JP2022516779A - 二本鎖ｒｎａ及びその使用 - Google Patents

Abstract

二本鎖ＲＮＡ及びその使用本開示は、特にマカド－ジョゼフ病（ＭＪＤ）のための、アレル特異的な非侵襲性の処置に関する。本開示は、顕性の機能獲得型変異アタキシン－３タンパク質をコードするアタキシン－３遺伝子におけるエキソン一塩基多型（ＳＮＰ）に対するＲＮＡサイレンシング技術（例えば、ＲＮＡ干渉）を使用し、これにより、効果的なＭＪＤの処置をもたらす。この目的のために、上記疾患を引き起こす伸長と連鎖不平衡の関係にあるＳＮＰに対して相補的なアンチセンス配列を有する、非常に標的特異的な遺伝子サイレンシングＲＮＡを設計し、試験した。さらに、本開示は、遺伝子送達用ベクターとして選択されたアデノ随伴ウイルスベクター、特に、アデノ随伴ウイルスベクター血清型９（ＡＡＶ９）にも関するが、この特定の血清型は血液脳関門（ＢＢＢ）を効率的に通過するため、侵襲性が最小限の経路（例えば、静脈内投与）によって、前記二本鎖ＲＮＡを中枢神経系（ＣＮＳ）に送達することができる。

Description

本開示は、特にマカド－ジョゼフ病（ＭＪＤ）のための、アレル特異的な非侵襲性の処置に関する。本開示は、顕性の機能獲得型変異アタキシン－３タンパク質をコードするアタキシン－３遺伝子におけるエキソン一塩基多型（ＳＮＰ）に対するＲＮＡサイレンシング技術（例えば、ＲＮＡ干渉）を使用し、これにより、効果的なＭＪＤの処置をもたらす。この目的のために、上記疾患を引き起こす伸長と連鎖不平衡の関係にあるＳＮＰに対して相補的なアンチセンス配列を有する、非常に標的特異的な遺伝子サイレンシングＲＮＡを設計し、試験した。

さらに、本開示は、遺伝子送達用ベクターとして選択されたアデノ随伴ウイルスベクター、特に、アデノ随伴ウイルスベクター血清型９（ＡＡＶ９）にも関するが、この特定の血清型は血液脳関門（ＢＢＢ）を効率的に通過するため、侵襲性が最小限の経路（例えば、静脈内投与）によって、前記二本鎖ＲＮＡを中枢神経系（ＣＮＳ）に送達することができる。

マカド－ジョゼフ病（ＭＪＤ）は、小脳機能障害及び運動協調性の喪失を特徴とする常染色体顕性神経変性障害である。この障害は、世界中で最も一般的な種類の脊髄小脳失調症に相当するものであるが、アタキシン－３遺伝子（ＭＪＤ１／ＡＴＸＮ３遺伝子）のコード領域における遺伝子変異によって引き起こされる。この遺伝子変異には、ＣＡＧトリヌクレオチドリピートとして知られた、アタキシン－３遺伝子のＤＮＡセグメントを要する。通常、人間のアタキシン－３遺伝子中のＣＡＧセグメントは、複数回、すなわち、約１０～４２回繰り返されている。ＭＪＤを発症する人々は、少なくとも１つのアレルにおいて、ＣＡＧリピートの数が増加している。発症者には通常、発症した片方の親から変異アレルが遺伝している。５１超のＣＡＧリピートを有する人々には、ＭＪＤの徴候及び症状を発症する可能性があるが、６０以上のリピートを有する人々は、ほぼ必ず障害を発症する。ＣＡＧリピートのサイズが増大すると、細長い（変異した）アタキシン－３タンパク質が生成される。このタンパク質は細胞内で処理されて、ニューロン内に蓄積及び凝集する細胞傷害性のより小さいフラグメントになる。これは、複数の発症機構を誘導し、最終的には、いくつかの脳領域に神経変性を起こすことになるが、これが、ＭＪＤの徴候及び症状の根本原因となる。

ＭＪＤを矯正するための最も直接的で、特異的で、効果的なソリューションの１つは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて変異アタキシン－３発現を阻害することにより、障害の一次的原因を標的とすることであろう。ＲＮＡｉは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列特異的なダウンレギュレーションを伴う自然発生の機構である。ｍＲＮＡのダウンレギュレーションにより、発現するタンパク質の量が減少する。ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘導される。ｄｓＲＮＡの鎖のうちの１つは、標的であるｍＲＮＡに対して実質的に又は完全に相補的である。この鎖は、ガイド鎖又はアンチセンス鎖と呼ばれる。ＲＮＡｉの機構は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へのガイド鎖の取り込みを伴う。このプロセスにおいて、ＲＩＳＣは、５’末端がその相補体とより緩く対合する鎖を好む。ＲＩＳＣは、相補的な塩基対の形成によって標的ｍＲＮＡに結合する、マルチプルターンオーバー複合体である。一旦標的ｍＲＮＡに結合したら、ＲＩＳＣは、ｍＲＮＡを切断し、又は翻訳効率を低下させることができる。ＲＩＳＣは、ガイド鎖のヌクレオチド１０及び１１に対合した残基間にあるｍＲＮＡを切断することができる。ＲＮＡｉは、発見されてから、特定の標的遺伝子をノックダウンするために幅広く使用されてきた。ＲＮＡｉを誘導するために利用されてきたトリガーは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の使用を伴う。さらに、ＲＮＡｉを自然に誘導することができる分子、いわゆるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、天然に存在する対応物を模倣する人工ｍｉＲＮＡを作製するために使用されてきた。これらの戦略は、選定した遺伝子を標的化するように設計されたｄｓＲＮＡ分子を用意するという共通点を有する。ＲＮＡｉの配列特異的な様式を利用するＲＮＡｉをベースとする治療法が開発中であり、現在、いくつかは臨床試験中である。

ＲＮＡ干渉は、変異アタキシン－３遺伝子と非変異アタキシン－３遺伝子との両方の標的化に利用されてきた（ＷＯ２００５１０５９９５、Ａｌｖｅｓら、２０１０）。後者の場合、ラットにおける正常なアタキシン－３タンパク質のノックダウンには、いかなる明らかな有害な効果もないことが示された。しかしながら、ヒトの脳の神経細胞が変異アタキシン－３遺伝子と非変異アタキシン－３遺伝子との両方の長期のサイレンシングに耐えられるかどうかは、判明していない。したがって、ＭＪＤには何十年にもわたる治療が必要とされるため、サイレンシングを制御する又は変異アレルのみを阻害する努力が検討されるべきである。

最も特異的で効果的なソリューションのうちの１つは、アタキシン－３遺伝子のコード領域内に位置するＳＮＰ、特に、疾患アレルと連鎖不平衡の関係にあるＳＮＰベースヌクレオチドを標的化することであろう。例えば、伸長ＣＡＧトラクトの３’末端に位置するＳＮＰ（Ｃ^９８７ＧＧ／Ｇ^９８７ＧＧ：ｒｓ１２８９５３５７）中のシトシン（Ｃ）は、上記疾患と連鎖不平衡の関係にあるものとして記述されており、世界中のＭＪＤ患者の７０％では異常なＣＡＧリピート伸長が伴う。

変異アタキシン－３遺伝子のアレル特異的な抑制は、ｒｓ１２８９５３５７のシトシン（Ｃ）を対象とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを使用して、細胞（ＵＳ１００７２２６４Ｂ２）及びＭＪＤのげっ歯類モデル（Ａｌｖｅｓら、２００８ａ、Ｎｏｂｒｅｇａら、２０１３）で調査されてきた。しかしながら、これらの従前の研究においては、設計された配列は、変異アレルの完全なアレル特異的サイレンシングを行うことができなかった。さらに、げっ歯類モデルの中枢神経系（ＣＮＳ）におけるサイレンシング配列の毒性は、持続的な処置又は野生型動物においては、評価されなかった。実際、ｓｈＲＮＡは、長期の処置の場合、又は高用量が使用された場合においては、強い脳毒性につながり得ると最近では報告されている。有毒な副作用は、細胞のＲＮＡｉ機構の飽和及び内因性ｍｉＲＮＡ発現の変化と関連付けられている。さらに、従前のげっ歯類モデルにおける変異アタキシン－３のアレル特異的ウイルスベースサイレンシングは、開頭術及び脳実質内へのウイルスベクターの直接投与を要していたが、このウイルスベクターの直接投与は、侵襲性の手順であり、潜在的な有害作用と関連付けられおり、脳の隅々までベクターが分散されるのを制限するが、これにより、ＭＪＤの発症領域がすべて標的化されるわけではなくなってしまう。

ＷＯ２００５１０５９９５

Ａｌｖｅｓら、２０１０ Ａｌｖｅｓら、２００８ａ Ｎｏｂｒｅｇａら、２０１３

上記の事実は、本開示によって対処する技術的課題を説明するために開示されている。

ＭＪＤは変異アタキシン－３タンパク質の発現を伴い、変異アタキシン－３タンパク質の蓄積は疾患につながるため、ＲＮＡｉは、アタキシン－３遺伝子の発現を低減することができるという理由から、疾患を治療できる可能性をもたらす。この手法の基礎をなす理論的枠組みは、正常なアタキシン－３ ｍＲＮＡを保存しながら、変異アタキシン－３ ｍＲＮＡのレベルを低下させることにより、変異アタキシン－３タンパク質に起因する毒性作用を低減して、ＭＪＤ症状の低減及び／若しくは遅延を達成し、又はＭＪＤ症状を完全に予防するものである。

本開示は、第１のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡ配列が、実質的に相補的であり、第１のＲＮＡ配列が、少なくともヌクレオチド１９個分の配列長を有し、好ましくは１９～２３個のヌクレオチドの配列長を有し、配列番号１、７、１３又は１９に対して相補的である、第１のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡ配列を含む、ＳＮＰ標的化用ｄｓＲＮＡを提供する。前記ｄｓＲＮＡは、ヒト変異アタキシン－３遺伝子に対して標的特異的なＲＮＡｉを誘導するのに使用するためのものである。

本開示のＳＮＰ標的化用ｄｓＲＮＡは、２つの疾患アレルコード領域、すなわち、ｒｓ１２８９５３５７（エキソン１０）及びｒｓ１０４８７５５（エキソン８）（図１）に存在するＳＮＰの標的化を伴う。このようなｄｓＲＮＡは単独で又は組み合わせて、トランスフェクションによって細胞内に直接送達して、又は、ＤＮＡの送達（例えば、トランスフェクション）を介して、若しくは、前記ｄｓＲＮＡを発現させることが可能なベクターによって媒介される発現を介して、細胞内に間接的に送達して、ｒｓ１２８９５３５７（Ｃ^９８７ＧＧ／Ｇ^９８７ＧＧ）（エキソン１０）のシトシン（Ｃ）（配列番号２、３、４、５及び６）若しくはグアニン（Ｇ）（配列番号８、９、１０、１１及び１２）；又は、ｒｓ１０４８７５５（Ａ^６６９ＴＧ／Ｇ^６６９ＴＧ）（エキソン８）のアデニン（Ａ）（配列番号１４、１５、１６、１７及び１８）若しくはグアニン（Ｇ）（配列番号２０、２１、２２、２３及び２４）を含む、変異したアタキシン－３遺伝子の発現を特異的に標的化及び低減することができる。代替的には、ＳＮＰ標的化用ｄｓＲＮＡを組み合わせて使用して、非変異アタキシン－３遺伝子と変異アタキシン－３遺伝子との両方を標的化することもできる。

特に、第１の鎖／配列が配列番号２である設計された本開示のＳＮＰ標的化用ｄｓＲＮＡの１つは、ｍｉＲＮＡスキャフォールドに入った状態で用意された場合、ｒｓ１２８９５３５７のＣヌクレオチドを標的化することによって、変異アタキシン－３ ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを低下させることが可能だった。このｄｓＲＮＡは、当技術分野の従来のＳＮＰ標的化用ｄｓＲＮＡに比較して改善をもたらしており、変異アタキシン－３遺伝子をより特異的に標的化するものである。ｍｉＲＮＡカセットにおけるＡＡＶ９によって媒介される発現を介して、ＭＪＤのレンチウイルスベースマウスモデルの線条体に送達された場合、神経細胞死及び変異アタキシン－３凝集体を低減することが可能だった。さらに、非常に重症のＭＪＤのトランスジェニックマウスモデルでは、静脈内投与すると、運動行動障害、小脳の神経病理、及び、磁気共鳴分光法におけるバイオマーカーの機能不全を低減することも可能だった。

本開示によるｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡとして用意することができる。このようなｄｓＲＮＡは例えば、例えばトランスフェクション法を用いた細胞内への取り込みによって、標的細胞に直接送達することができる。好ましくは、前記送達は、遺伝子治療用ベクターを用いて達成されるが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡのための発現カセットは、ベクターに含まれる。このように、細胞に一定のｄｓＲＮＡを供給すれば、反復投与を必要とすることなく、持続的なアタキシン－３遺伝子の抑制を実現することができる。好ましくは、選定したウイルスベクターは、ＡＡＶ９又はＡＡＶ９誘導体であるが、その理由は、この特定のＡＡＶ血清型がＢＢＢを効率的に通過し、静脈内投与を可能にするためである。ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、又は、ＰＨＰ．Ｂ若しくはＰＨＰ．ｅＢ若しくはＰＨＰ．Ｓ等の誘導体は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｖｉｒａｌ－ｓｅｒｖｉｃｅ／ａａｖ－ｐｒｅｐ／から入手することができる。

したがって、本開示は、ＭＪＤの処置等、本開示によるｄｓＲＮＡの医療目的での使用を提供し、このような医療目的での使用は、本開示の前記ｄｓＲＮＡを発現させることができる、発現カセット又はＡＡＶ９等のウイルスベクターも含み得る。

本開示は、
ＲＮＡの第１の鎖及びＲＮＡの第２の鎖が、互いに対して実質的に相補的であり、好ましくは、ＲＮＡの第１の鎖及び第２の鎖が、互いに対して少なくとも９０％相補的であり；
ＲＮＡの第１の鎖が、少なくともヌクレオチド１９個分の配列長を有し；
ＲＮＡの第１の鎖が、配列番号１、７、１３又は１９に対して少なくとも８６％相補的であり；
ＲＮＡの第１の鎖が、配列番号２６とは異なり；
ＲＮＡの第１の鎖の第１のヌクレオチドが、シトシンとは異なる、
ＲＮＡの第１の鎖及びＲＮＡの第２の鎖を含む二本鎖ＲＮＡに関する。

一実施形態において、ＲＮＡの第１の鎖は、少なくともヌクレオチド１９個分からヌクレオチド２３個分までの配列長を有することができ、好ましくは、ＲＮＡの第１の鎖は、ヌクレオチド２０～２２個分の配列長を有することもでき、より好ましくは、より良好な結果を得るために、ＲＮＡの第１の鎖は、ヌクレオチド２１～２２個分の配列長を有することもでき、さらにより好ましくは、より良好な結果を得るために、ＲＮＡの第１の鎖は、ヌクレオチド２２個分の配列長を有してもよい。

一実施形態において、ＲＮＡの第１の鎖は、配列番号２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２３又は２４に対して９０％同一であってよく；好ましくは、配列番号２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２３又は２４に対して９５％同一であってよく；より好ましくは、配列番号２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２３又は２４に対して１００％同一であってよい。

同一性は、下記の表にまとめられているようにして判定した。

一実施形態において、ＲＮＡの第１の鎖は、配列番号１、７、１３又は１９に対して少なくとも９０％相補的であってよく、好ましくは、配列番号１、７、１３又は１９に対して９５％相補的であってよく、より好ましくは、配列番号１、７、１３又は１９に対して９９％相補的であってよく、さらにより好ましくは、ＲＮＡの第１の鎖は、配列番号１、７、１３又は１９に対して１００％相補的である。

一実施形態において、ＲＮＡの第１の鎖は、配列番号２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２３又は２４から選択することができる。

一実施形態において、より良好な結果を得るために、ＲＮＡの第１の鎖は、配列番号１に対して相補的であってもよく、ＲＮＡの第１の鎖は、配列番号２、３、４、５又は６から選択することもできる。

一実施形態において、より良好な結果を得るために、ＲＮＡの第１の鎖は、配列番号２又は配列番号３であってもよい。

一実施形態において、ＲＮＡの第１の鎖は、配列番号７に対して相補的であってよく、ＲＮＡの第１の鎖は、配列番号８、９、１０、１１又は１２から選択することができる。

一実施形態において、ＲＮＡの第１の鎖は、配列番号１３に対して相補的であってよく、ＲＮＡの第１の鎖は、配列番号１４、１５、１６、１７又は１８から選択することができる。

一実施形態において、ＲＮＡの第１の鎖は、配列番号１９に対して相補的であってよく、ＲＮＡの第１の鎖は、配列番号２０、２１、２２、２３又は２４から選択することができる。

一実施形態において、より良好な結果を得るために、ＲＮＡの第１の鎖の第１のヌクレオチドは、ウラシルであってもよい。

一実施形態において、二本鎖ＲＮＡは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡスキャフォールド、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡスキャフォールド、ｍｉＲＮＡスキャフォールド、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡに含まれていてもよく、好ましくは、ｍｉＲＮＡスキャフォールド又はｓｈＲＮＡに含まれていてもよく、より好ましくはｍｉＲＮＡに含まれていてもよい。

一実施形態において、二本鎖ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡスキャフォールドの中に含まれていてもよく、好ましくは、Ｃｈｕｎｇら、（２００６）によって開示されたｍｉＲＮＡスキャフォールド等、ｍｉＲ－１５５に由来するｍｉＲＮＡスキャフォールドの中に含まれていてもよく、より好ましくは、ｍｉＲ１５５をベースとするスキャフォールドは、配列番号２７、２８及び２９を含む。

本開示は、本明細書に開示されている二本鎖ＲＮＡをコードする単離されたＤＮＡ配列、前記単離されたＤＮＡ配列又は前記二本鎖ＲＮＡを含む発現カセットにも関する。

本開示は、本明細書に開示されている単離されたＤＮＡ又は二本鎖ＲＮＡ又は発現カセットを含む、ベクターにも関し；好ましくは、前記ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター又はレンチウイルスベクター又はアデノウイルスベクター又は非ウイルスベクターであり；より好ましくは、アデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ１０又はＰＨＰ．Ｂ又はＰＨＰ．ｅＢ又はＰＨＰ．Ｓである。

本開示は、本明細書に開示されている単離されたＤＮＡ配列又は二本鎖ＲＮＡ又は発現カセット又はベクターを含む、宿主細胞にも関し、好ましくは、前記宿主細胞は、真核細胞であり、より好ましくは、前記宿主細胞は、ほ乳類細胞である。

本開示は、本明細書に開示されている単離されたＤＮＡ又は二本鎖ＲＮＡ又は発現カセット又はベクター又は宿主細胞を含む、組成物にさらに関する。

本開示は、本明細書に開示されている単離されたＤＮＡ配列又は二本鎖ＲＮＡ又は発現カセット又はベクター又は宿主細胞又は組成物を含む、キットにさらに関する。

さらに、本開示は、医薬品における使用のための二本鎖ＲＮＡ、前記二本鎖ＲＮＡをコードする単離されたＤＮＡ配列を含むベクター、又は、前記単離されたＤＮＡ配列を含む発現カセットにも関する。

本開示は、神経変性疾患の処置若しくは予防又は前記神経変性疾患の細胞毒性効果の処置若しくは予防における使用のための二本鎖ＲＮＡ、前記二本鎖ＲＮＡをコードする単離されたＤＮＡ配列を含むベクター、又は、前記単離されたＤＮＡ配列を含む発現カセットにさらに関し、好ましくは、神経変性疾患は、トリヌクレオチドリピート病であってよく、より好ましくは、神経変性疾患は、ＣＡＧトリヌクレオチドリピート病であってよく、さらにより好ましくは、二本鎖ＲＮＡ、ベクター又は発現カセットは、ニューロメタボライト（ｎｅｕｒｏｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）のレベルを制御するために投与され、好ましくは、Ｎ－アセチルアスパルテートを増加させ、ミオイノシトール、グリセロホスホコリン及びホスホコリンを減少させるために投与される。

一実施形態において、神経変性疾患は、マカド－ジョゼフ病である。

一実施形態において、二本鎖ＲＮＡは、全身投与され、静脈内投与され、腫瘍内投与され、経口投与され、鼻腔内投与され、腹腔内投与され、筋肉内投与され、脊椎内投与され、脳内投与され、脳室内投与され、大槽内投与され、髄腔内投与され、眼内投与され、心臓内投与され、皮内投与され、又は皮下投与され、好ましくは、静脈内投与され、大槽内投与され、髄腔内投与され、又は、インサイチューで脳内投与される。

本開示において、相補的という用語は、水素結合を介して別の核酸配列に結合することができる核酸配列のヌクレオチド、すなわち、塩基対を形成することができるヌクレオチドを意味する。相補的なＲＮＡ鎖は、二本鎖ＲＮＡを形成する。二本鎖ＲＮＡは、２つの独立した相補的なＲＮＡ鎖から形成されてもよいし、又は、２つの相補的なＲＮＡ鎖は、１つのＲＮＡ鎖に含まれてもよい。相補的なＲＮＡ鎖の中では、ヌクレオチドであるシトシンとグアニン（Ｃ及びＧ）が塩基対を形成することができ、グアニンとウラシル（ＧとＵ）も塩基対を形成することができ、ウラシルとアデニン（ＵとＡ）も塩基対を形成することができ。

本開示において、実質的な相補性という用語は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とを完全に相補的なものにし、又は第１のＲＮＡ配列と配列番号１、７、１３若しくは１９とを完全に相補的なものにする必要がないことを意味する。

さらに、本開示において、第１のＲＮＡ配列と配列番号１、７、１３又は１９との間での実質的な相補性は、ミスマッチを有さず、１個のミスマッチしたヌクレオチドを有し、２個のミスマッチしたヌクレオチドを有し、又は３個のミスマッチしたヌクレオチドを有することを意味する。例えば、第１のＲＮＡ配列と配列番号１とを考えた場合、１個のミスマッチしたヌクレオチドは、配列番号１との間で塩基対を形成する第１のＲＮＡ配列の全長にわたって、１個のヌクレオチドが、配列番号１との間で塩基対を形成しないことを意味すると解される。ミスマッチを有さないことは、すべてのヌクレオチドが、配列番号１との間で塩基対を形成することを意味する。２個のミスマッチを有することは、２個のヌクレオチドが、配列番号１との間で塩基対を形成しないことを意味する。３個のミスマッチを有することは、３個のヌクレオチドが、配列番号１との間で塩基対を形成しないことを意味する。同じことは、第１のＲＮＡ配列と配列番号７、第１のＲＮＡ配列と配列番号１３、又は、第１のＲＮＡ配列と配列番号１９にも当てはまる。

本開示において、第１のＲＮＡ配列は、ヌクレオチド１９個分より長くてもよく；この場合、実質的な相補性は、配列番号１の全長にわたって判定される。これは、配列番号１が、この実施形態においては、第１のＲＮＡ配列との間で塩基対を形成したときに、配列番号１の全長にわたってミスマッチを有さず、１個のミスマッチを有し、又は２個のミスマッチを有することを意味する。以下の表は、上記段落で説明した事柄を示している。

以下の図面は、本明細書を説明するための好ましい実施形態を提供するが、開示の範囲を限定するものとして考えるべきではない。

ＭＪＤ１遺伝子並びにエキソン一塩基多型ｒｓ１０４８７５５及びｒｓ１２８９５３５７の概略図である。ＭＪＤ１遺伝子は、１１のエキソン（灰色の枠）によって構成される。ＣＡＧリピートは、エキソン１０に位置し、ＭＪＤは、５１超の反復によって引き起こされ得る。ＳＮＰは、ＣＡＧリピート伸長（ヌクレオチド９８７）の直後に同定された（ｒｓ１２８９５３５７）。非変異アレルは、一般的には、この位置にグアニン（Ｇ）を示すが、変異アレルは、ＭＪＤ患者の７０％では、シトシン（Ｃ）を示す。別のＳＮＰが、エキソン８（ヌクレオチド６６９）に同定された（ｒｓ１０４８７５５）。この場合、非変異アレルは、通常、この位置にグアニン（Ｇ）を示すが、変異アレルは、ＭＪＤ患者の７０％では、アデニン（Ａ）を示す。 ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３が、インビトロでの変異アタキシン－３の効率的なアレル特異的サイレンシングを媒介する、図である。（ａ） 人工マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ：マイクロＲＮＡ）及び短鎖ヘアピン（ｓｈ）型ベクターコンストラクトの図。人工マイクロＲＮＡコンストラクトは、変異アタキシン－３を特異的にサイレンシングするために、本明細書に開示されているサイレンシング配列である配列番号２をベースとして設計された（ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３）。いかなるほ乳類ＲＮＡもサイレンシングしない配列を有する対照ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ）も設計された。前述の人工マイクロＲＮＡコンストラクトと、対照ｍｉＲＮＡは両方とも、Ｕ６プロモーターの制御下で、ＥＧＦＰレポーター遺伝子と一緒にして、ＡＡＶ２プラスミドベクター骨格に挿入された。変異アタキシン－３を特異的に標的化する当技術分野において公知（Ａｌｖｅｓら、２００８ａ）のｓｈＲＮＡをコードするプラスミドも使用した（ｓｈ－ｍｕｔＡＴＸＮ３）；ｂ、ｃ） ７２Ｑ付きのヒト変異アタキシン－３（ｂ）又は２７Ｑ付きのヒト野生型アタキシン－３（ｃ）をコードするレンチウイルスベクターをあらかじめインフェクションさせたＮｅｕｒｏ２ａ細胞（マウス神経冠由来細胞株）に、ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ（対照条件）、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３及びｓｈ－ＡＴＸＮ３をコードするプラスミドをトランスフェクトした。ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３は、ヒト変異アタキシン－３ ｍＲＮＡレベルの４２．０３±６．２６％の低下を誘導したが、ヒトアタキシン－３の野生型ｍＲＮＡレベルには影響しなかった。これらの結果は、それぞれｄ）及びｅ）におけるウェスタンブロッティングによって裏付けられた。データは、平均±ｓｅｍを示している；ＮＳ Ｐ＞０．０５、^＊Ｐ＜０．０５及び^＊＊Ｐ＜０．０１。ｂ、ｃ、ｄ、ｅ） 一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定。ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ ｎ＝５；ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３ ｎ＝５；ｓｈ－ＡＴＸＮ３ ｎ＝５。正規化のための内部対照は、ＧｅＮｅｘによる分析に応じて選択されたが、内因性マウスアタキシン－３及びグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡレベルに対応する。ＣＭＶ、サイトメガロウイルスエンハンサー；ＣＢＡ、ニワトリβ－アクチンプロモーター；ＥＧＦＰ、高感度緑色蛍光タンパク質；ＩＴＲ、末端逆位反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）。 配列番号２（ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３）と同様に、インビトロでの変異アタキシン－３の効率的なアレル特異的サイレンシングを媒介する、配列番号３の図である。ａ、ｂ） ７２Ｑ付きのヒト変異アタキシン－３（ａ）又は２７Ｑ付きのヒト野生型アタキシン－３（ｂ）をコードするレンチウイルスベクターをあらかじめインフェクションさせたＮｅｕｒｏ２ａ細胞に、ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ、配列番号２（ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３）、配列番号３又はｓｈ－ＡＴＸＮ３をコードするプラスミドをトランスフェクトした。配列番号３をコードする人工ｍｉＲ１５５をベースとするコンストラクトは、配列番号２（ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３）をコードするコンストラクトに類似したヒト変異アタキシン－３ ｍＲＮＡレベルの低下を誘導したが、野生型ｍＲＮＡレベルには影響しなかった。データは、平均±ｓｅｍを示している；ＮＳ Ｐ＞０．０５、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１及び^＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ａ、ｂ） 一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定。ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ ｎ＝５；ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３ ｎ＝５；配列番号３ ｎ＝５及びｓｈ－ＡＴＸＮ３ ｎ＝５。正規化のための内部対照は、ＧｅＮｅｘによる分析に応じて選択されたが、内因性マウスアタキシン－３及びグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡレベルに対応する。 ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３処置が、インビトロでの内因性マウスアタキシン－３ ｍＲＮＡレベルの変化を誘導しない、図である。（ａ、ｂ） （ａ） ヒト変異アタキシン－３（７２Ｑ）又は（ｂ） ヒト野生型アタキシン－３（２７Ｑ）をインフェクションさせたＮｅｕｒｏ２ａ細胞に、ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３及びｓｈ－ＡＴＸＮ３をコードするプラスミドをトランスフェクトした。マウスアタキシン－３ ｍＲＮＡの相対的な発現レベルは、定量的逆転写ＰＣＲによって判定された。データは、相対的な平均ｍＲＮＡレベル±ｓｅｍを示している；ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌに比較したとき、ｎｓ＝ｐ＞０．０５。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定。ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ ｎ＝５；ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３ ｎ＝５；ｓｈ－ＡＴＸＮ３ ｎ＝５。 ＭＪＤのレンチウイルスベースマウスモデルに頭蓋内注射したときに、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３が、変異アタキシン－３ ｍＲＮＡ及び凝集した変異アタキシン－３のレベルを低下させ、線条体変性を防止する、図である。（ａ） ＭＪＤの線条体レンチウイルスベースマウスモデルを作製し、ＡＡＶ９を使用して変異アタキシン－３をサイレンシングするために使用された、戦略の概略図。１０週齢マウスの線条体に、７２Ｑ付きのヒト変異アタキシン－３をコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ－Ａｔｘ３－ＭＵＴ）と、右半球用のｍｉＲ－ＡＴＸＮ３をコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３）及び左半球用のｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ）とを左右相称に同時注射した。手術から５週間後、マウスを安楽死させた。（ｂ） 両方のｒＡＡＶ９ベクターによる、ＭＪＤの線条体レンチウイルスモデルのマウス線条体の効果的なトランスダクションを示している、共焦点顕微鏡法の画像。（ｃ） 定量的逆転写ＰＣＲ分析により、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３が、６３．７５±２を誘導することが実証された。対照用の左半球に比較して、変異アタキシン－３ ｍＲＮＡのレベルの２５％の低下。（ｄ） ウエスタンブロット分析によっても、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３発現が変異アタキシン－３凝集体を有意に低減することが確認された。（ｅ） ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ又はｍｉｒ－ＡＴＸＮ３を同時注射されたＭＪＤの線条体レンチウイルスベースマウスモデルの線条体における、ユビキチン免疫反応性。（ｆ）では、変異アタキシン－３封入体の総数をカウントし、定量化した。スケールバー、５０μｍ。（ｇ） ＤＡＲＰＰ－３２の染色により、ヒト変異アタキシン－３とｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌとを同時インフェクションさせた半球の線条体における、ＤＡＲＰＰ－３２免疫反応性の大きな低下が明らかになった。スケールバー、２００μｍ。（ｈ）では、これを、ＤＡＲＰＰ－３２染色の体積の減少として定量化した。（ｉ） 両方の半球におけるピクノーシス核を示している、クレシルバイオレット染色。対照半球においては、より多数のピクノーシス核が視認可能だった。ｊ）では、これを定量化した。スケールバー、２０μｍ。データは、平均±ｓｅｍを示している；対照半球との比較で、ｎｓ ｐ＞０．０５、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１。（ｃ、ｄ） 対応のあるスチューデントのｔ検定。ｎ＝５。（ｆ、ｈ） 対応のあるスチューデントのｔ検定。ｎ＝８。（ｊ） 対応のあるスチューデントのｔ検定。ｎ＝４。 静脈内注射されたｒＡＡＶ９ベクターが、野生型ＭＪＤマウス及びトランスジェニックＭＪＤマウスの脳の全体にわたって、効率的なトランスダクションを媒介する、図である。月齢３か月のマウスの脳におけるＧＦＰ免疫組織化学（灰色）の代表画像：Ａ） 注射なしのトランスジェニックマウス；Ｂ） 生後１日目でｒＡＡＶ９－ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３ ＩＶ注射を受けたトランスジェニックマウス；Ｃ） 同じ手順に供した野生型マウス。画像は、５倍及び２０倍の倍率で得られた、脳全体、小脳（ＣＢ）、海馬（ＨＩＰ）、橋核（ＰＮ）及び延髄／脊髄（Ｍｄ／ＳＣ：ｍｅｄｕｌｌａ／ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ）のｒＡＡＶ９トランスダクションを示している。 ｒＡＡＶ９ベクターが、トランスジェニックマウスの小脳の効率的なトランスダクションを示す、図である。ｒＡＡＶ９－ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３新生仔ＩＶ注射を受けた月齢３か月のマウスの小脳における、視認可能なＧＦＰ免疫組織化学（灰色）の代表画像。画像は２０倍の倍率で得たが、深部小脳核（ＤＣＮ）、第１０、第９、第７及び第６小葉、並びに、第四脳室（４Ｖ）の脈絡叢細胞を含む、特に効率的なトランスダクションの小脳領域を示している。 ｒＡＡＶ９が、トランスジェニックマウスの小脳における変異アタキシン－３の蓄積の主要領域を標的化する、図である。代表画像は、Ｐ１にｒＡＡＶ９－ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３注射を受けたトランスジェニックマウスの小脳における、ＨＡ及びＧＦＰを対象とする免疫蛍光法を示している。画像は、２０倍の倍率の共焦点顕微鏡で得た。ａ） ＨＡシグナルとＧＦＰシグナル（白色）との共局在を示している、ｒＡＡＶ９陽性のプルキンエ細胞の代表画像。ＤＣＮ 深部小脳核；ＰＣＬ プルキンエ細胞層。 変異アタキシン－３のサイレンシングが、ＭＪＤトランスジェニックマウスにおけるロータロッド成績を改善する、図である。ａ） ３つの重要な作業に分割されている、ＭＪＤトランスジェニックマウスの実験計画：１） ＰＮ１におけるＡＡＶ９静脈内注射；２） ３つの異なる時点における行動判定、並びに、３） 屠殺及び神経病理学的分析。ｂ） 一定の速度（５ｒｐｍ）におけるロータロッド成績。ｃ） 速度を加速させていったときのロータロッド成績。データは、対照マウス（ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ、ｎ＝１１）及びｍｉＲ－ＡＴＸＮ３（ｎ＝８）を注射されたマウスを対象にして、落下までに要する平均待ち時間±ＳＥＭとして提示されている。統計解析は、対応のないスチューデントのｔ検定（^＊Ｐ≦０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１）を用いて実施された。 ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３処置が、ＭＪＤトランスジェニックマウスの水泳、梁歩行成績及び歩行失調を改善する、図である。ａ ）動物は、プールを泳ぎ切り、台を登るまでにかかった時間に基づいて評価された。データは、平均待ち時間±ＳＥＭとして提示されている。ｂ） 動物は、９ｍｍの円形の梁を歩行したときの成績に基づいて評価された。梁を通過するまでの合計時間と、運動協調性とを考慮して、各動物にスコアを付与した。歩行パターンは、ｃ） 後側歩隔幅、ｄ） 前側歩隔幅及びｅ） 足跡の重複（ｃｍ）を測定することによって分析された。データは、平均成績スコア±ＳＥＭとして提示されている。統計解析は、対照マウス（ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ、ｎ＝１１）の成績と、ｒＡＡＶ９－ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３（ｎ＝８）を注射されたマウスの成績とを比較して、対応のないスチューデントのｔ検定（^＊ｐ＜０．０５）を用いて実施された。 ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３処置が、変異アタキシン－３凝集体の数を効率的に減らし、分子層厚さを効率的に保つ、図である。ａ） 対照（ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ）トランスジェニックマウス及び処置された（ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３）トランスジェニックマウスの第１０小葉内の変異アタキシン－３（白色のＨＡ）を標識した、免疫蛍光法の代表画像。画像は、２０倍の倍率にした共焦点顕微鏡で得られた。ｂ） 第１０、第９及び第６小葉におけるある面積当たりの変異アタキシン－３凝集体の定量化。ｃ） ２０倍の倍率で得られた、処置されたトランスジェニックマウス及び対照トランスジェニックマウスの第１０小葉のクレシルバイオレット染色の代表画像。ｄ） 第１０、第９及び第６小葉における分子層厚さの定量化。値は、各動物（ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ、ｎ＝１１；ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３、ｎ＝８）の３個の特定の切片の平均±ＳＥＭに対応する。統計解析は、対応のないスチューデントのｔ検定（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１）を用いて実施された。ＭＬ 分子層厚さ；Ｌｏｂ１０ 第１０小葉 本開示においてＡＡＶ９－ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３の治療効果の基礎をなす、可能な機構の概略図である。ｉ） ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３をコードするｒＡＡＶ９ベクターを、新生仔ＭＪＤトランスジェニックマウスに静脈内注射すると、ｉｉ） 小脳において変異アタキシン－３のサイレンシングが起き、この結果、ｉｉｉ） 神経病理学的障害及び行動障害が軽減された。ｒＡＡＶ９ベクターにより、プルキンエ細胞（ＰＣ）が第１０小葉及び第９小葉内に効率的にトランスダクションされたが、他の機構も、プルキンエ細胞（ＰＣ）のトランスダクションレベルを高め、並びに／又は、１） 血液からＣＳＦへのウイルスベクターの移送、及び／若しくは、脈絡叢内のトランスダクションされた上皮細胞によるＣＳＦへのｍｉＲコンストラクトの分泌；２） ＤＣＮからＰＣ層へのｒＡＡＶ９の逆行輸送、及び／若しくは、ＤＣＮ内のトランスダクションされた細胞からＰＣの突起部へのｍｉＲの移送；３） 隣接するＰＣ間でのｍｉＲの移送；４ ）にｒＡＡＶ９陽性のＰＣよって誘導される神経保護効果等の有益な効果を高めることができる可能性がある。ＣＳＦ 脳せき髄液；ＤＣＮ 深部小脳核；ＰＣ プルキンエ細胞 異なるｒＡＡＶ９トランスダクションレベルが、処置されたマウスの神経病理学的パラメータ及び行動パラメータと相関する、図である。ａ） ｒＡＡＶ９－ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３処置された動物（ｎ＝８）（ｐ＝０．０３０９、Ｒ２＝０．５６７５）に関する、第９小葉及び第１０小葉におけるＧＦＰ平均強度（Ａ．Ｕ．＝任意単位）と、同じ領域内における凝集体の数／ｍｍ^２との線形回帰グラフ。ｂ） すべての時点（３５日目、５５日目及び８５日目）を考慮に入れた、ｒＡＡＶ９－ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３処置された動物（ｎ＝８）に関する、すべての小脳小葉におけるＧＦＰ積分強度（Ａ．Ｕ．＝任意単位）と、加速ロータロッドにおける落下までに要する平均待ち時間との線形回帰グラフ。残差分析によれば、１匹の動物は、予測線形回帰モデルの外れ値であると考えられた。分析は、この動物（ｐ＝０．０１２３、Ｒ^２＝０．７４５７）を含めないで実施された。統計解析は、Ｐｅａｒｓｏｎの相関関係（両側ｐ値）を用いて実施された。点線は、９５％信頼区間を表す。 ｒＡＡＶ９－ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３ ＩＶ注射が、野生型マウスのロータロッド成績に影響しない、図である。ａ） 一定の速度（５ｒｐｍ）におけるロータロッド成績。ｂ） 速度を加速させていったときのロータロッド成績。データは、野生型マウス（ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ、ｎ＝５）及びＡＡＶ９－ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３（ｎ＝５）を注射されたマウスを対象として、落下までに要する平均待ち時間±＿ＳＥＭとして提示されている。統計解析は、対応のないスチューデントのｔ検定（ｎｓ＝有意差なし）を用いて実施された。 ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３処置が、小脳中における主要な代謝産物のレベルを改善する、図である。ａ） 磁気共鳴分光法：７５日目のｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌマウス、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３マウス及びＷＴマウスの小脳神経化学的プロファイル。ＷＴマウスに比較すると、トランスジェニックＭＪＤにおいては、ＮＡＡ、ｔＣｈｏｌ及びＩｎｓ代謝産物が大きく調節解除されていた。対照マウスに比較して、ｒＡＡＶ９ ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３を注射されたマウスは、より高いＮＡＡ（神経細胞マーカー）のレベル並びにより低いＩｎｓ及びｔＣｈｏ（細胞死のマーカー）のレベルを提示しており、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３処置の有効性を実証した。ｂ） ＮＡＡ／Ｉｎｓ比、ＮＡＡ／ｔＣｈｏ比及びＮＡＡ／（Ｉｎｓ＋ｔＣｈｏ）比を使用して、この遺伝子ベースの治療法の有効性を評価した。すべての値は、平均±ＳＥＭとして提示されており、統計解析は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて実施された。ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ（ｎ＝８）、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３（ｎ＝７）及びＷＴ（ｎ＝８）。星印は、群間の統計学的に有意な差を示しており、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ｉｎｓ：ｍｙｏ－イノシトール、ＮＡＡ：Ｎ－アセチルアスパルテート、ｔＣｈｏ：グリセロホスホコリン＋ホスホコリン。 ｐｒｉ－ｍｉＲ－１５５を使用して人工ｍｉＲＮＡスキャフォールドに埋め込まれた、ｒｓ１２８９５３５７（シトシン）のアタキシン－３ ｍＲＮＡを標的化する、本開示のｄｓＲＮＡの例の図である。ｄｓＲＮＡ（配列番号２）の第１のＲＮＡ配列／鎖は、長方形の中に図示されている。

本開示は、第１のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡ配列／鎖が、互いに対して実質的に相補的であり、好ましくは、ＲＮＡの第１の鎖及びＲＮＡの第２の鎖が、互いに対して少なくとも９０％相補的であり、第１のＲＮＡ配列／鎖が、少なくともヌクレオチド１９個分の配列長を有し、好ましくは、１９～２３個のヌクレオチドの配列を有し、配列番号１、７、１３又は１９に対して少なくとも８６％相補的である、第１のＲＮＡ配列／鎖及び第２のＲＮＡ配列／鎖を含む、ＳＮＰ標的化用ｄｓＲＮＡを提供する。好ましくは、ＲＮＡの第１の鎖は、配列番号２６とは異なり；ＲＮＡの第１の鎖の第１のヌクレオチドは、シトシンとは異なる。

本開示においては、ほ乳類細胞における遺伝子サイレンシング効率を高めるために、設計されたすべてのＳＮＰ標的化用ｄｓＲＮＡは例外なく、ｉ） ５’末端に１個のウラシル（Ｕ）があることと、ｉｉ） ５’末端の最初の８個のヌクレオチド中に少なくとも５個のＡ／Ｕ残基があることと、ｉｉｉ） 第１の鎖（アンチセンス鎖）中に、長さがヌクレオチド５個分を超えるいかなるＧＣ区間もないこととを含む。

本明細書に開示されているアレル特異的遺伝子サイレンシングは、切断部位に近い第１のＲＮＡ配列／鎖（すなわち、アンチセンス）のシード領域の範囲外での正確な対合、より正確には、１２位における正確な対合によって達成される。アンチセンス（２～８位）の５’末端「シード」配列は、両方のアレル（すなわち、正常アレル及び変異アレル）に対して相補的である。したがって、選択されたすべてのＳＮＰ標的化用ｄｓＲＮＡは、標的ＳＮＰアレルを含有するｍＲＮＡに対しては完全に相補的であるが、標的ではないｍＲＮＡとの間では１２位にミスマッチを形成するため、特徴的なサイレンシングを可能にする。

上記理論的根拠に従って、最初に、サイレンシング配列（配列番号２）を、アタキシン－３遺伝子のエキソン１０の伸長ＣＡＧトラクトの３’末端に位置するＳＮＰ（Ｃ^９８７ＧＧ／Ｇ^９８７ＧＧ：ｒｓ１２８９５３５７）中のシトシン（Ｃ）を標的化するように設計した。アタキシン－３遺伝子のエキソン１０は、変異した場合には５１超のＣＡＧリピートを有し、ＭＪＤ患者の７０％では過剰伸長ＣＡＧの後にＣヌクレオチドも有するが、非変異アタキシン－３アレルは、一般的には、この位置にＧを有する（図１）。これにより、配列番号２は配列番号３、４、５又は６と同様に、変異アタキシン－３のアレル特異的サイレンシングを促進することができる。配列番号８、９、１０、１１又は１２は、Ｇヌクレオチドがこの位置に存在し、変異アレルと関連付けられている、珍しいケースにおいて、用いることが可能である。さらに、ｒｓ１２８９５３５７（配列番号２、３、４、５又は６）のＣを標的化する任意のサイレンシング配列は、この位置のＧを標的化するサイレンシング（配列番号８、９、１０、１１又は１２）と組み合わせられたとき、変異アタキシン－３と非変異アタキシン－３との両方をサイレンシングし、アタキシン－３発現を完全にノックダウンすることができる。

同じ理論的根拠に従えば、エキソン８に位置するエキソンＳＮＰ ｒｓ１０４８７５５（Ａ^６６９ＴＧ／Ｇ^６６９ＴＧ）は、変異アタキシン－３遺伝子のアレル特異的サイレンシングのために使用することもできる（図１）。例えば、配列番号１４、１５、１６、１７又は１８は、やはりＭＪＤ家系の７０％では疾患を引き起こす伸長と連鎖不平衡の関係にある、この位置のアデニン（Ａ）を標的とするが、配列番号２０、２１、２２、２３又は２４は、この位置のＧヌクレオチドが変異アレルと関連付けられている珍しい状況下において、使用することが可能である。

アレル特異的サイレンシング配列の設計のために本開示において採用されている理論的根拠を評価するために、本発明者らは最初に、インビトロ研究を実施して、配列番号２を評価した。その後、配列番号２の治療可能性を、２種の異なるＭＪＤのマウスモデル、すなわち、ＭＪＤのレンチウイルスベースマウスモデル及びＭＪＤのトランスジェニックマウスモデルにおいて試験した。

インビトロ研究
一実施形態において、ｍｉＲＮＡをベースとするＲＮＡｉプラスミドを、次のようにして作製した。配列番号２又は配列番号３をベースとして、ｒｓ１２８９５３５７（ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３）のアタキシン－３ ｍＲＮＡを標的化するｍｉＲ１５５ベースの人工ｍｉＲＮＡを設計した。いかなるほ乳類ｍＲＮＡもサイレンシングしない配列を有する対照ｍｉＲＮＡも設計した（ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ）。続いて、両方の人工ｍｉＲＮＡを、親切にもＭｉｇｕｅｌ Ｓｅｎａ－Ｅｓｔｅｖｅｓ（ＵＭａｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ、ＵＳＡ）から提供されている自己相補的なアデノ随伴ウイルス血清型２骨格（ｓｃＡＡＶ２－Ｕ６－ｍｉＲｅｍｐｔｙ－ＣＢＡ－ｅＧＦＰプラスミド）内にクローニングしたが、この自己相補的なアデノ随伴ウイルス血清型２骨格は、高感度緑色蛍光レポーター遺伝子（ＥＧＦＰ）を含み、ここでは、人工ｍｉＲＮＡがＵ６プロモーターによって操縦される（図２Ａ）。

一実施形態において、変異アタキシン－３を特異的に標的化する当技術分野において公知のｓｈＲＮＡをコードするプラスミド（ｓｈ－ＡＴＸＮ３）を、先述したようにして作製した（Ａｌｖｅｓら、２００８ａ）（図２Ａ）。配列番号２と同様に、ｓｈ－ＡＴＸＮ３（配列番号２６）は、エキソン１０（ｒｓ１２８９５３５７）の伸長ＣＡＧトラクトの３’末端に位置するＳＮＰ中のＣヌクレオチドを標的化することを目的とする。ｓｈＲＮＡ発現は、Ｈ１プロモーターによって操縦される。

一実施形態においては、先述したようにして（Ａｌｖｅｓら、２００８ｂ）、２７Ｑ付きのヒト野生型アタキシン－３をコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ－ＷＴ－ＡＴＸＮ３）、及び、７２Ｑ付きの変異アタキシン－３をコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ－Ｍｕｔ－ＡＴＸＮ３）を、４種のプラスミドからなる系を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にあらかじめ作製した。レンチウイルス粒子を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に再懸濁させた。バッチのウイルス粒子含量は、ＨＩＶ－１ ｐ２４抗原レベル（ＲＥＴＲＯｔｅｋ、Ｇｅｎｔａｕｒ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を評価することによって判定された。ウイルスストックは、使用まで－８０℃で貯蔵された。

一実施形態において、マウス神経冠由来細胞株（Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞）培養物を、次のようにして得た。マウス神経冠由来細胞株は、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｂａｎｋ（ＣＣＬ－１３１）から入手し、５％ＣＯ_２／空気雰囲気下３７℃において、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）（完全培地）が添加されたＤＭＥＭ培地に取り込ませた状態で管理した。

一実施形態において、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞インフェクションを、次のようにして実施した。先述したようにして、変異体又は非変異体（すなわち、野生型）アタキシン－３を安定に発現させる神経細胞株を得るために、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞に、ｒｓ１２８９５３５７（エキソン１０）にＣを有する完全長ヒト変異アタキシン－３（７２Ｑ）又は同じＳＮＰにＧを有する野生型形態（２７Ｑ）をコードするレンチウイルスベクターをインフェクションさせた。簡潔に言うと、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を、ポリブレンの存在下において、１０ｎｇのｐ２４抗原／１０^５細胞の比で各ベクターと一緒にしてインキュベートした。

一実施形態において、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞のトランスフェクションを、次のようにして実施した。トランスフェクションの前日に、レンチウイルスベクターを使用して変異アタキシン－３又は野生型アタキシン－３をあらかじめインフェクションさせたＮｅｕｒｏ２ａ細胞を、１２ウェルプレートに播種した（１８０．０００細胞／ウェル）。細胞には、トランスフェクション試薬としてＭｗ４０，０００の直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ、ＵＳＡ）を使用して、各ＡＡＶプラスミド：ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３及びｓｈ－ＡＴＸＮ３をトランスフェクトした。簡潔に言うと、ＤＮＡ：ＰＥＩ複合体の形成を、１０μＬのＤＭＥＭ、４μＬのＰＥＩ（１ｍｇ／ｍｌ）及び８００ｎｇのＤＮＡを混合することによって誘導した。室温での１０分のインキュベーション後、５００μＬのＤＭＥＭ完全培地を混合物に加えた。最後に、培地の半分を除去した後で、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を、ウェル１個当たり５００μＬのトランスフェクション溶液と一緒にしてインキュベートした。トランスフェクションから４８時間後、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞をＰＢＳ１Ｘで洗浄し、トリプシンで処理し、遠心分離によって分離し、－８０℃で貯蔵した。

一実施形態において、ＲＮＡ抽出、ＤＮａｓｅ処理及びｃＤＮＡ合成を、次のようにして実施した。製造業者の取扱説明書に従ってＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、全ＲＮＡを単離した。簡潔に言うと、細胞溶解後、全ＲＮＡをシリカマトリックスに吸着させ、推奨バッファーで洗浄し、遠心分離により、ＲＮＡａｓｅ不含の水を用いて溶出させた。ＲＮＡの総量は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）を使用して、光学密度（ＯＤ）によって評価され、純度は、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおけるＯＤの比を測定することによって評価された。

一実施形態において、ゲノムＤＮＡ汚染及び共増幅を回避するために、製造業者の取扱説明書に従ってＱｉａｇｅｎ ＲＮＡａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＤＮａｓｅ処理を実施した。簡潔に言うと、反応の最終的な体積は、０．６μＬのＤＮａｓｅバッファー、０．２５μＬのＤＮａｓｅ及び５００ｎｇのＲＮＡを含めて、６μＬだった。３７℃での３０分のインキュベーション後、０．５μＬの２０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ＝８を加えて、反応を停止させた。最後のステップは、６５℃における１０分間のインキュベーションだった。

一実施形態においては、次いで、製造業者の取扱説明書に従ってｉＳｃｒｉｐｔ Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）を使用して、４２０ｎｇの全ＲＮＡを変換することによってｃＤＮＡを得た。２μＬの反応混合物（５ｘ）、０．５μＬのｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素並びに適切な体積のＲＮＡ鋳型及びヌクレアーゼ不含の水を使用して、総体積が１０μＬの完全な混合物を調製した。全量の反応混合物を２５℃で５分インキュベートし、続いて、４２℃での３０分のインキュベーション及び８５℃での５分のインキュベーションを行った。逆転写酵素反応後、混合物は、－２０℃で貯蔵された。

一実施形態において、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、次のようにして実施した。すべてのｑＰＣＲは、製造業者の取扱説明書に従って９６ウェルマイクロタイタープレート及びＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）で実施された。

一実施形態においては、ＭＩＱＥガイドラインに従って、１０μＬのＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）、１０ｎｇのＤＮＡ鋳型、並びに、ヒトアタキシン－３、マウスアタキシン－３、マウスグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びマウスヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）のための５００ｎＭのあらかじめ確認済みの特異的プライマーを含有する、最終的な体積が２０μＬの反応混合物中で、反応を実施した。ＰＣＲプロトコルは、変性プログラム（９５℃で３０秒）によって開始され、続いて、２つのステップ：９５℃における５秒間の変性、及び、５６℃における１０秒間のアニーリング／伸長という２つのステップが４０サイクル行われた。増幅サイクル後には、０．５℃／５ｓの加熱速度で６５℃から９５℃まで温度を緩やかに上昇させることによって、融解曲線プロトコルが開始された。

一実施形態において、サイクルしきい値（Ｃｔ）は、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓソフトウェア（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）によって自動的に決定された。各遺伝子を対象にして、標準曲線を得、定量的ＰＣＲ効率をソフトウェアによって判定した。対照試料を基準とするｍＲＮＡの相対的な定量化は、Ｐｆａｆｆ法によって判定された。理想的な参照用遺伝子は、ＧｅＮｅｘソフトウェアを使用して決定された。

一実施形態において、タンパク質をｎｅｕｒｏ２ａ細胞から抽出し、プロテアーゼ阻害剤混合物及び２ｍＭのジチオスレイトールと混合されたＲＩＰＡ溶解バッファーを使用して均一化した。ライセートをさらにソニケーションし、タンパク質濃度を、ブラッドフォード法によって見積もった（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｏｔａｉｎ Ａｓｓａｙ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）。次いで、合計変性タンパク質のうちのマイクログラムを、電気泳動分離のために、４％濃縮用、１０％分離用ポリアクリルアミドゲル中にロードした。次いで、タンパク質をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、５％脱脂乳中でブロッキングした。モノクローナル抗アタキシン－３抗体（１Ｈ９、１：１０００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）及びβ－チューブリンを使用して、イムノブロッティングを実施した。デンシメトリーによる変異又は非変異ヒトアタキシン－３及び内因性マウスアタキシン－３の定量化は、β－チューブリンタンパク質を基準とするものだった。

インビボ研究
一実施形態において、アデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）ベクターの作製を、次のようにして実施した。簡潔に言うと、先述したようにｒＡＡＶ９－ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３及びｒＡＡＶ９－ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌの作製につながる、ＡＡＶコンストラクト（ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３及びｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ）、ｐＦΔ６（アデノウイルスヘルパープラスミド）及びＡＡＶ９ ｒｅｐ／ｃａｐプラスミドを、リン酸カルシウム沈殿により、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に三重トランスフェクションすることによって、ベクターストックを調製した。次いで、ＡＡＶ９ベクターを、イオジクサノール勾配遠心分離によって精製し、続いて、先述したようにして濃縮及び透析を行った。ウシ成長ホルモンポリＡ要素のための特異的なプライマー及びプローブ（ｐＢＧＨ）を用いる定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって、ベクターの力価を測定した。

一実施形態においては、頭蓋内投与したときの、ＭＪＤのレンチウイルス（ＬＶ：ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）ベースマウスモデルにおける上記ＡＡＶ９ベースの戦略の機能性及び有効性が評価された（図５Ａ）。この特定のマウスモデルは、治療法を短時間で試験し、変異アタキシン－３発現（Ａｌｖｅｓら、２００８ｂ）によって誘導される神経病理学的障害の定量的分析を可能にする。

一実施形態において、１３匹の１０週齢マウスを麻酔し、これらのマウスの線条体に、ヒト変異アタキシン－３（７２Ｑ）（３×１０^５ｎｇのｐ２４）をコードするレンチウイルスベクターと、右半球用の変異アタキシン－３ ｍＲＮＡを標的化する人工ｍｉＲをコードするｒＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ｍｉＲ－ＡＴＡＸ３）（７×１０^９ウイルスゲノム）及び左半球用の対照ｍｉＲをコードするｒＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ－ｍｉＲ Ｃｏｎｔｒｏｌ）（７×１０^９ウイルスゲノム）とを左右相称に同時注射した（図５Ａ）。

一実施形態において、３匹の動物の両方の半球のウェスタンブロッティングを実施した。注射された線条体を解剖し、プロテアーゼ阻害剤混合物及び２ｍＭのジチオスレイトールと混合されたＲＩＰＡ溶解バッファーを使用して均一化した。ライセートをさらにソニケーションし、タンパク質濃度をブラッドフォード法によって見積もった（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｏｔａｉｎ Ａｓｓａｙ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）。次いで、合計変性タンパク質のうちの６０マイクログラムを、電気泳動分離のために、４％濃縮用、１０％分離用ポリアクリルアミドゲル中にロードした。次いで、タンパク質をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、５％脱脂乳中でブロッキングした。モノクローナル抗アタキシン３抗体（１Ｈ９、１：１０００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）及び抗アクチン（ｃｌｏｎｅ ＡＣ－７４、１：５０００；Ｓｉｇｍａ）を使用して、イムノブロッティングを実施した。デンシメトリーによる凝集した変異アタキシン－３の定量化は、β－アクチンタンパク質を基準とするものだった。

一実施形態において、線条体（１２個の切片／動物）の体軸方向の完全なサンプリングを示す冠状切片を、２０倍の倍率でＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｚ２顕微鏡を使用してスキャンした。線条体の分析領域は、抗ユビキチン抗体を用いる染色によって明らかにされたように、ユビキチン封入体の全領域を包含していた。すべての封入体及びこれらの封入体の面積を、自動式画像分析ソフトウェアパッケージ（Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア、ＵＳＡ）を使用してカウントした。

一実施形態においては、動物１匹当たり１２個の染色された切片（２００μｍの間隔を空けた厚さ２５μｍの切片）をデジタル化して、線条体の体軸方向の完全なサンプリングを実施することによって、線条体におけるＤＡＲＰＰ－３２減少の程度を分析した。ＤＡＲＰＰ－３２減少を計算するために、Ｚｅｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）のタイル機能を使用して、切片をイメージングした。減少した線条体の面積を、次の式を用いて見積もった：体積＝ｄ（ａ＋ａ２＋ａ３＋．．．）（式中、ｄは、連続切片間の距離（２００μｍ）であり、ａ１、ａ２、ａ３は、個々の連続切片においてＤＡＲＰＰ－３２が減少した面積。）。

一実施形態において、線条体中における凝縮されたピクノーシス核の数の定量的分析が、動物１匹当たり３個の染色された切片（注射痕（ｎｅｅｄｌｅ ｔｒａｃｋ）に近いもの）を２００μｍの間隔で分析することによって実施された。定量化は、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを使用して手動で実施された。

一実施形態においては、ｐｏｌｙＱ６９トランスジェニックＭＪＤマウスも使用した。このモデルは、Ｌ７プロモーターの制御下で、６９ポリグルタミントラクトを有するＮ末端切断型ヒトアタキシン－３を、小脳プルキンエ細胞内に特異的に発現させる。さらに、変異タンパク質は、アミノ末端に、ヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープを示す。重要な点として、導入遺伝子は、ＣＡＧリピート伸長（ｒｓ１２８９５３５７）の下流側に、あらかじめ同定されたＳＮＰを含有し、この結果として、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３との相補性を示す。トランスジェニックマウスは、プルキンエ細胞層及び深部小脳核における変異アタキシン－３の蓄積と、顕著な小脳萎縮とを特徴とする。トランスジェニックマウスは、生後２１日目（Ｐ２１）から始まる、失調性表現型を示す。

一実施形態において、トランスジェニックマウスのコロニー（Ｃ５７ＢＬ／６背景）は、ヘテロ接合体の雄を、Ｃ５７ＢＬ／６の雌と戻し交配することによって、ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｏｉｍｂｒａ（ＣＮＣ）の動物収容施設の中で維持される。動物は、１２時間の明／１２時間の暗のサイクルが維持されている温度制御された部屋に収容された。食物と水は、自由に与えた。４週齢のときに、ＰＣＲによってジェノタイピングを実施した。

一実施形態において、実験は、実験動物のケア及び使用に関するｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ（８６／６０９／ＥＥＣ）に従って実施された。研究者らは、十分なトレーニング（ＦＥＬＡＳＡ認定コース）を受講し、ポルトガル当局（Ｄｉｒｅｃｃａｏ Ｇｅｒａｌ ｄｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ）からの実験実施の認可も受けた。

一実施形態において、実験設計を、次のようにして実施した。本開示は、生後１日目（Ｐ１）にｍｉＲ－ＡＴＸＮ３（ｎ＝８）をコードするＡＡＶ９及びｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ（ｎ＝１１）をコードするＡＡＶ９を注射された（図９Ａ）、１９匹の雌のヘテロ接合体ＭＪＤマウスを使用した。

一実施形態においては、次いで、対照用のＭＪＤマウス及び処置されたＭＪＤマウスが、行動成績及び神経病理学的変化に基づいて評価された。１つのバッテリーの行動試験を、３５日目、５５日目及び８５日目に実施した。マウスを生後９５日目（Ｐ９５）に屠殺し、続いて、脳病理分析を行った。

一実施形態において、ＡＡＶ９新生仔注射を、次のようにして実施した。静脈内注射が、新生ＭＪＤマウス及び野生型同腹仔（Ｐ１）の顔面静脈内に実施された。最適化されたプロトコルにおいては、最初に、新生仔を、敷き詰めた氷を用いておよそ１分間麻酔した。その後、合計で３．５×１０^１１ｖｇのＡＡＶ９ベクターを、総体積が５０μＬになるようにして、３０ゲージ注射器（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ、ＵＳＡ）を使用して顔面静脈内に注射した。正しい注射は、静脈の蒼白現象（ｂｌａｎｃｈｉｎｇ）に注目することによって確認された。

一実施形態において、行動試験を次のようにして実施した。ＭＪＤトランスジェニックマウスは、３５日齢、５５日齢及び８５日齢において、温度制御された静かな暗い同じ部屋の中で、１時間の順化の後に、１つのバッテリーの行動試験を実施した。

一実施形態においては、落下までに要する平均待ち時間（秒）を測定することによってＭＪＤマウスの運動協調性及びバランスを評価するためにロータロッド装置（Ｌｅｔｉｃａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐａｎｌａｂ）を使用した。成績は、５ｒｐｍの一定の速度を採用する定速ロータロッドと、４ｒｐｍから４０ｒｐｍまで速度が徐々に上昇していく加速ロータロッドとにおいて分析されたが、両方とも、最大５分間の分析だった。各時点（３５日目、５５日目及び８５日目）においては、試験は、１日当たり合計４回の試行にして、連続する３日間で実施された。連続する試行間には、マウスに、少なくとも２０分の休憩期間を与えた。統計解析のために、各時点における落下までに要する平均待ち時間が、すべての連続日及び連続する試行を検討して計算された。

一実施形態において、処置による可能性がある毒性を評価するために、ｒＡＡＶ９－ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３（ｎ＝５）及びｒＡＡＶ９－ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ（ｎ＝５）ＩＶ注射を受けた野生型マウスの群も、ロータロッド試験を実施した。この場合、試験は、１日当たり合計４回の試行にして、最後の時点（８５日目）においてのみ、連続する２日間で実施された。統計解析のために、落下までに要する平均待ち時間が、２日目を検討して計算された。

一実施形態において、ＭＪＤマウスの肢の協調性も、ガラスタンク（長さ７０ｃｍ、幅１２．５ｃｍで、高さ１９．５ｃｍの壁付き）内での水泳の成績によって評価された。プールには、その端部に、視認できる１つの台が設けられており、この台の高さ（８．５ｃｍ）まで水で満たした。次いで、マウスをタンクの一方の端部に配置し、反対側の端部にある避難台まで泳ぐように促した。各時点においては、動物は、試行１回当たりタンクを２回泳ぎ切り、試行の間に少なくとも２０分の休憩を入れるものである試行を４回実施した。これらの動物の成績は、全距離を泳ぎ、四肢を使って台を登るまでに必要な時間を測定するために、ビデオ記録された。統計解析は、試行２、３及び４の平均スコアに基づいた。

一実施形態において、ＭＪＤマウスの運動協調性及びバランスが、一連の高架梁を通過する能力の評価によって、評価された。長い木製の梁が、両端を支柱に取り付けたパッド付きの表面より２０ｃｍ高いところに、水平に配置された。各時点においては、マウスは、最も容易な梁から最も難しい梁に進んでいくようにして、連続する２回の試行を各梁の上で実施した：ｉ） 幅１８ｍｍの正方形の梁、ｉｉ） 幅９ｍｍの正方形の梁及びｉｉｉ） 直径９ｍｍの円形の梁。これらの梁のすべてにおいて、マウスは、囲い付きの安全台（ｓａｆｅｔｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ）に到達するまでに４０ｃｍを横断しなければならなかった。梁を通過するまでに要する待ち時間及び運動成績は、あらかじめ定めされた評価尺度に従って記録し、採点した。

一実施形態においては、様々な歩行パラメータを比較するために、ＭＪＤマウスの足跡パターンを分析した。前肢及び後肢を、それぞれ無毒性の赤色及び青色のペイントによってコーティングした後、動物は、紙で覆われた長さ５０ｃｍ、幅１０ｃｍの狭い通路の上を直線的に歩行して、囲い付きの箱に入るように促された。各時点においては、それぞれの側の連続する５回のステップ、好適には走行の中間でのステップを、分析のために選択した。連続する左側及び右側の前肢間及び後肢間の距離に対応する、歩長の値を測定した。後側歩隔幅及び前側歩隔幅は、右側及び左側の後肢間及び前肢間の距離をそれぞれ測定することによって、判定された。ステップ交代の一様性を評価するために、重複を、前肢と、同じ側の後肢との距離として測定した。各時点においては、選択された連続する５回のステップから得られた平均値を、統計解析のために使用した。

一実施形態では、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ Ｈｅａｌｔｈ（ＩＣＮＡＳ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｉｍｂｒａにおいて、励起のためのボリュームコイル（内径／外径は、それぞれ８６ｍｍ／１１２ｍｍ）と、シグナル検出のためのマウス用クアドラチュア型サーフェスコイル（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ、Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）とを使用する標準的なＢｒｕｋｅｒクロスコイル構成により、９．４Ｔ磁気共鳴小動物用スキャナ（ＢｉｏＳｐｅｃ９４／２０）を使ってインビボ画像を取得した。容量分析及び１Ｈ－ＭＲＳを実施した。

一実施形態において、ペントバルビタールの過剰投与後に組織調製を実施し、マウスを、冷ＰＢＳ １Ｘによって心臓内灌流し、続いて、４％冷パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ４％）を用いる固定を行った。次いで、脳を取り出し、４℃で２４時間４％パラホルムアルデヒド中に後固定（ｐｏｓｔ－ｆｉｘ）し、４℃で４８時間２５％スクロース／ＰＢＳ中でインキュベーションすることによって凍結保護した。

一実施形態において、各動物を対象にして、－２０℃でクリオスタット（ＬＥＩＣＡ ＣＭ３０５０Ｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、９６個の３０μｍの矢状切片を、１つの脳半球の全体から切り出した。次いで、これらの矢状切片を収集し、０．０５％アジ化ナトリウムが添加されたＰＢＳ １Ｘ中のフリーフローティング切片として、２つの４８ウェルプレート内に４℃で貯蔵した。

一実施形態において、免疫組織化学プロトコルを、既報（Ａｌｖｅｓら、２０１０）のようにして実施した。各動物を対象にして、交差距離が２４０μｍの８個の矢状切片を選択した。

一実施形態において、手順は、０．１％フェニルヒドラジン（Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）を含有するＰＢＳ１Ｘ中の切片を３７℃で３０分インキュベートすることによる、内因性ペルオキシダーゼ阻害から開始された。続いて、組織のブロッキング及び透過処理を、ＰＢＳ１Ｘ中に調製された０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ １０％ＮＧＳ（正常ヤギ血清、Ｇｉｂｃｏ）の中で、室温で１時間実施した。次いで、適切な希釈（１：１０００）にしてブロッキング溶液上にあらかじめ調製された一次抗体ウサギ抗ＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒にして、切片を４℃で終夜インキュベートした。３回の洗浄後、脳切片を、ブロッキング溶液中に希釈（１：２５０）された抗ウサギビオチン化二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に入れて室温で２時間インキュベートした。続いて、フリーフローティング切片をすすぎ、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって室温で３０分処理し、アビジン／ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体の形成を誘導した。次いで、切片をペルオキシダーゼ基質：３，３’－ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と一緒にしてインキュベートすることによって、シグナルを発色させた。最適な染色が実現された後、ＰＢＳ１Ｘ中で切片を洗浄することによって、反応を停止させた。続いて、脳切片をゼラチンコーティング済みのスライドにマウントし、昇順のエタノール系列（７５％、９５％及び１００％）中で脱水し、キシレンで透明にし、最後に、Ｅｕｋｉｔｔ封入剤（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してカバースリップを付けた。

一実施形態において、ＧＦＰ免疫組織化学に供した矢状脳切片の画像を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｚ２顕微鏡で得た。脳全体の画像は、ＥＣ Ｐｌａｎ－Ｎｅｏｆｌｕａｒ ５×／０．１６対物レンズを使って取得されたが、特定の領域の画像は、Ｐｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ２０×／０．８対物レンズを使って得られた。

一実施形態においては、免疫蛍光法も実施した。各動物を対象にして、交差距離が２４０μｍの８個の矢状切片を選択した。簡潔に言うと、プロトコルは、ブロッキング及び透過処理ステップから開始されたが、このステップでは、フリーフローティング切片を、１０％ＮＧＳ（正常ヤギ血清、Ｇｉｂｃｏ）が添加されたＰＢＳ１Ｘ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００に入れて、室温で１時間保持した。次いで、脳切片を、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中の１０％ＮＧＳ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）に溶かして希釈した次の一次抗体と一緒にして４℃で終夜インキュベートした：マウス抗ＨＡ（１：１０００、Ｉｎｖｉｖｏ Ｇｅｎ）及びウサギ抗ＧＦＰ（１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ＰＢＳ１Ｘ中での３回の洗浄ステップ後、フリーフローティング切片を、次の適切な希釈になるようにブロッキング溶液中に調製されたフルオロフォア結合二次抗体に入れて室温で２時間インキュベートした：抗マウス及び抗ウサギが、それぞれＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４及び４８８に結合したもの（１：２００、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＰＢＳ１Ｘ中での３回のすすぎステップ後、ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）を使用して核の染色を実施した。続いて、脳切片を洗浄し、ゼラチンコーティングされた顕微鏡スライド上にマウントし、最後に、Ｄａｋｏ蛍光封入剤（Ｓ３０２３）上でカバースリップを付けた。

一実施形態においては、動物１匹当たり８個の交差距離が２４０μｍの矢状切片を使用して、クレシルバイオレット染色を実施した。選択された脳切片を、ゼラチンコーティングされたスライドにあらかじめマウントし、室温で乾燥させた。水に入れて洗浄した後、切片を（９６％及び１００％エタノールを使用して）脱水し、（キシレン代用物を使用して）脱脂し、（７５％エタノール及び水を使用して）再水和した。次いで、神経細胞体中に存在するニッスル物質を染色するために、スライドをクレシルバイオレットに５分浸漬した。最後に、切片を水に入れて洗浄し、７０％エタノール中で分化させ、９６％及び１００％エタノール溶液に通すことによって脱水した。キシレン中での透明化ステップの後、Ｅｕｋｉｔｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使って切片をマウントした。

免疫蛍光法による定量的分析
ＧＦＰ及びＨＡ免疫蛍光法の後、特定の矢状切片を選択して、小脳全体の画像を取得した。シリアルｚスタック画像（間隔＝０．９μｍ）を、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ｃｅｌｌ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｓｐｉｎｎｉｎｇ Ｄｉｓｋ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）によってキャプチャした。画像は、励起のために固体レーザー線（５６１ｎｍ又は４８８ｎｍ）を使用して、Ｐｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ２０×／０．８対物レンズを使って取得された。

一実施形態において、平均ＧＦＰ蛍光強度及び積分ＧＦＰ蛍光強度の定量化を、処置された動物から得た（正中線に対して０．４８ｍｍ、０．７２ｍｍ及び０．９６ｍｍ外側の矢状面：（Ｆｒａｎｋｌｉｎ ａｎｄ Ｐａｘｉｎｏｓ）における矢状図１０５、１０７及び１０９において切り出された）３個の特定の矢状切片で実施した。先述したようにして、共焦点顕微鏡法を用いて小脳全体の画像を取得した。次いで、Ｚｅｎ Ｂｌａｃｋ ２０１２ソフトウェアを使用して、各切片を対象にして最大強度の突出部を得た。

一実施形態において、平均ＧＦＰ蛍光強度を測定して、特定の小脳小葉におけるウイルストランスダクションレベルを定量化した。各切片を対象にして、平均ＧＦＰ蛍光強度をＺｅｎソフトウェアによって判定し、バックグラウンドを差し引いた後に計算した。最終的な値は、動物１匹当たり３個の分析切片を検討した、平均強度に対応する。

一実施形態においては、異なる動物における合計でのウイルストランスダクションレベルを比較するために、小脳小葉をひとまとめにした場合の積分ＧＦＰ蛍光強度を測定した。この場合、すべての小脳小葉を含めて平均ＧＦＰ蛍光強度を測定し、この値にそれぞれの面積をかけて、積分蛍光強度を計算した。最終的な値は、動物１匹当たり３個の分析切片を検討した、平均積分強度に対応する。

一実施形態において、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ付きの凝集体の定量的分析を、次のようにして実施した。動物１匹あたり３個の特定の切片を選択して、第１０、第９及び第６小葉における凝集体の数を定量化した（（Ｆｒａｎｋｌｉｎ ａｎｄ Ｐａｘｉｎｏｓ）に従って、第９小葉及び第１０小葉の正中線に対して０．４８ｍｍ、０．７２ｍｍ及び０．９６ｍｍ外側の矢状面；第６小葉の場合は、正中線に対して０．７２ｍｍ、０．９６ｍｍ及び１．６８ｍｍ外側の矢状面）。

画像は、先述したように、共焦点顕微鏡を使用して取得された。Ｚｅｎ Ｂｌａｃｋ ２０１２ソフトウェアを使用して、各切片を対象にして、平均強度の突出部を得た。各小葉における凝集体の数を手動で定量化した後、その値を、Ｚｅｎソフトウェアで決定されたそれぞれの小葉面積で正規化した。最終的な値は、動物１匹当たり３個の選択された切片における、凝集体の平均数／ｍｍ^２に対応する。この分析には、処置群と対照群の両方が含まれた。

一実施形態において、分子層厚さの定量化を、次のようにして実施した。動物１匹当たり３個の特定の切片を選択して、クレシルバイオレット染色後に、第１０、第９及び第６小葉における分子層厚さを定量化した（（Ｆｒａｎｋｌｉｎ ａｎｄ Ｐａｘｉｎｏｓ）に従って、第９小葉及び第１０小葉の正中線に対して０．４８ｍｍ、０．７２ｍｍ及び０．９６ｍｍ外側の矢状面；第６小葉の場合は、正中線に対して０．７２ｍｍ、０．９６ｍｍ及び１．６８ｍｍ外側の矢状面）。

一実施形態において、小脳全体の画像を、Ｐｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ２０×／０．８対物レンズ付きのＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｚ２顕微鏡で得、Ｚｅｎ Ｂｌｕｅソフトウェアによって分析した。

一実施形態において、各切片を対象にして、あらかじめ定めされた特定の領域における３回の測定値を用いて、第１０、第９及び第６小葉における分子層厚さを別々に計算した。最終的な値は、動物１匹当たり３個の選択された切片を検討した、各小葉における平均分子層厚さに対応する。この分析には、処置群と対照群の両方が含まれた。

一実施形態においては、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して、統計解析を実施した。データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として提示されており、外れ値は、Ｇｒｕｂｂ検定（α＝０．０５）に従って除外された。対応のないスチューデントのｔ検定は、対照群と処置群とを比較するために実施されたが、一元配置ＡＮＯＶＡ検定は、多重比較のために使用された。パラメータ間の相関関係は、Ｐｅａｒｓｏｎの相関係数に従って判定された。有意性は、次の判断基準に従って判定された：ｐ＞０．０５＝有意差なし（ｎｓ）；^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１及び^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

本開示は、非変異形態のレベル維持しながらヒト変異アタキシン－３タンパク質のレベルを特異的に標的化し、低下させることができる、ＳＮＰ標的化用ｄｓＲＮＡに関する。

本開示は、世界中のＭＪＤ患者の７０％では異常なＣＡＧリピート伸長が伴うことが報告されているものである、アタキシン－３遺伝子のエキソン１０の伸長ＣＡＧトラクトの３’末端に位置するＳＮＰ（ｒｓ１２８９５３５７）のＣヌクレオチドを正確に標的化するように設計された、ｄｓＲＮＡ配列（配列番号２）に特に関する（図１）。

一実施形態において、配列番号２をｍｉＲ－１５５スキャフォールドに取り込ませ、人工マイクロＲＮＡを作製した（図１６）。平行して、いかなるほ乳類ｍＲＮＡもサイレンシングしない対照配列（配列番号２５）も使用し、ｍｉＲ－１５５スキャフォールドに取り込ませた。両方の人工ｍｉＲＮＡが、Ｕ６プロモーターの制御下で、レポーター遺伝子としてのＥＧＦＰと一緒にして、自己相補的なＡＡＶ２骨格内にクローニングされた（ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ及びｍｉＲ－ＡＴＸＮ３）（図２Ａ）。

この新規なサイレンシング配列のサイレンシング能及び特異性を確認するために、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３プラスミドが、ｉ） ｒｓ１２８９５３５７にＣヌクレオチドを有するヒト変異アタキシン－３（７２Ｑ）、又は、ｉｉ） ｒｓ１２８９５３５７にＧヌクレオチドを有するヒト野生型アタキシン－３（２７Ｑ）を安定に発現させるレンチウイルスベクターをあらかじめインフェクションさせたマウス神経冠由来細胞株（Ｎｅｕｒｏ２ａ）内にトランスフェクトされた。ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドを陰性対照として使用し、ヒト変異アタキシン－３（配列番号２６）をサイレンシングすることが当技術分野において公知のｓｈ－ＡＴＸＮ３をコードするレンチウイルスプラスミドを、陽性対照として使用した（図２Ａ）。

定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の結果によれば、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３プラスミドのトランスフェクションすることにより、ｓｈ－ＡＴＸＮ３の存在下で起きるものに近い、変異アタキシン－３ ｍＲＮＡレベルの４２，０３％±６．２６％の低下が起きた（図２Ｂ）。しかしながら、ｓｈ－ＡＴＸＮ３とは著しく異なり、ｍｕｔ－ＡＴＸＮ３プラスミドのトランスフェクション後には、野生型アタキシン－３ ｍＲＮＡレベルの変化は検出されておらず（図２Ｃ）、このことは、配列番号２が、ＳＮＰ ｒｓ１２８９５３５７のＣヌクレオチドを正確に標的化し、ヒトアタキシン－３のアレル特異的サイレンシングを可能にすることを証明していた。図３に図示されているように、同様の結果が、配列番号３をコードする人工ｍｉＲＮＡ－１５５コンストラクトを用いたときに得られた。

タンパク質レベルとの関連では、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３は、ｓｈ－ＡＴＸＮ３と同じくらい、変異アタキシン－３タンパク質レベルを低下させるのに効果的だったが（図２Ｄ）（ｍｉＲ－ＡＴＸＮ：５０．６６±８．３４％に対してｓｈ－ＡＴＸＮ３：５５．６５±６．０４％）；ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３は、はるかに選択的だった。実際、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３プラスミドのトランスフェクション後には、野生型タンパク質レベルの変化が検出されなかったが、ｓｈ－ＡＴＸＮ３は、野生型形態を発現させるＮｅｕｒｏ２ａ細胞において、ヒト野生型アタキシン－３ ｍＲＮＡレベルの有意な低下を誘導した（図２Ｅ）。

概して、これにより、本明細書に開示されているｍｉＲベースの戦略は、当技術分野において既報の配列の変異アタキシン－３サイレンシング能力を保持しているが、はるかに選択的であることが示唆されている。これは、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３により、変異転写物と野生型転写物とを識別し、これにより、アタキシン－３の正常な機能を維持することが可能になることを意味するが、このことは、この治療アプローチをヒト患者に適合させる場合においては、著しい利点である。

さらに、内因性マウスアタキシン－３ ｍＲＮＡのレベルの変化が検出されておらず（図４）、このことは、サイレンシング効果がヒトアタキシン－３ ｍＲＮＡに対して特異的であることを証明していた。

インビボにおける配列番号２の治療可能性を調査するために、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３ ＡＡＶプラスミド及びｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ ＡＡＶプラスミドを、ｒＡＡＶ９カプシドにパッケージした。ＡＡＶベクターは、効率的な神経細胞トランスダクション、長期にわたる導入遺伝子の発現及び安全性プロファイルを鑑みると、ＣＮＳ遺伝子送達のための好ましいプラットフォームであると考えられた。特に、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）は、野生型げっ歯類、ネコ、ヒト以外の霊長類及びヒトにおいてもＢＢＢを迂回する能力を有するため、静脈内（ＩＶ）注射を可能にする。

ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３は、２種の異なるＭＪＤのマウスモデル、すなわち、ＭＪＤのレンチウイルスベースマウスモデル及びＭＪＤのトランスジェニックマウスモデルにおいて、実質内投与及び静脈内投与のそれぞれによって、試験された。

最初に、本発明者らは、頭蓋内（ＩＣ）投与したときの、ＭＪＤのレンチウイルス（ＬＶ）ベースマウスモデルにおけるｍｉＲ－ＡＴＸＮ３の機能性及び有効性を評価した。このマウスモデルは、治療法を短時間で試験し、変異アタキシン－３発現によって誘導される神経病理学的障害（Ａｌｖｅｓら、２００８ｂ）の正確な定量的分析を可能にする。したがって、１３匹の１０週齢マウスの線条体に、７２のＣＡＧリピートを有するヒト変異アタキシン－３をコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）（ＬＶ－Ａｔｘ３－ＭＵＴ）と、右半球用のｍｉＲ－ＡＴＸＮ３をコードするｒＡＡＶ９ベクター及び左半球用のｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌをコードするｒＡＡＶ９ベクターを左右相称に同時注射した（図５Ａ）。

注射から５週間後、５匹のマウスを屠殺して、（ｑＰＣＲによる）変異アタキシン－３ ｍＲＮＡの発現レベル及び（ウェスタンブロッティングによる）凝集した変異アタキシン－３タンパク質レベルの評価を行い、８匹のマウスを灌流し、免疫組織化学分析（ＥＧＦＰ、抗ユビキチン、ＤＡＲＰＰ－３２、クレシルバイオレット）のために屠殺した。

図５Ｂに図示されているように、蛍光顕微鏡法により、ＡＡＶ９ベクターの頭蓋内投与は、レポーター遺伝子ＥＧＦＰの強い発現によって分かるように、両方の半球において効果的であることが示された。

ｑＰＣＲ（図５Ｃ）及びウェスタンブロッティング（図５Ｄ）によって、ｍｉｒ－ＡＴＸＮ３の発現は、対照用の左半球に比較して、変異アタキシン－３の線条体ｍＲＮＡレベルの６３．７５±２．２５％の低下、及び、変異アタキシン３の凝集形態３７．６４±４．５２％の減少を、それぞれ誘導することが観察された。

凝集したアタキシン－３を含有する神経核内封入体の存在は、ＭＪＤの重要な特徴の１つであるため、次に、ＩＣ投与したときのユビキチン陽性の封入体の総数及びサイズを減少させるｍｉＲ－ＡＴＸＮ３処置のポテンシャルを評価した。対照用左半球に比較すると、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３をコードするｒＡＡＶ９を注射された半球における凝集体の数の一掃が観察され、処置の有効性を実証していた（図５Ｅ及び図５Ｆ）。

次いで、この戦略が線条体神経保護を媒介し得るかを評価するために、ＤＡＲＰＰ－３２に対する免疫組織化学を実施したが、ＤＡＲＰＰ－３２は、ドーパミン受容体シグナル伝達の調節因子であり、本発明者らが、ＭＪＤ（Ａｌｖｅｓら、２００８ｂ）のＬＶベースのモデルにおける早期の神経機能障害を検出するための感度の高いマーカーであることを以前に実証した、神経機能障害に対する感度の高いマーカーでもある。ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３の頭蓋内投与は、ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌに比較して、ＤＡＲＰ－３２減少型病変を減少させた（８０．８７％）（図５Ｇ及び図５Ｈ）。

最後に、クレシルバイオレット染色を実施して、変異アタキシン－３発現による細胞傷害を評価すると、処置された右半球においては、過色素性の核の明瞭な減少が観察された（およそ３０％）（図５Ｉ及び図５Ｊ）。

概して、上記結果により、ＡＡＶ９ベースの戦略に基づいた変異アタキシン－３のアレル特異的サイレンシングは、ＩＣ注射した場合において、変異アタキシン－３ ｍＲＮＡ及び凝集した変異タンパク質のレベルを低下させるのに効果的であることが示されている。これにより、ユビキチン陽性の封入体のクリアランスを促進し、細胞傷害及び線条体変性を防止した。

次に、本発明者らは、開発されたｒＡＡＶ９ベクターが、ＢＢＢを転位させる能力と、Ｐ１に静脈内注射した場合において、重度の障害があるＭＪＤのトランスジェニックマウスモデル（ＰｏｌｙＱ６９トランスジェニックマウス）及びこれらのトランスジェニックマウスモデルの野生型同腹仔にニューロンをトランスダクションする能力とを調査した。このトランスジェニックマウスモデルは、６９のグルタミンリピートを含有するヒトアタキシン－３の切断型携帯を、小脳プルキンエ細胞（ＰＣ）内に特異的に発現させ、早発性（Ｐ２１）で重症の病理学的表現型を発症させる。さらに、切断型ヒトアタキシン－３が、ＭＪＤ患者の７０％に存在するｒｓ１２８９５３５７ ＳＮＰのＣバリアントを有するため、このＭＪＤトランスジェニックマウスモデルは、アレル特異的な戦略の評価を可能にする。

実際、ＰｏｌｙＱ６９トランスジェニックマウスにおいて治療効果を引き出すためには、ＩＶ注射されたｒＡＡＶ９ベクターは、ＢＢＢを迂回し、脳を効率的にトランスダクションしなければならない。この結果、９５日齢で屠殺した後、ＭＪＤトランスジェニックマウス脳におけるｒＡＡＶ９分配の調査を実施した。この目的のために、ＡＡＶ－プラスミド内に存在するレポーター遺伝子である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対する抗体を使用して、矢状脳切片の免疫組織化学を実施した。ｒＡＡＶ９注射されたトランスジェニックマウスから得た切片の分析に加えて、本発明者らは、陰性対照としての注射なしのＭＪＤマウス、及び、ｒＡＡＶ９分配を比較するためのｒＡＡＶ９注射された野生型（ＷＴ）マウスも使用した（図６）。

ＧＦＰ発現のパターンは、ｒＡＡＶ９ ＩＶ注射を受けたトランスジェニックマウスにおいては、対照群と処置群の両方で、非常に類似していた。ベクターは、小脳、脳幹、脊髄及び線条体等、ＭＪＤにおいて通常影響を受ける領域を含む脳の全体にわたって効率的に広がることが判明した。特に、ＭＪＤにおける主要な変性部位である橋核は、かなりの導入遺伝子の発現を示した。他の効率的にトランダクションされた領域には、大脳皮質、嗅球及び海馬が含まれた。成体トランスジェニック動物の尾静脈内へのｒＡＡＶ９ ＩＶ注射も、マウス脳の効果的なトランスダクションを媒介した。トランスジェニック動物と野生型動物との間に観察された主な差異は、小脳ＧＦＰ発現に対応している。実際、ＭＪＤ動物は、ＷＴマウスの小脳全体における活発な導入遺伝子の発現に比較して、空間的に限局されたより弱いＧＦＰシグナルを示している（図６Ｂ及び図６Ｃ）。これらの所見は、以前に報告されたこの特定のトランスジェニック動物モデルにおける小脳での血管新生の欠陥によって説明され得る。

ヒト変異アタキシン－３発現がｐｏｌｙＱ６９ ＭＪＤトランスジェニックマウスの小脳ＰＣに制限されることを考えると、ｒＡＡＶ９－ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３の治療作用は、小脳、特に、この細胞サブタイプをトランダクションするベクターの能力に大きく依存する。したがって、この領域におけるＧＦＰシグナルの分布を、免疫組織化学的処理の後にさらに詳細に分析した。

図７に示されているように、ＧＦＰ発現は、小脳の全体にわたって等しく分配されておらず、特に、小脳第１０小葉、続いて、深部小脳核（ＤＣＮ、おそらくは、ＭＪＤにおいて最も早期に罹患した領域）及び第９小葉においては明らかなである。トランスダクション済みの単離されたニューロンも第６小葉及び第７小葉においては検出されたが、残りの小葉においては、検出の程度が減じていた。重要な点として、第四脳室の脈絡叢細胞も、顕著なＧＦＰ発現を示した。このＧＦＰ分布パターンは、対照群及び処置群を含む、ｒＡＡＶ９ ＩＶ注射を受けたすべてのトランスジェニック動物において、観察された。

上記の第９小葉及び第１０小葉における優先的な小脳トランスダクションは、この領域における血管新生がより良好であることにより、又は可能性としては、この領域が第四脳室の脈絡叢の近くにあることにより、起き得る。脈絡叢（ＣＰ）は、脳脊髄液（ＣＳＦ）の生成を担うものであり、血液とＣＳＦとの間にバリア（血液ＣＳＦ関門（ＢＣＳＦＢ））を構成する、上皮細胞の単層によって構成される。したがって、血液を循環してＣＰに到達するｒＡＡＶ９ベクターは、最終的には、ＢＣＳＦＢを迂回し、ＣＳＦに移ることができる。第１０小葉はＣＰに近く、ＣＳＦの流れの経路内にあるため、ＰＣへのｒＡＡＶ９の到達は、この小脳領域で優先的に起きる。

最後に、ｒＡＡＶ９が、このマウスモデルにおいて主に影響を受ける細胞集団、すなわち、変異アタキシン－３を発現させるＰＣを標的化するかどうかを判定した。このために、ＧＦＰとヘマグルチニン（ＨＡ）との両方を、共免疫蛍光法標識した。予想されたように、ＨＡシグナルは、ＰＣ細胞層において検出されたが、ここでは、変異アタキシン－３は、拡散染色により、細胞体の全体にわたって凝集体の形態で分配されていた（図８）。さらに、変異アタキシン－３凝集体も、ＰＣの軸索終末、深部小脳核（ＤＣＮ）において検出された。ＧＦＰシグナルの分布とＨＡシグナルの分布とを比較すると、変異アタキシン－３蓄積の２つの主要な領域であるＰＣ層とＤＣＮとに共局在が観察された（図８）。この後者の発見は、ＡＡＶベクターが、ＤＣＮからＰＣに逆行輸送され、治療効果に寄与し得ることを示唆している。さらに、ＤＣＮ ｒＡＡＶ９トランスダクションは、この領域が疾患との関連では深刻な影響を受けるものであるため、ＭＪＤ患者においても有益である可能性がある。このパターンは、対照群及び処置群を含む、すべてのｒＡＡＶ９－ＩＶ注射されたマウスにおいて同様だった。

本開示においては、ｒＡＡＶ９－ｍｉＲ ＡＴＸＮ３注射が、ＭＪＤ関連の行動障害を軽減するかどうかも調査した。最も典型的なＭＪＤ症状は、運動協調性及びバランスの障害、並びに失調性歩行を含む。ＰｏｌｙＱ６９トランスジェニックマウスは、これらの特徴をうまく模倣し、早期発症（Ｐ２１）を伴う極めて重症の失調性表現型を示す。これらの行動障害は、運動協調性及び学習において重要な役割を担う神経細胞亜集団であるＰＣの機能障害によって起きる。実際、ＰＣは脆弱なものであり、容易に損傷して、運動制御能力が損なわれる。

トランスジェニックマウスの行動に対するｍｉＲ－ＡＴＸＮ３処置の影響を調査するために、処置された動物と対照動物との両方、すなわち、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３又はｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌをそれぞれコードするｒＡＡＶ９ベクターのＰ１静脈内注射を受けた動物を、異なる３種の齢：３５日齢、５５日齢及び８５日齢のときに、１つのバッテリーの試験に供した（図９Ａ）。これらの試験は、定速ロータロッド及び加速ロータロッド、並びに梁歩行試験を含んだが、その理由は、これらが、バランス及び運動協調性を評価するのに適するためである。さらに、水泳試験は、運動成績及び強度のさらなる評価を可能にした。一方、足跡分析により、本発明者らは、ＭＪＤ関連の歩行障害を評価することができた。

ロータロッド成績は、マウスが、一定の速度と加速する速度の両方でロータロッド装置の中を歩行したときに、落下までに要する平均待ち時間として判定された。処置は、両方の理論的枠組みの場合ですべての時点において、有益な効果を有することが判明した（図９Ｂ及び図９Ｃ）。最も一貫性のある結果は８５日目に得られたが、その理由は、この改善が、定速ロータロッドと加速ロータロッドとの両方において統計学的に有意だったためである（それぞれ、落下までに要する待ち時間の１．７倍及び１．５倍の延長）。

水泳試験においては、水を満たしたガラスタンクの一端にマウスを配置し、プールを泳ぎ切って台を登るように促した。各動物が全距離を泳ぎ、台を登るまでに必要だった時間を記録した。この結果によれば、処置された動物は、５５日目により良好な成績を示した（図１０Ａ）。

梁歩行試験においては、マウスは、ｉ） 幅１８ｍｍの正方形の高架梁、ｉｉ） 幅９ｍｍ正方形の高架梁及びｉｉｉ） 直径９ｍｍの円形の高架梁を通過した。動物は、歩行を完了するまでにかかった時間と運動協調性とに基づいて評価された。成績は、あらかじめ定めされた評価尺度に従って採点されたが、スコアが高いほど、より良好なバランス及び協調性を示している。この分析によれば、対照群と処置群との差異は、幅１８ｍｍ及び９ｍｍの正方形の梁においては検出されなかった。しかしながら、動物は、通過が最も難しいと考えられる直径９ｍｍの円形の梁においては、相異なる成績を示した（図１０Ｂ）。対照群においては、時間に伴う成績スコアの漸減が観察されたが、処置されたマウスは、梁を横断する能力を保っていた。この結果、ｒＡＡＶ９－ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３を注射された動物は、最後の時点においては、著しくより良好な梁歩行試験の成績を示した（平均スコアの２．２倍の上昇）（図１０Ｂ）。

処置がＭＪＤに特徴的な四肢失調及び歩行失調を減じることができるかどうかを判定するために、両方の実験群の足跡パターンを分析した。失調性歩行は通常、ステップ交代の一様性の低下を反映する、ｉ） 広くなった歩幅；ｉｉ） 短くなった歩長及びｉｉｉ） 長くなった重複の距離を特徴とする。処置された動物の歩行パターンの分析により、異なる時点において、対照群との比較でのいくつかの改善、主には、それぞれ５５日目及び３５日目における後側歩隔幅及び前側歩隔幅の有意な減少が明らかにされた。さらに、最後の時点（８５日目）においては、足跡の重複の距離の有意な減少が検出された（図１０Ｃ、図Ｄ及び図Ｅ）。

概して、処置された動物は、すべての行動試験において、運動スキルの総合的な改善を示すロータロッド、水泳、梁歩行及び足跡分析の有意な結果を伴う、より良好な成績を示した（図９及び図１０）。これは、ＡＡＶによって媒介されるアタキシン－３のサイレンシング後の有意な行動改善に関する最初の報告であり、ｒＡＡＶ９－ＩＶ注射が、ＰｏｌｙＱ障害における行動への肯定的な影響を実証したのは、初めてのことである。

概して、これは、おそらくは本開示のＳＮＰ標的化用ｄｓＲＮＡの選択制、選択された血清型及び送達経路を理由とする、本発明者らの戦略のより優れた治療効果を示唆している。

ＭＪＤ関連の神経病理学的変化に及ぼされるｒＡＡＶ９－ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３注射の影響も、評価した。ＭＪＤの主要な特徴のうちの１つは、疾患の進行を反映する変異アタキシン－３凝集体の蓄積からなる。選択されたマウスモデルにおいて、これらの凝集体はＰＣに形成されるが、Ｐ４０に形成し始めてからは、時間が経つにつれて数とサイズを顕著に増やしていく。

したがって、処置ＭＪＤマウス及び対照ＭＪＤマウスから得た矢状切片におけるヘマグルチニン（ＨＡ）を対象とする免疫蛍光法を実施したが、その理由は、このタグが、変異アタキシン－３のＮ末端に存在するためである（図１１Ａ）。次いで、小脳第１０小葉及び第９小葉におけるある面積当たりの変異アタキシン－３凝集体の数を定量化したが、その理由は、これらの変異アタキシン－３凝集体が、トランスダクションレベルがより高い領域に対応するためである。トランスダクション効率が低い領域におけるｒＡＡＶ９処置の影響を評価するために、第６小葉も分析した。本明細書に開示されている結果によれば、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３処置は、分析された３つすべての小葉における凝集を減少させ（第１０、第９及び第６小葉において、それぞれ３５％、１８％及び２０％の減少）、これにより、神経病理の減弱に寄与した（図１１Ｂ）。

ＭＪＤ患者の別の重要な特徴は、この領域における神経変性の結果として起き、通常、臨床症状との相関関係を示す、小脳萎縮を含む。この特定のマウスモデルにおいては、３週齢という早い時期に、顕著な小脳萎縮が検出される。したがって、ＰＣの変性又は機能的／形態学的変化は、異なる細胞型間の強い相互接続のため、他の小脳領域に影響を与える可能性がある。特に、Ｑ６９トランスジェニックマウスは、ＰＣにおける樹状突起分岐が不十分であり、この結果として、分子層厚さが薄くなることを特徴とする。したがって、両方の実験群から得た矢状切片には、小脳層を識別するために、クレシルバイオレット染色を実施した（図１１Ｃ）。分子層の分析によって、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３処置されたマウスの第１０小葉及び第９小葉においては、より厚くなった有意な厚さが認められ（それぞれ２１％及び１５％）、さらには、第６小葉においても強い傾向が認められた（１３％、ｐ＝０，０５８７）（図１１Ｄ）。

概して、本明細書に開示されている結果により、ｒＡＡＶ９ ＩＶ注射による変異アタキシン－３のサイレンシングは、トランスジェニックＭＪＤマウスにおける効率的な治療アプローチであり、行動障害と神経病理学的障害の両方を軽減することが、実証されている。重要な点として、これらの肯定的な効果は、誕生日の時点ですでに神経の欠陥及び血管新生の欠陥を示すことができた、早期発症を伴う非常に重症のモデルにおいて得られた。したがって、この戦略を、遅発性かつ軽症の表現型を示す他のＭＪＤモデルにおいても試験する場合、さらにより有意な影響が予測され得る。

ＭＪＤトランスジェニックマウスにおけるｒＡＡＶ９分配に関する最初の所見は、第１０小葉のみに限局した治療反応を示唆していたが、非常に一般化された効果が、小脳全体及びマウスの行動には検出された。第１０小葉における非常に効率的なトランスダクションは、この小葉が前庭系の一部であり、バランスにとって重要であるため、梁歩行試験又はロータロッドにおける改善を引き出すのには十分であり得ると推測することができた。しかしながら、全体的な有益な効果のみによっても、処置されたマウスの一般成績が、特に運動協調性、強度及び歩行運動を調査する試験においては、より良好であることを説明することができた。可能な説明の１つとしては、他の小葉内のトランスダクションされたＰＣは乏しいものではあるが、各領域において肯定的な効果を誘導するのには十分であるかもしれないというものがある。これは、例えば、小脳全体においてｒＡＡＶ９陽性のＰＣが誘導する神経保護作用により、神経栄養因子が放出され、又は神経炎症が阻害されることで起き得る。代替的には、トランスダクションされたＰＣが、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３分子を、隣り合う細胞に移送することもあり得る。したがって、トランスダクションされたＰＣは、可能なソロｍｉＲ（ｓｏｌｏ ｍｉＲ）の移送によって、及び／又は、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３を内包する細胞外小胞を用いて、ｒＡＡＶ９陰性のニューロンとの間で情報伝達することができる。類似の機構を用いることにより、ＤＣＮ内のトランスダクションされた細胞は、ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３コンストラクトを放出することもでき、これらのｍｉＲ－ＡＴＸＮ３コンストラクトは後で、ＰＣの突起部に送達される。最後に、ｒＡＡＶ９によってＣＰ上皮細胞自体がトランスダクションされることも、本発明者らの発見に寄与することができた。したがって、ＣＰを対象とする遺伝子治療は、リソソーム貯蔵障害との関連で調査されてきており、この場合、ＣＰを対象とする遺伝子治療により、ＣＳＦ内に治療用タンパク質を絶え間なく分泌させ、有益な効果をもたらすことができる。同様に、ＣＰ上皮細胞は、細胞外小胞に取り込まれたｍｉＲＮＡを分泌することができる。このことに基づけば、第四脳室内のｒＡＡＶ９陽性のＣＰ細胞は、後で小脳においてサイレンシング作用を発揮することになるｍｉＲ－ＡＴＸＮ３含有細胞外小胞を、ＣＳＦに移送することができる可能性がある。図１２は、本開示におけるｒＡＡＶ９－ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３治療効果の基礎をなす、可能な機構を要約している。

処置されたマウスにおける治療効果がｒＡＡＶ９小脳トランスダクションのレベルに依存するかどうかも判定した。特定の動物が、より明らかな行動改善又は神経病理の減弱を示したことは、ＰＣをトランスダクションするベクターの用量が高められていたことによって説明することができた。

上記目的のために、ＧＦＰ平均蛍光を第１０小葉及び第９小葉において分析するとともに、各領域におけるある面積当たりの凝集体の数も分析した。これらの２つのパラメータ間には逆相関が認められ、第１０小葉及び第９小葉におけるより高いトランスダクションレベルには、凝集体クリアランスの改善が伴うという結論に至った（図１３Ａ）。しかしながら、同じ関係は、第６小葉の場合には確立され得ず、このことは、この特定の領域における有益な効果が、他のパラメータに依存する可能性があることを示唆している。

さらに、小脳トランスダクションがより優れたマウスが、運動成績がより良好なマウスに対応するかどうかも判定した。この点について、すべての小脳小葉におけるＧＦＰ積分強度と、加速ロータロッドにおける平均成績との間には、良好な関係が認められた（図１３Ｂ）。

上記のすべてを考慮に入れると、処置された動物の行動試験及び神経病理学的徴候に関して観察されたバラつきは、異なるトランスダクション効率によって生じ得るものだと結論付けられた。これは、多量の注射量と相まった、新生仔マウスへの顔面内投与に関する技術的要求を理由とするものであり、又は、一部の動物が異なるベクター用量を受け取った可能性があることを理由とするものである可能性がある。さらに、小脳に到達するウイルス粒子の量も、おそらくは血管新生又はＡＡＶ受容体レベルが異なることにより、異なる動物間では相違し得る。

要するに、小脳内のベクター濃度が高いほど、より強力な治療効果に対応するため、ｒＡＡＶ９－ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３注射は、用量に応じた応答を誘導する。したがって、これらの結果に基づくと、治療効果は潜在的には、注射されるベクター用量、すなわち、動物１匹当たりのウイルス粒子の数を増やすことによって最大化され得ると結論付けることができる。

証明された有効性の他に、治療戦略の安全性プロファイルは、見込みのある臨床への適合を可能にするかを評価する必要がある。最近の研究は、ｒＡＡＶ９送達後の脳内で誘起される免疫反応と、ｍｉＲによって誘導されるオフターゲットサイレンシングによる毒性とを報告している。本発明者らは、これらのすべてのパラメータを詳細には調査していないが、本明細書に開示されている治療戦略は、野生型動物においては、この処置が良好な耐用性を示すかどうかを判定するために、８５日目における定速ロータロッド及び加速ロータロッドの成績に基づいて評価された。ｒＡＡＶ９－ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ又はｒＡＡＶ９－ｍｉＲ－ＡＴＸＮ３を静脈内注射された野生型マウスのロータロッド成績には、差異が検出されなかった（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。これらの発見は、治療用配列が重度の有毒な効果を誘導しないことを示唆している。

最後に、ＰＮ７５において、９．４Ｔｅｓｌａスキャナを使用して、動物を磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）及び磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）にも供して、処置されたＭＪＤトランスジェニックマウスと対照ＭＪＤトランスジェニックマウスとの両方、並びに野生型同腹仔の小脳の形態学的変化及び代謝変化を評価した。

小脳においては、これらの神経化学物質、すなわち、Ｎ－アセチルアスパルテート（ＮＡＡ）、ミオイノシトール（Ｉｎｓ）及びグリセロホスホコリン＋ホスホコリン（ｔＣｈｏ）は、トランスジェニックＭＪＤにおいては、野生型マウスに比較して大いに調節解除されていた（図１５Ａ）。興味深いことに、これら３種の神経代謝産物のレベルは、ｍｉＲ－ＡＴＡＸ３を注射されたＭＪＤマウスにおいては改善されており、これは、対照ＭＪＤマウスに比較して、ＮＡＡ（神経細胞マーカー）のレベルがより高いこと、並びに、Ｉｎｓ及びｔＣｈｏ（細胞死のマーカー）のレベルがより低いことを意味する（図１５Ｂ）。

神経化学的な比であるＮＡＡ／Ｉｎｓ及びＮＡＡ／総コリン並びにＮＡＡ／（Ｉｎｓ＋ｔＣｈｏ）比もまた、上記治療法の有効性を評価するために用いられた。３つすべての比の値は、対照ＭＪＤマウスに比較して、処置されたＭＪＤマウスの場合の方が有意に高く、ｍｉＲ－ＡＴＡＸ３処置の有効性を実証した（図１５Ｂ）。

概して、これにより、神経化学的バイオマーカー、特にＮＡＡ、Ｉｎｓ及びｔＣｈｏを、重要な非侵襲性の治療用バイオマーカーとして使用して、前臨床試験中に上記遺伝子ベースの治療法の有効性をモニタリングし、続いて、ヒト臨床試験に適合させることが可能であることが、実証されている。

結論として、本開示は、配列番号２を含むｍｉＲ１５５ベースの人工ｍｉＲＮＡをコードするｒＡＡＶ９をＰ１に単回静脈内注射することにより、ｉ） 血液脳関門を転位させ、ｉｉ） 変異アタキシン－３ ｍＲＮＡを正確にサイレンシングし、ｉｉｉ） ＭＪＤによる神経病理学的変化及び運動障害を軽減することができるという、説得力のあるエビデンスを提供する。

さらに、本開示は、ｒＡＡＶ９静脈内投与後のポリグルタミン障害における有意な行動改善を報告しており、非侵襲性のシステムを用いて広範かつ長期にわたるアタキシン－３のサイレンシングを誘導することができる第１のＭＪＤ治療アプローチを構成する。

本明細書において使用されているときは常に、「含む」という用語は、記載された特徴、整数、ステップ、構成要素の存在を示すが、１つ以上の他の特徴、整数、ステップ、構成要素又はこれらの群の存在又は追加を排除しないように意図されている。

当業者ならば、そうではないと本明細書において示されていない限り、記述されたステップの特定の順序は説明用のものにすぎず、本開示から逸脱することなく変更することができることを理解されよう。したがって、そうではないとの記載がない限り、記述されたステップは、前述のように順序付けられておらず、このことは、これらのステップが、可能な場合であれば、任意の好都合な又は望ましい順番で実施され得ることを意味する。

本開示は、記述された実施形態に限定されるものとして決して解されるべきではなく、当業者ならば、これらの記述された実施形態の変更形態に至る数多くの可能性を予見されよう。上記に記述された実施形態は、組み合わせることが可能である。

下記の特許請求の範囲には、本開示の特定の実施形態がさらに記載されている。

配列表：
１） 標的配列、及び、ＡＴＸＮ３常在性ＳＮＰを標的化する二本鎖ＲＮＡ配列
１．１ エキソン１０（ｒｓ１２８９５３５７）の標的配列、及び、ＳＮＰを標的化する各二本鎖ＲＮＡ
１．１．１ 標的配列、及び、ｒｓ１２８９５３５７（シトシン）のアタキシン－３ ｍＲＮＡを標的化する二本鎖ＲＮＡのアンチセンス配列
配列番号１：エキソン１０（ｒｓ１２８９５３５７）（Ｃ）の標的配列：ａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃｇｇｇａｃｃｕａｕｃａ
配列番号２：（ｍｉＲ３５７Ｃ．２２）：５’－ｕｇａｕａｇｇｕｃｃｃｇｃｕｇｃｕｇｃｕｇｃ－３’（２２ｎｔ）
配列番号３：（ｍｉＲ３５７Ｃ．２１）：５’－ｕｇａｕａｇｇｕｃｃｃｇｃｕｇｃｕｇｃｕｇ－３’（２１ｎｔ）
配列番号４：（ｍｉＲ３５７Ｃ．１９）：５’－ｕｇａｕａｇｇｕｃｃｃｇｃｕｇｃｕｇｃ－３’（１９ｎｔ）
配列番号５：（ｍｉＲ３５７Ｃ．２０）：５’－ｕｇａｕａｇｇｕｃｃｃｇｃｕｇｃｕｇｃｕ－３’（２０ｎｔ）
配列番号６：（ｍｉＲ３５７Ｃ．２３）：５’－ｕｇａｕａｇｇｕｃｃｃｇｃｕｇｃｕｇｃｕｇｃｕ－３’（２３ｎｔ）

１．１．２． 標的配列、及び、ｒｓ１２８９５３５７（グアニン）のアタキシン－３ ｍＲＮＡを標的化する二本鎖ＲＮＡのアンチセンス配列
配列番号７：エキソン１０（ｒｓ１２８９５３５７）（Ｇ）の標的配列：ａｇｃａｇｃａｇｃａｇｇｇｇｇａｃｃｕａｕｃａ
配列番号８（ｍｉＲ３５７Ｇ．２２）：５’－ｕｇａｕａｇｇｕｃｃｃｃｃｕｇｃｕｇｃｕｇｃ－３’（２２ｎｔ）
配列番号９（ｍｉＲ３５７Ｇ．１９）：５’－ｕｇａｕａｇｇｕｃｃｃｃｃｕｇｃｕｇｃ－３’（１９ｎｔ）
配列番号１０（ｍｉＲ３５７Ｇ．２０）：５’－ｕｇａｕａｇｇｕｃｃｃｃｃｕｇｃｕｇｃｕ－３’（２０ｎｔ）
配列番号１１（ｍｉＲ３５７Ｇ．２１）：５’－ｕｇａｕａｇｇｕｃｃｃｃｃｕｇｃｕｇｃｕｇ－３’（２１ｎｔ）
配列番号１２（ｍｉＲ３５７Ｇ．２３）：５’－ｕｇａｕａｇｇｕｃｃｃｃｃｕｇｃｕｇｃｕｇｃｕ－３’（２３ｎｔ）

１．２ エキソン８（ｒｓ１０４８７５５）の標的配列、及び、ＳＮＰを標的化する各二本鎖ＲＮＡ
１．２．１ 標的配列、及び、ｒｓ１０４８７５５（アデニン）のアタキシン－３アレルを標的化する二本鎖ＲＮＡのアンチセンス配列
配列番号１３：エキソン８（ｒｓ１０４８７５５）（Ａ）の標的配列：ａｃｃｕｇｇａａｃｇａａｕｇｕｕａｇａａｇｃａ
配列番号１４（ｍｉＲ７５５Ａ．２２）：５’－ｕｇｃｕｕｃｕａａｃａｕｕｃｇｕｕｃｃａｇｇ－３’（２２ｎｔ）
配列番号１５（ｍｉＲ７５５Ａ．１９）：５’－ｕｇｃｕｕｃｕａａｃａｕｕｃｇｕｕｃｃ－３’（１９ｎｔ）
配列番号１６（ｍｉＲ７５５Ａ．２０）：５’－ｕｇｃｕｕｃｕａａｃａｕｕｃｇｕｕｃｃａ－３’（２０ｎｔ）
配列番号１７（ｍｉＲ７５５Ａ．２１）：５’－ｕｇｃｕｕｃｕａａｃａｕｕｃｇｕｕｃｃａｇ－３’（２１ｎｔ）
配列番号１８（ｍｉＲ７５５Ａ．２３）：５’－ｕｇｃｕｕｃｕａａｃａｕｕｃｇｕｕｃｃａｇｇｕ－３’（２３ｎｔ）

１．２．２ 標的配列、及び、ｒｓ１０４８７５５（グアニン）のアタキシン－３アレルを標的化する二本鎖ＲＮＡのアンチセンス配列
配列番号１９：エキソン８（ｒｓ１０４８７５５）（Ｇ）の標的配列：ａｃｃｕｇｇａａｃｇａｇｕｇｕｕａｇａａｇｃａ
配列番号２０（ｍｉＲ７５５Ｇ．２２）：５’－ｕｇｃｕｕｃｕａａｃａｃｕｃｇｕｕｃｃａｇｇ－３’（２２ｎｔ）
配列番号２１（ｍｉＲ７５５Ｇ．１９）：５’－ｕｇｃｕｕｃｕａａｃａｃｕｃｇｕｕｃｃ－３’（１９ｎｔ）
配列番号２２（ｍｉＲ７５５Ｇ．２０）：５’－ｕｇｃｕｕｃｕａａｃａｃｕｃｇｕｕｃｃａ－３’（２０ｎｔ）
配列番号２３（ｍｉＲ７５５Ｇ．２１）：５’－ｕｇｃｕｕｃｕａａｃａｃｕｃｇｕｕｃｃａｇ－３’（２１ｎｔ）
配列番号２４（ｍｉＲ７５５Ｇ．２３）：５’－ｕｇｃｕｕｃｕａａｃａｃｕｃｇｕｕｃｃａｇｇｕ－３’（２３ｎｔ）

その他の配列
配列番号２５（ｍｉＲ－ｃｏｎｔｒｏｌ）：５’－ｃａａｃａａｇａｕｇａａｇａｇｃａｃｃａａ－３’（２１ｎｔ）
配列番号２６（ｓｈ－ＡＴＸＮ３）：５’－ｇａｕａｇｇｕｃｃｃｇｃｕｇｃｕｇｃｕ－３’（１９ｎｔ）
配列番号２７（ｍｉＲ１５５－５’アーム）：５’－ｃｕｇｇａｇｇｃｕｕｇｃｕｇａａｇｇｃｕｇｕａｕｇｃｕｇ－３’
配列番号２８（ｍｉＲループ）：５’－ｇｕｕｕｕｇｇｃｃａｃｕｇａｃｕｇａｃ－３’（１９ｎｔ）
配列番号２９（ｍｉＲ１５５－３’アーム）：５’－ｃａｇｇａｃａａｇｇｃｃｕｇｕｕａｃｕａｇｃａｃｕｃａｃａｕｇｇａａｃａａａｕｇｇｃｃ－３’（４３ｎｔ）

参考文献
ＵＳ１００７２２６４Ｂ２
ＷＯ２００５１０５９９５
Ａｌｖｅｓ，Ｓ．，Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ－Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｉ．，Ａｕｒｅｇａｎ，Ｇ．，Ｈａｓｓｉｇ，Ｒ．，Ｄｕｆｏｕｒ，Ｎ．，Ｂｒｏｕｉｌｌｅｔ，Ｅ．，Ｐｅｄｒｏｓｏ ｄｅ Ｌｉｍａ，Ｍ．Ｃ．，Ｈａｎｔｒａｙｅ，Ｐ．，Ｐｅｒｅｉｒａ ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ，Ｌ．，ａｎｄ Ｄｅｇｌｏｎ，Ｎ．（２００８ａ）．Ａｌｌｅｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＮＡ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ａｔａｘｉｎ－３ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｍａｃｈａｄｏ－Ｊｏｓｅｐｈ ｄｉｓｅａｓｅ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ３，ｅ３３４１
Ａｌｖｅｓ，Ｓ．，Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ－Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｉ．，Ｄｕｆｏｕｒ，Ｎ．，Ｈａｓｓｉｇ，Ｒ．，Ａｕｒｅｇａｎ，Ｇ．，Ｎｏｂｒｅｇａ，Ｃ．，Ｂｒｏｕｉｌｌｅｔ，Ｅ．，Ｈａｎｔｒａｙｅ，Ｐ．，Ｐｅｄｒｏｓｏ ｄｅ Ｌｉｍａ，Ｍ．Ｃ．，Ｄｅｇｌｏｎ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａｔａｘｉｎ－３ ｍｉｔｉｇａｔｅｓ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｍａｃｈａｄｏ－Ｊｏｓｅｐｈ ｄｉｓｅａｓｅ： ｎｏ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ａｔａｘｉｎ－３？Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９，２３８０－２３９４
Ｎｏｂｒｅｇａ，Ｃ．，Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ－Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｉ．，Ｏｎｏｆｒｅ，Ｉ．，Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ，Ｄ．，Ｈｉｒａｉ，Ｈ．，Ｄｅｇｌｏｎ，Ｎ．，ａｎｄ ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ，Ｌ．Ｐ．（２０１３）．Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ａｔａｘｉｎ－３ ｒｅｓｃｕｅｓ ｍｏｔｏｒ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｍａｃｈａｄｏ－Ｊｏｓｅｐｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ８，ｅ５２３９６
Ａｌｖｅｓ，Ｓ．，Ｒｅｇｕｌｉｅｒ，Ｅ．，Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ－Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｉ．，Ｈａｓｓｉｇ，Ｒ．，Ｄｕｆｏｕｒ，Ｎ．，Ｋｏｅｐｐｅｎ，Ａ．，Ｃａｒｖａｌｈｏ，Ａ．Ｌ．，Ｓｉｍｏｅｓ，Ｓ．，ｄｅ Ｌｉｍａ，Ｍ．Ｃ．，Ｂｒｏｕｉｌｌｅｔ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２００８ｂ）．Ｓｔｒｉａｔａｌ ａｎｄ ｎｉｇｒａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ａ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｍａｃｈａｄｏ－Ｊｏｓｅｐｈ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７，２０７１－２０８３
Ｋ．Ｈ．Ｃｈｕｎｇ，Ｃ．Ｃ．Ｈａｒｔ，Ｓ．Ａｌ－Ｂａｓｓａｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＢＩＣ／ｍｉＲ－１５５，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３４，ｎｏ．７，ａｒｔｉｃｌｅ ｅ５３，２００６

Claims (17)

1. 実質的に相補的なセンスリボヌクレオチド配列との間で塩基対を形成したアンチセンスリボヌクレオチド配列
   を含む、リボ核酸（ＲＮＡ）分子であって、
   アンチセンスＲＮＡ配列の各リボヌクレオチドが、変異ヒトアタキシン－３遺伝子のマカド－ジョゼフ病（ＭＪＤ）アレルと連鎖不平衡の関係にある一塩基多形を含む、対応する変異ヒトアタキシン－３のリボヌクレオチドに対して相補的であり、
   変異ヒトアタキシン－３ ｍＲＮＡの一塩基多型に対して相補的なアンチセンスＲＮＡ配列のリボヌクレオチドが、アンチセンスＲＮＡ配列の５’末端のリボヌクレオチドからリボヌクレオチド１０個分離れている、
   リボ核酸（ＲＮＡ）分子。
2. 塩基対を形成したセンスリボヌクレオチド配列が、アンチセンスリボヌクレオチド配列に対して完全に相補的ではない、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
3. アンチセンスリボヌクレオチド配列が、センスリボヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％相補的である、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
4. アンチセンスリボヌクレオチド配列が、配列番号１又は１３に対して相補的である、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
5. アンチセンスリボヌクレオチド配列が、配列番号２、３、４、５、６、１４、１５、１６、１７又は１８である、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
6. アンチセンスリボヌクレオチド配列が、配列番号２である、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
7. アンチセンスＲＮＡ配列の５’末端及び３’末端のリボヌクレオチドが、少なくともリボヌクレオチド１７個分離れている、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
8. アンチセンスＲＮＡ配列の５’末端及び３’末端のリボヌクレオチドが、リボヌクレオチド１７～２１個分離れている、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
9. ＲＮＡ分子が、単一のＲＮＡ分子である、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
10. ＲＮＡ分子が、ｍｉＲＮＡである、請求項７に記載のＲＮＡ分子。
11. 一塩基多型（ＳＮＰ）が、ヒトアタキシン－３遺伝子のｒｓ１０４８７５５（エキソン８）アレル又はｒｓ１２８９５３５７（エキソン１０）アレルのＳＮＰを含む、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
12. ＲＮＡ分子が、野生型ヒトアタキシン－３アレルではない、変異ヒトアタキシン－３遺伝子のマカド－ジョゼフ病（ＭＪＤ）アレルの発現を選択的にサイレンシングするときに、治療の観点から効果的である、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
13. ｍｉＲ－１５５に由来するｍｉＲＮＡスキャフォールドを含む、請求項１に記載のＲＮＡ分子であって、アンチセンスリボヌクレオチドが、配列番号２であり、センスリボヌクレオチドが、配列番号１である、ＲＮＡ分子。
14. プロモーターに機能可能な様式で連結した単離されたＤＮＡ配列を含む、アデノ随伴ウイルスベクターであって、単離されたＤＮＡ配列が、請求項１に記載のＲＮＡ分子をコードする、アデノ随伴ウイルスベクター。
15. 変異ヒトアタキシン－３のマカド－ジョゼフ病（ＭＪＤ）アレルと連鎖不平衡の関係にある一塩基多形を有する、変異ヒトアタキシン－３アレルの発現を選択的にサイレンシングするための方法であって、請求項１２に記載のアデノ随伴ウイルスベクターを、それを必要としている対象に投与することを含む、方法。
16. 一塩基多型（ＳＮＰ）が、変異ヒトアタキシン－３遺伝子のｒｓ１０４８７５５（エキソン８）又はｒｓ１２８９５３５７（エキソン１０）アレルのＳＮＰを含む、請求項１３に記載の方法。
17. アデノ随伴ウイルスベクターが、全身投与され、静脈内投与され、腫瘍内投与され、経口投与され、鼻腔内投与され、腹腔内投与され、筋肉内投与され、脊椎内投与され、脳内投与され、脳室内投与され、大槽内投与され、髄腔内投与され、眼内投与され、心臓内投与され、皮内投与され、又は皮下投与され、好ましくは、静脈内投与され、大槽内投与され、髄腔内投与され、又は、インサイチューで脳内投与される、請求項１４に記載の方法。
    

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