CN111088284B - 携带截短抗肌萎缩蛋白基因表达框的aav载体、制备方法及应用 - Google Patents

携带截短抗肌萎缩蛋白基因表达框的aav载体、制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111088284B
CN111088284B CN201910467558.3A CN201910467558A CN111088284B CN 111088284 B CN111088284 B CN 111088284B CN 201910467558 A CN201910467558 A CN 201910467558A CN 111088284 B CN111088284 B CN 111088284B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mini
dystrophin
virus
msp
gluc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910467558.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111088284A (zh
Inventor
田文洪
董小岩
吴小兵
马思思
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Jingpu Di Gene Technology Co ltd
Original Assignee
Beijing Jingpu Di Gene Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Jingpu Di Gene Technology Co ltd filed Critical Beijing Jingpu Di Gene Technology Co ltd
Priority to CN201910467558.3A priority Critical patent/CN111088284B/zh
Publication of CN111088284A publication Critical patent/CN111088284A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111088284B publication Critical patent/CN111088284B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一系列携带截短抗肌萎缩蛋白基因表达框的重组腺相关病毒。体内实验表明，该重组腺相关病毒载体能够高效地导入体内，持续稳定地表达截短的抗肌萎缩蛋白，降低动物模型血液中的肌酸激酶，恢复其肌肉功能。结果提示，该重组腺相关病毒载体有希望开发成为新的杜氏肌营养不良症治疗药物。

Description

携带截短抗肌萎缩蛋白基因表达框的AAV载体、制备方法及 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及重组腺相关病毒载体携带人为设计的截短的抗肌萎缩蛋白基因表达框的杜氏肌营养不良症基因药物。
背景技术
Duchenne型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是一种由抗肌萎缩蛋白基因的致病性变异所导致的X染色体连锁隐性遗传性肌病，其致病基因简称为DMD基因（dystrophinmusculardystrophygene，DMD）。DMD基因是人类最大的基因之一，位于Xp21，编码dystrophin蛋白，即抗肌萎缩蛋白。该基因在基因组序列上跨越了2.5Mb，占全部基因组序列长度的0.1%，占X染色体全长的1. 5%，该基因99%的序列由内含子组成，编码区包括79个外显子及7个组织特异性的启动子，其mRNA序列长14kb，主要表达于骨骼肌、心肌，少量表达于脑组织。约60%～65%的DMD /BMD（Becker muscular dystrophy，Becker型肌营养不良）患者是由于DMD基因中一个或多个外显子的缺失突变而致病，且缺失突变存在两个热区（外显子45～54和外显子 3～22）；重复型突变约占5%～10%，主要发生在3～11和21～37外显子区域，与缺失热区有部分重叠；其余的30%为点突变或微缺失。与缺失突变不同，点突变没有显著的分布热点，随机地分布于整个基因上，根据目前DMD基因突变统计结果，所有的外显子都有发现微小突变或点突变，通常导致无义突变和移码突变，内含子区域的点突变也会导致选择性剪切、外显子跳跃等，引起疾病。
全长dystrophin是一个很大的杆状蛋白，主要有四个结构域：1个N端结构域，24个重复序列，4个铰链区，1个富含半胱氨酸的结构域和1个C端结构域。1号铰链区和4号铰链区分别在24个重复序列的两端，2号和3号铰链区分布在24个重复序列的中间。N端结构域主要结合细胞骨架上的F肌动蛋白，CR结构域和CT结构域通过dystrophin相关蛋白复合物而锚定在细胞膜上，中间一大部分是24个三重螺旋的杆状重复和四个铰链区H，即central roddomain。
该病的发病率在存活男婴中为1/5000(1/3599～1/9337)(Scheuerbrandt G.Muscle Nerve. 2018; 57(2):185-188. Moat SJ, et al. Eur J Hum Genet. 2013; 21(10): 1049-1053. Mah JK, et al. NeuromusculDisord. 2014; 24(6): 482-491.Mendell JR, et al. Ann Neurol. 2012; 71(3): 304-313.)，中国大陆为1/4560(Ke Q,et al. World J Pediatr. 2017; 13(3): 197-201.)。DMD基因的致病性变异引起多种抗肌萎缩蛋白亚型的异常表达，肌肉亚型的阴性表达或显著下降导致了肌营养不良的发生发展，表达于脑组织、心肌、视网膜、肾脏、周围神经等组织的多种亚型的异常表达(MuntoniF, et al. Lancet Neurol. 2003; 2(12): 731-740. Pillers DA, et al. Nat Genet.1993; 4(1): 82-86. Lidov HG, et al. Hum Mol Genet. 1995; 4(3): 329-335. ByersTJ, et al. Nat Genet. 1993; 4(1): 77-81.)，导致部分患者还伴有其他器官系统的受累表现，出现认知功能受损、行为障碍、消化功能障碍以及心肌病等(Ricotti V, et al.Dev Med Child Neurol. 2011;53(1):12. Ricotti V, et al. Eur J Hum Genet. 2016;24(4)：562-568.)。
根据患者肢体无力的表现以及伴随的其他器官系统损害，DMD病情进展可分为五个阶段，分别是症状前期、早期独走期、晚期独走期、早期不能独走期以及晚期不能独走期(Bushby K, et al. Lancet Neurol. 2010; 9(1): 77-93. Birnkrant DJ, et al.Lancet Neurol. 2018; 17(3): 251-267. Brooke MH, et al. Muscle Nerve. 1983; 6(2): 91-103. Mazzone E, et al. Neurology. 2011; 77(3): 250-256. Ricotti V, etal. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2016; 87(2):149-155.)
症状前期：多数患者出现运动发育迟缓（Wang DN, et al. NeuromusculDisord.2017; 27(8): 715-722.），可伴有不同程度的静止性精神发育迟滞或认知功能受损，爬、独走的时间较同龄儿延迟，跑步慢，不能连续跳跃，腓肠肌开始出现肥大；部分患者平卧位坐起困难。
早期独走期：患者一般在5岁前发病，多数从3～4岁开始出现肢体无力的症状与体征，进入该期。表现为上台阶费力、蹲起费力、跑步缓慢、Gowers’征阳性、下蹲后足跟不能着地、腓肠肌肥大以及双膝腱反射减弱或消失。在运动功能的上升期，患者的病情相对稳定，并有一定的提升，随后出现平台期；此后，行走姿势异常，摇摆呈鸭步，腰椎开始前凸，跟腱挛缩，踮脚尖走路。
晚期独走期：一般7岁后病情进展加速（Brooke MH, et al. Muscle Nerve.1983; 6(2): 91-103. Li W, et al. NeuromusculDisord. 2015; 25(5): 375-380.），进入该期。临床特点是不能上楼梯，不能完成Gowers’征，不能跑步，跟腱挛缩加重；部分患者可出现膝关节挛缩，少数患者可能出现髋关节的半脱位或脱位（Chan KG, et al. JPediatrOrthop B. 2001; 10(3): 219-225.）。
早期不能独走期：患者下肢肌力继续下降，通常在9～10岁丧失独立行走能力（VryJ, et al. J Neuromuscul Dis. 2016; 3(4): 517-527. Eagle M, et al.NeuromusculDisord. 2002; 12(10): 926-929. Mendell JR, et al. Arch Neurol.1987; 44(8): 808-811.），少数患者在8岁前丧失独立行走能力（Humbertclaude V, etal. Eur J Paediatr Neurol. 2012; 16(2): 149-160. Bello L, et al. Neurology.2016; 87(4): 401-409. McDonald CM, et al. Muscle Nerve. 2013; 48(1):32-54.），进入该期。患者还可以短距离扶行、独坐或扶站，髋关节出现半脱位或脱位（Chan KG, etal. J PediatrOrthop B. 2001; 10(3): 219-225.），膝关节挛缩加重，肘关节开始挛缩，出现脊柱侧弯，腓肠肌逐渐萎缩。
晚期不能独走期：通常在14～15岁后不能独坐，双上肢活动开始受限，进入该期。开始出现心肌病和呼吸功能障碍，发病越早，呼吸与心脏功能损害越明显（Desguerre I,et al. PLoS One. 2009; 4(2): e4347.），进行性的呼吸肌无力发生无效咳嗽、夜间低通气、睡眠呼吸紊乱，最终可致呼吸衰竭。多数患者因呼吸或心力衰竭在30岁前死亡，中位数在25岁左右（Nigro G, et al. Int J Cardiol. 1990; 26(3): 271-277. Passamano L,et al. Acta Myol. 2012; 31(2): 121-125. Rall S, et al. Acta Myol. 2012; 31(2): 117-120.）。
少数早期诊断为DMD的患者，可在13～16岁之间丧失独立行走能力（Bello L, etal. Neurology. 2016; 87(4): 401-409.），属于中间型抗肌萎缩蛋白病，临床表现较经典DMD轻，但比经典Becker型肌营养不良(Becker muscular dystrophy，BMD)重，可视为轻型DMD，导致上述分期的延迟出现。在疾病发展过程中，部分患者出现非进展性认知功能受损、注意力缺陷/多动障碍(attention-deficit/hyperactivity disorder，ADHD)、学习困难、孤独症样表现以及抑郁状态等。多数患者的生长发育速度慢于正常同龄人，表现为矮身材（Eiholzer U, et al. Eur J Pediatr. 1988; 147(6): 602-605.）和青春期延迟（WoodCL, et al. Arch Dis Child. 2016; 101(1): 101-106.)
DMD至今尚无治愈手段，需通过遗传、呼吸、循环、康复、整形、社会心理、营养等多学科联合诊治。近年在药物治疗、基因治疗、骨髓干细胞移植等方面均取得了重大进展。
1、糖皮质激素治疗
糖皮质激素是治疗DMD患儿的传统药物，强的松或其他糖皮质激素治疗可以帮助患者延长行走时间，降低脊柱侧弯的发生率，延迟呼吸衰竭，延长10～20年的寿命。2016年美国神经病学学会指南开发小组委员会对DMD使用糖皮质激素的治疗指南基于MED-LINE和Cochrane数据库检索相关文章进行了更新。共总结分析了63篇文献，推荐强的松首选治疗剂量为0.75mg/（kg·d），最大量＜40mg/d；不建议早期（尤其２岁前）服药治疗，建议在运动能力提升进入稳定期（平均４～６岁）后开始服药治疗；不良反应明显可降低强的松剂量至0.3mg/（kg·d），但效果较差；强的松10mg/kg周末服用同样有效；疗程尚无明确规定，临床试验表明，治疗６个月后患者的临床症状可有改善(Rao VK. Pediatr Neurol Briefs.2017; 30(3): 21-48.)。
强的松长期治疗存在不良反应，需引起重视。其中可预防的不良反应包括：超重；糖耐量异常和糖尿病；皮肤异常；高血压；骨质疏松；踝关节水肿。必须要治疗的不良反应包括：白内障；行为问题；骨质疏松和骨折；肾上腺功能抑制；免疫抑制。糖皮质激素不可避免的不良反应是导致患者的身高增长迟缓。
新型糖皮质激素地夫可特临床试验显示也有较好的疗效和相对较少的不良反应。目前Marathon Pharmaceuticals公司的Emflaza已获美国FDA批准临床使用，推荐剂量为每日0.9mg/kg(Rao VK. Pediatr Neurol Briefs. 2017; 30(3): 21-48. Biggar WD, etal. NeuromusculDisord. 2006; 16(4): 249-255. Biggar WD, et al.NeuromusculDisord. 2004; 14(8-9): 476-482.)。其它用于减轻肌肉炎症的激素如脂联素Adi-ponectin、Vamorolone、HT-100也已进入临床试验。艾迪苯醌在临床试验中发现有保护DMD患者肺功能作用，且没有激素样副作用。早期应用血管紧张素转换酶抑制剂可缓解DMD心肌并发症。
２、基因治疗进展
由于DMD致病原因是人抗肌萎缩蛋白基因（dystrophin）发生突变，导致其功能缺失，因此基因治疗是DMD治疗的最佳选择之一。目前关于DMD的基因治疗研究，可以分为以下几类。
2.1针对致病基因
2.1.1 靶向致病基因脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）
（1）基因替代疗法
目前具有很大潜力，具体操作为通过将功能性 DMD基因转移到DMD患者的骨骼肌、心肌细胞，从而恢复其抗肌萎缩蛋白。然而，DMD全基因组长度达2.3Mb，难以被多数病毒基因载体包装运载。有研究发现在mdx小鼠模型局部注射的小型肌萎缩蛋白，尽管缺少约70％的编码序列，但仍可保护mdx小鼠的四肢肌肉和心脏(Harper SQ, et al. Nat Med. 2002;8(3): 253-261. Yue Y, et al. Circulation. 2003; 108(13): 1626-1632.)。同样，在贝克肌营养不良症（Becker muscular dystrophy，BMD）患者中，研究发现注射小型或微型抗肌萎缩蛋白可使患者临床症状减轻(Mendell JR, et al. Mol Ther. 2015; 23(1):192-201.)。基于上述证据，腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）介导的微型抗肌萎缩蛋白基因治疗应运而生。研究表明微型抗肌萎缩蛋白基因治疗可降低 DMD 动物模型肌酸激酶（creatine kinase，CK）水平并显著改善其肌肉萎缩表现(Yue Y, et al.Circulation. 2003; 108(13): 1626-1632.)。基于基因替代疗法，现在进入临床试验阶段的DMD治疗药物有Solid Bioscience的SGT-001(NCT03368742)、Pfizer公司的PF-06939926(NCT03362502)、Sarepta Therapeutics公司收购自National Children’s hospital的rAAVrh74·MHCK7·microdystrophin(NCT03375164)。更多信息可参见www.clinicaltrials.gov。
（2）基因定向编辑
成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspersed shortpalindromic repeats，CRISPR）是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊 DNA 重复序列家族，其上游还有一个多态性的家族基因，该基因编码的蛋白均可与 CRISPR 序列区域发生作用。因此，该基因被命名为 CRISPR 关联基因（CRISPR associated，Cas）。CRISPR/Cas 系统可识别外源 DNA，并将它们切断以沉默外源基因的表达，正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas 系统被开发成一种高效的基因编辑工具。其中，CRISPR/Cas9系统是研究最深入、应用最成熟的一类。当 Cas9 的内切核酸酶与向导核糖核酸（guideRibonucleic acid，gRNA）链结合时，可精确切割基因组（Cong L, et al. Science. 2013;339(6121): 819-823.）。体外研究表明，CRISPR / Cas9 技术可用于许多不同的突变，包括占DMD突变谱12%~15％的多外显子重复（Wojtal D, et al. Am J Hum Genet. 2016; 98(1): 90-101.）。根据大多数重复区域头尾结构， gRNA 就可去除突变并恢复形成具有功能的抗肌萎缩蛋白。考虑到AAV载体容量的限制，需要两个AAV载体，一个AAV载体携带Cas9基因表达框，另一个AAV载体携带sgRNA编码框。在 mdx 小鼠模型中，一个AAV载体携带Cas9基因表达框，另一个AAV载体携带两个sgRNA编码框，证明了 CRISPR / Cas9 介导恢复体内DMD 开放阅读框的治疗潜力（Long C, et al. Science. 2016; 351(6271): 400-403.Nelson CE, et al. Science. 2016; 351(6271): 403-407.），并显示出长期的治疗作用（Nelson CE, et al. Nat Med. 2019; 25(3): 427-432.）。在DMD狗模型中，用一个AAV载体携带Cas9基因表达框，另一个AAV载体携带三个sgRNA表达框，也证明了基因编辑治疗DMD的可行性（Amoasii L, et al. Science. 2018; 362(6410): 86-91.）。
2.1.2 靶向致病基因核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）
DMD基因突变中外显子缺失突变最常见，占55%～65％。缺失突变包括移码编码和整码突变两种类型，移码突变破坏了开放阅读框，从而导致患者不能产生抗肌萎缩蛋白。整码突变虽然也破坏了开放阅读框，但可产生缩短的、有一定功能的抗肌萎缩蛋白，导致临床症状较轻的BMD。外显子跳跃技术是通过引入跳过一个或多个靶向外显子的替代剪接位点，将DMD患儿的移码突变类型修改为整码突变类型，这样就有可能使临床症状较重的DMD转换为症状较轻的BMD（Wilton SD, et al. NeuromusculDisord. 1997; 7(5): 329-335.）。
反义寡核苷酸是一种修饰合成的核酸链，其长度通常为 20～30 个核苷酸，由抗肌萎缩蛋白前体信使 RNA（messenger RNA，mRNA）的互补序列组成，通过与 mRNA 上要去除的外显子剪切序列杂交，干扰剪切机制，从而导致该外显子跳跃来恢复阅读框。目前，已有多种反义寡核苷酸被开发合成。外显子 45~50，47~50，48~50，49~50，50，52 或 52~63缺失所致的移码突变均可通过跳跃51号外显子转变为整码突变，这将治疗大约13％的DMD患者(Wilton SD, et al. NeuromusculDisord. 1997; 7(5): 329-335.)。2'O-甲基低聚核糖核苷硫代磷酸酯（2'O-methyl-ribo-oligonucleosidephosphorothioate，2'OMePS）和磷酸二酰胺吗啉低聚物（phosphorodiami-date morpholinooligomers，PMOs）是两种靶向外显子51的寡聚体，但其生物化学结构、对内切核酸酶的稳定性和毒性特征均不同。一系列临床前研究成功验证了2'OMePS 和 PMOs 在DMD治疗中的潜力(McClorey G, Wood MJ.CurrOpinPharmacol. 2015; 24: 52-58. Yokota T, et al. Methods Mol Biol. 2011;709: 299-312.)。其中，研究发现对肌营养不良犬模型进行肌内注射 2'OMePS 和 PMOs 可介导有效的外显子跳跃，增加抗肌萎缩蛋白表达，改善其临床表型(Yokota T, et al.Methods Mol Biol. 2011; 709: 299-312.)。随后，研究者们对2'OMePS 寡聚物（drisapersen）和 PMO（eteplirsen）进行了一系列系统的临床试验。在一个为期48周的研究中，18名患者以每周 6 mg/kg 的剂量皮下施用drisapersen（连续方案）；另一组 17名患者则在 6 周内接受了 9 次注射，然后中断 4 周（间歇性方案）；第三组 18名患者接受安慰剂治疗。24 周后，相比安慰剂组，连续方案组患者步行距离显著增加（约 35 m）。但由于研究结果显示药物的改善作用不够突出，且出现了蛋白尿等不良反应(Viot T, et al.Lancet Neurol. 2014; 13(10): 987-996.)，目前该试验已被取消。在一项纳入 12 名DMD 男孩的双盲试验中，一组接受每周一次 30 mg/kg eteplirsen静脉给药，另一组接受每周一次 50 mg/kg eteplirsen静脉给药；第三组给予安慰剂。48 周后，eteplirsen组与对照组相比，行走距离均延长，活检中抗肌萎缩蛋白增加了 40%～50％，并且该药耐受性良好(Mendell JR, et al. Ann Neurol. 2016; 79(2): 257-271.)。2016 年美国食品药品监督管理局宣布如果该药能成功完成，且完成药物上市后公司承诺的其他额外试验(Dowling JJ. Nat Rev Neurol. 2016; 12(12): 675-676.)，将加速批准eteplirsen的临床应用。目前eteplirsen已经被FDA批准上市，但真实的有效性情况仍然需要进一步的观察。
2.1.3 靶向致病基因编码蛋白约15％DMD具有提前终止密码子，这导致了DMD 的mRNA 衰变和 / 或蛋白质翻译的过早停止，最后产生截短的、无功能的蛋白质。ataluren（PTC124，商品名Tranlsarna）能够降低核糖体对过早终止密码子的敏感性，造成所谓“终止密码子通读”(Peltz SW, et al. Annu Rev Med. 2013; 64: 407-425.)，使含有无义突变的基因产生功能性蛋白。但是，目前ataluren 的作用机制尚存在争议(McElroy SP, etal. PLoS Biol. 2013; 11(6): e1001593.)。2014 年，欧洲药品管理局和欧洲委员会批准Translarna品牌药物用于治疗无义突变的 DMD 患者。在2016年进行了一项关于ataluren的随机双盲多中心试验，纳入 173 名年龄 5～20 岁的 DMD 患者(Bushby K, et al.Muscle Nerve. 2014; 50(4): 477-487.)。治疗 48 周后，口服 ataluren 40 mg/（kg•d）的研究对象（步行距离仅下降 13m）与安慰剂组相比（下降 44 m）下降更为缓慢，且过程中未报告严重不良事件。2017 年完成的第二个 ataluren Ⅲ期临床试验未能达到预期的稳定 6 min 步行距离，且大部分 DMD 患者无显著症状改善(McDonald CM, et al. Lancet.2017; 390(10101): 1489-1498.)。但对第一次和第二次试验结果的荟萃分析显示，用药后在临床症状改善和统计数据上均显示患者受益，特别是对 6 min 步行距离测试成绩 300～400 m 的患者，治疗效果显著(Nance ME, et al. Wiley Interdiscip RevNanomedNanobiotechnol. 2018; 10(2).)。基于以上结果，该类药物的后续试验已在多个国家启动。
2.1.4 靶向相关信号通路/分子抗肌萎缩蛋白缺失会导致肌细胞膜的断裂和撕裂，随着时间推移导致膜不稳定性增加，关键离子梯度改变和第二信使路径破坏。许多治疗方法试图改善膜稳定性或改变肌肉内因抗肌萎缩蛋白缺失干扰的第二信使信号传导途径，另外，将失调的细胞内途径正常化也是目前的研究策略之一。例如，肌浆网/内质网钙三磷酸腺苷酶 1 的基因上调对 mdx 小鼠表型慢性钙调节及改变兴奋性收缩耦合和钙稳态的兰尼碱受体（ryanodine receptor，RyR）中 RyR1、RyR2 的翻译产生影响(Goonasekera SA,et al. J Clin Invest. 2011; 121(3): 1044-1052.)，同样，已有研究证明药物Rycals有利于改善 FK506 结合蛋白与RyR的结合(Bellinger AM, et al. Nat Med. 2009; 15(3):325-330.)。另一个重要的信号级联是肌肉生长抑制素和骨桥蛋白参与的典型和非典型转化生长因子-β 信号传导，也已被证明在肌肉再生和组织纤维化形成中发挥作用(VetroneSA, et al. J Clin Invest. 2009; 119(6): 1583-1594.)。调节转化生长因子-β 信号的治疗，如抑制肌生长抑制素，同样是目前临床试验的热点。其他关键的下游途径包括核因子κB和抗炎信号及靶向线粒体的化合物功能和组蛋白脱乙酰酶抑制剂也在进行相应的研究中(Saccone V, et al. Genes Dev. 2014; 28(8): 841-857. Janghra N, et al. PlosOne. 2016; 11(3): e0150818.)。
2.1.5 其他抗肌萎缩蛋白曾被认为只存在于肌纤维中。但近年Rudnicki及其团队发现，其在肌肉干细胞中也可表达(Dumont NA, et al. Nat Med. 2015; 21(12): 1455-1463.)。应用 CRISPR/Cas9 对肌肉干细胞的基因进行编辑也是目前的研究热点。如何准确靶标肌肉干细胞，目前的方法仍需进一步改进。同时利用iPS细胞技术结合转录激活因子样效应物核酸酶或 CRISPR 纠正DMD基因突变的可能性尽管已在实验室得到验证(Li HL, etal. Stem Cell Reports. 2015; 4(1): 143-154.)，但因可编程的核酸酶存在
致有害突变的可能，目前仍无法应用于临床。
2.2 针对临床表型
2.2.1 上调抗肌萎缩蛋白替代蛋白
Utrophin 蛋白是一种和抗肌萎缩蛋白具有相似组织结构和蛋白质结合性质的同系物，分子量为395kDa。Utrophin上调曾经是DMD分子治疗中首先被考虑的方法之一。Utrophin 在子宫肌膜中无处不在，肌肉成熟时逐渐被抗肌萎缩蛋白取代。在成人肌肉中，Urophin在神经肌肉和肌腱结中可见。在DMD 患者和 mdx 小鼠模型的肌肉修复中观察到，由于抗肌萎缩蛋白的缺失，Utrophin 表达自然增加，以重建肌肉纤维的连续性(JanghraN, et al. Plos One. 2016; 11(3): e0150818.)。尽管两种蛋白质之间存在一些不同的功能特征，但已有研究表明，Utrophin 可在 mdx 小鼠肌肉中起到有效的替代作用。而ezutromid被发现具有上调Utrophin 蛋白表达的作用，且已在健康志愿者身上证明其安全性(Ricotti V, et al. PloS One. 2016; 11(4): e0152840.)。目前正在进行ezutromid应用于 DMD 患者的有效性和安全性研究，这项历时 48 周的试验招募了40 名来自美国和英国的 5～10 岁男患儿，并将其分成两组，各 2 次/d 接受两种ezutromid制剂中的一种，以确定哪种制剂将在未来的临床试验中使用。试验进行24 周后，通过肌肉活组织检查发现，与基线相比，两组肌肉损伤明显减少，并伴有 Utrophin 蛋白的增加。
GALGT2蛋白是一种N-乙酰半乳糖胺转移酶（Smith PL, et al. J Biol Chem.1994; 269: 15162-15171.），由细胞毒性T细胞编码产生(Xia B, et al. Dev Biol.2002; 242: 58-73.)。通过人为表达GALGT2蛋白，能够促进神经肌肉的发育和骨骼肌的生长，显著抑制抗肌萎缩蛋白缺乏带来的影响（Nguyen HH, et al. Proc Natl Acad SciUSA. 2002; 99: 5616-5621.），从而达到治疗DMD的目的。目前用AAV载体携带GALGT2基因表达框的基因药物rAAVrh74·MCK-GALGT2已经进入临床阶段（NCT03333590），正在进行临床试验。详细信息见www.clinicaltrials.gov。
2.2.2修复/重新密封受损细胞膜
有研究者一直致力于开发一种修复/重新密封DMD中损伤肌细胞膜的膜聚合物(Houang EM, et al. Mol Ther Methods Clin Dev. 2015; 2: 15042.)。在mdx小鼠和DMD狗模型中，候选药物之一的泊洛沙姆P188已显示出在修复/改善心肌病方面的潜力。另一种基于上述治疗策略的分子是层粘连蛋白-111，它是一种天然存在的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白，功能是促进 ECM 和肌膜之间的相互作用。有研究发现，肌内注射或全身注射层粘连蛋白-111可改善mdx小鼠的肌营养不良表型(Li HL, etal. Stem Cell Reports. 2015; 4(1): 143-154.)。但与泊洛沙姆P188一样，层粘连蛋白-111也面临着与药物传递和分布相关的挑战，这两种药物都尚未进入临床试验。
2.3骨髓干细胞移植
干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞。研究发现将骨髓干细胞移植入小鼠内，可促进肌纤维的再生、抗肌萎缩蛋白的表达从而改善小鼠运动功能(Dezawa M, et al.Science. 2005; 309(5732): 314-317.)。许忆峰等对332例患者行自体骨髓干细胞移植，12个月后评估临床效果，显示自体骨髓干细胞移植疗法可在近期增加患者肌力、提高生活能力、改善运动功能(许忆峰，等.实用医学杂志. 2011; 27(10): 1770-1773.)。
综上所述，DMD是最常见的严重的 X连锁先天性肌病，目前在药物治疗、基因治疗、骨髓干细胞移植等方面均取得了重大进展。
在充分调研别人工作的基础上，我们设计了一系列基于AAV载体的DMD基因治疗药物。首先，参考文献（Wang B, et al. ProcNatl Acad Sci USA. 2000; 97(25):13714-13719.）和中国专利“编码抗肌萎缩蛋白小基因的DNA序列及其使用方法”(专利号：ZL018099935.1)，人工优化合成了截短的人抗肌萎缩蛋白编码序列（mini-dystrophin），通过序列优化，消除了mRNA二级结构、稀有密码子和隐蔽剪接位点对mini-dystrophin基因编码序列转录和翻译的影响，提高了基因表达水平。其次，采用mMCK、HSA和MSP等肌肉特异性启动子调控mini-dystrophin基因的转录，mMCK、HSA和MSP等启动子具有肌肉组织特异性好、转录水平高、序列短小等特点，有助于mini-dystrophin特异性在肌肉组织中高效表达。此外，利用正常肝脏特异性高表达miR-122的特点（Jopling C. RNA Biol. 2012; 9(2):137-142.），在mini-dystrophin基因表达框的3’UTR中设计miR-122靶序列，降低mini-dystrophin基因在肝细胞中表达，增强其安全性。选择安全、不致病的重组AAV载体（Dismuke DJ, et al. Curr Gene Ther. 2013; 13(6): 434-452.）携带mini-dystrophin基因表达框。进一步提高了药物开发成功的可能性。
腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）因在腺病毒制品中发现而得名（Atchison RW, et al. Science. 1965; 149: 754-756.Hoggan MD, et al. Proc NatlSci USA. 1966; 55: 1467-1474.）。AAV是微小病毒科 (Parvovirus)成员，包含多种血清型，其基因组为单链DNA(Rose JA, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1969; 64: 863-869.)，其中AAV2的基因组大小为4682个核苷酸。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒(Geoffroy MC, et al. Curr Gene Ther. 2005; 5(3):265-271.)，或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态(Chiorini JA, et al. Curr Top MicrobiolImmunol. 1996; 218:25-33.)，而不产生子代病毒。
最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV（AAV2）(Atchison RW, et al. Science.1965; 149: 754-756.)。AAV2基因组长约4.7kb，基因组两端为长度145bp的 “反向末端重复序列”（ inverted terminal repeat, ITR），呈回文-发卡结构(Lusby E, et al. JVirol. 1980; 34: 402-409.)。基因组中有两个大开放阅读框（ORF），分别编码rep和cap基因。AAV2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中(Samulski RJ, et al. Proc Natl AcadSci USA. 1982; 79: 2077-2081. Laughlin CA, et al. Gene. 1983; 23: 65-73.)。
ITR是AAV载体基因组的顺式作用元件，在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用(Xiao X, et al. J Virol. 1997; 71(2): 941-948. )。ITR序列中包含Rep蛋白结合位点（Rep binding site，RBS）和末端解链位点trs（terminal resolutionsite），能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口(Linden RM, et al. Proc Natl AcadSci USA. 1996; 93(15): 7966-7972.)。ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用(Ashktorab H, et al. J Virol. 1989; 63(7):3034-3039.)。
AAV2基因组其余部分可分为2个功能区，rep基因区和cap基因区(Srivastava A,et al. J Virol. 1983; 45(2): 555-564.)。rep基因区编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四种Rep蛋白。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR中的末端解链位点trs（terminal resolution site）和GAGY重复基序（repeat motif）特异性结合(Hüser D, et al. PLoSPathog. 2010; 6(7): e1000985.)，启动AAV基因组由单链向双链的复制过程。ITR中trs和GAGC重复基序是AAV基因组复制的中心，因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同，但是都能形成发卡结构和存在Rep结合位点。在AAV2基因组图谱位置19处有p19启动子，分别表达Rep52和Rep40。Rep52和Rep40没有结合DNA的功能，而有ATP依赖的DNA解旋酶活性。cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中，VP3分子量最小，但数量最多，在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例大致为1:1:10。VP1是形成有感染性的AAV所必需的；VP2协助VP3进入细胞核；VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。
随着对AAV病毒生活周期及其相关分子生物学机制的了解，AAV病毒被改造成了一种高效的外源基因转移工具，即AAV载体。改造后的AAV载体基因组中只包含AAV病毒的ITR序列和携带转运的外源基因表达框，病毒包装需要的Rep和Cap蛋白通过外源质粒反式提供，降低了rep和cap基因包装入AAV载体可能带来的危害。加之，AAV病毒本身不具有致病性，使AAV载体成为公认的最安全的病毒载体之一。删除AAV病毒的一侧ITR序列中的D序列和trs（terminal resolution site）序列还能够使包装得到的重组AAV病毒载体携带基因组自我互补，形成双链，显著提高AAV载体的体内外转导效率（Wang Z, et al. Gene Ther.2003;10(26):2105-2111. McCarty DM, et al. Gene Ther. 2003;10(26):2112-2118.）。包装得到的病毒成为scAAV（self-complementary AAV）病毒，即所谓的双链AAV病毒。不同于双侧ITR均未突变的ssAAV（single-stranded AAV），即传统的AAV病毒。scAAV病毒的包装容量更小，仅为ssAAV包装容量的一半，约为2.2kb-2.5kb，但感染细胞后转导效率更高。AAV病毒血清型众多，不同的血清型具有不同的组织感染嗜性，因此应用AAV载体能够将外源基因转运至特定的器官和组织(Wu Z, et al. Mol Ther. 2006; 14(3): 316-327.)。某些血清型AAV载体还可穿越血脑屏障，将外源基因导致大脑神经元中，为靶向大脑的基因转导提供了可能(Samaranch L, et al. Hum Gene Ther. 2012; 23(4): 382-389.)。此外，AAV载体的理化性质稳定，对酸碱和高温体现出较强的耐受性(Gruntman AM, et al. Hum GeneTher Methods. 2015; 26(2): 71-76.)，容易开发出稳定性较高的生物制品。
AAV载体还具有相对成熟的包装系统，便于规模化生产。目前国内外常用的AAV载体包装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒为辅助病毒系统、单纯疱疹病毒（Herpessimplex virus type 1，HSV1）为辅助病毒的包装系统以及基于杆状病毒的包装系统。其中，三质粒转染包装系统因无需辅助病毒，安全性高，是应用最为广泛的AAV载体包装系统，也是目前国际上主流的生产系统。略显不足的是，高效大规模转染方法的缺失限制了三质粒转染系统在AAV载体大规模制备中的应用。Yuan等建立以腺病毒为辅助病毒的AAV大规模包装系统（Yuan Z, et al. Hum Gene Ther, 2011,22(5):613-624.），该系统生产效率高，但包装系统中腺病毒在最后AAV成品中的痕量存在，影响了AAV成品的安全性。HSV1作为辅助病毒的包装系统是另一类应用较为广泛的AAV载体包装系统。伍志坚和Conway等几乎同时在国际上提出了以HSV1为辅助病毒的AAV2载体包装策略（伍志坚，吴小兵等。科学通报，1999，44（5）：506-509。Conway JE, et al. Gene Ther, 1999,6:986-993.）。随后Wustner等提出了以HSV1为辅助病毒的AAV5载体包装策略（Wustner JT, et al. Mol Ther, 2002,6(4):510-518.）。在此基础上，Booth等利用两个HSV1分别携带AAV的rep/cap基因和AAV的反向末端序列（Inverted terminal repeat，ITR）/外源基因表达框，然后两个重组HSV1病毒共同感染生产细胞，包装产生AAV病毒（Booth MJ,et al. Gene Ther,2004,11:829-837.）。Thomas等进一步建立双HSV1病毒AAV生产的悬浮细胞系统（Thomas DL, et al.Gene Ther,2009,20:861-870.），使更大规模的AAV病毒生产成为可能。另外，Urabe等利用三个杆状病毒分别携带AAV的结构、非结构和ITR/外源基因表达框，构建了AAV载体的杆状病毒包装系统。考虑到杆状病毒携带外源基因的不稳定性，随后减少了生产系统中所需杆状病毒的个数，逐渐从最开始的需要三个杆状病毒到需要两或一个杆状病毒（Chen H. MolTher.2008;16(5):924-930. GalibertL,etal.JInvertebrPathol, 2011,107 Suppl:S80-93.）以及一个杆状病毒加一株诱导细胞株策略（Mietzsch M, et al. Hum Gene Ther.2014;25:212-222. Mietzsch M, et al. Hum Gene Ther. 2015;26(10):688-697.）。每种包装系统都各具特点，可根据需要做出合适的选择。
由于上述特点，AAV载体逐渐成为一种广泛应用于基因治疗，特别是遗传病的基因治疗的外源基因转运工具。截至2018年12月，世界上批准的机遇AAV载体的基因治疗临床试验方案有238项（http://www.abedia.com/wiley/vectors.php）。更为重要的是，基于AAV载体的脂蛋白脂酶基因治疗药物Glybera已于2012年被欧洲药监局批准上市，成为西方世界批准的第一个基因治疗药物（Ylä-Herttuala S. Mol Ther. 2012; 20(10): 1831-1832.）；2017年12月19日美国FDA批准先天性黑曚症（RPE65基因突变引起）基因治疗药物Luxturna上市，成为美国第一个罕见病的基因治疗药物（https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm589467.htm）。血友病B（Kay MA, et al.Nat Genet. 2000; 24(3): 257-261.）的AAV载体基因治疗药物均取得不错的临床试验效果，预期在不久的将来会上市销售，造福广大患者。
本发明中，我们选择AAV载体来携带mini-dystrophin基因表达框，主要是基于AAV载体的以下特点。其一，AAV载体仅保留野生型病毒中包装需要的两个ITR序列，不含有野生型病毒基因组中的蛋白编码基因（Salgenik M, et al. Microbiol Spectr. 2015; 3(4).），免疫原性低。其二，AAV通常以不整合的染色体外遗传物质形式实现携带基因读框的持续稳定表达（Chen ZY, et al. Mol Ther. 2001; 3(3): 403-410.），避免引导入基因随机整合而带来的安全性问题。其三，AAV载体通过静脉注射、肌肉注射都具有较高的转导效率（Wang Z, et al. Nat Biotechnol. 2005;23:321-328. Bish LT, et al. Hum GeneTher. 2008;19:1359-1368.Zincarelli C, et al. Mol Ther. 2008;16:1073-1080.Prasad KM, et al. Gene Ther. 2011;18:43-52.Rebuffat A, et al. Hum GeneTher.2010;21(4):463-477.），保证mini-dystrophin基因表达框能够在体内高效地表达mini-dystrophin蛋白。
为了降低机体产生针对mini-dystrophin蛋白免疫反应的概率，延长mini-dystrophin基因持续稳定表达的时间。我们选择肌肉特异性高效表达启动子调控mini-dystrophin基因的表达，让导入的mini-dystrophin基因在肌肉中特异高效表达。进一步，我们利用正常肝脏特异性高表达miR-122的特点（Jopling C. RNA Biol. 2012; 9(2):137-142.），在mini-dystrophin基因表达框的3’UTR区克隆入miR-122靶序列。借用miRNA抑制基因表达的原理（Kim VN. Nat Rev Mol Cell Biol.2005;6(5):376-385.），肝细胞内的miR-122分子会抑制mini-dystrophin蛋白的表达，显著降低mini-dystrophin蛋白在肝脏中的表达。通过肌肉特异性启动子和miR-122靶序列调控，实现mini-dystrophin蛋白的靶向性表达。
miRNAs（microRNAs）是广泛存在于人类和动物体内的长度为18至25个核苷酸（nucleotide，nt）的单链非编码RNA(Bartel DP. Cell. 2004; 116: 281-297. Kim VN.Nat Rev Mol Cell Biol. 2005; 6: 376-385.)。1993年miRNA首先在秀丽线虫（C.elegans）中发现(Lee RC, et al. Cell. 1993; 75: 843-854. Wightman B, et al.Cell. 1993; 75: 855-862.)。C.elegans中lin-4基因能够下调lin-14基因的表达，但lin-4基因的编码产物不是蛋白质，而是一种小RNA分子，表明自身编码小RNA分子能够调节基因的表达。随后，多种类似的小RNA分子在不同的物种和细胞中相继发现(Lagos-Quintana M,et al. Science. 2001; 294: 853-858. Lau NC, et al. Science. 2001; 294: 858-862. Lee RC, et al. Science. 2001;294: 862-864.)，miRNA开始成为该类小RNA 的统称。miRNA调节人类大约60%基因的表达(Lewis BP, et al. Cell. 2005;120: 15-20.Friedman RC, et al. Genome Res. 2009; 19: 92-105.)，在多种生理和病理过程中发挥重要作用(Careton M, et al. Cell Cycle. 2007; 6: 2127-2132. Ambros V. Cell.2003; 113:673-676. Schichel R, et al. Oncogene. 2008; 27: 5959-5974.)。
miRNA基因通常位于基因组的外显子、内含子和基因间区中(Olena AF, et al. JCell Physiol. 2010; 222: 540-545. Kim VN, et al. Trends Genet. 2006; 22: 165-173.)。在细胞内，miRNA的产生过程如下述(Winter J, et al. Nat Cell Biol. 2009;11:228-234.)。首先在细胞核中，miRNA基因由RNA聚合酶II或III启动转录产生初始产物pri-microRNA；pri-microRNA自我折叠部分序列形成茎环结构。随后，由核糖核酸酶III Drosha和DGCR8分子组成的加工复合体作用pri-microRNA，切去多余序列，留下60nt左右的茎环结构，即前体miRNA分子pre-microRNA(Lee Y, et al. Nature. 2003;425: 415-419. DenliAM, et al. Nature. 2004;432: 231-235. Gregory RI, et al. Nature. 2004; 432:235-240. Han J, et al. Genes Dev. 2004; 18: 3016-3027. Landthaler M, et al.Curr Biol. 2004;14: 2162-2167.)。然后在转运蛋白Exportin-5的协助下，pre-microRNA从细胞核进入细胞质中(Lund E, et al. Science. 2003; 303: 95-98. Yi R, et al.Genes Dev. 2003;17: 3011-3016. Bohnsack MT, et al. RNA. 2004; 10: 185-191.)，经Dicer酶加工去掉其茎环结构中的环形部分，变为双链RNA分子( Jiang F, et al.Genes Dev. 2005;, 19: 1674-1679. Saito K, et al. PLoS Biol. 2005; 3: e235.)。最后，双链RNA分子被AGO2等蛋白因子结合，其中一条链发生降解，另一条链和蛋白因子形成RNA诱导沉默复合物（RNA induced silencing complex，RISC）。RISC识别mRNA中靶序列，通过降解mRNA分子、促进mRNA分子3’端去腺苷化和抑制翻译来降低mRNA的表达水平，在转录后水平调节基因的表达(Storz G, et al. CurrOpin Microbiol.2004; 7: 140-144.Fabian MR, et al. Annu Rev Biochem. 2010; 79: 351-379. Valencia-Sanchez MA,et al. Genes Dev. 2006; 20: 515-524.)。因此利用细胞内高表达的miRNA，在外源基因的3’UTR(untranslated region)插入该miRNA的靶序列，能够有效地抑制外源基因在导入细胞中的表达。
根据以上设计思路，首先我们根据文献和自主设计合成一系列的肌肉特异启动子。体外细胞实验验证肌肉特异性启动子的功能。接下来，参考文献和专利合成截短的mini-dystrophin基因，用肌肉特异性启动子调控mini-dystrophin基因的表达，制备得到一系列携带mini-dystrophin基因表达框的重组AAV病毒。在mdx小鼠中，以携带分泌型报告基因Gluc表达框的AAV载体为对照，验证AAV病毒携带mini-dystrophin基因表达框对mdx小鼠肌酸激酶水平和运动能力的作用效果，并检测不同组织中mini-dystrophin蛋白的表达水平。结果显示，注射携带mini-dystrophin基因表达框的AAV病毒后，mdx小鼠肌酸激酶水平显著降低，运动能力明显增强，心肌和骨骼肌中mini-dystrophin蛋白的表达水平显著增加。然后，比较了mini-dystrophin基因表达框中不同启动子以及是否存在miR-122靶序列对mdx小鼠作用效果的影响。结果表明，肌肉特异性启动子和miR-122靶序列都不影响mini-dystrophin表达框的有效性，而且还能够显著降低mini-dystrophin在肝脏中的表达水平，减少mini-dystrophin在肝脏中过表达可能带来的安全性风险。用不同血清型AAV载体携带mini-dystrophin基因表达框，经尾静脉注射mdx小鼠，比较小鼠体内肌酸激酶水平、运动能力变化，分析小鼠不同组织的mini-dystrophin蛋白表达水平。结果显示，不同的AAV载体血清型都可显著降低mdx小鼠的肌酸激酶水平，提高mdx小鼠的运动能力，增加mdx小鼠不同组织的mini-dystrophin蛋白的表达水平。最后，我们比较了不同AAV载体包装系统生产得到AAV病毒对mini-dystrophin基因表达框作用效果的影响。将昆虫细胞-杆状病毒（Bac-to-AAV）生产系统生产AAV病毒和三质粒共转染包装得到AAV病毒分别注射mdx小鼠，比较mdx小鼠肌酸激酶水平、运动功能变化情况以及不同组织的mini-dystrophin基因表达情况，结果显示两种系统生产AAV病毒之间并未发现明显差异。这些结果表明本发明设计的DMD基因药物具有开发成为新型DMD治疗药物的潜力，为DMD患者的治疗提供新的选择。
发明内容
有鉴于此，本发明提供基于AAV载体的新型的DMD基因治疗药物。该药物由AAV载体携带mini-dystrophin基因表达框。参考文献（Wang B, et al. ProcNatl Acad Sci USA.2000; 97(25):13714-13719.）和中国专利“编码抗肌萎缩蛋白小基因的DNA序列及其使用方法”(专利号：ZL018099935.1)，人工优化合成了截短的人抗肌萎缩蛋白编码序列（mini-dystrophin），通过序列优化，消除了mRNA二级结构、稀有密码子和隐蔽剪接位点对mini-dystrophin基因编码序列转录和翻译的影响，提高了基因表达水平。采用肌肉特异性启动子调控mini-dystrophin编码序列的表达，在基因表达框的3’UTR（untranslated region）区加入miR-122靶序列。用不同血清型的AAV载体携带mini-dystrophin基因表达框。基于上述设计，预期该药物通过静脉注射后能够在DMD模型mdx小鼠肌肉组织中高效表达产生截短的抗肌萎缩蛋白（mini-dystrophin蛋白），降低模型小鼠的肌酸激酶水平，增强模型小鼠的运动能力。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了治疗杜氏肌营养不良症（DMD）的基因治疗药物，其特征在于，该药物基于重组AAV载体，利用AAV载体通过静脉注射能高效地把药物效应元件导入体内，实现药物效应元件高效表达产生治疗作用的截短的抗肌萎缩蛋白（mini-dystrophin蛋白）。为了实现mini-dystrophin蛋白的高效表达，根据不同血清型AAV的转导特点，选用的AAV载体血清型主要为AAV8、AAV9和AAVrh74。AAV8（Mack DL, et al. Mol Ther. 2017; 25(4): 839-854.）、AAV9(Kornegay JN, et al. Mol Ther. 2010; 18(8): 1501-1508.)和AAVrh74(Pozsqai ER, et al. Mol Ther. 2017; 25(4): 855-869.)经静脉注射后都可高效地转导肌肉组织，把mini-dystrophin基因表达框送至肌肉细胞，表达产生具有生理学功能的截短的抗肌萎缩蛋白（mini-dystrophin蛋白），从而达到治疗DMD的作用。在实施例7中，比较分析了不同血清型AAV携带mini-dystrophin基因表达框对mdx小鼠肌酸激酶水平、运动功能变化的影响，检测分析了不同组织mini-dystrophin蛋白的表达水平，结果表明3种血清型AAV载体都能有效地将mini-dystrophin基因表达框转运至肌肉细胞，表达产生mini-dystrophin蛋白，降低mdx小鼠的肌酸激酶水平，提高其运动功能。
本发明提供的DMD基因治疗药物，其特征在于，参考文献（Wang B, et al.ProcNatl Acad Sci USA. 2000; 97(25):13714-13719.）和中国专利“编码抗肌萎缩蛋白小基因的DNA序列及其使用方法”(专利号：ZL018099935.1)，人工优化合成了截短的人抗肌萎缩蛋白编码序列（mini-dystrophin），通过序列优化，消除了mRNA二级结构、稀有密码子和隐蔽剪接位点对mini-dystrophin基因编码序列转录和翻译的影响，提高了基因表达水平。同参考文献（Wang B, et al. ProcNatl Acad Sci USA. 2000; 97(25):13714-13719.）和中国专利“编码抗肌萎缩蛋白小基因的DNA序列及其使用方法”(专利号：ZL018099935.1)报道的截短的抗肌萎缩蛋白序列“Δ3990”相比，本发明中的截短的抗肌萎缩蛋白（mini-dystrophin蛋白）的氨基酸序列比“Δ3990”编码氨基酸序列少4个氨基酸。缺少4个氨基酸序列位于“Δ3990”编码蛋白的C末端。而且本发明中的mini-dystrophin序列经过人源表达优化，编码蛋白的核苷酸序列已不同于参考文献（Wang B, et al. ProcNatlAcad Sci USA. 2000; 97(25):13714-13719.）和中国专利“编码抗肌萎缩蛋白小基因的DNA序列及其使用方法”(专利号：ZL018099935.1)报道的来源于人的天然的抗肌萎缩蛋白编码核苷酸序列截短而来的“Δ3990”。
本发明提供的DMD基因治疗药物，其特征还在于，采用肌肉特异性启动子调控mini-dystrophin编码序列的表达，具体为mMCK启动子、HSA启动子和MSP启动子等肌肉特异性启动子。其中mMCK启动子为小鼠肌酸激酶启动子，参考文献（Sternberg EA, et al. MolCell Biol. 1988; 8(7): 2896-2909.）合成；HSA启动子为人为拼接合成的肌肉特异性启动子，由小鼠肌酸激酶基因增强子（Sternberg EA, et al. Mol Cell Biol. 1988; 8(7):2896-2909.）、人骨骼肌alpha肌动蛋白（Human skeletal alpha-actin gene）增强子和基础启动子（Muscar GE, Kedes L. Mol Cell Biol. 1987; 7(11):4089-4099.）组成；MSP启动子由alpha肌球蛋白重链基因（alpha-myosin heavy chain）增强子和改造后的小鼠肌酸激酶基因启动子组成，参考文献合成（Salva MZ, et al. Mol Ther. 2007; 15(2): 320-329.）。在实施例3中，以分泌型荧光素酶Gluc为报告基因，体外细胞实验证明了mMCK启动子、HSA启动子和MSP启动子的肌肉来源细胞表达特异性。进一步，在实施例5、实施例6、实施例7和实施例8中，mdx小鼠体内实验表明了mMCK启动子、HSA启动子和MSP启动子的肌肉细胞表达特异性。
本发明提供的DMD基因治疗药物，其特征还在于，在mini-dystrophin基因表达框的3’UTR（untranslated region）区加入miR-122靶序列。miR-122特异性在正常肝脏组织中高表达（Jopling C. RNA Biol. 2012; 9(2): 137-142.）。借用miRNA抑制基因表达的原理（Kim VN. Nat Rev Mol Cell Biol.2005;6(5):376-385.），肝细胞内的miR-122分子会抑制mini-dystrophin蛋白的表达，显著降低mini-dystrophin蛋白在肝脏中的表达。AAV病毒经静脉注射后会在肝脏组织中富集，感染肝细胞。肌肉特异性启动子和miR-122靶序列能够显著地降低mini-dystrophin基因在肝脏中的表达，降低肝脏中高效表达mini-dystrophin可能带来的风险。实施例6、实施例7和实施例8都证明了miR-122降低mini-dystrophin基因在肝脏中表达的有效性。
本发明提供的DMD基因治疗药物，其特征还在于，载体的生产系统可采用昆虫细胞-杆状病毒（Bac-to-AAV）AAV载体生产系统和AAV载体三质粒共转染包装生产系统。在实施例8中，两种生产系统生产得到AAV病毒分别经静脉注射mdx小鼠，比较mdx小鼠肌酸激酶水平、运动功能变化情况以及不同组织的mini-dystrophin基因表达情况，结果显示两种系统生产AAV病毒之间并未发现明显差异。
本发明提供的DMD基因治疗药物，其特征在于，将该药物经静脉注射注射至DMD模型小鼠体内后，能在小鼠体内高效稳定持续地表达截短的抗肌萎缩蛋白蛋白（mini-dystrophin蛋白），表达产生的mini-dystrophin蛋白能够降低模型小鼠的肌酸激酶水平，增强模型小鼠的运动能力。
本发明提供的DMD基因治疗药物，其特征还在于，经静脉注射一次给药就能够长期持续地在DMD模型小鼠体内高效稳定持续地表达截短的抗肌萎缩蛋白蛋白（mini-dystrophin蛋白），表达产生的mini-dystrophin蛋白能够降低模型小鼠的肌酸激酶水平，增强模型小鼠的运动能力。
本发明用到的重要原始实验材料如下所示：
pHelper质粒，来源于AAV Helper Free System（Agilent Technologies，美国），由本公司购自AgilentTechnologies公司并保存。该质粒包含三质粒共转染HEK293细胞制备重组AAV病毒所需要的腺病毒来源辅助功能基因E2A、E4和VA RNA等。
pAAV-RC质粒，来源于AAV Helper Free System（Agilent Technologies，美国），由本公司购自AgilentTechnologies公司并保存。pAAV-RC质粒包含完整的AAV2的rep和cap基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV2病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV2外壳蛋白。
pAAV-R2C8质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV8基因组（GenBank ID：AF513852）中外壳蛋白编码序列Cap8（基因组中第2121至4337位序列）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C8质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C8质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C8质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒中HindIII和PmeI酶切位点之间序列获得pAAV-R2C8质粒。pAAV-R2C8质粒包含完整的AAV8的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV8病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV8外壳蛋白。
pAAV-R2C9质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV9外壳蛋白编码序列（GenBankID：AY530579）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C9质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C9质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C9质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒HindIII和PmeI酶切位点之间序列获得pAAV-R2C9质粒。pAAV-R2C9质粒包含完整的AAV9的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV9病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV9外壳蛋白。
pAAV-R2Crh74质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAVrh74基因组（GenBank ID：LP899424.1）中外壳蛋白编码序列Caprh74（基因组中第2098至4311位序列）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2Crh74质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2Crh74质粒序列信息，人工合成pAAV-R2Crh74质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒HindIII和PmeI酶切位点之间序列获得pAAV-R2Crh74质粒。pAAV-R2Crh74质粒包含完整的AAVrh74的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAVrh74病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAVrh74外壳蛋白。
pAAV-DJ质粒，包含完整的AAVDJ的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAVDJ病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAVDJ外壳蛋白。由本公司购自美国Cell Biolabs公司并保存。
杜氏肌营养不良症小鼠模型制备种鼠，购自美国The Jackson Laboratory，商品名C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J，保种号001801。该种鼠性别为雌性，X染色体连锁DMD（dystrophinmusculardystrophygene）基因外显子23中3185位“C”突变为“T”的突变杂合子，突变的DMD基因表达产生截短的不具有生理功能的DMD蛋白（Bulfield G, et al. ProcNatl Acad Sci USA. 1984; 81(4):1189-1192. ）。该种鼠同雄性野生型C57BL/10ScSnJ小鼠(The Jackson Laboratory, 保种号：000476)杂交后，大约一半的新生雄性小鼠DMD基因突变，出现同人相似的杜氏肌营养不良症。
对照小鼠，雄性野生型C57BL/10ScSnJ小鼠，购自The Jackson Laboratory，保种号为000476，用作动物实验的野生型对照。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1 pAAV2neo载体结构示意图。本公司保存的两侧ITR均为145bp野生型ITR的AAV载体pAAV2neo（Dong X, et al. PLoS ONE. 2010; 5(10):e13479.）。ITR，invertedterminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CMV promoter，人巨细胞病毒早期启动子。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图2 pAAV2-CMV-Gluc载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CMV promoter，人巨细胞病毒早期启动子。Gluc，分泌型荧光素酶（Gaussialuciferase）编码区序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图3 pAAV2-SCMV-Gluc载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。SCMV promoter，缩小版的人巨细胞病毒早期启动子，序列信息详见SEQ ID NO.1。Gluc，分泌型荧光素酶（Gaussialuciferase）编码区序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图4 pAAV2-mMCK-Gluc载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。mMCK promoter，小鼠肌酸激酶启动子，序列信息详见SEQ IDNO.2。Gluc，分泌型荧光素酶（Gaussialuciferase）编码区序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图5 pAAV2-HSA-Gluc载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。HSA promoter，由小鼠肌酸激酶基因增强子、人骨骼肌alpha肌动蛋白（Human skeletal alpha-actin gene）增强子和基础启动子组成，序列信息详见SEQID NO.3。Gluc，分泌型荧光素酶（Gaussialuciferase）编码区序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图6 pAAV2-MSP-Gluc载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。MSP promoter，由alpha肌球蛋白重链基因（alpha-myosinheavy chain）增强子和改造后的小鼠肌酸激酶基因启动子组成，序列信息详见SEQ IDNO.4。Gluc，分泌型荧光素酶（Gaussialuciferase）编码区序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图7 pAAV2-SCMV-mini-dystrophin载体结构示意图。ITR，inverted terminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。SCMV promoter，缩小版的人巨细胞病毒早期启动子，序列信息详见SEQ ID NO.1。mini-dystrophin，截短的人抗肌萎缩蛋白基因编码序列，序列信息详见SEQ ID NO.5。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图8 pAAV2-mMCK -mini-dystrophin载体结构示意图。ITR，inverted terminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。mMCK promoter，小鼠肌酸激酶启动子，序列信息详见SEQ ID NO.2。mini-dystrophin，截短的人抗肌萎缩蛋白基因编码序列，序列信息详见SEQ ID NO.5。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图9 pAAV2-HSA-mini-dystrophin载体结构示意图。ITR，inverted terminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。HSA promoter，由小鼠肌酸激酶基因增强子、人骨骼肌alpha肌动蛋白（Human skeletal alpha-actin gene）增强子和基础启动子组成，序列信息详见SEQ ID NO.3。mini-dystrophin，截短的人抗肌萎缩蛋白基因编码序列，序列信息详见SEQ ID NO.5。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图10 pAAV2-MSP-mini-dystrophin载体结构示意图。ITR，inverted terminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。MSP promoter，由alpha肌球蛋白重链基因（alpha-myosin heavy chain）增强子和改造后的小鼠肌酸激酶基因启动子组成，序列信息详见SEQ ID NO.4。mini-dystrophin，截短的人抗肌萎缩蛋白基因编码序列，序列信息详见SEQ ID NO.5。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图11 pAAV2-mMCK-mini-dystrophin-122T载体结构示意图。ITR，invertedterminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。mMCK promoter，小鼠肌酸激酶启动子，序列信息详见SEQ ID NO.2。mini-dystrophin，截短的人抗肌萎缩蛋白基因编码序列，序列信息详见SEQ ID NO.5。122T，1个拷贝完全互补的人miR-122靶序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图12 pAAV2-HSA-mini-dystrophin-122T载体结构示意图。ITR，invertedterminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。HSA promoter，由小鼠肌酸激酶基因增强子、人骨骼肌alpha肌动蛋白（Human skeletal alpha-actin gene）增强子和基础启动子组成，序列信息详见SEQ ID NO.3。mini-dystrophin，截短的人抗肌萎缩蛋白基因编码序列，序列信息详见SEQ ID NO.5。122T，1个拷贝完全互补的人miR-122靶序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图13 pAAV2-MSP-mini-dystrophin-122T载体结构示意图。ITR，invertedterminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。MSP promoter，由alpha肌球蛋白重链基因（alpha-myosin heavy chain）增强子和改造后的小鼠肌酸激酶基因启动子组成，序列信息详见SEQ ID NO.4。mini-dystrophin，截短的人抗肌萎缩蛋白基因编码序列，序列信息详见SEQ ID NO.5。122T，1个拷贝完全互补的人miR-122靶序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图14不同启动子在C2C12细胞中表达水平比较结果。用三质粒包装系统，将pAAV2-SCMV-Gluc、pAAV2-mMCK-Gluc、pAAV2-HSA-Gluc和pAAV2-MSP-Gluc包装得到rAAVDJ-SCMV-Gluc、rAAVDJ-mMCK-Gluc、rAAVDJ-HSA-Gluc和rAAVDJ-MSP-Gluc等4种病毒。培养的C2C12细胞以4×104cells/孔接种96孔细胞培养板。接种后第二天，4种病毒分别以1×104vg/cell的感染剂量感染C2C12细胞。每种病毒做3个复孔。病毒感染细胞48h后，取培养上清，检测Gluc表达活性。用相对光强度单位（relativelightunit，RLU）表示Gluc活性。SCMV，感染rAAVDJ-SCMV-Gluc病毒的细胞培养上清的Gluc活性检测结果。mMCK，感染rAAVDJ-mMCK-Gluc病毒的细胞培养上清的Gluc活性检测结果。HSA，感染rAAVDJ-HSA-Gluc病毒的细胞培养上清的Gluc活性检测结果。MSP，感染rAAVDJ-MSP-Gluc病毒的细胞培养上清的Gluc活性检测结果。纵坐标下数字表示检测Gluc活性的平均值。
图15不同启动子在HEK293细胞中表达水平比较结果。用三质粒包装系统，将pAAV2-SCMV-Gluc、pAAV2-mMCK-Gluc、pAAV2-HSA-Gluc和pAAV2-MSP-Gluc包装得到rAAVDJ-SCMV-Gluc、rAAVDJ-mMCK-Gluc、rAAVDJ-HSA-Gluc和rAAVDJ-MSP-Gluc等4种病毒。培养的HEK293细胞以4×104cells/孔接种96孔细胞培养板。接种后第二天，4种病毒分别以1×104vg/cell的感染剂量感染HEK293细胞。每种病毒做3个复孔。病毒感染细胞48h后，取培养上清，检测Gluc表达活性。用相对光强度单位（relativelightunit，RLU）表示Gluc活性。SCMV，感染rAAVDJ-SCMV-Gluc病毒的细胞培养上清的Gluc活性检测结果。mMCK，感染rAAVDJ-mMCK-Gluc病毒的细胞培养上清的Gluc活性检测结果。HSA，感染rAAVDJ-HSA-Gluc病毒的细胞培养上清的Gluc活性检测结果。MSP，感染rAAVDJ-MSP-Gluc病毒的细胞培养上清的Gluc活性检测结果。纵坐标下数字表示检测Gluc活性的平均值。
图16 不同启动子在Huh7细胞中表达水平比较结果。用三质粒包装系统，将pAAV2-SCMV-Gluc、pAAV2-mMCK-Gluc、pAAV2-HSA-Gluc和pAAV2-MSP-Gluc包装得到rAAVDJ-SCMV-Gluc、rAAVDJ-mMCK-Gluc、rAAVDJ-HSA-Gluc和rAAVDJ-MSP-Gluc等4种病毒。培养的Huh7细胞以4×104cells/孔接种96孔细胞培养板。接种后第二天，4种病毒分别以1×104vg/cell的感染剂量感染Huh7细胞。每种病毒做3个复孔。病毒感染细胞48h后，取培养上清，检测Gluc表达活性。用相对光强度单位（relativelightunit，RLU）表示Gluc活性。SCMV，感染rAAVDJ-SCMV-Gluc病毒的细胞培养上清的Gluc活性检测结果。mMCK，感染rAAVDJ-mMCK-Gluc病毒的细胞培养上清的Gluc活性检测结果。HSA，感染rAAVDJ-HSA-Gluc病毒的细胞培养上清的Gluc活性检测结果。MSP，感染rAAVDJ-MSP-Gluc病毒的细胞培养上清的Gluc活性检测结果。纵坐标下数字表示检测Gluc活性的平均值。
图17 注射rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒的4周大mdx模型小鼠的肌酸激酶变化结果。rAAV9-SCMV-Gluc和rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒分别经尾静脉注射4周大的mdx模型小鼠。每种病毒各注射5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg等3个剂量。每种病毒单一剂量注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，尾静脉采血，分离血清，测定血清中肌酸激酶活性。5×1013vg/kg，注射剂量为5×1013vg/kg的mdx小鼠；1×1014vg/kg，注射剂量为1×1014vg/kg的mdx小鼠；3×1014vg/kg，注射剂量为3×1014vg/kg的mdx小鼠。
图18 注射rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒的12周大mdx模型小鼠的肌酸激酶变化结果。rAAV9-SCMV-Gluc和rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒分别经尾静脉注射12周大的mdx模型小鼠。每种病毒各注射5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg等3个剂量。每种病毒单一剂量注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，尾静脉采血，分离血清，测定血清中肌酸激酶活性。5×1013vg/kg，注射剂量为5×1013vg/kg的mdx小鼠；1×1014vg/kg，注射剂量为1×1014vg/kg的mdx小鼠；3×1014vg/kg，注射剂量为3×1014vg/kg的mdx小鼠。
图19 rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒注射4周大mdx模型小鼠后骨骼肌和心肌中mini-dystrophin阳性细胞比例分析。rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒分别经尾静脉注射4周大的mdx模型小鼠。病毒注射5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg等3个剂量。单一剂量注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，处死小鼠，取骨骼肌和心肌，切片，免疫组化检测表达mini-dystrophin细胞，计算表达mini-dystrophin细胞占总细胞的比例，得到mini-dystrophin阳性细胞比例。5×1013vg/kg，注射剂量为5×1013vg/kg的mdx小鼠；1×1014vg/kg，注射剂量为1×1014vg/kg的mdx小鼠；3×1014vg/kg，注射剂量为3×1014vg/kg的mdx小鼠。
图20 rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒注射12周大mdx模型小鼠后骨骼肌和心肌中mini-dystrophin阳性细胞比例分析。rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒分别经尾静脉注射12周大的mdx模型小鼠。病毒注射5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg等3个剂量。单一剂量注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，处死小鼠，取骨骼肌和心肌，切片，免疫组化检测表达mini-dystrophin细胞，计算表达mini-dystrophin细胞占总细胞的比例，得到mini-dystrophin阳性细胞比例。5×1013vg/kg，注射剂量为5×1013vg/kg的mdx小鼠；1×1014vg/kg，注射剂量为1×1014vg/kg的mdx小鼠；3×1014vg/kg，注射剂量为3×1014vg/kg的mdx小鼠。
图21 注射rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒的4周大mdx模型小鼠的运动功能测试结果。rAAV9-SCMV-Gluc和rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒分别经尾静脉注射4周大的mdx模型小鼠。每种病毒各注射5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg等3个剂量。每种单一剂量注射5只mdx小鼠。注射病毒6个月后，小鼠转棒仪测定小鼠运动功能。记录小鼠在转棒仪上的维持不滑落掉下时长，用于表示模型小鼠的运动功能。5×1013vg/kg，注射剂量为5×1013vg/kg的mdx小鼠；1×1014vg/kg，注射剂量为1×1014vg/kg的mdx小鼠；3×1014vg/kg，注射剂量为3×1014vg/kg的mdx小鼠。
图22 注射rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒的12周大mdx模型小鼠的运动功能测试结果。rAAV9-SCMV-Gluc和rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒分别经尾静脉注射12周大的mdx模型小鼠。每种病毒各注射5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg等3个剂量。每种单一剂量注射5只mdx小鼠。注射病毒6个月后，小鼠转棒仪测定小鼠运动功能。记录小鼠在转棒仪上的维持不滑落掉下时长，用于表示模型小鼠的运动功能。5×1013vg/kg，注射剂量为5×1013vg/kg的mdx小鼠；1×1014vg/kg，注射剂量为1×1014vg/kg的mdx小鼠；3×1014vg/kg，注射剂量为3×1014vg/kg的mdx小鼠。
图23 注射不同启动子调控mini-dystrophin表达的AAV病毒的4周大mdx模型小鼠的肌酸激酶变化结果。rAAV9-SCMV-Gluc、rAAV9-SCMV-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒分别经尾静脉注射4周大的mdx模型小鼠。每种病毒各注射5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg等3个剂量。每种病毒单一剂量注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，尾静脉采血，分离血清，测定血清中肌酸激酶活性。5×1013vg/kg，注射剂量为5×1013vg/kg的mdx小鼠；1×1014vg/kg，注射剂量为1×1014vg/kg的mdx小鼠；3×1014vg/kg，注射剂量为3×1014vg/kg的mdx小鼠。
图24 不同启动子调控mini-dystrophin表达的AAV病毒注射4周大mdx模型小鼠后骨骼肌和心肌中mini-dystrophin阳性细胞比例分析。rAAV9-SCMV-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒分别经尾静脉注射4周大的mdx模型小鼠。每种病毒各注射5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg等3个剂量。每种病毒单一剂量注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，处死小鼠，取骨骼肌和心肌，切片，免疫组化检测表达mini-dystrophin细胞，计算表达mini-dystrophin细胞占总细胞的比例，得到mini-dystrophin阳性细胞比例。SCMV-5×1013vg/kg，注射rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒剂量为5×1013vg/kg的mdx小鼠；SCMV-1×1014vg/kg，注射rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒剂量为1×1014vg/kg的mdx小鼠；SCMV-3×1014vg/kg，注射rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒剂量为3×1014vg/kg的mdx小鼠。mMCK-5×1013vg/kg，注射rAAV9-mMCK-mini-dystrophin病毒剂量为5×1013vg/kg的mdx小鼠；mMCK-1×1014vg/kg，注射rAAV9-mMCK-mini-dystrophin病毒剂量为1×1014vg/kg的mdx小鼠；mMCK-3×1014vg/kg，注射rAAV9-mMCK-mini-dystrophin病毒剂量为3×1014vg/kg的mdx小鼠。HSA-5×1013vg/kg，注射rAAV9-HSA-mini-dystrophin病毒剂量为5×1013vg/kg的mdx小鼠；HSA-1×1014vg/kg，注射rAAV9-HSA-mini-dystrophin病毒剂量为1×1014vg/kg的mdx小鼠；HSA-3×1014vg/kg，注射rAAV9-HSA-mini-dystrophin病毒剂量为3×1014vg/kg的mdx小鼠。MSP-5×1013vg/kg，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒剂量为5×1013vg/kg的mdx小鼠；MSP-1×1014vg/kg，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒剂量为1×1014vg/kg的mdx小鼠；MSP-3×1014vg/kg，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒剂量为3×1014vg/kg的mdx小鼠。
图25 注射不同启动子调控mini-dystrophin表达的AAV病毒的4周大mdx模型小鼠的运动功能测试结果。rAAV9-SCMV-Gluc、rAAV9-SCMV-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒分别经尾静脉注射4周大的mdx模型小鼠。每种病毒各注射5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg等3个剂量。每种病毒单一剂量注射5只mdx小鼠。注射病毒6个月后，小鼠转棒仪测定小鼠运动功能。记录小鼠在转棒仪上的维持不滑落掉下时长，用于表示模型小鼠的运动功能。5×1013vg/kg，注射剂量为5×1013vg/kg的mdx小鼠；1×1014vg/kg，注射剂量为1×1014vg/kg的mdx小鼠；3×1014vg/kg，注射剂量为3×1014vg/kg的mdx小鼠。
图26 不同启动子调控mini-dystrophin表达的AAV病毒注射4周大mdx模型小鼠后骨骼肌、心肌和肝脏中mini-dystrophin表达分析。rAAV9-SCMV-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒分别经尾静脉注射4周大的mdx模型小鼠。每种病毒各注射5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg等3个剂量。每种病毒单一剂量注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，处死小鼠，取骨骼肌、心肌和肝脏，提取组织总RNA，定量PCR检测总RNA中mini-dystrophinmRNA含量，用于表示mini-dystrophin表达。SCMV-5×1013vg/kg，注射rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒剂量为5×1013vg/kg的mdx小鼠；SCMV-1×1014vg/kg，注射rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒剂量为1×1014vg/kg的mdx小鼠；SCMV-3×1014vg/kg，注射rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒剂量为3×1014vg/kg的mdx小鼠。mMCK-5×1013vg/kg，注射rAAV9-mMCK-mini-dystrophin病毒剂量为5×1013vg/kg的mdx小鼠；mMCK-1×1014vg/kg，注射rAAV9-mMCK-mini-dystrophin病毒剂量为1×1014vg/kg的mdx小鼠；mMCK-3×1014vg/kg，注射rAAV9-mMCK-mini-dystrophin病毒剂量为3×1014vg/kg的mdx小鼠。HSA-5×1013vg/kg，注射rAAV9-HSA-mini-dystrophin病毒剂量为5×1013vg/kg的mdx小鼠；HSA-1×1014vg/kg，注射rAAV9-HSA-mini-dystrophin病毒剂量为1×1014vg/kg的mdx小鼠；HSA-3×1014vg/kg，注射rAAV9-HSA-mini-dystrophin病毒剂量为3×1014vg/kg的mdx小鼠。MSP-5×1013vg/kg，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒剂量为5×1013vg/kg的mdx小鼠；MSP-1×1014vg/kg，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒剂量为1×1014vg/kg的mdx小鼠；MSP-3×1014vg/kg，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒剂量为3×1014vg/kg的mdx小鼠。
图27 注射含有miR-122靶序列的AAV病毒的4周大mdx模型小鼠的肌酸激酶变化结果。rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒分别经尾静脉注射4周大的mdx模型小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。每种病毒注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，尾静脉采血，分离血清，测定血清中肌酸激酶活性。rAAV9-mMCK-mini-dystrophin，注射rAAV9-mMCK-mini-dystrophin病毒的mdx小鼠；rAAV9-HSA-mini-dystrophin，注射rAAV9-HSA-mini-dystrophin病毒的mdx小鼠；rAAV9-MSP-mini-dystrophin，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒的mdx小鼠；rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T，注射rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠；rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T，注射rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠；rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠。
图28 含有miR-122靶序列的AAV病毒注射4周大mdx模型小鼠后骨骼肌和心肌中mini-dystrophin阳性细胞比例分析。rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒分别经尾静脉注射4周大的mdx模型小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。注射病毒6周后，处死小鼠，取骨骼肌和心肌，切片，免疫组化检测表达mini-dystrophin细胞，计算表达mini-dystrophin细胞占总细胞的比例，得到mini-dystrophin阳性细胞比例。rAAV9-mMCK-mini-dystrophin，注射rAAV9-mMCK-mini-dystrophin病毒的mdx小鼠；rAAV9-HSA-mini-dystrophin，注射rAAV9-HSA-mini-dystrophin病毒的mdx小鼠；rAAV9-MSP-mini-dystrophin，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒的mdx小鼠；rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T，注射rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠；rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T，注射rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠；rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠。
图29 注射含有miR-122靶序列的AAV病毒的4周大mdx模型小鼠的运动功能测试结果。rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒分别经尾静脉注射4周大的mdx模型小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。注射病毒6个月后，小鼠转棒仪测定小鼠运动功能。记录小鼠在转棒仪上的维持不滑落掉下时长，用于表示模型小鼠的运动功能。rAAV9-mMCK-mini-dystrophin，注射rAAV9-mMCK-mini-dystrophin病毒的mdx小鼠；rAAV9-HSA-mini-dystrophin，注射rAAV9-HSA-mini-dystrophin病毒的mdx小鼠；rAAV9-MSP-mini-dystrophin，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒的mdx小鼠；rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T，注射rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠；rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T，注射rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠；rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠。
图30 含有miR-122靶序列的AAV病毒注射4周大mdx模型小鼠后骨骼肌、心肌和肝脏中mini-dystrophin表达分析。rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒分别经尾静脉注射4周大的mdx模型小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。注射病毒6周后，处死小鼠，取骨骼肌、心肌和肝脏，提取组织总RNA，定量PCR检测总RNA中mini-dystrophinmRNA含量，用于表示mini-dystrophin表达。rAAV9-mMCK-mini-dystrophin，注射rAAV9-mMCK-mini-dystrophin病毒的mdx小鼠；rAAV9-HSA-mini-dystrophin，注射rAAV9-HSA-mini-dystrophin病毒的mdx小鼠；rAAV9-MSP-mini-dystrophin，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒的mdx小鼠；rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T，注射rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠；rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T，注射rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠；rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠。
图31 注射不同血清型的AAV病毒的4周大mdx模型小鼠的肌酸激酶变化结果。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T病毒分别经尾静脉注射4周大的mdx模型小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。每种病毒注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，尾静脉采血，分离血清，测定血清中肌酸激酶活性。AAV9，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠；AAVrh74，注射rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠；AAV8，注射rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠。
图32 不同血清型AAV病毒注射4周大mdx模型小鼠后骨骼肌和心肌中mini-dystrophin阳性细胞比例分析。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T病毒分别经尾静脉注射4周大的mdx模型小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。注射病毒6周后，处死小鼠，取骨骼肌和心肌，切片，免疫组化检测表达mini-dystrophin细胞，计算表达mini-dystrophin细胞占总细胞的比例，得到mini-dystrophin阳性细胞比例。AAV9，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠；AAVrh74，注射rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠；AAV8，注射rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠。
图33 注射不同血清型AAV病毒的4周大mdx模型小鼠的运动功能测试结果。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T病毒分别经尾静脉注射4周大的mdx模型小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。注射病毒6个月后，小鼠转棒仪测定小鼠运动功能。记录小鼠在转棒仪上的维持不滑落掉下时长，用于表示模型小鼠的运动功能。AAV9，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠；AAVrh74，注射rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠；AAV8，注射rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠。
图34 不同血清型AAV病毒注射4周大mdx模型小鼠后骨骼肌、心肌和肝脏中mini-dystrophin表达分析。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T病毒分别经尾静脉注射4周大的mdx模型小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。注射病毒6周后，处死小鼠，取骨骼肌、心肌和肝脏，提取组织总RNA，定量PCR检测总RNA中mini-dystrophinmRNA含量，用于表示mini-dystrophin表达。AAV9，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠；AAVrh74，注射rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠；AAV8，注射rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠。
图35 注射不同生产系统生产的AAV病毒的4周大mdx模型小鼠的肌酸激酶变化结果。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BTA）病毒分别经尾静脉注射4周大的mdx模型小鼠。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒用三质粒转染生产；rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T(BTA)病毒用杆状病毒生产体系Bac-to-AAV生产。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。每种病毒注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，尾静脉采血，分离血清，测定血清中肌酸激酶活性。TPT，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠；BTA，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T(BTA)病毒的mdx小鼠。
图36 不同生产系统生产的AAV病毒注射4周大mdx模型小鼠后骨骼肌和心肌中mini-dystrophin阳性细胞比例分析。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BTA）病毒分别经尾静脉注射4周大的mdx模型小鼠。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒用三质粒转染生产；rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T(BTA)病毒用杆状病毒生产体系Bac-to-AAV生产。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。每种病毒注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，处死小鼠，取骨骼肌和心肌，切片，免疫组化检测表达mini-dystrophin细胞，计算表达mini-dystrophin细胞占总细胞的比例，得到mini-dystrophin阳性细胞比例。TPT，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠；BTA，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T(BTA)病毒的mdx小鼠。
图37 注射不同血清型AAV病毒的4周大mdx模型小鼠的运动功能测试结果。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BTA）病毒分别经尾静脉注射4周大的mdx模型小鼠。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒用三质粒转染生产；rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T(BTA)病毒用杆状病毒生产体系Bac-to-AAV生产。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。每种病毒注射5只mdx小鼠。注射病毒6个月后，小鼠转棒仪测定小鼠运动功能。记录小鼠在转棒仪上的维持不滑落掉下时长，用于表示模型小鼠的运动功能。TPT，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠；BTA，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T(BTA)病毒的mdx小鼠。
图38 不同生产系统生产AAV病毒注射4周大mdx模型小鼠后骨骼肌、心肌和肝脏中mini-dystrophin表达分析。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BTA）病毒分别经尾静脉注射4周大的mdx模型小鼠。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒用三质粒转染生产；rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T(BTA)病毒用杆状病毒生产体系Bac-to-AAV生产。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。每种病毒注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，处死小鼠，取骨骼肌、心肌和肝脏，提取组织总RNA，定量PCR检测总RNA中mini-dystrophinmRNA含量，用于表示mini-dystrophin表达。TPT，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠；BTA，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T(BTA)病毒的mdx小鼠。
具体实施方式
本发明公开了一种X连锁杜氏肌营养不良症的基因治疗药物，包含药物的设计、小量制备及功能验证，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 质粒载体构建
为了构建获得包装重组AAV病毒需要的pAAV2-SCMV-Gluc、pAAV2-mMCK-Gluc、pAAV2-HSA-Gluc、pAAV2-MSP-Gluc、pAAV2-SCMV-mini-dystrophin、pAAV2-mMCK-mini-dystrophin、pAAV2-HSA-mini-dystrophin、pAAV2-MSP-mini-dystrophin、pAAV2-mMCK-mini-dystrophin-122T、pAAV2-HSA-mini-dystrophin-122T、pAAV2-MSP-mini-dystrophin-122T质粒，我们首先以公司保存的pAAV2neo（图1）为基础，将分泌型荧光素酶基因编码序列（Gaussialuciferase，Gluc）插入pAAV2neo载体得到pAAV2-CMV-Gluc（图2）。然后用SCMV启动子、mMCK启动子、HSA启动子和MSP启动子序列，替换pAAV2-CMV-Gluc载体中的CMV启动子序列，得到pAAV2-SCMV-Gluc（图3）、pAAV2-mMCK-Gluc（图4）、pAAV2-HSA-Gluc（图5）、pAAV2-MSP-Gluc（图6）。
接下来，用人工合成的截短的抗肌萎缩蛋白编码序列（mini-dystrophin）分别替换pAAV2-SCMV-Gluc（图3）、pAAV2-mMCK-Gluc（图4）、pAAV2-HSA-Gluc（图5）和pAAV2-MSP-Gluc（图6）载体中的Gluc序列，得到pAAV2-SCMV-mini-dystrophin（图7）、pAAV2-mMCK-mini-dystrophin（图8）、pAAV2-HSA-mini-dystrophin（图9）、pAAV2-MSP-mini-dystrophin（图10）。
最后，用含有miR-122靶序列的mini-dystrophin序列（mini-dystrophin-122T）分别替换pAAV2-mMCK-Gluc（图4）、pAAV2-HSA-Gluc（图5）和pAAV2-MSP-Gluc（图6）载体中的Gluc序列，得到pAAV2-mMCK-mini-dystrophin-122T（图11）、pAAV2-HSA-mini-dystrophin-122T（图12）、pAAV2-MSP-mini-dystrophin-122T（图13）。
（1） Gluc报告基因载体构建
pAAV2-CMV-Gluc载体构建
以pCMV-Gluc2质粒(NEB，美国)为模板，设计合成Gluc-F（SEQ ID NO.6）、Gluc-R(SEQ ID NO.7)两条引物，并在Gluc-F引物的5’端引入KpnI酶切位点，在Gluc-R引物的5’端引入EcoRI酶切位点。利用合成的Gluc-F和Gluc-R引物，以pCMV-Gluc2质粒为模板，PCR扩增得到含有Gluc编码序列片段的Gluc-KE序列，长度约为0.6kb，序列信息详见SEQ ID NO.8。用KpnI和EcoRI分别双酶切消化Gluc-KE片段和pAAV2neo载体，回收消化后的Gluc-KE片段和线性化的pAAV2neo载体片段（约6.9kb），两片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定后得到含有Gluc基因编码区的AAV质粒载体pAAV2-CMV-Gluc（图3）。
5’ataggtaccgccaccatgggagtcaaagttctg3’Gluc-F（SEQ ID NO.6）
5’cgcgaattccggccgcttagtcaccaccggc3’ Gluc-R (SEQ ID NO.7)
pAAV2-SCMV-Gluc、pAAV2-mMCK-Gluc、pAAV2-HSA-Gluc和pAAV2-MSP-Gluc载体构建
参考文献（Boshart M,et al. Cell. 1985; 521-530.），以pAAV2neo载体中CMV启动子为模板，设计引物扩增长度为594bp的CMV启动子（命名为SCMV），序列信息详见SEQ IDNO.1，替换pAAV2-CMV-Gluc中长度为758bp启动子。构建过程如下，设计SCMV-F/SCMV-R引物，以pAAV2neo为模板，PCR扩增得到添加XhoI和KpnI酶切位点序列的SCMV启动子序列SCMV-XK片段，序列信息详见SEQ ID NO.9。XhoI和KpnI双酶切SCMV-XK序列，替换pAAV2-CMV-Gluc中长度为758bp序列，得到pAAV2-SCMV-Gluc，EcoRI+SpeI双酶切鉴定（线性化）。SCMV-F/SCMV-R引物序列如下，
5’cgcctcgagcgttacataacttacggt3’ SCMV-F(SEQ ID NO.10)
5’attggtacccggaggctggatcggtcc3’ SCMV-R(SEQ ID NO.11)
参考文献（Shield MA, et al. Mol Cell Biol. 1996; 16(9): 5058-5068.），在GeneBank数据库中搜索得到小鼠肌酸激酶（mMCK）启动子的序列编号（M21390.1），分析得到mMCK启动子序列，序列信息见SEQ ID NO.2。在mMCK启动子序列5’端添加XhoI限制性酶切位点“5’-CTCGAG-3’”，在启动子序列的3’端添加KpnI限制性酶切位点“5’-GGTACC-3’”，得到mMCK-XK序列，序列信息如SEQ ID NO.12所示。将mMCK-XK序列送南京金斯瑞生物技术有限公司合成，合成序列克隆入pUC57-1.8K载体（南京金斯瑞生物科技有限公司），得到pUC57-1.8K-mMCK。KpnI和XhoI双酶切消化产生0.6kb的mMCK-XK序列片段和1.8kb的载体片段，回收mMCK-XK序列片段备用。用mMCK-XK序列片段替换pAAV2-CMV-Gluc载体中XhoI和KpnI酶切位点之间的CMV启动子序列，酶切测序鉴定得到pAAV2-mMCK-Gluc载体（图4）。
HSA启动子为人为拼接合成的肌肉特异性启动子，由小鼠肌酸激酶基因增强子（Sternberg EA, et al. Mol Cell Biol. 1988; 8(7): 2896-2909.）、人骨骼肌alpha肌动蛋白（Human skeletal alpha-actin gene）增强子和基础启动子（Muscar GE, Kedes L.Mol Cell Biol. 1987; 7(11):4089-4099.）组成，序列信息详见SEQ ID NO.3。在HSA启动子序列5’端添加XhoI限制性酶切位点“5’-CTCGAG-3’”，在启动子序列的3’端添加KpnI限制性酶切位点“5’-GGTACC-3’”，得到HSA-XK序列，序列信息如SEQ ID NO.13所示。将HSA-XK序列送南京金斯瑞生物技术有限公司合成，合成序列克隆入pUC57-1.8K载体（南京金斯瑞生物科技有限公司），得到pUC57-1.8K-HSA。KpnI和XhoI双酶切消化产生0.5kb的HSA-XK序列片段和1.8kb的载体片段，回收HSA-XK序列片段备用。用HSA-XK序列片段替换pAAV2-CMV-Gluc载体中XhoI和KpnI酶切位点之间的CMV启动子序列，酶切测序鉴定得到pAAV2-HSA-Gluc载体（图5）。
MSP启动子由alpha肌球蛋白重链基因（alpha-myosin heavy chain）增强子和改造后的小鼠肌酸激酶基因启动子组成，序列信息参考文献（Salva MZ, et al. Mol Ther.2007; 15(2): 320-329.），具体序列信息见SEQ ID NO.4。在MSP启动子序列5’端添加XhoI限制性酶切位点“5’-CTCGAG-3’”，在启动子序列的3’端添加KpnI限制性酶切位点“5’-GGTACC-3’”，得到MSP-XK序列，序列信息如SEQ ID NO.14所示。将MSP-XK序列送南京金斯瑞生物技术有限公司合成，合成序列克隆入pUC57-1.8K载体（南京金斯瑞生物科技有限公司），得到pUC57-1.8K-MSP。KpnI和XhoI双酶切消化产生0.6kb的MSP-XK序列片段和1.8kb的载体片段，回收MSP-XK序列片段备用。用MSP-XK序列片段替换pAAV2-CMV-Gluc载体中XhoI和KpnI酶切位点之间的CMV启动子序列，酶切测序鉴定得到pAAV2-MSP-Gluc载体（图6）。
（2） 携带mini-dystrophin表达框载体构建
参考文献（Wang B, et al. ProcNatl Acad Sci USA. 2000; 97(25):13714-13719.）和中国专利“编码抗肌萎缩蛋白小基因的DNA序列及其使用方法”(专利号：ZL018099935.1)，人工优化合成了截短的人抗肌萎缩蛋白编码序列（mini-dystrophin），序列信息详见SEQ ID NO.5。同参考文献（Wang B, et al. ProcNatl Acad Sci USA. 2000;97(25):13714-13719.）和中国专利“编码抗肌萎缩蛋白小基因的DNA序列及其使用方法”(专利号：ZL018099935.1)报道的截短的抗肌萎缩蛋白序列“Δ3990”相比，本发明中的截短的抗肌萎缩蛋白（mini-dystrophin蛋白）的氨基酸序列比“Δ3990”编码氨基酸序列少4个氨基酸。缺少4个氨基酸序列位于“Δ3990”编码蛋白的C末端。而且本发明中的mini-dystrophin序列经过人源表达优化，编码蛋白的核苷酸序列已不同于参考文献（Wang B,et al. ProcNatl Acad Sci USA. 2000; 97(25):13714-13719.）和中国专利“编码抗肌萎缩蛋白小基因的DNA序列及其使用方法”(专利号：ZL018099935.1)报道的来源于人的天然的抗肌萎缩蛋白编码核苷酸序列截短而来的“Δ3990”。
在mini-dystrophin序列5’端添加KpnI限制性酶切位点“5’-GGTACC-3’”，在序列的3’端依次添加BglII限制性酶切位点“5’-AGATCT-3’”、polyA序列“5’-tcgagaggcctaataaagagctcagatgcatcgatcagagtgtgttggttttttgtgtg-3’”和BamHI限制性酶切位点“5’-GGATCC-3’”，得到mini-dystrophin-KB序列，序列信息如SEQ ID NO.15所示。将mini-dystrophin-KB序列送南京金斯瑞生物技术有限公司合成，合成序列克隆入pUC57-1.8K载体（南京金斯瑞生物科技有限公司），得到pUC57-1.8K-mini-dystrophin-KB。KpnI和BamHI双酶切消化产生4.1kb的mini-dystrophin-KB序列片段和1.8kb的载体片段，回收mini-dystrophin-KB序列片段备用。用mini-dystrophin-KB序列片段分别替换pAAV2-SCMV-Gluc载体、pAAV2-mMCK-Gluc载体、pAAV2-HSA-Gluc载体和pAAV2-MSP-Gluc载体中的Gluc序列，得到pAAV2-SCMV-mini-dystrophin载体（图7）、pAAV2-mMCK-mini-dystrophin载体（图8）、pAAV2-HSA-mini-dystrophin载体（图9）和pAAV2-MSP-mini-dystrophin载体（图10）。
（3） 携带mini-dystrophin-122T表达框载体构建
以pAAV2-SMCV-mini-dystrophin质粒为模板，设计引物mDys-F/mDys-122T-R为引物，PCR扩增mini-dystrophin序列。通过引物在PCR扩增片段的5’端引入KpnI限制性酶切位点“5’-GGTACC-3’”，在3’端依次引入miR-122完全互补的靶序列“5’-caaacaccattgtcacactcca-3’”和BglII酶切位点“5’-AGATCT-3’”。扩增序列命名为mini-dystrophin-122T，序列信息详见SEQ ID NO.16。用KpnI和BglII双酶切消化mini-dystrophin-122T片段，得到消化后的mini-dystrophin-122T片段。用KpnI和BglII双酶切消化pAAV2-mMCK-mini-dystrophin载体（图8）、pAAV2-HSA-mini-dystrophin载体（图9）和pAAV2-MSP-mini-dystrophin载体（图10），都产生两条片段，回收长度较大的载体片段。将载体片段和回收的消化后的mini-dystrophin-122T片段连接，得到pAAV2-mMCK-mini-dystrophin-122T载体（图11）、pAAV2-HSA-mini-dystrophin-122T载体（图12）和pAAV2-MSP-mini-dystrophin-122T载体（图13）。
5’ataggtaccgccaccatggtgtggtgg3’mDys-F（SEQ ID NO.17）
5’ggcagatcttggagtgtgacaatggtgtttggtcatcttatcatgtctccatatt3’ mDys-122T-R(SEQ ID NO.18)
实施例2 重组AAV病毒制备及检定
参照文献（Xiao X, et al. J Virol. 1998;72(3):2224-2232.），应用三质粒包装系统包装重组AAV病毒，采用氯化铯密度梯度离心法分离纯化包装得到AAV病毒。简要地，AAV载体质粒（pAAV2-SCMV-Gluc、pAAV2-mMCK-Gluc、pAAV2-HSA-Gluc、pAAV2-MSP-Gluc、pAAV2-SCMV-mini-dystrophin、pAAV2-mMCK-mini-dystrophin、pAAV2-HSA-mini-dystrophin、pAAV2-MSP-mini-dystrophin、pAAV2-mMCK-mini-dystrophin-122T、pAAV2-HSA-mini-dystrophin-122T、pAAV2-MSP-mini-dystrophin-122T）、辅助质粒（pHelper）和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒（pAAV-DJ、pAAV-R2C8、pAAV-R2C9或pAAV-R2Crh74）按照1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法转染HEK293细胞，转染48h后，收获细胞和培养上清，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。包装纯化得到rAAVDJ-SCMV-Gluc、rAAVDJ-mMCK-Gluc、rAAVDJ-HSA-Gluc、rAAVDJ-MSP-Gluc、rAAV9-SCMV-Gluc、rAAV9-SCMV-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T 和rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T等14种重组病毒。
其中rAAVDJ-SCMV-Gluc、rAAVDJ-mMCK-Gluc、rAAVDJ-HSA-Gluc和rAAVDJ-MSP-Gluc等4种病毒用于细胞实验比较不同启动子的表达特性，具体见实施例3；rAAV9-SCMV-Gluc和rAAV9-SCMV-mini-dystrophin等2种病毒用于mdx小鼠模型体内评价携带mini-dystrophin表达框AAV载体的功能，具体见实施例4；rAAV9-SCMV-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin等4种病毒用于实施例5“不同启动子对携带mini-dystrophin表达框AAV载体的功能影响研究”；rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T等6种病毒用于实施例6“miR-122调控元件对携带mini-dystrophin表达框AAV载体的功能影响研究”；rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T 和rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T等3种病毒用于实施例7“不同AAV血清型对携带mini-dystrophin表达框AAV载体的功能影响研究”。
采用定量PCR方法测定制备得到AAV病毒的基因组滴度。rAAVDJ-SCMV-Gluc、rAAVDJ-mMCK-Gluc、rAAVDJ-HSA-Gluc、rAAVDJ-MSP-Gluc和rAAV9-SCMV-Gluc等5种病毒采用针对Gluc编码序列设计定量PCR检测用引物和探针。rAAV9-SCMV-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T 和rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T等9种病毒采用针对mini-dystrophin编码区序列设计引物和探针。
rAAVDJ-SCMV-Gluc、rAAVDJ-mMCK-Gluc、rAAVDJ-HSA-Gluc、rAAVDJ-MSP-Gluc和rAAV9-SCMV-Gluc等5种病毒检测过程如下：
Gluc-Q-F：5’-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3’ (SEQ ID NO.19)
Gluc-Q-R：5’-CGGACTCTTTGTCGCCTTC-3’ (SEQ ID NO.20)
Gluc-Q-P：5’-CATCCCAGGACGCTGCCACACCT-3’ (SEQ ID NO.21)
Gluc-Q-F和Gluc-Q-R为引物，Gluc-Q-P为探针。探针5’端用FAM荧光蛋白标记，3’端连接BlackBerry quencher。引物和探针由Thermofisher Scientific合成。以Gluc-Q-F和Gluc-Q-R为引物特异性地扩增Gluc编码序列中长度为65bp片段，采用TaqMan探针结合法，以1μg/μl的pAAV2-SCMV-Gluc质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用Premix ExTaq (Probe qPCR)试剂（Takara，大连，中国），使用荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500 fast，ABI）检测病毒基因组滴度。操作过程参见Premix Ex Taq (Probe qPCR)试剂说明书。病毒的处理方法参见文献（Aurnhammer C, et al. Hum Gene Ther Methods. 2012;23(1):18-28.）。
rAAV9-SCMV-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T 和rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T等9种病毒检测过程如下：
MDP-Q-F：5’- AGGATCTGAAGAGGCAGGTG-3’ (SEQ ID NO.22)
MDP-Q-R：5’- ACCATGTGTGTCAGGGAGTT-3’ (SEQ ID NO.23)
MDP-Q-P：5’- CGCGCACCTGCTCCTGCTCC-3’ (SEQ ID NO.24)
MDP-Q-F和MDP-Q-R为引物，MDP-Q-P为探针。探针5’端用FAM荧光蛋白标记，3’端连接BlackBerry quencher。引物和探针由Thermofisher Scientific合成。以MDP-Q-F和MDP-Q-R为引物特异性地扩增mini-dystrophin编码序列中长度为91bp片段，采用TaqMan探针结合法，以1μg/μl的pAAV2-SCMV-mini-dystrophin质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用Premix Ex Taq (Probe qPCR)试剂（Takara，大连，中国），使用荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500 fast，ABI）检测病毒基因组滴度。操作过程参见Premix Ex Taq (Probe qPCR)试剂说明书。病毒的处理方法参见文献（Aurnhammer C, et al. Hum Gene Ther Methods.2012;23(1):18-28.）。
实施例3 体外启动子筛选实验
用三质粒包装系统，将pAAV2-SCMV-Gluc、pAAV2-mMCK-Gluc、pAAV2-HSA-Gluc和pAAV2-MSP-Gluc包装得到rAAVDJ-SCMV-Gluc、rAAVDJ-mMCK-Gluc、rAAVDJ-HSA-Gluc和rAAVDJ-MSP-Gluc等4种病毒，具体见实施例2。4种病毒分别由不同的启动子调控Gluc的表达。用小鼠肌肉来源的成肌细胞C2C12细胞，人胚肾细胞HEK293细胞和肝癌细胞Huh7细胞等3种细胞来验证启动子的功能。
将培养的C2C12细胞、HEK293细胞和Huh7细胞以4×104cells/孔的密度分别接种96孔细胞培养板。接种后第二天，4种病毒分别以1×104vg/cell的感染剂量感染C2C12细胞、HEK293细胞或Huh7细胞。每种病毒做3个复孔。病毒感染细胞48h后，每孔取20μL培养上清，用Gaussia荧光素酶检测试剂盒（New England Biolabs，E3300L），采用发光检测仪检测Gluc表达活性，用相对光强度单位（relativelightunit，RLU）表示Gluc活性。C2C12细胞的检测结果如图14所示。HEK293细胞的检测结果如图15所示。Huh7细胞的检测结果如图16所示。
从图14的结果可知，在C2C12细胞中，rAAVDJ-SCMV-Gluc的Gluc表达水平最高，rAAVDJ-MSP-Gluc次之，rAAVDJ-HSA-Gluc再次，rAAVDJ-mMCK-Gluc最低。进一步分析了rAAVDJ-SCMV-Gluc/rAAVDJ-mMCK-Gluc、rAAVDJ-SCMV-Gluc/rAAVDJ-HSA-Gluc、rAAVDJ-SCMV-Gluc/rAAVDJ-MSP-Gluc的Gluc表达活性的比值，分别为14.70、11.96和9.50。
从图15的结果可知，在HEK293细胞中，rAAVDJ-SCMV-Gluc的Gluc表达水平最高，rAAVDJ-mMCK-Gluc次之，rAAVDJ-HSA-Gluc再次，rAAVDJ-MSP-Gluc最低。进一步分析了rAAVDJ-SCMV-Gluc/rAAVDJ-mMCK-Gluc、rAAVDJ-SCMV-Gluc/rAAVDJ-HSA-Gluc、rAAVDJ-SCMV-Gluc/rAAVDJ-MSP-Gluc的Gluc表达活性的比值，分别为305.37、4528.44和6615.91。
从图16的结果可知，在Huh7细胞中，rAAVDJ-SCMV-Gluc的Gluc表达水平最高，rAAVDJ-MSP-Gluc次之，rAAVDJ-HSA-Gluc再次，rAAVDJ-mMCK-Gluc最低。进一步分析了rAAVDJ-SCMV-Gluc/rAAVDJ-mMCK-Gluc、rAAVDJ-SCMV-Gluc/rAAVDJ-HSA-Gluc、rAAVDJ-SCMV-Gluc/rAAVDJ-MSP-Gluc的Gluc表达活性的比值，分别为201.25、34.59和90.06。
综上所述，在3种细胞中，rAAVDJ-SCMV-Gluc的Gluc表达水平都最高，其余3种病毒明显低于rAAVDJ-SCMV-Gluc病毒。但rAAVDJ-SCMV-Gluc/rAAVDJ-mMCK-Gluc、rAAVDJ-SCMV-Gluc/rAAVDJ-HSA-Gluc、rAAVDJ-SCMV-Gluc/rAAVDJ-MSP-Gluc的Gluc表达活性的比值存在差异。在C2C12细胞中，Gluc表达活性的比值明显低于HEK293细胞或Huh7细胞中的Gluc表达活性比值，说明mMCK启动子、HSA启动子和MSP启动子的肌肉细胞特异性良好。
实施例4 mdx小鼠模型体内评价携带mini-dystrophin表达框AAV载体的功能
为了评价携带mini-dystrophin表达框AAV载体的功能，选择不同年龄大小（4周龄和12周龄）的DMD模型小鼠mdx小鼠，以高中低3个剂量（5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg）将rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒经静脉注射至模型小鼠体内。注射病毒6周后，尾静脉采血，分离血清，测定血清中肌酸激酶活性；处死小鼠，取骨骼肌和心肌，切片，免疫组化检测表达mini-dystrophin细胞，计算表达mini-dystrophin细胞占总细胞的比例，得到mini-dystrophin阳性细胞比例。注射病毒6个月后，小鼠转棒仪测定小鼠运动功能。实验过程中，以注射rAAV9-SCMV-Gluc病毒的mdx小鼠作为阴性对照。
杜氏肌营养不良症模型小鼠mdx小鼠由mdx制备种鼠（雌性）同雄性野生型C57BL/10ScSnJ小鼠(The Jackson Laboratory, 000476)杂交后获得。出生后雄性小鼠参照文献（Trebbin AL,Hoey AJ. Muscle Nerve. 2009; 39(5): 603-608.），采用PCR方法鉴别基因组DNA，选择基因组鉴别正确小鼠进行实验。mdx小鼠制备种鼠，购自美国The JacksonLaboratory，商品名C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J，保种号001801。该种鼠性别为雌性，X染色体连锁DMD（dystrophinmusculardystrophygene）基因外显子23中3185位“C”突变为“T”的突变杂合子，突变的DMD基因表达产生截短的不具有生理功能的DMD蛋白（Bulfield G, et al.Proc Natl Acad Sci USA. 1984; 81(4):1189-1192. ）。该种鼠同雄性野生型C57BL/10ScSnJ小鼠(The Jackson Laboratory, 000476)杂交后，大约一半的新生雄性小鼠Dmd基因突变，出现同人相似的杜氏肌营养不良症。
首先我们研究了病毒注射后mdx小鼠体内肌酸激酶活性变化。rAAV9-SCMV-Gluc和rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒分别经尾静脉注射4周龄或12周龄的mdx模型小鼠。每种病毒各注射5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg等3个剂量。每种病毒单一剂量注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，尾静脉采血，分离血清。采用肌酸激酶活性测定试剂盒（Sigma-Aldrich，MAK116），参照说明书测定血清中肌酸激酶活性。图17显示的是4周龄mdx小鼠肌酸激酶检测结果。图18显示的是12周龄mdx小鼠肌酸激酶检测结果。
从图17的结果可知，相比于注射rAAV9-SCMV-Gluc病毒mdx小鼠，注射rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒小鼠的肌酸激酶水平明显下降，且随着注射病毒剂量的增加，肌酸激酶下降越多。说明rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒经静脉注射4周大mdx小鼠后，能够有效地降低肌酸激酶含量。
从图18的结果可知，同图17结果一致，相比于注射rAAV9-SCMV-Gluc病毒mdx小鼠，注射rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒小鼠的肌酸激酶水平明显下降，且随着注射病毒剂量的增加，肌酸激酶下降越多。说明rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒经静脉注射12周大mdx小鼠后，也能够有效地降低肌酸激酶含量。结果还说明12周大mdx小鼠体内的肌酸激酶活性会高于4周大mdx小鼠，且注射同等剂量rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒下，4周大mdx小鼠肌酸激酶水平低于12周大mdx小鼠的肌酸激酶水平。
接下来，我们研究了病毒注射后mdx小鼠骨骼肌和心肌中mini-dystrophin表达情况。rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒分别经尾静脉注射4周大或12周大的mdx模型小鼠。病毒注射5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg等3个剂量。单一剂量注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，处死小鼠，取骨骼肌和心肌，切片，用抗肌萎缩蛋白抗体NCL-DYS3-ce（NovoCastra Laboratories）作为一抗，免疫组化检测表达mini-dystrophin细胞，计算表达mini-dystrophin细胞占总细胞的比例，得到mini-dystrophin阳性细胞比例。免疫组化操作过程参见文献（Wang B, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97(25): 13714-13719.）。图19显示的是4周龄mdx小鼠骨骼肌和心肌中mini-dystrophin表达结果。图20显示的是12周龄mdx小鼠骨骼肌和心肌中mini-dystrophin表达结果。
从图19的结果可知，rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒注射4周大mdx小鼠后，心肌和骨骼肌中mini-dystrophin表达阳性细胞比例都达到20%以上，且随着注射病毒剂量的增加，mini-dystrophin表达阳性细胞比例逐渐增加。当注射剂量达到1×1014vg/kg及以上时，心肌和骨骼肌中mini-dystrophin表达阳性细胞比例达60%以上，且骨骼肌中比例高于心肌中比例。
从图20的结果可知，rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒注射12周大mdx小鼠后，心肌和骨骼肌中mini-dystrophin表达阳性细胞比例也都达到20%以上，且随着注射病毒剂量的增加，mini-dystrophin表达阳性细胞比例也逐渐增加。当注射剂量达到1×1014vg/kg及以上时，心肌和骨骼肌中mini-dystrophin表达阳性细胞比例达60%以上，且骨骼肌中比例高于心肌中比例。
最后，我们用小鼠转棒仪测定了病毒注射后小鼠运动功能的变化。rAAV9-SCMV-Gluc和rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒分别经尾静脉注射4周大的mdx模型小鼠。每种病毒各注射5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg等3个剂量。每种单一剂量注射5只mdx小鼠。注射病毒6个月后，小鼠转棒仪测定小鼠运动功能。记录小鼠在转棒仪上的维持不滑落掉下时长，用于表示模型小鼠的运动功能。运动功能测定过程参见文献（Kelly MA, etal. J Neurosci. 1998; 18: 3470-3479.）。图21显示的是4周龄mdx小鼠运动功能测定结果。图22显示的是12周龄mdx小鼠运动功能检测结果。
从图21的结果可知，与注射rAAV9-SCMV-Gluc病毒4周大mdx小鼠相比，注射rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒mdx小鼠在转棒仪上的维持时间明显增加，且随着注射病毒剂量的增加，维持时间逐渐延长。当注射剂量达到1×1014vg/kg及以上时，mdx小鼠在转棒仪上的维持时间达到900s以上，接近或达到正常小鼠水平。说明rAAV9-SCMV-mini-dystrophin经静脉注射mdx小鼠后能够有效地恢复其运动功能。
从图22的结果可知，与注射rAAV9-SCMV-Gluc病毒12周大mdx小鼠相比，注射rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒mdx小鼠在转棒仪上的维持时间也明显增加，且随着注射病毒剂量的增加，维持时间逐渐延长。当注射剂量达到1×1014vg/kg及以上时，mdx小鼠在转棒仪上的维持时间达到800s以上，低于病毒注射4周大mdx小鼠结果，接近正常小鼠水平。说明rAAV9-SCMV-mini-dystrophin经静脉注射mdx小鼠后能够有效地恢复其运动功能。
综上所述，rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒经尾静脉注射4周龄或12周龄mdx小鼠，都能够有效地降低mdx小鼠体内的肌酸激酶含量，表达产生mini-dystrophin蛋白，恢复其运动功能。而且当注射剂量达到1×1014vg/kg及以上时，基本上完全恢复mdx小鼠运动功能。此外，不同年龄大小的mdx小鼠，显示出相似的结果，虽然12周龄mdx小鼠的效果弱于4周龄mdx小鼠，提示病毒注射时mdx小鼠年龄大小会影响病毒的作用效果。
实施例5 不同启动子对携带mini-dystrophin表达框AAV载体的功能影响研究
为了评价不同启动子对携带mini-dystrophin表达框AAV载体的功能的影响，将不同启动子调控的携带mini-dystrophin表达框AAV病毒（rAAV9-SCMV-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin），以高中低3个剂量（5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg）经静脉注射至4周大DMD模型小鼠mdx小鼠体内。mdx小鼠来源详见实施例4。注射病毒6周后，尾静脉采血，分离血清，测定血清中肌酸激酶活性；处死小鼠，取骨骼肌和心肌，切片，免疫组化检测表达mini-dystrophin细胞，计算表达mini-dystrophin细胞占总细胞的比例，得到mini-dystrophin阳性细胞比例；取肝脏、心脏和骨骼肌组织，提取总RNA，定量PCR检测不同组织来源总RNA中mini-dystrophin RNA含量，用于表示mini-dystrophin表达水平。注射病毒6个月后，小鼠转棒仪测定小鼠运动功能。
首先我们研究了病毒注射后mdx小鼠体内肌酸激酶活性变化。rAAV9-SCMV-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒分别经尾静脉注射4周龄的mdx模型小鼠。每种病毒各注射5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg等3个剂量。每种病毒单一剂量注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，尾静脉采血，分离血清。采用肌酸激酶活性测定试剂盒（Sigma-Aldrich，MAK116），参照说明书测定血清中肌酸激酶活性。结果如图23所示。
从图23的结果可知，同注射rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒mdx小鼠一样，注射rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒小鼠的肌酸激酶水平明显下降，且随着注射病毒剂量的增加，肌酸激酶下降逐渐增加，4种病毒相同的注射剂量之间未见明显差异。说明rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin等病毒同rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒一样，都能够有效地降低mdx小鼠体内的肌酸激酶含量。
接下来，我们研究了病毒注射后mdx小鼠骨骼肌和心肌中mini-dystrophin表达情况。rAAV9-SCMV-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒分别经尾静脉注射4周龄的mdx模型小鼠。病毒注射5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg等3个剂量。单一剂量注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，处死小鼠，取骨骼肌和心肌，切片，用抗肌萎缩蛋白抗体NCL-DYS3-ce（NovoCastra Laboratories）作为一抗，免疫组化检测表达mini-dystrophin细胞，计算表达mini-dystrophin细胞占总细胞的比例，得到mini-dystrophin阳性细胞比例。免疫组化操作过程参见文献（Wang B, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97(25): 13714-13719.）。结果如图24所示。
从图24的结果可知，同注射rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒mdx小鼠一样，注射rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒mdx小鼠的心肌和骨骼肌中mini-dystrophin表达阳性细胞比例都达到20%以上，且随着注射病毒剂量的增加，mini-dystrophin表达阳性细胞比例逐渐增加。当注射剂量达到1×1014vg/kg及以上时，心肌和骨骼肌中mini-dystrophin表达阳性细胞比例达60%以上，且骨骼肌中比例高于心肌中比例。唯一例外的是注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒mdx小鼠的心肌中mini-dystrophin表达阳性细胞比例高于注射其他病毒种类小鼠。
然后，我们用小鼠转棒仪测定了病毒注射后小鼠运动功能的变化。rAAV9-SCMV-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒分别经尾静脉注射4周龄的mdx模型小鼠。每种病毒各注射5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg等3个剂量。每种单一剂量注射5只mdx小鼠。注射病毒6个月后，小鼠转棒仪测定小鼠运动功能。记录小鼠在转棒仪上的维持不滑落掉下时长，用于表示模型小鼠的运动功能。运动功能测定过程参见文献（Kelly MA, et al. JNeurosci. 1998; 18: 3470-3479.）。结果如图25所示。
从图25的结果可知，同注射rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒mdx小鼠一样，注射rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒mdx小鼠在转棒仪上的维持时间明显增加，且随着注射病毒剂量的增加，维持时间逐渐延长。当注射剂量达到1×1014vg/kg及以上时，mdx小鼠在转棒仪上的维持时间达到900s以上，接近或达到正常小鼠水平。说明rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒经静脉注射mdx小鼠后能够有效地恢复其运动功能。
最后，我们用定量PCR方法检测了不同组织的mini-dystrophin表达情况。rAAV9-SCMV-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒分别经尾静脉注射4周龄的mdx模型小鼠。每种病毒各注射5×1013vg/kg、1×1014vg/kg和3×1014vg/kg等3个剂量。每种单一剂量注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，处死小鼠，取骨骼肌、心肌和肝脏，用TRIzol试剂（Invitrogen，15596018）提取组织总RNA，测定浓度后备用。人工合成定量PCR检测用RNA标准品，命名为MDP-SR，序列信息详见SEQ ID NO.25。RNA标准品由Thermo Fisher公司合成，长度为100nt，用无RNase水稀释至1×1010copies/μL备用。定量PCR检测用引物为MDP-Q-F（SEQ ID NO.22）和MDP-Q-R（SEQ ID NO.23），探针为MDP-Q-P（SEQ ID NO.24）。引物和探针的详细信息见实施例2。采用“一步法”检测总RNA中mini-dystrophinmRNA拷贝数。以MDP-Q-F和MDP-Q-R为引物特异性地反转录扩增mini-dystrophinmRNA（messenger RNA，信使RNA）序列中长度为91bp片段，采用TaqMan探针结合法，以1×108copies/μl的合成的MDP-SR RNA及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用One StepPrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time）试剂（货号:RR064A）（Takara，大连，中国），使用荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500 fast，ABI）检测总RNA中mini-dystrophinmRNA含量，用于表示mini-dystrophin表达。具体检测过程参见OneStepPrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time）试剂说明书。检测结果如图26所示。
从图26的结果可知，在骨骼肌中，注射rAAV9-SCMV-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin等4种病毒的mdx小鼠之间，mini-dystrophinmRNA的表达水平未见明显差异。随着注射病毒剂量的增加，mini-dystrophinmRNA的表达水平逐渐增加，呈现出剂量依赖性。在心肌中，注射病毒mdx小鼠的mini-dystrophinmRNA的表达水平呈现出同骨骼肌相似的规律，唯一的例外是注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒的mdx小鼠的mini-dystrophinmRNA的表达水平高于注射其他3种病毒的mdx小鼠，提示MSP启动子在心肌中表现出更高的表达水平。在肝脏中，注射rAAV9-SCMV-mini-dystrophin病毒的mdx小鼠的mini-dystrophinmRNA表达水平明显高于注射其他3种病毒的mdx小鼠，说明mMCK启动子、HSA启动子和MSP启动子等肌肉特异性启动子能够有效地降低mini-dystrophinmRNA的表达水平。而且3种肌肉特异性启动子之间，MSP启动子调控的rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒在肝脏中的表达水平最低。
综上所述，不同启动子调控的携带mini-dystrophin表达框AAV病毒（rAAV9-SCMV-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin）经尾静脉注射4周龄mdx小鼠，都能够有效地降低mdx小鼠体内的肌酸激酶含量，表达产生mini-dystrophin蛋白，恢复其运动功能。说明3种肌肉特异性启动子mMCK启动子、HSA启动子和MSP启动子调控的rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin和rAAV9-MSP-mini-dystrophin有效性良好。而且在肝细胞中3种肌肉特异性启动子调控的病毒表现出更低的mini-dystrophinmRNA表达水平，有助于降低肝脏过表达mini-dystrophinmRNA及mini-dystrophin蛋白可能带来的毒性作用，应用前景广阔。
实施例6 miR-122调控元件对携带mini-dystrophin表达框AAV载体的功能影响研究
为了评价miR-122靶序列调控元件对携带mini-dystrophin表达框AAV载体的功能的影响，将含有或不含有miR-122靶序列调控元件的携带mini-dystrophin表达框AAV病毒（rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T），以1×1014vg/kg的剂量经静脉注射至4周大DMD模型小鼠mdx小鼠体内。mdx小鼠来源详见实施例4。注射病毒6周后，尾静脉采血，分离血清，测定血清中肌酸激酶活性；处死小鼠，取骨骼肌和心肌，切片，免疫组化检测表达mini-dystrophin细胞，计算表达mini-dystrophin细胞占总细胞的比例，得到mini-dystrophin阳性细胞比例；取肝脏、心脏和骨骼肌组织，提取总RNA，定量PCR检测不同组织来源总RNA中mini-dystrophin RNA含量，用于表示mini-dystrophin表达水平。注射病毒6个月后，小鼠转棒仪测定小鼠运动功能。
首先我们研究了病毒注射后mdx小鼠体内肌酸激酶活性变化。rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒分别经尾静脉注射4周龄的mdx模型小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。每种病毒注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，尾静脉采血，分离血清。采用肌酸激酶活性测定试剂盒（Sigma-Aldrich，MAK116），参照说明书测定血清中肌酸激酶活性。结果如图27所示。
从图27的结果可知，同注射不含miR-122靶序列病毒（rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin）的mdx小鼠一样，注射含有miR-122靶序列病毒（rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T）的mdx小鼠的肌酸激酶水平明显下降。2种含有相同启动子的病毒（含有或不含有miR-122靶序列）之间，对mdx小鼠的肌酸激酶下降作用未见明显差异。说明mini-dystrophin基因表达框中加入miR-122靶序列不影响其对mdx小鼠体内肌酸激酶的降低作用。
接下来，我们研究了病毒注射后mdx小鼠骨骼肌和心肌中mini-dystrophin表达情况。rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒分别经尾静脉注射4周龄的mdx模型小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。每种病毒注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，处死小鼠，取骨骼肌和心肌，切片，用抗肌萎缩蛋白抗体NCL-DYS3-ce（NovoCastra Laboratories）作为一抗，免疫组化检测表达mini-dystrophin细胞，计算表达mini-dystrophin细胞占总细胞的比例，得到mini-dystrophin阳性细胞比例。免疫组化操作过程参见文献（Wang B, et al.Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97(25): 13714-13719.）。结果如图28所示。
从图28的结果可知，同注射不含miR-122靶序列病毒（rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin）的mdx小鼠一样，注射含有miR-122靶序列病毒（rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T）的mdx小鼠的心肌和骨骼肌中mini-dystrophin表达阳性细胞比例都达到20%以上，且骨骼肌中比例高于心肌中比例。唯一例外的是注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒或rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒mdx小鼠的心肌中mini-dystrophin表达阳性细胞比例高于注射其他病毒种类小鼠。说明在mini-dystrophin基因表达框中加入miR-122靶序列不影响其在mdx小鼠体内表达产生mini-dystrophin蛋白。
然后，我们用小鼠转棒仪测定了病毒注射后小鼠运动功能的变化。rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒分别经尾静脉注射4周龄的mdx模型小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。每种病毒注射5只mdx小鼠。注射病毒6个月后，小鼠转棒仪测定小鼠运动功能。记录小鼠在转棒仪上的维持不滑落掉下时长，用于表示模型小鼠的运动功能。运动功能测定过程参见文献（Kelly MA, et al. J Neurosci. 1998; 18: 3470-3479.）。结果如图29所示。
从图29的结果可知，同注射不含miR-122靶序列病毒（rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin）的mdx小鼠一样，注射含有miR-122靶序列病毒（rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T）的mdx小鼠在转棒仪上的维持时间明显增加，都达到900s以上，接近或达到正常小鼠水平。说明在mini-dystrophin基因表达框中加入miR-122靶序列不影响rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒对mdx小鼠的运动功能的恢复。
最后，我们用定量PCR方法检测了不同组织的mini-dystrophin表达情况。rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin、rAAV9-MSP-mini-dystrophin、rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒分别经尾静脉注射4周龄的mdx模型小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。每种病毒注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，处死小鼠，取骨骼肌、心肌和肝脏，用TRIzol试剂（Invitrogen，15596018）提取组织总RNA，测定浓度后备用。人工合成定量PCR检测用RNA标准品，命名为MDP-SR，序列信息详见SEQ ID NO.25。RNA标准品由ThermoFisher公司合成，长度为100nt，用无RNase水稀释至1×1010copies/μL备用。定量PCR检测用引物为MDP-Q-F（SEQ ID NO.22）和MDP-Q-R（SEQ ID NO.23），探针为MDP-Q-P（SEQ IDNO.24）。引物和探针的详细信息见实施例2。采用“一步法”检测总RNA中mini-dystrophinRNA拷贝数。以MDP-Q-F和MDP-Q-R为引物特异性地反转录扩增mini-dystrophinmRNA（messenger RNA，信使RNA）序列中长度为91bp片段，采用TaqMan探针结合法，以1×108copies/μl的合成的MDP-SR RNA及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用OneStepPrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time）试剂（货号: RR064A）（Takara，大连，中国），使用荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500 fast，ABI）检测总RNA中mini-dystrophinmRNA含量，用于表示mini-dystrophin表达。具体检测过程参见One StepPrimeScriptTM RT-PCRKit（Perfect Real Time）试剂说明书。检测结果如图30所示。
从图30的结果可知，在骨骼肌中，注射不含有miR-122靶序列的rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin和rAAV9-MSP-mini-dystrophin病毒的mdx小鼠同注射含有miR-122靶序列的rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T和rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠之间，mini-dystrophinmRNA的表达水平未见明显差异。在心肌中，注射含有miR-122靶序列的rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T和rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠的mini-dystrophinmRNA的表达水平呈现出同骨骼肌相似的规律，唯一的例外是注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠的mini-dystrophinmRNA的表达水平高于注射其他2种病毒(rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T和rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T)的mdx小鼠，提示MSP启动子在心肌中表现出更高的表达水平。在肝脏中，注射含有miR-122靶序列的rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T和rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠的mini-dystrophinmRNA表达水平明显低于注射其他3种不含有miR-122靶序列病毒（rAAV9-mMCK-mini-dystrophin、rAAV9-HSA-mini-dystrophin和rAAV9-MSP-mini-dystrophin）的mdx小鼠，说明在mini-dystrophin表达框中加入miR-122靶序列能够进一步降低肝脏中mini-dystrophinmRNA的表达水平。
综上所述，携带含有miR-122靶序列的mini-dystrophin表达框AAV病毒（rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T和rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T）经尾静脉注射4周龄mdx小鼠，都能够有效地降低mdx小鼠体内的肌酸激酶含量，表达产生mini-dystrophin蛋白，恢复其运动功能。说明含有miR-122靶序列的rAAV9-mMCK-mini-dystrophin-122T、rAAV9-HSA-mini-dystrophin-122T和rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒有效性良好。而且在肝细胞中3种含有miR-122靶序列的病毒表现出比对应肌肉特异性启动子调控病毒更低的mini-dystrophinmRNA表达水平，进一步降低了肝脏过表达mini-dystrophinmRNA及mini-dystrophin蛋白可能带来的毒性作用。
实施例7 不同AAV血清型对携带mini-dystrophin表达框AAV载体的功能影响研究
为了评价不同血清型AAV对携带相同mini-dystrophin表达框AAV载体的功能，将rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T等3种不同血清型AAV载体，以1×1014vg/kg的剂量经静脉注射至4周大DMD模型小鼠mdx小鼠体内。mdx小鼠来源详见实施例4。注射病毒6周后，尾静脉采血，分离血清，测定血清中肌酸激酶活性；处死小鼠，取骨骼肌和心肌，切片，免疫组化检测表达mini-dystrophin细胞，计算表达mini-dystrophin细胞占总细胞的比例，得到mini-dystrophin阳性细胞比例；取肝脏、心脏和骨骼肌组织，提取总RNA，定量PCR检测不同组织来源总RNA中mini-dystrophin RNA含量，用于表示mini-dystrophin表达水平。注射病毒6个月后，小鼠转棒仪测定小鼠运动功能。
首先我们研究了病毒注射后mdx小鼠体内肌酸激酶活性变化。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T病毒分别经尾静脉注射4周龄的mdx模型小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。每种病毒注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，尾静脉采血，分离血清。采用肌酸激酶活性测定试剂盒（Sigma-Aldrich，MAK116），参照说明书测定血清中肌酸激酶活性。结果如图31所示。
从图31的结果可知，同注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠一样，注射rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠的肌酸激酶水平明显下降。3种不同血清型AAV之间，对mdx小鼠的肌酸激酶下降作用未见明显差异。说明用AAV8或AAVrh74血清型携带mini-dystrophin基因表达框都能有效地降低mdx小鼠体内的肌酸激酶。
接下来，我们研究了病毒注射后mdx小鼠骨骼肌和心肌中mini-dystrophin表达情况。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T病毒分别经尾静脉注射4周龄的mdx模型小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。每种病毒注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，处死小鼠，取骨骼肌和心肌，切片，用抗肌萎缩蛋白抗体NCL-DYS3-ce（NovoCastra Laboratories）作为一抗，免疫组化检测表达mini-dystrophin细胞，计算表达mini-dystrophin细胞占总细胞的比例，得到mini-dystrophin阳性细胞比例。免疫组化操作过程参见文献（Wang B, et al. Proc NatlAcad Sci USA. 2000; 97(25): 13714-13719.）。结果如图32所示。
从图32的结果可知，同注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠一样，注射rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠的心肌和骨骼肌中mini-dystrophin表达阳性细胞比例都达到20%以上，且骨骼肌中比例高于心肌中比例。说明用AAV8或AAVrh74血清型携带mini-dystrophin基因表达框不影响其在mdx小鼠体内表达产生mini-dystrophin蛋白。
然后，我们用小鼠转棒仪测定了病毒注射后小鼠运动功能的变化。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T病毒分别经尾静脉注射4周龄的mdx模型小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。每种病毒注射5只mdx小鼠。注射病毒6个月后，小鼠转棒仪测定小鼠运动功能。记录小鼠在转棒仪上的维持不滑落掉下时长，用于表示模型小鼠的运动功能。运动功能测定过程参见文献（Kelly MA, et al. J Neurosci. 1998; 18: 3470-3479.）。结果如图33所示。
从图33的结果可知，同注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠一样，注射rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T病毒的mdx小鼠在转棒仪上的维持时间明显增加，都达到900s以上，接近或达到正常小鼠水平。说明用AAV8或AAVrh74血清型携带mini-dystrophin基因表达框不影响其对mdx小鼠运动功能的恢复。
最后，我们用定量PCR方法检测了不同组织的mini-dystrophin表达情况。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T病毒分别经尾静脉注射4周龄的mdx模型小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。每种病毒注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，处死小鼠，取骨骼肌、心肌和肝脏，用TRIzol试剂（Invitrogen，15596018）提取组织总RNA，测定浓度后备用。人工合成定量PCR检测用RNA标准品，命名为MDP-SR，序列信息详见SEQ ID NO.25。RNA标准品由Thermo Fisher公司合成，长度为100nt，用无RNase水稀释至1×1010copies/μL备用。定量PCR检测用引物为MDP-Q-F（SEQ ID NO.22）和MDP-Q-R（SEQ ID NO.23），探针为MDP-Q-P（SEQ ID NO.24）。引物和探针的详细信息见实施例2。采用“一步法”检测总RNA中mini-dystrophin RNA拷贝数。以MDP-Q-F和MDP-Q-R为引物特异性地反转录扩增mini-dystrophinmRNA（messenger RNA，信使RNA）序列中长度为91bp片段，采用TaqMan探针结合法，以1×108copies/μl的合成的MDP-SR RNA及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用One StepPrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time）试剂（货号: RR064A）（Takara，大连，中国），使用荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500 fast，ABI）检测总RNA中mini-dystrophinmRNA含量，用于表示mini-dystrophin表达。具体检测过程参见One StepPrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect RealTime）试剂说明书。检测结果如图34所示。
从图34的结果可知，在骨骼肌中，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T等3种不同血清型AAV病毒的mdx小鼠之间，mini-dystrophinmRNA的表达水平未见明显差异。在心肌中，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T等3种不同血清型AAV病毒的mdx小鼠之间的mini-dystrophinmRNA的表达水平呈现出同骨骼肌相似的规律。在肝脏中，rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T等3种不同血清型AAV病毒经尾静脉注射mdx小鼠后，肝脏中mini-dystrophinmRNA表达水平都降低，且未见明显差异，说明肌肉特异性启动子和miR-122靶序列能够有效地抑制AAV8、AAV9和AAVrh74携带mini-dystrophin基因表达框在肝脏中的表达。
综上所述，用AAV9、AAV8和AAVrh74携带含有miR-122靶序列的mini-dystrophin表达框，制备得到的AAV病毒（rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T、rAAV8-MSP-mini-dystrophin-122T和rAAVrh74-MSP-mini-dystrophin-122T）经尾静脉注射4周龄mdx小鼠，都能够有效地降低mdx小鼠体内的肌酸激酶含量，表达产生mini-dystrophin蛋白，恢复其运动功能。说明除AAV9外，AAV8和AAVrh74都能够用于携带mini-dystrophin表达框，开发DMD的基因治疗药物。
实施例8 Bac-to-AAV系统生产的携带mini-dystrophin表达框AAV载体的功能影响研究
Bac-to-AAV系统生产病毒及检定
Bac-to-AAV系统是一种用两个杆状病毒共感染Sf9细胞包装生产AAV的系统。一个杆状病毒携带AAV载体的rep和cap基因表达框，另一个杆状病毒携带AAV病毒的ITR序列和外源基因表达框。包装系统的详细信息见参考文献（Chen H. MolTher. 2008;16(5):924-930.）和专利（美国专利：US8945918、中国专利：CN101522903B）。Bac-to-AAV系统为美国Virovek公司专利。将MSP-mini-dystrophin-122T表达框信息发送给美国Virovek公司，委托其应用Bac-to-AAV系统包装制备rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T重组病毒，命名为rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BAT）。包装得到病毒应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BAT）。将实施例2用三质粒共转染方法制备得到的rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T病毒，命名为rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（TPT），以区别于Bac-to-AAV系统包装得到的AAV病毒rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BAT）。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BAT）和rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（TPT）等2种病毒含有相同的基因组结构和相同的AAV外壳。二者唯一的区别是采用不同的生产系统制备。
采用定量PCR方法测定制备得到AAV病毒rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BAT）的基因组滴度，针对mini-dystrophin编码区序列设计引物和探针。引物和探针序列如下，
MDP-Q-F：5’- AGGATCTGAAGAGGCAGGTG-3’ (SEQ ID NO.22)
MDP-Q-R：5’- ACCATGTGTGTCAGGGAGTT-3’ (SEQ ID NO.23)
MDP-Q-P：5’- CGCGCACCTGCTCCTGCTCC-3’ (SEQ ID NO.24)
MDP-Q-F和MDP-Q-R为引物，MDP-Q-P为探针。探针5’端用FAM荧光蛋白标记，3’端连接BlackBerry quencher。引物和探针由Thermofisher Scientific合成。以MDP-Q-F和MDP-Q-R为引物特异性地扩增动子mini-dystrophin编码序列中长度为91bp片段，采用TaqMan探针结合法，以1μg/μl的pAAV2-SCMV-mini-dystrophin质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用Premix Ex Taq (Probe qPCR)试剂（Takara，大连，中国），使用荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500 fast，ABI）检测病毒基因组滴度。操作过程参见Premix Ex Taq (ProbeqPCR)试剂说明书。病毒的处理方法参见文献（Aurnhammer C, et al. Hum Gene TherMethods. 2012;23(1):18-28.）。
mdx小鼠体内评价实验
为了评价不同AAV载体生产系统生产得到病毒的功能，将rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BTA）、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（TPT）病毒，以1×1014vg/kg的剂量经静脉注射至4周大DMD模型小鼠mdx小鼠体内。mdx小鼠来源详见实施例4。注射病毒6周后，尾静脉采血，分离血清，测定血清中肌酸激酶活性；处死小鼠，取骨骼肌和心肌，切片，免疫组化检测表达mini-dystrophin细胞，计算表达mini-dystrophin细胞占总细胞的比例，得到mini-dystrophin阳性细胞比例；取肝脏、心脏和骨骼肌组织，提取总RNA，定量PCR检测不同组织来源总RNA中mini-dystrophin RNA含量，用于表示mini-dystrophin表达水平。注射病毒6个月后，小鼠转棒仪测定小鼠运动功能。
首先我们研究了病毒注射后mdx小鼠体内肌酸激酶活性变化。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BTA）、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（TPT）病毒分别经尾静脉注射4周龄的mdx模型小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。每种病毒注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，尾静脉采血，分离血清。采用肌酸激酶活性测定试剂盒（Sigma-Aldrich，MAK116），参照说明书测定血清中肌酸激酶活性。结果如图35所示。
从图35的结果可知，同注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（TPT）病毒的mdx小鼠一样，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BTA）病毒的mdx小鼠的肌酸激酶水平明显下降。而且2种不同AAV包装体系制备的AAV之间，对mdx小鼠的肌酸激酶下降作用未见明显差异。说明用2种AAV载体包装体系包装制备得到AAV病毒都能有效地降低mdx小鼠体内的肌酸激酶。
接下来，我们研究了病毒注射后mdx小鼠骨骼肌和心肌中mini-dystrophin表达情况。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BTA）、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（TPT）病毒分别经尾静脉注射4周龄的mdx模型小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。每种病毒注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，处死小鼠，取骨骼肌和心肌，切片，用抗肌萎缩蛋白抗体NCL-DYS3-ce（NovoCastra Laboratories）作为一抗，免疫组化检测表达mini-dystrophin细胞，计算表达mini-dystrophin细胞占总细胞的比例，得到mini-dystrophin阳性细胞比例。免疫组化操作过程参见文献（Wang B, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97(25): 13714-13719.）。结果如图36所示。
从图36的结果可知，同注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（TPT）病毒的mdx小鼠一样，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BTA）病毒的mdx小鼠的心肌和骨骼肌中mini-dystrophin表达阳性细胞比例都达到20%以上，且骨骼肌中比例高于心肌中比例。说明用Bac-to-AAV系统生产的rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BTA）注射mdx小鼠体内能够有效地表达产生mini-dystrophin蛋白，具有同三质粒共转染生产的rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（TPT）一样的功能。
然后，我们用小鼠转棒仪测定了病毒注射后小鼠运动功能的变化。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BTA）、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（TPT）病毒分别经尾静脉注射4周龄的mdx模型小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。每种病毒注射5只mdx小鼠。注射病毒6个月后，小鼠转棒仪测定小鼠运动功能。记录小鼠在转棒仪上的维持不滑落掉下时长，用于表示模型小鼠的运动功能。运动功能测定过程参见文献（Kelly MA, et al.J Neurosci. 1998; 18: 3470-3479.）。结果如图37所示。
从图37的结果可知，同注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（TPT）病毒的mdx小鼠一样，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BTA）病毒的mdx小鼠在转棒仪上的维持时间明显增加，都达到900s以上，接近或达到正常小鼠水平。说明用Bac-to-AAV系统生产得到的rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BTA）也能够有效地恢复mdx小鼠的运动功能。
最后，我们用定量PCR方法检测了不同组织的mini-dystrophin表达情况。rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BTA）、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（TPT）病毒分别经尾静脉注射4周龄的mdx模型小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1014vg/kg。每种病毒注射5只mdx小鼠。注射病毒6周后，处死小鼠，取骨骼肌、心肌和肝脏，用TRIzol试剂（Invitrogen，15596018）提取组织总RNA，测定浓度后备用。人工合成定量PCR检测用RNA标准品，命名为MDP-SR，序列信息详见SEQ ID NO.25。RNA标准品由Thermo Fisher公司合成，长度为100nt，用无RNase水稀释至1×1010copies/μL备用。定量PCR检测用引物为MDP-Q-F（SEQ ID NO.22）和MDP-Q-R（SEQ ID NO.23），探针为MDP-Q-P（SEQ ID NO.24）。引物和探针的详细信息见实施例2。采用“一步法”检测总RNA中mini-dystrophin RNA拷贝数。以MDP-Q-F和MDP-Q-R为引物特异性地反转录扩增mini-dystrophinmRNA（messenger RNA，信使RNA）序列中长度为91bp片段，采用TaqMan探针结合法，以1×108copies/μl的合成的MDP-SR RNA及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用One StepPrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time）试剂（货号: RR064A）（Takara，大连，中国），使用荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500 fast，ABI）检测总RNA中mini-dystrophinmRNA含量，用于表示mini-dystrophin表达。具体检测过程参见One StepPrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time）试剂说明书。检测结果如图38所示。
从图38的结果可知，在骨骼肌中，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BTA）、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（TPT）等2种不同AAV生产系统制备AAV病毒的mdx小鼠之间，mini-dystrophinmRNA的表达水平未见明显差异。在心肌中，注射rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BTA）、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（TPT）等2种不同AAV生产系统制备AAV病毒的mdx小鼠之间的mini-dystrophinmRNA的表达水平呈现出同骨骼肌相似的规律。在肝脏中，rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BTA）、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（TPT）等2种不同AAV生产系统制备AAV病毒经尾静脉注射mdx小鼠后，肝脏中mini-dystrophinmRNA表达水平都降低，且未见明显差异。结果说明不同的生产体系制备病毒的组织表达特异性未见明显差异，两种病毒的质量具有可比性。
综上所述，用2种不同的AAV载体包装体系，制备得到的AAV病毒（rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（BTA）、rAAV9-MSP-mini-dystrophin-122T（TPT））经尾静脉注射4周龄mdx小鼠，都能够有效地降低mdx小鼠体内的肌酸激酶含量，表达产生mini-dystrophin蛋白，恢复其运动功能。说明Bac-to-AAV生产系统能够用于DMD基因治疗药物的生产，开发DMD的基因治疗药物。
序列表
<110> 北京五加和分子医学研究所有限公司
<120> 携带截短抗肌萎缩蛋白基因表达框的AAV载体、制备方法及应用
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 594
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480
acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg 540
ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac cgatccagcc tccg 594
<210> 2
<211> 560
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
ccactatggg tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct 60
ggttataatt aacccagaca tgtggctgct cccccccccc caacacctgc tgcctgagcc 120
tcacccccac cccggtgcct gggtcttagg ctctgtacac catggaggag aagctcgctc 180
taaaaataac cctgtccctg gtggagcccg tgcctgggac tcccaaagta ttactgttcc 240
atgttcccgg cgaagggcca gctgtccccc gccagctaga ctcagcactt agtttaggaa 300
ccagtgagca agtcagccct tggggcagcc catacaaggc catggggctg ggcaagctgc 360
acgcctgggt ccggggtggg cacggtgccc gggcaacgag ctgaaagctc atctgctctc 420
aggggcccct ccctggggac agcccctcct ggctagtcac accctgtagg ctcctctata 480
taacccaggg gcacaggggc tgcccccggg tcaccaccac ctccacagca cagacagaca 540
ctcaggagcc agccagccag 560
<210> 3
<211> 440
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
ccactatggg tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct 60
ggttataatt aacccagaca tgtggctgct cccccccccc caacacctgc tgcctgagcc 120
tcacccccac cccggtgcct gggtcttagg ctctgtacac catggaggag aagctcgctc 180
taaaaataac cctgtccctg gtggagcccg ggggcccagg ccgcgaaccg gccgagggag 240
ggggctctag tgcccaacac ccaaatatgg gggcagcgac attcctgcgg ggtggcgcgg 300
agggaatgcc cgcgggctat ataaaacctg agcagaggga caagcggcca ccgcagcgga 360
cagcgccaag tgaagcctcg cttcccctcc gcggcgacca gggcccgagc cgagagtagc 420
agttgtagct acccgcccag 440
<210> 4
<211> 618
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
ccttcagatt aaaaataact aaggtaaggg ccatgtgggt aggggaggtg gtgtgagacg 60
gtcctgtctc tcctctatct gcccatcggc cctttgggga ggaggaatgt gcccaaggac 120
taaaaaaagg ccctggagcc agaggggcga gggcagcaga cctttcatgg gcaaacctca 180
gggctgctgg gctgcccatg taaggaggca aggcctgggg acacccgaga tgcctggtta 240
taattaaccc agacatgtgg ctgctccccc cccccaacac ctgctgcctc taaaaataac 300
ctgttcccgg cgaagggcca gctgtccccc gccagctaga ctcagcactt agtttaggaa 360
ccagtgagca agtcagccct tggggcagcc catacaaggc catggggctg ggcaagctgc 420
acgcctgggt ccggggtggg cacggtgccc gggcaacgag ctgaaagctc atctgctctc 480
aggggcccct ccctggggac agcccctcct ggctagtcac accctgtagg ctcctctata 540
taacccaggg gcacaggggc tgccctcatt ctaccaccac ctccacagca cagacagaca 600
ctcaggagcc agccagcc 618
<210> 5
<211> 3981
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
atggtgtggt gggaggaggt ggaggattgt tacgagagag aggacgtgca gaagaagacc 60
ttcacaaagt gggtgaacgc ccagttcagc aagtttggca agcagcacat cgagaatctg 120
ttttccgacc tgcaggatgg ccggagactg ctggatctgc tggagggcct gacaggccag 180
aagctgccca aggagaaggg ctccaccagg gtgcacgccc tgaacaatgt gaacaaggcc 240
ctgcgcgtgc tgcagaacaa taacgtggac ctggtgaata tcggctctac agacatcgtg 300
gatggcaacc acaagctgac cctgggcctg atctggaata tcatcctgca ctggcaggtg 360
aagaatgtga tgaagaacat catggccggc ctgcagcaga caaactctga gaagatcctg 420
ctgagctggg tgaggcagtc cacccgcaat taccctcaag tgaatgtgat caactttacc 480
acaagctggt ccgacggact ggccctgaac gcactgatcc acagccaccg cccagacctg 540
ttcgattgga attctgtggt gtgccagcag agcgccaccc agcggctgga gcacgccttt 600
aatatcgcca gatatcagct gggcatcgag aagctgctgg accccgagga cgtggatacc 660
acatacccag acaagaagag catcctgatg tatatcacat ccctgttcca ggtgctgccc 720
cagcaggtga gcatcgaggc catccaggag gtggagatgc tgcctaggcc acctaaggtg 780
accaaggagg agcactttca gctgcaccac cagatgcact actcccagca gatcacagtg 840
tctctggcac agggatatga gcggaccagc tcccctaagc caagattcaa gtcttacgcc 900
tatacacagg ccgcctacgt gaccacaagc gatcccaccc ggagcccatt ccctagccag 960
cacctggagg cacctgagga taagtccttt ggctctagcc tgatggagtc tgaggtgaac 1020
ctggacaggt atcagacagc cctggaggag gtgctgtcct ggctgctgtc tgccgaggac 1080
accctgcagg cacagggaga gatcagcaac gatgtggagg tggtgaagga ccagttccac 1140
acacacgagg gctacatgat ggatctgacc gcacaccagg gaagggtggg aaatatcctg 1200
cagctgggca gcaagctgat cggcacaggc aagctgtccg aggacgagga gaccgaagtg 1260
caggagcaga tgaatctgct gaacagcaga tgggagtgtc tgcgcgtggc ctctatggag 1320
aagcagagca atctgcaccg ggtgctgatg gatctgcaga atcagaagct gaaggagctg 1380
aacgactggc tgaccaagac agaggagcgg accagaaaga tggaggagga gccactggga 1440
cccgacctgg aggatctgaa gaggcaggtg cagcagcaca aggtgctgca ggaggacctg 1500
gagcaggagc aggtgcgcgt gaactccctg acacacatgg tggtggtggt ggatgagtcc 1560
tctggcgacc acgcaaccgc cgccctggag gagcagctga aggtgctggg cgatagatgg 1620
gccaatatct gccggtggac cgaggacaga tgggtgctgc tgcaggacca gcctgatctg 1680
gcaccaggac tgaccacaat cggagcatct ccaacccaga cagtgaccct ggtgacacag 1740
cccgtggtga caaaggagac cgccatcagc aagctggaga tgcccagctc cctgatgctg 1800
gaggtgccta cccacaggct gctgcagcag ttccccctgg atctggagaa gtttctggcc 1860
tggctgacag aggccgagac cacagccaac gtgctgcagg atgccacccg gaaggagaga 1920
ctgctggagg acagcaaggg cgtgaaggag ctgatgaagc agtggcagga cctgcaggga 1980
gagatcgagg cacacaccga cgtgtaccac aatctggacg agaacagcca gaagatcctg 2040
cggagcctgg agggctccga cgatgccgtg ctgctgcaga ggcgcctgga taatatgaac 2100
tttaagtggt ccgagctgag gaagaagtcc ctgaacatcc gctctcacct ggaggcctct 2160
agcgaccagt ggaagcgcct gcacctgtcc ctgcaggagc tgctggtgtg gctgcagctg 2220
aaggacgatg agctgtctag gcaggcacca atcggaggcg atttcccagc cgtgcagaag 2280
cagaatgacg tgcaccgggc ctttaagaga gagctgaaga caaaggagcc tgtgatcatg 2340
tccacactgg agaccgtgag aatcttcctg accgagcagc ctctggaggg cctggagaag 2400
ctgtaccagg agccaaggga gctgccacca gaggagagag cacagaacgt gacaaggctg 2460
ctgcgcaagc aggccgagga agtgaatacc gagtgggaga agctgaacct gcacagcgcc 2520
gattggcaga ggaagatcga cgagacactg gagcgcctgc aggagctgca ggaggcaacc 2580
gacgagctgg atctgaagct gaggcaggcc gaagtgatca agggctcctg gcagccagtg 2640
ggcgacctgc tgatcgattc tctgcaggac cacctggaga aggtgaaggc cctgagggga 2700
gagatcgcac cactgaagga gaacgtgagc cacgtgaacg atctggccag acagctgacc 2760
acactgggca tccagctgag cccctataat ctgtccacac tggaggacct gaacaccagg 2820
tggaagctgc tgcaggtggc agtggaggat agggtgcgcc agctgcacga ggcacacaga 2880
gacttcggcc cagccagcca gcactttctg tctaccagcg tgcagggacc atgggagagg 2940
gcaatctccc ccaataaggt gccttactat atcaaccacg agacacagac cacatgttgg 3000
gatcacccca agatgaccga gctgtaccag tctctggccg acctgaataa cgtgaggttt 3060
agcgcctatc gcaccgccat gaagctgcgg agactgcaga aggccctgtg cctggatctg 3120
ctgtccctgt ctgccgcatg cgacgcactg gatcagcaca atctgaagca gaacgatcag 3180
cccatggaca tcctgcagat catcaactgc ctgaccacaa tctacgaccg cctggagcag 3240
gagcacaata acctggtgaa tgtgcctctg tgcgtggata tgtgcctgaa ttggctgctg 3300
aacgtgtatg acacaggccg caccggccgg atcagagtgc tgtctttcaa gacaggcatc 3360
atcagcctgt gcaaggccca cctggaggac aagtaccggt atctgttcaa gcaggtggcc 3420
tcctctaccg gcttttgcga tcagaggcgc ctgggactgc tgctgcacga cagcatccag 3480
atcccaaggc agctgggaga ggtggcatct ttcggcggca gcaacatcga gcctagcgtg 3540
cgctcctgtt tccagtttgc caataacaag ccagagatcg aggccgccct gtttctggat 3600
tggatgcggc tggagcccca gtctatggtg tggctgcctg tgctgcacag agtggcagca 3660
gcagagaccg caaagcacca ggccaagtgc aacatctgta aggagtgccc catcatcggc 3720
ttccggtaca gaagcctgaa gcactttaat tatgacatct gtcagtcctg cttcttttct 3780
ggccgggtgg ccaagggcca caagatgcac tacccaatgg tggagtattg cacccccacc 3840
acatccggcg aggacgtgag agatttcgcc aaggtgctga agaacaagtt ccggacaaag 3900
agatactttg ccaagcaccc taggatgggc tatctgccag tgcagaccgt gctggagggc 3960
gataatatgg agacatgata a 3981
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
ataggtaccg ccaccatggg agtcaaagtt ctg 33
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
cgcgaattcc ggccgcttag tcaccaccgg c 31
<210> 8
<211> 584
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
ggtaccagcc accatgggag tcaaagttct gtttgccctg atctgcatcg ctgtggccga 60
ggccaagccc accgagaaca acgaagactt caacatcgtg gccgtggcca gcaacttcgc 120
gaccacggat ctcgatgctg accgcgggaa gttgcccggc aagaagctgc cgctggaggt 180
gctcaaagag atggaagcca atgcccggaa agctggctgc accaggggct gtctgatctg 240
cctgtcccac atcaagtgca cgcccaagat gaagaagttc atcccaggac gctgccacac 300
ctacgaaggc gacaaagagt ccgcacaggg cggcataggc gaggcgatcg tcgacattcc 360
tgagattcct gggttcaagg acttggagcc catggagcag ttcatcgcac aggtcgatct 420
gtgtgtggac tgcacaactg gctgcctcaa agggcttgcc aacgtgcagt gttctgacct 480
gctcaagaag tggctgccgc aacgctgtgc gacctttgcc agcaagatcc agggccaggt 540
ggacaagatc aagggggccg gtggtgacta agcggccgga attc 584
<210> 9
<211> 606
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
ctcgagcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 60
cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 120
acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 180
tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 240
ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 300
tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc 360
acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa 420
tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag 480
gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg 540
gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg 600
ggtacc 606
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 10
cgcctcgagc gttacataac ttacggt 27
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 11
attggtaccc ggaggctgga tcggtcc 27
<210> 12
<211> 572
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 12
ctcgagccac tatgggtcta ggctgcccat gtaaggaggc aaggcctggg gacacccgag 60
atgcctggtt ataattaacc cagacatgtg gctgctcccc cccccccaac acctgctgcc 120
tgagcctcac ccccaccccg gtgcctgggt cttaggctct gtacaccatg gaggagaagc 180
tcgctctaaa aataaccctg tccctggtgg agcccgtgcc tgggactccc aaagtattac 240
tgttccatgt tcccggcgaa gggccagctg tcccccgcca gctagactca gcacttagtt 300
taggaaccag tgagcaagtc agcccttggg gcagcccata caaggccatg gggctgggca 360
agctgcacgc ctgggtccgg ggtgggcacg gtgcccgggc aacgagctga aagctcatct 420
gctctcaggg gcccctccct ggggacagcc cctcctggct agtcacaccc tgtaggctcc 480
tctatataac ccaggggcac aggggctgcc cccgggtcac caccacctcc acagcacaga 540
cagacactca ggagccagcc agccagggta cc 572
<210> 13
<211> 452
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 13
ctcgagccac tatgggtcta ggctgcccat gtaaggaggc aaggcctggg gacacccgag 60
atgcctggtt ataattaacc cagacatgtg gctgctcccc cccccccaac acctgctgcc 120
tgagcctcac ccccaccccg gtgcctgggt cttaggctct gtacaccatg gaggagaagc 180
tcgctctaaa aataaccctg tccctggtgg agcccggggg cccaggccgc gaaccggccg 240
agggaggggg ctctagtgcc caacacccaa atatgggggc agcgacattc ctgcggggtg 300
gcgcggaggg aatgcccgcg ggctatataa aacctgagca gagggacaag cggccaccgc 360
agcggacagc gccaagtgaa gcctcgcttc ccctccgcgg cgaccagggc ccgagccgag 420
agtagcagtt gtagctaccc gcccagggta cc 452
<210> 14
<211> 630
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 14
ctcgagcctt cagattaaaa ataactaagg taagggccat gtgggtaggg gaggtggtgt 60
gagacggtcc tgtctctcct ctatctgccc atcggccctt tggggaggag gaatgtgccc 120
aaggactaaa aaaaggccct ggagccagag gggcgagggc agcagacctt tcatgggcaa 180
acctcagggc tgctgggctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc 240
tggttataat taacccagac atgtggctgc tccccccccc caacacctgc tgcctctaaa 300
aataacctgt tcccggcgaa gggccagctg tcccccgcca gctagactca gcacttagtt 360
taggaaccag tgagcaagtc agcccttggg gcagcccata caaggccatg gggctgggca 420
agctgcacgc ctgggtccgg ggtgggcacg gtgcccgggc aacgagctga aagctcatct 480
gctctcaggg gcccctccct ggggacagcc cctcctggct agtcacaccc tgtaggctcc 540
tctatataac ccaggggcac aggggctgcc ctcattctac caccacctcc acagcacaga 600
cagacactca ggagccagcc agccggtacc 630
<210> 15
<211> 3999
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 15
ggtaccgcca ccatggtgtg gtgggaggag gtggaggatt gttacgagag agaggacgtg 60
cagaagaaga ccttcacaaa gtgggtgaac gcccagttca gcaagtttgg caagcagcac 120
atcgagaatc tgttttccga cctgcaggat ggccggagac tgctggatct gctggagggc 180
ctgacaggcc agaagctgcc caaggagaag ggctccacca gggtgcacgc cctgaacaat 240
gtgaacaagg ccctgcgcgt gctgcagaac aataacgtgg acctggtgaa tatcggctct 300
acagacatcg tggatggcaa ccacaagctg accctgggcc tgatctggaa tatcatcctg 360
cactggcagg tgaagaatgt gatgaagaac atcatggccg gcctgcagca gacaaactct 420
gagaagatcc tgctgagctg ggtgaggcag tccacccgca attaccctca agtgaatgtg 480
atcaacttta ccacaagctg gtccgacgga ctggccctga acgcactgat ccacagccac 540
cgcccagacc tgttcgattg gaattctgtg gtgtgccagc agagcgccac ccagcggctg 600
gagcacgcct ttaatatcgc cagatatcag ctgggcatcg agaagctgct ggaccccgag 660
gacgtggata ccacataccc agacaagaag agcatcctga tgtatatcac atccctgttc 720
caggtgctgc cccagcaggt gagcatcgag gccatccagg aggtggagat gctgcctagg 780
ccacctaagg tgaccaagga ggagcacttt cagctgcacc accagatgca ctactcccag 840
cagatcacag tgtctctggc acagggatat gagcggacca gctcccctaa gccaagattc 900
aagtcttacg cctatacaca ggccgcctac gtgaccacaa gcgatcccac ccggagccca 960
ttccctagcc agcacctgga ggcacctgag gataagtcct ttggctctag cctgatggag 1020
tctgaggtga acctggacag gtatcagaca gccctggagg aggtgctgtc ctggctgctg 1080
tctgccgagg acaccctgca ggcacaggga gagatcagca acgatgtgga ggtggtgaag 1140
gaccagttcc acacacacga gggctacatg atggatctga ccgcacacca gggaagggtg 1200
ggaaatatcc tgcagctggg cagcaagctg atcggcacag gcaagctgtc cgaggacgag 1260
gagaccgaag tgcaggagca gatgaatctg ctgaacagca gatgggagtg tctgcgcgtg 1320
gcctctatgg agaagcagag caatctgcac cgggtgctga tggatctgca gaatcagaag 1380
ctgaaggagc tgaacgactg gctgaccaag acagaggagc ggaccagaaa gatggaggag 1440
gagccactgg gacccgacct ggaggatctg aagaggcagg tgcagcagca caaggtgctg 1500
caggaggacc tggagcagga gcaggtgcgc gtgaactccc tgacacacat ggtggtggtg 1560
gtggatgagt cctctggcga ccacgcaacc gccgccctgg aggagcagct gaaggtgctg 1620
ggcgatagat gggccaatat ctgccggtgg accgaggaca gatgggtgct gctgcaggac 1680
cagcctgatc tggcaccagg actgaccaca atcggagcat ctccaaccca gacagtgacc 1740
ctggtgacac agcccgtggt gacaaaggag accgccatca gcaagctgga gatgcccagc 1800
tccctgatgc tggaggtgcc tacccacagg ctgctgcagc agttccccct ggatctggag 1860
aagtttctgg cctggctgac agaggccgag accacagcca acgtgctgca ggatgccacc 1920
cggaaggaga gactgctgga ggacagcaag ggcgtgaagg agctgatgaa gcagtggcag 1980
gacctgcagg gagagatcga ggcacacacc gacgtgtacc acaatctgga cgagaacagc 2040
cagaagatcc tgcggagcct ggagggctcc gacgatgccg tgctgctgca gaggcgcctg 2100
gataatatga actttaagtg gtccgagctg aggaagaagt ccctgaacat ccgctctcac 2160
ctggaggcct ctagcgacca gtggaagcgc ctgcacctgt ccctgcagga gctgctggtg 2220
tggctgcagc tgaaggacga tgagctgtct aggcaggcac caatcggagg cgatttccca 2280
gccgtgcaga agcagaatga cgtgcaccgg gcctttaaga gagagctgaa gacaaaggag 2340
cctgtgatca tgtccacact ggagaccgtg agaatcttcc tgaccgagca gcctctggag 2400
ggcctggaga agctgtacca ggagccaagg gagctgccac cagaggagag agcacagaac 2460
gtgacaaggc tgctgcgcaa gcaggccgag gaagtgaata ccgagtggga gaagctgaac 2520
ctgcacagcg ccgattggca gaggaagatc gacgagacac tggagcgcct gcaggagctg 2580
caggaggcaa ccgacgagct ggatctgaag ctgaggcagg ccgaagtgat caagggctcc 2640
tggcagccag tgggcgacct gctgatcgat tctctgcagg accacctgga gaaggtgaag 2700
gccctgaggg gagagatcgc accactgaag gagaacgtga gccacgtgaa cgatctggcc 2760
agacagctga ccacactggg catccagctg agcccctata atctgtccac actggaggac 2820
ctgaacacca ggtggaagct gctgcaggtg gcagtggagg atagggtgcg ccagctgcac 2880
gaggcacaca gagacttcgg cccagccagc cagcactttc tgtctaccag cgtgcaggga 2940
ccatgggaga gggcaatctc ccccaataag gtgccttact atatcaacca cgagacacag 3000
accacatgtt gggatcaccc caagatgacc gagctgtacc agtctctggc cgacctgaat 3060
aacgtgaggt ttagcgccta tcgcaccgcc atgaagctgc ggagactgca gaaggccctg 3120
tgcctggatc tgctgtccct gtctgccgca tgcgacgcac tggatcagca caatctgaag 3180
cagaacgatc agcccatgga catcctgcag atcatcaact gcctgaccac aatctacgac 3240
cgcctggagc aggagcacaa taacctggtg aatgtgcctc tgtgcgtgga tatgtgcctg 3300
aattggctgc tgaacgtgta tgacacaggc cgcaccggcc ggatcagagt gctgtctttc 3360
aagacaggca tcatcagcct gtgcaaggcc cacctggagg acaagtaccg gtatctgttc 3420
aagcaggtgg cctcctctac cggcttttgc gatcagaggc gcctgggact gctgctgcac 3480
gacagcatcc agatcccaag gcagctggga gaggtggcat ctttcggcgg cagcaacatc 3540
gagcctagcg tgcgctcctg tttccagttt gccaataaca agccagagat cgaggccgcc 3600
ctgtttctgg attggatgcg gctggagccc cagtctatgg tgtggctgcc tgtgctgcac 3660
agagtggcag cagcagagac cgcaaagcac caggccaagt gcaacatctg taaggagtgc 3720
cccatcatcg gcttccggta cagaagcctg aagcacttta attatgacat ctgtcagtcc 3780
tgcttctttt ctggccgggt ggccaagggc cacaagatgc actacccaat ggtggagtat 3840
tgcaccccca ccacatccgg cgaggacgtg agagatttcg ccaaggtgct gaagaacaag 3900
ttccggacaa agagatactt tgccaagcac cctaggatgg gctatctgcc agtgcagacc 3960
gtgctggagg gcgataatat ggagacatga taaagatct 3999
<210> 16
<211> 4009
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 16
atggtgtggt gggaggaggt ggaggattgt tacgagagag aggacgtgca gaagaagacc 60
ttcacaaagt gggtgaacgc ccagttcagc aagtttggca agcagcacat cgagaatctg 120
ttttccgacc tgcaggatgg ccggagactg ctggatctgc tggagggcct gacaggccag 180
aagctgccca aggagaaggg ctccaccagg gtgcacgccc tgaacaatgt gaacaaggcc 240
ctgcgcgtgc tgcagaacaa taacgtggac ctggtgaata tcggctctac agacatcgtg 300
gatggcaacc acaagctgac cctgggcctg atctggaata tcatcctgca ctggcaggtg 360
aagaatgtga tgaagaacat catggccggc ctgcagcaga caaactctga gaagatcctg 420
ctgagctggg tgaggcagtc cacccgcaat taccctcaag tgaatgtgat caactttacc 480
acaagctggt ccgacggact ggccctgaac gcactgatcc acagccaccg cccagacctg 540
ttcgattgga attctgtggt gtgccagcag agcgccaccc agcggctgga gcacgccttt 600
aatatcgcca gatatcagct gggcatcgag aagctgctgg accccgagga cgtggatacc 660
acatacccag acaagaagag catcctgatg tatatcacat ccctgttcca ggtgctgccc 720
cagcaggtga gcatcgaggc catccaggag gtggagatgc tgcctaggcc acctaaggtg 780
accaaggagg agcactttca gctgcaccac cagatgcact actcccagca gatcacagtg 840
tctctggcac agggatatga gcggaccagc tcccctaagc caagattcaa gtcttacgcc 900
tatacacagg ccgcctacgt gaccacaagc gatcccaccc ggagcccatt ccctagccag 960
cacctggagg cacctgagga taagtccttt ggctctagcc tgatggagtc tgaggtgaac 1020
ctggacaggt atcagacagc cctggaggag gtgctgtcct ggctgctgtc tgccgaggac 1080
accctgcagg cacagggaga gatcagcaac gatgtggagg tggtgaagga ccagttccac 1140
acacacgagg gctacatgat ggatctgacc gcacaccagg gaagggtggg aaatatcctg 1200
cagctgggca gcaagctgat cggcacaggc aagctgtccg aggacgagga gaccgaagtg 1260
caggagcaga tgaatctgct gaacagcaga tgggagtgtc tgcgcgtggc ctctatggag 1320
aagcagagca atctgcaccg ggtgctgatg gatctgcaga atcagaagct gaaggagctg 1380
aacgactggc tgaccaagac agaggagcgg accagaaaga tggaggagga gccactggga 1440
cccgacctgg aggatctgaa gaggcaggtg cagcagcaca aggtgctgca ggaggacctg 1500
gagcaggagc aggtgcgcgt gaactccctg acacacatgg tggtggtggt ggatgagtcc 1560
tctggcgacc acgcaaccgc cgccctggag gagcagctga aggtgctggg cgatagatgg 1620
gccaatatct gccggtggac cgaggacaga tgggtgctgc tgcaggacca gcctgatctg 1680
gcaccaggac tgaccacaat cggagcatct ccaacccaga cagtgaccct ggtgacacag 1740
cccgtggtga caaaggagac cgccatcagc aagctggaga tgcccagctc cctgatgctg 1800
gaggtgccta cccacaggct gctgcagcag ttccccctgg atctggagaa gtttctggcc 1860
tggctgacag aggccgagac cacagccaac gtgctgcagg atgccacccg gaaggagaga 1920
ctgctggagg acagcaaggg cgtgaaggag ctgatgaagc agtggcagga cctgcaggga 1980
gagatcgagg cacacaccga cgtgtaccac aatctggacg agaacagcca gaagatcctg 2040
cggagcctgg agggctccga cgatgccgtg ctgctgcaga ggcgcctgga taatatgaac 2100
tttaagtggt ccgagctgag gaagaagtcc ctgaacatcc gctctcacct ggaggcctct 2160
agcgaccagt ggaagcgcct gcacctgtcc ctgcaggagc tgctggtgtg gctgcagctg 2220
aaggacgatg agctgtctag gcaggcacca atcggaggcg atttcccagc cgtgcagaag 2280
cagaatgacg tgcaccgggc ctttaagaga gagctgaaga caaaggagcc tgtgatcatg 2340
tccacactgg agaccgtgag aatcttcctg accgagcagc ctctggaggg cctggagaag 2400
ctgtaccagg agccaaggga gctgccacca gaggagagag cacagaacgt gacaaggctg 2460
ctgcgcaagc aggccgagga agtgaatacc gagtgggaga agctgaacct gcacagcgcc 2520
gattggcaga ggaagatcga cgagacactg gagcgcctgc aggagctgca ggaggcaacc 2580
gacgagctgg atctgaagct gaggcaggcc gaagtgatca agggctcctg gcagccagtg 2640
ggcgacctgc tgatcgattc tctgcaggac cacctggaga aggtgaaggc cctgagggga 2700
gagatcgcac cactgaagga gaacgtgagc cacgtgaacg atctggccag acagctgacc 2760
acactgggca tccagctgag cccctataat ctgtccacac tggaggacct gaacaccagg 2820
tggaagctgc tgcaggtggc agtggaggat agggtgcgcc agctgcacga ggcacacaga 2880
gacttcggcc cagccagcca gcactttctg tctaccagcg tgcagggacc atgggagagg 2940
gcaatctccc ccaataaggt gccttactat atcaaccacg agacacagac cacatgttgg 3000
gatcacccca agatgaccga gctgtaccag tctctggccg acctgaataa cgtgaggttt 3060
agcgcctatc gcaccgccat gaagctgcgg agactgcaga aggccctgtg cctggatctg 3120
ctgtccctgt ctgccgcatg cgacgcactg gatcagcaca atctgaagca gaacgatcag 3180
cccatggaca tcctgcagat catcaactgc ctgaccacaa tctacgaccg cctggagcag 3240
gagcacaata acctggtgaa tgtgcctctg tgcgtggata tgtgcctgaa ttggctgctg 3300
aacgtgtatg acacaggccg caccggccgg atcagagtgc tgtctttcaa gacaggcatc 3360
atcagcctgt gcaaggccca cctggaggac aagtaccggt atctgttcaa gcaggtggcc 3420
tcctctaccg gcttttgcga tcagaggcgc ctgggactgc tgctgcacga cagcatccag 3480
atcccaaggc agctgggaga ggtggcatct ttcggcggca gcaacatcga gcctagcgtg 3540
cgctcctgtt tccagtttgc caataacaag ccagagatcg aggccgccct gtttctggat 3600
tggatgcggc tggagcccca gtctatggtg tggctgcctg tgctgcacag agtggcagca 3660
gcagagaccg caaagcacca ggccaagtgc aacatctgta aggagtgccc catcatcggc 3720
ttccggtaca gaagcctgaa gcactttaat tatgacatct gtcagtcctg cttcttttct 3780
ggccgggtgg ccaagggcca caagatgcac tacccaatgg tggagtattg cacccccacc 3840
acatccggcg aggacgtgag agatttcgcc aaggtgctga agaacaagtt ccggacaaag 3900
agatactttg ccaagcaccc taggatgggc tatctgccag tgcagaccgt gctggagggc 3960
gataatatgg agacatgata agatgaccaa acaccattgt cacactcca 4009
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 17
ataggtaccg ccaccatggt gtggtgg 27
<210> 18
<211> 55
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 18
ggcagatctt ggagtgtgac aatggtgttt ggtcatctta tcatgtctcc atatt 55
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 19
cacgcccaag atgaagaagt 20
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 20
cggactcttt gtcgccttc 19
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 21
catcccagga cgctgccaca cct 23
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 22
aggatctgaa gaggcaggtg 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 23
accatgtgtg tcagggagtt 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 24
cgcgcacctg ctcctgctcc 20
<210> 25
<211> 100
<212> RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 25
cuggaggauc ugaagaggca ggugcagcag cacaaggugc ugcaggagga ccuggagcag 60
gagcaggugc gcgugaacuc ccugacacac augguggugg 100

Claims (9)

1.一种截短的人抗肌萎缩蛋白基因的表达框，其特征在于，
(Ⅰ)包含肌肉特异性启动子序列，所述肌肉特异性启动子序列为SEQ ID NO.2所示的序列、SEQ ID NO.3所示的序列或SEQ ID NO.4所示的序列；
(Ⅱ)含有优化的截短的人抗肌萎缩蛋白基因的编码序列，所述优化的截短的人抗肌萎缩蛋白基因的编码序列信息见SEQ ID NO.5；和
(Ⅲ)携带人miRNA靶序列，为人miR-122的完全互补的靶序列。
2.重组腺相关病毒载体，其特征在于，包含如权利要求1所述的截短的人抗肌萎缩蛋白基因的表达框。
3.如权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，重组腺相关病毒载体血清型包括AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh74。
4.如权利要求3所述的重组腺相关病毒载体，其中所述重组腺相关病毒载体血清型为AAV8、AAV9或AAVrh74。
5.如权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，其是通过三质粒共转染真核细胞和/或杆状病毒感染昆虫细胞的包装方式制备的。
6.一种基因药物，其特征在于，包含权利要求1所述的截短的人抗肌萎缩蛋白基因的表达框或权利要求2至5中任一项所述的重组腺相关病毒载体。
7.权利要求6所述的基因药物，其特征在于，给药方式为系统给药。
8.权利要求7所述的基因药物，其特征在于，给药方式为静脉注射给药。
9.权利要求6所述的基因药物，其特征在于，一次给药可持续表达产生截短的抗肌萎缩蛋白，有效缓解或治愈因抗肌萎缩蛋白基因突变带来的不良症状。
CN201910467558.3A 2019-05-31 2019-05-31 携带截短抗肌萎缩蛋白基因表达框的aav载体、制备方法及应用 Active CN111088284B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910467558.3A CN111088284B (zh) 2019-05-31 2019-05-31 携带截短抗肌萎缩蛋白基因表达框的aav载体、制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910467558.3A CN111088284B (zh) 2019-05-31 2019-05-31 携带截短抗肌萎缩蛋白基因表达框的aav载体、制备方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111088284A CN111088284A (zh) 2020-05-01
CN111088284B true CN111088284B (zh) 2022-02-01

Family

ID=70393033

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910467558.3A Active CN111088284B (zh) 2019-05-31 2019-05-31 携带截短抗肌萎缩蛋白基因表达框的aav载体、制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111088284B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4192518A1 (en) * 2020-08-05 2023-06-14 Hangzhou Exegenesis Bio Ltd. Nucleic acid constructs and uses thereof for treating spinal muscular atrophy

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108611355A (zh) * 2018-05-04 2018-10-02 北京五加和分子医学研究所有限公司 X染色体连锁肌小管肌病的基因药物

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITTO20130669A1 (it) * 2013-08-05 2015-02-06 Consiglio Nazionale Ricerche Vettore adeno-associato ricombinante muscolo-specifico e suo impiego nel trattamento di patologie muscolari
CA2971303A1 (en) * 2016-06-21 2017-12-21 Bamboo Therapeutics, Inc. Optimized mini-dystrophin genes and expression cassettes and their use

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108611355A (zh) * 2018-05-04 2018-10-02 北京五加和分子医学研究所有限公司 X染色体连锁肌小管肌病的基因药物

Also Published As

Publication number Publication date
CN111088284A (zh) 2020-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107438671B (zh) 变体RNAi
Elangkovan et al. Gene therapy for Duchenne muscular dystrophy
RU2752882C2 (ru) Линейная дуплексная днк с закрытым концом для невирусного переноса генов
KR20200036912A (ko) 안과 질환을 위한 세포 모델 및 치료요법
BR112020017348A2 (pt) Vetores de vírus adenoassociados (aav), vetores de aav tendo desamidação de capsídeos reduzida e usos dos mesmos
JP2022084810A (ja) 網膜色素変性症のための遺伝子治療
CN108795946B (zh) 携带设计smn1基因表达框的重组腺相关病毒及应用
CN116194154A (zh) 使用aav载体的plakophilin-2(pkp2)基因疗法
KR20220066225A (ko) 선택적 유전자 조절을 위한 조성물 및 방법
CN111356763A (zh) 变体RNAi
KR20230058102A (ko) Grn 관련 성인 발병 신경변성 치료를 위한 재조합 아데노-연관 바이러스
KR20210131370A (ko) Grn-연관 성인-발병 신경퇴화의 치료를 위한 재조합 아데노-연관 바이러스
KR20220140537A (ko) Cdkl5 결핍 장애를 치료하기 위한 유전자 요법
KR20230038503A (ko) 샤르코-마리-투스 질환의 치료에 유용한 조성물
KR20230042468A (ko) Csrp3 (시스테인 및 글리신 풍부 단백질 3) 유전자 요법
CN111088284B (zh) 携带截短抗肌萎缩蛋白基因表达框的aav载体、制备方法及应用
KR20210040984A (ko) 점액다당류증 iva의 치료
CN116685329A (zh) 核酸构建体及其用于治疗脊髓性肌肉萎缩症的用途
KR20230043123A (ko) Glut1 발현을 위한 아데노-연관 바이러스 벡터 및 이의 사용
CN108611355B (zh) X染色体连锁肌小管肌病的基因药物
KR20220007601A (ko) 치료제 투여를 위한 조성물 및 방법
KR20210086638A (ko) 진행성 가족성 간내 담즙정체 3형 (pfic3)의 치료를 위한 코돈-최적화 전이유전자
CN116171325A (zh) 用于eEF1A2的基因疗法载体及其用途
CN111084888A (zh) 一种用于治疗严重高甘油三酯血症的基因药物
RU2800026C2 (ru) МОДИФИЦИРОВАННАЯ ДНК С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20200827

Address after: 100176 Beijing Daxing District economic and Technological Development Zone, East Road, No. three Jinghai Road 35, high tech Park 2.

Applicant after: Beijing Jingpu Di Gene Technology Co., Ltd

Address before: 100176 Beijing Daxing District economic and Technological Development Zone, East Road, No. three Jinghai Road 35, high tech Park 2.

Applicant before: BEIJING FIVEPLUS MOLECULAR MEDICINE INSTITUTE Co.,Ltd.

SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant