CN114958850B - 一种基因组件、含有此基因组件的递送系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基因组件，所述基因组件包括用于表达RNA序列的DNA序列以及与该DNA序列能够形成至少80％互补的补偿序列，所述RNA序列为miRNA‑2911序列或与该miRNA‑2911序列同源性大于85％的序列；并公开了含有此基因组件的递送系统及其应用。本发明的有益效果为：本发明的基因组件以及递送系统能够在体外和体内实验中提高exosome中micro RNA2911有效成分的含量，能够有效提高细胞内micro RNA和补偿序列含量，以及基于这种microRNA体外合成生物学方式对下游靶蛋白的作用效果。

Description

一种基因组件、含有此基因组件的递送系统及其应用
技术领域
本发明涉及生物基因工程技术领域，具体涉及一种基因组件、含有此基因组件的递送系统及其应用。
背景技术
MIR2911是一种新型植物源性的MicroRNA，属于天然功能性小分子，具有调控非植物靶基因的功能，能抑制埃博拉病毒、寨卡病毒、非洲猪瘟病毒、中东呼吸热病毒、猪轮状病毒及新冠病毒等多种病毒，是一种具有广谱抗病毒潜力的新型核酸类有效成分。
天然的植物MicroRNA在动物体内一般是经胃部消化吸收后进入细胞，因为RNA容易被细胞外富含的RNase降解成碎片，因此必须找到能够使RNA稳定存在于细胞外，才能将植物源性的MicroRNA的抗病毒效果凸显出来。
RNA干扰(RNAi)疗法自从被发明以来，一直被认为是治疗人类疾病的一种很有前途的策略，但在临床实践过程中遇到了许多问题，该疗法的发展进度远远落后于预期。
目前与RNAi相关的专利很多，主要聚焦在以下几个方面：
1、设计具有医学效果的siRNA；
2、对siRNA进行化学修饰，提高siRNA在生物体内的稳定性，提高产率；
3、提高设计各种人工载体(如脂质纳米粒子、阳离子聚合物和病毒)，以提高siRNA在体内传递的效率。
其中第3方面的专利很多，其根本原因是研究人员们已经意识到目前缺乏合适的siRNA传递系统，将siRNA安全地、精确地、高效地输送到目标组织，该问题已经成为制约RNAi疗法的核心问题。
本发明的研究团队发现内源性细胞可以选择性地将miRNAs封装到外泌体(exosome)中，外泌体可以将miRNA传递到受体细胞中，其分泌的miRNA在相对较低的浓度下，即可有力阻断靶基因的表达。外泌体与宿主免疫系统生物相容，并具有在体内保护和运输miRNA跨越生物屏障的先天能力，因此成为克服与siRNA传递相关的问题的潜在解决方案。
但在miRNA-2911的前期研究中发现，miRNA-2911在体内的表达量有限，最终形成的含有该miRNA-2911的外泌体的量较低，基本无法满足后续无论是临床治疗还是其它实验用途的需要，因此，如何提高体外和体内细胞中micro RNA-2911的含量或含有该miRNA-2911的外泌体的含量尤为重要。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种基因组件、基于此基因组件的递送系统及其应用，此种基因组件能够高效表达micro RNA-2911，提升表达量，有效提高micro RNA基因组件合成生物学靶向下游基因的敲降效率。
上述高效表达的micro RNA，是指人工合成的micro RNA基因组件通过体外的合成生物学装配后的小核酸分子，设计思路为基因组件上micro RNA有效序列和补偿序列上形成的不匹配碱基环大小和个数不同，设计改变了基因组件上表达micro RNA的DNA序列对应的补偿序列上的碱基序列，最终结果显示，影响统计学上的差异是GC含量的改变。
人工合成的micro RNA基因组件的高效表达是通过转染细胞系后细胞内microRNA含量的检测来确定的，具体思路是基于人工合成的micro RNA基因组件的体外自组装含量检测，是通过转染细胞系后，分泌到外泌体中的micro RNA含量的检测来体现。
本发明提供了一种基因组件，所述基因组件包括用于表达RNA序列的DNA序列以及与该DNA序列能够形成至少80％互补的补偿序列，所述RNA序列为miRNA-2911序列或与该miRNA-2911序列85％以上同源的序列。该同源的序列包括在miRNA-2911序列基础上增加碱基、减少碱基、替换其中任意一个碱基。
进一步的，所述miRNA-2911序列可为SEQ No.8和SEQ No.9所示的序列。
SEQ No.8序列：GGCCGGGGGACGGGCUGGGA。
SEQ No.9序列：GGCCGGGGGACGGACUGGGA。
其中，SEQ No.9与SEQ No.8相比具有一个碱基(G->A)的改变。
进一步的，上述的基因组件，所述表达RNA序列的DNA序列和与该DNA序列互补的补偿序列的结合紧密度被降低；优选的，所述结合紧密度的降低是指，表达RNA序列的DNA序列和与该DNA序列互补的补偿序列的结合能低于表达RNA序列的DNA序列和与该DNA序列互补的补偿序列完全匹配时的正常的结合能。进一步的，上述的基因组件，所述表达RNA序列的DNA序列和与该DNA序列互补的补偿序列的结合能降低至完全匹配时的正常结合能的30％-85％，优选为40％-60％。
表达miRNA-2911序列的DNA序列以及与该DNA序列能够形成互补的补偿序列，其完全匹配时的正常结合能为44.3kcal/mol。
进一步的，上述的基因组件，采用将与表达RNA序列的DNA序列互补的补偿序列中碱基G和/或C突变为A和/或T的方式，达到所述表达RNA序列的DNA序列和与该DNA序列互补的补偿序列的结合能降低的效果。
进一步的，上述的基因组件，所述与表达RNA序列的DNA序列互补的补偿序列中碱基G和/或C突变为A和/或T的数量为3-8个，优选为4个C突变为A。
表达miRNA-2911序列的DNA序列以及与该DNA序列能够形成互补的补偿序列，在补偿序列碱基突变后，结合能降低至15.0-36.5kcal/mol，说明补偿序列碱基突变确实有效的影响了表达miRNA-2911序列的DNA序列以及与该DNA序列互补的补偿序列的结合紧密度。
进一步的，上述的基因组件，所述与表达RNA序列的DNA序列互补的补偿序列是选自SEQ No.1-7任一所述的序列。
未突变的补偿序列为与转录SEQ No.8序列或SEQ No.9序列或其同源序列的DNA序列互补配对的基因序列，如其可为TCCCAGCCTCCCCCGGCC。则，上述SEQ No.1-7可为如下序列。
SEQ No.1序列：TAACAGCATACCCCGGCC；其中，有4个C突变为A，结合能为28.7kcal/mol。
SEQ No.2序列：TTTTAGCCTCCCCCGGCC；其中，有3个C突变为T，结合能为36.5kcal/mol。
SEQ No.3序列：TTTTAGCCTCCTTTGGCC；其中，有6个C突变为T，结合能为28.7kcal/mol。
SEQ No.4序列：TTTTAGTTTCCTTTGGCC；其中，有8个C突变为T，结合能为24.5kcal/mol。
SEQ No.5序列：TTTTAGCCTTTTTTGGCC；其中，有8个C突变为T，结合能为23.5kcal/mol。
SEQ No.6序列：TTTTAGTTTTTTTTGGCC；其中，有10个C突变为T，结合能为19.0kcal/mol。
SEQ No.7序列：TTTTAGTTTTTTTTGGTT；其中，有12个C突变为T，结合能为15.0kcal/mol。
进一步的，所述基因组件还包括loop序列；所述基因组件的组成顺序为表达RNA序列的DNA序列-loop序列-与该DNA序列能够形成至少80％互补的补偿序列。
进一步的，所述loop序列为SEQ No.10所示的序列或与该SEQ No.10序列85％以上同源的序列。
SEQ No.10序列：GTTTTGGCCACTGACTGAC。
本发明的第二个目的是提供了一种递送系统，所述递送系统含有上述的基因组件，递送载体能够在宿主的器官组织中富集，并在所述施用对象的器官组织中内源性地自发形成含有所述RNA序列的复合结构；所述RNA序列是具有医学意义的miRNA-2911序列或与其同源性大于85％的序列。
进一步的，上述的递送系统，所述递送系统为病毒载体或非病毒载体；所述病毒载体包括腺相关病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体，所述非病毒载体包括质粒载体、脂质体载体、阳离子多聚物载体、纳米颗粒载体、多功能信封式纳米载体。
其中，以腺病毒载体为递送系统的示例及效果验证如图6所示。
进一步的，上述的递送系统，所述质粒系统还包括启动子和靶向标签，所述靶向标签能够在被施用对象的器官组织中形成复合结构的靶向结构，所述靶向结构位于复合结构的表面，所述复合结构能够通过所述靶向结构寻找并结合目标组织，将所述miRNA-2911序列递送进入目标组织。
进一步的，上述的递送系统，所述系统包括以下任意一种线路或几种线路的组合：启动子与表达miRNA-2911序列的DNA序列、启动子与靶向标签、启动子与表达miRNA-2911序列的DNA序列与靶向标签。
也即是说，在递送系统中，启动子是递送系统必须包含的，靶向标签(靶向肽)则不是必须包含的，包含启动子、靶向标签(RVG靶向肽)和miRNA-2911序列的示例如和效果验证如图7所示。
进一步的，上述的递送系统，所述器官组织为肝脏，所述复合结构为外泌体。
进一步的，上述的递送系统，所述靶向标签选自具有靶向功能的靶向肽或靶向蛋白；
优选的，所述靶向肽包括RVG靶向肽、GE11靶向肽、PTP靶向肽、TCP-1靶向肽、MSP靶向肽；更优选的，选自RVG靶向肽；
优选的，所述靶向蛋白包括RVG-LAMP2B融合蛋白、GE11-LAMP2B融合蛋白、PTP-LAMP2B融合蛋白、TCP-1-LAMP2B融合蛋白、MSP-LAMP2B融合蛋白；更优选的，选自RVG-LAMP2B融合蛋白。
图7已经显示了靶向蛋白为RVG-LAMP2B融合蛋白的示例和效果验证。
进一步的，上述的递送系统，所述递送载体为用于包括人在内的哺乳动物中的递送系统。
本发明的第三个目的是提供了上述的递送系统在药物中的应用。
进一步的，上述的应用，所述药物的给药方式包括口服、吸入、皮下注射、肌肉注射、静脉注射。
需要说明的是，以上所述的“同源性大于80％的序列”可以为同源性为85％、88％、90％、95％、98％等。
本发明的有益效果为：本发明的基因组件以及递送系统能够在体外和体内实验中提高exosome中micro RNA2911有效成分的含量，能够有效提高细胞内micro RNA和补偿序列含量，以及基于这种micro RNA体外合成生物学方式对下游靶蛋白的作用效果。
本发明人之前发现的特异性miRNA-MIR2911，具有广谱抗病毒特性，前期构建了一种全新的基因线路，包括有RNA序列、靶向标签及其组合，通过靶向作用，可将RNA锚定至靶器官或靶组织并充分发挥作用，兼具快速、准确的靶向功能与治疗功能，大幅提高了现有技术的效果，适用范围极广。同时，此基因线路能够在宿主的某些器官中富集，基于基因线路的可组装性，形成了外泌体或类似外泌体的复合结构，能够有效实现疾病/病灶的针对性治疗。
但由于miRNA-2911的生物学特性，表达miRNA-2911序列的DNA序列与其补偿序列在组装后，于体外实验的外泌体表达量一直很低，故此，发明人设计了本发明提供的新的基因组件，其中含有表达miRNA-2911序列的DNA序列，以及与表达miRNA-2911序列的DNA序列至少80％互补的补偿序列，具体方法是经过碱基突变，降低了结合紧密度，不仅能够有效提高其在外泌体中的有效表达量，同时，在原有补偿序列基础上，能够更进一步的防止RNA的降解，大幅增加了包含有此基因组件的载体型靶向治疗药物的稳定性。经过调整后的技术，一方面实现了基于体外Micro RNA基因原件的体外自组装的有效成分的提高，另一方面发现了一种调节体外功能性Micro RNA有效成分的方式，此方式后期还可用于完善MicroRNA基因组件发挥作用。
附图说明
图1显示为人工合成MIR2911基因组件上补偿序列上的碱基突变序列。
其中，表达miRNA2911序列的DNA序列，也即是有效序列，为左端起(20个碱基)GGCCGGGGGACGGGCTGGGA；
表达与miRNA2911序列的DNA序列互补的补偿序列，为右端起(18个碱基)的7个序列片段，分别为TAACAGCATACCCCGGCC、TTTTAGCCTCCCCCGGCC、TTTTAGCCTCCTTTGGCC、TTTTAGTTTCCTTTGGCC、TTTTAGCCTTTTTTGGCC、TTTTAGTTTTTTTTGGCC或TTTTAGTTTTTTTTGGTT；
表达loop序列的DNA序列，为中间部分的(19个碱基)GTTTTGGCCACTGACTGAC。图2显示为与图1对应的人工合成MIR2911基因组件转染进入细胞后形成的miRNA-2911片段结构。
图3显示为人工合成MIR2911基因组件转染进入293T细胞系36小时后的细胞中MIR2911的含量、细胞中antisense的含量、分泌出的exosome中MIR2911含量和细胞表达出的下游靶蛋白tgfb1含量(分别以图3A-图3D表示)。
图4显示为人工合成MIR2911基因组件转染进入Hepg2细胞系36小时后的细胞中MIR2911的含量、细胞中antisense的含量、分泌出的exosome中MIR2911含量和细胞表达出的下游靶蛋白tgfb1含量(分别以图4A-图4D表示)。
图5显示为含有人工合成MIR2911基因组件的体内体外exosome共培养对比实验结果。其中，图5A显示为人工合成MIR2911基因组件转染293T细胞系36小时后，从细胞培液中收集到的exosome与Hepg2共培24h后，细胞表达出的下游靶蛋白tgfb1含量；图5B显示为小鼠尾静脉注射人工合成MIR2911基因组件后，从血浆中收集到的exosome与Hepg2共培24h后，细胞表达出的下游靶蛋白tgfb1含量。
图6显示为本发明一实施例中，MIR2911 ADV基因组件在体外自组装过程中的稳定性检测结果。
图7显示为本发明一实施例中，RVG-LAM2B MIR2911基因组件在体外自组装过程中的稳定性和有效性效果图；其中，图7A显示为所有设计的基因组件均能够在细胞中表达MIR2911有效序列，图7B显示为RVG-LAM2B MIR2911基因组件可在脑组织中检测到。
具体实施方式
实施例1：
基因组件，包括用于表达RNA序列的DNA序列以及与该DNA序列能够形成至少80％互补的补偿序列，包括与其同源性为80％、85％、90％、95％、98％、99％的序列，RNA序列包括miRNA-2911序列以及与该miRNA-2911序列同源性大于85％的序列，包括与其同源性为85％、90％、92％、95％、98％、99％的序列。
其中，将表达RNA序列的DNA序列以及与该DNA序列互补的补偿序列的结合紧密度进行了降低；优选的，所述结合紧密度的降低是指，表达RNA序列的DNA序列以及与该DNA序列互补的补偿序列的结合能低于表达RNA序列的DNA序列与该DNA序列互补的补偿序列完全匹配时的正常的结合能。
结合能降低至完全匹配时的正常结合能的30％-85％；优选为40％-60％，还包括45％、50％、55％。
表达miRNA-2911序列的DNA序列以及与该DNA序列能够形成互补的补偿序列，其完全匹配时的正常结合能为44.3kcal/mol。
结合能的降低，采用将补偿序列中碱基G和/或C突变为A和/或T的方式进行，一般是将补偿序列中的3-8个G和/或C突变为A和/或T的方式进行；优选为4个C突变为A。
表达miRNA-2911序列的DNA序列以及与该DNA序列能够形成互补的补偿序列，在补偿序列碱基突变后，结合能降低至15.0-36.5kcal/mol，说明补偿序列碱基突变确实有效的影响了表达miRNA-2911序列的DNA序列以及与该DNA序列互补的补偿序列的结合紧密度。
miRNA-2911序列选自SEQ No.8和SEQ No.9所示的序列。
SEQ No.8序列：GGCCGGGGGACGGGCUGGGA。
SEQ No.9序列：GGCCGGGGGACGGGCUGGGA。
其中，SEQ No.9与SEQ No.8相比具有一个碱基(G->A)的改变。
补偿序列是选自SEQ No.1-7任一所述的序列。
未突变的补偿序列：TCCCAGCCTCCCCCGGCC。
SEQ No.1序列：TAACAGCATACCCCGGCC；其中，有4个C突变为A，结合能为28.7kcal/mol。
SEQ No.2序列：TTTTAGCCTCCCCCGGCC；其中，有3个C突变为T，结合能为36.5kcal/mol。
SEQ No.3序列：TTTTAGCCTCCTTTGGCC；其中，有6个C突变为T，结合能为28.7kcal/mol。
SEQ No.4序列：TTTTAGTTTCCTTTGGCC；其中，有8个C突变为T，结合能为24.5kcal/mol。
SEQ No.5序列：TTTTAGCCTTTTTTGGCC；其中，有8个C突变为T，结合能为23.5kcal/mol。
SEQ No.6序列：TTTTAGTTTTTTTTGGCC；其中，有10个C突变为T，结合能为19.0kcal/mol。
SEQ No.7序列：TTTTAGTTTTTTTTGGTT；其中，有12个C突变为T，结合能为15.0kcal/mol。
图1中，4个C突变为A(图1序列7)、3个C突变为T(图1序列11)、6个C突变为T(图1序列13)、8个C突变为T(图1序列13-1、13-2)、10个C突变为T(图1序列13-3)、12个C突变为T(图1序列13-4)。
图1中，
Ctr序列为：
GGCCGGGGGACGGGCTGGGA-GTTTTGGCCACTGACTGAC-TCCCAGCCTCCCCCGGCC；
序列7为：
GGCCGGGGGACGGGCTGGGA-GTTTTGGCCACTGACTGAC-TAACAGCATACCCCGGCC；
序列11为：
GGCCGGGGGACGGGCTGGGA-GTTTTGGCCACTGACTGAC-TTTTAGCCTCCCCCGGCC；
序列13为：
GGCCGGGGGACGGGCTGGGA-GTTTTGGCCACTGACTGAC-TTTTAGCCTCCTTTGGCC；
序列13-1为：
GGCCGGGGGACGGGCTGGGA-GTTTTGGCCACTGACTGAC-TTTTAGTTTCCTTTGGCC；
序列13-2为：
GGCCGGGGGACGGGCTGGGA-GTTTTGGCCACTGACTGAC-TTTTAGCCTTTTTTGGCC；
序列13-3为：
GGCCGGGGGACGGGCTGGGA-GTTTTGGCCACTGACTGAC-TTTTAGTTTTTTTTGGCC；
序列13-4为：
GGCCGGGGGACGGGCTGGGA-GTTTTGGCCACTGACTGAC-TTTTAGTTTTTTTTGGTT。
基因组件还包括loop序列；基因组件的组成方式为DNA序列-loop序列-补偿序列。
loop序列为SEQ No.10所示的序列或与其同源性大于80％的序列，包括与其同源性为85％、90％、92％、95％、98％、99％的序列等。
SEQ No.10序列：GTTTTGGCCACTGACTGAC。
实施例2：
一种递送载体，递送载体含有上述的基因组件，递送载体能够在宿主的器官组织中富集，并在所述施用对象的器官组织中内源性地自发形成含有所述RNA序列的复合结构；所述RNA序列是具有医学意义的miRNA-2911序列或与其同源性大于85％的序列。
miRNA-2911序列为GGCCGGGGGACGGGCUGGGA及与其同源性大于85％的序列或GGCCGGGGGACGGGCUGGGA及与其同源性大于85％的序列。
递送载体为病毒载体或非病毒载体；所述病毒载体包括腺相关病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体，所述非病毒载体包括质粒载体、脂质体载体、阳离子多聚物载体、纳米颗粒载体、多功能信封式纳米载体。
质粒载体还包括启动子和靶向标签，所述靶向标签能够在宿主的器官组织中形成所述复合结构的靶向结构，所述靶向结构位于复合结构的表面，所述复合结构能够通过所述靶向结构寻找并结合目标组织，将所述miRNA-2911序列递送进入目标组织。
质粒载体包括以下任意一种线路或几种线路的组合：启动子-表达miRNA-2911序列的DNA序列、启动子-靶向标签、启动子-表达miRNA-2911序列的DNA序列-靶向标签；每一个所述质粒中包括一个表达miRNA-2911序列的DNA序列和/或一个靶向标签。
质粒还包括能够使所述线路折叠成正确结构并表达的侧翼序列、补偿序列和loop序列，所述侧翼序列包括5’侧翼序列和3’侧翼序列；
递送系统包括以下任意一种线路或几种线路的组合：5’-启动子-5’侧翼序列-表达miRNA-2911序列的DNA序列-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列、5’-启动子-靶向标签或者5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-表达miRNA-2911序列的DNA序列-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列；
优选的，所述5’侧翼序列为ggatcctggaggcttgctgaaggctgtatgctgaattc或与其同源性大于80％的序列；
所述loop序列为gttttggccactgactgac或与其同源性大于80％的序列；
所述3’侧翼序列为accggtcaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcccagatctggccgcactcgag或与其同源性大于80％的序列；
所述补偿序列为所述表达miRNA-2911序列的DNA序列的反向互补序列。
器官组织为全身的组织、器官或细胞，如肝脏，所述复合结构为外泌体。
靶向标签选自具有靶向功能的靶向肽或靶向蛋白；
优选的，所述靶向肽包括RVG靶向肽、GE11靶向肽、PTP靶向肽、TCP-1靶向肽、MSP靶向肽；更优选的，选自RVG靶向肽；
优选的，所述靶向蛋白包括RVG-LAMP2B融合蛋白、GE11-LAMP2B融合蛋白、PTP-LAMP2B融合蛋白、TCP-1-LAMP2B融合蛋白、MSP-LAMP2B融合蛋白；更优选的，选自RVG-LAMP2B融合蛋白。
递送系统为用于包括人在内的哺乳动物中的递送系统。
还限定了递送系统在药物中的应用。
药物的给药方式包括口服、吸入、皮下注射、肌肉注射、静脉注射。
实施例3：
本发明人通过长期而深入的研究，发现一种高效表达micro RNA的基因组件，一方面大大提高了基于体外MicroRNA基因原件的体外自组装的有效成分，另一方面发现了一种调节体外功能性Micro RNA有效成分的方式，此方式后期还可用于完善MicroRNA基因组件发挥作用。因此可用于完善MicroRNA基因组件发挥作用。在此基础上，发明人完成了本发明。
本发明所提及的基因组件，是人工合成的表达miRNA-2911序列的DNA序列在转染到细胞后形成的MicroRNA的有效序列和补偿序列通过碱基互补构成的小核酸二级结构。
同时，通过突变人工合成MicroRNA基因组件上补偿序列上的碱基序列，主要是有效序列上G和C碱基互补配对的序列，因此后面形成的功能性基因组件的GC含量降低，基因组件上不配对碱基突起增加。
具体过程包括：
一、人工合成的MIR2911基因组件设计：
在原有的MIR2911基因组件上，突变补偿序列上特定的碱基序列，突变的碱基都是与有效序列GC互补配对的序列，如图1所示，7对应的是四个C突变为A的基因组件；11对应的是三个C突变为T的基因组件；13对应的是六个C突变为T的基因组件；13-1、13-2对应的是补偿序列上八个不同位置的C突变为T的基因组件；13-3对应的是补偿序列上十个不同位置的C突变为T的基因组件；13-4对应的是补偿序列上十二个不同位置的C突变为T的基因组件。
图1对应的人工合成MIR2911基因组件(表达miRNA-2911序列的DNA序列)转染进入细胞后形成的RNA基因环路如图2所示。
二、MIR2911基因组件在体外自组装过程中的稳定性和有效性：
将一得到的改造后人工合成的MIR2911基因组件分别转染到293T和Hepg2细胞系，用含有0.5％exosome free血清的培液进行培养，36小时后收集细胞、外泌体和培液上清，并检测细胞中MIR2911有效序列和补偿序列含量、外泌体中MIR2911有效序列和培液上清中tgfb1的含量，检测结果如图3(A-D)和图4(A-D)所示。
从图3(A-D)的对比结果可以说明：在293T细胞中转染了人工合成的MIR2911基因组件后，36小时后，所有设计的基因组件均能够在细胞中表达MIR2911有效序列(图3A)，其中13、13-2和13-4序列几乎不表达补偿序列(图3B)。进一步检测293T细胞分泌exosome中MIR2911有效序列含量，MIR2911基因组件7、13-1和13-2在exosome中有较高的MIR2911有效序列(图3C)。进一步检测293T细胞中MIR2911的调控基因TGFB1的蛋白含量，7、13-1和13-2能有效抑制293T细胞中TGFB1的含量(图3D)。
从图4(A-D)的对比结果可以说明：在HepG2细胞中转染了人工合成的MIR2911基因组件后，36小时后，所有设计的基因组件均能够在细胞中表达MIR2911有效序列(图4A)，其中13-1、13-2和13-3表达的MIR2911有效序列含量最高。检测标的补偿序列含量，13-2、13-3和13-4序列几乎不表达补偿序列(图4B)。进一步检测HepG2细胞分泌exosome中MIR2911有效序列含量，所有MIR2911基因组件在exosome中有MIR2911有效序列(图4C)。进一步检测HepG2细胞中MIR2911的调控基因TGFB1的蛋白含量，所有基因组件均能有效抑制HepG2细胞中TGFB1的含量(图4D)。
将一得到的改造后人工合成的MIR2911基因组件转染293T细胞系，36小时后通过超速离心收集exosome，100cm2的dish收集到的exosome为一个单位，将收集得到exosome加入到培养至70％-80％HepG2的孔板里，24小时后收集培液上清，检测上清中TGFB1的蛋白含量，检测结果如图5A所示。
从图5A的对比结果可以说明：转染基因组件13和13-2的293T细胞分泌的exosome可以有效的抑制共孵育的HepG2细胞分泌TGFB1的蛋白含量。
将一得到的改造后人工合成的MIR2911基因组件通过尾静脉注射递送到动物体内，动物选择的是6-8周龄的C57小鼠，反应时间是9小时，两只小鼠血浆通过超速离心收集到的exoxome量为一个单位，将收集得到的exosome加入到培养至70％-80％HepG2的孔板里，24小时后收集培液上清，检测上清中TGFB1的蛋白含量，检测结果如图5B所示。
从图5B的对比结果可以说明：注射基因组件13-2的小鼠血清exosome可以有效的抑制共孵育的HepG2细胞分泌TGFB1的蛋白含量。
实施例4：
一种递送载体，递送载体含有上述的基因组件，递送载体能够在宿主的器官组织中富集，并在所述施用对象的器官组织中内源性地自发形成含有所述RNA序列的复合结构；所述RNA序列是具有医学意义的miRNA-2911序列或与其同源性大于85％的序列。
将上述基因组件构建到腺病毒(ADV)载体中，检验该载体的表达效率。
具体过程包括：
一、ADV病毒载体的MIR2911基因组件设计：
在原有的MIR2911基因组件上，突变补偿序列上特定的碱基序列，突变的碱基都是与有效序列GC互补配对的序列，如图1所示，7对应的是四个C突变为A的基因组件；11对应的是三个C突变为T的基因组件；13对应的是六个C突变为T的基因组件；13-1、13-2对应的是补偿序列上八个不同位置的C突变为T的基因组件；13-3对应的是补偿序列上十个不同位置的C突变为T的基因组件；13-4对应的是补偿序列上十二个不同位置的C突变为T的基因组件。输送载体选择的是腺病毒(ADV)。
二、MIR2911 ADV基因组件在体外自组装过程中的稳定性：
将一得到的改造后人工合成的MIR2911基因组件分别转染到293T细胞系，用含有0.5％exosome free血清的培液进行培养，36小时后收集细胞并检测细胞中MIR2911有效序列和补偿序列含量，检测结果如图6所示。
从图6的对比结果可以说明：在293T细胞中转染了人工合成的MIR2911 ADV基因组件后，36小时后，所有设计的基因组件均能够在细胞中表达MIR2911有效序列，其中质粒载体组件效果最佳，13-2突变在质粒组件和ADV均有较好的稳定性。
实施例5：
本发明人通过长期而深入的研究，发现一种可以通过血脑屏障高效表达microRNA的基因组件，一方面大大提高了基于体外MicroRNA基因原件的体外自组装的有效成分和发现了一种调节体外功能性Micro RNA有效成分的方式，并在此基础上进一步完善了MicroRNA的基因组发挥作用。在此基础上，发明人完成了本发明。
具体过程包括：
一、人工合成的带RVG-LAM2B MIR2911基因组件设计：
在原有的有效MIR2911基因组件上，在这里筛选出来是3-2对应的是补偿序列上八个不同位置的C突变为T的基因组件，加上了RVG靶向肽。
图1对应的人工合成MIR2911基因组件(表达miRNA-2911序列的DNA序列)转染进入细胞后形成的RNA基因环路如图2所示。
二、RVG-LAM2B MIR2911基因组件在体外自组装过程中的稳定性和有效性：
稳定性试验中将改造后人工合成的RVG-LAM2B MIR2911基因组件分别转染293T细胞系，用含有0.5％exosome free血清的培液进行培养，36小时后收集细胞、外泌体和培液上清，并检测细胞中MIR2911有效序列；有效性实验是以6-8周的C57小鼠为实验对象，通过尾静脉注射质粒，给药浓度是5mg/kg，分别在不同时间点对小鼠的脑组织进行取样检测MIR2911的含量。
从图7(A-B)的对比结果可以说明：在293T细胞中转染了人工合成的MIR2911和RVG-LAM2B MIR2911基因组件后，36小时后，所有设计的基因组件均能够在细胞中表达MIR2911有效序列(图7A)，其中RVG-LAM2B MIR2911基因组件可以入脑如图7B。
实施例6：
高效表达Micro RNA的基因路线，技术要点解释：
一、基因路线的基础技术：
提供一种植物源性Micro RNA体外自组装系统，该系统包括人工合成植物源性Micro RNA基因组件的构建，所述基因组件携带功能性MicroRNA经体外自组装后进入细胞并发挥功能。
植物源性Micro RNA是具有医学意义的miRNA中的一种，即miRNA-2911。
基因组件包括所需递送的表达RNA序列的DNA序列，还包括其补偿序列。
质粒的功能结构区按以下顺序中的任一种排列：5’-启动子-5’侧翼序-RNA序列-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列。
其中RNA序列包括1个、两个或多个具有医疗意义的具体RNA序列，根据补偿序列与RNA序列的互补情况，所述RNA序列能够在细胞中被表达量不同，exosome中有效RNA的含量也不同。
复合结构为外泌体。
所需组装的RNA有效序列的数量为1条。
该自组装系统可接下来用于包括人在内的哺乳动物。
二、基因环路的设计思路及技术解释：
将基因组件中，用于表达miRNA-2911的DNA序列的补偿序列上的碱基进行突变，突变碱基为C，降低了MicroRNA基因组件的GC含量，基因组件的种类是根据突变的个数和位置来加以区分，改变了不配对碱基环的个数和大小，是构建高效RNAi基因原件关键性设计方法。
三、基因组件基础技术及基因组件的技术实际应用：
提供了一种RNA组装系统在药物中的应用。
药物通过静脉注射的方式进入体内后，能更高效的发挥后续的靶向作用。
药物为RNAi技术中基因组件的构建起到了重要作用，为治疗癌症、肺纤维化、结肠炎、肥胖症、由肥胖症引起的心血管疾病、二型糖尿病、亨廷顿病、帕金森病、重症肌无力、阿尔兹海默病或移植物抗宿主病的药物。
RNA组装系统以质粒作为基因组件，质粒作为成熟的注入物，其安全性和可靠性已被充分验证，成药性非常好。最终发挥效果的RNA序列由内源性外泌体包裹输送，不存在任何免疫反应，无需验证该外泌体的安全性。该递送系统可以递送各类小分子RNA，通用性强。并且质粒的制备要比外泌体或是蛋白质、多肽等物质的制备便宜地多，经济性好。本申请提供的RNA递送系统在体内自组装后能够与AGO2紧密结合并富集为复合结构(外泌体)，不仅能防止其过早降解，维持其在循环中的稳定性，而且有利于受体细胞吸收、胞浆内释放和溶酶体逃逸，所需剂量低。
提供的RNA组装系统应用于药物中，即提供了一个药物组装平台，可以通过该平台形成更多RNA类药物的研发基础，对RNA类药物研发和使用具有极大的推动作用。
提高植物源性MicroRNA在细胞中发挥作用。
植物源性MicroRNA较多，其中不乏一些功能性MicroRNA，主要通过下调动物体内靶基因，进而影响动物的生理特征。
非植物靶基因包括细菌基因、病毒基因、衣原体基因、酵母基因、动物基因或所述的非植物靶基因是病原体(包括细菌、病毒、衣原体等)的基因。
非植物靶基因相关疾病包括肿瘤(如肝癌、肺癌)；急慢性传染病(如病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病、SARS等的病毒性疾病，如结核、细菌性肺炎等的细菌性疾病，以及病原微生物导致的急慢性传染病)；其它急慢性疾病(如呼吸系统疾病、免疫系统疾病、血液与造血系统疾病、如心脑血管疾病的循环系统疾病、内分泌系统代谢性疾病、消化系统疾病、神经系统疾病、泌尿系统疾病、生殖系统疾病和运动系统疾病)。
在本发明中，所述的同源的序列均为在原序列基础上增加碱基、减少碱基、替换其中任意一个碱基后得到的序列。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京大学
<120> 一种基因组件、含有此基因组件的递送系统及其应用
<130> 2200241-I-SEQ
<140> 202210612132.4
<141> 2022-05-31
<150> 202110626964.7
<151> 2021-06-04
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
taacagcata ccccggcc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
ttttagcctc ccccggcc 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
ttttagcctc ctttggcc 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
ttttagtttc ctttggcc 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
ttttagcctt ttttggcc 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
ttttagtttt ttttggcc 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
ttttagtttt ttttggtt 18
<210> 8
<211> 20
<212> RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
ggccggggga cgggcuggga 20
<210> 9
<211> 20
<212> RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
ggccggggga cggacuggga 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 10
gttttggcca ctgactgac 19

Claims (7)

1.一种基因组件，其特征在于，所述基因组件包括用于表达RNA序列的DNA序列以及与该DNA序列互补的补偿序列，所述RNA序列为miRNA-2911序列，所述miRNA-2911序列选自SEQNo.8和SEQ No.9所示的序列；所述与表达RNA序列的DNA序列互补的补偿序列是选自SEQNo.1-7任一所述的序列。
2.根据权利要求1所述的基因组件，其特征在于，所述基因组件还包括loop序列；所述基因组件的组成顺序为表达RNA序列的DNA序列-loop序列-该DNA序列的补偿序列。
3.根据权利要求2所述的基因组件，其特征在于，所述loop序列为SEQNo.10所示的序列。
4.一种递送系统，其特征在于，所述递送系统含有如权利要求1-3任一所述的基因组件，递送系统能够在宿主的器官组织中富集，并在所述施用对象的器官组织中内源性地自发形成含有所述RNA序列的复合结构；所述RNA序列是具有医学意义的miRNA-2911序列；所述递送系统为质粒载体或腺病毒载体；所述递送系统还包括启动子和靶向标签，所述靶向标签能够在被施用对象的器官组织中形成复合结构的靶向结构，所述靶向结构位于复合结构的表面，所述复合结构能够通过所述靶向结构寻找并结合目标组织，将所述miRNA-2911序列递送进入目标组织；所述复合结构为外泌体；所述靶向标签为具有靶向功能的靶向蛋白，所述靶向蛋白为RVG-LAMP2B融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的递送系统，其特征在于，所述递送系统为用于包括人在内的哺乳动物中的递送系统。
6.一种权利要求4或5所述的递送系统在制备抗病毒药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗病毒药物的给药方式包括口服、吸入、皮下注射、肌肉注射、静脉注射。
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Honeysuckle-encoded atypical microRNA2911 directly targets inflenza A viruses;Zhen Zhou等;Cell Research;第25卷;39-49 *
MicroRNA-9过表达载体的构建与鉴定;张正平;赵勤鹏;黄琳红;王栋琪;许正伟;郭华;昌震;刘团江;;现代生物医学进展(26);5033-5037 *
中药金银花编码的MIR2911抗病毒作用的研究;周祯;中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑(第01期);E057-133 *
利用EST及生物信息学方法挖掘马铃薯中miRNA及其靶基因;郭强;项安玲;杨清;邱承祥;杨志敏;;科学通报(14);1656-1664 *
植物微小RNA跨界调控机制及其应用研究进展;田雪梅;张君;荣华;张莉华;马晓慧;孙立;;药学学报(06);1137-1146 *
猪杀菌/通透性增加蛋白基因siRNA载体构建及干扰效果评价;吴正常;殷学梅;夏日炜;孙寿永;朱国强;吴圣龙;包文斌;;畜牧兽医学报(03);491-496 *
造血系统中miRNAs的表达和功能;闫鸿斌;贾万忠;高闪电;才学鹏;;免疫学杂志(01);74-80 *
马铃薯microRNA及其靶基因的预测与功能分析;李世风;张宁;刘柏林;杜宏辉;司怀军;王蒂;;甘肃农业大学学报(06);43-48+65 *
鸡胚外泌体miRNAs功能分析;李莹;王艳;王劼;何静怡;罗成龙;瞿浩;;畜牧兽医学报(06);1260-1270 *

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