KR20180081566A - 근이영양증을 치료하는 방법 - Google Patents

근이영양증을 치료하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20180081566A
KR20180081566A KR1020187016152A KR20187016152A KR20180081566A KR 20180081566 A KR20180081566 A KR 20180081566A KR 1020187016152 A KR1020187016152 A KR 1020187016152A KR 20187016152 A KR20187016152 A KR 20187016152A KR 20180081566 A KR20180081566 A KR 20180081566A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
composition
seq
ano5
subject
muscle
Prior art date
Application number
KR1020187016152A
Other languages
English (en)
Inventor
루이스 로디노-클라파크
Original Assignee
리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 filed Critical 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈
Publication of KR20180081566A publication Critical patent/KR20180081566A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A61K31/122—Ketones having the oxygen directly attached to a ring, e.g. quinones, vitamin K1, anthralin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • A61K31/355—Tocopherols, e.g. vitamin E
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4707—Muscular dystrophy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases
    • C12N2015/8536—Animal models for genetic diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)

Abstract

본 발명은 ANO5 유전자를 발현하는 AAV 벡터 및 근육의 재생을 유도하는 방법 및 근이영양증의 치료 방법으로서 항산화제 요법을 제공한다.

Description

근이영양증을 치료하는 방법
본원은 전체가 본원에 참고로 인용된, 2015년 11월 12일에 출원된 미국 가출원 제62/254539호 및 2016년 11월 9일에 출원된 미국 가출원 제62/419793호에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 ANO5 유전자를 발현하는 AAV 벡터 및 근육의 재생을 유도하는 방법 및 근이영양증의 치료 방법으로서 항산화제 요법을 제공한다.
운동 및 호흡과 같은 일상 활동 및 전신 대사를 위한 근육 질량 및 강도의 중요성은 분명하다. 근육 기능의 결핍은 근육 약화 및 쇠약을 특징으로 하며 삶의 질에 심각한 영향을 미치는 근이영양증(MD)을 생성한다. 가장 잘 특성화된 MD는 디스트로핀 관련 단백질 복합체(DAPC)의 구성원을 코딩하는 유전자의 돌연변이로부터 기인한다. 이러한 MD는 DAPC에 의한 근형질막-세포 골격 계류의 손실과 관련된 막 취약성으로부터 기인한다. 대조적으로, 다른 MD의 서브 세트는 근형질막 회복의 결함에 의해 유발되는 것으로 간주된다. 기계적 스트레스 때문에 근형질막은 수축 동안 경험하고, 심지어 건강한 근육은 손상된 막을 패치하기 위한 회복 메커니즘을 끊임없이 필요로 한다. 근형질막 패치 교정은 손상 부위에서 막 소포의 융합에 의존하고, 이 과정의 감쇠는 추정적으로 디스퍼린의 돌연변이에 의해 유발되는 디스퍼린병증인 MD의 주요 원인으로 간주된다.
최근에, 디스퍼린병증과 유사한 특징을 갖고 근형질막 병변을 특징으로 하는 새로운 MD는 ANO5(TMEM16E)의 열성 돌연변이와 연관되어 있다. ANO5 돌연변이는 지대(limb-girdle) 근이영양증 타입 2L(LGMD2L) 및 미요시(Miyoshi) 근병증 이영양증 타입 3(MMD3)을 생성한다. ANO5 돌연변이와 관련된 표현형은 가변적이지만, 전형적으로 질환은 근위부 하지 약화, 고혈청 크레아틴 키나제 수준, 비대칭 근육 위축 및 약화를 갖는 성인(20세 내지 50세)에서 존재하고, 전형적으로 디스퍼린병증과 유사한 전형적으로 근형질막 병변에 의해 동반된다(참조: Bolduc 등, American journal of human genetics 86, 213-221 (2010)), Hicks 등, Brain : a journal of neurology 134, 171-182 (2011), Bouquet 등, Revue neurologique 168, 135-141 (2012)). 지금까지, 약 72개의 ANO5 돌연변이가 MD 환자에서 보고되었고, 다른 공지된 LGMD 유전자에서 돌연변이가 결여된 LGMD 환자에서 ANO5 돌연변이에 대한 스크린은, ANO5 돌연변이가 LGMD의 보다 일반적인 원인 중의 하나일 수 있음을 나타낸다(참조: Bolduc 등, American journal of human genetics 86, 213-221 (2010)), Hicks 등, Brain : a journal of neurology 134, 171-182 (2011), Penttila 등, Neurology 78, 897-903 (2012)).
아녹타민/TMEM16 계열은 기능적으로 두 개의 카테고리로 나누어졌다. 창립 멤버인 ANO1(TMEM16A) 및 ANO2(TMEM16B)는 칼슘 활성화된 클로라이드 채널을 코딩하는 반면, 다른 ANO는 인지질 스크램블링(PLS)에서 그들의 역할이 동정되었다. 그러나, ANO5는 골격근의 새로운 기능을 제안하는데 있어서 이러한 두 개의 활성 중 어느 하나를 나타내는 것으로 밝혀지지 않았다. 이러한 새로움을 감안하면, ANO5 기능의 결함이 LGMD 표현형을 도출하는 방법, 구체적으로 왜 Ano5 돌연변이가 디스퍼린 관련 MD와 임상적으로 유사한 방식으로 나타나는지는 불분명하다.
아데노 관련 바이러스(AAV)는 복제 결핍 파보바이러스이고, 이의 일본쇄 DNA 게놈은 145 뉴클레오티드 역전된 말단 반복(ITR)을 포함하여 길이가 약 4.7kb이다. AAV의 여러 혈청형이 존재한다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다. 예를 들면, AAV 혈청형 2(AAV2) 게놈의 뉴클레오티드 서열은 문헌(참조: Ruffing 등, J Gen Virol , 75:3385-3392 (1994))에 의해 보정된 바와 같은 문g헌(참조: Srivastava 등, J Virol , 45: 555-564 (1983))에 제시된다. 다른 예로서, AAV-1의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_002077로 제공되고; AAV-3의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_1829로 제공되고; AAV-4의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_001829로 제공되고; AAV-5 게놈은 GenBank 수탁 번호 AF085716로 제공되고; AAV-6의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_00 1862로 제공되고; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부는 각각 GenBank 수탁 번호 AX753246 및 AX753249로 제공되고(참조: AAV-8에 관한 미국 특허 제7,282,199호 및 제7,790,449호); AAV-9 게놈은 문헌(참조: Gao 등, J. Virol., 78: 6381-6388 (2004))에 제공되고; AAV-10 게놈은 문헌(참조: Mol . Ther ., 13(1): 67-76 (2006))에 제공되고; AAV-11 게놈은 문헌(참조: Virology, 330(2): 375-383 (2004))에 제공된다. AAV rh.74 게놈의 서열은 본원에 제공된다. 바이러스 DNA 복제(rep), 이입/패키징 및 숙주 세포 염색체 통합을 지향하는 시스-작용 서열은 ITR 내에 함유된다. 3개의 AAV 프로모터(이들의 상대적 지도 위치에 대해 p5, p19 및 p40으로 명명됨)는 rep 및 cap 유전자를 코딩하는 두 개의 AAV 내부 개방 판독 프레임의 발현을 구동한다. 단일 AAV 인트론(예: AAV2 뉴클레오티드 2107 및 2227에서)의 차별적 스플라이싱과 결합된 두 개의 rep 프로모터(p5 및 p19)는 rep 유전자로부터 4개의 rep 단백질(rep 78, rep 68, rep 52 및 rep 40)의 생산을 초래한다. Rep 단백질은 궁극적으로 바이러스 게놈을 복제할 책임이 있는 여러 가지 효소 특성을 보유한다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되고, 이는 3개의 캡시드 단백질VP1, VP2 및 VP3을 코딩한다. 대안적인 스플라이싱 및 비-컨센서스 번역 개시 부위는 3개의 관련 캡시드 단백질의 생산을 담당한다. 단일 컨센서스 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 지도 위치 95에 위치한다. AAV의 라이프 사이클 및 유전학은 문헌(참조: Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992))에서 검토된다.
AAV는, 예를 들면, 유전자 요법에서, 외래 DNA를 세포에 전달하기 위한 벡터로서 매력적이도록 하는 독특한 특징을 보유한다. 배양물 중 세포의 AAV 감염은 비세포변성이고, 인간 및 다른 동물의 천연 감염은 조용하고 무증상성이다. 또한, AAV는 많은 포유동물 세포를 감염시켜 생체내에서 많은 상이한 조직의 표적화 가능성을 허용한다. 또한, AAV는 천천히 분열 및 비분열 세포를 형질도입하고, 그들 세포의 생존 기간 동안 본질적으로 전사 활성 핵 에피솜(염색체외 요소)으로서 유지할 수 있다. AAV 프로바이러스 게놈은 재조합 게놈의 구성을 가능하게 하는 플라스미드에서 클로닝된 DNA와 같이 감염성이다. 또한, AAV 복제, 게놈 이입 및 통합을 지시하는 신호가 AAV 게놈의 ITR 내에 함유되기 때문에, (복제 및 구조적 캡시드 단백질, rep-cap를 코딩하는) 게놈의 내부 약 4.3kb의 일부 또는 모두가 프로모터, 관심 있는 DNA 및 폴리아데닐화 신호를 함유하는 유전자 카세트와 같은 외래 DNA로 대체될 수 있다. rep 및 cap 단백질은 트랜스로 제공될 수 있다. AAV의 또 다른 중요한 특징은, 그것이 매우 안정적이고 원기 왕성한 바이러스라는 것이다. 이는 아데노 바이러스를 불활성화하는데 사용된 조건(몇 시간 동안 56 내지 65℃)을 쉽게 견뎌 AAV의 저온 보존을 덜 위험하게 한다. AAV는 심지어 동결건조시킬 수 있다. 최종적으로, AAV-감염 세포는 중복감염에 내성이 없다.
다수의 연구가 근육에서 장기간(> 1.5년) 재조합 AAV-매개 단백질 발현을 입증했다. 문헌(참조: Clark 등, Hum Gene Ther , 8: 659-669 (1997); Kessler 등, Proc Nat. Acad Sc . USA, 93: 14082-14087 (1996); 및 Xiao 등, J Virol, 70: 8098-8108 (1996))을 참조한다. 또한, 문헌(참조: Chao 등, Mol Ther, 2:619-623 (2000) 및 Chao 등, Mol Ther, 4:217-222 (2001))을 참조한다. 또한, 근육이 고도로 혈관화되기 때문에, 재조합 AAV 형질도입은 문헌(참조: Herzog 등, Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997) and Murphy 등, Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921-13926 (1997))에 기재된 바와 같이 근육내 주사 후 전신 순환에서 유전자 도입 생성물의 출현을 초래했다. 또한, 문헌(참조: Lewis 등, J Virol , 76: 8769-8775 (2002))은 골격 근섬유가 올바른 항체 글리코실화, 폴딩 및 분비에 필요한 세포 인자를 보유하여 근육이 분비된 단백질 치료제의 안정한 발현을 가능하게 함을 나타낸다는 것을 입증했다.
본원에 제시된 바와 같이, 마우스에서 Ano5 유전자의 파괴는 다수의 이영양증성 근육 조직병리학적 특징, 운동 불내성, 근형질막 회복 및 근육아세포 융합 결함을 생성한다. 또한, 제공된 데이터는, 이러한 결함이 ANO5에 의해 매개되는 세포 이하 막 및/또는 막 및/또는 근형질막 역학의 변화와 관련된다는 것을 입증한다. 본 발명은 근육 회복을 유도하고/하거나 MD를 치료하는 방법에서 Ano5 유전자를 발현시키는 AAV 벡터의 사용에 관한 것이다.
발명의 요약
본 발명은 ANO5 단백질 또는 이의 기능적 활성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터에 관한 것이다. 실시예 1 내지 4에 기재된 실험은 근육 재생 및 회복에서 Ano5의 본질적인 역할을 입증한다. ANO5의 손실은 근육에서 운동 불내성, 손상된 재생 및 증가된 크레아틴 키나제 수준이 변하는 완만한 조직병리학을 갖는 LGMD2L 환자를 상기시키는 마우스에서 이영양증 표현형을 유발한다. 미토콘드리아 이상은 젊은 및 나이든 Ano5 -/- 마우스 모두에서 관찰되었다. 전자 현미경 이미징을 통해 표시되는 미토콘드리아의 구조적 결함 이외에, 시트레이트 신타제 정량화 검정은 또한 미토콘드리아가 기능적 결함을 갖는다는 것을 입증했다. 시트레이트 신타제의 정량적 효소 분석은 손상된 미토콘드리아의 존재를 시사한다. 이러한 결과는, 미토콘드리아 이상이 아녹타민 5 단백질의 손실로 인한 2차적 효과일 수 있음을 시사한다. 본원에 기재된 실험은 인간 ANO5의 바이러스 발현에 의해 구제된 Ano5 -/- 섬유에서 근형질막 패치 회복의 감쇠를 입증하고, Ano5의 파괴가 1차 근아세포의 융해성 품질을 교란시킨다는 것을 발견한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 ANO5 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 AAV 벡터를 제공한다. ANO5 핵산은 Genbank 수탁 번호 NM_213599.2(서열번호 13)로서 규정된다. AAV 벡터에서 ANO5 단백질을 코딩하는 예시적 핵산 서열은 서열번호 1로서 규정된다. 본 발명의 재조합 벡터는 적어도 서열번호 1 또는 서열번호 13과 적어도 85% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 엄격한 조건하에 서열번호 1 또는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열로 하이브리드화하는 뉴클레오티드를 포함하거나 ANO5 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 서열번호 1 또는 서열번호 13의 핵산의 단편을 포함한다. 하나의 측면에서, 본 발명의 재조합 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 또는 AAV rh.74이다.
본 발명의 재조합 AAV 벡터는 PLS 활성에 관여하는 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 단편을 포함하고, 상기 단백질은 PLS 활성을 유지한다. 다른 구현예에서, AAV 벡터는 ANO5 활성을 유지하는 단백질을 코딩하는 서열번호 1 또는 서열번호 13의 단편을 포함한다.
본 발명의 재조합 AAV 벡터는, 예를 들면, 서열번호 1 또는 서열번호 13과 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% 또는 89%, 더욱 전형적으로 적어도 90%, 91%, 92%, 93% 또는 94%, 더욱 더 전형적으로 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 ANO5 활성을 유지하는 단백질을 코딩한다.
본 발명의 재조합 AAV 벡터는, 예를 들면, 서열번호 2와 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% 또는 89%, 더욱 전형적으로 적어도 90%, 91%, 92%, 93% 또는 94%, 더욱 더 전형적으로 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성인 ANO5 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 ANO5 활성을 유지하는 단백질을 코딩한다.
본 발명의 재조합 AAV 벡터는 엄격한 조건하에 서열번호 1 또는 서열번호 13의 핵산 또는 이의 상보체로 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이 단편은 약 5개 초과 뉴클레오티드, 바람직하게는 7개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 9개 초과 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 17개 초과 뉴클레오티드이다. 예를 들면, 선택적인 (즉, 특이적으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나로 혼성화하는) 15, 17 또는 20개 이상의 뉴클레오티드의 단편이 고려되고, 이들 단편은 ANO5 활성을 유지한다. 폴리뉴클레오티드로 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 프로브는 본 발명의 NTHi 폴리뉴클레오티드 서열을 동일한 계열의 유전자에서 다른 폴리뉴클레오티드 서열과 구별할 수 있거나, NTHi 유전자를 다른 세균 유전자와 구별할 수 있고, 바람직하게는 독특한 뉴클레오티드 서열에 기초한다.
용어 "엄격한"은 일반적으로 당업계에서 엄격한 것으로 이해되는 조건을 의미하기 위해 사용된다. 하이브리드화 엄격성은 온도, 이온 강도 및 포름아미드와 같은 변성제의 농도에 의해 주로 결정된다. 하이브리드화 및 세척을 위한 엄격한 조건의 예는 65 내지 68℃에서 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 나트륨 시트레이트 또는 42℃에서 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 나트륨 시트레이트 및 50% 포름아미드이다. 문헌(참조: Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989))을 참조한다. 더욱 엄격한 조건(예: 고온, 낮은 이온 강도, 높은 포름아미드 또는 다른 변성제)도 또한 사용될 수 있지만, 하이브리드화 속도가 영향을 받는다. 데옥시올리고뉴클레오티드의 하이브리드화가 관련되는 경우에, 추가의 예시적인 엄격한 하이브리드화 조건은 37℃(14-염기 올리고용), 48℃(17-염기 올리고용), 55℃(20-염기 올리고용), 및 60℃(23-염기 올리고용)에서 6x SSC 0.05% 피로인산나트륨에서의 세척을 포함한다.
다른 제제가 비특이적 및/또는 배경 하이브리드화를 감소시킬 목적으로 하이브리드화 및 세척 완충제에 포함될 수 있다. 다른 적합한 제제가 또한 사용될 수 있지만, 예는 0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% 폴리비닐-피롤리돈, 0.1% 피로인산나트륨, 0.1% 도데실황산나트륨, NaDodSO4, (SDS), 피콜, 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 초음파 처리된 연어 정자 DNA (또는 다른 비상보성 DNA) 및 덱스트란 설페이트이다. 이러한 첨가제의 농도 및 종류는 실질적으로 하이브리드화 조건의 엄격성에 영향을 미치지 않고 변경될 수 있다. 하이브리드화 실험은 일반적으로 pH 6.8-7.4에서 수행되지만, 전형적인 이온 강도 조건하에서, 하이브리드화 속도는 거의 pH에 무관하다. 문헌(참조: Anderson 등, Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Ch. 4, IRL Press Limited (Oxford, England))을 참조한다. 하이브리드화 조건은 이러한 변수들을 수용하고 상이한 서열 관련성의 DNA가 하이브리드를 형성하도록 하기 위해 당업자에 의해 조정될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명의 재조합 AAV 벡터는 근육 특이적 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들면, 근육 특이적 조절 요소는 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 근원세포 특이적 인핸서 결합 인자 MEF, 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서 요소(MCK), MCK의 삼중 카피(tMCK), 골격 속근(fast-twitch) 트로포닌 C 유전자 요소, 지근(slow-twitch) 심장 트로포닌 C 유전자 요소, 지근 트로포닌 I 유전자 요소, 저산소증 유도성 핵 인자, 스테로이드 유도성 요소 또는 글루코코르티코이드 반응 요소(GRE)이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 형질감염된 세포를 본 발명의 임의의 재조합 AAV 벡터로 배양하는 단계 및 형질감염된 세포의 상청액으로부터 재조합 AAV 입자를 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 AAV 벡터 입자를 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 임의의 재조합 AAV 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 재조합 AAV 벡터의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 근이영양증의 치료 방법을 제공한다. 하나의 측면에서, 이를 필요로 하는 대상체는 ANO5 유전자의 열성 돌연변이를 갖는다. 상기 방법은 디스퍼린 관련 근이영양증, 지대 근이영양증 타입 2L, 미요시 근병증 타입 3, 베스렘(Bethlem) 근병증, 칼파인병증, 데스민 근병증, 디스퍼린병증, 근원섬유 근병증, 사르코글리칸병증 또는 ZASP-관련 근병증을 치료할 수 있다. 또한, 근이영양증을 치료하기 위한 임의의 상기 방법은 항산화제 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들면, 항산화제 조성물은 코엔자임 Q10, 리포산, 비타민, 카로티노이드, 비타민 보조 인자, 미네랄, 폴리페놀 또는 플라보노이드 중 적어도 하나를 포함한다. 특히, 항산화제 조성물은 코엔자임 Q10, 리포산 및 비타민 E를 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 재조합 AAV 벡터의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 근육을 재생시키는 방법을 제공한다. 하나의 측면에서, 이를 필요로 하는 대상체는 ANO5 유전자의 열성 돌연변이를 갖는다. 다른 측면에서, 이를 필요로 하는 대상체는 근이영양증, 예를 들면, 디스퍼린 관련 근이영양증, 지대 근이영양증 타입 2L, 미요시 근병증 타입 3, 베스렘 근병증, 칼파인병증, 데스민 근병증, 디스퍼린병증, 근원섬유 근병증, 사르코글리칸병증 또는 ZASP-관련 근병증을 앓고 있다. 또한, 근육을 재생시키기 위한 임의의 상기 방법은 항산화제 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들면, 항산화제 조성물은 코엔자임 Q10, 리포산, 비타민, 카로티노이드, 비타민 보조 인자, 미네랄, 폴리페놀 또는 플라보노이드 중 적어도 하나를 포함한다. 특히, 항산화제 조성물은 코엔자임 Q10, 리포산 및 비타민 E를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 재조합 AAV 벡터의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 만성 근육 쇠약을 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 측면에서, 이를 필요로 하는 대상체는 ANO5 유전자의 열성 돌연변이를 갖는다. 다른 측면에서, 이를 필요로 하는 대상체는 근이영양증, 예를 들면, 디스퍼린 관련 근이영양증, 지대 근이영양증 타입 2L, 또는 미요시 근병증 타입 3, 베스렘 근병증, 칼파인병증, 데스민 근병증, 디스퍼린병증, 근원섬유 근병증, 사르코글리칸병증 또는 ZASP-관련 근병증을 앓고 있다. 또한, 만성 근육 쇠약을 치료하기 위한 임의의 상기 방법은 항산화제 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들면, 항산화제 조성물은 코엔자임 Q10, 리포산, 비타민, 카로티노이드, 비타민 보조 인자, 미네랄, 폴리페놀 또는 플라보노이드 중 적어도 하나를 포함한다. 특히, 항산화제 조성물은 코엔자임 Q10, 리포산 및 비타민 E를 포함한다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체의 근이영양증 또는 만성 근육 쇠약을 치료하기 위한, 본 발명의 임의의 재조합 AAV 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체의 근육 재생을 위한, 본 발명의 임의의 재조합 AAV 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 하나의 측면에서, 본 발명의 조성물은 ANO5 유전자의 열성 돌연변이를 갖는 대상체에게 투여된다. 다른 측면에서, 본 발명의 조성물은 근이영양증, 예를 들면, 디스퍼린 관련 근이영양증, 지대 근이영양증 타입 2L, 미요시 근병증 타입 3, 베스렘 근병증, 칼파인병증, 데스민 근병증, 디스퍼린병증, 근원섬유 근병증, 사르코글리칸병증 또는 ZASP-관련 근병증을 앓고 있는 대상체에게 투여된다. 본 발명의 임의의 조성물은 근육내 또는 정맥내 주사용으로 제형화된다. 본 발명의 임의의 조성물은 항산화제 조성물의 치료적 유효량을 추가로 포함한다. 예를 들면, 항산화제 조성물은 코엔자임 Q10, 리포산, 비타민, 카로티노이드, 비타민 보조 인자, 미네랄, 폴리페놀 또는 플라보노이드 중 적어도 하나를 포함한다. 특히, 항산화제 조성물은 코엔자임 Q10, 리포산 및 비타민 E를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체의 근이영양증 또는 만성 근육 쇠약 증후군 치료용 약제를 제조하기 위한, 본 발명의 임의의 재조합 AAV 벡터의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체의 근육 재생용 약제를 제조하기 위한, 본 발명의 임의의 재조합 AAV 벡터의 용도를 제공한다. 하나의 측면에서, 약제는 ANO5 유전자의 열성 돌연변이를 갖는 대상체에게 투여된다. 다른 측면에서, 본 발명의 약제는 근이영양증, 예를 들면, 디스퍼린 관련 근이영양증, 지대 근이영양증 타입 2L, 미요시 근병증 타입 3, 베스렘 근병증, 칼파인병증, 데스민 근병증, 디스퍼린병증, 근원섬유 근병증, 사르코글리칸병증 또는 ZASP-관련 근병증을 앓고 있는 대상체에게 투여된다. 본 발명의 임의의 약제는 근육내 또는 정맥내 주사용으로 제형화된다. 본 발명의 임의의 약제는 항산화제 조성물의 치료적 유효량을 추가로 포함한다. 예를 들면, 항산화제 조성물은 코엔자임 Q10, 리포산, 비타민, 카로티노이드, 비타민 보조 인자, 미네랄, 폴리페놀 또는 플라보노이드 중 적어도 하나를 포함한다. 특히, 항산화제 조성물은 코엔자임 Q10, 리포산 및 비타민 E를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에게 항산화제 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 근이영양증 또는 만성 근육 쇠약의 치료 방법을 제공한다. 항산화제 조성물은 코엔자임 Q10, 리포산, 비타민, 카로티노이드, 비타민 보조 인자, 미네랄, 폴리페놀 또는 플라보노이드 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 측면에서, 항산화제 조성물은 코엔자임 Q10, 리포산 및 비타민 E를 포함한다. 하나의 측면에서, 이를 필요로 하는 대상체는 ANO5 유전자의 열성 돌연변이를 갖는다. 다른 측면에서, 산화적 스트레스는 대상체의 골격근에서 감소된다. 다른 측면에서, 대상체의 골격근 기능은 향상된다. 다른 측면에서, 대상체는 디스퍼린 관련 근이영양증, 지대 근이영양증 타입 2L, 미요시 근병증 타입 3, 베스렘 근병증, 칼파인병증, 데스민 근병증, 디스퍼린병증, 근원섬유 근병증, 사르코글리칸병증 또는 ZASP-관련 근병증을 앓고 있다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에게 항산화제 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 근이영양증 또는 만성 근육 쇠약의 진행을 늦추는 방법을 제공한다. 항산화제 조성물은 코엔자임 Q10, 리포산, 비타민, 카로티노이드, 비타민 보조 인자, 미네랄, 폴리페놀 또는 플라보노이드 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 측면에서, 항산화제 조성물은 코엔자임 Q10, 리포산 및 비타민 E를 포함한다. 하나의 측면에서, 이를 필요로 하는 대상체는 ANO5 유전자의 열성 돌연변이를 갖는다. 다른 측면에서, 산화적 스트레스는 대상체의 골격근에서 감소된다. 다른 측면에서, 대상체의 골격근 기능은 향상된다. 다른 측면에서, 대상체는 디스퍼린 관련 근이영양증, 지대 근이영양증 타입 2L, 미요시 근병증 타입 3, 베스렘 근병증, 칼파인병증, 데스민 근병증, 디스퍼린병증, 근원섬유 근병증, 사르코글리칸병증 또는 ZASP-관련 근병증을 앓고 있다.
본 발명의 임의의 방법에서, 항산화제 조성물은 경구 투여된다. 본 발명의 임의의 방법에서, 항산화제는 동일 조성물로 투여되거나, 항산화제는 별개의 조성물로 투여된다. 항산화제는 별개로 그러나 동시에 투여된다. 또한, 본 발명의 임의의 방법에서, 항산화제는 별개의 시간에 또는 연속적으로 투여된다. 본 발명의 임의의 방법에서, 항산화제 조성물은 1일 1회, 매주 1회, 매주 2회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 매월 또는 2개월마다 1회 투여된다.
본 발명은 또한 항산화제 조성물의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 제공한다. 항산화제 조성물은 이를 필요로 하는 대상체의 근이영양증 또는 만성 근육 쇠약을 치료하기 위한 코엔자임 Q10, 리포산, 비타민, 카로티노이드, 비타민 보조 인자, 미네랄, 폴리페놀 또는 플라보노이드 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명은 또한 항산화제 조성물의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 제공한다. 항산화제 조성물은 이를 필요로 하는 대상체의 근이영양증 또는 만성 근육 쇠약의 진행을 늦추기 위한 코엔자임 Q10, 리포산, 비타민, 카로티노이드, 비타민 보조 인자, 미네랄, 폴리페놀 또는 플라보노이드 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 측면에서, 항산화제 조성물은 코엔자임 Q10, 리포산 및 비타민 E를 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명의 임의의 조성물은 ANO5 유전자의 열성 돌연변이를 갖는 대상체에게 투여된다. 다른 측면에서, 산화적 스트레스는 조성물의 투여 후 대상체의 골격근에서 감소된다. 다른 측면에서, 대상체의 골격근 기능은 조성물의 투여 후 향상된다. 다른 측면에서, 본 발명의 임의의 조성물은 근이영양증, 예를 들면, 디스퍼린 관련 근이영양증, 지대 근이영양증 타입 2L, 미요시 근병증 타입 3, 베스렘 근병증, 칼파인병증, 데스민 근병증, 디스퍼린병증, 근원섬유 근병증, 사르코글리칸병증 또는 ZASP-관련 근병증을 앓고 있는 대상체에게 투여된다. 또한, 본 발명의 임의의 조성물은 근육내 또는 정맥내 주사용으로 제형화된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 근이영양증 또는 만성 근육 쇠약 증후군 치료용 약제를 제조하기 위한, 항산화제 조성물의 용도를 제공한다. 본 발명의 임의의 약제 중의 항산화제 조성물은 코엔자임 Q10, 리포산, 비타민, 카로티노이드, 비타민 보조 인자, 미네랄, 폴리페놀 또는 플라보노이드 중 적어도 하나를 포함한다.
또한, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 근육을 재생시키기 위한 약제를 제조하기 위한, 항산화제 조성물의 용도를 제공한다. 본 발명의 임의의 조성물 중의 항산화제 조성물은 코엔자임 Q10, 리포산, 비타민, 카로티노이드, 비타민 보조 인자, 미네랄, 폴리페놀 또는 플라보노이드 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 측면에서, 항산화제 조성물은 코엔자임 Q10, 리포산 및 비타민 E를 포함한다.
또한, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 근이영양증 또는 근육 쇠약 증후군의 진행을 늦추기 위한 약제를 제조하기 위한, 항산화제 조성물의 용도를 제공한다. 본 발명의 임의의 약제 중의 항산화제 조성물은 코엔자임 Q10, 리포산, 비타민, 카로티노이드, 비타민 보조 인자, 미네랄, 폴리페놀 또는 플라보노이드 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 측면에서, 항산화제 조성물은 코엔자임 Q10, 리포산 및 비타민 E를 포함한다.
본 발명의 임의의 약제는 ANO5 유전자의 열성 돌연변이를 갖는 대상체에게 투여된다. 다른 측면에서, 산화적 스트레스는 대상체의 골격근에서 감소된다. 다른 측면에서, 대상체의 골격근 기능이 개선된다. 다른 측면에서, 본 발명의 임의의 약제는 근이영양증, 예를 들면, 디스퍼린 관련 근이영양증, 지대 근이영양증 타입 2L, 미요시 근병증 타입 3, 베스렘 근병증, 칼파인병증, 데스민 근병증, 디스퍼린병증, 근원섬유 근병증, 사르코글리칸병증 또는 ZASP-관련 근병증을 앓고 있는 대상체에게 투여된다. 또한, 본 발명의 임의의 약제는 근육내 또는 정맥내 주사용으로 제형화된다.
일부 구현예에서, 항산화제 조성물은 경구 투여된다. 일부 측면에서, 항산화제는 동일 조성물에 존재한다. 다른 측면에서, 항산화제는 별개의 조성물에 존재한다. 일부 측면에서, 항산화제 조성물의 항산화제는 동시에 투여된다. 일부 측면에서, 항산화제 조성물의 항산화제는 별개의 시간에 또는 연속적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 항산화제 조성물은 1일 1회, 매주 1회, 매주 2회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 매월 또는 2개월마다 1회 투여된다.
도 1a 내지 1d는 Ano5 -/ - 마우스 모델의 생성을 도시한다. 패널 (a)는 외인성 인트론 및 폴리아데닐화 종결 신호를 갖는 lacZ-인코딩 엑손을 포함하는 Ano5 표적화 벡터를 나타낸다. 생성되는 mRNA는 엑손 8로 종결된다. 패널 (b)는 한배 새끼의 꼬리 절단물로부터 단리된 게놈 DNA를 나타낸다. 레인 1- 야생형(WT) 마우스, 레인 2 Ano5 +/- 마우스, 레인 3 Ano5 -/- 마우스, WT대립 유전자-300 bp 단편, Ano5 대립 유전자 - 200 bp 단편. 패널 (c)는 Ano5를 표적화하는 두 개의 프라이머 세트를 사용하여 Ano5 -/- 근육 조직 중 Ano5 전사물의 증거가 없음을 나타내는 RT-PCR로부터의 생성물을 나타낸다. 레인 1: GAPDH 대조군; 레인 2 엑손 10-14에 걸친 e10-14 프라이머; 레인 3 엑손 17-20에 걸친 e17-20 프라이머. 패널 (d)는 RNA 수준에서 ANO5의 >99% 상대적 발현 감소가 Ano5 -/- 마우스(P <0.001)로부터 추출된 사두근(QD), 비복근(GAS) 및 전경골근(TA) 근육에서 qRT-PCR을 통해 확인되었음을 입증한다.
도 2a 내지 2f는 Ano5 -/- 결핍 마우스의 특성화를 도시한다. 패널 (a)는 혈청 크레아틴 키나제가 9개월에 Ano5 -/- 마우스에서 상당히 증가된다(P<0.05, t-테스트)는 것을 입증한다. 패널 (b)는, 9개월령 Ano5 -/- 마우스의 횡경막 스트립의 특정 수축력이 대조군에 비해 상당히 감소되었다(P<0.01, t-테스트)는 것을 입증한다. 패널 (c)는 9개월 Ano5 -/- 마우스로부터의 EDL 및 전경골근(TA) 근육의 특정 수축력이 대조군과 유의한 차이가 없었다(P>0.05, t-테스트)는 것을 입증한다. 패널 (d)는 WT 대조군과 비교하여 Ano5 -/- 마우스의 TA 및 GAS에서의 중심 핵, 섬유 크기 변동성 및 괴사 영역을 포함하는 완만한 이영양증 병리를 나타내는 헤마톡실린 및 에오신 염색 조직 절편을 묘사한다. 기준자 = 50㎛. 패널 (e)는 특히 GAS 근육(P<0.0001, t-테스트)에서 WT와 비교하여 섬유 직경 크기의 감소를 나타내는 마우스 섬유 직경 측정치를 제공한다. 패널 (f)는, Ano5 -/- 마우스가 트레드밀 고갈 연구가 수행되었을 때 빈번한 일시 중지를 입증했다는 것을 나타낸다.
도 3a 내지 3e는 Ano5 -/- 마우스의 생리적 특성을 제공한다. 패널 (a) 락트산 수준은 트레드밀 작동(P=0.15) 후 WT 대조군과 비교하여 Ano5 -/- 마우스에서 크게 감소되었다. 패널 (b) 근육의 전기생리학적 특성. CMAP 진폭은 Ano5 -/- (45.1±2.2 mV) 및 WT (40.8±2.4 mV)(p=0.22)에서 유의하게 차이나지 않았다. 어떤 Ano5-/- 또는 WT 동물도 세동 잠재력을 입증하지 않았다. 패널 (c-e) 50kHz에서 근육의 임피던스 특성(각각, 위상; 리액턴스; 저항). Ano5 -/-(31.0±2.7; 248.1±37.8 Ω; 411.4±34.6 Ω) 및 WT 섬유(31.7±3.9; 269.0±83.9 Ω; 424.3±73.9 Ω)(위상: p=0.59; 리액턴스: p=0.44; 저항: p=0.59) 사이에는 차이가 없었다. 100kHz에서 Ano5 -/-(36.5±2.4; 216.2±27.3 Ω; 290.7±22.0 Ω) 및 WT 섬유(37.0±4.8; 228.4±63.9 Ω; 295.8±36.1 Ω)(위상: p=0.77; 리액턴스: p=0.55; 저항: p=0.68) 사이에서 차이는 관찰되지 않았다.
도 4a 내지 4g는 Ano5 -/- 근육의 세포내 조직병리학을 제공한다. 패널 (a)는 10 mo Ano5 -/- 및 WT TA 근육의 고모리 삼색 염색을 제공한다. Ano5 -/- 근육은 막 응집체를 함유한다(화살표). 기준자 = 20㎛. 패널 (b)는 WT (p<0.0001, 일원 ANOVA)과 비교하여 Ano5 -/- 의 TA 및 GAS 근육에서 응집체를 함유하는 다수의 섬유의 정량화를 제공한다. 패널 (c,d)는 Ano5 -/- 근육에서 막 응집체의 존재를 입증하는 전자 현미경 이미지를 제공한다. 응집체는 퍼지 내부 관을 갖는 느슨하게 포장된 상호연결성 관 형성(백색 화살표)이거나 소포 또는 관형 막의 치밀하게 충전된 축적(블랙 화살표)이었다. 기준자 = 500nm. 패널 (e)는 미토콘드리아의 근형질막 아래 축적(화살표) 및 퇴화성 미토콘드리아(별표)가 Ano5 -/- 근육에서 전자 현미경으로 자주 동정되었음을 입증한다. 기준자 = 500nm (좌측) 및 2㎛ (우측). 패널 (f)는 WT에 존재하지 않는 캡핑된 섬유 및 근형질막 증식을 나타내는 10 mo Ano5 -/- TA 근육의 석시네이트 데하이드로게나제 염색을 제공한다. 기준자 = 10㎛. 패널 (g)는 석시네이트 데하이드로게나제(SDH) 염색된 10 mo Ano5 -/- 마우스의 TA 근육의 냉동절편을 제공한다. 화살표는 SDH로 염색되지 않은 응집체를 나타낸다(좌측). 10 mo Ano5 -/- 마우스의 연속 절편은 삼색 염색으로 관찰된 다수의 막 응집체(백색 화살표)가 SERCA1에 대해 양성(우측)으로 그들이 근형질 세망으로부터 유래된다는 것을 시사함을 입증한다. 기준자 = 40㎛.
도 5a 내지 5e는 막 회복이 Ano5 -/- 마우스에서 결함이 있음을 입증한다. 패널 (a)는 손상 후 5초 및 190초에 제시된 레이저 펄스로 손상된 Ano5 -/- 및 WT 근섬유의 이미지를 제공한다. 적색 화살표는 WT와 비교하여 Ano5 -/- 근육에서 빠르게 축적되는 FM1-43 염료에 의한 손상 부위를 나타낸다. 기준자 = 50㎛. 패널 (b)는 레이저 유발 손상 후 형광 강도의 측정치를 제공한다. Ano5 -/- 근육은 손상 후 > 100초의 모든 시점에서 WT 및 AAV.ANO5 섬유와 통계적으로 상이하다(2원 ANOVA, P<0.001). 패널 (c)는 5 x1010 vg AAV.ANO5.FLAG 벡터가 주사된 Ano5 -/- 근육에서 ANO5-FLAG의 발현을 나타낸다. 항-FLAG 항체에 의한 면역형광은 처리되지 않은 Ano5 -/- 근육(하부)에 존재하지 않은 처리된 근육(상부)의 세포 표면에서 ANO5-FLAG 발현을 입증했다. 기준자 = 40㎛. 패널 (d)는 심장독 유발 근육 손상으로부터 회복을 입증한다. 심장독 주사 후 1일, 3일, 7일, 14일, 30일 및 90일 후에 WT 및 Ano5 -/- TA 근육의 헤마톡실린 및 에오신 염색된 조직 절편(3일, 7일, 14일 및 30일이 도시됨). Ano5 -/- 근육은 WT와 비교하여 더 많은 손상을 입었고 재생에서 장애를 나타냈다. 패널 (e)는 심장독 주사 후 30일(심장독 D30) 및 90일(심장독 D90)에 근섬유 크기가 WT와 비교하여 Ano5 -/- 근육에서 통계적으로 더 작게 유지된다(P<0.05, t-테스트)는 것을 입증한다.
도 6은 항산화제 요법 또는 플라시보 다이어트로 처리된 Ano5 -/- 마우스의 자발적인 활동을 입증한다. 그래프는 12주 및 16주 동안 항산화제 다이어트 또는 플라시보 대조군을 투여한 Ano5 -/- 마우스의 자발적 활동(마우스가 45분 동안 수평 및/또는 수직 레이저 빔을 끊은 횟수)을 나타낸다. 삼중 항산화제 요법으로 처리된 Ano5 -/- 마우스는 16주에 처리된 플라시보와 비교하여 활성이 상당히 증가되었다.
도 7은 삼중 항산화제 요법 또는 플라시보 다이어트를 투여한 Ano5 -/- 및 플라시보 다이어트에 대한 WT 대조군 마우스의 횡경막에 대한 특이적 힘 측정치를 도시한다. 삼중 항산화제 요법으로 처리된 Ano5 -/- 마우스는 16주에 처리된 위약과 비교하여 상당히 증가된 횡경막 특이적 힘을 나타냈다.
도 8a 및 8b는 삼중 항산화제 요법 미토콘드리아 생합성 및 기능의 효과를 입증한다. 남성 비복근 조직은 삼중 항산화제 공급 마우스에서 미토콘드리아 생합성 마커, 미토콘드리아 생합성 PGC -1a 발현 및 시트레이트 신타제 활성을 측정하는데 사용했다. 패널 (a)는 삼중 항산화제 요법 또는 플라시보 다이어트를 투여한 마우스의 PGC -1a 발현을 도시한다. 패널 (b)는 삼중 항산화제 요법 또는 플라시보 다이어트를 투여한 남성 및 여성 Ano5 -/- 및 WT 마우스의 시트레이트 신타제(CS) 활성을 도시한다.
ANO5는 근육 회복에 필수적인 역할을 하고, 본 발명은 MD 치료용 ANO5를 포함하는 AAV 벡터를 제공한다. ANO5의 분열은 뮤린 모델에서 디스퍼린 발현의 손실을 면밀하게 표현형복사하고, 디스퍼린 돌연변이는 ANO5 근병증과 유사한 MD를 유도한다(지대 근이영양증 2B(LGMD2B) 및 미요시 근병증 이영양증 1(MMD1) 대 지대 근이영양증 2L(LGMD2L) 및 미요시 근병증 이영양증 3(MMD3)).
Ano5 -/- 마우스는 ANO5-근병증, 근형질막 복구 및 근원성 세포 융합 연구용으로 중요한 모델을 나타낸다. 이하 실시예에 제공된 실험적 증거는 Ano5 -/- 마우스의 AAV.ANO5-FLAG 치료를 통해 막 복구 표현형을 부분적으로 구제함으로써 ANO5-근병증의 치료 전략으로서 유전자 대체 요법을 위한 방법을 지원한다.
AAV
본원에 사용된 용어 "AAV"는 아데노-관련 바이러스의 표준 약어이다. 아데노-관련 바이러스는 특정 기능이 공동 감염성 헬퍼 바이러스에 의해서 제공되는 세포에서만 성장하는 일본쇄 DNA 파로바이러스이다. 현재, 이하 표 1에 나타낸 바와 같이, 특성화된 AAV의 13개의 혈청형이 존재한다. AAV의 일반적인 정보 및 검토는, 예를 들면, 문헌(참조: Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169-228, and Berns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press, (New York))에서 찾을 수 있다. 그러나, 다양한 혈청형이 심지어 유전자 수준에서 구조적으로, 그리고 기능적으로 매우 밀접하게 관련되어 있다는 것이 익히 공지되어 있기 때문에, 이러한 동일한 원칙이 추가의 AAV 혈청형에 적용가능 할 것으로 완전 예상된다. 예를 들면, 문헌(Blacklowe, 1988, pp. 165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; and Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974)))을 참조한다). 예를 들면, 모든 AAV 혈청형은 상동성 rep 유전자에 의해 매개되는 매우 유사한 복제 성질을 나타내고, 모두 AAV2에서 발현된 것들과 같은 3개의 관련된 캡시드 단백질을 보유한다. 관련성의 정도는 게놈의 길이에 따르는 혈청형 사이에 광범위한 교차-하이브리드화를 나타내는 이형접합자 분석(heteroduplex analysis) 및 "역전된 말단 반복 서열"(ITR)에 상응하는 말단에서 유사한 자기 어닐링 세그먼트의 존재에 의해 추가로 시사된다. 유사한 감염 패턴은 또한 각 혈청형의 복제 기능이 유사한 규제 조절하에 있음을 시사한다.
본원에 사용된 "AAV 벡터"는 AAV 말단 반복 서열(ITR)에 인접하는 하나 이상의 관심 있는 폴리뉴클레오티드 (또는 도입 유전자)를 포함하는 벡터를 의미한다. 이러한 AAV 벡터는 복제되고 rep 및 cap 유전자 산물을 코딩하고 발현하는 벡터로 형질감염된 숙주 세포에 존재할 때 감염성 바이러스 입자 내로 패키징될 수 있다.
"AAV 비리온" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 이입된 폴리뉴클레오티드 AAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 의미한다. 입자가 이종성 폴리뉴클레오티드(즉, 포유동물 세포로 전달되는 도입 유전자와 같은 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 경우, 이는 전형적으로 "AAV 벡터 입자" 또는 간단히 "AAV 벡터"로서 지칭된다. 따라서, AAV 벡터 입자의 생산은 반드시 AAV 벡터의 생산을 포함하는데, 이는 이러한 벡터가 AAV 벡터 입자에 함유되어 있기 때문이다.
AAV 벡터는 AAV 5' 역전된 말단 반복(ITR) 서열 및 전사 조절 요소, 즉 하나 이상의 프로모터 및/또는 인핸서에 작동가능하게 연결된 단백질 코딩 서열에 인접하는 AAV 3' ITR, 및 폴리아데닐화 서열 및, 임의로, 단백질 코딩 서열의 엑손 사이에 삽입된 하나 이상의 인트론을 갖는 일본쇄 또는 이본쇄 핵산일 수 있다. 일본쇄 AAV 벡터는 AAV 바이러스 입자의 게놈에 존재하는 핵산을 의미하고, 본원에 개시된 핵산의 센스 스트랜드 또는 안티센스 스트랜드일 수 있다. 이러한 일본쇄 핵산의 크기는 염기로 제공된다. 이본쇄 AAV 벡터는 플라스미드의 DNA, 예를 들면, pUC19, 또는 AAV 벡터 핵산을 발현시키거나 이동시키는데 사용된 이본쇄 바이러스, 예를 들면, 바쿨로 바이러스의 게놈에 존재하는 핵산을 의미하다. 이러한 이본쇄 핵산의 크기는 염기쌍(bp)으로 제공된다.
본원에 사용된 용어 "역전된 말단 반복((ITR)"은 DNA 복제의 기원 및 바이러스 게놈의 패키징 신호로서 시스에서 기능하는 AAV 게놈의 5' 및 3' 말단에서 ㅂ바발견되는 당해 기술 분야 인식된 영역을 의미한다. AAV rep 코딩 영역과 함께 AAV ITR은 2개의 인접하는 ITR 사이에 삽입된 뉴클레오티드 서열의 효율적인 절제를 제공하고, 이로부터 구제하고, 숙주 세포 게놈에 통합시킨다. 특정 AAV-관련 ITR의 서열은 전문이 본원에 참조로 인용된 문헌(참조: Yan 등, J. Virol. 79(1):364-379 (2005))에 개시된다.
"전사 조절 요소"는 RNA 폴리머라제 결합을 돕고 발현을 촉진시키기 위해 전사 인자의 결합을 위한 프로모터, 플러스 반응 요소, 활성화제 및 인핸서 서열을 포함하는 유전 전사의 조절에 관여하는 유전자의 뉴클레오티드 서열, 및 RNA 폴리머라제 부착을 차단하고 발현을 예방하기 위해 억제 단백질이 결합하는 작동자 또는 사일런스 서열을 의미한다.
AAV "rep" 및 "cap" 유전자는 각각 복제 및 이입 단백질을 코딩하는 유전자이다. AAV rep 및 cap 유전자는 지금까지 시험된 모든 AAV 혈청형에서 발견되었고, 본원 및 인용된 참조문헌에 기재된다. 야생형 AAV에서, rep 및 cap 유전자는 일반적으로 바이러스성 게놈에서 서로 인접하여 발견되고(즉, 그들은 인접 또는 중첩 전사 단위로서 함께 "결합된다"), 그들은 일반적으로 AAV 혈청형 사이에 보존된다. AAV rep 및 cap 유전자는 또한 개별적으로 및 집단적으로 "AAV 패키징 유전자"로서 지칭된다. 본 발명에 따르는 AAV cap 유전자는 rep 및 아데노 헬퍼 기능의 존재하에 AAV 벡터를 패키징할 수 있고 표적 세포 수용체를 결합할 수 있는 Cap 단백질을 코딩한다. 일부 구현예에서, AAV cap 유전자는 특정 AAV 혈청형, 예를 들면, 표 1에 제시된 혈청형 및 AAV rh.74(참조: 미국 특허 제9,434,928호)로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 캡시드 단백질을 코딩한다. rAAV 변이체의 다른 유형, 예를 들면, 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV도 또한 고려된다. 예를 들면, 문헌(참조: Marsic 등, Mol Ther, 22(11): 1900-1909 (2014))을 참조한다.
Figure pct00001
AAV의 생산용으로 사용된 AAV 서열은 임의의 AAV 혈청형의 게놈으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, AAV 혈청형은 아미노산 및 핵산 수준에서 유의한 상동성의 게놈 서열을 갖고, 유사한 세트의 유전 기능을 제공하고, 물리적으로 그리고 기능적으로 실질적으로 등가인 비리온을 생성하고, 실질적으로 동일한 메커니즘에 의해 복제하고 조립한다. AAV 혈청형의 게놈 서열 및 게놈 유사성의 논의에 대해, 예를 들면, 문헌(참조: GenBank 수탁 번호 U89790; GenBank 수탁 번호 J01901; GenBank 수탁 번호 AF043303; GenBank 수탁 번호 AF085716; Chlorini 등, J. Vir. 71: 6823-33(1997); Srivastava 등, J. Vir. 45:555-64 (1983); Chlorini 등, J. Vir. 73:1309-1319 (1999); Rutledge 등, J. Vir. 72:309-319 (1998); and Wu 등, J. Vir. 74: 8635-47 (2000))을 참조한다.
모든 공지된 AAV 혈청형의 게놈 구조는 매우 유사하다. AAV의 게놈은 길이가 약 5,000 뉴클레오티드(nt) 미만인 선형의 일본쇄 DNA 분자이다. 역전된 말단 반복(ITR)은 비구조적 복제(Rep) 단백질 및 구조적(VP) 단백질의 독특한 코딩 뉴클레오티드 서열에 인접한다. VP 단백질은 캡시드를 형성한다. 말단 145 nt는 자기 상보성이고, T자형 헤어핀을 형성하는 에너지적으로 안정한 분자내 이합체가 형성될 수 있도록 구성된다. 이러한 헤어핀 구조는 바이러스 DNA 복제의 기원으로 기능하여 세포 DNA 폴리머라제 복합체의 프라이머로서 작용한다. Rep 유전자는 Rep 단백질, Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40을 코딩한다. Rep78 및 Rep68은 p5 프로모터로부터 전사되고, Rep 52 및 Rep40은 p19 프로모터로부터 전사된다. cap 유전자는 VP 단백질, VP1, VP2 및 VP3을 코딩한다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 전사된다.
일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 특정 세포 유형, 예를 들면, Sf9 또는 HEK 세포에서 발현을 위한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 곤충 숙주 세포 또는 포유동물 숙주 세포에서 외래 유전자를 발현시키기 위한 당업자에게 공지된 기술은 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다. 곤충 세포에서 폴리펩티드의 분자 유전자 조작 및 발현의 방법론은, 예를 들면, 문헌(참조: Summers and Smith. 1986. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555, College Station, Tex.; Luckow. 1991. In Prokop 등, Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152; King, L. A. and R. D. Possee, 1992, The baculovirus expression system, Chapman and Hall, United Kingdom; O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckow, 1992, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York; W.H. Freeman and Richardson, C. D., 1995, Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39; U.S. Pat. No. 4,745,051; US2003148506; 및 WO 03/074714)에 기재된다. AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사에 특히 적합한 프로모터는, 예를 들면, 다면체 프로모터이다. 그러나, 곤충 세포에서 활성인 다른 프로모터는 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, p10, p35 또는 IE-1 프로모터 및 상기 참조문헌에 기재된 추가의 프로모터도 또한 고려된다.
이종성 단백질의 발현을 위한 곤충 세포의 사용은, 핵산, 예를 들면, 벡터, 예를 들면, 곤충 세포 적합성 벡터를 이러한 세포로 도입하는 방법 및 이러한 세포를 배양물에 유지시키는 방법과 같이, 충분히 문서화되어 있다. 예를 들면, 문헌(참조: METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed. Richard, Humana Press, NJ (1995); O'Reilly 등, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS, A LABORATORY MANUAL, Oxford Univ. Press (1994); Samulski 등, J. Vir. 63:3822-8 (1989); Kajigaya 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-50 (1991); Ruffing 등, J. Vir. 66:6922-30 (1992); Kirnbauer 등, Vir. 219:37-44 (1996); Zhao 등, Vir. 272:382-93 (2000); 및 Samulski 등, 미국 특허 제6,204,059호)을 참조한다. 일부 구현예에서, 곤충 세포에서 AAV를 코딩하는 핵산 작제물은 곤충 세포 적합성 벡터이다. 본원에 사용된 "곤충 세포 적합성 벡터" 또는 "벡터"는 곤충 또는 곤충 세포의 생산성 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 예시적인 생물학적 벡터는 플라스미드, 선형 핵산 분자 및 재조합 바이러스를 포함한다. 임의의 벡터는 그것이 곤충 세포 적합성인 한 사용될 수 있다. 벡터는 곤충 세포 게놈에 통합될 수 있지만, 곤충 세포에서 벡터의 존재는 영구적일 필요는 없고, 일시적인 에피솜 벡터도 또한 포함된다. 벡터는 공지된 임의의 수단, 예를 들면, 세포의 화학적 처리, 전기천공 또는 감염에 의해 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 바쿨로 바이러스, 바이러스성 벡터 또는 플라스미드이다. 보다 바람직한 구현예에서, 벡터는 바쿨로 바이러스이다. 즉, 작제물은 바쿨로 바이러스 벡터이다. 바쿨로 바이러스 벡터 및 이들의 사용 방법은 곤충 세포의 분자 유전자 조작에 대한 상기 인용된 참조문헌에 기재되어 있다.
바쿨로 바이러스는 절지동물의 포위된 DNA 바이러스이고, 이의 두 구성원은 재조합 단백질을 세포 배양물에서 생산하기 위한 익히 공지된 발현 벡터이다. 바쿨로 바이러스는 거대한 게놈 함량이 특정 세포로 전달되도록 유전자 조작될 수 있는 원형의 이본쇄 게놈(80-200 kbp)을 갖는다. 벡터로서 사용된 바이러스는 일반적으로 오토그라파 캘리포니아 멀티캡시드 핵다각체바이러스(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus; AcMNPV) 또는 봄빅스 모리(Bombyx mori; (Bm)NPV))이다(참조: Kato 등, 2010).
바쿨로 바이러스는 일반적으로 재조합 단백질의 발현을 위한 곤충 세포의 감염용으로 사용된다. 특히, 곤충에서 이종성 유전자의 발현은, 예를 들면, 문헌(참조: 미국 특허 제4,745,051호; Friesen 등 (1986); EP 제127,839호; EP 제155,476호; Vlak 등 (1988); Miller 등 (1988); Carbonell 등 (1988); Maeda 등 (1985); Lebacq-Verheyden 등 (1988); Smith 등 (1985); Miyajima 등 (1987); 및 Martin 등 (1988))에 기재된 바와 같이 달성될 수 있다. 다수의 바쿨로 바이러스 균주 및 변이체 및 단백질 생산용으로 사용될 수 있는 상응하는 허용 곤충 숙주 세포는 문헌(참조: Luckow 등 (1988), Miller 등 (1986); Maeda 등 (1985) and McKenna (1989))에 기재되어 있다.
하나의 측면에서, 본 발명은 rAAV 게놈을 제공한다. rAAV 게놈은 ANO5 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 인접하는 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. 폴리뉴클레오티드가 ANO5 단백질을 코딩하면, 폴리뉴클레오티드는 유전자 카세트를 형성하기 위해 표적 세포, 예를 들면, 근육 세포에서 기능적인 전사 조절 DNA, 구체적으로 프로모터 DNA 및 폴리아데닐화 신호 서열 DNA에 작동 가능하게 연결된다. 유전자 카세트는 또한 포유동물 세포에서 발현될 때 RNA 전사물의 처리를 촉진시키기 위해 인트론 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, AAV 게놈은 ANO5 유전자의 하나 이상의 엑손, 예를 들면, ANO5의 엑손 8 및 엑손 9에 인접하는 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. AAV 게놈은 또한 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 인트론, 리포트 유전자, 예를 들면, Lac-Z β-갈락토시다제 또는 네오마이신 내성 유전자, CRE-Lox 재조합 부위, 예를 들면, Lox P, 및 내부 리보솜 진입 부위(IRE S).
재조합 AAV를 생산하는 방법
본 발명은 곤충 또는 포유동물 세포에서 재조합 AAV를 생산하기 위한 재료 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 바이러스 작제물은 관심 있는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 가능하게 하는 프로모터 및 프로모터의 제한 부위 하류를 추가로 포함하고, 여기서 프로모터 및 제한 부위는 5' AAV ITR의 하류 및 3' AAV ITR의 상류에 위치된다. 일부 구현예에서, 바이러스 작제물은 제한 부위의 전사 후 조절 요소 하류 및 3' AAV ITR의 상류를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 작제물은 제한 부위에 삽입되고 프로모터와 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 관심 있는 단백질의 코딩 영역을 포함한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 본원에 개시된 AAV 벡터 중의 어느 하나는 재조합 AAV를 생산하기 위한 바이러스 작제물로서 방법에 사용될 수 있다. DNA 플라스미드는 rAAV 게놈을 감염성 바이러스 입자로 조립하기 위한 AAV의 헬퍼 바이러스(예: 아데노바이러스 E1-결실된 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스)로 감염시킬 수 있는 세포로 전달된다. 패키징될 AAV 게놈, rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능이 세포에 제공되는 rAAV 입자를 생산하는 기술은 당업계에서 표준이다. rAAV의 생산은 다음 성분이 단일 세포(본원에서 패키징 세포로서 표시됨) 내에 존재한다는 것을 필요로 한다: rAAV 게놈, rAAV 게놈으로부터 분리된(즉, 이에 없는) AAV rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능.
일부 구현예에서, 헬퍼 기능은 아데노 바이러스 또는 바쿨로 바이러스 헬퍼 유전자를 포함하는 하나 이상의 헬퍼 플라스미드 또는 헬퍼 바일러스에 의해 제공된다. 아데노 바이러스 또는 바쿨로 바이러스 유전자의 비제한적인 예는 AAV 패키징에 헬퍼 기능을 제공할 수 있는 E1A, E1B, E2A, E4 및 VA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
AAV의 헬퍼 바이러스는 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 아데노비리대(Adenoviridae) 계열 및 헤르페스비리대(Herpesviridae) 계열의 바이러스를 포함한다. AAV의 헬퍼 바이러스의 예는 미국 공보 제20110201088호(이의 개시는 본원에 참조로 인용된다)에 기재된 SAdV-13 헬퍼 바이러스 및 SAdV-13-유사 헬퍼 바이러스, 헬퍼 바이러스 pHELP(Applied Viromics)를 포함한다. 당업자는 AAV에 적당한 헬퍼 기능을 제공할 수 있는 AAV의 임의의 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드가 본원에서 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, AAV cap 유전자는 플라스미드에 존재한다. 플라스미드는 AAV rep 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 임의의 AAV 혈청형(AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV rh.74 및 이의 임의의 변이체를 포함하지만, 이에 한정되지 않음)으로부터 cap 유전자 및/또는 rep 유전자는 재조합 AAV를 생성하기 위해 본원에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV cap 유전자는 혈청형 1, 혈청형 2, 혈청형 4, 혈청형 5, 혈청형 6, 혈청형 7, 혈청형 8, 혈청형 9, 혈청형 10, 혈청형 11, 혈청형 12, 혈청형 13 또는 이의 변이체로부터의 캡시드를 코딩한다.
일부 구현예에서, 곤충 또는 포유동물 세포는 헬퍼 플라스미드 또는 헬퍼 바이러스, 바이러스 작제물 및 AAV cap 유전자를 코딩하는 플라스미드로 형질감염될 수 있고; 재조합 AAV 바이러스는 공동형질감염 후 다양한 시점에서 수집될 수 있다. 예를 들면, 재조합 AAV 바이러스는 공동형질감염 후 12시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 72시간, 약 96시간, 약 120시간 또는 임의의 이러한 두 시점 사이의 시간에 수집될 수 있다.
재조합 AAV는 또한 감염성 재조합 AAV를 생성하는데 적합한 당해 기술 분야에 공지된 임의의 통상적 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 일부 예에서, 재조합 AAV는 AAV 입자 생산에 필요한 성분의 일부를 안정하게 발현시키는 곤충 또는 포유동물 세포를 사용함으로써 생성될 수 있다. 예를 들면, AAV rep 및 cap 유전자를 포함하는 플라스미드 (또는 복수의 플라스미드) 및 선택가능한 마커, 예를 들면, 네오마이신 내성 유전자는 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 이어서, 곤충 또는 포유동물 세포는 헬퍼 바이러스(예: 헬퍼 기능을 제공하는 아데노 바이러스 또는 바쿨로 바이러스) 및 5' 및 3' AAV ITR을 포함하는 바이러스 벡터 (및, 경우에 따라, 이종 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 공동 감염될 수 있다. 이 방법의 이점은 세포가 선택가능하고, 재조합 AAV의 대규모 생산에 적합하다는 것이다. 다른 비제한적인 예로서, 플라스미드 이외의 아데노 바이러스 또는 바쿨로 바이러스는 rep 및 cap 유전자를 패키징 세포로 도입하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 5' 및 3' AAV LTR를 함유하는 바이러스 벡터 및 rep-cap 유전자는 모두 생산자 세포의 DNA로 안정하게 통합될 수 있고, 헬퍼 기능은 재조합 AAV를 생성하기 위한 야생형 아데노 바이러스에 의해 제공될 수 있다.
패키징 세포를 생성하는 방법은 AAV 입자 생산에 필요한 성분 모두를 안정하게 발현시키는 세포주를 생성하는 것이다. 예를 들면, AAV rep 및 cap 유전자가 결여된 rAAV 게놈, rAAV 게놈으로부터 분리된 AAV rep 및 cap 유전자, 및 선택가능한 마커, 예를 들면, 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 플라스미드 (또는 복수의 플라스미드)는 세포의 게놈으로 통합된다. AAV 게놈은 GC 테일링(참조: Samulski 등, 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유하는 합성 링커의 첨가(참조: Laughlin 등, 1983, Gene, 23:65-73) 또는 직접적인 블런트 말단 결찰(참조: Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666)과 같은 절차에 의해 세균 플라스미드에 도입되었다. 이어서, 패키징 세포주는 아데노 바이러스와 같은 헬퍼 바이러스로 감염된다. 이 방법의 이점은 세포가 선택가능하고, rAAV의 대규모 생산에 적합하다는 것이다. 적합한 방법의 다른 예는 rAAV 게놈 및/또는 rep 및 cap 유전자를 패키징 세포로 도입하기 위해 플라스미드 이외의 아데노 바이러스 또는 바쿨로 바이러스를 사용한다.
일반적인 rAAV 생산 원리는, 예를 들면, 문헌(참조: Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; 및 Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129)에서 검토된다. 다양한 접근법은 문헌(참조: Ratschin 등, Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin 등, Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin 등, J. Virol., 62:1963 (1988); and Lebkowski 등, 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski 등 (1989, J. Virol., 63:3822-3828); 미국 특허 제5,173,414호; WO 95/13365 및 상응하는 미국 특허 제5,658.776호; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin 등 (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul 등 (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark 등 (1996) Gene Therapy 3:1124-1132; 미국 특허 제5,786,211호; 미국 특허 제5,871,982호; 및 미국 특허 제6,258,595호)에 기재되어 있다. 상기 문서들은 rAAV 생산과 관련된 문서의 단락을 특별히 강조하면서 전문이 본원에 참조로 인용된다.
따라서, 본 발명은 감염성 rAAV를 생성하는 패키징 세포를 제공한다. 하나의 구현예에서, 패키징 세포는 안정하게 형질전환된 암 세포, 예를 들면, HeLa 세포, 293 세포 및 PerC.6 세포(동족체 293 라인)일 수 있다. 다른 구현예에서, 패키징 세포는 형질전환된 암 세포가 아닌 세포, 예를 들면, 낮은 통로 293 세포(아데노 바이러스의 E1으로 형질전환된 인간 태아 신장 세포), MRC-5 세포(인간 태아 섬유아세포), WI-38 세포(인간 태아 섬유아세포), 베로 세포(원숭이 신장 세포) 및 FRHL-2 세포(레서스 태아 폐 세포)이다.
rAVV는 컬럼 크로마토그래피 또는 염화세슘 구배와 같은 당해 기술 분야의 표준 방법에 의해 정제될 수 있다. 헬퍼 바이러스로부터 rAAV 벡터를 정제하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌(참조: Clark 등, Hum. Gene Ther ., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp and Clark, Methods Mol . Med ., 69 427-443 (2002); 미국 특허 제6,566,118호 및 WO 98/09657)에 개시되어 있는 방법을 포함한다.
AAV 생산에 사용된 세포 유형
본 발명의 AAV 벡터를 포함하는 바이러스 입자는 AAV 또는 생물학적 생성물의 생산을 가능하게 하고 배양물에서 유지될 수 있는 임의의 무척추 세포 유형을 사용하여 도입될 수 있다. 예를 들면, 사용된 곤충 세포주는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 예를 들면, SF9, SF21, SF900+, 초파리 세포주, 모기 세포주, 예를 들면, 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) 유래 세포주, 국내 누에 세포주, 예를 들면, 봄빅스모리(Bombyxmori) 세포주, 트리코프루시아니(Trichoplusia ni) 세포주, 예를 들면, 하이 파이브(High Five) 세포 또는 레피도프테라(Lepidoptera) 세포주, 예를 들면, 아스칼라파 오도라타(Ascalapha odorata) 세포주로부터 유래될 수 있다. 바람직한 곤충 세포는 하이 파이브, Sf9, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf9, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, BM-N, Ha2302, Hz2E5 및 Ao38을 포함하여 바쿨로 바이러스 감염에 민감한 곤충 종으로부터의 세포이다.
바쿨로 바이러스는 절지동물의 포위된 DNA 바이러스이고, 이의 두 구성원은 재조합 단백질을 세포 배양물에서 생산하기 위한 익히 공지된 발현 벡터이다. 바쿨로 바이러스는 거대한 게놈 함량이 특정 세포로 전달되도록 유전자 조작될 수 있는 원형의 이본쇄 게놈(80-200 kbp)을 갖는다. 벡터로서 사용된 바이러스는 일반적으로 오토그라파 캘리포니아 멀티캡시드 핵다각체바이러스(AcMNPV) 또는 봄빅스 모리(Bm-NPV))이다(참조: Kato 등, 2010).
바쿨로 바이러스는 일반적으로 재조합 단백질의 발현을 위한 곤충 세포의 감염용으로 사용된다. 특히, 곤충에서 이종성 유전자의 발현은, 예를 들면, 문헌(참조: 미국 특허 제4,745,051호; Friesen 등 (1986); EP 제127,839호; EP 제155,476호; Vlak 등 (1988); Miller 등 (1988); Carbonell 등 (1988); Maeda 등 (1985); Lebacq-Verheyden 등 (1988); Smith 등 (1985); Miyajima 등 (1987); 및 Martin 등 (1988))에 기재된 바와 같이 달성될 수 있다. 다수의 바쿨로 바이러스 균주 및 변이체 및 단백질 생산용으로 사용될 수 있는 상응하는 허용 곤충 숙주 세포는 문헌(참조: Luckow 등 (1988), Miller 등 (1986); Maeda 등 (1985) and McKenna (1989))에 기재되어 있다.
다른 측면에서, 본 발명의 방법은 또한 AAV의 복제 또는 생물학적 생산을 허용하고, 배양물에서 유지될 수 있는 임의의 포유동물 세포 유형으로 수행된다. 사용된 바람직한 포유동물 세포는 HEK293, HeLa, CHO, NS0, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19 및 MRC-5 세포일 수 있다.
조성물
다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 rAAV 및/또는 항산화제를 포함하는 조성물을 고려한다. 이러한 조성물은 근육을 재생, 강화 또는 회복하고/하거나 근육 기능을 향상시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체에 rAAV를 포함한다. 조성물은 또한 다른 성분, 예를 들면, 희석제 및 보조제를 포함할 수 있다. 허용 가능한 담체, 희석제 및 보조제는 수용자에게 무독성이고, 바람직하게는 사용된 투여량 및 농도에서 불활성이고, 완충제, 예를 들면, 포스페이트, 시트레이트 또는 다른 유기 산; 항산화제; 저분자량 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들면, EDTA; 당 알콜, 예를 들면, 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예를 들면, 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들면, Tween, 플루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
생체내 또는 시험관내에서 표적 세포를 rAAV로 형질도입하는 방법은 본 발명에 의해 고려된다. 생체내 방법은 본 발명의 rAAV를 포함하는 조성물의 유효량 또는 유효한 다중 투여량을 이를 필요로 하는 동물(인간 환자 포함)에게 투여하는 단계를 포함한다. 대상체에 대한 본 개시의 rAAV를 포함하는 조성물의 배합물의 유료량 또는 유효한 다중 투여량은 치료되는 질환과 관련된 근육 병리학을 예방하거나 진행을 지연시키거나 개선(제거 또는 감소)시키는 투여량이다. 근육 병리학에 대한 효과는 다음과 같은 당업계의 하나 이상의 척도 표준의 개선에 의해 입증될 수 있다: 절대 근육 특이적 힘; 편심 근육 수축 동안 힘 감소; 혈청 CK 수준; 혈청 심장 트로포닌 수준; 혈청 MMP9 수준; 그립 강도; 사지 토크; 사지 이동성 또는 유연성; 보행; 6분 도보 테스트; 무릎 굴근 또는 신근 강도; 최대 자발적 등척성 근육 수척; 북극성 보행 평가(North Star Ambulatory Assessment); 근육량, 지방 감소, 또는 사지 T2-가중된 MRI 측정에 의한 부종; 근육 수축; 사지 관절 각; 심장 기능(심박수, 심박출량, 분획 단축률, 뇌졸중 용적); 호흡(호흡률, 혈액 산소, 보충 산소의 필요성 포함); 근육 괴사; 근육 재생; 근육 쇠약; 근육 염증; 근육 석회화; 근육 중앙 핵 생성; 근육 크기 또는 근섬유 크기; 수명; 및 디스트로핀 또는 라미닌 알파 2 대리 단백질 발현(유트로핀, 플렉틴 1, 라미닌 알파 5, 아그린). 예를 들면, 문헌(참조: Forbes 등, Radiology, 269(1): 198-207 (2013); Govoni 등, Cell Mol . Life Sci ., 70(23): 4585-4602 (2013); and Chandrasekharan and Martin, Methods Enzymol ., 479: 291-322 (2010))을 참조한다. 투여량이 질환의 발병 전에 투여되는 경우, 투여는 예방적이다. 투여량이 질환의 발병 후에 투여되는 경우, 투여는 치료적이다. 따라서, 본원에 기재된 방법에 의한 대상체의 치료는 치료되는 질환을 예방하거나 진행을 느리게 하거나 예방하거나, 질환의 정도를 감소시키고, 질환의 완화(부분 또는 전체)를 유도하고/하거나 질환의 생존을 연장시키는 것을 고려한다.
병용 요법도 또한 본 발명에 의해 고려된다. 본원에 사용된 조합은 동시 치료 또는 연속 치료 둘 다를 포함한다. 새로운 요법과의 조합과 같이, 본 발명의 방법과 표준 의학적 치료(예: 근이영양증을 위한 코르티코스테로이드)의 조합이 구체적으로 고려된다. 이와 관련하여, ANO5의 발현을 유도하여 근육 손상을 감소시키거나 억제하고, 근육을 강화시키거나 근육 회복을 유도한 다음, 2차 치료를 제공하는 것을 생각할 수 있다. 근이영양증을 위한 이러한 2차 치료는 항산화제(예: 리포산, 코엔자임 Q10 및 α-토코페롤), IGF-1, 간섭성 RNA 접근법, 엑손 스키핑, 칼파인 억제, 디스트로핀 상향 조절 및 디스트로글리칸 발현의 사용을 포함할 수 있다. 추가로, 근육 강화 효과를 향상시키기 위해 ANO5의 발현이 추가될 수 있다. 예를 들면, IGF-1 또는 다른 영양 인자 또는 근육 전구체 주사의 첨가가 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에서 투여되는 rAAV의 투여량은, 예를 들면, 특정 rAAV, 투여 방식, 치료 목적, 개체, 및 표적화될 세포 유형(들)에 따라 달라지고, 당업계의 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. 투여되는 각각의 rAAV의 역가는 ml당 약 1x106, 약 1x107, 약 1x108, 약 1x109, 약 1x1010, 약 1x1011, 약 1x1012, 약 1x1013, 약 1x1014, 또는 약 1x1015 이상의 DNase 내성 입자(DRP)의 범위일 수 있다. 투여량은 또한 바이러스 게놈(vg)의 단위로 표현될 수 있다(즉, 각각 1x107 vg, 1x108 vg, 1x109 vg, 1x1010 vg, 1x1011 vg, 1x1012 vg, 1x1013 vg, 1x1014 vg, 1x1015). AAV를 적정하는 방법은 문헌(참조: Clark 등, Hum. Gene Ther., 10: 1031-1039 (1999))에 기재되어 있다.
조성물의 유효량의 투여는, 근육내, 비경구, 정맥내, 경구, 구강, 비강, 폐내, 두개내, 골내, 안구, 직장 또는 질을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 당업계의 표준 경로에 의해서일 수 있다. 본 발명의 rAAV의 AAV 성분(특히, AAV ITR 및 캡시드 단백질)의 투여 경로(들) 및 혈청형(들)은 치료될 질환 상태 및 ANO5 단백질을 발현할 표적 세포/조직(들)을 고려하여 당업자에 의해 선택되고/되거나 일치될 수 있다. 일부 구현예에서, 경로는 환자의 사두근에 하나 이상의 근육내 주사이다. 일부 구현예에서, 경로는 환자의 사두근의 3개의 주요 근육 그룹 각각에 하나 이상의 근육내 주사이다.
특히, 본 발명의 rAAV의 실제 투여는 rAAV 재조합 벡터를 동물의 표적 조직으로 전송하는 임의의 물리적 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 본 발명에 따르는 투여는 근육, 혈류로의 주사 및/또는 간으로의 직접 주사를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 포스페이트 완충 식염수에 rAAV를 간단하게 재현탁하는 것은 근육 조직 발현에 유용한 소포를 제공하기에 충분한 것으로 입증되었고, 담체 또는 rAAV와 공동 투여될 수 있는 다른 성분에 대한 공지된 제한은 없다(비록 DNA를 분해하는 조성물은 rAAV를 사용하는 정상적인 방식에서 회피되어야 하지만). rAAV의 캡시드 단백질은 rAAV가 관심 있는 특정 표적 조직, 예를 들면, 근육에 표적화되도록 변형될 수 있다. 예를 들면, WO 02/053703을 참조하고, 이 개시는 본원에 참조로 인용된다. 약제학적 조성물은 주사가능한 제형으로서 또는 경피 수송에 의해 근육으로 전달되는 국소 제형으로서 제조될 수 있다. 근육내 주사 및 경피 수송 모두를 위한 다수의 제형이 이전에 개발되었고, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. rAAV는 투여 및 취급을 용이하게 하기 위한 임의의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 사용될 수 있다.
근육내 주사의 목적을 위해, 보조제, 예를 들면, 참깨 또는 땅콩 오일 또는 수성 프로필렌 글리콜 중의 용액 뿐만 아니라 멸균 수용액이 사용될 수 있다. 이러한 수용액은 경우에 따라 완충될 수 있고, 액체 희석제는 먼저 식염수 또는 글루코스로 등장성이 된다. 유리산(DNA는 산성 포스페이트 그룹을 함유한다) 또는 약제학적으로 허용되는 염으로서 rAAV의 용액은 계면활성제, 예를 들면, 하이드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 물 중에서 제조될 수 있다. rAAV의 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 중 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 통상적 조건하에 이들 제제는 미생물의 성장을 예방하기 위한 방부제를 함유한다. 이와 관련하여, 사용된 멸균 수성 매질은 모두 당업자에게 익히 공지된 표준 기술에 의해 용이하게 수득할 수 있다.
주사 가능한 사용에 적합한 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 멸균성이어야 하고, 용이한 주입가능성이 존재하는 정도로 유동성이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에 안정해야 하고, 미생물, 예를 들면, 세균 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들면, 코팅, 예를 들면, 레시틴의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 유도될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들면, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 연장 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 유도될 수 있다.
멸균 주사 용액은 rAAV를 필요할 경우 상기 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적합한 용매에 필요량으로 도입한 다음, 필터 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 멸균된 활성 성분을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말 및 이의 이전 멸균 여과된 용액으로부터 임의의 추가의 목적 성분을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.
rAAV에 의한 형질 도입은 또한 시험관내에서 수행될 수 있다. 하나의 구현예에서, 목적하는 표적 근육 세포를 대상체로부터 제거하고, rAAV로 형질 도입하고 대상체에 재도입한다. 대안적으로, 동종 또는 이종 근육 세포는 그들 세포가 대상체에서 부적절한 면역 반응을 생성하지 않는 경우에 사용될 수 있다.
형질도입 및 형질도입된 세포의 대상체로의 재도입에 적합한 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 하나의 구현예에서, 세포는 rAAV를, 예를 들면, 적합한 매질 중에서 근육 세포와 결합시키고, 서던 블롯 및 PCR과 같은 통상적인 기술을 사용하여 관심 있는 DNA를 보유하는 세포를 스크리닝하거나 선택가능한 마커를 사용함으로써 시험관내에서 형질도입할 수 있다. 이어서, 형질도입된 세포는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있고, 조성물은 다양한 기술, 예를 들면, 근육내, 정맥내, 피하 및 복강내 주사에 의해 또는, 예를 들면, 카테터를 사용하여 평활근 및 심근 내로 주사에 의해 대상체에게 도입된다.
본 발명의 rAAV로 세포를 형질 도입하면 ANO5 단백질의 지속적인 발현을 초래한다. 따라서, 본 발명은 ANO5를 발현시키는 rAAV를 동물, 바람직하게는 인간에게 투여하고/전달하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 조직(조직, 예를 들면, 근육, 기관, 예를 들면, 간 및 뇌, 및 샘, 예를 들면, 침샘을 포함하나, 이에 제한되지 않음)을 본 발명의 하나 이상의 rAAV로 형질 도입함을 포함한다. 형질도입은 조직 특이적 조절 요소를 포함하는 유전자 카세트로 수행될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 하나의 구현예는 액틴 및 미요신 유전자 계열로부터, 예를 들면, myoD 유전자 계열[참조: Weintraub 등, Science, 251: 761-766 (1991)], 근세포 특이적 인핸서 결합 인자 MEF-2[참조: Cserjesi and Olson, Mol Cell Biol 11: 4854-4862 (1991)], 인간 골격 액틴 유전자로부터 유래된 조절 요소[참조: Muscat 등, Mol Cell Biol, 7: 4089-4099 (1987)], 심장 액틴 유전자, 근육 크레아틴 키나제 서열 요소[참조: Johnson 등, Mol Cell Biol , 9:3393-3399 (1989)] 및 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서(mCK) 요소, 예를 들면, MCK7 또는 마우스 mCK의 삼중 카피인 tMCK, 골격 속근(fast-twitch) 트로포닌 C 유전자, 지근(slow-twitch) 심장 트로포닌 C 유전자 및 지근 트로포닌 I 유전자로부터 유도된 조절 요소; 저산소증 유도성 핵 인자(참조: Semenza 등, Proc Natl Acad Sci USA, 88: 5680-5684 (1991)), 글루코코르티코이드 반응 요소(GRE)를 포함하는 스테로이드 유도성 요소 및 프로모터[참조: Mader and White, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 5603-5607 (1993)], 및 다른 조절 요소로부터 유래된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 근육 특이적 조절 요소에 의해 지시된 근육 세포 및 근육 조직을 형질도입하는 방법을 제공한다.
근육 조직은 생체내 유전자 전달 및 유전자 요법을 위한 매력적인 표적인데, 이는 중요한 기관이 아니고 접근하기 쉽기 때문이다. 본 발명은 형질도입된 근섬유로부터 생물학적 활성 ANO5 단백질의 지속적인 발현을 고려한다.
"근육 세포" 또는 "근육 조직"은 임의의 종류의 근육(예: 예를 들면, 소화관, 방광, 혈관 또는 심장 조직으로부터의 골격근 및 평활근)으로부터 유래된 세포 또는 세포 그룹을 의미한다. 이러한 근육 세포는 근육 아세포, 근세포, 근육 대롱 세포, 심근 세포 및 심근아세포와 같이 분화되거나 분화되지 않을 수 있다. 근육 조직은 순환계에 쉽게 접근할 수 있기 때문에, 생체 내에서 근육 세포 및 조직에 의해 생성되고 분비된 단백질은 전신 전달을 위해 혈류에 논리적으로 도입되어 근육으로부터 단백질 분비의 지속적인 치료 수준을 제공한다.
용어 "형질 도입"은 수용체 세포에 의한 기능적 ANO5 단백질의 발현을 초래하는 본 발명의 복제-결핍 rAAV를 통해 생체내 또는 시험관내에서 수용체 세포로 ANO5 DNA의 투여/전달을 의미하기 위해 사용된다.
항산화제 조성물
골격근 수축 동안 반응성 산소 종의 생성은 잘 확립되어 있다. 장시간 운동 동안, 이러한 산화제의 증가량은 단백질 및 지질에 손상을 일으키고, 다중 스트레스 반응 신호 경로의 활성화를 유도한다(참조: Powers 등, Free Radic Biol Med 51: 942-50 (2011)). 결과적으로, 다수의 연구가 골격근에서 산화적 스트레스를 경감시키는 수단으로서 장기간 항산화 보충제의 사용을 조사했다. 최근 한 연구는, 암컷 마우스의 다이어트에 보충된 3개의 항산화제(비타민 E, α-리포산 및 코엔자임 Q10)의 제형이 미토콘드리아 기능의 마커뿐만 아니라 달리기 성능을 향상시켰다고 보고했다(참조: Abadi 등, PLoS One. 8:e60722 (2013)). 그러나, 다른 연구들은, 유사하게 변형된 다이어트(비타민 E + α-리포산)가 랫트의 미토콘드리아 생합성을 감소시켰다고 보고했다(참조: Strobel 등, Med Sci Sports Exerc. 43:1017-24 (2011)). 현재, 골격근 건강에 대한 장기한 항산화 보충제의 효과에 대한 당업계의 합의가 없고, 질환에 의해 약해진 근육에 대해서는 아주 작은 관심이 주어졌다. 그러나, 본 발명은 항산화제 다이어트가 Ano5-/- 마우스의 골격근에 유익한 효과를 제공한다는 증거를 제공한다.
항산화제
본 발명은 근이영양증을 앓고 있는 대상체에서 근육 생리 및 기능을 향상시키기 위한 항산화제 조성물의 투여를 제공한다. 본원에 개시된 항산화제 조성물은 적어도 하나의 항산화제를 사용한다. 또한, 본 발명은 적어도 2개 또는 적어도 3개의 항산화제를 포함하는 항산화제 조성물을 제공하고, 이러한 조성물에서 항산화제는 상이한 세포 기능을 가질 것이다. 바람직한 항산화제는 구체적으로 노화의 생산물로서 미토콘드리아 손상을 역전시키는 것으로 나타난 것들이다. 예를 들면, 본 발명은 코엔자임 Q10, α-리포산, 카로티노이드(α-카로틴, β-카로틴, 리코펜, 루테인, 아스타크산틴, 칸타크산틴 및 제아크산틴), 비타민, 예를 들면, 비타민 A(레티놀, 3,4-디데하이드로레티놀 및 3-하이드록시레티놀), 비타민 C(아스코르브산), 및 비타민 E(α-토코페롤), 비타민 보조 인자, 폴리페놀 및 플라보노이드(레스베라트롤, 진저놀, 쿠르코민) 또는 미네랄(철, 마그네슘, 셀레늄, 구리, 아연, 망간, 요오드화물) 중 적어도 하나를 포함하는 항산화제 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 이들 항산화제는 코엔자임 Q10, 비타민 E, α-리포산이다.
Q10, 비타민 Q10, 유비퀴논, 유비데카레논 또는 코엔자임 Q로서도 공지된 코엔자임 Q10은 지용성 물질이다. 코엔자임 Q10은 전자 수송 연쇄계(ETC)에 중요한 전자 왕복 화합물이다. ETC는 세포 에너지의 중요한 공급원인 ATP 생합성을 구동시킨다. α-토코페롤로도 공지된 비타민 E는 막(미토콘드리아 막 포함)의 중요한 성분이고, 지질 유리 라디칼을 제거하는 기능을 한다.
티옥산으로도 공지된 α-리포산은 궁극적으로 ATP 생산을 초래하는 크렙스(Krebs) 사이클의 적절한 기능에 대한 피루베이트 데하이드로게나제와 같은 미토콘드리아 데하이드로게나제의 필수 보조인자인 옥탄산으로부터 유래된 유기황 화합물이다. α-리포산은 또한 PGC1α를 통해 미토콘드리아 생합성을 조절하는 세포내 에너지 센서인 AMPK를 활성화시킴으로써 직접 골격근 효과를 갖는다.
폴리페놀은 페놀산 및 플라보노이드를 포함한다. 예를 들면, 페놀산은 프로모카테큐산, 갈산, 하이드록시벤조산, 하이드록시신남산, 예를 들면, 카페산, 클로로겐산, 쿠마르산, 페룰산, 시나프산, 안토시아닌, 예를 들면, 시아니딘, 펠라고니딘, 페오니딘, 델피니딘 및 말비딘을 포함한다. 예시적인 플라보노이드는 플라보놀, 예를 들면, 케르세틴, 캠페롤, 미리세틴, 플라본, 예를 들면, 아피게닌 및 루테올린, 글라바오논, 예를 들면, 헤스페레틴, 나린게닌 및 에리오딕티올, 이소플라본, 예를 들면, 다이제인, 게니스테인 및 글리시테인, 및 단량체성 플라보놀, 예를 들면, 카테킨 및 에피카테킨을 포함한다.
투여 및 투약
본 개시는 적어도 하나의 항산화제를 사용하여 근이영양증 및 만성 근육 쇠약을 치료하기 위한 물질 및 방법을 제공한다. 근이영양증을 치료하는 예시적인 조성물 및 방법은 적어도 1개의 항산화제를 투여하거나, 적어도 2개의 항산화제를 투여하거나 적어도 3개의 항산화제를 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 α-리포산, 코엔자임 Q10 및 α-토코페롤(비타민 E로서도 공지됨)을 포함하는 항산화제 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 항산화제 조성물은 단독으로 또는 ANO5 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능적 활성 단편을 포함하는 AAV 벡터와 함께 투여될 수 있다.
본 개시의 방법은 주사, 경구 소화, 비내, 국소, 경피, 비경구, 흡입 분무, 질내 또는 직장 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는, 제제를 포유동물 대상체에게 직접 또는 간접적으로 투여하기 위한 임의의 의학적으로 허용된 수단을 사용하여 수행된다. 본원에서 사용된 용어 비경구는 카테터 또는 주입 기술뿐만 아니라 피하, 정맥내, 근육내 및 수조내 주사를 포함한다. 특별한 부위에서 피내, 복강내, 척수강내, 안구후, 폐내 주사 및/또는 수술적 이식에 의한 투여도 또한 고려된다.
하나의 구현예에서, 투여는 부위 내로의 직접 주사에 의해 또는 제형을 내부적으로 전달할 수 있는 지속된 전달 또는 서방출 메카니즘을 통한 치료를 필요로 하는 감염된 조직(예: 근육)에서 수행된다. 예를 들면, 조성물(예: 가용성 폴리펩티드, 항체 또는 소분자)의 지속 전달이 가능한 생분해성 미소구 또는 캡슐 또는 다른 생분해성 중합체 배치가 감염된 조직 근처 또는 감염된 조직에 이식된 본 개시의 제형에 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, ANO5를 포함하는 AAV 벡터 및 항산화제의 동시 투여는 제제가 그들의 치료 효과를 발휘하는 기간 내에 중첩이 존재하는 한 제제가 동시에 또는 동일한 경로로 투여될 것을 요구하지 않는다. 다른 날 또는 주에의 투여와 같이, 동시 또는 순차적 투여가 고려된다.
일부 구현예에서, 항산화제 및/또는 AAV 벡터 조성물은 또한 다수의 부위에서 환자에게 전달될 수 있다. 다수의 투여가 동시에 제공될 수 있거나, 일정 기간 동안 투여될 수 있다. 특정 경우에, 치료 조성물의 연속적인 유동을 제공하는 것이 유익하다. 추가 요법은 기간 기준, 예를 들면, 시간별, 일별, 격일, 주 2회, 주 3회, 매주, 2주에 1회, 3주에 1회, 매월 또는 더 긴 간격으로 투여될 수 있다.
본 개시의 제제는 동일한 제형으로 동시에 투여될 수 있다는 것이 고려된다. 제제는 별개의 제형으로 투여되고, 동시에 투여되며, 동시에 30분 이내에 서로 투여되는 제제를 지칭하는 것이 추가로 고려된다.
따라서, 본 발명은, 예를 들면, ANO5 및/또는 항산화제를 코딩하는 rAAV의 유효량 (또는 본질적으로 동시에 투여된 투여량 또는 간격을 두고 투여된 투여량)을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 방법을 제공한다.
주어진 투여량에서 항산화제 조성물의 양은 치료될 장애의 특성뿐만 아니라 요법이 투여되는 개체의 크기에 따라 달라질 수 있다. 예시적 치료에서, 약 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%. 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0% 리포산, 약 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%. 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0% 코엔자임 Q10 및 약 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 IU α-토코페롤 또는 비타민 E를 포함하는 항산화제 다이어트를 투여하는 것이 필요할 수 있다. 이러한 농도는 단일 투여 형태 또는 복수의 투여량으로 투여될 수 있다. 표준 용량-반응 연구는 먼저 동물 모델에서, 이어서 임상 시험에서 특정 질환 상태와 환자 집단에 대한 최적의 투여량을 나타낸다.
또한, 전통적인 치료제가 본 개시의 치료제와 함께 투여되는 경우, 투약이 변형될 수 있음이 자명할 것이다.
실시예
실시예 1
Ano5 -/- 마우스 모델의 단리 및 생성
Ano5 녹-아웃 모델은 도 1a에 도시된 바와 같이 절단된 전사물을 생성하기 위해 엑손 8에서 엑손 9까지 Ano5를 표적화하는 벡터를 사용하여 생성하였다. 표적화 작제물은 무효의 대립 유전자가 문헌(참조: Tesla 등 (Genesis 38, 151-158 (2004))에 기재된 바와 같이 lacZ 트래핑 요소로의 스플라이싱을 통해 생성되도록 "녹-아웃 1차(knout-out first)" 조건부 준비 작제물로서 설계되었다. 이 lacZ-태그 돌연변이 대립 유전자 Ano5:tm1a(KOMP)Wtsi 표적화 벡터는 UC Davis KOMP 저장소(PG00097βZβ1βG0; Karnes. Nature 474, 337-342 (2011)로부터 입수했다. 표적화 카세트는 배아 치사율이 주목되는 경우 조건부 대립 유전자를 생성하기 위해 제공된 인접하는 FRT 및 loxP 부위와 함께 엑손 8 다음에 삽입되었다.
배아 줄기 세포 표적화 및 전이 후, 유전자형은 게놈 PCR에 의해 확인되었다(도 1b). 크론은 도 1c에 도시된 바와 같이, 내인성 Ano5 유전자좌로부터 300bp 앰플리콘 및 Ano5 카세트 삽입 유전자좌로부터 200bp 앰플리콘을 생성하는 엑손 1-6(e1-6) 또는 엑손 17-20(e17-20)에 걸친 다음의 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR에 의해 스크리닝했다:
유전자형 F 5'-AGTCCTTTTCAGCACAGTCTTTG-3' (서열번호 3)
유전자형 R 5'-TGAGGCAGTGTGGAGTGAGTA-3' (서열번호 4)
DF38700 5'-GCCAATCATATGGTCTCAGT-3' (서열번호 5)
LR-loxp R 5'-ACTGATGGCGAGCTCAGACC-3' (서열번호 6)
이어서, 성공적으로 표적화된 ES 세포를 C57BL/6 마우스의 배반포에 주사하고, 생식선 절단을 위한 키메라를 생성하기 위해 배아를 전달했다. 유전자 도입 이형 접합체는 유전자형에 의해 확인되었고, 동형 접합성으로 번식하기 전에 C57BL/6 야생형으로 4회 역교배시켰다. Ano5 -/- 및 C57BL/6마우스의 스톡은 RINCH의 동물 사육장에서 표준화된 조건에서 동형 접합성 동물로서 사육되고 유지되었다. 그들은 12:12 시간 암:명 사이클로 테클라드 글로벌 설치류 다이어트(Teklad Global Rodent Diet(3.8% 섬유, 18.8% 단백질, 5% 지방 음식))에 유지시켰다.
정량적 PCR을 수행하고, 신속한 실시간 PCR 시스템(Fast Real-Time PCR System)(Thermo Fisher Scientific))에서 분석하였다. 반응은 어플라이드 바이오시스템즈 프라이머-FAM 프로브 칵테일스(Applied Biosystems primer-FAM probe cocktails)를 사용하여 Ano5(Mm00624629βm1, Mm01335981βm1), Ano6(Mm00614693βm1) 및 Gapdh(Mm99999915βgl)에 대해 각 샘플에 대해 삼중으로 실행되었다. ΔΔCt 방법을 사용하여 야생형과 비교하여 Ano5 -/- 근육에서 Ano5 및 Ano6 mRNA의 정규화된 배수 변화 감소를 계산하였다. 총 RNA는 제조업자의 프로토콜에 따라서 트리졸(Life Technologies, Carslbad, CA)을 사용하여 신선한 동결 근육 부스러기로부터 단리시켰다. 이어서, RNA를 RNAEasy 방법(Qiagen, Valencia, CA)으로 컬럼 정제하고, NanoDropLite(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 분광광도계로 정량화하였다. cDNA는 반응당 샘플 RNA의 동일량(200 내지 500ng)을 사용하여 고용량 cDNA 역전 전사 키트(Thermo Fisher Scientific)로 생성하였다. 반정량적 PCR을 위해, 동일 용적의 cDNA를 30회 PCR 사이클에 이어, 아가로스 겔 전기영동에 적용하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같다:
mβACt-rt-5' CCTGGCCGTCAGGCAGAT (서열번호 7)
mβAct-rt-3' GACATGGAGAAGATCTGGCACC (서열번호 8)
mAno5-rt-F1 CCAACAGAATGAGAACCT (서열번호 9)
mAno5-rt-R1 GACAGGGGTGGGTACTTTGG (서열번호 10)
mAno5-rt-F3 CGTTGGCAGCAAGATCAT (서열번호 11)
mAno5-rt-R3 GGGTACCTATAATCTCTGTACCTGC (서열번호 12)
정량적 RT-PCR은 시험된 모든 근육에서 전카세트 전사물의 약 80% 감소 및 후카세트 ANO5 전사물의 >90% 감소를 입증했다(도 1d). 배아 치사율 또는 사육 어려움은 주시되지 않았다. Ano5가 Ano6과 유의한 서열 상동성을 공유하고, Ano6이 일부 조건하에 골격근에서 발현되는 것으로 공지되어 있기 때문에, RT-PCR을 수행하여 Ano5 -/- 마우스 근육의 ANO6 cDNA의 상대적 발현을 측정했다. 정량적 RT-PCR은 Ano5 결핍 근육에서 Ano6의 보통이지만 통계적으로 사소한 상승을 입증한다.
실시예 2
Ano5 -/- 마우스의 임상적 및 조직병리학적 평가
Ano5 -/- 마우스는 증가된 혈청 크레아틴 키나제 수준, 근육간의 변화 가능한 약화, 변경된 근섬유 직경, 및 운동 불내성을 포함하는 인간 ANO5-근병증의 독특한 많은 특징을 나타냈다. 혈청 크레아틴 키나제는 Ano5 -/- 마우스에서 약 2배 증가된다(도 2a).
파상풍 힘 측정치는 10개월령 마우스(균주당 n=6 마우스)의 장지신근(EDL), 4개월령 마우스(균주당 n=5 마우스)의 전경골근(TA) 및 10개월령 Ano5 -/- 및 WT 마우스(균주당 n=4 마우스)의 횡경막근으로부터 수득했다. EDL을 힘줄에서 절개하고, 문헌(참조: Rodino-Klapac 등 (J. Transl. Med. 5: 45, 2007) and Liu 등 (Mol. Ther . 11:245-256, 2005))에 기재된 바와 같이 기능을 평가하기 위해 생리학적 프로토콜을 수정하면서 실시하였다. 편심 수축 프로토콜 동안, 5% 연신-재연장 절차를 500 내지 700ms에서 실행했다(100ms 동안 5% 연신, 이어서 100ms에서 최적 길이로 복귀). 파상풍 및 편심 수축 프로토콜 후, 마우스를 안락사시키고, 근육을 절개하고, 습윤 칭량하고, 트라가간트 검을 사용하여 척 상에 장착한 다음, 액체 질소로 냉각시킨 메틸-부탄에서 동결시켰다. TA에서의 힘 측정은 문헌(참조: Hakim 등 (J. Appl . Physiol . 110: 1656-1663, 2011) 및 Wein 등 (Nat. Med. 20:992-1000, 2014))에 기재된 바와 같이 수행했다.
횡경막 힘 측정을 위해, 마우스를 안락사시키고, 횡경막을 립 부착물과 중심 힘줄을 손상 없이 절개하고, 이미 문헌(참조: Beastrom 등 (Am. J. Pathol. 179: 2464-2474, 2011), Rafeal-Fortney 등 Circ . 124: 582-588, 2011) 및 Grose 등 (Ann. Clin . Trans. Neurol . 1: 34-44, 2014))에 기재된 바와 같이 크렙스-헨셀렛(K-H) 완충제에 위치시켰다. 횡경막의 2-4mm 너비 단면을 단리시켰다. 횡경막 스트립을 중심 힘줄에서 편조된 외과용 실크(6/0; Surgical Specialties, Reading, PA)로 견고하게 묶고, 스트립의 말단부에 부착된 늑골의 일부를 통해 봉합하였다. 각 근육은 37℃에서 유지된 산소화된 K-H 용액이 충전된 수욕으로 옮겼다. 근육을 수평으로 정렬시키고, 고정 핀과 듀얼-모드 힘 변환기-서보모터(305C; Aurora Scientific, Aurora, Ontario, Canada) 사이에 직접 묶었다. 2개의 백금 플레이트 전극을 근육의 길이에 인접하도록 장기 욕조에 배치하였다. 근육을 1g의 최적 장력으로 연신시킨 다음, 파상풍 프로토콜의 개시 전에 10분 동안 휴지시켰다. 일단 근육이 안정화되면, 근육을 30초마다 3번의 1Hz 경련에 이어 매분 3회의 150Hz 경련으로 구성된 워밍업을 수행하였다. 3분 휴지 기간 후, 횡경막은 최대 파상풍 힘을 결정하기 위해 각각 250ms의 기간을 갖고 각 자극 사이에 2분 휴지 기간을 허용하여 20, 50, 80, 120, 150, 180Hz에서 자극하였다. 근육 길이 및 중량을 측정하였다. 힘은 근육 중량 및 길이에 대해 표준화하였다(CSA: 근육 질량 (mg)/{Lf(mm) x 근육 밀도 (1.06mg/mm3)}). 통계적 유의성은 편심 수축 프로토콜에 대한 내성을 반복 측정한 특이적 힘 및 2원 ANOVA에 대한 비쌍체 스튜던츠 T-테스트를 사용하여 평가하였다.
근육 수축의 특이적 힘은 횡경막에서 약 15%로 상당히 감소되었지만(도 2b), Ano5 -/- 마우스의 장지신근(EDL) 및 전경골근(TA) 근육에서 본질적으로 영향을 받지 않았다(도 2c). 근육간 이러한 변동성은 ANO5 근병증의 특징이고, 상이한 근육의 조직학적 분석에서도 또한 관찰되었다. 야생형(WT)과 비교하여, 평균 근섬유 직경은 Ano5 -/- 마우스의 비복근(GAS) 근육에서 상당히 더 작았고(Ano5 -/- 35.8 ± 8.3 ㎛, WT: 41.8 ± 11.0 ㎛, P<0.001), TA 근육에서는 다소 적은 정도로 작았다(Ano5 -/- 38.1 ± 11.8 ㎛, WT: 44.3 ± 12.2 ㎛, P<0.001)(도 2d,e). Ano5 -/- 근육은 중심 핵 및 때때로 괴사성 섬유를 포함하는 경미한 조직 병리학을 나타냈다(Fig. 2d,e).
운동 내성을 평가하기 위해, 7.5개월령 Ano5 -/- 및 WT 마우스를 2개월 동안 매주 1시간 동안 운동 처방을 받았다. 각 마우스는 1주일에 한번 15m/분의 속도로 -10°감소로 실행하고, 고갈에 도달할 때까지(균주당 n=3 마우스) 매분 1m씩 증가시켰다. 마우스가 운동을 시도하지 않고 10초 이상 동안 전기 자극을 20V로 설정하면서 쇼크 플레이트(Columbus Instruments)에 잔류할 경우 각 개별 검사를 중지시켰다. 휴식은 마우스가 러닝을 중단하고, 트레드밀 벨트가 쇼크 플레이트로 반환되는 동안 휴지되는 시간으로서 정의되었다. WT 대조군 마우스가 휴식 없이 일관된 속도로 러닝하는 동안, Ano5 -/- 마우스는 트리이드밀 벨트가 쇼크 플레이트로 반환될 때까지 그들이 러닝을 중지하는 트레이드밀(14회 중지/분)에서 자주 휴식하는 경향이 있었다(도 2f).
전기 생리학은 문헌(참조: Arnold 등 (Ann. Clin . Trans. Neurol . 1:34-44, 2014))에 기재된 것들과 유사한 방법을 사용하여 6 내지 8개월 Ano5 -/- 및 대조군 근육에 수행하였다. 마우스를 흡입된 이소플루란을 사용하여 마취시키고, 동물의 몸체로부터 45°떨어져 연장된 뒷다리를 갖는 경향이 있는 위치에 위치시켰다. 복합 근활동 전위(CMAP) 진폭은 돌연변이체(n=6 동물, 12개의 뒷다리) 및 대조군(n=7 동물, 14개의 뒷다리) 마우스에서 초근성 좌골 신경 자극 후 양측 삼두근 종기 근육으로부터 측정하였다. 침상 근전도 검사는 오른쪽 GAS 근육에서 수행하여 세동 전위의 유무를 평가하였다. 국소화된 임피던스 측정 또는 전기적 임피던스 근시법(EIM)은 근위축성 측삭 경화증 및 근이양증의 마우스 모델(참조: Li 등 PLoS One 8:e65976, 2013; Li 등 Muscle & Nerve 49: 829-835, 2014)에서 이전에 보고된 것들과 유사한 방법을 사용하여 Skulpt Inc EIM1103 시스템(San Francisco, CA)을 사용하여 1000Hz 내지 10MHz의 주파수에서 양측 GAS 근육에서 수행되었다. 간격이 1mm인 4개의 26게이지 절연된 근전도 검사 침상 전극(참조: Natus, Middleton, WI)이 있는 고정 전극 어레이를 표준 전극 대신에 사용했다. 전극 어레이를 근육 섬유 방향에 대해 세로 배열로 양측 비복근 근육의 배꼽에 삽입하고, 각 근육에서 2회의 임피던스 측정을 수행하고, 각 사지(n=6 동물, 각 그룹에 대해 12개의 뒷다리)에서 단일 값을 평균하였다. 이전에 공개된 EIM 연구의 규칙을 사용하고 간결성을 위해, 리액턴스, 저항 및 위상을 두 개의 현재 주파수 50kHz 및 100kHz에서 분석했다. CMAP 진폭 및 임피던스 특성은 양측 t 테스트를 사용하여 비교하였다. 침상 근전도 검사, 발생된 복합근 활동 전위 기록 및 전기적 임피던스 근시법을 Ano5 -/- 및 WT 마우스의 뒷다리에서 수행하였지만, 인간 질환과 유사한 유의한 변화는 나타나지 않았다(도 3).
인간 ANO5 근병증의 또 다른 독특한 특징은 근육내 침착물과 함께 과도한 수의 근섬유의 존재이다. 근육 단면 섬유 직경은 6개월령 Ano5 -/- 및 WT 균주 대조군 마우스(균주당 n=3 마우스)의 TA 및 비복근(GAS) 근육으로부터 결정하였다. 근육을 절단하고, 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색했다. 동물당 섹션당 4개의 랜덤 20x 이미지를 Zeiss AxioCam MRC5 카메라로 촬영했다. 섬유 직경은 근섬유의 최단 거리를 Zeiss Axiovision LE4 소포트웨어를 사용하여 측정함으로써 결정했다. 섬유 직경 히스토그램은 TA당 평균 500 내지 600개의 섬유 및 GAS당 600 내지 700개 섬유로 생성되었다. 비쌍체 t-테스트를 사용하여 Ano5 -/- 및 WT 섬유 크기 사이의 유의한 차이를 시험하였다(****p<0.0001).
근육내 응집체를 정량화했다. 10개월령 Ano5 -/- 및 WT 마우스(조직 및 균주당 n=3 마우스)의 TA 및 GAS 근육으로부터 근육 절편을 고모리 삼색으로 염색했다. 4개의 20X 이미지를 촬영하고, 하나 이상의 응집체를 갖는 섬유의 수를 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 계수하고, 총 섬유 수의 백분율로서 표현했다. GraphPad Prism을 사용하여, 일원 ANOVA를 사용하여 Ano5 -/- 및 WT 섬유 사이의 유의성을 ㅌ테테스트했다(****p<0.0001).
또한, 석시네이트 데하이드로게나제 염색(SDH)을 응집체 및 근육에 수행하였다: 전경골근(TA) 및 사두근 근육을 18㎛로 절단하고, 0.1M 석신산 및 0.1M 포스페이트 완충제 pH 7.4에 용해된 0.2% 니트로 블루 테트라졸륨(NBT)로 구성된 SDH 용액으로 염색하고, 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후, 슬라이드를 물로 세정하고, 멸균 알콜로 탈수시킨 다음, 크실렌으로 청소했다. 슬라이드를 Zeiss AxioCam MRC5 카메라 상에서 이미지화했다.
4개월령 및 10개월령 Ano5 -/- 및 대조군 마우스의 TA 근육의 부분을 제거하고, 목재 압설자를 통해 그들의 원위치 길이로 연신시키고, 0.1M 포스페이트 완충제 pH 7.0 중의 3% 글루타르알데히드에 4시간 동안 침지시켰다. 근육을 2mm 길이 조직 블록으로 절개하고, 0.1M 포스페이트 완충제 pH 7.4에 밤새 저장한 다음, 1% 사산화오스뮴에 2시간 동안 사후 고정하고, 플라스틱 매립 전에 등급화된 에탄올 용액으로 탈수시켰다. 1㎛ 두께의 단면을 톨루이딘 블루로 염색하고, 광학 현미경으로 검사하고, 선택된 블록의 조직 단면을 Advanced Microscopy Techniques 카메라 및 소프트웨어를 사용하여 Hitachi H-7650 TEM 전자 현미경하에 검사하였다.
Ano5-/- 마우스 근육에서, 이러한 구조는 문헌(참조: Pavlocicova 등 (Gen. Physiol . Biophysics 22: 425-440, 2003))에 기재된 바와 같이 변형된 삼색 염색에 의해 적색으로 염색된 날카롭게 정의되고 불규칙하게 윤곽이 잡힌 영역으로 나타난다. 세포질 응집체는 9개월째부터 명백하게 시작하여 경시적으로 증가했다(도 4a). 유사한 외관의 응집체가 정상 년령의 마우스에서 주시되기 때문에, 응집체 발생을 정량화했다. 약 25%의 Ano5 -/- 섬유가 삼색 염색시 불규칙하게 윤곽이 잡힌 적색 영역을 나타낸 반면, 대조군 섬유의 <0.02%는 이러한 응집체를 가졌다(도 4b). 전자 현미경 검사(EM)는, 이러한 응집체가 막 재료로 구성되었음을 나타냈다. 많은 Ano5 -/- 근섬유는 소포 또는 관형 막의 치밀하게 패킹된 축적 또는 광학 현미경으로 관찰된 응집체에 상응하는 퍼지 내부 세관이 있는 되는 대로 배향되고 느슨하게 패킹된 상호 연결 관 형성을 나타냈다(도 4c,d). ANO5 -/- 마우스는 진단된 ANO5 환자와 일치하는 유사한 병리학적 소견을 나타냈다. ANO5 유전자의 코딩 영역에서 2개의 돌연변이 [c.155A>G (p.Asn52Ser)] + [c.191dupA (p.Asn64Lysfs*15)]에 대해 복합 이종 접합성인 환자 근육의 전자 현미경 검사는 다수의 응집체 및 퇴화성 미토콘드리아의 영역을 나타내는 다수 부위를 나타냈다. Ano5 -/- 근육 중 응집체는 SERCA1의 경우 양성으로 염색되었지만 석시네이트 데하이드로게나제(SDH) 활성에 대해서는 양성을 나타내지 않아 그들이 미토콘드리아가 아닌 근육질 세망에서 유래된다는 것을 시사한다(도 4g). 그러나, Ano5 -/- 마우스는 이러한 막 응집체 이외에 퇴행성 미토콘드리아 및 하위-근형질막 미토콘드리아 축적을 나타냈다(도 4e). 미토콘드리아의 하위-근형질막 축적은 근섬유의 표면 부근의 고밀도 패치에 편재된 SDH로 동결된 절편을 염색하여 확인하였다(도 4f). 관찰된 미토콘드리아 변성이 기능적 유의성을 갖는지의 여부를 확인하기 위해, 시트레이트 신타제 활성을 순수한 미토콘드리아의 척도로서 정량화하고, WT 대조군과 비교하여 Ano5 -/- 근육 추출물에서 유의한 감소가 존재하였음을 입증했다.
실시예 3
Ano5는 막 회복을 용이하게 한다
건강한 개체에서, 정상적인 운동은 다음 두 가지 과정으로 치유되는 원형질 막의 작은 병변을 초래한다: (i) 작은 눈물은 새로운 원형질 막의 조립에 의해 나타나고, (ii) 더 심각한 파괴 부위는 근아세포형 세포로 분화하고 융합하여 다핵화 근세포를 재생시키는 위성 세포에 의해 복구된다. 막 복구에 대한 ANO5 발현의 손실의 효과를 테스트하기 위해, 단리된 단지굴근(FDB) 근섬유로 전달된 강한 레이저 펄스에 의해 생성된 막 손상의 효과를 시험하였다. 12㎛의 냉각부분을 Fisher Superfrost 현미경 슬라이드 상에 위치시키고, 실온에서 1시간 동안 PBS 중의 0.1% Tween-20 및 10% 염소 혈청으로 차단하였다. 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 1차 항체에서 배양했다(Anti-FLAG F7425 Sigma-Aldrich, 1:175), Serca1 CaF2-5D2(Developmental Studies Hybridoma Bank, 1:50). 이어서, 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 PBS로 3회 세정한 다음, 30분 차단하였다. Alexa Fluor 594(A21125, Life Technologies)에 접합된 염소-항-마우스 또는 Alexa Fluor 568(A11011, Life Technologies)에 접합된 염소-항-토끼 2차 항체를 차단 용액으로 1:250 희석하고, 45분 동안 배양한 다음 1시간 동안 PBS로 3회 세정했다. 절편을 Vectashield(Vector Labs, Burlingame, CA) 장착 매질로 장착시키고, Cy5 필터(여기, 578nm-590nm; 발광 603nm-671nm)(Zeiss, Thornwood, NY)를 사용하여 Zeiss Axioskop 2 현미경으로 분석했다. 이미지 노출 시간은 각 항체에 대해 양성 대조군을 사용하여 매일 표준화했다. 이미지는 Axiovision 4.5 소프트웨어를 사용하여 촬영했다.
막 손상은 수용액에서 형광성이 아니고 지질 환경에서 밝게 형광을 내고, 막 회복을 연구하기 위해 광범위하게 사용된 막-불침투성 스티릴 양이온성 염료인 FM1-43의 축적에 의해 평가하였다. 레이저 손상 직후 WT 및 Ano5 -/- 섬유의 손상 부위에서 작은 형광 영역이 검출되었다(도 5a). 형광의 증가는 WT 섬유보다 Ano5 -/- 근섬유에서 약 2배 더 빠른 초기 속도에서 더 크게 발생했다. 형광이 WT에서 190초에 평준화되는 것처럼 보인 반면에, 형광은 실험 기간 동안 Ano5 -/- 섬유에서 계속 증가했다(도 5b).
막 회복의 결함이 ANO5 발현에 직접 관련되었지의 여부를 테스트하기 위해, 인간 ANO5 cDNA를 Ano5 -/ - 근육에서 아데노-관련 바이러스(AAV)를 사용하여 발현시켰다(도 4b,c). 인간 ANO5 cDNA(서열번호 1)는 MHCK7 프로모터와 폴리아데닐화 신호 사이의 Not1 제한 부위를 사용하여 AAV2 ITR 플라스미드로 클로닝했다. rAAV 벡터는 변형된 교차-패키징 접근법에 의해 생성되고, 이에 의해 AAV 유형 2 ITR은 문헌(참조: Rabinowitz 등 (J. Virol . 76: 791-801, 200))에 기재된 바와 같이 다수의 AAV 캡시드 혈청형으로 패키징될 수 있다. 생산은 HEK293 세포를 사용하는 표준 3-플라스미드 DNA CaPO4 침전법을 사용하여 달성하였다. HEK293 세포는 10% 우주 송아지 혈청(CCS, Hyclone)이 보충된 DMEM에서 유지시켰다. 생산 플라스미드는 다음과 같다: (i) pAAV.MHCK7.ANO5, (ii) cap 혈청형 8형 단리물 rh.74을 코딩하는 rep2-cap8 변형된 AAV 헬퍼 플라스미드 및 (iii) 아데노 바이러스 E2A, E4 ORF6 및 VA I/II RNA 유전자를 발현시키는 아데노 바이러스 유형 5 헬퍼 플라스미드(pAdhelper). 벡터를 문헌(참조: Clark 등 (Human Gene Ther . 10: 1031-10398, 1999))에 이전에 기재된 바와 같이 선형 NaCl 염 구배를 사용하여 순차적 요오딕사놀 구배 정제 및 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피에 의해 정화된 HEK293 세포 용해물로부터 정제하였다. 정량적 PCR-기반 적정법을 사용하여 Prism 7500 Taqman 검출기 시스템(PE Applied Biosystems, Carlsbad, CA)을 이용하는 이입된 벡터 게놈(vg) 역가를 결정하였다.
AAV 벡터는 근육내 주사를 통해 마우스 근육으로 전달한다. 4 내지 5주령 Ano5 -/- 마우스를 1x1011 vg의 rAAVrh.74.MHCK7.huANO5.FLAG를 TA(n=4) 또는 FDB(n=4) 근육으로 근육내 주사로 치료했다. TA 근육을 주사 4주 후에 수거하고, 조직학적 및 면역 형광 검사를 위해 처리했다.
단지굴근(FDB) 근섬유를 치료 10주 후에 수거하고, 레이저 유발 손상을 수행하였다. 막 수리 검정을 문헌(참조: Sondergaard 등 (Ann. Clin. Trans. Neurol. 2:256-270, 2015))에 기재된 바와 같이 Ano5 -/- (n=4) 및 연령 일치된 C57BL6 (n=4) 마우스의 좌측 및 우측 FDB 근육에 수행하였다. 간단하게, FDB 섬유를 DMEM에 현탁된 2% w/v 콜라게나제 유형 I를 함유하는 용액을 사용하여 단리시켰다. 근육의 해리 후, 섬유를 1.5mM Ca2+가 보충된 둘베코의 PBS(Ca/Mg 없음) 중의 2.5㎛ FM1-43 염료를 보유하는 유리 바닥 접시에 위치시켰다. 섬유는 FluoView® FV1000 두-광자 공초점 레이저-스캐닝 현미경(Olympus)을 사용하여 레이저 손상시켰다. 섬유는 20% 전력에서 4.479mm의 850nm 레이저 유도 스팟으로 손상시켰고, 190초 동안 5초마다 이미지화하여 FM1-43 염료 흡수를 가시화했다. 마우스당 근육당 평균 7 내지 10개의 섬유를 이미지화했다(총 31개 WT, 39개 Ano5 -/- 및 30개의 AAV-ANO5는 Ano5 -/- 섬유를 구제한다). 막 상의 손상 부위를 둘러싸는 염료 침투의 형광 강도를 정의된 영역 내에서 픽셀 강도의 통합 밀도를 측정함으로써 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 그렇게 하기 위해, ImageJ의 2X 줌 설정하에, 0.75 픽셀 x 1.00 픽셀을 측정하는 직사각형 박스를 그려 그 영역에서 염료의 강도를 측정하기 위해 사용한다. 분석에서, 개별적 시점에서 측정된 형광 강도를 t=-5s(손상 전)에 측정된 초기 강도로 정규화하였다. 형광 강도가 분석되면, 각 균주의 모든 섬유의 값을 함께 평균하였다. 2원 ANOVA를 수행하여 각 시점(p<0.001)에서 처리된 섬유 및 미처리된 섬유 사이의 통계적 유의성을 결정하였다. 형광의 변화를 정량화하기 위해, 데이터 점을 Origin Pro 9.1을 사용하여 힐(Hill) 방정식에 적합화했다. 모든 곡선을 조정된 R2 >0.998로 적합화했다. Ano5 -/- 섬유, WT 섬유 및 AAV.ANO5 처리된 Ano5 -/- 섬유는 손상 후 100초에 시작하여 상당히 상이하였다. AAV.ANO5는 Ano5 -/- 마우스에 재밀봉하는 막을 부분적으로 복원하였다(도 5a,b,c ).
실시예 4
Ano5 KO 마우스에서 손상된 재생
근육 재생이 Ano5 -/- 마우스에서도 결함이 있었는지의 여부를 심장독소 주사로 생성된 손상으로부터 근육을 회복하는 능력을 시험함으로써 조사했다(도 5d). 마우스를 흡입된 이소플루란으로 마취시키고, 총 3라운드 동안 2주 마다 심장독소(멸균 생리 식염수로 10μM로 희석됨)를 주사했다. 30μL 및 50μL의 심장독소를 8주령 Ano5 -/- 및 연령 일치된 대조군의 좌측 TA 및 좌측 GAS 근육 각각에 주입하였다. 멸균 생리 식염수를 허위 대조군으로서 반대쪽 근육에 주사하였다. 마우스 그룹을 안락사시키고, 그들의 근육을 심장독소의 최종 주사 후 1일, 3일, 7일 및 14일, 30일 및 90일에 수거하였다(시점당 균주당 n=3 마우스). TA당 4개의 20X 이미지를 이미지화하고, 섬유 직경을 Axio Vision 4.8을 사용하여 최종 심장독소 주사 1개월 및 3개월 후에 H&E-염색된 냉각 부분 상에서 측정했다. 평균 500 내지 600개 근육 섬유를 측정하고, 비쌍체 t-테스트를 수행하여(GraphPad Prism) 손상된 Ano5 -/- 마우스와 손상된 대조군 마우스 사이의 통계적 유의성을 결정하였다(****p<0.0001).
괴사 및 재생의 시간적 변화를 추적하기 위해, 8주령 마우스의 TA 및 GAS 근육에 2주 간격으로 3회 심장독소를 주사하였다. 조직을 최종 주사 후 1일, 3일, 7일, 14일, 30일 및 90일에 수거하였다(도 5d). 대측부는 생리 식염수 단독 대조군으로서 사용하였다. 1개월까지 새로 재생된 섬유 중의 중심 핵을 제외하고는 근육이 거의 정상적으로 보이도록 WT 근육을 심장독소 치료 후 재생시켰다. 그러나, Ano5 -/- 마우스에서, 재생 및 오랜 괴사의 광범위한 지연이 존재했다. 3개월 후, 잔류된 Ano5 -/- 근육의 평균 섬유 직경은 WT와 비교하여 상당히 감소되었고, 많은 섬유는 중심 핵을 나타냈다(도 5d,e).
실시예 5
항산화제 요법 효과의 평가
아녹타민 5 결핍(Ano5 -/-) 마우스의 골격근에 대한 삼중 항산화제 다이어트의 잠재적인 효과를 시험하기 위해, 2개월령 야생형(WT) BL6 마우스 및 Ano5 -/- 마우스의 코호트에 1000 IU 비타민 E, 0.1% α-리포산 및 0.25% 코엔자임 Q10(환원된 유비퀴놀 형태로)을 포함하는 삼중 항산화제 조성물이 보충된 정상 마우스 음식 또는 다이어트를 공급했다. 마우스를 16주의 기간 동안 4번째주마다 연속 3일 동안 고갈까지 실행하고, 희생시켜 근육 건강(활성 및 횡경막 힘) 및 산화적 스트레스(시트레이트 신타제 활성 및 pgc1α 발현)과 관련된 기능적 결과 척도를 시험하였다.
오픈 필드 케이지 활성의 레이저 모니터링
오픈 필드 활성 챔버를 사용하여 이전에 기재된 프로토콜(참조: Kobayashi 등, Nature 456: 511-5 (2008); Beastrom 등, Am J Pathol 179: 2464-74 (2011))에 따라 다수의 변형으로 실험 마우스의 전체 활성을 결정하엿다. 모든 마우스를 마우스가 가장 활동적일 때 야간 사이클이 끝난 후 이른 아침에 같은 시간에 테스트하였다. 모든 마우스를 희미한 조명하에 매번 동일한 핸들러로 단리된 방에서 테스트하였다. 또한, 불안을 감소시키고 마우스의 정상적 활동 및 결과적으로 검정의 결과에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 거동 변수를 최소한으로 유지하기 위해 이전 보고서에서 수행한 바와 같이, 본 발명자들은 개별적으로 수용되지 않은 마우스를 테스트했다(참조: Voikar 등, Genes Brain Behav 4: 240-52(2005)). 마우스는 Photobeam Activity System(San Diego Instruments, San Diego, CA)을 사용하여 활성 모니터링하였다. 이 시스템은 X-Y-Z 평면 내에서 마우스의 위치 및 운동을 모니터링하기 위해 동물 챔버을 전방에서 뒷쪽으로 좌측에서 우측으로 가로지르는 보이지 않는 적외선 광선 격자를 사용한다. 활성을 5분 간격으로 1시간 사이클 동안 기록하였다. 마우스를 데이터 수집을 시작하기 며칠 전에 최초 1시간 기간 동안 활동 테스트 룸에서 순응시켰다. 마우스를 4개의 세트로 개별 챔버에서 테스트했다. 테스트 장비를 각 사용 사이에 청소하여 본 결과를 변경할 수 있는 마우스 반동적 거동 변수를 감소시켰다. 수집된 데이터를 마이크로소프트 엑셀 워크시트로 변환시키고, 모든 계산은 엑셀 프로그램 내에서 수행하였다. X 및 Y 평면에서 운동을 위한 개별적 빔 차단을 총 보행을 나타내기 위해 각 마우스에 추가하였고, Z 평면에서의 빔 차단을 추가하여 1시간 간격 내에서 수직 활성을 수득하였다.
12주 및 16주 말기에, 각 그룹으로부터 2마리 마우스를 활동 케이지에 위치시켜 자발적 활동을 모니터링했다. 전체 마우스 활동을 트레드밀 고갈 후 45분 동안 마우스가 수평 및/또는 수직 레이저 빔을 끊은 횟수로서 측정되었다(도 6). 항산화제 다이어트를 투여한 Ano5 -/- 마우스는 16주에 표준(플라시보) 다이어트에서 보다 더 활동적인 것으로 밝혀져 항산화제가 고갈 후 자발적 활동에 양성 효과를 갖는다는 것을 시사한다.
기능적 평가를 위한 횡경막의 파상풍 수축
거동 검정은 일부 치료 효과를 암시하는 반면, 이러한 결과 측정은 다이어트와 무관한 몇 가지 변수에 적용된다. 골격근 기능에 대한 항산화제 보충의 영향을 조사하기 위해, 힘 측정을 마우스 Ano5 -/- 및 WT 마우스의 횡경막 상에서 수행하였다(도 7). 횡격막은 Ano5 -/- 마우스가 사지 근육이 아닌 횡경막 힘이 결핍되어 있음이 이전에 입증되었기 때문에 선택되었다(참조: Griffin 등, Hum Mol Genet 25: 1900-1911 (2016)).
마우스를 안락사시키고, 횡경막을 립 부착물과 중심 힘줄을 손상 없이 절개하고, 이미 문헌(참조: Beastrom 등, Am J Pathol 179: 2464-74 (2011); Rafael-Fortney 등, Circulation 124: 582-8 (2011); Moorwood 등, Journal of Visualized Experiments 71: e50036 (2013))에 기재된 바와 같이 K-H 완충제에 위치시켰다. 횡경막의 2-4mm 너비 절편을 단리시켰다. 횡경막 스트립을 중심 힘줄에서 편조된 외과용 실크(6/0; Surgical Specialties, Reading, PA)로 견고하게 묶고, 스트립의 말단부에 부착된 늑골의 일부를 통해 봉합하였다. 각 근육은 37℃에서 유지된 산소화된 K-H 용액이 충전된 수욕으로 옮겼다. 근육을 수평으로 정렬시키고, 고정 핀과 듀얼-모드 힘 변환기-서보모터(305C; Aurora Scientific, Aurora, Ontario, Canada) 사이에 직접 묶었다. 2개의 백금 플레이트 전극을 근육의 길이에 인접하도록 장기 욕조에 배치하였다. 근육을 경련 수축의 측정을 위해 최적 길이로 연신시킨 다음, 파상풍 프로토콜의 개시 전에 10분 동안 휴지시켰다. 일단 근육이 안정화되면, 근육을 1g의 최적 길이로 설정하고, 30초마다 3번의 1Hz 경련에 이어 매분 3회의 150Hz 경련으로 구성된 워밍업을 수행하였다. 3분 휴지 기간 후, 횡경막은 최대 파상풍 힘을 결정하기 위해 각각 250ms의 기간을 갖고 각 자극 사이에 2분 휴지 기간을 허용하여 20, 50, 80, 120, 150, 180Hz에서 자극하였다. 근육 길이 및 중량을 측정하였다. 힘은 근육 중량 및 길이에 대해 표준화하였다. 횡경막 특이적 힘에서의 유의한 향상은 플라시보 처리된 ano5 -/- 마우스와 비교하여 삼중 항산화제 처리된 ano5 -/- 마우스에서 관찰되었다(도 7)
미토콘드리아 생합성
삼중 항산화제 요법 및 산화적 섬유 함량과의 관계를 확립한 후, 미토콘드리아 생합성 및 기능을 분석했다. 이전 연구는 미토콘드리아 생합성을 유도하는 경로를 자극하는 운동을 나타낸 반면, 항산화제 요법은 이 신호전달을 감소시킨다. 남성 비복근 근육 조직에 대한 결과는, 항산화제 치료가 미토콘드리아 생합성 PGC-1a의 중요한 조절제의 발현을 감소시켰다는 것을 확인했다(도 8a). 흥미롭게도, 시트레이트 신타제 활성은 모든 유전자형-성별 조합 중에서 항산화제 공급 마우스에서 더 높은 것으로 밝혀졌다(도 8b). 이에 대한 하나의 간단한 설명은 미토콘드리아 함량이 높은 산화적 섬유의 증가된 비율이 섬유당 미토콘드리아 생합성에서 임의의 감소를 은폐한다는 것이다.
요약하면, 삼중 항산화제 요법은 자발적 활동, 횡경막 강도, 섬유 크기, 섬유 유형 조성, 및 미토콘드리아 효소 활성을 포함하는 근육 생리학 & 기능의 일부 측정에 중요한 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 특정 경우에 성별 특이적인 것으로 밝혀졌다. LGMD2L은 성별 특이적이고, 남성이 더 심하게 영향을 받는다.
<110> THE RESEARCH INSTITUTE AT NATIONWIDE CHILDREN'S HOSPITAL <120> METHODS OF TREATING MUSCULAR DYSTROPHY <130> 28335/49966A <150> 62/254,539 <151> 2015-11-12 <150> 62/419,793 <151> 2016-11-09 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2739 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgggcgacc cggatctcct ggaagtgttg gcggaggaag gggaaaaagt caataagcat 60 atagactact ctttccaaat gagtgagcag agcctgagca gcagagagac cagctttctc 120 atcaatgaag aaacaatgcc tgcaaagcga ttcaatttgt tcctgaggcg gcggcttatg 180 tttcaaaaaa atcagcaaag caaagattct atcttcttcc gagatgggat taggcaaatt 240 gattttgtgc tttcctacgt tgatgacgta aagaaagacg cagagttaaa ggcggaaaga 300 agaaaagagt ttgaaactaa tctcagaaaa acaggtcttg agttggaaat agaagacaaa 360 agggactcgg aagatggaag aacttatttt gtcaagatcc atgccccttg ggaggtatta 420 gttacctatg ctgaagtctt gggaatcaaa atgcctatta aggagagtga tattccccgc 480 cctaagcaca ctcctataag ctatgtgctt ggacctgtaa gactcccact gagtgtgaag 540 tatccccatc ctgaatattt tactgcacaa ttcagcagac atcggcagga gctcttcctc 600 atcgaagatc aggcaacctt ctttccatcc tcatcaagaa acagaattgt gtactatatt 660 ctctcaagat gtccttttgg catagaagat gggaagaaaa ggtttgggat tgaaagactg 720 ctaaactcta acacttactc atctgcctat ccactccatg atggccaata ttggaagcca 780 tcagaacctc ccaatcctac caatgaaaga tacacacttc accagaattg ggctcgattt 840 tcctatttct acaaggagca gcctttagac ttgattaaga attattatgg agaaaaaatt 900 ggtatctatt ttgtctttct tggattttac acagaaatgc tattctttgc agctgtagtt 960 ggcttagctt gttttattta tggcttatta tcaatggaac ataacacaag cagcactgaa 1020 atctgtgacc ctgagattgg tggtcagatg atcatgtgcc cactctgtga tcaagtgtgt 1080 gattattgga gactaaatag tacgtgtttg gcttcaaagt tctcccattt gtttgataat 1140 gagtcaacag tgttctttgc aatattcatg ggaatttggg tcaccttatt tttggagttt 1200 tggaaacaac gacaagccag actggaatat gaatgggacc tggtggactt tgaagaggaa 1260 cagcagcagc ttcagctgag accagaattt gaagctatgt gtaaacacag gaaattgaat 1320 gcagtgacta aggagatgga accttacatg cctctataca cgcgtattcc atggtacttt 1380 ctttcaggag ccacagtgac attatggatg tctcttgtcg tcaccagtat ggtagctgta 1440 attgtgtacc gcctgtcagt ctttgctaca tttgctagtt tcatggaaag tgatgcatcc 1500 ttaaagcagg tcaaaagctt ccttactcct cagataacca catcactcac aggatcatgc 1560 ttgaacttta ttgtcatctt gatcttgaat ttcttttatg aaaagatatc tgcctggatc 1620 acaaaaatgg aaattcctcg aacataccag gagtatgaga gcagtcttac cttgaaaatg 1680 ttcctgtttc agtttgtaaa tttttactca tcctgcttct acgtagcttt ctttaaaggg 1740 aagttcgtag gctatcctgg aaaatacaca tatttattta atgagtggag aagtgaagag 1800 tgtgatcctg gaggctgtct tatagaattg acaacccaat tgaccattat aatgaccggg 1860 aaacagattt ttggaaacat taaagaagcc atttatccct tggctttgaa ttggtggaga 1920 cgccgaaaag ctcggacaaa ctctgagaag ctgtatagtc gatgggagca ggatcatgac 1980 cttgaaagtt ttggacccct tgggcttttc tatgagtact tagaaacagt tactcaattt 2040 ggatttgtta cactatttgt ggcctctttt cctttggctc ctcttcttgc tctcataaat 2100 aatattgtag agattcgagt ggatgcctgg aaacttacca ctcaatacag gagaactgta 2160 gcttctaaag ctcatagcat aggtgtttgg caagacattc tttatggaat ggctgtcctt 2220 tctgttgcaa ctaatgcctt tattgttgca tttacgtcag acatcattcc ccgtctagtt 2280 tactactatg cttactcaac aaatgccaca cagcctatga caggatatgt gaataatagc 2340 ctgtcagtat tcctgatagc tgattttcca aaccacactg caccttcgga aaaacgagac 2400 ttcatcactt gcaggtacag agattacaga tatcctcctg atgacgagaa taaatatttt 2460 cataatatgc aattctggca tgtccttgct gccaagatga ccttcatcat tgttatggaa 2520 catgttgtgt ttttagttaa atttttgctg gcctggatga tacctgatgt tccaaaagat 2580 gttgtggaga gaatcaagag agaaaagtta atgactatca agattctcca tgattttgag 2640 ctcaacaaat taaaagagaa cttgggaatt aattctaatg aatttgccaa gcatgtcatg 2700 attgaggaaa acaaagcaca gctggctaaa tcaacactc 2739 <210> 2 <211> 913 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Asp Pro Asp Leu Leu Glu Val Leu Ala Glu Glu Gly Glu Lys 1 5 10 15 Val Asn Lys His Ile Asp Tyr Ser Phe Gln Met Ser Glu Gln Ser Leu 20 25 30 Ser Ser Arg Glu Thr Ser Phe Leu Ile Asn Glu Glu Thr Met Pro Ala 35 40 45 Lys Arg Phe Asn Leu Phe Leu Arg Arg Arg Leu Met Phe Gln Lys Asn 50 55 60 Gln Gln Ser Lys Asp Ser Ile Phe Phe Arg Asp Gly Ile Arg Gln Ile 65 70 75 80 Asp Phe Val Leu Ser Tyr Val Asp Asp Val Lys Lys Asp Ala Glu Leu 85 90 95 Lys Ala Glu Arg Arg Lys Glu Phe Glu Thr Asn Leu Arg Lys Thr Gly 100 105 110 Leu Glu Leu Glu Ile Glu Asp Lys Arg Asp Ser Glu Asp Gly Arg Thr 115 120 125 Tyr Phe Val Lys Ile His Ala Pro Trp Glu Val Leu Val Thr Tyr Ala 130 135 140 Glu Val Leu Gly Ile Lys Met Pro Ile Lys Glu Ser Asp Ile Pro Arg 145 150 155 160 Pro Lys His Thr Pro Ile Ser Tyr Val Leu Gly Pro Val Arg Leu Pro 165 170 175 Leu Ser Val Lys Tyr Pro His Pro Glu Tyr Phe Thr Ala Gln Phe Ser 180 185 190 Arg His Arg Gln Glu Leu Phe Leu Ile Glu Asp Gln Ala Thr Phe Phe 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Arg Asn Arg Ile Val Tyr Tyr Ile Leu Ser Arg Cys 210 215 220 Pro Phe Gly Ile Glu Asp Gly Lys Lys Arg Phe Gly Ile Glu Arg Leu 225 230 235 240 Leu Asn Ser Asn Thr Tyr Ser Ser Ala Tyr Pro Leu His Asp Gly Gln 245 250 255 Tyr Trp Lys Pro Ser Glu Pro Pro Asn Pro Thr Asn Glu Arg Tyr Thr 260 265 270 Leu His Gln Asn Trp Ala Arg Phe Ser Tyr Phe Tyr Lys Glu Gln Pro 275 280 285 Leu Asp Leu Ile Lys Asn Tyr Tyr Gly Glu Lys Ile Gly Ile Tyr Phe 290 295 300 Val Phe Leu Gly Phe Tyr Thr Glu Met Leu Phe Phe Ala Ala Val Val 305 310 315 320 Gly Leu Ala Cys Phe Ile Tyr Gly Leu Leu Ser Met Glu His Asn Thr 325 330 335 Ser Ser Thr Glu Ile Cys Asp Pro Glu Ile Gly Gly Gln Met Ile Met 340 345 350 Cys Pro Leu Cys Asp Gln Val Cys Asp Tyr Trp Arg Leu Asn Ser Thr 355 360 365 Cys Leu Ala Ser Lys Phe Ser His Leu Phe Asp Asn Glu Ser Thr Val 370 375 380 Phe Phe Ala Ile Phe Met Gly Ile Trp Val Thr Leu Phe Leu Glu Phe 385 390 395 400 Trp Lys Gln Arg Gln Ala Arg Leu Glu Tyr Glu Trp Asp Leu Val Asp 405 410 415 Phe Glu Glu Glu Gln Gln Gln Leu Gln Leu Arg Pro Glu Phe Glu Ala 420 425 430 Met Cys Lys His Arg Lys Leu Asn Ala Val Thr Lys Glu Met Glu Pro 435 440 445 Tyr Met Pro Leu Tyr Thr Arg Ile Pro Trp Tyr Phe Leu Ser Gly Ala 450 455 460 Thr Val Thr Leu Trp Met Ser Leu Val Val Thr Ser Met Val Ala Val 465 470 475 480 Ile Val Tyr Arg Leu Ser Val Phe Ala Thr Phe Ala Ser Phe Met Glu 485 490 495 Ser Asp Ala Ser Leu Lys Gln Val Lys Ser Phe Leu Thr Pro Gln Ile 500 505 510 Thr Thr Ser Leu Thr Gly Ser Cys Leu Asn Phe Ile Val Ile Leu Ile 515 520 525 Leu Asn Phe Phe Tyr Glu Lys Ile Ser Ala Trp Ile Thr Lys Met Glu 530 535 540 Ile Pro Arg Thr Tyr Gln Glu Tyr Glu Ser Ser Leu Thr Leu Lys Met 545 550 555 560 Phe Leu Phe Gln Phe Val Asn Phe Tyr Ser Ser Cys Phe Tyr Val Ala 565 570 575 Phe Phe Lys Gly Lys Phe Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Tyr Leu 580 585 590 Phe Asn Glu Trp Arg Ser Glu Glu Cys Asp Pro Gly Gly Cys Leu Ile 595 600 605 Glu Leu Thr Thr Gln Leu Thr Ile Ile Met Thr Gly Lys Gln Ile Phe 610 615 620 Gly Asn Ile Lys Glu Ala Ile Tyr Pro Leu Ala Leu Asn Trp Trp Arg 625 630 635 640 Arg Arg Lys Ala Arg Thr Asn Ser Glu Lys Leu Tyr Ser Arg Trp Glu 645 650 655 Gln Asp His Asp Leu Glu Ser Phe Gly Pro Leu Gly Leu Phe Tyr Glu 660 665 670 Tyr Leu Glu Thr Val Thr Gln Phe Gly Phe Val Thr Leu Phe Val Ala 675 680 685 Ser Phe Pro Leu Ala Pro Leu Leu Ala Leu Ile Asn Asn Ile Val Glu 690 695 700 Ile Arg Val Asp Ala Trp Lys Leu Thr Thr Gln Tyr Arg Arg Thr Val 705 710 715 720 Ala Ser Lys Ala His Ser Ile Gly Val Trp Gln Asp Ile Leu Tyr Gly 725 730 735 Met Ala Val Leu Ser Val Ala Thr Asn Ala Phe Ile Val Ala Phe Thr 740 745 750 Ser Asp Ile Ile Pro Arg Leu Val Tyr Tyr Tyr Ala Tyr Ser Thr Asn 755 760 765 Ala Thr Gln Pro Met Thr Gly Tyr Val Asn Asn Ser Leu Ser Val Phe 770 775 780 Leu Ile Ala Asp Phe Pro Asn His Thr Ala Pro Ser Glu Lys Arg Asp 785 790 795 800 Phe Ile Thr Cys Arg Tyr Arg Asp Tyr Arg Tyr Pro Pro Asp Asp Glu 805 810 815 Asn Lys Tyr Phe His Asn Met Gln Phe Trp His Val Leu Ala Ala Lys 820 825 830 Met Thr Phe Ile Ile Val Met Glu His Val Val Phe Leu Val Lys Phe 835 840 845 Leu Leu Ala Trp Met Ile Pro Asp Val Pro Lys Asp Val Val Glu Arg 850 855 860 Ile Lys Arg Glu Lys Leu Met Thr Ile Lys Ile Leu His Asp Phe Glu 865 870 875 880 Leu Asn Lys Leu Lys Glu Asn Leu Gly Ile Asn Ser Asn Glu Phe Ala 885 890 895 Lys His Val Met Ile Glu Glu Asn Lys Ala Gln Leu Ala Lys Ser Thr 900 905 910 Leu <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 3 agtccttttc agcacagtct ttg 23 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 4 tgaggcagtg tggagtgagt a 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 5 gccaatcata tggtctcagt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 6 actgatggcg agctcagacc 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 7 cctggccgtc aggcagat 18 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 8 gacatggaga agatctggca cc 22 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 9 ccaacagaat gagaacct 18 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 10 gacaggggtg ggtactttgg 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 11 cgttggcagc aagatcat 18 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 12 gggtacctat aatctctgta cctgc 25 <210> 13 <211> 6661 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <308> NCBI / NM_213599.2 <309> 2015-03-15 <313> 1-6661 <400> 13 agagcgccca ggagcgctac cggctgaggg tggggaagcg cagggccaag cgcgcgaagc 60 aggttgtggg ggaccgggtc gagtggaagt acccgccgga gaggaaggcc ggctggctgt 120 ggcgcccaga gacggtggag tccgaggagg aggagaagga ggcctgcaga aggaagagca 180 ggcccttaga agtccagcag cagcaactcc ggcggcccac agtcagattc agcacctgcc 240 tcagatctcc acgtctgtct cagctgcccc tctcctgctg cctctcaggc accagtgcca 300 ttaacgagct ggcgaagatg ggcgacccgg atctcctgga agtgttggcg gaggaagggg 360 aaaaagtcaa taagcatata gactactctt tccaaatgag tgagcagagc ctgagcagca 420 gagagaccag ctttctcatc aatgaagaaa caatgcctgc aaagcgattc aatttgttcc 480 tgaggcggcg gcttatgttt caaaaaaatc agcaaagcaa agattctatc ttcttccgag 540 atgggattag gcaaattgat tttgtgcttt cctacgttga tgatgtaaag aaagacgcag 600 agttaaaggc ggaaagaaga aaagagtttg aaactaatct cagaaaaaca ggtcttgagt 660 tggaaataga agacaaaagg gactcggaag atggaagaac ttattttgtc aagatccatg 720 ccccttggga ggtattagtt acctatgctg aagtcttggg aatcaaaatg cctattaagg 780 agagtgatat tccccgccct aagcacactc ctataagcta tgtgcttgga cctgtaagac 840 tcccactgag tgtgaagtat ccccatcctg aatattttac tgcacaattc agcagacatc 900 ggcaggagct cttcctcatc gaagatcagg caaccttctt tccatcctca tcaagaaaca 960 gaattgtgta ctatattctc tcaagatgtc cttttggcat agaagatggg aagaaaaggt 1020 ttgggattga aagactgcta aactctaaca cttactcatc tgcctatcca ctccatgatg 1080 gccaatattg gaagccatca gaacctccca atcctaccaa tgaaagatac acacttcacc 1140 agaattgggc tcgattttcc tatttctaca aggagcagcc tttagacttg attaagaatt 1200 attatggaga aaaaattggt atctattttg tctttcttgg attttacaca gaaatgctat 1260 tctttgcagc tgtagttggc ttagcttgtt ttatttatgg cttattatca atggaacata 1320 acacaagcag cactgaaatc tgtgaccctg agattggtgg tcagatgatc atgtgcccac 1380 tctgtgatca agtgtgtgat tattggagac taaatagtac gtgtttggct tcaaagttct 1440 cccatttgtt tgataatgag tcaacagtgt tctttgcaat attcatggga atttgggtca 1500 ccttattttt ggagttttgg aaacaacgac aagccagact ggaatatgaa tgggacctgg 1560 tggactttga agaggaacag cagcagcttc agctgagacc agaatttgaa gctatgtgta 1620 aacacaggaa attgaatgca gtgactaagg agatggaacc ttacatgcct ctatacacgc 1680 gtattccatg gtactttctt tcaggagcca cagtgacatt atggatgtct cttgtcgtca 1740 ccagtatggt agctgtaatt gtgtaccgcc tgtcagtctt tgctacattt gctagtttca 1800 tggaaagtga tgcatcctta aagcaggtca aaagcttcct tactcctcag ataaccacat 1860 cactcacagg atcatgcttg aactttattg tcatcttgat cttgaatttc ttttatgaaa 1920 agatatctgc ctggatcaca aaaatggaaa ttcctcgaac ataccaggag tatgagagca 1980 gtcttacctt gaaaatgttc ctgtttcagt ttgtaaattt ttactcatcc tgcttctacg 2040 tagctttctt taaagggaag ttcgtaggct atcctggaaa atacacatat ttatttaatg 2100 agtggagaag tgaagagtgt gatcctggag gctgtcttat agaattgaca acccaattga 2160 ccattataat gaccgggaaa cagatttttg gaaacattaa agaagccatt tatcccttgg 2220 ctttgaattg gtggagacgc cgaaaagctc ggacaaactc tgagaagctg tatagtcgat 2280 gggagcagga tcatgacctt gaaagttttg gaccccttgg gcttttctat gagtacttag 2340 aaacagttac tcaatttgga tttgttacac tatttgtggc ctcttttcct ttggctcctc 2400 ttcttgctct cataaataat attgtagaga ttcgagtgga tgcctggaaa cttaccactc 2460 aatacaggag aactgtagct tctaaagctc atagcatagg tgtttggcaa gacattcttt 2520 atggaatggc tgtcctttct gttgcaacta atgcctttat tgttgcattt acgtcagaca 2580 tcattccccg tctagtttac tactatgctt actcaacaaa tgccacacag cctatgacag 2640 gatatgtgaa taatagcctg tcagtattcc tgatagctga ttttccaaac cacactgcac 2700 cttcggaaaa acgagacttc atcacttgca ggtacagaga ttacagatat cctcctgatg 2760 acgagaataa atattttcat aatatgcaat tctggcatgt ccttgctgcc aagatgacct 2820 tcatcattgt tatggaacat gttgtgtttt tagttaaatt tttgctggcc tggatgatac 2880 ctgatgttcc aaaagatgtt gtggagagaa tcaagagaga aaagttaatg actatcaaga 2940 ttctccatga ttttgagctc aacaaattaa aagagaactt gggaattaat tctaatgaat 3000 ttgccaagca tgtcatgatt gaggaaaaca aagcacagct ggctaaatca acactctaat 3060 cagtatagtg aggaagcagc aggtgatctg ccttacttca ctttatcctc tggttttagg 3120 gccagacgcc agaagccatg tgtcaatttt accctttctt tttttttttt ttcttttttt 3180 ttttaaactc aaagttttta tacactttta tagaggccaa ctttgtgatg ttggaaatgt 3240 actacttctc tgcttcattg actgggccct ctccagatgt tgttttctga ggtgctgtaa 3300 atgactgttg aaagtgcagg tagaatcaga atactgggaa attatggagt cttgcagttt 3360 agtaagaaac actggccttg ggctgtccca tcactttcca gtgcatctat ttatttttgt 3420 ggtcttctct tgggttattt gatacctcct tccccattaa gaaaaatgtt ggggcaaaaa 3480 gaaatggatc aaagagactg actgagccct atatatccta tcattttaaa atatgcaaat 3540 gaattgccaa gatcagatga cataagaaaa ctcacacatt aaggtgttaa tgtatcatag 3600 cagaggttta ttcctaacac attcaactac catcagaatc ccagatagtt cttcctggta 3660 aaggcagaat tccttttctc gagactgaaa ttttgggttt caacataaaa caacttggtt 3720 cttagagata ataatttggt tataatagtt tcaagactga tcttatctgg aaagcaacat 3780 tatgaagctg ttagattgct tcaggttctc aagcaaagac acaatacaga agtaaatgtg 3840 ttttcttagt agttaatgga tgcaggacaa tgtatattga ttaatttgtt gattttaatt 3900 tagaaaattg ttaaattatt tcttaaaaat cacttttctt ctggaatgcc aatttcacat 3960 catgaagcct ttttgtataa gttagatacg agttgtttat gataaacatt tctttgcttt 4020 aaaataattg caaatatttt aataagttta caaccttttc tattgatgta tcatcttata 4080 caatgctcag tgccttgttc caatacctct gacacacaag aagtcatgtt gttagctagt 4140 gatttgatgt gatgtaacat cttaaatgta agcttgtctt aatgaaattg tcagtgtaat 4200 aacaactaca gtcttgaaaa ccaaaagtga atcaaccaac taagaatgag ttcatggact 4260 taataatcta agggggaaaa aatgtttgtt gaattattcc tctcaaattt aggcttgtgt 4320 tacatgcaca aaaatccttg ttctgttttc acttaaaaaa actaaatatg tataactttg 4380 tgtatacaca cacacacatc tatatatata attattagca ctagagggat atagtccagt 4440 tatgtagtat ttaaatctcc agtttcaaat tataattcac ctccaaaaga atagtttttt 4500 aatcacacac ataagaaatt ttatcacaat atttaaaact aatatttcat tatctaatgc 4560 taataaatta ttgtggtact gccagtatta aatatatggc agatggtatt aactactgat 4620 caatagtaag catacagaac tggggattat ggattttata aactatgaga cagtcacccc 4680 agtttggact gggactaatc cccagtactg atttgtcatc cactgagtag actttatgaa 4740 tattttgggt aatttgaaat gatctcatta ttgaaagatg atttcatatg tagagaagat 4800 aatatttctt tcttgaaaaa acaagtcagg cttaccatga tgtgtgcaac caatgtagga 4860 tctttggctt gtcaaatcag attctccatt gctatagtgt acagtgcaca cagctcatat 4920 tgcttccttc ctgggtgctg ataaaaataa gaaagagcat ggaaattggt ttcttgaata 4980 taagctttaa tttttaaggc ttaaaagtat tcatagaggt agactgtatg ataaataaaa 5040 acaaatttaa ttcacaaagt tatctgtaca ctgcagtttt aaaatatacc aactaaatta 5100 ttgggtttct ggaagtgaat ggagaaaaca gcaagggaag aaatcgtttt taagataagt 5160 aaataattcc catggattga taaatatttt ccttttaaaa tgttatggac tgatattttt 5220 tattcacctt taaatttctt atcaagaagt ttatctttgt ttttcagatt taaaaatgaa 5280 atacaggtat tcgtcacttt cctgaaacca tgctaaccaa aatcagtagc caaaccaatt 5340 cagatagatg tgtctcatct aattaaaccc attggttttt atgggagggc tgcattaaga 5400 gcacccaacc accacatgta agttgataat taccagcatg gcaggtgatt ttatctgctg 5460 accaagcgca tagttttgtt ttgttttcag aatgttctag ggaacatttg agattttatg 5520 tgaaataaaa ttttaagtgc caaagccaaa aaaatactta actcttttca aaggccctct 5580 ttcatccttg ccttcgtcaa ctttcctttg cacacaggaa gcaaaatcta cttcaagaca 5640 tttattttag aggaatccat taagaaagga ttgttttact taaatgaaat gctgtcttat 5700 ttttgctgtg tcttttgaca cctcttagct ttaacattct tcttttaacc aagccattat 5760 gcaaagttat caaagaagag gagaaggaaa ggaggacaga tgaaagtgac gggaaatgag 5820 aaagaagagg agtgaggaaa cagttatttc cttatgaatc ctgtgtgttt ctttggaaga 5880 aagagctgtt ccgaggaagt ttggtccagc tgtggttgat aagaggtata tctcttaaaa 5940 aagacaccta atgaaagtga gagaaaagct aaagaaaatt tcaatgtgac cactattatg 6000 tgtcaaaata aaacttagat tccaaagtgg ttttgtagtg ttgggtgcta tgagtaggta 6060 tggatctctg ttgattgact ccagttgaag gtgagaaatc tgtaccaatc attcaaaaag 6120 ggaatctatt gttttgaaag aaactctctc atatttcctt taaattgtta atagttgtta 6180 tgcaactaaa gaatgttatg aagaaaaata gcattgcaaa aagtaccatt ggccagcctt 6240 acaagtcagc cacaatgagt cggtataact actgtgttat tctttttcta gacaaatttt 6300 gactcttcta cttttatgtg taataattcc agtattctat ttatttcagc attatgtgaa 6360 aaatgataag aatgttaaaa agaaaataat agtgtggttt aattggtatg agatacctgc 6420 ttcctcctcc tcaaaggttt gactgggtgt atctctccta tgtgtgacat tatgtctcct 6480 ggtgttaaca caggaaatga gtgctccttt ttaaaatttc tttcttccaa gttttttttt 6540 ccaggaagag aaatatgcag ttatgcagga aaagctctct taaataatgt gtacataaat 6600 ctcaagagaa tcaaattcac agagtgaata aagtaataat attaaactac attttgacat 6660 g 6661

Claims (97)

1) 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열, 2) 엄격한 조건하에 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 하이브리드화하는 뉴클레오티드 또는 3) ANO5 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 핵산의 단편을 포함하는 재조합 AAV 벡터의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 근이영양증의 치료 방법.
1) 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열, 2) 엄격한 조건하에 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 하이브리드화하는 뉴클레오티드 또는 3) ANO5 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 핵산의 단편을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 근육을 재생시키기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 균육의 재생을 필요로 하는 대상체에서 근육의 재생 방법.
1) 서열번호 1과 적어도 85% 동일한 핵산 서열, 2) 엄격한 조건하에 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 하이브리드화하는 뉴클레오티드 또는 3) ANO5 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 핵산의 단편을 포함하는 재조합 AAV 벡터의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 만성 근육 쇠약의 치료 방법.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV가 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 또는 AAV rh.74인, 방법.
청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터가 근육 특이적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 근육 특이적 조절 요소가 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 근원세포 특이적 인핸서 결합 인자 MEF, 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서 요소, 골격 속근(fast-twitch) 트로포닌 C 유전자 요소, 지근(slow-twitch) 심장 트로포닌 C 유전자 요소, 지근 트로포닌 I 유전자 요소, 하이포지아(hypozia) 유도성 핵 인자, 스테로이드 유도성 요소 또는 글루코코르티코이드 반응 요소(GRE)인, 방법.
청구항 2 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 근이영양증을 앓고 있는, 방법.
청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근이영양증이 디스퍼린 관련 근이영양증, 지대 근이영양증 타입 2L, 또는 미요시(Miyoshi) 근병증 타입 3, 베스렘(Bethlem) 근병증, 칼파인병증, 데스민 근병증, 디스퍼린병증, 근원섬유 근병증, 사르코글리칸병증 또는 ZASP-관련 근병증인, 방법.
청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 ANO5 유전자의 열성 돌연변이를 갖는, 방법.
청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터가 근육내 또는 정맥내 주사에 의해 투여되는, 방법.
청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 항산화제 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 항산화제 조성물이 코엔자임 Q10, 리포산, 비타민, 카로티노이드, 비타민 보조 인자, 미네랄, 폴리페놀 또는 플라보노이드 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
청구항 12 또는 13에 있어서, 상기 항산화제 조성물이 코엔자임 Q10, 리포산 및 비타민 E를 포함하는, 방법.
항산화제 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 근이영양증의 치료 방법.
항산화제 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 만성 근육 쇠약의 치료 방법.
항산화제 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 근이영양증의 진행을 늦추는 방법.
항산화제 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 만성 근육 쇠약의 진행을 늦추는 방법.
청구항 15 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제 조성물이 코엔자임 Q10, 리포산, 비타민, 카로티노이드, 비타민 보조 인자, 미네랄, 폴리페놀 또는 플라보노이드 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
청구항 15 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제 조성물이 코엔자임 Q10, 리포산 및 비타민 E를 포함하는, 방법.
청구항 15 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근이영양증이 디스퍼린 관련 근이영양증, 지대 근이영양증 타입 2L, 또는 미요시 근병증 타입 3, 베스렘 근병증, 칼파인병증, 데스민 근병증, 디스퍼린병증, 근원섬유 근병증, 사르코글리칸병증 또는 ZASP-관련 근병증인, 방법.
청구항 15 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산화적 스트레스가 상기 대상체의 골격근에서 감소되는, 방법.
청구항 15 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 골격근 기능이 향상되는, 방법.
청구항 15 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 ANO5 유전자의 열성 돌연변이를 갖는, 방법.
청구항 12 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제 조성물이 경구 투여되는, 방법.
청구항 12 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제가 동일 조성물에 존재하는, 방법.
청구항 12 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제가 별개의 조성물에 존재하는, 방법.
청구항 12 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제 조성물의 상기 항산화제가 동시에 투여되는, 방법.
청구항 12 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제 조성물의 상기 항산화제가 별개의 시간에 또는 연속적으로 투여되는, 방법.
청구항 12 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제 조성물이 1일 1회, 매주 1회, 매주 2회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 매월 또는 2개월마다 1회 투여되는, 방법.
근이영양증의 치료를 필요로 하는 대상체의 근이영양증을 치료하기 위한, 1) 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열, 2) 엄격한 조건하에 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 하이브리드화하는 뉴클레오티드 또는 3) ANO5 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 핵산의 단편을 포함하는 재조합 AAV 벡터의 치료적 유효량을 포함하는 조성물.
근육의 재생을 필요로 하는 대상체에서 근육을 재생시키기 위한, 1) 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열, 2) 엄격한 조건하에 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 하이브리드화하는 뉴클레오티드 또는 3) 이를 필요로 하는 대상체에 대해 ANO5 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 핵산의 단편을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 포함하는 조성물.
만성 근육 쇠약의 치료를 필요로 하는 대상체의 만성 근육 쇠약을 치료하기 위한, 1) 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열, 2) 엄격한 조건하에 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 하이브리드화하는 뉴클레오티드 또는 3) ANO5 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 핵산의 단편을 포함하는 재조합 AAV 벡터의 치료적 유효량을 포함하는 조성물.
청구항 31 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV가 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조성물.
청구항 31 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 또는 AAV rh.74인, 조성물.
청구항 31 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터가 근육 특이적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
청구항 36에 있어서, 상기 근육 특이적 조절 요소가 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 근원세포 특이적 인핸서 결합 인자 MEF, 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서 요소, 골격 속근 트로포닌 C 유전자 요소, 지근 심장 트로포닌 C 유전자 요소, 지근 트로포닌 I 유전자 요소, 하이포지아 유도성 핵 인자, 스테로이드 유도성 요소 또는 글루코코르티코이드 반응 요소(GRE)인, 조성물.
청구항 31 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 근이영양증을 앓고 있는, 조성물.
청구항 31 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근이영양증이 디스퍼린 관련 근이영양증, 지대 근이영양증 타입 2L, 또는 미요시 근병증 타입 3, 베스렘 근병증, 칼파인병증, 데스민 근병증, 디스퍼린병증, 근원섬유 근병증, 사르코글리칸병증 또는 ZASP-관련 근병증인, 조성물.
청구항 31 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 ANO5 유전자의 열성 돌연변이를 갖는, 조성물.
청구항 31 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, 근육내 또는 정맥내 주사용으로 제형화되는, 조성물.
청구항 31 내지 41 중 어느 한 항에 있어서, 항산화제 조성물의 치료적 유효량을 추가로 포함하는, 조성물.
청구항 42에 있어서, 상기 항산화제 조성물이 코엔자임 Q10, 리포산, 비타민, 카로티노이드, 비타민 보조 인자, 미네랄, 폴리페놀 또는 플라보노이드 중 적어도 하나를 포함하는, 조성물.
청구항 42 또는 43에 있어서, 상기 항산화제 조성물이 코엔자임 Q10, 리포산 및 비타민 E를 포함하는, 조성물.
근이영양증의 치료를 필요로 하는 대상체의 근이영양증을 치료하기 위한, 항산화제 조성물의 치료적 유효량을 포함하는 조성물.
만성 근육 쇠약의 치료를 필요로 하는 대상체의 만성 근육 쇠약을 치료하기 위한, 항산화제 조성물의 치료적 유효량을 포함하는 조성물.
근이영양증의 진행의 늦춤을 필요로 대상체에서 근이영양증의 진행을 늦추기 위한, 항산화제 조성물의 치료적 유효량을 포함하는 조성물.
만성 근육 쇠약의 진행의 늦춤을 필요로 하는 대상체에서 만성 근육 쇠약의 진행을 늦추기 위한, 항산화제 조성물의 치료적 유효량을 포함하는 조성물.
청구항 45 내지 48 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제 조성물이 코엔자임 Q10, 리포산, 비타민, 카로티노이드, 비타민 보조 인자, 미네랄, 폴리페놀 또는 플라보노이드 중 적어도 하나를 포함하는, 조성물.
청구항 45 내지 49 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제 조성물이 코엔자임 Q10, 리포산 및 비타민 E를 포함하는, 조성물.
청구항 45 내지 50 중 어느 한 항에 있어서, 근이영양증이 디스퍼린 관련 근이영양증, 지대 근이영양증 타입 2L, 또는 미요시 근병증 타입 3, 베스렘 근병증, 칼파인병증, 데스민 근병증, 디스퍼린병증, 근원섬유 근병증, 사르코글리칸병증 또는 ZASP-관련 근병증인, 조성물.
청구항 45 내지 51 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산화적 스트레스가 상기 대상체의 골격근에서 감소되는, 조성물.
청구항 45 내지 51 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 골격근 기능이 향상되는, 조성물.
청구항 45 내지 51 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 ANO5 유전자의 열성 돌연변이를 갖는, 조성물.
청구항 42 내지 54 중 어느 한 항에 있어서, 경구 투여용으로 제형화되는, 조성물.
청구항 42 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 동일 조성물에 존재하는, 조성물.
청구항 42 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 별개의 조성물에 존재하는, 조성물.
청구항 42 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제 조성물의 상기 항산화제가 동시에 투여되는, 조성물.
청구항 42 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제 조성물의 상기 항산화제가 별개의 시간에 또는 연속적으로 투여되는, 조성물.
청구항 45 내지 59 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제 조성물이 1일 1회, 매주 1회, 매주 2회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 매월 또는 2개월마다 1회 투여되는, 조성물.
근이영양증 치료를 필요로 하는 대상체의 근이영양증 치료용 약제를 제조하기 위한, 1) 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열, 2) 엄격한 조건하에 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 하이브리드화하는 뉴클레오티드 또는 3) ANO5 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 핵산의 단편을 포함하는 재조합 AAV 벡터의 용도.
근육 재생을 필요로 하는 대상체의 근육 재생용 약제를 제조하기 위한, 1) 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열, 2) 엄격한 조건하에 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 하이브리드화하는 뉴클레오티드 또는 3) 이를 필요로 하는 대상체에 대해 ANO5 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 핵산의 단편을 포함하는 재조합 AAV 벡터의 용도.
만성 근육 쇠약의 치료를 필요로 하는 대상체의 만성 근육 쇠약 치료용 약제를 제조하기 위한, 1) 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열, 2) 엄격한 조건하에 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 하이브리드화하는 뉴클레오티드 또는 3) ANO5 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 핵산의 단편을 포함하는 재조합 AAV 벡터의 용도.
청구항 61 내지 63 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV가 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 용도.
청구항 61 내지 63 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 또는 AAV rh.74인, 용도.
청구항 61 내지 65 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터가 근육 특이적 조절 요소에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 용도.
청구항 66에 있어서, 상기 근육 특이적 조절 요소가 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 근원세포 특이적 인핸서 결합 인자 MEF, 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서 요소, 골격 속근 트로포닌 C 유전자 요소, 지근 심장 트로포닌 C 유전자 요소, 지근 트로포닌 I 유전자 요소, 하이포지아 유도성 핵 인자, 스테로이드 유도성 요소 또는 글루코코르티코이드 반응 요소(GRE)인, 용도.
청구항 61 내지 67 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 근이영양증을 앓고 있는, 용도.
청구항 61 내지 68 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 디스퍼린 관련 근이영양증, 지대 근이영양증 타입 2L, 또는 미요시 근병증 타입 3, 베스렘 근병증, 칼파인병증, 데스민 근병증, 디스퍼린병증, 근원섬유 근병증, 사르코글리칸병증 또는 ZASP-관련 근병증을 앓고 있는, 용도.
청구항 61 내지 69 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 ANO5 유전자의 열성 돌연변이를 갖는, 용도.
청구항 61 내지 70 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제가 근육내 또는 정맥내 주사용으로 제형화되는, 용도.
청구항 61 내지 71 중 어느 한 항에 있어서, 필요로 하는 대상체에서 항산화제 조성물의 치료적 유효량을 추가로 포함하는, 용도.
청구항 72에 있어서, 상기 항산화제 조성물이 코엔자임 Q10, 리포산, 비타민, 카로티노이드, 비타민 보조 인자, 미네랄, 폴리페놀 또는 플라보노이드 중 적어도 하나를 포함하는, 용도.
청구항 72 또는 73에 있어서, 상기 항산화제 조성물이 코엔자임 Q10, 리포산 및 비타민 E를 포함하는, 용도.
근이영양증의 치료를 필요로 하는 대상체의 근이영양증 치료용 약제를 제조하기 위한, 항산화제 조성물의 치료적 유효량의 용도.
만성 근육 쇠약 증후군 치료용 약제를 제조하기 위한, 항산화제 조성물의 치료적 유효량의 용도.
근이영양증의 진행의 늦춤을 필요로 하는 대상체에서 근이영양증의 진행을 늦추기 위한 약제를 제조하기 위한, 항산화제 조성물의 치료적 유효량의 용도.
만성 근육 쇠약 증후군의 진행의 늦춤을 필요로 하는 대상체에서 만성 근육 쇠약 증후군의 진행을 늦추기 위한 약제를 제조하기 위한, 항산화제 조성물의 치료적 유효량의 용도.
청구항 75 내지 78 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제 조성물이 코엔자임 Q10, 리포산, 비타민, 카로티노이드, 비타민 보조 인자, 미네랄, 폴리페놀 또는 플라보노이드 중 적어도 하나를 포함하는, 용도.
청구항 75 내지 79 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제 조성물이 코엔자임 Q10, 리포산 및 비타민 E를 포함하는, 용도.
청구항 75 내지 80 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 디스퍼린 관련 근이영양증, 지대 근이영양증 타입 2L, 또는 미요시 근병증 타입 3, 베스렘 근병증, 칼파인병증, 데스민 근병증, 디스퍼린병증, 근원섬유 근병증, 사르코글리칸병증 또는 ZASP-관련 근병증을 앓고 있는, 용도.
청구항 75 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 산화적 스트레스가 상기 대상체의 골격근에서 감소되는, 용도.
청구항 75 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 골격근 기능이 향상되는, 용도.
청구항 75 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 ANO5 유전자의 열성 돌연변이를 갖는, 용도.
청구항 55 내지 84 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제가 경구 투여용으로 제형화되는, 용도.
청구항 15 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 필요로 하는 대상체에게 1) 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 핵산 서열, 2) 엄격한 조건하에 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 하이브리드화하는 뉴클레오티드 또는 3) ANO5 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 핵산의 단편을 포함하는 재조합 AAV 벡터의 치료적 유효량을 항산화제 조성물의 치료적 유효량과 함께 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
청구항 86에 있어서, 상기 항산화제 조성물이 코엔자임 Q10, 리포산, 비타민, 카로티노이드, 비타민 보조 인자, 미네랄, 폴리페놀 또는 플라보노이드 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
청구항 86 또는 87에 있어서, 상기 항산화제 조성물이 코엔자임 Q10, 리포산 및 비타민 E를 포함하는, 방법.
청구항 86 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터가 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
청구항 86 내지 89 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 또는 AAV rh.74인, 방법.
청구항 86 내지 89 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터가 근육내 또는 정맥내 주사에 의해 투여되는, 방법.
청구항 86 내지 91 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제 조성물이 경구 투여되는, 방법.
청구항 86 내지 91 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터 및 항산화제 조성물이 동일 조성물에 존재하는, 방법.
청구항 86 내지 92 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터 및 항산화제 조성물이 별개의 조성물에 존재하는, 방법.
청구항 86 내지 92 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터 및 항산화제 조성물이 동시에 투여되는, 방법.
청구항 86 내지 92 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터 및 항산화제 조성물이 별개의 시간에 또는 연속적으로 투여되는, 방법.
청구항 86 내지 96 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터 및 항산화제 조성물이 1일 1회, 매주 1회, 매주 2회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 매월 또는 2개월마다 1회 투여되는, 방법.
KR1020187016152A 2015-11-12 2016-11-11 근이영양증을 치료하는 방법 KR20180081566A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562254539P 2015-11-12 2015-11-12
US62/254,539 2015-11-12
US201662419793P 2016-11-09 2016-11-09
US62/419,793 2016-11-09
PCT/US2016/061703 WO2017083776A1 (en) 2015-11-12 2016-11-11 Methods of treating muscular dystrophy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20180081566A true KR20180081566A (ko) 2018-07-16

Family

ID=58696162

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187016152A KR20180081566A (ko) 2015-11-12 2016-11-11 근이영양증을 치료하는 방법

Country Status (17)

Country Link
US (2) US11820972B2 (ko)
EP (1) EP3373980A4 (ko)
JP (3) JP6889717B2 (ko)
KR (1) KR20180081566A (ko)
CN (1) CN108883200B (ko)
AU (2) AU2016354561B2 (ko)
BR (1) BR112018009657A2 (ko)
CA (1) CA3005240A1 (ko)
CO (1) CO2018005928A2 (ko)
EA (1) EA201891134A1 (ko)
IL (1) IL259178B (ko)
MX (1) MX2018005882A (ko)
RU (1) RU2761264C2 (ko)
SG (1) SG11201803971UA (ko)
TN (2) TN2019000279A1 (ko)
WO (1) WO2017083776A1 (ko)
ZA (1) ZA201803080B (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200083495A (ko) 2017-10-20 2020-07-08 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 Nt-3 유전자 치료를 위한 방법 및 물질
US20220106592A1 (en) * 2018-12-31 2022-04-07 Research Institute At Nationwide Children's Hospital DUX4 RNA Silencing Using RNA Targeting CRISPR-CAS13b
EP4164668A1 (en) 2020-06-15 2023-04-19 Research Institute at Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus vector delivery for muscular dystrophies
CN117223686B (zh) * 2023-11-15 2024-01-23 四川省农业机械科学研究院 一种扩座除砂一体化蚕盘及养蚕方法

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3485810T2 (de) 1983-05-27 1992-12-10 Texas A & M University Syst Verfahren zur herstellung eines rekombinanten baculovirus-expressionsvektors.
DK518384A (da) 1984-01-31 1985-07-01 Idaho Res Found Vektor til fremstilling af et gen-produkt i insektceller, fremgangsmaade til dens fremstilling samt dens anvendelse
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
US6962815B2 (en) 2001-01-05 2005-11-08 Children's Hopital Inc. AAV2 vectors and methods
WO2003074714A1 (en) 2002-03-05 2003-09-12 Stichting Voor De Technische Wetenschappen Baculovirus expression system
JP2006121961A (ja) 2004-10-28 2006-05-18 Univ Of Tokushima 顎骨骨幹異形成症ｇｄｄの原因遺伝子ｇｄｄ１とその用途
US20100120627A1 (en) * 2006-08-02 2010-05-13 Abdelmajid Belouchi Genemap of the human genes associated with psoriasis
FR2919305B1 (fr) * 2007-07-26 2009-09-18 Genethon Ass Loi De 1901 Vecteurs viraux adeno-associes pour l'expression de la dysferline.
GB0715087D0 (en) 2007-08-03 2007-09-12 Summit Corp Plc Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy
US20100026655A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 Avago Technologies Ecbu Ip (Singapore) Pte. Ltd. Capacitive Touchscreen or Touchpad for Finger or Stylus
WO2011044138A1 (en) * 2009-10-05 2011-04-14 Catabasis Pharmaceuticals, Inc. Lipoic acid acylated salicylate derivatives and their uses
CN102598270A (zh) 2009-11-03 2012-07-18 加利福尼亚大学董事会 在多个表面上由在低温水性溶液中生长的氧化锌层覆盖的高亮度发光二极管
US9434928B2 (en) 2011-11-23 2016-09-06 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant adeno-associated virus delivery of alpha-sarcoglycan polynucleotides
EP2833923A4 (en) 2012-04-02 2016-02-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS
US20150247196A1 (en) 2012-09-07 2015-09-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) In vitro genetic diagnostic of inherited neuromuscular disorders
US9624282B2 (en) 2012-11-26 2017-04-18 The Curators Of The University Of Missouri Microdystrophin peptides and methods for treating muscular dystrophy using the same
ITTO20130669A1 (it) 2013-08-05 2015-02-06 Consiglio Nazionale Ricerche Vettore adeno-associato ricombinante muscolo-specifico e suo impiego nel trattamento di patologie muscolari
EP2859896B1 (en) * 2013-10-08 2018-01-31 Ystem S.r.l. Pharmaceutical compositions for the treatment of muscular disorders
US9850497B2 (en) * 2013-11-04 2017-12-26 Regents Of The University Of Minnesota Gene targeting methods and tools

Also Published As

Publication number Publication date
TN2018000163A1 (en) 2019-10-04
US11820972B2 (en) 2023-11-21
ZA201803080B (en) 2023-12-20
EP3373980A1 (en) 2018-09-19
AU2016354561B2 (en) 2021-12-02
IL259178B (en) 2022-08-01
EA201891134A1 (ru) 2018-11-30
AU2016354561A9 (en) 2019-07-25
SG11201803971UA (en) 2018-06-28
CN108883200A (zh) 2018-11-23
RU2018121289A3 (ko) 2020-05-13
CA3005240A1 (en) 2017-05-18
US20180340187A1 (en) 2018-11-29
JP2018538261A (ja) 2018-12-27
MX2018005882A (es) 2019-03-11
AU2022201427A1 (en) 2022-03-24
IL259178A (en) 2018-06-28
RU2761264C2 (ru) 2021-12-06
TN2019000279A1 (en) 2021-05-07
JP7307121B2 (ja) 2023-07-11
CO2018005928A2 (es) 2018-08-21
CN108883200B (zh) 2022-11-29
WO2017083776A1 (en) 2017-05-18
EP3373980A4 (en) 2019-06-12
WO2017083776A9 (en) 2018-05-31
JP2021121620A (ja) 2021-08-26
RU2018121289A (ru) 2019-12-16
BR112018009657A2 (pt) 2018-11-13
JP2023099184A (ja) 2023-07-11
JP6889717B2 (ja) 2021-06-18
US20240191250A1 (en) 2024-06-13
AU2016354561A1 (en) 2018-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230001015A1 (en) Adeno-Associated Virus Vector Delivery of Microrna-29 to Treat Muscular Dystrophy
JP7079733B2 (ja) β－サルコグリカン及びマイクロＲＮＡ－２９のアデノ随伴ウイルスベクター送達ならびに筋ジストロフィーの治療
KR101835490B1 (ko) 신경변성 질환에 대한 유전자 요법
JP7307121B2 (ja) 筋ジストロフィーの治療方法
BR112020015173A2 (pt) Terapia gênica para distrofia muscular da cintura e membros do tipo 2c
JP2020503265A (ja) メチル−ｃｐｇ結合タンパク質２をコードする組換えアデノ随伴ウイルスの髄腔内送達
EP4061831A1 (en) Materials and methods for treatment of disorders associated with the ighmbp2 gene
EA045951B1 (ru) Генная терапия против тазово-плечевой мышечной дистрофии типа 2c
EA042315B1 (ru) Доставка микродистрофина вектором на основе аденоассоциированного вируса для лечения мышечной дистрофии
BR122024002143A2 (pt) Vetor de aavrh7.4 recombinante, composição, uso dos mesmos e método para produzir uma proteína micro-distrofina funcional

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal