CN116348149A - 用于肌营养不良症的腺相关病毒载体递送 - Google Patents

用于肌营养不良症的腺相关病毒载体递送 Download PDF

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Abstract

本公开提供了治疗有需要的受试者的肌营养不良症的方法，所述方法包括施用表达小型化人微肌营养不良蛋白基因的基因疗法载体，如腺相关病毒(AAV)载体，与抑制所述受试者的免疫系统的步骤组合。

Description

用于肌营养不良症的腺相关病毒载体递送
本申请要求于2020年6月15日提交的美国临时申请第63/039,252号、于2020年9月27日提交的美国临时申请第63/083,953号、于2021年3月12日提交的美国临时申请第63/160,376号和于2021年5月13日提交美国临时申请第63/188,266号的优先权益，其中所述美国临时申请中的每个通过全文引用的方式并入本文。
以电子方式提交的材料通过引用并入
作为本公开的单独部分，本申请含有计算机可读形式的序列表，所述序列表通过全文引用的方式并入，并且标识如下：文件名：55714_Seqlisting.txt；大小：83,380字节；创建于2021年6月7日。
技术领域
本公开提供了治疗有需要的受试者的疾病，如肌营养不良症的方法，所述方法包括施用表达所关注的转基因，如小型化人微肌营养不良蛋白基因或β-肌聚糖基因的基因疗法载体，如腺相关病毒(AAV)载体，与抑制所述受试者的免疫系统的步骤组合。
背景技术
肌肉量和力量对日常活动(如运动和呼吸)以及全身新陈代谢的重要性是明确的。肌肉功能缺陷会产生肌营养不良症(MD)，其特点是肌肉无力和消瘦，对生活质量有严重影响。最充分表征的MD是由编码肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(DAPC)成员的基因突变引起的。这些MD是由与DAPC的肌膜-细胞骨架束缚丧失相关的膜脆性引起的。Duchenne肌营养不良症(DMD)是最具破坏性的肌肉疾病之一，影响5000名新生男性中的1名。
DMD由DMD基因突变引起，导致mRNA减少和肌营养不良蛋白的缺失，肌营养不良蛋白是与肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(DAPC)相关的427kD肌膜蛋白(Hoffman等人,Cell51(6):919-28,1987)。DAPC由肌肉肌膜上的多种蛋白质组成，通过肌营养不良蛋白(一种肌动蛋白结合蛋白)和α-肌营养不良蛋白聚糖(一种层粘连蛋白结合蛋白)在细胞外基质(ECM)和细胞骨架之间形成结构连接。这些结构连接用于在收缩期间稳定肌细胞膜并防止收缩引起的损伤。随着肌营养不良蛋白的丧失，膜脆性导致肌膜撕裂和钙的流入，引发钙激活的蛋白酶和节段性纤维坏死(Straub等人,Curr Opin.Neurol.10(2):168-75,1997)。这种不受控制的肌肉退化和再生循环最终会耗尽肌肉干细胞群(Sacco等人,Cell,2010.143(7):p.1059-71；Wallace等人,Annu Rev Physiol,2009.71:p.37-57)，导致进行性肌肉无力、肌内膜炎症和纤维化瘢痕形成。
如果没有肌营养不良蛋白或微肌营养不良蛋白的膜稳定作用，DMD将表现出不受控制的组织损伤和修复循环，最终通过结缔组织增殖用纤维化瘢痕组织代替丢失的肌纤维。纤维化的特征在于ECM基质蛋白的过量沉积，包含胶原蛋白和弹性蛋白。ECM蛋白主要由细胞因子如TGFβ产生，其由对应激和炎症有反应的活化的成纤维细胞释放。尽管DMD的主要病理特征是肌纤维变性和坏死，但纤维化作为病理后果具有相同的影响。纤维化组织的过度产生限制了肌肉再生并且有助于DMD患者的进行性肌肉无力。在一项研究中，初始DMD肌肉活检组织中纤维化的存在与10年随访时的不良运动结果高度相关(Desguerre等人,JNeuropathol Exp Neurol,2009.68(7):p.762-7)。这些结果表明纤维化是DMD肌肉功能障碍的主要原因，并强调在明显纤维化之前需要早期干预。
另一组MD是MD的肢带组(LGMD)。LGMD是罕见的病状并且在不同的人群中，发病年龄、肌肉无力区域、心脏和呼吸系统受累、进展速度和严重程度等方面存在差异。LGMD可能始于儿童期、青春期、青年期或甚至更晚。两性都受到同等的影响。LGMD导致肩部和骨盆带无力，大腿和手臂附近的肌肉有时也会随着时间的推移而感到无力。腿部无力通常先于手臂出现。面部肌肉通常不受影响。随着病症的进展，人们可能会出现行走问题，并且随着时间的推移可能需要使用轮椅。肩部和手臂肌肉的受累可能导致难以将手臂举过头顶和举起物体。在某些类型的LGMD中，心脏和呼吸肌可能受累。
至少有十九种LGMD形式，这些形式根据其相关的遗传缺陷进行分类。
Figure BDA0004113275930000021
Figure BDA0004113275930000031
针对LGMD的专门测试现在可以通过由国家诊断计划国家委员会(NationalCommissioning Group；NCG)制定的国家诊断计划获得。
随着用于治疗肌营养不良症的基因疗法(如DMD或LGMD)的开发，需要优化这些疗法，并且通过优化的基因疗法载体评估免疫抑制对微肌营养不良蛋白转基因表达的影响。
发明内容
本公开涉及将所关注的转基因表达到骨骼肌的基因疗法载体，例如AAV，以与免疫抑制剂的施用组合治疗肌营养不良症。另外，本公开包含用AAV基因疗法重新对受试者给药的方法，其中对所述受试者的血浆进行治疗性血浆交换(TPE)，以去除响应于第一剂量的AAV基因疗法而产生的AAV抗体。
本公开涉及将微肌营养不良蛋白基因表达到包含膈肌和心肌的骨骼肌的基因疗法载体，例如AAV，以与免疫抑制剂的施用组合保护肌肉纤维免受损伤，增加肌肉强度，减少和/或预防纤维化。另外，本公开包含用AAV基因疗法重新对受试者给药的方法，其中对所述受试者的血浆进行治疗性血浆交换(TPE)，以抗体受试者去除响应于第一剂量的AAV基因疗法而产生的AAV抗体。
另外，本公开涉及将β-肌聚糖基因表达到包含膈肌和心肌的骨骼肌的基因疗法载体，例如AAV与免疫抑制剂的施用组合。另外，本公开包含用AAV基因疗法重新对受试者给药的方法，其中对所述受试者的血浆进行治疗性血浆交换(TPE)，以抗体受试者去除响应于第一剂量的AAV基因疗法而产生的AAV抗体。
本公开提供了使用基因疗法载体来递送微肌营养不良蛋白以解决DMD中观察到的基因缺陷的用于增加肌肉力量和/或增加肌肉质量的组合疗法和方法。具体地，本公开提供了一项研究，以证明在非人灵长类动物模型中，使用不同的免疫抑制方案(其免疫抑制的持续时间、剂量和类型有所改变)，系统递送rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白的基因表达。本公开还提供了一项研究，以证明在使用TPE从先前给药的非人灵长类动物和使用rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白系统性再给药的灵长类动物中去除AAV病毒抗体后，微肌营养不良蛋白转基因表达。
本公开还提供了一种在施用rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白之前治疗患有DMD(其抗AAVrh.74抗体)的人受试者的方法，并且在施用所述rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白之前，所述受试者经历过多个疗程的TPE。
本公开提供了包括以下的核苷酸序列的核酸分子：SEQ ID NO:3、8或9。本公开还提供了包括以下的核酸序列的rAAV：SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQID NO:3的核苷酸55至5021，以及包括以下的核酸序列的rAAV颗粒：SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021。
本公开的另一方面提供了包括核酸分子的组合物，所述核酸分子包括以下的核苷酸序列：SEQ ID NO:3、8或9，包括以下的核酸序列的rAAV：SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021，以及包括以下的核酸序列的rAAV颗粒：SEQID NO:9或SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021。本文公开的任何方法都可以通过这些组合物执行。
另外，本公开提供了一种包括核酸的组合物，所述核酸包括以下之一的rAAV基因组：AAVrh.74.tMCK.CAP N3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。
本公开提供了治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的方法，所述方法包括包含施用重组腺病毒相关(rAAV)rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白和抗炎类固醇的步骤。另外，本公开提供了包括重组腺病毒相关(rAAV)rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白和抗炎类固醇的组合疗法在制备用于治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的药物中的用途，使得rAAV和所述药物的所述抗炎类固醇单独地共同施用，如所述rAAV和抗炎类固醇同时或顺序地共同施用。本公开还提供了一种用于治疗肌营养不良症的组合疗法，其中所述疗法包括重组腺病毒相关(rAAV)rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白和抗炎类固醇，其中rAAV和所述抗炎类固醇单独地共同施用，如rAAV和抗炎类固醇同时或顺序地共同施用。例如，所述肌营养不良症是DMD或碧加氏肌营养不良症(Becker's muscular dystrophy)。例如，抗炎类固醇是糖皮质激素。在一些实施例中，所述抗炎类固醇是强的松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)、倍他米松(betamethasone)、地塞米松(dexamethasone)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲基强的松龙(methylprednisolone)或地夫可特(deflazacort)。在一些实施例中，口服施用所述抗炎类固醇。抗炎类固醇可以在施用rAAV之前和之后施用。可替代地，仅在施用rAAV之前或之后施用抗炎类固醇。
另外，本公开提供了一种治疗有需要的人受试者的肢带型肌营养不良症(LimbGirdle Muscular Dystrophy)的方法，所述方法包括施用重组腺病毒相关(rAAV)和抗炎类固醇的步骤，其中所述rAAV选自由以下组成的组：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。另外，本公开提供了包括重组腺病毒相关(rAAV)和抗炎类固醇的组合疗法用于制备治疗有需要的人受试者的肢带型肌营养不良症的药物的用途，其中所述rAAV选自由以下组成的组：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05，使得rAAV和所述药物的所述抗炎类固醇单独地共同施用，如所述rAAV和抗炎类固醇同时或顺序地共同施用。本公开还提供了一种用于治疗肢带型肌营养不良症的组合疗法，其中所述组合疗法包括重组腺病毒相关(rAAV)和抗炎类固醇，其中所述rAAV选自由以下组成的组：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05，其中rAAV和所述抗炎类固醇单独地共同施用，如所述rAAV和抗炎类固醇同时或顺序地共同施用。例如，抗炎类固醇是糖皮质激素。在一些实施例中，所述抗炎类固醇是强的松、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙或地夫可特。在一些实施例中，口服施用所述抗炎类固醇。抗炎类固醇可以在施用rAAV之前和之后施用。可替代地，仅在施用rAAV之前或之后施用抗炎类固醇。
例如，在本文所公开的任何方法、用途或组合疗法中，在施用所述rAAV之前约12小时或施用所述rAAV之前约24小时或施用所述rAAV之前约36小时或施用所述rAAV之前约48小时或施用所述rAAV之前约60小时或施用所述rAAV之前约72小时或施用前约96小时施用所述抗炎类固醇。在一些实施例中，在施用所述rAAV前约5天小时、施用所述rAAV之前约6天小时、施用所述rAAV之前约7天小时、或施用所述rAAV之前约8天、或施用所述rAAV之前约9天、或施用所述rAAV之前约10天、或施用所述rAAV之前约11天、或施用所述rAAV之前约12天、或施用所述rAAV之前约13天、或施用所述rAAV之前约14天或施用所述rAAV之前约30天施用所述炎类固醇。
另外，在任何公开的方法、用途或组合疗法中，在施用所述rAAV之前，所述抗炎类固醇每天至少施用一次，持续约7天，或在施用所述rAAV之前，每天至少施用至少一次，持续约14天，或每天至少施用一次，持续21天，或在施用所述rAAV之前每天至少施用一次，持续约28天，或在施用所述rAAV前每天至少施用一次，持续约30天，或在施用所述rAAV前每天至少施用一次，持续约45天，或在施用所述rAAV前每天至少施用一次，持续约60天。在一些实施例中，在施用所述rAAV之前30天至60天施用所述抗炎类固醇。
例如，在任何公开的方法、用途或组合疗法中，在施用所述rAAV之前施用所述抗炎类固醇，并且从施用所述rAAV后的第1天至第30天，每天至少施用一次所述抗炎类固醇，或从施用所述rAAV后的第1天至第60天每天至少一次，或从施用所述rAAV后的第1天至第7天每天至少一次，或从施用所述rAAV后的第1天至第14天每天至少一次，或从施用所述rAAV后的第1天至第21天每天至少一次，或从施用所述rAAV后的第1天至第24天每天至少一次，或从施用所述rAAV后的第1天至第28天每天至少一次，或从施用所述rAAV后的第1天至第30天每天至少一次，或施用所述rAAV后的至少30天至60天。
在本文所公开的任何方法、用途或组合疗法中，在施用所述rAAV之前施用抗CD20特异性抗体。在一些实施例中，在施用所述rAAV之前至少7天施用所述抗CD20特异性抗体。术语抗CD20特异性抗体是指特异性结合或抑制或降低CD20的表达或活性的抗体。示例性抗CD20抗体包含利妥昔单抗(rituximab)、奥美珠单抗(ocrelizumab)或奥法木单抗(ofatumumab)。
在任何公开的方法、用途或组合疗法中，在施用所述rAAV前约60天、或在施用所述rAAV前约45天、或在施用所述rAAV前约30天、在施用所述rAAV前约14天、在施用所述rAAV前约7天，并且在施用所述rAAV的约24小时内施用抗CD20特异性抗体。在一些实施例中，在施用所述rAAV之前30至60天施用所述抗CD20抗体。在一些实施例中，所述抗CD20特异性抗体在所述rAAV施用后施用。例如，在施用所述rAAV之前和之后都施用所述抗CD20特异性抗体。可替代地，抗CD20特异性抗体在施用所述rAAV之前施用，或所述抗CD20特异性抗体施用所述rAAV之后施用。
另外，在任何公开的方法中，用途或组合疗法可以包括施用免疫抑制大环内酯类。术语免疫抑制大环内酯类是指抑制或调节受试者的免疫系统的大环内酯类药剂。大环内酯类是一类包括大环内酯环的药剂，一个或多个脱氧糖，如红霉支糖或红霉脱氧糖胺连接到其上。内酯环通常为14元、15元或16元。大环内酯类属于聚酮类药剂，并且可以是天然产物。免疫抑制大环内酯类的实例包含他克莫司(tacrolimus)、吡美莫司(pimecrolimus)和西罗莫司(sirolimus)。在一些实施例中，向所述受试者口服施用所述免疫抑制大环内酯类。在一些实施例中，可以在所述rAAV施用之前和所述rAAV施用之后施用所述免疫抑制大环内酯类。可替代地，在施用所述rAAV之前施用所述免疫抑制大环内酯类，或在施用所述rAAV之后施用所述免疫抑制大环内酯类。
在一些实施例中，所述免疫抑制大环内酯类在施用所述rAAV前至少三天每天至少一次施用、或在施用所述rAAV前至少4天施用、或在施用所述rAAV前至少5天施用、或在施用所述rAAV前至少6天施用、或在施用所述rAAV前至少7天施用、或在施用所述rAAV前至少10天施用、或在施用前至少14天施用、或在施用所述rAAV前至少30天施用、或在施用所述rAAV前至少45天施用、或在施用所述rAAV前至少60天施用。在一些实施例中，在施用所述rAAV之前30天至60天施用所述免疫抑制大环内酯类。
本公开还提供了一种治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的方法，所述方法包括施用重组腺病毒相关(rAAV)rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白和免疫抑制方案，其中所述免疫抑制方案包括施用抗炎类固醇、抗CD20抗体和免疫抑制大环内酯类中的一种或多种。本公开还提供了包括重组腺病毒相关(rAAV)rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白和免疫抑制方案的组合疗法用于制备用于治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的药物的用途，其中所述免疫抑制方案包括施用抗炎类固醇、抗CD20抗体和免疫抑制大环内酯类中的一种或多种，例如在所公开的药物中，所述rAAV和所述免疫抑制方案的一种或多种组分单独地共同施用，如所述rAAV和所述免疫抑制方案的一种或多种组分同时或顺序地共同施用。本公开还提供了用于治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的组合疗法，其中所述组合疗法包括重组腺病毒相关(rAAV)rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白和免疫抑制方案，其中所述rAAV和所述免疫抑制方案是单独共同施用的，如所述rAAV和所述免疫抑制方案的一种或多种组分同时或顺序地共同施用。术语免疫抑制方案是指抑制或调节受试者的免疫系统的治疗或疗法的方法。所述方案包括施用一种或多种免疫抑制剂。在一些实施例中，所述免疫抑制方案包括施用抗炎类固醇、抗CD20抗体和免疫抑制大环内酯类。
本公开还提供了一种治疗有需要的人受试者的肢带型肌营养不良症的方法，所述方法包括施用选自由以下组成的组的重组腺病毒相关(rAAV)：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；以及免疫抑制方案，其中所述免疫抑制方案包括施用抗炎类固醇、抗CD20抗体和免疫抑制大环内酯类中的一种或多种。本公开还提供了包括rAAV和免疫抑制方案的组合疗法用于制备用于治疗有需要的人受试者的肢带型肌营养不良症的药物的用途，其中所述rAAV包括选自由以下组成的组的rAAV重组腺病毒相关(rAAV)：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；并且其中所述免疫抑制方案包括施用抗炎类固醇、抗CD20抗体和免疫抑制大环内酯类中的一种或多种，例如在公开的药物中，所述rAAV和所述免疫抑制方案的一种或多种组分是单独共同施用的，如所述rAAV和所述免疫抑制方案的一种或多种组分同时或顺序地共同施用。本公开还提供了一种用于治疗有需要的人受试者的肢带型肌营养不良症的组合疗法，其中所述组合疗法包括选自由以下组成的组的重组腺病毒相关(rAAV)：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；并且其中所述免疫抑制方案包括施用抗炎类固醇、抗CD20抗体和免疫抑制大环内酯类中的一种或多种，其中所述rAAV和所述免疫抑制方案的一种或多种组分是单独共同施用的，如所述rAAV和所述免疫抑制方案的一种或多种组分同时或顺序地共同施用。在一些实施例中，所述免疫抑制方案包括施用抗炎类固醇、抗CD20抗体和免疫抑制大环内酯类。
在一个示例性免疫抑制方案中，在施用所述rAAV之前约24小时施用抗炎类固醇。在另一个示例性免疫抑制方案中，在施用所述rAAV之前施用抗炎类固醇，并且从施用所述rAAV后的第1天至第30天每天至少施用一次所述抗炎类固醇，或从施用所述rAAV后的第1天至第60天每天至少施用一次所述抗炎类固醇。
在任何公开的免疫抑制方案中，所述抗炎类固醇是糖皮质激素，如强的松、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙或地夫可特。在一些实施例中，口服施用所述抗炎类固醇。
在另外的示例性免疫抑制方案中，在施用所述rAAV之前抗CD20特异性抗体。例如，通过血管内输注施用抗CD20抗体。示例性抗CD20特异性抗体包含利妥昔单抗、奥美珠单抗或奥法木单抗。
在一个实施例中，在施用所述rAAV之前至少14天施用所述抗CD20特异性抗体。在另一个实施例中，在施用所述rAAV前约60天、在施用所述rAAV前约45天、在施用所述rAAV前约30天、在施用所述rAAV前14天、在施用所述rAAV前约7天，并且在施用所述rAAV的约24小时内施用所述抗CD20特异性抗体。另外，所述抗CD20特异性抗体在施用所述rAAV之前施用30天至60天。所公开的免疫抑制方案还包含在施用所述rAAV后施用抗CD20特异性抗体。
另外，所公开的免疫抑制方案包括在施用所述rAAV之前，每天至少一次施用免疫抑制大环内酯类，持续至少三天。免疫抑制方案还可以包括在施用所述rAAV后施用免疫抑制大环内酯类。在任何公开的免疫抑制方案中，口服施用所述免疫抑制大环内酯类。示例性免疫抑制大环内酯类包含他克莫司、吡美莫司或西罗莫司。
在一些实施例中，所公开的免疫抑制方案在施用所述rAAV之前30天至60天施用。另外，在施用所述rAAV前约60天、施用所述rAAV前约45天、施用所述rAAV前约30天、施用所述rAAV前约14天、施用所述rAAV前约7天、施用所述rAAV前约24小时施用所述免疫抑制方案。
在一个特定实施例中，本公开提供了治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的方法，所述方法包括施用重组腺病毒相关(rAAV)rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白和免疫抑制方案，其中所述免疫抑制方案包括以下步骤：i)在施用所述rAAV之前约24小时口服施用抗炎类固醇，并且从施用所述rAAV后的第1天至第30天每天至少施用一次抗炎类固醇，或从施用所述rAAV后的第1天至第60天每天至少施用一次抗炎类固醇，ii)在施用所述rAAV之前约14天、施用所述rAAV前约7天和施用所述rAAV的约24小时内静脉内施用抗CD20抗体，并且任选地在施用rAAV之后施用抗CD20抗体，iii)在施用所述rAAV之前，每天至少一次口服施用免疫抑制大环内酯类，持续至少三天，并且任选地在施用所述rAAV之后施用所述免疫抑制大环内酯类。例如，抗炎类固醇是强的松、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙或地夫可特，抗CD20特异性抗体是利妥昔单抗、奥美珠单抗或奥法木单抗或抗炎类固醇、抗CD20抗体和免疫抑制大环内酯类中的多种，所述免疫抑制大环内酯类是他克莫司、吡美莫司或西罗莫司。在一个示例性实施例中，免疫抑制方案包括抗炎类固醇强的松或泼尼松龙、抗CD20抗体利妥昔单抗和免疫抑制大环内酯类西罗莫司。
本公开还提供了包括rAAV和免疫抑制方案的组合疗法用于制备用于治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的药物中的用途，其中所述rAAV是rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白，并且所述免疫抑制方案包括：i)在施用所述rAAV之前约24小时口服施用抗炎类固醇，并且从施用所述rAAV后的第1天至第30天每天至少施用一次抗炎类固醇，或从施用所述rAAV后的第1天至第60天每天至少施用一次抗炎类固醇，ii)在施用所述rAAV之前约14天、施用所述rAAV前约7天和施用所述rAAV的约24小时内静脉内施用抗CD20抗体，并且任选地在施用rAAV之后施用抗CD20抗体，iii)在施用所述rAAV之前，每天至少一次口服施用免疫抑制大环内酯类，持续至少三天，并且任选地在施用所述rAAV之后施用所述免疫抑制大环内酯类。例如，抗炎类固醇是强的松、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙或地夫可特，抗CD20特异性抗体是利妥昔单抗、奥美珠单抗或奥法木单抗或抗炎类固醇、抗CD20抗体和免疫抑制大环内酯类中的多种，所述免疫抑制大环内酯类是他克莫司、吡美莫司或西罗莫司。在一个示例性实施例中，免疫抑制方案包括抗炎类固醇强的松或泼尼松龙、抗CD20抗体利妥昔单抗和免疫抑制大环内酯类西罗莫司。
本公开提供了一种包括rAAV和免疫抑制方案的组合疗法，用于治疗有需要的人受试者的肌营养不良症，其中所述rAAV是rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白，并且所述免疫抑制方案包括：i)在施用所述rAAV之前约24小时口服施用抗炎类固醇，并且从施用所述rAAV后的第1天至第30天每天至少施用一次抗炎类固醇，或从施用所述rAAV后的第1天至第60天每天至少施用一次抗炎类固醇，ii)在施用所述rAAV之前约14天、施用所述rAAV前约7天和施用所述rAAV的约24小时内静脉内施用抗CD20抗体，并且任选地在施用rAAV之后施用抗CD20抗体，iii)在施用所述rAAV之前，每天至少一次口服施用免疫抑制大环内酯类，持续至少三天，并且任选地在施用所述rAAV之后施用所述免疫抑制大环内酯类。例如，抗炎类固醇是强的松、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙或地夫可特，抗CD20特异性抗体是利妥昔单抗、奥美珠单抗或奥法木单抗或抗炎类固醇、抗CD20抗体和免疫抑制大环内酯类中的多种，所述免疫抑制大环内酯类是他克莫司、吡美莫司或西罗莫司。在一个示例性实施例中，免疫抑制方案包括抗炎类固醇强的松或泼尼松龙、抗CD20抗体利妥昔单抗和免疫抑制大环内酯类西罗莫司。
在另一个特定实施例中，本公开提供了一种治疗有需要的人受试者的肢带型肌营养不良症的方法，所述方法包括施用选自由以下组成的组的重组腺病毒相关(rAAV)：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；和免疫抑制方案，其中所述免疫抑制方案包括以下步骤：i)在施用所述rAAV之前约24小时口服施用抗炎类固醇，并且从施用所述rAAV后的第1天至第30天每天至少施用一次抗炎类固醇，或从施用所述rAAV后的第1天至第60天每天至少施用一次抗炎类固醇，ii)在施用所述rAAV之前约14天、施用所述rAAV前约7天和施用所述rAAV的约24小时内静脉内施用抗CD20抗体，并且任选地在施用rAAV之后施用抗CD20抗体，iii)在施用所述rAAV之前，每天至少一次口服施用免疫抑制大环内酯类，持续至少三天，并且任选地在施用所述rAAV之后施用所述免疫抑制大环内酯类。
在另一个特定实施例中，本公开提供了包括rAAV和免疫抑制方案的组合疗法用于 制备用于治疗有需要的人受试者的肢带型肌营养不良症的药物的用途，其中所述rAAV选自由以下组成的组：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；并且所述免疫抑制方案包括：i)在施用所述rAAV之前约24小时口服施用抗炎类固醇，并且从施用所述rAAV后的第1天至第30天每天至少施用一次抗炎类固醇，或从施用所述rAAV后的第1天至第60天每天至少施用一次抗炎类固醇，ii)在施用所述rAAV之前约14天、施用所述rAAV前约7天和施用所述rAAV的约24小时内静脉内施用抗CD20抗体，并且任选地在施用rAAV之后施用抗CD20抗体，iii)在施用所述rAAV之前，每天至少一次口服施用免疫抑制大环内酯类，持续至少三天，并且任选地在施用所述rAAV之后施用所述免疫抑制大环内酯类。
在另一个特定实施例中，本公开提供了一种组合疗法，其包括rAAV和免疫抑制方案，用于治疗有需要的人受试者的肢带型肌营养不良症，其中所述rAAV选自由以下组成的组：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；并且所述免疫抑制方案包括：i)在施用所述rAAV之前约24小时口服施用抗炎类固醇，并且从施用所述rAAV后的第1天至第30天每天至少施用一次抗炎类固醇，或从施用所述rAAV后的第1天至第60天每天至少施用一次抗炎类固醇，ii)在施用所述rAAV之前约14天、施用所述rAAV前约7天和施用所述rAAV的约24小时内静脉内施用抗CD20抗体，并且任选地在施用rAAV之后施用抗CD20抗体，iii)在施用所述rAAV之前，每天至少一次口服施用免疫抑制大环内酯类，持续至少三天，并且任选地在施用所述rAAV之后施用所述免疫抑制大环内酯类。
在另一个实施例中，本公开提供了治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的方法，所述方法包括在施用第二剂量重组腺病毒相关(rAAV)rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白之前，对所述受试者的血浆进行至少一次治疗性血浆交换(TPE)，其中所述受试者在经历TPE之前被施用第一剂量的rAAV。
在另一个实施例中，本公开提供了用于治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的组合疗法的用途，其中所述组合疗法包括在施用第二剂量重组腺病毒相关(rAAV)rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白之前，对所述受试者的血浆进行至少一次治疗性血浆交换(TPE)，其中所述受试者在经历TPE之前被施用第一剂量的rAAV。
在另一个实施例中，本公开提供了用于治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的组合疗法，其中所述组合疗法包括在施用第二剂量重组腺病毒相关(rAAV)rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白之前，对所述受试者的血浆进行至少一次治疗性血浆交换(TPE)，其中所述受试者在经历TPE之前被施用第一剂量的rAAV。
本公开提供了一种治疗有需要的人受试者的肢带型肌营养不良症的方法，所述方法包括在施用选自由以下组成的组的第二剂量的重组腺病毒相关(rAAV)之前，对所述受试者的血浆进行至少一次治疗性血浆交换(TPE)：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；其中所述受试者在经历TPE之前被施用第一剂量的rAAV。
在另一个实施例中，本公开提供了治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的方法，所述方法包括以下步骤：a)施用第一剂量的重组腺病毒相关(rAAV)rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白，b)对所述受试者的血浆进行至少一次治疗性血浆交换(TPE)，以及c)施用第二剂量的rAAV。在任何公开的方法中，在施用第2剂量或rAAV之前，对受试者的血浆进行至少两次TPE或至少三次TPE。在一些实施例中，在施用第2剂量rAAV之前受试者的血浆经历至少四次TPE，或在施用第2剂量的rAAV之前受试者的血浆经历五次TPE，或在施用第2剂量的rAAV之前受试者的血浆经历六次TPE，或在施用第2剂量的rAAV之前受试者的血浆经历七次TPE。
在另一个实施例中，本公开提供了一种治疗有需要的人受试者的肢带型肌营养不良症的方法，所述方法包括以下步骤：a)施用选自由以下组成的组的第一剂量的重组腺病毒相关：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；b)使所述受试者的血浆进行至少一次治疗性血浆交换(TPE)，以及c)施用第二剂量或rAAV。在任何公开的方法中，在施用第2剂量或rAAV之前，对受试者的血浆进行至少两次TPE或至少三次TPE。在一些实施例中，在施用第2剂量rAAV之前受试者的血浆经历至少四次TPE，或在施用第2剂量的rAAV之前受试者的血浆经历五次TPE，或在施用第2剂量的rAAV之前受试者的血浆经历六次TPE，或在施用第2剂量的rAAV之前受试者的血浆经历七次TPE。
在另外的实施例中，本公开提供了治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的方法，所述方法包括以下步骤：a)在施用重组腺病毒相关(rAAV)rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白之前，对所述受试者的血浆进行至少一次治疗性血浆交换(TPE)，以及b)施用rAAV。在任何公开的方法中，在施用rAAV之前对受试者的血浆进行至少两次TPE、在施用rAAV之前至少三次TPE、在施用rAAV之前至少四次TPE、在施用rAAV之前至少五次TPE、在施用rAAV之前至少六次TPE或在施用之前施用rAAV之前至少七次TPE、在这些公开的方法中，在施用rAAV之前约24小时向受试者施用抗炎类固醇。另外，在一些实施例中，从施用rAAV后的第1天至第60天，向受试者每天至少一次施用抗炎类固醇。例如，口服施用抗炎类固醇。另外，所述抗炎类固醇是糖皮质激素，如强的松、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙或地夫可特。
另外，本公开提供了治疗有需要的人受试者的肢带型肌营养不良症的方法，所述方法包括有需要的人受试者的肌营养不良症的步骤，包括以下步骤：a)在施用选自由以下组成的组的重组腺病毒相关(rAAV)之前，对所述受试者的血浆进行至少一次治疗性血浆交换(TPE)：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；b施用rAAV。在任何公开的方法中，在施用rAAV之前对受试者的血浆进行至少两次TPE、在施用rAAV之前至少三次TPE、在施用rAAV之前至少四次TPE、在施用rAAV之前至少五次TPE、在施用rAAV之前至少六次TPE或在施用之前施用rAAV之前至少七次TPE、在这些公开的方法中，在施用rAAV之前约24小时向受试者施用抗炎类固醇。另外，在一些实施例中，从施用rAAV后的第1天至第60天，向受试者每天至少一次施用抗炎类固醇。例如，口服施用抗炎类固醇。另外，所述抗炎类固醇是糖皮质激素，如强的松、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙或地夫可特。
在任何公开的方法中，在施用rAAV之前至少9天、施用之前至少7天、施用之前5天或施用之前2天，对受试者的血浆进行TPE。另外，在施用rAAV之前，在受试者的血浆上进行TPE的疗程之间有约24小时至约48小时。在特定实施例中，在施用rAAV之前，对受试者的血浆进行至少两次TPE，其中所述TPE之间约有48小时。
在本文所描述的任何方法中，受试者在施用rAAV时具有约1:400或更低的抗AAVrh.74抗体水平。例如，受试者在施用rAAV时具有约1:100至约1:400的抗AAVrh.74抗体水平，或约1:100至约1:300的抗AAVrh.74抗体水平，或约1:100至约1:200的抗AAVrh.74抗体水平，或约1:250至约1:500的抗AAVrh.74抗体水平，或约1:200至约1:400的抗AAVrh.74抗体水平，抗体滴度确定为总抗体结合滴度。在任何公开的治疗肌营养不良症的方法中，这些方法进一步包括确定所述受试者的血清或血浆中抗AAVrh.74抗体的存在的步骤。确定抗AAVrh.74抗体的存在的步骤可以在施用rAAV之前、施用rAAV之后、观察到免疫应答或不良事件之前或观察到免疫应答或不良事件之后进行。另外，确定步骤可以在施用免疫抑制方案或TPE的步骤之前进行。例如，确定步骤在向所述受试者施用任何AAV之前执行，或确定步骤在向所述受试者施用任何AAVrh.74之前执行。
本公开还提供了进一步包括将所述受试者的血清或血浆中的抗AAVrh.74抗体水平与阳性对照进行比较的步骤的方法。例如，阳性对照利用抗AAVrh.74单克隆抗体。
在任何公开的方法中，抗AAVrh.74的存在的确定可以利用免疫荧光测定、免疫组织化学测定、蛋白质印迹、直接酶联免疫吸附测定(ELISA)、间接ELISA、夹心ELISA、竞争性ELISA、反向ELISA、化学发光测定、放射免疫测定或免疫沉淀测定来确定。
在任何公开的方法中，确定抗AAVrh.74抗体的存在的步骤包括利用单克隆抗体，所述单克隆抗体包括VH CDR1氨基酸序列，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：NYGMN(SEQ ID NO:20)、DYGMN(SEQ ID NO:22)、YTFTNYGMN(SEQ ID NO:21)和YTFTKYGMN(SEQ IDNO:23)或包括VH CDR2氨基酸序列的单克隆抗体，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：WINTYTGEPTYADDFKG(SEQ ID NO:24)、WINTNTGEPTYGDDFKG(SEQ ID NO:25)和WMGWINTYTGEPTY(SEQ ID NO:26)或包括VH CDR3氨基酸序列的单克隆抗体，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：GVAHYSDSRFAFDY(SEQ ID NO:27)、GNAHPGGSAFVY(SEQ ID NO:28)、RGSYYYDSSPAWFAY(SEQ ID NO:29)、RGVDSSGYGAFAY(SEQ ID NO:30)和TRGTSTMISTFAFVY(SEQ ID NO:31)或包括VL CDR1氨基酸序列的单克隆抗体，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：SVSSSVSYMH(SEQ ID NO:32)、SASSGVTYMH(SEQ ID NO:33)、SSVSYMH(SEQ ID NO:34)和SSVRYMH(SEQ ID NO:35)或包括VL CDR2氨基酸序列的单克隆抗体，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：YTSNLAS(SEQ ID NO:36)、RTSNLAS(SEQ ID NO:37)、LWIYSTSNLAS(SEQ ID NO:38)和VWIYSTSNLAS(SEQ ID NO:39)或包括VH CDR3氨基酸序列的单克隆抗体，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：QQRSSYPFT(SEQ ID NO:40)、QQRSTYPF(SEQ ID NO:41)、QQRSFYPF(SEQ ID NO:42)和QQRTYYPF(SEQ ID NO:43)。
在一个示例性实施例中，所公开的方法包括利用抗AAVrh.74单克隆抗体确定抗AAVrh.74抗体的存在的步骤，如包括以下中所示的可变重链(VH)序列的单克隆抗体：SEQID NO:10、12、14、16或18，或包括以下中所示的可变轻链(VL)序列的单克隆抗体：SEQ IDNO:11、13、15、17或19。
在另外的实施例中，所公开的方法包括利用抗AAVrh.74单克隆抗体确定抗AAVrh.74抗体的存在的步骤，所述单克隆抗体包括以下中所示的可变重链(VH)序列：SEQID NO:10、12、14、16或18，以及以下中所示的可变轻链(VL)序列：SEQ ID NO:11、13、15、17或19。
在任何公开的方法中，确定抗AAVrh.74抗体的存在的步骤是定量的，其中所述受试者基于所述定量被鉴定为抗AAVrh.74抗体的血清阳性，并且其中所述免疫抑制方案或TPE被选择性地向血清阳性受试者施用。在本文所公开的任何方法中，rAAV以约5.0×1012vg/kg至约1.0×1015vg/kg的剂量通过全身施用途径施用。肌营养不良症可能是杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy)或碧加氏肌营养不良症。
例如，施用的rAAV的剂量为约5.0×1012vg/kg至约1.0×1014vg/kg、或约5.0×1012vg/kg至1.0×1014vg/kg、或约5.0×1012vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或约5.0×1012vg/kg至约1.0×1014vg/kg、或约5.0×1012vg/kg至约5.0×1013vg/kg、或约5.0×1012vg/kg至约2.0×1013vg/kg、或约5.0×1012vg/kg至约1.0×1013vg/kg或1.0×1014vg/kg至约1.0×1015vg/kg或1.0×1013vg/kg至约1.0×1014vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至1.0×1014vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至约1.0×1014vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至约5.0×1013vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至约3.0×1014vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至约5.0×1014vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至约6.0×1014vg/kg、或1.0×1013vg/kg至约1.0×1015vg/kg、或5.0×1013vg/kg至约1.0×1014vg/kg、或约5.0×1013vg/kg to1.0×1014vg/kg、或约5.0×1013vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或约5.0×1013vg/kg至约1.0×1014vg/kg、或约5.0×1013vg/kg至约3.0×1014vg/kg、或约5.0×1013vg/kg至约5.0×1014vg/kg、或约5.0×1013vg/kg至约6.0×1014vg/kg、或5.0×1013vg/kg至约1.0×1015vg/kg、或1.0×1014vg/kg至约6.0×1014vg/kg、或1.0×1014vg/kg至约5.0×1014vg/kg、或1.0×1014vg/kg至约4.0×1014vg/kg、或1.0×1014vg/kg至约1.0×1015vg/kg、或1.0×1014vg/kg至约3.0×1014vg/kg、或约1.0×1014vg/kg至约2.5×1014vg/kg、或1.0×1014vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至约3.75×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至6.0×1014、或约1.25×1014vg/kg至5.0×1014、或约1.25×1014vg/kg至4.0×1014、或约1.25×1014vg/kg至1.0×1015、或约1.25×1014vg/kg至约3.5×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至约3.0×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至约2.75×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至约2.5×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或1.25×1014vg/kg至约3.75×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至约3.5×1014vg/kg、或1.5×1014vg/kg至约1.0×1015vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至6.0×1014、或约1.5×1014vg/kg至5.0×1014、或约1.5×1014vg/kg至4.0×1014、或约1.5×1014vg/kg至约3.75×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至约3.5×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至约3.25×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至约3.0×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至约2.75×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至约2.5×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或1.75×1014vg/kg至约1.0×1015vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至6.0×1014、或约1.75×1014vg/kg至5.0×1014、或约1.75×1014vg/kg至4.0×1014、或约1.75×1014vg/kg至约3.75×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约3.5×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约3.25×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约3.0×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约2.75×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约2.5×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约2.25×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或约2.0×1014vg/kg至1.0×1015、或约2.0×1014vg/kg至6.0×1014、或约2.0×1014vg/kg至5.0×1014、或约2.0×1014vg/kg至约4.0×1014vg/kg、或约2.0×1014vg/kg至约3.75×1014vg/kg、或约2.0×1014vg/kg至约3.5×1014vg/kg、或约2.0×1014vg/kg至约3.25×1014vg/kg。
在一个实施例中，本公开的方法包括全身施用rAAV，其中全身施用途径是静脉内途径，并且施用的rAAV的剂量为约2.0×1014vg/kg。在另一个实施例中，本公开的方法包括全身施用rAAV，其中所述全身施用途径是静脉内途径，并且施用的rAAV剂量为约5.0×1012vg/kg、或约6.0×1012vg/kg、或约7.0×1012vg/kg、或约8.0×1012vg/kg、或约9.0×1012vg/kg、或约1.0×1013vg/kg、或约1.25×1013vg/kg、或约1.5×1013vg/kg、或约1.75×1013vg/kg、或约2.25×1013vg/kg、或约2.5×1013vg/kg、或约2.75×1013vg/kg、或约3.0×1013vg/kg、或约3.25×1013vg/kg、或约3.5×1013vg/kg、或约3.75×1013vg/kg、或约4.0×1013vg/kg、或约5.0×1013vg/kg、或约6.0×1013vg/kg、或约7.0×1013vg/kg、或约8.0×1013vg/kg、或约9.0×1013vg/kg、或约1.0×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg、或约2.25×1014vg/kg、或约2.5×1014vg/kg、或约2.75×1014vg/kg、或约3.0×1014vg/kg、或约3.25×1014vg/kg、或约3.5×1014vg/kg、或约3.75×1014vg/kg、或约4.0×1014vg/kg、或约5.0×1014vg/kg、或约6.0×1014vg/kg、或约1×1015vg/kg。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白或AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，rAAV是以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白：SEQID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。在一个实施例中，rAAV是以下的核苷酸56至4820的AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:5。
在本公开的任何方法、组合疗法或用途中，rAAV的剂量可以以约5mL/kg至约15mL/kg、或约8mL/kg至约12mL/kg、或8mL/kg至约10mL/kg、或5mL/kg至约10mL/kg或约10mL/kg至12mL/kg或约10mL/kg至15mL/kg或10mL/kg至约20mL/kg施用。在特定实施例中，以约10mL/kg的剂量或rAAV施用。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白或AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，rAAV是以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。在一个实施例中，rAAV是以下的核苷酸56至4820的AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:5。
在本公开的任何方法、组合疗法或药物中，rAAV的剂量可以通过注射、输注或植入来施用。例如，rAAV的剂量通过输注在大约一小时内给药。此外，rAAV的剂量是通过四肢外周静脉，例如臂外周静脉或腿部外周静脉的静脉内途径给药。或者，可以在大约30分钟、或大约1.5小时、或大约2小时、或大约2.5小时或大约3小时内给予注射。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白是以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白是以下的核苷酸56至4820的AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:5。
通过本公开的任何方法、组合疗法或用途施用的rAAV可以包括以下的人微肌营养不良蛋白核苷酸序列：SEQ ID NO:1，以下的MHCK7启动子序列：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7。另外，通过本公开的任何方法施用的rAAV包括以下的人微肌营养不良蛋白核苷酸序列：SEQ ID NO:1，以及以下的MHCK7启动子序列：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7。例如，rAAV可以包括以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白是以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白：SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。
在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白是以下的核苷酸56至4820的AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:5。
在本公开的任何方法、组合疗法或用途中，施用的rAAV是AAVrh.74抗体的血清型。
在一些实施例中，本公开的方法、组合疗法或用途治疗杜氏肌营养不良症或碧加氏肌营养不良症。一个示例性实施例是用于治疗有需要的人受试者的杜氏肌营养不良症或碧加氏肌营养不良症的方法、组合疗法或药物，包括施用重组腺病毒相关(rAAV)rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白的剂量的步骤，其中所述施用途径是静脉内输注，并且在约一小时内所施用的rAAV的剂量为约2×1014vg/kg，并且其中所述rAAV载体包括以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列：SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白是以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白是以下的核苷酸56至4820的AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:5。
在一个实施例中，本公开提供了rAAV，其包括肌肉特异性控制元件核苷酸序列和编码微肌营养不良蛋白的核苷酸序列。例如，核苷酸序列编码功能性微肌营养不良蛋白，其中所述核苷酸与以下具有例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，更通常地至少90％、91％、92％、93％或94％，甚至更通常地至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性：SEQ ID NO:1，其中所述蛋白质保持微肌营养不良蛋白活性。微肌营养不良蛋白在肌肉收缩期间为肌肉膜提供稳定性，例如微肌营养不良蛋白在肌肉收缩期间充当减震器。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白是以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白是以下的核苷酸56至4820的AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:5。
本公开还提供了rAAV，其中所述核苷酸序列包括在严格条件下与SEQ ID NO:1的核酸序列或其互补物杂交的核苷酸序列，并且编码功能性微肌营养不良蛋白。
在一个实施例中，rAAV是非复制的重组腺相关病毒(AAV)，称为以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ IDNO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。该载体基因组含有基因表达所需的最小元件，包含AAV2反向末端重复序列(ITR)、微肌营养不良蛋白、SV40内含子(SD/SA)和合成多聚腺苷酸化(Poly A)信号，均在MHCK7启动子/增强子的控制下。基因组和表达盒的示意图在图1中示出。AAVrh.74血清型可以用于在IV施用后在骨骼肌和心肌中实现有效的基因转移。
在另一个实施例中，本公开提供了一种治疗有需要的人受试者的肢带型肌营养不良症的方法，所述方法包括施用包括以下的核苷酸序列的rAAV：SEQ ID NO:44。
另一方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的肢带型肌营养不良症的方法、组合疗法或用途，包括基于超螺旋质粒为定量标准，以约5.0×1013vg/kg或约2.0×1014vg/kg的剂量在约1至2小时内向受试者静脉内输注施用rAAV，或基于线性化治理作为定量标准，约1.85×1013vg/kg或7.41×1013vg/kg，并且其中所述rAAV包括以下的核苷酸序列SEQ ID NO:44。另一方面，本公开描述了在受试者的细胞中表达β-肌聚糖基因的方法，所述方法包括向所述受试者施用scAAVrh74.MHCK7.hSGCB构建体，所述构建体包括与以下至少90％、95％或99％相同的核苷酸序列：SEQ ID NO:19。一方面，本公开提供了一种增加受试者肌肉组织中β-肌聚糖阳性纤维和/或降低CK水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用scAAVrh74.MHCK7.hSGCB构建体核苷酸序列，所述构建体核苷酸序列与以下至少90％、95％或99％相同：SEQ ID NO:44。
在另一方面，本文所述的重组AAV载体包括编码β-肌聚糖的多核苷酸序列。在一些实施例中，编码β-肌聚糖的多核苷酸序列包括与以下中所示的核苷酸序列具有例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％、更通常地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列：SEQ ID NO:45，并且编码保留β-肌聚糖活性的蛋白质。在一些实施例中，编码β-肌聚糖的多核苷酸序列包括以下中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:45。在一些实施例中，编码β-肌聚糖的多核苷酸序列由以下中所示的核苷酸序列组成：SEQ ID NO:45。
另一方面，本文所描述的重组AAV载体包括编码β-肌聚糖的多核苷酸序列，其与以下的氨基酸序列具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，更通常地至少90％、91％、92％、93％或94％，甚至更通常地至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性：SEQ ID NO:46，并且所述蛋白质保持β-肌聚糖活性。
另一方面，本文所描述的重组AAV载体包括编码β-肌聚糖的多核苷酸序列，其具有以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:46。
另一方面，本文描述了包括编码功能性β-肌聚糖的多核苷酸序列的重组AAV载体，所述多核苷酸序列包括在严格条件下与以下或其补体的核酸序列杂交的核苷酸序列：SEQID NO:45。
在特定实施例中，本公开提供了用于治疗有需要的人受试者的LGMD2E的方法、组合疗法或用途，包括施用rAAV scAAVrh74.MHCK7.HSGCB。例如，在治疗LGMD2E的任何方法中，scAAVrh74.MHCK7.HSGCB以约0.5×1014vg/kg或约2×1014vg/kg的剂量通过静脉内输注施用。本文中参考scAAVrh74.MHCK7.HSGCB所述的剂量，包含在前述内容中是基于利用超螺旋qPCR标准。通过利用线性qPCR标准测量，0.5×1014vg/kg和2×1014vg/kg分别对应于1.85×1013和7.41×1013。
在特定实施例中，在用于治疗人受试者的肢带型肌营养不良症的任何方法、组合疗法或用途中，所述人受试者患有LGMD2E，并且rAAV通过静脉输注以约2×1014vg/kg的剂量施用，并且其中所述rAAV包括是scAAVrh74.MHCK7.HSGCB的rAAV，其包括以下的核苷酸序列：SEQ ID NO:44。
在相关实施例中，人受试者患有肌营养不良症LGMD2E，并且rAAV是通过静脉内输注以约2×1014vg/kg的剂量施用的scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，所述方法进一步包括在施用rAAV之前的一天(12小时至24小时)开始向所述受试者施用1毫克/千克/天的强的松，并且在逐渐减量或不逐渐减量的情况下持续六十天。
在另一个相关实施例中，人受试者患有肌营养不良症LGMD2E，并且rAAV是通过静脉内输注以约0.5×1014vg/kg的剂量施用的scAAVrh74.MHCK7.HSGCB，所述方法进一步包括在施用rAAV之前的一天(12小时至24小时)开始向所述受试者施用1毫克/千克/天的强的松，并且在逐渐减量或不逐渐减量的情况下持续三十天。
认识到本领域技术人员可以根据受试者的特定临床表现以及本文中进一步描述的本发明的方法，逐渐减少强的松的三十天和六十天施用。
术语“严格”用于指本领域通常理解为严格的条件。杂交的严格性主要由温度、离子强度、以及如甲酰胺等变性剂的浓度决定。用于杂交和洗涤的严格条件的实例是0.015M氯化钠、65℃到68℃下的0.0015M柠檬酸钠，0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和42℃下的50％甲酰胺。参见Sambrook等人《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第2版,冷泉港实验室,(纽约冷泉港，1989)。还可以使用更严格的条件(例如更高的温度、更低的离子强度、更高的甲酰胺或其它变性剂)，然而，杂交速率将受到影响。在涉及脱氧寡核苷酸杂交的情况下，另外的示例性严格杂交条件包含在37℃(对于14碱基寡聚物)、48℃(对于17碱基寡聚物)、55℃(对于20碱基寡聚物)和60℃(对于23碱基寡聚物)下在6×SSC 0.05％焦磷酸钠中洗涤。
为了减少非特异性和/或背景杂交，可以在杂交和洗涤缓冲液中包含其它试剂。例子是0.1％牛血清白蛋白、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％焦磷酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠、NaDodSO4、(SDS)、ficoll、Denhardt溶液、超声处理鲑鱼精子DNA(或其它非互补DNA)和葡聚糖硫酸盐，尽管也可以使用其它合适的试剂。可以改变这些添加剂的浓度和类型，而基本上不影响杂交条件的严格性。杂交实验通常在pH 6.8-7.4下进行，然而，在典型的离子强度条件下，杂交速率几乎与pH无关。参见Anderson等人,《核酸杂交：一种实用的方法(Nucleic Acid Hybridisation:A Practical Approach)》,第4章,IRL出版社(英国牛津)。本领域技术人员可以调节杂交条件以适应这些变量并允许不同序列相关性的DNA形成杂交体。
术语“肌肉特异性控制元件”是指调节对肌肉组织中表达特异的编码序列的表达的核苷酸序列。这些控制元素包含增强子和启动子。本公开提供了包括肌肉特异性控制元件MCKH7启动子、MCK启动子和MCK增强子的构建体。
一方面，本公开了提供了rAAV，其中所述肌肉特异性控制元件是人骨骼肌动蛋白基因元件、心肌肌动蛋白基因元件，心肌细胞特异性增强子结合因子(MEF)、肌肉肌酸激酶(MCK)、截短MCK(tMCK)，肌球蛋白重链(MHC)、混合α-肌球蛋白重链增强子-/MCK增强子启动子(MHCK7)、C5-12、鼠肌酸激酶增强子元件、骨骼快收缩肌钙蛋白c基因元件、慢收缩心脏肌钙蛋白c基因元件、慢收缩肌钙蛋白i基因元件、缺氧诱导核因子、类固醇诱导元件或糖皮质激素应答元件(GRE)。
例如，肌肉特异性控制元件是MHCK7启动子核苷酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7，或肌肉特异性控制元件是MCK核苷酸序列SEQ ID NO:4。另外，在本公开的任何rAAV载体中，肌肉特异性控制元件核苷酸序列，例如MHCK7或MCK核苷酸序列与编码微肌营养不良蛋白的核苷酸序列可操作地连接。例如，MHCK7启动子核苷酸序列(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7)与人微肌营养不良蛋白编码序列(SEQ ID NO:1)可操作地连接，如图1或图2(SEQ ID NO:3)或图13(SEQ ID NO:9)中所提供的构建体所述。在另一个实例中，MCK启动子(SEQ ID NO:4)与人微肌营养不良蛋白编码序列(SEQ ID NO:1)可操作地连接，如图5或图6(SEQ ID NO:5)中所提供的构建体所述。另一方面，本公开提供了一种rAAV载体，其包括以下的核苷酸序列：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:7。本公开还提供了包括以下的核苷酸序列的rAAV载体：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4。
在另外的方面，本公开提供了包含在质粒中的rAAV构建体，所述质粒包括以下的核苷酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8。例如，AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白载体包括在以下的ITR内并包含其的核苷酸序列：SEQID NO:3，并且在图2中示出。rAAV载体包括5'ITR、MHCK7启动子、嵌合内含子序列、人微肌营养不良蛋白基因的编码序列、polyA和3'ITR。在一个实施例中，载体包括以下的核苷酸55至5021：SEQ ID NO:3。SEQ ID NO:3中阐述的质粒进一步包括氨苄青霉素(ampicillin)抗性和具有pBR322复制起点的pGEX质粒主链。
另一方面，本公开提供了包括以下的核苷酸序列的rAAV：SEQ ID NO:9。例如，AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白载体构建体包括以下的核苷酸序列：SEQ ID NO:9，并且在图7中示出。此rAAV载体构建体包括MHCK7启动子、嵌合内含子序列、人微肌营养不良蛋白基因的编码序列和polyA。在一个实施例中，rAAV载体构建体进一步包括到启动子的ITR 5'和到polyA的ITR 3'。在一个实施例中，rAAV是AAVrh.74。
另一方面，AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白载体包括在以下的ITR内并包含其的核苷酸序列：SEQ ID NO:8，并且在图9中示出。rAAV载体包括5'ITR、MHCK7启动子、嵌合内含子序列、人微肌营养不良蛋白基因的编码序列、polyA和3'ITR。在一个实施例中，载体包括以下的核苷酸1至4977：SEQ ID NO:9。SEQ ID NO:3中阐述的质粒进一步包括卡那霉素(kanamycin)抗性和具有pBR322复制起源的pGEX质粒主链。
另一方面，本公开提供了包括AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白载体构建体的质粒。在一个实施例中，质粒包括5'ITR、MHCK7启动子、嵌合内含子序列、人微肌营养不良蛋白基因的编码序列、polyA和3'ITR。在一个实施例中，质粒包括卡那霉素抗性，并且任选地包括具有pBR322复制起点的pGEX质粒主链。在特定实施例中，质粒在SEQ ID NO:8中阐述，并且在图8和图9中示出。
本公开提供了重组AAV载体，其包括以下的人微肌营养不良蛋白核苷酸序列：SEQID NO:1，以及以下的MHCK7启动子核苷酸序列：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7。该rAAV载体是AAV血清型AAVrh.74。
本公开还提供了rAAV，其包括在以下的ITR内并包含其的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列：SEQ ID NO:3，以下的ITR内并包含其的核苷酸序列：SEQ IDNO:8或如以下中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO:9。该rAAV载体是AAV血清型AAVrh.74。
本公开的rAAV载体可以是任何AAV血清型，如血清型AAVrh.74、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13。
本公开还提供了药物组合物(或有时在本文中被简单称为“组合物”)，所述药物组合物包括本公开的rAAV载体中的任何载体。
在另一个实施例中，本公开提供了产生rAAV载体颗粒的方法，所述方法包括培养用本公开的任何rAAV载体转染的细胞，并且从转染的细胞的上清液中回收rAAV颗粒。本公开还提供了包括本公开的任何重组AAV载体的病毒颗粒。
在治疗肌营养不良症的任何方法中，施用rAAV后，受试者细胞中所关注的转基因(如β-肌聚糖基因表达或微肌营养不良蛋白基因表达)的水平增加。通过在施用rAAV之前和之后在肌肉活检中通过蛋白质印迹测量所关注的蛋白质的水平来检测细胞中所关注的基因转基因的表达。特别地，与施用rAAV之前的所关注的蛋白质的水平相比，施用rAAV之后，所关注的蛋白质的水平增加至少约70％到至少约80％，或至少约70％到至少约90％，或至少约80％到至少约90％。例如，与施用rAAV之前的所关注的蛋白质的水平相比，施用rAAV之后，所关注的蛋白质的水平增加至少约70％或至少约71％或至少约72％或至少约73％或至少约74％或至少约75％或至少约76％或至少约77％或至少约78％或至少约79％或至少约80％或至少约81％或至少约82％或至少约83％或至少约84％或至少约85％。
另外，通过在施用rAAV之前和之后的肌肉活检中通过免疫组织化学测量所关注的蛋白质的水平来检测细胞中微肌营养不良蛋白基因的表达。与施用rAAV之前的所关注的蛋白质水平相比，施用rAAV之后，所关注的蛋白质水平增加至少约70％到至少约80％，或至少约70％到至少约90％，或至少约80％到至少约90％。例如，与施用rAAV之前的所关注的蛋白质的水平相比，施用rAAV之后，所关注的蛋白质的水平增加至少约70％或至少约71％或至少约72％或至少约73％或至少约74％或至少约75％或至少约76％或至少约77％或至少约78％或至少约79％或至少约80％或至少约81％或至少约82％或至少约83％或至少约84％或至少约85％。
在用于治疗肌营养不良症的任何方法、组合疗法或用途中，与施用rAAV前的血清CK水平相比，施用rAAV后受试者的血清CK水平降低。例如，与施用rAAV前的血清CK水平相比，施用rAAV后60天，受试者的血清CK水平降低约65％至约90％或约65％至约95％或约75％至约90％或约80％至约90％或约85％至约95％或约87％至约95％或约87％至约90％。特别地，在本公开的用于治疗肌营养不良症的任何方法、组合疗法或用途中，与施用本公开的用于治疗肌营养不良症的任何方法、组合疗法或用途中的rAAV前的血清CK水平相比，在施用rAAV后60天，受试者的血清CK水平下降约87％，与施用本公开的用于治疗肌营养不良症的任何方法、组合疗法或用途中的rAAV前的血清CK水平相比，在施用rAAV后60天，受试者的血清CK水平下降约72％，与施用rAAV前的血清CK水平相比，在施用rAAV后60天，受试者的血清CK水平下降约73％，或在本公开的用于治疗肌营养不良症的任何方法、组合疗法或用途中，与施用本公开的用于治疗肌营养不良症的任何方法、组合疗法或用途中的rAAV前的血清CK水平相比，在施用rAAV后60天，受试者的血清CK水平下降约78％，或在本公开的用于治疗肌营养不良症的任何方法、组合疗法或用途中，与施用rAAV前的血清CK水平相比，在施用rAAV后60天，受试者的血清CK水平下降约95％。在用于治疗肌营养不良症的任何方法、组合疗法或用途中，与施用rAAV之前所关注的蛋白质的阳性肌肉纤维的数量相比，施用rAAV之后受试者的肌肉组织中所关注的蛋白质的阳性肌肉纤维的数量增加。例如，通过在施用rAAV之前和之后对肌肉活检进行蛋白质印记或免疫组织化学检测所关注的蛋白质的阳性肌肉纤维水平，来检测所关注的蛋白质的阳性肌肉纤维的数量。
在用于治疗肌营养不良症的任何方法、组合疗法或用途中，rAAV的施用上调DAPC蛋白(如α-肌聚糖或β-肌聚糖)的表达。例如，与施用rAAV前的α-肌聚糖的水平相比，施用rAAV后受试者的α-肌聚糖的水平增加。另外，与施用rAAV前的β-肌聚糖的水平相比，施用rAAV后受试者的β-肌聚糖的水平增加。通过在施用rAAV之前和之后对肌肉活检进行蛋白质印迹或免疫组织化学测量α-肌聚糖或β-肌聚糖蛋白水平来检测α-肌聚糖或β-肌聚糖蛋白水平。
在用于治疗肌营养不良症的任何方法、组合疗法或用途中，施用rAAV后，受试者的疾病进展会延迟，如通过以下任一项测量的：六分钟步行测试、起身时间、上升4步、上升和下降4步、北极星移动评价量表(North Star Ambulatory Assessment，NSAA)、10米计时测试、100米计时测试，手持肌力测定法(HHD)、定时起立和行走和/或粗大运动子集量表(Bayley-III)评分。
例如，在任何方法、组合疗法或用途中，与施用rAAV之前的NSAA评分相比，受试者在施用rAAV之后至少270天的NSAA评分至少有6分的改善。此外，在任何方法、组合疗法或用途中，与施用rAAV之前的起身时间相比，受试者在施用rAAV之后至少270天的起身时间具有至少约0.8秒的改善。另外，在任何方法、组合疗法或用途中，与施用rAAV之前的上升4步测试时间相比，受试者在施用rAAV之后至少270天的上升4步测试时间具有至少约1.2秒的改善。另外，在任何方法、组合疗法或用途中，与施用rAAV前的100m定时测试相比，施用rAAV后至少270天，受试者在100m定时测试中具有至少约7秒的改善。
在另一个实施例中，本公开提供了用于在患者细胞中表达微肌营养不良蛋白基因的方法、组合物、组合疗法或用途，包括向患者施用以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。例如，通过在施用rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体之前和之后在肌肉活检中通过蛋白质印迹或免疫组织化学测量微肌营养不良蛋白水平来检测患者细胞中微肌营养不良蛋白基因的表达。另外，通过检测每个核的载体基因组的数量来测量微肌营养不良蛋白基因在患者中的表达，其中每个核的1个载体基因组为微肌营养不良蛋白表达的约50％，并且每个核大于1个拷贝与微肌营养不良蛋白表达水平一致。例如，细胞每个核具有1.2个载体拷贝，或每个核1.3个载体拷贝、或每个核1.4个载体拷贝、或每个核1.5个载体拷贝、或每个核1.6个载体拷贝、或每个核1.7个载体拷贝、或每个核1.8个载体拷贝、或每个核1.9个载体拷贝。
在另外的实施例中，本公开提供了用于降低有需要的患者血清CK水平的方法、组合物、组合疗法或用途，所述方法包括向患者施用以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。例如，与施用rAAV前的血清CK水平相比，施用rAAV后60天，患者的血清CK水平降低至少约65％至约90％或约65％至约95％或约75％至约90％或约80％至约90％或约85％至约95％或约87％至约95％或约87％至约90％。特别地，与施用本公开的用于治疗肌营养不良症的任何方法、组合物、组合疗法或用途中的rAAV前的血清CK水平相比，在施用rAAV后60天，受试者的血清CK水平下降约87％，与施用本公开的用于治疗肌营养不良症的任何方法、组合物、组合疗法或用途中的rAAV前的血清CK水平相比，在施用rAAV后60天，受试者的血清CK水平下降约72％，与施用rAAV前的血清CK水平相比，在施用rAAV后60天，受试者的血清CK水平下降约73％，或在本公开的用于治疗肌营养不良症的任何方法、组合物、组合疗法或用途中，与施用本公开的用于治疗肌营养不良症的任何方法、组合物、组合疗法或用途中的rAAV前的血清CK水平相比，在施用rAAV后60天，受试者的血清CK水平下降约78％，或在本公开的用于治疗肌营养不良症的任何方法、组合物、组合疗法或用途中，与施用rAAV前的血清CK水平相比，在施用rAAV后60天，受试者的血清CK水平下降约95％。
本公开还提供了用于增加患者肌肉组织中微肌营养不良蛋白阳性纤维的方法、组合物、组合疗法或用途，包括向患者施用以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。例如，在施用rAAV之前和之后，通过蛋白质印迹或免疫组织化学在肌肉活检上测量肌营养不良蛋白水平来检测微肌营养不良蛋白阳性纤维的数量。另外，通过检测每个核的载体基因组的数量来测量微肌营养不良蛋白基因在患者中的表达，其中每个核的1个载体基因组为微肌营养不良蛋白表达的约50％，并且每个核大于1个拷贝与微肌营养不良蛋白表达水平一致。例如，细胞每个核具有1.2个载体拷贝，或每个核1.3个载体拷贝、或每个核1.4个载体拷贝、或每个核1.5个载体拷贝、或每个核1.6个载体拷贝、或每个核1.7个载体拷贝、或每个核1.8个载体拷贝、或每个核1.9个载体拷贝。
在另一个实施例中，本公开提供了用于增加有需要的患者的α-肌聚糖的表达的方法、组合物、组合疗法或用途，包括向患者施用以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。例如，在施用rAAV之前和之后，通过蛋白质印迹或免疫组织化学在肌肉活检上测量α-肌聚糖蛋白水平来检测α-肌聚糖的水平。
另外，本公开提供了用于增加有需要的患者的β-肌聚糖的表达的方法、组合物、组合疗法或用途，包括向患者施用以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ IDNO:6的核苷酸56至5022。例如，在施用rAAV之前和之后，通过蛋白质印迹或免疫组织化学在肌肉活检上测量β-肌聚糖蛋白水平来检测β-肌聚糖的水平。
本公开还提供了用于治疗患有杜氏肌营养不良症或碧加氏肌营养不良症的患者的方法、组合物、组合疗法或用途，包括向患者施用以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022，使得患者的疾病进展延迟，如通过以下任一项测量的：六分钟步行测试、起身时间、上升4步、上升和下降4步、北极星移动评价量表(NSAA)、10米计时测试、100米计时测试，手持肌力测定法(HHD)、定时起立和行走和/或粗大运动子集量表(Bayley-III)评分。
例如，在任何方法、组合物、组合疗法或用途中，与施用rAAV之前的NSAA评分相比，受试者在施用rAAV之后至少270天的NSAA评分至少有6分的改善。此外，在任何方法中，与施用rAAV之前的起身时间相比，受试者在施用rAAV之后至少270天的起身时间具有至少约0.8秒的改善。另外，在任何方法中，与施用rAAV之前的上升4步测试时间相比，受试者在施用rAAV之后至少270天的上升4步测试时间具有至少约1.2秒的改善。另外，在任何方法中，与施用rAAV前的100m定时测试相比，施用rAAV后至少270天，受试者在100m定时测试中具有至少约7秒的改善。
“纤维化”是指细胞外基质(ECM)组分的过度的或未调节的沉积以及在损伤后组织中的异常修复过程，所述组织包含骨骼肌、心肌、肝脏、肺、肾和胰腺。被沉积的ECM组分包含纤连蛋白和胶原蛋白，例如胶原蛋白1、胶原蛋白2或胶原蛋白3。
本公开还提供了减少或预防患有肌营养不良症的受试者的纤维化的方法，所述方法包括施用治疗有效量的rAAV，所述rAAV包括以下的人微肌营养不良蛋白核苷酸序列：SEQID NO:1，以及以下的MHCK7启动子核苷酸序列：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7；或包括以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列的rAAV载体：SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白是以下的核苷酸55至5021的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:3。在另一个实施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白是以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:9。在另一个实施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白是以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5066。在另外的实施例中，rAAV是AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白是以下的核苷酸56至4820的AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:5。
在另一个实施例中，本公开提供了预防有需要的受试者的纤维化的方法，所述方法包括施用治疗有效量的以下的人微肌营养不良蛋白核苷酸序列：SEQ ID NO:1，以及以下的MHCK7启动子核苷酸序列：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7；或包括以下的AAV74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列的rAAV载体：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。例如，本公开的任何rAAV都可以向患有肌营养不良症的受试者施用以预防纤维化，例如，在受试者中观察到纤维化之前施用的表达人微肌营养不良蛋白的本公开的rAAV。另外，表达人微肌营养不良蛋白基因的本公开的rAAV可以向具有发展成纤维化风险的受试者施用，例如患有或被诊断患有肌营养不良症(例如DMD)的受试者。本公开的rAAV可以向患有肌营养不良症的受试者施用，以预防这些受试者的新纤维化。
本公开设想在受试者中观察到纤维化之前施用rAAV。另外，rAAV可以施用于有发展成纤维化风险的受试者，如患有或被诊断患有肌营养不良症(例如DMD)的受试者。rAAV可以施用于患有肌营养不良症且已发展为纤维化的受试者，以预防这些受试者的新纤维化。
本公开还提供了在患有肌营养不良症的受试者中增加肌肉力量和/或肌肉质量的方法，所述方法包括施用治疗有效量的以下的人微肌营养不良蛋白核苷酸序列：SEQ IDNO:1，以及以下的MHCK7启动子核苷酸序列：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7；或包括以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列的rAAV：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。
本公开设想在受试者中观察到纤维化之前或在肌肉力量已经减少之前或在肌肉质量已经减少之前，向被诊断为患有DMD的受试者施用rAAV载体。
本公开还考虑向患有肌营养不良症，已经发展为纤维化的受试者施用以下的人微肌营养不良蛋白核苷酸序列：SEQ ID NO:1，以及以下的MHCK7启动子核苷酸序列：SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:7；或包括以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列的rAAV：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022，以防止这些受试者的新纤维化或减少这些受试者的纤维化。本公开还提供了向患有肌营养不良症，已经出现肌肉力量减少或已经出现肌肉质量减少的受试者施用以下的人微肌营养不良蛋白核苷酸序列：SEQ ID NO:1，以及以下的MHCK7启动子核苷酸序列：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7；或包括以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列的rAAV载体：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022，以保护肌肉免受进一步损伤。
在本公开的任何方法中，受试者可能患有肌营养不良症，如DMD或任何其它肌营养不良蛋白相关的肌营养不良症。
在本文所描述的本公开的任何方法的其它实施例中，与施用rAAV之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后受试者的血清CK水平降低了选自由以下组成的组的百分比水平：
a)施用后90天、180天或270天至少78％；
b)施用后270天至少46％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％或85％。
c)施用后180天至少72％、73％、74％或95％；
d)施用后90天至少87％、88％、93％或95％；
e)施用后270天至少70％；
f)施用后90天、180天或270天，70％至95％；
g)施用后90天、180天或270天，至少56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％；以及
h)施用后90天、180天或270天，至少56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％。
在另一个实施例中，本公开提供了用于治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的组合物，其中所述组合物包括一定剂量的重组腺病毒相关(rAAV)rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白，其中组合物被调配用于全身施用途径，并且所述rAAV的剂量为约1×1014vg/kg至约4×1014vg/kg。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白是以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白：SEQID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白是以下的核苷酸56至4820的AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:5。
例如，本公开的组合物包括以下剂量的rAAV：约5.0×1012vg/kg至约1.0×1014vg/kg、或约5.0×1012vg/kg至1.0×1014vg/kg、或约5.0×1012vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或约5.0×1012vg/kg至约1.0×1014vg/kg、或约5.0×1012vg/kg至约5.0×1013vg/kg、或约5.0×1012vg/kg至约2.0×1013vg/kg、或约5.0×1012vg/kg至约1.0×1013vg/kg或1.0×1014vg/kg至约1.0×1015vg/kg或1.0×1013vg/kg至约1.0×1014vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至1.0×1014vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至约1.0×1014vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至约5.0×1013vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至约3.0×1014vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至约5.0×1014vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至约6.0×1014vg/kg、或1.0×1013vg/kg至约1.0×1015vg/kg、或5.0×1013vg/kg至约1.0×1014vg/kg、或约5.0×1013vg/kg to1.0×1014vg/kg、或约5.0×1013vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或约5.0×1013vg/kg至约1.0×1014vg/kg、或约5.0×1013vg/kg至约3.0×1014vg/kg、或约5.0×1013vg/kg至约5.0×1014vg/kg、或约5.0×1013vg/kg至约6.0×1014vg/kg、或5.0×1013vg/kg至约1.0×1015vg/kg、或1.0×1014vg/kg至约6.0×1014vg/kg、或1.0×1014vg/kg至约5.0×1014vg/kg、或1.0×1014vg/kg至约4.0×1014vg/kg、或1.0×1014vg/kg至约1.0×1015vg/kg、或1.0×1014vg/kg至约3.0×1014vg/kg、或约1.0×1014vg/kg至约2.5×1014vg/kg、或1.0×1014vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至约3.75×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至6.0×1014、或约1.25×1014vg/kg至5.0×1014、或约1.25×1014vg/kg至4.0×1014、或约1.25×1014vg/kg至1.0×1015、或约1.25×1014vg/kg至约3.5×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至约3.0×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至约2.75×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至约2.5×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或1.25×1014vg/kg至约3.75×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至约3.5×1014vg/kg、或1.5×1014vg/kg至约1.0×1015vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至6.0×1014、或约1.5×1014vg/kg至5.0×1014、或约1.5×1014vg/kg至4.0×1014、或约1.5×1014vg/kg至约3.75×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至约3.5×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至约3.25×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至约3.0×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至约2.75×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至约2.5×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或1.75×1014vg/kg至约1.0×1015vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至6.0×1014、或约1.75×1014vg/kg至5.0×1014、或约1.75×1014vg/kg至4.0×1014、或约1.75×1014vg/kg至约3.75×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约3.5×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约3.25×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约3.0×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约2.75×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约2.5×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约2.25×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或约2.0×1014vg/kg至1.0×1015、或约2.0×1014vg/kg至6.0×1014、或约2.0×1014vg/kg至5.0×1014、或约2.0×1014vg/kg至约4.0×1014vg/kg、或约2.0×1014vg/kg至约3.75×1014vg/kg、或约2.0×1014vg/kg至约3.5×1014vg/kg、或约2.0×1014vg/kg至约3.25×1014vg/kg。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白是以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ IDNO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白是以下的核苷酸56至4820的AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:5。
在一个实施例中，本公开的组合物被调配用于静脉内施用，并且包括约2.0×1014vg/kg的rAAV剂量。在另一个实施例中，本公开的组合物调配用于静脉内施用，并且包括以下剂量的rAAV：约5.0×1012vg/kg、或约6.0×1012vg/kg、或约7.0×1012vg/kg、或约8.0×1012vg/kg、或约9.0×1012vg/kg、或约1.0×1013vg/kg、或约1.25×1013vg/kg、或约1.5×1013vg/kg、或约1.75×1013vg/kg、或约2.25×1013vg/kg、或约2.5×1013vg/kg、或约2.75×1013vg/kg、或约3.0×1013vg/kg、或约3.25×1013vg/kg、或约3.5×1013vg/kg、或约3.75×1013vg/kg、或约4.0×1013vg/kg、或约5.0×1013vg/kg、或约6.0×1013vg/kg、或约7.0×1013vg/kg、或约8.0×1013vg/kg、或约9.0×1013vg/kg、或约1.0×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg、或约2.25×1014vg/kg、或约2.5×1014vg/kg、或约2.75×1014vg/kg、或约3.0×1014vg/kg、或约3.25×1014vg/kg、或约3.5×1014vg/kg、或约3.75×1014vg/kg、或约4.0×1014vg/kg、或约5.0×1014vg/kg、或约6.0×1014vg/kg、或约1×1015vg/kg。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白是以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。在另一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白是以下的核苷酸56至4820的AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:5。
在本公开的任何组合物中，rAAV的剂量可以以约5mL/kg至约15mL/kg、或约8mL/kg至约12mL/kg、或8mL/kg至约10mL/kg、或5mL/kg至约10mL/kg或约10mL/kg至12mL/kg或约10mL/kg至15mL/kg或10mL/kg至约20mL/kg递送。在特定实施例中，所述组合物包括以约10mL/kg递送的rAAV剂量。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白是以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQID NO:6的核苷酸56至5022。在另一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白是以下的核苷酸56至4820的AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:5。
本公开的组合物被调配用于通过注射、输注或植入施用。例如，所述组合物调配用于通过输注在约一小时内施用。另外，本公开的组合物被调配用于通过外周肢体静脉(如外周手臂静脉或外周腿部静脉)静脉内施用。或者，可以在大约30分钟、或大约1.5小时、或大约2小时、或大约2.5小时或大约3小时内给予注射。
本公开的任何组合物包括rAAV，其包括以下的人微肌营养不良蛋白核苷酸序列：SEQ ID NO:1，以及以下的MHCK7启动子序列：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7；或包括以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列的rAAV载体：SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。
特别地，本公开的组合物用于治疗杜氏肌营养不良症或碧加氏肌营养不良症。例如，本公开提供了用于治疗有需要的人受试者的杜氏肌营养不良症或碧加氏肌营养不良症的组合物，其中所述组合物包括一定剂量的重组腺病毒相关(rAAV)rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白，其中所述组合物被调配用于通过静脉内输注在约一小时内施用，并且施用的所述rAAV的剂量为约2×1014vg/kg，并且其中所述rAAV包括以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。
在另一个实施例中，本公开还提供了一种包括rAAV的组合物，用于减少有需要的受试者的纤维化。另外，本公开提供了一种组合物，其包括用于预防患有肌营养不良症的受试者的纤维化的rAAV载体。
本公开还提供了包括rAAV的组合物，其用于增加患有肌营养不良症的受试者的肌肉力量和/或肌肉质量。在另外的实施例中，本公开提供了包括本公开的任何rAAV的组合物，用于治疗肌营养不良症。
在本公开的任何组合物的其它实施例中，在将所述组合物向需要治疗肌营养不良症的人受试者施用之后，与施用所述组合物之前的血清CK水平相比，所述受试者的血清CK水平降低了选自由由以下组成的组的百分比水平：
a)施用后90天、180天或270天至少78％；
b)施用后270天，至少46％、55％、70％或85％；
c)施用后180天至少72％、73％、74％或95％；
d)施用后90天至少87％、99％、93％或95％；
e)施用后270天至少70％；
f)施用后90天、180天或270天，70％至95％；
g)施用后90天、180天或270天，至少69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％；以及
h)施用后90天、180天或270天，至少69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％。
在另一个实施例中，本公开提供了一定剂量的重组腺病毒相关(rAAV)rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白用于制备用于治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的药物的用途，其中所述药物被调配用于全身施用途径，并且所述rAAV的剂量为约1×1014vg/kg至约4×1014vg/kg。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白是以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ IDNO:6的核苷酸56至5022。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白是以下的核苷酸56至4820的AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:5。
例如，药物包括以下剂量的rAAV：约5.0×1012vg/kg至约1.0×1014vg/kg、或约5.0×1012vg/kg至1.0×1014vg/kg、或约5.0×1012vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或约5.0×1012vg/kg至约1.0×1014vg/kg、或约5.0×1012vg/kg至约5.0×1013vg/kg、或约5.0×1012vg/kg至约2.0×1013vg/kg、或约5.0×1012vg/kg至约1.0×1013vg/kg或1.0×1014vg/kg至约1.0×1015vg/kg或1.0×1013vg/kg至约1.0×1014vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至1.0×1014vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至约1.0×1014vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至约5.0×1013vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至约3.0×1014vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至约5.0×1014vg/kg、或约1.0×1013vg/kg至约6.0×1014vg/kg、或1.0×1013vg/kg至约1.0×1015vg/kg、或5.0×1013vg/kg至约1.0×1014vg/kg、或约5.0×1013vg/kg to1.0×1014vg/kg、或约5.0×1013vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或约5.0×1013vg/kg至约1.0×1014vg/kg、或约5.0×1013vg/kg至约3.0×1014vg/kg、或约5.0×1013vg/kg至约5.0×1014vg/kg、或约5.0×1013vg/kg至约6.0×1014vg/kg、或5.0×1013vg/kg至约1.0×1015vg/kg、或1.0×1014vg/kg至约6.0×1014vg/kg、或1.0×1014vg/kg至约5.0×1014vg/kg、或1.0×1014vg/kg至约4.0×1014vg/kg、或1.0×1014vg/kg至约1.0×1015vg/kg、或1.0×1014vg/kg至约3.0×1014vg/kg、或约1.0×1014vg/kg至约2.5×1014vg/kg、或1.0×1014vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至约3.75×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至6.0×1014、或约1.25×1014vg/kg至5.0×1014、或约1.25×1014vg/kg至4.0×1014、或约1.25×1014vg/kg至1.0×1015、或约1.25×1014vg/kg至约3.5×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至约3.0×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至约2.75×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至约2.5×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或1.25×1014vg/kg至约3.75×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg至约3.5×1014vg/kg、或1.5×1014vg/kg至约1.0×1015vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至6.0×1014、或约1.5×1014vg/kg至5.0×1014、或约1.5×1014vg/kg至4.0×1014、或约1.5×1014vg/kg至约3.75×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至约3.5×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至约3.25×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至约3.0×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至约2.75×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至约2.5×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或1.75×1014vg/kg至约1.0×1015vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至6.0×1014、或约1.75×1014vg/kg至5.0×1014、或约1.75×1014vg/kg至4.0×1014、或约1.75×1014vg/kg至约3.75×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约3.5×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约3.25×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约3.0×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约2.75×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约2.5×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约2.25×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg至约2.0×1014vg/kg、或约2.0×1014vg/kg至1.0×1015、或约2.0×1014vg/kg至6.0×1014、或约2.0×1014vg/kg至5.0×1014、或约2.0×1014vg/kg至约4.0×1014vg/kg、或约2.0×1014vg/kg至约3.75×1014vg/kg、或约2.0×1014vg/kg至约3.5×1014vg/kg、或约2.0×1014vg/kg至约3.25×1014vg/kg。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白是以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ IDNO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白是以下的核苷酸56至4820的AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:5。
在一个实施例中，本公开的药物被调配用于全身施用一定剂量的rAAV，其中全身施用途径是静脉内途径，并且施用的rAAV的剂量为约2.0×1014vg/kg。在另一个实施例中，本公开的药物被调配用于全身施用一定剂量的rAAV，其中全身施用途径是静脉内途径，并且所述rAAV的剂量为约5.0×1012vg/kg、或约6.0×1012vg/kg、或约7.0×1012vg/kg、或约8.0×1012vg/kg、或约9.0×1012vg/kg、或约1.0×1013vg/kg、或约1.25×1013vg/kg、或约1.5×1013vg/kg、或约1.75×1013vg/kg、或约2.25×1013vg/kg、或约2.5×1013vg/kg、或约2.75×1013vg/kg、或约3.0×1013vg/kg、或约3.25×1013vg/kg、或约3.5×1013vg/kg、或约3.75×1013vg/kg、或约4.0×1013vg/kg、或约5.0×1013vg/kg、或约6.0×1013vg/kg、或约7.0×1013vg/kg、或约8.0×1013vg/kg、或约9.0×1013vg/kg、或约1.0×1014vg/kg、或约1.25×1014vg/kg、或约1.5×1014vg/kg、或约1.75×1014vg/kg、或约2.25×1014vg/kg、或约2.5×1014vg/kg、或约2.75×1014vg/kg、或约3.0×1014vg/kg、或约3.25×1014vg/kg、或约3.5×1014vg/kg、或约3.75×1014vg/kg、或约4.0×1014vg/kg、或约5.0×1014vg/kg、或约6.0×1014vg/kg、或约1×1015vg/kg。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白是以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白是以下的核苷酸56至4820的AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:5。
在本公开的任何用途中，药物包括一定剂量的rAAV，所述剂量为约5mL/kg至约15mL/kg、或约8mL/kg至约12mL/kg、或8mL/kg至约10mL/kg、或5mL/kg至约10mL/kg或约10mL/kg至12mL/kg或约10mL/kg至15mL/kg或10mL/kg至约20mL/kg。在特定实施例中，剂量或rAAV为约10mL/kg。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白是以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ IDNO:6的核苷酸56至5022。在一个实施例中，rAAV是AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白。在一个实施例中，AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白是以下的核苷酸56至4820的AAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白：SEQ ID NO:5。
在本公开的任何用途中，将药物调配用于通过注射、输注或植入施用。例如，将药物调配用于通过输注在大约一小时内施用。此外，配制药物用于通过外周肢体静脉(例如外周手臂静脉或外周腿部静脉)静脉内施用。或者，可以在大约30分钟、或大约1.5小时、或大约2小时、或大约2.5小时或大约3小时内给予注射。
在本公开的任何用途中，所述药物包括rAAV，其包括以下的人微肌营养不良蛋白核苷酸序列：SEQ ID NO:1，以及以下的MHCK7启动子序列：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7；或以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。
本公开的具体用途是用于制备用于治疗杜氏肌营养不良症或碧加氏肌营养不良症的药物。例如，本公开提供了一定剂量的重组腺病毒相关(rAAV)rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白用于制备用于治疗有需要的杜氏肌营养不良症或碧加氏肌营养不良症人受试者的药物中的用途，其中所述药物调配成通过静脉内输注在大约一小时内施用，并且所施用的rAAV的剂量为约2×1014vg/kg，并且其中所述rAAV包括以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。
在另外的实施例中，本公开提供了rAAV用于制备用于减少有需要的受试者的纤维化的药物的用途。例如，有需要的受试者可能患有肌营养不良症，如DMD或任何其它与肌营养不良蛋白相关的肌营养不良症。
在另一个实施例中，本公开提供了rAAV用于制备药物以预防患有肌营养不良症的受试者的纤维化的用途。
另外，本公开提供了rAAV用于制备药物以增加患有肌营养不良症的受试者的肌肉强度和/或肌肉质量的用途。
本公开还提供了rAAV用于制备用于治疗肌营养不良症的药物的用途。
本公开提供了rAAV载体的用途，所述载体包括以下的人微肌营养不良蛋白核苷酸序列：SEQ ID NO:1，以及以下的MHCK7启动子核苷酸序列：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7，用于制备用于治疗肌营养不良症的药物，或包括以下的AAVrf74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列的rAAV载体：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022，用于治疗肌营养不良症。
在本公开的任何用途的其它实施例中，与施用rAAV之前的血清CK水平相比，向受试者施用rAAV之后受试者的血清CK水平降低了选自由以下组成的组的百分比水平：
a)施用后90天、180天或270天至少78％；
b)施用后270天，至少46％、55％、70％或95％；
c)施用后180天至少72％、73％、74％或95％；
d)施用后90天至少87％、88％、93％或95％；
e)施用后270天至少70％；
f)施用后90天、180天或270天，70％至95％；
g)施用后90天、180天或270天，至少69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％；以及
h)施用后90天、180天或270天，至少69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％。
在用于治疗肌营养不良症的任何组合疗法、组合物或用于治疗肌营养不良症的药物的用途中，在施用所述组合物或药物后，受试者细胞中的微肌营养不良蛋白基因表达水平增加。微肌营养不良蛋白基因在细胞中的表达是通过在施用组合物或药物之前和之后在肌肉活检中通过蛋白质印迹测量微肌营养不良蛋白水平来检测的。特别地，与施用组合物或药物之前的微肌营养不良蛋白水平相比，施用组合物或药物之后，微肌不良蛋白水平增加至少约70％到至少约80％，或至少约70％到至少约90％，或至少约80％到至少约90％。例如，与施用组合物或药物之前微肌营养不良蛋白的水平相比，施用组合物之后，微肌营养不良蛋白的水平增加至少约70％或至少约71％或至少约72％或至少约73％或至少约74％或至少约75％或至少约76％或至少约77％或至少约78％或至少约79％或至少约80％或至少约81％或至少约82％或至少约83％或至少约84％或至少约85％。
另外，通过在施用组合物或药物之前和之后通过免疫组织化学在肌肉活检中测量微肌营养不良蛋白水平来检测细胞中微肌营养不良蛋白基因的表达。与施用组合物或药物之前的微肌营养不良蛋白的水平相比，施用rAAV之后，微肌营养不良蛋白的水平增加至少约70％到至少约80％，或至少约70％到至少约90％，或至少约80％到至少约90％。例如，与施用组合物或药物之前微肌营养不良蛋白的水平相比，施用组合物或药物之后，微肌营养不良蛋白的水平增加至少约70％或至少约71％或至少约72％或至少约73％或至少约74％或至少约75％或至少约76％或至少约77％或至少约78％或至少约79％或至少约80％或至少约81％或至少约82％或至少约83％或至少约84％或至少约85％。
在用于治疗肌营养不良症的任何组合疗法、组合物和用于治疗肌营养不良症的药物的用途中，与施用组合物或药物之前的血清CK水平相比，施用rAAV后受试者的血清CK水平降低。例如，与施用组合物或药物前的血清CK水平相比，施用rAAV后60天，受试者的血清CK水平降低约65％至约90％或约65％至约95％或约75％至约90％或约80％至约90％或约85％至约95％或约87％至约95％或约87％至约90％。特别地，在本公开的用于治疗肌营养不良症的药物的任何组合疗法、组合物和用途中，与施用rAAV之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后60天，受试者的血清CK水平降低了约87％。在本公开的用于治疗肌营养不良症的任何组合疗法、组合物或用于治疗肌营养不良症的药物的用途中，与施用组合疗法、组合物或药物之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后60天，受试者的血清CK水平降低了约72％，或在本公开的用于治疗肌营养不良症的任何组合疗法、组合物或用于治疗肌营养不良症的药物的用途中，与施用rAAV之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后60天，受试者的血清CK水平降低了约73％，或在本公开的用于治疗肌营养不良症的任何组合物或用于治疗肌营养不良症的药物的用途中，与施用组合疗法、组合物或药物之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后60天，受试者的血清CK水平降低了约78％，或在本公开的用于治疗肌营养不良症的任何组合物或用于治疗肌营养不良症的药物的用途中，与施用组合疗法、组合物或药物之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后60天，受试者的血清CK水平降低了约95％。在用于治疗肌营养不良症的任何组合疗法、组合物或用于治疗肌营养不良症的药物的用途中，与施用rAAV之前微肌营养不良蛋白阳性纤维的数量相比，在施用组合疗法后，受试者肌肉组织中的微肌营养不良蛋白阳性纤维的数量增加。例如，通过在施用组合疗法、组合物或药物之前和之后在肌肉活检上通过蛋白质印迹或免疫组织化学测量微肌营养不良蛋白蛋白水平来检测微肌营养不良蛋白阳性纤维的数量。
在用于治疗肌营养不良症的任何组合疗法、组合物或用于治疗肌营养不良症的药物的用途中，施用所述组合物或药物上调DAPC蛋白(如α-肌聚糖或β-肌聚糖)的表达。例如，与施用组合疗法、组合物或药物前的α-肌聚糖的水平相比，施用rAAV后受试者的α-肌聚糖的水平增加。通过在施用rAAV之前和之后对肌肉活检进行蛋白质印迹或免疫组织化学测量α-肌聚糖或β-肌聚糖蛋白水平来，检测α-肌聚糖或β-肌聚糖蛋白水平。
在用于治疗肌营养不良症的任何组合疗法、组合物或用于治疗肌营养不良症的药物的用途中，施用rAAV后，受试者的疾病进展会延迟，如通过以下任一项测量的：六分钟步行测试、起身时间、上升4步、上升和下降4步、北极星移动评价量表(NSAA)、10米计时测试、100米计时测试，手持肌力测定法(HHD)、定时起立和行走和/或粗大运动子集量表(Bayley-III)评分。
例如，在施用用于治疗肌营养不良症的任何组合疗法、组合物或用于治疗肌营养不良症的药物的用途后，与施用rAAV之前的NSAA评分相比，受试者在施用组合物或药物之后至少270天的NSAA评分至少有6分的改善。此外，在用于治疗肌营养不良症的任何方法、组合疗法、组合物或用于治疗肌营养不良症的药物的用途中，与施用组合疗法、组合物或药物之前的起身时间相比，受试者在施用rAAV之后至少270天的起身时间具有至少约0.8秒的改善。另外，在本公开的任何方法、组合疗法、组合物或用途中，与施用组合疗法、组合物或药物之前的上升4步测试时间相比，受试者在施用rAAV之后至少270天的上升4步测试时间具有至少约1.2秒的改善。另外，在本公开的任何方法、组合疗法、组合物或用途中，与施用rAAV前的100m定时测试相比，施用rAAV后至少270天，受试者在100m定时测试中具有至少约7秒的改善。
在另一个实施例中，本公开提供了用于在患者细胞中表达微肌营养不良蛋白基因的组合物，所述组合物包括以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ IDNO:6的核苷酸56至5022。在另外的实施例中，本公开提供了一定剂量的以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列的用途：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022，用于制备用于在患者细胞中表达微肌营养不良蛋白基因的药物。例如，通过在施用rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体之前和之后在肌肉活检中通过蛋白质印迹或免疫组织化学测量微肌营养不良蛋白水平来检测患者细胞中微肌营养不良蛋白基因的表达。另外，通过检测每个核的载体基因组的数量来测量微肌营养不良蛋白基因在患者中的表达，其中每个核的1个载体基因组为微肌营养不良蛋白表达的约50％，并且每个核大于1个拷贝与微肌营养不良蛋白表达水平一致。例如，细胞每个核具有1.2个载体拷贝，或每个核1.3个载体拷贝、或每个核1.4个载体拷贝、或每个核1.5个载体拷贝、或每个核1.6个载体拷贝、或每个核1.7个载体拷贝、或每个核1.8个载体拷贝、或每个核1.9个载体拷贝。
在另外的实施例中，本公开提供了用于降低有需要的患者血清CK水平的组合物，所述组合物包括以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。另外，本公开提供了一定剂量的以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列的用途：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022，用于制备用于降低有需要的患者的血清CK水平的药物。例如，与施用组合物或药物前的血清CK水平相比，施用组合物或药物后60天，患者的血清CK水平降低至少约65％至约90％或约65％至约95％或约75％至约90％或约80％至约90％或约85％至约95％或约87％至约95％或约87％至约90％。特别地，与施用组合物或药物之前的血清CK水平相比，在施用组合物或药物后60天，受试者的血清CK水平降低约87％，或与施用组合物或药物之前的血清CK水平相比，在施用组合物或药物后60天，降低约72％，或与施用组合物或药物之前的血清CK水平相比，在施用组合物或药物后60天，降低约73％，或与施用组合物或药物之前的血清CK水平相比，在施用组合物或药物后60天，降低约78％，或与施用组合物或药物之前的血清CK水平相比，在施用组合物或药物后60天，降低约95％。
本公开还提供了用于增加患者肌肉组织中微肌营养不良蛋白阳性纤维的组合物，所述组合物包括以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。另外，本公开提供了一定剂量的以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列的用途：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022，用于增加患者肌肉组织中微肌营养不良蛋白阳性纤维的药物的制备。例如，在施用组合物或药物之前和之后，通过蛋白质印迹或免疫组织化学在肌肉活检上测量肌营养不良蛋白水平来检测微肌营养不良蛋白阳性纤维的数量。另外，通过检测每个核的载体基因组的数量来测量微肌营养不良蛋白基因在患者中的表达，其中每个核的1个载体基因组为微肌营养不良蛋白表达的约50％，并且每个核大于1个拷贝与微肌营养不良蛋白表达水平一致。例如，细胞每个核具有1.2个载体拷贝，或每个核1.3个载体拷贝、或每个核1.4个载体拷贝、或每个核1.5个载体拷贝、或每个核1.6个载体拷贝、或每个核1.7个载体拷贝、或每个核1.8个载体拷贝、或每个核1.9个载体拷贝。
在另一个实施例中，本公开提供了用于增加有需要的患者的α-肌聚糖的表达的组合物，所述组合物包括以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列：SEQID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。本公开还提供了一定剂量的以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列的用途：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022，用于制备用于增加需要的患者的α-肌聚糖的表达的药物。例如，在施用组合物或药物之前和之后，通过蛋白质印迹或免疫组织化学在肌肉活检上测量α-肌聚糖蛋白水平来检测α-肌聚糖的水平。
另外，本公开提供了用于增加有需要的患者的β-肌聚糖的表达的组合物，所述组合物包括以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列：SEQ ID NO:9、SEQID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022。本公开还提供了以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列的用途：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ IDNO:6的核苷酸56至5022，用于制备用于增加需要的患者的β-肌聚糖的表达的药物。例如，在施用组合物或药物之前和之后，通过蛋白质印迹或免疫组织化学在肌肉活检上测量β-肌聚糖蛋白水平来检测β-肌聚糖的水平。
本公开还提供了一定剂量的以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列的用途：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1至4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56至5022，用于制备用于治疗患有杜氏肌营养不良症或碧加氏肌营养不良症的患者的药物，使得施用药物导致患者的疾病进展延迟，如通过以下任一项测量的：六分钟步行测试、起身时间、上升4步、上升和下降4步、北极星移动评价量表(NSAA)、10米计时测试、100米计时测试，手持肌力测定法(HHD)、定时起立和行走和/或粗大运动子集量表(Bayley-III)评分。
例如，与施用rAAV之前的NSAA评分相比，受试者在施用rAAV之后至少270天的NSAA评分至少有6分的改善。此外，与施用rAAV之前的起身时间相比，受试者在施用rAAV之后至少270天的起身时间具有至少约0.8秒的改善。另外，与施用组合物或药物之前的上升4步测试时间相比，受试者在施用rAAV之后至少270天的上升4步测试时间具有至少约1.2秒的改善。另外，与施用组合物或药物前的100m定时测试相比，施用rAAV后至少270天，受试者在100m定时测试中具有至少约7秒的改善。
附图说明
图1展示了rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体。在该构建体中，cDNA表达盒的侧翼是AAV2反向末端重复序列(ITR)。该构建体的特征在于框内杆缺失(R4–R23)，而铰链1、2和4(H1、H2和H4)和富含半胱氨酸的结构域仍然产生138kDa蛋白质。微肌营养不良蛋白(3579bp)的表达由MHCK7启动子(795bp)引导。内含子和5'UTR衍生自质粒pCMVβ(Clontech)。微肌营养不良蛋白盒在ATG即将开始前具有共有Kozak，以及用于mRNA终止的小的53bp合成polyA信号。人微肌营养不良蛋白盒包含如先前Harper等人描述的(R4–R23/Δ71–78)结构域。(Nature Medicine 8,253-261(2002))。
图2提供了核酸序列(SEQ ID NO:3)rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。
图3提供了pNLREP2-Caprh74 AAV辅助质粒图。
图4提供了Ad辅助质粒pHELP。
图5展示了rAAV.MCK.微肌营养不良蛋白质粒构建体。
图6提供了核酸序列(SEQ ID NO:5)rAAVrh74.MCK.微肌营养不良蛋白。
图7提供了核酸序列(SEQ ID NO:9)rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。
图8展示了AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白质粒构建体。
图9提供了rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白质粒构建体的核酸序列(SEQ IDNO:8)，其包括卡那霉素抗性基因。
图10提供了治疗性β-肌聚糖转基因盒的示意图。含有密码子优化的人类β-肌聚糖基因(hSGCB)的自互补AAV载体。肌肉特异性MHCK7启动子驱动表达。所述盒还含有嵌合内含子，以增强加工和聚腺苷酸化信号的稳定性。
图11提供了用rAAVrh74.MHCK7微肌营养不良蛋白重新给药后NHP中AAVrh74抗体滴度的图表。虚线表示AAVrh.74抗体总滴度水平的包含标准，其针对AAVrh.74的阈值为1:400。
图12提供了与TPE前相比，在TPE后用rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白重新给药的NHP中，TPE后微肌营养不良蛋白表达的倍数变化。
图13提供了10天TPE过程中血浆体积(PV)去除后血浆抗体的过程。
具体实施方式
本公开涉及确定血管内递送rAAV.rh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白后增强基因表达的剂量、持续时间和免疫抑制方案；涉及鉴定技术和在用rAAV给药或重新给药后结合使用TPE去除预先存在的AAV抗体来增强基因表达；并且涉及在不使用TPE的情况下评估重新给药。本发明的方法涵盖在用如本文所描述的rAAV.rh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB或rAAVrh.74.MHCK7.huAN05的任何给药前，施用免疫抑制方案和/或TPE；并且所述方法涵盖在用如本文所描述的rAAV.rh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB或rAAVrh.74.MHCK7.huAN05重新给药前，施用免疫抑制方案和/或TPE。
本公开提供了基因疗法载体，例如rAAV载体，过度表达人微肌营养不良蛋白，以及减少和预防肌营养不良症患者的纤维化的方法。在DMD诊断的最早年龄取肌肉活检揭示突出的结缔组织增生。肌肉纤维化以多种方式是有害的。它通过结缔组织屏障减少肌内营养物质的正常转运，减少血液流动并剥夺肌肉的血管来源的营养成分，并且通过肢体挛缩在功能上促进早期丧失行走。随着时间的推移，治疗挑战因肌肉中明显纤维化而成倍增加。这可以在比较连续时间点的结缔组织增殖的肌肉活组织检查中观察到。这一过程继续加剧，导致行走丧失和加速失控，特别是在依赖轮椅的患者中。
如果没有早期治疗，包含减少纤维化的平行方法，就不可能完全实现外显子跳跃、终止密码子通读或基因替代疗法的益处。如果没有减少肌肉纤维化的方法，即使是小分子或蛋白质替代策略也可能会失败。先前在用AAV.微肌营养不良蛋白治疗的现有纤维化的老年mdx小鼠中的工作证明我们不能实现完全功能恢复(Liu,M.等人,Mol Ther 11,245-256(2005))。还已知DMD心肌病的进展伴随着心室壁中的瘢痕形成和纤维化。
除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的病毒学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法。这些技术在文献中进行充分解释。参见，例如，Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(现行版)；《DNA克隆：一种实用的方法(DNA Cloning:A Practical Approach)》,第I&II卷(D.Glover编)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(N.Gait编,现行版)；《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》(B.Hames&S.Higgins编,现行版)；《转录和翻译(Transcription and Translation)》(B.Hames&S.Higgins编,现行版)；《CRC细小病毒手册(CRC Handbook of Parvoviruses)》,第I&II卷(P.Tijssen编)；《基础病毒学(FundamentalVirology)》,第2版,第I&II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编)；《动物细胞的新鲜培养，基本技术手册(Freshney Culture of Animal Cells,A Manual of Basic Technique)》(Wiley-Liss，第三版)；和Ausubel等人(1991)《分子生物学的当前协议(Current Protocols inMolecular Biology)》(纽约威利跨学科出版社(Wiley Interscience,N.Y))。
无论是在上文还是在下文中，本文引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体全部并入。
定义
如本文所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”、和“所述(the)”包含复数指示物。因此，例如，提及“一个/种细胞”包含多个此类细胞并且提及“培养物”包含提及一种或多种培养物及本领域技术人员已知的其等价物，等等。提及“重组AAV”包含两种或更多种rAAV病毒粒子的混合物等。除非另外清楚地指示，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。
除非明确地指示，否则在权利要求书中使用术语“或”用于表示“和/或”，以仅指替代方案，或者替代方案是相互排斥的，尽管本公开支持仅指替代方案的定义和“和/或”。
在整个本申请中，术语“约”用于指示一值包含用于确定所述值的装置或方法的统计实验误差(误差的标准偏差)。
术语“载体”意指任何基因原件，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等，当与合适的控制元件相关时所述基因元件能够进行复制并且可以细胞之间转移基因序列。在一个实施例中，载体是病毒载体。
如本文所使用的，术语“AAV”是腺相关病毒的标准缩写。腺相关病毒是一种仅在细胞中生成的单链DNA细小病毒，其中某些功能由共感染辅助病毒提供。目前已经表征了十三种AAV血清型。AAV的基本信息和综述可以在例如Carter,1989,《细小病毒手册(Handbookof Parvoviruses)》,第1卷,第169到228页和Berns,1990,《病毒学(Virology)》,第1743到1764页,Raven出版社,(纽约)中找到。然而，完全可以预期这些相同的原理将可应用于额外AAV血清型，这是由于众所周知的是，各种血清型在结构和功能上均紧密相关，甚至在基因水平下亦是如此。(参见例如，Blacklowe,1988,《细小病毒和人类疾病(Parvoviruses andHuman Disease)》,第165至174页，J.R.Pattison编；以及Rose,《综合病毒学(Comprehensive Virology)》3:1-61(1974))。例如，所有AAV血清型均明显地展现出非常类似的由同源rep基因介导的复制特性；并且全部具有三种相关的衣壳蛋白，如在AAV2中表达的那些蛋白。相关性程度还进一步由异源双链体分析所表明，所述异源双链体分析显示血清型之间沿基因组长度具有广泛的交叉杂交；并且在末端处存在相似的自退火片段，所述自退火片段对应于“反向末端重复序列”(ITR)。类似的感染性模式还表明每种血清型的复制功能处于类似的调节控制下。
如本文所用的“AAV载体”是指包括一个或多个目的多核苷酸(或转基因)的载体，所述目的多核苷酸的侧翼是AAV末端重复序列(ITR)。当存在于已被对rep和cap基因产物进行编码和表达的载体转染的宿主细胞中时，这种AAV载体可以被复制并包装成传染性病毒颗粒。在一个实施例中，AAV载体是源自腺相关病毒血清型的载体，包含但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV rh10和AAVrh.74。AAV载体可以具有全部或部分缺失的一种或多种AAV野生型基因，优选为rep和/或cap基因，但保留功能性侧翼ITR序列。功能性ITR序列对于AAV病毒粒子的拯救、复制和包装是必需的。因此，AAV载体在本文中被定义为至少包含以顺式用于病毒复制和包装(例如，功能性ITR)所需的那些序列。ITR不需要是野生型核苷酸序列，并且可以被改变，例如，通过插入、缺失或替换核苷酸，只要序列提供功能性挽救、复制和包装。
术语“AAV辅助功能”是指AAV衍生的编码序列，其可以被表达以提供AAV基因产物，所述AAV基因产物进而以反式用于生产性AAV复制。因此，AAV辅助功能包括主要的AAV开放阅读框(ORF)、rep和cap。已示出Rep表达产物具有许多功能，其中包含：DNA复制的AAV起源的识别、结合和切口；DNA解旋酶活性；和来自AAV(或其它异源)启动子的转录调节。Cap表达产物提供必要的包装功能。本文使用AAV辅助功能来补充AAV载体中缺失的反式AAV功能。
“重组病毒”是指已经遗传改变的病毒，例如，通过将异源核酸序列添加或插入病毒颗粒中。
“AAV病毒体”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化的多核苷酸AAV载体构成的病毒颗粒。在一个实施例中，AAV病毒粒子包括异源多核苷酸(即，除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，例如待递送至哺乳动物细胞的转基因)。在一些实施例中，AAV载体颗粒的产生包含AAV载体的产生，因为此载体含于AAV载体颗粒内。
AAV基因组，如待递送给哺乳动物细胞的转基因，通常被称为“AAV载体颗粒”或简称为“AAV载体”。因此，AAV载体颗粒的产生必然包含产生AAV载体，如此AAV载体颗粒内含有载体。
例如，野生型(wt)AAV病毒颗粒包括与AAV衣壳蛋白包衣相关的线性单链AAV核酸基因组。AAV病毒粒子可以是单链(ss)AAV或自互补(SC)AAV。在一个实施例中，可将具有互补意义的单链AAV核酸分子(例如“有义”或“反义”链)包装到AAV病毒粒子中并且两条链具有同等的感染性。
术语“重组AAV”或“rAAV”在本文中定义为由AAV蛋白壳构成的感染性复制缺陷型病毒，其衣壳化两侧侧接AAV ITR的感兴趣的异源核苷酸序列。在一个实施例中，rAAV在合适的宿主细胞中产生，其中引入了AAV载体、AAV辅助功能和辅助功能。以这种方式，宿主细胞能够编码将AAV载体(含有感兴趣的重组核苷酸序列)包装成感染性重组病毒粒子颗粒以进行后续基因递送所需的AAV多肽。
术语“转染”是指细胞吸收外源DNA，并且当将外源DNA引入细胞膜内时，细胞被“转染”。许多转染技术通常是本领域已知的。参见，例如，Graham等人(1973)《病毒学》,52:456，Sambrook等人(1989)《分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning,a laboratorymanual)》,冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratories),纽约，Davis等人(1986)《分子生物学的基本方法(Basic Methods in Molecular Biology)》，Elsevier和Chu等人(1981)《基因(Gene)》13:197。此类技术可以用于将一种或多种外源DNA部分如核苷酸整合载体和其它核酸分子引入到合适的宿主细胞中。
术语“转导”表示通过复制缺陷型病毒载体，例如通过重组AAV病毒粒子，在体内或体外将DNA分子递送至受体细胞。
术语“宿主细胞”表示例如可以或已经用作AAV辅助构建体、AAV载体质粒、辅助功能载体或其它转移DNA的受体的微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。所述术语包含已转染的原始细胞的后代。因此，如本文所用的“宿主细胞”通常指已经用外源DNA序列转染的细胞。应当理解，由于自然的、偶然的或故意的突变，单一亲本细胞的后代在形态学或基因组或总DNA互补上不一定与原始亲本完全相同。
“肌肉细胞”或“肌肉组织”是指源自任何种类的肌肉的细胞或细胞群(例如，骨骼肌和平滑肌，例如来自消化道、膀胱、血管或心脏组织)。这类肌肉细胞可为分化的或未分化的，例如成肌细胞、肌细胞、肌管、心肌细胞和成心肌细胞。
术语“异源”在其涉及核酸序列(如编码序列和控制序列)时表示通常不接合在一起和/或通常不与特定细胞相关的序列。因此，核酸构建体或载体的“异源”区域是在另一个核酸分子内或附着于其上的核酸片段，未发现其在自然界中与其它分子相关。例如，核酸构建体的异源区域可以包含编码序列，其两侧是未在自然界中发现与编码序列相关的序列。异源编码序列的另一实例是其中编码序列本身未在自然界中发现的构建体(例如，具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。类似地，对于本发明的目的，将用通常不存在于细胞中的构建体转化的细胞视为异源的。如本文所用，等位基因变异或自然发生的突变事件不会产生异源DNA。
编码序列或编码特定蛋白质的序列是核酸序列，当置于适当的调节序列的控制下时其体外或体内转录(在DNA的情况下)且翻译(在mRNA的情况下)成多肽。编码序列的边界由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子决定。编码序列可以包含但不限于来自原核或真核mRNA的cDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列，并且甚至是合成的DNA序列。转录终止序列通常位于编码序列的3'。
“核酸”序列是指DNA或RNA序列。核酸包含DNA和RNA的碱基类似物，包含但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、氧基丁氧基胸苷(oxybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧、5-甲基尿嘧啶、-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
术语DNA“控制序列”统指启动子序列、多聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控域、复制起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等，其共同提供受体细胞中编码序列的复制、转录和翻译。只要所选编码序列能够在适当的宿主细胞中复制、转录和翻译，并非所有这些控制序列都需要一直存在。
术语“启动子”在本文中以其通常含义用于指包括DNA调控序列的核苷酸区域，其中所述调控序列来源于能够结合RNA聚合酶并启动下游(3′-方向)编码序列的转录的基因。转录启动子可包含“诱导型启动子”(其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)、“阻抑型启动子”(其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)以及“组成型启动子”。在一个实施例中，所述启动子是肌肉特异性启动子，其包含但不限于人类骨骼肌动蛋白基因元件、心脏肌动蛋白基因元件、肌间线蛋白启动子、骨骼α-肌动蛋白(ASKA)启动子、肌钙蛋白I(TNNI2)启动子、肌细胞特异性增强子结合因子mef结合元件、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、截短MCK(tMCK)启动子、肌球蛋白重链(MHC)启动子、杂合a-肌球蛋白重链增强子-/MCK增强子-启动子(MHCK7)启动子、C5-12启动子、鼠肌酸激酶增强子元件、骨骼快收缩肌钙蛋白c基因元件、慢收缩心脏肌钙蛋白c基因元件、慢收缩肌钙蛋白i基因元件、缺氧诱导核因子(HIF)应答元件(HRE)、类固醇诱导元件和糖皮质激素应答元件(gre)。在另一实施例中，启动子是MCK启动子、tMCK启动子或MHCK7启动子。
术语“可操作地连接”指的是元件的布置，其中如此描述的组分被配置为执行其的通常功能。因此，与编码序列可操作连接的控制序列能够影响编码序列的表达。控制序列不必与编码序列相邻，只要其起到指导其表达的作用。因此，例如，在启动子序列和编码序列之间可以存在插入的未翻译但已转录的序列，并且启动子序列仍然可以被认为与编码序列“可操作地连接”。
当RNA聚合酶将结合启动子序列并将编码序列转录为mRNA时，启动子“指导转录”细胞中的编码序列，然后将其翻译成由编码序列编码的多肽。
“表达盒”或“表达构建体”是指能够指导感兴趣的序列或基因的表达的装配体。如上所述，表达盒包含控制元件，例如与感兴趣的序列或基因可操作地连接(以便指导转录)的启动子，并且通常也包含多聚腺苷酸化序列。在本发明的某些实施例中，本文所述的表达盒可以含于质粒构建体中。除了表达盒的组分之外，质粒构建体还可以包含一种或多种选择标记物、允许质粒构建体作为单链DNA存在的信号、至少一个多克隆位点和“哺乳动物”复制起点(例如，SV40或腺病毒复制起点)。
当提及核苷酸序列时，“分离的”是指所指示的分子在基本上不存在其它生物大分子，例如其它核苷酸序列、染色质材料等的情况下存在。因此，“编码特定多肽的分离的核酸分子”是指基本上不含不编码主题多肽的其它核酸分子的核酸分子；然而，所述分子可以包含一些不会有害地影响组合物的基本特征的额外碱基或部分。
为了在整个本申请中描述特定核酸分子中核苷酸序列的相对位置，例如当特定核苷酸序列被描述为相对于另一序列位于“上游”、“下游”、“3”或“5”时，应理解其是DNA分子的“有义”或“编码”链中的序列位置，这在本领域中被称为是常规的。
在核酸序列或氨基酸序列的上下文中，术语“序列同一性”、“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指两个序列中的残基，其在比对以获得最大对应时是相同的。序列同一性比较的长度可以超过基因组的全长，期望至少约500至5000个核苷酸的基因编码序列或片段的全长。然而，也可能期望较小片段之间的同一性，例如至少约九个核苷酸，通常至少约20到24个核苷酸、至少约28到32个核苷酸、至少约36个或更多个核苷酸。可以通过本领域中已知的技术来确定序列的同一性百分比。例如，可以通过比对序列信息并使用容易获得的计算机程序(例如ALIGN、ClustalW2和BLAST)直接比较两个多肽分子之间的序列信息来确定同源性。在一个实施例中，当使用BLAST作为比对工具时，默认参数如下：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序依据＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+瑞士蛋白质+Spupdate+PIR。
术语“受试者”是指动物界的任何成员，包含但不限于人类和非人类灵长类动物，例如黑猩猩和其它猿类和猴类物种；农场动物，例如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物，包含啮齿动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠等。在一些实施例中，受试者是年龄范围从出生到2岁、从1岁到10岁、或从4岁到15岁、或从10岁到19岁、或从20岁到40岁、或从15岁到29岁、或从25岁到55岁、或从40岁到60岁、或50岁以上或60岁以上、或65岁以上或70岁以上的人类。
AAV
腺相关病毒(AAV)是复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组长约4.7kb，包含145个核苷酸的反向末端重复(ITR)。存在多种血清型AAV。AAV血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。例如，AAV血清型2(AAV2)基因组的核苷酸序列在如由Ruffing等人,《普通病毒学杂志(J Gen Virol)》75:3385-3392(1994)校正的Srivastava等人《病毒学杂志(J Virol)》45:555-564(1983)中提出。作为另一例子，AAV-1的完整基因组在GenBank登录号NC_002077中提供；AAV-3的完整基因组在GenBank登录号NC_1829中提供；AAV-4的完整基因组在GenBank登录号NC_001829中提供；AAV-5基因组在GenBank登录号AF085716中提供；AAV-6的完整基因组在GenBank登录号NC_00 1862中提供；至少部分AAV-7和AAV-8基因组分别在GenBank登录号AX753246和AX753249中提供(也参见涉及AAV-8的美国专利7,282,199和7,790,449)；AAV-9基因组在Gao等人,《病毒学期刊》,78:6381-6388(2004)中提供；AAV-10基因组在《分子疗法(Mol.Ther.)》,13(1):67-76(2006)中提供；和AAV-11基因组在《病毒学(Virology)》,330(2):375-383(2004)中提供。AAVrh.74血清型的克隆描述于Rodino-Klapac.等人,Journal of translational medicine 5,45(2007)。指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在ITR中。三个AAV启动子(其相对图谱位置命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。两个rep启动子(p5和p19)与单个AAV内含子的差异剪接(例如在AAV2核苷酸2107和2227处)结合导致从rep基因产生四种rep蛋白(rep 78、rep 68、rep 52和rep 40)。Rep蛋白具有多种酶特性，所述酶特性最终负责复制病毒基因组。cap基因由p40启动子表达，并且其编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。替代性剪接和非共有转译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。单一共有多腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95处。AAV的生命周期和遗传学在Muzyczka,《当前微生物学和免疫学的话题(Current Topics in Microbiology andImmunology)》,158:97-129(1992)中评论。
AAV具有独特的特征，这使其作为例如在基因疗法中将外源DNA递送到细胞的载体具有吸引力。培养中细胞的AAV感染是非细胞病变的，并且人类和其它动物的自然感染是沉默的和无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，允许体内靶向许多不同组织的可能性。而且，AAV转导缓慢分裂和非分裂细胞，并且可以作为转录活性核附加体(染色体外元件)基本上持续这些细胞的寿命。AAV原病毒基因组作为质粒中的克隆DNA具有感染性，这使得重组基因组的构建成为可能。此外，由于指导AAV复制、基因组衣壳化和整合的信号包含在AAV基因组的ITR中，因此部分或全部内部约4.3kb的基因组(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可以用如含有启动子、感兴趣的DNA和多腺苷酸化信号的基因盒等外源DNA替代。rep蛋白和cap蛋白可以以反式提供。AAV的另一个显著特征是其是极其稳定且强健的病毒。其易于承受用于使腺病毒失活的条件(56℃至65℃，持续数小时)，使AAV的冷保存不太重要。甚至可以将AAV冻干。最后，AAV感染的细胞不耐受重复感染。
多项研究证明了肌肉中长期(>1.5年)重组AAV介导的蛋白质表达。参见Clark等人,《人类基因治疗(Hum Gene Ther)》,8:659-669(1997)；Kessler等人,《美国国家科学研究院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,93:14082-14087(1996)；以及Xiao等人,《病毒学杂志(JVirol)》,70:8098-8108(1996)。还参见Chao等人,《分子疗法(Mol Ther)》,2:619-623(2000)和Chao等人,《分子疗法(Mol Ther)》,4:217-222(2001)。此外，由于肌肉高度血管化，重组AAV转导导致肌肉注射后在体循环中出现转基因产物，如在Herzog等人,《美国国家科学研究院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,94:5804-5809(1997)和Murphy等人,《美国国家科学研究院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,94:13921-13926(1997)中所述。此外，Lewis等人,《病毒学杂志(J Virol)》,76:8769-8775(2002)证明骨骼肌纤维具有正确的抗体糖基化、折叠和分泌所必需的细胞因子，表明肌肉能够稳定表达分泌的蛋白质治疗剂。
本公开的重组AAV基因组包括本公开的核酸分子和侧接核酸分子的一个或多个AAV ITR。rAAV基因组中的AAV DNA可以来自重组病毒可以源自的任何AAV血清型，包含但不限于AAV血清型AAVrh.74、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13和AAVrh.74。在例如WO 01/83692中公开了假型rAAV的产生。还考虑了其它类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见，例如，Marsic等人,《分子疗法(Molecular Therapy)》，22(11):1900-1909(2014)。如以上“背景技术”部分所提到的，各种AAV血清型的基因组的核苷酸序列是本领域已知的。为了促进肌肉特异性表达，可以使用AAVrh.74。
本公开的DNA质粒包括本公开的rAAV基因组。将DNA质粒转移到允许用AAV的辅助病毒(例如腺病毒、E1缺失的腺病毒或疱疹病毒)感染的细胞中，以将rAAV基因组装配成感染性病毒颗粒。产生rAAV颗粒的技术是本领域中的标准，其中将待包装的AAV基因组、rep和cap基因以及辅助病毒功能提供给细胞。rAAV的产生需要以下组分存在于单个细胞内(在本文中表示为包装细胞)：rAAV基因组、与rAAV基因组分开(即不在其中)的AAV rep和cap基因，以及辅助病毒功能。AAV rep和cap基因可以来自重组病毒可以衍生自的任何AAV血清型并且可以来自与rAAV基因组ITR不同的AAV血清，包含但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAVrh.74、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、以及AAV-13。假型rAAV的产生在例如WO 01/83692中公开，所述文献通过引用以其整体并入本文。
承诺书包装细胞的方法是创建稳定表达AAV颗粒产生的所有必需组分的细胞系。例如，包括缺乏AAV rep和cap基因的rAAV基因组的质粒(或多个质粒)、与rAAV基因组分开的AAV rep和cap基因、以及如新霉素抗性基因等可选择的标记整合到细胞的基因组中。已经通过如GC拖尾等程序将AAV基因组引入细菌质粒中(Samulski等人,1982,《美国国家研究院院刊(Proc.Natl.Acad.S6.USA)》,79:2077-2081)，添加含有限制性核酸内切酶切割位点的合成连接子(Laughlin等人,1983,《基因(Gene)》,23:65-73)或通过直接平末端连接(Senapathy和Carter,1984,《生物化学期刊(J.Biol.Chem.)》,259:4661-4666)。然后用如腺病毒等辅助病毒感染包装细胞系。这种方法的优点在于细胞为可选择的并且适合于大规模产生rAAV。合适方法的其它实例采用腺病毒或杆状病毒而非质体将rAAV基因组和/或rep及cap基因引入包装细胞。
rAAV产生的一般原理在例如以下中进行了评论：Carter,1992,《生物技术时论(Current Opinions in Biotechnology)》1533-539；以及Muzyczka,1992,《微生物学与免疫学当前课题(Curr.Topics in Microbial.and Immunol.)》158:97-129)。各种方法描述于Ratschin等人,《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》4:2072(1984)；Hermonat等人,《美国国家科学院院刊》81:6466(1984)；Tratschin等人,《分子与细胞生物学》5:3251(1985)；McLaughlin等人,《病毒学期刊》,62:1963(1988)；以及Lebkowski等人,《分子与细胞生物学》,7:349(1988)。Samulski等人,《病毒学期刊》,63:3822-3828(1989)；美国专利号5,173,414；WO 95/13365和对应美国专利号5,658.776；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人《疫苗(Vaccine)》13:1244-1250(1995)；Paul等人《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》4:609-615(1993)；Clark等人《基因疗法(Gene Therapy)》3:1124-1132(1996)；美国专利第5,786,211号；美国专利第5,871,982号；以及美国专利第6,258,595号。前述文献在此通过引用以其整体并入本文，特别强调与rAAV产生有关的文献的那些部分。
因此，本公开提供了产生感染性rAAV的包装细胞。在一个实施例中，包装细胞可以是稳定转化的癌细胞，如HeLa细胞、293细胞和PerC.6细胞(同源293系)。在另一实施例中，包装细胞是未转化的癌细胞的细胞，如低传代293细胞(用腺病毒E1转化的人类胚肾细胞)、MRC-5细胞(人类胚胎成纤维细胞)、WI-38细胞(人类胚胎成纤维细胞)、Vero细胞(猴肾细胞)和FRhL-2细胞(恒河猴胚肺细胞)。
本公开的重组AAV(即感染性衣壳化rAAV颗粒)包括rAAV基因组。在示例性实施例中，两种rAAV的基因组缺乏AAV rep和cap DNA，即，在基因组的ITR之间不存在AAV rep或cap DNA。可以被构建成包括本公开的核酸分子的rAAV的实例在国际专利申请第PCT/US2012/047999号(WO 2013/016352)中阐述，所述国际专利申请通过引用以其整体并入本文。
在一个示例性实施例中，本公开的重组AAV载体通过三重转染方法(Xiao等人,《病毒学杂志》72,2224-2232(1998))使用AAV载体质粒rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白、pNLRep2-Caprh74和pHelp产生，rAAV含有微肌营养不良蛋白基因表达盒，其侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)。正是此序列被衣壳化到AAVrh.74病毒粒子中。该质粒含有微肌营养不良蛋白序列和肌肉特异性启动子的MHCK7增强子和核心启动子元件，以驱动基因表达。表达盒还含有SV40内含子(SD/SA)以促进高水平基因表达，并且牛生长激素多腺苷酸化信号用于有效的转录终止。
pNLREP2-Caprh74是AAV辅助质粒，其编码来自血清型rh74的4种野生型AAV2 rep蛋白和3种野生型AAV VP衣壳蛋白。pNLREP2-Caprh74质粒的示意图在图3中示出。
pHELP腺病毒辅助质粒为11,635bp，从Applied Viromics获得。质粒含有对AAV复制很重要的腺病毒基因组区域，即E2A、E4ORF6和VA RNA(腺病毒E1功能由293个细胞提供)。存在于该质粒中的腺病毒序列仅占腺病毒基因组的约40％，并且不含有对复制至关重要的顺式元件，例如腺病毒末端重复序列。因此，预计不会从这种生产系统产生感染性腺病毒。pHELP质粒的示意图在图4中示出。
rAAV可以通过本领域标准方法纯化，如通过柱色谱法或氯化铯梯度。从辅助病毒中纯化rAAV载体的方法是本领域已知的，并且包含在例如Clark等人,《人类基因疗法》,10(6):1031-1039(1999)；Schenpp和Clark,《分子医学方法(Methods Mol.Med.)》,69 427-443(2002)；美国专利号6,566,118和WO 98/09657。
在另一个实施例中，本公开考虑包括本公开的rAAV的组合物。本公开的组合物包括rAAV和药学上可接受的载体。组合物还可包括其它成分，例如稀释剂和佐剂。可接受的载体、稀释剂和佐剂对接受者是无毒的，并且优选在所用的剂量和浓度下是惰性的，包含缓冲剂和表面活性剂，例如pluronics。
在本公开的方法中待施用的rAAV的滴度将根据例如特定rAAV、施用方式、治疗目标、个体以及靶向的一种或多种细胞类型而变化，并且可通过本领域标准的方法确定。rAAV的滴度的范围可以为每ml约1x 106个、约1x 107个、约1x 108个、约1x 109个、约1x 1010个、约1x 1011个、约1x 1012个、约1x 1013个到约1x 1014个或更多个DNA酶抗性颗粒(DRP)。剂量还可以以病毒基因组(vg)为单位表示。确定衣壳载体基因组滴度的一种示例性方法使用定量PCR，例如(Pozsgai等人,《分子疗法》25(4):855-869,2017)中描述的方法。除非另有说明，否则本文所描述的剂量对应于通过超螺旋DNA标准确定的剂量。
本公开考虑体内或体外用rAAV转导靶细胞的方法。体内方法包括向有需要的动物(包含人类)给药有效剂量或有效多剂量的包括本公开的rAAV的组合物的步骤。如果在病症/疾病发展之前施用剂量，则施用是预防性的。如果在病症/疾病发展之后施用剂量，则施用是治疗性的。在本公开的实施例中，有效剂量是减轻(消除或减少)至少一种与所治疗的病症/疾病状态相关的症状、减缓或防止向病症/疾病状态发展、减缓或防止病症/疾病状态发展、缩小疾病程度、导致疾病缓解(部分或全部)和/或延长存活的剂量。设想用本公开的方法预防或治疗的疾病的一个实例是DMD。
本公开还设想了组合疗法。如本文使用的组合包含同时医治和顺序医治两者。特别考虑本公开方法与标准医药医治(例如皮质类固醇)的组合，以及与新疗法的组合。
有效剂量的组合物、组合疗法或药物的施用可以通过本领域的标准途径进行，所述途径包含但不限于肌肉内、肠胃外、静脉内、口服、颊、鼻、肺、颅内、骨内、眼内、直肠或阴道。本公开的rAAV的AAV组分(具体地AAV ITR和衣壳蛋白)的施用途径和血清型可以由本领域的技术人员将所治疗的感染和/或疾病状态和要表达微肌营养不良蛋白的靶细胞/组织考虑在内来进行选择和/或匹配。
本公开提供了有效剂量的本公开的rAAV、药物和组合物的局部施用和全身施用。例如，全身施用是对循环系统的施用，从而影响整个身体。全身施用包含肠内施用，如通过胃肠道的吸收和通过注射、输注或植入的肠胃外施用。
具体地，可以通过使用将rAAV重组载体转运到动物的靶组织中的任何物理方法来完成本公开的rAAV的实际施用。根据本公开的施用包含但不限于注射到肌肉中和注射到血流中。简单地将rAAV重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中已经被证明足以提供用于肌肉组织表达的媒剂，并且对于可以与rAAV共施用的载体或其它成分没有已知的限制(尽管应避免使用与rAAV一起以正常方式降解DNA的组合物)。可以对rAAV的衣壳蛋白进行修饰，使得rAAV靶向所关注特定靶组织如肌肉。参见，例如，WO 02/053703中，所述文献的公开内容通过引用并入本文。药物组合物可制备成可注射调配物或局部调配物，通过经皮转运递送至肌肉。许多用于肌内注射和透皮转运两者的制剂先前已经被开发，并且可以用于本公开的实践中。rAAV可与任何药学上可接受的载体一起使用，以便于施用和处理。
在本公开的一个实施例中，本文所描述的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白在含有20mM Tris(pH 8.0)、1mM氯化镁(MgCl2)、200mM氯化钠(NaCl)和0.001％泊洛沙姆188的缓冲剂中调配。
在本文公开的方法中待给药的rAAV的剂量将根据例如特定rAAV、给药方式、医治目标、个体和靶向的一种或多种细胞类型而变化，并且可通过本领域标准的方法确定。施用的每种rAAV的滴度范围可为从每毫升约1×106、约1×107、约1×108、约1×109、约1×1010、约1×1011、约1×1012、约1×1013、约1×1014、约2×1014或至约1×1015或更多DNase抗性颗粒(DRP)。剂量也可以病毒基因组(vg)为单位表示(即，分别地1×107vg、1×108vg、1×109vg、1×1010vg、1×1011vg、1×1012vg、1×1013vg、1×1014vg、2×1014vg、1×1015vg)。剂量也可以以每千克(kg)体重的病毒基因组(vg)为单位表示(即分别地1×1010vg/kg、1×1011vg/kg、1×1012vg/kg、1×1013vg/kg、1×1014vg/kg、1.25×1014vg/kg、1.5×1014vg/kg、1.75×1014vg/kg、2.0×1014vg/kg、2.25×1014vg/kg、2.5×1014vg/kg、2.75×1014vg/kg、3.0×1014vg/kg、3.25×1014vg/kg、3.5×1014vg/kg、3.75×1014vg/kg、4.0×1014vg/kg、1×1015vg/kg)。滴定AAV的方法描述于Clark等人,Hum.Gene Ther.,10:1031-1039(1999)。
具体地，可以通过使用将rAAV重组载体转运到动物的靶组织中的任何物理方法来完成本公开的rAAV的实际施用。根据本公开的施用包含但不限于注射到肌肉中和注射到血流中。简单地将rAAV重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中已经被证明足以提供用于肌肉组织表达的媒剂，并且对于可以与rAAV共施用的载体或其它成分没有已知的限制(尽管应避免使用与rAAV一起以正常方式降解DNA的组合物)。可以对rAAV的衣壳蛋白进行修饰，使得rAAV靶向所关注特定靶组织如肌肉。参见，例如，WO 02/053703中，所述文献的公开内容通过引用并入本文。药物组合物可制备成可注射调配物或局部调配物，通过经皮转运递送至肌肉。许多用于肌内注射和透皮转运两者的制剂先前已经被开发，并且可以用于本公开的实践中。rAAV可与任何药学上可接受的载体一起使用，以便于施用和处理。
为了肌内注射的目的，可采用佐剂如芝麻油或花生油或丙二醇水溶液，以及无菌水溶液。如果期望，那么可缓冲这类水溶液，并且首先用盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。作为游离酸的rAAV溶液(DNA含有酸性磷酸酯基团)或药理学上可接受的盐可在适当地与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)混合的水中制备。还可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中以及在油中制备rAAV的分散体。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以预防微生物的生长。在这方面，采用的无菌含水介质都可通过本领域技术人员熟知的标准技术容易地获得。
适于可注射使用的药物载体、稀释剂或赋形剂包含无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且流动性必须达到存在流畅注射能力的程度。其必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止如细菌和真菌等微生物的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水；乙醇；多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)；其合适的混合物和植物油。举例来说，通过使用例如卵磷脂的包衣、通过在分散液的情况下维持所需的粒度和通过使用表面活性剂，可维持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等可以带来防止微生物的作用。在许多情况下，将优选的是包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过使用延迟吸收剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)延长可注射组合物的吸收。
根据需要，通过将rAAV以所需量掺入带有上面列举的各种其它成分的适当溶剂中来制备无菌可注射溶液，然后过滤灭菌。通常，通过将灭菌的活性成分并入到无菌媒剂中来制备分散体，所述无菌媒剂含有基础分散介质以及来自以上枚举的那些的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分的粉末加上来自其先前无菌过滤溶液的任何附加期望成分。
用rAAV进行的转导也可以在体外进行。在一个实施例中，从受试者中取出所需的靶肌肉细胞，用rAAV转导并重新引入到受试者体内。可替代地，可以使用同基因细胞或异基因肌肉细胞，其中那些细胞将不会在受试者中产生不适当的免疫应答。
用于将转导细胞转导和重新引入受试者的合适方法是本领域已知的。在一个实施例中，可通过将rAAV与肌肉细胞组合(例如在适当的培养基中)体外转导细胞，并且使用常规技术(例如Southern印迹和/或PCR)，或通过使用选择标记物来筛选具有感兴趣的DNA的那些细胞。然后可将转导的细胞配制成药物组合物，并且通过各种技术将组合物引入受试者，例如通过肌内、静脉内、皮下和腹膜内注射，或通过使用例如导管来注射到平滑肌和心肌中。
用本公开的rAAV转导细胞引起微肌营养不良蛋白的持续表达。因此，本公开提供了向动物，优选地人施用/递送表达微肌营养不良蛋白的rAAV的方法。这些方法包含用一种或多种本公开的rAAV转导组织(包含但不限于如肌肉的组织、如肝脏和脑的器官，以及如唾液腺的腺体)。转导可以用包括组织特异性控制元件的基因盒进行。例如，本公开的一个实施例提供了由肌肉特异性控制元件引导的转导肌肉细胞和肌肉组织的方法，包含但不限于源自肌动蛋白和肌球蛋白基因家族，如源自myoD基因家族的那些(参见Weintraub等人,《科学(Science)》,251:761-766(1991))、心肌细胞特异性增强子结合因子MEF-2(Cserjesi和Olson,《分子细胞生物学(Mol Cell Biol》)11:4854-4862(1991))、源自人骨骼肌动蛋白基因的控制元件(Muscat等人,《分子细胞生物学》,7:4089-4099(1987))、心肌肌动蛋白基因、肌肉肌酸激酶序列元件(参见Johnson等人,《分子细胞生物学》,9:3393-3399(1989))和小鼠肌酸激酶增强子(mCK)元件、源自骨骼快收缩肌钙蛋白C基因、慢收缩心脏肌钙蛋白C基因和慢收缩肌钙蛋白I基因：缺氧诱导的核因子的控制元件(Semenza等人,《美国国家科学院院刊》,88:5680-5684(1991))、类固醇诱导元件和启动子，包含糖皮质激素应答元件(GRE)(参见Mader和White,《美国国家科学院院刊》90:5603-5607(1993))和其它控制元件。
肌肉组织是体内DNA递送的有吸引力的靶标，因为其不是至关重要的器官并且易于接近。本公开设想了来自转导的肌纤维的微肌营养不良蛋白的持续表达。
因此，本公开提供了向有需要的受试者施用有效剂量(或多个剂量，基本上同时施用或间隔给予的剂量)的编码微肌营养不良蛋白的rAAV的方法。
免疫抑制方案
本公开提供了治疗肌营养不良症的方法，其中受试者正在经历免疫抑制方案。术语免疫抑制方案是指抑制或调节受试者的免疫系统的治疗方法。所述方案包括施用一种或多种免疫抑制剂。在任何一种方法中，免疫抑制方案包括至少一种免疫抑制剂，或至少两种免疫抑制剂或至少三种免疫抑制剂或至少四种免疫抑制剂或者至少五种抑制剂。
免疫抑制方案是预防性地施用的，其中免疫抑制方案在施用基因疗法之前施用，或在施用基因疗法之后受试者对rAAV产生免疫应答之前施用。免疫应答包含对施用的rAAV的不利免疫应答或炎性应答。免疫应答可以是受试者响应于施用的rAAV产生抗体，如抗AAVrh.74抗体。
预防性施用包含在施用基因疗法的同时施用免疫抑制方案，如在施用基因疗法的24小时内，或在施用基因疗法的12小时内，或在施用基因疗法的6小时内，或在施用基因疗法的5小时内，或在施用基因疗法的4小时内，或在施用基因疗法的3小时内，或在施用基因疗法的2小时内，或在施用基因疗法的一小时内。免疫抑制剂是抑制受试者的免疫系统、降低受试者的免疫系统的有效性或调节受试者免疫系统的活力或有效性的任何药剂。
在其它实施例中，免疫抑制方案是治疗性施用的。例如，免疫抑制方案是在施用基因疗法后受试者对rAAV的免疫应答开始后施用的。受试者的免疫应答包含在向受试者施用rAAV之后或由施用引起的不良免疫应答或炎性应答。免疫应答可以是受试者响应于施用的rAAV产生抗体，如抗AAVrh.74抗体。
在其它实施例中，在施用第二剂量的基因疗法之前施用免疫抑制方案。在一些实施例中，第二剂量在治疗性血浆交换(TPE)之后施用。
示例性免疫抑制剂包含糖皮质激素、janus激酶抑制剂、钙调神经磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂、细胞抑制剂，如嘌呤类似物、甲氨蝶呤和环磷酰胺、肌苷单磷酸脱氢酶(IMDH)抑制剂和生物制品，如单克隆抗体或融合蛋白和多肽。
免疫抑制剂可以是抗炎类固醇，其是减少炎症并抑制或调节受试者的免疫系统的类固醇。示例性抗炎类固醇是糖皮质激素，如强的松、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、地夫可特、布地奈德(budesonide)或强的松。
Janus激酶抑制剂是JAK/STAT信号通路的抑制剂，通过靶向酶的一个或多个Janus激酶家族。示例性janus激酶抑制剂包含托法替尼(tofacitinib)、巴瑞克替尼(baricitinib)、乌帕替尼(upadacitinib)、培非替尼(peficitinib)和奥拉替尼(oclacitinib)。
钙调神经磷酸酶抑制剂与亲环蛋白结合并抑制钙调神经磷酸酶的活性，示例性钙调神经磷酸酶抑制剂包含环孢霉素(cyclosporine)、他克莫司和匹克莫司。
mTOR抑制剂减少或抑制丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶mTOR。示例性mTOR抑制剂包含西罗莫司、依维莫司(everolimus)和替西罗莫司(temsirolimus)。
免疫抑制剂包含免疫抑制大环内酯类。术语“免疫抑制大环内酯类”是指抑制或调节受试者的免疫系统的大环内酯类药剂。大环内酯类是一类包括大环内酯环的药剂，一个或多个脱氧糖，如红霉支糖或红霉脱氧糖胺连接到其上。内酯环通常为14元、15元或16元。大环内酯类属于聚酮类药剂，并且可以是天然产物。免疫抑制大环内酯类的实例包含他克莫司、吡美莫司和西罗莫司。
嘌呤类似物阻断核苷酸合成，并且包含IMDH抑制剂。示例性嘌呤类似物包含硫唑嘌呤、吗替麦考酚酯和来氟米特(lefunomide)。
示例性免疫抑制生物制品包含阿巴西普(abatacept)、阿达木单抗(adalimumab)、阿那白滞素(anakinra)、赛妥珠单抗(certolizumab)、依那西普(etanercept)、戈利木单抗(golimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、伊克珠单抗(ixekizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、利妥昔单抗、苏金单抗(secukinumab)、托珠单抗(tocilizumab)、乌斯特单抗(ustekinenumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、巴拉塔赛(belatacep)和达克珠单抗(daclizumab)。
特别地，免疫抑制剂是抗CD20抗体。术语抗CD20特异性抗体是指特异性结合或抑制或降低CD20的表达或活性的抗体。示例性抗CD20抗体包含利妥昔单抗、奥美珠单抗或奥法木单抗。
免疫抑制抗体的另外的实例包含抗CD25抗体(或抗IL2抗体或抗TAC抗体)，如巴利昔单抗和达克珠单抗，以及抗CD3抗体，如莫罗单抗(muromonab)-CD3、奥昔珠单抗(otelixizumab)、替利组单抗(teplizumab)和维西珠单抗(visilizumab)，抗CD52抗体，如阿仑单抗(alemtuzumab)。
在本发明的实施例中，在本公开的一种或多种方法中使用的免疫抑制剂(免疫抑制抗体)可以作为纳米颗粒施用。制备和/或调配纳米颗粒的方法，以及可用于本公开方法中的纳米颗粒，包含以下中描述的那些，例如，作为聚合物(Patil等人,《药物纳米技术(Pharmaceutical Nanotechnol.)》367:195-203,2009；Yang等人,《美国化学会—应用材料与界面(ACS Appl.Mater.Interfaces,doi:10.1021/acsami.6b16556,2017；Perepelyuk等人,《分子疗法核酸(Mol.Ther.Nucleic Acids)》6:259-268,2017)；作为脂质体(Buyens等人,《控制释放杂志(J.Control Release)》158(3):362-370,2012；Scarabel等人,《药物递送专家意见(Expert Opin.Drug Deliv.)》17:1-14,2017)；作为胶束(Tangsangasaksri等人,《生物大分子(Bio Macromolecules)》17:246-255,2016；Wu等人,《纳米技术(Nanotechnology)》,doi:10.1088/1361-6528/aa6519,2017)；作微乳剂(WO 11/004395)，作为纳米乳剂或固体脂质纳米颗粒(Sahay等人,《自然生物技术(Nature Biotechnol.)》31:653-658,2013；以及Lin等人,《纳米医学(Nanomedicine)》9(1):105-120,2014)；以及以下中描述的：WO 2008/066965、WO 2011/143201、WO2008/014478、WO 2020/081938、WO2013/016058、WO 2013/086373、WO 2019/177550、WO 2013/016126、WO 2019//089828、WO99/39741、WO 2017/1 17528、WO 2017/004143、WO 2017/075531、WO 2015/199952、WO2014/008334、WO 2013/086373、WO 2013/086322、WO 2013/016058、WO 2013/086373、WO2011/141705和WO 2001/07548；美国专利公开第2004/0142025号、2007/0042031号、第2016/0199485号、第2016/0009637号、第2015/0273068号、第2015/0265708号、第2015/0203446号、第2015/0005363号、第2014/0308304号、第2014/0200257号、第2013/086373号、第2013/0338210号、第2013/0323269号、第2013/0245107号、第2013/0195920号、第2013/0123338号、第2013/0022649号、第2013/0017223号、第2012/0295832,2012/0183581号、第2012/017241 1号、第2012/0027803号、第2012/0058188号、第201 1/031 1583号、第201 1/031 1582号、第201 1/0262527号、第201 1/0216622号、第201 1/01 17125号、第201 1/0091525,201 1/0076335号、第201 1/0060032号、第2010/0130588号、第2007/0042031号、第2006/0240093号、第2006/0083780号、第2006/0008910号、第2005/0175682号、第2005/017054号、第2005/01 18253号、第2005/0064595号、第2004/0142025号、第2007/0042031号、第1999/009076号和美国专利第8,569,256号、第5,965,542号；所述文献的完整内容特此通过引用的方式并入本文。
治疗性血浆交换
治疗性血浆交换(TPE)是一种体外血液净化技术，旨在去除高分子量物质，如抗体。在初次全身施用一定剂量的rAAV后，受试者可能产生针对AAV血清型的抗体，例如，在施用rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白后，受试者产生针对AAVrh74的抗体。使用TPE去除这些抗体可以安全有效地重新给药rAAV载体。在TPE过程中，通过血管通路去除全血，然后通过单采血液成分术机器内的离心机旋转，在那里去除血浆(抗体)。红细胞与替换液(人白蛋白)一起递送回用于受试者的维持液。
TPE疗程中要交换的血浆量与受试者的估计血浆体积(EPV)相关。可以使用许多公式来计算EPV(参见例如Inkley等人,《实验室临床医学杂志(J.Lab Clin.Med.)》45:841-850,1955，Retzlaff等人,《血液(Blood)》33:649-887,1969，Feldschuh等人,《血液循环(Circulation)》56:605-612,1977，Spenger等人,血浆交换疗法中患者血浆体积的预测(Predication of patient's plasma volume in plasma exchange therapy.)来自:Smeby等人编辑,《治疗性血液净化系统的免疫和代谢方面(Immune and MetabolicAspects of Therapeutic Blood Purification Systems.)》瑞士巴塞尔(Basel,Switzerland):克拉格出版公司(Krager.)1986,第394-402页)。估计EPV的示例性方法根据以下描述的以下公式使用受试者的体重和血细胞比容来计算：Kaplan等人,《国际肾脏杂志(Kidney Intl.)》38:160-166,1990，所述文献通过全文引用的方式并入本文：
EPV＝[0.065x体重(kg)]x[1-血细胞比容]
实例5中描述的方案是基于IgG抗体的动力学制定的，显示48小时后出现反弹，恢复了从先前程序中去除的约50％至60％的抗体。为了本文所描述的方法的目的，确定在一个实施例中，抗体滴度必须降低到AAVrh.74抗体水平<1:100，以允许基因递送。
例如，对受试者的血浆进行TPE的方法去除受试者血管内空间内至少约50％的抗rAAV抗体，或去除受试者血管内空间内至少约55％的抗rAAV抗体，或去除受试者血管内空间内至少约60％的抗rAAV抗体，或去除至少约63％的抗rAAV抗体，或去除受试者血管内空间内至少约64％的抗rAAV抗体，或去除受试者血管内空间内至少约65％的抗rAAV抗体，或去除受试者血管内空间内至少约69％的抗rAAV抗体，或去除受试者血管内空间内至少约70％的抗rAAV抗体，或去除受试者血管内空间内至少约74％的抗rAAV抗体，或去除受试者血管内空间内至少约75％的抗rAAV抗体，或去除受试者血管内空间内至少约85％的抗rAAV抗体，或去除至少约90％的抗rAAV抗体，或去除受试者血管内空间内至少约95％的抗rAAV抗体。
所公开的方法包括对受试者的血浆进行至少一个TPE疗程、或至少两个TPE疗程、或至少三个TPE疗程、或至少5个TPE疗程、或至少6个TPE疗程、或至少7个TPE疗程、或至少8个TPE疗程、或至少9个TPE疗程或至少10个TPE疗程。另外，TPE疗程在约1天至5天、或约1天至10天、或约5天至10天、或大约5天至7天或约7天至10天内每天进行一次。TPE疗程连续两天每天进行一次，或连续三天每天一次，或连续四天、连续5天每天一次，或连续6天每天一次，或连续7天每天一次，或连续7天每天一次，或连续8天每天一次，或连续9天每天一次，或连续10天每天一次。
TPE是使用血库程序，使用选择性细胞去除(血液成份分离)进行的，如以下中所描述的：Gurland等人,《国际人造器官杂志(Int.J.Artif Organs)》7:35-38,1984，使用膜血浆分离(MPS)，其使用高渗透性过滤器和透析设备，如以下中所描述的：Guerland等人,《肾单位(Nephron)》36:173-182,1984。Sowada等人描述了进行TPE的另外的方法。(可用的去除系统：最新技术(Available removal systems:state of the art.)Nydegger UE,编辑.20世纪90年代的治疗性血液成分单采术(Therapeuitc Hemapheresis in the 1990s).《血液学和输血的当前研究(Current Studies in Hematology and Blood Transfusions)》,第57卷.瑞士巴塞尔:克拉格出版公司1990第57-113页)。这些参考文献以全文引用的方式并入本文。
本发明的实施例包含确定受试者的血清或血浆中抗AAVrh.74抗体的存在，同时用(rAAV)rAAV.MHCK7.微肌营养不良担保基因疗法(包含(rAAV)rh74MHCK7.微肌营养不良蛋白)治疗受试者，并且进一步用免疫抑制方案、TPE或两者治疗受试者。认识到受试者(包含人患者)的血清或血浆可能含有预先存在的抗AAVrh.74抗体，因此在接受任何基因疗法治疗之前可被鉴定为AAVrh.74血清阳性。进一步认识到，受试者(包含人患者)可以因接受基于AAV的基因疗法而变为血清阳性。因此，所述确定可以用于监测此类受试者的血清或血浆中抗AAVrh.74抗体的存在和水平，并且进一步用于确定在用rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白(包含AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白)治疗之前是否应向这些受试人施用免疫抑制方案、TPE或两者。在此方面，包含AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白的rAAV.MHCK7微肌营养不良蛋白可以是第一次基因疗法治疗或包含重新给药治疗的另外的基因疗法治疗。在此方面，使用此类血清或血浆中血清阳性的确定来确定受试者是否有资格接受rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白(包含AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白)的首次基因疗法；受试者是否需要免疫抑制方案和/或TPE，以及免疫抑制方案的治疗是否已导致受试者血清或血浆中的抗AAVrh74抗体清除到足以使受试者有资格接受rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白(包含AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白)的治疗或再治疗。用于此类确定受试者血清或血浆中抗AAVrh.74抗体存在的方法和组合物包含以下中的描述：Griffin等人,《腺相关病毒血清型rh74在肌营养不良症人群中的患病率(Adeno-associated Virus Serotyperh74Prevalence in Muscular Dystrophy Population)》,美国基因和细胞疗法学会(American Society of Gene and Cell Therapy),2019年第22届年会；以及在于2021年6月15日提交的国际专利申请PCT/US2021/037314中，对应于美国专利申请第63/038957号，所述文献的全部内容特此通过引用并入本文。
用于确定受试者血清或血浆中抗AAVrh.74抗体的存在的抗体的实例包含以下或如本文别处所描述：
Figure BDA0004113275930000621
/>
Figure BDA0004113275930000631
用于测定受试者血清或血浆中抗AAVrh.74抗体存在的抗体的另外的实例包含单克隆抗体，所述单克隆抗体包括选自由以下组成的组的VH CDR1氨基酸序列：NYGMN(SEQ IDNO:20)、DYGMN(SEQ ID NO:22)、YTFTNYGMN(SEQ ID NO:20)、YTFTKYGMN(SEQ ID NO:23)和YTFTNYGMN(SEQ ID NO:21)，和/或选自由以下组成的组的VH CDR2氨基酸序列：WINTYTGEPTYADDFKG(SEQ ID NO:24)、WINTNTGEPTYGDDFKG(SEQ ID NO:25)和WMGWINTYTGEPTY(SEQ ID NO:26)，和/或选自由以下组成的组的VH CDR3氨基酸序列：GVAHYSDSRFAFDY(SEQ ID NO:27)、GNAHPGGSAFVY(SEQ ID NO:28)、RGSYYYDSSPAWFAY(SEQID NO:29)、RGVDSSGYGAFAY(SEQ ID NO:30)和TRGTSTMISTFAFVY(SEQ ID NO:31)，和/或选自由以下组成的组的VL CDR1氨基酸序列：SVSSSVSYMH(SEQ ID NO:32)、SASSGVTYMH(SEQID NO:33)、SSVSYMH(SEQ ID NO:34)、SSVSYMH(SEQ ID NO:34)和SSVRYMH(SEQ ID NO:35)，和/或选自由以下组成的组的VL CDR2氨基酸序列：YTSNLAS(SEQ ID NO:36)、RTSNLAS(SEQID NO:37)、LWIYSTSNLAS(SEQ ID NO:38)和VWIYSTSNLAS(SEQ ID NO:39)，和/或选自由以下组成的组的VH CDR3氨基酸序列：QQRSSYPFT(SEQ ID NO:40)、QQRSTYPF(SEQ ID NO:41)、QQRSFYPF(SEQ ID NO:42)和QQRTYYPF(SEQ ID NO:43)。
用包括微肌营养不良蛋白的rAAV治疗肌营养不良症，包含杜氏肌营养不良症 (“DMD”)或碧加氏肌营养不良症(“BMD”)
本发明涵盖治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的方法，所述方法包括施用重组腺病毒相关(rAAV)的步骤，所述重组腺病毒相关包括编码微肌营养不良蛋白的异源核苷酸序列，并且进一步包括施用免疫抑制方案。在本发明的各种实施例中，所述方法包括施用包括编码微肌营养不良蛋白的异源核苷酸序列的重组腺病毒相关(rAAV)，并且进一步包括施用抗炎类固醇，包含例如强的松。
在本发明的涉及用包括微肌营养不良蛋白的rAAV治疗肌营养不良症，并且进一步包括施用免疫抑制方案或抗炎类固醇的所有实施例中，可用于本发明方法的rAAV或微肌营养不良蛋白编码核苷酸序列包含以下中描述的那些：WO-2020/123645、WO-2019/209777、WO-2019/195362、WO-2016/115543、WO-2019118806、WO-2017/221145，其中每个文献的内容通过引用并入本文，并包含SGT-001、zildistrogene varoparvovec和PF-06939926。
肢带型肌营养不良症的治疗
肢带型肌营养不良症(“LGMD”)的治疗是本发明的一个方面。应认识到，本文所描述的本发明方法可以通过使用可用于治疗此类肌营养不良症的rAAV载体来用于治疗肢带型肌营养不良症。此类rAAV载体包含PCT/US2019/039893(WO 2020/06458)中描述的那些，包含AAVrh.74.tMCK.CAPN3；美国专利申请63/024,338，包含rAAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV；PCT/US2019/015779(WO 2019/15474)，包含scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG；PCT/US2020/47339，包含AAVrh74.tMCK.hSCGA；PCT/US2020/019892(WO2020/176614)，包含scAAVrh74.MHCK7.HSGCB；PCT/US2016/061703(WO2017/083776)，包含rAAVrh.74.MHCK7.huAN05，其中每个文献的内容特此通过引用并入本文。
用于治疗肌营养不良症的组合疗法
本公开提供了用于治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的组合疗法，包含用于治疗DMD、碧加氏肌营养不良症和肢带型肌营养不良症，其中所述组合疗法包括rAAV和抗炎类固醇。本公开还提供了包括rAAV和抗炎类固醇的组合疗法用于制备用于治疗肌营养不良症的药物的用途，包含用于治疗DMD、碧加氏肌营养不良症和肢带型肌营养不良症。
本公开提供了包括组合施用的rAAV rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白和抗炎类固醇的组合疗法和药物，所述组合施用包含同时、顺序或在不同的时间点施用。本公开还提供了组合疗法和药物，所述组合疗法和药物包括选自由以下组成的组的rAAV：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05和组合施用的抗炎类固醇，包含同时、顺序或在不同的时间点施用。例如，抗炎类固醇是糖皮质激素。在一些实施例中，所述抗炎类固醇是强的松、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙或地夫可特。在一些实施例中，抗炎类固醇被调配用于口服施用。对于组合疗法和药物，抗炎类固醇可以在施用rAAV之前和之后施用。可替代地，仅在施用rAAV之前或之后施用抗炎类固醇。
在一些组合疗法和药物中，在施用所述rAAV之前约12小时或施用所述rAAV之前约24小时或施用所述rAAV之前约36小时或施用所述rAAV之前约48小时或施用所述rAAV之前约60小时或施用所述rAAV之前约72小时或施用前约96小时施用所述抗炎类固醇。在一些组合疗法和药物中，在施用所述rAAV前约5天小时、施用所述rAAV之前约6天小时、施用所述rAAV之前约7天小时、或施用所述rAAV之前约8天、或施用所述rAAV之前约9天、或施用所述rAAV之前约10天、或施用所述rAAV之前约11天、或施用所述rAAV之前约12天、或施用所述rAAV之前约13天、或施用所述rAAV之前约14天或施用所述rAAV之前约30天施用所述炎类固醇。
在一些组合疗法和药物中，在施用所述rAAV之前，所述抗炎类固醇每天至少施用一次，持续约7天，或在施用所述rAAV之前，每天至少施用至少一次，持续约14天，或每天至少施用一次，持续21天，或在施用所述rAAV之前每天至少施用一次，持续约28天，或在施用所述rAAV前每天至少施用一次，持续约30天，或在施用所述rAAV前每天至少施用一次，持续约45天，或在施用所述rAAV前每天至少施用一次，持续约60天。在一些组合物和药物中，在施用所述rAAV之前30天至60天施用所述抗炎类固醇。
在示例性组合疗法和药物中，在施用所述rAAV之前施用所述抗炎类固醇，并且从施用所述rAAV后的第1天至第30天，每天至少施用一次所述抗炎类固醇，或从施用所述rAAV后的第1天至第60天每天至少一次，或从施用所述rAAV后的第1天至第7天每天至少一次，或从施用所述rAAV后的第1天至第14天每天至少一次，或从施用所述rAAV后的第1天至第21天每天至少一次，或从施用所述rAAV后的第1天至第24天每天至少一次，或从施用所述rAAV后的第1天至第28天每天至少一次，或从施用所述rAAV后的第1天至第30天每天至少一次，或施用所述rAAV后的至少30天至60天。
在本文公开的任何组合疗法和药物中，组合疗法或药物还可以包括抗CD20特异性抗体，其与rAAV和抗炎类固醇组合施用。在施用rAAV之前施用抗CD20特异性抗体。在一些组合物中，在施用所述rAAV之前至少7天施用所述抗CD20特异性抗体。示例性抗CD20抗体包含利妥昔单抗、奥美珠单抗或奥法木单抗。
在一些组合疗法和药物中，在施用所述rAAV前约60天、或在施用所述rAAV前约45天、或在施用所述rAAV前约30天、在施用所述rAAV前约14天、在施用所述rAAV前约7天，并且在施用所述rAAV的约24小时内施用所述抗CD20特异性抗体。在一些组合物中，在施用所述rAAV之前30至60天施用所述抗CD20抗体。在一些组合疗法和药物中，所述抗CD20特异性抗体在所述rAAV施用后施用。例如，在施用所述rAAV之前和之后都施用所述抗CD20特异性抗体。可替代地，抗CD20特异性抗体在施用所述rAAV之前施用，或所述抗CD20特异性抗体施用所述rAAV之后施用。
另外，所公开的任何组合疗法和药物、免疫抑制大环内酯类与rAAV和抗炎类固醇以及任选地抗CD-20抗体组合向受试者施用。免疫抑制大环内酯类的实例包含他克莫司、吡美莫司和西罗莫司。在一些组合疗法和药物中，免疫抑制大环内酯类被调配用于口服施用。在一些组合疗法和药物中，可以在所述rAAV施用之前和所述rAAV施用之后施用所述免疫抑制大环内酯类。可替代地，在施用所述rAAV之前施用所述免疫抑制大环内酯类，或在施用所述rAAV之后施用所述免疫抑制大环内酯类。
在一些组合疗法和药物中，所述免疫抑制大环内酯类在施用所述rAAV前至少三天每天至少施用一次、或在施用所述rAAV前至少4天施用、或在施用所述rAAV前至少5天施用、或在施用所述rAAV前至少6天施用、或在施用所述rAAV前至少7天施用、或在施用所述rAAV前至少10天施用、或在施用前至少14天施用、或在施用所述rAAV前至少30天施用、或在施用所述rAAV前至少45天施用、或在施用所述rAAV前至少60天施用。在一些组合疗法和药物中，在施用所述rAAV之前30天至60天施用所述免疫抑制大环内酯类。
本公开还提供了用于治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的组合疗法，包括共同施用rAAV和免疫抑制方案，包含治疗DMD、碧加氏肌营养不良症和肢带型肌营养不良症，其中rAAV和免疫抑制方案的一种或多种组分同时、顺序地或在不同的时间点施用。另外，本公开还提供了包括rAAV和免疫抑制方案的组合疗法用于制备用于治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的药物的用途，包含治疗DMD、碧加氏肌营养不良症和肢带型肌营养不良症，其中rAAV和免疫抑制方案的一种或多种组分同时、顺序地或在不同的时间点施用。例如，本公开提供了用于治疗肌营养不良症的组合疗法，其包括rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白和免疫抑制方案，其中所述免疫抑制方案包括抗炎类固醇、抗CD20抗体和免疫抑制大环内酯类中的一种或多种，其中所述rAAV和所述免疫抑制方案的一种或多种组分同时、顺序地或在不同的时间点施用。例如，本公开提供了用于治疗肌营养不良症的组合疗法，其包括选自由以下组成的组的rAAV：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05和免疫抑制方案，其中所述免疫抑制方案包括抗炎类固醇、抗CD20抗体和免疫抑制大环内酯类中的一种或多种，其中所述rAAV和所述免疫抑制方案的一种或多种组分同时、顺序地或在不同的时间点施用。。
例如，本公开提供了包括rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白和免疫抑制方案的组合疗法用于制备用于治疗肌营养不良症的药物的用途，其中所述免疫抑制方案包括抗炎类固醇、抗CD20抗体和免疫抑制大环内酯类中的一种或多种，其中所述rAAV和所述免疫抑制方案的一种或多种组分同时、顺序地或在不同的时间点施用。例如，本公开提供了rAAV和免疫抑制方案用于治疗肌营养不良症的用途，其中所述rAAV选自由以下组成的组：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05，并且其中所述免疫抑制方案包括抗炎类固醇、抗CD20抗体和免疫抑制大环内酯类中的一种或多种，其中所述rAAV和所述免疫抑制方案的一种或者多种组分同时、顺序地或在不同的时间点施用。
术语免疫抑制方案是指抑制或调节受试者的免疫系统的治疗方法。所述方案包括施用一种或多种免疫抑制剂。在一些实施例中，所述免疫抑制方案包括施用抗炎类固醇、抗CD20抗体和免疫抑制大环内酯类。
在示例性组合疗法或药物中，免疫抑制方案包括在施用rAAV前约24小时施用的抗炎类固醇。在另一个示例性组合疗法或药物中，所述免疫抑制方案包括在施用所述rAAV之前施用的抗炎类固醇，并且从施用所述rAAV后的第1天至第30天每天至少施用一次所述抗炎类固醇，或从施用所述rAAV后的第1天至第60天每天至少施用一次所述抗炎类固醇。在另一个实施例中，在以1mg/kg施用rAAV之后，施用糖皮质激素抗炎类固醇(如强的松)，持续至少60天。
在任何公开的组合疗法和药物中，在免疫抑制方案中，所述抗炎类固醇是糖皮质激素，如强的松、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙或地夫可特。在一些组合疗法中，抗炎类固醇被调配用于口服施用。
在另外的示例性组合疗法和药物中，免疫抑制方案包括在施用rAAV之前施用的抗CD20特异性抗体。例如，抗CD20抗体被调配用于通过血管内输注施用。示例性抗CD20特异性抗体包含利妥昔单抗、奥美珠单抗或奥法木单抗。
在一些组合疗法和药物中，在施用所述rAAV之前至少14天施用所述抗CD20特异性抗体。在另一个实施例中，在施用所述rAAV前约60天、在施用所述rAAV前约45天、在施用所述rAAV前约30天、在施用所述rAAV前14天、在施用所述rAAV前约7天，并且在施用所述rAAV的约24小时内施用所述抗CD20特异性抗体。另外，所述抗CD20特异性抗体在施用所述rAAV之前施用30天至60天。所公开的免疫抑制方案还包含在施用所述rAAV后施用抗CD20特异性抗体。
另外，所公开的免疫抑制方案包括在施用所述rAAV之前，每天至少一次施用的免疫抑制大环内酯类，持续至少三天。免疫抑制方案还可以包括在施用rAAV后施用的免疫抑制大环内酯类。在任何公开的免疫抑制方案中，所述免疫抑制大环内酯类被调配用于口服施用。示例性免疫抑制大环内酯类包含他克莫司、吡美莫司或西罗莫司。
在一些实施例中，所公开的免疫抑制方案在施用所述rAAV之前30天至60天施用。另外，在施用所述rAAV前约60天、施用所述rAAV前约45天、施用所述rAAV前约30天、施用所述rAAV前约14天、施用所述rAAV前约7天，施用所述rAAV前约24小时或约12小时施用所述免疫抑制方案。
在一个特定实施例中，本公开提供了用于治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的组合疗法，其中所述组合疗法包括rAAV和免疫抑制方案，其中所述免疫抑制方案包括：i)在施用所述rAAV之前约24小时口服施用的抗炎类固醇，以及从施用所述rAAV后的第1天至第30天每天至少施用一次的抗炎类固醇，或从施用所述rAAV后的第1天至第60天每天至少施用一次的抗炎类固醇，ii)在施用所述rAAV之前约14天、施用所述rAAV前约7天和施用所述rAAV的约24小时内静脉内施用的抗CD20抗体，以及任选地包括在施用所述rAAV之后施用的抗CD20抗体，iii)在施用所述rAAV之前，每天至少一次口服施用，持续至少三天的免疫抑制大环内酯类，并且任选地包括在施用所述rAAV之后施用的免疫抑制大环内酯类。例如，抗炎类固醇是强的松、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙或地夫可特，抗CD20特异性抗体是利妥昔单抗、奥美珠单抗或奥法木单抗或抗炎类固醇、抗CD20抗体和免疫抑制大环内酯类中的多种，所述免疫抑制大环内酯类是他克莫司、吡美莫司或西罗莫司。在一个示例性实施例中，免疫抑制方案包括抗炎类固醇强的松或泼尼松龙、抗CD20抗体利妥昔单抗和免疫抑制大环内酯类西罗莫司。
在一个特定实施例中，本公开提供了组合疗法的用途，其包括rAAV和免疫抑制方案，用于治疗有需要的人受试者的肢带型肌营养不良症，其中所述rAAV选自由以下组成的组：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；其中所述组合疗法包括rAAV和免疫抑制方案，其中所述免疫抑制方案包括：i)在施用所述rAAV之前约24小时口服施用的抗炎类固醇，以及从施用所述rAAV后的第1天至第30天每天至少施用一次的抗炎类固醇，或从施用所述rAAV后的第1天至第60天每天至少施用一次的抗炎类固醇，ii)在施用所述rAAV之前约14天、施用所述rAAV前约7天和施用所述rAAV的约24小时内静脉内施用的抗CD20抗体，以及任选地包括在施用所述rAAV之后施用的抗CD20抗体，iii)在施用所述rAAV之前，每天至少一次口服施用，持续至少三天的免疫抑制大环内酯类，并且任选地包括在施用所述rAAV之后施用的所述免疫抑制大环内酯类。例如，抗炎类固醇是强的松、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙或地夫可特，抗CD20特异性抗体是利妥昔单抗、奥美珠单抗或奥法木单抗或抗炎类固醇、抗CD20抗体和免疫抑制大环内酯类中的多种，所述免疫抑制大环内酯类是他克莫司、吡美莫司或西罗莫司。在示例性实施例中，免疫抑制方案包括抗炎类固醇强的松或泼尼松龙、抗CD20抗体利妥昔单抗和免疫抑制大环内酯类西罗莫司。
本公开还提供了用于治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的组合疗法，其中所述组合疗法包括一定剂量的rAAV，例如第二剂量，其中在施用第二剂量的重组腺病毒相关(rAAV)之前，对所述受试者的血浆进行至少一次治疗性血浆交换(TPE)，并且其中所述受试者在经历TPE之前被施用第一剂量的rAAV。例如，所述rAAV是rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB或rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。肌营养不良症是DMD、碧加氏肌营养不良症和肢带型肌营养不良症。
另外，本公开提供了组合疗法用于制备用于治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的药物的用途，所述组合疗法包括向所述受试者施用的一定剂量的rAAV，例如“第二剂量的rAAV”，其中在施用第二剂量的重组腺病毒相关(rAAV)之前，对所述受试者的血浆进行至少一次治疗性血浆交换(TPE)，并且其中所述受试者在经历TPE之前被施用第一剂量的rAAV。例如，所述rAAV是rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB或rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。肌营养不良症是DMD、碧加氏肌营养不良症和肢带型肌营养不良症。
在任何公开的组合疗法和用途中，在施用第2剂量或rAAV之前，对受试者的血浆进行至少两次TPE或至少三次TPE。在一些实施例中，在施用第2剂量rAAV之前受试者的血浆经历至少四次TPE，或在施用第2剂量的rAAV之前受试者的血浆经历五次TPE，或在施用第2剂量的rAAV之前受试者的血浆经历六次TPE，或在施用第2剂量的rAAV之前受试者的血浆经历七次TPE。
本公开提供了用于治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的组合疗法，其中所述组合疗法包括向所述受试者施用的rAAV，并且其中在施用rAAV之前所述对所述受试者的血浆进行至少一次治疗性血浆交换(TPE)，并且其中所述rAAV是rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB或rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。肌营养不良症是DMD、碧加氏肌营养不良症和肢带型肌营养不良症。
本公开提供了用于制备用于治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的药物的组合疗法的用途，其中所述组合疗法包括向所述受试者施用的rAAV，并且其中在施用rAAV之前所述对所述受试者的血浆进行至少一次治疗性血浆交换(TPE)，并且其中所述rAAV是rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB或rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。肌营养不良症是DMD、碧加氏肌营养不良症和肢带型肌营养不良症。
在任何公开的组合疗法和用途中，在施用rAAV之前对受试者的血浆进行至少两次TPE、在施用rAAV之前至少三次TPE、在施用rAAV之前至少四次TPE、在施用rAAV之前至少五次TPE、在施用rAAV之前至少六次TPE或在施用之前施用rAAV之前至少七次TPE、在这些公开的组合疗法和用途中，在施用rAAV之前约24小时向受试者施用抗炎类固醇。另外，在一些实施例中，从施用rAAV后的第1天至第60天，向受试者每天至少一次施用抗炎类固醇。例如，抗炎类固醇被调配用于口服施用。另外，所述抗炎类固醇是糖皮质激素，如强的松、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙或地夫可特。
在任何公开的组合疗法和用途中，在施用rAAV之前至少9天、施用之前至少7天、施用之前5天或施用之前2天，对受试者的血浆进行TPE。另外，在施用rAAV之前，在受试者的血浆上进行TPE的疗程之间有约24小时至约48小时。在特定实施例中，在施用rAAV之前，对受试者的血浆进行至少两次TPE，其中所述TPE之间约有48小时。
在本文所描述的任何组合疗法和用途中，受试者在施用rAAV时具有约1:400或更低的抗AAVrh.74抗体水平。例如，受试者在施用rAAV时具有约1:100至约1:400的抗AAVrh.74抗体水平，或约1:100至约1:300的抗AAVrh.74抗体水平，或约1:100至约1:200的抗AAVrh.74抗体水平，或约1:250至约1:500的抗AAVrh.74抗体水平，或约1:200至约1:400的抗AAVrh.74抗体水平，抗体滴度确定为总抗体结合滴度。在用于治疗肌营养不良症的任何公开的组合疗法和用途中，在施用rAAV之前、施用rAAV之后、观察到免疫应答或不良事件之前或观察到免疫应答或不良事件之后，在所述受试者的血清或血浆中确定抗AAVrh.74抗体的存在。另外，在施用免疫抑制方案或TPE的步骤之前确定抗AAVrh.74抗体的存在。例如，在向所述受试者施用任何包括AAV的组合疗法或药物之前，或在向所述受试者施用任何包括AAVrh.74的组合疗法和药物之前，确定抗AAVrh.74抗体的存在。
另外，在所公开的组合疗法和用途中，所述受试者的血清或血浆中抗AAVrh.74抗体的水平用作阳性对照。例如，阳性对照利用抗AAVrh.74单克隆抗体，如本文所描述的任何抗AAVrh.74单克隆抗体。
在任何公开的用途中，使用定量方法确定受试者体内抗AAVrh.74抗体的存在，其中基于所述定量将所述受试者鉴定为抗AAVrh.74抗体的血清阳性，并且其中选择性地向血清阳性受试者施用所述免疫抑制方案或TPE。
本公开提供了以下另外的方面：
权利要求1.一种治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的方法，所述方法包括施用重组腺病毒相关(rAAV)和抗炎类固醇的步骤，其中所述rAAV是血清型AAVrh.74，并且所述rAAV包括以下的表达盒：SEQ ID NO:9。
权利要求2.根据权利要求1所述的方法，其中所述rAAV以1.33×1014vg/kg的剂量施用。使用线性qPCR DNA标准确定1.33×1014的剂量，对应于用于滴定确定的通过超螺旋qPCR DNA标准确定的2×1014。
权利要求3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述受试者患有杜氏肌营养不良症，之前未接受过基于rAAVrh.74的基因疗法，并且已确定为对rAAV.rh74抗体血清阳性。
权利要求4.根据权利要求3所述的方法，其中所述受试者基于ELISA免疫测定被确定为对rAAVrh.74抗体血清阳性，并且其中所述被试者在1:400的血清稀释度下表现出≥2.00的吸光度比。
权利要求5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其进一步包括在向所述受试者施用rAAVrh74之前确定所述受试者的血清或血浆中抗AAVrh.74抗体的存在的步骤。
权利要求6.根据权利要求5所述的方法，其中所述抗AAVrh.74抗体的存在的确定通过ELISA免疫测定来确定，并且其中所述被试者在1:400的血清稀释度下表现出≥2.00的吸光度比。
权利要求7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中口服施用所述抗炎类固醇。
权利要求8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在施用所述rAAV之前约12小时施用所述抗炎类固醇。
权利要求9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在施用所述rAAV之前至少12小时施用所述抗炎类固醇。
权利要求10.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在施用所述rAAV之前至少12小时施用所述抗炎类固醇。
权利要求11.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在施用所述rAAV之前至少24小时施用所述抗炎类固醇。
权利要求12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中从施用所述rAAV后的第1天至约第30天每天至少施用一次所述抗炎类固醇，或从施用所述rAAV后的第1天至第60天每天至少一次。
权利要求13.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中在施用rAAV之后每天至少施用一次所述抗炎类固醇，持续至少30天。
权利要求14.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中在施用rAAV之后每天至少施用一次所述抗炎类固醇，持续至少60天。
权利要求15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述抗炎类固醇是糖皮质激素。
权利要求16.根据权利要求13所述的方法，其中所述糖皮质激素是强的松。
另外，本公开提供了以下另外的方面：
权利要求1.一种治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的方法，其包括以下步骤
a)在施用重组腺病毒相关(rAAV)之前，对所述受试者的血浆进行至少一次治疗性血浆交换(TPE)，
b)施用rAAV，其中所述rAAV是血清型rhAAVrh.74，并且所述rAAV包括以下的表达盒：SEQ ID NO:9
权利要求2.根据权利要求1所述的方法，其中在施用之前对所述受试者的血浆进行至少两次TPE、至少三次TPE，至少四次TPE、至少五次TPE rAAV、至少六次TPE或至少七次TPE。
权利要求3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在施用所述rAAV之前至少9天、施用之前至少7天、施用之前5天或施用之前2天，对所述受试者的血浆进行TPE。
权利要求4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在施用所述rAAV的当天对所述受试者血浆进行TPE。
权利要求5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中对所述受试者的血浆进行至少两次TPE，其中在所述TPE之间有约48小时。
权利要求6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述rAAV以1.33×1014的剂量施用。使用线性qPCR DNA标准确定1.33×1014的剂量对应于用于滴定确定的通过超螺旋qPCR DNA标准确定的2×1014。
权利要求7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述受试者患有杜氏肌营养不良症，并且所述受检者已被确定对rAAVrh.74抗体血清阳性。
权利要求8.根据权利要求7所述的方法，其中在权利要求1b的施用步骤之前向所述受试者至少施用一次AAVrh.74。
权利要求9.根据权利要求7所述的方法，其中所述受试者基于ELISA免疫测定被确定为对rAAVrh7抗体血清阳性，并且其中所述被试者在1:100的血清稀释度下表现出≥2.00的吸光度比。
权利要求10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其进一步包括在施用rAAVrh.74之前确定所述受试者的血清或血浆中抗AAVrh.74抗体的存在的步骤。
权利要求11.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗AAVrh.74抗体的存在的确定通过ELISA免疫测定来确定，并且其中所述被试者在1:100的血清稀释度下表现出≥2.00的吸光度比。
权利要求12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其进一步包括施用抗炎类固醇。
权利要求13.根据权利要求12所述的方法，其中口服施用所述抗炎类固醇。
权利要求14.根据权利要求12或13所述的方法，其中在施用所述rAAV之前约12小时施用所述抗炎类固醇。
权利要求15.根据权利要求12或13所述的方法，其中在施用所述rAAV之前至少12小时施用所述抗炎类固醇。
权利要求16.根据权利要求12或13所述的方法，其中在施用所述rAAV之前至少12小时施用所述抗炎类固醇。
权利要求17.根据权利要求12或13所述的方法，其中在施用所述rAAV之前至少24小时施用所述抗炎类固醇。
权利要求18根据权利要求12至17中任一项所述的方法，其中从施用所述rAAV后的第1天至约第30天每天至少施用一次所述抗炎类固醇，或从施用所述rAAV后的第1天至第30天每天至少一次。
权利要求19.根据权利要求12至17中任一项所述的方法，其中在施用rAAV之后每天至少施用一次所述抗炎类固醇，持续至少30天。
权利要求20.根据权利要求12至17中任一项所述的方法，其中在施用rAAV之后每天至少施用一次所述抗炎类固醇，持续至少60天。
权利要求21.根据权利要求12至17中任一项所述的方法，其中所述抗炎类固醇是糖皮质激素。
权利要求22.根据权利要求21所述的方法，其中所述糖皮质激素是强的松。
提供以下实例是为了说明而不是为了限制。所描述的数值范围包含每个范围内的每个整数值，并且包含最低和最高的所述整数。
实例
实例1
A)AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体的产生
AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白质粒含有人微肌营养不良蛋白cDNA表达盒，其侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)(参见图1)。微肌营养不良蛋白构建体的特征在于框内杆缺失(R4–R23)，而铰链1、2和4和富含半胱氨酸的结构域仍然产生138kDa蛋白质。微肌营养不良蛋白(3579bp)的表达由MHCK7启动子(792bp)引导。通过去除MCK启动子并插入MHCK7启动子，从rAAV.MCK.微肌营养不良蛋白质粒构建质粒。在核心启动子后，存在53bp内源小鼠MCK外显子1(非翻译)用于有效转录起始，接着是SV40晚期16S/19S剪接信号(150bp)和小的5'UTR(61bp)。内含子和5'UTR衍生自质粒pCMVβ(Clontech)。微肌营养不良蛋白盒在ATG即将开始前具有共有Kozak，以及用于mRNA终止的小的53bp合成polyA信号。人微肌营养不良蛋白盒包含如先前Harper等人描述的(R4–R23/Δ71–78)结构域。(Nature Medicine 8,253-261(2002))。将互补DNA对人类使用进行了进行密码子优化并由GenScript(Piscataway,NJ)(Mol Ther 18,109-117(2010))合成。该载体中包含的唯一病毒序列是AAV2的反向末端重复，其是病毒DNA复制和包装所必需的。微肌营养不良蛋白盒具有用于mRNA终止的小的53bp合成polyA信号。
先前的研究已经证实了使用MHCK7启动子的心脏表达(Salva等人,《分子疗法(MolTher)》15,320-329(2007)和AAVrh.74实现骨骼、膈肌和心肌表达(Sondergaard等人,《临床和神经病学年鉴(nnals of clinical and Transl Neurology)》2,256-270(2015))，图1的构建体序列被衣壳化到AAVrh.74病毒体中。AAVrh.74血清型的分子克隆是从恒河猴淋巴结克隆的，并且在以下中进行了讨论：Rodino-Klapac等人,《转化医学杂志(Journal ofTranslational medicine)》5,45(2007)。
表1示出了质粒AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白(SEQ ID NO:3)的分子特征
Figure BDA0004113275930000751
B)从编码卡那霉素(Kan)抗性的质粒中产生AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体
MHCK7.μDys.KAN的克隆是通过从MHCK7.μDys.AMP质粒和卡那霉素主链中分离MHCK7.μDys片段，并且使用NEBuilder克隆工作流程对其进行退火来实现的。MHCK7.μDys片段通过用SnaBI限制性酶消化分离。在1x CutSmart缓冲剂(NEB)和1μL SnaBI中，在37℃下进行50μL总反应持续1小时的消化。使用1％琼脂糖凝胶，在105伏下运行1.5小时，通过电泳分离得到的片段。切下与MHCK7.μDys插入物对应的条带，并且使用凝胶纯化试剂盒(马歇雷-纳格尔公司(Macherey-Nagel))进行纯化。所得片段的DNA浓度为10ng/μL。Kan主链片段通过XbaI限制性酶消化在50μL反应中与1x CutSmart缓冲剂(NEB)和1μLXbaI在37℃下分离1小时。使用1％琼脂糖凝胶，在105伏下运行1.5小时，通过电泳分离得到的片段。切下与Kan主链对应的条带，并且通过凝胶纯化试剂盒(马歇雷-纳格尔公司)进行纯化。所得片段的DNA浓度为8.1ng/μL。使用NEB Builder克隆工作流程对两个片段进行退火，所述工作流程能够将两个片段与重叠序列连接起来。NEBuilder克隆反应按照制造商方案在50℃下进行15分钟，使用1x NEBuilder HiFi DNA组装主混合物中MHCK7.μDys与卡那霉素主链的1:1比例，总反应体积为20μL。通过向细胞中添加2.5μL克隆产物，然后在冰上30分钟，然后在42℃下30秒，再在冰上另外5分钟，将得到的克隆转化为
Figure BDA0004113275930000761
稳定的大肠杆菌(E.coli)(C3040)。转化后，将950μL的生长培养基添加到细胞中，并且在30℃下生长1.5小时，在225rpm下振荡。生长后，将450μL的这些细胞铺板在50μg/mL卡那霉素LB琼脂平板上，并且在30℃的干燥温育箱中温育过夜。从此平板中取出菌落，并在含有50μg/mL卡那霉素的LB中生长过夜。使用/>
Figure BDA0004113275930000762
Spin Miniprep试剂盒(凯杰公司(Qiagen))从3mL此培养物中分离DNA。此DNA用于证实克隆产物。克隆产物通过用PmeI、MscI和SmaI进行限制性酶消化，然后进行凝胶电泳来证实。通过测序另外证实了克隆产物。所得质粒在SEQ ID NO:8中阐述，并且在图8和图9中示出。图7的构建体序列(对应于以下的构建体序列：SEQ ID NO:9和以下的核苷酸1至4977：SEQ ID NO:8)被衣壳化到AAVrh.74病毒体中，如上文所描述的。
C)pAAV.MCK.微肌营养不良蛋白构建体的产生
通过将驱动密码子优化的人微肌营养不良蛋白cDNA序列的MCK表达盒插入AAV克隆载体psub201中构建pAAV.MCK.微肌营养不良蛋白质粒(Samulski等人,J.Virol.61(10):3096-3101)。肌肉特异性调节元件包含在构建体中以驱动肌肉特异性基因表达。该调节元件包括与351bp MCK核心启动子(近端)融合的小鼠MCK核心增强子(206bp)。在核心启动子后，构建体包括53bp内源小鼠MCK外显子1(非翻译)用于有效转录起始，接着是SV40晚期16S/19S剪接信号(97bp)和小的5'UTR(61bp)。内含子和5'UTR衍生自质粒pCMVβ(Clontech)。微肌营养不良蛋白盒在ATG即将开始前具有共有Kozak，以及用于mRNA终止的小的53bp合成polyA信号。人微肌营养不良蛋白盒包含如先前Harper等人Nat.Med8(3):253-61,2002描述的(R4-R23/Δ71-78)结构域。
pAAV.MCK.微肌营养不良蛋白质粒含有人微肌营养不良蛋白cDNA表达盒，其侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)(参见图5)。将该序列衣壳化到AAVrh.74病毒粒子中。AAVrh.74血清型的分子克隆是从恒河猴淋巴结克隆的，并且在以下中进行了描述：Rodino-Klapac等人,《转化医学杂志(Journal of Tran.Med.)》45(2007)。
D)载体产生
本文所描述的研究的载体是在研究级条件下利用HEK293细胞的三重转染方法制备的。生产后载体的表征包含用超螺旋标准品通过qPCR确定滴度、内毒素水平确定(EU/mL)和无菌评估。通过SDS-PAGE分析产生的载体，以验证条带模式与预期rAAV的一致性。这些研究中使用的替代载体rAAVrh74.MCHK7.uDYS.FLAG如上所述，添加了C末端FLAG标签。
实例2
非人类灵长类动物研究中具有免疫抑制的rAAVrh74.MCHK7.微肌营养不良蛋白的系统性基因递送
此研究的主要目标是确定最佳剂量、持续时间和免疫抑制方案，并且优化血管内递送rAAV.rh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白后的基因表达。此研究使用5个恒河猴队列(每组n＝3)开始，在载体施用前后免疫抑制持续时间不同(表1)。恒河猴在本文中被称为“非人灵长类动物”或NHP。
非人灵长类动物转基因递送优化研究
Figure BDA0004113275930000771
Figure BDA0004113275930000781
++利妥昔单抗：注射前10天至14天两次，注射当天一次。西罗莫司：注射前3天到活检。泼尼松龙：注射前1天到注射后30天。IF：免疫荧光；H&E：苏木精和苦辛染色；路径：正式组织病理学
在队列1中，对照恒河猴在不添加免疫抑制的情况下，以2×1014vg/kg的剂量在头静脉或隐静脉中血管内给药rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白(n＝2)。在所有其它队列中，恒河猴还接受了血管内注射rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白，剂量为2×1014vg/kg，递送到头静脉或隐静脉中，同时进行免疫抑制。
在队列2中，在全身基因转移前1天至基因转移后30天口服给予强的松(2毫克/千克/天)(n＝3)。在队列3中，在全身基因转移前1天至基因转移后60天口服给予强的松(2毫克/千克/天)(n＝3)。在队列4中，在全身基因转移前14天至基因转移后60天口服给予强的松(2毫克/千克/天)(n＝3)。
队列5(n＝3)研究了三重免疫抑制方案。在此队列中，通过血管内输注将利妥昔单抗(750mg/m2)给药两个剂量疗程，分别在载体施用前14天和7天，并且在基因转移前载体施用当天进行第三次给药。如果抗体对前三剂无反应，则可在输注后第四次施用利妥昔单抗。在载体施用前3天口服给药西罗莫司(4毫克/平方米/天)，并且持续给药直到抗体减少。在载体施用前1天到载体施用后30天口服给药强的松(2毫克/千克/天)。
治疗后，所有队列均接受了从胫骨前肌(TA)和/或腓肠肌(gn)获得的针活检。在基因转移前收集活检，并且在基因转移后6周、8周和12周收集三次。至少每两周抽取一次血液用于免疫学、CBC和化学。
对血样进行以下血液学测量：红细胞(红细胞)计数、血红蛋白、红细胞比容、平均红细胞体积、平均红血球血红蛋白、平均红细胞血红蛋白、浓度、红细胞分布宽度、绝对网织红细胞计数、血小板计数、白细胞计数、绝对嗜碱性粒细胞计数、绝对大未染色细胞计数和血液涂片。
对血样进行以下临床化学测量：葡萄糖、尿素氮、总蛋白、白蛋白、球蛋白、白蛋白:球蛋白比、总胆红素、丙氨酸氨基转移酶、谷氨酸脱氢酶、胆固醇、γ谷氨酰转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和碱性磷酸酶。
安全特性和转换效率
对AAVrh.74的总抗体应答(抗AAVrh.74抗体)在队列中相似，没有异常观察的证据，除了来自队列2的一个NHP(NHP_03)没有对AAVrh.74产生抗体应答。另外，来自队列5的NHP(尽管使用三重免疫抑制方案治疗)显示出与在队列1至4的NHP中观察到的AAVrh.74相似的抗体应答。来自队列1至4的NHP的不良反应包含短暂升高的丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)肝酶。来自队列1的两个NHP(NHP_12、NHP_13)、来自队列3的一个NHP(NHP_06)和来自队列4的一个(NHP_07)在基因转移后12周显示ALT和AST肝酶升高。关于转导效率，在基因转移后12周，NHP队列1至5之间的载体基因组拷贝(vg拷贝/μg DNA)没有观察到统计学显著差异(P>0.05)。
实例3
施用治疗性血浆交换(TPE)
此研究的主要目标是在使用治疗性血浆交换(TPE)重新给药rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白后，优化技术和基因表达两者，以去除预先存在的AAV抗体，并且在不使用TPE的情况下评估重新给药。
在实例2所描述的研究中先前注射rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白的非人灵长类动物(来自队列2、3和4)在一次单采血液成分术程序中经历了2次至3次TPE。在TPE前四周和两周，灵长类动物接受了最大限度的抽血(占灵长类动物体重的10％)。血液在ACDA溶液中保存最多30天，并且在TPE当天用于启动单采血液成分术机器，以防止程序期间过度失血。另外，确定AAVrh.74结合抗体滴度，以验证滴度是否大于1:400，这是当前临床试验中纳入标准的阈值。TPE后，通过隐静脉或头静脉系统递送2×1014vg/kg rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白或rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白.FLAG。
这些NHP也在TPE前1天和TPE和基因转移后30天每天接受一次强的松(2mg/kg)。化学、CBC、ELISA和ELISpot测定的抽血在TPE前、TPE后重新给药前，并且至少每两周抽血一次，直到终点。终点在第二次基因转移后8周与12周之间，并且包含完全尸检。为了评估功效，对载体基因组进行了蛋白质印迹和qPCR以及FLAG免疫荧光。
另外，在实例2(队列5)中所述的免疫抑制方案中之前注射的非人灵长类动物在不使用TPE的情况下用rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白重新注射，以降低预先存在的针对AAVrh.74的抗体。具体而言，在基因转移前7天和14天、注射当天和基因转移后静脉内递送(IV)利妥昔单抗(750毫克/平方米/天)，在基因转移前3天递送西罗莫司(4毫克/平方米/天)，直到研究结束。通过收集3ng/mL至14ng/mL的血液监测西罗莫司水平。化学、CBC、西罗莫司血液水平、ELISA和ELISpot测定的抽血至少每两周一次，直到终点。终点在第二次基因转移后8周与12周之间，并且包含完全尸检。每天对每只动物进行观察。每两周监测NHP体重，并且相应调整免疫抑制药物的剂量。
治疗性血浆交换程序：
在TPE过程中，通过血管通路去除全血，然后通过单采血液成分术机器内的离心机旋转，在那里去除血浆(抗体)。红细胞与替换液(人白蛋白)一起递送回用于灵长类动物的维持液。由于非人灵长类动物的体型较小(小于10kg)，在用保存的血液进行血浆交换之前启动单采血液成分术机器，以确保安全并减少从灵长类动物中抽取的血液量。在单采血液成分术前28和14天，进行最大限度的血液收集(10％的非人灵长类动物循环血液)。保存收集的全血并在4℃的抗凝剂酸柠檬酸葡萄糖(ACDA)溶液中储存不超过30天。另外，NHP还提供了额外的富铁补充和富集。单采血液成分术当天，非人类灵长类动物肌肉注射噻唑(3mg/kg至6mg/kg)镇静，插管，并且固定在加热的手术台上。在浓度为1％至4％的氧气中的异氟烷中实现麻醉维持。在两条腿(隐静脉)放置血管导管，其中一个入口用于抽取全血，另一个入口位于另一条腿，用于重新递送红细胞和替换液。在整个程序中，在手臂(头静脉)放置另外的导管以支持流体和血液抽取。在获得血管通路后，给动物注射肝素(50U/kg至100U/kg)，以维持足够的血液流动并防止单采血液成分术期间的凝血。使用温度、ECG和呼吸监测NHP，以确定合适的麻醉平面。
如上所述，NHP通过导管连接到COBE Spectra单采血液成分术机器，并且用预先收集的血液灌注机器。一次总血浆交换相当于一次移除和更换的循环血液总量。进行两到三次血浆交换以实现98％的估计抗体去除。每次完成交换后收集血液进行血液化学分析和血清抗体测试。血浆交换后，立即将NHP与单采血液成分术单元断开连接，并且全身重新给药rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。载体递送后，去除所有导管，提供压力以控制出血。对动物进行监测，直到完全可以行走。
尸检分析
对于尸检，在终点(可能发生在重新给药后8周至12周之间)给NHP注射Euthasol(1mL/101b)。收集血液并将全血送去进行全血计数(CBC)分析、西罗莫司测试水平和血清化学。然后收集组织并由独立的兽医组织病理学家进行分析，并且分析基因和蛋白质表达，以评估功效和毒性。
为了评估基因表达优化，收集NHP静脉内给药和重新给药2×1014vg/kgrAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白或rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白.FLAG的前后肌肉活检。提取肌肉组织前和所有肌肉组织后的DNA进行实时定量qPCR，以检测载体DNA的特异性序列。从收集的所有肌肉中提取蛋白质，并且进行蛋白质印迹，以检测与活检前组织相比的微肌营养不良蛋白(138kD)。另外，原始全长肌营养不良蛋白(427kD)被用作正常对照，并且与微肌营养不良蛋白定量比较，作为基因表达的结果量度。对输注rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白.FLAG的灵长类动物进行免疫荧光染色，以观察FLAG表达的存在。
为了评估免疫抑制方案、载体施用和重新给药的安全性，在基线处和每两周抽血一次，直到终点。在整个研究的两个目标中，每两周监测一次血清化学、CBC和西罗莫司水平。ELISpot分析用于评估T细胞对AAVrh.74肽和微肌营养不良蛋白肽的应答。最后，在整个研究的两个目标中，每两周监测一次抗AAVrh.74抗体应答。
对血样进行以下血液学测量：红细胞(红细胞)计数、血红蛋白、红细胞比容、平均红细胞体积、平均红血球血红蛋白、平均红细胞血红蛋白、浓度、红细胞分布宽度、绝对网织红细胞计数、血小板计数、白细胞计数、绝对嗜碱性粒细胞计数、绝对大未染色细胞计数和血液涂片。
对血样进行以下临床化学测量：葡萄糖、尿素氮、总蛋白、白蛋白、球蛋白、白蛋白:球蛋白比、总胆红素、丙氨酸氨基转移酶、谷氨酸脱氢酶、胆固醇、γ谷氨酰转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和碱性磷酸酶。
结果
在TPE之前和TPE之后(在用rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白重新给药之前)，NHP中针对AAVrh.74的总抗体滴度在下表中提供。图11提供了用rAAVrh74.MHCK7微肌营养不良蛋白重新给药后NHP中AAV74抗体滴度。由于缺乏可用的供体血液，可以在NHP中进行的TPC循环数量有限。在人中，可以施用多轮TPE。在初始基因转移后12周获得(*)实例2中检测到的滴度。在重新给药注射rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白之前，获得实例3中检测到的滴度(+)。由于缺乏对AAVrh.74的抗体应答，在没有预先TPE的情况下重新给药NHP_03。NHP_06由于体积小和血管通路差，仅进行了0.5个循环的TPE。
NHP(队列) 基因疗法后的滴度(实例2)* TPE后的滴定度(实例3)+ TPE循环数量
NHP_01(2) 1:51200 1:800 2.5
NHP_02(2) 1:6400 1:400 3
NHP_03(2) 1:50 NA NA
NHP_04(3) 1:12800 1:800 3
NHP_05(3) 1:25600 1:400 3
NHP_06(3) 1:25600 NA 0.5
NHP_07(4) 1:12800 1:1600 3
NHP_08(4) 1:12800 1:200 3
NHP_09(4) 1:12800 1:200 3
TPE程序通常耐受性良好。如通过针对AAVrh.74和来自外周血单核细胞的微肌营养不良蛋白肽的IFN-γ斑点形成细胞(SCF)水平评估的，无异常免疫生物学观察。TPE后重新给药导致以下NHP中肝酶水平(ALT/AST)升高：NHP_01和NHP_02，队列2；NHP_04，队列3；NHP_08和NHP_09，队列4)。每天持续施用强的松可解决此问题。
由于与之前的利妥昔单抗治疗不相容，来自队列5的NHP未接受TPE，并且重新给药了两种NHP(NHP_10、NHP_11)。在重新给药之前，队列5对AAVrh.74的总抗体滴度高于1:51,200。以高抗体滴度重新施用的NHP(队列5)经历了以下不良事件：心率和通气率增加、呕吐、递送部位附近皮疹、苍白和浅呼吸；在施用苯海拉明(diphenhydramine)和地塞米松后解决。
七个NHP经历了2个至3个连续的TPE循环，导致针对AAVrh.74的循环抗体水平降低。TPE后立即用rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白对NHP成功地重新给药。在来自队列4的两个NHP(NHP_08和NHP_09)中，抗体滴度达到1:200。
如图12所示，与第12周活检的TPE前表达相比，在TPE后重新给药rAAVrh74.MHCK7.的所有NHP的组织样品中观察到微肌营养不良蛋白的表达增加(如实例2所描述的)。在骨骼肌(例如腓肠肌)、心脏和膈肌中观察到微肌营养不良蛋白表达增加。
实例4
上述实例2和3中所描述的试验和研究可替代地利用一下中所示的rAAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体执行：SEQ ID NO:9；如一下中所示的：SEQ IDNO:8，核苷酸1至4977；或如以下中所示的：SEQ ID NO:6；核苷酸56至5022。
实例5
治疗性血浆交换(TPE)后用预先存在的AAVrh.74抗体对DMD进行基因疗法
在人中进行了一项1期临床试验，以研究治疗性血浆交换(TPE)后对预先存在AAVrh.74抗体的DMD患者的基因疗法。假设TPE的五个循环将降低AAVrh.74的结合抗体(本文也称为“抗AAVrh-74抗体”)，允许使用AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白安全有效地转导肌肉，以实现与基线相比>50％的平均表达水平。
研究目标和主要结果是携带微肌营养不良蛋白基因(AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白)的rAAV的安全递送。次要目标是患有DMD的受试者肌肉中微肌营养不良蛋白基因表达，并且使用针对肌营养不良症的北极星移动评价量表(NSAA)作为功能性结果量度评价临床改善。
治疗计划为两步(周)方案，将安全性和功效(表1)结合起来，首先在10天内通过单采血液成分术减少AAVrh.74抗体，然后静脉递送AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。在第1周，TPE每隔一天施用3天，如星期一(相对于基因疗法的输注日，第-9天)、星期三(第-7天)和星期五(第-5天)。在第2周，每隔一天施用TPE两天，然后静脉内输注AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白，如星期一(第-2天)、星期三(第1天)，并且在TPE后的同一天递送AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白(第1天)。根据表1中的时间表，患者被带到门诊单采血液成分术单元。患者于第1天进入儿科重症监护病房(PICU)接受住院基因疗法输注，计划于第2天出院。
表1.单采血液成分术时间表
Figure BDA0004113275930000831
Figure BDA0004113275930000841
*程序前的实验室包含纤维蛋白原和CBC以及差异和血小板；程序期间定期测量电离钙
**AAVrh.74抗体水平<1:100，以允许基因递送
***基因递送
****备用时间表
此方案是基于IgG抗体的动力学制定的，表明48小时后出现反弹，恢复了前一程序中去除的约50％至60％的抗体；因此，每隔一天在10天的疗程中支持TPE，然后在TPE的最后一天(与基因疗法相关的第1天)进行基因递送(图13和参见交换体积)。对于其它已知的抗体介导的医学病状，这些程序的时间遵循类似的过程(Padmanabhan等人,《临床单采血液成分术杂志(J Clin Aphereis)》34:171-354,2019)。
由于此方案是针对新的适应症而制定的，因此应遵循先前制定的指南，所述指南反复推荐5次至6次(Padmanabhan等人,《临床单采血液成分术杂志》34:171-354,2019)到5次至7次治疗(Pham等人,《输血与单采血液成分术科学(Transfusion and AphereissScience)》58:237-246,2019)。适用于此方案中服用强的松进行免疫抑制的受试者的另外的支持表明：“如果由于同时进行免疫抑制疗法，假设免疫球蛋白的产生率可以忽略不计，并且血管外到血管内的平衡率约为每小时1％到2％，那么需要在7天到10天内进行五次单独的程序，以消除90％的初始体内免疫球蛋白负荷”。如果产生新的抗体，可能需要另外的治疗。(Fridey和Kaplan,治疗性单采血液成分术(血浆交换或细胞单采)：适应症和技术(Therapeutic apheresis(plasma exchange or cytapheresis):Indications andtechnology.)《美国单采血液成分术协会指南(American Society for ApheresisGuidelines)》最新更新2020年5月(在线提供)(Kaplan等人,《临床单采血液成分术杂志》28:3-10,2013)
方案
此方案的患者特征：
纳入标准
●门诊男性受试者，任何种族，筛查年龄4岁至10岁(包含)
●确认DMD移码或过早终止密码子基因突变
●CK>1000U/L
●该年龄的100m步行测试中预测低于95％，表明有症状疾病
●能够配合运动评估测试
●基于跑步、跳跃和爬楼梯的困难史证明的弱点
●筛查前至少12周口服皮质类固醇的稳定剂量当量，预计在整个研究过程中剂量保持恒定(除了适应体重变化的潜在修改)。
●基线筛查时(第-40至第-10天)，通过ELISA免疫测定，AAVrh.74抗体滴度>1:400的患者
排除标准
●心肌病症状，包含LVEF<40％的ECHO
●人类免疫缺陷病毒(HIV)感染或乙型肝炎或丙型肝炎感染的血清学证据
●自身免疫性疾病的诊断(或正在进行的治疗)
●被认为具有临床意义的异常实验室值(γ-谷氨酰转移酶>3×正常上限，胆红素≥3mg/dL，肌酐≥1.8mg/dL，血红蛋白<8或>18g/dL，白细胞计数>18,500/cmm、血小板≤50,000/微升。
●PI认为，伴随疾病或需要慢性药物治疗会带来不必要的基因转移风险。
●4周内前发生严重感染(如肺炎、肾盂肾炎或脑膜炎)。
●在筛查后的6个月内，接受过任何试验药物(皮质类固醇除外)或外显子跳跃药物(包含EXONDYS
Figure BDA0004113275930000851
)，无论是实验药物还是其它药物。
●接受过任何类型的基因疗法、基于细胞的疗法(例如，干细胞移植)或CRISPR/Cas9疗法。
●家属不希望将患者的研究参与情况透露给初级保健医生和其它医疗提供者。
筛查/基线期
筛查/基线期为第-9天之前的至多4周。获得知情同意后，评估患者的资格。筛查包含收集人口统计和病史、生命体征测量、体检、心电图(ECG)、超声心动图(ECHO)和心脏MRI。收集血样和尿样用于临床和安全实验室评估。还收集血样以检测乙型肝炎和丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、针对AAVrh.74的抗体和针对AAVrh.74衣壳和微肌营养不良蛋白的抗原特异性T细胞。预处理肌肉活检涉及腓肠肌，或主要研究者(PI)选择的肌肉，并且在合格后但在第-9天之前进行。要求家长/护理者填写PROMIS调查问卷。身体功能评估包含针对肌营养不良症的北极星移动评价量表(NSAD)，以及定时功能测试，包含从地板上起身、上升4标准步、10米和100米步行/跑步测试。
治疗性血浆交换
TPE涉及去除患者血浆并用5％白蛋白替代。如果患者安全需要，新鲜冷冻血浆(FFP)可以用于任何TPE程序。根据美国食品和药物管理局(US Food and DrugAdministration，FDA)的规定，血浆交换期间取出的血浆不得用于输血给另一个体。
方案
如果可能，通过外周静脉进行TPE。更有可能的是，患者将有由介入放射科医生插入的隧道中心线。家长会被指导如何在预约之间护理导管。
交换体积–
每个程序进行1.0至1.5血浆体积交换的血浆交换。单次血浆交换可降低血浆大分子水平63％(《临床单采血液成分术杂志》2019；34:171-354)。分布在血管内和血管外隔室的IgG抗体需要多次交换以减少全身储存，通常每隔一天进行一次，以允许在两个隔室之间重新分布。第一次1.0至1.5血浆体积的交换去除了最高体积的靶标物质，随着每次后续交换去除的量逐渐减少。对于每个单个血浆体积交换，使用相同体积的替换液。对于此方案，5％白蛋白用作替换液。
建议采用免疫抑制方案以获得持续应答。如果没有免疫抑制，交换后可能会反弹，但所有参与此项目的DMD男孩都将使用糖皮质激素作为疾病的标准治疗。在血浆交换的实验方案期间，患者在TPE前一天服用糖皮质激素(强的松1mg/kg，或等效的皮质类固醇)。除非PI判断提前减量符合患者的最佳利益，否则患者将在基因转移后至少60天内维持此剂量。(表1)。
为了患者的进一步利益，提供了替代计划(称为“备用时间表”)，所述时间表可能会延迟基因递送，并提供#7TPE以允许基因疗法继续进行。如果单采血液成分术#4后第-1天未达到靶标AAVrh.74滴度，将进行TPE#5，但不继续进行基因递送。在第2天(星期四)获得AAV抗体水平，然后在星期五进行单采血液成分术、TPE#6和基因递送。然而，如果星期四(第2天)滴度未达到1:100的靶标，将不会在星期五进行TPE或基因递送。
基因递送
这是一项为期52周的开放标签临床试验。六名至十二名符合资格要求的患者入选并接受IV AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。在第-1天，作为门诊患者，进行体检，收集生命体征、血样和尿样。在第1天，患者入院。第五次也是最后一次TPE在上午进行，当天晚些时候根据IRB和FDA批准的先前方案使用的研究操作手册，在1小时至2小时内IV施用AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。输注后的那天(第2天)，患者接受体检，收集生命体征，并且在出院前提供血样和尿样。
患者随访452周，然后进行为期5年的长期随访研究。患者在基因递送后完成临床随访：第1周、第2周、第4周、第6周、第8周、第10周、第12周、第24周、第36周和第48周(相对于第1天的输注)。另外，在第3周和第5周，患者完成随访以评估肝功能测试。所有患者在第12周进行肌肉活检。活检涉及腓肠肌，或PI选择的肌肉。
通过监测治疗紧急不良事件(TEAE)、SAE和选择的实验室评估来评估安全性。
实例6
血清中抗体的夹心ELISA确定
夹心ELISA测定的材料如下：
●捕获抗体＝抗AAVrh.74mAb
●测试样品＝血清或血浆，将用于检测
●抗原＝AAVrh.74衣壳
●封闭溶液＝5％干牛奶、1％山羊血清、100mL PBS
●洗涤缓冲剂＝0.05％ PBS吐温
●阳性对照＝已知具有抗AAVrh.74抗体的血清
●次级抗体＝抗人HRP缀合抗体
●底物＝TMB
●停止溶液＝硫酸
方法
将96孔板的所有孔用在4C的碳酸盐缓冲剂中稀释的捕获抗体涂覆过夜。将内容物丢弃，并且用封闭溶液在37℃下封闭板1小时。丢弃封闭溶液以将AAVrh.74衣壳一式两份添加到捕获抗体涂覆的孔中。另外，将碳酸盐缓冲剂添加到重复孔中以确定背景值。丢弃未结合的衣壳，以1:25的起始稀释度在封闭溶液中添加测试血清并连续稀释。阳性对照用1:400稀释度的封闭溶液稀释。用洗涤缓冲剂洗涤板，然后在封闭溶液中以1:10,000的稀释度进行二次温育。洗涤板并丢弃缓冲剂，添加底物，然后用硫酸结束测定。在450nm处读取板吸光度。
分析和结果
通过从抗原涂覆的孔的平均OD减去非抗原涂覆的孔的平均光学密度(OD)并除以非抗原涂覆的孔的平均(OD)来确定吸收率。≥2.00的比率被认为是阳性抗体应答。通过确定最后一次血清稀释度确定终点滴度，其比率≥2.00。血清稀释度>1:400时定义抗体截止值。
实例7
间接ELISA：血清中抗AAVrh.74抗体的确定
材料
●抗原＝AAVrh.74衣壳
●封闭溶液＝5％干牛奶、1％山羊血清、100mL PBS不含钙和镁
●洗涤缓冲剂＝0.05％ PBS吐温
●一级抗体＝人测试血清或血浆
●阳性对照＝抗AAVrh74 mAb或任选地含有抗rh74抗体的血清(或血浆)
●阴性对照：无抗AAVrh74抗体的受试者血清可以包含为阴性对照
●次级抗体＝抗人抗体
●底物＝3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)
●停止溶液＝硫酸
方法
在96孔板内重复孔，用浓度为2×109vg/孔的抗原在碳酸盐缓冲剂中稀释过夜。另外，将碳酸盐缓冲剂添加到重复孔中以确定背景。丢弃抗原，并且用封闭溶液封闭孔。丢弃封闭溶液，以1:25的起始稀释度在封闭溶液中添加一级抗体(测试血清)并连续稀释。如果使用血清，阳性对照在1:400稀释度的封闭溶液中稀释，或者例如，如果使用AAVrh.74mAb，则在1:1,000至1:10,000稀释度下稀释。可以认识到，抗AAVrh.74mAb的特定稀释度可以任选地利用含有抗AAVrh.74抗体的血清或血浆作为参考来确定。用洗涤缓冲剂洗涤板，然后在封闭溶液中以1:10,000的稀释度进行二次温育。洗涤板并丢弃缓冲剂，添加底物，然后用硫酸结束测定。在450nm处读取板吸光度。
分析和结果
通过从抗原涂覆的孔的平均OD减去非抗原涂覆的孔的平均光学密度(OD)并除以非抗原涂覆的孔的平均(OD)来确定吸收率。≥2.00的比率被认为是阳性抗体应答，具有此类阳性应答的血浆或血清样品被认为是血清阳性。通过确定最后一次血清稀释度确定终点滴度，其比率≥2.00。血清稀释度>1:400时定义抗体滴度截止值。换言之，在1:400的血清稀释度下，比率≥2.00的受试者将被视为血清阳性，并且被排除在接受基于rAAVrh.74的基因疗法之外。
实例8
scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB构造
构建了含有密码子优化的全长人SCGB cDNA的转基因盒，如图10所示。所述盒包含共有Kozak序列(CCACC)、SV40嵌合内含子、合成的聚腺苷酸化位点，以及用于驱动盒表达的肌肉特异性MHCK7。这是基于MCK的启动子，其利用了206-bp的增强子，所述增强子取自内源性肌肉肌酸激酶基因内转录起始位点的约1.2kb 5'，具有近端启动子(enh358MCK，584-bp)。将所述盒包装到与AAV8具有93％同源性的自互补(sc)AAVrh.74载体中。AAVrh.74在小鼠和非人灵长类动物中被证明是安全有效的，特别是在通过循环递送到肌肉时，可以越过血管屏障。
参考文献
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Figure BDA0004113275930000931
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Figure BDA0004113275930001101
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Figure BDA0004113275930001201
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Figure BDA0004113275930001211
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Figure BDA0004113275930001221
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<110> 全国儿童医院研究所（RESEARCH INSTITUTE AT NATIONWIDE CHILDREN'SHOSPITAL）
萨雷塔治疗公司（SAREPTA THERAPEUTICS, INC.）
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<150> US 63/083,953
<151> 2020-09-27
<150> US 63/160,376
<151> 2021-03-12
<150> US 63/188,266
<151> 2021-05-13
<160> 46
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 3579
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
atgctgtggt gggaggaggt ggaggattgt tatgaaaggg aggacgtgca gaagaagact 60
tttaccaagt gggtgaacgc tcagttcagc aaatttggga agcagcacat cgagaatctg 120
ttttccgacc tgcaggatgg gagacggctg ctggatctgc tggaaggact gactggccag 180
aagctgccca aagagaaggg gagcactagg gtgcacgccc tgaacaacgt gaacaaagct 240
ctgagagtgc tgcagaacaa caacgtggat ctggtgaata ttggcagtac tgatatcgtg 300
gacgggaacc acaaactgac actgggcctg atctggaaca ttattctgca ctggcaggtg 360
aaaaatgtga tgaagaacat catggccggg ctgcagcaga ccaattccga gaagatcctg 420
ctgtcttggg tgcggcagag cacccgcaac tatccccagg tgaacgtgat taacttcact 480
acatcctgga gcgacgggct ggccctgaat gctctgattc acagccacag gcctgatctg 540
ttcgactgga atagcgtggt gtgccagcag tctgccacac agcgcctgga acatgccttc 600
aatatcgctc ggtaccagct ggggatcgaa aaactgctgg acccagagga tgtggacact 660
acatacccag ataaaaagtc tattctgatg tacattacta gcctgttcca ggtgctgcca 720
cagcaggtgt ctattgaagc cattcaggag gtggaaatgc tgccccgccc ccccaaagtg 780
actaaagagg agcattttca gctgcatcat cagatgcatt acagccagca gattaccgtg 840
agcctggctc agggatatga gcgcaccagt agtccaaaac cacggttcaa gtcctacgct 900
tatacccagg ctgcctacgt gacaactagc gaccctacta gatccccctt tccatcccag 960
cacctggagg ccccagagga caagagcttt gggtccagcc tgatggaaag cgaggtgaat 1020
ctggatcggt accagacagc cctggaggag gtgctgagct ggctgctgag tgctgaagac 1080
acactgcagg cccagggcga aatttccaat gacgtggaag tggtgaagga tcagttccac 1140
acacacgagg gctatatgat ggacctgaca gctcaccagg ggcgcgtggg caatatcctg 1200
cagctgggct ctaaactgat cggcaccggg aaactgagtg aggacgagga aacagaagtg 1260
caggagcaga tgaacctgct gaacagccgc tgggagtgtc tgagagtggc tagtatggag 1320
aagcagtcca acctgcaccg ggtgctgatg gacctgcaga accagaaact gaaagagctg 1380
aacgactggc tgacaaagac tgaggaacgc acaaggaaga tggaggagga gccactggga 1440
cccgacctgg aggatctgaa gagacaggtg cagcagcata aggtgctgca ggaggatctg 1500
gaacaggagc aggtgcgggt gaactccctg acacatatgg tggtggtggt ggacgaatct 1560
agtggagatc acgccaccgc cgccctggag gaacagctga aggtgctggg ggaccggtgg 1620
gccaacattt gccggtggac cgaggacagg tgggtgctgc tgcaggacat cctgctgaaa 1680
tggcagaggc tgaccgagga gcagtgtctg tttagtgctt ggctgagcga gaaagaggac 1740
gccgtgaaca agatccacac aaccggcttt aaggatcaga acgaaatgct gtctagcctg 1800
cagaaactgg ctgtgctgaa ggccgatctg gagaaaaaga agcagagcat gggcaaactg 1860
tatagcctga aacaggacct gctgagcacc ctgaagaaca agagcgtgac ccagaagaca 1920
gaagcctggc tggataactt tgcccgctgc tgggacaacc tggtgcagaa actggagaaa 1980
agtacagctc agatctctca ggctgtgacc acaacccagc ctagcctgac ccagacaacc 2040
gtgatggaaa ccgtgaccac cgtgacaacc cgcgaacaga tcctggtgaa acatgcccag 2100
gaagagctgc cacctccacc tccccagaag aagagaaccc tggagcggct gcaggagctg 2160
caggaagcca ctgacgaact ggacctgaag ctgaggcagg ccgaagtgat taaggggtct 2220
tggcagcctg tgggcgatct gctgattgat tccctgcagg accacctgga aaaggtgaag 2280
gctctgagag gcgaaattgc tccactgaag gagaacgtga gtcatgtgaa cgatctggct 2340
agacagctga caacactggg catccagctg agcccataca atctgagcac actggaggac 2400
ctgaatacca ggtggaagct gctgcaggtg gctgtggaag accgggtgcg gcagctgcat 2460
gaggcccatc gcgacttcgg accagccagc cagcactttc tgagcacatc cgtgcagggg 2520
ccctgggaga gggccatttc tcccaacaag gtgccctact atattaatca cgagacccag 2580
accacttgtt gggaccatcc caagatgaca gaactgtacc agtccctggc cgatctgaac 2640
aacgtgaggt ttagcgctta cagaaccgct atgaagctga gacggctgca gaaggccctg 2700
tgcctggatc tgctgtccct gtccgccgcc tgcgatgccc tggatcagca taatctgaag 2760
cagaacgatc agccaatgga tatcctgcag atcatcaact gcctgaccac tatctacgac 2820
aggctggagc aggagcacaa caacctggtg aacgtgcctc tgtgcgtgga tatgtgcctg 2880
aactggctgc tgaacgtgta tgacactggg cgcaccggcc ggatcagagt gctgagtttt 2940
aaaactggga ttatctccct gtgtaaggcc cacctggagg acaagtacag gtacctgttc 3000
aagcaggtgg ctagtagcac tggattttgt gaccagcgcc gcctgggact gctgctgcat 3060
gatagtatcc agattcctag acagctggga gaggtggcta gtttcggagg atctaacatc 3120
gaacccagcg tgcgcagctg tttccagttt gccaataaca aacctgaaat cgaggctgct 3180
ctgttcctgg attggatgcg cctggaacca cagagcatgg tgtggctgcc tgtgctgcac 3240
agagtggctg ccgccgaaac tgccaagcac caggctaaat gcaacatctg caaggaatgt 3300
cccattatcg gctttcgcta caggagtctg aaacatttta actacgatat ttgccagagc 3360
tgcttctttt ccggaagagt ggccaaagga cacaagatgc actaccctat ggtggaatat 3420
tgcaccccaa ctacatctgg cgaagatgtg cgcgattttg ccaaggtgct gaagaataag 3480
tttcggacta agaggtactt cgccaagcac ccccgcatgg ggtatctgcc agtgcagaca 3540
gtgctggaag gagacaatat ggagaccgat acaatgtga 3579
<210> 2
<211> 810
<212> DNA
<213> 腺相关病毒
<400> 2
gtttaaacaa gcttgcatgt ctaagctaga cccttcagat taaaaataac tgaggtaagg 60
gcctgggtag gggaggtggt gtgagacgct cctgtctctc ctctatctgc ccatcggccc 120
tttggggagg aggaatgtgc ccaaggacta aaaaaaggcc atggagccag aggggcgagg 180
gcaacagacc tttcatgggc aaaccttggg gccctgctgt ctagcatgcc ccactacggg 240
tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct ggttataatt 300
aacccagaca tgtggctgcc cccccccccc caacacctgc tgcctctaaa aataaccctg 360
tccctggtgg atcccctgca tgcgaagatc ttcgaacaag gctgtggggg actgagggca 420
ggctgtaaca ggcttggggg ccagggctta tacgtgcctg ggactcccaa agtattactg 480
ttccatgttc ccggcgaagg gccagctgtc ccccgccagc tagactcagc acttagttta 540
ggaaccagtg agcaagtcag cccttggggc agcccataca aggccatggg gctgggcaag 600
ctgcacgcct gggtccgggg tgggcacggt gcccgggcaa cgagctgaaa gctcatctgc 660
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tatataaccc aggggcacag gggctgccct cattctacca ccacctccac agcacagaca 780
gacactcagg agccagccag cggcgcgccc 810
<210> 3
<211> 8562
<212> DNA
<213> 腺相关病毒
<400> 3
gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctgcgcgc 60
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ggtaggggag gtggtgtgag acgctcctgt ctctcctcta tctgcccatc ggccctttgg 360
ggaggaggaa tgtgcccaag gactaaaaaa aggccatgga gccagagggg cgagggcaac 420
agacctttca tgggcaaacc ttggggccct gctgtctagc atgccccact acgggtctag 480
gctgcccatg taaggaggca aggcctgggg acacccgaga tgcctggtta taattaaccc 540
agacatgtgg ctgccccccc ccccccaaca cctgctgcct ctaaaaataa ccctgtccct 600
ggtggatccc ctgcatgcga agatcttcga acaaggctgt gggggactga gggcaggctg 660
taacaggctt gggggccagg gcttatacgt gcctgggact cccaaagtat tactgttcca 720
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cagtgagcaa gtcagccctt ggggcagccc atacaaggcc atggggctgg gcaagctgca 840
cgcctgggtc cggggtgggc acggtgcccg ggcaacgagc tgaaagctca tctgctctca 900
ggggcccctc cctggggaca gcccctcctg gctagtcaca ccctgtaggc tcctctatat 960
aacccagggg cacaggggct gccctcattc taccaccacc tccacagcac agacagacac 1020
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gacttttacc aagtgggtga acgctcagtt cagcaaattt gggaagcagc acatcgagaa 1320
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ccagaagctg cccaaagaga aggggagcac tagggtgcac gccctgaaca acgtgaacaa 1440
agctctgaga gtgctgcaga acaacaacgt ggatctggtg aatattggca gtactgatat 1500
cgtggacggg aaccacaaac tgacactggg cctgatctgg aacattattc tgcactggca 1560
ggtgaaaaat gtgatgaaga acatcatggc cgggctgcag cagaccaatt ccgagaagat 1620
cctgctgtct tgggtgcggc agagcacccg caactatccc caggtgaacg tgattaactt 1680
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cactacatac ccagataaaa agtctattct gatgtacatt actagcctgt tccaggtgct 1920
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cgcttatacc caggctgcct acgtgacaac tagcgaccct actagatccc cctttccatc 2160
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agacacactg caggcccagg gcgaaatttc caatgacgtg gaagtggtga aggatcagtt 2340
ccacacacac gagggctata tgatggacct gacagctcac caggggcgcg tgggcaatat 2400
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gacagaagcc tggctggata actttgcccg ctgctgggac aacctggtgc agaaactgga 3180
gaaaagtaca gctcagatct ctcaggctgt gaccacaacc cagcctagcc tgacccagac 3240
aaccgtgatg gaaaccgtga ccaccgtgac aacccgcgaa cagatcctgg tgaaacatgc 3300
ccaggaagag ctgccacctc cacctcccca gaagaagaga accctggagc ggctgcagga 3360
gctgcaggaa gccactgacg aactggacct gaagctgagg caggccgaag tgattaaggg 3420
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ggctagacag ctgacaacac tgggcatcca gctgagccca tacaatctga gcacactgga 3600
ggacctgaat accaggtgga agctgctgca ggtggctgtg gaagaccggg tgcggcagct 3660
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ccagaccact tgttgggacc atcccaagat gacagaactg taccagtccc tggccgatct 3840
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<212> DNA
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<212> DNA
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aacaagcttg catgtctaag ctagaccctt cagattaaaa ataactgagg taagggcctg 300
ggtaggggag gtggtgtgag acgctcctgt ctctcctcta tctgcccatc ggccctttgg 360
ggaggaggaa tgtgcccaag gactaaaaaa aggccatgga gccagagggg cgagggcaac 420
agacctttca tgggcaaacc ttggggccct gctgtctagc atgccccact acgggtctag 480
gctgcccatg taaggaggca aggcctgggg acacccgaga tgcctggtta taattaaccc 540
agacatgtgg ctgccccccc ccccccaaca cctgctgcct ctaaaaataa ccctgtccct 600
ggtggatccc ctgcatgcga agatcttcga acaaggctgt gggggactga gggcaggctg 660
taacaggctt gggggccagg gcttatacgt gcctgggact cccaaagtat tactgttcca 720
tgttcccggc gaagggccag ctgtcccccg ccagctagac tcagcactta gtttaggaac 780
cagtgagcaa gtcagccctt ggggcagccc atacaaggcc atggggctgg gcaagctgca 840
cgcctgggtc cggggtgggc acggtgcccg ggcaacgagc tgaaagctca tctgctctca 900
ggggcccctc cctggggaca gcccctcctg gctagtcaca ccctgtaggc tcctctatat 960
aacccagggg cacaggggct gccctcattc taccaccacc tccacagcac agacagacac 1020
tcaggagcca gccagcggcg cgcccaggta agtttagtct ttttgtcttt tatttcaggt 1080
cccggatccg gtggtggtgc aaatcaaaga actgctcctc agtggatgtt gcctttactt 1140
ctaggcctgt acggaagtgt tacttctgct ctaaaagctg cggaattgta cccgcggccg 1200
ccaccatgct gtggtgggag gaggtggagg attgttatga aagggaggac gtgcagaaga 1260
agacttttac caagtgggtg aacgctcagt tcagcaaatt tgggaagcag cacatcgaga 1320
atctgttttc cgacctgcag gatgggagac ggctgctgga tctgctggaa ggactgactg 1380
gccagaagct gcccaaagag aaggggagca ctagggtgca cgccctgaac aacgtgaaca 1440
aagctctgag agtgctgcag aacaacaacg tggatctggt gaatattggc agtactgata 1500
tcgtggacgg gaaccacaaa ctgacactgg gcctgatctg gaacattatt ctgcactggc 1560
aggtgaaaaa tgtgatgaag aacatcatgg ccgggctgca gcagaccaat tccgagaaga 1620
tcctgctgtc ttgggtgcgg cagagcaccc gcaactatcc ccaggtgaac gtgattaact 1680
tcactacatc ctggagcgac gggctggccc tgaatgctct gattcacagc cacaggcctg 1740
atctgttcga ctggaatagc gtggtgtgcc agcagtctgc cacacagcgc ctggaacatg 1800
ccttcaatat cgctcggtac cagctgggga tcgaaaaact gctggaccca gaggatgtgg 1860
acactacata cccagataaa aagtctattc tgatgtacat tactagcctg ttccaggtgc 1920
tgccacagca ggtgtctatt gaagccattc aggaggtgga aatgctgccc cgccccccca 1980
aagtgactaa agaggagcat tttcagctgc atcatcagat gcattacagc cagcagatta 2040
ccgtgagcct ggctcaggga tatgagcgca ccagtagtcc aaaaccacgg ttcaagtcct 2100
acgcttatac ccaggctgcc tacgtgacaa ctagcgaccc tactagatcc ccctttccat 2160
cccagcacct ggaggcccca gaggacaaga gctttgggtc cagcctgatg gaaagcgagg 2220
tgaatctgga tcggtaccag acagccctgg aggaggtgct gagctggctg ctgagtgctg 2280
aagacacact gcaggcccag ggcgaaattt ccaatgacgt ggaagtggtg aaggatcagt 2340
tccacacaca cgagggctat atgatggacc tgacagctca ccaggggcgc gtgggcaata 2400
tcctgcagct gggctctaaa ctgatcggca ccgggaaact gagtgaggac gaggaaacag 2460
aagtgcagga gcagatgaac ctgctgaaca gccgctggga gtgtctgaga gtggctagta 2520
tggagaagca gtccaacctg caccgggtgc tgatggacct gcagaaccag aaactgaaag 2580
agctgaacga ctggctgaca aagactgagg aacgcacaag gaagatggag gaggagccac 2640
tgggacccga cctggaggat ctgaagagac aggtgcagca gcataaggtg ctgcaggagg 2700
atctggaaca ggagcaggtg cgggtgaact ccctgacaca tatggtggtg gtggtggacg 2760
aatctagtgg agatcacgcc accgccgccc tggaggaaca gctgaaggtg ctgggggacc 2820
ggtgggccaa catttgccgg tggaccgagg acaggtgggt gctgctgcag gacatcctgc 2880
tgaaatggca gaggctgacc gaggagcagt gtctgtttag tgcttggctg agcgagaaag 2940
aggacgccgt gaacaagatc cacacaaccg gctttaagga tcagaacgaa atgctgtcta 3000
gcctgcagaa actggctgtg ctgaaggccg atctggagaa aaagaagcag agcatgggca 3060
aactgtatag cctgaaacag gacctgctga gcaccctgaa gaacaagagc gtgacccaga 3120
agacagaagc ctggctggat aactttgccc gctgctggga caacctggtg cagaaactgg 3180
agaaaagtac agctcagatc tctcaggctg tgaccacaac ccagcctagc ctgacccaga 3240
caaccgtgat ggaaaccgtg accaccgtga caacccgcga acagatcctg gtgaaacatg 3300
cccaggaaga gctgccacct ccacctcccc agaagaagag aaccctggag cggctgcagg 3360
agctgcagga agccactgac gaactggacc tgaagctgag gcaggccgaa gtgattaagg 3420
ggtcttggca gcctgtgggc gatctgctga ttgattccct gcaggaccac ctggaaaagg 3480
tgaaggctct gagaggcgaa attgctccac tgaaggagaa cgtgagtcat gtgaacgatc 3540
tggctagaca gctgacaaca ctgggcatcc agctgagccc atacaatctg agcacactgg 3600
aggacctgaa taccaggtgg aagctgctgc aggtggctgt ggaagaccgg gtgcggcagc 3660
tgcatgaggc ccatcgcgac ttcggaccag ccagccagca ctttctgagc acatccgtgc 3720
aggggccctg ggagagggcc atttctccca acaaggtgcc ctactatatt aatcacgaga 3780
cccagaccac ttgttgggac catcccaaga tgacagaact gtaccagtcc ctggccgatc 3840
tgaacaacgt gaggtttagc gcttacagaa ccgctatgaa gctgagacgg ctgcagaagg 3900
ccctgtgcct ggatctgctg tccctgtccg ccgcctgcga tgccctggat cagcataatc 3960
tgaagcagaa cgatcagcca atggatatcc tgcagatcat caactgcctg accactatct 4020
acgacaggct ggagcaggag cacaacaacc tggtgaacgt gcctctgtgc gtggatatgt 4080
gcctgaactg gctgctgaac gtgtatgaca ctgggcgcac cggccggatc agagtgctga 4140
gttttaaaac tgggattatc tccctgtgta aggcccacct ggaggacaag tacaggtacc 4200
tgttcaagca ggtggctagt agcactggat tttgtgacca gcgccgcctg ggactgctgc 4260
tgcatgatag tatccagatt cctagacagc tgggagaggt ggctagtttc ggaggatcta 4320
acatcgaacc cagcgtgcgc agctgtttcc agtttgccaa taacaaacct gaaatcgagg 4380
ctgctctgtt cctggattgg atgcgcctgg aaccacagag catggtgtgg ctgcctgtgc 4440
tgcacagagt ggctgccgcc gaaactgcca agcaccaggc taaatgcaac atctgcaagg 4500
aatgtcccat tatcggcttt cgctacagga gtctgaaaca ttttaactac gatatttgcc 4560
agagctgctt cttttccgga agagtggcca aaggacacaa gatgcactac cctatggtgg 4620
aatattgcac cccaactaca tctggcgaag atgtgcgcga ttttgccaag gtgctgaaga 4680
ataagtttcg gactaagagg tacttcgcca agcacccccg catggggtat ctgccagtgc 4740
agacagtgct ggaaggagac aatatggaga ccgatacaat gtgagcggcc gcaataaaag 4800
atctttattt tcattagatc tgtgtgttgg ttttttgtgt gtctagagca tggctacgta 4860
gataagtagc atggcgggtt aatcattaac tacaaggaac ccctagtgat ggagttggcc 4920
actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc 4980
ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc gccagctggc gtaatagcga 5040
agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatggaagtt 5100
ccagacgatt gagcgtcaaa atgtaggtat ttccatgagc gtttttcctg ttgcaatggc 5160
tggcggtaat attgttctgg atattaccag caaggccgat agtttgagtt cttctactca 5220
ggcaagtgat gttattacta atcaaagaag tattgcgaca acggttaatt tgcgtgatgg 5280
acagactctt ttactcggtg gcctcactga ttataaaaac acttctcagg attctggcgt 5340
accgttcctg tctaaaatcc ctttaatcgg cctcctgttt agctcccgct ctgattctaa 5400
cgaggaaagc acgttatacg tgctcgtcaa agcaaccata gtacgcgccc tgtagcggcg 5460
cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc 5520
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gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgattta cggcacctcg 5640
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tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg 5760
gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt 5820
cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa 5880
tattaacgtt tacaatttaa atatttgctt atacaatctt cctgtttttg gggcttttct 5940
gattatcaac cggggtacat atgattgaca tgctagtttt acgattaccg ttcatcgatt 6000
ctcttgtttg ctccagactc tcaggcaatg acctgatagc ctttgtagag acctctcaaa 6060
aatagctacc ctctccggca tgaatttatc agctagaacg gttgaatatc atattgatgg 6120
tgatttgact gtctccggcc tttctcaccc gtttgaatct ttacctacac attactcagg 6180
cattgcattt aaaatatatg agggttctaa aaatttttat ccttgcgttg aaataaaggc 6240
ttctcccgca aaagtattac agggtcataa tgtttttggt acaaccgatt tagctttatg 6300
ctctgaggct ttattgctta attttgctaa ttctttgcct tgcctgtatg atttattgga 6360
tgttggaagt tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 6420
atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac 6480
ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga 6540
caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa 6600
cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata 6660
atggtttctt agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt 6720
ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg 6780
cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt 6840
cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta 6900
aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc 6960
ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa 7020
gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc 7080
cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt 7140
acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact 7200
gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac 7260
aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata 7320
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ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg 7440
gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat 7500
aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt 7560
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gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag 7740
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gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat 7920
caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat 7980
actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcgt 8040
acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt 8100
cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg 8160
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tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc 8400
tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg 8460
gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat 8520
aaccgtatta ccgggtttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc 8580
agcgagtcag tgagcgacca agcggaagag c 8611
<210> 7
<211> 792
<212> DNA
<213> 腺相关病毒
<400> 7
aagcttgcat gtctaagcta gacccttcag attaaaaata actgaggtaa gggcctgggt 60
aggggaggtg gtgtgagacg ctcctgtctc tcctctatct gcccatcggc cctttgggga 120
ggaggaatgt gcccaaggac taaaaaaagg ccatggagcc agaggggcga gggcaacaga 180
cctttcatgg gcaaaccttg gggccctgct gtctagcatg ccccactacg ggtctaggct 240
gcccatgtaa ggaggcaagg cctggggaca cccgagatgc ctggttataa ttaacccaga 300
catgtggctg cccccccccc cccaacacct gctgcctcta aaaataaccc tgtccctggt 360
ggatcccctg catgcgaaga tcttcgaaca aggctgtggg ggactgaggg caggctgtaa 420
caggcttggg ggccagggct tatacgtgcc tgggactccc aaagtattac tgttccatgt 480
tcccggcgaa gggccagctg tcccccgcca gctagactca gcacttagtt taggaaccag 540
tgagcaagtc agcccttggg gcagcccata caaggccatg gggctgggca agctgcacgc 600
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gcccctccct ggggacagcc cctcctggct agtcacaccc tgtaggctcc tctatataac 720
ccaggggcac aggggctgcc ctcattctac caccacctcc acagcacaga cagacactca 780
ggagcagcca gc 792
<210> 8
<211> 8629
<212> DNA
<213> 卡那霉素质粒
<400> 8
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60
tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120
gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgtagc catgctctag 180
agtttaaaca agcttgcatg tctaagctag acccttcaga ttaaaaataa ctgaggtaag 240
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gtctaggctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat 480
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aggctgtaac aggcttgggg gccagggctt atacgtgcct gggactccca aagtattact 660
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gctgcacgcc tgggtccggg gtgggcacgg tgcccgggca acgagctgaa agctcatctg 840
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ctatataacc caggggcaca ggggctgccc tcattctacc accacctcca cagcacagac 960
agacactcag gagcagccag cggcgcgccc aggtaagttt agtctttttg tcttttattt 1020
caggtcccgg atccggtggt ggtgcaaatc aaagaactgc tcctcagtgg atgttgcctt 1080
tacttctagg cctgtacgga agtgttactt ctgctctaaa agctgcggaa ttgtacccgc 1140
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gaagatcctg ctgtcttggg tgcggcagag cacccgcaac tatccccagg tgaacgtgat 1620
taacttcact acatcctgga gcgacgggct ggccctgaat gctctgattc acagccacag 1680
gcctgatctg ttcgactgga atagcgtggt gtgccagcag tctgccacac agcgcctgga 1740
acatgccttc aatatcgctc ggtaccagct ggggatcgaa aaactgctgg acccagagga 1800
tgtggacact acatacccag ataaaaagtc tattctgatg tacattacta gcctgttcca 1860
ggtgctgcca cagcaggtgt ctattgaagc cattcaggag gtggaaatgc tgccccgccc 1920
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tcagttccac acacacgagg gctatatgat ggacctgaca gctcaccagg ggcgcgtggg 2340
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aacagaagtg caggagcaga tgaacctgct gaacagccgc tgggagtgtc tgagagtggc 2460
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gccactggga cccgacctgg aggatctgaa gagacaggtg cagcagcata aggtgctgca 2640
ggaggatctg gaacaggagc aggtgcgggt gaactccctg acacatatgg tggtggtggt 2700
ggacgaatct agtggagatc acgccaccgc cgccctggag gaacagctga aggtgctggg 2760
ggaccggtgg gccaacattt gccggtggac cgaggacagg tgggtgctgc tgcaggacat 2820
cctgctgaaa tggcagaggc tgaccgagga gcagtgtctg tttagtgctt ggctgagcga 2880
gaaagaggac gccgtgaaca agatccacac aaccggcttt aaggatcaga acgaaatgct 2940
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gggcaaactg tatagcctga aacaggacct gctgagcacc ctgaagaaca agagcgtgac 3060
ccagaagaca gaagcctggc tggataactt tgcccgctgc tgggacaacc tggtgcagaa 3120
actggagaaa agtacagctc agatctctca ggctgtgacc acaacccagc ctagcctgac 3180
ccagacaacc gtgatggaaa ccgtgaccac cgtgacaacc cgcgaacaga tcctggtgaa 3240
acatgcccag gaagagctgc cacctccacc tccccagaag aagagaaccc tggagcggct 3300
gcaggagctg caggaagcca ctgacgaact ggacctgaag ctgaggcagg ccgaagtgat 3360
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aaaggtgaag gctctgagag gcgaaattgc tccactgaag gagaacgtga gtcatgtgaa 3480
cgatctggct agacagctga caacactggg catccagctg agcccataca atctgagcac 3540
actggaggac ctgaatacca ggtggaagct gctgcaggtg gctgtggaag accgggtgcg 3600
gcagctgcat gaggcccatc gcgacttcgg accagccagc cagcactttc tgagcacatc 3660
cgtgcagggg ccctgggaga gggccatttc tcccaacaag gtgccctact atattaatca 3720
cgagacccag accacttgtt gggaccatcc caagatgaca gaactgtacc agtccctggc 3780
cgatctgaac aacgtgaggt ttagcgctta cagaaccgct atgaagctga gacggctgca 3840
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taatctgaag cagaacgatc agccaatgga tatcctgcag atcatcaact gcctgaccac 3960
tatctacgac aggctggagc aggagcacaa caacctggtg aacgtgcctc tgtgcgtgga 4020
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gctgagtttt aaaactggga ttatctccct gtgtaaggcc cacctggagg acaagtacag 4140
gtacctgttc aagcaggtgg ctagtagcac tggattttgt gaccagcgcc gcctgggact 4200
gctgctgcat gatagtatcc agattcctag acagctggga gaggtggcta gtttcggagg 4260
atctaacatc gaacccagcg tgcgcagctg tttccagttt gccaataaca aacctgaaat 4320
cgaggctgct ctgttcctgg attggatgcg cctggaacca cagagcatgg tgtggctgcc 4380
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caaggaatgt cccattatcg gctttcgcta caggagtctg aaacatttta actacgatat 4500
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gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca 4920
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tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 5040
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 5100
actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 5160
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 5220
ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 5280
acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 5340
ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 5400
cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 5460
tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 5520
gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 5580
ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 5640
acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 5700
gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 5760
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 5820
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 5880
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 5940
tctaaagtat atatgagtaa aaatattccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag 6000
gttgggaagc cctgcaaagt aaactggatg gctttcttgc cgccaaggat ctgatggcgc 6060
aggggatcaa gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat 6120
ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca 6180
caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg 6240
gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg 6300
cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact 6360
gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatcc 6420
caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg 6480
cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt 6540
actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc 6600
gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc 6660
gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga 6720
ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc 6780
cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt 6840
atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga 6900
accggtaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 6960
aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 7020
ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga 7080
ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc 7140
cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg 7200
cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg 7260
tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc 7320
gcatcaggcg attccaacat ccaataaatc atacaggcaa ggcaaagaat tagcaaaatt 7380
aagcaataaa gcctcagagc ataaagctaa atcggttgta ccaaaaacat tatgaccctg 7440
taatactttt gcgggagaag cctttatttc aacgcaagga taaaaatttt tagaaccctc 7500
atatatttta aatgcaatgc ctgagtaatg tgtaggtaaa gattcaaacg ggtgagaaag 7560
gccggagaca gtcaaatcac catcaatatg atattcaacc gttctagctg ataaattcat 7620
gccggagagg gtagctattt ttgagaggtc tctacaaagg ctatcaggtc attgcctgag 7680
agtctggagc aaacaagaga atcgatgaac ggtaatcgta aaactagcat gtcaatcata 7740
tgtaccccgg ttgataatca gaaaagcccc aaaaacagga agattgtata agcaaatatt 7800
taaattgtaa gcgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca 7860
ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagaccgag 7920
atagggttga gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc 7980
aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc 8040
taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc 8100
ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa 8160
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acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtact atggttgctt tgacgagcac 8280
gtataacgtg ctttcctcgt tagaatcaga gcgggagcta aacaggaggc cgattaaagg 8340
gattttagac aggaacggta cgccagaatc ctgagaagtg tttttataat cagtgaggcc 8400
accgagtaaa agagtctgtc catcacgcaa attaaccgtt gtcgcaatac ttctttgatt 8460
agtaataaca tcacttgcct gagtagaaga actcaaacta tcggccttgc tggtaatatc 8520
cagaacaata ttaccgccag ccattgcaac ggaatcgcca ttcgccattc aggctgcgca 8580
actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagct 8629
<210> 9
<211> 4977
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 卡那霉素盒
<400> 9
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60
tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120
gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgtagc catgctctag 180
agtttaaaca agcttgcatg tctaagctag acccttcaga ttaaaaataa ctgaggtaag 240
ggcctgggta ggggaggtgg tgtgagacgc tcctgtctct cctctatctg cccatcggcc 300
ctttggggag gaggaatgtg cccaaggact aaaaaaaggc catggagcca gaggggcgag 360
ggcaacagac ctttcatggg caaaccttgg ggccctgctg tctagcatgc cccactacgg 420
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gtccctggtg gatcccctgc atgcgaagat cttcgaacaa ggctgtgggg gactgagggc 600
aggctgtaac aggcttgggg gccagggctt atacgtgcct gggactccca aagtattact 660
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aggaaccagt gagcaagtca gcccttgggg cagcccatac aaggccatgg ggctgggcaa 780
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gcctgatctg ttcgactgga atagcgtggt gtgccagcag tctgccacac agcgcctgga 1740
acatgccttc aatatcgctc ggtaccagct ggggatcgaa aaactgctgg acccagagga 1800
tgtggacact acatacccag ataaaaagtc tattctgatg tacattacta gcctgttcca 1860
ggtgctgcca cagcaggtgt ctattgaagc cattcaggag gtggaaatgc tgccccgccc 1920
ccccaaagtg actaaagagg agcattttca gctgcatcat cagatgcatt acagccagca 1980
gattaccgtg agcctggctc agggatatga gcgcaccagt agtccaaaac cacggttcaa 2040
gtcctacgct tatacccagg ctgcctacgt gacaactagc gaccctacta gatccccctt 2100
tccatcccag cacctggagg ccccagagga caagagcttt gggtccagcc tgatggaaag 2160
cgaggtgaat ctggatcggt accagacagc cctggaggag gtgctgagct ggctgctgag 2220
tgctgaagac acactgcagg cccagggcga aatttccaat gacgtggaag tggtgaagga 2280
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gaaagagctg aacgactggc tgacaaagac tgaggaacgc acaaggaaga tggaggagga 2580
gccactggga cccgacctgg aggatctgaa gagacaggtg cagcagcata aggtgctgca 2640
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ggacgaatct agtggagatc acgccaccgc cgccctggag gaacagctga aggtgctggg 2760
ggaccggtgg gccaacattt gccggtggac cgaggacagg tgggtgctgc tgcaggacat 2820
cctgctgaaa tggcagaggc tgaccgagga gcagtgtctg tttagtgctt ggctgagcga 2880
gaaagaggac gccgtgaaca agatccacac aaccggcttt aaggatcaga acgaaatgct 2940
gtctagcctg cagaaactgg ctgtgctgaa ggccgatctg gagaaaaaga agcagagcat 3000
gggcaaactg tatagcctga aacaggacct gctgagcacc ctgaagaaca agagcgtgac 3060
ccagaagaca gaagcctggc tggataactt tgcccgctgc tgggacaacc tggtgcagaa 3120
actggagaaa agtacagctc agatctctca ggctgtgacc acaacccagc ctagcctgac 3180
ccagacaacc gtgatggaaa ccgtgaccac cgtgacaacc cgcgaacaga tcctggtgaa 3240
acatgcccag gaagagctgc cacctccacc tccccagaag aagagaaccc tggagcggct 3300
gcaggagctg caggaagcca ctgacgaact ggacctgaag ctgaggcagg ccgaagtgat 3360
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cgatctggct agacagctga caacactggg catccagctg agcccataca atctgagcac 3540
actggaggac ctgaatacca ggtggaagct gctgcaggtg gctgtggaag accgggtgcg 3600
gcagctgcat gaggcccatc gcgacttcgg accagccagc cagcactttc tgagcacatc 3660
cgtgcagggg ccctgggaga gggccatttc tcccaacaag gtgccctact atattaatca 3720
cgagacccag accacttgtt gggaccatcc caagatgaca gaactgtacc agtccctggc 3780
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tatctacgac aggctggagc aggagcacaa caacctggtg aacgtgcctc tgtgcgtgga 4020
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 10
Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
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Ala Gln Thr Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Lys
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Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Asn
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 11
Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
20 25 30
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser
35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser
50 55 60
Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg
100 105 110
Ser Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 12
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 12
Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1 5 10 15
Ala Gln Thr Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu
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Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser
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Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Asn Ala His Pro Gly Gly Ser Ala Phe Val
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
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<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 13
Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
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Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser
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Ser Gly Val Thr Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser
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65 70 75 80
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 14
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
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Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 16
Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
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Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr
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Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
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<220>
<223> 合成多肽
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Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
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Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
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His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
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Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Phe Tyr Pro Phe Thr
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 18
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ser Asp Leu Lys Lys Pro Gly Glu
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Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
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Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Phe Cys
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Thr Arg Gly Thr Ser Thr Met Ile Ser Thr Phe Ala Phe Val Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 19
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Met
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<223> 合成多肽
<400> 21
Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn
1 5
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 22
Asp Tyr Gly Met Asn
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 23
Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr Gly Met Asn
1 5
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 24
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 25
Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Gly Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 26
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 26
Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr
1 5 10
<210> 27
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 27
Gly Val Ala His Tyr Ser Asp Ser Arg Phe Ala Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 28
Gly Asn Ala His Pro Gly Gly Ser Ala Phe Val Tyr
1 5 10
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 29
Arg Gly Ser Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Pro Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10 15
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
Arg Gly Val Asp Ser Ser Gly Tyr Gly Ala Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 31
Thr Arg Gly Thr Ser Thr Met Ile Ser Thr Phe Ala Phe Val Tyr
1 5 10 15
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 32
Ser Val Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 33
Ser Ala Ser Ser Gly Val Thr Tyr Met His
1 5 10
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 34
Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 35
Ser Ser Val Arg Tyr Met His
1 5
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 36
Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 37
Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 38
Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5 10
<210> 39
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 39
Val Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5 10
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 40
Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 41
Gln Gln Arg Ser Thr Tyr Pro Phe
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 42
Gln Gln Arg Ser Phe Tyr Pro Phe
1 5
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 43
Gln Gln Arg Thr Tyr Tyr Pro Phe
1 5
<210> 44
<211> 2303
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 44
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggggtt aaccaattgg 120
cggccgcaag cttgcatgtc taagctagac ccttcagatt aaaaataact gaggtaaggg 180
cctgggtagg ggaggtggtg tgagacgctc ctgtctctcc tctatctgcc catcggccct 240
ttggggagga ggaatgtgcc caaggactaa aaaaaggcca tggagccaga ggggcgaggg 300
caacagacct ttcatgggca aaccttgggg ccctgctgtc tagcatgccc cactacgggt 360
ctaggctgcc catgtaagga ggcaaggcct ggggacaccc gagatgcctg gttataatta 420
acccagacat gtggctgccc cccccccccc aacacctgct gcctctaaaa ataaccctgt 480
ccctggtgga tcccctgcat gcgaagatct tcgaacaagg ctgtggggga ctgagggcag 540
gctgtaacag gcttgggggc cagggcttat acgtgcctgg gactcccaaa gtattactgt 600
tccatgttcc cggcgaaggg ccagctgtcc cccgccagct agactcagca cttagtttag 660
gaaccagtga gcaagtcagc ccttggggca gcccatacaa ggccatgggg ctgggcaagc 720
tgcacgcctg ggtccggggt gggcacggtg cccgggcaac gagctgaaag ctcatctgct 780
ctcaggggcc cctccctggg gacagcccct cctggctagt cacaccctgt aggctcctct 840
atataaccca ggggcacagg ggctgccctc attctaccac cacctccaca gcacagacag 900
acactcagga gcagccagcg gcgcgcccag gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca 960
ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa agaactgctc ctcagtggat gttgccttta 1020
cttctaggcc tgtacggaag tgttacttct gctctaaaag ctgcggaatt gtacccggta 1080
ccaccatggc agcagcagcc gccgcagccg ccgagcagca gtcaagcaat ggaccagtga 1140
aaaaatcaat gagagaaaaa gccgtcgaga ggagatcagt gaataaggag cacaacagca 1200
atttcaaagc cggctacatc cctattgacg aagatcgcct gcataagaca ggcctgaggg 1260
ggcgcaaagg aaacctggca atctgcgtca tcattctgct gtttatcctg gccgtgatta 1320
atctgatcat tactctggtg atttgggctg tcatccgcat tggcccaaac gggtgtgact 1380
ctatggagtt ccacgaaagt ggcctgctgc gatttaagca ggtgtccgat atgggggtca 1440
tccatccact gtacaaatct actgtcggcg ggcggagaaa cgagaatctg gtgatcaccg 1500
ggaacaatca gcccattgtg ttccagcagg gaaccacaaa gctgtctgtg gaaaacaata 1560
aaacatcaat cactagcgac attggcatgc agttctttga tccccggacc cagaatatcc 1620
tgttcagtac cgactatgag acacacgaat ttcatctgcc ttccggggtg aagtctctga 1680
acgtccagaa agccagcact gagagaatca ccagtaacgc tacatcagac ctgaatatca 1740
aggtggatgg acgagctatt gtccggggaa atgagggcgt gttcatcatg ggcaagacaa 1800
ttgaatttca catgggaggc aacatggagc tgaaagcaga aaacagcatc attctgaatg 1860
ggagcgtgat ggtctccact accagactgc ccagctcctc tagtggagac cagctggggt 1920
ccggagattg ggtcaggtat aagctgtgca tgtgtgccga tggcaccctg tttaaagtgc 1980
aggtcaccag ccagaatatg ggatgtcaga ttagcgataa cccttgtggg aatactcatt 2040
aaaagcttgg ccgcaataaa agatctttat tttcattaga tctgtgtgtt ggttttttgt 2100
gtgtcctgca ggggcgcgcc tctagagcat ggctacgtag ataagtagca tggcgggtta 2160
atcattaact acaaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc 2220
tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc 2280
tcagtgagcg agcgagcgcg cag 2303
<210> 45
<211> 957
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> misc_feature
<223> β-肌聚糖
<400> 45
atggcagcag cagccgccgc agccgccgag cagcagtcaa gcaatggacc agtgaaaaaa 60
tcaatgagag aaaaagccgt cgagaggaga tcagtgaata aggagcacaa cagcaatttc 120
aaagccggct acatccctat tgacgaagat cgcctgcata agacaggcct gagggggcgc 180
aaaggaaacc tggcaatctg cgtcatcatt ctgctgttta tcctggccgt gattaatctg 240
atcattactc tggtgatttg ggctgtcatc cgcattggcc caaacgggtg tgactctatg 300
gagttccacg aaagtggcct gctgcgattt aagcaggtgt ccgatatggg ggtcatccat 360
ccactgtaca aatctactgt cggcgggcgg agaaacgaga atctggtgat caccgggaac 420
aatcagccca ttgtgttcca gcagggaacc acaaagctgt ctgtggaaaa caataaaaca 480
tcaatcacta gcgacattgg catgcagttc tttgatcccc ggacccagaa tatcctgttc 540
agtaccgact atgagacaca cgaatttcat ctgccttccg gggtgaagtc tctgaacgtc 600
cagaaagcca gcactgagag aatcaccagt aacgctacat cagacctgaa tatcaaggtg 660
gatggacgag ctattgtccg gggaaatgag ggcgtgttca tcatgggcaa gacaattgaa 720
tttcacatgg gaggcaacat ggagctgaaa gcagaaaaca gcatcattct gaatgggagc 780
gtgatggtct ccactaccag actgcccagc tcctctagtg gagaccagct ggggtccgga 840
gattgggtca ggtataagct gtgcatgtgt gccgatggca ccctgtttaa agtgcaggtc 900
accagccaga atatgggatg tcagattagc gataaccctt gtgggaatac tcattaa 957
<210> 46
<211> 318
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> β-肌聚糖
<400> 46
Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Gln Gln Ser Ser Asn Gly
1 5 10 15
Pro Val Lys Lys Ser Met Arg Glu Lys Ala Val Glu Arg Arg Ser Val
20 25 30
Asn Lys Glu His Asn Ser Asn Phe Lys Ala Gly Tyr Ile Pro Ile Asp
35 40 45
Glu Asp Arg Leu His Lys Thr Gly Leu Arg Gly Arg Lys Gly Asn Leu
50 55 60
Ala Ile Cys Val Ile Ile Leu Leu Phe Ile Leu Ala Val Ile Asn Leu
65 70 75 80
Ile Ile Thr Leu Val Ile Trp Ala Val Ile Arg Ile Gly Pro Asn Gly
85 90 95
Cys Asp Ser Met Glu Phe His Glu Ser Gly Leu Leu Arg Phe Lys Gln
100 105 110
Val Ser Asp Met Gly Val Ile His Pro Leu Tyr Lys Ser Thr Val Gly
115 120 125
Gly Arg Arg Asn Glu Asn Leu Val Ile Thr Gly Asn Asn Gln Pro Ile
130 135 140
Val Phe Gln Gln Gly Thr Thr Lys Leu Ser Val Glu Asn Asn Lys Thr
145 150 155 160
Ser Ile Thr Ser Asp Ile Gly Met Gln Phe Phe Asp Pro Arg Thr Gln
165 170 175
Asn Ile Leu Phe Ser Thr Asp Tyr Glu Thr His Glu Phe His Leu Pro
180 185 190
Ser Gly Val Lys Ser Leu Asn Val Gln Lys Ala Ser Thr Glu Arg Ile
195 200 205
Thr Ser Asn Ala Thr Ser Asp Leu Asn Ile Lys Val Asp Gly Arg Ala
210 215 220
Ile Val Arg Gly Asn Glu Gly Val Phe Ile Met Gly Lys Thr Ile Glu
225 230 235 240
Phe His Met Gly Gly Asn Met Glu Leu Lys Ala Glu Asn Ser Ile Ile
245 250 255
Leu Asn Gly Ser Val Met Val Ser Thr Thr Arg Leu Pro Ser Ser Ser
260 265 270
Ser Gly Asp Gln Leu Gly Ser Gly Asp Trp Val Arg Tyr Lys Leu Cys
275 280 285
Met Cys Ala Asp Gly Thr Leu Phe Lys Val Gln Val Thr Ser Gln Asn
290 295 300
Met Gly Cys Gln Ile Ser Asp Asn Pro Cys Gly Asn Thr His
305 310 315

Claims (95)

1.一种治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的方法，所述方法包括施用重组腺病毒相关(rAAV)和抗炎类固醇的步骤，其中所述rAAV选自由以下组成的组：rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述肌营养不良症是杜氏肌营养不良症(DuchenneMuscular Dystrophy)，并且所述rAAV是rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述肌营养不良症是肢带型肌营养不良症(LimbGirdle Muscular Dystrophy)，并且其中所述rAAV选自由以下组成的组：AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在施用所述rAAV之前约24小时施用所述抗炎类固醇。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在施用所述rAAV之前每天至少施用一次所述抗炎类固醇，持续约14天。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在施用所述rAAV之前施用所述抗炎类固醇，并且从施用所述rAAV后的第1天至第30天每天至少施用一次所述抗炎类固醇，或从施用所述rAAV后的第1天至第60天每天至少一次。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中口服施用所述抗炎类固醇。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述抗炎类固醇是糖皮质激素。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述抗炎类固醇是强的松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)、倍他米松(betamethasone)、地塞米松(dexamethasone)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲基强的松龙(methylprednisolone)或地夫可特(deflazacort)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其进一步包括在施用所述rAAV之前施用抗CD20特异性抗体的步骤。
11.根据权利要求10所述的方法，其中在施用所述rAAV之前至少7天施用所述抗CD-20特异性抗体。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中在施用所述rAAV之前至少14天施用所述抗CD20特异性抗体。
13.根据权利要求10所述的方法，其中在施用所述rAAV之前约14天、施用所述rAAV之前约7天和施用所述rAAV的约24小时内施用所述抗CD20特异性抗体。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其进一步包括在施用所述rAAV之后施用抗CD20特异性抗体的步骤。
15.根据权利要求10至14所述的方法，其中所述抗CD20特异性抗体是利妥昔单抗(rituximab)、奥美珠单抗(ocrelizumab)或奥法木单抗(ofatumumab)。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其进一步包括施用免疫抑制大环内酯类的步骤。
17.根据权利要求16所述的方法，其中在施用所述rAAV之前每天至少施用一次所述免疫抑制大环内酯类，持续至少三天。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中在施用所述rAAV之后施用所述免疫抑制大环内酯类。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中口服施用所述免疫抑制大环内酯类。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述免疫抑制大环内酯类是他克莫司(tacrolimus)、吡美莫司(pinecrolimus)或西罗莫司(sirolimus)。
21.一种治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的方法，所述方法包括施用重组腺病毒相关(rAAV)；和免疫抑制方案，其中所述免疫抑制方案包括施用抗炎类固醇、抗CD20抗体和免疫抑制大环内酯类中的一种或多种，并且其中所述rAAV选自由以下组成的组：AAVrh.74.MHCK7.微肌营养不良蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述肌营养不良症是杜氏肌营养不良症，并且所述rAAV是rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述肌营养不良症是肢带型肌营养不良症，并且所述rAAV是AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述免疫抑制方案包括施用抗炎类固醇、抗CD20抗体和免疫抑制大环内酯类。
25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中在施用所述rAAV之前约24小时施用所述抗炎类固醇。
26.根据权利要求21至25中任一项所述的方法，其中在施用所述rAAV之前施用所述抗炎类固醇，并且从施用所述rAAV后的第1天至第30天每天至少施用一次所述抗炎类固醇。
27.根据权利要求21至26中任一项所述的方法，其中口服施用所述抗炎类固醇。
28.根据权利要求21至27中任一项所述的方法，其中所述抗炎类固醇是糖皮质激素。
29.根据权利要求21至28中任一项所述的方法，其中所述抗炎类固醇是强的松、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙或地夫可特。
30.根据权利要求21至295中任一项所述的方法，其中在施用所述rAAV之前施用所述抗CD20特异性抗体。
31.根据权利要求30所述的方法，其中在施用所述rAAV之前至少14天施用所述抗CD20特异性抗体。
32.根据权利要求30所述的方法，其中在施用所述rAAV之前约14天、施用所述rAAV之前约7天和施用所述rAAV的约24小时内施用所述抗CD20特异性抗体。
33.根据权利要求21至32中任一项所述的方法，其中所述免疫抑制方案进一步包括在施用所述rAAV之后施用抗CD20特异性抗体。
34.根据权利要求21至33中任一项所述的方法，其中通过静脉内输注施用所述抗CD20抗体。
35.根据权利要求21至34中任一项所述的方法，其中所述抗CD20特异性抗体是利妥昔单抗、奥美珠单抗或奥法木单抗。
36.根据权利要求21至35中任一项所述的方法，其中在施用所述rAAV之前每天至少施用一次所述免疫抑制大环内酯类，持续至少三天。
37.根据权利要求21至36中任一项所述的方法，其中所述免疫抑制方案进一步包括在施用所述rAAV之后施用免疫抑制大环内酯类。
38.根据权利要求21至37中任一项所述的方法，其中口服施用所述免疫抑制大环内酯类。
39.根据权利要求21至38中任一项所述的方法，其中所述免疫抑制大环内酯类是他克莫司、吡美莫司或西罗莫司。
40.一种治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的方法，所述方法包括施用选自由以下组成的组的重组腺病毒相关(rAAV)：AAVrh.74.MHCK7.微肌营养不良蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；和免疫抑制方案，其中所述免疫抑制方案包括以下步骤：
i)在施用所述rAAV之前约24小时口服施用抗炎类固醇，并且从施用所述rAAV后的第1天至第30天或从施用所述rAAV后的第1天至第60天每天至少施用一次抗炎类固醇，
ii)在施用所述rAAV之前约14天、施用所述rAAV之前约7天和施用所述rAAV的约24小时内静脉内施用抗CD20抗体，并且任选地在施用所述rAAV之后施用所述抗CD20抗体，
iii)在施用所述rAAV之前，每天至少一次口服施用免疫抑制大环内酯类，持续至少三天，并且任选地在施用所述rAAV之后施用所述免疫抑制大环内酯类。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述肌营养不良症是杜氏肌营养不良症，并且所述rAAV是AAVrh.74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述肌营养不良症是肢带型肌营养不良症，并且所述rAAV是AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB或rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中所述抗炎类固醇是强的松、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙或地夫可特。
44.根据权利要求40至43中任一项所述的方法，其中所述抗CD20特异性抗体是利妥昔单抗、奥美珠单抗或奥法木单抗。
45.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中所述免疫抑制大环内酯类是他克莫司、吡美莫司或西罗莫司。
46.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中所述抗炎类固醇是泼尼松龙，所述抗CD20抗体利妥昔单抗，并且所述免疫抑制大环内酯类是西罗莫司。
47.一种治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的方法，所述方法包括在施用第二剂量的选自由以下组成的组的重组腺病毒相关(rAAV)之前，对所述受试者的血浆进行至少一次治疗性血浆交换(TPE)：AAVrh.74.MHCK7.微肌营养不良蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05，其中所述受试者在经历TPE之前被施用第一剂量的rAAV。
48.一种治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的方法，所述方法包括以下步骤：
a)施用第一剂量的选自由以下组成的组的重组腺病毒相关：AAVrh.74.MHCK7.微肌营养不良蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05；
b)对所述受试者的血浆进行至少一次治疗性血浆交换(TPE)，以及c)施用第二剂量或rAAV。
49.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述肌营养不良症是杜氏肌营养不良症，并且所述rAAV是AAVrh.74.MHCK7.微肌营养不良蛋白。
50.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述肌营养不良症是肢带型肌营养不良症，并且所述rAAV是AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB和rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。
51.根据权利要求47至50中任一项所述的方法，其中在施用第2剂量或rAAV之前，对所述受试者的血浆进行至少两次TPE或至少三次TPE。
52.一种治疗有需要的人受试者的肌营养不良症的方法，其包括以下步骤
a)在施用重组腺病毒相关(rAAV)之前，对所述受试者的血浆进行至少一次治疗性血浆交换(TPE)，
b)施用rAAV，并且
其中所述rAAV是rAAV.MHCK7.微肌营养不良蛋白、AAVrh.74.tMCK.CAPN3、rAAVrh.74.MHCK7.DYSF、scAAVrh.74.MHCK7.hSGCG、AAVrh74.tMCK.hSCGA、scAAVrh74.MHCK7.HSGCB或rAAVrh.74.MHCK7.huAN05。
53.根据权利要求52所述的方法，其中在施用之前对所述受试者的血浆进行至少两次TPE、至少三次TPE、至少四次TPE、至少五次TPErAAV、至少六次TPE或至少七次TPE。
54.根据权利要求52或53所述的方法，其中在施用所述rAAV之前至少9天、施用之前至少7天、施用之前5天或施用之前2天，对所述受试者的血浆进行TPE。
55.根据权利要求52至54中任一项所述的方法，其中在施用所述rAAV的当天对所述受试者血浆进行TPE。
56.根据权利要求52至55中任一项所述的方法，其中对所述受试者的血浆进行至少两次TPE，其中在所述TPE之间有约48小时。
57.根据权利要求52至56中任一项所述的方法，其中在施用所述rAAV之前约24小时向所述受试者施用抗炎类固醇。
58.根据权利要求52至57中任一项所述的方法，其中从施用所述rAAV后的第1天至第60天，向所述受试者每天至少施用一次抗炎类固醇。
59.根据权利要求57或58所述的方法，其中口服施用所述抗炎类固醇。
60.根据权利要求57至59中任一项所述的方法，其中所述抗炎类固醇是糖皮质激素。
61.根据权利要求57至60中任一项所述的方法，其中所述抗炎类固醇是强的松、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙或地夫可特。
62.根据权利要求1至61中权利要求任一项所述的方法，其中所述rAAV通过全身施用途径施用。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述全身施用途径是静脉内途径，并且施用的所述rAAV的剂量为约2×1014vg/kg。
64.根据权利要求1至63中任一项所述的方法，其中所述剂量的rAAV以约10mL/kg的浓度施用。
65.根据权利要求1至64中任一项所述的方法，其中所述rAAV通过注射、输注或植入施用。
66.根据权利要求1至65中任一项所述的方法，其中所述rAAV在大约一小时内通过输注施用。
67.根据权利要求1至65中任一项所述的方法，其中所述rAAV通过外周肢静脉通过静脉内途径施用。
68.根据权利要求1至67中任一项所述的方法，其中所述rAAV是血清型AAVrh.74。
69.根据权利要求1至68中任一项所述的方法，其中所述rAAV包括以下的人微肌营养不良蛋白核苷酸序列：SEQ ID NO:1。
70.根据权利要求1至69中任一项所述的方法，其中所述rAAV包括以下的MHCK7启动子序列：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7。
71.根据权利要求1至70中任一项所述的方法，其中所述rAAV包括以下的核苷酸序列：SEQ ID NO:44。
72.根据权利要求1至68中任一项所述的方法，其中所述rAAV包括以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列：SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021。
73.根据权利要求1至68中任一项所述的方法，其中所述人受试者患有杜氏肌营养不良症，并且所述rAAV以约2×1014vg/kg的剂量通过静脉内输注在大约一小时内施用，并且其中所述rAAV包括以下的AAVrh74.MHCK7.微肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列：SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:3的核苷酸55至5021。
74.根据权利要求1至68中任一项所述的方法，其中所述肌营养不良症是LGMD2E，并且所述rAAV是scAAVrh74.MHCK7.HSGCB。
75.根据权利要求1至68中任一项所述的方法，其中所述人受试者患有LGMD2E，并且所述rAAV以约2×1014vg/kg的剂量通过静脉内输注施用，并且其中所述rAAV包括为scAAVrh74.MHCK7.HSGCB的rAAV，所述scAAVrh74.MHCK7.HSGCB包括以下的核苷酸序列：SEQID NO:44。
76.根据权利要求1至75中任一项所述的方法，其中与施用所述rAAV之前的微肌营养不良蛋白基因表达的水平相比，施用所述rAAV后，所述受试者的细胞中微肌营养不良蛋白基因表达的水平增加。
77.根据权利要求1至76中任一项所述的方法，其进一步包括确定所述受试者的血清或血浆中抗AAVrh.74抗体的存在的步骤。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述确定步骤在施用所述施用免疫抑制方案或TPE的步骤之前进行。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述确定步骤在向所述受试者进行任何AAV施用之前进行。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述确定步骤在向所述受试者施用aAAVrh.74之前进行。
81.根据权利要求77至80中任一项所述的方法，其中所述确定是定量的。
82.根据权利要求81所述的方法，其进一步包括将所述受试者的血清或血浆中的抗AAVrh.74抗体水平与阳性对照进行比较的步骤。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述阳性对照利用抗AAVrh.74单克隆抗体。
84.根据权利要求77至83中任一项所述的方法，其中所述确定步骤包括利用抗AAVrh.74单克隆抗体。
85.根据权利要求77至84中任一项所述的方法，其中所述确定步骤包括利用免疫荧光测定、免疫组织化学测定、蛋白质印迹、直接酶联免疫吸附测定(ELISA)、间接ELISA、夹心ELISA、竞争性ELISA、反向ELISA、化学发光测定、放射免疫测定或免疫沉淀测定。
86.根据权利要求83至85中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体包括选自由以下组成的组的VH CDR1氨基酸序列：NYGMN(SEQ ID NO:20)、DYGMN(SEQ ID NO:22)、YTFTNYGMN(SEQ ID NO:21)和YTFTKYGMN(SEQ ID NO:23)。
87.根据权利要求83至85中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体包括选自由以下组成的组的VH CDR2氨基酸序列：WINTYTGEPTYADDFKG(SEQ ID NO:24)、WINTNTGEPTYGDDFKG(SEQ ID NO:25)和WMGWINTYTGEPTY(SEQ ID NO:26)。
88.根据权利要求83至85中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体包括选自由以下组成的组的VH CDR3氨基酸序列：GVAHYSDSRFAFDY(SEQ ID NO:27)、GNAHPGGSAFVY(SEQ IDNO:28)、RGSYYYDSSPAWFAY(SEQ ID NO:29)、RGVDSSGYGAFAY(SEQ ID NO:30)和TRGTSTMISTFAFVY(SEQ ID NO:31)。
89.根据权利要求83至85中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体包括选自由以下组成的组的VL CDR1氨基酸序列：SVSSSVSYMH(SEQ ID NO:32)、SASSGVTYMH(SEQ ID NO:33)、SSVSYMH(SEQ ID NO:34)和SSVRYMH(SEQ ID NO:35)。
90.根据权利要求83至85中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体包括选自由以下组成的组的VL CDR2氨基酸序列：YTSNLAS(SEQ ID NO:36)、RTSNLAS(SEQ ID NO:37)、LWIYSTSNLAS(SEQ ID NO:38)和VWIYSTSNLAS(SEQ ID NO:39)。
91.根据权利要求83至85中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体包括选自由以下组成的组的VH CDR3氨基酸序列：QQRSSYPFT(SEQ ID NO:40)、QQRSTYPF(SEQ ID NO:41)、QQRSFYPF(SEQ ID NO:42)和QQRTYYPF(SEQ ID NO:43)。
92.根据权利要求83至85中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体包括以下中所示的可变重链(VH)序列：SEQ ID NO:10、12、14、16或18。
93.根据权利要求83至85中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体包括以下中所示的可变轻链(VL)序列：SEQ ID NO:11、13、15、17或19。
94.根据权利要求83至85中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体包括以下中所示的可变重链(VH)序列：SEQ ID NO:10、12、14、16或18，以及以下中所示的可变轻链(VL)序列：SEQ ID NO:11、13、15、17或19。
95.根据权利要求83至85中任一项所述的方法，其中所述确定是定量的，其中所述受试者基于所述定量被鉴定为抗AAVrh.74抗体的血清阳性，并且其中所述免疫抑制方案或TPE被选择性地向所述血清阳性受试者施用。
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