TW201704470A - 變體ＲＮＡｉ - Google Patents

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宋南錫
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Abstract

本案提供RNAi分子，其包括含有指導序列的第一鏈和包含非指導序列的第二鏈，其中所述非指導序列含有所述指導序列的種子區對側，例如切割序列對側的凸出。在一些方面，本發明提供用於治療亨廷頓病的RNAi。本申請進一步提供含有所述RNAi的表現盒、載體(例如，rAAV、重組腺病毒載體、重組慢病毒載體和重組HSV載體)、細胞、病毒顆粒和藥物組合物。本案又進一步提供關於使用所述RNAi，例如於治療亨廷頓病的方法和套組。

Description

變體RNAi
本發明係關於變體RNAi分子。在一些方面，本發明係關於變體RNAi以治療亨廷頓病。
相關申請的交叉引用
本案請求2015年2月10日提交的美國臨時申請號62/114,578的優先權，其內容出於全部的目的在此處通過提述以其整體併入。
以ASCII文本文件提交序列表
在ASCII文本文件上提交了下列內容：計算機可讀形式(CRF)的序列表(文件名：159792010140SEQLIST.txt，記錄日期：2016年2月4日，大小：11KB)，其在本文通過提述以其整體併入。
已顯示RNA干擾(RNAi)是用於基因功能基礎研究中基因沉默的有效工具，且顯示了作為抑制與多種疾病進展相關的基因的治療劑的巨大前景。天然情況下，通過RNAi的基團調節藉由稱為微小RNA(miRNA)的小RNA發生(Ambros,(2004)Nature 431：350-355；Krol等，(2010)Nat.Rev.Genet.11：597-610)。微小RNA已成為不同細胞過程的有利調節劑，且當通過病毒載體遞送時，人 工的miRNA持續表現，導致靶基因穩固和持續的抑制。涉及miRNA加工的機制的闡明已允許科學家指派(co-opt)內源細胞RNAi機制並使用人工miRNA指導靶基因產物的降解(參見例如US PG Pub.2014/0163214和Davidson等，(2012)Cell 150：873-875)。
RNAi臨床開發的阻礙是脫靶沉默的可能性，其中RNAi的種子區(通常為核苷酸1-7或1-8)在3’非翻譯區(UTR)中與非靶向mRNA中的序列配對，導致轉錄的不穩定化。減少脫靶沉默的嘗試包括使用算法以鑒定具有針對靶mRNA高度特異性的候選種子序列，其具有最小脫靶可能性(Boudreau RL等，(2012)Nucl.Acids Res.41(1)：e9)並在RNAi的指導區放置內在的凸出(Terasawa等，(2011)Journal of nucleic acids 2011：131579)。
已對RNAi作為治療亨廷頓病(HD)的治療劑進行了研究。HD是遺傳性神經退行性疾病，其由亨廷頓蛋白基因(HTT)內含子1中的CAG重複的擴展引起。所致的N-末端區中多聚穀氨醯胺束的延伸賦予了突變的亨廷頓蛋白蛋白(mHtt)毒性的獲得性功能。沉默mHtt表現作為針對HD的治療策略的可能性首先在疾病的條件性小鼠模型中得到證實(Yamamoto等，(2000)Cell 101：57-66.)。當在這些小鼠中誘導mHtt表現時，病理和行為畸變變得顯而易見。隨後mHtt轉基因的四環素介導抑制逆轉了這些異常，指示mHtt水平的減少允許神經元內的蛋白清除機制以標準化mHtt-誘導的變化。因此，誘導mHtt水平的治療策略可潛在阻止疾病進展並緩解HD症狀。
在一些方面，本發明提供包含第一鏈和第二鏈的RNAi，其中a)所述第一鏈和所述第二鏈形成雙鏈體；b)所述第一鏈包含至少19個鹼基的指導區，其中所述指導區包含含有指導鏈的鹼基1-N的種子區，其中N=7或N=8；和c)所述第二鏈包含至少11個鹼基的非指導區(例如至少19個鹼基)，所述非指導區包含雙鏈體中指導區鹼基1-(N+2)的任何一個或多個對側的凸出序列。在一些實施方案中，N=7且凸出是指導區的對側鹼基1、2、3、4、5、6、7、8 或9。在其他實施方案中，N=8且凸出是指導區的對側鹼基1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。在一些實施方案中，所述凸出是指導區的對側鹼基1或鹼基N+2。
在一些方面，本發明提供包含第一鏈和第二鏈的RNAi，其中a)所述第一鏈和所述第二鏈形成雙鏈體；b)所述第一鏈包含至少11個鹼基(例如至少19個鹼基)的指導區，其中所述指導區包含含有指導鏈的鹼基1-N的種子區，其中N=7或N=8；且c)所述第二鏈包含至少11個鹼基(例如至少19個鹼基)的非指導區，其中所述非指導區包含雙鏈體中指導區鹼基1-(N+1)的任何一個或多個對側的凸出序列。在一些實施方案中，N=7且所述凸出是指導區的對側鹼基1、2、3、4、5、6、7或8。在其他實施方案中，N=8且所述凸出是指導區的對側鹼基1、2、3、4、5、6、7、8或9。在一些實施方案中，所述凸出是指導區的對側鹼基1或鹼基N+1。
在一些方面，本發明提供包含第一鏈和第二鏈的RNAi，其中a)所述第一鏈和所述第二鏈形成雙鏈體；b)所述第一鏈包含至少11個鹼基(例如至少19個鹼基)的指導區，其中所述指導區包含含有指導鏈鹼基1-N的種子區，其中N=7或N=8；且c)所述第二鏈包含至少11個鹼基(例如至少19個鹼基)的非指導區，其中所述非指導區包含雙鏈體中指導區鹼基1-N的任何一個或多個對側的凸出序列。在一些實施方案中，N=7且所述凸出是指導區的對側鹼基1、2、3、4、5、6或7。在其他實施方案中，N=8且所述凸出是指導區的對側鹼基1、2、3、4、5、6、7或8。在一些實施方案中，所述凸出是指導區的對側鹼基1或鹼基N。在一些實施方案中，所述凸出是指導區的對側鹼基1。
在上述方面和實施方案的一些實施方案中，所述凸出通過指導區上的缺乏互補鹼基的雙鏈體中非指導鏈的一個或多個鹼基形成，其中所述凸出側翼為與指導鏈進行鹼基配對的鹼基。在一些實施方案中，所述凸出包含1-10個核苷酸。在一些實施方案中， 所述凸出包含1-3個核苷酸。在進一步的實施方案中，所述RNAi包含第二凸出，其中所述第二凸出位於定位在種子區3’的指導區中的所述第一鏈上。
在上述方面和實施方案的一些實施方案中，所述雙鏈體長度為19-25或19-23個鹼基對。在一些實施方案中，所述第一和/或第二鏈進一步包含3’懸垂區、5’懸垂區或3'和5’懸垂區兩者。在一些實施方案中，所述第一鏈和所述第二鏈通過能夠形成環結構的RNA接頭連接。在一些實施方案中，所述RNA接頭包含4-50個核苷酸。在一些實施方案中，其中所述環結構包含4-20個核苷酸。在一些實施方案中，所述RNAi以5’-3’包含所述第二鏈、所述RNA接頭和所述第一鏈。在一些實施方案中，所述RNAi以5’-3’包含所述第一鏈、所述RNA接頭和所述第二鏈。在一些實施方案中，所述RNAi是小抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或小髮夾RNA(shRNA)。
在上述方面的一些實施方案中，改進所述RNAi的核苷酸序列以減少脫靶基因沉默(例如改進以減少基因沉默，其中種子區與非目標mRNA的3'-UTR中的序列配對並指導那些轉錄物的去穩定化和翻譯抑制)。在一些實施方案中，所述核酸序列包含一個或多個CpG基序。在一些實施方案中，所述核酸序列在種子區包含一個或多個CpG基序。
在上述方面和實施方案的一些實施方案中，所述RNAi靶向編碼與病症相關的多肽的RNA。在一些實施方案中，所述病症是CNS病症。在一些實施方案中，所述病症是溶酶體貯積症(LSD)、亨廷頓病(Huntington’s disease)、癲癇、帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿爾茨海默氏病(Alzheimer's disease)、中風、皮質基底節變性(CBD)、皮質基底神經節變性(CBGD)、額顳葉癡呆(FTD)、多系統萎縮(MSA)、進行性核上性麻痹(PSP)或腦癌。在一些實施方案中，所述病症是亨廷頓病。在進一步的實施方案中，所述多肽是亨 廷頓蛋白。在另一些實施方案中，所述亨廷頓蛋白包含與亨廷頓病相關的突變。在一些實施方案中，所述指導區包含序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：1)且非指導區包含序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO：2)。在一些實施方案中，所述指導區包含序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：15)且所述非指導區包含序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO：16)。在一些實施方案中，所述指導區包含序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：17)且所述非指導區包含序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO：18)。
在一些實施方案中，本發明提供減少RNAi毒性的方法，其包括導入RNAi非指導區中的凸出以生成如本文所述的RNAi。
在一些方面，本發明提供表現構建體，其包含編碼如本文所述的RNAi的核酸。在一些實施方案中，編碼所述RNAi的核酸包含miRNA支架。在一些實施方案中，編碼所述RNAi的核酸與啟動子可操作地連接。在一些實施方案中，所述啟動子選自下組：巨細胞病毒(CMV)即刻早期啟動子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動子、猿猴病毒40(SV40)啟動子、CK6啟動子、轉甲狀腺素啟動子(TTR)、TK啟動子、四環素反應性啟動子(TRE)、HBV啟動子、hAAT啟動子、LSP啟動子、嵌合肝臟特異性啟動子(LSP)、E2F啟動子、端粒酶(hTERT)啟動子；巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白/兔β-球蛋白啟動子(CAG)啟動子、延伸因子1-α啟動子(EFl-α)啟動子、人β-葡糖醛酸糖苷酶啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、逆轉錄病毒勞斯(Rous)肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子和13-肌動蛋白啟動子。在一些實施方案中，所述表現構建體進一步包含多聚腺苷酸化信號。在一些實施方案中，所述多聚腺苷酸化信號是牛生長激素多聚腺苷酸化信號、SV40多聚腺苷 酸化信號或HSV TK pA。
在一些實施方案中，本發明提供包含如本文所述的表現構建體的載體。在一些實施方案中，所述載體是重組腺相關病毒(rAAV)載體、重組腺病毒載體、重組慢病毒載體或重組單純皰疹病毒(HSV)載體。在一些實施方案中，所述載體是重組腺病毒載體。在一些實施方案中，所述重組腺病毒載體源自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或豬Ad 3型。在一些實施方案中，所述重組腺病毒載體源自腺病毒血清型2或腺病毒血清型5的變體。在其他實施方案中，所述載體是重組慢病毒載體。在一些實施方案中，所述重組慢病毒載體源自具有水泡性口膜炎病毒(VSV)的慢病毒假型(lentivirus pseudotyped with vesicular stomatitis virus)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus)(LCMV)、羅斯河病毒(Ross river virus)(RRV)、埃博拉病毒(Ebola virus)、馬爾堡病毒(Marburg virus)、莫卡拉病毒(Mokala virus)、狂犬病毒(Rabies virus)、RD114或其中的變體。其他實施方案中，所述載體是rHSV載體。在一些實施方案中，所述rHSV載體源自rHSV-1或rHSV-2。
在上述方面和實施方案的一些實施方案中，本發明提供rAAV載體，其包含編碼如本文所述的RNAi的表現構建體。在一些實施方案中，所述表現構建體側翼為一個或多個AAV反向末端重複(ITR)序列。在一些實施方案中，所述表現構建體側翼為兩個AAV ITR。在一些實施方案中，所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些實施方案中，所述 AAV ITR是AAV2 ITR。在一些實施方案中，所述載體進一步包含填充核酸。在一些實施方案中，所述填充核酸位於啟動子和編碼RNAi的核酸之間。在一些實施方案中，所述載體是自身互補的rAAV載體。在一些實施方案中，所述載體包含編碼所述RNAi的第一核酸序列和編碼所述RNAi的互補物的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可與第二核酸序列沿其長度的大部分或全部形成鏈內鹼基對。在一些實施方案中，所述第一核酸序列和第二核酸序列通過突變的AAV ITR連接，其中所述突變的AAV ITR包含D區的缺失並包含末端解析序列的突變。在一些實施方案中，本發明提供包含如本文所述的載體(例如rAAV載體)的細胞。
在上述方面和實施方案的一些實施方案中，本發明提供包含編碼如本文所述的RNAi的載體的病毒顆粒，其中所述病毒顆粒是衣殼化所述rAAV載體的AAV顆粒、衣殼化所述重組腺病毒載體的腺病毒顆粒、衣殼化所述重組慢病毒載體的慢病毒顆粒或衣殼化所述重組HSV載體的HSV顆粒。在一些實施方案中，所述腺病毒顆粒是衣殼化所述重組腺病毒載體的腺病毒顆粒。在一些實施方案中，所述腺病毒顆粒包含來自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或豬Ad 3型的衣殼。在一些實施方案中，所述腺病毒顆粒包含腺病毒血清型2衣殼或腺病毒血清型5衣殼的變體。在其他實施方案中，所述病毒顆粒是衣殼化所述重組慢病毒載體的慢病毒顆粒。在一些實施方案中，所述慢病毒顆粒包含具有如下病毒假型的衣殼：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、羅斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病毒、RD114或其中的變體。在其他實施方案中，所述病毒顆粒是HSV顆粒。在 一些實施方案中，所述HSV顆粒是rHSV-1顆粒或rHSV-2顆粒。
在一些實施方案中，本發明提供包含編碼如本文所述的RNAi的rAAV載體的重組AAV顆粒。在一些實施方案中，所述AAV病毒顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、a山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合體、牛AAV或小鼠AAV衣殼rAAV2/HBoV1血清型衣殼。在一些實施方案中，所述rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼源自相同的AAV血清型。在其他實施方案中，所述rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼源自不同的AAV血清型。在一些實施方案中，所述ITR源自AAV2且所述rAAV顆粒的衣殼源自AAV1。
在一些實施方案中，本發明提供包含病毒顆粒(例如rAAV顆粒)的組合物，所述病毒顆粒含有編碼如本文所述的RNAi的載體。在一些實施方案中，所述組合物進一步包含藥學上可接受的載劑。
在一些方面中，本發明提供用於抑制或減少哺乳動物疾病中多肽表現的方法，其包括將如上文所述的RNAi、表現構建體、載體、rAAV載體、病毒顆粒、rAAV顆粒或組合物施用至所述哺乳動物，其中所述RNAi靶向編碼所述多肽的RNA。在一些實施方案中，本發明提供用於抑制哺乳動物細胞中多肽累積的方法，其包括將如上文所述的RNAi、表現構建體、載體、rAAV載體、病毒顆粒、rAAV顆粒或組合物施用至所述哺乳動物，其中所述RNAi靶向編碼所述多肽的RNA。在一些實施方案中，所述哺乳動物是人。
在一些實施方案中，本發明提供如上文所述的RNAi、表現構建體、載體、rAAV載體、病毒顆粒、rAAV顆粒或組合物在製造用於在本文所述的任何方法中的藥物的用途。在一些實施方案中，本發明提供如上文所述的RNAi、表現構建體、載體、rAAV載 體、病毒顆粒、rAAV顆粒或組合物用於如本文所述的任何方法的用途。在一些實施方案中，本發明提供用於在哺乳動物中誘導RNA干擾的套組，其包含如本文所述的RNAi、表現構建體、載體、rAAV載體、病毒顆粒、rAAV顆粒或組合物。在一些實施方案中，所述哺乳動物是人。在一些實施方案中，所述套組用於如本文所述的任何方法中使用。
在一些方面，本發明提供包含第一鏈和第二鏈的RNAi，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：1)的指導區且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO：2)的非指導區，其中所述第一鏈和第二鏈形成雙鏈體，且其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基形成非指導區中的凸出。在一些實施方案中，所述指導區包含與SEQ ID NO：1具有約90%同一性的核酸序列。在一些實施方案中，所述非指導區包含與SEQ ID NO：2具有約90%同一性的核酸序列。在一些實施方案中，在所述指導區殘基11和12處的U殘基在指導區中形成凸出。在一些實施方案中，所述雙鏈體長度為19-25或19-23鹼基對。在一些實施方案中，所述第一和/或第二鏈進一步包含3’懸垂區、5’懸垂區或3'和5’懸垂區兩者。在一些實施方案中，所述第一鏈和所述第二鏈通過能夠形成環結構的RNA接頭連接。在一些實施方案中，能夠形成環結構的RNA接頭包含4-50個核苷酸。在一些實施方案中，能夠形成環結構的RNA接頭包含4-20個核苷酸。在一些實施方案中，能夠形成環結構的RNA接頭包含13個核苷酸。在一些實施方案中，所述RNAi包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列。在其他實施方案中，所述RNAi包含與SEQ ID NO：3的核苷酸序列約90%相同的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述RNAi是小抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或小髮夾RNA(shRNA)。
在上述方面的一些實施方案中，改進所述RNAi的核酸 序列以減少脫靶基因沉默。在一些實施方案中，所述序列包含一個或多個CpG基序。在一些實施方案中，所述序列在種子區中包含一個或多個CpG基序。在一些實施方案中，所述RNAi包含第一鏈和第二鏈，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：15)的指導區且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO：16)的非指導區，其中所述第一鏈和第二鏈形成雙鏈體且其中在所述第二鏈殘基18或殘基19處的A殘基在非指導區中形成凸出。在一些實施方案中，所述RNAi包含第一鏈和第二鏈，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：17)的指導區且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO：18)的非指導區，其中所述第一鏈和第二鏈形成雙鏈體且其中在所述第二鏈殘基18或殘基19處的A殘基在非指導區中形成凸出。在一些實施方案中，所述指導區包含與SEQ ID NO：15具有約90%同一性的核酸序列且所述非指導區包含與SEQ ID NO：16具有約90%同一性的核酸序列或所述指導區包含與SEQ ID NO：17具有約90%同一性的核酸序列且所述非指導區包含與SEQ ID NO：18具有約90%同一性的核酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供包含編碼如上文所述的RNAi的核酸的表現構建體。在一些實施方案中，編碼所述RNAi的核酸包含miRNA支架。在一些實施方案中，編碼所述RNAi的核酸包含miR-155支架。在一些實施方案中，編碼所述RNA的核酸與啟動子可操作地連接。在一些實施方案中，所述啟動子能夠在哺乳動物的腦中表現所述RNAi。在一些實施方案中，所述啟動子選自下組：巨細胞病毒(CMV)即刻早期啟動子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動子、猿猴病毒40(SV40)啟動子、CK6啟動子、轉甲狀腺素啟動子(TTR)、TK啟動子、四環素反應性啟動子(TRE)、HBV啟動子、hAAT啟動子、LSP啟動子、嵌合肝臟特異 性啟動子(LSP)、E2F啟動子、端粒酶(hTERT)啟動子；巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白/兔β-球蛋白啟動子(CAG)啟動子、延伸因子1-α啟動子(EFl-α)啟動子、人β-葡糖醛酸糖苷酶啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、逆轉錄病毒勞斯肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子和13-肌動蛋白啟動子。在一些實施方案中，所述啟動子是雜合雞β-肌動蛋白啟動子。在一些實施方案中，所述表現構建體進一步包含多聚腺苷酸化信號。在一些實施方案中，所述多聚腺苷酸化信號是牛生長激素多聚腺苷酸化信號。
在一些實施方案中，本發明提供包含如上文所述的表現構建體的載體。在一些實施方案中，所述載體是重組腺相關病毒(rAAV)載體、重組腺病毒載體、重組慢病毒載體或重組單純皰疹病毒(HSV)載體。在一些實施方案中，所述載體是重組腺病毒載體。在一些實施方案中，所述重組腺病毒載體源自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或豬Ad 3型。在一些實施方案中，所述重組腺病毒載體源自腺病毒血清型2或腺病毒血清型5的變體。在一些實施方案中，所述載體是重組慢病毒載體。在一些實施方案中，所述重組慢病毒載體源自具有如下病毒假型的慢病毒：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、羅斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病毒、RD114或其中的變體。在一些實施方案中，所述載體是rHSV載體。在一些實施方案中，所述rHSV載體源自rHSV-1或rHSV-2。
在一些實施方案中，本發明提供重組AAV(rAAV)載體，其包含編碼如上文所述的RNAi的表現構建體。在一些實施方案中，所述表現構建體側翼為一個或多個AAV反向末端重複(ITR)序 列。在一些實施方案中，所述表現構建體側翼為兩個AAV ITR。在一些實施方案中，所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些實施方案中，所述AAV ITR是AAV2 ITR。在一些實施方案中，所述rAAV載體5’-3’包含AAV2 ITR、啟動子、編碼所述RNAi的核酸、多聚腺苷酸化信號和AAV2 ITR。在一些實施方案中，所述啟動子是CBA啟動子。在一些實施方案中，所述多聚腺苷酸化信號是牛生長激素多聚腺苷酸化信號。在一些實施方案中，所述rAAV載體5’-3’包含AAV2 ITR、CBA啟動子、編碼所述RNAi的核酸、牛生長激素多聚腺苷酸化信號和AAV2 ITR。在一些實施方案中，所述載體進一步包含填充核酸。在一些實施方案中，所述填充核酸包含編碼綠色熒光蛋白(GFP)的核酸。在一些實施方案中，所述填充核酸位於所述啟動子和編碼所述RNAi的核酸之間。在一些實施方案中，所述RNAi包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列。在其他實施方案中，所述RNAi包含與SEQ ID NO：3的核苷酸序列約90%相同的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述載體是自身互補的載體。在一些實施方案中，所述載體包含編碼所述RNAi的第一核酸序列和編碼所述RNAi的互補物的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可與所述第二核酸序列沿其長度的大部分或全部形成鏈內鹼基對。在一些實施方案中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通過突變的AAV ITR連接，其中所述突變的AAV ITR包含D區的缺失並包含末端解析序列的突變。
在一些實施方案中，本發明提供包含如本文所述的載體或rAAV載體的細胞。在一些實施方案中，所述細胞是中樞神經系統(CNS)細胞。
在一些實施方案中，本發明提供病毒顆粒，其包含編碼如本文所述的RNAi的載體，其中所述病毒顆粒是衣殼化所述 rAAV載體的AAV顆粒、衣殼化所述重組腺病毒載體的腺病毒顆粒、衣殼化所述重組慢病毒載體的慢病毒顆粒或衣殼化所述重組HSV載體的HSV顆粒。在一些實施方案中，所述病毒顆粒是衣殼化所述重組腺病毒載體的腺病毒顆粒。在一些實施方案中，所述腺病毒顆粒包含來自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或豬Ad 3型的衣殼。在一些實施方案中，所述腺病毒顆粒包含腺病毒血清型2衣殼或腺病毒血清型5衣殼的變體。在其他實施方案中，所述病毒顆粒是衣殼化所述重組慢病毒載體的慢病毒顆粒。在一些實施方案中，所述慢病毒顆粒包含具有如下病毒假型的衣殼：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、羅斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病毒、RD114或其中的變體。在其他實施方案中，所述病毒顆粒是HSV顆粒。在一些實施方案中，所述HSV顆粒是rHSV-1顆粒或rHSV-2顆粒。
在一些實施方案中，本發明提供重組AAV顆粒，其包含編碼如上文所述的RNAi的rAAV載體。在一些實施方案中，所述AAV病毒顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV2 V708K，山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣殼。在一些實施方案中，所述所述rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼源自相同的AAV血清型。在其他實施方案中，所述所述rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼源自不同的AAV血清型。在一些實施方案中，所述rAAV病毒顆粒包含AAV2衣殼。在一些實施方案中，所述rAAV病毒顆粒包含 AAV1衣殼且其中所述載體包含AAV2 ITR。
在一些實施方案中，本發明提供包含如上文所述的病毒顆粒或rAAV顆粒的組合物。在進一步的實施方案中，所述進一步包含藥學上可接受的載劑。在一些實施方案中，本發明提供用於治療哺乳動物中亨廷頓病的方法，其包括將所述組合物施用至所述哺乳動物。在一些實施方案中，本發明提供用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物中htt表現的方法，其包括將所述組合物施用至所述哺乳動物。在一些實施方案中，本發明提供用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物的細胞中htt累積的方法，其包括將所述組合物施用至所述哺乳動物。
在一些方面，本發明提供用於治療哺乳動物中亨廷頓病的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：1)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO：2)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。在一些方面，本發明提供用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物中htt表現的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：1)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO：2)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。在一些方面，本發明提供用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物的細胞中htt累積的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：1)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’ (SEQ ID NO：2)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。
在上述方法的一些實施方案中，所述指導區包含與SEQ ID NO：1具有約90%同一性的核酸序列。在一些實施方案中，所述非指導區包含與SEQ ID NO：2具有約90%同一性的核酸序列。在一些實施方案中，在所述指導區殘基11和12處的U殘基與在所述指導區中形成凸出。在一些實施方案中，所述雙鏈體長度為19-25或19-23個鹼基對。在一些實施方案中，所述第一和/或第二鏈進一步包含3'懸垂區、5'懸垂區或3'和5'懸垂區兩者。在一些實施方案中，所述第一鏈和所述第二鏈通過能夠形成環結構的RNA接頭連接。在一些實施方案中，能夠形成環結構的RNA接頭包含4-50個核苷酸。在一些實施方案中，能夠形成環結構的RNA接頭包含4-20個核苷酸。在一些實施方案中，能夠形成環結構的RNA接頭包含13個核苷酸。在一些實施方案中，所述RNAi包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列。在其他實施方案中，所述RNAi包含與SEQ ID NO：3的核苷酸序列約90%相同的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述RNAi是小抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或小髮夾RNA(shRNA)。
在上述方法的一些實施方案中，改進所述核酸以減少脫靶基因沉默。在一些實施方案中，所述核酸包含一個或多個CpG基序。在一些實施方案中，所述核酸在種子區中包含一個或多個CpG基序。
在一些實施方案中，本發明提供用於治療哺乳動物中亨廷頓病的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：15)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO：16)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。在一些實施方案 中，本發明提供用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物中htt表現的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：15)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO：16)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。在一些實施方案中，本發明提供用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物的細胞中htt累積的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：15)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO：16)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。在一些實施方案中，所述第一鏈包含與SEQ ID NO：15具有約90%同一性的核酸序列但保持所述CpG基序。在一些實施方案中，所述第二鏈包含與SEQ ID NO：16具有約90%同一性的核酸序列但保持所述CpG基序。
在一些實施方案中，本發明提供用於治療哺乳動物中亨廷頓病的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：17)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO：18)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。在一些實施方案中，本發明提供用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物中htt表現的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列 5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：17)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO：18)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。在一些實施方案中，本發明提供用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物的細胞中htt累積的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：17)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO：18)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。在一些實施方案中，所述第一鏈包含與SEQ ID NO：17具有約90%同一性的核酸序列但保持所述CpG基序。在一些實施方案中，所述第一鏈包含與SEQ ID NO：18具有約90%同一性的核酸序列但保持所述CpG基序。
在上述方法的一些實施方案中，所述表現構建體包含編碼如上文所述的RNAi的核酸。在一些實施方案中，編碼所述RNAi的核酸包含miRNA支架。在一些實施方案中，編碼所述RNAi的核酸包含miR-155支架。在一些實施方案中，編碼所述RNAi的核酸與啟動子可操作地連接。在一些實施方案中，所述啟動子能夠在哺乳動物的腦中表現所述RNAi。在一些實施方案中，所述啟動子選自下組：巨細胞病毒(CMV)即刻早期啟動子RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動子、猿猴病毒40(SV40)啟動子、CK6啟動子、轉甲狀腺素啟動子(TTR)、TK啟動子、四環素反應性啟動子(TRE)、HBV啟動子、hAAT啟動子、LSP啟動子、嵌合肝臟特異性啟動子(LSP)、E2F啟動子、端粒酶(hTERT)啟動子、巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白/兔β-球蛋白啟動子(CAG)啟動子、延伸因子1-α啟動子(EFl-α)啟動子、人β-葡糖醛酸糖苷酶啟動子、雞β-肌動蛋白 (CBA)啟動子、逆轉錄病毒勞斯肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子和13-肌動蛋白啟動子。在一些實施方案中，所述啟動子是雜合雞β-肌動蛋白啟動子。在一些實施方案中，所述表現構建體進一步包含多聚腺苷酸化信號。在一些實施方案中，所述多聚腺苷酸化信號是牛生長激素多聚腺苷酸化信號。
在上述方法的一些實施方案中，所述載體包含如上文所述的表現構建體。在一些實施方案中，所述載體是重組腺相關病毒(rAAV)載體、重組腺病毒載體、重組慢病毒載體或重組單純皰疹病毒(HSV)載體。在一些實施方案中，所述載體是重組腺病毒載體。在一些實施方案中，所述重組腺病毒載體源自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或豬Ad 3型。在一些實施方案中，所述重組腺病毒載體源自腺病毒血清型2或腺病毒血清型5的變體。在一些實施方案中，所述載體是重組慢病毒載體。在一些實施方案中，所述重組慢病毒載體源自具有如下病毒假型的慢病毒：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、羅斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病毒、RD114或其中的變體。在一些實施方案中，所述載體是rHSV載體。在一些實施方案中，所述rHSV載體源自rHSV-1或rHSV-2。
在上述方法的一些實施方案中，所述重組AAV(rAAV)載體包含編碼如上文所述的RNAi的表現構建體。在一些實施方案中，所述表現構建體側翼為一個或多個AAV反向末端重複(ITR)序列。在一些實施方案中，所述表現構建體側翼為兩個AAV ITR。在一些實施方案中，所述AAV ITR為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、 AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些實施方案中，所述AAV ITR為AAV2 ITR。在一些實施方案中，所述rAAV載體5’-3’包含AAV2 ITR、啟動子、編碼所述RNAi的核酸、多聚腺苷酸化信號和AAV2 ITR。在一些實施方案中，所述啟動子是CBA啟動子。在一些實施方案中，所述多聚腺苷酸化信號是牛生長激素多聚腺苷酸化信號。在一些實施方案中，所述rAAV載體5’-3’包含AAV2 ITR、CBA啟動子、編碼所述RNAi的核酸、牛生長激素多聚腺苷酸化信號和AAV2 ITR。在一些實施方案中，所述載體進一步包含填充核酸。在一些實施方案中，所述填充核酸包含編碼綠色熒光蛋白(GFP)的核酸。在一些實施方案中，所述填充核酸位於啟動子和編碼所述RNAi的核酸之間。在一些實施方案中，所述RNAi包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列。在其他實施方案中，所述RNAi包含與SEQ ID NO：3的核苷酸序列約90%相同的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述載體是自身互補的載體。在一些實施方案中，所述載體包含編碼所述RNAi的第一核酸序列和編碼所述RNAi的互補物的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可與所述第二核酸序列沿其長度的大部分或全部形成鏈內鹼基對。在一些實施方案中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通過突變的AAV ITR連接，其中所述突變的AAV ITR包含D區的缺失並包含末端解析序列的突變。
在上述方法的一些實施方案中，所述病毒顆粒包含編碼如上文所述的RNAi的載體，其中所述載體是衣殼化rAAV載體的AAV顆粒、衣殼化所述重組腺病毒載體的腺病毒顆粒、衣殼化所述重組慢病毒載體的慢病毒顆粒或衣殼化所述重組HSV載體的HSV顆粒。在一些實施方案中，所述病毒顆粒是衣殼化所述重組腺病毒載體的腺病毒顆粒。在一些實施方案中，所述腺病毒顆粒包含來自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、 AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或豬Ad 3型的衣殼。在一些實施方案中，所述腺病毒顆粒包含腺病毒血清型2衣殼或腺病毒血清型5衣殼的變體。在其他實施方案中，所述病毒顆粒是衣殼化所述重組慢病毒載體的慢病毒顆粒。在一些實施方案中，所述慢病毒顆粒包含具有如下病毒假型的衣殼：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、羅斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病毒、RD114或其中的變體。在其他實施方案中，所述病毒顆粒是HSV顆粒。在一些實施方案中，所述HSV顆粒是rHSV-1顆粒或rHSV-2顆粒。
在上述方法的一些實施方案中，所述重組AAV顆粒包含編碼如上文所述的RNAi的rAAV載體。在一些實施方案中，所述AAV病毒顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV2 V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合體、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣殼。在一些實施方案中，所述所述rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼源自相同的AAV血清型。在其他實施方案中，所述所述rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼源自不同的AAV血清型。在一些實施方案中，所述rAAV病毒顆粒包含AAV2衣殼。在一些實施方案中，所述rAAV病毒顆粒包含AAV1衣殼且其中所述載體包含AAV2 ITR。
在上述方法的一些實施方案中，所述病毒顆粒或rAAV顆粒在組合物中。在一些實施方案中，所述組合物進一步包含藥學上可接受的載劑。
在一些實施方案中，本發明提供如本文所述的RNAi、表現構建體、載體、rAAV載體、病毒顆粒、rAAV顆粒或組合物在 製造用於如本文所述的治療亨廷頓病的任何方法的藥物中的用途。在一些實施方案中，本發明提供如本文所述的RNAi、表現構建體、載體、rAAV載體、病毒顆粒、rAAV顆粒或組合物，其用於本文所述的治療亨廷頓病的任何方法。在一些實施方案中，本發明提供用於在哺乳動物中誘導RNA干擾以治療亨廷頓病的套組，其包含如本文所述的RNAi、表現構建體、載體、rAAV載體、病毒顆粒、rAAV顆粒或組合物。在一些實施方案中，所述哺乳動物是人。在一些實施方案中，所述套組用於如本文所述的任何方法。
本文引用的全部參考文獻，包括專利申請和出版物，通過提述以其整體併入。
圖1A&B顯示AAV2/1-miRNA-Htt介導的體外Htt水平的減少(圖1A)。使用了前病毒構建體方案生成AAV2/1-miRNA-Htt。設計質體以在雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子的轉錄控制下表現GFP和針對Htt的miRNA序列。ITR為反向末端重複。eGFP為增強的綠色熒光蛋白。多聚A為牛生長激素多聚A。(圖1B)在AAV-2/1-miRNA-Htt治療後48小時在HEK293細胞中評估Htt mRNA水平的定量PCR分析。PPIA作為標準化對照基因。值作為平均值±SEM給出。*p<0.05。
圖2A-D證明了用AAV2/1-eGFP-miRNA-Htt載體感染HEK293細胞後的熒光活化細胞分選(FACS)。(圖2A)具有eGFP的HEK293細胞的流式細胞散射概貌。正向光散射A(FSC-A)代表相對的細胞大小、區域和SSC-A代表相對的細胞複雜度，區域中每個點代表一個細胞。(圖2B)細胞的eGFP熒光強度的熒光作圖中每種顏色將分選的細胞分別界定為GFP-、GFP+、GFP++、或GFP+++。(圖2C)表現eGFP的HEK293細胞的FACS柱狀圖。(圖2D)FACS分選後的細胞計數表。
圖3A-E顯示YAC128小鼠中AAV2/1-miRNA-Htt注射 的紋狀體內注射後廣泛的紋狀體轉導和Htt減少。(圖3A)具有eGFP的紋狀體細胞的流式細胞散射概貌。流式細胞散射A(FSC-A)代表相對的細胞大小、區域且SSC-A代表相對的細胞複雜度，區域中每個點代表一個細胞。(圖3B)使用FSC-A對FITC-A的散點圖分析。分選出死細胞並選擇eGFP+和eGFP-細胞。評估並量化來自這些細胞的GFP表現且示於圖3C。(圖3C)用530/30BP過濾器505LP收集的eGFP熒光強度的熒光作圖。(圖3D)顯示AAV2/1-eGFP-miRNA-Htt的紋狀體內施用後遍及紋狀體的廣泛的eGFP表現的熒光顯微術。(圖3E)AAV2/1-miRNA-Htt或AAV2/1-空對照載體注射後1和5個月在紋狀體中評估Htt mRNA水平的定量PCR分析。PPIA作為標準化對照基因。值作為平均值±SEM給出。*p<0.05。當在治療後1和5個月與AAV2/1-空-注射的小鼠(N=8每時間點)比較時，AAV2/1-miRNA-Htt治療的YAC128小鼠(N=8)顯示紋狀體中Htt mRNA水平約50%的減少。
圖4顯示YAC128小鼠中AAV2/1-miRNA-Htt注射的紋狀體內注射後小鼠Htt mRNA的減少。在注射AAV2/1-miRNA-Htt或AAV2/1-空對照載體後1和5個月評估紋狀體中內源小鼠Htt mRNA水平的定量PCR分析。PPIA作為標準化對照基團。值作為平均值±SEM給出。*p<0.05。
圖5A-I證明了通過AAV2/1-miRNA-Htt持續降低YAC128小鼠中的Htt水平未引起明顯的神經炎症。(圖5A-C)來自使用AAV2/1-miRNA-Htt治療的YAC128小鼠在AAV-miRNA-Htt注射後1(圖5B)或5(圖5C)個月紋狀體組織切片的蘇木精和伊紅(H&E)染色，與使用AAV2/1-空載體治療的YAC128小鼠(圖5A)進行了比較。(圖5D-F)來自使用AAV2/1-miRNA-Htt治療的YAC128小鼠在AAV-miRNA-Htt注射後1(圖5E)或5(圖5F)個月紋狀體組織切片的GFAP免疫組化染色，與使用AAV2/1-空載體治療的YAC128小鼠(圖5D)進行了比較。(圖5G-I)來自使用AAV2/1-miRNA-Htt治療的 YAC128小鼠在AAV-miRNA-Htt注射後1(圖5H)或5(圖5I)個月紋狀體組織切片的Iba-1免疫組化染色，與使用AAV2/1-空載體治療的YAC128小鼠(圖5G)進行了比較。對所有照片曝光匹配用於精確比較。比例條：0.25mm。
圖5J&K證明了通過AAV2/1-miRNA-Htt持續降低YAC128小鼠中的Htt水平未引起明顯的神經炎症。(圖5J)注射AAV2/1-miRNA-Htt後1或5個月通過QPCR的GFAP mRNA水平的紋狀體水平。(圖5K)注射AAV2/1-miRNA-Htt後1或5個月通過QPCR的Iba1 mRNA水平。值作為平均值±SEM給出。*與AAV2/1-空小鼠顯著不同，p<0.05；ANOVA。
圖6A-D顯示用於測試YAC128小鼠中AAV2/1-miRNA-Htt的紋狀體施用對行為缺陷的影響的實驗設計。(圖6A)實驗時間表的說明。兩月齡的YAC128和野生型小鼠接受了雙側AAV2/1-miRNA-Htt(N=8 YAC且N=8 WT)或AAV2/1-空對照(N=8 YAC且N=8 WT)的紋狀體注射，且在4和5月齡時分別接受旋轉杆(rotarod)測試和Porsolt游泳測試。在5月齡時處死全部小鼠，隨後收集組織用於生化和組化分析。(圖6B)熒光顯微顯示了在處理後3個月紋狀體中eGFP的表現。AAV2/1-miRNA-Htt治療後3個月通過Western印跡的小鼠(圖6C)和人(圖6D)Htt蛋白水平。
圖6E&F證明了AAV2/1-miRNA-Htt的紋狀體施用減少了YAC128小鼠中的行為缺陷。(圖6E)注射AAV2/1-miRNA-Htt後2個月加速的旋轉杆測試。(圖6F)注射AAV2/1-miRNA-Htt後3個月Porsolt游泳測試中靜止花費的時間。值作為平均值±SEM給出。*與AAV2/1-空小鼠顯著不同，p<0.05；ANOVA隨後為Tukey的後-hoc檢驗。
圖7A&B顯示使用AAV2/1-miRNA-Htt的治療部分改正了YAC128小鼠中DARPP-32和D1受體的轉錄失調。注射AAV2/1-miRNA-Htt(N=8 YAC且N=8 WT)或AAV2/1-空對照(N=8 YAC且N=8 WT)後3個月通過QPCR評估的YAC128和野生型小鼠紋狀體中DARPP-32和D1受體的mRNA水平。(圖7A)AAV2/1-空或AAV2/1-miRNA-Htt治療後YAC128和FVB野生型同窩小鼠中紋狀體DARPP-32 mRNA水平。(圖7B)AAV2/1-空或AAV2/1-miRNA-Htt治療後YAC128和FVB野生型同窩小鼠中紋狀體D1受體mRNA水平。值作為平均值±SEM給出。*與AAV2/1-空樣品顯著不同，p<0.05；ANOVA隨後為Tukey的後-hoc檢驗。
圖8A-D顯示施用AAV2/1-miRNA-Htt在高齡(aged)YAC128小鼠的紋狀體中改善了運動缺陷並減少了突變的Htt聚集物。(圖8A)YAC128小鼠腦切片的免疫組化染色顯示紋狀體中突變的Htt聚集物。在6、9、12(未顯示)和24月齡的YAC128小鼠中觀察到了聚集物。野生型小鼠在全部測試的年齡都顯示無聚集物。(圖8B)在高齡YAC 128和野生型小鼠中用於檢測AAV2/1-miRNA-HTT的實驗時間表的圖示。七個月齡的小鼠接受AAV2/1-miRNA-Htt(N=6 YAC且N=4 WT)或AAV2/1-GFP對照(N=6 YAC且N=4 WT)的雙側紋狀體內注射，且隨後在10月齡接受了行為學測試。在注射後5個月收集腦部(當小鼠為12月齡時)。(圖8C)注射AAV-miRNA-Htt後3個月時高齡的YAC128小鼠對旋轉杆測試的表現。(圖8D)在治療後5個月AAV2/1-miRNA-Htt或AAV2/1-eGFO治療的YAC 128小鼠腦切片的EM-48免疫組化分析。
圖9A&B證明了用於本文所述實驗的shRNA的幹序列中的內部凸出。與完美匹配序列的比較示於圖9A(SEQ ID NO：23)，用於上文實驗的序列在種子序列3’末端包含額外的腺嘌呤核苷酸(A)(通過箭頭高亮)，其在指導鏈(SEQ ID NO：24)中不具有相應的胸腺嘧啶核苷酸(T)(圖9B)。與靶序列互補的序列高亮顯示。
圖10顯示原始PS170XA miRNA序列(SEQ ID NO：19)和兩種修飾的低脫靶版本PS170XAL1(SEQ ID NO：25)和PS170XAL2(SEQ ID NO：26)。
圖11顯示AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1和170XAL2在體外介導Htt減少的AAV能力的能力。值作為平均值±SEM給出。
圖12A-12D顯示AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1和170XAL2在YAC128小鼠的紋狀體中沉默Htt表現的AAV能力的能力。人Htt示於圖12A和12C。小鼠Htt示於圖12B和12D。β-微管蛋白作為對於全部Western印跡的標準化對照基因。*與未治療對照小鼠顯著不同，p<0.05；ANOVA隨後為Tukey的後-hoc檢驗。
圖13A顯示紋狀體中GFAP且圖13B顯示了紋狀體中Iba1 mRNA水平。人PPIA作為標準化對照基因。值作為平均值±SEM給出。*與未治療對照小鼠顯著不同，p<0.05；ANOVA隨後為Tukey的後-hoc檢驗。
圖14顯示來自用AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1或AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL2治療的YAC128小鼠的紋狀體組織切片的GFAP和Iba1免疫組化染色。比例條=50μM。
在一些方面中，本發明提供改進的RNAi；例如改進的用於治療用途的RNAi。在一些實施方案中，所述RNAi包含第一鏈和第二鏈，其中a)所述第一鏈和所述第二鏈形成雙鏈體；b)所述第一鏈包含至少11個鹼基的指導區，其中所述指導區包含含有指導鏈鹼基1-N的種子區，其中N=7或N=8；和c)所述第二鏈包含至少11個鹼基的非指導區，所述非指導區包含雙鏈體中指導區鹼基1-(N+2)的任何一個或多個對側的凸出序列。在一些實施方案中，所述RNAi包含第一鏈和第二鏈，其中a)所述第一鏈和所述第二鏈形成雙鏈體；b)所述第一鏈包含至少10個鹼基的指導區，其中所述指導區包含含有指導鏈鹼基1-N的種子區，其中N=7或N=8；c)所述第二鏈包含至少10個鹼基的非指導區，其中所述非指導區包含雙鏈體中指導區鹼基1-(N+1)的任何一個或多個對側的凸出序列。在一些實施方 案中，所述RNAi包含第一鏈和第二鏈，其中a)所述第一鏈和所述第二鏈形成雙鏈體；b)所述第一鏈包含至少9個鹼基的指導區，其中所述指導區包含含有指導鏈的鹼基2-7或2-8的種子區，且c)所述第二鏈包含至少9個鹼基的非指導區，其中所述非指導區包含雙鏈體中指導區鹼基1或鹼基9的對側的凸出序列。在一些實施方案中，所述RNAi包含第一鏈和第二鏈，其中a)所述第一鏈和所述第二鏈形成雙鏈體；b)所述第一鏈包含至少9個鹼基的指導區，其中所述指導區包含含有指導鏈的鹼基2-7或2-8的種子區，且c)所述第二鏈包含至少9個鹼基的非指導區，其中所述非指導區包含雙鏈體中指導區的鹼基1的對側的凸出序列。在一些實施方案中，所述RNAi是人工RNAi。
在一些方面，本發明提供表現盒、載體(例如重組AAV、腺病毒、慢病毒或HSV載體)、細胞、病毒顆粒(例如AAV、腺病毒、慢病毒或HSV病毒顆粒)和包含本公開的RNAi的藥物組合物。在另一方面中，本發明提供在哺乳動物中用於治療疾病或病症的方法，其包括將包含本公開的RNAi的藥物組合物施用至所述哺乳動物。在另一方面中，本發明提供包含本公開的RNAi的套組。
在一些方面，本發明提供用於治療亨廷頓病的RNAi。在一些實施方案中，所述RNAi包含包含第一鏈和第二鏈，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：1)的指導區且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO：2)的非指導區，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。在一些方面，本發明提供包含本公開的RNAi的表現盒、載體(例如重組AAV、腺病毒、慢病毒或HSV載體)、細胞、病毒顆粒(例如AAV、腺病毒、慢病毒或HSV病毒顆粒)和藥物組合物。在另一方面中，本發明提供用於治療亨廷頓病、抑制htt的表現、抑制htt在哺乳動物的細胞中累積的方法，其包括將包含本公開的RNAi的藥物組合物施用這所述哺乳動物。在另一方面中，本發明提供藥 物包含本公開的組合物用於治療亨廷頓病(例如改善亨廷頓病的症狀)、抑制htt的表現、抑制htt在具有亨廷頓病的哺乳動物的細胞中累積的用途。在另一方面中，本發明提供用於在哺乳動物中治療亨廷頓病的套組，其包含本公開的RNAi。
I.一般技術
本文描述和引用的技術和方法為本領域的技術人員一般充分理解的且使使用常規方法學所通常採用的，如例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Sambrook等，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2012)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等編，2003)；the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；PCR 2：A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor編，1995)；Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow和Lane，編，1988)；Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney，第6版，J.Wiley and Sons,2010)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編，1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編，Academic Press,1998)；Introduction toCell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,Plenum Press,1998)；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths，和D.G.Newell，編，J.Wiley and Sons,1993-8)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell，編，1996)；Gene Transfer vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos，編，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等編，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等編，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等編，J.Wiley and Sons,2002)；Immunobiology(C.A.Janeway等，2004)； Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：A Practical Approach(D.Catty.編，IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies：A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean，編，Oxford University Press,2000)；Using Antibodies：A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra，編，Harwood Academic Publishers,1995)和Cancer：Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等編，J.B.Lippincott Company,2011)中所述的廣泛採用的方法學。
II.定義
如本文使用的“載體”指包含體外或體內待遞送入宿主細胞的重組質體或病毒。
如本文使用的術語“多核苷酸”或“核酸”指任何長度的核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)的多聚形式。因此，該術語包括但不限於單-、雙-或多鏈DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜合體或包含嘌呤和嘧啶鹼基的多聚物或其他天然、化學或生物修飾的、非天然的或衍生的核苷酸鹼基。多核苷酸骨架可包含糖和磷酸基團(如通常在RNA或DNA中所發現)，或修飾或取代的糖或磷酸基團。可替換地，多核苷酸骨架可包含合成亞基如胺基磷酸酯的多聚物且因此可以是寡脫氧核苷胺基磷酸酯(P-NH2)或混合胺基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。此外，雙鏈多核苷酸可從化學合成的單鏈多核苷酸產物通過合成互補鏈和在合適的條件下退火該鏈，或用合適的引子通過使用DNA聚合酶從頭合成互補鏈而獲得。
術語“多肽”和“蛋白”可互換使用以指代胺基酸殘基的多聚物且不限於最小長度。這種胺基酸殘基的多聚物可包含天然或非天然胺基酸殘基，且包括但不限於肽、寡肽、胺基酸殘基的二聚體、三聚體和多聚體。定義涵蓋全長的蛋白及其片段兩者。術語還包括多肽的表現後修飾，例如，糖基化、唾液酸化、乙醯化，磷酸 化等。此外，就本發明而言，“多肽”指包含對天然序列的修飾的蛋白，如缺失、添加和取代，只要蛋白保持預期活性。這些修飾可以是刻意的，如通過定點誘變，或可以是意外的，如通過產生蛋白的宿主的突變或由於PCR擴增的錯誤。
“重組病毒載體”指包含一個或多個異源序列(即非病毒來源的核酸序列)的重組多核苷酸載體。在重組AAV載體的情況中，重組核酸側翼為至少一個，且在一些實施方案中為兩個反向末端重複序列(ITR)。
“重組AAV載體(rAAV載體)”指代包含一個或多個側翼為至少一個且在一些實施方案中為兩個AAV反向末端重複序列(ITR)的異源序列(即非AAV來源的核酸序列)的多核苷酸載體。當存在於已用合適的輔助病毒(或表現合適的輔助功能)感染且表現AAVrep和cap基因產物(即AAV Rep和Cap蛋白)的宿主細胞中，這種rAAV載體可複製並包裝入傳染性病毒顆粒。當rAAV載體併入更大的多核苷酸(例如在染色體中或另一用於克隆或轉染的載體如質體)時，隨後rAAV載體可稱作“促載體”，其在AAV包裝功能和合適的輔助功能存在下可通過複製和衣殼化“挽救”。rAAV載體可以是多種形式的任何，包括但不限於質體、線性人工染色體、與脂質的複合、包囊於脂質體內和衣殼化於病毒顆粒中，特別是AAV顆粒。rAAV載體可包裝入AAV病毒衣殼以生成“重組腺相關病毒顆粒(rAAV顆粒)”。
“重組腺病毒載體”指包含一個或多個側翼為至少一個腺病毒反向末端重複序列(ITR)的異源序列(即非腺病毒來源的核酸序列)的多核苷酸載體。在一些實施方案中，所述重組核酸側翼為兩個反向末端重複序列(ITR)。當存在於表現從重組病毒基因組缺失的必要腺病毒基因(例如E1基因、E2基因、E4基因等)的宿主細胞中時，這種重組病毒載體可複製並包裝入感染性病毒顆粒。當將重組病毒載體併入更大多核苷酸(例如在染色體中或另一載體如用於克隆或轉染的質體中)時，隨後rAAV載體可稱作“促載體”，其在AAV 包裝功能和合適的輔助功能存在下可通過複製和衣殼化“挽救”。重組病毒載體可以是多種形式的任何，包括但不限於質體、線性人工染色體、與脂質的複合、包囊於脂質體內和衣殼化於病毒顆粒中，例如AAV顆粒。重組病毒載體可包裝入腺病毒病毒衣殼以生成“重組腺病毒顆粒”。
“重組慢病毒載體”指包含一個或多個側翼為至少一個慢病毒末端重複序列(LTR)的異源序列(即非慢病毒來源的核酸序列)的多核苷酸載體。在一些實施方案中，所述重組核酸側翼為兩個慢病毒末端重複序列(LTR)。當存在於已用合適的輔助功能感染的宿主細胞中時，這種重組病毒載體可複製並包裝入感染性病毒顆粒。重組慢病毒載體可包裝入慢病毒衣殼以生成“重組慢病毒顆粒”。
“重組單純皰疹載體(重組HSV載體)”指包含一個或多個側翼為HSV末端重複序列的異源序列(即非HSV來源的核酸序列)的多核苷酸載體。當存在於已用合適的輔助功能感染的宿主細胞中時，這種重組病毒載體可複製並包裝入感染性病毒顆粒。當將重組病毒載體病毒併入更大的多核苷酸(例如在染色體中或另一載體如用於克隆或轉染的質體中)時，隨後重組病毒載體可稱作“促載體”，其在HSV包裝功能存在下可通過複製和衣殼化“挽救”。重組病毒載體可以是多種形式的任何，包括但不限於質體、線性人工染色體、與脂質的複合、包囊於脂質體內和衣殼化於病毒顆粒中，例如HSV顆粒。重組病毒載體可包裝入HSV衣殼以生成“重組單純皰疹病毒顆粒”。
“異源”意為源自與其所比較的或其所導入或併入的其餘實體基因型不同的實體。例如，通過基因工程技術導入不同細胞類型的多核苷酸是異源多核苷酸(且，當表現時，可編碼異源多核苷酸)。相似地，併入病毒載體的細胞序列(例如基因或其部分)是相對於該載體的異源核苷酸序列。
術語“轉基因”指導入細胞且能夠轉錄成RNA且任選 地翻譯和/或在合適條件下表現的多核苷酸。在一些方面中，其賦予所導入的細胞預期的特徵，或以其他方式導致預期的治療或診斷成果。另一方面，其可轉錄成介導RNA干擾的分子，如miRNA、siRNA或shRNA。
“雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子”指源自雞β-肌動蛋白基因的多核苷酸序列(例如，原雞(Gallus gallus)β肌動蛋白，由GenBank Entrez基因ID 396526所示)。如本文使用的“雞β-肌動蛋白啟動子”可指包含巨細胞病毒(CMV)早期增強元件、該啟動子和雞β-肌動蛋白基因的第一外顯子和內含子、和兔β-珠蛋白基因的剪接受體的啟動子，如描述於Miyazaki,J.等(1989)Gene 79(2)：269-77的序列。如本文使用的術語“CAG啟動子”可互換使用。如本文使用的術語“CMV早期增強子/雞β肌動蛋白(CAG)啟動子”可互換使用。
如指代病毒力價使用的術語“基因組顆粒(gp)”、“基因組等價物”或“基因組拷貝”指包含重組AAV DNA基因組的病毒的粒數目，無論感染性或功能性。特定載體製劑的基因組顆粒數目可通過如描述于本文實施例或例如Clark等(1999)Hum.Gene Ther.,10：1031-1039；Veldwijk等(2002)Mol.Ther.,6：272-278中的方法測量。
如本文使用的術語“載體基因組(vg)”可指包含載體例如病毒載體的多核苷酸序列集合的一個或多個多核苷酸。載體基因組可以在病毒顆粒中衣殼化。取決於特定的病毒載體，載體基因組可包含單鏈DNA、雙鏈DNA或單鏈RNA或雙鏈RNA。載體基因組可包含與特定病毒載體相關的內源序列和/或任何通過重組技術插入特定病毒載體的異源序列。例如，重組AAV載體基因組可包含啟動子側翼的至少一個ITR序列、填充物(stuffer)、感興趣的序列(例如RNAi)和多聚腺苷酸化序列。完整的載體基因組可包含載體的多核苷酸序列的完整集合。在一些實施方案中，病毒載體的核酸力價可以vg/mL計測量。適於測量該力價的方法為本領域已知(例如定量 PCR)。
如本文使用的術語“抑制”可指阻斷、減少、去除或以其他方式拮抗特定靶標的存在或活性的作用。抑制可指部分抑制或全部抑制。例如抑制基因的表現可指任何導致基因表現的阻斷、減少、去除或任何其他拮抗的任何作用，包括mRNA豐度的減少(例如沉默mRNA轉錄)、mRNA降解、抑制mRNA翻譯等。在一些實施方案中，抑制HTT的表現可指HTT表現的阻斷、減少、去除或任何其他拮抗，包括HTT mRNA豐度的減少(例如沉默HTT mRNA轉錄)、HTT mRNA的降解、抑制HTT mRNA翻譯等。作為另一實例，抑制蛋白在細胞中的累積可指任何導致所述蛋白表現的阻斷、減少、去除或其他拮抗的任何作用，包括減少mRNA豐度(例如沉默mRNA轉錄)、降解mRNA、抑制mRNA翻譯、降解所述蛋白等。在一些實施方案中，抑制細胞中HTT蛋白的累積指在細胞中HTT蛋白表現的阻斷、減少、去除或其他拮抗，包括減少HTT mRNA豐度(例如沉默HTT mRNA轉錄)、HTT mRNA的降解、抑制HTT mRNA翻譯、HTT蛋白的降解等。
如指代病毒力價使用的術語“感染單位(iu)”、“感染顆粒”或“複製單位”指如通過感染性中心測定法(也稱為複製中心測定法，如例如McLaughlin等(1988)J.Virol.,62：1963-1973中所述)所測量的感染性和有複製能力的重組AAV載體顆粒的數目。
指代病毒力價所使用的術語“轉導單位(tu)”指如本文實施例所述的功能性測定法或例如Xiao等(1997)Exp.Neurobiol.,144：113-124或Fisher等(1996)J.Virol.,70：520-532(LFU測定法)中所測量的導致功能性轉基因產物產生的感染性重組AAV載體顆粒的數目。
“反向末端重複”或“ITR”序列是本領域熟知的術語且指代在病毒基因組末端發現的處於相反方向的相對短的序列。
“AAV反向末端重複(ITR)”序列為本領域熟知，是在天 然單鏈AAV基因組兩末端都存在的約145個核苷酸的序列。ITR最外側的125個核苷酸可以可替換的兩個方向存在，導致不同AAV基因組之間和單AAV基因組兩末端之間的異質性。最外側的125個核苷酸還包含數個自我互補的較短區(稱為A、A'、B、B'、C、C'和D區)，允許鏈內鹼基配對在ITR的該部分內發生。
“末端解析序列”或“trs”是AAV ITR D區中的序列，其在病毒DNA複製過程中通過AAV rep蛋白裂解。突變的末端解析序列難以通過AAV rep蛋白的裂解。
“AAV輔助功能”指允許AVV通過宿主複製並細胞包裝的功能。AAV輔助功能可以任何多種形式提供，包括但不限於幫助AAV複製和包裝的輔助病毒或輔助病毒基因。其他AAV輔助功能為本領域已知如遺傳毒性劑。
AAV的“輔助病毒”指允許AAV(其為有缺陷的細小病毒)通過宿主複製並細胞包裝的病毒。輔助病毒提供"輔助功能"，其允許AAV的複製。已確定多種這樣的輔助病毒，包括腺病毒、皰疹病毒(herpesvirus)和痘病毒(poxvirus)如牛痘(vaccinia)和杆狀病毒(baculovirus)。腺病毒涵蓋多種不同的亞群，儘管亞群C的5型腺病毒(Ad5)是最常使用的。人、非人哺乳動物和禽類來源的多種腺病毒為已知且可從保藏機構如ATCC獲得。皰疹病毒家族(也可從保藏機構如ATCC獲得)包括例如單純皰疹病毒(herpes simplex virus)(HSV)、愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)(EBV)，巨細胞病毒(cytomegalovirus)(CMV)和偽狂犬病病毒(pseudorabies virus)(PRV)。用於AAV複製的腺病毒輔助功能的實例包括E1A功能、E1B功能、E2A功能、VA功能和E4orf6功能。可從保藏機構獲得的杆狀病毒(Baculovirus)包括苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)。
如果感染性AAV顆粒與感染性輔助病毒顆粒的比率至少為約102：1、至少約104：1、至少約106：1或至少約108：1或更多，則 稱rAAV的製備物“基本上無”輔助病毒。在一些實施方案中，製劑還基本上無等量的輔助病毒蛋白(即如果上文所示的輔助病毒顆粒雜質以破壞的形式存在，則蛋白將作為所述輔助病毒水平的結果存在)。病毒和/或細胞蛋白污染一般可作為SDS凝膠上考馬斯染色條帶的存在而觀察到(例如，條帶而非對應於AAV衣殼蛋白VP1、VP2和VP3的那些的出現)。
相對於參照多肽或核酸序列的“百分比(%)序列同一性”定義為對齊序列和導入缺口後(如果需要的話)以實現最大百分比序列同一性，且不考慮任何保守取代作為序列同一性的部分，與參照多肽或核酸序列中的胺基酸殘基或核苷酸相同的候選序列中的胺基酸殘基或核苷酸的百分比。出於確定百分比胺基酸或核酸序列同一性的目的，可以多種本領域已知的方式實現比對，例如，使用公眾可獲得的計算機軟件程序，例如，描述於Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等編，1987),Supp.30,section 7.7.18，表7.7.1的那些，且包括BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。優選的比對程序是ALIGN Plus(Scientific and Educational Software,Pennsylvania)。本領域的技術人員可確定用於測量比對的合適參數，包括任何以實現在所比較的序列全長上實現最大比對所需的算法。就本文而言，給定胺基酸序列A對、與或針對給定胺基酸序列B的%胺基酸序列同一性(其可替換地可稱為具有或包含對、與或針對胺基酸序列B一定%胺基酸序列同一性的胺基酸序列A)如下計算：100乘以分數X/Y，其中X是在A和B的程序比對中通過序列比對軟件評分為相同匹配的胺基酸殘基的數目，且其中Y是B中胺基酸殘基的總數。可以理解的是其中胺基酸序列A的長度與胺基酸序列B的長度不等，A對B的%胺基酸序列同一性將不等於B對A的%胺基酸序列同一性。就本文而言，給定核酸序列C對、與或針對給定核酸序列D的%核酸序列同一性(其可替換地可稱為對、與或針對給定核酸序列D具有或包含一定%核酸序列的給定核酸序列 C)如下計算：100乘以分數W/Z，其中W是在C和D的程序比對中通過序列比對軟件評分為相同匹配的核苷酸的數目，且其中Z是D中核苷酸的總數。可以理解的是其中核酸序列C的長度不等於核酸序列D的長度，C對D的%核酸序列同一性將不等於D對C的%核酸序列同一性。
“單離的”分子(例如核酸或蛋白)或細胞意為已鑒定和分離和/或從其天然環境的組分回收。
“有效量”是足以影響有益或預期結果的量，包括臨床結果(例如改善症狀、實現臨床終點等)。有效量可以一次或多次施用。就疾病狀態而言，有效量是足以改善、穩定或延遲疾病進展的量。
“個體”或“受試者”是哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養動物(例如，牛、綿羊(sheep)、貓、狗和馬)、靈長類動物(例如，人和非人靈長類動物如猴)、兔和齧齒類動物(例如小鼠和大鼠)。在一些實施方案中，個體或受試者是人。
如本文使用的“治療”是用於獲得有益或預期的臨床結果的方式。就本發明而言，有益或預期的臨床結果包括但不限於症狀改善、疾病程度的減少、疾病的穩定化(例如未惡化)狀態、疾病傳播(例如轉移)的預防、疾病進展的延遲或減緩、疾病狀態的改善或緩和以及緩解(無論部分或全部)，無論是可檢測的或不可檢測的。“治療”還可意為與未接受治療的預期生存率相比延長生存率。
如本文使用的術語“預防性治療”指治療，其中個體已知或疑似具有或處於具有病症的風險，但未顯示或顯示最小的病症症狀。經歷預防性治療的個體可在症狀發生前治療。
“亨廷頓氏病(HD)”指進展性腦病症，通常由HTT基因中的突變引起(又名亨廷頓蛋白，HD或IT15)。其可通過下列症狀表徵：異常運動(稱為舞蹈病)、運動功能逐漸喪失、情緒或精神疾病和漸進性認知障礙。儘管大多症狀在30和40歲出現，但已發現 疾病的青少年形式。對於HD的進一步描述，參見OMIM Entry No.143100。
“亨廷頓蛋白(HTT)”可指與大多數亨廷頓氏病情況相關的基因或其多肽產物。亨廷頓蛋白的正常功能尚未完全理解。然而，已知亨廷頓蛋白基因中的突變引起HD。這些突變通常以常染色體顯性遺傳方式遺傳且涉及HTT基因中三核苷酸CAG重複的擴增，導致Htt蛋白中的多聚穀氨醯胺(多聚Q)束。
如本文使用“RNAi”可指任何在細胞中誘導RNA干擾的RNA分子。RNAi的實例包括但不限於小抑制性RNAs(siRNA)、微小RNAs(miRNA)和小髮夾RNA(shRNA)。
“miRNA支架”可指多核苷酸，其包含：(i)靶向感興趣的基因以通過RNAi敲低的雙鏈序列和(ii)形成類似內源miRNA的莖-環結構的額外的序列。當多核苷酸組裝入miRNA樣二級結構時，靶向感興趣的基因用於RNAi的序列(例如短的，~20-nt序列)可連接于生成miRNA樣莖-環的序列和與感興趣的序列鹼基配對的序列以形成雙鏈體。如本文所述，該雙鏈體可不完美雜交，例如其可包含一個或多個未配對或錯配的鹼基。當通過Dicer切割該多核苷酸時，該包含靶向感興趣的基因的序列的雙鏈體可展開且併入RISC複合物。miRNA支架可指miRNA自身或編碼所述miRNA的DNA多核苷酸。miRNA支架的實例是miR-155序列(Lagos-Quintana,M.等(2002)Curr.Biol.12：735-9)。商業上可得到的用於將序列克隆入miRNA支架的套組為本領域已知(例如來自Life Technologies的InvitrogenTM BLOCK-iTTM Pol II miR RNAi表現載體套組，Thermo Fisher Scientific；Waltham,MA)。
如本文使用的“凸出”指在雙鏈體核酸中與對側核酸不互補的核酸區。例如，凸出可指在雙鏈體核酸中與對側核酸不互補的核酸序列，其中所述凸出側翼為與雙鏈體核酸中的對側核酸互補的核酸區。在一些實例中，凸出可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10或大於10個鹼基的任何長度。在一些實例中，凸出可由錯配導致(例如對側鏈包含非互補的鹼基)或凸出可由未配對導致(例如對側鏈包含與凸出側翼的核酸互補但對側鏈不包含凸出對側的核酸)。
如本文使用的術語“有義”核酸是包含編碼全部或部分轉基因的序列的核酸。在一些實例中，轉基因的mRNA是有義核酸。
如本文使用的“反義”核酸是與“有義”核酸互補的核酸序列。例如反義核酸可與編碼轉基因的mRNA互補。
如本文使用的RNAi的“指導區”是結合靶mRNA的RNAi的鏈，通常基於互補性。互補區可涵蓋指導區的全部或部分。通常，互補區至少包括種子區。在許多情況中，RNAi的反義區是指導區。
如本文使用，對於RNAi的“過客區”或“非指導區”在本文可互換使用，是與指導區互補的RNAi區。在許多情況中，RNAi的有義區是過客區。
如本文使用RNAi的“種子區”(例如miRNA)是微小RNA的長度上約1-8核苷酸的區。在一些實例中，種子區和其靶mRNA的3'-UTR可以是RNAi識別中的核心決定部分。
如本文使用的“脫靶基因沉默”指RNAi種子區與非故意的mRNA的3'-UTR配對且指導翻譯抑制和那些轉錄物的去穩定化(例如減少非故意的mRNA的表現)。
本文值或參數“約”的指代包括(和描述)針對值或參數本身的實施方案。例如，指“約X”的描述包括“X”的描述。
除非另外指明，如本文使用的製品的單數形式“一種”、“一個”和“所述”包括複數指稱。
可以理解的是，本文所述的本發明的方面和實施方案包括“包含”、“由...組成”和/或“基本上由...組成”的方面和實施方案。
III. RNAi
在一些方面，本發明提供改進的RNAi。在一些實施方案中，所述RNAi是小抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或小髮夾RNA(shRNA)。小抑制性或干擾RNA(siRNA)在本領域已知是誘導細胞中RNAi的長度為19-25(例如19-23)鹼基對的雙鏈RNA分子。小髮夾RNA(shRNA)在本領域已知為誘導細胞中RNAi的包含通過短環(例如~4-11核苷酸)連接的雙鏈RNA的約19-25(例如19-23)鹼基對的RNA分子。
微小RNA(miRNA)在本領域已知為誘導細胞中RNAi的包含通過環連接的雙鏈RNA的短(例如19-25鹼基對)序列並包含含有一個或多個凸出(例如錯配或未配對的鹼基對)的雙鏈RNA的一個或多個額外序列的RNA分子。如本文使用的術語“miRNA”涵蓋內源miRNA以及外源或異源miRNA。在一些實施方案中，“miRNA”可指初級miRNA(pri-miRNA)或前-miRNA(pre-miRNA)。在miRNA加工過程中，產生初級miRNA轉錄物。初級miRNA通過Drosha-DGCR8通過切除一個或多個序列以保留具有5’側翼區、指導鏈、環區、非指導鏈和3’側翼區；或者5’側翼區、非指導鏈、環區、指導鏈和3’側翼區的前-miRNA進行加工以產生前-miRNA。前-RNA隨後輸出至細胞質並通過Dicer加工以得到具有指導鏈和非指導(或過客)鏈的siRNA。所述指導鏈隨後被RISC複合物使用以催化基因沉默，例如通過識別與指導鏈互補的靶RNA序列。對miRNA的進一步描述可在例如WO 2008/150897中發現。靶序列通過miRNA的識別最初由在靶標和miRNA種子序列(例如指導鏈的核苷酸1-8(5’-3’))之間的配對確定(參見例如Boudreau,R.L.等(2013)Nucleic Acids Res.41：e9)。
在初級/前-miRNA結構中，雙鏈體中指導鏈：非指導鏈的界面部分通過互補鹼基配對形成(例如Watson-Crick鹼基配對)。然而，在一些實施方案中，該互補鹼基配對不通過整個雙鏈體延伸。在一些實施方案中，界面中各凸出可在一個或多個核苷酸位置存 在。如本文使用的術語"凸出"可指與雙鏈體中其對側的核酸不互補的核酸區。在一些實施方案中，當互補核酸區彼此結合而中心非互補區的區域不結合時，形成凸出。在一些實施方案中，當位於兩互補區之間的兩核酸鏈長度不同時，形成凸出。如下文所述，凸出可以是1個或多個核苷酸。
在miRNA加工過程中，miRNA在鄰近指導鏈：非指導鏈界面處的切割位點切割，因此釋放指導和非指導鏈的siRNA雙鏈體。在一些實施方案中，所述miRNA在與切割位點鄰近的有義或反義鏈中包含凸出。為說明另一方式，在一些實施方案中，所述miRNA在與種子序列鄰近的指導或非指導鏈中包含凸出。在該位置中各凸出通過圖9B中所述的示例性實施方案中的箭頭指示。
在一些實施方案中，所述miRNA在成熟非指導鏈的5’切割位點對側的指導鏈中包含凸出。在一些實施方案中，所述miRNA在非指導鏈5’核苷酸對側包含凸出。在一些實施方案中，所述miRNA在成熟指導鏈3’切割位點的對側有義鏈中包含凸出。在一些實施方案中，所述miRNA在指導鏈3’核苷酸對側包含凸出。
在一些實施方案中，所述RNAi包含第一鏈和第二鏈，其中a)所述第一鏈和所述第二鏈形成雙鏈體；b)所述第一鏈包含至少11個鹼基的指導區，其中所述指導區包含含有指導鏈的鹼基1-N的種子區，其中N=7或N=8；且c)所述第二鏈包含至少11個鹼基的非指導區，其中所述非指導區包含雙鏈體中指導區的鹼基1-(N+2)的任何一個或多個對側的凸出序列。在一些實施方案中，其中N=7且凸出是指導區的對側鹼基1、2、3、4、5、6、7、8或9。在其他實施方案中，N=8且凸出是指導區的對側鹼基1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。
在一些實施方案中，所述RNAi包含第一鏈和第二鏈，其中a)所述第一鏈和所述第二鏈形成雙鏈體；b)所述第一鏈包含至少10個鹼基的指導區，其中所述指導區包含含有指導鏈鹼基1-N的種 子區，其中N=7或N=8；且c)所述第二鏈包含至少10個鹼基的非指導區，其中所述非指導區包含雙鏈體中指導區鹼基1-(N+1)的任何一個或多個對側的凸出序列。在一些實施方案中，N=7且所述凸出是指導區的對側鹼基1、2、3、4、5、6、7或8。在其他實施方案中，N=8且所述凸出是指導區的對側鹼基1、2、3、4、5、6、7、8或9。
在一些實施方案中，所述非指導區包含雙鏈體中指導區鹼基1-N的任何一個或多個對側的凸出序列。在一些實施方案中，N=7且所述凸出是指導區的對側鹼基1、2、3、4、5、6或7。在其他實施方案中，N=8且所述凸出是指導區的對側鹼基1、2、3、4、5、6、7或8。
在一些實施方案中，所述RNAi包含第一鏈和第二鏈，其中a)所述第一鏈和所述第二鏈形成雙鏈體；b)所述第一鏈包含至少9個鹼基的指導區，其中所述指導區包含含有指導鏈鹼基2-7或2-8的種子區，且c)所述第二鏈包含至少9個鹼基的非指導區，其中所述非指導區包含雙鏈體中指導區鹼基1或鹼基9的對側的凸出序列。
在一些實施方案中，所述RNAi包含第一鏈和第二鏈，其中a)所述第一鏈和所述第二鏈形成雙鏈體；b)所述第一鏈包含至少9個鹼基的指導區，其中所述指導區包含含有指導鏈的鹼基2-7或2-8的種子區，且c)所述第二鏈包含至少9個鹼基的非指導區，其中所述非指導區包含雙鏈體中指導區的鹼基1或鹼基9對側的凸出序列。
在一些實施方案中，所述凸出通過在指導區上缺乏互補鹼基的雙鏈體中非指導鏈的一個或多個鹼基形成，其中所述凸出側翼為與指導鏈進行鹼基配對的鹼基。在一些實施方案中，所述凸出序列具有約1-10核苷酸。在一些實施方案中，所述凸出序列具有約2-15核苷酸。在一些實施方案中，所述凸出序列具有約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、 約14或約15個核苷酸。
基於RNAi的療法的安全性可由小抑制性RNA(siRNA)與非故意的的mRNA結合並減少其表現(稱為脫靶基因沉默的作用)阻礙。脫靶主要發生在當種子區(小RNA的核苷酸2-8)與非故意的mRNA的3'-UTR中的序列配對並指導翻譯抑制和那些轉錄物的去穩定化時。減少的脫靶RNAi可通過取代指導和非指導序列內鹼基，例如通過生成CpG基序而設計。可導致顯著更低的脫靶評分的潛在取代可使用SiSPOTR算法(一種針對特異性的siRNA設計算法，其識別具有最小脫靶潛力和強大的沉默能力的候選序列)評估(Boudreau等，Nucleic Acids Res.2013 Jan；41(1)e9。減少的SiSPOTR評分預測與親本RNAi分子相比具有較低潛在人脫靶數目的序列。在本發明的一些實施方案中，改進所述RNAi以減少脫靶基因沉默。在一些實施方案中，所述RNAi包含一個或多個CpG基序。在一些實施方案中，所述RNAi在種子區包含一個或多個CpG基序。
在一些實施方案中，所述第一鏈和所述第二鏈通過能夠形成環結構的RNA(例如RNA接頭)的方式連接。如本領域中已知的，當RNA分子包含由不鹼基配對在一起的RNA序列分開的鹼基配對在一起的兩個RNA序列時，形成RNA環結構(例如莖-環或髮夾)。例如，如果序列A和C互補或部分互補使得它們鹼基配對在一起，但在序列B中的鹼基不鹼基配對在一起，則可在RNA分子A-B-C中形成環結構。
在一些實施方案中，能夠形成環結構的RNA包含4-50個核苷酸。在一些實施方案中，能夠形成環結構的RNA包含13個核苷酸。在一些實施方案中，在能夠形成環的RNA中核苷酸的數目為4-50個核苷酸或其間的任何整數。在一些實施方案中，0-50%的環可與環的另一部分互補。如本文使用的術語“環結構”是接合核酸兩互補鏈的序列。在一些實施方案中，環結構的1-3個核苷酸鄰接核酸的互補鏈且可與環結構遠端部分的1-3個核苷酸互補。例如在所述環結 構5’末端的三核苷酸可與在環結構3’末端的三核苷酸互補。
在一些實施方案中，編碼本公開的RNAi的核酸包含異源miRNA支架。在一些實施方案中，使用異源miRNA支架用於調節miRNA表現；例如以增加miRNA表現或減少miRNA表現。可使用本領域已知的任何miRNA支架。在一些實施方案中，所述miRNA支架源自miR-155支架(參見例如Lagos-Quintana,M.等(2002)Curr.Biol.12：735-9和來自Life Technologies,Thermo Fisher Scientific；Waltham,MA的InvitrogenTM BLOCK-iTTM Pol II miR RNAi表現載體套組)。
IV.亨廷頓病及其實驗模型
亨廷頓病(HD)是通過在亨廷頓蛋白基因(HTT)外顯子1中CAG重複擴展引起的遺傳性神經退行性疾病。所致的N-末端區中多聚穀氨醯胺束的延伸賦予突變的亨廷頓蛋白蛋白(mHtt)毒性獲得性功能。mHtt毒性可從不溶的包含mHtt的聚集物形成、轉錄失調和蛋白穩態中的擾動產生，其全部導致神經元死亡(Saudou等(1998)Cell,95：55-66；Zuccato等(2003)Nat.Genet.35：76-83；Schaffar等(2004)Mol.Cell.15：95-105；Benn等(2008)J.Neurosci.28：10720-10733)。在具有HD的患者中的病理性發現包括皮質變薄和紋狀體神經元驚人的進行性喪失(Rosas等，(2002)Neurology 58：695-701)。疾病初始通常在生命的30至40歲過程中發生；症狀包括舞蹈病樣動作、協調障礙、進行性癡呆和其他精神障礙(Vonsattel等，(1985)J.Neuropathol.Exp.Neurol.44：559-577)。在大多數的情況中，症狀在30-40歲開始出現，伴隨運動技能、認知和個性的細微破壞。隨時間這些進展成為不平穩、無法控制的運動和肌肉控制喪失、癡呆和精神疾病如抑鬱、侵略、焦慮和強迫行為。死亡通常在症狀發病後的10-15年發生。少於10%的HD情況涉及疾病的青少年發病形式，其由更快的疾病進展表徵。認為約10,000的美國人中約有1 人具有HD。
儘管HD的遺傳基礎已發現近20年，目前的療法大部分是姑息的，而不解決疾病的根本原因。這可能部分是由於如下事實：該疾病的病因學複雜，在多種細胞過程中都觀察到了不利的影響。因此，藥物開發的焦點已針對解決主要的激惹的(offending)觸發因素，即突變的HTT基因本身。
HD的大多數情況與HTT基因中的三核苷酸CAG重複擴展相關。HTT基因中CAG重複的數目與HD的表現強烈相關。例如，具有35或更少重複的個體通常不發展HD，但具有27-35重複的個體具有更高的後代患有HD的風險。具有36至40-42重複的個體具有不完全顯性的HD，而具有多於40-42重複的個體顯示完全的顯性。青少年發病的HD情況可與60或更多的CAG重複大小相關。
由該CAG重複擴大導致的多聚Q-擴展的Htt蛋白與細胞聚集物或包涵體、擾動的蛋白穩態和轉錄失調相關。儘管這些毒性表型可與機體的數個部分相關，其最常與神經元細胞死亡相關。HD患者經常顯示皮質變薄和紋狀體神經元驚人、進行性喪失。紋狀體表現為對HD最脆弱的腦部區域(特別是紋狀體介質多棘神經元)，在殼核和尾狀核中可見早期影響。在HD患者的腦中觀察到紋狀體多棘神經元中的細胞死亡、增加數目的星形膠質細胞和小神經膠質細胞的激活。HD還可影響海馬區、大腦皮質、丘腦、下丘腦和小腦的一些區域。
提出的阻斷Htt表現的方式包括使用反義寡核苷酸(ASO)以及雙鏈體RNA(dsRNA)或化學修飾的單鏈RNA(ssRNA)的RNA干擾(RNAi)(Harper等，(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：5820-5825；DiFiglia等，(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104：17204-17209；Boudreau等，(2009b)Mol.Ther.17：1053-1063；Drouet等，(2009)Ann.Neurol.65：276-285；Sah等，(2011)J.Clin.Invest.121：500-507；Matsui等，(2012)Drug Discov.Today 17：443-450；Yu等，(2012)Cell 150：895-908)。然而，將ASO方式轉換成臨床的障礙可包括併入裝置以促進將ASO重複和長期輸注入CNS的需求，和充足分佈藥物至大腦的靶區的需求。
為回避這些ASO的潛在問題，採用提供增加的安全性、增加的效率和更長效的效力的潛力的RNAi的AAV-介導表現(例如siRNA)可為有優勢的。由於HD患者表現突變和野生型Htt等位基因兩者，大多數siRNA靶向序列將可能降解這兩種等位基因。然而，已顯示HD小鼠中的非等位基因特異性Htt沉默為良好耐受的並可提供與單獨減少突變Htt相同的益處(Boudreau等，(2009b)Mol.Ther.17：1053-1063；Drouet等，(2009)Ann.Neurol.65：276-285；Kordasiewicz等，(2012)Neuron 74(6)：1031-1044)。此外，報告的AAV-介導的RNAi後非人靈長類的殼核中野生型Htt的部分和持續抑制不具有任何不想要的效果，這表明成年腦可耐受減少的野生型Htt水平(McBride等，(2011)Mol.Ther.19：2152-2162；Grondin等，(2012)Brain 135：1197-1209)。
HD的動物模型可用於測試潛在的治療策略，如本公開的組合物和方法。用於HD的小鼠模型為本領域已知。這些包括具有突變的HTT片段的小鼠模型如R6/1和N171-82Q HD小鼠(Harper等，(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：5820-5825,Rodriguez-Lebron等，(2005)Mol.Ther.12：618-633,Machida等，(2006)Biochem.Biophys.Res.Commun.343：190-197)。本文所述的小鼠HD模型的另一實例是YAC128小鼠模型。該模型攜帶表現有128 CAG重複的突變人HTT基因的酵母人工染色體(YAC)，且YAC128小鼠12個月齡時在紋狀體中顯示Htt聚集物的顯著和廣泛的累積(Slow等，(2003)Hum.Mol.Genet.12：1555-1567,Pouladi等，(2012)Hum.Mol.Genet.21：2219-2232)。
也可使用HD的其他動物模型。例如已描述了轉基因大鼠(von Horsten,S.等(2003)Hum.Mol.Genet.12：617-24)和恒河猴 (Yang,S.H.等(2008)Nature 453：921-4)模型。還已知非遺傳模型。這些最常涉及使用興奮性毒性化合物(如喹啉酸或紅藻胺酸)或線粒體毒素(如3-硝基丙酸和丙二酸)以誘導齧齒類動物或非人靈長類動物中紋狀體神經元死亡(更多的描述和參照，參見Ramaswamy,S.等(2007)ILAR J.48：356-73)。
V.治療亨廷頓病的方法
在一些方面，本發明提供用於在哺乳動物中治療亨廷頓病的方法和組合物，其包括將本公開的藥物組合物(例如包含本發明的病毒顆粒的藥物組合物)施用至所述哺乳動物。在一些方面，本發明提供用於在具有亨廷頓病的哺乳動物中抑制htt表現的方法和組合物，其包括將本公開的藥物組合物(例如包含本發明的病毒顆粒的藥物組合物)施用至所述哺乳動物。在一些方面，本發明提供用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物的細胞中htt累積的方法和組合物，其包含將本公開的藥物組合物(例如包含本發明的病毒顆粒的藥物組合物)施用至所述哺乳動物。
在一些方面，本發明提供用於改善HD症狀的方法和組合物，其包括將有效量的包含編碼本公開的RNAi的載體的重組病毒顆粒施用至哺乳動物的腦部。在一些實施方案中，HD的症狀包括但不限於舞蹈病、強直、無法控制的身體運動、肌肉失去控制、缺乏協調、躁動、減緩眼部運動、異常姿態、不穩、共濟失調步態、表情異常、言語障礙、咀嚼和/或吞咽困難、睡眠障礙、癲癇、癡呆，認知障礙(例如涉及規劃、抽象思維、靈活性、規則獲取、人際關係敏感性、自我控制、注意力、學習、記憶的能力減退)、抑鬱、焦慮、人格改變、侵略、強迫行為、著迷-強迫行為、性欲亢進、精神病、情感淡漠、煩躁、自殺的念頭、體重下降、肌肉萎縮、心臟衰竭、減少葡萄糖耐受、睾丸萎縮和骨質疏鬆症。
在一些方面中，本發明提供方法以預防或延遲HD的進 展。常染色體顯性HD是遺傳性疾病，其可進行基因分型。例如，HTT中CAG重複的數目可通過基於PCR重複大小確定。該類診斷可在生命的任何階段通過直接檢測青少年或成人(例如伴隨臨床症狀顯現)、產前篩查或產前排除測試(例如通過絨毛取樣或羊膜穿刺術)或胚胎植入前篩查實施。由此，本文所述的方法可用作HD的預防性治療，這是由於診斷可在症狀初始前發生。例如，HD可通過基因檢查(產前檢查、出生檢查等)診斷並在症狀發生前(例如CNS細胞喪失)進行預防性治療(例如使用本文所述的rAAV顆粒)以預HD症狀的發病和/或進展。此外，HD可通過腦部成像、尋找尾狀核和/或殼核的收縮和/或腦室擴大來診斷。這些症狀與HD家族史和/或臨床症狀組合可指示HD。
用於確定HD症狀改善的方式為本領域已知。例如，美國亨廷頓氏病評定量表(UHDRS)可用於評估運動功能、認知功能、行為異常和功能性能力(參見例如Huntington Study Group(1996)Movement Disorders 11：136-42)。建立該評定量表以提供統一、全面的測試用於疾病病理的多面性，併入來自測試如HD活動和日常生活能力量表(HD Activities and Daily Living Scale)、馬斯登和奎因的舞蹈病嚴重程度量表(Marsden and Quinn’s chorea severity scale)、肢體殘疾和獨立量表(Physical Disability and Independence scales)、HD運動評定量表(HD motor rating scale)(HDMRS)、HD功能性能力量表(HD functional capacity scale)(HDFCS)和神經定量檢查(QNE)的元素。其他有效用於確定HD症狀改善的測試可包括但不限於蒙特利爾認知評估(Montreal Cognitive Assessment)、腦成像(例如MRI)、分類流暢性測驗(Category Fluency Test)、連線測驗(Trail Making Test)、地圖搜索(Map Search)、斯特魯普字閱讀測試(Map Search)、加快拍打任務(Speeded Tapping Task)和符號數字模式測試(Symbol Digit Modalities Test)。
在本發明的一些方面中，使用用於治療具有HD的人的 方法。如上文所述，HD以常染色體顯性遺傳的方式遺傳且由HTT基因中的CAG重複擴展導致。青少年發病的HD最經常從父系遺傳。亨廷頓疾病樣表型已與其他基因座如HDL1、PRNP、HDL2、HDL3和HDL4相關。認為其他基因座可修飾HD症狀的表現，包括GRIN2A、GRIN2B、MSX1、GRIK2和APOE基因中的突變。
在一些方面，本發明提供用於靶向具有亨廷頓病的哺乳動物中的htt mRNA的改進的RNAi。在一些實施方案中，所述RNAi包含第一鏈和第二鏈，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：1)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO：2)的第二核酸，其中第一鏈和第二鏈形成雙鏈體而且其中在所述第二鏈的SEQ ID NO：2的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。如本文所述的RNAi(例如作為rAAV載體的部分)可用於，特別是治療亨廷頓病。
在本發明的一些實施方案中，改進所述RNAi以減少脫靶基因沉默。在一些實施方案中，所述RNAi包含一個或多個CpG基序。在一些實施方案中，所述RNAi在種子區中包含一個或多個CpG基序。
在一些實施方案中，本發明提供用於在哺乳動物中治療亨廷頓病的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：15)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO：16)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。在一些實施方案中，本發明提供用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物中htt表現的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’ (SEQ ID NO：15)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO：16)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。在一些實施方案中，本發明提供用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物的細胞中htt累積的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：15)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO：16)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。在一些實施方案中，所述第一鏈包含與SEQ ID NO：15具有大於約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的任何同一性的核酸序列但保持CpG基序。在一些實施方案中，所述第二鏈包含與SEQ ID NO：16具有大於約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的任何同一性的核酸序列但保持CpG基序。
在一些實施方案中，本發明提供用於治療哺乳動物中亨廷頓病的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：17)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO：18)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。在一些實施方案中，本發明提供用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物中htt表現的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：17)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO：18)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中 的殘基形成鹼基對。在一些實施方案中，本發明提供用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物的細胞中htt累積的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：17)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO：18)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。在一些實施方案中，所述第一鏈包含與SEQ ID NO：17具有大於約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的任何同一性的核酸序列但保持CpG基序。在一些實施方案中，所述第二鏈包含與SEQ ID NO：18具有大於約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的任何同一性的核酸序列但保持CpG基序。
在一些實施方案中，所述RNAi是小抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或小髮夾RNA(shRNA)。小抑制性或干擾RNA(siRNA)在本領域已知是誘導細胞中RNAi的長度為約19-25(例如19-23)鹼基對的雙鏈RNA分子。小髮夾RNA(shRNA)在本領域已知為誘導細胞中RNAi的包含通過短環(例如~4-11核苷酸)連接的雙鏈RNA的約19-25(例如19-23)鹼基對的RNA分子。
在一些實施方案中，所述miRNA包含與SEQ ID NO：1約90%相同的指導序列。在一些實施方案中，所述miRNA包含指導序列，其為約與SEQ ID NO：190%相同、91%相同、92%相同、93%相同、94%相同、95%相同、96%相同、97%相同、98%相同、99%相同或100%相同中的任何。
在一些實施方案中，所述miRNA包含與SEQ ID NO：2約90%相同的非指導序列。在一些實施方案中，所述miRNA包含非指導序列，其為約與SEQ ID NO：2約90%相同、91%相同、92%相同、93%相同、94%相同、95%相同、96%相同、97%相同、98%相同、99%相同或100%相同中的任何。
在一些實施方案中，所述第一核酸殘基11和12處的U殘基與所述第二鏈中的殘基不形成鹼基對。在一些實施方案中，所述雙鏈體的長度為18-25個鹼基對。在一些實施方案中，所述第一和/或第二鏈進一步包含3’懸垂區、5’懸垂區或3'和5’懸垂區兩者。在一些實施方案中，本發明提供RNAi及其方法和組合物，其包含第一鏈和第二鏈，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：1)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO：2)的第二核酸，其中所述第一鏈和第二鏈形成雙鏈體且其中在SEQ ID NO：2的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對而且在第一核酸的SEQ ID NO：1的殘基11和12處的U殘基與所述第二鏈中的殘基不形成鹼基對。
在一些實施方案中，所述第一鏈和所述第二鏈通過能夠形成環結構的RNA連接。如本領域中已知的，當RNA分子包含由不鹼基配對在一起的RNA序列分開的鹼基配對在一起的兩RNA序列時，形成RNA環結構(例如莖-環或髮夾)。例如，如果序列A和C互補或部分互補使得它們鹼基配對在一起但在序列B中的鹼基不鹼基配對在一起，則在RNA分子A-B-C中可形成環結構。
在一些實施方案中，能夠形成環結構的RNA包含4-50個核苷酸。在一些實施方案中，能夠形成環結構的RNA接頭包含13個核苷酸。在一些實施方案中，能夠形成環結構的RNA包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列。在一些實施方案中，載體基因組包含核苷酸序列，其與SEQ ID NO：13的序列為至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，或99%的任何相同。
在一些方面，本發明提供將RNAi施用至哺乳動物(例如具有HD的哺乳動物)的方法，所述RNAi包含第一鏈和第二鏈，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：1)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’- ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO：2)的第二核酸，其中SEQ ID NO：2的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。在一些實施方案中，第一核酸的SEQ ID NO：1的位置11和12處的U殘基不與所述第二鏈中的殘基鹼基配對。在一些實施方案中，在SEQ ID NO：2的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對且在第一核酸的SEQ ID NO：1的位置11和12處的U殘基不與所述第二鏈中的殘基鹼基配對。在一些實施方案中，重組病毒顆粒包含所述RNAi。在一些實施方案中，所述重組病毒顆粒是衣殼化rAAV載體的AAV顆粒、衣殼化重組腺病毒載體的腺病毒顆粒、衣殼化重組慢病毒載體的慢病毒顆粒或衣殼化重組HSV載體的HSV顆粒，其中所述rAAV載體、腺病毒載體、慢病毒載體或HSV載體編碼所述RNAi。
在一些實施方案中，重組病毒顆粒通過將病毒顆粒注射至腦部遞送。在一些實施方案中，重組病毒顆粒通過將病毒顆粒注射至紋狀體遞送。遞送重組病毒顆粒至腦部區域(紋狀體)(包括殼核和尾狀核)的紋狀體施用受HD高度影響。此外，且不希望受理論限制，認為注射入紋狀體的重組病毒顆粒(例如rAAV顆粒)還可分散(例如通過逆行轉運)至腦部的其他區域，包括但不限於投射區域(例如皮質)。在一些實施方案中，重組病毒顆粒通過對流增強遞送進行遞送(例如對流增強遞送至紋狀體)。
在一些方面，本發明提供用於在哺乳動物中治療亨廷頓病的方法，其包括將本公開的藥物組合物施用至所述哺乳動物。在一些方面，本發明提供用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物的細胞中htt累積的方法，其包括將本公開的藥物組合物施用至所述哺乳動物。在一些方面，本發明提供用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物中htt表現的方法，其包括將本公開的藥物組合物施用至所述哺乳動物。在一些實施方案中，所述htt是突變的htt(例如包含多於35、多於36、多於37、多於38、多於39、多於40、多於41或多於42個CAG 重複的htt)。在一些實施方案中，野生型htt的表現和/或累積也受到抑制。如本文所述，且不希望受到理論限制，認為在具有HD的哺乳動物中抑制突變的htt的表現和/或累積是高度有益的，但在相同的哺乳動物中野生型htt表現和/或累積的抑制作為副作用(例如本公開的RNAi)是可以良好耐受的(例如產生少量或不產生非故意的副作用)。
在一些實施方案中，細胞包含載體(例如包含編碼本公開的RNAi的表現構建體的載體)。在一些實施方案中，所述載體是rAAV載體。在一些實施方案中，所述載體是重組腺病毒載體、重組慢病毒載體或重組單純皰疹病毒(HSV)載體。在一些實施方案中，所述細胞是中樞神經系統(CNS)細胞。
在一些實施方案中，有效量的包含編碼本公開的RNAi的載體的重組病毒顆粒的施用在或靠近施用位點轉導神經元(例如紋狀體神經元如多棘神經元)。在一些實施方案中，轉導了多於任何的約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或100%之神經元。在一些實施方案中，轉導了約5%至約100%、約10%至約50%、約10%至約30%、約25%至約75%、約25%至約50%，或約30%至約50%的神經元。本領域已知鑒定通過表現miRNA的重組病毒顆粒轉導的神經元的方法；例如免疫組化、RNA檢測(例如qPCR、Northern印跡、RNA-seq、原位雜交等)或共表現標記物如增強的綠色熒光蛋白的使用可用於檢測表現。
在本發明的一些實施方案中，所述方法包括將有效量的重組病毒顆粒施用至哺乳動物的腦部用於治療具有HD的哺乳動物例如人，其中所述重組病毒顆粒包含編碼本公開的RNAi的載體。在一些實施方案中，將所述組合物注射至腦中的一處或多處位置以允許本公開的RNAi至少在神經元中表現。在一些實施方案中，將所述組合物注射入腦中的任何一處、兩處、三處、四處、五處、六處、七處、八處、九處、十處或多於十處的位置。在一些實施方案中， 將所述組合物注射入紋狀體。在一些實施方案中，將所述組合物注射入背側紋狀體。在一些實施方案中，將所述組合物注射入殼核。在一些實施方案中，將所述組合物注射入尾狀核。在一些實施方案中，將所述組合物注射入殼核和注射入尾狀核。
在一些實施方案中，將所述重組病毒顆粒施用至腦部的一個半球。在一些實施方案中，將重組病毒顆粒施用至腦部的兩半球。
在一些實施方案中，將所述重組病毒顆粒同時或順序施用至多於一處的位置。在一些實施方案中，重組病毒顆粒的多重注射的間隔不多於1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、9小時、12小時或24小時。
在一些實施方案中，本發明提供通過施用有效量的包含編碼本公開的RNAi的重組病毒載體的藥物組合物以抑制突變的HTT的活性用於治療具有HD的人的方法。在一些實施方案中，所述藥物組合物包含一個或多個藥學上可接受的賦形劑。
在一些實施方案中，所述方法包括施用有效量含有編碼本公開的RNAi的重組病毒載體的藥物組合物以抑制突變的HTT的活性。在一些實施方案中，病毒顆粒(例如rAAV顆粒)的病毒力價為至少約5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、10×1012、11×1012、15×1012、20×1012、25×1012、30×1012，或50×1012基因組拷貝/mL中的任何。在一些實施方案中，病毒顆粒(例如rAAV顆粒)的病毒力價約為5×1012至6×1012、6×1012至7×1012、7×1012至8×1012、8×1012至9×1012、9×1012至10×1012、10×1012至11×1012、11×1012至15×1012、15×1012至20×1012、20×1012至25×1012、25×1012至30×1012、30×1012至50×1012，或50×1012至100×1012基因組拷貝/mL中的任何。在一些實施方案中，病毒顆粒(例如rAAV顆粒)的病毒力價為約5×1012至10×1012、10×1012至25×1012，或25×1012至50×1012基因組拷貝/mL中的任何。在一些實施 方案中，病毒顆粒(例如rAAV顆粒)的病毒力價為至少約5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、10×109、11×109、15×109、20×109、25×109、30×109或50×109轉導單位/mL中的任何。在一些實施方案中，病毒顆粒(例如rAAV顆粒)的病毒力價為約5×109至6×109、6×109至7×109、7×109至8×109、8×109至9×109、9×109至10×109、10×109至11×109、11×109至15×109、15×109至20×109、20×109至25×109、25×109至30×109、30×109至50×109，或50×109至100×109轉導單位/mL中的任何。在一些實施方案中，病毒顆粒(例如rAAV顆粒)的病毒力價為約5×109至10×109、10×109至15×109、15×109至25×109，或25×109至50×109轉導單位/mL中的任何。在一些實施方案中，病毒顆粒(例如rAAV顆粒)的病毒力價為至少約5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、10×1010、11×1010、15×1010、20×1010、25×1010、30×1010、40×1010，或50×1010感染單位/mL中的任何。在一些實施方案中，病毒顆粒(例如rAAV顆粒)的病毒力價為至少約5×1010至6×1010、6×1010至7×1010、7×1010至8×1010、8×1010至9×1010、9×1010至10×1010、10×1010至11×1010、11×1010至15×1010、15×1010至20×1010、20×1010至25×1010、25×1010至30×1010、30×1010至40×1010、40×1010至50×1010，或50×1010至100×1010感染單位/mL中的任何。在一些實施方案中，病毒顆粒(例如rAAV顆粒)的病毒力價為至少約5×1010至10×1010、10×1010至15×1010、15×1010至25×1010，或25×1010至50×1010感染單位/mL中的任何。
在一些實施方案中，施用至個體的病毒顆粒的劑量為至少約1×108至約1×1013基因組拷貝/kg體重中的任何。在一些實施方案中，施用至個體的病毒顆粒的劑量為約1×108至約1×1013基因組拷貝/kg體重。
在一些實施方案中，施用至個體的病毒顆粒總量為至少約1×109至約1×1014基因組拷貝中的任何。在一些實施方案 中，施用至個體的病毒顆粒總量為約1×109至約1×1014基因組拷貝中的任何。
在本發明的一些實施方案中，注射至紋狀體的組合物的體積多於約下列任何：1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、15μl、20μl、25μl、50μl、75μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl或1mL或其間任何量。
在一些實施方案中，將第一體積的組合物注射入腦部的第一區，並將第二體積的組合物注射入腦部的第二區。例如，在一些實施方案中，將第一體積的組合物注射入尾狀核，並將第二體積的組合物注射入殼核。在一些實施方案中，將1X體積的組合物注射入尾狀核，並將1.5X、2X、2.5X、3X、3.5X，或4X體積的組合物注射入殼核，其中X是多於約下列的任何體積：1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、15μl、20μl、25μl、50μl、75μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl或1mL或其間的任何量。
本發明的組合物(例如包含編碼本公開的RNAi的載體的重組病毒顆粒)可單獨或與一個或多個其他治療劑組合使用用於治療HD。順序施用間的時間間隔可就至少(或可替換地少於)數分鐘、數小時或數天而言。
V. RNAi表現構建體和載體
本發明提供用於表現本文所述的RNAi的表現構建體、載體和病毒顆粒。
在一些實施方案中，編碼本公開的RNAi的核酸包含異源miRNA支架。在一些實施方案中，使用異源miRNA支架用於調節miRNA表現；例如以增加miRNA表現或減少miRNA表現。可使用本領域已知的任何miRNA支架。在一些實施方案中，所述miRNA支架 源自miR-155支架(參見例如Lagos-Quintana,M.等(2002)Curr.Biol.12：735-9和來自Life Technologies,Thermo Fisher Scientific；Waltham,MA的InvitrogenTM BLOCK-iTTM Pol II miR RNAi表現載體套組)。在一些實施方案中，編碼本公開的RNAi的核酸包含miRNA支架。在一些實施方案中，miRNA支架由SEQ ID NO：14提供。
在一些實施方案中，所述RNAi靶向編碼與病症相關的多肽的RNA。在一些實施方案中，所述病症是CNS病症。不希望受到理論限制，認為可使用RNAi以減少或去除其獲得性功能已與病症關聯的多肽的表現和/或活性。可通過本發明的治療多肽或治療核酸治療的本發明CNS病症的非限制性實例(對於每種病症可靶向或補給的示例性基因在括號中提供)包括中風(例如caspase-3、Beclin1、Ask1、PAR1、HIF1α、PUMA和/或Fukuda,A.M.和Badaut,J.(2013)Genes(Basel)4：435-456中所述的任何基因)、亨廷頓氏病(突變的HTT)、癲癇(例如SCN1A、NMDAR、ADK和/或Boison,D.(2010)Epilepsia51：1659-1668中所述的任何基因)、帕金森氏病(α-突觸核蛋白)、Lou Gehrig’s疾病(也稱為肌萎縮性側索硬化；SOD1)、阿爾茨海默氏病(tau、澱粉樣前體蛋白)、皮質基底節變性或CBD(tau)、皮質基底節變性或CBGD(tau)、額顳葉癡呆或FTD(tau)、進行性核上性麻痹或PSP(tau)、多系統萎縮或MSA(α-突觸核蛋白)、腦癌(例如突變或過表現的牽涉腦癌的原癌基因)和溶酶體貯積症(LSD)。本發明的病症可包括涉及皮質大區域的那些，例如多於一處皮質區域，多於一葉皮質和/或整個皮質。其他可由本發明的治療多肽或治療核酸治療的本發明的疾病的非限制性實例包括創傷性腦損傷、酶功能障礙病症、精神病症(包括創傷後應激綜合征)、神經退行性疾病和認知病症(包括癡呆、自閉症和抑鬱)。酶功能障礙病症包括但不限於腦白質營養不良(包括Canavan’s Disease)和任何下文所述的溶酶體貯積症。
在一些實施方案中，轉基因(例如本文所述的RNAi)與 啟動子可操作地連接。示例性啟動子包括但不限於巨細胞病毒(CMV)即刻早期啟動子、GUSB啟動子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶1(PGK)啟動子、猴病毒40(SV40)啟動子和CK6啟動子、轉甲狀腺素啟動子(TTR)、TK啟動子、四環素反應性啟動子(TRE)、HBV啟動子、hAAT啟動子、LSP啟動子、嵌合體肝臟特異性啟動子(LSP)、E2F啟動子、端粒酶(hTERT)啟動子；巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白/兔β-珠蛋白啟動子(CAG啟動子；Niwa等，Gene,1991,108(2)：193-9)和延伸因子1-α啟動子(EFl-α)啟動子(Kim等，Gene,1990,91(2)：217-23和Guo等，Gene Ther.,1996,3(9)：802-10)。在一些實施方案中，所述啟動子包含與雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子連接的巨細胞病毒增強子或人β-葡糖醛酸糖苷酶啟動子。所述啟動子可以是組成型、誘導型或阻遏型啟動子。在一些實施方案中，本發明提供重組載體，其包含與CBA啟動子可操作連接的編碼本發明異源轉基因的核酸。示例性的啟動子和描述可在例如U.S.PG Pub.20140335054中發現。在一些實施方案中，啟動子是CBA啟動子、最小CBA啟動子、CMV啟動子或GUSB啟動子。
組成型啟動子的實例包括但不限於逆轉錄病毒勞斯肉瘤病毒(retroviral Rous sarcoma virus)(RSV)LTR啟動子(任選地具有RSV增強子)、巨細胞病毒(CMV)啟動子(任選地具有CMV增強子)[參見例如Boshart等，Cell,41：521-530(1985)]、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、13-肌動蛋白啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子和EFLa啟動子[Invitrogen]。
誘導型啟動子允許調節基因表現且可通過外源補給化合物、環境因素如溫度或特定的生理狀態(例如急性期、細胞的特定分化狀態或僅在複製細胞中)的存在來調節。誘導型啟動子和誘導系統可從多種商業來源獲得，包括但不限於Invitrogen、Clontech和Ariad。已描述了許多其他的系統且可由本領域的技術人員容易地選擇。通過外源補給啟動子調節的誘導型啟動子的實例包括鋅誘導羊 金屬硫蛋白(MT)啟動子、地塞米松(Dex)-誘導型小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子、T7聚合酶啟動子系統(WO 98/10088)；蛻皮激素昆蟲啟動子(No等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93：3346-3351(1996))、四環素阻遏系統(Gossen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：5547-5551(1992))、四環素誘導系統(Gossen等，Science,268：1766-1769(1995)，另見Harvey等，Curr.Opin.Chem.Biol.,2：512-518(1998))、RU486-誘導系統(Wang等，Nat.Biotech.,15：239-243(1997)和Wang等，Gene Ther.,4：432-441(1997))和雷帕黴素-誘導系統(Magari等，J.Clin.Invest.,100：2865-2872(1997))。其他可在該背景中有效的誘導型啟動子類型是通過特定生理狀態調節的那些，例如溫度、急性期、細胞的特定分化狀態或僅在複製中的細胞。
在另一實施方案中，可使用用於轉基因的天然啟動子或其片段。當預期表現的轉基因應模擬天然表現時，天然啟動子可以是優選的。當轉基因的表現必須暫時或發展性或以組織特異性的方式或響應特定轉錄刺激調節時，可以使用天然啟動子。在進一步的實施方案中，也可使用其他天然表現控制元件如增強子元件、多聚腺苷酸化位點或Kozak共有序列以模擬天然表現。
在一些實施方案中，調節序列賦予組織特異性基因表現能力。在一些情況中，組織特異性調節序列結合以組織特異性的方式誘導轉錄的組織特異性轉錄因子。這種組織特異性調節序列(例如啟動子、增強子等)為本領域熟知的。示例性組織特異性調節序列包括但不限於下列組織特異性啟動子：神經元性如神經元特異性烯醇化酶(NSE)啟動子(Andersen等，Cell.Mol.Neurobiol.,13：503-15(1993))、神經絲輕鏈基因啟動子(Piccioli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88：5611-5(1991))和神經元特異性vgf基因啟動子(Piccioli等，Neuron,15：373-84(1995))。在一些實施方案中，組織特異性啟動子是選自下組的基因的啟動子：神經元核(NeuN)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、腺瘤性結腸息肉病(APC)和離子化鈣結合適配分子1 (Iba-1)。其他合適的組織特異性啟動子對本領域的技術人員將是顯而易見的。在一些實施方案中，啟動子是雞β-肌動蛋白啟動子。
在一些實施方案中，啟動子在CNS的細胞中表現異源核酸。由此，在一些實施方案中，本發明的治療多肽或治療核酸可用於治療CNS病症。在一些實施方案中，啟動子在腦細胞中表現異源核酸。腦細胞可指本領域已知的任何腦細胞，包括但不限於神經元(如感覺神經元、運動神經元、中間神經元、多巴胺能神經元、中型多棘神經元、膽鹼能神經、GABA能神經元、錐體神經元等)、神經膠質細胞(如小神經膠質細胞、大膠質細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞、室管膜細胞、徑向膠質細胞等)、腦實質細胞、小神經膠質細胞1細胞、室管膜細胞和/或浦肯野(Purkinje)細胞。在一些實施方案中，啟動子在神經元和/或神經膠質細胞中表現異源核酸。在一些實施方案中，神經元是尾狀核的中型多棘神經元、殼核的中型多棘神經元、皮質層IV的神經元和/或皮質層V的神經元。
在CNS細胞、腦細胞、神經元和神經膠質細胞中表現轉錄物(例如異源轉基因)的多種啟動子為本領域已知且描述于本文。這種啟動子可包含與所選基因或異源控制序列相關的控制序列。經常，有效的異源控制序列包括源自編碼哺乳動物或病毒基因的序列的那些。實例包括但不限於SV40早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒LTR啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)、單純皰疹病毒(HSV)啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子如CMV即刻早期啟動子區(CMVIE)、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、合成的啟動子、雜合的啟動子等等。此外，也可使用源自非病毒基因如鼠類金屬硫蛋白基因的序列。這種啟動子序列為從例如Stratagene(San Diego,CA)商業上可得到的。可使用CNS-特異性啟動子和誘導型啟動子。CNS-特異性啟動子的實例包括但不限於分離自CNS-特異性基因如髓鞘鹼性蛋白(MBP)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和神經元特異性烯醇化酶(NSE)的那些。誘導型啟動子的實例包括對於蛻皮激素、四環素、金屬硫 蛋白、缺氧(hypoxia)等響應的DNA元件。
本發明涵蓋重組病毒基因組用於將一個或多個編碼如本文所述的RNAi的核酸序列導入或包裝入AAV病毒顆粒的用途。重組病毒基因組可包括任何元件以建立RNAi的表現，例如，啟動子、異源核酸、ITR、核糖體結合元件、終止子、增強子、選擇性標記物、內含子、多聚A信號和/或複製起點。在一些實施方案中，rAAV載體包含一個或多個增強子、剪接供體/剪接受體對、基質附接位點或多聚腺苷酸化信號。
在一些實施方案中，包含編碼RNAi的載體的rAAV顆粒有效量的施用在或鄰近施用位點(例如紋狀體和/或皮質)或距施用位點的更遠處轉導細胞(例如CNS細胞、腦細胞、神經元和/或神經膠質細胞)。在一些實施方案中，轉導了多於約下列任何比率的神經元：5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或100%。在一些實施方案中，轉導了約5%至約100%、約10%至約50%、約10%至約30%、約25%至約75%、約25%至約50%或約30%至約50%的神經元。鑒定通過表現miRNA的重組病毒顆粒轉導的神經元的方法為本領域已知；例如，免疫組化、RNA檢測(例如qPCR、Northern印跡、RNA-seq、原位雜交等)或使用共表現標記物如可使用增強的綠色熒光蛋白以檢測表現。
在一些方面中，本發明提供包含重組自身互補基因組(例如自身互補的rAAV載體)的病毒顆粒。具有自身互補載體基因組的AAV病毒顆粒和自身互補的AAV基因組的使用方法描述於美國專利號6,596,535；7,125,717；7,465,583；7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054和8,361,457和Wang Z.，等，(2003)Gene Ther 10：2105-2111，其每一篇通過提述以其整體併入本文。包含自身互補基因組的rAAV將憑藉其部分互補序列(例如異源核酸的互補編碼和非編碼鏈)迅速形成雙鏈DNA分子。在一些實施方案中，載體包含編碼異源核酸的第一核酸序列和編碼核酸的互補物的第二核酸序 列，其中第一核酸序列可與第二核酸序列沿其長度的大部分或全部形成鏈內鹼基對。
在一些實施方案中，第一異源核酸序列和第二異源核酸序列通過突變的ITR(例如右側ITR)連接。在一些實施方案中，ITR包含多核苷酸序列5’-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG-3’(SEQ ID NO：1)。突變的ITR包含含有末端解析序列的D區的缺失。作為結果，在複製AAV病毒基因組時，rep蛋白將不會在突變的ITR切割病毒基因組且如此以5'-3'將包含下列的重組病毒基因組將包裝入病毒衣殼：AAV ITR、包括調節序列的第一異源多核苷酸序列、突變的AAV ITR、與第一異源多核苷酸反向的異源多核苷酸和第三AAV ITR。
VI.病毒顆粒和產生病毒顆粒的方法
本發明特別提供了包含編碼本公開的RNAi的核酸的重組病毒顆粒以及方法及其治療哺乳動物中疾病或病症例如亨廷頓病的用途。
病毒顆粒
本發明提供包含本文公開的RNAi的病毒顆。在一些實施方案中，本發明提供用於遞送本文公開的本發明的RNAi的病毒顆粒。例如，本發明提供使用重組病毒顆粒的方法以遞送RNAi來治療哺乳容物中的疾病或病症的方法；例如包含RNAi來治療HD的rAAV顆粒。在一些實施方案中，重組病毒顆粒是重組AAV顆粒。在一些實施方案中，病毒顆粒是重組AAV顆粒，其包含含有側翼為一個或兩個ITR的本文公開序列RNAi的核酸。所述核酸在AAV顆粒中衣殼化。所述AAV顆粒還包含衣殼蛋白。在一些實施方案中，所述核酸包含在轉錄方向與元件、控制序列包括轉錄初始和終止序列連接的 感興趣的編碼序列(例如本公開的核酸)，由此形成表現盒。表現盒側翼的5'和3'末端為至少一個功能性AAV ITR序列。“功能性AAV ITR序列”意為用於AAV病毒粒的挽救、複製和包裝的ITR序列功能。參見Davidson等，PNAS,2000,97(7)3428-32；Passini等，J.Virol.,2003,77(12)：7034-40；和Pechan等，Gene Ther.,2009,16：10-16，其全部通過提述以其整體併入本文。對於本發明一些方面的實踐，所述重組載體包含至少全部用於衣殼化所必需的AAV序列和用於由rAAV感染的物理結構。用於本發明載體使用的AAV ITR不需要具有野生型核苷酸序列(例如如Kotin,Hum.GeneTher.,1994,5：793-801中所述)，且可通過核苷酸的插入、缺失或取代改變或AAV ITR可源自數種AAV血清型中的任何。目前已知多於40種AAV血清型，且持續鑒定了新型血清型和已有血清型的變體。參見Gao等，PNAS,2002,99(18)：11854-6；Gao等，PNAS,2003,100(10)：6081-6；和Bossis等，J.Virol.,2003,77(12)：6799-810。認為任何AAV血清型的用途都在本發明的範圍之內。在一些實施方案中，rAAV載體是源自AAV血清型的載體，包括但不限於AAV ITR為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV衣殼血清型ITR等等。在一些實施方案中，AAV中的核酸包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV的ITR或小鼠AAV衣殼血清型ITR等等的ITR。在一些實施方案中，AAV中的核酸進一步編碼如本文所述的RNAi。例如，AAV中的核酸可包含本文涵蓋的任何AAV血清型的至少一個ITR且可進一步編碼包含第一鏈和第二鏈的RNAi，其中a)所述第一鏈和第二鏈形成雙鏈體；b)所述第一鏈包含至少11個鹼基的指導區，其中所述指導區包含含有指導鏈的鹼基1-N的種子區，其中N=7或N=8；且c)所述第二鏈包含至少11 個鹼基的非指導區，其中所述非指導區包含雙鏈體中指導區鹼基1-(N+2)的任何一個或多個對側的凸出序列。在一些實施方案中，所述rAAV可包含第一鏈和第二鏈，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：1)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO：2)的第二核酸。在一些實施方案中，AAV中的核酸包含5’至3’編碼下列的核酸：ITR(例如AAV2 ITR)、啟動子、編碼如本文公開的RNAi的核酸、多聚腺苷酸化信號、AAV ITR(例如AAV2 ITR)。在一些實施方案中，AAV中的核酸包含5’至3’編碼下列的核酸：ITR(例如AAV2 ITR)、啟動子、編碼包含第一鏈和第二鏈的RNAi的核酸(其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：1)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO：2)的第二核酸)、多聚腺苷酸化信號和AAV ITR(例如AAV2 ITR)。在一些實施方案中，AAV中的核酸包含5’至3’編碼下列的核酸：ITR(例如AAV2 ITR)、CBA啟動子、編碼如本文公開的RNAi的核酸、多聚腺苷酸化信號(例如牛生長激素多聚A)和AAV ITR(例如AAV2 ITR)。在一些實施方案中，AAV中的核酸包含5’至3’編碼下列的核酸：ITR(例如AAV2 ITR)、CBA啟動子、編碼包含第一鏈和第二鏈的RNAi的核酸(其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：1)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO：2)的第二核酸)、多聚腺苷酸化信號(例如牛生長激素多聚A)和AAV ITR(例如AAV2 ITR)。在一些實施方案中，所述第一鏈和第二鏈形成雙鏈體，且所述第二鏈的SEQ ID NO：2的殘基18或殘基19處的A殘基不與第一鏈中的殘基形成鹼基配對。在一些實施方案中，第一鏈的SEQ ID NO：1的殘基11和12處的U殘基不與所述第二鏈形成鹼基配對。在一些實施方案中，在所述第二鏈的SEQ ID NO：2的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基配對且所述第一鏈的SEQ ID NO：1的鹼基11和12處的U殘基不與所述第二鏈鹼基形成配對。
在一些實施方案中，載體可包含填充核酸。在一些實施方案中，填充核酸可編碼綠色熒光蛋白。在一些實施方案中，填充核酸可位於啟動子和編碼RNAi的核酸之間。在一些實施方案中，填充核酸可以是α-1-抗胰蛋白酶(AAT)填充序列或C16 P1染色體16 P1克隆(人C16)填充序列。
在一些實施方案中，AAV中的核酸包含SEQ ID NO：13的核酸。在一些實施方案中，AAV中的核酸包含與SEQ ID NO：13至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸。在進一步的實施方案中，所述rAAV顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh8R、AAVrh.10、AAV11、AAV12的衣殼蛋白或這些衣殼蛋白的突變體。在一些實施方案中，突變的衣殼蛋白保持形成AAV衣殼的能力。在一些實施方案中，rAAV顆粒包含AAV5酪胺酸突變衣殼(Zhong L.等，(2008)Proc Natl Acad Sci U S A 105(22)：7827-7832。在進一步的實施方案中，rAAV顆粒包含來自進化枝A-F的AAV血清型的衣殼蛋白(Gao，等，J.Virol.2004,78(12)：6381)。
將不同AAV血清型用於優化特定靶細胞的轉導或靶向特定靶組織內(例如疾病組織)的特定細胞類型。rAAV顆粒可包含病毒蛋白和相同血清型或混合的血清型的病毒核酸。例如，在一些實施方案中，rAAV顆粒可包含AAV1衣殼蛋白和至少一種AAV2 ITR或其可包含AAV2衣殼蛋白和至少一個AAV1 ITR。本文提供用於產生rAAV顆粒的AAV血清型的任何組合，正如每種組合都在本文明確續述一般。在一些實施方案中，本發明提供rAAV顆粒，其包含本公開的AAV1衣殼和rAAV載體(例如包含編碼本公開的RNAi的核酸的 表現盒)，側翼為至少一個AAV2 ITR。在一些實施方案中，本發明提供包含AAV2衣殼的rAAV顆粒。
在一些方面，本發明提供包含重組自身互補基因組的病毒顆粒。具有自身互補基因組的AAV病毒顆粒和使用自身互補AAV基因組的方法公開於美國專利號6,596,535；7,125,717；7,465,583；7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054和8,361,457和Wang Z.，等，(2003)Gene Ther 10：2105-2111，其每一篇都通過提述以其整體併入。包含自身互補基因組的rAAV將憑藉其部分互補序列迅速形成雙鏈DNA分子(例如轉基因的互補編碼或非編碼鏈)。在一些實施方案中，本發明提供包含AAV基因組的AAV病毒顆粒，其中所述rAAV基因組包含第一異源多核苷酸序列(例如本公開的RNAi)和第二異源多核苷酸序列(例如本公開的RNAi的反義鏈)，其中第一異源多核苷酸序列可與第二異源多核苷酸序列沿其長度的大部分或全部形成鏈內鹼基配對。在一些實施方案中，第一異源多核苷酸序列和第二異源多核苷酸序列通過促進鏈內鹼基配對的序列，例如髮夾DNA結構連接。髮夾結構為本領域已知，例如miRNA或siRNA分子中。在一些實施方案中，第一異源多核苷酸序列和第二異源多核苷酸序列通過突變的ITR(例如右側ITR)連接。在一些實施方案中，所述ITR包含多核苷酸序列5’-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG-3’(SEQ ID NO：12)。突變的ITR包含含有末端解析序列的D區的缺失。結果，在複製AAV病毒基因組時，rep蛋白將不會在突變的ITR處切割病毒基因組，且如此以5'至3'的順序包含下列的重組病毒基因組將包裝入病毒衣殼：AAV ITR、包含調節序列的第一異源多核苷酸序列、突變的AAV ITR、與第一異源多核苷酸反向的第二異源多核苷酸和第三AAV ITR。在一些實施方案中，本發明提供AAV病毒顆粒，其包含含有功能性AAV2 ITR的重組病毒基因組、編碼本公開的RNAi的 第一多核苷酸序列、包含D區缺失並缺乏功能性末端解析序列的突變AAV2 ITR、包含與編碼本公開的RNAi的第一多核苷酸序列互補的序列的第二多核苷酸序列和功能性AAV2 ITR。
在一些實施方案中，所述病毒顆粒是腺病毒顆粒。在一些實施方案中，腺病毒顆粒是重組腺病毒載體顆粒，例如包含兩ITR間的本公開的RNAi的多核苷酸載體。在一些實施方案中，腺病毒顆粒缺乏或包含一個或多個E1基因的缺陷性拷貝，其賦予腺病毒複製缺陷。腺病毒包含在大(~950Å)的、非包膜的二十面體衣殼內的線性、雙鏈DNA基因組。腺病毒具有可併入大於30kb異源序列的大基因組(例如代替E1和/或E3區)，使其獨特地適用於較大異源基因。還已知其感染分裂和未分裂的細胞且不天然整合入宿主基因組(儘管雜合變體可具有該能力)。在一些實施方案中，腺病毒載體可以是具有代替E1的異源序列的第一代腺病毒載體。在一些實施方案中，腺病毒載體可以是在E2A、E2B和/或E4中具有額外突變或缺失的第二代腺病毒載體。在一些實施方案中，所述腺病毒載體可以是缺乏全部病毒編碼基因的第三代或受損的腺病毒載體，其僅保留ITR和包裝信號並需要反式的輔助腺病毒用於複製和包裝。已研究了腺病毒顆粒用作用於哺乳動物細胞的瞬時轉染的載體以及基因治療載體。進一步說明參見例如Danthinne,X.和Imperiale,M.J.(2000)Gene Ther.7：1707-14和Tatsis,N.和Ertl,H.C.(2004)Mol.Ther.10：616-29。
在一些實施方案中，所述病毒顆粒是重組腺病毒載體顆粒，其包含編碼本公開的RNAi的核酸。認為任何腺病毒血清型的使用都在本發明的範圍之內。在一些實施方案中，所述重組腺病毒載體是源自腺病毒血清型的載體，其包括但不限於AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu5、AdHu7、AdHu11、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad和豬Ad 3型。腺病毒顆粒還包含衣殼蛋白。在一些實施方案中，所述重組病毒顆 粒包含病毒顆粒與一個或多個外源病毒衣殼蛋白的組合。這種組合可指假型重組腺病毒載體顆粒。在一些實施方案中，用於假型重組腺病毒載體顆粒的外源病毒衣殼蛋白源自外源病毒或源自其他腺病毒血清型。在一些實施方案中，外源病毒衣殼蛋白源自或包括但不限於呼腸孤病毒3型。用於假型腺病毒顆粒的載體和衣殼蛋白組合的實例可在下列參考文獻中獲得(Tatsis,N.等(2004)Mol.Ther.10(4)：616-629和Ahi,Y.等(2011)Curr.Gene Ther.11(4)：307-320)。不同的腺病毒血清型可用於優化特定靶細胞的轉導或靶向在特定靶組織(例如疾病組織)內的特定細胞類型。由特定腺病毒血清型靶向的組織或細胞包括但不限於肺(例如HuAd3)、脾和肝(例如HuAd37)、平滑肌、滑膜細胞、樹突細胞、心血管細胞、腫瘤細胞系(例如HuAd11)和樹突細胞(例如具有呼腸孤病毒3型假型的HuAd5、HuAd30或HuAd35)。進一步說明參見Ahi,Y.等(2011)Curr.Gene Ther.11(4)：307-320,Kay,M.等(2001)Nat.Med.7(1)：33-40和Tatsis,N.等(2004)Mol.Ther.10(4)：616-629。腺病毒載體已通過紋狀體內施用進行施用(參見例如Mittoux,V.等(2002)J.Neurosci.22：4478-86)。
在一些實施方案中，病毒顆粒是慢病毒顆粒。在一些實施方案中，慢病毒顆粒是重組慢病毒載體顆粒，例如編碼在兩ITR間的本公開的RNAi的多核苷酸載體。慢病毒是具有約10kb的基因組的陽性-有義、ssRNA逆轉錄病毒。已知慢病毒整合入分離和未分離細胞的基因組。可產生慢病毒顆粒，例如通過將多重質體(通常分開慢病毒基因組和對於複製和/或包裝所需的基因以預防病毒複製)轉染入包裝細胞系系，其將修飾的慢病毒基因組包裝入慢病毒顆粒。在一些實施方案中，慢病毒顆粒可指缺乏包膜蛋白的第一代載體。在一些實施方案中，慢病毒顆粒可指除gag/pol和tat/rev區缺乏全部基因的第二代載體。在一些實施方案中，慢病毒顆粒可指僅包含內源rev、gag和pol基因且具有用於轉導的嵌合LTR而無tat基因的第三代載體(參見Dull,T.等(1998)J.Virol.72：8463-71)。進一步說明參見 Durand,S.和Cimarelli,A.(2011)Viruses 3：132-59。
在一些實施方案中，病毒顆粒是包含編碼本公開的RNAi的核酸的重組慢病毒載體顆粒。認為任何慢病毒載體的使用都在本發明的範圍之內。在一些實施方案中，慢病毒載體源自慢病毒，其包括但不限於人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)、人免疫缺陷病毒-2(HIV-2)、類人猿免疫缺陷病毒(SIV)、貓科免疫缺陷病毒(FIV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、Jembrana病病毒(JDV)、維斯納病毒(visna virus)(VV)和羊關節炎腦炎病毒(CAEV)。慢病毒顆粒還包含衣殼蛋白。在一些實施方案中，重組病毒顆粒包含慢病毒載體與一個或多個外源病毒衣殼蛋白的組合。這種組合可指假型重組慢病毒載體顆粒。在一些實施方案中，用於假型重組慢病毒載體顆粒中的外源病毒衣殼蛋白源自外源病毒。在一些實施方案中，用於假型重組慢病毒載體顆粒中的外源病毒衣殼蛋白是水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSV-GP)。VSV-GP與遍在的細胞受體相互作用，為假型重組慢病毒載體顆粒提供廣泛組織嗜性。此外，認為VSV-GP為假型重組慢病毒載體顆粒提供更高的穩定性。在其他實施方案中，外源病毒衣殼蛋白源自包括但不限於Chandipura病毒、狂犬病毒、Mokola病毒、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、羅斯河病毒(RRV)、Sindbis病毒、森林腦炎病毒(Semliki Forest virus)(SFV)、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、埃博拉病毒Reston、埃博拉病毒Zaire、馬爾堡病毒、拉沙病毒(Lassa virus)、禽白血病病毒(Avian leukosis virus)(ALV)、南非羊肺炎羊反轉錄病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus)(JSRV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine leukemia virus)(MLV)、長臂猿白血病病毒(Gibbon ape leukemia virus)(GALV)、貓內源性逆轉錄病毒(Feline endogenous retrovirus)(RD114)、人T-淋巴細胞病毒1(HTLV-1)、人泡沫病毒、Maedi-visna病毒(MVV)、SARS-CoV、仙台病毒(Sendai virus)、呼吸道合胞體病毒(Respiratory syncytia virus)(RSV)、人副 流感病毒3型、丙型肝炎病毒(HCV)、流感病毒、雞瘟病毒(Fowl plague virus)(FPV)或苜蓿銀紋夜蛾多重核型多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedro virus)(AcMNPV)。用於假型慢病毒的載體和衣殼蛋白組合的實例可在例如Cronin,J.等(2005).Curr.GeneTher.5(4)：387-398中發現。不同的假型重組慢病毒載體顆粒可用於優化特定靶細胞的轉導或靶向在特定靶組織(例如疾病組織)內的特定細胞。例如通過特定假型重組慢病毒載體顆粒靶向的組織，包括但不限於肝(例如具有VSV-G、LCMV、RRV或SeV F蛋白的假型)、肺(例如具有埃博拉病毒(Ebola)，馬爾堡病毒(Marburg)、SeV F和HN或JSRV蛋白的假型)、胰腺小島細胞(例如具有LCMV蛋白的假型)、中樞神經系統(例如具有VSV-G、LCMV、狂犬病毒或Mokola蛋白的假型)、視網膜(例如具有VSV-G或Mokola蛋白的假型)、單核細胞或肌肉(例如具有Mokola或埃博拉病毒蛋白的假型)、造血系統(例如具有RD114或GALV蛋白的假型)或癌細胞(例如具有GALV或LCMV蛋白的假型)。進一步說明參見Cronin,J.等(2005).Curr.GeneTher.5(4)：387-398和Kay,M.等(2001)Nat.Med.7(1)：33-40。
在一些實施方案中，病毒顆粒是單純皰疹病毒(HSV)顆粒。在一些實施方案中，HSV顆粒是rHSV顆粒，例如編碼在兩ITR間的本公開的RNAi的多核苷酸載體。HSV是具有約152kb基因組的DNA病毒。有利的是，約一半的其基因是非必須的且可缺失以容納異源序列。HSV顆粒感染非分裂細胞。此外，其在神經元中天然建立潛伏，通過逆行運輸運動，且可跨突觸轉移，使得其對於神經元的轉染和/或涉及神級系統的基因療法方式具有優勢。在一些實施方案中，HSV顆粒可以是複製缺陷或能夠複製的(例如能夠通過失活一個或多個晚期基因進行單複製循環)。進一步描述參見Manservigi,R.等(2010)Open Virol.J.4：123-56。
在一些實施方案中，病毒顆粒是包含編碼本公開的 RNAi的核酸的rHSV顆粒。認為任何HSV載體的使用都在本發明的範圍之內。在一些實施方案中，HSV載體源自HSV血清型，包括但不限於HSV-1和HSV-2。HSV顆粒還包含衣殼蛋白。在一些實施方案中，重組病毒顆粒包含HSV載體與一個或多個外源病毒衣殼蛋白的組合。這種組合可指假型rHSV顆粒。在一些實施方案中，在假型rHSV顆粒中使用的外源病毒衣殼蛋白源自外源病毒或源自另一HSV血清型。在一些實施方案中，在假型rHSV顆粒中使用的外源病毒衣殼蛋白是水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSV-GP)。VSV-GP與遍在的細胞受體相互作用，為假型rHSV顆粒提供廣泛地細胞嗜性。此外，認為人VSV-GP為假型rHSV顆粒提供更高的穩定性。在其他實施方案中，外源病毒衣殼蛋白可來自不同的HSV血清型。例如HSV-1載體可包含一個或多個HSV-2衣殼蛋白。不同的HSV血清型可用於優化特定靶細胞的轉導或靶向在特定靶組織(例如疾病組織)內的特定細胞類型。由特定腺病毒血清型靶向的組織或細胞包括但不限於中樞神經系統和神經元(例如HSV-1)。進一步說明參見Manservigi,R.等(2010)Open Virol J 4：123-156,Kay,M.等(2001)Nat.Med.7(1)：33-40，和Meignier,B.等(1987)J.Infect.Dis.155(5)：921-930。
病毒顆粒的產生
rAAV顆粒可使用本領域已知的方法產生。參見例如美國專利號6,566,118；6,989,264和6,995,006。在本發明的實踐中，用於產生rAAV顆粒的細胞包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、微生物和酵母。宿主細胞還可以是包裝細胞，其中的AAV rep和cap基因穩定保持在AAV載體基因組中穩定保持的宿主細胞或生產細胞內。示例性的包裝和生產細胞源自293、A549或HeLa細胞。AAV載體並使用本領域的標準技術純化和配製。
本領域已知用於產生rAAV載體的方法包括但不限於轉染、穩定細胞系產生和感染性雜合病毒產生系統(其包括腺病毒-AAV雜合、皰疹病毒-AAV雜合和杆狀病毒-AAV雜合)(Conway, JE等，(1997)J.Virology 71(11)：8780-8789)。用於產生rAAV病毒顆粒的rAAV生產培養都需要：1)合適的宿主細胞，包括例如，衍生自人的細胞系如HeLa、A549或293細胞或在杆狀病毒產生系統的情況中昆蟲衍生細胞系如SF-9；2)合適的輔助病毒功能，由野生型或突變腺病毒(如溫度敏感的腺病毒)、皰疹病毒、杆狀病毒或提供輔助功能的質體構建體提供；3)AAV rep和cap基因和基因產物；4)側翼為至少一個AAV ITR序列的核酸(如治療核酸)；和5)合適的介質或介質組分以支持rAAV產生。在一些實施方案中，AAV rep和cap基因產物可形成任何AAV血清型。一般而言但不是強制性的，AAV rep基因產物為與rAAV載體基因組的ITR相同的血清型只要rep基因產物可發揮功能以複製和包裝rAAV基因組。本領域已知的合適介質可用於rAAV載體的產生。該介質包括但不限於Hyclone Laboratories和JRH生成的介質，包括改進的Eagle介質(MEM)、杜貝爾克氏改進的Eagle介質(DMEM)，定制配方如描述於美國專利號6,566,118的那些和如美國專利號6,723,551中所述的Sf-900 II SFM介質，其每一篇通過提述以其整體併入，特別是對應重組AAV載體產生用途的定制介質配方。在一些實施方案中，AAV輔助功能由腺病毒或HSV提供。在一些實施方案中，AAV輔助功能由杆狀病毒提供且宿主細胞是昆蟲細胞(例如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)細胞)。
在一些實施方案中，rAAV顆粒可通過三重轉染的方法產生，如下文提供的示例性三重轉染方法。簡言之，包含基因和衣殼基因的質體以及輔助腺病毒質體可轉染(例如使用磷酸鈣方法)入細胞系(例如HEK-293細胞)，且可收集並任選地純化病毒。如此，在一些實施方案中，rAAV顆粒可通過編碼rAAV載體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸和編碼AAV輔助病毒功能的核酸三重轉染入宿主細胞而產生，其中所述核酸轉染至宿主細胞生成能夠產生rAAV顆粒的宿主細胞。
在一些實施方案中，rAAV顆粒可由生產細胞系方法 產生，如下文提供的示例性生產細胞系方法(還參見(參照Martin等，(2013)HumanGeneTherapy Methods 24：253-269)。簡言之，細胞系(例如HeLa細胞系)可用包含rep基因、衣殼基因和啟動子-異源核酸序列的質體穩定轉染。可篩選細胞系以選擇先導克隆用於rAAV產生，其隨後可擴大至生產生物反應器並用腺病毒(例如野生型腺病毒)作為輔助感染以初始rAAV產生。隨後可收穫病毒，腺病毒可失活(例如通過加熱)或和/或去除，且可純化rAAV顆粒。如此，在一些實施方案中，通過包含一個或多個編碼rAAV載體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸和編碼AAV輔助病毒功能的核酸的生產細胞系產生rAAV顆粒。
在一些方面中，提供了用於產生任何如本文所述的rAAV顆粒的方法，其包括(a)在產生rAAV顆粒的條件下培養宿主細胞，其中所述宿主細胞包含(i)一個或多個AAV包裝基因，其中每種所述AAV包裝基因編碼AAV複製和/或衣殼化蛋白；(ii)rAAV促-載體，其包含編碼側翼為至少一個AAV ITR如本文公開的RNAi的核酸，和(iii)AAV輔助功能；和(b)回收由宿主細胞產生的rAAV顆粒。在一些實施方案中，RNAi包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述至少一個AAV ITR選自下組：AAV ITR為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV衣殼血清型ITR或等等。在一些實施方案中，所述衣殼化蛋白選自下組：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6(例如野生型AAV6衣殼或變體AAV6衣殼如ShH10，如U.S.PG Pub.2012/0164106中所述)、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9(例如野生型AAV9衣殼或如U.S.PG Pub.2013/0323226中所述的修飾的AAV9衣殼)、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、酪胺酸衣殼突變體、髮夾結構結合衣殼突變體、AAV2R471A衣殼、AAVAAV2/2-7m8衣殼、AAV DJ衣殼(例如AAV-DJ/8衣殼、AAV-DJ/9衣殼或任何U.S.PG Pub.2012/0066783中所述的其他衣殼)、AAV2 N587A衣殼、AAV2 E548A衣殼、AAV2 N708A衣殼、AAV V708K衣殼、山羊AAV衣殼、AAV1/AAV2嵌合衣殼、牛AAV衣殼、小鼠AAV衣殼、rAAV2/HBoV1衣殼或美國專利號8,283,151或國際公開號WO/2003/042397中所述的AAV衣殼。在一些實施方案中，突變衣殼蛋白保持形成AAV衣殼的能力。在一些實施方案中，衣殼蛋白是AAV5酪胺酸突變衣殼蛋白。在進一步的實施方案中，rAAV顆粒包含來自進化枝A-F的AAV血清型的衣殼蛋白。在一些實施方案中，rAAV顆粒包含AAV1衣殼和含有AAV2 ITR、突變的AAV2 ITR和編碼本公開的RNAi的核酸的重組基因組。在進一步的實施方案中，純化了rAAV顆粒。本文使用的術語“純化”包括缺少至少一部分其他組分的rAAV顆粒的製備物，其可存在于rAAV顆粒天然存在處或初始製備處。因此，例如，單離的rAAV顆粒可使用純化技術製備以從來源混合物如培養裂解物或生產培養上清液將其富集。富集可以多種方式測量，如例如，通過存在於溶液中的DNA酶抗性顆粒(DRP)或基因組拷貝(gc)的調和，或通過感染性，或其可相對于來源混合物中存在的第二、潛在干擾物質如污染物(包括生產培養基污染物或進程內污染物，包括輔助病毒、介質組分等)測量。
本領域已知多種用於產生腺病毒載體顆粒的方法。例如，用於受損的腺病毒載體，腺病毒載體基因組和輔助腺病毒基因組可轉染入包裝細胞系(例如293細胞系)。在一些實施方案中，輔助腺病毒基因組可包含重組位點，其在其包裝信號的側翼，且可將兩基因組轉染入表現重組酶的包裝細胞系(例如可使用Cre/loxP系統)，由此比輔助腺病毒更有效地包裝感興趣的腺病毒載體(參見例如Alba,R.等(2005)Gene Ther.12 Suppl 1：S18-27)。可收穫腺病毒載體並使用標準方法純化，如本文所述的那些。
用於產生慢病毒載體顆粒的多種方法為本領域已 知。例如，對於第三代慢病毒載體，可將包含具有gag和pol基因的感興趣的慢病毒基因組的載體與包含rev基因的載體共同轉染入包裝細胞系。感興趣的慢病毒基因組還包含在Tat不存在下促進轉錄的嵌合LTR(參見Dull,T.等(1998)J.Virol.72：8463-71)。可收穫慢病毒載體並使用本文所述的方法(例如Segura MM，等，(2013)Expert Opin Biol Ther.13(7)：987-1011)純化。
用於產生HSV顆粒的多種方法為本領域已知。可收穫HSV載體並使用標準方法純化，如本文所述的那些。例如用於複製-缺陷的HSV載體，可將缺乏全部即刻早期(IE)基因的感興趣的HSV基因組轉染入提供病毒輔助所需基因的互補細胞系，如ICP4、ICP27和ICP0(參見例如Samaniego,L.A.等(1998)J.Virol.72：3307-20)。可收穫HSV載體並使用本文所述的方法純化(例如Goins,WF等，(2014)Herpes Simplex Virus Methods in Molecular Biology1144：63-79)。
本文還提供了藥物組合物，其包含含有編碼本文公開的RNAi的轉基因的重組病毒顆粒和藥學上可接受的載劑。藥物組合物適於本文所述的任何施用模式。可將包含本公開的RNAi的核酸的重組病毒顆粒的藥物組合物引入腦部。例如包含編碼本公開的RNAi的核酸的重組病毒顆粒可在紋狀體內施用。可使用任何本公開的重組病毒顆粒，包括rAAV、腺病毒、慢病毒和HSV顆粒。
在一些實施方案中，包含含有編碼如本公開所述的RNAi的轉基因的重組病毒顆粒和藥學上可接受的載劑的藥物組合物適於施用至人。這種載劑為本領域熟知(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences,15th Edition,pp.1035-1038和1570-1580)。在一些實施方案中，包含如本文所述的rAAV和藥學上可接受的載劑的藥物組合物適於注射入哺乳動物腦部(例如紋狀體內施用)。在一些實施方案中，包含本文所述的重組慢病毒顆粒和藥學上可接受的載劑的藥物組合物適於注射入哺乳動物腦部(例如紋狀體內施用)。 在一些實施方案中，包含本文所述的重組腺病毒顆粒和藥學上可接受的載劑的藥物組合物適於注射入哺乳動物腦部(例如紋狀體內施用)。在一些實施方案中，包含本文所述的重組HSV顆粒和藥學上可接受的載劑的藥學上可接受的載劑適於注射入哺乳動物腦部(例如紋狀體內施用)。
這種藥學上可接受的載劑可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些，如花生油、大豆油、礦物油等。還可採用鹽水溶液和葡萄糖水溶液、聚乙二醇(PEG)和甘油溶液作為液體載劑，特別是用於可注射的溶液。藥物組合物可機一部包含其他成分，例如防腐劑、緩衝劑、張力劑、抗氧化劑和穩定劑、非離子型潤濕劑或澄清劑、增粘劑等。本文描述的藥物組合物可包裝成單一單位劑量或多重劑量形式。所述組合物一般配製為無菌或基本上等滲的溶液。
VII.製品和套組
還提供了用於在本文所述的方法中使用的套組或製品。一些方面中，所述套組包含在合適包裝中的本文所述的組合物(例如本公開的重組病毒顆粒，如包含編碼本公開的RNAi的核酸的rAAV顆粒)。用於本文所述的組合物(如紋狀體內組合物)的合適包裝為本領域已知，且包括例如小瓶(如密封小瓶)、容器、安瓿、瓶、罐、軟包裝(例如密封的Mylar或塑料袋)等。這些製品可進一步除菌和/或密封。
本發明還提供包含本文所述的組合物的套組且可進一步包含關於使用所述組合物的方法說明，如本文所述的用途。本文所述的套組可進一步包括商業和使用者角度預期的其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器和具有用於實施任何本文所述方法的說明的包裝插頁。例如在一些實施方案中，所述套組包含含有編碼本公開的RNAi的轉基因的重組病毒顆粒的組合物 (其用於將至少1×109基因組拷貝遞送入哺乳動物腦部(例如通過紋狀體內施用)至如本文所述的靈長類動物)、適於注射入靈長類動物腦部的藥學上可接受的載劑和如下的一個或多個：緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器和具有用於實施向靈長類腦部注射(例如通過紋狀體內施用)的說明的包裝插頁。在一些實施方案中，所述套組包含使用本文所述的重組病毒顆粒治療亨廷頓病的說明。在一些實施方案中，所述套組包含根據本文所述的任何方法使用如本文所述的重組病毒顆粒的說明。
實施例
通過參照下述實施例更充分地理解本發明。然而，它們不應解釋為限制本發明的範圍。應該理解的是：本文所述的實施例和實施方案僅出於說明目的，由其啟示的不同修飾或改變將建議給本領域的技術人員而且也包括在本申請的精神和範疇及所附權利要求的範圍內。
實施例1：AAV2/1-miRNA-Htt在體外減少Htt表現。
亨廷頓病(HD)是致命的常染色體顯性遺傳性神經變性疾病，其由亨廷頓蛋白(Htt)中多個多聚穀氨醯胺殘基的增加導致。基於對HD的根本識別，開發了減少致病突變Htt的表現的療法。尋求選擇性減少該致病作用劑的表現的RNA干擾(RNAi)作為該疾病和相似病症的潛在治療策略出現。為檢查HD小鼠模型中RNA干擾療法的優點，將之前顯示有效靶向小鼠和人Htt mRNA(McBride等，(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：5868-5873)的靶序列嵌入人工miRNA骨架並克隆入前病毒載體。
方法
動物
使用通過Sanofi公司Genzyme的機構性動物關懷和使用委員會(Department of Health and Human Services,NIH Publication 86-23)批准的方案實施全部方法。使用的小鼠包括YAC128小鼠(含有在純FVB/NJ背景具有128個CAG重複的全長人突變的HTT轉基因的酵母人工染色體)和FVB/NJ同窩小鼠(Slow等，(2003)Hum.Mol.Genet.12：1555-1567；Van Raamsdonk等，(2005)Hum.Mol.Genet.3823-3835)。YAC128小鼠和FVB/NJ同窩都從在Charles River實驗室飼養的Genzyme群落獲得。所述小鼠在12小時日/夜循環的具有不限量的食物和水的情況下維持。全部行為測試在動物日循環過程中實施(8am-4pm的小時之間)。
質體和病毒載體
為生成編碼針對亨廷頓蛋白基因的基於miRNA的髮夾結構的重組AAV2/1血清型載體(AAV2/1-miRNA-Htt)，將人HTT的miRNA克隆入包含AAV2反向末端重複(ITR)、牛生長激素多聚A和1.6-kb巨細胞病毒增強子/雞-肌動蛋白(CBA)啟動子的穿梭質體。miRNA的支架來自InvitrogenTM BLOCK-iTTM Pol II miR RNAi表現載體套組(Life Technologies,Thermo Fisher Scientific；Waltham,MA)。對照載體包含空載體骨架(AAV2/1-空)或表現在相同啟動子(AAV2/1-eGFP)控制下的增強的綠色熒光蛋白(AAV2/1-eGFP)。全部病毒載體通過如上文所述的人293細胞的三重質體共轉染生成(Xiao等(1998)J.Virol.72：2224-2232)，且重組病毒顆粒如上文所述進行柱純化(Passini等，(2001)J.Virol.75：12382-12392)。使用定量PCR獲得的AAV2/1-miRNA-Htt的力價確定為4.5 x 1012vg/ml，且AAV2/1-空的力價為2.3 x 1012vg/ml。
手術步驟
將動物使用3%異氟醚麻醉並置於立體定位儀。如前文所述實施了顱內注射(Treleaven,C.M.等(2012)Mol.Ther.20：1713-1723)。簡言之，將2μl的重組病毒載體(AAV2/1-eGFP或AAV2/1-miRNA-Htt)使用10μl Hamilton注射器以0.5μl/min的速率注射入紋狀體(AP,+0.50；ML,±2.00；DV,-2.5來自前囟及硬腦膜；門齒條，0.0)。完成注射後將針留在原處1分鐘。手術前1小時和手術後24小時，將酮洛芬皮下施用至小鼠(5mg/kg)用於鎮痛。
動物灌注和組織收集
使用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)通過心臟灌注小鼠以去除全部血液。將腦部沿中線矢狀位切割，並將左半球後-固定於4%多聚甲醛，隨後為30%蔗糖且隨後使用低溫恒溫器切成20-μm切片。使用小鼠腦基質(Harvard Apparatus,Holliston,MA)將右半球沿冠狀軸切割成2-mm板且隨後在液氮中快速冷凍並在-80℃保存直至使用。對於Htt聚集物的分析，將腦在4%多聚甲醛中後-固定48小時，用PBS洗滌、且隨後使用振動切片機切成40-μm冠狀切片。
細胞培養和轉染
將HEK293細胞用5 x 109vg的AAV2/1-eGFP或AAV2/1-miRNA-Htt感染並3天后收集。通過實時定量RT-PCR測量RNA水平。使用TaqMan® Cells-to-CTTM套組(Ambion)分離總RNA。實施Q-PCR反應並如上文所述在ABI Prism 7500序列檢測儀(Applied Biosystems)上分析(Kordasiewicz,H.B.等(2012)Neuron 74：1031-1044)。將表現水平標準化至PPIA(肽基脯氨醯異構酶)水平。
實時定量PCR(TaqMan)
RNA水平通過實時定量RT-PCR測量。將來自腦板2的腦組織樣品用於全部RT-PCR分析。使用QIAGEN RNEasy迷你套組提取總RNA且隨後逆轉錄，並使用TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix套組(Applied Biosystems)根據製造商的說明擴增。為檢測小鼠Htt mRNA，使用了下列探針集：Mm01213820_m1(Life Technologies目錄號4331182)。為檢測人Htt mRNA，使用了下列寡聚物：5’-ctccgtccggtagacatgct-3’(正向引子，SEQ ID NO：9)；5’-ggaaatcagaaccctcaaatgg-3’(反向引子；SEQ ID NO：10)和5’-tgagcactgttcaactgtgtgtatcggga-3’(探針，SEQ ID NO：11)。實施了定量RT-PCR反應並在ABI PRISM® 7500 Real Time PCR系統(Applied Biosystems)上分析。將Htt mRNA的表現水平標準化至次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶1(Hprt1)mRNA水平。使用小鼠腦cDNA的5倍系列稀釋生成標準曲線。一式兩份運行每個樣品。通過使用標準曲線或△△CT方法確定相對基因表現並標準化至Hprt1 mRNA水平。
蛋白免疫印跡
以50mg/ml的終濃度在包含完全蛋白酶抑制劑混合物(Roche)的T-Per裂解緩衝液(Pierce)中均質化組織。通過在4C 10,000×g離心6分鐘使均質物澄清。通過使用BSA測定法(Pierce)測量蛋白濃度。在3-8%的Novex Tris-乙酸鹽凝膠上解析20-30微克的均質物且隨後轉移至硝酸纖維素膜。使用小鼠抗亨廷頓蛋白單克隆抗體(Mab2166；1：2,000稀釋，Millipore)和兔多克隆抗β-微管蛋白抗體(1：750稀釋，Santa Cruz Biotechnology)探測膜。隨後使用紅外二級抗體(1：20,000稀釋，Rockland)溫育膜，且所述蛋白通過使用Odyssey(LI-COR Biosciences)的定量熒光可視化。為控制裝載差異，將Htt蛋白標準化至β-微管蛋白並作為未處理或鹽水處理的動物的百分比表示。使用分子量標記以驗證蛋白的同一性。
流式細胞術和細胞分選(FCM細胞分選)
使用具有100μm噴嘴FACS Aria II細胞分選儀(BD Biosciences San Jose,CA)在Genzyme Flow Cytometry Core Facility(a Sanofi Company)分析並分離了單細胞懸液。通過由前向散射(FWD-SC)和側散射(SSC)上的門控從碎片區分活的單細胞實施細胞分析。使用具有530/30BP過濾器505LP的檢測儀E收集EGFP陽性細胞。EGFP熒光數據文件作為單參數柱狀圖顯示且分選決定以EGFP-和EGFP+為基礎。在包含5%胎牛血清的組織培養介質中收集分選的細胞並以50 000細胞/孔的濃度鋪板于4孔-室載玻片(LabTek,Nalge Nunc International,Naperville,Ill)。
免疫組織化學
處理振動切片機切片用於通過EM48(一種優先識別聚集的亨廷頓蛋白的抗體)的免疫染色(Gutekunst等，(1999)J.Neurosci.19：2522-2534)。自由浮動的切片首先用Dual Endogenous Enzyme Block(Dako)處理30分鐘以阻斷內源過氧化物酶活性。其隨後用0.01M PBS洗滌(3分鐘)，隨後用PBS中的0.5% Triton X-100洗滌三次，每次10分鐘。非特異性位點通過在室溫在Rodent Block M中溫育切片1小時封閉。用EM48抗體(Millipore，在PBS中1：25稀釋)通過在4℃冷室的溫和搖床上溫育過夜探測切片。第二天，用二級抗體(MM HRP Polymer,Biocare Medical)在室溫搖床上溫育切片1小時。PBS中三次洗滌(每次15分鐘)後，使用DAB Peroxidase Substrate套組(Vector)檢測信號。洗滌後，在Superfrost plus載玻片上固定切片，乾燥過夜並用Acrytol封固劑覆蓋載玻片。
行為學分析
加速旋轉杆測試：在加速旋轉杆設備(AccuScan Instruments)上評估運動協調和運動學習。在旋轉杆上用每天3次試驗訓練小鼠，持續3個連續天。在訓練的第一天，設置旋轉杆以在300秒內從0加速至5RPM。完成300秒前從杆上跌落的小鼠放回杆上直至超過完整的300秒。在訓練的第二天和第三天，設置旋轉杆以在300秒內從0加速至40RPM，再次需要全部小鼠在杆上完成全部的300秒。在第四天(測試日)，將小鼠置於設置在300秒內從0加速至40RPM的旋轉杆。跌倒後不再將動物重置，且在3次測定法中記錄跌落潛伏期時間。跌落潛伏期時間通過直至動物從旋轉杆跌落的流逝的時間定義。
Porsolt游泳測試：將在Porsolt游泳測試中的不動性作為齧齒動物中抑鬱的測量(Porsolt等，(1977)Arch.Int.Pharmacodyn.Ther.229：327-336,Cryan等，(2002a)Trends Pharmacol.Sci.23：238-245,Cryan等，(2002b)Eur.J.Pharmacol.436：197-205)。該測試通過將小鼠置於填充了直至15cm高度的23℃水的單獨的玻璃圓筒(20cm高度×10cm直徑)中實施。將小鼠置於圓筒中7分鐘的時間。認為該階段的最初3分鐘為適應期，其間不收集數據。在測試部分的最後4分鐘，小鼠的表現通過使用時間採樣技術的盲測觀察評分以對10秒時間間隔的主要行為進行評級。測量游泳和不動行為並在每10秒末記錄，其產生每測試的24個數據點。對於每只小鼠計算不動狀態花費的時間的百分比。
統計學
對於統計學分析使用平均值。數據表示為平均值±SEM。對於使用兩組的研究，使用了Student’s T檢驗用於統計學比較。對於多於兩組的比較，使用了單向ANOVA，隨後為Tukey’s多重比較後-hoc檢驗(Prism GraphPad)。認為p<0.05為統計學顯著性差異。
結果
如圖1A所示工程化質體以表現靶向Htt的miRNA和在雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子(pSP70-CBA-EGFP)轉錄控制下的增強的GFP(eGFP)報告基因。選自Htt編碼區的候選靶序列為5’-TAGACAATGATTCACACGGT-3’(SEQ ID NO：4)。生成高力價的編碼靶序列的重組AAV2/1-血清型載體(AAV2/1-miRNA-Htt)和對照載體(AAV2/1-eGFP和AAV2/1-空)且其基因沉默活性通過感染人胚胎腎(HEK)293細胞檢測。細胞用5×109vg的AAV載體感染。使用熒光激活細胞分選(FACS)分析，確認了用AAV-eGFP-miRNA-HTT感染後，該劑量導致HEK293細胞中多於90%的感染效率(圖2A-D)。當在感染後第3天通過實時PCR分析時，用AAV2/1-eGFP感染的細胞不顯示任何內源Htt水平的減少，然而，用AAV2/1-miRNA-Htt感染的細胞顯示了Htt mRNA水平約40%的減少(圖1B)。
實施例2：將AAV2/1-miRNA-Htt注射入YAC128小鼠導致廣泛的紋狀體轉導和Htt mRNA的減少。
驗證了AAV2/1-miRNA-Htt在體外抑制Htt mRNA水平的能力後，對該載體在YAC128小鼠紋狀體中沉默Htt表現的能力進行了評估。為確定紋狀體內注射AAV2/1-miRNA-Htt後紋狀體內細胞的轉導百分比，根據實施例1中所述的方法採用了熒光活化細胞分選(FACS)。
結果
成年YAC128小鼠接受了AAV2/1-eGFP-miRNA-Htt(4.5×1012vg/ml)、對照載體AAV2/1-eGFP(5.6×1012vg/ml)的雙側紋狀體內注射。注射後一個月，對每動物紋狀體區進行了微解剖並分選了含eGFP細胞對不含eGFP細胞且通過FACS分析量化(圖3A&B)。數據顯示多於80%的紋狀被載體轉導，如通過大量分選的紋狀體細胞內eGFP存在證明的(圖3C)。
為評估載體減少體內Htt的能力並監測響應的壽命，成 年小鼠接受了AAV2/1-miRNA-Htt(4.5E12vg/ml)(N=16，N=8+8每時間點)或AAV2/1-空對照載體(2.3E12vg/ml)(N=8)的雙側紋狀體內注射，且在治療後的1或5個月分析了腦部。在兩時間點來自用AAV2/1-miRNA-Htt治療的小鼠的腦部切片的熒光顯微分析顯示遍及整個紋狀體和周邊腦區的廣泛eGFP熒光，與FACS分析一致，這表明幾乎全部的紋狀體轉導(圖3D)。在治療後1個月獲得的小鼠腦部中的eGFP表現水平在5個月的時間點表現得未減少(圖3D)。當與AAV2/1-空-治療的對照相比時，在AAV2/1-miRNA-Htt-注射的小鼠中突變的人Htt mRNA的紋狀體水平顯著減少，且在兩時間點都注意到了等同的減少程度(約45%，p<0.01)(圖3E)。當與AAV2/1-空-治療的對照相比時，AAV2/1-miRNA-Htt後內源小鼠Htt mRNA的紋狀體水平顯著減少。在兩時間點都注意到了等同的減少程度(約45%，p<0.01)(圖4)。
實施例3：AAV2/1-miRNA-Htt注射入YAC128小鼠未引起腦中明顯的毒性。
為確定AAV2/1-miRNA-Htt和後續Htt的減少是否賦予了神經毒性和炎症，根據實施例1所述的方法通過蘇木精和伊紅(H&E)染色檢查了紋狀體切片的細胞形態學和完整性。神經炎症標記物膠質纖維酸性蛋白(GFAP，星形膠質細胞的標記物)和Iba-1(小膠質細胞的標記物)的水平也在治療後的1個月和5個月進行了檢查。
結果
H&E分析顯示了注射的腦區中無明顯的組織病理學變化(圖5A-C)。當與AAV2/1-空-治療的動物比較時，在注射後1或5個月的注射區中未觀察到GFAP-陽性星形膠質細胞的數目(通過免疫組化進行可視化)或GFAP mRNA的水平(通過QPCR定量)的明顯增加(圖5D-F；圖5J)。然而在注射後1個月注意到通過紋狀體中Iba-1免疫染色(圖5H)和Iba-1 mRNA水平增加所證實的活化的小膠質細 胞數目增加(圖5K)。有趣的是，在注射後5個月，小膠質細胞活化回到對照水平(圖5I&5K)，這表明響應時瞬時的。不希望受到理論限制，由於在本研究中使用的AAV2/1-空對照載體不包含eGFP基因，認為來自AAV2/1-miRNA-Htt的eGFP的表現可能為瞬時的小膠質細胞活化的原因。
總之，這些結果證實並擴展了如下發現：AAV2/1-miRNA-Htt能夠不僅在體外也在YAC128小鼠紋狀體中介導持續的Htt沉默。而且，Htt水平多至5個月的部分抑制在小鼠腦中未導致明顯的毒性或神經炎症。
實施例4：AAV2/1-miRNA-Htt的紋狀體遞送改正了YAC128小鼠中的異常行為和神經化學概貌
根據實施例1所述的方法還檢查了在HD的YAC128小鼠模型中存在的AAV-介導的突變的Htt水平減少對詳細表徵的表型缺陷的影響。已報告在3月齡開始的YAC128小鼠顯示運動協調缺陷(其通過實驗旋轉杆測試揭示)和抑鬱表型(使用Porsolt游泳測試揭示)(Slow等，(2003)Hum.Mol.Genet.12：1555-1567；Van Raamsdonk等，(2007)Neurobiol Dis 26：189-200)。
結果
年齡匹配的(2月齡)YAC128和野生型同窩小鼠接受了AAV2/1-miRNA-Htt或AAV2/1-空載體的雙側紋狀體內注射且隨後在治療後3個月處死(圖6A)。如預期，腦切片的分析證明了遍及整個紋狀體和周邊區域的eGFP表現，如之前觀察的(圖6B)。但與AAV2/1-空-治療對照相比時，腦部均質物的Western印跡分析顯示突變的人和內源小鼠Htt蛋白在AAV2/1-miRNA-Htt注射的YAC128和野生型小鼠的紋狀體中顯著減少(約55%的減少，p<0.01)(圖6C&D)。實時定量PCR分析指示還獲得了mRNA水平的相稱的減少。
當與AAV2/1-空或AAV2/1-miRNA-Htt-治療的野生型 同窩比較時，在注射後2個月的AAV2/1-空-治療YAC128小鼠的旋轉杆測試中顯示明顯的運動協調缺陷(ANOVA，p<0.01)(圖6E)。然而，已用AAV2/1-miRNA-Htt治療的YAC128小鼠顯示了與野生型小鼠沒有區別的表現水平(ANOVA，Tukey的後-hoc；WT Htt對YAC128 Htt，p=NS；WT空對YAC128空，p<0.05)。因此，突變的Htt水平的部分降低足以改正YAC128小鼠的運動缺陷。在接受AAV2/1-miRNA-Htt的野生型小鼠和接受AAV2/1-空的野生型小鼠之間的旋轉杆表現無明顯差異。
之前的報道指示YAC128小鼠(始於3月齡)顯示可使用Porsolt游泳測試檢測的抑鬱表型(Pouladi等，(2009)Brain 132：919-932)。當置於水的容器中時，如果它們長時間不動，則認為動物表現出抑鬱狀態。使用基本游泳速度測試(其中測量了到達平臺的游泳延遲)，研究者證明了該Porsolt游泳測試中的抑鬱表型與YAC128小鼠的游泳能力無關且不依賴於在該模型中觀察到的完整記錄的運動協調缺陷(Pouladi等，(2009)Brain 132：919-932)。用AAV2/1-miRNA-Htt-或AAV2/1-空-載體注射了兩月齡的YAC128和WT同窩小鼠並在3個月後進行了Porsolt游泳測試。當與AAV2/1-miRNA-Htt-治療的YAC小鼠或AAV2/1-空-治療的野生型動物相比時，未治療的YAC128小鼠顯示了不動狀態的時間的增加(圖6F；ANOVA p<0.05)。再次，接受了AAV2/1-miRNA-Htt或AAV2/1-空的野生型小鼠的表現無明顯差異。已用AAV2/1-miRNA-Htt注射的YAC128小鼠相比AAV2/1-空治療的對照在不動狀態花費了顯著更少的時間。的確，AAV2/1-miRNA-Htt治療的YAC128小鼠的表現與其野生型同窩相似，表明該異常表型幾乎完全改正(ANOVA，Tukey的後-hoc；YAC Htt對YAC空，p<0.05)(圖6F)。
實施例5：使用AAV2/1-miRNA-Htt的治療部分改正了YAC128小鼠中DARPP-32和D1的轉錄失調。
已在HD腦中觀察到了多種在紋狀體中富集的基因的轉錄失調(Richfiel等，(1995)Ann.Neurol.37：335-343；Augood等，(1997)Ann.Neurol.42：215-221；Sugars等，(2004)J.Biol.Chem.279：4988-4999；Desplats等，(2006)J.Neurochem.96：743-757)。該異常在YAC128小鼠中也明顯，如具體地通過與野生型動物的那些相比DARPP-32和D1多巴胺受體的顯著較低的紋狀體水平所示(Pouladi等，(2012)Mol.Genet.21：2219-2232)。為檢查YAC128小鼠中Htt水平的抑制是否改正了此改變的轉錄概貌，對已在2月齡用AAV2/1-miRNA-Htt治療的YAC128小鼠的紋狀體組織實施了實時定量PCR分析，並根據實施例1所述的方法在3個月後進行了分析。
結果
當與年齡匹配的野生型對照相比時，AAV2/1-空-治療的YAC128小鼠的腦提取物的分析指示DARPP-32和D1多巴胺受體(D1R)的mRNA水平顯著降低(ANOVA，Tukey的後-hoc；WT空對YAC128空，p<0.05)(圖7A&B)。相比用AAV2/1-空載體治療的那些，施用了AAV2/1-miRNA-Htt的YAC128小鼠顯示更高的DARPP-32和D1R mRNA水平；然而這些水平仍低於在野生型對照中觀察到的那些(ANOVA，Tukey的後-hoc；WT空對YAC Htt，p=NS)。因此，AAV2/1-miRNA-Htt-介導的YAC128小鼠中Htt水平的減少賦予了異常紋狀體轉錄概貌的部分改正。在稍後的時間點(治療後多於5個月)的檢查可揭示該異常概貌的更完全的改正。
總之，這些結果確證了AAV2/1-miRNA-Htt能夠介導持續降低的Htt水平的體外和體內發現。重要的是，證明了該YAC 128小鼠中紋狀體Htt水平的減少導致了運動功能和行為的可測量改進以及詳細表徵的紋狀體中的轉錄失調的部分改正。
實施例6：AAV2/1-miRNA-Htt的紋狀體遞送減少了YAC128小鼠的腦中的Htt聚集物
CNS中Htt聚集物和包涵體的出現是HD的神經病理學特點。這些聚集物在HD小鼠中降低的水平已與病理學引人注目的改善關聯(Harper等，(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：5820-5825；Rodriguez-Lebron等，(2005)Mol.Ther.12：618-633)。報告了12月齡的YAC128小鼠模型顯示紋狀體中Htt聚集物的顯著和廣泛的累積(Slow等，(2003)Hum.Mol.Genet.12：1555-1567,Pouladi等，(2012)Hum.Mol.Genet.21：2219-2232)。AAV2/1-miRNA-Htt遞送對YAC128小鼠中Htt聚集物的影響根據實施例1中所述的方法檢查。
結果
使用抗Htt抗體EM48的6、9和24月齡的YAC128小鼠腦切片的免疫組化染色顯示了隨時間進展早在6月齡的紋狀體和皮質兩者中聚集物的證據(圖8A)。還分析了12月齡的組織(16微米冷凍切片)，顯示與24月齡群組具有相似的聚集物程度；然而，冷凍切片中的非特異性背景染色顯著高於振動切片機切片(數據未顯示)。
為檢查AAV-介導的突變的Htt水平的減少是否降低了Htt聚集物在後-症狀性YAC128小鼠(7月齡)腦中的累積程度，且進而改正運動和行為缺陷，對小鼠進行雙側紋狀體內的AAV2/1-miRNA-Htt或AAV2/1-GFP注射。在注射後3個月(動物為10月齡)將動物置於旋轉杆上測試並在注射後5個月處死(當小鼠為12月齡時)(圖8B)。旋轉杆上的AAV2/1-miRNA-Htt-治療的YAC128小鼠顯示了與其野生型同窩可比較的能力水平(圖8C；ANOVA，Tukey的後-hoc；p=NS)。然而，由於在該研究中使用的小鼠數目較低，這些結果並未達到統計學顯著性(N=4 WT；N=6 YAC128)。使用EM48抗體的紋狀體切片的免疫組化染色顯示AAV2/1-miRNA-Htt相比AAV2/1-GFP-治療的YAC128小鼠顯著更少的Htt聚集物的存在(圖 8D)。AAV-miRNA-Htt-治療的YAC128小鼠的腦部與野生型小鼠的那些實質上不可區分。
為確認使用AAV2/1-miRNA-Htt觀察到的聚集物減少並非是由於神經元喪失或潛在的神經毒性，在相鄰的矢狀位腦切片上實施了對於NeuN(神經元標記物)、GFAP(星形膠質細胞標記物)和Iba1(小膠質細胞標記物)的H&E染色以及免疫組化染色。與AAV-2/1-空注射的對照相比，通過熒光顯微術，AAV2/1-miRNA-Htt注射的動物顯示紋狀體中NeuN-陽性神經元相同的豐度。使用光學顯微術，相鄰冠狀腦切片的H&E染色也表現正常並提供了此缺乏神經喪失的支持性證據；然而，由於未實施體視(stereology)，該結果不可量化。此外，如在早期研究中所觀察，在注射後5個月的AAV2/1-miRNA-Htt-治療的小鼠中未檢測到GFAP或Iba-1染色的增加。
結論
本研究顯示了降低的突變的Htt水平是針對HD的治療策略，且證明了紋狀體中突變的Htt的部分減少在HD全長轉基因小鼠模型YAC128小鼠模型中產生行為、生化和神經病理的改善。評估該治療策略的之前的努力實施於攜帶突變的HTT基因片段的小鼠模型，如R6/1和N171-82Q HD小鼠(Harper等，(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：5820-5825,Rodriguez-Lebron等，(2005)Mol.Ther.12：618-633,Machida等，(2006)Biochem.Biophys.Res.Commun.343：190-197)。突變的Htt水平的部分減少賦予了一些更嚴重模型如N171-82Q HD小鼠模型中適度的存活益處，但在其他模型(例如R6/1小鼠模型)中卻非如此(Harper等，(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：5820-5825,Rodriguez-Lebron等，(2005)Mol.Ther.12：618-633,Machida等，(2006)Biochem.Biophys.Res.Commun.343：190-197)。在使用旋轉杆和步幅長度測試的這些研究中也注意到了運動的改 善；然而，這些模型的嚴重性排除了治療對行為、神經病理和生化異常的長期評估。
本研究利用了YAC128小鼠模型(該模型含有突變的包含128個CAG重複的人HTT基因)，其發生進行性運動異常和年齡依賴性的神經病理。與其他HD小鼠模型相比，YAC128小鼠很適於測試治療效力，這是由於其概括了人疾病的顯著遺傳和臨床特徵。YAC128小鼠中疾病相關改變的自然史已詳盡定義，且動物顯示具有低動物間差異性的表型上均一的疾病特徵。YAC128小鼠發生改變的紋狀體轉錄概貌，此為未在其他相似小鼠如BAC HD小鼠模型中觀察到的性狀(Pouladi等，(2012)Hum.Mol.Genet.21：2219-2232)，且YAC128小鼠顯示年齡依賴性紋狀體神經退化。由此，該模型中治療干預的測試和結果的測量對於臨床轉化可能更具預測價值(Slow等，(2003)Hum.Mol.Genet.12：1555-1567)。
使用YAC128小鼠，這些研究證明了靶向突變的人Htt的miRNA的AAV2/1-介導的表現導致Htt mRNA和蛋白在紋狀體中的顯著減少。與該激惹實體的降低相關的是如使用旋轉杆和Porsolt游泳測試在治療後5個月的顯著改善以及紋狀體內Htt聚集物的顯著減少。值得注意的是，在這些研究中觀察到的Htt水平的減少僅約為對照的40%，指示突變的Htt的部分減少足以在該小鼠模型中產生顯著的治療益處。而且，用AAV載體的紋狀體的80%的轉導僅導致部分Htt減少。在培養中的HEK293細胞內看到了相似的現象，其中約90-95%的轉導效率僅得到作為結果的內源Htt水平40-50%的減少(參見圖2A-D)。這些發現與齧齒類動物和靈長類動物中之前的發現一致，顯示使用基於miRNA的沉默的可比較策略僅減少部分Htt水平(McBride等，(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：5868-5873；Boudreau等，(2009b)Mol.Ther.17：1053-1063；McBride等，(2011)Mol.Ther.19：2152-2162；Grondin等，(2012)Brain 135：1197-1209)。不希望受到理論限制，對於為什麼miRNA在該轉導區僅產生部分靶 敲低存在多種潛在的假設。用於介導Htt沉默的miRNA莖-環形式在生成功能性小干擾RNA前需要通過細胞加工。這些對於細胞加工的需要可因此對由基於miRNA的髮夾賦予的RNA沉默的程度設置天然限制。由Boudreau等(Boudreau等，(2009a)Mol.Ther.17：169-175)的報導描述了基於miRNA的平臺對於在哺乳動物腦中的治療性沉默改進的安全性，且強調了與傳統短的髮夾結構相比miRNA的改進的毒性概貌。該安全性改進可能是由於miRNA對內源細胞加工機制的依賴(Boudreau等，(2009a)Mol.Ther.17：169-175)。儘管提出了這些假設，腦中基於miRNA的Htt沉默的精確機制仍未知，然而本文提供的數據證明了Htt的部分減少可至少在HD的小鼠模型中實現治療益處。
由於Htt的功能性角色仍不清楚，存在著與利用賦予非等位基因特異性沉默的治療策略相關的明顯困擾。本文公開的研究指示野生型小鼠以及患病的YAC128小鼠CNS中內源性小鼠Htt的部分降低，直至5個月仍良好耐受。AAV-miRNA-Htt的施用減少了約40%的野生型小鼠和突變的人Htt，因此允許野生型Htt水平至少60%的保持而仍保持沉默突變的毒性Htt的治療益處。未觀察到明顯的毒性或異常行為。目前的數據與之前的研究一致，後者顯示HD小鼠和野生型小鼠中非等位基因特異性Htt沉默治療後多至9個月後毒性的相似缺少(Boudreau等，(2009b)Mol.Ther.17：1053-1063)。野生型Htt的部分抑制的安全性以在非人靈長類動物中進行了報道(McBride等，(2011)Mol.Ther.19：2152-2162；Grondin等，(2012)Brain 135：1197-1209)，提供了正常Htt的部分水平的降低可不會導致顯著的有害後果的信心。該研究進一步證明了YAC128小鼠中突變和野生型Htt兩者的部分抑制(~40%)是治療性的，如通過在多項行為測試中它們表現所證明的，且不與任何明顯的副作用相關。之前的報導已表明Htt在胚胎發育和出生後神經發生中的作用(Bhide等，(1996)J.Neurosci.16：5523-5535；Reiner等，(2003)Mol.Neurobiol. 28：259-276；Cattaneo等，(2005)Nat.Rev.Neurosci.6：919-930)。然而，至今數項臨床前研究證明在成年腦中部分減少野生型Htt水平在小鼠和非人靈長類動物中都表現為良好耐受(Boudreau等，(2009b)Mol.Ther.17：1053-1063；McBride等，(2011)Mol.Ther.19：2152-2162；Grondin等，(2012)Brain 135：1197-1209)。
在小鼠模型和人患者兩者中的HD病理值得注意的特點是突變的Htt免疫反應性(IR)聚集物的存在(DiFiglia等，(1997)Science 277：1990-1993；Scherzinger等，(1997)Cell 90：549-558)。HD中病理生理事件級聯內的聚集物的精確作用一直是爭論的問題(Lansbury等，(2006)Nature 443：774-779)且突變的Htt聚集物和疾病之間的因果關係的表明仍然是爭議性的(Bates,(2003)Lancet 361：1642-1644；Arrasate等，(2004)Nature 431：805-810)。然而，存在共識的是不溶性蛋白聚集物的形成賦予了細胞降解過程增加的負擔(Yamamoto等，(2000)細胞101：57-66)。本文公開的研究證明了YAC128小鼠早在6月齡即顯示廣泛的紋狀體聚集物(早於之前報道)且在7月齡(聚集物形成後)注射AAV2/1-miRNA-Htt顯著減少了紋狀體內EM48-陽性Htt聚集物的數目幾乎至野生型水平。不希望受到理論限制，這些數據表明AAV2/1-miRNA-Htt治療可消除Htt可能的彙集，顯著改善了突變體Htt聚集物的負擔且因此潛在有助於在該小鼠模型中所注意到的功能性改善。
除Htt聚集物的基本上去除，AAV-miRNA-Htt治療還賦予YAC128小鼠中的行為益處。YAC128小鼠在3月齡開始顯示旋轉杆上的缺陷，且在7月齡其顯示嚴重的損傷(Slow等，(2003)Hum.Mol.Genet.12：1555-1567)。用AAV2/1-miRNA-Htt治療的YAC128小鼠在7月齡(當運動協調顯著損傷時)顯示了在旋轉杆上測試的改善，這表明獲得了建立的運動缺陷的逆轉。儘管之前已報道了Htt聚集物的減少(N171和R6/2片段模型)(Rodriguez-Lebron等，(2005)Mol.Ther.12：618-633；Machida等，(2006)Biochem.Biophys.Res. Commun.343：190-197)，本研究證明了聚集物的改善和伴隨的HD的全長小鼠模型中行為的改善。還觀察到了AAV-miRNA-Htt注射入紋狀體後的Porsolt游泳測試中顯著的改善。這是首次報道AAV-RNAi後該抑鬱表型中的改善且不希望受到理論限制，重要的是這些結果表明紋狀體中Htt水平的減少足以改善YAC128模型中顯示的抑鬱表型。最後，當用AAV-miRNA-Htt治療7月齡的YAC128小鼠時(後-症狀性治療)，觀察到了該模型顯示的紋狀體中Htt聚集物的顯著減少和運動協調缺陷的可能的逆轉。不希望受到理論限制，這些數據指示AAV2/1-miRNA-Htt的後-症狀性治療可改善細胞內的mHtt負擔並即使在mHtt聚集物形成後提供了治療益處。
紋狀體Htt的抑制還導致了DARPP-32和D1受體mRNA(YAC128小鼠和人HD患者中隨年齡進行性衰退的2種轉錄物)水平的適度改正。已知突變的Htt參與導致神經功能障礙和轉錄失調的多種細胞過程(Cha,(2000)Trends Neurosci.23：387-392)。
總之，這些研究證明了AAV-介導的RNAi顯著改進了HD的YAC128小鼠模型中的HD-相關的行為異常。此外，其還顯示了靶向Htt的miRNA的AAV-介導的遞送可導致HD的轉基因小鼠模型中Htt水平的持續抑制、細胞和神經病理異常的改正以及運動和行為缺陷的改善而無明顯毒性。
通過修飾shRNA鹼基配對改進RNAi
本研究利用了重組AAV2/1載體以編碼針對嵌入miRNA支架(miR-155)的Htt基因的短髮夾結構。從之前公開的序列mirR2.4(其靶向小鼠和人htt轉錄物的外顯子2)對使用的shRNA序列進行修飾(McBride等，(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：5868-5873)。短髮夾結構RNA的修飾已用於增加穩定性和生物活性、最小化脫靶效應並減少天然免疫響應(Castanotto等，(2009)Nature 457：426-433；Jackson等，(2010)Nature Rev.Drug Disc. 9：57-67)。在本研究中使用的修飾序列包含與miR2.4相同的指導鏈序列(圖9A)；然而，將構建體工程化以在種子序列的3’末端具有額外的腺嘌呤核苷酸(A)，其在指導鏈中不具有相應的胸腺嘧啶核苷酸(T)(圖9B)。不希望受到理論限制，熱動力學模型表明指導鏈上的種子序列對側的非指導鏈中的凸出序列的添加可改進RNAi表現的方面。相應地，發明人還開發了可用于生成新型的轉化的核酸療法的進展以治療多種病症。
實施例7. 脫靶基因沉默的減少
RNA干擾(RNAi)提供用於治療多種人疾病的方式。然而，基於RNAi療法的安全性可由小抑制性RNA(siRNA)與非故意的mRNA結合並減少其表現的能力所阻礙，該作用稱為脫靶基因沉默。脫靶主要在當種子區(小RNA的核苷酸2-8)與非故意的mRNA的3'-UTR中的序列配對並指導翻譯抑制和那些轉錄物的去穩定化時發生。至今，大多治療性RNAi序列主要選擇其基因沉默效力，且後續評估安全性。此處，在設計治療亨廷頓病(HD)(顯性遺傳性神經退行性病症)的siRNA中，生成了在小鼠腦中顯示強沉默及低生物信息學(in silico)脫靶概貌的兩個具有最小脫靶潛在性(即在全部已知的人和恒河猴3'-UTR內具有種子互補物缺乏的那些)的新序列。
表1中顯示是原始的PS170XA miRNA序列和該序列的兩種修飾的低脫靶版本：170XAL1和170XAL2。PS170XA的兩種低脫靶版本通過取代來自鹼基2-8的七聚物內的鹼基設計以生成CpG基序(Boudreau等，2012)。在170XAL1(5'-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3')(SEQ ID NO：15)中位置2處的‘A’改變為C，且在170XAL2(5'-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3')(SEQ ID NO：17)中位置6處的‘A’改變為‘G’。使用SiSPOTR算法(針對特異性的siRNA設計算法，其識別具有最小脫靶潛在性和強沉默能力的候選序列)，這些取代導致顯著更低的脫靶評分(Boudreau等，Nucleic Acids Res.2013 Jan；41(1)e9。減少的SiSPOTR評分將預測與原始170XA序列相比具有較低潛在人脫靶數目的新序列。
原始PS170XA miRNA序列是5'-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3'(SEQ ID NO：1)。將如下序列(其包含指導鏈、修飾的mir-155內環(鼠)和過客鏈)克隆入表現載體：5’TAGACAATGATTCACACGGTGTTTTGGCCACTGACTGACACCGTGTGTCATTGTCTAA-3’(SEQ ID NO：19)。額外的‘A’包括在3’末端。指導和過客鏈為粗體，且指導鏈的鹼基11和12在過客鏈中並非反向互補，生成成熟、加工的雙鏈體中的小內部環。位置2處的‘A’改變為170XAL1中的C，且位置6處的‘A’改變為170XAL2中的‘G’，除此之外，170XAL1和170XAL2具有與原始PS170XA相同的結構。結構示於圖10。
測試了AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1和170XAL2在體外人胚腎(HEK293)細胞中介導Htt減少的能力。用 AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1和170XAL2表現質體以及包含非編碼miRNA序列(CTL3)的對照質體轉染HEK293細胞(每處理8個重複)。使用Fugene轉染試劑轉染細胞並在48小時後收集。使用TaqMan®Cells-to-CTTM套組(Ambion)分離總RNA。通過實時定量RT-PCR測量RNA水平(在ABI Prism 7500序列檢測儀(Applied Biosystems)上實施並分析)。表現水平標準化至人PPIA(肽基脯氨醯異構酶)。與CTL3和未處理的對照相比，用170XAL2和170XAL2兩質體轉染後減少了人Htt mRNA水平，然而該減少未達到統計學顯著性(圖11)。
評估了AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1和170XAL2在YAC128小鼠紋狀體中沉默Htt表現的能力。成年YAC128小鼠接受了AAV2/1-miRNA-Htt 170XA(2E10vgs/位點)、AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1(2E10vgs/位點)或AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL2(3E10 vgs/位點)的雙側紋狀體內注射。原始AAV2/1-miRNA-Htt 170XA作為陽性對照而未處理(未注射)的另一組作為陰性對照。注射後一個月，處死動物並用PBS灌注。收集腦部用於組織學和生化分析。對於生化分析，顯微解剖一半球的紋狀體區並在液氮中速凍。突變體人和小鼠Htt mRNA和蛋白的紋狀體水平分別通過QPCR和Western印跡評估。當與未處理的對照動物相比時，突變的人Htt和小鼠Htt mRNA在AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1和AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL2注射的小鼠中顯著減少(圖12A和12B)。對於全部QPCR測定法，PPIA作為標準化對照基因。當與未處理的對照動物相比時，突變的人和小鼠Htt蛋白在全部AAV2/1-miRNA-Htt-注射的小鼠中顯著減少，且在全部治療組中注意到等同的減少程度(約50%，p<0.05)(圖12C和12D)。
通過QPCR評估紋狀體中的GFAP和Iba1 mRNA水平以確定我們的AAV-miRNA-Htt載體注射後這些炎症標記物基因是否上調。GFAP是星形細胞增生的標記物且Iba1作為小膠質細胞活化標記物。我們證明了紋狀體1個月注射中AAV2/1-miRNA-Htt 170XA 的紋狀體內注射導致GFAP mRNA(圖13A)和Iba1 mRNA(圖13B)的顯著增加。AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1或AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL2注射後觀察到GFAP或Iba1不增加且GFAP和Iba1 mRNA水平與未處理的對照的等同。人PPIA作為標準化對照基因。值作為平均值±SEM給出。*與未治療的對照小鼠顯著不同，p<0.05；ANOVA隨後為Tukey的後-hoc檢驗。
注射後1個月來自用AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1或AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL2治療的YAC128小鼠的紋狀體組織切片的GFAP和Iba1免疫組化染色證實：GFAP和Iba1蛋白水平在注射後的紋狀體中未升高(圖14)。使用熒光顯微術評估腦中GFAP和Iba1免疫染色的水平。如通過熒光顯微術所見，AAV2/1-miRNA-Htt 170XA的紋狀體內注射未導致GFAP和Iba-1免疫反應性的增加，然而在注射AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL1或AAV2/1-miRNA-Htt 170XAL2後的GFAP或Iba1免疫染色中我們未觀察到任何增加，其中染色水平與未治療的對照腦等同。比例條=50μM。
序列
除非另外表明，全部多肽序列以N-末端至C-末端顯示。除非另外表明，全部核酸序列以5’至3’顯示。
miRNA htt反義鏈
UAGACAAUGAUUCACACGGU(SEQ ID NO：1)
miRNA過客鏈補體
ACCGUGUGUCAUUGUCUAA(SEQ ID NO：2)
有義靶序列
ACCGUGUGAAUCAUUGUCUAA(SEQ ID NO：3)
miRNA htt反義鏈DNA序列
TAGACAATGATTCACACGGT(SEQ ID NO：4)
miRNA過客鏈補體
ACCGTGTGTCATTGTCTAA(SEQ ID NO：5)
有義靶序列
ACCGTGTGAATCATTGTCUTAA(SEQ ID NO：6)
3A170 RNA序列
(SEQ ID NO：7)
3A170 DNA序列
(SEQ ID NO：8)
人Htt mRNA正向引子
Ctccgtccggtagacatgct(SEQ ID NO：9)
人Htt mRNA反向引子
Ggaaatcagaaccctcaaatgg(SEQ ID NO：10)
人Htt mRNA探針
Tgagcactgttcaactgtgtgtatcggga(SEQ ID NO：11)
scAAV載體的變體AAV ITR
(SEQ ID NO：12).
全長的AAV載體基因組DNA序列
(SEQ ID NO：13)
miRNA支架DNA序列
c(SEQ ID NO：14)
170XAL1指導(反義)
UCGACAAUGAUUCACACGGU(SEQ ID NO：15)
170XAL1非指導
ACCGUGUGUCAUUGUCGAA(SEQ ID NO：16).
170XAL2指導(反義)
UAGACGAUGAUUCACACGGU(SEQ ID NO：17)
170XAL1非指導
ACCGUGUGUCAUCGUCUAA(SEQ ID NO：18)
170XA
(SEQ ID NO：19)
<110> STANEK,Lisa M. PALERMO,Adam RICHARDS,Brenda SARDI,Sergio Pablo O’RIORDAN,Catherine SONG,Antonius
<120> 變體RNAi
<130> 159792010140
<140> 尚未分配
<141> 同時附上
<150> US 62/114,578
<151> 2015-02-10
<160> 26
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 1
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 2
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 3
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 4
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 5
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
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<211> 65
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 7
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<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 8
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
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<211> 4297
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
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<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
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<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
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<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
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<210> 20
<21> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 20
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<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 21
<210> 22
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 22
<210> 23
<211> 66
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 23
<210> 24
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 24
<210> 25
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 25
<210> 26
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 26

Claims (246)

  1. 一種包含第一鏈和第二鏈的RNAi，其中a)所述第一鏈和所述第二鏈形成雙鏈體；b)所述第一鏈包含至少19個鹼基的指導區，其中所述指導區包含含有指導鏈的鹼基1-N的種子區，其中N=7或N=8；且c)所述第二鏈包含至少19個鹼基的非指導區，其中所述非指導區包含雙鏈體中指導區的鹼基1-(N+2)的任何一個或多個對側的凸出序列。
  2. 如請求項1的RNAi，其中N=7且所述凸出是指導區的對側鹼基1、2、3、4、5、6、7、8或9。
  3. 如請求項1的RNAi，其中N=8且所述凸出是指導區的對側鹼基1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。
  4. 如請求項1-3中任一項的RNAi，其中所述凸出是指導區的對側鹼基1或鹼基N+2。
  5. 一種包含第一鏈和第二鏈的RNAi，其中a)所述第一鏈和所述第二鏈形成雙鏈體；b)所述第一鏈包含至少19個鹼基的指導區，其中所述指導區包含含有指導鏈的鹼基1-N的種子區，其中N=7或N=8；且c)所述第二鏈包含至少19個鹼基的非指導區，其中所述非指導區包含雙鏈體中指導區的鹼基1-(N+1)的任何一個或多個對側的凸出序列。
  6. 如請求項5的RNAi，其中N=7且所述凸出是指導區的對側鹼基1、2、3、4、5、6、7或8。
  7. 如請求項5的RNAi，其中N=8且所述凸出是指導區的對側鹼基1、2、3、4、5、6、7、8或9。
  8. 如請求項5-7任一項的RNAi，其中所述凸出是指導區的對側 鹼基1或鹼基N+1。
  9. 一種包含第一鏈和第二鏈的RNAi，其中a)所述第一鏈和所述第二鏈形成雙鏈體；b)所述第一鏈包含至少19個鹼基的指導區，其中所述指導區包含含有指導鏈的鹼基1-N的種子區，其中N=7或N=8；且c)所述第二鏈包含至少19個鹼基的非指導區，其中所述非指導區包含雙鏈體中指導區的鹼基1-N的任何一個或多個對側的凸出序列。
  10. 如請求項9的RNAi，其中N=7且所述凸出是指導區的對側鹼基1、2、3、4、5、6或7。
  11. 如請求項9的RNAi，其中N=8且所述凸出是指導區的對側鹼基1、2、3、4、5、6、7或8。
  12. 如請求項9-11中任一項的RNAi，其中所述凸出是指導區的對側鹼基1或鹼基N。
  13. 如請求項1-12中任一項的RNAi，其中所述凸出是指導區的對側鹼基1。
  14. 如請求項1-13中任一項的RNAi，其中所述凸出通過指導區上缺乏互補鹼基的雙鏈體中非指導鏈的一個或多個鹼基形成，其中所述凸出側翼為與所述指導鏈進行鹼基配對的鹼基。
  15. 如請求項1-14中任一項的RNAi，其中所述凸出包含1-10個核苷酸。
  16. 如請求項1-15中任一項的RNAi，其中所述凸出包含1-3個核苷酸。
  17. 如請求項1-16中任一項的RNAi，其中所述RNAi包含第二凸出，其中所述第二凸出位於定位在種子區3’的指導區中的第一鏈上。
  18. 如請求項1-17中任一項的RNAi，其中所述雙鏈體長度為19-25 或19-23個鹼基對。
  19. 如請求項1-18中任一項的RNAi，其中所述第一和/或第二鏈進一步包含3’懸垂區、5’懸垂區或3'和5’懸垂區兩者。
  20. 如請求項1-19中任一項的RNAi，其中所述第一鏈和所述第二鏈通過能夠形成環結構的RNA接頭連接。
  21. 如請求項20的RNAi，其中所述RNA接頭包含4-50個核苷酸。
  22. 如請求項20或21的RNAi，其中所述環結構包含4-20個核苷酸。
  23. 如請求項20-22中任一項的RNAi，其中所述RNAi以5’-3’包含所述第二鏈、所述RNA接頭和所述第一鏈。
  24. 如請求項20-22中任一項的RNAi，其中所述RNAi以5’-3’包含所述第一鏈、所述RNA接頭和所述第二鏈。
  25. 如請求項1-24中任一項的RNAi，其中改進所述序列以減少脫靶基因沉默。
  26. 如請求項1-25中任一項的RNAi，其中所述序列包含一個或多個CpG基序。
  27. 如請求項1-26中任一項的RNAi，其中所述序列在種子區包含一個或多個CpG基序。
  28. 如請求項1-27中任一項的RNAi，其中所述RNAi是小抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或小髮夾RNA(shRNA)。
  29. 如請求項1-28中任一項的RNAi，其中所述RNAi靶向編碼與病症相關的多肽的RNA。
  30. 如請求項29的RNAi，其中所述病症是CNS病症。
  31. 如請求項29或30的RNAi，其中所述病症是溶酶體貯積症(LSD)、亨廷頓病(Huntington’s disease)、癲癇、帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿爾茨海默氏病(Alzheimer's disease)、中風、皮質基底節變性(CBD)、皮質基底神經節變性(CBGD)、額顳葉癡呆(FTD)、多系統萎縮(MSA)、進行性核上性麻痹(PSP) 或腦癌。
  32. 如請求項29-31中任一項的RNAi，其中所述病症是亨廷頓病。
  33. 如請求項32的RNAi，其中所述多肽是亨廷頓蛋白。
  34. 如請求項33的RNAi，其中所述亨廷頓蛋白包含與亨廷頓病相關的突變。
  35. 如請求項32-34中任一項的RNAi，其中所述指導區包含序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：1)且所述非指導區包含序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO：2)。
  36. 如請求項32-34中任一項的RNAi，其中所述指導區包含序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：15)且所述非指導區包含序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO：16)。
  37. 如請求項32-34中任一項的RNAi，其中所述指導區包含序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：17)且所述非指導區包含序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO：18)。
  38. 一種減少RNAi毒性的方法，其包括導入RNAi非指導區中的凸出以生成如請求項1-37中任一項的RNAi。
  39. 一種表現構建體，其包含編碼如請求項1-38中任一項的RNAi的核酸。
  40. 如請求項39的表現構建體，其中編碼所述RNAi的核酸包含miRNA支架。
  41. 如請求項39或40的表現構建體，其中編碼所述RNAi的核酸與啟動子可操作地連接。
  42. 如請求項41的表現構建體，其中所述啟動子選自下組：巨細胞病毒(CMV)即刻早期啟動子、RSV LTR、MOMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動子、猿猴病毒40(SV40)啟動子、 CK6啟動子、轉甲狀腺素啟動子(TTR)、TK啟動子、四環素反應性啟動子(TRE)、HBV啟動子、hAAT啟動子、LSP啟動子、嵌合肝臟特異性啟動子(LSP)、E2F啟動子、端粒酶(hTERT)啟動子；巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白/兔β-球蛋白啟動子(CAG)啟動子、延伸因子1-α啟動子(EFl-α)啟動子、人β-葡糖醛酸糖苷酶啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、逆轉錄病毒勞斯(Rous)肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子和13-肌動蛋白啟動子。
  43. 如請求項39-42中任一項的表現構建體，其中所述表現構建體進一步包含多聚腺苷酸化信號。
  44. 如請求項43的表現構建體，其中所述多聚腺苷酸化信號是牛生長激素多聚腺苷酸化信號、SV40多聚腺苷酸化信號或HSV TK pA。
  45. 一種載體，其包含如請求項39-44中任一項的表現構建體。
  46. 如請求項45的載體，其中所述載體是重組腺相關病毒(rAAV)載體、重組腺病毒載體、重組慢病毒載體或重組單純皰疹病毒(HSV)載體。
  47. 如請求項46的載體，其中所述載體是重組腺病毒載體。
  48. 如請求項47的載體，其中所述重組腺病毒載體源自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或豬Ad 3型。
  49. 如請求項47的載體，其中所述重組腺病毒載體源自腺病毒血清型2或腺病毒血清型5的變體。
  50. 如請求項46的載體，其中所述載體是重組慢病毒載體。
  51. 如請求項50的載體，其中所述重組慢病毒載體源自具有水泡性口膜炎病毒的慢病毒假型(lentivirus pseudotyped with vesicular stomatitis virus(VSV))、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus)(LCMV)、羅斯河病毒(Ross river virus)(RRV)、埃博拉病毒(Ebola virus)、馬爾堡病毒(Marburg virus)、莫卡拉病毒(Mokala virus)、狂犬病毒(Rabies virus)、RD114或其中的變體。
  52. 如請求項46的載體，其中所述載體是rHSV載體。
  53. 如請求項52的載體，其中所述rHSV載體源自rHSV-1或rHSV-2。
  54. 如請求項46的載體，其中所述載體是rAAV載體。
  55. 如請求項54的rAAV載體，其中所述表現構建體側翼為一個或多個AAV反向末端重複(ITR)序列。
  56. 如請求項55的rAAV載體，其中所述表現構建體側翼為兩個AAV ITR。
  57. 如請求項55或56的rAAV載體，其中所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。
  58. 如請求項55-57中任一項的rAAV載體，其中所述AAV ITR是AAV2 ITR。
  59. 如請求項54-58中任一項的rAAV載體，其中所述載體進一步包含填充核酸。
  60. 如請求項59的rAAV載體，其中所述填充核酸位於啟動子和編碼RNAi的核酸之間。
  61. 如請求項54-60中任一項的rAAV載體，其中所述載體是自身互補的rAAV載體。
  62. 如請求項61的rAAV載體，其中所述載體包含編碼所述RNAi的第一核酸序列和編碼所述RNAi的互補物的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可與第二核酸序列沿其長度的大部分或全部形成鏈內鹼基對。
  63. 如請求項62的rAAV載體，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列通過突變的AAV ITR連接，其中所述突變的AAV ITR包含D區的缺失並包含末端解析序列的突變。
  64. 一種細胞，其包含如請求項45-53中任一項的載體或如請求項54-63中任一項的rAAV載體。
  65. 一種包含如請求項45的載體的病毒顆粒，其中所述病毒顆粒是衣殼化所述rAAV載體的AAV顆粒、衣殼化所述重組腺病毒載體的腺病毒顆粒、衣殼化所述重組慢病毒載體的慢病毒顆粒或衣殼化所述重組HSV載體的HSV顆粒。
  66. 如請求項65的病毒顆粒，其中所述病毒顆粒是衣殼化所述重組腺病毒載體的腺病毒顆粒。
  67. 如請求項66的病毒顆粒，其中所述腺病毒顆粒包含來自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或豬Ad 3型的衣殼。
  68. 如請求項66的病毒顆粒，其中所述腺病毒顆粒包含腺病毒血清型2衣殼或腺病毒血清型5衣殼的變體。
  69. 如請求項66的病毒顆粒，其中所述病毒顆粒是衣殼化所述重組慢病毒載體的慢病毒顆粒。
  70. 如請求項69的病毒顆粒，其中所述慢病毒顆粒包含具有如下病毒假型的衣殼：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴細胞性脈絡 叢腦膜炎病毒(LCMV)、羅斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病毒、RD114或其中的變體。
  71. 如請求項66的病毒顆粒，其中所述病毒顆粒是HSV顆粒。
  72. 如請求項71的病毒顆粒，其中所述HSV顆粒是rHSV-1顆粒或rHSV-2顆粒。
  73. 一種重組AAV顆粒，其包含如請求項54-63任一項的rAAV載體。
  74. 如請求項73的rAAV顆粒，其中所述AAV病毒顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合體、牛AAV或小鼠AAV衣殼rAAV2/HBoV1血清型衣殼。
  75. 如請求項73或74的AAV顆粒，其中所述rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼源自相同的AAV血清型。
  76. 如請求項73或74的AAV顆粒，其中所述rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼源自不同的AAV血清型。
  77. 如請求項76的rAAV顆粒，其中所述ITR源自AAV2且所述rAAV顆粒的衣殼源自AAV1。
  78. 一種組合物，其包含如請求項65-72中任一項的病毒顆粒或如請求項73-77中任一項的rAAV顆粒。
  79. 如請求項78的組合物，其中所述組合物進一步包含藥學上可接受的載劑。
  80. 一種用於抑制或減少哺乳動物疾病中多肽表現的方法，其包括將如請求項1-37中任一項的RNAi、如請求項39-44中任一項的表現構建體、如請求項45-54中任一項的載體、如請求項55-63中任一項的rAAV載體、如請求項65-72中任一項的病 毒顆粒、如請求項73-77中任一項的rAAV顆粒或如請求項78或79的組合物施用至所述哺乳動物，其中所述RNAi靶向編碼所述多肽的RNA。
  81. 一種用於抑制哺乳動物細胞中多肽累積的方法，其包括將如請求項1-37中任一項的RNAi、如請求項39-44中任一項的表現構建體、如請求項45-53中任一項的載體、如請求項54-63中任一項的rAAV載體、如請求項65-72中任一項的病毒顆粒、如請求項73-77中任一項的rAAV顆粒或如請求項78或79的組合物施用至所述哺乳動物，其中所述RNAi靶向編碼所述多肽的RNA。
  82. 如請求項80或81的方法，其中所述哺乳動物是人。
  83. 一種如請求項1-37中任一項的RNAi、如請求項39-44中任一項的表現構建體、如請求項45-53中任一項的載體、如請求項54-63中任一項的rAAV載體、如請求項65-72中任一項的病毒顆粒、如請求項73-77中任一項的rAAV顆粒或如請求項78或79的組合物在製造用於如請求項80-82中任一項的方法中的藥物之用途。
  84. 如請求項1-37中任一項的RNAi、如請求項39-44中任一項的表現構建體、如請求項45-53中任一項的載體、如請求項54-63中任一項的rAAV載體、如請求項65-72中任一項的病毒顆粒、如請求項73-77中任一項的rAAV顆粒或如請求項78或79的組合物用於如請求項80-82中任一項的方法中。
  85. 一種用於在哺乳動物中誘導RNA干擾的套組，其包含如請求項1-37中任一項的RNAi、如請求項39-44中任一項的表現構建體、如請求項45-53中任一項的載體、如請求項54-63中任一項的rAAV載體、如請求項65-72中任一項的病毒顆粒、如請求項73-77中任一項的rAAV顆粒或如請求項78或79的組合物。
  86. 如請求項85的套組，其中所述哺乳動物是人。
  87. 一種用於如請求項80-82中任一項的方法中使用的套組，其包含如請求項1-37中任一項的RNAi、如請求項39-44中任一項的表現構建體、如請求項45-53中任一項的載體、如請求項54-63中任一項的rAAV載體、如請求項65-72中任一項的病毒顆粒、如請求項73-77中任一項的rAAV顆粒或如請求項78或79的組合物。
  88. 一種包含第一鏈和第二鏈的RNAi，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：1)的指導區且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO：2)的非指導區，其中所述第一鏈和第二鏈形成雙鏈體，且其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基形成非指導區中的凸出。
  89. 如請求項88的RNAi，其中所述指導區包含與SEQ ID NO：1具有約90%同一性的核酸序列。
  90. 如請求項88的RNAi，其中所述非指導區包含與SEQ ID NO：2具有約90%同一性的核酸序列。
  91. 如請求項88-90中任一項的RNAi，其中改進所述序列以減少脫靶基因沉默。
  92. 如請求項求88-91中任一項的RNAi，其中序列包含一個或多個CpG基序。
  93. 如請求項88-92中任一項的RNAi，其中所述序列在種子區中包含一個或多個CpG基序。
  94. 一種包含第一鏈和第二鏈的RNAi，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：15)的指導區且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO：16)的非指導區，其中所述第一鏈和第二鏈形成雙鏈體且其中在所述第二 鏈殘基18或殘基19處的A殘基在非指導區中形成凸出。
  95. 一種包含第一鏈和第二鏈的RNAi，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：17)的指導區且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO：18)的非指導區，其中所述第一鏈和第二鏈形成雙鏈體且其中在所述第二鏈殘基18或殘基19處的A殘基在非指導區中形成凸出。
  96. 如請求項的RNAi，其中所述指導區包含與SEQ ID NO：15具有約90%同一性的核酸序列且所述非指導區包含與SEQ ID NO：16具有約90%同一性的核酸序列或所述指導區包含與SEQ ID NO：17具有約90%同一性的核酸序列且所述非指導區包含與SEQ ID NO：18具有約90%同一性的核酸序列。
  97. 如請求項88-96中任一項的RNAi，其中在所述指導區殘基11和12處的U殘基在所述指導區中形成凸出。
  98. 如請求項88-97中任一項的RNAi，其中所述雙鏈體長度為19-25或19-23鹼基對。
  99. 如請求項88-98中任一項的RNAi，其中所述第一和/或第二鏈進一步包含3’懸垂區、5’懸垂區或3'和5’懸垂區兩者。
  100. 如請求項88-99中任一項的RNAi，其中所述第一鏈和所述第二鏈通過能夠形成環結構的RNA接頭連接。
  101. 如請求項100的RNAi，其中能夠形成環結構的RNA接頭包含4-50個核苷酸。
  102. 如請求項求100或101的RNAi，其中能夠形成環結構的RNA接頭包含4-20個核苷酸。
  103. 如請求項100-102中任一項的RNAi，其中能夠形成環結構的RNA接頭包含13個核苷酸。
  104. 如請求項88-103中任一項的RNAi，其中所述RNAi包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
  105. 如請求項88-103中任一項的RNAi，其中所述RNAi包含與SEQ ID NO：3的核苷酸序列約90%相同的核苷酸序列。
  106. 如請求項88-94中任一項的RNAi，其中所述RNAi是小抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或小髮夾RNA(shRNA)。
  107. 一種包含編碼如請求項88-106中任一項的RNAi的核酸的表現構建體。
  108. 如請求項107的表現構建體，其中編碼所述RNAi的核酸包含miRNA支架。
  109. 如請求項108的表現構建體，其中編碼所述RNAi的核酸包含miR-155支架。
  110. 如請求項107-109中任一項的表現構建體，其中所述編碼RNAi的核酸與啟動子可操作地連接。
  111. 如請求項110的表現構建體，其中所述啟動子能夠在哺乳動物的腦中表現所述RNAi。
  112. 如請求項110或111的表現構建體，其中所述啟動子選自下組：巨細胞病毒(CMV)即刻早期啟動子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動子、猿猴病毒40(SV40)啟動子、CK6啟動子、轉甲狀腺素啟動子(TTR)、TK啟動子、四環素反應性啟動子(TRE)、HBV啟動子、hAAT啟動子、LSP啟動子、嵌合肝臟特異性啟動子(LSP)、E2F啟動子、端粒酶(hTERT)啟動子；巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白/兔β-球蛋白啟動子(CAG)啟動子、延伸因子1-α啟動子(EFl-α)啟動子、人β-葡糖醛酸糖苷酶啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、逆轉錄病毒勞斯肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子和13-肌動蛋白啟動子。
  113. 如請求項110-112中任一項的表現構建體，其中所述啟動子是雜合雞β-肌動蛋白啟動子。
  114. 如請求項110-113中任一項的表現構建體，其中所述表現構建 體進一步包含多聚腺苷酸化信號。
  115. 如請求項114的表現構建體，其中所述多聚腺苷酸化信號是牛生長激素多聚腺苷酸化信號。
  116. 一種包含如請求項107-115中任一項的表現構建體的載體。
  117. 如請求項116的載體，其中所述載體是重組腺相關病毒(rAAV)載體、重組腺病毒載體、重組慢病毒載體或重組單純皰疹病毒(HSV)載體。
  118. 如請求項117的載體，其中所述載體是重組腺病毒載體。
  119. 如請求項118的載體，其中所述重組腺病毒載體源自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或豬Ad 3型。
  120. 如請求項119的載體，其中所述重組腺病毒載體源自腺病毒血清型2或腺病毒血清型5的變體。
  121. 如請求項117的載體，其中所述載體是重組慢病毒載體。
  122. 如請求項121的載體，其中所述重組慢病毒載體源自具有如下病毒假型的慢病毒：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、羅斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病毒、RD114或其中的變體。
  123. 如請求項117的載體，其中所述載體是rHSV載體。
  124. 如請求項123的載體，其中所述rHSV載體源自rHSV-1或rHSV-2。
  125. 如請求項117的載體，其中所述載體是重組AAV(rAAV)載體。
  126. 如請求項125的rAAV載體，其中所述表現構建體側翼為一個 或多個AAV反向末端重複(ITR)序列。
  127. 如請求項126的rAAV載體，其中所述表現構建體側翼為兩個AAV ITR。
  128. 如請求項126或127的rAAV載體，其中所述AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。
  129. 如請求項125-128中任一項的rAAV載體，其中所述AAV ITR是AAV2 ITR。
  130. 如請求項129的rAAV載體，其中所述rAAV載體5’-3’包含AAV2 ITR、啟動子、編碼所述RNAi的核酸、多聚腺苷酸化信號和AAV2 ITR。
  131. 如請求項130的rAAV載體，其中所述啟動子是CBA啟動子。
  132. 如請求項130或131的rAAV載體，其中所述多聚腺苷酸化信號是牛生長激素多聚腺苷酸化信號。
  133. 如請求項130-132中任一項的rAAV載體，其中所述rAAV載體5’-3’包含AAV2 ITR、CBA啟動子、編碼所述RNAi的核酸、牛生長激素多聚腺苷酸化信號和AAV2 ITR。
  134. 如請求項133的rAAV載體，其中所述載體進一步包含填充核酸。
  135. 如請求項133的rAAV載體，其中所述填充核酸包含編碼綠色熒光蛋白(GFP)的核酸。
  136. 如請求項134或135的rAAV載體，其中所述填充核酸位於所述啟動子和編碼所述RNAi的核酸之間。
  137. 如請求項125-136中任一項的rAAV載體，其中所述RNAi包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
  138. 如請求項125-136中任一項的rAAV載體，其中所述RNAi包 含與SEQ ID NO：3的核苷酸序列約90%相同的核苷酸序列。
  139. 如請求項125-138中任一項的rAAV載體，其中所述載體是自身互補的載體。
  140. 如請求項139的rAAV載體，其中所述載體包含編碼所述RNAi的第一核酸序列和編碼所述RNAi的互補物的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可與所述第二核酸序列沿其長度的大部分或全部形成鏈內鹼基對。
  141. 如請求項140的rAAV載體，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通過突變的AAV ITR連接，其中所述突變的AAV ITR包含D區的缺失並包含末端解析序列的突變。
  142. 一種細胞，其包含如請求項116-124中任一項的載體或如請求項125-141任一項的rAAV載體。
  143. 如請求項142的細胞，其中所述細胞是中樞神經系統(CNS)細胞。
  144. 一種包含如請求項116的載體的病毒顆粒，其中所述病毒顆粒是衣殼化rAAV載體的AAV顆粒、衣殼化所述重組腺病毒載體的腺病毒顆粒、衣殼化所述重組慢病毒載體的慢病毒顆粒或衣殼化所述重組HSV載體的HSV顆粒。
  145. 如請求項144的病毒顆粒，其中所述病毒顆粒是衣殼化所述重組腺病毒載體的腺病毒顆粒。
  146. 如請求項145的病毒顆粒，其中所述腺病毒顆粒包含來自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或豬Ad 3型的衣殼。
  147. 如請求項146的病毒顆粒，其中所述腺病毒顆粒包含腺病毒血 清型2衣殼或腺病毒血清型5衣殼的變體。
  148. 如請求項144的病毒顆粒，其中所述病毒顆粒是衣殼化所述重組慢病毒載體的慢病毒顆粒。
  149. 如請求項148的病毒顆粒，其中所述慢病毒顆粒包含具有如下病毒假型的衣殼：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、羅斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病毒、RD114或其中的變體。
  150. 如請求項144的病毒顆粒，其中所述病毒顆粒是HSV顆粒。
  151. 如請求項150的病毒顆粒，其中所述HSV顆粒是rHSV-1顆粒或rHSV-2顆粒。
  152. 一種包含如請求項125-141任一項的rAAV載體的重組AAV顆粒。
  153. 如請求項141的rAAV顆粒，其中所述AAV病毒顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV2 V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣殼。
  154. 如請求項152或153的rAAV顆粒，其中所述rAAV病毒顆粒的衣殼和ITR源自相同的AAV血清型。
  155. 如請求項152或153的rAAV顆粒，其中所述rAAV病毒顆粒的衣殼和ITR源自不同的AAV血清型。
  156. 如請求項152-155任一項的rAAV顆粒，其中所述rAAV病毒顆粒包含AAV2衣殼。
  157. 如請求項156的rAAV顆粒，其中所述rAAV病毒顆粒包含AAV1衣殼，且其中所述載體包含AAV2 ITR。
  158. 一種組合物，其包含如請求項144-151任一項的病毒顆粒和如 請求項152-157任一項的rAAV顆粒。
  159. 如請求項158的組合物，其進一步包含藥學上可接受的載劑。
  160. 一種用於治療哺乳動物中亨廷頓病的方法，其包括將如請求項158或159的組合物施用至所述哺乳動物。
  161. 一種用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物中htt表現的方法，其包括將如請求項158或159的組合物施用至所述哺乳動物。
  162. 一種用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物的細胞中htt累積的方法，其包括將如請求項158或159的組合物施用至所述哺乳動物。
  163. 一種用於治療哺乳動物中亨廷頓病的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：1)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO：2)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。
  164. 一種用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物中htt表現的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：1)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO：2)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。
  165. 一種用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物的細胞中htt累積的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：1)的第一 核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCUAA-3’(SEQ ID NO：2)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。
  166. 如請求項163-165中任一項的方法，其中所述第一鏈包含與SEQ ID NO：1具有約90%同一性的核酸序列。
  167. 如請求項163-165中任一項的方法，其中所述第二鏈包含與SEQ ID NO：2具有約90%同一性的核酸序列。
  168. 如請求項163-167中任一項的方法，其中改進所述核酸以減少脫靶基因沉默。
  169. 如請求項163-168中任一項的方法，其中所述核酸包含一個或多個CpG基序。
  170. 如請求項163-169中任一項的方法，其中所述核酸在種子區中包含一個或多個CpG基序。
  171. 一種用於治療哺乳動物中亨廷頓病的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：15)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO：16)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。
  172. 一種用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物中htt表現的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：15)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO：16)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不 與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。
  173. 一種用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物的細胞中htt累積的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UCGACAAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：15)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUUGUCGAA-3’(SEQ ID NO：16)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。
  174. 如請求項171-173中任一項的方法，其中所述第一鏈包含與SEQ ID NO：15具有約90%同一性的核酸序列但保持所述CpG基序。
  175. 如請求項171-174中任一項的方法，其中所述第二鏈包含與SEQ ID NO：16具有約90%同一性的核酸序列但保持所述CpG基序。
  176. 一種用於治療哺乳動物中亨廷頓病的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：17)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO：18)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。
  177. 一種用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物中htt表現的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：17)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO：18)的第二 核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。
  178. 一種用於抑制具有亨廷頓病的哺乳動物的細胞中htt累積的方法，其包括將包含第一鏈和第二鏈的RNAi施用至所述哺乳動物，其中所述第一鏈包含含有序列5’-UAGACGAUGAUUCACACGGU-3’(SEQ ID NO：17)的第一核酸且所述第二鏈包含含有序列5’-ACCGUGUGUCAUCGUCUAA-3’(SEQ ID NO：18)的第二核酸，其中在所述第二鏈的殘基18或殘基19處的A殘基不與所述第一鏈中的殘基形成鹼基對。
  179. 如請求項176-178中任一項的方法，其中所述第一鏈包含與SEQ ID NO：17具有約90%同一性的核酸序列但保持所述CpG基序。
  180. 如請求項176-179中任一項的方法，其中所述第二鏈包含與SEQ ID NO：18具有約90%同一性的核酸序列但保持所述CpG基序。
  181. 如請求項163-180中任一項的方法，其中在所述第一核酸殘基11和12處的U殘基不與所述第二鏈中的殘基形成鹼基對。
  182. 如請求項163-181中任一項的方法，其中所述雙鏈體長度為18-25鹼基對。
  183. 如請求項163-182中任一項的方法，其中所述第一和/或第二鏈進一步包含3’懸垂區、5’懸垂區或3'和5’懸垂區兩者。
  184. 如請求項163-183中任一項的方法，其中所述第一鏈和所述第二鏈通過能夠形成環結構的RNA連接。
  185. 如請求項163-184中任一項的方法，其中能夠形成環結構的RNA包含4-50核苷酸或4-20核苷酸。
  186. 如請求項163-185中任一項的方法，其中能夠形成環結構的RNA包含13個核苷酸。
  187. 如請求項163-186中任一項的方法，其中所述RNAi包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
  188. 如請求項163-187中任一項的方法，其中所述RNAi包含與SEQ ID NO：3的核苷酸序列約90%相同的核苷酸序列。
  189. 如請求項163-188中任一項的方法，其中所述RNAi的第一鏈在所述第二鏈的5’。
  190. 如請求項163-189中任一項的方法，其中所述RNAi的第二鏈在所述第一鏈的5’。
  191. 如請求項163-166中任一項的方法，其中所述RNAi在表現構建體上編碼。
  192. 如請求項163-191中任一項的方法，其中編碼所述RNAi的核酸包含miRNA支架。
  193. 如請求項192的方法，其中所述miRNA支架是miR-155支架。
  194. 如請求項163-193中任一項的方法，其中編碼所述RNAi的核酸與啟動子可操作地連接。
  195. 如請求項194的方法，其中所述啟動子能夠在哺乳動物的腦中表現所述RNAi。
  196. 如請求項195的方法，其中所述啟動子選自下組：巨細胞病毒(CMV)即刻早期啟動子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動子、猿猴病毒40(SV40)啟動子、CK6啟動子、轉甲狀腺素啟動子(TTR)、TK啟動子、四環素反應性啟動子(TRE)、HBV啟動子、hAAT啟動子、LSP啟動子、嵌合肝臟特異性啟動子(LSP)、E2F啟動子、端粒酶(hTERT)啟動子；巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白/兔β-球蛋白(CAG)啟動子、延伸因子1-α啟動子(EFl-α)啟動子和人β-葡糖醛酸糖苷酶啟動子。
  197. 如請求項194-196中任一項的方法，其中所述啟動子是雜合雞β-肌動蛋白啟動子。
  198. 如請求項167-173中任一項的方法，其中所述表現構建體進一步包含多聚腺苷酸化信號。
  199. 如請求項174的方法，其中所述多聚腺苷酸化信號是牛生長激素多聚腺苷酸化信號。
  200. 如請求項191-199中任一項的方法，其中所述表現構建體通過載體編碼。
  201. 如請求項200的方法，其中所述載體是重組腺相關病毒(rAAV)載體、重組腺病毒載體、重組慢病毒載體或重組單純皰疹病毒(HSV)載體。
  202. 如請求項201的方法，其中所述載體是重組腺病毒載體。
  203. 如請求項202的方法，其中所述重組腺病毒載體源自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或豬Ad 3型。
  204. 如請求項203的方法，其中所述重組腺病毒載體源自腺病毒血清型2或腺病毒血清型5的變體。
  205. 如請求項201的方法，其中所述載體是重組慢病毒載體。
  206. 如請求項205的方法，其中所述重組慢病毒載體源自具有如下病毒假型的慢病毒：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、羅斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病毒、RD114或其中的變體。
  207. 如請求項201的方法，其中所述載體是rHSV載體。
  208. 如請求項207的方法，其中所述rHSV載體源自rHSV-1或rHSV-2。
  209. 如請求項201的方法，其中所述載體是重組AAV(rAAV)載 體。
  210. 如請求項209的方法，其中所述表現構建體側翼為一個或多個AAV反向末端重複(ITR)序列。
  211. 如請求項210的方法，其中所述表現構建體側翼為兩個AAV ITR。
  212. 如請求項210或211的方法，其中所述AAV ITR為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。
  213. 如請求項210-212中任一項的方法，其中所述AAV ITR為AAV2 ITR。
  214. 如請求項213的方法，其中所述rAAV載體5’-3’包含AAV2 ITR、啟動子、編碼所述RNAi的核酸、多聚腺苷酸化信號和AAV2 ITR。
  215. 如請求項214的方法，其中所述啟動子是CBA啟動子。
  216. 如請求項214或215的方法，其中所述多聚腺苷酸化信號是牛生長激素多聚腺苷酸化信號。
  217. 如請求項213的方法，其中所述rAAV載體5’-3’包含AAV2 ITR、CBA啟動子、編碼所述RNAi的核酸、牛生長激素多聚腺苷酸化信號和AAV2 ITR。
  218. 如請求項217的方法，其中所述載體進一步包含填充核酸。
  219. 如請求項218的方法，其中所述填充核酸包含編碼綠色熒光蛋白(GFP)的核酸。
  220. 如請求項218或219的方法，其中所述填充核酸位於啟動子和編碼所述RNAi的核酸之間。
  221. 如請求項214-220中任一項的方法，其中所述RNAi包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
  222. 如請求項214-220中任一項的方法，其中所述RNAi包含與SEQ ID NO：3的核苷酸序列約90%相同的核苷酸序列。
  223. 如請求項209-222中任一項的方法，其中所述載體是自身互補的載體。
  224. 如請求項223的方法，其中所述載體包含編碼所述RNAi的第一核酸序列和編碼所述RNAi的互補物的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可與所述第二核酸序列沿其長度的大部分或全部形成鏈內鹼基對。
  225. 如請求項224的方法，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通過突變的AAV ITR連接，其中所述突變的AAV ITR包含D區的缺失並包含末端解析序列的突變。
  226. 如請求項200或201的方法，其中所述載體在rAAV顆粒中衣殼化、所述重組腺病毒載體在腺病毒顆粒中衣殼化、所述重組慢病毒載體在慢病毒顆粒中衣殼化或所述重組HSV載體在HSV中衣殼化。
  227. 如請求項226的方法，其中所述病毒顆粒是衣殼化所述重組腺病毒載體的腺病毒顆粒。
  228. 如請求項227的方法，其中所述腺病毒顆粒包含來自腺病毒血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24-30、37、40、41、AdHu2、AdHu 3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、牛Ad 3型、犬Ad 2型、羊Ad或豬Ad 3型的衣殼。
  229. 如請求項228的方法，其中所述腺病毒顆粒包含腺病毒血清型2衣殼或腺病毒血清型5衣殼的變體。
  230. 如請求項226的方法，其中所述病毒顆粒是衣殼化所述重組慢病毒載體的慢病毒顆粒。
  231. 如請求項230的方法，其中所述慢病毒顆粒包含具有如下病毒假型的衣殼：水泡性口膜炎病毒(VSV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、羅斯河病毒(RRV)、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、莫卡拉病毒、狂犬病毒、RD114或其中的變體。
  232. 如請求項226的方法，其中所述病毒顆粒是HSV顆粒。
  233. 如請求項232的方法，其中所述HSV顆粒是rHSV-1顆粒或rHSV-2顆粒。
  234. 如請求項209-225中任一項的方法，其中所述rAAV載體在重組AAV顆粒中衣殼化。
  235. 如請求項234的方法，其中所述AAV病毒顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV2 V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合體、牛AAV、小鼠AAV或rAAV2/HBoV1血清型衣殼。
  236. 如請求項234或235的方法，其中所述rAAV病毒顆粒的衣殼和ITR源自相同的AAV血清型。
  237. 如請求項234或235的方法，其中所述rAAV病毒顆粒的衣殼和ITR源自不同的AAV血清型。
  238. 如請求項234-235中任一項的方法，其中所述rAAV病毒顆粒包含AAV2衣殼。
  239. 如請求項237的方法，其中所述rAAV病毒顆粒包含AAV1衣殼且其中所述載體包含AAV2 ITR。
  240. 如請求項226-239任一項的方法，其中如請求項226-233任一項的病毒顆粒或如請求項234-239任一項的rAAV顆粒在組合物中。
  241. 如請求項240的方法，其中所述組合物進一步包含藥學上可接受的載劑。
  242. 一種如請求項86-106中任一項的RNAi、如請求項96-104中任一項的表現構建體、如請求項116-124中任一項的載體、如請求項125-141中任一項的rAAV載體、如請求項144-151中任一項的病毒顆粒、如請求項152-157中任一項的rAAV顆粒或如請求項158或159的組合物在製造用於如請求項160-241中任一項的方法中的藥物的用途。
  243. 如請求項86-106中任一項的RNAi、如請求項107-115中任一項的表現構建體、如請求項116-124中任一項的載體、如請求項125-141中任一項的rAAV載體、如請求項144-151中任一項的病毒顆粒、如請求項152-157中任一項的rAAV顆粒或如請求項158或159的組合物，其用於如請求項160-241中任一項的方法。
  244. 一種用於在具有亨廷頓病的哺乳動物中誘導RNA干擾的套組，其包含如請求項86-106中任一項的RNAi、如請求項107-115中任一項的表現構建體、如請求項116-124中任一項的載體、如請求項125-141中任一項的rAAV載體、如請求項144-151中任一項的病毒顆粒、如請求項152-157中任一項的rAAV顆粒或如請求項158或159的組合物。
  245. 如請求項244的套組，其中所述哺乳動物是人。
  246. 一種用於如請求項160-241中任一項的方法中、製造如請求項160-241中任一項的方法中使用的藥物的套組，其包含如請求項86-106中任一項的RNAi、如請求項107-115中任一項的表現構建體、如請求項116-124中任一項的載體、如請求項125-141中任一項的rAAV載體、如請求項144-151中任一項的病毒顆粒、如請求項152-157中任一項的rAAV顆粒或如請求項158或159的組合物。
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Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2744987C (en) 2008-12-02 2018-01-16 Chiralgen, Ltd. Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
BR112012000828A8 (pt) 2009-07-06 2017-10-10 Ontorii Inc Novas pró-drogas de ácido nucleico e métodos de uso das mesmas
US10428019B2 (en) 2010-09-24 2019-10-01 Wave Life Sciences Ltd. Chiral auxiliaries
RU2014105311A (ru) 2011-07-19 2015-08-27 Уэйв Лайф Сайенсес Пте. Лтд. Способы синтеза функционализованных нуклеиновых кислот
JP6268157B2 (ja) 2012-07-13 2018-01-24 株式会社Ｗａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｊａｐａｎ 不斉補助基
SG10201912895PA (en) 2012-07-13 2020-02-27 Wave Life Sciences Ltd Chiral control
MX356830B (es) 2012-07-13 2018-06-15 Shin Nippon Biomedical Laboratories Ltd Adyuvante de acido nucleico quiral.
WO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
JPWO2015108046A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗アレルギー作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗アレルギー剤
JPWO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
KR102423317B1 (ko) 2014-01-16 2022-07-22 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 디자인
AU2015346162B2 (en) 2014-11-14 2022-02-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
AU2016219396B2 (en) 2015-02-10 2022-03-17 Genzyme Corporation Variant RNAi
MA43072A (fr) 2015-07-22 2018-05-30 Wave Life Sciences Ltd Compositions d'oligonucléotides et procédés associés
EP3366774A4 (en) * 2015-10-23 2019-03-27 Rena Therapeutics Inc. NUCLEIC ACID COMPLEX WITH AT LEAST ONE WOOD STRUCTURE
MA45270A (fr) 2016-05-04 2017-11-09 Wave Life Sciences Ltd Compositions d'oligonucléotides et procédés associés
RU2764587C2 (ru) 2016-05-18 2022-01-18 Вояджер Терапьютикс, Инк. Способы и композиции для лечения хореи гентингтона
SG11201809699XA (en) 2016-05-18 2018-12-28 Voyager Therapeutics Inc Modulatory polynucleotides
SG11201909868YA (en) 2017-05-05 2019-11-28 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods of treating huntington's disease
KR20200056428A (ko) * 2017-09-22 2020-05-22 젠자임 코포레이션 변이체 RNAi
US10870855B2 (en) * 2017-12-06 2020-12-22 Ovid Therapeutics Inc. Use of MIR101 or MIR128 in the treatment of seizure disorders
SG11202011296VA (en) 2018-05-15 2020-12-30 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods for the treatment of parkinson's disease
US20210355454A1 (en) 2018-07-24 2021-11-18 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing gene therapy formulations
EP3830265A1 (en) * 2018-08-03 2021-06-09 Genzyme Corporation Variant rnai against alpha-synuclein
MX2021008331A (es) * 2019-01-09 2021-08-05 Univ De Coimbra Arn bicatenario y usos del mismo.
EP3983077A4 (en) * 2019-06-17 2023-12-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. DELIVERY OF OLIGONUCLEOTIDES TO THE STRIATUM
CA3176204A1 (en) * 2020-04-20 2021-10-28 Anastasia Khvorova Oligonucleotides for msh3 modulation

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998010088A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing t7 polymerase
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
US6995006B2 (en) 1997-09-05 2006-02-07 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
AU781958C (en) 1999-08-09 2006-03-30 Targeted Genetics Corporation Enhancement of expression of a single-stranded, heterologous nucleotide sequence from recombinant viral vectors by designing the sequence such that it forms intrastrand base pairs
ES2256265T3 (es) 2000-06-01 2006-07-16 University Of North Carolina At Chapel Hill Vectores de parvovirus duplicados.
US6723551B2 (en) 2001-11-09 2004-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
NZ532635A (en) 2001-11-13 2007-05-31 Univ Pennsylvania A method of identifying unknown adeno-associated virus (AAV) sequences and a kit for the method
US20080274989A1 (en) * 2002-08-05 2008-11-06 University Of Iowa Research Foundation Rna Interference Suppression of Neurodegenerative Diseases and Methods of Use Thereof
CA2500224C (en) * 2002-09-25 2015-04-28 University Of Massachusetts In vivo gene silencing by chemically modified and stable sirna
US7589189B2 (en) * 2003-05-14 2009-09-15 Japan Science And Technology Agency Inhibition of the expression of huntingtin gene
WO2006119432A2 (en) 2005-04-29 2006-11-09 The Government Of The U.S.A., As Rep. By The Sec., Dept. Of Health & Human Services Isolation, cloning and characterization of new adeno-associated virus (aav) serotypes
US7902352B2 (en) 2005-05-06 2011-03-08 Medtronic, Inc. Isolated nucleic acid duplex for reducing huntington gene expression
WO2007120542A2 (en) 2006-03-30 2007-10-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Aav capsid library and aav capsid proteins
US20090036395A1 (en) 2007-04-26 2009-02-05 Davidson Beverly L Rna interference suppression of neurodegenerative diseases and methods of use thereof
DK2164967T3 (en) * 2007-05-31 2015-10-19 Univ Iowa Res Found Reduction of off-target rna interferenstoksicitet
JP2011517339A (ja) * 2008-02-04 2011-06-02 ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップ 神経変性疾患の治療に有用な分子標的及び化合物並びにこれらの同定方法
WO2009100502A1 (en) * 2008-02-14 2009-08-20 Monash University Immunostimulatory sirna molecules
FR2929292A1 (fr) 2008-03-28 2009-10-02 Exonhit Therapeutics S A Sa Procede et methodes de diagnostic de la maladie d'alzheimer
US8796238B2 (en) * 2009-09-17 2014-08-05 Sigma-Aldrich Co. Llc Short RNA mimetics
DK2826860T3 (en) 2010-04-23 2018-12-03 Univ Massachusetts CNS targeting AAV vectors and methods for their use
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
BR112013020734A2 (pt) 2011-02-17 2017-06-13 Univ Pennsylvania composições e métodos para alterar a especificidade do tecido e aprimorar a transferência gênica mediada por aav9
JP6490426B2 (ja) 2012-02-29 2019-03-27 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ハンチントン病を治療するための方法および組成物
US9550989B2 (en) * 2013-10-03 2017-01-24 Washington University Rational design of microRNA-siRNA chimeras for multi-functional target suppression
HRP20231077T1 (hr) 2014-03-21 2023-12-22 Genzyme Corporation Genska terapija za pigmentni retinitis
HUE054768T2 (hu) 2014-05-02 2021-09-28 Genzyme Corp AAV vektorok retina és CNS génterápiára
LT3237618T (lt) 2014-12-24 2019-07-10 Uniqure Ip B.V. Rnri sukeltas hantingtino geno slopinimas
AU2016219396B2 (en) 2015-02-10 2022-03-17 Genzyme Corporation Variant RNAi
KR20200056428A (ko) 2017-09-22 2020-05-22 젠자임 코포레이션 변이체 RNAi

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MX2022013005A (es) 2022-11-09
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