WO2019093423A1 - ｍＲＮＡの安定化方法 - Google Patents

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WO2019093423A1
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rna
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linker
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智士 内田
直人 吉永
オル 趙
恭子 小路
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国立大学法人東京大学
公益財団法人 川崎市産業振興財団
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    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Definitions

  • the present invention relates to a method for stabilizing mRNA.
  • RNA delivery is attracting attention as a means for safely and continuously supplying therapeutic proteins.
  • mRNA is rapidly enzymatically degraded in vivo.
  • methods of protecting mRNA from degradation using mRNA transporters and methods of improving mRNA molecule itself are being studied, further technological innovations are made because RNAse in vivo is very strong. Is required.
  • Non-Patent Document 1 As a method of improving the mRNA molecule itself, a method of substituting a portion of the mRNA base with a chemically modified one has been studied (for example, Non-Patent Document 1). Although various chemically modified bases have been comprehensively examined up to now, no one that can significantly improve the enzyme resistance of mRNA has not been reported yet. In addition, free chemical modification was difficult because modification often resulted in a significant decrease in the efficiency of protein translation from mRNA.
  • Patent Document 1 describes a polyion complex of a cationic polymer and mRNA, and describes that it is used for delivery of mRNA.
  • Non-Patent Document 2 describes the stability of a polymeric micelle type mRNA transport carrier, evaluation of enzymatic degradation, and the effect of cholesterol modification of a polymer.
  • these documents do not describe a method for stabilizing mRNA that can improve the enzyme resistance of mRNA in the living body without significantly reducing the efficiency of protein translation from mRNA.
  • An object of the present invention is to provide a novel method for stabilizing mRNA.
  • the present inventors made mRNA into at least two RNA oligomers containing a first sequence complementary to mRNA, a linker sequence, and a second sequence which is the same sequence as the first sequence.
  • a complex of mRNA and RNA oligomer can be obtained, and it is found that this complex can stabilize mRNA, etc., and the present invention has been completed. That is, the present invention is as follows.
  • RNA oligomer is at least two RNA oligomers comprising the RNA sequence of (a) or (b) below: At least two RNA oligomers are capable of hybridizing to different sequences in the sequence of the mRNA, A complex formed by hybridizing a first sequence of an RNA oligomer to an mRNA different from the second sequence of the RNA oligomer (ie, the mRNAs are cross-linked by the RNA oligomer).
  • RNA comprising a first sequence of 12 to 40 bases complementary to the sequence of mRNA, a linker sequence of 0 to 100 bases, and a second sequence identical to the first sequence in this order Array;
  • B a first sequence having 90% or more identity to a sequence of 12 to 40 bases complementary to the sequence of mRNA, and hybridizable to mRNA, a linker sequence of 0 to 100 bases, and RNA Sequence [1-2] Comprising in This Order the Same as the First Sequence and the Second Sequence which is the Same Sequence [1-2]
  • the RNA Oligomer Contains at Least Two RNA Oligomers Comprising the RNA Sequence of (a) or (b) And the complex according to the above [1-1].
  • RNA sequence including a first sequence of 15 to 23 bases complementary to the sequence of mRNA, a linker sequence of 0 to 30 bases, and a second sequence which is the same sequence as the first sequence in this order
  • B a first sequence having 90% or more identity with a sequence of 15 to 23 bases complementary to the sequence of mRNA, and hybridizing to mRNA, a linker sequence of 0 to 30 bases, and RNA Sequences [1-3] Containing in Order a Second Sequence that is the Same as the Sequence of 1 [1-3]
  • the RNA Oligomer is at least Two RNA Oligomers Containing the RNA Sequence of (a) or (b) The complex according to the above [1-1].
  • RNA sequence including in this order a first sequence of 17 bases complementary to the sequence of mRNA, a linker sequence of 10 bases, and a second sequence which is the same sequence as the first sequence
  • mRNA A first sequence that is 90% or more identical to a 17 base sequence complementary to the sequence of SEQ ID NO: and hybridizes to mRNA, a 10 base linker sequence, and the same sequence as the first sequence RNA Sequence [1-4] Containing Second Sequence in this Order [1-4] The complex according to any one of the above [1-1] to [1-3], wherein all the bases of the linker sequence are adenine.
  • [1-5] The complex according to any one of the above [1-1] to [1-4], wherein the at least two RNA oligomers are two to eight RNA oligomers.
  • mRNA is at least 2 so that the molar ratio of 1 ⁇ g / mL to 10,000 ⁇ g / mL and mRNA to at least two kinds of each RNA oligomer is 1: 0.05 to 0.05: 1
  • the complex according to any one of the above [1-1] to [1-5] which comprises an RNA oligomer of a species.
  • a pharmaceutical composition comprising the complex according to any one of the above [1-1] to [1-6].
  • [2-1] including forming a complex of an mRNA encoding a target gene and at least two RNA oligomers containing the following (a) or (b) RNA sequences, At least two RNA oligomers are capable of hybridizing to different sequences in the sequence of mRNA, In the complex, the first sequence of the RNA oligomer hybridizes to a different mRNA than the second sequence of the RNA oligomer, mRNA stabilization method.
  • RNA comprising a first sequence of 12 to 40 bases complementary to the sequence of mRNA, a linker sequence of 0 to 100 bases, and a second sequence identical to the first sequence in this order
  • Sequence (b) A first sequence having 90% or more identity to a sequence of 12 to 40 bases complementary to the sequence of mRNA and capable of hybridizing to mRNA, and a linker sequence of 0 to 100 bases, [2-2] RNA Sequence Containing, in Order, a Second Sequence that is the Same Sequence as the First Sequence [2-2]
  • the RNA Oligomer Contains at least Two RNAs Containing the RNA Sequence of (a) or (b) The method according to the above [2-1], which is an oligomer.
  • RNA sequence including a first sequence of 15 to 23 bases complementary to the sequence of mRNA, a linker sequence of 0 to 30 bases, and a second sequence which is the same sequence as the first sequence in this order
  • B a first sequence having 90% or more identity with a sequence of 15 to 23 bases complementary to the sequence of mRNA, and hybridizing to mRNA, a linker sequence of 0 to 30 bases, and [2-3] RNA Sequence Containing in Order a Second Sequence which is the Same as the Sequence of 1 [2-3]
  • the RNA Oligomer is at least Two RNA Oligomers Containing the RNA Sequence of the Following (a) or (b) The method described in the above [2-1].
  • RNA sequence including in this order a first sequence of 17 bases complementary to the sequence of mRNA, a linker sequence of 10 bases, and a second sequence which is the same sequence as the first sequence
  • mRNA A first sequence that is 90% or more identical to a 17 base sequence complementary to the sequence of SEQ ID NO: and hybridizes to mRNA, a 10 base linker sequence, and the same sequence as the first sequence [2-4] RNA Sequence Containing Second Sequence in This Order [2-4] The method according to any one of the above [2-1] to [2-3], wherein all the bases of the linker sequence are adenine.
  • RNA oligomers are two to eight RNA oligomers.
  • the amount of mRNA is at least 2 so that the molar ratio of 1 ⁇ g / mL to 10,000 ⁇ g / mL and the mRNA to at least two kinds of each RNA oligomer is 1: 0.05 to 0.05: 1.
  • RNA oligomer is at least one RNA oligomer containing the following (a) or (b) RNA sequence, A complex formed by hybridizing a first sequence of an RNA oligomer to an mRNA different from the second sequence of the RNA oligomer (ie, the mRNAs are cross-linked by the RNA oligomer).
  • RNA sequence A first sequence of 12 to 40 bases complementary to the sequence of mRNA, a linker sequence of 0 to 100 bases, a sequence of 12 to 40 bases complementary to the sequence of mRNA, and the first An RNA sequence comprising in this order a second sequence which differs from the sequence;
  • B a first sequence having 90% or more identity to a sequence of 12 to 40 bases complementary to the sequence of mRNA, and hybridizable to mRNA, a linker sequence of 0 to 100 bases, and mRNA
  • RNA oligomer is 2 to 8 RNA oligomers.
  • mRNA is at least 1 ⁇ g / mL to 10,000 ⁇ g / mL, and the molar ratio of mRNA to at least one of each RNA oligomer is 1: 0.05 to 0.05: 1
  • a pharmaceutical composition comprising the complex according to any one of the above [3-1] to [3-6].
  • [4-1] including forming a complex of an mRNA encoding a target gene and at least one RNA oligomer containing the following (a) or (b) RNA sequence, In the complex, the first sequence of the RNA oligomer hybridizes to a different mRNA than the second sequence of the RNA oligomer, mRNA stabilization method.
  • RNA sequence A first sequence of 12 to 40 bases complementary to the sequence of mRNA, a linker sequence of 0 to 100 bases, a sequence of 12 to 40 bases complementary to the sequence of mRNA, and the first An RNA sequence comprising in this order a second sequence which differs from the sequence;
  • B a first sequence having 90% or more identity to a sequence of 12 to 40 bases complementary to the sequence of mRNA, and hybridizable to mRNA, a linker sequence of 0 to 100 bases, and mRNA
  • RNA oligomer is 2 to 8 RNA oligomers.
  • mRNA is at least 1 ⁇ g / mL to 10,000 ⁇ g / mL, and the molar ratio of mRNA to at least one of each RNA oligomer is 1: 0.05 to 0.05: 1.
  • [5-1] A carrier for transporting an mRNA, comprising the complex according to any one of the above [1-1] to [1-6] and [3-1] to [3-6].
  • [5-2] A carrier for transporting mRNA as described in the above [5-1], wherein the carrier is a polymeric micelle or a lipidic mRNA carrier.
  • [5-3] A pharmaceutical composition comprising the mRNA transport carrier according to the above [5-1] or [5-2].
  • the present invention provides a novel method for stabilizing mRNA.
  • the present invention can stabilize mRNA in vivo while maintaining the efficiency of protein translation from mRNA. More preferably, the present invention can inhibit enzymatic degradation of mRNA in vivo.
  • FIG. 1 It is a conceptual diagram of mRNA nanoassembly.
  • A Formation of mRNA nanoassembly,
  • B RNA oligomer. It is a figure which shows the mRNA nanoassembly used in the Example.
  • A Types of mRNA nanoassembly (mRNA only, mRNA + non-linker RNA oligomer, and mRNA + linker RNA oligomer),
  • B hybridization conditions. It is a figure which shows the physical-property analysis of the mRNA nanoassembly produced in the Example.
  • A Size analysis result by FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy),
  • B AFM (Atomic Force Microscopy) photograph.
  • RNA nanoassembly a complex of an mRNA encoding a target gene and an RNA oligomer (sometimes referred to as “mRNA nanoassembly”) is provided (FIG. 1 (A)).
  • the RNA oligomer is an RNA sequence comprising, in order, a first sequence substantially complementary to a sequence of mRNA, and a second sequence, optionally a linker sequence and the same sequence as the first sequence.
  • Figure 1 (B) At least two RNA oligomers are used.
  • An mRNA nanoassembly can be produced by hybridizing mRNA and RNA oligomers using at least two RNA oligomers for one type of mRNA.
  • mRNAs approach each other by the action of RNA oligomers, that is, mRNAs are crosslinked by RNA oligomers.
  • hybridization is partially formed between the mRNAs (FIG. 1 (A)).
  • MRNA in mRNA nanoassembly is considered to be less likely to be recognized by degradation enzymes compared to single-stranded mRNA because of its steric hindrance.
  • the enzyme resistance was greatly improved (FIG. 4 (A)).
  • the mRNA nanoassembly maintained translational activity while the intracellular uptake efficiency was almost the same as mRNA (Fig. 4 (B), Fig. 5 (B) and (C)).
  • the present invention is a complex of mRNA encoding a target gene and RNA oligomer
  • the RNA oligomer is at least two RNA oligomers comprising the RNA sequence of (a) or (b) below: At least two RNA oligomers are capable of hybridizing to different sequences in the sequence of the mRNA, The first sequence of the RNA oligomer is formed by hybridizing to an mRNA different from the second sequence of the RNA oligomer (ie, the mRNAs are cross-linked by the RNA oligomer), providing a complex.
  • RNA comprising a first sequence of 12 to 40 bases complementary to the sequence of mRNA, a linker sequence of 0 to 100 bases, and a second sequence identical to the first sequence in this order Array;
  • B a first sequence having 90% or more identity to a sequence of 12 to 40 bases complementary to the sequence of mRNA, and hybridizable to mRNA, a linker sequence of 0 to 100 bases, and RNA sequence including, in order, a first sequence and a second sequence which is the same sequence
  • the present invention is also a complex of mRNA encoding a target gene and RNA oligomer
  • the RNA oligomer is at least one RNA oligomer containing the following (a) or (b) RNA sequence
  • the first sequence of the RNA oligomer is formed by hybridizing to an mRNA different from the second sequence of the RNA oligomer (ie, the mRNAs are cross-linked by the RNA oligomer), providing a complex.
  • the target gene can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose.
  • the target gene is, for example, a reporter gene, a growth factor gene, a cell growth factor gene, a cell growth inhibitor gene, a cell death promoting factor gene, a cell death suppressing factor gene, a tumor suppressor gene, a transcription factor gene, a genome editing gene or a vaccine antigen It is a gene.
  • a complex containing mRNA encoding a growth factor gene of a particular cell to a subject in need of growing the particular cell, a disease or condition in the subject can be treated. .
  • Reporters include, for example, luminescent proteins and fluorescent proteins.
  • growth factors for example, epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), vascular endothelial cell growth factor (VEGF), granulocyte colony Stimulatory factor (G-CSF), granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), platelet derived growth factor (PDGF), erythropoietin (EPO), thrombopoietin (TPO), basic fibroblast growth factor (bFGF or FGF-) 2) and hepatocyte growth factor (HGF).
  • EGF epidermal growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • VEGF vascular endothelial cell growth factor
  • G-CSF granulocyte colony Stimulatory factor
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony
  • cell growth inhibitors examples include p21, p17, p16 and p53.
  • apoptosis inducer for example, Smac / Diablo, apoptosis inducer (AIF), HtrA2, Bad, Bim, Bax, p53, caspase 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10 (Eg, caspases 2, 3, 6, 7, 8, 9 and 10, preferably caspases 3, 6 and 7), Fas ligand (FasL), tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand (TRAIL) and FoxO1.
  • Cell death inhibitors include, for example, anti-apoptotic factors (eg, FLIP, Mcl-1, Xiap, crmA, Bcl-2 and Bcl-xL).
  • Tumor suppressor genes include, for example, p53, retinoblastoma gene (Rb), colorectal adenomatous gene (APC), neurofibromatosis type 1 gene (NF1), neurofibromatosis type 2 gene (NF2), WT1 , VHL, BRCA1, BRCA2, CHEK2, maspin, p73, Smad4, MSH2, MLH1, PMS2, DCC, phosphatase tensin homolog (PTEN), SDHD, p16, p57 Kip2 , PTC, TSC1, TSC2, EXT1 and EXT2.
  • transcription factors examples include Runt-related transcription factor 1 (Runx1), p53, c-fos, c-Jun, CREB, C / EBP, MyoD, c-Myc, c-Myb, Oct3 / 4, NF- ⁇ B, These include NF-AT, Mef-2 and extracellular signal response factor (SRF).
  • Runx1 Runt-related transcription factor 1
  • p53 c-fos
  • c-Jun c-Jun
  • CREB C / EBP
  • MyoD MyoD
  • c-Myc c-Myb
  • Oct3 / 4 NF- ⁇ B
  • genome editing genes include zinc finger nuclease (ZNF), transcription activator like effector nuclease (TALEN), and clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat (Prisins) / Crisps-associated (Cas) 9 genes.
  • ZNF zinc finger nuclease
  • TALEN transcription activator like effector nuclease
  • Primsins clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat
  • Cas Crisps-associated
  • Vaccine antigen genes include, for example, pathogen antigens and tumor specific antigens.
  • MRNA means messenger RNA and usually comprises a 5 'untranslated region (5' UTR), a coding region and a 3 'untranslated region (3' UTR).
  • the mRNA usually further comprises a 5 'end cap structure (5' Cap) and a 3 'end poly A sequence.
  • the mRNA used here may be any of the following. (1) mRNA containing 5 'Cap, 5' UTR, coding region, 3 'UTR, and poly A in this order. (2) mRNA containing 5 'Cap, 5' UTR, coding region, and poly A in this order. (3) mRNA containing 5 'UTR, coding region, 3' UTR, and poly A in this order. (4) mRNA containing 5 'UTR, coding region, and poly A in this order. (5) mRNA containing 5 'Cap, 5' UTR, coding region, and 3 'UTR in this order. (6) mRNA containing 5 'Cap, 5' UTR, and coding region in this order. (7) mRNA containing 5 'UTR, coding region, and 3' UTR in this order. (8) 5 'UTR, mRNA containing the coding region in this order.
  • the mRNA encoding the target gene can be prepared by transcribing the template DNA encoding the target gene in an in vitro environment by a known method. For example, it can be produced according to the method described in Blood 108 (13) (2006) 4009-17. Specifically, the template DNA in which the poly A / T chain is incorporated downstream of the protein coding sequence is cleaved immediately downstream of the poly A / T chain, and is contained in a buffer solution containing a translation enzyme, a nucleoside, and a 5 'cap analog. In vitro transcription can be performed, and then the mRNA can be purified. A more specific method for preparing mRNA is as described in the examples below.
  • no chemical modification of the base of the mRNA itself is performed. In this case, since the mRNA itself is natural, it can be expected that the process of translation is hardly disturbed.
  • chemical modification of the base of the mRNA itself is performed. Chemical modification of the base of mRNA itself is known to improve, for example, the enzyme resistance of mRNA and to reduce its immunogenicity.
  • Such mRNA's own chemically modified bases include, for example, methylated bases (eg, 5-methylcytosine), sulfur modified bases (eg, 2-thiouridine), pseudouridine, N1 methyl pseudouridine and 5-methoxyuridine .
  • the RNA oligomer of some embodiments is an RNA strand comprising the following sequence (a) or (b): (A) RNA comprising a first sequence of 12 to 40 bases complementary to the sequence of mRNA, a linker sequence of 0 to 100 bases, and a second sequence identical to the first sequence in this order Array; (B) a first sequence having 90% or more identity to a sequence of 12 to 40 bases complementary to the sequence of mRNA, and hybridizable to mRNA, a linker sequence of 0 to 100 bases, and RNA sequence including, in order, a first sequence and a second sequence which is the same sequence
  • RNA oligomer is an RNA strand comprising the following sequence (a) or (b): (A) A first sequence of 12 to 40 bases complementary to the sequence of mRNA, a linker sequence of 0 to 100 bases, a sequence of 12 to 40 bases complementary to the sequence of mRNA, and the first An RNA sequence comprising in this order a second sequence which differs from the sequence; (B) a first sequence having 90% or more identity to a sequence of 12 to 40 bases complementary to the sequence of mRNA, and hybridizable to mRNA, a linker sequence of 0 to 100 bases, and mRNA A sequence of 12 to 40 bases complementary to the sequence of SEQ ID NO: 90 and a sequence having 90% or more identity, and a sequence capable of hybridizing to mRNA and different from the first sequence in this order RNA sequence containing
  • the first sequence and the second sequence of the RNA oligomer are identical complementary sequences that hybridize with the same sequence on one type of mRNA, and crosslink mRNAs of the same type to form a complex.
  • the first sequence and the second sequence may not necessarily be the same sequence, but the first sequence and the second sequence may each be identical on one RNA. It can also be composed of complementary sequences that hybridize with the sequence but can form perfect matches, mismatches, bulge structures.
  • RNA / DNA chimeric sequences can also be inserted.
  • the first and second sequences may optionally be selected as perfect match, mismatch formation, bulge formation, DNA / RNA chimera, etc.
  • the target sequence on mRNA is the same in the first and second sequences.
  • the same target sequence on the mRNA means that the sequence on the hybridizable mRNA of the second sequence is the same as the first sequence.
  • Such first sequence and second sequence can be appropriately set by a known method or a method analogous thereto.
  • the second sequence is 90% or more (eg, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, and 90% or more) , 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99 .7% or more, 99.8% or more, or 99.9% or more).
  • identity of the RNA sequence can be determined using an analysis program such as BLAST (see, for example, Altzshulf SF et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)). When using BLAST, use the default parameters of each program.
  • the first sequence is a sequence that hybridizes only on the mRNA of one species
  • the second sequence is an mRNA of the other species
  • Two mRNAs can be cross-linked with RNA oligomers by selecting sequences that hybridize only above.
  • the range of “90% or more” in “having 90% or more identity” in the RNA sequence is, for example, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% Above, 99.7% or more, 99.8% or more, or 99.9% or more. Generally, the larger the value of identity, the better.
  • the identity of the RNA sequence can be determined using an analysis program such as BLAST (see, for example, Altzshulf SF et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)). When using BLAST, use the default parameters of each program.
  • Hybridize to mRNA means that an RNA oligomer hybridizes to mRNA under the hybridization conditions described later.
  • the first and second sequences of the RNA oligomer consist of 12 to 40 consecutive bases (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 of the mRNA). , 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 or 40 bases) are designed to be hybridized.
  • each of the first and second sequences of the RNA oligomer is preferably 12 to 30 bases, more preferably 15 to 23 bases, and still more preferably 17 bases.
  • the length of the linker sequence is preferably 0 to 100 bases (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86
  • the length of the linker sequence is "0 base” means that there is no linker sequence.
  • the first and second sequences of the RNA oligomer each consist of a sequence of 12 to 30 bases complementary to the sequence of mRNA. More preferably, the sequence of the RNA oligomer consists of a sequence of 15 to 23 bases complementary to the sequence of mRNA. More preferably, the sequence of the RNA oligomer consists of a sequence of 17 bases complementary to the sequence of mRNA.
  • the linker sequence is not particularly limited as long as it has a chain length of 0 to 100 bases.
  • the linker sequence is designed not to hybridize to or difficult to hybridize to the sequence on the mRNA.
  • the linker sequence preferably consists of a sequence that does not form a complementary strand with the sequence on the mRNA. Since adenine (A): uracil (U) bond is weaker than guanine (G): cytosine (C) bond, it is preferable to use A or U as a base used for a linker sequence. In particular, it is more preferable to use A because U may hybridize to the poly A chain on mRNA.
  • the linker sequence is a sequence in which the bases are all adenine.
  • the position in the mRNA to which the RNA oligomer hybridizes may be any position of the 5 'UTR, the coding region, the 3' UTR, and the poly A sequence. It is desirable to design an RNA oligomer so that the secondary structure of mRNA is predicted, and the mRNA strand hybridizes to a portion having no secondary structure. That is, the RNA oligomer is preferably designed to hybridize to the portion of the entire mRNA sequence that does not have secondary structure. Examples of software for predicting the secondary structure of mRNA include those described in the examples below.
  • RNA oligomers are designed to hybridize to the coding region of mRNA.
  • the RNA oligomers used to generate the complex are, for example, at least two types for one type of mRNA.
  • "One kind of mRNA” indicates one mRNA group containing the same sequence.
  • One RNA oligomer refers to one RNA oligomer group that includes the same sequence as the first sequence.
  • the “at least two RNA oligomers” indicates that there are two or more such RNA oligomer groups, and the first sequence is different between the respective RNA oligomer groups.
  • the amount of RNA oligomers used for preparation of the complex is preferably 2 to 50, more preferably 2 to 30, and still more preferably 2 to 8 based on one type of mRNA. As the number of RNA oligomers increases, the stability of mRNA further improves. If the number of RNA oligomers used for preparation of the complex is in the range of 2 to 50, the translation efficiency of mRNA can be maintained at a relatively high level.
  • the RNA oligomers are designed such that the respective RNA oligomers do not overlap on the mRNA.
  • the RNA oligomer is, for example, at least one, relative to one mRNA.
  • the amount of RNA oligomers used to prepare the complex is preferably 1 to 50, more preferably 1 to 30, and still more preferably 1 to 8 based on one mRNA. .
  • the stability of mRNA further improves.
  • the number of RNA oligomers used for preparation of the complex is in the range of 1 to 50, translation efficiency of mRNA can be maintained at a relatively high level.
  • one complex includes one mRNA. In another aspect, one complex includes two or more (eg, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10) mRNAs.
  • the concentration of mRNA used for producing the complex is, for example, 1 ⁇ g / mL to 10,000 ⁇ g / mL, more preferably 10 ⁇ g / mL to 10,000 ⁇ g / mL, still more preferably 50 ⁇ g / mL for one type of mRNA. mL to 10,000 ⁇ g / mL.
  • a solvent of mRNA at the time of complex formation for example, phosphate buffer, saline, distilled water, Tris buffer, or HEPES buffer may be mentioned, preferably phosphate buffer or saline is preferable. And more preferably saline.
  • the molar ratio of one kind of mRNA to each RNA oligomer at this time is, for example, 1: 0.05 to 0.05: 1, preferably 1: 0.1 to 0.1: 1, more preferably 1: 0 .3 to 0.3: 1.
  • the molar ratio of one type of mRNA to each RNA oligomer is, in theory, the most preferable value of 1: 0.5.
  • a molar ratio of 1: 0.5 means that the mRNA and the complementary sequence on the linker are all bound together without excess or deficiency, assuming that all the hybridization has been formed.
  • a complex is a collection of mRNAs and RNA oligomers assembled by cross-linking mRNAs by RNA oligomers.
  • the size of the complex is preferably 10 nm to 10,000 nm, more preferably 30 nm to 1,000 nm, and still more preferably 50 nm to 500 nm.
  • the size of the complex can be appropriately changed in consideration of factors such as mRNA concentration at preparation, salt concentration, number of RNA oligomers and the like. Specifically, formation of a large aggregate is expected when the mRNA concentration at preparation is higher. In addition, when the salt concentration is high, the electrostatic interaction is suppressed, the hydrogen bond becomes dominant, and hybridization becomes easy, and as a result, formation of a large complex is assumed. In addition, by increasing the types of RNA oligomers used for preparation, formation of a larger aggregate is expected as shown in FIG. 3 (A).
  • the formation of the complex that is, the hybridization of the RNA oligomer to the mRNA can be performed by known methods and conditions.
  • the temperature is raised after being warmed and allowed to stand for a certain period of time. Heating is performed for the purpose of more efficiently binding the mRNA and the oligomer by releasing the complementary bond which is present in the molecule or within the molecule of the oligomer or oligomer beforehand. If proper hybridization is ensured, the temperature time can be adjusted appropriately. As the temperature decrease is gradual, the specificity of hybridization increases. In addition, the oligomer chain length does not greatly affect the setting of hybridization conditions. Conditions should be set appropriately while evaluating the hybridization efficiency. For example, the methods and conditions described in the examples below can be mentioned.
  • the present invention also includes forming a complex of an mRNA encoding a target gene and at least two RNA oligomers containing the RNA sequence of (a) or (b) below: At least two RNA oligomers are capable of hybridizing to different sequences in the sequence of mRNA, In the complex, the first sequence of the RNA oligomer hybridizes to a different mRNA than the second sequence of the RNA oligomer, Provided is a method for stabilizing mRNA.
  • RNA sequence including, in order, a second sequence which is a sequence
  • the present invention includes the formation of a complex of an mRNA encoding a target gene and at least one RNA oligomer containing the RNA sequence of (a) or (b) below:
  • the first sequence of the RNA oligomer hybridizes to a different mRNA than the second sequence of the RNA oligomer
  • the mRNA and RNA oligomer used for the stabilization method are as described in the description of the complex.
  • the complex comprising the mRNA is in the form of a naked. That is, the complex containing mRNA is not accompanied by a transport carrier.
  • the complex containing mRNA is in a form encapsulated in a transport carrier.
  • the transport carrier is not particularly limited as long as it can be delivered to a suitable site in the subject's body by enclosing the complex containing the mRNA.
  • the transport carrier is a lipidic mRNA carrier, or a cationic polymer complex, more preferably a polymeric micelle or a lipidic mRNA carrier.
  • Polymer micelles have a two-layer structure of a condensed nucleic acid, an inner core formed of a cationic polymer, and an outer shell formed of a hydrophilic polymer.
  • the cationic polymer is, for example, a polyamino acid derivative.
  • the hydrophilic polymer is, for example, polyethylene glycol ("PEG").
  • the inner core physically or chemically encapsulates the mRNA.
  • the outer shell by its physicochemical properties, defines the physicochemical properties of the polymeric micelle in the in vivo environment. For example, in the case of PEG, in addition to suppressing nonspecific adsorption of surrounding substances to the polymeric micelle, foreign body recognition of the polymeric micelle in vivo can be avoided.
  • Polymeric micelles can enter cells by endocytosis.
  • Polymeric micelles can, for example, utilize the interaction of a polycation on a block polymer with a nucleic acid (polyion complex ("PIC”)), as well as hybrid micelles with it and inorganic molecules.
  • PIC type polymer micelles for example, PEG-PAsp (DET) -Chol, PEG-PAsp (DET), PIC micelles formed by multimolecular association of PEG-PLys and mRNA, PAsp (TET), PAsp Other polycations such as TEP) used as block copolymers (Uchida, S., et al., Biomaterials (2016) 82, p.
  • hybrid polymer micelles with inorganic particles include PEGylated calcium phosphate (CaP) particles (Pittela, et al., Biomaterials (2011) 32, p. 3106-3114), PEGylated silica particles (Miyata, K. et al. , Et al. Biomaterials (2010) 31, p4764-4770).
  • CaP PEGylated calcium phosphate
  • the lipidic mRNA carrier is formed using a lipid or a cationic lipid as a carrier, and the mRNA is in a form in which it is enclosed or bound.
  • a lipid or a cationic lipid for example, N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA), 2,3-dioleyloxy-N- [2- (spermine carboxamide) Ethyl] -N, N-Dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate (DOSPA), 1,2-dioleoyloxy-3- (trimethylammonium) propane (DOTAP), N- [1- (2,3 Cationic lipids such as -dimyristyloxy) propyl] -N, N-dimethyl-N- (2-hydroxyethyl) ammonium bromide (DMRIE) or DC-cholesterol; distearoylphosphatid
  • the cationic polymer complex is, for example, a mixture of linear or branched polyethyleneimine, polylysine, polyarginine, chitosan derivative, polymethacrylic acid derivative and mRNA.
  • the amount of complex comprising mRNA to be encapsulated in the transport carrier is the ratio of the cationic charge (+) in the transport carrier to the anionic charge (-) of the complex comprising mRNA (+/ ⁇ ratio) For example, 0.5 to 200, preferably 1 to 50, and more preferably 1 to 10.
  • compositions The present invention provides a pharmaceutical composition containing the complex.
  • the complex is in the form of being encapsulated in a transport carrier.
  • the pharmaceutical composition is used to deliver the complex into the subject's body.
  • Subject is a human or non-human organism, eg, birds and non-human mammals (eg, cattle, monkeys, cats, mice, rats, guinea pigs, hamsters, pigs, dogs, dogs, rabbits, sheep, and horses) is there.
  • non-human mammals eg, cattle, monkeys, cats, mice, rats, guinea pigs, hamsters, pigs, dogs, dogs, rabbits, sheep, and horses
  • the pharmaceutical composition is intravenously, intraarterially, orally, tissueally (eg, intravesical, intrapleural, intraperitoneal, intraocular, intracerebral administration), transdermally administered to the subject , Transmucosal administration, pulmonary administration or rectal administration.
  • tissueally eg, intravesical, intrapleural, intraperitoneal, intraocular, intracerebral administration
  • transmucosal administration pulmonary administration or rectal administration.
  • intravenous administration, transdermal administration and transmucosal administration are desirable.
  • Dosages suitable for these administrations for example, various injections, oral agents, drops, inhalants, eye drops, ointments, lotions, suppositories, etc.
  • Each condition such as dosage, administration frequency and administration period may be appropriately determined by those skilled in the art, taking into consideration the type of mRNA, dosage form, subject condition such as age and body weight, administration route, nature and extent of disease. It can be set.
  • the pharmaceutical composition can be used for treatment of introducing mRNA encoding a desired gene into cells causing various diseases.
  • the present invention can also provide a method for treating various diseases, including administering the pharmaceutical composition to a subject in need of treatment for various diseases.
  • the conditions such as the dose, the number of administrations and the administration period are the same as described above.
  • Various diseases to be treated include, for example, cancer, viral diseases, metabolic diseases, cardiovascular diseases, neurological diseases, renal urinary diseases, hematologic malignancies, diseases for which promotion or suppression of apoptosis is desired, collagen diseases, respiration Organ diseases and digestive diseases.
  • excipients for pharmaceutical compositions, excipients, fillers, fillers, binders, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants, surfactants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers commonly used in the manufacture of pharmaceuticals
  • Preservatives, flavoring agents, soothing agents, stabilizers, tonicity agents and the like can be appropriately selected and used, and can be prepared by a conventional method.
  • intravenous injection including instillation
  • it is provided, for example, in the form of a unit dose ampoule or a multiple dose container.
  • the amount of mRNA administered is, for example, 1 for adults, taking into consideration the type of mRNA, dosage form, subject condition such as age and body weight, administration route, nature and degree of disease, etc. It is generally in the range of 0.1 mg to 5 g / human, preferably in the range of 1 mg to 2 g per day.
  • the dose may vary depending on the type of disease to be targeted, the administration form and the target molecule. Therefore, in some cases below this may be sufficient, and conversely more doses may be required. It can be administered once to several times a day, or at intervals of one day to several days.
  • the mRNA delivery kit of the present invention is characterized by containing the complex.
  • the complex is in the form of being encapsulated in a transport carrier.
  • the kit can be preferably used, for example, in a method of treating various diseases using the complex.
  • the storage state of the complex is not limited, and the state of solution or powder can be selected in consideration of its stability (preservability) and ease of use.
  • the kit may include other components in addition to the complex.
  • Other components can include, for example, various buffers and instructions for use (manual for use).
  • Example 1 Preparation of mRNA mRNA was prepared from template DNA by in vitro transcription, where template DNA was prepared as follows. First, T7-Gluc plasmid inserts the Gluc coding sequence (Figure 7; SEQ ID NO: 1) from pCMV-Gluc control plasmid (New England BioLabs, Ipswich, Mass., USA) into HindIII, Xba1 site of pSP73 vector (Promega) Made by Thereafter, T7-Gluc poly A120 plasmid was prepared by inserting A120- (BsmBI cleavage site) into the EcoR1-Bgl2 site of T7-Gluc plasmid. Then, after cleaving with BsmBI, blunting of the end with T4 DNA Polymerase (Takara Bio) was used for the following in vitro transcription.
  • Figure 7 SEQ ID NO: 1
  • T7-Gluc poly A120 plasmid was prepared by inserting A120- (BsmBI clea
  • the mRNA was subjected to the above-mentioned restriction enzyme treatment encoding Gaussia luciferase (Gluc) using mMESSAGE mMACHINE (trade name) T7 (Thermo Fisher Scientific), and the blunted template DNA (T7-Gluc poly A120 plasmid) was added in It was produced by transcription in an in vitro environment.
  • the transcribed mRNA was purified and recovered using RNeasy Mini Kit (QIAGEN). The recovered mRNA concentration was measured by NanoDrop (Thermo Fisher Scientific).
  • NanoDrop confirmed the production of highly pure mRNA with an absorbance ratio of 260 to 280 nm of 2.0 to 2.2 at a high concentration of 500 to 1,000 ng / ⁇ L.
  • analysis of the bioanalyzer confirmed that mRNA of the intended size was produced.
  • the sequence of the prepared mRNA (SEQ ID NO: 2) is shown in FIG.
  • the underlined portion is the open reading frame (ORF)
  • the upstream of the ORF is the 5 'UTR (54 bases)
  • the downstream of the ORF is the 3' UTR (52 bases)
  • further downstream 120A is a poly A sequence.
  • the number of Poly A theoretically it is 120 bp in the template DNA and 119 bases in the mRNA. However, the number can be increased or decreased at the stage of DNA amplification or mRNA preparation.
  • RNA oligomers were designed and prepared as follows.
  • the RNA secondary structure prediction software http://rtips.dna.bio.keio.ac.jp/ipknot/) predicts the secondary structure of Gluc mRNA, and the RNA strand does not have secondary structure.
  • the RNA oligomer was designed against.
  • the RNA oligomer was requested to be synthesized at Hokkaido System Science Inc., including cholesterol modification at the 5 'end or 3' end.
  • linker RNA oligomer comprises in this order a 17-mer sequence capable of hybridizing to mRNA, a 10-mer linker sequence which is all adenine (A), and the same sequence as the 17-mer sequence. It is an RNA oligomer.
  • the “non-linker RNA oligomer” is a structure in which the linker RNA oligomer is halved, and contains in this order a 17-mer sequence capable of hybridizing to mRNA and a 5-mer linker sequence which is all adenine (A). It is an RNA oligomer.
  • non-linker RNA oligomers non-linker RNA oligomer 1: UCUUUGAGCACACCUCCAGAAAAA (SEQ ID NO: 11) non-linker RNA oligomer 2: GCGGCAGCCACUUCUUGAAAAA (SEQ ID NO: 12) non-linker RNA oligomer 3: ACUCUUUGUCGCUUCGAAAAA (SEQ ID NO: 13) non-linker RNA oligomer 4: CUCGCCCACAGCGAUGCAAAAA (SEQ ID NO: 14) non-linker RNA oligomer 5: GUGGGACAGGCAGAUCAAAAA (SEQ ID NO: 15) non-linker RNA oligomer 6: GCAGCCAGCUUUCCGGGAAAA (SEQ ID NO: 16) non-linker RNA oligomer 7: UUGAAGUCUUCGUGUUUAAAAAA (SEQ ID NO: 17) non-linker RNA oligomer 8: CUCUAGAUGCAU
  • RNA oligomer is added in a molar ratio of 0.5 with the mRNA at a molar ratio of 500 ng / ⁇ L of NaCl 150 mM solution (Wako Pure Chemical Industries), heated at 65 ° C. for 5 minutes, 30 ° C. over 90 minutes Hybridization was performed by cooling down to (FIG. 2 (B)).
  • mRNA + linker RNA oligomers a complex of mRNA and RNA oligomer was produced ("mRNA + linker RNA oligomers" in FIG. 2 (A)).
  • mRNA + non-linker RNA oligomers were also prepared, except that RNA oligomers were added in one equivalent molar ratio to mRNA (FIG. 2 (A)). This is a control in which RNA oligomers are formed but the mRNAs are not cross-linked to form a nanoassembly.
  • single-stranded mRNA is also shown in FIG. 2 (A).
  • mRNA nanoassembly the complex of mRNA and RNA oligomer produced by hybridization is referred to as mRNA nanoassembly.
  • Example 3 Physical property analysis of mRNA nanoassembly (1) Analysis of FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy, manufactured by OLYMPUS, MF20) The size of mRNA nanoassembly was evaluated by FCS analysis, and the optimal Linker number was examined. The method of producing the mRNA nanoassembly is as described in Example 2.
  • FCS Fluorescence Correlation Spectroscopy
  • RNA Oligomers 1 1, 2, 4, 6, and 8
  • Linker number ie, the type of RNA oligomers used
  • linker RNA oligomers 2 4, 6 and 8
  • linker RNA oligomers 1 2, 4, 5, 6 and 8
  • the mRNA was stained with fluorescent Cy5 to form an mRNA nanoassembly, and then measured to 5 ng / ⁇ L (in distilled water).
  • Label IT tracker Cy5 kit (Mirus) was used for fluorescent staining of mRNA.
  • FIG. 3 (A) The results are shown in FIG. 3 (A).
  • the number of linkers was 6 or more, the size of mRNA nanoassembly became constant. Therefore, in the following embodiments, eight linkers are mainly selected with a certain margin.
  • AFM Anamic Force Microscopy, Shimadzu, SPM-9700 analysis
  • the mRNA concentration is 3 ng / ⁇ L (10 mM MgCl 2 solution, (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)), added to the substrate, dried and measured by AFM did.
  • FIG. 3 (B) The results are shown in FIG. 3 (B).
  • the color scale is shown on the right of FIG. 3 (B), and the closer the color is to white, the higher the height, ie, the larger the size.
  • Linker The number 8 mRNA nanoassembly has many white parts, and some with a particle size of over 100 nm. On the other hand, it can be seen that mRNA alone has few white parts, and few particles with a particle size exceeding 100 nm, and that mRNA nanoassembly has a larger particle size compared to mRNA alone.
  • Example 4 Enzyme-resistant and translational activity in cell-free translation system of mRNA nanoassembly (1) Enzyme resistance test The enzyme resistance of mRNA nanoassembly in Fetal Bovine Serum (FBS, Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd., Osaka, Japan) was examined.
  • Fetal Bovine Serum Fetal Bovine Serum
  • Fetal bovine serum is diluted with phosphate buffer (PBS, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to a predetermined concentration, and there is a solution of mRNA nanoassembly so that the final concentration of mRNA is 6.25 ng / ⁇ L.
  • PBS phosphate buffer
  • mRNA was extracted from the solution using RNeasy Mini Kit (QIAGEN). After reverse transcription of the extracted mRNA into complementary DNA (cDNA), the remaining cDNA was quantitatively evaluated by qRT-PCR. The relative value of the amount of mRNA was determined, assuming that the amount of mRNA when left at 37 ° C. in the presence of FBS was 100%.
  • “MRNA + 8 non-linker RNA oligomers” is mRNA plus 8 non-linker RNA oligomers (non-linker RNA oligomers 1 to 8) as RNA oligomers.
  • the "mRNA + 8 non-linker RNA oligomers” showed slightly improved enzyme stability than mRNA. This is considered to be due to the formation of a double strand between the mRNA and the RNA oligomer.
  • “MRNA + 8 linker RNA oligomers” is the mRNA to which 8 linker RNA oligomers (linker RNA oligomers 1 to 8) are added as RNA oligomers.
  • the enzyme stability in "mRNA + 8 linker RNA oligomers" is more than 100 times greater than "mRNA + 8 non-linker RNA oligomers". This is a result that the FBS concentration at which 50% of mRNA is degraded is about 1% in "mRNA + 8 linker RNA oligomers” while it is about 0.005% in "mRNA + 8 non-linker RNA oligomers". It can be calculated based on From the above, it was found that the formation of the mRNA nanoassembly dramatically improves the enzyme resistance.
  • mRNA nanoassembly can significantly improve enzyme resistance while maintaining translational activity.
  • Example 5 Cellular uptake of mRNA nanoassembly and mRNA expression in cells After 24 hours, the cells were replaced with Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) in serum-free medium and added with 250 ng of mRNA to HuH-7 cells (Riken Cell Bank) grown in 10,000 cells / well in 96 well plates . The measurement was performed 4 h after that (FIG. 5 (A)).
  • Opti-MEM Thermo Fisher Scientific
  • HuH-7 cells Raken Cell Bank
  • mRNA was fluorescently labeled with Label IT tracker Cy3 kit (Mirus). After washing the cell surface twice with PBS after 4 h of mRNA introduction, dissolve the cells with Lysis buffer (Promega) and use an Infinite M1000 PRO spectrophotometer (Tecan Group Ltd., Mannedorf, Switzerland) as an excitation wavelength of 543 nm and a detection wavelength of 568 nm. The fluorescence intensity was observed.
  • mRNA nanoassembly has the same cellular uptake efficiency as mRNA but the same expression efficiency in cells as mRNA. This result suggests that, even in cells, the translational activity of mRNA nanoassembly is almost the same as the translational activity of mRNA alone.
  • NCA- ⁇ -benzyl-L-aspartate-N-carboxylic acid anhydride
  • NCA- ⁇ -benzyl-L-aspartate-N-carboxylic acid anhydride
  • MeO-PEG-NH 2 M w : 12 kDa of PEG
  • PEG-poly ( ⁇ -benzyl L-aspartate) PEG-PBLA was synthesized by ring-opening polymerization of BLA). 505 mg of MeO-PEG-NH 2 were taken up, dissolved in benzene and lyophilized overnight.
  • PEG-PBLA 200 mg was dissolved in benzene, lyophilized and dried.
  • PEG-PBLA and Dry diethylenetriamine (DET) 50 equivalents relative to PBLA were dissolved in 0.5 N thiourea in Dry NMP.
  • the solutions were cooled to 10 ° C. and the PEG-PBLA solution was slowly dropped into the DET solution and stirred for 1 hour.
  • the reaction solution was neutralized with 5 N HCl aqueous solution while keeping the solution temperature at 10 ° C. or less, and dialyzed with 0.01 N HCl aqueous solution at 4 ° C. for 1 day. Thereafter, dialysis was performed for another day at 4 ° C. with ion-exchanged water. After dialysis, the solution was lyophilized to obtain PEG-PAsp (DET) white powder.
  • MeO-PEG-NH 2 400 mg was taken up, dissolved in benzene and lyophilized overnight. After lyophilization, MeO-PEG-NH 2 and NCA-Lys (TFA) were completely dissolved in 0.5 M thiourea dry dimethylformamide (DMF) solvent under Ar atmosphere. The NCA-Lys (TFA) solution was added to the MeO-PEG-NH 2 solution and stirred at 25 ° C. for 3 days. The reaction solution was reprecipitated in diethyl ether to recover PEG-PLys (TFA). Then, PEG-PLys (TFA) was vacuum dried to obtain a white powder. Then, the reaction was carried out at 35 ° C.
  • FBS serum Fetal bovine serum
  • 10 mM HEPES buffer pH 7.4
  • PM solution is added thereto, and left at 37 ° C. for 15 minutes did.
  • RNA was extracted from the solution using RNeasy Mini Kit (QIAGEN). After reverse transcription of the extracted RNA into complementary DNA (cDNA), the remaining cDNA was quantitatively evaluated by qRT-PCR. The relative value is shown with the amount of mRNA when left to stand at 37 ° C. in the presence of FBS as 100%.
  • N 4 (FIGS. 10 and 11).
  • PM composed of nano-aggregates showed higher enzyme resistance than PM composed of non-aggregated mRNA.
  • Student's t-test is performed, n. s. Means no significance.
  • Example 7 Preparation of nanoassembly from GFP mRNA
  • the above example shows the analysis result of the nanoassembly prepared from GLuc mRNA
  • this example shows that the same strategy is effective for other mRNAs.
  • analysis of nanoassembly prepared from GFP mRNA was performed.
  • the coding sequence of GFP SEQ ID NO: 21 is shown in FIG.
  • the GFP mRNA (manufactured by Trilink) was purchased, and the following eight linker RNA oligomers (# 17 to # 24) synthesized by Hokkaido System Science Inc. were used in the same manner as in the case of GLuc in Example 2 described above.
  • the nanoassembly was prepared by hybridization to The GFP mRNA contains a 5 'UTR upstream of an open reading frame (ORF), a 3' UTR downstream of the ORF, and a poly A sequence downstream thereof.
  • ORF open reading frame
  • the “linker RNA oligomer” is an RNA oligomer comprising, in this order, a 17-mer sequence capable of hybridizing to mRNA, a 10-mer linker sequence which is all adenine (A), and the same sequence as the 17-mer sequence.
  • Example 8 Analysis of mRNA nanoassembly Although analysis was performed on the mRNA nanoassembly prepared in Example 7, each method is the same as that of GLuc mRNA of the previous example.
  • AFM Anamic Force Microscopy, Shimadzu, SPM-9700 Analysis
  • the mRNA nanoassembly was measured by AFM in the same manner as in Example 3 (1).
  • the results are shown in FIGS. 15 (A) to (D).
  • the color scale is shown on the right of FIG. 15C, and the closer the color is to white, the higher the height, that is, the larger the size.
  • the Linker number 8 mRNA nanoassembly has many white parts, and some with a particle size of over 100 nm are scattered (Fig. 15 (C) and (D)).
  • the white portion is small, and the size of particles exceeding 100 nm is hardly present (FIGS. 15A and 15B). From these facts, it is understood that the mRNA nanoassembly has a larger particle size than the mRNA alone.
  • Example 9 FFF (Field Forward Fractionation) Analysis of mRNA Nanoassembly
  • FFF Field Forward Fractionation
  • ⁇ Device name Eclipse AF4 (Ako Scientific Scientific Co., Ltd.)
  • MRNA concentration 100 ng / ⁇ L
  • Injection volume 25 ⁇ L
  • Flow rate The detector flow was 1 mL / min, and the cross flow was decreased from 1 mL / min to 0 mL / min at a constant pace over 28 minutes.
  • FIG. Nanoassembly shifted to the right compared to unhybridize (FIG. 16 (B)), and large particle formation was confirmed (FIG. 16 (A)). Also, in this method it is possible to separate nanoassembly by size.
  • MRNA delivery using a complex of mRNA and RNA oligomer is expected to be applied to medical treatment as a method for safely and continuously supplying a therapeutic protein.
  • Sequence number 1 Synthetic DNA SEQ ID NOs: 2 to 18: synthetic RNA SEQ ID NOS: 19 to 21: Synthetic DNA SEQ ID NOs: 22-29: synthetic RNA SEQ ID NOs: 30 to 31: synthetic DNA

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Abstract

目的遺伝子をコードするｍＲＮＡとＲＮＡオリゴマーとの複合体であって、ＲＮＡオリゴマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーであり、少なくも２種のＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡの配列中のそれぞれ異なる配列にハイブリダイズ可能であり、ＲＮＡオリゴマーの第１の配列が、ＲＮＡオリゴマーの第２の配列とは異なるｍＲＮＡにハイブリダイズすることで形成される、複合体：（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列をこの順に含むＲＮＡ配列；（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列。これにより、ｍＲＮＡの新たな安定化方法が提供される。

Description

ｍＲＮＡの安定化方法
　本発明は、ｍＲＮＡの安定化方法に関する。
　ｍＲＮＡ送達は、治療用タンパク質を安全かつ持続的に供給するための手法として注目を集めている。一方でｍＲＮＡが生体内で速やかに酵素分解を受けてしまうことが大きな課題である。これに対して、ｍＲＮＡ輸送担体を用いてｍＲＮＡを分解から保護する方法、及びｍＲＮＡ分子自体を改良する方法が検討されているが、生体内でのＲＮＡ分解酵素が非常に強いため、さらなる技術革新が求められている。
　ｍＲＮＡ分子自体を改良する方法について、ｍＲＮＡ塩基の一部を化学修飾したものに置換する方法が検討されている（例えば、非特許文献１）。これまでに様々な化学修飾塩基が網羅的に検討されたが、ｍＲＮＡの酵素耐性を大幅に向上させることができるものは未だに報告されていない。また、修飾を行うことでしばしばｍＲＮＡからのタンパク質翻訳効率が大きく低下してしまうことから、自由な化学修飾は困難であった。
　ここで、特許文献１には、カチオン性ポリマーとｍＲＮＡのポリイオンコンプレックスが記載され、これをｍＲＮＡの送達に用いることが記載されている。また、非特許文献２には、高分子ミセル型ｍＲＮＡ輸送担体の安定性、酵素分解の評価、およびポリマーにコレステロール修飾を行う効果について記載されている。しかしながら、これらの文献には、生体内において、ｍＲＮＡからのタンパク質翻訳効率を大きく低下させることなく、ｍＲＮＡの酵素耐性を向上させることできる、ｍＲＮＡの安定化方法は記載されていない。
ＷＯ２０１５／１２１９２４Ａ
Ｍｅｉｓ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ　Ｃｈｅｎ，Ｆ．（２００２）ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ　Ｆｏｒｕｍ　９（１），１０ Ｕｃｈｉｄａ，Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１６）８２，ｐ．２２１-２２８．
　本発明は、ｍＲＮＡの新たな安定化方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ｍＲＮＡと相補的な第１の配列とリンカー配列と第１の配列と同じ配列である第２の配列を含む少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーをｍＲＮＡにハイブリダイズさせることでｍＲＮＡとＲＮＡオリゴマーの複合体を得ることができ、この複合体がｍＲＮＡを安定化できることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１－１］　目的遺伝子をコードするｍＲＮＡとＲＮＡオリゴマーとの複合体であって、
　ＲＮＡオリゴマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーであり、
　少なくも２種のＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡの配列中のそれぞれ異なる配列にハイブリダイズ可能であり、
　ＲＮＡオリゴマーの第１の配列が、ＲＮＡオリゴマーの第２の配列とは異なるｍＲＮＡにハイブリダイズすることで形成される（すなわち、ｍＲＮＡ同士がＲＮＡオリゴマーにより架橋された）、複合体。
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列；
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
［１－２］　前記ＲＮＡオリゴマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーである、上記［１－１］に記載の複合体。
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の第１の配列と、０～３０塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列をこの順に含むＲＮＡ配列
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズする第１の配列と、０～３０塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
［１－３］　前記ＲＮＡオリゴマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーである、上記［１－１］に記載の複合体。
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の第１の配列と、１０塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列をこの順に含むＲＮＡ配列
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズする第１の配列と、１０塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
［１－４］　前記リンカー配列の塩基が全てアデニンである、上記［１－１］～［１－３］のいずれか１項に記載の複合体。
［１－５］　前記少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーが、２～８種のＲＮＡオリゴマーである、上記［１－１］～［１－４］のいずれか１項に記載の複合体。
［１－６］　ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ～１０，０００μｇ／ｍＬ、ｍＲＮＡと少なくとも２種の各ＲＮＡオリゴマーとのモル比が１：０．０５～０．０５：１となるようにｍＲＮＡと少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーを含む、上記［１－１］～［１－５］のいずれか１項に記載の複合体。
［１－７］　上記［１－１］～［１－６］のいずれか１項に記載の複合体を含有する、医薬組成物。
［２－１］　目的遺伝子をコードするｍＲＮＡと、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーとの複合体を形成させることを含み、
　少なくも２種のＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡの配列中のそれぞれ異なる配列にハイブリダイズ可能なものであり、
　複合体において、ＲＮＡオリゴマーの第１の配列は、ＲＮＡオリゴマーの第２の配列とは異なるｍＲＮＡにハイブリダイズする、
　ｍＲＮＡの安定化方法。
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
［２－２］　前記ＲＮＡオリゴマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーである、上記［２－１］に記載の方法。
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の第１の配列と、０～３０塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列をこの順に含むＲＮＡ配列
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズする第１の配列と、０～３０塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
［２－３］　前記ＲＮＡオリゴマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーである、上記［２－１］に記載の方法。
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の第１の配列と、１０塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列をこの順に含むＲＮＡ配列
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズする第１の配列と、１０塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
［２－４］　前記リンカー配列の塩基が全てアデニンである、上記［２－１］～［２－３］のいずれか１項に記載の方法。
［２－５］　前記少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーが、２～８種のＲＮＡオリゴマーである、上記［２－１］～［２－４］のいずれか１項に記載の方法。
［２－６］　ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ～１０，０００μｇ／ｍＬ、ｍＲＮＡと少なくとも２種の各ＲＮＡオリゴマーとのモル比が１：０．０５～０．０５：１となるようにｍＲＮＡと少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーを含む、上記［２－１］～［２－５］のいずれか１項に記載の方法。
［３－１］　目的遺伝子をコードするｍＲＮＡとＲＮＡオリゴマーとの複合体であって、
　ＲＮＡオリゴマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも１種のＲＮＡオリゴマーであり、
　ＲＮＡオリゴマーの第１の配列が、ＲＮＡオリゴマーの第２の配列とは異なるｍＲＮＡにハイブリダイズすることで形成される（すなわち、ｍＲＮＡ同士がＲＮＡオリゴマーにより架橋された）、複合体。
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列；
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
［３－２］　前記ＲＮＡオリゴマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも１種のＲＮＡオリゴマーである、上記［３－１］に記載の複合体。
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の第１の配列と、０～３０塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、０～３０塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
［３－３］　前記ＲＮＡオリゴマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも１種のＲＮＡオリゴマーである、上記［３－１］に記載の複合体。
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の第１の配列と、１０塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、１０塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
［３－４］　前記リンカー配列の塩基が全てアデニンである、上記［３－１］～［３－３］のいずれか１項に記載の複合体。
［３－５］　前記少なくとも１種のＲＮＡオリゴマーが、２～８種のＲＮＡオリゴマーである、上記［３－１］～［３－４］のいずれか１項に記載の複合体。
［３－６］　ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ～１０，０００μｇ／ｍＬ、ｍＲＮＡと少なくとも１種の各ＲＮＡオリゴマーとのモル比が１：０．０５～０．０５：１となるようにｍＲＮＡと少なくとも１種のＲＮＡオリゴマーを含む、上記［３－１］～［３－５］のいずれか１項に記載の複合体。
［３－７］　上記［３－１］～［３－６］のいずれか１項に記載の複合体を含有する、医薬組成物。
［４－１］　目的遺伝子をコードするｍＲＮＡと、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも１種のＲＮＡオリゴマーとの複合体を形成させることを含み、
　複合体において、ＲＮＡオリゴマーの第１の配列は、ＲＮＡオリゴマーの第２の配列とは異なるｍＲＮＡにハイブリダイズする、
　ｍＲＮＡの安定化方法。
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列；
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
［４－２］　前記ＲＮＡオリゴマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも１種のＲＮＡオリゴマーである、上記［４－１］に記載の方法。
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の第１の配列と、０～３０塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、０～３０塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
［４－３］　前記ＲＮＡオリゴマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも１種のＲＮＡオリゴマーである、上記［４－１］に記載の方法。
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の第１の配列と、１０塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、１０塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
［４－４］　前記リンカー配列の塩基が全てアデニンである、上記［４－１］～［４－３］のいずれか１項に記載の方法。
［４－５］　前記少なくとも１種のＲＮＡオリゴマーが、２～８種のＲＮＡオリゴマーである、上記［４－１］～［４－４］のいずれか１項に記載の方法。
［４－６］　ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ～１０，０００μｇ／ｍＬ、ｍＲＮＡと少なくとも１種の各ＲＮＡオリゴマーとのモル比が１：０．０５～０．０５：１となるようにｍＲＮＡと少なくとも１種のＲＮＡオリゴマーを含む、上記［４－１］～［４－５］のいずれか１項に記載の方法。
［５－１］　上記［１－１］～［１－６］及び［３－１］～［３－６］のいずれか１項に記載の複合体を内包したｍＲＮＡの輸送担体。
［５－２］　輸送担体が、高分子ミセル又は脂質性ｍＲＮＡキャリアである、上記［５－１］に記載のｍＲＮＡの輸送担体。
［５－３］　上記［５－１］又は［５－２］に記載のｍＲＮＡの輸送担体を含む、医薬組成物。
　本発明は、ｍＲＮＡの新たな安定化方法を提供する。好ましくは、本発明は、生体内において、ｍＲＮＡからのタンパク質翻訳効率を維持したまま、ｍＲＮＡを安定化することができる。より好ましくは、本発明は、生体内でのｍＲＮＡの酵素分解を抑制することができる。
ｍＲＮＡナノアッセンブリの概念図である。（Ａ）ｍＲＮＡナノアッセンブリの形成、（Ｂ）ＲＮＡオリゴマー。 実施例で使用したｍＲＮＡナノアッセンブリを示す図である。（Ａ）ｍＲＮＡナノアッセンブリの種類（ｍＲＮＡのみ、ｍＲＮＡ＋ｎｏｎ－ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ、及びｍＲＮＡ＋ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ）、（Ｂ）ハイブリダイズ条件。 実施例で作製したｍＲＮＡナノアッセンブリの物性解析を示す図である。（Ａ）ＦＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）によるサイズ解析結果、（Ｂ）ＡＦＭ（Ａｔｏｍｉｃ　Ｆｏｒｃｅ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）写真。 実施例で作製したｍＲＮＡナノアッセンブリの酵素耐性試験及び無細胞系における翻訳活性解析の結果を示す図である。（Ａ）酵素耐性試験、（Ｂ）無細胞系における翻訳活性解析。 実施例で作製したｍＲＮＡナノアッセンブリの培養細胞への細胞内取り込み量及び細胞でのｍＲＮＡ発現量を示す図である。（Ａ）実験手順、（Ｂ）細胞内取り込み量、（Ｃ）ｍＲＮＡ発現量。 実施例で作製したガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）のｍＲＮＡの配列である（配列番号２）。下線部がｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｌａｍｅである。 実施例で使用したガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）のコード配列である（配列番号１）。 実施例でＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いて作製した高分子ミセル（ＰＭｓ）の粒径を評価した結果を示す図である。 実施例でＰＥＧ－ＰＬｙｓを用いて作製した高分子ミセル（ＰＭｓ）の粒径を評価した結果を示す図である。 実施例でＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いて作製したｍＲＮＡナノアッセンブリの、１０％血清培養下での酵素耐性試験の結果を示す図である。 実施例でＰＥＧ－ＰＬｙｓを用いて作製したｍＲＮＡナノアッセンブリの、５０％血清培養下での酵素耐性試験の結果を示す図である。 実施例で使用したＥＧＦＰのコード配列である（配列番号２１）。 実施例で作製したＥＧＦＰｍＲＮＡナノアッセンブリのＦＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）によるサイズ解析結果を示す図である（Ｎ＝５）。 実施例で作製したＥＧＦＰｍＲＮＡナノアッセンブリの血清中での分解酵素耐性試験の結果を示す図である（Ｎ＝４）。 実施例で作製したＥＧＦＰｍＲＮＡナノアッセンブリのＡＦＭ（Ａｔｏｍｉｃ　Ｆｏｒｃｅ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によるサイズ解析結果を示す図である。（Ａ）および（Ｂ）ｕｎｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ、（Ｃ）および（Ｄ）Ｎａｎｏ－ａｓｓｅｍｂｌｙ。 実施例で作製したＥＧＦＰｍＲＮＡナノアッセンブリのＦＦＦ（Ｆｉｅｌｄ　ｆｏｒｗａｒｄ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）によるサイズ解析結果を示す図である。（Ａ）ｕｎｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ、（Ｂ）Ｎａｎｏ－ａｓｓｅｍｂｌｙ。
　以下、本発明を詳細に説明するが、以下の実施の形態は本発明を説明するための例示であり、本発明はその要旨を逸脱しない限りさまざまな形態で実施することができる。また、本明細書において引用した全ての刊行物、例えば、先行技術文献及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、その全体が本明細書において参照として組み込まれる。また、本明細書は、本願の優先権主張の基礎となる米国仮出願Ｎｏ．６２／５８３，６９１（２０１７年１１月９日出願）の特許請求の範囲、明細書、及び図面の開示内容を参照して組み込むものとする。
１．概要
　ここでは、目的遺伝子をコードするｍＲＮＡとＲＮＡオリゴマーとの複合体（「ｍＲＮＡナノアッセンブリ」という場合がある）が提供される（図１（Ａ））。いくつかの態様ではＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡの配列に実質的に相補的な第１の配列と場合によりリンカー配列と第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列である（図１（Ｂ））。ＲＮＡオリゴマーは少なくとも２種用いる。１種のｍＲＮＡに対して少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーを用い、ｍＲＮＡとＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせることで、ｍＲＮＡナノアッセンブリを作製できる。ｍＲＮＡナノアッセンブリにおいては、ｍＲＮＡ同士がＲＮＡオリゴマーの作用によって、すなわち、ｍＲＮＡ同士がＲＮＡオリゴマーによって架橋されることによって互いに近づく。ｍＲＮＡ同士が互いに近づくことによって、ｍＲＮＡ同士の間でも部分的にハイブリダイゼーションが形成される（図１（Ａ））。
　ｍＲＮＡナノアッセンブリ中のｍＲＮＡは、その立体障害のために、一本鎖のｍＲＮＡと比較して分解酵素に認識されにくいと考えられる。実際に、ｍＲＮＡナノアッセンブリでは、酵素耐性が大きく向上した（図４（Ａ））。しかも、ｍＲＮＡナノアッセンブリは、細胞内取り込み効率がｍＲＮＡとほとんど変わらない一方で、翻訳活性が保たれていることがわかった（図４（Ｂ）、図５（Ｂ）及び（Ｃ））。
２．複合体
　本発明は、目的遺伝子をコードするｍＲＮＡとＲＮＡオリゴマーとの複合体であって、
　ＲＮＡオリゴマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーであり、
　少なくも２種のＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡの配列中のそれぞれ異なる配列にハイブリダイズ可能であり、
　ＲＮＡオリゴマーの第１の配列が、ＲＮＡオリゴマーの第２の配列とは異なるｍＲＮＡにハイブリダイズすることで形成される（すなわち、ｍＲＮＡ同士がＲＮＡオリゴマーにより架橋された）、複合体を提供する。
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列；
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
　また、本発明は、目的遺伝子をコードするｍＲＮＡとＲＮＡオリゴマーとの複合体であって、
　ＲＮＡオリゴマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも１種のＲＮＡオリゴマーであり、
　ＲＮＡオリゴマーの第１の配列が、ＲＮＡオリゴマーの第２の配列とは異なるｍＲＮＡにハイブリダイズすることで形成される（すなわち、ｍＲＮＡ同士がＲＮＡオリゴマーにより架橋された）、複合体を提供する。
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列；
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
　目的遺伝子は、当業者であれば目的に応じて適宜選択することができる。目的遺伝子は、例えば、レポーター遺伝子、成長因子遺伝子、細胞増殖因子遺伝子、細胞増殖抑制因子遺伝子、細胞死促進因子遺伝子、細胞死抑制因子遺伝子、癌抑制遺伝子、転写因子遺伝子、ゲノム編集遺伝子又はワクチン抗原遺伝子である。例えば、特定の細胞を増殖させることが必要な対象に対して該特定の細胞の増殖因子遺伝子をコードするｍＲＮＡを含む複合体を投与することで、該対象における疾患や状態を処置することができる。
　レポーターとしては、例えば、発光タンパク質、及び蛍光タンパク質が挙げられる。
　成長因子としては、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ又はＦＧＦ－２）及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が挙げられる。
　細胞増殖抑制因子としては、例えば、ｐ２１、ｐ１７、ｐ１６及びｐ５３が挙げられる。
　細胞死促進因子としては、例えば、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）、ＨｔｒＡ２、Ｂａｄ、Ｂｉｍ、Ｂａｘ、ｐ５３、カスパーゼ１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０（例えば、カスパーゼ２、３、６、７、８、９及び１０、好ましくはカスパーゼ３、６及び７）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）並びにＦｏｘＯ１が挙げられる。
　細胞死抑制因子としては、例えば、抗アポトーシス因子（例えば、ＦＬＩＰ、Ｍｃｌ－１、Ｘｉａｐ、ｃｒｍＡ、Ｂｃｌ－２及びＢｃｌ－ｘＬ）が挙げられる。
　癌抑制遺伝子としては、例えば、ｐ５３、網膜芽細胞腫遺伝子（Ｒｂ）、大腸腺腫症遺伝子（ＡＰＣ）、神経線維腫症１型遺伝子（ＮＦ１）、神経線維腫症２型遺伝子（ＮＦ２）、ＷＴ１、ＶＨＬ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＨＥＫ２、マスピン、ｐ７３、Ｓｍａｄ４、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＤＣＣ、ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、ＳＤＨＤ、ｐ１６、ｐ５７Ｋｉｐ２、ＰＴＣ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＥＸＴ１及びＥＸＴ２が挙げられる。
　転写因子としては、例えば、Ｒｕｎｔ関連転写因子１（Ｒｕｎｘ１）、ｐ５３、ｃ－ｆｏｓ、ｃ－Ｊｕｎ、ＣＲＥＢ、Ｃ／ＥＢＰ、ＭｙｏＤ、ｃ－Ｍｙｃ、ｃ－Ｍｙｂ、Ｏｃｔ３／４、ＮＦ－κＢ、ＮＦ－ＡＴ、Ｍｅｆ－２及び細胞外シグナル応答因子（ＳＲＦ）が挙げられる。
　ゲノム編集遺伝子としては、例えば、ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＮＦ）、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｌｉｋｅ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）及びｃｌｕｓｔｅｒｅｄ，ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ，ｓｈｏｒｔ　ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ-ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）９遺伝子が挙げられる。
　ワクチン抗原遺伝子としては、例えば、病原体抗原及び腫瘍特異的抗原が挙げられる。
　ｍＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡを意味し、通常、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）とコード領域と３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）とを含む。ｍＲＮＡは、さらに、通常、５’末端のキャップ構造（５’Ｃａｐ）と３’末端のｐｏｌｙ　Ａ配列を含む。
　ここで用いるｍＲＮＡは、次のいずれかのものであってよい。
　（１）５’Ｃａｐ、５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、及びｐｏｌｙ　Ａをこの順に含むｍＲＮＡ。
　（２）５’Ｃａｐ、５’ＵＴＲ、コード領域、及びｐｏｌｙ　Ａをこの順に含むｍＲＮＡ。
　（３）５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、及びｐｏｌｙ　Ａをこの順に含むｍＲＮＡ。
　（４）５’ＵＴＲ、コード領域、及びｐｏｌｙ　Ａをこの順に含むｍＲＮＡ。
　（５）５’Ｃａｐ、５’ＵＴＲ、コード領域、及び３’ＵＴＲをこの順に含むｍＲＮＡ。
　（６）５’Ｃａｐ、５’ＵＴＲ、コード領域をこの順に含むｍＲＮＡ。
　（７）５’ＵＴＲ、コード領域、及び３’ＵＴＲをこの順に含むｍＲＮＡ。
　（８）５’ＵＴＲ、コード領域をこの順に含むｍＲＮＡ。
　目的遺伝子をコードするｍＲＮＡは、公知の方法により、目的遺伝子をコードするテンプレートＤＮＡをｉｎ　ｖｉｔｒｏ環境下で転写することで作製することができる。例えば、Ｂｌｏｏｄ　１０８（１３）　（２００６）　４００９－１７に記載の方法に従って、作製することができる。具体的には、タンパク質コード配列の下流にｐｏｌｙ　Ａ／Ｔ鎖が組み込まれた鋳型ＤＮＡをｐｏｌｙ　Ａ／Ｔ鎖のすぐ下流で切断し、翻訳酵素、ヌクレオシド、５’キャップアナログを含むバッファー溶液中にてｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写を行い、その後、ｍＲＮＡを精製することで作製することができる。ｍＲＮＡのより具体的な調製方法は後述の実施例に記載した通りである。
　いくつかの態様では、ｍＲＮＡ自体の塩基の化学修飾は行わない。この場合、ｍＲＮＡ自体は天然のものであるため、翻訳の過程はほとんど障害されないことが期待できる。別のいくつかの態様では、ｍＲＮＡ自体の塩基の化学修飾を行う。ｍＲＮＡ自体の塩基の化学修飾は、例えば、ｍＲＮＡの酵素耐性を向上させることや免疫原性を軽減できることが知られているものである。そのようなｍＲＮＡ自体の化学修飾塩基は、例えば、メチル化塩基（例えば、５－メチルシトシン）、硫黄修飾塩基（例えば、２－チオウリジン）、シュードウリジン、Ｎ１メチルシュードウリジン及び５メトキシウリジンが挙げられる。
　いくつかの態様のＲＮＡオリゴマーは、以下の（ａ）又は（ｂ）の配列を含むＲＮＡ鎖である。
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列；
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
　別のいくつかの態様のＲＮＡオリゴマーは、以下の（ａ）又は（ｂ）の配列を含むＲＮＡ鎖である。
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列；
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
　ＲＮＡオリゴマーの第１の配列と第２の配列とは、１種のｍＲＮＡ上の同一の配列とハイブリダイズする同一の相補配列とし、同種のｍＲＮＡ間を架橋し複合体を形成する。しかし、複合体を形成することができれば、必ずしも第１の配列と第２の配列とは同一の配列でなくとも、第１の配列と第２の配列はそれぞれ、１種のＲＮＡ上の同一の配列とハイブリダイズするが、完全マッチ、ミスマッチ、バルジ構造を形成し得る相補配列から構成することもできる。また、ＲＮＡ／ＤＮＡのキメラ配列などを挿入することもできる。さらには、１種のｍＲＮＡ間を架橋するＲＮＡオリゴマーの設計において、第１の配列と第２の配列とがハイブリダイズするｍＲＮＡ上の配列は、一部が共通するもののずれた位置にハイブリダイズする相補配列とすることもできる。この場合にも、第１の配列と第２の配列は任意に完全マッチ、ミスマッチ形成、バルジ形成、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラなどの設計を選択してもよい。
　ＲＮＡオリゴマーが「第１の配列とは異なる第２の配列」を含むとき、第１の配列と第２の配列とでｍＲＮＡ上の標的配列が同じであることが好ましい。ｍＲＮＡ上の標的配列が同じであるとは、第２の配列がハイブリダイズ可能なｍＲＮＡ上の配列が、第１の配列と同じであることを意味する。そのような第１の配列と第２の配列は、公知の方法またはそれに準ずる方法にて適宜設定することができる。いくつかの態様では、第２の配列は、第１の配列と９０％以上（例えば、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上）の同一性を有する。同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、ＲＮＡ配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（例えば、Ａｌｔｚｓｈｕｌ　Ｓ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３（１９９０）参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
　２種のｍＲＮＡを架橋するＲＮＡオリゴマーの第１の配列と第２の配列では、第１の配列は一方の種のｍＲＮＡ上にのみハイブリダイズする配列とし、第２の配列は他方の種のｍＲＮＡ上にのみハイブリダイズする配列を選択することにより、２種のｍＲＮＡをＲＮＡオリゴマーにより架橋形成することができる。
　ＲＮＡ配列において「９０％以上の同一性を有し」における「９０％以上」の範囲は、例えば、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上である。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、ＲＮＡ配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（例えば、Ａｌｔｚｓｈｕｌ　Ｓ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３（１９９０）参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
　「ｍＲＮＡにハイブリダイズする」とは、後述のハイブリダイズ条件で、ＲＮＡオリゴマーがｍＲＮＡにハイブリダイズすることを意味する。
　ＲＮＡオリゴマーの第１の配列及び第２の配列は、ｍＲＮＡの連続する１２～４０塩基（１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０塩基）の配列にハイブリダイズするように設計されている。
　ＲＮＡオリゴマーの第１の配列及び第２の配列のそれぞれの長さは、好ましくは、１２～３０塩基、より好ましくは１５～２３塩基、さらに好ましくは１７塩基である。いくつかの態様ではＲＮＡオリゴマーの第１の配列及び第２の配列の長さがこのような長さであることに加えて、リンカー配列の長さは、好ましくは、０～１００塩基（０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００塩基）、より好ましくは０～３０塩基、さらに好ましくは１０塩基である。いくつかの態様では、ＲＮＡオリゴマーの全体の長さは、例えば２４～１８０塩基、好ましくは３０～１５０塩基、より好ましくは４０～１００塩基、さらに好ましくは４０～７０塩基、特に好ましくは４４塩基である。
　ここで、リンカー配列の長さが「０塩基」であることは、リンカー配列が存在しないことを意味する。
　好ましくは、ＲＮＡオリゴマーの第１の配列及び第２の配列は、それぞれ、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～３０塩基の配列からなる。より好ましくは、ＲＮＡオリゴマーの配列は、ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の配列からなるものである。さらに好ましくは、ＲＮＡオリゴマーの配列は、ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の配列からなるものである。
　リンカー配列は、０～１００塩基の鎖長の配列であれば特に限定されない。いくつかの態様では、リンカー配列はｍＲＮＡ上の配列にハイブリダイズしない、又はハイブリダイズし難いように設計される。リンカー配列は、好ましくは、ｍＲＮＡ上の配列と相補鎖を形成しない配列からなる。アデニン（Ａ）：ウラシル（Ｕ）結合はグアニン（Ｇ）：シトシン（Ｃ）結合より弱いので、リンカー配列に用いる塩基としてはＡやＵを用いるのが好ましい。特に、Ｕは、ｍＲＮＡ上のｐｏｌｙ　Ａ鎖とハイブリダイズする可能性があることから、Ａを用いるのがより好ましい。いくつかの好ましい態様では、リンカー配列は、塩基が全てアデニンである配列である。
　ＲＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせるｍＲＮＡ中の位置は、５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、及びｐｏｌｙ　Ａ配列のいずれの位置でもよい。ＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡの２次構造を予測し、ｍＲＮＡ鎖が２次構造を持たない部分に対してハイブリダイズするようにＲＮＡオリゴマーを設計するのが望ましい。すなわち、ＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡ全配列のうち２次構造を持たない部分に対してハイブリダイズするように設計するのが好ましい。ｍＲＮＡの２次構造を予測するソフトウエアとしては、例えば、後述の実施例に記載のものが挙げられる。
　いくつかの態様では、ＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡのコード領域にハイブリダイズするように設計する。
　複合体の作製に用いるＲＮＡオリゴマーは、１種のｍＲＮＡに対して、例えば、少なくとも２種である。「１種のｍＲＮＡ」は、同じ配列を含む１つのｍＲＮＡ群のことを示す。１種のＲＮＡオリゴマーは、第１の配列として同じ配列を含む１つのＲＮＡオリゴマー群のことを示す。「少なくとも２種のＲＮＡオリゴマー」とは、そのようなＲＮＡオリゴマー群が２つ以上あり、かつ、それぞれのＲＮＡオリゴマー群の間で第１の配列が異なることを示す。複合体の作製に用いるＲＮＡオリゴマーは、１種のｍＲＮＡに対して、好ましくは２～５０種であり、より好ましくは２～３０種であり、さらに好ましくは、２～８種である。ＲＮＡオリゴマーの数が増えるにしたがって、ｍＲＮＡの安定性はさらに向上する。複合体の作製に用いるＲＮＡオリゴマーが２～５０種の範囲であれば、ｍＲＮＡの翻訳効率を比較的高いレベルに維持することができる。
　少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーを用いる場合、いくつかの態様では、それぞれのＲＮＡオリゴマーがｍＲＮＡ上で重ならないようにＲＮＡオリゴマーを設計する。
　いくつかの態様では、ＲＮＡオリゴマーは、１種のｍＲＮＡに対して、例えば、少なくとも１種である。この場合、複合体の作製に用いるＲＮＡオリゴマーは、１種のｍＲＮＡに対して、好ましくは１～５０種であり、より好ましくは１～３０種であり、さらに好ましくは、１～８種である。ＲＮＡオリゴマーの数が増えるにしたがって、ｍＲＮＡの安定性はさらに向上する。複合体の作製に用いるＲＮＡオリゴマーが１～５０種の範囲であれば、ｍＲＮＡの翻訳効率を比較的高いレベルに維持することができる。
　いくつかの態様では、１つの複合体には、１種のｍＲＮＡが含まれる。別のいくつかの態様では、１つの複合体には、２種以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０種）のｍＲＮＡが含まれる。
　好ましくは、複合体の作製に用いるｍＲＮＡの濃度は、１種のｍＲＮＡについて、例えば１μｇ／ｍＬ～１０，０００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０μｇ／ｍＬ～１０，０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは、５０μｇ／ｍＬ～１０，０００μｇ／ｍＬである。複合体生成の際のｍＲＮＡの溶媒としては、例えばリン酸緩衝液、生理食塩水、蒸留水、Ｔｒｉｓ緩衝液、又はＨＥＰＥＳ緩衝液が挙げられ、好ましくは、リン酸緩衝液、又は生理食塩水が挙げられ、より好ましくは生理食塩水が挙げられる。塩濃度を高くすることで、静電相互作用が抑えられ、水素結合が支配的になり、ハイブリダイズしやすくなり、結果的に、複合体形成が促進されることが想定される。
　このときの１種のｍＲＮＡと各ＲＮＡオリゴマーとのモル比は、例えば１：０．０５～０．０５：１、好ましくは１：０．１～０．１：１、より好ましくは１：０．３～０．３：１である。ここで、１種のｍＲＮＡ：各ＲＮＡオリゴマーのモル比は、１：０．５が理論上、最も好ましい値である。モル比１：０．５は、ハイブリダイズが全て形成されたと仮定して、ｍＲＮＡとｌｉｎｋｅｒ上の相補配列が全て過不足なく結合した状態を意味する。
　複合体は、ｍＲＮＡ同士がＲＮＡオリゴマーによって架橋されることによって複数のｍＲＮＡと複数のＲＮＡオリゴマーが集合した集合体である。複合体のサイズは、好ましくは１０ｎｍ～１０，０００ｎｍ、より好ましくは３０ｎｍ～１，０００ｎｍ、さらに好ましくは５０ｎｍ～５００ｎｍである。複合体のサイズは、調製時のｍＲＮＡ濃度、塩濃度、ＲＮＡオリゴマーの数などの要素を考慮して適宜変更することができる。具体的には、調製時のｍＲＮＡ濃度が濃い方が、大きな集合体の形成が期待される。また、塩濃度が高い方が、静電相互作用が抑えられ、水素結合が支配的になり、ハイブリダイズしやすくなり、結果的に、大きな複合体の形成が想定される。また、調製に用いるＲＮＡオリゴマーの種類を多くすることで、図３（Ａ）に示すようにより大きな集合体の形成が期待される。
　複合体の作製、すなわち、ＲＮＡオリゴマーのｍＲＮＡへのハイブリダイズは、公知の方法及び条件により行うことができる。ハイブリダイズでは、加温して、一定時間静置したのち、徐々に温度を低下させる。加温は、ｍＲＮＡやオリゴマーの分子内、分子間にあらかじめ存在する相補的結合を解くことで、ｍＲＮＡとオリゴマーをより効率的に結合させることを目的として行う。適切なハイブリダイズが保証されるならば、その温度時間は適宜調整可能である。温度低下は緩やかな方がハイブリダイズの特異性が増す。また、オリゴマー鎖長は、ハイブリダイズの条件設定に大きく影響しない。ハイブリダイズ効率を評価しながら、適宜条件を設定するべきである。例えば、後述の実施例に記載の方法及び条件が挙げられる。
　また、本発明は、目的遺伝子をコードするｍＲＮＡと、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーとの複合体を形成させることを含み、
　少なくも２種のＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡの配列中のそれぞれ異なる配列にハイブリダイズ可能なものであり、
　複合体において、ＲＮＡオリゴマーの第１の配列は、ＲＮＡオリゴマーの第２の配列とは異なるｍＲＮＡにハイブリダイズする、
　ｍＲＮＡの安定化方法を提供する。
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列をこの順に含むＲＮＡ配列
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
　さらに、本発明は、目的遺伝子をコードするｍＲＮＡと、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも１種のＲＮＡオリゴマーとの複合体を形成させることを含み、
　ＲＮＡオリゴマーの第１の配列が、ＲＮＡオリゴマーの第２の配列とは異なるｍＲＮＡにハイブリダイズする、
　ｍＲＮＡの安定化方法を提供する。
　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列；
　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
　安定化方法に用いる、ｍＲＮＡ、ＲＮＡオリゴマーは、前記複合体に関する説明で記載した通りである。
３．輸送担体
　いくつかの態様では、ｍＲＮＡを含む複合体は、ネイキッドの形態である。すなわち、ｍＲＮＡを含む複合体は、輸送担体を伴わない。
　別のいくつかの態様では、ｍＲＮＡを含む複合体は、輸送担体に内包される形態である。輸送担体は、ｍＲＮＡを含む複合体を内包して、対象の体内の好適な箇所に送達することができるものであればよく、特に限定されない。輸送担体は脂質性ｍＲＮＡキャリア、又はカチオン性ポリマー複合体であり、より好ましくは、高分子ミセル又は脂質性ｍＲＮＡキャリアである。
　高分子ミセルは、凝縮した核酸とカチオン性ポリマーで形成される内核と親水性ポリマーで形成される外殻との二層構造を有している。カチオン性ポリマーは、例えば、ポリアミノ酸誘導体である。親水性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）である。内核は、ｍＲＮＡを物理的又は化学的に封入する。外殻は、その物理化学的な性質によって、高分子ミセルの生体内環境での物理化学的性質を規定する。例えば、PEGの場合、周囲の物質の高分子ミセルへの非特異的吸着を抑制するほか、生体内での高分子ミセルの異物認識を回避することができる。高分子ミセルは、エンドサイトーシスによって細胞内に入り込むことができる。高分子ミセルは、例えば、ブロックポリマー上のポリカチオンと核酸の相互作用（ポリイオンコンプレックス（「ＰＩＣ」））を利用することもできるほか、それと無機分子とのハイブリットミセルを利用することもできる。ＰＩＣ型高分子ミセルとしては、例えば、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）－Ｃｈｏｌ、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）、ＰＥＧ-ＰＬｙｓとｍＲＮＡの多分子会合により形成されるＰＩＣミセルや、ＰＡｓｐ（ＴＥＴ），　ＰＡｓｐ（ＴＥＰ）といった別のポリカチオンをブロック共重合体に用いたもの（Ｕｃｈｉｄａ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　（２０１６）８２，ｐ．２２１-２２８）及びトリブロック共重合体を用いたもの（Ｏｓａｗａ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　１７，　ｐ３５４-３６１　（２０１６））が挙げられる。無機粒子とのハイブリッド型高分子ミセルとしては、例えば、ＰＥＧ化リン酸カルシウム（ＣａＰ）粒子（Ｐｉｔｔｅｌａ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１１）３２，ｐ．３１０６－３１１４）、ＰＥＧ化シリカ粒子（Ｍｉｙａｔａ，　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　（２０１０）３１，　ｐ４７６４-４７７０　）が挙げられる。
　脂質性ｍＲＮＡキャリアは、脂質またはカチオン性脂質をキャリアとして形成され、そしてｍＲＮＡが内包もしくは結合された形態にある。例えば、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパナミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、１、２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２、３－ジミリスチルオキシ）プロピル］－Ｎ、Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）又はＤＣ-ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌといったカチオン性脂質；ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）といった中性リン脂質；ＰＥＧ化脂質；及びコレステロールからなる群より選択される一つまたは複数からなり、それとｍＲＮＡを混合して得られるものである。
　カチオン性ポリマー複合体は、例えば、直鎖状もしくは分枝状ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、キトサン誘導体、ポリメタクリル酸誘導体とｍＲＮＡの混合物である。
　これらの輸送担体は、公知の方法又はそれに準ずる方法にて調製することができる。
　いくつかの態様では、輸送担体に内包させるｍＲＮＡを含む複合体の量は、輸送担体中のカチオン電荷（＋）とｍＲＮＡを含む複合体のアニオン電荷（－）の比（＋／－比）において、例えば、０．５～２００であり、好ましくは１～５０であり、より好ましくは１～１０である。
４．医薬組成物
　本発明は、前記複合体を含有する医薬組成物を提供する。いくつかの態様では、複合体は輸送担体に内包されている形態である。医薬組成物は、前記複合体を、対象の体内に送達することに用いられる。
　「対象」は、ヒト、又はヒト以外の生物、例えば、トリ及び非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、サル、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、及びウマ）である。
　医薬組成物は、対象に対し、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与（例えば、膀胱内投与、胸腔内投与、腹腔内投与、眼内投与、脳内投与）、経皮投与、経粘膜投与、経肺投与又は経直腸投与することができる。特に静脈内投与、経皮投与、経粘膜投与が望ましい。これらの投与に適した剤型、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸入剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、座剤で投与される。投与量、投与回数及び投与期間などの各条件は、ｍＲＮＡの種類、剤型、年齢や体重等の対象の状態、投与経路、疾患の性質や程度を考慮した上で、当業者であれば適宜設定することができる。
　医薬組成物は、各種疾患の原因となる細胞に所望の遺伝子をコードするｍＲＮＡを導入する治療に用いることができる。よって、本発明は、医薬組成物を、各種疾患の治療を必要とする対象に投与することを含む、各種疾患の治療方法を提供することもできる。なお、投与量、投与回数及び投与期間などの各条件は前記と同様である。
　治療する各種疾患は、例えば、癌、ウイルス性疾患、代謝性疾患、循環器疾患、神経疾患、腎泌尿器疾患、血液学的悪性疾患、アポトーシスの促進又は抑制が所望される疾患、膠原病、呼吸器疾患及び消化器疾患が挙げられる。
　医薬組成物については、薬剤製造上一般に用いられる賦形材、充填材、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することができる。静脈内注射剤（点滴を含む）とする場合、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態等で提供される。
　いくつかの態様では、ｍＲＮＡの投与量は、ｍＲＮＡの種類、剤型、年齢や体重等の対象の状態、投与経路、疾患の性質や程度を考慮した上で、例えば、成人に対して、１日当たり０．１ｍｇ～５ｇ／ヒトの範囲内が、好ましくは１ｍｇ～２ｇの範囲内が一般的である。この投与量は、標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。従って、場合によってはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とするときもある。また１日１回から数回の投与又は１日から数日間の間隔で投与することができる。
５．ｍＲＮＡ送達用キット
　本発明のｍＲＮＡ送達用キットは、前記複合体を含むことを特徴とするものである。いくつかの態様では、複合体は輸送担体に内包されている形態である。当該キットは、例えば、前記複合体を用いた各種疾患の治療方法に好ましく用いることができる。
　キットにおいて、前記複合体の保存状態は、限定はされず、その安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮して溶液状又は粉末状等の状態を選択できる。
　キットは、前記複合体以外に、他の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては、例えば、各種バッファー及び使用説明書（使用マニュアル）を挙げることができる。
　以下の実施例により本発明を更に詳述するが、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきものではない。
実施例１：ｍＲＮＡの調製
 
　ｍＲＮＡは鋳型ＤＮＡよりｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写により調製するが、ここで鋳型ＤＮＡは以下のように作製した。まず、Ｔ７－Ｇｌｕｃ　ｐｌａｓｍｉｄは、ｐＣＭＶ－Ｇｌｕｃ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｐｌａｓｍｉｄ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）からＧｌｕｃコード配列（図７；配列番号１）をｐＳＰ７３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＨｉｎｄＩＩＩ，Ｘｂａ１サイトに挿入することで作製した。その後、Ｔ７－Ｇｌｕｃ　ｐｏｌｙ　Ａ１２０　ｐｌａｓｍｉｄを、Ｔ７－Ｇｌｕｃ　ｐｌａｓｍｉｄのＥｃｏＲ１－Ｂｇｌ２サイトにＡ１２０－（ＢｓｍＢＩ切断部位）を挿入することで作製した。その後、ＢｓｍＢＩで切断したのち、Ｔ４　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）で末端の平滑化を用い、以下のｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写に用いた。
　ｍＲＮＡは、ｍＭＥＳＳＡＧＥ　ｍＭＡＣＨＩＮＥ（商品名）　Ｔ７（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）をコードした上述の制限酵素処理を行い、平滑化したテンプレートＤＮＡ（Ｔ７－Ｇｌｕｃ　ｐｏｌｙ　Ａ１２０　ｐｌａｓｍｉｄ）をｉｎ　ｖｉｔｒｏ環境下で転写することで作製した。転写されたｍＲＮＡはＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製、回収した。回収したｍＲＮＡ濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により測定した。また、Ａｇｉｌｅｎｔ　２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた電気泳動法により目的のｍＲＮＡが作成されていることを確認した。
　ＮａｎｏＤｒｏｐにより、５００～１，０００ｎｇ／μＬという高い濃度で、２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度比が２．０～２．２という高純度のｍＲＮＡの作製が確認された。また、バイオアナライザの解析で、意図した大きさのｍＲＮＡの作製が確認された。
　作製したｍＲＮＡの配列（配列番号２）を、図６に示す。図６の配列において、下線部分がｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）であり、ＯＲＦの上流が５’ＵＴＲ（５４塩基）であり、ＯＲＦの下流に３’ＵＴＲ（５２塩基）があり、さらにその下流の１２０Ａがｐｏｌｙ　Ａ配列である。
　ここで、Ｐｏｌｙ　Ａの数について、理論上は鋳型ＤＮＡに１２０ｂｐに組み込まれ、ｍＲＮＡでは１１９塩基である。しかし、ＤＮＡ増幅や、ｍＲＮＡ調製の段階でその数は増減しうる。
実施例２：ＲＮＡオリゴマーのハイブリダイゼーション
 
　ＲＮＡオリゴマーを次のようにして設計し、調製した。ＲＮＡ２次構造予測ソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｒｔｉｐｓ．ｄｎａ．ｂｉｏ．ｋｅｉｏ．ａｃ．ｊｐ／ｉｐｋｎｏｔ／）にて、Ｇｌｕｃ　ｍＲＮＡの２次構造を予測し、ＲＮＡ鎖が２次構造を持たない部分に対してＲＮＡオリゴマーを設計した。ＲＮＡオリゴマーは、５’末端又は３’末端のコレステロール修飾を含めて、北海道システムサイエンス社にて、依頼合成した。尚、下記ＲＮＡオリゴマーのうち「ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ」は、ｍＲＮＡにハイブリダイズし得る１７ｍｅｒの配列と、全てアデニン（Ａ）である１０ｍｅｒのリンカー配列と、１７ｍｅｒの配列と同じ配列とを、この順に含むＲＮＡオリゴマーである。「ｎｏｎ－ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ」は、ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒを半分にしたような構造であり、ｍＲＮＡにハイブリダイズし得る１７ｍｅｒの配列と、全てアデニン（Ａ）である５ｍｅｒのリンカー配列とを、この順に含むＲＮＡオリゴマーである。
　ＲＮＡオリゴマー
　ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ
　　ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　１：ＵＣＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＣＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＵＣＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＣＣＡＧ（配列番号３）
　　ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　２：ＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＣＵＵＣＵＵＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＣＵＵＣＵＵＧ（配列番号４）
　　ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　３：ＡＣＵＣＵＵＵＧＵＣＧＣＣＵＵＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＵＣＵＵＵＧＵＣＧＣＣＵＵＣＧ（配列番号５）
　　ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　４：ＣＵＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＵＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＵＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＵＧＣ（配列番号６）
　　ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　５：ＧＵＧＧＧＡＣＡＧＧＣＡＧＡＵＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＵＧＧＧＡＣＡＧＧＣＡＧＡＵＣＡ（配列番号７）
　　ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　６：ＧＣＡＧＣＣＡＧＣＵＵＵＣＣＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＣＣＡＧＣＵＵＵＣＣＧＧＧ（配列番号８）
　　ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　７：ＵＵＧＡＡＧＵＣＵＵＣＧＵＵＧＵＵＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＵＵＧＡＡＧＵＣＵＵＣＧＵＵＧＵＵ（配列番号９）
　　ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　８：ＣＵＣＵＡＧＡＵＧＣＡＵＧＣＵＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＵＣＵＡＧＡＵＧＣＡＵＧＣＵＣＧ（配列番号１０）
　ｎｏｎ－ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ
　　ｎｏｎ－ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　１：ＵＣＵＵＵＧＡＧＣＡＣＣＵＣＣＡＧＡＡＡＡＡ（配列番号１１）
　　ｎｏｎ－ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　２：ＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＣＵＵＣＵＵＧＡＡＡＡＡ（配列番号１２）
　　ｎｏｎ－ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　３：ＡＣＵＣＵＵＵＧＵＣＧＣＣＵＵＣＧＡＡＡＡＡ（配列番号１３）
　　ｎｏｎ－ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　４：ＣＵＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＵＧＣＡＡＡＡＡ（配列番号１４）
　　ｎｏｎ－ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　５：ＧＵＧＧＧＡＣＡＧＧＣＡＧＡＵＣＡＡＡＡＡＡ（配列番号１５）
　　ｎｏｎ－ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　６：ＧＣＡＧＣＣＡＧＣＵＵＵＣＣＧＧＧＡＡＡＡＡ（配列番号１６）
　　ｎｏｎ－ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　７：ＵＵＧＡＡＧＵＣＵＵＣＧＵＵＧＵＵＡＡＡＡＡ（配列番号１７）
　　ｎｏｎ－ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　８：ＣＵＣＵＡＧＡＵＧＣＡＵＧＣＵＣＧＡＡＡＡＡ（配列番号１８）
　ｍＲＮＡ濃度５００ｎｇ／μＬのＮａＣｌ　１５０ｍＭ溶液(和光純薬)に対してそれぞれのＲＮＡオリゴマーをｍＲＮＡとのモル比で０．５等量で加え、６５℃で５分加熱し、９０分かけて３０℃まで冷却することで、ハイブリダイゼーションを行った（図２（Ｂ））。このようにして、ｍＲＮＡとＲＮＡオリゴマーの複合体を作製した（図２（Ａ）の「ｍＲＮＡ＋ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ」）。同様に、「ｍＲＮＡ＋ｎｏｎ－ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒs」も作製したが、ただし、ＲＮＡオリゴマーはｍＲＮＡとのモル比で１等量加えた（図２（Ａ））。これはＲＮＡオリゴマーが形成されるものの、ｍＲＮＡ同士が架橋されずナノ集合体を形成しないコントロールである。尚、図２（Ａ）には、一本鎖のｍＲＮＡも示されている。
　以下、ハイブリダイゼーションにより生じたｍＲＮＡとＲＮＡオリゴマーの複合体をｍＲＮＡナノアッセンブリという。
実施例３：ｍＲＮＡナノアッセンブリの物性解析
 
（１）ＦＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＯＬＹＭＰＵＳ社製、ＭＦ２０）解析
 
　ｍＲＮＡナノアッセンブリの大きさをＦＣＳ解析により評価し、最適なＬｉｎｋｅｒ数を検討した。ｍＲＮＡナノアッセンブリの作製方法は、実施例２に記載した通りである。
　用いたＲＮＡオリゴマーの種類
　Ｌｉｎｋｅｒ数（すなわち、用いたＲＮＡオリゴマーの種類）が２、４、６、８個の実験では、それぞれ、実施例２に記載の以下のＲＮＡオリゴマーを用いた。
　　　２個：ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　３及び５
　　　４個：ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　２、４、６及び８
　　　６個：ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　１、２、４、５、６及び８
　　　８個：ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　１、２、３、４、５、６、７及び８
　ｍＲＮＡを蛍光Ｃｙ５で染色し、ｍＲＮＡナノアッセンブリを形成させたのち、５ｎg／μＬ(蒸留水中)にしてから測定した。ｍＲＮＡの蛍光染色にはＬａｂｅｌ　ＩＴ　ｔｒａｃｋｅｒ　Ｃｙ５　ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ）を用いた。
　その結果を図３（Ａ）に示す。図３（Ａ）の縦軸（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ　ｔｉｍｅ（μｓｅｃ））の数値が大きいほど、拡散が遅く、ｍＲＮＡナノアッセンブリの粒子径が大きくなったことを意味する。Ｌｉｎｋｅｒ数が６個以降ではｍＲＮＡナノアッセンブリのサイズが一定になった。そこで、以降の実施例では、ある程度の余裕を見て主にＬｉｎｋｅｒ数８個を選択した。
（２）ＡＦＭ（Ａｔｏｍｉｃ　Ｆｏｒｃｅ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、島津製作所、ＳＰＭ－９７００）解析
　ｍＲＮＡ濃度を３ｎｇ／μＬ（１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２溶液, (和光純薬)）にして、基板上に添加し、乾かしたのちＡＦＭにより測定した。
　その結果を図３（Ｂ）に示す。図３（Ｂ）の右にカラースケールを示すが、色が白に近ければ近いほど高さが増していること、すなわちサイズが大きいことを示す。Ｌｉｎｋｅｒ数８個のｍＲＮＡナノアッセンブリは、白い部分が多く、かつ１００ｎｍを越える粒径のものが散見される。一方で、ｍＲＮＡ単体では白い部分は少なく、かつ１００ｎｍを越える粒径のものはほとんどなく、ｍＲＮＡナノアッセンブリの方が、ｍＲＮＡ単体と比較して粒径が大きいことが分かる。
実施例４：ｍＲＮＡナノアッセンブリの酵素耐性および無細胞翻訳系における翻訳活性
 
（１）酵素耐性試験
　Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ、Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ　Ｓｕｍｉｔｏｍｏ　Ｐｈａｒｍａ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）中でのｍＲＮＡナノアッセンブリの酵素耐性を調べた。
　ウシ胎児血清（ＦＢＳ）をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、和光純薬）で所定の濃度となるよう希釈し、そこにｍＲＮＡナノアッセンブリの溶液を、ｍＲＮＡの最終濃度が６．２５ｎｇ／μＬとなるように添加したのち、３７℃で１５分静置した。その後、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて溶液よりｍＲＮＡを抽出した。抽出したｍＲＮＡをコンプリメンタリーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写した後、ｑＲＴ－ＰＣＲにより残存しているｃＤＮＡを定量評価した。ＦＢＳ存在下で３７℃静置を行わなかった場合のｍＲＮＡ量を１００％として、ｍＲＮＡ量の相対値を求めた。
　ｑＲＴ－ＰＣＲでは以下のプライマーを用いた。
　　　ＦｏｒｗａｒｄのＴａｒｇｅｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＴＧＡＧＡＴＴＣＣＴＧＧＧＴＴＣＡＡＧＧ（配列番号１９）
　　　ＲｅｖｅｒｓｅのＴａｒｇｅｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＧＴＣＡＧＡＡＣＡＣＴＧＣＡＣＧＴＴＧＧ（配列番号２０）
　その結果を、図４（Ａ）に示す。「ｍＲＮＡ＋８　ｎｏｎ－ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ」は、ｍＲＮＡにＲＮＡオリゴマーとして８つのｎｏｎ－ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ（ｎｏｎ－ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　１～８）を加えたものである。「ｍＲＮＡ＋８　ｎｏｎ－ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ」ではｍＲＮＡよりもやや酵素安定性が向上した。これは、ｍＲＮＡとＲＮＡオリゴマーとの間で２本鎖が形成されたためであると考えられる。「ｍＲＮＡ＋８　ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ」は、ｍＲＮＡにＲＮＡオリゴマーとして８つのｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ（ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　１～８）を加えたものである。「ｍＲＮＡ＋８　ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ」での酵素安定性は、「ｍＲＮＡ＋８　ｎｏｎ－ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ」よりも１００倍以上増えている。これは、５０％のｍＲＮＡが分解されるＦＢＳ濃度が、「ｍＲＮＡ＋８　ｎｏｎ－ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ」では約０．００５％であるのに対して、「ｍＲＮＡ＋８　ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ」では約１％であるという結果に基づいて計算することができる。以上のことから、ｍＲＮＡナノアッセンブリを形成させることで、酵素耐性が飛躍的に向上することがわかった。
　なお、統計解析は、ＡＮＯＶＡ（ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｎｃｅ）検定ののち、Ｔｕｋｅｙ検定を行った。＊＊＊は、ｍＲＮＡ＋８　ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ群が、ｍＲＮＡ単体群とｍＲＮＡ＋８　ｎｏｎ－ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ群のどちらに対しても、ｐ＜０．００１であることを示す。
（２）無細胞翻訳系における翻訳活性
　Ｒａｂｂｉｔ　ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ　ｌｙｓａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に添加し、３７℃で４時間ｉｎｃｕｂａｔｅした後のＧｌｕｃ発光強度を測定した。発光強度はＲｅｎｉｌｌａ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。ルミノメーターはＢｅｒｔｈｏｌｄ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＭｉｔｈｒａｓ　ＬＢ　９４０を用いた。
　その結果を、図４（Ｂ）に示す。「＋８　ｌｉｎｋｅｒｓ」は、ｍＲＮＡにＲＮＡオリゴマーとして８つのｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ（ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏ　１～８）を加えたものである。無細胞翻訳系に添加した時の翻訳活性は、ｍＲＮＡ単体と「＋８　ｌｉｎｋｅｒｓ」とではほとんど変わらなかった。
　なお、統計学的解析は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行い、ｎ．ｓ．はｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅを意味する。
　以上から、ｍＲＮＡナノアッセンブリは、翻訳活性を維持したまま、酵素耐性を大きく向上させることができることが分かる。
実施例５：ｍＲＮＡナノアッセンブリの細胞内取り込み及び細胞でのｍＲＮＡ発現
 
　９６　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１０，０００　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ蒔いたＨｕＨ-７細胞（Ｒｉｋｅｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋ）に対して、２４ｈ後に無血清培地Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に置換した上で、２５０nｇのｍＲＮＡを添加した。その４ｈ後に測定を行なった（図５（Ａ））。
（１）ｍＲＮＡナノアッセンブリの細胞内取り込み
　細胞内取り込み量に関しては、ｍＲＮＡはＬａｂｅｌ　ＩＴ　ｔｒａｃｋｅｒ　Ｃｙ３　ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ）で蛍光標識化した。ｍＲＮＡ導入４ｈ後にＰＢＳで２回細胞表面を洗浄した後、Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で細胞を溶かし、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ１０００　ＰＲＯ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｅｃａｎ　Ｇｒｏｕｐ　Ｌｔｄ．，Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にて励起波長５４３ｎｍ、検出波長５６８ｎｍとして、蛍光強度を観察した。
　その結果を、図５（Ｂ）に示す。「＋８　ｌｉｎｋｅｒｓ」は、ｍＲＮＡにＲＮＡオリゴマーとして８つのｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ（ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　１～８）を加えたものである。細胞内取り込み量は、ｍＲＮＡ単体と「＋８　ｌｉｎｋｅｒｓ」とではほとんど変わらなかった。
　なお、統計学的解析は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行い、ｎ．ｓ．はｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅを意味する。
（２）細胞でのｍＲＮＡ発現
　細胞でのｍＲＮＡ発現量については、ｍＲＮＡ導入の４時間後の培地を回収し、そこに含まれるＧｌｕｃ量をＲｅｎｉｌｌａ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。
　その結果を、図５（Ｃ）に示す。「＋８　ｌｉｎｋｅｒｓ」は、ｍＲＮＡにＲＮＡオリゴマーとして８つのｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ（ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏ　１～８）を加えたものである。細胞でのｍＲＮＡ発現効率は、ｍＲＮＡ単体と「＋８　ｌｉｎｋｅｒｓ」とではほとんど変わらなかった。
　なお、統計学的解析は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行い、ｎ．ｓ．はｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅを意味する。
　以上から、ｍＲＮＡナノアッセンブリは、細胞内取り込み効率がｍＲＮＡと変わらない一方で、細胞での発現効率もｍＲＮＡと変わらないことがわかった。この結果は、細胞内においても、ｍＲＮＡナノアッセンブリの翻訳活性が、ｍＲＮＡ単体の翻訳活性とほぼ同程度であることを示唆している。
実施例６：ｍＲＮＡナノアッセンブリとブロック共重合体からなる高分子ミセル（ＰＭ）の調製
（１）ポリマー合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　まず、α－メトキシ－ω－アミノ－ポリエチレングリコール（ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２，ＰＥＧのＭｗ：１２ｋＤａ）を開始剤としたβ－ベンジル－Ｌ－アスパルテート－Ｎ－カルボン酸無水物（ＮＣＡ－ＢＬＡ）の開環重合によって、ＰＥＧ－ｐｏｌｙ（β－ｂｅｎｚｙｌ　Ｌ－ａｓｐａｒｔａｔｅ）（ＰＥＧ－ＰＢＬＡ）を合成した。ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２を５０５ｍｇとり、ベンゼンに溶解させて一晩凍結乾燥させた。凍結乾燥後、Ａｒ雰囲気下においてＤｒｙジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：Ｄｒｙジクロロメタン（ＤＣＭ）＝１：１０混合溶媒にＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２及びＮＣＡ－ＢＬＡを完全に溶解させた。ＮＣＡ－ＢＬＡ溶液をＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２溶液に添加し、２５℃で３日間撹拌した。反応溶液をｎ－ヘキサン／酢酸エチル（３：２）混合溶液に再沈殿させ、ＰＥＧ－ＰＢＬＡを回収した。その後、ＰＥＧ－ＰＢＬＡを真空乾燥させ、白色粉末を得た。ＰＢＬＡの重合度は６８（ｎ＝６８）であった。尚、上記式中、ｍ＝２９３であった。
　ＰＥＧ－ＰＢＬＡ（２００ｍｇ）をベンゼンに溶解させて凍結乾燥し、乾燥した。ＰＥＧ－ＰＢＬＡ及びＤｒｙジエチレントリアミン（ＤＥＴ）（ＰＢＬＡに対して５０当量）を０．５ＭチオウレアとしたＤｒｙＮＭＰに溶解させた。これら溶液を１０℃に冷却し、ＰＥＧ－ＰＢＬＡ溶液をゆっくりＤＥＴ溶液に滴下し、１時間撹拌した。反応後、溶液温度を１０度以下に保ったまま反応溶液を５Ｎ　ＨＣｌ水溶液で中和し、０．０１Ｎ　ＨＣｌ水溶液で４℃にて１日透析を行った。その後、イオン交換水で４℃にてもう１日透析を行った。透析後、溶液を凍結乾燥することでＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）白色粉末を得た。尚、上記式中、ｎ＝６８であり、ｍ＝２９３であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２を４００ｍｇとり、ベンゼンに溶解させて一晩凍結乾燥させた。凍結乾燥後、Ａｒ雰囲気下において０．５ＭチオウレアとしたＤｒｙジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶媒にＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２及びＮＣＡ－Ｌｙｓ（ＴＦＡ）を完全に溶解させた。ＮＣＡ－Ｌｙｓ（ＴＦＡ）溶液をＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２溶液に添加し、２５℃で３日間撹拌した。反応溶液をジエチルエーテルに再沈殿させ、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＴＦＡ）を回収した。その後、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＴＦＡ）を真空乾燥させ、白色粉末を得た。その後、０．１Ｎ　ＮａＯＨを含むメタノール混合溶媒中において３５℃で６時間反応させ、ＴＦＡ基を脱保護し、０．０１Ｎ　ＨＣｌ水溶液で４℃にて１日透析を行った。その後、イオン交換水で４℃にてもう１日透析を行った。ＰＥＧ－ＰＬｙｓ白色粉末を得た。１Ｈ－ＮＭＲ分析より、回収したＰＥＧ－ＰＬｙｓのＰＬｙｓ重合度は６９であった。
（２）ミセル調製と粒子径測定
　ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）とナノ集合体はそれぞれ独立して１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）に溶解させた。ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の濃度は、ｐＨ７．４において（（ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の正電荷数）／（ｍＲＮＡナノ集合体の負電荷数））（Ｎ＋／Ｐ―比）が１．５となるように調整した。ｍＲＮＡ最終濃度が３３．３μｇ／ｍＬとなるようにＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）溶液をｍＲＮＡナノ集合体溶液に添加し、高分子ミセルを調製した。ＰＥＧ－ＰＬｙｓの場合は、ｐＨ７．４において（（ＰＬｙｓの正電荷数）／（ｍＲＮＡナノ集合体の負電荷数））（Ｎ＋／Ｐ―比）が２となるように調整し、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の場合と同様にＰＭを調製した。ＰＭｓの粒径はＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって評価した。結果を図８および図９に示す。集合体を形成していないｍＲＮＡ（ｕｎｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ　ｍＲＮＡ）でも同様にＰＭを形成した。
　ナノ集合体とブロック共重合体を形成させた場合でも、１００ｎｍ以下の粒子が形成された。生体に投与した際、様々な細胞に効率的に取り込まれるサイズである。
（２）血清中での安定性
　ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で所定の濃度となるよう希釈し、そこにＰＭ溶液を添加したのち、３７℃で１５分静置した。その後、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて溶液よりＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡをコンプリメンタリーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写した後、ｑＲＴ－ＰＣＲにより残存しているｃＤＮＡを定量評価した。ＦＢＳ存在下で３７℃静置を行わなかった場合のｍＲＮＡ量を１００％として、相対値を示した。以下の実験はＮ＝４で行った（図１０および１１）。
　ナノ集合体からなるＰＭは、集合体を形成していないｍＲＮＡからなるＰＭと比べて高い酵素耐性を示した。
　尚、統計学的解析は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行い、ｎ．ｓ．はｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅを意味する。
実施例７：ＧＦＰ　ｍＲＮＡからのナノアッセンブリの調製
　前述の実施例ではＧＬｕｃ　ｍＲＮＡから調製したナノアッセンブリの解析結果を示したが、他のｍＲＮＡでも同様の戦略が有効であることを示すため、本実施例では、ＧＦＰ　ｍＲＮＡから調製したナノアッセンブリの解析を行った。ここで、ＧＦＰのコード配列（配列番号２１）を図１２に示す。
　ＧＦＰ　ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ社製）を購入し、北海道システムサイエンス社で合成した以下の８個のｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ（＃１７～＃２４）を前述の実施例２のＧＬｕｃの場合と同様の方法でＧＦＰ　ｍＲＮＡにハイブリダイズすることでナノアッセンブリを調製した。ＧＦＰ　ｍＲＮＡは、ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）の上流に５’ＵＴＲを含み、ＯＲＦの下流に３’ＵＴＲを含み、さらにその下流にｐｏｌｙ　Ａ配列を含む。
　「ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ」は、ｍＲＮＡにハイブリダイズし得る１７ｍｅｒの配列と、全てアデニン（Ａ）である１０ｍｅｒのリンカー配列と、１７ｍｅｒの配列と同じ配列とを、この順に含むＲＮＡオリゴマーである。
ｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ
＃１７：　ＣＡＣＣＣＣＧＧＵＧＡＡＣＡＧＣＵＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡＣＣＣＣＧＧＵＧＡＡＣＡＧＣＵ（配列番号２２）
＃１８：　ＣＧＣＵＧＡＡＣＵＵＧＵＧＧＣＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＧＣＵＧＡＡＣＵＵＧＵＧＧＣＣＧ（配列番号２３）
＃１９：　ＣＵＵＧＣＣＧＧＵＧＧＵＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＵＵＧＣＣＧＧＵＧＧＵＧＣＡＧＡ（配列番号２４）
＃２０：　ＧＵＧＧＵＣＧＧＧＧＵＡＧＣＧＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＵＧＧＵＣＧＧＧＧＵＡＧＣＧＧＣ（配列番号２５）
＃２１：　ＧＣＧＣＧＧＧＵＣＵＵＧＵＡＧＵＵＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＧＣＧＧＧＵＣＵＵＧＵＡＧＵＵ（配列番号２６）
＃２２：　ＧＣＣＡＵＧＡＵＡＵＡＧＡＣＧＵＵＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＣＡＵＧＡＵＡＵＡＧＡＣＧＵＵ（配列番号２７）
＃２３：　ＣＵＣＧＡＵＧＵＵＧＵＧＧＣＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＵＣＧＡＵＧＵＵＧＵＧＧＣＧＧＡ（配列番号２８）
＃２４：　ＣＵＵＣＵＣＧＵＵＧＧＧＧＵＣＵＵＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＵＵＣＵＣＧＵＵＧＧＧＧＵＣＵＵ（配列番号２９）
実施例８：ｍＲＮＡナノアッセンブリの解析
　実施例７で調製したｍＲＮＡナノアッセンブリについて解析を行ったが、各方法は前述の実施例のＧＬｕｃ　ｍＲＮＡの場合と同様である。
（１）ＦＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＯＬＹＭＰＵＳ社製、ＭＦ２０）解析
　実施例３（１）と同様の方法によりｍＲＮＡナノアッセンブリの大きさをＦＣＳ解析により評価した。
　その結果を図１３に示す。図１３の縦軸（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ　ｔｉｍｅ（μｓｅｃ））の数値が大きいほど、拡散が遅く、ｍＲＮＡナノアッセンブリの粒子径が大きくなったことを意味する。ＧＦＰ　ｍＲＮＡナノアッセンブリの粒子径は、ＧＬｕｃ　ｍＲＮＡナノアッセンブリの粒子径（図３（Ａ））とほぼ同じであることが分かる。
（２）酵素耐性試験
　実施例４（１）と同様の方法によりＦｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ、Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ　Ｓｕｍｉｔｏｍｏ　Ｐｈａｒｍａ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）中でのｍＲＮＡナノアッセンブリの酵素耐性を調べた。ただし、ＦＢＳ濃度は１％に固定した。
　ここでｑＲＴ－ＰＣＲでは以下のプライマーを用いた。
　　　ＦｏｒｗａｒｄのＴａｒｇｅｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣ（配列番号３０）
　　　ＲｅｖｅｒｓｅのＴａｒｇｅｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＴＧＣＴＣＡＧＧＴＡＧＴＧＧＴＴＧＴＣＧ（配列番号３１）
　その結果を、図１４に示す。「Ｎａｎｏ－ａｓｓｅｍｂｌｙ」は、ｍＲＮＡにＲＮＡオリゴマーとして８つのｌｉｎｋｅｒ　ＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ（＃１７～＃２４）を加えたものである。「Ｎａｎｏ－ａｓｓｅｍｂｌｙ」ではｍＲＮＡ（「Ｕｎｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ」）よりも酵素安定性が向上した。
　尚、統計学的解析は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行い、ｎ．ｓ．はｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅを意味する。
（３）ＡＦＭ（Ａｔｏｍｉｃ　Ｆｏｒｃｅ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、島津製作所、ＳＰＭ－９７００）解析
　実施例３（１）と同様の方法により、ｍＲＮＡナノアッセンブリをＡＦＭにより測定した。
　その結果を図１５（Ａ）～（Ｄ）に示す。図１５（Ｃ）の右にカラースケールを示すが、色が白に近ければ近いほど高さが増していること、すなわちサイズが大きいことを示す。Ｌｉｎｋｅｒ数８個のｍＲＮＡナノアッセンブリは、白い部分が多く、かつ１００ｎｍを越える粒径のものが散見される（図１５（Ｃ）および（Ｄ））。一方で、ｍＲＮＡ単体では白い部分は少なく、かつ１００ｎｍを越える粒径のものはほとんどない（図１５（Ａ）および（Ｂ））。これらのことから、ｍＲＮＡナノアッセンブリの方が、ｍＲＮＡ単体と比較して粒径が大きいことが分かる。
実施例９：ｍＲＮＡナノアッセンブリのＦＦＦ（Ｆｉｅｌｄ　ｆｏｒｗａｒｄ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）解析
　ＦＦＦでは、ｍＲＮＡナノアッセンブリの大きさに従った分離が可能であり、時間を経るに従い大きい粒子が分離される。
　具体的には、実施例７で調製したＧＦＰ　ｍＲＮＡナノアッセンブリについて以下の条件にて解析を行った。
・機器名：Ｅｃｌｉｐｓｅ　ＡＦ４（昭光サイエンティフィック（株））
・ｍＲＮＡ濃度：１００ｎｇ／μＬ
・注入量：２５μＬ
・流速は：ｄｅｔｅｃｔｏｒ　ｆｌｏｗを１ｍＬ／ｍｉｎとし、ｃｒｏｓｓ　ｆｌｏｗを２８分かけて１ｍＬ／ｍｉｎ～０ｍＬ／ｍｉｎへ一定のペースで低下させた。
　その結果を、図１６に示す。Ｎａｎｏａｓｓｅｍｂｌｙでは、ｕｎｈｙｂｒｉｄｉｚｅ（図１６（Ｂ））と比較して右にシフトしており、大きな粒子形成が確認された（図１６（Ａ））。また、この方法ではｎａｎｏａｓｓｅｍｂｌｙをサイズごとに分離することが可能である。
　ｍＲＮＡとＲＮＡオリゴマーとの複合体を用いたｍＲＮＡ送達は、治療用タンパク質を安全かつ持続的に供給するための手法として、その医療への応用が期待される。
　配列番号１：合成ＤＮＡ
　配列番号２～１８：合成ＲＮＡ
　配列番号１９～２１：合成ＤＮＡ
　配列番号２２～２９：合成ＲＮＡ
　配列番号３０～３１：合成ＤＮＡ

Claims (19)

  1. 　目的遺伝子をコードするｍＲＮＡとＲＮＡオリゴマーとの複合体であって、
    　ＲＮＡオリゴマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーであり、
    　少なくも２種のＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡの配列中のそれぞれ異なる配列にハイブリダイズ可能であり、
    　ＲＮＡオリゴマーの第１の配列が、ＲＮＡオリゴマーの第２の配列とは異なるｍＲＮＡにハイブリダイズすることで形成される、複合体。
    　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列；
    　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
  2. 　前記ＲＮＡオリゴマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーである、請求項１に記載の複合体。
    　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の第１の配列と、０～３０塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列をこの順に含むＲＮＡ配列
    　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズする第１の配列と、０～３０塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
  3. 　前記ＲＮＡオリゴマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーである、請求項１に記載の複合体。
    　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の第１の配列と、１０塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列をこの順に含むＲＮＡ配列
    　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズする第１の配列と、１０塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
  4. 　前記リンカー配列の塩基が全てアデニンである、請求項１～３のいずれか１項に記載の複合体。
  5. 　前記少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーが、２～８種のＲＮＡオリゴマーである、請求項１～４のいずれか１項に記載の複合体。
  6. 　ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ～１０，０００μｇ／ｍＬ、ｍＲＮＡと少なくとも２種の各ＲＮＡオリゴマーとのモル比が１：０．０５～０．０５：１となるようにｍＲＮＡと少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の複合体。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の複合体を含有する、医薬組成物。
  8. 　目的遺伝子をコードするｍＲＮＡと、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも２種のＲＮＡオリゴマーとの複合体を形成させることを含み、
    　少なくも２種のＲＮＡオリゴマーは、ｍＲＮＡの配列中のそれぞれ異なる配列にハイブリダイズ可能なものであり、
    　複合体において、ＲＮＡオリゴマーの第１の配列は、ＲＮＡオリゴマーの第２の配列とは異なるｍＲＮＡにハイブリダイズする、
    　ｍＲＮＡの安定化方法。
    　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
    　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、前記第１の配列と同じ配列である第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
  9. 　目的遺伝子をコードするｍＲＮＡとＲＮＡオリゴマーとの複合体であって、
    　ＲＮＡオリゴマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも１種のＲＮＡオリゴマーであり、
    　ＲＮＡオリゴマーの第１の配列が、ＲＮＡオリゴマーの第２の配列とは異なるｍＲＮＡにハイブリダイズすることで形成される、複合体。
    　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列；
    　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
  10. 　前記ＲＮＡオリゴマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも１種のＲＮＡオリゴマーである、請求項９に記載の複合体。
    　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の第１の配列と、０～３０塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
    　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、０～３０塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１５～２３塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
  11. 　前記ＲＮＡオリゴマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも１種のＲＮＡオリゴマーである、請求項９に記載の複合体。
    　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の第１の配列と、１０塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
    　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、１０塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１７塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
  12. 　前記リンカー配列の塩基が全てアデニンである、請求項９～１１のいずれか１項に記載の複合体。
  13. 　前記少なくとも１種のＲＮＡオリゴマーが、２～８種のＲＮＡオリゴマーである、請求項９～１２のいずれか１項に記載の複合体。
  14. 　ｍＲＮＡが１μｇ／ｍＬ～１０，０００μｇ／ｍＬ、ｍＲＮＡと少なくとも１種の各ＲＮＡオリゴマーとのモル比が１：０．０５～０．０５：１となるようにｍＲＮＡと少なくとも１種のＲＮＡオリゴマーを含む、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の複合体。
  15. 　請求項１１～１４のいずれか１項に記載の複合体を含有する、医薬組成物。
  16. 　目的遺伝子をコードするｍＲＮＡと、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡ配列を含む少なくとも１種のＲＮＡオリゴマーとの複合体を形成させることを含み、
    　複合体において、ＲＮＡオリゴマーの第１の配列は、ＲＮＡオリゴマーの第２の配列とは異なるｍＲＮＡにハイブリダイズする、
    　ｍＲＮＡの安定化方法。
    　（ａ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列；
    　（ｂ）ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な第１の配列と、０～１００塩基のリンカー配列と、ｍＲＮＡの配列に相補的な１２～４０塩基の配列と９０％以上の同一性を有し、かつｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第１の配列とは異なる第２の配列とをこの順に含むＲＮＡ配列
  17. 　請求項１～６及び１１～１４のいずれか１項に記載の複合体を内包したｍＲＮＡの輸送担体。
  18. 　輸送担体が、高分子ミセル又は脂質性ｍＲＮＡキャリアである、請求項１７に記載のｍＲＮＡの輸送担体。
  19. 　請求項１７または１８に記載のｍＲＮＡの輸送担体を含む、医薬組成物。
     
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