CN111356763A - 变体RNAi - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于治疗亨廷顿氏病的RNAi分子。本文进一步提供了含有所述RNAi的表达盒、载体(例如，rAAV、重组腺病毒、重组慢病毒和重组HSV载体)、细胞、病毒颗粒和药物组合物。本文又进一步提供了涉及使用所述RNAi，例如，以治疗亨廷顿氏病的方法和试剂盒。

Description

变体RNAi
相关申请的交叉引用
此申请要求保护2017年9月22日提交的美国临时申请号62/561,843的优选权权益，该美国临时申请通过提述以其整体并入本文。
以ASCII文本文件提交序列表
以下以ASCII文本文件提交的内容通过提述以其整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名称：159792014740SeqList.txt，记录的日期：2018年9月20日，大小：19KB)。
发明领域
本发明涉及变体RNAi分子。在一些方面中，本发明涉及变体RNAi以治疗亨廷顿氏病。
背景
已表明RNA干扰(RNAi)是用于基因功能基础研究中基因沉默的有效工具，且显示出作为抑制与许多疾病进展相关的基因的治疗剂的巨大前景。事实上，通过RNAi的基团调节通过称作微小RNA (miRNA)的小RNA发生(Ambros,(2004)Nature 431:350-355；Krol等,(2010)Nat.Rev.Genet.11:597-610)。微小RNA已成为不同细胞过程的强效调节剂，且当通过病毒载体递送时，人工miRNA持续表达，导致靶基因稳固和持续的抑制。涉及miRNA加工的机制的阐明已允许科学家指派(co-opt)内源性细胞RNAi机制并使用人工miRNA指导靶基因产物的降解(参见，例如，US PG Pub.2014/0163214和Davidson等,(2012)Cell 150:873-875)。
RNAi临床开发的阻碍是脱靶沉默的可能性，其中RNAi的种子区(通常为核苷酸1-7或1-8)在3’非翻译区(UTR)中与非靶mRNA中的序列配对，导致转录不稳定。减少脱靶沉默的尝试包括使用算法来鉴定对靶mRNA具有高度特异性的候选种子序列，其具有最小脱靶可能性(Boudreau RL等，(2012)Nucl.Acids Res.41(1):e9)和在RNAi的指导区放置内在的凸出(Terasawa等,(2011)Journal of nucleic acids 2011:131579)。
已对RNAi作为治疗亨廷顿氏病(HD)的治疗剂进行了研究。HD是遗传性神经退行性疾病，其由亨廷顿蛋白基因(HTT)外显子1中的CAG重复的扩增引起。所得的N-末端区中多聚谷氨酰胺束的延伸赋予突变的亨廷顿蛋白蛋白(mHtt)以毒性的获得性功能。沉默mHtt表达作为针对HD的治疗策略的可能性首先在疾病的条件性小鼠模型中得到证明(Yamamoto等,(2000)Cell101:57-66.)。当在这些小鼠中诱导mHtt表达时，病理和行为异常变得明显。随后mHtt转基因的四环素介导的抑制逆转了这些异常，指示mHtt水平的减少允许神经元内的蛋白质清除机制以使mHtt-诱导的变化正常化。因此，降低mHtt水平的治疗策略可潜在阻止疾病进展并减轻HD症状。在WO 2016/130589中提供了靶向Htt的miRNA，该文件以其整体并入本文。
本文引用的所有参考文件(包括专利申请和出版物)通过提述以其整体并入。
发明概述
在一些方面中，本发明提供包含第一链和第二链的RNAi，其中a)所述第一链和所述第二链形成双链体；b)所述第一链包含指导区，其中所述指导区包含核酸序列5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’(SEQ ID NO:1)或5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)；且c)所述第二链包含非指导区。在一些实施方案中，所述核所述指导区包含核酸序列5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’(SEQ ID NO:1)且所述非指导区包含序列5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，所述第一链包含与SEQ IDNO:1具有约90％同一性或与SEQ ID NO:2具有约90％同一性的核酸序列。在其它实施方案中，所述核所述指导区包含核酸序列5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)且所述非指导区包含序列5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’(SEQ ID NO:8)。在一些实施方案中，所述第二链包含与SEQ ID NO:7具有约90％同一性或与SEQ ID NO:8具有约90％同一性的核酸序列。在上述实施方案的一些实施方案中，所述第一链和所述第二链借由能够形成环结构的RNA接头连接。在一些实施方案中，所述RNA接头包含4至50个核苷酸。在一些实施方案中，所述环结构包含4至20个核苷酸。在一些实施方案中，所述RNAi以5’至3’包含第二链、RNA接头和所述第一链。在一些实施方案中，所述RNAi以5’至3’包含所述第一链、RNA接头和第二链。在一些实施方案中，所述RNAi包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNAi包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的核苷酸序列约90％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述RNAi是小抑制性RNA (siRNA)、微小RNA (miRNA)或小发夹RNA (shRNA)。在一些实施方案中，所述RNAi靶向编码与亨廷顿氏病相关的多肽的RNA。在一些实施方案中，所述多肽是亨廷顿蛋白。在一些实施方案中，所述亨廷顿蛋白包含与亨廷顿氏病相关的突变。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，本发明提供一种表达构建体，其包含编码权利要求1-16中任一项所述的RNAi的核酸。在一些实施方案中，编码所述RNAi的核酸包含miRNA支架。在一些实施方案中，编码所述RNAi的核酸可操作地与启动子连接。在一些实施方案中，所述启动子选自巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、CK6启动子、转甲状腺素蛋白启动子(TTR)、TK启动子、四环素响应性启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-球蛋白启动子(CAG)启动子、延长因子1-α启动子(EF1-α)启动子、人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、二氢叶酸还原酶启动子和13-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，所述表达构建体进一步包含多腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述多腺苷酸化信号是牛生长激素多腺苷酸化信号、SV40多腺苷酸化信号或HSV TK pA。
在一些实施方案中，本发明提供一种载体，其包含本文所述的实施方案中任一项所述的表达构建体。在一些实施方案中，所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体、重组腺病毒载体、重组慢病毒载体或重组单纯疱疹病毒(HSV)载体。在一些实施方案中，所述载体是重组腺病毒载体。在一些实施方案中，所述重组腺病毒载体衍生自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad型3、犬Ad型2、绵羊Ad或猪Ad型3。在一些实施方案中，所述重组腺病毒载体衍生自腺病毒血清型2或腺病毒血清型5的变体。在一些实施方案中，所述载体是重组慢病毒载体。在一些实施方案中，所述重组慢病毒载体衍生自用以下假型化的慢病毒：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病病毒、RD114或其中的变体。在一些实施方案中，所述载体是rHSV载体。在一些实施方案中，所述rHSV载体衍生自rHSV-1或rHSV-2。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述载体是rAAV载体。在一些实施方案中，所述表达构建体的侧翼为一个或多个AAV反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，所述表达构建体的侧翼为两个AAV ITR。在一些实施方案中，所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些实施方案中，所述AAV ITR是AAV2 ITR。在一些实施方案中，所述载体进一步包含填充核酸。在一些实施方案中，所述填充核酸位于编码RNAi的核酸的上游或下游。在一些实施方案中，所述载体是自身互补的rAAV载体。在一些实施方案中，所述载体包含编码RNAi的第一核酸序列和编码所述RNAi的互补物的第二核酸序列，所述第一核酸序列可与所述第二核酸序列沿其长度的大部分或全部形成链内碱基对。在一些实施方案中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通过突变的AAV ITR连接，其中所述突变的AAV ITR包含D区的缺失且包含末端解析序列的突变。在一些实施方案中，本发明提供一种细胞，其包含本文所述的任何载体(例如，rAAV载体)。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，本发明提供一种病毒颗粒，其包含本文所述的任何载体，其中所述病毒颗粒是使rAAV载体衣壳化的AAV颗粒、使重组腺病毒载体衣壳化的腺病毒颗粒、使重组慢病毒载体衣壳化的慢病毒颗粒或使重组HSV载体衣壳化的HSV颗粒。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是使重组腺病毒载体衣壳化的腺病毒颗粒。在一些实施方案中，所述腺病毒颗粒包含来自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad型3、犬Ad型2、绵羊Ad或猪Ad型3的衣壳。在一些实施方案中，所述腺病毒颗粒包含腺病毒血清型2衣壳或腺病毒血清型5衣壳的变体。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是衣壳化重组慢病毒载体的慢病毒颗粒。在一些实施方案中，所述慢病毒颗粒包含用以下假型化的衣壳：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病病毒、RD114或其中的变体。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是HSV颗粒。在一些实施方案中，所述HSV颗粒是rHSV-1颗粒或rHSV-2颗粒。
在一些实施方案中，本发明提供一种重组AAV颗粒，其包含本文所述的任何rAAV载体。在一些实施方案中，所述AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAVDJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV或小鼠AAV衣壳、rAAV2-HBKO衣壳(参见WO2015/168666，其通过提述并入本文)。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳衍生自相同的AAV血清型。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳衍生自不同的AAV血清型。在一些实施方案中，所述ITR衍生自AAV2，且所述rAAV颗粒的衣壳衍生自AAV1。在一些实施方案中，所述rAAV载体以5’至3’包含AAV2ITR、启动子、编码RNAi的核酸、多腺苷酸化信号和AAV2 ITR。在一些实施方案中，所述启动子是CBA启动子。在一些实施方案中，所述多腺苷酸化信号是牛生长激素多腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述rAAV载体以5’至3’包含AAV2 ITR的全部或部分(例如，功能部分)、CBA启动子、内含子(例如，嵌合内含子)、编码RNAi的核酸、牛生长激素多腺苷酸化信号和AAV2 ITR。在一些实施方案中，所述载体进一步包含填充核酸。在一些实施方案中，所述填充核酸进一步包含编码报告分子多肽(例如，绿色荧光蛋白(GFP))的核酸。在一些实施方案中，所述填充核酸位于编码RNAi的核酸的上游或下游。
在一些实施方案中，本发明提供一种组合物(例如，药物组合物)，其包含本文所述的任何病毒颗粒(例如，rAAV颗粒)。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的载剂。
在一些方面中，本发明提供一种试剂盒，其包含本文所述的任何RNAi。在一些实施方案中，所述试剂盒包含本文所述的任何病毒颗粒(例如，rAAV颗粒)。在一些实施方案中，所述试剂盒包含本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含供使用的说明书。
在一些方面中，本发明提供用于治疗哺乳动物中的亨廷顿氏病的方法，其包括向所述哺乳动物施用包含第一链和第二链的RNAi，所述第一链包含含有序列5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸，或者第一链包含含有序列5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’(SEQ ID NO:8)的第二核酸。在一些方面中，本发明提供用于在具有亨廷顿氏病的哺乳动物中抑制htt表达的方法，其包括向所述哺乳动物施用包含第一链和第二链的RNAi，所述第一链包含含有序列5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸，或者所述第一链包含含有序列5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’(SEQ ID NO:8)的第二核酸。在一些方面中，本发明提供用于抑制htt在具有亨廷顿氏病的哺乳动物的细胞中积累的方法，其包括向所述哺乳动物施用包含第一链和第二链的RNAi，所述第一链包含含有序列5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸，或者所述第一链包含含有序列5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’(SEQ ID NO:8)的第二核酸。
在上述方法的一些实施方案中，所述第一链包含与SEQ ID NO:1具有约90％同一性或与SEQ ID NO:7具有约90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第二链包含与SEQ ID NO:2具有约90％同一性或与SEQ ID NO:8具有约90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第一链和所述第二链借由能够形成环结构的RNA接头连接。在一些实施方案中，所述NA接头包含4至50个核苷酸。在一些实施方案中，所述环结构包含4至20个核苷酸。在一些实施方案中，所述RNAi以5’至3’包含所述第二链、所述RNA接头和所述第一链。在一些实施方案中，所述RNAi以5’至3’包含所述第一链、所述RNA接头和所述第二链。在一些实施方案中，所述RNAi包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNAi包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的核苷酸序列约90％同一的核苷酸序列。
在上述方法的一些实施方案中，所述RNAi是表达构建体上编码的。在一些实施方案中，编码所述RNAi的核酸包含miRNA支架。在一些实施方案中，编码所述RNAi的核酸可操作地与启动子连接。在一些实施方案中，所述启动子能够在哺乳动物的脑中表达RNAi。在一些实施方案中，所述启动子选自巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、CK6启动子、转甲状腺素蛋白启动子(TTR)、TK启动子、四环素响应性启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-球蛋白(CAG)启动子、延长因子1-α启动子(EFl-α)启动子和人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子。在一些实施方案中，所述启动子是杂合鸡β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，所述核酸进一步包含内含子的全部或部分(例如，功能部分)和多腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述多腺苷酸化信号是牛生长激素多腺苷酸化信号，且所述内含子是嵌合内含子。
在上述方法的一些实施方案中，所述RNAi是在包含本文所述的实施方案中任一项的表达构建体的载体上编码的。在一些实施方案中，所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体、重组腺病毒载体、重组慢病毒载体或重组单纯疱疹病毒(HSV)载体。在一些实施方案中，所述载体是重组腺病毒载体。在一些实施方案中，所述重组腺病毒载体衍生自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad型3、犬Ad型2、绵羊Ad或猪Ad型3。在一些实施方案中，所述重组腺病毒载体衍生自腺病毒血清型2或腺病毒血清型5的变体。在一些实施方案中，所述载体是重组慢病毒载体。在一些实施方案中，所述重组慢病毒载体衍生自用以下假型化的慢病毒：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病病毒、RD114或其中的变体。在一些实施方案中，所述载体是rHSV载体。在一些实施方案中，所述rHSV载体衍生自rHSV-1或rHSV-2。
在上述方法的一些实施方案中，所述载体是rAAV载体。在一些实施方案中，所述表达构建体的侧翼为一个或多个AAV反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，所述表达构建体的侧翼为两个AAV ITR。在一些实施方案中，所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些实施方案中，所述AAV ITR是AAV2ITR。在一些实施方案中，所述载体进一步包含填充核酸。在一些实施方案中，所述填充核酸位于启动子和编码RNAi的核酸之间。在一些实施方案中，所述载体是自身互补的rAAV载体。在一些实施方案中，所述载体包含编码RNAi的第一核酸序列和编码所述RNAi的互补物的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可与第二核酸序列沿其长度的大部分或全部形成链内碱基对。在一些实施方案中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通过突变的AAV ITR连接，其中所述突变的AAV ITR包含D区的缺失且包含末端解析序列的突变。在一些实施方案中，本发明提供一种细胞，其包含本文所述的任何载体(例如，rAAV载体)。
在上述方法的一些实施方案中，编码所述RNAi的载体在病毒颗粒中，其中所述病毒颗粒是衣壳化rAAV载体的AAV颗粒、衣壳化重组腺病毒载体的腺病毒颗粒，衣壳化重组慢病毒载体的慢病毒颗粒或衣壳化重组HSV载体的HSV颗粒。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是衣壳化重组腺病毒载体的腺病毒颗粒。在一些实施方案中，所述腺病毒颗粒包含来自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad型3、犬Ad型2、绵羊Ad或猪Ad型3的衣壳。在一些实施方案中，所述腺病毒颗粒包含腺病毒血清型2衣壳或腺病毒血清型5衣壳的变体。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是衣壳化重组慢病毒载体的慢病毒颗粒。在一些实施方案中，所述慢病毒颗粒包含用以下假型化的衣壳：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病病毒、RD114或其中的变体。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是HSV颗粒。在一些实施方案中，所述HSV颗粒是rHSV-1颗粒或rHSV-2颗粒。
在上述方法的一些实施方案中，本发明提供一种重组AAV颗粒，其包含本文所述的任何rAAV载体。在一些实施方案中，所述AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV或小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1血清型衣壳。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳衍生自相同的AAV血清型。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳衍生自不同的AAV血清型。在一些实施方案中，所述ITR衍生自AAV2，且所述rAAV颗粒的衣壳衍生自AAV1。本发明提供一种载体，其包含本文所述的实施方案中任一项的表达构建体。在一些实施方案中，所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体、重组腺病毒载体、重组慢病毒载体或重组单纯疱疹病毒(HSV)载体。在一些实施方案中，所述载体是重组腺病毒载体。在一些实施方案中，所述重组腺病毒载体衍生自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad型3、犬Ad型2、绵羊Ad或猪Ad型3。在一些实施方案中，所述重组腺病毒载体衍生自腺病毒血清型2或腺病毒血清型5的变体。在一些实施方案中，所述载体是重组慢病毒载体。在一些实施方案中，所述重组慢病毒载体衍生自用以下假型化的慢病毒：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病病毒、RD114或其中的变体。在一些实施方案中，所述载体是rHSV载体。在一些实施方案中，所述rHSV载体衍生自rHSV-1或rHSV-2。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述载体是rAAV载体。在一些实施方案中，所述表达构建体的侧翼为一个或多个AAV反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，所述表达构建体的侧翼为两个AAV ITR。在一些实施方案中，所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些实施方案中，所述AAV ITR是AAV2 ITR。在一些实施方案中，所述载体进一步包含填充核酸。在一些实施方案中，所述填充核酸位于启动子和编码RNAi的核酸之间。在一些实施方案中，所述载体是自身互补的rAAV载体。在一些实施方案中，所述载体包含编码RNAi的第一核酸序列和编码所述RNAi的互补物的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可与所述第二核酸序列沿其长度的大部分或全部形成链内碱基对。在一些实施方案中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通过突变的AAV ITR连接，其中所述突变的AAV ITR包含D区的缺失且包含端解析序列的突变。在一些实施方案中，本发明提供一种细胞，其包含本文所述的任何载体(例如，rAAV载体)。
在上述方面和实施方案一些实施方案中，本发明提供一种病毒颗粒，其包含本文所述的任何载体，其中所述病毒颗粒是衣壳化rAAV载体的AAV颗粒、衣壳化重组腺病毒载体的腺病毒颗粒、衣壳化重组慢病毒载体的慢病毒颗粒或衣壳化重组HSV载体的HSV颗粒。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是衣壳化重组腺病毒载体的腺病毒颗粒。在一些实施方案中，所述腺病毒颗粒包含来自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad型3、犬Ad型2、绵羊Ad或猪Ad型3的衣壳。在一些实施方案中，所述腺病毒颗粒包含腺病毒血清型2衣壳或腺病毒血清型5衣壳的变体。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是衣壳化重组慢病毒载体的慢病毒颗粒。在一些实施方案中，所述慢病毒颗粒包含用以下假型化的衣壳：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病病毒、RD114或其中的变体。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是HSV颗粒。在一些实施方案中，所述HSV颗粒是rHSV-1颗粒或rHSV-2颗粒。
在一些实施方案中，本发明提供一种重组AAV颗粒，其包含本文所述的任何rAAV载体。在一些实施方案中，所述AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAVDJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV或小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1血清型衣壳。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳衍生自相同的AAV血清型。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳衍生自不同的AAV血清型。在一些实施方案中，所述ITR衍生自AAV2，且所述rAAV颗粒的衣壳衍生自AAV1。在一些实施方案中，所述rAAV载体以5’至3’包含AAV2 ITR、启动子、编码RNAi的核酸、多腺苷酸化信号和AAV2 ITR。在一些实施方案中，所述启动子是CBA启动子。在一些实施方案中，所述多腺苷酸化信号是牛生长激素多腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述rAAV载体以5’至3’包含AAV2 ITR、CBA启动子、内含子、编码RNAi的核酸、牛生长激素多腺苷酸化信号和AAV2 ITR。在一些实施方案中，所述载体进一步包含填充核酸。在一些实施方案中，所述填充核酸包含编码绿色荧光蛋白(GFP)的核酸。在一些实施方案中，所述填充核酸位于启动子和编码RNAi的核酸之间。
在上述方法的一些实施方案中，所述病毒颗粒(例如，rAAV颗粒)在组合物(例如，药物组合物)中。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的载剂。
附图简述
图1A显示Htt miRNA 206(SEQ ID NO:22)和Htt miRNA 207(SEQ ID NO:10)的DNA序列。图1B显示ssAAV2/1miRHtt.de的图谱。图1C显示ssAAV2/1miRHtt.de的编码链的序列(SEQ ID NO:16)和ssAAV2/1miRHtt.de的非编码链的序列(SEQ ID NO:19)。
图2显示Htt miRNA 170XA、Htt miRNA 206和Htt miRNA 207在体外介导Htt降低的能力。数值以平均值±SEM给出。
图3A和3B显示如通过蛋白质(图3A)或mRNA(图3B)测量的AAV2/1-Htt miRNA 206和AAV2/1-Htt miRNA 207介导Htt降低的能力。CTL-3是非编码的miRNA对照。数值以平均值±SEM给出。*指示与CTL3小鼠显著不同，p<0.05；ANOVA，随后进行图基事后检验(Tukey’spost-hoc test)。
图4A和4B显示施用AAV2/1-Htt miRNA 206和AAV2/1-Htt miRNA 207后一个月的体重(图4A)和脑重(图4B)。CTL-3是非编码的miRNA对照。*与CTL3对照小鼠显著不同，p<0.05；ANOVA，随后进行图基事后检验。
图5A-5D显示在注射AAV2/1-miRNA-Htt-207的YAC128和FVB野生型同窝小鼠的纹状体中人Htt显著降低。人HTT蛋白水平示于图5A中。小鼠HTT蛋白水平示于图5B中。人HTTmRNA水平示于图5C中。小鼠HTT mRNA水平示于图5D中。
图6A和6B显示用AAV2/1-miRNA-Htt-207的处理可校正YAC128小鼠中的运动协调缺陷，如通过转棒测试(图6A)确定的，以及YAC128小鼠中的抑郁表型，如使用Porsolt游泳测试确定的(图6B)。小鼠是用非编码的RNA对照(CTL3)或AAV2/1-miRNA-Htt-207(207)处理的野生型(WT也称作FVB)或YAC128(YAC)。图6A和6B中*指示相较于野生型小鼠，用AAV2/1-miRNA-Htt-207处理的野生型小鼠和用AAV2/1-miRNA-Htt-207处理的YAC128小鼠，CTL3非编码的miRNA对照小鼠中的显著缺陷，p<0.05；ANOVA，随后进行图基事后检验。
图7A和7B显示感染后三个月的体重(图7A)和脑重(图7B)。小鼠是用非编码RNA对照(CTL3)或AAV2/1-miRNA-Htt-207(207)处理的野生型(WT)或YAC128(YAC)。
图8显示自身互补的miRHtt 207载体基因组的图谱。CMV enh/CBA启动子是CMV增强子/鸡β肌动蛋白启动子。Δ嵌合内含子是简短的嵌合内含子。BGH是牛生长激素多腺苷酸化信号。ΔITR是缺少末端解析序列的AAV ITR。
图9显示可选的自身互补的miRHtt 207载体基因组的图谱。CBA启动子是鸡β肌动蛋白启动子。Δ嵌合内含子是简短的嵌合内含子。BGH是牛生长激素多腺苷酸化信号。
发明详述
在一些方面中，本发明提供用于治疗亨廷顿氏病的RNAi，其中所述RNAi包含第一链和第二链，所述第一链包含含有序列5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸，其中所述第一链和第二链形成双链体。在一些方面中，本发明提供用于治疗亨廷顿氏病的RNAi，其中所述RNAi包含第一链和第二链，所述第一链包含含有序列5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’(SEQ ID NO:8)的第二核酸，其中所述第一链和第二链形成双链体。在一些方面中，本发明提供包含本公开的RNAi的表达盒、载体(例如，重组AAV、腺病毒、慢病毒或HSV载体)、细胞、病毒颗粒(例如，AAV、腺病毒、慢病毒或HSV病毒颗粒)和药物组合物。在另一方面中，本发明提供用于治疗亨廷顿氏病、抑制htt的表达和抑制哺乳动物的细胞中htt的积累的方法，其包括向所述哺乳动物施用包含本公开的RNAi的药物组合物。在另一方面中，本发明提供包含本公开的RNAi的药物组合物用于治疗亨廷顿氏病(例如，减轻亨廷顿氏病的症状)、抑制htt在具有亨廷顿氏病的哺乳动物的细胞中表达、或抑制htt在具有亨廷顿氏病的哺乳动物的细胞中积累的用途。在又一方面中，本发明提供用于治疗哺乳动物中的亨廷顿氏病的试剂盒，其包含本公开的RNAi。
I.一般技术
本文描述和参考的技术和方法为本领域的技术人员一般充分理解的且是使用常规方法学所通常采用的，如，例如广泛利用的方法学描述于Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Sambrook等，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，ColdSpring Harbor，N.Y.，2012)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编，2003)；系列Methods in Enzymology(学术出版社(Academic Press,Inc.))；PCR 2:APractical Approach(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编，1995)；Antibodies，ALaboratory Manual(Harlow和Lane编，1988)；Culture of Animal Cells:A Manual ofBasic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney，第6版，J.Wiley andSons，2010)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Methods in MolecularBiology，Humana出版社；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编，Academic出版社，1998)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts，Plenum出版社，1998)；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle，J.B.Griffiths，和D.G.Newell编，J.Wiley和Sons，1993-8)；Handbook of ExperimentalImmunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1996)；Gene Transfer Vectors forMammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；PCR:The Polymerase ChainReaction，(Mullis等编，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等编，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等编，J.Wiley and Sons，2002)；Immunobiology(C.A.Janeway等，2004)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodies:APractical Approach(D.Catty.编，IRL出版社，1988-1989)；Monoclonal Antibodies:APractical Approach(P.Shepherd和C.Dean编，Oxford University出版社，2000)；UsingAntibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编，Harwood Academic出版商，1995)；和Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等编，J.B.Lippincott Company，2011)。
II.定义
如本文所用的“载体”，是指包含体外或体内待递送至宿主细胞中的核酸的重组质粒或病毒。
如本文使用的术语“多核苷酸”或“核酸”指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的多聚体形式。因此，此术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或包含嘌呤和嘧啶碱基的多聚物或其它天然、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基。多核苷酸的骨架可包含糖和磷酸基团(如通常在RNA或DNA中所发现的)，或修饰或取代的糖或磷酸基团。可替换地，多核苷酸的骨架可包含合成的亚基(如氨基磷酸酯)的多聚物且因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH 2)或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。此外，双链多核苷酸可从化学合成的单链多核苷酸产物通过合成互补链和在合适的条件下退火该链，或通过用合适的引物使用DNA聚合酶从头合成互补链而获得。
术语“多肽”和“蛋白”可互换使用以指代氨基酸残基的多聚物且不限于最小长度。此类氨基酸残基的多聚物可含有天然或非天然氨基酸残基，且包括但不限于肽、寡肽、氨基酸残基的二聚体、三聚体和多聚体。该定义涵盖全长的蛋白及其片段两者。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如，糖基化、唾液酸化、乙酰化，磷酸化等。此外，出于本发明的目的，“多肽”是指包括对天然序列的修饰(如缺失、添加和取代(通常其在自然中是保守的))的蛋白，只要蛋白质保持期望的活性。这些修饰可为故意的，如通过定点诱变，或可为意外的，如通过产生蛋白的宿主的突变或由于PCR扩增的错误。
“重组病毒载体”指包含一个或多个异源序列(即非病毒来源的核酸序列)的重组多核苷酸载体。在重组AAV载体的情况中，重组核酸的侧翼为至少一个，且在一些实施方案中为两个反向末端重复序列(ITR)。
“重组AAV载体(rAAV载体)”是指包含一个或多个侧翼为至少一个且在一些实施方案中为两个AAV反向末端重复序列(ITR)的异源序列(即非AAV来源的核酸序列)的多核苷酸载体。当存在于已用合适的辅助病毒感染(或表达合适的辅助功能)且表达AAV rep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的宿主细胞中，此类rAAV载体可被复制并包装入传染性病毒颗粒。当rAAV载体被并入到较大的多核苷酸(例如，在染色体中或另一载体如用于克隆或转染的质粒中)中时，然后rAAV载体可被称作“前载体”，其在AAV包装功能和合适的辅助功能存在下可通过复制和衣壳化“挽救”。rAAV载体可以是多种形式的任一种，包括但不限于质粒、线性人工染色体、与脂质的复合、包囊于脂质体内和衣壳化于病毒颗粒(特别是AAV颗粒)中。rAAV载体可被包装到AAV病毒衣壳中以生成“重组腺相关病毒颗粒(rAAV颗粒)”。
“重组腺病毒载体”指包含一个或多个侧翼为至少一个腺病毒反向末端重复序列(ITR)的异源序列(即，非腺病毒来源的核酸序列)的多核苷酸载体。在一些实施方案中，所述重组核酸侧翼为两个反向末端重复序列(ITR)。当存在于表达从重组病毒基因组缺失的必要腺病毒基因(例如，E1基因、E2基因、E4基因等)的宿主细胞中时，此类重组病毒载体可被复制并包装入感染性病毒颗粒。当将重组病毒载体被并入到较大的多核苷酸(例如，在染色体中或另一载体如用于克隆或转染的质粒中)中时，然后重组病毒载体可被称作“前载体”，其在AAV包装功能和合适的辅助功能存在下可通过复制和衣壳化“挽救”。重组病毒载体可以是多种形式的任一种，包括但不限于质粒、线性人工染色体、与脂质的复合、包囊于脂质体内和衣壳化于病毒颗粒(例如AAV颗粒)中。重组病毒载体可被包装到腺病毒病毒衣壳中以生成“重组腺病毒颗粒”。
“重组慢病毒载体”是指包含一个或多个侧翼为至少一个慢病毒末端重复序列(LTR)的异源序列(即，非慢病毒来源的核酸序列)的多核苷酸载体。在一些实施方案中，所述重组核酸侧翼为两个慢病毒末端重复序列(LTR)。当存在于已用合适的辅助功能感染的宿主细胞中时，此类重组病毒载体可被复制并包装入感染性病毒颗粒。重组慢病毒载体可被包装到慢病毒衣壳以生成“重组慢病毒颗粒”。
“重组单纯疱疹载体(重组HSV载体)”指包含一个或多个侧翼为HSV末端重复序列的异源序列(即，非HSV来源的核酸序列)的多核苷酸载体。当存在于已用合适的辅助功能感染的宿主细胞中时，此类重组病毒载体可被复制并包装入感染性病毒颗粒。当将重组病毒载体被并入到较大的多核苷酸(例如在染色体中或另一载体如用于克隆或转染的质粒中)中时，然后重组病毒载体可被称作“前载体”，其在HSV包装功能存在下可通过复制和衣壳化“挽救”。重组病毒载体可以是多种形式的任一种，包括但不限于质粒、线性人工染色体、与脂质的复合、包囊于脂质体内和衣壳化于病毒颗粒(例如HSV颗粒)中。重组病毒载体可被包装入HSV衣壳以生成“重组单纯疱疹病毒颗粒”。
“异源”意指源自与其所比较的或其所导入或并入的其余实体的基因型不同的实体。例如，通过基因工程技术被导入到不同细胞类型中的多核苷酸是异源多核苷酸(且，当表达时，可编码异源多肽)。相似地，被并入到病毒载体中的细胞序列(例如基因或其部分)是相对于该载体的异源核苷酸序列。
术语“转基因”是指导入到细胞中且能够转录成RNA且任选地在合适条件下翻译和/或表达的多核苷酸。在一些方面中，其赋予其被导入到的细胞期望的性质，或以其它方式产生期望的治疗或诊断成果。在另一方面，其可被转录成介导RNA干扰的分子，如miRNA、siRNA或shRNA。
“鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子”是指源自鸡β-肌动蛋白基因的多核苷酸序列(例如，原鸡(Gallus gallus)β肌动蛋白，其由GenBank Entrez Gene ID 396526表示)。如本文使用的“鸡β-肌动蛋白启动子”可指含有巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件、启动子和鸡β-肌动蛋白基因的第一外显子和内含子、和兔β-珠蛋白基因的剪接受体的启动子，如描述于Miyazaki,J.等(1989)Gene 79(2):269-77的序列。如本文使用的，术语“CAG启动子”可互换地使用。如本文使用的，术语“CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子”可互换地使用。
如关于病毒滴度使用的术语“基因组颗粒(gp)”、“基因组等价物”或“基因组拷贝”是指含有重组AAV DNA基因组的病毒体的数目，无论感染性或功能性如何。特定载体制备物的基因组颗粒数目可通过如描述于本文实施例或例如Clark等(1999)Hum.Gene Ther.,10:1031-1039；Veldwijk等(2002)Mol.Ther.,6:272-278中的方法测量。
如本文使用的，术语“载体基因组(vg)”可指包含载体(例如病毒载体)的一组多核苷酸序列的一个或多个多核苷酸。载体基因组可在病毒颗粒中衣壳化。取决于特定的病毒载体，载体基因组可包含单链DNA、双链DNA或单链RNA或双链RNA。载体基因组可包含与特定病毒载体相关的内源序列和/或任何通过重组技术插入到特定病毒载体中的异源序列。例如，重组AAV载体基因组可包括在启动子侧翼的至少一个ITR序列、填充片段、感兴趣的序列(例如RNAi)和多腺苷酸化序列。完整的载体基因组可包括载体的一整套多核苷酸序列。在一些实施方案中，病毒载体的核酸滴度可以vg/mL的形式测量。适于测量此滴度的方法为本领域已知的(例如定量PCR)。
如本文使用的术语“抑制”可指阻断、减少、去除或以其他方式拮抗特定靶标的存在或活性的作用。抑制可指部分抑制或完全抑制。例如，抑制基因的表达可指导致基因表达的阻断、减少、去除或任何其它拮抗的任何作用，包括mRNA丰度的减少(例如沉默mRNA转录)、mRNA的降解、mRNA翻译的抑制等。在一些实施方案中，抑制HTT的表达可指HTT表达的阻断、减少、消除或任何其它拮抗，包括HTT mRNA丰度的减少(例如沉默HTT mRNA转录)、HTTmRNA的降解、HTT mRNA翻译的抑制等。作为另一实例，抑制细胞中蛋白的积累可指导致所述蛋白表达的阻断、减少、消除或其它拮抗的任何作用，包括mRNA丰度的减少(例如沉默mRNA转录)、mRNA的降解、mRNA翻译的抑制、所述蛋白的降解等。在一些实施方案中，抑制细胞中HTT蛋白的积累是指细胞中HTT蛋白表达的阻断、减少、消除或其它拮抗，包括HTT mRNA丰度的减少(例如沉默HTT mRNA转录)、HTT mRNA的降解、抑制HTT mRNA翻译、HTT蛋白的降解等。
如关于病毒滴度使用的术语“感染单位(iu)”、“感染颗粒”或“复制单位”是指如通过感染性中心测定法(也称为复制中心测定法，如例如McLaughlin等(1988)J.Virol.,62:1963-1973中所述)所测量的感染性和有复制能力的重组AAV载体颗粒的数目。
如关于病毒滴度所使用的术语“转导单位(tu)”是指如本文实施例中所述的功能性测定法或例如Xiao等(1997)Exp.Neurobiol.,144:113-124；或Fisher等(1996)J.Virol.,70:520-532(LFU测定法)中所测量的导致功能性转基因产物产生的感染性重组AAV载体颗粒的数目。
反向末端重复”或“ITR”序列是本领域熟知的术语且指在病毒基因组末端发现的处于相反方向的相对短的序列。
本领域熟知的“AAV反向末端重复(ITR)”序列，是在天然单链AAV基因组两末端均存在的大约145个核苷酸的序列。ITR最外侧的125个核苷酸可以两个可替换的方向存在，这导致不同AAV基因组之间和单个AAV基因组两末端之间的异质性。最外侧的125个核苷酸还含有若干个自我互补的较短区(称为A、A’、B、B’、C、C’和D区)，这允许链内碱基配对在此部分的ITR内发生。
“末端解析序列”或“trs”是AAV ITR的D区中的序列，其在病毒DNA复制过程中通过AAV rep蛋白被切割。突变的末端解析序列耐受通过AAV rep蛋白的切割。
“AAV辅助功能”是指允许AVV被宿主细胞复制和包装的功能。AAV辅助功能可以以多种形式中的任一种提供，所述形式包括但不限于帮助AAV复制和包装的辅助病毒或辅助病毒基因。其它AAV辅助功能为本领域已知的，如遗传毒性剂。
AAV的“辅助病毒”是指允许AAV(其是缺陷型细小病毒)被宿主细胞复制和包装的病毒。辅助病毒提供“辅助功能”，其允许AAV的复制。已鉴定多种此类辅助病毒，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒(如牛痘)和杆状病毒。腺病毒涵盖多种不同的亚组，尽管亚组C的5型腺病毒(Ad5)是最常使用的。人、非人哺乳动物和禽类来源的多种腺病毒是已知的且可从保藏机构(如ATCC)获得。疱疹病毒家族(其也可从保藏机构如ATCC获得)包括例如单纯疱疹病毒(HSV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)和伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus，PRV)。用于复制AAV的腺病毒辅助功能的实例包括E1A功能、E1B功能、E2A功能、VA功能和E4orf6功能。可从保藏机构获得的杆状病毒包括苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)核型多角体病毒。
如果感染性AAV颗粒与感染性辅助病毒颗粒的比率为至少约102:l；至少约104:l、至少约106:l；或至少约108:l或更多，则称rAAV的制剂“基本上无”辅助病毒。在一些实施方案中，制剂也没有等量的辅助病毒蛋白(即，如果上文所示的辅助病毒颗粒杂质以破坏的形式存在，则将由于此类辅助病毒水平而存在的蛋白)。病毒和/或细胞蛋白污染通常可因SDS凝胶上考马斯染色条带的存在而被观察到(例如，除了对应于AAV衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的条带外的条带的出现)。
相对于参照多肽或核酸序列的“百分比(％)序列同一性”定义为对齐序列和引入缺口后(如果需要的话)以实现最大百分比序列同一性，且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的部分，候选序列中与参照多肽或核酸序列中的氨基酸残基或核苷酸同一的氨基酸残基或核苷酸的百分比。出于确定百分比氨基酸或核酸序列同一性的目的，可以以本领域技术内的多种方式实现比对，例如，使用公众可获得的计算机软件程序，例如，描述于CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等编,1987),Supp.30,section7.7.18,表7.7.1的那些，且包括BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。优选的比对程序是ALIGN Plus(Scientific and Educational Software,Pennsylvania)。本领域的技术人员可确定用于测量比对的合适参数，包括任何以实现在所比较的序列全长上实现最大比对所需的算法。就本文而言，给定氨基酸序列A对于、与或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可替换地可被称为对于、与或针对给定氨基酸序列B具有或包含一定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：100乘以分数X/Y，其中X是在A和B的程序比对中通过序列比对程序评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中氨基酸残基的总数。可理解的是其中氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不等，A对B的％氨基酸序列同一性将不等于B对A的％氨基酸序列同一性。就本文而言，给定核酸序列C对于、与或针对给定核酸序列D的％核酸序列同一性(其可替换地可被称为对于、与或针对给定核酸序列D具有或包含一定％核酸序列的给定核酸序列C)如下计算：100乘以分数W/Z，其中W是在C和D的程序比对中通过序列比对软件评分为同一匹配的核苷酸的数目，且其中Z是D中核苷酸的总数。可理解的是其中核酸序列C的长度不等于核酸序列D的长度，C对D的％核酸序列同一性将不等于D对C的％核酸序列同一性。
“分离的”分子(例如，核酸或蛋白)或细胞意指其已经被鉴定和分离和/或从其天然环境的组分回收。
“有效量”是足以影响有益或期望的结果的量，所述结果包括临床结果(例如，减轻症状、实现临床终点等)。有效量可以一次或多次施用。就疾病状态而言，有效量是足以减轻、稳定或延迟疾病进展的量。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)、兔和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。
如本文使用的“治疗”是用于获得有益或期望的临床结果的方式。就本发明而言，有益或期望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度的减少、疾病状态的稳定化(例如未恶化)、预防疾病传播(例如转移)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的减轻或缓和以及缓解(无论部分或全部)，无论是可检测的或不可检测的。“治疗”还可意指与如果未接受治疗的预期的生存相比延长生存。
如本文使用的术语“预防性治疗”是指治疗，其中个体已知或疑似具有或处于具有病症的风险，但不表现症状或表现出最少的病症症状。经历预防性治疗的个体可在症状发生前治疗。
“亨廷顿氏病(HD)”是指进展性脑病症，通常由HTT基因中的突变引起(又名亨廷顿蛋白，HD或IT15)。其可通过下列症状表征：异常运动(称为舞蹈病)、运动功能逐渐丧失、情绪或精神疾病和渐进性认知障碍。尽管大多症状在30和40岁出现，但已观察到疾病的青少年形式。对于HD的进一步描述，参见OMIM Entry No.143100。
“亨廷顿蛋白(HTT)”是指与亨廷顿氏病的大多数情况相关的基因或其多肽产物。亨廷顿蛋白的正常功能尚未被完全理解。然而，已知亨廷顿蛋白基因中的突变引起HD。这些突变通常以常染色体显性遗传方式遗传且涉及HTT基因中三核苷酸CAG重复的扩增，导致Htt蛋白中的多聚谷氨酰胺(多聚Q)束。
如本文使用，“RNAi”可指在细胞中诱导RNA干扰的任何RNA分子。RNAi的实例包括但不限于小抑制性RNA (siRNA)、微小RNA (miRNA)和小发夹RNA(shRNA)。
“miRNA支架”可指多核苷酸，其含有：(i)通过RNAi靶向感兴趣的基因用于敲低的双链序列和(ii)形成类似内源miRNA的茎-环结构的额外的序列。当多核苷酸组装入miRNA样二级结构时，RNAi的靶向感兴趣的基因的序列(例如短的，～20-nt序列)可连接于生成miRNA样茎-环的序列和与感兴趣的序列碱基配对的序列以形成双链体。如本文所述，此双链体可不完美杂交，例如，其可含有一个或多个未配对或错配的碱基。当通过Dicer切割此多核苷酸时，此含有靶向感兴趣的基因的序列的双链体可展开且并入RISC复合物中。miRNA支架可指miRNA自身或编码所述miRNA的DNA多核苷酸。miRNA支架的实例是miR-155序列(Lagos-Quintana,M.等(2002)Curr.Biol.12:735-9)。商业上可得到的用于将序列克隆至miRNA支架中的试剂盒是本领域已知的(例如，来自Life Technologies的InvitrogenTMBLOCK-iTTM Pol IImiR RNAi表达载体试剂盒，Thermo Fisher Scientific；Waltham,MA)。
如本文使用的“凸出”指在双链体核酸中与对侧核酸不互补的核酸区。例如，凸出可指在双链体核酸中与对侧核酸不互补的核酸序列，其中所述凸出的侧翼为与双链体核酸中的对侧核酸互补的核酸区。在一些实例中，凸出的长度可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10个碱基中的任何。在一些实例中，凸出可由错配导致(例如，对侧链含有非互补的碱基)或者凸出可由未配对导致(例如，对侧链包含与凸出侧翼的核酸互补但对侧链不含有凸出对侧的核酸)。
如本文使用的术语“有义”核酸是包含编码全部或部分转基因的序列的核酸。在一些实例中，转基因的mRNA是有义核酸。
如本文使用的“反义”核酸是与“有义”核酸互补的核酸序列。例如，反义核酸可与编码转基因的mRNA互补。
如本文使用的RNAi的“指导区”是结合靶mRNA的RNAi的链，通常基于互补性。互补区可涵盖指导区的全部或部分。通常，互补区至少包括种子区。在许多情况中，RNAi的反义区是指导区。
如本文使用，RNAi的“乘客区(passenger region)”或“非指导区”在本文可互换地使用，是RNAi的与指导区互补的区域。在许多情况中，RNAi的有义区是乘客区。
如本文使用的，RNAi的“种子区”(例如，miRNA)是微小RNA中长度为约1-8个核苷酸的区域。在一些实例中，种子区和其靶mRNA的3’-UTR可以是RNAi识别中的关键决定部分。
如本文使用的，“脱靶基因沉默”指RNAi的种子区与非预期的mRNA的3’-UTR中的序列配对并指导那些转录物的翻译抑制和去稳定化(例如，减少非预期的mRNA的表达)。
本文中对值或参数“约”的提及包括(且描述)针对值或参数本身的实施方案。例如，关于“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文使用的，除非另外指示，否则物品的单数形式“一(a、an)”和“所述(the)”包括复数指称。
可以理解的是，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“包含”、“由……组成”和/或“基本上由……组成”的方面和实施方案。
III.RNAi
在一些方面，本发明提供靶向htt RNA的改进的RNAi，用于治疗亨廷顿氏病。在一些实施方案中，所述RNAi是小抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或小发夹RNA(shRNA)。已知小抑制性或干扰RNA(siRNA)在本领域中作为诱导细胞中RNAi的长度为大约19-25(例如，19-23)个碱基对的双链RNA分子。已知小发夹RNA(shRNA)在本领域中作为诱导细胞中RNAi的包含大约19-25(例如，19-23)个碱基对的通过短环(例如～4-11个核苷酸)连接的双链RNA的RNA分子。在一些实施方案中，所述RNAi包含第一链和第二链，其中a)所述第一链和所述第二链形成双链体；b)所述第一链包含指导区，其中所述指导区包含核酸序列5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’(SEQ ID NO:1)或5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)；且c)所述第二链包含非指导区。在一些实施方案中，所述核所述指导区包含核酸序列5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’(SEQ ID NO:1)且所述非指导区包含序列5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’(SEQ ID NO:2)。在其它实施方案中，所述核所述核酸指导区包含核酸序列5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)且所述非指导区包含序列5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’(SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，所述第一链包含指导区，其中所述指导区包含与5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’(SEQ ID NO:1)具有多于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第一链包含指导区，其中所述指导区包含与5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’(SEQ ID NO:1)具有多于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列但维持至少一个CpG基序。在一些实施方案中，所述第一链包含指导区，其中所述指导区包含与5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)具有多于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第一链包含指导区，其中所述指导区包含与5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)具有多于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列但维持至少一个CpG基序。在一些实施方案中，所述第二链包含非指导区，其中所述非指导区包含与5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’(SEQ ID NO:2)具有多于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第二链包含非指导区，其中所述非指导区包含与5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’(SEQ ID NO:2)具有多于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列但维持至少一个CpG基序。在一些实施方案中，所述第二链包含非指导区，其中所述非指导区包含与5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’(SEQ ID NO:8)具有多于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述第二链包含非指导区，其中所述非指导区包含与5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’(SEQ ID NO:8)具有多于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列但维持至少一个CpG基序。
在一些实施方案中，所述RNAi包含SEQ ID NO:4的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNAi包含与SEQ ID NO:4具有多于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNAi包含与SEQ ID NO:4具有多于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列但维持至少一个序列(例如，在种子序列中)。在一些实施方案中，所述RNAi是miRNA-207。在其它实施方案中，所述RNAi是miRNA-206。
在一些实施方案中，所述RNAi包含SEQ ID NO:10的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNAi包含与SEQ ID NO:10具有多于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNAi包含与SEQ ID NO:10具有多于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核酸序列但维持至少一个CpG序列(例如，在种子序列中)。在一些实施方案中，所述RNAi是miRNA-207。在一些实施方案中，所述RNAi是miRNA-206。
已知微小RNA(miRNA)在本领域作为诱导细胞中RNAi的RNA分子，其包含通过环连接的双链RNA的短(例如，19-25个碱基对)序列且包含含有一个或多个凸出(例如错配或未配对的碱基对)的双链RNA的一个或多个额外序列的。如本文使用的术语“miRNA”涵盖内源性miRNA以及外源或异源miRNA。在一些实施方案中，“miRNA”可指初级miRNA(pri-miRNA)或前-miRNA(pre-miRNA)。在miRNA加工过程中，产生初级miRNA转录物。通过Drosha-DGCR8加工初级miRNA以通过切除一个或多个序列而保留具有5’侧翼区、指导链、环区、非指导链和3’侧翼区；或者5’侧翼区、非指导链、环区、指导链和3’侧翼区的前-miRNA来产生前-miRNA。然后将前-RNA输出至细胞质并通过Dicer加工以得到具有指导链和非指导(或乘客)链的siRNA。所述指导链然后被RISC复合物使用以催化基因沉默，例如，通过识别与指导链互补的靶RNA序列。miRNA的进一步描述可在例如WO 2008/150897中找到。通过miRNA的靶序列识别最初由在靶标和miRNA种子序列(例如，指导链的核苷酸1-8(5’-3’))之间的配对确定(参见，例如Boudreau,R.L.等(2013)Nucleic Acids Res.41:e9)。
在初级/前-miRNA结构中，双链体中指导链:非指导链的界面部分地通过互补碱基配对形成(例如，Watson-Crick碱基配对)。然而，在一些实施方案中，此互补碱基配对不通过整个双链体延伸。在一些实施方案中，界面中凸出可在一个或多个核苷酸位置存在。如本文使用的，术语“凸出”可指与双链体中其对侧的核酸不互补的核酸区。在一些实施方案中，当互补核酸区彼此结合而中心非互补区的区域不结合时，形成凸出。在一些实施方案中，当位于两互补区之间的两核酸链的长度不同时，形成凸出。如下文所述，凸出可包含1个或多个核苷酸。
在miRNA加工过程中，在邻近指导链:非指导链界面处的切割位点切割miRNA，因此释放指导和非指导链的siRNA双链体。在一些实施方案中，所述miRNA在与切割位点邻近的有义或反义链中包含凸出。为说明另一方式，在一些实施方案中，所述miRNA在与种子序列邻近的指导或非指导链中包含凸出。参见图1A。
在一些实施方案中，所述miRNA在成熟非指导链的5’切割位点对侧的指导链中包含凸出。在一些实施方案中，所述miRNA在非指导链的5’核苷酸对侧包含凸出。在一些实施方案中，所述miRNA在成熟指导链的3’切割位点的对侧有义链中包含凸出。在一些实施方案中，所述miRNA在指导链的3’核苷酸对侧包含凸出。
在一些实施方案中，所述RNAi包含第一链和第二链，其中a)所述第一链和所述第二链形成双链体；b)所述第一链包含至少11个碱基的指导区，其中所述指导区包含含有指导链的碱基1-N的种子区，其中N＝7或N＝8；且c)所述第二链包含至少11个碱基的非指导区，其中所述非指导区包含双链体中指导区的碱基1-(N+2)的任何一个或多个碱基对侧的凸出序列。在一些实施方案中，其中N＝7且凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6、7、8或9。在其它实施方案中，N＝8且凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。
在一些实施方案中，所述RNAi包含第一链和第二链，其中a)所述第一链和所述第二链形成双链体；b)所述第一链包含至少10个碱基的指导区，其中所述指导区包含含有指导链碱基1-N的种子区，其中N＝7或N＝8；且c)所述第二链包含至少10个碱基的非指导区，其中所述非指导区包含双链体中指导区的碱基1-(N+1)的任何一个或多个碱基对侧的凸出序列。在一些实施方案中，其中N＝7且所述凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6、7或8。在其它实施方案中，N＝8且所述凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6、7、8或9。
在一些实施方案中，所述非指导区包含双链体中指导区的碱基1-N的任何一个或多个碱基对侧的凸出序列。在一些实施方案中，N＝7且所述凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6或7。在其它实施方案中，N＝8且所述凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6、7或8。
在一些实施方案中，所述RNAi包含第一链和第二链，其中a)所述第一链和所述第二链形成双链体，b)所述第一链包含至少9个碱基的指导区，其中所述指导区包含含有指导链的碱基2-7或2-8的种子区，且c)所述第二链包含至少9个碱基的非指导区，其中所述非指导区包含双链体中指导区的碱基1或碱基9的对侧的凸出序列。
在一些实施方案中，所述RNAi包含第一链和第二链，其中a)所述第一链和所述第二链形成双链体，b)所述第一链包含至少9个碱基的指导区，其中所述指导区包含含有指导链的碱基2-7或2-8的种子区，且c)所述第二链包含至少9个碱基的非指导区，其中所述非指导区包含双链体中指导区的碱基1对侧的凸出序列。
在一些实施方案中，所述凸出通过在指导区上缺乏互补碱基的双链体中的非指导链的一个或多个碱基形成，其中所述凸出的侧翼为与指导链进行碱基配对的碱基。在一些实施方案中，所述凸出序列具有约1-10个核苷酸。在一些实施方案中，所述凸出序列具有约2-15个核苷酸。在一些实施方案中，所述凸出序列具有约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15个核苷酸。
基于RNAi的疗法的安全性可被小抑制性RNA(siRNA)与非预期的mRNA结合并减少其表达的能力(称为脱靶基因沉默的作用)阻碍。脱靶主要发生在当种子区(小RNA的核苷酸2-8)与非预期的mRNA的3’-UTR中的序列配对并指导那些转录物的翻译抑制和去稳定化时。可通过取代指导和非指导序列内的碱基，例如，通过生成CpG基序来设计减少的脱靶RNAi。可使用SiSPOTR算法(一种针对特异性的siRNA设计算法，其鉴定具有最小脱靶潜力和强大的沉默能力的候选序列)评价可导致显著更低的脱靶评分的潜在取代(Boudreau等,Nucleic Acids Res.2013Jan；41(1)e9。减少的SiSPOTR评分预测与亲本RNAi分子相比具有较低潜在人脱靶数目的序列。在本发明的一些实施方案中，改进所述RNAi以减少脱靶基因沉默。在一些实施方案中，所述RNAi包含一个或多个CpG基序。在一些实施方案中，所述RNAi在种子区中包含一个或多个CpG基序。
在一些实施方案中，所述第一链和所述第二链通过能够形成环结构的RNA(例如，RNA接头)的方式连接。如本领域众所周知的，当RNA分子包含由不碱基配对在一起的RNA序列分开的碱基配对在一起的两个RNA序列时，形成RNA环结构(例如茎-环或发夹)。例如，如果序列A和C互补或部分互补使得它们碱基配对在一起，但在序列B中的碱基不碱基配对在一起，则可在RNA分子A-B-C中形成环结构。
在一些实施方案中，能够形成环结构的RNA包含4-50个核苷酸。在某些实施方案中，能够形成环结构的RNA包含13个核苷酸。在一些实施方案中，在能够形成环的RNA中核苷酸的数目为4-50个核苷酸或其间的任何整数。在一些实施方案中，0-50％的环可与环的另一部分互补。如本文使用的，术语“环结构”是接合核酸的两互补链的序列。在一些实施方案中，环结构的1-3个核苷酸邻接核酸的互补链且可与环结构远端部分的1-3个核苷酸互补。例如，在环结构的5’末端的三核苷酸可与在环结构的3’末端的三核苷酸互补。
在一些实施方案中，编码本公开的RNAi的核酸包含异源miRNA支架。在一些实施方案中，使用异源miRNA支架以调节miRNA表达，例如，为了增加miRNA表达或减少miRNA表达。可使用本领域已知的任何miRNA支架。在一些实施方案中，所述miRNA支架源自miR-155支架(参见，例如Lagos-Quintana,M.等(2002)Curr.Biol.12:735-9和来自Life Technologies,Thermo Fisher Scientific；Waltham,MA的InvitrogenTM BLOCK-iTTM Pol II miR RNAi表达载体试剂盒)。
IV.亨廷顿病及其实验模型
亨廷顿病(HD)是通过在亨廷顿蛋白基因(HTT)外显子1中扩增CAG重复引起的遗传性神经退行性疾病。所得的N-末端区中多聚谷氨酰胺束的延伸赋予突变的亨廷顿蛋白(mHtt)毒性获得性功能。mHtt毒性可由不溶的含有mHtt的聚集物的形成、转录失调和蛋白稳态的扰动引起，它们全部导致神经元死亡(Saudou等(1998)Cell,95:55-66；Zuccato等(2003)Nat.Genet.35:76-83；Schaffar等(2004)Mol.Cell.15:95-105；Benn等，(2008)J.Neurosci.28:10720-10733)。在具有HD的患者中的病理性发现包括皮质变薄和纹状体神经元惊人的进行性丧失(Rosas等，(2002)Neurology 58:695-701)。疾病发作通常在生命的30至40岁期间发生；症状包括舞蹈病样动作、协调障碍、进行性痴呆和其他精神障碍(Vonsattel等，(1985)J.Neuropathol.Exp.Neurol.44:559-577)。在大多数的情况中，症状在30-40岁之间开始出现，伴随运动技能、认知和个性的细微破坏。随着时间的过去，这些进展成为不平稳、无法控制的运动和肌肉控制的丧失、痴呆和精神疾病如抑郁、侵略、焦虑和强迫行为。死亡通常在症状发作后的10-15年发生。少于10％的HD情况涉及疾病的青少年发作形式，其特征在于更快的疾病进展。认为约10,000名美国人中约有1人具有HD。
尽管已经发现HD的遗传基础已有近20年，但现有疗法大部分是姑息的，而不解决疾病的根本原因。这可能是部分地由于如下事实：此疾病的病因学复杂，在多种细胞过程中都观察到了不利作用。因此，药物开发的焦点已针对解决主要的有害引发因素，即突变的HTT基因本身。
HD的大多数情况与HTT基因中的三核苷酸CAG重复扩增相关。HTT基因中CAG重复的数目与HD的表现强烈相关。例如，具有35或更少个重复的个体通常不发生HD，但具有27-35个重复的个体具有更高的具有患HD的后代的风险。具有36至40-42个重复的个体具有不完全外显率的HD，而具有多于40-42个重复的个体显示完全外显率。青少年发作HD的情况可与60或更多的CAG重复大小相关。
由此CAG重复扩增导致的多聚Q-扩增的Htt蛋白与细胞聚集物或包涵体、蛋白稳态的扰动和转录失调相关。尽管这些毒性表型可能在整个人体中均可见，但它们最典型地与CNS中的神经元细胞死亡相关。HD患者经常表现出皮质变薄和纹状体神经元惊人、进行性丧失。纹状体似乎是HD中的脑部的最脆弱的区域(特别是纹状体中棘神经元)，在壳核和尾状核中可见早期影响。在HD患者的脑中观察到纹状体棘神经元中的细胞死亡、星形胶质细胞数目的增加和小神经胶质细胞的激活。HD还可影响海马区、大脑皮质、丘脑、下丘脑和小脑的某些区域。
提出的阻断Htt表达的方式包括使用反义寡核苷酸(ASO)以及使用双链体RNA(dsRNA)或化学修饰的单链RNA(ssRNA)的RNA干扰(RNAi)(Harper等，(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:5820-5825；DiFiglia等,(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA104:17204-17209；Boudreau等,(2009b)Mol.Ther.17:1053-1063；Drouet等,(2009)Ann.Neurol.65:276-285；Sah等,(2011)J.Clin.Invest.121:500-507；Matsui等,(2012)Drug Discov.Today 17:443-450；Yu等,(2012)Cell 150:895-908)。然而，将ASO方式转换成临床的障碍可包括并入一种装置以促进将ASO重复和长期输注到CNS中的需要，和充分地将药物分布至大脑的靶区的需求。
为回避ASO的这些潜在问题，采用RNAi的AAV-介导的表达(例如siRNA)可为有优势的，其提供增加的安全性、增加的效率和更持久的效力的潜力。由于HD患者表达突变和野生型Htt等位基因二者，大多数siRNA靶向序列将可能降解这两种等位基因。然而，已显示HD小鼠中的非等位基因特异性Htt沉默具有良好耐受并可提供与仅减少突变Htt相同的益处(Boudreau等，(2009b)Mol.Ther.17:1053-1063；Drouet等，(2009)Ann.Neurol.65:276-285；Kordasiewicz等，(2012)Neuron 74(6):1031-1044)。此外，据报道，AAV介导的RNAi后非人灵长类的壳核中野生型Htt的部分和持续抑制不具有任何不良的效果，这表明成年脑可耐受野生型Htt水平的减少(McBride等，(2011)Mol.Ther.19:2152-2162；Grondin等，(2012)Brain 135:1197-1209)。
HD的动物模型可用于测试潜在的治疗策略，如本公开的组合物和方法。用于HD的小鼠模型是本领域已知的。这些包括具有突变的HTT片段的小鼠模型如R6/1和N171-82Q HD小鼠(Harper等，(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:5820-5825、Rodriguez-Lebron等，(2005)Mol.Ther.12:618-633、Machida等，(2006)Biochem.Biophys.Res.Commun.343:190-197)。本文所述的小鼠HD模型的另一实例是YAC128小鼠模型。此模型携带表达具有128CAG重复的突变体人HTT基因的酵母人工染色体(YAC)，且YAC128小鼠12个月龄时在纹状体中显示Htt聚集物的显著和广泛的积累(Slow等，(2003)Hum.Mol.Genet.12:1555-1567、Pouladi等，(2012)Hum.Mol.Genet.21:2219-2232)。
也可使用HD的其它动物模型。例如，已描述了转基因大鼠(von Horsten,S.等(2003)Hum.Mol.Genet.12:617-24)和恒河猴(Yang,S.H.等(2008)Nature 453:921-4)模型。还已知非遗传模型。这些最常涉及使用兴奋性毒性化合物(如喹啉酸或红藻氨酸)或线粒体毒素(如3-硝基丙酸和丙二酸)以诱导啮齿类动物或非人类灵长类动物中纹状体神经元死亡(更多的描述和参照，参见Ramaswamy,S.等(2007)ILAR J.48:356-73)。
V.治疗亨廷顿病的方法
在一些方面，本发明提供用于治疗哺乳动物中亨廷顿氏病的方法和组合物，其包括向所述哺乳动物施用本公开的药物组合物(例如，包含本公开的病毒颗粒的药物组合物)。在一些方面，本发明提供用于抑制htt在具有亨廷顿氏病的哺乳动物中表达的方法和组合物，其包括向所述哺乳动物施用本公开的药物组合物(例如，包含本公开的病毒颗粒的药物组合物)。在一些方面，本发明提供用于抑制htt在具有亨廷顿氏病的哺乳动物的细胞中积累的方法和组合物，其包括向所述哺乳动物施用本公开的药物组合物(例如，包含本公开的病毒颗粒的药物组合物)。
在一些方面，本发明提供用于减轻HD的症状的方法和组合物，其包括将有效量的包含编码本公开的RNAi的载体的重组病毒颗粒施用至哺乳动物的脑。在一些实施方案中，HD的症状包括但不限于舞蹈病、强直、无法控制的身体运动、肌肉控制的丧失、缺乏协调、躁动、眼部运动减慢、异常姿态、不稳、共济失调步态、面部表情异常、言语障碍、咀嚼和/或吞咽困难、睡眠障碍、癫痫、痴呆、认知障碍(例如，涉及规划、抽象思维、灵活性、规则获取、人际关系敏感性、自我控制、注意力、学习和记忆的能力减退)、抑郁、焦虑、人格改变、侵略、强迫行为、强迫型行为(obsessive-compulsive behavior)、性欲亢进、精神病、情感淡漠、易怒、自杀的念头、体重减轻、肌肉萎缩、心力衰竭、葡萄糖耐受降低、睾丸萎缩和骨质疏松症。
在一些方面，本发明提供用以预防或延迟HD进展的方法。常染色体显性HD是可进行基因分型的遗传性疾病。例如，HTT中CAG重复的数目可通过基于PCR的重复大小确定。此类型的诊断可在生命的任何阶段通过直接检测青少年或成人(例如，伴随临床症状的表现)、产前筛查或产前排除测试(例如，通过绒毛膜绒毛取样或羊膜穿刺术)或胚胎植入前筛查实施。同样地，本文所述的方法可用作HD的预防性治疗，这是由于诊断可在症状发作前发生。例如，可通过基因检测(产前检查、出生检查等)诊断HD，并在症状发作前(例如，CNS细胞丧失)进行预防性治疗(例如，使用本文所述的rAAV颗粒)以预防HD症状发作和/或进展。如通过脑成像可见的，HD患者可显示出尾状核和/或壳核和/或皮质的收缩和/或脑室扩大。这些症状，结合HD的家族史和/或临床症状，可指示HD。
用于确定HD症状的减轻的手段是本领域已知的。例如，统一的亨廷顿氏病评定量表(UHDRS)可用于评估运动功能、认知功能、行为异常和功能性能力(参见，例如HuntingtonStudy Group(1996)Movement Disorders 11:136-42)。建立此评定量表以提供针对疾病病理的多个特征的统一、全面的测试，其并入来自测试的元素，所述测试如HD活动和日常生活能力量表(HDActivities and Daily Living Scale)、马斯登和奎因的舞蹈病严重程度量表(Marsdenand Quinn’s chorea severity scale)、身体残疾和独立量表(PhysicalDisability and Independence scales)、HD运动评定量表(HD motor rating scale)(HDMRS)、HD功能性能力量表(HD functional capacity scale)(HDFCS)和神经定量检查(QNE)。用于确定HD症状的减轻的其它测试可包括但不限于蒙特利尔认知评估(MontrealCognitive Assessment)、脑成像(例如MRI)、分类流畅性测验(Category Fluency Test)、连线测验(Trail Making Test)、地图搜索(Map Search)、斯特鲁普字阅读测试(StroopWord Reading Test)、加快拍打任务(Speeded Tapping Task)和符号数字模式测试(Symbol Digit ModalitiesTest)。
在本发明的一些方面中，所述方法和组合物用于治疗具有HD的人。如上文所述，HD以常染色体显性的方式遗传，且是由HTT基因中的CAG重复扩增导致的。青少年发作HD最常从父系遗传。亨廷顿疾病样表型已与其它基因座如HDL1、PRNP、HDL2、HDL3和HDL4相关。认为其它基因座可修饰HD症状的表现，包括GRIN2A、GRIN2B、MSX1、GRIK2和APOE基因中的突变。
在一些方面，本发明提供用于靶向具有亨廷顿氏病的哺乳动物中的htt mRNA的改进的RNAi。在一些实施方案中，所述RNAi包含第一链和第二链，所述第一链包含含有序列5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸。如本文所述的RNAi(例如，作为rAAV载体的一部分)可用于，特别是治疗亨廷顿氏病。
在一些方面中，本发明提供改进的RNAi，其用于靶向具有亨廷顿氏病的哺乳动物中的htt mRNA。在一些实施方案中，所述RNAi包含第一链和第二链，所述第一链包含含有序列5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’(SEQ ID NO:8)的第二核酸。本文所述的RNAi(例如，作为rAAV载体的一部分)可用于，特别是治疗亨廷顿氏病。
在本发明的一些实施方案中，改进所述RNAi以减少脱靶基因沉默。在一些实施方案中，所述RNAi包含一个或多个CpG基序。在一些实施方案中，所述RNAi在种子区中包含一个或多个CpG基序。
在一些实施方案中，所述第一链包含与SEQ ID NO:1具有多于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任何同一性的核酸序列但维持CpG基序。在一些实施方案中，所述第二链包含与SEQ ID NO:2具有多于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任何同一性的核酸序列但维持CpG基序。
在一些实施方案中，所述第一链包含与SEQ ID NO:7具有多于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任何同一性的核酸序列但维持CpG基序。在一些实施方案中，所述第二链包含与SEQ ID NO:8具有多于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任何同一性的核酸序列但维持CpG基序。
在一些实施方案中，所述RNAi是小抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或小发夹RNA(shRNA)。已知小抑制性或干扰RNA(siRNA)在本领域中作为长度为19-25(例如，19-23)个碱基对的诱导细胞中RNAi的双链RNA分子。已知小发夹RNA(shRNA)在本领域中作为RNA分子，其包含通过在细胞中诱导RNAi的短环(例如，～4-11个核苷酸)连接的双链RNA的大约19-25(例如，19-23)个碱基对。
在一些实施方案中，所述miRNA包含与SEQ ID NO:1约90％同一的指导序列。在一些实施方案中，所述miRNA包含指导序列，该指导序列与SEQ ID NO:1约90％同一、91％同一、92％同一、93％同一、94％同一、95％同一、96％同一、97％同一、98％同一、99％同一或100％同一中的任何。
在一些实施方案中，所述miRNA包含与SEQ ID NO:2约90％同一的非指导序列。在一些实施方案中，所述miRNA包含非指导序列，该非指导序列与SEQ ID NO:2约90％同一、91％同一、92％同一、93％同一、94％同一、95％同一、96％同一、97％同一、98％同一、99％同一或100％同一中的任何。
在一些实施方案中，所述miRNA包含与SEQ ID NO:7约90％同一的指导序列。在一些实施方案中，所述miRNA包含指导序列，该指导序列与SEQ ID NO:7约90％同一、91％同一、92％同一、93％同一、94％同一、95％同一、96％同一、97％同一、98％同一、99％同一或100％同一中的任何。
在一些实施方案中，所述miRNA包含与SEQ ID NO:8约90％同一的非指导序列。在一些实施方案中，所述miRNA包含非指导序列，该非指导序列与SEQ ID NO:8约90％同一、91％同一、92％同一、93％同一、94％同一、95％同一、96％同一、97％同一、98％同一、99％同一或100％同一的任何。
在一些实施方案中，所述第一链和所述第二链通过能够形成环结构的RNA的方式连接。如本领域中众所周知的，当RNA分子包含由不碱基配对在一起的RNA序列分开的碱基配对在一起的RNA的两个序列时，形成RNA环结构(例如，茎-环或发夹)。例如，如果序列A和C互补或部分互补使得它们碱基配对在一起，但在序列B中的碱基不碱基配对在一起，则可在RNA分子A-B-C中形成环结构。
在一些实施方案中，能够形成环结构的RNA包含4至50个核苷酸。在某些实施方案中，能够形成环结构的RNA包含13个核苷酸。在某些实施方案中，能够形成环结构的RNA包含核苷酸序列GUUUUGGCCACUGACUGAC(SEQ ID NO:13)。在一些实施方案中，所述载体基因组包含与SEQ ID NO:13的序列至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一中的任何的核苷酸序列。
在一些方面中，本发明提供包括向哺乳动物(例如，具有HD的哺乳动物)施用包含第一链和第二链的RNAi的方法，所述第一链包含含有序列5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸。在一些实施方案中，重组病毒颗粒包含所述RNAi。在一些实施方案中，所述重组病毒颗粒是衣壳化rAAV载体的AAV颗粒、衣壳化重组腺病毒载体的腺病毒颗粒、衣壳化重组慢病毒载体的慢病毒颗粒或衣壳化重组HSV载体的HSV颗粒，其中所述rAAV载体、所述腺病毒载体、所述慢病毒载体或所述HSV载体编码所述RNAi。
在一些方面中，本发明提供包括向哺乳动物(例如，具有HD的哺乳动物)施用包含第一链和第二链的RNAi的方法，所述第一链包含含有序列5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’(SEQ ID NO:8)的第二核酸。在一些实施方案中，重组病毒颗粒包含所述RNAi。在一些实施方案中，所述重组病毒颗粒是衣壳化rAAV载体的AAV颗粒、衣壳化重组腺病毒载体的腺病毒颗粒、衣壳化重组慢病毒载体的慢病毒颗粒或衣壳化重组HSV载体的HSV颗粒，其中所述rAAV载体、所述腺病毒载体、所述慢病毒载体或所述HSV载体编码RNAi。
在一些实施方案中，重组病毒颗粒的递送是通过将病毒颗粒注射至脑。在一些实施方案中，重组病毒颗粒的递送是通过将病毒颗粒注射至纹状体。纹状体内施用将重组病毒颗粒递送至受HD高度影响的脑部区域、纹状体(包括壳核和尾状核)。此外，且不希望受理论限制，认为注射入纹状体的重组病毒颗粒(例如，rAAV颗粒)还可分散(例如，通过逆行转运)至脑部的其它区域，包括但不限于投射区域(例如，皮质)。在一些实施方案中，重组病毒颗粒通过对流增强递送进行递送(例如，对流增强递送至纹状体)。
在一些方面中，本发明提供用于治疗哺乳动物中亨廷顿氏病的方法，其包括向所述哺乳动物施用本公开的药物组合物。在一些方面中，本发明提供用于抑制htt在具有亨廷顿病的哺乳动物的细胞中积累的方法，其包括向所述哺乳动物施用本公开的药物组合物。在一些方面中，本发明提供用于抑制htt在具有亨廷顿病的哺乳动物中表达的方法，其包括向所述哺乳动物施用本公开的药物组合物。在一些实施方案中，所述htt是突变体htt(例如，包含多于35、多于36、多于37、多于38、多于39、多于40、多于41或多于42个CAG重复的htt)。在一些实施方案中，野生型htt的表达和/或积累也受到抑制。如本文所述的，且不希望受到理论限制，认为抑制突变体htt在具有HD的哺乳动物中的表达和/或积累是高度有益的，但在相同的哺乳动物中野生型htt表达和/或积累的抑制作为副作用(例如，本公开的RNAi的副作用)是可以良好耐受的(例如，产生极少或不产生非预期的副作用)。
在一些实施方案中，细胞包含载体(例如，包含编码本公开的RNAi的表达构建体的载体)。在一些实施方案中，所述载体是rAAV载体。在一些实施方案中，所述载体是重组腺病毒载体、重组慢病毒载体或重组单纯疱疹病毒(HSV)载体。在一些实施方案中，所述细胞是中枢神经系统(CNS)细胞。
在一些实施方案中，有效量的包含编码本公开的RNAi的载体的重组病毒颗粒的施用在或靠近施用位点处转导神经元(例如，纹状体神经元，如棘神经元)。在一些实施方案中，转导了多于约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或100％中任何的神经元。在一些实施方案中，转导了约5％至约100％、约10％至约50％、约10％至约30％、约25％至约75％、约25％至约50％或约30％至约50％的神经元。本领域已知鉴定通过表达miRNA的重组病毒颗粒转导的神经元的方法；例如，免疫组织化学、RNA检测(例如，qPCR、Northern印迹、RNA-seq、原位杂交等)或共表达的标记物(如增强的绿色荧光蛋白)的使用可用于检测表达。
在本发明的一些实施方案中，所述方法包括将有效量的重组病毒颗粒施用至哺乳动物的脑部用于治疗具有HD的哺乳动物，例如人，其中所述重组病毒颗粒包含编码本公开的RNAi的载体。在一些实施方案中，将所述组合物注射至脑中的一处或多处位置以允许本公开的RNAi至少在神经元中表达。在一些实施方案中，将所述组合物注射入脑中的一处、两处、三处、四处、五处、六处、七处、八处、九处、十处或多于十处的位置中的任何。在一些实施方案中，将所述组合物注射入纹状体。在一些实施方案中，将所述组合物注射入背侧纹状体。在一些实施方案中，将所述组合物注射入壳核。在一些实施方案中，将所述组合物注射入尾状核。在一些实施方案中，将所述组合物注射入壳核并注射入尾状核。
在一些实施方案中，将所述重组病毒颗粒施用至脑部的一个半球。在一些实施方案中，将重组病毒颗粒施用至脑部的两半球。
在一些实施方案中，将所述重组病毒颗粒同时或顺序地施用至多于一处的位置。在一些实施方案中，重组病毒颗粒的多次注射的间隔不多于1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、9小时、12小时或24小时。
在一些实施方案中，本发明提供通过施用有效量的包含编码本公开的RNAi的重组病毒载体的药物组合物以抑制突变的HTT的活性来治疗具有HD的人的方法。在一些实施方案中，所述药物组合物包含一个或多个药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述方法包括施用有效量含有编码本公开的RNAi的重组病毒载体的药物组合物以抑制突变的HTT的活性。在一些实施方案中，病毒颗粒(例如，rAAV颗粒)的病毒滴度为至少约任何5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、10×1012、11×1012、15×1012、20×1012、25×1012、30×1012或50×1012个基因组拷贝/mL中的任何。在一些实施方案中，病毒颗粒(例如，rAAV颗粒)的病毒滴度为约5×1012至6×1012、6×1012至7×1012、7×1012至8×1012、8×1012至9×1012、9×1012至10×1012、10×1012至11×1012、11×1012至15×1012、15×1012至20×1012、20×1012至25×1012、25×1012至30×1012、30×1012至50×1012或50×1012至100×1012个基因组拷贝/mL中的任何。在一些实施方案中，病毒颗粒(例如rAAV颗粒)的病毒滴度为约5×1012至10×1012、10×1012至25×1012或25×1012至50×1012个基因组拷贝/mL中的任何。在一些实施方案中，病毒颗粒(例如，rAAV颗粒)的病毒滴度为至少约5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、10×109、11×109、15×109、20×109、25×109、30×109或50×109个转导单位/mL中的任何。在一些实施方案中，病毒颗粒(例如，rAAV颗粒)的病毒滴度为约5×109至6×109、6×109至7×109、7×109至8×109、8×109至9×109、9×109至10×109、10×109至11×109、11×109至15×109、15×109至20×109、20×109至25×109、25×109至30×109、30×109至50×109或50×109至100×109个转导单位/mL中的任何。在一些实施方案中，病毒颗粒(例如，rAAV颗粒)的病毒滴度为约5×109至10×109、10×109至15×109、15×109至25×109或25×109至50×109个转导单位/mL中的任何。在一些实施方案中，病毒颗粒(例如，rAAV颗粒)的病毒滴度为至少约5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、10×1010、11×1010、15×1010、20×1010、25×1010、30×1010、40×1010或50×1010个感染单位/mL中的任何。在一些实施方案中，病毒颗粒(例如，rAAV颗粒)的病毒滴度为至少约5×1010至6×1010、6×1010至7×1010、7×1010至8×1010、8×1010至9×1010、9×1010至10×1010、10×1010至11×1010、11×1010至15×1010、15×1010至20×1010、20×1010至25×1010、25×1010至30×1010、30×1010至40×1010、40×1010至50×1010或50×1010至100×1010个感染单位/mL中的任何。在一些实施方案中，病毒颗粒(例如，rAAV颗粒)的病毒滴度为至少约5×1010至10×1010、10×1010至15×1010、15×1010至25×1010或25×1010至50×1010个感染单位/mL中的任何。
在一些实施方案中，施用至个体的病毒颗粒的剂量为至少约1×108至约1×1013个基因组拷贝/kg体重中的任何。在一些实施方案中，施用至个体的病毒颗粒的剂量为约1×108至约1×1013基因组拷贝/kg体重。
在一些实施方案中，施用至个体的病毒颗粒的总量为至少约1×109至约1×1014个基因组拷贝中的任何。在一些实施方案中，施用至个体的病毒颗粒总量为约1×109至约1×1014个基因组拷贝中的任何。
在本发明的一些实施方案中，注射至纹状体的组合物的体积多于约1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、15μl、20μl、25μl、50μl、75μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl或1mL中的任何，或其之间的任何量。
在一些实施方案中，将第一体积的组合物注射入脑部的第一区，并将第二体积的组合物注射入脑部的第二区。例如，在一些实施方案中，将第一体积的组合物注射入尾状核，并将第二体积的组合物注射入壳核。在一些实施方案中，将1X体积的组合物注射入尾状核，并将1.5X、2X、2.5X、3X、3.5X,或4X体积的组合物注射入壳核，其中X是多于约1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、15μl、20μl、25μl、50μl、75μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl或1mL中的任何，或其之间的任何量的体积。
本发明的组合物(例如，包含编码本公开的RNAi的载体的重组病毒颗粒)可单独或与一个或多个额外的治疗剂组合使用用于治疗HD。顺序施用之间的间隔可按照至少(或可替换地，少于)数分钟、数小时或数天。
V.RNAi表达构建体和载体
本发明提供用于表达本文所述的RNAi的表达构建体、载体和病毒颗粒。
在一些实施方案中，编码本公开的RNAi的核酸包含异源miRNA支架。在一些实施方案中，使用异源miRNA支架用于调节miRNA表达；例如，用于增加miRNA表达或减少miRNA表达。可使用本领域已知的任何miRNA支架。在一些实施方案中，所述miRNA支架衍生自miR-155支架(参见，例如，Lagos-Quintana,M.等(2002)Curr.Biol.12:735-9和来自LifeTechnologies,Thermo Fisher Scientific；Waltham,MA的InvitrogenTM BLOCK-iTTM PolII miR RNAi表达载体试剂盒)。在一些实施方案中，编码本公开的RNAi的核酸包含miRNA支架。在一些实施方案中，miRNA支架由SEQ ID NO:14提供。
在一些实施方案中，所述RNAi靶向编码与亨廷顿氏病相关的多肽(例如，突变的HTT)的RNA。不希望受理论束缚，认为RNAi可用于降低或消除多肽的表达和/或活性，该多肽的获得性功能已与亨廷顿氏病(例如，突变的HTT)相关。
在一些实施方案中，转基因(例如，本公开的RNAi)与启动子可操作地连接。示例性启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、RSV LTR、MoMLVLTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子和CK6启动子、转甲状腺素蛋白启动子(TTR)、TK启动子、四环素响应性启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合体肝脏特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-珠蛋白启动子(CAG启动子；Niwa等，Gene,1991,108(2):193-9)和延伸因子1-α启动子(EFl-α)启动子(Kim等，Gene,1990,91(2):217-23和Guo等，Gene Ther.,1996,3(9):802-10)。在一些实施方案中，所述启动子包含人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子或与鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子连接的巨细胞病毒增强子。所述启动子可以是组成型、诱导型或阻遏型启动子。在一些实施方案中，本发明提供重组载体，其包含与CBA启动子可操作连接的编码本发明异源转基因的核酸。示例性的启动子和描述可在例如，U.S.PG Pub.20140335054中发现。在一些实施方案中，启动子是CBA启动子、最小CBA启动子、CMV启动子或GUSB启动子。
组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(retroviralRoussarcoma virus，RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)[参见，例如Boshart等，Cell,41:521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、13-肌动蛋白启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子和EF1a启动子[Invitrogen]。
诱导型启动子允许调节基因表达且可通过外源补给的化合物、环境因素如温度或特定的生理状态(例如，急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中)的存在来调节。诱导型启动子和诱导系统可从多种商业来源获得，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。已描述了许多其它的系统且可由本领域的技术人员容易地选择。通过外源补给的启动子调节的诱导型启动子的实例包括锌诱导型羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)-诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996))、四环素阻遏系统(Gossen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))、四环素诱导系统(Gossen等，Science,268:1766-1769(1995)，另见Harvey等，Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998))、RU486-诱导系统(Wang等，Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang等，GeneTher.,4:432-441(1997))和雷帕霉素-诱导系统(Magari等，J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997))。可在此上下文中有用的其它类型的诱导型启动子是通过特定生理状态调节的启动子，例如温度、急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制中的细胞。
在另一实施方案中，将会使用天然启动子或其片段用于转基因。当预期转基因的表达应模拟天然表达时，天然启动子可以是优选的。当必须暂时或发展性或以组织特异性的方式或响应于特定转录刺激物调节转基因的表达时，可使用天然启动子。在进一步的实施方案中，也可使用其它天然表达控制元件如增强子元件、多腺苷酸化位点或Kozak共有序列以模拟天然表达。
在一些实施方案中，调节序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况中，组织特异性调节序列结合以组织特异性的方式诱导转录的组织特异性转录因子。此类组织特异性调节序列(例如，启动子、增强子等)为本领域熟知的。示例性组织特异性调节序列包括但不限于下列组织特异性启动子：神经元性如神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(Andersen等，Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993))、神经丝轻链基因启动子(Piccioli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5(1991))和神经元特异性vgf基因启动子(Piccioli等，Neuron,15:373-84(1995))。在一些实施方案中，组织特异性启动子是选自下组的基因的启动子：神经元核(NeuN)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、腺瘤性结肠息肉病(APC)和离子化钙结合适配分子1(Iba-1)。其它合适的组织特异性启动子对于本领域的技术人员将是显而易见的。在一些实施方案中，启动子是鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。
在一些实施方案中，启动子在CNS的细胞中表达异源核酸。同样地，在一些实施方案中，本发明的治疗性多肽或治疗性核酸可用于治疗CNS的病症。在一些实施方案中，启动子在脑细胞中表达异源核酸。脑细胞可指本领域已知的任何脑细胞，包括但不限于神经元(如感觉神经元、运动神经元、中间神经元、多巴胺能神经元、中型多棘神经元、胆碱能神经元、GABA能神经元、锥体神经元等)、神经胶质细胞(如小神经胶质细胞、大胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、放射状胶质细胞等)、脑实质细胞、小神经胶质细胞、室管膜细胞和/或浦肯野(Purkinje)细胞。在一些实施方案中，启动子在神经元和/或神经胶质细胞中表达异源核酸。在一些实施方案中，神经元是尾状核的中型多棘神经元、壳核的中型多棘神经元、皮质层IV的神经元和/或皮质层V的神经元。
在CNS细胞、脑细胞、神经元和神经胶质细胞中表达转录物(例如，异源转基因)的多种启动子是本领域已知的且描述于本文。此类启动子可包含与所选基因或异源控制序列相关的控制序列。经常，有用的异源控制序列包括衍生自编码哺乳动物或病毒基因的序列的异源控制序列。实例包括但不限于SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)、单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子区(CMVIE)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、合成的启动子、杂合的启动子等。此外，也可使用衍生自非病毒基因如鼠类金属硫蛋白基因的序列。此类启动子序列是从例如Stratagene(SanDiego,CA)商业上可得到的。可使用CNS-特异性启动子和诱导型启动子。CNS-特异性启动子的实例包括但不限于分离自CNS-特异性基因如髓鞘碱性蛋白(MBP)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的那些启动子。诱导型启动子的实例包括对于蜕皮激素、四环素、金属硫蛋白、特别是低氧的DNA响应性元件。
本发明考虑重组病毒基因组用于将一个或多个编码如本文所述的RNAi的核酸序列导入或包装入AAV病毒颗粒的用途。重组病毒基因组可包括任何元件以建立RNAi的表达，例如，启动子的全部或功能部分、内含子(例如，嵌合内含子)、异源核酸、ITR、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择性标记物、内含子、多聚A信号和/或复制起点。在一些实施方案中，rAAV载体包含一个或多个增强子、内含子(例如，剪接供体/剪接受体对)、基质附接位点或多腺苷酸化信号。用于本发明的多种内含子是本领域技术人员已知的，且包括MVM内含子、FIX截短的内含子1、β-球蛋白SD/免疫球蛋白重链SA、腺病毒SD/免疫球蛋白SA、SV40晚期SD/SA(19S/16S)和杂合的腺病毒SD/IgG SA。(Wu等2008、Kurachi等,1995、Choi等2014)、Wong等1985,Yew等1997,Huang和Gorman(1990)。
在一些实施方案中，包含编码RNAi的载体的rAAV颗粒的有效量的施用在或邻近施用位点(例如，纹状体和/或皮质)处或距施用位点的更远处转导细胞(例如，CNS细胞、脑细胞、神经元和/或神经胶质细胞)。在一些实施方案中，转导了多于约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或100％中任何的神经元。在一些实施方案中，转导了约5％至约100％、约10％至约50％、约10％至约30％、约25％至约75％、约25％至约50％或约30％至约50％的神经元。鉴定通过表达miRNA的重组病毒颗粒转导的神经元的方法为本领域已知；例如，免疫组织化学、RNA检测(例如，qPCR、Northern印迹、RNA-seq、原位杂交等)或共表达的标记物(如增强的绿色荧光蛋白)的使用可用于检测表达。
在一些方面中，本发明提供包含重组自身互补的基因组(例如，自身互补的rAAV载体)的病毒颗粒。具有自身互补载体基因组的AAV病毒颗粒和自身互补的AAV基因组的使用方法描述于美国专利号6,596,535；7,125,717；7,465,583；7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054和8,361,457和Wang Z.,等，(2003)Gene Ther 10:2105-2111，其中每个通过提述以其整体并入本文。包含自身互补的基因组的rAAV将凭借其部分互补序列(例如，异源核酸的互补编码和非编码链)迅速形成双链DNA分子。在一些实施方案中，载体包含编码异源核酸的第一核酸序列和编码核酸的互补物的第二核酸序列，其中第一核酸序列可与第二核酸序列沿其长度的大部分或全部形成链内碱基对。
在一些实施方案中，编码RNAi的第一异源核酸序列和编码RNAi的互补物的第二异源核酸序列通过突变的ITR(例如，右侧ITR)连接。在一些实施方案中，ITR包含多核苷酸序列5’-CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGA-3(SEQ ID NO:15)。突变的ITR包含含有末端解析序列的D区的缺失。结果，在复制AAV病毒基因组时，rep蛋白将不会在突变的ITR切割病毒基因组，且如此，以5’-3’顺序包含下列的重组病毒基因组会被包装在病毒衣壳中：AAV ITR、包括调节序列的第一异源多核苷酸序列、突变的AAV ITR、与第一异源多核苷酸反向的第二异源多核苷酸和第三AAV ITR。
VI.病毒颗粒和产生病毒颗粒的方法
本发明特别提供，特别是包含编码本公开的RNAi的核酸的重组病毒颗粒以及使用其来治疗哺乳动物中的疾病或病症(例如，亨廷顿氏病)的方法。
病毒颗粒
本发明提供包含本文公开的RNAi的病毒颗粒。在一些实施方案中，本发明提供用于递送本文公开的本发明的RNAi的病毒颗粒。例如，本发明提供使用重组病毒颗粒来递送RNAi以治疗哺乳动物中的疾病或病症的方法；例如，包含RNAi以治疗HD的rAAV颗粒。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组AAV颗粒。在一些实施方案中，病毒颗粒是重组AAV颗粒，其包含含有侧翼为一个或两个ITR的本公开的序列RNAi的核酸。所述核酸在AAV颗粒中衣壳化。所述AAV颗粒还包含衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述核酸包含可操作地连接转录方向上的组分的感兴趣的编码序列、控制序列(包括转录起始和终止序列)，由此形成表达盒。表达盒的5’和3’末端侧翼为至少一个功能性AAV ITR序列。“功能性AAV ITR序列”意为旨在用于AAV病毒粒的挽救、复制和包装的ITR序列功能。参见Davidson等，PNAS,2000,97(7)3428-32；Passini等，J.Virol.,2003,77(12):7034-40；和Pechan等，Gene Ther.,2009,16:10-16，其全部通过提述以其整体并入本文。为了实践本发明的一些方面，所述重组载体包含至少全部的衣壳化所必需的AAV序列和用于由rAAV感染的物理结构。供本发明的载体使用的AAV ITR不需要具有野生型核苷酸序列(例如，如Kotin,Hum.Gene Ther.,1994,5:793-801中所述)，且可通过核苷酸的插入、缺失或取代而被改变，或者AAVITR可衍生自若干种AAV血清型中的任何。目前已知多于40种AAV血清型，且持续鉴定了新型血清型和已有血清型的变体。参见Gao等，PNAS,2002,99(18):11854-6；Gao等，PNAS,2003,100(10):6081-6；和Bossis等，J.Virol.,2003,77(12):6799-810。认为任何AAV血清型的使用均在本发明的范围之内。在一些实施方案中，rAAV载体是衍生自AAV血清型的载体，包括但不限于，AAV ITR为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV衣壳血清型ITR等等。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV的ITR或小鼠AAV衣壳血清型ITR等。在一些实施方案中，AAV中的核酸进一步编码如本文所述的RNAi。例如，AAV中的核酸可包含本文涵盖的任何AAV血清型的至少一个ITR且可进一步编码包含含有指导区的一条链和含有非指导区的另一条链的RNAi。在一个实施方案中，AAV中的核酸可包含任何AAV血清型的至少一个ITR且可进一步编码包含第一链和第二链的RNAi，所述第一链包含含有序列5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸以5’至3’包含编码以下的核酸：ITR(例如，AAV2ITR)、启动子、编码如本文公开的RNAi的核酸、多腺苷酸化信号和AAV ITR(例如，AAV2 ITR)。在一些实施方案中，AAV中的核酸以5’至3’包含编码以下的核酸：ITR(例如，AAV2 ITR)、启动子、编码包含第一链和第二链的RNAi的核酸、多腺苷酸化信号和AAV ITR(例如，AAV2 ITR)，所述第一链包含含有序列5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸以5’至3’包含编码以下的核酸：ITR(例如，AAV2 ITR)、CBA启动子、编码如本文公开的RNAi的核酸、多腺苷酸化信号(例如，牛生长激素多聚A)和AAV ITR(例如，AAV2ITR)。在一些实施方案中，AAV中的核酸以5’至3’包含编码以下的核酸：ITR(例如，AAV2ITR)、CBA启动子、内含子(例如，嵌合内含子)、编码包含第一链和第二链的RNAi的核酸、多腺苷酸化信号(例如，牛生长激素多聚A)和AAV ITR(例如，AAV2ITR)的全部或功能部分，所述第一链包含含有序列5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCC G-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-CGGGUCCAAGA UGGACGGCCA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸。在一些实施方案中，所述第一链和第二链形成双链体。在一些实施方案中，所述第一链与所述第二链通过接头连接。在一些实施方案中，所述接头包含SEQ ID NO:13的核酸序列。
在一些实施方案中，AAV中的核酸以5’至3’包含编码以下的核酸：ITR(例如，AAV2ITR)、CBA启动子、编码包含第一链和包含第二链的RNAi的核酸、多腺苷酸化信号(例如，牛生长激素多聚A)和AAV ITR(例如，AAV2ITR)，所述第一链包含含有序列5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’(SEQ ID NO:2)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’(SEQ ID NO:1)的第二核酸。在一些实施方案中，所述第一链和第二链形成双链体。在一些实施方案中，所述第一链与所述第二链通过接头连接。在一些实施方案中，所述接头包含SEQ ID NO:13的核酸序列。
在另一实施方案中，AAV中的核酸可包含本文预期的任何AAV血清型的至少一个ITR且可进一步编码包含第一链和第二链的RNAi，所述第一链包含含有序列5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’(SEQ ID NO:8)的第二核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸以5’至3’包含编码以下的核酸：ITR(例如，AAV2 ITR)、启动子、编码如本文公开的RNAi的核酸、多腺苷酸化信号和AAV ITR(例如，AAV2 ITR)。在一些实施方案中，AAV中的核酸以5’至3’包含编码以下的核酸：ITR(例如，AAV2 ITR)、启动子、编码包含第一链和第二链的RNAi的核酸、多腺苷酸化信号和AAV ITR(例如，AAV2 ITR)，所述第一链包含含有序列5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’(SEQ ID NO:8)的第二核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸以5’至3’包含编码以下的核酸：ITR(例如，AAV2 ITR)、CBA启动子、嵌合内含子、编码如本文公开的RNAi的核酸、多腺苷酸化信号(例如，牛生长激素多聚A)和AAV ITR(例如，AAV2ITR)。在一些实施方案中，AAV中的核酸以5’至3’包含编码以下的核酸：ITR(例如，AAV2ITR)、CBA启动子、嵌合内含子、编码包含第一链和第二链的RNAi的核酸、多腺苷酸化信号(例如，牛生长激素多聚A)和AAV ITR(例如，AAV2ITR)，所述第一链包含含有序列5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’(SEQ ID NO:8)的第二核酸。在一些实施方案中，所述第一链和第二链形成双链体。在一些实施方案中，所述第一链与所述第二链通过接头连接。在一些实施方案中，所述接头包含SEQ ID NO:13的核酸序列。
在另一实施方案中，AAV中的核酸可包含本文预期的任何AAV血清型的至少一个ITR且可进一步编码包含第一链和第二链的RNAi，所述第一链包含含有序列5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’(SEQ ID NO:8)的第一核酸且所述第二链包含含有序列AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)的第二核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸以5’至3’包含编码以下的核酸：ITR(例如，AAV2 ITR)、启动子、编码如本文公开的RNAi的核酸、多腺苷酸化信号和AAV ITR(例如，AAV2 ITR)。在一些实施方案中，AAV中的核酸以5’至3’包含编码以下的核酸：ITR(例如，AAV2 ITR)、启动子、内含子、编码包含第一链和第二链的RNAi的核酸、多腺苷酸化信号和AAV ITR(例如，AAV2ITR)，所述第一链包含含有序列5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’(SEQ ID NO:8)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)的第二核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸以5’至3’包含编码以下的核酸：ITR(例如，AAV2 ITR)、CBA启动子、编码如本文公开的RNAi的核酸、多腺苷酸化信号(例如，牛生长激素多聚A)和AAV ITR(例如，AAV2 ITR)。在一些实施方案中，AAV中的核酸以5’至3’包含编码以下的核酸：ITR(例如，AAV2 ITR)、CBA启动子、内含子、编码包含第一链和第二链的RNAi的核酸、多腺苷酸化信号(例如，牛生长激素多聚A)和AAV ITR(例如，AAV2 ITR)，所述第一链包含含有序列5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)的第二核酸。在一些实施方案中，所述第一链和第二链形成双链体。在一些实施方案中，所述第一链与所述第二链通过接头连接。在一些实施方案中，所述接头包含SEQ ID NO:13的核酸序列。
在一些实施方案中，载体可包括(一个或多个)填充核酸。在一些实施方案中，填充核酸可编码报告分子多肽的序列。如将由本领域技术人员所理解的，填充核酸可位于载体内的多个区域中，且可由连续序列(例如，单个位置中的单个填充核酸)或载体内的多个序列(例如，多于一个位置(例如，2处位置、3处位置等)中的多于一个填充核酸)组成。在一些实施方案中，填充核酸可位于RNAi序列的下游。在实施方案中，填充核酸可位于RNAi序列的上游(例如，在启动子和编码RNAi的核酸之间)。如本领域技术人员还将理解的，多种核酸可以用作填充核酸。在一些实施方案中，填充核酸包含是α-1-抗胰蛋白酶(AAT)填充序列或C16P1染色体16P1克隆(人C16)填充序列的全部或部分。在一些实施方案中，填充序列包含基因的全部或部分。例如，填充序列包含一部分人AAT序列。本领域技术人员将会认识到不同部分的基因(例如，人AAT序列)可用作填充片段。例如，填充片段可来自基因的5’末端、基因的3’末端、基因的中间、基因的非编码部分(例如，内含子)、基因的编码区(例如，外显子)，或基因的非编码和编码部分的混合物。本领域技术人员还将认识到所有或部分填充序列可用作填充序列。在一些实施方案中，填充序列包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列。
在进一步的实施方案中，rAAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh8R、AAVrh.10、AAV11、AAV12的衣壳蛋白，或这些衣壳蛋白的突变体。在一些实施方案中，突变的衣壳蛋白维持形成AAV衣壳的能力。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV5酪氨酸突变的衣壳(Zhong L.等，(2008)Proc Natl Acad Sci U S A105(22):7827-7832。在进一步的实施方案中，rAAV颗粒包含来自进化枝A-F的AAV血清型的衣壳蛋白(Gao，等，J.Virol.2004,78(12):6381)。
将不同AAV血清型用于优化特定靶细胞的转导或用于靶向特定靶组织内(例如，疾病组织)的特定细胞类型。rAAV颗粒可包含病毒蛋白和相同血清型或混合的血清型的病毒核酸。例如，在一些实施方案中，rAAV颗粒可包含AAV1衣壳蛋白和至少一种AAV2 ITR或者它可包含AAV2衣壳蛋白和至少一个AAV1ITR。本文提供用于产生rAAV颗粒的AAV血清型的任何组合，正如每种组合均已在本文明确陈述一般。在一些实施方案中，本发明提供rAAV颗粒，其包含本公开的AAV1衣壳和rAAV载体(例如，包含编码本公开的RNAi的核酸的表达盒)，其侧翼为至少一个AAV2 ITR。在一些实施方案中，本发明提供包含AAV2衣壳的rAAV颗粒。
在一些方面，本发明提供包含重组自身互补的基因组的病毒颗粒。具有自身互补的基因组的AAV病毒颗粒和使用自身互补AAV基因组的方法描述于美国专利号6,596,535；7,125,717；7,465,583；7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054；和8,361,457；和WangZ.,等,(2003)Gene Ther 10:2105-2111，其每个均通过提述以其整体并入本文。包含自身互补的基因组的rAAV将凭借其部分互补的序列迅速形成双链DNA分子(例如，转基因的互补编码或非编码链)。在一些实施方案中，本发明提供包含AAV基因组的AAV病毒颗粒，其中所述rAAV基因组包含第一异源多核苷酸序列(例如，本公开的RNAi)和第二异源多核苷酸序列(例如，本公开的RNAi的反义链)，其中第一异源多核苷酸序列可与第二异源多核苷酸序列沿其长度的大部分或全部形成链内碱基配对。在一些实施方案中，第一异源多核苷酸序列和第二异源多核苷酸序列通过促进链内碱基配对的序列(例如发夹DNA结构)连接。发夹结构是本领域已知的，例如在miRNA或siRNA分子中。在一些实施方案中，第一异源多核苷酸序列和第二异源多核苷酸序列通过突变的ITR(例如，右侧ITR)连接。在一些实施方案中，所述ITR包含多核苷酸序列5’-CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGA-3(SEQ ID NO:15)。突变的ITR包含含有末端解析序列的D区的缺失。结果，在复制AAV病毒基因组时，rep蛋白将不会在突变的ITR处切割病毒基因组，且同样地，以5’至3’顺序包含下列的重组病毒基因组将会被包装在病毒衣壳中：AAV ITR、包括调节序列的第一异源多核苷酸序列、突变的AAV ITR、与第一异源多核苷酸反向的第二异源多核苷酸和第三AAV ITR。在一些实施方案中，本发明提供AAV病毒颗粒，其包含含有功能性AAV2 ITR的重组病毒基因组、编码本公开的RNAi的第一多核苷酸序列、包含D区的缺失并缺乏功能性末端解析序列的突变的AAV2ITR、包含与编码本公开的RNAi的第一多核苷酸序列互补的序列的第二多核苷酸序列和功能性AAV2 ITR。
在一些实施方案中，所述病毒颗粒是腺病毒颗粒。在一些实施方案中，腺病毒颗粒是重组腺病毒颗粒，例如，在两ITR之间包含本公开的RNAi的多核苷酸载体。在一些实施方案中，腺病毒颗粒缺乏或含有一个或多个E1基因的缺陷性拷贝，其使腺病毒成为复制缺陷的。腺病毒在大的
Figure BDA0002491758540000451
非包膜的二十面体衣壳内包括线性、双链DNA基因组。腺病毒具有可并入大于30kb异源序列的大基因组(例如，代替E1和/或E3区)，使其独特地适用于较大异源基因。还已知其感染分裂和未分裂的细胞且不天然地整合入宿主基因组(尽管杂合变体可拥有此能力)。在一些实施方案中，腺病毒载体可为用异源序列代替E1的第一代腺病毒载体。在一些实施方案中，腺病毒载体可为在E2A、E2B和/或E4中具有额外的突变或缺失的第二代腺病毒载体。在一些实施方案中，所述腺病毒载体可为缺乏全部病毒编码基因的第三代或内部受损的(gutted)腺病毒载体，其仅保留ITR和包装信号并需要反式的辅助腺病毒用于复制和包装。已研究了腺病毒颗粒用作用于瞬时转染哺乳动物细胞的载体以及基因治疗载体。对于进一步说明，参见，例如Danthinne,X.和Imperiale,M.J.(2000)GeneTher.7:1707-14和Tatsis,N.和Ertl,H.C.(2004)Mol.Ther.10:616-29。
在一些实施方案中，所述病毒颗粒是重组腺病毒载体颗粒，其包含编码本公开的RNAi的核酸。认为任何腺病毒血清型的使用都在本发明的范围之内。在一些实施方案中，所述重组腺病毒载体是衍生自腺病毒血清型的载体，所述腺病毒血清型包括但不限于AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu5、AdHu7、AdHu11、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad和猪Ad 3型。腺病毒颗粒还包含衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述重组病毒颗粒包含与一个或多个外来病毒衣壳蛋白组合的病毒颗粒。此类组合可指假型化重组腺病毒颗粒。在一些实施方案中，用于假型化重组腺病毒颗粒的外来病毒衣壳蛋白衍生自外来病毒或衍生自另一腺病毒血清型。在一些实施方案中，外来病毒衣壳蛋白衍生自，包括但不限于，呼肠孤病毒3型。用于假型化腺病毒颗粒的载体和衣壳蛋白组合的实例可在下列参考文献中找到(Tatsis,N.等(2004)Mol.Ther.10(4):616-629和Ahi,Y.等(2011)Curr.Gene Ther.11(4):307-320)。不同的腺病毒血清型可用于优化特定靶细胞的转导或用于靶向在特定靶组织(例如，疾病组织)内的特定细胞类型。由特定腺病毒血清型靶向的组织或细胞包括但不限于肺(例如HuAd3)、脾和肝(例如HuAd37)、平滑肌、滑膜细胞、树突细胞、心血管细胞、肿瘤细胞系(例如HuAd11)和树突细胞(例如，用呼肠孤病毒3型假型化的HuAd5、HuAd30或HuAd35)。对于进一步描述，参见Ahi,Y.等(2011)Curr.Gene Ther.11(4):307-320、Kay,M.等(2001)Nat.Med.7(1):33-40和Tatsis,N.等(2004)Mol.Ther.10(4):616-629。已通过纹状体内施用来施用腺病毒载体(参见，例如Mittoux,V.等(2002)J.Neurosci.22:4478-86)。
在一些实施方案中，病毒颗粒是慢病毒颗粒。在一些实施方案中，慢病毒颗粒是重组慢病毒载体颗粒，例如，编码在两ITR之间的本公开的RNAi的多核苷酸载体。慢病毒是具有大约10kb的基因组的有义的、ssRNA逆转录病毒。已知慢病毒整合到分裂和未分裂的细胞的基因组中。可产生慢病毒颗粒，例如，通过将多个质粒(通常分开慢病毒基因组和对于复制和/或包装所需的基因以阻止病毒复制)转染入包装细胞系中，其将修饰的慢病毒基因组包装至慢病毒颗粒中。在一些实施方案中，慢病毒颗粒可指缺乏包膜蛋白的第一代载体。在一些实施方案中，慢病毒颗粒可指缺乏除gag/pol和tat/rev区外的全部基因的第二代载体。在一些实施方案中，慢病毒颗粒可指仅含有内源rev、gag和pol基因且具有用于转导的嵌合LTR而无tat基因的第三代载体(参见，Dull,T.等(1998)J.Virol.72:8463-71)。对于进一步描述，参见Durand,S.和Cimarelli,A.(2011)Viruses 3:132-59。
在一些实施方案中，病毒颗粒是包含编码本公开的RNAi的核酸的重组慢病毒颗粒。认为任何慢病毒载体的使用均在本发明的范围内。在一些实施方案中，慢病毒载体衍生自慢病毒，其包括但不限于人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)、人免疫缺陷病毒-2(HIV-2)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫科免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、Jembrana病病毒(JDV)、绵羊髓鞘脱落病毒(visna virus,VV)和山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)。慢病毒颗粒还包含衣壳蛋白。在一些实施方案中，重组病毒颗粒包含与一个或多个外来病毒衣壳蛋白组合的慢病毒载体。此类组合可指假型化重组慢病毒颗粒。在一些实施方案中，用于假型化重组慢病毒颗粒的外来病毒衣壳蛋白衍生自外来病毒。在一些实施方案中，用于假型化重组慢病毒颗粒的外来病毒衣壳蛋白是水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSV-GP)。VSV-GP与普遍存在的细胞受体相互作用，为假型化的重组慢病毒颗粒提供广泛的组织嗜性。此外，认为VSV-GP为假型化的重组慢病毒颗粒提供更高的稳定性。在其它实施方案中，外来病毒衣壳蛋白衍生自，包括但不限于，钱迪普病毒(Chandipura virus)、狂犬病毒、莫科拉病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、辛德比斯病毒、塞姆利基森林病毒(SemlikiForest virus，SFV)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelanequine encephalitis virus)、埃博拉病毒Reston、埃博拉病毒Zaire、马尔堡病毒、拉沙病毒(Lassa virus)、禽类白细胞增生病毒(Avian leukosis virus)(ALV)、南非羊肺炎羊反转录病毒(Jaagsiekte sheepretrovirus，JSRV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murineleukemia virus，MLV)、长臂猿白血病病毒(Gibbon ape leukemia virus，GALV)、猫内源性逆转录病毒(Felineendogenous retrovirus，RD114)、人T-嗜淋巴细胞病毒1(HTLV-1)、人合胞病毒、梅-维病毒(Maedi-visna vurus,MVV)、SARS-CoV、仙台病毒(Sendai virus)、呼吸道合胞体病毒(Respiratory syncytia virus，RSV)、人副流感病毒3型、丙型肝炎病毒(HCV)、流感病毒、家禽流感病毒(Fowl plague virus,FPV)或苜蓿银纹夜蛾多重核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedro virus,AcMNPV)。用于假型化的慢病毒的载体和衣壳蛋白组合的实例可在例如Cronin,J.等(2005).Curr.GeneTher.5(4):387-398中找到。不同的假型化重组慢病毒颗粒可用于优化特定靶细胞的转导或用于靶向特定靶组织(例如疾病组织)内的特定细胞。例如，通过特定假型化重组慢病毒颗粒靶向的组织，包括但不限于，肝(例如用VSV-G、LCMV、RRV或SeV F蛋白假型化的病毒)、肺(例如用埃博拉病毒(Ebola)，马尔堡病毒(Marburg)、SeV F和HN或JSRV蛋白假型化的病毒)、胰岛细胞(例如用LCMV蛋白假型化的病毒)、中枢神经系统(例如用VSV-G、LCMV、狂犬病毒或Mokola蛋白假型化的病毒)、视网膜(例如用VSV-G或Mokola蛋白假型化的病毒)、单核细胞或肌肉(例如用Mokola或埃博拉病毒蛋白假型化的病毒)、造血系统(例如用RD114或GALV蛋白假型化的病毒)或癌细胞(例如GALV或LCMV蛋白假型化的病毒)。对于进一步描述，参见Cronin,J.等(2005).Curr.Gene Ther.5(4):387-398和Kay,M.等(2001)Nat.Med.7(1):33-40。
在一些实施方案中，病毒颗粒是单纯疱疹病毒(HSV)颗粒。在一些实施方案中，HSV颗粒是rHSV颗粒，例如，编码在两TR之间的本公开的RNAi的多核苷酸载体。HSV是一种包膜的双链DNA病毒，基因组为大约152kb。有利地，大约一半的其基因是非必须的且可经缺失以容纳异源序列。HSV颗粒感染非分裂的细胞。此外，它们自然会在神经元中建立潜伏期，通过逆行运输运动，且可跨突触转移，使得其对于神经元的转染和/或涉及神级系统的基因疗法方式具有优势。在一些实施方案中，HSV颗粒可以是复制缺陷的或能够复制的(例如，能够通过失活一个或多个晚期基因进行单复制循环)。对于进一步描述，参见Manservigi,R.等(2010)Open Virol.J.4:123-56。
在一些实施方案中，病毒颗粒是包含编码本公开的RNAi的核酸的rHSV颗粒。认为任何HSV载体的使用均在本发明的范围内。在一些实施方案中，HSV载体衍生自HSV血清型，包括但不限于HSV-1和HSV-2。HSV颗粒还包含衣壳蛋白。在一些实施方案中，重组病毒颗粒包含与一个或多个外来病毒衣壳蛋白组合的HSV载体。此类组合可指假型rHSV颗粒。在一些实施方案中，在假型rHSV颗粒中使用的外来病毒衣壳蛋白衍生自外来病毒或衍生自另一HSV血清型。在一些实施方案中，在假型rHSV颗粒中使用的外来病毒衣壳蛋白是水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSV-GP)。VSV-GP与普遍存在的细胞受体相互作用，为假型rHSV颗粒提供广泛的细胞嗜性。此外，认为人VSV-GP为假型rHSV颗粒提供更高的稳定性。在其它实施方案中，外来病毒衣壳蛋白可来自不同的HSV血清型。例如，HSV-1载体可含有一个或多个HSV-2衣壳蛋白。不同的HSV血清型可用于优化转导特定靶细胞或用于靶向特定靶组织(例如，疾病组织)内的特定细胞类型。由特定腺病毒血清型靶向的组织或细胞包括但不限于中枢神经系统和神经元(例如HSV-1)。对于进一步描述，参见Manservigi,R.等(2010)Open VirolJ 4:123-156、Kay,M.等(2001)Nat.Med.7(1):33-40，和Meignier,B.等(1987)J.Infect.Dis.155(5):921-930。
病毒颗粒的产生
可使用本领域已知的方法产生rAAV颗粒。参见，例如美国专利号6,566,118；6,989,264；和6,995,006。在本发明的实践中，用于产生rAAV颗粒的宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、微生物和酵母。宿主细胞还可以是包装细胞，其中AAV rep和cap基因稳定保持在宿主细胞或生产细胞内中，其中稳定维持AAV载体基因组。示例性包装和生产细胞衍生自293、A549或HeLa细胞。使用本领域中已知的标准技术来纯化和配制AAV载体。
本领域中已知用于产生rAAV载体的方法包括但不限于转染、稳定细胞系产生和感染性杂合病毒产生系统(其包括腺病毒-AAV杂合体、疱疹病毒-AAV杂合体和杆状病毒-AAV杂合体)(Conway,JE等,(1997)J.Virology 71(11):8780-8789)。用于产生rAAV病毒颗粒的rAAV生成培养全部需要：1)合适的宿主细胞，包括例如，衍生自人的细胞系如HeLa、A549或293细胞或在杆状病毒产生系统的情况下昆虫衍生的细胞系如如SF-9；2)合适的辅助病毒功能，其由野生型或突变的腺病毒(如温度敏感性腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒或提供辅助功能的质粒构建体提供；3)AAV rep和cap基因和基因产物；4)侧翼为至少一个AAV ITR序列的核酸(如治疗性核酸)；和5)合适的培养基或培养基组分以支持rAAV产生。在一些实施方案中，AAV rep和cap基因产物可形成任何AAV血清型。通常，但不是强制性的，AAV rep基因产物为与rAAV载体基因组的ITR相同的血清型的基因产物，只要rep基因产物可发挥功能以复制和包装rAAV基因组。本领域中已知的合适培养基可用于产生rAAV载体。这些培养基包括但不限于Hyclone Laboratories和JRH生产的培养基，包括改良的Eagle培养基(MEM)、杜贝尔克氏改良的Eagle培养基(DMEM)，定制的配制物，如描述于美国专利号6,566,118的那些和如美国专利号6,723,551中所述的Sf-900II SFM介质，上述每篇文件通过提述以其整体并入本文，特别是关于供产生重组AAV载体中使用的定制的培养基配制物。在一些实施方案中，AAV辅助功能是由腺病毒或HSV提供的。在一些实施方案中，AAV辅助功能是由杆状病毒提供的，且宿主细胞是昆虫细胞(例如，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)细胞)。
在一些实施方案中，可通过三重转染的方法产生rAAV颗粒，如下文提供的示例性三重转染方法。简要地，含有rep基因和衣壳基因的质粒，连同辅助腺病毒质粒可被转染(例如，使用磷酸钙方法)至细胞系(例如，HEK-293细胞)中，且可收集并任选地纯化病毒。如此，在一些实施方案中，通过将编码rAAV载体的核酸、编码AAV rep和cap的核酸和编码AAV辅助病毒功能的核酸的三重转染至宿主细胞中来产生rAAV颗粒，其中所述核酸转染至宿主细胞生成能够产生rAAV颗粒的宿主细胞。
在一些实施方案中，可由生成细胞系方法产生rAAV颗粒，如下文提供的示例性生产细胞系方法(还参见(参照Martin等，(2013)Human Gene Therapy Methods 24:253-269)。简要地，可用包含rep基因、衣壳基因和启动子-异源核酸序列的质粒稳定转染细胞系(例如，HeLa细胞系)。可筛选细胞系以选择先导克隆用于rAAV产生，其随后可被扩大至生产生物反应器并用腺病毒(例如野生型腺病毒)作为辅助感染以起始rAAV产生。随后可收获病毒，可失活(例如通过加热)和/或去除腺病毒，并可纯化rAAV颗粒。如此，在一些实施方案中，通过包含一个或多个编码rAAV载体的核酸、编码AAV rep和cap的核酸和编码AAV辅助病毒功能的核酸的生产细胞系来产生rAAV颗粒。
在一些方面中，提供了用于产生如本文所公开的任何rAAV颗粒的方法，其包括(a)在产生rAAV颗粒的条件下培养宿主细胞，其中每个所述宿主细胞包含(i)一个或多个AAV包装基因，其中每个所述AAV包装基因编码AAV复制和/或衣壳化蛋白；(ii)rAAV促-载体，其包含编码侧翼为至少一个AAV ITR的如本文公开的RNAi的核酸，和(iii)AAV辅助功能；和(b)回收由宿主细胞产生的rAAV颗粒。在一些实施方案中，RNAi包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个AAV ITR选自下列AAV ITR：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAVDJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV衣壳血清型ITR或等等。在一些实施方案中，所述衣壳化蛋白选自下组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6(例如，野生型AAV6衣壳或变体AAV6衣壳，如ShH10，如U.S.PG Pub.2012/0164106中所述)、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9(例如，野生型AAV9衣壳或修饰的AAV9衣壳，如U.S.PG Pub.2013/0323226中所述)、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、酪氨酸衣壳突变体、肝素结合衣壳突变体、AAV2R471A衣壳、AAVAAV2/2-7m8衣壳、AAV DJ衣壳(例如，AAV-DJ/8衣壳、AAV-DJ/9衣壳或U.S.PG Pub.2012/0066783中所述的任何其它衣壳)、AAV2N587A衣壳、AAV2E548A衣壳、AAV2N708A衣壳、AAV V708K衣壳、山羊AAV衣壳、AAV1/AAV2嵌合衣壳、牛AAV衣壳、小鼠AAV衣壳、rAAV2/HBoV1衣壳或美国专利号8,283,151或国际公开号WO/2003/042397中所述的AAV衣壳。在一些实施方案中，突变的衣壳蛋白保持形成AAV衣壳的能力。在一些实施方案中，衣壳蛋白是AAV5酪氨酸突变衣壳蛋白。在进一步的实施方案中，rAAV颗粒包含来自进化枝A-F的AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV1衣壳和含有AAV2 ITR、突变的AAV2ITR和编码本公开的RNAi的核酸的重组基因组。在进一步的实施方案中，纯化rAAV颗粒。如本文使用的术语“纯化”包括缺少至少一部分其它组分的rAAV颗粒的制备物，所述其它组分在rAAV颗粒天然存在或在初始制备时可存在。因此，例如，分离的rAAV颗粒可使用纯化技术制备以从来源混合物(如培养裂解物或生产培养物上清液)将其富集。富集可以多种方式测量，如，例如，通过存在于溶液中的DNA酶抗性颗粒(DRP)或基因组拷贝(gc)的比例，或通过感染性，或其可相对于来源混合物中存在的第二、潜在干扰物质如污染物(包括生产培养基污染物或过程中污染物，包括辅助病毒、培养基组分等)进行测量。
本领域已知多种用于产生腺病毒载体颗粒的方法。例如，对于内部受损的腺病毒载体，腺病毒载体基因组和辅助腺病毒基因组可被转染入至包装细胞系(例如，293细胞系)。在一些实施方案中，辅助腺病毒基因组可含有重组位点，其侧翼为其包装信号，且两种基因组均可被转染至表达重组酶(例如，可使用Cre/loxP系统)的包装细胞系，使得感兴趣的腺病毒载体比辅助腺病毒更有效地被包装(参见，例如，Alba,R.等(2005)GeneTher.12Suppl 1:S18-27)。可收获腺病毒载体并使用标准方法进行纯化，如本文所述的方法。
用于产生慢病毒载体颗粒的多种方法是本领域已知的。例如，对于第三代慢病毒载体，可将含有具有gag和pol基因的感兴趣的慢病毒基因组的载体与包含rev基因的载体共转染至包装细胞系(例如，293细胞系)中。感兴趣的慢病毒基因组还含有在Tat不存在下促进转录的嵌合LTR(参见，Dull,T.等(1998)J.Virol.72:8463-71)。可收获慢病毒载体并使用本文所述的方法进行纯化(例如Segura MM,等，(2013)Expert Opin Biol Ther.13(7):987-1011)。
用于产生HSV颗粒的多种方法是本领域已知的。可收获HSV载体并使用标准方法纯化，如本文所述的方法。例如，对于复制缺陷性HSV载体，可将缺乏全部立即早期(IE)基因的感兴趣的HSV基因组转染至提供病毒产生所需的基因的互补细胞系，如ICP4、ICP27和ICP0(参见，例如Samaniego,L.A.等(1998)J.Virol.72:3307-20)。可收获HSV载体并使用本文所述的方法进行纯化(例如Goins,WF等，(2014)Herpes Simplex Virus Methods inMolecular Biology 1144:63-79)。
本文还提供了药物组合物，其包含含有编码本文公开的RNAi的转基因的重组病毒颗粒和药学上可接受的载剂。药物组合物可适于本文所述的任何施用模式。可将包含本公开的RNAi的核酸的重组病毒颗粒的药物组合物引入脑部。例如，包含编码本公开的RNAi的核酸的重组病毒颗粒可纹状体内施用。可使用本公开的任何重组病毒颗粒，包括rAAV、腺病毒、慢病毒和HSV颗粒。
在一些实施方案中，包含含有编码如本公开所述的RNAi的转基因的重组病毒颗粒和药学上可接受的载剂的药物组合物适于施用至人。此类载剂是本领域熟知的(参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第15版,第1035-1038页和第1570-1580页)。在一些实施方案中，包含如本文所述的rAAV和药学上可接受的载剂的药物组合物适于注射至哺乳动物的脑部中(例如，纹状体内施用)。在一些实施方案中，包含本文所述的重组慢病毒颗粒和药学上可接受的载剂的药物组合物适于注射至哺乳动物的脑部中(例如，纹状体内施用)。在一些实施方案中，包含本文所述的重组腺病毒颗粒和药学上可接受的载剂的药物组合物适于注射至哺乳动物的脑部中(例如，纹状体内施用)。在一些实施方案中，包含本文所述的重组HSV颗粒和药学上可接受的载剂的药学上可接受的载剂的药物组合物适于注射至哺乳动物的脑部中(例如，纹状体内施用)。
此类药学上可接受的载剂可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油等。还可采用盐水溶液和葡萄糖水溶液(aqueousdextrose)、聚乙二醇(PEG)和甘油溶液作为液体载剂，特别是用于可注射的溶液。药物组合物可进一步包含额外的成分，例如，防腐剂、缓冲剂、张力剂、抗氧化剂和稳定剂、非离子型润湿剂或澄清剂、增粘剂等。本文描述的药物组合物可被包装成单个单位剂量或多剂量形式。所述组合物通常被配制成无菌或基本上等渗的溶液。
VII.制品和试剂盒
还提供了供在本文所述的方法中使用的试剂盒或制品。在一些方面中，所述试剂盒在合适的包装中包含本文所述的组合物(例如，本公开的重组病毒颗粒，如包含编码本公开的RNAi的核酸的rAAV颗粒)。用于本文所述的组合物(如纹状体内组合物)的合适包装是本领域已知的，且包括例如小瓶(如密封的小瓶)、容器、安瓿、瓶、罐、软包装(例如密封的Mylar或塑料袋)等。这些制品可进一步被除菌和/或密封。
本发明还提供包含本文所述的组合物的试剂盒且可进一步包含关于使用所述组合物的方法的说明书，如本文所述的用途。本文所述的试剂盒可进一步包括从商业和使用者立场合意的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有用于实施本文所述的任何方法的说明书的包装插页。例如，在一些实施方案中，所述试剂盒包含含有编码本公开的RNAi的转基因的重组病毒颗粒的组合物(其用于将至少1x109个基因组拷贝递送至哺乳动物的脑部中(例如，通过纹状体内施用)至如本文所述的灵长类动物、适于注射至灵长类动物的脑部中的药学上可接受的载剂和如下的一个或多个：缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有用于实施向灵长类脑部中注射(例如，通过纹状体内施用)的说明书的包装插页。在一些实施方案中，所述试剂盒包含使用本文所述的重组病毒颗粒治疗亨廷顿氏病的说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒包含根据本文所述的任一方法使用如本文所述的重组病毒颗粒的说明书。
实施例
通过参照下述实施例更充分地理解本发明。然而，它们不应解释为限制本发明的范围。应该理解的是：本文所述的实施例和实施方案仅出于说明的目的，由其启示的多种修饰或改变将建议给本领域的技术人员而且也包括在本申请的精神和范畴及所附权利要求的范围内。
实施例1：AAV2/1-miRNA-Htt在体外降低Htt表达。
RNA干扰(RNAi)提供一种用于治疗许多人类疾病的方式。然而，基于RNAi的疗法的安全性可受小抑制性RNA(siRNA)与非预期的mRNA的结合并降低其表达(一种称作脱靶基因沉默的作用)的能力阻碍。脱靶主要发生在种子区(小RNA的核苷酸2-8)与非预期的mRNA的3’-UTR中的序列配对并指导这些转录物的翻译抑制和不稳定时。迄今为止，主要针对基因沉默效率来选择大多数治疗性RNAi序列，然后评估其安全性。生成了两种siRNA用于治疗亨廷顿氏病(HD)，其是一种显性神经退行性病症，该siRNA具有最小的脱靶可能(即，在所有已知的人和猕猴3’-UTR中缺乏种子互补物的那些)，其在小鼠脑部中以低模拟的脱靶概貌证明了有力的亨廷顿蛋白沉默(表1，图1A)。测试了一个序列(207)在HD的YAC128小鼠模型中挽救行为表型的能力。AAV2/1-miRNA-Htt-207的纹状体递送不仅降低脑中的Htt mRNA和蛋白水平，还校正了YAC128小鼠中的异常行为概貌，并且证明了高指导链活性和精确的5’加工，这最小程度地降低了脱靶作用的可能性。
表1.206和207的miRNA和反向互补物(靶标)序列以及用于克隆的顶部序列和底部序列，包括限制性位点悬突。
Figure BDA0002491758540000541
Figure BDA0002491758540000551
*加下划线的是用于克隆的克隆限制性位点悬突的序列；加粗的是miRNA序列；环序列以纯文本表示；miRNA反向互补序列的碱基1-8以斜体加粗表示；miRNA反向互补物的碱基11-21(对于170XX为11-20)以斜体表示。
在体外使用人胚肾(HEK293)细胞来测试AAV2/1-miRNA-Htt 206和207介导人亨廷顿蛋白mRNA降低的能力。AAV2/1-miRNA-206和207表达质粒，以及含有先前显示出降低Htt水平约50％的miRNA序列的阳性对照质粒(170XA)转染HEK293细胞(每个处理8个重复)。使用Fugene转染试剂转染细胞，并其后48小时收获细胞。使用
Figure BDA0002491758540000552
Cells-to-CTTM试剂盒(Ambion)分离总RNA。通过定量实时RT-PCR(在ABI Prism 7500Sequence Detector(Applied Biosystems)上进行并分析)来测量RNA水平。将表达水平相对于人PPIA(肽基脯氨酰异构酶)标准化。如图2中所示，与未经处理的对照相比，用206和207质粒转染后的人Htt mRNA水平都降低。与170XA阳性对照相比，Htt降低的水平几乎相等。
实施例2：AAV2/1-miRNA-Htt在体内降低Htt表达。
测试了AAV2/1-miRNA-206和207降低YAC128 HD小鼠的纹状体中的HTT蛋白水平的能力。成年YAC128小鼠接受双侧纹状体内注射AAV2/1-miRNA-Htt 206(1e10 vgs/位点)或AAV2/1-miRNA-Htt 207(1e10 vgs/位点)或AAV2/1-CTL3(非编码miRNA对照)(1e10 vgs/位点)。AAV注射后一个月，处死动物并用PBS灌注。收集脑进行组织学和生化分析。为了进行生化分析，对一个半球的纹状体区域进行了显微解剖，并在液氮中速冻。分别通过QPCR和Western印记评估的突变的人和小鼠Htt mRNA和HTT蛋白的纹状体水平。当与CTL3对照动物相比时，在注射AAV2/1-miRNA-Htt 206和AAV2/1-miRNA-Htt 207的小鼠中，突变的人Htt和小鼠Htt mRNA显著降低(图3A)。PPIA用作所有QPCR测定的标准化对照基因。当与CTL3对照动物相比时，在所有注射了AAV2/1-miRNA-Htt的小鼠中，突变的人和小鼠HTT蛋白显著降低，且在所有处理中均注意到相等程度的降低(大约50％，p<0.05)(图3B)。β-微管蛋白作为所有Western印迹的标准化对照基因。
评估了AAV2/1-miRNA-Htt 206和207对YAC128小鼠的脑重和体重的影响。将手术当天的动物体重与注射后1个月处死当天的体重进行比较(图4A)。与CTL3对照相比，AAV2/1-miRNA-Htt 206和207之间没有差异。处理后一个月，所有小鼠均表现出健康、机敏和有反应，且在任何处理组中均未观察到体重减轻。PBS灌注和脑解剖后记录湿脑重量。与CTL3处理的对照相比，观察到用AAV2/1-miRNA-Htt 206和207处理的YAC128小鼠的脑重的统计学上显著的增加(图4B)。
实施例3：AAV2/1-miRNA-Htt校正YAC128小鼠中的行为和协调缺陷
评估了AAV2/1-miRNA-Htt-207的纹状体递送校正YAC128小鼠异常行为表型的能力。还检查了AAV2/1-miRNA-Htt 207介导的突变的Htt水平的降低对HD的YAC128小鼠模型中存在的充分表征的表型缺陷的影响。年龄匹配的(3月龄)YAC128和FVB野生型同窝小鼠接受双侧纹状体内注射AAV2/1-miRNA-Htt-207(2e10vg/位点)或AAV2/1-CTL3对照载体(2e10vgs/位点)。小鼠接受行为测试，并在处理后3个月处死。脑组织匀浆的Western印记分析显示，当与AAV2/1-CTL3处理的对照相比，注射了AAV2/1-miRNA-Htt-207的YAC128和FVB野生型同窝小鼠的纹状体中的突变的人HTT蛋白的水平显著降低(大约50％降低，p<0.01)。在此研究中，小鼠HTT蛋白水平不是显著地降低(图5A和5B)。实时定量PCR分析指示mRNA水平的相应降低(图5C和5D)。
据报道，YAC128小鼠从3月龄时开始表现出运动协调缺陷(可通过转棒测试揭示)和抑郁表型(可通过Porsolt游泳测试揭示)(Slow等，2003、Van Raamsdonk等，2007)。当与AAV2/1-CTL3处理的野生型同窝小鼠相比，在注射后3个月，AAV2/1-CTL3处理的YAC128小鼠的转棒测试显示出显著的运动协调缺陷(ANOVA，p<0.05)(图6A)。然而，已经用AAV2/1-miRNA-Htt-207处理的YAC128小鼠显示的表现水平与野生型小鼠没有区别(ANOVA，图基事后检验；WT 207对比YAC128 207，p＝NS；WT CTL3对比YAC128 CTL3，p<0.05)。因此，突变的Htt水平的部分降低足以校正YAC128小鼠的运动缺陷。接受AAV2/1-miRNA-Htt-207的野生型小鼠和接受AAV2/1-CTL3的野生型小鼠之间在转棒表现上没有显著差异。先前的报告指示，YAC128小鼠表现出抑郁表型，其可以使用Porsolt游泳测试来检测(Pouladi等，2009)。如果将动物放置在盛水的容器中时长时间不活动，则它们被视为表现出抑郁状态。使用基本的游泳速度测试(测量到达平台的游泳潜伏期)，研究人员已证明，Porsolt游泳测试中的这种抑郁表型与YAC128小鼠的游泳能力无关，并且独立于此模型中观察到的充分记录的运动协调缺陷(Pouladi等，200)。向3月龄YAC128和WT同窝小鼠注射了AAV2/1-miRNA-Htt-207-载体或AAV2/1-CTL3-载体，且在随后3个月在Porsolt游泳测试中进行测试。与AAV2/1-miRNA-Htt-207处理的YAC小鼠或AAV2/1-CTL3处理的野生型动物相比，CTL3处理的YAC128小鼠表现出的不活动时间增加(图6B；ANOVA p<0.05)。此外，接受AAV2/1-miRNA-Htt或AAV2/1-CTL3的野生型小鼠在表现上没有显著差异。与AAV2/1-CTL3处理的对照相比，已注射了AAV2/1-miRNA-Htt-207的YAC128小鼠在不活动状态下花费的时间显著较少。的确，AAV2/1-miRNA-Htt-207处理的YAC128小鼠的表现与野生型同窝的表现相似，这表明此异常表型的校正接近完全(ANOVA，图基事后检验；YAC 207对比YAC CTL3，p<0.05)。
评价了AAV2/1-miRNA-Htt 207对YAC128小鼠的脑重和体重的影响。将手术当天的动物体重与注射后3个月处死当天的体重进行比较。与CTL3处理的对照相比，AAV2/1-miRNA-Htt 207处理的小鼠之间的体重没有差异(图7A)。处理后三个月，所有小鼠均表现出健康、机敏和有反应，且在任何处理组中均未观察到体重减轻。PBS灌注和脑解剖后记录湿脑重量。与CTL3处理的对照相比，观察到用AAV2/1-miRNA-Htt 207处理的YAC128小鼠在脑重上无差异(图7B)。
实施例4.miRNA在体内递送后显示出高指导活性和精确的5’加工
经由颅内注射用AAV2/1-miRNA-Htt 206或AAV2/1-miRNA-Htt 207处理YAC128小鼠。处理后，移出纹状体，并分离总RNA。使用NEBNext Small RNA Library Prep Set(NewEngland Biolabs)构建小RNA测序文库，并在Illumina MiSeq仪器上进行测序。对于每种处理，分析来自2只单独的小鼠的样品。在此显示了包括内源序列的所有miRNA读段的总数，以及每个处理载体的总指导和乘客读段。将AAV2/1-miRNA-Htt 202T载体处理包括在本实验中作为对照，因为先前已对其进行了测序，因此。每个指导和乘客链的预期起始位置百分比大于99％，并且207载体具有76.1％和79.3％的高的指导:乘客链比率。
表2.指导活性和5’加工
Figure BDA0002491758540000581
实施例5.自身互补的miRHtt207载体
207miRHtt表达盒可被包装为自身互补的载体基因组。为此，将ITR质粒设计为大小仅2.3kb，这有助于包装4.6kb二聚体载体；4.6kb是AAV载体的包装能力。如图8所示，可将ITR质粒设计成具有5’WT ITR和突变的D的缺失，截短的3‘ITR(ΔITR)。可包装的预测的载体基因组是自身互补的载体基因组，其长度为3165bp，且会含有5’和3’WT ITR和第三、内部δITR(例如，嵌合内含子)。另外地，预期会包装一些单体载体基因组，并且它们的大小会是1656bp。
生成自身互补性AAV miRHtt 207载体(即，每个衣壳包装两个载体基因组)的可替换的方式会是制成小的、单链(即，1755bp)的载体基因组，从而将载体基因组的两个拷贝包装为复制中间物种类，3365bp(图9)。在此实施例中，ITR质粒会具有5’和3’WT ITR和复制中间物，3365bp，会具有三个WT ITR，一个5’和3’和一个内部ITR。也可包装单链载体基因组种类，1755bp。
附加的序列
除非另有说明，否则所有多肽序列均以N端至C端的形式呈现。除非另有说明，否则所有核酸序列均以5’至3’呈现。
miRNA支架DNA序列
ctggaggcttgctgaaggctgtatgctgttagacaatgattcacacggtgttttggccactgactgacaccgtgtgtcattgtctaacaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcc(SEQ ID NO:14)
scAAV载体的变体AAV ITR
CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGA(SEQ ID NO:15).
ssAAV2/1miRHtt.de
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTCTATATTACCCTGCTAGGCAATTGGATCCCGGACCGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTTCGAAAGATCTGCTAGCCTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGAGTCGGTGTGGTTGACAAGCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGCTTGTCCCACACCGACTCAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGCTAGAGTCGACCGGACCGGTGGAAGTCCTCTTCCTCGGTGTCCTTGACTTCAAAGGGTCTCTCCCATTTGCCTGGAGAGAGGGGAAGGTGGGCATCACCAGGGGTGAGTGAAGGTTTGGAAGAGTGTAGCAGAATAAGAAACCATGAGTCCCCTCCCTGAGAAGCCCTGAGCCCCCTTGACGACACACATCCCTCGAGGCTCAGCTTCATCATCTGTAAAAGGTGCTGAAACTGACCATCCAAGCTGCCGAAAAAGATTGTGTGGGGATAATTCAAAACTAGAGGAAGATGCAGAATTTCTACATCGTGGCGATGTCAGGCTAAGAGATGCCATCGTGGCTGTGCATTTTTATTGGAATCATATGTTTATTTGAGGGTGTCTTGGATATTACAAATAAAATGTTGGAGCATCAGGCATATTTGGTACCTTCTGTCTAAGGCTCCCTGCCCCTTGTTAATTGGCAGCTCAGTTATTCATCCAGGGCAAACATTCTGCTTACTATTCCTGAGAGCTTTCCTCATCCTCTAGATTGGCAGGGGAAATGCAGATGCCTGAGCAGCCTCCCCTCTGCCATACCAACAGAGCTTCACCATCGAGGCATGCAGAGTGGACAGGGGCCTCAGGGACCCCTGATCCCAGCTTTCTCATTGGACAGAAGGAGGAGACTGGGGCTGGAGAGGGACCTGGGCCCCCACTAAGGCCACAGCAGAGCCAGGACTTTAGCTGTGCTGACTGCAGCCTGGCTTGCCTCCACTGCCCTCCTTTGCCTCAAGAGCAAGGGAGCCTCAGAGTGGAGGAAGCAGCCCCTGGCCTTGCCTCCCACCTCCCCTCCCCTATGCTGTTTTCCTGGGACAGTGGGAGCTGGCTTAGAATGCCCTGGGGCCCCCAGGACCCTGGCATTTTAACCCCTCAGGGGCAGGAAGGCAGCCTGAGATACAGAAGAGTCCATCACCTGCTGTATGCCACACACCATCCCCACAGTTACGTACTAGTTCGAAGCCACGCGGACCGTTATAGTTACGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAAAGATCT
(SEQ ID NO:16)
以粗体显示的mIR207 DNA序列(SEQ ID NO:17)
以斜体显示的填充序列(SEQ ID NO:18)
部分A1AT基因
aattcgcccttgggc
Figure BDA0002491758540000611
gccggcagagaaaacatcccagggatttacagatcacatgcaggcagggaccagctcaacccttctttaatgtcatccagggagggggccagggatggaggggaggggttgaggagcgagaggcagttatttttgggtgggattcaccacttttcccatgaagaggggagacttggtattttgttcaatcattaagaagacaaagggtttgttgaacttgacctcgggggggatagacatgggtatggcctctaaaaacatggccccagcagcttcagtccctttctcgtcgatggtcagcacagccttatgcacggcctggaggggagagaagcagagacacgttgtaaggctgatcccaggcctcgagcaaggctcacgtggacacctcccaggaagcgctcactccccctggacggccctggccctgcacatcctctccctccctgtcacataggccttgctcctcctcaaggctttggctgatggggctggctcccctctgtccatcttcctgacaagcgcctctccccctgctcaggtgcacccacaactcagaacagggaagagcatcgtcactccacgtctgcctccagggctctctcctttctagtacacggcttgaagctccttgaggacacggaccctggcagtgaccttcacagtgcccagaccccaagataatgcagccattcatggaactgcaggttgttcattggtcgcctttagttttccaaaataagtgtcactttagctgaaatcattcattaattcagacaccaaatctcacagatcgaaggagtcagaaattcctttgaaacaacttagcccaaacctttctgtgtcagtatggataaatcaaggcccaatgtctagaaggtcttgggcaaagttgaaattcagggtcagtgacacaacctcaagggaggccccgaaagtgccagctgcacagcagcccctgcctggctttgctgtttgcccaccgtcccgtgtcagtgaatcacgggcatcttcaggagctcagcctgggtcttcatttgtttccctcggccccttcctcagcctcaggacagtgctgcagcccccacacattcttccctacagataccatggtgcaacaaggtcgtcagggtgatctcaccttggagagcttcaggggtgcctcctctgtgaccccggagaggtcagccccattgctgaagaccttagtgatgcccagttgacccaggacgctcttcagatcataggttccagtaatggacagtttgggtaaatgtaagctggcagacctgtcgtgcagaaaagaaattcaaggcatggcacagcattcctcttgttcttctgggacccaccacagtgcaagtgttttcttttctgattatttctgccacttactcctgtgtcctccacccacactaagatgggaactcggctttggtttgttctacttttagctcttctacattgagtcaaagaatgttaacatcgaatgaatcacaaaagcttgaaatgccacctcctctgatattctaggtgtcctggaagcctgtctcatcttgccctgtagtgttgggtcacctggcccccagcctgtaacatccccagggccctacacccagagaaacacggggctggtggcagtgcccagtgacaaccgtttagtggataagagaagagtgaccacaccaggctgagtgctcctctctggttttccatggggagacaatgccaccctgagcagggtctggtgtgagcggcagctggctctgggctctctgatccgttaccctctcagcctctttgttctttctcaacccctggagcagagacctcaggaggtgctggcatggaacagagaaattccagcctcgattcctattatgaacccgacaccttttgtattttcatcttggttttacagtgtacaaaacgaactagatcagcagggcatgggcataatcacgaatgcacacacatacactaatgtgtggctcatgtttaagtatcacttactacaggacacccaatctaacagcaccgataaagtgacagagaaacgcaagccttctgcgaacatggcctggctgttccaattccgaaccttgcttttctgggccttgccacacaggctcttcccccgtccccccagggacattctacccttgaactccacactccactgctgcctttgccaggaagcccatctgttcctttttggttctgccagaacgtgtggtggtgctgctgtccctgccttgggcactggatattgggaagggacagtgtccacactggagtgggaagttcccagggacgagacctttacctcctcaccctgggtactgttctcctcatggagcatggacggcgctgcctgaactcagtggtggcctcattctggaagccaagtttatacagagtagcagtgacccagggatgtggggttcaccctcctcagccctctggccagtcctgatgggcctcagtcccaacatggctaagaggtgtgggcagcttcttggtcaccctcaggttggggaatcaccttctgtcttcattttccaggaacttggtgatgatatcgtgggtgagttcatttaccaggtgctgtagtttcccctcatcaggcaggaagaagatggcggtggcattgcccaggtatttcatcagcagcacccagctggacagcttcttacagtgctggatgttaaacatgcctaaacgcttcatcataggcaccttcacggtggtcacctggtccacgtggaagtcc tcttcctcggtgtccttgacttcaaagggtctctcccatttgcctggagagaggggaaggtgggcatcaccagggg tgagtgaaggtttggaagagtgtagcagaataagaaaccatgagtcccctccctgagaagccctgagcccccttga cgacacacatccctcgaggctcagcttcatcatctgtaaaaggtgctgaaactgaccatccaagctgccgaaaaag attgtgtggggataattcaaaactagaggaagatgcagaatttctacatcgtggcgatgtcaggctaagagatgcc atcgtggctgtgcatttttattggaatcatatgtttatttgagggtgtcttggatattacaaataaaatgttggag catcaggcatatttggtaccttctgtctaaggctccctgccccttgttaattggcagctcagttattcatccaggg caaacattctgcttactattcctgagagctttcctcatcctctagattggcaggggaaatgcagatgcctgagcag cctcccctctgccataccaacagagcttcaccatcgaggcatgcagagtggacaggggcctcagggacccctgatc ccagctttctcattggacagaaggaggagactggggctggagagggacctgggcccccactaaggccacagcagag ccaggactttagctgtgctgactgcagcctggcttgcctccactgccctcctttgcctcaagagcaagggagcctc agagtggaggaagcagcccctggccttgcctcccacctcccctcccctatgctgttttcctgggacagtgggagct ggcttagaatgccctggggcccccaggaccctggcattttaacccctcaggggcaggaaggcagcctgagatacag aagagtccatcacctgctgtatgccacacaccatccccacagttacgtactagttcgaagccacgcgtccgaaggg cgaatt
(SEQ ID NO:20)
一些实施方案中使用的填充序列以下划线表示
δ嵌合内含子序列
ggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattcctcgaagatccggtacccaattccggggccccacgctgcgcatccgcg
(SEQ ID NO:21)
序列表
<110> 建新公司(GENZYME CORPORATION)
<120> 变体RNAi
<130> 159792014740
<140> 尚未分配
<141> 与此同时
<150> US 62/561,843
<151> 2017-09-22
<160> 22
<170> Windows版本4.0的FastSEQ
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 1
uggccgucca ucuuggaccc g 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 2
cggguccaag auggacggcc a 21
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 3
gtggccgtcc atcttggacc cggttttggc cactgactga ccgggtccaa tggacggcca 60
<210> 4
<211> 60
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 4
guggccgucc aucuuggacc cgguuuuggc cacugacuga ccggguccaa uggacggcca 60
<210> 5
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 5
tgctgtggcc gtccatcttg gacccggttt tggccactga ctgaccgggt ccaatggacg 60
gcca 64
<210> 6
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 6
cctgtggccg tccattggac ccggtcagtc agtggccaaa accgggtcca agatggacgg 60
ccac 64
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 7
agucggugug guugacaagc a 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 8
ugcuugucaa ccacaccgac u 21
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 9
agtcggtgtg gttgacaagc agttttggcc actgactgac tgcttgtccc acaccgact 59
<210> 10
<211> 59
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 10
agucggugug guugacaagc aguuuuggcc acugacugac ugcuuguccc acaccgacu 59
<210> 11
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 11
tgctgagtcg gtgtggttga caagcagttt tggccactga ctgactgctt gtcccacacc 60
gact 64
<210> 12
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 12
cctgagtcgg tgtgggacaa gcagtcagtc agtggccaaa actgcttgtc aaccacaccg 60
actc 64
<210> 13
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 13
guuuuggcca cugacugac 19
<210> 14
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 14
ctggaggctt gctgaaggct gtatgctgtt agacaatgat tcacacggtg ttttggccac 60
tgactgacac cgtgtgtcat tgtctaacag gacacaaggc ctgttactag cactcacatg 120
gaacaaatgg cc 132
<210> 15
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 15
ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 60
gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag gga 113
<210> 16
<211> 3510
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 16
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg 60
cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctctata ttaccctgct aggcaattgg atcccggacc 180
gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 240
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 300
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 360
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 420
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 480
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 540
tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca 600
tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag 660
cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc 720
ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt 780
ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg 840
cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc 900
cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc 960
ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt ttcttttctg tggctgcgtg 1020
aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg gagcggctcg gggggtgcgt 1080
gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc gctgcccggc ggctgtgagc 1140
gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt gcgcgagggg agcgcggccg 1200
ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg 1260
tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt cgggctgcaa ccccccctgc 1320
acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg tgcggggctc cgtacggggc 1380
gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg 1440
cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg cggcggcccc cggagcgccg 1500
gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg 1560
cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca 1620
ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg 1680
agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc tctccagcct cggggctgtc 1740
cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg 1800
tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 1860
tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt tggcaaagaa ttcttcgaaa 1920
gatctgctag cctggaggct tgctgaaggc tgtatgctga gtcggtgtgg ttgacaagca 1980
gttttggcca ctgactgact gcttgtccca caccgactca ggacacaagg cctgttacta 2040
gcactcacat ggaacaaatg gccatgcatc tagagggccc tattctatag tgtcacctaa 2100
atgctagagc tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 2160
gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 2220
aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 2280
tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggagctag 2340
agtcgaccgg accggtggaa gtcctcttcc tcggtgtcct tgacttcaaa gggtctctcc 2400
catttgcctg gagagagggg aaggtgggca tcaccagggg tgagtgaagg tttggaagag 2460
tgtagcagaa taagaaacca tgagtcccct ccctgagaag ccctgagccc ccttgacgac 2520
acacatccct cgaggctcag cttcatcatc tgtaaaaggt gctgaaactg accatccaag 2580
ctgccgaaaa agattgtgtg gggataattc aaaactagag gaagatgcag aatttctaca 2640
tcgtggcgat gtcaggctaa gagatgccat cgtggctgtg catttttatt ggaatcatat 2700
gtttatttga gggtgtcttg gatattacaa ataaaatgtt ggagcatcag gcatatttgg 2760
taccttctgt ctaaggctcc ctgccccttg ttaattggca gctcagttat tcatccaggg 2820
caaacattct gcttactatt cctgagagct ttcctcatcc tctagattgg caggggaaat 2880
gcagatgcct gagcagcctc ccctctgcca taccaacaga gcttcaccat cgaggcatgc 2940
agagtggaca ggggcctcag ggacccctga tcccagcttt ctcattggac agaaggagga 3000
gactggggct ggagagggac ctgggccccc actaaggcca cagcagagcc aggactttag 3060
ctgtgctgac tgcagcctgg cttgcctcca ctgccctcct ttgcctcaag agcaagggag 3120
cctcagagtg gaggaagcag cccctggcct tgcctcccac ctcccctccc ctatgctgtt 3180
ttcctgggac agtgggagct ggcttagaat gccctggggc ccccaggacc ctggcatttt 3240
aacccctcag gggcaggaag gcagcctgag atacagaaga gtccatcacc tgctgtatgc 3300
cacacaccat ccccacagtt acgtactagt tcgaagccac gcggaccgtt atagttacga 3360
ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 3420
cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg 3480
agcgcgcaga gagggagtgg ccaaagatct 3510
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 17
agtcggtgtg gttgacaagc a 21
<210> 18
<211> 989
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 18
gtggaagtcc tcttcctcgg tgtccttgac ttcaaagggt ctctcccatt tgcctggaga 60
gaggggaagg tgggcatcac caggggtgag tgaaggtttg gaagagtgta gcagaataag 120
aaaccatgag tcccctccct gagaagccct gagccccctt gacgacacac atccctcgag 180
gctcagcttc atcatctgta aaaggtgctg aaactgacca tccaagctgc cgaaaaagat 240
tgtgtgggga taattcaaaa ctagaggaag atgcagaatt tctacatcgt ggcgatgtca 300
ggctaagaga tgccatcgtg gctgtgcatt tttattggaa tcatatgttt atttgagggt 360
gtcttggata ttacaaataa aatgttggag catcaggcat atttggtacc ttctgtctaa 420
ggctccctgc cccttgttaa ttggcagctc agttattcat ccagggcaaa cattctgctt 480
actattcctg agagctttcc tcatcctcta gattggcagg ggaaatgcag atgcctgagc 540
agcctcccct ctgccatacc aacagagctt caccatcgag gcatgcagag tggacagggg 600
cctcagggac ccctgatccc agctttctca ttggacagaa ggaggagact ggggctggag 660
agggacctgg gcccccacta aggccacagc agagccagga ctttagctgt gctgactgca 720
gcctggcttg cctccactgc cctcctttgc ctcaagagca agggagcctc agagtggagg 780
aagcagcccc tggccttgcc tcccacctcc cctcccctat gctgttttcc tgggacagtg 840
ggagctggct tagaatgccc tggggccccc aggaccctgg cattttaacc cctcaggggc 900
aggaaggcag cctgagatac agaagagtcc atcacctgct gtatgccaca caccatcccc 960
acagttacgt actagttcga agccacgcg 989
<210> 19
<211> 3510
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 19
aaccggtgag ggagagacgc gcgagcgagc gagtgactcc ggcgggcccg tttcgggccc 60
gcagcccgct ggaaaccagc gggccggagt cactcgctcg ctcgcgcgtc tctccctcac 120
cggttgaggt agtgatcccc aaggagatat aatgggacga tccgttaacc tagggcctgg 180
cagctgtaac taataactga tcaataatta tcattagtta atgccccagt aatcaagtat 240
cgggtatata cctcaaggcg caatgtattg aatgccattt accgggcgga ccgactggcg 300
ggttgctggg ggcgggtaac tgcagttatt actgcataca agggtatcat tgcggttatc 360
cctgaaaggt aactgcagtt acccacctca taaatgccat ttgacgggtg aaccgtcatg 420
tagttcacat agtatacggt tcatgcgggg gataactgca gttactgcca tttaccgggc 480
ggaccgtaat acgggtcatg tactggaata ccctgaaagg atgaaccgtc atgtagatgc 540
ataatcagta gcgataatgg taccagctcc actcggggtg caagacgaag tgagaggggt 600
agaggggggg gaggggtggg ggttaaaaca taaataaata aaaaattaat aaaacacgtc 660
gctacccccg cccccccccc ccccccgcgc gcggtccgcc ccgccccgcc ccgctccccg 720
ccccgccccg ctccgcctct ccacgccgcc gtcggttagt ctcgccgcgc gaggctttca 780
aaggaaaata ccgctccgcc gccgccgccg ccgggatatt tttcgcttcg cgcgccgccc 840
gccctcagcg acgcgcgacg gaagcggggc acggggcgag gcggcggcgg agcgcggcgg 900
gcggggccga gactgactgg cgcaatgagg gtgtccactc gcccgccctg ccgggaagag 960
gaggcccgac attaatcgcg aaccaaatta ctgccgaaca aagaaaagac accgacgcac 1020
tttcggaact ccccgaggcc ctcccgggaa acacgccccc ctcgccgagc cccccacgca 1080
cgcacacaca cacgcacccc tcgcggcgca cgccgaggcg cgacgggccg ccgacactcg 1140
cgacgcccgc gccgcgcccc gaaacacgcg aggcgtcaca cgcgctcccc tcgcgccggc 1200
ccccgccacg gggcgccacg ccccccccga cgctcccctt gtttccgacg cacgccccac 1260
acacgcaccc ccccactcgt cccccacacc cgcgcagcca gcccgacgtt gggggggacg 1320
tggggggagg ggctcaacga ctcgtgccgg gccgaagccc acgccccgag gcatgccccg 1380
caccgcgccc cgagcggcac ggcccgcccc ccaccgccgt ccacccccac ggcccgcccc 1440
gccccggcgg agcccggccc ctcccgagcc ccctccccgc gccgccgggg gcctcgcggc 1500
cgccgacagc tccgcgccgc tcggcgtcgg taacggaaaa taccattagc acgctctccc 1560
gcgtccctga aggaaacagg gtttagacac gcctcggctt tagaccctcc gcggcggcgt 1620
gggggagatc gcccgcgccc cgcttcgcca cgccgcggcc gtccttcctt tacccgcccc 1680
tcccggaagc acgcagcggc gcggcggcag gggaagaggg agaggtcgga gccccgacag 1740
gcgcccccct gccgacggaa gccccccctg ccccgtcccg ccccaagccg aagaccgcac 1800
actggccgcc gagatctcgg agacgattgg tacaagtacg gaagaagaaa aaggatgtcg 1860
aggacccgtt gcacgaccaa taacacgaca gagtagtaaa accgtttctt aagaagcttt 1920
ctagacgatc ggacctccga acgacttccg acatacgact cagccacacc aactgttcgt 1980
caaaaccggt gactgactga cgaacagggt gtggctgagt cctgtgttcc ggacaatgat 2040
cgtgagtgta ccttgtttac cggtacgtag atctcccggg ataagatatc acagtggatt 2100
tacgatctcg agcgactagt cggagctgac acggaagatc aacggtcggt agacaacaaa 2160
cggggagggg gcacggaagg aactgggacc ttccacggtg agggtgacag gaaaggatta 2220
ttttactcct ttaacgtagc gtaacagact catccacagt aagataagac cccccacccc 2280
accccgtcct gtcgttcccc ctcctaaccc ttctgttatc gtccgtacga cccctcgatc 2340
tcagctggcc tggccacctt caggagaagg agccacagga actgaagttt cccagagagg 2400
gtaaacggac ctctctcccc ttccacccgt agtggtcccc actcacttcc aaaccttctc 2460
acatcgtctt attctttggt actcagggga gggactcttc gggactcggg ggaactgctg 2520
tgtgtaggga gctccgagtc gaagtagtag acattttcca cgactttgac tggtaggttc 2580
gacggctttt tctaacacac ccctattaag ttttgatctc cttctacgtc ttaaagatgt 2640
agcaccgcta cagtccgatt ctctacggta gcaccgacac gtaaaaataa ccttagtata 2700
caaataaact cccacagaac ctataatgtt tattttacaa cctcgtagtc cgtataaacc 2760
atggaagaca gattccgagg gacggggaac aattaaccgt cgagtcaata agtaggtccc 2820
gtttgtaaga cgaatgataa ggactctcga aaggagtagg agatctaacc gtccccttta 2880
cgtctacgga ctcgtcggag gggagacggt atggttgtct cgaagtggta gctccgtacg 2940
tctcacctgt ccccggagtc cctggggact agggtcgaaa gagtaacctg tcttcctcct 3000
ctgaccccga cctctccctg gacccggggg tgattccggt gtcgtctcgg tcctgaaatc 3060
gacacgactg acgtcggacc gaacggaggt gacgggagga aacggagttc tcgttccctc 3120
ggagtctcac ctccttcgtc ggggaccgga acggagggtg gaggggaggg gatacgacaa 3180
aaggaccctg tcaccctcga ccgaatctta cgggaccccg ggggtcctgg gaccgtaaaa 3240
ttggggagtc cccgtccttc cgtcggactc tatgtcttct caggtagtgg acgacatacg 3300
gtgtgtggta ggggtgtcaa tgcatgatca agcttcggtg cgcctggcaa tatcaatgct 3360
ccttggggat cactacctca accggtgagg gagagacgcg cgagcgagcg agtgactccg 3420
gcccgctggt ttccagcggg ctgcgggccc gaaacgggcc cgccggagtc actcgctcgc 3480
tcgcgcgtct ctccctcacc ggtttctaga 3510
<210> 20
<211> 3798
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 20
aattcgccct tgggcctagg caattggatc cgccggcaga gaaaacatcc cagggattta 60
cagatcacat gcaggcaggg accagctcaa cccttcttta atgtcatcca gggagggggc 120
cagggatgga ggggaggggt tgaggagcga gaggcagtta tttttgggtg ggattcacca 180
cttttcccat gaagagggga gacttggtat tttgttcaat cattaagaag acaaagggtt 240
tgttgaactt gacctcgggg gggatagaca tgggtatggc ctctaaaaac atggccccag 300
cagcttcagt ccctttctcg tcgatggtca gcacagcctt atgcacggcc tggaggggag 360
agaagcagag acacgttgta aggctgatcc caggcctcga gcaaggctca cgtggacacc 420
tcccaggaag cgctcactcc ccctggacgg ccctggccct gcacatcctc tccctccctg 480
tcacataggc cttgctcctc ctcaaggctt tggctgatgg ggctggctcc cctctgtcca 540
tcttcctgac aagcgcctct ccccctgctc aggtgcaccc acaactcaga acagggaaga 600
gcatcgtcac tccacgtctg cctccagggc tctctccttt ctagtacacg gcttgaagct 660
ccttgaggac acggaccctg gcagtgacct tcacagtgcc cagaccccaa gataatgcag 720
ccattcatgg aactgcaggt tgttcattgg tcgcctttag ttttccaaaa taagtgtcac 780
tttagctgaa atcattcatt aattcagaca ccaaatctca cagatcgaag gagtcagaaa 840
ttcctttgaa acaacttagc ccaaaccttt ctgtgtcagt atggataaat caaggcccaa 900
tgtctagaag gtcttgggca aagttgaaat tcagggtcag tgacacaacc tcaagggagg 960
ccccgaaagt gccagctgca cagcagcccc tgcctggctt tgctgtttgc ccaccgtccc 1020
gtgtcagtga atcacgggca tcttcaggag ctcagcctgg gtcttcattt gtttccctcg 1080
gccccttcct cagcctcagg acagtgctgc agcccccaca cattcttccc tacagatacc 1140
atggtgcaac aaggtcgtca gggtgatctc accttggaga gcttcagggg tgcctcctct 1200
gtgaccccgg agaggtcagc cccattgctg aagaccttag tgatgcccag ttgacccagg 1260
acgctcttca gatcataggt tccagtaatg gacagtttgg gtaaatgtaa gctggcagac 1320
ctgtcgtgca gaaaagaaat tcaaggcatg gcacagcatt cctcttgttc ttctgggacc 1380
caccacagtg caagtgtttt cttttctgat tatttctgcc acttactcct gtgtcctcca 1440
cccacactaa gatgggaact cggctttggt ttgttctact tttagctctt ctacattgag 1500
tcaaagaatg ttaacatcga atgaatcaca aaagcttgaa atgccacctc ctctgatatt 1560
ctaggtgtcc tggaagcctg tctcatcttg ccctgtagtg ttgggtcacc tggcccccag 1620
cctgtaacat ccccagggcc ctacacccag agaaacacgg ggctggtggc agtgcccagt 1680
gacaaccgtt tagtggataa gagaagagtg accacaccag gctgagtgct cctctctggt 1740
tttccatggg gagacaatgc caccctgagc agggtctggt gtgagcggca gctggctctg 1800
ggctctctga tccgttaccc tctcagcctc tttgttcttt ctcaacccct ggagcagaga 1860
cctcaggagg tgctggcatg gaacagagaa attccagcct cgattcctat tatgaacccg 1920
acaccttttg tattttcatc ttggttttac agtgtacaaa acgaactaga tcagcagggc 1980
atgggcataa tcacgaatgc acacacatac actaatgtgt ggctcatgtt taagtatcac 2040
ttactacagg acacccaatc taacagcacc gataaagtga cagagaaacg caagccttct 2100
gcgaacatgg cctggctgtt ccaattccga accttgcttt tctgggcctt gccacacagg 2160
ctcttccccc gtccccccag ggacattcta cccttgaact ccacactcca ctgctgcctt 2220
tgccaggaag cccatctgtt cctttttggt tctgccagaa cgtgtggtgg tgctgctgtc 2280
cctgccttgg gcactggata ttgggaaggg acagtgtcca cactggagtg ggaagttccc 2340
agggacgaga cctttacctc ctcaccctgg gtactgttct cctcatggag catggacggc 2400
gctgcctgaa ctcagtggtg gcctcattct ggaagccaag tttatacaga gtagcagtga 2460
cccagggatg tggggttcac cctcctcagc cctctggcca gtcctgatgg gcctcagtcc 2520
caacatggct aagaggtgtg ggcagcttct tggtcaccct caggttgggg aatcaccttc 2580
tgtcttcatt ttccaggaac ttggtgatga tatcgtgggt gagttcattt accaggtgct 2640
gtagtttccc ctcatcaggc aggaagaaga tggcggtggc attgcccagg tatttcatca 2700
gcagcaccca gctggacagc ttcttacagt gctggatgtt aaacatgcct aaacgcttca 2760
tcataggcac cttcacggtg gtcacctggt ccacgtggaa gtcctcttcc tcggtgtcct 2820
tgacttcaaa gggtctctcc catttgcctg gagagagggg aaggtgggca tcaccagggg 2880
tgagtgaagg tttggaagag tgtagcagaa taagaaacca tgagtcccct ccctgagaag 2940
ccctgagccc ccttgacgac acacatccct cgaggctcag cttcatcatc tgtaaaaggt 3000
gctgaaactg accatccaag ctgccgaaaa agattgtgtg gggataattc aaaactagag 3060
gaagatgcag aatttctaca tcgtggcgat gtcaggctaa gagatgccat cgtggctgtg 3120
catttttatt ggaatcatat gtttatttga gggtgtcttg gatattacaa ataaaatgtt 3180
ggagcatcag gcatatttgg taccttctgt ctaaggctcc ctgccccttg ttaattggca 3240
gctcagttat tcatccaggg caaacattct gcttactatt cctgagagct ttcctcatcc 3300
tctagattgg caggggaaat gcagatgcct gagcagcctc ccctctgcca taccaacaga 3360
gcttcaccat cgaggcatgc agagtggaca ggggcctcag ggacccctga tcccagcttt 3420
ctcattggac agaaggagga gactggggct ggagagggac ctgggccccc actaaggcca 3480
cagcagagcc aggactttag ctgtgctgac tgcagcctgg cttgcctcca ctgccctcct 3540
ttgcctcaag agcaagggag cctcagagtg gaggaagcag cccctggcct tgcctcccac 3600
ctcccctccc ctatgctgtt ttcctgggac agtgggagct ggcttagaat gccctggggc 3660
ccccaggacc ctggcatttt aacccctcag gggcaggaag gcagcctgag atacagaaga 3720
gtccatcacc tgctgtatgc cacacaccat ccccacagtt acgtactagt tcgaagccac 3780
gcgtccgaag ggcgaatt 3798
<210> 21
<211> 350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 21
ggagtcgctg cgcgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg 60
ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct 120
ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa 180
agccttgagg ggctccggga gctagagcct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt 240
tcctacagct cctgggcaac gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat 300
tcctcgaaga tccggtaccc aattccgggg ccccacgctg cgcatccgcg 350
<210> 22
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 22
tggccgtcca tcttggaccc ggttttggcc actgactgac cgggtccaat ggacggcca 59

Claims (128)

1.一种包含第一链和第二链的RNAi，其中
a)所述第一链和所述第二链形成双链体；
b)所述第一链包含指导区，其中所述指导区包含核酸序列5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’(SEQ ID NO:1)或5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)；且
c)所述第二链包含非指导区。
2.根据权利要求1所述的RNAi，其中所述核所述指导区包含核酸序列5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’(SEQ ID NO:1)，且所述非指导区包含序列5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’(SEQ ID NO:2)。
3.根据权利要求2所述的RNAi，其中所述第一链包含与SEQ ID NO:1具有约90％同一性或与SEQ ID NO:2具有约90％同一性的核酸序列。
4.根据权利要求1所述的RNAi，其中所述核所述指导区包含核酸序列5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)，且所述非指导区包含序列5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’(SEQ ID NO:8)。
5.根据权利要求4所述的RNAi，其中所述第二链包含与SEQ ID NO:7具有约90％同一性或与SEQ ID NO:8具有约90％同一性的核酸序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的RNAi，其中所述第一链和所述第二链借由能够形成环结构的RNA接头连接。
7.根据权利要求6所述的RNAi，其中所述RNA接头包含4至50个核苷酸。
8.根据权利要求6或7所述的RNAi，其中所述环结构包含4至20个核苷酸。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的RNAi，其中所述RNAi以5’至3’包含所述第二链、所述RNA接头和所述第一链。
10.根据权利要求6-8中任一项所述的RNAi，其中所述RNAi以5’至3’包含所述第一链、所述RNA接头和所述第二链。
11.根据权利要求10所述的RNAi，其中所述RNAi包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的核酸序列。
12.根据权利要求11所述的RNAi，其中所述RNAi包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的核苷酸序列约90％同一的核苷酸序列。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的RNAi，其中所述RNAi是小抑制性RNA (siRNA)、微小RNA (miRNA)或小发夹RNA (shRNA)。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的RNAi，其中所述RNAi靶向编码与亨廷顿氏病相关的多肽的RNA。
15.根据权利要求14所述的RNAi，其中所述多肽是亨廷顿蛋白。
16.根据权利要求15所述的RNAi，其中所述亨廷顿蛋白包含与亨廷顿氏病相关的突变。
17.一种表达构建体，其包含编码权利要求1-16中任一项所述的RNAi的核酸。
18.根据权利要求17所述的表达构建体，其中编码所述RNAi的核酸包含miRNA支架。
19.根据权利要求17或18所述的表达构建体，其中编码所述RNAi的核酸可操作地与启动子连接。
20.根据权利要求19所述的表达构建体，其中所述启动子选自下组：巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、CK6启动子、转甲状腺素蛋白启动子(TTR)、TK启动子、四环素响应性启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-球蛋白启动子(CAG)启动子、延长因子1-α启动子(EF1-α)启动子、人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、二氢叶酸还原酶启动子和13-肌动蛋白启动子。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体进一步包含内含子。
22.根据权利要求21所述的表达构建体，其中所述内含子是嵌合内含子。
23.根据权利要求21所述的表达构建体，其中所述表达载体是自身互补的载体，且所述内含子是δ嵌合内含子。
24.根据权利要求17-23中任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体进一步包含多腺苷酸化信号。
25.根据权利要求24所述的表达构建体，其中所述多腺苷酸化信号是牛生长激素多腺苷酸化信号、SV40多腺苷酸化信号或HSV TK pA。
26.一种载体，其包含权利要求17-25中任一项所述的表达构建体。
27.根据权利要求26所述的载体，其中所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体、重组腺病毒载体、重组慢病毒载体或重组单纯疱疹病毒(HSV)载体。
28.根据权利要求27所述的载体，其中所述载体是重组腺病毒载体。
29.根据权利要求28所述的载体，其中所述重组腺病毒载体衍生自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad型3、犬Ad型2、绵羊Ad或猪Ad型3。
30.根据权利要求28所述的载体，其中所述重组腺病毒载体衍生自腺病毒血清型2或腺病毒血清型5的变体。
31.根据权利要求27所述的载体，其中所述载体是重组慢病毒载体。
32.根据权利要求31所述的载体，其中所述重组慢病毒载体衍生自用以下病毒假型化的慢病毒：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病病毒、RD114或其中的变体。
33.根据权利要求27所述的载体，其中所述载体是rHSV载体。
34.根据权利要求33所述的载体，其中所述rHSV载体衍生自rHSV-1或rHSV-2。
35.根据权利要求27所述的载体，其中所述载体是rAAV载体。
36.根据权利要求35所述的rAAV载体，其中所述表达构建体的侧翼为一个或多个AAV反向末端重复(ITR)序列。
37.根据权利要求36所述的rAAV载体，其中所述表达构建体的侧翼为两个AAV ITR。
38.根据权利要求36或37所述的rAAV载体，其中所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。
39.根据权利要求36-38中任一项所述的rAAV载体，其中所述AAV ITR是AAV2 ITR。
40.根据权利要求36-39中任一项所述的rAAV载体，其中所述载体进一步包含填充核酸。
41.根据权利要求40所述的rAAV载体，其中所述填充核酸位于编码所述RNAi的核酸的上游或下游。
42.根据权利要求36-41中任一项所述的rAAV载体，其中所述载体是自身互补的rAAV载体。
43.根据权利要求42所述的rAAV载体，其中所述载体包含编码所述RNAi的第一核酸序列和编码所述RNAi的互补物的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可与所述第二核酸序列沿其长度的大部分或全部形成链内碱基对。
44.根据权利要求43所述的rAAV载体，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通过突变的AAV ITR连接，其中所述突变的AAV ITR包含D区的缺失且包含末端解析序列的突变。
45.一种细胞，其包含权利要求26-35中任一项所述的载体或权利要求36-44中任一项所述的rAAV载体。
46.一种病毒颗粒，其包含权利要求26所述的载体，其中所述病毒颗粒是使所述rAAV载体衣壳化的AAV颗粒、使所述重组腺病毒载体衣壳化的腺病毒颗粒、使所述重组慢病毒载体衣壳化的慢病毒颗粒或使所述重组HSV载体衣壳化的HSV颗粒。
47.根据权利要求46所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是使所述重组腺病毒载体衣壳化的腺病毒颗粒。
48.根据权利要求47所述的病毒颗粒，其中所述腺病毒颗粒包含来自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad型3、犬Ad型2、绵羊Ad或猪Ad型3的衣壳。
49.根据权利要求48所述的病毒颗粒，其中所述腺病毒颗粒包含腺病毒血清型2衣壳或腺病毒血清型5衣壳的变体。
50.根据权利要求46所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是使所述重组慢病毒载体衣壳化的慢病毒颗粒。
51.根据权利要求50所述的病毒颗粒，其中所述慢病毒颗粒包含用以下病毒假型化的衣壳：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病病毒、RD114或其中的变体。
52.根据权利要求46所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是HSV颗粒。
53.根据权利要求52所述的病毒颗粒，其中所述HSV颗粒是rHSV-1颗粒或rHSV-2颗粒。
54.一种重组AAV颗粒，其包含权利要求36-44中任一项所述的rAAV载体。
55.根据权利要求54所述的rAAV颗粒，其中所述AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、AAV2-HBKO、AAVDJ8、AAVPHP.B、AAVPHP.eB、AAVBR1、AAVHSC15、AAVHSC17、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合型、牛AAV或小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1血清型衣壳。
56.根据权利要求54或55所述的rAAV颗粒，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳衍生自相同的AAV血清型。
57.根据权利要求54或55所述的rAAV颗粒，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳衍生自不同的AAV血清型。
58.根据权利要求57所述的rAAV颗粒，其中所述ITR衍生自AAV2，且所述rAAV颗粒的衣壳衍生自AAV1。
59.一种组合物，其包含权利要求41-50中任一项所述的病毒颗粒或权利要求54-58中任一项所述的rAAV颗粒。
60.根据权利要求59所述的组合物，其中所述组合物进一步包含药学上可接受的载剂。
61.一种试剂盒，其包含权利要求1-16中任一项所述的RNAi。
62.一种试剂盒，包含权利要求44-53中任一项所述的病毒颗粒或权利要求54-58中任一项所述的AAV颗粒。
63.一种试剂盒，包含权利要求59或60所述的组合物。
64.根据权利要求61-63中任一项所述的试剂盒，其进一步包含供使用的说明书。
65.一种用于治疗哺乳动物中亨廷顿氏病的方法，其包括向所述哺乳动物施用包含第一链和第二链的RNAi，所述第一链包含含有序列5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’(SEQ IDNO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸，或者所述第一链包含含有序列5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’(SEQ ID NO:8)的第二核酸。
66.一种用于抑制具有亨廷顿氏病的哺乳动物中htt的表达的方法，其包括向所述哺乳动物施用包含第一链和第二链的RNAi，所述第一链包含含有序列5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸，或者所述第一链包含含有序列5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’(SEQ ID NO:8)的第二核酸。
67.一种用于抑制具有亨廷顿氏病的哺乳动物的细胞中htt的积累的方法，其包括向所述哺乳动物施用包含第一链和第二链的RNAi，所述第一链包含含有序列5’-UGGCCGUCCAUCUUGGACCCG-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-CGGGUCCAAGAUGGACGGCCA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸，或者所述第一链包含含有序列5’-AGUCGGUGUGGUUGACAAGCA-3’(SEQ ID NO:7)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-UGCUUGUCAACCACACCGACU-3’(SEQ ID NO:8)的第二核酸。
68.根据权利要求65-67中任一项所述的方法，其中所述第一链包含与SEQ ID NO:1具有约90％同一性或与SEQ ID NO:7具有约90％同一性的核酸序列。
69.根据权利要求65-67中任一项所述的方法，其中所述第二链包含与SEQ ID NO:2具有约90％同一性或与SEQ ID NO:8具有约90％同一性的核酸序列。
70.根据权利要求65-69中任一项所述的方法，其中所述第一链和所述第二链借由能够形成环结构的RNA接头连接。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述RNA接头包含4至50个核苷酸。
72.根据权利要求71或71所述的方法，其中所述环结构包含4至20个核苷酸。
73.根据权利要求70-72中任一项所述的方法，其中所述RNAi以5’至3’包含所述第二链、所述RNA接头和所述第一链。
74.根据权利要求70-72中任一项所述的方法，其中所述RNAi以5’至3’包含所述第一链、所述RNA接头和所述第二链。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述RNAi包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的核酸序列。
76.根据权利要求74所述的方法，其中所述RNAi包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的核苷酸序列约90％同一的核苷酸序列。
77.根据权利要求65-76中任一项所述的方法，其中所述RNAi是在表达构建体上编码的。
78.根据权利要求65-77中任一项所述的方法，其中编码所述RNAi的核酸包含miRNA支架。
79.根据权利要求65-78中任一项所述的方法，其中编码所述RNAi的核酸可操作地与启动子连接。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述启动子能够在哺乳动物的脑中表达所述RNAi。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述启动子选自下组：巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、CK6启动子、转甲状腺素蛋白启动子(TTR)、TK启动子、四环素响应性启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-球蛋白(CAG)启动子、延长因子1-α启动子(EF1-α)启动子和人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子。
82.根据权利要求79-81中任一项所述的方法，其中所述启动子是包含CMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的杂合鸡β-肌动蛋白启动子(CBA)。
83.根据权利要求77-82中任一项所述的方法，其中所述表达盒进一步包含内含子。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述内含子是嵌合内含子。
85.根据权利要求83所述的方法，其中所述表达盒是自身互补的载体且所述内含子是δ嵌合内含子。
86.根据权利要求77-85中任一项所述的方法，其中所述核酸进一步包含多腺苷酸化信号。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述多腺苷酸化信号是牛生长激素多腺苷酸化信号。
88.根据权利要求77-87中任一项所述的方法，其中所述表达构建体是由载体编码的。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体、重组腺病毒载体、重组慢病毒载体或重组单纯疱疹病毒(HSV)载体。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述载体是重组腺病毒载体。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述重组腺病毒载体衍生自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad型3、犬Ad型2、绵羊Ad或猪Ad型3。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述重组腺病毒载体衍生自腺病毒血清型2或腺病毒血清型5的变体。
93.根据权利要求89所述的方法，其中所述载体是重组慢病毒载体。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述重组慢病毒载体衍生自用以下病毒假型化的慢病毒：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病病毒、RD114或其中的变体。
95.根据权利要求89所述的方法，其中所述载体是rHSV载体。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述rHSV载体衍生自rHSV-1或rHSV-2。
97.根据权利要求89所述的方法，其中所述载体是重组AAV(rAAV)载体。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述表达构建体的侧翼为一个或多个AAV反向末端重复(ITR)序列。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述表达构建体的侧翼为两个AAV ITR。
100.根据权利要求98或99所述的方法，其中所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。
101.根据权利要求98-100中任一项所述的方法，其中所述AAV ITR是AAV2 ITR。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述rAAV载体以5’至3’包含AAV2 ITR、启动子、内含子、编码所述RNAi的核酸、多腺苷酸化信号和AAV2 ITR。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述启动子是CBA启动子。
104.根据权利要求102所述的方法，其中所述内含子是嵌合内含子、δ嵌合内含子或简短的嵌合内含子。
105.根据权利要求102-104中任一项所述的方法，其中所述多腺苷酸化信号是牛生长激素多腺苷酸化信号。
106.根据权利要求101所述的方法，其中所述rAAV载体以5’至3’包含AAV2 ITR、CBA启动子、嵌合内含子、编码所述RNAi的核酸、牛生长激素多腺苷酸化信号和AAV2 ITR。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述载体进一步包含填充核酸。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述填充核酸进一步包含编码报告分子多肽的核酸。
109.根据权利要求107或108所述的方法，其中所述填充核酸位于编码所述RNAi的核酸的上游或下游。
110.根据权利要求97-109中任一项所述的方法，其中所述载体是自身互补的载体。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述载体包含编码所述RNAi的第一核酸序列和编码所述RNAi的互补物的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可与所述第二核酸序列沿其长度的大部分或全部形成链内碱基对。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通过突变的AAV ITR连接，其中所述突变的AAV ITR包含D区的缺失且包含末端解析序列的突变。
113.根据权利要求88或89所述的方法，其中所述载体在rAAV颗粒中衣壳化，所述重组腺病毒载体在腺病毒颗粒中衣壳化，所述重组慢病毒载体在慢病毒颗粒中衣壳化或所述重组HSV载体在HSV中衣壳化。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述病毒颗粒是使所述重组腺病毒载体衣壳化的腺病毒颗粒。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述腺病毒颗粒包含来自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad型3、犬Ad型2、绵羊Ad或猪Ad型3的衣壳。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述腺病毒颗粒包含腺病毒血清型2衣壳或腺病毒血清型5衣壳的变体。
117.根据权利要求113所述的方法，其中所述病毒颗粒是使所述重组慢病毒载体衣壳化的慢病毒颗粒。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述慢病毒颗粒包含用以下病毒假型化的衣壳：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病病毒、RD114或其中的变体。
119.根据权利要求113所述的方法，其中所述病毒颗粒是HSV颗粒。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述HSV颗粒是rHSV-1颗粒或rHSV-2颗粒。
121.根据权利要求113所述的方法，其中所述病毒颗粒是重组AAV颗粒。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV2 V708K、AAV2-HBKO、AAVDJ8、AAVPHP.B、AAVPHP.eB、AAVBR1、AAVHSC15、AAVHSC17、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣壳。
123.根据权利要求121或122所述的方法，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳衍生自相同的AAV血清型。
124.根据权利要求121或122所述的方法，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳衍生自不同的AAV血清型。
125.根据权利要求121-124中任一项所述的方法，其中所述rAAV病毒颗粒包含AAV2衣壳。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述rAAV病毒颗粒包含AAV1衣壳，且其中所述载体包含AAV2 ITR。
127.根据权利要求65-112中任一项所述的方法，其中权利要求113-120中任一项所述的病毒颗粒或权利要求121-126中任一项所述的rAAV颗粒在组合物中。
128.根据权利要求127所述的方法，其中所述组合物进一步包含药学上可接受的载剂。
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