CN117065051A - 含有自复制rna分子的药盒及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域，具体地，本申请涉及含有自复制RNA分子的药盒及其用途。本发明提供一种药盒，包括：第一药物组合物，第一药物组合物包含自复制RNA分子和第一递送载体；第二药物组合物，第二药物组合物包含自复制RNA分子和第二递送载体，第一递送载体不同于第二递送载体。采用本发明的药盒可以实现多次系统性给药，提升了核酸药物，尤其是自复制RNA的体内递送效率和药效。
Description
优先权信息
本发明请求2022年05月16日向中国国家知识产权局提交的专利申请202210531085.0的优先权和权益，并且通过参照将其全文并入此处。
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本申请涉及含有自复制RNA分子的药盒及其用途。
背景技术
近年来基于mRNA药物或mRNA疫苗的开发成为人们关注的热点之一。然而，传统mRNA不是很稳定，在细胞内几天内就会降解，导致不可持续的蛋白质表达水平。如果长期用于疾病治疗，需要患者注射大量的mRNA，这可能会增加mRNA治疗的毒副作用。
自复制RNA分子可以在细胞质内进行自我复制，因此可以在很低的剂量下达到不低于传统mRNA的蛋白表达水平，并且可以在一定时间内长效表达蛋白质，从而展现出比mRNA更有前景的技术优势。
目前针对核酸类药物通常采用病毒衣壳蛋白作为药物递送载体，但是由于其需要采用全身系统性给药方式，将会产生针对于衣壳蛋白自身的中和抗体，从而影响后续给药时的蛋白表达，降低药效，由此难于实现多次系统性给药。
因此，如何实现核酸类药物，尤其是自复制RNA的多次系统性给药仍有待研究。
发明内容
本申请旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种药盒。根据本发明的一个实施方案，所述药盒包括：
第一药物组合物，所述第一药物组合物包含自复制RNA分子和第一递送载体；
第二药物组合物，所述第二药物组合物包含所述自复制RNA分子和第二递送载体，所述第一递送载体不同于所述第二递送载体；
其中，所述自复制RNA分子包括：
第一RNA序列，所述第一RNA序列编码N蛋白或其功能片段；
第二RNA序列，所述第二RNA序列编码P蛋白或其功能片段；
第三RNA序列，所述第三RNA序列编码L蛋白或其功能片段；和
靶分子编码区，所述靶分子编码区编码至少一个靶分子。
参考图1，由此，这些第一、第二和第三RNA序列构成了自复制RNA分子的“核心区”区域，也称为“核心生命区”，可以作为能够在动物细胞内实现自我复制和翻译的最小区域，进一步可以携带载货区(即靶分子编码区)，用于搭载其他的编码或非编码序列来表达或者复制靶分子，表达小分子、多种肽、酶、抗体、通道蛋白以及受体蛋白等，从而达到不同的治疗目的。
同时，药盒中第一药物组合物和第二药物组合物中的自复制RNA分子分别被不同的递送载体包裹，在施用药盒中的药物时，通过分别施用第一药物组合物、第二药物组合物，能够实现多次给系统药，且不会影响RNA疫苗引起的免疫反应或治疗药物的药效。由此，本发明提供的药盒解决了核酸类药物多次系统给药时产生的针对病毒衣壳递送体系中病毒衣壳的中和抗体问题，可以实现多次系统给药，能够维持多次系统给药的递送效率和药效。
在本发明的第二方面，本发明提出了第一方面所述的药盒在制备药物中的用途。根据本发明的一个实施方案，所述药物用于预防或治疗疾病，所述药物可以为疫苗或者治疗疾病的药物。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
附图说明
本申请的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的自复制RNA分子(reRNATM)的结构示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的含有自复制RNA分子的蛋白质-RNA复合物的结构示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的含自复制RNA分子的LNP递送系统示意图；
图4显示了根据本发明一个实施例的含自复制RNA分子的蛋白质递送系统结构示意图；
图5显示了根据本发明一个实施例的抑瘤率实验结果；
图6显示了根据本发明一个实施例的抑瘤率实验结果，其中实验组为免疫健全小鼠进行荷瘤后，多次给予reRNATM-溶瘤病毒-LNP，同时reRNATM-溶瘤病毒-IND-G作为对照组。
具体实施方式
下面详细描述本申请的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本公开所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“核酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指明的序列。
在本文中，术语“同源性”与“同一性”可互换使用，用于描述相对于参考序列的氨基酸序列时，采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列之间的相同氨基酸的百分比，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols in Molecular Biology，第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure 5：Suppl.3(National BiomedicalResearch Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和BLASTP、BLASTN和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者WU-BLAST-2(Altschul等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或者GAP、BESTFIT、BLASTAltschul等。
在不实质性影响N蛋白、P蛋白、L蛋白活性(保留至少95％的活性)的前提下，本领域技术人员可以对本发明的N蛋白、P蛋白、L蛋白氨基酸序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述N蛋白、P蛋白、L蛋白序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。本发明所述变体序列可以与参比序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性(或同源性)。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP。
本文使用的术语“治疗”和“预防”以及源自于此的词不必暗示100％或完全治疗或预防。相反，存在不同程度的治疗或预防，本领域普通技术人员认为所述治疗或预防具有潜在的益处或治疗效果。而且，本公开提供的治疗或预防可包括正在治疗或预防的疾病。另外，为了本文的目的，“预防”可涵盖延缓疾病或其症状或病患的发作。
在本文中，术语“受试者”和“患者”可互换使用，而不管受试者是否已经或当前正在接受任何形式的治疗。如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指哺乳动物受试者或患者。除非指出时，否则所述术语“患者”或“受试者”在本文中可互换地使用。示例性受试者包括但不限于人、猴、犬、猫、小鼠、大鼠、牛、马、骆驼、禽、山羊和绵羊。在某些实施方案，所述受试者是人。
自复制RNA分子
在本文中所使用的术语“自复制RNA分子”也可以称为“自我扩增RNA”，与普通mRNA相比，自复制RNA分子的重要的区别在于它可以使用自己的RNA序列作为模板进行自我复制。根据本发明的实施例，自复制RNA分子还可以在细胞质进行翻译和复制工作，不进入细胞核，可以避免与基因组发生整合所带来的潜在风险。通常mRNA编码需要表达的蛋白质，细胞内的核糖体用来完成翻译和蛋白质生产。根据本发明的实施例，自复制RNA分子会携带一个能够表达RNA聚合酶(RNA依赖RNA聚合酶)的序列，在该RNA分子在细胞质中通过翻译产生RNA聚合酶后，它可以用该自复制RNA分子作为模板来产生更多的自复制RNA分子。
如图1和2所示，发明人通过对各种RNA病毒的RNA在细胞内的翻译及自我扩增机制进行了深入研究，发现通过采用编码来自弹状病毒的N蛋白、P蛋白及L蛋白的RNA分子作为核心区域，可以实现RNA在动物细胞内的自我复制和翻译，并且该核心区域作为强大的“引擎”，可以提供高效转录扩增和启动大分子蛋白的“动能”，能够进一步搭载“货物区”来复制或者翻译靶分子，这些靶分子几乎涵盖了目前市场上所有的蛋白质药物。根据本发明的实施例，“货物区”可设计不同的蛋白编码盒使机体在细胞内生产多种肽、酶、抗体、通道蛋白以及受体蛋白等，从而达到不同的治疗目的。由此，本发明的发明人提出了一种新型的自复制RNA分子，并将其命名为reRNATM，如前所述，reRNATM包含可以实现RNA翻译及自我扩增的元件编码序列及搭载的编码靶分子的基因序列(图2)。根据本发明的实施例，reRNATM技术借鉴了RNA病毒的特性，在体内实现从RNA到mRNA，再从mRNA到蛋白质的放大扩增，从而高效长效的表达治疗性药物以达到更好的临床疗效。
发明人在研究过程中发现，由于自复制RNA分子将至少编码RNA聚合酶的序列与表达靶蛋白的序列连接起来，因此整个mRNA分子的分子量比传统mRNA的分子量大得多，分子量过大可能导致递送效率、翻译效率以及复制效率显著降低。为了对这些效率进行改善，发明人进行了深入研究，希望能够寻找到最短的核酸片段，可以正常发挥自我复制和翻译的功能。发明人发现，通过采用编码来自弹状病毒的N蛋白、P蛋白及L蛋白的RNA分子作为核心区域，可以实现RNA在动物细胞内的自我复制和翻译，该自复制RNA分子包括：
第一RNA序列，所述第一RNA序列编码N蛋白或其功能片段；
第二RNA序列，所述第二RNA序列编码P蛋白或其功能片段；
第三RNA序列，所述第三RNA序列编码L蛋白或其功能片段；和
靶分子编码区，所述靶分子编码区编码至少一个靶分子。
根据本发明的一个实施例，所述靶分子适于作为核酸类药物、蛋白类药物、病原体疫苗、肿瘤疫苗和罕见病治疗制剂的至少之一。
这些第一、第二和第三RNA序列构成了自复制RNA分子的“核心区”区域，也称为“核心生命区”，可以作为能够在动物细胞内实现自我复制和翻译的最小区域，进一步可以搭载其他的编码序列来表达或者复制靶分子，从而发挥药物或者疫苗的功能。
药盒
含有核心区域和“货物区”的自复制RNA分子在施用于机体时，还需要被额外的递送载体包裹，以便于RNA分子在受试者的靶细胞或靶组织中发挥作用。为解决多次施用RNA疫苗或治疗药物时机体产生针对病毒衣壳递送体系中病毒衣壳的中和抗体影响药效的问题，发明人进一步发现，当RNA分子被不同的递送载体包裹，能够实现多次系统给药。
为此，本发明提供一种药盒，包括：
第一药物组合物，所述第一药物组合物包含自复制RNA分子和第一递送载体；
第二药物组合物，所述第二药物组合物包含所述自复制RNA分子和第二递送载体，所述第一递送载体不同于所述第二递送载体；
其中，所述自复制RNA分子包括：
第一RNA序列，所述第一RNA序列编码N蛋白或其功能片段；
第二RNA序列，所述第二RNA序列编码P蛋白或其功能片段；
第三RNA序列，所述第三RNA序列编码L蛋白或其功能片段；和
靶分子编码区，所述靶分子编码区编码至少一个靶分子。
根据本发明的实施例，当受试者需要多次系统给药时，可首先施用药盒中的第一药物组合物，二次给药时，可施用药盒中的第二药物组合物；或者，向患者首先施用药盒中的第二药物组合物，二次给药时，施用药盒中的第一药物组合物。需要说明的是，本发明中的药盒中含有第一药物组合物、第二药物组合物，这里的“第一”、“第二”是泛指，并不意味着该药盒仅含有具有两种不同递送载体的自复制RNA分子，事实上，根据给药次数的需求，本发明的药盒中还可以含有第三药物组合物或者更多的药物组合物，只要保证这些不同的药物组合物中，包裹或搭载自复制RNA分子的递送载体不同即可。
在本文中所使用的术语“功能片段”是指蛋白质的全长序列的一部分，但仍能够发挥与RNA分子自我复制相关的功能，例如可以是全长序列的截断型的，也可以是蛋白质全长序列的氨基酸序列发生替换、突变或者删除等改变后的蛋白质。根据本发明的实施例，对于N蛋白的功能片段，可以结合RNA分子，保护RNA不受核酸酶的影响，对于P蛋白的功能片段，能够结合N蛋白，在模板上定位L聚合酶，同时也能够作为RNA聚合酶转录和复制复合体的基本组成部分，进一步L蛋白的功能片段能够发挥RNA聚合酶的功能，与RNA的转录及复制有关。
根据本发明的实施例，所述第一递送载体和第二递送载体各自独立地选自蛋白质、脂质体、外泌体。
根据本发明的实施例，第一递送载体为蛋白质时，第二递送载体为脂质体，或者第一递送载体为脂质体时，第二递送载体为外泌体，或者第一递送载体为蛋白质时，第二递送载体为外泌体。根据本发明的另一个实施方案，第一递送载体、第二递送载体为具有不同氨基酸序列或者不同空间结构的蛋白质，或者相同或者不同结构的脂质体，或者不同细胞来源的外泌体。
蛋白质可以作为递送载体携带核酸分子进入细胞，以实现遗传物质的细胞内递送。
脂质体作为纳米级药物递送载体被广泛地应用于药物递送中，可以自组装成病毒大小的颗粒，并能够将mRNA从内质体释放到细胞质。同时，可以起到促进细胞摄取、提高核内体逃逸、保护核酸分子不被TLRs识别、避免先天免疫系统的过度激活等作用。如图3所示，LNP递送系统主要是由LNP电势及核酸电势决定包裹核酸的量，由此一个LNP递送系统可以包裹一个到多个核酸分子。
外泌体是从活细胞释放到细胞外微环境的50-150nm大小的囊泡，由于外泌体体积小和其本身就是细胞产物，通过外泌体递送药物可以避免巨噬细胞的吞噬作用或降解，还可以在体内长时间循环，保持效果。其中，外泌体能够穿过血脑屏障以将核酸药物递送到中枢神经系统是外泌体递送药物的一个显著优势。
根据本发明的实施例，所述蛋白质包括非人源蛋白和人源蛋白。本发明对于人源蛋白的类型不作严格限定，只要是能够作为递送载体将核酸分子递送到细胞内即可，包括但不限于SNARE蛋白家族。根据本发明的实施例，所述非人源蛋白包括病毒衣壳蛋白。相比于人源蛋白，病毒衣壳蛋白的递送效果更佳，由于病毒衣壳蛋白不具有病毒遗传物质，易感染进入细胞，靶向细胞特异性强，可以实现蛋白及遗传物质的细胞内递送。并且，病毒衣壳蛋白容易获得，提高了制备递送载体的效率，降低成本。如图4所示，病毒蛋白递送载体是源自病毒自身的特性，所以一个蛋白质递送载体只能包裹一个核酸分子。
除了弹状病毒科的外壳蛋白因其相似的结构可以完成reRNATM的递送外，其他病毒的外壳蛋白也可以用于reRNATM的递送。根据本发明的实施例，所述病毒包括痘类病毒、狂犬病病毒、黄病毒、麻疹病毒、冠状病毒、水疱性口炎病毒、新城疫病毒和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒的至少之一。上述病毒均具有衣壳蛋白，可以用作递送载体。
根据本发明的实施例，所述脂质体上含有靶向元件。由此，可以将携带的核酸分子靶向递送至特定组织或器官。
根据本发明的实施例，所述脂质体包括带永久正电荷的阳离子脂质体(如DOTAP、DOTMA)、辅助脂质体(如DSPC、DOPE)、结构脂质体、(如胆固醇、胆固醇脂)、长循环脂质体(如DMG-PEG2000)和可电离的阳离子脂质体(如DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DLin-DMA、DODMA、DODAP)的至少之一。
需要说明的是，本发明提供的药盒中，第一递送载体、第二递送载体均为脂质体时，第一递送载体、第二递送载体结构可以完全相同，在此种情况下，机体可以多次给药，并且中和抗体不会影响自复制RNA分子发挥作用。
根据本发明的实施例，所述第一药物组合物或第二药物组合物的制备方法包括：
(1)提供含有自复制RNA分子和蛋白递送载体的细胞，
(2)从所述细胞中分离出所述自复制RNA分子和蛋白递送载体，消除所述蛋白递送载体；
(3)采用第一递送载体或第二递送载体包裹所述自复制RNA分子，以便得到所述第一药物组合物或第二药物组合物。
根据本发明的实施例，第一药物组合物或第二药物组合物的制备方法中的步骤(1)和(2)的目的是为了富集更多的自复制RNA分子，其中蛋白递送载体例如可以是病毒衣壳蛋白或者其他的能够携带自复制RNA分子的蛋白递送载体。当蛋白递送载体为病毒衣壳蛋白时，携带自复制RNA分子的病毒衣壳蛋白感染受体细胞(例如293T细胞)，以便富集更多的自复制RNA分子。此处的蛋白递送载体可以与上述的第一递送载体、第二递送载体相同或不同。
根据本发明的实施例，如何实现RNA在细胞内的翻译同时具备自我扩增特点是最大的技术难点，目前已知的mRNA技术可以实现RNA在细胞内的翻译，但无法实现RNA的自我扩增，为了解决这一问题，发明人研究各种RNA病毒RNA在细胞内的翻译及自我扩增机制，试图找到一种蛋白或蛋白复合体，可以实现RNA在细胞内的翻译及自我扩增，经过大量的研究工作，最终确定弹状病毒的核衣壳蛋白复合体为最佳的候选组合。弹状病毒核衣壳蛋白复合体包含N蛋白，P蛋白及L蛋白，为了确定最小的功能单位，发明人使用水疱性口炎病毒(VSV，Indiana)的核衣壳蛋白复合体蛋白进行了筛选，结果发现，单独的N蛋白、P蛋白、L蛋白不能实现reRNATM在细胞内的翻译及自我扩增，而两蛋白的组合NP、NL、PL也不能实现reRNATM在细胞内的翻译及自我扩增，三蛋白复合体NPL可以实现reRNATM在细胞内的翻译及自我扩增。需要说明的是，对于这种组合包括但不限于弹状病毒科的水疱性病毒属、狂犬病病毒属、短暂热病毒属、非毒粒弹状病毒属等的NPL蛋白组合，以及交叉的组合方式。在此组合中N蛋白的功能为RNA结合蛋白，保护RNA不受核酸酶的影响；P蛋白的功能为连接蛋白，结合N蛋白，在模板上定位L聚合酶，同时也是RNA聚合酶转录和复制复合体的基本组成部分；L蛋白的功能为RNA聚合酶的功能，与RNA的转录及复制有关。本领域技术人员能够理解的是，对于N蛋白，P蛋白和L蛋白，其可以来自于不同的病毒类型。
根据本发明的实施例，所述N蛋白、所述P蛋白、所述L蛋白的至少之一分别独立地来自弹状病毒科病毒。
所述N蛋白、所述P蛋白、所述L蛋白，可以来自水疱性口炎病毒印第安纳株，N蛋白包括但不限于Uniprot ID为：P03521、P11212、Q77E03、Q8B0H4、B7UCZ2的序列；P蛋白包括但不限于Uniprot ID为：P04880、Q8B0H8、P04879、P03520、B7UCZ3的序列；L蛋白包括但不限于Uniprot ID为：Q8B0H0、Q98776、Q8B0I0、Q8B0H5、P03523的序列。
所述N蛋白、所述P蛋白、所述L蛋白，可以来自水疱性口炎病毒新泽西株，N蛋白包括但不限于Uniprot ID为：P04881、Q89034、S5TKS4、Q89036、Q89037的序列；P蛋白包括但不限于Uniprot ID为：P04877、Q89057、Q89052、Q89050、Q89049的序列；L蛋白包括但不限于Uniprot ID为：P16379、P16379、I7DDL0、Q8B545、S5TC82的序列。
所述N蛋白、所述P蛋白、所述L蛋白，还可以来自其他水疱性病毒属(如钱迪普拉水疱病毒、马拉巴水疱病毒)、狂犬病毒属。
根据本发明的实施例，所述N蛋白具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列，所述P蛋白具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列，所述L蛋白具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。
MSVTVKRIIDNTVVVPKLPANEDPVEYPADYFRKSKEIPLYINTTKSLSDLRGYVYQGLKSGNVSIIHVNSYLYGALKDIRGKLDKDWSSFGINIGKAGDTIGIFDLVSLKALDGVLPDGVSDASRTSADDKWLPLYLLGLYRVGRTQMPEYRKKLMDGLTNQCKMINEQFEPLVPEGRDIFDVWGNDSNYTKIVAAVDMFFHMFKKHECASFRYGTIVSRFKDCAALATFGHLCKITGMSTEDVTTWILNREVADEMVQMMLPGQEIDKADSYMPYLIDFGLSSKSPYSSVKNPAFHFWGQLTALLLRSTRARNARQPDDIEYTSLTTAGLLYAYAVGSSADLAQQFCVGDNKYTPDDSTGGLTTNAPPQGRDVVEWLGWFEDQNRKPTPDMMQYAKRAVMSLQGLREKTIGKYAKSEFDK(SEQ ID NO：1)
MDNLTKVREYLKSYSRLDQAVGEIDEIEAQRAEKSNYELFQEDGVEEHTKPSYFQAADDSDTESEPEIEDNQGLYAPDPEAEQVEGFIQGPLDDYADEEVDVVFTSDWKQPELESDEHGKTLRLTSPEGLSGEQKSQWLSTIKAVVQSAKYWNLAECTFEASGEGVIMKERQITPDVYKVTPVMNTHPSQSEAVSDVWSLSKTSMTFQPKKASLQPLTISLDELFSSRGEFISVGGDGRMSHKEAILLGLRYKKLYNQARVKYSL(SEQ ID NO：2)
MEVHDFETDEFNDFNEDDYATREFLNPDERMTYLNHADYNLNSPLISDDIDNLIRKFNSLPIPSMWDSKNWDGVLEMLTSCQANPIPTSQMHKWMGSWLMSDNHDASQGYSFLHEVDKEAEITFDVVETFIRGWGNKPIEYIKKERWTDSFKILAYLCQKFLDLHKLTLILNAVSEVELLNLARTFKGKVRRSSHGTNICRIRVPSLGPTFISEGWAYFKKLDILMDRNFLLMVKDVIIGRMQTVLSMVCRIDNLFSEQDIFSLLNIYRIGDKIVERQGNFSYDLIKMVEPICNLKLMKLARESRPLVPQFPHFENHIKTSVDEGAKIDRGIRFLHDQIMSVKTVDLTLVIYGSFRHWGHPFIDYYTGLEKLHSQVTMKKDIDVSYAKALASDLARIVLFQQFNDHKKWFVNGDLLPHDHPFKSHVKENTWPTAAQVQDFGDKWHELPLIKCFEIPDLLDPSIIYSDKSHSMNRSEVLKHVRMNPNTPIPSKKVLQTMLDTKATNWKEFLKEIDEKGLDDDDLIIGLKGKERELKLAGRFFSLMSWKLREYFVITEYLIKTHFVPMFKGLTMADDLTAVIKKMLDSSSGQGLKSYEAICIANHIDYEKWNNHQRKLSNGPVFRVMGQFLGYPSLIERTHEFFEKSLIYYNGRPDLMRVHNNTLINSTSQRVCWQGQEGGLEGLRQKGWSILNLLVIQREAKIRNTAVKVLAQGDNQVICTQYKTKKSRNVVELQGALNQMVSNNEKIMTAIKIGTGKLGLLINDDETMQSADYLNYGKIPIFRGVIRGLETKRWSRVTCVTNDQIPTCANIMSSVSTNALTVAHFAENPINAMIQYNYFGTFARLLLMMHDPALRQSLYEVQDKIPGLHSSTFKYAMLYLDPSIGGVSGMSLSRFLIRAFPDPVTESLSFWRFIHVHARSEHLKEMSAVFGNPEIAKFRITHIDKLVEDPTSLNIAMGMSPANLLKTEVKKCLIESRQTIRNQVIKDATIYLYHEEDRLRSFLWSINPLFPRFLSEFKSGTFLGVADGLISLFQNSRTIRNSFKKKYHRELDDLIVRSEVSSLTHLGKLHLRRGSCKMWTCSATHADTLRYKSWGRTVIGTTVPHPLEMLGPQHRKETPCAPCNTSGFNYVSVHCPDGIHDVFSSRGPLPAYLGSKTSESTSILQPWERESKVPLIKRATRLRDAISWFVEPDSKLAMTILSNIHSLTGEEWTKRQHGFKRTGSALHRFSTSRMSHGGFASQSTAALTRLMATTDTMRDLGDQNFDFLFQATLLYAQITTTVARDGWITSCTDHYHIACKSCLRPIEEITLDSSMDYTPPDVSHVLKTWRNGEGSWGQEIKQIYPLEGNWKNLAPAEQSYQVGRCIGFLYGDLAYRKSTHAEDSSLFPLSIQGRIRGRGFLKGLLDGLMRASCCQVIHRRSLAHLKRPANAVYGGLIYLIDKLSVSPPFLSLTRSGPIRDELETIPHKIPTSYPTSNRDMGVIVRNYFKYQCRLIEKGKYRSHYSQLWLFSDVLSIDFIGPFSISTTLLQILYKPFLSGKDKNELRELANLSSLLRSGEGWEDIHVKFFTKDILLCPEEIRHACKFGIAKDNNKDMSYPPWGRESRGTITTIPVYYTTTPYPKMLEMPPRIQNPLLSGIRLGQLPTGAHYKIRSILHGMGIHYRDFLSCGDGSGGMTAALLRENVHSRGIFNSLLELSGSVMRGASPEPPSALETLGGDKSRCVNGETCWEYPSDLCDPRTWDYFLRLKAGLGLQIDLIVMDMEVRDSSTSLKIETNVRNYVHRILDEQGVLIYKTYGTYICESEKNAVTILGPMFKTVDLVQTEFSSSQTSEVYMVCKGLKKLIDEPNPDWSSINESWKNLYAFQSSEQEFARAKKVSTYFTLTGIPSQFIPDPFVNIETMLQIFGVPTGVSHAAALKSSDRPADLLTISLFYMAIISYYNINHIRVGPIPPNPPSDGIAQNVGIAITGISFWLSLMEKDIPLYQQCLAVIQQSFPIRWEAVSVKGGYKQKWSTRGDGLPKDTRISDSLAPIGNWIRSLELVRNQVRLNPFNEILFNQLCRTVDNHLKWSNLRRNTGMIEWINRRISKEDRSILMLKSDLHEENSWRD(SEQ ID NO：3)
根据本申请的实施例，所述第一RNA序列具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，所述第二RNA序列具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，所述第三RNA序列具有如SEQ IDNO：6所示的核苷酸序列。
AUGUCCGUGACCGUGAAGAGGAUCAUCGACAAUACCGUGGUGGUGCCCAAGCUGCCCGCCAAUGAGGACCCUGUGGAGUACCCUGCCGAUUACUUUAGGAAGAGCAAGGAGAUCCCUCUGUACAUCAAUACAACCAAGAGCCUGAGCGAUCUGAGAGGCUACGUGUACCAGGGCCUGAAGUCCGGCAACGUGAGCAUCAUCCACGUGAACAGCUACCUGUACGGCGCCCUGAAGGAUAUCAGAGGCAAGCUGGAUAAGGAUUGGUCCUCCUUCGGCAUCAACAUCGGCAAGGCCGGCGACACCAUCGGCAUCUUUGAUCUGGUGUCCCUGAAGGCCCUGGACGGCGUGCUGCCCGACGGAGUUAGCGACGCCAGCAGGACAUCCGCCGACGACAAGUGGCUGCCUCUGUACCUGCUGGGCCUGUACAGAGUGGGCAGAACACAGAUGCCCGAGUACAGGAAGAAGCUGAUGGACGGCCUGACCAAUCAGUGCAAGAUGAUCAAUGAGCAGUUCGAGCCCCUGGUGCCCGAGGGCAGAGAUAUCUUUGACGUGUGGGGCAAUGAUAGCAACUACACCAAGAUCGUGGCCGCCGUGGACAUGUUUUUCCACAUGUUCAAGAAGCACGAGUGUGCCAGCUUUAGGUACGGCACAAUCGUGUCCAGGUUCAAGGACUGCGCCGCCCUGGCCACAUUUGGCCACCUGUGCAAGAUCACCGGCAUGUCCACAGAGGAUGUGACCACAUGGAUCUUGAACAGGGAGGUGGCCGAUGAGAUGGUGCAGAUGAUGCUGCCUGGCCAGGAGAUCGAUAAGGCCGACUCCUACAUGCCUUACCUGAUCGAUUUCGGCCUGAGCUCCAAGUCCCCUUACAGCUCCGUGAAGAACCCCGCCUUCCACUUUUGGGGCCAGCUGACAGCCCUGCUGCUGAGAUCCACCAGAGCCAGAAAUGCCAGGCAGCCUGACGAUAUCGAGUACACCAGCCUGACAACAGCCGGCCUGCUGUACGCCUACGCCGUGGGAAGCUCCGCCGAUCUGGCCCAGCAGUUCUGUGUGGGCGAUAAUAAGUACACCCCUGAUGAUUCCACAGGCGGCCUGACCACAAACGCCCCCCCUCAGGGCAGAGAUGUGGUGGAGUGGCUGGGCUGGUUCGAGGACCAGAAUAGGAAGCCUACACCCGACAUGAUGCAGUACGCCAAGAGAGCCGUGAUGUCCCUGCAGGGCCUGAGAGAGAAGACCAUCGGCAAGUACGCCAAGAGCGAGUUUGACAAGUAA(SEQ ID NO：4)
AUGGAUAACCUGACAAAGGUGAGAGAGUACCUGAAGAGCUACAGCAGACUGGACCAGGCCGUGGGCGAGAUCGACGAGAUCGAGGCCCAGAGAGCCGAGAAGUCCAAUUACGAGCUGUUCCAGGAGGAUGGCGUGGAGGAGCACACAAAGCCUAGCUACUUUCAGGCCGCCGAUGAUAGCGACACAGAGAGCGAGCCCGAGAUCGAGGAUAAUCAGGGCCUGUACGCCCCCGACCCUGAGGCUGAGCAGGUGGAGGGCUUCAUCCAGGGCCCUCUGGAUGACUACGCCGACGAGGAGGUGGACGUGGUGUUUACAAGCGAUUGGAAGCAGCCCGAGCUGGAGAGCGAUGAGCACGGCAAGACACUGAGGCUGACCAGCCCUGAGGGCCUGUCCGGCGAGCAGAAGAGCCAGUGGCUGUCCACAAUCAAGGCCGUGGUGCAGUCCGCCAAGUACUGGAAUCUGGCCGAGUGCACAUUUGAGGCCAGCGGCGAGGGCGUGAUCAUGAAGGAGAGACAGAUCACACCCGAUGUGUACAAGGUGACCCCUGUGAUGAACACACACCCCUCCCAGUCCGAGGCCGUGUCCGACGUGUGGUCCCUGAGCAAGACAAGCAUGACAUUCCAGCCCAAGAAGGCCUCCCUGCAGCCUCUGACCAUCUCCCUGGACGAGCUGUUCAGCAGCAGAGGCGAGUUUAUCAGCGUGGGCGGCGACGGCAGAAUGAGCCACAAGGAGGCCAUCCUGCUGGGCCUGAGAUACAAGAAGCUGUACAAUCAGGCCAGAGUGAAGUACUCCCUGUAA(SEQ ID NO：5)
AUGGAGGUGCACGAUUUUGAGACAGAUGAGUUCAACGAUUUUAACGAGGAUGAUUACGCCACCAGAGAGUUCCUGAACCCCGACGAGAGGAUGACAUACCUGAAUCACGCCGACUACAAUCUGAACUCCCCUCUGAUCAGCGACGAUAUCGAUAAUCUGAUCAGGAAGUUCAACUCCCUGCCUAUCCCCUCCAUGUGGGACUCCAAGAACUGGGAUGGCGUGCUGGAGAUGCUGACCUCCUGCCAGGCCAACCCCAUCCCUACCUCCCAGAUGCACAAGUGGAUGGGCUCCUGGCUGAUGUCCGAUAACCACGACGCCUCCCAGGGCUACUCCUUUCUGCACGAGGUGGAUAAGGAGGCCGAGAUCACCUUUGAUGUGGUGGAGACAUUCAUUAGAGGCUGGGGCAACAAGCCUAUCGAGUACAUCAAGAAGGAGAGAUGGACCGACUCCUUUAAGAUCCUGGCCUACCUGUGUCAGAAGUUCCUGGAUCUGCACAAGCUGACACUGAUCCUGAACGCCGUGUCCGAGGUGGAGCUGCUGAAUCUGGCCAGGACCUUCAAGGGCAAGGUGAGGAGGAGCUCCCACGGCACCAAUAUCUGUAGGAUCAGAGUGCCCAGCCUGGGCCCCACAUUCAUCAGCGAGGGCUGGGCCUACUUUAAGAAGCUGGACAUCCUGAUGGAUAGAAACUUCCUGCUGAUGGUGAAGGAUGUGAUCAUCGGCAGGAUGCAGACCGUGCUGAGCAUGGUGUGCAGGAUCGACAAUCUGUUCAGCGAGCAGGACAUCUUCUCCCUGCUGAAUAUCUACAGGAUCGGCGAUAAGAUCGUGGAGAGGCAGGGCAACUUCAGCUACGAUCUGAUCAAGAUGGUGGAGCCCAUCUGUAAUCUGAAGCUGAUGAAGCUGGCCAGAGAGAGCAGACCUCUGGUGCCCCAGUUUCCUCACUUCGAGAAUCACAUCAAGACAAGCGUGGAUGAGGGCGCCAAGAUCGAUAGAGGCAUCAGAUUUCUGCACGAUCAGAUCAUGUCCGUGAAAACUGUUGAUCUGACACUGGUCAUCUAUGGCUCCUUCAGACACUGGGGCCACCCCUUUAUCGAUUACUACACCGGCCUGGAGAAGCUGCACAGCCAGGUGACCAUGAAGAAGGACAUCGACGUGUCCUACGCCAAGGCCCUGGCCUCCGAUCUGGCCAGGAUCGUGCUGUUUCAGCAGUUCAACGACCACAAGAAGUGGUUUGUGAAUGGCGAUCUGCUGCCUCACGACCACCCCUUUAAGUCCCACGUGAAGGAGAAUACAUGGCCCACAGCCGCCCAGGUGCAGGACUUCGGCGAUAAGUGGCACGAGCUGCCCCUGAUCAAGUGUUUCGAGAUCCCUGAUCUGCUGGACCCCAGCAUCAUCUACUCCGAUAAGUCCCACAGCAUGAACAGAAGCGAGGUGCUGAAGCACGUGAGAAUGAACCCCAAUACCCCUAUCCCUUCCAAGAAGGUGCUGCAGACCAUGCUGGACACCAAGGCCACCAACUGGAAGGAGUUUCUGAAGGAGAUCGACGAGAAGGGCCUGGAUGAUGACGACCUGAUCAUCGGCCUGAAGGGCAAGGAGAGAGAGCUGAAGCUGGCCGGCAGAUUUUUCUCCCUGAUGUCCUGGAAGCUGAGAGAGUACUUCGUGAUCACCGAGUACCUGAUCAAGACCCACUUCGUGCCCAUGUUCAAGGGCCUGACCAUGGCCGAUGACCUGACCGCCGUGAUCAAGAAGAUGCUGGAUAGCUCCAGCGGCCAGGGCCUGAAGUCCUACGAGGCCAUCUGCAUCGCCAAUCACAUCGACUACGAGAAGUGGAAUAACCACCAGAGGAAGCUGAGCAACGGCCCCGUGUUCAGAGUGAUGGGCCAGUUCCUGGGCUACCCCUCCCUGAUCGAGAGGACACACGAGUUCUUCGAGAAGAGCCUGAUCUACUACAAUGGCAGACCUGACCUGAUGAGGGUGCACAAUAAUACCCUGAUCAAUUCCACAUCCCAGAGGGUGUGCUGGCAGGGCCAGGAGGGCGGACUGGAGGGACUGAGGCAGAAGGGCUGGAGCAUCCUGAACCUGCUGGUCAUUCAGAGAGAGGCCAAGAUCAGAAACACCGCCGUGAAGGUGCUGGCCCAGGGCGACAAUCAGGUCAUUUGCACACAGUACAAGACAAAGAAGAGCAGGAAUGUGGUGGAGCUGCAGGGCGCCCUGAAUCAGAUGGUGAGCAAUAACGAGAAGAUCAUGACAGCCAUCAAGAUCGGCACCGGCAAGCUGGGCCUGCUGAUCAACGAUGAUGAGACAAUGCAGUCCGCCGAUUACCUGAAUUACGGCAAGAUCCCCAUCUUCAGAGGCGUGAUCAGGGGCCUGGAGACAAAGAGGUGGAGCAGAGUGACAUGUGUGACCAACGAUCAGAUCCCUACAUGCGCCAACAUCAUGUCCUCCGUGUCCACAAAUGCCCUGACCGUGGCCCACUUUGCCGAGAAUCCUAUCAAUGCCAUGAUCCAGUACAAUUACUUCGGCACCUUUGCCAGGCUGCUGCUGAUGAUGCACGAUCCCGCCCUGAGGCAGAGCCUGUACGAGGUGCAGGACAAGAUCCCUGGCCUGCACAGCUCCACAUUCAAAUACGCCAUGCUGUACCUGGACCCUUCCAUCGGCGGCGUGAGCGGCAUGUCCCUGUCCAGAUUCCUGAUCAGAGCCUUCCCCGAUCCUGUGACCGAGAGCCUGAGCUUUUGGAGGUUUAUCCACGUGCACGCCAGAUCCGAGCACCUGAAGGAGAUGUCCGCCGUGUUCGGCAACCCUGAGAUCGCCAAGUUUAGGAUCACCCACAUCGACAAGCUGGUGGAGGACCCUACAUCCCUGAACAUCGCCAUGGGCAUGAGCCCCGCCAAUCUGCUGAAAACUGAAGUUAAGAAGUGCCUGAUCGAGUCCAGACAGACAAUCAGAAACCAGGUCAUUAAGGAUGCCACAAUCUACCUGUACCACGAGGAGGAUAGACUGAGGUCCUUCCUGUGGAGCAUCAAUCCCCUGUUUCCCAGAUUCCUGUCCGAGUUCAAGAGCGGCACCUUCCUGGGCGUGGCCGAUGGCCUGAUCUCCCUGUUCCAGAAUAGCAGAACAAUCAGAAAUUCCUUCAAGAAGAAGUACCACAGAGAGCUGGAUGACCUGAUCGUGAGAUCCGAGGUGUCCAGCCUGACCCACCUGGGCAAGCUGCACCUGAGAAGGGGCUCCUGCAAGAUGUGGACCUGCAGCGCCACCCACGCCGACACACUGAGAUACAAGUCCUGGGGCAGAACAGUGAUCGGCACCACCGUGCCUCACCCCCUGGAGAUGCUCGGCCCUCAGCACAGGAAGGAGACACCUUGUGCCCCUUGCAAUACAAGCGGCUUUAAUUACGUGUCCGUGCACUGUCCCGAUGGCAUCCACGAUGUGUUCUCCAGCAGAGGCCCUCUGCCUGCCUACCUGGGCUCCAAGACCUCCGAGUCCACAAGCAUCCUGCAGCCUUGGGAGAGAGAGUCCAAGGUGCCUCUGAUCAAGAGGGCCACCAGACUGAGAGAUGCCAUCAGCUGGUUCGUGGAGCCUGACUCCAAGCUGGCCAUGACCAUCCUGUCCAACAUCCACAGCCUGACCGGCGAGGAGUGGACCAAGAGGCAGCACGGCUUUAAGAGGACCGGCUCCGCCCUGCACAGAUUUUCCACCUCCAGAAUGUCCCACGGCGGCUUUGCCAGCCAGAGCACCGCCGCUCUGACCAGACUGAUGGCCACCACAGACACAAUGAGAGAUCUGGGCGAUCAGAAUUUCGAUUUCCUGUUCCAGGCCACACUGCUGUACGCCCAGAUCACAACCACCGUGGCCAGGGACGGCUGGAUCACCUCCUGUACCGACCACUACCACAUCGCCUGCAAGAGCUGCCUGAGGCCCAUCGAGGAGAUCACACUGGACAGCAGCAUGGAUUACACACCUCCUGAUGUGAGCCACGUGCUGAAAACUUGGCGUAACGGCGAGGGCAGCUGGGGCCAGGAGAUCAAGCAGAUCUACCCUCUGGAGGGCAACUGGAAGAAUCUGGCCCCUGCCGAGCAGUCCUACCAGGUGGGCAGGUGUAUCGGCUUCCUGUACGGCGACCUGGCCUACAGGAAGAGCACACACGCCGAGGACUCCUCCCUGUUCCCCCUGAGCAUCCAGGGCAGAAUCAGGGGCAGGGGCUUCCUGAAGGGCCUGCUGGACGGCCUGAUGAGGGCCAGCUGUUGUCAGGUCAUUCACAGGAGGUCCCUGGCCCACCUGAAGAGGCCCGCCAACGCCGUGUACGGCGGCCUGAUCUACCUGAUCGACAAGCUCUCCGUGAGCCCCCCUUUUCUGUCCCUGACAAGGUCCGGCCCCAUCAGAGAUGAGCUGGAGACAAUCCCUCACAAGAUCCCUACCAGCUACCCCACCAGCAAUAGGGACAUGGGCGUGAUCGUGAGAAACUACUUUAAGUACCAGUGCAGGCUGAUCGAGAAGGGCAAGUACAGAUCCCACUACUCCCAGCUGUGGCUGUUCAGCGAUGUGCUGUCCAUCGAUUUCAUCGGCCCCUUUAGCAUCAGCACCACACUGCUGCAGAUCCUGUACAAGCCUUUCCUGAGCGGCAAGGACAAGAAUGAGCUGAGGGAGCUGGCCAAUCUGUCCUCCCUGCUGAGGUCCGGCGAGGGCUGGGAGGACAUCCACGUGAAGUUUUUCACAAAGGAUAUCCUGCUGUGCCCUGAGGAGAUCAGACACGCCUGUAAGUUUGGCAUCGCCAAGGACAACAACAAGGAUAUGAGCUACCCCCCUUGGGGCAGGGAGAGCAGAGGCACAAUCACCACCAUCCCCGUGUACUACACAACAACCCCCUACCCUAAGAUGCUGGAGAUGCCUCCUAGAAUCCAGAAUCCUCUGCUGUCCGGCAUCAGACUGGGCCAGCUGCCCACAGGCGCCCACUACAAGAUCAGAUCCAUCCUGCACGGCAUGGGCAUCCACUACAGAGACUUUCUGUCCUGUGGCGAUGGCUCCGGCGGCAUGACCGCCGCUCUCCUGAGGGAGAAUGUGCACAGCAGAGGCAUCUUUAAUAGCCUGCUGGAGCUGUCCGGCAGCGUGAUGAGAGGCGCCUCCCCCGAGCCCCCUUCCGCUCUGGAAACACUGGGCGGCGAUAAGAGCAGGUGUGUGAAUGGCGAGACAUGCUGGGAGUACCCCAGCGAUCUGUGUGAUCCCAGAACAUGGGACUACUUUCUGAGGCUGAAGGCCGGCCUGGGCCUGCAGAUCGAUCUGAUCGUGAUGGAUAUGGAGGUGAGAGACAGCAGCACCAGCCUGAAGAUCGAGACAAAUGUGAGAAACUAUGUGCACAGGAUCUUGGAUGAGCAGGGCGUGCUGAUCUACAAGACCUACGGCACAUACAUCUGCGAGAGCGAGAAGAAUGCCGUGACCAUCCUGGGCCCUAUGUUUAAGACAGUGGACCUGGUGCAGACCGAGUUUAGCUCCAGCCAGACAUCCGAGGUGUACAUGGUGUGUAAGGGCCUGAAGAAGCUGAUCGAUGAGCCCAAUCCUGAUUGGAGCUCCAUCAAUGAGUCCUGGAAGAAUCUCUACGCCUUUCAGAGCAGCGAGCAGGAGUUCGCCAGGGCCAAGAAGGUGAGCACAUACUUCACCCUGACCGGCAUCCCCUCCCAGUUCAUCCCUGAUCCCUUCGUGAACAUCGAGACAAUGCUGCAGAUCUUUGGCGUGCCUACCGGCGUGAGCCACGCCGCUGCUCUGAAGAGCUCCGACAGGCCCGCCGAUCUGCUGACAAUCUCCCUGUUUUACAUGGCCAUCAUCUCCUACUACAACAUCAACCACAUCAGAGUGGGCCCCAUCCCCCCUAACCCUCCUAGCGACGGCAUCGCCCAGAAUGUGGGCAUCGCCAUCACCGGCAUCUCCUUUUGGCUGAGCCUGAUGGAGAAGGACAUCCCCCUGUACCAGCAGUGUCUGGCCGUGAUCCAGCAGAGCUUUCCCAUCAGGUGGGAGGCCGUGUCCGUGAAGGGCGGCUACAAGCAGAAGUGGUCCACAAGGGGCGAUGGCCUGCCUAAGGAUACAAGGAUCAGCGACAGCCUGGCCCCCAUCGGCAACUGGAUCAGGUCCCUGGAGCUGGUGAGGAAUCAGGUGAGACUGAACCCUUUCAACGAGAUCCUGUUUAACCAGCUGUGCAGAACAGUGGACAACCACCUGAAGUGGUCCAAUCUGAGAAGAAAUACAGGCAUGAUCGAGUGGAUCAACAGAAGGAUCUCCAAGGAGGACAGGAGCAUCCUGAUGCUGAAGAGCGACCUGCACGAGGAGAACUCCUGGAGAGACUAA(SEQ ID NO：6)
根据本发明的实施例，药盒中的药物组合物进一步包括药学上可接受的辅料。本发明对于辅料的种类不做严格限定，可以根据情况灵活选择。对于注射制剂，药物上可接受的载体可以包括缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂等渗压剂(isotonic agent)和稳定剂。
药盒在制备药物中的用途
根据本发明的实施例，本发明提供前面所述的药盒在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗疾病。所述疾病例如可以是细菌或病毒感染，例如革兰氏阳性菌感染、革兰氏阴性菌感染、冠状病毒(例如，SARS-CoV病毒、SARS-CoV-2病毒)感染、甲型流感病毒感染、乙型流感病毒感染等，所述疾病还可以是临床上常见的一些疾病，例如不同种类的癌症(例如，肺癌、胃癌、肝癌、淋巴癌、甲状腺癌、卵巢癌、脑癌、乳腺癌、血癌等)、心血管疾病、高血压、神经系统疾病等等。本发明提供的药盒中含有的药物组合物，可根据治疗需求，对靶分子序列进行特定的设计，需要说明的是，只要需要通过表达某种或某些蛋白来治疗或者预防的疾病，都可以通过本发明的药盒进行适应性的设计实现。
根据本发明的实施例，采用多次系统给药方式，所述第一药物组合物和所述第二药物组合物间隔给药。例如第一药物组合物和第二药物组合物可以间隔几天或者几个月给药，根据实际需要进行给药间隔调整。
根据本发明的实施例，采用多次系统给药方式，第一药物组合物中含有的递送载体和第二药物组合物含有的递送载体可以是不同氨基酸序列或者不同空间结构的蛋白质，例如可以是来源于不同病毒的衣壳蛋白。
根据本发明的实施例，第一药物组合物中含有的递送载体为某种病毒的衣壳蛋白，第二药物组合物含有的递送载体为脂质体。
根据本发明的实施例，第一药物组合物中含有的递送载体和第二药物组合物含有的递送载体为相同的脂质体时，多次系统给药，中和抗体的产生并不会影响药物的效价。
根据本发明的实施例，所述药盒中药物的给药方式为静脉注射。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
相同病毒的不同血清型及不同病毒产生的中和抗体，对除自身之外的病毒没有中和作用，而这种特性是由病毒表面的外壳蛋白决定的。将同一种病毒不同血清型的外壳蛋白或不同病毒的外壳蛋白作为reRNATM的递送蛋白，也有相同的特性。
具体地，水疱性口炎病毒有两种血清型：印第安纳株(IND)和新泽西株(NJ)，将印第安纳株的外壳蛋白免疫兔子，将产生的抗体进行纯化作为印第安纳株的中和抗体，进行抗体效价测定，抗体效价为1:24000。reRNATM的核心复制子来源于病毒，将其功能蛋白作为reRNATM负载基因就可以组成完整的病毒，该病毒具有杀伤肿瘤细胞的作用，命名为reRNATM-溶瘤病毒。将水疱性口炎病毒印第安纳株和新泽西株的外壳蛋白及淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的外壳蛋白LCMV-GP分别作为递送蛋白生产基于不同递送蛋白的reRNATM-溶瘤病毒产品，并进行病毒滴度的测定，具体步骤如下：
将经培养的HEK 293T细胞用转染试剂Lipo8000TM进行reRNATM质粒(质粒上携带有reRNATM序列，SEQ ID NO：4-6序列、外壳蛋白序列、功能蛋白序列)及辅助质粒(辅助质粒包括SEQ ID NO：4-6序列的单独质粒、外壳蛋白质粒、T7 RNA聚合酶质粒)的转染，转染完毕后，培养细胞，培养箱中培养24-48小时，收取上清进行纯化，得到reRNATM-溶瘤病毒。
表1展示了印第安纳株外壳蛋白中和抗体对不同外壳蛋白药物的中和作用。reRNATM-溶瘤病毒-IND-G产生的中和抗体可以很好的中和reRNATM-溶瘤病毒-IND-G，但是对于reRNATM-溶瘤病毒-NJ-G和reRNATM-溶瘤病毒-LCMV-GP几乎没有中和效果，表明更换不同递送蛋白的溶瘤病毒可以很好的躲避先前蛋白产生的中和抗体。
表1.印第安纳株外壳蛋白中和抗体对不同外壳蛋白药物的中和作用
为了验证不同外壳的溶瘤病毒产品是否可以采用组合多次静脉给药的方式进行给药，将健康小鼠进行静脉reRNATM-溶瘤病毒-IND-G注射，两周后进行B16F10细胞荷瘤(因B16F10肿瘤生长迅速而抗体产生到一定的滴度至少需2周时间，所以采用预先免疫，后荷瘤的策略进行验证)，待瘤长到合适大小，分别静脉给予相同剂量的reRNATM-溶瘤病毒-IND-G、reRNATM-溶瘤病毒-NJ-G、reRNATM-溶瘤病毒-LCMV-GP，观察抑瘤率，结果如图5所示，reRNATM-溶瘤病毒-IND-G已经几乎没有抑瘤效果，而reRNATM-溶瘤病毒-NJ-G和reRNATM-溶瘤病毒-LCMV-GP依然具有很好的抑瘤效果，表明此种方案可以用于药物的多次静脉给药。
实施例2
将溶瘤病毒的囊膜溶掉换成LNP的策略，可以摆脱中和抗体对病毒的影响，实现多次系统静脉给药。具体转换步骤为：向reRNATM-溶瘤病毒-IND-G中缓慢加入消融剂亚油酸(消融剂：病毒溶液体积比为1：200)，吹打混合均匀，孵育1小时，离心，轻柔的取出上层液，避免震荡，得到含蛋白核酸复合物溶液。将脂质体溶液(摩尔比DOTAP：DSPC：胆固醇：DMG-PEG2000＝44:16:37.5:2.5)与蛋白核酸复合物以1:3的体积比，通过微流控芯片进行混合。混合完成后混入PBS缓冲液中稀释5～10倍，使用截留分子量为10KDa的超滤装置进行浓缩纯化，并用0.22μm的滤膜过滤除菌，处理好的成品分装后短期保存于4℃，长期储存在-80℃。
体外将中和抗体与reRNATM-溶瘤病毒-LNP共孵育，按照病毒滴度的方法进行滴度的测定，如下表2所示，发现滴度没有明显的变化。
表2
| control | 中和抗体孵育 | |
| reRNATM-溶瘤病毒 | 1E9 TCID50 | 0TCID50 |
| reRNATM-溶瘤病毒+LNP | 1.32E8 TCID50 | 9.87E7 TCID50 |
免疫健全小鼠进行荷瘤，多次给予reRNATM-溶瘤病毒-LNP，同时reRNATM-溶瘤病毒-IND-G作为对照组，结果如图6，显示reRNATM-溶瘤病毒-LNP多次静脉给药依然具有抑瘤效果。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本申请的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本申请的限制，本领域的普通技术人员在本申请的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (8)
1.一种药盒，其特征在于，包括：
第一药物组合物，所述第一药物组合物包含自复制RNA分子和第一递送载体；
第二药物组合物，所述第二药物组合物包含所述自复制RNA分子和第二递送载体，所述第一递送载体不同于所述第二递送载体；
其中，所述自复制RNA分子包括：
第一RNA序列，所述第一RNA序列编码N蛋白或其功能片段；
第二RNA序列，所述第二RNA序列编码P蛋白或其功能片段；
第三RNA序列，所述第三RNA序列编码L蛋白或其功能片段；和
靶分子编码区，所述靶分子编码区编码至少一个靶分子。
2.根据权利要求1所述的药盒，其特征在于，所述第一递送载体和第二递送载体各自独立地选自蛋白质、脂质体或外泌体。
3.根据权利要求1所述的药盒，其特征在于，所述第一药物组合物或第二药物组合物的制备方法包括：
(1)提供含有自复制RNA分子和蛋白递送载体的细胞，
(2)从所述细胞中分离出所述自复制RNA分子和蛋白递送载体，消除所述蛋白递送载体；
(3)采用第一递送载体或第二递送载体包裹所述自复制RNA分子，以便得到所述第一药物组合物或第二药物组合物。
4.根据权利要求1所述的药盒，其特征在于，所述N蛋白、所述P蛋白、所述L蛋白的至少之一分别独立地来自弹状病毒科病毒。
5.根据权利要求1所述的药盒，其特征在于，所述N蛋白具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列，所述P蛋白具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列，所述L蛋白具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。
6.权利要求1～5任一项所述的药盒在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于预防或治疗疾病。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，采用多次系统给药方式，所述第一药物组合物和所述第二药物组合物间隔给药。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述药物的给药方式为静脉注射。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2022105310850 | 2022-05-16 | ||
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Publications (1)
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|---|---|
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Family
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202310547414.5A Pending CN117065051A (zh) | 2022-05-16 | 2023-05-15 | 含有自复制rna分子的药盒及其用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
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-
2023
- 2023-05-15 CN CN202310547414.5A patent/CN117065051A/zh active Pending
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Legal Events
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