JP2021118740A - バリアントＲＮＡｉ - Google Patents

バリアントＲＮＡｉ Download PDF

Info

Publication number
JP2021118740A
JP2021118740A JP2021078464A JP2021078464A JP2021118740A JP 2021118740 A JP2021118740 A JP 2021118740A JP 2021078464 A JP2021078464 A JP 2021078464A JP 2021078464 A JP2021078464 A JP 2021078464A JP 2021118740 A JP2021118740 A JP 2021118740A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
rnai
vector
strand
promoter
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2021078464A
Other languages
English (en)
Other versions
JP7526710B2 (ja
Inventor
エム・リサ・スタネック
M Stanek Lisa
アダム・パレーモ
Palermo Adam
ブレンダ・リチャーズ
Richards Brenda
パブロ・セルジオ・サルディ
Pablo Sardi Sergio
キャサリン・オリオーダン
O'riordan Catherine
アントニウス・ソング
Song Antonius
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genzyme Corp
Original Assignee
Genzyme Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genzyme Corp filed Critical Genzyme Corp
Publication of JP2021118740A publication Critical patent/JP2021118740A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7526710B2 publication Critical patent/JP7526710B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/533—Physical structure partially self-complementary or closed having a mismatch or nick in at least one of the strands
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Abstract

【課題】ハンチントン病（ＨＤ）を処置するためのバリアントＲＮＡｉを提供する。【解決手段】ガイド配列を含有する第１の鎖および非ガイド配列を含む第２の鎖を包含するＲＮＡｉ分子であって、非ガイド配列は、ガイド配列のシード領域と反対側；例えば、切断配列の反対側にバルジを含有する、ＲＮＡｉ分子が提供される。一部の態様において、ハンチントン病を処置するためのＲＮＡｉを提供する。さらに、ＲＮＡｉを含有する、発現カセット、ベクター（例えば、ｒＡＡＶ、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルスの、および組換えＨＳＶベクター）、細胞、ウイルス粒子、および医薬組成物が提供される。さらに、例えば、ハンチントン病を処置するための、ＲＮＡｉの使用に関する方法およびキットが提供される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年２月１０日付けで出願された米国仮出願第６２／１１４，５７８号の優先権を主張し、その内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列リストの提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる：配列リストのコンピューター読み取り可能な形態（ＣＲＦ）（ファイル名：１５９７９２０１０１４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録された日付：２０１６年２月４日、サイズ：１１ＫＢ）。
本発明は、バリアントＲＮＡｉ分子に関する。一部の態様において、本発明は、ハンチントン病を処置するためのバリアントＲＮＡｉに関する。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、遺伝子の機能の基礎的な調査における遺伝子サイレンシングのための有用なツールであることが示されており、数々の疾患の発症と関連する遺伝子を抑制するための治療剤として大きな将来性を示す。本来、ＲＮＡｉによる遺伝子の制御は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）として公知の小型ＲＮＡを介して起こる（非特許文献１；非特許文献２）。マイクロＲＮＡは、多様な細胞プロセスの強力な制御因子として出現したものであり、ウイルスベクターによって送達されると、人工ｍｉＲＮＡが継続的に発現され、結果として標的遺伝子のロバストで持続的な抑制が起こる。ｍｉＲＮＡプロセシングに関与するメカニズムの解明により、科学者は、内因性細胞ＲＮＡｉの機構を取り入れて、人工ｍｉＲＮＡの使用により標的遺伝子産物の分解を方向付けることが可能になった（例えば、特許文献１および非特許文献３を参照）。
ＲＮＡｉの臨床開発の障害は、オフターゲットのサイレンシングの可能性であり、その場合、ＲＮＡｉのシード領域（典型的にはヌクレオチド１〜７または１〜８）が、非標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）中の配列と対合して、転写の不安定化を引き起こす。オフターゲットのサイレンシングを低減する試みとしては、起こり得るオフターゲットが最小である標的ｍＲＮＡに高い特異性を有する候補シード配列を同定するためのアルゴリズムの使用（非特許文献４）、およびＲＮＡｉのガイド領域中に内部のバルジを設置すること（非特許文献５）が挙げられる。
ＲＮＡｉは、ハンチントン病（ＨＤ）を処置するための治療物質として調査されてきた。ＨＤは、ハンチンチン遺伝子（ＨＴＴ）のエクソン１におけるＣＡＧリピートの拡大によって引き起こされる遺伝性神経変性疾患である。結果生じたＮ末端領域中のポリグルタミン鎖の伸長は、突然変異ハンチンチンタンパク質（ｍＨｔｔ）に毒性の機能獲得をもたらす。ＨＤの治療戦略としてｍＨｔｔ発現をサイレンシングする可能性は、最初に、条件付きのマウス疾患モデルで実証された（非特許文献６）。これらのマウスにおいてｍＨｔｔの発現が誘導されたら、病理学的および行動に関する異常が出現した。それに続くテトラサイクリン媒介によるｍＨｔｔ導入遺伝子の抑制が、これらの異常を元に戻したことから、ｍＨｔｔレベルを低減することで、ニューロン内のタンパク質のクリアランスメカニズムがｍＨｔｔによって誘発された変化を正常化することを可能にしたことが示される。したがって、ｍＨｔｔレベルを低減する治療戦略は、疾患の進行を止めて、ＨＤの症状を軽減する可能性がある。
米国付与前公報第２０１４／０１６３２１４号
Ａｍｂｒｏｓ、（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３１：３５０〜３５５ Ｋｒｏｌら、（２０１０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１１：５９７〜６１０ Ｄａｖｉｄｓｏｎら、（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８７３〜８７５ Ｂｏｕｄｒｅａｕ ＲＬら、（２０１２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１（１）：ｅ９ Ｔｅｒａｓａｗａら、（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ２０１１：１３１５７９ Ｙａｍａｍｏｔｏら、（２０００）Ｃｅｌｌ １０１：５７〜６６
一部の態様において、本発明は、第１の鎖および第２の鎖を含むＲＮＡｉであって、ａ）第１の鎖および第２の鎖は、二重鎖を形成し；ｂ）第１の鎖は、少なくとも１９塩基のガイド領域を含み、ガイド領域は、ガイド鎖の塩基１〜Ｎを含むシード領域を含み、Ｎ＝７またはＮ＝８であり；ｃ）第２の鎖は、少なくとも１１塩基（例えば、少なくとも１９塩基）の非ガイド領域を含み、非ガイド領域は、二重鎖中のガイド領域の塩基１〜（Ｎ＋２）のいずれか１つまたはそれ以上の反対側に、バルジ配列を含む、ＲＮＡｉを提供する。一部の実施形態において、Ｎ＝７であり、バルジは、ガイド領域の塩基１、２、３、４、５、６、７、８、または９の反対側にある。他の実施形態において、Ｎ＝８であり、バルジは、ガイド領域の塩基１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の反対側にある。一部の実施形態において、バルジは、ガイド領域の塩基１または塩基Ｎ＋２の反対側にある。
一部の態様において、本発明は、第１の鎖および第２の鎖を含むＲＮＡｉであって、ａ）第１の鎖および第２の鎖は、二重鎖を形成し；ｂ）第１の鎖は、少なくとも１１塩基（例えば、少なくとも１９塩基）のガイド領域を含み、ガイド領域は、ガイド鎖の塩基１〜Ｎを含むシード領域を含み、Ｎ＝７またはＮ＝８であり；ｃ）第２の鎖は、少なくとも１１塩基（例えば、少なくとも１９塩基）の非ガイド領域を含み、非ガイド領域は、二重鎖中のガイド領域の塩基１〜（Ｎ＋１）のいずれか１つまたはそれ以上の反対側に、バルジ配列を含む、ＲＮＡｉを提供する。一部の実施形態において、Ｎ＝７であり、バルジは、ガイド領域の塩基１、２、３、４、５、６、７、または８の反対側にある。他の実施形態において、Ｎ＝８であり、バルジは、ガイド領域の塩基１、２、３、４、５、６、７、８、または９の反対側にある。一部の実施形態において、バルジは、ガイド領域の塩基１または塩基Ｎ＋１の反対側にある。
一部の態様において、本発明は、第１の鎖および第２の鎖を含むＲＮＡｉであって、ａ）第１の鎖および第２の鎖は、二重鎖を形成し；ｂ）第１の鎖は、少なくとも１１塩基（例えば、少なくとも１９塩基）のガイド領域を含み、ガイド領域は、ガイド鎖の塩基１〜Ｎを含むシード領域を含み、Ｎ＝７またはＮ＝８であり；ｃ）第２の鎖は、少なくとも１１塩基（例えば、少なくとも１９塩基）の非ガイド領域を含み、非ガイド領域は、二重鎖中のガイド領域の塩基１〜Ｎのいずれか１つまたはそれ以上の反対側に、バルジ配列を含
む、ＲＮＡｉを提供する。一部の実施形態において、Ｎ＝７であり、バルジは、ガイド領域の塩基１、２、３、４、５、６または７の反対側にある。他の実施形態において、Ｎ＝８であり、バルジは、ガイド領域の塩基１、２、３、４、５、６、７または８の反対側にある。一部の実施形態において、バルジは、ガイド領域の塩基１または塩基Ｎの反対側にある。一部の実施形態において、バルジは、ガイド領域の塩基１の反対側にある。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、バルジは、ガイド領域における相補的な塩基が欠失した、二重鎖中の非ガイド鎖の１つまたはそれ以上の塩基によって形成され、バルジに、ガイド鎖と対合する塩基が隣接する。一部の実施形態において、バルジは、１〜１０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、バルジは、１〜３ヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、ＲＮＡｉは、第２のバルジを含み、第２のバルジは、シード領域の３’に配置された第１の鎖のガイド領域に配置されている。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、二重鎖は、１９〜２５または１９〜２３塩基対の長さである。一部の実施形態において、第１および／または第２の鎖は、３’オーバーハング領域、５’オーバーハング領域、または３’および５’オーバーハング領域の両方をさらに含む。一部の実施形態において、第１の鎖および第２の鎖は、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーによって連結されている。一部の実施形態において、ＲＮＡリンカーは、４〜５０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ループ構造は、４〜２０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、５’から３’へ、第２の鎖、ＲＮＡリンカー、および第１の鎖を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、５’から３’へ、第１の鎖、ＲＮＡリンカー、および第２の鎖を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。
上記の態様の一部の実施形態において、ＲＮＡｉのヌクレオチド配列は、オフターゲットの遺伝子サイレンシングを低減するように改善されている（例えば、遺伝子のサイレンシングを低減するように改善され、その場合、シード領域は、意図されないｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ中の配列と対合して、それらの転写物の翻訳の抑制および不安定化を指示する）。一部の実施形態において、核酸配列は、１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを含む。一部の実施形態において、核酸配列は、シード領域中に１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを含む。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、障害に関連するポリペプチドをコードするＲＮＡを標的化する。一部の実施形態において、障害は、ＣＮＳ障害である。一部の実施形態において、障害は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、ハンチントン病、てんかん、パーキンソン病、アルツハイマー病、卒中、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、大脳皮質基底核神経節変性症（ＣＢＧＤ）、前頭側頭認知症（ＦＴＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）または脳のがんである。一部の実施形態において、障害は、ハンチントン病である。さらなる実施形態において、ポリペプチドは、ハンチンチンである。よりさらなる実施形態において、ハンチンチンは、ハンチントン病に関連する突然変異を含む。一部の実施形態において、ガイド領域は、配列５’−ＵＡＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１）を含み、非ガイド領域は、配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号２）を含む。一部の実施形態において、ガイド領域は、配列５’−ＵＣＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１５）を含み、非ガイド領域は、配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＧＡＡ−３’（配列番号１６）を含む。一部の実施形態において、ガイド領域は、配列５’−ＵＡＧＡＣＧＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１７）を含み、非ガイド領域は、配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＣＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号１８）を含む。
一部の実施形態において、本発明は、ＲＮＡｉの毒性を低減する方法であって、ＲＮＡｉの非ガイド領域にバルジを導入して、本明細書に記載のＲＮＡｉを生成することを含む、方法を提供する。
一部の態様において、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉをコードする核酸を含む発現コンストラクトを提供する。一部の実施形態において、ＲＮＡｉをコードする核酸は、ｍｉＲＮＡ足場を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉをコードする核酸は、プロモーターに機能するように連結されている。一部の実施形態において、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ−アクチン／ウサギβ−グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、延長因子１−アルファプロモーター（ＥＦ１−アルファ）プロモーター、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、レトロウイルス性のラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および１３−アクチンプロモーターから選択される。一部の実施形態において、発現コンストラクトは、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナル、またはＨＳＶ ＴＫ ｐＡである。
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の発現コンストラクトを含むベクターを提供する。一部の実施形態において、ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、組換えアデノウイルスベクターである。一部の実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４〜３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄ、またはブタＡｄ３型から誘導される。一部の実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２またはアデノウイルス血清型５のバリアントから誘導される。他の実施形態において、ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。一部の実施形態において、組換えレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはそれらのバリアントで偽型化したレンチウイルスから誘導される。他の実施形態において、ベクターは、ｒＨＳＶベクターである。一部の実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ｒＨＳＶ−１またはｒＨＳＶ−２から誘導される。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉをコードする発現コンストラクトを含むｒＡＡＶベクターを提供する。一部の実施形態において、発現コンストラクトに、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する。一部の実施形態において、発現コンストラクトに、２つのＡＡ
ＶのＩＴＲが隣接する。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである。一部の実施形態において、ベクターは、スタッファー核酸（ｓｔｕｆｆｅｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）をさらに含む。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、プロモーターとＲＮＡｉをコードする核酸との間に配置されている。一部の実施形態において、ベクターは、自己相補的なｒＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、ＲＮＡｉをコードする第１の核酸配列およびＲＮＡｉの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる。一部の実施形態において、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の突然変異を含む。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）を含む細胞を提供する。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉをコードするベクターを含むウイルス粒子であって、ウイルス粒子は、ｒＡＡＶベクターをキャプシド化するＡＡＶ粒子、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド化するアデノウイルス粒子、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド化するレンチウイルス粒子、または組換えＨＳＶベクターをキャプシド化するＨＳＶ粒子である、ウイルス粒子を提供する。一部の実施形態において、ウイルス粒子は、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド化するアデノウイルス粒子である。一部の実施形態において、アデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４〜３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄ、またはブタＡｄ３型由来のキャプシドを含む。一部の実施形態において、アデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２のキャプシドまたはアデノウイルス血清型５のキャプシドのバリアントを含む。他の実施形態において、ウイルス粒子は、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド化するレンチウイルス粒子である。一部の実施形態において、レンチウイルス粒子は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはそれらのバリアントで偽型化したキャプシドを含む。他の実施形態において、ウイルス粒子は、ＨＳＶ粒子である。一部の実施形態において、ＨＳＶ粒子は、ｒＨＳＶ−１粒子またはｒＨＳＶ−２粒子である。
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉをコードするｒＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシド
ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。一部の実施形態において、ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、同じＡＡＶ血清型から誘導される。他の実施
形態において、ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型から誘導される。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ２から誘導され、ｒＡＡＶ粒子のキャプシドは、ＡＡＶ１から誘導される。
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉをコードするベクターを含むウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）を含む組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む。
一部の態様において、本発明は、哺乳動物の疾患におけるポリペプチドの発現を阻害または低減するための方法であって、本明細書に記載のＲＮＡｉ、発現コンストラクト、ベクター、ｒＡＡＶベクター、ウイルス粒子、ｒＡＡＶ粒子、または組成物を哺乳動物に投与することを含み、ＲＮＡｉは、ポリペプチドをコードするＲＮＡを標的化する、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、哺乳動物の細胞におけるポリペプチドの蓄積を阻害するための方法であって、本明細書に記載のＲＮＡｉ、発現コンストラクト、ベクター、ｒＡＡＶベクター、ウイルス粒子、ｒＡＡＶ粒子、または組成物を哺乳動物に投与することを含み、ＲＮＡｉは、ポリペプチドをコードするＲＮＡを標的化する、方法を提供する。一部の実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の方法のいずれかで使用するための医薬品の製造における、本明細書に記載のＲＮＡｉ、発現コンストラクト、ベクター、ｒＡＡＶベクター、ウイルス粒子、ｒＡＡＶ粒子、または組成物の使用を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の方法のいずれかで使用するための、本明細書に記載のＲＮＡｉ、発現コンストラクト、ベクター、ｒＡＡＶベクター、ウイルス粒子、ｒＡＡＶ粒子、または組成物を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉ、発現コンストラクト、ベクター、ｒＡＡＶベクター、ウイルス粒子、ｒＡＡＶ粒子、または組成物を含む、哺乳動物においてＲＮＡ干渉を誘導するためのキットを提供する。一部の実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかで使用するためである。
一部の態様において、本発明は、配列５’−ＵＡＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１）を含むガイド領域を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号２）を含む非ガイド領域を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉであって、第１の鎖および第２の鎖は、二重鎖を形成し、第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、非ガイド領域においてバルジを形成する、ＲＮＡｉを提供する。一部の実施形態において、ガイド領域は、配列番号１に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態において、非ガイド領域は、配列番号２に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態において、ガイド領域の残基１１および１２におけるＵ残基は、ガイド領域中でバルジを形成する。一部の実施形態において、二重鎖は、１９〜２５または１９〜２３塩基対の長さである。一部の実施形態において、第１および／または第２の鎖は、３’オーバーハング領域、５’オーバーハング領域、または３’および５’オーバーハング領域の両方をさらに含む。一部の実施形態において、第１の鎖および第２の鎖は、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーによって連結されている。一部の実施形態において、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーは、４〜５０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーは、４〜２０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーは、１３ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列番号３のヌクレオチド配列と約９０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ
）である。
上記の態様の一部の実施形態において、ＲＮＡｉの核酸配列は、オフターゲットの遺伝子サイレンシングを低減するように改善されている。一部の実施形態において、配列は、１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを含む。一部の実施形態において、配列は、シード領域中に１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列５’−ＵＣＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１５）を含むガイド領域を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＧＡＡ−３’（配列番号１６）を含む非ガイド領域を含み、第１の鎖および第２の鎖は、二重鎖を形成し、第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、非ガイド領域においてバルジを形成する。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列５’−ＵＡＧＡＣＧＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１７）を含むガイド領域を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＣＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号１８）を含む非ガイド領域を含み、第１の鎖および第２の鎖は、二重鎖を形成し、第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、非ガイド領域においてバルジを形成する。一部の実施形態において、ガイド領域は、配列番号１５に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含み、非ガイド領域は、配列番号１６に対して約９０％の同一性を有する核酸配列または配列番号１７に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含み、非ガイド領域は、配列番号１８に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態において、本発明は、上述したＲＮＡｉをコードする核酸を含む発現コンストラクトを提供する。一部の実施形態において、ＲＮＡｉをコードする核酸は、ｍｉＲＮＡ足場を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉをコードする核酸は、ｍｉＲ−１５５足場を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉをコードする核酸は、プロモーターに機能するように連結されている。一部の実施形態において、プロモーターは、哺乳動物の脳でＲＮＡｉを発現させることが可能である。一部の実施形態において、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ
ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ−アクチン／ウサギβ−グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、延長因子１−アルファプロモーター（ＥＦ１−アルファ）プロモーター、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、レトロウイルス性のラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および１３−アクチンプロモーターから選択される。一部の実施形態において、プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ−アクチンプロモーターである。一部の実施形態において、発現コンストラクトは、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルである。
一部の実施形態において、本発明は、上述したような発現コンストラクトを含むベクターを提供する。一部の実施形態において、ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ベクターである。一部の実施形態において、組換えアデノウイルスベクター。一部の実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４〜３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、
ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄ、またはブタＡｄ３型から誘導される。一部の実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２またはアデノウイルス血清型５のバリアントから誘導される。一部の実施形態において、ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。一部の実施形態において、組換えレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはそれらのバリアントで偽型化したレンチウイルスから誘導される。一部の実施形態において、ベクターは、ｒＨＳＶベクターである。一部の実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ｒＨＳＶ−１またはｒＨＳＶ−２から誘導される。
一部の実施形態において、本発明は、上述したＲＮＡｉをコードする発現コンストラクトを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。一部の実施形態において、発現コンストラクトに、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する。一部の実施形態において、発現コンストラクトに、２つのＡＡＶのＩＴＲが隣接する。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’へ、ＡＡＶ２のＩＴＲ、プロモーター、ＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶ２のＩＴＲを含む。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＢＡプロモーターである。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’へ、ＡＡＶ２のＩＴＲ、ＣＢＡプロモーター、ＲＮＡｉをコードする核酸、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶ２のＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ベクターは、スタッファー核酸をさらに含む。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、プロモーターとＲＮＡｉをコードする核酸との間に配置されている。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列番号３のヌクレオチド配列と約９０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ベクターは、自己相補的なベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、ＲＮＡｉをコードする第１の核酸配列およびＲＮＡｉの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる。一部の実施形態において、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む。
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のベクターまたはｒＡＡＶベクターを含む細胞を提供する。一部の実施形態において、細胞は、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞である。
一部の実施形態において、本発明は、上述したようなＲＮＡｉをコードするベクターを含むウイルス粒子であって、ウイルス粒子は、ｒＡＡＶベクターをキャプシド化するＡＡＶ粒子、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド化するアデノウイルス粒子、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド化するレンチウイルス粒子、または組換えＨＳＶベクターをキャプシド化するＨＳＶ粒子である、ウイルス粒子を提供する。一部の実施形態
において、ウイルス粒子は、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド化するアデノウイルス粒子である。一部の実施形態において、アデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４〜３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄ、またはブタＡｄ３型由来のキャプシドを含む。一部の実施形態において、アデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２のキャプシドまたはアデノウイルス血清型５のキャプシドのバリアントを含む。他の実施形態において、ウイルス粒子は、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド化するレンチウイルス粒子である。一部の実施形態において、レンチウイルス粒子は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはそれらのバリアントで偽型化したキャプシドを含む。他の実施形態において、ウイルス粒子は、ＨＳＶ粒子である。一部の実施形態において、ＨＳＶ粒子は、ｒＨＳＶ−１粒子またはｒＨＳＶ−２粒子である。
一部の実施形態において、本発明は、上述したようなＲＮＡｉをコードするｒＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシド ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。一部の実施形態において、ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、同じＡＡＶ血清型から誘導される。他の実施形態において、ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型から誘導される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ２キャプシドを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１キャプシドを含み、ベクターは、ＡＡＶ２のＩＴＲを含む。
一部の実施形態において、本発明は、上述したようなウイルス粒子またはｒＡＡＶ粒子を含む組成物を提供する。さらなる実施形態において、組成物は、医薬的に許容される担体を含む。一部の実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるハンチントン病を処置するための方法であって、組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ハンチントン病を有する哺乳動物におけるｈｔｔの発現を阻害するための方法であって、組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ハンチントン病を有する哺乳動物の細胞におけるｈｔｔの蓄積を阻害するための方法であって、組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法を提供する。
一部の態様において、本発明は、哺乳動物におけるハンチントン病を処置するための方法であって、配列５’−ＵＡＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号２）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、方法を提供する。一部の態様において、本発明は、ハンチントン病を有する哺乳動物におけるｈｔｔの発現を阻害するための方法であって、配列５’−ＵＡＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１）を含む第１の核
酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号２）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、方法を提供する。一部の態様において、本発明は、ハンチントン病を有する哺乳動物の細胞におけるｈｔｔの蓄積を阻害するための方法であって、配列５’−ＵＡＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号２）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、方法を提供する。
上記の方法の一部の実施形態において、ガイド領域は、配列番号１に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態において、非ガイド領域は、配列番号２に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態において、ガイド領域の残基１１および１２におけるＵ残基は、ガイド領域中でバルジを形成する。一部の実施形態において、二重鎖は、１９〜２５または１９〜２３塩基対の長さである。一部の実施形態において、第１および／または第２の鎖は、３’オーバーハング領域、５’オーバーハング領域、または３’および５’オーバーハング領域の両方をさらに含む。一部の実施形態において、第１の鎖および第２の鎖は、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーによって連結されている。一部の実施形態において、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーは、４〜５０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーは、４〜２０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーは、１３ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列番号３のヌクレオチド配列と約９０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。
上記の方法の一部の実施形態において、核酸は、オフターゲットの遺伝子サイレンシングを低減するように改善されている。一部の実施形態において、核酸は、１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを含む。一部の実施形態において、核酸は、シード領域中に１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを含む。
一部の実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるハンチントン病を処置するための方法であって、配列５’−ＵＣＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１５）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＧＡＡ−３’（配列番号１６）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ハンチントン病を有する哺乳動物におけるｈｔｔの発現を阻害するための方法であって、配列５’−ＵＣＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１５）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＧＡＡ−３’（配列番号１６）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ハンチントン病を有する哺乳動物の細胞におけるｈｔｔの蓄積を阻害するための方法であって、配列５’−ＵＣＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１５）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＧＡＡ−３’（配列番号１６）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に
投与することを含み、第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、方法を提供する。一部の実施形態において、第１の鎖は、配列番号１５に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含むが、ＣｐＧモチーフを維持する。一部の実施形態において、第２の鎖は、配列番号１６に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含むが、ＣｐＧモチーフを維持する。
一部の実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるハンチントン病を処置するための方法であって、配列５’−ＵＡＧＡＣＧＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１７）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＣＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号１８）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ハンチントン病を有する哺乳動物におけるｈｔｔの発現を阻害するための方法であって、配列５’−ＵＡＧＡＣＧＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１７）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＣＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号１８）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ハンチントン病を有する哺乳動物の細胞におけるｈｔｔの蓄積を阻害するための方法であって、配列５’−ＵＡＧＡＣＧＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１７）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＣＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号１８）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、方法を提供する。一部の実施形態において、第１の鎖は、配列番号１７に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含むが、ＣｐＧモチーフを維持する。一部の実施形態において、第２の鎖は、配列番号１８に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含むが、ＣｐＧモチーフを維持する。
上記の方法の一部の実施形態において、上述したＲＮＡｉをコードする核酸を含む発現コンストラクト。一部の実施形態において、ＲＮＡｉをコードする核酸は、ｍｉＲＮＡ足場を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉをコードする核酸は、ｍｉＲ−１５５足場を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉをコードする核酸は、プロモーターに機能するように連結されている。一部の実施形態において、プロモーターは、哺乳動物の脳でＲＮＡｉを発現させることが可能である。一部の実施形態において、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ−アクチン／ウサギβ−グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、延長因子１−アルファプロモーター（ＥＦ１−アルファ）プロモーター、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、レトロウイルス性のラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および１３−アクチンプロモーターから選択される。一部の実施形態において、プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ−アクチンプロモーターである。一部の実施形態において、発現コンストラクトは、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルである。一部の実施形態において。
上記の方法の一部の実施形態において、上述したような発現コンストラクトを含むベクター。一部の実施形態において、ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ベクターである。一部の実施形態において、組換えアデノウイルスベクター。一部の実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４〜３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄ、またはブタＡｄ３型から誘導される。一部の実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２またはアデノウイルス血清型５のバリアントから誘導される。一部の実施形態において、ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。一部の実施形態において、組換えレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはそれらのバリアントで偽型化したレンチウイルスから誘導される。一部の実施形態において、ベクターは、ｒＨＳＶベクターである。一部の実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ｒＨＳＶ−１またはｒＨＳＶ−２から誘導される。
上記の方法の一部の実施形態において、上述したＲＮＡｉをコードする発現コンストラクトを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター。一部の実施形態において、発現コンストラクトに、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する。一部の実施形態において、発現コンストラクトに、２つのＡＡＶのＩＴＲが隣接する。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’へ、ＡＡＶ２のＩＴＲ、プロモーター、ＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶ２のＩＴＲを含む。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＢＡプロモーターである。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’へ、ＡＡＶ２のＩＴＲ、ＣＢＡプロモーター、ＲＮＡｉをコードする核酸、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶ２のＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ベクターは、スタッファー核酸をさらに含む。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、プロモーターとＲＮＡｉをコードする核酸との間に配置されている。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列番号３のヌクレオチド配列と約９０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ベクターは、自己相補的なベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、ＲＮＡｉをコードする第１の核酸配列およびＲＮＡｉの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる。一部の実施形態において、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む。
上記の方法の一部の実施形態において、上述したようなＲＮＡｉをコードするベクターを含むウイルス粒子であって、ウイルス粒子は、ｒＡＡＶベクターをキャプシド化するＡ
ＡＶ粒子、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド化するアデノウイルス粒子、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド化するレンチウイルス粒子、または組換えＨＳＶベクターをキャプシド化するＨＳＶ粒子である、ウイルス粒子。一部の実施形態において、ウイルス粒子は、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド化するアデノウイルス粒子である。一部の実施形態において、アデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４〜３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄ、またはブタＡｄ３型由来のキャプシドを含む。一部の実施形態において、アデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２のキャプシドまたはアデノウイルス血清型５のキャプシドのバリアントを含む。他の実施形態において、ウイルス粒子は、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド化するレンチウイルス粒子である。一部の実施形態において、レンチウイルス粒子は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはそれらのバリアントで偽型化したキャプシドを含む。他の実施形態において、ウイルス粒子は、ＨＳＶ粒子である。一部の実施形態において、ＨＳＶ粒子は、ｒＨＳＶ−１粒子またはｒＨＳＶ−２粒子である。
上記の方法の一部の実施形態において、上述したようなＲＮＡｉをコードするｒＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶ粒子。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシド ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。一部の実施形態において、ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、同じＡＡＶ血清型から誘導される。他の実施形態において、ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型から誘導される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ２キャプシドを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１キャプシドを含み、ベクターは、ＡＡＶ２のＩＴＲを含む。
上記の方法の一部の実施形態において、ウイルス粒子またはｒＡＡＶ粒子は、組成物の形態である。一部の実施形態において、組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む。
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のハンチントン病を処置するための方法のいずれかで使用するための医薬品の製造における、本明細書に記載のＲＮＡｉ、発現コンストラクト、ベクター、ｒＡＡＶベクター、ウイルス粒子、ｒＡＡＶ粒子、または組成物の使用を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のハンチントン病を処置するための方法のいずれかで使用するための、本明細書に記載のＲＮＡｉ、発現コンストラクト、ベクター、ｒＡＡＶベクター、ウイルス粒子、ｒＡＡＶ粒子、または組成物を提供する。一部の実施形態において、本発明は、哺乳動物においてハンチントン病を処置するためのＲＮＡ干渉を誘導するためのキットであって、本明細書に記載のＲＮＡｉ、発現コンストラクト、ベクター、ｒＡＡＶベクター、ウイルス粒子、ｒＡＡＶ粒子、または組成物を含む、キットを提供する。一部の実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかで使用するためである。
本明細書において引用された特許出願および公報を包含する全ての参考文献は、参照によってそれら全体が開示に組み入れられる。
図１ＡおよびＢは、インビトロにおけるＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔが媒介するＨｔｔレベルの低減を示す図である。（図１Ａ）ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔを生成するのに使用されたプレウイルスコンストラクトの略図。ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターの転写コントロール下でＨｔｔに対してＧＦＰおよびｍｉＲＮＡ配列を発現するようにプラスミドを設計した。ＩＴＲ、逆方向末端反復。ｅＧＦＰ、強化緑色蛍光タンパク質。ポリＡ、ウシ成長ホルモンのポリＡ。（図１Ｂ）ＡＡＶ−２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ処置の４８時間後のＨＥＫ２９３細胞におけるＨｔｔのｍＲＮＡレベルを評価する定量ＰＣＲ分析。ＰＰＩＡは、正規化の対照遺伝子として役立てた。値は平均±ＳＥＭとして示される。＊ｐ＜０．０５。 図２Ａ〜Ｄは、ＡＡＶ２／１−ｅＧＦＰ−ｍｉＲＮＡ−ＨｔｔベクターでＨＥＫ２９３細胞を感染させた後の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を実証する図である。（図２Ａ）ｅＧＦＰを含むＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリーの散乱プロファイル。前方光散乱Ａ（ＦＳＣ−Ａ）は、相対的な細胞サイズ、領域を表し、ＳＳＣ−Ａは、相対的な細胞の複雑さ、領域を表し、各ドットは１つの細胞を表す。（図２Ｂ）細胞のｅＧＦＰ蛍光強度の蛍光プロットであり、各色は、それぞれＧＦＰ−、ＧＦＰ＋、ＧＦＰ＋＋、またはＧＦＰ＋＋＋としてソートされた細胞の境界を定める。（図２Ｃ）ｅＧＦＰを発現するＨＥＫ２９３細胞のＦＡＣＳヒストグラム。（図２Ｄ）ＦＡＣＳソーティング後の細胞数の表。 図３Ａ〜Ｅは、ＹＡＣ１２８マウスにおけるＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ注射の線条体内注射後の拡大した線条体の形質導入およびＨｔｔの低減を示す図である。（図３Ａ）ｅＧＦＰを含む線条体細胞のフローサイトメトリーの散乱プロファイル。前方光散乱Ａ（ＦＳＣ−Ａ）は、相対的な細胞サイズ、領域を表し、ＳＳＣ−Ａは、相対的な細胞の複雑さ、領域を表し、各ドットは１つの細胞を表す。（図３Ｂ）ＦＳＣ−Ａ対ＦＩＴＣ−Ａ分析を使用したドットプロット。死細胞をソートして、ｅＧＦＰ＋およびｅＧＦＰ−細胞を選択した。これらの細胞によるＧＦＰ発現を評価し、定量し、図３Ｃに示した。（図３Ｃ）５３０／３０ＢＰフィルター５０５ＬＰを用いて収集されたｅＧＦＰ蛍光強度の蛍光プロット。（図３Ｄ）ＡＡＶ２／１−ｅＧＦＰ−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔの頭蓋内投与後の線条体全体にわたるｅＧＦＰ発現の拡大を示す蛍光顕微鏡検査法。（図３Ｅ）ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−ＨｔｔまたはＡＡＶ２／１−ヌル対照ベクターの注射の１および５カ月後の線条体におけるＨｔｔのｍＲＮＡレベルを評価する定量ＰＣＲ分析。ＰＰＩＡは、正規化の対照遺伝子として役立てた。値は平均±ＳＥＭとして示される。＊ｐ＜０．０５。ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔで処置したＹＡＣ１２８マウス（Ｎ＝８）は、処置後１および５カ月でＡＡＶ２／１−ヌルが注射されたマウスと比較した場合（Ｎ＝８／タイムポイント）、線条体中のＨｔｔのｍＲＮＡレベルのおよそ５０％の低減を示した。 ＹＡＣ１２８マウスにおけるＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ注射の線条体内注射後のマウスＨｔｔのｍＲＮＡの低減を示す図である。ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−ＨｔｔまたはＡＡＶ２／１−ヌル対照ベクターの注射の１および５カ月後の線条体における内因性マウスＨｔｔのｍＲＮＡレベルを評価する定量ＰＣＲ分析。ＰＰＩＡは、正規化の対照遺伝子として役立てた。値は平均±ＳＥＭとして示される。＊ｐ＜０．０５。 図５Ａ〜Ｉは、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−ＨｔｔによるＹＡＣ１２８マウスにおけるＨｔｔレベルの持続的な低下は、明白な神経炎症を引き起こさなかったことを実証する図である。（図５Ａ〜Ｃ）ＡＡＶ２／１−ヌルベクターを使用して処置されたＹＡＣ１２８マウス（図５Ａ）と比較した、ＡＡＶ−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ注射後１カ月（図５Ｂ）または５カ月（図５Ｃ）におけるＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔを使用して処置されたＹＡＣ１２８マウスからの線条体の組織断片のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色。（図５Ｄ〜Ｆ）ＡＡＶ２／１−ヌルベクターを使用して処置されたＹＡＣ１２８マウス（図５Ｄ）と比較した、ＡＡＶ−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ注射後１カ月（図５Ｅ）または５カ月（図５Ｆ）におけるＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔを使用して処置されたＹＡＣ１２８マウスからの線条体の組織断片のＧＦＡＰ免疫組織化学的染色。（図５Ｇ〜Ｉ）ＡＡＶ２／１−ヌルベクターを使用して処置されたＹＡＣ１２８マウス（図５Ｇ）と比較した、ＡＡＶ−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ注射後１カ月（図５Ｈ）または５カ月（図５Ｉ）におけるＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔを使用して処置されたＹＡＣ１２８マウスからの線条体の組織断片のＩｂａ−１免疫組織化学的染色。正確な比較のために全ての写真の露光量を一致させた。スケールバー：０．２５ｍｍ。 図５ＪおよびＫは、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−ＨｔｔによるＹＡＣ１２８マウスにおけるＨｔｔレベルの持続的な低下は、明白な神経炎症を引き起こさなかったことを実証する図である。（図５Ｊ）ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔの注射後の１または５カ月におけるＱＰＣＲによるＧＦＡＰのｍＲＮＡレベルの線条体のレベル。（図５Ｋ）ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔの注射後の１または５カ月におけるＱＰＣＲによるＩｂａ１のｍＲＮＡレベル。値は平均±ＳＥＭとして示される。＊ＡＡＶ２／１−ヌルマウスと有意に異なる、ｐ＜０．０５；ＡＮＯＶＡ。 図６Ａ〜Ｄは、ＹＡＣ１２８マウスにおけるＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔの線条体投与の行動の欠陥に対する作用を試験するための実験の設計を示す図である。（図６Ａ）実験のタイムラインの図解。２月齢のＹＡＣ１２８および野生型マウスに、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ（Ｎ＝８匹のＹＡＣおよびＮ＝８匹のＷＴ）またはＡＡＶ２／１−ヌル対照（Ｎ＝８匹のＹＡＣおよびＮ＝８匹のＷＴ）のいずれかを両側線条体に注射し、それぞれ４および５月齢でロータロッド試験およびポーソルト水泳試験に供した。５月齢で全てのマウスを殺し、次いで生化学および組織学的な分析のために組織を収集した。（図６Ｂ）処置後３カ月の線条体におけるｅＧＦＰ発現を示す蛍光顕微鏡法。ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ処置後３カ月のウェスタンブロットによるマウス（図６Ｃ）およびヒト（図６Ｄ）Ｈｔｔタンパク質レベル。 図６ＥおよびＦは、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔの線条体投与が、ＹＡＣ１２８マウスにおいて行動の欠陥を低減したことを実証する図である。（図６Ｅ）ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔの注射後の２カ月における促進ロータロッド試験。（図６Ｆ）ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔの注射後の３カ月のポーソルト水泳試験における静止したままの時間。値は平均±ＳＥＭとして示される。＊ＡＡＶ２／１−ヌルマウスと有意に異なる、ｐ＜０．０５；ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの事後検定。 図７ＡおよびＢは、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔを使用した処置が、ＹＡＣ１２８マウスにおいてＤＡＲＰＰ−３２およびＤ１受容体の転写調節異常を部分的に修正したことを示す図である。ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ（Ｎ＝８匹のＹＡＣおよびＮ＝８匹のＷＴ）またはＡＡＶ２／１−ヌル対照（Ｎ＝８匹のＹＡＣおよびＮ＝８匹のＷＴ）のいずれかの注射後の３カ月に、ＹＡＣ１２８および野生型マウスの線条体におけるＤＡＲＰＰ−３２およびＤ１受容体のｍＲＮＡレベルを、ＱＰＣＲによって査定した。（図７Ａ）ＡＡＶ２／１−ヌルまたはＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ処置後のＹＡＣ１２８およびＦＶＢ野生型同腹子マウスにおける線条体のＤＡＲＰＰ−３２のｍＲＮＡレベル。（図７Ｂ）ＡＡＶ２／１−ヌルまたはＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ処置後のＹＡＣ１２８およびＦＶＢ野生型同腹子マウスにおける線条体のＤ１受容体のｍＲＮＡレベル。値は平均±ＳＥＭとして示される。＊ＡＡＶ２／１−ヌルサンプルと有意に異なる、ｐ＜０．０５；ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの事後検定。 図８Ａ〜Ｄは、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔの頭蓋内投与が、運動障害を緩和し、老化したＹＡＣ１２８マウスの線条体における突然変異Ｈｔｔの凝集を低減することを示す図である。（図８Ａ）線条体における突然変異Ｈｔｔの凝集を示すＹＡＣ１２８マウス脳断片の免疫組織化学的染色。凝集は、６、９、１２（示されていない）および２４月齢のＹＡＣ１２８マウスで観察された。野生型マウスは、試験された全ての年齢において凝集を示さなかった。（図８Ｂ）老化したＹＡＣ１２８および野生型マウスにおけるＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−ＨＴＴを試験するための実験のタイムラインの図解。７月齢のマウスに、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ（Ｎ＝６匹のＹＡＣおよびＮ＝４匹のＷＴ）またはＡＡＶ２／１−ＧＦＰ対照（Ｎ＝６匹のＹＡＣおよびＮ＝４匹のＷＴ）を両側線条体内に注射し、次いで、１０月齢で行動試験に供した。注射後５カ月で（マウスが１２月齢になったとき）脳を回収した。（図８Ｃ）ＡＡＶ−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ注射後の３カ月のロータロッド試験における老化したＹＡＣ１２８マウスの性能。（図８Ｄ）処置後５カ月におけるＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−ＨｔｔまたはＡＡＶ２／１−ｅＧＦＯで処置したＹＡＣ１２８マウスの脳断片のＥＭ−４８免疫組織化学的分析。 図９ＡおよびＢは、本明細書に記載の実験に使用されたｓｈＲＮＡのステム配列における内部バルジを例示する図である。図９Ａに示される完全一致した配列（配列番号２３）と比較して、上記の実験で使用された配列は、シード配列の３’末端に追加のアデニンヌクレオチド（Ａ）を含有し（矢印で強調）、ガイド鎖に対応するチミンヌクレオチド（Ｔ）を有していなかった（配列番号２４）（図９Ｂ）。標的配列に相補的な配列を強調表示する。 元のＰＳ１７０ＸＡのｍｉＲＮＡ配列（配列番号１９）ならびに２つの改変された低オフターゲット型のＰＳ１７０ＸＡＬ１（配列番号２５）およびＰＳ１７０ＸＡＬ２（配列番号２６）を示す図である。 ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ １７０ＸＡＬ１および１７０ＸＡＬ２のＡＡＶのインビトロでＨｔｔにおいて低減を媒介する能力を示す図である。値は平均±ＳＥＭとして示される。 図１２Ａ〜Ｄは、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ １７０ＸＡＬ１および１７０ＸＡＬ２のＡＡＶの、ＹＡＣ１２８マウスの線条体におけるＨｔｔ発現をサイレンシングする能力を示す図である。図１２Ａおよび１２Ｃに、ヒトＨｔｔを示す。図１２Ｂおよび１２Ｄに、マウスＨｔｔを示す。ベータ−チューブリンは、全てのウェスタンブロットのための正規化の対照遺伝子として役立てた。＊未処置の対照マウスと有意に異なる、ｐ＜０．０５；ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの事後検定。 図１３Ａは、線条体におけるＧＦＡＰのｍＲＮＡレベルを示す図であり、図１３Ｂは、Ｉｂａ１のｍＲＮＡレベルを示す図である。ヒトＰＰＩＡは、正規化の対照遺伝子として役立てた。値は平均±ＳＥＭとして示される。＊未処置の対照マウスと有意に異なる、ｐ＜０．０５；ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの事後検定。 ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ １７０ＸＡＬ１またはＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ １７０ＸＡＬ２で処置されたＹＡＣ１２８マウスからの線条体の組織断片のＧＦＡＰおよびＩｂａ１の免疫組織化学的染色を示す図である。スケールバー＝５０μＭ。
一部の態様において、本発明は、改善されたＲＮＡｉ；例えば、治療用途のための改善されたＲＮＡｉを提供する。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、第１の鎖および第２の鎖を含み、ａ）第１の鎖および第２の鎖は、二重鎖を形成し；ｂ）第１の鎖は、少なくとも１１塩基のガイド領域を含み、ガイド領域は、ガイド鎖の塩基１〜Ｎを含むシード領域を含み、Ｎ＝７またはＮ＝８であり；ｃ）第２の鎖は、少なくとも１１塩基の非ガイド領域を含み、非ガイド領域は、二重鎖中のガイド領域の塩基１〜（Ｎ＋２）のいずれか１つまたはそれ以上の反対側に、バルジ配列を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、第１の鎖および第２の鎖を含み、ａ）第１の鎖および第２の鎖は、二重鎖を形成し；ｂ）第１の鎖は、少なくとも１０塩基のガイド領域を含み、ガイド領域は、ガイド鎖の塩基１〜Ｎを含むシード領域を含み、Ｎ＝７またはＮ＝８であり；ｃ）第２の鎖は、少なくとも１０塩基の非ガイド領域を含み、非ガイド領域は、二重鎖中のガイド領域の塩基１〜（Ｎ＋１）のいずれか１つまたはそれ以上の反対側に、バルジ配列を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、第１の鎖および第２の鎖を含み、ａ）第１の鎖および第２の鎖は
、二重鎖を形成し、ｂ）第１の鎖は、少なくとも９塩基のガイド領域を含み、ガイド領域は、ガイド鎖の塩基２〜７または２〜８を含むシード領域を含み、ｃ）第２の鎖は、少なくとも９塩基の非ガイド領域を含み、非ガイド領域は、二重鎖中のガイド領域の塩基１または塩基９の反対側に、バルジ配列を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、第１の鎖および第２の鎖を含み、ａ）第１の鎖および第２の鎖は、二重鎖を形成し、ｂ）第１の鎖は、少なくとも９塩基のガイド領域を含み、ガイド領域は、ガイド鎖の塩基２〜７または２〜８を含むシード領域を含み、ｃ）第２の鎖は、少なくとも９塩基の非ガイド領域を含み、非ガイド領域は、二重鎖中のガイド領域の塩基１の反対側に、バルジ配列を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、人工ＲＮＡｉである。
一部の態様において、本発明は、発現カセット、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス、またはＨＳＶベクター）、細胞、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス、またはＨＳＶウイルス粒子）、および本発明の開示のＲＮＡｉを含む医薬組成物を提供する。さらなる態様において、本発明は、哺乳動物における疾患または障害を処置するための方法であって、本発明の開示のＲＮＡｉを含む医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法を提供する。さらなる追加の態様において、本発明は、本発明の開示のＲＮＡｉを含むキットを提供する。
一部の態様において、本発明は、ハンチントン病を処置するためのＲＮＡｉを提供する。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列５’−ＵＡＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号２）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含み、第１の鎖および第２の鎖は、二重鎖を形成し、第２の鎖の配列番号２の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない。一部の態様において、本発明は、本発明の開示のＲＮＡｉを含む、発現カセット、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス、またはＨＳＶベクター）、細胞、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス、またはＨＳＶウイルス粒子）、および医薬組成物を提供する。さらなる態様において、本発明は、哺乳動物において、ハンチントン病を処置するため、細胞におけるｈｔｔの発現を阻害するため、およびｈｔｔの蓄積を阻害するための方法であって、本発明の開示のＲＮＡｉを含む医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法を提供する。よりさらなる態様において、本発明は、ハンチントン病を有する哺乳動物において、ハンチントン病を処置するため（例えば、ハンチントン病の症状を緩和するため）、ｈｔｔの発現を阻害するため、または細胞におけるｈｔｔの蓄積を阻害するための、本発明の開示のＲＮＡｉを含む医薬組成物の使用を提供する。さらなる追加の態様において、本発明は、本発明の開示のＲＮＡｉを含む、哺乳動物におけるハンチントン病を処置するためのキットを提供する。
Ｉ．一般的な技術
本明細書で記載または言及される技術および手順は、一般的によく認識され、当業者により従来の手法を使用して一般的に採用されており、このような手法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２０１２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙのシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、１９９５）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、１９８８）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎ
ｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、第６版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２０１０）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９３〜８）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９９６）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００２）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら、２００４）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）；およびＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、２０１１）に記載の広く利用されている手法である。
ＩＩ．定義
「ベクター」は、本明細書で使用される場合、インビトロまたはインビボのいずれかで宿主細胞に送達しようとする核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを指す。
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書で使用される場合、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかのあらゆる長さのヌクレオチドの多量体型を指す。したがって、この用語は、これらに限定されないが、一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマー、または他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を包含する。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基を含んでいてもよいし（典型的にＲＮＡまたはＤＮＡで見出されるように）、または修飾または置換された糖またはリン酸基を含んでいてもよい。代替として、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホロアミデートなどの合成サブユニットのポリマーを含んでいてもよく、したがってオリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミデート（Ｐ−ＮＨ２）または混成のホスホロアミデート−リン酸ジエステルオリゴマーであってもよい。加えて、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成して適切な条件下で鎖をアニーリングすること、または適切なプライマーでのＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖をデノボ合成することのいずれかによる、化学合成の一本鎖ポリヌ
クレオチド産物から得ることができる。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、同義的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指し、最小の長さに限定されない。このようなアミノ酸残基のポリマーは、天然または非天然のアミノ酸残基を含有していてもよく、そのようなものとしては、これらに限定されないが、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基の二量体、三量体、および多量体が挙げられる。全長タンパク質およびそれらのフラグメントはどちらも、この定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアル化、アセチル化、リン酸化なども包含する。さらに、本発明の目的に関して、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持しさえすれば、ネイティブの配列に対する修飾、例えば欠失、付加、および置換（一般的に保存的な性質を有するもの）を包含するタンパク質も指す。これらの修飾は、例えば部位特異的変異誘発を介して計画的であってもよいし、または例えばＰＣＲ増幅によりタンパク質またはエラーを生じる宿主の突然変異を介して偶発的であってもよい。
「組換えウイルスベクター」は、１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ウイルス由来ではない核酸配列）を含む組換えポリヌクレオチドベクターを指す。組換えＡＡＶベクターのケースにおいて、組換え核酸に、少なくとも１つの、実施形態においては２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する。
「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」は、少なくとも１つの、実施形態においては２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ＡＡＶ由来ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。このようなｒＡＡＶベクターは、好適なヘルパーウイルスに感染した（または好適なヘルパー機能を発現している）宿主細胞、ならびにＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわちＡＡＶのＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞中に存在する場合、複製して感染性のウイルス粒子にパッケージ化することができる。ｒＡＡＶベクターが、より大きいポリヌクレオチドに（例えば、染色体中、またはクローニングまたはトランスフェクションに使用されるプラスミドなどの別のベクター中に）取り込まれる場合、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージ化機能および好適なヘルパー機能の存在下で複製およびキャプシド化により「レスキュー」することができる「プロベクター」と称される場合もある。ｒＡＡＶベクターは、これらに限定されないが、脂質と複合体化した、リポソーム内にカプセル封入された、およびウイルス粒子、特にＡＡＶ粒子中にキャプシド化された、プラスミド、直鎖状人工染色体などの多数の形態のいずれかの形態であってもよい。ｒＡＡＶベクターは、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を生成するために、ＡＡＶウイルスのキャプシドにパッケージ化することができる。
「組換えアデノウイルスベクター」は、少なくとも１つのアデノウイルス逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、アデノウイルス由来ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。一部の実施形態において、組換え核酸に、２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する。このような組換えウイルスベクターは、組換えウイルスゲノムから欠失した必須のアデノウイルス遺伝子（例えば、Ｅ１遺伝子、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子など）を発現している宿主細胞中に存在する場合、複製して感染性のウイルス粒子にパッケージ化することができる。組換えウイルスベクターが、より大きいポリヌクレオチドに（例えば、染色体中、またはクローニングまたはトランスフェクションに使用されるプラスミドなどの別のベクター中に）取り込まれる場合、組換えウイルスベクターは、アデノウイルスパッケージ化機能の存在下で複製およびキャプシド化により「レスキュー」することができる「プロベクター」と称される場合もある。組換えウイルスベクターは、これらに限定されないが、脂質と複合体化した、リポソーム内にカプセル封入された、およびウイルス粒子、例えばアデノウイルス粒子
中にキャプシド化された、プラスミド、直鎖状人工染色体などの多数の形態のいずれかの形態であってもよい。組換えウイルスベクターは、「組換えアデノウイルス粒子」を生成するために、アデノウイルスウイルスのキャプシドにパッケージ化することができる。
「組換えレンチウイルスベクター」は、少なくとも１つのレンチウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）が隣接する１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、レンチウイルス由来ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。一部の実施形態において、組換え核酸に、２つのレンチウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）が隣接する。このような組換えウイルスベクターは、好適なヘルパー機能の影響を受けた宿主細胞中に存在する場合、複製して感染性のウイルス粒子にパッケージ化することができる。組換えレンチウイルスベクターは、「組換えレンチウイルス粒子」を生成するために、レンチウイルスのキャプシドにパッケージ化することができる。
「組換え単純ヘルペスベクター（組換えＨＳＶベクター）」は、ＨＳＶ末端反復配列が隣接する１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ＨＳＶ由来ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。このような組換えウイルスベクターは、好適なヘルパー機能の影響を受けた宿主細胞中に存在する場合、複製して感染性のウイルス粒子にパッケージ化することができる。組換えウイルスベクターが、より大きいポリヌクレオチドに（例えば、染色体中、またはクローニングまたはトランスフェクションに使用されるプラスミドなどの別のベクター中に）取り込まれる場合、組換えウイルスベクターは、ＨＳＶパッケージ化機能の存在下で複製およびキャプシド化により「レスキュー」することができる「プロベクター」と称される場合もある。組換えウイルスベクターは、これらに限定されないが、脂質と複合体化した、リポソーム内にカプセル封入された、およびウイルス粒子、例えばＨＳＶ粒子中にキャプシド化されたプラスミド、直鎖状人工染色体などの多数の形態のいずれかの形態であってもよい。組換えウイルスベクターは、「組換え単純ヘルペスウイルス粒子」を生成するために、ＨＳＶキャプシドにパッケージ化することができる。
「異種」は、比較されるかまたは導入されるかまたは取り込まれる物体の残部の遺伝子型と別個の遺伝子型を有する物体から誘導されたことを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって異なる細胞型に導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（発現される場合、異種ポリペプチドをコードすることができる）。同様に、ウイルスベクターに取り入れられる細胞性の配列（例えば、遺伝子またはそれらの一部）は、そのベクターに関して異種ヌクレオチド配列である。
用語「導入遺伝子」は、細胞に導入されて、ＲＮＡに転写させることができ、場合により適切な条件下で翻訳および／または発現させることができるポリヌクレオチドを指す。態様において、導入遺伝子は、それが導入される細胞に所望の特性を付与するか、またはそれ以外の方法で所望の治療または診断結果をもたらす。別の態様において、導入遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ干渉を媒介する分子に転写することができる。
「ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター」は、ニワトリβ−アクチン遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋのＥｎｔｒｅｚ遺伝子番号３９６５２６で示されるニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）ベータアクチン）から誘導されたポリヌクレオチド配列を指す。「ニワトリβ−アクチンプロモーター」は、本明細書で使用される場合、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントを含有するプロモーター、ニワトリβ−アクチン遺伝子のプロモーターならびに第１のエクソンおよびイントロン、ならびにウサギベータ−グロビン遺伝子のスプライスアクセプター、例えばＭｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．ら（１９８９）Ｇｅｎｅ ７９（２）：２６９〜７７に記載の配列を指す場合がある。用
語「ＣＡＧプロモーター」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用される場合がある。用語「ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーター」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用される場合がある。
用語「ゲノム粒子（ｇｐ）」、「ゲノム等価体」、または「ゲノムコピー」は、ウイルス力価への言及で使用される場合、感染力または機能性に関係なく、組換えＡＡＶのＤＮＡゲノムを含有するビリオンの数を指す。特定のベクター調製物中のゲノム粒子の数は、本明細書の実施例、または例えばＣｌａｒｋら（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０：１０３１〜１０３９；Ｖｅｌｄｗｉｊｋら（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、６：２７２〜２７８に記載されるような手順によって測定することができる。
用語「ベクターゲノム（ｖｇ）」は、本明細書で使用される場合、ベクター、例えばウイルスベクターの一連のポリヌクレオチド配列を含む１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを指す場合がある。ベクターゲノムは、ウイルス粒子中にキャプシド化されていてもよい。特定のウイルスベクターに応じて、ベクターゲノムは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、または一本鎖ＲＮＡ、もしくは二本鎖ＲＮＡを含んでいてもよい。ベクターゲノムは、特定のウイルスベクターに関連する内因性配列、および／または組換え技術を介して特定のウイルスベクターに挿入されたあらゆる異種配列を包含していてもよい。例えば、組換えＡＡＶベクターゲノムは、プロモーターの端にある少なくとも１つのＩＴＲ配列、スタッファー、目的の配列（例えば、ＲＮＡｉ）、およびポリアデニル化配列を包含していてもよい。完全なベクターゲノムは、ベクターのポリヌクレオチド配列の完全なセットを包含していてもよい。一部の実施形態において、ウイルスベクターの核酸の力価は、ｖｇ／ｍＬを単位として測定することができる。この力価を測定するのに好適な方法は、当業界において公知である（例えば、定量ＰＣＲ）。
用語「阻害する」は、本明細書で使用される場合、特定の標的の存在または活性をブロックする、低減する、消去する、またはそれ以外の方法で拮抗する作用を指す場合がある。阻害は、部分的な阻害または完全な阻害を指す場合がある。例えば、遺伝子の発現を阻害するとは、その遺伝子の発現の遮断、低減、消去、または他のあらゆる拮抗作用、例えばｍＲＮＡ量の低減（例えば、ｍＲＮＡ転写のサイレンシング）、ｍＲＮＡの分解、ｍＲＮＡ翻訳の阻害などを引き起こすあらゆる作用を指す場合がある。一部の実施形態において、ＨＴＴの発現を阻害するとは、ＨＴＴの発現の遮断、低減、消去、または他のあらゆる拮抗作用、例えばＨＴＴのｍＲＮＡ量の低減（例えば、ＨＴＴのｍＲＮＡ転写のサイレンシング）、ＨＴＴのｍＲＮＡの分解、ＨＴＴのｍＲＮＡ翻訳の阻害などを指す場合がある。別の例として、細胞中のタンパク質の蓄積を阻害するとは、そのタンパク質の発現の遮断、低減、消去、または他の拮抗作用、例えばｍＲＮＡ量の低減（例えば、ｍＲＮＡ転写のサイレンシング）、ｍＲＮＡの分解、ｍＲＮＡ翻訳の阻害、タンパク質の分解などを引き起こすあらゆる作用を指す場合がある。一部の実施形態において、細胞中のＨＴＴタンパク質の蓄積を阻害するとは、細胞中のＨＴＴタンパク質の発現の遮断、低減、消去、または他の拮抗作用、例えばＨＴＴのｍＲＮＡ量の低減（例えば、ＨＴＴのｍＲＮＡ転写のサイレンシング）、ＨＴＴのｍＲＮＡの分解、ＨＴＴのｍＲＮＡ翻訳の阻害、ＨＴＴタンパク質の分解などを指す。
用語「感染単位（ｉｕ）」、「感染性粒子」、または「複製単位」は、ウイルス力価への言及で使用される場合、例えばＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２：１９６３〜１９７３に記載されるような、複製中心のアッセイとしても公知の感染中心のアッセイによって測定した場合、感染性および複製能を有する組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。
用語「形質導入単位（ｔｕ）」は、ウイルス力価への言及で使用される場合、本明細書
の実施例、または例えばＸｉａｏら（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１４４：１１３〜１２４；またはＦｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０〜５３２（ＬＦＵアッセイ）に記載されるような機能アッセイで測定した場合、機能的な導入遺伝子産物の生産を引き起こす感染性の組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。
「逆方向末端反復」または「ＩＴＲ」配列は、当業界でよく理解されている用語であり、逆方向でウイルスゲノムの末端で見出される相対的に短い配列を指す。
「ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）」配列は、当業界でよく理解されている用語であり、ネイティブの一本鎖ＡＡＶゲノムの両方の末端に存在するおよそ１４５ヌクレオチドの配列である。ＩＴＲの最も外側の１２５ヌクレオチドは、異なるＡＡＶゲノム間および単一のＡＡＶゲノムの２つの末端の間に不均質性をもたらす２つの択一的な方向のいずれかに存在していてもよい。最も外側の１２５ヌクレオチドはまた、自己相補性を有する数種のより短い領域（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域と指定される）も含有し、それによりＩＴＲのこの部分内で鎖内の塩基対形成を起こすことが可能になる。
「末端分解配列」または「ｔｒｓ」は、ウイルスＤＮＡの複製中にＡＡＶのｒｅｐタンパク質によって切断されるＡＡＶのＩＴＲのＤ領域における配列である。突然変異末端分解配列は、ＡＡＶのｒｅｐタンパク質による切断に対して耐性を有する。
「ＡＡＶのヘルパー機能」は、ＡＡＶを宿主細胞により複製してパッケージ化することを可能にする機能を指す。ＡＡＶのヘルパー機能は、これらに限定されないが、ＡＡＶ複製およびパッケージ化に役立つヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス遺伝子などの多数の形態のいずれかで提供することができる。他のＡＡＶのヘルパー機能は、遺伝毒性物質などの分野において公知である。
ＡＡＶのための「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（これは、欠陥パルボウイルスである）を宿主細胞により複製してパッケージ化することを可能にするウイルスを指す。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶの複製を可能にする「ヘルパー機能」を提供する。このようなヘルパーウイルスが多数同定されており、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルス、例えばワクシニアおよびバキュロウイルスなどが挙げられる。アデノウイルスは、多数の異なるサブグループを包含するが、サブグループＣのアデノウイルス５型（Ａｄ５）が最も一般的に使用される。ヒト、ヒト以外の哺乳類および鳥類由来の数多くのアデノウイルスが公知であり、ＡＴＣＣなどの受託機関より入手可能である。ＡＴＣＣなどの受託機関より同様に入手可能なヘルペス科のウイルスとしては、例えば、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられる。ＡＡＶ複製に関するアデノウイルスのヘルパー機能の例としては、Ｅ１Ａ機能、Ｅ１Ｂ機能、Ｅ２Ａ機能、ＶＡ機能およびＥ４ｏｒｆ６機能が挙げられる。受託機関より入手可能なバキュロウイルスとしては、アウトグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）の核多角体病ウイルスが挙げられる。
ｒＡＡＶの調製は、感染性のＡＡＶ粒子と感染性のヘルパーウイルス粒子との比率が、少なくとも約１０２：１；少なくとも約１０４：１、少なくとも約１０６：１；または少なくとも約１０８：１であるかまたはそれより高い場合、ヘルパーウイルスを「実質的に含まない」と述べられる。一部の実施形態において、調製物も、それに相当する量のヘルパーウイルスタンパク質（すなわち、上記のヘルパーウイルス粒子の不純物が崩壊した形態で存在する場合、このようなレベルのヘルパーウイルスの結果として存在すると予想されるようなタンパク質）を含まない。ウイルスおよび／または細胞タンパク質の汚染は、ＳＤＳゲルにおけるクーマシー染色バンドの存在（例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質
ＶＰｌ、ＶＰ２およびＶＰ３に対応するバンド以外のバンドの出現）として一般的に観察することができる。
参照ポリペプチドまたは核酸配列に対する「パーセント（％）配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性が達成されるように配列を並べ、必要に応じてギャップを導入した後の、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない、参照ポリペプチドまたは核酸配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一な候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージと定義される。アミノ酸または核酸配列同一性のパーセントを決定する目的のためのアライメントは、当業界における能力の範囲内の様々な方法で、例えば、公共的に利用可能なコンピューターソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）、増刊３０、セクション７．７．１８、表７．７．１に記載されるもの、およびＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどを使用して達成することができる。好ましいアライメントプログラムは、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）である。当業者は、比較される配列の全長にわたり最大のアライメントを達成するのに必要なあらゆるアルゴリズムなど、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。本明細書に記載の目的のために、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（代替として、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する特定の％アミノ酸配列同一性を有するかまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと表すこともできる）は、以下のように計算される：１００×分数Ｘ／Ｙ（式中Ｘは、そのプログラムのＡおよびＢのアライメントにおいて、配列アライメントプログラムによって同一なマッチとスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性と等しくないと予想されることが理解される。本明細書に記載の目的のために、所与の核酸配列Ｄへの、それとの、またはそれに対する所与の核酸配列Ｃの％核酸配列同一性（代替として、所与の核酸配列Ｄへの、それとの、またはそれに対する特定の％核酸配列同一性を有するかまたは含む所与の核酸配列Ｃと表すこともできる）は、以下のように計算される：１００×分数Ｗ／Ｚ（式中Ｗは、そのプログラムのＣおよびＤのアライメントにおいて、配列アライメントプログラムによって同一なマッチとスコア付けされたヌクレオチドの数であり、Ｚは、Ｄ中のヌクレオチドの総数である）。核酸配列の長さＣが核酸配列Ｄの長さに等しくない場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性と等しくないと予想されることが理解される。
「単離された」分子（例えば、核酸またはタンパク質）または細胞は、それが、その天然の環境の要素から同定され分離および／または回収されていることを意味する。
「有効量」は、臨床結果などの（例えば、症状の緩和、臨床評価項目の達成などの）有益な、または所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回またはそれ以上の投与で投与することができる。病状の観点から、有効量は、疾患を緩和する、安定化する、またはその発症を遅延させるのに十分な量である。
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、これらに限定されないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられる。ある特定の実施形態において、個体または対象は、ヒトである。
「処置」は、本明細書で使用される場合、有益な、または所望の臨床結果を得るための
アプローチである。本発明の目的に関して、有益な、または所望の臨床結果としては、これらに限定されないが、検出可能かまたは検出不可能かにかかわらず、症状の軽減、疾患の程度の低減、疾患の安定化された（例えば、悪化しない）状況、疾患の拡大（例えば、転移）の予防、疾患進行の遅延または減速、病状の緩和または一時的緩和、および寛解（部分的かまたは完全化かどうかにかかわらず）が挙げられる。「処置」はまた、処置を受けない場合に予測される生存と比較した生存の延長を意味する場合もある。
用語「予防的処置」は、本明細書で使用される場合、個体が、障害を有するかまたは障害を有するリスクを有することがわかっているかまたはその疑いがあるが、障害の症状がないかまたは最小の症状を示す場合の処置を指す。予防的処置を受けている個体は、症状の発病の前に処置される。
「ハンチントン病（ＨＤ）」は、典型的にはＨＴＴ遺伝子（ａｋａハンチンチン、ＨＤまたはＩＴ１５）の突然変異によって引き起こされる進行性の脳障害を指す。ハンチントン病は、異常な動き（舞踏病と呼ばれる）、運動機能の段階的な損失、情緒的または精神医学的な疾患、および次第に損なわれていく認知力などの症状によって特徴付けることができる。ほとんどの症状は３０代および４０代で出現するが、疾患の若年型も観察されている。ＨＤのさらなる説明に関しては、ＯＭＩＭ登録番号１４３１００号を参照されたい。
「ハンチンチン（ＨＴＴ）」は、ハンチントン病のほとんどのケースと関連する遺伝子またはそれらのポリペプチド産物のどちらを指すこともできる。ハンチンチンの正常な機能は、十分に理解されていない。しかしながら、ハンチンチン遺伝子の突然変異は、ＨＤを引き起こすことが公知である。これらの突然変異は、典型的には常染色体優性に遺伝し、ＨＴＴ遺伝子におけるトリヌクレオチドＣＡＧリピートの拡大をもたらし、Ｈｔｔタンパク質においてポリグルタミン（ポリＱ）鎖を生じさせる。
「ＲＮＡｉ」は、本明細書で使用される場合、細胞においてＲＮＡ干渉を誘導するあらゆるＲＮＡ分子を指す場合がある。ＲＮＡｉの例としては、これらに限定されないが、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。
「ｍｉＲＮＡ足場」は、（ｉ）ＲＮＡｉによるノックダウンのための目的の遺伝子を標的化する二本鎖配列、および（ｉｉ）内因性ｍｉＲＮＡのものと類似したステム−ループ構造を形成する追加の配列を含有するポリヌクレオチドを指す場合がある。ＲＮＡｉのための目的の遺伝子を標的化する配列（例えば、短い、約２０ｎｔの配列）は、ｍｉＲＮＡ様のステム−ループを作り出す配列、およびポリヌクレオチドがｍｉＲＮＡ様の二次構造に組み立てられたときに、目的の配列と塩基対を形成して、二重鎖を形成する配列にライゲートすることができる。この二重鎖は、本明細書に記載される場合、不完全にハイブリダイズする、例えば、二重鎖は、１つまたはそれ以上の対合していないまたは誤って対合した塩基を含有していてもよい。このポリヌクレオチドがダイサーによって切断されると、この目的の遺伝子を標的化する配列を含有する二重鎖は、巻き戻されて、ＲＩＳＣ複合体に取り込まれる可能性がある。ｍｉＲＮＡ足場は、ｍｉＲＮＡそれ自体を指す場合もあるし、またはｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを指す場合もある。ｍｉＲＮＡ足場の例は、ｍｉＲ−１５５配列である（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２：７３５〜９）。ｍｉＲＮＡ足場に配列をクローニングするための市販のキットが当業界において公知である（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡからのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）Ｐｏｌ ＩＩ ｍｉＲ ＲＮＡｉ発現ベクターキット）。
「バルジ」は、本明細書で使用される場合、二重鎖核酸中のそれと反対側の核酸に非相補的な核酸の領域を指す。例えば、バルジは、二重鎖核酸中の反対側の核酸に非相補的な核酸配列であって、バルジに、二重鎖核酸中の反対側の核酸に相補的な核酸の領域が隣接するものを指す場合がある。一部の例において、バルジは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０塩基または１０塩基より長い長さのいずれかであり得る。一部の例において、バルジは、誤った対合の結果であってもよいし（例えば、反対側の鎖が非相補的な塩基を含有する）、またはバルジは、対合しないことの結果であってもよい（例えば、反対側の鎖は、バルジに隣接する核酸に相補的な核酸を含むが、反対側の鎖は、バルジと反対側の核酸を含有しない）。
本明細書で使用される場合、用語「センス」核酸は、導入遺伝子の全部または一部をコードする配列を含む核酸である。一部の例において、導入遺伝子の場合のｍＲＮＡは、センス核酸である。
「アンチセンス」核酸は、本明細書で使用される場合、「センス」核酸に相補的な核酸の配列である。例えば、アンチセンス核酸は、導入遺伝子をコードするｍＲＮＡに相補的であってもよい。
ＲＮＡｉの「ガイド領域」は、本明細書で使用される場合、典型的には相補性に基づいて、標的ｍＲＮＡと結合するＲＮＡｉの鎖である。相補性を有する領域は、ガイド領域の全部または一部を包含し得る。典型的には、相補性を有する領域は、少なくともシード領域を包含する。多くの場合において、ＲＮＡｉのアンチセンス領域は、ガイド領域である。
本明細書で使用される場合、ＲＮＡｉの「パッセンジャー領域」、または「非ガイド領域」は、本明細書では同義的に使用されており、ガイド領域に相補的なＲＮＡｉの領域である。多くの場合において、ＲＮＡｉのセンス領域は、パッセンジャー領域である。
ＲＮＡｉ（例えば、ｍｉＲＮＡ）の「シード領域」は、本明細書で使用される場合、マイクロＲＮＡの長さが約１〜８ヌクレオチドの領域である。一部の例において、その標的ｍＲＮＡのシード領域および３’−ＵＴＲは、ＲＮＡｉ認識における主要な決定要素であり得る。
「オフターゲットの遺伝子サイレンシング」は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡｉのシード領域と意図されないｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ中の配列との対合を指し、それらの転写物の翻訳の抑制および不安定化を指示する（例えば、意図されないｍＲＮＡの発現を低減する）。
本明細書における値またはパラメーターに「関して」という言及は、その値またはパラメーターそれ自体を対象とした実施形態を包含する（説明する）。例えば、「Ｘに関して」と言及されている説明は、「Ｘ」の説明を包含する。
単数形の冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、複数形の指示対象も包含する。
本明細書に記載の発明の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含む」、「からなる」、および／または「本質的にからなる」ことを包含することが理解される。
ＩＩＩ．ＲＮＡｉ
一部の態様において、本発明は、改善されたＲＮＡｉを提供する。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。低分子阻害性または干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、長さがおよそ１９〜２５（例えば、１９〜２３）塩基対の、細胞中でＲＮＡｉを誘導する二本鎖ＲＮＡ分子として当業界で公知である。小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、短いループ（例えば、約４〜１１ヌクレオチド）によって連結された二本鎖ＲＮＡのおよそ１９〜２５（例えば、１９〜２３）塩基対を含む、細胞中でＲＮＡｉを誘導するＲＮＡ分子として当業界で公知である。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ループによって連結された二本鎖ＲＮＡの短い（例えば、１９〜２５塩基対の）配列を含み、１つまたはそれ以上のバルジ（例えば、誤って対合したまたは対合していない塩基対）を含む二本鎖ＲＮＡの１つまたはそれ以上の追加の配列を含有する、細胞中でＲＮＡｉを誘導するＲＮＡ分子として当業界で公知である。用語「ｍｉＲＮＡ」は、本明細書で使用される場合、内因性ｍｉＲＮＡに加えて、外因性または異種ｍｉＲＮＡも包含する。一部の実施形態において、「ｍｉＲＮＡ」は、プリｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡを指す場合がある。ｍｉＲＮＡのプロセシング中に、プリｍｉＲＮＡの転写が起こる。プリｍｉＲＮＡは、ドローシャ−ＤＧＣＲ８によってプロセシングされて、５’フランキング領域、ガイド鎖、ループ領域、非ガイド鎖、および３’フランキング領域；または５’フランキング領域、非ガイド鎖、ループ領域、ガイド鎖、および３’フランキング領域を有するプレｍｉＲＮＡが残るように１つまたはそれ以上の配列を切り出すことによってプレｍｉＲＮＡが生産される。次いでプレｍｉＲＮＡは細胞質に運び出され、ダイサーによってプロセシングされて、ガイド鎖および非ガイド（またはパッセンジャー）鎖を有するｓｉＲＮＡが生じる。次いでガイド鎖は、ＲＩＳＣ複合体によって使用され、例えばガイド鎖に相補的な標的ＲＮＡ配列を認識することによって遺伝子サイレンシングを触媒する。ｍｉＲＮＡのさらなる説明は、例えば、ＷＯ２００８／１５０８９７で見出すことができる。ｍｉＲＮＡによる標的配列の認識は、主として、標的と、ｍｉＲＮＡのシード配列、例えばガイド鎖のヌクレオチド１〜８（５’から３’）との対合によって決定される（例えば、Ｂｏｕｄｒｅａｕ，Ｒ．Ｌ．ら（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：ｅ９を参照）。
プリ／プレｍｉＲＮＡ構造において、二重鎖中のガイド鎖：非ガイド鎖の境界は、部分的に相補的な塩基対形成（例えば、ワトソン−クリック塩基対形成）を介して形成される。しかしながら、一部の実施形態において、この相補的な塩基対形成は、二重鎖全体に及ばない。一部の実施形態において、境界中のバルジは、１つまたはそれ以上のヌクレオチド位置に存在し得る。用語「バルジ」は、本明細書で使用される場合、二重鎖中でそれと反対側の核酸に非相補的な核酸の領域を指す場合がある。一部の実施形態において、バルジは、中央の非相補的領域の領域は結合しないが、相補的核酸の領域が互いに結合するときに形成される。一部の実施形態において、バルジは、２つの相補的領域間に位置する核酸の２つの鎖が異なる長さを有する場合に形成される。後述するように、バルジは、１つまたはそれより多くのヌクレオチドであり得る。
ｍｉＲＮＡのプロセシング中に、ｍｉＲＮＡは、ガイド鎖：非ガイド鎖の境界に隣接する切断部位で切断されることにより、ガイドおよび非ガイド鎖のｓｉＲＮＡ二重鎖を放出する。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、切断部位に隣接するセンスまたはアンチセンス鎖中にバルジを含む。言い換えれば、一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、シード配列に隣接するガイドまたは非ガイド鎖中にバルジを含む。この位置におけるバルジは、図９Ｂに示される例示的な実施形態において、矢印で示される。
一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、成熟非ガイド鎖の５’切断部位と反対側のガイド鎖中に、バルジを含む。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、非ガイド鎖の５’
ヌクレオチドと反対側に、バルジを含む。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、成熟ガイド鎖の３’切断部位と反対側のセンス鎖中に、バルジを含む。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ガイド鎖の３’ヌクレオチドと反対側に、バルジを含む。
一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、第１の鎖および第２の鎖を含み、ａ）第１の鎖および第２の鎖は、二重鎖を形成し；ｂ）第１の鎖は、少なくとも１１塩基のガイド領域を含み、ガイド領域は、ガイド鎖の塩基１〜Ｎを含むシード領域を含み、Ｎ＝７またはＮ＝８であり；ｃ）第２の鎖は、少なくとも１１塩基の非ガイド領域を含み、非ガイド領域は、二重鎖中のガイド領域の塩基１〜（Ｎ＋２）のいずれか１つまたはそれ以上の反対側に、バルジ配列を含む。一部の実施形態において、Ｎ＝７であり、バルジは、ガイド領域の塩基１、２、３、４、５、６、７、８、または９の反対側にある。他の実施形態において、Ｎ＝８であり、バルジは、ガイド領域の塩基１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の反対側にある。
一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、第１の鎖および第２の鎖を含み、ａ）第１の鎖および第２の鎖は、二重鎖を形成し；ｂ）第１の鎖は、少なくとも１０塩基のガイド領域を含み、ガイド領域は、ガイド鎖の塩基１〜Ｎを含むシード領域を含み、Ｎ＝７またはＮ＝８であり；ｃ）第２の鎖は、少なくとも１０塩基の非ガイド領域を含み、非ガイド領域は、二重鎖中のガイド領域の塩基１〜（Ｎ＋１）のいずれか１つまたはそれ以上の反対側に、バルジ配列を含む。一部の実施形態において、Ｎ＝７であり、バルジは、ガイド領域の塩基１、２、３、４、５、６、７、または８の反対側にある。他の実施形態において、Ｎ＝８であり、バルジは、ガイド領域の塩基１、２、３、４、５、６、７、８、または９の反対側にある。
一部の実施形態において、非ガイド領域は、二重鎖中のガイド領域の塩基１〜Ｎのいずれか１つまたはそれ以上の反対側に、バルジ配列を含む。一部の実施形態において、Ｎ＝７であり、バルジは、ガイド領域の塩基１、２、３、４、５、６または７の反対側にある。他の実施形態において、Ｎ＝８であり、バルジは、ガイド領域の塩基１、２、３、４、５、６、７または８の反対側にある。
一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、第１の鎖および第２の鎖を含み、ａ）第１の鎖および第２の鎖は、二重鎖を形成し、ｂ）第１の鎖は、少なくとも９塩基のガイド領域を含み、ガイド領域は、ガイド鎖の塩基２〜７または２〜８を含むシード領域を含み、ｃ）第２の鎖は、少なくとも９塩基の非ガイド領域を含み、非ガイド領域は、二重鎖中のガイド領域の塩基１または塩基９の反対側に、バルジ配列を含む。
一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、第１の鎖および第２の鎖を含み、ａ）第１の鎖および第２の鎖は、二重鎖を形成し、ｂ）第１の鎖は、少なくとも９塩基のガイド領域を含み、ガイド領域は、ガイド鎖の塩基２〜７または２〜８を含むシード領域を含み、ｃ）第２の鎖は、少なくとも９塩基の非ガイド領域を含み、非ガイド領域は、二重鎖中のガイド領域の塩基１の反対側に、バルジ配列を含む。
一部の実施形態において、バルジは、ガイド領域における相補的な塩基が欠失した、二重鎖中の非ガイド鎖の１つまたはそれ以上の塩基によって形成され、バルジに、ガイド鎖と対合する塩基が隣接する。一部の実施形態において、バルジ配列は、約１〜１０ヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、バルジ配列は、約２〜１５ヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、バルジ配列は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、または約１５ヌクレオチドを有する。
ＲＮＡｉベースの療法の安全性は、意図されないｍＲＮＡに結合してそれらの発現を低減する低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の能力、すなわちオフターゲットの遺伝子サイレンシングとして公知の作用によって妨害される。オフターゲティングは、主として、シード領域（低分子ＲＮＡのヌクレオチド２〜８）が意図されないｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ中の配列と対合して、それらの転写物の翻訳の抑制および不安定化を指示するときに起こる。オフターゲティングが低減されたＲＮＡｉは、ガイドおよび非ガイド配列内の塩基を置換すること；例えばＣｐＧモチーフを作り出すことによって、設計することができる。より有意に低いオフターゲットスコアをもたらす可能性がある置換は、ＳｉＳＰＯＴＲアルゴリズム、すなわちオフターゲティングの可能性および有力なサイレンシング能力が最小の候補配列を同定する特異性に焦点を当てたｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムを使用して評価することができる（Ｂｏｕｄｒｅａｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３年１月；４１（１）ｅ９。ＳｉＳＰＯＴＲスコアの低減は、親のＲＮＡｉ分子比較してより少数の可能性のあるヒトのオフターゲットを有する配列を予測する。本発明の一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、オフターゲットの遺伝子サイレンシングを低減するように改善されている。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、シード領域中に１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを含む。
一部の実施形態において、第１の鎖および第２の鎖は、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡ（例えば、ＲＮＡリンカー）によって連結されている。一般的に当業界で公知のように、ＲＮＡループ構造（例えば、ステム−ループまたはヘアピン）は、ＲＮＡ分子が、一緒に塩基対を形成しないＲＮＡ配列によって隔てられた一緒に塩基対形成する２つのＲＮＡ配列を含む場合に形成される。例えば、配列ＡおよびＣが一緒に塩基対形成するようにそれらは相補的であるかまたは部分的に相補的であるが、配列Ｂ中の塩基は一緒に塩基対を形成しない場合、ＲＮＡ分子Ａ−Ｂ−Ｃでループ構造が形成される可能性がある。
一部の実施形態において、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡは、４〜５０ヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡは、１３ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ループを形成することが可能なＲＮＡ中のヌクレオチドの数は、４〜５０ヌクレオチドまたはその間のあらゆる整数である。一部の実施形態において、ループの０〜５０％が、ループの別の部分に相補的であってもよい。本明細書で使用される場合、用語「ループ構造」は、核酸の２つの相補鎖をつなぐ配列である。一部の実施形態において、ループ構造の１〜３ヌクレオチドは核酸の相補鎖に隣接しており、ループ構造の遠位部分の１〜３ヌクレオチドに相補的であってもよい。例えば、ループ構造の５’末端における３つのヌクレオチドは、ループ構造の３’末端における３つのヌクレオチドに相補的であってもよい。
一部の実施形態において、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸は、異種ｍｉＲＮＡ足場を含む。一部の実施形態において、異種ｍｉＲＮＡ足場の使用は、ｍｉＲＮＡ発現を調節する；例えば、ｍｉＲＮＡ発現を増加させる、またはｍｉＲＮＡ発現を減少させるために使用される。当業界において公知のあらゆるｍｉＲＮＡ足場を使用することができる。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡ足場は、ｍｉＲ−１５５足場から誘導される（例えば、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２：７３５〜９およびＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡからのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）Ｐｏｌ ＩＩ ｍｉＲ ＲＮＡｉ発現ベクターキットを参照）。
ＩＶ．ハンチントン病およびその実験モデル
ハンチントン病（ＨＤ）は、ハンチンチン遺伝子（ＨＴＴ）のエクソン１におけるＣＡ
Ｇリピートの拡大によって引き起こされる遺伝性神経変性疾患である。結果生じたＮ末端領域中のポリグルタミン鎖の伸長は、突然変異ハンチンチンタンパク質（ｍＨｔｔ）に毒性の機能獲得をもたらす。ｍＨｔｔの毒性は、不溶性ｍＨｔｔを含有する凝集体の形成、転写調節異常、およびタンパク質ホメオスタシスにおける不安定さに起因する可能性があり、これらは全て、ニューロンの死によって引き起こされる可能性がある（Ｓａｕｄｏｕら（１９９８）Ｃｅｌｌ、９５：５５〜６６；Ｚｕｃｃａｔｏら（２００３）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３５：７６〜８３；Ｓｃｈａｆｆａｒら（２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１５：９５〜１０５；Ｂｅｎｎら、（２００８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８：１０７２０〜１０７３３）。ＨＤを有する患者における病理学的所見としては、皮質が薄くなること、および線条体ニューロンの著しい進行性消失が挙げられる（Ｒｏｓａｓら、（２００２）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５８：６９５〜７０１）。疾患の発病は、典型的には、人生の３０代から４０代の間に起こり、症状としては、舞踏病に似た動き、協調の損失、進行性認知症、および他の精神医学的障害が挙げられる（Ｖｏｎｓａｔｔｅｌら、（１９８５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．４４：５５９〜５７７）。ほとんどの場合、症状は、３０歳から４０歳の間に、運動技能、認知、および人格の潜行性の崩壊を伴って出現し始める。時間が経つにつれて、これらは、ぎくしゃくしたコントロール不可能な動きおよび筋肉のコントロールの損失、認知症、ならびにうつ病などの精神医学的な疾患、攻撃性、不安、ならびに強迫行動に進む。典型的には、症状発病から１０〜１５年後に死に至る。ＨＤのケースの１０％未満は、より速い疾患の進行を特徴とする疾患の若年発症型を含む。米国人１０，０００人中およそ１人が、ＨＤを有すると考えられる。
ほぼ２０年にわたりＨＤの遺伝学的基礎が認識されるようになってきたが、現行の療法は主として緩和的なものであり、疾患の根本的な原因に対処していない。これは、この疾患の原因論は複雑であり、多種多様の細胞プロセスで有害作用が観察されているという事実に一部起因する可能性が高い。したがって、医薬開発の焦点は、主要な厄介な誘因、すなわち突然変異ＨＴＴ遺伝子それ自体に対処することに向けられてきた。
ＨＤのほとんどのケースは、ＨＴＴ遺伝子におけるトリヌクレオチドＣＡＧリピートの拡大に関連している。ＨＴＴ遺伝子におけるＣＡＧリピートの数は、ＨＤの症状発現と強く相関する。例えば、３５個またはそれ未満のリピートを有する個体は、典型的にはＨＤを発症しないが、２７〜３５個のリピートを有する個体は、子孫がＨＤを有するより高いリスクを有する。３６から４０〜４２個のリピートを有する個体は、ＨＤの不完全浸透を示し、それに対して４０〜４２個より多くのリピートを有する個体は、完全浸透を示す。若年発症ＨＤのケースは、６０またはそれより多くのＣＡＧリピートのサイズに関連する可能性がある。
このＣＡＧリピートの拡大の結果生じるポリＱが拡大したＨｔｔタンパク質は、細胞の凝集体または封入体、タンパク質ホメオスタシスにおける不安定さ、および転写調節異常と関連する。これらの毒性の表現型は体の数々の部分と関連し得るが、最も典型的には、これらはニューロン性細胞の死と関連する。ＨＤ患者は、皮質が薄くなること、および線条体ニューロンの著しい進行性消失を示すことが多い。線条体は、脳中のＨＤに対して最も弱い領域（特に線条体の中型有棘ニューロン）と考えられており、初期の作用は被殻および尾状核で見られる。ＨＤ患者の脳では、線条体の有棘ニューロンにおける細胞死、星状細胞数の増加、および小グリア細胞の活性化が観察されている。またＨＤは、海馬、大脳皮質、視床、視床下部、および小脳の特定の領域に影響を与える可能性もある。
Ｈｔｔ発現をブロックするための提唱されているアプローチとしては、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の使用に加えて、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または化学修飾された一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）のいずれかを使用するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が挙げられる（Ｈａｒｐｅｒら、（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ １０２：５８２０〜５８２５；ＤｉＦｉｇｌｉａら、（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０４：１７２０４〜１７２０９；Ｂｏｕｄｒｅａｕら、（２００９ｂ）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１０５３〜１０６３；Ｄｒｏｕｅｔら、（２００９）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．６５：２７６〜２８５；Ｓａｈら、（２０１１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２１：５００〜５０７；Ｍａｔｓｕｉら、（２０１２）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １７：４４３〜４５０；Ｙｕら、（２０１２）Ｃｅｌｌ
１５０：８９５〜９０８）。しかしながら、ＡＳＯアプローチを診療施設に転用することへの障害としては、ＡＳＯのＣＮＳへの繰り返しの長期にわたる点滴を容易にするためのデバイスを取り入れる必要があること、および大脳中の標的領域に薬物を適切に分布させる必要があることを挙げることができる。
これらの起こり得るＡＳＯに関する問題を回避するために、安全性の増加、効率の増加、およびより長く続く効能をもたらす可能性があるＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）のＡＡＶ媒介発現を採用することが有利な場合がある。ＨＤ患者は突然変異および野生型Ｈｔｔ対立遺伝子の両方を発現するため、ｓｉＲＮＡ標的配列の大部分は、両方の対立遺伝子を分解させる可能性が高いと予想される。しかしながら、ＨＤマウスにおける対立遺伝子特異的ではないＨｔｔサイレンシングは、十分許容されることが示されており、突然変異Ｈｔｔ単独を低減するのと同じ利益をもたらすことができる（Ｂｏｕｄｒｅａｕら、（２００９ｂ）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１０５３〜１０６３；Ｄｒｏｕｅｔら、（２００９）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．６５：２７６〜２８５；Ｋｏｒｄａｓｉｅｗｉｃｚら、（２０１２）Ｎｅｕｒｏｎ ７４（６）：１０３１〜１０４４）。さらに、ＡＡＶ媒介ＲＮＡｉ後の非ヒト霊長類の被殻における野生型Ｈｔｔの部分的および持続的な抑制は、いかなる不都合な作用も有さなかったことが報告されており、これは、成体の脳は、低下したレベルの野生型Ｈｔｔを許容できることを示唆する（ＭｃＢｒｉｄｅら、（２０１１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９：２１５２〜２１６２；Ｇｒｏｎｄｉｎら、（２０１２）Ｂｒａｉｎ １３５：１１９７〜１２０９）。
考えられる治療戦略、例えば本発明の開示の組成物および方法を試験するために、ＨＤの動物モデルを使用することができる。ＨＤのマウスモデルが当業界において公知である。そのようなものとしては、突然変異ＨＴＴのフラグメントを有するマウスモデル、例えばＲ６／１およびＮ１７１−８２Ｑ ＨＤマウスが挙げられる（Ｈａｒｐｅｒら、（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：５８２０〜５８２５、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｅｂｒｏｎら、（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：６１８〜６３３、Ｍａｃｈｉｄａら、（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４３：１９０〜１９７）。本明細書に記載のマウスＨＤモデルの別の例は、ＹＡＣ１２８マウスモデルである。このモデルは、１２８個のＣＡＧリピートを有する突然変異ヒトＨＴＴ遺伝子を発現する酵母人工染色体（ＹＡＣ）を有し、ＹＡＣ１２８マウスは、１２月齢までに線条体において顕著な広範にわたるＨｔｔ凝集体の蓄積を示す（Ｓｌｏｗら、（２００３）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：１５５５〜１５６７、Ｐｏｕｌａｄｉら、（２０１２）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２２１９〜２２３２）。
ＨＤの他の動物モデルも使用することができる。例えば、トランスジェニックラット（ｖｏｎ Ｈｏｒｓｔｅｎ，Ｓ．ら（２００３）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：６１７〜２４）およびアカゲザル（Ｙａｎｇ，Ｓ．Ｈ．ら（２００８）Ｎａｔｕｒｅ ４５３：９２１〜４）モデルが説明されている。非遺伝的モデルも公知である。これらは、ほとんどの場合、げっ歯類または非ヒト霊長類において線条体ニューロンの細胞死を誘導するための、興奮毒性の化合物（例えばキノリン酸またはカイニン酸）またはミトコンドリアの毒素（例えば３−ニトロプロピオン酸およびマロン酸）の使用を含む（さらなる説明および参考文献については、Ｒａｍａｓｗａｍｙ，Ｓ．ら（２００７）ＩＬＡＲ Ｊ．４８
：３５６〜７３を参照）。
Ｖ．ハンチントン病を処置するための方法
一部の態様において、本発明は、哺乳動物におけるハンチントン病を処置するための方法および組成物であって、本発明の開示の医薬組成物（例えば、本発明の開示のウイルス粒子を含む医薬組成物）を哺乳動物に投与することを含む、方法および組成物を提供する。一部の態様において、本発明は、ハンチントン病を有する哺乳動物におけるｈｔｔの発現を阻害するための方法および組成物であって、本発明の開示の医薬組成物（例えば、本発明の開示のウイルス粒子を含む医薬組成物）を哺乳動物に投与することを含む、方法および組成物を提供する。一部の態様において、本発明は、ハンチントン病を有する哺乳動物の細胞におけるｈｔｔの蓄積を阻害するための方法および組成物であって、本発明の開示の医薬組成物（例えば、本発明の開示のウイルス粒子を含む医薬組成物）を哺乳動物に投与することを含む、方法および組成物を提供する。
一部の態様において、本発明は、ＨＤの症状を緩和するための方法および組成物であって、本発明の開示のＲＮＡｉをコードするベクターを含む組換えウイルス粒子の有効量を哺乳動物の脳に投与することを含む、方法および組成物を提供する。一部の実施形態において、ＨＤの症状としては、これらに限定されないが、舞踏病、硬直、コントロール不可能な体の動き、筋肉コントロールの損失、協調運動障害、情動不安、眼球運動の遅延、異常な身振り、不安定さ、失調歩行、異常な顔の表情、言語障害、咀嚼および／または嚥下の困難さ、睡眠障害、発作、認知症、認知障害（例えば、計画、抽象的思考、柔軟性、ルール獲得、対人感受性、自己コントロール、注意力、学習、および記憶に関する能力の減退）、うつ病、不安、人格の変化、攻撃性、強制行動、強迫行動、性欲過剰、精神病、無感動、興奮性、自殺念慮、体重の減少、筋萎縮、心不全、グルコース耐性の低下、精巣萎縮、および骨粗鬆症が挙げられる。
一部の態様において、本発明は、ＨＤの進行を予防するかまたは遅延させる方法を提供する。常染色体優性のＨＤは、遺伝子型解析することが可能な遺伝病である。例えば、ＨＴＴ中のＣＡＧリピートの数は、ＰＣＲベースのリピートのサイジングによって決定することができる。このタイプの診断は、人生のあらゆる段階で、若い個体または成体を直接試験すること（例えば、臨床症状の出現に合わせて）、出生前スクリーニングまたは出生前除外の検査（例えば、絨毛膜絨毛のサンプリングまたは羊水穿刺によって）、または胎芽の着床前スクリーニングを介して実行することができる。そのようなものとして、本明細書に記載の方法は、症状の発現前に診断を行うことができるため、ＨＤの予防的処置として使用することができる。例えば、ＨＤを遺伝子検査（出生前検査、出生時検査など）によって診断し、症状の発現（例えば、ＣＮＳ細胞の損失）の前に予防的に処置して（例えば、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子を使用して）、ＨＤの症状の発現および／または進行を予防することができる。加えて、ＨＤは、脳を撮像して、尾状核および／もしくは被殻の縮小ならびに／または空洞の拡大を探すことによって診断することができる。これらの症状は、ＨＤの家族歴および／または臨床症状と組み合わせて、ＨＤを示す可能性がある。
ＨＤの症状の緩和を決定するための手段は、当業界において公知である。例えば、ハンチントン病統一評価尺度（Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ
Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ；ＵＨＤＲＳ）を使用して、運動機能、認知機能、行動異常、および機能的能力を評価することができる（例えば、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ （１９９６） Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ １１：１３６〜４２を参照）。この評価尺度は、ＨＤ日常生活動作尺度（ＨＤ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ
ａｎｄ Ｄａｉｌｙ Ｌｉｖｉｎｇ Ｓｃａｌｅ）、マースデンおよびクインの舞踏病重症度尺度（Ｍａｒｓｄｅｎ ａｎｄ Ｑｕｉｎｎ’ｓ ｃｈｏｒｅａ ｓｅｖｅｒｉｔ
ｙ ｓｃａｌｅ）、身体障害および自立性の尺度（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｓｃａｌｅ）、ＨＤ運動性評価尺度（ＨＤ ｍｏｔｏｒ ｒａｔｉｎｇ ｓｃａｌｅ；ＨＤＭＲＳ）、ＨＤ機能的能力尺度（ＨＤ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃａｐａｃｉｔｙ ｓｃａｌｅ；ＨＤＦＣＳ）、および定量的神経学的検査（ｑｕａｎｔｉｔａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｘａｍ；ＱＮＥ）などの試験からの要素を取り入れた、疾患の病理の様々な側面に関する一律の包括的試験を提供するために開発された。ＨＤの症状の緩和を決定するのに有用な他の試験としては、これらに限定されないが、モントリオール認知評価検査（Ｍｏｎｔｒｅａｌ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）、脳の撮像（例えば、ＭＲＩ）、カテゴリー流暢性検査（Ｃａｔｅｇｏｒｙ Ｆｌｕｅｎｃｙ Ｔｅｓｔ）、トレイルメイキングテスト、マップサーチ、ストループの文字読み取り検査（Ｓｔｒｏｏｐ Ｗｏｒｄ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｔｅｓｔ）、加速タッピング課題（Ｓｐｅｅｄｅｄ Ｔａｐｐｉｎｇ Ｔａｓｋ）、および符号数字モダリティー検査（Ｓｙｍｂｏｌ Ｄｉｇｉｔ Ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ Ｔｅｓｔ）を挙げることができる。
本発明の一部の態様において、本方法および本組成物は、ＨＤを有するヒトを処置するために使用される。上述したように、ＨＤは、常染色体優性の方式で遺伝し、ＨＴＴ遺伝子におけるＣＡＧリピートの拡大によって引き起こされる。若年発症ＨＤは、ほとんどの場合、父方から遺伝する。ハンチントン病様の表現型はまた、他の遺伝子座、例えばＨＤＬ１、ＰＲＮＰ、ＨＤＬ２、ＨＤＬ３、およびＨＤＬ４との相関も示されてきた。ＧＲＩＮ２Ａ、ＧＲＩＮ２Ｂ、ＭＳＸ１、ＧＲＩＫ２、およびＡＰＯＥ遺伝子における突然変異など、他の遺伝子座がＨＤの症状の発現を改変する可能性があると考えられる。
一部の態様において、本発明は、ハンチントン病を有する哺乳動物においてｈｔｔのｍＲＮＡを標的化するための改善されたＲＮＡｉを提供する。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列５’−ＵＡＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号２）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含み、第１の鎖および第２の鎖は、二重鎖を形成し、第２の鎖の配列番号２の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない。本明細書に記載のＲＮＡｉ（例えば、ｒＡＡＶベクターの一部として）は、とりわけハンチントン病の処置において用途を見出すことができる。
本発明の一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、オフターゲットの遺伝子サイレンシングを低減するように改善されている。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、シード領域中に１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを含む。
一部の実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるハンチントン病を処置するための方法であって、配列５’−ＵＣＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１５）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＧＡＡ−３’（配列番号１６）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ハンチントン病を有する哺乳動物におけるｈｔｔの発現を阻害するための方法であって、配列５’−ＵＣＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１５）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＧＡＡ−３’（配列番号１６）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、
ハンチントン病を有する哺乳動物の細胞におけるｈｔｔの蓄積を阻害するための方法であって、配列５’−ＵＣＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１５）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＧＡＡ−３’（配列番号１６）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、方法を提供する。一部の実施形態において、第１の鎖は、配列番号１５に対して、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のいずれかより高い同一性を有する核酸配列を含むが、ＣｐＧモチーフを維持する。一部の実施形態において、第２の鎖は、配列番号１６に対して、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のいずれかより高い同一性を有する核酸配列を含むが、ＣｐＧモチーフを維持する。
一部の実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるハンチントン病を処置するための方法であって、配列５’−ＵＡＧＡＣＧＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１７）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＣＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号１８）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ハンチントン病を有する哺乳動物におけるｈｔｔの発現を阻害するための方法であって、配列５’−ＵＡＧＡＣＧＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１７）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＣＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号１８）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ハンチントン病を有する哺乳動物の細胞におけるｈｔｔの蓄積を阻害するための方法であって、配列５’−ＵＡＧＡＣＧＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１７）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＣＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号１８）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、方法を提供する。一部の実施形態において、第１の鎖は、配列番号１７に対して、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のいずれかより高い同一性を有する核酸配列を含むが、ＣｐＧモチーフを維持する。一部の実施形態において、第２の鎖は、配列番号１８に対して、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のいずれかより高い同一性を有する核酸配列を含むが、ＣｐＧモチーフを維持する。
一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。低分子阻害性または干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、長さがおよそ１９〜２５（例えば、１９〜２３）塩基対の、細胞中でＲＮＡｉを誘導する二本鎖ＲＮＡ分子として当業界で公知である。小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、短いループ（例えば、約４〜１１ヌクレオチド）によって連結された二本鎖ＲＮＡのおよそ１９〜２５（例えば、１９〜２３）塩基対を含む、細胞中でＲＮＡｉを誘導するＲＮＡ分子として当業界で公知である。
一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、配列番号１と約９０％同一なガイド配列を含む。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、配列番号１に、約９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一、または１００％同一のいずれかであるガイド配列を含む。
一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、配列番号２と約９０％同一な非ガイド配列を
含む。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、配列番号２に、約９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一、または１００％同一のいずれかである非ガイド配列を含む。
一部の実施形態において、第１の核酸の配列番号１の残基１１および１２におけるＵ残基は、第２の鎖中の残基と塩基対を形成しない。一部の実施形態において、二重鎖は、１８〜２５塩基対の長さである。一部の実施形態において、第１および／または第２の鎖は、３’オーバーハング領域、５’オーバーハング領域、または３’および５’オーバーハング領域の両方をさらに含む。一部の実施形態において、本発明は、配列５’−ＵＡＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号２）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉならびにそれらの使用のための方法および組成物であって、第１の鎖および第２の鎖は二重鎖を形成し、配列番号２の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成せず、第１の核酸の配列番号１の残基１１および１２におけるＵ残基は、第２の鎖中の残基と塩基対を形成しない、ＲＮＡｉならびにそれらの使用のための方法および組成物を提供する。
一部の実施形態において、第１の鎖および第２の鎖は、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡによって連結されている。一般的に当業界で公知のように、ＲＮＡループ構造（例えば、ステム−ループまたはヘアピン）は、ＲＮＡ分子が、一緒に塩基対を形成しないＲＮＡ配列によって隔てられた一緒に塩基対形成する２つのＲＮＡ配列を含む場合に形成される。例えば、配列ＡおよびＣが一緒に塩基対形成するようにそれらは相補的であるかまたは部分的に相補的であるが、配列Ｂ中の塩基は一緒に塩基対を形成しない場合、ＲＮＡ分子Ａ−Ｂ−Ｃでのループ構造が形成される可能性がある。
一部の実施形態において、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡは、４〜５０ヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡは、１３ヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ベクターゲノムは、配列番号１３の配列に、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のいずれかであるヌクレオチド配列を含む。
一部の態様において、本発明は、配列５’−ＵＡＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号２）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを、哺乳動物（例えば、ＨＤを有する哺乳動物）に投与することを含む方法であって、配列番号２の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、方法を提供する。一部の実施形態において、第１の核酸の配列番号１の１１位および１２位におけるＵ残基は、第２の鎖の残基と塩基対を形成しない。一部の実施形態において、配列番号２の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成せず、第１の核酸の配列番号１の１１位および１２位におけるＵ残基は、第２の鎖の残基と塩基対を形成しない。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子は、ＲＮＡｉを含む。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子は、ｒＡＡＶベクターをキャプシド化するＡＡＶ粒子、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド化するアデノウイルス粒子、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド化するレンチウイルス粒子、または組換えＨＳＶベクターをキャプシド化するＨＳＶ粒子であり、ｒＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはＨＳＶベクターは、ＲＮＡｉをコードする。
一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の送達は、脳へのウイルス粒子の注射によってなされる。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の送達は、線条体へのウイルス粒子の注射によってなされる。線条体内投与は、高度にＨＤの影響を受けている脳、線条体（被殻および尾状核を包含する）の領域に、組換えウイルス粒子を送達することである。それに加えて、理論に縛られることは望まないが、線条体に注射された組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）は、これらに限定されないが、投射野（例えば、皮質）などの脳の他の領域に（例えば、逆行性輸送を介して）分散させることもできると考えられる。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子は、対流強化送達（例えば、線条体への対流強化送達）によって送達される。
一部の態様において、本発明は、哺乳動物におけるハンチントン病を処置するための方法であって、本発明の開示の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法を提供する。一部の態様において、本発明は、ハンチントン病を有する哺乳動物の細胞におけるｈｔｔの蓄積を阻害するための方法であって、本発明の開示の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法を提供する。一部の態様において、本発明は、ハンチントン病を有する哺乳動物におけるｈｔｔの発現を阻害するための方法であって、本発明の開示の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、ｈｔｔは、突然変異ｈｔｔ（例えば、３５個より多く、３６個より多く、３７個より多く、３８個より多く、３９個より多く、４０個より多く、４１個より多く、または４２個より多くのＣＡＧリピートを含むｈｔｔ）である。一部の実施形態において、野生型ｈｔｔの発現および／または蓄積も阻害される。本明細書に記載される場合、理論に縛られることは望まないが、ＨＤを有する哺乳動物における突然変異ｈｔｔの発現および／または蓄積の阻害は、大いに有益であるが、副作用（例えば、本発明の開示のＲＮＡｉの）としての同じ哺乳動物における野生型ｈｔｔの発現および／または蓄積の阻害は、十分許容される可能性がある（例えば、意図されない副作用をほとんどまたは全く引き起こさない）と考えられる。
一部の実施形態において、細胞は、ベクター（例えば、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする発現コンストラクトを含むベクター）を含む。一部の実施形態において、ベクターは、ｒＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ベクターである。一部の実施形態において、細胞は、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞である。
一部の実施形態において、本発明の開示のＲＮＡｉをコードするベクターを含む組換えウイルス粒子の有効量を投与することにより、投与部位かまたはその近くでニューロン（例えば、有棘ニューロンなどの線条体ニューロン）が形質導入される。一部の実施形態において、ニューロンの約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または１００％のいずれかより多くが形質導入される。一部の実施形態において、ニューロンの約５％〜約１００％、約１０％〜約５０％、約１０％〜約３０％、約２５％〜約７５％、約２５％〜約５０％、または約３０％〜約５０％が形質導入される。ｍｉＲＮＡを発現する組換えウイルス粒子が形質導入されたニューロンを同定する方法は、当業界において公知であり；例えば、免疫組織化学、ＲＮＡ検出（例えば、ｑＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＲＮＡ−ｓｅｑ、インサイチュハイブリダイゼーションなど）または強化緑色蛍光タンパク質などの共発現されたマーカーの使用が、発現を検出するのに使用することができる。
本発明の一部の実施形態において、本方法は、ＨＤを有する哺乳動物、例えばヒトを処置するための本発明の開示のＲＮＡｉをコードするベクターを含む組換えウイルス粒子の有効量を哺乳動物の脳に投与することを含む。一部の実施形態において、組成物は、脳中の１つまたはそれ以上の場所に注射されて、少なくともそのニューロン中で本発明の開示
のＲＮＡｉを発現させる。一部の実施形態において、組成物は、脳中の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のいずれか１つまたは１０個より多くの場所に注射される。一部の実施形態において、組成物は、線条体に注射される。一部の実施形態において、組成物は、背面の線条体に注射される。一部の実施形態において、組成物は、被殻に注射される。一部の実施形態において、組成物は、尾状核に注射される。一部の実施形態において、組成物は、被殻および尾状核に注射される。
一部の実施形態において、組換えウイルス粒子は、脳の一方の半球に投与される。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子は、脳の両方の半球に投与される。
一部の実施形態において、組換えウイルス粒子は、１つより多くの場所に同時または逐次的に投与される。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の複数回の注射は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、９時間、１２時間または２４時間以下の間隔があけられる。
一部の実施形態において、本発明は、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする組換えウイルスベクターを含む医薬組成物の有効量を投与して、突然変異ＨＴＴの活性を抑制することによる、ＨＤを有するヒトを処置するための方法を提供する。一部の実施形態において、医薬組成物は、１つまたはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤を含む。
一部の実施形態において、本方法は、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする組換えウイルスベクターを含む医薬組成物の有効量を投与して、突然変異ＨＴＴの活性を抑制することを含む。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルスの力価は、少なくとも約５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１０×１０１２、１１×１０１２、１５×１０１２、２０×１０１２、２５×１０１２、３０×１０１２、または５０×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルスの力価は、約５×１０１２〜６×１０１２、６×１０１２〜７×１０１２、７×１０１２〜８×１０１２、８×１０１２〜９×１０１２、９×１０１２〜１０×１０１２、１０×１０１２〜１１×１０１２、１１×１０１２〜１５×１０１２、１５×１０１２〜２０×１０１２、２０×１０１２〜２５×１０１２、２５×１０１２〜３０×１０１２、３０×１０１２〜５０×１０１２、または５０×１０１２〜１００×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルスの力価は、約５×１０１２〜１０×１０１２、１０×１０１２〜２５×１０１２、または２５×１０１２〜５０×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルスの力価は、少なくとも約５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１０×１０９、１１×１０９、１５×１０９、２０×１０９、２５×１０９、３０×１０９、または５０×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルスの力価は、約５×１０９〜６×１０９、６×１０９〜７×１０９、７×１０９〜８×１０９、８×１０９〜９×１０９、９×１０９〜１０×１０９、１０×１０９〜１１×１０９、１１×１０９〜１５×１０９、１５×１０９〜２０×１０９、２０×１０９〜２５×１０９、２５×１０９〜３０×１０９、３０×１０９〜５０×１０９または５０×１０９〜１００×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルスの力価は、約５×１０９〜１０×１０９、１０×１０９〜１５×１０９、１５×１０９〜２５×１０９、または２５×１０９〜５０×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルスの力価は、少なくとも約５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１０×１０１０、１１×１０１０、１５×１０１０、２０×１０１０、２５×１０１０、３０×
１０１０、４０×１０１０、または５０×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルスの力価は、少なくとも約５×１０１０〜６×１０１０、６×１０１０〜７×１０１０、７×１０１０〜８×１０１０、８×１０１０〜９×１０１０、９×１０１０〜１０×１０１０、１０×１０１０〜１１×１０１０、１１×１０１０〜１５×１０１０、１５×１０１０〜２０×１０１０、２０×１０１０〜２５×１０１０、２５×１０１０〜３０×１０１０、３０×１０１０〜４０×１０１０、４０×１０１０〜５０×１０１０、または５０×１０１０〜１００×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）のウイルスの力価は、少なくとも約５×１０１０〜１０×１０１０、１０×１０１０〜１５×１０１０、１５×１０１０〜２５×１０１０、または２５×１０１０〜５０×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。
一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、体重１ｋｇ当たり少なくとも約１×１０８〜約１×１０１３ゲノムコピーのいずれかである。一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、体重１ｋｇ当たり約１×１０８〜約１×１０１３ゲノムコピーのいずれかである。
一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の総量は、少なくとも約１×１０９〜約１×１０１４ゲノムコピーのいずれかである。一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の総量は、約１×１０９〜約１×１０１４ゲノムコピーのいずれかである。
本発明の一部の実施形態において、線条体に注射される組成物の体積は、約１μｌ、２μｌ、３μｌ、４μｌ、５μｌ、６μｌ、７μｌ、８μｌ、９μｌ、１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、５０μｌ、７５μｌ、１００μｌ、２００μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌ、もしくは１ｍＬのいずれか１つ、またはその間のいずれかの量より多くである。
一部の実施形態において、組成物の第１の体積が、脳の第１の領域に注射され、組成物の第２の体積が、脳の第２の領域に注射される。例えば、一部の実施形態において、組成物の第１の体積が、尾状核に注射され、組成物の第２の体積が、被殻に注射される。一部の実施形態において、組成物の１Ｘの体積が、尾状核に注射され、組成物の１．５Ｘ、２Ｘ、２．５Ｘ、３Ｘ、３．５Ｘ、または４Ｘの体積が、被殻に注射され、ここでＸは、約１μｌ、２μｌ、３μｌ、４μｌ、５μｌ、６μｌ、７μｌ、８μｌ、９μｌ、１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、５０μｌ、７５μｌ、１００μｌ、２００μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌ、もしくは１ｍＬのいずれか１つ、またはその間のいずれかの量より多くの体積である。
本発明の組成物（例えば、本発明の開示のＲＮＡｉをコードするベクターを含む組換えウイルス粒子）は、単独で、またはＨＤを処置するための１つまたはそれ以上の追加の治療剤と組み合わせてのいずれかで使用することができる。逐次的な投与間の間隔は、少なくとも数分、数時間、または数日（または代替としてそれ未満）の単位であってもよい。
Ｖ．ＲＮＡｉ発現コンストラクトおよびベクター
本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉの発現のための発現コンストラクト、ベクターおよびウイルス粒子を提供する。
一部の実施形態において、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸は、異種ｍｉＲＮＡ足場を含む。一部の実施形態において、異種ｍｉＲＮＡ足場の使用は、ｍｉＲＮＡ発現を調節する；例えば、ｍｉＲＮＡ発現を増加させるか、またはｍｉＲＮＡ発現を減少させ
るのに使用される。当業界において公知のあらゆるｍｉＲＮＡ足場を使用することができる。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡ足場は、ｍｉＲ−１５５足場から誘導される（例えば、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２：７３５〜９およびＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡからのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）Ｐｏｌ ＩＩ ｍｉＲ ＲＮＡｉ発現ベクターキットを参照）。一部の実施形態において、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸は、ｍｉＲＮＡ足場を含む。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡ足場は、配列番号１４によって提供される。
一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、障害に関連するポリペプチドをコードするＲＮＡを標的化する。一部の実施形態において、障害は、ＣＮＳ障害である。理論に縛られることは望まないが、ＲＮＡｉは、機能獲得が障害との関連が示されているポリペプチドの発現および／または活性を低減または消去するのに使用できると考えられる。本発明の治療用ポリペプチドまたは治療用核酸によって処置可能な本発明のＣＮＳ障害の非限定的な例（標的化または供給される可能性がある例示的な遺伝子は、各障害につきかっこ内に示される）としては、卒中（例えば、カスパーゼ−３、ベクリン１、Ａｓｋ１、ＰＡＲ１、ＨＩＦ１α、ＰＵＭＡ、および／またはＦｕｋｕｄａ，Ａ．Ｍ．およびＢａｄａｕｔ，Ｊ．（２０１３）Ｇｅｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ）４：４３５〜４５６に記載の遺伝子のいずれか）、ハンチントン病（突然変異ＨＴＴ）、てんかん（例えば、ＳＣＮ１Ａ、ＮＭＤＡＲ、ＡＤＫ、および／またはＢｏｉｓｏｎ，Ｄ．（２０１０）Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ ５１：１６５９〜１６６８に記載の遺伝子のいずれか）、パーキンソン病（アルファ−シヌクレイン）、ルー・ゲーリッグ病（筋萎縮性側索硬化症としても公知；ＳＯＤ１）、アルツハイマー病（タウ、アミロイド前駆タンパク質）、大脳皮質基底核変性症またはＣＢＤ（タウ）、大脳皮質基底核神経節変性症またはＣＢＧＤ（タウ）、前頭側頭認知症またはＦＴＤ（タウ）、進行性核上麻痺またはＰＳＰ（タウ）、多系統萎縮症またはＭＳＡ（アルファ−シヌクレイン）、脳のがん（例えば、脳がんに関与する突然変異または過剰発現した腫瘍遺伝子）、およびリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）が挙げられる。本発明の障害としては、皮質の大部分、例えば、皮質の１つより多くの機能的な領域、皮質の１つより多くの葉、および／または皮質全体に関与する障害が挙げられる。本発明の治療用ポリペプチドまたは治療用核酸によって処置可能な本発明の障害の他の非限定的な例としては、外傷性脳損傷、酵素の機能不全に関する障害、精神障害（心的外傷後ストレス症候群など）、神経変性疾患、および認識障害（認知症、自閉症、およびうつ病など）が挙げられる。酵素の機能不全に関する障害としては、これらに限定されないが、白質萎縮症（カナバン病など）および後述するリソソーム蓄積症のいずれかが挙げられる。
一部の実施形態において、導入遺伝子（例えば、本発明の開示のＲＮＡｉ）は、プロモーターに機能するように連結されている。例示的なプロモーターとしては、これらに限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターおよびＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ−アクチン／ウサギβ−グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター；Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ、１９９１、１０８（２）：１９３〜９）、ならびに延長因子１−アルファプロモーター（ＥＦ１−アルファ）プロモーター（Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ、１９９０、９１（２）：２１７〜２３およびＧｕｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９６、３（９）：８０２〜１０）が挙げられる。一部の実施形態において、プロモーターは、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターに連結
されたヒトβ−グルクロニダーゼプロモーターまたはサイトメガロウイルスエンハンサーを含む。プロモーターは、構成的、誘導性または抑制性プロモーターであってもよい。一部の実施形態において、本発明は、ＣＢＡプロモーターに機能するように連結した、本発明の開示の異種導入遺伝子をコードする核酸を含む組換えベクターを提供する。例示的なプロモーターおよび説明は、例えば、米国付与前公報第２０１４０３３５０５４号で見出すことができる。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、最小のＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＧＵＳＢプロモーターである。
構成的プロモーターの例としては、これらに限定されないが、レトロウイルス性のラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサーを有する）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１：５２１〜５３０（１９８５）を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、１３−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦｌａプロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が挙げられる。
誘導性プロモーターは、遺伝子発現の制御を可能にし、外因的に供給された化合物、温度などの環境要因、または具体的な生理学的条件の存在、例えば細胞の急性期、特定の分化状態によって制御される場合もあるし、または細胞の複製においてのみ制御される場合もある。誘導性プロモーターおよび誘導性の系は、これらに限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄなどの様々な商業的な供給源から入手可能である。他の多くの系が説明されており、当業者により容易に選択することができる。外因的に供給されたプロモーターによって制御される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６〜３３５１（１９９６））、テトラサイクリン抑制系（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７〜５５５１（１９９２））、テトラサイクリン誘導性の系（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６〜１７６９（１９９５）が挙げられる。Ｈａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２：５１２〜５１８（１９９８））、ＲＵ４８６誘導性の系（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：２３９〜２４３（１９９７）ならびにＷａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、４：４３２〜４４１（１９９７））およびラパマイシン誘導性の系（Ｍａｇａｒｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００：２８６５〜２８７２（１９９７））も参照されたい。この状況において有用な可能性があるよりさらに他のタイプの誘導性プロモーターは、具体的な生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態によって制御されるか、または細胞の複製においてのみ制御されるものである。
別の実施形態において、導入遺伝子にとってネイティブのプロモーター、またはそれらのフラグメントが使用されると予想される。導入遺伝子の発現がネイティブの発現を模擬することが望ましい場合、ネイティブのプロモーターが好ましい可能性がある。導入遺伝子の発現が、一時的もしくは発生的に、または組織特異的な方式で、または特異的な転写刺激に応答して制御されなければならない場合、ネイティブのプロモーターが使用される可能性がある。さらなる実施形態において、他のネイティブの発現コントロールエレメント、例えばエンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位またはコザックコンセンサス配列も、ネイティブの発現を模擬するのに使用することができる。
一部の実施形態において、制御配列は、組織特異的な遺伝子発現能をもたらす。一部のケースにおいて、組織特異的な制御配列は、組織特異的な方式で転写を誘導する組織特異
的な転写因子に結合する。このような組織特異的な制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）は当業界において周知である。例示的な組織特異的な制御配列としては、これらに限定されないが、以下の組織特異的なプロモーター：ニューロンの、例えばニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１３：５０３〜１５（１９９３））、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＩＤＳＡ、８８：５６１１〜５（１９９１））、およびニューロン特異的なｖｇｆ遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｎｅｕｒｏｎ、１５：３７３〜８４（１９９５））が挙げられる。一部の実施形態において、組織特異的なプロモーターは、ニューロン核（ＮｅｕＮ）、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、腺腫性結腸ポリポーシス（ＡＰＣ）、およびイオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ−１）から選択される遺伝子のプロモーターである。他の適切な組織特異的なプロモーターは、当業者に明らかであると予想される。一部の実施形態において、プロモーターは、ニワトリベータ−アクチンプロモーターである。
一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＮＳの細胞中で異種核酸を発現する。そのようなものとして、一部の実施形態において、本発明の治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、ＣＮＳの障害を処置するのに使用することができる。一部の実施形態において、プロモーターは、脳の細胞において異種核酸を発現する。脳の細胞は、これらに限定されないが、ニューロン（例えば感覚ニューロン、運動ニューロン、介在ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、中型有棘ニューロン、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、錐体ニューロンなど）、グリア細胞（例えば小グリア細胞、大グリア細胞、星状細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、放射状グリアなど）、脳実質細胞、小グリア細胞、上衣細胞（ｅｐｅｎｄｅｍａｌ ｃｅｌｌ）、および／またはプルキンエ細胞などの当業界において公知のあらゆる脳の細胞を指すことができる。一部の実施形態において、プロモーターは、ニューロンおよび／またはグリア細胞において異種核酸を発現する。一部の実施形態において、ニューロンは、尾状核の中型有棘ニューロン、被殻の中型有棘ニューロン、皮質第ＩＶ層のニューロンおよび／または皮質第Ｖ層のニューロンである。
ＣＮＳ細胞、脳の細胞、ニューロン、およびグリア細胞において転写物（例えば、異種導入遺伝子）を発現する様々なプロモーターは当業界において公知であり、本明細書で記載される。このようなプロモーターは、通常、選択された遺伝子または異種制御配列と連結された制御配列を含んでいてもよい。多くの場合、有用な異種制御配列としては、哺乳類またはウイルス遺伝子をコードする配列から誘導された配列が挙げられる。例としては、これらに限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳がんウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ前初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられる。加えて、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子から誘導された配列も使用することができる。このようなプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販されている。ＣＮＳ特異的なプロモーターおよび誘導性プロモーターを使用してもよい。ＣＮＳ特異的なプロモーターの例としては、これらに限定されないが、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、およびニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）などのＣＮＳ特異的な遺伝子から単離したプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、とりわけエクジソン、テトラサイクリン、メタロチオネイン、および低酸素に関するＤＮＡ応答エレメントが挙げられる。
本発明は、本明細書に記載されるＲＮＡｉをコードする１つまたはそれ以上の核酸配列を導入するため、またはＡＡＶウイルス粒子にパッケージ化するための組換えウイルスゲ
ノムの使用を予期する。組換えウイルスゲノムは、ＲＮＡｉの発現を確立するためのあらゆるエレメント、例えば、プロモーター、異種核酸、ＩＴＲ、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、イントロン、ポリＡシグナル、および／または複製起点を包含し得る。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、エンハンサー、スプライスドナー／スプライスアクセプター対、マトリックスアタッチメント部位、またはポリアデニル化シグナルの１つまたはそれ以上を含む。
一部の実施形態において、ＲＮＡｉをコードするベクターを含むｒＡＡＶ粒子の有効量を投与することにより、投与部位（例えば、線条体および／または皮質）かもしくはその近くで、または投与部位からより遠位で細胞（例えば、ＣＮＳ細胞、脳の細胞、ニューロン、および／またはグリア細胞）が形質導入される。一部の実施形態において、ニューロンの約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または１００％のいずれかより多くが形質導入される。一部の実施形態において、ニューロンの約５％〜約１００％、約１０％〜約５０％、約１０％〜約３０％、約２５％〜約７５％、約２５％〜約５０％、または約３０％〜約５０％が形質導入される。ｍｉＲＮＡを発現する組換えウイルス粒子によって形質導入されたニューロンを同定する方法は、当業界において公知であり；例えば、免疫組織化学、ＲＮＡ検出（例えば、ｑＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＲＮＡ−ｓｅｑ、インサイチュハイブリダイゼーションなど）または強化緑色蛍光タンパク質などの共発現されたマーカーの使用が、発現を検出するのに使用することができる。
一部の態様において、本発明は、組換え自己相補性ゲノム（例えば、自己相補的なｒＡＡＶベクター）を含むウイルス粒子を提供する。自己相補性ベクターゲノムを有するＡＡＶウイルス粒子および自己相補性ＡＡＶゲノムの使用方法は、米国特許第６，５９６，５３５号；７，１２５，７１７号；７，４６５，５８３号；７，７８５，８８８号；７，７９０，１５４号；７，８４６，７２９号；８，０９３，０５４号；および８，３６１，４５７号；ならびにＷａｎｇＺ．ら、（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：２１０５〜２１１１に記載されており、これらのそれぞれは、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。自己相補性ゲノムを含むｒＡＡＶは、その部分的に相補的な配列（例えば、異種核酸の相補的なコードおよび非コード鎖）によって二本鎖ＤＮＡ分子を迅速に形成すると予想される。一部の実施形態において、ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列およびその核酸の相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる。
一部の実施形態において、ＲＮＡｉをコードする第１の異種核酸配列およびＲＮＡｉの相補物をコードする第２の異種核酸配列は、突然変異ＩＴＲ（例えば、右のＩＴＲ）によって連結される。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ポリヌクレオチド配列５’−ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧ−３’（配列番号１２）を含む。突然変異ＩＴＲは、末端分解配列を含むＤ領域の欠失を含む。結果として、ＡＡＶウイルスゲノムの複製時に、ｒｅｐタンパク質は、突然変異ＩＴＲのところでウイルスゲノムを切断しないと予想され、そのようなものとして、以下のもの：ＡＡＶのＩＴＲ、制御配列を包含する第１の異種ポリヌクレオチド配列、突然変異したＡＡＶのＩＴＲ、第１の異種ポリヌクレオチドおよび第３のＡＡＶのＩＴＲと逆方向の第２の異種ポリヌクレオチドを、５’から３’の順で含む組換えウイルスゲノムが、ウイルスのキャプシド中にパッケージ化されると予想される。
ＶＩ．ウイルス粒子およびウイルス粒子を生産する方法
本発明は、とりわけ、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸を含む組換えウイルス
粒子、加えて、哺乳動物における疾患または障害；例えばハンチントン病を処置するためのそれらの使用方法を提供する。
ウイルス粒子
本発明は、本明細書で開示されるＲＮＡｉを含むウイルス粒子を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本明細書で開示される本発明のＲＮＡｉを送達するためのウイルス粒子を提供する。例えば、本発明は、哺乳動物において疾患または障害を処置するためのＲＮＡｉを送達するための、組換えウイルス粒子を使用する方法；例えば、ＨＤを処置するためのＲＮＡｉを含むｒＡＡＶ粒子を使用する方法を提供する。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子は、組換えＡＡＶ粒子である。一部の実施形態において、ウイルス粒子は、１または２つのＩＴＲが隣接する本発明の開示のＲＮＡｉの配列を含む核酸を含む組換えＡＡＶ粒子である。核酸は、ＡＡＶ粒子中にキャプシド化されている。またＡＡＶ粒子は、キャプシドタンパク質も含む。一部の実施形態において、核酸は、転写方向で構成要素に作動可能に連結された目的のコード配列（例えば、本発明の開示のＲＮＡｉの核酸）、転写開始および終結配列を包含する制御配列を含み、それにより発現カセットが形成される。発現カセットは、５’および３’末端に少なくとも１つの機能的なＡＡＶのＩＴＲ配列を有する。「機能的なＡＡＶのＩＴＲ配列」は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージ化を目的としたＩＴＲ配列機能を意味する。全て参照によってそれらの全体が本明細書に組み入れられる、Ｄａｖｉｄｓｏｎら、ＰＮＡＳ、２０００、９７（７）３４２８〜３２；Ｐａｓｓｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７７（１２）：７０３４〜４０；およびＰｅｃｈａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２００９、１６：１０〜１６を参照されたい。本発明の一部の態様を実施するために、組換えベクターは、少なくともキャプシド化に必須なＡＡＶの配列の全て、およびｒＡＡＶによる感染のための物理的構造を含む。本発明のベクターで使用するためのＡＡＶのＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有していなくてもよく（例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９４、５：７９３〜８０１で説明されている通り）、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更されてもよく、またはＡＡＶのＩＴＲは、数々のＡＡＶ血清型のいずれかからから誘導されてもよい。４０種を超えるＡＡＶ血清型がこれまでに知られており、新しい血清型および既存の血清型のバリアントが同定され続けている。Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００２、９９（１８）：１１８５４〜６；Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００３、１００（１０）：６０８１〜６；およびＢｏｓｓｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７７（１２）：６７９９〜８１０を参照されたい。あらゆるＡＡＶ血清型の使用が、本発明の範囲内であるとみなされる。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、これらに限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシド血清型ＩＴＲなどのＡＡＶ血清型から誘導されたベクターである。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシド血清型ＩＴＲなどのＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、本明細書に記載のＲＮＡｉをさらにコードする。例えば、ＡＡＶにおける核酸は、本明細書において予期されるあらゆるＡＡＶ血清型の少なくとも１つのＩＴＲを含んでいてもよく、第１の鎖および第２の鎖を含むＲＮＡｉをさらにコードしていてもよく、ａ）第１の鎖および第２の鎖は、二重鎖を形成し；ｂ）第１の鎖は、少なくとも１１塩基のガイド領域を含み、ガイド領域は、ガイド鎖の塩基１〜Ｎを含むシード領域を含み、Ｎ＝７またはＮ＝８であり；ｃ）第２の鎖は、少なくとも１１塩基の非ガイド領域を含み、非ガイド領域は、二重鎖中のガイド領域の塩基１〜（Ｎ＋２）のいずれか１つまたはそれ以上の反対側に、バルジ配列を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、配列５’−ＵＡ
ＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号２）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含んでいてもよい。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、５’から３’へ、以下：ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）、プロモーター、本明細書で開示されるＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル、ならびにＡＡＶのＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、５’から３’へ、以下：ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）、プロモーター、配列５’−ＵＡＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号２）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル、ならびにＡＡＶのＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、５’から３’へ、以下：ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）、ＣＢＡプロモーター、本明細書で開示されるＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモンのポリＡ）、ならびにＡＡＶのＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、５’から３’へ、以下：ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）、ＣＢＡプロモーター、配列５’−ＵＡＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号２）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモンのポリＡ）、およびＡＡＶのＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ）をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、第１の鎖および第２の鎖は二重鎖を形成し、第２の鎖の配列番号２の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない。一部の実施形態において、第１の鎖の配列番号１の残基１１および１２におけるＵ残基は、第２の鎖と塩基対を形成しない。一部の実施形態において、第２の鎖の配列番号２の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、第１の鎖中の残基と塩基対を形成せず、第１の鎖の配列番号１の残基１１および１２におけるＵ残基は、第２の鎖と塩基対を形成しない。
一部の実施形態において、ベクターは、スタッファー核酸を包含していてもよい。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、緑色蛍光タンパク質をコードしていてもよい。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、プロモーターとＲＮＡｉをコードする核酸との間に配置されていてもよい。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、ヒトアルファ−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）スタッファー配列またはＣ１６Ｐ１第１６染色体Ｐ１クローン（ヒトＣ１６）のスタッファー配列であり得る。
一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、配列番号１３の核酸を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、配列番号１３と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な核酸を含む。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２のキャプシドタンパク質、またはこれらのキャプシドタンパク質の突然変異体を含む。一部の実施形態において、突然変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶキャプシドを形成する能力を維持する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５チロシン突然変異キャプシドを含む（Ｚｈｏｎｇ Ｌ．ら、（２００８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５（２２）：７８２７〜７８３２）。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ〜ＦからのＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質を含む（Ｇａｏ、ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４、７８（１２）：６３８１）。
特定の標的細胞の形質導入を最適化するか、または特定の標的組織（例えば、罹患した組織）内の特異的な細胞型を標的化するのに、異なるＡＡＶ血清型が使用される。ｒＡＡＶ粒子は、同じ血清型または混成の血清型のウイルスタンパク質およびウイルス核酸を含んでいてもよい。例えば、一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ２のＩＴＲを含んでいてもよいし、またはｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ１のＩＴＲを含んでいてもよい。ｒＡＡＶ粒子生産のためのＡＡＶ血清型のあらゆる組合せが、本明細書に各組合せが明示的に述べられているものとして本明細書で提供される。一部の実施形態において、本発明は、ＡＡＶ１キャプシドおよび少なくとも１つのＡＡＶ２のＩＴＲが隣接する本発明の開示のｒＡＡＶベクター（例えば、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸を含む発現カセット）を含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ＡＡＶ２キャプシドを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。
一部の態様において、本発明は、組換え自己相補性ゲノムを含むウイルス粒子を提供する。自己相補性ゲノムを有するＡＡＶウイルス粒子および自己相補性ＡＡＶゲノムの使用方法は、米国特許第６，５９６，５３５号；７，１２５，７１７号；７，４６５，５８３号；７，７８５，８８８号；７，７９０，１５４号；７，８４６，７２９号；８，０９３，０５４号；および８，３６１，４５７号；ならびにＷａｎｇ Ｚ．ら、（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：２１０５〜２１１１に記載されており、これらのそれぞれは、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。自己相補性ゲノムを含むｒＡＡＶは、その部分的に相補的な配列（例えば、導入遺伝子の相補的なコードおよび非コード鎖）によって二本鎖ＤＮＡ分子を迅速に形成すると予想される。一部の実施形態において、本発明は、ＡＡＶゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子であって、ｒＡＡＶゲノムは、第１の異種ポリヌクレオチド配列（例えば、本発明の開示のＲＮＡｉ）および第２の異種ポリヌクレオチド配列（例えば、本発明の開示のＲＮＡｉのアンチセンス鎖）を含み、第１の異種ポリヌクレオチド配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２のポリヌクレオチド配列と鎖内の塩基対を形成することができる、ＡＡＶウイルス粒子を提供する。一部の実施形態において、第１の異種ポリヌクレオチド配列および第２の異種ポリヌクレオチド配列は、鎖内の塩基対形成を容易にする配列；例えば、ヘアピンＤＮＡ構造によって連結される。ヘアピン構造は、当業界において公知であり、例えばｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子である。一部の実施形態において、第１の異種ポリヌクレオチド配列および第２の異種ポリヌクレオチド配列は、突然変異ＩＴＲ（例えば、右のＩＴＲ）によって連結される。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ポリヌクレオチド配列５’−ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧ−３’（配列番号１２）を含む。突然変異ＩＴＲは、末端分解配列を含むＤ領域の欠失を含む。結果として、ＡＡＶウイルスゲノムの複製時に、ｒｅｐタンパク質は、突然変異ＩＴＲのところでウイルスゲノムを切断しないと予想され、そのようなものとして、以下のもの：ＡＡＶのＩＴＲ、制御配列を包含する第１の異種ポリヌクレオチド配列、突然変異したＡＡＶのＩＴＲ、第１の異種ポリヌクレオチドおよび第３のＡＡＶのＩＴＲと逆方向の第２の異種ポリヌクレオチドを、５’から３’の順で含む組換えウイルスゲノムが、ウイルスのキャプシド中にパッケージ化されると予想される。一部の実施形態において、本発明は、機能的なＡＡＶ２のＩＴＲ、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする第１のポリヌクレオチド配列、Ｄ領域の欠失を含み、機能的な末端分解配列が欠失した突然変異したＡＡＶ２のＩＴＲ、第１のポリヌクレオチド配列の本発明の開示のＲＮＡｉをコードする配列に相補的な配列を含む第２のポリヌクレオチド配列、および機能的なＡＡＶ２のＩＴＲを含む組換えウイルスゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子を提供する。
一部の実施形態において、ウイルス粒子は、アデノウイルス粒子である。一部の実施形態において、アデノウイルス粒子は、組換えアデノウイルス粒子、例えば、２つのＩＴＲ
間に本発明の開示のＲＮＡｉを含むポリヌクレオチドベクターである。一部の実施形態において、アデノウイルス粒子は、１つまたはそれ以上のＥ１遺伝子を欠失しているか、またはその不完全なコピーを含有しており、それによりアデノウイルスの複製は不完全になる。アデノウイルスは、大きい（約９５０Å）エンベロープのない正二十面体のキャプシド内に直鎖状の二本鎖ＤＮＡゲノムを包含する。アデノウイルスは、３０ｋｂより大きい異種配列（例えば、Ｅ１および／またはＥ３領域の代わりに）を取り込むことができる大きいゲノムを有し、それによって、より大きい異種遺伝子との使用にそれらを固有に適合させる。これらはまた、分裂および非分裂細胞に感染して、宿主ゲノムに天然に統合しない（ハイブリッドバリアントがこの能力を有する可能性があるにもかかわらず）ことも公知である。一部の実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ｅ１の代わりに異種配列を有する第１世代アデノウイルスベクターであり得る。一部の実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、および／またはＥ４において追加の突然変異または欠失を有する第２世代アデノウイルスベクターであり得る。一部の実施形態において、アデノウイルスベクターは、全てのウイルス性コード遺伝子を欠失した、ＩＴＲおよびパッケージ化シグナルのみを保持し、複製およびパッケージ化のためのトランスにヘルパーアデノウイルスを必要とする第３世代またはｇｕｔｔｅｄアデノウイルスベクターであり得る。アデノウイルス粒子は、哺乳類細胞の一過性トランスフェクションのためのベクターに加えて遺伝子治療用ベクターとして使用するために調査されている。さらなる説明については、例えば、Ｄａｎｔｈｉｎｎｅ，Ｘ．およびＩｍｐｅｒｉａｌｅ，Ｍ．Ｊ．（２０００）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１７０７〜１４およびＴａｔｓｉｓ，Ｎ．およびＥｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１０：６１６〜２９を参照されたい。
一部の実施形態において、ウイルス粒子は、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸を含む組換えアデノウイルス粒子である。いずれのアデノウイルス血清型の使用も、本発明の範囲内とみなされる。一部の実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、これらに限定されないが、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ５、ＡｄＨｕ７、ＡｄＨｕ１１、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄ、およびブタＡｄ３型などのアデノウイルス血清型から誘導されたベクターである。アデノウイルス粒子はまた、キャプシドタンパク質も含む。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子は、アデノウイルス粒子を、１つまたはそれ以上の外来ウイルスのキャプシドタンパク質と組み合わせて含む。このような組合せは、偽型組換えアデノウイルス粒子と称される場合もある。一部の実施形態において、偽型組換えアデノウイルス粒子で使用される外来ウイルスのキャプシドタンパク質は、外来ウイルスまたは別のアデノウイルス血清型から誘導される。一部の実施形態において、外来ウイルスのキャプシドタンパク質は、これらに限定されないが、レオウイルス３型などから誘導される。偽型アデノウイルス粒子で使用されるベクターおよびキャプシドタンパク質の組合せの例は、以下の参考文献に見出すことができる（Ｔａｔｓｉｓ，Ｎ．ら（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１０（４）：６１６〜６２９およびＡｈｉ，Ｙ．ら（２０１１）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１（４）：３０７〜３２０）。特定の標的細胞の形質導入を最適化するか、または特定の標的組織（例えば、罹患した組織）内の特異的な細胞型を標的化するのに、異なるアデノウイルス血清型が使用される可能性がある。特異的なアデノウイルス血清型によって標的化される組織または細胞としては、これらに限定されないが、肺（例えばＨｕＡｄ３）、脾臓および肝臓（例えばＨｕＡｄ３７）、平滑筋、滑膜細胞、樹状細胞、心臓血管細胞、腫瘍細胞株（例えばＨｕＡｄ１１）、ならびに樹状細胞（例えばレオウイルス３型で偽型化したＨｕＡｄ５、ＨｕＡｄ３０、またはＨｕＡｄ３５）が挙げられる。さらなる説明については、Ａｈｉ，Ｙ．ら（２０１１）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１（４）：３０７〜３２０、Ｋａｙ，Ｍ．ら（２００１）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７（１）：３３〜４０、およびＴａｔｓｉｓ，Ｎ．ら（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１０（４）：６１６〜６２９を参照さ
れたい。アデノウイルスベクターは、線条体内投与によって投与されている（例えば、Ｍｉｔｔｏｕｘ，Ｖ．ら（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：４４７８〜８６を参照）。
一部の実施形態において、ウイルス粒子は、レンチウイルス粒子である。一部の実施形態において、レンチウイルス粒子は、組換えレンチウイルス粒子、例えば、２つのＬＴＲ間に本発明の開示のＲＮＡｉをコードするポリヌクレオチドベクターである。レンチウイルスは、およそ１０ｋｂのゲノムを有するプラスセンスｓｓＲＮＡレトロウイルスである。レンチウイルスは、分裂および非分裂細胞のゲノムに統合されることが公知である。レンチウイルス粒子は、例えば、複数のプラスミド（典型的にはレンチウイルスのゲノムおよび複製および／またはパッケージ化に必要な遺伝子は、ウイルス複製を防ぐために分離されている）を、改変されたレンチウイルスのゲノムをレンチウイルス粒子にパッケージ化するパッケージング細胞株にトランスフェクトすることによって生産することができる。一部の実施形態において、レンチウイルス粒子は、エンベロープタンパク質を欠失した第１世代ベクターを指す場合がある。一部の実施形態において、レンチウイルス粒子は、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｔａｔ／ｒｅｖ領域を除いて全ての遺伝子を欠失した第２世代ベクターを指す場合がある。一部の実施形態において、レンチウイルス粒子は、内因性ｒｅｖ、ｇａｇ、およびｐｏｌ遺伝子のみを含有し、ｔａｔ遺伝子非含有の形質導入のためのキメラＬＴＲを有する第３世代ベクターを指す場合がある（Ｄｕｌｌ，Ｔ．ら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３〜７１を参照）。さらなる説明については、Ｄｕｒａｎｄ，Ｓ．およびＣｉｍａｒｅｌｌｉ，Ａ．（２０１１）Ｖｉｒｕｓｅｓ ３：１３２〜５９を参照されたい。
一部の実施形態において、ウイルス粒子は、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸を含む組換えレンチウイルス粒子である。いずれのレンチウイルスベクターの使用も、本発明の範囲内とみなされる。一部の実施形態において、レンチウイルスベクターは、これらに限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス−２（ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ジュンブラナ病ウイルス（Ｊｅｍｂｒａｎａ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ；ＪＤＶ）、ビスナウイルス（ＶＶ）、およびヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）などのレンチウイルスから誘導される。レンチウイルス粒子はまた、キャプシドタンパク質も含む。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子は、レンチウイルスベクターを、１つまたはそれ以上の外来ウイルスのキャプシドタンパク質と組み合わせて含む。このような組合せは、偽型組換えレンチウイルス粒子と称される場合もある。一部の実施形態において、偽型組換えレンチウイルス粒子で使用される外来ウイルスのキャプシドタンパク質は、外来ウイルスから誘導される。一部の実施形態において、偽型組換えレンチウイルス粒子で使用される外来ウイルスのキャプシドタンパク質は、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）である。ＶＳＶ−ＧＰは、遍在的な細胞受容体と相互作用し、偽型組換えレンチウイルス粒子に広範な組織親和性を提供する。加えて、ＶＳＶ−ＧＰは、偽型組換えレンチウイルス粒子により高い安定性を提供すると考えられる。他の実施形態において、外来ウイルスのキャプシドタンパク質は、これらに限定されないが、チャンディプラウイルス、狂犬病ウイルス、モコラウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、エボラウイルスレストン、エボラウイルスザイール、マールブルグウイルス、ラッサウイルス、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス（ＪＳＲＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、ネコ内因性レトロウイルス（ＲＤ１１４）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）、ヒトフォーミーウイルス、マエディビスナウイルス（ＭＶＶ）、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、センダイウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト
パラインフルエンザウイルス３型、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、家禽ペストウイルス（ＦＰＶ）、またはアウトグラファ・カリフォルニカ多重核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏ ｖｉｒｕｓ；ＡｃＭＮＰＶ）などから誘導される。偽型レンチウイルス粒子で使用されるベクターおよびキャプシドタンパク質の組合せの例は、例えば、Ｃｒｏｎｉｎ，Ｊ．ら（２００５）．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（４）：３８７〜３９８に見出すことができる。特定の標的細胞の形質導入を最適化するか、または特定の標的組織（例えば、罹患した組織）内の特異的な細胞型を標的化するのに、異なる偽型組換えレンチウイルス粒子を使用することができる。例えば、特異的な偽型組換えレンチウイルス粒子によって標的化された組織としては、これらに限定されないが、肝臓（例えばＶＳＶ−Ｇ、ＬＣＭＶ、ＲＲＶ、またはＳｅＶ Ｆタンパク質で偽型化された）、肺（例えばエボラ、マールブルグ、ＳｅＶ ＦおよびＨＮ、またはＪＳＲＶタンパク質で偽型化された）、膵島細胞（例えばＬＣＭＶタンパク質で偽型化された）、中枢神経系（例えばＶＳＶ−Ｇ、ＬＣＭＶ、狂犬病、またはモコラタンパク質で偽型化された）、網膜（例えばＶＳＶ−Ｇまたはモコラタンパク質で偽型化された）、単球または筋肉（例えばモコラまたはエボラタンパク質で偽型化された）、造血系（例えばＲＤ１１４またはＧＡＬＶタンパク質で偽型化された）、またはがん細胞（例えばＧＡＬＶまたはＬＣＭＶタンパク質で偽型化された）が挙げられる。さらなる説明については、Ｃｒｏｎｉｎ，Ｊ．ら（２００５）．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（４）：３８７〜３９８およびＫａｙ，Ｍ．ら（２００１）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７（１）：３３〜４０を参照されたい。
一部の実施形態において、ウイルス粒子は、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）粒子である。一部の実施形態において、ＨＳＶ粒子は、ｒＨＳＶ粒子、例えば、２つのＴＲ間に本発明の開示のＲＮＡｉをコードするポリヌクレオチドベクターである。ＨＳＶは、およそ１５２ｋｂのゲノムを有するエンベロープありの二本鎖ＤＮＡウイルスである。有利には、その遺伝子のおよそ半分は必須ではなく、異種配列を順応させるために欠失させてもよい。ＨＳＶ粒子は、非分裂細胞に感染する。加えて、ＨＳＶ粒子は、天然にニューロン中での潜伏を確立し、逆行性輸送によって移動し、シナプスを通過して移行させることができることから、それらをニューロンのトランスフェクションおよび／または神経系に関する遺伝子治療アプローチにとって有利にしている。一部の実施形態において、ＨＳＶ粒子は、複製欠損であってもよいし、または複製能を有していてもよい（例えば、１つまたはそれ以上の後期遺伝子の不活性化を介して単一の複製サイクルの能力を有する）。さらなる説明については、Ｍａｎｓｅｒｖｉｇｉ，Ｒ．ら（２０１０）Ｏｐｅｎ Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．４：１２３〜５６を参照されたい。
一部の実施形態において、ウイルス粒子は、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸を含むｒＨＳＶ粒子である。いずれのＨＳＶベクターの使用も、本発明の範囲内とみなされる。一部の実施形態において、ＨＳＶベクターは、これらに限定されないが、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２などのＨＳＶ血清型から誘導される。ＨＳＶ粒子はまた、キャプシドタンパク質も含む。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子は、ＨＳＶベクターを、１つまたはそれ以上の外来ウイルスのキャプシドタンパク質と組み合わせて含む。このような組合せは、偽型ｒＨＳＶ粒子と称される場合もある。一部の実施形態において、偽型ｒＨＳＶ粒子で使用される外来ウイルスのキャプシドタンパク質は、外来ウイルスまたは別のＨＳＶ血清型から誘導される。一部の実施形態において、偽型ｒＨＳＶ粒子で使用される外来ウイルスのキャプシドタンパク質は、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）である。ＶＳＶ−ＧＰは、遍在的な細胞受容体と相互作用し、偽型ｒＨＳＶ粒子に広範な組織親和性を提供する。加えて、ＶＳＶ−ＧＰは、偽型ｒＨＳＶ粒子により高い安定性を提供すると考えられる。他の実施形態において、外来ウイルスのキャプシドタンパク質は、異なるＨＳＶ血清型由来であってもよい。例えば、ＨＳＶ−１ベクターは、１つまたはそれ以上のＨＳＶ−２キャプシドタンパク質を含有していてもよい。特定
の標的細胞の形質導入を最適化するか、または特定の標的組織（例えば、罹患した組織）内の特異的な細胞型を標的化するのに、異なるＨＳＶ血清型を使用することができる。特異的なアデノウイルス血清型によって標的化された組織または細胞としては、これらに限定されないが、中枢神経系およびニューロン（例えばＨＳＶ−１）が挙げられる。さらなる説明については、Ｍａｎｓｅｒｖｉｇｉ，Ｒ．ら（２０１０）Ｏｐｅｎ Ｖｉｒｏｌ Ｊ ４：１２３〜１５６、Ｋａｙ，Ｍ．ら（２００１）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７（１）：３３〜４０、およびＭｅｉｇｎｉｅｒ，Ｂ．ら（１９８７）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５５（５）：９２１〜９３０を参照されたい。
ウイルス粒子の生産
ｒＡＡＶ粒子は、当業界において公知の方法を使用して生産することができる。例えば、米国特許第６，５６６，１１８号；６，９８９，２６４号；および６，９９５，００６号を参照されたい。本発明の実施において、ｒＡＡＶ粒子を生産するための宿主細胞としては、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物および酵母が挙げられる。宿主細胞はまた、ＡＡＶベクターゲノムが安定して維持される宿主細胞またはプロデューサー細胞中でＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が安定して維持されるパッケージング細胞であってもよい。例示的なパッケージングおよびプロデューサー細胞は、２９３、Ａ５４９またはＨｅＬａ細胞から誘導される。ＡＡＶベクターは、当業界において公知の標準的な技術を使用して精製され、製剤化される。
当業界において公知のｒＡＡＶベクターを生産するための方法としては、これらに限定されないが、トランスフェクション、安定な細胞株の生産、ならびにアデノウイルス−ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス−ＡＡＶハイブリッド（Ｃｏｎｗａｙ，ＪＥら、（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１（１１）：８７８０〜８７８９）およびバキュロウイルス−ＡＡＶハイブリッドなどの感染性のハイブリッドウイルスの生産系が挙げられる。ｒＡＡＶウイルス粒子を生産するためのｒＡＡＶ生産培養は全て、１）好適な宿主細胞、例えば、ヒトから誘導された細胞株、例えばＨｅＬａ、Ａ５４９、または２９３細胞、または昆虫から誘導された細胞株、例えばバキュロウイルス生産系のケースではＳＦ−９など；２）野生型または突然変異アデノウイルス（例えば温度感受性アデノウイルス）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミドコンストラクトによって提供される好適なヘルパーウイルス機能；３）ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子および遺伝子産物；４）少なくとも１つのＡＡＶのＩＴＲ配列が隣接する核酸（例えば治療用核酸）；ならびに５）ｒＡＡＶ生産を支持する好適な培地および培地成分を必要とする。一部の実施形態において、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物は、あらゆるＡＡＶ血清型由来でもよい。一般的に、ただし必須ではないが、ｒｅｐ遺伝子産物が複製されるように機能してｒＡＡＶゲノムをパッケージ化できる限りは、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子産物は、ｒＡＡＶベクターゲノムのＩＴＲと同じ血清型を有する。ｒＡＡＶベクターを生産するために、当業界において公知の好適な培地を使用することができる。これらの培地としては、これらに限定されないが、Ｈｙｃｌｏｎｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＪＲＨによって生産された培地、例えば改変イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）など、米国特許第６，５６６，１１８号に記載されたもの、ならびに米国特許第６，７２３，５５１号に記載されているようなＳｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地などの特注の調合物が挙げられ、これらのそれぞれは、特に組換えＡＡＶベクターの生産で使用するための特注の培地調合物に関して、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。一部の実施形態において、ＡＡＶのヘルパー機能は、アデノウイルスまたはＨＳＶによって提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶのヘルパー機能は、バキュロウイルスによって提供され、宿主細胞は、昆虫細胞（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）細胞）である。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、三重のトランスフェクション方法、例えば下記に示される例示的な三重のトランスフェクション方法によって生産することができる。簡単に言えば、ｒｅｐ遺伝子およびキャプシド遺伝子を含有するプラスミドを、ヘルパーアデノウイルスプラスミドと共に、（例えば、リン酸カルシウム方法を使用して）細胞株（例えば、ＨＥＫ−２９３細胞）にトランスフェクトしてもよいし、さらに、ウイルスを収集し、場合により精製してもよい。そのようなものとして、一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、およびＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の宿主細胞への三重のトランスフェクションによって生産されたものであり、宿主細胞への核酸のトランスフェクションは、ｒＡＡＶ粒子を生産することが可能な宿主細胞を生成する。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、プロデューサー細胞株の方法、例えば下記に示される例示的なプロデューサー細胞株の方法によって生産することができる（Ｍａｒｔｉｎら、（２０１３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：２５３〜２６９で参照されているものも参照されたい）。簡単に言えば、細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞株）は、ｒｅｐ遺伝子、キャプシド遺伝子、およびプロモーター−異種核酸配列を含有するプラスミドで安定してトランスフェクトすることができる。細胞株をスクリーニングしてｒＡＡＶ生産のためのリードクローンを選択してもよいし、次いでこれを生産バイオリアクターに拡大して、ｒＡＡＶ生産を開始させるためのヘルパーとしてアデノウイルス（例えば、野生型アデノウイルス）で感染させることもできる。その後ウイルスを回収してもよいし、アデノウイルスを不活性化させるか（例えば、熱によって）および／または除去してもよいし、ｒＡＡＶ粒子を精製してもよい。そのようなものとして、一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の１つまたはそれ以上を含むプロデューサー細胞株によって、ｒＡＡＶ粒子を生産した。
一部の態様において、本明細書で開示されるいずれかのｒＡＡＶ粒子を生産するための方法であって、（ａ）ｒＡＡＶ粒子が生産される条件下で宿主細胞を培養する工程であって、宿主細胞は、（ｉ）１つまたはそれ以上のＡＡＶパッケージ遺伝子であって、前記ＡＡＶパッケージ遺伝子のそれぞれは、ＡＡＶの複製および／またはキャプシド化タンパク質をコードする、ＡＡＶパッケージ遺伝子；（ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶのＩＴＲが隣接する本明細書に記載される本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸を含むｒＡＡＶプロベクター、および（ｉｉｉ）ＡＡＶのヘルパー機能を含む、工程；および（ｂ）宿主細胞によって生産されたｒＡＡＶ粒子を回収する工程を含む、方法が提供される。一部の実施形態において、ＲＮＡｉは、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、前記少なくとも１つのＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシド血清型ＩＴＲなどからなる群より選択される。一部の実施形態において、前記キャプシド化タンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６（例えば、野生型ＡＡＶ６キャプシド、またはバリアントＡＡＶ６キャプシド、例えば米国付与前公報第２０１２／０１６４１０６号に記載のＳｈＨ１０）、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９（例えば、野生型ＡＡＶ９キャプシド、または米国付与前公報第２０１３／０３２３２２６号に記載の改変されたＡＡＶ９キャプシド）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、チロシンキャプシド突然変異体、ヘパリン結合キャプシド突然変異体、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａキャプシド、ＡＡＶＡＡＶ２／２−７ｍ８キャプシド、ＡＡＶ ＤＪキャプシド（例えば、ＡＡＶ−ＤＪ／８キャプシド、ＡＡＶ−ＤＪ／９キャプシド、または米国付与前公報第２０１２／００６６７８３号に記載のキャプシドの他のいずれか）、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａキャプシ
ド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａキャプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋキャプシド、ヤギＡＡＶキャプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラキャプシド、ウシＡＡＶキャプシド、マウスＡＡＶキャプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１キャプシド、または米国特許第８，２８３，１５１号もしくは国際公報ＷＯ／２００３／０４２３９７号に記載のＡＡＶキャプシドからなる群より選択される。一部の実施形態において、突然変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶキャプシドを形成する能力を維持する。一部の実施形態において、キャプシド化タンパク質は、ＡＡＶ５チロシン突然変異キャプシドタンパク質である。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ〜ＦからのＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシド、ならびにＡＡＶ２のＩＴＲ、突然変異ＡＡＶ２のＩＴＲおよび本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸を含む組換えゲノムを含む。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、精製される。用語「精製される」は、本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶ粒子が天然に存在するかまたはそれから最初に調製されるときに存在する可能性もある他の要素の少なくとも一部を欠いているｒＡＡＶ粒子の調製物を包含する。したがって、例えば、単離されたｒＡＡＶ粒子は、培養溶解産物または生産培養上清などの源となる混合物からそれを富化するための精製技術を使用して調製することができる。富化は、様々な方法で、例えば、溶液中に存在するＤＮアーゼ耐性粒子（ＤＲＰ）もしくはゲノムコピー（ｇｃ）の比率、または感染力などによって測定してもよいし、または富化は、源となる混合物中に存在する第２の干渉する可能性がある物質、例えば生産培養物の汚染物質などの汚染物質、またはヘルパーウイルス、培地の要素などの製造過程の汚染物質に関して測定することができる。
アデノウイルスベクター粒子を生産するための数多くの方法が当業界において公知である。例えば、ｇｕｔｔｅｄアデノウイルスベクターの場合、アデノウイルスベクターゲノムおよびヘルパーアデノウイルスゲノムを、パッケージング細胞株（例えば、２９３細胞株）にトランスフェクトしてもよい。一部の実施形態において、ヘルパーアデノウイルスゲノムは、そのパッケージ化シグナルの端にある組換え部位を含有していてもよいし、ヘルパーアデノウイルスより効率的に目的のアデノウイルスベクターがパッケージ化されるように、両方のゲノムをリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系が使用される可能性がある）を発現するパッケージング細胞株にトランスフェクトしてもよい（例えば、Ａｌｂａ，Ｒ．ら（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２増刊１：Ｓ１８〜２７を参照）。アデノウイルスベクターは、本明細書に記載の方法などの標準的な方法を使用して回収および精製してもよい。
レンチウイルスベクター粒子を生産するための数多くの方法が当業界において公知である。例えば、第３世代レンチウイルスベクターの場合、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含む目的のレンチウイルスゲノムを含有するベクターを、ｒｅｖ遺伝子を含有するベクターと共にパッケージング細胞株（例えば、２９３細胞株）にコトランスフェクトしてもよい。目的のレンチウイルスゲノムはまた、Ｔａｔの非存在下で転写を促進するキメラＬＴＲも含有する（Ｄｕｌｌ，Ｔ．ら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７２：８４６３〜７１を参照）。レンチウイルスベクターは、本明細書に記載の方法を使用して回収および精製してもよい（例えば、Ｓｅｇｕｒａ ＭＭら、（２０１３）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．１３（７）：９８７〜１０１１）。
ＨＳＶ粒子を生産するための数多くの方法が当業界において公知である。ＨＳＶベクターは、本明細書に記載の方法などの標準的な方法を使用して回収および精製してもよい。例えば、複製欠損ＨＳＶベクターの場合、前初期（ＩＥ）遺伝子の全てを欠失した目的のＨＳＶゲノムを、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、およびＩＣＰ０などのウイルス生産に必要な遺伝子を提供する補完細胞株にトランスフェクトしてもよい（例えば、Ｓａｍａｎｉｅｇｏ，Ｌ．Ａ．ら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３３０７〜２０を参照）。ＨＳＶベクターは、報告されている方法（例えば、Ｇｏｉｎｓ，ＷＦら、（２０１４）Ｈｅｒｐｅｓ
Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１４４：６３〜７９）を使用して回収および精製してもよい。
本発明の開示のＲＮＡｉをコードする導入遺伝子を含む組換えウイルス粒子および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物も本明細書で提供される。医薬組成物は、本明細書に記載のあらゆる投与様式に適している可能性がある。本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸を含む組換えウイルス粒子の医薬組成物は、脳に導入することができる。例えば、本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸を含む組換えウイルス粒子は、線条体内に投与することができる。ｒＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス、およびＨＳＶ粒子などの本発明の開示の組換えウイルス粒子のどれでも使用することができる。
一部の実施形態において、本明細書に記載の本発明の開示のＲＮＡｉをコードする導入遺伝子を含む組換えウイルス粒子および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物は、ヒトへの投与に好適である。このような担体は当業界において周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照）。一部の実施形態において、本明細書に記載のｒＡＡＶおよび医薬的に許容される担体を含む医薬組成物は、哺乳動物の脳への注射に好適である（例えば、線条体内投与）。一部の実施形態において、本明細書に記載の組換えレンチウイルス粒子および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物は、哺乳動物の脳への注射に好適である（例えば、線条体内投与）。一部の実施形態において、本明細書に記載の組換えアデノウイルス粒子および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物は、哺乳動物の脳への注射に好適である（例えば、線条体内投与）。一部の実施形態において、本明細書に記載の組換えＨＳＶ粒子および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物は、哺乳動物の脳への注射に好適である（例えば、線条体内投与）。
このような医薬的に許容される担体は、滅菌された液体、例えば水および油、例えば石油、動物、植物または合成由来の油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油などであってもよい。塩類溶液および水性デキストロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびグリセロール溶液も、液体担体として、特に注射用溶液のために採用することができる。医薬組成物は、追加成分、例えば保存剤、緩衝液、等張化剤、抗酸化剤および安定剤、非イオン性の湿潤剤または清澄剤、増粘剤などをさらに含んでいてもよい。本明細書に記載の医薬組成物は、単回単位の剤形または複数回投与の剤形でパッケージ化することができる。組成物は、一般的に、滅菌された実質的に等張の溶液として製剤化される。
ＶＩＩ．製造品およびキット
本明細書に記載の方法で使用するためのキットまたは製造品も提供される。態様において、キットは、好適なパッケージ中に、本明細書に記載の組成物（例えば、本発明の開示の組換えウイルス粒子、例えば本発明の開示のＲＮＡｉをコードする核酸を含むｒＡＡＶ粒子）を含む。本明細書に記載の組成物（例えば線条体内用の組成物）のための好適なパッケージは、当業界において公知であり、例えば、バイアル（例えば密封バイアル）、容器、アンプル、ボトル、ジャー、フレキシブルなパッケージ（例えば、密封したマイラーまたはプラスチックバッグ）などが挙げられる。これらの製造品は、さらに滅菌および／または密封してもよい。
本発明はまた、本明細書に記載の組成物を含むキットも提供し、これは、組成物の使用方法、例えば本明細書に記載の使用に関する説明書をさらに含んでいてもよい。本明細書に記載のキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および本明細書に記載のいずれかの方法を実行するための説明を含む添付文書などの、商業的および使用者の観点から所望の他の材料をさらに包含していてもよい。例えば、一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載される哺乳動物から霊長類の脳に少なくとも１×１０９ゲ
ノムコピーを送達するための（例えば、線条体内投与を介して）本発明の開示のＲＮＡｉをコードする導入遺伝子を含む組換えウイルス粒子の組成物、霊長類の脳への注射に好適な医薬的に許容される担体、ならびに緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および霊長類の脳への注射（例えば、線条体内投与）を実行するための説明を含む添付文書の１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載の組換えウイルス粒子と共に、ハンチントン病を処置するための説明書を含む。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載の方法のいずれか１つに従って本明細書に記載の組換えウイルス粒子を使用するための説明書を含む。
本発明は、以下の実施例を参照することにより、よりよく理解される。しかしながら、これらは本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例および実施形態は単に例示の目的のためであり、それらの観点で様々な改変または変化が当業者に示唆されると予想され、本出願の本質および趣旨ならびに添付の特許請求の範囲のうちに包含されることが理解される。
実施例１：ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−ＨｔｔはインビトロでＨｔｔ発現を低減する。
ハンチントン病（ＨＤ）は、ハンチンチン（Ｈｔｔ）タンパク質におけるポリグルタミン残基数の増加によって引き起こされる致死性の常染色体優性の神経変性疾患である。ＨＤの根本的な基礎の同定に伴い、原因となる突然変異Ｈｔｔの発現を低減する療法が開発されつつある。このおよび類似の障害のための可能性のある治療戦略として、このような疾患を引き起こす薬剤の発現を選択的に低減しようとするＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が出現している。ＨＤのマウスモデルでＲＮＡｉ療法の長所を検査するために、これまでにマウスおよびヒトＨｔｔのｍＲＮＡを効果的に標的化することが示されている標的配列（ＭｃＢｒｉｄｅら、（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：５８６８〜５８７３）を人工ｍｉＲＮＡ骨格に埋め込み、プレウイルスベクターにクローニングした。
方法
動物
全ての手順を、Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｓａｎｏｆｉ社における動物実験倫理委員会によって承認されたプロトコール（保健福祉省、ＮＩＨ公報８６−２３）を使用して実行した。使用されたマウスは、ＹＡＣ１２８マウス（純粋なＦＶＢ／ＮＪバックグラウンドに１２８個のＣＡＧリピートを含む全長ヒト突然変異ＨＴＴ導入遺伝子を内包する酵母人工染色体）およびＦＶＢ／ＮＪ同腹子マウス（Ｓｌｏｗら、（２００３）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：１５５５〜１５６７；Ｖａｎ Ｒａａｍｓｄｏｎｋら、（２００５）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３８２３〜３８３５）を包含していた。ＹＡＣ１２８マウスおよびＦＶＢ／ＮＪ同腹子の両方を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに収容されていたＧｅｎｚｙｍｅのコロニーから得た。１２時間の明／暗サイクルで食物および水を不断給餌してマウスを維持した。動物の明サイクル中に（午前８時から午後４時の間に）全ての行動試験を実行した。
プラスミドおよびウイルスベクター
ハンチンチン遺伝子に対してｍｉＲＮＡベースのヘアピンをコードする組換えＡＡＶ２／１血清型ベクター（ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ）を生成するために、ヒトＨＴＴに関するｍｉＲＮＡを、ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）、ウシ成長ホルモンのポリＡ、および１．６ｋｂのサイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターを含有するシャトルプラスミドにクローニングした。ｍｉＲＮＡのための足場を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）Ｐｏｌ ＩＩ ｍｉＲ ＲＮＡｉ発現ベクターキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍ
ｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）からのものであった。対照ベクターは、空のベクター骨格のいずれか（ＡＡＶ２／１−ヌル）を含有していたか、または同じプロモーター（ＡＡＶ２／１−ｅＧＦＰ）のコントロール下で強化緑色蛍光タンパク質を発現した。これまでに述べられたように三重のプラスミドをヒト２９３細胞にコトランスフェクトすることによって全てのウイルスベクターを生成し（Ｘｉａｏら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４〜２２３２）、これまでに述べられたように組換えビリオンをカラムで精製した（Ｐａｓｓｉｎｉら、（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１２３８２〜１２３９２）。得られたＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔの力価は、４．５×１０１２ｖｇ／ｍｌであると決定され、ＡＡＶ２／１−ヌルの力価は、定量ＰＣＲを使用したところ２．３×１０１２ｖｇ／ｍｌであった。
外科手術
動物を３％イソフルランを使用して麻酔し、定位フレームに設置した。頭蓋内注射をこれまでに述べられたようにして実行した（Ｔｒｅｌｅａｖｅｎ，Ｃ．Ｍ．ら（２０１２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０：１７１３〜１７２３）。簡単に言えば、組換えウイルスベクター（ＡＡＶ２／１−ｅＧＦＰまたはＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ）２μｌを、１０μｌハミルトンシリンジを０．５μｌ／分の速度で使用して線条体に注射した（ＡＰ、＋０．５０；ＭＬ、±２．００；ＤＶ、前頂および硬膜から−２．５；切歯棒、０．０）。針を、点滴完了後１分間、その場に残した。外科手術前の１時間および外科手術後の２４時間に、無痛のためにマウスにケトプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与した。
動物の潅流および組織収集
マウスをリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）で心臓を介して潅流して、全ての血液を除去した。脳を中線に沿って矢状方向に切断し、左半球を４％パラホルムアルデヒド、それに続いて３０％スクロース中で後固定し、次いでクライオスタットを使用して２０μｍの断片に断片化した。右半球を、マウス脳マトリックス（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、冠状面の軸椎に沿って２ｍｍのスラブに切断し、次いで液体窒素中で瞬間冷凍して、使用するまで−８０℃で貯蔵した。Ｈｔｔ凝集の分析のために、脳を４％パラホルムアルデヒド中で４８時間後固定し、ＰＢＳで洗浄して、次いでビブラトームを使用して４０μｍの環状断片に断片化した。
細胞培養およびトランスフェクション
ＨＥＫ２９３細胞を、５×１０９ｖｇのＡＡＶ２／１−ｅＧＦＰまたはＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔのいずれかで感染させ、３日後に回収した。定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡレベルを測定した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して全ＲＮＡを単離した。Ｑ−ＰＣＲ反応を遂行し、上述したようにＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７５００シーケンスデテクター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した（Ｋｏｒｄａｓｉｅｗｉｃｚ，Ｈ．Ｂ．ら（２０１２）Ｎｅｕｒｏｎ ７４：１０３１〜１０４４）。発現レベルをＰＰＩＡ（ペプチジルプロリルイソメラーゼ）のレベルに正規化した。
定量リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）
定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡレベルを測定した。全てのＲＴ−ＰＣＲ分析に、脳スラブ２からの脳組織サンプルを使用した。ＱＩＡＧＥＮ ＲＮＥａｓｙミニキットを使用して全ＲＮＡを抽出し、次いで、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックスキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造元の説明書に従って使用して、逆転写し、増幅した。マウスＨｔｔのｍＲＮＡを検出するために、以下のプローブセットを使用した：Ｍｍ０１２１３８２０＿ｍ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号４３３１１８２）。ヒトＨｔｔのｍＲＮＡを検出するために、以下のオリゴを使用した：５’−ｃｔｃｃｇｔｃｃｇｇｔａｇａｃａｔｇｃｔ−
３’（フォワードプライマー、配列番号９）；５’−ｇｇａａａｔｃａｇａａｃｃｃｔｃａａａｔｇｇ−３’（リバースプライマー、配列番号１０）；および５’−ｔｇａｇｃａｃｔｇｔｔｃａａｃｔｇｔｇｔｇｔａｔｃｇｇｇａ−３’（プローブ、配列番号１１）。定量ＲＴ−ＰＣＲ反応を遂行し、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。ＨｔｔのｍＲＮＡの発現レベルをヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（Ｈｐｒｔ１）のｍＲＮＡレベルに正規化した。マウス脳ｃＤＮＡの５倍連続希釈物を使用して標準曲線を作成した。各サンプルを２連で試行した。標準曲線またはΔΔＣＴ方法を使用して、Ｈｐｒｔ１のｍＲＮＡレベルに正規化することによって、相対的な遺伝子発現を決定した。
ウェスタンブロッティング
完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＴ−Ｐｅｒ溶解緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）中５０ｍｇ／ｍｌの最終濃度で組織をホモジナイズした。ホモジネートを４℃における１０，０００×ｇで６分間の遠心分離によって清澄化した。ＢＳＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用することによってタンパク質濃度を測定した。２０から３０マイクログラムのホモジネートを３〜８％Ｎｏｖｅｘトリス−アセテートゲルで分離し、次いでニトロセルロース膜に移した。膜に、マウス抗ハンチンチンモノクローナル抗体（Ｍａｂ２１６６；１：２，０００希釈物、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびウサギポリクローナル抗β−チューブリン抗体（１：７５０希釈物、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でプローブを付けた。次いで膜を赤外二次抗体（１：２０，０００希釈物、Ｒｏｃｋｌａｎｄ）と共にインキュベートし、Ｏｄｙｓｓｅｙ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して定量的な蛍光によりタンパク質を可視化した。ローディングの分散をコントロールするために、Ｈｔｔタンパク質をβ−チューブリンに正規化し、未処置または塩類溶液処置した動物のパーセンテージとして表した。タンパク質の同一性を検証するために分子量マーカーを使用した。
フローサイトメトリーおよびセルソーティング（ＦＣＭセルソーティング）
Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｓａｎｏｆｉ社）において、１００μｍノズルを備えたＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して単一細胞の懸濁液を分析し、単離した。前方散乱（ＦＷＤ−Ｓｃ）および側方散乱（ＳＳＣ）でのゲーティングにより死細胞片から生きた単一細胞を識別することによって細胞の分析を実行した。５３０／３０ＢＰフィルター５０５ＬＰを備えたデテクターＥを使用してＥＧＦＰ陽性細胞を収集した。ＥＧＦＰ蛍光データプロファイルは、単一パラメーターのヒストグラムとして表示され、ソーティング決定は、ＥＧＦＰ−およびＥＧＦＰ＋に基づいていた。ソートされた細胞を５％ウシ胎児血清を含有する組織培養培地中に収集し、４ウェルのチャンバーを有するスライド（ＬａｂＴｅｋ、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、Ｉｌｌ）上で、細胞５００００個／ウェルの濃度で平板培養した。
免疫組織化学
ビブラトーム断片を、凝集したハンチンチンを優先的に認識する抗体であるＥＭ４８によって免疫染色のために処理した（Ｇｕｔｅｋｕｎｓｔら、（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：２５２２〜２５３４）。まず遊離の浮遊断片を、Ｄｕａｌ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｌｏｃｋ（Ｄａｋｏ）で３０分処置して内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。次いでこれらを０．０１ＭのＰＢＳで洗浄し（３分間）、続いてＰＢＳ中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で３回、各１０分で洗浄した。断片をＲｏｄｅｎｔ Ｂｌｏｃｋ Ｍ中で室温で１時間インキュベートすることによって非特異的な部位をブロックした。４℃の低温室において穏やかな振盪器で一晩インキュベートするこ
とによって、断片にＥＭ４８抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＰＢＳでの１：２５希釈物）でプローブを付けた。次の日、断片を、室温で１時間、振盪器で、二次抗体（ＭＭ ＨＲＰポリマー、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）と共にインキュベートした。それぞれＰＢＳで１５分間で３回洗浄した後、ＤＡＢペルオキシダーゼ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ）を使用してシグナルを検出した。洗浄後、断片をスーパーフロストプラススライドにマウントし、一晩乾燥させ、Ａｃｒｙｔｏｌマウント媒体と共にカバーガラスをかけた。
行動に関する分析
加速ロータロッド試験：運動協調性および運動学習を、加速ロータロッド装置（ＡｃｃｕＳｃａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で評価した。１日当たり３回の試験により３日連続でマウスをロータロッドで訓練した。最初の訓練日に、ロータロッドを、３００秒かけて０から５ＲＰＭに加速するように設定した。３００秒の期間を終える前にロッドから落下したマウスを、３００秒の期間が完全に満了するまでロッド上に戻した。訓練の２および３日目に、ロータロッドを再度、３００秒かけて０から４０ＲＰＭに加速するように設定し、全てのマウスがロッド上で３００秒を完全に終えるよう強制した。４日目（試験日）に、３００秒かけて０から４０ＲＰＭに加速するように設定されたロータロッド上にマウスを置いた。動物が落ちた後は再び置かず、落ちるまでの潜時を３回の試験にわたり記録した。落ちるまでの潜時は、動物がロータロッドから落ちるまでの経過時間によって定義された。
ポーソルト水泳試験：ポーソルト水泳試験における無動を、げっ歯類におけるうつ状態の尺度として使用した（Ｐｏｒｓｏｌｔら、（１９７７）Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．Ｔｈｅｒ．２２９：３２７〜３３６、Ｃｒｙａｎら、（２００２ａ）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２３：２３８〜２４５、Ｃｒｙａｎら、（２００２ｂ）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４３６：１９７〜２０５）。２３℃で高さ１５ｃｍまで水で満たされた個々のガラスシリンダー（高さ２０ｃｍ×直径１０ｃｍ）にマウスを置くことによって試験を遂行した。マウスを７分間にわたりシリンダーに置いた。この期間の最初の３分間を順化時間とみなし、その時間中はデータを収集しなかった。試験セッションの最後の４分間中に、盲検のオブザーバーにより、１０秒間隔で優勢な挙動を格付けする時間サンプリング技術を使用してマウスの性能をスコア付けした。水泳および無動の挙動を毎回１０秒の最後に測定して記録することにより、試験１回当たり２４データポイントを得た。各マウスにつき無動状態に費やした時間のパーセンテージを計算した。
統計
統計分析のために平均値を使用した。データを平均±ＳＥＭとして表した。２つのグループを使用した研究の場合、統計的比較のためにスチューデントのｔ検定を使用した。２つより多くのグループの比較の場合、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの多重比較事後検定（Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用した。ｐ＜０．０５を統計学的に有意な差とみなした。
結果
プラスミドを、図１Ａで例示されているようにニワトリベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター（ｐＳＰ７０−ＣＢＡ−ＥＧＦＰ）の転写コントロール下でＨｔｔを標的化するｍｉＲＮＡおよび強化されたＧＦＰ（ｅＧＦＰ）レポーター遺伝子を発現するように操作した。候補標的配列は、Ｈｔｔコード領域から選択されたものであり、５’−ＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＴＴＣＡＣＡＣＧＧＴ−３’（配列番号４）であった。標的配列をコードする高力価の組換えＡＡＶ２／１−血清型ベクター（ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ）および対照ベクター（ＡＡＶ２／１−ｅＧＦＰおよびＡＡＶ２／１−ヌル）を作製し、それらの遺伝子サイレンシング活性を、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を感染させるこ
とによって試験した。細胞を５×１０９ｖｇのＡＡＶベクターで感染させた。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析を使用して、この用量が、ＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ｍｉＲＮＡ−ＨＴＴで感染させた後、ＨＥＫ２９３細胞において９０％より高い感染効率をもたらしたことを確認した（図２Ａ〜Ｄ）。ＡＡＶ２／１−ｅＧＦＰで感染させた細胞は、感染後３日にリアルタイムＰＣＲによって分析したところ、内因性Ｈｔｔレベルのいかなる低減も示さなかった；しかしながら、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔで感染させた細胞は、ＨｔｔのｍＲＮＡレベルのおよそ４０％の低減を示した（図１Ｂ）。
実施例２：ＹＡＣ１２８マウスへのＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ注射は、拡大した線条体の形質導入およびＨｔｔのｍＲＮＡの低減をもたらす。
インビトロでＨｔｔのｍＲＮＡレベルを抑制するＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔの能力の検証後、このベクターの、ＹＡＣ１２８マウスの線条体におけるＨｔｔ発現をサイレンシングする能力を評価した。ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔを線条体内注射した後の線条体内の細胞の形質導入パーセントを決定するために、実施例１に記載の方法に従って蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を採用した。
結果
成体ＹＡＣ１２８マウスに、ＡＡＶ２／１−ｅＧＦＰ−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ（４．５×１０１２ｖｇ／ｍｌ）または対照ベクター、ＡＡＶ２／１−ｅＧＦＰ（５．６×１０１２ｖｇ／ｍｌ）の両側の線条体内注射を行った。注射後の１カ月に、各動物の線条体領域を顕微解剖し、ｅＧＦＰ含有細胞とｅＧＦＰ非含有細胞とをソートし、ＦＡＣＳ分析によって定量した（図３ＡおよびＢ）。データから、ソートされた線条体細胞の大部分のうちのｅＧＦＰの存在によって実証されたように、ベクターによって線条体の８０％より多くが形質導入されたことが示された（図３Ｃ）。
インビボでＨｔｔを低減するベクターの能力を評価して、応答の寿命をモニターするために、成体マウスに、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ（４．５Ｅ１２ｖｇ／ｍｌ）（タイムポイント１つ当たり、Ｎ＝１６、Ｎ＝８＋８）またはＡＡＶ２／１−ヌル対照ベクター（２．３Ｅ１２ｖｇ／ｍｌ）（Ｎ＝８）の両側の線条体内注射を行い、処置後１または５カ月に脳を分析した。両方のタイムポイントにおいてＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔで処置したマウスからの脳断片の蛍光顕微鏡検査法による分析によれば、線条体全体にわたり脳領域を取り囲んで広範なｅＧＦＰ蛍光が示され、これは、ほぼ完全な線条体の形質導入を示唆するＦＡＣＳ分析と一致していた（図３Ｄ）。処置後１カ月に達成されたマウスの脳におけるｅＧＦＰ発現のレベルは、５カ月のタイムポイントで減退していないようであった（図３Ｄ）。突然変異ヒトＨｔｔのｍＲＮＡの線条体レベルは、ＡＡＶ２／１−ヌルで処置された対照と比較した場合、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔが注射されたマウスにおいて有意に低減し、両方のタイムポイントで同程度の低減（およそ４５％、ｐ＜０．０１）を記録した（図３Ｅ）。内因性のマウスＨｔｔのｍＲＮＡの線条体レベルは、ＡＡＶ２／１−ヌルで処置された対照と比較した場合、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔの後に有意に低減した。両方のタイムポイントで同程度の低減（およそ４５％、ｐ＜０．０１）を記録した（図４）。
実施例３：ＹＡＣ１２８マウスへのＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ注射は、脳中で明白な毒性を引き起こさない。
ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔの注射およびその結果としてのＨｔｔの低減が神経毒性および炎症をもたらすかどうかを決定するために、線条体断片の細胞の形態および完全性を、実施例１に記載の方法に従ってヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって検査した。神経炎症マーカーであるグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、星状細胞マーカー）およびＩｂａ−１（小グリア細胞マーカー）のレベルも、処置後１および５カ月に検査した。
結果
Ｈ＆Ｅによる分析から、注射された脳領域において著しい病理組織学的変化は示されなかった（図５Ａ〜Ｃ）。注射後１または５カ月において、ＡＡＶ２／１−ヌルで処置した動物と比較した場合、ＧＦＡＰ陽性の星状細胞の数（免疫組織化学によって可視化された）またはＧＦＡＰのｍＲＮＡのレベル（ＱＰＣＲによって定量した）のいずれかにおける特筆すべき増加は、注射された領域で観察されなかった（図５Ｄ〜Ｆ；図５Ｊ）。しかしながら、注射後１カ月で、線条体におけるＩｂａ−１免疫染色（図５Ｈ）およびＩｂａ−１のｍＲＮＡレベルの増加によって証明されたように、活性化された小グリア細胞の数の増加が記録された（図５Ｋ）。興味深いことに、注射後５カ月で小グリア細胞の活性化は対照レベルに戻ったことから（図５Ｉおよび５Ｋ）、応答は一過性であったことが示唆される。理論に制限されることは望まないが、この研究で使用されたＡＡＶ２／１−ヌル対照ベクターはｅＧＦＰ遺伝子を内包していなかったことから、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−ＨｔｔからのｅＧＦＰの発現は一過性の小グリア細胞の活性化に関与する可能性があると考えられる。
総合すると、これらの結果は、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔは、インビトロだけでなくＹＡＣ１２８マウスの線条体でも持続的なＨｔｔサイレンシングを媒介することが可能であるという発見を裏付け拡張する。さらに、最大５カ月のＨｔｔレベルの部分的な抑制は、マウス脳において明白な毒性または神経炎症を引き起こさなかった。
実施例４：ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔの線条体の送達は、ＹＡＣ１２８マウスにおいて異常な行動および神経化学的なプロファイルを修正する。
ＨＤのＹＡＣ１２８マウスモデルに存在するよく特徴付けられた表現型の欠陥に対するＡＡＶが媒介する突然変異Ｈｔｔレベル低減の影響も、実施例１に記載の方法に従って検査した。ＹＡＣ１２８マウスは、３月齢から始まる運動協調性の欠陥（これは、ロータロッド試験を使用して解明することができる）およびうつ状態の表現型（ポーソルト水泳試験を使用して）を示すことが報告されている（Ｓｌｏｗら、（２００３）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：１５５５〜１５６７；Ｖａｎ Ｒａａｍｓｄｏｎｋら、（２００７）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ ２６：１８９〜２００）。
結果
年齢を適合させた（２月齢）ＹＡＣ１２８および野生型同腹子マウスに、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−ＨｔｔまたはＡＡＶ２／１−ヌルベクターのいずれかの両側の線条体内注射を行い、次いで処置後の３カ月に殺した（図６Ａ）。予想通りに、脳断片の分析から、これまで観察されたように線条体全体にわたり領域を取り囲んでｅＧＦＰ発現が実証された（図６Ｂ）。脳ホモジネートのウェスタンブロット分析から、突然変異ヒトおよび内因性マウスＨｔｔタンパク質の両方のレベルが、ＡＡＶ２／１−ヌルで処置された対照と比較した場合、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔが注射されたＹＡＣ１２８および野生型マウスの線条体において有意に低減した（およそ５５％の低減、ｐ＜０．０１）ことが示された（図６ＣおよびＤ）。リアルタイム定量ＰＣＲ分析から、ｍＲＮＡレベルにおける同程度の低減も達成されたことが示された。
注射後２カ月におけるＡＡＶ２／１−ヌルで処置したＹＡＣ１２８マウスのロータロッド試験から、ＡＡＶ２／１−ヌルまたはＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔで処置した野生型同腹子と比較した場合、有意な運動協調性の欠陥が示された（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０１）（図６Ｅ）。しかしながら、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔで処置されたＹＡＣ１２８マウスは、野生型マウスの性能レベルと区別できないほどの性能レベルを示した（ＡＮＯＶＡ、テューキーの事後検定；ＷＴ Ｈｔｔ対ＹＡＣ１２８Ｈｔｔ、ｐ＝ＮＳ；ＷＴヌル対ＹＡＣ１２８ヌル、ｐ＜０．０５）。したがって、突然変異Ｈｔｔレベルの部
分的な低下は、ＹＡＣ１２８マウスの運動障害を修正するのに十分であった。ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔを受けた野生型マウスとＡＡＶ２／１−ヌルを受けた野生型マウスとのロータロッド性能において有意差はなかった。
以前の報告から、ＹＡＣ１２８マウス（３月齢から始めて）は、ポーソルト水泳試験を使用して検出できるうつ状態の表現型を示すことが示された（Ｐｏｕｌａｄｉら、（２００９）Ｂｒａｉｎ １３２：９１９〜９３２）。水の容器中に置かれたとき動物が長期間無動である場合、動物は、うつ状態を示すとみなされる。基本的な水泳速度試験を使用して（この場合、プラットフォームに到達するまでの水泳潜時が測定された）、研究者は、このポーソルト水泳試験におけるうつ状態の表現型は、ＹＡＣ１２８マウスの水泳能力と関連せず、このモデルで観察された十分に立証された運動協調性の欠陥から無関係であったことを実証した（Ｐｏｕｌａｄｉら、（２００９）Ｂｒａｉｎ １３２：９１９〜９３２）。２月齢のＹＡＣ１２８およびＷＴ同腹子マウスに、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ−またはＡＡＶ２／１−ヌルベクターを注射し、３カ月後、ポーソルト水泳試験で試験した。未処置ＹＡＣ１２８マウスは、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔで処置したＹＡＣマウスまたはＡＡＶ２／１−ヌルで処置した野生型動物のいずれかと比較した場合、無動状態の期間が増加したことを示した（図６Ｆ；ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５）。この場合も、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−ＨｔｔまたはＡＡＶ２／１−ヌルのいずれかを受けた野生型マウスの性能において有意差はなかった。ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔが注射されたＹＡＣ１２８マウスは、ＡＡＶ２／１−ヌルで処置された対照より有意に短い時間を無動状態に費やした。実際に、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔで処置したＹＡＣ１２８マウスの性能は、それらの野生型同腹子の性能と類似していたことから、この異常な表現型がほぼ完全に修正されたことが示唆される（ＡＮＯＶＡ、テューキーの事後検定；ＹＡＣ Ｈｔｔ対ＹＡＣヌル、ｐ＜０．０５）（図６Ｆ）。
実施例５：ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔを使用した処置は、ＹＡＣ１２８マウスにおいてＤＡＲＰＰ−３２およびＤ１受容体の転写調節異常を部分的に修正する。
ＨＤの脳において、線条体で富化されている多数の遺伝子の転写調節異常が観察されている（Ｒｉｃｈｆｉｅｌら、（１９９５）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３７：３３５〜３４３；Ａｕｇｏｏｄら、（１９９７）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４２：２１５〜２２１；Ｓｕｇａｒｓら、（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４９８８〜４９９９；Ｄｅｓｐｌａｔｓら、（２００６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９６：７４３〜７５７）。この異常はまた、ＹＡＣ１２８マウスにおいても、例示されたように、特定には、野生型動物のレベルと比較してそれらの有意に低いＤＡＲＰＰ−３２およびＤ１ドーパミン受容体の線条体のレベルによって明白である（Ｐｏｕｌａｄｉら、（２０１２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２２１９〜２２３２）。ＹＡＣ１２８マウスにおけるＨｔｔレベルの抑制がこの変更された転写プロファイルを修正したかどうかを検査するために、実施例１に記載の方法に従って２月齢のときにＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔで処置して３カ月後に分析したＹＡＣ１２８マウスの線条体組織に、リアルタイム定量ＰＣＲ分析を実行した。
結果
ＡＡＶ２／１−ヌルで処置したＹＡＣ１２８マウスの脳抽出物の分析から、ＤＡＲＰＰ−３２およびＤ１ドーパミン受容体（Ｄ１Ｒ）のｍＲＮＡレベルが、年齢を適合させた野生型対照と比較して有意に低かったことが示された（ＡＮＯＶＡ、テューキーの事後検定；ＷＴヌル対ＹＡＣ１２８ヌル、ｐ＜０．０５）（図７ＡおよびＢ）。ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔを投与したＹＡＣ１２８マウスは、ＡＡＶ２／１−ヌルベクターで処置したものより高いレベルのＤＡＲＰＰ−３２およびＤ１ＲのｍＲＮＡを示した；しかしながら、これらのレベルはそれでもなお野生型対照で観察されたレベルより低かった（ＡＮＯＶＡ、テューキーの事後検定；ＷＴヌル対ＹＡＣ Ｈｔｔ、ｐ＝ＮＳ）。したがって、ＹＡＣ１２８マウスにおけるＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔが媒介するＨｔｔレベル
の低減は、異常な線条体の転写プロファイルの部分的な修正をもたらした。その後のタイムポイント（処置後５カ月より後）における検査により、この異常なプロファイルのより完全な修正が明らかになる可能性がある。
まとめると、これらの結果は、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔは、Ｈｔｔレベルの持続的な低下を媒介することが可能であるという初期のインビトロおよびインビボでの発見を裏付ける。重要なことに、このＹＡＣ１２８マウスにおける線条体のＨｔｔレベルの低減は、運動機能および挙動における測定可能な改善に加えて、線条体におけるよく特徴付けられた転写調節異常の部分的な修正をもたらすことが実証された。
実施例６：ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔの線条体の送達は、ＹＡＣ１２８マウスの脳においてＨｔｔの凝集を低減する。
ＣＮＳにおけるＨｔｔの凝集体および封入体の出現は、ＨＤの神経病理学的な特徴である。ＨＤマウスにおいてこれらの凝集体のレベルを低くすることは、病理学における特筆すべき改善との相関が示されてきた（Ｈａｒｐｅｒら、（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：５８２０〜５８２５；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｅｂｒｏｎら、（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：６１８〜６３３）。ＹＡＣ１２８マウスモデルは、１２月齢までに線条体においてＨｔｔ凝集体の有意な広範にわたる蓄積を示すことが報告されている（Ｓｌｏｗら、（２００３）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：１５５５〜１５６７、Ｐｏｕｌａｄｉら、（２０１２）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２２１９〜２２３２）。ＹＡＣ１２８マウスにおけるＨｔｔ凝集体に対するＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ送達の影響を実施例１に記載の方法に従って検査した。
結果
抗Ｈｔｔ抗体ＥＭ４８を使用した６、９、および２４月齢のＹＡＣ１２８マウスの脳断片の免疫組織化学的染色から、６月齢もの早期において、時間と共に進行する線条体および皮質の両方での凝集体の証拠が示された（図８Ａ）。１２月齢の組織（１６マイクロメートルの凍結断片）も分析したところ、２４月齢コホートと類似の程度の凝集物があることが示されたが、凍結断片における非特異的なバックグラウンドの染色が、ビブラトーム断片より有意に多かった（データ示さず）。
突然変異ＨｔｔレベルのＡＡＶが媒介する低減が、症候を示した後のＹＡＣ１２８マウス（７月齢）の脳におけるＨｔｔ凝集体蓄積の程度を低下させ、順に運動および行動の欠陥を修正するかどうかを検査するために、マウスに、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−ＨｔｔまたはＡＡＶ２／１−ＧＦＰのいずれかの両側の線条体内注射を行った。注射後３カ月に（動物は１０月齢であった）動物をロータロッドでの試験に供し、注射後５カ月で（マウスが１２月齢のとき）殺した（図８Ｂ）。ロータロッド上のＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔで処置したＹＡＣ１２８マウスは、それらの野生型同腹子の能力に匹敵する能力のレベルを示した（図８Ｃ；ＡＮＯＶＡ、テューキーの事後検定；ｐ＝ＮＳ）。しかしながら、これらの結果は、研究で使用されたマウスの数が少なかったために統計的有意性に達しなかった（Ｎ＝４匹のＷＴ；Ｎ＝６匹のＹＡＣ１２８）。ＥＭ４８抗体を使用した線条体断片の免疫組織化学的染色は、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔで処置されたＹＡＣ１２８マウスにおいて、ＡＡＶ２／１−ＧＦＰで処置されたＹＡＣ１２８マウスより有意に少ないＨｔｔ凝集体の存在を示した（図８Ｄ）。ＡＡＶ−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔで処置したＹＡＣ１２８マウスの脳は、野生型マウスの脳と本質的に区別できなかった。
観察されたＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔによる凝集体の低減はニューロンの損失または起こり得る神経毒性に起因するものではないことを確認するために、Ｈ＆Ｅ染色に加えて、ＮｅｕＮ（ニューロンマーカー）、ＧＦＡＰ（星状細胞マーカー）、およびＩｂａ１（小グリア細胞マーカー）に関する免疫組織化学的染色を隣接する矢状方向の脳断片
に実行した。ＡＡＶ−２／１−ヌルが注射された対照と比較して、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔが注射された動物は、蛍光顕微鏡法により、線条体において同じ存在度のＮｅｕＮ陽性ニューロンを示した。光学顕微鏡を使用して、隣接する冠状の脳断片のＨ＆Ｅ染色も正常であることが明らかになり、このニューロンの損失がないということを裏付ける証拠がもたらされた；しかしながら、立体解析学は実行されなかったため、これらの結果は定量できなかった。加えて、初期の研究で観察されたように、注射後５カ月のＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔで処置したマウスにおけるＧＦＡＰまたはＩｂａ−１染色のいずれかの増加は検出されなかった。
結論
本発明の研究から、突然変異Ｈｔｔレベルを低くすることは、ＨＤの治療戦略であることが示され、線条体における突然変異Ｈｔｔの部分的な低減は、ＨＤの完全トランスジェニックマウスモデルであるＹＡＣ１２８マウスモデルにおいて行動に関する、生化学的な、および神経病理学的な改善をもたらしたことが実証された。この治療戦略を評価することにおけるこれまでの試みは、突然変異ＨＴＴ遺伝子のフラグメントを内包するマウスモデル、例えばＲ６／１およびＮ１７１〜８２Ｑ ＨＤマウス（Ｈａｒｐｅｒら、（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：５８２０〜５８２５、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｅｂｒｏｎら、（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：６１８〜６３３、Ｍａｃｈｉｄａら、（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４３：１９０〜１９７）で実行された。突然変異Ｈｔｔのレベルにおける部分的な低減は、Ｎ１７１〜８２Ｑ ＨＤマウスモデルなどのより重症のモデルの一部では適度な延命効果をもたらしたが、他のモデル（例えば、Ｒ６／１マウスモデル）ではそうではなかった（Ｈａｒｐｅｒら、（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：５８２０〜５８２５、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｅｂｒｏｎら、（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：６１８〜６３３、Ｍａｃｈｉｄａら、（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４３：１９０〜１９７）。ロータロッドおよび歩幅試験を使用したこれらの研究において、運動の改善も特筆された；しかしながら、これらのモデルの重症度のために、行動に関する、神経病理学的な、および生化学的な異常に対する処置の長期的評価は除外された。
本発明の研究は、進行性の運動異常および年齢依存性の神経病理学的状態を発症するＹＡＣ１２８マウスモデル（このモデルは、１２８個のＣＡＧリピートを含有する突然変異ヒトＨＴＴ遺伝子を内包する）を利用した。他のＨＤマウスモデルと比較して、ＹＡＣ１２８マウスは、ヒト疾患の突出した遺伝学的および臨床的な特徴を再現するため、これらは治療効能を試験するのによく適している。ＹＡＣ１２８マウスにおける自然な病歴関連の変化は明確であり、この動物は、表現型において動物間の変動が低い一様の疾患特徴を示す。ＹＡＣ１２８マウスは、変更された線条体の転写プロファイルを展開するが、これは、ＢＡＣ ＨＤマウスなどの他の類似のマウスモデルで観察されない特色であり（Ｐｏｕｌａｄｉら、（２０１２）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２２１９〜２２３２）、年齢依存性の線条体の神経変性を示す。そのようなものとして、このモデルにおける治療的介入の試験および結果の測定は、臨床的な解釈のためのより高い予測的価値を有し得る（Ｓｌｏｗら、（２００３）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：１５５５〜１５６７）。
ＹＡＣ１２８マウスを使用して、これらの研究から、突然変異ヒトＨｔｔを標的化するｍｉＲＮＡのＡＡＶ２／１が媒介する発現は、ＨｔｔのｍＲＮＡおよびタンパク質の線条体のレベルにおける有意な低減をもたらしたことが実証された。この厄介な物体を少なくすることは、処置後５カ月におけるロータロッドおよびポーソルト水泳試験を使用して評価されたように、機能における有意な改善に加えて、線条体内におけるＨｔｔ凝集体の有意な低減に関連していた。特筆すべきことに、これらの研究で観察されたＨｔｔ低減のレ
ベルは、対照のおよそ４０％に過ぎなかったことから、突然変異Ｈｔｔの部分的な低減は、このマウスモデルにおいて有意な治療的な利益を生じさせるのに十分であったことが示される。さらに、ＡＡＶベクターでの線条体の８０％の形質導入は、部分的なＨｔｔの低減のみをもたらした。類似の現象が培養中のＨＥＫ２９３細胞で見られ、この場合、およそ９０〜９５％の形質導入効率は、内因性Ｈｔｔレベルにおける結果的な４０〜５０％の低減のみをもたらした（図２Ａ〜Ｄを参照）。これらの発見は、匹敵するｍｉＲＮＡベースのサイレンシング戦略を使用したところ、Ｈｔｔレベルの部分的な低減のみを示したげっ歯類および霊長類における以前の研究と一致する（ＭｃＢｒｉｄｅら、（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：５８６８〜５８７３；Ｂｏｕｄｒｅａｕら、（２００９ｂ）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１０５３〜１０６３；ＭｃＢｒｉｄｅら、（２０１１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９：２１５２〜２１６２；Ｇｒｏｎｄｉｎら、（２０１２）Ｂｒａｉｎ １３５：１１９７〜１２０９）。理論に制限されることは望まないが、なぜｍｉＲＮＡのみが形質導入された領域で部分的な標的ノックダウンを生じるかに関して多数の考えられる仮説がある。Ｈｔｔサイレンシングを媒介するのに使用されるｍｉＲＮＡステム−ループ様式は、機能的な低分子干渉ＲＮＡが生成される前に細胞によるプロセシングを必要とする。したがって、この細胞プロセシングに関する必要条件は、ｍｉＲＮＡベースのヘアピンによってもたらされたＲＮＡサイレンシングの程度に自然の制限を課す可能性がある。Ｂｏｕｄｒｅａｕらによる報告（Ｂｏｕｄｒｅａｕら、（２００９ａ）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１６９〜１７５）は、哺乳類の脳における治療的サイレンシングのためのｍｉＲＮＡベースのプラットフォームの改善された安全性を説明しており、従来の短鎖ヘアピン構造と比較してｍｉＲＮＡの改善された毒性プロファイルを強調した。この安全性の改善は、内因性細胞プロセシングメカニズムへのｍｉＲＮＡの依存に起因する可能性がある（Ｂｏｕｄｒｅａｕら、（２００９ａ）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１６９〜１７５）。これらの提唱されている仮説にもかかわらず、脳におけるｍｉＲＮＡベースのＨｔｔサイレンシングを支える正確なメカニズムに関しては未だにわかっていないが、本明細書で提示されたデータは、少なくともＨＤのマウスモデルにおいて、部分的なＨｔｔの低減が治療的な利益を達成できることを実証する。
Ｈｔｔの機能的役割は不明瞭なままであるため、対立遺伝子特異的ではないサイレンシングをもたらす治療戦略の展開に伴う明白な懸念がある。本明細書で開示された研究から、最大５カ月にわたる野生型マウスに加えて罹患したＹＡＣ１２８マウスのＣＮＳにおける内因性マウスＨｔｔの部分的な低下も同様に許容されることが示された。ＡＡＶ−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔの投与は、野生型マウスおよび突然変異ヒトＨｔｔをおよそ４０％低下させたことから、突然変異毒性Ｈｔｔをサイレンシングする治療的な利益を維持しながらも野生型Ｈｔｔレベルの少なくとも６０％の保存を可能にした。明白な毒性または異常な行動は観察されなかった。現在のデータは、ＨＤマウスおよび野生型マウスにおける対立遺伝子特異的ではないＨｔｔをサイレンシングした後、処置後最大９カ月にわたり同様に毒性がなかったことを示す以前の研究と一致する（Ｂｏｕｄｒｅａｕら、（２００９ｂ）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１０５３〜１０６３）。野生型Ｈｔｔの部分的な抑制の安全性はまた、非ヒト霊長類でも報告されており（ＭｃＢｒｉｄｅら、（２０１１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９：２１５２〜２１６２；Ｇｒｏｎｄｉｎら、（２０１２）Ｂｒａｉｎ １３５：１１９７〜１２０９）、正常なＨｔｔのレベルの部分的な低下は、有意な有害帰結を引き起こさない可能性があるというさらなる信頼性を提供する。この研究はさらに、ＹＡＣ１２８マウスにおける突然変異および野生型Ｈｔｔ両方の部分的な抑制（約４０％）は、それらの様々な行動試験に対する性能によって証明されるように治療効果があり、いかなる明白な有害問題にも関連しなかったことを実証する。以前の報告から、胚形成および出生後の神経形成におけるＨｔｔの役割が示唆された（Ｂｈｉｄｅら、（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：５５２３〜５５３５；Ｒｅｉｎｅｒら、（２００３）Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２８：２５９〜２７６；Ｃａｔｔａｎｅｏら、（２００５）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：９１９〜９３０）。しかしながら、これまでの数々の前
臨床研究から、成体の脳中で野生型Ｈｔｔレベルを部分的に低減することは、マウスおよび非ヒト霊長類の両方において十分許容されるようであることが実証される（Ｂｏｕｄｒｅａｕら、（２００９ｂ）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１０５３〜１０６３；ＭｃＢｒｉｄｅら、（２０１１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９：２１５２〜２１６２；Ｇｒｏｎｄｉｎら、（２０１２）Ｂｒａｉｎ １３５：１１９７〜１２０９）。
マウスモデルおよびヒト患者の両方におけるＨＤ病理の特筆すべき特徴は、突然変異Ｈｔｔ免疫反応性（ＩＲ）の凝集体の存在である（ＤｉＦｉｇｌｉａら、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１９９０〜１９９３；Ｓｃｈｅｒｚｉｎｇｅｒら、（１９９７）Ｃｅｌｌ ９０：５４９〜５５８）。ＨＤにおける病態生理学的な事象のカスケードにおける凝集体の正確な役割は目下議論中であり（Ｌａｎｓｂｕｒｙら、（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４３：７７４〜７７９）、突然変異Ｈｔｔの凝集体と疾患との因果関係の示唆は、依然として論争の的になっている（Ｂａｔｅｓ、（２００３）Ｌａｎｃｅｔ ３６１：１６４２〜１６４４；Ａｒｒａｓａｔｅら、（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３１：８０５〜８１０）。しかしながら、不溶性のタンパク質凝集体の形成は、細胞分解プロセスへの負担増加を引き起こすという意見は一致している（Ｙａｍａｍｏｔｏら、（２０００）Ｃｅｌｌ １０１：５７〜６６）。本明細書で開示された研究から、ＹＡＣ１２８マウスは、６月齢もの早期における（これまで報告されているものより早期における）広範にわたる線条体の凝集を示し、７月齢（凝集体がすでに形成された後）でのＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔの注射は、線条体内のＥＭ４８陽性のＨｔｔ凝集体の数を、ほぼ野生型レベルに有意に低下させたことが実証された。これらのデータから、理論に制限されることは望まないが、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ処置は、Ｈｔｔの利用可能なプールを減らす可能性があることから、有意に突然変異Ｈｔｔ凝集体の負担を軽減し、したがってこのマウスモデルにおいて指摘された機能的な改善に寄与する可能性があることが示唆される。
Ｈｔｔ凝集体の実質的な除去に加えて、ＡＡＶ−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ処置もＹＡＣ１２８マウスにおいて行動に関する利益をもたらした。ＹＡＣ１２８マウスは、３月齢で開始したロータロッドで欠陥を示し始め、７カ月までに重度の障害を示す（Ｓｌｏｗら、（２００３）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：１５５５〜１５６７）。７月齢（運動協調性が有意に損なわれていると予想されるとき）にＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔで処置したＹＡＣ１２８マウスは、ロータロッド試験で改善を示したことから、確立された運動障害の逆転が達成されたことが示唆される。これまでにＨｔｔ凝集体の低減が報告されているが（Ｎ１７１およびＲ６／２フラグメントモデル）（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｅｂｒｏｎら、（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：６１８〜６３３；Ｍａｃｈｉｄａら、（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４３：１９０〜１９７）、本発明の研究は、ＨＤの全長マウスモデルにおいて凝集の緩和とそれに付随する行動に関する改善を実証する。線条体へのＡＡＶ−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ注射後のポーソルト水泳試験における有意な改善も観察された。これは、ＡＡＶ−ＲＮＡｉ後におけるこのうつ状態の表現型における改善を示す最初の報告であり、重要なことに、これらの結果は、理論に制限されることは望まないが、線条体におけるＨｔｔレベルの低減は、ＹＡＣ１２８モデルで示されたうつ状態の表現型を改善するのに十分であったことを示唆する。最終的に、７月齢のＹＡＣ１２８マウスをＡＡＶ−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔで処置したとき（症候を示した後の処置）、線条体におけるＨｔｔ凝集体の有意な低減およびこのモデルによって示される運動協調性欠陥の起こり得る逆転が観察された。理論に制限されることは望まないが、これらのデータから、症候を示した後のＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ処置は、細胞中のｍＨｔｔの負担を軽減する可能性があり、ｍＨｔｔ凝集体が形成された後でさえも治療的な利益を提供することが示される。
線条体Ｈｔｔの抑制はまた、ＹＡＣ１２８マウスおよびヒトＨＤ患者において加齢に伴
い次第に衰退する２つの転写物であるＤＡＲＰＰ−３２およびＤ１受容体のｍＲＮＡレベルの適度な修正ももたらした。突然変異Ｈｔｔは、多数の細胞プロセスを混乱させてニューロンの機能不全および転写調節異常を引き起こすことが公知である（Ｃｈａ、（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：３８７〜３９２）。
まとめると、これらの研究から、ＡＡＶ媒介ＲＮＡｉが、ＨＤのＹＡＣ１２８マウスモデルにおいてＨＤ関連の行動異常を有意に改善させることが実証される。さらには、Ｈｔｔを標的化するｍｉＲＮＡのＡＡＶ媒介送達は、明白な毒性を起こすことなく、Ｈｔｔレベルの持続的な抑制、細胞および神経病理学的な異常の修正、ならびにＨＤのトランスジェニックマウスモデルにおける運動および行動の欠陥の改善をもたらすことができることも示される。
ｓｈＲＮＡの塩基対形成の改変によって改善されたＲＮＡｉ
本発明の研究は、Ｈｔｔ遺伝子はｍｉＲＮＡ足場（ｍｉＲ−１５５）に埋め込まれたのに対して、短鎖ヘアピンをコードするのに組換えＡＡＶ２／１ベクターを利用した。使用されたｓｈＲＮＡ配列は、以前の公開された配列の、マウスおよびヒトｈｔｔ転写物のエクソン２を標的化するｍｉｒＲ２．４から改変したものであった（ＭｃＢｒｉｄｅら、（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：５８６８〜５８７３）。短鎖ヘアピンＲＮＡの改変は、安定性および生物活性を増加させ、オフターゲット作用を最小化し、先天性免疫応答を低減するのに使用されてきた（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏら、（２００９）Ｎａｔｕｒｅ ４５７：４２６〜４３３；Ｊａｃｋｓｏｎら、（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．９：５７〜６７）。本発明の研究で使用された改変された配列は、ｍｉＲ２．４と同じガイド鎖配列を含有していた（図９Ａ）；しかしながら、シード配列の３’末端に、ガイド鎖に対応するチミンヌクレオチド（Ｔ）がない追加のアデニンヌクレオチド（Ａ）を有するようにコンストラクトを操作した（図９Ｂ）。理論に制限されることは望まないが、熱力学的なモデリングから、ガイド鎖におけるシード配列の反対側の非ガイド鎖におけるバルジ配列の追加は、ＲＮＡｉ性能の態様を改善できることが示唆される。したがって、本発明者らは、様々な障害を処置するための新規の形質転換可能な核酸による療法を生み出すのに使用できる進歩も開発した。
実施例７．オフターゲットの遺伝子サイレンシングの低減
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、多くのヒト疾患の処置のためのアプローチを提供する。しかしながら、ＲＮＡｉベースの療法の安全性は、オフターゲットの遺伝子サイレンシングとして公知の作用である、意図されないｍＲＮＡに結合してそれらの発現を低減する低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の能力によって妨げられる可能性がある。オフターゲティングは主として、シード領域（低分子ＲＮＡのヌクレオチド２〜８）が意図されないｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ中の配列と対合して、それらの転写物の翻訳の抑制および不安定化を指示するときに起こる。これまで、ほとんどの治療的ＲＮＡｉ配列は、主として遺伝子サイレンシング効能に関して選択され、安全性に関しては後で評価される。ここで、主要な神経変性障害であるハンチントン病（ＨＤ）を処置するためにｓｉＲＮＡを設計することにおいて、マウス脳において有力なサイレンシングを示し、低いインシリコでのオフターゲットプロファイルを有する、最小のオフターゲティング能を有する２つの新しい配列（すなわち、全ての公知のヒトおよびアカゲザル３’−ＵＴＲ内のシード相補物が希少なもの）を生成した。
Figure 2021118740
表１に、元のＰＳ１７０ＸＡのｍｉＲＮＡ配列およびこの配列の２つの改変された低オフターゲット型：１７０ＸＡＬ１および１７０ＸＡＬ２を示す。ＰＳ１７０ＸＡの２つの低オフターゲット型を、七量体内の塩基を塩基２〜８で置換してＣｐＧモチーフを作り出すことによって設計した。（Ｂｏｕｄｒｅａｕら、２０１２）。１７０ＸＡＬ１において２位の「Ａ」をＣに変更し（５’−ＵＣＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’）（配列番号１５）、１７０ＸＡＬ２において６位の「Ａ」を「Ｇ」に変更した（５’−ＵＡＧＡＣＧＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’）（配列番号１７）。これらの置換により、ＳｉＳＰＯＴＲアルゴリズム、すなわちオフターゲティングの可能性および有力なサイレンシング能力が最小の候補配列を同定する特異性に焦点を当てたｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムを使用してより有意に低いオフターゲットスコアを得た（Ｂｏｕｄｒｅａｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３年１月；４１（１）ｅ９）。ＳｉＳＰＯＴＲスコアの低減により、新しい配列が元の１７０ＸＡ配列と比較してより少数の可能性のあるヒトのオフターゲットを有することが予測されると予想された。
元のＰＳ１７０ＸＡのｍｉＲＮＡ配列は、５’−ＵＡＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１）である。ガイド鎖、改変されたｍｉｒ−１５５内部ループ（マウス）、およびパッセンジャー鎖を包含する以下の配列を、発現ベクターにクローニングした：５’ＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＴＴＣＡＣＡＣＧＧＴＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＡＣＣＧＴＧＴＧＴＣＡＴＴＧＴＣＴＡＡ−３’（配列番号１９）。追加の「Ａ」は、３’末端に包含される。ガイドおよびパッセンジャー鎖は、太字で示され、ガイド鎖の塩基１１および１２は、パッセンジャー鎖において逆相補物を有さず、プロセシングされた成熟二重鎖中に小さい内部ループを作り出す。１７０ＸＡＬ１において２位の「Ａ」をＣに変更し、１７０ＸＡＬ２において６位の「Ａ」を「Ｇ」に変更し、それ以外において１７０ＸＡＬ１および１７０ＸＡＬ２は、元のＰＳ１７０ＸＡと同じ構造を有していた。図１０に構造を示す。
インビトロでのヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞におけるＨｔｔの低減を媒介するＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ １７０ＸＡＬ１および１７０ＸＡＬ２の能力を試験した。ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ １７０ＸＡＬ１および１７０ＸＡＬ２発現プラスミドに加えて非コードｍｉＲＮＡ配列を含有する対照プラスミド（ＣＴＬ３）で、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした（処置ごとに８つの複製）。Ｆｕｇｅｎｅトランス
フェクション試薬を使用して細胞をトランスフェクトし、４８時間後に回収した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して全ＲＮＡを単離した。定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡレベルを測定した（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７５００シーケンスデテクター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で遂行し、分析した）。発現レベルをヒトＰＰＩＡ（ペプチジルプロリルイソメラーゼ）に正規化した。１７０ＸＡＬ２および１７０ＸＡＬ２プラスミドの両方でのトランスフェクション後、ヒトＨｔｔのｍＲＮＡレベルは、ＣＴＬ３および未処置対照と比較して低下したが、この低減は、統計的有意性に達しなかった（図１１）。
ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ １７０ＸＡＬ１および１７０ＸＡＬ２の、ＹＡＣ１２８マウスの線条体におけるＨｔｔ発現をサイレンシングする能力を評価した。成体ＹＡＣ１２８マウスは、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ １７０ＸＡ（２Ｅ１０ｖｇ／部位）、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ １７０ＸＡＬ１（２Ｅ１０ｖｇ／部位）、またはＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ １７０ＸＡＬ２（３Ｅ１０ｖｇ／部位）の両側の線条体内注射を受けた。元のＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ １７０ＸＡは、陽性対照として役立ち、一方で別の未処置グループ（注射なし）は、陰性対照として役立てた。注射後の１カ月に、動物を殺し、ＰＢＳで潅流した。組織学および生化学分析のために脳を収集した。生化学分析のために、１つの半球の線条体領域を顕微解剖し、液体窒素中で急速冷凍した。突然変異ヒトおよびマウスＨｔｔのｍＲＮＡおよびタンパク質の線条体のレベルを、それぞれＱＰＣＲおよびウェスタンブロットによって評価した。突然変異ヒトＨｔｔおよびマウスＨｔｔのｍＲＮＡは、未処置対照動物と比較した場合、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ １７０ＸＡＬ１およびＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ １７０ＸＡＬ２が注射されたマウスにおいて有意に低減した（図１２Ａおよび１２Ｂ）。ＰＰＩＡは、全てのＱＰＣＲアッセイで正規化の対照遺伝子として役立てた。突然変異ヒトおよびマウスＨｔｔタンパク質は、未処置対照動物と比較した場合、全てのＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔが注射されたマウスにおいて有意に低減し、全ての処置にわたり同程度の低減（およそ５０％、ｐ＜０．０５）を記録した（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。
本発明者らのＡＡＶ−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔベクターの注射後にこれらの炎症性マーカー遺伝子が上方調節されたかどうかを決定するためのＱＰＣＲによる線条体におけるＧＦＡＰおよびＩｂａ１のｍＲＮＡレベルを評価した。ＧＦＡＰは、アストログリオーシスのマーカーであり、Ｉｂａ１は、小グリア細胞の活性化に関するマーカーとして役立つ。本発明者らは、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ １７０ＸＡの線条体内注射は、注射１カ月の線条体におけるＧＦＡＰのｍＲＮＡ（図１３Ａ）およびＩｂａ１のｍＲＮＡ（図１３Ｂ）レベルの有意な増加をもたらすことを実証した。ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ
１７０ＸＡＬ１またはＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ １７０ＸＡＬ２の注射後、ＧＦＡＰまたはＩｂａ１のいずれかの増加は観察されず、ＧＦＡＰおよびＩｂａ１のｍＲＮＡレベルは未処置対照と同等であった。ヒトＰＰＩＡは、正規化の対照遺伝子として役立てた。値は平均±ＳＥＭとして示される。＊未処置の対照マウスと有意に異なる、ｐ＜０．０５；ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの事後検定。
注射後の１カ月にＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ １７０ＸＡＬ１またはＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ １７０ＸＡＬ２で処置したＹＡＣ１２８マウスからの線条体の組織断片のＧＦＡＰおよびＩｂａ１免疫組織化学的染色から、注射後、線条体においてＧＦＡＰおよびＩｂａ１タンパク質レベルは上昇しなかったことが確認された（図１４）。蛍光顕微鏡法を使用して、脳におけるＧＦＡＰおよびＩｂａ１免疫染色のレベルを評価した。ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ １７０ＸＡの線条体内注射は、蛍光顕微鏡法で見られるようにＧＦＡＰおよびＩｂａ−１免疫反応性の増加を引き起こしたが、本発明者らは、染色のレベルが未処置対照脳と同等であったＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ
１７０ＸＡＬ１またはＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ １７０ＸＡＬ２の注射後、
ＧＦＡＰまたはＩｂａ１免疫染色のどちらのいかなる増加も観察しなかった。スケールバー＝５０μＭ。
配列
全てのポリペプチド配列は、別段の指定がない限りＮ末端からＣ末端として提示される。全ての核酸配列は、別段の指定がない限り５’から３’として提示される。
ｍｉＲＮＡ ｈｔｔアンチセンス鎖
ＵＡＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ（配列番号１）
ｍｉＲＮＡパッセンジャー鎖の相補物
ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＡＡ（配列番号２）
センス標的配列
ＡＣＣＧＵＧＵＧＡＡＵＣＡＵＵＧＵＣＵＡＡ（配列番号３）
ｍｉＲＮＡ ｈｔｔアンチセンス鎖ＤＮＡ配列
ＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＴＴＣＡＣＡＣＧＧＴ（配列番号４）
ｍｉＲＮＡパッセンジャー鎖の相補物
ＡＣＣＧＴＧＴＧＴＣＡＴＴＧＴＣＴＡＡ（配列番号５）
センス標的配列
ＡＣＣＧＴＧＴＧＡＡＴＣＡＴＴＧＴＣＵＴＡＡ（配列番号６）
３Ａ１７０のＲＮＡ配列
ＵＧＣＵＧＵＡＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵＧＵＵＵＵＧＧＣＣＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＡＣＣＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＡＡＣＡＧＧ（配列番号７）
３Ａ１７０のＤＮＡ配列
ＴＧＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＴＴＣＡＣＡＣＧＧＴＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＡＣＣＧＴＧＴＣＡＴＴＧＴＣＴＡＡＣＡＧＧ（配列番号８）
ヒトＨｔｔのｍＲＮＡフォワードプライマー
Ｃｔｃｃｇｔｃｃｇｇｔａｇａｃａｔｇｃｔ（配列番号９）
ヒトＨｔｔのｍＲＮＡリバースプライマー
Ｇｇａａａｔｃａｇａａｃｃｃｔｃａａａｔｇｇ（配列番号１０）
ヒトＨｔｔのｍＲＮＡプローブ
Ｔｇａｇｃａｃｔｇｔｔｃａａｃｔｇｔｇｔｇｔａｔｃｇｇｇａ （配列番号１１）
ｓｃＡＡＶベクターのためのバリアントＡＡＶのＩＴＲ
ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧ（配列番号１２）。
完全ＡＡＶベクターゲノムのＤＮＡ配列
ｔｔｇｇｃｃａｃｔｃｃｃｔｃｔｃｔｇｃｇｃｇｃｔｃｇｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇａｇｇｃｃｇｇｇｃｇａｃｃａａａｇｇｔｃｇｃｃｃｇａｃｇｃｃｃｇｇｇｃｔｔｔｇｃｃｃｇｇｇｃｇｇｃｃｔｃａｇｔｇａｇｃｇａｇｃｇａｇｃｇｃｇｃａｇａｇａｇｇｇａｇｔｇｇｃｃａａｃｔｃｃａｔｃａｃｔａｇｇｇｇｔｔｃｃｔｇｇａｇｇｇｇｔｇｇａｇｔｃｇｔｇａｃａａｔｔｃｇｃｃｃｔｔｇｇｇｃｃｔａｇｇｃａａｔｔｇｇａｔｃｃｃｇｇａｃｃｇｔｃｇａｃａｔｔｇａｔｔａｔｔｇａｃｔａｇｔｔａｔｔａａｔａｇｔａａｔｃａａｔｔａｃｇｇｇｇｔｃａｔｔａｇｔｔｃａｔａｇｃｃｃａｔａｔａｔｇｇａｇｔｔｃｃｇｃｇｔｔａｃａｔａａｃｔｔａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｃｃａａｃｇａｃｃｃｃｃｇｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔａａｔｇａｃｇｔａｔｇｔｔｃｃｃａｔａｇｔａａｃｇｃｃａａｔａｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇｔｇｇａｇｔａｔｔｔａｃｇｇｔａａａｃｔｇｃｃｃａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃａａｇｔｇｔａｔｃａｔａｔｇｃｃａａｇｔａｃｇｃｃｃｃｃｔａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃａｔｔａｔｇｃｃｃａｇｔａｃａｔｇａｃｃｔｔａｔｇｇｇａｃｔｔｔｃｃｔａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃｔａｃ
ｇｔａｔｔａｇｔｃａｔｃｇｃｔａｔｔａｃｃａｔｇｇｔｃｇａｇｇｔｇａｇｃｃｃｃａｃｇｔｔｃｔｇｃｔｔｃａｃｔｃｔｃｃｃｃａｔｃｔｃｃｃｃｃｃｃｃｔｃｃｃｃａｃｃｃｃｃａａｔｔｔｔｇｔａｔｔｔａｔｔｔａｔｔｔｔｔｔａａｔｔａｔｔｔｔｇｔｇｃａｇｃｇａｔｇｇｇｇｇｃｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｃｇｃｇｃｇｃｃａｇｇｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇａｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇａｇｇｃｇｇａｇａｇｇｔｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｃｃａａｔｃａｇａｇｃｇｇｃｇｃｇｃｔｃｃｇａａａｇｔｔｔｃｃｔｔｔｔａｔｇｇｃｇａｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｃｃｔａｔａａａａａｇｃｇａａｇｃｇｃｇｃｇｇｃｇｇｇｃｇｇｇａｇｔｃｇｃｔｇｃｇｃｇｃｔｇｃｃｔｔｃｇｃｃｃｃｇｔｇｃｃｃｃｇｃｔｃｃｇｃｃｇｃｃｇｃｃｔｃｇｃｇｃｃｇｃｃｃｇｃｃｃｃｇｇｃｔｃｔｇａｃｔｇａｃｃｇｃｇｔｔａｃｔｃｃｃａｃａｇｇｔｇａｇｃｇｇｇｃｇｇｇａｃｇｇｃｃｃｔｔｃｔｃｃｔｃｃｇｇｇｃｔｇｔａａｔｔａｇｃｇｃｔｔｇｇｔｔｔａａｔｇａｃｇｇｃｔｔｇｔｔｔｃｔｔｔｔｃｔｇｔｇｇｃｔｇｃｇｔｇａａａｇｃｃｔｔｇａｇｇｇｇｃｔｃｃｇｇｇａｇｇｇｃｃｃｔｔｔｇｔｇｃｇｇｇｇｇｇａｇｃｇｇｃｔｃｇｇｇｇｇｇｔｇｃｇｔｇｃｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｃｇｔｇｇｇｇａｇｃｇｃｃｇｃｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｇｃｇｃｔｇｃｃｃｇｇｃｇｇｃｔｇｔｇａｇｃｇｃｔｇｃｇｇｇｃｇｃｇｇｃｇｃｇｇｇｇｃｔｔｔｇｔｇｃｇｃｔｃｃｇｃａｇｔｇｔｇｃｇｃｇａｇｇｇｇａｇｃｇｃｇｇｃｃｇｇｇｇｇｃｇｇｔｇｃｃｃｃｇｃｇｇｔｇｃｇｇｇｇｇｇｇｇｃｔｇｃｇａｇｇｇｇａａｃａａａｇｇｃｔｇｃｇｔｇｃｇｇｇｇｔｇｔｇｔｇｃｇｔｇｇｇｇｇｇｇｔｇａｇｃａｇｇｇｇｇｔｇｔｇｇｇｃｇｃｇｔｃｇｇｔｃｇｇｇｃｔｇｃａａｃｃｃｃｃｃｃｔｇｃａｃｃｃｃｃｃｔｃｃｃｃｇａｇｔｔｇｃｔｇａｇｃａｃｇｇｃｃｃｇｇｃｔｔｃｇｇｇｔｇｃｇｇｇｇｃｔｃｃｇｔａｃｇｇｇｇｃｇｔｇｇｃｇｃｇｇｇｇｃｔｃｇｃｃｇｔｇｃｃｇｇｇｃｇｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇｃａｇｇｔｇｇｇｇｇｔｇｃｃｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｃｇｃｃｔｃｇｇｇｃｃｇｇｇｇａｇｇｇｃｔｃｇｇｇｇｇａｇｇｇｇｃｇｃｇｇｃｇｇｃｃｃｃｃｇｇａｇｃｇｃｃｇｇｃｇｇｃｔｇｔｃｇａｇｇｃｇｃｇｇｃｇａｇｃｃｇｃａｇｃｃａｔｔｇｃｃｔｔｔｔａｔｇｇｔａａｔｃｇｔｇｃｇａｇａｇｇｇｃｇｃａｇｇｇａｃｔｔｃｃｔｔｔｇｔｃｃｃａａａｔｃｔｇｔｇｃｇｇａｇｃｃｇａａａｔｃｔｇｇｇａｇｇｃｇｃｃｇｃｃｇｃａｃｃｃｃｃｔｃｔａｇｃｇｇｇｃｇｃｇｇｇｇｃｇａａｇｃｇｇｔｇｃｇｇｃｇｃｃｇｇｃａｇｇａａｇｇａａａｔｇｇｇｃｇｇｇｇａｇｇｇｃｃｔｔｃｇｔｇｃｇｔｃｇｃｃｇｃｇｃｃｇｃｃｇｔｃｃｃｃｔｔｃｔｃｃｃｔｃｔｃｃａｇｃｃｔｃｇｇｇｇｃｔｇｔｃｃｇｃｇｇｇｇｇｇａｃｇｇｃｔｇｃｃｔｔｃｇｇｇｇｇｇｇａｃｇｇｇｇｃａｇｇｇｃｇｇｇｇｔｔｃｇｇｃｔｔｃｔｇｇｃｇｔｇｔｇａｃｃｇｇｃｇｇｃｔｃｔａｇａｇｃｃｔｃｔｇｃｔａａｃｃａｔｇｔｔｃａｔｇｃｃｔｔｃｔｔｃｔｔｔｔｔｃｃｔａｃａｇｃｔｃｃｔｇｇｇｃａａｃｇｔｇｃｔｇｇｔｔａｔｔｇｔｇｃｔｇｔｃｔｃａｔｃａｔｔｔｔｇｇｃａａａｇａａｔｔｃｔｔｃｇａａａｇａｔｃｔｇｃｔａｇｃｔｔａａｔｔａａｃｃｃｇｇｔｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇａｇｃｔｇｔｔｃａｃｃｇｇｇｇｔｇｇｔｇｃｃｃａｔｃｃｔｇｇｔｃｇａｇｃｔｇｇａｃｇｇｃｇａｃｇｔａａａｃｇｇｃｃａｃａａｇｔｔｃａｇｃｇｔｇｔｃｃｇｇｃｇａｇｇｇｃｇａｇｇｇｃｇａｔｇｃｃａｃｃｔａｃｇｇｃａａｇｃｔｇａｃｃｃｔｇａａｇｔｔｃａｔｃｔｇｃａｃｃａｃｃｇｇｃａａｇｃｔｇｃｃｃｇｔｇｃｃｃｔｇｇｃｃｃａｃｃｃｔｃｇｔｇａｃｃａｃｃｃｔｇａｃｃｔａｃｇｇｃｇｔｇｃａｇｔｇｃｔｔｃａｇｃｃｇｃｔａｃｃｃｃｇａｃｃａｃａｔｇａａｇｃａｇｃａｃｇａｃｔｔｃｔｔｃａａｇｔｃｃｇｃｃａｔｇｃｃｃｇａａｇｇｃｔａｃｇｔｃｃａｇｇａｇｃｇｃａｃｃａｔｃｔｔｃｔｔｃａａｇｇａｃｇａｃｇｇｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃｃｇｃｇｃｃｇａｇｇｔｇａａｇｔｔｃｇａｇｇｇｃｇａｃａｃｃｃｔｇｇｔｇａａｃｃｇｃａｔｃｇａｇｃｔｇａａｇｇｇｃａｔｃｇａｃｔｔｃａａｇｇａｇｇａｃｇｇｃａａｃａｔｃｃｔｇｇｇｇｃａｃａａｇｃｔｇｇａｇｔａｃａａｃｔａｃａａｃａｇｃｃａｃａａｃｇｔｃｔａｔａｔｃａｔｇｇｃｃｇａｃａａｇｃａｇａａｇａａｃｇｇｃａｔｃａａｇｇｔｇａａｃｔｔｃａａｇａｔｃｃｇｃｃａｃａａｃａｔｃｇａｇｇａｃｇｇｃａｇｃｇｔｇｃａｇｃｔｃｇｃｃｇａｃｃａｃｔａｃｃａｇｃａｇａａｃａｃｃｃｃｃａｔｃｇｇｃｇａｃｇｇｃｃｃｃｇｔｇｃｔｇｃｔ
ｇｃｃｃｇａｃａａｃｃａｃｔａｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃａｇｔｃｃｇｃｃｃｔｇａｇｃａａａｇａｃｃｃｃａａｃｇａｇａａｇｃｇｃｇａｔｃａｃａｔｇｇｔｃｃｔｇｃｔｇｇａｇｔｔｃｇｔｇａｃｃｇｃｃｇｃｃｇｇｇａｔｃａｃｔｃｔｃｇｇｃａｔｇｇａｃｇａｇｃｔｇｔａｃｃｃｔｇｇａｇｇｃｔｔｇｃｔｇａａｇｇｃｔｇｔａｔｇｃｔｇｔｔａｇａｃａａｔｇａｔｔｃａｃａｃｇｇｔｇｔｔｔｔｇｇｃｃａｃｔｇａｃｔｇａｃａｃｃｇｔｇｔｇｔｃａｔｔｇｔｃｔａａｃａｇｇａｃａｃａａｇｇｃｃｔｇｔｔａｃｔａｇｃａｃｔｃａｃａｔｇｇａａｃａａａｔｇｇｃｃａｔｇｃａｔｃｔａｇａｇｇｇｃｃｃｔａｔｔｃｔａｔａｇｔｇｔｃａｃｃｔａａａｔｇｃｔａｇａｇｃｔｃｇｃｔｇａｔｃａｇｃｃｔｃｇａｃｔｇｔｇｃｃｔｔｃｔａｇｔｔｇｃｃａｇｃｃａｔｃｔｇｔｔｇｔｔｔｇｃｃｃｃｔｃｃｃｃｃｇｔｇｃｃｔｔｃｃｔｔｇａｃｃｃｔｇｇａａｇｇｔｇｃｃａｃｔｃｃｃａｃｔｇｔｃｃｔｔｔｃｃｔａａｔａａａａｔｇａｇｇａａａｔｔｇｃａｔｃｇｃａｔｔｇｔｃｔｇａｇｔａｇｇｔｇｔｃａｔｔｃｔａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｇｔｇｇｇｇｔｇｇｇｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇｇｇｇａｇｇａｔｔｇｇｇａａｇａｃａａｔａｇｃａｇｇｃａｔｇｃｔｇｇｇｇａｇｃｔａｇａｇｔｃｇａｃｃｇｇａｃｃｇｇｔｇｇａａｇｔｃｃｔｃｔｔｃｃｔｃｇｇｔｇｔｃｃｔｔｇａｃｔｔｃａａａｇｇｇｔｃｔｃｔｃｃｃａｔｔｔｇｃｃｔｇｇａｇａｇａｇｇｇｇａａｇｇｔｇｇｇｃａｔｃａｃｃａｇｇｇｇｔｇａｇｔｇａａｇｇｔｔｔｇｇａａｇａｇｔｇｔａｇｃａｇａａｔａａｇａａａｃｃａｔｇａｇｔｃｃｃｃｔｃｃｃｔｇａｇａａｇｃｃｃｔｇａｇｃｃｃｃｃｔｔｇａｃｇａｃａｃａｃａｔｃｃｃｔｃｇａｇｇｃｔｃａｇｃｔｔｃａｔｃａｔｃｔｇｔａａａａｇｇｔｇｃｔｇａａａｃｔｇａｃｃａｔｃｃａａｇｃｔｇｃｃｇａａａａａｇａｔｔｇｔｇｔｇｇｇｇａｔａａｔｔｃａａａａｃｔａｇａｇｇａａｇａｔｇｃａｇａａｔｔｔｃｔａｃａｔｃｇｔｇｇｃｇａｔｇｔｃａｇｇｃｔａａｇａｇａｔｇｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｔｇｔｇｃａｔｔｔｔｔａｔｔｇｇａａｔｃａｔａｔｇｔｔｔａｔｔｔｇａｇｇｇｔｇｔｃｔｔｇｇａｔａｔｔａｃａａａｔａａａａｔｇｔｔｇｇａｇｃａｔｃａｇｇｃａｔａｔｔｔｇｇｔａｃｃｔｔｃｔｇｔｃｔａａｇｇｃｔｃｃｃｔｇｃｃｃｃｔｔｇｔｔａａｔｔｇｇｃａｇｃｔｃａｇｔｔａｔｔｃａｔｃｃａｇｇｇｃａａａｃａｔｔｃｔｇｃｔｔａｃｔａｔｔｃｃｔｇａｇａｇｃｔｔｔｃｃｔｃａｔｃｃｔｃｔａｇａｔｔｇｇｃａｇｇｇｇａａａｔｇｃａｇａｔｇｃｃｔｇａｇｃａｇｃｃｔｃｃｃｃｔｃｔｇｃｃａｔａｃｃａａｃａｇａｇｃｔｔｃａｃｃａｔｃｇａｇｇｃａｔｇｃａｇａｇｔｇｇａｃａｇｇｇｇｃｃｔｃａｇｇｇａｃｃｃｃｔｇａｔｃｃｃａｇｃｔｔｔｃｔｃａｔｔｇｇａｃａｇａａｇｇａｇｇａｇａｃｔｇｇｇｇｃｔｇｇａｇａｇｇｇａｃｃｔｇｇｇｃｃｃｃｃａｃｔａａｇｇｃｃａｃａｇｃａｇａｇｃｃａｇｇａｃｔｔｔａｇｃｔｇｔｇｃｔｇａｃｔｇｃａｇｃｃｔｇｇｃｔｔｇｃｃｔｃｃａｃｔｇｃｃｃｔｃｃｔｔｔｇｃｃｔｃａａｇａｇｃａａｇｇｇａｇｃｃｔｃａｇａｇｔｇｇａｇｇａａｇｃａｇｃｃｃｃｔｇｇｃｃｔｔｇｃｃｔｃｃｃａｃｃｔｃｃｃｃｔｃｃｃｃｔａｔｇｃｔｇｔｔｔｔｃｃｔｇｇｇａｃａｇｔｇｇｇａｇｃｔｇｇｃｔｔａｇａａｔｇｃｃｃｔｇｇｇｇｃｃｃｃｃａｇｇａｃｃｃｔｇｇｃａｔｔｔｔａａｃｃｃｃｔｃａｇｇｇｇｃａｇｇａａｇｇｃａｇｃｃｔｇａｇａｔａｃａｇａａｇａｇｔｃｃａｔｃａｃｃｔｇｃｔｇｔａｔｇｃｃａｃａｃａｃｃａｔｃｃｃｃａｃａｇｔｔａｃｇｔａｃｔａｇｔｔｃｇａａｇｃｃａｃｇｃｇｔｃｃｇａａｇｇｇｃｇａａｔｔｇｔａｇａｔａａｇｔａｇｃａｔｇｇｃｇｇｇｔｔａａｔｃａｔｔａａｃｔａｃａａｇｇａａｃｃｃｃｔａｇｔｇａｔｇｇａｇｔｔｇｇｃｃａｃｔｃｃｃｔｃｔｃｔｇｃｇｃｇｃｔｃｇｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇａｇｇｃｃｇｇｇｃｇａｃｃａａａｇｇｔｃｇｃｃｃｇａｃｇｃｃｃｇｇｇｃｔｔｔｇｃｃｃｇｇｇｃｇｇｃｃｔｃａｇｔｇａｇｃｇａｇｃｇａｇｃｇｃｇｃａｇａｇａｇｇｇａｇｔｇｇｃｃａａ
（配列番号１３）
ｍｉＲＮＡ足場のＤＮＡ配列
ｃｔｇｇａｇｇｃｔｔｇｃｔｇｇａｇｇｃｔｇｔａｔｇｃｔｇｔｔａｇａｃａａｔｇａｔｔｃａｃａｃｇｇｔｇｔｔｔｔｇｇｃｃａｃｔｇａｃｔｇａｃａｃｃｇｔｇｔｇｔｃａｔｔｇｔｃｔａａｃａｇｇａｃａｃａａｇｇｃｃｔｇｔｔａｃｔａｇｃａｃｔｃａｃａｔｇｇａａｃａａａｔｇｇｃｃ（配列番号１４）
１７０ＸＡＬ１ガイド（アンチセンス）
ＵＣＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ（配列番号１５）
１７０ＸＡＬ１非ガイド
ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＧＡＡ（配列番号１６）
１７０ＸＡＬ２ガイド（アンチセンス）
ＵＡＧＡＣＧＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ（配列番号１７）
１７０ＸＡＬ１非ガイド
ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＣＧＵＣＵＡＡ（配列番号１８）
１７０ＸＡ
ＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＴＴＣＡＣＡＣＧＧＴＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＡＣＣＧＴＧＴＧＴＣＡＴＴＧＴＣＴＡＡ（配列番号１９）

Claims (246)

  1. 第１の鎖および第２の鎖を含むＲＮＡｉであって、
    ａ）該第１の鎖および該第２の鎖は、二重鎖を形成し；
    ｂ）該第１の鎖は、少なくとも１９塩基のガイド領域を含み、該ガイド領域は、ガイド鎖の塩基１〜Ｎを含むシード領域を含み、Ｎ＝７またはＮ＝８であり；
    ｃ）該第２の鎖は、少なくとも１９塩基の非ガイド領域を含み、該非ガイド領域は、該二重鎖中の該ガイド領域の塩基１〜（Ｎ＋２）のいずれか１つまたはそれ以上の反対側に、バルジ配列を含む、前記ＲＮＡｉ。
  2. Ｎ＝７であり、バルジは、ガイド領域の塩基１、２、３、４、５、６、７、８、または９の反対側にある、請求項１に記載のＲＮＡｉ。
  3. Ｎ＝８であり、バルジは、ガイド領域の塩基１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の反対側にある、請求項１に記載のＲＮＡｉ。
  4. バルジは、ガイド領域の塩基１または塩基Ｎ＋２の反対側にある、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  5. 第１の鎖および第２の鎖を含むＲＮＡｉであって、
    ａ）該第１の鎖および該第２の鎖は、二重鎖を形成し；
    ｂ）該第１の鎖は、少なくとも１９塩基のガイド領域を含み、該ガイド領域は、ガイド鎖の塩基１〜Ｎを含むシード領域を含み、Ｎ＝７またはＮ＝８であり；
    ｃ）該第２の鎖は、少なくとも１９塩基の非ガイド領域を含み、該非ガイド領域は、該二重鎖中の該ガイド領域の塩基１〜（Ｎ＋１）のいずれか１つまたはそれ以上の反対側に、バルジ配列を含む、前記ＲＮＡｉ。
  6. Ｎ＝７であり、バルジは、ガイド領域の塩基１、２、３、４、５、６、７、または８の反対側にある、請求項５に記載のＲＮＡｉ。
  7. Ｎ＝８であり、バルジは、ガイド領域の塩基１、２、３、４、５、６、７、８、または９の反対側にある、請求項５に記載のＲＮＡｉ。
  8. バルジは、ガイド領域の塩基１または塩基Ｎ＋１の反対側にある、請求項５〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  9. 第１の鎖および第２の鎖を含むＲＮＡｉであって、
    ａ）該第１の鎖および該第２の鎖は、二重鎖を形成し；
    ｂ）該第１の鎖は、少なくとも１９塩基のガイド領域を含み、該ガイド領域は、ガイド鎖の塩基１〜Ｎを含むシード領域を含み、Ｎ＝７またはＮ＝８であり；
    ｃ）該第２の鎖は、少なくとも１９塩基の非ガイド領域を含み、該非ガイド領域は、該二重鎖中の該ガイド領域の塩基１〜Ｎのいずれか１つまたはそれ以上の反対側に、バルジ配列を含む、前記ＲＮＡｉ。
  10. Ｎ＝７であり、バルジは、ガイド領域の塩基１、２、３、４、５、６または７の反対側にある、請求項９に記載のＲＮＡｉ。
  11. Ｎ＝８であり、バルジは、ガイド領域の塩基１、２、３、４、５、６、７または８の反対側にある、請求項９に記載のＲＮＡｉ。
  12. バルジは、ガイド領域の塩基１または塩基Ｎの反対側にある、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  13. バルジは、ガイド領域の塩基１の反対側にある、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  14. バルジは、ガイド領域における相補的な塩基が欠失した、二重鎖中の非ガイド鎖の１つまたはそれ以上の塩基によって形成され、バルジに、ガイド鎖と対合する塩基が隣接する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  15. バルジは、１〜１０ヌクレオチドを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  16. バルジは、１〜３ヌクレオチドを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  17. ＲＮＡｉは、第２のバルジを含み、第２のバルジは、シード領域の３’に配置された第１の鎖のガイド領域に配置されている、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  18. 二重鎖は、１９〜２５または１９〜２３塩基対の長さである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  19. 第１および／または第２の鎖は、３’オーバーハング領域、５’オーバーハング領域、または３’および５’オーバーハング領域の両方をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  20. 第１の鎖および第２の鎖は、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーによって連結されている、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  21. ＲＮＡリンカーは、４〜５０ヌクレオチドを含む、請求項２０に記載のＲＮＡｉ。
  22. ループ構造は、４〜２０ヌクレオチドを含む、請求項２０または２１に記載のＲＮＡｉ。
  23. ５’から３’へ、第２の鎖、ＲＮＡリンカー、および第１の鎖を含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  24. ５’から３’へ、第１の鎖、ＲＮＡリンカー、および第２の鎖を含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  25. 配列は、オフターゲットの遺伝子サイレンシングを低減するように改善されている、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  26. 配列は、１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  27. 配列は、シード領域中に１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  28. 低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  29. 障害に関連するポリペプチドをコードするＲＮＡを標的化する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  30. 障害は、ＣＮＳ障害である、請求項２９に記載のＲＮＡｉ。
  31. 障害は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、ハンチントン病、てんかん、パーキンソン病、アルツハイマー病、卒中、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、大脳皮質基底核神経節変性症（ＣＢＧＤ）、前頭側頭認知症（ＦＴＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）または脳のがんである、請求項２９または３０に記載のＲＮＡｉ。
  32. 障害は、ハンチントン病である、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  33. ポリペプチドは、ハンチンチンである、請求項３２に記載のＲＮＡｉ。
  34. ハンチンチンは、ハンチントン病に関連する突然変異を含む、請求項３３に記載のＲＮＡｉ。
  35. ガイド領域は、配列５’−ＵＡＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１）を含み、非ガイド領域は、配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号２）を含む、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  36. ガイド領域は、配列５’−ＵＣＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１５）を含み、非ガイド領域は、配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＧＡＡ−３’（配列番号１６）を含む、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  37. ガイド領域は、配列５’−ＵＡＧＡＣＧＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１７）を含み、非ガイド領域は、配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＣＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号１８）を含む、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  38. ＲＮＡｉの毒性を低減する方法であって、該ＲＮＡｉの非ガイド領域にバルジを導入して、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のＲＮＡｉを生成することを含む、前記方法。
  39. 請求項１〜３８のいずれか１項に記載のＲＮＡｉをコードする核酸を含む発現コンストラクト。
  40. ＲＮＡｉをコードする核酸は、ｍｉＲＮＡ足場を含む、請求項３９に記載の発現コンストラクト。
  41. ＲＮＡｉをコードする核酸は、プロモーターに機能するように連結されている、請求項３９または４０に記載の発現コンストラクト。
  42. プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモ
    ーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ−アクチン／ウサギβ−グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、延長因子１−アルファプロモーター（ＥＦ１−アルファ）プロモーター、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、レトロウイルス性のラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および１３−アクチンプロモーターから選択される、請求項４１に記載の発現コンストラクト。
  43. ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の発現コンストラクト。
  44. ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナル、またはＨＳＶ ＴＫ ｐＡである、請求項４３に記載の発現コンストラクト。
  45. 請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の発現コンストラクトを含むベクター。
  46. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ベクターである、請求項４５に記載のベクター。
  47. 組換えアデノウイルスベクターである、請求項４６に記載のベクター。
  48. 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４〜３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄ、またはブタＡｄ３型から誘導される、請求項４７に記載のベクター。
  49. 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２またはアデノウイルス血清型５のバリアントから誘導される、請求項４７に記載のベクター。
  50. 組換えレンチウイルスベクターである、請求項４６に記載のベクター。
  51. 組換えレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはそれらのバリアントで偽型化したレンチウイルスから誘導される、請求項５０に記載のベクター。
  52. ｒＨＳＶベクターである、請求項４６に記載のベクター。
  53. ｒＨＳＶベクターは、ｒＨＳＶ−１またはｒＨＳＶ−２から誘導される、請求項５２に記載のベクター。
  54. ｒＡＡＶベクターである、請求項４６に記載のベクター。
  55. 発現コンストラクトに、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する、請求項５４に記載のｒＡＡＶベクター。
  56. 発現コンストラクトに、２つのＡＡＶのＩＴＲが隣接する、請求項５５に記載のｒＡＡＶベクター。
  57. ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである、請求項５５または５６に記載のｒＡＡＶベクター。
  58. ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである、請求項５５〜５７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
  59. スタッファー核酸をさらに含む、請求項５４〜５８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
  60. スタッファー核酸は、プロモーターとＲＮＡｉをコードする核酸との間に配置されている、請求項５９に記載のｒＡＡＶベクター。
  61. 自己相補的なｒＡＡＶベクターである、請求項５４〜６０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
  62. ベクターは、ＲＮＡｉをコードする第１の核酸配列およびＲＮＡｉの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる、請求項６１に記載のｒＡＡＶベクター。
  63. 第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む、請求項６２に記載のｒＡＡＶベクター。
  64. 請求項４５〜５３のいずれか１項に記載のベクターまたは請求項５４〜６３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを含む細胞。
  65. 請求項４５に記載のベクターを含むウイルス粒子であって、ｒＡＡＶベクターをキャプシド化するＡＡＶ粒子、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド化するアデノウイルス粒子、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド化するレンチウイルス粒子、または組換えＨＳＶベクターをキャプシド化するＨＳＶ粒子である、前記ウイルス粒子。
  66. 組換えアデノウイルスベクターをキャプシド化するアデノウイルス粒子である、請求項６５に記載のウイルス粒子。
  67. アデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４〜３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄ、またはブタＡｄ３型由来のキャプシドを含む、請求項６６に記載のウイルス粒子。
  68. アデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２のキャプシドまたはアデノウイルス血
    清型５のキャプシドのバリアントを含む、請求項６６に記載のウイルス粒子。
  69. 組換えレンチウイルスベクターをキャプシド化するレンチウイルス粒子である、請求項６６に記載のウイルス粒子。
  70. レンチウイルス粒子は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはそれらのバリアントで偽型化したキャプシドを含む、請求項６９に記載のウイルス粒子。
  71. ＨＳＶ粒子である、請求項６６に記載のウイルス粒子。
  72. ＨＳＶ粒子は、ｒＨＳＶ−１粒子またはｒＨＳＶ−２粒子である、請求項７１に記載のウイルス粒子。
  73. 請求項５４〜６３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶ粒子。
  74. ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシド ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、請求項７３に記載のｒＡＡＶ粒子。
  75. ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、同じＡＡＶ血清型から誘導される、請求項７３または７４に記載のｒＡＡＶ粒子。
  76. ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型から誘導される、請求項７３または７４に記載のｒＡＡＶ粒子。
  77. ＩＴＲは、ＡＡＶ２から誘導され、ｒＡＡＶ粒子のキャプシドは、ＡＡＶ１から誘導される、請求項７６に記載のｒＡＡＶ粒子。
  78. 請求項６５〜７２のいずれか１項に記載のウイルス粒子または請求項７３〜７７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を含む組成物。
  79. 医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項７８に記載の組成物。
  80. 哺乳動物の疾患におけるポリペプチドの発現を阻害または低減するための方法であって、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ；請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の発現コンストラクト；請求項４５〜５４のいずれか１項に記載のベクター；請求項５５〜６３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター；請求項６５〜７２のいずれか１項に記載のウイルス粒子；請求項７３〜７７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子；または請求項７８もしくは７９に記載の組成物を該哺乳動物に投与することを含み、該ＲＮＡｉは、該ポリペプチドをコードするＲＮＡを標的化する、前記方法。
  81. 哺乳動物の細胞におけるポリペプチドの蓄積を阻害するための方法であって、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ；請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の発現コンストラクト；請求項４５〜５３のいずれか１項に記載のベクター；請求項５４〜６３
    のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター；請求項６５〜７２のいずれか１項に記載のウイルス粒子；請求項７３〜７７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子；または請求項７８もしくは７９に記載の組成物を該哺乳動物に投与することを含み、該ＲＮＡｉは、該ポリペプチドをコードするＲＮＡを標的化する、前記方法。
  82. 哺乳動物は、ヒトである、請求項８０または８１に記載の方法。
  83. 請求項８０〜８２のいずれか１項に記載の方法で使用するための医薬品の製造における、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ；請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の発現コンストラクト；請求項４５〜５３のいずれか１項に記載のベクター；請求項５４〜６３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター；請求項６５〜７２のいずれか１項に記載のウイルス粒子；請求項７３〜７７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子；または請求項７８もしくは７９に記載の組成物の使用。
  84. 請求項８０〜８２のいずれか１項に記載の方法で使用するための、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ；請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の発現コンストラクト；請求項４５〜５３のいずれか１項に記載のベクター；請求項５４〜６３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター；請求項６５〜７２のいずれか１項に記載のウイルス粒子；請求項７３〜７７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子；または請求項７８もしくは７９に記載の組成物。
  85. 請求項１〜３７のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ；請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の発現コンストラクト；請求項４５〜５３のいずれか１項に記載のベクター；請求項５４〜６３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター；請求項６５〜７２のいずれか１項に記載のウイルス粒子；請求項７３〜７７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子；または請求項７８もしくは７９に記載の組成物を含む、哺乳動物においてＲＮＡ干渉を誘導するためのキット。
  86. 哺乳動物は、ヒトである、請求項８５に記載のキット。
  87. 請求項１〜３７のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ；請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の発現コンストラクト；請求項４５〜５３のいずれか１項に記載のベクター；請求項５４〜６３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター；請求項６５〜７２のいずれか１項に記載のウイルス粒子；請求項７３〜７７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子；または請求項７８もしくは７９に記載の組成物を含む、請求項８０〜８２のいずれか１項に記載の方法で使用するためのキット。
  88. 配列５’−ＵＡＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１）を含むガイド領域を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号２）を含む非ガイド領域を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉであって、該第１の鎖および該第２の鎖は、二重鎖を形成し、該第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、該非ガイド領域においてバルジを形成する、前記ＲＮＡｉ。
  89. ガイド領域は、配列番号１に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項８８に記載のＲＮＡｉ。
  90. 非ガイド領域は、配列番号２に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項８８に記載のＲＮＡｉ。
  91. 配列は、オフターゲットの遺伝子サイレンシングを低減するように改善されている、請
    求項８８〜９０のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  92. 配列は、１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを含む、請求項８８〜９１のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  93. 配列は、シード領域中に１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを含む、請求項８８〜９２のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  94. 配列５’−ＵＣＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１５）を含むガイド領域を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＧＡＡ−３’（配列番号１６）を含む非ガイド領域を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉであって、該第１の鎖および該第２の鎖は、二重鎖を形成し、該第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、該非ガイド領域においてバルジを形成する、前記ＲＮＡｉ。
  95. 配列５’−ＵＡＧＡＣＧＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１７）を含むガイド領域を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＣＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号１８）を含む非ガイド領域を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉであって、該第１の鎖および該第２の鎖は、二重鎖を形成し、該第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、該非ガイド領域においてバルジを形成する、前記ＲＮＡｉ。
  96. ガイド領域は、配列番号１５に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含み、非ガイド領域は、配列番号１６に対して約９０％の同一性を有する核酸配列または配列番号１７に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含み、非ガイド領域は、配列番号１８に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項９４または９５に記載のＲＮＡｉ。
  97. ガイド領域の残基１１および１２におけるＵ残基は、ガイド領域中でバルジを形成する、請求項８８〜９６のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  98. 二重鎖は、１９〜２５または１９〜２３塩基対の長さである、請求項８８〜９７のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  99. 第１および／または第２の鎖は、３’オーバーハング領域、５’オーバーハング領域、または３’および５’オーバーハング領域の両方をさらに含む、請求項８８〜９８のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  100. 第１の鎖および第２の鎖は、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーによって連結されている、請求項８８〜９９のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  101. ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーは、４〜５０ヌクレオチドを含む、請求項１００に記載のＲＮＡｉ。
  102. ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーは、４〜２０ヌクレオチドを含む、請求項１００または１０１に記載のＲＮＡｉ。
  103. ループ構造を形成することが可能なＲＮＡリンカーは、１３ヌクレオチドを含む、請求項１００〜１０２のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  104. 配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項８８〜１０３のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  105. 配列番号３のヌクレオチド配列と約９０％同一なヌクレオチド配列を含む、請求項８８〜１０３のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  106. 低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項８８〜９４のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ。
  107. 請求項８８〜１０６のいずれか１項に記載のＲＮＡｉをコードする核酸を含む発現コンストラクト。
  108. ＲＮＡｉをコードする核酸は、ｍｉＲＮＡ足場を含む、請求項１０７に記載の発現コンストラクト。
  109. ＲＮＡｉをコードする核酸は、ｍｉＲ−１５５足場を含む、請求項１０８に記載の発現コンストラクト。
  110. ＲＮＡｉをコードする核酸は、プロモーターに機能するように連結されている、請求項１０７〜１０９のいずれか１項に記載の発現コンストラクト。
  111. プロモーターは、哺乳動物の脳でＲＮＡｉを発現させることが可能である、請求項１１０に記載の発現コンストラクト。
  112. プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ−アクチン／ウサギβ−グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、延長因子１−アルファプロモーター（ＥＦ１−アルファ）プロモーター、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、レトロウイルス性のラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および１３−アクチンプロモーターから選択される、請求項１１０または１１１に記載の発現コンストラクト。
  113. プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ−アクチンプロモーターである、請求項１１０〜１１２のいずれか１項に記載の発現コンストラクト。
  114. 発現コンストラクトは、ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項１１０〜１１３のいずれか１項に記載の発現コンストラクト。
  115. ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルである、請求項１１４に記載の発現コンストラクト。
  116. 請求項１０７〜１１５のいずれか１項に記載の発現コンストラクトを含むベクター。
  117. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ベクターである、請求項１１６に記載のベクター。
  118. 組換えアデノウイルスベクターである、請求項１１７に記載のベクター。
  119. 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４〜３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄ、またはブタＡｄ３型から誘導される、請求項１１８に記載のベクター。
  120. 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２またはアデノウイルス血清型５のバリアントから誘導される、請求項１１９に記載のベクター。
  121. 組換えレンチウイルスベクターである、請求項１１７に記載のベクター。
  122. 組換えレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはそれらのバリアントで偽型化したレンチウイルスから誘導される、請求項１２１に記載のベクター。
  123. ｒＨＳＶベクターである、請求項１１７に記載のベクター。
  124. ｒＨＳＶベクターは、ｒＨＳＶ−１またはｒＨＳＶ−２から誘導される、請求項１２３に記載のベクター。
  125. 組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項１１７に記載のベクター。
  126. 発現コンストラクトに、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する、請求項１２５に記載のｒＡＡＶベクター。
  127. 発現コンストラクトに、２つのＡＡＶのＩＴＲが隣接する、請求項１２６に記載のｒＡＡＶベクター。
  128. ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである、請求項１２６または１２７に記載のｒＡＡＶベクター。
  129. ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである、請求項１２５〜１２８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
  130. ５’から３’へ、ＡＡＶ２のＩＴＲ、プロモーター、ＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶ２のＩＴＲを含む、請求項１２９に記載のｒＡＡＶベクター。
  131. プロモーターは、ＣＢＡプロモーターである、請求項１３０に記載のｒＡＡＶベクター。
  132. ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルである、請求
    項１３０または１３１に記載のｒＡＡＶベクター。
  133. ５’から３’へ、ＡＡＶ２のＩＴＲ、ＣＢＡプロモーター、ＲＮＡｉをコードする核酸、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶ２のＩＴＲを含む、請求項１３０〜１３２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
  134. スタッファー核酸をさらに含む、請求項１３３に記載のｒＡＡＶベクター。
  135. スタッファー核酸は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸を含む、請求項１３３に記載のｒＡＡＶベクター。
  136. スタッファー核酸は、プロモーターとＲＮＡｉをコードする核酸との間に配置されている、請求項１３４または１３５に記載のｒＡＡＶベクター。
  137. ＲＮＡｉは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１２５〜１３６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
  138. ＲＮＡｉは、配列番号３のヌクレオチド配列と約９０％同一なヌクレオチド配列を含む、請求項１２５〜１３６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
  139. 自己相補的なベクターである、請求項１２５〜１３８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
  140. ベクターは、ＲＮＡｉをコードする第１の核酸配列およびＲＮＡｉの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる、請求項１３９に記載のｒＡＡＶベクター。
  141. 第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む、請求項１４０に記載のｒＡＡＶベクター。
  142. 請求項１１６〜１２４のいずれか１項に記載のベクターまたは請求項１２５〜１４１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを含む細胞。
  143. 中枢神経系（ＣＮＳ）細胞である、請求項１４２に記載の細胞。
  144. 請求項１１６に記載のベクターを含むウイルス粒子であって、ｒＡＡＶベクターをキャプシド化するｒＡＡＶ粒子、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド化するアデノウイルス粒子、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド化するレンチウイルス粒子、または組換えＨＳＶベクターをキャプシド化するＨＳＶ粒子である、前記ウイルス粒子。
  145. 組換えアデノウイルスベクターをキャプシド化するアデノウイルス粒子である、請求項１４４に記載のウイルス粒子。
  146. アデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４〜３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、Ａ
    ｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄ、またはブタＡｄ３型由来のキャプシドを含む、請求項１４５に記載のウイルス粒子。
  147. アデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２のキャプシドまたはアデノウイルス血清型５のキャプシドのバリアントを含む、請求項１４６に記載のウイルス粒子。
  148. 組換えレンチウイルスベクターをキャプシド化するレンチウイルス粒子である、請求項１４４に記載のウイルス粒子。
  149. レンチウイルス粒子は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはそれらのバリアントで偽型化したキャプシドを含む、請求項１４８に記載のウイルス粒子。
  150. ＨＳＶ粒子である、請求項１４４に記載のウイルス粒子。
  151. ＨＳＶ粒子は、ｒＨＳＶ−１粒子またはｒＨＳＶ−２粒子である、請求項１５０に記載のウイルス粒子。
  152. 請求項１２５〜１４１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶ粒子。
  153. ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ２ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、またはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、請求項１４１に記載のｒＡＡＶ粒子。
  154. ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、同じＡＡＶ血清型から誘導される、請求項１５２または１５３に記載のｒＡＡＶ粒子。
  155. ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型から誘導される、請求項１５２または１５３に記載のｒＡＡＶ粒子。
  156. ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ２キャプシドを含む、請求項１５２〜１５５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  157. ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１キャプシドを含み、ベクターは、ＡＡＶ２のＩＴＲを含む、請求項１５６に記載のｒＡＡＶ粒子。
  158. 請求項１４４〜１５１のいずれか１項に記載のウイルス粒子または請求項１５２〜１５７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子を含む組成物。
  159. 医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項１５８に記載の組成物。
  160. 哺乳動物におけるハンチントン病を処置するための方法であって、請求項１５８または１５９に記載の組成物を該哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
  161. ハンチントン病を有する哺乳動物におけるｈｔｔの発現を阻害するための方法であって、請求項１５８または１５９に記載の組成物を該哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
  162. ハンチントン病を有する哺乳動物の細胞におけるｈｔｔの蓄積を阻害するための方法であって、請求項１５８または１５９に記載の医薬組成物を該哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
  163. 哺乳動物におけるハンチントン病を処置するための方法であって、配列５’−ＵＡＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号２）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、該第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、該第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、前記方法。
  164. ハンチントン病を有する哺乳動物におけるｈｔｔの発現を阻害するための方法であって、配列５’−ＵＡＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号２）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、該第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、該第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、前記方法。
  165. ハンチントン病を有する哺乳動物の細胞におけるｈｔｔの蓄積を阻害するための方法であって、配列５’−ＵＡＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号２）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、該第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、該第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、前記方法。
  166. 第１の鎖は、配列番号１に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１６３〜１６５のいずれか１項に記載の方法。
  167. 第２の鎖は、配列番号２に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１６３〜１６５のいずれか１項に記載の方法。
  168. 核酸は、オフターゲットの遺伝子サイレンシングを低減するように改善されている、請求項１６３〜１６７のいずれか１項に記載の方法。
  169. 核酸は、１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを含む、請求項１６３〜１６８のいずれか１項に記載の方法。
  170. 核酸は、シード領域中に１つまたはそれ以上のＣｐＧモチーフを含む、請求項１６３〜１６９のいずれか１項に記載の方法。
  171. 哺乳動物におけるハンチントン病を処置するための方法であって、配列５’−ＵＣＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１５）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＧＡＡ−３’（配列番号１６）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、該第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、該第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、前記方法。
  172. ハンチントン病を有する哺乳動物におけるｈｔｔの発現を阻害するための方法であって、配列５’−ＵＣＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１５）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＧＡＡ−３’（配列番号１６）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、該第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、該第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、前記方法。
  173. ハンチントン病を有する哺乳動物の細胞におけるｈｔｔの蓄積を阻害するための方法であって、配列５’−ＵＣＧＡＣＡＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１５）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＵＧＵＣＧＡＡ−３’（配列番号１６）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、該第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、該第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、前記方法。
  174. 第１の鎖は、配列番号１５に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含むが、ＣｐＧモチーフを維持する、請求項１７１〜１７３のいずれか１項に記載の方法。
  175. 第２の鎖は、配列番号１６に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含むが、ＣｐＧモチーフを維持する、請求項１７１〜１７４のいずれか１項に記載の方法。
  176. 哺乳動物におけるハンチントン病を処置するための方法であって、配列５’−ＵＡＧＡＣＧＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１７）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＣＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号１８）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、該第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、該第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、前記方法。
  177. ハンチントン病を有する哺乳動物におけるｈｔｔの発現を阻害するための方法であって、配列５’−ＵＡＧＡＣＧＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１７）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＣＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号１８）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、該第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、該第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、前記方法。
  178. ハンチントン病を有する哺乳動物の細胞におけるｈｔｔの蓄積を阻害するための方法であって、配列５’−ＵＡＧＡＣＧＡＵＧＡＵＵＣＡＣＡＣＧＧＵ−３’（配列番号１７）を含む第１の核酸を含む第１の鎖および配列５’−ＡＣＣＧＵＧＵＧＵＣＡＵＣＧＵＣＵＡＡ−３’（配列番号１８）を含む第２の核酸を含む第２の鎖を含むＲＮＡｉを哺乳動物に投与することを含み、該第２の鎖の残基１８または残基１９におけるＡ残基は、該第１の鎖中の残基と塩基対を形成しない、前記方法。
  179. 第１の鎖は、配列番号１７に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含むが、ＣｐＧモチーフを維持する、請求項１７６〜１７８のいずれか１項に記載の方法。
  180. 第２の鎖は、配列番号１８に対して約９０％の同一性を有する核酸配列を含むが、ＣｐＧモチーフを維持する、請求項１７６〜１７９のいずれか１項に記載の方法。
  181. 第１の核酸の残基１１および１２におけるＵ残基は、第２の鎖中の残基と塩基対を形成しない、請求項１６３〜１８０のいずれか１項に記載の方法。
  182. 二重鎖は、１８〜２５塩基対の長さである、請求項１６３〜１８１のいずれか１項に記載の方法。
  183. 第１および／または第２の鎖は、３’オーバーハング領域、５’オーバーハング領域、または３’および５’オーバーハング領域の両方をさらに含む、請求項１６３〜１８２のいずれか１項に記載の方法。
  184. 第１の鎖および第２の鎖は、ループ構造を形成することが可能なＲＮＡによって連結されている、請求項１６３〜１８３のいずれか１項に記載の方法。
  185. ループ構造を形成することが可能なＲＮＡは、４〜５０ヌクレオチドまたは４〜２０ヌクレオチドを含む、請求項１６３〜１８４のいずれか１項に記載の方法。
  186. ループ構造を形成することが可能なＲＮＡは、１３ヌクレオチドを含む、請求項１６３〜１８５のいずれか１項に記載の方法。
  187. ＲＮＡｉは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１６３〜１８６のいずれか１項に記載の方法。
  188. ＲＮＡｉは、配列番号３のヌクレオチド配列と約９０％同一なヌクレオチド配列を含む、請求項１６３〜１８７のいずれか１項に記載の方法。
  189. ＲＮＡｉの第１の鎖は、第２の鎖の５’にある、請求項１６３〜１８８のいずれか１項に記載の方法。
  190. ＲＮＡｉの第２の鎖は、第１の鎖の５’にある、請求項１６３〜１８９のいずれか１項に記載の方法。
  191. ＲＮＡｉは、発現コンストラクトにコードされている、請求項１６３〜１６６のいずれか１項に記載の方法。
  192. ＲＮＡｉをコードする核酸は、ｍｉＲＮＡ足場を含む、請求項１６３〜１９１のいずれか１項に記載の方法。
  193. ｍｉＲＮＡ足場は、ｍｉＲ−１５５足場である、請求項１９２に記載の方法。
  194. ＲＮＡｉをコードする核酸は、プロモーターに機能するように連結されている、請求項１６３〜１９３のいずれか１項に記載の方法。
  195. プロモーターは、哺乳動物の脳でＲＮＡｉを発現させることが可能である、請求項１９４に記載の方法。
  196. プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ−アクチン／ウサギβ−グ
    ロビン（ＣＡＧ）プロモーター、延長因子１−アルファプロモーター（ＥＦ１−アルファ）プロモーターおよびヒトβ−グルクロニダーゼプロモーターから選択される、請求項１９５に記載の方法。
  197. プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ−アクチンプロモーターである、請求項１９４〜１９６のいずれか１項に記載の方法。
  198. 発現コンストラクトは、ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項１６７〜１７３のいずれか１項に記載の方法。
  199. ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルである、請求項１７４に記載の方法。
  200. 発現コンストラクトは、ベクターによってコードされる、請求項１９１〜１９９のいずれか１項に記載の方法。
  201. ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ベクターである、請求項２００に記載の方法。
  202. ベクターは、組換えアデノウイルスベクターである、請求項２０１に記載の方法。
  203. 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４〜３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄ、またはブタＡｄ３型から誘導される、請求項２０２に記載の方法。
  204. 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２またはアデノウイルス血清型５のバリアントから誘導される、請求項２０３に記載の方法。
  205. ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである、請求項２０１に記載の方法。
  206. 組換えレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはそれらのバリアントで偽型化したレンチウイルスから誘導される、請求項２０５に記載の方法。
  207. ベクターは、ｒＨＳＶベクターである、請求項２０１に記載の方法。
  208. ｒＨＳＶベクターは、ｒＨＳＶ−１またはｒＨＳＶ−２から誘導される、請求項２０７に記載の方法。
  209. ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項２０１に記載の方法。
  210. 発現コンストラクトに、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する、請求項２０９に記載の方法。
  211. 発現コンストラクトに、２つのＡＡＶのＩＴＲが隣接する、請求項２１０に記載の方法。
  212. ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである、請求項２１０または２１１に記載の方法。
  213. ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである、請求項２１０〜２１２のいずれか１項に記載の方法。
  214. ｒＡＡＶベクターは、５’から３’へ、ＡＡＶ２のＩＴＲ、プロモーター、ＲＮＡｉをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶ２のＩＴＲを含む、請求項２１３に記載の方法。
  215. プロモーターは、ＣＢＡプロモーターである、請求項２１４に記載の方法。
  216. ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルである、請求項２１４または２１５に記載の方法。
  217. ｒＡＡＶベクターは、５’から３’へ、ＡＡＶ２のＩＴＲ、ＣＢＡプロモーター、ＲＮＡｉをコードする核酸、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル、およびＡＡＶ２のＩＴＲを含む、請求項２１３に記載の方法。
  218. ベクターは、スタッファー核酸をさらに含む、請求項２１７に記載の方法。
  219. スタッファー核酸は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸を含む、請求項２１８に記載の方法。
  220. スタッファー核酸は、プロモーターとＲＮＡｉをコードする核酸との間に配置されている、請求項２１８または２１９に記載の方法。
  221. ＲＮＡｉは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項２１４〜２２０のいずれか１項に記載の方法。
  222. ＲＮＡｉは、配列番号３のヌクレオチド配列と約９０％同一なヌクレオチド配列を含む、請求項２１４〜２２０のいずれか１項に記載の方法。
  223. ベクターは、自己相補性ベクターである、請求項２０９〜２２２のいずれか１項に記載の方法。
  224. ベクターは、ＲＮＡｉをコードする第１の核酸配列およびＲＮＡｉの相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる、請求項２２３に記載の方法。
  225. 第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む、請求項２２４に記載の方法。
  226. ベクターは、ｒＡＡＶ粒子中にキャプシド化されているか、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス粒子中にキャプシド化されているか、組換えレンチウイルスベクターは、レンチウイルス粒子中にキャプシド化されているか、または組換えＨＳＶベクターは、ＨＳＶ中にキャプシド化されている、請求項２００または２０１に記載の方法。
  227. ウイルス粒子は、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド化するアデノウイルス粒子である、請求項２２６に記載の方法。
  228. アデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４〜３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄ、またはブタＡｄ３型由来のキャプシドを含む、請求項２２７に記載の方法。
  229. アデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２のキャプシドまたはアデノウイルス血清型５のキャプシドのバリアントを含む、請求項２２８に記載の方法。
  230. ウイルス粒子は、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド化するレンチウイルス粒子である、請求項２２６に記載の方法。
  231. レンチウイルス粒子は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４またはそれらのバリアントで偽型化したキャプシドを含む、請求項２３０に記載の方法。
  232. ウイルス粒子は、ＨＳＶ粒子である、請求項２２６に記載の方法。
  233. ＨＳＶ粒子は、ｒＨＳＶ−１粒子またはｒＨＳＶ−２粒子である、請求項２３２に記載の方法。
  234. ｒＡＡＶベクターは、組換えＡＡＶ粒子中にキャプシド化されている、請求項２０９〜２２５のいずれか１項に記載の方法。
  235. ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２−７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ２ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、またはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、請求項２３４に記載の方法。
  236. ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、同じＡＡＶ血清型から誘導される、請求項２３４または２３５に記載の方法。
  237. ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型から誘導される、請求項２３４または２３５に記載の方法。
  238. ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ２キャプシドを含む、請求項２３４〜２３５のいずれ
    か１項に記載の方法。
  239. ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１キャプシドを含み、ベクターは、ＡＡＶ２のＩＴＲを含む、請求項２３７に記載の方法。
  240. 請求項２２６〜２３３のいずれか１項に記載のウイルス粒子または請求項２３４〜２３９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子は、組成物の形態である、請求項２２２６〜２３９のいずれか１項に記載の方法。
  241. 組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項２４０に記載の方法。
  242. 請求項１６０〜２４１のいずれか１項に記載の方法で使用するための医薬品の製造における、請求項８６〜１０６のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ；請求項９６〜１０４のいずれか１項に記載の発現コンストラクト；請求項１１６〜１２４のいずれか１項に記載のベクター；請求項１２５〜１４１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター；請求項１４４〜１５１のいずれか１項に記載のウイルス粒子；請求項１５２〜１５７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子；または請求項１５８もしくは１５９に記載の組成物の使用。
  243. 請求項１６０〜２４１のいずれか１項に記載の方法で使用するための、請求項８６〜１０６のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ；請求項１０７〜１１５のいずれか１項に記載の発現コンストラクト；請求項１１６〜１２４のいずれか１項に記載のベクター；請求項１２５〜１４１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター；請求項１４４〜１５１のいずれか１項に記載のウイルス粒子；請求項１５２〜１５７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子；または請求項１５８もしくは１５９に記載の組成物。
  244. ハンチントン病を有する哺乳動物においてＲＮＡ干渉を誘導するためのキットであって、請求項８６〜１０６のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ；請求項１０７〜１１５のいずれか１項に記載の発現コンストラクト；請求項１１６〜１２４のいずれか１項に記載のベクター；請求項１２５〜１４１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター；請求項１４４〜１５１のいずれか１項に記載のウイルス粒子；請求項１５２〜１５７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子；または請求項１５８もしくは１５９に記載の組成物を含む、前記キット。
  245. 哺乳動物は、ヒトである、請求項２４４に記載のキット。
  246. 請求項１６０〜２４１のいずれか１項に記載の方法で使用するための医薬品の製造における、請求項８６〜１０６のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ；請求項１０７〜１１５のいずれか１項に記載の発現コンストラクト；請求項１１６〜１２４のいずれか１項に記載のベクター；請求項１２５〜１４１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター；請求項１４４〜１５１のいずれか１項に記載のウイルス粒子；請求項１５２〜１５７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子；または請求項１５８もしくは１５９に記載の組成物を含む、請求項１６０〜２４１のいずれか１項に記載の方法で使用するためのキット。
JP2021078464A 2015-02-10 2021-05-06 バリアントＲＮＡｉ Active JP7526710B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562114578P 2015-02-10 2015-02-10
US62/114,578 2015-02-10
JP2017560478A JP2018506304A (ja) 2015-02-10 2016-02-09 バリアントＲＮＡｉ

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017560478A Division JP2018506304A (ja) 2015-02-10 2016-02-09 バリアントＲＮＡｉ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2021118740A true JP2021118740A (ja) 2021-08-12
JP7526710B2 JP7526710B2 (ja) 2024-08-01

Family

ID=56614905

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017560478A Pending JP2018506304A (ja) 2015-02-10 2016-02-09 バリアントＲＮＡｉ
JP2021078464A Active JP7526710B2 (ja) 2015-02-10 2021-05-06 バリアントＲＮＡｉ

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017560478A Pending JP2018506304A (ja) 2015-02-10 2016-02-09 バリアントＲＮＡｉ

Country Status (27)

Country Link
US (4) US10450563B2 (ja)
EP (1) EP3256588A2 (ja)
JP (2) JP2018506304A (ja)
KR (1) KR102670852B1 (ja)
CN (1) CN107438671B (ja)
AR (1) AR103646A1 (ja)
AU (2) AU2016219396B2 (ja)
BR (1) BR112017017028A2 (ja)
CA (1) CA2976075A1 (ja)
CL (1) CL2017002027A1 (ja)
CO (1) CO2017009083A2 (ja)
CR (1) CR20170406A (ja)
EA (1) EA201791805A1 (ja)
EC (1) ECSP17059343A (ja)
HK (1) HK1247641A1 (ja)
IL (1) IL253893B (ja)
MA (1) MA40819B1 (ja)
MX (2) MX2017010369A (ja)
MY (2) MY194175A (ja)
NZ (1) NZ735289A (ja)
PE (1) PE20171382A1 (ja)
PH (1) PH12017501432A1 (ja)
SG (3) SG10201907396XA (ja)
TN (1) TN2017000354A1 (ja)
TW (1) TWI781079B (ja)
UY (1) UY36554A (ja)
WO (1) WO2016130589A2 (ja)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101881596B1 (ko) 2008-12-02 2018-07-24 웨이브 라이프 사이언시스 재팬 인코포레이티드 인 원자 변형된 핵산의 합성 방법
CN102596204B (zh) 2009-07-06 2016-11-23 波涛生命科学有限公司 新的核酸前药及其使用方法
WO2012039448A1 (ja) 2010-09-24 2012-03-29 株式会社キラルジェン 不斉補助基
ES2626488T3 (es) 2011-07-19 2017-07-25 Wave Life Sciences Pte. Ltd. Procedimientos para la síntesis de ácidos nucleicos funcionalizados
SG11201500232UA (en) 2012-07-13 2015-04-29 Wave Life Sciences Pte Ltd Chiral control
AU2013288048A1 (en) 2012-07-13 2015-01-22 Wave Life Sciences Ltd. Asymmetric auxiliary group
EP2873674B1 (en) 2012-07-13 2020-05-06 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant
US10322173B2 (en) 2014-01-15 2019-06-18 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent
EP3095461A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator
EP3095459A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having antitumor effect and antitumor agent
CN106068325B (zh) 2014-01-16 2021-07-09 波涛生命科学有限公司 手性设计
ES2878451T3 (es) 2014-11-14 2021-11-18 Voyager Therapeutics Inc Polinucleótidos moduladores
US10597660B2 (en) 2014-11-14 2020-03-24 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
MX2017010369A (es) 2015-02-10 2017-12-14 Genzyme Corp Arni variante.
MA43072A (fr) 2015-07-22 2018-05-30 Wave Life Sciences Ltd Compositions d'oligonucléotides et procédés associés
US10633653B2 (en) 2015-08-14 2020-04-28 University Of Massachusetts Bioactive conjugates for oligonucleotide delivery
US20180228830A1 (en) * 2015-10-23 2018-08-16 Rena Therapeutics Inc. Nucleic acid complex having at least one bulge structure
MA45270A (fr) 2016-05-04 2017-11-09 Wave Life Sciences Ltd Compositions d'oligonucléotides et procédés associés
KR20240056729A (ko) 2016-05-18 2024-04-30 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
US11951121B2 (en) 2016-05-18 2024-04-09 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating Huntington's disease
CN111108198A (zh) 2017-05-05 2020-05-05 沃雅戈治疗公司 治疗亨廷顿病的组合物和方法
EP3642341A4 (en) 2017-06-23 2021-06-16 University Of Massachusetts TWO-DAY SELF-RELEASING SIRNA AND RELATED PROCEDURES
US20200377887A1 (en) * 2017-09-22 2020-12-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating huntington's disease
JP7248658B2 (ja) * 2017-09-22 2023-03-29 ジェンザイム・コーポレーション バリアントＲＮＡｉ
MX2020005952A (es) * 2017-12-06 2022-01-03 Ovid Therapeutics Inc Uso de mir101 o mir128 en el tratamiento de trastornos convulsivos.
WO2019183605A1 (en) * 2018-03-23 2019-09-26 University Of Massachusetts Gene therapeutics for treating bone disorders
WO2019222328A1 (en) 2018-05-15 2019-11-21 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of parkinson's disease
JP2021530548A (ja) 2018-07-24 2021-11-11 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドVoyager Therapeutics, Inc. 遺伝子治療製剤を生産するための系および方法
TW202022116A (zh) * 2018-08-03 2020-06-16 美商健臻公司 針對α－突觸核蛋白的變體ＲＮＡｉ
AU2020206617A1 (en) * 2019-01-09 2021-08-26 Centro De Neurociencias E Biologia Celular Double stranded RNA and uses thereof
EP3983077A4 (en) * 2019-06-17 2023-12-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. DELIVERY OF OLIGONUCLEOTIDES TO THE STRIATUM
AU2020329155A1 (en) 2019-08-09 2022-03-10 University Of Massachusetts Chemically modified oligonucleotides targeting SNPs
AU2021260581A1 (en) * 2020-04-20 2022-11-24 University Of Massachusetts Oligonucleotides for MSH3 modulation
TW202325850A (zh) 2021-11-29 2023-07-01 大陸商上海瑞宏迪醫藥有限公司 Aadc、gdnf多核苷酸及其用於治療帕金森病
CN118660913A (zh) 2022-02-21 2024-09-17 上海瑞宏迪医药有限公司 Vegf结合分子及其医药用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011034811A1 (en) * 2009-09-17 2011-03-24 Sigma-Aldrich Co. Short rna mimetics

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU722624B2 (en) 1996-09-06 2000-08-10 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing T7 polymerase
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
US6989264B2 (en) 1997-09-05 2006-01-24 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
DK1916258T3 (da) 1999-08-09 2014-07-28 Genzyme Corp Forøgelse af ekspression af en enkeltstrenget, heterolog nukleotidsekvens fra rekombinante, virale vektorer ved en sådan udformning af sekvensen at den danner intrastrengbasepar
DE60117550T2 (de) 2000-06-01 2006-12-07 University Of North Carolina At Chapel Hill Doppelsträngige parvovirus-vektoren
US6723551B2 (en) 2001-11-09 2004-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
PL222683B1 (pl) 2001-11-13 2016-08-31 Univ Pennsylvania Rekombinowane wirusy stowarzyszone z adenowirusem (AAV), sposoby ich wytwarzania, pakująca komórka gospodarza, kompozycja zawierająca wirus, zastosowanie wirusa, wyizolowane wirusy AAV, białka,sztuczne białka kapsydu, cząsteczki, komórki gospodarza, sposoby dostarczania transgenu, sposób identyfikacji serotypu, zestaw diagnostyczny, sposób izolacji nowych wirusów, rekombinowana komórka
US20080274989A1 (en) * 2002-08-05 2008-11-06 University Of Iowa Research Foundation Rna Interference Suppression of Neurodegenerative Diseases and Methods of Use Thereof
AU2003282877B9 (en) 2002-09-25 2011-05-12 University Of Massachusetts In Vivo gene silencing by chemically modified and stable siRNA
AU2004239114B2 (en) * 2003-05-14 2008-03-13 Japan Science And Technology Agency Inhibition of the expression of huntingtin gene
WO2006119432A2 (en) 2005-04-29 2006-11-09 The Government Of The U.S.A., As Rep. By The Sec., Dept. Of Health & Human Services Isolation, cloning and characterization of new adeno-associated virus (aav) serotypes
US7902352B2 (en) * 2005-05-06 2011-03-08 Medtronic, Inc. Isolated nucleic acid duplex for reducing huntington gene expression
US7588772B2 (en) 2006-03-30 2009-09-15 Board Of Trustees Of The Leland Stamford Junior University AAV capsid library and AAV capsid proteins
CA2688514A1 (en) 2007-04-26 2008-11-06 University Of Iowa Research Foundation Rna interference suppression of neurodegenerative diseases and methods of use thereof
DK2164967T3 (en) * 2007-05-31 2015-10-19 Univ Iowa Res Found Reduction of off-target rna interferenstoksicitet
JP2011517339A (ja) * 2008-02-04 2011-06-02 ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップ 神経変性疾患の治療に有用な分子標的及び化合物並びにこれらの同定方法
EP2250183A4 (en) * 2008-02-14 2012-07-25 Michael Paul Marie Gantier SMALL IMMUNOSTIMULATORY RNAI MOLECULES
FR2929292A1 (fr) 2008-03-28 2009-10-02 Exonhit Therapeutics S A Sa Procede et methodes de diagnostic de la maladie d'alzheimer
CA3049237C (en) 2010-04-23 2024-06-11 University Of Massachusetts Cns targeting aav vectors and methods of use thereof
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
MX353930B (es) 2011-02-17 2018-02-02 Univ Pennsylvania Composiciones y metodos para alterar la especificidad tisular y mejorar la transferencia de genes mediada por vector viral adeno-asociado 9.
KR102084539B1 (ko) 2012-02-29 2020-03-04 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 헌팅턴병을 치료하기 위한 방법 및 조성물
US9550989B2 (en) * 2013-10-03 2017-01-24 Washington University Rational design of microRNA-siRNA chimeras for multi-functional target suppression
EP3119437B1 (en) 2014-03-21 2019-09-04 Genzyme Corporation Gene therapy for retinitis pigmentosa
EP3913061A1 (en) 2014-05-02 2021-11-24 Genzyme Corporation Aav vectors for retinal and cns gene therapy
MX2017008500A (es) 2014-12-24 2018-02-01 Uniqure Ip Bv Supresión del gen de la huntingtina inducida por la arni.
MX2017010369A (es) 2015-02-10 2017-12-14 Genzyme Corp Arni variante.
JP7248658B2 (ja) 2017-09-22 2023-03-29 ジェンザイム・コーポレーション バリアントＲＮＡｉ

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011034811A1 (en) * 2009-09-17 2011-03-24 Sigma-Aldrich Co. Short rna mimetics

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CELL, vol. 151, JPN6020013319, 2012, pages 900 - 911, ISSN: 0004813105 *
MOLECULAR CELL, vol. 10, JPN6020013320, 2002, pages 549 - 561, ISSN: 0004813106 *
MOLECULAR THERAPY, vol. 18, no. 4, JPN6020013323, 2010, pages 785 - 795, ISSN: 0004813107 *
THE JOURNAL OF GENE MEDICINE, vol. 6, JPN6020013324, 2004, pages 715 - 723, ISSN: 0004813108 *
ＷＹＡＴＴ Ｊ．Ｒ． ＥＴ ＡＬ．, ＢＩＯＥＳＳＡＹＳ, vol. 11, no. 4, JPN6022037089, 1989, US, pages 100 - 106, ISSN: 0005029005 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107438671A (zh) 2017-12-05
KR20170110149A (ko) 2017-10-10
MY194175A (en) 2022-11-17
MX2017010369A (es) 2017-12-14
US11781137B2 (en) 2023-10-10
ECSP17059343A (es) 2019-03-29
JP2018506304A (ja) 2018-03-08
CL2017002027A1 (es) 2018-04-20
SG11201706444TA (en) 2017-09-28
IL253893B (en) 2021-08-31
EP3256588A2 (en) 2017-12-20
IL253893A0 (en) 2017-10-31
US20240182896A1 (en) 2024-06-06
UY36554A (es) 2016-09-30
MX2022013005A (es) 2022-11-09
CN107438671B (zh) 2021-05-25
MA40819A1 (fr) 2018-07-31
KR102670852B1 (ko) 2024-05-29
AU2016219396A1 (en) 2017-09-28
CO2017009083A2 (es) 2018-01-31
CR20170406A (es) 2017-11-14
SG10201907396XA (en) 2019-09-27
MY181458A (en) 2020-12-22
TW201704470A (zh) 2017-02-01
BR112017017028A2 (pt) 2018-04-10
AR103646A1 (es) 2017-05-24
US20180023082A1 (en) 2018-01-25
EA201791805A1 (ru) 2018-05-31
WO2016130589A3 (en) 2016-09-15
WO2016130589A2 (en) 2016-08-18
HK1247641A1 (zh) 2018-09-28
AU2016219396B2 (en) 2022-03-17
CA2976075A1 (en) 2016-08-18
MA40819B1 (fr) 2020-04-30
PE20171382A1 (es) 2017-09-15
TN2017000354A1 (en) 2019-01-16
US10450563B2 (en) 2019-10-22
NZ735289A (en) 2024-07-26
US20200109401A1 (en) 2020-04-09
TWI781079B (zh) 2022-10-21
JP7526710B2 (ja) 2024-08-01
US20210047641A1 (en) 2021-02-18
SG10201912942YA (en) 2020-02-27
PH12017501432A1 (en) 2018-01-15
AU2022204274A1 (en) 2022-07-07
US10760079B2 (en) 2020-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7526710B2 (ja) バリアントＲＮＡｉ
JP6985250B2 (ja) 深部イントロン突然変異の遺伝子編集
JP7248658B2 (ja) バリアントＲＮＡｉ
JP2021534814A (ja) アルファ−シヌクレインに対するバリアントＲＮＡｉ
JP2022545378A (ja) ＳＣＡ１の治療のための、導入遺伝子およびイントロン由来ｍｉＲＮＡを組み合わせた治療法
RU2789647C2 (ru) ВАРИАНТ СРЕДСТВА ДЛЯ RNAi

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210603

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210603

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220628

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20220928

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221223

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230404

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230704

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230929

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20240116

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240516

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20240531

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20240625

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20240722

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7526710

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150