CN107438671A - 变体RNAi - Google Patents

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Abstract

本申请提供RNAi分子，其包括含有指导序列的第一链和包含非指导序列的第二链，其中所述非指导序列含有所述指导序列的种子区对侧，例如切割序列对侧的凸出。在一些方面，本发明提供用于治疗亨廷顿病的RNAi。本申请进一步提供含有所述RNAi的表达盒、载体(例如，rAAV、重组腺病毒载体、重组慢病毒载体和重组HSV载体)、细胞、病毒颗粒和药物组合物。本申请还进一步提供涉及所述RNAi的用途，例如用于治疗亨廷顿病的方法和套盒。

Description

变体RNAi
相关申请的交叉引用
本申请要求保护2015年2月10日提交的美国临时申请号62/114,578的优先权，其内容出于全部的目的在此处通过提述以其整体并入。
以ASCII文本文件提交序列表
在ASCII文本文件上提交了下列内容：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：159792010140SEQLIST.txt，记录日期：2016年2月4日，大小：11KB)，其在本文通过提述以其整体并入。
发明领域
本发明涉及变体RNAi分子。在一些方面，本发明涉及变体RNAi以治疗亨廷顿病。
发明概述
已表明RNA干扰(RNAi)是用于基因功能基础研究中基因沉默的有效工具，且显示了作为抑制与多种疾病进展相关的基因的治疗剂的巨大前景。天然情况下，通过RNAi的基团调节通过称为微小RNA(miRNA)的小RNA发生(Ambros,(2004)Nature 431:350-355；Krol等，(2010)Nat.Rev.Genet.11:597-610)。微小RNA已成为不同细胞过程的有利调节剂，且当通过病毒载体递送时，人工的miRNA持续表达，导致靶基因稳固和持续的抑制。涉及miRNA加工的机制的阐明已允许科学家指派(co-opt)内源细胞RNAi机制并使用人工miRNA指导靶基因产物的降解(参见例如US PG Pub.2014/0163214和Davidson等，(2012)Cell 150:873-875)。
RNAi临床开发的阻碍是脱靶沉默的可能性，其中RNAi的种子区(通常为核苷酸1-7或1-8)在3’非翻译区(UTR)中与非靶向mRNA中的序列配对，导致转录的不稳定化。减少脱靶沉默的尝试包括使用算法以鉴定具有针对靶mRNA高度特异性的候选种子序列，其具有最小脱靶可能性(Boudreau RL等，(2012)Nucl.Acids Res.41(1):e9)并在RNAi的指导区放置内在的凸出(Terasawa等，(2011)Journal of nucleic acids 2011:131579)。
已对RNAi作为治疗亨廷顿病(HD)的治疗剂进行了研究。HD是遗传性神经退行性疾病，其由亨廷顿蛋白基因(HTT)内含子1中的CAG重复的扩展引起。所致的N-末端区中多聚谷氨酰胺束的延伸赋予了突变的亨廷顿蛋白蛋白(mHtt)毒性的获得性功能。沉默mHtt表达作为针对HD的治疗策略的可能性首先在疾病的条件性小鼠模型中得到证实(Yamamoto等，(2000)Cell 101:57-66.)。当在这些小鼠中诱导mHtt表达时，病理和行为畸变变得显而易见。随后mHtt转基因的四环素介导抑制逆转了这些异常，指示mHtt水平的减少允许神经元内的蛋白清除机制以标准化mHtt-诱导的变化。因此，诱导mHtt水平的治疗策略可潜在阻止疾病进展并缓解HD症状。
在一些方面，本发明提供包含第一链和第二链的RNAi，其中a)所述第一链和所述第二链形成双链体；b)所述第一链包含至少19个碱基的指导区，其中所述指导区包含含有指导链的碱基1-N的种子区，其中N＝7或N＝8；和c)所述第二链包含至少11个碱基的非指导区(例如至少19个碱基)，所述非指导区包含双链体中指导区碱基1-(N+2)的任何一个或多个对侧的凸出序列。在一些实施方案中，N＝7且凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6、7、8或9。在其他实施方案中，N＝8且凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。在一些实施方案中，所述凸出是指导区的对侧碱基1或碱基N+2。
在一些方面，本发明提供包含第一链和第二链的RNAi，其中a)所述第一链和所述第二链形成双链体；b)所述第一链包含至少11个碱基(例如至少19个碱基)的指导区，其中所述指导区包含含有指导链的碱基1-N的种子区，其中N＝7或N＝8；且c)所述第二链包含至少11个碱基(例如至少19个碱基)的非指导区，其中所述非指导区包含双链体中指导区碱基1-(N+1)的任何一个或多个对侧的凸出序列。在一些实施方案中，N＝7且所述凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6、7或8。在其他实施方案中，N＝8且所述凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6、7、8或9。在一些实施方案中，所述凸出是指导区的对侧碱基1或碱基N+1。
在一些方面，本发明提供包含第一链和第二链的RNAi，其中a)所述第一链和所述第二链形成双链体；b)所述第一链包含至少11个碱基(例如至少19个碱基)的指导区，其中所述指导区包含含有指导链碱基1-N的种子区，其中N＝7或N＝8；且c)所述第二链包含至少11个碱基(例如至少19个碱基)的非指导区，其中所述非指导区包含双链体中指导区碱基1-N的任何一个或多个对侧的凸出序列。在一些实施方案中，N＝7且所述凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6或7。在其他实施方案中，N＝8且所述凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方案中，所述凸出是指导区的对侧碱基1或碱基N。在一些实施方案中，所述凸出是指导区的对侧碱基1。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述凸出通过指导区上的缺乏互补碱基的双链体中非指导链的一个或多个碱基形成，其中所述凸出侧翼为与指导链进行碱基配对的碱基。在一些实施方案中，所述凸出包含1-10个核苷酸。在一些实施方案中，所述凸出包含1-3个核苷酸。在进一步的实施方案中，所述RNAi包含第二凸出，其中所述第二凸出位于定位在种子区3’的指导区中的所述第一链上。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述双链体长度为19-25或19-23个碱基对。在一些实施方案中，所述第一和/或第二链进一步包含3’悬垂区、5’悬垂区或3'和5’悬垂区两者。在一些实施方案中，所述第一链和所述第二链通过能够形成环结构的RNA接头连接。在一些实施方案中，所述RNA接头包含4-50个核苷酸。在一些实施方案中，其中所述环结构包含4-20个核苷酸。在一些实施方案中，所述RNAi以5’-3’包含所述第二链、所述RNA接头和所述第一链。在一些实施方案中，所述RNAi以5’-3’包含所述第一链、所述RNA接头和所述第二链。在一些实施方案中，所述RNAi是小抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或小发夹RNA(shRNA)。
在上述方面的一些实施方案中，改进所述RNAi的核苷酸序列以减少脱靶基因沉默(例如改进以减少基因沉默，其中种子区与非目标mRNA的3′-UTR中的序列配对并指导那些转录物的去稳定化和翻译抑制)。在一些实施方案中，所述核酸序列包含一个或多个CpG基序。在一些实施方案中，所述核酸序列在种子区包含一个或多个CpG基序。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述RNAi靶向编码与病症相关的多肽的RNA。在一些实施方案中，所述病症是CNS病症。在一些实施方案中，所述病症是溶酶体贮积症(LSD)、亨廷顿病(Huntington’s disease)、癫痫、帕金森氏病(Parkinson'sdisease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、中风、皮质基底节变性(CBD)、皮质基底神经节变性(CBGD)、额颞叶痴呆(FTD)、多系统萎缩(MSA)、进行性核上性麻痹(PSP)或脑癌。在一些实施方案中，所述病症是亨廷顿病。在进一步的实施方案中，所述多肽是亨廷顿蛋白。在另一些实施方案中，所述亨廷顿蛋白包含与亨廷顿病相关的突变。在一些实施方案中，所述指导区包含序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:1)且非指导区包含序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，所述指导区包含序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:15)且所述非指导区包含序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，所述指导区包含序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:17)且所述非指导区包含序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO:18)。
在一些实施方案中，本发明提供减少RNAi毒性的方法，其包括导入RNAi非指导区中的凸出以生成如本文所述的RNAi。
在一些方面，本发明提供表达构建体，其包含编码如本文所述的RNAi的核酸。在一些实施方案中，编码所述RNAi的核酸包含miRNA支架。在一些实施方案中，编码所述RNAi的核酸与启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述启动子选自下组：巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、CK6启动子、转甲状腺素启动子(TTR)、TK启动子、四环素反应性启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝脏特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-球蛋白启动子(CAG)启动子、延伸因子1-α启动子(EFl-α)启动子、人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、逆转录病毒劳斯(Rous)肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、二氢叶酸还原酶启动子和13-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，所述表达构建体进一步包含多聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述多聚腺苷酸化信号是牛生长激素多聚腺苷酸化信号、SV40多聚腺苷酸化信号或HSV TK pA。
在一些实施方案中，本发明提供包含如本文所述的表达构建体的载体。在一些实施方案中，所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体、重组腺病毒载体、重组慢病毒载体或重组单纯疱疹病毒(HSV)载体。在一些实施方案中，所述载体是重组腺病毒载体。在一些实施方案中，所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad3型、犬Ad 2型、羊Ad或猪Ad 3型。在一些实施方案中，所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2或腺病毒血清型5的变体。在其他实施方案中，所述载体是重组慢病毒载体。在一些实施方案中，所述重组慢病毒载体源自具有水泡性口膜炎病毒(VSV)的慢病毒假型(lentiviruspseudotyped with vesicular stomatitis virus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus)(LCMV)、罗斯河病毒(Ross river virus)(RRV)、埃博拉病毒(Ebola virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、莫卡拉病毒(Mokala virus)、狂犬病毒(Rabies virus)、RD114或其中的变体。其他实施方案中，所述载体是rHSV载体。在一些实施方案中，所述rHSV载体源自rHSV-1或rHSV-2。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，本发明提供rAAV载体，其包含编码如本文所述的RNAi的表达构建体。在一些实施方案中，所述表达构建体侧翼为一个或多个AAV反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，所述表达构建体侧翼为两个AAV ITR。在一些实施方案中，所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些实施方案中，所述AAV ITR是AAV2ITR。在一些实施方案中，所述载体进一步包含填充核酸。在一些实施方案中，所述填充核酸位于启动子和编码RNAi的核酸之间。在一些实施方案中，所述载体是自身互补的rAAV载体。在一些实施方案中，所述载体包含编码所述RNAi的第一核酸序列和编码所述RNAi的互补物的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可与第二核酸序列沿其长度的大部分或全部形成链内碱基对。在一些实施方案中，所述第一核酸序列和第二核酸序列通过突变的AAV ITR连接，其中所述突变的AAV ITR包含D区的缺失并包含末端解析序列的突变。在一些实施方案中，本发明提供包含如本文所述的载体(例如rAAV载体)的细胞。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，本发明提供包含编码如本文所述的RNAi的载体的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是衣壳化所述rAAV载体的AAV颗粒、衣壳化所述重组腺病毒载体的腺病毒颗粒、衣壳化所述重组慢病毒载体的慢病毒颗粒或衣壳化所述重组HSV载体的HSV颗粒。在一些实施方案中，所述腺病毒颗粒是衣壳化所述重组腺病毒载体的腺病毒颗粒。在一些实施方案中，所述腺病毒颗粒包含来自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或猪Ad 3型的衣壳。在一些实施方案中，所述腺病毒颗粒包含腺病毒血清型2衣壳或腺病毒血清型5衣壳的变体。在其他实施方案中，所述病毒颗粒是衣壳化所述重组慢病毒载体的慢病毒颗粒。在一些实施方案中，所述慢病毒颗粒包含具有如下病毒假型的衣壳：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病毒、RD114或其中的变体。在其他实施方案中，所述病毒颗粒是HSV颗粒。在一些实施方案中，所述HSV颗粒是rHSV-1颗粒或rHSV-2颗粒。
在一些实施方案中，本发明提供包含编码如本文所述的RNAi的rAAV载体的重组AAV颗粒。在一些实施方案中，所述AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2N587A、AAV2E548A、AAV2N708A、AAV V708K、a山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合体、牛AAV或小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1血清型衣壳。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自相同的AAV血清型。在其他实施方案中，所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自不同的AAV血清型。在一些实施方案中，所述ITR源自AAV2且所述rAAV颗粒的衣壳源自AAV1。
在一些实施方案中，本发明提供包含病毒颗粒(例如rAAV颗粒)的组合物，所述病毒颗粒含有编码如本文所述的RNAi的载体。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的载剂。
在一些方面中，本发明提供用于抑制或减少哺乳动物疾病中多肽表达的方法，其包括将如上文所述的RNAi、表达构建体、载体、rAAV载体、病毒颗粒、rAAV颗粒或组合物施用至所述哺乳动物，其中所述RNAi靶向编码所述多肽的RNA。在一些实施方案中，本发明提供用于抑制哺乳动物细胞中多肽积累的方法，其包括将如上文所述的RNAi、表达构建体、载体、rAAV载体、病毒颗粒、rAAV颗粒或组合物施用至所述哺乳动物，其中所述RNAi靶向编码所述多肽的RNA。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。
在一些实施方案中，本发明提供如上文所述的RNAi、表达构建体、载体、rAAV载体、病毒颗粒、rAAV颗粒或组合物在制造用于在本文所述的任何方法中的药物的用途。在一些实施方案中，本发明提供如上文所述的RNAi、表达构建体、载体、rAAV载体、病毒颗粒、rAAV颗粒或组合物用于如本文所述的任何方法的用途。在一些实施方案中，本发明提供用于在哺乳动物中诱导RNA干扰的套盒，其包含如本文所述的RNAi、表达构建体、载体、rAAV载体、病毒颗粒、rAAV颗粒或组合物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述套盒用于如本文所述的任何方法中使用。
在一些方面，本发明提供包含第一链和第二链的RNAi，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:1)的指导区且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO:2)的非指导区，其中所述第一链和第二链形成双链体，且其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基形成非指导区中的凸出。在一些实施方案中，所述指导区包含与SEQ ID NO:1具有约90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述非指导区包含与SEQ ID NO:2具有约90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，在所述指导区残基11和12处的U残基在指导区中形成凸出。在一些实施方案中，所述双链体长度为19-25或19-23碱基对。在一些实施方案中，所述第一和/或第二链进一步包含3’悬垂区、5’悬垂区或3'和5’悬垂区两者。在一些实施方案中，所述第一链和所述第二链通过能够形成环结构的RNA接头连接。在一些实施方案中，能够形成环结构的RNA接头包含4-50个核苷酸。在一些实施方案中，能够形成环结构的RNA接头包含4-20个核苷酸。在一些实施方案中，能够形成环结构的RNA接头包含13个核苷酸。在一些实施方案中，所述RNAi包含SEQ IDNO:3的核苷酸序列。在其他实施方案中，所述RNAi包含与SEQ ID NO:3的核苷酸序列约90％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述RNAi是小抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或小发夹RNA(shRNA)。
在上述方面的一些实施方案中，改进所述RNAi的核酸序列以减少脱靶基因沉默。在一些实施方案中，所述序列包含一个或多个CpG基序。在一些实施方案中，所述序列在种子区中包含一个或多个CpG基序。在一些实施方案中，所述RNAi包含第一链和第二链，其中所述第一链包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:15)的指导区且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO:16)的非指导区，其中所述第一链和第二链形成双链体且其中在所述第二链残基18或残基19处的A残基在非指导区中形成凸出。在一些实施方案中，所述RNAi包含第一链和第二链，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:17)的指导区且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO:18)的非指导区，其中所述第一链和第二链形成双链体且其中在所述第二链残基18或残基19处的A残基在非指导区中形成凸出。在一些实施方案中，所述指导区包含与SEQ ID NO:15具有约90％同一性的核酸序列且所述非指导区包含与SEQ ID NO:16具有约90％同一性的核酸序列或所述指导区包含与SEQ ID NO:17具有约90％同一性的核酸序列且所述非指导区包含与SEQ ID NO:18具有约90％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含编码如上文所述的RNAi的核酸的表达构建体。在一些实施方案中，编码所述RNAi的核酸包含miRNA支架。在一些实施方案中，编码所述RNAi的核酸包含miR-155支架。在一些实施方案中，编码所述RNA的核酸与启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述启动子能够在哺乳动物的脑中表达所述RNAi。在一些实施方案中，所述启动子选自下组：巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、CK6启动子、转甲状腺素启动子(TTR)、TK启动子、四环素反应性启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝脏特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-球蛋白启动子(CAG)启动子、延伸因子1-α启动子(EFl-α)启动子、人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、二氢叶酸还原酶启动子和13-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，所述启动子是杂合鸡β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，所述表达构建体进一步包含多聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述多聚腺苷酸化信号是牛生长激素多聚腺苷酸化信号。
在一些实施方案中，本发明提供包含如上文所述的表达构建体的载体。在一些实施方案中，所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体、重组腺病毒载体、重组慢病毒载体或重组单纯疱疹病毒(HSV)载体。在一些实施方案中，所述载体是重组腺病毒载体。在一些实施方案中，所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad3型、犬Ad 2型、羊Ad或猪Ad 3型。在一些实施方案中，所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2或腺病毒血清型5的变体。在一些实施方案中，所述载体是重组慢病毒载体。在一些实施方案中，所述重组慢病毒载体源自具有如下病毒假型的慢病毒：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病毒、RD114或其中的变体。在一些实施方案中，所述载体是rHSV载体。在一些实施方案中，所述rHSV载体源自rHSV-1或rHSV-2。
在一些实施方案中，本发明提供重组AAV(rAAV)载体，其包含编码如上文所述的RNAi的表达构建体。在一些实施方案中，所述表达构建体侧翼为一个或多个AAV反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，所述表达构建体侧翼为两个AAV ITR。在一些实施方案中，所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些实施方案中，所述AAV ITR是AAV2ITR。在一些实施方案中，所述rAAV载体5’-3’包含AAV2ITR、启动子、编码所述RNAi的核酸、多聚腺苷酸化信号和AAV2ITR。在一些实施方案中，所述启动子是CBA启动子。在一些实施方案中，所述多聚腺苷酸化信号是牛生长激素多聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述rAAV载体5’-3’包含AAV2ITR、CBA启动子、编码所述RNAi的核酸、牛生长激素多聚腺苷酸化信号和AAV2ITR。在一些实施方案中，所述载体进一步包含填充核酸。在一些实施方案中，所述填充核酸包含编码绿色荧光蛋白(GFP)的核酸。在一些实施方案中，所述填充核酸位于所述启动子和编码所述RNAi的核酸之间。在一些实施方案中，所述RNAi包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。在其他实施方案中，所述RNAi包含与SEQ ID NO:3的核苷酸序列约90％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述载体是自身互补的载体。在一些实施方案中，所述载体包含编码所述RNAi的第一核酸序列和编码所述RNAi的互补物的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可与所述第二核酸序列沿其长度的大部分或全部形成链内碱基对。在一些实施方案中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通过突变的AAV ITR连接，其中所述突变的AAV ITR包含D区的缺失并包含末端解析序列的突变。
在一些实施方案中，本发明提供包含如本文所述的载体或rAAV载体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是中枢神经系统(CNS)细胞。
在一些实施方案中，本发明提供病毒颗粒，其包含编码如本文所述的RNAi的载体，其中所述病毒颗粒是衣壳化所述rAAV载体的AAV颗粒、衣壳化所述重组腺病毒载体的腺病毒颗粒、衣壳化所述重组慢病毒载体的慢病毒颗粒或衣壳化所述重组HSV载体的HSV颗粒。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是衣壳化所述重组腺病毒载体的腺病毒颗粒。在一些实施方案中，所述腺病毒颗粒包含来自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或猪Ad 3型的衣壳。在一些实施方案中，所述腺病毒颗粒包含腺病毒血清型2衣壳或腺病毒血清型5衣壳的变体。在其他实施方案中，所述病毒颗粒是衣壳化所述重组慢病毒载体的慢病毒颗粒。在一些实施方案中，所述慢病毒颗粒包含具有如下病毒假型的衣壳：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病毒、RD114或其中的变体。在其他实施方案中，所述病毒颗粒是HSV颗粒。在一些实施方案中，所述HSV颗粒是rHSV-1颗粒或rHSV-2颗粒。
在一些实施方案中，本发明提供重组AAV颗粒，其包含编码如上文所述的RNAi的rAAV载体。在一些实施方案中，所述AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2N587A、AAV2E548A、AAV2N708A、AAV2V708K,山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣壳。在一些实施方案中，所述所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自相同的AAV血清型。在其他实施方案中，所述所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自不同的AAV血清型。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒包含AAV2衣壳。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒包含AAV1衣壳且其中所述载体包含AAV2ITR。
在一些实施方案中，本发明提供包含如上文所述的病毒颗粒或rAAV颗粒的组合物。在进一步的实施方案中，所述进一步包含药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗哺乳动物中亨廷顿病的方法，其包括将所述组合物施用至所述哺乳动物。在一些实施方案中，本发明提供用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物中htt表达的方法，其包括将所述组合物施用至所述哺乳动物。在一些实施方案中，本发明提供用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物的细胞中htt积累的方法，其包括将所述组合物施用至所述哺乳动物。
在一些方面，本发明提供用于治疗哺乳动物中亨廷顿病的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。在一些方面，本发明提供用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物中htt表达的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。在一些方面，本发明提供用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物的细胞中htt积累的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。
在上述方法的一些实施方案中，所述指导区包含与SEQ ID NO:1具有约90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述非指导区包含与SEQ ID NO:2具有约90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，在所述指导区残基11和12处的U残基与在所述指导区中形成凸出。在一些实施方案中，所述双链体长度为19-25或19-23个碱基对。在一些实施方案中，所述第一和/或第二链进一步包含3'悬垂区、5'悬垂区或3'和5'悬垂区两者。在一些实施方案中，所述第一链和所述第二链通过能够形成环结构的RNA接头连接。在一些实施方案中，能够形成环结构的RNA接头包含4-50个核苷酸。在一些实施方案中，能够形成环结构的RNA接头包含4-20个核苷酸。在一些实施方案中，能够形成环结构的RNA接头包含13个核苷酸。在一些实施方案中，所述RNAi包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。在其他实施方案中，所述RNAi包含与SEQ ID NO:3的核苷酸序列约90％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述RNAi是小抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或小发夹RNA(shRNA)。
在上述方法的一些实施方案中，改进所述核酸以减少脱靶基因沉默。在一些实施方案中，所述核酸包含一个或多个CpG基序。在一些实施方案中，所述核酸在种子区中包含一个或多个CpG基序。
在一些实施方案中，本发明提供用于治疗哺乳动物中亨廷顿病的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:15)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO:16)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。在一些实施方案中，本发明提供用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物中htt表达的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ IDNO:15)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO:16)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。在一些实施方案中，本发明提供用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物的细胞中htt积累的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:15)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO:16)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。在一些实施方案中，所述第一链包含与SEQ ID NO:15具有约90％同一性的核酸序列但保持所述CpG基序。在一些实施方案中，所述第二链包含与SEQ ID NO:16具有约90％同一性的核酸序列但保持所述CpG基序。
在一些实施方案中，本发明提供用于治疗哺乳动物中亨廷顿病的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:17)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO:18)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。在一些实施方案中，本发明提供用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物中htt表达的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ IDNO:17)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO:18)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。在一些实施方案中，本发明提供用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物的细胞中htt积累的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:17)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO:18)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。在一些实施方案中，所述第一链包含与SEQ ID NO:17具有约90％同一性的核酸序列但保持所述CpG基序。在一些实施方案中，所述第一链包含与SEQ ID NO:18具有约90％同一性的核酸序列但保持所述CpG基序。
在上述方法的一些实施方案中，所述表达构建体包含编码如上文所述的RNAi的核酸。在一些实施方案中，编码所述RNAi的核酸包含miRNA支架。在一些实施方案中，编码所述RNAi的核酸包含miR-155支架。在一些实施方案中，编码所述RNAi的核酸与启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述启动子能够在哺乳动物的脑中表达所述RNAi。在一些实施方案中，所述启动子选自下组：巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、CK6启动子、转甲状腺素启动子(TTR)、TK启动子、四环素反应性启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝脏特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-球蛋白启动子(CAG)启动子、延伸因子1-α启动子(EFl-α)启动子、人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、二氢叶酸还原酶启动子和13-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，所述启动子是杂合鸡β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，所述表达构建体进一步包含多聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述多聚腺苷酸化信号是牛生长激素多聚腺苷酸化信号。
在上述方法的一些实施方案中，所述载体包含如上文所述的表达构建体。在一些实施方案中，所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体、重组腺病毒载体、重组慢病毒载体或重组单纯疱疹病毒(HSV)载体。在一些实施方案中，所述载体是重组腺病毒载体。在一些实施方案中，所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或猪Ad 3型。在一些实施方案中，所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2或腺病毒血清型5的变体。在一些实施方案中，所述载体是重组慢病毒载体。在一些实施方案中，所述重组慢病毒载体源自具有如下病毒假型的慢病毒：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病毒、RD114或其中的变体。在一些实施方案中，所述载体是rHSV载体。在一些实施方案中，所述rHSV载体源自rHSV-1或rHSV-2。
在上述方法的一些实施方案中，所述重组AAV(rAAV)载体包含编码如上文所述的RNAi的表达构建体。在一些实施方案中，所述表达构建体侧翼为一个或多个AAV反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，所述表达构建体侧翼为两个AAV ITR。在一些实施方案中，所述AAV ITR为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些实施方案中，所述AAV ITR为AAV2ITR。在一些实施方案中，所述rAAV载体5’-3’包含AAV2ITR、启动子、编码所述RNAi的核酸、多聚腺苷酸化信号和AAV2ITR。在一些实施方案中，所述启动子是CBA启动子。在一些实施方案中，所述多聚腺苷酸化信号是牛生长激素多聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述rAAV载体5’-3’包含AAV2ITR、CBA启动子、编码所述RNAi的核酸、牛生长激素多聚腺苷酸化信号和AAV2ITR。在一些实施方案中，所述载体进一步包含填充核酸。在一些实施方案中，所述填充核酸包含编码绿色荧光蛋白(GFP)的核酸。在一些实施方案中，所述填充核酸位于启动子和编码所述RNAi的核酸之间。在一些实施方案中，所述RNAi包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。在其他实施方案中，所述RNAi包含与SEQID NO:3的核苷酸序列约90％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述载体是自身互补的载体。在一些实施方案中，所述载体包含编码所述RNAi的第一核酸序列和编码所述RNAi的互补物的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可与所述第二核酸序列沿其长度的大部分或全部形成链内碱基对。在一些实施方案中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通过突变的AAV ITR连接，其中所述突变的AAV ITR包含D区的缺失并包含末端解析序列的突变。
在上述方法的一些实施方案中，所述病毒颗粒包含编码如上文所述的RNAi的载体，其中所述载体是衣壳化rAAV载体的AAV颗粒、衣壳化所述重组腺病毒载体的腺病毒颗粒、衣壳化所述重组慢病毒载体的慢病毒颗粒或衣壳化所述重组HSV载体的HSV颗粒。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是衣壳化所述重组腺病毒载体的腺病毒颗粒。在一些实施方案中，所述腺病毒颗粒包含来自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad3型、犬Ad 2型、羊Ad或猪Ad 3型的衣壳。在一些实施方案中，所述腺病毒颗粒包含腺病毒血清型2衣壳或腺病毒血清型5衣壳的变体。在其他实施方案中，所述病毒颗粒是衣壳化所述重组慢病毒载体的慢病毒颗粒。在一些实施方案中，所述慢病毒颗粒包含具有如下病毒假型的衣壳：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病毒、RD114或其中的变体。在其他实施方案中，所述病毒颗粒是HSV颗粒。在一些实施方案中，所述HSV颗粒是rHSV-1颗粒或rHSV-2颗粒。
在上述方法的一些实施方案中，所述重组AAV颗粒包含编码如上文所述的RNAi的rAAV载体。在一些实施方案中，所述AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2N587A、AAV2E548A、AAV2N708A、AAV2V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合体、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣壳。在一些实施方案中，所述所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自相同的AAV血清型。在其他实施方案中，所述所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自不同的AAV血清型。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒包含AAV2衣壳。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒包含AAV1衣壳且其中所述载体包含AAV2ITR。
在上述方法的一些实施方案中，所述病毒颗粒或rAAV颗粒在组合物中。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的载剂。
在一些实施方案中，本发明提供如本文所述的RNAi、表达构建体、载体、rAAV载体、病毒颗粒、rAAV颗粒或组合物在制造用于如本文所述的治疗亨廷顿病的任何方法的药物中的用途。在一些实施方案中，本发明提供如本文所述的RNAi、表达构建体、载体、rAAV载体、病毒颗粒、rAAV颗粒或组合物，其用于本文所述的治疗亨廷顿病的任何方法。在一些实施方案中，本发明提供用于在哺乳动物中诱导RNA干扰以治疗亨廷顿病的套盒，其包含如本文所述的RNAi、表达构建体、载体、rAAV载体、病毒颗粒、rAAV颗粒或组合物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述套盒用于如本文所述的任何方法。
本文引用的全部参考文献，包括专利申请和出版物，通过提述以其整体并入。
附图简述
图1A&B显示AAV2/1-miRNA-Htt介导的体外Htt水平的减少(图1A)。使用了前病毒构建体方案生成AAV2/1-miRNA-Htt。设计质粒以在鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子的转录控制下表达GFP和针对Htt的miRNA序列。ITR为反向末端重复。eGFP为增强的绿色荧光蛋白。多聚A为牛生长激素多聚A。(图1B)在AAV-2/1-miRNA-Htt治疗后48小时在HEK293细胞中评估HttmRNA水平的定量PCR分析。PPIA作为标准化对照基因。值作为平均值±SEM给出。*p<0.05。
图2A-D证明了用AAV2/1-eGFP-miRNA-Htt载体感染HEK293细胞后的荧光活化细胞分选(FACS)。(图2A)具有eGFP的HEK293细胞的流式细胞散射概貌。正向光散射A(FSC-A)代表相对的细胞大小、区域和SSC-A代表相对的细胞复杂度，区域中每个点代表一个细胞。(图2B)细胞的eGFP荧光强度的荧光作图中每种颜色将分选的细胞分别界定为GFP-、GFP+、GFP++、或GFP+++。(图2C)表达eGFP的HEK293细胞的FACS柱状图。(图2D)FACS分选后的细胞计数表。
图3A-E显示YAC128小鼠中AAV2/1-miRNA-Htt注射的纹状体内注射后广泛的纹状体转导和Htt减少。(图3A)具有eGFP的纹状体细胞的流式细胞散射概貌。流式细胞散射A(FSC-A)代表相对的细胞大小、区域且SSC-A代表相对的细胞复杂度，区域中每个点代表一个细胞。(图3B)使用FSC-A对FITC-A的散点图分析。分选出死细胞并选择eGFP+和eGFP-细胞。评估并量化来自这些细胞的GFP表达且示于图3C。(图3C)用530/30BP过滤器505LP收集的eGFP荧光强度的荧光作图。(图3D)显示AAV2/1-eGFP-miRNA-Htt的纹状体内施用后遍及纹状体的广泛的eGFP表达的荧光显微术。(图3E)AAV2/1-miRNA-Htt或AAV2/1-空对照载体注射后1和5个月在纹状体中评估Htt mRNA水平的定量PCR分析。PPIA作为标准化对照基因。值作为平均值±SEM给出。*p<0.05。当在治疗后1和5个月与AAV2/1-空-注射的小鼠(N＝8每时间点)比较时，AAV2/1-miRNA-Htt治疗的YAC128小鼠(N＝8)显示纹状体中Htt mRNA水平约50％的减少。
图4显示YAC128小鼠中AAV2/1-miRNA-Htt注射的纹状体内注射后小鼠Htt mRNA的减少。在注射AAV2/1-miRNA-Htt或AAV2/1-空对照载体后1和5个月评估纹状体中内源小鼠Htt mRNA水平的定量PCR分析。PPIA作为标准化对照基团。值作为平均值±SEM给出。*p<0.05。
图5A-I证明了通过AAV2/1-miRNA-Htt持续降低YAC128小鼠中的Htt水平未引起明显的神经炎症。(图5A-C)来自使用AAV2/1-miRNA-Htt治疗的YAC128小鼠在AAV-miRNA-Htt注射后1(图5B)或5(图5C)个月纹状体组织切片的苏木精和伊红(H&E)染色，与使用AAV2/1-空载体治疗的YAC128小鼠(图5A)进行了比较。(图5D-F)来自使用AAV2/1-miRNA-Htt治疗的YAC128小鼠在AAV-miRNA-Htt注射后1(图5E)或5(图5F)个月纹状体组织切片的GFAP免疫组化染色，与使用AAV2/1-空载体治疗的YAC128小鼠(图5D)进行了比较。(图5G-I)来自使用AAV2/1-miRNA-Htt治疗的YAC128小鼠在AAV-miRNA-Htt注射后1(图5H)或5(图5I)个月纹状体组织切片的Iba-1免疫组化染色，与使用AAV2/1-空载体治疗的YAC128小鼠(图5G)进行了比较。对所有照片曝光匹配用于精确比较。比例条：0.25mm。
图5J&K证明了通过AAV2/1-miRNA-Htt持续降低YAC128小鼠中的Htt水平未引起明显的神经炎症。(图5J)注射AAV2/1-miRNA-Htt后1或5个月通过QPCR的GFAP mRNA水平的纹状体水平。(图5K)注射AAV2/1-miRNA-Htt后1或5个月通过QPCR的Iba1mRNA水平。值作为平均值±SEM给出。*与AAV2/1-空小鼠显著不同，p<0.05；ANOVA。
图6A-D显示用于测试YAC128小鼠中AAV2/1-miRNA-Htt的纹状体施用对行为缺陷的影响的实验设计。(图6A)实验时间表的说明。两月龄的YAC128和野生型小鼠接受了双侧AAV2/1-miRNA-Htt(N＝8YAC且N＝8WT)或AAV2/1-空对照(N＝8YAC且N＝8WT)的纹状体注射，且在4和5月龄时分别接受旋转杆(rotarod)测试和Porsolt游泳测试。在5月龄时处死全部小鼠，随后收集组织用于生化和组化分析。(图6B)荧光显微显示了在处理后3个月纹状体中eGFP的表达。AAV2/1-miRNA-Htt治疗后3个月通过Western印迹的小鼠(图6C)和人(图6D)Htt蛋白水平。
图6E&F证明了AAV2/1-miRNA-Htt的纹状体施用减少了YAC128小鼠中的行为缺陷。(图6E)注射AAV2/1-miRNA-Htt后2个月加速的旋转杆测试。(图6F)注射AAV2/1-miRNA-Htt后3个月Porsolt游泳测试中静止花费的时间。值作为平均值±SEM给出。*与AAV2/1-空小鼠显著不同，p<0.05；ANOVA随后为Tukey的后-hoc检验。
图7A&B显示使用AAV2/1-miRNA-Htt的治疗部分改正了YAC128小鼠中DARPP-32和D1受体的转录失调。注射AAV2/1-miRNA-Htt(N＝8YAC且N＝8WT)或AAV2/1-空对照(N＝8YAC且N＝8WT)后3个月通过QPCR评估的YAC128和野生型小鼠纹状体中DARPP-32和D1受体的mRNA水平。(图7A)AAV2/1-空或AAV2/1-miRNA-Htt治疗后YAC128和FVB野生型同窝小鼠中纹状体DARPP-32mRNA水平。(图7B)AAV2/1-空或AAV2/1-miRNA-Htt治疗后YAC128和FVB野生型同窝小鼠中纹状体D1受体mRNA水平。值作为平均值±SEM给出。*与AAV2/1-空样品显著不同，p<0.05；ANOVA随后为Tukey的后-hoc检验。
图8A-D显示施用AAV2/1-miRNA-Htt在高龄(aged)YAC128小鼠的纹状体中改善了运动缺陷并减少了突变的Htt聚集物。(图8A)YAC128小鼠脑切片的免疫组化染色显示纹状体中突变的Htt聚集物。在6、9、12(未显示)和24月龄的YAC128小鼠中观察到了聚集物。野生型小鼠在全部测试的年龄都显示无聚集物。(图8B)在高龄YAC 128和野生型小鼠中用于检测AAV2/1-miRNA-HTT的实验时间表的图示。七个月龄的小鼠接受AAV2/1-miRNA-Htt(N＝6YAC且N＝4WT)或AAV2/1-GFP对照(N＝6YAC且N＝4WT)的双侧纹状体内注射，且随后在10月龄接受了行为学测试。在注射后5个月收集脑部(当小鼠为12月龄时)。(图8C)注射AAV-miRNA-Htt后3个月时高龄的YAC128小鼠对旋转杆测试的表现。(图8D)在治疗后5个月AAV2/1-miRNA-Htt或AAV2/1-eGFO治疗的YAC 128小鼠脑切片的EM-48免疫组化分析。
图9A&B证明了用于本文所述实验的shRNA的干序列中的内部凸出。与完美匹配序列的比较示于图9A(SEQ ID NO:23)，用于上文实验的序列在种子序列3’末端包含额外的腺嘌呤核苷酸(A)(通过箭头高亮)，其在指导链(SEQ ID NO:24)中不具有相应的胸腺嘧啶核苷酸(T)(图9B)。与靶序列互补的序列高亮显示。
图10显示原始PS170XAmiRNA序列(SEQ ID NO:19)和两种修饰的低脱靶版本PS170XAL1(SEQ ID NO:25)和PS170XAL2(SEQ ID NO:26)。
图11显示AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1和170XAL2在体外介导Htt减少的AAV能力的能力。值作为平均值±SEM给出。
图12A-12D显示AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1和170XAL2在YAC128小鼠的纹状体中沉默Htt表达的AAV能力的能力。人Htt示于图12A和12C。小鼠Htt示于图12B和12D。β-微管蛋白作为对于全部Western印迹的标准化对照基因。*与未治疗对照小鼠显著不同，p<0.05；ANOVA随后为Tukey的后-hoc检验。
图13A显示纹状体中GFAP且图13B显示了纹状体中Iba1mRNA水平。人PPIA作为标准化对照基因。值作为平均值±SEM给出。*与未治疗对照小鼠显著不同，p<0.05；ANOVA随后为Tukey的后-hoc检验。
图14显示来自用AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1或AAV2/1-miRNA-Htt170XAL2治疗的YAC128小鼠的纹状体组织切片的GFAP和Iba1免疫组化染色。比例条＝50μM。
发明详述
在一些方面中，本发明提供改进的RNAi；例如改进的用于治疗用途的RNAi。在一些实施方案中，所述RNAi包含第一链和第二链,其中a)所述第一链和所述第二链形成双链体；b)所述第一链包含至少11个碱基的指导区，其中所述指导区包含含有指导链碱基1-N的种子区，其中N＝7或N＝8；和c)所述第二链包含至少11个碱基的非指导区，所述非指导区包含双链体中指导区碱基1-(N+2)的任何一个或多个对侧的凸出序列。在一些实施方案中，所述RNAi包含第一链和第二链，其中a)所述第一链和所述第二链形成双链体；b)所述第一链包含至少10个碱基的指导区，其中所述指导区包含含有指导链碱基1-N的种子区，其中N＝7或N＝8；c)所述第二链包含至少10个碱基的非指导区，其中所述非指导区包含双链体中指导区碱基1-(N+1)的任何一个或多个对侧的凸出序列。在一些实施方案中，所述RNAi包含第一链和第二链,其中a)所述第一链和所述第二链形成双链体；b)所述第一链包含至少9个碱基的指导区，其中所述指导区包含含有指导链的碱基2-7或2-8的种子区，且c)所述第二链包含至少9个碱基的非指导区，其中所述非指导区包含双链体中指导区碱基1或碱基9的对侧的凸出序列。在一些实施方案中，所述RNAi包含第一链和第二链，其中a)所述第一链和所述第二链形成双链体；b)所述第一链包含至少9个碱基的指导区，其中所述指导区包含含有指导链的碱基2-7或2-8的种子区，且c)所述第二链包含至少9个碱基的非指导区，其中所述非指导区包含双链体中指导区的碱基1的对侧的凸出序列。在一些实施方案中，所述RNAi是人工RNAi。
在一些方面，本发明提供表达盒、载体(例如重组AAV、腺病毒、慢病毒或HSV载体)、细胞、病毒颗粒(例如AAV、腺病毒、慢病毒或HSV病毒颗粒)和包含本公开的RNAi的药物组合物。在另一方面中，本发明提供在哺乳动物中用于治疗疾病或病症的方法，其包括将包含本公开的RNAi的药物组合物施用至所述哺乳动物。在另一方面中，本发明提供包含本公开的RNAi的套盒。
在一些方面，本发明提供用于治疗亨廷顿病的RNAi。在一些实施方案中，所述RNAi包含包含第一链和第二链，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:1)的指导区且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ IDNO:2)的非指导区，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。在一些方面，本发明提供包含本公开的RNAi的表达盒、载体(例如重组AAV、腺病毒、慢病毒或HSV载体)、细胞、病毒颗粒(例如AAV、腺病毒、慢病毒或HSV病毒颗粒)和药物组合物。在另一方面中，本发明提供用于治疗亨廷顿病、抑制htt的表达、抑制htt在哺乳动物的细胞中积累的方法，其包括将包含本公开的RNAi的药物组合物施用这所述哺乳动物。在另一方面中，本发明提供药物包含本公开的组合物用于治疗亨廷顿病(例如改善亨廷顿病的症状)、抑制htt的表达、抑制htt在具有亨廷顿病的哺乳动物的细胞中积累的用途。在另一方面中，本发明提供用于在哺乳动物中治疗亨廷顿病的套盒，其包含本公开的RNAi。
I.一般技术
本文描述和引用的技术和方法为本领域的技术人员一般充分理解的且使使用常规方法学所通常采用的，如例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook等，第4版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2012)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编，2003)；the seriesMethods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编，1995)；Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow和Lane,编，1988)；Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Techniqueand Specialized Applications(R.I.Freshney,第6版,J.Wiley and Sons,2010)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编,Academic Press,1998)；Introduction toCell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,PlenumPress,1998)；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,和D.G.Newell,编，J.Wiley and Sons,1993-8)；Handbook ofExperimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell,编，1996)；Gene Transfervectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos,编，1987)；PCR:The PolymeraseChain Reaction,(Mullis等编,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等编,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等编,J.Wiley and Sons,2002)；Immunobiology(C.A.Janeway等，2004)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:APractical Approach(D.Catty.编,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:APractical Approach(P.Shepherd和C.Dean,编，Oxford University Press,2000)；UsingAntibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra,编，Harwood AcademicPublishers,1995)和Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等编,J.B.Lippincott Company,2011)中所述的广泛采用的方法学。
II.定义
如本文使用的“载体”指包含体外或体内待递送入宿主细胞的重组质粒或病毒。
如本文使用的术语“多核苷酸”或“核酸”指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的多聚形式。因此，该术语包括但不限于单-、双-或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或包含嘌呤和嘧啶碱基的多聚物或其他天然、化学或生物修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基。多核苷酸骨架可包含糖和磷酸基团(如通常在RNA或DNA中所发现)，或修饰或取代的糖或磷酸基团。可替换地，多核苷酸骨架可包含合成亚基如氨基磷酸酯的多聚物且因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。此外，双链多核苷酸可从化学合成的单链多核苷酸产物通过合成互补链和在合适的条件下退火该链，或用合适的引物通过使用DNA聚合酶从头合成互补链而获得。
术语“多肽”和“蛋白”可互换使用以指代氨基酸残基的多聚物且不限于最小长度。这种氨基酸残基的多聚物可包含天然或非天然氨基酸残基，且包括但不限于肽、寡肽、氨基酸残基的二聚体、三聚体和多聚体。定义涵盖全长的蛋白及其片段两者。术语还包括多肽的表达后修饰，例如，糖基化、唾液酸化、乙酰化，磷酸化等。此外，就本发明而言，“多肽”指包含对天然序列的修饰的蛋白，如缺失、添加和取代，只要蛋白保持预期活性。这些修饰可以是刻意的，如通过定点诱变，或可以是意外的，如通过产生蛋白的宿主的突变或由于PCR扩增的错误。
“重组病毒载体”指包含一个或多个异源序列(即非病毒来源的核酸序列)的重组多核苷酸载体。在重组AAV载体的情况中，重组核酸侧翼为至少一个，且在一些实施方案中为两个反向末端重复序列(ITR)。
“重组AAV载体(rAAV载体)”指代包含一个或多个侧翼为至少一个且在一些实施方案中为两个AAV反向末端重复序列(ITR)的异源序列(即非AAV来源的核酸序列)的多核苷酸载体。当存在于已用合适的辅助病毒(或表达合适的辅助功能)感染且表达AAV rep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的宿主细胞中，这种rAAV载体可复制并包装入传染性病毒颗粒。当rAAV载体并入更大的多核苷酸(例如在染色体中或另一用于克隆或转染的载体如质粒)时，随后rAAV载体可称作“促载体”，其在AAV包装功能和合适的辅助功能存在下可通过复制和衣壳化“挽救”。rAAV载体可以是多种形式的任何，包括但不限于质粒、线性人工染色体、与脂质的复合、包囊于脂质体内和衣壳化于病毒颗粒中，特别是AAV颗粒。rAAV载体可包装入AAV病毒衣壳以生成“重组腺相关病毒颗粒(rAAV颗粒)”。
“重组腺病毒载体”指包含一个或多个侧翼为至少一个腺病毒反向末端重复序列(ITR)的异源序列(即非腺病毒来源的核酸序列)的多核苷酸载体。在一些实施方案中，所述重组核酸侧翼为两个反向末端重复序列(ITR)。当存在于表达从重组病毒基因组缺失的必要腺病毒基因(例如E1基因、E2基因、E4基因等)的宿主细胞中时，这种重组病毒载体可复制并包装入感染性病毒颗粒。当将重组病毒载体并入更大多核苷酸(例如在染色体中或另一载体如用于克隆或转染的质粒中)时，随后rAAV载体可称作“促载体”，其在AAV包装功能和合适的辅助功能存在下可通过复制和衣壳化“挽救”。重组病毒载体可以是多种形式的任何，包括但不限于质粒、线性人工染色体、与脂质的复合、包囊于脂质体内和衣壳化于病毒颗粒中，例如AAV颗粒。重组病毒载体可包装入腺病毒病毒衣壳以生成“重组腺病毒颗粒”。
“重组慢病毒载体”指包含一个或多个侧翼为至少一个慢病毒末端重复序列(LTR)的异源序列(即非慢病毒来源的核酸序列)的多核苷酸载体。在一些实施方案中，所述重组核酸侧翼为两个慢病毒末端重复序列(LTR)。当存在于已用合适的辅助功能感染的宿主细胞中时，这种重组病毒载体可复制并包装入感染性病毒颗粒。重组慢病毒载体可包装入慢病毒衣壳以生成“重组慢病毒颗粒”。
“重组单纯疱疹载体(重组HSV载体)”指包含一个或多个侧翼为HSV末端重复序列的异源序列(即非HSV来源的核酸序列)的多核苷酸载体。当存在于已用合适的辅助功能感染的宿主细胞中时，这种重组病毒载体可复制并包装入感染性病毒颗粒。当将重组病毒载体病毒并入更大的多核苷酸(例如在染色体中或另一载体如用于克隆或转染的质粒中)时，随后重组病毒载体可称作“促载体”，其在HSV包装功能存在下可通过复制和衣壳化“挽救”。重组病毒载体可以是多种形式的任何，包括但不限于质粒、线性人工染色体、与脂质的复合、包囊于脂质体内和衣壳化于病毒颗粒中，例如HSV颗粒。重组病毒载体可包装入HSV衣壳以生成“重组单纯疱疹病毒颗粒”。
“异源”意为源自与其所比较的或其所导入或并入的其余实体基因型不同的实体。例如，通过基因工程技术导入不同细胞类型的多核苷酸是异源多核苷酸(且，当表达时，可编码异源多核苷酸)。相似地，并入病毒载体的细胞序列(例如基因或其部分)是相对于该载体的异源核苷酸序列。
术语“转基因”指导入细胞且能够转录成RNA且任选地翻译和/或在合适条件下表达的多核苷酸。在一些方面中，其赋予所导入的细胞预期的特征，或以其他方式导致预期的治疗或诊断成果。另一方面，其可转录成介导RNA干扰的分子，如miRNA、siRNA或shRNA。
“鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子”指源自鸡β-肌动蛋白基因的多核苷酸序列(例如，原鸡(Gallus gallus)β肌动蛋白，由GenBank Entrez基因ID 396526所示)。如本文使用的“鸡β-肌动蛋白启动子”可指包含巨细胞病毒(CMV)早期增强元件、该启动子和鸡β-肌动蛋白基因的第一外显子和内含子、和兔β-珠蛋白基因的剪接受体的启动子，如描述于Miyazaki,J.等(1989)Gene79(2):269-77的序列。如本文使用的术语“CAG启动子”可互换使用。如本文使用的术语“CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子”可互换使用。
如指代病毒滴度使用的术语“基因组颗粒(gp)”、“基因组等价物”或“基因组拷贝”指包含重组AAV DNA基因组的病毒的粒数目，无论感染性或功能性。特定载体制剂的基因组颗粒数目可通过如描述于本文实施例或例如Clark等(1999)Hum.Gene Ther.,10:1031-1039；Veldwijk等(2002)Mol.Ther.,6:272-278中的方法测量。
如本文使用的术语“载体基因组(vg)”可指包含载体例如病毒载体的多核苷酸序列集合的一个或多个多核苷酸。载体基因组可以在病毒颗粒中衣壳化。取决于特定的病毒载体，载体基因组可包含单链DNA、双链DNA或单链RNA或双链RNA。载体基因组可包含与特定病毒载体相关的内源序列和/或任何通过重组技术插入特定病毒载体的异源序列。例如，重组AAV载体基因组可包含启动子侧翼的至少一个ITR序列、填充物(stuffer)、感兴趣的序列(例如RNAi)和多聚腺苷酸化序列。完整的载体基因组可包含载体的多核苷酸序列的完整集合。在一些实施方案中，病毒载体的核酸滴度可以vg/mL计测量。适于测量该滴度的方法为本领域已知(例如定量PCR)。
如本文使用的术语“抑制”可指阻断、减少、去除或以其他方式拮抗特定靶标的存在或活性的作用。抑制可指部分抑制或全部抑制。例如抑制基因的表达可指任何导致基因表达的阻断、减少、去除或任何其他拮抗的任何作用，包括mRNA丰度的减少(例如沉默mRNA转录)、mRNA降解、抑制mRNA翻译等。在一些实施方案中，抑制HTT的表达可指HTT表达的阻断、减少、去除或任何其他拮抗，包括HTT mRNA丰度的减少(例如沉默HTT mRNA转录)、HTTmRNA的降解、抑制HTT mRNA翻译等。作为另一实例，抑制蛋白在细胞中的积累可指任何导致所述蛋白表达的阻断、减少、去除或其他拮抗的任何作用，包括减少mRNA丰度(例如沉默mRNA转录)、降解mRNA、抑制mRNA翻译、降解所述蛋白等。在一些实施方案中，抑制细胞中HTT蛋白的积累指在细胞中HTT蛋白表达的阻断、减少、去除或其他拮抗，包括减少HTT mRNA丰度(例如沉默HTT mRNA转录)、HTT mRNA的降解、抑制HTT mRNA翻译、HTT蛋白的降解等。
如指代病毒滴度使用的术语“感染单位(iu)”、“感染颗粒”或“复制单位”指如通过感染性中心测定法(也称为复制中心测定法，如例如McLaughlin等(1988)J.Virol.,62:1963-1973中所述)所测量的感染性和有复制能力的重组AAV载体颗粒的数目。
指代病毒滴度所使用的术语“转导单位(tu)”指如本文实施例所述的功能性测定法或例如Xiao等(1997)Exp.Neurobiol.,144:113-124或Fisher等(1996)J.Virol.,70:520-532(LFU测定法)中所测量的导致功能性转基因产物产生的感染性重组AAV载体颗粒的数目。
“反向末端重复”或“ITR”序列是本领域熟知的术语且指代在病毒基因组末端发现的处于相反方向的相对短的序列。
“AAV反向末端重复(ITR)”序列为本领域熟知，是在天然单链AAV基因组两末端都存在的约145个核苷酸的序列。ITR最外侧的125个核苷酸可以可替换的两个方向存在，导致不同AAV基因组之间和单AAV基因组两末端之间的异质性。最外侧的125个核苷酸还包含数个自我互补的较短区(称为A、A'、B、B'、C、C'和D区)，允许链内碱基配对在ITR的该部分内发生。
“末端解析序列”或“trs”是AAV ITR D区中的序列，其在病毒DNA复制过程中通过AAV rep蛋白裂解。突变的末端解析序列难以通过AAV rep蛋白的裂解。
“AAV辅助功能”指允许AVV通过宿主复制并细胞包装的功能。AAV辅助功能可以任何多种形式提供，包括但不限于帮助AAV复制和包装的辅助病毒或辅助病毒基因。其他AAV辅助功能为本领域已知如遗传毒性剂。
AAV的“辅助病毒”指允许AAV(其为有缺陷的细小病毒)通过宿主复制并细胞包装的病毒。辅助病毒提供"辅助功能"，其允许AAV的复制。已确定多种这样的辅助病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(herpesvirus)和痘病毒(poxvirus)如牛痘(vaccinia)和杆状病毒(baculovirus)。腺病毒涵盖多种不同的亚群，尽管亚群C的5型腺病毒(Ad5)是最常使用的。人、非人哺乳动物和禽类来源的多种腺病毒为已知且可从保藏机构如ATCC获得。疱疹病毒家族(也可从保藏机构如ATCC获得)包括例如单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)(HSV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)(EBV)，巨细胞病毒(cytomegalovirus)(CMV)和伪狂犬病病毒(pseudorabies virus)(PRV)。用于AAV复制的腺病毒辅助功能的实例包括E1A功能、E1B功能、E2A功能、VA功能和E4orf6功能。可从保藏机构获得的杆状病毒(Baculovirus)包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclearpolyhedrosis virus)。
如果感染性AAV颗粒与感染性辅助病毒颗粒的比率至少为约102:l、至少约104:l、至少约106:l或至少约108:l或更多，则称rAAV的制备物“基本上无”辅助病毒。在一些实施方案中，制剂还基本上无等量的辅助病毒蛋白(即如果上文所示的辅助病毒颗粒杂质以破坏的形式存在，则蛋白将作为所述辅助病毒水平的结果存在)。病毒和/或细胞蛋白污染一般可作为SDS凝胶上考马斯染色条带的存在而观察到(例如，条带而非对应于AAV衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的那些的出现)。
相对于参照多肽或核酸序列的“百分比(％)序列同一性”定义为对齐序列和导入缺口后(如果需要的话)以实现最大百分比序列同一性，且不考虑任何保守取代作为序列同一性的部分，与参照多肽或核酸序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的候选序列中的氨基酸残基或核苷酸的百分比。出于确定百分比氨基酸或核酸序列同一性的目的，可以多种本领域已知的方式实现比对，例如，使用公众可获得的计算机软件程序，例如，描述于CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等编,1987),Supp.30,section 7.7.18,表7.7.1的那些，且包括BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。优选的比对程序是ALIGN Plus(Scientific and Educational Software,Pennsylvania)。本领域的技术人员可确定用于测量比对的合适参数，包括任何以实现在所比较的序列全长上实现最大比对所需的算法。就本文而言，给定氨基酸序列A对、与或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可替换地可称为具有或包含对、与或针对氨基酸序列B一定％氨基酸序列同一性的氨基酸序列A)如下计算：100乘以分数X/Y，其中X是在A和B的程序比对中通过序列比对软件评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中氨基酸残基的总数。可以理解的是其中氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不等，A对B的％氨基酸序列同一性将不等于B对A的％氨基酸序列同一性。就本文而言，给定核酸序列C对、与或针对给定核酸序列D的％核酸序列同一性(其可替换地可称为对、与或针对给定核酸序列D具有或包含一定％核酸序列的给定核酸序列C)如下计算：100乘以分数W/Z，其中W是在C和D的程序比对中通过序列比对软件评分为相同匹配的核苷酸的数目，且其中Z是D中核苷酸的总数。可以理解的是其中核酸序列C的长度不等于核酸序列D的长度，C对D的％核酸序列同一性将不等于D对C的％核酸序列同一性。
“分离的”分子(例如核酸或蛋白)或细胞意为已鉴定和分离和/或从其天然环境的组分回收。
“有效量”是足以影响有益或预期结果的量，包括临床结果(例如改善症状、实现临床终点等)。有效量可以一次或多次施用。就疾病状态而言，有效量是足以改善、稳定或延迟疾病进展的量。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如，牛、绵羊(sheep)、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)、兔和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。
如本文使用的“治疗”是用于获得有益或预期的临床结果的方式。就本发明而言，有益或预期的临床结果包括但不限于症状改善、疾病程度的减少、疾病的稳定化(例如未恶化)状态、疾病传播(例如转移)的预防、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论部分或全部)，无论是可检测的或不可检测的。“治疗”还可意为与未接受治疗的预期生存率相比延长生存率。
如本文使用的术语“预防性治疗”指治疗，其中个体已知或疑似具有或处于具有病症的风险，但未显示或显示最小的病症症状。经历预防性治疗的个体可在症状发生前治疗。
“亨廷顿氏病(HD)”指进展性脑病症，通常由HTT基因中的突变引起(又名亨廷顿蛋白，HD或IT15)。其可通过下列症状表征：异常运动(称为舞蹈病)、运动功能逐渐丧失、情绪或精神疾病和渐进性认知障碍。尽管大多症状在30和40岁出现，但已发现疾病的青少年形式。对于HD的进一步描述，参见OMIM Entry No.143100。
“亨廷顿蛋白(HTT)”可指与大多数亨廷顿氏病情况相关的基因或其多肽产物。亨廷顿蛋白的正常功能尚未完全理解。然而，已知亨廷顿蛋白基因中的突变引起HD。这些突变通常以常染色体显性遗传方式遗传且涉及HTT基因中三核苷酸CAG重复的扩增，导致Htt蛋白中的多聚谷氨酰胺(多聚Q)束。
如本文使用“RNAi”可指任何在细胞中诱导RNA干扰的RNA分子。RNAi的实例包括但不限于小抑制性RNAs(siRNA)、微小RNAs(miRNA)和小发夹RNA(shRNA)。
“miRNA支架”可指多核苷酸，其包含：(i)靶向感兴趣的基因以通过RNAi敲低的双链序列和(ii)形成类似内源miRNA的茎-环结构的额外的序列。当多核苷酸组装入miRNA样二级结构时，靶向感兴趣的基因用于RNAi的序列(例如短的，～20-nt序列)可连接于生成miRNA样茎-环的序列和与感兴趣的序列碱基配对的序列以形成双链体。如本文所述，该双链体可不完美杂交，例如其可包含一个或多个未配对或错配的碱基。当通过Dicer切割该多核苷酸时，该包含靶向感兴趣的基因的序列的双链体可展开且并入RISC复合物。miRNA支架可指miRNA自身或编码所述miRNA的DNA多核苷酸。miRNA支架的实例是miR-155序列(Lagos-Quintana,M.等(2002)Curr.Biol.12:735-9)。商业上可得到的用于将序列克隆入miRNA支架的套盒为本领域已知(例如来自Life Technologies的InvitrogenTM BLOCK-iTTM Pol IImiR RNAi表达载体套盒，Thermo Fisher Scientific；Waltham,MA)。
如本文使用的“凸出”指在双链体核酸中与对侧核酸不互补的核酸区。例如，凸出可指在双链体核酸中与对侧核酸不互补的核酸序列，其中所述凸出侧翼为与双链体核酸中的对侧核酸互补的核酸区。在一些实例中，凸出可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10个碱基的任何长度。在一些实例中，凸出可由错配导致(例如对侧链包含非互补的碱基)或凸出可由未配对导致(例如对侧链包含与凸出侧翼的核酸互补但对侧链不包含凸出对侧的核酸)。
如本文使用的术语“有义”核酸是包含编码全部或部分转基因的序列的核酸。在一些实例中，转基因的mRNA是有义核酸。
如本文使用的“反义”核酸是与“有义”核酸互补的核酸序列。例如反义核酸可与编码转基因的mRNA互补。
如本文使用的RNAi的“指导区”是结合靶mRNA的RNAi的链，通常基于互补性。互补区可涵盖指导区的全部或部分。通常，互补区至少包括种子区。在许多情况中，RNAi的反义区是指导区。
如本文使用，对于RNAi的“过客区”或“非指导区”在本文可互换使用，是与指导区互补的RNAi区。在许多情况中，RNAi的有义区是过客区。
如本文使用RNAi的“种子区”(例如miRNA)是微小RNA的长度上约1-8核苷酸的区。在一些实例中，种子区和其靶mRNA的3′-UTR可以是RNAi识别中的核心决定部分。
如本文使用的“脱靶基因沉默”指RNAi种子区与非故意的mRNA的3′-UTR配对且指导翻译抑制和那些转录物的去稳定化(例如减少非故意的mRNA的表达)。
本文值或参数“约”的指代包括(和描述)针对值或参数本身的实施方案。例如，指“约X”的描述包括“X”的描述。
除非另外指明，如本文使用的制品的单数形式“一种”、“一个”和“所述”包括复数指称。
可以理解的是，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“包含”、“由...组成”和/或“基本上由...组成”的方面和实施方案。
III.RNAi
在一些方面，本发明提供改进的RNAi。在一些实施方案中，所述RNAi是小抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或小发夹RNA(shRNA)。小抑制性或干扰RNA(siRNA)在本领域已知是诱导细胞中RNAi的长度为19-25(例如19-23)碱基对的双链RNA分子。小发夹RNA(shRNA)在本领域已知为诱导细胞中RNAi的包含通过短环(例如～4-11核苷酸)连接的双链RNA的约19-25(例如19-23)碱基对的RNA分子。
微小RNA(miRNA)在本领域已知为诱导细胞中RNAi的包含通过环连接的双链RNA的短(例如19-25碱基对)序列并包含含有一个或多个凸出(例如错配或未配对的碱基对)的双链RNA的一个或多个额外序列的RNA分子。如本文使用的术语“miRNA”涵盖内源miRNA以及外源或异源miRNA。在一些实施方案中，“miRNA”可指初级miRNA(pri-miRNA)或前-miRNA(pre-miRNA)。在miRNA加工过程中，产生初级miRNA转录物。初级miRNA通过Drosha-DGCR8通过切除一个或多个序列以保留具有5’侧翼区、指导链、环区、非指导链和3’侧翼区；或者5’侧翼区、非指导链、环区、指导链和3’侧翼区的前-miRNA进行加工以产生前-miRNA。前-RNA随后输出至细胞质并通过Dicer加工以得到具有指导链和非指导(或过客)链的siRNA。所述指导链随后被RISC复合物使用以催化基因沉默，例如通过识别与指导链互补的靶RNA序列。对miRNA的进一步描述可在例如WO 2008/150897中发现。靶序列通过miRNA的识别最初由在靶标和miRNA种子序列(例如指导链的核苷酸1-8(5’-3’))之间的配对确定(参见例如Boudreau,R.L.等(2013)Nucleic Acids Res.41:e9)。
在初级/前-miRNA结构中，双链体中指导链:非指导链的界面部分通过互补碱基配对形成(例如Watson-Crick碱基配对)。然而，在一些实施方案中，该互补碱基配对不通过整个双链体延伸。在一些实施方案中，界面中各凸出可在一个或多个核苷酸位置存在。如本文使用的术语"凸出"可指与双链体中其对侧的核酸不互补的核酸区。在一些实施方案中，当互补核酸区彼此结合而中心非互补区的区域不结合时，形成凸出。在一些实施方案中，当位于两互补区之间的两核酸链长度不同时，形成凸出。如下文所述，凸出可以是1个或多个核苷酸。
在miRNA加工过程中，miRNA在邻近指导链:非指导链界面处的切割位点切割，因此释放指导和非指导链的siRNA双链体。在一些实施方案中，所述miRNA在与切割位点邻近的有义或反义链中包含凸出。为说明另一方式，在一些实施方案中，所述miRNA在与种子序列邻近的指导或非指导链中包含凸出。在该位置中各凸出通过图9B中所述的示例性实施方案中的箭头指示。
在一些实施方案中，所述miRNA在成熟非指导链的5’切割位点对侧的指导链中包含凸出。在一些实施方案中，所述miRNA在非指导链5’核苷酸对侧包含凸出。在一些实施方案中，所述miRNA在成熟指导链3’切割位点的对侧有义链中包含凸出。在一些实施方案中，所述miRNA在指导链3’核苷酸对侧包含凸出。
在一些实施方案中，所述RNAi包含第一链和第二链,其中a)所述第一链和所述第二链形成双链体；b)所述第一链包含至少11个碱基的指导区，其中所述指导区包含含有指导链的碱基1-N的种子区，其中N＝7或N＝8；且c)所述第二链包含至少11个碱基的非指导区，其中所述非指导区包含双链体中指导区的碱基1-(N+2)的任何一个或多个对侧的凸出序列。在一些实施方案中，其中N＝7且凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6、7、8或9。在其他实施方案中，N＝8且凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。
在一些实施方案中，所述RNAi包含第一链和第二链,其中a)所述第一链和所述第二链形成双链体；b)所述第一链包含至少10个碱基的指导区，其中所述指导区包含含有指导链碱基1-N的种子区，其中N＝7或N＝8；且c)所述第二链包含至少10个碱基的非指导区，其中所述非指导区包含双链体中指导区碱基1-(N+1)的任何一个或多个对侧的凸出序列。在一些实施方案中，N＝7且所述凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6、7或8。在其他实施方案中，N＝8且所述凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6、7、8或9。
在一些实施方案中，所述非指导区包含双链体中指导区碱基1-N的任何一个或多个对侧的凸出序列。在一些实施方案中，N＝7且所述凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6或7。在其他实施方案中，N＝8且所述凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6、7或8。
在一些实施方案中，所述RNAi包含第一链和第二链，其中a)所述第一链和所述第二链形成双链体；b)所述第一链包含至少9个碱基的指导区，其中所述指导区包含含有指导链碱基2-7或2-8的种子区，且c)所述第二链包含至少9个碱基的非指导区，其中所述非指导区包含双链体中指导区碱基1或碱基9的对侧的凸出序列。
在一些实施方案中，所述RNAi包含第一链和第二链,其中a)所述第一链和所述第二链形成双链体；b)所述第一链包含至少9个碱基的指导区，其中所述指导区包含含有指导链的碱基2-7或2-8的种子区，且c)所述第二链包含至少9个碱基的非指导区，其中所述非指导区包含双链体中指导区的碱基1或碱基9对侧的凸出序列。
在一些实施方案中，所述凸出通过在指导区上缺乏互补碱基的双链体中非指导链的一个或多个碱基形成，其中所述凸出侧翼为与指导链进行碱基配对的碱基。在一些实施方案中，所述凸出序列具有约1-10核苷酸。在一些实施方案中，所述凸出序列具有约2-15核苷酸。在一些实施方案中，所述凸出序列具有约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15核苷酸。
基于RNAi的疗法的安全性可由小抑制性RNA(siRNA)与非故意的的mRNA结合并减少其表达(称为脱靶基因沉默的作用)阻碍。脱靶主要发生在当种子区(小RNA的核苷酸2-8)与非故意的mRNA的3′-UTR中的序列配对并指导翻译抑制和那些转录物的去稳定化时。减少的脱靶RNAi可通过取代指导和非指导序列内碱基，例如通过生成CpG基序而设计。可导致显著更低的脱靶评分的潜在取代可使用SiSPOTR算法(一种针对特异性的siRNA设计算法，其识别具有最小脱靶潜力和强大的沉默能力的候选序列)评估(Boudreau等,Nucleic AcidsRes.2013Jan；41(1)e9。减少的SiSPOTR评分预测与亲本RNAi分子相比具有较低潜在人脱靶数目的序列。在本发明的一些实施方案中，改进所述RNAi以减少脱靶基因沉默。在一些实施方案中，所述RNAi包含一个或多个CpG基序。在一些实施方案中，所述RNAi在种子区包含一个或多个CpG基序。
在一些实施方案中，所述第一链和所述第二链通过能够形成环结构的RNA(例如RNA接头)的方式连接。如本领域中已知的，当RNA分子包含由不碱基配对在一起的RNA序列分开的碱基配对在一起的两个RNA序列时，形成RNA环结构(例如茎-环或发夹)。例如，如果序列A和C互补或部分互补使得它们碱基配对在一起，但在序列B中的碱基不碱基配对在一起，则可在RNA分子A-B-C中形成环结构。
在一些实施方案中，能够形成环结构的RNA包含4-50个核苷酸。在一些实施方案中，能够形成环结构的RNA包含13个核苷酸。在一些实施方案中，在能够形成环的RNA中核苷酸的数目为4-50个核苷酸或其间的任何整数。在一些实施方案中，0-50％的环可与环的另一部分互补。如本文使用的术语“环结构”是接合核酸两互补链的序列。在一些实施方案中，环结构的1-3个核苷酸邻接核酸的互补链且可与环结构远端部分的1-3个核苷酸互补。例如在所述环结构5’末端的三核苷酸可与在环结构3’末端的三核苷酸互补。
在一些实施方案中，编码本公开的RNAi的核酸包含异源miRNA支架。在一些实施方案中，使用异源miRNA支架用于调节miRNA表达；例如以增加miRNA表达或减少miRNA表达。可使用本领域已知的任何miRNA支架。在一些实施方案中，所述miRNA支架源自miR-155支架(参见例如Lagos-Quintana,M.等(2002)Curr.Biol.12:735-9和来自Life Technologies,Thermo Fisher Scientific；Waltham,MA的InvitrogenTM BLOCK-iTTM Pol II miR RNAi表达载体套盒)。
IV.亨廷顿病及其实验模型
亨廷顿病(HD)是通过在亨廷顿蛋白基因(HTT)外显子1中CAG重复扩展引起的遗传性神经退行性疾病。所致的N-末端区中多聚谷氨酰胺束的延伸赋予突变的亨廷顿蛋白蛋白(mHtt)毒性获得性功能。mHtt毒性可从不溶的包含mHtt的聚集物形成、转录失调和蛋白稳态中的扰动产生，其全部导致神经元死亡(Saudou等(1998)Cell,95:55-66；Zuccato等(2003)Nat.Genet.35:76-83；Schaffar等(2004)Mol.Cell.15:95-105；Benn等(2008)J.Neurosci.28:10720-10733)。在具有HD的患者中的病理性发现包括皮质变薄和纹状体神经元惊人的进行性丧失(Rosas等，(2002)Neurology 58:695-701)。疾病初始通常在生命的30至40岁过程中发生；症状包括舞蹈病样动作、协调障碍、进行性痴呆和其他精神障碍(Vonsattel等，(1985)J.Neuropathol.Exp.Neurol.44:559-577)。在大多数的情况中，症状在30-40岁开始出现，伴随运动技能、认知和个性的细微破坏。随时间这些进展成为不平稳、无法控制的运动和肌肉控制丧失、痴呆和精神疾病如抑郁、侵略、焦虑和强迫行为。死亡通常在症状发病后的10-15年发生。少于10％的HD情况涉及疾病的青少年发病形式，其由更快的疾病进展表征。认为约10,000的美国人中约有1人具有HD。
尽管HD的遗传基础已发现近20年，目前的疗法大部分是姑息的，而不解决疾病的根本原因。这可能部分是由于如下事实：该疾病的病因学复杂，在多种细胞过程中都观察到了不利的影响。因此，药物开发的焦点已针对解决主要的激惹的(offending)触发因素，即突变的HTT基因本身。
HD的大多数情况与HTT基因中的三核苷酸CAG重复扩展相关。HTT基因中CAG重复的数目与HD的表现强烈相关。例如，具有35或更少重复的个体通常不发展HD，但具有27-35重复的个体具有更高的后代患有HD的风险。具有36至40-42重复的个体具有不完全显性的HD，而具有多于40-42重复的个体显示完全的显性。青少年发病的HD情况可与60或更多的CAG重复大小相关。
由该CAG重复扩大导致的多聚Q-扩展的Htt蛋白与细胞聚集物或包涵体、扰动的蛋白稳态和转录失调相关。尽管这些毒性表型可与机体的数个部分相关，其最常与神经元细胞死亡相关。HD患者经常显示皮质变薄和纹状体神经元惊人、进行性丧失。纹状体表现为对HD最脆弱的脑部区域(特别是纹状体介质多棘神经元)，在壳核和尾状核中可见早期影响。在HD患者的脑中观察到纹状体多棘神经元中的细胞死亡、增加数目的星形胶质细胞和小神经胶质细胞的激活。HD还可影响海马区、大脑皮质、丘脑、下丘脑和小脑的一些区域。
提出的阻断Htt表达的方式包括使用反义寡核苷酸(ASO)以及双链体RNA(dsRNA)或化学修饰的单链RNA(ssRNA)的RNA干扰(RNAi)(Harper等，(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:5820-5825；DiFiglia等，(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA104:17204-17209；Boudreau等，(2009b)Mol.Ther.17:1053-1063；Drouet等，(2009)Ann.Neurol.65:276-285；Sah等，(2011)J.Clin.Invest.121:500-507；Matsui等，(2012)Drug Discov.Today 17:443-450；Yu等，(2012)Cell 150:895-908)。然而，将ASO方式转换成临床的障碍可包括并入装置以促进将ASO重复和长期输注入CNS的需求，和充足分布药物至大脑的靶区的需求。
为回避这些ASO的潜在问题，采用提供增加的安全性、增加的效率和更长效的效力的潜力的RNAi的AAV-介导表达(例如siRNA)可为有优势的。由于HD患者表达突变和野生型Htt等位基因两者，大多数siRNA靶向序列将可能降解这两种等位基因。然而，已显示HD小鼠中的非等位基因特异性Htt沉默为良好耐受的并可提供与单独减少突变Htt相同的益处(Boudreau等，(2009b)Mol.Ther.17:1053-1063；Drouet等，(2009)Ann.Neurol.65:276-285；Kordasiewicz等，(2012)Neuron 74(6):1031-1044)。此外，报告的AAV-介导的RNAi后非人灵长类的壳核中野生型Htt的部分和持续抑制不具有任何不想要的效果，这表明成年脑可耐受减少的野生型Htt水平(McBride等，(2011)Mol.Ther.19:2152-2162；Grondin等，(2012)Brain 135:1197-1209)。
HD的动物模型可用于测试潜在的治疗策略，如本公开的组合物和方法。用于HD的小鼠模型为本领域已知。这些包括具有突变的HTT片段的小鼠模型如R6/1和N171-82Q HD小鼠(Harper等，(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:5820-5825,Rodriguez-Lebron等，(2005)Mol.Ther.12:618-633,Machida等，(2006)Biochem.Biophys.Res.Commun.343:190-197)。本文所述的小鼠HD模型的另一实例是YAC128小鼠模型。该模型携带表达有128CAG重复的突变人HTT基因的酵母人工染色体(YAC)，且YAC128小鼠12个月龄时在纹状体中显示Htt聚集物的显著和广泛的积累(Slow等，(2003)Hum.Mol.Genet.12:1555-1567,Pouladi等，(2012)Hum.Mol.Genet.21:2219-2232)。
也可使用HD的其他动物模型。例如已描述了转基因大鼠(von Horsten,S.等(2003)Hum.Mol.Genet.12:617-24)和恒河猴(Yang,S.H.等(2008)Nature453:921-4)模型。还已知非遗传模型。这些最常涉及使用兴奋性毒性化合物(如喹啉酸或红藻氨酸)或线粒体毒素(如3-硝基丙酸和丙二酸)以诱导啮齿类动物或非人灵长类动物中纹状体神经元死亡(更多的描述和参照，参见Ramaswamy,S.等(2007)ILAR J.48:356-73)。
V.治疗亨廷顿病的方法
在一些方面，本发明提供用于在哺乳动物中治疗亨廷顿病的方法和组合物，其包括将本公开的药物组合物(例如包含本发明的病毒颗粒的药物组合物)施用至所述哺乳动物。在一些方面，本发明提供用于在具有亨廷顿病的哺乳动物中抑制htt表达的方法和组合物，其包括将本公开的药物组合物(例如包含本发明的病毒颗粒的药物组合物)施用至所述哺乳动物。在一些方面，本发明提供用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物的细胞中htt积累的方法和组合物，其包含将本公开的药物组合物(例如包含本发明的病毒颗粒的药物组合物)施用至所述哺乳动物。
在一些方面，本发明提供用于改善HD症状的方法和组合物，其包括将有效量的包含编码本公开的RNAi的载体的重组病毒颗粒施用至哺乳动物的脑部。在一些实施方案中，HD的症状包括但不限于舞蹈病、强直、无法控制的身体运动、肌肉失去控制、缺乏协调、躁动、减缓眼部运动、异常姿态、不稳、共济失调步态、表情异常、言语障碍、咀嚼和/或吞咽困难、睡眠障碍、癫痫、痴呆，认知障碍(例如涉及规划、抽象思维、灵活性、规则获取、人际关系敏感性、自我控制、注意力、学习、记忆的能力减退)、抑郁、焦虑、人格改变、侵略、强迫行为、着迷-强迫行为、性欲亢进、精神病、情感淡漠、烦躁、自杀的念头、体重下降、肌肉萎缩、心脏衰竭、减少葡萄糖耐受、睾丸萎缩和骨质疏松症。
在一些方面中，本发明提供方法以预防或延迟HD的进展。常染色体显性HD是遗传性疾病，其可进行基因分型。例如，HTT中CAG重复的数目可通过基于PCR重复大小确定。该类诊断可在生命的任何阶段通过直接检测青少年或成人(例如伴随临床症状显现)、产前筛查或产前排除测试(例如通过绒毛取样或羊膜穿刺术)或胚胎植入前筛查实施。由此，本文所述的方法可用作HD的预防性治疗，这是由于诊断可在症状初始前发生。例如,HD可通过基因检查(产前检查、出生检查等)诊断并在症状发生前(例如CNS细胞丧失)进行预防性治疗(例如使用本文所述的rAAV颗粒)以预HD症状的发病和/或进展。此外，HD可通过脑部成像、寻找尾状核和/或壳核的收缩和/或脑室扩大来诊断。这些症状与HD家族史和/或临床症状组合可指示HD。
用于确定HD症状改善的方式为本领域已知。例如，美国亨廷顿氏病评定量表(UHDRS)可用于评估运动功能、认知功能、行为异常和功能性能力(参见例如HuntingtonStudy Group(1996)Movement Disorders 11:136-42)。建立该评定量表以提供统一、全面的测试用于疾病病理的多面性，并入来自测试如HD活动和日常生活能力量表(HDActivities and Daily Living Scale)、马斯登和奎因的舞蹈病严重程度量表(Marsdenand Quinn’s chorea severity scale)、肢体残疾和独立量表(Physical Disability andIndependence scales)、HD运动评定量表(HD motor rating scale)(HDMRS)、HD功能性能力量表(HD functional capacity scale)(HDFCS)和神经定量检查(QNE)的元素。其他有效用于确定HD症状改善的测试可包括但不限于蒙特利尔认知评估(Montreal CognitiveAssessment)、脑成像(例如MRI)、分类流畅性测验(Category Fluency Test)、连线测验(Trail Making Test)、地图搜索(Map Search)、斯特鲁普字阅读测试(Map Search)、加快拍打任务(Speeded Tapping Task)和符号数字模式测试(Symbol Digit ModalitiesTest)。
在本发明的一些方面中，使用用于治疗具有HD的人的方法。如上文所述，HD以常染色体显性遗传的方式遗传且由HTT基因中的CAG重复扩展导致。青少年发病的HD最经常从父系遗传。亨廷顿疾病样表型已与其他基因座如HDL1、PRNP、HDL2、HDL3和HDL4相关。认为其他基因座可修饰HD症状的表现，包括GRIN2A、GRIN2B、MSX1、GRIK2和APOE基因中的突变。
在一些方面，本发明提供用于靶向具有亨廷顿病的哺乳动物中的htt mRNA的改进的RNAi。在一些实施方案中，所述RNAi包含第一链和第二链，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸，其中第一链和第二链形成双链体而且其中在所述第二链的SEQ ID NO:2的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。如本文所述的RNAi(例如作为rAAV载体的部分)可用于，特别是治疗亨廷顿病。
在本发明的一些实施方案中，改进所述RNAi以减少脱靶基因沉默。在一些实施方案中，所述RNAi包含一个或多个CpG基序。在一些实施方案中，所述RNAi在种子区中包含一个或多个CpG基序。
在一些实施方案中，本发明提供用于在哺乳动物中治疗亨廷顿病的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:15)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO:16)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。在一些实施方案中，本发明提供用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物中htt表达的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ IDNO:15)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO:16)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。在一些实施方案中，本发明提供用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物的细胞中htt积累的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:15)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO:16)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。在一些实施方案中，所述第一链包含与SEQ ID NO:15具有大于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的任何同一性的核酸序列但保持CpG基序。在一些实施方案中，所述第二链包含与SEQ ID NO:16具有大于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的任何同一性的核酸序列但保持CpG基序。
在一些实施方案中，本发明提供用于治疗哺乳动物中亨廷顿病的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:17)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO:18)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。在一些实施方案中，本发明提供用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物中htt表达的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ IDNO:17)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO:18)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。在一些实施方案中，本发明提供用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物的细胞中htt积累的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:17)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO:18)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。在一些实施方案中，所述第一链包含与SEQ ID NO:17具有大于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的任何同一性的核酸序列但保持CpG基序。在一些实施方案中，所述第二链包含与SEQ ID NO:18具有大于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的任何同一性的核酸序列但保持CpG基序。
在一些实施方案中，所述RNAi是小抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或小发夹RNA(shRNA)。小抑制性或干扰RNA(siRNA)在本领域已知是诱导细胞中RNAi的长度为约19-25(例如19-23)碱基对的双链RNA分子。小发夹RNA(shRNA)在本领域已知为诱导细胞中RNAi的包含通过短环(例如～4-11核苷酸)连接的双链RNA的约19-25(例如19-23)碱基对的RNA分子。
在一些实施方案中，所述miRNA包含与SEQ ID NO:1约90％相同的指导序列。在一些实施方案中，所述miRNA包含指导序列，其为约与SEQ ID NO:1 90％相同、91％相同、92％相同、93％相同、94％相同、95％相同、96％相同、97％相同、98％相同、99％相同或100％相同中的任何。
在一些实施方案中，所述miRNA包含与SEQ ID NO:2约90％相同的非指导序列。在一些实施方案中，所述miRNA包含非指导序列，其为约与SEQ ID NO:2约90％相同、91％相同、92％相同、93％相同、94％相同、95％相同、96％相同、97％相同、98％相同、99％相同或100％相同中的任何。
在一些实施方案中，所述第一核酸残基11和12处的U残基与所述第二链中的残基不形成碱基对。在一些实施方案中，所述双链体的长度为18-25个碱基对。在一些实施方案中，所述第一和/或第二链进一步包含3’悬垂区、5’悬垂区或3'和5’悬垂区两者。在一些实施方案中，本发明提供RNAi及其方法和组合物，其包含第一链和第二链，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸，其中所述第一链和第二链形成双链体且其中在SEQ ID NO:2的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对而且在第一核酸的SEQ ID NO:1的残基11和12处的U残基与所述第二链中的残基不形成碱基对。
在一些实施方案中，所述第一链和所述第二链通过能够形成环结构的RNA连接。如本领域中已知的，当RNA分子包含由不碱基配对在一起的RNA序列分开的碱基配对在一起的两RNA序列时，形成RNA环结构(例如茎-环或发夹)。例如，如果序列A和C互补或部分互补使得它们碱基配对在一起但在序列B中的碱基不碱基配对在一起，则在RNA分子A-B-C中可形成环结构。
在一些实施方案中，能够形成环结构的RNA包含4-50个核苷酸。在一些实施方案中，能够形成环结构的RNA接头包含13个核苷酸。在一些实施方案中，能够形成环结构的RNA包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。在一些实施方案中，载体基因组包含核苷酸序列，其与SEQID NO:13的序列为至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％,或99％相同中的任何。
在一些方面，本发明提供将RNAi施用至哺乳动物(例如具有HD的哺乳动物)的方法，所述RNAi包含第一链和第二链，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸，其中SEQ ID NO:2的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。在一些实施方案中，第一核酸的SEQ IDNO:1的位置11和12处的U残基不与所述第二链中的残基碱基配对。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:2的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对且在第一核酸的SEQ ID NO:1的位置11和12处的U残基不与所述第二链中的残基碱基配对。在一些实施方案中，重组病毒颗粒包含所述RNAi。在一些实施方案中，所述重组病毒颗粒是衣壳化rAAV载体的AAV颗粒、衣壳化重组腺病毒载体的腺病毒颗粒、衣壳化重组慢病毒载体的慢病毒颗粒或衣壳化重组HSV载体的HSV颗粒，其中所述rAAV载体、腺病毒载体、慢病毒载体或HSV载体编码所述RNAi。
在一些实施方案中，重组病毒颗粒通过将病毒颗粒注射至脑部递送。在一些实施方案中，重组病毒颗粒通过将病毒颗粒注射至纹状体递送。递送重组病毒颗粒至脑部区域(纹状体)(包括壳核和尾状核)的纹状体施用受HD高度影响。此外，且不希望受理论限制，认为注射入纹状体的重组病毒颗粒(例如rAAV颗粒)还可分散(例如通过逆行转运)至脑部的其他区域，包括但不限于投射区域(例如皮质)。在一些实施方案中，重组病毒颗粒通过对流增强递送进行递送(例如对流增强递送至纹状体)。
在一些方面，本发明提供用于在哺乳动物中治疗亨廷顿病的方法，其包括将本公开的药物组合物施用至所述哺乳动物。在一些方面，本发明提供用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物的细胞中htt积累的方法，其包括将本公开的药物组合物施用至所述哺乳动物。在一些方面，本发明提供用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物中htt表达的方法，其包括将本公开的药物组合物施用至所述哺乳动物。在一些实施方案中，所述htt是突变的htt(例如包含多于35、多于36、多于37、多于38、多于39、多于40、多于41或多于42个CAG重复的htt)。在一些实施方案中，野生型htt的表达和/或积累也受到抑制。如本文所述，且不希望受到理论限制，认为在具有HD的哺乳动物中抑制突变的htt的表达和/或积累是高度有益的，但在相同的哺乳动物中野生型htt表达和/或积累的抑制作为副作用(例如本公开的RNAi)是可以良好耐受的(例如产生少量或不产生非故意的副作用)。
在一些实施方案中，细胞包含载体(例如包含编码本公开的RNAi的表达构建体的载体)。在一些实施方案中，所述载体是rAAV载体。在一些实施方案中，所述载体是重组腺病毒载体、重组慢病毒载体或重组单纯疱疹病毒(HSV)载体。在一些实施方案中，所述细胞是中枢神经系统(CNS)细胞。
在一些实施方案中，有效量的包含编码本公开的RNAi的载体的重组病毒颗粒的施用在或靠近施用位点转导神经元(例如纹状体神经元如多棘神经元)。在一些实施方案中，转导了多于约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或100％中任何的神经元。在一些实施方案中，转导了约5％至约100％、约10％至约50％、约10％至约30％、约25％至约75％、约25％至约50％，或约30％至约50％的神经元。本领域已知鉴定通过表达miRNA的重组病毒颗粒转导的神经元的方法；例如免疫组化、RNA检测(例如qPCR、Northern印迹、RNA-seq、原位杂交等)或共表达标记物如增强的绿色荧光蛋白的使用可用于检测表达。
在本发明的一些实施方案中，所述方法包括将有效量的重组病毒颗粒施用至哺乳动物的脑部用于治疗具有HD的哺乳动物例如人，其中所述重组病毒颗粒包含编码本公开的RNAi的载体。在一些实施方案中，将所述组合物注射至脑中的一处或多处位置以允许本公开的RNAi至少在神经元中表达。在一些实施方案中，将所述组合物注射入脑中的任何一处、两处、三处、四处、五处、六处、七处、八处、九处、十处或多于十处的位置。在一些实施方案中，将所述组合物注射入纹状体。在一些实施方案中，将所述组合物注射入背侧纹状体。在一些实施方案中，将所述组合物注射入壳核。在一些实施方案中，将所述组合物注射入尾状核。在一些实施方案中，将所述组合物注射入壳核和注射入尾状核。
在一些实施方案中，将所述重组病毒颗粒施用至脑部的一个半球。在一些实施方案中，将重组病毒颗粒施用至脑部的两半球。
在一些实施方案中，将所述重组病毒颗粒同时或顺序施用至多于一处的位置。在一些实施方案中，重组病毒颗粒的多重注射的间隔不多于1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、9小时、12小时或24小时。
在一些实施方案中，本发明提供通过施用有效量的包含编码本公开的RNAi的重组病毒载体的药物组合物以抑制突变的HTT的活性用于治疗具有HD的人的方法。在一些实施方案中，所述药物组合物包含一个或多个药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述方法包括施用有效量含有编码本公开的RNAi的重组病毒载体的药物组合物以抑制突变的HTT的活性。在一些实施方案中，病毒颗粒(例如rAAV颗粒)的病毒滴度为至少约5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、10×1012、11×1012、15×1012、20×1012、25×1012、30×1012,或50×1012基因组拷贝/mL中的任何。在一些实施方案中，病毒颗粒(例如rAAV颗粒)的病毒滴度约为5×1012至6×1012、6×1012至7×1012、7×1012至8×1012、8×1012至9×1012、9×1012至10×1012、10×1012至11×1012、11×1012至15×1012、15×1012至20×1012、20×1012至25×1012、25×1012至30×1012、30×1012至50×1012，或50×1012至100×1012基因组拷贝/mL中的任何。在一些实施方案中，病毒颗粒(例如rAAV颗粒)的病毒滴度为约5×1012至10×1012、10×1012至25×1012，或25×1012至50×1012基因组拷贝/mL中的任何。在一些实施方案中，病毒颗粒(例如rAAV颗粒)的病毒滴度为至少约5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、10×109、11×109、15×109、20×109、25×109、30×109或50×109转导单位/mL中的任何。在一些实施方案中，病毒颗粒(例如rAAV颗粒)的病毒滴度为约5×109至6×109、6×109至7×109、7×109至8×109、8×109至9×109、9×109至10×109、10×109至11×109、11×109至15×109、15×109至20×109、20×109至25×109、25×109至30×109、30×109至50×109，或50×109至100×109转导单位/mL中的任何。在一些实施方案中，病毒颗粒(例如rAAV颗粒)的病毒滴度为约5×109至10×109、10×109至15×109、15×109至25×109，或25×109至50×109转导单位/mL中的任何。在一些实施方案中，病毒颗粒(例如rAAV颗粒)的病毒滴度为至少约5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、10×1010、11×1010、15×1010、20×1010、25×1010、30×1010、40×1010，或50×1010感染单位/mL中的任何。在一些实施方案中，病毒颗粒(例如rAAV颗粒)的病毒滴度为至少约5×1010至6×1010、6×1010至7×1010、7×1010至8×1010、8×1010至9×1010、9×1010至10×1010、10×1010至11×1010、11×1010至15×1010、15×1010至20×1010、20×1010至25×1010、25×1010至30×1010、30×1010至40×1010、40×1010至50×1010，或50×1010至100×1010感染单位/mL中的任何。在一些实施方案中，病毒颗粒(例如rAAV颗粒)的病毒滴度为至少约5×1010至10×1010、10×1010至15×1010、15×1010至25×1010，或25×1010至50×1010感染单位/mL中的任何。
在一些实施方案中，施用至个体的病毒颗粒的剂量为至少约1×108至约1×1013基因组拷贝/kg体重中的任何。在一些实施方案中，施用至个体的病毒颗粒的剂量为约1×108至约1×1013基因组拷贝/kg体重。
在一些实施方案中，施用至个体的病毒颗粒总量为至少约1×109至约1×1014基因组拷贝中的任何。在一些实施方案中，施用至个体的病毒颗粒总量为约1×109至约1×1014基因组拷贝中的任何。
在本发明的一些实施方案中，注射至纹状体的组合物的体积多于约下列任何：1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、15μl、20μl、25μl、50μl、75μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl或1mL或其间任何量。
在一些实施方案中，将第一体积的组合物注射入脑部的第一区，并将第二体积的组合物注射入脑部的第二区。例如，在一些实施方案中，将第一体积的组合物注射入尾状核，并将第二体积的组合物注射入壳核。在一些实施方案中，将1X体积的组合物注射入尾状核，并将1.5X、2X、2.5X、3X、3.5X,或4X体积的组合物注射入壳核，其中X是多于约下列的任何体积：1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、15μl、20μl、25μl、50μl、75μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl或1mL或其间的任何量。
本发明的组合物(例如包含编码本公开的RNAi的载体的重组病毒颗粒)可单独或与一个或多个其他治疗剂组合使用用于治疗HD。顺序施用间的时间间隔可就至少(或可替换地少于)数分钟、数小时或数天而言。
V.RNAi表达构建体和载体
本发明提供用于表达本文所述的RNAi的表达构建体、载体和病毒颗粒。
在一些实施方案中，编码本公开的RNAi的核酸包含异源miRNA支架。在一些实施方案中，使用异源miRNA支架用于调节miRNA表达；例如以增加miRNA表达或减少miRNA表达。可使用本领域已知的任何miRNA支架。在一些实施方案中，所述miRNA支架源自miR-155支架(参见例如Lagos-Quintana,M.等(2002)Curr.Biol.12:735-9和来自Life Technologies,Thermo Fisher Scientific；Waltham,MA的InvitrogenTM BLOCK-iTTM Pol II miR RNAi表达载体套盒)。在一些实施方案中，编码本公开的RNAi的核酸包含miRNA支架。在一些实施方案中，miRNA支架由SEQ ID NO:14提供。
在一些实施方案中，所述RNAi靶向编码与病症相关的多肽的RNA。在一些实施方案中，所述病症是CNS病症。不希望受到理论限制，认为可使用RNAi以减少或去除其获得性功能已与病症关联的多肽的表达和/或活性。可通过本发明的治疗多肽或治疗核酸治疗的本发明CNS病症的非限制性实例(对于每种病症可靶向或补给的示例性基因在括号中提供)包括中风(例如caspase-3、Beclin1、Ask1、PAR1、HIF1α、PUMA和/或Fukuda,A.M.和Badaut,J.(2013)Genes(Basel)4:435-456中所述的任何基因)、亨廷顿氏病(突变的HTT)、癫痫(例如SCN1A、NMDAR、ADK和/或Boison,D.(2010)Epilepsia51:1659-1668中所述的任何基因)、帕金森氏病(α-突触核蛋白)、Lou Gehrig’s疾病(也称为肌萎缩性侧索硬化；SOD1)、阿尔茨海默氏病(tau、淀粉样前体蛋白)、皮质基底节变性或CBD(tau)、皮质基底节变性或CBGD(tau)、额颞叶痴呆或FTD(tau)、进行性核上性麻痹或PSP(tau)、多系统萎缩或MSA(α-突触核蛋白)、脑癌(例如突变或过表达的牵涉脑癌的原癌基因)和溶酶体贮积症(LSD)。本发明的病症可包括涉及皮质大区域的那些，例如多于一处皮质区域，多于一叶皮质和/或整个皮质。其他可由本发明的治疗多肽或治疗核酸治疗的本发明的疾病的非限制性实例包括创伤性脑损伤、酶功能障碍病症、精神病症(包括创伤后应激综合征)、神经退行性疾病和认知病症(包括痴呆、自闭症和抑郁)。酶功能障碍病症包括但不限于脑白质营养不良(包括Canavan’s Disease)和任何下文所述的溶酶体贮积症。
在一些实施方案中，转基因(例如本文所述的RNAi)与启动子可操作地连接。示例性启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子、GUSB启动子、RSV LTR、MoMLVLTR、磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子、猴病毒40(SV40)启动子和CK6启动子、转甲状腺素启动子(TTR)、TK启动子、四环素反应性启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合体肝脏特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-珠蛋白启动子(CAG启动子；Niwa等，Gene,1991,108(2):193-9)和延伸因子1-α启动子(EFl-α)启动子(Kim等，Gene,1990,91(2):217-23和Guo等，Gene Ther.,1996,3(9):802-10)。在一些实施方案中，所述启动子包含与鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子连接的巨细胞病毒增强子或人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子。所述启动子可以是组成型、诱导型或阻遏型启动子。在一些实施方案中，本发明提供重组载体，其包含与CBA启动子可操作连接的编码本发明异源转基因的核酸。示例性的启动子和描述可在例如U.S.PG Pub.20140335054中发现。在一些实施方案中，启动子是CBA启动子、最小CBA启动子、CMV启动子或GUSB启动子。
组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(retroviral Roussarcoma virus)(RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)[参见例如Boshart等，Cell,41:521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、13-肌动蛋白启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子和EFLa启动子[Invitrogen]。
诱导型启动子允许调节基因表达且可通过外源补给化合物、环境因素如温度或特定的生理状态(例如急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中)的存在来调节。诱导型启动子和诱导系统可从多种商业来源获得，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。已描述了许多其他的系统且可由本领域的技术人员容易地选择。通过外源补给启动子调节的诱导型启动子的实例包括锌诱导羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)-诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996))、四环素阻遏系统(Gossen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))、四环素诱导系统(Gossen等，Science,268:1766-1769(1995)，另见Harvey等，Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998))、RU486-诱导系统(Wang等，Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang等，Gene Ther.,4:432-441(1997))和雷帕霉素-诱导系统(Magari等，J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997))。其他可在该背景中有效的诱导型启动子类型是通过特定生理状态调节的那些，例如温度、急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制中的细胞。
在另一实施方案中，可使用用于转基因的天然启动子或其片段。当预期表达的转基因应模拟天然表达时，天然启动子可以是优选的。当转基因的表达必须暂时或发展性或以组织特异性的方式或响应特定转录刺激调节时，可以使用天然启动子。在进一步的实施方案中，也可使用其他天然表达控制元件如增强子元件、多聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列以模拟天然表达。
在一些实施方案中，调节序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况中，组织特异性调节序列结合以组织特异性的方式诱导转录的组织特异性转录因子。这种组织特异性调节序列(例如启动子、增强子等)为本领域熟知的。示例性组织特异性调节序列包括但不限于下列组织特异性启动子：神经元性如神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(Andersen等，Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993))、神经丝轻链基因启动子(Piccioli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5(1991))和神经元特异性vgf基因启动子(Piccioli等，Neuron,15:373-84(1995))。在一些实施方案中，组织特异性启动子是选自下组的基因的启动子：神经元核(NeuN)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、腺瘤性结肠息肉病(APC)和离子化钙结合适配分子1(Iba-1)。其他合适的组织特异性启动子对本领域的技术人员将是显而易见的。在一些实施方案中，启动子是鸡β-肌动蛋白启动子。
在一些实施方案中，启动子在CNS的细胞中表达异源核酸。由此，在一些实施方案中，本发明的治疗多肽或治疗核酸可用于治疗CNS病症。在一些实施方案中，启动子在脑细胞中表达异源核酸。脑细胞可指本领域已知的任何脑细胞，包括但不限于神经元(如感觉神经元、运动神经元、中间神经元、多巴胺能神经元、中型多棘神经元、胆碱能神经、GABA能神经元、锥体神经元等)、神经胶质细胞(如小神经胶质细胞、大胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、径向胶质细胞等)、脑实质细胞、小神经胶质细胞l细胞、室管膜细胞和/或浦肯野(Purkinje)细胞。在一些实施方案中，启动子在神经元和/或神经胶质细胞中表达异源核酸。在一些实施方案中，神经元是尾状核的中型多棘神经元、壳核的中型多棘神经元、皮质层IV的神经元和/或皮质层V的神经元。
在CNS细胞、脑细胞、神经元和神经胶质细胞中表达转录物(例如异源转基因)的多种启动子为本领域已知且描述于本文。这种启动子可包含与所选基因或异源控制序列相关的控制序列。经常，有效的异源控制序列包括源自编码哺乳动物或病毒基因的序列的那些。实例包括但不限于SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)、单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV即刻早期启动子区(CMVIE)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、合成的启动子、杂合的启动子等等。此外，也可使用源自非病毒基因如鼠类金属硫蛋白基因的序列。这种启动子序列为从例如Stratagene(SanDiego,CA)商业上可得到的。可使用CNS-特异性启动子和诱导型启动子。CNS-特异性启动子的实例包括但不限于分离自CNS-特异性基因如髓鞘碱性蛋白(MBP)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的那些。诱导型启动子的实例包括对于蜕皮激素、四环素、金属硫蛋白、缺氧(hypoxia)等响应的DNA元件。
本发明涵盖重组病毒基因组用于将一个或多个编码如本文所述的RNAi的核酸序列导入或包装入AAV病毒颗粒的用途。重组病毒基因组可包括任何元件以建立RNAi的表达，例如，启动子、异源核酸、ITR、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择性标记物、内含子、多聚A信号和/或复制起点。在一些实施方案中，rAAV载体包含一个或多个增强子、剪接供体/剪接受体对、基质附接位点或多聚腺苷酸化信号。
在一些实施方案中，包含编码RNAi的载体的rAAV颗粒有效量的施用在或邻近施用位点(例如纹状体和/或皮质)或距施用位点的更远处转导细胞(例如CNS细胞、脑细胞、神经元和/或神经胶质细胞)。在一些实施方案中，转导了多于约下列任何比率的神经元：5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或100％。在一些实施方案中，转导了约5％至约100％、约10％至约50％、约10％至约30％、约25％至约75％、约25％至约50％或约30％至约50％的神经元。鉴定通过表达miRNA的重组病毒颗粒转导的神经元的方法为本领域已知；例如，免疫组化、RNA检测(例如qPCR、Northern印迹、RNA-seq、原位杂交等)或使用共表达标记物如可使用增强的绿色荧光蛋白以检测表达。
在一些方面中，本发明提供包含重组自身互补基因组(例如自身互补的rAAV载体)的病毒颗粒。具有自身互补载体基因组的AAV病毒颗粒和自身互补的AAV基因组的使用方法描述于美国专利号6,596,535；7,125,717；7,465,583；7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054和8,361,457和Wang Z.,等，(2003)Gene Ther 10:2105-2111，其每一篇通过提述以其整体并入本文。包含自身互补基因组的rAAV将凭借其部分互补序列(例如异源核酸的互补编码和非编码链)迅速形成双链DNA分子。在一些实施方案中，载体包含编码异源核酸的第一核酸序列和编码核酸的互补物的第二核酸序列，其中第一核酸序列可与第二核酸序列沿其长度的大部分或全部形成链内碱基对。
在一些实施方案中，第一异源核酸序列和第二异源核酸序列通过突变的ITR(例如右侧ITR)连接。在一些实施方案中，ITR包含多核苷酸序列5’-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG-3’(SEQ ID NO:1)。突变的ITR包含含有末端解析序列的D区的缺失。作为结果，在复制AAV病毒基因组时，rep蛋白将不会在突变的ITR切割病毒基因组且如此以5'-3'将包含下列的重组病毒基因组将包装入病毒衣壳：AAV ITR、包括调节序列的第一异源多核苷酸序列、突变的AAV ITR、与第一异源多核苷酸反向的异源多核苷酸和第三AAV ITR。
VI.病毒颗粒和产生病毒颗粒的方法
本发明特别提供了包含编码本公开的RNAi的核酸的重组病毒颗粒以及方法及其治疗哺乳动物中疾病或病症例如亨廷顿病的用途。
病毒颗粒
本发明提供包含本文公开的RNAi的病毒颗。在一些实施方案中，本发明提供用于递送本文公开的本发明的RNAi的病毒颗粒。例如，本发明提供使用重组病毒颗粒的方法以递送RNAi来治疗哺乳容物中的疾病或病症的方法；例如包含RNAi来治疗HD的rAAV颗粒。在一些实施方案中，重组病毒颗粒是重组AAV颗粒。在一些实施方案中，病毒颗粒是重组AAV颗粒，其包含含有侧翼为一个或两个ITR的本文公开序列RNAi的核酸。所述核酸在AAV颗粒中衣壳化。所述AAV颗粒还包含衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述核酸包含在转录方向与元件、控制序列包括转录初始和终止序列连接的感兴趣的编码序列(例如本公开的核酸)，由此形成表达盒。表达盒侧翼的5'和3'末端为至少一个功能性AAV ITR序列。“功能性AAV ITR序列”意为用于AAV病毒粒的挽救、复制和包装的ITR序列功能。参见Davidson等，PNAS,2000,97(7)3428-32；Passini等，J.Virol.,2003,77(12):7034-40；和Pechan等，GeneTher.,2009,16:10-16，其全部通过提述以其整体并入本文。对于本发明一些方面的实践，所述重组载体包含至少全部用于衣壳化所必需的AAV序列和用于由rAAV感染的物理结构。用于本发明载体使用的AAV ITR不需要具有野生型核苷酸序列(例如如Kotin,Hum.GeneTher.,1994,5:793-801中所述)，且可通过核苷酸的插入、缺失或取代改变或AAVITR可源自数种AAV血清型中的任何。目前已知多于40种AAV血清型，且持续鉴定了新型血清型和已有血清型的变体。参见Gao等，PNAS,2002,99(18):11854-6；Gao等，PNAS,2003,100(10):6081-6；和Bossis等，J.Virol.,2003,77(12):6799-810。认为任何AAV血清型的用途都在本发明的范围之内。在一些实施方案中，rAAV载体是源自AAV血清型的载体，包括但不限于AAV ITR为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV衣壳血清型ITR等等。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV的ITR或小鼠AAV衣壳血清型ITR等等的ITR。在一些实施方案中，AAV中的核酸进一步编码如本文所述的RNAi。例如，AAV中的核酸可包含本文涵盖的任何AAV血清型的至少一个ITR且可进一步编码包含第一链和第二链的RNAi，其中a)所述第一链和第二链形成双链体；b)所述第一链包含至少11个碱基的指导区，其中所述指导区包含含有指导链的碱基1-N的种子区，其中N＝7或N＝8；且c)所述第二链包含至少11个碱基的非指导区，其中所述非指导区包含双链体中指导区碱基1-(N+2)的任何一个或多个对侧的凸出序列。在一些实施方案中，所述rAAV可包含第一链和第二链，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含5’至3’编码下列的核酸：ITR(例如AAV2ITR)、启动子、编码如本文公开的RNAi的核酸、多聚腺苷酸化信号、AAV ITR(例如AAV2ITR)。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含5’至3’编码下列的核酸：ITR(例如AAV2ITR)、启动子、编码包含第一链和第二链的RNAi的核酸(其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸)、多聚腺苷酸化信号和AAV ITR(例如AAV2ITR)。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含5’至3’编码下列的核酸：ITR(例如AAV2ITR)、CBA启动子、编码如本文公开的RNAi的核酸、多聚腺苷酸化信号(例如牛生长激素多聚A)和AAV ITR(例如AAV2ITR)。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含5’至3’编码下列的核酸：ITR(例如AAV2ITR)、CBA启动子、编码包含第一链和第二链的RNAi的核酸(其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸)、多聚腺苷酸化信号(例如牛生长激素多聚A)和AAV ITR(例如AAV2ITR)。在一些实施方案中，所述第一链和第二链形成双链体，且所述第二链的SEQ ID NO:2的残基18或残基19处的A残基不与第一链中的残基形成碱基配对。在一些实施方案中，第一链的SEQ ID NO:1的残基11和12处的U残基不与所述第二链形成碱基配对。在一些实施方案中，在所述第二链的SEQ ID NO:2的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基配对且所述第一链的SEQ ID NO:1的碱基11和12处的U残基不与所述第二链碱基形成配对。
在一些实施方案中，载体可包含填充核酸。在一些实施方案中，填充核酸可编码绿色荧光蛋白。在一些实施方案中，填充核酸可位于启动子和编码RNAi的核酸之间。在一些实施方案中，填充核酸可以是α-1-抗胰蛋白酶(AAT)填充序列或C16P1染色体16P1克隆(人C16)填充序列。
在一些实施方案中，AAV中的核酸包含SEQ ID NO:13的核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含与SEQ ID NO:13至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸。在进一步的实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh8R、AAVrh.10、AAV11、AAV12的衣壳蛋白或这些衣壳蛋白的突变体。在一些实施方案中，突变的衣壳蛋白保持形成AAV衣壳的能力。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV5酪氨酸突变衣壳(Zhong L.等，(2008)ProcNatl Acad Sci U S A 105(22):7827-7832。在进一步的实施方案中，rAAV颗粒包含来自进化枝A-F的AAV血清型的衣壳蛋白(Gao,等，J.Virol.2004,78(12):6381)。
将不同AAV血清型用于优化特定靶细胞的转导或靶向特定靶组织内(例如疾病组织)的特定细胞类型。rAAV颗粒可包含病毒蛋白和相同血清型或混合的血清型的病毒核酸。例如，在一些实施方案中，rAAV颗粒可包含AAV1衣壳蛋白和至少一种AAV2ITR或其可包含AAV2衣壳蛋白和至少一个AAV1ITR。本文提供用于产生rAAV颗粒的AAV血清型的任何组合，正如每种组合都在本文明确续述一般。在一些实施方案中，本发明提供rAAV颗粒，其包含本公开的AAV1衣壳和rAAV载体(例如包含编码本公开的RNAi的核酸的表达盒)，侧翼为至少一个AAV2ITR。在一些实施方案中，本发明提供包含AAV2衣壳的rAAV颗粒。
在一些方面，本发明提供包含重组自身互补基因组的病毒颗粒。具有自身互补基因组的AAV病毒颗粒和使用自身互补AAV基因组的方法公开于美国专利号6,596,535；7,125,717；7,465,583；7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054和8,361,457和WangZ.,等，(2003)Gene Ther 10:2105-2111，其每一篇都通过提述以其整体并入。包含自身互补基因组的rAAV将凭借其部分互补序列迅速形成双链DNA分子(例如转基因的互补编码或非编码链)。在一些实施方案中，本发明提供包含AAV基因组的AAV病毒颗粒，其中所述rAAV基因组包含第一异源多核苷酸序列(例如本公开的RNAi)和第二异源多核苷酸序列(例如本公开的RNAi的反义链)，其中第一异源多核苷酸序列可与第二异源多核苷酸序列沿其长度的大部分或全部形成链内碱基配对。在一些实施方案中，第一异源多核苷酸序列和第二异源多核苷酸序列通过促进链内碱基配对的序列，例如发夹DNA结构连接。发夹结构为本领域已知，例如miRNA或siRNA分子中。在一些实施方案中，第一异源多核苷酸序列和第二异源多核苷酸序列通过突变的ITR(例如右侧ITR)连接。在一些实施方案中，所述ITR包含多核苷酸序列5’-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG-3’(SEQ ID NO:12)。突变的ITR包含含有末端解析序列的D区的缺失。结果，在复制AAV病毒基因组时，rep蛋白将不会在突变的ITR处切割病毒基因组，且如此以5'至3'的顺序包含下列的重组病毒基因组将包装入病毒衣壳：AAV ITR、包含调节序列的第一异源多核苷酸序列、突变的AAV ITR、与第一异源多核苷酸反向的第二异源多核苷酸和第三AAV ITR。在一些实施方案中，本发明提供AAV病毒颗粒，其包含含有功能性AAV2ITR的重组病毒基因组、编码本公开的RNAi的第一多核苷酸序列、包含D区缺失并缺乏功能性末端解析序列的突变AAV2ITR、包含与编码本公开的RNAi的第一多核苷酸序列互补的序列的第二多核苷酸序列和功能性AAV2ITR。
在一些实施方案中，所述病毒颗粒是腺病毒颗粒。在一些实施方案中，腺病毒颗粒是重组腺病毒载体颗粒，例如包含两ITR间的本公开的RNAi的多核苷酸载体。在一些实施方案中，腺病毒颗粒缺乏或包含一个或多个E1基因的缺陷性拷贝，其赋予腺病毒复制缺陷。腺病毒包含在大的、非包膜的二十面体衣壳内的线性、双链DNA基因组。腺病毒具有可并入大于30kb异源序列的大基因组(例如代替E1和/或E3区)，使其独特地适用于较大异源基因。还已知其感染分裂和未分裂的细胞且不天然整合入宿主基因组(尽管杂合变体可具有该能力)。在一些实施方案中，腺病毒载体可以是具有代替E1的异源序列的第一代腺病毒载体。在一些实施方案中，腺病毒载体可以是在E2A、E2B和/或E4中具有额外突变或缺失的第二代腺病毒载体。在一些实施方案中，所述腺病毒载体可以是缺乏全部病毒编码基因的第三代或受损的腺病毒载体，其仅保留ITR和包装信号并需要反式的辅助腺病毒用于复制和包装。已研究了腺病毒颗粒用作用于哺乳动物细胞的瞬时转染的载体以及基因治疗载体。进一步说明参见例如Danthinne,X.和Imperiale,M.J.(2000)Gene Ther.7:1707-14和Tatsis,N.和Ertl,H.C.(2004)Mol.Ther.10:616-29。
在一些实施方案中，所述病毒颗粒是重组腺病毒载体颗粒，其包含编码本公开的RNAi的核酸。认为任何腺病毒血清型的使用都在本发明的范围之内。在一些实施方案中，所述重组腺病毒载体是源自腺病毒血清型的载体，其包括但不限于AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu5、AdHu7、AdHu11、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad和猪Ad 3型。腺病毒颗粒还包含衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述重组病毒颗粒包含病毒颗粒与一个或多个外源病毒衣壳蛋白的组合。这种组合可指假型重组腺病毒载体颗粒。在一些实施方案中，用于假型重组腺病毒载体颗粒的外源病毒衣壳蛋白源自外源病毒或源自其他腺病毒血清型。在一些实施方案中，外源病毒衣壳蛋白源自或包括但不限于呼肠孤病毒3型。用于假型腺病毒颗粒的载体和衣壳蛋白组合的实例可在下列参考文献中获得(Tatsis,N.等(2004)Mol.Ther.10(4):616-629和Ahi,Y.等(2011)Curr.Gene Ther.11(4):307-320)。不同的腺病毒血清型可用于优化特定靶细胞的转导或靶向在特定靶组织(例如疾病组织)内的特定细胞类型。由特定腺病毒血清型靶向的组织或细胞包括但不限于肺(例如HuAd3)、脾和肝(例如HuAd37)、平滑肌、滑膜细胞、树突细胞、心血管细胞、肿瘤细胞系(例如HuAd11)和树突细胞(例如具有呼肠孤病毒3型假型的HuAd5、HuAd30或HuAd35)。进一步说明参见Ahi,Y.等(2011)Curr.GeneTher.11(4):307-320,Kay,M.等(2001)Nat.Med.7(1):33-40和Tatsis,N.等(2004)Mol.Ther.10(4):616-629。腺病毒载体已通过纹状体内施用进行施用(参见例如Mittoux,V.等(2002)J.Neurosci.22:4478-86)。
在一些实施方案中，病毒颗粒是慢病毒颗粒。在一些实施方案中，慢病毒颗粒是重组慢病毒载体颗粒，例如编码在两ITR间的本公开的RNAi的多核苷酸载体。慢病毒是具有约10kb的基因组的阳性-有义、ssRNA逆转录病毒。已知慢病毒整合入分离和未分离细胞的基因组。可产生慢病毒颗粒，例如通过将多重质粒(通常分开慢病毒基因组和对于复制和/或包装所需的基因以预防病毒复制)转染入包装细胞系系，其将修饰的慢病毒基因组包装入慢病毒颗粒。在一些实施方案中，慢病毒颗粒可指缺乏包膜蛋白的第一代载体。在一些实施方案中，慢病毒颗粒可指除gag/pol和tat/rev区缺乏全部基因的第二代载体。在一些实施方案中，慢病毒颗粒可指仅包含内源rev、gag和pol基因且具有用于转导的嵌合LTR而无tat基因的第三代载体(参见Dull,T.等(1998)J.Virol.72:8463-71)。进一步说明参见Durand,S.和Cimarelli,A.(2011)Viruses 3:132-59。
在一些实施方案中，病毒颗粒是包含编码本公开的RNAi的核酸的重组慢病毒载体颗粒。认为任何慢病毒载体的使用都在本发明的范围之内。在一些实施方案中，慢病毒载体源自慢病毒，其包括但不限于人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)、人免疫缺陷病毒-2(HIV-2)、类人猿免疫缺陷病毒(SIV)、猫科免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、Jembrana病病毒(JDV)、维斯纳病毒(visna virus)(VV)和羊关节炎脑炎病毒(CAEV)。慢病毒颗粒还包含衣壳蛋白。在一些实施方案中，重组病毒颗粒包含慢病毒载体与一个或多个外源病毒衣壳蛋白的组合。这种组合可指假型重组慢病毒载体颗粒。在一些实施方案中，用于假型重组慢病毒载体颗粒中的外源病毒衣壳蛋白源自外源病毒。在一些实施方案中，用于假型重组慢病毒载体颗粒中的外源病毒衣壳蛋白是水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSV-GP)。VSV-GP与遍在的细胞受体相互作用，为假型重组慢病毒载体颗粒提供广泛组织嗜性。此外，认为VSV-GP为假型重组慢病毒载体颗粒提供更高的稳定性。在其他实施方案中，外源病毒衣壳蛋白源自包括但不限于Chandipura病毒、狂犬病毒、Mokola病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、Sindbis病毒、森林脑炎病毒(SemlikiForest virus)(SFV)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、埃博拉病毒Reston、埃博拉病毒Zaire、马尔堡病毒、拉沙病毒(Lassa virus)、禽白血病病毒(Avian leukosis virus)(ALV)、南非羊肺炎羊反转录病毒(Jaagsiekte sheepretrovirus)(JSRV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine leukemia virus)(MLV)、长臂猿白血病病毒(Gibbon ape leukemia virus)(GALV)、猫内源性逆转录病毒(Felineendogenous retrovirus)(RD114)、人T-淋巴细胞病毒1(HTLV-1)、人泡沫病毒、Maedi-visna病毒(MVV)、SARS-CoV、仙台病毒(Sendai virus)、呼吸道合胞体病毒(Respiratorysyncytia virus)(RSV)、人副流感病毒3型、丙型肝炎病毒(HCV)、流感病毒、鸡瘟病毒(Fowlplague virus)(FPV)或苜蓿银纹夜蛾多重核型多角体病毒(Autographa californicamultiple nucleopolyhedro virus)(AcMNPV)。用于假型慢病毒的载体和衣壳蛋白组合的实例可在例如Cronin,J.等(2005).Curr.GeneTher.5(4):387-398中发现。不同的假型重组慢病毒载体颗粒可用于优化特定靶细胞的转导或靶向在特定靶组织(例如疾病组织)内的特定细胞。例如通过特定假型重组慢病毒载体颗粒靶向的组织，包括但不限于肝(例如具有VSV-G、LCMV、RRV或SeV F蛋白的假型)、肺(例如具有埃博拉病毒(Ebola)，马尔堡病毒(Marburg)、SeV F和HN或JSRV蛋白的假型)、胰腺小岛细胞(例如具有LCMV蛋白的假型)、中枢神经系统(例如具有VSV-G、LCMV、狂犬病毒或Mokola蛋白的假型)、视网膜(例如具有VSV-G或Mokola蛋白的假型)、单核细胞或肌肉(例如具有Mokola或埃博拉病毒蛋白的假型)、造血系统(例如具有RD114或GALV蛋白的假型)或癌细胞(例如具有GALV或LCMV蛋白的假型)。进一步说明参见Cronin,J.等(2005).Curr.GeneTher.5(4):387-398和Kay,M.等(2001)Nat.Med.7(1):33-40。
在一些实施方案中，病毒颗粒是单纯疱疹病毒(HSV)颗粒。在一些实施方案中，HSV颗粒是rHSV颗粒，例如编码在两ITR间的本公开的RNAi的多核苷酸载体。HSV是具有约152kb基因组的DNA病毒。有利的是，约一半的其基因是非必须的且可缺失以容纳异源序列。HSV颗粒感染非分裂细胞。此外，其在神经元中天然建立潜伏，通过逆行运输运动，且可跨突触转移，使得其对于神经元的转染和/或涉及神级系统的基因疗法方式具有优势。在一些实施方案中，HSV颗粒可以是复制缺陷或能够复制的(例如能够通过失活一个或多个晚期基因进行单复制循环)。进一步描述参见Manservigi,R.等(2010)Open Virol.J.4:123-56。
在一些实施方案中，病毒颗粒是包含编码本公开的RNAi的核酸的rHSV颗粒。认为任何HSV载体的使用都在本发明的范围之内。在一些实施方案中，HSV载体源自HSV血清型，包括但不限于HSV-1和HSV-2。HSV颗粒还包含衣壳蛋白。在一些实施方案中，重组病毒颗粒包含HSV载体与一个或多个外源病毒衣壳蛋白的组合。这种组合可指假型rHSV颗粒。在一些实施方案中，在假型rHSV颗粒中使用的外源病毒衣壳蛋白源自外源病毒或源自另一HSV血清型。在一些实施方案中，在假型rHSV颗粒中使用的外源病毒衣壳蛋白是水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSV-GP)。VSV-GP与遍在的细胞受体相互作用，为假型rHSV颗粒提供广泛地细胞嗜性。此外，认为人VSV-GP为假型rHSV颗粒提供更高的稳定性。在其他实施方案中，外源病毒衣壳蛋白可来自不同的HSV血清型。例如HSV-1载体可包含一个或多个HSV-2衣壳蛋白。不同的HSV血清型可用于优化特定靶细胞的转导或靶向在特定靶组织(例如疾病组织)内的特定细胞类型。由特定腺病毒血清型靶向的组织或细胞包括但不限于中枢神经系统和神经元(例如HSV-1)。进一步说明参见Manservigi,R.等(2010)Open Virol J 4:123-156,Kay,M.等(2001)Nat.Med.7(1):33-40，和Meignier,B.等(1987)J.Infect.Dis.155(5):921-930。
病毒颗粒的产生
rAAV颗粒可使用本领域已知的方法产生。参见例如美国专利号6,566,118；6,989,264和6,995,006。在本发明的实践中，用于产生rAAV颗粒的细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、微生物和酵母。宿主细胞还可以是包装细胞，其中的AAV rep和cap基因稳定保持在AAV载体基因组中稳定保持的宿主细胞或生产细胞内。示例性的包装和生产细胞源自293、A549或HeLa细胞。AAV载体并使用本领域的标准技术纯化和配制。
本领域已知用于产生rAAV载体的方法包括但不限于转染、稳定细胞系产生和感染性杂合病毒产生系统(其包括腺病毒-AAV杂合、疱疹病毒-AAV杂合和杆状病毒-AAV杂合)(Conway,JE等，(1997)J.Virology 71(11):8780-8789)。用于产生rAAV病毒颗粒的rAAV生产培养都需要：1)合适的宿主细胞，包括例如，衍生自人的细胞系如HeLa、A549或293细胞或在杆状病毒产生系统的情况中昆虫衍生细胞系如SF-9；2)合适的辅助病毒功能，由野生型或突变腺病毒(如温度敏感的腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒或提供辅助功能的质粒构建体提供；3)AAV rep和cap基因和基因产物；4)侧翼为至少一个AAV ITR序列的核酸(如治疗核酸)；和5)合适的介质或介质组分以支持rAAV产生。在一些实施方案中，AAV rep和cap基因产物可形成任何AAV血清型。一般而言但不是强制性的，AAV rep基因产物为与rAAV载体基因组的ITR相同的血清型只要rep基因产物可发挥功能以复制和包装rAAV基因组。本领域已知的合适介质可用于rAAV载体的产生。该介质包括但不限于Hyclone Laboratories和JRH生成的介质，包括改进的Eagle介质(MEM)、杜贝尔克氏改进的Eagle介质(DMEM)，定制配方如描述于美国专利号6,566,118的那些和如美国专利号6,723,551中所述的Sf-900II SFM介质，其每一篇通过提述以其整体并入，特别是对应重组AAV载体产生用途的定制介质配方。在一些实施方案中，AAV辅助功能由腺病毒或HSV提供。在一些实施方案中，AAV辅助功能由杆状病毒提供且宿主细胞是昆虫细胞(例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)细胞)。
在一些实施方案中，rAAV颗粒可通过三重转染的方法产生，如下文提供的示例性三重转染方法。简言之，包含基因和衣壳基因的质粒以及辅助腺病毒质粒可转染(例如使用磷酸钙方法)入细胞系(例如HEK-293细胞)，且可收集并任选地纯化病毒。如此，在一些实施方案中，rAAV颗粒可通过编码rAAV载体的核酸、编码AAV rep和cap的核酸和编码AAV辅助病毒功能的核酸三重转染入宿主细胞而产生，其中所述核酸转染至宿主细胞生成能够产生rAAV颗粒的宿主细胞。
在一些实施方案中，rAAV颗粒可由生产细胞系方法产生，如下文提供的示例性生产细胞系方法(还参见(参照Martin等，(2013)HumanGeneTherapy Methods 24:253-269)。简言之，细胞系(例如HeLa细胞系)可用包含rep基因、衣壳基因和启动子-异源核酸序列的质粒稳定转染。可筛选细胞系以选择先导克隆用于rAAV产生，其随后可扩大至生产生物反应器并用腺病毒(例如野生型腺病毒)作为辅助感染以初始rAAV产生。随后可收获病毒，腺病毒可失活(例如通过加热)或和/或去除，且可纯化rAAV颗粒。如此，在一些实施方案中，通过包含一个或多个编码rAAV载体的核酸、编码AAV rep和cap的核酸和编码AAV辅助病毒功能的核酸的生产细胞系产生rAAV颗粒。
在一些方面中，提供了用于产生任何如本文所述的rAAV颗粒的方法，其包括(a)在产生rAAV颗粒的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含(i)一个或多个AAV包装基因，其中每种所述AAV包装基因编码AAV复制和/或衣壳化蛋白；(ii)rAAV促-载体，其包含编码侧翼为至少一个AAV ITR如本文公开的RNAi的核酸，和(iii)AAV辅助功能；和(b)回收由宿主细胞产生的rAAV颗粒。在一些实施方案中，RNAi包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个AAV ITR选自下组：AAV ITR为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAVDJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV衣壳血清型ITR或等等。在一些实施方案中，所述衣壳化蛋白选自下组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6(例如野生型AAV6衣壳或变体AAV6衣壳如ShH10，如U.S.PG Pub.2012/0164106中所述)、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9(例如野生型AAV9衣壳或如U.S.PG Pub.2013/0323226中所述的修饰的AAV9衣壳)、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、酪氨酸衣壳突变体、发夹结构结合衣壳突变体、AAV2R471A衣壳、AAVAAV2/2-7m8衣壳、AAV DJ衣壳(例如AAV-DJ/8衣壳、AAV-DJ/9衣壳或任何U.S.PG Pub.2012/0066783中所述的其他衣壳)、AAV2N587A衣壳、AAV2E548A衣壳、AAV2N708A衣壳、AAV V708K衣壳、山羊AAV衣壳、AAV1/AAV2嵌合衣壳、牛AAV衣壳、小鼠AAV衣壳、rAAV2/HBoV1衣壳或美国专利号8,283,151或国际公开号WO/2003/042397中所述的AAV衣壳。在一些实施方案中，突变衣壳蛋白保持形成AAV衣壳的能力。在一些实施方案中，衣壳蛋白是AAV5酪氨酸突变衣壳蛋白。在进一步的实施方案中，rAAV颗粒包含来自进化枝A-F的AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV1衣壳和含有AAV2ITR、突变的AAV2ITR和编码本公开的RNAi的核酸的重组基因组。在进一步的实施方案中，纯化了rAAV颗粒。本文使用的术语“纯化”包括缺少至少一部分其他组分的rAAV颗粒的制备物，其可存在于rAAV颗粒天然存在处或初始制备处。因此，例如，分离的rAAV颗粒可使用纯化技术制备以从来源混合物如培养裂解物或生产培养上清液将其富集。富集可以多种方式测量，如例如，通过存在于溶液中的DNA酶抗性颗粒(DRP)或基因组拷贝(gc)的调和，或通过感染性，或其可相对于来源混合物中存在的第二、潜在干扰物质如污染物(包括生产培养基污染物或进程内污染物，包括辅助病毒、介质组分等)测量。
本领域已知多种用于产生腺病毒载体颗粒的方法。例如，用于受损的腺病毒载体，腺病毒载体基因组和辅助腺病毒基因组可转染入包装细胞系(例如293细胞系)。在一些实施方案中，辅助腺病毒基因组可包含重组位点，其在其包装信号的侧翼，且可将两基因组转染入表达重组酶的包装细胞系(例如可使用Cre/loxP系统)，由此比辅助腺病毒更有效地包装感兴趣的腺病毒载体(参见例如Alba,R.等(2005)Gene Ther.12Suppl 1:S18-27)。可收获腺病毒载体并使用标准方法纯化，如本文所述的那些。
用于产生慢病毒载体颗粒的多种方法为本领域已知。例如，对于第三代慢病毒载体，可将包含具有gag和pol基因的感兴趣的慢病毒基因组的载体与包含rev基因的载体共同转染入包装细胞系。感兴趣的慢病毒基因组还包含在Tat不存在下促进转录的嵌合LTR(参见Dull,T.等(1998)J.Virol.72:8463-71)。可收获慢病毒载体并使用本文所述的方法(例如Segura MM,等，(2013)Expert Opin Biol Ther.13(7):987-1011)纯化。
用于产生HSV颗粒的多种方法为本领域已知。可收获HSV载体并使用标准方法纯化，如本文所述的那些。例如用于复制-缺陷的HSV载体，可将缺乏全部即刻早期(IE)基因的感兴趣的HSV基因组转染入提供病毒辅助所需基因的互补细胞系，如ICP4、ICP27和ICP0(参见例如Samaniego,L.A.等(1998)J.Virol.72:3307-20)。可收获HSV载体并使用本文所述的方法纯化(例如Goins,WF等，(2014)Herpes Simplex Virus Methods in MolecularBiology 1144:63-79)。
本文还提供了药物组合物，其包含含有编码本文公开的RNAi的转基因的重组病毒颗粒和药学上可接受的载剂。药物组合物适于本文所述的任何施用模式。可将包含本公开的RNAi的核酸的重组病毒颗粒的药物组合物引入脑部。例如包含编码本公开的RNAi的核酸的重组病毒颗粒可在纹状体内施用。可使用任何本公开的重组病毒颗粒，包括rAAV、腺病毒、慢病毒和HSV颗粒。
在一些实施方案中，包含含有编码如本公开所述的RNAi的转基因的重组病毒颗粒和药学上可接受的载剂的药物组合物适于施用至人。这种载剂为本领域熟知(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,15th Edition,pp.1035-1038和1570-1580)。在一些实施方案中，包含如本文所述的rAAV和药学上可接受的载剂的药物组合物适于注射入哺乳动物脑部(例如纹状体内施用)。在一些实施方案中，包含本文所述的重组慢病毒颗粒和药学上可接受的载剂的药物组合物适于注射入哺乳动物脑部(例如纹状体内施用)。在一些实施方案中，包含本文所述的重组腺病毒颗粒和药学上可接受的载剂的药物组合物适于注射入哺乳动物脑部(例如纹状体内施用)。在一些实施方案中，包含本文所述的重组HSV颗粒和药学上可接受的载剂的药学上可接受的载剂适于注射入哺乳动物脑部(例如纹状体内施用)。
这种药学上可接受的载剂可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油等。还可采用盐水溶液和葡萄糖水溶液、聚乙二醇(PEG)和甘油溶液作为液体载剂，特别是用于可注射的溶液。药物组合物可机一部包含其他成分，例如防腐剂、缓冲剂、张力剂、抗氧化剂和稳定剂、非离子型润湿剂或澄清剂、增粘剂等。本文描述的药物组合物可包装成单一单位剂量或多重剂量形式。所述组合物一般配制为无菌或基本上等渗的溶液。
VII.制品和套盒
还提供了用于在本文所述的方法中使用的套盒或制品。一些方面中，所述套盒包含在合适包装中的本文所述的组合物(例如本公开的重组病毒颗粒，如包含编码本公开的RNAi的核酸的rAAV颗粒)。用于本文所述的组合物(如纹状体内组合物)的合适包装为本领域已知，且包括例如小瓶(如密封小瓶)、容器、安瓿、瓶、罐、软包装(例如密封的Mylar或塑料袋)等。这些制品可进一步除菌和/或密封。
本发明还提供包含本文所述的组合物的套盒且可进一步包含关于使用所述组合物的方法说明，如本文所述的用途。本文所述的套盒可进一步包括商业和使用者角度预期的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有用于实施任何本文所述方法的说明的包装插页。例如在一些实施方案中，所述套盒包含含有编码本公开的RNAi的转基因的重组病毒颗粒的组合物(其用于将至少1×109基因组拷贝递送入哺乳动物脑部(例如通过纹状体内施用)至如本文所述的灵长类动物)、适于注射入灵长类动物脑部的药学上可接受的载剂和如下的一个或多个：缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有用于实施向灵长类脑部注射(例如通过纹状体内施用)的说明的包装插页。在一些实施方案中，所述套盒包含使用本文所述的重组病毒颗粒治疗亨廷顿病的说明。在一些实施方案中，所述套盒包含根据本文所述的任何方法使用如本文所述的重组病毒颗粒的说明。
实施例
通过参照下述实施例更充分地理解本发明。然而，它们不应解释为限制本发明的范围。应该理解的是：本文所述的实施例和实施方案仅出于说明目的，由其启示的不同修饰或改变将建议给本领域的技术人员而且也包括在本申请的精神和范畴及所附权利要求的范围内。
实施例1:AAV2/1-miRNA-Htt在体外减少Htt表达。
亨廷顿病(HD)是致命的常染色体显性遗传性神经变性疾病，其由亨廷顿蛋白(Htt)中多个多聚谷氨酰胺残基的增加导致。基于对HD的根本识别，开发了减少致病突变Htt的表达的疗法。寻求选择性减少该致病作用剂的表达的RNA干扰(RNAi)作为该疾病和相似病症的潜在治疗策略出现。为检查HD小鼠模型中RNA干扰疗法的优点，将之前显示有效靶向小鼠和人Htt mRNA(McBride等，(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:5868-5873)的靶序列嵌入人工miRNA骨架并克隆入前病毒载体。
方法
动物
使用通过Sanofi公司Genzyme的机构性动物关怀和使用委员会(Department ofHealth and Human Services,NIH Publication 86–23)批准的方案实施全部方法。使用的小鼠包括YAC128小鼠(含有在纯FVB/NJ背景具有128个CAG重复的全长人突变的HTT转基因的酵母人工染色体)和FVB/NJ同窝小鼠(Slow等，(2003)Hum.Mol.Genet.12:1555-1567；VanRaamsdonk等，(2005)Hum.Mol.Genet.3823-3835)。YAC128小鼠和FVB/NJ同窝都从在Charles River实验室饲养的Genzyme群落获得。所述小鼠在12小时日/夜循环的具有不限量的食物和水的情况下维持。全部行为测试在动物日循环过程中实施(8am-4pm的小时之间)。
质粒和病毒载体
为生成编码针对亨廷顿蛋白基因的基于miRNA的发夹结构的重组AAV2/1血清型载体(AAV2/1-miRNA-Htt)，将人HTT的miRNA克隆入包含AAV2反向末端重复(ITR)、牛生长激素多聚A和1.6-kb巨细胞病毒增强子/鸡-肌动蛋白(CBA)启动子的穿梭质粒。miRNA的支架来自InvitrogenTM BLOCK-iTTM Pol II miR RNAi表达载体套盒(Life Technologies,ThermoFisher Scientific；Waltham,MA)。对照载体包含空载体骨架(AAV2/1-空)或表达在相同启动子(AAV2/1-eGFP)控制下的增强的绿色荧光蛋白(AAV2/1-eGFP)。全部病毒载体通过如上文所述的人293细胞的三重质粒共转染生成(Xiao等(1998)J.Virol.72:2224-2232)，且重组病毒颗粒如上文所述进行柱纯化(Passini等，(2001)J.Virol.75:12382-12392)。使用定量PCR获得的AAV2/1-miRNA-Htt的滴度确定为4.5x 1012vg/ml，且AAV2/1-空的滴度为2.3x1012vg/ml。
手术步骤
将动物使用3％异氟醚麻醉并置于立体定位仪。如前文所述实施了颅内注射(Treleaven,C.M.等(2012)Mol.Ther.20:1713-1723)。简言之，将2μl的重组病毒载体(AAV2/1-eGFP或AAV2/1-miRNA-Htt)使用10μl Hamilton注射器以0.5μl/min的速率注射入纹状体(AP,+0.50；ML,±2.00；DV,-2.5来自前囟及硬脑膜；门齿条，0.0)。完成注射后将针留在原处1分钟。手术前1小时和手术后24小时，将酮洛芬皮下施用至小鼠(5mg/kg)用于镇痛。
动物灌注和组织收集
使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)通过心脏灌注小鼠以去除全部血液。将脑部沿中线矢状位切割，并将左半球后-固定于4％多聚甲醛，随后为30％蔗糖且随后使用低温恒温器切成20-μm切片。使用小鼠脑基质(Harvard Apparatus,Holliston,MA)将右半球沿冠状轴切割成2-mm板且随后在液氮中快速冷冻并在-80℃保存直至使用。对于Htt聚集物的分析，将脑在4％多聚甲醛中后-固定48小时，用PBS洗涤、且随后使用振动切片机切成40-μm冠状切片。
细胞培养和转染
将HEK293细胞用5x 109vg的AAV2/1-eGFP或AAV2/1-miRNA-Htt感染并3天后收集。通过实时定量RT-PCR测量RNA水平。使用Cells-to-CTTM套盒(Ambion)分离总RNA。实施Q-PCR反应并如上文所述在ABI Prism 7500序列检测仪(Applied Biosystems)上分析(Kordasiewicz,H.B.等(2012)Neuron 74:1031-1044)。将表达水平标准化至PPIA(肽基脯氨酰异构酶)水平。
实时定量PCR(TaqMan)
RNA水平通过实时定量RT-PCR测量。将来自脑板2的脑组织样品用于全部RT-PCR分析。使用QIAGEN RNEasy迷你套盒提取总RNA且随后逆转录，并使用One-StepRT-PCR Master Mix套盒(Applied Biosystems)根据制造商的说明扩增。为检测小鼠HttmRNA，使用了下列探针集：Mm01213820_m1(Life Technologies目录号4331182)。为检测人Htt mRNA，使用了下列寡聚物：5’-ctccgtccggtagacatgct-3’(正向引物，SEQ ID NO:9)；5’-ggaaatcagaaccctcaaatgg-3’(反向引物；SEQ ID NO:10)和5’-tgagcactgttcaactgtgtgtatcggga-3’(探针，SEQ ID NO:11)。实施了定量RT-PCR反应并在ABI7500Real Time PCR系统(Applied Biosystems)上分析。将Htt mRNA的表达水平标准化至次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1(Hprt1)mRNA水平。使用小鼠脑cDNA的5倍系列稀释生成标准曲线。一式两份运行每个样品。通过使用标准曲线或ΔΔCT方法确定相对基因表达并标准化至Hprt1mRNA水平。
蛋白免疫印迹
以50mg/ml的终浓度在包含完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的T-Per裂解缓冲液(Pierce)中均质化组织。通过在4C 10,000×g离心6分钟使均质物澄清。通过使用BSA测定法(Pierce)测量蛋白浓度。在3-8％的Novex Tris-乙酸盐凝胶上解析20-30微克的均质物且随后转移至硝酸纤维素膜。使用小鼠抗亨廷顿蛋白单克隆抗体(Mab2166；1:2,000稀释，Millipore)和兔多克隆抗β-微管蛋白抗体(1:750稀释，Santa Cruz Biotechnology)探测膜。随后使用红外二级抗体(1:20,000稀释，Rockland)温育膜，且所述蛋白通过使用Odyssey(LI-COR Biosciences)的定量荧光可视化。为控制装载差异，将Htt蛋白标准化至β-微管蛋白并作为未处理或盐水处理的动物的百分比表示。使用分子量标记以验证蛋白的同一性。
流式细胞术和细胞分选(FCM细胞分选)
使用具有100μm喷嘴FACS Aria II细胞分选仪(BD Biosciences San Jose,CA)在Genzyme Flow Cytometry Core Facility(a Sanofi Company)分析并分离了单细胞悬液。通过由前向散射(FWD-SC)和侧散射(SSC)上的门控从碎片区分活的单细胞实施细胞分析。使用具有530/30BP过滤器505LP的检测仪E收集EGFP阳性细胞。EGFP荧光数据文件作为单参数柱状图显示且分选决定以EGFP-和EGFP+为基础。在包含5％胎牛血清的组织培养介质中收集分选的细胞并以50000细胞/孔的浓度铺板于4孔-室载玻片(LabTek,Nalge NuncInternational,Naperville,Ill)。
免疫组化
处理振动切片机切片用于通过EM48(一种优先识别聚集的亨廷顿蛋白的抗体)的免疫染色(Gutekunst等，(1999)J.Neurosci.19:2522-2534)。自由浮动的切片首先用DualEndogenous Enzyme Block(Dako)处理30分钟以阻断内源过氧化物酶活性。其随后用0.01MPBS洗涤(3分钟)，随后用PBS中的0.5％Triton X-100洗涤三次，每次10分钟。非特异性位点通过在室温在Rodent Block M中温育切片1小时封闭。用EM48抗体(Millipore，在PBS中1:25稀释)通过在4℃冷室的温和摇床上温育过夜探测切片。第二天，用二级抗体(MM HRPPolymer,Biocare Medical)在室温摇床上温育切片1小时。PBS中三次洗涤(每次15分钟)后，使用DAB Peroxidase Substrate套盒(Vector)检测信号。洗涤后，在Superfrost plus载玻片上固定切片，干燥过夜并用Acrytol封固剂覆盖载玻片。
行为学分析
加速旋转杆测试：在加速旋转杆设备(AccuScan Instruments)上评估运动协调和运动学习。在旋转杆上用每天3次试验训练小鼠，持续3个连续天。在训练的第一天，设置旋转杆以在300秒内从0加速至5RPM。完成300秒前从杆上跌落的小鼠放回杆上直至超过完整的300秒。在训练的第二天和第三天，设置旋转杆以在300秒内从0加速至40RPM，再次需要全部小鼠在杆上完成全部的300秒。在第四天(测试日)，将小鼠置于设置在300秒内从0加速至40RPM的旋转杆。跌倒后不再将动物重置，且在3次测定法中记录跌落潜伏期时间。跌落潜伏期时间通过直至动物从旋转杆跌落的流逝的时间定义。
Porsolt游泳测试：将在Porsolt游泳测试中的不动性作为啮齿动物中抑郁的测量(Porsolt等，(1977)Arch.Int.Pharmacodyn.Ther.229:327-336,Cryan等，(2002a)TrendsPharmacol.Sci.23:238-245,Cryan等，(2002b)Eur.J.Pharmacol.436:197-205)。该测试通过将小鼠置于填充了直至15cm高度的23℃水的单独的玻璃圆筒(20cm高度×10cm直径)中实施。将小鼠置于圆筒中7分钟的时间。认为该阶段的最初3分钟为适应期，其间不收集数据。在测试部分的最后4分钟，小鼠的表现通过使用时间采样技术的盲测观察评分以对10秒时间间隔的主要行为进行评级。测量游泳和不动行为并在每10秒末记录，其产生每测试的24个数据点。对于每只小鼠计算不动状态花费的时间的百分比。
统计学
对于统计学分析使用平均值。数据表示为平均值±SEM。对于使用两组的研究，使用了Student’s T检验用于统计学比较。对于多于两组的比较，使用了单向ANOVA，随后为Tukey’s多重比较后-hoc检验(Prism GraphPad)。认为p<0.05为统计学显著性差异。
结果
如图1A所示工程化质粒以表达靶向Htt的miRNA和在鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子(pSP70-CBA-EGFP)转录控制下的增强的GFP(eGFP)报告基因。选自Htt编码区的候选靶序列为5’-TAGACAATGATTCACACGGT-3’(SEQ ID NO:4)。生成高滴度的编码靶序列的重组AAV2/1-血清型载体(AAV2/1-miRNA-Htt)和对照载体(AAV2/1-eGFP和AAV2/1-空)且其基因沉默活性通过感染人胚胎肾(HEK)293细胞检测。细胞用5×109vg的AAV载体感染。使用荧光激活细胞分选(FACS)分析，确认了用AAV-eGFP-miRNA-HTT感染后，该剂量导致HEK293细胞中多于90％的感染效率(图2A-D)。当在感染后第3天通过实时PCR分析时，用AAV2/1-eGFP感染的细胞不显示任何内源Htt水平的减少，然而，用AAV2/1-miRNA-Htt感染的细胞显示了Htt mRNA水平约40％的减少(图1B)。
实施例2:将AAV2/1-miRNA-Htt注射入YAC128小鼠导致广泛的纹状体转导和HttmRNA的减少。
验证了AAV2/1-miRNA-Htt在体外抑制Htt mRNA水平的能力后，对该载体在YAC128小鼠纹状体中沉默Htt表达的能力进行了评估。为确定纹状体内注射AAV2/1-miRNA-Htt后纹状体内细胞的转导百分比，根据实施例1中所述的方法采用了荧光活化细胞分选(FACS)。
结果
成年YAC128小鼠接受了AAV2/1-eGFP-miRNA-Htt(4.5×1012vg/ml)、对照载体AAV2/1-eGFP(5.6×1012vg/ml)的双侧纹状体内注射。注射后一个月，对每动物纹状体区进行了微解剖并分选了含eGFP细胞对不含eGFP细胞且通过FACS分析量化(图3A&B)。数据显示多于80％的纹状被载体转导，如通过大量分选的纹状体细胞内eGFP存在证明的(图3C)。
为评估载体减少体内Htt的能力并监测响应的寿命，成年小鼠接受了AAV2/1-miRNA-Htt(4.5E12vg/ml)(N＝16，N＝8+8每时间点)或AAV2/1-空对照载体(2.3E12vg/ml)(N＝8)的双侧纹状体内注射，且在治疗后的1或5个月分析了脑部。在两时间点来自用AAV2/1-miRNA-Htt治疗的小鼠的脑部切片的荧光显微分析显示遍及整个纹状体和周边脑区的广泛eGFP荧光，与FACS分析一致，这表明几乎全部的纹状体转导(图3D)。在治疗后1个月获得的小鼠脑部中的eGFP表达水平在5个月的时间点表现得未减少(图3D)。当与AAV2/1-空-治疗的对照相比时，在AAV2/1-miRNA-Htt-注射的小鼠中突变的人Htt mRNA的纹状体水平显著减少，且在两时间点都注意到了等同的减少程度(约45％，p<0.01)(图3E)。当与AAV2/1-空-治疗的对照相比时，AAV2/1-miRNA-Htt后内源小鼠Htt mRNA的纹状体水平显著减少。在两时间点都注意到了等同的减少程度(约45％，p<0.01)(图4)。
实施例3：AAV2/1-miRNA-Htt注射入YAC128小鼠未引起脑中明显的毒性。
为确定AAV2/1-miRNA-Htt和后续Htt的减少是否赋予了神经毒性和炎症，根据实施例1所述的方法通过苏木精和伊红(H&E)染色检查了纹状体切片的细胞形态学和完整性。神经炎症标记物胶质纤维酸性蛋白(GFAP，星形胶质细胞的标记物)和Iba-1(小胶质细胞的标记物)的水平也在治疗后的1个月和5个月进行了检查。
结果
H&E分析显示了注射的脑区中无明显的组织病理学变化(图5A-C)。当与AAV2/1-空-治疗的动物比较时，在注射后1或5个月的注射区中未观察到GFAP-阳性星形胶质细胞的数目(通过免疫组化进行可视化)或GFAP mRNA的水平(通过QPCR定量)的明显增加(图5D-F；图5J)。然而在注射后1个月注意到通过纹状体中Iba-1免疫染色(图5H)和Iba-1mRNA水平增加所证实的活化的小胶质细胞数目增加(图5K)。有趣的是，在注射后5个月，小胶质细胞活化回到对照水平(图5I&5K)，这表明响应时瞬时的。不希望受到理论限制，由于在本研究中使用的AAV2/1-空对照载体不包含eGFP基因，认为来自AAV2/1-miRNA-Htt的eGFP的表达可能为瞬时的小胶质细胞活化的原因。
总之，这些结果证实并扩展了如下发现：AAV2/1-miRNA-Htt能够不仅在体外也在YAC128小鼠纹状体中介导持续的Htt沉默。而且，Htt水平多至5个月的部分抑制在小鼠脑中未导致明显的毒性或神经炎症。
实施例4：AAV2/1-miRNA-Htt的纹状体递送改正了YAC128小鼠中的异常行为和神经化学概貌
根据实施例1所述的方法还检查了在HD的YAC128小鼠模型中存在的AAV-介导的突变的Htt水平减少对详细表征的表型缺陷的影响。已报告在3月龄开始的YAC128小鼠显示运动协调缺陷(其通过实验旋转杆测试揭示)和抑郁表型(使用Porsolt游泳测试揭示)(Slow等，(2003)Hum.Mol.Genet.12:1555-1567；Van Raamsdonk等，(2007)Neurobiol Dis 26:189-200)。
结果
年龄匹配的(2月龄)YAC128和野生型同窝小鼠接受了AAV2/1-miRNA-Htt或AAV2/1-空载体的双侧纹状体内注射且随后在治疗后3个月处死(图6A)。如预期，脑切片的分析证明了遍及整个纹状体和周边区域的eGFP表达，如之前观察的(图6B)。但与AAV2/1-空-治疗对照相比时，脑部均质物的Western印迹分析显示突变的人和内源小鼠Htt蛋白在AAV2/1-miRNA-Htt注射的YAC128和野生型小鼠的纹状体中显著减少(约55％的减少，p<0.01)(图6C&D)。实时定量PCR分析指示还获得了mRNA水平的相称的减少。
当与AAV2/1-空或AAV2/1-miRNA-Htt-治疗的野生型同窝比较时，在注射后2个月的AAV2/1-空-治疗YAC128小鼠的旋转杆测试中显示明显的运动协调缺陷(ANOVA，p<0.01)(图6E)。然而，已用AAV2/1-miRNA-Htt治疗的YAC128小鼠显示了与野生型小鼠没有区别的表现水平(ANOVA，Tukey的后-hoc；WT Htt对YAC128Htt，p＝NS；WT空对YAC128空，p<0.05)。因此，突变的Htt水平的部分降低足以改正YAC128小鼠的运动缺陷。在接受AAV2/1-miRNA-Htt的野生型小鼠和接受AAV2/1-空的野生型小鼠之间的旋转杆表现无明显差异。
之前的报道指示YAC128小鼠(始于3月龄)显示可使用Porsolt游泳测试检测的抑郁表型(Pouladi等，(2009)Brain 132:919-932)。当置于水的容器中时，如果它们长时间不动，则认为动物表现出抑郁状态。使用基本游泳速度测试(其中测量了到达平台的游泳延迟)，研究者证明了该Porsolt游泳测试中的抑郁表型与YAC128小鼠的游泳能力无关且不依赖于在该模型中观察到的完整记录的运动协调缺陷(Pouladi等，(2009)Brain 132:919-932)。用AAV2/1-miRNA-Htt-或AAV2/1-空-载体注射了两月龄的YAC128和WT同窝小鼠并在3个月后进行了Porsolt游泳测试。当与AAV2/1-miRNA-Htt-治疗的YAC小鼠或AAV2/1-空-治疗的野生型动物相比时，未治疗的YAC128小鼠显示了不动状态的时间的增加(图6F；ANOVAp<0.05)。再次，接受了AAV2/1-miRNA-Htt或AAV2/1-空的野生型小鼠的表现无明显差异。已用AAV2/1-miRNA-Htt注射的YAC128小鼠相比AAV2/1-空治疗的对照在不动状态花费了显著更少的时间。的确，AAV2/1-miRNA-Htt治疗的YAC128小鼠的表现与其野生型同窝相似，表明该异常表型几乎完全改正(ANOVA，Tukey的后-hoc；YAC Htt对YAC空，p<0.05)(图6F)。
实施例5:使用AAV2/1-miRNA-Htt的治疗部分改正了YAC128小鼠中DARPP-32和D1的转录失调。
已在HD脑中观察到了多种在纹状体中富集的基因的转录失调(Richfiel等，(1995)Ann.Neurol.37:335-343；Augood等，(1997)Ann.Neurol.42:215-221；Sugars等，(2004)J.Biol.Chem.279:4988-4999；Desplats等，(2006)J.Neurochem.96:743-757)。该异常在YAC128小鼠中也明显，如具体地通过与野生型动物的那些相比DARPP-32和D1多巴胺受体的显著较低的纹状体水平所示(Pouladi等，(2012)Mol.Genet.21:2219-2232)。为检查YAC128小鼠中Htt水平的抑制是否改正了此改变的转录概貌，对已在2月龄用AAV2/1-miRNA-Htt治疗的YAC128小鼠的纹状体组织实施了实时定量PCR分析，并根据实施例1所述的方法在3个月后进行了分析。
结果
当与年龄匹配的野生型对照相比时，AAV2/1-空-治疗的YAC128小鼠的脑提取物的分析指示DARPP-32和D1多巴胺受体(D1R)的mRNA水平显著降低(ANOVA，Tukey的后-hoc；WT空对YAC128空，p<0.05)(图7A&B)。相比用AAV2/1-空载体治疗的那些，施用了AAV2/1-miRNA-Htt的YAC128小鼠显示更高的DARPP-32和D1R mRNA水平；然而这些水平仍低于在野生型对照中观察到的那些(ANOVA，Tukey的后-hoc；WT空对YAC Htt，p＝NS)。因此，AAV2/1-miRNA-Htt-介导的YAC128小鼠中Htt水平的减少赋予了异常纹状体转录概貌的部分改正。在稍后的时间点(治疗后多于5个月)的检查可揭示该异常概貌的更完全的改正。
总之，这些结果确证了AAV2/1-miRNA-Htt能够介导持续降低的Htt水平的体外和体内发现。重要的是，证明了该YAC 128小鼠中纹状体Htt水平的减少导致了运动功能和行为的可测量改进以及详细表征的纹状体中的转录失调的部分改正。
实施例6：AAV2/1-miRNA-Htt的纹状体递送减少了YAC128小鼠的脑中的Htt聚集物
CNS中Htt聚集物和包涵体的出现是HD的神经病理学特点。这些聚集物在HD小鼠中降低的水平已与病理学引人注目的改善关联(Harper等，(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:5820-5825；Rodriguez-Lebron等，(2005)Mol.Ther.12:618-633)。报告了12月龄的YAC128小鼠模型显示纹状体中Htt聚集物的显著和广泛的积累(Slow等，(2003)Hum.Mol.Genet.12:1555-1567,Pouladi等，(2012)Hum.Mol.Genet.21:2219-2232)。AAV2/1-miRNA-Htt递送对YAC128小鼠中Htt聚集物的影响根据实施例1中所述的方法检查。
结果
使用抗Htt抗体EM48的6、9和24月龄的YAC128小鼠脑切片的免疫组化染色显示了随时间进展早在6月龄的纹状体和皮质两者中聚集物的证据(图8A)。还分析了12月龄的组织(16微米冷冻切片)，显示与24月龄群组具有相似的聚集物程度；然而，冷冻切片中的非特异性背景染色显著高于振动切片机切片(数据未显示)。
为检查AAV-介导的突变的Htt水平的减少是否降低了Htt聚集物在后-症状性YAC128小鼠(7月龄)脑中的积累程度，且进而改正运动和行为缺陷，对小鼠进行双侧纹状体内的AAV2/1-miRNA-Htt或AAV2/1-GFP注射。在注射后3个月(动物为10月龄)将动物置于旋转杆上测试并在注射后5个月处死(当小鼠为12月龄时)(图8B)。旋转杆上的AAV2/1-miRNA-Htt-治疗的YAC128小鼠显示了与其野生型同窝可比较的能力水平(图8C；ANOVA，Tukey的后-hoc；p＝NS)。然而，由于在该研究中使用的小鼠数目较低，这些结果并未达到统计学显著性(N＝4WT；N＝6YAC128)。使用EM48抗体的纹状体切片的免疫组化染色显示AAV2/1-miRNA-Htt相比AAV2/1-GFP-治疗的YAC128小鼠显著更少的Htt聚集物的存在(图8D)。AAV-miRNA-Htt-治疗的YAC128小鼠的脑部与野生型小鼠的那些实质上不可区分。
为确认使用AAV2/1-miRNA-Htt观察到的聚集物减少并非是由于神经元丧失或潜在的神经毒性，在相邻的矢状位脑切片上实施了对于NeuN(神经元标记物)、GFAP(星形胶质细胞标记物)和Iba1(小胶质细胞标记物)的H&E染色以及免疫组化染色。与AAV-2/1-空注射的对照相比，通过荧光显微术，AAV2/1-miRNA-Htt注射的动物显示纹状体中NeuN-阳性神经元相同的丰度。使用光学显微术，相邻冠状脑切片的H&E染色也表现正常并提供了此缺乏神经丧失的支持性证据；然而，由于未实施体视(stereology)，该结果不可量化。此外，如在早期研究中所观察，在注射后5个月的AAV2/1-miRNA-Htt-治疗的小鼠中未检测到GFAP或Iba-1染色的增加。
结论
本研究显示了降低的突变的Htt水平是针对HD的治疗策略，且证明了纹状体中突变的Htt的部分减少在HD全长转基因小鼠模型YAC128小鼠模型中产生行为、生化和神经病理的改善。评估该治疗策略的之前的努力实施于携带突变的HTT基因片段的小鼠模型，如R6/1和N171-82Q HD小鼠(Harper等，(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:5820-5825,Rodriguez-Lebron等，(2005)Mol.Ther.12:618-633,Machida等，(2006)Biochem.Biophys.Res.Commun.343:190-197)。突变的Htt水平的部分减少赋予了一些更严重模型如N171-82Q HD小鼠模型中适度的存活益处，但在其他模型(例如R6/1小鼠模型)中却非如此(Harper等，(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:5820-5825,Rodriguez-Lebron等，(2005)Mol.Ther.12:618-633,Machida等，(2006)Biochem.Biophys.Res.Commun.343:190-197)。在使用旋转杆和步幅长度测试的这些研究中也注意到了运动的改善；然而，这些模型的严重性排除了治疗对行为、神经病理和生化异常的长期评估。
本研究利用了YAC128小鼠模型(该模型含有突变的包含128个CAG重复的人HTT基因)，其发生进行性运动异常和年龄依赖性的神经病理。与其他HD小鼠模型相比，YAC128小鼠很适于测试治疗效力，这是由于其概括了人疾病的显著遗传和临床特征。YAC128小鼠中疾病相关改变的自然史已详尽定义，且动物显示具有低动物间差异性的表型上均一的疾病特征。YAC128小鼠发生改变的纹状体转录概貌，此为未在其他相似小鼠如BAC HD小鼠模型中观察到的性状(Pouladi等，(2012)Hum.Mol.Genet.21:2219-2232)，且YAC128小鼠显示年龄依赖性纹状体神经退化。由此，该模型中治疗干预的测试和结果的测量对于临床转化可能更具预测价值(Slow等，(2003)Hum.Mol.Genet.12:1555-1567)。
使用YAC128小鼠，这些研究证明了靶向突变的人Htt的miRNA的AAV2/1-介导的表达导致Htt mRNA和蛋白在纹状体中的显著减少。与该激惹实体的降低相关的是如使用旋转杆和Porsolt游泳测试在治疗后5个月的显著改善以及纹状体内Htt聚集物的显著减少。值得注意的是，在这些研究中观察到的Htt水平的减少仅约为对照的40％，指示突变的Htt的部分减少足以在该小鼠模型中产生显著的治疗益处。而且，用AAV载体的纹状体的80％的转导仅导致部分Htt减少。在培养中的HEK293细胞内看到了相似的现象，其中约90-95％的转导效率仅得到作为结果的内源Htt水平40-50％的减少(参见图2A-D)。这些发现与啮齿类动物和灵长类动物中之前的发现一致，显示使用基于miRNA的沉默的可比较策略仅减少部分Htt水平(McBride等，(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:5868-5873；Boudreau等，(2009b)Mol.Ther.17:1053-1063；McBride等，(2011)Mol.Ther.19:2152-2162；Grondin等，(2012)Brain 135:1197-1209)。不希望受到理论限制，对于为什么miRNA在该转导区仅产生部分靶敲低存在多种潜在的假设。用于介导Htt沉默的miRNA茎-环形式在生成功能性小干扰RNA前需要通过细胞加工。这些对于细胞加工的需要可因此对由基于miRNA的发夹赋予的RNA沉默的程度设置天然限制。由Boudreau等(Boudreau等，(2009a)Mol.Ther.17:169-175)的报导描述了基于miRNA的平台对于在哺乳动物脑中的治疗性沉默改进的安全性，且强调了与传统短的发夹结构相比miRNA的改进的毒性概貌。该安全性改进可能是由于miRNA对内源细胞加工机制的依赖(Boudreau等，(2009a)Mol.Ther.17:169-175)。尽管提出了这些假设，脑中基于miRNA的Htt沉默的精确机制仍未知，然而本文提供的数据证明了Htt的部分减少可至少在HD的小鼠模型中实现治疗益处。
由于Htt的功能性角色仍不清楚，存在着与利用赋予非等位基因特异性沉默的治疗策略相关的明显困扰。本文公开的研究指示野生型小鼠以及患病的YAC128小鼠CNS中内源性小鼠Htt的部分降低，直至5个月仍良好耐受。AAV-miRNA-Htt的施用减少了约40％的野生型小鼠和突变的人Htt，因此允许野生型Htt水平至少60％的保持而仍保持沉默突变的毒性Htt的治疗益处。未观察到明显的毒性或异常行为。目前的数据与之前的研究一致，后者显示HD小鼠和野生型小鼠中非等位基因特异性Htt沉默治疗后多至9个月后毒性的相似缺少(Boudreau等，(2009b)Mol.Ther.17:1053-1063)。野生型Htt的部分抑制的安全性以在非人灵长类动物中进行了报道(McBride等，(2011)Mol.Ther.19:2152-2162；Grondin等，(2012)Brain 135:1197-1209)，提供了正常Htt的部分水平的降低可不会导致显著的有害后果的信心。该研究进一步证明了YAC128小鼠中突变和野生型Htt两者的部分抑制(～40％)是治疗性的，如通过在多项行为测试中它们表现所证明的，且不与任何明显的副作用相关。之前的报导已表明Htt在胚胎发育和出生后神经发生中的作用(Bhide等，(1996)J.Neurosci.16:5523-5535；Reiner等，(2003)Mol.Neurobiol.28:259-276；Cattaneo等，(2005)Nat.Rev.Neurosci.6:919-930)。然而，至今数项临床前研究证明在成年脑中部分减少野生型Htt水平在小鼠和非人灵长类动物中都表现为良好耐受(Boudreau等，(2009b)Mol.Ther.17:1053-1063；McBride等，(2011)Mol.Ther.19:2152-2162；Grondin等，(2012)Brain 135:1197-1209)。
在小鼠模型和人患者两者中的HD病理值得注意的特点是突变的Htt免疫反应性(IR)聚集物的存在(DiFiglia等，(1997)Science 277:1990-1993；Scherzinger等，(1997)Cell 90:549-558)。HD中病理生理事件级联内的聚集物的精确作用一直是争论的问题(Lansbury等，(2006)Nature 443:774-779)且突变的Htt聚集物和疾病之间的因果关系的表明仍然是争议性的(Bates,(2003)Lancet 361:1642-1644；Arrasate等，(2004)Nature431:805-810)。然而，存在共识的是不溶性蛋白聚集物的形成赋予了细胞降解过程增加的负担(Yamamoto等，(2000)细胞101:57-66)。本文公开的研究证明了YAC128小鼠早在6月龄即显示广泛的纹状体聚集物(早于之前报道)且在7月龄(聚集物形成后)注射AAV2/1-miRNA-Htt显著减少了纹状体内EM48-阳性Htt聚集物的数目几乎至野生型水平。不希望受到理论限制，这些数据表明AAV2/1-miRNA-Htt治疗可消除Htt可能的汇集，显著改善了突变体Htt聚集物的负担且因此潜在有助于在该小鼠模型中所注意到的功能性改善。
除Htt聚集物的基本上去除，AAV-miRNA-Htt治疗还赋予YAC128小鼠中的行为益处。YAC128小鼠在3月龄开始显示旋转杆上的缺陷，且在7月龄其显示严重的损伤(Slow等，(2003)Hum.Mol.Genet.12:1555-1567)。用AAV2/1-miRNA-Htt治疗的YAC128小鼠在7月龄(当运动协调显著损伤时)显示了在旋转杆上测试的改善，这表明获得了建立的运动缺陷的逆转。尽管之前已报道了Htt聚集物的减少(N171和R6/2片段模型)(Rodriguez-Lebron等，(2005)Mol.Ther.12:618-633；Machida等，(2006)Biochem.Biophys.Res.Commun.343:190-197)，本研究证明了聚集物的改善和伴随的HD的全长小鼠模型中行为的改善。还观察到了AAV-miRNA-Htt注射入纹状体后的Porsolt游泳测试中显著的改善。这是首次报道AAV-RNAi后该抑郁表型中的改善且不希望受到理论限制，重要的是这些结果表明纹状体中Htt水平的减少足以改善YAC128模型中显示的抑郁表型。最后，当用AAV-miRNA-Htt治疗7月龄的YAC128小鼠时(后-症状性治疗)，观察到了该模型显示的纹状体中Htt聚集物的显著减少和运动协调缺陷的可能的逆转。不希望受到理论限制，这些数据指示AAV2/1-miRNA-Htt的后-症状性治疗可改善细胞内的mHtt负担并即使在mHtt聚集物形成后提供了治疗益处。
纹状体Htt的抑制还导致了DARPP-32和D1受体mRNA(YAC128小鼠和人HD患者中随年龄进行性衰退的2种转录物)水平的适度改正。已知突变的Htt参与导致神经功能障碍和转录失调的多种细胞过程(Cha,(2000)Trends Neurosci.23:387-392)。
总之，这些研究证明了AAV-介导的RNAi显著改进了HD的YAC128小鼠模型中的HD-相关的行为异常。此外，其还显示了靶向Htt的miRNA的AAV-介导的递送可导致HD的转基因小鼠模型中Htt水平的持续抑制、细胞和神经病理异常的改正以及运动和行为缺陷的改善而无明显毒性。
通过修饰shRNA碱基配对改进RNAi
本研究利用了重组AAV2/1载体以编码针对嵌入miRNA支架(miR-155)的Htt基因的短发夹结构。从之前公开的序列mirR2.4(其靶向小鼠和人htt转录物的外显子2)对使用的shRNA序列进行修饰(McBride等，(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:5868-5873)。短发夹结构RNA的修饰已用于增加稳定性和生物活性、最小化脱靶效应并减少天然免疫响应(Castanotto等，(2009)Nature457:426-433；Jackson等，(2010)Nature Rev.Drug Disc.9:57-67)。在本研究中使用的修饰序列包含与miR2.4相同的指导链序列(图9A)；然而，将构建体工程化以在种子序列的3’末端具有额外的腺嘌呤核苷酸(A)，其在指导链中不具有相应的胸腺嘧啶核苷酸(T)(图9B)。不希望受到理论限制，热动力学模型表明指导链上的种子序列对侧的非指导链中的凸出序列的添加可改进RNAi表现的方面。相应地，发明人还开发了可用于生成新型的转化的核酸疗法的进展以治疗多种病症。
实施例7.脱靶基因沉默的减少
RNA干扰(RNAi)提供用于治疗多种人疾病的方式。然而，基于RNAi疗法的安全性可由小抑制性RNA(siRNA)与非故意的mRNA结合并减少其表达的能力所阻碍，该作用称为脱靶基因沉默。脱靶主要在当种子区(小RNA的核苷酸2-8)与非故意的mRNA的3′-UTR中的序列配对并指导翻译抑制和那些转录物的去稳定化时发生。至今，大多治疗性RNAi序列主要选择其基因沉默效力，且后续评估安全性。此处，在设计治疗亨廷顿病(HD)(显性遗传性神经退行性病症)的siRNA中，生成了在小鼠脑中显示强沉默及低生物信息学(in silico)脱靶概貌的两个具有最小脱靶潜在性(即在全部已知的人和恒河猴3′-UTR内具有种子互补物缺乏的那些)的新序列。
表1.miRNA序列
表1中显示是原始的PS170XAmiRNA序列和该序列的两种修饰的低脱靶版本：170XAL1和170XAL2。PS170XA的两种低脱靶版本通过取代来自碱基2-8的七聚物内的碱基设计以生成CpG基序(Boudreau等,2012)。在170XAL1(5'-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3')(SEQ IDNO:15)中位置2处的‘A’改变为C，且在170XAL2(5'-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3')(SEQ IDNO:17)中位置6处的‘A’改变为‘G’。使用SiSPOTR算法(针对特异性的siRNA设计算法，其识别具有最小脱靶潜在性和强沉默能力的候选序列)，这些取代导致显著更低的脱靶评分(Boudreau等,Nucleic Acids Res.2013Jan；41(1)e9。减少的SiSPOTR评分将预测与原始170XA序列相比具有较低潜在人脱靶数目的新序列。
原始PS170XAmiRNA序列是5'-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3'(SEQ ID NO:1)。将如下序列(其包含指导链、修饰的mir-155内环(鼠)和过客链)克隆入表达载体:5’TAGACAATGATTCACACGGTGTTTTGGCCACTGACTGACACCGTGTGTCATTGTCTAA-3’(SEQ ID NO:19)。额外的‘A’包括在3’末端。指导和过客链为粗体，且指导链的碱基11和12在过客链中并非反向互补，生成成熟、加工的双链体中的小内部环。位置2处的‘A’改变为170XAL1中的C，且位置6处的‘A’改变为170XAL2中的‘G’，除此之外，170XAL1和170XAL2具有与原始PS170XA相同的结构。结构示于图10。
测试了AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1和170XAL2在体外人胚肾(HEK293)细胞中介导Htt减少的能力。用AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1和170XAL2表达质粒以及包含非编码miRNA序列(CTL3)的对照质粒转染HEK293细胞(每处理8个重复)。使用Fugene转染试剂转染细胞并在48小时后收集。使用Cells-to-CTTM套盒(Ambion)分离总RNA。通过实时定量RT-PCR测量RNA水平(在ABI Prism 7500序列检测仪(Applied Biosystems)上实施并分析)。表达水平标准化至人PPIA(肽基脯氨酰异构酶)。与CTL3和未处理的对照相比，用170XAL2和170XAL2两质粒转染后减少了人Htt mRNA水平，然而该减少未达到统计学显著性(图11)。
评估了AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1和170XAL2在YAC128小鼠纹状体中沉默Htt表达的能力。成年YAC128小鼠接受了AAV2/1-miRNA-Htt170XA(2E10vgs/位点)、AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1(2E10vgs/位点)或AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL2(3E10vgs/位点)的双侧纹状体内注射。原始AAV2/1-miRNA-Htt 170XA作为阳性对照而未处理(未注射)的另一组作为阴性对照。注射后一个月，处死动物并用PBS灌注。收集脑部用于组织学和生化分析。对于生化分析，显微解剖一半球的纹状体区并在液氮中速冻。突变体人和小鼠Htt mRNA和蛋白的纹状体水平分别通过QPCR和Western印迹评估。当与未处理的对照动物相比时，突变的人Htt和小鼠Htt mRNA在AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1和AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL2注射的小鼠中显著减少(图12A和12B)。对于全部QPCR测定法，PPIA作为标准化对照基因。当与未处理的对照动物相比时，突变的人和小鼠Htt蛋白在全部AAV2/1-miRNA-Htt-注射的小鼠中显著减少，且在全部治疗组中注意到等同的减少程度(约50％，p<0.05)(图12C和12D)。
通过QPCR评估纹状体中的GFAP和Iba1mRNA水平以确定我们的AAV-miRNA-Htt载体注射后这些炎症标记物基因是否上调。GFAP是星形细胞增生的标记物且Iba1作为小胶质细胞活化标记物。我们证明了纹状体1个月注射中AAV2/1-miRNA-Htt 170XA的纹状体内注射导致GFAP mRNA(图13A)和Iba1mRNA(图13B)的显著增加。AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1或AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL2注射后观察到GFAP或Iba1不增加且GFAP和Iba1mRNA水平与未处理的对照的等同。人PPIA作为标准化对照基因。值作为平均值±SEM给出。*与未治疗的对照小鼠显著不同，p<0.05；ANOVA随后为Tukey的后-hoc检验。
注射后1个月来自用AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1或AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL2治疗的YAC128小鼠的纹状体组织切片的GFAP和Iba1免疫组化染色证实：GFAP和Iba1蛋白水平在注射后的纹状体中未升高(图14)。使用荧光显微术评估脑中GFAP和Iba1免疫染色的水平。如通过荧光显微术所见，AAV2/1-miRNA-Htt 170XA的纹状体内注射未导致GFAP和Iba-1免疫反应性的增加，然而在注射AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1或AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL2后的GFAP或Iba1免疫染色中我们未观察到任何增加，其中染色水平与未治疗的对照脑等同。比例条＝50μM。
序列
除非另外表明，全部多肽序列以N-末端至C-末端显示。除非另外表明，全部核酸序列以5’至3’显示。
miRNA htt反义链
UAGACAAUGAUUCACACGGU(SEQ ID NO:1)
miRNA过客链补体
ACCGUGUGUCAUUGUCUAA(SEQ ID NO:2)
有义靶序列
ACCGUGUGAAUCAUUGUCUAA(SEQ ID NO:3)
miRNA htt反义链DNA序列
TAGACAATGATTCACACGGT(SEQ ID NO:4)
miRNA过客链补体
ACCGTGTGTCATTGTCTAA(SEQ ID NO:5)
有义靶序列
ACCGTGTGAATCATTGTCUTAA(SEQ ID NO:6)
3A170RNA序列
UGCUGUAGACAAUGAUUCACACGGUGUUUUGGCCACUGACUGACACCGUGUCAUUGUCUAACAGG(SEQ ID NO:7)
3A170DNA序列
TGCTGTAGACAATGATTCACACGGTGTTTTGGCCACTGACTGACACCGTGTCATTGTCTAACAGG(SEQ ID NO:8)
人Htt mRNA正向引物
Ctccgtccggtagacatgct(SEQ ID NO:9)
人Htt mRNA反向引物
Ggaaatcagaaccctcaaatgg(SEQ ID NO:10)
人Htt mRNA探针
Tgagcactgttcaactgtgtgtatcggga(SEQ ID NO:11)
scAAV载体的变体AAV ITR
CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCC
GGGCG(SEQ ID NO:12).
全长的AAV载体基因组DNA序列
ttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctggaggggtggagtcgtgacaattcgcccttgggcctaggcaattggatcccggaccgtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattcttcgaaagatctgctagcttaattaacccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtaccctggaggcttgctgaaggctgtatgctgttagacaatgattcacacggtgttttggccactgactgacaccgtgtgtcattgtctaacaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggccatgcatctagagggccctattctatagtgtcacctaaatgctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggagctagagtcgaccggaccggtggaagtcctcttcctcggtgtccttgacttcaaagggtctctcccatttgcctggagagaggggaaggtgggcatcaccaggggtgagtgaaggtttggaagagtgtagcagaataagaaaccatgagtcccctccctgagaagccctgagcccccttgacgacacacatccctcgaggctcagcttcatcatctgtaaaaggtgctgaaactgaccatccaagctgccgaaaaagattgtgtggggataattcaaaactagaggaagatgcagaatttctacatcgtggcgatgtcaggctaagagatgccatcgtggctgtgcatttttattggaatcatatgtttatttgagggtgtcttggatattacaaataaaatgttggagcatcaggcatatttggtaccttctgtctaaggctccctgccccttgttaattggcagctcagttattcatccagggcaaacattctgcttactattcctgagagctttcctcatcctctagattggcaggggaaatgcagatgcctgagcagcctcccctctgccataccaacagagcttcaccatcgaggcatgcagagtggacaggggcctcagggacccctgatcccagctttctcattggacagaaggaggagactggggctggagagggacctgggcccccactaaggccacagcagagccaggactttagctgtgctgactgcagcctggcttgcctccactgccctcctttgcctcaagagcaagggagcctcagagtggaggaagcagcccctggccttgcctcccacctcccctcccctatgctgttttcctgggacagtgggagctggcttagaatgccctggggcccccaggaccctggcattttaacccctcaggggcaggaaggcagcctgagatacagaagagtccatcacctgctgtatgccacacaccatccccacagttacgtactagttcgaagccacgcgtccgaagggcgaattgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaa
(SEQ ID NO:13)
miRNA支架DNA序列
ctggaggcttgctgaaggctgtatgctgttagacaatgattcacacggtgttttggccactgactgacaccgtgtgtcattgtctaacaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcc(SEQ ID NO:14)
170XAL1指导(反义)
UCGACAAUGAUUCACACGGU(SEQ ID NO:15)
170XAL1非指导
ACCGUGUGUCAUUGUCGAA(SEQ ID NO:16).
170XAL2指导(反义)
UAGACGAUGAUUCACACGGU(SEQ ID NO:17)
170XAL1非指导
ACCGUGUGUCAUCGUCUAA(SEQ ID NO:18)
170XA
TAGACAATGATTCACACGGTGTTTTGGCCACTGACTGACACCGTGTGTCATTGTCTAA(SEQ ID NO:19)
序列表
<110> L.M.施塔内克
A.巴勒莫
B.理查兹
S.P.萨尔迪
C.奥赖尔登
A.宋
<120> 变体RNAi
<130> 159792010140
<140> 尚未指定
<141> 同时附上
<150> US 62/114,578
<151> 2015-02-10
<160> 26
<170> 用于Windows的FastSEQ 4.0版
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
uagacaauga uucacacggu 20
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
accguguguc auugucuaa 19
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
accgugugaa ucauugucua a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
tagacaatga ttcacacggt 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
accgtgtgtc attgtctaa 19
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
accgtgtgaa tcattgtcut aa 22
<210> 7
<211> 65
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
ugcuguagac aaugauucac acgguguuuu ggccacugac ugacaccgug ucauugucua 60
acagg 65
<210> 8
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
tgctgtagac aatgattcac acggtgtttt ggccactgac tgacaccgtg tcattgtcta 60
acagg 65
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
ctccgtccgg tagacatgct 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
ggaaatcaga accctcaaat gg 22
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
tgagcactgt tcaactgtgt gtatcggga 29
<210> 12
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccacgc 60
ccgggctttg cccgggcg 78
<210> 13
<211> 4297
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcctggagg ggtggagtcg tgacaattcg cccttgggcc 180
taggcaattg gatcccggac cgtcgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa 240
ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 300
atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 360
ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 420
aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 480
tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 540
ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtcgag gtgagcccca 600
cgttctgctt cactctcccc atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta 660
ttttttaatt attttgtgca gcgatggggg cggggggggg gggggggcgc gcgccaggcg 720
gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc 780
agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata 840
aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct 900
ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 960
gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagcg cttggtttaa tgacggcttg 1020
tttcttttct gtggctgcgt gaaagccttg aggggctccg ggagggccct ttgtgcgggg 1080
ggagcggctc ggggggtgcg tgcgtgtgtg tgtgcgtggg gagcgccgcg tgcggctccg 1140
cgctgcccgg cggctgtgag cgctgcgggc gcggcgcggg gctttgtgcg ctccgcagtg 1200
tgcgcgaggg gagcgcggcc gggggcggtg ccccgcggtg cggggggggc tgcgagggga 1260
acaaaggctg cgtgcggggt gtgtgcgtgg gggggtgagc agggggtgtg ggcgcgtcgg 1320
tcgggctgca accccccctg cacccccctc cccgagttgc tgagcacggc ccggcttcgg 1380
gtgcggggct ccgtacgggg cgtggcgcgg ggctcgccgt gccgggcggg gggtggcggc 1440
aggtgggggt gccgggcggg gcggggccgc ctcgggccgg ggagggctcg ggggaggggc 1500
gcggcggccc ccggagcgcc ggcggctgtc gaggcgcggc gagccgcagc cattgccttt 1560
tatggtaatc gtgcgagagg gcgcagggac ttcctttgtc ccaaatctgt gcggagccga 1620
aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg ggcgaagcgg tgcggcgccg 1680
gcaggaagga aatgggcggg gagggccttc gtgcgtcgcc gcgccgccgt ccccttctcc 1740
ctctccagcc tcggggctgt ccgcgggggg acggctgcct tcggggggga cggggcaggg 1800
cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg gctctagagc ctctgctaac catgttcatg 1860
ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca acgtgctggt tattgtgctg tctcatcatt 1920
ttggcaaaga attcttcgaa agatctgcta gcttaattaa cccggtcgcc accatggtga 1980
gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg 2040
taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc 2100
tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga 2160
ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg 2220
acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg 2280
acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc 2340
gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg 2400
agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca 2460
aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact 2520
accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga 2580
gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg 2640
agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtaccct ggaggcttgc 2700
tgaaggctgt atgctgttag acaatgattc acacggtgtt ttggccactg actgacaccg 2760
tgtgtcattg tctaacagga cacaaggcct gttactagca ctcacatgga acaaatggcc 2820
atgcatctag agggccctat tctatagtgt cacctaaatg ctagagctcg ctgatcagcc 2880
tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg 2940
accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat 3000
tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag 3060
gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gagctagagt cgaccggacc ggtggaagtc 3120
ctcttcctcg gtgtccttga cttcaaaggg tctctcccat ttgcctggag agaggggaag 3180
gtgggcatca ccaggggtga gtgaaggttt ggaagagtgt agcagaataa gaaaccatga 3240
gtcccctccc tgagaagccc tgagccccct tgacgacaca catccctcga ggctcagctt 3300
catcatctgt aaaaggtgct gaaactgacc atccaagctg ccgaaaaaga ttgtgtgggg 3360
ataattcaaa actagaggaa gatgcagaat ttctacatcg tggcgatgtc aggctaagag 3420
atgccatcgt ggctgtgcat ttttattgga atcatatgtt tatttgaggg tgtcttggat 3480
attacaaata aaatgttgga gcatcaggca tatttggtac cttctgtcta aggctccctg 3540
ccccttgtta attggcagct cagttattca tccagggcaa acattctgct tactattcct 3600
gagagctttc ctcatcctct agattggcag gggaaatgca gatgcctgag cagcctcccc 3660
tctgccatac caacagagct tcaccatcga ggcatgcaga gtggacaggg gcctcaggga 3720
cccctgatcc cagctttctc attggacaga aggaggagac tggggctgga gagggacctg 3780
ggcccccact aaggccacag cagagccagg actttagctg tgctgactgc agcctggctt 3840
gcctccactg ccctcctttg cctcaagagc aagggagcct cagagtggag gaagcagccc 3900
ctggccttgc ctcccacctc ccctccccta tgctgttttc ctgggacagt gggagctggc 3960
ttagaatgcc ctggggcccc caggaccctg gcattttaac ccctcagggg caggaaggca 4020
gcctgagata cagaagagtc catcacctgc tgtatgccac acaccatccc cacagttacg 4080
tactagttcg aagccacgcg tccgaagggc gaattgtaga taagtagcat ggcgggttaa 4140
tcattaacta caaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct 4200
cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct 4260
cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaa 4297
<210> 14
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
ctggaggctt gctgaaggct gtatgctgtt agacaatgat tcacacggtg ttttggccac 60
tgactgacac cgtgtgtcat tgtctaacag gacacaaggc ctgttactag cactcacatg 120
gaacaaatgg cc 132
<210> 15
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
ucgacaauga uucacacggu 20
<210> 16
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
accguguguc auugucgaa 19
<210> 17
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
uagacgauga uucacacggu 20
<210> 18
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
accguguguc aucgucuaa 19
<210> 19
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
tagacaatga ttcacacggt gttttggcca ctgactgaca ccgtgtgtca ttgtctaa 58
<210> 20
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
tgctgtagac aatgattcac acggtgtttt ggccactgac tgacaccgtg tgtcattgtc 60
taa 63
<210> 21
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
tgctgtcgac aatgattcac acggtgtttt ggccactgac tgacaccgtg tgtcattgtc 60
gaa 63
<210> 22
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
tgctgtagac gatgattcac acggtgtttt ggccactgac tgacaccgtg tgtcatcgtc 60
taa 63
<210> 23
<211> 66
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
ugcuguagac aaugauucac acgguguuuu ggccacugac ugacaccgug ugucauuguc 60
uacagg 66
<210> 24
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
ugcuguagac aaugauucac acgguguuuu ggccacugac ugacaccgug ugucauuguc 60
uaacagg 67
<210> 25
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
tcgacaatga ttcacacggt gttttggcca ctgactgaca ccgtgtgtca ttgtcgaa 58
<210> 26
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
tagacgatga ttcacacggt gttttggcca ctgactgaca ccgtgtgtca tcgtctaa 58

Claims (246)

1.包含第一链和第二链的RNAi，其中
a)所述第一链和所述第二链形成双链体；
b)所述第一链包含至少19个碱基的指导区，其中所述指导区包含含有指导链的碱基1-N的种子区，其中N＝7或N＝8；且
c)所述第二链包含至少19个碱基的非指导区，其中所述非指导区包含双链体中指导区的碱基1-(N+2)的任何一个或多个对侧的凸出序列。
2.权利要求1的RNAi，其中N＝7且所述凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6、7、8或9。
3.权利要求1的RNAi，其中N＝8且所述凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。
4.权利要求1-3任一项的RNAi，其中所述凸出是指导区的对侧碱基1或碱基N+2。
5.包含第一链和第二链的RNAi，其中
a)所述第一链和所述第二链形成双链体；
b)所述第一链包含至少19个碱基的指导区，其中所述指导区包含含有指导链的碱基1-N的种子区，其中N＝7或N＝8；且
c)所述第二链包含至少19个碱基的非指导区，其中所述非指导区包含双链体中指导区的碱基1-(N+1)的任何一个或多个对侧的凸出序列。
6.权利要求5的RNAi，其中N＝7且所述凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6、7或8。
7.权利要求5的RNAi，其中N＝8且所述凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6、7、8或9。
8.权利要求5-7任一项的RNAi，其中所述凸出是指导区的对侧碱基1或碱基N+1。
9.包含第一链和第二链的RNAi，其中
a)所述第一链和所述第二链形成双链体；
b)所述第一链包含至少19个碱基的指导区，其中所述指导区包含含有指导链的碱基1-N的种子区，其中N＝7或N＝8；且
c)所述第二链包含至少19个碱基的非指导区，其中所述非指导区包含双链体中指导区的碱基1-N的任何一个或多个对侧的凸出序列。
10.权利要求9的RNAi，其中N＝7且所述凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6或7。
11.权利要求9的RNAi，其中N＝8且所述凸出是指导区的对侧碱基1、2、3、4、5、6、7或8。
12.权利要求9-11任一项的RNAi，其中所述凸出是指导区的对侧碱基1或碱基N。
13.权利要求1-12任一项的RNAi，其中所述凸出是指导区的对侧碱基1。
14.权利要求1-13任一项的RNAi，其中所述凸出通过指导区上缺乏互补碱基的双链体中非指导链的一个或多个碱基形成，其中所述凸出侧翼为与所述指导链进行碱基配对的碱基。
15.权利要求1-14任一项的RNAi，其中所述凸出包含1-10个核苷酸。
16.权利要求1-15任一项的RNAi，其中所述凸出包含1-3个核苷酸。
17.权利要求1-16任一项的RNAi，其中所述RNAi包含第二凸出，其中所述第二凸出位于定位在种子区3’的指导区中的第一链上。
18.权利要求1-17任一项的RNAi，其中所述双链体长度为19-25或19-23个碱基对。
19.权利要求1-18任一项的RNAi，其中所述第一和/或第二链进一步包含3’悬垂区、5’悬垂区或3'和5’悬垂区两者。
20.权利要求1-19任一项的RNAi，其中所述第一链和所述第二链通过能够形成环结构的RNA接头连接。
21.权利要求20的RNAi，其中所述RNA接头包含4-50个核苷酸。
22.权利要求20或21的RNAi，其中所述环结构包含4-20个核苷酸。
23.权利要求20-22任一项的RNAi，其中所述RNAi以5’-3’包含所述第二链、所述RNA接头和所述第一链。
24.权利要求20-22任一项的RNAi，其中所述RNAi以5’-3’包含所述第一链、所述RNA接头和所述第二链。
25.权利要求1-24任一项的RNAi，其中改进所述序列以减少脱靶基因沉默。
26.权利要求1-25任一项的RNAi，其中所述序列包含一个或多个CpG基序。
27.权利要求1-26任一项的RNAi，其中所述序列在种子区包含一个或多个CpG基序。
28.权利要求1-27任一项的RNAi，其中所述RNAi是小抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或小发夹RNA(shRNA)。
29.权利要求1-28任一项的RNAi，其中所述RNAi靶向编码与病症相关的多肽的RNA。
30.权利要求29的RNAi，其中所述病症是CNS病症。
31.权利要求29或30的RNAi，其中所述病症是溶酶体贮积症(LSD)、亨廷顿病(Huntington’s disease)、癫痫、帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、中风、皮质基底节变性(CBD)、皮质基底神经节变性(CBGD)、额颞叶痴呆(FTD)、多系统萎缩(MSA)、进行性核上性麻痹(PSP)或脑癌。
32.权利要求29-31任一项的RNAi，其中所述病症是亨廷顿病。
33.权利要求32的RNAi，其中所述多肽是亨廷顿蛋白。
34.权利要求33的RNAi，其中所述亨廷顿蛋白包含与亨廷顿病相关的突变。
35.权利要求32-34任一项的RNAi，其中所述指导区包含序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:1)且所述非指导区包含序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO:2)。
36.权利要求32-34任一项的RNAi，其中所述指导区包含序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:15)且所述非指导区包含序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO:16)。
37.权利要求32-34任一项的RNAi，其中所述指导区包含序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:17)且所述非指导区包含序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO:18)。
38.减少RNAi毒性的方法，其包括导入RNAi非指导区中的凸出以生成权利要求1-37任一项的RNAi。
39.一种表达构建体，其包含编码权利要求1-38任一项的RNAi的核酸。
40.权利要求39的表达构建体，其中编码所述RNAi的核酸包含miRNA支架。
41.权利要求39或40的表达构建体，其中编码所述RNAi的核酸与启动子可操作地连接。
42.权利要求41的表达构建体，其中所述启动子选自下组：巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、CK6启动子、转甲状腺素启动子(TTR)、TK启动子、四环素反应性启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝脏特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-球蛋白启动子(CAG)启动子、延伸因子1-α启动子(EFl-α)启动子、人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、逆转录病毒劳斯(Rous)肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、二氢叶酸还原酶启动子和13-肌动蛋白启动子。
43.权利要求39-42任一项的表达构建体，其中所述表达构建体进一步包含多聚腺苷酸化信号。
44.权利要求43的表达构建体，其中所述多聚腺苷酸化信号是牛生长激素多聚腺苷酸化信号、SV40多聚腺苷酸化信号或HSV TK pA。
45.一种载体，其包含权利要求39-44任一项的表达构建体。
46.权利要求45的载体，其中所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体、重组腺病毒载体、重组慢病毒载体或重组单纯疱疹病毒(HSV)载体。
47.权利要求46的载体，其中所述载体是重组腺病毒载体。
48.权利要求47的载体，其中所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或猪Ad 3型。
49.权利要求47的载体，其中所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2或腺病毒血清型5的变体。
50.权利要求46的载体，其中所述载体是重组慢病毒载体。
51.权利要求50的载体，其中所述重组慢病毒载体源自具有水泡性口膜炎病毒的慢病毒假型(lentivirus pseudotyped with vesicular stomatitis virus(VSV))、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus)(LCMV)、罗斯河病毒(Rossriver virus)(RRV)、埃博拉病毒(Ebola virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、莫卡拉病毒(Mokala virus)、狂犬病毒(Rabies virus)、RD114或其中的变体。
52.权利要求46的载体，其中所述载体是rHSV载体。
53.权利要求52的载体，其中所述rHSV载体源自rHSV-1或rHSV-2。
54.权利要求46的载体，其中所述载体是rAAV载体。
55.权利要求54的rAAV载体，其中所述表达构建体侧翼为一个或多个AAV反向末端重复(ITR)序列。
56.权利要求55的rAAV载体，其中所述表达构建体侧翼为两个AAVITR。
57.权利要求55或56的rAAV载体，其中所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAVDJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。
58.权利要求55-57任一项的rAAV载体，其中所述AAV ITR是AAV2ITR。
59.权利要求54-58任一项的rAAV载体，其中所述载体进一步包含填充核酸。
60.权利要求59的rAAV载体，其中所述填充核酸位于启动子和编码RNAi的核酸之间。
61.权利要求54-60任一项的rAAV载体，其中所述载体是自身互补的rAAV载体。
62.权利要求61的rAAV载体，其中所述载体包含编码所述RNAi的第一核酸序列和编码所述RNAi的互补物的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可与第二核酸序列沿其长度的大部分或全部形成链内碱基对。
63.权利要求62的rAAV载体，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列通过突变的AAVITR连接，其中所述突变的AAV ITR包含D区的缺失并包含末端解析序列的突变。
64.包含权利要求45-53任一项的载体或权利要求54-63任一项的rAAV载体的细胞。
65.包含权利要求45的载体的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是衣壳化所述rAAV载体的AAV颗粒、衣壳化所述重组腺病毒载体的腺病毒颗粒、衣壳化所述重组慢病毒载体的慢病毒颗粒或衣壳化所述重组HSV载体的HSV颗粒。
66.权利要求65的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是衣壳化所述重组腺病毒载体的腺病毒颗粒。
67.权利要求66的病毒颗粒，其中所述腺病毒颗粒包含来自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或猪Ad 3型的衣壳。
68.权利要求66的病毒颗粒，其中所述腺病毒颗粒包含腺病毒血清型2衣壳或腺病毒血清型5衣壳的变体。
69.权利要求66的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是衣壳化所述重组慢病毒载体的慢病毒颗粒。
70.权利要求69的病毒颗粒，其中所述慢病毒颗粒包含具有如下病毒假型的衣壳：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病毒、RD114或其中的变体。
71.权利要求66的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是HSV颗粒。
72.权利要求71的病毒颗粒，其中所述HSV颗粒是rHSV-1颗粒或rHSV-2颗粒。
73.包含权利要求54-63任一项的rAAV载体的重组AAV颗粒。
74.权利要求73的rAAV颗粒，其中所述AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合体、牛AAV或小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1血清型衣壳。
75.权利要求73或74的AAV颗粒，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自相同的AAV血清型。
76.权利要求73或74的AAV颗粒，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自不同的AAV血清型。
77.权利要求76的rAAV颗粒，其中所述ITR源自AAV2且所述rAAV颗粒的衣壳源自AAV1。
78.包含权利要求65-72任一项的病毒颗粒或权利要求73-77任一项的rAAV颗粒的组合物。
79.权利要求78的组合物，其中所述组合物进一步包含药学上可接受的载剂。
80.用于抑制或减少哺乳动物疾病中多肽表达的方法，其包括将权利要求1-37任一项的RNAi、权利要求39-44任一项的表达构建体、权利要求45-54任一项的载体、权利要求55-63任一项的rAAV载体、权利要求65-72任一项的病毒颗粒、权利要求73-77任一项的rAAV颗粒或权利要求78或79的组合物施用至所述哺乳动物，其中所述RNAi靶向编码所述多肽的RNA。
81.用于抑制哺乳动物细胞中多肽积累的方法，其包括将权利要求1-37任一项的RNAi、权利要求39-44任一项的表达构建体、权利要求45-53任一项的载体、权利要求54-63任一项的rAAV载体、权利要求65-72任一项的病毒颗粒、权利要求73-77任一项的rAAV颗粒或权利要求78或79的组合物施用至所述哺乳动物，其中所述RNAi靶向编码所述多肽的RNA。
82.权利要求80或81的方法，其中所述哺乳动物是人。
83.权利要求1-37任一项的RNAi、权利要求39-44任一项的表达构建体、权利要求45-53任一项的载体、权利要求54-63任一项的rAAV载体、权利要求65-72任一项的病毒颗粒、权利要求73-77任一项的rAAV颗粒或权利要求78或79的组合物在制造用于在权利要求80-82任一项的方法中使用的药物中的用途。
84.权利要求1-37任一项的RNAi、权利要求39-44任一项的表达构建体、权利要求45-53任一项的载体、权利要求54-63任一项的rAAV载体、权利要求65-72任一项的病毒颗粒、权利要求73-77任一项的rAAV颗粒或权利要求78或79的组合物在用于权利要求80-82任一项的方法中的用途。
85.用于在哺乳动物中诱导RNA干扰的套盒，其包含权利要求1-37任一项的RNAi、权利要求39-44任一项的表达构建体、权利要求45-53任一项的载体、权利要求54-63任一项的rAAV载体、权利要求65-72任一项的病毒颗粒、权利要求73-77任一项的rAAV颗粒或权利要求78或79的组合物。
86.权利要求85的套盒，其中所述哺乳动物是人。
87.用于权利要求80-82任一项的方法中使用的套盒，其包含权利要求1-37任一项的RNAi、权利要求39-44任一项的表达构建体、权利要求45-53任一项的载体、权利要求54-63任一项的rAAV载体、权利要求65-72任一项的病毒颗粒、权利要求73-77任一项的rAAV颗粒或权利要求78或79的组合物。
88.包含第一链和第二链的RNAi，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:1)的指导区且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO:2)的非指导区，其中所述第一链和第二链形成双链体，且其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基形成非指导区中的凸出。
89.权利要求88的RNAi，其中所述指导区包含与SEQ ID NO:1具有约90％同一性的核酸序列。
90.权利要求88的RNAi，其中所述非指导区包含与SEQ ID NO:2具有约90％同一性的核酸序列。
91.权利要求88-90任一项的RNAi，其中改进所述序列以减少脱靶基因沉默。
92.权利要求88-91任一项的RNAi，其中序列包含一个或多个CpG基序。
93.权利要求88-92任一项的RNAi，其中所述序列在种子区中包含一个或多个CpG基序。
94.包含第一链和第二链的RNAi，其中所述第一链包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:15)的指导区且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO:16)的非指导区，其中所述第一链和第二链形成双链体且其中在所述第二链残基18或残基19处的A残基在非指导区中形成凸出。
95.包含第一链和第二链的RNAi，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:17)的指导区且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO:18)的非指导区，其中所述第一链和第二链形成双链体且其中在所述第二链残基18或残基19处的A残基在非指导区中形成凸出。
96.权利要求的RNAi，其中所述指导区包含与SEQ ID NO:15具有约90％同一性的核酸序列且所述非指导区包含与SEQ ID NO:16具有约90％同一性的核酸序列或所述指导区包含与SEQ ID NO:17具有约90％同一性的核酸序列且所述非指导区包含与SEQ ID NO:18具有约90％同一性的核酸序列。
97.权利要求88-96任一项的RNAi，其中在所述指导区残基11和12处的U残基在所述指导区中形成凸出。
98.权利要求88-97任一项的RNAi，其中所述双链体长度为19-25或19-23碱基对。
99.权利要求88-98任一项的RNAi，其中所述第一和/或第二链进一步包含3’悬垂区、5’悬垂区或3'和5’悬垂区两者。
100.权利要求88-99任一项的RNAi，其中所述第一链和所述第二链通过能够形成环结构的RNA接头连接。
101.权利要求100的RNAi，其中能够形成环结构的RNA接头包含4-50个核苷酸。
102.权利要求100或101的RNAi，其中能够形成环结构的RNA接头包含4-20个核苷酸。
103.权利要求100-102任一项的RNAi，其中能够形成环结构的RNA接头包含13个核苷酸。
104.权利要求88-103任一项的RNAi，其中所述RNAi包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
105.权利要求88-103任一项的RNAi，其中所述RNAi包含与SEQ ID NO:3的核苷酸序列约90％相同的核苷酸序列。
106.权利要求88-94任一项的RNAi，其中所述RNAi是小抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或小发夹RNA(shRNA)。
107.包含编码权利要求88-106任一项的RNAi的核酸的表达构建体。
108.权利要求107的表达构建体，其中编码所述RNAi的核酸包含miRNA支架。
109.权利要求108的表达构建体，其中编码所述RNAi的核酸包含miR-155支架。
110.权利要求107-109任一项的表达构建体，其中所述编码RNAi的核酸与启动子可操作地连接。
111.权利要求110的表达构建体，其中所述启动子能够在哺乳动物的脑中表达所述RNAi。
112.权利要求110或111的表达构建体，其中所述启动子选自下组：巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、CK6启动子、转甲状腺素启动子(TTR)、TK启动子、四环素反应性启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝脏特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-球蛋白启动子(CAG)启动子、延伸因子1-α启动子(EFl-α)启动子、人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、二氢叶酸还原酶启动子和13-肌动蛋白启动子。
113.权利要求110-112任一项的表达构建体，其中所述启动子是杂合鸡β-肌动蛋白启动子。
114.权利要求110-113任一项的表达构建体，其中所述表达构建体进一步包含多聚腺苷酸化信号。
115.权利要求114的表达构建体，其中所述多聚腺苷酸化信号是牛生长激素多聚腺苷酸化信号。
116.包含权利要求107-115任一项的表达构建体的载体。
117.权利要求116的载体，其中所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体、重组腺病毒载体、重组慢病毒载体或重组单纯疱疹病毒(HSV)载体。
118.权利要求117的载体，其中所述载体是重组腺病毒载体。
119.权利要求118的载体，其中所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或猪Ad 3型。
120.权利要求119的载体，其中所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2或腺病毒血清型5的变体。
121.权利要求117的载体，其中所述载体是重组慢病毒载体。
122.权利要求121的载体，其中所述重组慢病毒载体源自具有如下病毒假型的慢病毒：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病毒、RD114或其中的变体。
123.权利要求117的载体，其中所述载体是rHSV载体。
124.权利要求123的载体，其中所述rHSV载体源自rHSV-1或rHSV-2。
125.权利要求117的载体，其中所述载体是重组AAV(rAAV)载体。
126.权利要求125的rAAV载体，其中所述表达构建体侧翼为一个或多个AAV反向末端重复(ITR)序列。
127.权利要求126的rAAV载体，其中所述表达构建体侧翼为两个AAVITR。
128.权利要求126或127的rAAV载体，其中所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAVDJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。
129.权利要求125-128任一项的rAAV载体，其中所述AAV ITR是AAV2ITR。
130.权利要求129的rAAV载体，其中所述rAAV载体5’-3’包含AAV2 ITR、启动子、编码所述RNAi的核酸、多聚腺苷酸化信号和AAV2 ITR。
131.权利要求130的rAAV载体，其中所述启动子是CBA启动子。
132.权利要求130或131的rAAV载体，其中所述多聚腺苷酸化信号是牛生长激素多聚腺苷酸化信号。
133.权利要求130-132任一项的rAAV载体，其中所述rAAV载体5’-3’包含AAV2 ITR、CBA启动子、编码所述RNAi的核酸、牛生长激素多聚腺苷酸化信号和AAV2 ITR。
134.权利要求133的rAAV载体，其中所述载体进一步包含填充核酸。
135.权利要求133的rAAV载体，其中所述填充核酸包含编码绿色荧光蛋白(GFP)的核酸。
136.权利要求134或135的rAAV载体，其中所述填充核酸位于所述启动子和编码所述RNAi的核酸之间。
137.权利要求125-136任一项的rAAV载体，其中所述RNAi包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
138.权利要求125-136任一项的rAAV载体，其中所述RNAi包含与SEQ ID NO:3的核苷酸序列约90％相同的核苷酸序列。
139.权利要求125-138任一项的rAAV载体，其中所述载体是自身互补的载体。
140.权利要求139的rAAV载体，其中所述载体包含编码所述RNAi的第一核酸序列和编码所述RNAi的互补物的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可与所述第二核酸序列沿其长度的大部分或全部形成链内碱基对。
141.权利要求140的rAAV载体，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通过突变的AAV ITR连接，其中所述突变的AAV ITR包含D区的缺失并包含末端解析序列的突变。
142.包含权利要求116-124任一项的载体或权利要求125-141任一项的rAAV载体的细胞。
143.权利要求142的细胞，其中所述细胞是中枢神经系统(CNS)细胞。
144.包含权利要求116的载体的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是衣壳化rAAV载体的AAV颗粒、衣壳化所述重组腺病毒载体的腺病毒颗粒、衣壳化所述重组慢病毒载体的慢病毒颗粒或衣壳化所述重组HSV载体的HSV颗粒。
145.权利要求144的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是衣壳化所述重组腺病毒载体的腺病毒颗粒。
146.权利要求145的病毒颗粒，其中所述腺病毒颗粒包含来自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或猪Ad 3型的衣壳。
147.权利要求146的病毒颗粒，其中所述腺病毒颗粒包含腺病毒血清型2衣壳或腺病毒血清型5衣壳的变体。
148.权利要求144的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是衣壳化所述重组慢病毒载体的慢病毒颗粒。
149.权利要求148的病毒颗粒，其中所述慢病毒颗粒包含具有如下病毒假型的衣壳：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病毒、RD114或其中的变体。
150.权利要求144的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是HSV颗粒。
151.权利要求150的病毒颗粒，其中所述HSV颗粒是rHSV-1颗粒或rHSV-2颗粒。
152.包含权利要求125-141任一项的rAAV载体的重组AAV颗粒。
153.权利要求141的rAAV颗粒，其中所述AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV2 V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣壳。
154.权利要求152或153的rAAV颗粒，其中所述rAAV病毒颗粒的衣壳和ITR源自相同的AAV血清型。
155.权利要求152或153的rAAV颗粒，其中所述rAAV病毒颗粒的衣壳和ITR源自不同的AAV血清型。
156.权利要求152-155任一项的rAAV颗粒，其中所述rAAV病毒颗粒包含AAV2衣壳。
157.权利要求156的rAAV颗粒，其中所述rAAV病毒颗粒包含AAV1衣壳，且其中所述载体包含AAV2 ITR。
158.包含权利要求144-151任一项的病毒颗粒和权利要求152-157任一项的rAAV颗粒的组合物。
159.权利要求158的组合物，其进一步包含药学上可接受的载剂。
160.用于治疗哺乳动物中亨廷顿病的方法，其包括将权利要求158或159的组合物施用至所述哺乳动物。
161.用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物中htt表达的方法，其包括将权利要求158或159的组合物施用至所述哺乳动物。
162.用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物的细胞中htt积累的方法，其包括将权利要求158或159的组合物施用至所述哺乳动物。
163.用于治疗哺乳动物中亨廷顿病的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ IDNO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。
164.用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物中htt表达的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。
165.用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物的细胞中htt积累的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:1)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO:2)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。
166.权利要求163-165任一项的方法，其中所述第一链包含与SEQ ID NO:1具有约90％同一性的核酸序列。
167.权利要求163-165任一项的方法，其中所述第二链包含与SEQ ID NO:2具有约90％同一性的核酸序列。
168.权利要求163-167任一项的方法，其中改进所述核酸以减少脱靶基因沉默。
169.权利要求163-168任一项的方法，其中所述核酸包含一个或多个CpG基序。
170.权利要求163-169任一项的方法，其中所述核酸在种子区中包含一个或多个CpG基序。
171.用于治疗哺乳动物中亨廷顿病的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ IDNO:15)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO:16)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。
172.用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物中htt表达的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:15)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO:16)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。
173.用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物的细胞中htt积累的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:15)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO:16)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。
174.权利要求171-173任一项的方法，其中所述第一链包含与SEQ ID NO:15具有约90％同一性的核酸序列但保持所述CpG基序。
175.权利要求171-174任一项的方法，其中所述第二链包含与SEQ ID NO:16具有约90％同一性的核酸序列但保持所述CpG基序。
176.用于治疗哺乳动物中亨廷顿病的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ IDNO:17)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO:18)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。
177.用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物中htt表达的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:17)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO:18)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。
178.用于抑制具有亨廷顿病的哺乳动物的细胞中htt积累的方法，其包括将包含第一链和第二链的RNAi施用至所述哺乳动物，其中所述第一链包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO:17)的第一核酸且所述第二链包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO:18)的第二核酸，其中在所述第二链的残基18或残基19处的A残基不与所述第一链中的残基形成碱基对。
179.权利要求176-178任一项的方法，其中所述第一链包含与SEQ ID NO:17具有约90％同一性的核酸序列但保持所述CpG基序。
180.权利要求176-179任一项的方法，其中所述第二链包含与SEQ ID NO:18具有约90％同一性的核酸序列但保持所述CpG基序。
181.权利要求163-180任一项的方法，其中在所述第一核酸残基11和12处的U残基不与所述第二链中的残基形成碱基对。
182.权利要求163-181任一项的方法，其中所述双链体长度为18-25碱基对。
183.权利要求163-182任一项的方法，其中所述第一和/或第二链进一步包含3’悬垂区、5’悬垂区或3'和5’悬垂区两者。
184.权利要求163-183任一项的方法，其中所述第一链和所述第二链通过能够形成环结构的RNA连接。
185.权利要求163-184任一项的方法，其中能够形成环结构的RNA包含4-50核苷酸或4-20核苷酸。
186.权利要求163-185任一项的方法，其中能够形成环结构的RNA包含13个核苷酸。
187.权利要求163-186任一项的方法，其中所述RNAi包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
188.权利要求163-187任一项的方法，其中所述RNAi包含与SEQ ID NO:3的核苷酸序列约90％相同的核苷酸序列。
189.权利要求163-188任一项的方法，其中所述RNAi的第一链在所述第二链的5’。
190.权利要求163-189任一项的方法，其中所述RNAi的第二链在所述第一链的5’。
191.权利要求163-166任一项的方法，其中所述RNAi在表达构建体上编码。
192.权利要求163-191任一项的方法，其中编码所述RNAi的核酸包含miRNA支架。
193.权利要求192的方法，其中所述miRNA支架是miR-155支架。
194.权利要求163-193任一项的方法，其中编码所述RNAi的核酸与启动子可操作地连接。
195.权利要求194的方法，其中所述启动子能够在哺乳动物的脑中表达所述RNAi。
196.权利要求195的方法，其中所述启动子选自下组：巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、CK6启动子、转甲状腺素启动子(TTR)、TK启动子、四环素反应性启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝脏特异性启动子(LSP)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-球蛋白(CAG)启动子、延伸因子1-α启动子(EFl-α)启动子和人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子。
197.权利要求194-196任一项的方法，其中所述启动子是杂合鸡β-肌动蛋白启动子。
198.权利要求167-173任一项的方法，其中所述表达构建体进一步包含多聚腺苷酸化信号。
199.权利要求174的方法，其中所述多聚腺苷酸化信号是牛生长激素多聚腺苷酸化信号。
200.权利要求191-199任一项的方法，其中所述表达构建体通过载体编码。
201.权利要求200的方法，其中所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体、重组腺病毒载体、重组慢病毒载体或重组单纯疱疹病毒(HSV)载体。
202.权利要求201的方法，其中所述载体是重组腺病毒载体。
203.权利要求202的方法，其中所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或猪Ad 3型。
204.权利要求203的方法，其中所述重组腺病毒载体源自腺病毒血清型2或腺病毒血清型5的变体。
205.权利要求201的方法，其中所述载体是重组慢病毒载体。
206.权利要求205的方法，其中所述重组慢病毒载体源自具有如下病毒假型的慢病毒：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病毒、RD114或其中的变体。
207.权利要求201的方法，其中所述载体是rHSV载体。
208.权利要求207的方法，其中所述rHSV载体源自rHSV-1或rHSV-2。
209.权利要求201的方法，其中所述载体是重组AAV(rAAV)载体。
210.权利要求209的方法，其中所述表达构建体侧翼为一个或多个AAV反向末端重复(ITR)序列。
211.权利要求210的方法，其中所述表达构建体侧翼为两个AAV ITR。
212.权利要求210或211的方法，其中所述AAV ITR为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAVDJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。
213.权利要求210-212任一项的方法，其中所述AAV ITR为AAV2 ITR。
214.权利要求213的方法，其中所述rAAV载体5’-3’包含AAV2 ITR、启动子、编码所述RNAi的核酸、多聚腺苷酸化信号和AAV2 ITR。
215.权利要求214的方法，其中所述启动子是CBA启动子。
216.权利要求214或215的方法，其中所述多聚腺苷酸化信号是牛生长激素多聚腺苷酸化信号。
217.权利要求213的方法，其中所述rAAV载体5’-3’包含AAV2 ITR、CBA启动子、编码所述RNAi的核酸、牛生长激素多聚腺苷酸化信号和AAV2 ITR。
218.权利要求217的方法，其中所述载体进一步包含填充核酸。
219.权利要求218的方法，其中所述填充核酸包含编码绿色荧光蛋白(GFP)的核酸。
220.权利要求218或219的方法，其中所述填充核酸位于启动子和编码所述RNAi的核酸之间。
221.权利要求214-220任一项的方法，其中所述RNAi包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
222.权利要求214-220任一项的方法，其中所述RNAi包含与SEQ ID NO:3的核苷酸序列约90％相同的核苷酸序列。
223.权利要求209-222任一项的方法，其中所述载体是自身互补的载体。
224.权利要求223的方法，其中所述载体包含编码所述RNAi的第一核酸序列和编码所述RNAi的互补物的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可与所述第二核酸序列沿其长度的大部分或全部形成链内碱基对。
225.权利要求224的方法，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通过突变的AAVITR连接，其中所述突变的AAV ITR包含D区的缺失并包含末端解析序列的突变。
226.权利要求200或201的方法，其中所述载体在rAAV颗粒中衣壳化、所述重组腺病毒载体在腺病毒颗粒中衣壳化、所述重组慢病毒载体在慢病毒颗粒中衣壳化或所述重组HSV载体在HSV中衣壳化。
227.权利要求226的方法，其中所述病毒颗粒是衣壳化所述重组腺病毒载体的腺病毒颗粒。
228.权利要求227的方法，其中所述腺病毒颗粒包含来自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或猪Ad 3型的衣壳。
229.权利要求228的方法，其中所述腺病毒颗粒包含腺病毒血清型2衣壳或腺病毒血清型5衣壳的变体。
230.权利要求226的方法，其中所述病毒颗粒是衣壳化所述重组慢病毒载体的慢病毒颗粒。
231.权利要求230的方法，其中所述慢病毒颗粒包含具有如下病毒假型的衣壳：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、罗斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病毒、RD114或其中的变体。
232.权利要求226的方法，其中所述病毒颗粒是HSV颗粒。
233.权利要求232的方法，其中所述HSV颗粒是rHSV-1颗粒或rHSV-2颗粒。
234.权利要求209-225任一项的方法，其中所述rAAV载体在重组AAV颗粒中衣壳化。
235.权利要求234的方法，其中所述AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV2 V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合体、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣壳。
236.权利要求234或235的方法，其中所述rAAV病毒颗粒的衣壳和ITR源自相同的AAV血清型。
237.权利要求234或235的方法，其中所述rAAV病毒颗粒的衣壳和ITR源自不同的AAV血清型。
238.权利要求234-235任一项的方法，其中所述rAAV病毒颗粒包含AAV2衣壳。
239.权利要求237的方法，其中所述rAAV病毒颗粒包含AAV1衣壳且其中所述载体包含AAV2 ITR。
240.权利要求226-239任一项的方法，其中权利要求226-233任一项的病毒颗粒或权利要求234-239任一项的rAAV颗粒在组合物中。
241.权利要求240的方法，其中所述组合物进一步包含药学上可接受的载剂。
242.权利要求86-106任一项的RNAi；权利要求96-104任一项的表达构建体；权利要求116-124任一项的载体；权利要求125-141任一项的rAAV载体；权利要求144-151任一项的病毒颗粒；权利要求152-157任一项的rAAV颗粒或权利要求158或159的组合物在制造用于权利要求160-241任一项的方法中的药物的用途。
243.权利要求86-106任一项的RNAi；权利要求107-115任一项的表达构建体；权利要求116-124任一项的载体；权利要求125-141任一项的rAAV载体；权利要求144-151任一项的病毒颗粒；权利要求152-157任一项的rAAV颗粒或权利要求158或159的组合物，其用于权利要求160-241任一项的方法。
244.用于在具有亨廷顿病的哺乳动物中诱导RNA干扰的套盒，其包含权利要求86-106任一项的RNAi；权利要求107-115任一项的表达构建体；权利要求116-124任一项的载体；权利要求125-141任一项的rAAV载体；权利要求144-151任一项的病毒颗粒；权利要求152-157任一项的rAAV颗粒或权利要求158或159的组合物。
245.权利要求244的套盒，其中所述哺乳动物是人。
246.用于权利要求160-241任一项的方法中、制造权利要求160-241任一项的方法中使用的药物的套盒，其包含权利要求86-106任一项的RNAi；权利要求107-115任一项的表达构建体；权利要求116-124任一项的载体；权利要求125-141任一项的rAAV载体；权利要求144-151任一项的病毒颗粒；权利要求152-157任一项的rAAV颗粒或权利要求158或159的组合物。
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