CNBP基因中突变型转录物的扩增重复序列的RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA)、反义序列或微小RNA(miRNA)，用于RNA酶介导的降解。一个或多个另外的编码序列还可编码导致DM1患者的CLCN1基因中的外显子7A的跳跃的外显子跳跃反义序列。
在一个实施方案中，肌营养不良是由dysferlin(DYSF)基因中的突变引起的Dysferlin肌病，包括2B型肢带型肌营养不良(LGMD2B)和Miyoshi肌病(MM)。
因此，本发明的慢病毒或rAAV载体可包含编码LGMD2B或MM中有缺陷的功能性DYSF蛋白的多核苷酸。一个或多个另外的编码序列可编码外显子跳跃反义序列，所述外显子跳跃反义序列导致在dysferlin肌病患者中的缺陷型DYSF基因中的外显子32的跳跃。
在一个实施方案中，肌营养不良是由四种肌聚糖基因，即α(LGMD2D)、β(LGMD2E)、γ(LGMD2C)和δ(LGMD2F)基因中任一者的突变引起的肢带型肌营养不良(LGMD)，特别是由SGCG基因编码的γ肌聚糖(LGMD2C)。
因此，本发明的慢病毒或rAAV载体可包含编码LGMD中有缺陷的功能性肌聚糖蛋白，如LGMD2C中有缺陷的SGCG基因的多核苷酸。一个或多个另外的编码序列可编码外显子跳跃反义序列，所述外显子跳跃反义序列导致缺陷型LGMD2C基因(如具有Δ-521T SGCG突变的基因)中外显子4至7的跳跃。
在一个实施方案中，肌营养不良是由DUX4基因中的突变引起的面肩肱型肌营养不良(FSHD)。
因此，一个或多个另外的编码序列可编码降低DUX4或下游靶标如PITX1的表达的RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA)、反义序列或微小RNA(miRNA)。
在某些实施方案中，一个或多个另外的编码序列编码靶向DUX4的3'-UTR以降低其表达的外显子跳跃反义序列。这是因为DUX4编码序列完全位于基因第一外显子中，并且靶向mRNA 3'UTR中的元件的外显子跳跃可能破坏允许的聚腺苷酸化或干扰内含子1或2剪接，从而破坏功能性DUX4 mRNA。
面肩肱型肌营养不良(FSHD)是遗传性常染色体显性遗传病症，临床特征为进行性肌肉变性。它是继杜氏肌营养不良(DMD)和强直性肌营养不良之后第三常见的肌营养不良。FSHD的遗传特征是染色体4上一部分大卫星重复序列的致病性收缩，从而导致双同源盒蛋白4(DUX4)基因的异常表达。
存在两种类型的FSHD：FSHD1和FSHD2。FSHD1是最常见的形式，在95％以上的所有FSHD患者中发生。遗传分析将FSHD 1与染色体4上大卫星D4Z4重复序列阵列的遗传收缩联系起来。另一方面，FSHD2具有正常数量的D4Z4重复序列，但涉及染色体18p上的SMCHD1基因(染色质修饰因子)的杂合突变。具有FSHD1和FSHD2的患者具有相似的临床表现。
目前的药物治疗不能治愈FSHD，但侧重于FSHD症状的管理，包括肌肉生长抑制素抑制剂鲁特西普和抗炎生物制剂(ATYR1940)。抗炎生物制剂的基础是抑制FSHD患者的肌肉病理中常见的炎症，以减缓表型进展。因此，受试者的一个或多个编码序列可编码针对肌肉生长抑制素或炎症途径基因的RNAi试剂或反义RNA。同时，RNAi试剂如小干扰RNA(siRNA)和小发夹RNA(shRNA)或微小RNA(miRNA)或反义寡核苷酸可用于敲低肌病DUX4基因及其下游分子(包括配对样同源结构域转录因子1(PITX1))的表达。事实上，体外研究已经证明，通过将反义寡核苷酸施用到FSHD患者的初级骨骼肌细胞中，以及通过使用针对DUX4的miRNA递送至使用AAV载体的DUX4小鼠模型，成功抑制DUX4 mRNA表达。此外，已经在体内系统地证明了抑制PITX1表达的成功。
在某些实施方案中，一个或多个另外的编码序列可编码相同序列(例如，siRNA、shRNA、miRNA或反义)，并且因此另外的编码序列的拷贝数可出于剂量考虑进行调控或微调。
在某些实施方案中，一个或多个另外的编码序列可编码不同的序列，或者靶向不同的靶标，或者靶向同一靶标。例如，在某些实施方案中，一个另外的编码序列是针对靶标的反义序列，而另一个另外的编码序列是针对相同靶标的shRNA。或者，两个另外的编码序列都是shRNA，但它们靶向同一靶标的不同区域。
在某些实施方案中，一个或多个编码序列的插入不会不利地影响功能性蛋白质如肌营养不良蛋白小基因产物的表达。
到20世纪90年代初期，发现许多无内含子的转基因虽然在体外组织培养细胞中完美表达，但不能在体内(例如，在携带转基因的转基因小鼠中)表达相同的转基因，而在转基因的启动子与(无内含子)编码序列之间插入某些异源内含子序列大大增强了体内转基因表达。
特别地，Palmiter等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:478-482,1991，以引用方式并入本文)表明在金属硫蛋白启动子与生长激素转基因之间插入的几个异源内含子提高转基因表达，并且提供了某些异源内含子的添加作为提高转基因表达的一般策略。这些包括选自以下的异源内含子：rGH的天然第一内含子、大鼠胰岛素II(rIns-II)基因的内含子A、hβG基因的内含子B和SV40小t内含子。
类似的发现由Choi等人(Mol.Cell.Biol.11(6):3070-3074,1991，以引用的方式并入本文)证实，他报告在携带与氯霉素乙酰转移酶(CAT)的细菌基因连接的人组蛋白H4启动子的转基因小鼠中，转录单位中230bp异源杂合内含子的存在大大增强了CAT活性(与精确缺失插入序列的类似转基因相比，增强5至300倍)。这种由腺病毒剪接供体和免疫球蛋白G剪接受体组成的杂合内含子刺激了动物的广泛组织中的表达。由于杂合内含子刺激组织培养中组织纤溶酶原活化剂和因子VIII的表达，所以Choi得出结论，在小鼠中观察到的增强不太可能是CAT特异性的，而是普遍适用于转基因小鼠中任何cDNA的表达。
因此，在某些实施方案中，主题慢病毒或rAAV载体中的异源内含子选自由以下组成的组：rGH的天然第一内含子、大鼠胰岛素II(rIns-II)基因的内含子A、hβG基因的内含子B、SV40小t内含子和Choi的杂合内含子。
在某些实施方案中，异源内含子序列是SEQ ID NO:1：
GTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG。
在某些实施方案中，一个或多个另外的编码序列全部插入异源内含子序列(SEQID NO:1)中，或全部插入3’-UTR区中，或插入两个区中。例如，微小RNA-29c编码序列可被插入如SEQ ID NO:2中的内含子编码序列中：
GTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGATCTCTTACACAGGCTGACCGATTTCTCCTGGTGTTCAGAGTCTGTTTTTGTCTAGCACCATTTGAAATCGGTTATGATGTAGGGGGAAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG。
SEQ ID NO:2中的miR-29c序列是
ATCTCTTACACAGGCTGACCGATTTCTCCTGGTGTTCAGAGTCTGTTTTTGTCTAGCACCATTTGAAATCGGTTATGATGTAGGGGGA(SEQ ID NO:3)。
在某些实施方案中，慢病毒或rAAV还包含位于多核苷酸(如肌营养不良蛋白小基因)和另外的编码序列侧翼的两个慢病毒或AAV LTR/ITR序列。
在某些实施方案中，本发明的慢病毒或rAAV载体可与肌肉特异性控制元件可操作地连接。例如，肌肉特异性控制元件可以是：人骨骼肌动蛋白基因元件、心脏肌动蛋白基因元件、肌细胞特异性增强子结合因子MEF、肌肉肌酸激酶(MCK)、tMCK(截短的MCK)、肌球蛋白重链(MHC)、C5-12(合成启动子)、鼠肌酸激酶增强子元件、骨骼快缩肌钙蛋白C基因元件、慢缩心脏肌钙蛋白C基因元件、慢缩肌钙蛋白I基因元件、缺氧诱导核因子、类固醇诱导元件或糖皮质激素应答元件(GRE)。
在某些实施方案中，肌肉特异性控制元件位于异源内含子序列的5'，异源内含子序列位于肌营养不良蛋白小基因的5'，肌营养不良蛋白小基因包含3'-UTR区，包括翻译终止密码子(如TAG)、polyA腺苷酸化信号(如AATAAA)和mRNA裂解位点(如CA)。
在某些实施方案中，肌肉特异性控制元件包含WO2017/181015的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
WO2017/181015的SEQ ID NO:10：
Figure BDA0003202388630000311
WO2017/181015的SEQ ID NO:11:
Figure BDA0003202388630000312
在某些实施方案中，本发明的rAAV载体能够可操作地连接至包含MCK增强子核苷酸序列(参见WO2017/181015的SEQ ID NO:10，以引用的方式并入本文)和/或MCK启动子的肌肉特异性控制元件序列(参见WO2017/181015的SEQ ID NO:11，以引用的方式并入本文)。
在某些实施方案中，rAAV还包含与肌营养不良蛋白小基因和另外的编码序列可操作地连接并能够驱动其转录的启动子。
示例性启动子是CMV启动子。
在某些实施方案中，rAAV还包含用于将polyA序列插入转录的mRNA中的poly-A腺苷酸化序列。
在某些实施方案中，本发明的rAAV载体具有血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh.74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13。
本发明的另一方面提供了一种产生病毒载体例如本发明的rAAV载体的方法，所述方法包括培养已用任何病毒载体例如本发明的rAAV载体转染的细胞，以及回收病毒，例如来自转染细胞的上清液的rAAV颗粒。
本发明的另一方面提供了包含任何病毒载体例如本发明的重组AAV载体的病毒颗粒。
本发明的另一方面提供了产生在肌营养不良中有缺陷或有效治疗肌营养不良的功能性蛋白质(如微型肌营养不良蛋白)和一个或多个另外的编码序列的方法，所述方法包括用在宿主细胞中共表达本发明的功能性蛋白质(例如微型肌营养不良蛋白)和编码序列产物(例如，RNAi、siRNA、shRNA、miRNA、反义、微小RNA或其抑制剂)的主题重组AAV载体感染宿主细胞。
本发明的另一方面提供了治疗有需要的受试者的肌营养不良(如DMD或BMD)或抗肌萎缩蛋白病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的病毒载体例如本发明的重组AAV载体或本发明的组合物。
本发明考虑将任何病毒载体例如本发明的AAV载体施用至被诊断患有抗肌萎缩蛋白病或肌营养不良如DMD或BMD或任何其他MD、特别是缺陷型肌营养不良蛋白相关肌营养不良的患者，优选在所述受试者中观察到一种或多种继发性级联症状(如纤维化)之前，或者在受试者的肌肉力量已经减少之前，或者在受试者的肌肉质量已经减少之前。
本发明还考虑将本发明的任何病毒载体，例如，rAAV施用至患有抗肌萎缩蛋白病或肌营养不良如DMD或BMD或任何其他MD、特别是肌营养不良蛋白相关肌营养不良的受试者，所述受试者已经发展了一种或更多继发性级联症状如纤维化，以预防或减缓这些受试者的进一步疾病进展。
本发明的另一方面提供了重组病毒载体，例如包含编码功能性蛋白质的核苷酸序列和一个或多个另外的编码序列的AAV载体，所述功能性蛋白质在肌营养不良中有缺陷或有效治疗肌营养不良(例如，微型肌营养不良蛋白)。
在某些实施方案中，本发明提供了rAAV，所述rAAV包含与编码功能性微型肌营养不良蛋白如microD5的核苷酸序列具有至少85％、90％、95％、97％或99％同一性的核苷酸序列。
所述病毒载体例如rAAV载体可包含肌肉特异性启动子(如MCK启动子)、有效增强肌营养不良蛋白基因的表达的异源内含子序列、微型肌营养不良蛋白基因的编码序列、polyA腺苷酸化信号序列、在这些序列的侧翼的ITR/LTR重复序列。病毒载体例如rAAV载体可任选地还包含氨苄青霉素抗性和质粒主链序列或pBR322复制起点，以用于在细菌宿主中扩增。
在一个方面，本发明的重组AAV载体是AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh.74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV 12或AAV13。
在本发明的任何方法中，rAAV载体可通过肌内注射或静脉内注射施用。
在本发明的任何方法中，病毒载体例如rAAV载体或组合物全身施用。例如，病毒载体例如rAAV载体或组合物通过注射、输注或植入肠胃外施用。
本发明的另一方面提供了组合物，如药物组合物，所述组合物包含任何病毒载体例如本发明的rAAV载体。
在某些实施方案中，所述组合物是药物组合物，所述药物组合物还可包含治疗相容的载体或赋形剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含任何病毒载体，例如共表达主题功能性蛋白质(例如，微型肌营养不良蛋白)和所述一个或多个另外的编码序列的rAAV载体的组合物，用于治疗患有抗肌萎缩蛋白病或肌营养不良如DMD或贝克尔肌营养不良的受试者。
本发明的组合物(例如，药物组合物)可被配制用于肌内注射或静脉内注射。本发明的组合物还可被配制用于全身施用，如通过注射、输注或植入进行肠胃外施用。此外，任何组合物被配制用于施用至患有抗肌萎缩蛋白病或肌营养不良，例如DMD、Becker肌营养不良或任何其他肌营养不良蛋白相关的肌营养不良的受试者。
在另一个实施方案中，本发明提供了任何病毒载体，例如共表达主题功能性蛋白质(例如微型肌营养不良蛋白)和所述一个或多个另外的编码序列的本发明的rAAV载体用于制备用于减少受试者患有抗肌萎缩蛋白病或肌营养不良如DMD、贝克尔肌营养不良或任何其他肌营养不良蛋白相关的肌营养不良的药物的用途。
本发明考虑了任何病毒载体例如本发明的AAV载体用于制备用于在受试者中观察到一种或多种继发性级联症状如纤维化之前施用至被诊断患有DMD的患者的药物的用途。
本发明还考虑了任何病毒载体例如本发明的AAV载体用于制备用于将任何病毒载体例如本发明的rAAV施用至已经发展了继发性级联症状如纤维化的患有肌营养不良的受试者以预防或延迟这些受试者的疾病进展的药物的用途。
本发明还提供了病毒载体，例如，共表达主题功能性蛋白质如微型肌营养不良蛋白和所述一个或多个另外的编码序列的本发明的rAAV载体用于制备用于治疗肌营养不良如DMD/BMD的药物的用途。
在本发明的任何用途中，药物可被配制用于肌内注射。此外，可制备任何药物以施用于患有肌营养不良如DMD或任何其他肌营养不良蛋白相关的肌营养不良的受试者。
本发明还提供基因治疗载体，例如，在肌营养不良患者中共表达主题功能性蛋白质(例如微型肌营养不良蛋白)和所述一种或多种另外的编码序列的rAAV载体。
应理解，本文描述的本发明的任一个实施方案可与本发明的任何一个或多个另外的实施方案组合，包括仅在实施例中描述或仅在上文或下文部分之一或本发明的一方面中描述的那些实施方案。
AAV
如本文所用，术语“AAV”是腺相关病毒的标准缩写。腺相关病毒是单链DNA细小病毒，其仅在细胞中生长，其中某些功能由共同感染的辅助病毒提供。存在至少13种已被表征的AAV血清型。AAV的一般信息和综述可在例如Carter,1989,Handbook of Parvoviruses,第1卷,第169-228页；和Berns,1990,Virology,第1743-1764页,Raven Press,(New York)(以引用的方式并入本文)中找到。然而，完全可预期这些相同的原则将适用于另外的AAV血清型，因为众所周知，即使在遗传水平下，各种血清型在结构和功能上非常密切相关。参见例如，Blacklowe,1988,Parvoviruses and Human Disease,J.R.Pattison,编的第165-174页；和Rose,Comprehensive Virology3:1-61(1974)。例如，所有AAV血清型明显表现出非常相似的由同源rep基因介导的复制性质；并且全部携带三种相关的衣壳蛋白，如在AAV2中表达的那些。异源双链体分析进一步表明了相关性程度，所述分析揭示了沿基因组长度的血清型之间的广泛交叉杂交；并且在对应于“反向末端重复序列”(ITR)的末端存在类似的自退火区段。相似的感染模式也表明每种血清型中的复制功能都处于相似的调控控制之下。
如本文所用的“AAV载体”是指包含侧接AAV末端重复序列(ITR)的一种或多种目标多核苷酸(或转基因)的载体。当存在于已经用编码和表达rep和cap基因产物的载体转染的宿主细胞中时，此类AAV载体能够复制并包装成感染性病毒颗粒。
“AAV病毒粒子”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化的多核苷酸AAV载体组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸(即，除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，则通常将其称为“AAV载体颗粒”或简称为“AAV载体。”因此，AAV载体颗粒的产生必然包括AAV载体的产生，因为这样的载体包含在AAV载体颗粒内。
本发明的重组AAV基因组包含本发明的核酸分子和核酸分子侧翼的一个或多个AAV ITR。
存在多种AAV血清型，并且AAV血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。例如，AAV血清型2(AAV2)基因组的核苷酸序列呈现在Srivastava等人,J Virol 45:555-564(1983)中，由Ruffing等人,JGen Virol 75:3385-3392(1994)校正。两者均以引用的方式并入本文。作为其他实例，AAV-1的完整基因组提供于GenBank登录号NC_002077(以引用的方式并入本文)中；AAV-3的完整基因组提供于GenBank登录号NC_001829(以引用的方式并入本文)中；AAV-4的完整基因组提供于GenBank登录号NC_001829(以引用的方式并入本文)中；AAV-5基因组提供于GenBank登录号AF085716(以引用的方式并入本文)中；AAV-6的完整基因组提供于GenBank登录号NC_001862(以引用的方式并入本文)中；AAV-7和AAV-8基因组的至少一部分分别提供于GenBank登录号AX753246(以引用的方式并入本文)和AX753249(以引用的方式并入本文)中(还参见与AAV-8有关的美国专利号7,282,199和7,790,449)；AAV-9基因组提供于Gao等人,J.Virol 78:6381-6388(2004)中，以引用的方式并入本文；AAV-10基因组提供于Mol.Ther.13(1):67-76(2006)中，以引用的方式并入本文；并且AAV-11基因组提供于Virology 330(2):375-383(2004)中，以引用的方式并入本文。AAVrh74血清型描述于Rodino-Klapac等人,J.Trans.Med.5:45(2007)中，以引用的方式并入本文。
rAAV基因组中的AAV DNA可来自可衍生重组病毒的任何AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、Rh10、Rh74和AAV-2i8。
假型化rAAV的产生公开于例如以引用的方式整体并入本文的WO 01/83692中。
还考虑了其他类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见例如，Marsic等人,Molecular Therapy,22(11):1900-1909(2014)。各种AAV血清型的基因组的核苷酸序列是本领域中已知的。
在某些实施方案中，为了促进骨骼肌特异性表达，可使用AAV1、AAV6、AAV8或AAVrh.74。
在某些实施方案中，主题AAV载体的AAV血清型是AAV9。
指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装以及宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在所述ITR内。三种AAV启动子(出于它们的相对图谱位置命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两种AAV内部开放阅读框的表达。
两种rep启动子(p5和p19)加上单个AAV内含子的差异剪接(例如，在AAV2核苷酸2107和2227)使得从rep基因产生四种rep蛋白(rep78、rep 68、rep 52和rep 40)。Rep蛋白具有最终负责复制病毒基因组的多种酶促性质。
cap基因由p40启动子表达，并且它编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。选择性剪接和非共有翻译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。
单个共有聚腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95。Muzyczka,CurrentTopics in Microbiology and Immunology 158:97-129(1992)中综述了AAV的生命周期和遗传学。
本发明的DNA质粒包含本发明的rAAV基因组。将DNA质粒转移至允许用AAV的辅助病毒(例如腺病毒、El缺失的腺病毒或疱疹病毒)感染的细胞，用于将rAAV基因组组装到感染性病毒颗粒中。用于产生rAAV颗粒的技术是本领域标准的，其中将待包装的AAV基因组、rep和cap基因以及辅助病毒功能提供给细胞。rAAV的产生要求在单个细胞(本文中表示为包装细胞)内存在以下组分：rAAV基因组、与rAAV基因组分离(即不在)rAAV基因组中的AAVrep和cap基因，以及辅助病毒功能。AAV rep和cap基因可来自重组病毒可来源的任何AAV血清型，并且可来自与rAAV基因组ITR不同的AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAVrh.74、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12和AAV-13。
产生包装细胞的方法是产生稳定表达用于AAV颗粒产生的所有必需组分的细胞系。例如，将包含缺乏AAV rep和cap基因的rAAV基因组、与rAAV基因组分离的AAV rep和cap基因以及选择性标记物(如新霉素抗性基因)的质粒(或多个质粒)整合到细胞的基因组中。AAV基因组已通过诸如GC加尾(Samulski等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79:2077-2081,1982)、添加含有限制性内切酶裂解位点的合成接头(Laughlin等人,Gene 23:65-73,1983)或通过直接平末端连接(Senapathy和Carter,J.Biol.Chem.259:4661-4666,1984)的程序引入到细菌质粒中。然后用辅助病毒如腺病毒感染包装细胞系。这种方法的优点是细胞是选择性的并且适合于rAAV的大规模产生。
适合方法的其他实例采用腺病毒或杆状病毒而不是质粒来将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入包装细胞中。
rAAV产生的一般原理综述于例如Carter,Current Opinions in Biotechnology1533-1539,1992；和Muzyczka,Curr.Topics in Microbial.and Immunol.158:97-129,1992)中。各种方法描述于Ratschin等人,Mol.Cell.Biol.4:2072,1984；Hermonat等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466,1984；Tratschin等人,Mol.Cell.Biol.5:3251,1985；McLaughlin等人,J.Virol.62:1963,1988；和Lebkowski等人,Mol.Cell.Biol.7:349,1988；Samulski等人,J.Virol.63:3822-3828,1989；美国专利号5,173,414；WO 95/13365和相应的美国专利号5,658,776；WO95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人,Vaccine 13:1244-1250,1995；Paul等人,Human Gene Therapy 4:609-615,1993；Clark等人,Gene Therapy 3:1124-1132,1996；美国专利号5,786,211；美国专利号5,871,982；和美国专利号6,258,595中。前述文件特此以引用的方式整体并入本文，特别强调与rAAV产生相关的文件的那些部分。
在某些实施方案中，本发明的AAV载体根据Adamson-Small等人描述的方法产生(Molecular Therapy-Methods&Clinical Development(2016)3,16031；doi:10.1038/mtm.2016.31，以引用的方式并入本文)，其是一种使用HSV平台产生高滴度和高质量腺相关9型载体的可规模化方法。它是完整的基于单纯疱疹病毒(HSV)的产生和纯化过程，能够在HEK 293生产细胞的每10层CellSTACK中产生大于1×1014个rAAV9载体基因组，或在最终完全纯化的产物中每个细胞大于1×105个载体基因组。这表示相对于基于转染的方法的5至10倍增加。此外，与基于转染的产生相比，通过这种方法产生的rAAV载体表现出改进的生物学特性，包括如由更高的转导单位与载体基因组比率所显示的感染性增加和总衣壳蛋白量减少，由更低的空与完整比率所示。这种方法还可容易地适于rAAV9载体的大规模良好实验室规范(GLP)和良好生产规范(GMP)生产，以实现临床前和临床研究并提供平台以实现后期和商业生产。尽管此研究中使用了AAV9，但这种方法很可能可扩展到其他血清型，并且应弥合临床前研究、早期临床研究与用于遗传疾病和病症的基于基因疗法的药物的大规模全球开发之间的差距。
本发明因此提供产生感染性rAAV的包装细胞。在一个实施方案中，包装细胞可以是稳定转化的癌细胞，如HeLa细胞、293细胞和PerC.6细胞(同源293系)。在另一个实施方案中，包装细胞是未转化癌细胞的细胞，如低传代293细胞(用腺病毒El转化的人胎肾细胞)、MRC-5细胞(人胚胎成纤维细胞)、WI-38细胞(人胚胎成纤维细胞)、Vero细胞(猴肾细胞)和FRhL-2细胞(恒河猴胚胎肺细胞)。
本发明的重组AAV(即感染性衣壳化rAAV颗粒)包含rAAV基因组。在示例性实施方案中，rAAV的基因组均缺乏AAV rep和cap DNA，即基因组的ITR之间没有AAV rep或capDNA。可构建以包含本发明的核酸分子的rAAV的实例在国际专利申请号PCT/US2012/047999(WO2013/016352)中阐述，所述专利以引用的方式整体并入本文。
rAAV可通过本领域的标准方法如通过柱色谱法或氯化铯梯度纯化。用于从辅助病毒纯化rAAV载体的方法是本领域已知的，并且包括公开于例如Clark等人,Hum.GeneTher.10(6):1031-1039,1999；Schenpp和Clark,Methods Mol.Med.69:427-443,2002；美国专利号6,566,118和WO 98/09657中的方法。
另外的编码序列
除了肌营养不良蛋白(如microD5)的编码序列外，本发明的重组载体还包含一个或多个另外的编码序列，用于靶向与肌营养不良蛋白损失相关或由肌营养不良蛋白损失引起的继发并发症/继发级联之一中的基因。
在某些实施方案中，本发明的载体编码能够校正特定肌营养不良蛋白基因突变的外显子跳跃反义序列。
例如，外显子跳跃反义序列在受试者的缺陷型肌营养不良蛋白基因的前信使RNA(pre-mRNA)剪接过程中诱导特定外显子的跳跃，从而导致阅读框的恢复和内部截短蛋白质的部分产生，类似于在贝克尔肌营养不良中观察到的肌营养不良蛋白表达。
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列跳过或剪接掉破坏框的外显子(突变外显子)和/或相邻外显子以恢复正确的转录阅读框，并产生较短但功能性的肌营养不良蛋白。
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列诱导单一外显子跳跃。在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列诱导多个外显子跳跃，如外显子45至55中的一个或多个或全部的跳跃(即，天然外显子44直接连接至外显子56)。例如，11个反义序列可一起使用以跳过包括外显子45至55在内的所有11个外显子。在mdx52小鼠模型(缺失外显子52)中使用10个AON的混合物来诱导外显子45至51和53至55的跳跃，从而恢复功能性肌营养不良蛋白表达。
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列诱导肌营养不良蛋白pre-mRNA中外显子51的跳跃。理论上，外显子51的成功跳跃可治疗约14％的DMD患者。
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列靶向肌营养不良蛋白基因的外显子51中的外显子剪接增强子(ESE)位点，从而导致外显子51跳跃并产生截短但部分功能的肌营养不良蛋白。
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列诱导外显子44、45和53中的一者或多者的跳跃。
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列靶向与卡西姆生(casimersen)(外显子45)、NS-065/NCNP-01或戈罗迪生(golodirsen)(外显子53)或依替勒森(eteplirsen)或Exondys 51(外显子51)相同的靶序列。
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列靶向福山型先天性肌营养不良(FCMD)患者中的突变FCMD/FKTN基因中的隐蔽剪接供体和/或受体位点以恢复正确的外显子10剪接。
福山型先天性肌营养不良(FCMD)是罕见的常染色体隐性疾病，并且是日本儿童肌营养不良的第二种流行形式。负责FCMD(FCMD，也称为FKTN)的基因编码蛋白fukutin，它是推定的糖基转移酶和糖基化α-肌营养不良蛋白聚糖，是肌营养不良蛋白相关糖蛋白复合物(DAGC)的成员。FCMD的发病机制是由SINE-VNTR-Alu(SVA)逆转录转座子祖先插入fukutin基因的3'-非翻译区(UTR)引起的，从而导致外显子10中新的、隐蔽的剪接供体以及SVA插入位点中的新的隐蔽剪接受体的活化，从而诱导隐蔽供体与受体位点之间的异常mRNA剪接。结果是FCMD的外显子10过早截短。在FCMD患者细胞和体内模型小鼠中，已经表明，靶向隐蔽剪接调节区域的三种体内PMO的混合物阻止了致病性SVA外显子捕获并恢复了正常FKTN蛋白水平和α-肌营养不良蛋白聚糖的O-糖基化。
在某些实施方案中，反义序列靶向3-或4-核苷酸重复序列的病理性扩增，如DM1患者的DMPK基因的3'-UTR区中的CTC三联体重复序列，或DM2患者的CNBP基因的第一内含子中的CCTG重复序列。
肌强直性营养不良(DM)是成年期最常见的肌营养不良形式。它是可分为肌强直性营养不良1型(DM1)和肌强直性营养不良2型(DM2)的常染色体显性遗传病。DM1是由强直性肌营养不良蛋白激酶(DMPK)基因的3'-UTR区中的CTC三联体的病理性扩增引起的，而DM2是由CCHC型锌指核酸结合蛋白基因(CNBP)的第一内含子中的CCTG段的病理性扩增引起的。RNA功能获得毒性由具有扩增的重复序列的转录RNA聚集体引起，导致异常剪接(剪接病(spliceopathy))。毒性RNA的聚集体通过鳌合和耗尽核RNA病灶内的前者并增加后者在DM1中的表达和磷酸化来破坏选择性剪接调控因子盲肌样(MBNL)蛋白和CUG结合蛋白1(CUGBP1)的功能。MBNL和CUGBP1蛋白功能的改变导致靶基因的pre-mRNA的异常剪接，即胰岛素受体(INSR)、肌肉氯化物通道(CLCN1)、桥接整合因子-1(BIN1)和肌营养不良蛋白(DMD)，它们分别与胰岛素抵抗、肌强直、肌无力和营养不良的肌肉过程(肌强直性营养不良的所有典型症状)相关。
因此，DMPK基因中的扩增CUG重复序列鳌合MBNL1蛋白并导致几种下游基因的异常剪接，从而导致DM1表型。同时，反义寡核苷酸可用于靶向突变型转录物的这种扩增的重复序列，以进行RNA酶介导的降解，从而恢复下游基因的剪接。2’-O-甲氧基乙基缺口聚物AON已被用于靶向突变型RNA转录物中RNA酶H对扩增的CUG的降解，从而导致突变型mRNA转录物的减少和蛋白质表达的恢复。
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列导致DM1患者的CLCN1基因中外显子7A的跳跃。
DM1也可通过校正氯化物通道1(CLCN1)的异常剪接来治疗，因为这种基因导致DM1患者的肌强直。通过超声暴露使用PMO(磷酰二胺吗啉代寡聚物)和气泡脂质体以增强PMO递送到DM1小鼠(HSALR)肌肉中，在体内实现CLCN1的外显子7A的跳跃，从而改善骨骼肌中的肌强直和Clcn1蛋白质表达。
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列靶向DYSF基因的外显子17、32、35、36和/或42，优选外显子32和/或36，用于在具有DYSF突变的dysferlin肌病(例如，LGMD2B或MM)患者中的外显子跳跃。
Dysferlin肌病是总称，包括由dysferlin(DYSF)基因中的突变引起的肌营养不良。Dysferlin基因编码修复肌膜损伤所需的肌纤维膜蛋白。它由钙依赖性C2脂质结合结构域和重要的跨膜结构域组成。存在两种常见的dysferlin肌病-2B型肢带型肌营养不良(LGMD2B)和Miyoshi肌病(MM)，两者都具有不同的临床表型和常染色体隐性遗传。LGMD2B的特征在于近端肌无力，而MM的特征值在于远端肌无力。LGMD2B和MM的初始临床表型是不同的。然而，随着疾病进展，两种疾患的临床表现会叠，变得更加相似，并且患者经历近端肢体和远端肢体的肌无力。Dysferlin缺乏的肌纤维在膜修复方面存在缺陷。
可使用反义寡核苷酸通过外显子跳跃治疗Dysferlin肌病，部分是由于在患者中观察到的轻度表型，截短的突变型DYSF蛋白只有10％的野生型水平表达。具体而言，在复合杂合女性患者的LGMD2B病例中，患者携带一个无效等位基因，以及内含子31中的另一个等位基因上的DYSF分支点突变。外显子32的自然框内跳跃导致以野生型水平的约10％表达的截短的dysferlin蛋白水平，这足以部分补充无效突变。患者表现出轻微症状，并且在70岁时可行走。最近，已经表明，患者细胞中的外显子32跳跃导致准dysferlin表达水平，其挽救了在体外经受低渗透压和肌纤维膜局部激光损伤的治疗细胞的膜修复。
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列靶向LAMA2基因的外显子4，用于在具有LAMA2突变的分区蛋白缺乏型先天性肌营养不良1A型(MDC1A)患者中进行外显子跳跃。在某些实施方案中，外显子跳跃导致C末端G结构域(外显子45至64)、特别是对于介导与α-肌营养不良蛋白聚糖的相互作用最重要的G4和G5的表达恢复。
分区蛋白缺乏型先天性肌营养不良1A型(MDC1A)是由65外显子LAMA2基因中的突变引起的，导致层粘连蛋白-α2链表达的完全或部分缺乏。层粘连蛋白-α2链与β1(β1)和γ1(γ1)链一起是异源三聚体层粘连蛋白同种型(称为层粘连蛋白211或分区蛋白)的一部分，其特别在骨骼肌的基底膜中表达，包括神经肌肉接点和雪旺氏细胞(外周神经)。层粘连蛋白-α2与肌营养不良蛋白-肌营养不良蛋白复合物(DGC)相互作用，介导骨骼肌和周围神经中的细胞信号传导、粘附和组织完整性。尽管并非总是如此，层粘连蛋白-α2的部分表达导致较温和的MDC1A，而层粘连蛋白-α2的完全缺失导致严重的MDC1A。C末端G结构域(外显子45至64)、特别是G4和G5对于介导与α-肌营养不良蛋白聚糖的相互作用最重要。即使在部分截短的层粘连蛋白-α2表达存在下，消除G4和G5的突变也与严重表型相关。
外显子跳跃已被探索用于治疗MDC1A，因为PMO介导的外显子4跳跃校正了开放阅读框，从而导致截短的层粘连蛋白-α2链的恢复和稍微延长的患者寿命。
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列诱导LGMD2C/SGCG基因中最常见的Δ-521T突变的外显子4至7的跳跃，以及阅读框的恢复以产生内部截短的SGCG蛋白，以用于治疗具有Δ-521T SGCG突变的2C型肢带型肌营养不良患者。在某些实施方案中，外显子跳跃导致保留野生型SGCG蛋白的细胞内、跨膜和极端羧基末端的内部截短的SGCG蛋白的表达恢复。
肌营养不良蛋白相关蛋白(DAP)是肌细胞膜中的复合物，其跨膜组分将细胞骨架连接至成体肌肉纤维中的细胞外基质，并且对于保持肌细胞膜的完整性至关重要。DGC内的肌聚糖亚复合物由4个单程跨膜亚基组成：α-、β-、γ-和δ-肌聚糖。α至δ-肌聚糖基因，即α(LGMD2D)、β(LGMD2E)、γ(LGMD2C)和δ(LGMD2F)主要(β)或仅(α、γ和δ)在横纹肌中表达。四种肌聚糖基因中的任一者的突变都可能导致其他肌聚糖蛋白的继发性缺乏，这可能是由于肌聚糖复合物的不稳定，从而导致肌聚糖病-常染色体隐性肢带型肌营养不良(LGMD)。α至δ基因中的致病突变导致肌细胞膜中肌营养不良蛋白相关蛋白(DAP)复合物的破坏。
在人中，γ肌聚糖(LGMD2C)是由SGCG基因编码的蛋白质。严重的儿童常染色体隐性肌营养不良(SCARMD)是与γ-肌聚糖基因处的微卫星标志物分离的进行性肌肉萎缩病症。γ-肌聚糖基因的突变首先在北非的马格里布国家被描述，在那里γ-肌聚糖病的发病率高于平常。LGMD 2C患者中最常见的突变之一，Δ-521T，是从γ-肌聚糖基因的外显子6中的核苷酸碱基521至525处的5个胸腺嘧啶串中缺失胸腺嘧啶。这种突变改变阅读框架，并且导致γ-肌聚糖蛋白的缺失以及β-和δ-肌聚糖的继发性减少，从而导致严重的表型。这种突变发生在马格里布群体和其他国家。
外显子跳跃已被探索用于治疗具有Δ-521T突变的LGMD2C，因为由此产生的内部截短的SGCG蛋白提供了功能和病理学益处，以校正果蝇模型、异源细胞表达研究和缺乏γ-肌聚糖的转基因小鼠中的γ-肌聚糖损失。还产生了人肌肉疾病的细胞模型，以表明可在编码突变型人γ-肌聚糖的RNA中诱导多外显子跳跃。
在某些实施方案中，本发明的载体编码拮抗肌脂蛋白(SLN)的功能的反义序列或RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA等)。在某些实施方案中，本发明的载体编码拮抗肌脂蛋白(shSLN)的功能的shRNA。
示例性shSLN序列包括图9和10中公开的那些(例如，图9中带下划线的序列和图10中突出显示的序列)。
另外的示例性shSLN序列包括WO2018/136880(以引用的方式并入本文)中公开的SEQ ID NO:7至11。
可基于任何本领域公认的方法，使用如下所示的人SLN mRNA序列设计其它shSLN序列。
Figure BDA0003202388630000451
在某些实施方案中，本发明的载体编码拮抗一种或多种靶基因如炎症基因的功能的反义序列或RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA等)。
IκB激酶/核因子-κB(NF-κB)信号传导在动物模型和DMD患者的免疫细胞和再生肌纤维中持续升高。此外，NF-κB的活化因子如TNF-α和IL-1和IL-6在DMD肌肉中上调。因此，抑制NF-κB信号传导级联组分(如NF-κB本身、其上游活化因子和下游炎性细胞因子)对于结合替代/修复缺陷型肌营养不良蛋白基因治疗受试者是有益的。
因此，在某些实施方案中，本发明的载体编码反义序列或RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA等)，其拮抗一种或多种炎症基因如NF-κB、TNF-α、IL-1(IL-1β)、IL-6、NF-κB受体活化因子(RANK)和Toll样受体(TLR)的功能。
在某些实施方案中，本发明的载体编码拮抗组蛋白脱乙酰酶(如HDAC2)的功能的反义序列或RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA等)。在DMD中，肌纤维膜缺乏肌营养不良蛋白使一氧化氮合酶(nNOS)离域并下调，从而改变HDAC2的S-亚硝基化及其染色质缔合。在NO途径有缺陷的肌营养不良蛋白缺乏的mdx小鼠中，HDAC2的活性导致特异性地增加。相比之下，mdx动物中nNOS表达的挽救改善了营养不良表型。此外，脱乙酰酶抑制剂赋予营养不良的肌肉纤维强大的形态功能益处。事实上，组蛋白脱乙酰酶抑制剂吉维司他正在评估作为DMD的潜在疾病改善治疗。数据表明，在鼠和人营养不良细胞中，肌营养不良蛋白的缺失与HDAC2与特定miRNA子集的结合相关(参见下文)，而在肌营养不良蛋白挽救后，HDAC2从这些启动子中释放。
在某些实施方案中，本发明的载体编码拮抗TGF-β或结缔组织生长因子(CTGF)的功能的反义序列、RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA等)或微小RNA。肌营养不良中TGF-β的水平升高通过阻断卫星细胞的活化来刺激纤维化并损害肌肉再生。抗纤维化剂已在肌营养不良的鼠模型中进行了测试，包括氯沙坦，一种降低TGF-β表达的血管紧张素II-1型受体阻滞剂。HT-100(卤夫酮)也已被证明通过TGF-β/Smad3途径预防肌营养不良中的纤维化。同时，FG-3019(一种干扰结缔组织生长因子的作用的完全人源单克隆抗体，结缔组织生长因子是纤维化发病机制的中心介质)已在患有特发性肺纤维化(IPF)的患者中的开放标签2期试验中进行了评估。
在某些实施方案中，本发明的载体编码微小RNA(miR)，如miR-1、miR-29c、miR-30c、miR-133和/或miR-206。杜氏对比野生型条件的差异HDAC2亚硝基化状态使特定微小RNA基因子集的表达失调。由鉴定的微小RNA控制的几种环路(如将miR-1连接至G6PD酶和细胞的氧化还原状态或将miR-29连接至细胞外蛋白和纤维化过程的环路)解释了一些DMD致病性状。肌肉特异性(myomiR)miR-1和miR-133以及普遍存在的miR-29c和miR-30c在mdx中下调，在外显子跳跃治疗的动物中恢复到野生型水平。根据mdx模型，当通过外显子跳跃恢复肌营养不良蛋白合成时，miR-1、miR-133a、miR-29c、miR-30c和miR-206的水平增加，而miR-23a表达没有变化。
在某些实施方案中，本发明的载体编码微小RNA抑制剂，其抑制在DMD或其相关疾病中上调的微小RNA的功能。例如，炎性miR-223表达水平在mdx小鼠肌肉中上调，而在外显子跳跃治疗的小鼠中下调。它的减少与观察到的肌肉炎症状态的改善一致，这是由于外显子跳跃对肌营养不良蛋白的挽救。
mdx动物经历广泛纤维变性，并且miR-29已被证明可靶向参与纤维变性的关键因子如胶原蛋白、弹性蛋白和细胞外基质的结构组分的mRNA。在mdx小鼠中，miR-29表达不佳，并且胶原蛋白(COL1A1)和弹性蛋白(ELN)的mRNA上调。因此，miR-29c的表达减轻DMD患者的纤维变性，部分是通过下调胶原蛋白和弹性蛋白表达，以及与胶原蛋白和弹性蛋白表达相关的病理性细胞外基质修饰。
在某些实施方案中，本发明的载体编码拮抗G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)的功能的反义序列或RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA等)。营养不良肌肉的一个重要问题是它们对表明参与疾病进展的氧化应激的易感性和响应。G6PD是磷酸戊糖途径中的胞质酶，通过维持NADPH的水平为细胞提供还原能量，其进而确保还原型与氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)之间的高比例，GSH是保护细胞免受氧化损伤的主要抗氧化分子。G6PD mRNA在mdx肌肉中失调。它在其3'-UTR区中含有miR-1家族的三个推定结合位点，并且miR-1和miR-206能够阻抑G6PD表达。事实上，G6PD与miR-1表达之间存在负相关：C2成肌细胞的体外分化表明miR-1水平的增加与G6PD蛋白、mRNA水平和GSH/GSSG比率的降低相关。在miR-1下调的mdx小鼠中，与WT肌肉中相比，以较高水平检测G6PD，而在miR-1恢复的外显子跳跃治疗的mdx中，G6PD的量减少。值得注意的是，在mdx小鼠中，G6PD水平的增加伴随着GSH/GSSG比率的降低。
在某些实施方案中，本发明的载体编码拮抗肌肉生长抑制素的功能的反义序列或RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA等)。肌肉生长抑制素是肌肉质量的负调控因子。内源性肌肉生长抑制素的抑制或阻断补偿许多类型的肌营养不良(包括DMD)中常见的严重肌肉萎缩。肌肉生长抑制素阻断抗体MYO-029正在用于治疗患有BMD和其他营养不良的成人受试者的临床试验中。还进行了使用肌肉生长抑制素抑制剂如卵泡抑素和PF-06252616(NCT02310764)以及BMS-986089的其他临床试验。
在某些实施方案中，本发明的载体编码拮抗磷酸二酯酶-5(PED-5)或ACE或VEGF诱饵受体1型(VEGFR-1或Flt-1)的功能的反义序列或RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA等)。肌营养不良蛋白的损失导致神经元一氧化氮合酶的置换和肌肉来源的一氧化氮减少到微血管系统，从而导致功能性肌肉缺血和进一步的肌肉损伤。因此，已经测试了几种磷酸二酯酶-5或ACE或VEGF诱饵受体1型(VEGFR-1或Flt-1)的抑制剂作为增加肌肉血流量的策略的一部分，包括对磷酸二酯酶-5或ACE的药物抑制。
在某些实施方案中，本发明的载体编码拮抗造血前列腺素D合酶(HPGDS)的功能的反义序列或RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA等)。前列腺素D2(PGD2)由各种炎症细胞产生，并且造血PGD合酶(HPGDS)显示在DMD患者的坏死肌肉中表达。在DMD的mdx小鼠模型中，HPGDS抑制剂的施用减少了tetranor-PGDM(PGD2的尿代谢物)的尿排泄，并且抑制了肌坏死。TAS-205(一种新型HPGDS抑制剂)已在临床试验中针对DMD治疗进行了评估。
RNAi和反义设计
在RNA干扰(RNAi)中，产生互补并与内源性靶mRNA结合的短RNA分子。这种结合导致靶mRNA的功能失活，包括靶mRNA的降解。
RNAi途径存在于包括植物和动物在内的许多真核生物中，并且由酶Dicer在细胞质中起始，所述酶将长双链RNA(dsRNA)或小发夹RNA(shRNA)分子裂解成约21个核苷酸siRNA的短双链片段。每个siRNA然后被解绕成两条单链RNA(ssRNA)，即过客链和引导链。过客链被降解，并且引导链被整合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。研究最充分的结果是转录后基因沉默，其在引导链与mRNA分子中的互补序列配对并诱导Argonaute 2(Ago2)(RISC的催化组分)裂解时发生。在一些生物体中，尽管siRNA的初始摩尔浓度有限，但这一过程全身传播。
除了siRNA和shRNA，对RNA干扰至关重要的另一种小RNA分子是微小RNA(miRNA)。
微小RNA是基因组编码的非编码RNA，有助于调控基因表达，尤其是在发育过程中。成熟的miRNA在结构上与siRNA相似，但它们在达到成熟之前必须首先进行广泛的转录后修饰。miRNA由更长的RNA编码基因表达，作为初级转录物(称为pri-miRNA)，其然后在细胞核中通过由RNA酶III酶Drosha和dsRNA结合蛋白DGCR8组成的微处理器复合物被加工成70个核苷酸的茎环结构(称为pre-miRNA)。在将这种pre-miRNA转运到细胞质中后，其dsRNA部分被Dicer结合并裂解以产生成熟的miRNA分子，其中两条链可分离为过客链和引导链。与siRNA引导链一样，miRNA引导链可整合到同一RISC复合物中。
因此，两种dsRNA途径，miRNA和siRNA/shRNA都需要加工具有主链序列的前体分子(pri-miRNA、pre-miRNA和dsRNA或shRNA)，以便产生miRNA或siRNA的成熟功能性引导链，并且两种途径最终会聚在RISC复合物上。
整合到RISC后，siRNA与其靶mRNA碱基配对并裂解它，从而防止其被用作翻译模板。然而，与siRNA不同的是，负载miRNA的RISC复合物扫描细胞质mRNA以寻找潜在互补性。miRNA不是破坏性裂解(通过Ago2)，而是靶向mRNA的3'-UTR区，其中它们通常以不完全互补性结合，从而阻止核糖体进入进行翻译。
siRNA与miRNA的不同之处在于miRNA，尤其是动物体内的miRNA，通常与靶标具有不完全碱基配对并抑制许多具有相似序列的不同mRNA的翻译。相比之下，siRNA通常完美地进行碱基配对并仅在单个特定靶标中诱导mRNA裂解。
历史上，siRNA和shRNA已用于RNAi应用。siRNA通常是双链RNA分子，长度为20至25个核苷酸。siRNA暂时抑制靶mRNA，直到它们也在细胞内降解。shRNA的长度通常为约80个碱基对，包括产生发夹结构的内部杂交区域。如先前所述，shRNA分子在细胞内被加工形成siRNA，其进而敲低基因表达。shRNA的一个益处是它们能够并入到质粒载体中并整合到基因组DNA中以实现长期或稳定表达，由此更长时间地敲低靶mRNA。
shRNA设计是可商购的。例如，Cellecta使用人全基因组shRNA文库或小鼠DECIPHER shRNA文库(其靶向约10,000个小鼠基因)提供针对任何靶基因(例如，所有19,276种蛋白质编码人基因)的RNAi筛选服务。ThermoFisher Scientific提供来自Ambion的Silencer Select siRNA(经典21聚体)，根据制造商，其并入了siRNA设计、脱靶效应预测算法和化学方面的最新改进。
ThermoFisher Scientific还提供
Figure BDA0003202388630000491
Pre-miRTM miRNA前体分子，所述分子是旨在模拟内源性成熟miRNA的经化学修饰的小型双链RNA分子。使用此类Pre-miR miRNA前体可通过上调miRNA活性来进行miRNA功能分析，并且可用于miRNA靶位点鉴定和验证、筛选调控靶基因的表达的miRNA以及筛选影响靶基因(如SLN)或细胞过程的功能的miRNA。
ThermoFisher Scientific进一步提供
Figure BDA0003202388630000492
Anti-miRTM miRNA抑制剂，所述抑制剂是经化学修饰的单链核酸，旨在特异性地结合至并抑制内源性微小RNA(miRNA)分子。
反义序列设计也可从许多商业和公共来源获得，如IDT(Integrated DNATechnologies)和GenLink。设计考虑可包括寡核苷酸长度、靶mRNA中的二级/三级结构、靶mRNA上的蛋白质结合位点、靶mRNA或反义寡核苷酸中CG基序的存在、反义寡核苷酸中四链体的形成以及反义活性增加或降低基序的存在。
外显子跳跃反义寡核苷酸设计是本领域已知的。参见例如，Camilla Bernardini(编),Duchenne Muscular Dystrophy:Methods and Protocols,Methods in MolecularBiology,第1687卷,DOI10.1007/978-1-4939-7374-3_10,第10章Shimo等人,由SpringerScience+Business Media LLC,2018出版)，其详细讨论了有效外显子跳跃寡核苷酸的设计，考虑到诸如靶位点的选择、寡核苷酸的长度、寡核苷酸化学性质以及解链温度对比RNA链等的因素。还讨论了使用反义寡核苷酸的混合物来跳过多个外显子。所涵盖的特定基因和肌营养不良包括：DMD(杜氏肌营养不良)、LAMA2(分区蛋白缺乏型CMD、DYSF(dysferlin肌病，FKTN(福山型CMD)、DMPK(肌强直性营养不良)和SGCG(LGMD2C)。全部内容以引用的方式并入本文。
例如，受影响的疾病基因中的蛋白质/基因序列及其突变可从NCBI和Leiden肌营养不良页面在线公开获得。可通过使用人剪接查找器网站www.umd.be slash HSF获得用于有效外显子跳跃的潜在靶位点。可使用例如Albany.edu网站上的mfod网络服务器来评估靶mRNA的二级结构。寡核苷酸的长度通常可以是8至30聚体。寡核苷酸GC含量计算可在OligoCalc网站上的西北大学服务器上获得。可使用GGGenome网站搜索任何脱靶序列。寡核苷酸的解链温度可通过LNA寡核苷酸预测工具或OligoAnalyzer 3.1软件在sg.idtdna.com进行估计。
增强的RNAi引导链生成(miR、siRNA和shRNA)
在某些实施方案中，编码序列编码RNAi试剂，如miR、siRNA或shRNA。
在某些实施方案中，对于miR和/或shRNA/siRNA设计，可修饰产生成熟miR或成熟siRNA的野生型主链序列以增强引导链产生并最小化/消除过客链产生。由于成熟miR/siRNA/shRNA的两条链(裂解后)理论上都可并入RISC复合物并成为RNAi的引导链，因此有利于选择性地增强所设计的引导链的利用率并最小化对RISK复合物中很大程度上互补的过客链的利用率，以减少或最小化例如脱靶效应(例如，当过客链负载到RISC中时，由于意外靶序列的裂解所致)。
可用于实现此目标的一种方法(增强前导链产生和最小化/消除过客链产生)是通过使用杂合构建体，其中包含所需引导链的设计的成熟miR/siRNA/shRNA序列嵌入其他miR序列的主链序列内，这有利于引导链的产生而不利于过客链的产生。
这一原理在一些经修饰的miR-29c构建体和shSLN构建体的设计中得到了说明，尽管相同的原理可容易地用于靶向任何其他序列的其他RNAi试剂。
对于下文说明的所有设计，所采用的设计策略包括工程化侧翼主链序列、环序列和过客链核苷酸序列，以保留天然主链序列的2D和3D结构。在这种情况下，对于miRNA/shRNA设计，天然主链序列的2D/3D结构主要是指茎环与侧翼主链多核苷酸序列之间的距离、中央茎的结构、凸起的位置和/或大小、茎内任何内部环和错配的存在和定位等。下文提供了选定的基于miR-30E、miR-101和miR-451主链序列的miR-29c杂合构建体的某些示例性2D结构图作为说明。
A.具有miR-30主链序列(29c-M30E)的杂合miR-29c
Fellmann等人(Cell Rep.5(6):1704-1713,2013，以引用的方式并入本文)描述了一种通过将基部茎的3'保守元件鉴定为最佳加工所谓的“shRNAmir”——一种嵌入内源性微小RNA环境中的合成shRNA所必需而优化实验miR-30主链的系统方法。由此产生的优化主链(称为“miR-E”)大大提高了成熟shRNA水平和敲低功效。这种方法可容易地将现有miR和shRNA试剂转化为miR-E，以生成更有效的miR和shRNA。
应用这种技术，基于所需的成熟miR-29c序列和Fellmann等人描述的工程化/优化的miR-30主链序列产生了29c-M30E杂合序列。这种29c-M30E序列(关于其预测2D结构，参见图29)已并入以下实施例中使用的以下主题病毒载体中：μDys-29c-M30E-i2、EF1A-29c-M30E、U6-29c-M30E。29c-M30E的以下5’→3’序列是连续序列，人工分离成不同的线来说明连续序列的不同区段。
Figure BDA0003202388630000521
具体来说，在上面的连续序列中，中间线表示过客链序列、加双下划线的环序列和成熟miR-29c引导序列。注意，过客序列和引导序列可彼此反向互补，并且可快速返回并与居间的环序列形成茎环结构。然而，应注意完美的反向互补序列不是必需的。可能存在内部凸起等，因此在一些情况下，两条链不一定是100％互补的(参见本小节最后一个序列中的引导链和过客链)。顶部线和底部线表示经优化以确保增强引导序列的产生并最小化过客链的产生的M30E侧翼主链序列。
在类似的设计中，靶向人SLN的siRNA被嵌入miR-30E-hSLN-c1的同一M30E主链序列中(比较本段正上方和下方序列的顶行和底行，以及加双下划线的环序列)。但是引导链和过客链是不同的。这种所谓的c1-M30E序列已并入以下实施例中使用的以下主题病毒载体中：c1-M30E-i2、c1-M30E-3UTR和c1-M30E-pa。
Figure BDA0003202388630000522
也靶向人SLN的类似设计的第二siRNA嵌入miR-30E-hSLN-c2的同一M30E主链序列中(比较本段正上方和下方序列的顶行和底行，以及加双下划线的环序列)。但是引导链和过客链是不同的。这种所谓的c2-M30E序列已并入以下实施例中使用的以下主题病毒载体中：c2-M30E-i2、c2-M30E-3UTR和c2-M30E-pa。
Figure BDA0003202388630000523
下文还提供了使用天然miR-30主链序列(“M30N”)的经修饰的miR-29c的序列作为比较。注意，在这种情况下，引导链位于环序列的5'。此M30N主链序列类似地增强了引导链的产生，但程度低于所测试的实验系统中的M30E主链序列(数据未示出)。
Figure BDA0003202388630000531
B.具有miR-101主链序列(29c-101)的杂合miR-29c
使用miR-101主链序列的不同miR-29c杂合体(29c-101，关于其预测2D结构，参见图30)在下面使用本文中相同的命名惯例进行说明。在此，最上面一行和最后两行表示miR-101的主链序列，而第二行是具有过客链、环序列和引导链的成熟miR-29c。此29c-101序列已并入以下实施例中使用的以下主题病毒载体中：μDys-29c-101-i2、μDys-29c-3UTR-101。
Figure BDA0003202388630000532
C.具有miR-155主链序列(29c-155)的杂合miR-29c
使用miR-155主链序列的不同miR-29c杂合体(29c-155)在下面使用本文中相同的命名惯例进行说明。在此，顶行和底行表示miR-155的侧翼主链序列，而第二行是具有引导链、环序列和过客链的成熟miR-29c。此29c-155序列已并入以下实施例中使用的以下主题病毒载体中：EF1A-29c-155。
Figure BDA0003202388630000533
也使用miR-155主链序列的另一种miR-29c杂合体(29c-19nt)在下面使用本文中相同的命名惯例进行说明。在此，顶行和底行表示miR-155的侧翼主链序列(与紧接上面的序列中相同)，而第二行是具有引导链、环序列和过客链的成熟miR-29c。注意这里的环序列是19nt，而不是以上序列中的17nt环。此29c-19nt序列已并入以下实施例中使用的以下主题病毒载体中：EF1A-29c-19nt、29c-19nt-μDys-pA、29c-19nt-μDys-3UTR。
Figure BDA0003202388630000534
D.具有miR-155主链序列的杂合shSLN(shmSLN-v2&c1/c2-m155)
miR-155主链序列中的shSLN在下面使用本文中相同的命名惯例进行说明。在此，顶行和底行表示miR-155的侧翼主链序列，而第二行是具有引导链、环序列(19nt)和过客链的靶向小鼠SLN(shmSLN)的成熟shRNA。此shmSLN-v2序列已并入以下实施例中使用的以下主题病毒载体中：EF1A-mSLN、融合-v1、μDys-shmSLN-v1。
Figure BDA0003202388630000541
miR-155主链序列中的shSLN在下面使用本文中相同的命名惯例进行说明。在此，顶行和底行表示miR-155的侧翼主链序列，而第二行是具有引导链、环序列(19nt)和过客链的靶向小鼠SLN(shmSLN)的另一成熟shRNA。与上述相似/相关的shmSLN序列相比，额外的二核苷酸碱基对TT:AA(或者严格地说，siRNA的3'端的UU)的存在与所产生的引导链siRNA的效力增加相关。此shmSLN-v2序列已并入以下实施例中使用的以下主题病毒载体中：EF1A-mSLN-v2、融合-v2、μDys-shmSLN-v2。
Figure BDA0003202388630000542
miR-155主链序列中的另一shSLN在下面使用本文中相同的命名惯例进行说明。在此，顶行和底行表示miR-155的侧翼主链序列，而第二行是具有引导链、环序列(19nt)和过客链的靶向人SLN的成熟shRNA。此c1-m155序列已并入以下实施例中使用的以下主题病毒载体中：c1-m155-pa、c1-m155-i2、c1-m155-3UTR。
Figure BDA0003202388630000543
miR-155主链序列中的另一shSLN在下面使用本文中相同的命名惯例进行说明。在此，顶行和底行表示miR-155的侧翼主链序列，而第二行是具有不同引导链、环序列(19nt)和过客链的靶向人SLN的成熟shRNA。此c2-m155序列已并入以下实施例中使用的以下主题病毒载体中：c2-m155-pa、c2-m155-i2、c2-m155-3UTR。
Figure BDA0003202388630000551
E.具有miR-451主链序列(29c-451)的杂合miR-29c
使用miR-451主链序列的miR-29c杂合体(29c-451，关于其预测2D结构，参见图31)在下面使用本文中相同的命名惯例进行说明。在此，顶部2行和底部2行表示miR-451的侧翼主链序列，并且第3行是具有引导链、环序列和过客链的成熟miR-29c。
Figure BDA0003202388630000552
F.U6驱动的miR-29c和shSLN
下面的实验部分还描述了某些“单独”病毒载体构建体的使用，所述构建体仅表达miR-29c或仅表达shSLN。这种单独表达盒由强Pol III U6启动子驱动。此类序列不属于经修饰的miR-29c或经修饰的shSLN序列，因为强U6启动子直接产生pre-miRNA或shSLN，而没有任何侧翼核苷酸序列。然而，出于比较目的，此类序列也使用相同的命名法在此处列出。
由U6启动子驱动的miR-29c如下所示(U6-29c-v1)。此处，第2行是具有过客链、环序列和引导链的成熟miR-29c。这已用于pGFP-U6-shAAV-GFP载体中以产生“单独”对照载体。下面连续序列第一行中的核苷酸是U6启动子中转录起始位点后的前5个核苷酸，并且T6转录终止序列在下面连续序列最后一行用于克隆的序列之前。
Figure BDA0003202388630000553
由U6启动子驱动的shSLN如下所示(U6-shmSLN-v1)。此处，第2行是具有过客链、环序列和引导链的成熟shSLN。这已在实施例中的U6-shmSLN-v1载体中使用。
Figure BDA0003202388630000561
由U6启动子驱动的shSLN如下所示(U6-mSLN-v4)。此处，第2行是具有过客链、环序列和引导链的成熟shSLN。这已在实施例中的U6-mSLN-v4载体中使用(参见图15)。
Figure BDA0003202388630000562
组合物和药物组合物
在另一个实施方案中，本发明考虑包含本发明的rAAV的组合物。本发明的组合物包含rAAV和药学上可接受的载体。所述组合物还可包含其他成分，如稀释剂和佐剂。可接受的载体、稀释剂和佐剂对接受者是无毒的，并且优选在所采用的剂量和浓度下是惰性的，并且包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如吐温、普朗尼克或聚乙二醇(PEG)。
给药和施用
在本发明的方法中施用的rAAV的滴度将根据例如特定的rAAV、施用模式、治疗目标、个体和所靶向的细胞类型而变化，并且可通过本领域中的标准方法来确定。rAAV的滴度可在约1×106、约1×107、约1×108、约1×109、约1×1010、约1×1011、约1×1012、约1×1013至约1×1014或更多DNA酶抗性颗粒(DRP)/ml的范围内。剂量也可以病毒基因组(vg)为单位表示。
本发明考虑了在体内或体外用rAAV转导靶细胞的方法。体内方法包括向有需要的动物(包括人)施用有效剂量或有效多剂量的包含本发明的rAAV的组合物的步骤。如果在病症/疾病发展之前施用剂量，则所述施用是预防性的。如果在病症/疾病发展之后施用剂量，则所述施用是治疗性的。在本发明的实施方案中，有效剂量是减轻(消除或减少)与所治疗的病症/疾病状态相关的至少一种症状、减缓或预防进展至病症/疾病状态、减缓或预防病症/疾病状态的进展、减轻疾病的程度、产生疾病的缓解(部分或全部)和/或延长存活期的剂量。预期用本发明的方法预防或治疗的疾病的一个实例是PMD或以髓鞘产生、变性、再生或功能的缺陷为特征的其他疾病。
对于施用，可基于来自体外测定和/或动物模型研究的结果初始估计有效量和治疗有效量(本文中也称为剂量)。例如，可在动物模型中配制剂量以达到包括在细胞培养物中确定的IC50的循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定目标受试者的可用剂量。
有效剂量的组合物的施用可通过本领域的标准途径，包括但不限于肌内、肠胃外、静脉内、口服、经颊、经鼻、肺部、颅内、骨内、眼内、直肠或阴道。本领域技术人员可选择和/或匹配本发明的rAAV的AAV组分(特别是AAV ITR和衣壳蛋白)的施用途径和血清型，同时考虑所治疗的感染和/或疾病状态和将表达一个或多个编码序列和/或微型肌营养不良蛋白的靶细胞/组织。
具体地，本文所述的制剂可通过但不限于注射、输注、灌注、吸入、灌洗和/或摄取来施用。施用途径可包括但不限于静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、肿瘤内、肌内、囊内、心包内、脐内、眼内、粘膜、口腔、皮下和/或结膜下。
本发明提供有效剂量的rAAV和本发明组合物(包括本发明的组合疗法)的局部施用或全身施用。例如，全身施用是施用到循环系统中，从而影响整个身体。全身施用包括肠内施用，如通过胃肠道吸收和通过注射、输注或植入进行肠胃外施用。
特别地，本发明的rAAV的实际施用可通过使用将rAAV重组载体转运到动物的靶组织，如骨骼肌中的任何物理方法来实现。根据本发明的施用包括但不限于注射到肌肉、血流和/或直接注射到肝脏中。简单地将rAAV重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中已被证明足以提供对肌肉组织表达有用的载体，并且对可与rAAV共同施用的载体或其他组分没有已知的限制(尽管降解DNA的组合物应避免以rAAV的正常方式使用)。可修饰rAAV的衣壳蛋白，以使得rAAV靶向目标特定靶组织，如肌肉。参见例如，WO 02/053703，其公开内容以引用的方式并入本文。
药物组合物可制备为可注射制剂或作为局部制剂以通过透皮转运递送至肌肉。先前已经开发了许多用于肌内注射和经皮转运的制剂并且可用于本发明的实践中。rAAV可与任何药学上可接受的载体一起使用，以便于施用和处理。
在本文公开的方法中施用的rAAV的剂量将根据例如特定rAAV、施用模式、治疗目标、个体和所靶向的细胞类型而变化，并且可通过本领域的标准方法来确定。
还可由医师、兽医或研究人员在考虑诸如但不限于包括受试者的体重、疾患的严重程度、疾病类型、先前或同时的治疗干预、特发性疾病的物理和生理因素和/或施用途径的参数的情况下，确定施用至特定受试者的实际剂量的量。
所施用的每个rAAV的滴度可在约约1×106、约1×107、约1×108、约1×109、约1×1010、约1×1011、约1×1012、约1×1013、约1×1014或至约1×1015或更多DNA酶抗性颗粒(DRP)/ml的范围内。剂量也可以病毒基因组(vg)的单位表示(即，分别1×107vg、1×108vg、1×109vg、1×1010vg、1×1011vg、1×1012vg、1×1013vg、1×1014vg、1×1015vg)。剂量也可以每千克(kg)体重的病毒基因组(vg)单位表示(即，分别1×1010vg/kg、1×1011vg/kg、1×1012vg/kg、1×1013vg/kg、1×1014vg/kg、1×1015vg/kg)。用于滴定AAV的方法在描述于Clark等人,Hum.Gene Ther.10:1031-1039,1999中。
示例性剂量可在约1×1010至约1×1015个载体基因组(vg)/千克体重的范围内。在一些实施方案中，剂量可包括1×1010vg/kg体重、1×1011vg/kg体重、1×1012vg/kg体重、1×1013vg/kg体重、1×1014vg/kg体重或1×1015vg/kg体重。剂量可包括1×1010vg/kg/天、1×1011vg/kg/天、1×1012vg/kg/天、1×1013vg/kg/天、1×1014vg/kg/天或1×1015vg/kg/天。剂量可在0.1mg/kg/天至5mg/kg/天或0.5mg/kg/天至1mg/kg/天或0.1mg/kg/天至5μg/kg/天或0.5mg/kg/天至1μg/kg/天的范围内。在其他非限制性实例中，剂量可包括1μg/kg/天、5μg/kg/天、10μg/kg/天、50μg/kg/天、100μg/kg/天、200μg/kg/天、350μg/kg/天、500μg/kg/天、1mg/kg/天、5mg/kg/天、10mg/kg/天、50mg/kg/天、100mg/kg/天、200mg/kg/天、350mg/kg/天、500mg/kg/天或1000mg/kg/天。治疗有效量可通过在治疗方案的过程中(即，数天、数周、数月等)施用单剂量或多剂量来实现。
在一些实施方案中，药物组合物呈具有至少1.6×1013个载体基因组的10mL水溶液的剂型。在一些实施方案中，所述剂量具有每毫升至少2×1012个载体基因组的效力。在一些实施方案中，所述剂量包含无菌水溶液，所述无菌水溶液包含pH 6.0的10mM L-组氨酸、150mM氯化钠和1mM氯化镁。在一些实施方案中，药物组合物呈10mL无菌水溶液的剂型，所述无菌水溶液包含pH 6.0的10mM L-组氨酸、150mM氯化钠和1mM氯化镁；并且具有至少1.6×1013个载体基因组。
在一些实施方案中，药物组合物可以是包含在10mL水溶液中介于1×1010与1×1015个之间的载体基因组；在10mL水溶液中介于1×1011与1×1014个之间的载体基因组；在10mL水溶液中介于1×1012与2×1013个之间的载体基因组；或在10mL水溶液中大于或等于约1.6×1013个载体基因组的剂量。在一些实施方案中，水溶液是包含约10mM L-组氨酸pH6.0、150mM氯化钠和1mM氯化镁的无菌水溶液。在一些实施方案中，剂量具有大于约1×1011个载体基因组/毫升(vg/mL)、大于约1×1012vg/mL、大于约2×1012vg/mL、大于约3×1012vg/mL或大于约4×1012vg/mL的效力。
在一些实施方案中，至少一种AAV载体作为药物组合物的一部分提供。药物组合物可包含例如0.1％w/v的AAV载体。在一些其他实施方案中，药物组合物可包含每药物组合物的重量介于2％至75％之间的化合物，或每药物组合物的重量介于25％至60％之间的化合物。
在一些实施方案中，剂量在药盒中。药盒还可包括剂量的使用说明。
为了肌内注射，可采用在佐剂如芝麻油或花生油中或在丙二醇水溶液中的溶液，以及无菌水溶液。如果需要，可缓冲此类水溶液，并且首先使液体稀释剂与盐水或葡萄糖等渗。rAAV作为游离酸(DNA含有酸性磷酸基团)或药理学上可接受的盐的溶液可在与表面活性剂(如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。rAAV的分散液也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。就此而言，所采用的无菌水性介质均可通过本领域技术人员熟知的标准技术容易地获得。
在一些实施方案中，对于注射，制剂可制成水溶液，如在包括但不限于汉克斯溶液、林格溶液和/或生理盐水的缓冲液中。溶液可含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，制剂可呈冻干和/或粉末形式，以便在使用前用合适的媒介物对照(例如无菌无热原水)重构。
本文公开的任何制剂可有利地包含任何其他药学上可接受的载体，所述载体包括不会产生显著不利的、过敏或其他可能超过施用益处的不良反应的那些，无论是用于研究、预防性和/或治疗性治疗。示例性的药学上可接受的载体和制剂公开于Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版,Mack Printing Company,1990中，所述文献关于药学上可接受的载体和制剂的其教义以引用的方式并入本文。此外，可按照美国FDA生物标准和质量控制司和/或其他相关美国和外国监管机构的要求，制备制剂以满足无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。
常用的示例性药学上可接受的载体可包括但不限于增积剂或填充剂、溶剂或助溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸和维生素E)、防腐剂、等渗剂、吸收延迟剂、盐、稳定剂、缓冲剂、螯合剂(例如，EDTA)、凝胶、粘合剂、崩解剂和/或润滑剂。
示例性缓冲剂可包括但不限于柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、富马酸盐缓冲剂、葡萄糖酸盐缓冲剂、草酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和/或三甲胺盐。
示例性防腐剂可包括但不限于苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤铵、氯化六烃季铵、对羟基苯甲酸甲酯(如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和/或3-戊醇。
示例性等渗剂可包括多元糖醇，包括但不限于三元或更高级的糖醇(例如，甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和/或甘露糖醇)。
示例性稳定剂可包括但不限于有机糖、多元糖醇、聚乙二醇、含硫还原剂、氨基酸、低分子量多肽、蛋白质、免疫球蛋白、亲水性聚合物和/或多糖。
制剂也可以是长效制剂。在一些实施方案中，此类长效制剂可通过但不限于植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射来施用。因此，例如，化合物可与合适的聚合材料和/或疏水性材料(例如，配制为在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂一起配制，或配制为略微可溶的衍生物(例如，为微溶盐)。
此外，在各种实施方案中，AAV载体可使用缓释系统递送，如包含AAV载体的固体聚合物的半透性基质。各种持续释放材料已经建立并且是本领域普通技术人员所熟知的。取决于其化学性质，持续释放胶囊可在施用数周后直至100天释放载体。
适于可注射用途的药物载体、稀释剂或赋形剂包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有的情况下，所述形式必须是无菌的并且必须是流体性的到存在可易于注射性的程度。在制造和储存条件下，所述组合物必须稳定且必须在贮存中防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载体可以是含有以下各项的溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其适合的混合物、以及植物油。可例如通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等)来预防微生物的作用。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过使用延迟吸收的剂，例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射组合物的吸收。
通过将在适当的溶剂中的所需量的rAAV与如上列举的各种其他成分(根据需要)合并，接着过滤灭菌来制备无菌注射液。通常，通过将灭菌活性成分合并到含有基本分散介质和来自以上列举的所需其他成分的无菌媒介物中来制备悬浮液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法可包括真空干燥和冻干技术，其产生一种或多种活性成分外加来自其先前无菌过滤溶液的任何其它所需成分的粉末。
还在体外进行用rAAV转导。在一个实施方案中，从受试者取出所需的靶肌细胞，用rAAV转导并重新引入受试者。或者，可使用同种或异种肌细胞，其中这些细胞不会在受试者中产生不适当的免疫应答。
用于转导和将转导的细胞重新引入受试者中的合适方法是本领域已知的。在一个实施方案中，细胞可通过将rAAV与肌细胞合并，例如在适当的培养基中进行体外转导，并使用常规技术如RNA印迹和/或PCR或通过使用选择性标记筛选携带目标DNA的那些细胞。然后可将转导的细胞配制到药物组合物中，并通过各种技术(如通过肌内、静脉内、皮下和腹膜内注射)或通过使用例如导管注射到平滑肌和心肌中将组合物引入受试者。
用本发明的rAAV转导细胞导致所述一个或多个另外的编码序列和微型肌营养不良蛋白的持续共表达。因此，本发明提供了向动物、优选人施用/递送共表达所述一个或多个另外的编码序列和微型肌营养不良蛋白的rAAV的方法。这些方法包括用本发明的一种或多种rAAV转导组织(包括但不限于组织如肌肉、器官如肝脏和脑，以及腺体如唾液腺)。可用包含组织特异性控制元件的基因盒进行转导。例如，本发明的一个实施方案提供了转导由肌肉特异性控制元件指导的肌肉细胞和肌肉组织的方法，所述控制元件包括但不限于来自肌动蛋白和肌球蛋白基因家族的那些，如来自myoD基因家族的那些(参见Weintraub等人,Science 251:761-766,1991)、肌细胞特异性增强子结合因子MEF-2(Cserjesi和Olson,MolCell Biol 11:4854-4862,1991)、源自人骨骼肌动蛋白基因的控制元件(Muscat等人,MolCell Biol7:4089-4099,1987)、心脏肌动蛋白基因、肌肉肌酸激酶序列元件(Johnson等人,Mol Cell Biol 9:3393-3399,1989)和鼠肌酸激酶增强子(mCK)元件、源自骨骼快缩肌钙蛋白C基因、慢缩肌钙蛋白C基因和慢缩肌钙蛋白I基因的控制元件：缺氧诱导核因子(Semenza等人,Proc Natl Acad Sci U.S.A.88:5680-5684,1991)、类固醇诱导元件和启动子包括糖皮质激素应答元件(GRE)(参见Mader和White,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5603-5607,1993)和其他控制元件。
肌肉组织是体内DNA递送的有吸引力的靶标，因为它不是重要的器官并且容易接近。本发明考虑了来自转导的肌纤维的miRNA和微型肌营养不良蛋白的持续共表达。
如本文所用，“肌细胞”或“肌肉组织”是指源自任何种类生物肌肉(例如骨骼肌和平滑肌，例如来自消化道、膀胱、血管或心脏组织)的细胞或一组细胞。此类肌肉细胞可以是分化的或未分化的，如成肌细胞、肌细胞、肌管、心肌细胞和成心肌细胞。
术语“转导”用于指通过本发明的复制缺陷型rAAV在体内或体外向受体细胞施用/递送一个或多个另外的编码序列和微型肌营养不良蛋白的编码区，从而导致所述受体细胞共表达所述一个或多个另外的编码序列和微型肌营养不良蛋白。
因此，本发明提供了向有需要的患者施用有效剂量(或多个剂量，基本上同时施用或间隔给予的剂量)的编码所述一个或多个另外的编码序列和微型肌营养不良蛋白的rAAV的方法。
AAV产生
编码AAV载体的必需复制(rep)和结构(cap)蛋白的基因已从AAV载体缺失，以允许在剩余的末端重复序列之间插入待递送的序列。因此，对于AAV载体的生长，不仅需要辅助病毒，而且需要将编码rep和cap蛋白的基因递送至受感染的细胞。或者，编码rep和cap蛋白的基因需要存在于用于生产的细胞中。
适用于本发明方法的AAV载体可使用任何本领域公认的方法产生。在最近的综述中，Penaud-Budloo等人(Molecular Therapy:Methods&Clinical Development第8卷,第166-180页,2018)提供了最常用的上游方法来产生rAAV的综述。其中描述的每种方法以引用的方式并入本文。
包装细胞系(HEK293)的瞬时转染
特别地，在某些实施方案中，使用包装细胞系如HEK293细胞的瞬时转染产生AAV载体。这是最成熟的AAV生产方法，包括人胚胎HEK293细胞的质粒转染。通常，使用磷酸钙或聚乙烯亚胺转染(PEI)(一种阳离子聚合物)，HEK293细胞同时被载体质粒(含有目标基因，如编码肌营养不良蛋白小基因和一个或多个另外的编码序列的主题多核苷酸)和一个或两个辅助质粒转染。
辅助质粒允许四种Rep蛋白、三种AAV结构蛋白VP1、VP2和VP3、AAP和腺病毒辅助功能E2A、E4和VARNA的表达。rAAV复制所需的额外腺病毒E1A/E1B辅助因子在HEK293生产细胞中表达。Rep-cap和腺病毒辅助序列克隆到两个单独的质粒上，或者合并到一个质粒上，因此用于转染的三重质粒系统和双质粒系统都是可能的。三重质粒方案通过可容易地从一种血清型切换至另一种血清型的cap基因提供了多功能性。
质粒通常通过常规技术在大肠杆菌中使用细菌来源和抗生素抗性基因或通过微环技术产生。
贴壁HEK293细胞的瞬时转染已被用于大规模制造rAAV载体。最近，HEK293细胞也已适应悬浮条件，以便在长期经济上可行。
HEK293细胞系通常在补充有L-谷氨酰胺、5％至10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的DMEM中繁殖，但保持在无血清悬浮液F17、Expi293或其他制造商特定介质中的悬浮HEK293细胞除外。对于贴壁细胞，在AAV生产过程中可降低FBS的百分比，以限制动物源性组分的污染。
通常，在质粒转染后48–72小时从细胞沉淀和/或上清液中回收rAAV载体，这取决于血清型。
用重组杆状病毒感染昆虫细胞
杆状病毒-Sf9平台已被确立为哺乳动物细胞中GMP相容且可扩展的替代AAV生产方法。它可在粗收获物中生成每个细胞多达2×105个载体基因组(vg)。
当前的方案涉及用两种重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞，允许合成Rep78/52和Caps的杆状病毒表达载体(BEV)，和携带侧接AAV ITR的目标基因的重组杆状病毒。几种无血清培养基适用于悬浮的Sf9细胞生长。
关于这些安全问题，双杆状病毒-Sf9生产系统比其他生产平台具有许多优势：(1)使用无血清培养基；(2)尽管在Sf细胞系中发现了偶然病毒转录物，但大多数感染昆虫的病毒在哺乳动物细胞中并不活跃复制；以及(3)除杆状病毒外，昆虫细胞中rAAV的产生不需要辅助病毒。
在某些实施方案中，使用表达Rep和Cap蛋白的稳定Sf9昆虫细胞系，因此只需要感染一种重组杆状病毒即可以高产率产生感染性rAAV载体。
用rHSV载体感染哺乳动物细胞
HSV是用于在许可细胞中复制AAV的辅助病毒。因此，HSV可充当辅助病毒和穿梭载体两者，以将支持AAV基因组复制和包装的所需AAV功能递送至生产细胞。
基于与rHSV共感染的AAV产生可有效地产生大量rAAV。除了高总体产率(高达1.5×105vg/细胞)之外，所述方法的进一步优势在于它产生质量明显提高的rAAV原液，如通过提高的病毒效力所测量。
在这种方法中，将细胞(通常是仓鼠BHK21细胞系或HEK293和衍生物)用两种rHSV感染，一种携带由AAV ITR(rHSV-AAV)圈定的目标基因，并且第二种具有所需血清型的AAVrep和cap ORF(rHSVrepcap)。2至3天后，收集细胞和/或培养基，并通过多个纯化步骤纯化rAAV，以除去细胞杂质、HSV来源的污染物和未包装的AAV DNA。
因此在一些实施方案中，HSV充当AAV感染的辅助病毒。在一些实施方案中，AAV生长是使用缺失ICP27的HSV的非复制突变体实现的。
在哺乳动物细胞中产生重组AAV病毒颗粒的某些方法是本领域已知的并且在过去十年中得到了改进。例如，美国申请公布号20070202587描述了基于细胞与两种或更多种复制缺陷型重组HSV载体的共感染，在哺乳动物细胞中产生重组AAV。美国申请公布号20110229971和Thomas等人(Hum.Gene Ther.20(8):861-870,2009)描述了可扩展的重组AAV生产方法，所述方法使用悬浮适应的哺乳动物细胞的重组HSV 1型共感染。Adamson-Small等人(Hum.Gene Ther.Methods 28(1):1-14,2017)描述了使用HSV系统在无血清悬浮液制造平台中改进的AAV生产方法。
哺乳动物稳定细胞系
rAAV载体也可使用稳定表达rep和cap基因的稳定哺乳动物生产细胞高效且可扩展地产生。此类细胞可被野生型Ad5辅助病毒(其在遗传上稳定并且能够容易地以高滴度产生)感染，以诱导rep和cap的高水平表达。感染性rAAV载体可在用野生型Ad 5型感染这些包装细胞系时产生，并通过质粒转染或在感染重组Ad/AAV杂合病毒后提供rAAV基因组。
或者，Ad可被HSV-1代替作为辅助病毒。
合适的稳定哺乳动物生产细胞可包括HeLa来源的生产细胞系、A549细胞或HEK293细胞。优选的HeLa细胞系是HeLaS3细胞，一种悬浮液适应的HeLa亚克隆。
本文所述的方法可用于在不含动物组分的培养基中制造主题AAV载体，优选以250-L规模或2,000-L商业规模。
实施例
实施例1 microD5(SGT001)构建体在C2C12细胞中的表达验证
确认microD5(SGT-001)微型肌营养不良蛋白转基因可在有或无插入同一AAV载体中的微小RNA(如miR-29c编码序列)或shRNA(如针对SLN的shRNA)的另外编码序列的情况下在体外表达，将C2C12细胞在体外用三种AAV病毒构建体感染：一种编码野生型microD5(SGT-001)构建体；一种编码microD5(SGT-001)和miR-29c的融合构建体，其中miR-29c编码序列插入到microD5(SGT-001)编码序列的5'的异源内含子区中；并且一种编码microD5(SGT-001)和针对SLN的shRNA的融合构建体，其中shRNA的编码序列插入到SGT-001编码序列的5'的异源内含子区中。参见图3。
预测microD5(SGT-001)/miR-29c融合构建体将产生编码肌营养不良蛋白小基因产物和miR-29c RNA两者的初始转录物。还预测microD5(SGT-001)/针对SLN的shRNA融合构建体将产生编码肌营养不良蛋白小基因产物和shRNA两者的初始转录物。
虽然不希望受任何特定理论的束缚，但申请人还相信融合转录物的后续加工可导致融合mRNA的过早裂解(如导致polyA尾的丢失)。与通过没有另外编码序列的野生型微型肌营养不良蛋白构建体感染的细胞相比，这可能导致通过融合构建体感染的C2C12细胞中微型肌营养不良蛋白的表达降低。参见图3。
然而，实验确实证实了microD5(SGT-001)构建体成功表达了所需的微型肌营养不良蛋白(如使用对微型肌营养不良蛋白基因产物具有特异性的抗体进行免疫荧光染色所证明)，并且所述表达在用miR-29c或shRNA融合构建体感染的C2C12细胞中持续存在，尽管处于略微降低/受抑制/受遏制的水平。
对其他融合构建体也进行了类似的实验，其中将miR-29c编码序列插入启动子与microD5(SGT-001)编码序列之间的异源内含子的不同位置中。关于各种融合构建体Imir2、Imir3、Imir4和Imir5的插入位置，参见图11。
通过PCR扩增有或没有插入的编码序列的内含子序列后确认插入，并通过电泳分析扩增产物。例如，插入88bp miR-29c编码序列仅使PCT扩增产物的大小增加100bp以下。
然后将融合构建体用于几个实验，以确定受感染的C2C12细胞中的microD5(SGT-001)表达是否受到影响。
很明显，在此特定实验中，shRNA编码序列的存在最初阻碍了转染后一天的转染的C2C12细胞中微型肌营养不良蛋白的表达。然而，微型肌营养不良蛋白的表达迅速赶上，因此到转染后第6天，转染的C2C12细胞中的微型肌营养不良蛋白表达几乎相同，无论在AAV载体上是否存在shRNA的另外编码序列。参见图8A至8C。
数据证明，主题AAV构建体可包含shRNA或microRNA的另外编码序列，而不会显著影响微型肌营养不良蛋白基因表达。
实施例2针对肌脂蛋白(SLN)的shRNA的功能测定
此实施例表明，插入主题AAV载体中的针对SLN(shSLN)的shRNA编码序列可产生功能性shRNA，从而降低SLN的表达。
图4是示出由AAV载体编码的肌脂蛋白-荧光素酶融合报告基因的示意图。将带有荧光素酶的报告基因和编码有或无shSLN的microD5的AAV共转染到C2C12细胞中后，可基于荧光素酶产生的信号评估编码的shSLN降低SLN-荧光素酶融合物表达的能力。
图5示出这种共转染实验的代表性结果。具体而言，在一项实验中，SLN-荧光素酶融合报告基因构建体与仅编码microD5的AAV载体(“SGT001”)的共转染产生了强荧光素酶信号。同时，在另一项实验中，将SLN-荧光素酶融合报告基因构建体与编码microD5和shSLN的AAV载体(“SGT001+SLN”)共转染导致荧光素酶信号降低86.7％，从而表明shSLN被表达并且可有效降低靶基因(microD5-荧光素酶融合物)的表达。
图6A示出基于肌脂蛋白的直接免疫染色的shRNA(SLN)功能测试的结果。在用编码microD5(SGT-001)肌营养不良蛋白小基因和shRNA(shSLN)的编码序列的AAV9载体转染的C2C12细胞中，与用仅编码microD5(SGT-001)肌营养不良蛋白小基因的相同载体转染的C2C12细胞相比，内源性SLN表达降低了55％。参见图6B中的免疫荧光图像。
基于测量钙再摄取到肌质网中，进一步测试了AAV载体中shRNA(SLN)编码序列的功能。
肌(内)质网(Sarco(Endo)plasmic)Ca2+-ATP酶(SERCA)是催化Ca2+从细胞溶质ATP依赖性转运到肌细胞中的肌质网腔中的跨膜蛋白。由SLN基因编码的肌脂蛋白是小的跨膜蛋白脂质，它通过减少肌质网中Ca2+的累积来调控几种SERCA而不影响ATP水解的速率。肌脂蛋白的消融增加心房Ca2+瞬态振幅并增强心房收缩力。此外，肌脂蛋白缺失小鼠的心房对异丙肾上腺素刺激的应答迟钝，从而表明肌脂蛋白是心房中β-肾上腺素能应答的介质。
因此，将预期功能性shRNA(SLN)降低内源性SLN的表达水平，从而导致较少的SLN与SERCA结合，并且因此钙再摄取到肌质网中的障碍较小。从表型上看，表达功能性shRNA(SLN)的效应将类似于过表达SERCA，如SERCA2a，其在大鼠中的过表达已被证明减少右心室乳头肌的松弛时间，从而表明更快钙再摄取到肌质网中。
实际上，更快钙再摄取至肌质网中是图7中所示，其示出由钙结合染料Fluo-8发出的归一化荧光信号。
Fluo-8(Abcam)是细胞可渗透的中等亲和力绿色荧光钙结合染料。它以约390nM的Kd与细胞内钙结合。其荧光强度随Ca2+结合而增加。
与未转染的C2C12细胞和由仅编码microD5(SGT-001)肌营养不良蛋白小基因的AAV载体感染的C2C12细胞相比，Fluo-8信号的更快降低表示由编码microD5(SGT-001)-shSLN的AAV载体感染的C2C12细胞中细胞溶质钙的降低更快。
另一方面，在将细胞通过AAV构建体感染后几天(例如6天)，microD5(SGT-001)肌营养不良蛋白小基因的表达在很大程度上不受shSLN编码序列的存在或shSLN表达的影响，尽管microD5(SGT-001)肌营养不良蛋白小基因表达最初降低(即感染后1天)。参见图8A至8C。
相比之下，在感染后第6天，内源性SLN表达降低了55％。参见图6A。这与在图5中的SLN-荧光素酶报告基因测定中观察到的86％减少一致。
这些数据支持以下观点，即共表达微型肌营养不良蛋白和shSLN的主题AAV载体能够在同一AAV载体上有效表达两种转基因，而shSLN的表达不会对微型肌营养不良蛋白小基因的长期表达产生不利影响。
此外，基于荧光素酶报告基因测定以及内源性SLN表达的直接测量，所表达的shSLN似乎是功能性的。
实施例3来自融合构建体的编码序列的体外表达
本发明的融合病毒载体不仅能够表达功能性目标基因或蛋白质(GOI)，而且能够表达某些RNAi、反义、sgRNA、miRNA或其抑制剂的一个或多个编码序列。本发明的重组病毒载体的代表性非限制性构型示于图12中。例如，本发明的重组病毒载体可以是融合AAV载体，如AAV9载体，其被设计用于表达功能性肌营养不良蛋白基因(如本文以上所述的任一μDys基因)的型式。同一融合载体还在重组AAV9载体的初始转录物中的内含子内、3'-UTR内或polyA信号之后，如在polyA信号之后但在转录终止序列之前，或在转录终止序列之后表达一个或多个另外的编码序列。
如果另外的编码序列编码miRNA，如miR-29c，则可修饰miR-29c编码序列的主链序列，以使得从其他miRNA如miR-30、-101、-155或-451获得成熟miR-29c序列的周围序列(参见上文)。已经发现用来自miR-30、-101、-155或-451的天然周围序列替代miR-29c的天然周围序列可增强被设计为靶向miR-29c靶序列的miR-29c的一条链(即引导链)的产生(即减少其对靶向miR-29c靶序列无用的补体过客链的产生)。
作为对照，在相同载体背景上生成了几个所谓的单独表达构建体。这些单独表达构建体不表达μDys基因，但可表达报告基因如EGFP或GFP。
例如，一种这样的单独载体可表达插入EGFP编码序列上游的内含子序列中的miR-29c编码序列，全部来自EF1A启动子。miR-29c编码序列的主链序列可通过miR-30、-101、-155或-451的主链序列进行修饰。
另一种这样的单独载体可表达shRNA，如靶向/下调SLN表达的shSLN。shRNA的表达可由U6启动子驱动，U6启动子可由RNA Pol III使用，其产生短RNA转录物的强转录。shRNA编码序列可在GFP编码序列之前插入U6转录盒中的内含子中。
几种此类代表性的融合或单独载体用于在体外转染人iPS来源的心肌细胞，并且测定受感染心肌细胞中miR-29c的表达，并且结果在图13中示出。
具体而言，根据标准程序将五种单独构建体、五种融合构建体和对照μDys表达构建体转染至人iPS来源的心肌细胞中。通过Taqman茎环QPCR测量成熟miR-29c水平。所测试的五种单独构建体包括在miR-30(EF1A-29c-M30E和U6-29c-M30E)和miR-155(EF1A-29c-19nt和EF1A-29c-155)主链中设计的U6-或EF1A-驱动的miR-29c表达盒。所测试的五种融合构建体包括在miR-101(μDys-29c-101-i2和μDys-29c-3UTR-101)、miR-30(μDys-29c-M30E-i2)和miR-155(29c-19nt-μDys-3UTR和29c-19nt-μDys-pa)主链中设计的miR-29c表达盒，插入相对于μDys表达盒的内含子(i2)、3'UTR(3UTR)和pA(pa)后位点位置中。
显然，与使用类似构建体仅表达μDys(并且因此仅存在内源性miR-29c表达的背景水平)的对照相比，本发明的融合构建体通常在受感染的人iPS来源的心肌细胞中过表达miR-29c 2至11倍。
用于产生图13中的数据的特定融合构建体包括：
29c-19nt-μDys-3UTR：miR-155主链中经修饰的miR29c，插入μDys表达盒的3'-UTR区中(polyA腺苷酸化信号序列之前)。
29c-19nt-μDys-pA：miR-155主链中相同经修饰的miR29c编码序列，插入μDys表达盒的polyA腺苷酸化信号序列之后。
μDys-29c-M30E-i2：miR-30E主链中经修饰的miR29c编码序列，插入μDys表达盒的内含子区中。
μDys-29c-101-i2：miR-101主链中经修饰的miR29c编码序列，插入μDys表达盒的内含子区中。
μDys-29c-3UTR-101：miR-101主链中经修饰的miR29c编码序列，插入μDys表达盒的3’-UTR区中。
同时，与仅表达μDys的相同对照载体相比，表达miR-29c的单独构建体通常在受感染的人iPS来源的心肌细胞中过表达miR-29c 6至73倍。
用于产生图13中的数据的特定单独构建体包括：
EF1A-29c-M30E：miR-30E主链中经修饰的miR29c编码序列，由EF1A启动子驱动。
U6-29c-M30E：miR-30E主链中经修饰的miR29c编码序列，由Pol III U6启动子驱动。
U6-29c-v1：由Pol III U6启动子驱动的miR29c编码序列。
EF1A-29c-19nt：miR-155主链中经修饰的miR29c编码序列，由EF1A启动子驱动。
EF1A-29c-155：miR-155主链中另一经修饰的miR29c编码序列，由EF1A启动子驱动。
当在其他体外细胞系统(包括Mouly人健康原代成肌细胞和小鼠C2C12永生化成肌细胞系)中评估这些构建体时，也获得了指示从这些构建体(优先)产生miR-29c的类似趋势(数据未示出)。在μDys表达盒中插入miR-29c元件不会导致μDys mRNA产生的显著减少。
AAV9病毒颗粒中的一些选定融合重组病毒载体也被用于感染分化的C2C12肌管和原代小鼠心肌细胞，并且在这些细胞中也证实了miR-29c的表达。参见图14，结果表示为相对于仅表达μDys的对照归一化后的相对miR-29c表达。
在此实验中，μDys产生相对于对照组似乎基本上没有受到影响。此外，miR-29c过客链水平没有显示出增加的水平。
同时，来自主题融合构建体的shSLN的表达，以及在被此类融合构建体感染的小鼠细胞中产生的约50％的SLN下调分别示于图16和15中。
具体而言，将仅表达μDys的三种单独构建体以及表达μDys和shSLN的两种融合构建体转染到稳定过表达SLN-Myc/DDK(Myc-DDK标记的SLN的小鼠C2C12细胞中。DDK与SigmaAldrich的商标
Figure BDA0003202388630000721
标签相同，并且可使用抗Myc或抗DDK抗体检测Myc-DDK标签)。小鼠C2C12稳定细胞系是通过慢病毒转导编码SLN-Myc/DDK的载体并随后选择稳定细胞系而产生的。其中一种融合构建体“Fusion-v2”或μDys-shmSLN-v2显示通过Myc标签特异性抗体检测到的SLN蛋白表达水平的约50％敲低。参见图15。
图15中使用的各种构建体描述如下。
μDys：仅编码μDys GOI的对照AAV9载体。
EF1A-mSLN：仅表达靶向小鼠SLN的shRNA的单独构建体。shRNA编码序列的转录由EF1A启动子驱动。
EF1A-mSLN(V2)：仅表达靶向小鼠SLN的shRNA的另一种单独构建体。shRNA编码序列的转录由EF1A启动子驱动。
EF1A-mSLN(V4)：仅表达靶向小鼠SLN的shRNA的另一种单独构建体。shRNA编码序列的转录由EF1A启动子驱动。
融合-v1：本发明的融合构建体，其表达μDys GOI和靶向小鼠SLN的shRNA的编码序列两者。
融合-v2：本发明的另一融合构建体，其表达μDys GOI和靶向小鼠SLN的shRNA的编码序列两者。
显然，由于小鼠细胞被编码mSLN shRNA的型式的主题融合构建体感染，mSLN的表达降低了约50％。
图16示出对于编码shSLN的各种重组AAV9载体，shSLN作为病毒载体(“单独”)中的唯一编码序列或作为本公开的融合构建体(“融合”)的一部分，在分化的C2C12肌管或小鼠原代心肌细胞中siSLN(来自转录的shSLN的加工的siRNA产物)的相对表达水平。siRNA产量通过定制的Taqman茎环QPCR系统进行量化。将单独构建体和融合构建体的相对siSLN表达水平针针对μDys对照组中的水平进行归一化，尽管由于对照组中几乎不存在或非常少的siSLN样RNA产生，明显的高倍数变化可能无法提供信息。然而，很明显，在所测试的两种细胞类型中，与对照组相比，单独构建体从强U6 Pol III启动子表达的siSLN水平高约1000倍。同时，与对照相比，所测试的融合构建体表达的siSLN水平高1至2个数量级。
还在人iPS来源的心肌细胞中测试了许多额外的单独构建体和表达靶向人SLN的shRNA的融合构建体。这些包括6种单独构建体和12种靶向人SLN的融合构建体。融合构建体包括miR-29和miR-155主链中的shSLN序列，并且插入相对于μDys表达盒的内含子、3'-UTR中或pA位点之后。这些实验的结果总结在图17中。
具体地，在图17的实验中使用了几种阴性对照(例如，多个μDys和GFP质粒)和阳性对照。阴性对照包括：单独表达μDys的两种构建体(μDys1和μDys2)(其对SLN mRNA的表达水平没有影响)；在肌肉特异性启动子CK8下表达GFP的构建体(CK8-GFP)(所述GFP对SLN mRNA表达也没有影响)；和“σ杂乱(sigma scramble)”—一种表达hSLN靶向性shSLN的杂乱序列的构建体(其预期对SLN mRNA表达没有影响)。阳性对照是“σshrna”，它是来自Sigma的编码可下调约80％的hSLN mRNA的hSLN靶向性shSLN的市售shRNA质粒。
测试了六种单独的构建体，每个构建体都表达靶向hSLN的shRNA的一种型式，并且每个构建体都在强Pol III U6启动子的转录控制下，并且显示通常下调约80％至90％的hSLN mRNA表达。
在本发明的6种单独构建体和4种融合构建体中也观察到高达90％的hSLN mRNA表达下调。例如，c2-m30e-i2构建体是共表达μDys和靶向hSLN的shRNA的融合构建体。shRNA嵌入M30E主链序列(参见上文)中，并插入μDys表达盒的内含子中。在用这种构建体感染人iPS来源的心肌细胞后，高达90％的hSLN mRNA被敲低。
尽管融合构建体极大地影响了hSLN mRNA表达，但它们似乎对同一载体上μDys的表达没有不利影响。如图18所示，将6种单独构建体和12种靶向人SLN的融合构建体转染到人iPS来源的心肌细胞中。大多数融合构建体显示出与对照仅μDys构建体非常相似(>50％)的μDys mRNA表达。
选定的单独构建体和两种融合构建体的变性琼脂糖凝胶分析也证实，这些miR-29c构建体的AAV9基因组在很大程度上是完整的。参见图19。
实施例4来自融合构建体的编码序列的体内表达
此实验表明，主题融合构建体可用于同时表达μDys和一个或多个影响单独途径(例如，SLN的下调和/或miR-29c的上调)的另外编码序列以便即使不是协同治疗功效也能达到优于单独的治疗功效。
在这组实验中，将编码μDys基因的AAV9构建体以及第二编码序列-miR-29c或靶向小鼠SLN的shSLN融合。将各种融合构建体以约5E13 vg/kg(除了一组，U6-29c-v1，以1E14vg/kg)的剂量通过尾静脉注射到6周龄的雄性mdx小鼠中。然后在注射后28天的时间段内监测μDys、miR-29c和SLN mRNA的表达。详细的实验设置总结如下：
组 类型 名称 动物编号
miR μDys μDys 4
miR 单独 U6-29c-v1 4
miR 融合 μDys-29c-M30E-i2 4
miR 融合 μDys-29c-101-3UTR 4
miR 单独-1E14 U6-29c0v1(2X) 2
miR 对照 对照 4
shSLN μDys μDys 4
shSLN 单独 U6-shmSLN-v1 4
shSLN 融合 μDys-shmSLN-v2 4
在miR-29c实验组中，发现两种测试的融合构建体(一种在M30E主链中并插入μDys表达盒的内含子中，并且一种在miR-101主链中并插入μDys表达盒的3’-UTR区中)导致左腓肠肌(图20A)、膈肌(图20B)和左心室(图20C)中1.4至2.8倍的miR-29c上调。以5E13 vg/kg剂量施用miR-29c-μDys融合AAV9构建体。AAV9中单独U6启动子驱动的miR-29c构建体在5E13 vg/kg剂量下产生2至11倍的上调，并且在1E14 vg/kg剂量下产生6至16倍的上调。
同时，融合AAV9构建体对miR-29c的上调并未导致腓肠肌(图21)、膈肌(数据未示出)和左心室(数据未示出)中μDys产生的减少。融合AAV9构建体在RNA和蛋白质水平下均显示出与对照仅μDys AAV9构建体相似的μDys表达。仅表达miR-29c的单独构建体不产生μDys，因此显示不存在μDys水平。
在shSLN实验组中，发现所测试的shSLN融合AAV9构建体导致膈肌、腓肠肌和左心房(图22)以及舌头(数据未示出)中达50％的mSLN mRNA下调。类似地，与仅表达μDys的对照AAV9相比，融合AAV9构建体对mSLN mRNA的下调并未导致在RNA和蛋白质水平下腓肠肌(图23)、膈肌(数据未示出)和左心室(数据未示出)中的μDys产生减少。仅表达shmSLN的单独构建体不产生μDys，因此显示不存在μDys水平。示出了膈肌结果。舌头和心房的结果相似。
这些数据表明，主题融合构建体可同时表达μDys基因和至少一个另外的编码序列，如miR-29c或针对SLN的shRNA，因此与仅表达一个编码序列(如μDys)的病毒载体相比，实现了更好的治疗结果。
实施例5来自融合构建体的体内表达的编码序列具有生物活性
此实验证明由本发明的融合构建体表达的编码序列具有生物活性。
肌营养不良蛋白为肌细胞膜提供结构稳定性，并且肌纤维膜通透性增加导致肌酸激酶(CK)从肌纤维中释放。因此，肌酸激酶(CK)水平升高是肌肉损伤的标志。在DMD患者中，CK水平显著增加高于正常范围(例如，自出生以来的正常水平的10至100倍)。同样，血清CK水平被认为是mdx小鼠模型中肌肉健康的一般衡量标准。
本实验中的数据表明，AAV9的miR-29c单独(以1E14 vg/kg的高剂量施用)和miR-29c-μDys融合(以5E13 vg/kg剂量施用)构建体均降低了mdx小鼠模型中的血清CK水平，与μDys对照相比程度相似，因此表明了在DMD患者中表达miR-29c的治疗益处。
具体而言，在实施例4的体内实验中，还测定了各组小鼠的血清CK水平。图24示出单独μDys的表达导致血清CK水平的显著下降。与两种测试的融合构建体一起共表达μDys和miR-29c也导致血清CK水平类似地显著下降。令人感兴趣地，单独表达miR-29c也导致血清CK水平的显著降低，尤其是当使用更高病毒剂量(的表达miR-29c的单独构建体)时。
另一方面，金属蛋白酶-1(TIMP-1)的组织抑制剂已被提议作为监测杜氏肌营养不良(DMD)患者的疾病进展和/或治疗效果的血清生物标志物，因为与健康对照相比，TIMP-1的血清水平在DMD患者中显著更高。类似地，TIMP1也是mdx小鼠模型中肌肉健康的血清标志物。
因此，在实施例4的体内实验中，还测定了各组mdx小鼠的血清TIMP1水平。图25，左图，示出单独μDys的表达导致血清TIMP1水平的显著下降。与两种测试的融合构建体一起共表达μDys和miR-29c也导致血清TIMP1水平类似地显著下降。同时，即使当使用更高病毒剂量(的表达miR-29c的单独构建体)时，单独表达miR-29c也不会导致血清TIMP1水平降低。
同样，图25，右图，示出单独μDys的表达导致血清TIMP1水平的显著下降。与所测试的融合构建体一起共表达μDys和针对mSLN的shRNA也导致血清TIMP1水平类似地显著下降。同时，单独表达针对mSLN的shRNA不导致血清TIMP1水平降低。
这些数据表明由本发明的融合构建体在体内表达的编码序列具有生物活性。
实施例6融合构建体不改变病毒载体的生物分布
在实施例4的体内实验中，将融合病毒载体的生物分布与仅表达μDys的单独病毒载体的生物分布进行比较。发现使用的所有病毒载体的生物分布在腓肠肌中基本相同，无论融合构建体是表达miR-29c还是shSLN。参见图26。
腓肠肌中病毒滴度的定量也显示出与融合和对照AAV9相似的病毒滴度。
实施例7融合构建体不改变病毒载体的肝脏生物分布
在实施例4的体内实验中，将融合病毒载体的肝脏水平与仅表达μDys的单独病毒载体的肝脏水平进行比较。发现使用的所有病毒载体的病毒滴度在肝脏中基本相同，无论融合构建体是表达miR-29c还是shSLN。参见图27。
实施例8与μDys单一疗法相比，使用融合构建体的增强的治疗功效
为了确定共表达μDys和miR-29c是否产生更好的治疗功效和/或更少的并发症(如纤维化)，在实施例4中施用各种融合、单独或对照构建体的小鼠中检查了两种纤维化标志物基因Col3a1和Fn1的表达水平。Col3A1表达和FN1表达已被用作纤维化活性的标志物。
仅表达miR-29c的单独AAV9载体在5E13 vg/kg的低剂量和1E14vg/kg的高剂量下导致Col3A1和FN1表达降低。融合AAV9载体也导致膈肌中标志物基因表达降低。参见图28。
结果显示了基于它们对这两种纤维化标志物基因的影响，膈肌中本发明的融合构建体相对于单独μDys构建体的额外益处。
实施例9基于酶的基因编辑的递送：CRISPR/Cas和sgRNA/crRNA
主题病毒载体(例如rAAV病毒载体)可用于将CRISPR/Cas9或CRISPR/Cas12a(或其他工程化的或经修饰的Cas酶或其同源物)与一种或多种sgRNA(对于Cas9)或一种或多种crRNA(对于Cas12a)一起递送到靶细胞中，用于同时敲低靶细胞中的靶基因。CRISPR/Cas和sgRNA/crRNA编码序列所在的病毒颗粒的向性可部分控制靶细胞向性。
例如，对于AAV介导的递送，主题病毒载体中的GOI可以是CRISPR/Cas9或CRISPR/Cas12a的编码序列。可分别负载到Cas9或Cas12a上的一种或多种sgRNA或crRNA可从内含子、3'-UTR或Cas9/Cas12a表达盒中的其他地方表达。
在用主题病毒载体(例如AAV载体)感染靶细胞后，Cas蛋白和sgRNA/crRNA在靶细胞内共表达以介导基因编辑。

Claims (37)

1.一种重组病毒载体，所述重组病毒载体包含：
a)编码功能性目标基因或蛋白质(GOI)如有效治疗肌营养不良的功能性目标基因或蛋白质的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含3'-UTR编码区并且紧邻异源内含子序列的3'，所述异源内含子序列增强由所述多核苷酸编码的所述功能性蛋白质的表达；
b)与所述多核苷酸可操作地连接并驱动所述多核苷酸的表达的控制元件(例如，肌肉特异性控制元件)；以及
c)插入所述内含子序列或所述3'-UTR编码区中的一个或多个编码序列；
其中所述一个或多个编码序列独立地编码：RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA)、反义序列、基因编辑酶的引导序列、微小RNA(miRNA)和/或miRNA抑制剂。
2.如权利要求1所述的重组病毒载体，其中所述重组病毒载体是重组AAV(腺相关病毒)载体。
3.如权利要求1或2所述的重组病毒载体，其中：所述一个或多个编码序列插入所述3'-UTR编码区中，或在聚腺苷酸化(polyA)信号序列(例如，AATAAA)之后。
4.如权利要求1至3中任一项所述的重组病毒载体，其中在所述一个或多个编码序列存在下，所述功能性GOI的表达基本上不受影响(例如，与没有插入所述一个或多个编码序列的其他方面相同的对照构建体相比)。
5.如权利要求1至4中任一项所述的重组病毒载体，其中：
a)所述多核苷酸是编码功能性肌营养不良蛋白的肌营养不良蛋白微基因或小基因；和/或，
b)所述控制元件是与所述肌营养不良蛋白小基因可操作地连接并驱动所述肌营养不良蛋白小基因的表达的肌肉特异性启动子。
6.如权利要求5所述的重组病毒载体，其中所述功能性肌营养不良蛋白是microD5，和/或所述肌肉特异性启动子是CK启动子。
7.如权利要求1至6中任一项所述的重组病毒载体，其中所述一个或多个编码序列包含诱导缺陷型肌营养不良蛋白的外显子如肌营养不良蛋白的外显子45-55或肌营养不良蛋白的外显子44、45、51和/或53中的任一个的跳跃的外显子跳跃反义序列。
8.如权利要求1至7中任一项所述的重组病毒载体，其中所述微小RNA是miR-1、miR-133a、miR-29c、miR-30c和/或miR-206。
9.如权利要求8所述的重组病毒载体，其中所述微小RNA是任选地具有经修饰的侧翼主链序列的miR-29c，所述经修饰的侧翼主链序列增强针对靶序列设计的miR-29c的引导链的加工。
10.如权利要求9所述的重组病毒载体，其中所述经修饰的侧翼主链序列来自或基于miR-30、-101、-155或-451。
11.如权利要求8至10中任一项所述的重组病毒载体，其中所述微小RNA在宿主细胞中的表达与所述微小RNA在所述宿主细胞中的内源表达相比上调至少约1.5至15倍(例如，约2至10倍、约1.4至2.8倍、约2至5倍、约5至10倍、约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或约15倍)。
12.如权利要求1至11中任一项所述的重组病毒载体，其中所述RNAi序列是针对肌脂蛋白(shSLN)的shRNA。
13.如权利要求1至12中任一项所述的重组病毒载体，其中所述一个或多个编码序列编码一种或多种相同或不同的针对肌脂蛋白(shSLN)的shRNA。
14.如权利要求12或13所述的重组病毒载体，其中所述shRNA使肌脂蛋白mRNA和/或肌脂蛋白蛋白质表达降低至少约50％。
15.如权利要求1至14中任一项所述的重组病毒载体，其中所述GOI是CRISPR/Cas9，并且所述引导序列是sgRNA(单引导RNA)；或者其中所述GOI是CRISPR/Cas12a，并且所述引导序列是crRNA。
16.如权利要求1至15中任一项所述的重组病毒载体，其中所述RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA)、所述反义序列、所述CRISPR/Cas9 sgRNA、所述CRISPR/Cas12a crRNA和/或所述微小RNA拮抗一种或多种靶基因的功能，所述靶基因如炎症基因、NF-κB信号传导途径的活化因子(例如，TNF-α、IL-1、IL-1β、IL-6、NF-κB的受体活化因子(RANK)和Toll样受体(TLR))、NF-κB、由NF-κB诱导的下游炎性细胞因子、组蛋白脱乙酰酶(例如，HDAC2)、TGF-β、结缔组织生长因子(CTGF)、胶原蛋白、弹性蛋白、细胞外基质的结构组分、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、肌肉生长抑制素、磷酸二酯酶-5(PED-5)或ACE、VEGF诱饵受体1型(VEGFR-1或Flt-1)和造血前列腺素D合酶(HPGDS)。
17.如权利要求1所述的重组病毒载体，其中：
a)所述多核苷酸编码功能性fukutin(FKTN)蛋白；和/或，
b)所述一个或多个编码序列编码外显子跳跃反义序列，所述外显子跳跃反义序列恢复福山型先天性肌营养不良(FCMD)患者的缺陷型FKTN基因中的正确外显子10剪接。
18.如权利要求1所述的重组病毒载体，其中：
a)所述多核苷酸编码功能性LAMA2蛋白；和/或，
b)所述一个或多个编码序列编码外显子跳跃反义序列，所述外显子跳跃反义序列恢复分区蛋白缺乏型先天性肌营养不良1A型(MDC1A)患者的缺陷型LAMA2基因的C末端G结构域(外显子45至64)、特别是G4和G5的表达。
19.如权利要求1所述的重组病毒载体，其中：
a)所述多核苷酸编码功能性DMPK蛋白或CLCN1基因；和/或，
b)所述RNAi序列(siRNA、shRNA、miRNA)、所述反义序列或所述微小RNA(miRNA)靶向缺陷型DMPK基因中的突变转录物的扩增重复序列，或编码外显子跳跃反义序列，所述外显子跳跃反义序列导致DM1患者的CLCN1基因中的外显子7A的跳跃。
20.如权利要求1所述的重组病毒载体，其中：
a)所述多核苷酸编码功能性DYSF蛋白；和/或，
b)一个或多个编码序列编码外显子跳跃反义序列，所述外显子跳跃反义序列导致dysferlin肌病(LGMD2B或MM)患者的缺陷型DYSF基因中的外显子32的跳跃。
21.如权利要求1所述的重组病毒载体，其中：
a)所述多核苷酸编码功能性SGCG蛋白；和/或，
b)一个或多个编码序列编码外显子跳跃反义序列，所述外显子跳跃反义序列导致LGMD2C患者的缺陷型LGMD2C基因(例如，具有Δ-521T SGCG突变的基因)中的外显子4至7的跳跃。
22.如权利要求1至21中任一项所述的重组病毒载体，其中所述异源内含子序列是SEQID NO:1。
23.如权利要求1至22中任一项所述的重组病毒载体，其中所述一个或多个编码序列插入所述内含子序列中。
24.如权利要求1至23中任一项所述的重组病毒载体，其中所述功能性蛋白质的表达不受所述一个或多个编码序列的所述插入的不利影响。
25.如权利要求1至24中任一项所述的重组病毒载体，其中所述载体是血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV 12或AAV 13的重组AAV载体。
26.如权利要求1至25中任一项所述的重组病毒载体，其中所述控制元件是人骨骼肌动蛋白基因元件、心脏肌动蛋白基因元件、肌细胞特异性增强子结合因子mef、肌肉肌酸激酶(MCK)、截短的MCK(tMCK)、肌球蛋白重链(MHC)、C5-12、鼠肌酸激酶增强子元件、骨骼快缩肌钙蛋白c基因元件、慢缩心脏肌钙蛋白c基因元件、慢缩肌钙蛋白i基因元件、缺氧诱导核因子、类固醇诱导元件或糖皮质激素应答元件(gre)。
27.如权利要求1至26中任一项所述的重组病毒载体，其中所述控制元件包含WO2017/181015的SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
28.一种组合物，所述组合物包含权利要求1至27中任一项所述的重组病毒载体。
29.如权利要求28所述的组合物，所述组合物是还包含治疗相容的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
30.如权利要求29所述的组合物，其中所述治疗上可接受的载体、稀释剂或赋形剂是包含pH 6.0的10mM L-组氨酸、150mM氯化钠和1mM氯化镁的无菌水溶液。
31.如权利要求29或30所述的组合物，所述组合物呈约10mL具有至少1.6×1013个载体基因组的水溶液的剂型。
32.如权利要求29至31中任一项所述的组合物，所述组合物具有每毫升至少2×1012个载体基因组的效力。
33.一种产生权利要求28至32中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括在细胞中产生所述重组病毒载体(例如，所述重组AAV载体)，以及裂解所述细胞以获得所述载体。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述载体是血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV 12或AAV 13的重组AAV载体。
35.一种治疗有需要的受试者的肌营养不良或抗肌萎缩蛋白病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1至27中任一项所述的重组病毒载体(例如，重组AAV载体)或权利要求28至32中任一项所述的组合物。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述重组AAV载体或所述组合物通过肌内注射、静脉内注射、肠胃外施用或全身施用来施用。
37.如权利要求35或36所述的方法，其中所述肌营养不良是杜氏肌营养不良、贝克尔肌营养不良、福山型先天性肌营养不良(FCMD)、dysferlin肌病、肌强直性肌营养不良和分区蛋白缺乏型先天性肌营养不良1A型、面肩肱型肌营养不良(FSHD)、先天性肌营养不良(CMD)或肢带型肌营养不良(LGMDR5或LGMD2C)。
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