KR20210124969A - 근이영양증의 치료를 위한 조합 요법 - Google Patents

근이영양증의 치료를 위한 조합 요법 Download PDF

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에릭 레이스
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솔리드 바이오사이언시즈 인크.
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Abstract

본원에서 기재된 본 발명은 기능적 단백질 (예컨대 소형화된 인간 마이크로-디스트로핀 유전자 산물) 및 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA), 안티센스 서열, 유전자 편집 효소를 위한 가이드 서열 (예컨대 CRISPR/Cas9를 위한 sgRNA, 또는 CRISPR/Cas12a를 위한 crRNA), 및/또는 마이크로RNA에 대하여 하나 이상의 추가의 코딩 서열을 공-발현시키는, 유전자 요법 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터, 그리고 근이영양증 예컨대 DMD / BMD를 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 상기 벡터의 사용 방법을 제공한다.

Description

근이영양증의 치료를 위한 조합 요법
관련 출원에 대한 참조
본원은 2018년 12월 12일 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/778,646의 출원일에 우선권 그리고 이의 이익을 주장하며, 그의 전체 내용이 참고로 본원에 편입된다.
근이영양증 (MD)은 점진적 쇠약 그리고 근육량의 손실을 야기시키는 질병의 군이다. 근이영양증에서, 비정상 유전자 (돌연변이체 유전자)는 건강한 근육을 형성하는데 필요한 기능적 야생형 단백질을 생산하지 않는다.
근이영양증은 이환된 환자의 삶의 질에 심각한 약체화 영향을 갖는다. 뒤센형 근이영양증 (DMD)은 5,000명 신생 남아 중 1명을 이환시키는 가장 황폐화 근육 질환 중 하나이다. 이것은 디스트로핀-연관 단백질 복합체 (DAPC)의 구성원을 인코딩하는 유전자내 돌연변이에서 비롯하는, 가장 잘-특성규명된 근이영양증이다. 이들 MD는 DAPC에 의한 근육속막-세포골격 테더링의 손실과 연관된 막 취약성에서 비롯한다.
구체적으로, DMD는, 디스트로핀-연관 단백질 복합체 (DAPC)와 연관된 427 kDa 세포속막 단백질인, 디스트로핀 또는 기능적 디스트로핀의 부재 및 DMD mRNA내 감소를 초래하는, DMD 유전자에서 돌연변이에 의해 야기된다 (Hoffman 등, Cell 51(6):919-928, 1987). DAPC는 디스트로핀을 통해 세포외 기질 (ECM)과 세포골격 사이 구조적 링크를 형성하는 근육 근섬유막에 다중 단백질, 액틴 결합 단백질, 및 알파-디스트로글리칸, 라미닌-결합 단백질로 구성된다. 이들 구조적 링크는 수축 도중 근육 세포 막을 안정화시키고, 수축-유도된 손상에 대해 보호한다.
DMD 유전자 돌연변이의 결과로서 디스트로핀의 손실은 디스트로핀 당단백질 복합체를 파괴하여, 증가된 근육 막 취약성을 초래한다. 근형질로의 칼슘의 유입, 프로테아제 및 전염증성 사이토카인의 활성화, 및 미토콘드리아성 기능장애를 포함하는 사건의 캐스케이드는 진행성 근육 퇴화를 초래한다. 이 밖에도, 뉴런성 산화질소 신타제 (nNOS)의 변위는 조직 허혈, 증가된 산화적 스트레스, 및 회복 실패에 기여한다. 질환 진행은 근육 괴사, 섬유증, 및 지방 조직 대체 그리고 후속 근육 생검에서 보여진 더 큰 정도의 섬유 크기 변동을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
축적된 증거는 세포내 Ca2+ (Ca2+ i)의 비정상 상승이 DMD에서 질환 진행을 시작하고 지속시키는 중요한, 초기 병원성 사건인 것을 시사한다. 근소포체/소포체 Ca2+ ATPase (SERCA) 펌프의 정상 기능은 시토졸 및 적합한 근육 수축으로부터 Ca2+ 제거의 > 70%를 차지한다. SERCA 활동성의 감소는 그러므로 DMD에서 근육 기능장애 및 Ca2+ i 과적재의 일차 원인으로서 간주되었다.
현재 DMD에 대한 치료법은 없다. 치료 기준은 코르티코스테로이드 (예컨대 프레드니손 또는 데플라자코르트)를 투여하여 근력 및 기능을 안정화시키는 것, 독립적 보행을 연장시키는 것, 그리고 척추측만증 및 심근증; 비스포스포네이트; 및 데노수맙 및 재조합 부갑상선 호르몬을 지연시키는 것을 포함한다.
유전자 요법의 출현으로, DMD 치료에 대한 조사 및 임상 시험은 디스트로핀 기능을 적어도 부분적으로 복원하기 위한 기타 유전적 요법 또는 유전자 대체에 집중하였다. 이들은 디스트로핀 유전자의 기능적 카피, 예컨대 디스트로핀 미니유전자를 공급하는 것, 또는 엑손 스키핑 및 넌센스 돌연변이 억압에 의해 결함 디스트로핀 유전자 산물을 복구하는 것을 포함한다.
하지만, 디스트로핀 돌연변이에 의해 야기된 광범위한 효과로 인해, 일차 디스트로핀 돌연변이와 연관된 기타 이차 증상을 치료할 필요가 있다.
예를 들어, 디스트로핀의 손실은 디스트로핀-연관 단백질 복합체 (DAPC)의 손실로 이어지고, 이는 차례로 nNOS에 의한 산화질소 (NO)의 생산, 및 HDAC2의 비정상 N-니트로실화로 이어진다. 그러한 비정상적으로 N-니트로실화된 HDAC2는 염색질로부터 해리하고, 차례로 다수의 다운스트림 사건 예컨대 섬유증 및 증가된 산화적 스트레스로 이어지는 특이적 마이크로RNA의 캐스케이드의 억제를 해제한다.
특히, 섬유증에 관하여, 디스트로핀 손실로, 막 취약성은 세포속막 눈물 및 칼슘의 유입, 칼슘-활성화된 프로테아제 및 세그먼트성 섬유 괴사 유발을 초래한다 (Straub 등, Curr. Opin. Neurol. 10(2): 168-175, 1997). 근육 퇴화 및 재생의 이러한 제어되지 않은 주기는 궁극적으로 근육 줄기 세포 집단을 소모시켜 (Sacco 등, Cell 143(7): 1059-1071, 2010; Wallace 등, Annu Rev Physiol 71:37-57, 2009), 점진적 근육 쇠약, 근내막 염증, 및 섬유증성 반흔화를 초래한다.
디스트로핀 또는 마이크로-디스트로핀으로부터 막 안정화 없이, DMD는 조직 부상 및 회복의 제어되지 않은 주기를 나타낼 것이고, 궁극적으로 결합 조직 증식을 통해서 손실된 근육 섬유를 섬유증성 반흔 조직으로 대체할 것이다.
DMD의 진단의 최초기 (예를 들면, 4살 내지 5살)에 실시된 근육 생검은 우세한 결합 조직 증식을 나타낸다. 근육 섬유증은 여러 방면에서 해롭다. 이는 결합 조직 장벽을 통해 근내막 영양분의 정상 통행을 감소시키고, 혈류를 감소시키고 혈관-유래된 영양적 구성성분의 근육을 박탈하고, 사지 구축을 통해 보행의 초기 손실에 기능적으로 기여한다. 경시적으로, 치료 과제는 근육내 두드러진 섬유증의 결과로서 증대한다. 이것은 연속적인 시점에 결합 조직 증식을 비교하는 근육 생검에서 관찰될 수 있다. 상기 과정은 계속 악화하여, 특히 휠체어-의존성 환자에서, 보행의 상실을 초래하고 제어 불가능을 가속화한다.
따라서 섬유증성 침윤은 DMD에서 심오하고, 임의의 잠재적 요법에 상당한 장애물이다. 이와 관련하여, 유전자 대체 요법 단독은 일반적으로, DMD를 가진 아주 어린 아이들에서 이미 존재하는, 섬유증의 중증도에 의해 방해된다.
섬유증은 콜라겐 및 엘라스틴을 포함하는 ECM 기질 단백질의 과도한 침착물을 특징으로 한다. ECM 단백질은 스트레스 및 염증에 반응하는 활성화된 섬유아세포에 의해 방출되는 사이토카인 예컨대 TGF로부터 주로 생산된다. DMD의 일차 병리학적 특성이 근섬유 퇴화 및 괴사이어도, 병리학적 결과로서 섬유증은 똑같은 반향을 갖는다. 섬유증성 조직의 과-생산은 근육 재생을 한정하고 DMD 환자에서 점진적 근육 쇠약에 기여한다.
하나의 연구에서, 초기 DMD 근육 생검에서 섬유증의 존재는 10년 추적조사에서 열악한 운동 결과와 높은 상관 관계가 있었다 (Desguerre 등, J Neuropathol Exp Neurol 68(7):762-767, 2009). 이들 결과는 DMD 근육 기능장애에 대한 주요 기여자로서 섬유증을 가리키고 섬유증성 조직을 감소시키는 요법을 개발하는 필요를 강조한다.
mdx 마우스에서 테스트된 대부분의 항-섬유증성 요법은 TGF 경로의 억제를 통해서 섬유증성 사이토카인 신호전달을 차단하는 역할을 한다.
마이크로RNA (miRNA)는 mRNA의 3' UTR 내에서 염기와의 짝짓기, 번역 억제 또는 mRNA 분해 촉진에 의해 전사 후 수준에서 유전자 침묵화를 매개하는 ~22개 뉴클레오타이드의 단일- 가닥 RNA이다. miRNA의 5' 단말에 7 bp의 씨드 서열은 miRNA를 표적하고; 추가의 인식은 표적화된 서열의 나머지, 뿐만 아니라 이의 이차 구조에 의해 제공된다. miRNA는 근육 질환 병리에서 중요한 역할을 하고 당해 근이영양증의 유형에 독특하게 의존적인 발현 프로파일을 나타낸다 (Eisenberg 등, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 104(43):17016-17021, 2007). 증가하는 증거 전체는 miRNA가 심장, 간, 신장, 및 폐를 포함하는 많은 기관의 섬유증성 과정에서 관여됨을 시사한다 (Jiang 등, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 104(43):17016-17021, 2007).
최근, miR-29의 하향-조절은 심장 섬유증에 기여하는 것으로 나타났다 (Cacchiarelli 등, Cell Metab 12(4):341-351, 2010). miR-29의 감소된 발현은 인간 DMD 환자 근육과 유전적으로 연결되었다 (Eisenberg 등, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 104(43):17016-17021, 2007).
miR-29 계열은 2개 비시스트론성 miRNA 클러스터로부터 발현된 3개 계열 구성원으로 이루어진다. miR-29a는 miR-29b (miR-29b-1)와 공발현되고; miR-29c는 miR-29b의 제 2 카피 (miR-29b-2)와 공-발현된다. miR-29 계열은 보존된 씨드 서열을 공유하고, miR-29a 및 miR-29b 각각은 miR-29c로부터 단 1개 염기만큼 상이하다. 게다가, mdx 마우스 근육에 miR-29 플라스미드 (miR-29a 및 miR-29b-1의 클러스터)의 전기천공은 ECM 성분, 콜라겐 및 엘라스틴의 발현 수준을 감소시켰고, 치료 후 25 일 이내에 근육 부문에서 콜라겐 침착을 강하게 감소시켰다 (Cacchiarelli 등, Cell Metab 12(4):341-351, 2010).
아데노-연관 바이러스 (AAV)는 복제-결핍 파보바이러스이고, 이의 단일-스트란드 DNA 게놈은, 145개 뉴클레오타이드 반전된 말단 반복부 (ITR)를 포함하는, 약 4.7 kb 길이이다.
AAV는 예를 들어, 유전자 요법에서 외래 DNA를 세포에 전달하기 위한 벡터로서 이것을 유인하는 독특한 특성을 소유한다. 배양물내 세포의 AAV 감염은 비세포병리학적이고, 인간 및 기타 동물의 자연 감염은 침묵적이고 무증상적이다. 더욱이, AAV는 많은 포유류 세포를 감염시켜, 생체내 많은 상이한 조직 표적화의 가능성을 허용한다. 더욱이, AAV는 느리게 분열 및 비-분열 세포를 형질도입하고, 그들 세포의 수명을 전사적으로 활성 핵 에피솜 (염색체외 요소)으로서 본질적으로 지속할 수 있다. AAV 프로바이러스성 게놈은 플라스미드에서 클로닝된 DNA로서 감염성이고, 이는 재조합 게놈의 작제를 가능하게 만든다. 게다가, AAV 복제, 게놈 캡시드화 및 통합에 관한 신호가 AAV 게놈의 ITR 내에 들어있기 때문에, (복제 및 구조적 캡시드 단백질, rep-cap를 인코딩하는) 내부 대략 4.3 kb의 게놈의 일부 또는 전부는 외래 DNA 예컨대 프로모터, 관심의 DNA 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 유전자 카셋트로 대체될 수 있다. rep 및 cap 단백질은 트랜스로 제공될 수 있다. AAV의 또 다른 상당한 특성은 극히 안정적이고 건장한 바이러스라는 점이다. 아데노바이러스를 불활성화시키는데 사용된 조건 (수 시간 동안 56 내지 65℃)을 쉽게 견뎌서, AAV의 차가운 보존을 덜 중요하게 한다. AAV는 심지어 동결건조될 수 있다. 마지막으로, AAV-감염된 세포는 중복감염에 저항성이지 않다.
다중 연구는 근육내 장기 (> 1.5 년) 재조합 AAV-매개된 단백질 발현을 입증하였다. Clark 등, Hum Gene Ther 8:659-669 (1997); Kessler 등, Proc Nat. Acad Sc. U.S.A. 93:14082-14087 (1996); 및 Xiao 등, J Virol 70: 8098-8108 (1996), 참고. 또한, Chao 등, Mol Ther 2:619-623 (2000) 및 Chao 등, Mol Ther 4:217-222 (2001), 참고. 더욱이, 근육이 고도로 혈관화되기 때문에, 재조합 AAV 형질도입은 Herzog 등, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 94: 5804-5809 (1997) 및 Murphy 등, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 94: 13921-13926 (1997)에서 기재된 바와 같이 근육내 주사 이후 전신 순환에서 이식유전자 산물의 출현을 초래하였다. 더욱이, Lewis 등, J Virol 76: 8769-8775 (2002)은 골격 근섬유가 정확한 항체 글리코실화, 폴딩, 및 분비를 위하여 필요한 세포성 인자를 소유한다는 것을 입증하여, 근육이 분비된 단백질 치료학의 안정하게 발현할 수 있다는 것을 나타낸다.
AAV 벡터를 사용하는 유전자 요법이 그 부문에 상당한 투자를 촉진하였지만, 상업화에 대하여 상당한 과제는 남아있다. 재조합 바이러스성 벡터 생산에서 생산 규모확대가 기술적으로 주요 도전과제이면서 상업화의 높은 장벽이기 때문에 복잡한 것으로 보인다.
구체적으로, AAV-기반된 바이러스성 벡터에 대하여 보고된 임상 용량은 치료적 영역에 의존적인 환자 당 1011 내지 1014 게놈성 입자 (벡터 게놈; vg) 범위이다. 따라서, 더 넓은 유전자 요법 개발 전망으로부터, 현행 규모확대 접근법은 나중 단계 (예를 들면, 단계 II/III) 실마리를 진행하는데 필요한 수의 용량 공급에 미치지 못하고, 따라서 유전자 요법 산물의 개발을 지체시킨다. 이것은 대부분의 임상 연구가, 매우 적은 양의 산물을 생성하는 유착성 세포 형질감염 과정을 사용하는, <100 환자 (및 일부 경우에 <10)에서 수행된, 매우 작다는 사실에 의해 뒷받침된다. 나중 단계 개발을 위하여 요구된 바이러스의 예측된 양이 현행 생산력 (예를 들면, 단일 10개 층 세포 공장으로부터 5 × 1011 vg)과 비교되는 경우, 이러한 접근법이 후기 단계에 대하여 물질 요건 및, 더 많은 "표준" 유전자 요법 적응증은 말할 것도 없고, 고 용량 및 작은 환자 코호트를 갖는, 심지어 극희귀 질환에 대하여 시장내 필요에 미치지 못할 것이라는 실제 염려가 있다.
최근 리뷰 기사 (Molecular Therapy-Methods & Clinical Development (2016) 3, 16002; doi:10.1038/mtm.2016.2)에서 Clement 및 Grieger에 의해 언급된 바와 같이: "임상 셋팅에서 rAAV의 사용은 고도로 순수한 rAAV 입자의 매우 많은 양을 생성할 수 있는 생산 및 정제 시스템에 대하여 긴급한 필요를 부각시켰다. 전형적 FDA-승인된 조사 신약은, 1E15 내지 1E16 벡터 게놈 범위로 종종 도달하는 벡터 요건으로, 독성, 안전성, 용량, 및 생물-분포 사정에 대하여 광대한 전임상 연구를 포함한다. 그러한 양을 제조하는 것은, 기술적으로 실행가능하여도, 현행 생산 시스템을 사용하는 경우 여전히 엄청난 노력을 나타낸다."
이러한 문제는 (국소적으로와는 대조적으로) 전신적으로 바람직하게는 전달되는 AAV 벡터에 대하여 특히 절실하다. 최근 기사에서, Adamson-Small 등. (Molecular Therapy - Methods & Clinical Development (2016) 3, 16031; doi:10.1038/mtm.2016.31)은 "벡터 생산 및 정제에서 현행 제한이 임상 후보 벡터의 만연한 이행을, 특히 전신 투여가 고려되는 경우 방해되었다.... 이것은, 높은 AAV 용량에서 종종 전신 용량화에 의존하여, 신체 전반 유전자 전달이 필요할 수 있는 경우, 유전된 유전적 질환 예컨대 근이영양증의 치료에 특히 사실이다." 실제로, 근이영양증에 대하여 임상 시험에서 rAAV의 이전의 연구는 전신 투여를 지원하는데 필요한 양을 생성하기 위한 대규모 제조 용량의 부족으로 종종 인해 근육내 주사를 통해 벡터를 전달하였다. 조합 요법에서 2개 AAV 벡터의 전신 전달은 조합 요법에 요구된 고품질 AAV 벡터의 충분한 양 생산의 면에서 심지어 더 큰 과제를 제기한다.
따라서, DMD 및 기타 근이영양증을 앓고 있는 환자에서 기능적 개선은 다수의 이차 캐스케이드와 연관된 증상 예컨대 섬유증의 감소 및 유전자 복원 둘 모두를 요구한다. 대안적으로 또는 이 밖에도, 근이영양증은 상이한 질환-유발 경로를 동시에 표적화하는 치료로부터 유익할 수 있다. DMD 및 기타 근이영양증의 더욱 효과적 치료를 위하여 유전자 복원 방법과 짝짓기될 수 있는 그러한 이차 캐스케이드 증상 (예를 들면, 섬유증)의 감소 방법이 필요하다. 그러한 조합 요법은, 특히 유전자 요법 벡터의 전신 전달의 셋팅에서, 표적 조직에 두 치료적 성분을 전달하기 위해 유전자 요법 벡터의 충분한 양을 생산하는 상당한 임상 및 상업화 과제를 또한 극복해야 한다.
발명의 개요
본원에서 기재된 본 발명은, 제 1 폴리펩타이드 또는 제 1 RNA, 및 제 2 폴리펩타이드 또는 제 2 RNA를 동시에 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 유전자 요법을 위한 바이러스성 벡터를 제공한다.
예를 들어, 벡터는 제 1 치료적 단백질 및 제 2 치료적 RNA를 동시에 인코딩할 수 있다.
하지만, 제 1 또는 제 2 RNA, 또는 양쪽은 단백질 또는 폴리펩타이드를 생산하지 않는 비-코딩 RNA일 수 있다. 그러한 비-코딩 RNA는, 바람직하게는 치료적 가치, 예를 들면, 질환 예컨대 암, 자폐증, 알츠하이머병, 연골털형성저하증, 청력 상실, 및 프라더-윌리 증후군, 특히 DMD/BMD를 포함하는, 다양한 유형의 근이영양증 (MD)과 연관된 것들을 가진, 마이크로RNA (miR), shRNA (짧은 헤어핀 RNA), piRNA, snoRNA, snRNA, exRNA, scaRNA, 긴 ncRNA 예컨대 Xist 및 HOTAIR, 안티-센스 RNA, 또는 이들의 전구체일 수 있다.
그러한 비-코딩 RNA는 또한 CRISPR/Cas9 단백질의 단일 또는 다중 가이드 RNA(들), 또는 CRISPR/Cas12a(이전에 Cpf1) 프로티엔의 CRISPR RNA (crRNA)일 수 있다.
따라서 일 양태에서, 본 발명은 a) 관심의 기능적 유전자 또는 단백질 (GOI), 예컨대 근이영양증을 치료하는데 효과적인 것을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드는 3'-UTR 코딩 영역을 포함하고, 폴루뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 기능적 단백질의 발현을 향상시키는 이종성 인트론 서열에 즉시 3'임; b) 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결되고 이의 발현을 구동하는 제어 요소 (예를 들면, 근육-특이적 제어 요소); 및, c) 인트론 서열에서 또는 3'-UTR 코딩 영역에서 삽입된 하나 이상의 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스성 벡터를 제공하고; 여기서 상기 하나 이상의 코딩 서열은 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA), 안티센스 서열, 효소를 편집하는 유전자를 위한 가이드 서열 (예컨대 CRISPR/Cas9를 위한 단일 가이드 RNA (sgRNA), 또는 CRISPR/Cas12a를 위한 acrRNA), 마이크로RNA (miRNA), 및/또는 miRNA 억제제를 독립적으로 인코딩한다.
특정 구현예에서, 재조합 바이러스성 벡터는 재조합 AAV (아데노 연관 바이러스성) 벡터 또는 재조합 렌티바이러스성 벡터이다.
관련 양태에서, 본 발명은 a) 근이영양증을 치료하는데 효과적인 기능적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드는 3'-UTR 코딩 영역을 포함하고, 폴루뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 기능적 단백질의 발현을 향상시키는 이종성 인트론 서열에 즉시 3'임; b) 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결되고 이의 발현을 구동하는 근육-특이적 제어 요소; 및, c) 인트론 서열에서 또는 3'-UTR 코딩 영역에서 삽입된 하나 이상의 코딩 서열을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 벡터를 제공하고; 여기서 상기 하나 이상의 코딩 서열은 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA), 안티센스 서열, 마이크로RNA (miRNA), 및/또는 miRNA 억제제를 독립적으로 인코딩한다.
특정한 구현예에서, 본원에서 기재된 본 발명은 a) 기능적 마이크로-디스트로핀 단백질 (예를 들면, 마이크로D5)를 인코딩하는 디스트로핀 미세유전자 또는 미니유전자, 여기서 상기 디스트로핀 미세유전자 또는 미니유전자는 3'-UTR 코딩 영역을 포함하고, 디스트로핀 미세유전자 또는 미니유전자의 발현을 향상시키는 이종성 인트론 서열에 즉시 3'임; b) 디스트로핀 미세유전자 또는 미니유전자에 작동가능하게 연결되고 이의 발현을 구동하는 근육-특이적 제어 요소; 및, c) 인트론 서열에서 또는 3'-UTR 코딩 영역에서 삽입된 1개 이상 (예를 들면, 1, 2, 3, 4, 또는 5개) 코딩 서열(들)을 포함하는 바이러스성 벡터, 예컨대 재조합 AAV 벡터를 제공하고; 여기서 상기 하나 이상의 코딩 서열(들)은 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA), 안티센스 서열, 마이크로RNA (miRNA), 및/또는 miRNA 억제제를 독립적으로 인코딩한다.
특정 구현예에서, 기능적 디스트로핀 단백질은 마이크로D5이고/거나, 근육-특이적 제어 요소 / 프로모터는 CK 프로모터이다.
본 발명은 하나 이상의 코딩 서열(들)이 특정 위치, 예컨대 이종성 인트론에 삽입될 수 있고, 반면에 양쪽 기능적 단백질 (예컨대 디스트로핀 미세유전자 또는 미니유전자 산물) 및 하나 이상의 코딩 서열이 기능적 단백질 (예컨대 디스트로핀 미니유전자 산물)만 또는 하나 이상의 코딩 서열만을 포괄하는 비슷한 벡터 작제물과 비교하여 발현에서의 상당한 감소 없이 감염된 표적 세포 (예를 들면, 근육 세포) 내부에서 발현될 수 있다는 놀라운 사실에 부분적으로 기반된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 코딩 서열은 3'-UTR 코딩 영역에서, 또는 폴리아데닐화 (polyA) 신호 서열 (예를 들면, AATAAA) 후에 삽입된다.
특정 구현예에서, 기능적 GOI의 발현은 (예를 들면, 삽입된 상기 하나 이상의 코딩 서열 없이 달리 동일한 대조 작제물과 비교해서) 하나 이상의 코딩 서열의 존재 하에서 실질적으로 영향받지 않는다.
특정 구현예에서, 재조합 AAV (rAAV) 벡터에서: a) 폴리뉴클레오타이드는 기능적 5-스펙트린-유사 반복부 디스트로핀 단백질 (예를 들면, 마이크로D5; 본원에서 참고로 편입된, US10,479,821에서 기재된 바와 같음)을 인코딩하는 디스트로핀 미니유전자이고/거나; b) 근육-특이적 제어 요소는 디스트로핀 미니유전자에 작동가능하게 연결되고 이의 발현을 구동시키는 CK 프로모터이다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 코딩 서열은 결함 디스트로핀의 엑손의 스키핑, 예컨대 디스트로핀의 엑손 45-55 중 어느 하나, 또는 디스트로핀의 엑손 44, 45, 51, 및/또는 53의 스키핑을 유도하는 엑손-스키핑 안티센스 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 마이크로RNA는 miR-1, miR-133a, miR-29c, miR-30c, 및/또는 miR-206이다. 예를 들어, 마이크로RNA가 miR-29c인 경우, miR-29c는 표적 서열에 대하여 설계된 miR-29c의 가이드 스트란드의 가공을 향상시키는 변형된 측접 백본 서열을 임의로 갖는다. 상기 변형된 측접 백본 서열은 기타 miR 서열, 예컨대 miR-30, -101, -155, 또는 -451 유래일 수 있거나 이에 기반될 수 있다.
특정 구현예에서, 숙주 세포에서 마이크로RNA의 발현은 숙주 세포에서 마이크로RNA의 내인성 발현과 비교하여 적어도 약 1.5-15 배 (예를 들면, 약 2-10 배, 약 1.4-2.8 배, 약 2-5 배, 약 5-10 배, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 약 15 배) 만큼 상향-조절된다.
특정 구현예에서, RNAi 서열은 사르콜리핀 (shSLN)에 대해 shRNA이다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 코딩 서열은 사르콜리핀 (shSLN)에 대해 하나 이상의 동일한 또는 상이한 shRNA를 인코딩한다.
특정 구현예에서, shRNA는 사르콜리핀 mRNA 및/또는 사르콜리핀 단백질 발현을 적어도 약 50% 만큼 감소시킨다.
특정 구현예에서, GOI는 CRISPR/Cas9이고, 가이드 서열은 sgRNA이거나; 여기서 GOI가 CRISPR/Cas12a이고, 가이드 시켄데가 crRNA이다.
특정 구현예에서, RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA), 안티센스 서열, 상기 CRISPR/Cas9 sgRNA, 상기 CRISPR/Cas12a crRNA 및/또는 마이크로RNA는 하나 이상의 표적 유전자, 예컨대 염증성 유전자, NF-κB 신호전달 경로의 활성화제 (예를 들면, TNF-α, IL-1, IL-1β, IL-6, NF-κB의 수용체 활성화제 (RANK), 및 톨-유사 수용체 (TLRs)), NF-κB, NF-κB에 의해 유도된 다운스트림 염증성 사이토카인, 히스톤 데아세틸라제 (예를 들면, HDAC2), TGF-β, 결합 조직 성장 인자 (CTGF), 콜라겐, 엘라스틴, 세포외 기질의 구조적 성분, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 (G6PD), 마이오스타틴, 포스포디에스테라제-5 (PED-5) 또는 ACE, VEGF 디코이-수용체 유형 1 (VEGFR-1 또는 Flt-1), 및 조혈 프로스타글란딘 D 신타제 (HPGDS)의 기능을 길항시킨다.
특정 구현예에서, 벡터, 예를 들면, 재조합 AAV (rAAV) 벡터에서: 후쿠야마 선천성 근이영양증 (FCMD) 환자에 있어서 a) 폴리뉴클레오타이드는 기능적 푸쿠틴 (FKTN) 단백질을 인코딩하고/거나; b) 하나 이상의 코딩 서열은 결함 FKTN 유전자에서 정확한 엑손 10 스플라이싱을 복원하는 엑손-스키핑 안티센스 서열을 인코딩한다.
특정 구현예에서, 벡터, 예를 들면, 재조합 AAV (rAAV) 벡터에서: 메로신-결핍 선천성 근이영양증 유형 1A (MDC1A) 환자에 있어서 a) 폴리뉴클레오타이드는 기능적 LAMA2 단백질을 인코딩하고/거나; b) 하나 이상의 코딩 서열은 결함 LAMA2 유전자의 C-말단 G-도메인 (엑손 45-64), 특히 G4 및 G5의 발현을 복원하는 엑손-스키핑 안티센스 서열을 인코딩한다.
특정 구현예에서, 벡터, 예를 들면, 재조합 AAV (rAAV) 벡터에서: DM1 환자에 있어서 a) 폴리뉴클레오타이드는 기능적 DMPK 단백질, 또는 CLCN1 유전자를 인코딩하고/거나; b) RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA), 안티센스 서열, 또는 마이크로RNA (miRNA)는 결함 DMPK 유전자에서 돌연변이체 전사물의 확장된 반복부를 표적하거나, CLCN1 유전자내 엑손 7A의 스키핑을 초래하는 엑손-스키핑 안티센스 서열을 인코딩한다.
특정 구현예에서, 벡터, 예를 들면, 재조합 AAV (rAAV) 벡터에서: 디스펄린병증 (LGMD2B 또는 MM) 환자에 있어서 a) 폴리뉴클레오타이드는 기능적 DYSF 단백질을 인코딩하고/거나; b) 하나 이상의 코딩 서열은 결함 DYSF 유전자에서 엑손 32의 스키핑을 초래하는 엑손-스키핑 안티센스 서열을 인코딩한다.
특정 구현예에서, 벡터, 예를 들면, 재조합 AAV (rAAV) 벡터에서: LGMD2C 환자에 있어서 a) 폴리뉴클레오타이드는 기능적 SGCG 단백질을 인코딩하고/거나; b) 하나 이상의 코딩 서열은 결함 LGMD2C 유전자 (예를 들면, △-521T SGCG 돌연변이를 가진 것)에서 엑손 4-7의 스키핑을 초래하는 엑손-스키핑 안티센스 서열을 인코딩한다.
특정 구현예에서, 이종성 인트론 코딩 서열은 서열번호: 1이다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 코딩 서열은 인트론 서열에서 삽입된다.
특정 구현예에서, 기능적 단백질의 발현은 상기 하나 이상의 코딩 서열의 삽입에 의해 부정적으로 영향받지 않는다.
특정 구현예에서, 벡터는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAVrh74, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV 12, 또는 AAV 13의 것이다. 특정 구현예에서, 벡터는 공지된 혈청형의 유도체이다. 특정 구현예에서, 유도체는 원하는 조직 특이성 또는 지향성, 원하는 면역원성 프로파일 (예를 들면, 대상체 환자의 면역 시스템에 의해 공격 당하지 않는), 또는 다양한 적응증에 대하여 유전자 요법 또는 약학적 조성물에 대하여 원하는 기타 속성을 나타낼 수 있다.
특정 구현예에서, 근육-특이적 제어 요소는 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 근세포-특이적 인핸서 결합 인자 mef, 근육 크레아틴 키나제 (MCK), 절단된 MCK (tMCK), 미오신 중쇄 (MHC), C5-12, 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서 요소, 골격 속근 트로포닌 c 유전자 요소, 지근 심장 트로포닌 c 유전자 요소, 지근 트로포닌 i 유전자 요소, 저산소증-유도성 핵 인자, 스테로이드-유도성 요소, 또는 글루코코르티코이드 반응 요소 (gre)이다.
특정 구현예에서, 근육-특이적 제어 요소는 (본원에서 참고로 편입된) WO2017/181015의 서열번호: 10 또는 서열번호: 11의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 임의의 벡터, 예를 들면, 본 발명의 재조합 바이러스성 (AAV) 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 조성물은 치료적으로 호환성 담체, 희석제, 또는 부형제를 추가로 포함하는 약학적 조성물이다.
특정 구현예에서, 치료적으로 허용가능한 담체, 희석제, 또는 부형제는 pH 6.0에 10 mM L-히스티딘, 150 mM 염화나트륨, 및 1 mM 염화마그네슘을 포함하는 멸균 수용액이다.
특정 구현예에서, 조성물은 적어도 1.6 × 1013 벡터 게놈을 갖는 약 10 mL의 수용액의 투약량 형태이다.
특정 구현예에서, 조성물은 적어도 2 × 1012 벡터 게놈 / 밀리리터의 역가를 갖는다.
본 발명의 또 다른 양태는, 세포에서 벡터, 예를 들면, 재조합 AAV 벡터를 생산하는 단계 및 세포를 용해시켜 벡터를 수득하는 단계를 포함하는, 대상체 조성물의 생산 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 벡터는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAVrh74, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV 12, 또는 AAV 13 벡터이다.
본 발명의 또 다른 양태는 치료를 필요로 하는 대상체에서 근이영양증 또는 디스트로핀병증의 치료 방법으로서, 재조합 벡터, 예를 들면, 본 발명의 재조합 AAV 벡터 중 어느 하나, 또는 본 발명의 조성물 중 어느 하나의 치료적으로 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 재조합 벡터, 예를 들면, 재조합 AAV 벡터 또는 조성물은 근육내 주사, 정맥내 주사, 비경구 투여 또는 전신 투여에 의해 투여된다.
특정 구현예에서, 근이영양증은 뒤센 근이영양증 또는 베커 근이영양증이다.
특정 구현예에서, 근이영양증은 뒤센 근이영양증, 베커 근이영양증, 후쿠야마 선천성 근이영양증 (FCMD), 디스펄린병증, 근긴장성 이영양증, 및 메로신-결핍 선천성 근이영양증 유형 1A, 안면견갑상완 근이영양증 (FSHD), 선천성 근이영양증 (CMD), 또는 지대 근이영양증 (LGMDR5 또는 LGMD2C)이다.
본 발명의 또 다른 양태는 대상체에서 DMD 또는 관련된 / 연관된 질환의 예방 또는 치료를 위한 키트로서, 하나 이상의 벡터, 예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같은 재조합 AAV, 또는 본원에서 기재된 바와 같은 조성물; (기록된, 인쇄된, 전자 / 광학 저장 매체, 또는 온라인) 사용을 위한 지침; 및/또는 패키징을 포함하는 키트를 제공한다. 특정 구현예에서, 키트는 조합 요법을 위한 공지된 MD (예를 들면, DMD) 치료제를 또한 포함한다.
실시예 또는 청구항에서 단지 기재된 것을 포함하는, 본원에서 기재된 어느 하나의 구현예가 그러한 조합이 명백하게 부인되거나 부적절하지 않는 한 본 발명의 임의의 하나 이상의 기타 구현예와 조합될 수 있음이 이해되어야 한다.
도 1은 관심의 유전자 (GOI), 예컨대 아래 기재된 바와 같이 마이크로디스트로핀, 미니디스트로핀 또는 디스트로핀 미니유전자 (예를 들면, 아래 기재된 5-스펙트린-유사-반복 마이크로D5 디스트로핀 단백질) 및, 2개 ITR 서열 사이, 비-단백질 코딩 RNA (ncRNA) 예컨대 shRNA를 위한 하나 이상의 (즉, 도시된 바와 같이, 5개) 추가의 코딩 서열을 포괄하는 대표적 재조합 바이러스성 (예를 들면, 렌티바이러스성 또는 AAV) 벡터를 도시하는 개략도 (축척이 아님)를 도시한다. 추가의 ncRNA (예를 들면, shRNA) 코딩 서열은 동일 또는 상이할 수 있고, 본 도면에서, 추가의 코딩 서열의 자리가 그렇게 제한되지 않아도, 관심의 유전자 (GOI) 코딩 영역에 대해 이종성 인트론 서열 5' (예를 들면, 마이크로디스트로핀 코딩 서열)내인 것으로 나타날 수 있다. 즉, 코딩 서열은 AAV 벡터에서, 예컨대 3'-UTR 영역 내에서, 또는 양쪽 이종성 인트론 및 3'-UTR 영역에서 다른 곳에 자리잡을 수 있다. AAV 벡터 게놈의 전사시, GOI 또는 디스트로핀 미니유전자 (예를 들면, 마이크로D5) mRNA 및 추가적으로 코딩된 서열을 융합 RNA로서 포괄하는 사전-가공된 mRNA는 생산된다. 추가 가공시, GOI, 예컨대 (항-DMD 약물로서) 디스트로핀 미니유전자 mRNA 및 추가의 코딩된 서열, 예컨대 도시된 shRNA들은 분리된다.
도 2a는 단일 추가의 마이크로RNA29c 코딩 서열이 3'-UTR 영역에 삽입되는 재조합 바이러스성 (예를 들면, 렌티바이러스성 또는 AAV) 벡터의 하나의 특이적 구현예를 도시한다. 전사 및 추가 가공은 마이크로디스트로핀을 위한 ("SGT-001"로서 라벨링된) 마이크로D5 mRNA, 및 기능적 miR29c 마이크로RNA의 창출을 초래한다. 본 실례적, 비-제한 예에서 TAG 정지 코돈, AATAAA polyA 신호 서열, 및 (CA인 것으로 일어나는) miR-29c 삽입 서열이 모두 강조되는 것을 주목한다. 본 실례에서, miR29c 코딩 서열이 polyA 신호 서열 후에 삽입되도록 묘사되었어도, 동일한 것은 다른 곳에, 예컨대 polyA 신호 서열 전인 성숙한 mRNA의 3'-UTR 영역에서 또한 삽입될 수 있다. 또한 도 12 참고.
도 2b는 단일 추가의 사르콜리핀 (SLN) shRNA 코딩 서열 (shSLN)이 이종성 인트론에 삽입되는 재조합 바이러스성 (예를 들면, 렌티바이러스성 또는 AAV) 벡터의 또 다른 특이적 구현예를 도시한다. 전사 및 추가 가공은 마이크로디스트로핀을 위한 (SGT-001로서 라벨링된) 마이크로D5 mRNA, 및 기능적 사르콜리핀 shRNA의 창출을 초래한다. 재차, shSLN을 위한 삽입의 자리는 실례적 목적만을 위한 것이고, 본 개시내용에 따라 다른 곳에, 예컨대 3'-UTR 영역에서, 또는 polyA 신호 서열 전에 또는 후에 삽입될 수 있다.
도 3은, (SGT-001로서 라벨링된) 마이크로D5 마이크로디스트로핀 (좌측)만을 인코딩하는 AAV 벡터, 이종성 인트론에서 마이크로RNA 29c를 추가로 인코딩하는 AAV 벡터 (중간), 및 이종성 인트론에서 사르콜리핀 shRNA를 추가로 인코딩하는 AAV 벡터 (우측)에 의해 감염된 세포에서, 핵을 위한 DAPI 염색, 및 디스트로핀을 위한 면역형광성 염색을 도시한다. 백분율 값은 형질감염 효율, 또는 성공적으로 형질감염된 세포의 백분율을 나타낸다.
도 4는 사르콜리핀-루시페라제 리포터 융합을 인코딩하는 AAV 벡터를 도시하는 개략도이다. 사르콜리핀에 대한 shRNA의 표적 자리는 또한 도시된다.
도 5는, 세포가 마이크로D5 ("SGT001")만을 발현시키는 AAV 벡터에 의해 공-형질감염된 세포와 비교하여, 양쪽 마이크로D5 및 shSLN ("SGT001 + SLN")을 발현시키는 AAV 벡터에 의해 공-형질감염된 경우, C2C12 세포에서 사르콜리핀-루시페라제 융합 리포터의 발현이 86.8% 만큼 감소되는 것을 도시한다.
도 6a는 C2C12 세포에서 (형질감염 6 일후) 내인성 사르콜리핀 발현이, ("SGT-001"로서 라벨링된) 마이크로D5만을 인코딩하는 AAV 벡터에 의해 형질감염된 C2C12 세포와 비교하여, ("SGT001-shSLN"로서 라벨링된) shSLN 및 마이크로D5를 인코딩하는 AAV 벡터에 의해 형질감염된 C2C12 세포에서 55% 만큼 감소되었다는 것을 도시한다.
도 6b는, 도 6a에서의 데이터가 컴파일링된 것에 기반된, 내인성 SLN 발현을 위한 면역형광 염색 이미지를 도시한다.
도 7은 C2C12 세포에서 (양쪽 마이크로D5 디스트로핀 및 shSLN을 인코딩하는 AAV 벡터를 형질감염시킴으로써) shSLN의 발현이 내인성 SLN의 기능을 감소시켜서, 근소포체로의 칼슘 재흡수가 시간 경과에 따라 영향받는 것을 도시한다. 대조군은 shSLN 없이 마이크로D5 디스트로핀만을 인코딩하는 AAV 벡터에 의해 형질감염된 세포, 및 비-형질감염된 세포를 포함한다. Y-축에서 상대 형광성 강도는 칼슘 프로브 Fluo-8의 형광성 강도의 측정에 기반된다.
도 8a는 SGT-001-shSLN (양쪽 마이크로D5 디스트로핀 및 shSLN을 인코딩하는 AAV 벡터)에 의해 형질감염된 C2C12 세포에서 마이크로디스트로핀 발현이 형질감염 1 일 (1d)후 단지 SGT-001 (마이크로D5 디스트로핀을 인코딩하는 AAV 벡터)에 의해 형질감염된 C2C12 세포의 것을, 즉, 약 20% 수준으로 지체시켰지만, 마이크로D5 디스트로핀 미니유전자 발현이 (오차 범위 내에서) 형질감염 후 6 일차 (6d)까지 재빨리 따라잡았다는 것을 도시한다.
도 8b는, 도 8a에서의 데이터가 컴파일링된 것에 기반된, 형질감염 후 1 일에 외인성 마이크로D5 디스트로핀 미니유전자 발현을 위한 면역형광 염색 이미지를 도시한다.
도 8c는, 도 8a에서의 데이터가 컴파일링된 것에 기반된, 형질감염 후 6 일에 외인성 마이크로D5 디스트로핀 미니유전자 발현을 위한 면역형광 염색 이미지를 도시한다.
도 9는 마우스 SLN을 위한 몇몇 예시적 shRNA 설계를 도시한다.
도 10은 마우스 (대상체) 및 인간 (쿼리) 사르콜리핀 서열 사이 뉴클레오타이드 서열 비교, 및 마우스- 또는 인간-특이적 shRNA를 위한 가능한 shRNA 설계, 뿐만 아니라 마우스 및 인간에 공통인 shRNA를 도시한다.
도 11은 디스트로핀 미니유전자 (마이크로D5, "SGT-001"로서 라벨링됨)를 인코딩하는 AAV 벡터에서 대표적 자리가 하나 이상의 코딩 서열 예컨대 (도시된 경우에) miR-29c 코딩 서열 또는 SLN에 대해 shRNA를 위한 코딩 서열에 대하여 삽입 지점으로서 역할을 할 수 있다는 것을 도시한다. 구체적으로, SGT-001 미니유전자의 인트론 내에서 다중 자리는, 일부 자리 (예컨대 Imir2)가 디스트로핀 미니유전자 발현에 관한 부정적 영향의 부족으로 인해 더욱 바람직할 수 있어도, 사용될 수 있다.
도 12는 대상체 재조합 바이러스성 (예를 들면, 렌티바이러스성 또는 AAV) 벡터의 하나의 대표적 및 비-제한 구현예를 도시하는 (축척이 아닌) 개략도이다. 도시된 본 구체적 구현예에서, 제어 요소는 근육-특이적 프로모터 CK8이고 GOI는 기능적 DMD 유전자의 한 버전 (마이크로 디스트로핀 또는 μDys)이다. RNAi, miRNA, 등을 위한 코딩 서열은 "전사물"이 표시되는 벡터에서, 예를 들면, GOI 전에 인트론에서, 3'-UTR 영역에서, 또는 polyA 신호 서열 후에 어느 곳에 삽입될 수 있다. 프로모터로부터 생성된 전사는 초기 융합 전사물을 초래할 것이다.
도 13은, 바이러스성 벡터에서 단독의 코딩 서열 ("솔로" 작제물)로서 또는 본 개시내용의 융합 작제물의 일부 ("융합" 작제물)로서 miR-29c를 인코딩하는 다양한 재조합 바이러스성 (예를 들면, AAV) 벡터에 대하여, 인간 iPS-유래된 심근세포에서 (μDys 만을 발현시키는 대조군 벡터에 대해 배수로) 상대 miR-29c 발현 수준 변화를 도시한다.
도 14는 바이러스성 벡터에서 단독의 코딩 서열 ("솔로" 작제물)로서 또는 본 개시내용의 융합 작제물의 일부 ("융합" 작제물)로서 miR-29c를 인코딩하는 다양한 재조합 AAV 벡터에 대하여 분화된 C2C12 세포 또는 마우스 심근세포에서 miR-29c의 상대 발현 수준을 도시한다.
도 15는 본 개시내용의 shSLN-μDys 융합 작제물뿐만 아니라 동일한 shSLN 코딩 서열을 발현시키는 몇몇 솔로 작제물을 통해 마우스 SLN 단백질 발현 수준 (최하부 열)의 약 50% 녹-다운을 도시한다. 최상부 열은 부하 대조군이다.
도 16은 바이러스성 벡터에서 단독의 코딩 서열 ("솔로")로서 또는 본 개시내용의 융합 작제물의 일부 ("융합")로서 shSLN을 인코딩하는 다양한 재조합 AAV 벡터에 대하여 분화된 C2C12 근관세포 또는 마우스 심근세포에서 siSLN (전사된 shSLN으로부터 가공된 siRNA 산물)의 상대 발현 수준을 도시한다.
도 17은 shSLN을 인코딩하는 몇몇 대상체 융합 작제물에 의해 인간 iPS-유래된 심근세포에서 최대 ~90% 인간 SLN mRNA 녹-다운을 도시한다.
도 18은 인간 iPS-유래된 심근세포에서 몇몇 Hum-shSLN-μDys 융합　작제물의 정상화된 μDys mRNA 수준을 도시한다.
도 19는 miR-29c 코딩 서열을 가진 솔로 및 융합 작제물에서 주로 온전한 AAV 게놈을 시사하는 변성 아가로스 겔의 이미지이다.
도 20a-20c는 AAV9 벡터내 본 발명의 miR-29c-μDys 융합 작제물을 사용하여, 좌측 비복근 (도 20a), 횡경막 (도 20b), 및 좌심실 (도 20c) 각각에서 약 1.4-2.8-배 miR-29c 발현 상향-조절을 도시한다.
도 21은 융합 AAV9 벡터를 상향-조절하는 miR-29c로 비복근내 단백질 수준 그리고 RNA에서 μDys 발현의 감소가 없음을 도시한다.
도 22는 μDys-단독 AAV9에 비해 shSLN-μDys 융합 작제물의 AAV9-매개된 발현을 통해, 횡경막, 좌측 비복근 (좌측 가스트), 및 심방 각각에서 최대 50% mSLN mRNA 하향-조절을 도시한다. 최대 50% mSLN mRNA 하향-조절은 혀에서 또한 관찰되었다 (데이터 도시되지 않음).
도 23은 AAV9의 shSLN-μDys 융합 작제물을 통해 횡경막내 μDys RNA/단백질 발현의 비슷한 수준을 도시한다. 비슷한 결과는 혀 및 심방에 대하여 또한 수득되었다 (데이터 도시되지 않음).
도 24는 AAV9의 miR-29c 솔로 및 miR-29c-μDys 융합 작제물이 혈청 CK 수준을 감소시킨다는 것을 도시한다.
도 25는 AAV9의 miR-29c 솔로 및 miR-29c-μDys 융합 작제물이 혈청 TIMP1 수준을 감소시킨다는 것을 도시한다.
도 26은 AAV9의 몇몇 miR-29c-μDys 융합 벡터 또는 AAV9의 shSLN-μDys 융합 벡터로부터 비복근내 miR-29c 또는 shSLN 벡터의 주로 비슷한 생물분포를 도시한다.
도 27은 miR-29c-μDys 융합 및 shSLN-μDys 융합 대 μDys 솔로 작제물에 대하여 간내 AAV9 벡터의 비슷한 역가를 도시한다.
도 28은 2개 섬유증성 마커 유전자에 관한 그들의 효과에 기반된, 횡경막내 μDys 작제물 단독에 대한 본 발명의 융합 작제물의 부가된 이익을 도시한다.
도 30은 miR-30E 백본 서열에 기반된 대표적 변형된 miR-29c 작제물에 대하여 예측된 2D 구조를 도시한다.
도 31은 miR-101 백본 서열에 기반된 대표적 변형된 miR-29c 작제물에 대하여 예측된 2D 구조를 도시한다.
도 32는 miR-451 백본 서열에 기반된 대표적 변형된 miR-29c 작제물에 대하여 예측된 2D 구조를 도시한다.
다양한 이차 캐스케이드 증상 예컨대 섬유증 및 세포내 Ca2+의 비정상 상승에 대한 병행 접근법 없이, 엑손 스키핑, 정지-코돈 통독, 또는 유전자 대체 요법의 이익이 지금까지 완전히 달성될 수 있을 것 같지 않다. 심지어 작은 분자 또는 단백질 대체 전략은 근육 섬유증을 포함하는 그러한 이차 캐스케이드 사건의 증상을 감소시키기 위한 접근법 없이 실패할 것 같다. 예를 들어, AAV 마이크로-디스트로핀으로 치료된 기존 섬유증을 가진 노령의 mdx 마우스에서 이전의 작업은 완전한 기능적 복원을 달성할 수 없었다는 것을 증명하였다 (Human molecular genetics 22:4929-4937, 2013). DMD 심근증의 진행이 심실 벽에서 반흔화 및 섬유증에 의해 수반된다는 것이 또한 공지된다.
본 발명은 대체, 기능적 디스트로핀 미니유전자를 제공함으로써 디스트로핀내 결점 및 이의 기능을 보충할 뿐만 아니라 동일한 유전자 요법 벡터에서 하나 이상의 추가의 코딩 서열을 사용하여 하나 이상의 이차 캐스케이드 유전자를 직접적으로 표적하고, 따라서 전신 전달을 위한 하나의 콤팩트 벡터에서 조합 요법을 달성하는 환자를 치료하기 위한 유전자 치료법에 부분적으로 관한 것이다.
실제로, 본 발명, 특히 본 발명의 재조합 AAV (rAAV) 벡터는 DMD를 치료하는데 제한되지 않는다. 본 발명은 유전자가 결함인 기타 근이영양증을 치료하는데 적용가능하다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 AAV (rAAV) 벡터는 근이영양증을 치료하기 위해 기능적 단백질 및/또는 하나 이상의 코딩 서열 (예컨대 비-코딩 RNA, 예를 들면, RNAi 서열, 안티센스 RNA, miRNA)를 제공할 수 있고, 여기서 상기 기능적 단백질은 근이영양증에서 결함 유전자 산물에 대한 야생형 대체물을 제공하거나, 근이영양증을 치료하는데 그럼에도 불구하고 효과적인 비-야생형 대체물 (예를 들면, 5-스펙트린-유사 마이크로D5 디스트로핀 미니유전자 산물)을 제공한다.
따라서 일 양태에서, 본 발명은 a) 치료가 필요한 환자 / 대상체 / 개체에서 근이영양증을 치료하는데 효과적인 기능적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드는 3'-UTR 코딩 영역을 포함하고, 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 기능적 단백질의 발현을 향상시키는 이종성 인트론 서열에 즉시 3'이거나, 여기서 기능적 단백질의 상응하는 야생형은 근이영양증에서 결함이거나, 여기서 기능적 단백질은, 야생형이 아니라도, 근이영양증을 치료하는데 그럼에도 불구하고 효과적임; b) 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결되고 이의 발현을 구동시키는 제어 요소 (예를 들면, 근육-특이적 제어 요소); 및 c) 인트론 서열에서 또는 3'-UTR 코딩 영역에서 또는 기능적 단백질을 위한 발현 카셋트에서 다른 곳에 삽입된 하나 이상의 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스성 벡터, 예를 들면, 재조합 렌티바이러스성 또는 AAV (rAAV) 벡터를 제공하고; 여기서 상기 하나 이상의 코딩 서열은 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA), 안티센스 서열, 마이크로RNA (miRNA) 및/또는 miRNA 억제제를 독립적으로 인코딩한다.
관련 양태에서, 본원에서 기재된 본 발명은 효소-기반된 유전자 편집 시스템의 2개 이상의 성분, 예를 들면, 예컨대 표적 게놈성 부위 / 표적 게놈성 서열, 그리고 (야생형 또는 원하는) 표적 게놈 서열을 매칭하는 기증자 또는 템플레이트 서열에 DNA 이중 가닥 절단 (DSB)을 창출할 수 있는 표적 서열-특이적 (조작된) 뉴클레아제를 동시에 전달하기 / 발현하기 위한 바이러스성 벡터로서 또한 사용될 수 있다. 그러한 시스템은 결함 / 원치않는 표적 게놈성 서열을 편집 제거하고, 이것을 원하는 표적 게놈성 자리에 야생형 또는 달리 원하는 서열로 대체하기 위해 표적 세포 내에서 내인성 상동 재조합 (HR) 과정을 활용하는 것을 가능하게 한다.
예를 들어, 표적 서열-특이적 (조작된) 뉴클레아제는 독특한 표적 게놈성 서열을 인식하는 메가뉴클레아제 (예컨대 LAGLIDADG 계열에서의 것들) 및 이의 변이체; 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN); 전사 활성화제-유사 이팩터 뉴클레아제 (TALEN); 및 CRISPR/Cas 유전자 편집 효소를 포함할 수 있다.
CRISPR/Cas의 경우에, 예를 들어, 대상체 벡터는 기증자 서열이 아닌 또는 그에 추가하여 하나 이상의 표적 서열(들)을 표적화하기 위하여 원하는 서열(들)을 갖는 하나 이상의 유전자 편집 가이드 서열(들), 및 GOI로서 바이러스성 벡터에 의해 인코딩될 수 있는 호환성 편집 효소를 동시에 전달할 수 있다. 그러한 바이러스성 전달 시스템은 원하는 서열을 세포, 조직, 또는 유기체에서 발생하는 원치않는 서열로 대체하는데 사용될 수 있다. CRISPR/Cas 효소 시스템의 하나의 예는 표적 세포에 대한 CRISPR/Cas9 또는 CRISPR/Cas12a (이전에 Cpf1), 및 하나 이상의 요구된 가이드 서열 (예를 들면, Cas9를 위한 단일 가이드 RNA 또는 sgRNA, 또는 Cas12a를 위한 crRNA)이다. Cas9는 야생형 Cas9 및 이의 기능적 변이체를 포함한다. 몇몇 Cas9 변이체는 마이크로 디스트로핀 유전자와 거의 동일한 크기이고, 본 발명의 바이러스성 벡터에 의해 인코딩된 기능적 GOI일 수 있다. Cas12a는 Cas9보다 심지어 더 작고 GOI로서 또한 인코딩될 수 있다. 특정 구현예에서, 바이러스성 작제물에 의해 인코딩된 Cas 유전자는 UTR 및/또는 인트론 요소를 가질 수 있거나 아닐 수 있다.
관련 양태에서, 본 발명은 생체외 또는 생체내 유전자 요법에서 사용을 위하여 재조합 렌티바이러스성 벡터를 제공한다. 생체외 유전자 요법에서, 배양된 숙주 세포는 대상체 바이러스성 벡터를 사용하여 시험관내 형질감염되어 관심의　유전자를 발현시키고, 그 다음 신체에 이식된다. 생체내 유전자 요법은 유전적　물질을 표적화된 조직에 삽입하는 직접 방법이고, 형질도입은 환자의 자체 세포 내에서 발생한다. 따라서 본 발명의 렌티바이러스성 벡터는 a) 치료가 필요한 환자 / 대상체 / 개체에서 근이영양증을 치료하는데 효과적인 기능적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드는 3'-UTR 코딩 영역을 포함하고, 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 기능적 단백질의 발현을 향상시키는 이종성 인트론 서열에 즉시 3'이거나, 여기서 기능적 단백질의 상응하는 야생형은 근이영양증에서 결함이거나, 여기서 기능적 단백질은, 야생형이 아니라도, 근이영양증을 치료하는데 그럼에도 불구하고 효과적임; b) 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결되고 이의 발현을 구동시키는 제어 요소 (예를 들면, 근육-특이적 제어 요소); 및 c) 인트론 서열에서 또는 3'-UTR 코딩 영역에서 또는 발현 카셋트에서 다른 곳에 삽입된 하나 이상의 코딩 서열을 포함할 수 있고; 여기서 상기 하나 이상의 코딩 서열은 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA), 안티센스 서열, 마이크로RNA (miRNA), 및/또는 miRNA 억제제를 독립적으로 인코딩한다.
본원에서 사용되는 경우에, 그리고 문맥에 따라, 용어 "융합"은, 융합 단백질, 1개 초과의 인코딩된 서열 (예컨대 GOI를 위한 코딩 서열 및 3-UTR 영역에서 삽입된 / 내장된 하나 이상의 RNAi 제제 등을 위한 코딩 서열 또는 GOI의 인트론 서열이 존재할 수 있는 융합 RNA 전사물, 그리고 바이러스성 벡터가 GOI 및 하나 이상의 RNAi 제제, 등을 위한 코딩 서열을 함유하는 융합 작제물을 포함하는, 상이한 의미를 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 코딩 서열은 3'-UTR 코딩 영역에서, 또는 폴리아데닐화 (polyA) 신호 서열 (예를 들면, AATAAA) 후에 삽입된다.
특정 구현예에서, 기능적 GOI의 발현은 (예를 들면, 삽입된 상기 하나 이상의 코딩 서열 없이 달리 동일한 대조 작제물과 비교해서) 하나 이상의 코딩 서열의 존재로 인해 상향- 또는 하향-조절된다.
특정 구현예에서, 기능적 GOI의 발현은 (예를 들면, 삽입된 상기 하나 이상의 코딩 서열 없이 달리 동일한 대조 작제물과 비교해서) 하나 이상의 코딩 서열의 존재 하에서 실질적으로 영향받지 않는다.
본원에서 사용되는 경우에, "근이영양증 (MD)"은, 건강한 근육을 형성하는데 필요한 야생형 단백질의 생산을 방해하는 비정상 유전자 또는 유전자 돌연변이로 인해, 점진적 쇠약 및 근육량의 상실을 특징으로 하는 질환의 한 그룹을 포함한다. MD는 뒤센 근이영양증 (DMD); 베커 근이영양증 (BMD); 선천성 근이영양증 (CMD), 특히 식별된 유전적 돌연변이를 가진 것, 예컨대 아래에 기재된 것들, 후쿠야마 선천성 근이영양증 (FCMD) 및 메로신-결핍 선천성 근이영양증 유형 1A (MDC1A) 포함; 디스펄린병증 (LGMD2B 및 미요시 근병증); 근긴장성 이영양증; 지대 근이영양증 (LGMD) 예컨대 LGMD2C; 및 안면견갑상완 (FSHD)을 포함한다.
본원에서 사용되는 경우에, "환자", "대상체", 및 "개체"는 대상 방법에서부터 생물학적 샘플을 처리되기, 진단되기, 및/또는 수득하기 위해 포유류 (예를 들면, 인간) 대상체를 포함하도록 호환적으로 사용된다. 전형적으로, 대상체는 DMD 및 본원에서 기재된 기타 관련된 질환, 그리고 일부 구현예에서, DMD 및 연관된 심근증 및 근이영양성 심근증에 영향받거나 영향받을 것 같다. 특정한 구현예에서, 대상체는 인간 아동 또는 청소년 (예를 들면, 18세, 15세, 12세, 10세, 8세, 5세, 3세, 1세, 6 개월, 3 개월, 1 개월 이하 등)이다. 특정한 구현예에서, 아동 또는 청소년은 남성이다. 또 다른 특정한 구현예에서, 대상체는 인간 성인 (예를 들면, ≥18세), 예컨대 남성 성인이다.
전장　디스트로핀　유전자는 2.6 mb이고 79개　엑손을 인코딩한다. 11.5-kb 코딩 서열은 427-kD 단백질로 번역한다. 디스트로핀은, N-말단 도메인, 로드 도메인, 시스테인-풍부 도메인, 및　C-말단 도메인을 포함하는, 4개 주요 도메인으로 분할될 수 있다. 로드 도메인은 24개 스펙트린-유사 반복부 및 4개 힌지로 추가 분할될 수 있다.
기능적 "디스트로핀 미니유전자" 또는 "디스트로핀 미세유전자"는 (아데노바이러스성 및 렌티바이러스성) 유전자 요법 전달 벡터와 호환성인 하나 이상의 힌지 영역/s 및 24개 미만 스펙트린-유사 반복부를 갖고 (본원에서 참고로 모두 편입된) US7001761, US6869777, US8501920, US7892824, US10479821, 및 US10166272에서 기재되어 있다.
일 구현예에서, 근이영양증은 DMD 또는 BMD이고, 재조합 AAV (rAAV) 벡터에서: a) 폴리뉴클레오타이드는 기능적 5-스펙트린-유사 반복부 디스트로핀 단백질 (예컨대 본원에서 참고로 편입된, US10,479,821에서 기재된 바와 같이 마이크로D5 디스트로핀 단백질)을 인코딩하는 디스트로핀 미니유전자이고/거나; b) 근육-특이적 제어 요소는 디스트로핀 미니유전자에 작동가능하게 연결되고 이의 발현을 구동시키는 CK 프로모터이다.
본원에서 사용되는 경우에, "마이크로D5", "SGT-001에 의해 인코딩된 마이크로디스트로핀 미니유전자", 또는 생략하여 "SGT-001"은 N-말단부터 C-말단까지 N-말단 액틴 결합 도메인, 힌지 영역 1 (H1), 스펙트린-유사 반복부 R1, R16, R17, R23, 및 R24, 힌지 영역 4 (H4), 그리고 인간 전장 디스트로핀 단백질의 C-말단 디스트로글리칸 결합 도메인을 함유하는 특이적 조작된 5-반복부 마이크로디스트로핀 단백질을 지칭한다. 이러한 5-반복부 마이크로디스트로핀의 단백질 서열 및 관련된 디스트로핀 미니유전자는 (본원에서 참고로 편입된) US10,479,821 & WO2016/115543에서 기재된다.
특정 구현예에서, 예를 들어, 특이적 스펙트린-유사 반복부, 및/또는 (예를 들면, 바람직하게는 1, 2, 또는 3개 대부분의 N- 및/또는 대부분의 C-말단 반복부를 포함하는, 인간 디스트로핀의 최소 4, 5, 또는 6개 스펙트린-유사 반복부를 포함하는) 스펙트린-유사 반복부의 수에 관하여 마이크로D5와 상이한 기능적 디스트로핀 단백질을 인코딩하는 디스트로핀 미니유전자. 인간 디스트로핀의 하나 이상의 스펙트린-유사 반복부는 우트로핀 또는 스펙트린으로부터 스펙트린-유사 반복부에 의해 또한 치환될 수 있다. 특정 구현예에서, 디스트로핀 미니유전자는 AAV 바이러스성 벡터의 5 kb 미만 패키징 한계, 바람직하게는 4.9 kb, 4.8 kb, 4.6 kb, 4.5 kb, 4.4 kb, 4.3 kb, 4.2 kb, 4.1 kb, 또는 4 kb 미만이다.
특정 구현예에서, 디스트로핀 미니유전자는, 예를 들면, 마이크로D5와 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%, 더욱 전형적으로 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 및 더더욱 전형적으로 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성인 마이크로-디스트로핀 단백질을 인코딩하고, 여기서 단백질은 마이크로-디스트로핀 활동성을 보유한다.
특정 구현예에서, 마이크로-디스트로핀은 마이크로D 마이크로-디스트로핀을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%, 더욱 전형적으로 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 및 더더욱 전형적으로 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된다. 폴리뉴클레오타이드는 포유동물에서, 예컨대 인간에서 발현에 최적화된 임의로 코돈이다.
특정 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 마이크로D5 마이크로-디스트로핀, 또는 이의 보체를 인코딩하는 핵산 서열에 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하고, 기능적 마이크로-디스트로핀 단백질을 인코딩한다.
용어 "엄격한"은 당업계에서 엄격한 것으로 통상 이해되는 조건을 지칭하는데 사용된다. 하이브리드화 엄격성은 온도, 이온성 강도, 및 변성 제제 예컨대 포름아미드의 농도에 의해 주로 결정된다. 하이브리드화 및 세정을 위한 엄격한 조건의 예는 65-68℃에서 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산 나트륨 또는 42℃에서 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산 나트륨, 및 50% 포름아미드이다. Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989) 참고.
더욱 엄격한 조건 (예컨대 더 높은 온도, 더 낮은 이온성 강도, 더 높은 포름아미드, 또는 기타 변성 제제)은 또한 사용될 수 있지만, 하이브리드화의 속도는 영향받을 것이다. 데옥시올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화가 염려되는 경우에, 추가의 예시적 엄격한 하이브리드화 조건은 (14-염기 올리고를 위한) 37℃, (17-염기 올리고를 위한) 48℃, (20-염기 올리고를 위한) 55℃, 및 (23-염기 올리고를 위한) 60℃에 6× SSC 0.05% 피로인산 나트륨에서 세정을 포함한다.
기타 제제는 비-특이적 및/또는 배경 하이브리드화 감소의 목적을 위하여 하이브리드화 및 세정 완충액에서 포함될 수 있다. 기타 적합한 제제가 또한 사용될 수 있어도 예는 0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% 폴리비닐 -피롤리돈, 0.1% 피로인산나트륨, 0.1% 도데실황산나트륨, NaDodS04, (SDS), 피콜, 덴하르트 용액, 초음파 연어 정자 DNA (또는 기타 비-상보적 DNA) 및 덱스트란 설페이트이다. 이들 첨가제의 농도 및 유형은 하이브리드화 조건의 엄격성에 실질적으로 영향 없이 변화될 수 있다. 하이브리드화 실험은 일반적으로 pH 6.8-7.4에서 실시되지만, 전형적 이온성 강도 조건에서 하이브리드화의 속도는 pH에 거의 독립적이다. Anderson 등, Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Ch. 4, IRL Press Limited (Oxford, England) 참고. 하이브리드화 조건은 이들 변수를 수용하고 상이한 서열 관련성의 DNA가 하이브리드를 형성하도록 하기 위해 당업자에 의해 조정될 수 있다.
추가의 디스트로핀 미니유전자 서열은 예를 들어, (본원에서 참고로 편입된) US2017/0368198 및 (본원에서 참고로 편입된) WO 2017/181015의 서열번호: 7에서 발견될 수 있다.
특정 구현예에서, 임의의 디스트로핀 미니유전자 예컨대 마이크로D5를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 개시된 단백질 서열에 기반된 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, 뉴클레오타이드 서열은 인간내 발현을 위하여 최적화된 코돈이다.
마이크로-디스트로핀 단백질은 근육 수축 도중 근육 막에 안정성을 제공하고, 예를 들면, 마이크로-디스트로핀은 근육 수축 도중 충격 흡수제로서 작용한다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 코딩 서열 중 적어도 하나는 DMD에서 이차 캐스케이드 유전자 중 하나를 표적한다.
예를 들어, 특정 구현예에서, 하나 이상의 코딩 서열 중 적어도 하나는 마이크로RNA, 예컨대 miR-1, miR-133a, miR-29 특히 miR29c, miR-30c, 및/또는 miR-206을 인코딩한다. 예를 들어, miR-29c는 결합 조직의 3개 주요 성분 (예를 들면, 콜라겐 1, 콜라겐 3 및 피브로넥틴)을 직접적으로 감소시켜 섬유증을 감소시킨다.
"섬유증"은 본원에서 사용되는 경우에 세포외 기질 (ECM) 성분의 과도하거나 조절되지 않은 침착 그리고 골격 근육, 심장 근육, 간, 폐, 신장, 및 췌장을 포함하는 부상시 조직내 비정상 복구 과정을 지칭한다. 침착되는 ECM 성분은 피브로넥틴 및 콜라겐, 예를 들면, 콜라겐 1, 콜라겐 2 또는 콜라겐 3을 포함한다.
본원에서 사용되는 경우에, "miR-29"는 miR-29a, -29b, 또는 -29c 중 하나를 지칭한다. 특정 구현예에서, miR-29는 miR-29c를 지칭한다.
임의의 특정한 이론에 의해 구속됨의 바램 없이, 발현된 miR29 (예컨대 miR-29a, miR-29b, 또는 miR-29c)가 콜라겐 및 피브로넥틴 유전자의 3' UTR에 결합하여 이들 표적 유전자의 발현을 하향-조절하는 것으로 여겨진다.
또 다른 구현예에서, 하나 이상의 코딩 서열 중 적어도 하나는 RNAi 서열, 예컨대 사르콜리핀 (shSLN)에 대한 shRNA를 인코딩한다. 하나 이상의 코딩 서열은 동일하거나 상이한 사르콜리핀 (shSLN)에 대한 shRNA를 인코딩할 수 있다. 특정 구현예에서, shRNA는 사르콜리핀 mRNA 및/또는 사르콜리핀 단백질 발현을 적어도 약 50%만큼 감소시킨다.
본원에서 사용되는 경우에, "사르콜리핀 (SLN)", "사르콜리핀 단백질", "SLN 단백질", "사르콜리핀 폴리펩타이드" 및 "SLN 폴리펩타이드"는 SLN 유전자의 발현 산물, 예컨대 (MGINTRELFLNFTIVLITVILMWLLVRSYGY) (서열번호: 1), 기탁 번호 NP_003054.1의 아미노산 서열을 갖는 천연 인간 SLN 단백질을 포함하기 위해 호환적으로 사용된다. 상기 용어는 바람직하게는 인간 SLN을 지칭한다. 상기 용어는 1개 아미노산, 2개 아미노산, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산, 또는 8개 아미노산만큼 서열번호: 1과 상이한 변이체 SLN 단백질을 지칭하는데 또한 사용될 수 있고, 임의로 그 차이는 잔기 2-5, 10, 14, 17, 20, 및 30, 바람직하게는 2-5 및 30 내이다. 상기 용어는 잔기 6-29에서 서열번호: 1과 동일하거나, 최대 1, 2, 또는 3개 보존적 치환 예컨대 L→I 및/또는 I→V만큼 잔기 6-29에서 상이한 변이체 SLN 단백질을 지칭하는데 또한 사용될 수 있다. 임의로, 변이체 SLN은 G30Q 치환을 갖는다. 변이체는 천연 SLN 단백질의 기능적 활동성을 표시하고, 이는 SLN의 인산화, 탈인산화, 니트로실화 및/또는 유비퀴틴화, 또는 SERCA에의 결합을 포함할 수 있고/거나, 예를 들어, ATP 가수분해, 또는 에너지 대사 및 체중 증가의 조절에서 이의 역할로부터 Ca2+ 수송의 언커플링을 통해서 근육 내형질 세망 속에 SERCA에 의한 칼슘 유입의 속도를 감소시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 경우에, "SLN 유전자", "SLN 폴리뉴클레오타이드", 및 "SLN 핵산"은 천연 인간 SLN-인코딩 핵산 서열, 예를 들면, 천연 인간 SLN 유전자 (RefSeq 기탁: NM_003063.2), SLN cDNA가 전사될 수 있는 서열을 갖는 핵산; 및/또는 전술한 것의 대립유전자성 변이체 및 동족체, 예컨대 본원에서 기재된 임의의 변이체 SLN을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하기 위해 호환적으로 사용된다. 상기 용어는 이중-스트란드 DNA, 단일-스트란드 DNA, 및 RNA를 포괄한다.
또 다른 구현예에서, 대상체 벡터의 하나 이상의 추가의 코딩 서열은 디스트로핀 유전자의 상실에서 비롯하는 이차 캐스케이드 사건 중 하나와 연관된 임의의 기타 유전자, 예컨대 염증성 유전자, NF-κB 신호전달 경로의 활성화제 (예를 들면, TNF-α, IL-1, IL-1β, IL-6, NF-κB의 수용체 활성화제 (RANK), 및 톨-유사 수용체 (TLR)), NF-κB, NF-κB에 의해 유도된 다운스트림 염증성 사이토카인, 히스톤 데아세틸라제 (예를 들면, HDAC2), TGF-β, 결합 조직 성장 인자 (CTGF), 올라겐, 엘라스틴, 세포외 기질의 구조적 성분, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 (G6PD), 마이오스타틴, 포스포디에스테라제-5 (PED-5) 또는 ACE, VEGF 디코이-수용체 유형 1 (VEGFR-1 또는 Flt-1), 및 조혈 프로스타글란딘 D 신타제 (HPGDS) 표적화 중일 수 있다. 하나 이상의 추가의 코딩 서열은 상기 표적 유전자의 기능을 길항하는 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA), 안티센스 서열, 및/또는 마이크로RNA일 수 있다.
대상체 재조합 벡터의 설계는 하나 이상 (예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5개) 그러한 이차 캐스케이드 유전자 또는 경로, 예컨대 SLN, 마이크로RNA, 등을 동시에 표적할 수 있다.
예를 들어, 특정 구현예에서, 대상체 벡터의 추가의 코딩 서열 중 하나는 SLN 발현을 하향-조절하도록 설계된 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA) 또는 안티센스 서열일 수 있고, 그러므로 SERCA에 의한 칼슘의 재흡수를 증가시킴으로써 이영양증 근육내 세포내 Ca2+의 비정상 상승의 이차 결점을 적어도 부분적으로 완화시킨다.
특정 대안적 구현예에서, 이차 캐스케이드 유전자 중 하나의 표적화 대신 또는 이 밖에도, 하나 이상의 코딩 서열 중 적어도 하나는 결함 내인성 디스트로핀의 엑손, 예컨대 디스트로핀의 엑손 45-55 중 어느 하나, 또는 디스트로핀의 엑손 44, 45, 51, 및/또는 53의 스키핑을 유도하고, 따라서 디스트로핀 미니유전자 (예를 들면, 마이크로D5)의 치료적 효과를 추가로 향상시키는 엑손-스키핑 안티센스 서열일 수 있다.
본원에서 사용되는 경우에, "엑손 스키핑" 또는 "스플라이스-스위칭" 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (AON)는 RNase-H-저항성인 안티센스 서열의 한 유형이고, 사전-mRNA 스플라이싱을 조정하고 사전-mRNA에서 스플라이싱 결점을 수정하는 역할을 한다. 안티센스-매개된 엑손 스키핑 요법에서, AON은 특이적 스플라이싱 신호를 차단하고 특정 엑손의 특이적 스키핑을 유도하는데 일반적으로 사용된다. 이것은 돌연변이된 전사물의 판독 프레임의 수정을 초래하여서, 내부적으로 결실되지만 부분적으로 기능적 단백질로 번역될 수 있다.
특이적 양태에서, 본 발명은 디스트로핀 미니유전자 코딩 서열 (예컨대 마이크로D5 / SGT-001), 및 디스트로핀 기능의 상실에서 비롯하는 이차 캐스케이드에서 관여된 하나 이상의 추가의 표적 유전자 표적화를 위한 하나 이상의 추가의 서열 둘 모두를 인코딩하는 재조합 AAV (rAAV) 벡터를 제공한다. 그러한 작제물은 양쪽 디스트로핀 미니유전자, 그리고 디스트로핀 미니유전자에 대한 이종성 인트론 5' 속에, 및/또는 디스트로핀 미니유전자의 3'-UTR 영역 속에 삽입된 하나 이상의 추가의 코딩 서열을 포함한다.
구체적으로, 일 양태에서, 본 발명은 a) 기능적 마이크로-디스트로핀 단백질을 인코딩하는 디스트로핀 미니유전자, 여기서 상기 디스트로핀 미니유전자는 3'-UTR 코딩 영역을 포함하고, 디스트로핀 미니유전자의 발현을 향상시키는 이종성 인트론 서열 바로 옆의 3'임; b) 디스트로핀 미니유전자에 작동가능하게 연결되고 이의 발현을 구동시키는 근육-특이적 제어 요소; 및, c) 인트론 서열에서 또는 3'-UTR 코딩 영역에서 삽입된 하나 이상 (예를 들면, 1, 2, 3, 4, 또는 5개) 코딩 서열(들)을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 벡터를 제공하고; 여기서 상기 하나 이상의 코딩 서열(들)은 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA), 안티센스 서열, 마이크로RNA (miRNA), 및/또는 miRNA 억제제를 독립적으로 인코딩한다.
예를 들어, rAAV 벡터는 miR-29 를 발현시키는 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들면, miR-29c), 예컨대 miR-29c 표적 가이드 스트란드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열 (ACCGATTTCAAATGGTGCTAGA, WO2017/181015의 또는, 본원에서 참고로 편입된 서열번호: 3), miR-29c 가이드 스트란드 (TCTAGCACCATTTGAAATCGGTTA, 본원에서 참고로 편입된, WO2017/181015의 서열번호: 4) 그리고 천연 miR-30 백 본 및 줄기 루프 (GTGAAGCCACAGATG, 본원에서 참고로 편입된, WO2017/181015의 서열번호: 5)를 포함할 수 있다.
miR-30 백본에서 miR-29c cDNA를 포함하는 예시적 폴리뉴클레오타이드 서열은 (본원에서 참고로 편입된) WO2017/181015의 서열번호: 2 및 도 1로서 제시된다.
특정 구현예에서, 마이크로RNA-29 코딩 서열은 miR-29c를 인코딩한다.
특정 구현예에서, miR-29c는 임의로 표적 서열을 위하여 설계된 miR-29c의 가이드 스트란드의 가공을 향상시키는 변형된 측접 백본 서열을 갖는다. 예를 들어, 변형된 측접 백본 서열은 miR-30 (miR-30E), -101, -155, 또는 -451 유래일 수 있거나 이의 서열에 기반될 수 있다.
특정 구현예에서, 마이크로RNA는 miR-1, miR-133a, miR-30c, 및/또는 miR-206이다.
특정 구현예에서, 숙주 세포에서 상기 마이크로RNA의 발현은 상기 숙주 세포에서 상기 마이크로RNA의 내인성 발현과 비교하여 적어도 약 1.5-15 배 (예를 들면, 약 2-10 배, 약 1.4-2.8 배, 약 2-5 배, 약 5-10 배, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 약 15 배)만큼 상향-조절된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 벡터는, 사르콜리핀 (SLN)의 기능을 길항시키는 안티센스 서열 또는 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA 등)을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 벡터는 사르콜리핀 (shSLN)의 기능을 길항시키는 shRNA를 인코딩한다. 예시적 shSLN 서열은 도 9 및 10에서 개시된 것들 (예를 들면, 도 9에서 밑줄친 서열, 및 도 10에서 강조된 서열)을 포함한다. 추가의 예시적 shSLN 서열은 (본원에서 참고로 편입된) WO2018/136880에서 개시된 서열번호: 7-11을 포함한다.
본 발명은 또한 부분적으로 유전자 요법 벡터, 예를 들면, 하나 이상의 코딩 서열(들)을 발현시키는 렌티바이러스성 또는 AAV, 및 디스트로핀 미니유전자, 뿐만 아니라 동종을 근육에 전달하여 디스트로핀 기능을 복원하면서 이차 캐스케이드 증상을 감소시키고/거나 예방하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 근이영양증은 공지된 유전적 결점, 예컨대 푸쿠틴 유전자 또는 FKRP (푸쿠틴 관련된 단백질) 유전자와 연관된 선천성 근이영양증 (CMD)이다. 따라서 특정 구현예에서, 선천성 근이영양증은 후쿠야마 선천성 근이영양증 (FCMD)이다.
선천성 근이영양증 (CMD)은 출생시 또는 출생 근처에 나타나는 근이영양증의 한 그룹이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법 및 rAAV는 CMD, 특히 유전자 예컨대 티틴 (심근증이 있는 CMD); SEPN1 (데스민 내포물이 있는 CMD, 또는 (초기) 척추 강직성이 있는 CMD); 인테그린-알파 7 (인테그린 알파 7 돌연변이가 있는 CMD); 인테그린-알파 9 (관절 과잉이완이 있는 CMD); 플렉틴 (가족성 연접부 수포성 표피박리증이 있는 CMD); 푸쿠틴 (후쿠야마 CMD 또는 MDDGA4); 푸쿠틴-관련된 단백질 (FKRP) (근육 비대 또는 MDC1C가 있는 CMD); LARGE (MDC1D); DOK7 (근무력 증후군이 있는 CMD); 라민 A/C (척추 강직성 및 라민 A/C 비정상이 있는 CMD); SBP2 (척추 강직성 및 셀렌단백질 결핍이 있는 CMD); 콜린 키나제 베타 (미토콘드리아의 구조적 비정상이 있는 CMD); 라미닌 알파 2 (메로신-결핍 CMD 또는 MDC1A); POMGnT1 (산타부오리 근육-눈-뇌 질환); COLGA1, COL6A2, 또는 COL6A3 (Ullrich CMD); B3GNT1 (워커-워버그 증후군: MDDGA 유형); POMT1 (워커-워버그 증후군: MDDGA1 유형); POMT2 (워커-워버그 증후군: MDDGA2 유형); ISPD (MDDGA3, MDDGA4, MDDGB5, MDDGA6, 및 MDDGA7); GTDC2 (MDDGA8); TMEM5 (MDDGA10); B3GALNT2 (MDDGA11); 또는 SGK196 (MDDGA12)에서 공지된 유전적 결점을 가진 CMD을 치료하는데 사용될 수 있다.
따라서 본 발명의 렌티바이러스성 또는 rAAV 벡터는 치료가 필요한 대상체에서 CMD를 치료하기 위해 CMD (예컨대 상기 본원에서 열거된 것들), 또는 이의 기능적 등가물에서 결함인 야생형 유전자 중 어느 하나를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 추가의 코딩 서열은 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA), 안티센스 서열, 또는 돌연변이체 CMD 유전자, 또는 야생형 유전자 기능의 상실로 인해 상향-조절된 이차 캐스케이드 유전자를 제거하거나 변형시키는 마이크로RNA (miRNA)를 인코딩할 수 있다.
예를 들어, 후쿠야마 선천성 근이영양증 (FCMD)은 돌연변이체 FKTN 유전자에 기인되고, 하나 이상의 추가의 코딩 서열은 엑손-스키핑 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 인코딩하여 환자의 결함 FKTN 유전자에서 정확한 엑손 10 스플라이싱을 복원할 수 있다.
또 다른 예에서, 선천성 근이영양증은 65-엑손 LAMA2 유전자에서 돌연변이에 의해 야기된 메로신-결핍 선천성 근이영양증 유형 1A (MDC1A)이다.
따라서 본 발명의 렌티바이러스성 또는 rAAV 벡터는 기능적 LAMA2 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 추가의 코딩 서열은 α-디스트로글리칸과의 상호작용 매개에 가장 중요한 C-말단 G-도메인 (엑손 45-64), 특히 LAMA2의 G4 및 G5의 복원된 발현을 초래하는 엑손-스키핑 안티센스 서열을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 LAMA2 유전자의 엑손 4는 MDC1A를 치료하기 위해 스키핑될 수 있다.
일 구현예에서, 근이영양증은 근긴장성 이영양증 (DM), 예컨대 DM1 또는 DM2이다.
따라서 본 발명의 렌티바이러스성 또는 rAAV 벡터는 DM1에서 결함인 기능적 근긴장성 이영양증 단백질 키나제 (DMPK) 단백질, 또는 DM2에서 핵산 결합 단백질 유전자 (CNBP) 단백질인, 기능적 CCHC-유형 징크 핑거를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 추가의 코딩 서열은 RNase-매개된 분해를 위하여 DMPK 유전자 또는 CNBP 유전자에서 돌연변이체 전사물의 확장된 반복부를 표적하는데 사용될 수 있는 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA), 안티센스 서열, 또는 마이크로RNA (miRNA)를 인코딩할 수 있다. 하나 이상의 추가의 코딩 서열은 DM1 환자의 CLCN1 유전자에서 엑손 7A의 스키핑을 초래하는 엑손-스키핑 안티센스 서열을 또한 인코딩할 수 있다.
일 구현예에서, 근이영양증은, 지대 근이영양증 유형 2B (LGMD2B) 및 미요시 근병증 (MM)을 포함하는, 디스펄린 (DYSF) 유전자에서 돌연변이에 의해 야기된 디스펄린병증이다.
따라서 본 발명의 렌티바이러스성 또는 rAAV 벡터는 LGMD2B 또는 MM에서 결함인 기능적 DYSF 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 추가의 코딩 서열은 디스펄린병증 환자의 결함 DYSF 유전자에서 엑손 32의 스키핑을 초래하는 엑손-스키핑 안티센스 서열을 인코딩할 수 있다.
일 구현예에서, 근이영양증은 4개 사르코글리칸 유전자, 즉 α (LGMD2D), β (LGMD2E), γ (LGMD2C) 및 δ (LGMD2F) 유전자 중 어느 하나, 특히 SGCG 유전자에 의해 인코딩된 γ 사르코글리칸 (LGMD2C)에서 돌연변이에 의해 야기된 지대 근이영양증 (LGMD)이다.
따라서 본 발명의 렌티바이러스성 또는 rAAV 벡터는 LGMD에서 결함인 기능적 사르코글리칸 단백질, 예컨대 LGMD2C에서 결함인 SGCG 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 추가의 코딩 서열은 결함 LGMD2C 유전자, 예컨대 △-521T SGCG 돌연변이가 있는 유전자에서 엑손 4-7의 스키핑을 초래하는 엑손-스키핑 안티센스 서열을 인코딩할 수 있다.
일 구현예에서, 근이영양증은 DUX4 유전자에서 돌연변이에 의해 야기된 안면견갑상완 근이영양증 (FSHD)이다.
따라서 하나 이상의 추가의 코딩 서열은 DUX4 또는 다운스트림 표적 예컨대 PITX1의 발현을 감소시키는 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA), 안티센스 서열, 또는 마이크로RNA (miRNA)를 인코딩할 수 있다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 추가의 코딩 서열은 DUX4의 3'-UTR을 표적하는 엑손 스키핑 안티센스 서열을 인코딩하여 이의 발현을 감소시킨다. 이것은 DUX4 코딩 서열이 유전자 제 1 엑손에서 전적으로 자리하기 때문이고, mRNA 3' UTR에서 요소를 표적하는 엑손 스키핑은 묵인된 폴리아데닐화를 붕괴시킬 수 있거나 인트론 1 또는 2 스플라이싱을 방해할 수 있으므로, 기능적 DUX4 mRNA를 파괴시킨다.
안면견갑상완 근이영양증 (FSHD)은 진행성 근육 퇴화에 의해 임상적으로 특성규명된 유전되는 상염색체 우성 장애이다. 뒤센 근이영양증 (DMD) 및 근긴장성 이영양증 다음으로 세번째 가장 흔한 근이영양증이다. FSHD는 염색체 4에서 거대부수체 반복부의 서브세트의 병인성 수축에 의해 유전적으로 특성규명되어, 이중 호메오박스 단백질 4 (DUX4) 유전자의 비정상적인 발현을 초래한다.
2개 유형의 FSHD: FSHD1 및 FSHD2가 있다. FSHD1은 모든 FSHD 환자의 95% 이상에서 발생하는 가장 흔한 형태이다. 유전적 분석은 염색체 4에서 거대부수체 D4Z4 반복부 어레이의 유전적 수축에 FSHD 1을 연결시킨다. FSHD2는, 다른 한편으로, D4Z4 반복부의 정상 수를 갖지만 대신, 크로마틴 변형제인, 염색체 18p상의 SMCHD1 유전자에서 이형접합성 돌연변이를 관여시킨다. FSHD1 및 FSHD2를 가진 환자는 비슷한 임상 표시를 공유한다.
현행 약물 요법은 FSHD를 치유하지 않지만, 마이오스타틴 억제제 루스파터셉트 및 항-염증성 생물제제 (ATYR1940)를 포함하는, FSHD 증상의 관리에 중점을 둔다. 항-염증성 생물제제에 대하여 근본은 표현형 진행을 둔화시키기 위해 FSHD 환자의 근육 병리에서 흔히 보여진 염증을 억압하는 것이다. 따라서 대상체 하나 이상의 코딩 서열은 마이오스타틴 또는 염증성 경로 유전자에 대해 RNAi 시약 또는 안티센스 RNA를 인코딩할 수 있다. 한편으로, RNAi 시약 예컨대 작은 간섭 RNA (siRNA) 및 작은 헤어핀 RNA (shRNA), 또는 마이크로RNA (miRNA), 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 짝짓기된-유사 호메오도메인 전사 인자 1 (PITX1)을 포함하는 근병증성 DUX4 유전자 및 이의 다운스트림 분자의 발현을 녹다운시키는데 사용될 수 있다. 실제로, 시험관내 연구는 FSHD 환자의 일차 골격 근육 세포에 안티센스 올리고를 투여함으로써, 그리고 AAV 벡터를 사용하여 DUX4 마우스 모델에 전달된 DUX4에 대해 miRNA를 사용함으로써 DUX4 mRNA 발현의 억압에서 성공을 증명하였다. 이 밖에도, PITX1 발현의 억압에서 성공은 생체내 전신적으로 이미 증명되었다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 추가의 코딩 서열은 동일한 서열 (예를 들면, siRNA, shRNA, miRNA, 또는 안티센스)를 인코딩할 수 있고, 따라서 추가의 코딩 서열의 카피 수는 용량화 고려를 위하여 조절될 수 있거나 미세 튜닝될 수 있다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 추가의 코딩 서열은 상이한 서열을 인코딩하여, 상이한 표적을 표적할 수 있거나, 동일한 표적을 표적할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 1개 추가의 코딩 서열은 표적에 대해 안티센스이고, 반면에 또 다른 추가의 코딩 서열은 동일한 표적에 대해 shRNA이다. 대안적으로, 2개 추가의 코딩 서열은 모두 shRNA이지만 이들은 동일한 표적의 상이한 영역을 표적한다.
특정 구현예에서, 기능적 단백질, 예컨대 디스트로핀 미니유전자 산물의 발현은 하나 이상의 코딩 서열(들)의 삽입에 의해 부정적으로 영향받지 않는다.
1990년대 초까지, 많은 인트론없는 이식유전자가 시험관내 조직 배양 세포에서 완벽하게 발현하는 동안, 생체내 (예를 들면, 이식유전자를 보유하는 이식유전자성 마우스내) 동일한 이식유전자를 발현시키지 못하는 한편, 이식유전자의 (인트론없는) 코딩 서열과 프로모터 사이 특정 이종성 인트론 서열 삽입이 생체내 이식유전자 발현을 크게 향상시키는 것으로 밝혀졌다.
특히, Palmiter 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:478-482, 1991, 본원에서 참고로 편입됨)은 메탈로티오네인 프로모터와 성장 호르몬 이식유전자 사이에 삽입된 몇몇 이종성 인트론이 이식유전자 발현을 개선한다는 것을 보여주었고, 이식유전자 발현을 개선하기 위하여 일반 전략으로서 특정 이종성 인트론의 첨가를 제공하였다. 이들은 rGH의 천연 제 1 인트론, 랫트 인슐인 II (rIns-II) 유전자의 인트론 A, hβG 유전자의 인트론 B, 및 SV40 작은 t 인트론으로부터 선택된 이종성 인트론을 포함한다.
유사한 발견은 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT)를 위하여 박테리아성 유전자에 연결된 인간 히스톤 H4 프로모터를 운반하는 이식유전자성 마우스에서, 전사 단위로 230-bp 이종성 하이브리드 인트론의 존재가 (개입하는 서열에 대하여 정밀하게 결실된 동종성 이식유전자와 비교하여, 5-배 내지 300-배 만큼) CAT 활동성을 크게 향상시켰다는 것을 보고한, Choi 등 (Mol. Cell. Biol. 11(6):3070-3074, 1991, 본원에서 참고로 편입됨)에 의해 확인되었다. 아데노바이러스 스플라이스 도너 및 면역글로불린 G 스플라이스 억셉터로 이루어지는, 이러한 하이브리드 인트론은 동물내 광범위의 조직에서 발현을 자극시켰다. 하이브리드 인트론이 조직 배양물내 인자 VIII 및 조직 플라스미노겐 활성화제의 발현을 자극하였기 때문에, Choi는 마우스에서 보여진 향상이 CAT에 특이적이지 않을 것 같고 대신 이식유전자성 마우스내 임의의 cDNA의 발현에 일반적으로 적용가능한 것으로 결론내었다.
따라서 특정 구현예에서, 대상체 렌티바이러스성 또는 rAAV 벡터에서 이종성 인트론은 rGH의 천연 제 1 인트론, 랫트 인슐린 II (rIns-II) 유전자의 인트론 A, hβG 유전자의 인트론 B, SV40 작은 t 인트론, 및 Choi의 하이브리드 인트론으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 이종성 인트론 서열은 서열번호: 1이다:
Figure pct00001
특정 구현예에서, 하나 이상의 추가의 코딩 서열은 이종성 인트론 서열 (서열번호: 1)에 모두 삽입되거나, 3'-UTR 영역에 모두 삽입되거나, 양쪽 영역에 삽입된다. 예를 들어, 마이크로RNA-29c 코딩 서열은 서열번호: 2에서 처럼 인트론 코딩 서열에 삽입될 수 있다
Figure pct00002
서열번호: 2에서 miR-29c 서열은
Figure pct00003
특정 구현예에서, 렌티바이러스성 또는 rAAV는 폴리뉴클레오타이드 (예컨대 디스트로핀 미니유전자)를 측접하는 2개 렌티바이러스성 또는 AAV LTR/ITR 서열 그리고 추가의 코딩 서열(들)을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 렌티바이러스성 또는 rAAV 벡터는 근육-특이적 제어 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 근육-특이적 제어 요소는 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 근세포-특이적 인핸서 결합 인자 MEF, 근육 크레아틴 키나제 (MCK), tMCK (절단된 MCK), 미오신 중쇄 (MHC), C5-12 (합성 프로모터), 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서 요소, 골격 속근 트로포닌 C 유전자 요소, 지근 심장 트로포닌 C 유전자 요소, 지근 트로포닌 I 유전자 요소, 하이포지아-유도성 핵 인자, 스테로이드-유도성 요소, 또는 글루코코르티코이드 반응 요소 (GRE)일 수 있다.
특정 구현예에서, 근육-특이적 제어 요소는, 번역 정지 코돈 (예컨대 TAG), polyA 아데닐화 신호 (예컨대 AATAAA), 및 mRNA 절단 부위 (예컨대 CA)를 포함하는 3'-UTR 영역을 포함하는, 디스트로핀 미니유전자에 5'인, 이종성 인트론 서열에 5'이다.
특정 구현예에서, 근육-특이적 제어 요소는 WO2017/181015의 서열번호: 10 또는 서열번호: 11의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
WO2017/181015의 서열번호: 10:
Figure pct00004
WO2017/181015의 서열번호: 11:
Figure pct00005
특정 구현예에서, 본 발명의 rAAV 벡터는 MCK 인핸서 뉴클레오타이드 서열 (본원에서 참고로 편입된, WO2017/181015의 서열번호: 10 참고) 및/또는 MCK 프로모터 서열 (본원에서 참고로 편입된, WO2017/181015의 서열번호: 11 참고)을 포함하는 근육-특이적 제어 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다.
특정 구현예에서, rAAV는 디스트로핀 미니유전자 및 추가의 코딩 서열에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 추가로 포함하고 이의 전사를 구동시킬 수 있다.
예시적 프로모터는 CMV 프로모터이다.
특정 구현예에서, rAAV는 polyA 서열을 전사된 mRNA에 삽입하기 위하여 poly-A 아데닐화 서열을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 rAAV 벡터는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAVrh.74, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 또는 AAV13의 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는, 임의의 바이러스성 벡터, 예를 들면, 본 발명의 rAAV 벡터로 형질감염된 세포를 배양시키는 단계 및 바이러스, 예를 들면, rAAV 입자를 형질감염된 세포의 상청액으로부터 회수하는 단계를 포함하는, 바이러스성 벡터, 예를 들면, 본 발명의 rAAV 벡터의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 임의의 바이러스성 벡터, 예를 들면, 본 발명의 재조합 AAV 벡터를 포함하는 바이러스성 입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 숙주 세포에서 코딩 서열 산물 (예를 들면, RNAi, siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스, 마이크로RNA 또는 이의 억제제) 및 본 발명의 기능적 단백질 (예를 들면, 마이크로-디스트로핀)을 공-발현시키는 대상체 재조합 AAV 벡터로 숙주 세포를 감염시키는 단계를 포함하는, 근이영양증에서 결함인, 또는 근이영양증을 치료하는데 효과적인 기능적 단백질 (예컨대 마이크로-디스트로핀 단백질), 및 하나 이상의 추가의 코딩 서열(들)의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 치료가 필요한 대상체에서 근이영양증 (예컨대 DMD 또는 BMD) 또는 디스트로핀병증의 치료 방법으로서, 치료적으로 유효량의 바이러스성 벡터, 예를 들면, 본 발명의 재조합 AAV 벡터, 또는 본 발명의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 바람직하게는 하나 이상의 이차 캐스케이드 증상 예컨대 섬유증이 대상체에서 관찰되기 전에, 또는 근력이 대상체에서 감소되기 전에, 또는 근육량이 대상체에서 감소되기 전에, 디스트로핀병증 또는 근이영양증, 예컨대 DMD 또는 BMD 또는 임의의 기타 MD, 특히 결함 디스트로핀-연관 근이영양증으로 진단된 환자에게 임의의 바이러스성 벡터, 예를 들면, 본 발명의 AAV 벡터를 투여하는 단계를 고려한다.
본 발명은 또한, 이들 대상체에서 추가 질환 진행을 예방 또는 저속화하기 위해, 하나 이상의 이차 캐스케이드 증상 예컨대 섬유증이 이미 발병된, 디스트로핀병증 또는 근이영양증, 예컨대 DMD 또는 BMD 또는 임의의 기타 MD, 특히 디스트로핀-연관 근이영양증을 앓고 있는 대상체에게 임의의 바이러스성 벡터, 예를 들면, 본 발명의 rAAV를 투여하는 단계를 고려한다.
본 발명의 또 다른 양태는 근이영양증에서 결함인, 또는 근이영양증을 치료하는데 효과적인 기능적 단백질 (예를 들면, 마이크로-디스트로핀 단백질)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 하나 이상의 추가의 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스성 벡터, 예를 들면, AAV 벡터를 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 기능적 마이크로-디스트로핀 단백질 예컨대 마이크로D5를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 rAAV를 제공한다.
바이러스성 벡터, 예를 들면, rAAV 벡터는 근육-특이적 프로모터, 예컨대 MCK 프로모터, 디스트로핀 유전자의 발현을 향상시키는데 효과적인 이종성 인트론 서열, 마이크로-디스트로핀 유전자를 위한 코딩 서열, polyA 아데닐화 신호 서열, 이들 서열을 측접하는 ITR/LTR 반복부를 포함할 수 있다. 바이러스성 벡터, 예를 들면, rAAV 벡터는 암피실린 내성 및 플라스미드 백본 서열 또는 박테리아 숙주에서 증폭을 위한 pBR322 기원 또는 복제를 임의로 추가로 포함할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 재조합 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAVrh.74, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11 , AAV 12 또는 AAV 13이다.
본 발명의 임의의 방법에서, rAAV 벡터는 근육내 주사 또는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 임의의 방법에서, 바이러스성 벡터, 예를 들면, rAAV 벡터 또는 조성물은 전신으로 투여된다. 예로, 바이러스성 벡터, 예를 들면, rAAV 벡터 또는 조성물은 주사, 주입 또는 이식에 의해 비경구로 투여된다.
본 발명의 또 다른 양태는, 임의의 바이러스성 벡터, 예를 들면, 본 발명의 rAAV 벡터를 포함하는, 조성물, 예컨대 약학적 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 조성물은, 치료적으로 호환성 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있는, 약학적 조성물이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 디스트로핀병증 또는 근이영양증, 예컨대 DMD 또는 베커 근이영양증을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위하여 대상체 기능적 단백질 (예를 들면, 마이크로-디스트로핀) 및 상기 하나 이상의 추가의 코딩 서열을 공-발현시키는 임의의 바이러스성 벡터, 예를 들면, rAAV 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물 (예를 들면, 약학적 조성물)은 근육내 주사 또는 정맥내 주사를 위하여 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 전신 투여, 예컨대 주사, 주입 또는 이식에 의한 비경구 투여를 위하여 또한 제형화될 수 있다. 이 밖에도, 임의의 조성물은 디스트로핀병증 또는 근이영양증, 예컨대 DMD, 베커 근이영양증 또는 임의의 기타 디스트로핀 연관된 근이영양증을 앓고 있는 대상체에게 투여를 위하여 제형화된다.
추가 구현예에서, 본 발명은 디스트로핀병증 또는 근이영양증, 예컨대 DMD, 베커 근이영양증 또는 임의의 기타 디스트로핀 연관된 근이영양증을 앓고 있는 대상체를 감소시키기 위한 약제의 제조를 위하여 대상체 기능적 단백질 (예를 들면, 마이크로-디스트로핀) 및 상기 하나 이상의 추가의 코딩 서열을 공-발현시키는 임의의 바이러스성 벡터, 예를 들면, 본 발명의 rAAV 벡터의 용도를 제공한다.
본 발명은 하나 이상의 이차 캐스케이드 증상 예컨대 섬유증이 대상체에서 관찰되기 전에 DMD로 진단된 환자에게 투여를 위한 약제의 제조를 위하여 임의의 바이러스성 벡터, 예를 들면, 본 발명의 AAV 벡터의 용도를 고려한다.
본 발명은 또한, 이들 대상체에서 질환 진행을 예방 또는 지연시키기 위해, 이차 캐스케이드 증상 예컨대 섬유증이 이미 발병된 근이영양증을 앓고 있는 대상체에게 임의의 바이러스성 벡터, 예를 들면, 본 발명의 rAAV를 투여하기 위한 약제의 제조를 위하여 임의의 바이러스성 벡터, 예를 들면, 본 발명의 AAV 벡터의 용도를 고려한다.
본 발명은 또한 근이영양증, 예컨대 DMD / BMD의 치료를 위한 약제의 제조를 위하여 대상체 기능적 단백질 예컨대 마이크로-디스트로핀, 및 상기 하나 이상의 추가의 코딩 서열을 공-발현시키는 바이러스성 벡터, 예를 들면, 본 발명의 rAAV 벡터의 용도를 제공한다.
본 발명의 임의의 용도에서, 약제는 근육내 주사를 위하여 제형화될 수 있다. 이 밖에도, 임의의 약제는 근이영양증 예컨대 DMD 또는 임의의 기타 디스트로핀 연관된 근이영양증을 앓고 있는 대상체에게 투여를 위하여 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 근이영양증 환자에서 대상체 기능적 단백질 (예를 들면, 마이크로-디스트로핀) 및 상기 하나 이상의 추가의 코딩 서열을 공-발현시키는 유전자 요법 벡터, 예를 들면, rAAV 벡터를 제공한다.
본원에서 기재된 본 발명의 어느 하나의 구현예가, 실시예에서만 기재되거나 상기나 하기 섹션들 중 하나에서 단지 기재된 그들 구현예를 포함하는, 본 발명의 임의의 하나 이상의 추가의 구현예, 또는 본 발명의 하나의 양태와 조합될 수 있음이 이해되어야 한다.
AAV
본원에서 사용되는 경우에, 용어 "AAV"는 아데노-연관 바이러스에 대한 표준 약어이다. 아데노-연관 바이러스는 특정 기능이 공-감염 헬퍼 바이러스에 의해 제공되는 세포에서만 성장하는 단일-스트란드 DNA 파보바이러스이다. 특성규명된 AAV의 적어도 13개 혈청형이 있다. AAV의 일반 정보 및 검토는, 예를 들어, Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169-228, and Berns, 1990, Virology, pp. 1743- 1764, Raven Press, (New York) (본원에서 참고로 편입됨)에서 찾아질 수 있다. 하지만, 다양한 혈청형이 양쪽 구조적으로 및 기능적으로, 심지어 유전적 수준에서 상당히 밀접하게 관련되는 것이 널리 공지되기 때문에 이들 동일한 원칙이 추가의 AAV 혈청형에 적용가능할 것이 충분히 예상된다. 예를 들어, Blacklowe, 1988, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; 및 Rose, Comprehensive Virology 3: 1-61 (1974) 참고. 예를 들어, 모든 AAV 혈청형은 상동 rep 유전자에 의해 매개된 매우 비슷한 복제 속성을 분명히 나타내고; 모두는 3개 관련된 캡시드 단백질 예컨대 AAV2에서 발현된 것들을 보유한다. 관련성의 정도는 게놈의 길이를 따라 혈청형 사이 방대한 교차-하이브리드화를 표시하는 이형이중나선 분석; 그리고 "역 말단 반복부 서열" (ITR)에 상응하는 말단에서 유사한 자가-어닐링 세그먼트의 존재에 의해 추가로 시사된다. 비슷한 감염력 패턴은 또한 각 혈청형에서의 복제 기능이 비슷한 조절 제어 하에 있음을 시사한다.
"AAV 벡터"는 본원에서 사용되는 경우에 AAV 말단 반복부 서열 (ITR)에 의해 측접되는 관심의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 (또는 이식유전자)를 포함하는 벡터를 지칭한다. 그러한 AAV 벡터는 rep 및 cap 유전자 산물을 인코딩하고 발현시키는 벡터로 형질감염된 숙주 세포에서 존재한 경우 감염성 바이러스성 입자로 복제 및 패키징될 수 있다.
"AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스성 입자" 또는 "AAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 폴리뉴클레오타이드 AAV 벡터로 구성된 바이러스성 입자를 지칭한다. 입자가 이종성 폴리뉴클레오타이드 (즉, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오타이드 예컨대 포유류 세포에 전달되어야 하는 이식유전자)를 포함하면, 전형적으로 "AAV 벡터 입자" 또는 단순히 "AAV 벡터"로서 지칭된다. 따라서, 그러한 벡터가 AAV 벡터 입자 내에 들어있음에 따라, AAV 벡터 입자의 생산은 필연적으로 AAV 벡터의 생산을 포함한다.
본 발명의 재조합 AAV 게놈은 본 발명의 핵산 분자 그리고 핵산 분자를 측접하는 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다.
AAV의 다중 혈청형이 있고, AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오타이드 서열은 공지된다. 예를 들어, AAV 혈청형 2 (AAV2) 게놈의 뉴클레오타이드 서열은 Ruffing 등, J Gen Virol 75:3385-3392 (1994)에 의해 수정된 바와 같이 Srivastava 등, J Virol 45:555-564 (1983)에서 제시된다. 본원에서 참고로 양쪽 편입됨. 기타 예로서, AAV-1의 완전한 게놈은 (본원에서 참고로 편입된) GenBank 기탁 번호 NC_002077에 제공되고; AAV-3의 완전한 게놈은 (본원에서 참고로 편입된) GenBank 기탁 번호 NC_001829에 제공되고; AAV-4의 완전한 게놈은 (본원에서 참고로 편입된) GenBank 기탁 번호 NC_001829에 제공되고; AAV-5 게놈은 (본원에서 참고로 편입된) GenBank 기탁 번호 AF085716에 제공되고; AAV-6의 완전한 게놈은 (본원에서 참고로 편입된) GenBank 기탁 번호 NC_001862에 제공되고; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부는 (본원에서 참고로 편입된) GenBank 기탁 번호 AX753246 및 (본원에서 참고로 편입된) AX753249 각각에 제공되고 (AAV-8과 관련하여 미국 특허 번호 7,282,199 및 7,790,449를 또한 참고); AAV-9 게놈은, 본원에서 참고로 편입된, Gao 등, J. Virol 78:6381-6388 (2004)에 제공되고; AAV-10 게놈은, 본원에서 참고로 편입된, Mol. Ther. 13(1):67-76 (2006)에 제공되고; AAV-11 게놈은, 본원에서 참고로 편입된, Virology 330(2):375-383 (2004)에 제공된다. AAVrh74 혈청형은, 본원에서 참고로 편입된, Rodino-Klapac 등, J. Trans. Med. 5:45 (2007)에 기재된다.
rAAV 게놈에서 AAV DNA는, 비제한적으로, AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV- 9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, Rh10, Rh74, 및 AAV-2i8을 포함하는 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형 유래일 수 있다.
위형화된 rAAV의 생산은, 예를 들어, 이 전체가 본원에서 참고로 편입되는 WO 01/83692에서 개시된다.
rAAV 변이체의 기타 유형, 예를 들어 캡시드 돌연변이가 있는 rAAV는 또한 고려된다. 예를 들어, Marsic 등, Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014) 참고. 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오타이드 서열은 당업계에 공지된다.
특정 구현예에서, 골격 근육 특이적 발현을 촉진시키기 위해, AAV1, AAV6, AAV8 또는 AAVrh.74는 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 대상체 AAV 벡터의 AAV 혈청형은 AAV9이다.
바이러스성 DNA 복제 (rep), 캡시드화/패키징 및 숙주 세포 염색체 통합에 관한 Cis-작용 서열은 ITR 내에 들어있다. 3개 AAV 프로모터 (그들의 상대 맵 자리에 대하여 일명 p5, p19, 및 p40)은 rep 및 cap 유전자를 인코딩하는 2개 AAV 내부 개방 판독 프레임의 발현을 구동시킨다.
(예를 들면, AAV2 뉴클레오타이드 2107 및 2227에서) 단일 AAV 인트론의 차등 스플라이싱과 커플링된, 2개 rep 프로모터 (p5 및 p19)는 rep 유전자로부터 4개 rep 단백질 (rep 78, rep 68, rep 52, 및 rep 40)의 생산을 초래한다. rep 단백질은 바이러스성 게놈을 복제하는 것을 궁극적으로 담당하는 다중 효소적 속성을 보유한다.
cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되고 3개 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3을 인코딩한다. 대안적 스플라이싱 및 비-공통 번역 시작 부위는 3개 관련된 캡시드 단백질의 생산을 담당한다.
단일 공통 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 맵 위치 95에 자리한다. AAV의 수명 주기 및 유전학은 Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology 158:97-129 (1992)에서 검토된다.
본 발명의 DNA 플라스미드는 본 발명의 rAAV 게놈을 포함한다. DNA 플라스미드는 rAAV 게놈의 감염성 바이러스성 입자로의 조립을 위하여 AAV의 헬퍼 바이러스 (예를 들면, 아데노바이러스, El-결실된 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스)를 이용한 감염에 묵인가능한 세포로 이동된다. 패키징되어야 하는 AAV 게놈, rep 및 cap 유전자, 그리고 헬퍼 바이러스 기능이 세포에 제공되는, rAAV 입자를 생산하기 위한 기법은 당업계에서 표준이다. rAAV의 생산은 하기 성분이 (본원에서 패키징 세포로서 표시된) 단일 세포 내에 존재한다는 것을 요구한다: rAAV 게놈, rAAV 게놈에서 분리된 (즉, 게놈에 없는) AAV rep 및 cap 유전자, 그리고 헬퍼 바이러스 기능. AAV rep 및 cap 유전자는 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형 유래일 수 있고, 비제한적으로, AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAVrh.74, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12 및 AAV-13을 포함하는, rAAV 게놈 ITR 이외의 상이한 AAV 혈청형 유래일 수 있다.
패키징 세포의 생성 방법은 AAV 입자 생산을 위하여 모든 필요한 성분을 안정하게 발현시키는 세포주를 창출하는 것이다. 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자가 부족한 rAAV 게놈, rAAV 게놈에서 분리된 AAV rep 및 cap 유전자, 그리고 선택가능한 마커, 예컨대 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 플라스미드 (또는 다중 플라스미드)는 세포의 게놈 속에 통합된다. AAV 게놈은 절차 예컨대 GC 테일링 (Samulski 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:2077-2081, 1982), 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유하는 합성 링커의 부가 (Laughlin 등, Gene 23:65-73, 1983)에 의해 또는 직접, 무딘-단말 결찰 (Senapathy & Carter, J. Biol. Chem. 259:4661-4666, 1984)에 의해 박테리아성 플라스미드 속에 도입되었다. 패키징 세포주는 그 다음 헬퍼 바이러스 예컨대 아데노바이러스로 감염된다. 이러한 방법의 이점은 세포가 선택가능하고 rAAV의 대규모 생산에 적당하다는 것이다.
적당한 방법의 다른 예는 플라스미드보다 오히려 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스를 이용하여 rAAV 게놈 및/또는 rep 및 cap 유전자를 패키징 세포에 도입한다.
rAAV 생산의 일반 원칙은, 예를 들어, Carter, Current Opinions in Biotechnology 1533-1539, 1992; 및 Muzyczka, Curr. Topics in Microbial. and Immunol. 158:97-129, 1992)에서 검토된다. 다양한 접근법은 Ratschin 등, Mol. Cell. Biol. 4:2072, 1984; Hermonat 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6466, 1984; Tratschin 등, Mol. Cell. Biol. 5:3251, 1985; McLaughlin 등, J. Virol. 62: 1963, 1988; 및 Lebkowski 등, Mol. Cell. Biol. 7:349, 1988; Samulski 등, J. Virol. 63:3822-3828, 1989; 미국 특허 번호 5,173,414; WO 95/13365, 및 상응하는 미국 특허 번호 5,658,776; WO95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin 등, Vaccine 13:1244-1250, 1995; Paul 등, Human Gene Therapy 4:609-615, 1993; Clark 등, Gene Therapy 3:1124-1132, 1996; 미국 특허 번호 5,786,211; 미국 특허 번호 5,871,982; 및 미국 특허 번호 6,258,595에서 기재된다. 상기 문헌은, rAAV 생산에 관한 문헌의 섹션들을 특히 강조하면서, 본원에서 그들 전체가 참고로 이로써 편입된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 HSV 플랫폼을 사용하는 고-역가 및 고 품질 아데노-연관 유형 9 벡터의 확장가능한 생산 방법인 Adamson-Small 등. (Molecular Therapy - Methods & Clinical Development (2016) 3, 16031; doi:10.1038/mtm.2016.31, 본원에서 참고로 편입됨)에서 기재된 방법에 따라 생산된다. 최종, 완전히 정제된 산물에서, 1×105 초과 벡터 게놈 / 세포 또는, 1×1014 초과 rAAV9 벡터 게놈 / HEK 293 프로듀서 세포의 10-층 CellSTACK을 생성할 수 있는 완전한 단순 포진 바이러스 (HSV)-기반된 생산 및 정제 과정이다. 이것은 형질감염-기반된 방법보다 5-배 내지 10-배 증가를 나타낸다. 이 밖에도, 이러한 방법에 의해 생산된 rAAV 벡터는, 더 낮은 비움-대-채움 비에 의해 나타난, 감소된 총 캡시드 단백질 양 및 더 높은 형질 도입 단위-대-벡터 게놈 비에 의해 나타난 경우에 증가된 감염력을 포함하는, 형질감염-기반된 생산과 비교된 경우 개선된 생물학적 특징을 입증하였다. 이러한 방법은 rAAV9 벡터의 대규모 우수 실험실 실무 (GLP) 및 우수 제조 실무 (GMP) 생산에 또한 용이하게 적응되어 전임상 및 임상 연구를 가능하게 하고 플랫폼을 제공하여 후기 및 상업적 생산을 구축할 수 있다. AAV9가 연구에서 사용되었어도, 이러한 방법은 다른 혈청형으로 확대가능할 것 같고 전임상 조사, 초기 임상 연구, 그리고 유전적 질환 및 장애에 대한 유전자 요법 기반된-약물의 대규모, 전세계 개발 사이 갭을 매울 수 있다.
본 발명은 따라서 감염성 rAAV를 생산하는 패키징 세포를 제공한다. 일 구현예에서, 패키징 세포는 안정하게 형질전환된 암 세포 예컨대 HeLa 세포, 293 세포 및 PerC.6 세포 (동족 293 계통)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 패키징 세포는 형질전환된 암 세포가 아닌 세포, 예컨대 저 계대 293 세포 (아데노바이러스의 El로 형질전환된 인간 태아 신장 세포), MRC-5 세포 (인간 태아 섬유아세포), WI-38 세포 (인간 태아 섬유아세포), 베로 세포 (원숭이 신장 세포) 및 FRhL-2 세포 (붉은털원숭이 태아 폐 세포)이다.
본 발명의 재조합 AAV (즉, 감염성 캡시드화된 rAAV 입자)는 rAAV 게놈을 포함한다. 예시적 구현예에서, 양쪽 rAAV의 게놈은 AAV rep 및 cap DNA이 부족하다, 즉, 게놈의 ITR 사이 AAV rep 또는 cap DNA가 없다. 본 발명의 핵산 분자를 포함하기 위해 작제될 수 있는 rAAV의 예는 전체가 본원에서 참고로 편입된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2012/047999 (WO 2013/016352)에서 제시된다.
rAAV는 당업계에서 표준 방법에 의해 예컨대 컬럼 크로마토그래피 또는 염화세슘 구배에 의해 정제될 수 있다. 헬퍼 바이러스로부터 rAAV 벡터의 정제 방법은 당업계에서 공지되고, 예를 들어, Clark 등, Hum. Gene Ther. 10(6):1031-1039, 1999; Schenpp and Clark, Methods Mol. Med. 69:427-443, 2002; 미국 특허 번호 6,566,118 및 WO 98/09657에서 개시된 방법을 포함한다.
추가의 코딩 서열
디스트로핀 단백질, 예컨대 마이크로D5를 위한 코딩 서열 외에도, 본 발명의 재조합 벡터는 디스트로핀의 손실과 연관되거나 손실에서 비롯하는 이차 합병증 / 이차 캐스케이드 중 하나에서 유전자(들) 표적화를 위하여 하나 이상의 추가의 코딩 서열을 또한 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 벡터는 특이적 디스트로핀 유전자 돌연변이를 수정할 수 있는 엑손-스키핑 안티센스 서열을 인코딩한다.
예를 들어, 엑손-스키핑 안티센스 서열은, 베커 근이영양증에서 보여진 디스트로핀 단백질 발현과 비슷하게, 내부적으로 절단된 단백질의 부분적 생산 그리고 판독 프레임의 복원을 초래하는, 대상체에서 결함 디스트로핀 유전자의 프레-메신저 RNA (pre-mRNA) 스플라이싱 도중 특이적 엑손의 스키핑을 유도한다.
특정 구현예에서, 엑손-스키핑 안티센스 서열은 프레임-붕괴 엑손 (돌연변이된 엑손) 및/또는 이웃 엑손을 스키핑하거나 스플라이싱하여 정확한 전사적 판독 프레임을 복원하고, 더 짧지만 기능적인 디스트로핀 단백질을 생산한다.
특정 구현예에서, 엑손-스키핑 안티센스 서열은 단일 엑손 스키핑을 유도한다. 특정 구현예에서, 엑손-스키핑 안티센스 서열은 다중 엑손 스키핑, 예컨대 엑손 45-55의 하나 이상, 또는 모두의 스키핑을 유도한다 (즉, 천연 엑손 44는 엑손 56에 직접 결합된다). 예를 들어, 11개 안티센스 서열은 엑손 45-55를 포함하는 모든 11개 엑손을 스키핑하기 위해 함께 사용될 수 있다. 10개 AON의 칵테일은 (엑손 52의 결실을 가진) mdx52 마우스 모델에서 사용되어 엑손 45-51 및 53-55의 스키핑을 유도하고, 따라서 기능적 디스트로핀 발현을 복원한다.
특정 구현예에서, 엑손-스키핑 안티센스 서열은 디스트로핀 pre-mRNA에서 엑손 51의 스키핑을 유도한다. 엑손 51의 성공적 스키핑은 모든 DMD 환자의 약 14%를 이론적으로 치료할 수 있다.
특정 구현예에서, 엑손-스키핑 안티센스 서열은 디스트로핀 유전자의 엑손 51내 엑손적 스플라이스 인핸서 (ESE) 부위를 표적하고, 따라서 엑손 51의 스킵을 야기시키고 절단되지만 부분적으로 기능적인 디스트로핀 단백질을 생산한다.
특정 구현예에서, 엑손-스키핑 안티센스 서열은 엑손 44, 45, 및 53 중 하나 이상의 스키핑을 유도한다.
특정 구현예에서, 엑손-스키핑 안티센스 서열은 카시머센(casimersen) (엑손 45), NS-065/NCNP-01 또는 골로디르센(golodirsen) (엑손 53), 또는 에테플리르센(eteplirsen) 또는 Exondys 51 (엑손 51)의 것과 동일한 표적 서열을 표적한다.
특정 구현예에서, 엑손-스키핑 안티센스 서열은 후쿠야마 선천성 근이영양증 (FCMD) 환자의 돌연변이된 FCMD/FKTN 유전자에서 비밀 스플라이싱 도너 및/또는 억셉터 부위를 표적하여 정확한 엑손 10 스플라이싱을 복원한다.
후쿠야마 선천성 근이영양증 (FCMD)은 희귀한 상염색체 열성 질환이며 일본에서 두번째로 널리 퍼진 소아 근이영양증이다. FCMD (FCMD, FKTN으로서 또한 공지됨)을 담당하는 유전자는 단백질 푸쿠틴을 인코딩하고, 이는 잠정적 글리코실트랜스퍼라제이고, 디스트로핀-연관 당단백질 복합체 (DAGC)의 구성원인, α-디스트로글리칸을 글리코실화한다. FCMD의 병인은 푸쿠틴 유전자의 3'-번역되지 않은 영역 (UTR)에 SINE-VNTR-Alu(SVA) 레트로트랜스포존의 선구적 삽입에 의해 야기되어, 엑손 10에서 새로운, 비밀 스플라이스 도너, 그리고 SVA 삽입 부위에서 새로운, 비밀 스플라이스 억셉터의 활성화를 초래하고, 따라서 비밀 도너와 억셉터 부위 사이 비정상적인 mRNA 스플라이싱을 유도한다. 결과는 FCMD의 엑손 10의 조기 절단이다. 생체내 FCMD 환자 세포 및 모델 마우스에서, 비밀 스플라이스 조정 영역을 표적하는 3개 비보-PMO의 칵테일이 병인성 SVA 엑손 트랩핑을 예방하고 α-디스트로글리칸의 정상 FKTN 단백질 수준 및 O-글리코실화를 복원한 것으로 밝혀졌다.
특정 구현예에서, 안티센스 서열은 3- 또는 4-뉴클레오타이드 반복부, 예컨대 DM1 환자내 DMPK 유전자의 3'-UTR 영역에서의 CTC 삼중 반복부, 또는 DM2 환자내 CNBP 유전자의 제 1 인트론에서의 CCTG 반복부의 병리학적 확장을 표적한다.
근긴장성 이영양증 (DM)은 성인기에 가장 흔한 형태의 근이영양증이다. 근긴장성 이영양증 유형 1 (DM1) 및 근긴장성 이영양증 유형 2 (DM2)로 카테고리화될 수 있는 상염색체 우성 질환이다. DM1은 근긴장성 이영양증 단백질 키나제 (DMPK) 유전자의 3'-UTR 영역에서 CTC 삼중항의 병리학적 확장에 의해 야기되고, 반면에 DM2는 CCHC-유형 징크 핑거, 핵산 결합 단백질 유전자 (CNBP)의 제 1 인트론에서 CCTG 관의 병리학적 확장에 의해 야기된다. 확장된 반복부를 가진 전사된 RNA 응집체로부터 발생하는, RNA 기능 획득 독성은 비정상적인 스플라이싱 (스플라이스병증)을 초래한다. 독성 RNA의 응집체는, 핵 RNA 중심지 내에서 전자를 격리시키고 고갈시킴으로써, 그리고 DM1에서 후자의 발현 및 인산화를 증가시킴으로써, 대안적 스플라이싱 조절제 예컨대 머슬블라인드-유사 (MBNL) 단백질 및 CUG-결합 단백질 1 (CUGBP1)의 기능을 붕괴시킨다. MBNL 및 CUGBP1 단백질의 기능에서의 변동은 표적 유전자, 즉 인슐린 수용체 (INSR), 근육 클로라이드 채널 (CLCN1), 브릿징 통합체-1 (BIN1), 및 디스트로핀 (DMD)의 pre-mRNA에서 비정상적인 스플라이싱을 초래하며, 이들은 인슐린 저항성, 근긴장, 근육 약화, 및 이영양증성 근육 과정 (근긴장성 이영양증의 모든 전형적 증상)과 각각 연관된다.
따라서 DMPK 유전자에서 확장된 CUG 반복부는 MBNL1 단백질을 격리시키고 몇몇 다운스트림 유전자에서 비정상적인 스플라이싱을 야기시키며, 이에 의해 DM1 표현형을 야기시킨다. 한편으로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 RNase-매개된 분해를 위하여 돌연변이체 전사물의 그러한 확장된 반복부를 표적하는데 사용될 수 있고, 이에 의해 다운스트림 유전자의 스플라이싱을 복원한다. 2'-O-메톡시에틸 갭머 AON은 돌연변이체 RNA 전사물에서 RNase H에 의해 확장된 CUG의 분해를 표적하는데 사용되어, 돌연변이체 mRNA 전사물의 감소 및 복원된 단백질 발현을 초래하였다.
특정 구현예에서, 엑손-스키핑 안티센스 서열은 DM1 환자의 CLCN1 유전자에서 엑손 7A의 스키핑을 초래한다.
DM1은 이러한 유전자가 DM1 환자에서 근긴장증을 유발하기 때문에, 클로라이드 채널 1 (CLCN1)의 비정상적인 스플라이싱을 수정함으로써 또한 치료될 수 있다. DM1 마우스 (HSALR)의 근육에 PMO의 전달을 향상시키기 위해 초음파 노출을 통해서 버블 리포솜을 가진 PMO (포스포로디아미데이트 모폴리노 올리고머)를 사용하여, CLCN1의 엑손 7A의 스키핑은 생체내 달성되어, 골격 근육에서 호전된 근긴장증 및 Clcn1 단백질 발현을 초래하였다.
특정 구현예에서, 엑손-스키핑 안티센스 서열은 DYSF 돌연변이를 가진 디스펄린병증 (예를 들면, LGMD2B 또는 MM) 환자에서 엑손 스키핑에 대하여, DYSF 유전자의 엑손 17, 32, 35, 36, 및/또는 42, 바람직하게는 엑손 32 및/또는 36을 표적한다.
디스펄린병증은 디스펄린 (DYSF) 유전자에서 돌연변이에 의해 야기된 근이영양증을 포괄하는 포괄적인 용어이다. 디스펄린 유전자는 근육 막 손상을 복구하는데 요구된 세포속막 단백질을 인코딩한다. 칼슘-의존적 C2 지질 결합 도메인 및 활력 막횡단 도메인으로 이루어진다. 2개의 흔한 디스펄린병증 - 지대 근이영양증 유형 2B (LGMD2B) 및 미요시 근병증 (MM)이 있고, 둘 모두 임상적으로 뚜렷한 표현형 및 상염색체 열성 유전을 갖는다. LGMD2B는 근위 근육 약화를 특징으로 하고, 반면에 MM은 원위 근육 약화를 특징으로 한다. LGMD2B 및 MM의 초기 임상 표현형은 뚜렷하다. 하지만, 질환이 진행함에 따라, 두 병태에 대하여 임상 표시는 겹쳐서, 더욱 비슷해지고, 환자는 양쪽 근위 및 원위 사지에서 근육 약화를 경험한다. 디스펄린-결핍 근육 섬유는 막 복구에서 결점을 갖는다.
디스펄린병증은, 절단된 돌연변이체 DYSF 단백질의 단 10% 야생형 수준 발현을 가진 환자에서 관찰된 가벼운 표현형으로 부분적으로 인해, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 엑손 스키핑에 의해 치료될 수 있다. 구체적으로, 복합 이형접합 여성 환자의 LGMD2B 경우에, 환자는 인트론 31에서 1개의 무효 대립유전자 그리고 기타 대립유전자에서의 DYSF 분지 점 돌연변이를 보유하였다. 엑손 32의 천연 프레임내 스키핑은 야생형 수준의 것 약 10%에서 발현된 절단된 디스펄린 단백질을 초래하였고, 이는 무효 돌연변이를 부분적으로 보충하는데 충분하였다. 환자는 가벼운 증상을 경험하였고, 70세에 보행할 수 있었다. 최근에, 환자 세포에서 엑손 32 스키핑이 준-디스펄린 발현 수준을 초래하였음이 밝혀졌고, 이는 시험관내 저-삼투압 및 세포속막 국소화된 레이저 부상을 당한 처리된 세포에서 막 복구를 구조하였다.
특정 구현예에서, 엑손-스키핑 안티센스 서열은 LAMA2 돌연변이를 가진 메로신-결핍 선천성 근이영양증 유형 1A (MDC1A) 환자에서 엑손 스키핑을 위하여, LAMA2 유전자의 엑손 4를 표적한다. 특정 구현예에서, 엑손 스키핑은 C-말단 G-도메인 (엑손 45-64), 특히 α-디스트로글리칸과 상호작용 매개에 가장 중요한 G4 및 G5의 복원된 발현을 초래한다.
메로신-결핍 선천성 근이영양증 유형 1A (MDC1A)는 라미닌-α2 쇄 발현에서 완전 또는 부분 결핍을 초래하는 65-엑손 LAMA2 유전자에서 돌연변이에 의해 야기된다. 라미닌-α2 쇄는 베타1 (β1), 및 감마1 (γ1) 쇄와 함께 라미닌-211 또는 메로신으로서 공지된 이종삼량체성 라미닌 이소폼의 일부이고, 이는 신경근 접합부 및 슈반 세포 (말초 신경)을 포함하는 특히 골격 근육의 기저 막에서 발현된다. 라미닌-α2는 디스트로핀-디스트로글리칸 복합체 (DGC)와 상호작용하여, 골격 근육 및 말초 신경에서 세포 신호전달, 유착 및 조직 완전성을 매개한다. 항상 그런 것은 아니지만, 라미닌-α2의 부분 발현은 더 가벼운 MDC1A을 야기시키고, 반면에 라미닌-α2의 완전 부재는 심각한 MDC1A를 야기시킨다. C-말단 G-도메인 (엑손 45-64), 특히 G4 및 G5는 α-디스트로글리칸과의 상호작용 매개에 가장 중요하다. G4 및 G5를 제거하는 돌연변이는 부분 절단된 라미닌-α2 발현의 존재 하에서 심각한 표현형과 연관된다.
엑손-스키핑은 PMO-매개된 엑손 4 스키핑이 개방 판독 프레임을 수정하였다는 점에서, MDC1A 치료를 위하여 탐구되었으며, 절단된 라미닌-α2 쇄를 회복시키고 환자 수명을 약간 연장시켰다.
특정 구현예에서, 엑손-스키핑 안티센스 서열은, △-521T SGCG 돌연변이를 가진 지대 근이영양증 유형 2C 환자를 치료하기 위하여, LGMD2C / SGCG 유전자에서 가장 흔한 △-521T 돌연변이의 엑손 4-7의 스키핑, 그리고 내부적으로 절단된 SGCG 단백질을 생성하기 위한 판독 프레임의 복원을 유도한다. 특정 구현예에서, 엑손 스키핑은 야생형 SGCG 단백질의 세포내, 막횡단, 및 극단적 카복시-말단을 보유하는 내부적으로 절단된 SGCG 단백질의 복원된 발현을 초래한다.
디스트로핀-연관 단백질 (DAP)은 근육 세포 막에 있는 복합체이고, 이의 막횡단 성분은 성인 근육 섬유에서 세포외 기질에 세포골격을 연결시키고, 근육 세포 막의 완전성의 보존에 필수적이다. DGC 내에서 사르코글리칸 하위복합체는 4개 단일-통과 막횡단 하위단위: α-, β-, γ-, 및 δ-사르코글리칸으로 구성된다. α 내지 δ-사르코글리칸 유전자, 즉 α (LGMD2D), β (LGMD2E), γ (LGMD2C) 및 δ (LGMD2F)는 횡문근에서 우세하게 (β) 또는 배타적으로 (α, γ 및 δ) 발현된다. 4개 사르코글리칸 유전자 중 어느 하나에서 돌연변이는, 아마도 사르코글리칸 복합체의 탈안정화로 인해, 다른 사르코글리칸 단백질의 이차 결핍을 초래하여, 사르코글리칸병증 - 상염색체 열성 지대 근이영양증 (LGMD)을 초래할 수 있다. α 내지 δ 유전자에서 질환-야기 돌연변이는 근육 세포 막에서 디스트로핀-연관 단백질 (DAP) 복합체 내에 붕괴를 야기시킨다.
인간에서, γ 사르코글리칸 (LGMD2C)은 SGCG 유전자에 의해 인코딩된 단백질이다. 심각한 유아기 상염색체 열성 근이영양증 (SCARMD)은 γ-사르코글리칸 유전자에서 현미부수체 마커로 분리하는 진행성 근육-소모 장애이다. γ-사르코글리칸 유전자에서 돌연변이는 북아프리카의 마그레브 국가에서 처음 설명되었고, 여기에서 γ-사르코글리칸병증은 평소보다 높은 발병률을 갖는다. LGMD 2C 환자에서 가장 흔한 돌연변이 중 하나인, △-521T는 γ-사르코글리칸 유전자의 엑손 6내 뉴클레오타이드 염기 521-525에 5개 티민의 한줄에서 한 티민의 결실이다. 이러한 돌연변이는 판독 프레임을 이동시키고 γ-사르코글리칸 단백질의 부재 그리고 β- 및 δ-사르코글리칸의 이차 감소를 초래하고, 따라서 심각한 표현형을 야기시킨다. 돌연변이는 마그레브 인구 및 기타 국가에서 모두 발생한다.
엑손-스키핑은 생성된 내부적으로 절단된 SGCG 단백질이 드로소필라(Drosophila) 모델에서, 이종성 세포 발현 연구에서, 그리고 γ-사르코글리칸이 부족한 이식유전자성 마우스에서 γ-사르코글리칸의 손실을 수정하기 위한 기능적 및 병리학적 이익을 제공하였다는 점에서 △-521T 돌연변이를 가진 LGMD2C 치료를 위하여 탐구되었다. 인간 근육 질환의 세포성 모델은 다중 엑손 스키핑이 돌연변이체 인간 γ-사르코글리칸을 인코딩하는 RNA에서 유도될 수 있다는 것을 보여주기 위해 또한 생성되었다.
특정 구현예에서, 본 발명의 벡터는 사르콜리핀 (SLN)의 기능을 길항하는 안티센스 서열, 또는 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA 등)을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 벡터는 사르콜리핀 (shSLN)의 기능을 길항하는 shRNA를 인코딩한다.
예시적 shSLN 서열은 도 9 및 10에 개시된 것들 (예를 들면, 도 9에서 밑줄친 서열, 및 도 10에서 강조된 서열)을 포함한다. 추가의 예시적 shSLN 서열은 (본원에서 참고로 편입된) WO2018/136880에서 개시된 서열번호: 7-11을 포함한다.
추가 shSLN 서열은, 아래 보여진 인간 SLN mRNA 서열을 사용하여, 임의의 기술 인정된 방법에 기반되어 설계될 수 있다.
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특정 구현예에서, 본 발명의 벡터는 하나 이상의 표적 유전자, 예컨대 염증성 유전자의 기능을 길항하는 안티센스 서열 또는 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA 등)을 인코딩한다.
IκB 키나제 / 핵 인자-카파 B (NF-κB) 신호전달은 DMD를 가진 양쪽 동물 모델 및 환자에 있어서 면역 세포 및 재생적 근육 섬유에서 지속적으로 상승된다. 이 밖에도, NF-κB의 활성화제 예컨대 TNF-α 및 IL-1 및 IL-6은 DMD 근육에서 상향조절된다. 따라서, NF-κB 신호전달 캐스케이드 성분, 예컨대 NF-κB 자체, 이의 업스트림 활성화제 및 다운스트림 염증성 사이토카인을 억제시키는 것은 결함 디스트로핀 유전자 대체 / 복구와 함께 대상체 환자를 치료하는데 유익하다.
따라서 특정 구현예에서, 본 발명의 벡터는 하나 이상의 염증성 유전자, 예컨대 NF-κB, TNF-α, IL-1 (IL-1β), IL-6, NF-κB의 수용체 활성화제 (RANK), 및 톨-유사 수용체 (TLR)의 기능을 길항하는 안티센스 서열 또는 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA 등)을 인코딩한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 벡터는 히스톤 데아세틸라제, 예컨대 HDAC2의 기능을 길항하는 안티센스 서열 또는 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA 등)을 인코딩한다. DMD에서, 근섬유막에 디스트로핀의 부재는 산화질소 신타제 (nNOS)를 탈국소화하고 하향조절하며, 이는 HDAC2의 S-니트로실화 및 이의 염색질 회합을 변경시킨다. NO 경로에 결함인, 디스트로핀-결핍 mdx 마우스에서, HDAC2의 활동성은 특별히 증가되었다. 대조적으로, mdx 동물에서 nNOS 발현의 구제는 이영양증성 표현형을 호전시켰다. 이 밖에도, 데아세틸라제 억제제는 이영양증성 근육 섬유에 강한 형태기능적 이익을 부여하였다. 실제로, 기비노스타트(givinostat), 히스톤 데아세틸라제 억제제는 DMD에 대하여 잠재적 질환-변형 치료로서 평가 중이다. 데이터는, 양쪽 뮤린 및 인간 이영양증성 세포에서, 디스트로핀의 부재가 miRNA의 특이적 서브세트에 결합하는 HDAC2와 상관관계가 있고 (아래 참고), 반면에 디스트로핀 구조시 HDAC2가 이들 프로모터에서 방출된다는 것을 나타낸다.
특정 구현예에서, 본 발명의 벡터는 TGF-β 또는 결합 조직 성장 인자 (CTGF)의 기능을 길항하는 안티센스 서열, RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA 등), 또는 마이크로RNA를 인코딩한다. 근이영양증에서 TGF-β의 상승된 수준은 부수체 세포의 활성화를 차단함으로써 섬유증을 자극하고 근육 재생을 손상시킨다. TGF-β의 발현을 감소시키는 안지오텐신 II-유형 1 수용체 차단제인, 로사르탄을 포함하는, 항-섬유증성 제제는 근이영양증의 뮤린 모델에서 테스트되었다. HT-100 (할로푸지논)은 근이영양증에서 TGF-β/Smad3 경로를 통해 섬유증을 예방하는 것으로 또한 밝혀졌다. 한편으로, 섬유증의 병인에서 중추적 매개체인, 결합 조직 성장 인자의 작용을 방해하는 완전히 인간 단클론성 항체인, FG-3019는 특발성 폐 섬유증 (IPF)을 가진 환자에서 개방-라벨 제2 상 시험에서 평가되었다.
특정 구현예에서, 본 발명의 벡터는 마이크로RNA (miR), 예컨대 miR-1, miR-29c, miR-30c, miR-133, 및/또는 miR-206을 인코딩한다. 뒤센 대 야생형 병태에서 차등 HDAC2 니트로실화 상태는 마이크로RNA 유전자의 특이적 서브세트의 발현을 조절해제시킨다. 식별된 마이크로RNA, 예컨대 세포의 산화환원 상태 및 G6PD 효소에 miR-1을, 또는 세포외 단백질 및 섬유증성 과정에 miR-29를 연결하는 것에 의해 제어된 몇몇 신경회로는 DMD 병원성 특질 중 일부를 설명한다. 근육-특이적 (myomiR) miR-1 및 miR-133, 그리고 mdx에서 하향조절된 유비쿼터스 miR-29c 및 miR-30c는 엑손-스키핑-처리된 동물에서 야생형 수준 쪽으로 회복하였다. mdx 모델에 따르면, 디스트로핀 합성이 엑손 스키핑을 통해 복원된 경우, miR-1, miR-133a, miR-29c, miR-30c, 및 miR-206의 수준은 증가하였고, 반면에 miR-23a 발현은 변화하지 않았다.
특정 구현예에서, 본 발명의 벡터는 마이크로RNA 억제제를 인코딩하고, 상기 억제제는 DMD 또는 이의 관련된 질환에서 상향조절된 마이크로RNA의 기능을 억제시킨다. 예를 들어, 염증성 miR-223 발현 수준은 mdx 마우스 근육에서 상향조절되고, 엑손-스키핑-처리된 마우스에서 하향조절된다. 이의 감소는, 엑손-스키핑에 의한 디스트로핀 구조로 인해, 근육의 염증성 상태의 관찰된 호전과 일치한다.
mdx 동물은 광대한 섬유증성 퇴화를 겪고, miR-29는 섬유증성 퇴화에 관여된 결정적 인자, 예컨대 콜라겐, 엘라스틴, 및 세포외 기질의 구조적 성분의 mRNA를 표적하는 것으로 밝혀졌다. mdx 마우스에서, miR-29는 저조하게 발현되고, 콜라겐 (COL1A1) 및 엘라스틴 (ELN)을 위한 mRNA는 상향조절되었다. 따라서 miR-29c의 발현은, 콜라겐 및 엘라스틴 발현, 그리고 콜라겐 및 엘라스틴 발현과 연관된 병리학적 세포외 기질 변형 하향조절을 부분적으로 통해서, DMD 환자에서 섬유증성 퇴화를 완화시킨다.
특정 구현예에서, 본 발명의 벡터는, G6PD (글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제)의 기능을 길항시키는, 안티센스 서열, 또는 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA 등)을 인코딩한다. 이영양증성 근육에서 하나의 중요한 쟁점은 질환 진행에 관여되도록 시사된 산화적 스트레스에 대한 반응 및 그들의 취약성이다. G6PD는 NADPH의 수준을 유지함으로써 세포에 감소하는 에너지를 공급하는 펜토스 포스페이트 경로에서 시토졸성 효소이고, 이는 차례로 환원된 및 산화된 글루타티온 (GSH/GSSG) 사이 높은 비를 보장하며, GSH는 산화적 손상에 대해 세포를 보호하는 주요 항산화제 분자이다. G6PD mRNA는 mdx 근육에서 조절해제된다. miR-1 계열에 대하여 3개 추정적 결합 부위를 이의 3'-UTR 영역에서 함유하고, miR-1 및 miR-206은 G6PD 발현을 억누를 수 있다. 실제로, G6PD와 miR-1 발현 사이 역 상관관계가 있다: C2 근아세포의 시험관내 분화는 miR-1 수준에서의 증가가 G6PD 단백질, mRNA 수준, 및 GSH/GSSG 비의 감소와 상관관계가 있다는 것을 보여주었다. mdx 마우스에서, miR-1이 하향조절된 경우, G6PD는 WT 근육에서보다 더 높은 수준에서 검출되었고, 이에 반에 miR-1이 재개하는, 엑손-스키핑-처리된 mdx에서, G6PD의 양은 감소되었다. 현저히, mdx 마우스에서, G6PD 수준의 증가는 GSH/GSSG 비의 감소에 의해 수반되었다.
특정 구현예에서, 본 발명의 벡터는 마이오스타틴의 기능을 길항하는 안티센스 서열 또는 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA 등)을 인코딩한다. 마이오스타틴은 근육량의 음성 조절제이다. 내인성 마이오스타틴의 억제 또는 차단은 DMD를 포함하는 많은 유형의 근이영양증에서 흔한 심각한 근육 소모를 보충한다. 마이오스타틴 차단 항체, MYO-029는 BMD 및 기타 이영양증을 가진 성인 대상체에 대하여 임상 시험중이다. 마이오스타틴 억제제 예컨대 폴리스타틴 그리고 PF-06252616 (NCT02310764) 및 BMS-986089를 사용하는 기타 임상 시험은 또한 실행되었다.
특정 구현예에서, 본 발명의 벡터는 포스포디에스테라제-5 (PED-5) 또는 ACE 또는 VEGF 디코이-수용체 유형 1 (VEGFR-1 또는 Flt-1)의 기능을 길항하는 안티센스 서열 또는 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA 등)을 인코딩한다. 디스트로핀의 손실은 뉴런성 산화질소 신타제의 변위 그리고 근육-유래된 산화질소의 미세혈관으로의 감소로 이어져, 기능적 근육 허혈 및 추가로 근육 부상을 초래한다. 따라서 포스포디에스테라제-5 또는 ACE, 또는 VEGF 디코이-수용체 유형 1 (VEGFR-1 또는 Flt-1)의 몇몇 억제제는, 포스포디에스테라제-5 또는 ACE의 약학적 억제를 포함하는, 근육에 혈류를 증가시키기 위한 전략의 일부로서 테스트되었다.
특정 구현예에서, 본 발명의 벡터는 조혈 프로스타글란딘 D 신타제 (HPGDS)의 기능을 길항하는 안티센스 서열, 또는 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA 등)을 인코딩한다. 프로스타글란딘 D2 (PGD2)는 다양한 염증성 세포에 의해 생산되고, 조혈 PGD 신타제 (HPGDS)는 DMD 환자의 괴사성 근육에서 발현되는 것으로 나타난다. HPGDS 억제제의 투여는 PGD2의 소변 대사산물인 테트라노르(tetranor)-PGDM의 소변 배설을 감소시켰고, DMD의 mdx 마우스 모델에서 근괴사를 억압하였다. 신규한 HPGDS 억제제인, TAS-205는 임상 시험에서 DMD 치료를 위하여 평가되었다.
RNAi 및 안티센스 설계
RNA 간섭 (RNAi)에서, 내인성 표적 mRNA에 보완적이고 결합하는 짧은 RNA 분자는 창출된다. 그러한 결합은 표적 mRNA의 분해를 포함하는 표적 mRNA의 기능적 불활성화로 이어진다.
RNAi 경로는 식물 및 동물을 포함하는 많은 진핵생물에서 발견되고, 긴 이중-스트란드 RNA (dsRNA) 또는 작은 헤어핀 RNA (shRNA) 분자를 ~21개 뉴클레오타이드 siRNA의 짧은 이중-스트란드 단편으로 절단하는, 효소 다이서(Dicer)에 의해 세포질에서 개시된다. 각 siRNA는 그 다음 2개 단일-스트란드 RNA (ssRNA), 패신저 스트란드 및 가이드 스트란드로 풀린다. 패신저 스트란드는 분해되고 가이드 스트란드는 RNA-유도된 침묵화 복합체 (RISC)에 편입된다. 가장 널리-연구된 성과는 전사후 유전자 침묵화이고, 이는 가이드 스트란드가 mRNA 분자에서 상보적 서열과 짝짓기하고, RISC의 촉매적 성분인 아르고노트(Argonaute) 2 (Ago2)에 의한 절단을 유도하는 경우에 발생한다. 일부 유기체에서, 이 과정은 siRNA의 초기에 제한된 몰 농도에도 불구하고 전신적으로 확산한다.
siRNA 및 shRNA 이외에, RNA 간섭에 중추적인 또 다른 유형의 작은 RNA 분자는 마이크로RNA (miRNA)이다.
마이크로RNA는, 특히 발생 도중, 유전자 발현 조절을 돕는 게놈적으로 인코딩된 비-코딩 RNA이다. 성숙한 miRNA는 siRNA와 구조적으로 비슷하지만, 이들은 성숙기에 도달하기 전에 광대한 전사후 변형을 먼저 겪어야 한다. miRNA는 pri-miRNA로서 공지된 일차 전사물로서 훨씬 더 긴 RNA-코딩 유전자로부터 발현되고, 그 다음 RNase III 효소 Drosha 및 dsRNA-결합 단백질 DGCR8로 이루어지는 마이크로프로세서 복합체에 의해, pre-miRNA로 불리는 70-뉴클레오타이드 줄기-루프 구조로 세포에서 가공된다. 이러한 pre-miRNA를 시토졸에 수송시, 이의 dsRNA 부분은 결합되고 다이서에 의해 절단되어 성숙한 miRNA 분자를 생산하고, 2개 스트란드는 패신저 스트란드 및 가이드 스트란드로 분리될 수 있다. miRNA 가이드 스트란드는, siRNA 가이드 스트란드처럼, 동일한 RISC 복합체로 통합될 수 있다.
따라서, 2개 dsRNA 경로인 miRNA 및 siRNA/shRNA 둘 모두는 miRNA 또는 siRNA를 위한 성숙한 기능적 가이드 스트란드를 생성하기 위해 백본 서열을 가진 전구체 분자 (pri-miRNA, pre-miRNA, 및 dsRNA 또는 shRNA)의 가공을 요구하고, 경로 둘 모두는 결과적으로 RISC 복합체에서 수렴한다.
RISC로 통합한 후, siRNA는 그들의 표적 mRNA에 염기-짝짓기하고 그것을 절단하여, 이에 의해 번역 템플레이트로서 사용됨으로부터 그것을 보호한다. 그러나, siRNA와 상이하게, miRNA-부하된 RISC 복합체는 잠재적 상보성을 위하여 세포질성 mRNA를 스캐닝한다. (Ago2에 의한) 파괴적 절단 대신에, miRNA는 이들이 불완전한 상보성으로 전형적으로 결합하는 mRNA의 3'-UTR 영역을 표적하고, 따라서 번역을 위한 리보솜의 접근을 차단한다.
miRNA, 특히 동물의 것들이 표적에 짝짓기하는 불완전 염기를 전형적으로 갖고 비슷한 서열을 가진 많은 상이한 mRNA의 번역을 억제한다는 점에서 siRNA는 miRNA와 상이하다. 대조적으로, siRNA는 전형적으로 완벽하게 염기-짝짓기하고 단일, 특이적 표적에서만 mRNA 절단을 유도한다.
역사적으로, siRNA 및 shRNA는 RNAi 적용에서 사용되었다. siRNA는 20-25 뉴클레오타이드 길이인, 전형적으로 이중-스트란드 RNA 분자이다. siRNA는 이들이 세포 내에서 또한 분해되는 때까지 일시적으로 표적 mRNA를 억제시킨다. 헤어핀 구조를 창출하는 내부 하이브리드화의 영역을 포함하는 shRNA는 전형적으로 ~80개 염기 쌍 길이이다. 이전에 기재된 경우에, shRNA 분자는 세포 내에서 가공되어 siRNA를 형성하며, 이는 차례로 유전자 발현을 녹다운시킨다. shRNA의 하나의 이익은 이들이 플라스미드 벡터에 편입될 수 있고 장기 또는 안정한 발현, 및 따라서 표적 mRNA의 더 긴 녹다운을 위하여 게놈성 DNA로 통합될 수 있다는 점이다.
shRNA 설계는 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, Cellecta는 (약 10,000개 마우스 유전자를 표적하는) 마우스 DECIPHER shRNA 라이브러리 또는 인간 게놈식 shRNA 라이브러리를 사용하여 임의의 표적 유전자 (예를 들면, 모두 19,276개 단백질-인코딩 인간 유전자)에 대해 RNAi 스크리닝 서비스를 제공한다. ThermoFisher Scientific은 제조업체에 따르면 siRNA 설계, 표적외 효과 예측 알로리즘, 및 화학에서 최신 개선을 편입시키는, Ambion으로부터 Silencer Select siRNA (전통적 21-mers)를 제공한다.
ThermoFisher Scientific은 또한 내인성 성숙한 miRNA를 모방하도록 설계된 작은, 화학적으로 변형된 이중-스트란드 RNA 분자인 Ambion® Pre-miR™ miRNA 전구체 분자를 제공한다. 그러한 Pre-miR miRNA 전구체의 사용은 miRNA 활동성의 상향-조절에 의해 miRNA 기능적 분석을 가능하게 하고, miRNA 표적 부위 식별 및 검증, 표적 유전자의 발현을 조절하는 miRNA를 위한 스크리닝, 그리고 표적 유전자 (예컨대 SLN)의 기능 또는 세포성 과정에 영향을 주는 miRNA를 위한 스크리닝에서 사용될 수 있다.
ThermoFisher Scientific은 추가로, 내인성 마이크로RNA (miRNA) 분자에 특이적으로 결합하고 분자를 억제하도록 설계된 화학적으로 변형된, 단일 스트란드 핵산인, Ambion® 항-miR™ miRNA 억제제를 제공한다.
안티센스 서열 설계는 다수의 상업적 및 공공 공급원, 예컨대 IDT (Integrated DNA Technologies) 및 GenLink로부터 또한 상업적으로 이용가능하다. 설계 고려는 올리고 길이, 표적 mRNA에서 이차 / 삼차 구조, 표적 mRNA 상에서 단백질-결합 부위, 표적 mRNA 또는 안티센스 올리고에서 CG 모티프의 존재, 안티센스 올리고내 사중체의 형성, 및 안티센스 활동성-증가 또는 -감소 모티프의 존재를 포함할 수 있다.
엑손 스키핑 안티센스 올리고 설계는 당업계에서 공지된다. 예를 들어, 고려 인자 예컨대 표적 부위의 선택, 올리고의 길이, 올리고 화학, 및 용융 온도 대 RNA 스트란드, 등을 고려하여, 효과적 엑손-스키핑 올리고뉴클레오타이드의 설계를 상세히 논의하는, Camilla Bernardini (ed.), Duchenne Muscular Dystrophy: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1687, DOI 10.1007/978-1-4939-7374-3_10, Chapter 10 Shimo 등 저작, Springer Science+Business Media LLC, 2018 출판)을 참고한다. 다중 엑손을 스키핑하기 위해 안티센스 올리고의 칵테일의 사용이 또한 논의된다. 포함된 특이적 유전자 및 근이영양증은 DMD (뒤센 근이영양증), LAMA2 (메로신-결핍 CMD, DYSF (디스펄린병증, FKTN (후쿠야마 CMD), DMPK (근긴장성 이영양증, 및 SGCG (LGMD2C)를 포함한다. 전체 내용은 본원에서 참고로 편입된다.
예를 들어, 이환된 질환 유전자에서 단백질 / 유전자 서열 및 이의 돌연변이는 NCBI 및 Leiden 근이영양증 온라인 페이지로부터 공적으로 이용가능하다. 효율적 엑손 스키핑을 위한 잠재적 표적 부위는 www dot umd dot be slash HSF에서 인간 스플라이싱 파인더 웹사이트를 사용함으로써 수득될 수 있다. 표적 mRNA의 이차 구조는, 예를 들면, 알바니 닷 에두 웹사이트에서 엠포드(mfod) 웹 서버를 사용하여 평가될 수 있다. 올리고의 길이는 정상적으로 8-30 mer일 수 있다. 올리고 GC 함량 계산은 노스웨스턴 대학교 서버에서 OligoCalc 웹사이트에서 이용가능하다. 임의의 표적외 서열을 위한 검색은 GGGenome 웹사이트를 사용하여 실시될 수 있다. 올리고의 용융 온도는 sg dot idtdna dot com.에서 LNA 올리고 예측 도구 또는 OligoAnalyzer 3.1 소프트웨어에 의해 추정될 수 있다.
RNAi (miR, siRNA, & shRNA)를 위한 향상된 가이드 스트란드 생성
특정 구현예에서, 코딩 서열은 RNAi 시약, 예컨대 miR, siRNA, 또는 shRNA를 인코딩한다.
특정 구현예에서, miR 및/또는 shRNA / siRNA 설계를 위하여, 성숙한 miR 또는 성숙한 siRNA가 생성되는 것으로부터 야생형 백본 서열은 변형되어 가이드 스트란드 생성을 향상시키고 패신저 스트란드 생산을 최소화 / 제거할 수 있다. (절단 후) 성숙한 miR / siRNA / shRNA의 양쪽 스트란드가 이론적으로 RISC 복합체에 편입될 수 있고 RNAi를 위한 가이드 스트란드가 될 수 있으므로, (예를 들면, 패신저 스트란드가 RISC에 부하되는 경우 의도되지 않은 표적 서열의 절단으로 인해), 예를 들면, 표적외 효과를 감소시키거나 최소화하기 위해, RISK 복합체에서 설계된 가이드 스트란드의 활용을 선택적으로 향상시키고 주로 상보적 패신저 스트란드의 활용을 최소화하는 것이 유리하다.
이러한 목표를 달성 (선도하는 스트란드 생성을 향상시키고 패신저 스트란드 생산을 최소화 / 제거)하는데 사용될 수 있는 하나의 접근법은 원하는 가이드 스트란드를 포함하는 설계된 원하는 성숙한 miR / siRNA / shRNA 서열이 가이드 스트란드의 생성을 선호하고 패신저 스트란드의 생산을 선호하지 않는 기타 miR 서열의 백본 서열 내부에서 매몰되는 하이브리드 작제물 사용을 통해서이다.
임의의 기타 서열을 표적하는 기타 RNAi 시약에 대하여 용이하게 채택될 수 있는 동일한 원칙이어도, 이러한 원칙은 소수의 변형된 miR-29c 작제물 및 shSLN 작제물의 설계에서 실례된다.
아래 실례된 모든 설계의 경우에, 채택된 설계 전략은, 천연 백본 서열의 2D 및 3D 구조를 보존하기 위해 측접 백본 서열, 루프 서열, 및 패신저 스트란드 뉴클레오타이드 서열을 조작하는 것을 포함한다. 이러한 맥락에서, miRNA/shRNA 설계의 경우에, 천연 백본 서열의 2D/3D 구조는 줄기 루프와 측접 백본 폴리뉴클레오타이드 서열 사이 거리, 중심 줄기의 구조, 벌지의 자리 및/또는 크기, 임의의 내부 루프의 존재 및 국소화 그리고 줄기 내의 미스매치 등을 주로 지칭한다. 선택된 miR-30E, miR-101, 및 miR-451 백본 서열-기반된 miR-29c 하이브리드 작제물을 위한 특정 예시적 2D 구조 맵은 아래에 실례로서 제공된다.
A. miR-30 백본 서열을 가진 하이브리드 miR-29c (29c-M30E)
Fellmann 등 (Cell Rep. 5(6):1704-1713, 2013, 본원에서 참고로 편입됨)은 내인성 마이크로RNA 상황에 내장된 합성 shRNA - 소위 "shRNAmir"의 최적 가공에 결정적으로 요구된 경우에 기저 줄기의 보존된 요소 3'를 식별함으로써, 실험적 miR-30 백본을 최적화하기 위한 체계적인 접근법을 기재한다. 생성된 최적화된 백본, 일명 "miR-E"는 성숙한 shRNA 수준 및 녹다운 효능을 강하게 증가시켰다. 이러한 접근법은 더욱 효과적 miR 및 shRNA를 생성하기 위하여 기존의 miR 및 shRNA 시약을 miR-E로 쉽게 전환시킬 수 있다.
이러한 기술을 적용하여, 29c-M30E 하이브리드 서열은 원하는 성숙한 miR-29c 서열, 및 Fellmann 등에서 기재된 조작된 / 최적화된 miR-30 백본 서열에 기반하여 생성되었다. 이러한 29c-M30E 서열 (이의 예측된 2D 구조에 대하여 도 29 참고)은 아래 실시예에서 사용된 하기 대상체 바이러스성 벡터에 편입되었다: μDys-29c-M30E-i2, EF1A-29c-M30E, U6-29c-M30E. 29c-M30E의 하기 5'→3' 서열은 연속 서열의 상이한 세그먼트를 실례하기 위해 상이한 라인으로 인공적으로 분리된 연속 서열이다.
Figure pct00007
구체적으로, 상기 연속 서열에서, 중간 라인은 패신저 스트란드 서열, 이중 밑줄친 루프 서열, 및 성숙한 miR-29c 가이드 서열을 나타낸다. 패신저 및 가이드 서열이 서로의 역 보체일 수 있고 잽싸게 되돌려서 개입하는 루프 서열과 줄기-루프 구조를 형성할 수 있다는 것을 주목한다. 하지만, 완벽한 역 보체 서열이 필요 없다는 것이 주목되어야 한다. 내부 벌지 등이 있을 수 있고, 그러므로 2개 스트란드는 일부 경우에서 서로에 반드시 100% 상보적이지 않다 (본 서브섹션의 마지막 서열에서 가이드 및 패신저 스트란드 참고). 최상부 라인 및 최하부 라인은 가이드 서열의 향상된 생산을 보장하기 위해 그리고 패신저 스트란드의 생산을 최소화하기 위해 최적화된 M30E 측접 백본 서열을 나타낸다.
비슷한 설계에서, 인간 SLN을 표적하는 siRNA는 miR-30E-hSLN-c1내 동일한 M30E 백본 서열에서 내장된다 (본 단락의 바로 위 및 아래 서열의 최상부 및 최하부 열, 그리고 이중 밑줄친 루프 서열을 비교한다). 그러나 가이드 및 패신저 스트란드는 상이하다. 이러한 소위 c1-M30E 서열은 아래 실시예에서 사용된 하기 대상체 바이러스성 벡터에 편입되었다: c1-M30E-i2, c1-M30E-3UTR, 및 c1-M30E-pa.
Figure pct00008
인간 SLN를 또한 표적하는 비슷하게 설계된 제2 siRNA는 miR-30E-hSLN-c2내 동일한 M30E 백본 서열에서 내장된다 (본 단락의 바로 위 및 아래 서열의 최상부 및 최하부 열, 그리고 이중 밑줄친 루프 서열을 비교한다). 그러나 가이드 및 패신저 스트란드는 상이하다. 이러한 소위 c2-M30E 서열은 아래 실시예에서 사용된 하기 대상체 바이러스성 벡터에 편입되었다: c2-M30E-i2, c2-M30E-3UTR, 및 c2-M30E-pa.
Figure pct00009
천연 miR-30 백본 서열 ("M30N")을 사용하는 변형된 miR-29c의 서열은 비교로서 아래 또한 제공된다. 이 경우에 가이드 스트란드가 루프 서열에 대해 5'인 것을 주목한다. 이러한 M30N 백본 서열은, 테스트된 실험 시스템에서 M30E 백본 서열보다 더 적은 정도로, 가이드 스트란드의 생산을 비슷하게 향상시켰다 (데이터 도시되지 않음).
Figure pct00010
B. miR-101 백본 서열을 가진 하이브리드 miR-29c (29c-101)
miR-101 백본 서열을 사용하는 상이한 miR-29c 하이브리드 (29c-101, 이의 예측된 2D 구조에 대하여 도 30 참고)는 본원에서 동일한 명명 전환을 사용하여 아래 실례된다. 여기에서, 최상부 열 및 마지막 2개 열은 miR-101의 백본 서열을 나타내고, 반면에 두번째 열은 패신저 스트란드, 루프 서열, 및 가이드 스트란드를 가진 성숙한 miR-29c이다. 이러한 29c-101 서열은 아래 실시예에서 사용된 하기 대상체 바이러스성 벡터에 편입되었다: μDys-29c-101-i2, μDys-29c-3UTR-101.
Figure pct00011
C. miR-155 백본 서열을 가진 하이브리드 miR-29c (29c-155)
miR-155 백본 서열을 사용하는 상이한 miR-29c 하이브리드 (29c-155)는 본원에서 동일한 명명 전환을 사용하여 아래 실례된다. 여기에서, 최상부 열 및 최하부 열은 miR-155의 측접 백본 서열을 나타내고, 반면에 두번째 열은 가이드 스트란드, 루프 서열, 및 패신저 스트란드를 가진 성숙한 miR-29c이다. 이러한 29c-155 서열은 아래 실시예에서 사용된 하기 대상체 바이러스성 벡터에 편입되었다: EF1A-29c-155.
Figure pct00012
miR-155 백본 서열을 또한 사용하는 또 다른 miR-29c 하이브리드 (29c-19nt)는 본원에서 동일한 명명 전환을 사용하여 아래 실례된다. 여기에서, 최상부 열 및 최하부 열은 (바로 위 서열에서의 것과 동일한) miR-155의 측접 백본 서열을 나타내고, 반면에 두번째 열은 가이드 스트란드, 루프 서열, 및 패신저 스트란드를 가진 성숙한 miR-29c이다. 루프 서열이, 상기 서열에서 17 nt 루프 대신, 여기에서 19 nt인 것을 주목한다. 이러한 29c-19nt 서열은 아래 실시예에서 사용된 하기 대상체 바이러스성 벡터에 편입되었다: EF1A-29c-19nt, 29c-19nt-μDys-pA, 29c-19nt-μDys-3UTR.
Figure pct00013
D. miR-155 백본 서열을 가진 하이브리드 shSLN (shmSLN-v2 & c1/c2-m155)
miR-155 백본 서열에서 shSLN은 본원에서 동일한 명명 전환을 사용하여 아래 실례된다. 여기에서, 최상부 열 및 최하부 열은 miR-155의 측접 백본 서열을 나타내고, 반면에 두번째 열은 가이드 스트란드, 루프 서열 (19 nt), 및 패신저 스트란드를 가진 마우스 SLN (shmSLN)를 표적하는 성숙한 shRNA이다. 이러한 shmSLN-v2 서열은 아래 실시예에서 사용된 하기 대상체 바이러스성 벡터에 편입되었다: EF1A-mSLN, 융합-v1, μDys-shmSLN-v1.
Figure pct00014
miR-155 백본 서열에서 shSLN은 본원에서 동일한 명명 전환을 사용하여 아래 실례된다. 여기에서, 최상부 열 및 최하부 열은 miR-155의 측접 백본 서열을 나타내고, 반면에 두번째 열은 가이드 스트란드, 루프 서열 (19 nt), 및 패신저 스트란드를 가진 마우스 SLN (shmSLN)을 표적하는 또 다른 성숙한 shRNA이다. 상기 비슷한 / 관련된 shmSLN 서열과 비교하여, 잉여의 디뉴클레오타이드 염기 쌍 TT:AA (또는 엄격히 말해서, siRNA의 3' 말단에서 UU)의 존재는 생산된 가이드 스트란드 siRNA의 증가된 효력과 연관되었다. 이러한 shmSLN-v2 서열은 아래 실시예에서 사용된 하기 대상체 바이러스성 벡터에 편입되었다: EF1A-mSLN-v2, 융합-v2, μDys-shmSLN-v2.
Figure pct00015
miR-155 백본 서열에서 또 다른 shSLN은 본원에서 동일한 명명 전환을 사용하여 아래 실례된다. 여기에서, 최상부 열 및 최하부 열은 miR-155의 측접 백본 서열을 나타내고, 반면에 두번째 열은 가이드 스트란드, 루프 서열 (19 nt), 및 패신저 스트란드를 가진 인간 SLN을 표적하는 성숙한 shRNA이다. 이러한 c1-m155 서열은 아래 실시예에서 사용된 하기 대상체 바이러스성 벡터에 편입되었다: c1-m155-pa, c1-m155-i2, c1-m155-3UTR.
Figure pct00016
miR-155 백본 서열에서 또 다른 shSLN은 본원에서 동일한 명명 전환을 사용하여 아래 실례된다. 여기에서, 최상부 열 및 최하부 열은 miR-155의 측접 백본 서열을 나타내고, 반면에 두번째 열은 상이한 가이드 스트란드, 루프 서열 (19 nt), 및 패신저 스트란드를 가진 인간 SLN을 표적하는 성숙한 shRNA이다. 이러한 c2-m155 서열은 아래 실시예에서 사용된 하기 대상체 바이러스성 벡터에 편입되었다: c2-m155-pa, c2-m155-i2, c2-m155-3UTR.
Figure pct00017
E. miR-451 백본 서열을 가진 하이브리드 miR-29c (29c-451)
miR-451 백본 서열을 사용하는 miR-29c 하이브리드 (29c-451, 이의 예측된 2D 구조에 대하여 도 31 참고)는 본원에서 동일한 명명 전환을 사용하여 아래 실례된다. 여기에서, 최상부 2 열 및 최하부 2 열은 miR-451의 측접 백본 서열을 나타내고, 반면에 세번째 열은 가이드 스트란드, 루프 서열, 및 패신저 스트란드를 가진 성숙한 miR-29c이다.
Figure pct00018
F. U6 구동된 miR-29c 및 shSLN
아래 실험 섹션은 또한 miR-29c만 또는 shSLN만을 발현시키는 특정 "솔로" 바이러스성 벡터 작제물의 용도를 기재한다. 그러한 솔로 발현 카셋트는 강한 Pol III U6 프로모터에 의해 구동된다. 그러한 서열이 변형된 miR-29c 또는 변형된 shSLN 서열에 속하지 않는 것은, 강한 U6 프로모터가 임의의 측접 뉴클레오타이드 서열 없이 pre-miRNA 또는 shSLN을 직접적으로 생성하기 때문이다. 비교 목적으로, 하지만, 그러한 서열은 동일한 명명법을 사용하여 여기에서 또한 열거된다.
U6 프로모터에 의해 구동된 miR-29c는 아래 실례된다 (U6-29c-v1). 여기에서, 두번째 열은 패신저 스트란드, 루프 서열, 및 가이드 스트란드를 가진 성숙한 miR-29c이다. 이것은 "솔로" 대조군 벡터를 생성하기 위해 pGFP-U6-shAAV-GFP 벡터에서 사용되었다. 아래 연속 서열의 첫번째 열에서 뉴클레오타이드는 U6 프로모터에서 전사 시작 부위 후에 첫 5개 뉴클레오타이드이고, T6 전사 종료 서열은 아래 연속 서열의 마지막 열에서 클로닝에 사용된 서열에 프레시드.
Figure pct00019
U6 프로모터에 의해 구동된 shSLN은 아래 실례된다 (U6-shmSLN-v1). 여기에서, 두번째 열은 패신저 스트란드, 루프 서열, 및 가이드 스트란드를 가진 성숙한 shSLN이다. 이것은 실시예에서 U6-shmSLN-v1 벡터에서 사용되었다.
Figure pct00020
U6 프로모터에 의해 구동된 shSLN은 아래 실례된다 (U6-mSLN-v4). 여기에서, 두번째 열은 패신저 스트란드, 루프 서열, 및 가이드 스트란드를 가진 성숙한 shSLN이다. 이것은 실시예에서 U6-mSLN-v4 벡터에서 사용되었다 (도 15 참고).
Figure pct00021
조성물 및 약학적 조성물
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 rAAV를 포함하는 조성물을 고려한다. 본 발명의 조성물은 rAAV 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 조성물은 기타 구성성분 예컨대 희석제 및 아쥬반트를 또한 포함할 수 있다. 허용가능한 담체, 희석제 및 아쥬반트는 이식자에 비독성이고 바람직하게는 이용된 투약 및 농도에서 불활성이고, 완충액 예컨대 인산염, 시트르산염, 또는 기타 유기 산; 항산화제 예컨대 아스코르브산; 저분자량 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트 제제 예컨대 EDTA; 당 알코올 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제 예컨대 Tween, 플루로닉스(pluronics) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
용량화 및 투여
본 발명의 방법에서 투여되어야 하는 rAAV의 역가는, 예를 들어, 특정한 rAAV, 투여의 모드, 치료 목표, 개체, 및 표적화 중인 세포 유형(들)에 따라 다양할 것이고, 당업계에서 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. rAAV의 역가는 약 1×106, 약 1×107, 약 1×108, 약 1×109, 약 1×1010, 약 1×1011, 약 1×1012, 약1×1013, 내지 약 1×1014 또는 초과 DNase 내성 입자 (DRP) / ml 범위일 수 있다. 투약은 바이러스성 게놈 (vg)의 단위로 또한 표현될 수 있다.
표적 세포를 rAAV로, 생체내 또는 시험관내 형질전환시키는 방법은 본 발명에 의해 고려된다. 생체내 방법은 본 발명의 rAAV를 포함하는 조성물의 효과적 용량, 또는 효과적 다중 용량을 치료가 필요한 (인간을 포함한) 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 용량이 장애/질환의 발생에 앞서 투여되면, 투여는 예방적이다. 용량이 장애/질환의 발생 후 투여되면, 투여는 치료적이다. 본 발명의 구현예에서, 효과적 용량은 치료 중인 장애/질환 상태와 연관된 적어도 하나의 증상을 완화 (제거 또는 감소)시키는, 장애/질환 상태로의 진행을 둔화시키거나 예방하는, 장애/질환 상태의 진행을 둔화시키거나 예방하는, 질환의 정도를 하락시키는, 질환의 (부분 또는 전체) 회븍을 초래하는, 및/또는 생존을 연장시키는 용량이다. 본 발명의 방법으로 예방 또는 치료하도록 고려된 질환의 예는 미엘린 생산, 퇴화, 재생, 또는 기능에서의 결점을 특징으로 하는 PMD 또는 기타 질환이다.
투여의 경우에, (본원에서 용량으로서 또한 지칭된) 유효량 및 치료적으로 유효량은 시험관내 검정 및/또는 동물 모델 연구로부터 결과에 기반하여 초기에 추정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 세포 배양물에서 결정된 경우에 IC50을 포함하는 순환하는 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 그러한 정보는 관심의 대상체에서 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다.
조성물의 효과적 용량의 투여는, 비제한적으로, 근육내, 비경구, 정맥내, 경구, 구강, 비강, 폐, 두개내, 골강내, 안구내, 직장, 또는 질을 포함하는 당업계에서 표준 경로에 의한 것일 수 있다. 본 발명의 rAAV (특히, AAV ITRs 및 캡시드 단백질)의 AAV 성분의 혈청형(들) 및 투여의 경로(들)는 하나 이상의 코딩 서열 및/또는 마이크로-디스트로핀을 발현시키기 위한 표적 세포/조직(들) 그리고 치료 중인 감염 및/또는 질환 상태를 고려하여 당업자에 의해 선택 및/또는 매칭될 수 있다.
구체적으로, 본원에서 기재된 제형은 제한 없이 주사, 주입, 관류, 흡입, 세척, 및/또는 섭취에 의해 투여될 수 있다. 투여의 경로는 비제한적으로 정맥내, 피내, 동맥내, 복강내, 병변내, 두개내, 관절내, 전립선내, 흉막내, 기관내, 비강내, 유리체내, 질내, 직장내, 국소, 종양내, 근육내, 방광내, 심낭내, 제대내, 안구내, 점막, 경구, 피하, 및/또는 결막하를 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 조합 요법을 포함하는 본 발명의 rAAV 및 조성물의 효과적 용량의 국소 투여 또는 전신 투여를 제공한다. 예를 들어, 전신 투여는 전신이 영향받도록 순환계에 투여된다. 전신 투여는 장내 투여 예컨대 위장관을 통한 흡수 및 주사, 주입 또는 이식을 통한 비경구 투여를 포함한다.
특히, 본 발명의 rAAV의 실제 투여는 rAAV 재조합 벡터를 동물의 표적 조직, 예컨대 골격 근육에 수송할 임의의 물리적 방법을 사용함으로써 성취될 수 있다. 본 발명에 따른 투여는, 비제한적으로, 근육, 혈류에 및/또는 직접적으로 간에 주사를 포함한다. 인산염 완충된 염수에 rAAV를 단순히 재-현탁시키는 것은 근육 조직 발현에 유용한 비히클을 제공하는데 충분한 것으로 입증되었고, (DNA를 분해하는 조성물이 rAAV를 이용하여 정상 방식으로 회피되어야 하지만) rAAV와 공-투여될 수 있는 담체 또는 기타 성분에 공지된 국한이 없다. rAAV의 캡시드 단백질은 rAAV가 관심의 특정한 표적 조직 예컨대 근육에 표적되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, WO 02/053703을 참고하고, 이의 개시내용은 본원에서 참고로 편입된다.
약학적 조성물은 경피 수송에 의해 근육에 전달되도록 국부 제형으로서 또는 주사가능한 제형으로서 제조될 수 있다. 양쪽 근육내 주사 및 경피 수송을 위한 수많은 제형은 이전에 개발되었고 본 발명의 실무에서 사용될 수 있다. rAAV는 투여 및 취급의 용이성을 위하여 임의의 약학적으로 허용가능한 담체와 사용될 수 있다.
본원에서 개시된 방법에서 투여되기 위한 rAAV의 용량은, 예를 들어, 특정한 rAAV, 투여의 모드, 치료 목표, 개체, 및 표적화 중인 세포 유형(들)에 따라 다양할 것이고, 당업계에서 표준 방법에 의해 결정될 수 있다.
특정한 대상체에 투여된 실제 용량화 양은, 파라미터 예컨대, 비제한적으로, 체중, 병태의 중증도, 질환의 유형, 이전의 또는 병발 치료적 개입, 대상체의 특발증, 및/또는 투여의 경로를 고려하여, 의사, 수의사, 또는 연구자에 의해 또한 결정될 수 있다.
투여된 각 rAAV의 역가는 약 1×106, 약 1×107, 약 1×108, 약 1×109, 약 1×1010, 약 1×1011, 약 1×1012, 약1×1013, 약 1×1014, 또는 내지 약 1×1015 또는 초과 DNase 내성 입자 (DRP) / ml 범위일 수 있다. 투약량은 바이러스성 게놈 (vg) (즉, 1×107 vg, 1×108 vg, 1×109 vg, 1×1010 vg, 1×1011 vg, 1×1012 vg, 1×1013 vg, 1×1014 vg, 1×1015 vg, 각각)의 단위로 또한 표현될 수 있다. 투약량은 바이러스성 게놈 (vg) / 킬로그램 (kg)의 체중 (즉, 1×1010 vg/kg, 1×1011 vg/kg, 1×1012 vg/kg, 1×1013 vg/kg, 1×1014 vg/kg, 1×1015 vg/kg 각각)의 단위로 또한 표현될 수 있다. AAV 역가화 방법은 Clark 등, Hum. Gene Ther. 10:1031-1039, 1999에서 기재된다.
예시적 용량은 약 1×1010 내지 약 1×1015 벡터 게놈 (vg)/킬로그램의 체중 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 용량은 1×1010 vg/kg의 체중, 1×1011 vg/kg의 체중, 1×1012 vg/kg의 체중, 1×1013 vg/kg의 체중, 1×1014 vg/kg의 체중, 또는 1×1015 vg/kg의 체중을 포함할 수 있다. 용량은 1×1010 vg/kg/일, 1×1011 vg/kg/일, 1×1012 vg/kg/일, 1×1013 vg/kg/일, 1×1014 vg/kg/일, 또는 1×1015 vg/kg/일을 포함할 수 있다. 용량은 0.1 mg/kg/일 내지 5 mg/kg/일 또는 0.5 mg/kg/일 내지 1 mg/kg/일 또는 0.1 mg/kg/일 내지 5 μg/kg/일 또는 0.5 mg/kg/일 내지 1 μg/kg/일 범위일 수 있다. 기타 비-제한 예에서, 용량은 1 μg/kg/일, 5 μg/kg/일, 10 μg/kg/일, 50 μg/kg/일, 100 μg/kg/일, 200 μg/kg/일, 350 μg/kg/일, 500 μg/kg/일, 1 mg/kg/일, 5 mg/kg/일, 10 mg/kg/일, 50 mg/kg/일, 100 mg/kg/일, 200 mg/kg/일, 350 mg/kg/일, 500 mg/kg/일 또는 1000 mg/kg/일을 포함할 수 있다. 치료적으로 유효량은 치료 레지멘의 과정 (즉, 일, 주, 개월, 등) 도중 단일 또는 다중 용량을 투여함으로써 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 적어도 1.6×1013 벡터 게놈을 갖는 10 mL의 수용액의 투약량 형태이다. 일부 구현예에서, 투약량은 적어도 2×1012 벡터 게놈 / 밀리리터의 역가를 갖는다. 일부 구현예에서, 투약량은 pH 6.0에 10 mM L-히스티딘, 150 mM 염화나트륨, 및 1 mM 염화마그네슘을 포함하는 멸균 수용액을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 pH 6.0에 10 mM L-히스티딘, 150 mM 염화나트륨, 및 1 mM 염화마그네슘을 포함하는; 그리고 적어도 1.6×1013 벡터 게놈을 갖는 10 mL의 멸균 수용액의 투약량 형태이다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 10 mL 수용액내 1×1010 내지 1×1015 벡터 게놈; 10 mL 수용액내 1×1011 내지 1×1014 벡터 게놈; 10 mL 수용액내 1×1012 내지 2×1013 벡터 게놈; 또는 10 mL 수용액내 약 1.6×1013 벡터 게놈 이상을 포함하는 투약량일 수 있다. 일부 구현예에서 수용액은 멸균 수용액이다 약 10 mM L-히스티딘 pH 6.0을 150 mM 염화나트륨, 및 1 mM 염화마그네슘과 포함한다. 일부 구현예에서, 투약량은 약 1×1011 벡터 게놈 / 밀리리터 (vg/mL) 초과, 약 1×1012 vg/mL 초과, 약 2×1012 vg/mL 초과, 약 3×1012 vg/mL 초과, 또는 약 4×1012 vg/mL 초과의 역가를 갖는다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 AAV 벡터는 약학적 조성물의 일부로서 제공된다. 약학적 조성물은, 예를 들어, 적어도 0.1% w/v의 AAV 벡터를 포함할 수 있다. 일부 기타 구현예에서, 약학적 조성물은 2% 내지 75%의 화합물 / 약학적 조성물의 중량, 또는 25% 내지 60%의 화합물 / 약학적 조성물의 중량을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 투약량은 키트 안에 있다. 키트는 투약량의 사용을 위한 지침을 추가로 포함할 수 있다.
근육내 주사의 목적으로, 아쥬반트 예컨대 참기름이나 낙화생유에서 또는 수성 프로필렌 글리콜에서 용액, 뿐만 아니라 멸균 수용액은 이용될 수 있다. 그러한 수용액은, 원한다면, 완충될 수 있고, 액체 희석제가 염수 또는 글루코스로 먼저 등장성이 될수 있다. 유리 산 (DNA가 산성 인산염 기를 함유한다) 또는 약리학적으로 허용가능한 염으로서 rAAV의 용액은 계면활성제 예컨대 하이드록시프로필셀룰로스와 적당히 혼합된 물에서 제조될 수 있다. rAAV의 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물에서 그리고 오일에서 또한 제조될 수 있다. 일반적인 저장 및 사용 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 예방하기 위해 방부제를 함유한다. 이와 관련하여, 이용된 멸균 수성 배지는 당업자에게 널리-공지된 표준 기술에 의해 모두 용이하게 수득가능하다.
일부 구현예에서, 주사의 경우에, 제형은 수용액으로서, 예컨대, 비제한적으로, 항크액, 링거액, 및/또는 생리학적 염수를 포함하는 완충액으로 만들어질 수 있다. 용액은 제형성 제제 예컨대 현탁, 안정화, 및/또는 분산 제제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 제형은 사용 전에 적당한 비히클 대조군 (예를 들면, 멸균 무발열원 수)과 구성을 위하여 동결건조된 및/또는 분말 형태일 수 있다.
본원에 개시된 임의의 제형은 조사, 예방적, 및/또는 치료적 처치를 위하여, 투여의 이익을 능가할 수 있는 상당히 불리한, 알레르기성, 또는 기타 유해 반응을 생산하지 않는 것들을 포함하는 임의의 기타 약학적으로 허용가능한 담체 또는 담체들을 유리하게 포함할 수 있다. 예시적 약학적으로 허용가능한 담체 및 제형은, 동종에 관한 이의 교시를 위하여 본원에서 참고로 편입되는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Printing Company, 1990에서 개시된다. 더욱이, 제형은 미국 FDA의 생물학적 표준 및 품질 관리 부서 및/또는 기타 관련 미국 및 외국 규제 기관에 의해 요구된 경우에 무균성, 발열원성, 일반 안전, 및 순도 표준을 충족하도록 제조될 수 있다.
예시적, 일반적으로 사용된 약학적으로 허용가능한 담체는 비제한적으로 벌크화 제제 또는 충전제, 용매 또는 공-용매, 분산매, 코팅물, 계면활성제, 항산화제 (예를 들면, 아스코르브산, 메티오닌, 및 비타민 E), 방부제, 등장성 제제, 흡수 지연 제제, 염, 안정화제, 완충 제제, 킬레이트 제제 (예를 들면, EDTA), 젤, 결합제, 붕해 제제, 및/또는 윤활제를 포함할 수 있다.
예시적 완충 제제는 비제한적으로 시트르산염 완충액, 숙신산염 완충액, 타르트산염 완충액, 푸마르산염 완충액, 글루콘산염 완충액, 옥살산염 완충액, 락트산염 완충액, 아세트산염 완충액, 인산염 완충액, 히스티딘 완충액, 및/또는 트리메틸아민 염을 포함할 수 있다.
예시적 방부제는 비제한적으로 페놀, 벤질 알코올, 메타-크레졸, 메틸파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤잘코늄 할라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 알킬 파라벤 (예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤), 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥산올, 및/또는 3-펜탄올을 포함할 수 있다.
예시적 등장성 제제는 비제한적으로 3가 이상 당 알코올을 포함하는 다가 당 알코올, (예를 들면, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨, 및/또는 만니톨)을 포함할 수 있다.
예시적 안정화제는 비제한적으로 유기 당, 다가 당 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 황-함유 환원 제제, 아미노산, 저분자량 폴리펩타이드, 단백질, 면역글로불린, 친수성 중합체 및/또는 다당류를 포함할 수 있다.
제형은 또한 데포 제제일 수 있다. 일부 구현예에서, 그러한 장기-작용성 제형은 제한 없이 (예를 들면, 피하로 또는 근육내로) 이식에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 화합물은 적당한 중합체성 및/또는 소수성 물질 (예를 들면, 허용가능한 오일에서 유탁액으로서) 또는 이온 교환 수지로, 또는 난용성 유도체로서 (예를 들면, 난용성 염으로서) 제형화될 수 있다.
추가적으로, 다양한 구현예에서 AAV 벡터는 지속-방출 시스템, 예컨대 AAV 벡터를 포함하는 고체 중합체의 반투과성 매트릭스를 사용하여 전달될 수 있다. 다양한 지속-방출 물질은 확립되었고 당업자에 의해 널리 공지된다. 지속-방출 캡슐은 그들의 화학적 성격에 따라 투여 후 몇 주 내지 최대 100 일 이상 동안 벡터를 방출시킬 수 있다.
주사가능한 용도에 적당한 약학적 담체, 희석제 또는 부형제는 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말 그리고 멸균 수용액 또는 분산액을 포함한다. 모든 경우에 상기 형태는 멸균이어야 하고 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유체이어야 한다. 제조 및 저장의 조건 하에서 안정해야 하고 미생물 예컨대 박테리아 및 곰팡이의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 기타 등등), 이들의 적당한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적합한 유동성은, 예를 들어, 코팅물 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구된 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균 제제 및 항진균 제제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 및 기타 등등에 의해 발생될 수 있다. 많은 경우에 등장성 제제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 발생될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 필요시 상기 열거된 다양한 기타 구성성분과 적절한 용매에서 요구된 양으로 rAAV를 편입시키고, 이어서 필터 멸균화에 의해 제조된다. 일반적으로, 분산액은 멸균화된 활성 구성성분을 상기 열거된 것들로부터 염기성 분산매 및 요구된 기타 구성성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 구성성분 더하기 임의의 추가의 원하는 구성성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 냉동 건조 기법이다.
rAAV를 이용한 형질도입은 또한 시험관내 실시될 수 있다. 일 구현예에서, 원하는 표적 근육 세포는 대상체로부터 제거되어, rAAV로 형질도입되고 대상체에 재도입된다. 대안적으로, 상승작용성 또는 이종발생성 근육 세포는 그들 세포가 대상체에서 적절하지 않은 면역 반응을 생성하지 않을 경우에 사용될 수 있다.
적당한 형질도입 방법 및 형질도입된 세포의 대상체로의 재도입은 당업계에서 공지된다. 일 구현예에서, 세포는, 예를 들면, 적절한 배지에서 rAAV를 근육 세포와 조합시키고, 종래의 기법 예컨대 서던 블랏 및/또는 PCR을 사용하여 관심의 DNA를 갖는 그들 세포를 스크리닝함으로써, 또는 선택가능한 마커를 사용함으로써 시험관내 형질도입될 수 있다. 형질도입된 세포는 그 다음 약학적 조성물로 제형화될 수 있고, 조성물은, 예를 들면, 카테터를 사용하여, 다양한 기법에 의해, 예컨대 근육내, 정맥내, 피하 및 복강내 주사에 의해, 또는 평활 근육 및 심장 근육에 주사함으로써 대상체에 도입될 수 있다.
본 발명의 rAAV를 가진 세포의 형질도입은 상기 하나 이상의 추가의 코딩 서열 및 마이크로-디스트로핀의 지속된 공-발현을 초래한다. 본 발명은 따라서 상기 하나 이상의 추가의 코딩 서열 및 마이크로-디스트로핀을 동물, 바람직하게는 인간에게 공-발현시키는 rAAV의 투여/전달 방법을 제공한다. 이들 방법은 (비제한적으로, 조직 예컨대 근육, 기관 예컨대 간 및 뇌, 그리고 샘 예컨대 침샘을 포함한) 조직을 본 발명의 하나 이상의 rAAV로 형질도입하는 단계를 포함한다. 형질도입은 조직 특이적 제어 요소를 포함하는 유전자 카셋트로 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 하나의 구현예는, 비제한적으로, 액틴 및 미오신 유전자 계열에서, 예컨대 myoD 유전자 계열에서 유래된 것들을 포함하는, 근육 특이적 제어 요소 (See Weintraub 등, Science 251:761-766, 1991), 근세포-특이적 인핸서 결합 인자 MEF-2 (Cserjesi 및 Olson, Mol Cell Biol 11:4854-4862, 1991), 인간 골격 액틴 유전자에서 유래된 제어 요소 (Muscat 등, Mol Cell Biol 7:4089-4099, 1987), 심장 액틴 유전자, 근육 크레아틴 키나제 서열 요소 (Johnson 등, Mol Cell Biol 9:3393-3399, 1989), 및 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서 (mCK) 요소, 골격 속근 트로포닌 C 유전자, 지근 심장 트로포닌 C 유전자 및 지근 트로포닌 I 유전자에서 유래된 제어 요소: 저산소증-유도성 핵 인자 (Semenza 등, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 88:5680-5684, 1991), 스테로이드-유도성 요소 및 글루코코르티코이드 반응 요소 (GRE)를 포함하는 프로모터 (Mader 및 White, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5603-5607, 1993 참고), 및 기타 제어 요소에 의해 구동된 근육 세포 및 근육 조직의 형질도입 방법을 제공한다.
근육 조직이 생체내 DNA 전달을 위한 매력적인 표적인 것은, 중요한 기관이 아니고 접근하기 쉽기 때문이다. 본 발명은 형질도입된 근섬유로부터 miRNA 및 마이크로-디스트로핀의 지속된 공-발현을 고려한다.
본원에서 사용되는 경우에, "근육 세포" 또는 "근육 조직"은 임의의 종류의 근육 (예를 들면, 소화관, 방광, 혈관 또는 심장 조직으로부터, 예를 들어, 골격 근육 및 평활 근육)에서 유래된 세포 또는 세포들의 그룹을 의미한다. 그러한 근육 세포, 예컨대 근아세포, 근세포, 근관세포, 심근세포 및 심근모세포는 분화될 수 있거나 분화되지 않을 수 있다.
용어 "형질도입"은, 이식자 세포에 의해 하나 이상의 추가의 코딩 서열 및 마이크로-디스트로핀의 공-발현을 초래하는 본 발명의 복제-결핍 rAAV를 통해, 생체내 또는 시험관내 이식자 세포에 마이크로-디스트로핀의 코딩 영역 및 하나 이상의 추가의 코딩 서열의 투여/전달을 지칭하는데 사용된다.
따라서, 본 발명은 치료가 필요한 환자에게 상기 하나 이상의 추가의 코딩 서열 및 마이크로-디스트로핀을 인코딩하는 rAAV의 효과적 용량 (또는 본질적으로 동시에 투여된 용량들, 또는 간격으로 주어진 용량들)의 투여 방법을 제공한다.
AAV 생산
AAV 벡터의 필요한 복제 (rep) 및 구조적 (cap) 단백질을 인코딩하는 유전자는 AAV 벡터로부터 결실되어 서열의 삽입이 잔류 말단 반복부 서열들 사이 전달되도록 한다. 따라서 AAV 벡터의 성장의 경우에, 헬퍼 바이러스가 요구되고, 뿐만 아니라 rep 및 cap 단백질을 인코딩하는 유전자는 감염된 세포에 전달될 필요가 있다. 대안적으로, rep 및 cap 단백질을 인코딩하는 유전자는 생산에 사용된 세포에서 존재할 필요가 있다.
본 발명의 방법에 적당한 AAV 벡터는 임의의 기술-인식된 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 최근 검토에서, Penaud-Budloo 등 (Molecular Therapy: Methods & Clinical Development Vol. 8, pages 166-180, 2018)은 rAAV를 생산하기 위한 가장 흔히 사용된 업스트림 방법의 검토를 제공하였다. 거기에 기재된 각 방법은 본원에서 참고로 편입된다.
패키징 세포주 (HEK293)의 일시적 형질감염
특히, 특정 구현예에서, AAV 벡터는 패키징 세포주 예컨대 HEK293 세포의 일시적 형질감염을 사용하여 생산된다. 이것은 인간 배아 HEK293 세포의 플라스미드 형질감염을 포함하는 가장 확립된 AAV 생산 방법이다. 전형적으로, HEK293 세포는, 양이온성 중합체인, 인산칼슘 또는 폴리에틸렌이민 (PEI)을 사용하여, (관심의 유전자, 예컨대 디스트로핀 미니유전자 및 하나 이상의 추가의 코딩 서열 양쪽을 인코딩하는 대상체 폴리뉴클레오타이드를 함유하는) 벡터 플라스미드, 및 1개 또는 2개 헬퍼 플라스미드에 의해 동시에 형질감염된다.
헬퍼 플라스미드(들)는 4개 Rep 단백질, 3개 AAV 구조적 단백질 VP1, VP2, 및 VP3, AAP, 그리고 아데노바이러스성 보조 기능 E2A, E4, 및 VARNA의 발현을 허용한다. rAAV 복제에 필요한 추가의 아데노바이러스성 E1A/E1B 공-인자는 HEK293 프로듀서 세포에서 발현된다. rep-cap 및 아데노바이러스성 헬퍼 서열은, 형질감염을 위하여 양쪽 삼중 플라스미드 시스템 및 2개 플라스미드 시스템이 가능하므로, 2개 별도 플라스미드에서 클로닝되거나 1개 플라스미드에서 조합된다. 삼중 플라스미드 프로토콜은 하나의 혈청형부터 또 다른 혈청형으로 쉽게 스위칭될 수 있는 cap 유전자로 다용성을 제공한다.
플라스미드는 박테리아성 기원 및 항-생물-저항성 유전자를 사용하는 E. 콜리에서 종래 기법에 의해 또는 미니서클 기술에 의해 일반적으로 생산된다.
유착성 HEK293 세포에서 일시적 형질감염은 rAAV 벡터의 대규모 제조에 사용되었다. 최근에, HEK293 세포는 장기간에서 경제적으로 생존하기 위한 현탁 조건에 또한 적응되었다.
HEK293 계통은 무혈청 현탁 F17, Expi293, 또는 기타 제조업체-특이적 배지에서 유지되는 현탁 HEK293 세포를 제외하고, L-글루타민, 5%-10%의 태아 소 혈청 (FBS), 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 완성된 DMEM에서 일반적으로 번식된다. 유착성 세포의 경우에, FBS의 백분율은 동물-유래된 성분에 의한 오염을 제한하기 위해 AAV 생산 도중 감소될 수 있다.
일반적으로 rAAV 벡터는 혈청형에 따라 세포 펠렛 및/또는 상청액으로부터 플라스미드 형질감염 48-72 시간 후 회복된다.
재조합 바큘로바이러스를 이용한 곤충 세포의 감염
바큘로바이러스-Sf9 플랫폼은 포유류 세포에서 GMP-호환성 및 확장가능성 대안 AAV 생산 방법으로서 확립되었다. 미정제 수확물에서 세포당 최대 2×105 벡터 게놈 (vg)를 생성할 수 있다.
현행 프로토콜은 Rep78/52 및 Caps의 합성을 허용하는 바큘로바이러스 발현 벡터 (BEV) 2개 재조합 바큘로바이러스, 및 AAV ITR에 의해 측접된 관심의 유전자를 운반하는 재조합 바큘로바이러스로 Sf9 곤충 세포의 감염을 포함한다. 몇몇 무혈청 배지는 현탁액에서 Sf9 세포 성장을 위하여 적응된다.
이중-바큘로바이러스-Sf9 생산 시스템은 이들 안전성 쟁점에 관하여 기타 생산 플랫폼보다 많은 이익을 갖는다: (1) 무혈청 배지의 사용; (2) Sf 세포주에서 부정 바이러스 전사물의 발견에도 불구하고, 곤충을 감염시키는 대부분의 바이러스가 포유류 세포에서 활발하게 복제하지 않음; 및 (3) 헬퍼 바이러스가 바큘로바이러스 이외에 곤충 세포에서 rAAV 생산에 요구되지 않음.
특정 구현예에서, Rep 및 Cap 단백질을 발현시키는 안정한 Sf9 곤충 세포주는 사용되고, 따라서 고수율로 감염성 rAAV 벡터의 생산을 위하여 단 하나의 재조합 바큘로바이러스의 감염을 요구한다.
rHSV 벡터를 이용한 포유류 세포의 감염
HSV는 묵인적 세포에서 AAV의 복제를 위한 헬퍼 바이러스이다. 따라서, HSV는 생산하는 세포에 AAV 게놈 복제 및 패키징을 지원하는 필요한 AAV 기능을 전달하기 위해 양쪽 헬퍼 및 셔틀의 역할을 할 수 있다.
rHSV를 이용한 공-감염에 기반된 AAV 생산은 다량의 rAAV를 효율적으로 생성할 수 있다. 전반적 고수율 (최대 1.5×105 vg/세포) 외에, 본 방법은 개선된 바이러스성 효력에 의해 측정된 경우에 분명히 증가된 품질을 가진 rAAV 스톡을 창출한다는 점에서 추가로 유리하다.
이러한 방법에서, 세포, 전형적으로 햄스터 BHK21 세포주 또는 HEK293 및 유도체는, AAV ITR (rHSV-AAV)에 의해 묶어진 관심의 유전자를 운반하는 하나, 및 원하는 혈청형 (rHSVrepcap)의 AAV rep 및 cap ORF를 가진 두번째인, 2개 rHSV로 감염된다. 2-3 일후, 세포 및/또는 배지는 수집되고, rAAV는 다중 정제 단계 동안 정제되어 세포성 불순물, HSV-유래된 오염물, 및 패키징되지 않은 AAV DNA를 제거한다.
따라서 일부 구현예에서, HSV는 AAV 감염을 위한 헬퍼 바이러스의 역할을 한다. 일부 구현예에서, AAV 성장은 결실된 ICP27과 HSV의 비-복제 돌연변이체를 사용하여 성취된다.
포유류 세포에서 재조합 AAV 바이러스성 입자의 특정 생산 방법은 당업계에서 공지되었고 지난 10년 동안 개선되었다. 예를 들어, 미국 출원 공개 번호 20070202587은 2개 이상의 복제-결함 재조합 HSV 벡터를 이용한 세포의 공-감염에 기반된 포유류 세포에서 재조합 AAV 생산을 기재한다. 미국 출원 공개 번호 20110229971 및 Thomas 등 (Hum. Gene Ther. 20(8):861-870, 2009)은 현탁-적응된 포유류 세포의 재조합 HSV 유형 1 공감염을 사용하는 확대가능한 재조합 AAV 생산 방법을 기재한다. Adamson-Small 등 (Hum. Gene Ther. Methods 28(1):1-14, 2017)은 HSV 시스템을 사용하는 무혈청 현탁액 제조 플랫폼에서 개선된 AAV 생산 방법을 기재한다.
포유류 안정한 세포주
rAAV 벡터는 rep 및 cap 유전자를 안정하게 발현시키는 안정한 포유류 프로듀서 세포를 사용하여 또한 효율적이고 확대가능하게 생산될 수 있다. 그러한 세포는 (유전적으로 안정하고 고 역가로 쉽게 생산될 수 있는) 야생형 Ad5 헬퍼 바이러스에 의해 감염되어 rep 및 cap의 고-수준 발현을 유도할 수 있다. 감염성 rAAV 벡터는 야생형 Ad 유형 5로 이들 패키징 세포주의 감염시 생성될 수 있고, 플라스미드 형질감염에 의해 또는 재조합 Ad/AAV 하이브리드 바이러스를 이용한 감염 후 rAAV 게놈을 제공할 수 있다.
대안적으로, Ad는 헬퍼 바이러스로서 HSV-1에 의해 대체될 수 있다.
적당한 안정한 포유류 프로듀서 세포는 HeLa-유래된 프로듀서 세포주, A549 세포, 또는 HEK293 세포를 포함할 수 있다. 바람직한 HeLa 세포주는 현탁 적응된 HeLa 아클론인 HeLaS3 세포이다.
본원에서 기재된 방법은 바람직하게는 250-L 척도, 또는 2,000-L 상업적 척도로 동물 성분 없는 배지에서 대상체 AAV 벡터를 제조하는데 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1 C2C12 세포에서 마이크로D5 (SGT001) 작제물의 발현 검증
마이크로D5 (SGT-001) 마이크로-디스트로핀 이식유전자가 동일한 AAV 벡터에 삽입된 마이크로RNA (예컨대 miR-29c 코딩 서열) 또는 shRNA (예컨대 SLN에 대한 shRNA)를 위하여 추가의 코딩 서열 있거나 없이 시험관내 발현될 수 있는지를 확인하기 위해, C2C12 세포는 3개 AAV 바이러스성 작제물: 야생형 마이크로D5 (SGT-001) 작제물을 인코딩하는 것; 마이크로D5 (SGT-001) 및 miR-29c의 융합 작제물을 인코딩하는 것으로, miR-29c 코딩 서열이 마이크로D5 (SGT-001) 코딩 서열에 대해 이종성 인트론 영역 5'로 삽입된 것; 그리고 마이크로D5 (SGT-001) 및 SLN에 대한 shRNA의 융합 작제물을 인코딩하는 것으로, shRNA를 위한 코딩 서열은 SGT-001 코딩 서열에 대해 이종성 인트론 영역 5'로 삽입된 것에 의해 시험관내 감염되었다. 도 3 참고.
마이크로D5 (SGT-001) / miR-29c 융합 작제물이 양쪽 디스트로핀 미니유전자 산물 및 miR-29c RNA를 인코딩하는 초기 전사물을 생산할 것이 예측되었다. 마이크로D5 (SGT-001) / SLN에 대한 shRNA 융합 작제물이 양쪽 디스트로핀 미니유전자 산물 및 shRNA를 인코딩하는 초기 전사물을 생산할 것이 또한 예측되었다.
임의의 특정한 이론에 의해 구속됨의 바램 없이, 출원인은 융합 전사물의 후속 가공이 융합 mRNA의 사전-성숙한 절단 (예컨대 polyA 꼬리의 손실 야기)을 초래할 수 있다는 것을 또한 믿었다. 이것은, 추가의 코딩 서열 없이 야생형 마이크로디스트로핀 작제에 의해 감염된 것과 비교하여, 융합 작제물에 의해 감염된 C2C12 세포에서 마이크로디스트로핀의 감소된 발현에 기여할 수 있었다. 도 3 참고.
하지만, 실험은 마이크로D5 (SGT-001) 작제물이 (마이크로디스트로핀 유전자 산물에 특이적인 항체를 사용하는 면역형광성 염색에 의한 증거로서) 원하는 마이크로디스트로핀 단백질을 성공적으로 발현한다는 것을 확인하였고, 상기 발현은 약간 감소된 / 억제된 / 억압된 수준에서라도 miR-29c 또는 shRNA 융합 작제물로 감염된 C2C12 세포에서 지속한다.
비슷한 실험은 기타 융합 작제물에 대하여 또한 실행되었고, 여기에서 miR-29c 코딩 서열은 프로모터와 마이크로D5 (SGT-001) 코딩 서열 사이 이종성 인트론에서 상이한 자리에 삽입되었다. 다양한 융합 작제물 Imir2, Imir3, Imir4, 및 Imir5를 위한 삽입 자리에 대하여 도 11 참고.
삽입은 PCR에 의해 삽입된 코딩 서열 있거나 없이 인트론 서열을 증폭시킨 후 확인되었고, 증폭 산물은 전기영동에 의해 분석되었다. 예를 들어, 88-bp miR-29c 코딩 서열의 삽입은 PCT 증폭 산물의 크기를 100 bp 직전만큼 증가시켰다.
융합 작제물은 그 다음 감염된 C2C12 세포에서 마이크로D5 (SGT-001) 발현이 영향받는지를 결정하기 위해 몇몇 실험에서 사용되었다.
이러한 특정한 실험에서, shRNA를 위한 코딩 서열의 존재가, 형질감염 1 일후, 형질감염된 C2C12 세포에서 마이크로디스트로핀 발현을 초기에 방해하였다는 것이 분명하다. 하지만, 마이크로디스트로핀 발현은 재빨리 포착하였고, 이로써 형질감염후 6 일차까지, 형질감염된 C2C12 세포에서 마이크로디스트로핀 발현이 AAV 벡터에서 shRNA를 위한 추가의 코딩 서열 있거나 없이 사실상 동일하였다. 도 8a-8c 참고.
데이터는 대상체 AAV 작제물이 마이크로디스트로핀 유전자 발현에 상당히 영향 없이 shRNA 또는 마이크로RNA에 대하여 추가의 코딩 서열을 포괄할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 2 사르콜리핀 (SLN)에 대한 shRNA를 위한 기능적 검정
본 실시예는 대상체 AAV 벡터에 삽입된 SLN (shSLN)에 대한 shRNA를 위한 코딩 서열이 SLN의 발현을 감소시키는 기능적 shRNA를 생산할 수 있다는 것을 입증한다.
도 4는 AAV 벡터에 의해 인코딩된 사르콜리핀-루시페라제 융합 리포터를 도시하는 개략도이다. C2C12 세포에, shSLN 있거나 없이 마이크로D5를 인코딩하는 AAV 및, 루시페라제-보유 리포터 공-형질감염시, SLN-루시페라제 융합의 발현을 감소시키기 위해 인코딩된 shSLN의 능력은 루시페라제 생성된 신호에 기반하여 사정될 수 있다.
도 5는 그러한 공-형질감염 실험의 대표적 결과를 도시한다. 구체적으로, 하나의 실험에서, 마이크로D5 ("SGT001")만을 인코딩하는 AAV 벡터를 이용한 SLN-루시페라제 융합 리포터 작제물의 공-형질감염은 강한 루시페라제 신호를 초래하였다. 한편으로, 또 다른 실험에서, 마이크로D5 및 shSLN ("SGT001 + SLN")을 인코딩하는 AAV 벡터를 이용한 SLN-루시페라제 융합 리포터 작제물의 공-형질감염은 루시페라제 신호의 86.7% 감소를 초래하여서, shSLN이 발현되었고 표적 유전자 (마이크로D5-루시페라제 융합) 발현을 감소시키는데 효과적이었음을 시사하였다.
도 6a는 사르콜리핀의 직접 면역염색에 기반된 shRNA(SLN) 기능적 테스트의 결과를 도시한다. 마이크로D5 (SGT-001) 디스트로핀 미니유전자 및 shRNA (shSLN)를 위한 코딩 서열을 인코딩하는 AAV9 벡터로 형질감염된 C2C12 세포에서, 내인성 SLN 발현은, 마이크로D5 (SGT-001) 디스트로핀 미니유전자만을 인코딩하는 동일한 벡터로 형질감염된 C2C12 세포와 비교하여, 55%만큼 감소되었다. 도 6b에서 면역형광성 이미지 참고.
AAV 벡터에서 shRNA(SLN) 코딩 서열의 기능은 근소포체로의 칼슘 재-흡수 측정에 기반하여 추가로 테스트되었다.
근소포체(소포체) Ca2+-ATPases (Sarco(Endo)plasmic Reticulum Ca2+-ATPases; SERCA)는 시토졸로부터 Ca2+의 근육 세포내 근소포체의 내강으로의 ATP-의존적 수송을 촉매화하는 막횡단 단백질이다. SLN 유전자에 의해 인코딩된 사르콜리핀은 ATP 가수분해의 속도에 영향 없이 근소포체에서 Ca2+의 축적을 감소시킴으로써 몇몇 SERCA를 조절하는 작은 막횡단 단백지질이다. 사르콜리핀의 절제는 심방 Ca2+ 일시적 진폭을 증가시키고 심방 수축성을 향상시켰다. 게다가, 사르콜리핀-무효 마우스로부터 심방은 이소프로테레놀 자극에 대한 반응을 둔화시켜, 심방내 베타-아드레날린 반응의 매개자로서 사르콜리핀을 암시한다.
따라서 기능적 shRNA(SLN)는 내인성 SLN의 발현 수준을 감소시키는 것으로 예상되어, SERCA에 더 적은 SLN 결합 및 따라서 근소포체에 칼슘 재-흡수의 방해로 이어질 것이다. 표현형적으로, 기능적 shRNA(SLN)를 발현시키는 효과는 과발현하는 SERCA, 예컨대 SERCA2a와 비슷할 것이고, 랫트에서 이의 과발현은 우심실 유두 근육의 이완 시간을 감소시키는 것으로 나타나, 근소포체로의 더 빠른 칼슘 재흡수를 시사한다.
실제로, 근소포체로의 더 빠른 칼슘 재흡수는 도　7에서 도시된 것이고, 이는 칼슘-결합 염료 Fluo-8에 의해 방출된 정상화된 형광성 신호를 보여준다.
Fluo-8 (Abcam)은 세포-투과성 중간 친화도 녹색 형광성 칼슘 결합 염료이다. 약 390 nM의 Kd에서 세포내 칼슘에 결합한다. 이의 형광 강도는 Ca2+ 결합시 증가한다.
Fluo-8 신호로 더 빠른 감소는, 비-형질감염된 C2C12 세포와 비교하여, 마이크로D5 (SGT-001)-shSLN을 인코딩하는 AAV 벡터에 의해 감염된 C2C12 세포에서, 그리고 마이크로D5 (SGT-001) 디스트로핀 미니유전자만을 인코딩하는 AAV 벡터에 의해 감염된 C2C12 세포에서 시토졸성 칼슘의 더 빠른 감소를 나타낸다.
다른 한편으로, 마이크로D5 (SGT-001) 디스트로핀 미니유전자 발현이 초기에 (즉, 감염 1 일후) 감소되었어도, 마이크로D5 (SGT-001) 디스트로핀 미니유전자 발현은, 세포가 AAV 작제물에 의해 감염된 수일 (예를 들면, 6 일)후, shSLN 코딩 서열 또는 shSLN 발현의 존재에 의해 크게 영향을 받지 않는다. 도 8a-8c 참고.
비교로, 감염 후 6 일차에, 내인성 SLN 발현은 55%만큼 감소된다. 도 6a 참고. 이것은 도 5의 SLN-루시페라제 리포터 검정에서 보여진 86% 감소와 일치한다.
이들 데이터는 양쪽 마이크로-디스트로핀 및 shSLN을 공-발현시키는 대상체 AAV 벡터가 동일한 AAV 벡터 상에서 양쪽 이식유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있고, 반면에 shSLN의 발현이 장기간에서 마이크로디스트로핀 미니유전자 발현에 부정적으로 영향을 주지 않는다는 생각을 뒷받침한다.
게다가, 발현된 shSLN은 루시페라제 리포터 검정, 뿐만 아니라 내인성 SLN 발현의 직접 측정 양쪽에 기반할 때 기능성으로 보인다.
실시예 3 융합 작제물로부터 코딩 서열의 시험관내 발현
본 발명의 융합 바이러스성 벡터는 관심의 기능적 유전자 또는 단백질 (GOI) 뿐만 아니라 특정 RNAi, 안티센스, sgRNA, miRNA 또는 이들의 억제제를 위하여 하나 이상의 코딩 서열을 발현시킬 수 있다. 본 발명의 재조합 바이러스성 벡터의 대표적, 비-제한 구성이 도 12에서 실례된다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 바이러스성 벡터는 기능적 디스트로핀 유전자 예컨대 상기 본원에서 기재된 μDys 유전자의 어느 하나의 버전을 발현시키도록 설계된 융합 AAV 벡터, 예컨대 AAV9 벡터일 수 있다. 동일한 융합 벡터는 또한 재조합 AAV9 벡터의 인트론 내에서, 3'-UTR 내에서, 또는 초기 전사물에서 polyA 신호 후에, 예컨대 polyA 신호 후 하지만 전사 종료 서열 전에, 또는 전사 종료 서열 후에 하나 이상의 추가의 코딩 서열(들)을 발현시킨다.
추가의 코딩 서열이 miRNA, 예컨대 miR-29c를 인코딩하는 경우에, miR-29c 코딩 서열의 백본 서열은 성숙한 miR-29c 서열을 위하여 주변 서열이 기타 miRNA, 예컨대 miR-30, -101, -155, 또는 -451를 위한 것 (상기 참고)으로부터 수득되도록 변형될 수 있다. miR-30, -101, -155, 또는 -451로부터의 것들에 의해 miR-29c의 천연 주변 서열을 대체하는 것이 miR-29c 표적 서열을 표적 (즉, miR-29c 표적 서열 표적화에 유용하지 않은 이의 보체 패신저 스트란드의 생산을 감소)하도록 설계된 miR-29c의 1개 스트란드 (즉, 가이드 스트란드)의 생산을 향상시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
대조군으로서, 몇몇 소위 솔로 발현 작제물은 동일한 벡터 배경에서 생성되었다. 이들 솔로 발현 작제물은 μDys 유전자를 발현시키지 않지만, 리포터 유전자 예컨대 EGFP 또는 GFP를 대신 발현시킬 수 있다.
예를 들어, 하나의 그러한 솔로 벡터는, 모두 EF1A 프로모터로부터, EGFP 코딩 서열의 인트론 서열 업스트림에 삽입된 miR-29c 코딩 서열을 발현시킬 수 있다. miR-29c 코딩 서열의 백본 서열은 miR-30, -101, -155, 또는 -451의 것에 의해 변형될 수 있다.
또 다른 그러한 솔로 벡터는 shRNA, 예컨대 SLN의 발현을 표적 / 하향-조절하는 shSLN을 발현시킬 수 있다. shRNA의 발현은 RNA Pol III에 의해 사용될 수 있는 U6 프로모터에 의해 구동될 수 있고, 이는 짧은 RNA 전사물의 강한 전사를 생산한다. shRNA 코딩 서열은 GFP를 위한 코딩 서열 전에 U6 전사 카셋트에서 인트론에 삽입될 수 있다.
몇몇 그러한 대표적 융합 또는 솔로 벡터는 시험관내 인간 iPS-유래된 심근세포를 형질감염시키는데 사용되었고, 감염된 심근세포에서 miR-29c의 발현은 결정되었고, 그 결과는 도 13에서 도시되었다.
구체적으로, 5개 솔로 작제물, 5개 융합 작제물, 및 대조 μDys 발현 작제물은 표준 절차에 따라 인간 iPS-유래된 심근세포에 형질감염되었다. 성숙한 miR-29c 수준은 Taqman 줄기-루프 QPCR을 통해 측정되었다. 테스트된 5개 솔로 작제물은 miR-30 (EF1A-29c-M30E 및 U6-29c-M30E) 및 miR-155 (EF1A-29c-19nt 및 EF1A-29c-155) 백본에서 설계된 U6- 또는 EF1A- 구동된 miR-29c 발현 카셋트를 포함한다. 테스트된 5개 융합 작제물은 μDys 발현 카셋트에 비해 인트론성 (i2), 3'UTR (3UTR)에 그리고 pA (pa) 부위 자리 후에 삽입된 miR-101 (μDys-29c-101-i2 & μDys-29c-3UTR-101), miR-30 (μDys-29c-M30E-i2) 및 miR-155 (29c-19nt-μDys-3UTR & 29c-19nt-μDys-pa) 백본에서 설계된 miR-29c 발현 카셋트를 포함한다.
본 발명의 융합 작제물이 일반적으로, 비슷한 작제물이 μDys만을 발현시키는데 사용된 (그리고 따라서 내인성 miR-29c 발현의 배경 수준만이 존재하였던) 대조군과 비교하여 2 내지 11 배의 비율로 감염된 인간 iPS-유래된 심근세포에서 miR-29c를 과-발현시켰다는 것이 분명하다.
도 13에서 데이터를 생성하는데 사용된 특이적 융합 작제물은 하기를 포함한다:
29c-19nt-μDys-3UTR: (polyA 아데닐화 신호 서열 전에) μDys 발현 카셋트의 3'-UTR 영역에 삽입된, miR-155 백본내 변형된 miR29c.
29c-19nt-μDys-pA: μDys 발현 카셋트의 polyA 아데닐화 신호 서열 후에 삽입된, miR-155 백본내 동일한 변형된 miR29c 코딩 서열.
μDys-29c-M30E-i2: μDys 발현 카셋트의 인트론 영역에 삽입된, miR-30E 백본내 변형된 miR29c 코딩 서열.
μDys-29c-101-i2: μDys 발현 카셋트의 인트론 영역에 삽입된, miR-101 백본내 변형된 miR29c 코딩 서열.
μDys-29c-3UTR-101: μDys 발현 카셋트의 3'-UTR 영역에 삽입된, miR-101 백본내 변형된 miR29c 코딩 서열.
한편으로, miR-29c를 발현시키는 솔로 작제물은 일반적으로, μDys만을 발현시키는 동일한 대조군 벡터와 비교하여, 6-73 배의 비율로 감염된 인간 iPS-유래된 심근세포에서 miR-29c를 과-발현시켰다.
도 13에서 데이터를 생성하는데 사용된 특이적 솔로 작제물은 하기를 포함한다:
EF1A-29c-M30E: EF1A 프로모터에 의해 구동된, miR-30E 백본에서 변형된 miR29c 코딩 서열.
U6-29c-M30E: Pol III U6 프로모터에 의해 구동된, miR-30E 백본내 변형된 miR29c 코딩 서열.
U6-29c-v1: Pol III U6 프로모터에 의해 구동된 miR29c 코딩 서열.
EF1A-29c-19nt: EF1A 프로모터에 의해 구동된, miR-155 백본내 변형된 miR29c 코딩 서열.
EF1A-29c-155: EF1A 프로모터에 의해 구동된, miR-155 백본내 또 다른 변형된 miR29c 코딩 서열.
이들 작제물로부터 miR-29c의 (우선적) 생산을 나타내는 비슷한 경향은, 모울리(Mouly) 인간 건강한 일차 근아세포 및 마우스 C2C12 불멸화된 근아세포 계통을 포함하는 기타 시험관내 세포 시스템에서 이들 작제물이 평가된 경우에 또한 수득되었다 (데이터 도시되지 않음). μDys 발현 카셋트내 miR-29c 요소의 삽입은 μDys mRNA 생산에서 상당한 감소를 야기시키지 않는다.
AAV9 바이러스성 입자내 소수의 선택된 융합 재조합 바이러스성 벡터는 분화된 C2C12 근관세포 및 일차 마우스 심근세포를 감염시키는데 또한 사용되었고, miR-29c의 발현은 이들 세포에서 또한 확인되었다. μDys만을 발현시키는 대조군에 대해 정상화 후에 상대 miR-29c 발현으로서 발현중인 결과로, 도 14 참고.
본 실험에서, μDys 생산은 대조 그룹에 비해 주로 영향받지 않는 것 같았다. 이 밖에도, miR-29c 패신저 스트란드 수준은 증가된 수준을 보여주지 않았다.
한편으로, 대상체 융합 작제물로부터 shSLN의 발현, 및 그러한 융합 작제물에 의해 감염된 마우스 세포내 SLN의 생성된 ~50% 하향-조절은 도 16 및 15 각각에서 도시되었다.
구체적으로, μDys만을 발현시키는 3개 솔로 작제물 그리고 μDys 및 shSLN을 발현시키는 2개 융합 작제물은 발현하는 SLN-Myc/DDK (Myc-DDK-태그된 SLN. DDK는 Sigma Aldrich의 상표가 붙은 FLAG® 태그와 동일한 것이고, Myc-DDK 태그는 항-Myc 또는 항-DDK 항체를 사용하여 검출될 수 있음)를 안정하게 과발현시키는 마우스 C2C12 세포에 형질감염되었다. 마우스 C2C12 안정한 세포주는 SLN-Myc/DDK를 인코딩하는 벡터의 렌티바이러스성 형질도입 그리고 안정한 세포주를 위한 후속 선택에 의해 생성되었다. 융합 작제물 "융합-v2" 또는 μDys-shmSLN-v2 중 하나는 Myc 태그-특이적 항체를 통해 검출된 SLN 단백질 발현 수준에서 ~50% 녹-다운을 보여주었다. 도 15 참고.
도 15에서 사용된 다양한 작제물은 아래 기재된다.
μDys: μDys GOI만을 인코딩하는 대조군 AAV9 벡터.
EF1A-mSLN: 마우스 SLN을 표적하는 shRNA만을 발현시키는 솔로 작제물. shRNA 코딩 서열의 전사는 EF1A 프로모터에 의해 구동된다.
EF1A-mSLN (V2): 마우스 SLN을 표적하는 shRNA만을 발현시키는 또 다른 솔로 작제물. shRNA 코딩 서열의 전사는 EF1A 프로모터에 의해 구동된다.
EF1A-mSLN (V4): 마우스 SLN을 표적하는 shRNA만을 발현시키는 더욱 또 다른 솔로 작제물. shRNA 코딩 서열의 전사는 EF1A 프로모터에 의해 구동된다.
융합-v1: μDys GOI 그리고 마우스 SLN을 표적하는 shRNA를 위한 코딩 서열 양쪽을 발현시키는 본 발명의 융합 작제물.
융합-v2: μDys GOI 그리고 마우스 SLN을 표적하는 shRNA를 위한 코딩 서열 양쪽을 발현시키는 본 발명의 또 다른 융합 작제물.
mSLN의 발현이 mSLN shRNA의 버전을 인코딩하는 대상체 융합 작제물에 의해 마우스 세포의 감염으로 인해 약 50%만큼 감소되었음이 분명하다.
도 16은, 바이러스성 벡터에서 단독의 코딩 서열 ("솔로")로서, 또는 본 개시내용의 융합 작제물의 일부 ("융합")로서, shSLN을 인코딩하는 다양한 재조합 AAV9 벡터를 위하여 분화된 C2C12 근관세포 또는 마우스 일차 심근세포내 siSLN (전사된 shSLN으로부터 가공된 siRNA 산물)의 상대 발현 수준을 도시한다. siRNA 생산은 맞춤의 Taqman 줄기-루프 QPCR 시스템을 통해 정량화되었다. 솔로 및 융합 작제물의 상대 siSLN 발현 수준은, 분명한 고 배수 변화가 대조 그룹에서 거의 없거나 극소의 siSLN-유사 RNA 생산으로 인해 유익할 수 없어도, μDys 대조 그룹에서의 수준에 대해 정상화되었다. 그럼에도 불구하고, 테스트된 양쪽 세포 유형에서 솔로 작제물이 대조 그룹에 비해 강한 U6 Pol III 프로모터로부터 siSLN의 약 1000-배 더 높은 수준을 발현시켰음이 분명하다. 한편으로, 테스트된 융합 작제물은 대조군과 비교된 siSLN의 1-2 규모 더 높은 수준을 발현시켰다.
인간 SLN을 표적하는 shRNA를 발현시키는 수많은 추가의 솔로 및 융합 작제물은 인간 iPS-유래된 심근세포에서 또한 테스트되었다. 이들은 인간 SLN을 표적하는 6개 솔로 작제물 및 12개 융합 작제물을 포함한다. 융합 작제물은 miR-29 및 miR-155 백본에서 shSLN 서열을 포함하였고, μDys 발현 카셋트에 비해 인트론, 3'-UTR에, 또는 pA 부위 후에 삽입되었다. 이들 실험의 결과는 도 17에서 요약되었다.
구체적으로, 몇몇 음성 대조군 (예를 들면, 다중 μDys 및 GFP 플라스미드) 및 양성 대조군은 도 17의 실험에서 사용되었다. 음성 대조군은 (SLN mRNA의 발현 수준에 효과가 없었던) μDys 단독을 발현시키는 2개 작제물 (μDys1 및 μDys2); (GFP가 SLN mRNA 발현에 또한 효과가 없었던)근육-특이적 프로모터 CK8 하의 GFP (CK8-GFP)를 발현시키는 작제물; 및 "시그마 스크램블" - (SLN mRNA 발현에 예상대로 효과가 없었던) hSLN-표적화 shSLN의 스크램블된 서열을 발현시키는 작제물을 포함한다. 양성 대조군은 hSLN mRNA의 약 80%를 하향-조절하는 hSLN-표적화 shSLN을 인코딩하는 Sigma로부터 상업적으로 이용가능한 shRNA 플라스미드인, "시그마 shrna"이다.
hSLN을 표적하는 shRNA의 버전을 각각 발현시키고, 강한 Pol III U6 프로모터의 전사적 제어 각각 하에서, 6개 솔로 작제물은 테스트되었고 hSLN mRNA 발현의 약 80-90%를 일반적으로 하향-조절하는 것으로 나타났다.
최대 90% hSLN mRNA 발현 다운-다운은 본 발명의 6개 솔로 작제물 및 4개 융합 작제물에 걸쳐서 또한 관찰되었다. 예를 들어, c2-m30e-i2 작제물은 hSLN을 표적하는 shRNA 및 μDys를 공-발현시키는 융합 작제물이다. shRNA는 M30E 백본 서열에서 매몰되고 (상기 참고), μDys 발현 카셋트의 인트론에 삽입된다. 최고 90%의 hSLN mRNA는 본 작제물로 인간 iPS-유래된 심근세포 감염시 녹다운되었다.
융합 작제물이 hSLN mRNA 발현에 크게 영향을 주었어도, 이들은 동일한 벡터상에서 μDys의 발현에 부정적 영향을 갖는 것으로 보이지 않았다. 도 18에서 도시된 바와 같이, 인간 SLN을 표적하는 6개 솔로 및 12개 융합 작제물은 인간 iPS-유래된 심근세포에 형질감염되었다. 대부분의 융합 작제물은 대조군 μDys-단독 작제물의 것과 주로 비슷한 (>50%) μDys mRNA 발현을 보여주었다.
선택된 솔로 및 2개 융합 작제물의 변성 아가로스 겔 분석은 이들 miR-29c 작제물의 AAV9 게놈이 주로 온전하다는 것을 또한 확인하였다. 도 19 참고.
실시예 4 융합 작제물로부터 코딩 서열의 생체내 발현
본 실험은 대상체 융합 작제물이 상승작용 치료적 효력이 없으면 솔로보다 양호한 효력을 달성하기 위해 별도 경로 (예를 들면, SLN의 하향-조절, 및/또는 miR-29c의 상향-조절)에 영향을 미치는 μDys 및 하나 이상의 추가의 코딩 서열(들)을 동시에 발현시키는데 사용될 수 있음을 입증한다.
이러한 세트의 실험에서, μDys 유전자 뿐만 아니라 제 2 코딩 서열 - 마우스 SLN을 표적하는 shSLN 또는 miR-29c를 인코딩하는 AAV9의 융합 작제물. 다양한 융합 작제물은, 약 5E13 vg/kg의 용량으로 (1개 그룹, U6-29c-v1 제외, 1E14 vg/kg으로), 꼬리 정맥을 통해 6주령 숫컷 mdx 마우스에 주사되었다. μDys, miR-29c, 및 SLN mRNA의 발현은 그 다음 주사후 28 일의 기간 동안 모니터링되었다. 상세한 실험 설정은 아래 요약된다:
Figure pct00022
miR-29c 실험 그룹에서, 2개 테스트된 융합 작제물, M30E 백본에서 그리고 μDys 발현 카셋트의 인트론에 삽입된 1개, 그리고 miR-101 백본에서 그리고 μDys 발현 카셋트의 3'-UTR 영역에 삽입된 1개가 좌측 비복근 (도 20a), 횡경막 (도 20b), 및 좌심실 (도 20c)에서 1.4-2.8-배 miR-29c 상향-조절을 초래하였음이 밝혀졌다. miR-29c-μDys 융합 AAV9 작제물은 5E13 vg/kg 용량으로 투여되었다. AAV9내 솔로 U6 프로모터-구동된 miR-29c 작제물은 5E13 vg/kg 용량에서 2-11 배 상향-조절, 및 1E14 vg/kg 용량에서 6-16-배 생산하였다.
한편으로, 융합 AAV9 작제물에 의한 miR-29c 상향-조절은 비복근 (도 21), 횡경막 (데이터 도시되지 않음) 및 좌심실 (데이터 도시되지 않음)내 μDys 생산의 감소를 초래하지 않았다. 융합 AAV9 작제물은 양쪽 RNA 및 단백질 수준에서 대조군 μDys-단독 AAV9 작제물의 것과 비슷한 μDys 발현을 보여주었다. miR-29c만을 발현시키는 솔로 작제물은 μDys를 생산하지 않고, 그러므로 없는 μDys 수준을 보여주었다.
shSLN 실험 그룹에서, 테스트된 shSLN 융합 AAV9 작제물이 횡경막, 좌측 가스트, 및 심방 (도 22)에서, 뿐만 아니라 혀 (데이터 도시되지 않음)에서 최대 50% mSLN mRNA 하향-조절을 초래하였음이 밝혀졌다. 비슷하게, 융합 AAV9 작제물에 의한 mSLN mRNA 하향-조절은, μDys만을 발현시키는 대조군 AAV9의 것과 비교해서, 양쪽 RNA 및 단백질 수준에서, 비복근 (도 23), 횡경막 (데이터 도시되지 않음), 및 좌심실 (데이터 도시되지 않음)에서 μDys 생산의 감소를 초래하지 않았다. shmSLN만을 발현시키는 솔로 작제물은 μDys를 생산하지 않았고, 따라서 없는 μDys 수준을 보여주었다. 횡경막 결과는 도시된다. 혀 및 심방에서 비슷한 결과.
이들 데이터는 대상체 융합 작제물이 양쪽 μDys 유전자 및 적어도 하나의 추가의 코딩 서열 예컨대 miR-29c 또는 SLN에 대한 shRNA를 동시에 발현시킬 수 있고, 따라서 단 하나의 코딩 서열 예컨대 μDys를 발현시키는 바이러스성 벡터와 비교된 더 양호한 치료적 성과를 달성함을 보여준다.
실시예 5 융합 작제물로부터 생체내 발현된 코딩 서열은 생물학적으로 활성이다
본 실험은 본 발명의 융합 작제물로부터 발현된 코딩 서열이 생물학적으로 활성인 것을 입증한다.
디스트로핀은 근육 세포 막에 구조적 안정성을 제공하고, 근섬유막의 증가된 투과성은 근육 섬유로부터 크레아틴 키나제 (CK)의 방출을 초래한다. 따라서, 증가된 크레아틴 키나제 (CK) 수준은 근육 손상의 특질이다. DMD 환자에서, CK 수준은 정상 범위보다 (예를 들면, 생후 정상 수준의 10-100 배) 크게 증가된다. 마찬가지로, 혈청 CK 수준은 mdx 마우스 모델에서 근육 건강의 일반 척도로서 간주된다.
본 실험에서 데이터는 AAV9의 miR-29c 솔로 (1E14 vg/kg의 고용량으로 투여된) 및 miR-29c-μDys 융합 (5E13 vg/kg 용량으로 투여된) 작제물 양쪽이 μDys 대조군과 비교된 비슷한 정도로 mdx 마우스 모델에서 혈청 CK 수준을 감소시켰고, 그러므로 DMD 환자내 발현하는 miR-29c의 치료적 이익을 시사함을 보여준다.
구체적으로, 실시예 4의 생체내 실험에서, 혈청 CK 수준은 마우스의 다양한 그룹에 대하여 또한 결정되었다. 도 24는 μDys 단독의 발현이 혈청 CK 수준에서 상당한 저하를 야기시켰음을 보여준다. 모두 테스트된 융합 작제물로, μDys 및 miR-29c를 공-발현시키는 것은 또한 혈청 CK 수준에서 비슷하게 상당한 저하로 이어졌다. 흥미롭게도, miR-29c 단독을 발현시키는 것은 또한 특히 (miR-29c-발현 솔로 작제물의) 더 높은 바이러스성 용량이 사용된 경우에 혈청 CK 수준의 상당한 감소로 이어졌다.
다른 한편으로, 메탈로프로테이나제-1의 조직 억제제 (TIMP-1)는 뒤센 근이영양증 (DMD) 환자에서 질환 진행 및/또는 치료 효과를 모니터링하기 위한 혈청 바이오마커로서 제안되었는데, TIMP-1의 혈청 수준이 건강한 대조군과 비교하여 DMD 환자에서 상당히 더 높았기 때문이다. 비슷하게, TIMP1은 또한 mdx 마우스 모델에서 근육 건강을 위한 혈청 마커이다.
따라서 실시예 4의 생체내 실험에서, 혈청 TIMP1 수준은 mdx 마우스의 다양한 그룹에 대하여 또한 결정되었다. 도 25, 좌측 패널은 μDys 단독의 발현이 혈청 TIMP1 수준에서 상당한 저하를 야기시켰음을 보여준다. 양쪽 테스트된 융합 작제물로, μDys 및 miR-29c를 공-발현시키는 것은 또한 혈청 TIMP1 수준에서 비슷하게 상당한 저하로 이어졌다. 한편으로, miR-29c 단독을 발현시키는 것은 (miR-29c-발현 솔로 작제물의) 더 높은 바이러스성 용량이 사용된 경우에도 혈청 TIMP1 수준의 감소로 이어지지 않았다.
마찬가지로, 도 25의 우측 패널은 μDys 단독의 발현이 혈청 TIMP1 수준에서 상당한 저하를 야기시켰음을 보여준다. 테스트된 융합 작제물로 mSLN에 대한 shRNA 및 μDys를 공-발현시키는 것은 또한 혈청 TIMP1 수준에서 비슷하게 상당한 저하로 이어졌다. 한편으로, mSLN 단독에 대한 shRNA를 발현시키는 것은 혈청 TIMP1 수준의 감소로 이어지지 않았다.
이들 데이터는 본 발명의 융합 작제물로부터 생체내 발현된 코딩 서열이 생물학적으로 활성인 것을 시사한다.
실시예 6 융합 작제물은 바이러스성 벡터의 생물분포를 변화시키지 않는다
실시예 4의 생체내 실험에서, 융합 바이러스성 벡터의 생물분포는 μDys만을 발현시키는 솔로 바이러스성 벡터의 것과 비교되었다. 사용된 모든 바이러스성 벡터의 생물분포가, 융합 작제물이 miR-29c 또는 shSLN을 발현시키는지 여부와 무관하게, 비복근에서 주로 동일하였던 것으로 밝혀졌다. 도 26 참고.
비복근에서 바이러스성 역가의 정량화는 또한 융합 및 대조군 AAV9와 비슷한 바이러스성 역가를 보여주었다.
실시예 7 융합 작제물은 바이러스성 벡터의 간 생물분포를 변화시키지 않는다
실시예 4의 생체내 실험에서, 융합 바이러스성 벡터의 간 수준은 μDys만을 발현시키는 솔로 바이러스성 벡터의 것과 비교되었다. 사용된 모든 바이러스성 벡터의 바이러스성 역가가, 융합 작제물이 miR-29c 또는 shSLN을 발현시키는지 여부와 무관하게, 간에서 주로 동일하였던 것으로 밝혀졌다. 도 27 참고.
실시예 8 μDys 단일 요법과 비교된 융합 작제물을 사용한 향상된 치료적 효력
μDys 및 miR-29c를 공-발현시키는 것이 더 양호한 치료적 효력 및/또는 더 적은 합병증 예컨대 섬유증을 초래하는지 여부를 결정하기 위해, 2개 섬유증성 마커 유전자, Col3a1 및 Fn1의 발현 수준은 실시예 4에서 다양한 융합, 솔로, 또는 대조 작제물로 투여된 마우스에서 시험되었다. Col3A1 발현 및 FN1 발현은 섬유증성 활동성의 마커로서 사용되었다.
miR-29c만을 발현시키는 솔로 AAV9 벡터는 저 용량의 5E13 vg/kg, 및 고 용량의 1E14 vg/kg에서 Col3A1 및 FN1 발현의 감소를 초래하였다. 융합 AAV9 벡터는 또한 횡경막에서 마커 유전자 발현에서의 감소를 초래하였다. 도 28 참고.
결과는, 이들 2개 섬유증성 마커 유전자에 관한 그들의 효과에 기반된, 횡경막에서 μDys 작제물 단독보다 본 발명의 융합 작제물의 부가된 이익을 보여준다.
실시예 9 효소-기반된 유전자 편집의 전달: CRISPR/Cas 및 sgRNA/crRNA
대상체 바이러스성 벡터, 예를 들면, rAAV 바이러스성 벡터는 표적 세포에서 표적 유전자의 동시 녹 다운을 위하여 (Cas9를 위한) 하나 이상의 sgRNA, 또는 (Cas12a를 위한) 하나 이상의 crRNA와 함께, 표적 세포에 CRISPR/Cas9 또는 CRISPR/Cas12a (또는 기타 조작된 또는 변형된 Cas 효소 또는 이의 상동)을 전달하는데 사용될 수 있다. 표적 세포 지향성은 CRISPR/Cas 및 sgRNA/crRNA-인코딩 서열이 체류하는 바이러스성 입자의 지향성에 의해 부분적으로 제어될 수 있다.
예를 들어, AAV-매개된 전달을 위하여, 대상체 바이러스성 벡터에서 GOI는 CRISPR/Cas9 또는 CRISPR/Cas12a를 위한 코딩 서열일 수 있다. Cas9 또는 Cas12a 각각에 부하될 수 있는 하나 이상의 sgRNA 또는 crRNA는 Cas9 / Cas12a의 발현 카셋트에서 인트론, 3'-UTR 또는 다른 곳으로부터 발현될 수 있다.
표적 세포를 대상체 바이러스성 벡터, 예를 들면, AAV 벡터로 감염시, Cas 단백질 및 sgRNA/crRNA는 표적 세포 내부에서 공-발현되어 유전자 편집을 매개한다.
<110> SOLID BIOSCIENCES INC. <120> COMBINATION THERAPY FOR TREATING MUSCULAR DYSTROPHY <130> 129159-01120 <140> PCT/US2019/065718 <141> 2019-12-11 <150> 62/778,646 <151> 2018-12-12 <160> 39 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa actgggcttg tcgagacaga 60 gaagactctt gcgtttctga taggcaccta ttggtcttac tgacatccac tttgcctttc 120 tctccacag 129 <210> 2 <211> 217 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2 gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa actgggcttg tcgagacaga 60 tctcttacac aggctgaccg atttctcctg gtgttcagag tctgtttttg tctagcacca 120 tttgaaatcg gttatgatgt agggggaaga agactcttgc gtttctgata ggcacctatt 180 ggtcttactg acatccactt tgcctttctc tccacag 217 <210> 3 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 atctcttaca caggctgacc gatttctcct ggtgttcaga gtctgttttt gtctagcacc 60 atttgaaatc ggttatgatg taggggga 88 <210> 4 <211> 722 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 agacagcctg ggaggggaga aggagttgga gctcaagttg gagacagcga ggagaaacct 60 gccatagcca gggtgtgtct ttgatcctct tcaggaggtg aggagaagcc agaggtcctt 120 ggtgtgccct cagaaatctg cctgcagttc tcaccaagcc gctgtgaaaa tggggataaa 180 cacccgggag ctgtttctca acttcactat tgtcttgatt acggttattc ttatgtggct 240 ccttgtgagg tcctatcagt actgagaggc catgccatgg tcctgggatt gactgagatg 300 ctccggagct gcctgctcta tgccctgaga ccccactgct gtcattgtca caggatgcca 360 ttctccatcc gagggcacct gtgacctgca ctcacaatat ctgctatgct gtagtgctag 420 gattgattat gtgttctcca aagatgctgc tcccaagggc tgccaagtgt ttgccaggga 480 acggtagatt tattccccaa ctcttaactg aaaatgtgtt agacaagcca caaagttaaa 540 attaaactgg attcatgatg atgtaggatt gttacaagcc cctgatctgt ctcaccacac 600 atcccttcaa cccacacggt ctgcaaccaa actctaattc aacctgccag aaggaatgtt 660 agaggaagtc tttgtcagcc cttatagcta 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60 atttgaaatc ggttactgtg aagccacaga tgggtaaccg attaaatggt gctagctgcc 120 tactgcctcg gacttcaagg ggctacttta gga 153 <210> 16 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 16 ccaccagaaa ggatgccgtt gaccgacaca gtgactgaca ggctgccctg gcgaaccgat 60 ttcaaatggt gcataccgtc tattctaaag gtagcaccat ttgaaatcgg ttaggatggc 120 agccatctta ccttccatca gaggagcctc accgtaccca ggaagaaaga aggtgaaaga 180 ggaatgtgaa acaggtggct ggga 204 <210> 17 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 17 cctggaggct tgctgaaggc tgtatgctgt agcaccattt gaaatcggtt attttggcct 60 ctgactgatg accgctggaa tggtgctaca ggacacaagg cctgttacta gcactcacat 120 ggaacaaatg gcc 133 <210> 18 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 18 cctggaggct tgctgaaggc tgtatgctgt agcaccattt gaaatcggtt agttttggcc 60 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139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 22 cctggaggct tgctgaaggc tgtatgctgt tgagaaacag ctcccgggtg ttgttttggc 60 cactgactga caacacccgg gagctgtttc tcaacaggac acaaggcctg ttactagcac 120 tcacatggaa caaatggcc 139 <210> 23 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 23 ggacaggaga gatgctgcaa gcccaagaag ctctctgctc agcctgtcac aacctactga 60 ctgccagggc acttgggaat ggcaaggtag caccatttga aatcggttac gatttcaaat 120 ggtgctgtct tgctataccc agaaaacgtg ccaggaagag aactcaggac cctgaagcag 180 actactggaa gggagactcc agctcaaaca aggca 215 <210> 24 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 24 gatcgtaacc gatttcaaat ggtgctagcc ctgacccagc tagcaccatt tgaaatcggt 60 tattttttga agct 74 <210> 25 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 gatcgacttc acagttgtcc tcatcactcg agtgatgagg acaactgtga agcttttttg 60 aagct 65 <210> 26 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 gatcgacttc acagttgtcc tcatcactca agaggtgatg aggacaactg tgaagttttt 60 tgaagct 67 <210> 27 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 taggaagtct tttaataaaa gatccttatt ttcattggat ctgtgtgttg gttttttgtg 60 t 61 <210> 28 <211> 698 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 28 tcagatccaa gctttagact agcatgctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc 60 cgagatgcct ggttataatt aacccagaca tgtggctgcc cccccccccc caacacctgc 120 tgcctctaaa aataaccctg catgccatgt tcccggcgaa gggccagctg tcccccgcca 180 gctagactca gcacttagtt taggaaccag tgagcaagtc agcccttggg gcagcccata 240 caaggccatg gggctgggca agctgcacgc 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 36 gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa actgggcttg tcgagacaga 60 gaagactctt gcgtttctga taggcaccta ttggtcttac tgacatccac tttgcctttc 120 tctccacag 129 <210> 37 <211> 157 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 37 ucgacuucuu aacccaacag aaggcucgag aagguauauu gcuguugaca gugagcguaa 60 ccgauuucaa auggugcuau agugaagcca cagauguaua gcaccauuug aaaucgguua 120 ugccuacugc cucggacuuc aaggggcuag aauucga 157 <210> 38 <211> 254 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 38 gaucuuuuag uccuucacuu cauggggagc cuucagagag aguaaugcag ccaccagaaa 60 ggaugccguu gaccgacaca gugacugaca ggcugcccug gcgaaccgau uucaaauggu 120 gcauaccguc uauucuaaag guagcaccau uugaaaucgg uuaggauggc agccaucuua 180 ccuuccauca gaggagccuc accguaccca ggaagaaaga aggugaaaga ggaaugugaa 240 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Claims (37)

  1. 재조합 바이러스성 벡터로서,
    a) 근이영양증을 치료하는데 효과적인 것과 같이 관심의 기능적 유전자 또는 단백질 (GOI)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서, 3'-UTR 코딩 영역을 포함하고, 상기 폴루뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 상기 기능적 단백질의 발현을 향상시키는 이종성 인트론 서열에 즉시 3'인 상기 폴리뉴클레오타이드;
    b) 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결되고 이의 발현을 구동시키는 제어 요소 (예를 들면, 근육-특이적 제어 요소); 및,
    c) 상기 인트론 서열에서 또는 상기 3'-UTR 코딩 영역에서 삽입된 하나 이상의 코딩 서열을 포함하고,
    상기 하나 이상의 코딩 서열이 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA), 안티센스 서열, 효소를 편집하는 유전자를 위한 가이드 서열, 마이크로RNA (miRNA), 및/또는 miRNA 억제제를 독립적으로 인코딩하는, 재조합 바이러스성 백터.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 재조합 바이러스성 벡터가 재조합 AAV (아데노 연관 바이러스성) 벡터인, 재조합 바이러스성 벡터.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 하나 이상의 코딩 서열이 상기 3'-UTR 코딩 영역에서, 또는 상기 폴리아데닐화 (polyA) 신호 서열 (예를 들면, AATAAA) 후에 삽입되는, 재조합 바이러스성 벡터.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능적 GOI의 발현이 상기 하나 이상의 코딩 서열의 존재 하에서 (예를 들면, 삽입된 상기 하나 이상의 코딩 서열이 없는 것을 제외하고 동일한 대조 작제물과 비교해서) 실질적으로 영향받지 않는, 재조합 바이러스성 벡터.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 상기 폴리뉴클레오타이드가 기능적 디스트로핀 단백질을 인코딩하는 디스트로핀 미세유전자 또는 미니유전자이고/거나;
    b) 상기 제어 요소가 상기 디스트로핀 미니유전자에 작동가능하게 연결되고 이의 발현을 구동시키는 근육-특이적 프로모터인,
    재조합 바이러스성 벡터.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 기능적 디스트로핀 단백질이 마이크로D5이고/거나, 상기 근육-특이적 프로모터가 CK 프로모터인, 재조합 바이러스성 벡터.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 코딩 서열이 결함 디스트로핀의 엑손, 예컨대 디스트로핀의 엑손 45-55 중 어느 하나, 또는 디스트로핀의 엑손 44, 45, 51, 및/또는 53의 스키핑을 유도하는 엑손-스키핑 안티센스 서열을 포함하는, 재조합 바이러스성 벡터.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로RNA가 miR-1, miR-133a, miR-29c, miR-30c, 및/또는 miR-206인, 재조합 바이러스성 벡터.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 마이크로RNA가 표적 서열을 위하여 설계된 miR-29c의 상기 가이드 스트란드의 가공을 향상시키는 변형된 측접 백본 서열을 임의로 갖는 miR-29c인, 재조합 바이러스성 벡터.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 변형된 측접 백본 서열이 miR-30, -101, -155, 또는 -451 유래이거나 이에 기반되는, 재조합 바이러스성 벡터.
  11. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포에서 상기 마이크로RNA의 발현이 상기 숙주 세포에서 상기 마이크로RNA의 내인성 발현과 비교하여 적어도 약 1.5-15 배 (예를 들면, 약 2-10 배, 약 1.4-2.8 배, 약 2-5 배, 약 5-10 배, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 약 15 배)만큼 상향-조절되는, 재조합 바이러스성 벡터.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi 서열이 사르콜리핀 (shSLN)에 대한 shRNA인, 재조합 바이러스성 벡터.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 코딩 서열이 사르콜리핀 (shSLN)에 대한 하나 이상의 동일하거나 상이한 shRNA를 인코딩하는, 재조합 바이러스성 벡터.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 상기 shRNA가 사르콜리핀 mRNA 및/또는 사르콜리핀 단백질 발현을 적어도 약 50%만큼 감소시키는, 재조합 바이러스성 벡터.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GOI가 CRISPR/Cas9이고, 상기 가이드 서열이 sgRNA (단일 가이드 RNA)이거나; 상기 GOI가 CRISPR/Cas12a이고, 상기 가이드 시켄데가 crRNA인, 재조합 바이러스성 벡터.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA), 상기 안티센스 서열, 상기 CRISPR/Cas9 sgRNA, 상기 CRISPR/Cas12a crRNA 및/또는 상기 마이크로RNA가 하나 이상의 표적 유전자, 예컨대 염증성 유전자, NF-κB 신호전달 경로의 활성화제 (예를 들면, TNF-α, IL-1, IL-1β, IL-6, NF-κB의 수용체 활성화제 (RANK), 및 톨-유사 수용체 (TLR)), NF-κB, NF-κB에 의해 유도된 다운스트림 염증성 사이토카인, 히스톤 데아세틸라제 (예를 들면, HDAC2), TGF-β, 결합 조직 성장 인자 (CTGF), 올라겐, 엘라스틴, 세포외 기질의 구조적 성분, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 (G6PD), 마이오스타틴, 포스포디에스테라제-5 (PED-5) 또는 ACE, VEGF 디코이-수용체 유형 1 (VEGFR-1 또는 Flt-1), 및 조혈 프로스타글란딘 D 신타제 (HPGDS)의 기능을 길항하는, 재조합 바이러스성 벡터.
  17. 제 1 항에 있어서,
    a) 상기 폴리뉴클레오타이드가 기능적 푸쿠틴 (FKTN) 단백질을 인코딩하고/거나;
    b) 상기 하나 이상의 코딩 서열이 후쿠야마 선천성 근이영양증 (FCMD) 환자에서 결함 FKTN 유전자내 정확한 엑손 10 스플라이싱을 복원하는 엑손-스키핑 안티센스 서열을 인코딩하는,
    재조합 바이러스성 벡터.
  18. 제 1 항에 있어서,
    a) 상기 폴리뉴클레오타이드가 기능적 LAMA2 단백질을 인코딩하고/거나;
    b) 상기 하나 이상의 코딩 서열이 메로신-결핍 선천성 근이영양증 유형 1A (MDC1A) 환자에서 결함 LAMA2 유전자의 C-말단 G-도메인 (엑손 45-64), 특히 G4 및 G5의 발현을 복원하는 엑손-스키핑 안티센스 서열을 인코딩하는,
    재조합 바이러스성 벡터.
  19. 제 1 항에 있어서,
    a) 상기 폴리뉴클레오타이드가 기능적 DMPK 단백질, 또는 CLCN1 유전자를 인코딩하고/거나;
    b) 상기 RNAi 서열 (siRNA, shRNA, miRNA), 상기 안티센스 서열, 또는 상기 마이크로RNA (miRNA)가 결함 DMPK 유전자에서 돌연변이체 전사물의 확장된 반복부를 표적하거나, DM1 환자에서 CLCN1 유전자내 엑손 7A의 스키핑을 초래하는 엑손-스키핑 안티센스 서열을 인코딩하는,
    재조합 바이러스성 벡터.
  20. 제 1 항에 있어서,
    a) 상기 폴리뉴클레오타이드가 기능적 DYSF 단백질을 인코딩하고/거나;
    b) 하나 이상의 코딩 서열이 디스펄린병증 (LGMD2B 또는 MM) 환자에서 결함 DYSF 유전자내 엑손 32의 스키핑을 초래하는 엑손-스키핑 안티센스 서열을 인코딩하는,
    재조합 바이러스성 벡터.
  21. 제 1 항에 있어서,
    a) 상기 폴리뉴클레오타이드가 기능적 SGCG 단백질을 인코딩하고/거나;
    b) 하나 이상의 코딩 서열이 LGMD2C 환자에서 결함 LGMD2C 유전자 (예를 들면, △-521T SGCG 돌연변이를 가진 것)내 엑손 4-7의 스키핑을 초래하는 엑손-스키핑 안티센스 서열을 인코딩하는,
    재조합 바이러스성 벡터.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 인트론 서열이 서열번호: 1인, 재조합 바이러스성 벡터.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 코딩 서열이 상기 인트론 서열에서 삽입되는, 재조합 바이러스성 벡터.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능적 단백질의 발현이 상기 하나 이상의 코딩 서열의 삽입에 의해 부정적으로 영향받지 않는, 재조합 바이러스성 벡터.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 혈청형 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAVrh74, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV 12, 또는 AAV 13의 재조합 AAV 벡터인, 재조합 바이러스성 벡터.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제어 요소가 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 근세포-특이적 인핸서 결합 인자 mef, 근육 크레아틴 키나제 (MCK), 절단된 MCK (tMCK), 미오신 중쇄 (MHC), C5-12, 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서 요소, 골격 속근 트로포닌 c 유전자 요소, 지근 심장 트로포닌 c 유전자 요소, 지근 트로포닌 i 유전자 요소, 저산소증-유도성 핵 인자, 스테로이드-유도성 요소, 또는 글루코코르티코이드 반응 요소 (gre)인, 재조합 바이러스성 벡터.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제어 요소가 WO2017/181015의 서열번호: 10 또는 서열번호: 11의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 재조합 바이러스성 벡터.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 재조합 바이러스성 벡터를 포함하는, 조성물.
  29. 제 28 항에 있어서, 치료적으로 호환성 담체, 희석제, 또는 부형제를 추가로 포함하는 약학적 조성물인, 조성물.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 치료적으로 허용가능한 담체, 희석제, 또는 부형제가 pH 6.0에 10 mM L-히스티딘, 150 mM 염화나트륨, 및 1 mM 염화마그네슘을 포함하는 멸균 수용액인, 조성물.
  31. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 적어도 1.6 × 1013 벡터 게놈을 갖는 수용액의 약 10 mL의 투약량 형태인, 조성물.
  32. 제 29 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2 × 1012 벡터 게놈 / 밀리리터의 역가를 갖는, 조성물.
  33. 세포에서 상기 재조합 바이러스성 벡터 (예를 들면, 상기 재조합 AAV 벡터)를 생산하는 단계 그리고 상기 세포를 용해시켜 상기 벡터를 수득하는 단계를 포함하는, 제 28 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항의 조성물의 생산 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 벡터가 혈청형 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAVrh74, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV 12, 또는 AAV 13의 재조합 AAV 벡터인, 방법.
  35. 치료가 필요한 대상체에서 근이영양증 또는 디스트로핀병증의 치료 방법으로서, 상기 대상체에게 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 상기 재조합 바이러스성 벡터 (예를 들면, 상기 재조합 AAV 벡터), 또는 제 28 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항의 상기 조성물의 치료적으로 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터 또는 상기 조성물이 근육내 주사, 정맥내 주사, 비경구 투여 또는 전신 투여에 의해 투여되는, 방법.
  37. 제 35 항 또는 제 36 항에 있어서, 상기 근이영양증이 뒤센 근이영양증, 베커 근이영양증, 후쿠야마 선천성 근이영양증 (FCMD), 디스펄린병증, 근긴장성 이영양증, 및 메로신-결핍 선천성 근이영양증 유형 1A, 안면견갑상완 근이영양증 (FSHD), 선천성 근이영양증 (CMD), 또는 지대 근이영양증 (LGMDR5 또는 LGMD2C)인, 방법.
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