WO2015121924A1 - ｍＲＮＡ送達用組成物 - Google Patents

ｍＲＮＡ送達用組成物 Download PDF

Info

Publication number
WO2015121924A1
WO2015121924A1 PCT/JP2014/053190 JP2014053190W WO2015121924A1 WO 2015121924 A1 WO2015121924 A1 WO 2015121924A1 JP 2014053190 W JP2014053190 W JP 2014053190W WO 2015121924 A1 WO2015121924 A1 WO 2015121924A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mrna
polyion complex
subject
integer
factor
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/053190
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
片岡　一則
啓史 位▲高▼
石井　武彦
寛邦 内田
智士 内田
美雪 馬場
Original Assignee
一般社団法人医療産業イノベーション機構
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 一般社団法人医療産業イノベーション機構 filed Critical 一般社団法人医療産業イノベーション機構
Priority to PCT/JP2014/053190 priority Critical patent/WO2015121924A1/ja
Priority to US15/118,407 priority patent/US10232054B2/en
Priority to JP2015562586A priority patent/JPWO2015121924A1/ja
Priority to EP14882238.0A priority patent/EP3106177B1/en
Publication of WO2015121924A1 publication Critical patent/WO2015121924A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7115—Nucleic acids or oligonucleotides having modified bases, i.e. other than adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A61K38/1761—Apoptosis related proteins, e.g. Apoptotic protease-activating factor-1 (APAF-1), Bax, Bax-inhibitory protein(s)(BI; bax-I), Myeloid cell leukemia associated protein (MCL-1), Inhibitor of apoptosis [IAP] or Bcl-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/185—Nerve growth factor [NGF]; Brain derived neurotrophic factor [BDNF]; Ciliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins, e.g. NT-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention relates to a polyion complex of mRNA and a polycationic polymer, an mRNA delivery composition, and a pharmaceutical composition.
  • PIC polyion complex
  • Polyion complex is generally a block copolymer obtained by mixing a copolymer of PEG and an anionic block and a copolymer of PEG and a cationic block in a solution. An ionic layer formed between the cationic block and the anionic block.
  • the polyion complex is prevented from aggregating and precipitating, and the formation of nanoparticles with a monodisperse core-shell structure with a particle size of several tens of nm is promoted. Is done.
  • PEG covers the outer shell (shell) of the nanoparticle, it is known that it is highly biocompatible and convenient in terms of improving the residence time in blood.
  • Patent Documents 1 and 2 propose a polyion complex of DNA and a new cationic polymer.
  • the present invention provides a composition for delivering mRNA and a pharmaceutical composition, and a polyion complex of mRNA and polycationic polymer useful for these.
  • the present inventors have found that a polyion complex of mRNA and a polycationic polymer can deliver mRNA into cells in the subject's body with little induction of inflammation.
  • the present inventors have also found that the polyion complex can uniformly express mRNA in cells in a subject's body.
  • the present inventors have further found that the polyion complex allows mRNA to be rapidly expressed in cells in the subject's body.
  • the present inventors have found that the polyion complex allows mRNA to be continuously expressed in cells in the subject's body.
  • the present invention has been made based on the above findings.
  • a polyion complex comprising a cationic polymer and messenger RNA (mRNA).
  • mRNA messenger RNA
  • the cationic polymer is Cationic natural amino acids,
  • the cationic unnatural amino acid is an amino acid having a group represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) p —NH 2 as a side chain, where p is an integer of 1 to 5.
  • the cationic polymer has the following general formula (I): ⁇ Where R 1 is a hydroxyl group, a protecting group, or a polymerizable group, R 4 is H, a protecting group, a hydrophobic group, or a polymerizable group; R 2 is methylene or ethylene; R 3 is a group represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) p —NH 2 ; X is any one amino acid selected from cationic natural amino acids; p is an integer from 1 to 5, preferably p is 2, 3 or 4; n is an integer of 2 to 5000, n 1 is an integer from 0 to 5000, n 3 is an integer from 0 to 5000, nn 1 -n 3 is an integer of 0 or more, and each repeating unit in the formula is shown in a specific order for convenience of description, but each repeating unit can exist in any order, Repeating units may be present randomly, and each repeating unit may be the same or different.
  • the polycation block has the following general formula (II): ⁇ Where R 1 is a hydroxyl group, a protecting group, or a polymerizable group, R 4 is H, a protecting group, a hydrophobic group, or a polymerizable group; R 2 is methylene or ethylene; R 3 is a group represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) p —NH 2 ; p is an integer from 1 to 5, q is an integer from 1 to 5, n is an integer of 2 to 5000, n 1 is an integer from 0 to 5000, n 2 is an integer from 0 to 5000, nn 1 -n 2 is an integer of 0 or more, although each repeating unit in the formula is shown in a specific order, each repeating unit can be present in any order, each repeating unit may be present randomly, and each repeating unit is the same.
  • ⁇ Is a polycation block represented by However, when the polycation block forms a copolymer with polyethylene glycol, R 1 or R 4 represents a bond, and polyethylene glycol is a polycation block via R 1 or R 4 which is a bond. And forming a copolymer, The polyion complex according to (5) above. (7) The above (1) to (6), wherein the mRNA is an mRNA encoding a growth factor, cell growth factor, cell growth inhibitory factor, cell death promoting factor, cell death inhibitory factor, tumor suppressor gene product or transcription factor. The polyion complex in any one of.
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • the cell death inhibitor is Bcl-2.
  • a method for delivering mRNA to the cytoplasm of a body cell of a subject comprising administering the polyion complex according to any one of (1) to (10) to the subject.
  • a method for suppressing cell death in a lesioned part of a disease in a subject having an acute disease comprising administering the polyion complex according to any one of (1) to (10) to the subject The method wherein the mRNA encodes a cell death inhibitor.
  • a method for promoting hematopoiesis in a subject in need of promoting hematopoiesis comprising administering to the subject the polyion complex according to any one of (1) to (10) above, wherein mRNA is A method that encodes a hematopoietic factor.
  • a method for treating an olfactory disorder in a subject having an olfactory disorder comprising administering the polyion complex according to any one of (1) to (10) to the subject, wherein mRNA is derived from the brain
  • BDNF neurotrophic factor
  • a method for treating cancer in a subject having cancer comprising administering to the subject the polyion complex according to any one of (1) to (10) above, wherein mRNA is a cell growth inhibitory factor.
  • compositions for use in delivering mRNA into cells in the body comprising the polyion complex according to any one of (1) to (10) above.
  • the composition according to (18) above which is used for uniformly expressing a protein in a target tissue or a part thereof in a subject.
  • the composition according to (19) above, wherein the tissue is liver or mucosal tissue.
  • a pharmaceutical composition comprising the polyion complex according to any one of (1) to (10) above.
  • the pharmaceutical composition according to the above (21) for use in treating an acute disease in a subject in need thereof.
  • mRNA can be delivered into the cell (particularly the cytoplasm), but it is advantageous in that the induction of inflammation is suppressed and the protein can be expressed uniformly throughout the tissue at an early stage. is there.
  • FIG. 1A shows a formation scheme of a polyion complex (mRNA-encapsulating micelle) using mRNA as an anionic polymer and a block copolymer of PEG and polycation as a cationic polymer.
  • FIG. 1B shows protein expression in the cerebrospinal fluid of mice administered with mRNA-encapsulating micelles in the cervical subarachnoid space.
  • FIG. 2A is a photograph of luciferase monitoring of protein expression in mice administered with mRNA-encapsulating micelles from the tail vein by the hydrodynamics method.
  • FIG. 2B is a diagram showing changes in protein expression over time.
  • FIG. 1A shows a formation scheme of a polyion complex (mRNA-encapsulating micelle) using mRNA as an anionic polymer and a block copolymer of PEG and polycation as a cationic polymer.
  • FIG. 1B shows protein expression in the cerebrospinal fluid of mice administered with mRNA-encapsulating mic
  • FIG. 3A is a diagram showing protein expression in a section of a liver of a mouse administered with mRNA-encapsulated micelles from the tail vein by the hydrodynamics method
  • FIG. 3B is a diagram showing the image analysis result
  • FIG. 3C is a diagram showing reduction in degradation of mRNA delivered by mRNA-encapsulating micelles in the liver.
  • FIG. 4A shows a reduction in inflammation induced in mice administered with mRNA-encapsulating micelles.
  • FIG. 4B shows that modified RNA can extend the duration of protein expression.
  • FIG. 5 is a diagram showing hematopoietic recovery in mice administered with an mRNA-encapsulating micelle that encapsulates mRNA encoding erythropoietin as mRNA.
  • FIG. 5 is a diagram showing hematopoietic recovery in mice administered with an mRNA-encapsulating micelle that encapsulates mRNA encoding erythropoietin as mRNA.
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) using mRNA-encapsulating micelles in olfactory disturbance model mice.
  • FIG. 6A is a diagram showing the expression and persistence of mRNA in nasal mucosal epithelial cells.
  • FIG. 6B shows that mRNA is uniformly expressed throughout the nasal mucosal epithelial tissue.
  • FIG. 6C is a graph showing the effect of promoting the treatment of mRNA-encapsulated micelles on olfactory disturbance.
  • FIG. 6D is a cross-sectional photograph of nasal mucosal epithelial tissue showing the effect of promoting the treatment of mRNA micelles on olfactory disturbance.
  • FIG. 6A is a diagram showing the expression and persistence of mRNA in nasal mucosal epithelial cells.
  • FIG. 6B shows that mRNA is uniformly expressed throughout the nasal mucosal epithelial tissue.
  • FIG. 6C is a
  • FIG. 6E shows the expression of olfactory marker protein (OMP) in nasal mucosal epithelial tissue 28 days after treatment with mRNA-encapsulating micelles.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of Bcl-2 expression using mRNA-encapsulating micelles in fulminant hepatitis model mice.
  • OMP olfactory marker protein
  • the polyion complex of the present invention comprises (i) a block copolymer containing a cationic polymer and (ii) mRNA comprising at least a polyion complex.
  • the cationic polymer may be one in which a block copolymer is formed with a polyethylene glycol block.
  • the copolymer (i) and the mRNA (ii) form a polyion complex in the solution.
  • the polyion complex of the present invention can be provided in solution, preferably in aqueous solution.
  • mRNA means messenger RNA.
  • cytidine and uridine in mRNA may be modified.
  • Modified cytidines include, for example, 5-methyl-cytidine, and modified uridines include pseudouridine and 2-thio-cytidine.
  • the modified cytidine and uridine may be contained at 10 mol% or more, 20 mol% or more, or 30 mol% or more of the total cytidine and uridine.
  • the polyion complex of the present invention is considered to be in the form of micelles that encapsulate mRNA therein, as shown in the examples below, since there are few inflammatory reactions caused by mRNA. Therefore, in the present specification, the polyion complex of the present invention is also referred to as “mRNA-encapsulating micelle”.
  • mRNA-encapsulating micelle a micelle containing plasmid DNA instead of mRNA in the above-described mRNA-containing micelle.
  • micelle means a vesicle formed by a single layer of molecular film.
  • examples of micelles include micelles formed from amphiphilic molecules such as surfactants, and micelles formed from polyion complexes (PIC micelles). It is known that micelles are preferably modified on the outer surface with polyethylene glycol from the viewpoint of residence time in blood.
  • subject refers to mammals including humans.
  • the subject may be a healthy subject or a subject suffering from some disease.
  • the polycation block includes, for example, cationic natural amino acids and cationic unnatural amino acids, for example, cationic natural amino acids such as histidine, tryptophan, ornithine, arginine and lysine, and / or — (NH— ( A group represented by CH 2 ) 2 ) p —NH 2 , wherein p is an integer of 1 to 5.
  • a side chain for example, a cationic non-natural amino acid polymer block having the cationic side chain, for example, a cationic non-natural amino acid such as aspartic acid or glutamic acid having the cationic side chain. Examples include polymer blocks.
  • the polycation block is a group represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) p —NH 2 , where p is an integer of 1 to 5.
  • p is an integer of 1 to 5.
  • the cationic natural amino acid is preferably histidine, tryptophan, ornithine, arginine and lysine, more preferably arginine, ornithine and lysine, still more preferably ornithine and lysine, and still more preferably. Includes lysine.
  • the polycation block has the following general formula (I): ⁇ Where R 1 is a hydroxyl group, a protecting group, or a polymerizable group, R 4 is H, a protecting group, a hydrophobic group, or a polymerizable group; R 2 is methylene or ethylene; R 3 is a group represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) p —NH 2 ; X is any one amino acid selected from cationic natural amino acids; p is an integer from 1 to 5, preferably p is 2, 3 or 4; n is an integer from 2 to 5000, for example, an integer from 2 to 500, n 1 is any integer from 0 to 5000, for example, any integer from 0 to 500, n 3 is any integer from 0 to 5000, for example, any integer from 0 to 500, nn 1 -n 3 is an integer of 0 or more, Each repeating unit in the formula is shown in a specific order for convenience of description, but
  • the group represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) p —NH 2 is known to induce the escape of the polyion complex from the endosome, and its properties change depending on n. It has been known. Therefore, in the present invention, a group represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) p —NH 2 ⁇ wherein p is an integer of 1 to 5. ⁇ As a side chain can be preferably used. In the present invention, for example, the cationic side chain is a group represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) p —NH 2 , where p is 2 or 4. In this way, protein expression can be induced in cells early (eg, within 24 hours or within 12 hours).
  • the cationic side chain is a group represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) p —NH 2 (where p is 3).
  • an amino acid in an amino acid polymer, forms a peptide bond between its carboxyl group and amino group.
  • the polycation block In the polycation block, a cationic amino acid and an amino acid having a cationic side chain may be mixed. That is, in one embodiment of the present invention, the polycation block is a polymer of monomer units containing a cationic natural amino acid, a cationic unnatural amino acid, or a cationic natural amino acid and a cationic unnatural amino acid. In some embodiments of the invention, the bond between monomer units in the polycation block is a peptide bond.
  • the cationic unnatural amino acid is a group represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) p —NH 2 as a side chain ⁇ where n is an integer of 1 to 5 ⁇ It is an amino acid having
  • the polycation block includes a cationic natural amino acid and a group represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) p —NH 2 , where p is an integer of 1 to 5. is there.
  • 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, or 100% of the monomer units in the polymer have-(NH- (CH 2 2 ) a group represented by p -NH 2 (where p is an integer of 1 to 5). ⁇ .
  • the polycation block comprises a polymer of one or more amino acids selected from lysine, aspartic acid and glutamic acid as the main chain.
  • one or more amino acids selected from lysine, aspartic acid and glutamic acid account for 80%, 90%, 95% or 98% of the monomer units in the polymer.
  • the main chain of the polycation block consists of a polymer of one or more amino acids selected from lysine, aspartic acid and glutamic acid.
  • a group in which substantially all aspartic acid and glutamic acid are represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) p —NH 2 as a side chain, where p is an integer of 1 to 5 It is. ⁇ .
  • the group represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) p —NH 2 is bonded to the carboxylic acid group of aspartic acid or glutamic acid by a peptide bond.
  • the polycation block includes the following general formula (II): ⁇ Where R 1 is a hydroxyl group, a protecting group, or a polymerizable group, R 4 is H, a protecting group, a hydrophobic group, or a polymerizable group; R 2 is methylene or ethylene; R 3 is a group represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) p —NH 2 ; p is an integer from 1 to 5, preferably p is 2, 3 or 4; q is an integer from 1 to 5, preferably q is 2, 3 or 4; n is an integer from 2 to 5000, for example, an integer from 2 to 500, n 1 is any integer from 0 to 5000, for example, any integer from 0 to 500, n 2 is any integer from 0 to 5000, for example, any integer from 0 to 500, nn 1 -n 2 is an integer of 0 or more, Each repeating unit in the formula is shown in a specific order for convenience
  • poly (Asp (diethyltriamine)) (hereinafter referred to as “poly (Asp (DET))”) is used as the polycation block.
  • the structure of poly Asp (DET) is each represented by the following general formula (III).
  • R 1 and R 4 must not be a bond.
  • R 1 is a hydroxyl group, a protecting group, a hydrophobic group, or a polymerizable group
  • R 4 is H, a protecting group, a hydrophobic group, or a polymerizable group
  • R 3 is a group represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) 2 —NH 2
  • n is an integer of 0 to 5000, for example, an integer of 0 to 500
  • m is an integer from 0 to 5000, for example, an integer from 0 to 500
  • m + n is an integer from 2 to 5000, for example, an integer from 2 to 500
  • n ⁇ m is an integer of 0 or more
  • Each repeating unit in the formula is shown in a specific order for convenience of description, but each repeating unit can be present in any order, each repeating unit may be present randomly, and each repeating unit is They may be the same or different, and each repeating unit may be the same or different, However, when the polycation block forms a
  • examples of the protecting group include a C 1-6 alkylcarbonyl group, preferably an acetyl group, and examples of the hydrophobic group include benzene, naphthalene, and anthracene. , Pyrene and derivatives thereof, or a C 1-6 alkyl group, and examples of the polymerizable group include a methacryloyl group and an acryloyl group.
  • the polycation block may be linked to PEG.
  • the compounds of the above formulas (I), (II) and (III) can form block copolymers with polyethylene glycol via any of the bonds R 1 and R 4 .
  • PEG has an average degree of polymerization of 5 to 20000, preferably 10 to 5000, more preferably 40 to 500, but is not particularly limited as long as the formation of a polyion complex between a block copolymer and mRNA is not inhibited.
  • R 1 or R 4 which is a bond and PEG may be bonded via a linker.
  • the linker is, for example, — (CH 2 ) r —NH— ⁇ where r is an integer of 1 to 5. ⁇ Or — (CH 2 ) s —CO— ⁇ where s is an integer of 1 to 5. And is preferably linked to the polycation block of formula (I), (II) and (III) by a peptide bond.
  • the linker is preferably bonded via PEG and the O atom of PEG on the methylene side. Another terminal carbon atom of PEG may be substituted with a hydroxyl group, a methoxy group or a protecting group.
  • a block copolymer of PEG-linker-polycation block is converted into a cationic polymer (wherein PEG, linker and polycation block are as defined above).
  • WO 2006/085664 discloses a technique for encapsulating DNA with low immunogenicity in micelles.
  • WO2006 / 085664 uses poly Asp (DET) as a cationic polymer or a block copolymer of PEG and poly Asp (DET), and is formed from the cationic polymer and plasmid DNA.
  • the disclosed pDNA-encapsulated micelles are disclosed to be less toxic in vivo and to efficiently express genes in plasmid DNA.
  • mRNA is known to have extremely high immunogenicity, and in order to deliver mRNA into the cytoplasm without inflammation, the mRNA must be completely processed throughout the process until delivery to the cytoplasm. It was thought that it was necessary to keep it contained in the micelle. Therefore, introduction of mRNA into the body was expected to be difficult even when included in micelles.
  • the mRNA-encapsulating micelle of the present invention surprisingly hardly caused an inflammatory reaction in the body. This suggests that the mRNA-encapsulating micelle of the present invention can deliver mRNA specifically into the cytoplasm.
  • the present invention provides a composition for delivering mRNA to the cytoplasm in the body of the subject, comprising a polyion complex of a cationic polymer and mRNA. That is, the composition of the present invention is an mRNA delivery agent for delivering mRNA to the cytoplasm of a subject's body.
  • the polyion complex of the present invention can uniformly express mRNA in a wide range of cells, can rapidly express mRNA after administration, and / or hardly cause an inflammatory reaction in the body. Therefore, the polyion complex of the present invention is preferable for the treatment of diseases that require expression of mRNA in a wide range of cells and that require rapid mRNA expression, for example, diseases with a rapid disease progression or acute diseases. Can be used.
  • the present invention provides a composition for use in delivering mRNA into the body of a subject having an early disease or acute disease, comprising the polyion complex of the present invention.
  • a pharmaceutical composition for treating a disease whose disease state progresses rapidly or an acute disease, comprising the polyion complex of the present invention comprising the polyion complex of the present invention.
  • the progression or worsening of symptoms can be suppressed by cell death suppression treatment.
  • the polyion complex of the present invention can be advantageously used for the treatment of such diseases if mRNA is used as a cell death inhibitor.
  • a disease involving rapid apoptosis of cells the progression or worsening of symptoms can be suppressed by an apoptosis inhibitor treatment.
  • the polyion complex of the present invention can be advantageously used for the treatment of such diseases if mRNA is used as an anti-apoptotic factor.
  • Examples of the disease accompanied by rapid cell death or apoptosis of cells include acute spinal cord injury or fulminant hepatitis.
  • apoptosis occurs in a wide range of affected cells. Specifically, in acute spinal cord injury, many nerve cells cause cell death at the site of injury. In fulminant hepatitis, extensive liver cell death occurs in the liver, resulting in liver failure. In acute spinal cord injury and fulminant hepatitis, the treatment of suppressing cell death uniformly throughout the tissue suppresses the deterioration of symptoms or improves the symptoms. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention capable of expressing the protein uniformly throughout the tissue can be preferably used for the treatment of these diseases.
  • the pharmaceutical composition of the present invention suppresses cell death, and includes, for example, mRNA encoding a cell death inhibitor.
  • the pharmaceutical composition of the present invention suppresses apoptosis, and includes, for example, mRNA encoding an anti-apoptotic factor.
  • the anti-apoptotic factor is not particularly limited, and examples thereof include FLIP, Mcl-1, Xiap, crmA, Bcl-2, and Bcl-xL, and Bcl-2 can be preferably used.
  • mRNA is mRNA encoding an anti-apoptotic factor.
  • the polyion complex of the present invention can efficiently deliver mRNA to cells, it can be applied to the treatment of various other diseases.
  • mRNA used in the present invention include growth factors, cell growth factors, cell growth inhibitory factors, cell death promoting factors, cell death inhibitory factors, tumor suppressor gene products, and mRNAs encoding transcription factors. If there is, it can be appropriately selected according to the purpose.
  • a disease or condition in a subject can be treated by administering, as a polyion complex, mRNA that encodes the growth factor of the particular cell to a subject that needs to grow a particular cell.
  • the growth factor means an endogenous protein that promotes proliferation and differentiation of a specific cell, and is not particularly limited.
  • epidermal growth factor EGF
  • insulin-like growth factor IGF
  • nerve growth factor NGF
  • Brain derived neurotrophic factor BDNF
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • PDGF platelet derived growth factor
  • EPO erythropoietin
  • TPO basic fibroblast growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • a cell growth inhibitory factor For example, p21, p17, p16, and p53 are mentioned. Although it does not specifically limit as a cell death promotion factor, For example, Smac / Diablo, an apoptosis induction factor (AIF), HtrA2, Bad, Bim, Bax, p53, caspase 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10 (eg caspase 2, 3, 6, 7, 8, 9 and 10, preferably caspase 3, 6 and 7), Fas ligand (FasL), tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) and For example, FoxO1.
  • AIF apoptosis induction factor
  • HtrA2 HtrA2
  • Bad Bim
  • Bax Bax
  • p53 caspase 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10
  • caspase 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10 eg caspase 2, 3, 6, 7, 8, 9 and 10, preferably caspase
  • the tumor suppressor gene product is not particularly limited.
  • p53 retinoblastoma gene (Rb), adenomatous adenomatous gene (APC), neurofibromatosis type 1 gene (NF1), neurofibromatosis type 2 Gene (NF2), WT1, VHL, BRCA1, BRCA2, CHEK2, Maspin, p73, Smad4, MSH2, MLH1, PMS2, DCC, phosphatase tensin homolog (PTEN), SDHD, p16, p57 Kip2 , PTC, TSC1, TSC1, TSC1, TSC1 And EXT2.
  • the transcription factor is not particularly limited.
  • Runt-related transcription factor 1 (Runx1), p53, c-fos, c-Jun, CREB, C / EBP, MyoD, c-Myc, c-Myb, Oct3 / 4 NF- ⁇ B, NF-AT, Mef-2 and extracellular signal response factor (SRF).
  • a pharmaceutical composition for use in promoting hematopoiesis in a subject for example, an anemia patient in need of promoting hematopoiesis, wherein mRNA is a hematopoietic factor (eg, colony stimulating factor).
  • a pharmaceutical composition comprising the polyion complex of the present invention encoding erythropoietin) is provided.
  • a pharmaceutical composition for use in treating an olfactory disorder in a subject having an olfactory disorder associated with destruction of olfactory tissue eg, mucosal epithelial cells or olfactory nerves
  • mRNA is
  • a pharmaceutical composition comprising the polyion complex of the present invention encoding brain-derived neurotrophic factor (BDNF).
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • a pharmaceutical composition for use in treating cancer in a subject having cancer comprising the polyion complex of the present invention, wherein mRNA is a cell growth inhibitory factor, a cancer suppressor gene
  • a pharmaceutical composition is provided that encodes a product or cell death promoting factor.
  • cancer tissue it is desired to suppress the growth of all cancer cells, and the pharmaceutical composition of the present invention that can uniformly express a growth inhibitory factor throughout the cancer tissue can be particularly preferably used.
  • the polyion complex of the present invention preferably has a particle size of 20-100 nm. By doing in this way, the polyion complex of this invention becomes easy to penetrate
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain an excipient.
  • a method for delivering mRNA to the cytoplasm of a body cell of a subject comprising administering the polyion complex of the present invention to the subject.
  • a method for delivering mRNA to the cytoplasm of a body cell of a subject which is used to uniformly express a protein in a tissue or a part thereof in the subject, the subject being a polyion complex of the present invention.
  • a method is provided that comprises administering, wherein the mRNA encodes a protein that is to be expressed.
  • the tissue is in some embodiments liver or mucosal tissue (eg, olfactory epithelial tissue).
  • the hydrodynamics method is a method in which a drug solution having the same volume as the blood volume is administered from a vein in a short time, and the drug solution is permeated into the organ by the pressure at the time of administration.
  • a hydrodynamics method is known in which a part is limited. For example, after temporarily stopping the blood flow around the target part, the target part has a chemical solution of the same amount as the amount of blood contained in the part. Is also known that allows the drug solution to penetrate into the target tissue and can be used in the present invention.
  • the PIC of the present invention penetrates deep into mucosal tissue by application and is taken up by the tissue or a part thereof.
  • a suitable administration method and deliver the polyion complex to various tissues.
  • the administration method used in the present invention include subcutaneous injection, intramuscular injection, intraarticular injection, and intrathecal injection.
  • a method of infiltrating the polyion complex in a carrier such as a collagen sponge and placing it under the skin or muscle layer is also known and can be used in the present invention.
  • a method for inhibiting cell death in a lesion of the disease, wherein the polyion complex of the present invention in which mRNA encodes a cell death inhibitor is administered to the subject.
  • a method comprising:
  • cell death is apoptosis and the cell death inhibitor is an anti-apoptotic factor.
  • a method for suppressing cell death in a subject having a disease associated with enhanced cell death wherein the polyion complex of the present invention in which mRNA encodes a cell death inhibitor is administered to the subject.
  • a method comprising is provided.
  • cell death is apoptosis and the cell death inhibitor is an anti-apoptotic factor.
  • a method for treating fulminant hepatitis or acute spinal cord injury comprising administering to a subject a polyion complex of the present invention, wherein the mRNA encodes a cell death inhibitor.
  • the cell death inhibitor is an anti-apoptotic factor.
  • a method for promoting hematopoiesis in a subject in need of promoting hematopoiesis comprising administering the polyion complex of the present invention to a subject, mRNA Is provided that encodes a hematopoietic factor (eg, colony stimulating factor or erythropoietin).
  • a hematopoietic factor eg, colony stimulating factor or erythropoietin
  • a method for treating an olfactory disorder in a subject having an olfactory disorder involving destruction of olfactory tissue comprising administering the polyion complex of the present invention to the subject And a method is provided wherein the mRNA encodes brain-derived neurotrophic factor (BDNF).
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • a method for treating cancer in a subject having cancer comprising administering to the subject the polyion complex of the present invention, wherein the mRNA is a cell growth inhibitory factor, a tumor suppressor gene product.
  • a method is provided that encodes a cell death promoting factor.
  • Example 1 Production of Polyion Complex First, a polyion complex containing mRNA was produced.
  • a block copolymer capable of forming a polyion complex with mRNA having a negative charge a block copolymer of polyethylene glycol (PEG) and a polycation was used (FIG. 1A).
  • PEG-polycation block copolymer a PEG-pAsp (DET) block copolymer was used.
  • PEG-pAsp (DET) block copolymer a PEG-pAsp (DET) block copolymer was synthesized. Specifically, polyethylene glycol (MeO-PEG-NH 2 ) having a number average molecular weight of 12,000, one end of which is a methoxy group and the other end of an aminopropyl group, was dissolved in methylene chloride.
  • MeO-PEG-NH 2 polyethylene glycol having a number average molecular weight of 12,000, one end of which is a methoxy group and the other end of an aminopropyl group
  • BLA-NCA ⁇ -Benzyl-L-aspartate-N-carboxylic acid anhydride
  • DMF N, N-dimethylformamide
  • MEF polyethylene glycol-poly ( ⁇ -benzyl-L-aspartate) block copolymer
  • MeO-PEG-PBLA The amino terminus of MeO-PEG-PBLA was acetylated by reacting with acetic anhydride to obtain MeO-PEG-PBLA-Ac. From the analysis by 1 H-NMR, it was found that the number average molecular weight of the PBLA moiety was 14,000 and the degree of polymerization was 70.
  • MeO-PEG-PBLA-Ac was reacted with diethylenetriamine to obtain a MeO-PEG-pAsp (DET) block copolymer.
  • MeO-PEG-PBLA-Ac was dissolved in benzene and lyophilized. Lyophilized MeO-PEG-PBLA-Ac was dissolved in N-methyl-2-pyrrolidone (NMP). Thereafter, the obtained solution was dropped into an NMP solution of diethylenetriamine and stirred at 5 to 10 ° C. for 1 hour. Further, the mixture was neutralized with hydrochloric acid under ice-cooling, dialyzed and freeze-dried to obtain a MeO-PEG-pAsp (DET) block copolymer.
  • NMP N-methyl-2-pyrrolidone
  • the dialysis was carried out at 4 ° C. using a 0.01N hydrochloric acid aqueous solution as the external dialysis solution and finally as pure water. From the analysis by 1 H-NMR, it was found that the polymerization degree of the pAsp (DET) portion of the obtained MeO-PEG-pAsp (DET) block copolymer was 63.
  • mRNA mRNA was prepared by performing in vitro transcription using plasmid DNA as a template and using mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit (Ambion, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). First, plasmid DNA was introduced with a luciferase gene, a GFP gene, an erythropoietin gene or a Bcl-2 gene under the control of a T7 promoter, and a 120-base polyA sequence was incorporated downstream of the gene. Modified mRNA was obtained by adding 5-methyl-CTP, pseudo-UTP and 2-thio-UTP (TriLink BioTechnologies, San Diego, CA, USA) as bases during in vitro transcription.
  • RNA concentration was measured using absorbance at 260 nm.
  • the particle size of micelles obtained by dynamic light scattering (DLS) was measured.
  • the particle size of the obtained mRNA-encapsulating micelle was about 50 nm, and the particle size of the obtained plasmid DNA-encapsulated micelle was about 90 nm.
  • Example 2 Administration test of mRNA-encapsulated micelles
  • the micelles obtained in Example 1 were administered to experimental animals to examine the expression of protein from mRNA.
  • mice As an experimental animal, Balb / c ( ⁇ , 7 weeks old) purchased from Charles River, Japan was used. mRNA-encapsulating micelles were administered to mice by the hydrodynamics method. That is, 5 ⁇ g of mRNA-encapsulated micelles or plasmid DNA-encapsulated micelles were each diluted with 1.8 mL of physiological saline, and the entire amount was administered from the mouse tail vein over 5 seconds. It is known that drugs administered by the hydrodynamics method are efficiently taken up by hepatocytes.
  • Gaussia luciferase As the secreted protein, Gaussia luciferase (GLuc) was used. MRNA-encapsulated micelles or GLuc protein were administered to the cervical subarachnoid space, and the amount of protein in the cerebrospinal fluid after administration was monitored over 5 days.
  • Example 3 Delivery of mRNA to liver
  • mRNA-encapsulated micelles were administered to mice, and the accumulation and expression of mRNA in the liver were monitored.
  • FIGS. 2A and B strong luciferase luminescence was observed in mice administered with mRNA-encapsulated micelles, but only weak fluorescence was observed in mice administered with naked mRNA. It was. In addition, luciferase luminescence persisted for a long time in mice administered with mRNA-encapsulating micelles (FIG. 2B).
  • livers were collected 24 hours after administration from mice administered micelles containing mRNA or plasmid DNA expressing GFP.
  • the obtained liver was fixed overnight with a phosphate buffer solution (Wako Pure Chemical Industries) containing 4% paraformaldehyde, and then at room temperature in a PBS solution containing 10%, 15% and 20% sucrose, respectively.
  • OCT optimal cutting temperature
  • GFP immunostaining was performed by reacting overnight at room temperature with 500-fold diluted anti-GFP rabbit IgG (Invitrogen) as the primary antibody, and then with 200-fold diluted Alexa 488 goat anti-rabbit IgG (Invitrogen) at room temperature as the secondary antibody. The reaction was carried out for 1 hour. The antibody-stained sections were observed using an In Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK), which is a fluorescence microscope equipped with an image analysis function.
  • In Cell Analyzer 1000 GE Healthcare, Buckinghamshire, UK
  • FIG. 3A As a result, as shown in FIG. 3A, all cells uniformly expressed GFP protein in the liver of mice administered with mRNA-encapsulated micelles, but some cells in GFP protein-encapsulated micelles contained GFP protein. While strong expression was shown, GFP protein expression was not seen in many cells. This was also supported by the fluorescence intensity distribution (FIG. 3B).
  • the administered mRNA amount was quantified by both a method using a fluorescently labeled nucleic acid and a quantitative PCR method.
  • quantitative PCR the amount of mRNA in which the full length of the sequence is maintained is quantified, and in the method using a fluorescence-labeled nucleic acid, all mRNAs including degraded mRNA are quantified.
  • mRNA-containing micelles or naked mRNA was administered to mice, and the liver was collected 10 minutes later to quantify mRNA.
  • the method using fluorescently labeled nucleic acid was performed as follows. Cy5-labeled mRNA was introduced into micelles with or without labeling by Label IT TM Nucleic Labeling Kit, Cy5Mi (Mirus, Madison, WI, USA), and then the liver was collected and homogenized. Thereafter, the amount of fluorescence in the homogenizing solution was measured with a fluorescence plate reader (TECAN, Mannedorf, Switzerland).
  • Quantitative PCR was performed as follows. After introducing luciferase-expressing mRNA in micelles with or without inclusion, mRNA was extracted from the collected liver using RNA ⁇ ⁇ easy mini preparation kit (Qiagen). In quantitative PCR, primer sets of TGCAAAAGATCCCTCAACTGTG and AATGGGAAGTCACGAAGTGTG were used, and detection was performed using ABIAPrism 7500 Sequence Detector (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). In any method, the amount of mRNA introduced into the liver was determined by the ratio (%) of the amount of mRNA introduced into the liver in the amount of administered mRNA.
  • Example 4 Inflammatory reaction by mRNA-encapsulating micelles
  • the inflammatory reaction produced by introducing mRNA-encapsulating micelles was examined.
  • mice administered with physiological saline were used.
  • the production amount of the inflammatory cytokine IL-6 was extremely low as compared with the case where naked mRMA was introduced (FIG. 4A).
  • the production amount of the inflammatory cytokine IL-6 was low compared with the case where the unmodified mRNA was introduced.
  • the production amount of the inflammatory cytokine IL-6 can be reduced by inclusion in the micelle. (FIG. 4A). Since mRNA is known for its strong immunogenicity, it was surprising that inflammatory cytokine production was comparable to controls.
  • MRNA-encapsulated micelles are thought to be taken up by cells by endocytosis. And since the pH in endosome is low, the mRNA-encapsulated micelle of the present invention changes the amine structure of the side chain and increases its membrane fusion property, which is considered to cause the micelle to migrate from endosome to cell (Miyata et al., J. Am. Chem. Soc., 130 (48): 16287-16294 (2008)). Toll-like receptor (TLR) is expressed on the inner surface of endosomes, and innate immunity is induced when mRNA is recognized. Therefore, when mRNA is released within the endosome, a strong innate immune response is elicited even if the amount is small. However, the mRNA-encapsulating micelle of the present invention surprisingly hardly caused an inflammatory reaction.
  • TLR Toll-like receptor
  • the micelle of the present invention is a micelle encapsulating mRNA and has high selectivity capable of delivering mRNA into the cytoplasm without being released in endosomes. It is also believed that this surprising property of the mRNA-encapsulating micelles of the present invention enabled efficient delivery of mRNA to the cells.
  • luciferase mRNA was used, and the expression level of luciferase was measured by the method described in Example 3.
  • Example 5 Hematopoietic recovery experiment In this example, recovery of hematopoiesis was confirmed in mice administered with micelles containing erythropoietin mRNA.
  • Blood was collected from mice administered with micelles containing erythropoietin gene mRNA by the method described in Example 2 28 or 56 days after administration, and hematocrit and hemoglobin levels were measured with pocH-100i (Sysmex, Hyogo) did.
  • mice administered with mRNA-encapsulating micelles showed a significant increase in both hematocrit and hemoglobin, and an effective and sustained hematopoietic effect (FIG. 5).
  • Example 6 Treatment of olfactory disorder model animal by nasal administration
  • treatment of an olfactory disorder model animal by nasal administration of mRNA-containing micelles was attempted.
  • mice were kept in a supine position under anesthesia, and 50 ⁇ L of mRNA-containing micelle solution (containing 10 ⁇ g of mRNA) was dropped onto the nostril.
  • mRNA-containing micelle solution containing 10 ⁇ g of mRNA
  • 10 ⁇ g each of naked plasmid DNA (pDNA) and mRNA not encapsulated in micelles was dropped into the nostril.
  • micelles encapsulating mRNA encoding GFP were prepared by the same method as the method for preparing luciferase mRNA-encapsulating micelles of this example. 50 ⁇ L of mRNA-containing micelle solution (containing 10 ⁇ g of mRNA) was dropped onto the nostril. Twenty-four hours after administration, the mice were euthanized, the nose was excised, and a frozen section having a thickness of 5 ⁇ m was prepared from the leading edge of the olfactory bulb.
  • Immunohistochemical staining of the expressed GFP protein was performed according to a conventional method.
  • a primary antibody 500-fold diluted anti-GFP rabbit IgG (manufactured by Invitrogen) was used, and reacted with a section overnight at room temperature.
  • Alexa 488 goat anti-rabbit IgG (manufactured by Invitrogen) diluted 200-fold was used and reacted with a section at room temperature for 1 hour. Nuclei were stained with a blocking solution containing Hoechst 33342 (Dojindo, Kumamoto, Japan).
  • the obtained sections were observed using a fluorescence microscope (Axiovert 200 fluorescence microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)) as a microscope and 20 ⁇ EC Plan Neofuar objective (Carl Zeiss) as an objective lens.
  • olfactory disturbance behavior test was performed by evaluating the time until the mouse found a piece of cheese. Specifically, a mouse in which olfactory disturbance was induced by methimazole was used as a model of olfactory disturbance. First, 150 mg / kg body weight of methimazole was intraperitoneally administered to mice to induce olfactory disturbance. Twenty-four hours after the administration of methimazole, olfactory disturbance model mice (7 mice) were placed one by one in the cage and fasted for 24 hours.
  • mice containing mRNA encoding brain-derived neurotrophic factor (BDNF) were prepared by the same method as in Example 1, and 50 ⁇ L of the resulting micelle solution (containing 10 ⁇ g of mRNA) was administered nasally to the nostrils of mice. Control mice received buffer only.
  • the behavioral test was performed 1 day, 3 days, 5 days, 7 days or 10 days after micelle administration. In this test, mice were fasted 24 hours before the behavioral test. A small piece of cheese was placed in the corner of a 4 cm thick floor covering cage, and the time from when the mouse found the cheese and started grasping or feeding was measured. The test was repeated four times at 10 minute intervals. The cut-off value for the required time was set to 5 minutes, and when the mouse could not find cheese by that time, the required time was recorded as 5 minutes.
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • a blocking solution containing 5000-fold diluted goat anti-OMP antibody (Wako Chemical USA, Richmond, VA) was used to react with the section overnight at room temperature, and the secondary antibody was diluted 400-fold.
  • a blocking solution containing conjugated secondary antibody (manufactured by Invitrogen) was reacted with the section at room temperature for 1 hour. Nuclei were stained with roLong Gold Antifade Reagent with DAPI (Invitrogen).
  • the mRNA-encapsulating micelle of the present invention was able to treat an olfactory disorder model by nasal administration.
  • Example 7 Therapeutic effect on fulminant hepatitis
  • treatment of fulminant hepatitis which is known to cause rapid cell death extensively by administering an mRNA-encapsulating micelle encoding a factor that suppresses apoptosis. Tried.
  • a fulminant hepatitis model was prepared by intraperitoneally administering 5 ⁇ g of Fa-2 ligand (FasL), Jo-2 (BD Bioscience). 15 minutes after preparation, mice with fulminant hepatitis were administered micelles containing Bcl-2 gene mRNA, plasmid DNA or B saline into which Bcl-2 gene was expressed so that it could be expressed as described above. Liver was collected. Liver sections were prepared by the above method, and TUNEL staining treatment was performed using in situ cell death detection kit and TMR red (Roche, Basel, Switzerland). After observing with In Cell Analyzer 1000, the proportion of TUNEL positive cells was quantified with the software of In Cell Analyzer 1000. The average number of cells per visual field was 2,000, and more than 5 visual fields per mouse were used for analysis.
  • Fa-2 ligand Fa-2 ligand
  • Jo-2 BD Bioscience
  • the mRNA-encapsulating micelle of the present invention is evaluated as providing an effective therapeutic method for a disease in which a wide range of cells rapidly change and the pathological condition rapidly deteriorates.
  • MRNA has been considered unsuitable as a candidate drug for introduction due to its strong immunogenicity and high instability.
  • mRNA-encapsulated micelles surprisingly have little immunogenicity and provide a method for expressing proteins uniformly, rapidly and continuously in all cells in vivo. It was. mRNA is expected to provide a safe gene therapy because it does not cause integration into the genome.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

［課題］本発明は、ｍＲＮＡ送達用組成物および医薬組成物を提供する。 ［解決手段］ポリカチオン性ポリマーとメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とを含んでなる、ポリイオンコンプレックス。

Description

ｍＲＮＡ送達用組成物
　本発明は、ｍＲＮＡとポリカチオン性ポリマーとのポリイオンコンプレックスおよびｍＲＮＡ送達用組成物並びに医薬組成物に関する。
　体内の好適な箇所に薬剤を送り届けるドラッグデリバリーシステムは、副作用の少ない新しい医薬を提供するものとして研究開発が行われている。その中で、ポリイオンコンプレックス（以下、「PIC」ともいう）を用いたドラックデリバリーシステムは、ナノミセルに薬物を包接させて疾患部位特異的に薬物を送達することが可能な技術として注目を集めている。「ポリイオンコンプレックス」とは、一般的に、ＰＥＧとアニオン性ブロックとの共重合体と、ＰＥＧとカチオン性ブロックとの共重合体とを溶液中で混合することにより得られる、両ブロック共重合体のカチオン性ブロックとアニオン性ブロックとの間で形成されるイオン層を意味する。ＰＥＧと上記の荷電性連鎖とを結合させることにより、ポリイオンコンプレックスが凝集して沈殿することが抑制されるとともに、粒径数十ｎｍの単分散なコア－シェル構造を有するナノ微粒子の形成が促進される。この際、ＰＥＧはナノ微粒子の外殻（シェル）を覆うため、生体適合性が高く、血中滞留時間を向上させる点で都合がよいことが知られている。
　ＰＩＣを応用した技術として、特に核酸を副作用少なく体内に送達できるシステムが開発されてきた（特許文献１および２）。特許文献１および２では、ＤＮＡと新しいカチオン性ポリマーとのポリイオンコンプレックスが提案されている。
特許第４５３５２２９号公報 特許第５０６１３４９号公報
　本発明は、ｍＲＮＡ送達用組成物および医薬組成物ならびにこれらに有用なｍＲＮＡとポリカチオン性ポリマーとのポリイオンコンプレックスを提供する。
　本発明者らは、ｍＲＮＡとポリカチオン性ポリマーとのポリイオンコンプレックスが、炎症をほとんど誘発させずにｍＲＮＡを対象の体内の細胞内に送達できることを見出した。本発明者らはまた、上記ポリイオンコンプレックスが、ｍＲＮＡを対象の体内の細胞に一様に発現させることができることを見出した。本発明者らはさらに、上記ポリイオンコンプレックスが、ｍＲＮＡを対象の体内の細胞内で迅速に発現させることを見出した。本発明者らはさらにまた、上記ポリイオンコンプレックスが、ｍＲＮＡを対象の体内の細胞内で持続的に発現させることを見出した。本発明は上記知見に基づいてなされたものである。
　すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）カチオン性ポリマーとメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とを含んでなる、ポリイオンコンプレックス。
（２）カチオン性ポリマーが、ポリエチレングリコールブロックとのブロック共重合体を形成している、上記（１）に記載のポリイオンコンプレックス。
（３）カチオン性ポリマーが、
　カチオン性天然アミノ酸、
　カチオン性非天然アミノ酸、または
　カチオン性天然アミノ酸およびカチオン性非天然アミノ酸
　を含むモノマー単位の重合体である、上記（１）または（２）に記載のポリイオンコンプレックス。
（４）カチオン性非天然アミノ酸が、側鎖として－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）ｐ－ＮＨ２で表される基｛ここで、ｐは１～５の整数である｝を有するアミノ酸である、上記（３）に記載のポリイオンコンプレックス。
（５）カチオン性ポリマーが、下記一般式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 ｛式中、
　Ｒ１は、水酸基、保護基、または重合性基であり、
　Ｒ４は、Ｈ、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
　Ｒ２は、メチレンまたはエチレンであり、
　Ｒ３は、－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）ｐ－ＮＨ２で表される基であり、
　Ｘは、カチオン性天然アミノ酸から選択されるいずれか１のアミノ酸であり、
　ｐは、１～５のいずれかの整数であり、好ましくは、ｐは、２、３または４であり、
　ｎは、２～５０００のいずれかの整数であり、
　ｎ１は、０～５０００のいずれかの整数であり、
　ｎ３は、０～５０００のいずれかの整数であり、
　　ｎ－ｎ１－ｎ３は、０以上の整数であり、式中の各繰り返し単位は記載の都合上特定の順で示されているが、各繰り返し単位は順不同に存在することができ、各繰り返し単位はランダムに存在してもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよい。｝
　で表されるポリカチオンブロックであり、
　但し、ポリカチオンブロックが、ポリエチレングリコールと共重合体を形成している場合には、Ｒ１またはＲ４は結合を表し、ポリエチレングリコールは、結合であるＲ１またはＲ４を介してポリカチオンブロックと共重合体を形成している、
　上記（１）～（４）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
（６）ポリカチオンブロックが、下記一般式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ｛式中、
　Ｒ１は、水酸基、保護基、または重合性基であり、
　Ｒ４は、Ｈ、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
　Ｒ２は、メチレンまたはエチレンであり、
　Ｒ３は、－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）ｐ－ＮＨ２で表される基であり、
　ｐは、１～５のいずれかの整数であり、
　ｑは、１～５のいずれかの整数であり、
　ｎは、２～５０００のいずれかの整数であり、
　ｎ１は、０～５０００のいずれかの整数であり、
　ｎ２は、０～５０００のいずれかの整数であり、
　ｎ－ｎ１－ｎ２は、０以上の整数であり、
式中の各繰り返し単位は特定の順で示されているが、各繰り返し単位は順不同に存在することができ、各繰り返し単位はランダムに存在してもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよい。｝
で表されるポリカチオンブロックであり、
　但し、ポリカチオンブロックが、ポリエチレングリコールと共重合体を形成している場合には、Ｒ１またはＲ４は結合を表し、ポリエチレングリコールは、結合であるＲ１またはＲ４を介してポリカチオンブロックと共重合体を形成している、
　上記（５）に記載のポリイオンコンプレックス。
（７）ｍＲＮＡが、成長因子、細胞増殖因子、細胞増殖抑制因子、細胞死促進因子、細胞死抑制因子、癌抑制遺伝子産物または転写因子をコードするｍＲＮＡである、上記（１）～（６）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
（８）細胞増殖因子が、造血因子または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である、上記（７）に記載のポリイオンコンプレックス。
（９）細胞死抑制因子が、Ｂｃｌ－２である、上記（７）に記載のポリイオンコンプレックス。
（１０）ｍＲＮＡが、修飾されたシチジンおよびウリジンを含んでなる、上記（１）～（９）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス。
（１１）ｍＲＮＡを対象の体内細胞の細胞質に送達する方法であって、上記（１）～（１０）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなる、方法。
（１２）対象において、対象の組織またはその一部に均一にタンパク質を発現させるための上記（１１）に記載の方法であって、上記（１）～（１０）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなる、方法。
（１３）組織が肝臓または粘膜組織である、上記（１２）に記載の方法。
（１４）急性疾患を有する対象において、該疾患の病変部における細胞死を抑制する方法であって、上記（１）～（１０）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが細胞死抑制因子をコードするものである、方法。
（１５）造血を促進させる必要のある対象において造血を促進させる方法であって、上記（１）～（１０）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが造血因子をコードするものである、方法。
（１６）嗅覚障害を有する対象において嗅覚障害を処置する方法であって、上記（１）～（１０）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコードするものである、方法。
（１７）癌を有する対象において癌を処置する方法であって、上記（１）～（１０）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが細胞増殖抑制因子、癌抑制遺伝子産物または細胞死促進因子をコードするものである、方法。
（１８）上記（１）～（１０）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスを含んでなる、ｍＲＮＡを体内の細胞内に送達することに用いるための組成物。
（１９）対象において、対象の組織またはその一部に均一にタンパク質を発現させることに用いるための、上記（１８）に記載の組成物。
（２０）組織が肝臓または粘膜組織である、上記（１９）に記載の組成物。
（２１）上記（１）～（１０）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックスを含んでなる、医薬組成物。
（２２）急性疾患をその必要のある対象において処置することに用いるための、上記（２１）に記載の医薬組成物。
（２３）疾患が、劇症肝炎または急性期の脊髄損傷である、上記（２２）に記載の医薬組成物。
（２４）疾患がアポトーシスの亢進を伴う疾患である、上記（２２）または（２３）に記載の医薬組成物。
（２５）嗅覚障害をその必要のある対象において処置することに用いるための、上記（２１）に記載の医薬組成物。
（２６）対象における造血を促進させることに用いるための、上記（２１）に記載の医薬組成物であって、ｍＲＮＡが造血因子をコードする、医薬組成物。
　本発明によれば、ｍＲＮＡの細胞内（特に細胞質）に送達することができるが、炎症の誘発が抑制され、かつ、早期にかつ組織全体に均一にタンパク質を発現させることができる点で有利である。
図１Ａは、アニオン性ポリマーとしてｍＲＮＡを用い、カチオン性ポリマーとしてＰＥＧとポリカチオンとのブロックコポリマーを用いたポリイオンコンプレックス（ｍＲＮＡ内包ミセル）の形成スキームを示す。図１Ｂは、頚部クモ膜下腔にｍＲＮＡ内包ミセルを投与したマウスの髄液中でのタンパク質発現を示す。 図２Ａは、ハイドロダイナミクス法によりｍＲＮＡ内包ミセルを尾静脈から投与したマウスのタンパク質発現をルシフェラーゼによりモニターした写真である。図２Ｂは、タンパク質発現の経時的変化を示す図である。 図３Ａは、ハイドロダイナミクス法によりｍＲＮＡ内包ミセルを尾静脈から投与したマウスの肝臓の切片におけるタンパク質発現を示す図であり、図３Ｂは、その画像解析結果を示す図である。図３Ｃは、ｍＲＮＡ内包ミセルにより送達されたｍＲＮＡの肝臓での分解の低減を示す図である。 図４Ａは、ｍＲＮＡ内包ミセルを投与したマウスにおいて誘発された炎症の低減を示す図である。図４Ｂは、修飾ＲＮＡでタンパク質発現の持続時間を延長させることができることを示す図である。 図５は、ｍＲＮＡとしてエリスロポエチンをコードするｍＲＮＡを内包した、ｍＲＮＡ内包ミセルを投与したマウスでの造血回復を示す図である。 図６は、嗅覚障害モデルマウスにおける、ｍＲＮＡ内包ミセルを用いた脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の発現の効果を示す図である。図６Ａは、鼻の粘膜上皮細胞でのｍＲＮＡの発現とその持続を示す図である。図６Ｂは、鼻の粘膜上皮組織全体にｍＲＮＡが均一に発現することを示す図である。図６Ｃは、嗅覚障害に対するｍＲＮＡ内包ミセルの治療促進効果を示すグラフである。図６Ｄは、嗅覚障害に対するｍＲＮＡミセルの治療促進効果を示す鼻の粘膜上皮組織の切片写真である。図６Ｅは、ｍＲＮＡ内包ミセルでの処置２８日後の鼻の粘膜上皮組織における嗅覚マーカータンパク質（ＯＭＰ）の発現を示す図である。 図７は、劇症肝炎モデルマウスにおける、ｍＲＮＡ内包ミセルを用いたＢｃｌ－２の発現の効果を示す図である。
発明の具体的な説明
　本発明のポリイオンコンプレックスは、（ｉ）カチオン性ポリマーを含んでなるブロック共重合体と、（ｉｉ）ｍＲＮＡとがポリイオンコンプレックスとを少なくとも含んでなるものである。カチオン性ポリマーは、ポリエチレングリコールブロックとブロック共重合体を形成したものであってもよい。（ｉ）の共重合体と（ｉｉ）のｍＲＮＡは溶液中でポリイオンコンプレックスを形成している。本発明のポリイオンコンプレックスは、溶液中、好ましくは水溶液中に提供され得る。
　本明細書では、ｍＲＮＡとは、メッセンジャーＲＮＡを意味する。
　本発明のポリイオンコンプレックスでは、ｍＲＮＡ中のシチジンおよびウリジンは修飾されていてもよい。修飾されたシチジンとしては、例えば、５－メチル－シチジンが挙げられ、修飾したウリジンとしては、シュードウリジンおよび２－チオ－シチジンが挙げられる。修飾シチジンおよびウリジンは、全シチジンおよびウリジンの１０モル％以上、２０モル％以上、または３０モル％以上含まれていればよい。
　本発明のポリイオンコンプレックスは、後記実施例に示されるようにｍＲＮＡに起因する炎症反応が少ないことから、ｍＲＮＡをその内部に内包するミセルの形態を取ると考えられる。従って、本明細書では、本発明のポリイオンコンプレックスを「ｍＲＮＡ内包ミセル」とも呼ぶ。また、本明細書では、上記ｍＲＮＡ内包ミセルにおいて、ｍＲＮＡの代わりにプラスミドＤＮＡを内包したミセルを「プラスミドＤＮＡ内包ミセル」と呼ぶ。
　本明細書では、「ミセル」とは、１層の分子膜により形成される小胞を意味する。ミセルとしては、界面活性剤などの両親媒性分子により形成されるミセル、および、ポリイオンコンプレックスにより形成されるミセル（ＰＩＣミセル）が挙げられる。ミセルは、血中滞留時間の観点では、その外表面をポリエチレングリコールで修飾することが好ましいことが知られている。
　本明細書では、「対象」とは、ヒトを含む哺乳動物である。対象は、健常の対象であってもよいし、何らかの疾患に罹患した対象であってもよい。
　本発明では、ポリカチオンブロックとしては、例えば、カチオン性天然アミノ酸およびカチオン性非天然アミノ酸、例えば、ヒスチジン、トリプトファン、オルニチン、アルギニンおよびリジンなどのカチオン性天然アミノ酸、および／または、－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）ｐ－ＮＨ２で表される基｛ここで、ｐは１～５の整数である。｝を側鎖として有するポリマーブロック、例えば、上記カチオン性の側鎖を有するカチオン性非天然アミノ酸のポリマーブロック、例えば、上記カチオン性の側鎖を有するアスパラギン酸またはグルタミン酸などのカチオン性非天然アミノ酸のポリマーブロックが挙げられる。本発明のある態様では、ポリカチオンブロックは、－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）ｐ－ＮＨ２で表される基｛ここで、ｐは１～５の整数である。｝を側鎖として有するポリマーブロックである。ここで、カチオン性天然アミノ酸としては、好ましくはヒスチジン、トリプトファン、オルニチン、アルギニンおよびリジンが挙げられ、より好ましくはアルギニン、オルニチンおよびリジンが挙げられ、さらに好ましくはオルニチンおよびリジンが挙げられ、さらにより好ましくはリジンが挙げられる。
　本発明のある態様では、ポリカチオンブロックは、下記一般式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ｛式中、
　Ｒ１は、水酸基、保護基、または重合性基であり、
　Ｒ４は、Ｈ、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
　Ｒ２は、メチレンまたはエチレンであり、
　Ｒ３は、－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）ｐ－ＮＨ２で表される基であり、
　Ｘは、カチオン性天然アミノ酸から選択されるいずれか１のアミノ酸であり、
　ｐは、１～５のいずれかの整数であり、好ましくは、ｐは、２、３または４であり、
　ｎは、２～５０００のいずれかの整数であり、例えば、２～５００のいずれかの整数であり、
　ｎ１は、０～５０００のいずれかの整数であり、例えば、０～５００のいずれかの整数であり、
　ｎ３は、０～５０００のいずれかの整数であり、例えば、０～５００のいずれかの整数であり、
　ｎ－ｎ１－ｎ３は、０以上の整数であり、
式中の各繰り返し単位は記載の都合上特定の順で示されているが、各繰り返し単位は順不同に存在することができ、各繰り返し単位はランダムに存在してもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよく、
　但し、ポリカチオンブロックが、ポリエチレングリコールと共重合体を形成している場合には、Ｒ１またはＲ４が結合を表し、ポリエチレングリコールは、該結合を介してポリカチオンブロックと共重合体を形成している。｝
で表されるポリカチオンブロックが用いられる。なお、上記一般式（Ｉ）のポリマーでは、各繰り返し単位がペプチド結合により結合している。
　－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）ｐ－ＮＨ２で表される基は、エンドソームからのポリイオンコンプレックスの脱出を誘発することが知られており、また、ｎに応じてその特性が変化することが知られている。そのため、本発明では、－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）ｐ－ＮＨ２で表される基｛ここで、ｐは１～５の整数である。｝を側鎖として有するポリマーブロックが好ましく用いられ得る。本発明では、例えば、上記カチオン性の側鎖は、－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）ｐ－ＮＨ２で表される基｛ここで、ｐは２または４である。｝とすることができ、このようにすると、早期に（例えば、２４時間以内または１２時間以内に）細胞内でタンパク質発現を誘導することができる。また、本発明では、上記カチオン性の側鎖は、－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）ｐ－ＮＨ２で表される基｛ここで、ｐは３である。｝とすることができ、このようにすると、ポリイオンコンプレックスからのｍＲＮＡの放出が穏やかであり、長期的（例えば、１日～５日）にタンパク質発現を高発現させることができる。
　本発明のある態様では、アミノ酸のポリマーでは、アミノ酸が、そのカルボキシル基とアミノ基との間でペプチド結合を形成している。
　ポリカチオンブロックには、カチオン性アミノ酸およびカチオン性の側鎖を有するアミノ酸が混在していてもよい。すなわち、本発明のある態様では、ポリカチオンブロックは、カチオン性天然アミノ酸、カチオン性非天然アミノ酸、または、カチオン性天然アミノ酸およびカチオン性非天然アミノ酸を含むモノマー単位の重合体である。本発明のある態様では、ポリカチオンブロック中のモノマー単位間の結合はペプチド結合である。本発明の好ましい態様では、カチオン性非天然アミノ酸が、側鎖として－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）ｐ－ＮＨ２で表される基｛ここで、ｎは１～５の整数である｝を有するアミノ酸である。また、本発明のある態様では、ポリカチオンブロックは、カチオン性天然アミノ酸並びに－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）ｐ－ＮＨ２で表される基｛ここで、ｐは１～５の整数である。｝で修飾されたアスパラギン酸およびグルタミン酸が任意の順番で重合してなるポリカチオンブロックとすることができる。本発明のある態様では、ポリマー中のモノマー単位の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または１００％が側鎖として－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）ｐ－ＮＨ２で表される基｛ここで、ｐは１～５の整数である。｝を有する。
　また、本発明のある態様では、ポリカチオンブロックは、主鎖として、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される１以上のアミノ酸のポリマーを含んでなる。本発明のある態様では、ポリカチオンブロックの主鎖中では、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される１以上のアミノ酸がポリマー中のモノマー単位の８０％、９０％、９５％または９８％を占める。本発明のある態様では、ポリカチオンブロックの主鎖は、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される１以上のアミノ酸のポリマーからなる。本発明のある態様では、実質的にすべてのアスパラギン酸およびグルタミン酸が側鎖として－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）ｐ－ＮＨ２で表される基｛ここで、ｐは１～５の整数である。｝を有する。本発明のある態様では、－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）ｐ－ＮＨ２で表される基は、アスパラギン酸またはグルタミン酸のカルボン酸基とペプチド結合により結合している。
　また、本発明のある態様では、ポリカチオンブロックとしては、下記一般式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ｛式中、
　Ｒ１は、水酸基、保護基、または重合性基であり、
　Ｒ４は、Ｈ、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
　Ｒ２は、メチレンまたはエチレンであり、
　Ｒ３は、－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）ｐ－ＮＨ２で表される基であり、
　ｐは、１～５のいずれかの整数であり、好ましくは、ｐは、２、３または４であり、
　ｑは、１～５のいずれかの整数であり、好ましくは、ｑは、２、３または４であり、
　ｎは、２～５０００のいずれかの整数であり、例えば、２～５００のいずれかの整数であり、
　ｎ１は、０～５０００のいずれかの整数であり、例えば、０～５００のいずれかの整数であり、
　ｎ２は、０～５０００のいずれかの整数であり、例えば、０～５００のいずれかの整数であり、
　ｎ－ｎ１－ｎ２は、０以上の整数であり、
　式中の各繰り返し単位は記載の都合上特定の順で示されているが、各繰り返し単位は順不同に存在することができ、各繰り返し単位はランダムに存在してもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよく、
　但し、ポリカチオンブロックが、ポリエチレングリコールと共重合体を形成している場合には、Ｒ１またはＲ４が結合を表し、ポリエチレングリコールは、該結合を介してポリカチオンブロックと共重合体を形成している。｝
で表されるポリカチオンブロックが用いられる。なお、上記一般式（ＩＩ）のポリマーでは、各繰り返し単位がペプチド結合により結合している。
　本発明のある態様では、ポリカチオンブロックとしては、ポリ（Ａｓｐ（ジエチルトリアミン））（以下「ポリ（Ａｓｐ（ＤＥＴ））」という）が用いられる。ポリＡｓｐ（ＤＥＴ）の構造はそれぞれ、下記一般式（ＩＩＩ）で表される。なお、カチオン性ポリマーが下記一般式（ＩＩＩ）で表されるポリカチオンブロックからなる場合には、Ｒ１およびＲ４はいずれも結合であってはならない。
ポリＡｓｐ（ＤＥＴ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ｛式中、
　Ｒ１は、水酸基、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
　Ｒ４は、Ｈ、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
　Ｒ３は、－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）２－ＮＨ２で表される基であり、
　ｎは、０～５０００のいずれかの整数であり、例えば、０～５００のいずれかの整数であり、
　ｍは、０～５０００のいずれかの整数であり、例えば、０～５００のいずれかの整数であり、
　ｍ＋ｎは、２～５０００のいずれかの整数であり、例えば、２～５００のいずれかの整数であり、
　ｎ－ｍは、０以上の整数であり、
　式中の各繰り返し単位は記載の都合上特定の順で示しているが、各繰り返し単位は順不同に存在することができ、各繰り返し単位はランダムに存在してもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよく、
　但し、ポリカチオンブロックが、ポリエチレングリコールと共重合体を形成している場合には、Ｒ１またはＲ４が結合を表し、ポリエチレングリコールは、該結合を介してポリカチオンブロックと共重合体を形成している。｝なお、上記一般式（ＩＩＩ）のポリマーでは、各繰り返し単位がペプチド結合により結合している。
　上記一般式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）において、保護基としては、Ｃ１－６アルキルカルボニル基が挙げられ、好ましくはアセチル基であり、疎水性基としては、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ピレンおよびこれらの誘導体またはＣ１－６アルキル基が挙げられ、重合性基としては、メタクリロイル基およびアクリロイル基が挙げられる。これらの保護基、疎水性基および重合性基をブロックコポリマーに導入する方法は当業者に周知である。
　本発明では、カチオン性ポリマーは、ポリカチオンブロックは、ＰＥＧと連結していてもよい。例えば、上記式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の化合物は、結合であるＲ１とＲ４のいずれかを介してポリエチレングリコールとブロックコポリマーを形成することができる。ＰＥＧは、平均重合度５～２００００、好ましくは１０～５０００、より好ましくは４０～５００であるが、ブロックコポリマーとｍＲＮＡとのポリイオンコンプレックス形成が阻害されない限り特に限定されない。
　結合であるＲ１とＲ４のいずれかとＰＥＧとは、リンカーを介して結合していてもよい。リンカーは、例えば、－（ＣＨ２）ｒ－ＮＨ－｛ここでｒは、１～５のいずれかの整数である。｝または－（ＣＨ２）ｓ－ＣＯ－｛ここでｓは、１～５のいずれかの整数である。｝とすることができ、好ましくはペプチド結合により式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）のポリカチオンブロックと結合する。また、リンカーは、好ましくは、メチレン側でＰＥＧとＰＥＧのＯ原子を介して結合する。ＰＥＧの別の末端の炭素原子は、水酸基、メトキシ基または保護基で置換されていてもよい。
　すなわち、本発明のある態様では、ＰＥＧ－リンカー－ポリカチオンブロックのブロック共重合体をカチオン性ポリマー｛ここで、ＰＥＧ、リンカーおよびポリカチオンブロックは、上記で定義される通りである。｝として用いる。
　本発明者らは、以前、プラスミドＤＮＡを内包するミセルを報告している（ＷＯ２００６／０８５６６４）。ＷＯ２００６／０８５６６４では、免疫原性の低いＤＮＡをミセルに内包させる技術が開示されている。具体的には、ＷＯ２００６／０８５６６４は、カチオン性ポリマーとして、ポリＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いるか、またはＰＥＧとポリＡｓｐ（ＤＥＴ）とのブロック共重合体を用い、上記カチオン性ポリマーとプラスミドＤＮＡにより形成されたｐＤＮＡ内包ミセルは、インビボで毒性が低くプラスミドＤＮＡ中の遺伝子を効率的に発現させることを開示する。ＷＯ２００６／０８５６６４では、細胞に取り込まれる過程において、上記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）においてＲ３が－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）２－ＮＨ２で表される基であるときに、エンドソームから細胞質にミセルが極めて効率的に脱出することを開示する。
　一方、免疫原性の低いＤＮＡとは異なり、ｍＲＮＡは免疫原性が極めて高いことで知られ、ｍＲＮＡを炎症無く細胞質内に送達するためには、細胞質に送達するまでの全過程でｍＲＮＡを完全にミセル内に封じ込め続けておく必要があると考えられた。そのため、ｍＲＮＡの体内への導入はミセルに内包させた場合でも困難であると予想された。しかし、本発明者らによれば、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルは、意外にも体内でほとんど炎症反応を引き起こさなかった。このことは、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルは、細胞質内に特異的にｍＲＮＡを送達できることを示唆する。
　また、ｐＤＮＡ内包ミセルでは、ＤＮＡは一部の細胞でしか発現を示さなかったが、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルは、インビボで肝臓においてほぼ１００％の細胞に均一にタンパク質を発現させた（図３Ａ）。このことは、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルは、組織全体で均一にｍＲＮＡを発現させたい場合に極めて有利に用いられ得ることを示す。また、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルは、インビボで非常に素早くｍＲＮＡによりコードされるタンパク質を発現させた。従って、本願発明のｍＲＮＡ内包ミセルは、急速なタンパク質発現が要求される場合に有利に用いられ得る。
　従って、本発明では、カチオン性ポリマーとｍＲＮＡとのポリイオンコンプレックスを含んでなる、ｍＲＮＡを対象の体内の細胞質に送達するための組成物が提供される。すなわち、本発明の組成物は、ｍＲＮＡを対象の体内の細胞質に送達するためのｍＲＮＡ送達剤である。
　このように本発明のポリイオンコンプレックスは、広範な細胞で均一にｍＲＮＡを発現させることができ、投与後迅速にｍＲＮＡを発現させることができ、および／または、体内で炎症反応を引き起こし難い。従って、本発明のポリイオンコンプレックスは、広範な細胞でｍＲＮＡを発現させることが必要であり、かつ、迅速なｍＲＮＡ発現が必要である疾患、例えば、病状の進行の早い疾患や急性疾患の処置に好ましく用いられ得る。
　従って、本発明では、本発明のポリイオンコンプレックスを含んでなる、病状の進行の早い疾患や急性疾患を有する対象の体内にｍＲＮＡを送達することに用いるための組成物が提供される。本発明では、本発明のポリイオンコンプレックスを含んでなる、病状の進行の早い疾患や急性疾患を処置することに用いるための医薬組成物が提供される。
　細胞の急速な細胞死を伴う疾患では、細胞死抑制処理により、症状の進行または悪化を抑制ことができる。本発明のポリイオンコンプレックスは、ｍＲＮＡを細胞死抑制因子とすれば、このような疾患の処置に有利に用いることができる。細胞の急速なアポトーシスを伴う疾患では、アポトーシス抑制処理により、症状の進行または悪化を抑制ことができる。本発明のポリイオンコンプレックスは、ｍＲＮＡを抗アポトーシス因子とすれば、このような疾患の処置に有利に用いることができる。細胞の急速な細胞死またはアポトーシスを伴う疾患としては、例えば、急性期脊髄損傷または劇症肝炎が挙げられる。
　急性期脊髄損傷および劇症肝炎では、病変部の広範な細胞において細胞死（アポトーシス）が発生する。具体的には、急性期脊髄損傷では、損傷部位で多くの神経細胞が細胞死を起こす。また、劇症肝炎では、肝臓において広範な肝細胞死が発生し、その結果、肝不全が引き起こされる。そして、急性期脊髄損傷および劇症肝炎では、組織全体で均一に細胞死を抑制する処置をすることで、症状の悪化が抑制されるか、症状が改善される。そのため、組織全体で均一にタンパク質を発現させることのできる本発明の医薬組成物は、これらの疾患の処置に好ましく用いられ得る。
　従って、本発明の医薬組成物は、ある態様では、細胞死を抑制するものであり、例えば、細胞死抑制因子をコードするｍＲＮＡを含んでなる。本発明の医薬組成物は、ある態様では、アポトーシスを抑制するものであり、例えば、抗アポトーシス因子をコードするｍＲＮＡを含んでなる。
　抗アポトーシス因子としては、特に限定されないが、例えば、ＦＬＩＰ、Ｍｃｌ－１、Ｘｉａｐ、ｃｒｍＡ、Ｂｃｌ－２およびＢｃｌ－ｘＬなどが挙げられ、Ｂｃｌ－２が好ましく用いられ得る。このように、急性疾患が、細胞のアポトーシスの亢進を伴う疾患、特に急性疾患である場合には、ｍＲＮＡは抗アポトーシス因子をコードするｍＲＮＡである。
　また、本発明のポリイオンコンプレックスは、効率良くｍＲＮＡを細胞に送達することができるため、その他の様々な疾患の処置に適用することができる。本発明で用いられるｍＲＮＡとしては、成長因子、細胞増殖因子、細胞増殖抑制因子、細胞死促進因子、細胞死抑制因子、癌抑制遺伝子産物および転写因子をコードするｍＲＮＡなどが挙げられ、当業者であれば目的に応じて適宜選択することができる。例えば、特定の細胞を増殖させることが必要な対象に対して該特定の細胞の増殖因子をコードするｍＲＮＡをポリイオンコンプレックスとして投与することで、該対象における疾患や状態を処置することができる。
　成長因子とは、特定の細胞の増殖や分化を促進する内因性タンパク質を意味し、特に限定されないが、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ－２）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が挙げられる。細胞増殖抑制因子としては、特に限定されないが、例えば、ｐ２１、ｐ１７、ｐ１６およびｐ５３が挙げられる。細胞死促進因子としては、特に限定されないが、例えば、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）、ＨｔｒＡ２、Ｂａｄ、Ｂｉｍ、Ｂａｘ、ｐ５３、カスパーゼ１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０（例えば、カスパーゼ２、３、６、７、８、９および１０、好ましくはカスパーゼ３、６および７）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）並びにＦｏｘＯ１が挙げられる。細胞死抑制因子としては、上記のような抗アポトーシス因子が挙げられる。癌抑制遺伝子産物としては、特に限定されないが、例えば、ｐ５３、網膜芽細胞腫遺伝子（Ｒｂ）、大腸腺腫症遺伝子（ＡＰＣ）、神経線維腫症１型遺伝子（ＮＦ１）、神経線維腫症２型遺伝子（ＮＦ２）、ＷＴ１、ＶＨＬ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＨＥＫ２、マスピン、ｐ７３、Ｓｍａｄ４、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＤＣＣ、ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、ＳＤＨＤ、ｐ１６、ｐ５７Ｋｉｐ２、ＰＴＣ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＥＸＴ１およびＥＸＴ２が挙げられる。転写因子としては、特に限定されないが、例えば、Ｒｕｎｔ関連転写因子１（Ｒｕｎｘ１）、ｐ５３、ｃ－ｆｏｓ、ｃ－Ｊｕｎ、ＣＲＥＢ、Ｃ／ＥＢＰ、ＭｙｏＤ、ｃ－Ｍｙｃ、ｃ－Ｍｙｂ、Ｏｃｔ３／４、ＮＦ－κＢ、ＮＦ－ＡＴ、Ｍｅｆ－２および細胞外シグナル応答因子（ＳＲＦ）などが挙げられる。
　本発明によれば、例えば、造血を促進させる必要のある対象（例えば、貧血患者など）において造血を促進させるために用いるための医薬組成物であって、ｍＲＮＡが造血因子（例えば、コロニー刺激因子またはエリスロポエチン）をコードする、本発明のポリイオンコンプレックスを含んでなる医薬組成物を提供する。
　本発明によれば、例えば、嗅覚組織（例えば、粘膜上皮細胞または嗅覚神経）の破壊を伴う嗅覚障害を有する対象において、嗅覚障害を処置することに用いるための医薬組成物であって、ｍＲＮＡが脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコードする、本発明のポリイオンコンプレックスを含んでなる医薬組成物が提供される。
　本発明のさらに別の側面では、癌を有する対象において癌を処置することに用いるための医薬組成物であって、本発明のポリイオンコンプレックスを含んでなり、ｍＲＮＡが細胞増殖抑制因子、癌抑制遺伝子産物または細胞死促進因子をコードするものである、医薬組成物が提供される。癌組織では、すべての癌細胞の増殖を抑制することが望まれ、増殖抑制因子を癌組織全体に均一に発現させることができる本発明の医薬組成物は特に好適に用いることができる。癌を処置することに用いるための医薬組成物では、本発明のポリイオンコンプレックスは、２０～１００ｎｍの粒径を有することが好ましい。このようにすることで、本発明のポリイオンコンプレックスは、癌組織近傍の毛細血管から組織に侵入しやすくなる。
　本発明の医薬組成物は、賦形剤をさらに含んでいてもよい。
　本発明のある側面では、ｍＲＮＡを対象の体内細胞の細胞質に送達する方法であって、本発明のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなる方法が提供される。
　本発明のある側面では、対象において組織またはその一部に均一にタンパク質を発現させるために用いられる、ｍＲＮＡを対象の体内細胞の細胞質に送達する方法であって、本発明のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが発現させたいタンパク質をコードするものである、方法が提供される。組織は、ある態様では、肝臓または粘膜組織（例えば、嗅覚上皮組織）である。
　臓器（例えば、肝臓）には、静脈注射で本発明のポリイオンコンプレックスを送達することができるが、ハイドロダイナミクス法により、臓器、特に肝臓へのポリイオンコンプレックスの送達効率を著しく向上させることができる。ハイドロダイナミクス法とは、血液量と同量程度の薬液を静脈から短時間の間に投与する方法であり、投与の際の圧力により臓器の内部に薬液を浸透させるものである。ハイドロダイナミクス法には、部位を限定したものが知られており、例えば、標的部位周辺の血流を一時的に止めた上で、標的部位にその部位に含まれる血液量と同量程度の薬液を投与して薬液を標的組織に浸透させるものも知られており、本発明で用いることができる。
　粘膜組織には、本発明のポリイオンコンプレックスを塗布することで送達することができる。本発明のＰＩＣは、塗布により粘膜組織の深部に浸透し、組織またはその一部に取り込まれる。
　当業者であれば適切な投与方法を選択して、様々な組織にポリイオンコンプレックスを送達することができる。本発明で用いられる投与方法としては、例えば、皮下注射、筋肉注射、関節内注射およびくも膜下腔注射などが挙げられる。ポリイオンコンプレックスを徐放させるために、コラーゲンスポンジなどの担体にポリイオンコンプレックスを浸潤させて皮下または筋層下に留置する方法も知られ、本発明で用いることができる。
　本発明の別の側面では、急性疾患を有する対象において、該疾患の病変部における細胞死を抑制する方法であって、ｍＲＮＡが細胞死抑制因子をコードする本発明のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなる方法が提供される。本発明のある態様では、細胞死はアポトーシスであり、細胞死抑制因子は抗アポトーシス因子である。
　本発明の別の側面では、細胞死の亢進を伴う疾患を有する対象において該細胞死を抑制する方法であって、ｍＲＮＡが細胞死抑制因子をコードする本発明のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなる方法が提供される。本発明のある態様では、細胞死はアポトーシスであり、細胞死抑制因子は抗アポトーシス因子である。
　本発明の別の側面では、劇症肝炎または急性期の脊髄損傷を処置する方法であって、本発明のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが細胞死抑制因子をコードするものである、方法が提供される。本発明のある態様では、細胞死抑制因子は抗アポトーシス因子である。
　本発明の別の側面では、造血を促進させる必要のある対象（例えば、貧血患者など）において造血を促進させる方法であって、本発明のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが造血因子（例えば、コロニー刺激因子またはエリスロポエチン）をコードするものである、方法が提供される。
　本発明の別の側面では、嗅覚組織（例えば、粘膜上皮細胞または嗅覚神経）の破壊を伴う嗅覚障害を有する対象において、嗅覚障害を処置する方法であって、本発明のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコードするものである、方法が提供される。
　本発明のさらに別の側面では、癌を有する対象において癌を処置する方法であって、本発明のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが細胞増殖抑制因子、癌抑制遺伝子産物または細胞死促進因子をコードするものである、方法が提供される。
実施例１：ポリイオンコンプレックスの作製
　まず、ｍＲＮＡを含有するポリイオンコンプレックスを作製した。
　負電荷を有するｍＲＮＡとポリイオンコンプレックスを形成し得るブロック共重合体として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とポリカチオンとのブロック共重合体を用いた（図１Ａ）。
　ＰＥＧ－ポリカチオンブロック共重合体としては、ＰＥＧ－ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ブロック共重合体を用いた。
１－１．ＰＥＧ－ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ブロック共重合体の合成
　まず、ＰＥＧ－ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ブロック共重合体を合成した。具体的には、一方の末端がメトキシ基であり、他方の末端がアミノプロピル基である、数平均分子量１２，０００のポリエチレングリコール（ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２）を塩化メチレンに溶解した。β－ベンジル－Ｌ－アスパルテート－Ｎ－カルボン酸無水物（ＢＬＡ－ＮＣＡ）（中央化製品社に製造委託して得た）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）と上記塩化メチレン溶液の混合液に添加して溶解させ、反応溶液を得た。次いで、反応溶液を４０℃で２日間反応させて、ポリエチレングリコール－ポリ（β－ベンジル－Ｌ－アスパルテート）ブロック共重合体（ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＢＬＡ）を得た。
　ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＢＬＡのアミノ末端を無水酢酸と反応させてアセチル化し、ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＢＬＡ－Ａｃを得た。１Ｈ－ＮＭＲによる解析から、ＰＢＬＡ部分の数平均分子量は１４，０００であり、重合度は７０であることが分かった。
　次に、ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＢＬＡ－Ａｃにジエチレントリアミンを反応させて、ＭｅＯ－ＰＥＧ－ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ブロック共重合体を得た。具体的には、ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＢＬＡ－Ａｃをベンゼンに溶解し凍結乾燥させた。凍結乾燥したＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＢＬＡ－ＡｃをＮ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）に溶解させた。その後、得られた溶液をジエチレントリアミンのＮＭＰ溶液中に滴下し、５～１０℃で１時間攪拌した。さらに氷冷下で塩酸で中和し、透析および凍結乾燥を行い、ＭｅＯ－ＰＥＧ－ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ブロック共重合体を得た。透析は、透析外液を０．０１Ｎ塩酸水溶液とし、最終的には純水として４℃で行った。１Ｈ－ＮＭＲによる解析から、得られたＭｅＯ－ＰＥＧ－ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）ブロック共重合体のｐＡｓｐ（ＤＥＴ）部分の重合度は６３であることが分かった。
１－２．ｍＲＮＡの調製
　ｍＲＮＡは、プラスミドＤＮＡを鋳型としてmMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit (Ambion, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いてインビトロ転写を行うことで作製した。まず、プラスミドＤＮＡは、Ｔ７プロモーターの制御下にルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、エリスロポエチン遺伝子またはＢｃｌ－２遺伝子を導入し、遺伝子の下流に１２０塩基のポリＡ配列を組み込んだ。修飾ｍＲＮＡは、インビトロ転写の際に、塩基として５－メチル－ＣＴＰ、シュード－ＵＴＰおよび２－チオ－ＵＴＰ(TriLink BioTechnologies, San Diego, CA, USA)を添加することにより得た。具体的には、インビトロ転写の際に、全ＣＴＰに対して５－メチル－ＣＴＰを２０モル％、全ＵＴＰに対してシュード－ＵＴＰおよび２－チオ－ＵＴＰを各１０％ずつ加えた。転写された非修飾ｍＲＮＡおよび修飾ＲＮＡは、RNeasy Mini Preparation Kit (Qiagen, Hilden, Germany)で精製した。mRNA濃度は260 nmの吸光度を用いて測定した。
１－３．ポリイオンコンプレックスの調製
　ＰＥＧ－ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）溶液（１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３））と、ｍＲＮＡ溶液（１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３））またはプラスミドＤＮＡ溶液（１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３））とを混合して、ポリイオンコンプレックス（それぞれ、ｍＲＮＡ内包ミセルまたはプラスミドＤＮＡ内包ミセルという）を得た。ＰＥＧ－ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）中のアミノ酸残基のアミノ基（Ｎ）と核酸中のリン酸基と混合比（Ｎ／Ｐ）は、３となるようにした。また、核酸最終濃度が３３．３ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。動的光散乱法（ＤＬＳ）により得られたミセルの粒径を測定した。得られたｍＲＮＡ内包ミセルの粒径は約５０ｎｍであり、得られたプラスミドＤＮＡ内包ミセルの粒径は約９０ｎｍであった。
実施例２：ｍＲＮＡ内包ミセルの投与試験
　本実施例では、実施例１で得られたミセルを実験動物に投与してｍＲＮＡからのタンパク質の発現を調べた。
　実験動物としては日本チャールズリバーから購入したＢａｌｂ／ｃ（♀、７週齢）を用いた。ｍＲＮＡ内包ミセルはハイドロダイナミクス法によりマウスに投与した。すなわち、それぞれ５μｇのｍＲＮＡ内包ミセルまたはプラスミドＤＮＡ内包ミセルを生理食塩水１．８ｍＬで希釈し、マウス尾静脈より５秒間かけて全量を投与した。ハイドロダイナミクス法により投与された薬剤は肝細胞に効率的に取り込まれることが知られている。
　分泌性タンパク質としては、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）を用いた。頚部クモ膜下腔にｍＲＮＡ内包ミセルまたはＧＬｕｃタンパク質を投与して、投与後の髄液中でのタンパク質量を５日にわたりモニターした。
　すると、図１Ｂに示されるように、ｍＲＮＡ内包ミセルによりｍＲＮＡを投与すると、ＧＬｕｃの持続的な発現が観察された。
実施例３：肝臓へのｍＲＮＡの送達
　実施例２と同じ方法でｍＲＮＡ内包ミセルをマウスに投与し、肝臓へのｍＲＮＡの蓄積およびその発現をモニターした。
３－１．肝臓でのタンパク質発現
　肝臓でのタンパク質の発現は、ルシフェラーゼの発光により定量した。具体的には、ルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡを内包させたミセルまたは裸のｍＲＮＡを投与したマウスに、投与４時間後にＤルシフェリン（住友ファーマ）を１５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与し、IVIS Imaging System (Xenogen, Alameda, CA, USA)を用いてその発光を観察、定量した。
　その結果、図２ＡおよびＢに示されるように、ｍＲＮＡ内包ミセルを投与したマウスでは、ルシフェラーゼの強い発光が観察されたが、裸のｍＲＮＡを投与したマウスでは、弱い蛍光が観察されるに過ぎなかった。また、ｍＲＮＡ内包ミセルを投与したマウスではルシフェラーゼの発光が長期間持続した（図２Ｂ）。
３－２．肝臓でのタンパク質発現の免疫組織学的解析
　さらに、免疫組織学により肝臓でのタンパク質発現を詳細にモニターした。この目的のために、ＧＦＰを発現するｍＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡを内包させたミセルを投与したマウスから投与２４時間後に肝臓を採取した。得られた肝臓を４％パラホルムアルデヒドを含有するリン酸緩衝溶液(和光純薬)で一晩固定し、次いで、１０％、１５％および２０％のスクロースを含有するＰＢＳ溶液中で常温にてそれぞれ４時間、４時間および一晩静置したのち、optimal cutting temperature (OCT) compound (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA)中で凍結させた。その後、厚さ１０μｍの組織切片を作成した。ＧＦＰの免疫染色は１次抗体として５００倍希釈の抗ＧＦＰウサギＩｇＧ（インビトロジェン社）と室温で一晩反応させ、その後２次抗体として２００倍希釈Alexa 488ヤギ抗ウサギＩｇＧ（インビトロジェン社）と室温で１時間反応させた。抗体染色した切片は、画像解析機能を搭載した蛍光顕微鏡であるIn Cell Analyzer 1000 (GE ヘルスケア社, Buckinghamshire, UK)を用いて観察した。
　その結果、図３Ａに示されるように、ｍＲＮＡ内包ミセルを投与したマウスの肝臓では、すべての細胞が一様にＧＦＰタンパク質を発現したが、プラスミドＤＮＡ内包ミセルでは、一部の細胞がＧＦＰタンパク質の強い発現を示した一方で、多くの細胞ではＧＦＰタンパク質の発現は見られなかった。このことは、蛍光強度分布からも支持された（図３Ｂ）。
３－３．投与されたｍＲＮＡ量の肝臓での分解
　ｍＲＮＡの肝臓での分解の有無を確認するため、投与されたｍＲＮＡ量を蛍光標識核酸を用いた方法および定量ＰＣＲ法の両方により定量した。定量ＰＣＲでは、配列の全長が保たれているｍＲＮＡの量が定量され、蛍光標識核酸を用いた方法では、分解されたｍＲＮＡも含むすべてのｍＲＮＡが定量される。実施例２の方法により、マウスにｍＲＮＡ内包ミセルまたは裸のｍＲＮＡを投与し、１０分後に肝臓を採取してｍＲＮＡを定量した。
　蛍光標識核酸を用いた方法は以下のように行なった。Label IT（商標） Nucleic Acid Labeling Kit, Cy5 (Mirus, Madison, WI, USA)によりＣｙ５標識されたｍＲＮＡをミセルに内包させてまたはさせないで導入した後、肝臓を採取しホモジナイズした。その後、ホモジナイズ液中の蛍光量を蛍光プレートリーダー (TECAN, Mannedorf, Switzerland)にて測定した。
　定量ＰＣＲ法は以下のように行なった。ルシフェラーゼ発現ｍＲＮＡをミセルに内包させてまたはさせないで導入した後、採取した肝臓よりRNA easy mini preparation kit (Qiagen)を用いてｍＲＮＡを抽出した。定量ＰＣＲでは、ＴＧＣＡＡＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＡＣＧＴＧおよびＡＡＴＧＧＧＡＡＧＴＣＡＣＧＡＡＧＧＴＧのプライマーセットを用い、検出はABI Prism 7500 Sequence Detector (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いた。いずれの方法でも、投与したｍＲＮＡ量のうちの肝臓に導入されたｍＲＮＡ量の割合（％）により肝臓に導入されたｍＲＮＡ量を求めた。
　その結果、裸のｍＲＮＡを投与したマウスでは、ｍＲＮＡが肝臓で急速に分解を受けているのに対して、ｍＲＮＡ内包ミセルを投与したマウスでは、ｍＲＮＡの分解はほとんど確認されなかった（図３Ｃ）。
実施例４：ｍＲＮＡ内包ミセルによる炎症反応
　本実施例では、ｍＲＮＡ内包ミセルを導入することにより生じる炎症反応を調べた。
　ｍＲＮＡ導入による炎症の誘発を評価した。具体的には、実施例２の通りマウスにｍＲＮＡ内包ミセルを投与した。実施例３－３の方法に従って投与４時間後に抽出したｍＲＮＡを用い、ABI Prism 7500 Sequence Detector (Applied Biosystems)とTaqman Gene Expression Assays (Applied Biosystem, IL-6: Mm00446190_m1, TNF-α: Mm00443258, IFN-β: Mm00439552_s1)により炎症性サイトカインのｍＲＮＡの量を定量ＰＣＲにより定量した。ｍＲＮＡ量はβ－アクチン量(Mm00607939)のｍＲＮＡ量で標準化した。対照としては、生理食塩水を投与したマウスを用いた。
　すると、非修飾ｍＲＮＡ（天然型）内包ミセルでは、裸のｍＲＭＡを導入する場合と比較して炎症性サイトカインＩＬ－６の産生量は極めて低かった（図４Ａ）。修飾ｍＲＮＡでは、非修飾ｍＲＮＡを導入する場合と比較して炎症性サイトカインＩＬ－６の産生量は低かったが、ミセルに内包させることにより炎症性サイトカインＩＬ－６の産生量を低減させることができた（図４Ａ）。ｍＲＮＡは強い免疫原性で知られるため、炎症性サイトカインの産生が対照と同等程度であったことは驚くべきことであった。
　ｍＲＮＡ内包ミセルは細胞にエンドサイトーシスにより取り込まれると考えられる。そして、エンドソーム内はｐＨが低いため、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルは側鎖のアミン構造が変化してその膜融合性を増加させ、これによりミセルはエンドソームから細胞内に移行すると考えられる（Miyata et al., J. Am. Chem. Soc., 130 (48): 16287-16294 (2008)）。エンドソームの内表面にはトル様受容体（ＴＬＲ）が発現しており、ｍＲＮＡを認識すると自然免疫を惹起する。そのため、エンドソーム内でｍＲＮＡが放出された場合には、それが例え少ない量であったとしても強い自然免疫応答が惹起される。しかしながら、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルは、驚くべきことに炎症反応をほとんど惹起しなかった。
　このことから、本発明のミセルは、ｍＲＮＡを内包したミセルであること、および、エンドソーム内では放出させずにｍＲＮＡを細胞質内に送達できる高い選択性を有することが理解できる。また、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルのこの驚くべき性質がｍＲＮＡの細胞への効率的な送達を可能にしたと考えられる。
　また、タンパク質発現の持続時間を非修飾ｍＲＮＡ内包ミセルと修飾ＲＮＡ内包ミセルとで比較した。ｍＲＮＡとしては、ルシフェラーゼのｍＲＮＡを用い、ルシフェラーゼの発現量を実施例３に記載の方法により測定した。
　すると、修飾ｍＲＮＡ内包ミセルでは、より長く持続する発現を示した（図４Ｂ）。
実施例５：造血回復実験
　本実施例では、エリスロポエチンのｍＲＮＡを内包したミセルを投与したマウスでの造血回復を確認した。
　実施例２に記載の方法によりエリスロポエチン遺伝子のｍＲＮＡを内包させたミセルを投与したマウスから投与２８日後または５６日後に血液を採取し、ヘマトクリットおよびヘモグロビン値をpocH-100i (Sysmex社、兵庫)により測定した。
　その結果、ｍＲＮＡ内包ミセルを投与したマウスでは、ヘマトクリットおよびヘモグロビンのいずれにもいても有意に増加を示し、効果的かつ持続的な造血効果を示すことが分かった（図５）。
実施例６：点鼻投与による嗅覚障害モデル動物の治療
　本実施例では、ｍＲＮＡ内包ミセルの点鼻投与による嗅覚障害モデル動物の治療を試みた。
６－１．ルシフェラーゼタンパク質の発現定量
　まず、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを内包するミセルは、核酸最終濃度を２００μｇ／ｍＬとする以外は実施例１に記載の方法により調製した。４匹のマウスを麻酔下で仰臥位に保持し、ｍＲＮＡ内包ミセル溶液５０μＬ（ｍＲＮＡは１０μｇ含有）を鼻孔上に点下した。対照としてミセルに内包させていない裸のプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）およびｍＲＮＡのそれぞれ１０μｇを鼻孔に点下した。投与４時間後、２４時間後または４８時間後に１５ｍｇ／ｍＬのＤルシフェリン（住友ファーマ社製）を２００μＬ点鼻投与した。１０分後、IVIS Imaging System (Xenogen, Alameda, CA, USA)を用いて，ルシフェラーゼ発光を観察、定量した。
　その結果、図６Ａに示されるように、ｍＲＮＡ内包ミセルでは、ルシフェラーゼの高発現が認められた。発現は、ミセル投与４時間後から観察され、４８時間後まで発現が持続した。
　培養細胞にｍＲＮＡをトランスフェクションすると、通常は、数時間後から長くても４８時間程度しか発現が持続しないため、本発明で４８時間後でも発現が持続していることは、とても意外なことであった。
　なお、ｍＲＮＡの代わりにルシフェラーゼ発現プラスミドＤＮＡを内包するミセルでも同様の実験を行なったが、タンパク質の発現は観察されなかった（データ掲載省略）。また、ルシフェラーゼをコードする裸のｍＲＮＡまたはＤＮＡの投与でも、タンパク質の発現は観察されなかった（データ省略）。
６－２．ＧＦＰタンパク質の発現定量（免疫組織化学）
　また、ＧＦＰをコードするｍＲＮＡを内包するミセルは、本実施例のルシフェラーゼｍＲＮＡ内包ミセルの調製方法と同じ方法により調製した。ｍＲＮＡ内包ミセル溶液５０μＬ（ｍＲＮＡは１０μｇ含有）を鼻孔上に点下した。投与２４時間後、マウスを安楽死させ、鼻部を切除し、嗅球前縁から５μｍ厚の凍結切片を作製した。
　発現したＧＦＰタンパク質の免疫組織化学染色は常法に従い行なった。１次抗体としては、５００倍希釈の抗ＧＦＰウサギＩｇＧ（インビトロジェン社製）を用い、室温で一晩切片と反応させた。２次抗体としては、２００倍希釈のＡｌｅｘａ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（インビトロジェン社製）を用い、室温で１時間切片と反応させた。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を含有するブロッキング液（同人堂、熊本、日本）により染色した。得られた切片は、顕微鏡として蛍光顕微鏡（Axiovert 200 fluorescence microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)） を用い、対物レンズとして20×EC Plan Neofuar objective (Carl Zeiss）を用いて観察した。
　その結果、図６Ｂに示されるように、粘膜皮下組織全体において均一にＧＦＰが発現していることが明らかであった。
６－３．嗅覚障害行動試験による治療効果の評価
　嗅覚障害行動試験は、マウスがチーズ片を発見するまでの時間を評価することにより行なった。具体的には、嗅覚障害モデルとして、メチマゾールにより嗅覚障害を誘発させたマウスを用いた。まず、１５０ｍｇ／ｋｇ体重のメチマゾールをマウスに腹腔内投与し、マウスに嗅覚障害を誘発させた。メチマゾール投与２４時間後、嗅覚障害モデルマウス（７匹）を１匹ずつケージに入れ、２４時間絶食させた。脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコードするｍＲＮＡを内包するミセルを実施例１と同じ方法により調製し、得られたミセル溶液５０μＬ（ｍＲＮＡを１０μｇ含有する）をマウスの鼻孔に点鼻投与した。対照のマウスには、バッファーのみを投与した。ミセル投与１日後、３日後、５日後、７日後または１０日後に行動試験を行なった。この試験では、行動試験の２４時間前からマウスを絶食させた。４ｃｍ厚に敷いた床敷きのケージ隅にチーズ小片を置き、マウスがチーズを発見して把持または摂食開始するまでの時間を計測した。試験は１０分の間隔を置いて４回繰り返して行った。所要時間のカットオフ値を５分に設定し、それまでにマウスがチーズを発見できないときは、所要時間５分と記録した。
　その結果、図６Ｃに示されるように、ＢＤＮＦ発現ｍＲＮＡ内包ミセルを投与したマウスでは、チーズ片を発見するまでの時間が対照マウスと比べて有意に短く、回復速度も改善していた。
６－４．組織学による治療効果の評価
　ｍＲＮＡ内包ミセルによる嗅覚障害の治療効果を組織学的に検証した。ｍＲＮＡ内包ミセル投与１日後、７日後、１４日後または２８日後に、マウスを安楽死させ、頭部を切除した。脱灰後、頭部組織をパラフィン法包埋し、５μｍ厚の組織切片を作製した。その後、切片をヘマトキシリンエオジン染色した。嗅覚マーカータンパク質（ＯＭＰ）の発現を可視化するため免役組織化学染色を行なった。１次抗体としては、５０００倍希釈のヤギ抗ＯＭＰ抗体を含むブロッキング液（Wako Chemical USA, Richmond, VA）を用いて切片と室温で一晩反応させ、２次抗体としては４００倍希釈したAlexa546-conjugated secondary antibodyを含むブロッキング液（インビトロジェン社製）を用いて切片と室温で１時間反応させた。核は、roLong Gold Antifade Reagent with DAPI（インビトロジェン社製）により染色した。
　結果、ＢＤＮＦをコードするｍＲＮＡ内包ミセルを投与した群では、７日後、１４日後および２８日後において明らかな嗅覚上皮組織および嗅覚神経の回復が見られた（図６Ｄ）。また、再生した組織は、ＯＭＰを発現していた（図６Ｅ）。これにより、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルにより神経細胞が効率よく回復することが示された。
　このように、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルは、点鼻投与により嗅覚障害モデルを治療することができた。
実施例７：劇症肝炎に対する治療効果
　本実施例では、アポトーシスを抑制する因子をコードするｍＲＮＡ内包ミセルを投与することにより、急速な細胞死が広範に引き起こされることで知られる劇症肝炎に対する治療を試みた。
　まず、Fasリガンド（ＦａｓＬ）であるＪｏ－２(BD Bioscience)を５μｇを腹腔内投与することで、劇症肝炎モデルを作製した。作製１５分後に劇症肝炎マウスにＢｃｌ－２遺伝子のｍＲＮＡを内包するミセル、Ｂｃｌ－２遺伝子を発現可能に組み込んだプラスミドＤＮＡまたは生理食塩水を上述の通りに投与し、投与４時間後にマウスから肝臓を採取した。上記の方法で肝臓の切片を作製し、in situ cell death detection kit, TMR red (Roche, Basel, Switzerland)を用いて、ＴＵＮＥＬ染色処理を行った。In Cell Analyzer 1000にて観察した後、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合を、In Cell Analyzer 1000のソフトウェアにて定量した。１視野当りの細胞数は平均２，０００個であり、マウス１匹あたり５視野以上を解析に用いた。
　その結果、生理食塩水を投与した群およびプラスミドＤＮＡを投与した群では、未処理の群と比べてＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合が増加し、却って病態が悪化したが、ｍＲＮＡ内包ミセルを投与した群では、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合が減少し、病態が改善した（図７）。
　すべての細胞に均一、急速かつ持続的にタンパク質を発現させられるｍＲＮＡ内包ミセルの性質が、急速な細胞死が広範に引き起こされることで知られる劇症肝炎の治療上有効であったことを示唆するものである。
　このように、本発明のｍＲＮＡ内包ミセルは、広範な細胞が急速に変容し、病態が急速に悪化する疾患に対して有効な治療法を提供するものと評価される。
　ｍＲＮＡは、その強い免疫原性と高い不安定性のために導入薬剤の候補としては適していないと考えられてきた。しかし、本発明によれば、ｍＲＮＡ内包ミセルは、意外にも、免疫原性がほとんど無く、かつ、インビボですべての細胞に均一、迅速かつ持続的にタンパク質を発現する方法を提供するものであった。ｍＲＮＡは、ゲノムへのインテグレーションを起こさない点で安全な遺伝子治療法を提供するものとして期待される。

Claims (26)

  1. 　カチオン性ポリマーとメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とを含んでなる、ポリイオンコンプレックス。
  2. 　カチオン性ポリマーが、ポリエチレングリコールブロックとのブロック共重合体を形成している、請求項１に記載のポリイオンコンプレックス。
  3. 　カチオン性ポリマーが、
    　　カチオン性天然アミノ酸、
    　　カチオン性非天然アミノ酸、または、
    　　カチオン性天然アミノ酸およびカチオン性非天然アミノ酸
    を含むモノマー単位の重合体である、請求項１または２に記載のポリイオンコンプレックス。
  4. 　カチオン性非天然アミノ酸が、側鎖として－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）ｐ－ＮＨ２で表される基｛ここで、ｐは１～５の整数である｝を有するアミノ酸である、請求項３に記載のポリイオンコンプレックス。
  5. 　カチオン性ポリマーが、下記一般式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ｛式中、
    　Ｒ１は、水酸基、保護基、または重合性基であり、
    Ｒ４は、Ｈ、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
    　Ｒ２は、メチレンまたはエチレンであり、
    　Ｒ３は、－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）ｐ－ＮＨ２で表される基であり、
    　Ｘは、カチオン性天然アミノ酸から選択されるいずれか１のアミノ酸であり、
    　ｐは、１～５のいずれかの整数であり、好ましくは、ｐは、２、３または４であり、
    　ｎは、２～５０００のいずれかの整数であり、
    　ｎ１は、０～５０００のいずれかの整数であり、
    　ｎ３は、０～５０００のいずれかの整数であり、
    　ｎ－ｎ１－ｎ３は、０以上の整数であり、式中の各繰り返し単位は記載の都合上特定の順で示されているが、各繰り返し単位は順不同に存在することができ、各繰り返し単位はランダムに存在してもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよい。｝
    で表されるポリカチオンブロックであり、
    　但し、ポリカチオンブロックが、ポリエチレングリコールと共重合体を形成している場合には、Ｒ１またはＲ４は結合を表し、ポリエチレングリコールは、結合であるＲ１またはＲ４を介してポリカチオンブロックと共重合体を形成している、
    　請求項１～４のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックス。
  6. 　ポリカチオンブロックが、下記一般式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ｛式中、
    　Ｒ１は、水酸基、保護基、または重合性基であり、
    　Ｒ４は、Ｈ、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
    　Ｒ２は、メチレンまたはエチレンであり、
    　Ｒ３は、－（ＮＨ－（ＣＨ２）２）ｐ－ＮＨ２で表される基であり、
    　ｐは１～５のいずれかの整数であり、
    　ｑは、１～５のいずれかの整数であり、
    　ｎは、２～５０００のいずれかの整数であり、
    　ｎ１は、０～５０００のいずれかの整数であり、
    　ｎ２は、０～５０００のいずれかの整数であり、
    　ｎ－ｎ１－ｎ２は、０以上の整数であり、
    　式中の各繰り返し単位は特定の順で示されているが、各繰り返し単位は順不同に存在することができ、各繰り返し単位はランダムに存在してもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよい。｝
    で表されるポリカチオンブロックであり、
    　但し、ポリカチオンブロックが、ポリエチレングリコールと共重合体を形成している場合には、Ｒ１またはＲ４は結合を表し、ポリエチレングリコールは、結合であるＲ１またはＲ４を介してポリカチオンブロックと共重合体を形成している、
    　請求項５に記載のポリイオンコンプレックス。
  7. 　ｍＲＮＡが、成長因子、細胞増殖因子、細胞増殖抑制因子、細胞死促進因子、細胞死抑制因子、癌抑制遺伝子産物または転写因子をコードするｍＲＮＡである、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックス。
  8. 　細胞増殖因子が、造血因子または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である、請求項７に記載のポリイオンコンプレックス。
  9. 　細胞死抑制因子が、Ｂｃｌ－２である、請求項７に記載のポリイオンコンプレックス。
  10. 　ｍＲＮＡが、修飾されたシチジンおよびウリジンを含んでなる、請求項１～９のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックス。
  11. 　ｍＲＮＡを対象の体内細胞の細胞質に送達する方法であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなる、方法。
  12. 　対象において、対象の組織またはその一部に均一にタンパク質を発現させるための請求項１１に記載の方法であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなる、方法。
  13. 　組織が肝臓または粘膜組織である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　急性疾患を有する対象において、該疾患の病変部における細胞死を抑制する方法であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが細胞死抑制因子をコードするものである、方法。
  15. 　造血を促進させる必要のある対象において造血を促進させる方法であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが造血因子をコードするものである、方法。
  16. 　嗅覚障害を有する対象において嗅覚障害を処置する方法であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコードするものである、方法。
  17. 　癌を有する対象において癌を処置する方法であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスを対象に投与することを含んでなり、ｍＲＮＡが細胞増殖抑制因子、癌抑制遺伝子産物または細胞死促進因子をコードするものである、方法。
  18. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスを含んでなる、ｍＲＮＡを体内の細胞内に送達することに用いるための組成物。
  19. 　対象において、対象の組織またはその一部に均一にタンパク質を発現させることに用いるための、請求項１８に記載の組成物。
  20. 　組織が肝臓または粘膜組織である、請求項１９に記載の組成物。
  21. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックスを含んでなる、医薬組成物。
  22. 　急性疾患をその必要のある対象において処置することに用いるための、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. 　疾患が、劇症肝炎または急性期の脊髄損傷である、請求項２２に記載の医薬組成物。
  24. 　疾患がアポトーシスの亢進を伴う疾患である、請求項２２または請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. 　嗅覚障害をその必要のある対象において処置することに用いるための、請求項２１に記載の医薬組成物。
  26. 　対象における造血を促進させることに用いるための、請求項２１に記載の医薬組成物であって、ｍＲＮＡが造血因子をコードする、医薬組成物。
PCT/JP2014/053190 2014-02-12 2014-02-12 ｍＲＮＡ送達用組成物 WO2015121924A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2014/053190 WO2015121924A1 (ja) 2014-02-12 2014-02-12 ｍＲＮＡ送達用組成物
US15/118,407 US10232054B2 (en) 2014-02-12 2014-02-12 Composition for mRNA delivery
JP2015562586A JPWO2015121924A1 (ja) 2014-02-12 2014-02-12 ｍＲＮＡ送達用組成物
EP14882238.0A EP3106177B1 (en) 2014-02-12 2014-02-12 Polyion complex comprising mrna for therapy

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2014/053190 WO2015121924A1 (ja) 2014-02-12 2014-02-12 ｍＲＮＡ送達用組成物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015121924A1 true WO2015121924A1 (ja) 2015-08-20

Family

ID=53799694

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2014/053190 WO2015121924A1 (ja) 2014-02-12 2014-02-12 ｍＲＮＡ送達用組成物

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10232054B2 (ja)
EP (1) EP3106177B1 (ja)
JP (1) JPWO2015121924A1 (ja)
WO (1) WO2015121924A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017022665A1 (ja) * 2015-07-31 2017-02-09 啓史 位▲高▼ ｍＲＮＡを効率よく生体内に送達できるポリイオンコンプレックス並びにこれを用いた関節症の治療薬および治療法
WO2018124181A1 (ja) 2016-12-27 2018-07-05 国立大学法人東京大学 ｍＲＮＡの機能化方法
WO2019093423A1 (ja) 2017-11-09 2019-05-16 国立大学法人東京大学 ｍＲＮＡの安定化方法
WO2024029331A1 (ja) * 2022-07-30 2024-02-08 国立大学法人 東京医科歯科大学 関節疾患の治療及び／又は予防に用いるための医薬組成物

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10905766B2 (en) 2017-03-23 2021-02-02 Oregon State University Therapeutic compositions and methods for treatment of muscle wasting diseases
JP2019069933A (ja) * 2017-10-05 2019-05-09 公益財団法人川崎市産業振興財団 体内における薬物動態を制御する組成物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006085664A1 (ja) * 2005-02-10 2006-08-17 The University Of Tokyo ポリカチオン荷電性ポリマー及び核酸のキャリヤーとしての使用
WO2007099660A1 (ja) * 2006-03-01 2007-09-07 The University Of Tokyo 核酸内包高分子ミセル複合体
WO2008062909A1 (fr) * 2006-11-22 2008-05-29 The University Of Tokyo Support d'arnsi sensible à l'environnement utilisant une micelle polymérique à pont disulfure

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001161372A (ja) 1999-12-09 2001-06-19 Hisamitsu Pharmaceut Co Inc アポトーシス抑制ポリペプチド、それをコードする遺伝子およびポリヌクレオチド、並びにそれらを含む組成物
JP3929744B2 (ja) 2001-03-26 2007-06-13 協和醗酵工業株式会社 新規ポリぺプチド、新規ｄｎａ、新規抗体および新規遺伝子改変動物
JP4535229B2 (ja) 2003-05-08 2010-09-01 国立大学法人 東京大学 ポリエチレングリコール−ポリカチオンブロック共重合体
DE10335833A1 (de) 2003-08-05 2005-03-03 Curevac Gmbh Transfektion von Blutzellen mit mRNA zur Immunstimulation und Gentherapie
US8546487B2 (en) * 2009-02-13 2013-10-01 The University Of Tokyo Cationic poly (amino acids) and uses thereof
CA2831613A1 (en) * 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
KR101912978B1 (ko) 2011-11-17 2018-10-29 도꾜 다이가꾸 페닐보론산기가 도입된 블록 공중합체 및 그의 용도

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006085664A1 (ja) * 2005-02-10 2006-08-17 The University Of Tokyo ポリカチオン荷電性ポリマー及び核酸のキャリヤーとしての使用
WO2007099660A1 (ja) * 2006-03-01 2007-09-07 The University Of Tokyo 核酸内包高分子ミセル複合体
WO2008062909A1 (fr) * 2006-11-22 2008-05-29 The University Of Tokyo Support d'arnsi sensible à l'environnement utilisant une micelle polymérique à pont disulfure

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHENG C. ET AL.: "Multifunctional triblock copolymers for intracellular messenger RNA delivery", BIOMATERIALS, vol. 33, no. 28, 2012, pages 6868 - 6876, XP028428397, ISSN: 0142-9612 *
KATAOKA K.: "Polymeric micellar nanocarriers for gene and oligonucleotide delivery", MOLECULAR THERAPY, vol. 21, no. 350, May 2013 (2013-05-01), pages S135, XP055355910 *
KEIJI ITAKA ET AL.: "Nanomicelle ni yoru Jitsuyoteki in vivo mRNA Delivery", ANTISENSE SYMPOSIUM KOEN YOSHISHU, vol. 22, September 2012 (2012-09-01), pages 115, XP008183891 *
See also references of EP3106177A4 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017022665A1 (ja) * 2015-07-31 2017-02-09 啓史 位▲高▼ ｍＲＮＡを効率よく生体内に送達できるポリイオンコンプレックス並びにこれを用いた関節症の治療薬および治療法
JPWO2017022665A1 (ja) * 2015-07-31 2018-05-31 アキュルナ株式会社 ｍＲＮＡを効率よく生体内に送達できるポリイオンコンプレックス並びにこれを用いた関節症の治療薬および治療法
WO2018124181A1 (ja) 2016-12-27 2018-07-05 国立大学法人東京大学 ｍＲＮＡの機能化方法
KR20190102041A (ko) 2016-12-27 2019-09-02 고쿠리츠다이가쿠호우진 도쿄다이가쿠 mRNA 의 기능화 방법
JPWO2018124181A1 (ja) * 2016-12-27 2019-10-31 国立大学法人 東京大学 ｍＲＮＡの機能化方法
JP2021035377A (ja) * 2016-12-27 2021-03-04 国立大学法人 東京大学 ｍＲＮＡの機能化方法
JP7264378B2 (ja) 2016-12-27 2023-04-25 国立大学法人 東京大学 ｍＲＮＡの機能化方法
WO2019093423A1 (ja) 2017-11-09 2019-05-16 国立大学法人東京大学 ｍＲＮＡの安定化方法
WO2024029331A1 (ja) * 2022-07-30 2024-02-08 国立大学法人 東京医科歯科大学 関節疾患の治療及び／又は予防に用いるための医薬組成物

Also Published As

Publication number Publication date
EP3106177A4 (en) 2018-01-03
US10232054B2 (en) 2019-03-19
EP3106177B1 (en) 2022-07-27
US20170173182A1 (en) 2017-06-22
JPWO2015121924A1 (ja) 2017-03-30
EP3106177A1 (en) 2016-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Uchida et al. Systemic delivery of messenger RNA for the treatment of pancreatic cancer using polyplex nanomicelles with a cholesterol moiety
WO2015121924A1 (ja) ｍＲＮＡ送達用組成物
Chen et al. Combining mannose receptor mediated nanovaccines and gene regulated PD-L1 blockade for boosting cancer immunotherapy
JP5826174B2 (ja) 核酸送達用組成物及び担体組成物、それを用いた医薬組成物、並びに核酸送達方法
KR102285326B1 (ko) Rna를 세포에 도입하기 위한 조성물
Wang et al. A self-assembled system for tumor-targeted co-delivery of drug and gene
Kim et al. Poly (ethylene glycol)–poly (beta-amino ester)-based nanoparticles for suicide gene therapy enhance brain penetration and extend survival in a preclinical human glioblastoma orthotopic xenograft model
JP7424984B2 (ja) 核酸分子送達のためのナノ粒子－ヒドロゲル複合材料
US11793764B2 (en) siRNA nanocapsule and preparation method and use thereof
US11603543B2 (en) Fusogenic lipid nanoparticles for target cell-specific production of a therapeutic protein
Kozlu et al. An aquaporin 4 antisense oligonucleotide loaded, brain targeted nanoparticulate system design
Wang et al. Acid-and reduction-sensitive micelles for improving the drug delivery efficacy for pancreatic cancer therapy
WO2019110067A1 (en) Hybrid nanoparticle
EP3214178B1 (en) Polyol-based osmotic polydixylitol polymer based gene transporter and use thereof
Zhang et al. A nanogel with passive targeting function and adjustable polyplex surface properties for efficient anti-tumor gene therapy
Kim et al. Highly compacted pH-responsive DNA nanoparticles mediate transgene silencing in experimental glioma
WO2019133190A1 (en) High efficient delivery of plasmid dna into human and vertebrate primary cells in vitro and in vivo by nanocomplexes
Zhang et al. A zwitterionic polymer-inspired material mediated efficient CRISPR-Cas9 gene editing
Liu et al. Integrating disulfides into a polyethylenimine gene carrier selectively boosts significant transfection activity in lung tissue enabling robust IL-12 gene therapy against metastatic lung cancers
Vaughan Engineered therapeutic plasmids and nanoparticle delivery vehicles for targeted treatment of hepatocellular carcinoma
Wan et al. Rational design of polymer-based mRNA delivery systems for cancer treatment
KR101327181B1 (ko) 신장세포특이적인 펩타이드 및 폴리에스테르아민 중합체를 포함하는 유전자 전달체 및 이를 포함한 신장 섬유증 예방 또는 치료용 조성물.
KR101958828B1 (ko) 양이온성 작용기가 곁사슬 또는 말단에 도입된 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체를 포함하는 생리활성물질 전달체
Aliabadi et al. Nucleolin-targeted cationic nanoparticle for delivery of survivin shRNA against colorectal cancer in vitro and in vivo
Hall Design and Evaluation of Peptide Lipid-Associated Nucleic Acids (PLANAs) for siRNA and CRISPR/Cas9 Delivery and Protein Silencing

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14882238

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015562586

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2014882238

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014882238

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15118407

Country of ref document: US