CZ243498A3 - Oligonukleotidy s mezerou a modifikovaným cukrem - Google Patents

Oligonukleotidy s mezerou a modifikovaným cukrem Download PDF

Info

Publication number
CZ243498A3
CZ243498A3 CZ982434A CZ243498A CZ243498A3 CZ 243498 A3 CZ243498 A3 CZ 243498A3 CZ 982434 A CZ982434 A CZ 982434A CZ 243498 A CZ243498 A CZ 243498A CZ 243498 A3 CZ243498 A3 CZ 243498A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
oligonucleotide
oligonucleotides
sequence
nucleoside
nucleoside units
Prior art date
Application number
CZ982434A
Other languages
English (en)
Inventor
Phillip D. Cook
Brett P. Monia
Karl-Heinz Altmann
Pierre Martin
Original Assignee
Isis Pharmaceuticals, Inc.
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Isis Pharmaceuticals, Inc., Novartis Ag filed Critical Isis Pharmaceuticals, Inc.
Publication of CZ243498A3 publication Critical patent/CZ243498A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

(54) Název přihlášky vynálezu:
Oligonukleotidy s mezerou a modifikovaným cukrem (57) Anotace:
Jedno ztělesnění tohoto vynálezu poskytuje oligonukleotidy vytvářené ze sekvence nukleosidových jednotek. Tyto oligonukleotidy zahrnují alespoň jednu nukleosidovou jednotku, která je opatřena funkčními skupinami pro zvýšení nukleasové resistence oligonukleotidů. Dále jsou alespoň některé z oligonukleosidových jednotek oligonukleotidů opatřeny funkčními skupinami, kde skupina substituentu zvyšuje vazebnou afinitu oligonukleotidů k cílovým ribonukleovým kyselinám a alespoň některé nukleosidové jednotky mají 2 deoxy-erythro-pento-furanosylové zbytky cukru.Tyto nukleotidy lze použít pro diagnostiku a další výzkumné účely, pro modulaci exprese proteinu v organismu a pro diagnózu, detekci a léčbu stavů vhodných pro léčbu oligonukleotidy.
• ·
·· ·· • · · · • · · · • · · · · · · ·
Oligonukleotidy s mezerou a modifikovaným cukrem
Oblast techniky
Tento vynález se týká způsobu syntézy a použití oligonukleotidů pro vyvolání aktivity RNasy H pro štěpení v protějším vlákně. Vynález zahrnuje oligonukleotidy, ve kterých alespoň některá z nukleotidových jednotek oligonukleotidů je opatřena funkčními skupinami tak, aby byla rezistentní vůči nuklease, alespoň některé z nukleotidových , jednotek oligonukleotidů obsahují substituent, který zesiluje hybridjzaci oligonukleotidu s komplementárním vláknem nukleové kyseliny a alespoň některé z nukleotidových jednotek oligonukleotidů obsahují
2'-deoxy-erythro-pentofuranosylové zbytky cukru. Tyto oligonukleotidy lze použít pro léčení, pro diagnostiku a jako výzkumné prostředky.
Dosavadní stav techniky
Je známo, že oligonukleotidy hybridizují s jednovláknovými molekulami deoxyribonukleových kyselin nebo ribonukleových kyselin. Hybridizace je sekvenčně specifické vytváření párových vodíkových vazeb mezi bázemi těchto oligonukleotidů a bázemi cílových deoxyribonukleových či ribonukleových kyselin. Tyto páry bází se považují navzájem za komplementární .
• · · · · 4 ·· «44 4 4 4 4 • 4 4·· · ·· · • 4 4 · · 4 · · · 4 ·
4 4 4 · · ·· ·· 44 ··
Při stanovování rozsahu hybridizace oligonukleotidu s komplementární nukleovou kyselinou lze srovnávat relativní schopnost určitého oligonukleotidu pro vytváření vazby s komplementární nukleovou kyselinou určením teploty tání daného hybridizačního komplexu. Teplota tání (T ), charaktexn.
ristická fyzikální vlastnost dvojitých helixů, je teplota (ve stupních Celsia), při které je přítomno 50 % forem v rámci helixu (hybridizovaných) a 50 % v rámci jednoho závitu (nehybridizovaných). T se měří na základě ultrafialoxci vého spektra pro stanovení vytváření a rozbití (tavení) hybridizačního komplexu. Staking bází, který nastává během hybridizace, je doprovázen snížením absorpce ultrafialového světla (hypochromicita). Snížení absorpce ultrafialového světla tedy ukazuje na vyšší T^. Čím vyšší je T , tím silnější je vazba mezi vlákny.
Oligonukleotidy lze použít pro uskutečnění enzymatického štěpení cílové ribonukleové kyseliny použitím intracelulárního enzymu RNasy H. Uvažuje se, že mechanismus tohoto štěpení RNasou H vyžaduje hybridizaci
2'-deoxyribofuranosylového oligonukleotidu s cílovou ribonukleovou kyselinou. Výsledný duplex kyselina deoxyribonukleová-kyselina ribonukleová aktivuje enzym RNasu H a aktivovaný enzym štěpí vlákno ribonukleové kyseliny. Štěpení vlákna ribonukleové kyseliny ruší normální funkci ribonukleové kyseliny. Uvažuje se, že tímto způsobem se uplatňují fosforothioatové oligonukleotidy. Avšak proto, aby byl oligonukleotid deoxyribonukleové kyseliny použitelný pro buněčnou aktivaci RNasy H, je oligonukleotid přednostně rozumným způsobem stabilní vůči nukleasám, aby přežíval v buňkách po dobu dostatečnou pro aktivaci RNasy. Pro použití mimo buňky, jako je použití nukleotidů jako výzkumných prostředků, není tato nukleasová stabilita nezbytná.
·* ·· ·· ·· • · * · · · ·
Β · · · · · ·« · ·· · · · · ··· · · · • · · · · · • · · · ·· · ·
Několik publikací popisuje interakci RNasy H a oligonukleotidů. Zvláště důležité jsou: (1) Dagle a kol., Nucleic Acids Research, 18., 4751 (1990), (2) Dagle a kol., Antisense Research And Development, 1, ll (1991), (3) Eder a kol., J. Biol. Chem., 266, 6472 (1991) a (4) Dagle a kol., Nucleic Acids Research, 19, 1805 (1991). Podle těchto publikací jsou oligonukleotidy deoxyribonukleových kyselin mající nemodikovaná fosfodiesterová internukleosidová spojení a modifikovaná fosforothioatová internukleosidová spojení substráty pro buněčnou RAasu H. Jelikož jsou těmito substráty, aktivují štěpení cílové ribonukleové kyseliny RNasou H. Avšak autoři dále zaznamenali u embryí žab rodu Xenopus, že fosfodiesterová spojení a fosforothioatová spojení nepodléhají exonukleasové degradaci. Taková nukleasová degradace je škodlivá, neboť rychle vyčerpává oligonukleotidy dostupné pro aktivaci RNasy H.
Jak se popisuje v odkazech (1), (2) a (4), byly vytvořeny 2'-deoxyoligonukleotidy mající krátký úsek fosfodiesterových spojených nukleotidů umístěných mezi úseky fosforoamidatových, alkylfosfonatových nebo fosfotriesterových spojení pro stabilizaci oligonukleotidů proti nukleasové degradaci při zachování aktivace RNasy Η. V odkazu (4) autoři uvádějí, že při stabilizaci oligonukleotidů obsahující fosforamidat proti exonukleasám vede každé fosforamidatové spojeni k poklesu měřené hodnoty Tm oligonukleotidů obsahující fosforamidat o 1,6 °C. Tento pokles hodnoty T ukazuje pokles hybridizace mezi oligonukleotidem a jeho cílovým vláknem.
Další autoři komentují účinek takového poklesu hybridizace mezi oligonukleotidem a jeho cílovým vláknem.
44 44 44
4 4 4 4 4
4444 4 44 4
44 444 444
4 4 4 4 4
Saison-Behmoaras a kol. [EMBO Journal, 10., 1111 (1991)] pozorovali, že i když může být oligonukleotid substrátem pro RNasu H, je účinnost štěpení RNasou H nízká vzhledem ke slabé hybridizaci s informační ribonuleovou kyselinou. Autoři též poznamenávají, že zavedení akridinové substituce na konci 3’ oligonukleotidu chrání tento oligonukleotid proti exonukleasám.
US patent č. 5 013 830 vydaný 7. května 1991 uveřejňuje směsné oligomery zahrnující oligomer ribonukleové kyseliny nebo jeho derivát konjugovaný s oligomerem deoxyribonukleové kyseliny fosfodiesterovým spojením. Oligomery ribonukleové kyseliny mají též 2·-O-alkylové substituenty. Avšak jako fosfodiestery jsou tyto oligomery citlivé vůči nukleasovému štěpení.
Evropská patentová přihláška 339 842 registrovaná
13. dubna'1989 uveřejňuje 21-O-substituované fosforothioatové oligonukleotidy včetně
2’-O-methylribooligonukleotidových fosforothioatových derivátů. Toto výše popsané použití též uveřejňuje 2’-O-methylfosfodiesterové oligonukleotidy postrádající nukleasovou resistenci.
US patent č. 5 149 797 vydaný 22. září 1992 uveřejňuje oligonukleotidy se základním řetězcem se směsnými fosfáty zahrnující vnitřní část deoxynukleotidů spojených fosfodiesterovými vazbami a majících na každé straně připojenou část modifikovaných sekvenci deoxyribonukleových kyselin či ribonukleových kyselin. Připojené sekvence zahrnují methylfosfonatové, fosforomorfolidatové, fosforopiperazidatové nebo fosforamidatové vazby.
• · ··· ···
US patent č. 5 256 775 vydaný 26. října 1993 popisuje směsné oligonukleotidy, které inkorporují fosforamidatové vazby a fosforothioatové nebo fosforodithioatové vazby.
Při zjištění užitečnosti štěpení cílového vlákna ribonukleové kyseliny pomocí oligonukleotidu a RNasy H existuje též značná důležitost nukleasové resistence oligonukleotidu a věrnost hybridizace v rozvoji oligonukleotidové terapie. V souladu s tím zůstává dlouho pociťovaná potřeba způsobů a látek, které by mohly aktivovat RNasu H při současném udržování či zlepšování hybridizačnich vlastností a zajišťování nukleasové resistence. Tyto oligonukleotidy se též požadují jako výzkumné a diagnostické prostředky.
Podstata vynálezu
Jedno ztělesnění tohoto vynálezu poskytuje oligonukleotidy vytvářené ze sekvence nukleosidových jednotek. Tyto oligonukleotidy zahrnují alespoň jednu nukleosidovou jednotku, která je opatřena funkčními skupinami pro zvýšení nukleasové resistence oligonukleotidů. Dále jsou alespoň některé z nukleosidových jednotek oligonukleotidů opatřeny funkčními skupinami, kde skupina substituentu zvyšuje vazebnou afinitu oligonukleotidů k cílovým ribonukleovým kyselinám a alespoň některé nukleosidové jednotky mají 2’-deoxy-erythro-pentofuranosylové zbytky cukru.
V preferovaných oligonukleotidech podle tohoto vynálezu zahrnují nukleosidové jednotky, které jsou opatřeny funkčními skupinami pro zvýšení vazebné afinity, skupinu substituentu 21. V preferovaných ztělesněních tato skupina substituentu 2' zahrnuje atom fluoru, Ci-C2o alkoxyskupinu, Ci-Ce aminoalkoxyskupinu včetně aminopropoxyskupiny, allyl• · ·· ·· l · · ' oxyskupinu, imidazolylalkoxyskupinu a polyethylenglykolovou skupinu. Preferované alkoxysubstituenty zahrnuji methoxy-, ethoxy- a propoxyskupiny. Preferovanou aminoalkoxyskupinou je aminopropoxyskupina. Preferovanou imidazolylalkoxyskupinou je imidazolylpropoxyskupina. Preferovaným polyethylenglykolovým substituentem je -O-ethyl-O-methylová skupina nebo methoxyethoxyskupina (-O-CH2-CH2-O-CH3).
Oligonukleotidy podle tohoto vynálezu zahrnuji nukleosidové jednotky spojené nabitými fosforovými vazbami volenými ze skupiny zahrnující fosfodiesterové a fosforothioatové vazby.
Oligonukleotidy podle tohoto vynálezu zahrnují více spojených nukleosidových jednotek nesoucích substituenty, které zvyšují vazebnou afinitu oligonukleotidu ke komplemen* tárnímu vláknu nukleové kyseliny. V určitých preferovaných ztělesněních lze sekvenci oligonukleotidu mající nukleosidové jednotky nesoucí tyto substituenty rozdělit na první subsekvenci a druhou subsekvenci, kde první subsekvence má spojené nukleosidové jednotky nesoucí 2’-substituované-erythro-pentofuranosylové zbytky cukru a druhou subsekvenci mající spojené nukleosidové jednotky nesoucí 2'-deoxy-erythro-pentofuranosylové zbytky cukru. V preferovaných případech má tato druhá subsekvence alespoň tři nukleosidové jednotky a v ještě preferovanějších případech má alespoň pět nukleosidových jednotek. V dalších preferovaných ztělesněních existuje třetí subsekvence, jejíž nukleosidové jednotky se volí z těch, které lze zvolit pro první subsekvenci. Dává se přednost tomu, aby se druhá subsekvence umístila mezi třetí a první subsekvenci. Tyto oligonukleotidy podle tohoto vynálezu se též uvádějí jako chiméry’1 nebo chimérické oligonukleotidy či oligonukleotidy s mezerou.
4
V dalších preferovaných oligonukleotidech podle tohoto vynálezu se nukleosidové jednotky nesoucí substituenty zvyšující vazebnou afinitu umisťují na jednom nebo obou koncích 3' nebo 5’ oligonukleotidu. Mohou obsahovat jednu až osm nukleosidových jednotek, které jsou substituované skupinami. V preferovaných případech nese alespoň pět nukleosidů 2'-deoxy-erythro-pentofuranosylové zbytky cukru.
Nukleosidové jednotky oligonukleotidů podle tohoto vynálezu zahrnují nukleové báze připojené k 2'-substituovaným a 2'-deoxy-erythro-pentofuranosylovým zbytkům cukru fosforovými vazbami, jako jsou fosfodiesterové a fosforothioatové vazby. Preferované nukleové báze podle tohoto vynálezu zahrnují puriny a pyrimidiny, jako je adenin, guanin, cytosin, uridin a thymin i další syntetické a přírodní nukleové báze, jako jsou xanthin, hypoxanthin, 2-aminoadenin, 6-methylové deriváty a dalši alkylové deriváty adeninu a guaninu, 2-propylové deriváty a další alkylové deriváty adeninu a guaninu, 5-halouracil a 5-halocytosin, 5-propinyluracil a 5-propinylcytosin, 6-azouracil, 6-azocytosin a 6-azothymin, 5-uracil (pseudouracil), 4-thiouracil, 8-halo-, amino-, thiol-, thioalkyl-, hydroxyl- a dalši 8-substituované adeniny a guaniny, 5-trifluormethyl a další 5-substituované uráčily a cytosiny a 7-methylguanin. Další puriny a pyrimidiny zahrnují ty, které jsou uveřejněné v US patentu č. 3 687 808, ty, které jsou uveřejněné v Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, str. 858-859, Kroschwitz, J. I., red. John Wiley & Sons, 1990 a ty, které uveřejňuje Englisch a kol., Angewandte Chemie, International Edition, 30, 613 (1991).
Tento vynález též poskytuje způsoby léčby organismu ·· 9 99 »· • · ·· · 9 9
9 9 9999
9 9 9 9 9 • 9 9 · A
9999 999 99 99 s onemocněním charakterizovaným nežádoucí tvorbou bílkovin. Tyto způsoby zahrnují styk organismu s oligonukleotidem majícím sekvenci nukleosidových jednotek schopnou specifické hybridizace s komplementárním vláknem nukleové kyseliny s nejméně jednou nukleosidovou jednotkou, která je opatřena funkčními skupinami pro zvýšení nukleasové resistence oligonukleotidů vůči nukleasám se skupinou substituentu umístěnou na této jednotce pro zvýšeni vazebné afinity oligonukleotidu ke komplementárnímu vláknu nukleové kyseliny a s větším počtem nukleosidových jednotek majících 2'-deoxy-erythro-pentofuranosylové zbytky cukru.
Dále se podle tohoto vynálezu poskytují prostředky zahrnující farmaceuticky účinné množství oligonukleotidu majícího sekvenci nukleosidových jednotek schopných specifické hybridizace s komplementárním vláknem nukleové kyseliny mající alespoň jednu z nukleosidových jednotek opatřenou funkční skupinou pro zvýšení nukleasové resistence oligonukleotidů vůči nukleasám, ve kterých má více nukleosidových jednotek skupinu substituentu umístěnou na těchto jednotkách pro zvýšení vazebné afinity oligonukleotidu ke komplementárnímu vláknu nukleové kyseliny, kde větší počet těchto nukleosidových jednotek má 2'-deoxy-erythro-pentofuranosylové zbytky cukru. Tyto prostředky dále obsahují farmaceuticky přijatelnou zřeďovací látku či nosič.
Dále se v souladu s tímto vynálezem poskytují způsoby modifikace in vitro sekvenčně specifické nukleové kyseliny zahrnující styk zkušebního roztoku obsahujícího enzym RNasu H a tuto nukleovou kyselinu s oligonukleotidem majícím sekvenci nukleosidových jednotek schopnou specifické hybridizace s komplementárním vláknem nukleové kyseliny, kde alespoň jedna z nukleosidových jednotek je opatřena funkční • to to · «
···· ·« ·· • · « >·· > · to • ·· · • to· ·· to · ·· ·· • ·· · • toto to to ··« ··· • · ·« ·· skupinou pro zvýšení nukleasové resistence oligonukleotidu vůči nukleasám, kde více nukleosidových jednotek má substituční skupinu pro zvýšení vazebné afinity oligonukleotidu ke komplementárnímu vláknu nukleové kyseliny a kde větší počet nukleosidových jednotek má 2’-deoxy-erythro-pentofuranosylové zbytky cukru.
Poskytují se též způsoby současného zvýšeni hybridizace a aktivace enzymu RNasy H v organismu zahrnující kontakt organismu s oligonukleotidem majícím sekvenci nukleosidových jednotek schopnou specifické hybridizace s komplementárním vláknem nukleové kyseliny, kde alespoň jedna z nukleosidových jednotek je opatřena funkční skupinou pro zvýšení nukleasové resistence oligonukleotidu vůči nukleasám, kde větší počet těchto nukleosidových jednotek má substituční skupinu pro zvýšení vazebné afinity oligonukleotidu ke komplementárnímu vláknu nukleové kyseliny a kde větší počet nukleosidových jednotek má 2’-deoxy-erythro-pentofuranosylové zbytky cukru.
Tento vynález dále poskytuje diagnostické způsoby pro zjištění přítomnosti či nepřítomnosti abnormálních molekul ribonukleových kyselin nebo abnormální či nevhodné exprese normálních molekul ribonukleových kyselin v organismu či buňkách.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 je čárový graf ukazující dávkovou závislost aktivity oligonukleotidů podle tohoto vynálezu a referenční sloučeniny.
Obr. 2 je sloupcový graf ukazující dávkovou závislost
aktivity oligonukleotidů podle tohoto vynálezu a referenční sloučeniny.
Obr. 3 je sloupcový graf ukazujíc! účinky několika 21-O-methyl-chimerických oligonukleotidů na hladiny PKC-a informační ribonukleové kyseliny. Vyčárkované sloupce představují transkript 8,5 kb a prázdné sloupce představují transkript 4,0 kb.
Obr. 4 je sloupcový graf ukazující účinky několika 2'-O-methyl- a 2'-Q-propyl-chimérických oligonukleotidů na hladiny PKC-α informační ribonukleové kyseliny. Vyčárkované sloupce představují transkript 8,5 kb a prázdné sloupce představuji transkript 4,0 kb.
Obr. 5 je sloupcový graf ukazující účinky přídavných 2’-O-methyl- a 2'-O-propyl-chimerických oligonukleotidů na hladiny PKC-α informační ribonukleové kyseliny. Vyčárkované sloupce představují transkript 8,5 kb a prázdné sloupce představují transkript 4,0 kb.
Obr. 6a a 6b jsou čárové grafy ukazující účinek 2'-methoxyethoxy-modifikovaných oligonukleotidů majících číslo identifikace sekvence 30 na hladiny PKC-α informační ribonukleové kyseliny v buňkách A549. Obr. 6a ukazuje účinek ISIS 9605 ve srovnání s deoxyfosforothioatovou sloučeninou ISIS 3521. Obr. 6b ukazuje účinek ISIS 9606 ve srovnání s deoxyfosforothioatovou sloučeninou ISIS 3521.
Obr. 7a a 7b jsou čárové grafy ukazující účinky oligonukleotidů majících číslo identifikace sekvence 30 na růst tumorových xenograftů lidského karcinomu tlustého střeva (Colo 205) u athymických nu/nu myší. Obr. 7a ukazuje účinek • · · · · · · · ···· ··· ·· ·· ·« ·· deoxyfosforothioatové sloučeniny ISIS 3521. Obr. 7b ukazuje účinek 2’-methoxyethoxy-modifikované sloučeniny ISIS 12723.
Obr. 8a a 8b jsou čárové grafy ukazující účinek ISIS 5132 (Obr. 6a) a CGP 69845, 2'-methoxyethoxy(2'-O-CH -CH -O-CH ) verze téže sekvence (Obr. 6b) na růst xenograftů plicního tumoru A549 u athymických nu/nu myší.
Obr. 9 je čárový graf ukazující koncentrace kontrolní sloučeniny a dvou sloučenin podle tohoto vynálezu v krevní plazmě myší. Koncentrace v krevní plazmě jsou vyneseny proti času.
Obr. 10 je třírozměrný sloupcový graf ukazující distribuci kontrolní sloučeniny v různých tkáních myši. Jednotlivé tkáně jsou na jedné ose, čas na druhé ose a procento ‘ dávky na třetí ose. Sloučenina se podávala v intravenózní injekci. '
Obr. 11 je třírozměrný sloupcový graf ukazující distribuci sloučeniny podle tohoto vynálezu v různých tkáních myši. Jednotlivé tkáně jsou na jedné ose, čas na druhé ose a procento dávky na třetí ose. Sloučenina se podávala v intravenózní injekci.
Obr. 12 je třírozměrný sloupcový graf ukazující distribuci další sloučeniny podle tohoto vynálezu v různých tkáních myši. Jednotlivé tkáně jsou na jedné ose, čas na druhé ose a procento dávky na třetí ose. Sloučenina se podávala v intravenózní injekci.
Následuje podrobný popis tohoto vynálezut • · · · • * » 9 9 9 9 » · ·
R · · « ♦ · ♦·
Předmětem tohoto vynálezu je oligonukleotid mající zvýšenou resistenci vůči nukleasám, zvýšenou vazebnou afinitu ke komplementárním vláknům nukleových kyselin a substráty pro RNasu H. Oligonukleotidy podle tohoto vynálezu jsou sestaveny z většího počtu nukleosidových jednotek. Každý oligonukleotid podle tohoto vynálezu zahrnuje alespoň jednu nukleosidovou jednotku, která je opatřena funkční skupinou pro zvýšení nukleasové resistence tohoto oligonukleotidu. Dále v určitých ztělesněních tohoto vynálezu alespoň některé nukleosidové jednotky nesou substituční skupinu, která zvyšuje vazebnou afinitu oligonukleotidu ke komplementárnímu vláknu nukleové kyseliny. Navíc alespoň některé z nukleosidových jednotek zahrnují 2’-deoxy-erythro-pentofuranosylové zbytky cukru.
• Ve spojení s tím, co se uvádí výše, každá nukleosidová jednotká oligonukleotidu podle tohoto vynálezu, alternativně nazývaná jako nukleosid” nebo podjednotka může být přírodním či syntetickým zbytkem. Proto se v souvislosti s tímto vynálezem pojem oligonukleotid vztahuje k oligomeru vytvářenému z řady spojených nukleosidových jednotek.
Tyto nukleosidové jednotky jsou spolu spojeny fosforovými vazbami, jako jsou fosfodiesterové nebo fosforothioatové vazby. Nukleosidové jednotky se vytvářejí z přírodních nebo nepřírodnich bází nukleových kyselin a pentofuranosylových zbytků cukru. Termín oligonukleotid tedy zahrnuje přírodní druhy nebo nepřírodní druhy vytvářené z přírodních nukleosidových j ednotek.
Oligonukleotidy podle tohoto vynálezu mohou též zahrnovat modifikované podjednotky. Tyto modifikace mohou nastat na části báze nukleosidu, na části cukru nukleosidu nebo na
vazbě spojující jeden nukleosid s druhým.
V tomto vynálezu se zjišťuje, že se vazebná afinita oligonukleotidu podle tohoto vynálezu může zvýšit inkorporacl substitučních skupin do nukleosidových jednotek oligonukleotidů. Preferovanými substitučními skupinami jsou skupiny 2' substituentů, to jest skupiny substituentů umístěných v poloze 2' pentofuranosylových zbytků cukru nukleosidových jednotek oligonukleotidů podle tohoto vynálezu. V současné době preferované substituční skupiny zahrnují atom fluoru, alkoxyskupinu, aminoalkoxyskupinu, allyloxyskupinu, imidazolylalkoxyskupinu a polyethylenglykovou skupinu. Alkoxyskupiny a aminoalkoxyskupiny obecně zahrnuji nižší alkylové skupiny, zejména C -C alkylové skupiny. Polyethylenglykolové skupiny mají strukturu (O-CH^-CH^J^-O-alkylová skupina. Zvláště preferovanou substituční skupinou je polyethylengly• kolový substituent vzorce (-O-CH^-CH^J^-O-alkylová skupina, ve které η = 1 a alkylová skupina = methylová skupina.
Vazebná aktivita se též může zvýšit použitím určitých bází nukleových kyselin v nukleosidových jednotkách vytvářejících oligonukleotidy podle tohoto vynálezu. Tyto modifikované báze nukleových kyselin mohou zahrnovat 5-substituované pyrimidiny, 6-azapyrimidiny a N-2-, N-6- a 0-6-substituované puriny včetně 2-aminopropyladeninu, 5-propinyluracilu a 5-propinylcytosinu. Pro ostatní modifikované pyrimidinové a purinové báze lze očekávat zvýšení vazebné afinity oligonukleotidů ke komplementárnímu vláknu nukleové kyseliny.
Použití skupin substituentů v poloze 2’ zvyšuje vazebnou afinitu substituovaných oligonukleotidů podle tohoto vynálezu. Publikovaná studie (Synthesis and Biophysical Stu• · dies of 2'-dRIB0-F Modified Oligonucleotides, Conference On Nucleic Acid Therapeutics, Clearwater, FL, 13. ledna 1991) uvádí vzrůst vazebné afinity o 1,6 °C na substituovanou nukleosidovou jednotku 15-merního fosfodiesterového oligonukleotidu majícího substituent 2'-fluor na pěti nukleosidových jednotkách oligonukleotidu. Jestliže 11 nukleosidových jednotek oligonukleotidu nese substituční skupiny 2'-fluor, zvyšuje se vazebná aktivita o 1,8 °C na substituovanou nukleosidovou jednotku.
Ve výše popsané studii byl 15-merní fosfodiesterový oligonukleotid derivatizován na odpovídající fosforothioatový analog. Při srovnání 15-merního fosfodiesterového oligonukleotidu se svým fosforothioatovým analogem vykazuje fosforothioatový analog vazebnou afinitu pouze 66 % hodnoty 15-merního fosfodisterového oligonukleotidu. Jinými slovy •došlo ke ztrátě vazebné aktivity derivatizací oligonukleotidu na jeho' fosforothioatový analog. Avšak jestliže se umístí substituenty 2’-fluor na 11 nukleosidů 15-merního fosforothioatového oligonukleotidu, potom vazebná afinita substitučních skupin v poloze 2' je schopna více než překonat pokles zaznamenaný při derivatizaci 15-merního oligonukleotidu na jeho fosforothioatový analog. V této sloučenině, to jest 15-merním fosforothioatovém oligonukleotidu majícím 11 nukleosidových jednotek substituovaných skupinami 2'-fluor se vazebná afinita zvýšila o 2,5 °C na jednu substituční skupinu. V této studii nebyla žádná snaha zahrnovat vhodnou konsekutivní sekvenci nukleosidových jednotek majících 2'-deoxy-erythro-pentofuranosylové zbytky cukru, které by vyvolaly enzymatické štěpeni RNasou H cílové ribonukleové kyseliny komplementární ke studovanému oligonukleotidu.
Pro vyvolání enzymatického štěpení cílové ribonukleo• 4 vé kyseliny RNasou H musí oligonukleotid podle tohoto vynálezu obsahovat segment či subsekvenci typu segmentu deoxyribonukleové kyseliny. Jinými slovy alespoň některé z nukleosidových podjednotek oligonukleotidů podle tohoto vynálezu musí mít 2'-deoxy-erythro-pentofuranosylové zbytky cukru. Subsekvence mající více než tři konsekutivně připojené nukleosidové podjednotky obsahující 2'-deoxy-erythro-pentofuranosyl je nezbytná pro vyvolání aktivity RNasy H při hybridizaci oligonukleotidu podle tohoto vynálezu s cílovou ribonukleovou kyselinou. Nyní se dává přednost subsekvenci tří či více konsekutivních nukleosidových podjednotek obsahujících 2'-deoxy-erythro-pentofuranosyl v oligonukleotidu podle tohoto vynálezu. Použití alespoň pěti konsekutivních nukleosidových podjednotek obsahujících 21-deoxy-erythropentof uranosyl se zvláště preferuje.
Mechanismus působení RNasy H je rozpoznání duplexu deoxyribohukleová kyselina-ribonukleová kyselina s následným štěpením vlákna ribonukleové kyseliny tohoto duplexu. Jak se pojednává výše v oddílu Současný stav techniky, ostatní autoři v oboru užívají modifikovaná vlákna deoxyribonukleové kyseliny pro zajištění nukleasové stability vzhledem k vláknu deoxyribonukleové kyseliny. Pro tento účel používají modifikované fosforové vazby, které zajišťují zvýšenou nukleasovou stabilitu, avšak snižují hybridizační vlastnosti.
Tento vynález určuje určitá kritéria, která musí být pro RNasu H splněná pro rozpoznání a vyvolání štěpení ve vláknu ribonukleové kyseliny. První z nich je, že vlákno ribonukleové kyseliny musí mít v místě štěpení své nukleosidové jednotky spojené prostřednictvím fosforové vazby, která nese negativní náboj. Navíc zbytek cukru oligonukleotidů v místě štěpení musí být β-pentofuranosylový zbytek cukru ·
00 ·· 0·
0 0 0 0 0
0 0 0 · · · ·
0 0 0 0 0 0 000 0 0 0 0 0
00 00 00 a musí též být v 2’ endo-konformaci. Jediné nukleosidy, které splňují tato kritéria, jsou 21-deoxy-erythro-pentofuranosylové β-nukleosidy připojené fosfodiesterovou, fosforothioatovou a fosforodithioatovou vazbou.
Pro použiti při přípravě těchto strukturních jednotek zahrnují vhodné báze nukleových kyselin puriny a pyrimidiny, jako je adenin, guanin, cytosin, uridin a thymin, stejně tak jako další syntetické i přirozené báze nukleových kyselin, jako je xanthin, hypoxanthin, 2-aminoadenin, 6-methyla další alkyl-deriváty adeninu a guaninu, 2-propyl- a další alkyl-deiváty adeninu a guaninu, 5-halouracil a 5-halocytosin, 5-propynyluracil a 5-propynylcytosin, 6-azouracil,
6- azocytosin a 6-azothymin, 5-uracil (pseudouracil),
4-thiouracil, 8-halo-, 8-amino-, 8-thiol-, 8-thioalkyl-, 8-hydroxy- a další 8-substituované adeniny a guaniny, • 5-trifluormethyl a další 5-substituované uráčily a cytosiny,
7- methylguanin. Další puriny a pyrimidiny zahrnují ty, které uveřejňuje US patent č. 3 687 808, ty, které se uveřejňují v Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, str. 858-859, Kroschwitz, J. I., red. John Wiley & Sons,
1990 a ty, které uveřejňuje Englisch a kol., Angewandte Chemie, Mezinárodní vydání, 30., 613 (1991).
Oligonukleotidy podle tohoto vynálezu obsahují modifikaci methoxyethoxy (-OCH2CH2OCH3) v poloze 2' nejméně jednoho nukleosidu. Ukazuje se, že tato modifikace zvyšuje afinitu oligonukleotidu k jeho cíli i nukleasovou resistenci tohoto oligonukleotidu. Oligonukleotidy v souladu s tímto vynálezem přednostně obsahují zhruba od 5 do 50 nukleosidových jednotek. V kontextu tohoto vynálezu se též rozumí, že zahrnují nepřirozené oligomery, jak se popisují výše, mající 5 až 50 nukleosidových jednotek. Více se preferuje, *44 4 4 4 4
4 · 4 4 4 44 4
44 44 444 444 obsahují-li oligonukleotidy podle tohoto vynálezu zhruba 15 až 25 nukleosidových jednotek. Předmětem kladného hodnocení je, že ňukleosidová jednotka je kombinací báze nukleové kyseliny a cukru vhodně připojená k přilehlým podjednotkám fosforovými vazbami. Pojem podjednotka se užívá střídavě s pojmem ňukleosidová jednotka. Pro vyvolání odpovědi RNasy H, jak se specifikuje výše, v rámci této celkové sekvenční délky oligonukleotidu bude subsekvence více než tří, avšak přednostně pěti či více konsekutivně spojených nukleosidových jednotek obsahujících 21-deoxy-erythro-pentofuranosyl.
Nyní se preferuje inkorporace nukleosidové subsekvence obsahující 2'-deoxy-erythro-pentofuranosyl do oligonukleotidu takovým způsobem, že v rámci oligonukleotidu jsou další nukleosidové subsekvence obsahující 2'-substituovaný pen. tofuranosyl umístěné na jedné nebo druhé straně nukleotidové subsekvence obsahující 21-deoxy-erythro-pentofuranosyl.
V této struktuře se ňukleosidová subsekvence obsahující 2'-deoxy-erythro-pentofuranosyl též uvádi jako centrální oblast a nukleosidové subsekvence obsahující 21-substituovaný pentofuranosyl se uvádějí jako připojené oblasti.
V určitých ztělesněních tohoto vynálezu, pokud každá ze zbývajících nukleosidových jednotek zahrnuje substituční skupinu v poloze 2' pro zvýšení vazebné afinity, potom bude nukleosid obsahujíc! 2’-deoxy-erythro-pentofuranosyl umístěný mezi první subsekvencí nukleosidových jednotek majících substituenty v poloze 2' a druhou subsekvencí nukleosidových jednotek mající substituenty v poloze 2'. Jsou též možné jiné struktury včetně umístění nukleosidové subsekvence obsahující 2’-deoxy-erythro-pentofuranosyl na jednom z konců 3’ nebo 5' oligonukleotidů podle tohoto vynálezu.
AAA AAAA
A AAAA A AA A
AA AA AA AAA AAA AAAA A A
A AA AA AA AA
Oligonukleotidy používané podle tohoto vynálezu se mohou vhodně a rutinně připravit dobře známým způsobem syntézy v tuhé fázi. [Martin, Helv. Chim. Acta, 78, 486-504 (1995)]. Zařízení pro tyto syntézy prodává několik společností včetně Applied Biosystems. Lze též použít jiné prostředky pro tuto syntézu. Vlastní syntéza oligonukleotidů je věcí schopnosti toho, kdo má zkušenost v oboru. Je též dobře známa možnost použití podobných způsobů pro přípravu ostatních oligonukleotidů, jako jsou fosforothioatové a alkylované deriváty. Je též známo použiti podobných způsobů a komerčně dostupných modifikovaných amiditů a skel s kontrolovanými póry (CPG), jako jsou biotin, fluorescein, akridin nebo psaralinem modifikované amidity a/nebo CPG (dostupné od Glen Research, Sterling VA), pro syntézu fluorescenčně značených biotinylovaných nebo jinak konjugovaných oligonukleotidů.
S-loučeniny podle tohoto vynálezu lze použit jako diagnostické a terapeutické prostředky a jako činidla a soupravy pro výzkumné účely. Mohou se použit ve farmaceutických přípravcích přídavkem účinného množství oligonukleotidu podle tohoto vynálezu k vhodnému farmaceuticky přijatelnému zřeďovadlu či nosné látce. Dále se mohou použít pro léčbu organismu trpícího onemocněním charakterizovaným nežádoucí tvorbou bílkoviny. Tento organismus se může uvést do styku s oligonukleotidem podle tohoto vynálezu majícím sekvenci, která je schopná specifické hybridizace s vláknem cílové nukleové kyseliny poskytující kód pro tento nežádoucí protein.
Formulaci terapeutických přípravků a jejich následné podávání je věcí toho, kdo má zkušenost v oboru. Obecně ten, kdo provádí léčbu, podává pacientovi, který tuto léčbu po• 4 ·4
4 4 4 • 4 4 4
4 4 444
4
·· • · ·
44 třebuje, oligonukleotid podle tohoto vynálezu ve farmaceuticky přijatelné nosné látce v dávkách v rozmezí od 0,01 Mg do 100 g na kg tělesné hmotnosti v závislosti na stáří pacienta a závažnosti léčeného chorobného stavu. Dále může léčebný režim trvat po dobu, která se mění v závislosti na povaze daného onemocnění, na její závažnosti a celkovém stavu nemocného a může být v rozmezí od jednou denně do jednou každých 20 let. Po léčbě se nemocný sleduje ohledně změn stavu a ulehčení symptomů onemocněni. Dávkování oligonukleotidu může být buď zvýšeno v případě, že nemocný nevykazuje významnou odpověď na současné dávkové hladiny, nebo může být dávka snížena, pokud se pozoruje ulehčení symptomů onemocnění nebo pokud byl chorobný stav odstraněn.
V některých případech může být efektivnější léčení pacienta oligonukleotidem podle tohoto vynálezu ve spojení s jinými tradičními terapeutickými modalitami. Například nemocný léčený na AIDS může dostávat oligonukleotid spolu s AZT nebo nemocný s aterosklerózou může být léčen oligonukleotidem podle tohoto vynálezu po angioplastice pro zabránění reokluze léčených artéríí.
Po úspěšné terapii může být vhodné podrobit pacienta udržovací léčbě, aby se zabránilo opakováni chorobného stavu, při které se podává oligonukleotid v udržovacích dávkách od 0,01 μg do 100 g na kg tělesné hmotnosti jednou denně nebo až jednou každých 20 let.
Farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu se mohou podávat řadou způsobů v závislosti na tom, zda se požaduje místní či systémová léčba a na oblasti, která se má léčit. Podávání může být lokální (včetně očního, vaginálního, rektálního, intranasálního, transdermálního), perorální či • 9 • 9
9 9
999 · ·
99 • ·
9 99 9 9 9 9
9 9 9
99
9 9 9 • 9 · *
999 999
9 parenterální. Parenterální podávání zahrnuje intravenózní kapací, podkožní, intraperitoneální či intramuskulárni injekce nebo intrathekální či intraventrikulární způsoby podávání .
Formulace pro lokální podávání může zahrnovat transdermální náplasti, masti, tekuté formy k zevnímu použití, krémy, gely, kapky, čípky, spreje, tekutiny a prášky. Mohou být nezbytné či žádoucí farmaceutické nosné látky, vodné, práškové či olejovíté báze, zahušťovací prostředky a podobně. Je možno též použít potahované kondomy, rukavice a podobně .
Přípravky pro perorální podávání zahrnují prášky nebo granule, suspenze nebo roztoky ve vodě nebo nevodných médiích, tobolky, sáčky či tablety. Mohou se požadovat zahušťo. vací prostředky, příchutě, zřeďovací látky, emulgátory, dispergační prostředky či pojivá.
Přípravky pro intrathekální nebo intraventrikulární podávání mohou obsahovat sterilní vodné roztoky, které mohou též zahrnovat pufry, zřeďovací látky a další vhodné přísady.
Formulace pro parenterální podáváni může zahrnovat sterilní vodné roztoky, které mohou též obsahovat pufry, zřeďovací látky a další vhodné přísady.
Dávkování závisí na závažnosti a odpovědi chorobného stavu, který se má léčit při průběhu léčby, která trvá od několika dnů do několika měsíců nebo do dosažení vyléčení či snížení chorobného stavu. Optimální rozpisy dávkování lze vypočítat z měření akumulace léku v těle pacienta. Osoby s běžnou zkušeností mohou snadno určit optimální dávky, způ21 ·* • 9 ·« • * · • 9 9 99 ··
• · 9 9
99
9 9
999 999 • · »· ·· soby dávkování a frekvenci opakování podávání. Optimální dávky se mohou měnit v závislosti na relativní schopnosti jednotlivých oligonukleotidů a mohou se obecně určit na základě hodnoty ECso, která byla shledána účinnou na živočišných modelech in vitro a in vivo. Obecně je dávkování od 0,01 μg do 100 g na kg tělesné hmotnosti a lék lze podávat jednou nebo vícekrát denně, týdně, měsíčně či ročně nebo dokonce jednou za 2 až 20 let.
Tato terapeutická léčba se může provádět v řadě organismů od jednobuněčných prokaryotických a eukaryotických organismů k mnohobuněčným eukaryotickým organismům. Jakýkoliv organismus, který používá transkripci kyselina deoxyribonukleová-kyselina ribonukleová nebo translaci kyselina ribonukleová-protein jako základní část svých dědičných metabolických či buněčných mechanismů, je citlivý vůči tomuto terapeutickému a/nebo profylaktickému způsobu léčby. Zdá se, že tímto Způsobem lze léčit různé organismy, jako jsou . bakterie, kvasinky, prvoci, řasy, rostliny a vyšší formy živočichů včetně teplokrevných živočichů. Dále, jelikož každá z buněk mnohobuněčných eukaryotních organismů též obsahuje transkripci kyselina deoxyribonukleová-kyselina ribonukleová a translaci kyselina ribonukleová-protein jako nedílnou část buněčné aktivity, lze též tyto terapeutické a/nebo diagnostické způsoby provádět na těchto buněčných populacích. Navíc mnohé organely, například mitochondrie a chloroplasty eukaryotních buněk, rovněž zahrnují mechanismy transkripce a translace. Jako takové lze jednotlivé buňky buněčné populace či organely též zahrnout do definice organismů, které jsou schopné léčby terapeutickými či diagnostickými oligonukleotidy podle tohoto vynálezu. Termín terapie, jak se zde používá, znamená eradikaci chorobného stavu, zabití organismu například takového, který způsobuje bakteriální, protozo- 22 • ·· · · ální či jinou infekci nebo kontrolu aberantního či nežádoucího buněčného růstu či exprese.
V souvislosti s tímto vynálezem bude hybridizace znamenat vodíkovou vazbu, která může být Watson-Crickovou, Hoogsteenovou nebo reversní Hoogsteenovou vodíkovou vazbou mezi komplementárními bázemi nukleových kyselin. Například adenin a thymin jsou komplementární báze nukleových kyselin, které se párují vytvářením vodíkových vazeb. Komplementární a specificky hybridizovatelná, jak se zde používá, znamená sekvenční komplementaritu mezi dvěma nukleovými kyselinami obsahujícími nukleosidové jednotky, kde jedna nukleová kyselina je oligonukleotidem a druhá nukleová kyselina je cílová molekula kyseliny deoxyribonukleové nebo kyseliny ribonukleové. Jestliže například je báze nukleové kyseliny v určitém místě oligonukleotidu schopná vodíkové vazby s bází nukleové kyseliny ve stejném místě molekuly deoxyribonukleové nebo ribonukleové kyseliny, potom se molekuly oligonukleotidu a kyseliny deoxyribonukleové nebo ribonukleové považují za navzájem komplementární v tomto místě. Oligonukleotid a molekula kyseliny deoxyribonukleové nebo kyseliny ribonukleové jsou navzájem komplementární, jestliže je dostatečný počet odpovídajících poloh v každé molekule obsazen bázemi nukleových kyselin, které se mohou navzájem vázat vodíkovými můstky. Proto specificky hybridizovatelný a komplementární jsou termíny užívané k indikaci dostatečného stupně komplementarity, takže nastává vytvoření stabilní a specifické vazby mezi oligonukleotidem a cílovou molekulou kyseliny deoxyribonukleové nebo kyseliny ribonukleové. Uvažuje se, že oligonukleotid nemusí být 100% komplementární vůči své sekvenci cílové kyseliny deoxyribonukleové pro to, aby byl specificky hybridizovatelný. Oligonukleotid je specificky hybridizovatelný, jestliže vazba tohoto oligonukleo23 • to • · ··· • · · · • to· • · · · · • · · • ·· • to ·· • · · · • to · · • toto · ··· ··· to · ·· ·· tidu na cílovou kyselinu deoxyribonukleovou nebo kyselinu ribonukleovou interferuje s normální funkcí cílové kyseliny deoxyribonukleové nebo kyseliny ribonukleové se způsobením ztráty použitelnosti a existuje dostatečný stupeň komplementarity, aby se předešlo nespecifické vazbě oligonukleotidu na necílové sekvence za podmínek, za kterých se požaduje specifická vazba, to jest za fyziologických podmínek v případě rozborů in vivo nebo v terapeutickém použití nebo v případě rozborů in vitro za podmínek, za kterých se rozbory provádějí.
Pro ilustraci se použily sloučeniny podle vynálezu ve fůzním systému ras-luciferasy s použitím transaktivace ras-luciferasy. Jak se popisuje v mezinárodní publikaci č.
WO 92/22651, publikované 23. prosince 1992, a obecně určuje touto patentovou přihláškou, jejíž úplné obsahy se zde zahr• nují formou odkazu, jsou onkogeny ras členy genové skupiny, které kódují příslušné proteiny, které jsou umístěné na vnitřní straně plazmatické membrány. Proteiny ras se ukázaly být vysoce zachované na hladině aminokyselin pro vazbu GTP s vysokou afinitou a specifičností a pro vykazování aktivity GTPasy. I když buněčná funkce produktů genů ras není známá, jejich biochemické vlastnosti spolu s jejich významnou sekvenční homologií se skupinou proteinů přenášejících signál známých jako GTP vazebné proteiny nebo G proteiny ukazuji, že produkty genů ras hrají základní úlohu při zásadních buněčných regulačních funkcích týkajících se přenosu extracelulárních signálů plazmatickými membránami.
Tři geny ras označené H-ras, K-ras a N-ras byly identifikovány v savčím genomu. Savčí geny ras získávají transformačně indukční vlastnosti jednobodovými mutacemi v rámci svých kódovacích sekvencí. Mutace v přirozených onkogenech ras byly lokalizovány na kodony 12, 13 a 61. Nejběžněji detekovaná aktivační mutace ras nalézaná v lidských tumorech je kodon-12 genu H-ras, ve kterém změna báze z GGC na GTC vede k substituci glycin-valin v regulační doméně GTPasy ras-proteinového produktu. Tato jednotlivá změna aminokyselin ruší normální kontrolu funkce proteinu ras, čímž převádí normálně regulovaný buněčný protein na takový, který je nepřetržitě aktivní. Uvažuje se, že tato deregulace normální funkce proteinu ras je odpovědná za transformaci z normálního růstu na maligní.
Oligonukleotidy podle tohoto vynálezu se též používají pro modulaci a expresi genu raf a přírodně přítomného buněčného genu, který se příležitostně převádí na aktivovanou formu implikovanou při abnormální buněčné proliferaci a tvorbě tumoru.
Oligonukleotidy podle tohoto vynálezu jsou též specificky hybridizovatelné s nukleovými kyselinami vztahujícími se k proteinkinase C(PKC). Bylo zjištěno, že tyto oligonukleotidy modulují expresi PKC.
Následující příklady a způsoby ilustrují tento vynález a nejsou zamýšleny tak, aby jej omezovaly.
Příklady provedení vynálezu
Příklad l
Oligonukleotidová syntéza
Nesubstituované a substituované oligonukleotidy se syntetizují na automatizovaném syntetizátoru deoxyribonukle25 ·
ových kyselin (Applied Biosystems model 380B) s použitím standardních fosforamiditových způsobů s oxidací jodem. Pro fosforothioatové oligonukleotidy se standardní oxidační baňka nahradí 0,2 M roztokem 3H-1,2-benzodithiol-3-on-l,1-dioxidu v acetonitrilu pro postupnou thiaci fosfitových vazeb. Krok vyčkávání thiace se zvýšil na 68 s s následovným krokem kapingu. Po štěpení ze sloupce skla s kontrolovanými póry a odblokování v koncentrovaném roztoku hydroxidu amonného při 55 °C (18 h) se oligonukleotidy čistí srážením dvakrát 2,5 objemy ethanolu z 0,5 M roztoku chloridu sodného. Provádí se analytická gelová elektroforéza v 20% akrylamidu, 8 M močovině, 454 mM tris-boratovém pufru, pH = 7,0. Oligonukleotidy a fosforothioaty se posuzují na základě polyakrylamidové gelové elektroforézy jako větší než 80 % látky plné délky.
‘Příklad 2
Oligonukleotid mající 2'-substituované oblasti připojené k centrální 2'-deoxy-fosforothioatové oblasti
15-Merní cílová ribonukleová kyselina o sekvenci 5'GCGTTTTTTTTTTGCG 3’ (číslo identifikace sekvence 28) se připraví normálním způsobem na sekvenovacím zařízení pro deoxyribonukleové kyseliny s použitím postupu pro ribonukleové kyseliny. Řada komplementárních fosforothioatových oligonukleotidů majících 21-substituované nukleosidové jednotky v oblastech, které se připojují k oblasti 2'-deoxy se připraví s použitím 2'-substituovaných prekursorů nukleosidů obdržených podle způsobů v literatuře, to jest 2'-O-methyl nebo podle způsobu mezinárodní publikace č. WO 92/03568, publikované 5. března 1992. 2'-Substituované nukleosidy se přidávají jako jejich 5'-0-dimethoxytrítyl-3'-fosforamidi- 26 • · · 0
0 0 · • · 0 · 0 0 • 0 • 0 ·0 ty normálním způsobem v syntetizátoru DNA. Komplementární oligonukleotidy mají sekvenci 5' CGC AAA AAA AAA AAA ACG C 3' (číslo identifikace sekvence 29). 2'-Substituent je umístěný v oblasti CGC a CG těchto oligonukleotidů. Používají se následující 2'-O-substituenty: 2’-0-fluor, 2’-0-methyl, 2*-0-propyl, 2’-0-allyl, 2’-O-aminopropoxy,
21-O-(methoxyethoxyethyl), 2'-O-imidazolbutoxy a 21-imidazolpropoxy.
Příklad 3
Vytvoření reporterového genu ras-luciferasy
Reportérové geny ras-luciferasy popsané v této studii se vytvoří s použitím technologie PCR. Oligonukleotidové primery se syntetizují pro použití jako primery pro klonování PCR 5’-oblastí exonu 1 mutantu (kodon-12) a nemutovaného lidského gehu H-ras (divokého typu). Templáty genu H-ras se obdrží of American Type Culture Collection (ATCC č. 41000 a 41001) v Bethesdě, Marryland. Oligonukleotidové primery PCR # #5'-ACA-TTA-TGC-TAG-CTT-TTT-GAG-TAA-ACT-TGT-GGG-GCA-GGA-GAC-CCT-GT-3’ (kódující) (číslo identifikace sekvence 15) a 5'-GAG-ATC-TGA-AGC-TTC-TGG-ATG-GTC-AGC-GC-3’ (antikódující) (číslo identifikace sekvence 16) se použijí ve standardních reakcích PCR pomocí mutovaných a nemutovaných genů H-ras jako templátů. Očekává se, že tyto primery poskytují produkt deoxyribonukleové kyseliny o 145 párů bází odpovídající sekvencím -53 až +65 (vzhledem k translačnímu místu iniciace) normálních a mutovaných H-ras s připojenými restrikčními endonukleasovými místy Nhel a HindlII. Produkt PCR se podrobí gelovému čištění, srážení, promytí a resuspenduje se ve vodě standardním způsobem.
• · ··· ·
Primery PCR pro klonování genu luciferasy P. pyralis (světluška) byly navrženy tak, aby produkt PCR poskytoval kód pro luciferasový protein plné délky s výjimkou amino-terminálního methioninového zbytku, který by byl nahrazen dvěma aminokyselinami, amino-terminálního lysinového zbytku s následujícím leucinovým zbytkem. Oligonukleotidové PCR primery použité pro klonování luciferasového genu jsou 5'-GAG-ATC-TGA-AGC-TTG-AAG-ACG-CCA-AAA-ACA-TAA-AG-3' (kódující) (číslo identifikace sekvence 17) a 5'-ACG-CAT-CTG-GCG—CGC-CGA-TAC—CGT-CGA-CCT-CGA-3' (antikódující) (číslo identifikace sekvence 18), .## se užívají ve standardních reakcích PCR s použitím komerčně dostupného plasmidu (pT3/T7-Luc) (Clontech) obsahujícího luciferasový reporterový gen jako templát. Očekává se, že tyto primery poskytnou produkt o zhruba 1,9 kb odpovídající luciferasovému genu s restrikčními endonukleasovými místy HindlII a BssHII připojenými na koncích. Tento fragment se podrobí gelovému čištění , sráženi, promytí a resuspenduje se ve vodě standardním způsobem.
Pro ukončení vytvoření reporterového genu fuze ras-luciferasy se produkty PCR ras a luciferasy digerují s příslušnými restrikčními endonukleasami a klonují třídílnou ligací do expresního vektoru obsahujícího promotor viru myšího karcinomu mamy indukovatelného steroidem MMTV s použitím restrikčních endonukleas Nhel, HindlII a BssHII. Výsledný klon vede ke vložení sekvencí H-ras 5’ (-53 až +65) spojených do rámce s genem luciferasy světlušky. Výsledný vektor exprese kóduje produkt fůze ras-luciferasy, který se exprimuje pod kontrolou promotoru MMTV indukovaného steroidem.
Příklad 4 • 4 44 44 44
4 4 4 4 4 4
444· 4 44 4 • 4
4 4 4 4 4
44 44 44 44
Transfekce buněk plasmidovou deoxyribonukleovou kyselinou
Transfekce se provádějí, jak popisuje Greenberg (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel a kol., red., John Wiley and Sons, NY) s následujícími modifikacemi: HeLa cells se očkují na misky 60 mm, 5 χ 10Ξ buněk/miska. Celkem se na každou misku umisťuje 10 pq DNA, z čehož 9 Mg je ras-luciferasový reporterový plasmid a 1 Mg je vektor exprimující krysí glukokortikoidový receptor pod kontrolou konstitučního promotoru Rousova sarkomového viru (RSV). Koprecipitáty fosforečnan vápenatý-deoxyribonukleová kyselina se odstraní po 16 až 20 h promytím fyziologickým roztokem pufrovaným Tris [50 Mm Tris-Cl (pH 7,5), 150 mM NaCl] s obsahem 3 mM EGTA. Poté se k buňkám přidá čerstvé médium s přídavkem 10% fetálního bovinního séra. V této době se ’ všechny buňky předběžně zpracuji antikódujícími oligonukleotidy přeď aktivací exprese reporterového genu dexamethasonem.
Příklad 5
Oligonukleotidové zpracování buněk
Ihned po plasmidové transfekci se buňky třikrát promyjí OptiMEM (GIBCO) a předehřejí na 37 °C. Do každé misky se přidají 2 ml OptiMEM s obsahem 10 M9/ml N-[l-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchloridu (DOTMA) (Bethesda Research Labs. Gaithersburg, MD) a po přímém přidání oligonukleotidů se inkubují po dobu 4 h při 37 °C. Poté se OptiMEM odstraní a nahradí příslušným médiem pro růst buněk obsahujícím oligonukleotid. V tomto čase se aktivuje exprese reporterového genu zpracováním buněk dexamethasonem na
♦ · ·· » · · > · · · · k · · « k · · <
·· ·· ·· ·· • · · · • · · · konečnou koncentraci 0,2 μΜ. Buňky se sbírají 12 až 16 h po zpracování steroidem.
Příklad 6
Analýzy luciferasy
Luciferasa se extrahuje z buněk lýzí detergentem Triton X-100, jak popisuje Greenberg (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel a kol., red., John Wiley and Sons, NY). Použije se luminometr Dynatech ML1000 pro změření luminiscence píku při přídavku luciferinu (Sigma) k dosažení koncentrace 625 μΜ. Pro každý extrakt se provede stanovení luciferasy několikrát s použitím různých množství extraktu, aby se zajistilo, že se získala data v lineárním rozmezí rozboru.
Příklad 7'
Inhibice antikódujícího oligonukleotidu exprese genu ras-luciferasy
Řada fosforothioatových oligonukleotidů cílených pro bodovou mutaci kodonu-12 aktivovaného H-ras se testuje s použitím systému reporterového genu ras-luciferasy popsaného v předchozích případech. Tato řada zahrnuje základní sekvenci a analogy této základní sekvence. Základní sekvence je známá, jak se uvádí v mezinárodní publikaci č. WO 92/22651 identifikované výše. U základní sekvence i u jejích analogů každá z nukleosidových jednotek obsahuje fosforothioatová spojení pro zajištění nukleasové resistence. Každý z analogů má inkorporované nukleosidové jednotky obsahující 2'-O-methylové substituenty a 2’-deoxy-erythro-pentofura• 4 • 4
4 4 444 4 4 4
4 4
44 ► 4 4 ·
I 4 4 1 nosylové zbytky cukru. V analogu je subsekvence 2'-deoxy-erythro-pentofuranosylových podjednotek obsahujících cukr připojená na oba konce subsekvencemi podjednotek substituovaných 21-O-methylem. Analogy se liší navzájem délkou subsekvence nukleosidů obsahujících 21-deoxy-erythro-pentofuranosylový cukr. Subsekvence 21-deoxy-erythro-pentofuranosylového nukleosidu se soustřeďuji na bodovou mutaci kodonu-12 aktivovaného ras.
Oligonukleotidové sekvence, sekvenční referenční čísla a sekvenční identifikační čísla (všechny jsou fosforothioatové analogy) jsou shrnuty v tabulce 1. V této tabulce nukleosidy označené ”M obsahují 2’-O-methylový substituent a nukleosidy označené >>a>i jsou 21-deoxy-erythro-pentofuranosylové nukleosidy.
Tabulka 1
Chimérické 2'-0-methyl P=S oligonukleotidy
Oligo Sekvence Id. č.
sekvence
2570 CCA C A C CGA C G G CGC C C 1
a a a a a a a a a ca ca ca a a a ca ca
3975 CMCMAM CMAMCM CMGMA a cmgmgm CMGMCM CMCM 1
3979 C^A^C3^ CMG A c gmgm qMqMqM CMCM 1
a a ca
3980 CGA C G GM CMGMCM cMcM 1
a a a <a <a
3985 CMCMAM CMAMC CGA C G G cMcM 1
a a a a ca ca ca
3984 ζ-ιΓ“Τ£ΐ]Μ^Μ CMA C CGA C G G c gmcm cMcM 1
a a a a a ca ca ca a
Obr. 1 ukazuje údaje závislostí odpovědi na dávce, při které byly buňky zpracovány fosforothioasovými oligonu
kleotidy podle tabulky 1. Oligonukleotid 2570 byl cílen na bodovou mutaci kodonu 12 mutované (aktivované) H-ras ribonukleové kyseliny. Ostatní nukleosidy mají 2’-O-methylové substituenty pro zvýšení vazebné afinity s úseky různých délek vložených 2'-deoxy-erythro-pentofuranosylových nukleosidů. Kontrolní oligonukleotid je náhodným 20-merním fosforothioatovým oligonukleotidem. Výsledky se vyjadřují jako procento aktivity luciferasy v transfektovaných buňkách nezpracovaných oligonukleotidem. Jak ukazuje obrázek, zpracování buněk vzrůstajícími koncentracemi oligonukleotidů 2570 vedlo k dávkově závislé inhibici aktivity ras-luciferasy v buňkách exprimujících mutovanou formu ras-luciferasy. Oligonukleotid 2570 ukazuje zhruba trojnásobnou selektivitu pro mutovanou formu ras-luciferasy ve srovnání s normální formou .
Jak lze dále vidět na obr. 1, každý z oligonukleotidů 3980, 3985 a 3984 vykazuje větší inhibici aktivity ras-luciferasy než oligonukleotid 2570. Nejvyšší inhibici vykazuje oligonukleotid 3985, který má 7-merní subsekvenci 2’-deoxy-erythro-pentofuranosylových nukleosidů. Oligonukleotid 3980 majíc! 5-merní subsekvenci 2’-deoxy-erythro-pentofuranosylových nukleosidových jednotek vykazuje druhou nejvyšší inhibici a následuje oligonukleotid 3984, který má 9-merní subsekvenci 2'-deoxy-erythro-pentofuranosylových nukleosidových jednotek.
Obr. 2 ukazuje výsledky podobné obr. 1 kromě toho, že je ve formě sloupcového grafu. Na obr. 2 je dále vidět aktivita oligonukleotidů 3975 a oligonukleotidů 3979. Tyto oligonukleotidy mají subsekvence 2’-deoxy-erythro-pentofuranosylových nukleosidových jednotek o délce 1 respektive 3 nukleosidů. Jak lze vidět z obr. 2, žádný z těchto oligo32 • · · • · ··· • · · · • 9 9 ·
99 ·· ·· • · · ·
9 9 9 nukleotidů nevykazuje významnou aktivitu. Měřitelnou aktivitu lze pozorovat pro oligonukleotid 3979 mající 3-merní deoxysubsekvenci při nejvyšši koncentraci dávky.
Vzrůsty aktivity oligonukleotidů 3980, 3985 a 3984 ve srovnání s oligonukleotidem 2570 se připisují vzrůstu vazebné aktivity propůjčené těmto sloučeninám 2’-O-methylovými substituenty umístěnými na těchto sloučeninách a aktivaci RNasy H zajištěné pro tyto sloučeniny inkorporací subsekvence 2'-deoxy-erythro-pentofuranosylových nukleosidů v rámci hlavní sekvence nukleosidů. Oproti aktivním sloučeninám podle tohoto vynálezu je zajímavé zaznamenat, že sekvence identické se sekvencemi aktivních oligonukleotidů 2570,
3980, 3985 a 3984, které však mají fosfodiesterová spojení místo fosforothioatových spojení aktivních oligonukleotidů podle tohoto vynálezu, nevykazují žádnou aktivitu. To se přisuzuje fosfodiesterovým sloučeninám, které jsou substráty pro nukleasy degradující fosfodiesterové sloučeniny a tak brání potenciální aktivaci RNasou H.
Ostatní modifikace cukru
Účinky ostatních modifikací cukru v poloze 2' kromě 2'-O-methylových substituentů na antikódující aktivitu v chimerních oligonukleotidech byly zkoumány. Tyto modifikace se uvádějí v tabulce 2 spolu s hodnotami Tm obdrženými při hybridizaci 17-merních oligonukleotidů majících 2'-modifikované nukleosidy připojené na okrajích 7-merní deoxy-subsekvence (nebo 7-merní deoxy-mezery) 25-merním oligoribonukleotidovým komplementem, jak se popisuje v příkladu 8. Pro tyto oligonukleotidy lze pozorovat vztah mezi délkou alkylové skupiny v poloze 2' a T . Když délka alkylové skupiny vzrůstá, Tm klesá. Chimérický oligonukleotid substituo33 • 4 • 4 « 44 · 4 • 4 4 ··
4* ·♦ • *
4
4· váný atomem fluoru v poloze 2' vykazoval nejvyšší Tm z této řady.
Tabulka 2
Korelace s antikódující aktivitou 2'-modifikovaného 17-meru se 7-deoxy-mezerou
CCACACCGACGGCGCCC (číslo identifikace sekvence 1)
21-Modifikace T (°C) IC (nM) m * * * v ' so v *
Deoxy 64,2 150 O-Pentyl 68,5 150 O-Propyl 70,4 70 O-Methyl 74,7 20 Fluor 76,9 10
Tyto 2'-modifikované oligonukleotidy se testují ohledně jejich antikódující aktivity proti H-ras použitím transaktivačniho reporterového genového testu popsaného v příkladu 9. Všechny tyto 2’-modifikované chimérické sloučeniny inhibují expresi ras a 7-merní 2’-fluorosloučenina s mezerou je nejaktivnější. Chimérický oligonukleotid substituovaný atomem fluoru v poloze 2’ s 5-merní centrální deoxy-mezerou je též aktivní.
Chimérické fosforothioatové oligonukleotidy mající číslo identifikace sekvence 1 a 21-O-propylové subsekvence připojené po stranách na 5-merní nebo 7-merní deoxy-subsekvence lze porovnat s 21-0-methylovými chimérickými oligonukleotidy. Exprese ras v buňkách T24 se inhibuje 21-O-methylovými a 2’-0-propylovými chimérickými oligonukle34 • ·
otidy se 7-merní deoxy-mezerou a jednotným fosforothioatovým základním řetězcem. Když deoxy-mezera klesá na pět nukleosidů, exprese ras se inhibuje pouze 2'-O-methylovým oligonukleotidem.
Antikódující inhibice oligonukleotidu exprese genu H-ras v nádorových buňkách
Dva fosforothioatové oligonukleotidy (2502, 2503) komplementární k oblasti ras AUG se testují, jak se popisuje v příkladu 10, spolu s chimérickými oligonukleotidy (4998, 5122) majícími stejné sekvence a 7-merní deoxy-subsekvence s 2'-O-methylovými subsekvencemi připojenými po stranách. Tyto chimérické oligonukleotidy ukazuje tabulka 3.
Tabulka 3
Chimérické fosforothioatové oligonukleotidy mající
21-0-methylové konce (polotučná písmena) a centrální deoxy-mezeru (cíl AUG)
Oligo #Deoxy Sekvence Id. č. sek.
2502 20 CTTATATTCCGTCATCGCTC 2
4998 7 CTTATATTCCGTCATCGCTC 2
2503 20 TCCGTCATCGCTCCTCAGGG 3
5122 7 TCCGTCATCGCTCCTCAGGG 3
Sloučenina 2503 inhibuje expresi ras v buňkách T24
o 71 % a chimérická sloučenina (4998) inhibuje informační ribonukleovou kyselinu ras dokonce ještě více (84% inhibice). Sloučenina 2502, která je též komplementární oblasti • ·· · · ·· ·· 99 99
9 9 9 9 9 ···· · · · « • · 9 9 9 9 9 999
9 9 9 9 9
99 9· 99
AUG, snižuje hladiny ribonukleové kyseliny ras o 26 % a chimérická verze tohoto oligonukleotidu (5122) ukazuje 15% inhibici. Tento rozbor též zahrnuje dva oligonukleotidy cílené na mutovaný kodon-12. Sloučenina 2570 (identifikační číslo sekvence 1) snižuje ribonukleovou kyselinu ras o 82 % a 2'-O-methylovou chimérickou verzi tohoto oligonukleotidu se 7-merní deoxy-subsekvencí (3985) snižuje ribonukleovou kyselinu ras o 95 %.
Oligonukleotidy 2570 a 2503 se též testuji pro stanovení jejich účinků na expresi ras v HeLa buňkách, které mají H-ras kodon-12 divokého typu (to jest neaktivovaný). Zatímco oba tyto oligonukleotidy ínhíbují expresi ras v T24 buňkách (majících aktivovaný kodon-12), pouze oligonukleotid (2503) specificky hybridizovatelný onkogenem ras AUG inhibuje expresi ras v HeLa buňkách. Oligonukleotid 2570 (identifikační číslo sekvence 1) specificky hybridizovatelný aktivovaným kodonem-T2 neinhibuje expresi ras v HeLa buňkách, neboť tyto buňky postrádají aktivovaný cíl kodon-12.
Oligonukleotid 2570, 17-merní fosforothioatový oligonukleotid komplementární oblasti kodonu-12 aktivovaného H-ras se testuje ohledně inhibice exprese ras (jak popisuje příklad 8) v buňkách T24 spolu s chimérickými fosforothioatovými 2'-O-methyl substituovanými oligonukleotidy 3980, 3985 a 3984, které mají stejnou sekvenci jako 2570 a mají deoxy-subsekvence o 5, 7 a 9 nukleosidových jednotkách (viz tabulku 1). Jednotný 2'-deoxyoligonukleotid 2570 a tři chimérické oligonukleotidy snižovaly hladiny informační ribonukleové kyseliny ras v buňkách T24. Sloučeniny 3985 (7-merní deoxy-mezera) a 3984 (5-merní deoxy-mezera) snižovaly informační ribonukleovou kyselinu ras o 81 %, sloučenina 3980 (5-merní deoxy-mezera) snižovala informační ribonu36 kleovou kyselinu ras o 61 %. Chimérické oligonukleotidy mající tuto sekvenci, avšak mající 2’-fluorsubstituované nukleosidy připojené po stranách 5-merní deoxy (4689) nebo
7-merní deoxy (4690) subsekvence, připojenou po stranách inhibovaly expresi informační ribonukleové kyseliny ras v buňkách T24 s preferovanou 7-merní deoxy-subsekvencí (82% inhibice proti 63% inhibici 2'-fluor-chimerou s 5-merní deoxy-subsekvencí).
Antikódujíci oligonukleotidová inhibice proliferace nádorových buněk
Tři 17-merní oligonukleotidy mající stejnou sekvenci (identifikační číslo sekvence 1) komplementární k oblasti kodonu-12 aktivovaného ras se testují ohledně účinků na proliferaci nádorových buněk T24, jak se popisuje v příkladu • 11. Oligonukleotid 3985 je jednotný fosforothioat mající
7-merní déoxy-subsekvenci s po stranách připojenými 2'-O-methylsubstituovanými nukleosidy a 4690 je jednotný fosforothioat mající 7-merní deoxy-subsekvencí (mezeru) s po stranách připojenými 2'-fluorsubstituovanými nukleosidy (CFCPAF cfafc CGA C G G CFGFCF CFCF, identifikační číslo sekvence 1, nukleosidy označené obsahují 2’-fluor-substituent a nukleosidy označené t jsou 2’-deoxy-erythro-pentofuranosylové nukleosidy). Účinky těchto nukleotidů na proliferaci nádorových buněk dobře korelují s jejich účinky na expresi informační ribonukleové kyseliny ras ukázanou Northernovou analýzou skvrny: oligonukleotid 2570 inhibuje buněčnou proliferaci o 61 %, 2’-0-methylový chimérický oligonukleotid 3985 inhibuje buněčnou proliferaci o 82 % a 2'-fluor-chimerický analog inhibuje buněčnou proliferaci o 93 %.
• 4 44 44 44
4 4 4 4 «
4444 4 44 4 ·« 444 444
4 4 4 » 4
4« 44 «4 4 4
Při studiích závislosti odpovědi na dávce těchto oligonukleotidů na buněčnou proliferací je tato inhibice dávkově závislá v rozmezí 25 nM až 100 nM. Hodnoty IC__o 44 nM, nM a 98 nM by bylo možno přisoudit oligonukleotidům 4690, 3985 respektive 2570. Kontrolní náhodný oligonukleotid nemá žádný účinek na testované dávky.
Účinek ISIS 2570 na buněčnou proliferací je specifický pro typ buněk. Inhibice proliferace buněk T24 tímto oligonukleotidem je čtyřikrát silnější než inhibice buněk HeLa stejným oligonukleotidem (koncentrace oligonukleotidu 100 nM). ISIS 2570 byl cílen k aktivovanému (mutovanému) kodonu-12 ras, který je přítomen v T24, avšak chybí v buňkách HeLa, které mají kodon-12 divokého typu.
Oligonukleotidy s modifikovaným chimérickým základním řetěz* cem
Oligonukleotidy diskutované v dřívějších příkladech mají jednotné fosforothioatové základní řetězce. 2'-Modifikované chimérické oligonukleotidy diskutované výše nejsou aktivní při jednotném fosfodiesterovém základním řetězci.
Byl syntetizován chimérický oligonukleotid (ISIS 4226) mající 2'-O-methyl-substituované oblasti připojené na 5-merní deoxy-mezeru, kde oblast mezery má vazby P=S a oblasti připojené po stranách mají vazby P=O. Byl též připraven další chimérický oligonukleotid (ISIS 4223) mající základní řetězec P=O v mezeře a P=S v oblastech připojených po stranách. Tyto oligonukleotidy se uvádějí v tabulce 4.
Byly též připraveny oligonukleotidy mající jednotné 21-deoxynukleosidové jednotky. Tyto oligonukleotidy mají fosforothioatové vazby buď s jednou fosfodiesterovou vazbou • 4
44 ··
4 6 4 • 4 4 4 · 4
4 4 4 444
4 4 4 4 « 4 · 4 * *' (ISIS 4248), dvěma fosfodiesterovými vazbami (ISIS 4546), třemi fosfodiesterovými vazbami (ISIS 4551), čtyřmi fosfodiesterovými vazbami (ISIS 4593), pěti fosfodiesterovými vazbami (ISIS 4606) nebo deseti fosfodiesterovými vazbami (ISIS 4241) v centrální oblasti molekuly. Tyto oligonukleotidy se též uvádějí v tabulce 4.
Tabulka 4
Oligonukleotidy s chimérickým základním řetězcem (P=S/P=O) majícím po stranách připojené 21-O-methylové skupiny (polo tučně) a centrální deoxy-mezeru [vazby základního řetězce označené s (P=S) nebo o (P=0)]
Oligo # P=S Sekvence Id. I sek v
2570 16 CsCsAsCsAsCsCsGsAsCsGsGsCsGsCsCsC 1
4226 5 C0C0A0C0A0CSCSCSASCSG0G0C0G0C0C0C 1
4233 11 CsCsAsCsAsCoCoGoAoCoGsGsCsGsCsCsC 1
4248 15 CsCsAsCsAsCsCsGsAoCsGsGsCsGsCsCsC 1
4546 14 CsCsAsCsAsCsCsGoAoCsGsGsCsGsCsCsC 1
4551 13 CsCsAsCsAsCsCsGoAoCoGsGsCsGsCsCsC 1
4593 12 CsCsAsCsAsCsCoGoAoCoGsGsCsGsCsCsC 1
4606 11 CsCsAsCsAsCsCoGoAoCoGoGsCsGsCsCsC 1
4241 6 CsCsAsCoAoCoCoGoAoCoGoGoCoGsCsCsC 1
Oligonukleotidy se inkubují v surových extraktech buněk HeLa při teplotě 37 °C pro určení jejich citlivosti k nukleasové degradaci, jak popisuje Dignam a kol., Nucleic Acids Res., li, 1475-1489 (1983). Oligonukleotid (4233) s 5-merní fosfodiesterovou centrální oblastí a s fosforo39 ·
• · » · · « » · · · • · · · ·« • <
f ·· thioatovými/21 -Ό-methyl-substituovanými oblastmi připojenými po stranách má = 7 h. Oligonukleotid s 5-merní fosforothioatovou centrální oblastí a s fosforothioatovými/2·-0-methyl-substituovanými oblastmi připojenými po stranách má T = 30 h. V souboru oligonukleotidů majících jednu až deset fosfodiesterových vazeb je oligonukleotid (4248) s jednou fosfodiesterovou vazbou tak stabilní vůči nukleasám jako jednotný fosforothioatový oligonukleotid ISIS 2570, který nevykazoval žádnou degradaci po 5 h v extraktu buněk HeLa. Oligonukleotidy s 2-merními, 3-merními a 4-merními fosfodiesterovými centrálními oblastmi mají T 3 zhruba 5,5 h,
3.75 h respektive 3,2 h a oligonukleotidy s 5-merními nebo
10-merními fosfodiesterovými centrálními oblastmi mají T z
1.75 h respektive 0,9 h.
Antikódující aktivita chimérických oligonukleotidů s modifi. kovaným základním řetězcem
Pro antikódující aktivitu se nepožaduje jednotný fosforothioatový základní řetězec. ISIS 4226 a ISIS 4233 se testují na ras-luciferasovém reporterovém systému ohledně účinku na expresi ras spolu s ISIS 2570 (jednotný řetězec fosforothioat/jednotný deoxy), ISIS 3980 (jednotný řetězec fosforothioat, po stranách připojené oblasti 2'-0-methyl s centrální deoxy-oblastí) a ISIS 3961 (jednotný fosfodiesterový řetězec, po stranách připojené 2'-0-methylové oblasti s centrální deoxy-oblastí). Všechny oligonukleotidy mající centrální oblast s P=S (to jest resistentní vůči nuklease) inhibovaly expresi ras. Dva jednotné 2'-deoxyoligonukleotidy mající fosforothioatové vazby obsahující bud’ jednu fosfodiesterovou vazbu (ISIS 4248) nebo 10 fosfodiesterových vazeb (ISIS 4241) ve středu molekuly byly též analyzovány ohledně aktivity. Oligonukleotid obsahující jednu vazbu P=0 φφ φ« φ · · · • φ · · · • · · · · · · • · φ φ · · · φφφφ · · φφ φφ φφ ·· φφφ byl stejně aktivní jako oligonukleotid obsahující všechny fosforothioatové vazby (jednotný oligonukleotid P=S), zatímco tentýž oligonukleotid obsahující 10 vazeb P=O byl zcela neaktivní.
Byly připraveny chimérické fosforothioatové oligonukleotidy identifikační číslo sekvence 1 mající fosforothioatový základní řetězec v 7-merní centrální deoxy-oblasti (mezeru) a fosfodiesterové vazby v oblastech připojených po stranách, které jsou buď 2'-0-methyl- nebo 2’-0-propyl-substituované. Oligonukleotid s oblastmi připojenými po stranách s 2’-O-propyl-substituovaným fosfodiesterem jsou schopné inhibovat expresi ras.
Příklad 8 . Křivky tání
Křivky absorbance proti teplotě se měří při 260 nm s použitím spektrofotometru Gilford 260 propojeného na počítač IBM PC a spektrofotometru Gilford Response II. Pufr obsahuje koncentrace 100 mM sodných iontů, 10 mM fosfátu a 0,1 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové při pH 7. Koncentrace oligonukleotidu je 4 μΜ, každé vlákno se určuje podle absorbance při 85 °C a extinkční koeficienty se vypočítávají podle Puglisiho a Tinocoa, Methods in Enzymol., 180,
304-325 (1989). Hodnoty Tm volných energií tvorby duplexu a asociačních konstant se obdrží z proložení hodnot pro dvojstavový model se základními hodnotami s lineárním sklonem. M. Petersheim a D. H. Turner, Biochemistry, 22f 256-263 (1983). Uváděné parametry jsou průměry alespoň tří pokusů. Pro některé oligonukleotidy se též obdržely volné energie tvorby duplexů z vynesení Tý1 proti logio(končen41 ·· * ·· ·· ·· ·· ··«· ··· ·<· • · · ···· · ·9
999··»· ··· ·· • · · · · · · ···· ··· «· ·· ♦· *· trace). P. N. Borer, B. Dengler, I. Tinoco, Jr. a 0. C. Uhlenbeck, J. Mol. Biol., 86, 843-853 (1974).
Příklad 9
Reportérovy genový systém transaktivace ras
Expresní plasmid pSV2-oli obsahující aktivovanou (kodon-12, GGC—>GTC) vloženou část komplementární deoxyribonukleové kyseliny H-ras za kontroly konstitučního promotoru SV40 byl dar od Dr. Bruno Tocgue (Rhone-Poulenc Sante, Vitry, Francie). Tento plasmid se použije jako templát pro vytvoření pomocí PCR expresního plasmidu H-ras při regulaci steroidem indukovatelným promotorem myšího viru karcinomu mamy (MMTV). Pro obdržení kódovacích sekvencí H-ras se kódovací oblast 570 bp genu H-ras amplifikuje PCR. Primery PCR se vytvářejí s jedinečnými restrikčními endonukleasovými místy ve- svých oblastech 5· pro usnadnění klonování. Produkt PCR obsahující kódovací oblast mutovaného onkogenu kodonu-12 H-ras se podrobí gelovému čištění, digeruje a gel se před klonováním čistí ještě jednou. Tato konstrukce se dokončuje klonováním vložené části do plasmidu exprese pMAMneo (Clontech Laboratories, CA).
Ras-responsivní reporterový gen pRDO53 se používá pro detekci exprese ras. Owen a kol., Proč. Nati. Acad. Sci.
USA, 87, 3866-3870 (1990).
Příklad 10
Northernova analýza skvrny pro expresi ras in vivo • 9 · 99
9*99 9 9 9 9 · 9 · • · · · · · · · · 9 · • · · 9 ·· · · ······ • 9 9 9 9 · 99 • 999 ··· ·· 99 99 99
Buněčná linie Τ24 lidského nádoru močového měchýře pochází od American Type Culture Gollection (Rockville MD). Buňky se pěstují v McCoyově médiu 5A s L-glutaminem (Gibco BRL, Gaithersburg MD) s přídavkem 10 % tepelně inaktivovaného fetálního telecího séra a 50 jednotek /ml penicilinu a 50 jednotek/ml streptomycinu. Buňky se očkují na desky 100 mm. Při dosaženi 70% splynutí se zpracuji oligonukleotidem. Desky se promyjí 10 ml předehřátého fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem a 5 ml média s redukovaným sérem OptiMEM obsahujícího 2,5 μΐ DOTMA. Poté se přidá oligonukleotid do žádané koncentrace. Po 4 h zpracování se médium nahradí McCoyovým médiem. Buňky se sbírají 48 h po zpracování oligonukleotidem a ribonukleová kyselina se izoluje s použitím standardního způsobu čištění s chloridem česným. R. E. Kingston, v Current Protocols in Molecular Biology, (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman a K. Strahl, red.), John Wiley and Sons, NY.
Buněčná linie HeLa 229 lidského epithelioidního karcinomu pochází od American Type Culture Collection (Bethesda, MD). Buňky HeLa se udržují jako monovrstvy na
6-jamkových deskách v Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) s přídavkem 10% fetálního bovinního séra a penicilinu 100 jednotek/ml. Zpracování oligonukleotidem a izolace ribonukleové kyseliny jsou v podstatě stejné, jako se popisuje pro buňky T24 výše.
Northernova hybridizace. 10 μg každé ribonukleové kyseliny se podrobí elektroforéze na 1,2% gelu agarosa/formaldehyd a přenese přes noc na nylonovou membránu GeneBind 45 (Pgharmacia LKB, Piscataway, NJ) s použitím standardních způsobů. R. E. Kingston, v Current Protocols in Molecular Biology, (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D.
·· · 00 0 * 0 0 0 0
0 0 000· 0 00 0
0 00 00 00 000 000
0 0000 0 0 0000 000 00 00 00 00
Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman a K. Strahl, red.), John Wiley and Sons, NY. Ribonukleová kyselina se připojí k membráně působením ultrafialového světla. Dvojvláknové sondy značené 32P se připravují s použitím značkovací soupravy Prime a Gene (Promega, Madison WI). Sonda ras je fragment klonu Sall-Nhel komplementární deoxyribonukleové kyseliny aktivované (mutované) informační ribonukleovou kyselinou H-ras s mutaci GGC-na-GTC na kodonu-12. Kontrolní sonda je G3PDH. Skvrny se předběžně hybridizují po dobu 15 min při 68 °C hybridizačním roztokem QuickHyb (Stratagene, La Jolla, CA). Přidá se tepelně denaturovaná radioaktivní sonda (2,5 x 10® impulsů/2 ml hybridizačního roztoku) smíchaná se 100 μΐ deoxyribonukleové kyseliny lososího spermatu 10 mg/ml a membrána se hybridizuje po dobu 1 h při teplotě 68 °C. Skvrny se promývají dvakrát po dobu 15 min při teplotě místnosti dvakrát v SSC/0,1 % SDS a jednou po dobu 30 min při ’ teplotě 60 °C v 0,lxSSC/0,1%SDS. Skvrny se vyhodnotí autoradiografičky a intensita signálu se hodnotí kvantitativně s použitím přístroje ImageQuant Fosphorlmager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Northernovy skvrny se nejprve hybridizují se sondou ras, poté se sejmou varem po dobu 15 min v 0,lxSSC/0,1%SDS a rehybridizují s kontrolní sondou G3PDH pro ověření správného nanesení vzorku.
Příklad 11
Antikódující oligonukleotidová inhibice proliferace nádorových buněk
Buňky se pěstují a zpracovávají oligonukleotidem v podstatě tak, jak se popisuje v příkladu 10. Buňky se nanášejí na desky 60 mm a zpracují oligonukleotidem v přítomnosti DOTMA, až dosáhnou 70% splynutí.
• • 44
4 4 » 4 4 • 44 4 4 4«
Pokus pro určení časového průběhu. Prvního dne se buňky zpracují jednou dávkou oligonukleotidu při konečné koncentraci 100 nM. Růstové médium se vymění jednou třetího dne a buňky se počítají každý den po dobu 5 dnů s použitím počítací komůrky.
Pokus pro určení závislosti dávka-odpověď. Různé koncentrace oligonukleotidu (10, 25, 50, 100 nebo 250 nM) se přidají k buňkám a buňky se sbírají a počítají po třech dnech. Oligonukleotidy 2570, 3985 a 4690 se testují ohledně účinků na proliferaci nádorových buněk T24.
Příklad 12
Inhibice exprese PKC-α informační ribonukleové kyseliny chi• merickými (s deoxy-mezerou) 2’-O-methyl-oligonukleotidy
Oligonukleotidy s číslem identifikace sekvence 4 se připravují jako jednotné fosforothioatové chimérické oligonukleotidy mající centrální deoxy-oblast neboli deoxy-mezeru o různé délce s 2’-O-methyl-substituovanými subsekvencemi připojenými po stranách. Tyto oligonukleotidy (koncentrace 500 nM) se testují ohledně účinku na hladiny informační ribonukleové kyseliny PKC-α na základě Northernovy analýzy skvrny. Deoxy-mezery o 8 či více nukleosidech poskytují maximální snížení hladin PKC-α informační ribonukleové kyseliny (oba transkripty) ve všech případech. Tyto oligonukleotidy snižují informační ribonukleovou kyselinu PKC-a zhruba o 83 % s deoxy-mezerou o délce 4 nukleotidů a poskytují téměř úplnou redukci informační ribonukleové kyseliny PKC-α s délkou deoxy-mezery o 6 či více nukleosidech.
• 9
99 99 99
9 9 9 9 9
9999 9 99 9
99 999 999
9 9 9 9 9
99 99 99
2'-O-Methyl-substituované chimérické oligonukleotidy se 4-merními nebo 6-merními deoxy-mezerami mají ICso pro sníženi informační ribonukleové kyseliny PKC-α (koncentrace oligonukleotidu potřebná pro 50% snížení hladin PKC-α informační ribonukleové kyseliny) 200 nM až 250 nM jako jednotný deoxy-oligonukleotid (všechny jsou jednotnými fosforothioaty). 21-Ο-Methyl-substituovaný chimérický oligonukleotid s 8-merní deoxy-mezerou má IC zhruba 85 nM.
Několik variací tohoto chimérického oligonukleotidu (číslo identifikace sekvence 4) se porovnává ohledně schopností snižovat hladiny informační ribonukleové kyseliny PKC-α. Tyto oligonukleotidy ukazuje tabulka 5.
Tabulka 5 • Chimérické 2’-O-methyl/deoxy P=S oligonukleotidy (polotučně) = 2’-O-methyl, s = vazba P=S, o = vazba P=O
Oligo Sekvence Id. č.
sekv.
3522 AsAsAsAsCsGsTsCsAsGsCsCsAsTsGsGsTsCsCsC 4 5352 AsAsAsAsCsGsTsCsAsGsCsCsAsTsGsGsTsCsCsC 4 6996 AoAoAoAoCoGsTsCsAsGsCsCsAsTsGoGoToCoCoC 4 7008 AsAoAoAoCoGsTsCsAsGsCsCsAsTsGoGoToCoCsC 4 7024 AsAoAoAoCoGsToCsAoGsCoCsAsTsGoGoToCoCsC 4
Obr. 3 ukazuje účinek těchto oligonukleotidů na hladiny informační ribonukleové kyseliny PKC-α. Oligonukleotidy 7008, 3522 a 5352 vykazují snížení informační ribonukleové kyseliny PKC-α a nejaktivnější z nich je 5352.
• 4 ·· 99 44 • · 4 · 9 9
9999 9 99 9
44 444 444
4 4 4 ·
44 44 44
Připraví se řada chimérických 2’-0-propyl oligonukleotidů s číslem identifikace sekvence 4. Tyto oligonukleotidy ukazuje tabulka 6.
Tabulka 6
Chimérické 2'-O-propyl/deoxy P=S oligonukleotidy (polotučně) = 2'-0-propyl, s = vazba P=S, o = vazba P=0
Oligo Sekvence
Id. č. sekv.
7199 AsAsAsAsCsGsTsCsAsGsCsCsAsTsGsGsTsCsCsC 4
7273 AoAoAoAoCoGsTsCsAsGsCsCsAsTsGoGoToCóCoC 4 . 7294 AsAoAoAoCoGsTsCsAsGsCsCsAsTsGoGoToCoCsC 4
7295 ,AsAoAoAoCoGsToCsAoGsCoCsAsTsGoGoToCoCsC 4
Tyto 2’-O-propyl-substituované chimérické oligonukleotidy se porovnávají s 2'-O-methyl-substituovanými chimérickými oligonukleotidy. Oligonukleotidy 7273 a 7294 jsou aktivnější než jejich 21-O-methylové protějšky při snižování hladin informační ribonukleové kyseliny PKC-α. Obr. 4 a 5 ukazují tyto výsledky.
Příklad 13
Přídavné oligonukleotidy snižující expresi informační ribonukleové kyseliny PKC-a
Navrhují se a připravují přídavné fosforothioatové oligonukleotidy cílené na oblast lidských PKC-a 3’ bez
9 9
99
9 9 9
9 9 9
999 999
9 translace. Tabulka 7 ukazuje tyto sekvence.
Tabulka 7
Chimérické 2'-O-propyl/deoxy oligonukleotidy P=S cílené na 3' -UTR PKC-a (polotučně) = 2’-0-propyl, s = vazba P=S, o = vazba P=0
Oligo Sekvence
Id. č. sekv.
6632 TsTsCs TsCsGs CsTsGs GsTsGs AsGsTs TsTsC 5
6653 TsTsCs TsCsGs CsTsGs GsTsGs AsGsTs TsTsC 5
6665 ToToCo TsCsGs CsTsGs GsTsGs AsGsTo ToToC 5
7082 TsCsTs CsGsCs TsGsGs TsGsAs GsTsTS Tsc 6
7083 ÍTsCsTs CsGsCs TsGsGs TsGsAs GsTsTs TsC 6
7084 ToCoTo CsGsCs TsGsGs TsGsAs GsToTo ToC 6
Oligonukleotidy 6632, 6653, 7082 a 7083 jsou při snižování hladin informační ribonukleové kyselinyPKC-α nejaktivnější .
Příklad 14
Účinek oligonukleotidů majících číslo identifikace sekvence 30 na hladiny informační ribonukleové kyseliny PKC-a
Buňky A549 byly zpracovány fosforothioatovými oligonukleotidy při koncentraci 500 nM po dobu 4 h za přítomnosti kationtových lipidů DOTMA/DOPE, promyty a ponechány v klidu po dobu dalších 20 h. Celková ribonukleová kyselina se • · • 44 44
4 4 · • · · · · ·
4 4 4 4 4
4 4 4 4
444 44 44
44 » 4 4 4 » 4 4 4
444 444
4
44 extrahovala a 20 Mg z každého vzorku bylo rozděleno na 1,2% gelech a přeneseno na nylonové membrány. Skvrny byly opatřeny sondou informační ribonukleové kyseliny PKC-α s radioaktivním značením nuklidem 32P a poté byly sejmuty a znovu opatřeny radioaktivní sondou G3PDH pro ověření stejného obsazeni ribonukleové kyseliny. Každý oligonukleotid [3520 (číslo identifikace sekvence 31), 3521 (číslo identifikace sekvence 30), 3520 (číslo identifikace sekvence 4) a 3527 (číslo identifikace sekvence 32)] se použil duplikátně. Dva hlavní transkripty PKC-a (8,5 kb a 4,0 kb) se vyšetřují a hodnotí kvantitativně pomocí přístroje Phosphorlmager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). ISIS 3521 (číslo identifikace sekvence 30) poskytuje zhruba 80% snížení menšího transkriptu a více než 90% snížení většího transkriptu.
Připraví se dva oligonukleotidy mající číslo identifikace sekvence 30 a 8-merní centrální deoxy-oblast, ke které jsou ha každé straně připojeny nukleosidy mající modifikaci 2'-OCH2CH2OCH3. Pro snadnou přípravu je posledním nukleosidem deoxynukleosid. Tyto sloučeniny ukázané v tabulce 8 se liší v tom, že jeden z nich, ISIS 9606 má jednotný fosforothioatový základní řetězec, zatímco druhý, ISIS 9605, má fosforothioatový základní řetězec v centrální oblasti (vazby základního řetězce 7 až 14) a fosfodiesterový základní řetězec v připojených oblastech. Tyto oligonukleotidy se testují ohledně schopnosti inhibovat expresi informační ribonukleové kyseliny PKC-a v buňkách A549 ve srovnání s fosforothioatovou sloučeninou ISIS 3521. Obrázky 6a a 6b ukazují výsledky. ICso jsou vypočítané (oligonukleotidové koncentrace poskytující 50% inhibici) pro tři sloučeniny. Fosforothioatové sloučenina ISIS 3521 vykazuje ICso zhruba 170 nM. Obě methoxyethoxysloučeniny, ISIS 9605 a 9606 ukazují ICso zhruba 25 nM. Tento šestinásobný až sedminásobný vzrůst schopnosti
4 4 44
4 44 · · · 4 · 4 · • · 4 444· 4 44 4
4444444 444 444
4 4444 · 4
4444 444 44 4· 44 44 methoxyethoxy-modifikace ukazuje na překvapivou aktivitu. Vzhledem k mimořádně nízkým hodnotám ICso se preferují sloučeniny 9605 a 9606.
Tabulka 8
Oligonukleotidy mající číslo identifikace sekvence 30
ISIS # Sekvence
3521 GsTsTsCsTsGsGsCsTsGsGsTsGsAsGsTsTsTsCsA
9605 GoToToCoToCsGsCsTsGsGsTsGsAsGoToToToCoA
9606 GsTsTsCsTsCsGsCsTsGsGsTsGsAsGsTsTsTsCsA
12723 GoToToCoToCsGsCsTsGsGsTsGsAsGoToToToCoA • polotučně = 2'-OCH CH OCH x 2 2 3 s = fosfďrothioatová vazba (P=S) o = fosfodiesterová vazba (P=0)
Příklad 15
Účinek 21-methoxyethoxyoligonukleotidu ISIS 12723 na růst lidských tumorů tlustého střeva Colo-205 u athymických nu/nu myši
Subkutánní xenografty karcinomu tlustého střeva Colo-205 u athymických nu/nu myší se vytvoří podkožní injekcí 5 x 10® buněk Colo-205. Myši dostávají ISIS 12723 (číslo identifikace sekvence 30), oligonukleotid mající 8-merní centrální deoxy-oblast, ke které je na každé straně připojena 6-merní subsekvence mající modifikaci 2*-OCH CH OCH , fosforothioatový základní řetězec v centrální oblasti (vazby ··
• · · · 4 4 · · *
4« <4 4 4
44
4 » 4
444 444 základního řetězce 7 až 14) a fosfodiesterový základní řetězec v připojených oblastech, nebo ISIS 3521 (číslo identifikace sekvence 30, jednotný deoxyfosforothioat), intravenózní podáváním jednou denně v dávce 0,006, 0,06, 0,6 nebo 6,0 mg/kg. V této studii inhiboval ISIS 12723 růst nádoru o více než 95 % ve srovnání s kontrolními zvířaty, která dostávala fyziologický roztok jako placebo (obr. 7b) a ISIS 3521 inhibuje růst tumoru o více než 83 % ve srovnání s kontrolami (obr. 7a). Proto se preferuje methoxyethoxysloučenina ISIS 12723 .
Příklad 16
Inhibice exprese c-raf chimérickými oligonukleotidy
Chimérické oligonukleotidy mající číslo identifikace • sekvence 7 se navrhují s použitím sekvence c-raf Genbank HUMRAFR fGenbank listing X03484) synthetizují a testují ohledně inhibice exprese informační ribonukleové kyseliny onkogenu c-raf v buňkách karcinomu měchýře s použitím Northernovy analýzy skvrny. Tyto chimérické oligonukleotidy mají centrální oblasti mezery o 6, 8 nebo 10 deoxynukleosidech připojených po stranách dvěma oblastmi 2'-0-methyl-modifikováných nukleosidů, jak ukazuje tabulka 9. Základní řetězce jsou jednotně fosforothioatové. V Northernově analýze skvrny, jak se popisuje v příkladu 20, vykazují všechny tři oligonukleotidy (ISIS 6720, 6-merní deoxy-mezera, ISIS 6717, 8-merní deoxy-mezera, ISIS 6729, 10-merní deoxy-mezera) více než 70% inhibici exprese informační ribonukleové kyseliny c-raf v buňkách T24. Tyto oligonukleotidy se preferují. Oligonukleotid s 8-mernl deoxy-mezerou (6717) vykazuje více než 90% inhibici a preferuje se ještě více.
Tabulka 9
Chimérické oligonukleotidy s 2’-0-methyl deoxy-mezerou s P=S polotučně = 2'-O-methyl
Oligo Sekvence Cílové místo č. id.
sek v.
6720 TCCCGCCTGTGACATGCATT 3·UTR 6717 TCCCGCCTGTGACATGCATT 3'UTR 6729 TCCCGCCTGTGACATGCATT 3'UTR
Další připravované chimérické oligonukleotidy mají jednu či více oblastí 2'-O-methyl-modifikace a jednotné fosforothioatové základní řetězce. Tabulka 10 ukazuje tyto oli• gonukleotidy. Všechny jsou fosforothioaty, polotučně vytištěné oblasti znáči 2·-O-methyl-modifikované oblasti.
Tabulka 10
Chimérické 2'-O-methyl-oligonukleotidy c-raf P=s
Oligo Sekvence Cílové místo Č. id sekv.
7848 TCCTCCTCCCCGCGGCGGGT 5'UTR 8
7852 TCCTCCTCCCCGCGGCGGGT 5'UTR 8
7849 CTCGCCCGCTCCTCCTCCCC 5'UTR 9
7851 CTCGCCCGCTCCTCCTCCCC 5'UTR 9
7856 TTCTCGCCCGCTCCTCCTCC 5'UTR 10
7855 TTCTCGCCCGCTCCTCCTCC 5'UTR 10
7854 TTCTCCTCCTCCCCTGGCAG 3 'UTR 11
7847 CTGGCTTCTCCTCCTCCCCT 3 'UTR 12
7850 CTGGCTTCTCCTCCTCCCCT 3'UTR 12
7853 CCTGCTGGCTTCTCCTCCTC 3 'UTR 13
9355 CGGGAGGCGGTCACATTCGG 5'UTR 19
Při testování schopnosti inhibovat informační ribonukleové kyseliny c-raf Northernovou analýzou skvrny poskytují ISIS 7848, 7849, 7851, 7856, 7855, 7854, 7847 a 7853 více než 70% inhibici a proto se preferují. Z nich 7851, 7855, 7847 a 7853 poskytuji vyšší než 90% inhibici a proto se preferují více.
Připravují se a zkoušejí další chimérické oligonukleotidy s různými 2'-modifikacemi. Tabulka 11 ukazuje tyto oligonukleotidy. Jsou to vesměs fosforothioaty, polotučně vytištěné oblasti označují 2’-modifikované oblasti.
Tabulka 11
Chimérické 2'-modifikované oligonukleotidy c-raf P=S
Oligo Sekvence Cílové místo Č. sel· id. :v.
6720 TCCCGCCTGTGACATGCATT 3 1UTR 2' -O-Me 7
6717 TCCCGCCTG TGACATGCATT 3 'UTR 2 ' -O-Me 7
6729 TCCCGCCTGTGACATGCATT 3 'UTR 2' -O-Me 7
8097 TCTGGCGCTGCACCACTCTC 3 'UTR 2' -O-Me 14
9270 TCCCGCCTGTGACATGCATT 3 'UTR 2' -O-Pr 7
9058 TCCCGCCTGTGACATGCATT 3 'UTR 2' -F 7
9057 TCTGGCGCTGCACCACTCTC 3 'UTR 2' -F 14
Z nich se preferují oligonukleotidy 6720, 6717, . 6729, 9720 a 9058. Více se preferuji oligonukleotidy 6717,
6729, 9720 a 9058.
Přiklad 17
Účinek 2'-methoxyethoxyoligonukleotidů majících číslo identifikace sekvence 7 na expresi informační ribonukleové kyseliny c-raf
Připraví se dva oligonukleotidy mající číslo identifikace sekvence 7 a centrální subsekvenci 8-nukleosidové jednotky obsahující 2'-deoxy-erythro-pentofuranosylové zbytky cukru se subsekvencemi 6-nukleosidových jednotek připojenými na každé straně majícími modifikace 2'-O-CH -CH -O-CH . Tyto sloučeniny se liší v tom, že jedna z nich, ISIS 10755 (též známá jako CIBA 1440) má jednotný fosforothioatový základní řetězec, druhá, ISIS 10754 (též známá jako CIBA 1439 nebo CGP 69845) má fosforothioatové vazby v centrální oblas- 54 • t « ·
Φ··· ·· • · · · • · · · • · ·'» ·· ·· • · · · • · · · • ·· · ··· • · • · * · ti ( vazby 7 až 14) a fosfodiesterové vazby v oblastech připojených po stranách. Tyto oligonukleotidy se testují ohledně schopnosti inhibovat expresi informační ribonukleové kyseliny c-raf v buňkách T24. Vypočítané ICso (oligonukleotidová koncentrace poskytující 50% inhibici) jsou v tabulce 12 spolu s hodnotami Tm ukazujícími afinitu těchto oligonukleotidů k jejich komplementu. Vzhledem ke svým mimořádně nízkým hodnotám ICso se oba, ISIS 10755 a ISIS 10754, preferují. Oligonukleotidy použité podle tohoto vynálezu se mohou výhodně rutinně připravovat dobře známými způsoby syntézy v pevné fázi [Martin, Helv. Chim. Acta, 78, 486-504 (1995)]. Zařízení pro tuto syntézu prodávají různé společnosti včetně Applied Biosystems. Lze též použít kterékoliv jiné prostředky pro tuto syntézu a samotná syntéza oligonukleotidů je dobře známá v rámci schopností toho, kdo má zkušenost v oboru.
Tabulka 12
Antikódující aktivita v buňkách T24 a T m
ISIS # Modifikace T (°C) IC so (nM) Č. id. sek v.
5132 deoxy/P=S 62,2 125 7
10755 2'-O-CH CH OCH /P=S 2 2 3' 76,1 20 7
10754 2’-O-CH CH OCH / 2 S 3Z 77,5 20 7
P=S/P=O
Příklad 18
Účinek ISIS 5132 a CGP 69845 na lidské plicní adenokarcinomy
A549
Subkutánní xenografty lidského plicního adenokarcinomu A549 se vytvoří u samců athymických nu/nu myší Balb/c a léčí se ISIS 5132 (číslo identifikace sekvence 7) nebo methoxyethoxy (2'-O-CH2-CH2-O-CH3) verzí sekvence čísla identifikace 7 (CGP 69845), v obou případech denním podáváním intravenózní injekce v dávkách od 0,006 do 6,0 mg/kg. ISIS 5132 snižuje velikost tumoru pří všech dávkách způsobem závislým na dávce, jak ukazují obr. 6a a 6b. Methoxyethoxyoligonukleotid (2’-O-CH2-CH2-O-CH3), CGP 69845, má účinky podobné jako ISIS 5132 při nižších dávkách a dokonce vyšší inhibiční účinky než ISIS 5132 při dávce 6,0 mg/kg.
Příklad 19
Xenografty A549 x 106 buněk A549 se implantuje subkutánně do vnější strany stehna athymické nu/nu myši. Oligonukleotidy (ISIS 5132 a CGP 69845, též známé jako ISIS 10754) suspendované ve fyziologickém roztoku se podávají jednou denně intravenózní injekcí při dávkách mezi 0,006 a 6,0 mg/kg. Výsledné tumory se měří 9., 12., 17. a 21. dne a vypočítají se objemy tumorů.
Přiklad 20
Northernova analýza skvrny pro inhibici exprese informační ribonukleové kyseliny c-raf
Linie buněk T24 lidského nádoru močového měchýře pochází od American Type Culture Collection (Rockville, MD). Buňky se pěstují v McCoyově médiu 5A s L-glutaminem (Gibco
·· ··
BRL, Gaithersburg MD) s přídavkem 10% tepelně inaktivovaného fetálního telecího séra, 50 jednotek/ml penicilinu a 50 jednotek/ml streptomycinu. Buňky se očkují na desky 100 mm. Při dosažení 70% splynutí se zpracují oligonukleotidem. Desky se promyjí 10 ml předehřátého fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem a 5 ml média s redukovaným sérem OptiMEM obsahujícím 2,5 μΐ DOTMA. Poté se přidá oligonukleotid s lipofektinem do žádané koncentrace. Po 4 h zpracování se médium nahradí McCoyovým médiem. Buňky se sbírají 24 až 72 h po zpracování oligonukleotidem a ribonukleová kyselina se izoluje s použitím standardního purifikačního způsobu s chloridem česným. R. E. Kingston v Current Protocols in Molecular Biology, (F. M. Ausubel, R.- Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman a K. Strahl, red.), John Wiley and Sons, NY. Celková ribonukleová kyselina se izoluje centrifugací na lysátech buněk přes vrstvu chloridu česného.
• Vzorky ribonukleové kyseliny se podrobí elektroforéze s 1,2% gelem agarosa-formaldehyd a přenesou na hybridizační membrány kapilární difúzí probíhající po dobu 12 až 14 h. Ribonukleová kyselina se připojí k membráně expozicí ultrafialovému světlu v zařízení Stratalinker (Stratagene La Jolla, CA) a hybridizuje s náhodně aktivovanou sondou komplementární deoxyribonukleové kyseliny c-raf značenou radionuklidem 32P (obdrženou z ATCC) nebo se sondou G3PDH jako kontrolou. Ribonukleová kyselina se vyhodnotí kvantitativně s použitím přístroje Phosphorimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Příklad 21
Oligonukleotidová inhibice exprese genu Rev
Tabulka 13 níže ukazuje chimérické oligonukleotidy
4
444 444 • 4 • 4 44 použité v tomto rozboru.
Tabulka 13
Chimérické 2'-O-propyl/deoxy-oligonukleotidy s vazbami P=S cílené na gen rev HIV polotučně = 2’-0-propyl s = vazba P=S, o = vazba P=0
Oligo Sekvence Id. č.
sekv.
8907 UoAoGoGoAoGoAsUsGsCsCsUsAsAoGoGoCoUoUoU 20
8908 GoCoUoAoUoGoUsCsGsAsCsAsCsCoCoAoAoUoUoC 21
8909 CoAoUoAoGoGoAsGsAsUsGsCsCsUoAoAoGoGoCoT 22
Stanovení transfekce a luciferasy. Buňky 3T3 se udržují V DMEM s glukósou, L-glutaminem, pyruvatem sodným a 10% fetálním hovězím sérem (GIBCO). Pro všechny experimenty se buňky očkují předchozí noci v množství 75000 buněk/jamka v 6-jamkových deskách (Falcon). Transfekce se provádí s použitím standardního způsobu s fosforečnanem vápenatým. Pro každý soubor replikátů se vysráží 15 μg/ml plasmidu pSG5/rev, 18 μg/ml pHIVenu-luc a 2 μg/ml Rep 6 a 200 μΐ této směsi se nakape do každé jamky. Sraženina se ponechá inkubovat na buňkách po dobu 7 h při teplotě 37 °C. Média se potom odsají, buňky se promyjí jednou fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a přidají se čerstvá úplná média pro inkubaci přes noc. Po inkubaci se média odstraní, buňky se promyjí 2 ml OPTIMEM (GIBCO) a 1 ml OPTIMEM obsahujícím 2,5 μg/ml Lipofektinu (GIBCO-BRL) a přidá se oligonukleotid. Směs se inkubuje po dobu 4 h při 37 °C a po tomto čase se odsaje od buněk a přidají se úplná média. Po dvou • 0 » ·· ·* • 0 00 0 0 0
0 0 0000
0 0 0 0 0
0 0 0 0
0000 000 00 00 h tohoto zpracování se přidá 0,2 gg/ml dexamethasonu (Sigma) do všech jamek pro umožnění indukce promotoru MMTV pHIVenu-luc.
Stanovení luciferasy se provede po 24 h následujícím způsobem. Jamky se promyjí dvakrát fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a buňky se sbírají stíráním do 200 μΐ pufru pro lýzu (koncentrace Tritonu 1%, glycylglycinu 25 mM, pH 7,8, síranu hořečnatého 15 mM, EGTA 4 mM a DTT 1 mM). Lyzát se vyčeří mikrocentrifugací po dobu 5 min při frekvenci otáčení 11500 min“1 za chladu. Poté se 100 μΐ lyzátu spojí v mikrotitrační misce s 50 μΐ pufru pro rozbor (koncentrace glycylglycinu 25 mM, pH 7,8, síranu hořečnatého 15 mM, EGTA 4 mM, fosforečnanu draselného 15 mM pH 7,8, DTT 1 mM a ATP
7,5 mM). Detekce luciferasy se provede s použitím mikrotitračního luminiscenčního odečítacího zařízení (Dynatech Labo• ratories). Reakce se zahájí injekcí 50 μΐ luciferasového roztoku IX (Sigma). Roztok IX se zředí luciferinovým pufrem (koncentrace glycylglycinu 25 mM, pH 7,8, síranu hořečnatého 15 mM, EGTA 4 mM a DTT 4 mM) před použitím z desetinásobného zásobního roztoku (koncentrace luciferinu 10 mM v 10 mM roztoku DTT). Vzorky se měří po dobu 20 s. Kinetika emise světla luciferasy od světlušky se charakterizuje trváním doby záblesku několik s po které následuje emise světla o nižší intenzitě trvající několik min.
Syntéza ribonukleové kyseliny Rev a PRE. pSG%-Rev obsahuje gen Rev přiléhající k promotoru T7. Používá se BglII linearizovaný pSG5-Rev jako templát deoxyribonukleové kyseliny pro transkripci T7 RNA polymerasy. Templát pro produkci ribonukleové kyseliny RRE se vytváří pomocí PCR. Pro syntézu ribonukleové kyseliny se používají templáty deoxyribonukleové kyseliny při 0,2 až 1,0 mg/ml s koncentracemi ATP, CTP φ AA AA AA AA
AAA AAA AAA • · A A A A A AAA
a GTP 5 mM, UTP 0,5 mM, DTT 10 mM, Tris-HCl 40 mM, pH 7,5, chloridu horečnatého 6 mM, Spermidinu 4 mM, RNAsinu 500 jednotek/ml, a 32P UTP 2500 μΟί/πιΙ při 10 mCi/ml a T7 RNA-polymerasy 1000 jednotek/ml. Reakční směs se inkubuje po dobu 1 h při teplotě 37 °C. Reakce transkripce se ukončí přídavkem pufru s formamidem a provede se postup v denaturačním polyakrylamidovém gelu s obsahem močoviny o koncentraci 8 M. Ribonukleová kyselina se eluuje z gelu podle postupu Schwartze a kol. [Gene, 88, 197 (1990)].
Příklad 22
Imunoassay pro antivirový screening
Buňky NHDF se naočkují na 96-jamkové desky při hustotě 15000 buněk/jamka v médiu FGM bez séra. Vytvořené monovrstvy se předběžně zpracují oligonukleotidem přes noc v FGM před infé'kcí. Po předběžném zpracování se buňky promyjí třikrát čerstvým předehřátým FGM a virus ve 100 μΐ FGM/jamka se přidá pro dosažení MOI 0,05 PFU/buňka. Po 2 h inkubace při 37 °C se virus odebere a přidá se čerstvé médium (100 μΐ/jamka) obsahující oligonukleotid. Médium se vymění 2 d po infekci za čerstvé médium obsahující oligonukleotid a 6 d po infekci se buňky fixují v absolutním ethanolu a suší pro barvení protilátek. Modifikovaný postup se používá pro některé rozbory, ve kterých se FGM dodává při nízkých hladinách fetálního hovězího séra (0,2 %) a inkubační doba po infekci se zkrátí ze 6 d na 3 d. Kratší rozbor eliminuje nutnost výměny média 2 d po přenesení infekce. Oba rozbory poskytují srovnatelné výsledky pro 50% účinné koncentrace (EC ) .
' 50 '
Fixované buňky se blokují v roztoku PBS obsahujícím • ·
2% bovinní serumalbumin (BSA) a myší monoklonální protilátku (1H10 od Eisai Co., Ltd., Japan) se přidá ve zředění 1:2000 ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem s 1 % BSA. Protilátka 1H10 rozpoznává dřívější výskyt polypeptidu HCMV o rozměru zhruba 65 kDa. Detekce vázané monoklonální protilátky se umožní biotinylovanou β-galaktosidasou spojenou s streptavídinem kozího protimyšího imonoglubulinu G abd (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD). β-D-Galaktopyranosid chlorfenolové červeně se použije jako substrát pro β-galaktosidasu a aktivita se stanoví měřením optické hustoty při 575 nm jednotlivých jamek odečítacím zařízením BioTex model EL312e.
Tabulka 14 ukazuje oligonukleotidy použité v tomto rozboru.
Tabulka 14
Inhibice'replikace CMV chimérickými 2’-O-methyl-oligonukleotidy s vazbami P=S polotučně = 21-0-methyl
Oligo Sekvence Id. č.
sekvence
4325 GCG UUT GCT CTT CTT CUU GCG 23
4326 GCG UUU GCT CTT CTU CDU GCG 24
Příklad 23
Vyhodnocení oligonukleotidů 270 a 330 v rozboru proteinů HCV H8Adl7 ·* ·· » · ·
I · · · ·
Westernová analýza skvrny s použitím afinitně čištěného lidského polyklonálního séra anti-HCV a 12SI-konjugované kozí protilátky proti lidskému IgG se používá místo rozborů ELISA dříve užívaných pro vyhodnocení účinků oligonukleotidů na hladiny proteinu jádra HCV. Šestijamkové desky se naočkují buňkami H8 v množství 3,5 x 105 buněk/jamka. Buňky se ponechají růst přes noc. Dále se buňky zpracují oligonukleotidem v Optimem obsahujícím 5 Mg/ml lipofektinu po dobu 4 h. K buňkám se přidají 2 ml média H8 a ponechají se v klidu přes noc. Pro sběr se buňky promyjí jednou 2 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem, podrobí lýze v 100 μΐ Laemmliho pufru a sbírají stíráním.
Pro elektroforézu se lyzáty buněk vaří a 10 až 14 μΐ lyzátu buněk se nanese na každou dráhu 16% polyakrylamidového gelu. Po elektroforéze se proteiny přenášejí elektroforeticky na membránu PVDF. Membrána se blokuje ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem obsahujícím 2% kozí sérum a 0,3%
Tween-20 a inkubuje přes noc s primární protilátkou (lidská protijaderná protilátka 2243 a králičí protilátka proti-G3PDH). Membrána se promyje 5x po 5 min v pufru, poté se inkubuje se sekundárními protilátkami po dobu 4 až 8 h (X25I-konjugovaná kozí protilidská protilátka a 125I-konjugovaná kozí protikráličí protilátka). Membrána se promyje 5x po 5 min pufrem, uzavře v plastikové nádobce a exponuje přes noc v kazetě Phosphorlmager. Pásy se kvantitativně hodnotí na zařízení Phosphorlmager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA), normalizují na hladiny exprese G3PDH a výsledky se vynesou jako procentický podíl kontrolních nezpracovaných buněk.
Tabulka 15 ukazuje oligonukleotidy hodnocené touto Westernovou analýzou skvrny. V ukázané sekvenci velká písmena znamenají základní sekvenci, malá písmena (o nebo s) zna62
• · 00 • 0 0 0 • · · 0 • 00 00 0 0 0 měnají internukleosidovou vazbu, buď fosfodiesterovou (P=0) nebo fosforothioatovou (P=S). Polotučně = 2'-0-propyl, * =
2'-O-butylimidazol, + = 2'-O-propylamin.
Tabulka 15
Oligo
Sekvence
Id. č. sekv.
270A GsTsAsCsCsAsCsAsAsGsGsCsCsTsTsTsCsGsCsG 270B GsTsAsCsCsAsCsAsAsGsGsCsCsTsTsTsCsGsCsG * * * *
7 0 C G0T0A0C0C0A0C0A0A0G0G0C0C0T0T0T0C0G0C0G + + + +
7 0D G0T0A0C0C0A0C0A0A0G0G0C0C0T0T0T0C0G0C0G
3 0A GsTsGsCsTsCsAsTsGsGsTsGsCsAsCsGsGsTsCsT
33OB GsTsGsCsTsCsAsTsGsGsTsGsCsAsCsGsGsTsCsT * * * *
3 0 C G0T0G0C0T0C0A0T0G0G0T0G0C0A0C0G0G0T0C0T + + + +
3 0 D G0T0G0C0T0C0A0T0G0G0T0G0C0A0C0G0G0T0C0T
Příklad 24
Syntéza 2,6-diamino-9-(2-0-oktadecyl-B-D-ribofuranosyl)purinu • 9 9 ♦· 99 99 99
99 999 9 9 9 9 • · · · 999 9 9 9 9
999 99 99 999 999
9 9999 9 9
9999 999 99 99 99 99
2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)purin (50 g, 180 mmol) a hydrid sodný (7 g) v dimethylformamidu (1 litr) se zahřívá k varu po dobu 2 h. Přidá se jodooktadekan (100 g) při 150 °C a reakční směs se ponechá ochladit na teplotu místnosti. Dále se reakční směs míchá po dobu 11 d při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se čistí chromatografii na silikagelu. Produkt se eluuje 5% směsí methanol/dichlormethan. Příslušné frakce se odpaří s obdržením produktu (11 g).
XH NMR (DMSO-de) δ 0,84 (t, 3, CH2), 1,22 (m, 32,
O-CH -CH (CH ) , 1,86 (m, 2, O-CH CH ), 3,25 (m, 2,
2 2 1G 2 2
o-ch2), 3,93 (d, 1, 4’H), 4,25 (m, 1, 3Ή), 4,38 (t, 1,
2Ή), 5 ,08 (d, 1, 3' '-OH), 5,48 (t, 1, 5'-0H), 5,75 (s, 2,
6-NH2), 5,84 (d, 1, l'-H), 6,8 (s, 2, 2-NH2) a 7,95 (s, 1,
8-H) .
Příklad 25
Syntéza 2'-O-oktadecylguanosinu
2,6-Diamino-9-(2-0-oktadecyl-S-D-ribofuranosyl)-purin (10 g) v 0,1 M roztoku pufru fosforečnanu sodného (50 ml, pH 7,4), 0,1 M roztoku pufru tris (1000 ml, pH 7,4) a dimethylsulfoxidu (1000 ml) se zpracuje adenosindeaminasou (1,5 g) při teplotě místnosti. 3., 5. a 7. den se přidá další alikvót (500 mg, 880 mg respektive 200 mg) adenosindeaminasy. Reakční směs se míchá po celkovou dobu 9 d a purifikace silikagelovou chromatografii poskytuje produkt (2 g). Analytický vzorek se rekrystaluje z methanolu.
XH NMR (DMSO-d6) δ 0,84 (t, 3, CHa), 1,22 [s, 32, • 0 · ·· 4 4 4 0 · 0 4 • · 4 4 4 0 4 4 4 0 4
4 44 44 44 40 4 044
0 4004 4 4
0440 400 00 00 04 44
O-CH2-CH2-(CH2)ie], 5,07 (m, 2, 3 ’-OH a 5'-OH), 5,78 (d, 1, l'-H), 6,43 (s, 2, NH2), 7,97 (s, 1, 8-H) a 10,64 (s, 1,
NH ) .
Výsledky elementární analýzy vypočítané pro C Η N O : 62,80 % C, 9,16 % H, 12,95 % N. Nalezené hodnoty: 62,54 % C, 9,18 % H, 12,95 % N.
Příklad 26
Syntéza N2-isobutyryl-2'-0-oktadecylguanosinu
2'-O-Oktadecylguanosin (1,9 g) v pyridinu (150 ml) se ochladí v ledové lázni a zpracuje trimethylsilylchloridem (2 g, 5 ekvivalentů) a isobutyrylchloridem (2 g, 5 ekvivalentů) . Reakční směs se míchá po dobu 4 h a během této doby se ponechá ohřát na teplotu místnosti. Roztok se ochladí, přidá se voda (10 ml) a směs se míchá po dobu dalších 30 min. Přidá se koncentrovaný roztok hydroxidu amonného (10 ml) a získaný roztok se odpaří ve vakuu. Zbytek se vyčistí chromatografii na silikagelu (eluce 3% směsí methanol/ethylacetat) s obdržením 1,2 g produktu.
1H NMR (DMSO-de) S 0,85 (t, 3, CH3), 1,15 (m, 38,
O-CH CH (CH ) , CH(CH ) , 2,77 (m, 1, CH(CH ) ), 4,25 (m,
2, 2’-H a 3’-H), 5,08 (t, 1, 5’-0H), 5,12 (d, 1, 3'-OH),
5,87 (d, 1, l'-H), 8,27 (s, 1, 8-H), 11,68 (s, 1, NH^) a 12,08 (s, 1, NHa).
Výsledky elementární analýzy vypočtené pro C Η N 0 : 63,47 % C, 9,09 % H, 11,57 % N. Nalezené hodno3 2 55 5 6 9 9 9 9 9 ty: 63,53 % C, 9,20 % H, 11,52 % N. Před inkorporací do oligonukleotidů se tento produkt převádí na N2-isobutyryl-5'65
4 4* 4* 44 44 «4 44 444 ····
4 4 4 444 4 4 4 4
4 44 44 44 444 444
4 4444 · 4
44*4 444 44 44 44 44
-dimethoxytrityl-2'-O-oktadecylguanosin a poté na fosforoamidit podle způsobu popsaného v mezinárodní publikaci č. WO 94/02501 vydané 3. února 1994.
Příklad 27
Diagnostický rozbor pro detekci nadměrné exprese informační ribonukleové kyseliny
Oligonukleotidy jsou označeny radionuklidem 32P na konci 5' polynukleotidkinasy. Sambrook a kol. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, sv. 2, str. 11.31-11.32). Oligonukleotid značený radionuklidem je přiveden do styku se vzorky tkání či buněk se suspektní nadměrnou expresí informační ribonukleové kyseliny, jako je vzorek od pacienta, za podmínek, za kterých může nastat specifická hybridizace a vzorek se promyje pro odstřaněni nenavázaného oligonukleotidu. Udržuje se podobná kontrola, ve které je oligonukleotid značený radionuklidem přiveden do styku s normálním vzorkem buněk či tkání za podmínek umožňujících specifickou hybridizaci a vzorek se promyje pro odstranění nenavázaného oligonukleotidu. Aktivita zbývající ve vzorku ukazuje navázaný oligonukleotid a vyjádří se kvantitativně s použitím scintilačního počítače a dalších rutinních prostředků. Srovnání radioaktivity zbývající ve vzorku mezi normálními a chorobnými buňkami ukazuje nadměrnou expresi informační ribonukleové kyseliny, která je předmětem zájmu.
Oligonukleotidy podle tohoto vynálezu označené radionuklidem lze též použít v autoradiografii. Řezy tkání se zpracuji oligonukleotidem značeným radionuklidem a promyjí, jak se popisuje výše, poté se promyjí fotografickou emulzí podle standardních autoradiografických způsobů. Udržuje se též kontrola s normálním vzorkem buněk či tkání. Emulze při vyvolání poskytuje zobrazení zrn stříbra nad oblastmi nadměrné exprese informační ribonukleové kyseliny, která se vyhodnotí kvantitativně. Rozsah nadměrné exprese informační ribonukleové kyseliny se určí srovnáním stříbrných zrn pozorovaných v normálních a chorobných buňkách.
Podobné rozbory pro fluorescenční detekci exprese informační ribonukleové kyseliny používají oligonukleotidy podle tohoto vynálezu, která se značí fluoresceinem nebo jinými fluorescenčními značkami. Značené oligonukleotidy deoxyribonukleových kyselin se syntetizují na automatizovaném syntetizátoru deoxyribonukleových kyselin (Applied Biosystems model 380B) s použitím standardních fosforamiditových systémů s oxidaxí jodem. B-Kyanoethyldiisopropyl-fosforamidity se obdrží od Applied Biosystems (Foster City, CA). Amidity značené fluoresceinem se obdrží od Glen Research (Sterling, VA). Inkubace oligonukleotidových a biologických vzorků se provádí podle popisu pro oligonukleotidy značené radionuklidem s tím rozdílem, že místo scintilačního počítače se pro detekci fluorescence používá fluorescenční mikroskop. Srovnávání fluorescence pozorované ve vzorcích od normálních a patologických buněk umožňuje detekci nadměrné exprese informační ribonukleové kyseliny.
Příklad 28
Detekce exprese abnormální exprese informační ribonukleové kyseliny
Vzorky tkání či buněk se suspektní expresí abnormální informační ribonukleové kyseliny se inkubují s oligonukleo• 4 • 44 * •4 ·· ··
4 4 4
tidem značeným radionuklidem 32P nebo fluoresceinem, který je cílený na divoký typ (normální) informační ribonukleové kyseliny. Identický vzorek buněk či tkání se inkubuje s druhým značeným radionuklidem, který je cílený na abnormální informační ribonukleovou kyselinu za podmínek, při kterých může dojít ke specifické hybridizaci, a vzorek se promyje pro odstranění nenavázaného oligonukleotidu. Značka zbývající ve vzorku ukazuje navázaný oligonukleotid a může se vyhodnotit kvantitativně s použitím scintilačního počítače, fluorimetru nebo dalších rutinních prostředků. Přítomnost abnormální informační ribonukleové kyseliny se indikuje tehdy, jestliže se pozoruje vazba v případě druhého vzorku, avšak nikoliv v případě prvního vzorku.
Může se též použít dvojité značeni s oligonukleotidy a způsoby podle tohoto vynálezu pro specifickou detekci exprese abnormální informační ribonukleové kyseliny. Jeden vzorek tkáně se inkubuje s prvním oligonukleotidem značeným radionuklidem 32P, který je cílen na divoký typ informační ribonukleové kyseliny a s druhým oligonukleotidem značeným fluoresceinem, který je cílen na abnormální informační ribonukleovou kyselinu za podmínek, za kterých může nastat specifická hybridizace. Vzorek se promyje pro odstranění nenavázaného oligonukleotidu a značky se detekují scintilačním počítačem a fluorimetrií. Ukazuje se přítomnost abnormální nformační ribonukleové kyseliny, pokud vzorek neváže oligonukleotid značený nuklidem 32P (to jest není radioaktivní) avšak zadržuje fluorescenční značku (to jest vykazuje fluorescenci ) .
Příklad 29
Plazmatické vychytávání a tkáňová distribuce oligonukleotidů • · » ·
u myši
Připraví se následující oligonukleotidy
UsGsCsAsTsCsCsCsCsCsGsGsCsCsAsCsCsAsT
UsGsCsAsTsCsCsCsCsAsGsGsCsCsAsCsCsAsT
UsGsCsAsTsCsCCCCAGGCsCsAsCsCsAsT
č. id. sek. 27
č. id. sek. 27
č. id. sek. 27
ve kterých polotučný tisk značí 2’-O-propylové substituenty s značí fosforothioatové vazby a nepřítomnost s” značí fosfodiesterové vazby v příslušných oligonukleotidech. První oligonukleotid se identifikuje jako ISIS 3082, druhý jako ISIS 9045 a třetí jako ISIS 9046 v obr. 9, 10, 11 a 12. Oligonukleotidy se značí tritiem podle způsobu Grahama a kol., NUC. Acids Res., 16, 3737-3743 (1993).
Způsoby použité na zvířatech a v experimentu. Pro každý studovaný oligonukleotid se použije 20 myších samců Balb/c (Charles River) o hmotnosti okolo 25 g, kteří se náhodně rozdělí do jedné ze čtyř skupin. Po jednom týdnu aklimatizace myši dostávají injekci oligonukleotidu značeného tritiem do ocasní vény (zhruba 750 nmol/kg, 124 až 170 μα/Ίπζ) ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem, pH 7,0. Koncentrace oligonukleotidu v podávaném roztoku je zhruba 60 μΜ. Od každé skupiny se odebere jeden retroorbitální vzorek krve (0,25, 0,5, 2 nebo 4 h po podání) a terminální vzorek krve (1, 3, 8 nebo 24 h po podání) od každé skupiny. Terminální vzorek krve se odebírá kardiální punkcí po ketaminové/xylazinové anestézi. Alikvot každého vzorku krve se uchová pro měření aktivity a zbývající krev se přenese do zkumavky potažené roztokem kyseliny ethylendiamintetraoctové a centrifuguje pro obdržení krevní plazmy. Sbírá se moč a stolice v intervalech (0 až 4, 4 až 8 a 8 až 24 h) od skupiny, se kterou se pokus ukončuje po 24 h.
Při ukončení pokusu se odeberou játra, ledviny, slezina, plíce, srdce, mozek, vzorek kosterního svalu, část tenkého střeva, vzorek kůže, pankreas, kost (oba femury obsahující kostní dřen) a dvě lymfatické uzliny od každé myši a zváží. Stolice se zváží, poté se zhomogenizuje destilovanou vodou přidanou v poměru 1:1 s použitím homogenizátoru Brinkmann Polytron (Westbury, NY). Homogenáty plazmy, tkání, moči a stolice se rozdělí pro analýzu radioaktivity spálením a pro stanovení obsahu intaktniho oligonukleotidu. Veškeré vzorky se zmrazí ihned po odebrání na suchém ledu a ukládají při -80 °C do provedení analýzy.
Stanovení aktivity v krevní plazmě, tkáních a exkrementech. Vzorky krevní plazmy a moči se přímo naváží do scintilačních nádobek a měří se přímo kapalinovou scintilační technikou po přídavku 15 ml BetaBlend (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA). Všechny ostatní vzorky (tkáně, krev a homogenizovaná stolice) se naváží do spalovacích loděk a oxidují v zařízení Biological Materials Oxidizer (Model OX-100,
R. J. Harvey Instrument Corp., Hillsdale, NJ). Poté se sbírá triciovaná voda do 20 ml směsi složené z 15 ml BetaBlend a 5 ml Harvey Tritium Cocktail (R. J. Harvey Instrument Corp., Hillsdale, NJ). Účinnost spalování se stanovuje denně spalováním vzorků nasáklých roztokem 3H-mannitolu a pohybuje se v rozmezí mezi 73,9 a 88,3 %. Kapalné scintilační měření se provádí s použitím Beckman LS 9800 nebo LS 6500 Liguid Scintillation System (Beckamn Instruments, Fullerton, CA). Četnost impulsů vzorků se měří po dobu 10 min s automatickou korekcí na zhášení. Počet rozpadů za minutu se koriguje na účinnost spalovacího postupu.
• · • ·
Analýza výsledků. Radioaktivita vzorků se vyjádři jako počet impulsů za minutu na gram vzorku. Tyto hodnoty se dělí specifickou aktivitou nuklidu použitého pro značení pro vyjádření údajů v nanomol-ekvivalentech celkového množství oligonukleotidu na gram vzorku, poté se převádějí na procento podané dávky v orgánu či tkáni. Za předpokladu hustoty tkáně 1 g/ml se údaje nmol/g převádějí na celkovou koncentraci v μΜ. Pro výpočet koncentrace intaktního oligonukleotidu v krevní plazmě, játrech či ledvinách v každém čase se střední koncentrace vyjádřené v μΜ dělí procentem intaktního oligonukleotidu v podávaném roztoku (82 až 97 %), poté se násobí středním procentickým obsahem intaktního oligonukleotidu v každém čase, jak se určí pomocí CGE nebo vysokovýkonné kapalinové chromatografie. Tyto údaje se poté použití pro výpočet tkáňových poločasů lineární regresí a srovnávání plazmatické farmakokinetiky různých modifikovaných oligonukleotidů. Farmakokinetické parametry se stanoví s použitím programu RCNONLIN 4.0 (Statistical Consultants, Inc., Apex, NC). Po zjištění těchto údajů se pro použití zvolí jednokompartmentový model se vstupem bolusu a výstupem prvního řádu (model knihovny 1).
Výsledky plazmatického vychytávání a tkáňové distribuce u zvířat ukazují graficky obr. 9, 10, 11 a 12. Jak lze vidět z obr. 9, plazmatická koncentrace každého testovaného oligonukleotidu klesá od počátečních hladin po injekci k nižším hladinám v průběhu 24-hodinového období zkoušky. Plazmatické koncentrace oligonukleotidů podle tohoto vynálezu se udržují na hladinách ekvivalentních hladinám nekonjugovaných oligonukleotidů s fosforothioatem. Veškeré testované sloučeniny se vychytají z krevní plazmy do tkání, jak ukazují obr. 10, 11 a 12. Sloučeniny podle tohoto vynálezu mají různé distribuce pro různé tkáně. Obr.10 ukazuje typ ·· · ·· · • · · · · · · • · · · · · • · · · · · ···· ··· · · · · distribuce kontrolního oligonukleotidu identifikovaného jako ISIS 3082, fosforothioatového oligonukleotidu. Obr. 11 ukazuje typ distribuce pro první sloučeninu podle tohoto vynálezu, oligonukleotidu identifikovaného jako ISIS 9045, který má substituent 2’ na každém nukleosidu. Obr. 12 ukazuje typ distribuce pro další sloučeninu podle tohoto vynálezu, oligonukleotidu s mezerou, identifikovaného jako ISIS 9046, majícího substituent 2’ a fosfodiesterové vazby v každém nukleotidu v úsecích připojených po stranách oligonukleotidu a 2’-deoxy-fosforothioatové nukleosidy v centrální oblasti neboli v oblasti mezery.
Příklad 30
2,2’-Anhydro[1-(β-D-arabinofuranosyl)-5-methyluridin]
5-Methyluridin (ribosylthymin, komerčně dostupný od Yamasa, Choshi, Japan) (72,0 g, 0,279 mol), difenylkarbonat (90,0 g, 0,420 mol) a hydrogenuhličitan sodný (2,0 g, 0,024 mol) se přidá k dimethylformamidu (300 ml). Směs se vaří za míchání pod zpětným chladičem, což umožňuje kontrolovaný únik vyvíjeného oxidu uhličitého. Po 1 h se slabě ztmavlý roztok odpaří za sníženého tlaku. Výsledná sirupovitá látka se vylije do diethyletheru (2,5 litru) za míchání. Produkt vytváří gumovitou látku. Ether se dekantuje a zbytek se rozpustí v minimálním množství methanolu (zhruba 400 ml). Roztok se vylije do čerstvého etheru (2,5 litru) s obdržením tuhé gumovité látky. Ether se dekantuje a tato látka se suší ve vakuové sušárně (60 °C při 1 mm Hg po dobu 24 h) s obdržením pevné látky, která se rozdrtí na světle hnědý prášek (57 g, 85% surový výtěžek). Spektrum NMR je konzistentní se strukturou s kontaminací fenolem ve formě sodné soli (zhruba 5 %). Látka se používá jako taková pro další reakce [nebo
může být dále vyčištěna sloupcovou chromatografii s použitím gradientu methanolu v ethylacetatu (10 až 25 %) s obdržením bílé tuhé látky s teplotou tání 222 až 224 °C].
Příklad 31
2'-O-Methoxyethyl-5-methyluridin
2,2'-Anhydro-5-methyluridin (195 g, 0,81 mol), tris(2-methoxyethyl)borát (231 g, 0,98 mol) a 2-methoxyethanol (1,2 litru) se přidá do tlakové nádoby z nerezavějící oceli o obsahu 2 litry a umístí do předehřáté olejové lázně při 160 °C. Po zahřívání po dobu 48 h při 155 až 160 °C se nádoba otevře a roztok se odpaří do sucha a trituruje methanolem (200 ml). Zbytek se suspenduje v horkém acetonu (1 litr). Nerozpustné soli se filtrují, promyjí acetonem (150 ml) a filtrát se odpaří. Zbytek (280 g) se rozpustí v acetonitrilu (600 ml) a odpaří. Sloupec silikagelu (3 kg) se naplní ve směsi dichlormethan/aceton/methanol (20:5:3) s obsahem 0,5 % triethylaminu. Zbytek se rozpustí v dichlormethanu (250 ml) a adsorbuje na silikagelu (150 g) před nanesením na sloupec. Produkt se eluuje s plnícím rozpouštědlem s obdržením 160 g (63 %) produktu. Další podíl látky se obdrží přepracováním nečistých frakcí.
Příklad 32
2'-O-Methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridin
2’-O-Methoxyethyl-5-methyluridin (160 g, 0,506 mol) se odpařuje spolu s pyridinem (250 ml) a vysušený zbytek se rozpustí v pyridinu (1,3 litru). Přidá se první alikvót dimethoxytritylchloridu (94,3 g, 0,278 mol) a směs se míchá
• · při teplotě místnosti po dobu 1 h. Přidá se druhý alikvót dimethoxytritylchloridu (94,3 g, 0>278 mol) a reakční směs se míchá po dobu další 1 h. Poté se přidá methanol (170 ml) pro zastavení reakce. Vysokovýkonná kapalinová chromatografie ukazuje na přítomnost zhruba 70 % produktu. Rozpouštědlo se odpaří a trituruje acetonitrilem (200 ml). Zbytek se rozpustí v chloroformu (1,5 litru) a extrahuje 2x500 ml nasyceného hydrogenuhličitanu sodného a 2x500 ml nasyceného chloridu sodného. Organická fáze se suší nad síranem sodným, zfiltruje a odpaří. Obdrží se 275 g zbytku. Zbytek se vyčistí na sloupci silikagelu 3,5 kg a eluuje směsí ethylacetat/ hexan/aceton (5:5:1) obsahující 0,5 % triethylaminu. Čisté frakce se odpaří s obdržením 164 g produktu. Zhruba dalších 20 g se obdrží z nečistých frakcí, což poskytuje celkový výtěžek 183 g (57 %) .
Příklad 33
3'-O-Acetyl-2'-O-methoxyethyl-5’-O-dimethoxytrityl-5-methyluridin
Smíchá se 2’-O-methoxyethyl-51-0-dimethoxytrityl-5-methyluridin (106 g, 0,167 mol), dimethylformamid/pyridin (750 ml směsi 3:1 připravené z 562 ml dimethylformamidu a 188 ml pyridinu) a acetanhydrid (24,38 ml, 0,258 mol) a tato směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 24 h. Reakce se sleduje pomocí chromatografie na tenké vrstvě s předchozím ukončením reakce v odebraném vzorku přídavkem methanolu. Při dokončení reakce na základě posouzení z chromatografie na tenké vrstvě se přidá methanol (50 ml) a směs se odpařuje při 35 °C. Zbytek se rozpustí v chloroformu (800 ml) a extrahuje 2x200 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 2x200 ml nasyceného roztoku chloridu • 9
9 9 •
9999 9 • 9 9·
• 9 9 sodného. Vodné vrstvy se reextrahují 200 ml chloroformu. Spojené organické fáze se vysuší síranem sodným a odpaří s obdržením 122 g zbytku (zhruba 90% produkt). Zbytek se vyčistí na sloupci silikagelu 3,5 kg a eluuje s použitím směsi ethylacetat/hexan (4:1), Čisté frakce produktu se odpaří s obdržením 96 g (84 %). Dalších 1,5 g se získá z dalších frakcí.
Příklad 34
3’-O-Acetyl-21-O-methoxyethyl-51-0-dimethoxytrityl-5-methyl-4-triazoluridin
První roztok se připraví rozpuštěním 3'-0-acetyl—2’-O-methoxyethyl-5’-0-dimethoxytrityl-5-methyluridinu (96 g, 0,144 mol) v acetonitrilu (700 ml) a ponechá se stát. Triethylamin (189 ml, 1,44 mol) se přidá k roztoku triazolu (90 g, 1,3 mol) v acetonitrilu (1 litr), směs se ochladí na -5 °C a míchá po dobu 0,5 h s použitím míchadla zavedeného zhora. Po dobu 30 min se po kapkách přidává fosforylchlorid k míchanému roztoku udržovanému při teplotě 0 až 10 °C a výsledná směs se míchá po dobu dalších 2 h. První roztok se přidává k tomuto roztoku po kapkách po dobu 45 min. Výsledná reakční směs se ponechá přes noc v chladné místnosti. Soli se odstraní z reakční směsi filtrací a roztok se odpaří. Zbytek se rozpustí v ethylacetátu (1 litr) a nerozpustné pevné látky se odstraní filtraci. Filtrát se promyje 1x300 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 2x300 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysuší síranem sodným a odpaří. Zbytek se trituruje ethylacetatem s obdržením sloučeniny podle nadpisu.
Příklad 35 ·· · ·· ·· ·· ·· ···· · · · · · · • · · · ··· · · · « · · · ·· ·» ····· • · · · · · · ···· ··· ·· ·· ·· ··
2'-O-Methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin
Roztok 3’-0-acetyl-2’-0-methoxyethyl-5’-O-dimethoxytrityl-5-methyl-4-triazoluridinu (103 g, 0,141 mol) v dioxanu (500 ml) a hydroxidu amonném (30 ml) se míchá při teplotě místnosti po dobu 2 h. Roztok dioxanu se odpaří a zbytek se podrobí azeotropické destilaci s methanolem (2x200 ml). Zbytek se rozpustí v methanolu (300 ml) a přenese do tlakové nádoby z nerezavějící oceli o obsahu 2 litry. Přidá se methanol (400 ml) nasycený plynným amoniakem a nádoba se zahřívá na 100 °C po dobu 2 h (chromatografie na tenké vrstvě ukazuje úplnou konverzi). Obsah nádoby se odpaří do sucha a zbytek se rozpustí v ethylacetátu (500 ml) a promyje jednou nasyceným roztokem chloridu sodného (200 ml). Organická fáze se vysuší síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří s obdržením 85 g (95 %) sloučeniny podle nadpisu.
Příklad 36
N4-Benzoyl-2’-0-methoxyethyl-51-0-dimethoxytrityl-5-methylcytidin
2’-O-Methoxyethyl-5’-0-dimethoxytrityl-5-methylcytidin (85 g, 0,134 mol) se rozpustí v dimethylformamidu (800 ml) a přidá se anhydrid kyseliny benzoové (37,2 g,
0,165 mol) za míchání. Po 3 h míchání ukazuje chromatografie na tenké vrstvě ukončení průběhu reakce z 95 %. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se podrobí azeotropické destilaci s methanolem (200 ml). Zbytek se rozpustí v chloroformu (700 ml) a extrahuje nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (2x300 ml) a nasyceným roztokem chloridu sodného (2x300 ml), vysuší síranem hořečnatým a odpaří s obdržením zbytku (96 g). Zbytek se čistí chromatograficky na sloupci • ·
ΦΦ φφ ♦ · • ·* ·· ·· · · · • · 9 9 99 • · · · · · • » Φ · Φ
ΦΦΦ ΦΦ ΦΦ
Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ
Φ ΦΦΦ ΦΦΦ Φ Φ
ΦΦ Φ» silikagelu 1,5 kg směsí rozpouštědel ethylacetat/hexan (1:1) obsahující 0,3 % triethylaminu jako elučním rozpouštědlem. Čisté frakce produktu se odpaří s obdržením 90 g (90 %) sloučeniny podle nadpisu.
Příklad 37
NA-Benzoyl-21-0-methoxyethyl-5·-0-dimethoxytrityl-5-methylcytidin-3'-amidit
N‘4-Benzoyl-2 · -0-meťhoxyethyl-5 1 -0-dimethoxytrityl-5-methylcytidin (74 g, 0,10 mol) se rozpustí v dichlormethanu (1 litr). Přidává se tetrazoldiisopropylamin (7,1 g) a 2-kyanoethoxy-tetra(isopropyl)fosfit (40,5 ml, 0,123 mol) za míchání pod atmosférou dusíku. Výsledná směs se míchá po dobu 20 h při teplotě místnosti (chromatografie na tenké vrstvě vykazuje ukončení reakce z 95 %). Reakční směs se extrahuje nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (1x300 ml) a nasyceným roztokem chloridu sodného (3x300 ml). Vodné podíly z promývání se reextrahují dichlormethanem (300 ml) a extrakty se spojí, vysuší síranem hořečnatým a odpaří. Obdržený zbytek se dělí chromatograficky na sloupci silikagelu 1,5 kg s použitím směsi ethylacetat/hexan (3:1) jako elučniho činidla. Čisté frakce se spojí s obdržením 90,6 g (87 %) sloučeniny podle nadpisu.
• · » · · * > · · *
4 4 4 4 4
4
4 ··
SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL: ISIS Pharmaceuticals, lne. a Novartis AG (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Oligonukleotidy s mezerou a modifikovaným cukrem
(iii) POČET SEKVENCÍ: 32 ·
(iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:
(A) ADRESÁT: Woodcock Washburn Kurtz Mackiewicz
& Norris
(B) ULICE: One Liberty Plače - 46th Floor
« (C) MĚSTO: Philadelphia
(D) STÁT: PA
(E) ZEMĚ: USA
(F) POŠTOVNÍ KÓD: 19103
(V) FORMA PRO ČTENÍ NA POČÍTAČI:
(A) TYP MÉDIA: disketa 3,5 palce, 720 Kb
(B) POČÍTAČ: Kompatibilní s PC IBM
(C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS
(D) PROGRAMOVÉ VYBAVENÍ: WordPerfect 5.1
(vi) SOUČASNÉ ÚDAJE 0 PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: Není
(B) DATUM PODÁNÍ: Tímto materiálem
(C) KLASIFIKACE: Není
(vil) ÚDAJE 0 PRIORITNÍ PŘIHLÁŠCE:
• · • · • · · · · • · · · * • 4» · ·
C · · · • · 4 • · 4 ··· · · 4 • 4 ·· 4®
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: 60 011 620
(B) DATUM PODÁNÍ: 14. února 1996
(viii) ÚDAJE 0 ZÁSTUPCI: (A) JMÉNO: Joseph Lucci (B) ČÍSLO REGISTRACE: 33 307 (C) REFERENČNÍ ČÍSLO PRO ODKAZ:
(ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE: (A) TELEFON: 215-568-3100 (B) FAX: 215-568-3439
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY: (A) DÉLKA: 17 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární
(iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ: 1:
CCACACCGAC GGCGCCC
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 20 bází
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) POČET VLÁKEN: jedno
(D) TOPOLOGIE: 1ineární
• · · · (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 2:
CTTATATTCC GTCATCGCTC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 3:
(1) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano ‘ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 3:
TCCGTCATCG CTCCTCAGGG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 4:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 4:
AAAACGTCAG CCATGGTCCC • 9 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 5:
(1) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 18 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 5:
TTCTCGCTGG TGAGTTTC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 6:
(1) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 17 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 6:
TCTCGCTGGT GAGTTTC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 7:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina • 4
- 81 • * · 4 » · · <
» · · <
• · · · · <
β <
• · · · (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 7:
TCCCGCCTGT GACATGCATT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 8:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 8:
TCCTCCTCCC CGCGGCGGGT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 9:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 9:
• 44 ·· <4 44
4944 444 9444
Γ · 4 444 · 44 4
4 44 44 ·« 444444 • 4 »444 « ·
4444 444 44 44 44 44
CTCGCCCGCT CCTCCTCCCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 10:
(1) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 10:
TTCTCGCCCG CTCCTCCTCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 11:
(1) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 11:
TTCTCCTCCT CCCCTGGCAG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 12:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
• · 4 · · • · · 4 4 4 4 • · ··· 4 · · · • 4 · · 4 4 444 444
4 4 4 · ·
44 44 4 4 44 (A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 12:
CTGGCTTCTC CTCCTCCCCT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 13:
(1) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 13:
CCTGCTGGCT TCTCCTCCTC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 14:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano » · « • ·· <· (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 14:
TCTGGCGCTG CACCACTCTC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 15:
(1) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 47 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 15:
•
ACATTATGCT,AGCTTTTTGA GTAAACTTGT GGGGCAGGAG ACCCTGT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 16:
(1) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 29 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 16:
GAGATCTGAA GCTTCTGGAT GGTCAGCGC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 17:
(1) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 35 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 17:
GAGATCTGAA GCTTGAAGAC GCCAAAAACA TAAAG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 18:
(1) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 33 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 18:
ACGCATCTGG CGCGCCGATA CCGTCGACCT CGA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 19:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární • 9 ·
9 9
9 9 9· • 9 9 • 9 9· (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 19:
CGGGAGGCGG TCACATTCGG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 20:
(1) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 20:
UAGGAGAUGC CUAAGGCUUU (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 21:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 20 bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 21:
GCUAUGUCGA CACCCAAUUC
0 0 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 22:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 18 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 22:
CAUAGGAGAU GCCUAAGGCT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 23:
(1) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 21 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 23:
GCGUUTGCTC TTCTTCUUGC G (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 24:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 21 bází (B) TYP: nukleová kyselina
• · · • · ··· a · · ·· to·
(C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 24:
GCGUUUGCTC TTCTUCUUGC G (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 25:
(1) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 25:
GTACCACAAG GCCTTTCGCG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 26:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 26:
4
4 • 4 • · * · · · ·
4 444 4 4 4 4 • · · · 4 4 444 4 4 4
4 4 4 · ·
GTGCTCATGG TGCACGGTCT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 27:
(1) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 27:
UGCATCCCCC AGGCCACCAT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 28:
(1) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 16 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 28:
GCGTTTTTTT TTTGCG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 29:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 19 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 29:
CGCAAAAAAA AAAAAACGC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 30:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 30:
AAAACGTCAG CCATGGTCCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 31:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 31:
CCCCAACCAC CTCTTGCTCC
• 9 9 9
9 9
9 9 99
9 9 9
9 9 9
99
99 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 32:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 20 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iv) ANTIKÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 32:
GAGACCCTGA ACAGTTGATC
SPOLEČNÁ ADVOKÁTNÍ KANCELÁŘ VŠETEČKA ZELENÝ ČVÓPČÍK KALENSKÝ λ PARTNEŘI (náhradní strana)
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (13)

1. Oligonukleotid specificky hybridizovatelný s kyselinou deoxyribonukleovou nebo kyselinou ribonukleovou obsahující lineární sekvenci kovalentně vázaných nukleosidových jednotek, ve které:
tato sekvence obsahuje první nukleosidovou subsekvenci mající zbytky cukru 2'-O-CH2-CH2-O-CH3, druhou nukleosidovou subsekvenci mající zbytky cukru 2'-deoxy a třetí nukleosidovou subsekvenci mající zbytky cukru 2'-O-CH2-CH2-OCH3, kde druhá subsekvence je umístěná mezi touto první a třetí subsekvenci, a . nukleosidové jednotky první a druhé subsekvence jsou kovalentně vázané fosfodiesterovými nebo fosforothioatovými vazbami.
2. Oligonukleotid podle nároku 1, ve kterém jsou tyto nukleosidové jednotky této první a druhé subsekvence kovalentně vázané fosforothioatovými vazbami.
3. Oligonukleotid podle nároku 1, ve kterém jsou tyto nukleosidové jednotky této první subsekvence kovalentně vázané fosfodiesterovými vazbami a tyto nukleosidové jednotky této druhé subsekvence jsou kovalentně vázané fosforothioatovými vazbami.
4. Oligonukleotid podle nároku 1, ve kterém jsou tyto nukleosidové jednotky této první subsekvence kovalentně vázané fosforothioatovými vazbami a tyto nukleosidové jednotky této druhé subsekvence jsou kovalentně vázané fosfodiestero93 ·· «· ·· ·· • · · · · · · • ···· · · · · (náhradní strana) vými vazbami.
5. Oligonukleotid podle nároku 1, ve kterém tato druhá subsekvence zahrnuje alespoň tři nukleosidové jednotky.
6. Oligonukleotid podle nároku 1, ve kterém tato druhá subsekvence zahrnuje alespoň pět nukleosidových jednotek.
7. Oligonukleotid podle nároku 1 mající 5 až 50 nukleosidových jednotek.
8. Oligonukleotid podle nároku 1, ve kterém jsou tyto nukleosidové jednotky této první, druhé a třetí subsekvence kovalentně vázané fosforothioatovými vazbami.
.
9. Oligonukleotid podle nároku 1, ve kterém jsou tyto nukleosidové jednotky této první a třetí subsekvence kovalentně vázané fosfodiesterovými vazbami a tyto nukleosidové jednotky této druhé subsekvence jsou kovalentně vázané fosforothioatovými vazbami.
10. Oligonukleotid podle nároku 1, ve kterém jsou tyto nukleosidové jednotky této první a třetí subsekvence kovalentně vázané fosforothioatovými vazbami a tyto nukleosidové jednotky této druhé subsekvence jsou kovalentně vázané fosfodiesterovými vazbami.
11. Oligonukleotid podle nároku 1, ve kterém tato druhá subsekvence obsahuje alespoň tři nukleosidové jednotky.
12. Oligonukleotid podle nároku 1, ve kterém tato druhá subsekvence obsahuje alespoň pět nukleosidových jedno94 tek.
(náhradní strana) • B • B
13. Oligonukleotid podle nároku 1 mající 5 až 50 nukleosidových jednotek.
SPOLEČNÁ ADVOKÁTNÍ KANCELÁŘ VŠETEČKA ZELfcNV SVORČÍK KALENSKÝ A PARTNEŘI
120 00 Praha 2, Hálkova 2 Česká republika /¾7 Zzů - ýz & Ό CL M
O
OU9J}9SO9N ri —’>
M11 osa I I wuos V777Á muoz
CZ982434A 1996-02-14 1997-02-07 Oligonukleotidy s mezerou a modifikovaným cukrem CZ243498A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1162096P 1996-02-14 1996-02-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ243498A3 true CZ243498A3 (cs) 1999-09-15

Family

ID=21751248

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ982434A CZ243498A3 (cs) 1996-02-14 1997-02-07 Oligonukleotidy s mezerou a modifikovaným cukrem

Country Status (22)

Country Link
US (1) US6451991B1 (cs)
EP (1) EP0882061B1 (cs)
JP (1) JP4293636B2 (cs)
KR (1) KR19990082476A (cs)
CN (1) CN1214688A (cs)
AT (1) ATE267207T1 (cs)
AU (1) AU725262B2 (cs)
BR (1) BR9707529A (cs)
CA (2) CA2246229C (cs)
CZ (1) CZ243498A3 (cs)
DE (1) DE69729179T2 (cs)
DK (1) DK0882061T3 (cs)
ES (1) ES2221039T3 (cs)
HU (1) HUP9901118A3 (cs)
IL (1) IL125759A0 (cs)
NO (1) NO983718L (cs)
NZ (1) NZ331217A (cs)
PL (1) PL328563A1 (cs)
SK (1) SK109198A3 (cs)
TR (1) TR199801581T2 (cs)
WO (1) WO1997030067A1 (cs)
ZA (1) ZA971208B (cs)

Families Citing this family (122)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6346614B1 (en) * 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
AU767133B2 (en) 1999-02-26 2003-10-30 University Of British Columbia, The TRPM-2 antisense therapy
US7569551B2 (en) 2000-02-25 2009-08-04 The University Of British Columbia Chemo- and radiation-sensitization of cancer by antisense TRPM-2 oligodeoxynucleotides
WO2001075164A2 (en) 2000-03-30 2001-10-11 Whitehead Institute For Biomedical Research Rna sequence-specific mediators of rna interference
EP1191097A1 (en) 2000-09-21 2002-03-27 Leids Universitair Medisch Centrum Induction of exon skipping in eukaryotic cells
DK2813582T3 (en) 2000-12-01 2017-07-31 Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wss E V Small RNA molecules that mediate RNA interference
WO2003062421A1 (en) 2002-01-17 2003-07-31 The University Of British Columbia Bispecific antisense olignucleotides that inhibit igfbp-2 and igfbp-5 and methods of using same
WO2004083432A1 (en) 2003-03-21 2004-09-30 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure
EP1667731B1 (en) * 2003-10-01 2013-05-22 The University Of British Columbia Bispecific oligonucleotide for the treatment of cns malignancies
KR101147147B1 (ko) 2004-04-01 2012-05-25 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 Ｒｎａ 간섭의 오프 타겟 효과 감소를 위한 변형된폴리뉴클레오타이드
US8710020B2 (en) 2004-04-02 2014-04-29 The University Of British Columbia Clusterin antisense therapy for treatment of cancer
USRE48960E1 (en) 2004-06-28 2022-03-08 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
ES2361325T3 (es) 2004-06-28 2011-06-16 The University Of Western Australia Oligonucleótidos antisentido para inducir la omisión de exón y métodos de uso de los mismos.
US20060166234A1 (en) 2004-11-22 2006-07-27 Barbara Robertson Apparatus and system having dry control gene silencing compositions
US7935811B2 (en) 2004-11-22 2011-05-03 Dharmacon, Inc. Apparatus and system having dry gene silencing compositions
US7923207B2 (en) 2004-11-22 2011-04-12 Dharmacon, Inc. Apparatus and system having dry gene silencing pools
PL1814595T3 (pl) * 2004-11-23 2014-08-29 Univ British Columbia Leczenie raka za pomocą kombinacji czynnika zakłócającego ścieżkę sygnalizacyjną EGF oraz oligonukleotydu obniżającego poziom klusteryny
JP5713377B2 (ja) 2005-12-28 2015-05-07 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 薬物標的としての天然アンチセンスおよび非コードｒｎａ転写物
WO2007123391A1 (en) 2006-04-20 2007-11-01 Academisch Ziekenhuis Leiden Therapeutic intervention in a genetic disease in an individual by modifying expression of an aberrantly expressed gene.
EP1857548A1 (en) 2006-05-19 2007-11-21 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and method for inducing exon-skipping
WO2007139943A2 (en) * 2006-05-26 2007-12-06 Ico Therapeutics Inc. Therapeutic drug combinations and delivery systems comprising c-raf kinase antisense polynucleotides for treating ocular diseases and disorders
PL2049664T3 (pl) 2006-08-11 2012-02-29 Biomarin Tech Bv Jednoniciowe oligonukleotydy komplementarne do powtarzalnych elementów do leczenia chorób genetycznych związanych z niestabilnością powtórzeń DNA
EP2081949B1 (en) 2006-09-22 2014-12-10 GE Healthcare Dharmacon, Inc. Tripartite oligonucleotide complexes and methods for gene silencing by rna interference
DK2167136T3 (en) 2007-07-12 2016-07-25 Biomarin Tech Bv Molecules for targeting compounds at different selected organs or tissues
AU2008317566B2 (en) 2007-10-26 2014-05-01 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and methods for counteracting muscle disorders
USRE48468E1 (en) 2007-10-26 2021-03-16 Biomarin Technologies B.V. Means and methods for counteracting muscle disorders
NZ587178A (en) 2008-02-08 2011-11-25 Prosensa Holding Bv Methods and means for treating dna repeat instability associated genetic disorders
US8188060B2 (en) 2008-02-11 2012-05-29 Dharmacon, Inc. Duplex oligonucleotides with enhanced functionality in gene regulation
EP2119783A1 (en) 2008-05-14 2009-11-18 Prosensa Technologies B.V. Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means
RU2604489C2 (ru) 2008-10-03 2016-12-10 КьюРНА,Инк.,US Лечение заболеваний, связанных с аполипопротеином-а1, путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта аполипопротеина-а1
PL3133160T3 (pl) 2008-10-24 2019-06-28 Sarepta Therapeutics, Inc. Kompozycje do pomijania eksonów w DMD
WO2010048552A2 (en) * 2008-10-24 2010-04-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of using oligomeric compounds comprising 2'-substituted nucleosides
JP6091752B2 (ja) 2008-12-04 2017-03-08 クルナ・インコーポレーテッド Ｅｐｏに対する天然アンチセンス転写物の抑制によるエリスロポエチン（ｅｐｏ）関連疾患の治療
RU2618688C2 (ru) 2008-12-04 2017-05-10 КьюРНА,Инк.,US Лечение связанных с геном-супрессором опухолей заболеваний посредством ингибирования природного транскрипта в антисмысловой ориентации относительно этого гена
WO2010065671A2 (en) 2008-12-04 2010-06-10 Curna, Inc. Treatment of vascular endothelial growth factor (vegf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to vegf
HUE026280T2 (en) 2009-02-12 2016-06-28 Curna Inc Treatment of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) -related diseases by inhibition of natural antisense transcripts associated with BDNF \ t
US9464287B2 (en) 2009-03-16 2016-10-11 Curna, Inc. Treatment of nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (NRF2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to NRF2
US9708604B2 (en) 2009-03-17 2017-07-18 Curna, Inc. Treatment of delta-like 1 homolog (DLK1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to DLK1
US20120046342A1 (en) 2009-04-24 2012-02-23 Prosensa Technologies B.V. Oligonucleotide comprising an inosine for treating dmd
CA2761152A1 (en) 2009-05-06 2010-11-11 Opko Curna, Llc Treatment of lipid transport and metabolism gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a lipid transport and metabolism gene
CN102803492B (zh) 2009-05-06 2016-06-29 库尔纳公司 通过抑制针对三重四脯氨酸(ttp)的天然反义转录物来治疗ttp相关疾病
ES2618572T3 (es) 2009-05-08 2017-06-21 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con la familia de la distrofina mediante inhibición de un transcrito antisentido natural para la familia de dmd
US8957037B2 (en) 2009-05-18 2015-02-17 Curna, Inc. Treatment of reprogramming factor related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a reprogramming factor
JP2012527248A (ja) 2009-05-22 2012-11-08 クルナ・インコーポレーテッド 転写因子ｅ３（ｔｆｅ３）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｔｆｅ３およびインスリン受容体基質２（ｉｒｓ２）関連疾患の処置
KR101704988B1 (ko) 2009-05-28 2017-02-08 큐알엔에이, 인크. 항바이러스 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 항바이러스 유전자 관련된 질환의 치료
EP2443237B1 (en) 2009-06-16 2017-02-22 CuRNA, Inc. Treatment of collagen gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a collagen gene
KR101702689B1 (ko) 2009-06-16 2017-02-06 큐알엔에이, 인크. Ｐｏｎ1에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 파라옥소나제 1(ｐｏｎ1) 관련된 질환의 치료
CN102597238B (zh) 2009-06-24 2016-06-29 库尔纳公司 通过抑制针对肿瘤坏死因子受体2(tnfr2)的天然反义转录物来治疗tnfr2相关的疾病
CN102482672B (zh) 2009-06-26 2016-11-09 库尔纳公司 通过抑制唐氏综合征基因的天然反义转录物治疗唐氏综合征基因相关疾病
US10704096B2 (en) 2009-07-07 2020-07-07 University Of Southern California Biomarkers for the early detection of autoimmune diseases
KR101801407B1 (ko) 2009-07-24 2017-11-24 큐알엔에이, 인크. 시르투인 (ｓｉｒｔ)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 시르투인 관련된 질환의 치료
EP2462229B1 (en) 2009-08-05 2016-05-11 CuRNA, Inc. Treatment of insulin gene (ins) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an insulin gene (ins)
ES2599986T3 (es) 2009-08-11 2017-02-06 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con adiponectina (ADIPOQ) mediante la inhibición de un transcrito antisentido natural de una adiponectina (ADIPOQ)
EP2982755B1 (en) 2009-08-21 2020-10-07 CuRNA, Inc. Treatment of 'c terminus of hsp70-interacting protein' (chip) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to chip
US9023822B2 (en) 2009-08-25 2015-05-05 Curna, Inc. Treatment of 'IQ motif containing GTPase activating protein' (IQGAP) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to IQGAP
CN102791861B (zh) 2009-09-25 2018-08-07 库尔纳公司 通过调节聚丝蛋白(flg)的表达和活性而治疗flg相关疾病
KR102239374B1 (ko) 2009-11-12 2021-04-14 더 유니버시티 오브 웨스턴 오스트레일리아 안티센스 분자 및 이를 이용한 질환 치료방법
KR101823702B1 (ko) 2009-12-16 2018-01-30 큐알엔에이, 인크. 막 결합 전사 인자 펩티다제, 부위 １(ｍｂｔｐｓ１)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 ｍｂｔｐｓ１ 관련 질환의 치료
KR101793753B1 (ko) 2009-12-23 2017-11-03 큐알엔에이, 인크. 커플링방지 단백질 ２(ｕｃｐ２)에 대한 천연 안티센스 전사체의 저해에 의한 ｕｃｐ２ 관련 질환의 치료
DK2516648T3 (en) 2009-12-23 2018-02-12 Curna Inc TREATMENT OF HEPATOCYTE GROWTH FACTOR (HGF) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT AGAINST HGF
CN102770540B (zh) 2009-12-29 2017-06-23 库尔纳公司 通过抑制肿瘤蛋白63(p63)的天然反义转录物而治疗p63相关疾病
KR101838305B1 (ko) 2009-12-29 2018-03-13 큐알엔에이, 인크. ＮＲＦ1(Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ 1)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 핵 호흡 인자 1 관련된 질환의 치료
RU2616283C2 (ru) 2009-12-31 2017-04-13 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с субстратом рецептора инсулина 2 (irs2), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к irs2
RU2611187C2 (ru) 2010-01-04 2017-02-21 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с интерферон-регуляторным фактором 8 (irf8), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к irf8
CA2786056C (en) 2010-01-06 2023-03-14 Curna, Inc. Treatment of pancreatic developmental gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a pancreatic developmental gene
DK2524039T3 (en) 2010-01-11 2018-03-12 Curna Inc TREATMENT OF GENDER HORMON-BINDING GLOBULIN (SHBG) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENCE TRANSCRIPTS TO SHBG
US8946182B2 (en) 2010-01-25 2015-02-03 Curna, Inc. Treatment of RNASE H1 related diseases by inhibition of natural antisense transcript to RNASE H1
CN102844435B (zh) 2010-02-22 2017-05-10 库尔纳公司 通过抑制吡咯啉‑5‑羧酸还原酶1(pycr1)的天然反义转录物而治疗pycr1相关疾病
ES2557407T3 (es) 2010-03-01 2016-01-25 Tau Therapeutics Llc Procedimiento de imaginología de una enfermedad
WO2011112516A1 (en) * 2010-03-08 2011-09-15 Ico Therapeutics Inc. Treating and preventing hepatitis c virus infection using c-raf kinase antisense oligonucleotides
ES2657969T3 (es) 2010-04-02 2018-03-07 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con el Factor 3 estimulante de colonias (CSF3) por inhibición del transcrito antisentido natural a CSF3
CN102858979B (zh) 2010-04-09 2018-01-26 库尔纳公司 通过抑制成纤维细胞生长因子21(fgf21)的天然反义转录物而治疗fgf21相关疾病
KR101936011B1 (ko) 2010-05-03 2019-01-07 큐알엔에이, 인크. 시르투인 (sirt)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 시르투인 (sirt) 관련된 질환의 치료
TWI531370B (zh) 2010-05-14 2016-05-01 可娜公司 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病
EP3299464B1 (en) 2010-05-26 2019-10-02 CuRNA, Inc. Treatment of atonal homolog 1 (atoh1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to atoh1
CN102971423B (zh) 2010-05-26 2018-01-26 库尔纳公司 通过抑制蛋氨酸硫氧化物还原酶a(msra)的天然反义转录物而治疗msra相关疾病
US9771579B2 (en) 2010-06-23 2017-09-26 Curna, Inc. Treatment of sodium channel, voltage-gated, alpha subunit (SCNA) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to SCNA
CA2805318A1 (en) 2010-07-14 2012-01-19 Curna, Inc. Treatment of discs large homolog (dlg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlg
US8993533B2 (en) 2010-10-06 2015-03-31 Curna, Inc. Treatment of sialidase 4 (NEU4) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to NEU4
JP6049623B2 (ja) 2010-10-22 2016-12-21 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド α‐Ｌ‐イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）への天然アンチセンス転写物の阻害によるＩＤＵＡ関連疾患の治療
US9920317B2 (en) 2010-11-12 2018-03-20 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
EP3260540A1 (en) 2010-11-12 2017-12-27 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding rnas
WO2012068340A2 (en) 2010-11-18 2012-05-24 Opko Curna Llc Antagonat compositions and methods of use
JP6071893B2 (ja) 2010-11-23 2017-02-01 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｎａｎｏｇへの天然アンチセンス転写物の阻害によるｎａｎｏｇ関連疾患の治療
US9593330B2 (en) 2011-06-09 2017-03-14 Curna, Inc. Treatment of frataxin (FXN) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to FXN
CA2847811C (en) 2011-09-06 2019-10-22 Curna, Inc. Treatment of diseases related to alpha subunits of sodium channels, voltage-gated (scnxa) with small molecules
WO2013039859A1 (en) 2011-09-12 2013-03-21 Gray Lloyd S Antagonists of products of the hs.459642 unigene cluster for the inhibition of proliferation, development or differentiation of stem cells including cancer stem cells
DK2756080T3 (da) 2011-09-14 2019-05-20 Translate Bio Ma Inc Multimeriske oligonukleotidforbindelser
JP2015509922A (ja) 2012-01-27 2015-04-02 プロセンサ テクノロジーズ ビー．ブイ．Ｐｒｏｓｅｎｓａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｂ．Ｖ． デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィーの治療のための改善された特徴を有するｒｎａ調節オリゴヌクレオチド
KR20140136488A (ko) 2012-03-15 2014-11-28 큐알엔에이, 인크. 뇌 유래 신경영양 인자（ｂｄｎｆ）에 대한 천연 안티센스 전사체의 저해에 의한 뇌 유래 신경영양 인자（ｂｄｎｆ）관련 질환의 치료
EP2850186B1 (en) 2012-05-16 2018-12-19 Translate Bio MA, Inc. Compositions and methods for modulating smn gene family expression
AP2014008100A0 (en) 2012-05-16 2014-12-31 Gen Hospital Corp Compositions and methods for modulating hemoglobingene family expression
US10058623B2 (en) 2012-05-16 2018-08-28 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating UTRN expression
AU2013262709A1 (en) 2012-05-16 2015-01-22 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating MECP2 expression
BR112014028644A2 (pt) 2012-05-16 2017-08-15 Rana Therapeutics Inc Composições e métodos para modulação da expressão de atp2a2
US10837014B2 (en) 2012-05-16 2020-11-17 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating SMN gene family expression
US20150247141A1 (en) 2012-09-14 2015-09-03 Rana Therapeutics, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds
US10024844B2 (en) 2012-12-20 2018-07-17 Hospital For Special Surgery Identification of an inhibitor of iRhom1 or an inhibitor of iRhom2
JP6449231B2 (ja) 2013-03-14 2019-01-09 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド 筋ジストロフィを処置するためのエキソンスキッピング組成物
KR20200139271A (ko) 2013-03-15 2020-12-11 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 근육 이영양증의 치료를 위한 개선된 조성물
JP2016531570A (ja) 2013-08-16 2016-10-13 ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド ユークロマチン領域を標的とするオリゴヌクレオチド
WO2015048531A1 (en) 2013-09-26 2015-04-02 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Inhibition of sgk1 in the treatment of heart conditions
US10272058B2 (en) 2014-03-20 2019-04-30 Cymabay Therapeutics, Inc. Treatment of intrahepatic cholestatic diseases
MX367478B (es) 2014-03-20 2019-08-23 Cymaby Therapeutics Inc Tratamiento de enfermedades colestasicas intrahepaticas.
PL3129018T3 (pl) 2014-04-11 2020-05-18 Cymabay Therapeutics, Inc. Leczenie NAFLD i NASH
GB201410693D0 (en) 2014-06-16 2014-07-30 Univ Southampton Splicing modulation
JP6867945B2 (ja) 2014-10-03 2021-05-12 コールド スプリング ハーバー ラボラトリー 核内遺伝子出力の標的とされた増強
WO2016070060A1 (en) 2014-10-30 2016-05-06 The General Hospital Corporation Methods for modulating atrx-dependent gene repression
US10758558B2 (en) 2015-02-13 2020-09-01 Translate Bio Ma, Inc. Hybrid oligonucleotides and uses thereof
US10900036B2 (en) 2015-03-17 2021-01-26 The General Hospital Corporation RNA interactome of polycomb repressive complex 1 (PRC1)
SG11201802870RA (en) 2015-10-09 2018-05-30 Univ Southampton Modulation of gene expression and screening for deregulated protein expression
FI3364993T3 (fi) 2015-10-22 2023-01-13 Menetelmiä angelmanin oireyhtymän hoitamiseksi
US11096956B2 (en) 2015-12-14 2021-08-24 Stoke Therapeutics, Inc. Antisense oligomers and uses thereof
AU2016370653A1 (en) 2015-12-14 2018-06-21 Cold Spring Harbor Laboratory Antisense oligomers for treatment of Autosomal Dominant Mental Retardation-5 and Dravet Syndrome
JOP20200228A1 (ar) 2015-12-21 2017-06-16 Novartis Ag تركيبات وطرق لخفض تعبير البروتين tau
WO2018152317A1 (en) 2017-02-15 2018-08-23 Cavion, Inc. Calcium channel inhibitors
JP7321097B2 (ja) 2017-04-26 2023-08-04 カビオン・インコーポレイテッド 記憶および認知を改善する、ならびに記憶および認知障害を処置するための方法
CN107460219B (zh) * 2017-07-24 2020-04-10 武汉大学 一种差异核酸酶切方法及其在LC-MS法检测mRNA内部修饰中的应用
EP4303321A3 (en) 2017-08-25 2024-07-24 Stoke Therapeutics, Inc. Antisense oligomers for treatment of conditions and diseases
MX2020011695A (es) 2018-05-04 2021-02-26 Stoke Therapeutics Inc Métodos y composiciones para el tratamiento de la enfermedad por almacenamiento de éster de colesterilo.
WO2020072773A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Cavion, Inc. Treating essential tremor using (r)-2-(4-isopropylphenyl)-n-(1-(5-(2,2,2-trifluoroethoxy)pyridin-2-yl)ethyl)acetamide
AU2021270720A1 (en) 2020-05-11 2022-12-08 Stoke Therapeutics, Inc. OPA1 antisense oligomers for treatment of conditions and diseases

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
DE3788914T2 (de) 1986-09-08 1994-08-25 Ajinomoto Kk Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.
DE68929305T2 (de) 1988-04-27 2002-05-02 Isis Pharmaceutical, Inc. Oligoribonukleotid-Derivate und Verwendung davon als Antiviral Arzneimittel
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
JPH0813274B2 (ja) 1990-08-13 1996-02-14 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 遺伝子発現を検出及び変調する糖修飾されたオリゴヌクレオチド
BR9206156A (pt) 1991-06-14 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals Inc Oligonucleotídeo ou análogo de aligonucleotídeo processo de modular a expressão do gene H-RAS humano processo de detectar a presença do gene H-RAS em células ou em tecidos processo de detectar H-RAS ativado baseado na afinidade diferencial de oligonucleotídeos particulares por H-RAS ativado VS,tipo,processo de tratar condicões que surgem da ativacão do oncogene H-RAS
DE4216134A1 (de) * 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
US5948898A (en) * 1992-03-16 1999-09-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methoxyethoxy oligonucleotides for modulation of protein kinase C expression
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
TW244371B (cs) 1992-07-23 1995-04-01 Tri Clover Inc
ATE256143T1 (de) 1992-07-23 2003-12-15 Isis Pharmaceuticals Inc 2'-0-alkyl-nukleoside und-phosphoramidite, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendungen
EP0626387B1 (de) 1993-05-12 1999-03-10 Novartis AG Nukleoside und Oligonukleotide mit 2'-Ethergruppen
US5627053A (en) * 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid

Also Published As

Publication number Publication date
TR199801581T2 (xx) 1998-10-21
JP2000504725A (ja) 2000-04-18
US6451991B1 (en) 2002-09-17
ATE267207T1 (de) 2004-06-15
NO983718D0 (no) 1998-08-13
AU1955297A (en) 1997-09-02
DK0882061T3 (da) 2004-09-27
DE69729179D1 (de) 2004-06-24
BR9707529A (pt) 2000-01-04
EP0882061A4 (en) 2000-12-13
NO983718L (no) 1998-10-13
KR19990082476A (ko) 1999-11-25
EP0882061B1 (en) 2004-05-19
CN1214688A (zh) 1999-04-21
DE69729179T2 (de) 2004-12-30
SK109198A3 (en) 1999-06-11
AU725262B2 (en) 2000-10-12
CA2246229A1 (en) 1997-08-21
ES2221039T3 (es) 2004-12-16
ZA971208B (en) 1997-10-23
HUP9901118A3 (en) 2000-06-28
NZ331217A (en) 2000-02-28
IL125759A0 (en) 1999-04-11
EP0882061A1 (en) 1998-12-09
CA2749312A1 (en) 1997-08-21
HUP9901118A2 (hu) 1999-07-28
CA2246229C (en) 2011-08-23
WO1997030067A1 (en) 1997-08-21
PL328563A1 (en) 1999-02-01
JP4293636B2 (ja) 2009-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ243498A3 (cs) Oligonukleotidy s mezerou a modifikovaným cukrem
US7015315B1 (en) Gapped oligonucleotides
US5955589A (en) Gapped 2&#39; modified oligonucleotides
US5859221A (en) 2&#39;-modified oligonucleotides
US5872232A (en) 2&#39;-O-modified oligonucleotides
US6221850B1 (en) Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins
US7138517B2 (en) Sugar modified oligonucleotides
US6005087A (en) 2&#39;-modified oligonucleotides
JP3131222B2 (ja) ギャップを有する２′修飾オリゴヌクレオチド
KR100354610B1 (ko) 키메라 및 교호결합 올리고뉴클레오티드를 갖는 ｒａｓ 유전자의 안티센스 저해
KR100363475B1 (ko) ｒａｓ의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해
JP3745226B2 (ja) サービビン発現のアンチセンス・モジュレーション
US20060270624A1 (en) Gapped 2&#39; modified oligonucleotides
WO1995014706A1 (en) Pna-dna-pna chimeric macromolecules
JP2001097994A (ja) ２’−ｏ−置換ピリミジンおよびそのオリゴマー化合物の合成の改良法
KR100199247B1 (ko) Ras 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해
US6465250B1 (en) Antisense modulation of protein phosphatase 2 catalytic subunit alpha expression
US20040029823A1 (en) Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins
US20040121973A1 (en) Antisense modulation of protein phosphatase 2 Catalytic subunit alpha expression
JP2002519015A (ja) Ｔｎｆｒ１発現のアンチセンスモジュレーション