JP2018506304A - バリアントRNAi - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年2月10日付けで出願された米国仮出願第62/114,578号の優先権を主張し、その内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
ASCIIテキストファイルでの以下の提出物の内容は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる:配列リストのコンピューター読み取り可能な形態(CRF)(ファイル名:159792010140SEQLIST.txt、記録された日付:2016年2月4日、サイズ:11KB)。
本明細書で記載または言及される技術および手順は、一般的によく認識され、当業者により従来の手法を使用して一般的に採用されており、このような手法は、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrookら、第4版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、2012);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubelら編、2003);Methods in Enzymologyのシリーズ(Academic Press,Inc.);PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.HamesおよびG.R.Taylor編、1995);Antibodies,A Laboratory Manual(HarlowおよびLane編、1988);Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney、第6版、J.Wiley and Sons、2010);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984);Methods in Molecular Biology、Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編、Academic Press、1998);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.MatherおよびP.E.Roberts、Plenum Press、1998);Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths、およびD.G.Newell編、J.Wiley and Sons、1993〜8);Handbook of Experimental Immunology(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編、1996);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.MillerおよびM.P.Calos編、1987);PCR:The Polymerase Chain Reaction、(Mullisら編、1994);Current Protocols in Immunology(J.E.Coliganら編、1991);Short Protocols in Molecular Biology(Ausubelら編、J.Wiley and Sons、2002);Immunobiology(C.A.Janewayら、2004);Antibodies(P.Finch、1997);Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.編、IRL Press、1988〜1989);Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.ShepherdおよびC.Dean編、Oxford University Press、2000);Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.HarlowおよびD.Lane、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1999);The Antibodies(M.ZanettiおよびJ.D.Capra編、Harwood Academic Publishers、1995);およびCancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVitaら編、J.B.Lippincott Company、2011)に記載の広く利用されている手法である。
「ベクター」は、本明細書で使用される場合、インビトロまたはインビボのいずれかで宿主細胞に送達しようとする核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを指す。
一部の態様において、本発明は、改善されたRNAiを提供する。一部の実施形態において、RNAiは、低分子阻害性RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、または小ヘアピンRNA(shRNA)である。低分子阻害性または干渉RNA(siRNA)は、長さがおよそ19〜25(例えば、19〜23)塩基対の、細胞中でRNAiを誘導する二本鎖RNA分子として当業界で公知である。小ヘアピンRNA(shRNA)は、短いループ(例えば、約4〜11ヌクレオチド)によって連結された二本鎖RNAのおよそ19〜25(例えば、19〜23)塩基対を含む、細胞中でRNAiを誘導するRNA分子として当業界で公知である。
ハンチントン病(HD)は、ハンチンチン遺伝子(HTT)のエクソン1におけるCAGリピートの拡大によって引き起こされる遺伝性神経変性疾患である。結果生じたN末端領域中のポリグルタミン鎖の伸長は、突然変異ハンチンチンタンパク質(mHtt)に毒性の機能獲得をもたらす。mHttの毒性は、不溶性mHttを含有する凝集体の形成、転写調節異常、およびタンパク質ホメオスタシスにおける不安定さに起因する可能性があり、これらは全て、ニューロンの死によって引き起こされる可能性がある(Saudouら(1998)Cell、95:55〜66;Zuccatoら(2003)Nat.Genet.35:76〜83;Schaffarら(2004)Mol.Cell.15:95〜105;Bennら、(2008)J.Neurosci.28:10720〜10733)。HDを有する患者における病理学的所見としては、皮質が薄くなること、および線条体ニューロンの著しい進行性消失が挙げられる(Rosasら、(2002)Neurology 58:695〜701)。疾患の発病は、典型的には、人生の30代から40代の間に起こり、症状としては、舞踏病に似た動き、協調の損失、進行性認知症、および他の精神医学的障害が挙げられる(Vonsattelら、(1985)J.Neuropathol.Exp.Neurol.44:559〜577)。ほとんどの場合、症状は、30歳から40歳の間に、運動技能、認知、および人格の潜行性の崩壊を伴って出現し始める。時間が経つにつれて、これらは、ぎくしゃくしたコントロール不可能な動きおよび筋肉のコントロールの損失、認知症、ならびにうつ病などの精神医学的な疾患、攻撃性、不安、ならびに強迫行動に進む。典型的には、症状発病から10〜15年後に死に至る。HDのケースの10%未満は、より速い疾患の進行を特徴とする疾患の若年発症型を含む。米国人10,000人中およそ1人が、HDを有すると考えられる。
一部の態様において、本発明は、哺乳動物におけるハンチントン病を処置するための方法および組成物であって、本発明の開示の医薬組成物(例えば、本発明の開示のウイルス粒子を含む医薬組成物)を哺乳動物に投与することを含む、方法および組成物を提供する。一部の態様において、本発明は、ハンチントン病を有する哺乳動物におけるhttの発現を阻害するための方法および組成物であって、本発明の開示の医薬組成物(例えば、本発明の開示のウイルス粒子を含む医薬組成物)を哺乳動物に投与することを含む、方法および組成物を提供する。一部の態様において、本発明は、ハンチントン病を有する哺乳動物の細胞におけるhttの蓄積を阻害するための方法および組成物であって、本発明の開示の医薬組成物(例えば、本発明の開示のウイルス粒子を含む医薬組成物)を哺乳動物に投与することを含む、方法および組成物を提供する。
本発明は、本明細書に記載のRNAiの発現のための発現コンストラクト、ベクターおよびウイルス粒子を提供する。
本発明は、とりわけ、本発明の開示のRNAiをコードする核酸を含む組換えウイルス粒子、加えて、哺乳動物における疾患または障害;例えばハンチントン病を処置するためのそれらの使用方法を提供する。
本発明は、本明細書で開示されるRNAiを含むウイルス粒子を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本明細書で開示される本発明のRNAiを送達するためのウイルス粒子を提供する。例えば、本発明は、哺乳動物において疾患または障害を処置するためのRNAiを送達するための、組換えウイルス粒子を使用する方法;例えば、HDを処置するためのRNAiを含むrAAV粒子を使用する方法を提供する。一部の実施形態において、組換えウイルス粒子は、組換えAAV粒子である。一部の実施形態において、ウイルス粒子は、1または2つのITRが隣接する本発明の開示のRNAiの配列を含む核酸を含む組換えAAV粒子である。核酸は、AAV粒子中にキャプシド化されている。またAAV粒子は、キャプシドタンパク質も含む。一部の実施形態において、核酸は、転写方向で構成要素に作動可能に連結された目的のコード配列(例えば、本発明の開示のRNAiの核酸)、転写開始および終結配列を包含する制御配列を含み、それにより発現カセットが形成される。発現カセットは、5’および3’末端に少なくとも1つの機能的なAAVのITR配列を有する。「機能的なAAVのITR配列」は、AAVビリオンのレスキュー、複製およびパッケージ化を目的としたITR配列機能を意味する。全て参照によってそれらの全体が本明細書に組み入れられる、Davidsonら、PNAS、2000、97(7)3428〜32;Passiniら、J.Virol.、2003、77(12):7034〜40;およびPechanら、Gene Ther.、2009、16:10〜16を参照されたい。本発明の一部の態様を実施するために、組換えベクターは、少なくともキャプシド化に必須なAAVの配列の全て、およびrAAVによる感染のための物理的構造を含む。本発明のベクターで使用するためのAAVのITRは、野生型ヌクレオチド配列を有していなくてもよく(例えば、Kotin,Hum.Gene Ther.、1994、5:793〜801で説明されている通り)、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更されてもよく、またはAAVのITRは、数々のAAV血清型のいずれかからから誘導されてもよい。40種を超えるAAV血清型がこれまでに知られており、新しい血清型および既存の血清型のバリアントが同定され続けている。Gaoら、PNAS、2002、99(18):11854〜6;Gaoら、PNAS、2003、100(10):6081〜6;およびBossisら、J.Virol.、2003、77(12):6799〜810を参照されたい。あらゆるAAV血清型の使用が、本発明の範囲内であるとみなされる。一部の実施形態において、rAAVベクターは、これらに限定されないが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、ヤギAAV、ウシAAV、またはマウスAAVキャプシド血清型ITRなどのAAV血清型から誘導されたベクターである。一部の実施形態において、AAVにおける核酸は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、ヤギAAV、ウシAAV、またはマウスAAVキャプシド血清型ITRなどのITRを含む。一部の実施形態において、AAVにおける核酸は、本明細書に記載のRNAiをさらにコードする。例えば、AAVにおける核酸は、本明細書において予期されるあらゆるAAV血清型の少なくとも1つのITRを含んでいてもよく、第1の鎖および第2の鎖を含むRNAiをさらにコードしていてもよく、a)第1の鎖および第2の鎖は、二重鎖を形成し;b)第1の鎖は、少なくとも11塩基のガイド領域を含み、ガイド領域は、ガイド鎖の塩基1〜Nを含むシード領域を含み、N=7またはN=8であり;c)第2の鎖は、少なくとも11塩基の非ガイド領域を含み、非ガイド領域は、二重鎖中のガイド領域の塩基1〜(N+2)のいずれか1つまたはそれ以上の反対側に、バルジ配列を含む。一部の実施形態において、rAAVは、配列5’−UAGACAAUGAUUCACACGGU−3’(配列番号1)を含む第1の核酸を含む第1の鎖および配列5’−ACCGUGUGUCAUUGUCUAA−3’(配列番号2)を含む第2の核酸を含む第2の鎖を含んでいてもよい。一部の実施形態において、AAVにおける核酸は、5’から3’へ、以下:ITR(例えば、AAV2のITR)、プロモーター、本明細書で開示されるRNAiをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル、ならびにAAVのITR(例えば、AAV2のITR)をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、AAVにおける核酸は、5’から3’へ、以下:ITR(例えば、AAV2のITR)、プロモーター、配列5’−UAGACAAUGAUUCACACGGU−3’(配列番号1)を含む第1の核酸を含む第1の鎖および配列5’−ACCGUGUGUCAUUGUCUAA−3’(配列番号2)を含む第2の核酸を含む第2の鎖を含むRNAiをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル、ならびにAAVのITR(例えば、AAV2のITR)をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、AAVにおける核酸は、5’から3’へ、以下:ITR(例えば、AAV2のITR)、CBAプロモーター、本明細書で開示されるRNAiをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル(例えば、ウシ成長ホルモンのポリA)、ならびにAAVのITR(例えば、AAV2のITR)をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、AAVにおける核酸は、5’から3’へ、以下:ITR(例えば、AAV2のITR)、CBAプロモーター、配列5’−UAGACAAUGAUUCACACGGU−3’(配列番号1)を含む第1の核酸を含む第1の鎖および配列5’−ACCGUGUGUCAUUGUCUAA−3’(配列番号2)を含む第2の核酸を含む第2の鎖を含むRNAiをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル(例えば、ウシ成長ホルモンのポリA)、およびAAVのITR(例えば、AAV2のITR)をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、第1の鎖および第2の鎖は二重鎖を形成し、第2の鎖の配列番号2の残基18または残基19におけるA残基は、第1の鎖中の残基と塩基対を形成しない。一部の実施形態において、第1の鎖の配列番号1の残基11および12におけるU残基は、第2の鎖と塩基対を形成しない。一部の実施形態において、第2の鎖の配列番号2の残基18または残基19におけるA残基は、第1の鎖中の残基と塩基対を形成せず、第1の鎖の配列番号1の残基11および12におけるU残基は、第2の鎖と塩基対を形成しない。
rAAV粒子は、当業界において公知の方法を使用して生産することができる。例えば、米国特許第6,566,118号;6,989,264号;および6,995,006号を参照されたい。本発明の実施において、rAAV粒子を生産するための宿主細胞としては、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物および酵母が挙げられる。宿主細胞はまた、AAVベクターゲノムが安定して維持される宿主細胞またはプロデューサー細胞中でAAVのrepおよびcap遺伝子が安定して維持されるパッケージング細胞であってもよい。例示的なパッケージングおよびプロデューサー細胞は、293、A549またはHeLa細胞から誘導される。AAVベクターは、当業界において公知の標準的な技術を使用して精製され、製剤化される。
本明細書に記載の方法で使用するためのキットまたは製造品も提供される。態様において、キットは、好適なパッケージ中に、本明細書に記載の組成物(例えば、本発明の開示の組換えウイルス粒子、例えば本発明の開示のRNAiをコードする核酸を含むrAAV粒子)を含む。本明細書に記載の組成物(例えば線条体内用の組成物)のための好適なパッケージは、当業界において公知であり、例えば、バイアル(例えば密封バイアル)、容器、アンプル、ボトル、ジャー、フレキシブルなパッケージ(例えば、密封したマイラーまたはプラスチックバッグ)などが挙げられる。これらの製造品は、さらに滅菌および/または密封してもよい。
ハンチントン病(HD)は、ハンチンチン(Htt)タンパク質におけるポリグルタミン残基数の増加によって引き起こされる致死性の常染色体優性の神経変性疾患である。HDの根本的な基礎の同定に伴い、原因となる突然変異Httの発現を低減する療法が開発されつつある。このおよび類似の障害のための可能性のある治療戦略として、このような疾患を引き起こす薬剤の発現を選択的に低減しようとするRNA干渉(RNAi)が出現している。HDのマウスモデルでRNAi療法の長所を検査するために、これまでにマウスおよびヒトHttのmRNAを効果的に標的化することが示されている標的配列(McBrideら、(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:5868〜5873)を人工miRNA骨格に埋め込み、プレウイルスベクターにクローニングした。
動物
全ての手順を、Genzyme、Sanofi社における動物実験倫理委員会によって承認されたプロトコール(保健福祉省、NIH公報86−23)を使用して実行した。使用されたマウスは、YAC128マウス(純粋なFVB/NJバックグラウンドに128個のCAGリピートを含む全長ヒト突然変異HTT導入遺伝子を内包する酵母人工染色体)およびFVB/NJ同腹子マウス(Slowら、(2003)Hum.Mol.Genet.12:1555〜1567;Van Raamsdonkら、(2005)Hum.Mol.Genet.3823〜3835)を包含していた。YAC128マウスおよびFVB/NJ同腹子の両方を、Charles River Laboratoriesに収容されていたGenzymeのコロニーから得た。12時間の明/暗サイクルで食物および水を不断給餌してマウスを維持した。動物の明サイクル中に(午前8時から午後4時の間に)全ての行動試験を実行した。
ハンチンチン遺伝子に対してmiRNAベースのヘアピンをコードする組換えAAV2/1血清型ベクター(AAV2/1−miRNA−Htt)を生成するために、ヒトHTTに関するmiRNAを、AAV2逆方向末端反復(ITR)、ウシ成長ホルモンのポリA、および1.6kbのサイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターを含有するシャトルプラスミドにクローニングした。miRNAのための足場を、Invitrogen(商標)BLOCK−iT(商標)Pol II miR RNAi発現ベクターキット(Life Technologies、Thermo Fisher Scientific;Waltham、MA)からのものであった。対照ベクターは、空のベクター骨格のいずれか(AAV2/1−ヌル)を含有していたか、または同じプロモーター(AAV2/1−eGFP)のコントロール下で強化緑色蛍光タンパク質を発現した。これまでに述べられたように三重のプラスミドをヒト293細胞にコトランスフェクトすることによって全てのウイルスベクターを生成し(Xiaoら(1998)J.Virol.72:2224〜2232)、これまでに述べられたように組換えビリオンをカラムで精製した(Passiniら、(2001)J.Virol.75:12382〜12392)。得られたAAV2/1−miRNA−Httの力価は、4.5×1012vg/mlであると決定され、AAV2/1−ヌルの力価は、定量PCRを使用したところ2.3×1012vg/mlであった。
動物を3%イソフルランを使用して麻酔し、定位フレームに設置した。頭蓋内注射をこれまでに述べられたようにして実行した(Treleaven,C.M.ら(2012)Mol.Ther.20:1713〜1723)。簡単に言えば、組換えウイルスベクター(AAV2/1−eGFPまたはAAV2/1−miRNA−Htt)2μlを、10μlハミルトンシリンジを0.5μl/分の速度で使用して線条体に注射した(AP、+0.50;ML、±2.00;DV、前頂および硬膜から−2.5;切歯棒、0.0)。針を、点滴完了後1分間、その場に残した。外科手術前の1時間および外科手術後の24時間に、無痛のためにマウスにケトプロフェン(5mg/kg)を皮下投与した。
マウスをリン酸緩衝塩類溶液(PBS)で心臓を介して潅流して、全ての血液を除去した。脳を中線に沿って矢状方向に切断し、左半球を4%パラホルムアルデヒド、それに続いて30%スクロース中で後固定し、次いでクライオスタットを使用して20μmの断片に断片化した。右半球を、マウス脳マトリックス(Harvard Apparatus、Holliston、MA)を使用して、冠状面の軸椎に沿って2mmのスラブに切断し、次いで液体窒素中で瞬間冷凍して、使用するまで−80℃で貯蔵した。Htt凝集の分析のために、脳を4%パラホルムアルデヒド中で48時間後固定し、PBSで洗浄して、次いでビブラトームを使用して40μmの環状断片に断片化した。
HEK293細胞を、5×109vgのAAV2/1−eGFPまたはAAV2/1−miRNA−Httのいずれかで感染させ、3日後に回収した。定量リアルタイムRT−PCRによってRNAレベルを測定した。TaqMan(登録商標)Cells−to−CT(商標)キット(Ambion)を使用して全RNAを単離した。Q−PCR反応を遂行し、上述したようにABI PRISM7500シーケンスデテクター(Applied Biosystems)で分析した(Kordasiewicz,H.B.ら(2012)Neuron 74:1031〜1044)。発現レベルをPPIA(ペプチジルプロリルイソメラーゼ)のレベルに正規化した。
定量リアルタイムRT−PCRによってRNAレベルを測定した。全てのRT−PCR分析に、脳スラブ2からの脳組織サンプルを使用した。QIAGEN RNEasyミニキットを使用して全RNAを抽出し、次いで、TaqMan(登録商標)ワンステップRT−PCRマスターミックスキット(Applied Biosystems)を製造元の説明書に従って使用して、逆転写し、増幅した。マウスHttのmRNAを検出するために、以下のプローブセットを使用した:Mm01213820_m1(Life Technologiesカタログ番号4331182)。ヒトHttのmRNAを検出するために、以下のオリゴを使用した:5’−ctccgtccggtagacatgct−3’(フォワードプライマー、配列番号9);5’−ggaaatcagaaccctcaaatgg−3’(リバースプライマー、配列番号10);および5’−tgagcactgttcaactgtgtgtatcggga−3’(プローブ、配列番号11)。定量RT−PCR反応を遂行し、ABI Prism(登録商標)7500リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)で分析した。HttのmRNAの発現レベルをヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ1(Hprt1)のmRNAレベルに正規化した。マウス脳cDNAの5倍連続希釈物を使用して標準曲線を作成した。各サンプルを2連で試行した。標準曲線またはΔΔCT方法を使用して、Hprt1のmRNAレベルに正規化することによって、相対的な遺伝子発現を決定した。
完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)を含有するT−Per溶解緩衝液(Pierce)中50mg/mlの最終濃度で組織をホモジナイズした。ホモジネートを4℃における10,000×gで6分間の遠心分離によって清澄化した。BSAアッセイ(Pierce)を使用することによってタンパク質濃度を測定した。20から30マイクログラムのホモジネートを3〜8%Novexトリス−アセテートゲルで分離し、次いでニトロセルロース膜に移した。膜に、マウス抗ハンチンチンモノクローナル抗体(Mab2166;1:2,000希釈物、Millipore)およびウサギポリクローナル抗β−チューブリン抗体(1:750希釈物、Santa Cruz Biotechnology)でプローブを付けた。次いで膜を赤外二次抗体(1:20,000希釈物、Rockland)と共にインキュベートし、Odyssey(LI−COR Biosciences)を使用して定量的な蛍光によりタンパク質を可視化した。ローディングの分散をコントロールするために、Httタンパク質をβ−チューブリンに正規化し、未処置または塩類溶液処置した動物のパーセンテージとして表した。タンパク質の同一性を検証するために分子量マーカーを使用した。
Genzyme Flow Cytometry Core Facility(Sanofi社)において、100μmノズルを備えたFACS Aria IIセルソーター(BD Biosciences San Jose、CA)を使用して単一細胞の懸濁液を分析し、単離した。前方散乱(FWD−Sc)および側方散乱(SSC)でのゲーティングにより死細胞片から生きた単一細胞を識別することによって細胞の分析を実行した。530/30BPフィルター505LPを備えたデテクターEを使用してEGFP陽性細胞を収集した。EGFP蛍光データプロファイルは、単一パラメーターのヒストグラムとして表示され、ソーティング決定は、EGFP−およびEGFP+に基づいていた。ソートされた細胞を5%ウシ胎児血清を含有する組織培養培地中に収集し、4ウェルのチャンバーを有するスライド(LabTek、Nalge Nunc International、Naperville、Ill)上で、細胞50000個/ウェルの濃度で平板培養した。
ビブラトーム断片を、凝集したハンチンチンを優先的に認識する抗体であるEM48によって免疫染色のために処理した(Gutekunstら、(1999)J.Neurosci.19:2522〜2534)。まず遊離の浮遊断片を、Dual Endogenous Enzyme Block(Dako)で30分処置して内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。次いでこれらを0.01MのPBSで洗浄し(3分間)、続いてPBS中0.5%Triton X−100で3回、各10分で洗浄した。断片をRodent Block M中で室温で1時間インキュベートすることによって非特異的な部位をブロックした。4℃の低温室において穏やかな振盪器で一晩インキュベートすることによって、断片にEM48抗体(Millipore、PBSでの1:25希釈物)でプローブを付けた。次の日、断片を、室温で1時間、振盪器で、二次抗体(MM HRPポリマー、Biocare Medical)と共にインキュベートした。それぞれPBSで15分間で3回洗浄した後、DABペルオキシダーゼ基質キット(Vector)を使用してシグナルを検出した。洗浄後、断片をスーパーフロストプラススライドにマウントし、一晩乾燥させ、Acrytolマウント媒体と共にカバーガラスをかけた。
加速ロータロッド試験:運動協調性および運動学習を、加速ロータロッド装置(AccuScan Instruments)で評価した。1日当たり3回の試験により3日連続でマウスをロータロッドで訓練した。最初の訓練日に、ロータロッドを、300秒かけて0から5RPMに加速するように設定した。300秒の期間を終える前にロッドから落下したマウスを、300秒の期間が完全に満了するまでロッド上に戻した。訓練の2および3日目に、ロータロッドを再度、300秒かけて0から40RPMに加速するように設定し、全てのマウスがロッド上で300秒を完全に終えるよう強制した。4日目(試験日)に、300秒かけて0から40RPMに加速するように設定されたロータロッド上にマウスを置いた。動物が落ちた後は再び置かず、落ちるまでの潜時を3回の試験にわたり記録した。落ちるまでの潜時は、動物がロータロッドから落ちるまでの経過時間によって定義された。
統計分析のために平均値を使用した。データを平均±SEMとして表した。2つのグループを使用した研究の場合、統計的比較のためにスチューデントのt検定を使用した。2つより多くのグループの比較の場合、一元配置ANOVA、続いてテューキーの多重比較事後検定(Prism GraphPad)を使用した。p<0.05を統計学的に有意な差とみなした。
プラスミドを、図1Aで例示されているようにニワトリベータ−アクチン(CBA)プロモーター(pSP70−CBA−EGFP)の転写コントロール下でHttを標的化するmiRNAおよび強化されたGFP(eGFP)レポーター遺伝子を発現するように操作した。候補標的配列は、Httコード領域から選択されたものであり、5’−TAGACAATGATTCACACGGT−3’(配列番号4)であった。標的配列をコードする高力価の組換えAAV2/1−血清型ベクター(AAV2/1−miRNA−Htt)および対照ベクター(AAV2/1−eGFPおよびAAV2/1−ヌル)を作製し、それらの遺伝子サイレンシング活性を、ヒト胎児腎臓(HEK)293細胞を感染させることによって試験した。細胞を5×109vgのAAVベクターで感染させた。蛍光活性化セルソーティング(FACS)分析を使用して、この用量が、AAV−eGFP−miRNA−HTTで感染させた後、HEK293細胞において90%より高い感染効率をもたらしたことを確認した(図2A〜D)。AAV2/1−eGFPで感染させた細胞は、感染後3日にリアルタイムPCRによって分析したところ、内因性Httレベルのいかなる低減も示さなかった;しかしながら、AAV2/1−miRNA−Httで感染させた細胞は、HttのmRNAレベルのおよそ40%の低減を示した(図1B)。
インビトロでHttのmRNAレベルを抑制するAAV2/1−miRNA−Httの能力の検証後、このベクターの、YAC128マウスの線条体におけるHtt発現をサイレンシングする能力を評価した。AAV2/1−miRNA−Httを線条体内注射した後の線条体内の細胞の形質導入パーセントを決定するために、実施例1に記載の方法に従って蛍光活性化セルソーティング(FACS)を採用した。
成体YAC128マウスに、AAV2/1−eGFP−miRNA−Htt(4.5×1012vg/ml)または対照ベクター、AAV2/1−eGFP(5.6×1012vg/ml)の両側の線条体内注射を行った。注射後の1カ月に、各動物の線条体領域を顕微解剖し、eGFP含有細胞とeGFP非含有細胞とをソートし、FACS分析によって定量した(図3AおよびB)。データから、ソートされた線条体細胞の大部分のうちのeGFPの存在によって実証されたように、ベクターによって線条体の80%より多くが形質導入されたことが示された(図3C)。
AAV2/1−miRNA−Httの注射およびその結果としてのHttの低減が神経毒性および炎症をもたらすかどうかを決定するために、線条体断片の細胞の形態および完全性を、実施例1に記載の方法に従ってヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色によって検査した。神経炎症マーカーであるグリア細胞繊維性酸性タンパク質(GFAP、星状細胞マーカー)およびIba−1(小グリア細胞マーカー)のレベルも、処置後1および5カ月に検査した。
H&Eによる分析から、注射された脳領域において著しい病理組織学的変化は示されなかった(図5A〜C)。注射後1または5カ月において、AAV2/1−ヌルで処置した動物と比較した場合、GFAP陽性の星状細胞の数(免疫組織化学によって可視化された)またはGFAPのmRNAのレベル(QPCRによって定量した)のいずれかにおける特筆すべき増加は、注射された領域で観察されなかった(図5D〜F;図5J)。しかしながら、注射後1カ月で、線条体におけるIba−1免疫染色(図5H)およびIba−1のmRNAレベルの増加によって証明されたように、活性化された小グリア細胞の数の増加が記録された(図5K)。興味深いことに、注射後5カ月で小グリア細胞の活性化は対照レベルに戻ったことから(図5Iおよび5K)、応答は一過性であったことが示唆される。理論に制限されることは望まないが、この研究で使用されたAAV2/1−ヌル対照ベクターはeGFP遺伝子を内包していなかったことから、AAV2/1−miRNA−HttからのeGFPの発現は一過性の小グリア細胞の活性化に関与する可能性があると考えられる。
HDのYAC128マウスモデルに存在するよく特徴付けられた表現型の欠陥に対するAAVが媒介する突然変異Httレベル低減の影響も、実施例1に記載の方法に従って検査した。YAC128マウスは、3月齢から始まる運動協調性の欠陥(これは、ロータロッド試験を使用して解明することができる)およびうつ状態の表現型(ポーソルト水泳試験を使用して)を示すことが報告されている(Slowら、(2003)Hum.Mol.Genet.12:1555〜1567;Van Raamsdonkら、(2007)Neurobiol Dis 26:189〜200)。
年齢を適合させた(2月齢)YAC128および野生型同腹子マウスに、AAV2/1−miRNA−HttまたはAAV2/1−ヌルベクターのいずれかの両側の線条体内注射を行い、次いで処置後の3カ月に殺した(図6A)。予想通りに、脳断片の分析から、これまで観察されたように線条体全体にわたり領域を取り囲んでeGFP発現が実証された(図6B)。脳ホモジネートのウェスタンブロット分析から、突然変異ヒトおよび内因性マウスHttタンパク質の両方のレベルが、AAV2/1−ヌルで処置された対照と比較した場合、AAV2/1−miRNA−Httが注射されたYAC128および野生型マウスの線条体において有意に低減した(およそ55%の低減、p<0.01)ことが示された(図6CおよびD)。リアルタイム定量PCR分析から、mRNAレベルにおける同程度の低減も達成されたことが示された。
HDの脳において、線条体で富化されている多数の遺伝子の転写調節異常が観察されている(Richfielら、(1995)Ann.Neurol.37:335〜343;Augoodら、(1997)Ann.Neurol.42:215〜221;Sugarsら、(2004)J.Biol.Chem.279:4988〜4999;Desplatsら、(2006)J.Neurochem.96:743〜757)。この異常はまた、YAC128マウスにおいても、例示されたように、特定には、野生型動物のレベルと比較してそれらの有意に低いDARPP−32およびD1ドーパミン受容体の線条体のレベルによって明白である(Pouladiら、(2012)Mol.Genet.21:2219〜2232)。YAC128マウスにおけるHttレベルの抑制がこの変更された転写プロファイルを修正したかどうかを検査するために、実施例1に記載の方法に従って2月齢のときにAAV2/1−miRNA−Httで処置して3カ月後に分析したYAC128マウスの線条体組織に、リアルタイム定量PCR分析を実行した。
AAV2/1−ヌルで処置したYAC128マウスの脳抽出物の分析から、DARPP−32およびD1ドーパミン受容体(D1R)のmRNAレベルが、年齢を適合させた野生型対照と比較して有意に低かったことが示された(ANOVA、テューキーの事後検定;WTヌル対YAC128ヌル、p<0.05)(図7AおよびB)。AAV2/1−miRNA−Httを投与したYAC128マウスは、AAV2/1−ヌルベクターで処置したものより高いレベルのDARPP−32およびD1RのmRNAを示した;しかしながら、これらのレベルはそれでもなお野生型対照で観察されたレベルより低かった(ANOVA、テューキーの事後検定;WTヌル対YAC Htt、p=NS)。したがって、YAC128マウスにおけるAAV2/1−miRNA−Httが媒介するHttレベルの低減は、異常な線条体の転写プロファイルの部分的な修正をもたらした。その後のタイムポイント(処置後5カ月より後)における検査により、この異常なプロファイルのより完全な修正が明らかになる可能性がある。
CNSにおけるHttの凝集体および封入体の出現は、HDの神経病理学的な特徴である。HDマウスにおいてこれらの凝集体のレベルを低くすることは、病理学における特筆すべき改善との相関が示されてきた(Harperら、(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:5820〜5825;Rodriguez−Lebronら、(2005)Mol.Ther.12:618〜633)。YAC128マウスモデルは、12月齢までに線条体においてHtt凝集体の有意な広範にわたる蓄積を示すことが報告されている(Slowら、(2003)Hum.Mol.Genet.12:1555〜1567、Pouladiら、(2012)Hum.Mol.Genet.21:2219〜2232)。YAC128マウスにおけるHtt凝集体に対するAAV2/1−miRNA−Htt送達の影響を実施例1に記載の方法に従って検査した。
抗Htt抗体EM48を使用した6、9、および24月齢のYAC128マウスの脳断片の免疫組織化学的染色から、6月齢もの早期において、時間と共に進行する線条体および皮質の両方での凝集体の証拠が示された(図8A)。12月齢の組織(16マイクロメートルの凍結断片)も分析したところ、24月齢コホートと類似の程度の凝集物があることが示されたが、凍結断片における非特異的なバックグラウンドの染色が、ビブラトーム断片より有意に多かった(データ示さず)。
本発明の研究から、突然変異Httレベルを低くすることは、HDの治療戦略であることが示され、線条体における突然変異Httの部分的な低減は、HDの完全トランスジェニックマウスモデルであるYAC128マウスモデルにおいて行動に関する、生化学的な、および神経病理学的な改善をもたらしたことが実証された。この治療戦略を評価することにおけるこれまでの試みは、突然変異HTT遺伝子のフラグメントを内包するマウスモデル、例えばR6/1およびN171〜82Q HDマウス(Harperら、(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:5820〜5825、Rodriguez−Lebronら、(2005)Mol.Ther.12:618〜633、Machidaら、(2006)Biochem.Biophys.Res.Commun.343:190〜197)で実行された。突然変異Httのレベルにおける部分的な低減は、N171〜82Q HDマウスモデルなどのより重症のモデルの一部では適度な延命効果をもたらしたが、他のモデル(例えば、R6/1マウスモデル)ではそうではなかった(Harperら、(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:5820〜5825、Rodriguez−Lebronら、(2005)Mol.Ther.12:618〜633、Machidaら、(2006)Biochem.Biophys.Res.Commun.343:190〜197)。ロータロッドおよび歩幅試験を使用したこれらの研究において、運動の改善も特筆された;しかしながら、これらのモデルの重症度のために、行動に関する、神経病理学的な、および生化学的な異常に対する処置の長期的評価は除外された。
臨床研究から、成体の脳中で野生型Httレベルを部分的に低減することは、マウスおよび非ヒト霊長類の両方において十分許容されるようであることが実証される(Boudreauら、(2009b)Mol.Ther.17:1053〜1063;McBrideら、(2011)Mol.Ther.19:2152〜2162;Grondinら、(2012)Brain 135:1197〜1209)。
本発明の研究は、Htt遺伝子はmiRNA足場(miR−155)に埋め込まれたのに対して、短鎖ヘアピンをコードするのに組換えAAV2/1ベクターを利用した。使用されたshRNA配列は、以前の公開された配列の、マウスおよびヒトhtt転写物のエクソン2を標的化するmirR2.4から改変したものであった(McBrideら、(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:5868〜5873)。短鎖ヘアピンRNAの改変は、安定性および生物活性を増加させ、オフターゲット作用を最小化し、先天性免疫応答を低減するのに使用されてきた(Castanottoら、(2009)Nature 457:426〜433;Jacksonら、(2010)Nature Rev. Drug Disc.9:57〜67)。本発明の研究で使用された改変された配列は、miR2.4と同じガイド鎖配列を含有していた(図9A);しかしながら、シード配列の3’末端に、ガイド鎖に対応するチミンヌクレオチド(T)がない追加のアデニンヌクレオチド(A)を有するようにコンストラクトを操作した(図9B)。理論に制限されることは望まないが、熱力学的なモデリングから、ガイド鎖におけるシード配列の反対側の非ガイド鎖におけるバルジ配列の追加は、RNAi性能の態様を改善できることが示唆される。したがって、本発明者らは、様々な障害を処置するための新規の形質転換可能な核酸による療法を生み出すのに使用できる進歩も開発した。
RNA干渉(RNAi)は、多くのヒト疾患の処置のためのアプローチを提供する。しかしながら、RNAiベースの療法の安全性は、オフターゲットの遺伝子サイレンシングとして公知の作用である、意図されないmRNAに結合してそれらの発現を低減する低分子阻害性RNA(siRNA)の能力によって妨げられる可能性がある。オフターゲティングは主として、シード領域(低分子RNAのヌクレオチド2〜8)が意図されないmRNAの3’−UTR中の配列と対合して、それらの転写物の翻訳の抑制および不安定化を指示するときに起こる。これまで、ほとんどの治療的RNAi配列は、主として遺伝子サイレンシング効能に関して選択され、安全性に関しては後で評価される。ここで、主要な神経変性障害であるハンチントン病(HD)を処置するためにsiRNAを設計することにおいて、マウス脳において有力なサイレンシングを示し、低いインシリコでのオフターゲットプロファイルを有する、最小のオフターゲティング能を有する2つの新しい配列(すなわち、全ての公知のヒトおよびアカゲザル3’−UTR内のシード相補物が希少なもの)を生成した。
170XAL1またはAAV2/1−miRNA−Htt 170XAL2の注射後、GFAPまたはIba1免疫染色のどちらのいかなる増加も観察しなかった。スケールバー=50μM。
全てのポリペプチド配列は、別段の指定がない限りN末端からC末端として提示される。全ての核酸配列は、別段の指定がない限り5’から3’として提示される。
UAGACAAUGAUUCACACGGU(配列番号1)
miRNAパッセンジャー鎖の相補物
ACCGUGUGUCAUUGUCUAA(配列番号2)
センス標的配列
ACCGUGUGAAUCAUUGUCUAA(配列番号3)
miRNA httアンチセンス鎖DNA配列
TAGACAATGATTCACACGGT(配列番号4)
miRNAパッセンジャー鎖の相補物
ACCGTGTGTCATTGTCTAA(配列番号5)
センス標的配列
ACCGTGTGAATCATTGTCUTAA(配列番号6)
3A170のRNA配列
UGCUGUAGACAAUGAUUCACACGGUGUUUUGGCCACUGACUGACACCGUGUCAUUGUCUAACAGG(配列番号7)
3A170のDNA配列
TGCTGTAGACAATGATTCACACGGTGTTTTGGCCACTGACTGACACCGTGTCATTGTCTAACAGG(配列番号8)
ヒトHttのmRNAフォワードプライマー
Ctccgtccggtagacatgct(配列番号9)
ヒトHttのmRNAリバースプライマー
Ggaaatcagaaccctcaaatgg(配列番号10)
ヒトHttのmRNAプローブ
Tgagcactgttcaactgtgtgtatcggga (配列番号11)
scAAVベクターのためのバリアントAAVのITR
CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG(配列番号12)。
完全AAVベクターゲノムのDNA配列
ttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctggaggggtggagtcgtgacaattcgcccttgggcctaggcaattggatcccggaccgtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattcttcgaaagatctgctagcttaattaacccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtaccctggaggcttgctgaaggctgtatgctgttagacaatgattcacacggtgttttggccactgactgacaccgtgtgtcattgtctaacaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggccatgcatctagagggccctattctatagtgtcacctaaatgctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggagctagagtcgaccggaccggtggaagtcctcttcctcggtgtccttgacttcaaagggtctctcccatttgcctggagagaggggaaggtgggcatcaccaggggtgagtgaaggtttggaagagtgtagcagaataagaaaccatgagtcccctccctgagaagccctgagcccccttgacgacacacatccctcgaggctcagcttcatcatctgtaaaaggtgctgaaactgaccatccaagctgccgaaaaagattgtgtggggataattcaaaactagaggaagatgcagaatttctacatcgtggcgatgtcaggctaagagatgccatcgtggctgtgcatttttattggaatcatatgtttatttgagggtgtcttggatattacaaataaaatgttggagcatcaggcatatttggtaccttctgtctaaggctccctgccccttgttaattggcagctcagttattcatccagggcaaacattctgcttactattcctgagagctttcctcatcctctagattggcaggggaaatgcagatgcctgagcagcctcccctctgccataccaacagagcttcaccatcgaggcatgcagagtggacaggggcctcagggacccctgatcccagctttctcattggacagaaggaggagactggggctggagagggacctgggcccccactaaggccacagcagagccaggactttagctgtgctgactgcagcctggcttgcctccactgccctcctttgcctcaagagcaagggagcctcagagtggaggaagcagcccctggccttgcctcccacctcccctcccctatgctgttttcctgggacagtgggagctggcttagaatgccctggggcccccaggaccctggcattttaacccctcaggggcaggaaggcagcctgagatacagaagagtccatcacctgctgtatgccacacaccatccccacagttacgtactagttcgaagccacgcgtccgaagggcgaattgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaa
(配列番号13)
miRNA足場のDNA配列
ctggaggcttgctggaggctgtatgctgttagacaatgattcacacggtgttttggccactgactgacaccgtgtgtcattgtctaacaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcc(配列番号14)
170XAL1ガイド(アンチセンス)
UCGACAAUGAUUCACACGGU(配列番号15)
170XAL1非ガイド
ACCGUGUGUCAUUGUCGAA(配列番号16)
170XAL2ガイド(アンチセンス)
UAGACGAUGAUUCACACGGU(配列番号17)
170XAL1非ガイド
ACCGUGUGUCAUCGUCUAA(配列番号18)
170XA
TAGACAATGATTCACACGGTGTTTTGGCCACTGACTGACACCGTGTGTCATTGTCTAA(配列番号19)
Claims (246)
- 第1の鎖および第2の鎖を含むRNAiであって、
a)該第1の鎖および該第2の鎖は、二重鎖を形成し;
b)該第1の鎖は、少なくとも19塩基のガイド領域を含み、該ガイド領域は、ガイド鎖の塩基1〜Nを含むシード領域を含み、N=7またはN=8であり;
c)該第2の鎖は、少なくとも19塩基の非ガイド領域を含み、該非ガイド領域は、該二重鎖中の該ガイド領域の塩基1〜(N+2)のいずれか1つまたはそれ以上の反対側に、バルジ配列を含む、前記RNAi。 - N=7であり、バルジは、ガイド領域の塩基1、2、3、4、5、6、7、8、または9の反対側にある、請求項1に記載のRNAi。
- N=8であり、バルジは、ガイド領域の塩基1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10の反対側にある、請求項1に記載のRNAi。
- バルジは、ガイド領域の塩基1または塩基N+2の反対側にある、請求項1〜3のいずれか1項に記載のRNAi。
- 第1の鎖および第2の鎖を含むRNAiであって、
a)該第1の鎖および該第2の鎖は、二重鎖を形成し;
b)該第1の鎖は、少なくとも19塩基のガイド領域を含み、該ガイド領域は、ガイド鎖の塩基1〜Nを含むシード領域を含み、N=7またはN=8であり;
c)該第2の鎖は、少なくとも19塩基の非ガイド領域を含み、該非ガイド領域は、該二重鎖中の該ガイド領域の塩基1〜(N+1)のいずれか1つまたはそれ以上の反対側に、バルジ配列を含む、前記RNAi。 - N=7であり、バルジは、ガイド領域の塩基1、2、3、4、5、6、7、または8の反対側にある、請求項5に記載のRNAi。
- N=8であり、バルジは、ガイド領域の塩基1、2、3、4、5、6、7、8、または9の反対側にある、請求項5に記載のRNAi。
- バルジは、ガイド領域の塩基1または塩基N+1の反対側にある、請求項5〜7のいずれか1項に記載のRNAi。
- 第1の鎖および第2の鎖を含むRNAiであって、
a)該第1の鎖および該第2の鎖は、二重鎖を形成し;
b)該第1の鎖は、少なくとも19塩基のガイド領域を含み、該ガイド領域は、ガイド鎖の塩基1〜Nを含むシード領域を含み、N=7またはN=8であり;
c)該第2の鎖は、少なくとも19塩基の非ガイド領域を含み、該非ガイド領域は、該二重鎖中の該ガイド領域の塩基1〜Nのいずれか1つまたはそれ以上の反対側に、バルジ配列を含む、前記RNAi。 - N=7であり、バルジは、ガイド領域の塩基1、2、3、4、5、6または7の反対側にある、請求項9に記載のRNAi。
- N=8であり、バルジは、ガイド領域の塩基1、2、3、4、5、6、7または8の反対側にある、請求項9に記載のRNAi。
- バルジは、ガイド領域の塩基1または塩基Nの反対側にある、請求項9〜11のいずれか1項に記載のRNAi。
- バルジは、ガイド領域の塩基1の反対側にある、請求項1〜12のいずれか1項に記載のRNAi。
- バルジは、ガイド領域における相補的な塩基が欠失した、二重鎖中の非ガイド鎖の1つまたはそれ以上の塩基によって形成され、バルジに、ガイド鎖と対合する塩基が隣接する、請求項1〜13のいずれか1項に記載のRNAi。
- バルジは、1〜10ヌクレオチドを含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載のRNAi。
- バルジは、1〜3ヌクレオチドを含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載のRNAi。
- RNAiは、第2のバルジを含み、第2のバルジは、シード領域の3’に配置された第1の鎖のガイド領域に配置されている、請求項1〜16のいずれか1項に記載のRNAi。
- 二重鎖は、19〜25または19〜23塩基対の長さである、請求項1〜17のいずれか1項に記載のRNAi。
- 第1および/または第2の鎖は、3’オーバーハング領域、5’オーバーハング領域、または3’および5’オーバーハング領域の両方をさらに含む、請求項1〜18のいずれか1項に記載のRNAi。
- 第1の鎖および第2の鎖は、ループ構造を形成することが可能なRNAリンカーによって連結されている、請求項1〜19のいずれか1項に記載のRNAi。
- RNAリンカーは、4〜50ヌクレオチドを含む、請求項20に記載のRNAi。
- ループ構造は、4〜20ヌクレオチドを含む、請求項20または21に記載のRNAi。
- 5’から3’へ、第2の鎖、RNAリンカー、および第1の鎖を含む、請求項20〜22のいずれか1項に記載のRNAi。
- 5’から3’へ、第1の鎖、RNAリンカー、および第2の鎖を含む、請求項20〜22のいずれか1項に記載のRNAi。
- 配列は、オフターゲットの遺伝子サイレンシングを低減するように改善されている、請求項1〜24のいずれか1項に記載のRNAi。
- 配列は、1つまたはそれ以上のCpGモチーフを含む、請求項1〜25のいずれか1項に記載のRNAi。
- 配列は、シード領域中に1つまたはそれ以上のCpGモチーフを含む、請求項1〜26のいずれか1項に記載のRNAi。
- 低分子阻害性RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、または小ヘアピンRNA(shRNA)である、請求項1〜27のいずれか1項に記載のRNAi。
- 障害に関連するポリペプチドをコードするRNAを標的化する、請求項1〜28のいずれか1項に記載のRNAi。
- 障害は、CNS障害である、請求項29に記載のRNAi。
- 障害は、リソソーム蓄積症(LSD)、ハンチントン病、てんかん、パーキンソン病、アルツハイマー病、卒中、大脳皮質基底核変性症(CBD)、大脳皮質基底核神経節変性症(CBGD)、前頭側頭認知症(FTD)、多系統萎縮症(MSA)、進行性核上麻痺(PSP)または脳のがんである、請求項29または30に記載のRNAi。
- 障害は、ハンチントン病である、請求項29〜31のいずれか1項に記載のRNAi。
- ポリペプチドは、ハンチンチンである、請求項32に記載のRNAi。
- ハンチンチンは、ハンチントン病に関連する突然変異を含む、請求項33に記載のRNAi。
- ガイド領域は、配列5’−UAGACAAUGAUUCACACGGU−3’(配列番号1)を含み、非ガイド領域は、配列5’−ACCGUGUGUCAUUGUCUAA−3’(配列番号2)を含む、請求項32〜34のいずれか1項に記載のRNAi。
- ガイド領域は、配列5’−UCGACAAUGAUUCACACGGU−3’(配列番号15)を含み、非ガイド領域は、配列5’−ACCGUGUGUCAUUGUCGAA−3’(配列番号16)を含む、請求項32〜34のいずれか1項に記載のRNAi。
- ガイド領域は、配列5’−UAGACGAUGAUUCACACGGU−3’(配列番号17)を含み、非ガイド領域は、配列5’−ACCGUGUGUCAUCGUCUAA−3’(配列番号18)を含む、請求項32〜34のいずれか1項に記載のRNAi。
- RNAiの毒性を低減する方法であって、該RNAiの非ガイド領域にバルジを導入して、請求項1〜37のいずれか1項に記載のRNAiを生成することを含む、前記方法。
- 請求項1〜38のいずれか1項に記載のRNAiをコードする核酸を含む発現コンストラクト。
- RNAiをコードする核酸は、miRNA足場を含む、請求項39に記載の発現コンストラクト。
- RNAiをコードする核酸は、プロモーターに機能するように連結されている、請求項39または40に記載の発現コンストラクト。
- プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーター、RSV LTR、MoMLV LTR、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1(PGK)プロモーター、シミアンウイルス40(SV40)プロモーター、CK6プロモーター、トランスチレチンプロモーター(TTR)、TKプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター(TRE)、HBVプロモーター、hAATプロモーター、LSPプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター(LSP)、E2Fプロモーター、テロメラーゼ(hTERT)プロモーター;サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリベータ−アクチン/ウサギβ−グロビンプロモーター(CAG)プロモーター、延長因子1−アルファプロモーター(EF1−アルファ)プロモーター、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーター、レトロウイルス性のラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および13−アクチンプロモーターから選択される、請求項41に記載の発現コンストラクト。
- ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項39〜42のいずれか1項に記載の発現コンストラクト。
- ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル、SV40のポリアデニル化シグナル、またはHSV TK pAである、請求項43に記載の発現コンストラクト。
- 請求項39〜44のいずれか1項に記載の発現コンストラクトを含むベクター。
- 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純疱疹ウイルス(HSV)ベクターである、請求項45に記載のベクター。
- 組換えアデノウイルスベクターである、請求項46に記載のベクター。
- 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24〜30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、ウシAd3型、イヌAd2型、ヒツジAd、またはブタAd3型から誘導される、請求項47に記載のベクター。
- 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型2またはアデノウイルス血清型5のバリアントから誘導される、請求項47に記載のベクター。
- 組換えレンチウイルスベクターである、請求項46に記載のベクター。
- 組換えレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、ロスリバーウイルス(RRV)、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、RD114またはそれらのバリアントで偽型化したレンチウイルスから誘導される、請求項50に記載のベクター。
- rHSVベクターである、請求項46に記載のベクター。
- rHSVベクターは、rHSV−1またはrHSV−2から誘導される、請求項52に記載のベクター。
- rAAVベクターである、請求項46に記載のベクター。
- 発現コンストラクトに、1つまたはそれ以上のAAVの逆方向末端反復(ITR)配列が隣接する、請求項54に記載のrAAVベクター。
- 発現コンストラクトに、2つのAAVのITRが隣接する、請求項55に記載のrAAVベクター。
- AAVのITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、ヤギAAV、ウシAAV、またはマウスAAV血清型のITRである、請求項55または56に記載のrAAVベクター。
- AAVのITRは、AAV2のITRである、請求項55〜57のいずれか1項に記載のrAAVベクター。
- スタッファー核酸をさらに含む、請求項54〜58のいずれか1項に記載のrAAVベクター。
- スタッファー核酸は、プロモーターとRNAiをコードする核酸との間に配置されている、請求項59に記載のrAAVベクター。
- 自己相補的なrAAVベクターである、請求項54〜60のいずれか1項に記載のrAAVベクター。
- ベクターは、RNAiをコードする第1の核酸配列およびRNAiの相補物をコードする第2の核酸配列を含み、第1の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第2の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる、請求項61に記載のrAAVベクター。
- 第1の核酸配列および第2の核酸配列は、突然変異したAAVのITRによって連結されており、突然変異したAAVのITRは、D領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む、請求項62に記載のrAAVベクター。
- 請求項45〜53のいずれか1項に記載のベクターまたは請求項54〜63のいずれか1項に記載のrAAVベクターを含む細胞。
- 請求項45に記載のベクターを含むウイルス粒子であって、rAAVベクターをキャプシド化するAAV粒子、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド化するアデノウイルス粒子、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド化するレンチウイルス粒子、または組換えHSVベクターをキャプシド化するHSV粒子である、前記ウイルス粒子。
- 組換えアデノウイルスベクターをキャプシド化するアデノウイルス粒子である、請求項65に記載のウイルス粒子。
- アデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24〜30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、ウシAd3型、イヌAd2型、ヒツジAd、またはブタAd3型由来のキャプシドを含む、請求項66に記載のウイルス粒子。
- アデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型2のキャプシドまたはアデノウイルス血清型5のキャプシドのバリアントを含む、請求項66に記載のウイルス粒子。
- 組換えレンチウイルスベクターをキャプシド化するレンチウイルス粒子である、請求項66に記載のウイルス粒子。
- レンチウイルス粒子は、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、ロスリバーウイルス(RRV)、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、RD114またはそれらのバリアントで偽型化したキャプシドを含む、請求項69に記載のウイルス粒子。
- HSV粒子である、請求項66に記載のウイルス粒子。
- HSV粒子は、rHSV−1粒子またはrHSV−2粒子である、請求項71に記載のウイルス粒子。
- 請求項54〜63のいずれか1項に記載のrAAVベクターを含む組換えAAV粒子。
- AAVウイルス粒子は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2−7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、ヤギAAV、AAV1/AAV2キメラ、ウシAAV、またはマウスAAVキャプシド rAAV2/HBoV1血清型キャプシドを含む、請求項73に記載のrAAV粒子。
- ITRおよびrAAVウイルス粒子のキャプシドは、同じAAV血清型から誘導される、請求項73または74に記載のrAAV粒子。
- ITRおよびrAAVウイルス粒子のキャプシドは、異なるAAV血清型から誘導される、請求項73または74に記載のrAAV粒子。
- ITRは、AAV2から誘導され、rAAV粒子のキャプシドは、AAV1から誘導される、請求項76に記載のrAAV粒子。
- 請求項65〜72のいずれか1項に記載のウイルス粒子または請求項73〜77のいずれか1項に記載のrAAV粒子を含む組成物。
- 医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項78に記載の組成物。
- 哺乳動物の疾患におけるポリペプチドの発現を阻害または低減するための方法であって、請求項1〜37のいずれか1項に記載のRNAi;請求項39〜44のいずれか1項に記載の発現コンストラクト;請求項45〜54のいずれか1項に記載のベクター;請求項55〜63のいずれか1項に記載のrAAVベクター;請求項65〜72のいずれか1項に記載のウイルス粒子;請求項73〜77のいずれか1項に記載のrAAV粒子;または請求項78もしくは79に記載の組成物を該哺乳動物に投与することを含み、該RNAiは、該ポリペプチドをコードするRNAを標的化する、前記方法。
- 哺乳動物の細胞におけるポリペプチドの蓄積を阻害するための方法であって、請求項1〜37のいずれか1項に記載のRNAi;請求項39〜44のいずれか1項に記載の発現コンストラクト;請求項45〜53のいずれか1項に記載のベクター;請求項54〜63のいずれか1項に記載のrAAVベクター;請求項65〜72のいずれか1項に記載のウイルス粒子;請求項73〜77のいずれか1項に記載のrAAV粒子;または請求項78もしくは79に記載の組成物を該哺乳動物に投与することを含み、該RNAiは、該ポリペプチドをコードするRNAを標的化する、前記方法。
- 哺乳動物は、ヒトである、請求項80または81に記載の方法。
- 請求項80〜82のいずれか1項に記載の方法で使用するための医薬品の製造における、請求項1〜37のいずれか1項に記載のRNAi;請求項39〜44のいずれか1項に記載の発現コンストラクト;請求項45〜53のいずれか1項に記載のベクター;請求項54〜63のいずれか1項に記載のrAAVベクター;請求項65〜72のいずれか1項に記載のウイルス粒子;請求項73〜77のいずれか1項に記載のrAAV粒子;または請求項78もしくは79に記載の組成物の使用。
- 請求項80〜82のいずれか1項に記載の方法で使用するための、請求項1〜37のいずれか1項に記載のRNAi;請求項39〜44のいずれか1項に記載の発現コンストラクト;請求項45〜53のいずれか1項に記載のベクター;請求項54〜63のいずれか1項に記載のrAAVベクター;請求項65〜72のいずれか1項に記載のウイルス粒子;請求項73〜77のいずれか1項に記載のrAAV粒子;または請求項78もしくは79に記載の組成物。
- 請求項1〜37のいずれか1項に記載のRNAi;請求項39〜44のいずれか1項に記載の発現コンストラクト;請求項45〜53のいずれか1項に記載のベクター;請求項54〜63のいずれか1項に記載のrAAVベクター;請求項65〜72のいずれか1項に記載のウイルス粒子;請求項73〜77のいずれか1項に記載のrAAV粒子;または請求項78もしくは79に記載の組成物を含む、哺乳動物においてRNA干渉を誘導するためのキット。
- 哺乳動物は、ヒトである、請求項85に記載のキット。
- 請求項1〜37のいずれか1項に記載のRNAi;請求項39〜44のいずれか1項に記載の発現コンストラクト;請求項45〜53のいずれか1項に記載のベクター;請求項54〜63のいずれか1項に記載のrAAVベクター;請求項65〜72のいずれか1項に記載のウイルス粒子;請求項73〜77のいずれか1項に記載のrAAV粒子;または請求項78もしくは79に記載の組成物を含む、請求項80〜82のいずれか1項に記載の方法で使用するためのキット。
- 配列5’−UAGACAAUGAUUCACACGGU−3’(配列番号1)を含むガイド領域を含む第1の鎖および配列5’−ACCGUGUGUCAUUGUCUAA−3’(配列番号2)を含む非ガイド領域を含む第2の鎖を含むRNAiであって、該第1の鎖および該第2の鎖は、二重鎖を形成し、該第2の鎖の残基18または残基19におけるA残基は、該非ガイド領域においてバルジを形成する、前記RNAi。
- ガイド領域は、配列番号1に対して約90%の同一性を有する核酸配列を含む、請求項88に記載のRNAi。
- 非ガイド領域は、配列番号2に対して約90%の同一性を有する核酸配列を含む、請求項88に記載のRNAi。
- 配列は、オフターゲットの遺伝子サイレンシングを低減するように改善されている、請求項88〜90のいずれか1項に記載のRNAi。
- 配列は、1つまたはそれ以上のCpGモチーフを含む、請求項88〜91のいずれか1項に記載のRNAi。
- 配列は、シード領域中に1つまたはそれ以上のCpGモチーフを含む、請求項88〜92のいずれか1項に記載のRNAi。
- 配列5’−UCGACAAUGAUUCACACGGU−3’(配列番号15)を含むガイド領域を含む第1の鎖および配列5’−ACCGUGUGUCAUUGUCGAA−3’(配列番号16)を含む非ガイド領域を含む第2の鎖を含むRNAiであって、該第1の鎖および該第2の鎖は、二重鎖を形成し、該第2の鎖の残基18または残基19におけるA残基は、該非ガイド領域においてバルジを形成する、前記RNAi。
- 配列5’−UAGACGAUGAUUCACACGGU−3’(配列番号17)を含むガイド領域を含む第1の鎖および配列5’−ACCGUGUGUCAUCGUCUAA−3’(配列番号18)を含む非ガイド領域を含む第2の鎖を含むRNAiであって、該第1の鎖および該第2の鎖は、二重鎖を形成し、該第2の鎖の残基18または残基19におけるA残基は、該非ガイド領域においてバルジを形成する、前記RNAi。
- ガイド領域は、配列番号15に対して約90%の同一性を有する核酸配列を含み、非ガイド領域は、配列番号16に対して約90%の同一性を有する核酸配列または配列番号17に対して約90%の同一性を有する核酸配列を含み、非ガイド領域は、配列番号18に対して約90%の同一性を有する核酸配列を含む、請求項94または95に記載のRNAi。
- ガイド領域の残基11および12におけるU残基は、ガイド領域中でバルジを形成する、請求項88〜96のいずれか1項に記載のRNAi。
- 二重鎖は、19〜25または19〜23塩基対の長さである、請求項88〜97のいずれか1項に記載のRNAi。
- 第1および/または第2の鎖は、3’オーバーハング領域、5’オーバーハング領域、または3’および5’オーバーハング領域の両方をさらに含む、請求項88〜98のいずれか1項に記載のRNAi。
- 第1の鎖および第2の鎖は、ループ構造を形成することが可能なRNAリンカーによって連結されている、請求項88〜99のいずれか1項に記載のRNAi。
- ループ構造を形成することが可能なRNAリンカーは、4〜50ヌクレオチドを含む、請求項100に記載のRNAi。
- ループ構造を形成することが可能なRNAリンカーは、4〜20ヌクレオチドを含む、請求項100または101に記載のRNAi。
- ループ構造を形成することが可能なRNAリンカーは、13ヌクレオチドを含む、請求項100〜102のいずれか1項に記載のRNAi。
- 配列番号3のヌクレオチド配列を含む、請求項88〜103のいずれか1項に記載のRNAi。
- 配列番号3のヌクレオチド配列と約90%同一なヌクレオチド配列を含む、請求項88〜103のいずれか1項に記載のRNAi。
- 低分子阻害性RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、または小ヘアピンRNA(shRNA)である、請求項88〜94のいずれか1項に記載のRNAi。
- 請求項88〜106のいずれか1項に記載のRNAiをコードする核酸を含む発現コンストラクト。
- RNAiをコードする核酸は、miRNA足場を含む、請求項107に記載の発現コンストラクト。
- RNAiをコードする核酸は、miR−155足場を含む、請求項108に記載の発現コンストラクト。
- RNAiをコードする核酸は、プロモーターに機能するように連結されている、請求項107〜109のいずれか1項に記載の発現コンストラクト。
- プロモーターは、哺乳動物の脳でRNAiを発現させることが可能である、請求項110に記載の発現コンストラクト。
- プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーター、RSV LTR、MoMLV LTR、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1(PGK)プロモーター、シミアンウイルス40(SV40)プロモーター、CK6プロモーター、トランスチレチンプロモーター(TTR)、TKプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター(TRE)、HBVプロモーター、hAATプロモーター、LSPプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター(LSP)、E2Fプロモーター、テロメラーゼ(hTERT)プロモーター;サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリベータ−アクチン/ウサギβ−グロビンプロモーター(CAG)プロモーター、延長因子1−アルファプロモーター(EF1−アルファ)プロモーター、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーター、レトロウイルス性のラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および13−アクチンプロモーターから選択される、請求項110または111に記載の発現コンストラクト。
- プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ−アクチンプロモーターである、請求項110〜112のいずれか1項に記載の発現コンストラクト。
- 発現コンストラクトは、ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項110〜113のいずれか1項に記載の発現コンストラクト。
- ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルである、請求項114に記載の発現コンストラクト。
- 請求項107〜115のいずれか1項に記載の発現コンストラクトを含むベクター。
- 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純疱疹ウイルス(HSV)ベクターである、請求項116に記載のベクター。
- 組換えアデノウイルスベクターである、請求項117に記載のベクター。
- 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24〜30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、ウシAd3型、イヌAd2型、ヒツジAd、またはブタAd3型から誘導される、請求項118に記載のベクター。
- 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型2またはアデノウイルス血清型5のバリアントから誘導される、請求項119に記載のベクター。
- 組換えレンチウイルスベクターである、請求項117に記載のベクター。
- 組換えレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、ロスリバーウイルス(RRV)、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、RD114またはそれらのバリアントで偽型化したレンチウイルスから誘導される、請求項121に記載のベクター。
- rHSVベクターである、請求項117に記載のベクター。
- rHSVベクターは、rHSV−1またはrHSV−2から誘導される、請求項123に記載のベクター。
- 組換えAAV(rAAV)ベクターである、請求項117に記載のベクター。
- 発現コンストラクトに、1つまたはそれ以上のAAVの逆方向末端反復(ITR)配列が隣接する、請求項125に記載のrAAVベクター。
- 発現コンストラクトに、2つのAAVのITRが隣接する、請求項126に記載のrAAVベクター。
- AAVのITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、ヤギAAV、ウシAAV、またはマウスAAV血清型のITRである、請求項126または127に記載のrAAVベクター。
- AAVのITRは、AAV2のITRである、請求項125〜128のいずれか1項に記載のrAAVベクター。
- 5’から3’へ、AAV2のITR、プロモーター、RNAiをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル、およびAAV2のITRを含む、請求項129に記載のrAAVベクター。
- プロモーターは、CBAプロモーターである、請求項130に記載のrAAVベクター。
- ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルである、請求項130または131に記載のrAAVベクター。
- 5’から3’へ、AAV2のITR、CBAプロモーター、RNAiをコードする核酸、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル、およびAAV2のITRを含む、請求項130〜132のいずれか1項に記載のrAAVベクター。
- スタッファー核酸をさらに含む、請求項133に記載のrAAVベクター。
- スタッファー核酸は、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする核酸を含む、請求項133に記載のrAAVベクター。
- スタッファー核酸は、プロモーターとRNAiをコードする核酸との間に配置されている、請求項134または135に記載のrAAVベクター。
- RNAiは、配列番号3のヌクレオチド配列を含む、請求項125〜136のいずれか1項に記載のrAAVベクター。
- RNAiは、配列番号3のヌクレオチド配列と約90%同一なヌクレオチド配列を含む、請求項125〜136のいずれか1項に記載のrAAVベクター。
- 自己相補的なベクターである、請求項125〜138のいずれか1項に記載のrAAVベクター。
- ベクターは、RNAiをコードする第1の核酸配列およびRNAiの相補物をコードする第2の核酸配列を含み、第1の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第2の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる、請求項139に記載のrAAVベクター。
- 第1の核酸配列および第2の核酸配列は、突然変異したAAVのITRによって連結されており、突然変異したAAVのITRは、D領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む、請求項140に記載のrAAVベクター。
- 請求項116〜124のいずれか1項に記載のベクターまたは請求項125〜141のいずれか1項に記載のrAAVベクターを含む細胞。
- 中枢神経系(CNS)細胞である、請求項142に記載の細胞。
- 請求項116に記載のベクターを含むウイルス粒子であって、rAAVベクターをキャプシド化するrAAV粒子、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド化するアデノウイルス粒子、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド化するレンチウイルス粒子、または組換えHSVベクターをキャプシド化するHSV粒子である、前記ウイルス粒子。
- 組換えアデノウイルスベクターをキャプシド化するアデノウイルス粒子である、請求項144に記載のウイルス粒子。
- アデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24〜30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、ウシAd3型、イヌAd2型、ヒツジAd、またはブタAd3型由来のキャプシドを含む、請求項145に記載のウイルス粒子。
- アデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型2のキャプシドまたはアデノウイルス血清型5のキャプシドのバリアントを含む、請求項146に記載のウイルス粒子。
- 組換えレンチウイルスベクターをキャプシド化するレンチウイルス粒子である、請求項144に記載のウイルス粒子。
- レンチウイルス粒子は、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、ロスリバーウイルス(RRV)、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、RD114またはそれらのバリアントで偽型化したキャプシドを含む、請求項148に記載のウイルス粒子。
- HSV粒子である、請求項144に記載のウイルス粒子。
- HSV粒子は、rHSV−1粒子またはrHSV−2粒子である、請求項150に記載のウイルス粒子。
- 請求項125〜141のいずれか1項に記載のrAAVベクターを含む組換えAAV粒子。
- AAVウイルス粒子は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2−7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV2 V708K、ヤギAAV、AAV1/AAV2キメラ、ウシAAV、マウスAAV、またはrAAV2/HBoV1血清型キャプシドを含む、請求項141に記載のrAAV粒子。
- ITRおよびrAAVウイルス粒子のキャプシドは、同じAAV血清型から誘導される、請求項152または153に記載のrAAV粒子。
- ITRおよびrAAVウイルス粒子のキャプシドは、異なるAAV血清型から誘導される、請求項152または153に記載のrAAV粒子。
- rAAVウイルス粒子は、AAV2キャプシドを含む、請求項152〜155のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- rAAVウイルス粒子は、AAV1キャプシドを含み、ベクターは、AAV2のITRを含む、請求項156に記載のrAAV粒子。
- 請求項144〜151のいずれか1項に記載のウイルス粒子または請求項152〜157のいずれか1項に記載のrAAV粒子を含む組成物。
- 医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項158に記載の組成物。
- 哺乳動物におけるハンチントン病を処置するための方法であって、請求項158または159に記載の組成物を該哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
- ハンチントン病を有する哺乳動物におけるhttの発現を阻害するための方法であって、請求項158または159に記載の組成物を該哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
- ハンチントン病を有する哺乳動物の細胞におけるhttの蓄積を阻害するための方法であって、請求項158または159に記載の医薬組成物を該哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
- 哺乳動物におけるハンチントン病を処置するための方法であって、配列5’−UAGACAAUGAUUCACACGGU−3’(配列番号1)を含む第1の核酸を含む第1の鎖および配列5’−ACCGUGUGUCAUUGUCUAA−3’(配列番号2)を含む第2の核酸を含む第2の鎖を含むRNAiを哺乳動物に投与することを含み、該第2の鎖の残基18または残基19におけるA残基は、該第1の鎖中の残基と塩基対を形成しない、前記方法。
- ハンチントン病を有する哺乳動物におけるhttの発現を阻害するための方法であって、配列5’−UAGACAAUGAUUCACACGGU−3’(配列番号1)を含む第1の核酸を含む第1の鎖および配列5’−ACCGUGUGUCAUUGUCUAA−3’(配列番号2)を含む第2の核酸を含む第2の鎖を含むRNAiを哺乳動物に投与することを含み、該第2の鎖の残基18または残基19におけるA残基は、該第1の鎖中の残基と塩基対を形成しない、前記方法。
- ハンチントン病を有する哺乳動物の細胞におけるhttの蓄積を阻害するための方法であって、配列5’−UAGACAAUGAUUCACACGGU−3’(配列番号1)を含む第1の核酸を含む第1の鎖および配列5’−ACCGUGUGUCAUUGUCUAA−3’(配列番号2)を含む第2の核酸を含む第2の鎖を含むRNAiを哺乳動物に投与することを含み、該第2の鎖の残基18または残基19におけるA残基は、該第1の鎖中の残基と塩基対を形成しない、前記方法。
- 第1の鎖は、配列番号1に対して約90%の同一性を有する核酸配列を含む、請求項163〜165のいずれか1項に記載の方法。
- 第2の鎖は、配列番号2に対して約90%の同一性を有する核酸配列を含む、請求項163〜165のいずれか1項に記載の方法。
- 核酸は、オフターゲットの遺伝子サイレンシングを低減するように改善されている、請求項163〜167のいずれか1項に記載の方法。
- 核酸は、1つまたはそれ以上のCpGモチーフを含む、請求項163〜168のいずれか1項に記載の方法。
- 核酸は、シード領域中に1つまたはそれ以上のCpGモチーフを含む、請求項163〜169のいずれか1項に記載の方法。
- 哺乳動物におけるハンチントン病を処置するための方法であって、配列5’−UCGACAAUGAUUCACACGGU−3’(配列番号15)を含む第1の核酸を含む第1の鎖および配列5’−ACCGUGUGUCAUUGUCGAA−3’(配列番号16)を含む第2の核酸を含む第2の鎖を含むRNAiを哺乳動物に投与することを含み、該第2の鎖の残基18または残基19におけるA残基は、該第1の鎖中の残基と塩基対を形成しない、前記方法。
- ハンチントン病を有する哺乳動物におけるhttの発現を阻害するための方法であって、配列5’−UCGACAAUGAUUCACACGGU−3’(配列番号15)を含む第1の核酸を含む第1の鎖および配列5’−ACCGUGUGUCAUUGUCGAA−3’(配列番号16)を含む第2の核酸を含む第2の鎖を含むRNAiを哺乳動物に投与することを含み、該第2の鎖の残基18または残基19におけるA残基は、該第1の鎖中の残基と塩基対を形成しない、前記方法。
- ハンチントン病を有する哺乳動物の細胞におけるhttの蓄積を阻害するための方法であって、配列5’−UCGACAAUGAUUCACACGGU−3’(配列番号15)を含む第1の核酸を含む第1の鎖および配列5’−ACCGUGUGUCAUUGUCGAA−3’(配列番号16)を含む第2の核酸を含む第2の鎖を含むRNAiを哺乳動物に投与することを含み、該第2の鎖の残基18または残基19におけるA残基は、該第1の鎖中の残基と塩基対を形成しない、前記方法。
- 第1の鎖は、配列番号15に対して約90%の同一性を有する核酸配列を含むが、CpGモチーフを維持する、請求項171〜173のいずれか1項に記載の方法。
- 第2の鎖は、配列番号16に対して約90%の同一性を有する核酸配列を含むが、CpGモチーフを維持する、請求項171〜174のいずれか1項に記載の方法。
- 哺乳動物におけるハンチントン病を処置するための方法であって、配列5’−UAGACGAUGAUUCACACGGU−3’(配列番号17)を含む第1の核酸を含む第1の鎖および配列5’−ACCGUGUGUCAUCGUCUAA−3’(配列番号18)を含む第2の核酸を含む第2の鎖を含むRNAiを哺乳動物に投与することを含み、該第2の鎖の残基18または残基19におけるA残基は、該第1の鎖中の残基と塩基対を形成しない、前記方法。
- ハンチントン病を有する哺乳動物におけるhttの発現を阻害するための方法であって、配列5’−UAGACGAUGAUUCACACGGU−3’(配列番号17)を含む第1の核酸を含む第1の鎖および配列5’−ACCGUGUGUCAUCGUCUAA−3’(配列番号18)を含む第2の核酸を含む第2の鎖を含むRNAiを哺乳動物に投与することを含み、該第2の鎖の残基18または残基19におけるA残基は、該第1の鎖中の残基と塩基対を形成しない、前記方法。
- ハンチントン病を有する哺乳動物の細胞におけるhttの蓄積を阻害するための方法であって、配列5’−UAGACGAUGAUUCACACGGU−3’(配列番号17)を含む第1の核酸を含む第1の鎖および配列5’−ACCGUGUGUCAUCGUCUAA−3’(配列番号18)を含む第2の核酸を含む第2の鎖を含むRNAiを哺乳動物に投与することを含み、該第2の鎖の残基18または残基19におけるA残基は、該第1の鎖中の残基と塩基対を形成しない、前記方法。
- 第1の鎖は、配列番号17に対して約90%の同一性を有する核酸配列を含むが、CpGモチーフを維持する、請求項176〜178のいずれか1項に記載の方法。
- 第2の鎖は、配列番号18に対して約90%の同一性を有する核酸配列を含むが、CpGモチーフを維持する、請求項176〜179のいずれか1項に記載の方法。
- 第1の核酸の残基11および12におけるU残基は、第2の鎖中の残基と塩基対を形成しない、請求項163〜180のいずれか1項に記載の方法。
- 二重鎖は、18〜25塩基対の長さである、請求項163〜181のいずれか1項に記載の方法。
- 第1および/または第2の鎖は、3’オーバーハング領域、5’オーバーハング領域、または3’および5’オーバーハング領域の両方をさらに含む、請求項163〜182のいずれか1項に記載の方法。
- 第1の鎖および第2の鎖は、ループ構造を形成することが可能なRNAによって連結されている、請求項163〜183のいずれか1項に記載の方法。
- ループ構造を形成することが可能なRNAは、4〜50ヌクレオチドまたは4〜20ヌクレオチドを含む、請求項163〜184のいずれか1項に記載の方法。
- ループ構造を形成することが可能なRNAは、13ヌクレオチドを含む、請求項163〜185のいずれか1項に記載の方法。
- RNAiは、配列番号3のヌクレオチド配列を含む、請求項163〜186のいずれか1項に記載の方法。
- RNAiは、配列番号3のヌクレオチド配列と約90%同一なヌクレオチド配列を含む、請求項163〜187のいずれか1項に記載の方法。
- RNAiの第1の鎖は、第2の鎖の5’にある、請求項163〜188のいずれか1項に記載の方法。
- RNAiの第2の鎖は、第1の鎖の5’にある、請求項163〜189のいずれか1項に記載の方法。
- RNAiは、発現コンストラクトにコードされている、請求項163〜166のいずれか1項に記載の方法。
- RNAiをコードする核酸は、miRNA足場を含む、請求項163〜191のいずれか1項に記載の方法。
- miRNA足場は、miR−155足場である、請求項192に記載の方法。
- RNAiをコードする核酸は、プロモーターに機能するように連結されている、請求項163〜193のいずれか1項に記載の方法。
- プロモーターは、哺乳動物の脳でRNAiを発現させることが可能である、請求項194に記載の方法。
- プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーター、RSV LTR、MoMLV LTR、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1(PGK)プロモーター、シミアンウイルス40(SV40)プロモーター、CK6プロモーター、トランスチレチンプロモーター(TTR)、TKプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター(TRE)、HBVプロモーター、hAATプロモーター、LSPプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター(LSP)、E2Fプロモーター、テロメラーゼ(hTERT)プロモーター;サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリベータ−アクチン/ウサギβ−グロビン(CAG)プロモーター、延長因子1−アルファプロモーター(EF1−アルファ)プロモーターおよびヒトβ−グルクロニダーゼプロモーターから選択される、請求項195に記載の方法。
- プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ−アクチンプロモーターである、請求項194〜196のいずれか1項に記載の方法。
- 発現コンストラクトは、ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項167〜173のいずれか1項に記載の方法。
- ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルである、請求項174に記載の方法。
- 発現コンストラクトは、ベクターによってコードされる、請求項191〜199のいずれか1項に記載の方法。
- ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純疱疹ウイルス(HSV)ベクターである、請求項200に記載の方法。
- ベクターは、組換えアデノウイルスベクターである、請求項201に記載の方法。
- 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24〜30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、ウシAd3型、イヌAd2型、ヒツジAd、またはブタAd3型から誘導される、請求項202に記載の方法。
- 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型2またはアデノウイルス血清型5のバリアントから誘導される、請求項203に記載の方法。
- ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである、請求項201に記載の方法。
- 組換えレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、ロスリバーウイルス(RRV)、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、RD114またはそれらのバリアントで偽型化したレンチウイルスから誘導される、請求項205に記載の方法。
- ベクターは、rHSVベクターである、請求項201に記載の方法。
- rHSVベクターは、rHSV−1またはrHSV−2から誘導される、請求項207に記載の方法。
- ベクターは、組換えAAV(rAAV)ベクターである、請求項201に記載の方法。
- 発現コンストラクトに、1つまたはそれ以上のAAVの逆方向末端反復(ITR)配列が隣接する、請求項209に記載の方法。
- 発現コンストラクトに、2つのAAVのITRが隣接する、請求項210に記載の方法。
- AAVのITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、ヤギAAV、ウシAAV、またはマウスAAV血清型のITRである、請求項210または211に記載の方法。
- AAVのITRは、AAV2のITRである、請求項210〜212のいずれか1項に記載の方法。
- rAAVベクターは、5’から3’へ、AAV2のITR、プロモーター、RNAiをコードする核酸、ポリアデニル化シグナル、およびAAV2のITRを含む、請求項213に記載の方法。
- プロモーターは、CBAプロモーターである、請求項214に記載の方法。
- ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルである、請求項214または215に記載の方法。
- rAAVベクターは、5’から3’へ、AAV2のITR、CBAプロモーター、RNAiをコードする核酸、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル、およびAAV2のITRを含む、請求項213に記載の方法。
- ベクターは、スタッファー核酸をさらに含む、請求項217に記載の方法。
- スタッファー核酸は、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする核酸を含む、請求項218に記載の方法。
- スタッファー核酸は、プロモーターとRNAiをコードする核酸との間に配置されている、請求項218または219に記載の方法。
- RNAiは、配列番号3のヌクレオチド配列を含む、請求項214〜220のいずれか1項に記載の方法。
- RNAiは、配列番号3のヌクレオチド配列と約90%同一なヌクレオチド配列を含む、請求項214〜220のいずれか1項に記載の方法。
- ベクターは、自己相補性ベクターである、請求項209〜222のいずれか1項に記載の方法。
- ベクターは、RNAiをコードする第1の核酸配列およびRNAiの相補物をコードする第2の核酸配列を含み、第1の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第2の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる、請求項223に記載の方法。
- 第1の核酸配列および第2の核酸配列は、突然変異したAAVのITRによって連結されており、突然変異したAAVのITRは、D領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む、請求項224に記載の方法。
- ベクターは、rAAV粒子中にキャプシド化されているか、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス粒子中にキャプシド化されているか、組換えレンチウイルスベクターは、レンチウイルス粒子中にキャプシド化されているか、または組換えHSVベクターは、HSV中にキャプシド化されている、請求項200または201に記載の方法。
- ウイルス粒子は、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド化するアデノウイルス粒子である、請求項226に記載の方法。
- アデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24〜30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、ウシAd3型、イヌAd2型、ヒツジAd、またはブタAd3型由来のキャプシドを含む、請求項227に記載の方法。
- アデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型2のキャプシドまたはアデノウイルス血清型5のキャプシドのバリアントを含む、請求項228に記載の方法。
- ウイルス粒子は、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド化するレンチウイルス粒子である、請求項226に記載の方法。
- レンチウイルス粒子は、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、ロスリバーウイルス(RRV)、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、RD114またはそれらのバリアントで偽型化したキャプシドを含む、請求項230に記載の方法。
- ウイルス粒子は、HSV粒子である、請求項226に記載の方法。
- HSV粒子は、rHSV−1粒子またはrHSV−2粒子である、請求項232に記載の方法。
- rAAVベクターは、組換えAAV粒子中にキャプシド化されている、請求項209〜225のいずれか1項に記載の方法。
- AAVウイルス粒子は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2−7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV2 V708K、ヤギAAV、AAV1/AAV2キメラ、ウシAAV、マウスAAV、またはrAAV2/HBoV1血清型キャプシドを含む、請求項234に記載の方法。
- ITRおよびrAAVウイルス粒子のキャプシドは、同じAAV血清型から誘導される、請求項234または235に記載の方法。
- ITRおよびrAAVウイルス粒子のキャプシドは、異なるAAV血清型から誘導される、請求項234または235に記載の方法。
- rAAVウイルス粒子は、AAV2キャプシドを含む、請求項234〜235のいずれか1項に記載の方法。
- rAAVウイルス粒子は、AAV1キャプシドを含み、ベクターは、AAV2のITRを含む、請求項237に記載の方法。
- 請求項226〜233のいずれか1項に記載のウイルス粒子または請求項234〜239のいずれか1項に記載のrAAV粒子は、組成物の形態である、請求項2226〜239のいずれか1項に記載の方法。
- 組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項240に記載の方法。
- 請求項160〜241のいずれか1項に記載の方法で使用するための医薬品の製造における、請求項86〜106のいずれか1項に記載のRNAi;請求項96〜104のいずれか1項に記載の発現コンストラクト;請求項116〜124のいずれか1項に記載のベクター;請求項125〜141のいずれか1項に記載のrAAVベクター;請求項144〜151のいずれか1項に記載のウイルス粒子;請求項152〜157のいずれか1項に記載のrAAV粒子;または請求項158もしくは159に記載の組成物の使用。
- 請求項160〜241のいずれか1項に記載の方法で使用するための、請求項86〜106のいずれか1項に記載のRNAi;請求項107〜115のいずれか1項に記載の発現コンストラクト;請求項116〜124のいずれか1項に記載のベクター;請求項125〜141のいずれか1項に記載のrAAVベクター;請求項144〜151のいずれか1項に記載のウイルス粒子;請求項152〜157のいずれか1項に記載のrAAV粒子;または請求項158もしくは159に記載の組成物。
- ハンチントン病を有する哺乳動物においてRNA干渉を誘導するためのキットであって、請求項86〜106のいずれか1項に記載のRNAi;請求項107〜115のいずれか1項に記載の発現コンストラクト;請求項116〜124のいずれか1項に記載のベクター;請求項125〜141のいずれか1項に記載のrAAVベクター;請求項144〜151のいずれか1項に記載のウイルス粒子;請求項152〜157のいずれか1項に記載のrAAV粒子;または請求項158もしくは159に記載の組成物を含む、前記キット。
- 哺乳動物は、ヒトである、請求項244に記載のキット。
- 請求項160〜241のいずれか1項に記載の方法で使用するための医薬品の製造における、請求項86〜106のいずれか1項に記載のRNAi;請求項107〜115のいずれか1項に記載の発現コンストラクト;請求項116〜124のいずれか1項に記載のベクター;請求項125〜141のいずれか1項に記載のrAAVベクター;請求項144〜151のいずれか1項に記載のウイルス粒子;請求項152〜157のいずれか1項に記載のrAAV粒子;または請求項158もしくは159に記載の組成物を含む、請求項160〜241のいずれか1項に記載の方法で使用するためのキット。
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