JP7264378B2 - ｍＲＮＡの機能化方法 - Google Patents

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Description

本発明は、ｍＲＮＡの機能化方法に関する。より具体的には、本発明は、ｍＲＮＡ輸送担体の安定化方法、ｍＲＮＡワクチンなどに関する。
ｍＲＮＡ送達は、治療用タンパク質を安全かつ持続的に供給するための手法として注目を集めている。一方でｍＲＮＡが生体内で速やかに酵素分解を受けてしまうことが大きな課題である。これに対して、ｍＲＮＡ輸送担体を用いてｍＲＮＡを分解から保護する方法、及びｍＲＮＡ分子自体を改良する方法が検討されているが、生体内でのＲＮＡ分解酵素が非常に強いため、さらなる技術革新が求められている。
ｍＲＮＡ分子自体を改良する方法について、ｍＲＮＡ塩基の一部を化学修飾したものに置換する方法が検討されている（例えば、非特許文献１）。これまでに様々な化学修飾塩基が網羅的に検討されたが、ｍＲＮＡの酵素耐性を大幅に向上させることができるものは未だに報告されていない。また、修飾を行うことでしばしばｍＲＮＡからのタンパク質翻訳効率が大きく低下してしまうことから、自由な化学修飾は困難であった。
ここで、特許文献１には、ポリカチオン性ポリマーとｍＲＮＡのポリイオンコンプレックスが記載され、これをｍＲＮＡの送達に用いることが記載されている。また、非特許文献２には、高分子ミセル型ｍＲＮＡ輸送担体の安定性、酵素分解の評価、およびポリマーにコレステロール修飾を行う効果について記載されている。しかしながら、これらの文献には、生体内において、ｍＲＮＡからのタンパク質翻訳効率を大きく低下させることなく、ｍＲＮＡの酵素耐性を向上させることできる、ｍＲＮＡ輸送担体の安定化方法は記載されていない。
また、病原体の病原性を弱めて用いる従来の生ワクチンは病原性の復帰により副作用が生じる恐れがある。また、病原体の病原性をなくして用いる従来の不活化ワクチンは感染細胞が出現しないため細胞性免疫を誘導しにくいという問題がある。
ＤＮＡワクチン、ｍＲＮＡワクチンなどの核酸ワクチンでは、抗原タンパク質を提示するために核酸を用いる。すなわち、核酸ワクチンは、投与した核酸を抗原提示細胞の核内又は細胞質に移行させて抗原タンパク質を発現させ、抗原タンパク質を提示させることによって免疫を賦活化させる。核酸ワクチンは、病原性の復帰の問題がないため生ワクチンと比較して安全性が高いと考えられている。また、核酸ワクチンでは抗原提示細胞が抗原タンパク質を提示するため細胞性免疫を誘導することが可能であり、このため、核酸ワクチンは、がんや慢性感染症への展開が可能である。さらに、核酸ワクチンでは配列を変えるだけで比較的自由な核酸の設計が可能であり、このため、核酸ワクチンには、がんの個別化治療に用いることができること、ウイルス変異にも迅速に対応可能あることからパンデミックへの素早い対応が可能であること、などの利点もある。
このうちＤＮＡワクチンでは、ホストゲノムへのランダムな挿入による変異誘発のリスクがあると考えられている。その一方で、抗原タンパク質を提示するためにｍＲＮＡを用いるｍＲＮＡワクチンは、ホストゲノムへの変異誘発のリスクがないと考えられており、近年注目を集められている。
ｍＲＮＡワクチンにより免疫誘導効果を得るためには、抗原タンパク質を発現させると同時に、炎症反応を惹起する必要がある。しかしながら、ｍＲＮＡ自体は免疫原性が低いために炎症反応を惹起しにくい。そこで従来、ｍＲＮＡとは別に炎症反応を惹起するためのアジュバンドを同時に投与する必要があった（例えば、特許文献２）。
このような従来のｍＲＮＡワクチンには、以下の３つの問題がある。１つ目の問題は、外来物質をアジュバントとして用いる場合にはその安全性に相当の注意を払う必要が生じることである。２つ目の問題は、投与したｍＲＮＡとアジュバントの組織分布が異なると、抗原タンパク質を発現する細胞に十分な炎症反応が惹起されない可能性があることである。３つ目の問題は、ｍＲＮＡを生体へ投与する際、ｍＲＮＡを酵素分解から保護するためにしばしば輸送担体が必要になるが、アジュバントが輸送担体の機能に影響する可能性があることである。
ここで、非特許文献３には、ｍＲＮＡワクチンとして、ｍＲＮＡをアジュバント成分であるプロタミンと一体化したものが記載されている。
ＷＯ２０１５／１２１９２４Ａ 特表２０１２－５０２０７４号公報
Ｍｅｉｓ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ｆ．（２００２）ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｆｏｒｕｍ ９（１），１０ Ｕｃｈｉｄａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１６）８２，ｐ．２２１-２２８． Ｋａｒｌ－Ｊｏｓｅｆ Ｋａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ＆Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２０１３）９：１０，ｐ．２２６３－２２７６
このような状況のもと、機能化ｍＲＮＡが求められていた。
本発明の第１の態様は、ｍＲＮＡ輸送担体の新たな安定化方法を提供することを目的とする。
本発明の第２及び第３の態様は、効率のよいタンパク質発現及び免疫誘導を可能とする新たなｍＲＮＡワクチンを提供することを目的とする。
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ｍＲＮＡと相補的な配列を持つＲＮＡオリゴマーをｍＲＮＡにハイブリダイズさせることによりｍＲＮＡを機能化できることを見出し、本発明を完成するに至った。
また、本発明者らは、ｍＲＮＡと相補的な配列を持つＲＮＡオリゴマーに化学修飾を行い、それをｍＲＮＡにハイブリダイズさせることでｍＲＮＡの化学修飾を行うことができ、これによりそのｍＲＮＡを安定化できること、あるいはそのｍＲＮＡを輸送担体に搭載することにより輸送担体を安定化できることを見出し、本発明の第１の態様を完成するに至った。
また、本発明者らは、抗原をコードするｍＲＮＡのｐｏｌｙ Ａ配列と相補的な配列をもつＲＮＡオリゴマーをｍＲＮＡにハイブリダイズさせることで、ｍＲＮＡからの効率のよいタンパク質発現及び免疫誘導の両方を達成できることなどを見出し、本発明の第２の態様を完成するに至った。
さらに、本発明者らは、抗原をコードするｍＲＮＡの配列と相補的な配列をもつ第１のＲＮＡオリゴマーをｍＲＮＡにハイブリダイズさせ、かつ第１のＲＮＡオリゴマーと相補的な配列をもつ第２のＲＮＡオリゴマーを第１のＲＮＡオリゴマーにハイブリダイズさせることで、ｍＲＮＡからの効率のよいタンパク質発現及び免疫誘導の両方を達成できることなどを見出し、本発明の第３の態様を完成するに至った。
本発明は以下のとおりである。
ｍＲＮＡと、ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つの修飾されたＲＮＡオリゴマーとを含む二本鎖ＲＮＡを含む、機能化ｍＲＮＡ。
本発明の第１の態様は以下のとおりである。
［１－１］ 目的遺伝子をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーとを内包した前記ｍＲＮＡの輸送担体であって、
ＲＮＡオリゴマーは、
（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなるＲＮＡ配列、又は
（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列
を含み、かつ化学修飾されている、輸送担体。
［１－１Ａ］ 目的遺伝子をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーとを内包した前記ｍＲＮＡの輸送担体であって、
ＲＮＡオリゴマーは、
（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなるＲＮＡ配列、又は
（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列
を含み、かつ化学修飾されていない又は化学修飾されている、輸送担体。
［１－２］ 前記ＲＮＡ配列が１５～２３塩基の配列からなる、上記［１－１］又は［１－１Ａ］に記載の輸送担体。
［１－３］ 前記ＲＮＡ配列が１７塩基の配列からなる、上記［１－２］に記載の輸送担体。
［１－４］ 前記化学修飾は、１～５塩基のオーバーハング配列を介してＲＮＡオリゴマーの配列の５’末端又は３’末端になされたものである、上記［１－１］～［１－３］のいずれか１項に記載の輸送担体。
［１－５］ 前記オーバーハング配列が２塩基の配列である、上記［１－４］に記載の輸送担体。
［１－６］ 前記化学修飾が疎水性基による修飾である、上記［１－１］～［１－５］のいずれか１項に記載の輸送担体。
［１－７］ 前記疎水性基による修飾がコレステロール修飾である、上記［１－６］に記載の輸送担体。
［１－８］ 前記化学修飾がポリエレングリコール修飾である、上記［１－１］～［１－５］のいずれか１項に記載の輸送担体。
［１－９］ 前記輸送担体が、高分子ミセル又は脂質性ｍＲＮＡキャリアである、上記［１－１］～［１－８］のいずれか１項に記載の輸送担体。
［１－１０］ 上記［１－１］～［１－９］のいずれか１項に記載の輸送担体を含有する、医薬組成物。
［１－１１］ 目的遺伝子をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーとを輸送担体に内包させることを含み、
ＲＮＡオリゴマーは、
（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなるＲＮＡ配列、又は
（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列
を含み、かつ化学修飾されている、輸送担体の安定化方法。
［１－１１Ａ］ 目的遺伝子をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーとを輸送担体に内包させることを含み、
ＲＮＡオリゴマーは、
（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなるＲＮＡ配列、又は
（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列
を含み、かつ化学修飾されていない又は化学修飾されている、輸送担体の安定化方法。
［１－１２］ 目的遺伝子をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーとを含む二本鎖ＲＮＡであって、
ＲＮＡオリゴマーは、
（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなるＲＮＡ配列、又は
（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列
を含み、かつ化学修飾されていない又は化学修飾されている、二本鎖ＲＮＡ。
［１－１３］ 前記ＲＮＡ配列が１５～２３塩基の配列からなる、上記［１－１２］に記載の二本鎖ＲＮＡ。
［１－１４］ 前記ＲＮＡ配列が１７塩基の配列からなる、上記［１－１３］に記載の二本鎖ＲＮＡ。
［１－１５］ 前記化学修飾は、１～５塩基のオーバーハング配列を介してＲＮＡオリゴマーの配列の５’末端又は３’末端になされたものである、上記［１－１２］～［１－１４］のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ。
［１－１６］ 前記オーバーハング配列が２塩基の配列である、上記［１－１５］に記載の二本鎖ＲＮＡ。
［１－１７］ 前記化学修飾が疎水性基による修飾である、上記［１－１２］～［１－１６］のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ。
［１－１８］ 前記疎水性基による修飾がコレステロール修飾である、上記［１－１７］に記載の二本鎖ＲＮＡ。
［１－１９］ 前記化学修飾がポリエレングリコール修飾である、上記［１－１２～［１－１６］のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ。
［１－２０］ 上記［１－１２］～［１－１９］のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡが輸送担体に内包されている、ｍＲＮＡ輸送担体。
［１－２１］ 前記輸送担体が、高分子ミセル又は脂質性ｍＲＮＡキャリアである、上記［１－２０］に記載の輸送担体。
［１－２２］ 上記［１－２０］または［１－２１］のいずれか１項に記載の輸送担体を含有する、医薬組成物。
本発明の第２の態様は以下のとおりである。
［２－１］ 抗原をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡの少なくともｐｏｌｙ Ａ配列にハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーからなる二本鎖ＲＮＡを含み、前記少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーは化学修飾されていない、ｍＲＮＡワクチン。
［２－１Ａ］ 抗原をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡの少なくともｐｏｌｙ Ａ配列にハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーからなる二本鎖ＲＮＡを含み、前記少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーは化学修飾されていない又は化学修飾されている、ｍＲＮＡワクチン。
［２－２］ ＲＮＡオリゴマーは、１０～５００塩基配列からなる、上記［２－１］又は［２－１Ａ］に記載のｍＲＮＡワクチン。
［２－３］ ＲＮＡオリゴマーは、５’末端にトリリン酸構造を有する、上記［２－１］～［２－２］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［２－４］ 二本鎖ＲＮＡは、ｍＲＮＡの少なくともｐｏｌｙ Ａ配列に１つのＲＮＡオリゴマーがハイブリダイズしたものである、上記［２－１］～［２－３］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［２－５］ 二本鎖ＲＮＡがネイキッドの形態である、上記［２－１］～［２－４］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［２－６］ アジュバントと共に用いない、上記［２－１］～［２－５］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［２－７］ 疾患の予防又は治療を必要とする対象において当該疾患の予防又は治療に用いるための、上記［２－１］～［２－６］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［２－８］ 疾患の予防又は治療を必要とする対象に、上記［２－１］～［２－６］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチンを投与することを含む、疾患の予防又は治療方法。
本発明の第３の態様は以下の通りである。
［３－１］ 抗原をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つの第１のＲＮＡオリゴマーと、当該第１のＲＮＡオリゴマーにハイブリダイズした第２のＲＮＡオリゴマーからなる二本鎖ＲＮＡを含み、
第１のＲＮＡオリゴマーは、
（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなる第１のＲＮＡ配列と、第２のＲＮＡオリゴマーの配列に相補的な１０～２００塩基の配列からなる第２のＲＮＡ配列を、５’末端よりこの順に含むＲＮＡ配列、
（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズする第１のＲＮＡ配列と、第２のＲＮＡオリゴマーの配列に相補的な１０～２００塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつ第２のＲＮＡオリゴマーにハイブリダイズする第２のＲＮＡ配列を、５’末端よりこの順に含むＲＮＡ配列、
（ｃ）第２のＲＮＡオリゴマーの配列に相補的な１０～２００塩基の配列からなる第２のＲＮＡ配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなる第１のＲＮＡ配列を、５’末端よりこの順に含むＲＮＡ配列、又は
（ｄ）第２のＲＮＡオリゴマーの配列に相補的な１０～２００塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつ第２のＲＮＡオリゴマーにハイブリダイズする第２のＲＮＡ配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズする第１のＲＮＡ配列と、５’末端よりこの順に含むＲＮＡ配列
を含む、ｍＲＮＡワクチン。
［３－２］ 第１のＲＮＡオリゴマーは、２２～２４０塩基の配列からなる、上記［３－１］に記載のｍＲＮＡワクチン。
［３－３］ １つのｍＲＮＡにハイブリダイズさせる第１のＲＮＡオリゴマーの数が、１～５０個である、上記［３－１］または［３－２］に記載のｍＲＮＡワクチン。
［３－４］ 第１のＲＮＡオリゴマーは、前記（ａ）のＲＮＡ配列又は前記（ｂ）のＲＮＡ配列を含み、第２のＲＮＡオリゴマーは、５’末端にトリリン酸構造を有する、上記［３－１］～［３－３］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［３－５］ 第１のＲＮＡオリゴマーは、前記（ｃ）のＲＮＡ配列又は前記（ｄ）のＲＮＡ配列を含み、第１のＲＮＡオリゴマーは、５’末端にトリリン酸構造を有する、上記［３－１］～［３－３］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［３－６］ 第２のＲＮＡオリゴマーが第１のＲＮＡオリゴマーにハイブリダイズしている側の二本鎖ＲＮＡの末端が、平滑末端である、上記［３－１］～［３－５］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［３－７］ 第２のＲＮＡオリゴマーは１０～２００塩基の配列を含む、上記［３－１］～［３－６］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［３－８］ 二本鎖ＲＮＡがネイキッドの形態である、上記［３－１］～［３－７］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［３－９］ アジュバントと共に用いない、上記［３－１］～［３－８］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
［３－１０］ 疾患の予防又は治療を必要とする対象において当該疾患の予防又は治療に用いるための、上記［３－１］～［３－９］のいずれか１項に記載のｍＲＮＡワクチン。
本発明は、機能化ｍＲＮＡを提供することができる。
本発明の第１の態様は、ｍＲＮＡ、又はｍＲＮＡ輸送担体の新たな安定化方法を提供する。好ましくは、本発明の第１の態様は、生体内において、ｍＲＮＡからのタンパク質翻訳効率を維持したまま、比較的自由なｍＲＮＡ修飾を実現することができる。より好ましくは、本発明の第１の態様は、生体内でのｍＲＮＡの酵素分解を抑制することができる。
本発明の第２及び第３の態様は、効率のよいタンパク質発現及び免疫誘導を可能とする新たなｍＲＮＡワクチンを提供する。好ましくは、本発明の第２及び第３の態様のｍＲＮＡワクチンは、アジュバントを同時投与しなくても、抗原提示及び免疫誘導が可能である。より好ましくは、本発明の第２及び第３の態様のｍＲＮＡワクチンは、より強い細胞性免疫を誘導することができる。さらに好ましくは、本発明の第２及び第３のｍＲＮＡワクチンは、ｍＲＮＡ単独で投与するよりも強い液性免疫を誘導することができる。
ＲＮＡオリゴマーがｍＲＮＡにハイブリダイズしたことを示す電気泳動画像である。（１）ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）のみ；（２）ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）をハイブリダイズさせたｍＲＮＡ；（３）ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）をハイブリダイズしていないｍＲＮＡ。 ＲＮＡオリゴマーのｍＲＮＡへのハイブリダイズによる影響を示す図である。（Ａ）培養細胞へのｍＲＮＡ導入効率；（Ｂ）無細胞系でのタンパク質翻訳効率。 ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたｍＲＮＡを内包した高分子ミセルの物理化学的性質を示す図である。（Ａ）ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）＋ＲＮＡオリゴ（－）；（Ｂ）ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌ＋ＲＮＡオリゴ（－）；（Ｃ）ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）＋未修飾ＲＮＡオリゴ；（Ｄ）ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌ＋未修飾ＲＮＡオリゴ；（Ｅ）ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）＋Ｃｈｏｌ－ＲＮＡオリゴ；（Ｆ）ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌ＋Ｃｈｏｌ－ＲＮＡオリゴ。 Ｃｈｏｌ修飾ＲＮＡオリゴマーのｍＲＮＡへのハイブリダイズによる安定性への影響を示す図である。（Ａ）ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌ；（Ｂ）ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）；（Ｃ）ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌ；（Ｄ）ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）；（Ｅ）ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌ。 上記の通りである。 Ｃｈｏｌ修飾ＲＮＡオリゴマーのｍＲＮＡへのハイブリダイズによる安定性への影響を示す図である。（Ａ）ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌ＋オリゴ（－）；（Ｂ）ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌ＋Ｃｈｏｌオリゴ；（Ｃ）ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）＋オリゴ（－）；（Ｄ）ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）＋Ｃｈｏｌオリゴ。 複数のＣｈｏｌ修飾ＲＮＡオリゴマーをｍＲＮＡへハイブリダイズさせたことによる安定性への影響を示す図である。１０ｖ／ｖ％のＦＢＳ条件。 複数のＣｈｏｌ修飾ＲＮＡオリゴマーをｍＲＮＡへハイブリダイズさせたことによる、細胞へ導入した際のたんぱく質翻訳効率への影響を示す図である。１０ｖ／ｖ％のＦＢＳ条件。 オリゴマーへのＣｈｏｌ修飾を３’側に行った場合と、５’側に行った場合を比較する図である。（Ａ）安定性への影響、（Ｂ） 細胞に導入した際のたんぱく質翻訳効率。 Ｃｈｏｌ修飾ＲＮＡオリゴマーのｍＲＮＡへのハイブリダイズによる無細胞系でのタンパク質翻訳効率への影響を示す図である。 Ｃｈｏｌ修飾ＲＮＡオリゴマーの内因性遺伝子発現に対する影響を示す図である。 Ｃｈｏｌ修飾ＲＮＡオリゴマーのｍＲＮＡへのハイブリダイズによる安定性への影響を示す図である。（Ａ）ゲル電気泳動（ＰＥＧ－ＰＬｙｓ＋オリゴ（-））；（Ｂ）ゲル電気泳動（ＰＥＧ－ＰＬｙｓ＋Ｃｈｏｌオリゴ）；（Ｃ）翻訳効率。 マウスを用いた血中安定性試験の結果を示す図である。 Ｃｈｏｌ修飾ＲＮＡオリゴマーを肺へ投与した結果を示す図である。（Ａ）タンパク質発現効率；（Ｂ）ｍＲＮＡ量。 実施例で作製したガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）のｍＲＮＡの配列である（配列番号１）。下線部がｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｌａｍｅである。 実施例で使用したガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）のコード配列である（配列番号３２）。 実施例で使用したＬｕｃのｍＲＮＡの配列である（配列番号３３）。下線部がｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｌａｍｅである。 ｍＲＮＡ輸送担体の安定化の概念図である。 ＰＥＧ修飾ＲＮＡオリゴマーのｍＲＮＡへのハイブリダイズによる翻訳効率の変化を示す図である。 ＰＥＧ修飾ＲＮＡオリゴマーのｍＲＮＡへのハイブリダイズによる安定化効果の変化を示す図である。（Ａ）実験手順、（Ｂ）安定性への影響。 ＰＥＧ化ｍＲＮＡの発現試験の結果を示す図である。
ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ又はＬｕｃ）ｍＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を示す図である。(Ａ) Ｇｌｕｃ ｓｅｎｓｅ鎖、（Ｂ）Ｇｌｕｃ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖（ｐｏｌｙ Ｕ込み）、（Ｃ）Ｇｌｕｃ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖（ｐｏｌｙ Ｕなし）、及び（Ｄ）ｐｏｌｙ Ｕ。 二本鎖ＲＮＡを示す図である。（Ａ）ｍＲＮＡ：ＲＮＡ、（Ｂ）ｍＲＮＡ：ＲＮＡ ｐｏｌｙ Ｕ（－）、（Ｃ）ｍＲＮＡ：ｐｏｌｙ Ｕ、及び（Ｄ）ｍＲＮＡ：ｐｏｌｙ Ｕ ｐｐｐ（－）。 二本鎖ＲＮＡを樹状細胞株（ＤＣ２．４）へ導入した結果を示す図である。（Ａ）インターフェロンβ発現量、及び（Ｂ）Ｌｕｃ発現量。 二本鎖ＲＮＡをマウスに投与した結果を示す図である。（Ａ）Ｌｕｃ発現量、（Ｂ）インターフェロンβ発現量、及び（Ｃ）インターロイキン６発現量。 二本鎖ＲＮＡをマウスに投与した結果を示す図である。（Ａ）投与から細胞数定量までの手順、及び（Ｂ）ＩＦＮ－γ産生細胞数。 二本鎖ＲＮＡをマウスに投与した結果を示す図である。（Ａ）投与から抗ＯＶＡ ＩｇＧの血清中濃度定量までの手順、及び（Ｂ）抗ＯＶＡ ＩｇＧの血清中濃度。 実施例で作製したＧｌｕｃ ｓｅｎｓｅ鎖の配列である（配列番号５１）。下線部がｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｌａｍｅである。 実施例で作製したＧｌｕｃ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖（ｐｏｌｙ Ｕ込み）の配列である（配列番号５２）。 実施例で作製したＧｌｕｃ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖（ｐｏｌｙ Ｕなし）の配列である（配列番号５３）。 実施例で作製したｐｏｌｙ Ｕの配列である（配列番号５４）。 実施例で作製したＯＶＡ ｓｅｎｓｅ鎖の配列である（配列番号５５）。下線部がｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｌａｍｅである。 実施例で作製したｐｏｌｙ Ｕの配列である（配列番号５６）。 実施例で使用したガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）のコード配列である（配列番号５７）。 実施例で使用した卵白アルブミン（ＯＶＡ）のコード配列である（配列番号５８）。 二本鎖ＲＮＡを樹状細胞株（ＤＣ２．４）へ導入し、ルシフェラーゼ発現量を確認した結果を示す図である。 実施例で作製した３つのｐｏｌｙ Ｕの配列である。（Ａ）各ｐｏｌｙ Ｕの作製方法、及び（Ｂ）各ｐｏｌｙ Ｕの配列（それぞれ、配列番号５６、５４及び５９）。
二本鎖ＲＮＡを示す図である。 二本鎖ＲＮＡを樹状細胞株（ＤＣ２．４）へ導入した結果を示す図である。未投与に対するインターフェロンβの相対発現量。 二本鎖ＲＮＡを樹状細胞株（ＤＣ２．４）へ導入した結果を示す図である。未投与に対するインターロイキン６の相対発現量。 二本鎖ＲＮＡを樹状細胞株（ＤＣ２．４）へ導入した結果を示す図である。一本鎖ＲＮＡに対するＬｕｃの相対発現量。 実施例で使用したベクターの配列である（配列番号６５）。
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の実施の形態は本発明を説明するための例示であり、本発明はその要旨を逸脱しない限りさまざまな形態で実施することができる。また、本明細書において引用した全ての刊行物、例えば、先行技術文献及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、その全体が本明細書において参照として組み込まれる。また、本明細書は、本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願である特願２０１６－２５２４８７号（２０１６年１２月２７日出願）及び特願２０１６－２５２４８８号（２０１６年１２月２７日出願）の特許請求の範囲、明細書、及び図面の開示内容を参照して組み込むものとする。
ここでは、ｍＲＮＡと、ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つの修飾されたＲＮＡオリゴマーとを含む二本鎖ＲＮＡを含む、機能化ｍＲＮＡが提供される。以下、機能化ｍＲＮＡの各態様について説明する。
１．本発明の第１の態様
１．１．本発明の第１の態様の概要
ｍＲＮＡの塩基修飾では、従来は、自由な化学修飾の設計が困難であった。そこで、本発明者らは、ｍＲＮＡと相補的な配列を持つＲＮＡオリゴマーに化学修飾を行い、それをｍＲＮＡにハイブリダイズさせることで、ｍＲＮＡの化学修飾を行うことができないかと考えた（図１）。この場合、ｍＲＮＡ自体は天然のものであるため、翻訳の過程は障害されず、自由な化学修飾が可能になることが期待された。一方でハイブリダイズを行うことによる翻訳過程の障害も懸念されたため、まず、様々な鎖長のＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせ、翻訳効率への影響を調べた。すると、ＲＮＡオリゴマー鎖長を長くすればするほど翻訳効率が低下していく傾向にあることが明らかとなった。一方で、１７～４０塩基のＲＮＡオリゴマーでは、ハイブリダイズに伴う発現の低下を十分に防ぐことができることがわかった（図２）。特に、１７塩基のオリゴマーでは、ハイブリダイズに伴う発現の低下がほとんど見られなかった（図２）。これらのことから、１２～４０塩基のＲＮＡオリゴマーを用いることで、翻訳効率を十分に維持することができることが分かった。
次に、化学修飾の１例として、コレステロール（Ｃｈｏｌ）修飾ＲＮＡオリゴマーのハイブリダイズを検討した（図１７）。Ｃｈｏｌ修飾を行うとｍＲＮＡ輸送担体にｍＲＮＡを搭載した際、輸送担体が疎水性相互作用により安定化され、結果的にｍＲＮＡの酵素分解を防ぐことができることが期待された（図１７）。ｍＲＮＡ輸送担体として、生体適合性ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で覆われた高分子ミセルを用いた（図３、図１７）。この高分子ミセルは、とりわけｉｎ ｖｉｖｏ環境で高い安全性及びｍＲＮＡ導入効率を示すことが明らかとなっている。
Ｃｈｏｌ修飾ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたｍＲＮＡを搭載した高分子ミセルの血清中での酵素耐性を調べたところ、ハイブリダイズにより酵素耐性が顕著に向上することが明らかとなった（図４）。結果的に、培養細胞に対するｍＲＮＡの導入効率を有意に向上させることに成功した（図７）。また、生体内は、ポリアニオンが豊富に存在することから、ポリアニオン存在下での高分子ミセルの安定性は重要であるが、実際に本技術によりポリアニオン存在下でミセルの崩壊が抑制された（図５）。さらに、マウスの経気道肺投与において、ｍＲＮＡ導入効率を比較したところ、ここでもハイブリダイズによる導入効率向上効果が得られた（図１３）。以上のことから、本発明の第１の態様により、ｍＲＮＡ搭載輸送担体（例えば、高分子ミセル）が安定化され、結果的にｍＲＮＡ酵素分解を様々な環境下で抑制できることが明らかとなった。また、このようなＣｈｏｌ修飾オリゴマーによる安定化効果は、複数の高分子ミセルの組成において得られており（図１１）、ｍＲＮＡの酵素耐性を向上させるための汎用性の高いプラットフォームと言える。
ＲＮＡオリゴマーに関して、Ｃｈｏｌ基を５’及び３’のどちらの末端に修飾しても、安定性及びｍＲＮＡからのタンパク質発現効率に大きく影響しなかった（図８）。また、ＲＮＡオリゴマーの相補配列とＣｈｏｌ基との間にハイブリダイズしないオーバーハング配列を挿入することもできる。例えば、Ｃｈｏｌが修飾されたブロック共重合体を用いた場合、オーバーハング配列がない場合と比較して、２塩基のオーバーハング配列がある場合でより高い安定化効果が得られる傾向があった（図４（Ａ）及び（Ｃ））。一方で、Ｃｈｏｌが修飾されていないブロック共重合体を用いた場合は、オーバーハング配列がなくてもより優れた安定化効果が得られた（図４（Ｂ）及び（Ｄ））。
ハイブリダイズするＣｈｏｌ修飾ＲＮＡオリゴマーの数に関して、１つだけでも非常に高い安定性向上効果が得られたが、数を増やすにしたがって、安定性はさらに向上した（図６、１１）。一方で、数を大きく増やすと過度の安定化による、ｍＲＮＡ翻訳の阻害の傾向が見られた（図９）。投与システムにより求められる安定性は異なるので、それに伴ったＣｈｏｌ修飾オリゴマーの最適な数も異なると想定される。
ＲＮＡオリゴマーに化学修飾を行い、それをｍＲＮＡにハイブリダイズさせることで、ｍＲＮＡを自由に化学修飾できると考えられる。しかし、ハイブリダイズすることにより、ｍＲＮＡからの翻訳効率が低下してしまうことが懸念されるため、化学修飾したｍＲＮＡをハイブリダイズしてｍＲＮＡの酵素分解の抑制に用いるという検討は行われてこなかった。
本発明者らは、様々な鎖長のＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせて検討を行ったところ、安定なハイブリダイズを形成できる鎖長をもち、翻訳効率に影響しない組成として１２～４０塩基の相補配列を持つものがよいということを見出した。また、化学修飾ＲＮＡオリゴマーのハイブリダイズを用いた高分子ミセルの安定化において、化学修飾位置に関して５’末端でも３’末端でもよいことを見出した（図８）。また、ＲＮＡオリゴマーの相補配列とＣｈｏｌ基との間に、オーバーハング配列がなくてもよいし、あるいは１～５塩基のオーバーハング配列があってもよいことを見出した。これらの特徴を持つ化学修飾ＲＮＡオリゴマーを用いることで、比較的高い酵素分解抑制効果が得られることは、従来の生物学的知見からは予想されない結果である。
さらに本発明の第１の態様は、ｍＲＮＡ自体、又は様々な輸送担体（例えば、高分子ミセル）においてｍＲＮＡの酵素分解を抑制できる汎用性がある技術である。
１．２．二本鎖ＲＮＡおよび輸送担体
本発明の第１の態様は、目的遺伝子をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーとを含む二本鎖ＲＮＡであって、
ＲＮＡオリゴマーは、
（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなるＲＮＡ配列、又は
（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列
を含み、かつ化学修飾されていない又は化学修飾されている、二本鎖ＲＮＡを提供する。
二本鎖ＲＮＡは、輸送担体に内包されていてよい。あるいは、二本鎖ＲＮＡは輸送担体に内包されていなくてもよく、すなわちネイキッドの形態でもよい。前者の本発明の第１の態様は、目的遺伝子をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーとを内包した前記ｍＲＮＡの輸送担体であって、
ＲＮＡオリゴマーは、
（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなるＲＮＡ配列、又は
（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列
を含み、かつ化学修飾されていない又は化学修飾されている、輸送担体を提供する。
輸送担体は、核酸を内包して、対象の体内の好適な箇所に送達することができるものであればよく、特に限定されない。輸送担体は、例えば、高分子ミセル、脂質性ｍＲＮＡキャリア、又はカチオン性ポリマー複合体であり、より好ましくは、高分子ミセル又は脂質性ｍＲＮＡキャリアである。
高分子ミセルは、凝縮した核酸とカチオン性ポリマーで形成される内核と親水性ポリマーで形成される外殻との二層構造を有している。カチオン性ポリマーは、例えば、ポリアミノ酸誘導体である。親水性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）である。内核は、ｍＲＮＡを物理的又は化学的に封入する。外殻は、その物理化学的な性質によって、内殻に封入されたｍＲＮＡを所定の組織に送達する。高分子ミセルは、エンドサイトーシスによって細胞内に入り込むことができる。高分子ミセルは、例えば、ブロックポリマー上のポリカチオンと核酸の相互作用（ポリイオンコンプレックス（「ＰＩＣ」））を利用することもできるほか、それと無機分子とのハイブリッドミセルを利用することもできる。ＰＩＣ型高分子ミセルとしては、例えば、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌ、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）、ＰＥＧ-ＰＬｙｓとｍＲＮＡの多分子会合により形成されるＰＩＣミセル（後述の実施例を参照）や、ＰＡｓｐ（ＴＥＴ）、ＰＡｓｐ（ＴＥＰ）といった別のポリカチオンをブロック共重合体に用いたもの（Ｕｃｈｉｄａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１６）８２，ｐ．２２１-２２８）及びトリブロック共重合体を用いたもの（Ｏｓａｗａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １７，ｐ３５４-３６１（２０１６））が挙げられる。無機分子とのハイブリッドミセルとしては、例えば、ＰＥＧ化リン酸カルシウム（ＣａＰ）粒子（Ｐｉｔｔｅｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１１）３２，ｐ．３１０６－３１１４）、ＰＥＧ化シリカ粒子（Ｍｉｙａｔａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１０）３１，ｐ４７６４-４７７０）が挙げられる。
脂質性ｍＲＮＡキャリアは、リピッドまたはカチオニックリピッドをキャリアとして形成され、そしてｍＲＮＡが内包もしくは結合された形態にある。例えば、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパナミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、１、２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２、３－ジミリスチルオキシ）プロピル］－Ｎ、Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）又はＤＣ-Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌといったカチオン性脂質；ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）といった中性リン脂質；ＰＥＧ化脂質；及びコレステロールからなる群より選択される一つまたは複数からなり、それとｍＲＮＡを混合して得られるものである。
カチオン性ポリマー複合体は、例えば、直鎖状もしくは分枝状ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、キトサン誘導体、ポリメタクリル酸誘導体とｍＲＮＡの混合物である。
これらの輸送担体は、公知の方法又はそれに準ずる方法にて調製することができる。
いくつかの態様では、輸送担体に内包させるｍＲＮＡの量は、輸送担体中のカチオン電荷（＋）とｍＲＮＡのアニオン電荷（－）の比（＋／－比）において、例えば、０．５～２００であり、好ましくは１～５０であり、より好ましくは１～１０である。
目的遺伝子は、当業者であれば目的に応じて適宜選択することができる。目的遺伝子は、例えば、レポーター遺伝子、成長因子遺伝子、細胞増殖因子遺伝子、細胞増殖抑制因子遺伝子、細胞死促進因子遺伝子、細胞死抑制因子遺伝子、癌抑制遺伝子、転写因子遺伝子、ゲノム編集遺伝子又はワクチン抗原遺伝子である。例えば、特定の細胞を増殖させることが必要な対象に対して該特定の細胞の増殖因子遺伝子をコードするｍＲＮＡを内包する輸送担体を投与することで、該対象における疾患や状態を処置することができる。
レポーターとしては、例えば、発光タンパク質、及び蛍光タンパク質が挙げられる。
成長因子としては、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ又はＦＧＦ－２）及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が挙げられる。
細胞増殖抑制因子としては、例えば、ｐ２１、ｐ１７、ｐ１６及びｐ５３が挙げられる。
細胞死促進因子としては、例えば、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）、ＨｔｒＡ２、Ｂａｄ、Ｂｉｍ、Ｂａｘ、ｐ５３、カスパーゼ１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０（例えば、カスパーゼ２、３、６、７、８、９及び１０、好ましくはカスパーゼ３、６及び７）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）並びにＦｏｘＯ１が挙げられる。
細胞死抑制因子としては、例えば、抗アポトーシス因子（例えば、ＦＬＩＰ、Ｍｃｌ－１、Ｘｉａｐ、ｃｒｍＡ、Ｂｃｌ－２及びＢｃｌ－ｘＬ）が挙げられる。
癌抑制遺伝子としては、例えば、ｐ５３、網膜芽細胞腫遺伝子（Ｒｂ）、大腸腺腫症遺伝子（ＡＰＣ）、神経線維腫症１型遺伝子（ＮＦ１）、神経線維腫症２型遺伝子（ＮＦ２）、ＷＴ１、ＶＨＬ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＨＥＫ２、マスピン、ｐ７３、Ｓｍａｄ４、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＤＣＣ、ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、ＳＤＨＤ、ｐ１６、ｐ５７Ｋｉｐ２、ＰＴＣ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＥＸＴ１及びＥＸＴ２が挙げられる。
転写因子としては、例えば、Ｒｕｎｔ関連転写因子１（Ｒｕｎｘ１）、ｐ５３、ｃ－ｆｏｓ、ｃ－Ｊｕｎ、ＣＲＥＢ、Ｃ／ＥＢＰ、ＭｙｏＤ、ｃ－Ｍｙｃ、ｃ－Ｍｙｂ、Ｏｃｔ３／４、ＮＦ－κＢ、ＮＦ－ＡＴ、Ｍｅｆ－２及び細胞外シグナル応答因子（ＳＲＦ）が挙げられる。
ゲノム編集遺伝子としては、例えば、ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＮＦ）、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）及びｃｌｕｓｔｅｒｅｄ，ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ，ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ-ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）９遺伝子が挙げられる。
ワクチン抗原遺伝子としては、例えば、病原体抗原及び腫瘍特異的抗原が挙げられる。
ｍＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡを意味し、通常、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）とコード領域と３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）とを含む。ｍＲＮＡは、さらに、通常、５’末端のキャップ構造（５’Ｃａｐ）と３’末端のｐｏｌｙ Ａ配列を含む。
ここで用いるｍＲＮＡは、次のいずれかのものであってよい。
（１）５’Ｃａｐ、５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、及びｐｏｌｙ Ａをこの順に含むｍＲＮＡ。
（２）５’Ｃａｐ、５’ＵＴＲ、コード領域、及びｐｏｌｙ Ａをこの順に含むｍＲＮＡ。
（３）５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、及びｐｏｌｙ Ａをこの順に含むｍＲＮＡ。
（４）５’ＵＴＲ、コード領域、及びｐｏｌｙ Ａをこの順に含むｍＲＮＡ。
（５）５’Ｃａｐ、５’ＵＴＲ、コード領域、及び３’ＵＴＲをこの順に含むｍＲＮＡ。
（６）５’Ｃａｐ、５’ＵＴＲ、コード領域をこの順に含むｍＲＮＡ。
（７）５’ＵＴＲ、コード領域、及び３’ＵＴＲをこの順に含むｍＲＮＡ。
（８）５’ＵＴＲ、コード領域をこの順に含むｍＲＮＡ。
目的遺伝子をコードするｍＲＮＡは、公知の方法により、目的遺伝子をコードするテンプレートＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ環境下で転写することで作製することができる。例えば、Ｂｌｏｏｄ １０８（１３）（２００６）４００９－１７に記載の方法に従って、作製することができる。具体的には、タンパク質コード配列の下流にｐｏｌｙ Ａ／Ｔ鎖が組み込まれた鋳型ＤＮＡをｐｏｌｙ Ａ／Ｔ鎖のすぐ下流で切断し、翻訳酵素、ヌクレオシド、５’キャップアナログを含むバッファー溶液中にてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行い、その後、ｍＲＮＡを精製することで作製することができる。ｍＲＮＡのより具体的な調製方法は後述の実施例に記載した通りである。
いくつかの態様では、ｍＲＮＡ自体の塩基の化学修飾は行わない。この場合、ｍＲＮＡ自体は天然のものであるため、翻訳の過程はほとんど障害されないことが期待できる。別のいくつかの態様では、ｍＲＮＡ自体の塩基の化学修飾を行う。ｍＲＮＡ自体の塩基の化学修飾は、例えば、ｍＲＮＡの酵素耐性を向上させることや免疫原性を軽減できることが知られているものである。そのようなｍＲＮＡ自体の化学修飾塩基は、例えば、メチル化塩基（例えば、５－メチルシトシン）、硫黄修飾塩基（例えば、２－チオウリジン）、シュードウリジン、Ｎ１メチルシュードウリジン及び５メトキシウリジンが挙げられる。
ＲＮＡオリゴマーは、
（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなるＲＮＡ配列、又は
（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列
を含むＲＮＡ鎖である。
「９０％以上の同一性を有するＲＮＡ配列」における「９０％以上」の範囲は、例えば、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上である。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、ＲＮＡ配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（例えば、Ａｌｔｚｓｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３（１９９０）参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
「ｍＲＮＡにハイブリダイズする」とは、後述のハイブリダイズ条件で、ＲＮＡオリゴマーがｍＲＮＡにハイブリダイズすることを意味する。
ＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡの連続する１２～４０塩基の配列にハイブリダイズするように設計されている。いくつかの態様では、ＲＮＡオリゴマーの配列は、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～３０塩基の配列からなる。より好ましくは、ＲＮＡオリゴマーの配列は、ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の配列からなるものである。さらに好ましくは、ＲＮＡオリゴマーの配列は、ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の配列からなるものである。
ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせるｍＲＮＡ中の位置は、５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、及びｐｏｌｙ Ａ配列のいずれの位置でもよい。ＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡの２次構造を予測し、ｍＲＮＡ鎖が２次構造を持たない部分に対してハイブリダイズするようにＲＮＡオリゴマーを設計するのが望ましい。すなわち、ＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡ全配列のうち２次構造を持たない部分に対してハイブリダイズするように設計するのが好ましい。ｍＲＮＡの２次構造を予測するソフトウエアとしては、例えば、後述の実施例に記載のものが挙げられる。
いくつかの態様では、ＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡのポリＡの配列にハイブリダイズするように設計する。
オリゴＲＮＡの化学修飾は、オーバーハング配列を介さずに行ってよく、あるいは、オーバーハング配列を介して行ってもよい。ここで、「オーバーハング配列」は、ｍＲＮＡにハイブリダイズしない配列である。
化学修飾は、オーバーハング配列を介さずに行う場合、オリゴＲＮＡは、好ましくは、前記（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列のみからなる。この場合、化学修飾は、ＲＮＡオリゴマーの配列の例えば５’末端又は３’末端に行う。いくつかの態様では、輸送担体が、疎水性基により修飾されていない輸送担体（例えば、疎水性基により修飾されていないブロック共重合体）であるときに、オリゴＲＮＡの化学修飾はオーバーハング配列を介さずに行う。
一方、化学修飾は、オーバーハング配列を介して行う場合、オリゴＲＮＡは、好ましくは、前記（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列とオーバーハング配列からなる。この場合、化学修飾は、ＲＮＡオリゴマーの前記（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列の５’末端又は３’末端に、１～５塩基のオーバーハング配列を介して行う。化学修飾をオーバーハング配列を介して行う場合、オーバーハング配列の鎖長は、好ましくは、１～４塩基であり、より好ましくは、１～３塩基であり、さらに好ましくは、２塩基である。オーバーハング配列の鎖長が１～５塩基あれば、比較的高いｍＲＮＡ安定化効果が期待できる。いくつかの態様では、輸送担体が、疎水性基により修飾された輸送担体（例えば、疎水性基により修飾されたブロック共重合体）であるときに、オリゴＲＮＡの化学修飾は、１～５塩基のオーバーハング配列を介してＲＮＡオリゴマーの前記（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列の５’末端又は３’末端になされる。
ＲＮＡオリゴマーに関して、オーバーハング配列を介して前記（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列の５’末端及び３’末端のどちらの末端を化学修飾してもよい。ここでは、オーバーハング配列を介して化学修飾したＲＮＡオリゴマーを、「化学修飾オリゴマー」という場合がある。
化学修飾は、例えば、ネイキッドの二本鎖ＲＮＡ又はｍＲＮＡ輸送担体を安定化させることができる修飾である。そのような化学修飾としては、例えば、疎水性基による修飾、ポリエチレングリコールによる修飾が挙げられる。疎水性基による修飾としては、コレステロール修飾、及びトコフェロール修飾が挙げられる。疎水性基による修飾を行うとｍＲＮＡ輸送担体にｍＲＮＡを搭載した際、輸送担体が疎水性相互作用により安定化され、結果的にｍＲＮＡの酵素分解を防ぐことができることが期待できる。いくつかの態様では、疎水性基による修飾は、コレステロール修飾である。疎水性基による修飾は、例えば、（Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１）２２，ｐ．１８５９-１８６２）に記載のホスホロアミダイト法又はそれに準ずる方法にて行うことができる。疎水性基による修飾は、例えば、次のようにして行うことができる。ＲＮＡオリゴマーを合成した後、アミダイト化した疎水性基とＲＮＡオリゴマーの５’末端ＯＨ基を反応させることで、５’末端に疎水性基を導入したＲＮＡオリゴマーを得ることができる。また、ＯＨ基末端の疎水性基からホスホロアミダイト法によりＲＮＡ合成を行うことで、３’末端に疎水性基を導入したＲＮＡオリゴマーを得ることができる。
尚、「化学修飾」の定義には、５’末端のトリリン酸構造は含まれない。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）による修飾を行うと、ｍＲＮＡ輸送担体にｍＲＮＡを搭載した際、輸送担体がポリエチレングリコール鎖により覆われ、そのステルス性により安定化されることに加え、ポリエチレングリコール鎖のシールディング効果により表面電位が減少し、カチオン性タンパク質である分解酵素からの認識を抑えることができる。その結果、ｍＲＮＡの酵素分解を防ぐことができることが期待できる。ポリエチレングリコールによる修飾は、例えば、文献Ｍ．Ｏｉｓｈｉ，ｅｔａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ６（４），２００５，７１８－７２５に記載の方法又はそれに準ずる方法にて行うことができる。より具体的には、ＤＭＳ（Ｏ）ＭＴ－ＡＭＩＮＯ－ＭＯＤＩＦＩＥＲ（ＧＬＥＮＲＥＳＥＲＣＨ）などの開始剤を用いてＲＮＡオリゴマーを合成し、脱保護することで５’末端アミノ化ＲＮＡオリゴマーを得る。この５’末端アミノ化ＲＮＡオリゴと例えばＰＥＧ－Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅと反応させることでＰＥＧ化ＲＮＡオリゴマーを得ることができる。用いるポリエチレングリコールとしては、例えば、重量平均分子量１，０００～８０，０００の直鎖状のＰＥＧや、同分子量の２分岐型、４分岐型、８分岐型などの分岐状のＰＥＧなどが挙げられる。
ｍＲＮＡにハイブリダイズさせる化学修飾されていないＲＮＡオリゴマー又は化学修飾ＲＮＡオリゴマーの数は、少なくとも１つであり、好ましくは１～５０個であり、より好ましくは１～１５個であり、さらに好ましくは、１～５個である。ＲＮＡオリゴマーの数を増やすにしたがって、ｍＲＮＡの安定性はさらに向上する。ＲＮＡオリゴマーの数が１～５０個の範囲であれば、ｍＲＮＡの翻訳効率を比較的高いレベルに維持することができる。
複数の化学修飾されていないＲＮＡオリゴマー又は化学修飾ＲＮＡオリゴマーをｍＲＮＡにハイブリダイズさせる場合、いくつかの態様では、それぞれの化学修飾されていないＲＮＡオリゴマー又は化学修飾ＲＮＡオリゴマーがｍＲＮＡ上で重ならないようにＲＮＡオリゴマーを設計する。
ＲＮＡオリゴマーのｍＲＮＡへのハイブリダイズは、公知の方法及び条件により行うことができる。ハイブリダイズでは、加温して、一定時間静置したのち、徐々に温度を低下させる。加温は、ｍＲＮＡやオリゴマーの分子内、分子間にあらかじめ存在する相補的結合を解くことで、ｍＲＮＡとオリゴマーをより効率的に結合させることを目的として行う。適切なハイブリダイズが保証されるならば、その温度時間は適宜調整可能である。温度低下は緩やかな方がハイブリダイズの特異性が増す。また、オリゴマー鎖長は、ハイブリダイズの条件設定に大きく影響しない。ハイブリダイズ効率を評価しながら、適宜条件を設定するべきである。例えば、後述の実施例に記載の方法及び条件が挙げられる。
また、本発明の第１の態様は、目的遺伝子をコードするｍＲＮＡに、少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせて二本鎖ＲＮＡを得ることを含み、
ＲＮＡオリゴマーは、
（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなるＲＮＡ配列、又は
（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列
を含み、かつ化学修飾されていない又は化学修飾されている、ｍＲＮＡの安定化方法を提供する。
安定化方法において、化学修飾されていないＲＮＡオリゴマー又は化学修飾ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたｍＲＮＡは、輸送担体に内包されていてよい。あるいは、化学修飾されていないＲＮＡオリゴマー又は化学修飾ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたｍＲＮＡは輸送担体に内包されていなくてもよく、すなわちネイキッドの形態でもよい。好ましくは、化学修飾されていないＲＮＡオリゴマー又は化学修飾ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたｍＲＮＡは、輸送担体に内包されていている。前者の本発明の第１の態様は、目的遺伝子をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーとを輸送担体に内包させることを含み、ＲＮＡオリゴマーは、
（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなるＲＮＡ配列、又は
（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列
を含み、かつ化学修飾されていない又は化学修飾されている、輸送担体の安定化方法も提供する。
安定化方法に用いる、ｍＲＮＡ、ＲＮＡオリゴマー、輸送担体、化学修飾等は、前記輸送担体に関する説明で記載した通りである。
１．３．医薬組成物
本発明の第１の態様は、前記二本鎖ＲＮＡ又は輸送担体を含有する医薬組成物を提供する。医薬組成物は、ｍＲＮＡ、又はｍＲＮＡを内包する輸送担体を、対象の体内に送達することに用いられる。
「対象」は、ヒト、又はヒト以外の生物、例えば、トリ及び非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、サル、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、及びウマ）である。
医薬組成物は、対象に対し、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与（例えば、膀胱内投与、胸腔内投与、腹腔内投与、眼内投与、脳内投与）、経皮投与、経粘膜投与、経肺投与又は経直腸投与することができる。特に静脈内投与、経皮投与、経粘膜投与が望ましい。これらの投与に適した剤型、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸入剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、座剤で投与される。投与量、投与回数及び投与期間などの各条件は、ｍＲＮＡの種類、剤型、年齢や体重等の対象の状態、投与経路、疾患の性質や程度を考慮した上で、当業者であれば適宜設定することができる。
医薬組成物は、各種疾患の原因となる細胞に所望の遺伝子をコードするｍＲＮＡを導入する治療に用いることができる。よって、本発明の第１の態様は、医薬組成物を、各種疾患の治療を必要とする対象に投与することを含む、各種疾患の治療方法を提供することもできる。なお、投与量、投与回数及び投与期間などの各条件は前記と同様である。
治療する各種疾患は、例えば、癌、ウイルス性疾患、代謝性疾患、循環器疾患、神経疾患、腎泌尿器疾患、血液学的悪性疾患、アポトーシスの促進又は抑制が所望される疾患、膠原病、呼吸器疾患及び消化器疾患が挙げられる。
医薬組成物については、薬剤製造上一般に用いられる賦形材、充填材、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することができる。静脈内注射剤（点滴を含む）とする場合、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態等で提供される。
いくつかの態様では、ｍＲＮＡの投与量は、ｍＲＮＡの種類、剤型、年齢や体重等の対象の状態、投与経路、疾患の性質や程度を考慮した上で、例えば、成人に対して、１日当たり０．１ｍｇ～５ｇ／ヒトの範囲内が、好ましくは１ｍｇ～２ｇの範囲内が一般的である。この投与量は、標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。従って、場合によってはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とするときもある。また１日１回から数回の投与又は１日から数日間の間隔で投与することができる。
１．４．ｍＲＮＡ送達用キット
本発明の第１の態様のｍＲＮＡ送達用キットは、前記化学修飾されていないＲＮＡオリゴマー又は化学修飾ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたｍＲＮＡを含むことを特徴とするものである。化学修飾されていないＲＮＡオリゴマー又は化学修飾ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたｍＲＮＡは、輸送担体に内包されていてよい。あるいは、化学修飾されていないＲＮＡオリゴマー又は化学修飾ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたｍＲＮＡは輸送担体に内包されていなくてもよく、すなわちネイキッドの形態でもよい。好ましくは、化学修飾されていないＲＮＡオリゴマー又は化学修飾ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたｍＲＮＡは、輸送担体に内包されていている。前者の本発明の第１の態様のｍＲＮＡ送達用キットは、輸送担体を含むことを特徴とするものである。当該キットは、例えば、前記化学修飾されていないＲＮＡオリゴマー又は化学修飾ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたｍＲＮＡ又は輸送担体を用いた各種疾患の治療方法に好ましく用いることができる。
キットにおいて、前記化学修飾されていないＲＮＡオリゴマー又は化学修飾ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたｍＲＮＡ又は輸送担体の保存状態は、限定はされず、その安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮して溶液状又は粉末状等の状態を選択できる。
キットは、前記化学修飾されていないＲＮＡオリゴマー又は化学修飾ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたｍＲＮＡ又は輸送担体以外に、他の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては、例えば、各種バッファー及び使用説明書（使用マニュアル）を挙げることができる。
２．本発明の第２の態様
２．１．本発明の第２の態様の概要
ｍＲＮＡ自体は免疫原性が低いために炎症反応を惹起しにくい。そのため、従来の一本鎖のｍＲＮＡを用いたワクチンは、効果的に炎症反応を惹起するためのアジュバント併用が避けられなかった。
ここで、ＲＮＡを二本鎖にするとより強い炎症反応が誘導されることが知られている。そこで、本発明者らは、抗原タンパク質をコードする一本鎖のｍＲＮＡに対して、そのｍＲＮＡに相補的な配列を持つＲＮＡ鎖（「相補鎖ＲＮＡ」）をハイブリダイズさせ二本鎖ＲＮＡとして投与することに着想した。相補鎖ＲＮＡからのタンパク質発現が起こらない制御を加えることで、二本鎖ＲＮＡが目的とするタンパク質発現を得つつ、十分な免疫誘導を同時に達成することが期待できる。また、ＲＮＡ分子自体は生体内に存在し、外来物質を用いるわけではないので、二本鎖ＲＮＡを用いる場合、比較的高い安全性が担保されると考えられる。
ｍＲＮＡの全長に対して相補鎖ＲＮＡをハイブリダイズさせた場合、ハイブリダイズさせていないｍＲＮＡと比べ、非常に強い炎症反応が見られたものの（図２３（Ａ））、ｍＲＮＡからのタンパク質発現効率が１／１００以下に低下した（図２３（Ｂ））。そこで、本発明者らは、より短い相補鎖を部分的にハイブリダイズさせることに着想した。二本鎖を形成させる部位としてコード配列にハイブリダイズさせた場合は、タンパク質発現効率が低下したが、３’末端に付加されるｐｏｌｙ Ａ配列に相補鎖（ｐｏｌｙ Ｕ）を主にハイブリダイズさせると、タンパク質発現効率をほとんど低下させることなく（図２３（Ｂ））、強い炎症反応を惹起することが分かった（図２３（Ａ））。
そこで、本発明の第２の態様は、抗原をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡの少なくともｐｏｌｙ Ａ配列にハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーからなる二本鎖ＲＮＡを含み、前記少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーは化学修飾されていない又は化学修飾されている、ｍＲＮＡワクチンを提供する。本発明の第２の態様のｍＲＮＡワクチンは、効率よいタンパク質発現及び免疫誘導能を共に達成することができる。
本発明の第２の態様のｍＲＮＡワクチンを用いて、実際にワクチンの効果を向上できるかについて、マウスにおける免疫誘導能を細胞性免疫に着目して評価した（図２５（Ａ））。ここでは、モデル抗原として卵白アルブミン（ＯＶＡ）を用い、ＯＶＡ発現ｍＲＮＡをマウスの鼠径リンパ節に投与した。続いて、その１週間後の脾臓の細胞を回収し、その中でＯＶＡに特異的に反応する細胞の数をＥＬIＳＰＯＴ法にて評価した。すると、リンパ節に投与した場合に、ｐｏｌｙ Ａ配列に相補鎖ＲＮＡ（ｐｏｌｙ Ｕ）をハイブリダイズさせたｍＲＮＡが、ハイブリダイズしていないｍＲＮＡと比べて、有意に強く抗原特異的な細胞性免疫を誘導していることが明らかとなった（図２５（Ｂ））。このように、本発明の第２の態様のｍＲＮＡワクチンを用いることで、細胞性免疫誘導効果が向上することが、実証された。
さらに、本発明の第２の態様のｍＲＮＡワクチンを用いてマウスにおける免疫誘導能を液性免疫について評価したところ（図２６（Ａ））、ｐｏｌｙ Ａ配列に相補鎖ＲＮＡ（ｐｏｌｙ Ｕ）をハイブリダイズさせたｍＲＮＡが、ハイブリダイズしていないｍＲＮＡと比べて、有意に強く抗原特異的な液性免疫を誘導していることが明らかとなった（図２６（Ｂ））。
ｐｏｌｙ Ａ配列にｐｏｌｙ ＵをハイブリダイズさせたｍＲＮＡが炎症反応を惹起するメカニズムに関する検証も行った。二本鎖ＲＮＡ認識において細胞内受容体であるＲＩＧ－Ｉが重要な役割を担うことが知られている。そして、ＲＩＧ－Ｉと二本鎖ＲＮＡの結合において、片方のＲＮＡ鎖の５’末端がトリリン酸化されていることが重要であるとの報告もある。５’末端がトリリン酸化された相補鎖ＲＮＡ（ｐｏｌｙ Ｕ）をｐｏｌｙ Ａ配列にハイブリダイズしたｍＲＮＡを用いた場合、５’末端がトリリン酸化されていない相補鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ ｐｐｐ（－））をｐｏｌｙ Ａ配列にハイブリダイズしたｍＲＮＡを用いた場合と比較して、より強い炎症反応が惹起されることが分かった（図２３（Ａ））。従って、ＲＩＧ－Ｉがｐｏｌｙ Ａ配列をハイブリダイズさせたｍＲＮＡに対する炎症反応に強く関わっていることが示唆された。
ここで、ｐｏｌｙ Ｕをハイブリダイズさせた時は炎症反応が惹起された一方で、タンパク質コード配列に対する相補鎖をハイブリダイズさせた時はあまり炎症が起きなかった（図２３（Ａ））。用いる相補鎖に依存してＲＩＧ－Ｉによるトリリン酸認識が異なることが強く示唆されるが、ｐｏｌｙ Ｕの場合、５’末端がｍＲＮＡ末端に露出され、トリリン酸が立体的にＲＩＧ－Ｉに認識されやすくなった可能性、トリリン酸周囲の配列にＵを多く含むが、ＡＵ結合が弱いのでトリリン酸の運動性が高まり、認識されやすくなった可能性等が想定される。このように相補鎖の選択がＲＩＧ－Ｉを介した自然免疫応答に重要である可能性が強く示唆された。
一般的に二本鎖ＲＮＡは細胞内に導入されると強い炎症反応が惹起されることは知られる。しかし、ｍＲＮＡに対して全長の相補鎖を結合させると、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を阻害してしまうことが分かった。本発明の第２の態様では、ｐｏｌｙ Ａ配列を中心に、相補鎖を部位特異的にハイブリダイズさせることで、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を保ったまま炎症反応を惹起することができる。
２．２．ｍＲＮＡワクチン
本発明の第２の態様は、抗原をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡの少なくともｐｏｌｙ Ａ配列にハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーからなる二本鎖ＲＮＡを含み、前記少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーは化学修飾されていない又は化学修飾されている、ｍＲＮＡワクチンを提供する。
２．２．１．ｍＲＮＡ
ｍＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡを意味し、通常、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）とコード領域と３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）とを含む。ｍＲＮＡは、さらに、通常、５’末端のキャップ構造（５’Ｃａｐ）と３’末端のｐｏｌｙ Ａ配列を含む。
ｍＲＮＡワクチンに用いるｍＲＮＡは、次のいずれかのものであってよい。

（１）５’Ｃａｐ、５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、及びｐｏｌｙ Ａをこの順に含むｍＲＮＡ。
（２）５’Ｃａｐ、５’ＵＴＲ、コード領域、及びｐｏｌｙ Ａをこの順に含むｍＲＮＡ。
（３）５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、及びｐｏｌｙ Ａをこの順に含むｍＲＮＡ。
（４）５’ＵＴＲ、コード領域、及びｐｏｌｙ Ａをこの順に含むｍＲＮＡ。

ｍＲＮＡワクチンに用いるｍＲＮＡは、公知の方法により、目的遺伝子をコードするテンプレートＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ環境下で転写することで作製することができる。例えば、Ｂｌｏｏｄ １０８（１３）（２００６）４００９－１７に記載の方法に従って、作製することができる。具体的には、タンパク質コード配列の下流にｐｏｌｙ Ａ／Ｔ鎖が組み込まれた鋳型ＤＮＡをｐｏｌｙ Ａ／Ｔ鎖のすぐ下流で切断し、翻訳酵素、ヌクレオシド、５’キャップアナログを含むバッファー溶液中にてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行い、その後、ｍＲＮＡを精製することで作製する。ｍＲＮＡのより具体的な調製方法は、後述の実施例に記載の通りである。
ｍＲＮＡのコード領域によってコードされる抗原としては、免疫応答を誘発するのに好適な公知の抗原から任意に選択することができる。抗原としては、より具体的には、腫瘍抗原、ウイルス由来抗原、細菌由来抗原、真菌由来抗原、原生生物由来抗原、動物由来抗原、植物由来抗原、自己免疫疾患の自己抗原などが挙げられる。ｍＲＮＡにコードされる抗原は、１つの抗原であってもよいし、あるいは、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ又は５つ以上）の同一又は異なる抗原であってもよい。本発明の第２の態様のいくつかの態様では、ｍＲＮＡのコードされる抗原は、１つの抗原である。
ｍＲＮＡのｐｏｌｙ Ａ配列の長さは、例えば、１０～５００塩基であり、好ましくは、３０～３００塩基であり、より好ましくは、６０～２５０塩基である。
ｍＲＮＡの５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの配列は、天然に生じる配列と１００％の配列同一性を有するものとしてよく、あるいは、部分的又はその全体を他の５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲの配列と置換してもよい。他の５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲの配列としては、例えば、グロビン、ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ（１７－β）ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ４、又はアルブミンをコードするｍＲＮＡの５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲの配列が挙げられる。
いくつかの態様では、ｍＲＮＡは修飾されていない。この場合、ｍＲＮＡ自体は天然のものであるため翻訳の過程はほとんど障害されないことが期待できる。
別のいくつかの態様では、ｍＲＮＡをさらに安定化させるためにｍＲＮＡは修飾されている。ｍＲＮＡの修飾としては、ｍＲＮＡの塩基の化学修飾、ｍＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量の修飾、ｍＲＮＡのＣａｐ構造の修飾などが挙げられる。
ｍＲＮＡの塩基の化学修飾は、例えば、ｍＲＮＡの酵素耐性を向上させることが知られているものである。そのようなｍＲＮＡ自体の化学修飾塩基は、例えば、メチル化塩基（例えば、５－メチルシトシン）、硫黄修飾塩基（例えば、２－チオウリジン）、シュードウリジン、Ｎ１メチルシュードウリジン及び５－メトキシウリジンが挙げられる。
ｍＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量の修飾は、Ｇ（グアニン）／Ｃ（シトシン）の含有量が多くなるように修飾することであり、これにより、より安定なｍＲＮＡとすることができる。
ｍＲＮＡのＣａｐ構造の修飾は、５’側の１番目もしくは２番目のリボースの２位をメトキシ基とすることであり、これにより、発現効率が向上することも知られている。
ｍＲＮＡの調製及び修飾は、公知の方法又はそれに準ずる方法により行うことができる。
２．２．２．ＲＮＡオリゴマー
本発明の第２の態様では、ｍＲＮＡの少なくともｐｏｌｙ Ａ配列に少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーがハイブリダイズしている。また、当該ＲＮＡオリゴマーは、化学修飾を含まないものである。
１つのＲＮＡオリゴマーがハイブリダイズするｍＲＮＡの配列は、例えば、次のいずれかの配列である。
（１）ｍＲＮＡのｐｏｌｙ Ａ配列中の連続する配列。
（２）ｍＲＮＡの３’ＵＴＲとｐｏｌｙ Ａ配列中の連続する配列。
（３）ｍＲＮＡのコード領域とｐｏｌｙ Ａ配列中の連続する配列。
（１）ｍＲＮＡのｐｏｌｙ Ａ配列中の連続する配列の場合、ｐｏｌｙ Ａ配列の全体（１００％）又は一部には１つのＲＮＡオリゴマーがハイブリダイズするが、その直前の配列（すなわち、３’ＵＴＲ又はコード領域）には当該ＲＮＡオリゴマーはハイブリダイズしないように、ＲＮＡオリゴマーを設計する。ここで、ｐｏｌｙ Ａ配列の一部は、ｐｏｌｙ Ａ配列の全長の０％より大きく１００％未満の塩基長、かつ、例えば１０塩基長以上の塩基長（好ましくは１７塩基長以上の塩基長）の配列である。ｍＲＮＡのｐｏｌｙ Ａ配列部分には、ＲＮＡオリゴマーがハイブリダイズする１７塩基以上の相補配列があることが好ましい。
ｍＲＮＡを、ｐｏｌｙ Ａ配列の直前に３’ＵＴＲ配列を含む設計とする場合は、１つのＲＮＡオリゴマーがハイブリダイズする配列が、（２）ｍＲＮＡの３’ＵＴＲとｐｏｌｙ Ａ配列中の連続する配列であってよい。この場合、ｐｏｌｙ Ａ配列の全体（１００％）又は一部とその直前の３’ＵＴＲ配列の一部の連続する配列に１つのＲＮＡオリゴマーがハイブリダイズするように、ＲＮＡオリゴマーを設計する。この場合、１つのＲＮＡオリゴマーは、例えば、ｐｏｌｙ Ａ配列の全長の０％より大きく１００％未満の塩基長、かつ、例えば１０塩基長以上の塩基長（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７塩基長以上の塩基長、好ましくは１７塩基長以上の塩基長）の配列とその直前の３’ＵＴＲ配列の全長の０％より大きく１００％未満の塩基長の配列にハイブリダイズするように設計される。ｍＲＮＡのｐｏｌｙ Ａ配列部分と３’ＵＴＲ配列部分には、ＲＮＡオリゴマーがハイブリダイズする、合わせて１７塩基以上の相補配列があることが好ましい。ＲＮＡオリゴマーがハイブリダイズするｍＲＮＡの３’ＵＴＲ配列部分は短ければ短いほど好ましく、例えば、１～３０塩基長であり、好ましくは、１～２５塩基長であり、より好ましくは、１～２塩基長である。
ｍＲＮＡを、ｐｏｌｙ Ａ配列の直前にコード配列を含む設計とする場合は、１つのＲＮＡオリゴマーがハイブリダイズする配列が、（３）ｍＲＮＡのコード配列とｐｏｌｙ Ａ配列中の連続する配列であってよい。この場合、ｐｏｌｙ Ａ配列の全体（１００％）又は一部とその直前のコード配列の一部の連続する配列に１つのＲＮＡオリゴマーがハイブリダイズするように、ＲＮＡオリゴマーを設計する。この場合、１つのＲＮＡオリゴマーは、例えば、ｐｏｌｙ Ａ配列の全長の０％より大きく１００％未満の塩基長、かつ、例えば１０塩基長以上の塩基長（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７塩基長以上の塩基長、好ましくは１７塩基長以上の塩基長）とその直前のコード配列の全長の０％より大きく１００％未満の塩基長の配列にハイブリダイズするように設計される。ｍＲＮＡのｐｏｌｙ Ａ配列部分とコード配列部分には、ＲＮＡオリゴマーがハイブリダイズする、合わせて１７塩基以上の相補配列があることが好ましい。ＲＮＡオリゴマーがハイブリダイズするｍＲＮＡのコード配列部分は短ければ短いほど好ましく、例えば、１～３０塩基長であり、好ましくは、１～２５塩基長であり、より好ましくは、１～２塩基長である。
ＲＮＡオリゴマーは、具体的には、以下のものが挙げられる。
（ａ）上記（１）～（３）のいずれかの連続する配列に相補的な配列を有するＲＮＡオリゴマー、または、
（ｂ）上記（１）～（３）のいずれかの連続する配列に相補的な配列と９０％以上の同一性を有するＲＮＡ配列を有し、かつ、ｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡオリゴマー。
「９０％以上の同一性を有するＲＮＡ配列」における「９０％以上」の範囲は、例えば、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上である。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、ＲＮＡ配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（例えば、Ａｌｔｚｓｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３（１９９０）参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
「ｍＲＮＡにハイブリダイズする」とは、後述のハイブリダイズ条件で、ＲＮＡオリゴマーがｍＲＮＡにハイブリダイズすることを意味する。
ＲＮＡオリゴマーは、さらに、他の配列を含むようにしてもよいし、あるいは、他の配列を含まないようにしてもよい。「他の配列」は、例えば、ＲＮＡオリゴマーを作製する際に残ったプロモーター配列、制限酵素配列、その他、ＲＮＡオリゴマー設計の際止むを得ず残る配列、またはその一部である。「他の配列」を含み場合、「他の配列」の塩基長は、例えば、１～３０塩基であり、好ましくは、１～２５塩基であり、より好ましくは、１～２塩基である。
ＲＮＡオリゴマーは、好ましくは、少なくとも１０塩基の配列からなり、より好ましくは、少なくとも１７塩基の配列からなり、さらに好ましくは、少なくとも３０塩基の配列からなり、特に好ましくは少なくとも６０塩基の配列からなる。また、いくつかの態様では、ＲＮＡオリゴマーは、好ましくは、１０～５００塩基の配列からなり、より好ましくは、１７塩基～５００塩基の配列からなり、さらに好ましくは、３０～３００塩基の配列からなり、特に好ましくは、６０～２５０塩基の配列からなる。ＲＮＡオリゴマーの塩基長は、ｍＲＮＡのｐｏｌｙ Ａ配列の長さ等を考慮して適宜設計することができる。
いくつかの態様のＲＮＡオリゴマーは、化学修飾を含まないものである。別のいくつかの態様のＲＮＡオリゴマーは、又は化学修飾を含むものである。化学修飾は、例えば、疎水性基による修飾が挙げられる。疎水性基による修飾としては、コレステロール修飾、及びトコフェロール修飾が挙げられる。また、化学修飾としては、例えば、ポリエチレングリコール修飾も挙げられる。
尚、「化学修飾」の定義には、５’末端のトリリン酸構造は含まれない。
ＲＮＡオリゴマーの調製は、公知の方法又はそれに準ずる方法により行うことができる。ＲＮＡオリゴマーは、テンプレートＤＮＡよりｉｎ ｖｉｔｒｏ転写にて作製される。原理上、ＲＮＡオリゴマーの調製は、前述のｍＲＮＡの作製とほぼ同様にして行うことができるが、ｍＲＮＡは転写の際に５’キャップアナログを添加しているのに対して、ＲＮＡオリゴマーの作製の際はキャップアナログを添加せずに作製する。このように生物学的にＲＮＡオリゴマーを調製した場合、５’末端にトリリン酸構造を有するものとすることができる。トリリン酸の除去方法は、後述の通りである。
２．２．３．二本鎖ＲＮＡ
二本鎖ＲＮＡは、前述のｍＲＮＡに少なくとも１つの前述のＲＮＡオリゴマーがハイブリダイズしたものである。
二本鎖ＲＮＡは、ｍＲＮＡとＲＮＡオリゴマーのハイブリダイゼーションにより調製することができる。ハイブリダイゼーションは、より具体的には、後述の実施例に記載の条件又はそれに準ずる条件にて行うことができる。１つのｍＲＮＡにハイブリダイズさせるＲＮＡオリゴマーの数は、少なくとも１つであり、好ましくは１～５個であり、より好ましくは１～３個であり、さらに好ましくは、１～２個であり、特に好ましくは、１個である。
ＲＮＡオリゴマーのｍＲＮＡへのハイブリダイズは、公知の方法及び条件により行うことができる。より具体的には、ハイブリダイズでは、加温して、一定時間静置したのち、徐々に温度を低下させる。加温は、ｍＲＮＡやオリゴマーの分子内、分子間にあらかじめ存在する相補的結合を解くことで、ｍＲＮＡとオリゴマーをより効率的に結合させることを目的として行う。適切なハイブリダイズが保証されるならば、その温度時間は適宜調整可能である。とりわけｐｏｌｙ Ａやｐｏｌｙ Ｕは予め他の配列と結合している可能性は低く、より穏やかな加温条件の設定が可能である。温度低下は緩やかな方がハイブリダイズの特異性が増す。また、オリゴマー鎖長は、ハイブリダイズの条件設定に大きく影響しない。ハイブリダイズ効率を評価しながら、適宜条件を設定するべきである。例えば、後述の実施例に記載の方法及び条件が挙げられる。
いくつかの態様では、二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡオリゴマーの５’末端のトリリン酸構造を有する。ＲＮＡオリゴマーの５’末端のトリリン酸構造を有するものとすることで、より強い炎症反応を惹起することができる。
別のいくつかの態様では、二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡオリゴマーの５’末端のトリリン酸構造を有さない。トリリン酸化を除く方法は、公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。トリリン酸化を除く方法としては、例えば、後述の実施例のように、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ｃａｔ．ｎｏ．Ｍ０２８９Ｓ）を用いる方法が挙げられる。
いくつかの態様では、二本鎖ＲＮＡは、ネイキッドの形態である。すなわち、二本鎖ＲＮＡは、輸送担体を伴わない。
別のいくつかの態様では、二本鎖ＲＮＡは、輸送担体に内包される形態である。輸送担体は、二本鎖ｍＲＮＡを内包して、対象の体内の好適な箇所に送達することができるものであればよく、特に限定されない。輸送担体は脂質性ｍＲＮＡキャリア、又はカチオン性ポリマー複合体であり、より好ましくは、高分子ミセル又は脂質性ｍＲＮＡキャリアである。
高分子ミセルは、凝縮した核酸とカチオン性ポリマーで形成される内核と親水性ポリマーで形成される外殻との二層構造を有している。カチオン性ポリマーは、例えば、ポリアミノ酸誘導体である。親水性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）である。内核は、ｍＲＮＡを物理的又は化学的に封入する。外殻は、その物理化学的な性質によって、内殻に封入されたｍＲＮＡを所定の組織に送達する。高分子ミセルは、エンドサイトーシスによって細胞内に入り込むことができる。高分子ミセルは、例えば、ブロックポリマー上のポリカチオンと核酸の総合作用（ポリイオンコンプレックス（「ＰＩＣ」））を利用することもできるほか、それと無機分子とのハイブリットミセルを利用することもできる。ＰＩＣ型高分子ミセルとしては、例えば、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌ、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）、ＰＥＧ-ＰＬｙｓとｍＲＮＡの多分子会合により形成されるＰＩＣミセルや、ＰＡｓｐ（ＴＥＴ）， ＰＡｓｐ（ＴＥＰ）といった別のポリカチオンをブロック共重合体に用いたもの（Ｕｃｈｉｄａ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ （２０１６）８２，ｐ．２２１-２２８）及びトリブロック共重合体を用いたもの（Ｏｓａｗａ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １７， ｐ３５４-３６１ （２０１６））が挙げられる。無機粒子とのハイブリッド型高分子ミセルとしては、例えば、ＰＥＧ化リン酸カルシウム（ＣａＰ）粒子（Ｐｉｔｔｅｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１１）３２，ｐ．３１０６－３１１４）、ＰＥＧ化シリカ粒子（Ｍｉｙａｔａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ （２０１０）３１， ｐ４７６４-４７７０ ）が挙げられる。
脂質性ｍＲＮＡキャリアは、リピッドまたはカチオニックリピッドをキャリアとして形成され、そしてｍＲＮＡが内包もしくは結合された形態にある。例えば、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパナミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、１、２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２、３－ジミリスチルオキシ）プロピル］－Ｎ、Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）又はＤＣ-ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌといったカチオン性脂質；ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）といった中性リン脂質；ＰＥＧ化脂質；及びコレステロールからなる群より選択される一つまたは複数からなり、それとｍＲＮＡを混合して得られるものである。
カチオン性ポリマー複合体は、例えば、直鎖状もしくは分枝状ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、キトサン誘導体、ポリメタクリル酸誘導体とｍＲＮＡの混合物である。
これらの輸送担体は、公知の方法又はそれに準ずる方法にて調製することができる。
２．２．４．アジュバント
いくつかの好ましい態様では、ＲＮＡワクチンは、アジュバントと共には用いない。
別のいくつかの態様では、ＲＮＡワクチンは、アジュバントと共に用いる。アジュバントと共に用いる場合、ＲＮＡワクチンは、アジュバントと共に製剤化されてもよい。アジュバントは、免疫反応を増強するのに好適な任意の化合物である。そのようなアジュバントは公知であり、当業者であれば、任意のアジュバントの中から適切なものを選択することができる。
２．３．疾患の予防又は治療
ｍＲＮＡワクチンは、疾患の予防又は治療を必要とする対象において当該疾患の予防又は治療に用いることができる。
予防又は治療する疾患は、例えば、がん、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌感染症、原生生物感染症、及び自己免疫疾患を挙げることができる。前述のｍＲＮＡのコード領域がコードする抗原を、予防又は治療する疾患に応じて適切に選択することで、当該疾患を予防又は治療することができる。
「対象」は、ヒト、又はヒト以外の生物、例えば、トリ及び非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、サル、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、及びウマ）である。
ｍＲＮＡワクチンは、常法に従って製剤化することができる。いくつかの態様では、ｍＲＮＡワクチンは、医薬的に許容される添加剤を含む。医薬的に許容される添加剤としては、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬的に許容される界面活性剤等が挙げられる。
上記添加剤は、ｍＲＮＡワクチンの剤形に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された二本鎖ＲＮＡを溶剤（例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等）に溶解し、これにＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えばマンニトール、ブドウ糖、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール等の糖類、トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモまたは他の植物由来のデンプン等のデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース、アラビアゴム、トラガカントゴム等のゴム、ゼラチン、コラーゲン等などが挙げられる。
ｍＲＮＡワクチンの投与量は、対象の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤形などによって適宜選択することができる。ｍＲＮＡワクチンの有効投与量は、疾患の兆候又は状態を軽減するワクチンの量である。このようなｍＲＮＡワクチンの治療効果及び毒性は、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）、及びＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的である用量）によって決定することができる。いくつかの態様では、ｍＲＮＡワクチンの投与量は、成人に対して、１日当たり１０ｎｇ～１ｇ、１００ｎｇ～１００ｍｇ、１μｇ～１０μｇ、又は３０μｇ～３００μｇのｍＲＮＡの範囲とする。
ｍＲＮＡワクチンの投与経路は適切に選択することができ、例えば、経皮、鼻腔内、経気管支、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、直腸内、及び膣内の経路を含むが、これらの経路に限定されるものではない。
ｍＲＮＡワクチンの投与回数は、１回、又は副作用が臨床上許容される範囲内である限り複数回とすることができる。
いくつかの態様では、ｍＲＮＡワクチン投与における抗体価又は細胞性免疫活性を測定する。例えば、抗体価は、生体より血液を採取し、血清中のＩｇＧを定量することにより評価できる。細胞性免疫活性は、生体よりリンパ球を分離及び培養し、３Ｈ－チミジンの取り込みを測定することにより評価できる。
２．４．キット
本発明の第２の態様のキットは、前記ｍＲＮＡワクチンを含むことを特徴とするものである。当該キットは、例えば、前記ＲＮＡワクチンを用いた前記各種疾患の治療方法に好ましく用いることができる。
キットにおいて、前記ｍＲＮＡワクチンの保存状態は、限定はされず、その安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮して溶液状又は粉末状等の状態を選択できる。
キットは、前記ｍＲＮＡワクチン以外に、他の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては、例えば、各種バッファー及び使用説明書（使用マニュアル）を挙げることができる。キットには、アジュバントを含めてもよいし、含めなくてもよい。好ましくは、キットは、アジュバントを含めない。
３．本発明の第３の態様
３．１．本発明の第３の態様の概要
二本鎖ＲＮＡ認識において細胞内受容体であるＲＩＧ－Ｉが重要な役割を担うことが知られている。そして、ＲＩＧ－Ｉと二本鎖ＲＮＡの結合において、片方のＲＮＡ鎖の５’末端がトリリン酸化されていることが重要であるとの報告もある。５’末端がトリリン酸化された第２のＲＮＡオリゴマーを第１のＲＮＡオリゴマーにハイブリダイズし、これをｍＲＮＡにハイブリダイズした二本鎖ｍＲＮＡを作製した。図３７の二本鎖ｍＲＮＡは、１つのｍＲＮＡにつき、５つのＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせたものを例示している。一方、後述の実施例では、１つのｍＲＮＡにつき、１～３個のＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせたものを用いた。これらの二本鎖ｍＲＮＡを用いた場合、ハイブリダイズさせていないｍＲＮＡと比べ、免疫賦活化作用が向上し（図３８及び３９）、また、ｍＲＮＡの発現効率は維持された（図４０）。このとき、免疫賦活化作用は、ｍＲＮＡにハイブリダイズする二本鎖ＲＮＡオリゴマーの個数が増えるにしたがって向上した（図３８及び３９）。従って、ＲＩＧ－ＩがＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせたｍＲＮＡに対する炎症反応に強く関わっていることが示唆された。
本発明の第２の態様の特定のｍＲＮＡワクチンはタンパク質発現効率がやや低下したが（図４０の「ｍＲＮＡ：ｐＵ」）、上記の二本鎖ｍＲＮＡを用いた場合、翻訳活性が十分に維持された（図４０の「１個」、「２個」及び「３個」）。さらに、ハイブリダイズするＲＮＡオリゴマー数を調整することで、免疫応答の強度を調整することができた（図３８及び３９の「１個」、「２個」及び「３個」）。過度の炎症は副作用の原因ともなるほか、ワクチン効果を得る上でも好ましくない可能性がある。ＲＮＡオリゴマーの数を変えることで、今回の免疫応答の強度を調整できた点は、ワクチン効果を得るのに適当な強度の炎症反応を得る上で極めて重要となる。
また、本発明の第３の態様のｍＲＮＡワクチンは、第２の態様のｍＲＮＡワクチンと比べ、ＲＩＧ－Ｉ認識に必要な平滑５’末端トリリン酸化構造を構築するのが容易である。
さらに、本発明の第３の態様のｍＲＮＡワクチンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写で第２のＲＮＡ鎖を調製する際に副産物として目的ＲＮＡの相補鎖ＲＮＡが転写されるが、第２の態様の特定のｍＲＮＡワクチンと比べ、その副産物の産生を容易に回避できる。
３．２．ｍＲＮＡワクチン
本発明の第３の態様は、抗原をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つの第１のＲＮＡオリゴマーと、当該第１のＲＮＡオリゴマーにハイブリダイズした第２のＲＮＡオリゴマーからなる二本鎖ＲＮＡを含み、
第１のＲＮＡオリゴマーは、
（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなる第１のＲＮＡ配列と、第２のＲＮＡオリゴマーの配列に相補的な１０～２００塩基の配列からなる第２のＲＮＡ配列を、５’末端よりこの順に含むＲＮＡ配列、
（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズする第１のＲＮＡ配列と、第２のＲＮＡオリゴマーの配列に相補的な１０～２００塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつ第２のＲＮＡオリゴマーにハイブリダイズする第２のＲＮＡ配列を、５’末端よりこの順に含むＲＮＡ配列、
（ｃ）第２のＲＮＡオリゴマーの配列に相補的な１０～２００塩基の配列からなる第２のＲＮＡ配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなる第１のＲＮＡ配列を、５’末端よりこの順に含むＲＮＡ配列、又は
（ｄ）第２のＲＮＡオリゴマーの配列に相補的な１０～２００塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつ第２のＲＮＡオリゴマーにハイブリダイズする第２のＲＮＡ配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズする第１のＲＮＡ配列と、５’末端よりこの順に含むＲＮＡ配列
を含む、ｍＲＮＡワクチンを提供する。
３．２．１．ｍＲＮＡ
ｍＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡを意味し、通常、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）とコード領域と３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）とを含む。ｍＲＮＡは、さらに、通常、５’末端のキャップ構造（５’Ｃａｐ）と３’末端のｐｏｌｙ Ａ配列を含む。
ｍＲＮＡワクチンに用いるｍＲＮＡは、次のいずれかのものであってよい。
（１）５’Ｃａｐ、５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、及びｐｏｌｙ Ａをこの順に含むｍＲＮＡ。
（２）５’Ｃａｐ、５’ＵＴＲ、コード領域、及びｐｏｌｙ Ａをこの順に含むｍＲＮＡ。
（３）５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、及びｐｏｌｙ Ａをこの順に含むｍＲＮＡ。
（４）５’ＵＴＲ、コード領域、及びｐｏｌｙ Ａをこの順に含むｍＲＮＡ。
ｍＲＮＡワクチンに用いるｍＲＮＡは、公知の方法により、目的遺伝子をコードするテンプレートＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ環境下で転写することで作製することができる。例えば、Ｂｌｏｏｄ １０８（１３）（２００６）４００９－１７に記載の方法に従って、作製することができる。具体的には、タンパク質コード配列の下流にｐｏｌｙ Ａ／Ｔ鎖が組み込まれた鋳型ＤＮＡをｐｏｌｙ Ａ／Ｔ鎖のすぐ下流で切断し、翻訳酵素、ヌクレオシド、５’キャップアナログを含むバッファー溶液中にてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行い、その後、ｍＲＮＡを精製することで作製する。ｍＲＮＡのより具体的な調製方法は、後述の実施例に記載の通りである。
ｍＲＮＡのコード領域によってコードされる抗原としては、免疫応答を誘発するのに好適な公知の抗原から任意に選択することができる。抗原としては、より具体的には、腫瘍抗原、ウイルス由来抗原、細菌由来抗原、真菌由来抗原、原生生物由来抗原、動物由来抗原、植物由来抗原、自己免疫疾患の自己抗原などが挙げられる。ｍＲＮＡにコードされる抗原は、１つの抗原であってもよいし、あるいは、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ又は５つ以上）の同一又は異なる抗原であってもよい。本発明の第３の態様のいくつかの態様では、ｍＲＮＡのコードされる抗原は、１つの抗原である。
ｍＲＮＡのｐｏｌｙ Ａ配列の長さは、例えば、１０～５００塩基であり、好ましくは、３０～３００塩基であり、より好ましくは、６０～２５０塩基である。
ｍＲＮＡの５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの配列は、天然に生じる配列と１００％の配列同一性を有するものとしてよく、あるいは、部分的又はその全体を他の５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲの配列と置換してもよい。他の５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲの配列としては、例えば、グロビン、ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ（１７－β）ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ４、又はアルブミンをコードするｍＲＮＡの５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲの配列が挙げられる。
いくつかの態様では、ｍＲＮＡは修飾されていない。この場合、ｍＲＮＡ自体は天然のものであるため翻訳の過程はほとんど障害されないことが期待できる。
別のいくつかの態様では、ｍＲＮＡをさらに安定化させるためにｍＲＮＡは修飾されている。ｍＲＮＡの修飾としては、ｍＲＮＡの塩基の化学修飾、ｍＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量の修飾、ｍＲＮＡのＣａｐ構造の修飾などが挙げられる。
ｍＲＮＡの塩基の化学修飾は、例えば、ｍＲＮＡの酵素耐性を向上させることが知られているものである。そのようなｍＲＮＡ自体の化学修飾塩基は、例えば、メチル化塩基（例えば、５－メチルシトシン）、硫黄修飾塩基（例えば、２－チオウリジン）、シュードウリジン、Ｎ１メチルシュードウリジン及び５－メトキシウリジンが挙げられる。
ｍＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量の修飾は、Ｇ（グアニン）／Ｃ（シトシン）の含有量が多くなるように修飾することであり、これにより、より安定なｍＲＮＡとすることができる。
ｍＲＮＡのＣａｐ構造の修飾は、５’側の１番目もしくは２番目のリボースの２位をメトキシ基とすることであり、これにより、発現効率が向上することも知られている。
ｍＲＮＡの調製及び修飾は、公知の方法又はそれに準ずる方法により行うことができる。
３．２．２．ＲＮＡオリゴマー
本発明の第３の態様では、少なくとも１つの第１のＲＮＡオリゴマーがｍＲＮＡにハイブリダイズする。また、さらに第２のＲＮＡオリゴマーが第１のＲＮＡオリゴマーにハイブリダイズしている。
第１のＲＮＡオリゴマーは、
（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなる第１のＲＮＡ配列と、第２のＲＮＡオリゴマーの配列に相補的な１０～２００塩基の配列からなる第２のＲＮＡ配列を、５’末端よりこの順に含むＲＮＡ配列、
（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズする第１のＲＮＡ配列と、第２のＲＮＡオリゴマーの配列に相補的な１０～２００塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつ第２のＲＮＡオリゴマーにハイブリダイズする第２のＲＮＡ配列を、５’末端よりこの順に含むＲＮＡ配列、
（ｃ）第２のＲＮＡオリゴマーの配列に相補的な１０～２００塩基の配列からなる第２のＲＮＡ配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなる第１のＲＮＡ配列を、５’末端よりこの順に含むＲＮＡ配列、又は
（ｄ）第２のＲＮＡオリゴマーの配列に相補的な１０～２００塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつ第２のＲＮＡオリゴマーにハイブリダイズする第２のＲＮＡ配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズする第１のＲＮＡ配列と、５’末端よりこの順に含むＲＮＡ配列
を含むＲＮＡ鎖である。
「９０％以上の同一性を有するＲＮＡ配列」における「９０％以上」の範囲は、例えば、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上である。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、ＲＮＡ配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（例えば、Ａｌｔｚｓｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３（１９９０）参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
「ｍＲＮＡにハイブリダイズする」とは、後述のハイブリダイズ条件で、ＲＮＡオリゴマーがｍＲＮＡにハイブリダイズすることを意味する。「第１のＲＮＡにハイブリダイズする」とは、後述のハイブリダイズ条件で、第２のＲＮＡオリゴマーが第１のＲＮＡにハイブリダイズすることを意味する。
第１のＲＮＡオリゴマーの第１のＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡの連続する１２～４０塩基の配列にハイブリダイズするように設計されている。いくつかの態様では、第１のＲＮＡオリゴマーの第１のＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～３０塩基の配列からなる。より好ましくは、第１のＲＮＡオリゴマーの第１のＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の配列からなるものである。さらに好ましくは、第１のＲＮＡオリゴマーの配列の第１のＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の配列からなるものである。
ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせるｍＲＮＡ中の位置は、５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、及びｐｏｌｙ Ａ配列のいずれの位置でもよい。ＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡの２次構造を予測し、ｍＲＮＡ鎖が２次構造を持たない部分に対してハイブリダイズするようにＲＮＡオリゴマーを設計するのが望ましい。すなわち、ＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡ全配列のうち２次構造を持たない部分に対してハイブリダイズするように設計するのが好ましい。ｍＲＮＡの２次構造を予測するソフトウエアとしては、例えば、後述の実施例に記載のものが挙げられる。いくつかの態様では、ＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ、コード領域および３’ＵＴＲの少なくとも１つの配列にハイブリダイズするように設計する。
第１のＲＮＡオリゴマーの第２のＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列が前記各塩基長であることに加えて、第２のＲＮＡオリゴマーの連続する１０～２００塩基の配列にハイブリダイズするように設計されている。いくつかの態様では、第１のＲＮＡオリゴマーの第２のＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列が前記各塩基長であることに加えて、第２のＲＮＡオリゴマーの配列に相補的な１５～１５０塩基の配列からなる。より好ましくは、第１のＲＮＡオリゴマーの第２のＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列が前記各塩基長であることに加えて、第２のＲＮＡオリゴマーの配列に相補的な２０～１００塩基の配列からなるものである。さらに好ましくは、第１のＲＮＡオリゴマーの配列の第２のＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列が前記各塩基長であることに加えて、第２のＲＮＡオリゴマーの配列に相補的な２０～８０塩基の配列からなるものである。
第１のＲＮＡオリゴマーの第２のＲＮＡ配列は、例えば、次のように設計する。すなわち、以下の（ｉ）～（ｉｖ）の少なくとも１つを満たすように、より好ましくは、２つ、３つ、または４つを満たすように設計する。いくつかの好ましい態様では、第１のＲＮＡオリゴマーの第２のＲＮＡ配列は、少なくとも以下の（ｉ）及び（ｉｉ）を満たすように、より好ましくは、さらに以下の（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の少なくとも１つを満たすように設計する。
（ｉ）テンプレートＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ環境下で転写することにより５’末端トリリン酸化を含む第２のＲＮＡオリゴマーを調製する際に、目的ＲＮＡオリゴマーに対する相補鎖ＲＮＡ（副産物）が形成されないようにすること、
（ｉｉ）第２のＲＮＡオリゴマーが第１のＲＮＡオリゴマーにハイブリダイズしている側の二本鎖ＲＮＡの末端が、５’末端トリリン酸化構造、好ましくは平滑５’末端トリリン酸化構造を取るようにすること、
（ｉｉｉ）第２のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡオリゴマーがｍＲＮＡ上の配列にハイブリダイズしないこと、及び
（ｉｖ）第１及び第２のＲＮＡオリゴマーが２次構造を作らないこと。
ここで、「（ｉ）テンプレートＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ環境下で転写することにより５’末端トリリン酸化を含む第２のＲＮＡオリゴマーを調製する際に、目的ＲＮＡオリゴマーに対する相補鎖ＲＮＡ（副産物）が形成されないようにする」ためには、例えば、次のように設計する。すなわち、相補鎖ＲＮＡの転写に必要な塩基を除いて第２のＲＮＡオリゴマーを調製する。そこで、その塩基を除いても、目的とする第２のＲＮＡオリゴマーが転写されるように、テンプレートＤＮＡを設計する。例えば、配列ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ（配列番号６７）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写する際、配列ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ（配列番号６８）が副産物として生じうるが、Ａを除いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写することでこの副産物の生成は回避される。そして、このような第２のＲＮＡオリゴマーが調製できるように、第１のＲＮＡオリゴマーの第２のＲＮＡ配列を設計する。
また、「（ｉｉ）第２のＲＮＡオリゴマーが第１のＲＮＡオリゴマーにハイブリダイズしている側の二本鎖ＲＮＡの末端が、５’末端トリリン酸化構造、好ましくは平滑５’末端トリリン酸化構造を取るようにする」ためには次のように設計する。
すなわち、第１のＲＮＡオリゴマーが前記（ａ）のＲＮＡ配列又は前記（ｂ）のＲＮＡ配列であるときは、５’末端にトリリン酸化構造を有する第２のＲＮＡオリゴマーをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写させることで第２のオリゴマーを調製する。好ましくは、このとき、第２のオリゴマーの５’末端と、第１オリゴマーの３’末端がハイブリダイズしたときに平滑末端になるように第１のオリゴマーを調製する。そして、このような第１及び第２のＲＮＡオリゴマーが調製できるように、第１のＲＮＡオリゴマーの第２のＲＮＡ配列を設計する。
一方、第１のＲＮＡオリゴマーが前記（ｃ）のＲＮＡ配列又は前記（ｄ）のＲＮＡ配列であるときは、第１のＲＮＡオリゴマーをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写させることで第１のＲＮＡオリゴマーを調製する。好ましくは、このとき、第１のＲＮＡオリゴマーの５’末端と、第２のＲＮＡオリゴマーの３’末端がハイブリダイズしたときに平滑末端になるよう第２オリゴマーを調製する。そして、このような第１及び第２のＲＮＡオリゴマーが調製できるように、第１のＲＮＡオリゴマーの第２のＲＮＡ配列を設計する。
「（ｉｉｉ）第２のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡオリゴマーがｍＲＮＡ上の配列にハイブリダイズしない」ようにするためには、設計後の２次構造を、複数のＲＮＡ鎖の２次構造を予測できるソフト（ＮＵＰＡＣＫ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｕｐａｃｋ．ｏｒｇ）等で検証する。
「（ｉｖ）第１及び第２のＲＮＡオリゴマーが２次構造を作らない」ようにするためには、設計後の２次構造を、複数のＲＮＡ鎖の２次構造を予測できるソフト（ＮＵＰＡＣＫ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｕｐａｃｋ．ｏｒｇ）等で検証する。
第１のＲＮＡオリゴマーの第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列の間には、リンカー配列が含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。いくつかの態様では、リンカー配列が含まれる。リンカー配列の塩基長は、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列が前記各塩基長であることに加えて、好ましくは１～１００塩基であり、より好ましくは２～３０塩基であり、さらに好ましくは２～２０塩基である。リンカー配列は、具体的には、ｍＲＮＡやＲＮＡオリゴマーの他の部位とハイブリダイズしないように、又はハイブリダイズしづらいように設計する。いくつかの態様では、リンカー配列は、ｍＲＮＡにハイブリダイズしづらいように、アデニン（Ａ）やウラシル（Ｕ）を用いたリンカーを設計する。このとき、Ｕを用いたリンカーは一定以上長くなるとｐｏｌｙ Ａと結合する可能性があるので、原則として、Ａを使うのが好ましい。例えば、リンカー配列は、前記塩基長のオリゴアデニン配列である。ただし、リンカー配列のその位置に対応するｍＲＮＡがウラシル（Ｕ）であると、その位置の塩基をアデニン（Ａ）にするとｍＲＮＡにハイブリダイズされてしまう。この場合、その位置の塩基をウラシル（Ｕ）に変えるのが好ましい。
第１のＲＮＡオリゴマーは、さらに、他の配列を含むようにしてもよいし、あるいは、他の配列を含まないようにしてもよい。いくつかの態様では、他の配列が含まれる。「他の配列」は、例えば、ＲＮＡオリゴマーを作製する際に残ったプロモーター配列、制限酵素配列、その他ＲＮＡオリゴマー設計の際止むを得ず残る配列、またはその一部である。「他の配列」を含み場合、「他の配列」の塩基長は、例えば、１～３０塩基であり、好ましくは、１～２５塩基であり、より好ましくは、１～２塩基である。
第２のＲＮＡオリゴマーは、第１のＲＮＡオリゴマーの第２のＲＮＡ配列にハイブリダイズする例えば１０～２００塩基の配列を含み、好ましくは１５～１５０塩基の配列を含み、より好ましくは２０～１００塩基の配列を含み、さらに好ましくは２４塩基の配列を含む。第２のＲＮＡオリゴマーの設計方法は、上記第１のＲＮＡオリゴマーの第２のＲＮＡ配列で説明した通りである。
第２のＲＮＡオリゴマーは、さらに、他の配列を含むようにしてもよいし、あるいは、他の配列を含まないようにしてもよい。「他の配列」は、例えば、ＲＮＡオリゴマーを作製する際に残ったプロモーター配列、制限酵素配列、その他ＲＮＡオリゴマー設計の際止むを得ず残る配列、またはその一部である。「他の配列」を含み場合、「他の配列」の塩基長は、例えば、１～３０塩基であり、好ましくは、１～２５塩基であり、より好ましくは、１～２塩基である。
いくつかの態様では、第１及び第２のＲＮＡオリゴマーは、化学修飾を含まないものである。別のいくつかの態様の第１及び第２のＲＮＡオリゴマーは、化学修飾を含むものである。化学修飾は、例えば、疎水性基による修飾が挙げられる。疎水性基による修飾としては、コレステロール修飾、及びトコフェロール修飾が挙げられる。また、化学修飾としては、例えば、ポリエチレングリコール修飾も挙げられる。
尚、「化学修飾」の定義には、５’末端のトリリン酸構造は含まれない。
第１および第２のＲＮＡオリゴマーの調製は、公知の方法又はそれに準ずる方法により行うことができる。具体的には、第１及び第２のＲＮＡオリゴマーは、例えば、テンプレートＤＮＡよりｉｎ ｖｉｔｒｏ転写にて作製される。原理上、第１及び第２のＲＮＡオリゴマーの調製は、前述のｍＲＮＡの作製とほぼ同様にして行うことができるが、ｍＲＮＡは転写の際に５’キャップアナログを添加しているのに対して、第１及び第２のＲＮＡオリゴマーの作製の際はキャップアナログを添加せずに作製する。このように生物学的に第１及び第２のＲＮＡオリゴマーを調製した場合、５’末端にトリリン酸構造を有するものとすることができる。トリリン酸の除去方法は、後述の通りである。５’末端にトリリン酸構造を有さない方のＲＮＡオリゴマーに関しては、化学合成することができる。
３．２．３．二本鎖ＲＮＡ
ここで、「二本鎖ＲＮＡ」は、前述のｍＲＮＡに少なくとも１つの前述の第１のＲＮＡオリゴマーがハイブリダイズし、かつ第１のＲＮＡオリゴマーに第２のＲＮＡオリゴマーがハイブリダイズしたものである。また、第１のＲＮＡオリゴマーと、第１のＲＮＡオリゴマーにハイブリダイズした第２のＲＮＡオリゴマーからなるものを、「二本鎖ＲＮＡオリゴマー」という場合がある。
二本鎖ＲＮＡは、ｍＲＮＡと第１のＲＮＡオリゴマーのハイブリダイゼーションおよび第１のＲＮＡオリゴマーと第２のＲＮＡオリゴマーのハイブリダイゼーションにより調製することができる。ハイブリダイゼーションは、より具体的には、後述の実施例に記載の条件又はそれに準ずる条件にて行うことができる。
１つのｍＲＮＡにハイブリダイズさせる第１のＲＮＡオリゴマーの数は、少なくとも１つであり、好ましくは１～５０個であり、より好ましくは１～１５個であり、さらに好ましくは、１～５個である。第１のＲＮＡオリゴマーの数が１～５０個の範囲であれば、ｍＲＮＡの翻訳効率を比較的高いレベルに維持することができる。また、１つのｍＲＮＡにハイブリダイズさせる第１のＲＮＡオリゴマーと第２のＲＮＡオリゴマーからなる二本鎖ＲＮＡオリゴマーの個数が増えると、免疫賦活作用が向上する。このため、１つのｍＲＮＡにハイブリダイズさせる第１のＲＮＡオリゴマーと第２のＲＮＡオリゴマーからなる二本鎖ＲＮＡオリゴマーの個数を調節することで、免疫反応を調節することができる。
そこで、ここでは、１つのｍＲＮＡにハイブリダイズさせる二本鎖ＲＮＡオリゴマーの個数を調節することを含む、免疫反応を調節する方法が提供される。
また、１つの第１のＲＮＡオリゴマーにハイブリダイズさせる第２のＲＮＡオリゴマーの数は１つである。
ＲＮＡオリゴマーのｍＲＮＡへのハイブリダイズは、公知の方法及び条件により行うことができる。より具体的には、ハイブリダイズでは、加温して、一定時間静置したのち、徐々に温度を低下させる。加温は、ｍＲＮＡやオリゴマーの分子内、分子間にあらかじめ存在する相補的結合を解くことで、ｍＲＮＡとオリゴマーをより効率的に結合させることを目的として行う。適切なハイブリダイズが保証されるならば、その温度時間は適宜調整可能である。とりわけｐｏｌｙ Ａやｐｏｌｙ Ｕは予め他の配列と結合している可能性は低く、より穏やかな加温条件の設定が可能である。温度低下は緩やかな方がハイブリダイズの特異性が増す。また、オリゴマー鎖長は、ハイブリダイズの条件設定に大きく影響しない。ハイブリダイズ効率を評価しながら、適宜条件を設定するべきである。例えば、後述の実施例に記載の方法及び条件が挙げられる。
いくつかの態様では、二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡオリゴマーの５’末端のトリリン酸構造を有する。ＲＮＡオリゴマーの５’末端のトリリン酸構造を有するものとすることで、より強い炎症反応を惹起することができる。
別のいくつかの態様では、二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡオリゴマーの５’末端のトリリン酸構造を有さない。トリリン酸化を除く方法は、公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。トリリン酸化を除く方法としては、例えば、後述の実施例のように、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ｃａｔ．ｎｏ．Ｍ０２８９Ｓ）を用いる方法が挙げられる。
いくつかの態様では、二本鎖ＲＮＡは、第２のＲＮＡオリゴマーが第１のＲＮＡオリゴマーにハイブリダイズしている側の末端が、平滑末端である。平滑末端の５’にトリリン酸化構造がある際にＲＩＧ－Ｉを介した、免疫誘導が向上されることが知られている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により５’末端トリリン酸化を含むＲＮＡを転写する際、目的ＲＮＡに対する相補鎖ＲＮＡが形成されないよう設計する。ここでは、相補鎖ＲＮＡの転写に必要な塩基を除いてＲＮＡを調製する。そこで、その塩基を除いても、目的とするＲＮＡが転写されるよう設計する。例えば、配列ＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵ（配列番号６７）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写する際、配列ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ（配列番号６８）が副産物として生じうるが、Ａを除いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写することでこの副産物の生成は回避される。
いくつかの態様では、二本鎖ＲＮＡは、ネイキッドの形態である。すなわち、二本鎖ＲＮＡは、輸送担体を伴わない。
別のいくつかの態様では、二本鎖ＲＮＡは、輸送担体に内包される形態である。輸送担体は、二本鎖ｍＲＮＡを内包して、対象の体内の好適な箇所に送達することができるものであればよく、特に限定されない。輸送担体は脂質性ｍＲＮＡキャリア、又はカチオン性ポリマー複合体であり、より好ましくは、高分子ミセル又は脂質性ｍＲＮＡキャリアである。
高分子ミセルは、凝縮した核酸とカチオン性ポリマーで形成される内核と親水性ポリマーで形成される外殻との二層構造を有している。カチオン性ポリマーは、例えば、ポリアミノ酸誘導体である。親水性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）である。内核は、ｍＲＮＡを物理的又は化学的に封入する。外殻は、その物理化学的な性質によって、内殻に封入されたｍＲＮＡを所定の組織に送達する。高分子ミセルは、エンドサイトーシスによって細胞内に入り込むことができる。高分子ミセルは、例えば、ブロックポリマー上のポリカチオンと核酸の総合作用（ポリイオンコンプレックス（「ＰＩＣ」））を利用することもできるほか、それと無機分子とのハイブリットミセルを利用することもできる。ＰＩＣ型高分子ミセルとしては、例えば、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌ、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）、ＰＥＧ-ＰＬｙｓとｍＲＮＡの多分子会合により形成されるＰＩＣミセルや、ＰＡｓｐ（ＴＥＴ）， ＰＡｓｐ（ＴＥＰ）といった別のポリカチオンをブロック共重合体に用いたもの（Ｕｃｈｉｄａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１６）８２，ｐ．２２１-２２８）及びトリブロック共重合体を用いたもの（Ｏｓａｗａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １７，ｐ３５４-３６１（２０１６））が挙げられる。無機粒子とのハイブリッド型高分子ミセルとしては、例えば、ＰＥＧ化リン酸カルシウム（ＣａＰ）粒子（Ｐｉｔｔｅｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１１）３２，ｐ．３１０６－３１１４）、ＰＥＧ化シリカ粒子（Ｍｉｙａｔａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１０）３１，ｐ４７６４-４７７０）が挙げられる。
脂質性ｍＲＮＡキャリアは、リピッドまたはカチオニックリピッドをキャリアとして形成され、そしてｍＲＮＡが内包もしくは結合された形態にある。例えば、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパナミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、１、２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２、３－ジミリスチルオキシ）プロピル］－Ｎ、Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）又はＤＣ-ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌといったカチオン性脂質；ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）といった中性リン脂質；ＰＥＧ化脂質；及びコレステロールからなる群より選択される一つまたは複数からなり、それとｍＲＮＡを混合して得られるものである。
カチオン性ポリマー複合体は、例えば、直鎖状もしくは分枝状ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、キトサン誘導体、ポリメタクリル酸誘導体とｍＲＮＡの混合物である。
これらの輸送担体は、公知の方法又はそれに準ずる方法にて調製することができる。
３．２．４．アジュバント
いくつかの好ましい態様では、ＲＮＡワクチンは、アジュバントと共には用いない。
別のいくつかの態様では、ＲＮＡワクチンは、アジュバントと共に用いる。アジュバントと共に用いる場合、ＲＮＡワクチンは、アジュバントと共に製剤化されてもよい。アジュバントは、免疫反応を増強するのに好適な任意の化合物である。そのようなアジュバントは公知であり、当業者であれば、任意のアジュバントの中から適切なものを選択することができる。
３．３．疾患の予防又は治療
ｍＲＮＡワクチンは、疾患の予防又は治療を必要とする対象において当該疾患の予防又は治療に用いることができる。
予防又は治療する疾患は、例えば、がん、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌感染症、原生生物感染症、及び自己免疫疾患を挙げることができる。前述のｍＲＮＡのコード領域がコードする抗原を、予防又は治療する疾患に応じて適切に選択することで、当該疾患を予防又は治療することができる。
「対象」は、ヒト、又はヒト以外の生物、例えば、トリ及び非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、サル、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、及びウマ）である。
ｍＲＮＡワクチンは、常法に従って製剤化することができる。いくつかの態様では、ｍＲＮＡワクチンは、医薬的に許容される添加剤を含む。医薬的に許容される添加剤としては、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬的に許容される界面活性剤等が挙げられる。
上記添加剤は、ｍＲＮＡワクチンの剤形に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された二本鎖ＲＮＡを溶剤（例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等）に溶解し、これにＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えばマンニトール、ブドウ糖、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール等の糖類、トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモまたは他の植物由来のデンプン等のデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース、アラビアゴム、トラガカントゴム等のゴム、ゼラチン、コラーゲン等などが挙げられる。
ｍＲＮＡワクチンの投与量は、対象の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤形などによって適宜選択することができる。ｍＲＮＡワクチンの有効投与量は、疾患の兆候又は状態を軽減するワクチンの量である。このようなｍＲＮＡワクチンの治療効果及び毒性は、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）、及びＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的である用量）によって決定することができる。いくつかの態様では、ｍＲＮＡワクチンの投与量は、成人に対して、１日当たり１０ｎｇ～１ｇ、１００ｎｇ～１００ｍｇ、１μｇ～１０μｇ、又は３０μｇ～３００μｇのｍＲＮＡの範囲とする。
ｍＲＮＡワクチンの投与経路は適切に選択することができ、例えば、経皮、鼻腔内、経気管支、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、直腸内、及び膣内の経路を含むが、これらの経路に限定されるものではない。
ｍＲＮＡワクチンの投与回数は、１回、又は副作用が臨床上許容される範囲内である限り複数回とすることができる。
いくつかの態様では、ｍＲＮＡワクチン投与における抗体価又は細胞性免疫活性を測定する。例えば、抗体価は、生体より血液を採取し、血清中のＩｇＧを定量することにより評価できる。細胞性免疫活性は、生体よりリンパ球を分離及び培養し、３Ｈ－チミジンの取り込みを測定することにより評価できる。
３．４．キット
本発明の第３の態様のキットは、前記ｍＲＮＡワクチンを含むことを特徴とするものである。当該キットは、例えば、前記ＲＮＡワクチンを用いた前記各種疾患の治療方法に好ましく用いることができる。
キットにおいて、前記ｍＲＮＡワクチンの保存状態は、限定はされず、その安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮して溶液状又は粉末状等の状態を選択できる。
キットは、前記ｍＲＮＡワクチン以外に、他の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては、例えば、各種バッファー及び使用説明書（使用マニュアル）を挙げることができる。キットには、アジュバントを含めてもよいし、含めなくてもよい。好ましくは、キットは、アジュバントを含めない。
以下の実施例により本発明を更に詳述するが、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきものではない。
実施例１－１：各種ブロック共重合体の合成
１．１．ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌの合成
ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌは既報に従い合成した（Ｏｂａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１１）３２，ｐ．６５２-６６３）(Ｓｃｈｅｍｅ１)。合成スキームは以下のとおりである。
Ｓｃｈｅｍｅ１
Figure 0007264378000001
まず、α－メトキシ－ω－アミノ－ポリエチレングリコール（ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２，ＰＥＧのＭｗ：１２ｋＤａ）を開始剤としたβ－ベンジル－Ｌ－アスパルテート－Ｎ－カルボン酸無水物（ＮＣＡ－ＢＬＡ）の開環重合によって、ＰＥＧ－ｐｏｌｙ（β－ｂｅｎｚｙｌ Ｌ－ａｓｐａｒｔａｔｅ）（ＰＥＧ－ＰＢＬＡ）を合成した。ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２を５０５ｍｇとり、ベンゼンに溶解させて一晩凍結乾燥させた。凍結乾燥後、Ａｒ雰囲気下においてジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：ジクロロメタン（ＤＣＭ）＝１：１０混合溶媒にＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２及びＮＣＡ－ＢＬＡを完全に溶解させた。ＮＣＡ－ＢＬＡ溶液をＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２溶液に添加し、２５℃で３日間撹拌した。反応溶液をｎ－ヘキサン／酢酸エチル（３：２）混合溶液に再沈殿させ、ＰＥＧ－ＰＢＬＡを回収した。その後、ＰＥＧ－ＰＢＬＡを真空乾燥させ、白色粉末を得た。ＰＢＬＡの重合度は６８（ｎ＝６８）であった。尚、上記式中、ｍ＝２９３であった。
次に、合成したＰＥＧ－ＰＢＬＡのω末端にコレステロール基を導入した。ＤＣＭ（４ｍＬ）に溶解させたＰＥＧ－ＰＢＬＡ（２００ｍｇ）に、１１ｖ／ｖ％ トリエチルアミン（ＴＥＡ）／ＤＣＭ混合溶液（２００μＬ）に溶解させたＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ（３２８ｍｇ）をゆっくり添加し、室温で２４時間撹拌した。反応溶液をジエチルエーテルに再沈殿させ、ＰＥＧ－ＰＢＬＡ－Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（Ｃｈｏｌ）を回収した。
回収したＰＥＧ－ＰＢＬＡ－Ｃｈｏｌのアミノリシス反応によりＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌを合成した。ＰＥＧ－ＰＢＬＡ－Ｃｈｏｌ（１００ｍｇ）をベンゼンに溶解させて凍結乾燥し、乾燥したＰＥＧ－ＰＢＬＡ－Ｃｈｏｌ及びＤｒｙジエチレントリアミン（ＤＥＴ）（ＰＢＬＡに対して５０当量）を０．５ＭチオウレアとしたＮ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）に溶解させた。これら溶液を１０℃に冷却し、ＰＥＧ－ＰＢＬＡ－Ｃｈｏｌ溶液をゆっくりＤＥＴ溶液に滴下し、１時間撹拌した。反応後、溶液温度を１０度以下に保ったまま反応溶液を５Ｎ ＨＣｌ水溶液で中和し、０．０１Ｎ ＨＣｌ水溶液で４℃にて１日透析を行った。その後、イオン交換水で４℃にてもう１日透析を行った。透析後、溶液を凍結乾燥することでＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌ白色粉末を得た。
１．２．ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の合成
また、同様のＰＥＧ－ＰＢＬＡのアミノリシス反応によりＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を合成した（Ｓｃｈｅｍｅ２）。
Ｓｃｈｅｍｅ２
Figure 0007264378000002
ＰＥＧ－ＰＢＬＡ（２００ｍｇ）をベンゼンに溶解させて凍結乾燥し、乾燥したＰＥＧ－ＰＢＬＡ及びＤｒｙジエチレントリアミン（ＤＥＴ）（ＰＢＬＡに対して５０当量）を０．５ＭチオウレアとしたＮＭＰに溶解させた。これら溶液を１０℃に冷却し、ＰＥＧ－ＰＢＬＡ溶液をゆっくりＤＥＴ溶液に滴下し、１時間撹拌した。反応後、溶液温度を１０度以下に保ったまま反応溶液を５Ｎ ＨＣｌ水溶液で中和し、０．０１Ｎ ＨＣｌ水溶液で４℃にて１日透析を行った。その後、イオン交換水で４℃にてもう１日透析を行った。透析後、溶液を凍結乾燥することでＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）白色粉末を得た。尚、上記式中、ｎ＝６８であり、ｍ＝２９３であった。
実施例１－２：ｍＲＮＡの調製
ｍＲＮＡは鋳型ＤＮＡよりｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により調製するが、ここで鋳型ＤＮＡは以下のように作製した。まず、Ｔ７－Ｇｌｕｃ ｐｌａｓｍｉｄは、ｐＣＭＶ－Ｇｌｕｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｌａｓｍｉｄ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）からＧｌｕｃコード配列（図１５および配列番号３２）をｐＳＰ７３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＨｉｎｄＩＩＩ，Ｘｂａ１サイトに挿入することで作製した。その後、Ｔ７－Ｇｌｕｃ ｐｏｌｙ Ａ１２０ ｐｌａｓｍｉｄを、Ｔ７－Ｇｌｕｃ ｐｌａｓｍｉｄのＥｃｏＲ１－Ｂｇｌ２サイトにＡ１２０－（ＢｓｍＢＩ切断部位）を挿入することで作製した。その後、ＢｓｍＢＩで切断したのち、Ｔ４ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）で末端の平滑化を用い、以下のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に用いた。
ｍＲＮＡは、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（商品名） Ｔ７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）をコードした上述の制限酵素処理を行い、平滑化したテンプレートＤＮＡ（Ｔ７－Ｇｌｕｃ ｐｏｌｙ Ａ１２０ ｐｌａｓｍｉｄ）をｉｎ ｖｉｔｒｏ環境下で転写することで作製した。転写されたｍＲＮＡはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製、回収した。回収したｍＲＮＡ濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により測定した。また、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた電気泳動法により目的のｍＲＮＡが作成されていることを確認した。
ＮａｎｏＤｒｏｐにより、５００～１，０００ｎｇ／μＬという高い濃度で、２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度比が２．０～２．２という高純度のｍＲＮＡの作製が確認された。また、バイオアナライザの解析で、意図した大きさのｍＲＮＡの作製が確認された。
作製したｍＲＮＡの配列を、図１４および配列番号１に示す。図１４の配列において、下線部分がｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）であり、ＯＲＦの上流が５’ＵＴＲ（５４塩基）であり、ＯＲＦの下流に３’ＵＴＲ（５２塩基）があり、さらにその下流の１２０Ａがｐｏｌｙ Ａ配列である。
ここで、Ｐｏｌｙ Ａの数について、理論上は鋳型ＤＮＡに１２０ｂｐに組み込まれ、ｍＲＮＡでは１１９塩基である。しかし、ＤＮＡ増幅や、ｍＲＮＡ調製の段階でその数は増減しうる。
実施例１－３：ＲＮＡオリゴマーのハイブリダイゼーション
ＲＮＡオリゴマーを次のようにして設計し、調製した。ＲＮＡ２次構造予測ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｔｉｐｓ．ｄｎａ．ｂｉｏ．ｋｅｉｏ．ａｃ．ｊｐ／ｉｐｋｎｏｔ／）にて、Ｇｌｕｃ ｍＲＮＡの２次構造を予測し、ＲＮＡ鎖が２次構造を持たない部分に対してＲＮＡオリゴマーを設計した。ＲＮＡオリゴマーは、５’末端又は３’末端のコレステロール修飾を含めて、北海道システムサイエンス社にて、依頼合成した。尚、下記ＲＮＡオリゴマーの配列中の下線部はオーバーハング配列を示す。また、ミスマッチＣｈｏｌ－ＲＮＡオリゴは、ｍＲＮＡとハイブリダイズしない１９ｍｅｒのＣｈｏｌ修飾ポリＡである。「Ｃｈｏｌ－ｏｖｅｒｈａｎｇ」は、ＲＮＡオリゴマーの５’末端がコレステロール修飾されていることを示し、「Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ３’」はＲＮＡオリゴマーの３’末端がコレステロール修飾されていることを示す。
ＲＮＡオリゴマー
１７ｍｅｒ（１）（配列番号２）：ＵＣＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＣＣＡＧ
１７ｍｅｒ（２）（配列番号３）：ＣＵＣＵＡＧＡＵＧＣＡＵＧＣＵＣＧ
１７ｍｅｒ（３）（配列番号４）：ＣＵＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＵＧＣ
１７ｍｅｒ（４）（配列番号５）：ＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＣＵＵＣＵＵＧ
１７ｍｅｒ（５）（配列番号６）：ＡＵＣＵＣＡＧＧＡＡＵＧＵＣＧＡＣ
２３ｍｅｒ（配列番号７）：ＵＣＣＡＵＣＵＣＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＣＣＡＧ
４０ｍｅｒ（配列番号８）：ＣＵＵＵＣＣＧＧＧＣＡＵＵＧＧＣＵＵＣＣＡＵＣＵＣＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＣＣＡＧ
６０ｍｅｒ（配列番号９）：ＡＣＡＧＣＣＣＣＵＧＧＵＧＣＡＧＣＣＡＧＣＵＵＵＣＣＧＧＧＣＡＵＵＧＧＣＵＵＣＣＡＵＣＵＣＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＣＣＡＧ
ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）（配列番号１０）：ＡＡＵＣＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＣＣＡＧ
Ｃｈｏｌ－ｏｖｅｒｈａｎｇ ０（１）（１７ｍｅｒ（１）；配列番号２）：ＵＣＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＣＣＡＧ
Ｃｈｏｌ－ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）（配列番号１０）：ＡＡＵＣＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＣＣＡＧ
Ｃｈｏｌ－ｏｖｅｒｈａｎｇ ５ｂａｓｅ（１）（配列番号１１）：ＡＡＵＡＡＵＣＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＣＣＡＧ
Ｃｈｏｌ－ｏｖｅｒｈａｎｇ ０（２）（１７ｍｅｒ（２）；配列番号３）：ＣＵＣＵＡＧＡＵＧＣＡＵＧＣＵＣＧ
Ｃｈｏｌ－ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（２）（配列番号１２）：ＡＡＣＵＣＵＡＧＡＵＧＣＡＵＧＣＵＣＧ
Ｃｈｏｌ－ｏｖｅｒｈａｎｇ ５ｂａｓｅ（２）（配列番号１３）：ＡＡＵＡＡＣＵＣＵＡＧＡＵＧＣＡＵＧＣＵＣＧ
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（３）（配列番号１４）：ＡＡＣＵＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＵＧＣ
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（４）（配列番号１５）：ＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＣＵＵＣＵＵＧ
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（５）（配列番号１６）：ＡＵＡＵＣＵＣＡＧＧＡＡＵＧＵＣＧＡＣ
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（６）（配列番号１７）：ＡＡＧＣＡＧＣＣＡＧＣＵＵＵＣＣＣＧＧ
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（７）（配列番号１８）：ＡＡＡＣＵＣＵＵＵＧＵＣＧＣＣＵＵＣＧ
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（８）（配列番号１９）：ＡＡＵＵＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＧＵＵＧＵ
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（９）（配列番号２０）：ＵＡＧＵＧＧＧＡＣＡＧＧＣＡＧＡＵＣＡ
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１０）（配列番号２１）：ＡＡＵＵＧＡＡＧＵＣＵＵＣＧＵＵＧＵＵ
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１１）（配列番号２２）：ＡＡＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ３’ ２ｂａｓｅ（１）（配列番号２３）：ＵＣＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＣＣＡＧＡＵ
ミスマッチＣｈｏｌ－ＲＮＡオリゴ（配列番号２４）：ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ｍＲＮＡに対して１当量のＲＮＡオリゴマー（ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１））を、６５℃で５分加熱し、１０分かけて３０℃まで冷却することで、ハイブリダイゼーションを行った。調製したＲＮＡオリゴマー修飾ｍＲＮＡの評価はポリアクリルアミドゲル電気泳動により行った。ｍＲＮＡ溶液（１×ＴＢＥ ｂｕｆｆｅｒ）に最終濃度が５ｗｔ％となるようにグリセロール溶液を添加し、１００Ｖ，８００ｍＡ，２００Ｗ，３０ｍｉｎの条件で電気泳動を行った。
その結果を図１に示す。図１（２）及び（３）ではそれぞれＣｈｏｌ修飾していないＲＮＡオリゴマー（ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１））、ハイブリダイズしていないｍＲＮＡの電気泳動を行った。図１（１）では、図１（２）でハイブリダイズした量の１／１６量のＲＮＡオリゴマー（ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１））だけを電気泳動した。図１（２）でハイブリダイズが起きていなければ、図１（１）と同じ位置にＲＮＡオリゴマー由来のバンドが見られるはずであるが、実際ほとんど見られなかった。すなわち大多数のＲＮＡオリゴマーがハイブリダイズしていることが確認された。
このように、本実施例では、ＲＮＡオリゴマーがハイブリダイズしていることが確認できた。
実施例１－４：培養細胞およびＣｅｌｌ－ｆｒｅｅ系におけるｍＲＮＡ発現能評価
培養細胞を用いた評価では、ＲＡＷ２６４．７細胞を１２ｗｅｌｌプレートに３００，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、１０ｖ／ｖ％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）中で２４ｈインキュベーションした。インキュベーション後、ＤＭＥＭをＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商品名）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に置き換え、実施例１－２で調製したＧｌｕｃ ｍＲＮＡ又は実施例１－３で調製したＲＮＡオリゴマー（１７ｍｅｒ（１），２３ｍｅｒ，４０ｍｅｒ又は６０ｍｅｒ）をハイブリダイズしたＧｌｕｃ ｍＲＮＡが１μｇ／ｗｅｌｌとなるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商品名） ＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とｍＲＮＡからなるコンプレックスを添加した。トランスフェクションから４ｈ後、培地を回収し、そこに含まれるＧｌｕｃの量をルミノメータにて評価した。
Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ系での評価では、Ｒａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、実施例１－２で調製したｍＲＮＡ又は実施例１－３で調製したＲＮＡオリゴマー（１７ｍｅｒ（１），２３ｍｅｒ，４０ｍｅｒ又は６０ｍｅｒ）をハイブリダイズしたＧｌｕｃ ｍＲＮＡの発現能を評価した。プロトコルに従い、ｍＲＮＡを含む混合溶液を調製した後、３０℃で９０ｍｉｎインキュベートした。発現したＧｌｕｃはルミノメータを用いて発光強度を測定することで評価した。
その結果を図２に示す。図２（Ａ）に示すように、培養細胞へのｍＲＮＡ導入効率を検討したところ、２３ｍｅｒ以上の鎖長のオリゴマーをハイブリダイズした場合（２３ｍｅｒ，４０ｍｅｒ，６０ｍｅｒ）、ハイブリダイズしていないｍＲＮＡを用いた場合（オリゴ（－））と比べて有意にＧｌｕｃ発現量が低下していた。一方で、１７ｍｅｒのオリゴマーを修飾した場合の発現量はハイブリダイズしていないｍＲＮＡを用いた場合とほぼ同等であった。一方で、図２（Ｂ）に示すように、無細胞系でのタンパク質翻訳効率は、ＲＮＡオリゴマーの鎖長によらず一定で、ハイブリダイズしていないｍＲＮＡとほぼ同程度であった。すなわち、無細胞系ではハイブリダイズによる翻訳効率の低下は見られなかった。以上の実験より、細胞内の何らかの機構により長鎖長をハイブリダイズした場合に発現がやや低下することが分かった。これらのことから、ＲＮＡオリゴマーの鎖長は１２～４０ｍｅｒとするのが望ましいことが明らかとなった。
ここで図２中、「＊＊」及び「＊＊＊」はオリゴ修飾していない場合と比べた場合、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１という統計学的有意差があることを示す。統計処理はＡＮＯＶＡ検定ののち、オリゴ修飾していない場合をコントロールとしたＤｕｎｎｅｔｔ検定を行った。
このように、本実施例では、培養細胞へのｍＲＮＡの導入効率を確認した結果、長鎖長ＲＮＡオリゴマーは発現がやや低下するものの、１７ｍｅｒのＲＮＡオリゴマーでは発現がほぼ維持できることが確認できた（図２（Ａ））。一方、無細胞系でのタンパク質翻訳効率は、ＲＮＡオリゴマーの鎖長によらず一定であることが確認できた（図２（Ｂ））。
実施例１－５：ｍＲＮＡ内包ＰＭｓの調製
ここでは実施例１－２で調製したＧｌｕｃ ｍＲＮＡ又は実施例１－３で調製したＲＮＡオリゴマー（ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）又はＣｈｏｌ－ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１））をハイブリダイズしたＧｌｕｃ ｍＲＮＡを用いた。
ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－ＣｈｏｌとＧｌｕｃ ｍＲＮＡはそれぞれ独立して１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）に溶解させた。ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌの濃度は、ｐＨ７．４において（（ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の正電荷数）／（ｍＲＮＡの負電荷数））（Ｎ＋／Ｐ―比）が１．５となるように調整した。ｍＲＮＡ最終濃度が３３．３μｇ／ｍＬとなるようにＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌ溶液をｍＲＮＡ溶液に添加し、高分子ミセル（ＰＭｓ）を調製した。ＰＭｓの粒径及び多分散度はＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって評価した。また、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて調製したＰＭｓを観察した。ＰＥＧ-ＰＡｓｐ(ＤＥＴ)からなるＰＭｓに関しても同様の方法で調製した。
その結果を、表１及び２、図３に示す。
Figure 0007264378000003
Figure 0007264378000004
実施例１－６：血清中での酵素耐性試験
ここでは実施例１－２で調製したＧｌｕｃ ｍＲＮＡ又は実施例１－３で調製した以下のＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたＧｌｕｃ ｍＲＮＡを用いた。
図４（Ａ）及び（Ｂ）の実験で用いたＲＮＡオリゴマー
Ｃｈｏｌ－ｏｖｅｒｈａｎｇ ０（１）
Ｃｈｏｌ－ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）
Ｃｈｏｌ－ｏｖｅｒｈａｎｇ ５ｂａｓｅ（１）
ミスマッチＣｈｏｌ－ＲＮＡオリゴ
図４（Ｃ）及び（Ｄ）の実験で用いたＲＮＡオリゴマー
Ｃｈｏｌ－ｏｖｅｒｈａｎｇ ０（２）
Ｃｈｏｌ－ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（２）
Ｃｈｏｌ－ｏｖｅｒｈａｎｇ ５ｂａｓｅ（２）
ミスマッチＣｈｏｌ－ＲＮＡオリゴ
図４（Ｅ）で用いたＲＮＡオリゴマー
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１１）
各ＰＭｓは実地例５と同様の条件で調製した。尚、図４（Ａ）（Ｃ）（Ｅ）の実験ではＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌを用い、図４（Ｂ）及び（Ｄ）の実験ではＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いた。
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で所定の濃度となるよう希釈し、そこにＰＭ溶液を添加したのち、３７℃で１５分静置した。その後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて溶液よりＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡをコンプリメンタリーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写した後、ｑＲＴ－ＰＣＲにより残存しているｃＤＮＡを定量評価した。ＦＢＳ存在下で３７℃静置を行わなかった場合のｍＲＮＡ量を１００％として、相対値を示した。
その結果を、図４に示す。図４（Ａ）に示すように、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌを用いた場合、２ｂａｓｅのオーバーハングを持つオリゴマーをハイブリダイズした群で、ハイブリダイズを行わなかった群と比べ、有意な血清中での安定性の向上を認めた。なお、オーバーハングがない場合は安定性が向上する傾向が見られたものの有意差うは得られなかった。５ｂａｓｅの場合では安定化効果は認めなかった。一方で、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いた場合、オーバーハングがない場合、および２ｂａｓｅのオーバーハングがある場合に、安定性の向上を認めた（図４（Ｂ））。以上のデータは、ハイブリダイズする場所が異なる別のオリゴを用いた場合も再現された（図４（Ｃ）：ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌ，図４（Ｄ）：ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））。なお、ミスマッチＣｈｏｌ－ＲＮＡオリゴは、ｍＲＮＡとハイブリダイズしない１９ｍｅｒのＣｈｏｌ修飾ポリＡをｍＲＮＡと混ぜて、ＰＭを形成したものであるが、この場合血清中での酵素耐性は向上しておらず、効果を得るにはハイブリダイズする必要があることが示された。
また、ポリＡ配列に対して２ｂａｓｅのオーバーハングを持つＣｈｏｌ修飾オリゴをハイブリダイズさせたｍＲＮＡとＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－ＣｈｏｌからなるＰＭに関しても、ハイブリダイズによる安定化作用を認めた（図４（Ｅ））。
このように、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌを用いた場合、２ｂａｓｅのオーバーハングがあり、かつコレステロール修飾したオリゴマーで特に高い安定性を示すことが分かった（図４（Ａ）及び（Ｃ））。一方で、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いた場合、オーバーハングがない場合および２ｂａｓｅのオーバーハングがある場合の両方で安定性の向上を認めた（図４（Ｂ）及び（Ｄ））。また、ハイブリダイズの位置に関して、タンパク質コード配列だけではなく、ポリＡ部分にハイブリダイズした場合も安定性が向上することが明らかとなった（図４（Ｅ））。
実施例１－７：アガロースゲル電気泳動
ここでは実施例１－２で調製したＧｌｕｃ ｍＲＮＡ又は実施例１－３で調製したＲＮＡオリゴマー（Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１））をハイブリダイズしたＧｌｕｃ ｍＲＮＡを用いた。
各ＰＭｓは実地例５と同様の条件で調製した。
Ｔｒｉｓ ４０ｍＭ，酢酸２０ｍＭ，エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）・２Ｎａ １ｍＭとなるように１×ＴＡＥバッファー（トリス－酢酸－ＥＤＴＡバッファー）を調製し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．４に調整したものを電気泳動用バッファーとした。０．９重量％アガロースゲルを作成し、ＰＭ溶液１５μＬにＡ／Ｐ比（ポリアニオンの負電荷数／ｍＲＮＡのリン酸基数）に応じたデキストラン硫酸５μＬと７５０ｍＭ ＮａＣｌ溶液５μＬを加えた後、３７℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、ローディングバッファーを２．５μＬ加えて１００Ｖで６０分間電気泳動を行い、ｍＲＮＡの放出の有無を確認した。
その結果を、図５に示す。
図５（Ａ）～（Ｄ）ではいずれも最も左の列にｎａｋｅｄ ｍＲＮＡを置いたが、ミセルからｍＲＮＡが放出されると、ｎａｋｅｄ ｍＲＮＡと同じ位置にバンドが見られる。Ｃｈｏｌ修飾オリゴマーをハイブリダイズしていない場合、すなわち、図５（Ａ）のＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌを用いた場合と、図５（Ｃ）のＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いた場合には、Ａ／Ｐ比１．５から２でミセルからの多量のｍＲＮＡの放出が観られた。一方でＣｈｏｌ修飾オリゴマーをハイブリダイズした場合、いずれのポリマーを用いた場合も、Ａ／Ｐ比２でもあまりｍＲＮＡの放出は観られなかった（図５（Ｂ）及び（Ｄ））。
このように、ＣｈｏｌオリゴによりｍＲＮＡの放出が抑制されることが分かった（図５（Ｂ）及び（Ｄ））。
実施例１－８：ハイブリダイズするオリゴの数を増やした際の血清中での酵素耐性試験
ここでは、ここでは実施例１－２で調製したＧｌｕｃ ｍＲＮＡ又は実施例１－３で調製した以下のＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたＧｌｕｃ ｍＲＮＡを用いた。
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（２）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（３）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（４）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（５）
各ＰＭｓは実施例１－５と同様の条件でＰＥＧ-ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）-Ｃｈｏｌを用いて調製した。
１箇所又は５箇所にＣｈｏｌ修飾オリゴマーをハイブリダイズしたｍＲＮＡを用い、実施例１－６と同様の方法で実験をおこなった。尚、Ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏでは、ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）を用いた。Ｃｈｏｌ修飾オリゴマー１個の実験（Ｃｈｏｌ ｏｌｉｇｏ Ｘ１）では、Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）を用いた。また、Ｃｈｏｌ修飾オリゴマー５個の実験（Ｃｈｏｌ ｏｌｉｇｏ Ｘ５）では、Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）～（５）を用いた。
その結果を図６示す。ハイブリダイズしていないものと比べて、１箇所に修飾した場合（Ｃｈｏｌ ｏｌｉｇｏ Ｘ１）安定性が向上し、また、５箇所に修飾した場合（Ｃｈｏｌ ｏｌｉｇｏ Ｘ５）１箇所に修飾した場合（Ｃｈｏｌ ｏｌｉｇｏ Ｘ１）と比べて、更に高い安定性を示した。
実施例１－９：ＰＭｓのルシフェラーゼ発現試験
ここでは実施例１－２で調製したＧｌｕｃ ｍＲＮＡ又は実施例１－３で調製した以下のＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたＧｌｕｃ ｍＲＮＡを用いた。
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（２）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（３）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（４）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（５）
１７ｍｅｒ（１）
各ＰＭｓは実地例５と同様の条件でＰＥＧ-ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）-Ｃｈｏｌを用いて調製した。
Ｈｕｈ－７細胞（５，０００ｃｅｌｌｓ－ｗｅｌｌ）を９６－ｗｅｌｌプレートに播種し、１０ｖ／ｖ％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（１００μＬ）中で２４時間インキュベーションした。培地を１０ｖ／ｖ％ＦＢＳを含む新しいものに取り替えた後、２５０ｎｇのｍＲＮＡを含むＰＭｓ溶液を７．５μＬ加えた。２４時間のインキュベーション後、ＤＭＥＭの上澄みを１０μＬ回収し、ルミノメータを用いてＧｌｕｃの発光強度を測定した。
１箇所又は５箇所にＣｈｏｌ修飾オリゴマーをハイブリダイズしたｍＲＮＡを用いた。尚、Ｃｈｏｌ修飾オリゴマー１個の実験（Ｃｈｏｌ ｏｌｉｇｏ Ｘ１）では、Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）を用いた。また、Ｃｈｏｌ修飾オリゴマー５個の実験（Ｃｈｏｌ ｏｌｉｇｏ Ｘ５）では、Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）～（５）を用いた。さらに、非修飾オリゴマーの実験（Ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏ）では、ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）１７ｍｅｒ（１）を用いた。
その結果を、図７に示す。Ｃｈｏｌオリゴマーで１個もしくは５個修飾したｍＲＮＡを導入した群（Ｃｈｏｌ ｏｌｉｇｏ Ｘ１もしくはＣｈｏｌ ｏｌｉｇｏ Ｘ５）で、オリゴマーをハイブリダイズしていないｍＲＮＡを導入した群（ハイブリ（－））もしくはＣｈｏｌ修飾のないオリゴマーで修飾したｍＲＮＡを導入した群（Ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏ）と比べて、高いｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現効率を示した。
このように、Ｃｈｏｌオリゴ修飾により、発現が上昇することがわかった。また、オリゴの個数で差は見られなかった。
実施例１－１０：Ｃｈｏｌを５’側に修飾した場合と３’側に修飾した場合の比較
ここでは実施例１－２で調製したＧｌｕｃ ｍＲＮＡ、実施例１－３で調製した以下のＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたＧｌｕｃ ｍＲＮＡ、またはそれと同じ場所に設計し３’側に２ｂａｓｅのｏｖｅｒｈａｎｇ配列をもつ以下の配列のオリゴマーをハイブリダイズしたＧｌｕｃ ｍＲＮＡを用いた。
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ３’ ２ｂａｓｅ（１）
各ＰＭｓは実地例５と同様の条件で、ＰＥＧ-ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）-Ｃｈｏｌを用いて調製した。実施例１－８と同様の方法で血清耐性試験を行い、実施例１－９と同様の方法でＰＭをＨｕＨ-７細胞に導入し、Ｇｌｕｃ発現量を評価した。
血清耐性試験の結果を図８（Ａ）に、Ｇｌｕｃ発現量の結果を図８（Ｂ）に示す。いずれの評価においても、Ｃｈｏｌの修飾位置が３’の場合と５’の場合で大きな違いは観察されなかった。
実施例１－１１：無細胞系でのＣｈｏｌ修飾ｍＲＮＡからの翻訳効率の評価
ここでは実施例１－２で調製したＧｌｕｃ ｍＲＮＡ又は実施例１－３で調製した以下のＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたＧｌｕｃ ｍＲＮＡを用いた。
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（２）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（３）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（４）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（５）
この評価では、ｍＲＮＡはＰＭに内包せず、単体で用いた。
Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ系での評価では、Ｒａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、Ｃｈｏｌ―ＲＮＡオリゴマーを修飾したｍＲＮＡの発現能を評価した。プロトコルに従い、ｍＲＮＡを含む混合溶液を調製した後、３０℃で９０ｍｉｎインキュベートした。発現したＧｌｕｃはルミノメータを用いて発光強度を測定することで評価した。
その結果を図９に示す。Ｃｈｏｌ―ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたｍＲＮＡの無細胞系でのタンパク質翻訳効率は、Ｃｈｏｌ―ＲＮＡオリゴマー数の増加に伴い減少していくことが確認された。すなわち、複数のＣｈｏｌ基はｍＲＮＡの翻訳効率を低下させることが明らかとなった。
ここで、Ｃｈｏｌ―ＲＮＡオリゴマー数が１個の実験ではＣｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）を用いた。Ｃｈｏｌ―ＲＮＡオリゴマー数が２個の実験ではＣｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）と（３）を用いた。Ｃｈｏｌ―ＲＮＡオリゴマー数が３個の実験ではＣｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）～（３）を用いた。Ｃｈｏｌ―ＲＮＡオリゴマー数が４個の実験ではＣｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）～（４）を用いた。Ｃｈｏｌ―ＲＮＡオリゴマー数が５個の実験ではＣｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）～（５）を用いた。
実施例１－１２：内因性遺伝子発現への影響
ここでは実施例１－３と同様に設計し、調製した以下のＲＮＡオリゴ、又は後述のように調製した以下のｓｉＲＮＡを用いた。「Ｃｈｏｌ―」は、ＲＮＡオリゴマーの５’末端がコレステロール修飾されていることを示す。
ここで、ＲＮＡオリゴマーの設計に用いたＬｕｃ ｍＲＮＡの配列を図１６及び配列番号３３に示す。
ｌｕｃ ｏｌｉｇｏ（配列番号２５）：ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡ
Ｃｈｏｌ―ｏｌｉｇｏ ｌｕｃ（配列番号２６）：ＡＡＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡ
ｏｌｉｇｏ Ｓｃｒ（配列番号２７）：ＵＣＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＣＣＡＧ
Ｃｈｏｌ―ｏｌｉｇｏ Ｓｃｒ（配列番号２７）：ＵＣＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＣＣＡＧ
ｓｉＬｕｃ（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）（配列番号２８）：ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ
ｓｉＬｕｃ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）（配列番号２９）：ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ
ｓｉＳｃｒａｍｂｌｅ(ｓｉＳｃｒ)（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）(配列番号３０)：ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵｄＴｄＴ
ｓｉＳｃｒ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）(配列番号３１)：ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡｄＴｄＴ
ここで、ｓｉＲＮＡは北海道システムサイエンス社に依頼合成し、そのまま使用した。
Ｌｕｃを恒常発現しているＨｅｌａ－ｌｕｃ細胞（Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ 社）（５，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６－ｗｅｌｌプレートに播種し、１０ｖ／ｖ％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（１００μＬ）中で２４時間インキュベーションした。その後、培地を無血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商品名）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））（１００μＬ）に取り換え、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＲＮＡオリゴ又はｓｉＲＮＡからなるコンプレックスを細胞に添加した。４時間インキュベーションした後、添加した各コンプレックスを除去した。トランスフェクションから２４時間後、Ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞を溶解し、ルミノメータを用いて１０μＬ細胞溶解液中のルシフェラーゼ発現量を評価した。
その結果を図１０に示す。ここで、ｓｉＬｕｃ、Ｌｕｃ Ｏｌｉｇｏ及びＣｈｏｌ Ｏｌｉｇｏ ＬｕｃはそれぞれＬｕｃ配列をターゲットとしたｓｉＲＮＡ、未修飾ＲＮＡ Ｏｌｉｇｏ及びＣｈｏｌ修飾ＲＮＡ Ｏｌｉｇｏを示し、ｓｉＳｃｒ、Ｏｌｉｇｏ Ｓｃｒ、Ｃｈｏｌ Ｏｌｉｇｏ ＳｃｒはＧｌｕｃ配列と相同性のない配列のｓｉＲＮＡ、未修飾ＲＮＡ Ｏｌｉｇｏ及びＣｈｏｌ修飾ＲＮＡ Ｏｌｉｇｏを示している。図２及び７に示すような培養細胞へのｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ実験では、８ｎＭの濃度のｏｌｉｇｏを用いているが、その濃度では内因性遺伝子発現は減少しなかった。ｓｉＲＮＡと比較して１，０００倍という高濃度でないと、内因性遺伝子発現の減少は観られなかったことから、内因性遺伝子に対する影響は非常に軽微なものと想定される。図１０に示すように、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と同配列のＲＮＡオリゴマー及び他配列ＲＮＡオリゴマー群はｓｉＲＮＡと比較して、内因性遺伝子をノックダウンしないことが確認された。以上の結果から、ＲＮＡオリゴマーは内因性遺伝子を阻害することなくｍＲＮＡを機能化することが確認された。
実施例１－１３：ＰＥＧ－Ｐｌｙｓによる検討
ＰＥＧ－ＰＬｙｓは既報に従い合成した（Ｋ．Ｏｓａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３３，３２５－３３２，（２０１２））（Ｓｃｈｅｍｅ３）。合成スキームは以下のとおりである。
Ｓｃｈｅｍｅ３
Figure 0007264378000005
ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２を４００ｍｇとり、ベンゼンに溶解させて一晩凍結乾燥させた。凍結乾燥後、Ａｒ雰囲気下において０．５Ｍジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶媒にＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２及びＮＣＡ－Ｌｙｓ（ＴＦＡ）を完全に溶解させた。ＮＣＡ－Ｌｙｓ（ＴＦＡ）溶液をＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２溶液に添加し、２５℃で３日間撹拌した。反応溶液をｎ－ヘキサン／酢酸エチル（３：２）混合溶液に再沈殿させ、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＴＦＡ）を回収した。その後、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＴＦＡ）を真空乾燥させ、白色粉末を得た。その後、０．１Ｎ ＮａＯＨを含むメタノール混合溶媒中において３５℃で６時間反応させ、ＴＦＡ基を脱保護した。透析による精製後、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ白色粉末を得た。１Ｈ－ＮＭＲ分析より、回収したＰＥＧ－ＰＬｙｓのＰＬｙｓ重合度は６９であった。
ここでは、ここでは実施例１－２で調製したＧｌｕｃ ｍＲＮＡ又は実施例１－３で調製した以下のＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたＧｌｕｃ ｍＲＮＡを用いた。
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（２）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（３）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（４）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（５）
ＰＭの作製では、ＰＥＧ－ＰＬｙｓとｍＲＮＡはそれぞれ独立して１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）に溶解させた。ＰＥＧ－ＰＬｙｓの濃度は、ｐＨ７．４において（（ＰＬｙｓの正電荷数）／（ｍＲＮＡの負電荷数））（Ｎ＋／Ｐ-比）が２となるように調整した。ｍＲＮＡ最終濃度が３３．３μｇ／ｍＬとなるように、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ溶液をｍＲＮＡ溶液に添加し、ＰＭｓを調製した。
合成したＰＥＧ－ＰＬｙｓを用いて、実施例１－７におけるＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌと同様にゲル電気泳動を行った。また、実施例１－９におけるＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌと同様にルシフェラーゼ発現試験を行った。
ゲル電気泳動の実験では、１箇所にＣｈｏｌ修飾オリゴマーをハイブリダイズしたｍＲＮＡを用い、ルシフェラーゼ発現実験では１箇所又は５箇所にＣｈｏｌ修飾オリゴマーをハイブリダイズしたｍＲＮＡを用いた。この際、Ｃｈｏｌ修飾オリゴマー１個の実験（Ｃｈｏｌ ｏｌｉｇｏ Ｘ１）では、Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）を用いた。また、Ｃｈｏｌ修飾オリゴマー５個の実験（Ｃｈｏｌ ｏｌｉｇｏ Ｘ５）では、Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）～（５）を用いた。
その結果を図１１に示す。ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）やＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－ＣｈｏｌからなるＰＭｓと同様（図５）にＰＥＧ－ＰＬｙｓからなるＰＭｓにおいても、Ｃｈｏｌ－ＲＮＡオリゴマー（Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）
）を用いることで、ポリアニオンを加えた際のｍＲＮＡの放出が抑制されたほか（図１１（Ｂ））、細胞に導入した際のｍＲＮＡからのタンパク質発現効率が向上した（図１１（Ｃ））。一方、Ｃｈｏｌ－ＲＮＡオリゴマーを用いない場合には、Ａ／Ｐ比１．５から２でミセルからの多量のｍＲＮＡの放出が観られた（図１１（Ａ））。従って、様々な組成のポリカチオンにおいて、Ｃｈｏｌ修飾オリゴのハイブリダイズがその安定化に有効であることが明らかとなった。
実施例１－１４：マウスを用いた血中安定性試験
ここでは実施例１－２で調製したＧｌｕｃ ｍＲＮＡ又は実施例１－３で調製した以下のＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたＧｌｕｃ ｍＲＮＡを用いた。
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（２）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（３）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（４）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（５）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（６）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（７）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（８）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（９）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１０）
ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－ＣｈｏｌとｍＲＮＡはそれぞれ独立して１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）に溶解させた。ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌの濃度は、ｐＨ７．４において（（ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の正電荷数）／（ｍＲＮＡの負電荷数））（Ｎ＋／Ｐ―比）が１．５となるように調整した。ｍＲＮＡ最終濃度が２００μｇ／ｍＬとなるようにＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌ溶液をｍＲＮＡ溶液に添加し、ＰＭｓを調製した。
Ｂａｌｂ／Ｃマウス（メス、６週齡）の尾静脈より、４０μｇのｍＲＮＡを含むＰＭｓ溶液を２００μＬ投与した。２．５、５、１０分後に尾静脈より２μＬの血液を採取した。採取した血液から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｍＲＮＡを抽出し、抽出したｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した後、ｑＲＴ－ＰＣＲにより残存しているｃＤＮＡを定量評価した。統計学的処理は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により行った。
その結果を、図１２に示す。図１２に示すように、Ｃｈｏｌ修飾オリゴを１０個ハイブリダイズすることで、血中滞留性が向上する傾向が見られた。
実施例１－１５：マウスを用いたＰＭｓの肺への局所投与
ここでは実施例１－２で調製したＧｌｕｃ ｍＲＮＡ又は実施例１－３で調製した以下のＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたＧｌｕｃ ｍＲＮＡを用いた。
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（１）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（２）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（３）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（４）
Ｃｈｏｌ―ｏｖｅｒｈａｎｇ ２ｂａｓｅ（５）
各ＰＭｓは実地例５と同様の方法でＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌを用いて調製した。
Ｂａｌｂ／Ｃマウス（メス、６週齡）の気管を切開し、１．６７μｇのｍＲＮＡを含むＰＭｓ溶液５０μＬを噴霧器により直接肺へ投与した。２４時間後、マウスの肺を摘出し、ホモジェナイズした後に、そこに含まれるＧｌｕｃタンパク質量をルミノメータにて定量した。また、投与4時間後の肺を用いて、肺において残存しているＧｌｕｃ ｍＲＮＡ量を定量する目的で、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｍＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した後、ｑＲＴ－ＰＣＲにより残存しているｃＤＮＡを定量評価した。この際、組織に含まれるアクチンの量を下にｍＲＮＡ発現量を規格化した。
その結果を、図１３に示す。図１３（Ａ）に示すように、Ｃｈｏｌ修飾オリゴマーを５個ハイブリダイズしたｍＲＮＡで、ハイブリダイズしていないｍＲＮＡと比べて、有意に高いｍＲＮＡからのタンパク質発現効率が得られた。また、図１３（Ｂ）に示すように、肺組織に分解されずに残存したｍＲＮＡ量も、Ｃｈｏｌ修飾オリゴマーを５個ハイブリダイズすることで、有意に増加することから、生体内での安定性が向上したことが明らかとなった。また安全性に関して、投与後の肺組織での（ｃ）インターフェロンβ、（ｄ）インターロイキン６の発現量は、ハイブリダイズしていないｍＲＮＡとＣｈｏｌ修飾オリゴマーを５個ハイブリダイズしたもので有意な変化はなく、低い値にとどまったことから、安全性は担保されたものと考えられた。
このように、安定性が向上した結果（図１３（Ｂ））、発現が向上することが分かった（図１３（Ａ））。このことから、ｉｎ ｖｉｖｏでも有効であることが分かる。
実施例１－１５：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化ｍＲＮＡの作製
ＰＥＧ化ｍＲＮＡを、以下のように作製した。ＲＮＡ２次構造予測ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｔｉｐｓ．ｄｎａ．ｂｉｏ．ｋｅｉｏ．ａｃ．ｊｐ／ｉｐｋｎｏｔ／）にて、Ｇｌｕｃ ｍＲＮＡの２次構造を予測し、ＲＮＡ鎖が２次構造を持たない部分に対してＲＮＡオリゴマーを設計した。ＲＮＡオリゴマーは、５’末端のＰＥＧ修飾を含めて、ジーンデザイン社にて、依頼合成した。ここで、重量平均分子量１２，０００の直鎖ＰＥＧを用いた。そして、以下の５’末端ＰＥＧ修飾ＲＮＡオリゴマーをジーンデザイン社より購入した。
配列ｐ１（配列番号３４）：５’―ＰＥＧ－ＡＣＵＣＵＵＵＧＵＣＧＣＣＵＵＣＧ―３’
配列ｐ２（配列番号３５）：５’―ＰＥＧ－ＣＵＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＵＧＣ―３’
配列ｐ３（配列番号３６）：５’―ＰＥＧ－ＵＣＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＣＣＡＧ―３’
配列ｐ４（配列番号３７）：５’―ＰＥＧ－ＣＵＣＵＡＧＡＵＧＣＡＵＧＣＵＣＧ―３’
配列ｐ５（配列番号３８）：５’―ＰＥＧ－ＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＣＵＵＣＵＵＧ―３’
配列ｐ６（配列番号３９）：５’―ＰＥＧ－ＡＵＣＵＣＡＧＧＡＡＵＧＵＣＧＡＣ―３’
配列ｐ７（配列番号４０）：５’―ＰＥＧ－ＧＣＡＧＣＣＡＧＣＵＵＵＣＣＧＧＧ―３’
配列ｐ８（配列番号４１）：５’―ＰＥＧ－ＵＵＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＧＵＵＧＵ―３’
配列ｐ９（配列番号４２）：５’―ＰＥＧ－ＵＧＡＵＣＵＵＧＵＣＣＡＣＣＵＧＧ―３’
配列ｐ１０（配列番号４３）：５’―ＰＥＧ－ＧＡＵＧＡＡＣＵＵＣＵＵＣＡＵＣＵ―３’
配列ｐ１１（配列番号４４）：５’―ＰＥＧ－ＧＵＧＧＧＡＣＡＧＧＣＡＧＡＵＣＡ―３’
配列ｐ１２（配列番号４５）：５’―ＰＥＧ－ＵＵＧＡＡＧＵＣＵＵＣＧＵＵＧＵＵ―３’
配列ｐ１３（配列番号４６）：５’―ＰＥＧ－ＧＧＧＣＡＡＣＵＵＣＣＣＧＣＧＧＵ―３’
配列ｐ１４（配列番号４７）：５’―ＰＥＧ－ＣＵＧＣＵＣＣＡＵＧＧＧＣＵＣＣＡ―３’
配列ｐ１５（配列番号４８）：５’―ＰＥＧ－ＣＵＵＧＣＵＧＧＣＡＡＡＧＧＵＣＧ―３’
以下の実施例１－１６～１８では、ｍＲＮＡとして実施例１－３で調製したものを用いた。ｍＲＮＡに対して１当量のＲＮＡオリゴマーを加え、６５℃で５分加熱し、１０分かけて３０℃まで冷却することで、ハイブリダイゼーションを行った。これにより、ＰＥＧ化ｍＲＮＡを作製した。
実施例１－１６：ＰＥＧ修飾ＲＮＡオリゴマーのｍＲＮＡへのハイブリダイズによる翻訳効率の変化
１箇所、５箇所、１０箇所、又は１５箇所にＰＥＧ修飾ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたｍＲＮＡを用いた。尚、ＰＥＧＲＮＡ修飾オリゴマー１個、５個、１０個、及び１５個の各実験では、実施例１－１５で作製した以下のＰＥＧ修飾ＲＮＡオリゴマーを用いた。
ＰＥＧ修飾ＲＮＡオリゴマー１個の実験：配列ｐ１
ＰＥＧ修飾ＲＮＡオリゴマー５個の実験：配列ｐ１～ｐ５
ＰＥＧ修飾ＲＮＡオリゴマー１０個の実験：配列ｐ１～ｐ１０
ＰＥＧ修飾ＲＮＡオリゴマー１５個の実験：配列ｐ１～ｐ１５
さらに、ＰＥＧ修飾ＲＮＡオリゴマー０個の実験では、ｍＲＮＡだけを６５℃で５分加熱し、１０分かけて３０℃まで冷却したものを用いた。
実験は、それぞれ３回行った。
調製したｍＲＮＡサンプルの無細胞系でのタンパク質翻訳効率は、Ｒａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｔｒｅａｔｅｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて評価した。３００ｎｇのＧＬｕｃ ｍＲＮＡを含むサンプル溶液をＲａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅに添加し、３０℃で９０分インキュベートした後、反応溶液１０μＬの発光強度をＲｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて定量した。測定にはＭｉｔｈｒａｓ ＬＢ ９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏ．）を用いた。
その結果を、図１８に示す。ＰＥＧ量の増加に伴う、若干の翻訳活性の低下を認めたが、１５個のＰＥＧ修飾ＲＮＡオリゴマーを用いてｍＲＮＡを修飾しても、未修飾のものと比べ６４％程度の翻訳活性は得られた。
ここで、図１８中、「＊」はオリゴ修飾していない場合と比べた場合、ｐ＜０．０５という統計学的有意差があることを示す。統計処理はＡＮＯＶＡ検定ののち、オリゴ修飾していない場合をコントロールとしたＤｕｎｎｅｔｔ検定を行った。
実施例１－１７：ＰＥＧ修飾ＲＮＡオリゴマーのｍＲＮＡへのハイブリダイズによる安定化効果
１箇所、５箇所、１０箇所、又は１５箇所にＰＥＧ修飾ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたｍＲＮＡを用いた。尚、ＰＥＧ修飾オリゴマー１個、５個、１０個、及び１５個の各実験では、実施例１－１５で作製した以下のＰＥＧ修飾オリゴマーを用いた。
ＰＥＧ修飾オリゴマー１個の実験：配列ｐ１
ＰＥＧ修飾オリゴマー５個の実験：配列ｐ１～ｐ５
ＰＥＧ修飾オリゴマー１０個の実験：配列ｐ１～ｐ１０
ＰＥＧ修飾オリゴマー１５個の実験：配列ｐ１～ｐ１５
さらに、ＰＥＧ修飾オリゴマー０個の実験では、ｍＲＮＡだけを６５℃で５分加熱し、１０分かけて３０℃まで冷却したものを用いた。
実験は、それぞれ３回行った。
ＦＢＳに対する安定性を確認する試験の手順は図１９（Ａ）に示す通りである。１００ｎｇのＧＬｕｃ ｍＲＮＡを含むサンプルを０．５％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ，Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｐｈａｒｍａ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）溶液中で３７℃、１５分インキュベートした。その後、１ｖ／ｖ％２－メルカプトエタノールを含むＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｕｉａｇｅ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）３５０μＬを添加し、６５℃で５分間インキュベートした後、氷上で急冷することで、ＰＥＧ－ＲＮＡオリゴマーをｄｅｎａｔｕｒｅした。ｍＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて精製した後、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（商品名）ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ ＣＯ．，Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いてコンプリメンタリーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写した。逆転写したｃＤＮＡを定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）により定量評価した。ここで、ｑＲＴ－ＰＣＲ測定には下記配列のプライマーを用いた。
Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号４９）：ＴＧＡＧＡＴＴＣＣＴＧＧＧＴＴＣＡＡＧＧ
Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号５０）：ＧＴＣＡＧＡＡＣＡＣＴＧＣＡＣＧＴＴＧＧ
その結果を図１９（Ｂ）に示す。ＰＥＧ修飾オリゴマーによって分解酵素耐性が向上することが示唆された。また、分解酵素耐性は修飾されるＰＥＧオリゴの数が多いほど向上する傾向があった。
実施例１－１８：ＰＥＧ化ｍＲＮＡの発現試験
１５箇所にＰＥＧ修飾ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズしたｍＲＮＡを用いた。尚、ＰＥＧ修飾オリゴマー１５個の実験では、実施例１－１５で作製した以下のＰＥＧ修飾オリゴマーを用いた。
ＰＥＧ修飾オリゴマー１５個の実験：配列ｐ１～ｐ１５
さらに、ＰＥＧ修飾オリゴマー０個の実験では、ｍＲＮＡだけを６５℃で５分加熱し、１０分かけて３０℃まで冷却したものを用いた。
実験は、それぞれ３回行った。
培養細胞（ＨｕＨ－７細胞）に対するｍＲＮＡ発現試験を次のように行った。ヒト肝がん細胞（ＨｕＨ－７細胞）を９６－ｗｅｌｌプレートに５，０００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、ａ ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ ｗｉｔｈ ５％ＣＯ２ ａｔ ３７°Ｃで２４時間インキュベートした。血清培地を取り除いた後、無血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）１００μＬに置換し、２５０ｎｇのＧｌｕｃ ｍＲＮＡを含むサンプル溶液を添加した。４時間後、Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて１０μＬの上澄中の発光強度を定量した。測定にはＭｉｔｈｒａｓ ＬＢ ９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏ．）を用いた。
その結果を、図２０に示す。培養細胞においてＰＥＧ修飾ｍＲＮＡは未修飾のものと比較して有意に高い発現を示した。これはＰＥＧ修飾ｍＲＮＡの安定化効果によるものと考えられる。
実施例２－１：様々な二本鎖ＲＮＡの作製
Ｔ７－Ｇｌｕｃ ｐｌａｓｍｉｄは、ｐＣＭＶ－Ｇｌｕｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｌａｓｍｉｄ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）からＧｌｕｃコード配列（配列番号５７及び図３３）をｐＳＰ７３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＨｉｎｄＩＩＩ，Ｘｂａ１サイトに挿入することで作製した。
Ｔ７－Ｇｌｕｃ ｐｏｌｙ Ａ１２０ ｐｌａｓｍｉｄは、Ｔ７－Ｇｌｕｃ ｐｌａｓｍｉｄのＥｃｏＲ１－Ｂｇｌ２サイトにＡ１２０－（ＢｓｍＢ１切断部位）を挿入することで作製した。
図２１（Ａ）に示した通り、Ｇｌｕｃ ｓｅｎｓｅ鎖は、Ｔ７－Ｇｌｕｃ ｐｏｌｙ Ａ１２０ ｐｌａｓｍｉｄをＢｓｍＢＩで切断し、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にてＴ７プロモーターより転写することで作製した。このキットでＲＮＡを作成した場合、５’末端はＣａｐ修飾される。
図２１（Ｂ）に示した通り、Ｇｌｕｃ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖（ｐｏｌｙ Ｕ込み）はＴ７－Ｇｌｕｃ ｐｏｌｙ Ａ１２０ ｐｌａｓｍｉｄをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ＳＰ６ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にてＳｐ６プロモーターより転写することで作製した。ここではＣａｐアナログを加えずにＲＮＡを作製しているため、５’末端はＣａｐ修飾されず、トリリン酸基が結合した状態となる。
図２１（Ｃ）に示した通り、Ｇｌｕｃ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖（ｐｏｌｙ Ｕなし）はＴ７－Ｇｌｕｃ ｐｌａｓｍｉｄをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ＳＰ６ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にてＳｐ６プロモーターより転写することで作製した。
図２１（Ｄ）に示した通り、ｐｏｌｙ ＵはＴ７－Ｇｌｕｃ ｐｏｌｙ Ａ１２０ ｐｌａｓｍｉｄをＳｍａＩで切断し、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ＳＰ６ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にてＳｐ６プロモーターより転写することで作製した。ｐｏｌｙ Ｕは、ｐｏｌｙ Ａ全体の配列に相補的な配列（１２０塩基）と、その下流に、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの一部（すなわち、３’ＵＴＲの約３７％の塩基長の配列）に相補的な配列（１９塩基）を含む。尚、ｐｏｌｙ Ｕは、上流に、ＳＰ６プロモーター内の配列、及び、クローニングに用いた制限酵素配列を他の配列（１７塩基）としてさらに含む。すなわち、ここで用いたｐｏｌｙ Ｕは、１５６塩基長の配列を有する。また、５’末端にトリリン酸構造を有する。
以下に、作製したセンス鎖、アンチセンス酸、及びｐｏｌｙ Ｕの塩基配列を示す。

Ｇｌｕｃ ｓｅｎｓｅ鎖（配列番号５１及び図２７）
Ｇｌｕｃ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖（ｐｏｌｙ Ｕ込み）（配列番号５２及び図２８）
Ｇｌｕｃ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖（ｐｏｌｙ Ｕなし）（配列番号５３及び図２９）
ｐｏｌｙ Ｕ（配列番号５４及び図３０）
ここで、図２７の配列において、下線部分がｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）であり、ＯＲＦの上流が５’ＵＴＲ（５４塩基長）であり、ＯＲＦの下流に３’ＵＴＲ（５２塩基長）があり、さらにその下流の１１９Ａがｐｏｌｙ Ａ配列である。
ここで、Ｐｏｌｙ Ａの数について、理論上は鋳型ＤＮＡに１２０ｂｐに組み込まれ、Ｔ７プロモーターから転写したｍＲＮＡは１１９塩基のＡを、Ｓｐ６プロモーターから転写したＲＮＡは１２０塩基のＵをそれぞれ有する。しかし、ＤＮＡ増幅や、ｍＲＮＡ調製の段階でその数は増減しうる。
作製したセンス鎖、アンチセンス鎖、及びｐｏｌｙ Ｕを用いて、次のように、二本鎖ＲＮＡを作製した。先ず、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓバッファー中にセンス鎖、アンチセンス鎖又はｐｏｌｙ Ｕが等モル量含まれ、ＲＮＡ濃度が３００μｇ／ｍｌとなる溶液を調製した。その溶液を６５℃で５分維持した後、１０分かけて３０℃に下げることでハイブリダイズを行った。
トリリン酸化を除く際は、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ｃａｔ．ｎｏ．Ｍ０２８９Ｓ）を用いた。
ここで、図２２に、作製した二本鎖ＲＮＡの模式図を示す。図２２（Ａ）がｍＲＮＡ：ＲＮＡであり、図２２（Ｂ）がｍＲＮＡ：ＲＮＡ ｐｏｌｙ Ｕ（－）であり、図２２（Ｃ）がｍＲＮＡ：ｐｏｌｙ Ｕであり、図２２（Ｄ）がｍＲＮＡ：ｐｏｌｙ Ｕ ｐｐｐ（－）である。
尚、図２２中、ｍＲＮＡのタンパク質コード配列の上流には５’ＵＴＲがあり、下流には３’ ＵＴＲが存在する。
実施例２－２：樹状細胞株を用いた二本鎖ＲＮＡワクチンの最適化
ＤＣ２．４細胞を６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１，０００，０００／ｗｅｌｌ蒔き、２４ｈ後に培地を交換し、無血清培地Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商品名）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に置換したのち、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商品名） ＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｍＲＮＡを２．５μｇ／ｗｅｌｌ投与した。４時間後、細胞からＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にてＲＮＡを精製し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）にてｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）にした後、ｔａｑｍａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、インターフェロンβの発現量を調べた。この際、ａｃｔｉｎ ｂの発現量にて標準化した。また培地に含まれるＧｌｕｃタンパク質量をＲｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ）にて定量した。
その結果を図２３に示す。全長にハイブリダイズしたｍＲＮＡ：ＲＮＡでは強い炎症反応を惹起できたものの（図２３（Ａ））、ｍＲＮＡからのＧｌｕｃタンパク質発現量は、１本鎖ｍＲＮＡと比べて１００倍程度低下した（図２３（Ｂ））。一方で、ｍＲＮＡ：ＲＮＡ ｐｏｌｙ Ｕ（－）では、ｍＲＮＡ：ＲＮＡと比べ炎症反応が著明に低下したのに加え（図２３（Ａ））、Ｇｌｕｃ発現量もｍＲＮＡ：ＲＮＡと同程度であった（図２３（Ｂ））。それに対して、主にｐｏｌｙ Ｕ部分だけハイブリダイズしたものでは、ｍＲＮＡ：ＲＮＡと同等に強い炎症反応が見られたのに加え（図２３（Ａ））、ｍＲＮＡからのタンパク質発現量も、１本鎖ｍＲＮＡとほぼ同程度のレベルに保たれた（図２３（Ｂ））。なお、ここでアンチセンス鎖ＲＮＡの５’末端はトリリン酸化された状態であるが、これは細胞内核酸受容体であるＲＩＧ－Ｉに認識され、強い炎症反応を惹起することが知られている。そこで、トリリン酸と炎症反応の関係を調べるために、トリリン酸を除いたｐｏｌｙ ＵをハイブリダイズさせたｍＲＮＡを導入したところ、炎症反応はトリリン酸化ｐｏｌｙ Ｕの場合と比べやや低下した。従って、ＲＮＡオリゴマーが５’末端トリリン酸を有することで、より強い炎症反応が惹起されることが明らかになった。
ｍＲＮＡ：ＲＮＡ ｐｏｌｙ Ｕ（－）ではあまり炎症が起きなかったことから、用いる相補鎖に依存してＲＩＧ－Ｉによるトリリン酸認識が異なることが強く示唆される。ｐｏｌｙ Ｕの場合、５’末端がｍＲＮＡ末端に露出され、トリリン酸が立体的にＲＩＧ－Ｉに認識されやすくなった可能性、トリリン酸周囲の配列にＵを多く含むが、ＡＵ結合が弱いのでトリリン酸の運動性が高まり、認識されやすくなった可能性等が想定される。このように相補鎖の選択がＲＩＧ－Ｉを介した自然免疫応答に重要である可能性が強く示唆された。
このように、ｍＲＮＡの３’末端に付加されるｐｏｌｙ Ａ鎖の部分に相補鎖（ｐｏｌｙ Ｕ）を主にハイブリダイズさせた場合、タンパク質発現効率がほとんど低下させることなく、強い炎症反応を惹起することが分かった。
実施例２－３：ｐｏｌｙ ＵハイブリダイズｍＲＮＡのリンパ節内投与
ｍＲＮＡ：ｐｏｌｙ Ｕは実施例２－２と同様に作製した。Ｇｌｕｃ ｍＲＮＡ ３μｇを含む１０μＬの１０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ溶液をＣ５７ＢＬ６Ｎマウスの鼠径リンパ節に投与した。４時間後、鼠径リンパ節を回収し、Ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にて溶解し、Ｌｕｃ発現量をＲｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にて定量した。また、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）にてｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ （ｃＤＮＡ）にした後、ｔａｑｍａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、インターフェロンβ及びインターロイキン６の発現量を調べた。この際、ａｃｔｉｎ ｂの発現量にて標準化した。
その結果を図２４に示す。すると、図２３の培養細胞を用いた解析と同様に、ｐｏｌｙ Ｕをハイブリダイズさせただけで、炎症反応は１本鎖ｍＲＮＡと比べ著明に向上し（図２４（Ｂ）及び（Ｃ））、さらにｍＲＮＡからのＧｌｕｃ発現効率は、ほぼ１本鎖ｍＲＮＡと同程度であった（図２４（Ａ））。
このように、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてもｐｏｌｙ ＵハイブリダイズｍＲＮＡは、翻訳効率を大きく損なうことなく、強い炎症反応を惹起することが分かった。
実施例２－４：ｐｏｌｙ ＵハイブリダイズｍＲＮＡによる細胞性免疫の誘導
Ｔ７－ＯＶＡ ｐｏｌｙ Ａ１２０ ｐｌａｓｍｉｄは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社にてコドン最適化を行ったＯＶＡコード配列（配列番号５８及び図３４）をｐＳＰ７３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＸｈｏＩ、ＥｃｏＲ１サイトに挿入することで作成した。ＯＶＡ ｓｅｎｓｅ鎖は、Ｔ７－ＯＶＡ ｐｏｌｙ Ａ１２０ ｐｌａｓｍｉｄをＢｓｍＢＩで切断し、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にてＴ７プロモーターより転写することで作製した。ｐｏｌｙ ＵはＴ７－Ｇｌｕｃ ｐｏｌｙ Ａ１２０ ｐｌａｓｍｉｄをＥｃｏＲＩで切断し、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ＳＰ６ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にてＳｐ６プロモーターより転写することで作製した。
ここで、ｐｏｌｙ Ｕは、ｐｏｌｙ Ａ全体の配列に相補的な配列（１２０塩基）と、その下流に、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの一部（すなわち、３’ＵＴＲの約８３％の塩基長の配列）に相補的な配列（５塩基）を含む。尚、ここで用いたｐｏｌｙ Ｕは、ＳＰ６プロモーター内の配列、及び、クローニングに用いた制限酵素配列を他の配列（１７塩基）としてさらに含む。すなわち、ここで用いたｐｏｌｙ Ｕは、１４２塩基長の配列を有する。また、５’末端にトリリン酸構造を有する。
以下に、作製したセンス鎖、及びｐｏｌｙ Ｕの塩基配列を示す。

ＯＶＡ ｓｅｎｓｅ鎖（配列番号５５及び図３１）
ｐｏｌｙ Ｕ（配列番号５６及び図３２）
尚、図３１の配列において、下線部分がｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）であり、ＯＲＦの上流が５’ＵＴＲ（１６塩基）であり、ＯＲＦの下流に３’ＵＴＲ（６塩基）があり、さらにその下流の１１９Ａがｐｏｌｙ Ａ配列である。
ＡやＵの数に関しては、実施例２－１の場合と同様であり、Ｔ７プロモーターから転写したｍＲＮＡは１１９塩基のＡを、Ｓｐ６プロモーターから転写したＲＮＡは１２０塩基のＵをそれぞれ有する。しかし、ＤＮＡ増幅や、ｍＲＮＡ調製の段階でその数は増減しうる。
ｐｏｌｙ ＵをハイブリダイズさせたＯＶＡ発現ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ：ｐｏｌｙ Ｕ）は、実施例２－２と同様に作製した。具体的には、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓバッファー中にセンス鎖、アンチセンス鎖、又はｐｏｌｙ Ｕが等モル量含まれ、ＲＮＡ濃度が３００μｇ／ｍｌとなる溶液を調製した。その溶液を６５℃で５分維持した後、１０分かけて３０℃に下げることハイブリダイズを行った。
図２５（Ａ）に以下の実験の手順を示す。先ず、ＯＶＡ ｍＲＮＡ ３μｇを含む１０μＬの１０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ溶液をＣ５７ＢＬ６Ｎマウスの鼠径リンパ節に投与した。７日後、脾臓細胞を回収し、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔ ＰＬＵＳ、Ｍｏｕｓｅ（－）ＨＲＰキット（ＭＡＢＴＥＣＨ 社）にてＥｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを行った。ここでは、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに２５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ蒔いた。最終ＯＶＡ濃度１０μｇ／ｍＬで２４時間培養したのち、ＩＦＮ－γ産生細胞数を計測した。
その結果を図２５（Ｂ）に示す。図２５（Ｂ）の縦軸は、ＯＶＡに反応してＩＦＮ－γを産生した脾細胞の数を示し、細胞性免疫の指標となる。図２５（Ｂ）に示されているように、１本鎖のＯＶＡ ｍＲＮＡでは、細胞性免疫をほとんど誘導できなかったのに対して、ｐｏｌｙ ＵをハイブリダイズさせたＯＶＡ ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ：ｐｏｌｙ Ｕ）では、有意な細胞性免疫反応が観察された。
このように、ｐｏｌｙ Ｕハイブリダイズにより、より強い細胞性免疫を誘導することができることが分かった。
実施例２－５：ｐｏｌｙ ＵハイブリダイズｍＲＮＡによる液性免疫の誘導
実施例２－４と同様の方法でＯＶＡ ｍＲＮＡをＣ５７ＢＬ６Ｎマウスに投与し、７日後に血液を採取した（図２６（Ａ））。血清中の抗ＯＶＡ ＩｇＧをＭｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－ＯＶＡ ＩｇＧ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（コンドレックス社）にて定量した。
その結果を図２６（Ｂ）に示す。１本鎖ｍＲＮＡではＯＶＡ反応性ＩｇＧ値はコントロール群に比べ上昇しなかったのに対して、ｐｏｌｙ ＵをハイブリダイズさせたＯＶＡ ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ：ｐｏｌｙ Ｕ）では、ＩｇＧ値の有意な上昇が観察された。
このように、ｐｏｌｙ Ｕハイブリダイズにより、より強い液性免疫を誘導することができることが分かった。
実施例２－６：樹状細胞を用いた二本鎖ＲＮＡワクチンの最適化
実施例２－２と同様の方法で、樹状細胞（Ｄ．Ｃ．２．４細胞）におけるｍＲＮＡからのタンパク質発現量（すなわちルシフェラーゼ発現量）を定量した。
ただし、Ｄ．Ｃ．２．４細胞を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに４０,０００／ｗｅｌｌ蒔いて実験を行った。また、ＲＮＡオリゴマーとして、以下の３つを用いた。

ｐｏｌｙ Ｕ（３’ＵＴＲと相補的な配列の鎖長：５塩基）（配列番号５６、図３６（Ｂ））
ｐｏｌｙ Ｕ（３’ＵＴＲと相補的な配列の鎖長：１９塩基）（配列番号５４、図３６（Ｂ））
ｐｏｌｙ Ｕ（３’ＵＴＲと相補的な配列の鎖長：５０塩基）（配列番号５９、図３６（Ｂ））
「ｐｏｌｙ Ｕ（３’ＵＴＲと相補的な配列の鎖長：５塩基）（配列番号５６）」Ｔ７－Ｇｌｕｃ ｐｏｌｙ Ａ１２０ ｐｌａｓｍｉｄをＥｃｏＲＩで切断し、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ＳＰ６ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にてＳｐ６プロモーターより転写することで作製した（図３６（Ａ））。
「ｐｏｌｙ Ｕ（３’ＵＴＲと相補的な配列の鎖長：１９塩基）（配列番号５４）」Ｔ７－Ｇｌｕｃ ｐｏｌｙ Ａ１２０ ｐｌａｓｍｉｄをＳｍａＩで切断し、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ＳＰ６ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にてＳｐ６プロモーターより転写することで作製した（図３６（Ａ））。
尚、「ｐｏｌｙ Ｕ（３’ＵＴＲと相補的な配列の鎖長：５塩基）（配列番号５６）」は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの一部（すなわち、３’ＵＴＲ（５２塩基長）の約１０％の塩基長の配列）に相補的な配列（５塩基）を含む。
また、ｐｏｌｙ Ｕ（３’ＵＴＲと相補的な配列の鎖長：１９塩基）は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの一部（すなわち、３’ＵＴＲ（５２塩基長）の約３６％の塩基長の配列）に相補的な配列（１９塩基）を含む。
「ｐｏｌｙ Ｕ（３’ＵＴＲと相補的な配列の鎖長：５０塩基）」は、Ｔ７－Ｇｌｕｃ ｐｏｌｙ Ａ１２０ ｐｌａｓｍｉｄをＮｏｔＩで切断し、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ＳＰ６ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にてＳｐ６プロモーターより転写することで作製した（図３６（Ａ））。
ここで、ｐｏｌｙ Ｕは、ｐｏｌｙ Ａ全体の配列に相補的な配列（１２０塩基）と、その下流に、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの一部（すなわち、３’ＵＴＲ（５２塩基長）の約９６％の塩基長の配列）に相補的な配列（５０塩基）を含む。尚、ここで用いたｐｏｌｙ Ｕは、ＳＰ６プロモーター内の配列、及び、クローニングに用いた制限酵素配列を他の配列（１７塩基）としてさらに含む。すなわち、ここで用いたｐｏｌｙ Ｕは、１８７塩基長の配列を有する。また、５’末端にトリリン酸構造を有する。
その結果を、図３５に示す。図３５に示されるように、各ｐｏｌｙ Ｕの３’ＵＴＲと相補的な配列の鎖長は、短ければ短いほど、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を維持する上で好ましいことが分かる。
実施例３－１：ＲＮＡオリゴマーのハイブリダイゼーション
合成ＲＮＡオリゴマーを以下のように作製した。先ず、Ｇｌｕｃ ｍＲＮＡに相補的な第１の配列については、ＲＮＡ２次構造予測ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｔｉｐｓ．ｄｎａ．ｂｉｏ．ｋｅｉｏ．ａｃ．ｊｐ／ｉｐｋｎｏｔ／）にて、Ｇｌｕｃ ｍＲＮＡの２次構造を予測し、ＲＮＡ鎖が２次構造を持たない部分に対してＲＮＡオリゴマーを設計した。ｏｖｅｒｈａｎｇ配列については、可能な限りｍＲＮＡ鎖とハイブリダイズしないようＡまたはＵを用いて設計した。５’ｐｐｐ－ＲＮＡオリゴマーと相補的な第２の配列については、先ず、５’ｐｐｐ－ＲＮＡオリゴマーの配列を設計し、その配列に相補的な第２の配列を得た。５’ｐｐｐ－ＲＮＡオリゴマーではＧＵの繰り返し配列を用いたが、これは、ＡＴＰを含まない系でｉｎ ｖｉｔｒｏ転写をすることにより、相補鎖の副産物の生成が抑制されるほか、ＧＵ繰り返し配列はそのＲＮＡ自体で２次構造を形成しないことが特徴である。この５’ｐｐｐ－ＲＮＡオリゴマーに相補的な配列として第２の配列を得たが、この際、５’ｐｐｐ－ＲＮＡオリゴマーのトリリン酸化された５’末端が平滑になるよう配列設計を行っている。。
そのように設計した合成ＲＮＡオリゴマーの合成を依頼し、５’側より、Ｇｌｕｃ ｍＲＮＡに相補的な１７塩基の配列、２塩基のｏｖｅｒｈａｎｇ配列、５’ｐｐｐ－ＲＮＡオリゴマーと相補的な２４塩基の配列からなる以下の合成ＲＮＡオリゴマーを購入した。
合成ＲＮＡオリゴマーは北海道システムサイエンスより購入した。
合成ＲＮＡオリゴマー配列１（配列番号６０）：ＣＡＧＣＣＡＧＣＵＵＵＣＣＧＧＧＣＵＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣ
合成ＲＮＡオリゴマー配列２（配列番号６１）：ＡＣＵＣＵＵＵＧＵＣＧＣＣＵＵＣＧＡＵＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣ
合成ＲＮＡオリゴマー配列３（配列番号６２）：ＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＣＵＵＣＵＵＧＵＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣ
５’ｐｐｐ－ＲＮＡオリゴマーは次のように作製した。先ず、ＤＲ２７４ベクター（ａｄｄｇｅｎｅ）をＢｓａＩで切断し、以下の２種類のオリゴマーをハイブリダイズさせたものをそこに挿入した。
ＤＮＡオリゴマー（配列番号６３）：ＴＡＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＧＣＣＣ
ＤＮＡオリゴマー（配列番号６４）：ＡＡＡＣＧＧＧＣＣＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ
これにより図４１に示した塩基配列（配列番号６５）のベクターを作製した。次に、５’ｐｐｐ－ＲＮＡオリゴマーは、図４１に示した塩基配列（配列番号６５）のベクターをＡｐａＩとＳｎａＢＩで切断してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により調製した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の際、ＡＴＰを含まない反応液を用いることで目的配列の相補鎖ＲＮＡの転写を抑制した。これにより５’がトリリン酸化された以下の５’ｐｐｐ－ＲＮＡオリゴマーが調製された。
５’ｐｐｐ－ＲＮＡオリゴマー（配列番号６６）：ＧＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧ
合成ＲＮＡオリゴマー配列１～３と５’ｐｐｐ－ＲＮＡオリゴマーとのハイブリダイズにより、これらがハイブリダイズする側に平滑５’末端トリリン酸化構造が得られることが期待された。
２４ｎｔ １個：５’ｐｐｐ－ＲＮＡオリゴマー、合成ＲＮＡオリゴマー配列１、Ｇｌｕｃ ｍＲＮＡをモル比１：１：１で混合し、ハイブリダイズさせたものである。
２４ｎｔ ２個：５’ｐｐｐ－ＲＮＡオリゴマー、合成ＲＮＡオリゴマー配列１及び２、Ｇｌｕｃ ｍＲＮＡをモル比１：１：１：１で混合し、ハイブリダイズさせたものである。
２４ｎｔ ３個：５’ｐｐｐ－ＲＮＡオリゴマー、合成ＲＮＡオリゴマー配列１、２及び３、Ｇｌｕｃ ｍＲＮＡをモル比１：１：１：１：１で混合し、以下の条件でハイブリダイズさせたものである。
以下の実施例３－２及び３－３では、Ｇｌｕｃ ｍＲＮＡとして実施例１－３で調製したものを用いた。ハイブリダイゼーションは、６５℃で５分加熱し、１０分かけて３０℃まで冷却することで行った。
また、実施例３－３では、「ｍＲＮＡ：ｐＵ」として、実施例２－１で調製した「ｍＲＮＡ：ｐｏｌｙＵ」を用いた。
実施例３－２：免疫賦活化
ＤＣ２．４細胞を１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに４００，０００／ｗｅｌｌ蒔き、２４ｈ後に培地を交換し、無血清培地Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商品名）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に置換したのち、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商品名） ＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｍＲＮＡを２．５μｇ／ｗｅｌｌ投与した。４時間後、細胞からＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にてＲＮＡを精製し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）にてｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）にした後、ｔａｑｍａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、インターフェロンβおよびインターロイキン６の発現量を調べた。この際、ａｃｔｉｎ ｂの発現量にて標準化した。
その結果を図３８及び図３９に示す。５’ｐｐｐ－ＲＮＡオリゴマーと合成ＲＮＡオリゴマーからなる２本鎖構造の増加に従って、インターフェロンβおよびインターロイキン６の発現量が増加していた。そこから、２本鎖構造の増加に従って、免疫賦活化効果が上昇したことが明らかとなった。
実施例３－３：タンパク質翻訳
ＤＣ２．４細胞を９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに４０，０００／ｗｅｌｌ蒔き、２４ｈ後に培地を交換し、無血清培地Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商品名）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に置換したのち、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商品名） ＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｍＲＮＡを０．２５μｇ／ｗｅｌｌ投与した。４時間後Ｇｌｕｃタンパク質量をＲｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ）にて定量した。
その結果を図４０に示す。５’ｐｐｐ－ＲＮＡオリゴマーと合成ＲＮＡオリゴマーからなる２本鎖構造の増加に従って、若干の翻訳活性の低下を認めたものの、３個結合した場合でも１本鎖ＲＮＡと比べ、７０％程度の翻訳活性が保たれた。態様２のｍＲＮＡ：ｐＵと比較して、優れた翻訳活性が得られた。
ここで図３８～４０のＰ値は、統計処理としてＡＮＯＶＡ検定ののち、Ｔｕｋｅｙ検定を行った際の統計学的有意差を示す。
ｍＲＮＡ送達は、治療用タンパク質を安全かつ持続的に供給するための手法として、その医療への応用が期待されている。一方で、ｍＲＮＡが生体内で速やかに酵素分解を受けてしまうことが大きな課題とされていた。これに対して、本発明の第１の態様では、ｍＲＮＡ分子自体を化学修飾することで、高分子ミセルに内包した際のｍＲＮＡの酵素分解を顕著に抑制し、ｍＲＮＡ導入効率を高めることに成功した。ここで用いたｍＲＮＡ内包高分子ミセルは、中枢神経疾患、運動感覚器疾患、肝疾患、悪性腫瘍などの様々な疾患のモデル動物に対する治療実験において、優れた効果を示しており、将来の臨床応用を見据えた研究が進められている。高分子ミセルの組成は、標的臓器、投与法により異なるが、本発明の第１の態様の技術は様々な組成のミセルを安定化できることから、幅広く応用できる。
ｍＲＮＡワクチンは、従来のワクチンとは全く異なった仕組みによる医薬品として位置づけられる。特徴として、発現させる抗原タンパク質を自由に構築できること、細胞性免疫を誘導できることが挙げられる。また、同種の核酸ワクチンとしてＤＮＡワクチンの研究例はあるが、ＤＮＡはホストゲノムへのランダムな挿入による変異誘発リスクがあり、実用化の障害となるのに対し、ｍＲＮＡはその危険性がない。
従来の一本鎖のｍＲＮＡを用いたワクチン開発はアメリカ、ドイツを中心に進んでいるが、効果的に炎症反応を惹起するためのアジュバント併用が避けられなかった。本発明の第２及び第３の態様のｍＲＮＡワクチンは、アジュバントが必ずしも必要ではなく、ｍＲＮＡのみで効果的に炎症反応を惹起することが可能であり、また、抗原提示と同時かつ同所的に炎症反応を惹起できる。
ｍＲＮＡワクチンは、投与経路（皮下投与、筋肉内投与、経粘膜投与等）、輸送担体などを選ばず、用途や目的に応じた柔軟な適応を可能である。また、ｍＲＮＡワクチンで用いるｍＲＮＡは化学反応をベースに精製され、塩基配列を変えるだけであらゆるタンパク質に対応可能であるため、スケールメリットによる大幅なコストダウンが見込まれる。これらのことは、従来のワクチンとは明白に異なったメリットである。本発明の第２及び第３の態様のワクチンは、新しいワクチンシステムとして、がんなどの個別化治療、ウイルス変異に迅速に対応可能な感染症ワクチンなど、広範なマーケットが期待される。
配列番号１～２７：合成ＲＮＡ
配列番号２８～３１：合成ＤＮＡ／ＲＮＡ
配列番号３２：合成ＤＮＡ
配列番号３３：合成ＲＮＡ
配列番号３４～４８：合成ＲＮＡ
配列番号４９及び５０：合成ＤＮＡ
配列番号５１～５６：合成ＲＮＡ
配列番号５７及び５８：合成ＤＮＡ
配列番号５９：合成ＲＮＡ
配列番号６０～６２：合成ＲＮＡ
配列番号６３～６５：合成ＤＮＡ
配列番号６６～６８：合成ＲＮＡ

Claims (20)

  1. 目的遺伝子をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーとを内包した前記ｍＲＮＡの輸送担体であって、
    ＲＮＡオリゴマーは、
    （ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなるＲＮＡ配列、又は
    （ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列
    を含み、かつ化学修飾されていない又は化学修飾されており、
    前記ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせるｍＲＮＡ中の位置は、５’ＵＴＲ、コード領域および３’ＵＴＲのいずれかの位置である、輸送担体。
  2. 前記ＲＮＡ配列が１５～２３塩基の配列からなる、請求項１に記載の輸送担体。
  3. 前記ＲＮＡ配列が１７塩基の配列からなる、請求項２に記載の輸送担体。
  4. 前記化学修飾は、１～２塩基のオーバーハング配列を介してＲＮＡオリゴマーの配列の５’末端又は３’末端になされたものである、請求項１～３のいずれか１項に記載の輸送担体。
  5. 前記オーバーハング配列が２塩基の配列である、請求項４に記載の輸送担体。
  6. 前記化学修飾が疎水性基による修飾である、請求項１～５のいずれか１項に記載の輸送担体。
  7. 前記疎水性基による修飾がコレステロール修飾である、請求項６に記載の輸送担体。
  8. 前記化学修飾がポリエチレングリコール修飾である、請求項１～５のいずれか１項に記載の輸送担体。
  9. 前記輸送担体が、高分子ミセル又は脂質性ｍＲＮＡキャリアである、請求項１～８のいずれか１項に記載の輸送担体。
  10. 請求項１～９のいずれか１項に記載の輸送担体を含有する、医薬組成物。
  11. 目的遺伝子をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーとを輸送担体に内包させることを含み、
    ＲＮＡオリゴマーは、
    （ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなるＲＮＡ配列、又は
    （ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列
    を含み、かつ化学修飾されており、
    前記ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせるｍＲＮＡ中の位置は、５’ＵＴＲ、コード領域および３’ＵＴＲのいずれかの位置である、輸送担体の安定化方法。
  12. 目的遺伝子をコードするｍＲＮＡと、当該ｍＲＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つのＲＮＡオリゴマーとを含む二本鎖ＲＮＡであって、
    ＲＮＡオリゴマーは、
    （ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列からなるＲＮＡ配列、又は
    （ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列
    を含み、かつ化学修飾されていない又は化学修飾されており、
    前記ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせるｍＲＮＡ中の位置は、５’ＵＴＲ、コード領域および３’ＵＴＲのいずれかの位置である、二本鎖ＲＮＡ。
  13. 前記ＲＮＡ配列が１５～２３塩基の配列からなる、請求項１２に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  14. 前記ＲＮＡ配列が１７塩基の配列からなる、請求項１３に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  15. 前記化学修飾は、１～２塩基のオーバーハング配列を介してＲＮＡオリゴマーの配列の５’末端又は３’末端になされたものである、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  16. 前記オーバーハング配列が２塩基の配列である、請求項１５に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  17. 前記化学修飾が疎水性基による修飾である、請求項１２～１６のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  18. 前記疎水性基による修飾がコレステロール修飾である、請求項１７に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  19. 前記化学修飾がポリエチレングリコール修飾である、請求項１２～１６のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  20. 請求項１２～１９のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡを含有する、医薬組成物。
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