ITTO20130669A1 - Vettore adeno-associato ricombinante muscolo-specifico e suo impiego nel trattamento di patologie muscolari - Google Patents
Vettore adeno-associato ricombinante muscolo-specifico e suo impiego nel trattamento di patologie muscolariInfo
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Description
DESCRIZIONE dell’invenzione industriale dal titolo: “Vettore adeno-associato ricombinante muscolospecifico e suo impiego nel trattamento di patologie muscolari”
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda un nuovo vettore adeno-associato (AAV) ricombinante muscolospecifico, particolarmente adatto per l’espressione di minigeni artificiali codificanti per proteine che devono essere specificamente espresse nel tessuto muscolare (scheletrico e cardiaco).
Vettori di espressione muscolo-specifici sono descritti nella tecnica anteriore.
US 2013/0136729 insegna che determinate combinazioni di vettori adeno-associati e di sequenze regolatrici promotore/enhancer possono essere ottimali per veicolare geni terapeutici per malattie muscolari. In US 2013/0136729 è descritta la combinazione di AAV-9 e promotore CK6 muscolo-specifico, come un sistema particolarmente efficiente nel veicolare per via sistemica geni di interesse in muscolo scheletrico ischemico. Questa domanda di brevetto descrive altresì la combinazione AAV-9 e promotore cardiaco troponina C, come un sistema particolarmente efficace in cardiomiociti e miociti scheletrici con danno ischemico.
La domanda di brevetto internazionale WO 2005/118611 descrive la veicolazione di microutrofina attraverso vettori adeno-associati, nel modello distrofico murino mdx. Sono descritti in particolare vettori adeno-associati ottimizzati per l’espressione nel tessuto muscolare, incorporanti promotori attivi nel muscolo quali i promotori della β-actina scheletrica, della catena leggera 2A della miosina, della distrofina, della creatina chinasi muscolare.
Anche i presenti inventori, in precedenti brevetti, avevano descritto vettori per l’espressione di geni esogeni in tessuto muscolare.
Ad esempio, la domanda di brevetto italiano RM2007A000523 descrive il gene sintetico UtroUp fuso con il dominio di forte attivazione della trascrizione “Vp16” proveniente dal virus Herpes simplex e la sua espressione tramite il vettore eucariotico pRK5 (Clonthec) sotto il controllo di sequenze regolatrici del citomegalovirus (CMV).
La domanda di brevetto italiano RM2005A000493 descrive il gene sintetico Vp16-Jazz e la sua espressione tramite il vettore pMEX sotto il controllo della regione promotrice ed enhancer del gene murino della Miosina Catena Leggera (MLC).
Tuttavia, le soluzioni tecniche descritte nella tecnica anteriore presentano l’inconveniente di promuovere l’espressione del gene esogeno principalmente nel tessuto muscolare scheletrico o nel tessuto muscolare cardiaco.
Onde superare questo inconveniente, i presenti inventori hanno creato un nuovo vettore adenoassociato ricombinante muscolo-specifico, che è vantaggiosamente atto a promuovere l’espressione del gene esogeno sia nel muscolo scheletrico sia in quello cardiaco, il che rappresenta un notevole vantaggio per l’impiego nella terapia genica di patologie che colpiscono gravemente sia la muscolatura scheletrica sia quella cardiaca, quale ad esempio la Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD).
Inoltre, il vettore adeno-associato della presente invenzione presenta, rispetto alla tecnica anteriore, gli ulteriori vantaggi di una maggiore efficienza nell’espressione del gene esogeno (sia nelle fibre muscolari lente sia in quelle veloci), una maggiore stabilità del trascritto e una maggiore persistenza dell’espressione nel tempo.
Pertanto, un primo aspetto dell’invenzione è un vettore adeno-associato ricombinate muscolo-specifico come definito nell’annessa rivendicazione 1.
Un secondo aspetto dell’invenzione è una cellula ospite ricombinante comprendente il vettore come definito in precedenza.
Un terzo aspetto dell’invenzione è l’impiego del vettore e/o della cellula ospite come definiti in precedenza nel trattamento di una patologia muscolare, quale preferibilmente la Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD).
Ulteriori caratteristiche dell’invenzione sono definite nelle annesse rivendicazioni dipendenti, che formano parte integrante della descrizione.
In una forma di realizzazione preferita, il vettore adeno-associato ricombinante muscolospecifico dell’invenzione consiste della sequenza nucleotidica denominata SEQ ID NO:1. Il vettore secondo tale forma di realizzazione preferita è denominato “muscle AAV” (“mAAV”).
Gli elementi funzionali essenziali di tale sequenza sono qui di seguito descritti.
All’estremità 5’ si trova la sequenza Left-Inverted Terminal Repeat (L-ITR) del virus adenoassociato, mentre all’estremità 3’ si trova la sequenza Right-Inverted Terminal Repeat (R-ITR) del virus adeno-associato. Tali sequenze terminali ripetute invertite sono di per sé note e descritte in letteratura. In SEQ ID NO:1 esse sono rispettivamente comprese fra le posizioni nucleotidiche da 1 bp a 141 bp (L-ITR) e da 2899 bp a 3040 bp (R-ITR).
Fra le posizioni nucleotidiche da 156 bp a 2219 bp di SEQ ID NO:1 è altresì presente una regione regolativa della trascrizione, che include il promotore del gene umano dell’alfa-actina, parte del primo introne del gene umano dell’alfa-actina, ivi incluso il sito donatore di splicing, nonché parte del secondo introne del gene umano della beta-globina e parte del terzo esone del gene umano della beta-globina, ivi incluso il sito accettore di splicing.
Fra le posizioni nucleotidiche da 2219 a 2264 bp di SEQ ID NO:1 è altresì presente un polilinker, o sito di clonaggio multiplo, che contiene una pluralità di siti di taglio di enzimi di restrizione che permettono di inserire all’interno del vettore qualsivoglia gene codificante per una proteina di interesse.
In aggiunta ai succitati elementi funzionali essenziali possono essere altresì presenti elementi funzionali accessori, come ad esempio un segnale di capping, una sequenza codificante per un’etichetta di identificazione (per esempio Myc-tag), una sequenza consenso per la poliadenilazione, etc.
I principali siti di restrizione, il polylinker, la regione regolativa e gli elementi del vettore AAV di SEQ ID NO:1 sono indicati nella Tabella 1 sottostante.
<(*)>atcgatgggaattccgggatccggtcgaccgtacgtacaagatct = SEQ ID NO:7 ;Come indicato in precedenza, in virtù della presenza del sito di clonaggio multiplo, il vettore dell’invenzione può accogliere una sequenza codificante per qualsiasi gene di interesse, come ad esempio un gene codificante per una proteina reporter oppure un gene codificante per una proteina da esprimere specificamente nel tessuto muscolare scheletrico e cardiaco. ;Una proteina da esprimere specificamente nel tessuto muscolare scheletrico e cardiaco particolarmente preferita è un fattore di trascrizione artificiale atto a modulare la trascrizione del gene dell’utrofina. ;Il gene dell’utrofina è un omologo autosomale del gene della distrofina. Esso mappa nel cromosoma 6q24, produce un trascritto di 13 kilobasi (numero di accesso NM_007124) e un prodotto proteico di 400 kilodalton (numero di accesso NP_009055). ;Utrofina e distrofina presentano forti omologie, sia strutturali sia funzionali. Entrambe fun gono infatti da ponte di connessione fra l’actina citoscheletrica, la membrana cellulare e la matrice extracellulare, attraverso proteine collettivamente denominate DAPs (“dystrophin associated proteins”). Studi effettuati su topi mdx (modello murino della distrofia muscolare di Duchenne) transgenici per l’utrofina, hanno dimostrato che una sovraespressione e rilocalizzazione dell’utrofina, che nel muscolo adulto è naturalmente localizzata nella giunzione neuromuscolare, induce un netto miglioramento del fenotipo distrofico. L’aumento dei livelli di espressione dell’utrofina è pertanto uno degli approcci terapeutici più promettenti per il trattamento della distrofia muscolare di Duchenne. ;Fattori di trascrizione artificiali atti a modulare la trascrizione del gene dell’utrofina sono descritti nella tecnica anteriore. In Corbi N et a. ;2000. Gene Ther 7:1076-83; Corbi N et al. 2004. Biochem Cell Biol 82(4):428-36; Mattei E et al. ;2007, PloS ONE 2(8)e774; e Onori A et al. 2007. Biochem Cell Biol, (3)358-365, Onori A et al. 2013. BMC Mol Biol. 14:3, sono ad esempio descritti geni artificiali codificanti per fattori di trascrizione comprendenti domini leganti il DNA del tipo “zinc finger”, che sono in grado di legare e attivare il gene dell’utrofina portando ad una sovraespressione di questa proteina. ;Pertanto, in una forma di realizzazione preferita, il vettore adeno-associato ricombinante muscolo-specifico comprende, inserito nel polylinker o sito di clonaggio multiplo, un gene esogeno che codifica per un fattore di trascrizione artificiale comprendente un dominio di legame al DNA del tipo zinc finger e un fattore di attivazione della trascrizione. Geni esogeni preferiti a tale scopo sono quelli che codificano per i succitati fattori di trascrizione artificiali descritti in letteratura. Fra di essi è maggiormente preferito il gene esogeno codificante per il fattore denominato “Vp16-Jazz” descritto nella domanda di brevetto italiano RM2005A000493, che codifica per un dominio di legame al DNA a tre zinc fingers (Jazz) fuso con il dominio di forte attivazione della trascrizione Vp16 del virus Herpes simplex (numero di accesso P04486). ;La sequenza completa del vettore mAAV dell’invenzione includente, inserito nel sito di clonaggio multiplo, la sequenza codificante per il fattore di trascrizione artificiale “Vp16-Jazz”, è denominata SEQ ID NO:2. I principali siti di restrizione, la regione regolativa e gli elementi del vettore AAV di SEQ ID NO:2 sono indicati in Tabella 2 sottostante. ;Tabella 2 ; ;;
(*)TGGGCCCTAAAAAGAAGCGTAAA = SEQ ID NO:8
I presenti inventori hanno utilizzato il vettore mAAV dell’invenzione per esprimere in modo specifico il mini gene artificiale Vp16-Jazz nel tessuto muscolare di topi mdx, ottenendo risultati estremamente positivi.
Più in particolare, il vettore mAAV è stato utilizzato per produrre due differenti costrutti (vedi figura 1), uno esprimente il gene test “Enhanced Green Fluorescent Protein” (mAAV-EGFP) e l’altro esprimente il mini gene artificiale “Vp16-Jazz” (mAAV-Vp16-Jazz).
Il costrutto mAAV-EGFP è stato impiegato per sviluppare protocolli di purificazione del virus e per regolare in modo fine le condizioni di infezione del tessuto muscolare. Il costrutto mAAV-EGFP è stato altresì utilizzato per valutare l’efficienza, i tempi e la tessuto-specificità dell’infezione di mAAV in topi mdx, basandosi sull’espressione della proteina reporter EGFP. Mediante microscopia a fluorescenza su sezioni muscolari, è stato dimostrato che l’espressione di mAAV-EGFP nei topi mdx era già consolidata 15 giorni dopo la somministrazione per via iniettiva intraperitoneale e che tale espressione era ancora stabile dopo 2 mesi. Non si è notata alcuna espressione di EGFP nel fegato e in altri tessuti non muscolari. Questi risultati dimostrano l’elevata muscolo-specificità del vettore mAAV secondo l’invenzione.
L’espressione del fattore di trascrizione artificiale Vp16-Jazz, introdotto nei topi mdx mediante infezione con AAV sierotipo 8, è stata monitorata con diverse tecniche.
Come illustrato in Figura 2, pannello A, la presenza di trascritti Vp16-Jazz è stata verificata mediante esperimenti di RT-PCR utilizzando RNA estratto dai muscoli addominali e dai quadricipiti di topi mdx ai quali era stato somministrato, mediante iniezione intraperitoneale, mAAV-Vp16-Jazz o soluzione salina come controllo. In Figura 2, pannello B, l’analisi western blot delle proteine totali estratte da tessuto muscolare scheletrico, cardiaco e fegato di topi mdx trattati con mAAV-Vp16-Jazz, mAAV-EGFP e soluzione salina, ha confermato la muscolo-specificità dell’espressione di Vp16-Jazz e della proteina reporter EGFP. L’analisi immunoistochimica su sezioni di quadricipiti, colorate con anticorpo anti-myc tag, ha rivelato la presenza della proteina Vp16-Jazz nei nuclei di miofibrille infettate (Figura 4, pannello C).
Per determinare se l’utrofina fosse sovraregolata nei muscoli infettati con mAAV-Vp1-Jazz, campioni di muscolo scheletrico e cardiaco sono stati analizzati sia mediante real time PCR sia mediante western blot. Come mostrato nella Figura 2, pannello D, in tessuti infettati con mAAV-Vp16-Jazz, il livello di espressione dell’mRNA dell’utrofina era chiaramente incrementato (induzione fino a 2-volte). Il western blot presentato nella Figura 2, pannello E, mostra un incremento della proteina utrofina nei muscoli infettati con mAAV-Vp16-Jazz.
Questi dati dimostrano che la somministrazione per via intraperitoneale di mAAV-Vp16-Jazz in topi mdx è efficace e adeguata per riprogrammare l’espressione dell’utrofina nel muscolo.
Gli inventori hanno altresì valutato i possibili effetti terapeutici derivanti dalla sovraregolazione dell’utrofina nei muscoli dei topi mdx, conseguita mediante trattamento con mAAV-Vp16-Jazz. Tale valutazione è stata effettuata utilizzando tipici parametri diagnostici per la distrofia muscolare di Duchenne (DMD).
L’analisi di sezioni sottili ottenute da muscoli di topi mdx trattati con mAAV-Vp16-Jazz mostra un miglioramento morfologico/architetturale sostanziale in confronto ai topi mdx trattati con mAAV-EGFP e soluzione salina come controlli.
E’ anche stata quantificata la frequenza di miofibrille centralmente nucleate (CNFs), l’area trasversale delle fibre (CSA) e il grado di infiltrazione di cellule infiammatorie mononucleate in sezioni sottili da muscoli colorate con ematossilina e eosina (H&E). I risultati dimostrano una riduzione nei processi degenerativi/rigenerativi in muscoli trattati con mAAV-Vp16-Jazz (Figura 3).
Inoltre, l’immunocolorazione del muscolo distrofico con il marcatore dei macrofagi CD68, ha mostrato una riduzione della risposta infiammatoria muscolare nei topi mdx trattati con mAAV-Vp16-Jazz.
I muscoli con deficit di distrofina sono caratterizzati da un severo deficit nella forza di contrazione e da una marcata suscettibilità alle lesioni indotte dalla contrazione muscolare. Per verificare se l’espressione di mAAV-Vp16-Jazz fosse in grado di migliorare le risposte meccaniche del muscolo distrofico, gli inventori hanno misurato l’attività di contrazione di preparazioni muscolari da topi mdx di due mesi trattati con mAAV-Vp16-Jazz e topi mdx di controllo. I muscoli dei topi mdx trattati con mAAV-Vp16-Jazz avevano una forza di contrazione molto superiore a quella dei muscoli dei topi di controllo. Alla fine del test di misurazione della forza, sono anche state valutate le lesioni del sarcolemma indotte dalla contrazione, mediante colorazione di ciascuna preparazione muscolare con il colorante fluorescente Procion Orange, il cui ingresso nelle fibre muscolari è indice di una perdita di integrità della membrana. Mediante microscopia in fluorescenza è stato dimostrato un ingresso estensivo di Procion Orange nei muscoli di topi mdx non trattati in confronto ai muscoli di topi mdx trattati con mAAV-Vp16-Jazz.
Nel loro insieme questi dati, dal punto di vista fisiologico, provano che nei topi mdx trattati con mAAV-Vp16Jazz vi è un recupero sia in termini di forza di contrazione sia in termini di integrità del sarcolemma.
Oltre alle prove di funzionalità muscolare in vitro sono state effettuate sperimentazioni in vivo. A tre mesi di età, dei topi mdx trattati con mAAV-Vp16Jazz e dei topi mdx di controllo trattati con mAAV-Vp16-EGFP o non trattati sono stati sottoposti ad esercizio fisico forzato su tapis roulant. L’esercizio è stato ripetuto una volta la settimana per quattro settimane consecutive e il tempo di corsa è stato registrato in ciascuna sessione. I topi mdx trattati con mAAV-Vp16-Jazz hanno fatto registrare un tempo di corsa cumulativo, dopo le quattro sessioni, di circa 110 minuti prima di raggiungere lo sfinimento, in confronto alla media di 70 minuti fatta registrare dai topi non trattati e trattati con mAAV-Vp16-EGFP. Pertanto, la sovra-regolazione dell’utrofina ottenuta con la somministrazione di mAAV-Vp16-Jazz secondo l’invenzione, contrasta efficacemente i sintomi della patologia distrofica, risultando in un miglioramento della resistenza fisica. Inoltre, come dimostrato mediante iniezione sistemica di colorante Evan’s blue nei topi al termine dell’allenamento su tapis roulant, la sovraespressione di utrofina preserva l’integrità del sarcolemma anche in vivo durante l’esercizio fisico.
L’esempio che segue, che illustra la creazione del vettore mAAV secondo l’invenzione, è fornito a puro titolo illustrativo e non limitativo della portata dell’invenzione, come definita dalle annesse rivendicazioni.
Esempio
Costruzione del vettore “mAAV”
Un vettore adeno-associato ricombinante muscolo-specifico rientrante nell’ambito della presente invenzione, denominato nel seguito per brevità “mA-AV”, è stato costruito nel modo che segue.
Per la costruzione di “mAAV” si è partiti dalla molecola commerciale pAAV-hrGFP (Stratagene, La Jolla, CA). La sequenza codificante per il test gene hrGFP presente in pAAV-hrGFP è stata deleta tra i siti di restrizione ClaI al 5’ (nt 1312) e XhoI al 3’(nt 2051) e sostituita dal mini gene artificiale Vp16-Jazz descritto in RM2005A000, ottenendo la molecola “pAAV-Vp16-Jazz”.
Al fine di rendere l’espressione di pAAV-Vp16-Jazz muscolo-specifica, i presenti inventori, utilizzando il taglio degli enzimi di restrizione MluI e ClaI, hanno deleto altre due regioni appartenenti all’iniziale vettore pAAV-hrGFP, ossia la regione regolatrice della trascrizione proveniente dal Citomegalovirus (CMV) (nt 150 a nt 812) e la regione contenente l’introne del gene Beta-Globina (nt 820 a nt 1312).
La regione deleta è stata sostituita dal promotore umano e dal primo introne del gene muscolo specifico dell’alfa-actina, ottenuto come descritto qui di seguito. E’ stato amplificato e isolato un frammento di DNA del cromosoma umano 1 (NT_167186.1) contenente le principali sequenze regolatrici e parte del primo introne del gene dell’alfa-actina. Il frammento è lungo 2329 coppie di basi e va dal nucleotide 283190 al nucleotide 285519. Gli oligonucleotidi usati nella reazione di amplificazione sono rispettivamente:
5’-ACGCGTCACCAACTGGGTAACCTCTGCTGA-3’ (SEQ ID NO:3) 5’-GCTAGCAAGCTTACCAGGTGAACCGACTGGGTTCTG-3’ (SEQ ID NO:4) Le condizioni di amplificazione utilizzate sono: 30 cicli a 95°C per 15 secondi, 70°C per 30 secondi, 72°C per 2,5 minuti e in finale una extra estensione a 72°C per 10 minuti.
Il frammento di DNA contenente le regioni regolative ed il primo introne (completo di donatore e accettore) del gene dell’alfa-actina è lungo 2345 coppie di basi ed è stato ingegnerizzato con alle estremità i siti di restrizione MluI (5’) e ClaI (3’) per essere inserito nel vettore “pAAV-Vp16-Jazz”, producendo la molecola denominata “pAAV-Act-Vp16-Jazz”. Al fine di ottimizzare espressione tessuto specifica, l’efficienza di trascrizione, la maturazione e la stabilità del trascritto, il vettore “pAAV-Act-Vp16-Jazz” è stato ulteriormente modificato nella regione accettrice dello splicing nell’introne del gene dell’alfa-actina. Il frammento di DNA, lungo 2329 coppie di basi, contenente le regioni regolative ed il primo introne (completo di donatore e accettore) del gene dell’alfa-actina è stato deleto della sua sequenza accettore dello splicing alla estremità 3’ e la regione deleta è stata sostituita con un frammento contenente la sequenza accettrice del secondo introne e parte del terzo esone del gene umano della Beta-Globina. Questo frammento ha la lunghezza totale di 514 coppie di basi ed è contenuto tra i siti ex-SacI e ClaI. La lunghezza totale della regione così modificata è di 2070 coppie di basi. Sulla sequenza designata SEQ ID NO:2, le posizioni rispettive del donatore e dell’accettore dello splicing sono 1606 e 2154. La molecola così ottenuta è stata chiamata “muscle pA-AV-Vp16-Jazz” e contratta in “mAAV-Vp16-Jazz”.
Il vettore “mAAV-Vp16-Jazz” è stato depleto di Vp16-Jazz tra i siti di restrizione ClaI al 5’ (nt 1312) e BglII al 3’(nt 3023). La regione deleta è stata sostituita dal frammento di DNA ottenuto dall’annealing dei seguenti oligonucleotidi:
5’-CGATGGGAATTCCGGGATCCGGTCGACCGTACGTACAA-3’ (SEQ ID NO:5)
5’-GATCTTGTACGTACGGTCGACCGGATCCCGGAATTCCCAT-3’(SEQ ID NO:6)
corredati di siti di restrizione multipli per il clonaggio (MCS). La molecola così ottenuta è stata chiamata “muscle pAAV” (abbreviato in “mA-AV”). Il vettore mAAV dell’invenzione può accogliere qualsiasi gene di interesse.
Claims (15)
- RIVENDICAZIONI 1. Vettore adeno-associato ricombinante muscolospecifico per l’espressione di un gene esogeno specificamente nel tessuto muscolare scheletrico e cardiaco, caratterizzato dal fatto che comprende in direzione 5’-3’: a) la regione L-ITR di un vettore adeno-associato, b) il promotore del gene umano dell’alfa-actina, c) la sequenza donatrice di splicing del primo introne del gene umano dell’alfa-actina, d) la sequenza accettrice di splicing del secondo introne del gene umano della beta-globina, e) un sito di clonaggio multiplo, e f) la regione R-ITR di un vettore adeno-associato.
- 2. Vettore adeno-associato ricombinante muscolospecifico secondo la rivendicazione 1, comprendente altresì un segnale di capping.
- 3. Vettore adeno-associato ricombinante muscolospecifico secondo la rivendicazione 1 o 2, comprendente altresì un segnale di localizzazione nucleare.
- 4. Vettore adeno-associato ricombinante muscolospecifico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, comprendente altresì una sequenza consenso per la poliadenilazione.
- 5. Vettore adeno-associato ricombinante muscolospecifico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, comprendente un gene esogeno inserito nel sito di clonaggio multiplo.
- 6. Vettore adeno-associato ricombinante muscolospecifico secondo la rivendicazione 5, in cui il gene esogeno codifica per una proteina o un peptide reporter.
- 7. Vettore adeno-associato ricombinante muscolospecifico secondo la rivendicazione 6, in cui il gene esogeno codifica per una proteina o un peptide da esprimere specificamente nel tessuto muscolare scheletrico e cardiaco.
- 8. Vettore adeno-associato ricombinante muscolospecifico secondo la rivendicazione 7, in cui la proteina o il peptide da esprimere specificamente nel tessuto muscolare scheletrico e cardiaco è un fattore di trascrizione artificiale atto a modulare la trascrizione del gene dell’utrofina.
- 9. Vettore adeno-associato ricombinante muscolospecifico secondo la rivendicazione 8, in cui il fattore di trascrizione artificiale comprende un dominio di legame al DNA del tipo zinc finger.
- 10. Vettore adeno-associato ricombinante muscolospecifico secondo la rivendicazione 8 o 9, in cui il fattore di trascrizione artificiale comprende il dominio di forte attivazione della trascrizione VP16 del virus Herpes simplex.
- 11. Vettore adeno-associato ricombinante muscolospecifico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 10, per l’impiego nel trattamento terapeutico di una patologia muscolare.
- 12. Vettore adeno-associato ricombinante muscolospecifico per l’impiego secondo la rivendicazione 11, in cui la patologia muscolare è la distrofia muscolare di Duchenne.
- 13. Cellula ospite ricombinante comprendente un vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 10.
- 14. Cellula ospite secondo la rivendicazione 13, per l’impiego nel trattamento terapeutico di una patologia muscolare.
- 15. Cellula ospite per l’impiego secondo la rivendicazione 14, in cui la patologia muscolare è la distrofia muscolare di Duchenne.
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