JP2014527819A - 多量体オリゴヌクレオチド化合物 - Google Patents

多量体オリゴヌクレオチド化合物 Download PDF

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Abstract

本開示は、それぞれが切断に耐性であり、切断可能リンカーによって一緒に連結された２つ以上の標的特異的オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ））を含む多量体オリゴヌクレオチド化合物を提供する。特に、それぞれ異なる標的に対する、２つ以上の連結された標的特異的オリゴヌクレオチドにより、好都合な薬物動態学的性質および薬力学的性質を呈しながら、複数の遺伝子の発現レベルの同時阻害が可能になる。記載した化合物を製造する方法およびこれらの化合物の使用も提供されている。

Description

関連出願
本願は、「Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」と題された、米国特許法第１１９条の下、２０１１年９月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／５３４，５６１号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
発明の分野
本発明は、オリゴヌクレオチド試薬、オリゴヌクレオチド治療剤、ならびにこれらを作製および使用する方法に関する。
発明の背景
オリゴヌクレオチドを臨床薬へと開発し、基礎研究ツールとしてこれらを使用する試みが継続している。例えば、遺伝子サイレンシングのためにアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することは、１９７８年もの早期に記述されている。この時以来、ＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ、および最近、長鎖非コードＲＮＡの標的化阻害または不活化を含めた遺伝子発現の制御のための他のオリゴヌクレオチドに基づく手法が登場している。
天然のホスホジエステル骨格オリゴヌクレオチドは、細胞によって効率的に取り込まれるが、これらは、血漿中のヌクレアーゼ分解を非常に受けやすく、それにより、いくつかの場合では、治療剤としてのこれらの有効性が限定されている。したがって場合によって、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼによって分解される程度を限定またはコントロールすることが有利である。この点において、場合によって安定性を改善するいくつかの修飾ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ）および骨格修飾（例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート）が報告されている。それにもかかわらず、好都合な薬物動態学的性質および薬力学的性質を有するオリゴヌクレオチドを得ることが、オリゴヌクレオチドに基づく研究および開発における現在の目的として残っている。
発明の要旨
本発明のいくつかの態様によれば、遺伝子の発現および機能を制御するのに有用な多量体オリゴヌクレオチド化合物が提供される。本発明のいくつかの態様は、単量体ユニットが切断可能リンカー（例えば、エンドヌクレアーゼ感受性リンカー）によって接続され、多量体として投与される場合、相対的に高いレベルの単量体オリゴヌクレオチドを標的組織または細胞内で達成することができるという発見に基づく。いくつかの実施形態では、リンカーの性質は、多量体オリゴヌクレオチド化合物の薬物動態学的性質および薬力学的性質を調節するように選択される。例えば、いくつかの実施形態では、単量体ユニットが、標的とされる特定の組織タイプまたは細胞タイプ内で放出される程度をコントロールするように、リンカーの性質をチューニングすることができる。
いくつかの実施形態では、多量体を使用することの利点は、これが、投与されるオリゴヌクレオチドの薬物動態学的利点および／または薬力学的利点を活用しながら、複数の標的の同時ノックダウンを可能にすることである。いくつかの実施形態では、２つ以上の標的の配列特異的同時ノックダウンを、いくつかの標的遺伝子組合せに対して向けられるターゲティングオリゴヌクレオチドを含有するヘテロ多量体を用いて達成することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される多量体オリゴヌクレオチド化合物は、切断可能リンカーによって一緒に連結された２つ以上のターゲティングオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、各ターゲティングオリゴヌクレオチドは、ゲノム標的配列の一標的領域と相補的な領域を有する。いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、ゲノム標的配列によってコードされる標的核酸とハイブリダイズし、標的核酸の機能を阻害し、かつ／またはその分解をもたらす。標的核酸は、例えば、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、またはｍＲＮＡとすることができる。
いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｓｉＲＮＡ（例えば、一本鎖ｓｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡスポンジ、または抗マイクロＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＭＯ）である。いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、細胞内の標的核酸に特異的に結合し、標的核酸の分解を生じさせる。いくつかの実施形態では、分解は、ＲＮＡｓｅ Ｈによって媒介される。いくつかの実施形態では、分解は、ＲＮＡｉ経路によって媒介される。いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、細胞内のその標的核酸に特異的に結合し、標的核酸の機能を阻害する。例えば、いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、標的ｌｎｃＲＮＡに結合し、ｌｎｃＲＮＡの１種または複数の相互作用タンパク質（例えば、ポリコームリプレッサー複合体２（ＰＲＣ２）のサブユニット）との相互作用を阻害する。
本発明のいくつかの態様によれば、一般式：Ｘ−Ｌ−［Ｘ−Ｌ］ｉ−Ｘを含む化合物であって、式中、ｉは、０〜９の整数であり、その値は、化合物中に存在する［Ｘ−Ｌ］ｉの単位数を示し、各Ｘは、独立して、ゲノム標的配列の一標的領域と相補的な少なくとも７個の連続したヌクレオチドを含む相補性の領域を有するターゲティングオリゴヌクレオチドであり、各Ｌは、少なくとも２個のＸを連結し、各Ｘより哺乳動物の抽出物中で切断されやすいリンカーである、化合物が提供される。いくつかの実施形態では、ｉ＝０、および一般式が５’Ｘ３’−Ｌ−５’Ｘ３’であるとき、かつ第１のＸおよび第２のＸと相補的な標的領域がゲノム標的配列中で重ならないとき、第１のＸと相補的な標的領域の５’末端および第２のＸと相補的な標的領域の３’末端は、ゲノム標的配列内で０〜４ヌクレオチドの距離内にない。いくつかの実施形態では、第１のＸと相補的な標的領域の５’末端および第２のＸと相補的な標的領域の３’末端は、ゲノム標的配列内で０〜１、０〜２、０〜３、０〜４、０〜５、０〜６、０〜７、０〜８、０〜９、０〜１０、０〜１５、０〜２０、０〜２５、またはそれ以上のヌクレオチドの距離内にない。いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、長さが８〜１５、１０〜１６、１０〜２０、１０〜２５、１５〜３０、８〜５０、１０〜１００、またはそれ以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、長さが８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＬは、自己相補性ヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、すべてのＬが、自己相補性ヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＬは、少なくとも１個のＬの２個の直接隣接するＸと相補的な標的領域と連続したゲノム標的配列の一領域と相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、化合物は、リボザイムを含まない。いくつかの実施形態では、すべてのＬが、２個の直接隣接するＸと相補的な標的領域と連続したゲノム標的配列の一領域と相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含まない。
いくつかの実施形態では、ｉは、０〜３、１〜３、１〜５、１〜９、１〜１５、１〜２０の整数である。いくつかの実施形態では、ｉは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＬリンカーは、ターゲティングオリゴヌクレオチドより哺乳動物の抽出物中でエンドヌクレアーゼによって切断されやすいオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１個のＬは、１〜１０個のチミジンまたはウリジンを含むヌクレオチド配列を有するリンカーである。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＬは、ホスホジエステルヌクレオチド間連結によって連結されたデオキシリボヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有するリンカーである。ある特定の実施形態では、少なくとも１個のＬは、ホスホジエステルヌクレオチド間連結によって連結された１〜１０個のチミジンを含むヌクレオチド配列を有するリンカーである。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＬは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結によって連結された１〜１０個のウリジンを含むヌクレオチド配列を有するリンカーである。ある特定の実施形態では、少なくとも１個のＬは、式：
を有するリンカーであり、式中、Ｚはオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、Ｚは、１〜１０個のチミジンまたはウリジンを含むヌクレオチド配列を有する。ある特定の実施形態では、少なくとも１個のＬは、自己相補性ヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含まず、２つの隣接する標的領域と連続したゲノム標的配列の一領域と相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＬは、脱塩基部位を有するオリゴヌクレオチドを含まないリンカーである。
ある特定の実施形態では、少なくとも１個のＬについて、そのリンカーは、ターゲティングオリゴヌクレオチドより哺乳動物の抽出物中でエンドペプチダーゼによって切断されやすいポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、エンドペプチダーゼは、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、サーモリシン（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）、ペプシン、またはエンドペプチダーゼＶ８である。いくつかの実施形態では、エンドペプチダーゼは、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＬ、カテプシンＣ、パパイン、カテプシンＳ、またはエンドソーム酸性インスリナーゼ（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ａｃｉｄｉｃ ｉｎｓｕｌｉｎａｓｅ）である。ある特定の実施形態では、少なくとも１個のＬは、ＡＬＡＬ（配列番号１２５）、ＡＰＩＳＦＦＥＬＧ（配列番号１２６）、ＦＬ、ＧＦＮ、Ｒ／ＫＸＸ、ＧＲＷＨＴＶＧＬＲＷＥ（配列番号１２７）、ＹＬ、ＧＦ、およびＦＦから選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含むリンカーであり、式中、Ｘは、任意のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＬは、式−（ＣＨ２）ｎＳ−Ｓ（ＣＨ２）ｍ−を含むリンカーであり、式中、ｎおよびｍは、独立して、０〜１０の整数である。ある特定の実施形態では、少なくとも１個のＬリンカーは、低ｐＨ不安定結合を含む。いくつかの実施形態では低ｐＨ不安定結合は、アミン、イミン、エステル、安息香酸イミン、アミノエステル、ジオルトエステル、ポリホスホエステル、ポリホスファゼン、アセタール、ビニルエーテル、ヒドラゾン、アジドメチル−メチルマレイン酸無水物、チオプロピオネート、マスク化エンドソーム溶解剤（ｍａｓｋｅｄ ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ ａｇｅｎｔ）、またはシトラコニル基を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＬは、分枝状リンカーである。ある特定の実施形態では、分枝状リンカーは、ホスホラミダイト連結を含む。ある特定の実施形態では、化合物は、非対称分枝状三量体である。ある特定の実施形態では、化合物は、対称分枝状三量体である。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＬは、ターゲティングオリゴヌクレオチドより、哺乳動物の抽出物の存在下で切断に少なくとも２倍感受性であるリンカーである。
いくつかの実施形態では、化合物は、以下の一般式：
を有することができ、式中、ｉは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上であり、ｊおよびｋは、独立して０または１であり、その値はそれぞれ、存在するＸｊおよびＸｋの数を示し、ｌおよびｍは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上であり、その値はそれぞれ、化合物中に存在する［Ｘ−Ｌ］ｌおよび［Ｌ−Ｘ］ｍの単位数を示す。いくつかの実施形態では、［Ｘ−Ｌ］ｌおよび［Ｌ−Ｘ］ｍのうちの少なくとも１つが存在する。
いくつかの実施形態では、本化合物は、以下の一般式：
Ｘ−Ｌ−［Ｘ−Ｌ］ｉ−Ｘ
を有する。いくつかの実施形態では、本化合物は、以下の一般式：
を有する。いくつかの実施形態では、本化合物は、以下の一般式：
を有し、式中、ｊおよびｋは、独立して０または１であり、その値はそれぞれ、化合物中に存在するＸｊおよびＸｋの数を示し、ＸｊおよびＸｋのうちの少なくとも１つが化合物中に存在する。
本発明のいくつかの態様によれば、リンカーによって連結された少なくとも２つのターゲティングオリゴヌクレオチドを含む化合物であって、このリンカーは、少なくとも２つのターゲティングオリゴヌクレオチドより、哺乳動物の抽出物の存在下で酵素的切断に少なくとも２倍感受性であり、各ターゲティングオリゴヌクレオチドは、ゲノム標的配列の一標的領域と相補的な少なくとも７個の連続したヌクレオチドを含む相補性の領域を有する、化合物が提供される。いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、長さが８〜１５、１０〜１６、１２〜１６、１０〜２０、１０〜２５、１５〜３０、８〜５０、１０〜１００、またはそれ以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、長さが８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、リンカーは、２つのターゲティングオリゴヌクレオチドより、哺乳動物の抽出物の存在下で酵素的切断に少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、またはそれ以上感受性である。いくつかの実施形態では、リンカーは、オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的領域に直接隣り合う位置でゲノム標的配列と相補的でない配列を有する。ある特定の実施形態では、哺乳動物の抽出物は、腎臓、肝臓、腸、または腫瘍の組織からの抽出物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物の抽出物は、細胞抽出物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物の抽出物は、エンドソーム抽出物である。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のリボヌクレオチド、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチド、または少なくとも１個の架橋型ヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含む。いくつかの実施形態では、架橋型ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、またはＥＮＡ修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’末端および３’末端のそれぞれに、少なくとも１個の架橋型ヌクレオチドが隣接したデオキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドは、少なくとも２個のヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドは、２’Ｏ−メチルを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドは、Ｇ−クランプ（Ｇ−ｃｌａｍｐ）、５−プロピニル、または５−オクタジエニル−ピリミジンを含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ Ｈ動員ヌクレオチドを含むギャップマーである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドは、一本鎖ｓｉＲＮＡである。
ある特定の実施形態では、化合物は、機能部分（例えば、細胞表面受容体に結合する親油性部分またはターゲティング部分）に連結されている。いくつかの実施形態では、機能部分は、ターゲティングオリゴヌクレオチドに連結されている。いくつかの実施形態では、機能部分は、リンカーに連結されている。
ある特定の実施形態では、少なくとも２つのターゲティングオリゴヌクレオチドは、リンカーと比べて同じ５’から３’配向にある。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのターゲティングオリゴヌクレオチドは、リンカーと比べて反対の５’から３’配向にある。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドは、末端ヌクレオチドによってリンカーに連結されている。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドは、内部ヌクレオチドによってリンカーに連結されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドと相補的な標的領域が、遺伝子のセンス鎖中に存在する。いくつかの実施形態では、遺伝子は、非コードＲＮＡ遺伝子である。ある特定の実施形態では、非コードＲＮＡ遺伝子は、長鎖非コードＲＮＡ遺伝子である。いくつかの実施形態では、非コードＲＮＡ遺伝子は、ｍｉＲＮＡ遺伝子である。いくつかの実施形態では、遺伝子は、タンパク質コード遺伝子である。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドのゲノム標的配列は、ＰＲＣ−２関連領域の配列である。ある特定の実施形態では、少なくとも２つの標的領域が、異なる遺伝子のセンス鎖中に存在する。ある特定の実施形態では、少なくとも２つの標的領域が、同じ遺伝子のセンス鎖中に存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの標的領域は異なる。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの標的領域は同一である。ある特定の実施形態では、遺伝子の産物は、後成的機構によって遺伝子発現を媒介する。
本発明のいくつかの態様によれば、本明細書に開示の化合物のいずれか、および担体を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、化合物は、担体とコンジュゲートしている。本発明のいくつかの態様によれば、本明細書に開示の化合物のいずれか、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の化合物または組成物のいずれかを収容する容器を含むキットが提供される。
本発明のいくつかの態様によれば、細胞内の標的遺伝子の発現を増大させる方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞を本明細書に開示の化合物のいずれかと接触させるステップと、化合物が細胞内に入る条件下で細胞を維持するステップとを含む。本方法のいくつかの実施形態では、本化合物の少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドのゲノム標的配列は、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子のセンス鎖中に存在し、その産物は、標的遺伝子の発現を阻害するｌｎｃＲＮＡである。いくつかの実施形態では、細胞内に本化合物が存在すると、本化合物を含有しない対照細胞内の標的遺伝子の発現レベルより、少なくとも５０％大きい、少なくとも６０％大きい、少なくとも７０％大きい、少なくとも８０％、または少なくとも９０％大きい、標的遺伝子の発現レベルがもたらされる。
本発明のいくつかの態様によれば、被験体内の標的遺伝子のレベルを増大させる方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に開示の化合物のいずれかを被験体に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、本化合物の少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドのゲノム標的配列は、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子のセンス鎖中に存在し、その産物は、標的遺伝子の発現を阻害する。
本発明のいくつかの態様によれば、被験体内の標的遺伝子の発現レベルの変化と関連した状態を処置する方法が提供される。いくつかの実施形態では、この状態は、この状態を有さない対照の被験体と比較して、標的遺伝子の発現レベルの減少または増大と関連する。いくつかの実施形態では、本方法は、被験体に本化合物を投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、本化合物の少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドのゲノム標的配列は、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子のセンス鎖中に存在し、その産物は、標的遺伝子の発現を阻害する。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドは、ｌｎｃＲＮＡとハイブリダイズし、その機能を阻害し、またはその分解を生じさせる。
本発明のいくつかの態様によれば、細胞内の標的遺伝子の活性を調節する方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞を本明細書に開示の化合物のいずれかと接触させるステップと、化合物が細胞内に入る条件下で細胞を維持するステップとを含む。いくつかの実施形態では、細胞内に化合物が存在すると、細胞内の標的遺伝子の発現または活性が低減される。本発明のいくつかの態様によれば、被験体内の標的遺伝子のレベルを調節する方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に開示の化合物のいずれかを被験体に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドのゲノム標的配列は、標的遺伝子のセンス鎖中に存在する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、タンパク質コード遺伝子または非コード遺伝子である。
いくつかの実施形態では、それぞれがヌクレアーゼ耐性修飾骨格を有する、２つ以上のターゲティングオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）を含む多量体オリゴヌクレオチド化合物であって、ターゲティングオリゴヌクレオチドが１つまたは１つより多い分解性リンカーによって互いに連結されている、化合物が提供される。いくつかの実施形態では、骨格は、ヌクレオシド間連結を含有する。いくつかの実施形態では、化合物中に含有している個々の連結したターゲティングオリゴヌクレオチドは、同じ標的または複数の標的に向けることができる。多量体化合物は、ホモ二量体、ホモ三量体など、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体などとすることができる。これらは、線状、分枝状、または環状とすることができる。
いくつかの実施形態では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチド化合物（例えば、別の１４−ｍｅｒのＡＳＯに連結した１４−ｍｅｒのＡＳＯ）は、単量体単位が急速分解性リンカー（例えば、ヌクレアーゼ感受性リンカーまたはジスルフィドリンカー）によって接続されている場合、ヌクレアーゼ耐性、したがって、遅分解性であるリンカーとは対照的に、肝臓内で有意により高いレベルの対応する単量体オリゴヌクレオチド化合物を示すという発見に、一部分において基づく。予想外に、二量体由来単量体ユニットの検出肝臓レベルは、単量体形態で投与される対応する単量体の肝臓レベルより５〜１０倍高かった。肝臓への送達の増大は、マウスに投薬して１４日後のより有効な標的ｍＲＮＡノックダウンとも関連していた。したがって本発明は、リンカーのタイプおよび性質をこのように使用して、二量体アンチセンス分子の薬物動態学的性質および薬力学的性質を調節することができると気付いたことに、一部分において基づく。いくつかの実施形態では、急速分解性リンカーは、「切断可能」と呼ばれ（例えば、ヌクレアーゼ感受性ホスホジエステル連結、またはジスルフィド結合を含むリンカーなど）、一方、より安定な連結、例えば、ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエートなどは、「切断不可能」と呼ばれる。
例示的な実施形態では、本化合物は、１つまたは１つより多い肝標的に向けられ、ＡＳＯは、それだけに限らないが、ＡｐｏＣ３およびＡｐｏＢを含めた肝標的に向けられる。
いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）は、１２〜１６個のヌクレオチド塩基を含有し、ここで１つまたは１つより多いターゲティングオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。ギャップマーを含むターゲティングオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）は、糖残基中の２’修飾（例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾）、２’−Ｏ−メチル、および２’−フルオロ修飾、ならびに／またはヌクレオチド修飾、例えば、Ｇ−クランプ、５−プロピニル、および５−オクタジエニル−ピリミジンなどを含むことができる。
本発明は、薬学的に許容される添加剤とともに本発明の化合物を含む医薬組成物をさらに提供する。ある特定の実施形態では、本医薬組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏで投与される場合、以下の性質：
（ａ）それぞれの単量体ターゲティングオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）と比較して、肝臓内の濃度の増大および腎臓によるクリアランスの低減、
（ｂ）それぞれの単量体ターゲティングオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）と比較して、標的ノックダウンのより長い継続時間、ならびに
（ｃ）それぞれの単量体ターゲティングオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）、および／または切断可能リンカーが切断不可能リンカーで置換された同じ多量体オリゴヌクレオチド化合物を比較して、より低い有効濃度
のうちの１つまたは複数によって特徴付けられる。
本発明は、１つまたは１つより多い標的のｍＲＮＡレベルを阻害する方法であって、標的（複数可）の発現を阻害するのに有効な量で本発明の化合物を細胞または被験体に投与するステップを含む、方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、投与後２週間以上にわたって、標的（複数可）の治療的に有効なノックダウンをもたらす。本方法は、代謝疾患、がん、心血管疾患、および他の状態に関連する標的に対して使用することができる。
先の記述および以下の記述は、例示的で説明的であるだけであり、本文で主張される本発明を限定するものではなく、多量体ターゲティングオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）は、それぞれの標的名称のみによって呼ばれる場合があり、例えば、「ＡｐｏＣ３−ＡｐｏＣ３二量体」は、「ＡｐｏＣ３−ＡｐｏＣ３ ＡＳＯ二量体」を短縮形として意味する。
図１Ａは、２つの１４−ｍｅｒギャップマー（例えば、例示した３ＬＮＡ−８ＤＮＡ−３ＬＮＡ）がリンカー（薄く網掛けされた円で表された）を介して接続された例示的なコンストラクトの略図を示す。図１Ｂは、二量体および多量体（ホモポリマーまたはヘテロポリマー）の様々な構成の例を示す。図１Ｃおよび図１Ｄは、ある特定の多量体ＡＳＯの化学構造の詳細を示す。 図１Ａは、２つの１４−ｍｅｒギャップマー（例えば、例示した３ＬＮＡ−８ＤＮＡ−３ＬＮＡ）がリンカー（薄く網掛けされた円で表された）を介して接続された例示的なコンストラクトの略図を示す。図１Ｂは、二量体および多量体（ホモポリマーまたはヘテロポリマー）の様々な構成の例を示す。図１Ｃおよび図１Ｄは、ある特定の多量体ＡＳＯの化学構造の詳細を示す。 図１Ａは、２つの１４−ｍｅｒギャップマー（例えば、例示した３ＬＮＡ−８ＤＮＡ−３ＬＮＡ）がリンカー（薄く網掛けされた円で表された）を介して接続された例示的なコンストラクトの略図を示す。図１Ｂは、二量体および多量体（ホモポリマーまたはヘテロポリマー）の様々な構成の例を示す。図１Ｃおよび図１Ｄは、ある特定の多量体ＡＳＯの化学構造の詳細を示す。 図１Ａは、２つの１４−ｍｅｒギャップマー（例えば、例示した３ＬＮＡ−８ＤＮＡ−３ＬＮＡ）がリンカー（薄く網掛けされた円で表された）を介して接続された例示的なコンストラクトの略図を示す。図１Ｂは、二量体および多量体（ホモポリマーまたはヘテロポリマー）の様々な構成の例を示す。図１Ｃおよび図１Ｄは、ある特定の多量体ＡＳＯの化学構造の詳細を示す。
図２は、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）で判定した場合の、血漿中の二量体のｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性および肝臓ホモジネート中のこれらの分解を実証する図である。図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれマウス血漿およびサル血漿中のＡｐｏＣ３ ＡＳＯ単量体（配列番号１、実施例２（Ｅ）に従って命名）、ならびに切断可能ＡｐｏＣ３−ＡｐｏＣ３ ＡＳＯ二量体（配列番号２および配列番号４）の両方の遅い分解を実証する。図２Ｃは、マウス肝臓ホモジネート中の切断可能ＡｐｏＣ３−ＡｐｏＣ３ ＡＳＯ二量体（配列番号２および配列番号４）、ならびに相対的に安定な（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）ＡｐｏＣ３ ＡＳＯ単量体（配列番号１）の単量体への効率的な切断を実証する。図２Ｄは、マウス血漿または肝臓ホモジネート中でインキュベートされた切断可能（配列番号１８）および切断不可能（配列番号１９）ＡｐｏＢ−ＡｐｏＢ ＡＳＯホモ二量体を示し、血漿中の両タイプの分子の安定性、および肝臓ホモジネート中での切断可能バージョンの単量体へのより効率的な切断を実証する。 図２は、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）で判定した場合の、血漿中の二量体のｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性および肝臓ホモジネート中のこれらの分解を実証する図である。図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれマウス血漿およびサル血漿中のＡｐｏＣ３ ＡＳＯ単量体（配列番号１、実施例２（Ｅ）に従って命名）、ならびに切断可能ＡｐｏＣ３−ＡｐｏＣ３ ＡＳＯ二量体（配列番号２および配列番号４）の両方の遅い分解を実証する。図２Ｃは、マウス肝臓ホモジネート中の切断可能ＡｐｏＣ３−ＡｐｏＣ３ ＡＳＯ二量体（配列番号２および配列番号４）、ならびに相対的に安定な（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）ＡｐｏＣ３ ＡＳＯ単量体（配列番号１）の単量体への効率的な切断を実証する。図２Ｄは、マウス血漿または肝臓ホモジネート中でインキュベートされた切断可能（配列番号１８）および切断不可能（配列番号１９）ＡｐｏＢ−ＡｐｏＢ ＡＳＯホモ二量体を示し、血漿中の両タイプの分子の安定性、および肝臓ホモジネート中での切断可能バージョンの単量体へのより効率的な切断を実証する。 図２は、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）で判定した場合の、血漿中の二量体のｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性および肝臓ホモジネート中のこれらの分解を実証する図である。図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれマウス血漿およびサル血漿中のＡｐｏＣ３ ＡＳＯ単量体（配列番号１、実施例２（Ｅ）に従って命名）、ならびに切断可能ＡｐｏＣ３−ＡｐｏＣ３ ＡＳＯ二量体（配列番号２および配列番号４）の両方の遅い分解を実証する。図２Ｃは、マウス肝臓ホモジネート中の切断可能ＡｐｏＣ３−ＡｐｏＣ３ ＡＳＯ二量体（配列番号２および配列番号４）、ならびに相対的に安定な（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）ＡｐｏＣ３ ＡＳＯ単量体（配列番号１）の単量体への効率的な切断を実証する。図２Ｄは、マウス血漿または肝臓ホモジネート中でインキュベートされた切断可能（配列番号１８）および切断不可能（配列番号１９）ＡｐｏＢ−ＡｐｏＢ ＡＳＯホモ二量体を示し、血漿中の両タイプの分子の安定性、および肝臓ホモジネート中での切断可能バージョンの単量体へのより効率的な切断を実証する。 図２は、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）で判定した場合の、血漿中の二量体のｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性および肝臓ホモジネート中のこれらの分解を実証する図である。図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれマウス血漿およびサル血漿中のＡｐｏＣ３ ＡＳＯ単量体（配列番号１、実施例２（Ｅ）に従って命名）、ならびに切断可能ＡｐｏＣ３−ＡｐｏＣ３ ＡＳＯ二量体（配列番号２および配列番号４）の両方の遅い分解を実証する。図２Ｃは、マウス肝臓ホモジネート中の切断可能ＡｐｏＣ３−ＡｐｏＣ３ ＡＳＯ二量体（配列番号２および配列番号４）、ならびに相対的に安定な（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）ＡｐｏＣ３ ＡＳＯ単量体（配列番号１）の単量体への効率的な切断を実証する。図２Ｄは、マウス血漿または肝臓ホモジネート中でインキュベートされた切断可能（配列番号１８）および切断不可能（配列番号１９）ＡｐｏＢ−ＡｐｏＢ ＡＳＯホモ二量体を示し、血漿中の両タイプの分子の安定性、および肝臓ホモジネート中での切断可能バージョンの単量体へのより効率的な切断を実証する。
図３は、ホモ二量体でのリンカー設計の様々な態様に対処する図である。図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｄに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤（ｌｉｐｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図３Ｃおよび図３Ｅ〜３Ｋに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図３は、ホモ二量体でのリンカー設計の様々な態様に対処する図である。図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｄに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤（ｌｉｐｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図３Ｃおよび図３Ｅ〜３Ｋに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図３は、ホモ二量体でのリンカー設計の様々な態様に対処する図である。図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｄに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤（ｌｉｐｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図３Ｃおよび図３Ｅ〜３Ｋに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図３は、ホモ二量体でのリンカー設計の様々な態様に対処する図である。図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｄに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤（ｌｉｐｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図３Ｃおよび図３Ｅ〜３Ｋに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図３は、ホモ二量体でのリンカー設計の様々な態様に対処する図である。図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｄに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤（ｌｉｐｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図３Ｃおよび図３Ｅ〜３Ｋに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図３は、ホモ二量体でのリンカー設計の様々な態様に対処する図である。図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｄに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤（ｌｉｐｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図３Ｃおよび図３Ｅ〜３Ｋに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図３は、ホモ二量体でのリンカー設計の様々な態様に対処する図である。図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｄに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤（ｌｉｐｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図３Ｃおよび図３Ｅ〜３Ｋに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図３は、ホモ二量体でのリンカー設計の様々な態様に対処する図である。図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｄに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤（ｌｉｐｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図３Ｃおよび図３Ｅ〜３Ｋに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図３は、ホモ二量体でのリンカー設計の様々な態様に対処する図である。図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｄに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤（ｌｉｐｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図３Ｃおよび図３Ｅ〜３Ｋに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図３は、ホモ二量体でのリンカー設計の様々な態様に対処する図である。図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｄに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤（ｌｉｐｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図３Ｃおよび図３Ｅ〜３Ｋに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図３は、ホモ二量体でのリンカー設計の様々な態様に対処する図である。図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｄに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤（ｌｉｐｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図３Ｃおよび図３Ｅ〜３Ｋに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。
図４は、様々なヘテロ二量体（二量体および三量体）の設計の様々な態様に対処する図である。図４Ａに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図４Ｂ〜４Ｍに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図４は、様々なヘテロ二量体（二量体および三量体）の設計の様々な態様に対処する図である。図４Ａに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図４Ｂ〜４Ｍに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図４は、様々なヘテロ二量体（二量体および三量体）の設計の様々な態様に対処する図である。図４Ａに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図４Ｂ〜４Ｍに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図４は、様々なヘテロ二量体（二量体および三量体）の設計の様々な態様に対処する図である。図４Ａに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図４Ｂ〜４Ｍに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図４は、様々なヘテロ二量体（二量体および三量体）の設計の様々な態様に対処する図である。図４Ａに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図４Ｂ〜４Ｍに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図４は、様々なヘテロ二量体（二量体および三量体）の設計の様々な態様に対処する図である。図４Ａに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図４Ｂ〜４Ｍに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図４は、様々なヘテロ二量体（二量体および三量体）の設計の様々な態様に対処する図である。図４Ａに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図４Ｂ〜４Ｍに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図４は、様々なヘテロ二量体（二量体および三量体）の設計の様々な態様に対処する図である。図４Ａに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図４Ｂ〜４Ｍに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図４は、様々なヘテロ二量体（二量体および三量体）の設計の様々な態様に対処する図である。図４Ａに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図４Ｂ〜４Ｍに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図４は、様々なヘテロ二量体（二量体および三量体）の設計の様々な態様に対処する図である。図４Ａに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図４Ｂ〜４Ｍに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図４は、様々なヘテロ二量体（二量体および三量体）の設計の様々な態様に対処する図である。図４Ａに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図４Ｂ〜４Ｍに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図４は、様々なヘテロ二量体（二量体および三量体）の設計の様々な態様に対処する図である。図４Ａに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図４Ｂ〜４Ｍに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。 図４は、様々なヘテロ二量体（二量体および三量体）の設計の様々な態様に対処する図である。図４Ａに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、様々な濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）の、リポトランスフェクション剤とともに製剤化した指定されたオリゴヌクレオチドで処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。図４Ｂ〜４Ｍに示した結果については、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、８つの濃度（０．１、０．６、３．０、２０、８０、４００、２０００、および１０，０００ｎＭ）の、いずれのトランスフェクション剤も含まない指定されたオリゴヌクレオチドで処置した（「ジムノティック送達」）。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して８日後に求めた。すべての場合において、グラフは、非特異的オリゴヌクレオチド（陰性対照）と比べたパーセンテージ効果を表す。
図５Ａ〜５Ｃは、試験した条件下で、ノックダウンの時間経過が、二量体ＡＳＯ中の２つのアンチセンス部分を接続するのに使用したリンカーのタイプに依存したことを実証する図である。ヒトＡｐｏＣ３トランスジェニックマウスに、１０ｍｇ／ｋｇの単回皮下用量のホモ二量体である配列番号５または３（これらは、同じ単量体のジスルフィド連結ホモ二量体である）、またはビヒクルを投与した。図５Ａは、エンドヌクレアーゼ感受性ホスホジエステル連結ホモ二量体（配列番号４および配列番号２）で処置した後の、ヒトＡｐｏＣ３トランスジェニックマウスにおける肝臓ＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡレベルの低減の関連した増大を実証する。ホモ二量体の配列番号４および２は、１４日後に、単量体（配列番号１）と比較して肝臓ＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡレベルの低減の増大を呈した。図５Ｂおよび図５Ｃは、ヒトＡｐｏＣ３トランスジェニックマウス内に配列番号１の単量体および二量体ＬＮＡギャップマーの配列番号２〜配列番号５を１０ｍｇ／ｋｇで単回投薬して７日後（図５Ｂ）および１４日後（図５Ｃ）のＡｐｏＣ３タンパク質ノックダウンを示す図である。図は、エンドヌクレアーゼ感受性ホスホジエステル連結ホモ二量体、配列番号１、配列番号４、および配列番号２で処置した後の、ヒトＡｐｏＣ３トランスジェニックマウスにおける血清ＡｐｏＣ３タンパク質レベルの低減の継続時間の延長を実証する。ホモ二量体の配列番号４および配列番号２は、７日後に、単量体の配列番号１と同様の血清ＡｐｏＣ３レベルの低減を呈したが、この単量体と対照的に、切断可能二量体（配列番号２または４）で処置した細胞内の標的遺伝子発現の低減は、持続的であり、結果として、１４日後に、配列番号１と比較して低減が増大した。
図５Ａ〜５Ｃは、試験した条件下で、ノックダウンの時間経過が、二量体ＡＳＯ中の２つのアンチセンス部分を接続するのに使用したリンカーのタイプに依存したことを実証する図である。ヒトＡｐｏＣ３トランスジェニックマウスに、１０ｍｇ／ｋｇの単回皮下用量のホモ二量体である配列番号５または３（これらは、同じ単量体のジスルフィド連結ホモ二量体である）、またはビヒクルを投与した。図５Ａは、エンドヌクレアーゼ感受性ホスホジエステル連結ホモ二量体（配列番号４および配列番号２）で処置した後の、ヒトＡｐｏＣ３トランスジェニックマウスにおける肝臓ＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡレベルの低減の関連した増大を実証する。ホモ二量体の配列番号４および２は、１４日後に、単量体（配列番号１）と比較して肝臓ＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡレベルの低減の増大を呈した。図５Ｂおよび図５Ｃは、ヒトＡｐｏＣ３トランスジェニックマウス内に配列番号１の単量体および二量体ＬＮＡギャップマーの配列番号２〜配列番号５を１０ｍｇ／ｋｇで単回投薬して７日後（図５Ｂ）および１４日後（図５Ｃ）のＡｐｏＣ３タンパク質ノックダウンを示す図である。図は、エンドヌクレアーゼ感受性ホスホジエステル連結ホモ二量体、配列番号１、配列番号４、および配列番号２で処置した後の、ヒトＡｐｏＣ３トランスジェニックマウスにおける血清ＡｐｏＣ３タンパク質レベルの低減の継続時間の延長を実証する。ホモ二量体の配列番号４および配列番号２は、７日後に、単量体の配列番号１と同様の血清ＡｐｏＣ３レベルの低減を呈したが、この単量体と対照的に、切断可能二量体（配列番号２または４）で処置した細胞内の標的遺伝子発現の低減は、持続的であり、結果として、１４日後に、配列番号１と比較して低減が増大した。 図５Ａ〜５Ｃは、試験した条件下で、ノックダウンの時間経過が、二量体ＡＳＯ中の２つのアンチセンス部分を接続するのに使用したリンカーのタイプに依存したことを実証する図である。ヒトＡｐｏＣ３トランスジェニックマウスに、１０ｍｇ／ｋｇの単回皮下用量のホモ二量体である配列番号５または３（これらは、同じ単量体のジスルフィド連結ホモ二量体である）、またはビヒクルを投与した。図５Ａは、エンドヌクレアーゼ感受性ホスホジエステル連結ホモ二量体（配列番号４および配列番号２）で処置した後の、ヒトＡｐｏＣ３トランスジェニックマウスにおける肝臓ＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡレベルの低減の関連した増大を実証する。ホモ二量体の配列番号４および２は、１４日後に、単量体（配列番号１）と比較して肝臓ＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡレベルの低減の増大を呈した。図５Ｂおよび図５Ｃは、ヒトＡｐｏＣ３トランスジェニックマウス内に配列番号１の単量体および二量体ＬＮＡギャップマーの配列番号２〜配列番号５を１０ｍｇ／ｋｇで単回投薬して７日後（図５Ｂ）および１４日後（図５Ｃ）のＡｐｏＣ３タンパク質ノックダウンを示す図である。図は、エンドヌクレアーゼ感受性ホスホジエステル連結ホモ二量体、配列番号１、配列番号４、および配列番号２で処置した後の、ヒトＡｐｏＣ３トランスジェニックマウスにおける血清ＡｐｏＣ３タンパク質レベルの低減の継続時間の延長を実証する。ホモ二量体の配列番号４および配列番号２は、７日後に、単量体の配列番号１と同様の血清ＡｐｏＣ３レベルの低減を呈したが、この単量体と対照的に、切断可能二量体（配列番号２または４）で処置した細胞内の標的遺伝子発現の低減は、持続的であり、結果として、１４日後に、配列番号１と比較して低減が増大した。
図６Ａ〜６Ｃは、以下のＡＳＯ、それぞれ配列番号２（図６Ａ）、配列番号３（図６Ｂ）、および配列番号４（図６Ｃ）に関する、肝臓から抽出した試料についての例示的なＬＣ−ＭＳ結果を示す図である。「ＩＳ」は、内部標準を示す。 図６Ａ〜６Ｃは、以下のＡＳＯ、それぞれ配列番号２（図６Ａ）、配列番号３（図６Ｂ）、および配列番号４（図６Ｃ）に関する、肝臓から抽出した試料についての例示的なＬＣ−ＭＳ結果を示す図である。「ＩＳ」は、内部標準を示す。 図６Ａ〜６Ｃは、以下のＡＳＯ、それぞれ配列番号２（図６Ａ）、配列番号３（図６Ｂ）、および配列番号４（図６Ｃ）に関する、肝臓から抽出した試料についての例示的なＬＣ−ＭＳ結果を示す図である。「ＩＳ」は、内部標準を示す。
図７Ａおよび７Ｂは、配列番号２１、すなわちエンドヌクレアーゼ感受性ホスホジエステルリンカーを有するＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢヘテロ二量体ＡＳＯは、両標的ｍＲＮＡ［すなわち、ヒトＡＰＯＣ３（図７Ａ）およびマウスＡｐｏＢ（図７Ｂ）］の肝臓発現を有意に下方制御したことを例示する図である。 図７Ａおよび７Ｂは、配列番号２１、すなわちエンドヌクレアーゼ感受性ホスホジエステルリンカーを有するＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢヘテロ二量体ＡＳＯは、両標的ｍＲＮＡ［すなわち、ヒトＡＰＯＣ３（図７Ａ）およびマウスＡｐｏＢ（図７Ｂ）］の肝臓発現を有意に下方制御したことを例示する図である。
図８Ａおよび８Ｂは、肝臓内のｉｎ ｖｉｖｏ標的ｍＲＮＡに対するこれらの処置の効果を例示する図である。これらの図中のデータを、ｘ軸にマウスａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンをプロットし、ｙ軸にヒトＡｐｏＣ３（すなわち、導入遺伝子）のノックダウンをプロットして、標的ｍＲＮＡの％ノックダウンとしてプロットする。 図８Ａおよび８Ｂは、肝臓内のｉｎ ｖｉｖｏ標的ｍＲＮＡに対するこれらの処置の効果を例示する図である。これらの図中のデータを、ｘ軸にマウスａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンをプロットし、ｙ軸にヒトＡｐｏＣ３（すなわち、導入遺伝子）のノックダウンをプロットして、標的ｍＲＮＡの％ノックダウンとしてプロットする。
図９Ａおよび図９Ｂは、肝臓ホモジネートおよび腎臓ホモジネート中のヘテロ二量体ＡＳＯおよびＡｐｏＢ単量体ＡＳＯを３７℃で、または凍結条件下で一晩インキュベートした後のＡｐｏＢ単量体の濃度の差異を例示する図である。ＢＬＱは、「定量限界の下」である。 図９Ａおよび図９Ｂは、肝臓ホモジネートおよび腎臓ホモジネート中のヘテロ二量体ＡＳＯおよびＡｐｏＢ単量体ＡＳＯを３７℃で、または凍結条件下で一晩インキュベートした後のＡｐｏＢ単量体の濃度の差異を例示する図である。ＢＬＱは、「定量限界の下」である。
図１０は、ヘテロ二量体ＡＳＯおよびＡｐｏＢ単量体ＡＳＯで処置して３日後に血漿中で検出したＡｐｏＢ単量体の濃度の差異を例示する図である。
図１１Ａおよび図１１Ｂは、ヘテロ二量体ＡＳＯおよびＡｐｏＢ単量体ＡＳＯを投与後、３日目および１４日目における、腎臓内のＡｐｏＢ単量体代謝産物の測定濃度を例示する図である。 図１１Ａおよび図１１Ｂは、ヘテロ二量体ＡＳＯおよびＡｐｏＢ単量体ＡＳＯを投与後、３日目および１４日目における、腎臓内のＡｐｏＢ単量体代謝産物の測定濃度を例示する図である。
図１２Ａおよび図１２Ｂは、ヘテロ二量体ＡＳＯおよびＡｐｏＢ単量体ＡＳＯを投与後、３日目および１４日目における、肝臓内のＡｐｏＢ単量体代謝産物の測定濃度を例示する図である。 図１２Ａおよび図１２Ｂは、ヘテロ二量体ＡＳＯおよびＡｐｏＢ単量体ＡＳＯを投与後、３日目および１４日目における、肝臓内のＡｐｏＢ単量体代謝産物の測定濃度を例示する図である。
図１３Ａおよび図１３Ｂは、二量体オリゴヌクレオチドにより、ｍｉＲ−１２２が有意に減少したことを例示する図である（１０ｍｇ／ｋｇの用量、マウス肝臓）。 図１３Ａおよび図１３Ｂは、二量体オリゴヌクレオチドにより、ｍｉＲ−１２２が有意に減少したことを例示する図である（１０ｍｇ／ｋｇの用量、マウス肝臓）。
図１４Ａおよび図１４Ｂは、二量体オリゴヌクレオチドにより、ｍｉＲ−１２２が有意に減少したことを例示する図である（５０ｍｇ／ｋｇの用量、マウス肝臓）。 図１４Ａおよび図１４Ｂは、二量体オリゴヌクレオチドにより、ｍｉＲ−１２２が有意に減少したことを例示する図である（５０ｍｇ／ｋｇの用量、マウス肝臓）。
図１５は、二量体オリゴヌクレオチドは、単量体より約５倍活性であることを例示する図である（ｉｎ ｖｉｖｏ ７日の試験）。
図１６Ａ、図１６Ｂ、および図１６Ｃは、二量体オリゴヌクレオチドにより、Ｍａｌａｔ−１ ｌｎｃＲＮＡ発現がロバストに減少したことを例示する図である。
発明の詳細な説明
別段の記載のない限り、番号記号を伴った図中の数値（＃１、＃５０など）は、表１の通りのそれぞれの配列番号に対応する。
遺伝子の発現および／または機能を制御するのに有用な多量体オリゴヌクレオチド化合物が提供されている。一般に、本明細書に提供される多量体オリゴヌクレオチド化合物は、切断可能リンカーによって一緒に連結された２つ以上のターゲティングオリゴヌクレオチドを含む。多量体オリゴヌクレオチドは、例えば、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、またはｍＲＮＡを含めた広範囲の標的核酸の発現または機能を制御するのに有用である。いくつかの実施形態では、多量体のターゲティングオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｓｉＲＮＡ（例えば、一本鎖ｓｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡスポンジ、または抗マイクロＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＭＯ）である。しかし、他のタイプのターゲティングオリゴヌクレオチドも使用することができる。
Ａ．多量体オリゴヌクレオチドの一般構造
一般式：Ｘ−Ｌ−［Ｘ−Ｌ］ｉ−Ｘを含む多量体オリゴヌクレオチド化合物であって、式中、ｉは、整数であり、その値は、化合物中に存在する［Ｘ−Ｌ］ｉの単位数を示し、各Ｘは、ターゲティングオリゴヌクレオチドであり、各Ｌは、少なくとも２個のＸを連結し、各Ｘより哺乳動物の抽出物中で切断されやすいリンカーである、化合物が提供されている。いくつかの実施形態では、ｉは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上である。
本明細書において、用語「哺乳動物の抽出物」は、哺乳動物の組織、細胞、または細胞内コンパートメント（例えば、エンドソーム）から抽出された試料を指す。一般に、哺乳動物の抽出物は、組織、細胞、または細胞内コンパートメントに由来する１種または複数の生体分子（例えば、酵素）を含む。いくつかの実施形態では、哺乳動物の抽出物は、ヌクレアーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、およびレダクターゼのうちの１種または複数を含む。哺乳動物の抽出物は、例えば、腎臓、肝臓、腸、または腫瘍の組織を含めた任意の組織からの抽出物であり得る。哺乳動物の抽出物は、細胞抽出物であっても、細胞内成分からの抽出物、例えば、核抽出物またはエンドソーム抽出物などであってもよい。
本明細書において、用語「切断」は、２つ以上の相対的に小さい分子を生成する様式で、相対的に大きい分子中の１つまたは１つより多い化学結合を破断することを指す。哺乳動物の抽出物における切断は、例えば、ヌクレアーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、またはレダクターゼによって媒介され得る。いくつかの実施形態では、用語「切断可能な」は、本明細書において、急速分解性リンカー、例えば、ホスホジエステルおよびジスルフィドなどを指し、一方、用語「切断不可能な」は、より安定な連結、例えば、ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート（例えば、以下の実施例で使用されるＳｐおよびＲｐジアステレオ異性体のラセミ混合物、またはＳｐ形態に富む骨格）などを指す。切断可能および切断不可能リンカーの性質は、本明細書でさらに詳細に説明されている。
一例では、本化合物は、以下の一般式を有する：
この式では、ｉは化合物中に存在する［Ｘ−Ｌ］ｉの単位数を示し、ｊおよびｋは、独立して０または１であり、その値はそれぞれ、化合物中に存在するＸｊおよびＸｋの数を示し、ｌおよびｍは、整数であり、その値はそれぞれ、化合物中に存在する［Ｘ−Ｌ］ｌおよび［Ｌ−Ｘ］ｍの単位数を示す。いくつかの実施形態では、ｉは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれ以上である。ある特定の実施形態では、ｌおよびｍは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれ以上である。ある特定の実施形態では、［Ｘ−Ｌ］ｌおよび［Ｌ−Ｘ］ｍのうちの少なくとも１つが化合物中に存在する。いくつかの実施形態では、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、およびｍは、０である。いくつかの実施形態では、ｉは１であり、ｊ、ｋ、ｌ、およびｍは、０である。
一例では、本化合物は、以下の一般式：
Ｘ−Ｌ−［Ｘ−Ｌ］ｉ−Ｘ
を有することができ、式中、ｉは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上である。
別の例では、本化合物は、以下の一般式：
を有することができ、式中、ｉは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上である。
別の例では、本化合物は、以下の一般式：
を有することができ、式中、ｊおよびｋは、独立して０または１であり、その値はそれぞれ、存在するＸｊおよびＸｋの数を示し、ＸｊおよびＸｋのうちの少なくとも１つは、化合物中に存在する。
一般に、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、ゲノム標的配列の一標的領域と相補的な少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含む相補性の領域を有する。ターゲティングオリゴヌクレオチドは、ゲノム標的配列の一標的領域と相補的な４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、または５０個の連続したヌクレオチドを含む相補性の領域を有することができる。いくつかの実施形態では、相補性の領域は、標的領域のヌクレオチド配列と比較して、１つまたは１つより多いミスマッチを有することができることが察されるべきであり、ただし、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、依然として標的領域とハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、相補性の領域は、標的領域のヌクレオチド配列と比較して、ミスマッチをまったく有さない。ターゲティングオリゴヌクレオチドは、ワトソン−クリック塩基対合、フーグスティーン塩基対合、逆フーグスティーン結合、または他の結合機構によって、標的領域とハイブリダイズすることができることも察されるべきである。いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、アプタマー、例えば、細胞内タンパク質または核タンパク質に結合するアプタマーである。
いくつかの多量体オリゴヌクレオチドでは、２つのＸ、すなわち１つのＬによって分離された第１のＸおよび第２のＸについて、第１のＸと相補的な標的領域の５’末端、および第２のＸと相補的な標的領域の３’末端は、第１のＸおよび第２のＸと相補的な標的領域がゲノム標的配列内で重ならないとき、ゲノム標的配列内で０〜１、０〜２、０〜３、０〜４、０〜５、０〜１０、０〜１５、０〜２０、０〜２５、０〜５０のヌクレオチドの距離内にない。場合によっては、異なるＸは、同じ標的と相補性を有し、他の例では、異なる標的と相補性を有する。Ｘが同じ標的と相補性を有する場合、Ｘの核酸配列は、互いに同一であっても、重なっていても、完全に別個であってもよい。
いくつかの実施形態では、多量体オリゴヌクレオチド化合物は、ＡＳＯを含む。本発明は、いくつかの実施形態では、それぞれがヌクレアーゼ耐性修飾骨格を有する、２つ以上の標的特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含み、ターゲティングオリゴヌクレオチドが１つまたは１つより多い分解性リンカーによって互いに連結された、多量体オリゴヌクレオチド化合物を提供する。用語「単量体の」または「単量体」は、ターゲティングオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）との関連で、（ｉ）標的上の単一部位またはヌクレオチドの単一の連続したストレッチに向けられ、（ｉｉ）同じまたは別の標的上の同じまたは別の部位に向けられた別のターゲティングオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結されていないターゲティングオリゴヌクレオチドを指す。多量体オリゴヌクレオチド化合物は、互いに共有結合的に連結されたターゲティングオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）を含有するので、単量体のものでない。
本発明の多量体オリゴヌクレオチド化合物中のターゲティングオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）の数は、２以上、３以上、４以上などであり得る。例えば、多量体オリゴヌクレオチド化合物は、１つまたは１つより多い標的に向けられた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の個々のターゲティングオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）を含有することができる。個々のターゲティングオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）は、同じまたは異なる標的に特異的であり得る。例えば、図１Ａに例示したように、いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、同じ標的に特異的な２つのターゲティングオリゴヌクレオチドを含む二量体、もしくは２つの異なる標的に特異的な２つのターゲティングオリゴヌクレオチドを含む二量体、または代わりに、同じ標的に特異的な３つのターゲティングオリゴヌクレオチドを含む三量体、もしくは３つの異なる標的に特異的な３つのターゲティングオリゴヌクレオチドを含む三量体などである。いくつかの場合では、個々のターゲティングオリゴヌクレオチドは、同じ標的に特異的でありながらも、少なくとも１０、２０、５０、１００、３００、またはそれ以上のヌクレオチドによって分離された標的配列上の２つの部位などの、標的上の別個の標的部位に向けられ得る。いくつかの実施形態では、標的部位は、互いに直接隣り合っており、いずれの介在配列によっても分離されていない場合がある。
図１Ｂに示したように、多量体は、線状もしくは分枝状、またはこれらの組合せであり得る。例えば、２つのＡＳＯは、ヘッドトゥテール（５’−から−３’−線状）（タイプＡ）、またはタイプＢのように、テールトゥテール（３’−から−３’−分枝状）で接続されている場合があり、ＡＳＯは、ヘッドトゥヘッド（５’−から−５’−分枝状）で接続することもできる。同様に、３個以上のアンチセンス分子を接続することができる（図１Ｂ中の例Ｃ、Ｄ、Ｅ）。代替の実施形態では、多量体は、環状核酸の形態であり得る。
Ｂ．ターゲティングオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される多量体オリゴヌクレオチドは、切断可能リンカーによって一緒に連結された２つ以上のターゲティングオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、各ターゲティングオリゴヌクレオチドは、ゲノム標的配列の一標的領域と相補的な領域を有する。いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｓｉＲＮＡ（例えば、一本鎖ｓｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡスポンジ、または抗マイクロＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＭＯ）である。いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、細胞内の標的ＲＮＡに特異的に結合し、ＲＮＡの分解を生じさせる。いくつかの実施形態では、分解は、ＲＮＡｓｅ Ｈによって媒介される。いくつかの実施形態では、分解は、ＲＮＡｉ経路によって媒介される。脈絡から別段に明らかでない限り、本明細書で言及される「ターゲティングオリゴヌクレオチド（ａ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」または「ターゲティングオリゴヌクレオチド（ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、一般に、多量体化合物中に存在するターゲティングオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを意味することが察されるべきである。同様に、脈絡から別段に明らかでない限り、本明細書で言及される「リンカー（ａ ｌｉｎｋｅｒ）」または「リンカー（ｔｈｅ ｌｉｎｋｅｒ）」は、一般に、多量体化合物中に存在するリンカーの少なくとも１つを意味することが察されるべきである。
本明細書において、用語「ゲノム標的配列」は、ゲノム（例えば、哺乳動物ゲノム、例えば、ヒトまたはマウスゲノム）中の臨床的、治療的、または研究的興味のヌクレオチド配列を指す。一般に、ゲノム標的配列は、遺伝子コード領域もしくは遺伝子制御領域を含む、または遺伝子コード領域もしくは遺伝子制御領域内に存在するゲノムの配列である。いくつかの実施形態では、ゲノム標的配列は、遺伝子の少なくとも一部をコードする配列である。遺伝子は、非コードＲＮＡ遺伝子またはタンパク質コード遺伝子とすることができる。非コードＲＮＡ遺伝子は、例えば、長鎖非コードＲＮＡ遺伝子またはｍｉＲＮＡ遺伝子とすることができる。遺伝子の産物は、後成的機構によって遺伝子発現を媒介するＲＮＡまたはタンパク質であり得る。他の実施形態では、ゲノム標的配列は、１つまたは１つより多い遺伝子の制御領域、例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー領域、遺伝子座コントロール領域、およびゲノムの他の機能領域などに位置する配列である。
いくつかの実施形態では、ゲノム標的配列は、遺伝子のセンス鎖中に存在する。センス鎖またはコード鎖は、遺伝子のアンチセンス鎖または鋳型鎖と相補的である、５’から３’に伸びている二本鎖ＤＮＡのセグメントである。センス鎖は、転写中にその鋳型としてアンチセンス鎖をとる遺伝子（例えば、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）から転写されるＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡの鎖である。
ゲノム標的配列の「標的領域」は、ターゲティングオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部位を構成するヌクレオチドの配列である。実際の標的オリゴヌクレオチドは、ゲノム標的自体（例えば、プロモーターエレメント）、またはゲノム標的配列によってコードされ、もしくはゲノム標的配列を含有する核酸（例えば、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｍＲＮＡ）とハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、標的領域は、転写されるＲＮＡ上の部位をコードし、ターゲティングオリゴヌクレオチドがこの部位にハイブリダイズすると、転写されるＲＮＡが不活化または分解される。したがって、いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、ゲノム標的配列によってコードされる転写されるＲＮＡにハイブリダイズし、転写されるＲＮＡの機能を阻害し、かつ／またはその分解をもたらす。ＲＮＡは、例えば、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、またはｍＲＮＡとすることができる。
本明細書に提供される多量体オリゴヌクレオチド化合物は、同じまたは異なるゲノム標的配列とそれぞれ相補的であり、したがって、同じまたは異なる遺伝子を制御することができる２つ以上のターゲティングオリゴヌクレオチドを含み得ることが察されるべきである。いくつかの実施形態では、ゲノム標的配列は、異なる遺伝子のセンス鎖中に存在する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的配列は、同じ遺伝子のセンス鎖中に存在する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドのゲノム標的配列は、ＰＲＣ−２関連領域の配列であり、またはこれを含む。本明細書において、用語「ＰＲＣ２関連領域」は、ＰＲＣ２の成分と直接または間接的に相互作用するヌクレオチドの配列を含み、またはコードする核酸の領域を指す。ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用するＲＮＡ（例えば、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ））中に存在し得る。ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用するＲＮＡをコードするＤＮＡ中に存在し得る。
いくつかの実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＲＮＡを発現する細胞、またはそのＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域のｉｎ ｓｉｔｕ紫外線照射に応答してＰＲＣ２の成分にクロスリンクするＲＮＡの領域である。いくつかの実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２の成分を標的にする抗体、またはそのＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域とともに免疫沈降するＲＮＡの領域である。いくつかの実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＳＵＺ１２、ＥＥＤ、ＥＺＨ２、もしくはＲＢＢＰ４（これらは、上述したようにＰＲＣ２の成分である）に特異的に結合する抗体、またはそのＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域とともに免疫沈降するＲＮＡの領域である。
いくつかの実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２の成分を標的にする抗体を使用するＲＮＡ−免疫沈降アッセイにおいてヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ）から保護されるＲＮＡの領域、またはその保護されるＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。いくつかの実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＳＵＺ１２、ＥＥＤ、ＥＺＨ２、もしくはＲＢＢＰ４を標的にする抗体を使用するＲＮＡ−免疫沈降アッセイにおいてヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ）から保護されるＲＮＡの領域、またはその保護されるＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。
いくつかの実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２の成分を標的にする抗体を使用するＲＮＡ−免疫沈降アッセイの産物のシークエンシング反応において相対的に高頻度の配列読み取りが中で起こるＲＮＡの領域、またはそのＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。いくつかの実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＳＵＺ１２、ＥＥＤ、ＥＺＨ２、もしくはＲＢＢＰ４に特異的に結合する抗体を使用するＲＮＡ−免疫沈降アッセイの産物のシークエンシング反応において相対的に高頻度の配列読み取りが中で起こるＲＮＡの領域、またはその保護されるＲＮＡ領域をコードするゲノムＤＮＡの領域である。このような実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、「ピーク」と呼ばれる場合がある。
いくつかの実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２複合体と相互作用する４０〜６０のヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用するＲＮＡをコードする４０〜６０ヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用する配列（例えば、４０〜６０ヌクレオチドの）を含む長さが最大５ｋｂの配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用することが公知である配列（例えば、４０〜６０ヌクレオチドの）を有する、ＲＮＡが中でコードされる長さが最大５ｋｂの配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用する配列（例えば、４０〜６０ヌクレオチドの）を含む長さが約４ｋｂの配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、ＰＲＣ２と相互作用することが公知である配列（例えば、４０〜６０ヌクレオチドの）を含む、ＲＮＡが中でコードされる長さが約４ｋｂの配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＲＣ２関連領域は、国際特許出願公開第ＷＯ／２０１２／０８７９８３号の配列番号６３２，５６４、１〜９１６，２０９、もしくは９１６，６２６〜９３４，９３１、または国際特許出願公開第ＷＯ／２０１２／０６５１４３号の配列番号１〜１９３，０４９に示された配列を有し、これらの出願公開のそれぞれは、ＰＯＬＹＣＯＭＢ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＮＯＮ−ＣＯＤＩＮＧ ＲＮＡＳという表題であり、これらのそれぞれの内容は、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。
いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、ｌｎｃＲＮＡによる特異的染色体座へのＰＲＣ２の動員を防止することによって、ＰＲＣ２の結合および機能を妨げる。例えば、いくつかの実施形態では、ｌｎｃＲＮＡのＰＲＣ２関連領域に特異的に結合するように設計されたターゲティングオリゴヌクレオチドを含む多量体オリゴヌクレオチド化合物を投与すると、ｌｎｃＲＮＡだけでなく、ｌｎｃＲＮＡに結合するＰＲＣ２も、クロマチンに結合することから安定に追い出すことができる。さらに、ｌｎｃＲＮＡは、ｃｉｓ様式でＰＲＣ２を動員することができ、ｌｎｃＲＮＡが転写された特異的染色体座において、またはその付近で遺伝子発現を抑制する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示の化合物は、ｌｎｃＲＮＡによるｃｉｓ媒介遺伝子抑制を阻害するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のリボヌクレオチド、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチド、および／または少なくとも１個の架橋型ヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、架橋型ヌクレオチド、例えば、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、拘束エチル（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｅｔｈｙｌ）（ｃＥｔ）ヌクレオチド、またはエチレン架橋核酸（ＥＮＡ）ヌクレオチドなどを含むことができる。このようなヌクレオチドの例は、本明細書に開示されており、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、以下の米国特許または特許出願公開、すなわち、ＵＳ７，３９９，８４５、ＵＳ７，７４１，４５７、ＵＳ８，０２２，１９３、ＵＳ７，５６９，６８６、ＵＳ７，３３５，７６５、ＵＳ７，３１４，９２３、ＵＳ７，３３５，７６５、およびＵＳ７，８１６，３３３、ＵＳ２０１１０００９４７１のうちの１つに開示されたヌクレオチド類似体を含み、これらのそれぞれの内容全体は、すべての目的に関して参照により本明細書に組み込まれている。ターゲティングオリゴヌクレオチドは、１つまたは１つより多い２’Ｏ−メチルヌクレオチドを有してもよい。オリゴヌクレオチドは、２’Ｏ−メチルヌクレオチドから完全になる場合がある。
ターゲティングオリゴヌクレオチドは、１つまたは１つより多いヌクレオチド類似体を含有することができる。例えば、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を有することができ、それにより、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を有さないオリゴヌクレオチドと比較して、１℃、２℃、３℃、４℃、または５℃の範囲内でオリゴヌクレオチドのＴｍが上昇する。ターゲティングオリゴヌクレオチドは、複数のヌクレオチド類似体を有することができ、それにより、ヌクレオチド類似体を有さないオリゴヌクレオチドと比較して、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、またはそれ以上の範囲内のオリゴヌクレオチドのＴｍが合計で上昇する。
いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、長さが最大５０ヌクレオチド、または長さが最大１００ヌクレオチドのものとすることができ、この中で、オリゴヌクレオチドのうちの２〜１０、２〜１５、２〜１６、２〜１７、２〜１８、２〜１９、２〜２０、２〜２５、２〜３０、２〜４０、２〜４５、２〜７５、２〜９５、またはそれ以上のヌクレオチドがヌクレオチド類似体である。オリゴヌクレオチドは、長さが８〜３０ヌクレオチドのものとすることができ、この中で、オリゴヌクレオチドのうちの２〜１０、２〜１５、２〜１６、２〜１７、２〜１８、２〜１９、２〜２０、２〜２５、２〜３０ヌクレオチドがヌクレオチド類似体である。オリゴヌクレオチドは、長さが８〜１５ヌクレオチドのものとすることができ、この中で、オリゴヌクレオチドのうちの２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、２〜１１、２〜１２、２〜１３、２〜１４ヌクレオチドがヌクレオチド類似体である。任意選択により、オリゴヌクレオチドは、修飾された１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドを除くあらゆるヌクレオチドを有することができる。
ターゲティングオリゴヌクレオチドは、架橋型ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）から完全になる場合がある。オリゴヌクレオチドは、交互するデオキシリボヌクレオチドおよび２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、交互するデオキシリボヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、交互するデオキシリボヌクレオチドおよびＥＮＡヌクレオチド類似体を含み得る。オリゴヌクレオチドは、交互するデオキシリボヌクレオチドおよびＬＮＡヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、交互するＬＮＡヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、架橋型ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）である５’ヌクレオチドを有することができる。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである５’ヌクレオチドを有することができる。
ターゲティングオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’末端および３’末端のそれぞれに、少なくとも１個の架橋型ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）が隣接したデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’末端および３’末端のそれぞれに、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上の架橋型ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）が隣接したデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。オリゴヌクレオチドの３’位は、３’ヒドロキシル基を有する場合がある。オリゴヌクレオチドの３’位は、３’チオホスフェートを有する場合がある。
ターゲティングオリゴヌクレオチドは、標識とコンジュゲートすることができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、その５’末端または３’末端で、ビオチン部分、コレステロール、ビタミンＡ、フォレート、シグマ受容体リガンド、アプタマー、ＣＰＰなどのペプチド、脂質などの疎水性分子、ＡＳＧＰＲまたは動的ポリコンジュゲート（ｄｙｎａｍｉｃ ｐｏｌｙｃｏｎｊｕｇａｔｅ）およびこれらのバリアントとコンジュゲートすることができる。
ターゲティングオリゴヌクレオチドは、修飾糖部分、および／もしくは修飾ヌクレオシド間連結、および／もしくは修飾ヌクレオチド、ならびに／またはこれらの組合せを含む１つまたは１つより多い修飾を含むことができる。所与のオリゴヌクレオチド中のすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際に、本明細書に記載の修飾の１つを超える修飾を、単一オリゴヌクレオチド内に、またはさらにはオリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシド内に組み込むことができる。
いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、それぞれが少なくとも１個のヌクレオチドから構成される２つ以上の化学的に別個の領域を含有するキメラオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは一般に、１つまたは１つより多い有益な性質（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増大、細胞内への取込みの増大、標的に対する結合親和性の増大など）を付与する修飾ヌクレオチドの少なくとも１つの領域、およびＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質である領域を含有する。本発明のキメラターゲティングオリゴヌクレオチドは、２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および／または上述したオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造体として形成することができる。このような化合物は、ハイブリッドまたはギャップマーとも当技術分野で呼ばれている。このようなハイブリッド構造体の調製を教示する代表的な米国特許は、それだけに限らないが、米国特許第５，０１３，８３０号、同第５，１４９，７９７号、同第５，２２０，００７号、同第５，２５６，７７５号、同第５，３６６，８７８号、同第５，４０３，７１１号、同第５，４９１，１３３号、同第５，５６５，３５０号、同第５，６２３，０６５号、同第５，６５２，３５５号、同第５，６５２，３５６号、および同第５，７００，９２２号を含み、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれている。
いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、糖の２’位で修飾された少なくとも１個のヌクレオチド、最も好ましくは２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、または２’−フルオロ−修飾ヌクレオチドを含む。他の好適な実施形態では、ＲＮＡ修飾は、ＲＮＡの３’末端におけるピリミジン、脱塩基残基、または反転塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｂａｓｅ）上の２’−フルオロ、２’−アミノ、および２’Ｏ−メチル修飾がある。このような修飾は、オリゴヌクレオチド内に日常的に組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して、２’−デオキシオリゴヌクレオチドより高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合親和性）を有することが示されている。
いくつかのヌクレオチド修飾およびヌクレオシド修飾は、これらが組み込まれているオリゴヌクレオチドを、天然オリゴデオキシヌクレオチドよりヌクレアーゼ消化に対してより耐性にすることが示されており、これらの修飾オリゴ体（ｏｌｉｇｏ）は、いくつかの実験的または治療的状況において、無修飾オリゴヌクレオチドより長い時間にわたってインタクトで残存する。修飾オリゴヌクレオチドの具体例としては、修飾骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環糖間連結を含むものがある。ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド、ならびにヘテロ原子骨格、特に、ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ，〜Ｎ（ＣＨ３）〜Ｏ〜ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格、ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２およびＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２骨格としても公知、ここで、天然ホスホジエステル骨格は、Ｏ−Ｐ−−Ｏ−ＣＨ，として表される）；アミド骨格（Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ａｃｅ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．、１９９５年、２８巻：３６６〜３７４頁を参照）；モルホリノ骨格構造（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ、米国特許第５，０３４，５０６号を参照）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（ここで、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格は、ポリアミド骨格で置き換えられており、ヌクレオチドは、ポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接または間接的に結合している。Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年、２５４巻、１４９７頁を参照）を有するものが最も好適である。リン含有連結としては、それだけに限らないが、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに正常な３’−５’連結を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’連結類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣り合う対が３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’に連結されている逆極性を有するものがある。米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、および同第５，６２５，０５０号を参照。
モルホリノ系オリゴマー化合物は、Ｄｗａｉｎｅ Ａ． ＢｒａａｓｃｈおよびＤａｖｉｄ Ｒ． Ｃｏｒｅｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２年、４１巻（１４号）、４５０３〜４５１０頁；Ｇｅｎｅｓｉｓ、３０巻、３号、２００１年；Ｈｅａｓｍａｎ， Ｊ．、Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．、２００２年、２４３巻、２０９〜２１４頁；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ、２０００年、２６巻、２１６〜２２０頁；Ｌａｃｅｒｒａら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、２０００年、９７巻、９５９１〜９５９６頁；および１９９１年７月２３日に公布された米国特許第５，０３４，５０６号に記載されている。いくつかの実施形態では、モルホリノ系オリゴマー化合物は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）（例えば、Ｉｖｅｒｓｏｎ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．、３巻：２３５〜２３８頁、２００１年；およびＷａｎｇら、Ｊ． Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．、１２巻：３５４〜３６４頁、２０１０年に記載されている；これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）である。
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣体は、Ｗａｎｇら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、２０００年、１２２巻、８５９５〜８６０２頁に記載されている。
中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結の混合、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２成分部分を有するその他を有するものを含む。米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、および同第５，６７７，４３９号を参照。これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれている。
アラビノヌクレオチドまたは修飾アラビノヌクレオチド残基に基づく、またはこれらから構築されたオリゴヌクレオチドを含む修飾オリゴヌクレオチドも公知である。アラビノヌクレオシドは、糖環の２’位における立体配置のみが異なる、リボヌクレオシドの立体異性体である。いくつかの実施形態では、２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆアラビノである。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２’−フルオロ−Ｄ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）（例えば、Ｌｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４１巻：３４５７〜３４６７頁、２００２年、およびＭｉｎら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．、１２巻：２６５１〜２６５４頁、２００２年に記載されている；これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）である。同様の修飾は、糖上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオシド上または２’−５’連結オリゴヌクレオチド中の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位でも行うことができる。
ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／６７３７８号には、相補的なメッセンジャーＲＮＡへの会合を介して遺伝子発現の配列特異的阻害を改善するための、アラビノ核酸（ＡＮＡ）オリゴマーおよびこれらの類似体が開示されている。
他の好適な修飾には、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）が含まれる（例えば、国際特許公開第ＷＯ２００５／０４２７７７号、Ｍｏｒｉｔａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， Ｓｕｐｐｌ、１巻：２４１〜２４２頁、２００１年；Ｓｕｒｏｎｏら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１５巻：７４９〜７５７頁、２００４年；Ｋｏｉｚｕｍｉ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．、８巻：１４４〜１４９頁、２００６年、およびＨｏｒｉｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ （Ｏｘｆ）、４９巻：１７１〜１７２頁、２００５年；これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。好適なＥＮＡとしては、それだけに限らないが、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸がある。
ＬＮＡの例は、ＷＯ／２００８／０４３７５３号に記載されており、これらには、以下の一般式の化合物が含まれる。
式中、ＸおよびＹは、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−または−ＣＨ−（二重結合の一部である場合）、−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−または−ＣＨ２−ＣＨ−（二重結合の一部である場合）、−ＣＨ＝ＣＨ−の群の中で選択され、Ｒは、水素およびＣ１〜４−アルキルから選択され；ＺおよびＺ＊は、独立して、ヌクレオシド間連結、末端基、または保護基の中で選択され；Ｂは、天然または非天然ヌクレオチド塩基部分を構成し；不斉基がいずれかの配向において見出される場合がある。
好ましくは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド中に使用されるＬＮＡは、式
のいずれかに従う少なくとも１個のＬＮＡ単位を含み、式中、Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、またはＮ（ＲＨ）であり；ＺおよびＺ＊は、独立して、ヌクレオシド間連結、末端基、または保護基の中で選択され；Ｂは、天然または非天然ヌクレオチド塩基部分を構成し、ＲＨは、水素およびＣ１〜４−アルキルから選択される。
好ましくは、少なくとも１個のヌクレオチドを含む本明細書に記載のオリゴヌクレオチド中に使用されるロックされた核酸（ＬＮＡ）は、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２のスキーム２に示された式のいずれかに従うロックされた核酸（ＬＮＡ）単位を含む。
好ましくは、本発明のオリゴマー中に使用されるＬＮＡは、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（ＲＨ）−Ｏ−、Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−から選択されるヌクレオシド間連結を含み、式中、ＲＨは、水素およびＣ１〜４−アルキルから選択される。
特に好適なＬＮＡ単位をスキーム２に示す：
用語「チオ−ＬＮＡ」は、上記一般式中のＸまたはＹの少なくとも１つがＳまたは−ＣＨ２−Ｓ−から選択される、ロックされたヌクレオチドを含む。チオ−ＬＮＡは、β−Ｄおよびα−Ｌ立体配置の両方にあり得る。
用語「アミノ−ＬＮＡ」は、上記一般式中のＸまたはＹの少なくとも１つが−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、および−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−から選択され、式中、Ｒは、水素およびＣ１〜４−アルキルから選択される、ロックされたヌクレオチドを含む。アミノ−ＬＮＡは、β−Ｄおよびα−Ｌ立体配置の両方にあり得る。
用語「オキシ−ＬＮＡ」は、上記一般式中のＸまたはＹの少なくとも１つが−Ｏ−または−ＣＨ２−Ｏ−を表す、ロックされたヌクレオチドを含む。オキシ−ＬＮＡは、β−Ｄおよびα−Ｌ立体配置の両方にあり得る。
用語「エナ−ＬＮＡ」は、上記一般式中のＹが−ＣＨ２−Ｏ−である（この場合、−ＣＨ２−Ｏ−の酸素原子は、塩基Ｂに対して２’位に付着している）、ロックされたヌクレオチドを含む。
ＬＮＡは、本明細書でさらに詳細に記載されている。
１つまたは１つより多い置換された糖部分、例えば、以下のうちの１つも２’位に含められ得る：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、もしくはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（式中、ｎは、１〜約１０である）；Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリール、もしくはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基、および同様の性質を有する他の置換基。好適な修飾としては、２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても公知］（Ｍａｒｔｉｎら、ＨｅＩｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ、１９９５年、７８巻、４８６頁）がある。他の好適な修飾としては、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）がある。オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位にも同様の修飾を行うことができる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖模倣体も有することができる。
ターゲティングオリゴヌクレオチドは、さらに、または代わりに、核酸塩基（単に「塩基」と当技術分野で呼ばれることが多い）修飾または置換も含むことができる。本明細書において、「無修飾」または「天然」核酸塩基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基としては、天然核酸中に稀に、または一過性にのみ見つかる核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に、５−メチルシトシン（５−メチル−２’デオキシシトシンとも呼ばれ、５−Ｍｅ−Ｃと当技術分野で呼ばれることが多い）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ、およびゲントビオシルＨＭＣ、イソシトシン、プソイドイソシトシン、ならびに合成核酸塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ（ａｍｉｎｏａｌｋｌｙａｍｉｎｏ））アデニン、または他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−プロピニルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２−クロロ−６−アミノプリン、および２，６−ジアミノプリン、または他のジアミノプリンがある。例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ、「ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９８０年、７５〜７７頁；およびＧｅｂｅｙｅｈｕ， Ｇ．ら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５巻：４５１３頁（１９８７年））を参照。当技術分野で公知の「ユニバーサル」塩基、例えば、イノシンも含めることができる。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、核酸デュプレックス安定性を０．６〜１．２℃増大させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ、ｉｎ ＣｒｏｏｋｅおよびＬｅｂｌｅｕ編、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、１９９３年、２７６〜２７８頁）、塩基置換として使用することができる。１つまたは１つより多い修飾塩基がターゲティングオリゴヌクレオチドの相補性の領域中に存在し得ることが、察されるべきである。
所与のオリゴヌクレオチド中のすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際に、本明細書に記載の修飾の１つを超える修飾を、単一オリゴヌクレオチド内に、またはさらにはオリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシド内に組み込むことができる。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間連結の両方、すなわち、骨格が、新規の基で置き換えられている。基本単位は、適切な核酸標的化合物とハイブリダイズするのに維持されている。１つのこのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、例えば、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられている。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、それだけに限らないが、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、および同第５，７１９，２６２号があり、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれている。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年、２５４巻、１４９７〜１５００頁に見つけることができる。
さらに、核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、「Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０年に開示されているもの；Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｌｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１年、３０巻、６１３頁によって開示されているもの、およびＳａｎｇｈｖｉ、１５章、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、２８９〜３０２頁、ＣｒｏｏｋｅおよびＬｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３年によって開示されているものを含む。これらの核酸塩基のある特定のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらとしては、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンがある。５−メチルシトシン置換は、核酸デュプレックス安定性を０．６〜１．２℃（＜０＞Ｃ）増大させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉら編、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、１９９３年、２７６〜２７８頁）、現在好適な塩基置換であり、さらにより具体的には、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされる場合、好適な塩基置換である。修飾核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号、および同第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，７５０，６９２号、および同第５，６８１，９４１号に記載されており、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれている。
いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取込みを増強する１つまたは１つより多い部分またはコンジュゲートに化学的に連結されている。例えば、同じまたは異なるタイプの１つまたは１つより多いターゲティングオリゴヌクレオチドを、細胞型または組織型に対する特異性が増強されたターゲティング部分にコンジュゲートすることができる。このような部分としては、それだけに限らないが、コレステロール部分などの脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１９８９年、８６巻、６５５３〜６５５６頁）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．、１９９４年、４巻、１０５３〜１０６０頁）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、１９９２年、６６０巻、３０６〜３０９頁；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．、１９９３年、３巻、２７６５〜２７７０頁）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９２年、２０巻、５３３〜５３８頁）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９０年、２５９巻、３２７〜３３０頁；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９３年、７５巻、４９〜５４頁）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール、またはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５年、３６巻、３６５１〜３６５４頁；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９０年、１８巻、３７７７〜３７８３頁）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｃｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５年、１４巻、９６９〜９７３頁）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５年、３６巻、３６５１〜３６５４頁）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１９９５年、１２６４巻、２２９〜２３７頁）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール（ｔ ｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．、１９９６年、２７７巻、９２３〜９３７頁）がある。米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１、５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３、５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号も参照。これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれている。
これらの部分またはコンジュゲートは、１級または２級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合的に結合したコンジュゲート基を含むことができる。本発明のコンジュゲート基としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的性質を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態学的性質を増強する基がある。一般的なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素がある。薬力学的性質を増強する基には、本発明との関連で、取込みを改善し、分解に対する耐性を増強し、かつ／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が含まれる。薬物動態学的性質を増強する基には、本発明との関連で、本発明の化合物の取込み、分布、代謝、または排出を改善する基が含まれる。代表的なコンジュゲート基は、１９９２年１０月２３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号、および米国特許第６，２８７，８６０号に開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれている。コンジュゲート部分としては、それだけに限らないが、コレステロール部分などの脂肪部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミン、またはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分がある。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７、５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１、５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３、５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号を参照。
いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチド修飾は、オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端の修飾を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの３’末端は、ヒドロキシル基またはチオホスフェートを含む。追加の分子（例えば、ビオチン部分またはフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒ））を、ターゲティングオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端にコンジュゲートすることができることが察されるべきである。いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、５’ヌクレオチドにコンジュゲートされたビオチン部分を含む。
いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、ＥＮＡ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、または２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、交互するデオキシリボヌクレオチドおよび２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、交互するデオキシリボヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、交互するデオキシリボヌクレオチドおよびＥＮＡ修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、交互するデオキシリボヌクレオチドおよびロックされた核酸ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、交互するロックされた核酸ヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、ロックされた核酸ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’末端および３’末端のそれぞれに少なくとも１個のロックされた核酸ヌクレオチドが隣接したデオキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの３’位のヌクレオチドは、３’ヒドロキシル基または３’チオホスフェートを有する。
いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、すべてのヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。
ターゲティングオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の修飾の任意の組合せを有することができることが察されるべきである。
オリゴヌクレオチドベースのリンカーも、本明細書に開示の修飾のいずれも含むことができることも察されるべきである。
Ｃ．アンチセンスベースのターゲティングオリゴヌクレオチド
例示的な実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有するロックされた核酸３−８−３ギャップマーを含有するターゲティングオリゴヌクレオチドである。しかし、一般に、オリゴヌクレオチドの化学的性質は、ＬＮＡ（例えば、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９８／３９３５２号に記載の２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−架橋化核酸）、ＬＮＡギャップマー、またはホスホロチオエート骨格に限定されず、単量体ＡＳＯを使用する標的ノックダウンが有効である任意の化学的性質と連携することが期待され得る。このような化学的性質としては、例えば、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ；欧州特許第ＥＰ１１５２００９号）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ；ＷＯ９３／２５５６５およびＷＯ９７／３００６４）、フルオロ−ＨＮＡ、２’−デオキシ−２’−フルオロ−１３−Ｄ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ；ＥＰ１０８８０６６）、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）および２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（ＭＯＥ）修飾核酸などの２’修飾類似体、ＣｅＮＡ（ＥＰ１２１０３４７およびＥＰ１２４４６６７）、ならびにホスホロアミデートなどのホスフェート修飾類似体、モルホリノ、Ｇ−クランプ（ＷＯ９９／２４４５２）などの塩基修飾類似体、ならびに５−アルキニル−ピリミジンがある。ＬＮＡの他のギャップマーの例は、ＷＯ０１／２５２４８、ＷＯ０１／４８１９０、ＷＯ２００３／０８５１１０、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ２００８／１１３８３２、ＷＯ２００５／０２３８２５、およびＷＯ２００７／１４６５１として公開されたＰＣＴ特許出願に記載されており、ＦＡＮＡ／ＤＮＡ／ＦＡＮＡギャップマーの例は、ＥＰ１３１５８０７に記載されており、２’−ＯＭｅ／ＦＡＮＡ／２’−ＯＭｅギャップマーの例は、米国特許第６，６７３，６１１号に記載されている。
骨格は、他の修飾、例えば、メチルホスホネート、または他の化学的性質によって安定化することができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ Ｈ機構を介して働くことができるが、立体的遮断のみによっても働くことができ、これは、転写レベルでの遺伝子サイレンシングおよび転写遺伝子活性化も含む（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓら、２００９年、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３７巻（９号）：２９８４〜２９９５頁、およびＳｃｈｗａｒｔｚら、２００８年、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１５巻：８４２〜８４８頁を参照）。二量体／多量体手法は、親油性化、細胞表面受容体またはリガンド（例えば、フォレート）へのコンジュゲート、アプタマーなどを含めた、細胞内への送達を増大させる任意の修飾と組み合わせることもできる。例えば、ＲＮＡｓｅ Ｈ機構を活用するために、ＤＮＡ：ｍＲＮＡまたはギャップマー：ＲＮＡデュプレックスが、ＲＮＡｓｅを基質に結合させるのに形成される必要がある。しかし、立体的遮断の場合では、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＰＮＡ、またはＲＮＡ：ＬＮＡデュプレックス（ＤＮＡギャップを含まない）を使用することができる。したがって、ＡＳＯの化学的性質は、目的の用途に基づいて調整することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドに適した任意の化学的性質が本発明の二量体／多量体手法に適用可能であるはずである（最先端の化学的性質については、例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ ａｎｄ Ｓｗａｉｚｅ、２００９年、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．、５０巻：２５９〜２９３頁；Ｙｏｋｏｔａら、２０１０年、Ａｒｃｈ． Ｎｅｕｒｏｌ．、６６巻：３２〜３８頁；Ａｂｏｕｌ−Ｆａｄｌ、２００５年、Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、１２巻：２１９３〜２２１４頁；Ｋｕｒｒｅｃｋ、２００３年、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０巻：１６２８〜１６４４頁を参照）。
いくつかの例示的な実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、長さ１４ヌクレオチドであるが、一般に、より長いまたはより短い場合がある。例えば、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、長さ８〜５０ヌクレオチド、または長さ１０〜４０、１０〜２５、８〜２０、１０〜２５、１２〜２５、１２〜２０、１２〜１６、１２〜１５、１２〜１４、１２〜１３、１３〜１６、１３〜１５、もしくは１３〜１４ヌクレオチドとすることができる。いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、８以下という少ないヌクレオチドを含有するいわゆる微小ＬＮＡである（例えば、Ｏｂａｄら、（２０１１年）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、４３巻：３７１頁を参照）。
さらに、いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）は、標的配列と相補的な少なくとも７個の連続したヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）は、標的配列と相補的な少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、または４０個の連続したヌクレオチドを含む。特異性、およびアイソフォームの変異に起因して、ＡＳＯは、この連続した配列内に、またはこれらに隣接して１、２、３個、またはそれ以上の非相補的ヌクレオチドをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチドの少なくとも１つまたはすべてがギャップマーである。他の実施形態では、ターゲティングオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）は、Ｘ−Ｎ−Ｙギャップマーであり、式中、ＸまたはＹは、０、１、２、３、４、５個、またはそれ以上の修飾ヌクレオチド、例えば、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＦＡＮＡ、Ｇ−クランプを含有し、Ｎは、非修飾糖を有する３、４、５、６、７、８、９、または１０個のデオキシヌクレオチドである。例えば、ＡＳＯは、３−８−３、２−１０−２、３−９−２、２−９−３、２−８−２、３−７−２、２−７−３ギャップマーもしくは別のタイプのギャップマー、またはミックスマーであり得る。
Ｄ．リンカー
用語「リンカー」は一般に、２つ以上のターゲティングオリゴヌクレオチドを共有結合的に連結することができる化学部分であって、リンカー内に含まれる少なくとも１個の結合は、切断され得（例えば、生物学的状況において、例えば、エンドソーム抽出物などの哺乳動物の抽出物などの中で）、その結果、少なくとも２つのターゲティングオリゴヌクレオチドは、結合が切断された後、もはや互いに共有結合的に連結されていない化学部分を指す。提供されるリンカーは、切断可能である少なくとも１個の結合も含む限り、切断不可能である領域を含むことができることが察されるであろう。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ターゲティングオリゴヌクレオチドより、哺乳動物の抽出物中でエンドペプチダーゼによって切断されやすいポリペプチドを含む。エンドペプチダーゼは、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、サーモリシン、ペプシン、またはエンドペプチダーゼＶ８とすることができる。エンドペプチダーゼは、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＬ、カテプシンＣ、パパイン、カテプシンＳ、またはエンドソーム酸性インスリナーゼとすることができる。例えば、リンカーは、ＡＬＡＬ（配列番号１２５）、ＡＰＩＳＦＦＥＬＧ（配列番号１２６）、ＦＬ、ＧＦＮ、Ｒ／ＫＸＸ、ＧＲＷＨＴＶＧＬＲＷＥ（配列番号１２７）、ＹＬ、ＧＦ、およびＦＦから選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含み、式中、Ｘは、任意のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、リンカーは、式−（ＣＨ２）ｎＳ−Ｓ（ＣＨ２）ｍ−を含み、式中、ｎおよびｍは、独立して、０〜１０の整数である。
例えば、多量体オリゴヌクレオチドのリンカーは、ターゲティングオリゴヌクレオチドより、哺乳動物の抽出物中でエンドヌクレアーゼによって切断されやすいオリゴヌクレオチドを含むことができる。リンカーは、１〜１０個のチミジンまたはウリジンを含むヌクレオチド配列を有し得る。リンカーは、ホスホジエステルヌクレオチド間連結によって連結されたデオキシリボヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有し得る。リンカーは、ホスホジエステルヌクレオチド間連結によって連結された１〜１０個のチミジンを含むヌクレオチド配列を有し得る。リンカーは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結によって連結された１〜１０個のウリジンを含むヌクレオチド配列を有し得る。リンカーは、式：
を有することができ、式中、Ｚは、オリゴヌクレオチドである。Ｚは、１〜１０個のチミジンまたはウリジンを含むヌクレオチド配列を有し得る。
いくつかの実施形態では、リンカーは、自己相補性ヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、リンカーは、２つの隣接する標的領域と連続したゲノム標的配列の一領域と相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、リンカーは、自己相補性ヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含まず、特定のリンカーの２つの隣接する標的領域と連続したゲノム標的配列の一領域と相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＬは、脱塩基部位を有するオリゴヌクレオチドを含まないリンカーである。
他の実施形態では、それぞれがリンカーによって１つまたは２つの他のターゲティングオリゴヌクレオチドに連結された、少なくとも２つのターゲティングオリゴヌクレオチドを含む多量体オリゴヌクレオチド化合物が提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のリンカーは、少なくとも２つのターゲティングオリゴヌクレオチドより、哺乳動物の抽出物の存在下で酵素的切断に２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、またはそれ以上感受性である。２個以上のリンカーを含む化合物中で、異なる速度で、かつ／または異なる酵素によって切断されるように、異なるリンカーを設計することができることが察されるべきである。同様に、２個以上のリンカーを含む化合物中で、異なる組織、細胞、または細胞内コンパートメント中で切断に感受性であるように、異なるリンカーを設計することができる。それにより有利には、化合物が、異なる速度で、異なる酵素によって、または異なる組織、細胞、もしくは細胞内コンパートメント内で化合物から放出されるターゲティングオリゴヌクレオチドを有することが可能になり、それによって、投与後に、所望のｉｎ ｖｉｖｏ位置または所望の時間に単量体オリゴヌクレオチドの放出をコントロールすることができる。
いくつかの実施形態では、本発明は、ヌクレアーゼ耐性骨格（例えば、ホスホロチオエート）を有するターゲティングオリゴヌクレオチドを含むＡＳＯ多量体であって、ターゲティングオリゴヌクレオチドは、１つまたは１つより多い切断可能リンカーによって互いに連結されているＡＳＯ多量体も提供する。
ある特定の実施形態では、リンカーは、エキソヌクレアーゼにより富む血漿、血液、または血清中で安定であり、相対的にエンドヌクレアーゼに富む細胞内環境内でより不安定である。リンカーの細胞内安定性は、実施例に記載したようにｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで評価することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカーの半減期が、肝臓ホモジネート中などのここで記載される条件下で、少なくとも２４、もしくは２８、３２、３６、４８、７２、９６時間またはそれ以上である場合、「切断不可能」と見なされる。反対に、いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカーの半減期がせいぜい１０、もしくは８、６、５時間、またはそれ以下である場合、「切断可能」と見なされる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ヌクレアーゼ切断可能なオリゴヌクレオチドリンカーである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ切断可能リンカーは、オリゴヌクレオチド骨格中に１つまたは１つより多いホスホジエステル結合を含有する。例えば、リンカーは、単一のホスホジエステル架橋、または例えば、１〜１０個のデオキシヌクレオチド、例えば、ｄＴ、もしくはリボヌクレオチド、例えば、ＲＮＡリンカーの場合ではｒＵのストリングとして、２、３、４、５、６、７、もしくはそれ以上のホスホジエステル連結を含有することができる。リンカー中のｄＴまたは他のＤＮＡヌクレオチドｄＮの場合では、ある特定の実施形態では、切断可能リンカーは、１つまたは１つより多いホスホジエステル連結を含有する。他の実施形態では、ｒＵまたは他のＲＮＡヌクレオチドｒＮの場合では、切断可能リンカーは、ホスホロチオエート連結のみからなり得る。ヌクレアーゼによってのみ徐々に切断される（したがって「切断不可能」と呼ばれる）ホスホロチオエート連結デオキシヌクレオチドと対照的に、ホスホロチオエート連結ｒＵは、リボヌクレアーゼによって相対的に急速な切断を起こし、したがって本明細書で切断可能であると見なされる。リンカー領域内にｄＮおよびｒＮを組み合わせることも可能であり、これらは、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート連結によって接続される。他の実施形態では、リンカーは、ヌクレアーゼによって依然として切断可能である化学修飾されたヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−修飾類似体なども含有することができる。特に、２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロヌクレオチドは、互いに、またはｄＮもしくはｒＮヌクレオチドと組み合わせることができる。一般に、ヌクレオチドリンカーの場合では、リンカーは、通常、標的と相補的でないが、相補的である場合がある多量体の一部である。それは、リンカーは一般に、標的上でターゲティングオリゴヌクレオチドが作用する前に切断され、したがって、標的に対するリンカーの素性は、重要度が低いためである。したがって、いくつかの実施形態では、リンカーは、ターゲティングオリゴヌクレオチドが設計される標的のいずれとも相補的でない（オリゴ）ヌクレオチドリンカーである。
いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、意図的に導入されたＲｐホスホロチオエート立体異性体の連続ストレッチ（例えば、４、５、６、７、またはそれ以上のストレッチ）を含有するオリゴヌクレオチドリンカーである。Ｒｐステレオアイソフォーム（ｓｔｅｒｅｏｉｓｏｆｏｒｍ）は、Ｓｐアイソフォームと異なり、ヌクレアーゼ切断されやすいことが公知である（Ｋｒｉｅｇら、２００３年、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１３巻：４９１〜４９９頁）。混合された連結は、相対的に安定であり、Ｒｐ立体異性体の長いストレッチをおそらく含有せず、したがって、本明細書で「切断不可能」と見なされるので、このようなリンカーは、オリゴヌクレオチドを連結するＰＳのラセミミックスを含まないはずである。したがって、いくつかの実施形態では、リンカーは、４、５、６、７、またはそれ以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドのストレッチを含み、ここでストレッチは、相当量のＳｐステレオアイソフォームを含有せず、またはＳｐステレオアイソフォームのいずれも含有しない。量は、１モル当たりに基づいて１０％を超える場合、相当であると見なすことができる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、非ヌクレオチドリンカー、例えば、単一ホスホジエステル架橋である。このような切断可能リンカーの別の例は、ジスルフィド結合、例えば、−（ＣＨ２）ｎＳ−Ｓ（ＣＨ２）ｍ−を含む化学基であり、式中、ｎおよびｍは、０〜１０の整数である。例示的な実施形態では、ｎ＝ｍ＝６である。非ヌクレオチドリンカーの追加の例を以下に記載する。
切断可能リンカーは、他の線状または分枝状多量体中に存在し得る。例えば、いくつかの分枝状の実施形態では、切断可能リンカーは、例えば、図１Ｃおよび図１Ｄ、ならびに式ＩＶ、Ｖ、およびＶＩＩＩに例示したように、ホスホジエステル連結ヌクレオチドを連結する複数の「アーム」を有する「ダブラー」、「トレブラー」、または別の分枝化学基を含む。いくつかの線状の実施形態では、切断可能リンカーは、式ＩおよびＩＩに示したように組み込むことができる。
リンカーは、化学的または酵素的切断反応を起こすように設計することができる。化学反応は、例えば、酸性環境中の切断（例えば、エンドソーム）、還元切断（例えば、サイトゾルでの切断（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ））、または酸化切断（例えば、肝ミクロソーム中）を伴う。切断反応は、転位反応によって開始することもできる。酵素反応として、ヌクレアーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、レダクターゼなどによって媒介される反応を挙げることができる。例えば、リンカーは、ｐＨ感受性、カテプシン感受性とすることができ、またはエンドソームおよび／もしくはサイトゾル内で主に切断され得る。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、エンドペプチダーゼによって切断可能な配列を含むペプチドを含む。切断可能ペプチド配列に加えて、リンカーは、追加のアミノ酸残基および／またはアルキル鎖などの非ペプチド化学部分を含む場合がある。ある特定の実施形態では、リンカーは、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号：１２５）を含み、これは、カテプシンＢの基質である。例えば、Ｓｃｈｍｉｄら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ、２００７年、１８巻、７０２〜７１６頁に記載のマレイミドカプロイル−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号：１３６）リンカーを参照。ある特定の実施形態では、カテプシンＢ−切断可能リンカーは、腫瘍細胞内で切断される。ある特定の実施形態では、リンカーは、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号：１２６）を含み、これは、カテプシンＤ、Ｌ、およびＢの基質である（例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ、２００６年、７巻、１４２８〜１４３４頁を参照）。ある特定の実施形態では、カテプシン−切断可能リンカーは、ＨｅＬＡ細胞内で切断される。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｐｈｅ−Ｌｙｓを含み、これは、カテプシンＢの基質である。例えば、ある特定の実施形態では、リンカーは、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）を含む。例えば、Ｗａｌｋｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．、２００２年、１２巻、２１７〜２１９頁に記載のマレイミドカプロイル−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＡリンカーを参照。ある特定の実施形態では、リンカーは、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−２−ナフチルアミドを含み、これは、カテプシンＣの基質である（例えば、Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、１９９４年、３００巻、２２９〜２３５頁を参照）。ある特定の実施形態では、カテプシンＣ−切断可能リンカーは、肝実質細胞内で切断される。いくつかの実施形態では、リンカーは、カテプシンＳ切断部位を含む。例えば、いくつかの実施形態では、リンカーは、例えば、Ｌｕｔｚｎｅｒら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２００８年、２８３巻、３６１８５〜３６１９４頁に記載のＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ（配列番号：１２７）、Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ（配列番号：１３７）、またはＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ（配列番号：１３８）を含む。ある特定の実施形態では、カテプシンＳ−切断可能リンカーは、抗原提示細胞内で切断される。いくつかの実施形態では、リンカーは、パパイン切断部位を含む。パパインは一般に、配列−Ｒ／Ｋ−Ｘ−Ｘを有するペプチドを切断する（Ｃｈａｐｍａｎら、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ、１９９７年、５９巻、６３〜８８頁を参照）。ある特定の実施形態では、パパイン−切断可能リンカーは、エンドソーム内で切断される。いくつかの実施形態では、リンカーは、エンドソーム酸性インスリナーゼ切断部位を含む。例えば、いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｔｙｒ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、またはＰｈｅ−Ｐｈｅ（例えば、Ａｕｔｈｉｅｒら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９６年、３８９巻、５５〜６０頁を参照）。ある特定の実施形態では、エンドソーム酸性インスリナーゼ−切断可能リンカーは、肝細胞内で切断される。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ｐＨ感受性である。ある特定の実施形態では、リンカーは、低ｐＨ不安定結合を含む。本明細書において、低ｐＨ不安定結合は、酸性条件（ｐＨ＜７）下で選択的に破断される結合である。細胞のエンドソームおよびリソソームは、７未満のｐＨを有するため、このような結合は、エンドソームに不安定な結合とも呼ばれる場合がある。例えば、ある特定の実施形態では、リンカーは、アミン、イミン、エステル、安息香酸イミン、アミノエステル、ジオルトエステル、ポリホスホエステル、ポリホスファゼン、アセタール、ビニルエーテル、ヒドラゾン、アジドメチル−メチルマレイン酸無水物、チオプロピオネート、マスク化エンドソーム溶解剤、またはシトラコニル基を含む。
ある特定の実施形態では、リンカーは、以下、すなわち、ジオールおよびケトンを形成するための酸性環境（例えば、７未満、約４超のｐＨ）中で不安定なケタール；ジオールおよびアルデヒドを形成するための酸性環境（例えば、７未満、約４超のｐＨ）中で不安定なアセタール；アミンおよびアルデヒドもしくはケトンを形成するための酸性環境（例えば、７未満、約４超のｐＨ）中で不安定なイミンもしくはイミニウム；酸性条件下で不安定なケイ素−酸素−炭素連結；ケイ素−窒素（ｎｉｔｒｏｇｎｅ）（シラザン）連結；ケイ素−炭素連結（例えば、アリールシラン、ビニルシラン、およびアリルシラン）；マレアメート（無水マレイン酸誘導体およびアミンから合成されるアミド結合）；オルトエステル；ヒドラゾン；酸触媒加水分解を起こすように設計された活性化カルボン酸誘導体（例えば、エステル、アミド）；またはビニルエーテルから選択される低ｐＨ不安定結合を含む。さらなる例は、ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳ ＦＯＲ ＩＮ ＶＩＶＯ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＯＦ ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳという表題の国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０２２３０９号に見つけることができ、その内容は、参照により本明細書に組み込まれている。
有機シラン（例えば、シリルエーテル、シリルエノールエーテル）は、有機合成において酸素保護基として使用される。ケイ素−酸素−炭素連結は、酸性条件下で加水分解されやすいことによって、シラノールおよびアルコール（またはエノール）を形成する。ケイ素原子およびアルコール炭素の両方に対して置換すると、立体的および電子的効果に起因して加水分解速度が影響され得る。これにより、有機シラン、アルコール、または有機シランおよびアルコールの両方に対する置換を変更することによって、ケイ素−酸素−炭素連結の加水分解速度をチューニングする可能性が許容される。さらに、帯電基または反応基、例えば、アミンまたはカルボキシレートなどは、ケイ素原子に付着することができ、それにより、電荷および／または反応性を有する不安定化合物が付与される。
シラザンが加水分解すると、シラノールおよびアミンが形成される。シラザンは、ケイ素−酸素−炭素連結より本質的に加水分解されやすいが、加水分解速度は、酸性条件下で増大する。ケイ素原子およびアミンの両方に対して置換すると、立体的および電子的効果に起因して加水分解速度が影響され得る。これにより、ケイ素またはアミンに対する置換を変更することによって、シラザンの加水分解速度をチューニングする可能性が許容される。
ｐＨ不安定結合の別の例は、酸に不安定なエノールエーテル結合である。この不安定結合が切断される速度は、形成されるカルボニル化合物および放出されるアルコールの構造に依存する。例えば、β−ハロエーテルから合成され得るエチルイソプロペニルエーテルの類似体は、一般に、フェノールエーテルから合成され得るエチルシクロヘキセニルエーテルの類似体より短い半減期を有する。
無水物がアミンと反応すると、アミドおよび酸が形成される。一般に、逆反応（無水物およびアミンの形成）は、非常に遅く、エネルギー的に不都合である。しかし、無水物が環状無水物である場合、アミンと反応すると、アミドおよび酸が同じ分子中にある分子、アミド酸が生じる。両方の反応基（アミドおよびカルボン酸）が同じ分子中に存在すると、逆反応が加速される。ある特定の実施形態では、リンカーは、マレアミド酸を含む。アミド酸が切断されてアミンおよび無水物を形成することは、ｐＨに依存し、酸性ｐＨで大いに加速される。このｐＨ依存性反応性は、可逆性ｐＨ感受性結合およびリンカーを形成するのに活用することができる。ｃｉｓ−アコニット酸が、このようなｐＨ感受性リンカー分子として使用されている。γ−カルボキシレートが最初に、分子にカップリングされる。第２ステップでは、αまたはβカルボキシレートが第２の分子にカップリングされて、２分子のｐＨ感受性カップリングが形成される。
いくつかの実施形態では、リンカーは低ｐＨ不安定結合として安息香酸イミンを含む。例えば、Ｚｈｕら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２０１２年、２８巻、１１９８８〜９６頁；Ｄｉｎｇら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ．、２００９年、２０巻、１１６３〜７０頁に記載のコンジュゲートを参照。
いくつかの実施形態では、リンカーは、低ｐＨ不安定ヒドラゾン結合を含む。このような酸不安定結合は、コンジュゲート、例えば、抗体−薬物コンジュゲートの分野で広範に使用されている。例えば、Ｚｈｏｕら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２０１１年、１２巻、１４６０〜７頁；Ｙｕａｎら、Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．、２００８年、４巻、１０２４〜３７頁；Ｚｈａｎｇら、Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．、２００７年、６巻、８３８〜５０頁；Ｙａｎｇら、Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．、２００７年、３２１巻、４６２〜８頁；Ｒｅｄｄｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００６年、５８巻、２２９〜３６頁；Ｄｏｒｏｎｉｎａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００３年、２１巻、７７８〜８４頁を参照。いくつかの実施形態では、リンカーは、低ｐＨ不安定ビニルエーテルを含む。例えば、Ｓｈｉｎら、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌｅａｓｅ、２００３年、９１巻、１８７〜２００頁を参照。いくつかの実施形態では、リンカーは、低ｐＨ不安定ホスホアミン（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｎｅ）結合を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、低ｐＨ不安定トレースレスクリックリンカーを含む。例えば、ある特定の実施形態では、リンカーは、アジドメチル−メチルマレイン酸無水物を含む（Ｍａｉｅｒら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、２０１２年、１３４巻、１０１６９〜７３頁を参照）。いくつかの実施形態では、リンカーは、低ｐＨ不安定４−ヒドラジノスルホニル安息香酸リンカーを含む。例えば、Ｋａｍｉｎｓｋａｓら、Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍ．、２０１２年、９巻、４２２〜３２頁；Ｋａｍｉｎｓｋａｓら、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１１年、１５２巻、２４１〜８頁を参照。いくつかの実施形態では、リンカーは、低ｐＨ不安定パラ−フェニルプロピオン酸リンカーを含む（例えば、Ｉｎｄｉｒａ Ｃｈａｎｄｒａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．、２０１２年、３１６巻、１５１〜６頁を参照）。いくつかの実施形態では、リンカーは、低ｐＨ不安定β−チオプロピオネートリンカーを含む（例えば、Ｄａｎら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２０１１年、２７巻、６１２〜７頁を参照）。いくつかの実施形態では、リンカーは、低ｐＨ不安定エステルを含む（例えば、Ｚｈｕら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ．、２０１０年、２１巻、２１１９〜２７頁を参照）。いくつかの実施形態では、リンカーは、低ｐＨ不安定ケタール（例えば、Ａｂｒａｈａｍら、Ｊ． Ｂｉｏｍａｔｅｒ． Ｓｃｉ． Ｐｏｌｙｍ． Ｅｄ．、２０１１年、２２巻、１００１〜２２頁を参照）またはアセタール（例えば、Ｌｉｕら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、２０１０年、１３２巻、１５００頁を参照）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、低ｐＨ不安定４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸リンカーを含む（例えば、ＤｉＪｏｓｅｐｈら、Ｂｌｏｏｄ、２００４年、１０３巻、１８０７〜１４頁を参照）。いくつかの実施形態では、リンカーは、低ｐＨ不安定ｃｉｓ−アコニチルリンカー（例えば、Ｈａａｓら、Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ、２００２年、１０巻、８１〜９頁；Ａｈｍａｄら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９９０年、１０巻、８３７〜４３頁；Ｄｉｌｌｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９８８年、４８巻、６０９７〜１０２頁を参照）。いくつかの実施形態では、リンカーは、低ｐＨ不安定ジオルトエステルを含む（例えば、Ｇｕｏら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ．、２００１年、１２巻、２９１〜３００頁を参照）。
いくつかの実施形態では、リンカーは、マスク化エンドソーム溶解剤を含む。エンドソーム溶解性ポリマーは、ｐＨの変化に応答して、エンドソームの破壊もしくは溶解を引き起こすことができ、または通常、膜不透過性の化合物、例えば、ポリヌクレオチドもしくはタンパク質などを、細胞内膜に囲まれているベシクル、例えば、エンドソームもしくはリソソームなどから脱出させることができるポリマーである。エンドソーム溶解性化合物のサブセットは、融合ペプチドを含めた融合性化合物である。融合ペプチドは、オリゴマー化合物などの作用物質の細胞質へのエンドソーム放出を促進することができる。例えば、米国特許出願公開第２００４０１９８６８７号、同第２００８０２８１０４１号、同第２００８０１５２６６１号、および同第２００９００２３８９０号を参照。これらは、参照により本明細書に組み込まれている。
リンカーは、臓器／組織特異的切断を起こすように設計することもできる。例えば、複数の組織内で発現されるある特定の標的について、他の臓器内のノックダウンが望まれない副作用をもたらし得る場合、肝臓内のノックダウンのみが望ましい場合がある。したがって、肝臓特異的酵素、例えば、ピロラーゼ（ＴＰＯ）およびグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ−６−Ｐａｓｅ）などに敏感なリンカーを、アンチセンス効果を主に肝臓に限定するように操作することができる。あるいは、肝臓酵素に敏感でないが、γ−グルタミルトランスペプチダーゼなどの腎臓特異的酵素に敏感であるリンカーを、アンチセンス効果が主に腎臓に限定されるように操作することができる。同様に、Ｐｈｅ−ＡｌａおよびＬｅｕ−Ａｌａを切断する腸特異的ペプチダーゼを、経口投与される多量体ターゲティングオリゴヌクレオチドのために考慮することができる。同様に、プラスミン（例えば、ＰＨＥＡ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ認識部位）などの腫瘍内で過剰発現される酵素が認識する酵素認識部位をリンカー中に配置することによって、腫瘍特異的ノックダウンが実現可能であるはずである。リンカー中に適正な酵素認識部位を選択することによって、特異的切断およびノックダウンが多くの臓器内で達成可能であるはずである。さらに、リンカーは、ターゲティングシグナル、例えば、肝臓ターゲッティングのためのＮ−アセチルガラクトサミン、または腫瘍もしくは活性化マクロファージターゲティングの場合におけるフォレート、ビタミンＡもしくはＲＧＤ−ペプチドなども含有し得る。したがって、いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、臓器特異的または組織特異的、例えば、肝臓特異的、腎臓特異的、腸特異的などである。
ターゲティングオリゴヌクレオチドは、個々のターゲティングオリゴヌクレオチドの任意の部分によって、例えば、ホスフェート、糖（例えば、リボース、デオキシリボース）、または核酸塩基を介して連結することができる。ある特定の実施形態では、２つのオリゴヌクレオチドを一緒に連結する場合、リンカーは、例えば、第１のオリゴヌクレオチドの５’末端および第２のヌクレオチドの３’末端に、第１のオリゴヌクレオチドの５’末端および第２のヌクレオチドの５’末端に、第１のオリゴヌクレオチドの３’末端および第２のヌクレオチドの３’末端に付着することができる。他の実施形態では、２つのオリゴヌクレオチドを一緒に連結する場合、リンカーは、各オリゴヌクレオチドの内部残基を、例えば、修飾核酸塩基を介して付着することができる。当業者は、多くのこのような順列が多量体に利用可能であることを理解するであろう。
本明細書に記載のリンカーは、オリゴヌクレオチドの他の部分を付着するのに使用することもできる。このような部分としては、親油性部分、ターゲティング部分（例えば、細胞表面受容体のリガンド）、およびタグ（例えば、イメージング用蛍光部分、またはビオチンなどの親和性タグ）がある。
ある特定の実施形態では、リンカーは、クリック化学を介してオリゴヌクレオチドに付着される（ＤＮＡを用いたクリック化学を使用することの総説については、Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒら、Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ．、２０１０年、３９巻、１３８８〜１４０５頁を参照）。用語「クリック化学」は、穏やかな条件下および種々の官能基の存在下で、高収率で起こる任意の容易な反応を記述するのに使用されるが、［３＋２］アジド−アルキン環付加反応を指すのに最も一般に使用される。このような反応は一般に、ＣｕＩによって触媒され、生体分子中で一般に遭遇される官能基の存在下で進行する。いくつかの実施形態では、アルキンまたはアジドを含むように修飾された非天然塩基が、オリゴヌクレオチド中に導入される。例示的な塩基修飾については、以下を参照：
式中、Ｒ’は、例えば、水素、適当な保護基またはカップリング部分（例えば、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、もしくはホスホラミダイト基）、トリホスフェートであり、またはＲ’は、オリゴヌクレオチドの残りへの接続点を表す。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リボース部分がリンカーをカップリングするためのアルキンまたはアジドを含むように修飾されている。例えば：
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、クリック化学を介してリンカーをカップリングするために、アルキンまたはアジドを用いて５’末端または３’末端で修飾されている。例えば、以下に示すヌクレオシドを、このようなオリゴヌクレオチドを合成するのに使用することができる：
核酸塩基によってターゲティングオリゴヌクレオチドを連結することを可能にする例示的な試薬には、塩基における保護されたアミノ官能性が含まれ、次いでこの官能性は、他の適当な官能基にカップリングすることができる。ある特定の実施形態では、ＦｍｏｃアミノモディファイヤーＣ６ ｄＴ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０−１５３６−ｘｘ）が出発原料として使用される：
核酸塩基によってターゲティングオリゴヌクレオチドを連結することを可能にする他の例示的な試薬には、塩基における保護されたチオール官能性が含まれ、次いでこの官能性は、他の適当な官能基にカップリングし、またはジスルフィド結合を形成するのに使用することができる。ある特定の実施形態では、Ｓ−Ｂｚ−チオール−モディファイヤーＣ６ ｄＴ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０−１０３９−ｘｘ）が出発原料として使用される：
他の実施形態では、アミノモディファイヤーセリノールホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０−１９９７−ｘｘ）または３’−アミノモディファイヤーセリノールＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号２０−２９９７−ｘｘ）が、アミノ官能性リンカーを導入するのに使用され、次いでこのリンカーは、他の適当な官能基とカップリングすることができる：
他の実施形態では、チオールモディファイヤーＣ６ Ｓ−Ｓ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０−１９３６−ｘｘ）、３’−チオールモディファイヤーＣ３ Ｓ−Ｓ ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号２０−２９３３−ｘｘ）、または５’−マレイミドモディファイヤーホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０−１９３８−ｘｘ）が、リンカーを導入するのに使用される：
いくつかの実施形態では、コレステリル−ＴＥＧホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０−１９７５−ｘｘ）またはα−トコフェロール−ＴＥＧホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０−１９７７−ｘｘ）が、ターゲティングオリゴヌクレオチドに親油性部分を付加するためのホスホラミダイト合成において使用される：
いくつかの実施形態では、以下の出発原料のうちの１種または複数がオリゴヌクレオチド合成において使用されて、ターゲティングオリゴヌクレオチド中にアルキンが導入され、このオリゴヌクレオチドは、クリック化学を介してアジドと反応して別のターゲティングオリゴヌクレオチド、または親油性基もしくはターゲティング基などの別の部分を付着することができる：
いくつかの実施形態では、上述したものなどの以下の出発原料のうちの１種または複数が使用されて、アルキンで官能化されたターゲティングオリゴヌクレオチドにクリック化学を介して親油性基またはターゲティング基が付着される：
Ｅ．標的および使用
本開示は、１つまたは１つより多い標的の標的発現レベルを阻害する方法であって、標的（複数可）の発現を阻害するのに有効な量で本発明の化合物を細胞または被験体に投与するステップを含む、方法が提供される。ある特定の実施形態では、標的は、ｍＲＮＡである。他の実施形態では、標的は、上述したマイクロＲＮＡとすることができる。このような場合では、個々のターゲティングオリゴヌクレオチドは、「アンタゴマー（ａｎｔａｇｏｍｉＲ）」と呼ばれる場合がある。他の実施形態では、標的は、細胞内で天然に発現される非コードＲＮＡとすることができる。
本発明の方法によって処置される被験体は、ヒト、霊長類、およびげっ歯類を含めた動物とすることができる。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで存在しても、ｅｘ ｖｉｖｏで処置されてもよい。いくつかの場合では、ｅｘ ｖｉｖｏで処置された細胞が被験体に再投与される。
本発明は、二標的および複数標的アンチセンス阻害剤、特に、肝疾患、代謝疾患、心血管疾患、炎症疾患、神経疾患、ウイルス、細菌、寄生虫、またはプリオンの感染症、およびがんを処置するためのものも包含する。特に、本発明は、ＡｐｏＢおよびＡｐｏＣ３二重阻害などの肝臓標的（「肝標的」とも呼ばれる）を阻害するための二量体アンチセンス阻害剤の使用を含む。ＡｐｏＢをノックダウンすると、肝臓内に望まれない脂質が堆積することが報告されているので、ＡｐｏＣ３を同時にノックダウンすると、この副作用を減少させることができる。
がんでは、２つの標的を同時にノックダウンすると、相乗的な抗腫瘍効果をもたらすことができる。特に、異なる作用機序およびシグナル伝達経路を有する標的の組合せ、例えば、細胞増殖抑制性機構と抗転移性機構との組合せは、対象のものであるはずである。
様々ながんまたは腫瘍に関連する標的に対する適切な配列を選択することによって、本発明は、がんの処置にも適している。したがって、１）がんの分化、発達、もしくは増殖に関与する標的、例えば：オンコプロテインもしくは転写因子、例えば、ｃ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｆｏｓ／ｊｕｎ、ＰＣＮＡ、ｐ１２０、ＥＪ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ｒｒｇ、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ｘ、ｂｃｌ−ｗ、ｃｄｃ−２、ｃ−ｒａｆ−１、ｃ−ｍｏｓ、ｃ−ｓｒｃ、ｃ−ａｂｌ、ｃ−ｅｔｓなどに対して；２）細胞受容体、例えば、ＥＧＦ受容体、Ｈｅｒ−２、ｃ−ｅｒｂＡ、ＶＥＧＦ受容体（ＫＤＲ−１）、レチノイド受容体などに対して；３）プロテインキナーゼ、ｃ−ｆｍｓ、Ｔｉｅ−２、ｃ−ｒａｆ−１キナーゼ、ＰＫＣ−α、プロテインキナーゼＡ（Ｒ１α）に対して；４）増殖因子もしくは血管新生因子、例えば、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、およびＴＧＦ−βなどに対して；５）ＩＬ−１０などのサイトカインに対して、サイクリン−Ｅなどの細胞周期タンパク質に対して；６）ＭＡＴ−８などの腫瘍タンパク質に対して；または７）ＭＤＭ−２などの腫瘍抑制遺伝子の阻害物質に対して向けられたターゲティングオリゴヌクレオチドを含む本発明の多量体オリゴヌクレオチド化合物を使用することが可能である。８）紡錐体形成の成分、例えば、ｅｇ５およびＰＬＫ１など、または９）ＣＸＣＲ４などの転移を抑制する標的に対して向けられたアンチセンスも有用である。１０）アポトーシスを抑制する因子、例えば、サバイビン、ｓｔａｔ３、およびｈｄｍ２など、またはＭＤＲ１（Ｐ−糖タンパク質）などの多剤耐性遺伝子の発現を抑制する因子に対して向けられたアンチセンス配列は、有用である。
二量体／多量体は、遺伝子発現を制御する、長さが約２１〜２３ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ分子であるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）も分解またはアンタゴナイズすることができる。ｍｉＲＮＡは、ＤＮＡから転写されるが、翻訳されてタンパク質にならず（非コードＲＮＡ）、代わりにｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして公知の一次転写物から処理されてｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと呼ばれる短いステムループ構造に、最終的に機能的なｍｉＲＮＡにされる遺伝子によってコードされる。成熟したｍｉＲＮＡ分子は、１つまたは１つより多いメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子と部分的に相補的であり、これらの主な機能は、遺伝子発現を下方制御することである。ヒトゲノム中で発見された多くのｍｉＲＮＡ配列が、がんの発達の一因となるように思われる。いくつかのｍｉＲＮＡは、がんにおいて著しく無秩序である。さらに、腫瘍増殖をもたらしている過剰発現されたｍｉＲＮＡ（例えば、ＴＧＦ−β２受容体、ＲＢ１、およびＰＬＡＧ１）を、先に記載したアンチセンス手法を使用して下方制御することができる。がん遺伝子標的を定義するヒト固形腫瘍のｍｉＲＮＡ発現シグネチャーが、例えば、Ｖｏｌｉｎｉａら、ＰＮＡＳ、２００６年、１０３巻、２２５７〜６１頁によって報告された。
本発明の化合物および１つまたは１つより多い薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物がさらに提供される。オリゴヌクレオチドを製剤化し、細胞または被験体に投与する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｈａｒｄｅｅ， Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｅ．；Ｔｉｌｌｍａｎ， Ｌｌｏｙｄ Ｇ．；Ｇｅａｒｙ， Ｒｉｃｈａｒｄ Ｓ．、Ｒｏｕｔｅｓ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２版）２００８年、２１７〜２３６頁、出版社：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＬＣ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．；Ｚｈａｏら、２００９年、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．、６巻：６７３〜６８６頁；Ｊｕｌｉａｎｏら、２００８年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３６巻：４１５８〜４１７１頁；Ａｕｇｎｅｒ、２００６年、Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１〜１５頁；Ｗｉｌｓｏｎら、２００５年、Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、５４巻：２１〜４１頁；Ｈａｓｓａｎｅら、２０１０年、Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．、６７巻：７１５〜７２６頁；およびＮａｋａｇａｗａら、２０１０年、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、１３２巻：８８４８〜８８４９頁を参照）。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、好都合な薬物動態学的性質および／または薬力学的性質を持つ。例えば、いくつかの場合では、標的（複数可）の治療的に有効なノックダウンは、投与後２週間または２週間より長く持続する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏで投与される場合、以下の性質：
（ｄ）それぞれの単量体ターゲティングオリゴヌクレオチドと比較して、肝臓内（または他の組織）内の濃度の増大および腎臓によるクリアランスの低減；
（ｅ）それぞれの単量体ターゲティングオリゴヌクレオチドと比較して、標的ノックダウンのより長い継続時間；ならびに
（ｆ）それぞれの単量体ターゲティングオリゴヌクレオチド、および／または切断可能リンカーが切断不可能リンカーと置換された同じ多量体オリゴヌクレオチド化合物と比較して、より低い有効濃度
のうちの１つまたは複数によって特徴付けられる。
Ｆ．送達の経路
多量体オリゴヌクレオチド化合物を含む組成物は、様々な経路によって被験体に送達することができる。例示的な経路としては、静脈内、皮内、局部的、直腸、非経口、肛門、膣内、鼻腔内、経肺、眼球がある。用語「治療有効量」は、期待される生理反応を与えるように、処置される被験体において所望レベルの標的遺伝子調節（例えば、阻害または活性化）をもたらすのに必要とされる、組成物中に存在する多量体オリゴヌクレオチド化合物の量である。用語「生理学的有効量」は、所望の緩和効果または治癒効果を与えるように被験体に送達される量である。用語「薬学的に許容される担体」は、担体が、被験体に著しい有害な毒性効果をまったく伴わないで、被験体に投与され得ることを意味する。
本発明の多量体オリゴヌクレオチド化合物分子を、投与に適した医薬組成物中に組み込むことができる。このような組成物は一般に、多量体オリゴヌクレオチド化合物のうちの１つまたは１つより多い化学種、および薬学的に許容される担体を含む。本明細書において、「薬学的に許容される担体」という言い回しは、薬剤投与に適合した任意の、およびすべての溶媒、分散媒、被膜、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むように意図されている。薬学的活性物質に対してこのような媒体および作用物質を使用することは、当技術分野で周知である。任意の慣例的な媒体または作用物質が活性化合物と不適合である限りを除いて、組成物中にこれらを使用することが企図されている。補充の活性化合物も組成物中に組み込むことができる。
本発明の医薬組成物は、局所的処置が望まれているか、または全身的処置が望まれているかに応じて、および処置される範囲に応じていくつかの方法で投与することができる。投与は、局部的（眼、膣、直腸、鼻腔内、経皮を含む）、経口、または非経口とすることができる。非経口投与としては、点滴、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内の注射、またはクモ膜下もしくは脳室内の投与がある。
投与の経路および部位は、ターゲティングを増強するように選ぶことができる。例えば、筋細胞を標的にするために、対象の筋肉内への筋肉内投与が論理的な選択であるはずである。多量体オリゴヌクレオチド化合物をエアゾール形態で投与することによって、肺細胞を標的にすることができる。多量体オリゴヌクレオチド化合物でバルーンカテーテルを被覆し、オリゴヌクレオチドを機械的に導入することによって、血管内皮細胞を標的にすることができる。
局部投与は、被験体の表面に直接製剤を接触させることによる被験体への送達を指す。局部送達の最も一般的な形態は、皮膚へのものであるが、本明細書に開示の組成物は、体の他の表面に、例えば、目、粘膜に、体腔の表面に、または内表面に直接適用することもできる。上述したように、最も一般的な局部送達は、皮膚へのものである。この用語は、それだけに限らないが、局部的および経皮を含めたいくつかの投与経路を包含する。これらの投与モードは一般に、皮膚の透過バリアの貫通、および標的組織または層への効率的な送達を含む。局部投与は、表皮および真皮を貫通し、組成物の全身送達を最終的に達成するための手段として使用することができる。局部投与は、被験体の表皮もしくは真皮に、またはこれらの特定の層に、または下にある組織にオリゴヌクレオチドを選択的に送達するための手段として使用することもできる。
局部投与用製剤として、経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ剤、坐剤、スプレー剤、液体剤、および粉末剤を挙げることができる。慣例的な薬学的担体、水性基剤、粉末基剤、または油性基剤、増粘剤などが必要な場合があり、または望ましい場合がある。被覆されたコンドーム、グローブなども有用であり得る。
経皮送達は、脂溶性治療剤の投与に有益な経路である。真皮は、表皮より透過性であり、したがって吸収は、擦りむいた皮膚、熱傷した皮膚、または剥皮皮膚を通ってはるかに急速である。皮膚への血流を増大させる炎症および他の生理学的条件も経皮吸着を増強する。この経路を介した吸収は、油性ビヒクルの使用（塗油）によって、または１つまたは１つより多い浸透エンハンサーを使用することによって増強することができる。経皮経路を介して本明細書に開示の組成物を送達するための他の有効な方法には、皮膚の水和、およびコントロール放出局所パッチの使用が含まれる。経皮経路は、全身療法および／または局所療法のために本明細書に開示の組成物を送達する潜在的に有効な手段をもたらす。さらに、イオン導入（電場の影響下での生体膜を通じたイオン性溶質の移動）、音波泳動法または超音波導入（生体膜、特に、皮膚および角膜を横断する様々な治療エージェントの吸収を増強するための超音波の使用）、および投薬位置に対するビヒクル特性の最適化、および投与部位の保持は、皮膚および粘膜部位を横断して局部的に適用される組成物を輸送することを増強するための有用な方法であり得る。
口膜および鼻粘膜はともに、他の投与経路に対して利点を提供する。例えば、これらの膜を通して投与されるオリゴヌクレオチドは、急速な作用開始を有し、治療血漿レベルをもたらし、肝代謝の初回通過効果を回避し、厳しい消化管（ＧＩ）環境へのオリゴヌクレオチドの曝露を回避することができる。追加の利点には、膜部位への容易なアクセスが含まれ、その結果、オリゴヌクレオチドを容易に適用、局在化、および除去することができる。
経口送達では、組成物は、口腔の表面、例えば、舌の腹面の膜を含む舌下粘膜、および口腔底、または頬のライニングを構成する頬側粘膜を標的とすることができる。舌下粘膜は、相対的に透過性であり、したがって多くの作用物質の急速な吸収および許容可能な生物学的利用能を与える。さらに、舌下粘膜は、好都合、許容可能、および容易にアクセス可能である。
多量体オリゴヌクレオチド化合物の医薬組成物は、定量噴霧式スプレーディスペンサーから上述した混合ミセル医薬製剤、および噴霧剤を、吸入を用いずに腔内に吹き付けることによってヒトの頬側口腔に投与することもできる。一実施形態では、ディスペンサーは、医薬製剤および噴霧剤を頬側口腔内に吹き付ける前に最初に振盪される。
経口投与用組成物としては、散剤、または顆粒剤、水中の懸濁液もしくは溶液、シロップ剤、スラリー剤、乳剤、エリキシル剤、または非水性媒体、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、またはトローチ剤がある。錠剤の場合では、使用することができる担体には、ラクトース、クエン酸ナトリウム、およびリン酸の塩が含まれる。様々な、デンプンなどの崩壊剤、ならびに滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、硫酸ラウリルナトリウム、およびタルクなどが一般に、錠剤中に使用される。カプセル剤形態での経口投与に関して、有用な賦形剤は、ラクトースおよび高分子量ポリエチレングリコールである。水性懸濁液が経口使用に要求される場合、核酸組成物を乳化剤および懸濁化剤と組み合わせることができる。必要に応じて、ある特定の甘味剤および／または香味剤を添加することができる。
非経口投与としては、点滴、皮下、腹腔内、または筋肉内の注射、クモ膜下または脳室内の投与がある。いくつかの実施形態では、非経口投与（ｐａｒｅｎｔａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）では、疾患部位に直接投与する（例えば、腫瘍内への注射）。
非経口投与用製剤として、滅菌水溶液を挙げることができ、これは、緩衝液、賦形剤、および他の適当な添加物も含有することができる。脳室内注射は、例えば、リザーバに取り付けられた脳室内カテーテルによって促進することができる。静脈内使用に関して、溶質の総濃度は、調製物を等張性にするようにコントロールされるべきである。
本明細書に記載の多量体オリゴヌクレオチド化合物のいずれも、眼球組織に投与することができる。例えば、組成物を、目または周囲組織の表面、例えば、眼瞼の内側に適用することができる。眼球投与に関して、軟膏または滴下可能な液体を、当技術分野で公知の眼内送達システム、例えば、アプリケーターまたは点眼器などによって送達することができる。このような組成物は、粘液模倣剤（ｍｕｃｏｍｉｍｅｔｉｃ）、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリ（ビニルアルコール）など、防腐剤、例えば、ソルビン酸、ＥＤＴＡ、または塩化ベンジルクロニウム（ｂｅｎｚｙｌｃｈｒｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）など、ならびに通常量の賦形剤および／または担体を含むことができる。多量体オリゴヌクレオチド化合物は、目の内側に投与することもでき、選択された範囲または構造にこれを導入することができる針または他の送達デバイスによって導入することができる。
肺送達用組成物は、分散系を患者が吸入することによって送達することができ、その結果、分散系内の組成物、好ましくは、多量体オリゴヌクレオチド化合物は、肺に到達することができ、そこでこれは、肺胞の領域を通って直接血液循環中に容易に吸収され得る。肺送達は、肺の疾患を処置するための全身送達および局所送達の両方に有効であり得る。
肺送達は、霧状製剤、エアゾール化製剤、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｕｌａｒ）製剤、および乾燥粉末系製剤の使用を含めた様々な手法によって達成することができる。送達は、液体噴霧器、エアゾールベース吸入器、および乾燥粉末分散器を用いて達成することができる。定量デバイスが好適である。噴霧器または吸入器を使用することの利点の１つは、デバイスが自己充足型であるので、汚染の可能性が最小限にされることである。乾燥粉末分散器は、例えば、乾燥粉末として容易に製剤化することができる作用物質を送達する。多量体オリゴヌクレオチド化合物は、それ自体で、または適当な粉末担体と組み合わせて、凍結乾燥粉末または噴霧乾燥粉末として安定に貯蔵することができる。吸入用組成物の送達は、タイマー、投薬カウンター、時間測定デバイス、または時間インジケータを含み得る投薬タイミングエレメントによって媒介され得、このエレメントは、デバイス内に組み込まれたとき、エアゾール薬剤を投与する間の投薬追跡、コンプライアンス監視、および／または患者への投薬誘発を可能にする。
用語「粉末」は、自由流動性であり、吸入デバイス内で容易に分散され、引き続いて被験体によって吸入され得る細かく分散した固形粒子からなり、その結果、粒子が肺に到達して肺胞内への浸透を可能する組成物を意味する。したがって、粉末は、「呼吸性」であると言われる。好ましくは、平均粒径は、好ましくは相対的に均一な球状形状分布を伴って、直径約１０μｍ未満である。より好ましくは、直径は、約７．５μｍ未満であり、最も好ましくは約５．０μｍ未満である。通常、粒径分布は、直径が約０．１μｍ〜約５μｍ、特に、約０．３μｍ〜約５μｍの間である。
用語「乾燥」は、組成物が、約１０重量％（％ｗ）未満の水、通常約５％ｗ未満、好ましくは約３％ｗ未満の水分含量を有することを意味する。乾燥組成物は、粒子が吸入デバイス内で容易に分散性であることによってエアゾールを形成するようなものであり得る。
担体として有用な医薬添加剤のタイプとしては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安定剤、炭水化物などの増量剤、アミノ酸、およびポリペプチド；ｐＨ調整剤またはｐＨ緩衝液；塩化ナトリウムなどの塩；などがある。これらの担体は、結晶形であっても非晶形であってもよく、または２種の混合物であってもよい。
適当なｐＨ調整剤またはｐＨ緩衝液には、有機酸および有機塩基から調製される有機塩、例えば、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどが含まれ、クエン酸ナトリウムが好適である。ミセル多量体オリゴヌクレオチド化合物製剤の経肺投与は、噴霧剤、例えば、テトラフルオロエタン、ヘプタフルオロエタン、ジメチルフルオロプロパン、テトラフルオロプロパン、ブタン、イソブタン、ジメチルエーテル、ならびに他の非ＣＦＣおよびＣＦＣ噴霧剤などを用いて定量噴霧式スプレーデバイスによって達成することができる。
例示的なデバイスには、血管系内に導入されるデバイス、例えば、血管組織の管腔に挿入されるデバイス、またはステント、カテーテル、心臓弁、および他の血管デバイスを含めた、デバイス自体で血管系の一部を形成するデバイスが含まれる。これらのデバイス、例えば、カテーテルまたはステントは、肺、心臓、または脚の血管系内に配置することができる。
他のデバイスには、非血管デバイス、例えば、腹膜内、または臓器もしくは腺組織内に移植されるデバイス、例えば、人工臓器が含まれる。このデバイスは、多量体オリゴヌクレオチド化合物に加えて治療物質を放出することができ、例えば、デバイスは、インスリンを放出することができる。
一実施形態では、単位用量または測定用量の、多量体オリゴヌクレオチド化合物を含む組成物は、移植されたデバイスによって分配される。デバイスは、被験体内のパラメータを監視するセンサーを含むことができる。例えば、デバイスは、例えば、ポンプ、および任意選択により関連する電子機器を含むことができる。
組織、例えば、細胞または臓器は、ｅｘ ｖｉｖｏで、多量体オリゴヌクレオチド化合物で処置し、次いで被験体内に投与または移植することができる。組織は、自己組織、同種間組織、または異種間組織とすることができる。例えば、移植片対宿主疾患を低減するように組織を処置することができる。他の実施形態では、組織は、同種間のものであり、その組織内の望まれない遺伝子発現によって特徴付けられる障害を処置するように処置される。例えば、組織、例えば、造血細胞、例えば、骨髄造血細胞を、望まれない細胞増殖を阻害するように処置することができる。自己のものであっても移植のものであっても、処置された組織の導入は、他の療法と組み合わせることができる。いくつかの実施では、多量体オリゴヌクレオチド化合物で処置された細胞は、例えば、細胞がインプラントを出ることを防止するが、体からの分子が細胞に到達し、細胞によって生成される分子が体に入ることを可能にする半透性多孔質バリアによって他の細胞から隔離される。一実施形態では、多孔質バリアは、アルギネートから形成される。
一実施形態では、避妊具は、多量体オリゴヌクレオチド化合物で被覆され、またはこれを含有する。例示的なデバイスとしては、コンドーム、ダイヤフラム、ＩＵＤ（植込み型子宮デバイス（ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ ｕｔｅｒｉｎｅ ｄｅｖｉｃｅ））、スポンジ、膣シース（ｖａｇｉｎａｌ ｓｈｅａｔｈ）、および受胎調節デバイスがある。
Ｇ．投与量
一態様では、本発明は、多量体オリゴヌクレオチド化合物を被験体（例えば、ヒト被験体）に投与する方法を特徴として備える。一実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ〜２５ｍｇの間である。一実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜１００ｍｇの間である。一実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜５００ｍｇの間である。いくつかの実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、５、１０、２５、５０、または１００ｍｇ超である。
規定量は、疾患または障害、例えば、特定の標的遺伝子と関連した疾患または障害を処置または予防するのに有効な量とすることができる。単位用量は、例えば、注射（例えば、静脈内もしくは筋肉内）、吸入投薬、または局部適用によって投与することができる。
いくつかの実施形態では、単位用量が毎日投与される。いくつかの実施形態では、１日１回より少ない頻度で、例えば、２、４、８、または３０日毎未満。別の実施形態では、単位用量は、１つの頻度で投与されない（例えば、規則的な頻度でない）。例えば、単位用量を、単回投与することができる。いくつかの実施形態では、単位用量は、１日１回より多く、例えば、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間などに１回投与される。
一実施形態では、被験体は、初期用量および１回または複数の維持用量の多量体オリゴヌクレオチド化合物を投与される。１回または複数の維持用量は、一般に、初期用量より少なく、例えば、初期用量の半分未満である。維持レジメンは、１日当たり体重１ｋｇ当たり０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲、例えば、１日当たり体重１ｋｇ当たり１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１、または０．０００１ｍｇの１回または複数の用量で被験体を処置することを含むことができる。維持用量は、１、５、１０、または３０日毎以下で投与される場合がある。さらに、処置レジメンは、特定の疾患の特質、その重症度、および患者の全体的な状態に応じて変化することになる時間にわたって続き得る。いくつかの実施形態では、この投与量は、１日１回以下、例えば、２４、３６、４８、またはそれ以上の時間に１回以下、例えば、５または８日毎に１回以下送達される場合がある。処置した後、患者を、その状態の変化、および疾患状態の症状の軽減について監視することができる。オリゴヌクレオチドの投与量は、患者が現在の投与量レベルに有意に応答しない場合、増やすことができ、または疾患状態の症状の軽減が観察される場合、疾患状態がなくなった場合、もしくは望まれない副作用が観察される場合、用量を減らすことができる。
特定の状況下で望まれ、または適切と見なされる場合、単回用量で、または２回以上の用量で有効用量を投与することができる。繰り返しの、または頻繁な注入を促進することが望まれる場合、送達デバイス、例えば、ポンプ、半永久的ステント（例えば、静脈内、腹腔内、槽内、もしくは嚢内）、またはリザーバの移植が得策となり得る。
処置に成功した後、疾患状態の再発を防止するために、患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、ここで本発明の化合物は、体重１ｋｇ当たり０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲の維持用量で投与される。
多量体オリゴヌクレオチド化合物の濃度は、障害を処置もしくは予防することにおいて有効であるのに、またはヒトにおける生理的条件を制御するのに十分な量である。多量体オリゴヌクレオチド化合物の濃度または量は、作用物質、および投与方法、例えば、経鼻、頬側、経肺について決定されるパラメータに依存することになる。例えば、鼻腔投与製剤では、鼻腔の刺激またはヒリヒリする痛みを回避するために、いくつかの成分についてはるかに低い濃度が要求される傾向があり得る。適当な鼻腔投与製剤を提供するために、経口製剤を最大１０〜１００倍希釈することが時には望ましい。
それだけに限らないが、疾患または障害の重症度、以前の処置、被験体の全体的な健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含めたある特定の要因が、被験体を有効に処置するのに要求される投与量に影響する場合がある。さらに、治療有効量の多量体オリゴヌクレオチド化合物を用いた被験体の処置は、単回の処置を含むことができ、または好ましくは一連の処置を含むことができる。処置に使用される多量体オリゴヌクレオチド化合物の有効投与量は、特定の処置の過程にわたって増減することができることも察されるであろう。例えば、多量体オリゴヌクレオチド化合物を投与した後、被験体を監視することができる。監視からの情報に基づいて、追加の量の多量体オリゴヌクレオチド化合物を投与することができる。
投薬は、処置される病状の重症度および応答性に依存し、処置の過程は、数日〜数カ月、または治癒がもたらされ、もしくは疾患状態の縮小が達成されるまで続く。最適な投薬スケジュールは、患者の体内の標的遺伝子発現レベルの測定から計算することができる。当業者は、最適な投与量、投薬方法、および繰り返し率を容易に決定することができる。最適投与量は、個々の化合物の相対的な効力に応じて変更してもよく、一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいて有効であると判明したＥＣ５０に基づいて推定することができる。いくつかの実施形態では、動物モデルは、ヒト標的遺伝子を発現するトランスジェニック動物を含む。別の実施形態では、試験のための組成物は、動物モデルにおける標的遺伝子とヒトにおける標的遺伝子との間で保存されている配列と、少なくとも内部領域内で相補的である多量体オリゴヌクレオチド化合物を含む。
一実施形態では、多量体オリゴヌクレオチド化合物の投与は、非経口、例えば、静脈内（例えば、ボーラスとして、もしくは拡散性注入として）、皮内、腹腔内、筋肉内、クモ膜下、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、頬側、舌下、内視鏡下、直腸、口部、膣、局部的、経肺、鼻腔内、尿道、または眼球である。投与は、被験体によって、または別の人、例えば、医療提供者によってもたらすことができる。組成物は、測定用量で、または定量を送達するディスペンサーで提供することができる。送達の選択されたモードを、以下でより詳細に論じる。
Ｈ．キット
本発明のある特定の態様では、多量体オリゴヌクレオチド化合物を含む組成物を収容する容器を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、多量体オリゴヌクレオチド化合物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。いくつかの実施形態では、医薬組成物の個々の成分を、１つの容器内で提供することができる。あるいは、医薬組成物の個々の成分を、２つ以上の容器、例えば、多量体オリゴヌクレオチド化合物用の１つの容器、および担体化合物用の少なくとも別の容器内で別個に提供することが望ましい場合がある。キットは、単一ボックス内の１つまたは１つより多い容器などのいくつかの異なる構成で梱包することができる。例えば、キットに備わっている指示書に従って、異なる成分を組み合わせることができる。例えば、医薬組成物を調製および投与するために、本明細書に記載の方法に従って成分を組み合わせることができる。キットは、送達デバイスも含むことができる。
以下の実施例は、本発明の例示的な実施形態を提供するものである。当業者は、本発明の趣旨または範囲を変更することなく実施することができる多数の改変およびバリエーションを認識するであろう。このような改変およびバリエーションは、本発明の範囲内に包含されている。これらの実施例は、本発明を決して限定しない。
（実施例１）
アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計
ＡｐｏＣ３、ＡｐｏＢ、Ｈｉｆ−１α、サバイビン、およびＢ２Ｍに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、一連のバイオインフォマティクスフィルターおよびコンピュータ設計アルゴリズムを使用して選択し、または文献から得た。これらを、長さが１３、１４、またはそれ以上のヌクレオチドであるように選択し、１つまたは１つより多い化学修飾設計パターン（例えば、３ＬＮＡ−８ＤＮＡ−３ＬＮＡ）を使用して試験した。すべてのターゲティングオリゴヌクレオチド配列のリストを、表１に示し、特定の化学修飾パターンを、データが提示されている場合、明示的に指定する。設計中に考慮に入れた要因は、種の相同性、複数のヒト転写物のアライメント、オフターゲットマッチ（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｍａｔｃｈ）、ＳＮＰ、エクソン−エクソン境界、転写物のカバー率、ならびに効力およびｐｏｌｙＡ領域の統計モデルを含む。種の相同性に関して、ヒト、ラット、マウス、およびマカクの配列を考慮した。オフターゲットマッチに関して、推定される配列をヒトトランスクリプトームに対して探索し、パーフェクトマッチを、１つまたは２つのミスマッチのみを有していた化合物に沿って同定した。完全なオフターゲットマッチをまったく有さない化合物を優先したが、化合物が他の基準の多くを満たす場合、１つまたは２つのミスマッチを有する化合物を選択した。統計的分類モデルは、他のターゲティングオリゴヌクレオチドプロジェクトのための既存の社内プロジェクトから得た。これらのモデルを、潜在的なＡＳＯに適用し、活性と分類されたものを優先した。公知のＳＮＰ、エクソン−エクソン境界、およびｐｏｌｙＡ領域も、可能な場合設計において回避した。ＣｐＧモチーフなどの免疫刺激配列の回避、ポリＧ領域の回避、およびある特定のポリ−ピリミジンモチーフなどの毒性配列の回避など他のＡＳＯ設計特徴も当技術分野で周知である。
図１Ａおよび図１Ｂは、例示的な二量体／多量体コンストラクトの略図を示す。具体的には、図１Ａにおいて、２つの１４−ｍｅｒギャップマー（例えば、３ＬＮＡ−８ＤＮＡ−３ＬＮＡ）が切断可能リンカーを介して接続されており、このリンカーは、ヌクレアーゼ、ペプチダーゼなどの酵素によって、または還元もしくは酸化によって切断され得る。これは、細胞内のｐＨシフト（例えば、エンドソーム中で酸性ｐＨ）によって切断されるリンカーとすることもできる。２つのアンチセンスギャップマーは、同一（ホモ−二量体）とすることができ、それにより、単一標的ｍＲＮＡ１が抑制される。しかし、２つのアンチセンスギャップマーは、２つ以上の異なる標的と相補的であり、２つの標的（ｍＲＮＡ１およびｍＲＮＡ２）を阻害する、異なる配列（ヘテロ−二量体）、または３つ、４つ、またはそれ以上の異なる標的に特異的な三量体、もしくは四量体なども有することができる。
（実施例２）
アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成
（Ａ）オリゴマー合成の一般的な手順
すべてのオリゴヌクレオチドを、標準的なＣＰＧ支持体（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ）またはＧｌｅｎ ＵｎｙＳｕｐｐｏｒｔ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、２００〜１０００ナノモルスケールで、ＭｅｒＭａｄｅ１９２オリゴヌクレオチドシンセサイザー（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ）またはＯｌｉｇｏｐｉｌｏｔ１０シンセサイザー（ＧＥ）で、標準的なホスホラミダイトプロトコール（Ｂｅａｕｃａｇｅ， Ｓ．Ｌ．；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｍ．Ｈ．、「Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ − Ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｋｅｙ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｏｒ ｄｅｏｘｙｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９８１年、２２巻：１８５９頁）を使用して合成した。ＤＮＡ、２’−ＯＭｅ、２’−Ｆ、およびＧ−クランプ単量体は、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎまたはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから得、ＬＮＡ単量体は、他の市販源から得た。ＤＮＡ以外のすべてのホスホラミダイトは、カップリング時間を延長してカップリングさせた（例えば、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、５−プロピニル、およびＧ−クランプについて８〜１５分）。合成した後、オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、６５℃で１時間、ＡＭＡ（水酸化アンモニウムとメチルアミン水溶液の５０：５０混合物）を使用して、または５５℃で８時間、含水水酸化アンモニウムを使用して脱保護した。粗製ＤＭＴｒ−ｏｎオリゴヌクレオチドを、ＤＭＴｒ−選択的カートリッジ精製技法を介して精製し、必要であれば、ＲＰ ＨＰＬＣを介してさらに精製し、カートリッジベースの方法を介して脱塩した。あるいは、これらを、イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製した。最終的なオリゴヌクレオチドを、ＬＣ−ＭＳを使用して特徴付けた。
「Ｑｕｉｃｋ Ｓｌｏｐｅ」ソフトウェアを備えたＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｓｏｌｏ ＶＰ Ｓｌｏｐｅ（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）読み取り装置を使用して、オリゴヌクレオチドの濃度を求めた。マイクロ石英容器内で測定するのに、試料５０μｌを必要とした。最終濃度を求めるのにベールの法則を利用して、計測器により、様々な経路長での吸光度の変化を測定した。吸光係数を、最近接モデルを使用して計算した。
（Ｂ）線状二量体および三量体の合成
線状二量体および三量体の合成は、全長の配列が固体支持体上に得られるまで、すべての単量体を線状に付加することによって完了した。最初に、ＡＳＯ１を完全に合成し、その後切断可能または切断不可能リンカーＸ（例えば、トリ−チミジル、テトラ−チミジル、テトラ−ウリジル、ジスルフィドなど）を付加し、最終的にＡＳＯ１（「ホモ」二量体）、または別の配列ＡＳＯ２を有するＡＳＯ（「ヘテロ」二量体）および任意選択により別の標的ｍＲＮＡに対して向けられたものを付加した。最初に合成されるＡＳＯを、その５’末端を介してリンカーＸに接続し、一方、最終的に合成されるＡＳＯを、３’を介して接続する。これにより、切断後、３’−および５’−修飾代謝産物がもたらされる場合がある。その線形性に起因して、三量体、四量体、または他の多量体を、第２、第３、またはそれ以上の切断可能リンカー（複数可）、その後、別のＡＳＯ（１、２、または３）を付加することによって合成することができる。
上記に例示したように、例えば、配列番号（ＳＥＤ ＩＤ ＮＯ）２（ＡｐｏＣ３−ＡｐｏＣ３ホモ二量体ＡＳＯ）は、ＡＳＯ１（βＡ＊βＡ＊βＧ＊ｄＣ＊ｄＡ＊ｄＡ＊ｄＣ＊ｄＣ＊ｄＴ＊ｄＡ＊ｄＣ＊βＡ＊βＧ＊βＧ（配列番号１））を含有し、Ｘは、ｄＴ−ｄＴ−ｄＴ（トリ−チミジル）であり、式中、「−」は、ホスホジエステル連結であり、「＊」は、ホスホロチオエート連結であり、ｄＮは、２’−デオキシヌクレオチドであり、βＮは、ＬＮＡヌクレオチドである。
線状三量体の一般的な例を以下に示す：
（Ｃ）３’３’−分枝状二量体（ダブラー二量体（ｄｏｕｂｌｅｒ ｄｉｍｅｒ））の合成
対称二量体に関して、以下に例示したトリエチレングリコール（ｔｅｇ）誘導体化固体支持体、およびＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（カタログ番号１０−１９２０）製の対称ダブラー（ブランチャー）ホスホラミダイトを使用して合成を実施した。
ブランチャーホスホラミダイト（カタログ番号１０−１９２０）を固相に結合したトリエチレングリコールにカップリングした後、図１Ｃに例示したように、ＤＭＴ保護基を、酸を用いて除去し、リンカーＸとＡＳＯ１のカップリングを並行して実施した。配列番号４（βＡ＊βＡ＊βＧ＊ｄＣ＊ｄＡ＊ｄＡ＊ｄＣ＊ｄＣ＊ｄＴ＊ｄＡ＊ｄＣ＊βＡ＊βＧ＊βＧ−ｄＴ−ｄＴ−ｄＴ−ｄＴ−）２ｄｏｕｂ＊ｔｅｇに関して、リンカーＸは、ｄＴ−ｄＴ−ｄＴ−ｄＴであり、Ｙは、酸素であり、＊は、ホスホロチオエートであり、−は、ホスホジエステルであり、「ｄｏｕｂ＊ｔｅｇ」は、以下の下部構造を意味する：
並行して２本の同一鎖を合成するために、ダブルカップリングステップをオリゴヌクレオチドシンセサイザーで実施して、両鎖に対して最大カップリング効率を得た。
非対称ダブラーホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０−１９２１）を用いて、「ヘテロ」二量体の合成が可能である。したがって、ＡＳＯ１を最初にダブラーに接続し、ＡＳＯ２を２番目に接続する。
対称的ダブラーまたは枝分れストラテジーも、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ製のグリセロール様ＣＰＧ固体支持体（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｌｉｋｅ ＣＰＧ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ）（Ｎ−５２１６−０５およびＮ−７１７０−０５）を用いて実施した。対称的枝分れダブラーＮ−５２１６−０５を式ＶＩに示す。
非対称枝分れダブラーＮ−７１７０−０５を式ＶＩＩに示す。
このダブラー（ブランチャー）を用いて合成したオリゴヌクレオチド二量体は、以下の構造を有する：
（Ｄ）分枝状三量体の合成
２つの異なるＡＳＯ分子を用いた三量体の合成に関して、第１のＡＳＯ１を、ＡＳＯ１の全長の配列が固体支持体上に得られるまで、すべての単量体を線状に付加することによって合成する。次いで、切断可能（または切断不可能）リンカーＸ（テトラチミジル、テトラウリジル、ジスルフィドなど）を合成し、その後、対称なダブラーホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０−１９２０）を使用してダブラーを付加する。以下の図に示したように、リンカーＸおよびＡＳＯ１の固相合成を並行して実施した。
対称ダブラーのＤＭＴ保護基を除去した後、２つのＡＳＯ２分子を、標準的なホスホラミダイト化学を使用して３’から５’方向に同時に合成する。これにより、図１Ｄに示した構造の、２つの遊離５’末端を有する２つのＡＳＯ２分子、および１つの遊離３’末端を有する１つのＡＳＯ１分子からなる三量体がもたらされる。
３つの異なるＡＳＯ１、ＡＳＯ２、およびＡＳＯ３分子からなる分枝状三量体の合成に関して、非対称ブランチャーホスホラミダイトを、ＡＳＯ１を最初に合成し、その後、ＡＳＯ２およびＡＳＯ３を連続して合成した後、カップリングする。非対称ホスホラミダイト構造を式ＩＸに示す。得られる三量体は、図１Ｄに示した構造を有する。
式Ｘに示した「トレブラー」ホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０−１９２２）を使用することも可能であり、それにより、対称的ホモ三量体がもたらされる。
（Ｅ）合成したオリゴヌクレオチドの配列、および質量分析法による特徴付け
すべての化合物を、ＩＥＸ ＨＰＬＣまたはＩＰ−ＲＰ ＨＰＬＣによって精製し、ＬＣ−ＭＳ法を使用して特徴付けた。表１中の以下のリストは、特定の配列および修飾パターンを提供し、左側に対応する配列番号、その後に詳細な説明を伴っている。
表２は、表１中のものを含めた、本明細書全体にわたって使用される化学構造の名称についての記述的な説明文を提供する。
オリゴヌクレオチドの測定分子量を検査し、計算値と一致することが判明した（表３を参照）。
無修飾バージョンの配列（リンカー／架橋を除く）およびそれぞれの完全に修飾された配列についての配列相関を表４に示す。
表４中、
Ａは、アデノシンであり、
Ｃは、シチジンであり、
Ｇは、グアノシンであり、
Ｔは、チミジンであり、
Ｕは、ウリジンであり、
Ｚは、５−メチル−シトシンであり、
ＡＰＣは、Ｇ−クランプであり、
ＰＵは、５−プロピニル−ウリジンであり、
ＰＣは、５−プロピニル−シチジンであり、
ｄｏｕｂｔｅｇは、
である。
＊ 化学修飾（架橋／リンカーを除く）を含まない配列
＊＊ 配列番号＊に対応する完全に化学修飾された配列の配列
（実施例３）
血漿中の二量体安定性および肝臓ホモジネート中での切断
４つの異なるオリゴヌクレオチド（二量体および単量体、配列番号１、２、３、４を含む）を使用して安定性の測定を実施した。
簡単に言えば、３０μＭの濃度および３７℃で、マウスまたはサルの９５％の血漿中、および５％の肝臓ホモジネート中でオリゴ体をインキュベートした。測定用試料を、０、７、２４、および４８時間インキュベートした後に採取した。試料をフェノール／クロロホルム抽出にかけ、ＬＣ−ＭＳを使用して分析した。
詳細には、すべてのオリゴヌクレオチドの、６００μＭの最終濃度および１００μｌの最終体積を有する原液を調製した。ＣＤ１マウス（雌、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）からの肝臓約５０ｍｇの１２のピースを、個々の溶解マトリックスチューブに加えた。５％の肝臓の最終濃度（Ｗ／Ｗ）になるように計算した体積の１×ＰＢＳを、１２のチューブのそれぞれに添加した。ＢｉｏＲａｄ Ｆａｓｔ ｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、すべての試料をホモジナイズした。得られたホモジネート溶液を合わせて、１×ＰＢＳ中５％の肝臓ホモジネート約１２ｍＬを得、これをインキュベーションのために引き続いて使用した。
使用した血漿は、雌のＮＭＲＩマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）からのＮａ−クエン酸塩血漿、および雄のカニクイザルからのＫ−ＥＤＴＡ血漿（Ｓｅｒａｌａｂ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）であった。
それぞれマウスおよびサルの血漿中、ならびにマウス肝臓ホモジネート中の、それぞれの個々のインキュベーション時点（０、７、２４、および４８時間）を代表する、各オリゴ体の４つの試料を調製した。さらに、各オリゴ体およびインキュベーションマトリックスの空試料および回収試料を調製した。一般に、血漿試料は、６００μＭのオリゴ体原液５μｌを、それぞれマウスまたはサルの血漿９５μｌに添加することによって調製し、最終的なオリゴ体濃度は、３０μＭであった。回収試料は、水５μｌを血漿９５μｌに添加することによって調製した。空試料は、１００μＭの最終濃度を有する水中のオリゴ体である。肝臓の試料および回収サンプル（ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ）は、血漿の代わりにＰＢＳ中の肝臓ホモジネートを使用したことを除いて、同様に調製した。
すべての試料および回収サンプルを、３７℃でインキュベートした。試料を、０、７、２４、および４８時間後に室温に冷却し、フェノール／クロロホルム精製にかけた。そのために、水酸化アンモニウム（１５％）３７０μｌ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、１Ｍ、Ｓｉｇｍａカタログ番号４３８１６）１０μｌ、および予め混合したフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（Ｓｉｇｍａ Ｐ２０６９）８００μｌを、各試料に添加した。次いで試料を最大ボルテックス速度で１０分間ボルテックスし、４℃で２０分間インキュベートした。次いで試料を、４℃で２０分間、３５００ＲＦＣで遠心分離し、水層４００μｌを取り出し、凍結乾燥器内で乾燥させた。
乾燥した試料を水（１００μｌ）中に溶解させた。回収試料を水（９５μｌ）中に溶解させ、それぞれのオリゴ体原液（６００μＭ）５μｌでスパイクした。
ＬＣ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２００、Ｂｒｕｋｅｒ Ｅｓｑｕｉｒｅ ３０００）によって、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＯＳＴ Ｃ１８カラム（１．７μｍ、２．１×５０）を使用して、緩衝液ＡとしてＨＦＩＰ／ＴＥＡ／水（水中、３８５ｍＭの１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロパノール、１４．４ｍＭのトリエチルアミン）および緩衝液Ｂとしてメタノールを用いて、０．３ｍｌ／分の流量および６０℃のカラム温度で、試料を分析した。以下の勾配を使用した：５％のＢで３分、２．５分で５〜１５％のＢ（１０％／分）、５．５分で１５〜２３％のＢ、３分で２３〜３０％のＢ、０．５分で３０〜１００％のＢ、１００％のＢで５分、０．５分で１００〜５％のＢ、５％のＢで５分。
試料を９６ウェルプレートフォーマットで分析した。８つの標準（５、１０、１５、２０、５０、７５、９０、１００μｇ／ｍｌ；２５μｇ／ｍｌのＩＳ）、標準０（０μｇ／ｍｌ；２５μｇ／ｍｌのＩＳ）、および３つの回収試料（２０、５０、１００μｇ／ｍｌ；２５μｇ／ｍｌのＩＳ）を用いた検量線を、各オリゴ体について準備した。１つのオリゴ体に関連した試料を、同じプレート上で一緒に分析した。
標準は、以下のように調製した。組織約５０ｍｇのピースを、それぞれの臓器組織から切断し、秤量し、２．２ｍｌの９６ディープウェルプレート（ＶＷＲ７３２−０５８５）のそれぞれのウェル中に配置した。２つの鋼球（５ｍｍの直径、ＫＧＭ Ｋｕｇｅｌｆａｂｒｉｋ ＧｍｂＨ、部品番号１．３５４１）を各ウェル中に配置し、均質化緩衝液（下記参照）５００μｌ、ＤＴＴ（１Ｍ、Ｓｉｇｍａ ４３８１６）２０μｌ、プロテイナーゼＫ溶液（Ｑｉａｇｅｎ、１９１３３）５０μｌを添加した。さらに、ワーキング溶液分析物１０μｌおよびワーキング溶液内部標準１０μｌを標準の各ウェル中に添加して、（５、１０、１５、２０、５０、７５、９０、１００μｇ／ｍｌ；２５μｇ／ｍｌのＩＳ（内部標準））の対応する最終濃度を得た。標準０および回収した材料を、ワーキング溶液内部標準１０μｌのみでスパイクし、全抽出プロセスの後かつ分析の前に、ワーキング溶液分析物１０μｌで回収サンプルをスパイクした。
試料を以下のように処理した。組織約５０ｍｇのピースを、それぞれの臓器組織から切断し、秤量し、９６ディープウェルプレートのそれぞれのウェル中に配置した。２つの鋼球を各ウェル中に配置し、均質化緩衝液５００μｌ、ＤＴＴ（１Ｍ）２０μｌ、プロテイナーゼＫ溶液５０μｌを添加した。ＳＴＡＲラボ箔（ＳｔａｒＬａｂ Ｅ２７９６ ３０７０）でプレートをシールし、Ｑｉａｇｅｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｚｅｒ ３×３０秒を使用して、１７Ｈｚで試料をホモジナイズした。引き続いて、５５℃で２時間、水浴中でプレートをインキュベートし、その後、自動液体ハンドリングシステム（ＴｏｍＴｅｃ Ｑｕａｄｒａ３）を使用して、試料を新しい９６ディープウェルプレートに移した。水酸化アンモニウム（２５％）２００μｌおよびフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）５００μｌを添加した後、Ｍｕｌｔｉｔｕｂｅｖｏｒｔｅｘを使用して５分間、プレートをボルテックスした。引き続いて、プレートを４℃で１０分間インキュベートし、４℃でさらに１０分間、３５００ＲＣＦで遠心分離した。次いで、プレートをＴｏｍＴｅｃシステムに渡し、これを、水層を取り出すのに使用した。残っている有機層を、水５００μｌを添加することによって洗浄した。ＴｏｍＴｅｃシステムを使用して水相を再び取り出した。水相を合わせ、ＨＣｌ（１Ｎ）５０μｌ、ＳＡＸ Ｌｏａｄ Ｈｉｇｈ緩衝液（以下を参照）５００μｌ、およびアセトニトリル３００μｌを添加し、ＴｏｍＴｅｃシステムを使用して、上下ピペッティングによって得られた溶液を完全に混合した。プログラム「ＳＰＥ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｓａｍｐｌｅｓ １００４１６」を、後続の固相抽出手順に使用した。
ＶＡＲＩＡＮ Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ ９６スクウェアウェル ＳＡＸ １００ｍｇ（カタログ番号：Ａ３９６０８１Ｃ）を、アセトニトリル、水、およびＳＡＸロード緩衝液（以下を参照）で平衡化し、試料をロードし、ＳＡＸロード緩衝液で洗浄した。試料をＳＡＸ溶出緩衝液（下記参照）で溶出し、引き続いてＳＡＸ／ＲＰ希釈緩衝液（下記参照）で希釈した。ＷＡＴＥＲＳ Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ ＬＰ ９６ウェルプレート ６０μｍ ６０ｍｇ（部品番号１８６０００６７９）を、アセトニトリル、水、およびＳＡＸ希釈緩衝液（以下を参照）で平衡化した。試料をロードし、カートリッジを水で洗浄した。試料をＲＰ溶出緩衝液（下記参照）で溶出した。溶出プレートを８０℃で１時間凍結させ、凍結乾燥して乾燥させた。乾燥した試料を水５０μｌ中で再構成し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒを使用して、水に対して６０分間透析した。次いで試料を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰＡＣＥ／ＭＤＱシステムでＣＧＥ分析にかけた。条件は、（ｉ）キャピラリー：ｅＣＡＰ ＤＮＡ、中性、２１ｃｍ、１００μｍのＩ．Ｄ．（Ｂｅｃｋｍａｎ ＃４７７４７７）、（ｉｉ）キャピラリー温度：２０℃、（ｉｉｉ）試料貯蔵温度：１０℃、（ｉｖ）ゲル：ｓｓＤＮＡ １００Ｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ ＃４７７６２１）、（ｖ）緩衝液：７Ｍの尿素を含有するＴｒｉｓ／ホウ酸／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｂｅｃｋｍａｎ ＃３３８４８１）、（ｖｉ）検出波長：２６０ｎｍ、（ｖｉｉ）分離電圧：３０ｋＶ、（ｖｉｉｉ）注入時間：６０秒、（ｉｘ）注入電圧：１０ｋＶ、（ｘ）実行時間：２０分、（ｘｉ）データ取得速度：４ｐｔ／秒であった。分析は、Ｋａｒａｔ ７．０ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用して行った。
マウスおよびサルの血漿および肝臓ホモジネート中のｉｎ ｖｉｔｒｏでの二量体の安定性を、上述したアッセイを使用して評価した。インキュベーションに引き続いて、上述したように、試料をフェノール／クロロホルム抽出法で抽出し、ＬＣ−ＭＳによって分析した。図２は、ＬＣ−ＭＳによって求めた場合の、マウスまたはサルの血漿中のｉｎ ｖｉｔｒｏでの二量体の安定性、および肝臓ホモジネート中の二量体の分解を例示する。図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれマウスおよびサルの血漿中でのＡｐｏＣ３ ＡＳＯ単量体（配列番号１、実施例２（Ｅ）により命名）ならびに切断可能ＡｐｏＣ３−ＡｐｏＣ３ ＡＳＯ二量体（配列番号２および配列番号４）の両方の遅い分解を実証する。図２Ｃは、マウス肝臓ホモジネート中での切断可能ＡｐｏＣ３−ＡｐｏＣ３ ＡＳＯ二量体（配列番号２および配列番号４）の効率的な分解、ならびにＡｐｏＣ３ ＡＳＯ単量体（配列番号１）の相対的安定性を実証する。図２Ｄは、マウスの血漿または肝臓ホモジネート中でインキュベートした切断可能（配列番号１８）および切断不可能（配列番号１９）ＡｐｏＢ−ＡｐｏＢ ＡＳＯホモ二量体を示し、血漿中での両タイプの分子の安定性、および肝臓ホモジネート中での切断可能バージョンのより効率的な分解を実証する。
（実施例４）
ＡｐｏＣ３ ＡＳＯホモ二量体を用いた様々なリンカー設計のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験（図３Ａ）
細胞培養プロトコール
ヒト肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）を、「Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｒｋｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ」（ＤＳＭＺ）から取得した。ＫＤ試験のために、３，０００〜１０，０００細胞／ウェルを９６マルチタイタープレート中に播種し（処置の１〜３日前）、処置の日に７０〜８０％のコンフルエンスを生じた。リポトランスフェクション送達技法を使用してアッセイするために、リポフェクタミン２０００（Ｌ２ｋ）０．３μｌを用いて製剤化した指定濃度のＡＳＯとともに、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）を含むアール平衡塩溶液（Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、ベルギー）中で、細胞を４８時間インキュベートした。
ノックダウン分析プロトコール
処置期間の後、標的および参照（ハウスキーピング遺伝子）ｍＲＮＡのｍＲＮＡレベルを、製造者（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｓ）の標準プロトコールに従ってＱｕａｎｔｉ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって求めた。溶解の前に、細胞生存能をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）によって分析した。不活性なスクランブルＡＳＯを陰性対照および参照（配列番号３１）として使用した。ＡＳＯとともにインキュベートする前後に、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ２．０アッセイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を利用して、Ｈｅｐ３Ｂ細胞内の標的遺伝子の発現レベルを測定した。ヒトＡｐｏＢ／ＡｐｏＣ３プローブおよびハウスキーピング遺伝子ＰＰＩＢプローブは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘから購入した。標準アッセイ手順を、製造者の推奨に従って実施した。収集の日に、２００μｌ／ウェルの溶解緩衝液（１：１００のプロテアーゼＫを含む）を細胞に添加した。合計６０μｌの溶解産物をヒトＡｐｏＣ３プローブに使用し、一方、溶解産物２０μｌを、それぞれヒトＡｐｏＢプローブおよびＰＰＩＢプローブに使用した。アッセイプレートを、ＧｌｏＲｕｎｎｅｒ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）で読み取った。データをハウスキーピング遺伝子ＰＰＩＢに対して正規化した。
トランスフェクションプロトコール
リポトランスフェクション剤を用いて製剤化した８つの連続した濃度（０．００１、０．００６、０．０３、０．２、０．８、４．０、２０、および１００ｎＭ）のオリゴヌクレオチドでＨｅｐ３Ｂ細胞を処置した。ｍＲＮＡ含量および細胞生存能を、処置して４８時間後に求めた。
上記実験の結果を図３Ａに提示する。ヒト配列に由来するすべてのホモ二量体は、ノックダウンを示す。チオール（Ｓ−Ｓ）架橋を有するホモ二量体（配列番号２および４）は、細胞毒性の増大を示した。同時に、マウスＡｐｏＣ３オルソログから作製したホモ二量体（配列番号６）は、効果的でなかった。
（実施例５）
ＡｐｏＣ３ホモ二量体を用いた切断可能対切断不可能リンカー設計のｉｎ ｖｉｔｒｏでの比較（図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｊ、図３Ｋ）
細胞を、実施例４に記載したように処置および分析した。「ジムノティック送達」のために、細胞にＡＳＯをトランスフェクトせず、代わりに、高グルコース（６ｇ／ｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含み、Ｌ−グルタミンを含まないＭＥＭ中の指定濃度の未製剤化ＡＳＯとともに８日間インキュベートした。結果を図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｊ、図３Ｋに提示する。
リポトランスフェクション技法を使用する場合、より容易に切断可能なリンカーを有するＡｐｏＣ３ホモ二量体（図３Ｂ、配列番号１５および１７）は、これらのあまり切断可能でない対応物（図３Ｂ、配列番号１６）より高いノックダウン活性を示した。同じ効果がジムノティック送達で見られた（図３Ｃ）。図３Ｊは、ＡｐｏＣ３ホモ二量体（配列番号１５）からのノックダウン活性は、単量体として使用した同じ配列（配列番号３０）と比較してより良好であることを示す。図３Ｋは、ＡｐｏＣ３ホモ二量体は、代謝的に不安定なリンカーを介して接続されている場合（配列番号１５）、安定なリンカーによって接続されたその対応物（配列番号１６）よりはるかに有効であることを示す。
（実施例６）
ＡｐｏＢホモ二量体を用いた切断可能対切断不可能リンカー設計のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験（図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｈ、図３Ｉ）
細胞培養、ノックダウン分析、およびトランスフェクション手順を、実施例５に記載したように実施した。結果を図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｈ、および図３Ｉに提示する。リポトランスフェクションアッセイにおいて、容易に切断可能なリンカーを有するＡｐｏＢホモ二量体（図３Ｄ、配列番号１８、２０）は、これらの代謝的に（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ）より安定な類似体（図３Ｄ、配列番号１９）より高いノックダウン活性を示した。同じ効果がジムノティック送達で見られた（図３Ｅ）。図３Ｈは、ＡｐｏＢホモ二量体（配列番号１８）からのノックダウン活性は、単量体として使用した同じ配列（配列番号１３）と比較してより良好であることを示す。図３Ｉは、ＡｐｏＢホモ二量体は、代謝的に不安定なリンカーを介して接続されている場合（配列番号１８）、安定なリンカーによって接続されたその対応物（配列番号１９）よりはるかに有効であることを示す。
（実施例７）
ＡｐｏＢホモ二量体を用いた、異なる長さの切断可能リンカーのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験（図３Ｆ、３Ｇ）
細胞培養、ノックダウン分析、およびトランスフェクション手順を、実施例５に記載したように実施した。結果を図３Ｆおよび図３Ｇに提示する。図３Ｆについて、漸増数のＤＮＡ−ホスホジエステル連結（１（配列番号４４）〜８（配列番号４９）の範囲）を使用してＡｐｏＢ ＡＳＯ配列を連結した。リンカーの長さを長くしても、ホモ二量体のノックダウン活性に有意な効果を有さなかった。図３Ｇは、異なる長さ（１（配列番号５１）〜４（配列番号５４））のＲＮＡ−ホスホロチオエートリンカーを使用しても、ホモ二量体のノックダウン活性に有意なインパクトを生じなかったことを実証する。
（実施例８）
リポトランスフェクションおよびジムノティック送達を使用する、切断可能ＡｐｏＢ／ＡｐｏＣ３ ＡＳＯヘテロ二量体のノックダウン活性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性評価（図４Ａおよび図４Ｂ）
細胞培養、ノックダウン分析、およびトランスフェクション手順を、実施例５に記載したように実施した。結果を図４Ａおよび図４Ｂに提示する。ここで、使用したトランスフェクション方法（図４Ａ−リポトランスフェクション；図４Ｂ−ジムノティック送達）とは独立して、ＡｐｏＣ３（配列番号３０）およびＡｐｏＢ（配列番号１３）の単量体は、標的ｍＲＮＡの特異的ノックダウンを示し、ＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢヘテロ二量体（配列番号２１および２２）は、両標的に潜在的な固有のノックダウンを示す。
（実施例９）
様々な化学修飾を有する切断可能ＡｐｏＢ／ＡｐｏＣ３ヘテロ二量体のノックダウン活性についてのジムノティック送達によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性評価（図４Ｃ、図４Ｄ、図４Ｅ、図４Ｆ、図４Ｇ、図４Ｈ、図４Ｉ、および図４Ｊ）
細胞培養、ノックダウン分析、およびトランスフェクション手順を、実施例５に記載したように実施した。結果を図４Ｃおよび図４Ｄに提示する。図４Ｃにおいて、異なる修飾（例えば、２’−ＯＭｅ、２’Ｆ、５−プロピニル）を有するすべてのＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢヘテロ二量体は、両標的に対して同等のノックダウン活性を示した。図４Ｄは、５−プロピニル修飾（配列番号４１および４２）ならびに異なる量のＬＮＡモチーフ（配列番号４０）も、全体的なノックダウン活性を変化させないことを示す。しかし、ＡｐｏＢ ＡＳＯ配列にＧ−クランプ修飾を使用すると（配列番号３８）、ＡｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウン潜在性が減少する。図４Ｆ〜Ｊは、設計に使用した個々のヘテロ二量体対単量体を表す。図４Ｅにおいて、配列番号１３および配列番号５５からアセンブルしたヘテロ二量体（配列番号３３）は、両標的に対するノックダウン活性を増大させる。図４Ｆにおいて、配列番号１３および配列番号５６からアセンブルしたヘテロ二量体（配列番号３４）は、ＡｐｏＢ標的についてのみ、より低い濃度で効力を増大させた。図４Ｇにおいて、配列番号１３および配列番号５７からアセンブルしたヘテロ二量体（配列番号３５）は、ＡｐｏＢについて、より低い濃度で効力を増大させ、一方、ＡｐｏＣ３について活性を失った。図４Ｈにおいて、配列番号１３および配列番号５８からアセンブルしたヘテロ二量体（配列番号３６）は、ＡｐｏＢについて、より低い濃度でノックダウン効力を増大させ、一方、ＡｐｏＣ３について活性を失った。図４Ｉにおいて、配列番号１３および配列番号１からアセンブルしたヘテロ二量体（配列番号３９）は、ＡｐｏＢについて、より低い濃度で効力を増大させ、一方、ＡｐｏＣ３についてノックダウン活性の強い増大を示した。図４Ｊにおいて、配列番号１３および配列番号３０からアセンブルしたヘテロ二量体の配列番号２１は、ＡｐｏＢについて、ノックダウンの改変をまったく示さず、一方、ＡｐｏＣ３ノックダウン活性は減少した。
（実施例１０）
ジムノティック送達を使用する、切断可能Ｈｉｆ−１α／サバイビンヘテロ二量体対その親単量体のノックダウン活性の直接比較（図４Ｋ）
細胞培養、ノックダウン分析、およびトランスフェクション手順を、実施例５に記載したように実施した。図４Ｋ中のダイアグラムは、アセンブルされたＨｉＦ−１α（Ｈｉｆ−１ａ）／サバイビンヘテロ二量体（配列番号２３）は、両親配列（配列番号２７および２８）の個々のノックダウン潜在性を受け継ぐことを表す。
（実施例１１）
ジムノティック送達を使用する、切断可能ＨＩＦ−１α／ＡｐｏＢヘテロ二量体対その親単量体のノックダウン活性の直接比較（図４Ｌ）
細胞培養、ノックダウン分析、およびトランスフェクション手順を、実施例５に記載したように実施した。図４Ｌ中のダイアグラムは、アセンブルされたＨＩＦ−１α／ＡｐｏＢヘテロ二量体（配列番号２５）は、両親配列（配列番号１３および２７）の個々のノックダウン潜在性を受け継ぐことを表す。
（実施例１２）
ジムノティック送達を使用することによる、切断可能ＨＩＦ−１α／ＡｐｏＢ／ＡｐｏＣ３ヘテロ三量体対その親単量体のノックダウン活性の直接比較（図４Ｍ）
細胞培養、ノックダウン分析、およびトランスフェクション手順を、実施例５に記載したように実施した。図４Ｍ中のダイアグラムは、アセンブルされたＨＩＦ−１α／ＡｐｏＢ／ＡｐｏＣ３ヘテロ三量体（配列番号２６）は、すべての親配列（配列番号１３、配列番号２７、配列番号３０）の個々のノックダウン潜在性を受け継ぐことを表す。活性の減少がＡｐｏＣ３およびＡｐｏＢについて観察された。
（実施例１３）ｉｎ ｖｉｖｏでの二量体および単量体の活性の比較
Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド上にあり、ヒトプロモーターを含めたヒトａｐｏＣ３遺伝子を発現する、雄および雌のヒトＡｐｏＣ３トランスジェニックマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ Ｓｔｏｃｋ ９０５９１８、Ｂ６；ＣＢＡ Ｔｇ （ＡＰＯＣ３）３７０７Ｂｒｅｓ／Ｊ）において、急性ｉｎ ｖｉｖｏ活性評価を実施した。本試験で使用した雄（２２〜３０ｇ）および雌のマウス（２０〜２５ｇ）は、生後１０週であり、規則的な固形飼料食餌が与えられた。
ＡｐｏＣ３ ＡＳＯホモ二量体（配列番号４、５、２、もしくは３）またはＡｐｏＣ３ ＡＳＯ単量体の配列番号１を、皮下（ｓｃ）注射直前に、各投薬に対して滅菌ＰＢＳ ｐＨ７．０（Ｇｉｂｃｏ）中で製剤化した。動物に、等体積（１００μｌ）のホモ二量体または単量体を、肩甲骨の間にｓｃ経路を介して投与した。並行して、等体積のＰＢＳを使用して対照群を処置した。各処置群は、３匹の雄および４匹の雌のトランスジェニックマウスからなっていた。
マウスの血液を、顎下穿刺（５０〜７５μｌ）を介して０日目および７日目、ならびに安楽死後に心穿刺によって試験終結時に（１４日目）集めた。血液を室温で血清分離チューブ内に集め、３０分間凝血させた。チューブを、室温で５分間、１０００ｒｐｍで回転させ、セパレーター層の上の血清を集め、直ちにアリコートし、この先分析するために−８０℃で凍結させた。ＡｐｏＣ３タンパク質を、ＥＬＩＳＡを使用して判定した（Ｗａｎｇら、Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、２０１１年、５２巻（６号）：１２６５〜７１頁）。
肝臓内のＡｐｏＣ３発現に対する効果も試験終結時（１４日目）に評価し、ベースラインＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡレベルを、試験の０日目に安楽死させたマウスの群から求めた。安楽死直後に肝葉を切除し、液体窒素中でスナップ凍結させた。ＲＮＡを引き続いて単離し、ＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡ発現を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｂＤＮＡキット（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して判定した。ＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡ発現を、マウスＧＡＰＤＨ、ハウスキーパー遺伝子に対して正規化し、ＰＢＳ処置対照群と比較した際のＡｐｏＣ３ノックダウン（ＫＤ）率として報告した。
ｉｎ ｖｉｖｏ試験の結果を図５Ａ〜Ｃに示す。これらの図は、試験した条件下で、ノックダウンの時間経過は、二量体アンチセンスＯＤＮ中の２つのアンチセンス部分を接続するのに使用したリンカーのタイプに依存したことを実証する。図５Ａは、エンドヌクレアーゼ感受性ホスホジエステル連結ホモ二量体（配列番号４および配列番号２）で処置した後のヒトＡｐｏＣ３トランスジェニックマウスにおける肝臓ＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡレベルの低減の関連した増大を実証する。ヒトＡｐｏＣ３トランスジェニックマウスに、単回皮下用量の、同じ単量体のジスルフィド連結ホモ二量体であるホモ二量体（配列番号５もしくは３）（それぞれ１０ｍｇ／ｋｇで）、またはビヒクルを投与した。配列番号４および２は、１４日後に、単量体（配列番号１）と比較して、肝臓ＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡレベルの低減の増大を呈した。図５Ｂおよび図５Ｃは、ヒトＡｐｏＣ３トランスジェニックマウスにおける、単量体および二量体ＬＮＡギャップマー（配列番号４および３）を単回１０ｍｇ／ｋｇ投薬して７日後（図５Ｂ）および１４日後（図５Ｃ）のＡｐｏＣ３タンパク質ノックダウンを示す。合計８つのホスホジエステル連結を有する３’３’−ホスホジエステル連結二量体（配列番号４）は、単回１０ｍｇ／ｋｇ投薬後に、ノックダウンの最速の開始を示す。これは、薬物動態学的／薬力学的性質は、望ましいリンカーを選択することによって調節することができることを実証する。
（実施例１４）
二量体の生体内分布
別個のｉｎ ｖｉｖｏ実験において、３つの二量体（配列番号４、２、および３）のバイオ分布をマウスにおいて調査した。Ｋａｒａｔ ７．０ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を備えたＰＡＣＥ／ＭＤＱシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で実施したキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）によって、切断生成物を分析した。さらなるパーツは、ｅＣＡＰ ＤＮＡキャピラリー、中性、２１ｃｍ、１００μｍのＩ．Ｄ．（Ｂｅｃｋｍａｎ ＃４７７４７７）；ｓｓＤＮＡ １００Ｒゲル（Ｂｅｃｋｍａｎ ＃４７７６２１）；緩衝液：７Ｍの尿素を含有するＴｒｉｓ／ホウ酸／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｂｅｃｋｍａｎ ＃３３８４８１）であった。Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＯＳＴ Ｃ１８ １．７μｍ（部品番号１８６００３９４９）カラムと一緒に、Ｂｒｕｋｅｒ Ｅｓｑｕｉｒｅ ６０００およびＡｇｉｌｅｎｔ １２００ＨＰＬＣシステムで実施したＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ実験を使用して、切断生成物をさらに特徴付けた。組織のホモジナイゼーションを、Ｍｕｌｔｉ−Ｔｕｂｅ Ｖｏｒｔｅｘｅｒ（ＶＷＲ）およびＬｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｄ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて行った。プレート振盪は、ＶａｒｉｏＭａｇ ｍｏｎｏｓｈａｋｅｒを使用して行った。ディープウェルプレートは、ＶＷＲ（２．２ｍｌ、カタログ番号７３２−０５８５）製であり、透明シールダイヤモンド箔（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号７３２−４８９０）でシールした後、組織のホモジナイゼーションを行い、Ｒｅ−Ｓｅａｌ（３Ｍ Ｅｍｐｏｒｅ ９８−０６０４−０４７２−４接着剤（ａｄｈｅｓｉｖｅ））を使用して、フェノール／クロロホルム−抽出のために再びシールした。アセトニトリルは、Ｍｅｒｃｋから購入した。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１、Ｐ２０６９−１００ＭＬ）、およびジチオトレイトール（ＤＴＴ、カタログ番号４３８１６）は、Ｓｉｇｍａ製であり、プロテイナーゼＫは、Ｑｉａｇｅｎ製（カタログ番号１９１３３）であり、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−ｌｙｚｅｒ（２００μｌ、１０ｋＤａのカットオフ）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ハイグレード１８ＭＯｈｍ−１水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ｓｙｓｔｅｍ）を試薬および試料の調製に使用した。ＴｏｍＴｅｃ Ｑｕａｄｒａ３システムをすべての液体ハンドリングステップに使用した。
血漿および肝臓ホモジネートの安定性実験
すべてのオリゴヌクレオチドの、６００μＭの最終濃度および１００μＬの最終体積を有する原液を調製した。
ＣＤ１マウス（雌、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）からの肝臓約５０ｍｇの１２のピースを、個々の溶解マトリックスチューブに加えた。５％の肝臓の最終濃度（Ｗ／Ｗ）になるように計算した体積の１×ＰＢＳを、１２のチューブのそれぞれに添加した。ＢｉｏＲａｄ Ｆａｓｔ ｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、すべての試料をホモジナイズした。得られたホモジネート溶液を合わせて、１×ＰＢＳ中５％の肝臓ホモジネート約１２ｍＬを得、これをインキュベーションのために引き続いて使用した。
血漿は、雌のＮＭＲＩマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）由来のＮａ−クエン酸塩血漿、雄のカニクイザル由来のＫ−ＥＤＴＡ血漿（Ｓｅｒａｌａｂ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）であった。
それぞれマウスおよびサルの血漿中、ならびにマウス肝臓ホモジネート中の、それぞれの個々のインキュベーション時間点（０、７、２４、および４８時間）を代表する、各オリゴ体の４つの試料を調製した。さらに、各オリゴ体およびインキュベーションマトリックスの空試料および回収試料を調製した。一般に、血漿試料は、６００μＭのオリゴ体原液５μｌを、それぞれマウスまたはサルの血漿９５μｌに添加することによって調製し、最終的なオリゴ体濃度は、３０μＭであった。回収試料は、水５μｌを血漿９５μｌに添加することによって調製した。空試料は、１００μＭの最終濃度を有する水中のオリゴ体である。肝臓の試料および回収サンプルは、血漿の代わりにＰＢＳ中の肝臓ホモジネートを使用した事実を別として、同様に調製した。
試験試料の分析
試料を９６ウェルプレートフォーマットで分析した。８つの標準（５、１０、１５、２０、５０、７５、９０、１００μｇ／ｍｌ；２５μｇ／ｍｌのＩＳ）、標準０（０μｇ／ｍｌ；２５μｇ／ｍｌのＩＳ）、および３つの回収試料（２０、５０、１００μｇ／ｍｌ；２５μｇ／ｍｌのＩＳ）を用いた検量線を、各オリゴ体について準備した。１つの特定のオリゴ体の試料および標準を、同じプレート上で一緒に分析した。
標準は、以下のように調製した。組織約５０ｍｇのピースを、それぞれの臓器組織から切断し、秤量し、２．２ｍｌの９６ディープウェルプレート（ＶＷＲ７３２−０５８５）のそれぞれのウェル中に配置した。２つの鋼球（５ｍｍの直径、ＫＧＭ Ｋｕｇｅｌｆａｂｒｉｋ ＧｍｂＨ、部品番号１．３５４１）を各ウェル中に配置し、均質化緩衝液（下記参照）５００μｌ、ＤＴＴ（１Ｍ、Ｓｉｇｍａ ４３８１６）２０μｌ、プロテイナーゼＫ溶液（Ｑｉａｇｅｎ、１９１３３）５０μｌを添加した。さらに、ワーキング溶液分析物１０μｌおよびワーキング溶液内部標準１０μｌを標準の各ウェル中に添加して、（５、１０、１５、２０、５０、７５、９０、１００μｇ／ｍｌ；２５μｇ／ｍｌのＩＳ）の対応する最終濃度を得た。標準０および回収サンプルを、ワーキング溶液内部標準１０μｌのみでスパイクし、全抽出プロセスの後かつ分析の前に、ワーキング溶液分析物１０μｌで回収サンプルをスパイクした。
組織約５０ｍｇのピースを、それぞれの臓器組織から切断し、秤量し、９６ディープウェルプレートのそれぞれのウェル中に配置した。２つの鋼球を各ウェル中に配置し、均質化緩衝液５００μｌ、ＤＴＴ（１Ｍ）２０μｌ、プロテイナーゼＫ溶液５０μｌを添加した。ＳＴＡＲラボ箔（ＳｔａｒＬａｂ Ｅ２７９６ ３０７０）でプレートをシールし、Ｑｉａｇｅｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｚｅｒ ３×３０秒を使用して、１７Ｈｚで試料をホモジナイズした。引き続いて、５５℃で２時間、水浴中でプレートをインキュベートし、その後、自動液体ハンドリングシステム（ＴｏｍＴｅｃ Ｑｕａｄｒａ ３）を使用して、試料を新しい９６ディープウェルプレートに移した。水酸化アンモニウム（２５％）２００μｌおよびフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）５００μｌを添加した後、Ｍｕｌｔｉｔｕｂｅｖｏｒｔｅｘを使用して５分間、プレートをボルテックスした。引き続いて、プレートを４℃で１０分間インキュベートし、４℃でさらに１０分間、３５００ＲＣＦで遠心分離した。次いで、プレートをＴｏｍＴｅｃシステムに動かし、これを、水層を取り出すのに使用した。残っている有機層を、水５００μｌを添加することによって洗浄した。ＴｏｍＴｅｃシステムを使用して水相を再び取り出した。水相を合わせ、ＨＣｌ（１Ｎ）５０μｌ、ＳＡＸ Ｌｏａｄ Ｈｉｇｈ緩衝液（以下を参照）５００μｌ、およびアセトニトリル３００μｌを添加し、ＴｏｍＴｅｃシステムを使用して、上下ピペッティングによって得られた溶液を完全に混合した。（プログラム「ＳＰＥ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｓａｍｐｌｅｓ １００４１６」を、後続の固相抽出手順に使用した）。
簡単に言えば、ＶＡＲＩＡＮ Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔｅ ９６スクウェアウェル ＳＡＸ １００ｍｇ（カタログ番号：Ａ３９６０８１Ｃ）を、アセトニトリル、水、およびＳＡＸロード緩衝液（以下を参照）で平衡化し、試料をロードし、ＳＡＸロード緩衝液で洗浄した。試料をＳＡＸ溶出緩衝液（下記参照）で溶出し、引き続いてＳＡＸ／ＲＰ希釈緩衝液（下記参照）で希釈した。ＷＡＴＥＲＳ Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ ＬＰ ９６−ウェルプレート ６０μｍ ６０ｍｇ（部品番号１８６０００６７９）を、アセトニトリル、水、およびＳＡＸ希釈緩衝液（以下を参照）で平衡化した。試料をロードし、カートリッジを水で洗浄した。試料をＲＰ溶出緩衝液（下記参照）で溶出した。
溶出プレートを−８０℃で１時間凍結させ、凍結乾燥して乾燥させた。乾燥した試料を水５０μｌ中に再構成し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒを使用して、水に対して６０分間透析した。次いで試料を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰＡＣＥ／ＭＤＱシステムでＣＧＥ分析にかけた。条件は、（ｉ）キャピラリー：ｅＣＡＰ ＤＮＡ、中性、２１ｃｍ、１００μｍのＩ．Ｄ．（Ｂｅｃｋｍａｎ ＃４７７４７７）、（ｉｉ）キャピラリー温度：２０℃、（ｉｉｉ）試料貯蔵温度：１０℃、（ｉｖ）ゲル：ｓｓＤＮＡ １００Ｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ ＃４７７６２１）、（ｖ）緩衝液：７Ｍの尿素を含有するＴｒｉｓ／ホウ酸／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｂｅｃｋｍａｎ ＃３３８４８１）、（ｖｉ）検出波長：２６０ｎｍ、（ｖｉｉ）分離電圧：３０ｋＶ、（ｖｉｉｉ）注入時間：６０秒、（ｉｘ）注入電圧：１０ｋＶ、（ｘ）実行時間：２０分、（ｘｉ）データ取得速度：４ｐｔ／秒であった。分析は、Ｋａｒａｔ ７．０ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用して行った。
すべての試料および回収サンプルを３７℃でインキュベートした。それぞれのオリゴ体およびマトリックスのタイプの試料を、０、７、２４、および４８時間後に室温に冷却し、フェノール／クロロホルム精製にかけた。そのために、水酸化アンモニウム（１５％）３７０μｌ、ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌｅ）（ＤＴＴ、１Ｍ、Ｓｉｇｍａ ４３８１６）１０μｌ、および予め混合したフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（Ｓｉｇｍａ Ｐ２０６９）８００μｌを、各試料に添加した。試料を最大ボルテックス速度で１０分間ボルテックスし、次いで４℃で２０分間インキュベートした。引き続いて、試料を、４℃で２０分間、３５００ＲＦＣで遠心分離し、水層４００μｌを取り出し、凍結乾燥器内で乾燥させた。乾燥した試料を水（１００μｌ）中に溶解させた。回収試料を水（９５μｌ）中に溶解させ、それぞれのオリゴ体原液（６００μＭ）５μｌでスパイクした。ＬＣ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２００、Ｂｒｕｋｅｒ Ｅｓｑｕｉｒｅ ３０００）によって、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＯＳＴ Ｃ１８カラム（１．７μｍ、２．１×５０）を使用して、緩衝液ＡとしてＨＦＩＰ／ＴＥＡ／水（水中、３８５ｍＭの１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロパノール、１４．４ｍＭのトリエチルアミン）および緩衝液Ｂとしてメタノール、および０．３ｍｌ／分の流量を用いて、６０℃のカラム温度で、試料を分析した。以下の勾配を使用した：５％のＢで３分、２．５分で５〜１５％のＢ（１０％／分）、５．５分で１５〜２３％のＢ、３分で２３〜３０％のＢ、０．５分で３０〜１００％のＢ、１００％のＢで５分、０．５分で１００〜５％のＢ、５％のＢで５分。
意外にも、肝臓（ＡｐｏＢおよびＡｐｏＣ３の臓器標的）、ならびに腎臓中の二量体のレベルが、単回ｉ．ｖ．ボーラス注射後に劇的に増大した。二量体を注射して２４時間後に、肝臓内で、合計量の約１０〜１６％の単量体代謝産物が見つかり（表５）、一方、別個の試験で、マウスまたはサルにおいて単量体の１４−ｍｅｒ（配列番号１）の合計用量の２〜５％のみが（表６）検出されることが以前に公知であった。したがって、二量体は、単量体と比較して、肝臓および腎臓への著しくより高い生体内分布を呈した。表５は、マウス内に単回ｉ．ｖ．ボーラス注射して２４時間後の、合計投与用量のパーセントとしてのアンチセンス二量体の配列番号２，３、および４の臓器分布を示す。（ピーク１は、分解生成物を指し、一方、ピーク２は、残っている二量体出発材料である。両成分の和は、対応する臓器内の合計用量のパーセンテージを表す）。二量体と比較した、以前の試験でのマウスおよびサルにおける、投与された合計のパーセントとしての単量体の配列番号１の臓器分布（最後の行）を表６に示す。パーセント合計用量の計算は、５ｋｇのサル、１３５ｇの肝臓、３０ｇの腎臓に基づいた（Ｄａｖｉｅｓら、Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．、１９９３年、１０巻（７号）：１０９３頁）。
注射した二量体のほとんどは、既に処理されて単量体形態になったので、高レベルの単量体等価物（ピーク１）は、非常に意外であった（図６に示した、最短の保持時間を有する左のピーク１）。配列番号２の二量体の場合では、インタクトな二量体、ならびに単量体、およびリンカーの不完全な切断からの追加のｄＴを有する単量体（配列番号１＋ｄＴ）が６．４５８分に検出された。内部標準（ＩＳ）は、ポリ−（ｄＴ）３０ホスホロチオエートである。二量体の配列番号４および２は、既に完全に変換されて、単量体（配列番号１）および単量体＋ｄＴを含む単量体形態になっていた。ジスルフィドリンカーを有する二量体の配列番号３の場合では、単量体切断生成物は、還元的ジスルフィド切断から生じる単量体よりわずかに大きかった。これは、図に「＃１＋Ｘ」として示されており、ここで、Ｘは、分子量が１００Ｄａ未満の依然として未同定の有機ラジカルである。その「＃１＋Ｘ」は、ジスルフィド結合の還元切断ではなく、酸化切断から生じると仮定され得る。二量体が血清中で既に切断されていた場合、肝臓および腎臓へのバイオ分布は、単量体と比較してそれほど劇的に増大しなかったはずである。したがって、血漿中、および肝臓ホモジネート中の二量体の安定性を調査した。二量体の血漿安定性は、４８時間超と相対的に高く、一方、この二量体は、肝臓ホモジネート中で急速に切断されることが、実施例３で実証された。肝臓ホモジネート処置から抽出される試料のさらなる切断生成物分析により、二量体は、単量体形態に完全に変換されることが示された。この観察結果は、二量体が動物内への注射後に相対的に安定であるバイオ分布機構と適合する。二量体は、対応する単量体とは対照的に、肝臓および腎臓のような臓器に、より効率的に分布した。臓器（例えば、肝臓および腎臓）内で、二量体は、切断されて単量体になり、通常のアンチセンスオリゴヌクレオチドとして作用することができる。二量体は、血清（血漿）中で安定であるので、適切なリンカー化学を使用することによって、臓器特異的切断を起こすようにリンカーを設計することができる。
（実施例１５）
切断可能ＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体のｉｎ ｖｉｖｏでの活性評価
切断可能リンカーでＡｐｏＢ ＡＳＯに連結されたヒトＡｐｏＣ３ ＡＳＯのヘテロ二量体のｉｎ ｖｉｖｏ活性を、殺した時に生後１４〜１８週であった雄および雌のヒトＡｐｏＣ３トランスジェニックマウスにおいて評価した。
ＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（配列番号２１）または非ターゲティングＡＳＯ（配列番号１１９）を、尾静脈を介した静脈内（ｉｖ）注射直前に滅菌生理食塩水（ｐＨ７．０）中で製剤化した。ヘテロ二量体（０．３、１、３、もしくは１０ｍｇ／ｋｇ）、または陰性対照ＡＳＯ（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクル対照としての生理食塩水（０ｍｇ／ｋｇ）を、５ｍｌ／ｋｇの体積で動物に投与した。
マウスの群は、２匹の雄および２匹の雌のトランスジェニックマウスからなっており、これらを、処置投与後、１日目、３日目、７日目、１４日目、および２９日目に殺した。ＣＯ２吸入による安楽死後、血液を心穿刺によって得た（０．５〜１ｍｌ）。肝臓を解剖し、秤量し、断片を、標識した組織診断カセット内に保存し、液体窒素中に浸漬することによってスナップ凍結させた。肝臓試料を、後続の分析のために、−８０℃で維持した。
各血液試料を半分に分割した。血清を血清分離チューブ内で調製し、これらを氷上で４時間凝血させた。血漿を、ＥＤＴＡ含有チューブ内で調製し、これらを、処理するまで氷上で維持した。チューブを、４℃で５分間、１０，０００ｒｐｍで回転させ、上清を集め、この先分析するために−８０℃で凍結させた。
標的ｍＲＮＡの定量化
Ｆａｓｔｐｒｅｐ２４ Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｔｉｒｘ Ｄチューブ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）内でホモジナイズしたスナップ凍結した組織から、全肝臓ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）中で単離した。Ｔｒｉｚｏｌ−クロロホルム抽出の後、製造者の指示書に従って、カラムベースの方法（Ｑｉａｇｅｎ、ＲＮｅａｓｙ）を使用してさらに精製した。精製は、室温で１５分間のＤＮａｓｅ Ｉでの処理を含んでいた（Ｑｉａｇｅｎ、Ｒｎａｓｅ−Ｆｒｅｅ Ｄｎａｓｅ）。ＲＮＡの量および純度を、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで読み取ることによって（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）、分光光度法で（ｓｐｅｃｔｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）計測した。肝臓断片を、ＲＬＴ緩衝液およびＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて溶解させ、次いで、上記に示したように、ＲＮｅａｓｙカラムによって精製した。
試料を製造者の指示書（Ｑｉａｇｅｎ、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＲＴ−ＰＣＲキット）に従って増幅させた。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施した。すべての試料を、Ｍｉｃｒｏａｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ３８４ウェル反応プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、三つ組で分析し、内部対照としてＧａｐｄｈシグナルを用いて正規化した。プライマーは、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｍ００４４５６７０＿ｍ１およびＨｓ００１６３６４４＿ｍ１）、アポリポタンパク質Ｂ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｍ０１５４５１５６＿ｍ１およびＨｓ０１０７１２０９＿ｍ１）、ならびにＭｏｕｓｅ ＧＡＰＤＨ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４３５２９３２Ｅ）であった。結果を、ビヒクル処置試料に対して誘導倍率として表現する。
標的ｍＲＮＡのそれぞれのデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアで変数として「時間」および「処置」を使用して、二元配置ＡＮＯＶＡによって分析した。有意な主効果（ｐ≦０．０５）が観察された場合、ボンフェローニポストホックテストを行った。
このｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を、図７Ａおよび図７Ｂに示す。データは、配列番号２１、すなわち、エンドヌクレアーゼ感受性ホスホジエステルリンカーを有するＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢヘテロ二量体ＡＳＯが、両方の標的ｍＲＮＡ［すなわち、ヒトＡＰＯＣ３（図７Ａ）およびマウスＡｐｏＢ（図７Ｂ）］の肝臓発現を有意に下方制御したことを実証する。標的ｍＲＮＡノックダウンは、投与した用量および時間の両方に依存した。すなわち、より多くのＡＳＯコンストラクトを投与された動物において、より大きい標的ノックダウンが観察された。任意の用量レベルに対するノックダウンの最大の程度は、投与後第１週の間に観察され、有意な効果は、試料を得た最長時点である、投与後２９日目まで持続した。
（実施例１６）
ヘテロ二量体ＡＳＯおよび単量体のｉｎ ｖｉｖｏでの比較：標的ｍＲＮＡに対する効果
ＡｐｏＢ ＡＳＯに連結したヒトＡｐｏＣ３ ＡＳＯの３つのヘテロ二量体、ＡｐｏＣ３ ＡＳＯ単量体、ＡｐｏＢ ＡＳＯ単量体、および２つの単量体の物理的組合せのｉｎ ｖｉｖｏ活性を、殺した時に生後９〜１８週であった雄のヒトＡｐｏＣ３トランスジェニックマウスにおいて評価した。
４つのジエステル塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（切断可能；配列番号２１）、または４つのホスホチオエート塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（安定；配列番号５９）、またはＰＥＧ−６で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（安定；配列番号６０）、またはＡｐｏＣ３単量体ＡＳＯ（配列番号３０）、またはＡｐｏＢ単量体ＡＳＯ（配列番号１３）、またはＡｐｏＣ３およびＡｐｏＢ単量体の物理的組合せ（配列番号３０＋配列番号１３）、または非ターゲティングＡＳＯ（配列番号１１９）を、尾静脈を介した静脈内（ｉｖ）注射直前に滅菌生理食塩水（ｐＨ７．０）中で製剤化した。等モル量のヘテロ二量体（０．３μＭｏｌ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ）、単量体（０．３μＭｏｌ／ｋｇ〜１．３ｍｇ／ｋｇ）、共製剤化した単量体（それぞれ０．３μＭｏｌ／ｋｇ）、または陰性対照ＡＳＯ（０．３μＭｏｌ／ｋｇ〜１．４ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクル対照としての生理食塩水（０ｍｇ／ｋｇ）を、５ｍｌ／ｋｇの体積で動物に投与した。
群は、６〜７匹の雄のトランスジェニックマウスからなっており、これらを、処置投与後、３日目または１４日目に殺した。ＣＯ２吸入による安楽死後、血液を心穿刺によって得た（０．５〜１ｍｌ）。肝臓を解剖し、秤量し、断片を、標識した組織診断カセット内に入れ、液体窒素中に浸漬することによってスナップ凍結させた。腎臓全体も標識した組織診断カセット内に貯蔵し、液体窒素中でスナップ凍結させた。肝臓および腎臓の試料を、後続の分析のために、−８０℃で維持した。
各血液試料を半分に分割した。血清を血清分離チューブ内で調製し、これらを氷上で４時間凝血させた。血漿を、ＥＤＴＡ含有チューブ内で調製し、これらを、処理するまで氷上で維持した。チューブを、４℃で５分間、１０，０００ｒｐｍで回転させ、上清を集め、この先分析するために−８０℃で凍結させた。
３日目または１４日目の標的ｍＲＮＡのそれぞれのデータを、一元配置ＡＮＯＶＡ、その後ダネットポストホック検定によって分析して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して処置間の差異を求めた。
肝臓内のｉｎ ｖｉｖｏ標的ｍＲＮＡに対するこれらの処置の効果を、図８Ａおよび図８Ｂに示す。これらの図中のデータを、マウスａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンをｘ軸にプロットし、ヒトＡｐｏＣ３（すなわち、導入遺伝子）のノックダウンをｙ軸にプロットして、標的ｍＲＮＡの％ノックダウンとしてプロットする。データは、配列番号２１、すなわち、エンドヌクレアーゼ感受性ホスホジエステルリンカーを有するＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢヘテロ二量体ＡＳＯが、両標的ｍＲＮＡの肝臓発現を下方制御した程度において、３日目（図８Ａ）および１４日目（図８Ｂ）の両方で、すべての他の処置より優れていたことを実証する。
３日目に（図８Ａ）、肝臓内のＡｐｏＢ ｍＲＮＡは、ＡｐｏＣ３標的化ＡＳＯ単量体（配列番号３０）および陰性対照ＡＳＯ（配列番号１１９）を除いて、すべての処置によって有意に減少した。一般に、０日目に与えられるコンストラクトが標的ｍＲＮＡを抑制する有効性は、処置して３日後に観察されるものより、処置投与して１４日後で弱かった。それでもやはり、肝臓内のＡｐｏＢ ｍＲＮＡ（図８Ｂ）は、ＡｐｏＣ３標的化ＡＳＯ単量体（配列番号３０）、ＰＥＧ−６で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（安定；配列番号６０）、および陰性対照ＡＳＯ（配列番号１１９）を除いて、すべての処置によって抑制された。重要なことに、配列番号２１、すなわち、エンドヌクレアーゼ感受性ホスホジエステルリンカーを有するＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢヘテロ二量体ＡＳＯで処置すると、試料を採取した時間のそれぞれにおいて、任意の他の処置より、肝臓ＡｐｏＢ ｍＲＮＡの有意に大きいノックダウンがもたらされた（図８Ａおよび図８Ｂ）。
定性的に同様の結果が、これらのヒトＡｐｏＣ３トランスジェニックマウスにおけるヒトＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡのノックダウンについて観察された。３日目に（図８Ａ）、ＡｐｏＣ３単量体（配列番号３０）、ＡｐｏＣ３およびＡｐｏ Ｂ単量体の物理的組合せ（配列番号３０＋配列番号１３）、ＡｐｏＢ単量体（配列番号１３）、４つのジエステル塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（切断可能；配列番号２１）は、ヒトＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡの発現を有意に減少させた。１４日目に（図８Ｂ）、４つのジエステル塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（切断可能；配列番号２１）のみが、ヒトＡｐｏＣ３の発現を有意に抑制した。ＡｐｏＢの抑制におけるその有効性と同様に、配列番号２１を投与すると、任意の他の処置より、肝臓ヒトＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡ発現の有意に大きいノックダウンがもたらされた（図８Ａおよび図８Ｂ）。
（実施例１７）
ヘテロ二量体ＡＳＯの組織内安定性
血漿ならびに肝臓および腎臓のホモジネート中の４つのジエステル塩基に連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（切断可能；配列番号２１）、４つのホスホチオエート塩基に連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（安定；配列番号５９）、ならびにＡｐｏＢ単量体ＡＳＯ（配列番号１３）の組織内濃度を測定するために、ハイブリダイゼーションアッセイを開発した（以下を参照）。実施例１６に記載した実験からの試料を測定した。
捕捉および検出プローブ：
ヘテロ二量体ＡＳＯに対する相補的なハイブリダイゼーションプローブを設計し、ＬＮＡ修飾ホスホジエステル骨格（ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ ＧｍｂＨ）を用いてカスタム合成した。捕捉プローブは、５’末端にアミノリンカー（Ｃ１２−アミノ）およびＳｐａｃｅｒ−１８（ヘキサエチレングリコール（ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｅ）ホスフェート、ＰＥＧ−２８２）を含有していた。検出プローブは、特定プローブ配列の３’末端でＳｐａｃｅｒ−１８を含有しており、３’末端でビオチン標識された（Ｅｌｆｅｒら、２００５年）。アッセイで使用した捕捉および検出プローブの特定配列を、以下の表に示す。
化学：
オリゴヌクレオチドの合成：以下の手順は、２つのオリゴヌクレオチド［配列番号５９（５−βＧ＊βＺ＊ｄＡ＊ｄＣ＊ｄＴ＊ｄＧ＊ｄＡ＊ｄＧ＊ｄＡ＊ｄＡ＊ｄＴ＊ｄＡ＊βＺ＊βＴ＊ｄＴ＊ｄＴ＊ｄＴ＊ｄＴ＊βＧ＊βＺ＊ｄＡ＊ｄＴ＊ｄＴ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＴ＊ｄＡ＊ｄＴ＊βＴ＊βＺ＊βＡ−３’）および配列番号６０（５’−βＧ＊βＺ＊ｄＡ＊ｄＣ＊ｄＴ＊ｄＧ＊ｄＡ＊ｄＧ＊ｄＡ＊ｄＡ＊ｄＴ＊ｄＡ＊βＺ＊βＴ−ＨＥＧ−βＧ＊βＺ＊ｄＡ＊ｄＴ＊ｄＴ＊ｄＧ＊ｄＧ＊ｄＴ＊ｄＡ＊ｄＴ＊βＴ＊βＺ＊βＡ−３’）］の合成を扱う。合成は、ＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ １０ Ｐｌｕｓシンセサイザーで標準合成プロトコールを使用して、表８に要約した条件を使用して実施した。
５５℃で１７時間、水酸化アンモニウムおよびエタノールの溶液（３：１）を使用して、オリゴヌクレオチドを固体支持体から切断した。Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑカラム、および水酸化ナトリウムを含有する緩衝系を使用して、２ステップＩＥＸ精製手順で、粗オリゴヌクレオチドを精製した。ＥＳＩ−ＭＳを使用して質量分析計分析を行い、ＨＰＬＣおよび一般的な方法を使用して純度を確かめた。ＬＡＬ試験手順を使用して、エンドトキシンレベルを測定した。
捕捉および検出プローブの合成：この手順は、捕捉および検出プローブの両方［配列番号１２０（５’−（Ｃ１２−アミノ）（Ｓｐａｃｅｒ−１８）（Ｓｐａｃｅｒ−１８）−βＧ−βＣ−βＡ−βＡ−βＡ−βＡ−βＡ−βＧ−３’）；配列番号１２２（５’−βＴ−βＣ−βＡ−βＧ−βＴ−βＧ−βＣ−（Ｓｐａｃｅｒ−１８）（Ｓｐａｃｅｒ−１８）（ｄＴ−ビオチン）（ビオチンＴＥＧ）−３’）；配列番号１２３（５’−（Ｃ１２−アミノ）（Ｓｐａｃｅｒ−１８）（Ｓｐａｃｅｒ−１８）−βＴ−βＧ−βＡ−βＡ−βＴ−βＡ−βＣ−３’）、および配列番号１２１（５’−βＣ−βＡ−βＡ−βＴ−βＧ−βＣ−（Ｓｐａｃｅｒ−１８）（Ｓｐａｃｅｒ−１８）（ｄＴ−ビオチン）（ビオチンＴＥＧ）−３’）］の合成を扱う。合成は、ＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ １０ Ｐｌｕｓシンセサイザーで標準合成プロトコールを使用して、表９に要約した条件を使用して実施した。
５５℃で１７時間、水酸化アンモニウムおよびエタノールの溶液（３：１）を使用して、オリゴヌクレオチドを固体支持体から切断した。粗オリゴヌクレオチドを、２ステップＲＰ／ＩＥＸ精製手順で精製した。ＲＰ精製は、ＴＥＡＡ含有緩衝系を適用することによるものであり、ＩＥＸ精製は、生理的条件で実施した。質量分析計分析を、ＥＳＩ−ＭＳを使用して行い、ＨＰＬＣおよび一般的な方法を使用して純度を確かめた。
組織試料調製：
肝臓および腎臓ホモジネートを、ヘテロ二量体ＡＳＯまたは単量体ＡＳＯで処置した動物から調製した。指定時点で集めた組織試料を、１．４ｍｍのセラミック球ビーズを含有する、すぐに使えるＬｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｄチューブ（カタログ番号６９１３−１００、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）内で刻み、秤量した。ＤＮａｓｅ／ＲＮＡｓｅを含まない水（カタログ番号ＳＨ３０５３８．０２、Ｔｈｅｒｍｏ）を、組織１ｇ当たり５ｍＬまたは１０ｍＬの比でチューブに添加した。ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｆａｓｔ Ｐｒｅｐ−２４を使用して、４℃で２０秒にわたって２回、各組織試料を混合およびホモジナイズした。組織ホモジネートをフリーザー内に貯蔵し、または氷上で保持した後、ハイブリダイゼーションアッセイで分析した。
標準および対照の調製：
標準およびアッセイ品質対照（ＱＣ）をＫ２ ＥＤＴＡ血漿または対照組織マトリックス中で調製し、１００ｎｇ／ｍＬ〜０．０９８ｎｇ／ｍＬに２倍のステップで連続的に希釈した。ＱＣは、５０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、および０．４ｎｇ／ｍＬに設定した。標準およびＱＣを、試料とともにハイブリダイゼーションアッセイによって分析した。
比色検出を用いたハイブリダイゼーション法：
ＤＮＡ−Ｂｉｎｄプレート（９６ウェル）（カタログ番号２５０５、Ｃｏｓｔａｒ）を、ＨＥＰＥＳ／１ｍＭのＮａ２ ＥＤＴＡ緩衝液中５０ｎＭの捕捉プローブ１００μＬで、４℃で一晩被覆した。次いでプレートを洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ緩衝液／０．１％のＴｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ／３％ ＢＳＡ）中で１〜２時間インキュベートした。３０μＬの試料、標準、およびＱＣを、Ｃｏｓｔａｒクラスターチューブ内でハイブリダイゼーション緩衝液（４×ＳＳＣ／０．５％のＳａｒｋｏｓｙｌ）中５０ｎＭの検出プローブ２７０μＬと混合し、混合物からの２つの１００μＬのアリコートを９６ウェルＰＣＲプレート中に移し、サーモサイクラーで、９５℃で１２．５分間変性させた。試料を４０℃に冷却した後、これらを、捕捉プローブで既に被覆されたＤＮＡ−Ｂｉｎｄプレートに移した。プレートをシールし、４０℃で２時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後に、ポリ−ＨＲＰ希釈緩衝液（カタログ番号Ｎ５００、Ｔｈｅｒｍｏ）中で１：１０，０００希釈のポリ−ＨＲＰストレプトアビジンコンジュゲート（カタログ番号Ｎ２００、Ｔｈｅｒｍｏ）を添加した。発色（ｃｏｌｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）を、ＳｕｒｅＢｌｕｅ ＴＭＢ基質（カタログ番号５２−００−００、ＫＰＬ）を添加することによって開始し、ＴＭＢ基質用停止試薬（カタログ番号Ｓ５８１４、Ｓｉｇｍａ）を用いて停止した。
結果：
４つのジエステル塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（切断可能；配列番号２１）、または４つのホスホチオエート塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（安定；配列番号５９）を、上述したように、肝臓または腎臓（それぞれｎ＝２）中にスパイクし、ホモジナイズした。ホモジネートを分割して２つのアリコートにした。アリコートの一方は、−８０℃で貯蔵し、他方のアリコートは、３７℃で１５時間置いた後、−８０℃で貯蔵した。２つのアリコートを解凍し、ハイブリダイゼーションアッセイを用いてヘテロ二量体ＡＳＯおよびａｐｏＢ単量体の濃度について一緒に分析した。
図９Ａおよび図９Ｂに示したように、両ヘテロ二量体の濃度は、３７℃で一晩インキュベートした後でより低く、生理的温度で、組織中で分解したことを示唆する。ＡｐｏＢ単量体ＡＳＯは、４つのジエステル塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（切断可能；配列番号２１）でスパイクした肝臓および腎臓試料の両方中で代謝産物として検出可能であり、レベルは、３７℃でインキュベートした試料中より５倍超高かった。４つのホスホチオエート塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（安定；配列番号５９）でスパイクした後、ＡｐｏＢ単量体ＡＳＯは、凍結されていた肝臓ホモジネート中でのみ検出可能であった。総合すると、データは、配列番号２１は、４つのホスホチオエート塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（安定；配列番号５９）からより、４つのジエステル塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（切断可能；配列番号２１）から容易に分解されて活性ＡｐｏＢ単量体（配列番号１３）代謝産物になることを示唆する。
（実施例１８）
ヘテロ二量体ＡＳＯおよびＡｐｏＢ単量体ＡＳＯのｉｎ ｖｉｖｏでの分布
血漿中で、４つのジエステル塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（切断可能；配列番号２１）、４つのホスホチオエート塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（安定；配列番号５９）、ＡｐｏＢ単量体ＡＳＯ（配列番号１３）、またはＡｐｏＣ３およびＡｐｏＢ単量体ＡＳＯの物理的組合せ（配列番号３０＋配列番号１３）で処置した後、それぞれ３つの個体の２プールにおいて、上記方法を使用して、ヘテロ二量体ＡＳＯおよびＡｐｏＢ単量体を測定した。図１０に示したように、両ヘテロ二量体ＡＳＯは、処置して３日後に血漿中で検出された。ＡｐｏＢ単量体も、ＡｐｏＢ単量体ＡＳＯ単独、またはＡｐｏＣ３単量体との物理的組合せで処置して３日後に検出された。しかし、ＡｐｏＢ単量体ＡＳＯは、処置して３日後に４つのジエステル塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（切断可能；配列番号２１）の代謝産物として検出されたが、４つのホスホチオエート塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（安定；配列番号５９）を投与した後、検出されず、エンドヌクレアーゼ感受性リンカーは、活性ＡＳＯ単量体の代謝を高めることを実証した。分析物のいずれも、処置して１４日後に採取した血漿プール中で検出されなかった。
組織中のヘテロ二量体濃度または単量体濃度の間の差異を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、対応のないｔ−検定（ヘテロ二量体）、または一元配置ＡＮＯＶＡ、その後のボンフェローニポストホック比較（単量体）によって統計的に求めた。
腎臓において、すべての投与したコンストラクトおよびＡｐｏＢ単量体代謝産物の測定濃度は、投与して３日後と１４日後の間で有意に減少する。４つのジエステル塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（切断可能；配列番号２１）の濃度の低下が最も急速／顕著であり、これは、このコンストラクトがリンカーの切断を介した代謝に最も脆弱であるという仮説と適合する（図１１Ａおよび図１１Ｂを参照）。３日目および１４日目の両方で、ＡｐｏＢ単量体のレベルは、４つのホスホチオエート塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（安定；配列番号５９）を投与した後で最低であり、一方、インタクトな配列番号５９のレベルは、測定したコンストラクトのうちで最高である。総合すると、これらの観察結果は、相対的に安定なホスホチオエートリンカーのより遅い代謝を実証する。
肝臓において、４つのジエステル塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（切断可能；配列番号２１）は、４つのホスホチオエート塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（安定；配列番号５９）より、それぞれのコンストラクトで処置した後、低い濃度で存在し（図１２Ａおよび図１２Ｂを参照）、配列番号２１は、肝臓内でより急速に代謝されることを実証した。３日目および１４日目に測定した単量体レベルは、ＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯの測定したヘテロ二量体のいずれかで投与した後より、ＡｐｏＢ単量体（配列番号１３）を単独で、またはＡｐｏＣ３単量体との物理的組合せで投与した後で有意に低かった。３日目で、ヘテロ二量体を投与した後に代謝産物として肝臓内に存在するＡｐｏＢ単量体の濃度は、４つのホスホチオエート塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（安定；配列番号５９）より、４つのジエステル塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（切断可能；配列番号２１）を投与した後で有意に高く、エンドヌクレアーゼによる切断のために設計されたリンカーは、投与して数日以内により高い濃度の活性単量体ＡＳＯ代謝産物をもたらすことを裏付けた（図１２Ａを参照）。１４日目で、逆のことが観察された（図１２Ｂを参照）。ヘテロ二量体を投与した後に代謝産物として肝臓内に存在するＡｐｏＢ単量体の濃度は、４つのジエステル塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（切断可能；配列番号２１）より、４つのホスホチオエート塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（安定；配列番号５９）を投与した後で有意に高かった。ホスホチオエート連結ヘテロ二量体も、たとえより遅い速度であっても、組織内で分解するので、相対的により多くの単量体がこの時点で存在する。ＡｐｏＢ単量体の投与後の、または投与されたＡＳＯヘテロ二量体の代謝産物としてのＡｐｏＢ単量体のレベルは、標的ｍＲＮＡノックダウンに関連し、例えば、最高レベルのＡｐｏＢ単量体が、４つのジエステル塩基で連結したＡｐｏＣ３／ＡｐｏＢ ＡＳＯヘテロ二量体（切断可能；配列番号２１）を投与した後に存在し、最高レベルの標的ｍＲＮＡノックダウンも、この処置群において観察される（図１２Ａおよび図１２Ｂを図８Ａおよび図８Ｂと比較されたい）。
（実施例１９）
オリゴ体配列
１５−ｍｅｒのギャップマーオリゴ体を、単一単量体として、または切断可能ホスホジエステル結合を介してオリゴ−ｄＴリンカー（４塩基）によって連結されたホモ二量体（３０−ｍｅｒ）として設計した。オリゴ体は、ｍｉＲ−１２２またはＭＡＬＡＴ−１を標的にするように設計し、単量体のそれぞれの末端部における３つのＬＮＡ修飾塩基と、中央領域またはギャップ領域中の９個の無修飾ＤＮＡ塩基とからなっていた。このギャップマー設計により、ＲＮＡｓｅＨによる結合した標的ｍＲＮＡの切断が促進され、標的ｍＲＮＡ（ｍｉＲ−１２２またはＭＡＬＡＴ−１）が減少した。以下の表の配列は、上から下に、配列番号１２８〜１３５に対応する。
動物管理および処置：
動物実験は、実験動物管理評価認定協会（ＡＡＡＬＡＣ）設備内で、一定の明暗サイクル下で、標準的なマウス用食餌で維持し、食物および水に自由にアクセスさせて行った。マウスは、ＣＯ２吸入によって安楽死させた。すべてのマウス実験は、Ｖｉｖｉｓｏｕｒｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．の施設内動物管理使用委員会の指針に従って認可され、行われた。雌のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）から得、雌のＢａｌｂ／Ｃマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。オリゴヌクレオチドは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に溶解させ、皮下注射によって、体重に基づいてマウスに投与した。マウスに５０ｍｇ／ｋｇで１週間に１回（ＭＡＬＡＴ−１）、または１０ｍｇ／ｋｇもしくは５０ｍｇ／ｋｇで１週間に２回（ＭＩＲ−１２２）注射した。マウスを１週間後および試験終結時（４週間）に屠殺し、肝臓、腎臓、および血漿を収集してさらに分析した。
トリグリセリド、ＨＤＬ、および総コレステロール測定。
血液を心穿刺によって集め、総血漿をＭｉｎｉｃｏｌｌｅｃｔチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）内で遠心分離によって収集した。トリグリセリド、総コレステロール、およびＬＤＬコレステロールの血漿濃度を、製造者の推奨に従って、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで、酵素アッセイ（Ｂｉｏｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって求めた。
ＲＮＡ抽出、逆転写、およびｍＲＮＡ ｑＰＣＲ。
ＦａｓｔＰｒｅｐ−２４組織ホモジナイザー（ＭＰＢｉｏ）を使用して組織を分断し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｍｉＲＮＥａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してトータルＲＮＡを単離した。ＲＩｂｏＧｒｅｅｎプレート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｍ５マルチモーダルプレートリーダーを使用してＲＮＡ濃度を評価した。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを使用して、トータルＲＮＡ２５０ｎｇを、反応物５０ｍｌ中で、ランダム六量体で逆転写した。ｑＰＣＲは、Ｓｔｅｐ−Ｏｎｅ Ｐｌｕｓサーモサイクラーで、ＭＩＲ１２２またはＭＡＬＡＴ−１特異的ＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブを使用して、２０μｌの反応体積中で当量のｃＤＮＡ １２．５ｎｇを使用して実施した。個々の遺伝子の相対的なｑＰＣＲ発現を、ΔΔＣｔ法を使用して参照遺伝子ＧｕｓＢ（受託番号ＮＭ＿０１０３６８）、ＧＡＰＤＨ（受託番号ＮＭ＿００８０８４．２）、またはＳＮＯ−１３５（受託番号ＡＦ３５７３２３）ＲＮＡの発現に対して正規化した。
ｍｉＲ−１２２の試験結果
Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスの２つの別個のコホート（短いおよび長い投薬アーム）を分析した。マウスは雌であり、両コホートを通常の固形飼料で維持した。両コホートに、１週間に２回（１日目および４日目）皮下注射によって１０ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇで投薬した。使用したターゲティングオリゴヌクレオチドは、末端部にＬＮＡを有し（３−９−３）、完全なホスホロチオエート連結を有する１５塩基のギャップマーであった。動物を７日目（短いアーム）および２８日目（長いアーム）に安楽死させた。投薬群は、ｎ＝５であった。以下のパラメータ、すなわち、ＡＬＴ、総コレステロール、トリグリセリドをＥＬＩＳＡによって、ｅｘ ｖｉｖｏ分析で分析した。
図１３Ａおよび図１３Ｂに表したように、ｍｉＲ−１２２を標的にするオリゴヌクレオチドは、ＰＢＳ処置対照と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏで標的ｍｉＲＮＡを７５〜９０％減少させた。単量体は、ｍｉＲ−１２２の７５％のノックダウンを呈し、一方、二量体は、ｍｉＲ−１２２の９０％のノックダウンを生じさせた。
図１４Ａおよび図１４Ｂに表したように、ｍｉＲ−１２２を標的にするオリゴヌクレオチドを５０ｍｇ／ｋｇ投薬すると、ＰＢＳ処置対照と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏで標的ｍｉＲＮＡが９０〜９５％減少した。単量体は、ｍｉＲ−１２２の９０％のノックダウンを呈し、一方、二量体は、ｍｉＲ−１２２の９５％のノックダウンを生じさせた。５０ｍｇ／ｋｇの単量体は、％ｍｉＲ−１２２ノックダウンに関して、１０ｍｇ／ｋｇの二量体と等価であることが注目された。
図１５に例示したように、ｉｎ ｖｉｖｏでの結果は、１０ｍｇ／ｋｇの二量体は、５０ｍｇ／ｋｇの単量体と同様のノックダウンを呈することを示す。したがって、二量体オリゴヌクレオチドは、単量体より約５倍活性である（ｉｎ ｖｉｖｏでの７日の試験）。
ＭＡＬＡＴ−１の試験結果
出荷時に７週であった雌のＢａｌｂ／ｃマウスを評価した（Ｎ＝５）。マウスに、木曜日に５０ｍｇ／ｋｇで投薬し、テイクダウン（ｔａｋｅｄｏｗｎ）は、投薬して５日後であった。マウスから得た試料には、血清（ｔｓｅｒｕｍ）、腎臓、脳、および肝臓が含まれていた。高レベルのＭＡＬＡＴ−１を有する臓器は、心臓、腎臓、脳であり、脾臓および骨格筋において最小限で見つかった。Ｍａｌａｔ−１ノックダウンを評価するためにｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。図１６Ａ〜１６Ｃに表したように、二量体オリゴヌクレオチドは、Ｍａｌａｔ−１ ｌｎｃＲＮＡ発現をロバストに減少させた。この場合、対照のＧｕｓＢ遺伝子は、無影響であった。
本明細書は、本明細書内で引用した参考文献の教示を踏まえると最も完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の実例を提供するものであり、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきでない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明によって包含されていることを容易に認識する。当業者は、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態の多くの均等物を、日常の実験にすぎない実験を使用して認識し、または確認することができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。

Claims (99)

  1. 一般式：Ｘ−Ｌ−［Ｘ−Ｌ］ｉ−Ｘを含む化合物であって、
    式中、ｉは、０〜９の整数であり、その値は、前記化合物中に存在する［Ｘ−Ｌ］ｉの単位数を示し、
    各Ｘは、独立して、ゲノム標的配列の一標的領域と相補的な少なくとも７個の連続したヌクレオチドを含む相補性の領域を有する、長さが８〜５０ヌクレオチドのターゲティングオリゴヌクレオチドであり、各Ｌは、少なくとも２個のＸを連結し、各Ｘより哺乳動物の抽出物中で切断されやすいリンカーであり、
    ｉ＝０であるとき、かつ一般式が５’Ｘ３’−Ｌ−５’Ｘ３’であるとき、かつ第１のＸおよび第２のＸと相補的な前記標的領域が前記ゲノム標的配列中で重ならないとき、前記第１のＸと相補的な前記標的領域の５’末端および前記第２のＸと相補的な前記標的領域の３’末端は、前記ゲノム標的配列内で０〜４ヌクレオチドの距離内になく、
    少なくとも１個のＬは、自己相補性ヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含まず、少なくとも１個のＬは、２個の直接隣接するＸと相補的な前記標的領域と連続した前記ゲノム標的配列の一領域と相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含まない
    化合物。
  2. ｉが１〜９の整数である、請求項１に記載の化合物。
  3. 少なくとも１個のＬについて、前記リンカーが、前記ターゲティングオリゴヌクレオチドより前記哺乳動物の抽出物中でエンドヌクレアーゼによって切断されやすいオリゴヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の化合物。
  4. 少なくとも１個のＬが、１〜１０個のチミジンまたはウリジンを含むヌクレオチド配列を有するリンカーである、請求項１または３に記載の化合物。
  5. 少なくとも１個のＬが、ホスホジエステルヌクレオチド間連結によって連結されたデオキシリボヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有するリンカーである、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
  6. 少なくとも１個のＬが、ホスホジエステルヌクレオチド間連結によって連結された１〜１０個のチミジンを含むヌクレオチド配列を有するリンカーである、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物。
  7. 少なくとも１個のＬが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結によって連結された１〜１０個のウリジンを含むヌクレオチド配列を有するリンカーである、請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物。
  8. 少なくとも１個のＬが、式：
    を有するリンカーであり、式中、Ｚはオリゴヌクレオチドである、請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物。
  9. Ｚが、１〜１０個のチミジンまたはウリジンを含むヌクレオチド配列を有する、請求項８に記載の化合物。
  10. 少なくとも１個のＬが、自己相補性ヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含まず、２つの隣接する標的領域と連続した前記ゲノム標的配列の一領域と相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含まない、請求項１に記載の化合物。
  11. 少なくとも１個のＬが、脱塩基部位を有するオリゴヌクレオチドを含まないリンカーである、請求項１に記載の化合物。
  12. 少なくとも１個のＬについて、前記リンカーが、前記ターゲティングオリゴヌクレオチドより前記哺乳動物の抽出物中でエンドペプチダーゼによって切断されやすいポリペプチドを含む、請求項１または２に記載の化合物。
  13. 前記エンドペプチダーゼが、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、サーモリシン、ペプシン、またはエンドペプチダーゼＶ８である、請求項１２に記載の化合物。
  14. 前記エンドペプチダーゼが、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＬ、カテプシンＣ、パパイン、カテプシンＳ、またはエンドソーム酸性インスリナーゼである、請求項１３に記載の化合物。
  15. 少なくとも１個のＬが、ＡＬＡＬ（配列番号１２５）、ＡＰＩＳＦＦＥＬＧ（配列番号１２６）、ＦＬ、ＧＦＮ、Ｒ／ＫＸＸ、ＧＲＷＨＴＶＧＬＲＷＥ（配列番号１２７）、ＹＬ、ＧＦ、およびＦＦから選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含むリンカーであり、式中、Ｘは、任意のアミノ酸である、請求項１４に記載の化合物。
  16. 前記哺乳動物の抽出物中の前記切断が、ヌクレアーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、またはレダクターゼによって媒介される、請求項１または２に記載の化合物。
  17. 少なくとも１個のＬが、式−（ＣＨ２）ｎＳ−Ｓ（ＣＨ２）ｍ−を含むリンカーであり、式中、ｎおよびｍは、独立して、０〜１０の整数である、請求項１または２に記載の化合物。
  18. 少なくとも１個のＬリンカーが、低ｐＨ不安定結合を含む、請求項１または２に記載の化合物。
  19. 前記低ｐＨ不安定結合が、アミン、エステル、安息香酸アミン、アミノエステル、ジオルトエステル、ポリホスホエステル、ポリホスファゼン、アセタール、ビニルエーテル、ヒドラゾン、アジドメチル−メチルマレイン酸無水物、チオプロピオネート、マスク化エンドソーム溶解剤、またはシトラコニル基を含む、請求項１８に記載の化合物。
  20. 少なくとも１個のＬが分枝状リンカーである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物。
  21. 前記分枝状リンカーがホスホラミダイト連結を含む、請求項２０に記載の化合物。
  22. 非対称分枝状三量体である、請求項２０または２１に記載の化合物。
  23. 対称分枝状三量体である、請求項２０または２１に記載の化合物。
  24. 少なくとも１個のＬが、前記ターゲティングオリゴヌクレオチドより、哺乳動物の抽出物の存在下で切断に少なくとも２倍感受性であるリンカーである、請求項１から２３のいずれか一項に記載の化合物。
  25. 以下の一般式：
    Ｘ−Ｌ−［Ｘ−Ｌ］ｉ−Ｘ
    を有し、式中、ｉは０である、請求項１に記載の化合物。
  26. 以下の一般式：
    Ｘ−Ｌ−［Ｘ−Ｌ］ｉ−Ｘ
    を有し、式中、ｉは１である、請求項１に記載の化合物。
  27. 以下の一般式：
    を有し、式中、ｉは０である、請求項１に記載の化合物。
  28. 以下の一般式：
    を有し、式中、ｊおよびｋは、独立して０または１であり、その値はそれぞれ、前記化合物中に存在するＸｊおよびＸｋの数を示し、ＸｊおよびＸｋのうちの少なくとも１つが前記化合物中に存在する、請求項１に記載の化合物。
  29. 以下の一般式：
    を有し、式中、ｊおよびｋは、独立して０または１であり、その値はそれぞれ、前記化合物中に存在するＸｊおよびＸｋの数を示し、ｌおよびｍは、独立して０〜３の整数であり、その値はそれぞれ、前記化合物中に存在する［Ｘ−Ｌ］ｌおよび［Ｌ−Ｘ］ｍの単位数を示し、［Ｘ−Ｌ］ｌおよび［Ｌ−Ｘ］ｍのうちの少なくとも１つが前記化合物中に存在する、請求項１に記載の化合物。
  30. リンカーによって連結された、長さが８〜５０ヌクレオチドの少なくとも２つのターゲティングオリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記リンカーは、前記少なくとも２つのターゲティングオリゴヌクレオチドより、哺乳動物の抽出物の存在下で酵素的切断に少なくとも２倍感受性であり、各ターゲティングオリゴヌクレオチドは、ゲノム標的配列の一標的領域と相補的な少なくとも７個の連続したヌクレオチドを含む相補性の領域を有する、化合物。
  31. 前記リンカーが、２つのターゲティングオリゴヌクレオチドより、哺乳動物の抽出物の存在下で酵素的切断に少なくとも５倍感受性である、請求項２２に記載の化合物。
  32. 前記リンカーがオリゴヌクレオチドである、請求項３０または３１に記載の化合物。
  33. 前記オリゴヌクレオチドが、前記標的領域に直接隣り合う位置で前記ゲノム標的配列と相補的でない配列を有する、請求項３０から３２のいずれか一項に記載の化合物。
  34. 前記哺乳動物の抽出物が、腎臓、肝臓、腸、または腫瘍の組織からの抽出物である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の化合物。
  35. 前記哺乳動物の抽出物が細胞抽出物である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の化合物。
  36. 前記哺乳動物の抽出物がエンドソーム抽出物である、請求項３５に記載の化合物。
  37. 少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドが、少なくとも１個のリボヌクレオチド、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチド、または少なくとも１個の架橋型ヌクレオチドを含む、請求項１から３６のいずれか一項に記載の化合物。
  38. 前記架橋型ヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、またはＥＮＡ修飾ヌクレオチドである、請求項３７に記載の化合物。
  39. 少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドが、少なくとも１個の２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載の化合物。
  40. 少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドであって、前記デオキシリボヌクレオチドの５’末端および３’末端のそれぞれに、少なくとも１個の架橋型ヌクレオチドが隣接したデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項１から３９のいずれか一項に記載の化合物。
  41. 少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドが、少なくとも２個のヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、請求項１から４０のいずれか一項に記載の化合物。
  42. 少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドが２’Ｏ−メチルを含む、請求項１から４１のいずれか一項に記載の化合物。
  43. 少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドが、Ｇ−クランプ、５−プロピニル、または５−オクタジエニル−ピリミジンを含む、請求項１から４２のいずれか一項に記載の化合物。
  44. 少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドが、ＲＮａｓｅ Ｈ動員ヌクレオチドを含むギャップマーである、請求項１から６３のいずれか一項に記載の化合物。
  45. 少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドが一本鎖ｓｉＲＮＡである、請求項１から６３のいずれか一項に記載の化合物。
  46. 親油性部分にコンジュゲートされている、請求項１から４５のいずれか一項に記載の化合物。
  47. 細胞表面受容体に結合するターゲティング部分にコンジュゲートされている、請求項１から４６のいずれか一項に記載の化合物。
  48. 少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドが、長さが１２〜１６ヌクレオチドの範囲内である、請求項１から４７のいずれか一項に記載の化合物。
  49. 少なくとも２つのターゲティングオリゴヌクレオチドが、前記リンカーと比べて同じ５’から３’配向にある、請求項１から４８のいずれか一項に記載の化合物。
  50. 少なくとも２つのターゲティングオリゴヌクレオチドが、前記リンカーと比べて反対の５’から３’配向にある、請求項１から４８のいずれか一項に記載の化合物。
  51. 少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドが、末端ヌクレオチドによって前記リンカーに連結されている、請求項１から４９のいずれか一項に記載の化合物。
  52. 少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドが、内部ヌクレオチドによって前記リンカーに連結されている、請求項１から４９のいずれか一項に記載の化合物。
  53. 少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドが、一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１から５２のいずれか一項に記載の化合物。
  54. 少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドと相補的な前記標的領域が、遺伝子のセンス鎖中に存在する、請求項１から５１のいずれか一項に記載の化合物。
  55. 前記遺伝子が非コードＲＮＡ遺伝子である、請求項５４に記載の化合物。
  56. 前記非コードＲＮＡ遺伝子が長鎖非コードＲＮＡ遺伝子である、請求項５５に記載の化合物。
  57. 前記非コードＲＮＡ遺伝子がｍｉＲＮＡ遺伝子である、請求項５５に記載の化合物。
  58. 前記遺伝子がタンパク質コード遺伝子である、請求項５４に記載の化合物。
  59. 少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドの前記ゲノム標的配列が、ＰＲＣ−２関連領域の配列である、請求項１から５６に記載の化合物。
  60. 少なくとも２つの標的領域が、異なる遺伝子のセンス鎖中に存在する、請求項１から５９のいずれか一項に記載の化合物。
  61. 少なくとも２つの標的領域が、同じ遺伝子のセンス鎖中に存在する、請求項１から５９のいずれか一項に記載の化合物。
  62. 少なくとも２つの標的領域が異なる、請求項１から６１のいずれか一項に記載の化合物。
  63. 少なくとも２つの標的領域が同一である、請求項１から６２のいずれか一項に記載の化合物。
  64. 前記遺伝子の産物が、後成的機構によって遺伝子発現を媒介する、請求項５４に記載の化合物。
  65. 請求項１から６３のいずれか一項に記載の化合物および担体を含む組成物。
  66. 緩衝液中に請求項１から６３のいずれか一項に記載の化合物を含む組成物。
  67. 前記化合物が、前記担体にコンジュゲートされている、請求項６５に記載の組成物。
  68. 請求項１から６３のいずれか一項に記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  69. 請求項６５から６８のいずれか一項に記載の組成物を収容する容器を含むキット。
  70. 細胞内の標的遺伝子の発現を増大させる方法であって、前記細胞を請求項１から６４のいずれか一項に記載の化合物と接触させるステップと、前記化合物が前記細胞内に入る条件下で前記細胞を維持するステップとを含み、前記化合物の少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドの前記ゲノム標的配列は、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子のセンス鎖中に存在し、その産物は、前記標的遺伝子の発現を阻害する、方法。
  71. 前記細胞内に前記化合物が存在すると、前記化合物を含有しない対照細胞内の前記標的遺伝子の発現レベルより、少なくとも５０％大きい前記標的遺伝子の発現レベルがもたらされる、請求項７０に記載の方法。
  72. 被験体内の標的遺伝子のレベルを増大させる方法であって、請求項１から６４のいずれか一項に記載の化合物を前記被験体に投与するステップを含み、前記化合物の少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドの前記ゲノム標的配列は、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子のセンス鎖中に存在し、その産物は、前記標的遺伝子の発現を阻害する、方法。
  73. 被験体内の標的遺伝子のレベルの減少と関連した状態を処置する方法であって、請求項１から６４のいずれか一項に記載の化合物を前記被験体に投与するステップを含み、前記化合物の少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドの前記ゲノム標的配列は、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子のセンス鎖中に存在し、その産物は、前記標的遺伝子の発現を阻害する、方法。
  74. 細胞内の標的遺伝子の活性を調節する方法であって、前記細胞を請求項１から６４のいずれか一項に記載の化合物と接触させるステップと、前記化合物が前記細胞内に入る条件下で前記細胞を維持するステップとを含み、少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドの前記ゲノム標的配列は、前記標的遺伝子のセンス鎖中に存在する、方法。
  75. 前記標的遺伝子がタンパク質コード遺伝子であり、前記細胞内に前記化合物が存在すると、前記細胞内の前記標的遺伝子の発現が低減される、請求項７０に記載の方法。
  76. 被験体内の標的遺伝子のレベルを調節する方法であって、請求項１から６４のいずれか一項に記載の化合物を前記被験体に投与するステップを含み、少なくとも１つのターゲティングオリゴヌクレオチドの前記ゲノム標的配列は、前記標的遺伝子のセンス鎖中に存在する、方法。
  77. 少なくとも第１および第２の標的特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む、多量体オリゴヌクレオチド化合物であって、各ＡＳＯがヌクレアーゼ耐性修飾骨格を有し、前記ＡＳＯが切断可能リンカーによって一緒に連結されている、多量体オリゴヌクレオチド化合物。
  78. 前記第１および第２のＡＳＯが、同じ標的に向けられている、請求項７７に記載の化合物。
  79. ホモ二量体またはホモ三量体である、請求項７７に記載の化合物。
  80. 前記第１および第２のＡＳＯがＡｐｏＣ３に向けられている、請求項７８に記載の化合物。
  81. 前記第１および第２のＡＳＯが、異なる標的に向けられている、請求項７７に記載の化合物。
  82. ヘテロ二量体またはヘテロ三量体である、請求項８１に記載の化合物。
  83. 前記第１および第２のＡＳＯが、肝標的に向けられている、請求項８２に記載の化合物。
  84. 前記切断可能リンカーがヌクレアーゼ感受性リンカーである、請求項７７に記載の化合物。
  85. 前記切断可能リンカーがホスホジエステル連結を含む、請求項８４に記載の化合物。
  86. 前記切断可能リンカーが、ｄＴ、ポリ−ｄＴ、ｄＵ、ポリ−ｄＵ、ｒＵ、およびポリ−ｒＵから選ばれる、請求項８５に記載の化合物。
  87. 前記切断可能リンカーが、臓器特異的または組織特異的である、請求項７７に記載の化合物。
  88. 前記切断可能リンカーが肝臓特異的である、請求項８７に記載の化合物。
  89. 前記第１および第２のＡＳＯが、３’末端から３’末端で連結されている、請求項７７に記載の化合物。
  90. 前記第１および第２のＡＳＯがギャップマーである、請求項７７に記載の化合物。
  91. 前記ギャップマーが、糖残基中に２’修飾を含む、請求項９０に記載の化合物。
  92. 前記２’修飾が、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾、２’−Ｏ−メチル、および２’−フルオロから選ばれる、請求項９１に記載の化合物。
  93. 前記ギャップマーが、Ｇ−クランプ、５−プロピニル、および５−オクタジエニル−ピリミジンから選ばれる修飾を有するヌクレオチドを含む、請求項９０に記載の化合物。
  94. 前記第１および第２、ならびに任意選択により第３のＡＳＯが、それぞれ１２〜１６ヌクレオチド塩基を含有する、請求項７７に記載の化合物。
  95. 請求項７７に記載の化合物および１つまたは１つより多い薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物。
  96. ｉｎ ｖｉｖｏで投与される場合、以下の性質：
    （ａ）それぞれの単量体ＡＳＯと比較して、肝臓内の濃度の増大および腎臓によるクリアランスの低減、
    （ｂ）それぞれの単量体ＡＳＯと比較して、標的ノックダウンのより長い継続時間、ならびに
    （ｃ）それぞれの単量体ＡＳＯ、および／または前記切断可能リンカーが切断不可能リンカーで置換された同じ多量体オリゴヌクレオチド化合物と比較して、より低い有効濃度
    のうちの１つまたは複数によって特徴付けられる、請求項９５に記載の医薬組成物。
  97. １つまたは１つより多い標的のｍＲＮＡレベルを阻害する方法であって、前記標的（複数可）の発現を阻害するのに有効な量で請求項７７に記載の化合物を細胞または被験体に投与するステップを含む、方法。
  98. 前記標的（複数可）が、代謝疾患、がん、または心血管疾患に関連する、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記標的（複数可）の治療的に有効なノックダウンが、前記投与後２週間または２週間より長く持続する、請求項９７に記載の方法。
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