KR19990082476A - 당-변형되어 갭이 형성된 올리고뉴클레오티드 - Google Patents
당-변형되어 갭이 형성된 올리고뉴클레오티드 Download PDFInfo
- Publication number
- KR19990082476A KR19990082476A KR1019980706209A KR19980706209A KR19990082476A KR 19990082476 A KR19990082476 A KR 19990082476A KR 1019980706209 A KR1019980706209 A KR 1019980706209A KR 19980706209 A KR19980706209 A KR 19980706209A KR 19990082476 A KR19990082476 A KR 19990082476A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- oligonucleotides
- oligonucleotide
- nucleoside
- sequence
- deoxy
- Prior art date
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 376
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 241
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 57
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical group 0.000 claims description 54
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 abstract description 90
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 59
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 58
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 58
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 55
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract description 30
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 abstract description 25
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 abstract description 24
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 abstract description 22
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 abstract description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 20
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 abstract description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 18
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 16
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract description 16
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 14
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 89
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 69
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 45
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 44
- ABEXEQSGABRUHS-UHFFFAOYSA-N 16-methylheptadecyl 16-methylheptadecanoate Chemical compound CC(C)CCCCCCCCCCCCCCCOC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC(C)C ABEXEQSGABRUHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- 241000764238 Isis Species 0.000 description 44
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 44
- 238000005417 image-selected in vivo spectroscopy Methods 0.000 description 44
- 238000012739 integrated shape imaging system Methods 0.000 description 44
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 38
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 38
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 38
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 34
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 34
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 30
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- -1 aminopropoxy Chemical group 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 101710109947 Protein kinase C alpha type Proteins 0.000 description 22
- 102100024924 Protein kinase C alpha type Human genes 0.000 description 22
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 22
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 21
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 20
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 17
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 13
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 13
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 11
- 108010029869 Proto-Oncogene Proteins c-raf Proteins 0.000 description 11
- 102100033479 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 10
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 9
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 9
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 9
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 8
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- NMYKBZSMOUFOJV-FJSWQEPZSA-N aprinocarsen Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=S)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=S)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=S)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=S)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=S)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=S)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=S)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=S)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=S)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=S)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=S)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)CO)[C@@H](OP(O)(=S)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=S)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)OP(O)(=S)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=S)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=S)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)C1 NMYKBZSMOUFOJV-FJSWQEPZSA-N 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 108700042226 ras Genes Proteins 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 7
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 7
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 7
- OMEUGRCNAZNQLN-UHFFFAOYSA-N isis 5132 Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(S)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)CO)C(O)C1 OMEUGRCNAZNQLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 5
- WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N Tetraxetan Chemical compound OC(=O)CN1CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 5
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 125000002431 aminoalkoxy group Chemical group 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- UJBCLAXPPIDQEE-UHFFFAOYSA-N 5-prop-1-ynyl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CC#CC1=CNC(=O)NC1=O UJBCLAXPPIDQEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 3
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 3
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 3
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 3
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 3
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N diisopropylamine Chemical compound CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 3
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 229940043257 glycylglycine Drugs 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 108700004030 rev Genes Proteins 0.000 description 3
- 101150098213 rev gene Proteins 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 3
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- VGFVTPAWHPJDSV-VBHAUSMQSA-N (2r,3r,4r,5r)-5-(2,6-diaminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)-4-octadecoxyoxolan-3-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1 VGFVTPAWHPJDSV-VBHAUSMQSA-N 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LOSXTWDYAWERDB-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro(diphenyl)methyl]-2,3-dimethoxybenzene Chemical compound COC1=CC=CC(C(Cl)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1OC LOSXTWDYAWERDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound SC=1C=CNC(=O)N=1 OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 2
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013446 GTP Phosphohydrolases Human genes 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- 108091006109 GTPases Proteins 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005336 allyloxy group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000009134 cell regulation Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 2
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 125000005642 phosphothioate group Chemical group 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 2
- 125000004001 thioalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 2
- WLLOAUCNUMYOQI-JAGXHNFQSA-N (2r,3r,3as,9ar)-3-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-7-methyl-2,3,3a,9a-tetrahydrofuro[1,2][1,3]oxazolo[3,4-a]pyrimidin-6-one Chemical compound O1C2=NC(=O)C(C)=CN2[C@H]2[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O2 WLLOAUCNUMYOQI-JAGXHNFQSA-N 0.000 description 1
- JUDOLRSMWHVKGX-UHFFFAOYSA-N 1,1-dioxo-1$l^{6},2-benzodithiol-3-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)SS(=O)(=O)C2=C1 JUDOLRSMWHVKGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYADHXFMURLYQI-UHFFFAOYSA-N 1,2,4-triazine Chemical class C1=CN=NC=N1 FYADHXFMURLYQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZNJOCVLVYVOUGB-UHFFFAOYSA-N 1-iodooctadecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCI ZNJOCVLVYVOUGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NOGFHTGYPKWWRX-UHFFFAOYSA-N 2,2,6,6-tetramethyloxan-4-one Chemical compound CC1(C)CC(=O)CC(C)(C)O1 NOGFHTGYPKWWRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- QSHACTSJHMKXTE-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminopropyl)-7h-purin-6-amine Chemical compound CC(N)CC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 QSHACTSJHMKXTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDTFMPXQUSBYRL-UUOKFMHZSA-N 2-Aminoadenosine Chemical compound C12=NC(N)=NC(N)=C2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O ZDTFMPXQUSBYRL-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 2-METHOXYETHANOL Chemical compound COCCO XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ISPYQTSUDJAMAB-UHFFFAOYSA-N 2-chlorophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1Cl ISPYQTSUDJAMAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108091027075 5S-rRNA precursor Proteins 0.000 description 1
- QNNARSZPGNJZIX-UHFFFAOYSA-N 6-amino-5-prop-1-ynyl-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound CC#CC1=CNC(=O)N=C1N QNNARSZPGNJZIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 1
- 125000003860 C1-C20 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 239000004278 EU approved seasoning Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710113436 GTPase KRas Proteins 0.000 description 1
- 102100039788 GTPase NRas Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108700039791 Hepatitis C virus nucleocapsid Proteins 0.000 description 1
- 101000744505 Homo sapiens GTPase NRas Proteins 0.000 description 1
- 101001051777 Homo sapiens Protein kinase C alpha type Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 101000926938 Mus musculus Glucocorticoid receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- CWRVKFFCRWGWCS-UHFFFAOYSA-N Pentrazole Chemical compound C1CCCCC2=NN=NN21 CWRVKFFCRWGWCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000254064 Photinus pyralis Species 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101150040459 RAS gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 101150062264 Raf gene Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000566107 Scolopax Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001251 acridines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N chlorotrimethylsilane Chemical compound C[Si](C)(C)Cl IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012059 conventional drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 239000007933 dermal patch Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940043279 diisopropylamine Drugs 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ROORDVPLFPIABK-UHFFFAOYSA-N diphenyl carbonate Chemical compound C=1C=CC=CC=1OC(=O)OC1=CC=CC=C1 ROORDVPLFPIABK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N hydridophosphorus(.) (triplet) Chemical compound [PH] BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- QTBFPMKWQKYFLR-UHFFFAOYSA-N isobutyl chloride Chemical compound CC(C)CCl QTBFPMKWQKYFLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- HRFRDLYZTHJDNR-YUGARCTCSA-N n-[9-[(2r,3r,4r,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-3-octadecoxyoxolan-2-yl]-6-oxo-3h-purin-2-yl]-2-methylpropanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(NC(NC(=O)C(C)C)=NC2=O)=C2N=C1 HRFRDLYZTHJDNR-YUGARCTCSA-N 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- RLOWWWKZYUNIDI-UHFFFAOYSA-N phosphinic chloride Chemical compound ClP=O RLOWWWKZYUNIDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 125000002572 propoxy group Chemical group [*]OC([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N ribothymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 1
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 239000006208 topical dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IYGPXXORQKFXCZ-UHFFFAOYSA-N tris(2-methoxyethyl) borate Chemical compound COCCOB(OCCOC)OCCOC IYGPXXORQKFXCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Abstract
본 발명은 상대 스트랜드내에 스트랜드 분열을 위하여 RNase H 활성을 유도하기 위한 올리고뉴클레오티드의 합성 및 사용에 관한 것이다. 본 발명에 포함된 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드중의 적어도 일부의 뉴클레오시드 단위는 뉴클레아제 내성을 갖도록 기능화되고(functionalized), 올리고뉴클레오티드중의 적어도 일부의 뉴클레오시드 단위는 핵산의 상보 스트랜드에 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 잠재적으로 갖고 있는 치환체를 포함하며, 그리고 올리고뉴클레오티드중의 적어도 일부의 올리고뉴클레오시드 단위는 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 당 부(moiety)를 포함한다.
Description
올리고뉴클레오티드는 단일-스트랜드된 DNA 또는 RNA 분자에 혼성화하는 것으로 알려져 있다. 혼성화는 표적 DNA 또는 RNA의 핵염기에 대한 올리고뉴클레오티드 핵염기의 특이적 염기쌍 수소결합 염기서열이다. 이러한 핵염기쌍은 서로 상보적이다.
올리고뉴클레오티드의 상보 핵산에 대한 혼성화 포착 정도를 결정할 때, 상보 핵산에 결합하는 올리고뉴클레오티드의 상대능률은 특이적 혼성화 착물의 용융온도를 결정하는 것과 비교될 수 있다. 이중나선의 특징적 물리적 성질인 용융온도(Tm)는 50%의 나선형(혼성화된) vs 코일(혼성화 되지 않은)의 형태로 존재할 때의 온도(섭씨온도)를 나타낸다. Tm은 혼성화 착물의 형성과 파괴(용융)를 결정하기 위하여 UV 스펙트럼을 이용하여 측정한다. 혼성화 동안에 발생하는 염기 중첩현상은 UV 흡수(흡광)의 감소를 동반한다. 따라서 UV흡수의 감소는 더 높은 Tm값을 나타낸다. Tm값이 높아질수록, 스트랜드 사이의 결합강도는 더 커진다.
올리고뉴클레오티드는 세포내 효소인 RNase H에 의해 표적 RNA의 효소적 분열에 효과적으로 사용될 수 있다. 이러한 RNase H 분열의 메카니즘은 2'-데옥시리보푸라노실 올리고뉴클레오티드가 표적 RNA에 혼성화되는 것을 필요로하는 것으로 알려져 있다. 생성된 DNA-RNA쌍은 RNase H 효소를 활성화시키고, 그 활성화된 효소는 RNA 스트랜드를 분열시킨다. RNA 스트랜드의 분열로 RNA의 정상 기능이 파괴된다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 이러한 형태의 메카니즘을 통해 작동하는 것으로 알려져 있다. 그러나 DNA 올리고뉴클레오티드가 RNase H의 세포내 활성에 유용하기 위해서는, 올리고뉴클레오티드가 RNase H 활성을 위한 충분한 시간동안 세포내에서 생존할 수 있도록 뉴클레아제에 적당히 안정적인 것이 바람직하다. 올리고뉴클레오티드를 연구시약으로 이용하는 것과 같이 비-세포적으로 사용하는 경우에는, 이러한 뉴클레아제의 안정성을 필요로 하지는 않는다.
몇몇 간행물에서 RNase H 및 올리고뉴클레오티드의 상호작용을 게재하고 있다. 특별하게 관심을 가질 수 있는 것으로는 다음과 같다:
(1) Dagle et al. Nucleic Acids Research 1990, 18, 4751; (2) Dagle et al. Antisense Research And Development 1991, 1, 11; (3) Eder et al., J. Biol. Chem. 1991, 266, 6472; 및 (4) Dagle et al. Nucleic Acids Research 1991, 19, 1805. 이들 논문에 의하면, 비-변형 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 결합 및 변형 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 가지는 DNA 올리고뉴클레오티드는 세포 RNase H에 대한 기질이다. 이들이 기질이기 때문에, 이들은 RNase H에 의한 표적 RNA의 분열을 활성화시킨다. 그러나 저자들은 Xenopus 태아내에서, 포스포디에스테르 결합 및 포스포로티오에이트 결합은 모두 엑소뉴클레아제(exonuclease) 분해를 필요로 한다고 지적하였다. 이러한 뉴클레아제 분해는 RNase H 활성에 유용한 올리고뉴클레오티드를 빠르게 고갈시키기 때문에 해롭다.
상기 참고자료에서 기술한 대로 뉴클레아제 분해에는 대항적인 올리고뉴클레오티드를 안정화시키기 위하여, 포스포르아미데이트, 알킬 포스포네이트 또는 포스포트리에스테르 결합 영역 사이에 위치한 포스포디에스테르 결합된 뉴클레오시드의 짧은 영역을 함유하는 2'-데옥시 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 포스포르아미데이트-함유 올리고뉴클레오티드가 엑소뉴클레아제에 대항하여 안정하게 되는 반면, 참고자료 (4)에서 저자는 각 포스포르아미데이트 결합이 포스포르아미데이트 함유 올리고뉴클레오티드의 측정된 Tm값에서 1.6℃의 손실을 가져온다고 지적하였다. 이러한 Tm값의 감소는 올리고뉴클레오티드와 이의 표적 스트랜드 사이의 혼성화의 감소를 나타낸다.
다른 저자들은 올리고뉴클레오티드와 이들의 표적 스트랜드 사이의 혼성화의 손실과 같은 영향에 대해 지적하였다. Saison-Behmoaras등은 올리고뉴클레오티드가 RNase H에 대해 기질이 되더라도, mRNA로의 혼성화가 약하기 때문에 RNase H에 의한 분열 능률이 낮다는 것을 관찰하였다. 또한 이들은 올리고뉴클레오티드 3'말단에서 아크리딘의 치환으로 엑소뉴클레아제로부터 올리고뉴클레오티드가 보호된다고 지적하였다(EMBO Journal 1991, 10, 1111).
미국특허 제5,013,830호 (1991.5.7)는 RNA 올리고머 또는 이의 유도체를 함유하는 혼합 올리고머가 포스포디에스테르 결합을 통해 DNA 올리고머에 결합되어 있음을 개시하고 있다. 또한 RNA 올리고머는 2'-O-알킬 치환체를 갖고 있다. 하지만, 포스포디에스테르 올리고머는 뉴클레아제 분열에 대해 민감하다.
유럽특허출원 제339,842호 (1989.4.13 출원)는 2'-O-메틸리보올리고뉴클레오티드 포스포로티오에이트 유도체를 함유하는 2'-O-치환 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 개시하고 있다. 상기 특허출원은 또한 뉴클레아제 내성이 부족한 2'-O-메틸 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드를 개시하고 있다.
미국특허 제5,149,797호 (1992.11.22)는 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되어 있고, 그리고 변형 DNA 또는 RNA 염기서열의 일부가 양 측면에 있는 데옥시뉴클레오티드의 내부를 포함하는 혼합 포스페이트 골격 올리고뉴클레오티드를 개시하고 있다. 측부 염기서열은 메틸 포스포네이트, 포스포로모르폴리데이트, 포스포로피페라지데이트 또는 포스포르아미데이트 결합을 함유한다.
미국특허 제5,256,775호(1993.10.26)는 포스포르아미데이트 결합 및 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 결합을 하고 있는 혼합 올리고뉴클레오티드를 개시하고 있다.
올리고뉴클레오티드 및 RNase H를 이용함으로써 표적 RNA 스트랜드의 분열이 유용하다고 인식되는 반면에, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성 및 혼성화의 적합성은 올리고뉴클레오티드 치료법의 개발에 있어서 굉장히 중요하다. 따라서 혼성화 성질을 유지 또는 발전시키고, 뉴클레아제 내성을 동시에 제공하면서, RNaes H를 활성화시킬 수 있는 방법 및 물질에 대한 필요성이 남게된 것이다. 또한 이러한 올리고뉴클레오티드는 연구 및 진단 시약으로서도 요구된다.
발명의 요약
본 발명의 한 구체예에 따르면 뉴클레오시드 단위의 염기서열로부터 형성된 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 증가시키도록 기능화된 하나 변형 뉴클레오시드 단위를 합체시킨다. 또한 올리고뉴클레오티드중의 적어도 일부의 뉴클레오시드 단위는 표적 RNA에 올리고뉴클레오티드의 결합친화도를 증가시키기 위한 치환기로 기능화되고, 적어도 일부의 뉴클레오시드 단위는 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 당 부를 함유한다.
본 발명의 바람직한 올리고뉴클레오티드에서, 결합친화도를 증가시키도록 기능화된 뉴클레오시드 단위는 2'-치환기를 함유한다. 바람직한 구체예에 있어서, 2'-치환기로는 플루오로, C1-C20알콕시, 아미노프로폭시와 같은 C1-C9아미노 알콕시, 알릴옥시, 이미다조릴알콕시 및 폴리에틸렌 글리콜이 있다. 바람직한 알콕시 치환체는 메톡시, 에톡시 및 프로폭시를 함유한다. 바람직한 아미노알콕시 단위는 아미노프로폭시이다. 바람직한 이미다조릴알콕시 치환체는 이미다조릴프로폭시이다. 바람직한 폴리에틸렌 글리콜 치환체는 -O-에틸-O-메틸 또는 메톡시에톡시(-O-CH2-CH2-O-CH3)이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 결합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 전하된(charged) 포스포러스 결합으로 연결되어 있는 뉴클레오시드 단위를 포함한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 핵산의 상보적 스트랜드에 올리고뉴클레오티드의 결합친화도를 증가시키는 치환기를 갖는 다수의 연결된 뉴클레오시드 단위를 포함한다. 바람직한 특정예에서, 이러한 치환체를 갖는 뉴클레오시드 단위를 함유하는 올리고뉴클레오티드의 염기서열은 제 1 염기서열과 제 2 염기서열로 나누어지며, 제 1 염기서열은 2'-치환된-에리트로-펜토푸라노실 당 부를 함유하는 뉴클레오시드 단위가 연결되어 있으며, 제 2 염기서열은 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 당 부를 함유하는 뉴클레오시드 단위가 연결되어 있다. 바람직하게, 상기 제 2 염기서열은 3 변형 뉴클레오시드 단위를 가지며, 더 바람직하게는 5 이상의 뉴클레오시드 단위를 갖는다. 더욱 바람직한 구체예에서는 제 1 염기서열에 선택적인 단위로부터 선택되는 뉴클레오시드 단위인 제 3 염기서열이 존재한다. 제 2 염기서열은 제 1 염기서열과 제 3 염기서열 사이에 위치하는 것이 바람직하다. 본 발명의 이러한 올리고뉴클레오티드는 또한 "키메라", "키메라의" 또는 "갭이 형성된" 올리고뉴클레오티드로 언급된다.
본 발명의 더욱 바람직한 올리고뉴클레오티드에서, 결합친화도를 증가시키는 치환체를 함유하는 뉴클레오시드 단위가 올리고뉴클레오티드의 3'또는 5' 말단중의 한쪽 또는 양쪽에 위치한다. 치환기로 치환된 뉴클레오시드 단위가 1 내지 약 8개가 될 수 있다. 바람직하게는 5 이상의 뉴클레오시드 단위가 2'-데옥시 -에리트로-펜토푸라노실 당 부를 갖는다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드 단위는 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 결합과 같은 포스포러스 결합에 의해 2' 치환된 그리고 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 당 부와 연결된 핵염기로 이루어진다. 본 발명의 바람직한 핵염기는 크산틴, 히포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌과 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌과 구아닌의 다른 알킬 유도체, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 아미노, 티올, 티오알킬, 히드록실 및 다른 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환 우라실 및 시토신, 그리고 7-메틸구아닌과 같은 합성의 핵염기 및 자연산 핵염기 뿐만 아니라, 아데닌, 구아닌, 시토신, 우리딘 및 티민과 같은 피리미딘 및 퓨린을 포함한다. 미국특허 제3,687,808호에 더 많은 퓨린 및 피리미딘이 개시되어 있다(Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, pp 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, and Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613).
또한 본 발명에서는 바람직하지 못한 단백질 생성으로 특징되는 질환을 갖는 유기체의 치료방법을 제공한다. 이러한 방법은 뉴클레아제 내성을 증가시키도록 기능화된 하나 이상의 뉴클레오시드 단위의 염기서열을 가지며, 핵산의 상보 스트랜드에 특이적으로 혼성화할 수 있는 뉴클레오시드 단위의 염기서열을 가지며, 핵산의 상보 스트랜드에 올리고뉴클레오티드의 결합친화도를 증가시키도록 그 위에 위치하는 치환기를 가지며, 그리고 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 당 부를 갖는 다수의 뉴클레오시드 단위로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 유기체와 접촉시키는 것을 포함한다.
또한 본 발명에 따르면, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 증가시키도록 기능화된 하나 이상의 뉴클레오시드 단위를 갖는 핵산의 상보 스트랜드와 특이적으로 혼성화할 수 있는 뉴클레오시드 단위의 염기서열을 갖는 제약학적으로 유효량의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공하며, 이때 다수의 뉴클레오시드 단위는 핵산의 상보 스트랜드에 올리고뉴클레오티드의 결합친화도를 증가시키도록 그 위에 위치한 치환기를 가지며, 그리고 다수의 뉴클레오시드 단위는 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 당 부를 갖는다. 상기 조성물은 제약학적으로 수용가능한 희석제 또는 담체를 더 포함한다.
또한 본 발명에서는 핵산의 상보 스트랜드에 특이적으로 혼성화할 수 있는 뉴클레오시드 단위의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드와 RNase H 효소 및 상기 핵산을 함유하는 실험 용액을 접촉시키는 것을 포함하는 특이적 핵산 염기서열의 시험관내(in vitro)변형(modification)에 대한 방법을 제공하며, 이때 뉴클레오시드 단위중의 적어도 하나는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 증가시키도록 기능화되고, 다수의 뉴클레오시드 단위는 핵산의 상보 스트랜드에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합친화도를 증가시키도록 그 위에 위치한 치환기를 가지며, 그리고 다수의 뉴클레오시드 단위는 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 당 부를 갖는다.
또한 핵산의 상보 스트랜드에 특이적으로 혼성화할 수 있는 뉴클레오시드 단위의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드와 유기체가 접촉하는 것을 포함하는 유기체에서 혼성화 및 RNase H 효소 활성화를 동시에 증가시키는 방법을 제공하며, 이때 뉴클레오시드 단위중의 적어도 하나는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 증가시키도록 기능화되고, 다수의 뉴클레오시드 단위는 핵산의 상보 스트랜드에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합친화도를 증가시키도록 그 위에 위치한 치환기를 가지며, 그리고 다수의 뉴클레오시드 단위는 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 당 부를 갖는다.
본 발명은 또한 유기체 또는 세포에 있어서 비정상 RNA 분자의 존재여부를 또는 정상 RNA 분자의 비정상적 발현 또는 부적절한 발현을 검출하는 진단방법을 제공한다.
본 발명은 상대 스트랜드에서 스트랜드 분열을 위한 RNase H 활성을 유도하기 위한 올리고뉴클레오티드의 합성 및 용도에 관한 것이다. 본 발명에 포함된 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드중의 적어도 일부의 뉴클레오시드 단위가 뉴클레아제 내성을 갖도록 기능화되고(functionalized), 올리고뉴클레오티드중의 적어도 일부의 뉴클레오시드 단위는 핵산의 상보 스트랜드에 올리고뉴클레오티드가 혼성화할 잠재력을 가진 치환체를 함유하며, 그리고 올리고뉴클레오티드중의 적어도 일부의 올리고뉴클레오시드 단위는 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 당 부(moiety)를 포함한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 치료, 진단 및 연구시약으로서 유용하다.
도 1은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 참조용(reference) 화합물의 투여량 반응 활성을 나타낸 직선그래프이다.
도 2는 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 참조용(reference) 화합물의 투여량 반응 활성을 나타낸 막대그래프이다.
도 3는 PKC-α mRNA 레벨에 2'-O-메틸 키메라 올리고뉴클레오티드가 미치는 영향을 나타내는 막대그래프이다. 빗금친 막대는 8.5 kb 전사를 나타내며, 빈 막대는 4.0 kb 전사를 나타낸다.
도 4는 PKC-α mRNA 레벨에 2'-O-메틸 및 2'-O-프로필 키메라 올리고뉴클레오티드가 미치는 영향을 나타내는 막대그래프이다. 빗금친 막대는 8.5 kb 전사를 나타내며, 빈 막대는 4.0 kb 전사를 나타낸다.
도 5는 PKC-α mRNA 레벨에 다른 2'-O-메틸 및 2'-O-프로필 키메라 올리고뉴클레오티드가 미치는 영향을 나타내는 막대그래프이다. 빗금친 막대는 8.5 kb 전사를 나타내며, 빈 막대는 4.0 kb 전사를 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 A549 세포에서 PKC-α mRNA 레벨에 대한 SEQ ID NO:30을 갖는 2' 메톡시에톡시 변형된 올리고뉴클레오티드의 효과를 나타내는 직선그래프이다. 도 6a는 데옥시포스포로티오에이트 화합물 ISIS 3521과 비교한 ISIS 9605의 효과를 나타낸다. 도 6b는 데옥시포스포로티오에이트 화합물 ISIS 3521과 비교한 ISIS 9606의 효과를 나타낸다.
도 7a 및 도 7b는 누드 마우스에서 사람의 결장암 (Colo 205) 종양 크세노그라프트의 성장에 있어서 SEQ ID NO:30을 갖는 올리고뉴클레오티드가 미치는 영향을 나타내는 직선그래프이다. 도 7a는 데옥시포스포로티오에이트 화합물 ISIS 3521의 효과를 나타낸다. 도 7b는 2' 메톡시에톡시 변형된 화합물 ISIS 12723의 효과를 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 누드 마우스에서 폐암 크세노그라프트 A549의 성장에 있어서, ISIS 5132(도 6a) 및 동일 염기서열의 2'-메톡시에톡시(2'-O-CH2-CH2-O- CH3) 버전인 CGP 69845의 효과를 나타낸다.
도 9는 대조화합물 및 본 발명의 두 가지 화합물의 생쥐 플라즈마9의 농도를 나타내는 직선그래프이다. 플라즈마 농도 대 시간을 플로팅했다.
도 10는 생쥐의 여러 조직에서의 대조화합물 분포를 나타내는 3차원 막대그래프이다. 제1차 축은 특이성 조직을, 제2차 축은 시간을, 제3차 축은 투여량의 퍼센트를 나타낸다. 화합물은 정맥주사로 공급한다.
도 11는 생쥐의 여러 조직에서의 본 발명에 따른 화합물의 분포를 나타내는 3차원 막대그래프이다. 제1차 축은 특이성 조직을, 제2차 축은 시간을, 제3차 축은 투여량의 퍼센트를 나타낸다. 화합물은 정맥주사로 공급한다.
도 12는 생쥐의 여러 조직에서의 본 발명의 다른 예에 따른 화합물의 분포를 나타내는 3차원 막대그래프이다. 제1차 축은 특이성 조직을, 제2차 축은 시간을, 제3차 축은 투여량의 퍼센트를 나타낸다. 화합물은 정맥주사로 공급한다.
본 발명의 목적에 따라, 증가된 뉴클레아제 내성, 핵산의 상보 스트랜드에 대해 증가된 결합친화도를 가지며, RNase H에 대해 기질인 신규의 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 다수의 뉴클레오시드 단위로부터 조합된다. 본 발명의 각각의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 증가시키도록 작용하는 뉴클레오시드 단위중의 최소한 하나를 포함한다. 또한 본 발명의 특정 구체예에서, 뉴클레오시드 단위중의 적어도 일부는 핵산의 상보 스트랜드에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합친화도를 증가시키는 치환기를 함유한다. 또한 뉴클레오시드 단위 중의 적어도 일부는 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 당 부를 포함한다.
상기 표제와 관련하여, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 각 뉴클레오시드 단위는, 선택적으로 "뉴클레오시드" 또는 "부단위"로서 언급되는데, "천연의" 또는 "합성된" 부(moiety)가 될 수 있다. 따라서 본 발명의 내용에서 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 다수의 결합된 뉴클레오시드 단위로부터 형성된 올리고머를 나타낸다. 뉴클레오시드 단위는 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 결합과 같은 포스포러스 결합을 통해 함께 결합되어 있다. 뉴클레오시드 단위는 천연적으로 또는 비-천연적으로 발생하는 핵염기 및 펜토푸라노실 당 부로부터 형성된다. 따라서 "올리고뉴클레오티드"의 용어는 효과적으로 천연 발생 종(species) 또는 천연 발생 뉴클레오시드 단위로부터 형성된 합성 종을 포함한다.
또한 본 발명에서의 올리고뉴클레오티드는 변형된 부단위를 포함할 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오시드의 핵염기 부위에서, 뉴클레오시드의 당 부위에서 또는 하나의 뉴클레오시드를 그 다음의 것과 연결시키는 결합에서 일어날 수 있다.
본 발명에서 올리고뉴클레오티드의 결합친화도는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드 단위에 치환기를 결합시킴으로써 증가될 수 있는 것으로 나타난다. 바람직한 치환기는 2' 치환기, 예를들어 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드 단위의 펜토푸라노실 당 부의 2'부위에 위치한 치환기이다. 더 바람직한 치환기는 플루오로, 알콕시, 아미노알콕시, 알릴옥시, 이미다조릴알콕시 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 일반적으로 알콕시 및 아미노알콕시기는 낮은 알킬기, 특히 C1-C9알킬을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜은 (-O-CH2-CH2)n-O-알킬 구조이다. 특히 바람직한 치환기는 (-O-CH2-CH2)n-O-알킬 형태인 폴리에틸렌 글리콜 치환체이며, 여기서 n은 1, 알킬은 CH3이다.
또한 결합친화도는 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오시드 단위에서 특정 변형된 핵염기를 이용함으로써 증가될 수 있다. 이러한 변형 핵염기는 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하여 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 포함할 수 있다. 다른 변형 피리미딘 및 퓨린 염기는 핵산의 상보 스트랜드에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합친화도를 증가시키는 것으로 기대된다.
2'-치환기의 이용은 치환된 올리고뉴클레오티드의 결합친화도를 향상시킨다. 발표된 논문(Synthesis and Biophysical Studies of 2'-dRIBO-F-Modified Oligo nucleotides, Conference on Nucleic Acid Therapeutics, Clearwater, Fl, Jan. 13, 1991)에 의하면, 올리고뉴클레오티드의 5개의 뉴클레오시드 단위에서 2'-플루오로 치환기를 갖는 15-합체 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드의 치환된 뉴클레오시드 단위 각각당 1.6℃의 결합친화도가 증가하는 것으로 보고되었다. 올리고뉴클레오티드의 11개의 뉴클레오시드 단위가 2'-플루오로 치환기를 가졌을 때, 결합친화도는 치환된 뉴클레오시드 단위 각각당 1.8℃가 증가하였다.
상기 논문에서, 15-합체 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드는 상기 대응되는 포스포로티오에이트 유사체로 유도되었다. 15-합체 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드를 포스포로티오에이트 유사체와 비교하면, 포스포로티오에이트 유사체는 15-합체 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드의 결합친화도의 단지 66%의 결합친화도를 가졌다. 다시 말해서, 올리고뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 유사체를 유도하면서 결합친화도가 떨어졌다. 하지만, 2'-플루오로 치환체가 15-합체 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드 11에 위치했을 때에는, 2'-치환기의 결합친화도는 15-합체 올리고뉴클레오티드를 포스포포티오에이트 유사체로 유도하면서 나타난 감소를 더 많이 극복하였다. 2'-플루오로 치환기로 치환된 11-뉴클레오시드 단위를 갖는 15-합체 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 화합물에서, 결합친화도는 치환기마다 2.5℃까지 증가하였다. 이 연구에서는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 RNA 표적의 RNase H 효소 분열을 유도하는 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 당 부를 갖는 뉴클레오시드 단위의 적당한 연속 염기서열을 포함하는 시도는 이루어지지 않았다.
표적 RNA의 RNase H 효소 분열을 유도하기 위하여, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 분절 또는 DNA-형태의 분절인 하부염기서열을 포함해야 한다. 즉 본 발명의 올리고뉴클레오티드 중의 적어도 일부 뉴클레오시드 부단위(subunit)는 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 당 부를 가져야 한다. 세 번 이상의 연속적으로 연결된 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실-함유 뉴클레오시드 부단위를 가지는 하부염기서열이 표적 RNA와 본 발명의 올리고뉴클레오티드와의 혼성화에 있어서 RNase H 활성을 유도하기 위하여 필요하다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드에서 3 또는 그 이상의 연속적인 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실-함유 뉴클레오시드 부단위의 하부염기서열을 갖는 것이 바람직하다. 5 이상의 연속적인 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실-함유 뉴클레오시드 부단위를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
RNase H 활동의 메카니즘은 DNA-RNA 이중(duplex)을 인식하여 이중의 RNA 스트랜드 분열을 수행하는 것이다. 발명의 배경에서 설명된 바와 같이, 당 분야의 다른 연구에서는 DNA 스트랜드에 뉴클레아제 안정성을 부여할 수 있도록 변형된 DNA 스트랜드를 사용하였다. 이를 위해 변형된 포스포러스 결합을 사용하였지만, 이는 뉴클레아제 안정성은 증가시키는 반면, 혼성화 성질을 손상시킨다.
본 발명은 RNase H가 RNA 스트랜드의 분열을 인식하고 유도하는 특정 기준을 제시한다. 이러한 기준중의 첫번째는 분열 위치의 RNA 스트랜드는 음전하를 갖는 포스포러스 결합을 통하여 연결된 뉴클레오시드 단위를 가져야 한다는 것이다. 즉, 분열 위치에서 뉴클레오시드의 당 부는 β-펜토푸라노실 당 부이어야 하고 또한 2'엔도 형태이어야 한다. 이러한 기준에 맞는 유일한 뉴클레오시드는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트 결합에 의한 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 β-뉴클레오시드이다.
이러한 구조단위를 제조할 때 사용하기 위한, 적당한 핵염기로는 크산틴, 히포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌과 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌과 구아닌의 다른 알킬 유도체, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 아미노, 티올, 티오알킬, 히드록실 및 다른 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환 우라실 및 시토신, 그리고 7-메틸구아닌과 같은 합성 핵염기 및 자연산 핵염기 뿐만 아니라, 아데닌, 구아닌, 시토신, 우리딘 및 티민과 같은 피리미딘 및 퓨린을 포함한다. 미국특허 제3,687,808호에 더 많은 퓨린 및 피리미딘이 개시되어 있다(Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, pp 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, and Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613).
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 뉴클레오시드의 2' 위치에서 메톡시에톡시 (-OCH2CH2OCH3) 변형을 갖는다. 상기 변형은 올리고뉴클레오티드의 표적에 대한 친화도 및 뉴클레아제 내성 모두에 있어서 증가를 나타내었다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 50 뉴클레오시드 단위로 이루어지는 것이 바람직하다. 본 발명의 내용에서 앞서 기술한 듯이 상기 비-천연적으로 발생하는 올리고머는 5 내지 50 뉴클레오시드 단위를 갖는 것으로 이해된다. 좀 더 바람직하기로는 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 약 15 내지 25 뉴클레오시드 단위를 갖는 것이다. "뉴클레오시드 단위"란 포스포러스 결합을 통해 근접 부단위에 적당히 연결되는 핵염기 및 당 조합이다. "부단위" 용어는 "뉴클레오시드 단위" 와 호환적으로 사용된다. RNase H 반응을 유도하기 위하여, 올리고뉴클레오티드의 전체 서열 길이내에서 3 이상, 바람직하게는 5 이상의 연속적인 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 함유 뉴클레오시드 단위의 하부염기서열이 존재한다.
올리고뉴클레오티드에서 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 함유 뉴클레오시드 하부염기서열을 결합시키는 것이 바람직하며, 올리고뉴클레오티드 내에서 다른 2'-치환된 펜토푸라노실 함유 뉴클레오시드 하부염기서열이 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 함유 뉴클레오시드 하부염기서열의 어느 한 쪽에 위치한다. 이러한 구조에서, 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 함유 뉴클레오시드 하부염기서열은 또한 "중심영역(central region)" 이며, 2'-치환된 펜토푸라노실 함유 뉴클레오시드 하부염기서열은 "측면영역(flanking region)"으로서 언급된다.
본 발명의 구체적인 예에서, 뉴클레오시드 단위 각각의 잉여분이 증가된 결합친화도에 대하여 2'-치환기를 포함한다면, 이때 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 함유 뉴클레오시드 하부염기서열은 2'-치환기를 갖는 뉴클레오시드 단위의 제 1 의 하부염기서열과 2'-치환기를 갖는 뉴클레오시드 단위의 제 2 의 하부염기서열 사이에 위치한다. 또한 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단의 어느 한 쪽에서 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 함유 뉴클레오시드 하부염기서열이 위치하는 것을 포함하는 다른 구조가 가능하다.
본 발명에서 사용되는 올리고뉴클레오티드는 고체상 합성의 통상의 기술에 의해 편리하고 일상적으로 제조된다.[Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504.]. 이러한 합성에 필요한 장치는 Applied Biosystem을 비롯한 몇몇 벤더업체에서 구입한다. 합성을 위해 다른 방법이 이용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 실제적 합성은 선행기술을 이용할 수 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬레이트 유도체 같은 다른 올리고뉴클레오티드를 제조하는 유사한 방법도 사용될 수 있다. 또한 형광성으로 표지되고, 비오틴화되거나(biotinylate) 또는 다르게 결합된 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해서는 비오틴, 플루오레신, 아크리딘 또는 소라린-변형 아미디트 및/또는 CPG(글렌 리서치, 스터링 VA에서 입수가능) 같은 상업적으로 유용한 변형 아미디트 및 조절-공 유리(controlled-pore glass, CPG) 생성물 및 유사한 기술을 이용하는 것도 널리 알려져 있다.
본 발명의 화합물은 진단, 치료제로 이용되며 연구시약 및 보급품으로서도 이용된다. 이들은 적당하게 제약학적으로 수용가능한 희석제 또는 담체에 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 유효량을 부가하는 것을 포함하는 제약학적인 조성물에 이용될 수 있다. 바람직하지 않은 단백질 생성물에 의해 특징되는 질환을 갖는 유기체를 치료하는 데에도 또한 이용될 수 있다. 상기 유기체는 바람직하지 않은 단백질을 코드화하는 표적 핵산의 스트랜드와 특이적으로 혼성화할 수 있는 염기서열을 갖는 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 접촉시킬 수 있다.
치료 조성물의 형태화(formulation) 및 이의 투여는 종래의 기술내에서 이루어진다. 일반적으로, 치료제로서 이러한 치료를 필요로 하는 환자는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드를 복용하는데, 일상적으로는 제약학적으로 수용가능한 담체로, 환자의 나이 및 치료받아야할 질환 상태의 정도(severity)에 따라 몸무게 1㎏당 0.01㎍ 내지 100g 범위로 투여하게 된다. 또한 섭생 치료는 특정 질환의 성질에 따라, 정도 및 환자의 총체적 상태에 따라 다양화되는 시기동안 지속되며, 그리고 하루에 한 번씩에서부터 매 20년에 한 번씩으로 늘릴 수도 있다. 환자는 치료를 받으면서 그의 상태의 변화 및 질환 증상의 경감에 대해 관찰되어진다. 올리고뉴클레오티드의 복용은 환자가 현재의 투여량에 대해 심각한 반응이 있지 않는 경우에 증가시킨다거나, 또는 질환 증상의 경감이 관찰되거나 또는 질환이 제거되는 경우에는 복용량을 감소시킬 수도 있다.
어떤 경우에는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 다른 종래의 치료제를 함께 환자에게 치료하는 것이 더 효과적일 수도 있다. 예를들어 AIDS 치료를 받고 있는 한 환자에게 올리고뉴클레오티드를 AZT와 함께 투여한다거나, 또는 동맥경화증 환자에게 치료중인 동맥의 재흡장을 방지하기 위해 혈관성형술(angioplasty)에 따라 본 발명의 올리고뉴클레오티드로 치료할 수도 있다.
성공적인 치료를 위해서, 환자는 질병 상태의 재발을 방지하기 위해 꾸준히 지속적인 치료를 받는 것이 바람직한데, 이때 올리고뉴클레오티드는 몸무게 1㎏당 0.01㎍에서 100g의 양으로 하루에 한 번 또는 그 이상씩에서부터 매 20년에 한 번씩으로 꾸준히 복용해야 한다.
본 발명의 제약학적 조성물은 국소 또는 전신 치료의 필요성 여부 및 치료받을 부위에 따라 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 국소적(안과의, 질의, 직장의, 경비의, 피부의), 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여는 정맥 점적의, 피하의, 내복막의 또는 근육내 투여, 또는 포막내의 또는 심실내의 투여를 포함한다.
국소적 투여 형태에는 피부 패치(patch), 연고, 로션, 크림, 젤, 드롭, 좌약, 스프레이, 용액 및 분말이 포함된다. 종래의 제약학적 담체, 수양액의, 분말 또는 오일 베이스, 시크너(thickeners) 등이 필요하거나 바람직하다. 코팅된 콘돔, 장갑 등도 또한 유용하다.
경구 투여용 조성물은 분말 또는 입자, 현탁액 또는 수용성 또는 비-수용성배양액, 캡슐, 향낭 또는 정제를 포함한다. 시크너, 조미료, 희석제, 유화제, 소산제(dispersing aids) 또는 접합제가 바람직하다.
포막내 또는 심실내 투여용 조성물은 완충제, 희석제 및 다른 적당한 첨가제를 또한 포함하는 무균의 수용성 용액을 포함할 수 있다.
비경구 투여용 조성물은 완충제, 희석제 및 다른 적당한 첨가제를 함유할 수도 있는 무균의 수용성 용액을 포함할 수 있다.
투여량은 며칠에서부터 몇 달까지, 또는 치료가 효과를 보일 때까지 또는 질환 증상이 축소될 때까지 치료가 지속되는 동안에 치료중인 질환 증상의 엄격성 및 반응도에 따라 결정된다. 최적의 투여 계획은 환자의 신체내에서 약이 축적되는 것을 관찰하면서 수행될 수 있다. 통상의 지식을 가진 자라면 최적의 투여량, 투여 분류법 및 반복도를 쉽게 결정할 수 있다. 최적 투여량은 개개 올리고뉴클레오티드의 상대적 효능에 따라 다양하며, 일반적으로 시험관내 및 생체내 동물 모델에서 효과적으로 발견되는 EC50에 기초를 두는 것으로 추정될 수 있다. 일반적으로, 투여량은 몸무게 1㎏당 0.01㎍에서 100g이며, 하루에, 일주일에, 한 달에 또는 2년마다에서 20년에 한 번씩 또는 그 이상씩 복용될 수 있다.
이러한 치료는 단세포성 원핵 및 진핵 유기체에서 다세포성 진핵 유기체까지의 다양한 유기체에 이용된다. 치료 및/또는 질병예방 치료에 민감한 유전적, 대사적 또는 세포적인 조절의 기본적인 부분으로서 유기체는 DNA-RNA 전사 또는 RNA-단백질 해독을 이용한다. 유사하게 박테리아, 효모, 원생동물, 조류, 모든 식물 및 온혈 동물을 포함하는 모든 고등 동물 형태와 같은 다양한 유기체는 이러한 치료법이 이용된다. 또한 다세포성 진핵세포의 각 세포는 이들 세포활동의 통합 부분으로서 DNA-RNA 전사 및 RNA-단백질 해독을 포함하기 때문에, 이러한 치료법 및/또는 진단법은 이러한 세포성 집단에 이용된다. 또한 진핵세포의 많은 세포기관-예를 들면 미토콘드리아 및 클로로플라스트-은 또한 전사 및 해독 메카니즘을 포함한다. 이와 같이, 단세포, 세포성 집단 또는 세포기관은 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 치료법 또는 진단법으로 치료될 수 있는 유기체의 정의내에 포함된다. 여기에 사용되었듯이, 치료법은 질병상태의 박멸, 박테리아, 원생동물 또는 다른 감염물질의 제거, 또는 바람직하지 못한 또는 해로운 세포의 성장 또는 발현을 조절한다.
본 발명의 내용에서, "혼성화"란 수소결합을 의미하는데, 이는 상보적 핵염기 사이에서의 Watson-Crick, Hoogsteen 또는 역 Hoogsteen 수소결합이다. 예를들어 아데닌 및 티민은 수소결합의 형성을 통해 쌍을 이루는 상보적 핵염기이다. 여기에서 사용되는 "상보적" 및 "특이적으로 혼성화할 수 있는"은 뉴클레오시드 단위를 함유하는 두 개의 핵산, 하나는 올리고뉴클레오티드의 특정 위치에 있는 핵산이고 다른 하나는 표적 DNA 또는 RNA 분자인 핵산의 사이에서 상보적 염기서열을 나타내는 것이다. 예를들어, 올리고뉴클레오티드의 특정 위치에 있는 핵염기가 DNA 또는 RNA 분자의 동일한 위치에 있는 핵염기와 수소결합이 가능하다면, 올리고뉴클레오티드 및 DNA 또는 RNA 분자는 그 위치에서 각각에 대해 서로 상보적인 것으로 여겨진다. 올리고뉴클레오티드 및 상기 DNA 또는 RNA 분자의 충분한 수의 위치에서 각각에 대해 수소결합할 수 있는 핵염기에 의해 점유되어 있다면, 상기들은 서로 상보적이다. 그러므로 "특이적 혼성화" 및 "상보성"이라는 용어는 충분한 정도의 상보성을 나타내는 척도로 사용되므로, 올리고뉴클레오티드 및 표적 DNA 또는 RNA 분자 사이에서 안정적이고 특이한 결합이 이루어진다. 올리고뉴클레오티드가 특이하게 혼성화되기 위해서 표적 DNA 염기서열에 반드시 100% 상보적일 필요는 없는 것으로 보인다. 올리고뉴클레오티드와 표적 DNA 또는 RNA 분자와의 결합이 유용성을 감소시키는 표적 DNA 또는 RNA의 정상적 기능을 방해하고, 그리고 특이적 결합이 요구되는 조건, 예를들어 생체내 분석 또는 치료의 경우에, 또는 시험관내 분석이 이루어지는 경우 즉, 분석이 수행되는 조건하에서 올리고뉴클레오티드와 비-표적 염기서열과의 비-특이적 결합을 억제하는 상보화의 정도가 충분할 때 올리고뉴클레오티드는 특이하게 혼성화되는 것이다.
예시를 목적으로, 본 발명의 화합물은 ras-루시페라제 트랜스액티베이션(transactivation)을 이용하여 ras-루시페라제 용융 시스템에서 사용되었다. 국제특허 공개 제WO 92/22651호(1992.12.23 공개)에 따르면 -참고로 전문을 여기에 게재한다- ras 암관련 유전자는 플라즈마 막의 내면에 편재된 관련 단백질을 코드화하는 유전자 종의 요소이다. ras 단백질은 아미노산 레벨이 매우 보전적이며, 높은 친화성 및 특이성을 갖는 GTP와 결합하고, 그리고 GTPase 활성을 보유하는 것으로 나타났다. ras 유전자 생성물의 세포성 기능은 알려지지 않았지만, GTP 결합단백질, 또는 G 단백질로 알려진 시그날-형질도입 단백질 계열을 갖는 중요한 동종 염기서열에 의해, 이들의 생화학적 성질은 ras 유전자 산물이 플라즈마 막을 따라 세포외성 시그날의 형질도입과 관련된 기본적 세포조절 기능의 기초적인 역할을 한다고 제시한다.
지정된 H-ras, K-ras 및 N-ras의 세 가지 ras 유전자는 포유동물류 게놈(genome)내에서 동일시 되어왔다. 포유류 ras 유전자는 이들의 코드화 염기서열내에서 단일 점 돌연변이에 의하여 형질전환-유도성질을 얻는다. 천연 발생 ras 암관련 유전자내 돌연변이는 코돈 12, 13 및 61에 위치한다. 인간 종양에서 발견되는 주로 가장 잘 감지되는 활성 ras 돌연변이는 ras 단백질 생성물의 GTPase 조절영역에서 GGC로부터 GTC로의 염기 변화가 글리신-에서-발린으로의 치환을 일으키는 H-ras 유전자의 코돈-12에 있다. 상기 단일 아미노산 변화는 ras 단백질 기능의 정상조절을 방해하는 것으로 보이며, 이것에 의하여 정상적으로 조절되는 세포단백질이 지속적으로 활성이 있게 된다. 이러한 정상 ras 단백질 기능의 규제 해제로 정상적 성장에서 해로운 성장으로 형질변형된다고 여겨진다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 비정상적 세포증식 및 암 생성에 관련되는 활성화 형태로 이따금 전환시키는 천연적으로 존재하는 세포 유전자인, raf 유전자의 발현을 조절하는데 사용되어져 왔다.
또한 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 단백질 키나아제 C (PKC)와 관련된 핵산과 특이하게 혼성화될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 PKC의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다.
하기 실시예 및 절차는 본 발명을 서술하는 것이며, 하기 서술은 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예 1 : 올리고뉴클레오티드의 합성
미치환된 및 치환된 올리고뉴클레오티드는 요오드 산화로 표준 포스포르아미디트 케미스트리를 사용하여 DNA 자동합성기(Applied Biosystems model 380B)로 합성되었다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 있어서, 표준 산화용기를 포스파이트 결합의 단계적 티에이션(thiation)에 대해 아세토니트릴 내에 0.2M 3H-1,2-벤조디티올-3-원 1,1-디옥사이드 용액으로 교체시켰다. 티에이션(thiation) 정지 단계는 68초까지 증가되었고, 보호단계(Capping step)가 뒤따라 이루어졌다. 55℃(18시간)에서 농축 수산화암모늄내에 탈블럭화 및 CPG 칼럼으로부터 분열된 후에, 올리고뉴클레오티드는 0.5M NaCl 용액에서 2.5 부피 에탄올로 두번 침전시켜 정제시켰다. 분석적 겔 전기영동은 20% 아크릴아미드, 8M 요소, 454mM 트리-보레이트 완충액, pH=7.0 내에서 수행되었다. 올리고뉴클레오티드 및 포스포로티오에이트는 완전-길이 물질의 80% 이상이 되도록 하여, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 기초로 판단되었다.
실시예 2 : 중심 2'-데옥시 포스포로티오에이트 영역 측면에 2'-치환 영역을 갖는 올리고뉴클레오티드
염기서열 5'GCGTTTTTTTTTTGCG 3'(SEQ ID NO:28)의 15합체 RNA 표적은 RNA 프로토콜을 사용하여 DNA 시퀀서(sequencer)에서 일반적인 방법으로 제조하였다. 2'-데옥시 영역을 측면으로 하는 2'-치환 뉴클레오시드 단위를 갖는 일련의 상보 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 국제특허공개 제WO 92/ 03568호(1992.3.5 공개)의 각각의 제법에 따라, 또는 공지의 제법에 따라 제조된 2'-치환 뉴클레오시드 전구체, 예를들어 2'-O-메틸을 사용하여 제조되었다. 2'-치환 뉴클레오시드는 DNA 합성기에서 일반적인 방법으로 5'-O-디메톡시트리틸-3'-포스포아미디트에 첨가된다. 상보적 올리고뉴클레오티드는 5'CGC AAA AAA AAA AAA ACG C 3'(SEQ ID NO:29)의 염기서열을 갖는다. 2'-치환체는 이들 올리고뉴클레오티드의 CGC 및 CG 영역내에 위치한다. 2'-O-치환체로는 하기와 같은 것들이 사용되었다: 2'-플루오로; 2'-O-메틸; 2'-O-프로필; 2'-O-알릴; 2'-O-아미노프로폭시; 2'-O-(메톡시에톡시에틸), 2'-O-이미다졸부톡시 및 2'-O-이미다졸프로폭시.
실시예 3 : ras-루시페라제 리포터 유전자 조합
본 발명에 개시된 ras-루시페라제 리포터 유전자는 PCR 기술을 이용하여 조합시켰다. 올리고뉴클레오티드 프라이머(primer)는 돌연변이체(코돈-12) 및 비-돌연변이체(야생-형태) 인간 H-ras 유전자 둘다의 엑손(exon) 1의 5'-영역의 PCR 클로닝을 위한 프라이머로서 사용하기 위해 합성되었다. H-ras 유전자 주형은 Bethesda, MD에서 American Type Culture Collection (ATCC NO 41000 및 41001)에서 구입하였다. 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머 ## 5'-ACA-TTA-TGC- TAG-CTT-TTT-GAG-TAA-ACT-TGT-GGG-GCA-GGA-GAC-CCT-GT-3'(센스) (SEQ ID NO:15) 및 5'-GAG-ATC-TGA-AGC-TTC-TGG-ATG-GTC-AGC- GC-3'(안티센스) (SEQ ID NO:16)가 돌연변이체 및 비-돌연변이체 H-ras 유전자를 주형으로 이용한 표준 PCR 반응에 사용되었다. 이러한 프라이머는 NheI 및 HindⅢ 제한 엔도뉴클레아제 위치 에 의해 측면을 이루는 정상 및 돌연변이 H-ras의 염기서열 -53 에서부터 +65(해독 초기 위치에 상당하는)에 대응하는 145 염기쌍의 DNA 생성물을 제조하는 것으로 예측된다. PCR 생성물은 겔 정제, 침전, 세척 및 표준절차를 사용하여 물에서 재현탁시켰다.
P. Pyralis (반딧벌레) 루시페라제 유전자를 클론닝하는 PCR 프라이머는 PCR 생성물이 아미노-말단 메티오닌 잔기를 제외한 완전-길이 루시페라제 단백질을 코드화하는 것으로 조제되었는데, 아미노-말단 메티오닌 잔기는 루이신 잔기로 이어지는 아미노-말단 리신 잔기인 두 개의 아미노산으로 치환된다. 루시페라제 유전자의 클로닝에 사용된 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머는 5'-GAG-ATC-TGA-AGC-TTG-AAG-ACG-CCA-AAA-ACA-TAA-AG-3'(센스)(SEQ ID NO:17) 및 5'-ACG-CAT-CTG-GCG-CGC-CGA-TAC-CGT-CGA- CCT-CGA-3'(안티센스) (SEQ ID NO:18)이며, 이것은 주형으로서 루시페라제 리포터 유전자를 포함하는 상업적으로 유용한 플라스미드(pT3/T7-Luc)(Clontech)를 사용한 표준 PCR 반응에 이용되었다. 이들 프라이머는 HindⅢ 및 BssHⅡ 제한 엔도뉴클레아제 자리가 측면에 위치한 루시페라제 유전자에 대응하는 약 1.9kb의 생성물을 얻는다고 기대되었다. 이 분절을 겔 정화, 침전, 세척 및 표준절차를 이용하여 물에서 재현탁시켰다.
ras-루시페라제 용융 리포터 유전자의 조합을 완성하기 위하여, ras 및 루시페라제 PCR 생성물은 적당한 제한 엔도뉴클레아제로 침지되고 제한 엔도뉴클레아제 NheI, HindⅢ 및 BssHⅡ를 사용하여 스테로이드-유도성 생쥐 유방 종양 바이러스 프로모터 MMTV를 함유하는 발현벡터로 세 부분 리게이션(ligation)에 의하여 클로닝 시켰다. 생성물 클론은 반딧벌레 루시페라제 유전자를 갖는 프레임(frame)내에 용융된 H-ras 5'염기서열(-53 내지 +65)에 삽입된다. 생성 발현벡터는 스테로이드-유도성 MMTV 프로모터의 제어하에 발현된 ras-루시페라제 용융 생성물을 코드화한다.
실시예 4 : 플라스미드 DNA로 세포를 트랜스펙션(transfection)함
트랜스펙션을 다음 변형과 같이 Greenberg(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, John Wiley and Sons, NY)에 의해 기재된 대로 수행하였다: HeLa 세포를 5 x 105cells/dish에서 60mm 접시 위에 놓았다. 총 10㎍의 DNA를 각 접시에 부가시키는데, 9㎍은 ras-루시페라제 리포터 플라스미드이며 1㎍은 구성성분인 Rous sarcoma Virus(RSV) 프로모터의 제어하에 생쥐 글루코코르티코이드 리셉터를 발현하는 벡터였다. 칼슘 인산염-DNA 공침전물을 3mM EGTA를 함유하는 트리스-소금 완충액 (50mM 트리스-Cl(PH 7.5), 150mM NaCl)으로 세척하여 16∼20시간 후에 제거하였다. 그리고 나서 10% 소의 태아 혈청이 보강된 신선한 배지를 세포에 첨가시켰다. 이때 덱사메타손(dexamethasone)에 의한 리포터 유전자 발현이 활성화되기 전에 안티센스 올리고뉴클레오티드로 세포를 전처리하였다.
실시예 5 : 세포의 올리고뉴클레오티드 처리
플라스미드 트랜스펙션이 이루어지면 즉시, 세포를 OptiMEM(GIBCO)으로 세번 세척하고, 37℃까지 예열시켰다. 10㎍/mL N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTA)(Bethesda Research Labs, Gaithers burg, MD)를 함유하는 OptiMEM 2㎖를 각 접시에 부가하고, 올리고뉴클레오티드를 직접적으로 부가하면서 37℃에서 4시간동안 배양시켰다. 다시 OptiMEM을 제거하고 올리고뉴클레오티드를 함유하는 적당한 세포 배양 배지로 대체하였다. 이때, 리포터 유전자 발현은 덱사메타손으로 세포를 처리하여 최종농도가 0.2μM이 될때까지 활성화시켰다. 그리고 세포를 스테로이드 처리하여 12-16동안 배양시켰다.
실시예 6 : 루시페라제 분석
Greenberg에 의해 기술된 방법대로, 세정제 Triton X-100으로 분해하여 루시페라제를 세포로부터 추출하였다(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, NY). 루시페린(sigma)의 625μM까지의 부가에 대한 피크 발광을 측정하기 위하여 Dynatech ML1000 광도계를 사용하였다. 각 추출물에 대하여, 선형범위의 분석 데이타를 얻도록 다른 양의 추출물을 사용하여 루시페라제 분석을 수차례 수행하였다.
실시예 7 : ras-루시페라제 유전자 발현의 안티센스 올리고뉴크레오티드 저해
활성화된 H-ras의 코돈-12 포인트 돌연변이에 표적된 일련의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 이전의 실시예에 기재된 ras-루시페라제 리포터 유전자 시스템을 사용하여 실험하였다. 이 시리즈는 기본 염기서열 및 기본 염기서열의 유사체를 조성하였다. 상기와 동일한 국제공개특허 제WO 92/22651호에 보고된 대로 기본 염기서열의 활성이 공지되었다. 기본 염기서열 및 그 유사체에서, 각 뉴클레오시드 단위는 뉴클레아제 내성을 제공하도록 포스포로티오에이트 결합을 가졌다. 각 유사체는 2'-O-메틸 치환 및 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 당 부가 포함된 뉴클레오시드 단위와 결합하였다. 상기 유사체에서 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 당을 함유하는 부단위의 하부염기서열의 양쪽 끝 측면에는 2'-O-메틸 치환 부단위의 하부염기서열이 있었다. 이 유사체들은 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 당 함유 뉴클레오시드의 하부 염기서열 길이가 서로 달랐다. 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 뉴클레오시드 하부염기서열은 활성화된 ras의 코돈-12 포인트 돌연변이의 돌연변이 지점 중심에 있었다.
올리고뉴클레오티드의 염기서열, 염기서열 참고번호 및 염기서열 ID 번호를 표 1에 나타내었다(모두 포스포로티오에이트 유사체임). 이 표에서"M"으로 표시된 이들 뉴클레오시드는 2'-O-메틸 치환기를 함유하며“d”으로 표시된 뉴클레오시드는 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 뉴클레오시드이다.
표 1
키메라 2'-O-메틸 P=S 올리고뉴클레오티드
도 1은 세포를 표 1의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 투여량 반응 데이타를 나타낸다. 올리고뉴클레오티드 2570은 돌연변이(활성화된) H-ras RNA의 코돈-12 포인트 돌연변이에 표적된다. 다른 뉴클레오시드는 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 뉴클레오시드 내부사이의 다양한 길이의 부분과 결합친화도를 증가시키도록 그 위에 2'-O-메틸 치환기를 갖는다. 대조부 올리고뉴클레오티드는 랜덤 20-합체 포스포티오에이트 올리고뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드로 처리되지 않은 트랜스펙션 세포의 루시페라제 활성화 퍼센트로서 결과를 나타낸다. 그림에서 알 수 있듯이, 올리고뉴클레오티드 2570의 농도를 증가시켜 세포를 처리함으로써 ras-루시페라제의 돌연변이 형태를 발현하는 세포내 ras-루시페라제 활성의 투여량-방해의존성을 나타낸다. 올리고뉴클레오티드 2570은 정상 형태에 비하여 ras-루시페라제의 돌연변이 형태에 대하여 약 3배의 선택성을 나타낸다.
도 1에서 각 올리고뉴클레오티드 3980, 3985 및 3984는 올리고뉴클레오티드 2570보다 ras-루시페라제 활성 방해가 더 크다는 것을 나타내었다. 가장 큰 저해를 받는 올리고뉴클레오티드 3985는 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 뉴클레오시드의 7-합체 하부염기서열을 갖는다. 다음으로 큰 방해를 받는 올리고뉴클레오티드 3980은 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 뉴클레오시드 단위의 5-합체 하부염기서열을 가지며, 그 다음으로 큰 방해를 갖는 올리고뉴클레오티드 3984는 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 뉴클레오시드 단위의 9-합체 하부염기서열을 갖는다.
도 2는 막대그래프 형태임을 제외하고는 도 1과 유사한 결과를 나타낸다. 도 2에서는 올리고뉴클레오티드 3975 및 올리고뉴클레오티드 3979의 활성에 관하여 더 나타내었다. 이들 올리고뉴클레오티드는 각각 길이에 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 뉴클레오시드 단위 1 및 3의 하부염기서열을 갖는다. 도 2에 나타내었듯이, 올리고뉴클레오티드의 어느 것도 명백한 활성을 보이지 않았다. 가장 높은 투여량 농도에서 3-합체 데옥시 하부염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 3979에 대해 관측할만한 활성을 측정할 수 있었다.
올리고뉴클레오티드 2570에 비하여 올리고뉴클레오티드 3980, 3985 및 3984가 활성증가를 나타내는 것은, 상기 화합물 위에 위치한 2'-O-메틸 치환체에 의해서, 그리고 뉴클레오시드의 주요 염기서열내에 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 뉴클레오시드 하부염기서열의 결합으로 인해 이들 화합물에 부여된 RNase H 활성에 의해서 이들 화합물에 부여된 결합친화도가 증가하기 때문이다. 본 발명의 활성 화합물과는 반대로, 활성 올리고뉴클레오티드 2570, 3980, 3985 및 3984의 것과 동일한 염기서열을 갖지만 본 발명의 활성 올리고뉴클레오티드의 포스포티오에이트 결합 대신에 포스포디에스테르 결합을 갖는 염기서열은 활성을 보이지 않음은 흥미로운 점이다. 이는 포스포디에스테르 화합물이 이들을 분해하는 뉴클레아제에 대해 기질로 작용함으로써 RNase H의 활성을 잠재적으로 방해하기 때문이다.
다른 당 변형 : 키메라 올리고뉴클레오티드에 있어서 2'-O-메틸 치환체외에 다른 2'당 변형의 안티센스 활성에 대한 효과를 관찰하였다. 실시예 8에서 기술한 대로, 7-합체 데옥시 하부염기서열(또는 7-합체 데옥시 갭)을 측면에 갖는 2'-변형 뉴클레오시드를 갖는 17-합체 올리고뉴클레오티드가 25-합체 올리고리보뉴클레오티드와 상보적으로 혼성화되었을 경우에 획득되는 Tm값으로, 상기 변형을 표 2에 나타내었다. 올리고뉴클레오티드에 있어서 2'위치에서의 알킬 길이와 Tm사이의 관계를 나타내었다. 알킬 길이가 증가할수록, Tm값은 감소하였다. 2'-플루오로 키메라 올리고뉴클레오티드가 시리즈 중에서 가장 높은 Tm값을 나타내었다.
표 2
7-데옥시 갭 CCACACCGACGGCGCCC(SEQ ID NO:1)을
갖는 2'-변형 17-합체의 안티센스 활성과 Tm과의 연관성
2'변형 Tm(℃)IC50(nM)
데옥시 64.2 150
O-펜틸 68.5 150
O-프로필 70.4 70
O-메틸 74.7 20
플루오로 76.9 10
실시예 9에서 기술한 대로 상기 2'-변형 올리고뉴클레오티드를 활성 리포터 유전자 분석법을 사용하여 H-ras에 대한 안티센스 활성에 대해 실험하였다. 2'-플루오로 7-합체 갭이 형성된 화합물이 가장 활성화되었으며, 상기 모든 2'-변형 키메라 화합물은 ras 발현을 저해하였다. 5-합체 중심 데옥시 갭을 갖는 2'-플루오로 키메라 올리고뉴클레오티드도 또한 활성화되었다.
5-합체 또는 7-합체 데옥시 하부염기서열을 측면에 가지며 2'-O-프로필 하부염기서열을 갖는 SEQ ID NO:1을 가지는 키메라 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 2'-O-메틸 키메라 올리고뉴클레오티드와 비교하였다. T24 세포에서의 ras 발현은 7-합체 데옥시 갭 및 단일 포스포로티오에이트 골격을 갖는 2'-O-메틸 및 2'-O-프로필 키메라 올리고뉴클레오티드에 의해서 저해되었다. 데옥시 갭이 5개 뉴클레오시드로 감소될 경우에는, 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드만이 ras 발현을 저해하였다.
암세포에서 H-ras 유전자 발현의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해 : ras AUG 영역에 상보적인 두 개의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드(2502, 2503)를 실시예 10에서 기술한 대로 실험하였으며, 동일한 염기서열을 가지면서 측면이 2'-O-메틸이며 7-합체 데옥시 하부염기서열을 가지는 키메라 올리고뉴클레오티드(4998, 5122)를 가지고 실험하였다. 상기 키메라 올리고뉴클레오티드를 표 3에 나타내었다.
표 3
2'-O-메틸 말단(굵은글씨), 데옥시 갭 중심(AUG 표적)
영역을 갖는 키메라 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드
화합물 2503은 T24 세포에서 ras 발현을 71%로 저해하였으며, 상기 키메라 화합물(4998)은 ras mRNA를 더 많이 저해하였다(84%). 또한 AUG 영역에 상보적인 화합물 2502는 ras RNA 레벨을 26%로 감소시켰으며, 상기 올리고뉴클레오티드(5122)의 키메라 버전은 15% 저해를 나타내었다. 또한 이 분석법에서는 돌연변이 코돈-12에 표적되는 두 개의 올리로뉴클레오티드가 포함되었다. 화합물 2570(SEQ ID NO:1)은 ras RNA를 82%로 감소시켰으며, 7-합체 데옥시 하부염기서열(3985)을 가지는 상기 올리고뉴클레오티드의 2'-O-메틸 키메라 버전은 ras RNA를 95%로 감소시켰다.
또한 올리고뉴클레오티드 2570 및 2503가 야생-타입(활성되지 않은)의 H-ras 코돈-12를 가지는 HeLa 세포에 있어서 ras 발현에 끼치는 영향을 측정하기 위하여 실험하였다. 상기 두 개의 올리고뉴클레오티드가 모두 T24 세포에서 ras 발현을 저해하는 반면에, ras AUG와 특이하게 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드(2503)만이 HeLa 세포에서 ras 발현을 저해하였다. 활성화 코돈-12와 특이하게 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 2570(SEQ ID NO:1)은 HeLa 세포에서 ras 발현을 저해하지 않았으며, 이는 상기 세포들에 있어 활성화 코돈-12 표적이 부족하기 때문이다.
활성화 H-ras의 코돈-12 영역에 상보적인 17-합체 올리고뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드 2570를 T24 세포에서의 ras 발현 저해에 대해서 실험하였으며, 또한 2570과 동일한 염기서열을 가지면서 5, 7 및 9 뉴클레오시드 단위의 데옥시 하부염기서열을 갖는 키메라 포스포로티오에이트 2'-O-메틸 치환 올리고뉴클레오티드 3980, 3985 및 3984도 함께 각각 실험하였다(표 1). 균일한 2'-데옥시 올리고뉴클레오티드 2570 및 3가지 키메라 올리고뉴클레오티드는 T24 세포에서 ras mRNA 레벨을 감소시켰다. 화합물 3985(7-합체 데옥시 갭) 및 3984(9-합체 데옥시 갭)는 mRNA를 81%로 감소시켰으며; 화합물 3980(5-합체 데옥시 갭)은 mRNA를 61%로 감소시켰다. 상기 염기서열을 갖지만 5-합체 데옥시(4689) 또는 7-합체 데옥시(4690)를 측면에 가지는 2'-플루오로 치환 뉴클레오시드를 갖는 키메라 올리고뉴클레오티드는 T24 세포에서 ras mRNA 발현을 저해하였으며, 바람직하기로는 7-합체 데옥시 하부염기서열을 갖는 것이다(5-합체 데옥시 하부염기서열을 갖는 2'-플루오로 키메라에 대해서 82% 저해 대 63%의 저해를 가짐).
암세포 증식에 있어 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해 : 동일한 염기서열을 가지며, 활성화 ras의 코돈-12 영역에 상보적인 세 개의 17-합체 올리고뉴클레오티드가 실시예 11에서 기술하는 대로 T24 암세포의 증식에 미치는 영향에 대해 실험하였다. 올리고뉴클레오티드 3985는 2'-O-메틸 치환 뉴클레오시드를 측면에 가지며 7-합체 데옥시 하부염기서열(갭)을 갖는 균일한 포스포로티오에이트이며, 4690은 2'-플루오로 치환 뉴클레오시드를 측면에 갖는 7-합체 데옥시 하부염기서열(갭)을 갖는 균일한 포스포로티오에이트이다(CFCFAFCFAFCDCDGdAdCdGdGdCfGfCfCfCfSEQ ID NO:1,"F"로 표시되는 뉴클레오시드는 2'-플루오로 치환체를 가지며,"d"로 표시되는 뉴클레오시드는 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 뉴클레오시드임). 암세포 증식에 대해 이들 올리고뉴클레오티드가 미치는 영향은 노던 블롯 분석법에 의해 나타나는 ras mRNA 발현에 미치는 영향과 밀접한 관계가 있다: 올리고뉴클레오티드 2570은 세포증식을 61% 저해하였으며, 2'-O-메틸 키메라 올리고뉴클레오티드 3985는 82%, 그리고 2'-플루오로 키메라 유사체는 세포증식을 93% 저해하였다.
올리고뉴클레오티드의 세포 증식에 대한 투여량-반응 연구에 있어서, 저해는 25nM에서 100nM의 범위에서 투여량-의존적임이 나타났다. 44nM, 61nM 및 98nM의 IC50값은 올리고뉴클레오티드 4690, 3985 및 2570에 각각 지정될 수 있다. 랜덤 대조부 올리고뉴클레오티드는 실시된 투여량에서 아무 효과가 없었다.
세포 증식에 있어서 ISIS 2570의 효과는 세포 형태-특이적이었다. 상기 올리고뉴클레오티드에 의한 T24 세포 증식의 저해는 동일한 올리고뉴클레오티드에 의한 HeLa 세포의 저해보다 4배로 심했다(100nM 올리고뉴클레오티드 농도). ISIS 2570은 활성화(돌연변이) ras 코돈-12에 표적되며, 활성화 ras 코돈-12는 T24에는 존재하지만, HeLa 세포에는 부족하며, 야생-타입 코돈-12를 갖는다.
키메라 골격-변형 올리고뉴클레오티드 : 전술한 실시예에서 논의된 올리고뉴클레오티드는 균일한 포스포티오에이트 골격을 가졌었다. 상기 논의된 2'변형 키메라 올리고뉴클레오티드는 균일한 포스포디에스테르 골격에서 활성화를 나타내지 않는다. 키메라 올리고뉴클레오티드는 5-합체 데옥시 갭을 측면에 갖고 2'-O-메틸 치환 영역을 가지며 합성되었으며(ISIS 4226), 갭 영역으로 P=S 결합을 가지며, 측면 영역에 P=O 결합을 가졌다. 다른 키메라 올리고뉴클레오티드(ISIS 4223)도 만들었으며, 갭 영역에서 P=O 골격을 가지며, 측면 영역에 P=S 결합을 가진다. 이들 올리고뉴클레오티드를 표 4에 나타내었다.
균일한 2'-데옥시 뉴클레오시드 단위를 갖는 올리고뉴클레오티드를 또한 합성하였다. 이들 올리고뉴클레오티드는 분자의 중심 영역에 각각 단일 포스포디에스테르(ISIS 4248), 두 개의 포스포디에스테르(ISIS 4546), 세 개의 포스포디에스테르(ISIS 4551), 다섯 개의 포스포디에스테르(ISIS 4606) 또는 열 개의 포스포디에스테르 결합(ISIS 4241)을 갖는 포스포로티오에이트 결합을 갖는다. 표 4에 또한 나타내었다.
표 4
2'-O-메틸 날개(굵은글씨), 데옥시 갭 중심 영역을 갖는
키메라 골격(P=S/P=O) 올리고뉴클레오티드
(s는 P=S 또는 o는 P=O로 표현되는 골격 결합)
Digma등이 기술한 대로 뉴클레아제 분열에 대한 민감성을 측정하기 위하여 올리고뉴클레오티드를 천연 HeLa 세포추출물에서 37℃로 배양시켰다(Nucleic Acids Res., 1983, 11, 1475-1489). 5-합체 포스포디에스테르 중심영역을 가지며, 포스포로티오에이트/2'-O-메틸 치환된 측면영역을 갖는 올리고뉴클레오티드(4233)는 7시간의 T1/2를 나타내었다. 5-합체 포스포로티오에이트 중심영역을 가지며, 포스포로티오에이트/2'-O-메틸 치환된 측면영역을 갖는 올리고뉴클레오티드는 30시간의 T1/2를 나타내었다. 1 내지 10 포스포디에스테르 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드들 중에서, 포스포디에스테르 단일 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드(4248)는 HeLa 세포추출물에서 5시간 후에도 분해를 보이지 않는 균일한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 ISIS 2570 만큼 뉴클레아제에 대해 안정성을 나타내었다. 2-합체, 3-합체 및 4-합체 포스포디에스테르 중심영역을 갖는 올리고뉴클레오티드는 각각 5.5시간, 3.75시간 및 3.2시간의 T1/2를 나타내었으며, 5-합체 또는 10-합체 포스포디에스테르 중심영역을 갖는 올리고뉴클레오티드는 각각 1.75시간 및 0.9시간의 T1/2를 나타내었다.
키메라 골격-변형 올리고뉴클레오티드의 안티센스 활성화 : 균일한 포스포로티오에이트 골격은 안티센스 활성화에 있어서 요구조건은 아니다. ISIS 4226 및 ISIS 4233의 ras 루시페라제 리포터 시스템에서 ras 발현에 대한 효과에 대한 실험을 ISIS 2570(균일한 포스포로티오에이트/균일한 데옥시), ISIS 3980(데옥시 중심영역 및 2'O-메틸 측면영역을 갖는 균일한 포스포로티오에이트) 및 ISIS 3961(데옥시 중심영역 및 2'O-메틸 측면영역을 갖는 균일한 포스포디에스테르)과 함께 행하였다. P=S를 갖는 모든 올리고뉴클레오티드(즉 뉴클레아제-내성을 갖는)는 ras 발현을 저해하였다. 또한 분자의 중심영역에서 1 포스포디에스테르(ISIS 4248) 또는 10 포스포디에스테르 결합(ISIS 4241)을 함유하는 포스포로티오에이트 결합을 갖는 두 개의 균일한 2'-데옥시 올리고뉴클레오티드의 활성화에 대해 분석하였다. 단일 P=O를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 모든 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 올리고뉴클레오티드와 같이 활성되었으며(균일한 P=S 올리고뉴클레오티드), 10개의 P=O 결합을 함유하는 동일한 올리고뉴클레오티드는 완전히 비활성되었다.
SEQ ID NO:1의 키메라 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 제조하였으며, 7-합체 데옥시 중심영역(갭)에 포스포로티오에이트 골격을 가지며, 측면영역에 포스포디에스테르 결합을 갖고 있는데, 이들은 2'-O-메틸 또는 2'-O-프로필로 치환되었다. 2'-O-프로필 치환 포스포디에스테르 측면영역을 갖는 올리고뉴클레오티드는 ras 발현을 저해할 수 있었다.
실시예 8 : 용융 곡선
IBM PC 및 Gilford 반응Ⅱ 측광기(spectrophotometer)에 접속된 Gilford 260 측광기를 사용하여 흡수도 vs 온도 곡선을 260nm에서 측정하였다. 완충액은 100mM Na+, 10mM 포스페이트 및 0.1mM EDTA를 함유하며 pH 7 이었다. 올리고뉴클레오티드 농도는 85℃에서 흡수된 것으로부터 측정된 스트랜드당 4μM이며, 흡광계수는 Puglisi와 Tinoco에 따라 계산하였다(Methods in Enzymol., 1989, 180, 304-325). 이중 형성 및 결합계수의 자유에너지인 Tm값을 직선형 슬로핑 기준선으로 두가지 상 모델에 대한 데이타를 맞추어서 측정하였다. 계수들은 세 번 이상씩 실험하여 평균을 내었다(Petersheim, M and Turner, D.H., Biochemistry, 1983, 22, 256-263). 일부 올리고뉴클레오티드에 있어서, 이중 형성 자유에너지는 Tm -1vs log10(농도)를 플로팅하여 관측하였다(Borer, P.N., Dengler, B., Tinoco, I., Jr., and Uhlenbeck, O.C., J. Mol. Biol., 1974, 86, 843-853).
실시예 9 : ras 트랜스액티베이션 리포터 유전자 시스템
구성성분인 SV40 프로모터의 대조부하에서 삽입된 활성화(코돈-12, GGC→GTC) H-ras cDNA를 함유하는 발현 플라스미드 pSV2-oli는 Dr. Bruno Tocque의 산물이었다(Rhone-Poulence Santa, Vitry, France). PCR 반응에 의해, 스테로이드-유도성 생쥐 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터의 제어하에 H-ras 발현 플라스미드를 구성하기 위하여 주형으로서 상기 플라스미드를 사용하였다. H-ras 코딩 염기서열을 획득하기 위하여, H-ras 유전자의 570 bp 코딩 영역이 PCR에 의하여 증폭되었다. PCR 프라이머는 클로닝을 촉진하기 위하여 그들의 5'-영역에서 유일한 제한 엔도뉴클레아제 지점으로 표시되었다. H-ras 코돈-12 돌연변이 종양 유전자의 코딩 부위를 함유하는 PCR 산물은 겔 정제, 침지 및 클로닝에 앞서서 다시 한번 겔 정제시켰다. 상기 구조물은 도입물을 발현 플라스미드 pMAMneo로 클로닝함으로써 완성되었다(Clontech Laboratories, CA).
ras-반응성 리포터 유전자 pRDO53은 ras 발현을 검사하기 위하여 사용되었다(Owen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1990, 87, 3866-3870).
실시예 10 : ras 발현의 생체내(in vivo) 노던 블롯 분석
사람 방광 암세포 라인 T24는 American Type Culture Collection (Rockville MD)에서 구입하였다. 세포는 McCoy 5A 배지에서 L-글루타민과 함께 배양시켰으며(Gibco BRL, Gainthersburg MD), 10% 열-비활성화된 소의 태아 혈청 및 페니실린과 스트렙토마이신 각각 50U/mL를 보강하였다. 세포를 100mm 접시 위에 시드처리하였다. 컨플루언스율이 70%에 도달했을때, 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 예열처리한 PBS 10mL 및 2.5μL DOTA를 함유하는 optiMEM 유도-혈청 배지 5mL로 접시를 세척하였다. 그 다음 올리고뉴클레오티드를 바람직한 농도로 부가시켰다. 처리후 4시간이 지나서, 배지를 McCoy 배지로 교체하였다. 올리고뉴클레오티드 처리후에 세포를 48시간동안 배양시키고, 표준 CsCl 정제법을 이용하여 RNA를 분리시켰다.(F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K. Strahl, eds.)
사람 상피와 비슷한 암세포 라인 HeLa 229는 American Type Culture Collection에서 구입하였다. HeLa 세포는 10% 소의 태아 혈청 및 100U/mM 페니실린으로 보강된 Dulbecco's Modified Eagle's medium(DMEM)에서 6-well 접시 위에서 단일층(monolayer)으로 유지시켰다. 올리고뉴클레오티드 처리 및 RNA의 분리는 실질적으로 T24 세포에 있어서 상기 기술한 대로 행하였다.
노던(Northern) 혼성화 : 각각의 RNA 10㎍을 1.2% 아가로스/포름알데히드 겔에서 전기영동시키고 표준 제법을 사용하여 GeneBind 45 나일론 막으로 밤새동안 이동시켰다(Kingston, R.E., iN Current Protocols). RNA는 막으로 UV-가교결합시켰다. 이중-스트랜드32P-표지된 프로브는 프라임 유전자 표지 키트를 사용하여 합성되었다(Progma, Madison WI). ras 프로브는 코돈-12에서 GGC-에서부터-GTC까지의 돌연변이를 갖는 활성화(돌연변이) H-ras mRNA의 cDNA 클론의 SalI-NheI 단절이었다. 대조 프로브는 G3PDH이다. 블롯은 QuickHyb 혼성화 용액(Stratagene, La Jolla, CA)으로 68℃에서 15분간 미리 혼성화시켰다. 10mg/mL 연어 정자 DNA 100㎕로 혼합된 열-변성된 방사성 프로브(2.5 x 106counts/2mL 혼성화 용액)를 부가시키고, 막을 68℃에서 1시간동안 혼성화시켰다. 블롯은 2x SSC/0.1% SDS에서 상온에서 15분간 두 번 세척하였고, 0.1x SSC/0.1% SDS로 60℃에서 15분간 한 번 세척하였다. 블롯을 방사선 사진을 찍고, ImageQuant Phosphor Imager를 사용하여 시그날의 강도를 측정하였다. 노던 블롯은 우선 ras 프로브로 혼성화되고, 그 다음 0.1x SSC/0.1% SDS에서 15분간 가열하여 제거하고, 올바른 시료 로딩을 검사하기 위해 대조부 G3PDH 프로브로 다시 혼성화시켰다.
실시예 11 : 암세포 증식의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해
실시예 10에서 기술한 대로 세포를 배양시키고 필수적으로 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 세포를 60mm 접시에 시드처리하고, 컨플루언스율이 70%에 도달했을 때 DOTA의 존재하에서 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 시간 경과 실험 : 첫째날, 세포를 최종 농도 100nM의 올리고뉴클레오티드를 단일 투여하여 처리하였다. 배양배지는 3일째에 한 번 바꾸어 주었고, 5일동안 매일 카운팅 챔버(counting chamber)를 사용하여 세포수를 세었다. 투여량-반응 실험: 올리고뉴클레오티드를 다양한 농도로(10, 25, 50, 100 또는 250nM) 세포에 부가시키고, 배양한지 3일후에 세포수를 세었다. 올리고뉴클레오티드 2570, 3985 및 4690를 가지고 T24 암세포 증식에 대한 효과를 실험하였다.
실시예 12 : 키메라(데옥시 갭이 형성된) 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드에 의한 PKC-α mRNA 발현의 저해
SEQ ID NO:4를 갖는 올리고뉴클레오티드를 데옥시 중심영역 또는 2'-O-메틸 치환 하부염기서열을 측면으로 하는 다양한 길이의 데옥시 갭을 가지는 균일한 포스포로티오에이트 키메라 올리고뉴클레오티드로 합성시켰다. 이들 올리고뉴클레오티드(500nM 농도)를 노던 블롯 분석법에 의해 PKC-α mRNA 레벨에 미치는 영향에 대해 실험하였다. 8 뉴클레오시드 또는 그 이상의 데옥시 갭은 모든 경우에 있어서, PKC-α mRNA 레벨의 최고 감소를 나타내었다. 이들 올리고뉴클레오티드는 4 뉴클레오시드의 데옥시 갭 길이를 가지고 PKC-α mRNA를 약 83% 감소시켰으며, 그리고 6 또는 그 이상의 뉴클레오시드의 데옥시 갭 길이를 가지고 PKC-α mRNA를 거의 완벽하게 감소시켰다.
4-합체 또는 6-합체 데옥시 갭을 갖는 2'-O-메틸 치환 키메라 올리고뉴클레오티드는 균일한 데옥시 올리고뉴클레오티드에서 나타났듯이(모두 균일한 포스포로티오에이트임), PKC-α mRNA의 감소(PKC-α mRNA 레벨에서 50% 감소시키는데 필요한 올리고뉴클레오티드의 농도)에 대한 IC50가 200nM에서 250nM까지를 나타낸다. 8-합체 데옥시 갭을 갖는 2'-O-메틸 치환 키메라 올리고뉴클레오티드는 약 85nM의 IC50을 가졌다.
상기 키메라 올리고뉴클레오티드(SEQ. ID NO:4)를 몇가지 변화시켜서 PKC-α mRNA 레벨을 떨어뜨릴 수 있는 가능성을 비교하였다. 상기 올리고뉴클레오티드를 표 5에 나타낸다.
표 5
키메라 2'-O-메틸/데옥시 P=S 올리고뉴클레오티드
굵은글씨는 2'-O-메틸; s는 P=S 결합, o는 P=O 결합
PKC-α mRNA 레벨에 대한 상기 올리고뉴클레오티드의 효과를 도 3에 나타내었다. 올리고뉴클레오티드 7008, 3522 및 5352는 PKC-α mRNA의 감소를 나타내며, 이중 5352가 가장 활성을 나타낸다.
일련의 2'-O-프로필 키메라 올리고뉴클레오티드가 SEQ ID NO:4를 갖도록 합성하였다. 상기 올리고뉴클레오티드를 표 6에 나타내었다.
표 6
키메라 2'-O-프로필/데옥시 P=S 올리고뉴클레오티드
굵은글씨는 2'-O-프로필; s는 P=S 결합, o는 P=O 결합
상기 2'-O-프로필 치환 키메라 올리고뉴클레오티드를 2'-O-메틸 치환 키메라 올리고뉴클레오티드와 비교하였다. 올리고뉴클레오티드 7273 및 7294는 PKC-α mRNA 레벨을 낮추는데 있어서 2'-O-메틸 대응물보다 더 활성을 나타내었다. 도 4 및 도 5에서 나타내고 있다.
실시예 13 : PKC-α mRNA 발현을 감소시키는 부가적 올리고뉴클레오티드
사람 PKC-α 3' 비해독역(untranslated region)에 표적된 부가적 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 조제하여 합성하였다. 염기서열은 표 7과 같다.
표 7
PKC-α 3' 비해독역에 표적된
키메라 2'-O-프로필/데옥시 P=S 올리고뉴클레오티드
굵은글씨는 2'-O-프로필; s는 P=S 결합, o는 P=O 결합
올리고뉴클레오티드 6632, 6653, 7082 및 7083가 PKC-α mRNA 레벨을 감소시키는데 있어서 가장 높은 활성을 나타낸다.
실시예 14 : SEQ ID NO:30을 갖는 올리고뉴클레오티드가 PKC-α mRNA 레벨에 미치는 영향
A549 세포를 양이온 리피드 DOTA/DOPE의 존재하에 4시간동안 500nM에서 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리하고, 세척하였으며 그리고나서 부가적인 20시간동안 원상태로 복구하였다. RNA 전체를 추출하고 20㎍씩 각각 1.2% 겔에 용존시키고 나일론 막으로 옮겼다.32P 방사성표지된 PKC-α cDNA 프로브로 블롯을 조사하고, 다시 제거하고 그리고 동일한 RNA가 입혀졌는지 확인하기 위하여 방사성표지된 G3PDH 프로브로 재조사하였다. 각각의 올리고뉴클레오티드[3520 (SEQ ID NO : 31), 3521 (SEQ ID NO : 30), 3522 (SEQ ID NO : 4) 및 3527 (SEQ ID NO : 32)]를 두 번씩 사용하였다. 두 개의 주요 PKC-α 전사(8.5 kb 및 4.0 kb)를 검사하고 Phosphorimager로 측정하였다(Molecular Dynamics, Sunnyvale CA). ISIS 3521 (SEQ ID NO : 30)은 작은 전사의 약 80%를 감소시켰으며, 큰 전사의 90% 이상을 감소시켰다.
SEQ ID NO : 30 및 뉴클레오시드 양 측면에 2'-OCH2CH2OCH3변형을 갖고 8-합체 데옥시 중심영역을 갖는 두 개의 올리고뉴클레오티드가 합성되었다. 각각의 합성에 있어서, 마지막 뉴클레오시드는 데옥시뉴클레오시드였다. 표 8에 나타나듯이, 상기 화합물들은 그 중 하나인 ISIS 9606은 균일한 포스포로티오에이트 골격을 갖는 반면, 다른 하나인 ISIS 9605는 중심영역에 포스포로티오에이트 골격(골격 결합 7-14)을 가지며 측면영역에 포스포디에스테르 골격을 갖는다는 점에서 다르다. 상기 올리고뉴클레오티드를 포스포로티오에이트 화합물인 ISIS 3521과 비교하여, A549 세포에 있어서 PKC-α mRNA 발현을 저해하는 능력에 대해 측정하였다. 도 6a 및 도 6b에 결과가 나타나 있다. 상기 세 개의 화합물에 대해 IC50(50%로 저해시킬 때의 올리고뉴클레오티드 농도)을 측정하였다. 포스포로티오에이트 화합물인 ISIS 3521은 IC50이 대략 170nM이다. 두 개의 메톡시에톡시 화합물 ISIS 9605 및 ISIS 9606은 25nM의 IC50을 나타내었다. 메톡시에톡시 변형 능력이 6배 내지 7배 증가하는 것은 놀라운 활성화를 나타내는 척도인 것이다. 메톡시에톡시 화합물 ISIS 9605 및 ISIS 9606는 이들의 IC50가 굉장히 낮기 때문에 바람직하다.
표 8
SEQ ID NO : 30을 갖는 올리고뉴클레오티드
굵은글씨는 2'-OCH2CH2OCH3; s는 P=S 결합, o는 P=O 결합
실시예 15 : 2'-메톡시에톡시 올리고뉴클레오티드 ISIS 12723이 누드 마우스에서 사람의 Colo-205 결장암의 성장에 미치는 영향
사람 피하의 Colo-205 결장암을 누드 마우스 피하에 5 x 106Colo-205 세포를 주입하여 이종이식(xenograft)하였다. 생쥐를 ISIS 12723 (SEQ ID NO : 30이고 2'-OCH2CH2OCH3변형된 6-합체 하부염기서열을 양 측면으로 가지며, 8-합체 데옥시 중심영역을 갖고, 그리고 중심영역에 포스포로티오에이트 골격(골격결합 7-14) 및 측면영역에 포스포디에스테르 골격을 가짐) 또는 ISIS 3521 (SEQ ID NO : 30이고, 균일한 데옥시 포르포로티오에이트를 가지며, 하루에 한번씩 0.006, 0.06, 0.6 또는 6.0 ㎎/㎏의 투여량으로 정맥으로 공급함) 으로 처리하였다. 본 발명에서 ISIS 12723은 솔린 플라시보 대조부(saline placebo control)와 비교하여 암 성장을 95% 이상 저하시켰으며, ISIS 3521은 대조부와 비교하여 83% 이상 저해하였다(도 7a). 그러므로 상기 메톡시에톡시 화합물인 ISIS 12723가 바람직하다.
실시예 16 : 키메라 올리고뉴클레오티드에 의한 c-raf 발현 저해
SEQ ID NO : 7을 갖는 키메라 올리고뉴클레오티드를 Genbank c-raf sequence HUMRAFR(Genbank listing x03484)을 사용하여 조제하고, 합성하며 그리고 노던 블롯 분석법을 이용하여 T24 방광암 세포에서 c-raf mRNA 발현의 저해를 실험하였다. 상기 키메라 올리고뉴클레오티드는 측면영역에 두 개의 2'-O-메틸 변형 뉴클레오시드를 가지며, 중심 "갭" 영역에 6, 8 또는 10 데옥시 뉴클레오시드를 가지는데, 표 9에 나타나 있다. 실시예 20에서 보듯이 노던 블롯 분석법에서는 세 개의 올리고뉴클레오티드 (ISIS 6720, 6-합체 데옥시 갭; ISIS 6717, 8-합체 데옥시 갭; ISIS 6729, 10-합체 데옥시 갭)는 T24 세포에 있어서 c-raf mRNA 발현을 70% 이상을 저해하는 것으로 나타났다. 이들 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 8-합체 데옥시 갭을 갖는 올리고뉴클레오티드는 90% 이상의 저해를 나타냈으며, 더 바람직하다.
표 9
키메라 2'-O-메틸 P=S 데옥시 "갭" 올리고뉴클레오티드
굵은글씨는 2'-O-메틸
부가적 키메라 올리고뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형 및 균일한 포스포로티오에이트 골격을 하나 또는 그 이상 갖도록 합성하였다. 표 10에 나타나 있다. 모두 포스포로티오에이트이며; 굵게 인쇄된 영역은 2'-O-메틸 변형 영역을 나타낸다.
표 10
키메라 2'-O-메틸 P=S c-raf 올리고뉴클레오티드
노던 블롯 분석법으로 c-raf mRNA를 저해하는 능력에 대해 실험하였을 때, ISIS 7848, 7849, 7851, 7856, 7855, 7854, 7847 및 7853는 70% 이상의 저해를 나타내었으며, 그러므로 바람직하다. 이들 가운데 7851, 7855, 7847 및 7853은 90% 이상의 저해를 나타내었으며, 더욱 바람직하다.
다양한 2' 변형을 갖는 부가적 키메라 올리고뉴클레오티드를 제조하여 실험하였다. 표 11에 나타나 있다. 모두 포스포로티오에이트이며; 굵게 인쇄된 영역은 2' 변형 영역을 나타낸다.
표 11
키메라 2'-변형 P=S c-raf 올리고뉴클레오티드
이들 가운데 올리고뉴클레오티드 6720, 6717, 6729, 9720 및 9058가 바람직하다. 올리고뉴클레오티드 6717, 6729, 9720 및 9058가 더욱 바람직하다.
실시예 17 : SEQ ID NO : 7을 갖는 2'-메톡시에톡시 올리고뉴클레오티드가 c-raf mRNA 발현에 미치는 영향
SEQ ID NO : 7 및 2'-O-CH2CH2OCH3변형을 갖는 6 뉴클레오시드 단위 하부염기서열을 측부에 가지며 중심부에 2'-데옥시-에리트로-펜토푸라노실 당 부를 함유하는 8-뉴클레오시드 단위 하부염기서열을 갖는 두 개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 이들 화합물중의 하나인 ISIS 10755는 균일한 포스포로티오에이트 골격을 갖는 반면, 다른 하나인 ISIS 10754는 중심영역에는 포스포로티오에이트 결합(골격 결합 7-14)을 가지며 측면영역에는 포스포디에스테르 결합을 갖는다는 점에서 다르다. 상기 올리고뉴클레오티드를 T24 세포에 있어서 c-raf mRNA 발현을 저해하는 능력에 대해 측정하였다. IC50(50%로 저해시킬 때의 올리고뉴클레오티드 농도)을 측정하였으며, 그들 대응물에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화도를 타나내는 Tm데이타와 함께 표 12에 나타내었다. IC50이 극히 낮으므로 ISIS 10755 및 ISIS 10754가 모두 바람직하다. 본 발명에 의해 사용된 올리고뉴클레오티드는 고체상 합성에 대한 잘 알려진 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다(Martin, Helv. Chim. Acta, 1975, 78, 486-504). 이러한 합성을 위한 장비는 Applied Biosystems를 비롯하여 여러 벤더 업체에서 구입하였다. 이러한 합성에 있어서 다른 방법도 사용될 수 있는데; 올리고뉴클레오티드의 실제적 합성은 종래의 방법에 의해 통상의 지식을 가진자가 용이하게 수행할 수 있다.
표 12
T24 세포에 있어서 안티센스 활성 및 Tm
실시예 18 : ISIS 5132 및 CGP 69845가 사람 폐 선암종암 A549에 미치는 영향
사람 피하의 폐 선암종암 A549 세포를 수컷 Balb/c 누드 마우스에 이종이식하고, ISIS 5132 (SEQ ID NO : 7) 또는 SEQ ID NO : 7(CGP 69845)의 메톡시에톡시(2'-O-CH2CH2OCH3) 버전으로 처리하였으며, 이들 둘다 정맥주사로 하루에 투여량 0.006에서 6.0㎎/㎏ 범위로 투여하였다. ISIS 5132는 도 6a 및 도 6b에서 보듯이 투여량-의존 방식처럼 모든 투여량에서 종양의 크기가 감소하였다. 메톡시에톡시(2'-O-CH2CH2OCH3) 올리고뉴클레오티드, CGP 69845는 6.0㎎/㎏의 투여량에서 ISIS 5132보다 더 큰 저해 효과를 보인 반면에, 더 낮은 투여량에서는 ISIS 5132와 동일한 효과를 보였다.
실시예 19 : A549 이종이식
5 x 106A549 세포를 누드 마우스의 넙적다리 내부 피하로 이식하였다. 염수에 현탁시킨 올리고뉴클레오티드(ISIS 5132 및 ISIS 10754로도 알려진 CGP 69845)를 하루에 투여량 0.006에서 6.0㎎/㎏ 범위로 정맥주사 투여하였다. 생성된 종양은 9일째, 12일째, 17일째 및 21일째에 측정하였으며, 종양의 부피를 계산하였다.
실시예 20 : c-raf mRNA 발현을 저해하는 노던 블롯 분석법
사람 방광 암세포 라인 T24는 American Type Culture Collection (Rockville MD)에서 구입하였다. 세포는 McCoy 5A 배지에서 L-글루타민과 함께 배양시켰으며(Gibco BRL, Gainthersburg MD), 10% 열-비활성화된 송아지 태아 혈청 및 페니실린과 스트렙토마이신 각각 50U/mL를 보강하였다. 세포를 100 mm 접시 위에 시드처리하였다. 컨플루언스율이 70%에 도달했을때, 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 예열처리한 PBS 10mL 및 2.5μL DOTA를 함유하는 optiMEM 유도-혈청 배지 5mL로 접시를 세척하였다. 그리고나서 리포펙신과 함께 올리고뉴클레오티드를 바람직한 농도로 부가하였다. 처리후 4시간이 지나서, 배지를 McCoy 배지로 교체하였다. 올리고뉴클레오티드 처리후에 세포를 24시간 내지 72시간동안 배양시키고, 표준 CsCl 정제법을 사용하여 RNA를 분리시켰다(F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K. Strahl, eds.). RNA 시료를 1.2% 아가로스/포름알데히드 겔로 전기영동시켰으며 모세관 확산을 이용하여 혼성화 막으로 12-14시간동안 이동시켰다. RNA는 Stratalinker에서 UV 라이트에 노출시킴으로써 막으로 UV-가교결합시켰고 랜덤 프라임32P-표시된 c-raf cDNA 프로브 또는 대조부 G3PDH 프로브에 혼성화되었다. RNA는 Phosphorimager를 이용하여 그 양을 측정하였다.
실시예 21 : Rev 유전자 발현에 대한 올리고뉴클레오티드의 저해
이 분석에서 사용한 키메라 올리고뉴클레오티드를 표 13에 나타내었다.
표 13
HIV rev 유전자에 표적된 키메라
2'-O-프로필/데옥시 P=S 올리고뉴클레오티드
굵은글씨는 2'-O-프로필; s는 P=S 결합; o는 P=O 결합
트랜스펙션 및 루시페라제 분석 : 3T3 세포를 글루코스, L-글루타민, 소듐 피루베이트 및 10% 소의 혈청(GIBCO)을 함유하는 DMEM에 놓아두었다. 모든 실험에서, 세포를 전날밤에 6-well 접시에서 75,000 cells/well로 시드 처리하였다. 트랜스펙션은 표준 CaPO4방법을 이용하여 행하였다. 각각의 복제 세트에 대해서, pSG5/rev 플라스미드 15㎍/mL, pHIVenu-luc 18㎍/mL 및 2㎍/mL Rep 6을 침전시키고, 접시에 이들 200㎕를 각각 떨어뜨렸다. 침전물은 37℃에서 7시간동안 세포에서 배양되도록 하였다. 그리고나서 배지를 흡출기로 빨아내고, 세포를 PBS로 한번 세척하고 밤새동안 배양하기 위해 신선하고 완전한 배지를 부가하였다. 배양후에 배지를 제거하고, 세포를 2mL OptiMEM 및 2.5㎍/mL 리포펙틴을 함유하는 1mL OptiMEM으로 세척하고 올리고뉴클레오티드를 부가하였다. 혼합물을 37℃에서 4시간동안 배양시키고, 이 상태에서 세포를 흡출기로 제거하였으며 완전한 배지를 부가하였다. 두시간이 지나면 덱사메타손 0.2㎍/mL를 모든 접시에 부가하여 pHIVenu-luc의 MMTV 프로모터의 유도를 꾀하였다.
루시페라제 분석은 그 후 24시간동안 다음과 같이 행하였다 : 접시를 PBS로 두 번 세척하고 세포를 200㎕ 용해 완충액에서 긁어내어 배양시켰다(1% Triton, 25mM 글리실글리신, pH 7.8, 15mM MgSO4, 4mM EGTA 및 1mM DTT). 용해물을 차갑게 하여 11,500rpm에서 5분간 마이크로퓨징(microfuging)하여 정제시켰다. 그리고 용해물 100㎕를 분석 완충액 50㎕으로 접시에 결합시켰다(25mM 글리실글리신, pH 7.8, 15mM MgSO4, 4mM EGTA 및 15mM 포타슘 포스페이트, pH 7.8, 1mM DTT 및 7.5mM ATP). Luc 분석은 광도계를 사용하여 행하였다. 반응은 1x 루시페라제 용액 50㎕를 주입함으로써 시작되었다. 1x 용액을 10x 스톡으로부터 사용하기 전에 루시페린 완충액에서 희석시켰다(25mM 글리실글리신, pH 7.8, 15mM MgSO4, 4mM EGTA 및 4mM DTT). 시료는 20초동안 수를 세었다. luc 발광의 속도론은 몇초동안 지속되는 플래쉬 기간에 뒤이어 몇분동안 지속되는 더 낮은 광도 방출시간에 의해 특징지워진다.
Rev 및 RRE RNA 합성 : pSG%-Rev는 T7 프로모터에 인접한 Rev 유전자를 함유한다. pSG5-Rev와 직선상에 있는 BgⅢ는 T7 RNA 폴리머라제로 트랜스펙션하기 위한 DNA 주형으로서 사용되었다. RRE RNA 생성의 주형은 PCR에 의해 생성되었다. RNA 합성에 있어서 DNA 주형은 ATP, CTP 및 GTP 각각 5mM, UTP 0.5mM, DTT 10mM, Tris-HCl 40mM, pH 7.5, MgCl26mM,스페르미딘 4mM, 20U/㎕로 RNAsin 500U/mL, α32P UTP 10mCi/mL로 2500μCi/mL 및 T7 RNA 폴리머라제 1000U/mL와 함께 0.2 내지 1.0mg/mL로 사용되었다. 반응은 37℃에서 1시간동안 배양시켰다. 트랜스펙션 반응은 완충액을 입힌 포름알데히드를 부가함으로써 종료시켰고 8M 요소를 함유하는 변형 폴리아크릴아미드 겔에서 진행되었다. RNA는 Schwartz등에 의한 절차에 따라 겔로부터 추출되었다(Gene, 1990, 88, 197).
실시예 22 : 항비루성(antiviral) 스크리닝 면역분석법
NHDF 세포를 혈청없는 FGM에서 15,000 cells/well의 밀도로 96-well 배양접시에 시드 처리하였다. 형성된 단일층을 감염하기 전에 FGM에서 밤새동안 올리고뉴클레오티드로 전처리하였다. 전처리후에 세포를 신선하고 예열된 FGM으로 두 번 씻어내고, 그리고 FGM/well 100㎕에 있는 바이러스를 0.05 PFU/cell의 MOI를 얻도록 부가시켰다. 37℃에서 2시간동안 배양한 후, 바이러스를 제거하고 올리고뉴클레오티드를 함유한 신선한 배지(100㎕/well)를 부가하였다. 배지는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 신선한 배지로 감염시킨지 2일 후에 배지를 교환시켜주고, 감염시킨지 6일 후에는 세포를 에탄올에서 고정시키고 항체 염색 제법으로 건조시켰다. 변성 프로토콜은 FGM이 낮은 FBS 레벨(0.2%)로 보강되는 몇몇 분석에서 사용되었으며, 감염 후 배양시기는 6일에서 3일로 단축시켰다. 이렇게 단축시킴으로써 감염후 2일 후에 배지를 교체할 필요가 없어졌다. 두가지 분석으로 50% 유효농도(EC50s)에 대한 비교수치를 산출해내었다.
고정 세포들은 PBS 함유 2% 소혈청 알부민(BSA) 용액에서 폐쇄되었고, 쥐의 모노클론 항체(1H10, supplied by Eisai Co., Ltd., Japan)를 PBS-1% BSA에서 1 : 2000으로 희석하여 부가하였다. 1H10 항체는 약 65KDa 크기의 다수의 후반의 HCMV 폴리펩티드를 인식한다. 결합된 모노클론 항체의 감지는 비오틴화된 염소 항-생쥐 이뮤노글로불린 G abd 스트렙타비딘과 짝을 이루는 β-갈락토시다제로 촉진되었다(GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD). 붉은 클로로페놀 β-D-갈락토피라노시드는 β-갈락토시다제에 대한 기질로서 사용되었으며, 활성은 BioTex model EL312e microplate reader로 각각의 접시 575nm에서 광학 밀도를 관측함으로써 측정되었다. 이 분석에서 사용된 올리고뉴클레오티드는 표 14에 나타내었다.
표 14
키메라 2'-O-메틸 P=S 올리고뉴클레오티드에 의한 CMV 복제의 저해
굵은 글씨는 2'-O-메틸
OLIGO SEQUENCE SEQ ID NO:
4325GCG UUT GCT CTT CTT CUU GCG23
4326GCG UUU GCT CTT CTU CUU GCG24
실시예 23 : HCV H8Ad17 단백질 분석에서 올리고뉴클레오티드 270 및 330의 관측
친화도-정제된 사람 폴리클론 항-HCV 혈청 및125I-결합된 염소 항-사람 IgG을 활용하는 웨스턴 블롯 분석은 HCV 핵심 단백질 레벨에 대해 올리고뉴클레오티드가 미치는 영향을 측정하기 위해 이전에 사용되었던 ELISA 분석법을 대체하여 개발되었다. 세포는 밤새동안 배양시켰다. 세포를 5㎍/mL 리포펙신을 함유하는 OptiMEM에서 4시간동안 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 세포에 2mL M8 배지를 공급하고 밤새동안 회복하도록 해주었다. 세포를 배양하기 위해서 세포를 2mL PBS로 한번 세척하고 100μL Laemmli 완충액에서 용해시키며, 그리고 스크래핑하여 배양시켰다. 전기영동 분석을 위해, 세포 용해물을 끓이고, 그리고 세포 용해물 10-14μL를 10% 폴리아크릴아미드 겔의 각 레인위에 입혔다. 전기영동 후에, 단백질을 전기영동적으로 PVDF 막으로 이동시켰다. 막은 2% 염소 혈청 및 0.3% Tween-20을 함유하는 PBS에서 블로킹되었고, 그리고 밤새동안 주요 항체(사람 항-핵심 항체 2243 및 토끼 항-G3PDM 항체)로 배양시켰다. 막을 완충액에서 5 x 5분간 세척하고, 그 다음 두번째 항체로 4-8시간동안 배양시켰다(125I-결합한 염소 항-사람 및125I-결합한 염소 항-토끼). 막을 완충액에서 5 x 5분간 세척하고, 성형으로 밀봉하고 그리고 Phosphor Imager 카세트에서 밤새동안 노출시켰다. Phosphor Imager에서 밴드의 수치를 측정하고(Molecular Dynamics, Sunnyvale CA), G3PDH 발현 레벨로 정상화시키고 나서, 결과를 대조부 미처리 세포의 퍼센트로써 플로팅하였다.
웨스턴 블롯 분석법에 의해 측정한 올리고뉴클레오티드를 표 15에 나타내었다. 염기서열 부분에서 대문자는 염기 서열이고, 소문자(o 또는 s)는 뉴클레오시드 내부 결합으로서, 포스포디에스테르(P=O) 또는 포스포로티오에이트(P=S)를 나타낸다. 굵은 글씨는 2'-O-프로필, * 표시는 2'-O-부틸이미다졸, + 표시는 2'-O-프로필아민을 나타낸다.
표 15
실시예 24 : 2,6-디아미노-9-(2-O-옥타데실-β-D-리보푸라노실)퓨린의 합성
2,6-디아미노-9-(β-D-리보푸라노실)퓨린(50g, 180mmol) 및 소듐히드리드(7g)를 DMF(1L)에서 2시간동안 끓이며 가열하였다. 150℃에서 이오도옥타데칸(100g)을 부가하고 반응 혼합물을 RT로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 RT에서 11일간 섞어주었다. 용매는 증발되고, 잔기는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 생성물은 5% MeOH/CH2Cl2로 추출하였다. 생성물(11g)을 생성하기 위하여 적당한 부분들을 증발시켰다.1H NMR (DMSO-d6) δ 0.84(t, 3, CH2); 1.22 (m, 32, O-CH2- CH2-(CH2)16); 1.86 (m, 2, O-CH2-CH2); 3.25 (m, 2, O-CH2); 3.93 (d, 1, 4'H), 4.25 (m, 1, 3'H); 4.38 (t, 1, 2'H); 5.08 (d, 1, 3'-OH); 5.48 (t, 1, 5'-OH); 5.75 (s, 2, 6-NH2); 5.84 (d, 1, 1'-H); 6.8 (s, 2, 2-NH2); 및 7.95 (s, 1, 8-H)이다.
실시예 25 : 2'-O-옥타데실글루노신의 합성
2,6-디아미노-9-(2-O-옥타데실-β-D-리보푸라노실)퓨린(10g)을 0.1 M 소듐 포스페이트 완충액(50mL, pH 7.4), 0.1M tris 완충액(1000mL, pH 7.4) 및 DMSO(1000mL)에서 아데노신 데아미나제(1.5g)로 상온에서 처리하였다. 3일째, 5일째 및 7일째에 아데노신 데아미나제를 구분하여 부가하였다(각각 500mg, 880mg 및 200mg). 분석시료를 MeOH 'H NMR (DMSO-d6) δ 0.84 (t, 3, CH3), 1.22 [s, 32, O-CH2-CH2-(CH2)16], 5.07 (m, 2, 3'-OH 및 5'-OH); 5.78 (d, 1, 1'-H); 6.43 (s, 2, NH2), 7.97 (s, 1, 8-H) 및 10.64 (s, 1, NH2)로부터 재분별증류하였다. C28H49N5O5분석계산: C, 62.80; H, 9.16; N, 12.95이며, 발견: C, 62.54; H, 9.18; N, 12.95이다.
실시예 26 : N2-이소부티릴-2'-O-옥타데실구아노신의 합성
피리딘(150mL)에 있는 2'-O-옥타데실구아노신(1.9g)을 얼음 배스에서 냉각시키고, 트리메틸시릴 클로라이드(2g, 5eq) 및 이소부틸 클로라이드(2g, 5eq)으로 처리하였다. 반응 혼합물을 4시간동안 섞어서, 2시간동안 상온에서 식혀주었다. 용액을 냉각시키고, 물을 부가하며(10mL), 추가 30분간 섞어주었다. 농축 암모늄 히드록시드(10mL)를 부가하고, 용액을 진공상태에서 농축시켰다. 잔기는 실리카 겔 크로마토그래피(3% MeOH/EtOAc로 추출)로 정제시켜서 산물 1.2g을 생성하였다.
'H NMR (DMSO-d6) δ 0.85 (t, 3, CH3), 1.15 (m, 38, O-CH2- CH2-(CH2)16, CH(CH3)2, 2.77 (m, 1, CH(CH3)2), 4.25 (m, 2, 2'-H 및 3'-H); 5.08 (t, 1, 5'-OH), 5.12 (d, 1, 3'-OH), 5.87 (d, 1, 1'-H); 8.27 (s, 1, 8-H), 11.68 (s, 1, NH2) 및 12.08(s, 1, NH2). C32H55N5O6분석계산: C, 63.47; H, 9.09; N, 11.57. 발견: C, 63.53; H, 9.20; N, 11.52이다. 상기 생성물은 올리고뉴클레오티드와 결합시키기에 앞서, N2-이소부티릴-5'-디메톡시트리틸-2'-O-옥타데실구아노신으로 전환되었고, 그리고나서 국제특허공개 제WO 94/02501호(1994. 2. 3공개)에 개시된 절차에 따라 포스포르아미디트로 전환되었다.
실시예 27 : mRNA 과발현 측정을 위한 특징분석
올리고뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 키나아제와 5' 말단에서32P로 표시하여 합성한 후에 방사성표시하였다(Sambrook, "Molecular Cloning. A Caboratory Manual, "Cold Spring Marbor Laboratory Press, 1989. Volume 2, pg. 11. 31-11. 32). 특이적 혼성화가 발생할 수 있는 조건하에 있는 한 환자로부터 얻은 시료처럼, mRNA 과발현의 의심이 가는 조직 또는 세포 시료와 접촉시키고, 그리고 상기 시료를 세척하여 미결합된 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 대조부는 특이적 잡종화가 일어나는 조건하에서 정상적 세포 또는 조직 시료와 방사성표시된 올리고뉴클레오티드를 접촉시키도록 유사하게 유지시키고, 상기 시료를 세척하여 미결합 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 시료에 남아있는 방사성은 결합된 올리고뉴클레오티드를 의미하며 섬광계수기 또는 다른 일반적 수단을 이용하여 측정한다. 정상세포 및 질환세포로부터 획득한 시료에 남아있는 방사성은 관심의 대상인 mRNA의 과발현을 의미한다.
본 발명의 방사성표시된 올리고뉴클레오티드는 또한 방사선사진(auto chromatography)에 유용하다. 조직 부위를 방사성표시된 올리고뉴클레오티드로 처리하고 상기 기술한 대로 세척하며, 그리고 일반적인 방사선 사진 찍는 절차에 따라 포토그래픽 에멀젼에 노출시킨다. 대조부도 또한 정상 세포 또는 조직 시료를 갖고 유지시킨다. 에멀젼이 mRNA를 과발현하는 부위에서 실버그레인상을 나타낼 때, 이를 측정한다. mRNA 과발현 정도는 정상 및 질환세포에서 측정된 실버그레인을 비교하여 결정한다.
mRNA 발현의 형광성 검출에 대한 유사체 분석은 플루오레세인 또는 기타 형광성 태그로 표시되는 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 표시된 DNA 올리고뉴클레오티드는 DNA 자동합성기(Applied Biosystems model 380B)에서 아이오딘 산화로 표준 포스포르아미디트 케미스트리를 이용하여 합성된다. β-시아노에틸디이소프로필 포스포르아미디트는 Applied Biosystem에서 구입한다(Foster City, CA). 형광-표시된 아미디트는 Glen Research에서 구입한다(sterling, VA). 형광 탐지용으로 섬광계수기 대신에 형광현미경을 사용한 경우를 제외하고는, 올리고뉴클레오티드 및 생물학적 시료의 배양은 방사성표시된 올리고뉴클레오티드를 가지고 행한다. 정상 및 질환세포에서 획득한 시료로부터 관찰된 형광성의 비교로 mRNA 과발현을 측정할 수 있게 된다.
실시예 28 : 비정상 mRNA 발현의 관찰
비정상 mRNA 발현의 의심이 가는 조직 또는 세포 시료를 야생-형태(정상) mRNA에 표적된 제1의32P 또는 형광-표시된 올리고뉴클레오티드로 배양시킨다. 세포 또는 조직의 동일 시료는 특이적 혼성화가 발생하는 조건하에서 비정상 mRNA에 표적된 제2의 표시된 올리고뉴클레오티드로 배양시키고, 그리고 시료를 세척하여 미결합 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 시료에 남아있는 표시는 결합된 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 섬광계수기 및 형광계로 측정한다. 비정상 mRNA의 존재는 시료가32P-표시된 올리고뉴클레오티드에 결합하지 않고(방사성이 아닌) 형광-표시를 보유하고 있는지(형광성인)의 척도가 된다.
실시예 29 : 생쥐에서 올리고뉴클레오티드의 플라스마 흡착 및 조직분포
제조된 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다:
UsGsCsAsTsCsCsCsCsCsAsGsGsCsCsAsCsCsAsT, SEQ ID NO:27
UsGsCsAsTsCsCsCsCsAsGsGsCsCsAsCsCsAsT, SEQ ID NO:27
UsGsCsAsTsCsCCCCAGGCsCsAsCsCsAsT, SEQ ID NO:27
굵은 글씨는 2'-O-프로필 치환체, "s"는 포스포로티오에이트 결합이며, "s"가 없는 것은 포스포디에스테르 결합을 나타낸다. 첫번째 올리고뉴클레오티드는 ISIS 3082, 두번째는 ISIS 9045, 세번째는 ISIS 9046으로 명시되며 도 9, 도 10, 도 11 및 도 12에 나타나있다. Graham에 의한 절차대로 시행하였다(Nuc. Acids Res.) 1993. 16. 3737-3743).
동물 및 실험절차: 각각의 올리고뉴클레오티드에 있어서, 몸무게 25g의 Balb/c 생쥐 수컷 20마리를 랜덤하게 4그룹 중의 하나에 지정했다. 일주일간의 적응 훈련후에, 생쥐는 pH 7.0의 포스페이트 완충액 염수에 공급된3H-방사성표시된 올리고뉴클레오티드를 단일 꼬리 정맥 투여를 받았다(약 750nmoles/㎏; 124-170μci/μ의 범위). 투여 용액내의 올리고뉴클레오티드 농도는 약 60μM이었다. 각 그룹으로부터 한 개의 리트로-오비탈(retro-orbital) 혈액(투여한지 0.25, 0.5, 2 또는 4시간후) 및 종료혈액(투여한지 1, 3, 8 또는 24시간후)을 채취하였다. 종료 혈액을 케타민/크실라진 마취에 의해 심장에 구멍을 뚫어서 채취하였다. 각 혈액시료의 앨리컷(aliquot)을 방사성 측정을 위해 보존시켰고, 잔류 혈액은 EDTA-코팅된 콜렉션 튜브로 옮겨서 플라즈마를 획득하기 위해 원심분리시켰다. 24시간후에 종료된 그룹으로부터 간격을 두고 (0-4, 4-8 및 8-24 시간) 오줌 및 배설물을 수집하였다.
종료시, 간, 신장, 비장, 폐, 심장, 뇌, 골격근육 시료, 소장의 일부, 피부시료, 췌장, 뼈(골수를 함유하는 대퇴골) 및 두 개의 림프절을 각각의 쥐에서 수집하여 무게를 측정하였다. 배설물의 무게를 재고, Brinkmann Polytron homonizer를 사용하여 증류수와 1 : 1 로 균질화시켰다. 플라즈마, 조직, 소변 및 배설물 균질물을 연소에 의한 방사성 분석 및 본래의 올리고뉴클레오티드 내용물을 측정하기 위해 분리시켰다. 모든 시료는 수집후 드라이 아이스에서 급냉시켜서 분석하기전까지 -80℃에서 저장하였다.
플라즈마, 조직 및 배설물의 방사성 분석: 플라즈마 및 오줌 시료는 섬광 유리병으로 직접 무게를 측정하고 15mL BetaBlend (ICN. Biomedicals, Costa Mesa, CA)를 부가한후 액체 섬광계수를 측정하여 직접 분석하였다. 다른 모든 시료(조직, 혈액 및 균질화된 배설물)는 연소선(combustion boat)에서 무게를 측정하고, Biological Materials Oxidizer에서 산화시켰다(Model OX-100; R. J. Harvey Instrument Corp., Hillsdale, NJ).3H2O를 15mL BetaBlend 및 5mL Harvey Tritium Cocktail (R. J. Harvey Instrument Corp., Hillsdale, NJ)로 구성된 혼합물 20mL에 수집하였다. 연소능률(combustion efficiency)은3H-만니톨 용액에 첨가한 시료를 연소시킴으로써 매일 측정하였고 범위는 73.9 - 88.3% 사이였다. 액체 섬광계수측정은 Beckman LS 9800 또는 LS 6500 Liquid Scintillation System(Beckman Instruments, Fullerston, CA)을 사용하여 행해졌다. 시료는 자동소멸교정기(automatic quench correction)로 10분간 세었다. 연소과정상 효율을 위해 1분당 분해되는 수치를 교정하였다.
데이타 분석: 시료의 방사성은 시료 1g당 1분간 분해도로서 표시된다. 이 수치는 시료 1g당 전체 올리고뉴클레오티드의 10-9몰-당량으로 데이타를 나타내기 위해서 방사성표시의 특이적 활성으로 구분하였고, 그리고나서 유기체 또는 조직당 투여되는 투여량의 퍼센트로 전환시켰다. 조직 밀도를 1g/mL로 가정했을 경우, nmol/g 데이타를 전체 μM 농도로 전환시켰다. 플라즈마, 간 또는 신장내에 있는 올리고뉴클레오티드의 농도를 각 시간별로 측정하기 위해서, 전체 μM 농도의 평균을 투여용액(82-97%)에서 본래의 올리고뉴클레오티드의 퍼센트로 나누고, 그리고 각 시간별로 CGE 또는 HPLC에 의해 결정되는 본래의 올리고뉴클레오티드의 평균 퍼센트를 곱했다. 그리고 상기 데이타를 이용하여 선형회귀분석으로 조직의 반감기를 측정하였고 다른 변성된 올리고뉴클레오티드의 플라즈마 파마코키네틱스(pharmacokinetics)를 비교하였다. 파마코키네틱 계수는 PCNONLIN 4.0을 사용하여 결정하였다(Statisticoll Consultants, Inc., Apex, NC). 데이타 검사후에, 한 구획(one-compartment)의 볼러스(bolus)를 넣고, 첫번째 나오는 결과물(output)을 모델로 선택하여 사용하였다.
동물 플라즈마 흡수 및 세포조직 분포 실험 결과를 도 9, 10, 11 및 12에 그래프로 나타내었다. 도 9에서 보듯이, 각각의 실험된 올리고뉴클레오티드의 플라즈마 농도는 24시간의 실험기간동안 초기 투여 레벨에서부터 점점 낮은 레벨로 감소하고 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 플라즈마 농도는 미결합(non-conjugate) 함유 포스포로티오에이트의 농도와 같은 레벨에서 유지되었다. 모든 실험 화합물은 도 10, 11 및 12에서 나타나듯이 플라즈마로부터 조직으로 흡수되었다. 본 발명의 모든 화합물은 여러 조직 사이에서 다른 분포를 보였다. 도 10에서는 ISIS 3082, 즉 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 동일시되는 대조부 올리고뉴클레오티드에 대한 분포 패턴을 나타낸다. 도 11은 본 발명의 제 1 화합물, 각각의 뉴클레오시드에서 2'-치환체를 가지며 ISIS 9045로 동일시되는 올리고뉴클레오티드에 대한 분포패턴을 나타낸다. 도 12는 본 발명의 또 다른 화합물인 측부에 있는 각각의 뉴클레오시드에 2'-치환체 및 포스포디에스테르 결합을 가지며, 중심부 또는 갭이 형성된 영역에 2'-데옥시, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드를 갖는 ISIS 9046으로 동일시되는 "갭이 형성된" 올리고뉴클레오티드에 대한 분포 패턴을 나타낸다.
실시예 30 : 2,2'-안히드로[1-(β-D-아라비노푸라노실)-5-메틸우리딘]
5-메틸우리딘(리보실티민, Yamasa, Choshi, Japan)(72.0g, 0.279M), 디페닐-카르보네이트 (90.0g, 0.420M) 및 소듐 비카르보네이트 (2.0g, 0.024M)을 DMF (300mL)에 부가하였다. 혼합물을 섞어서 가열하여 환류시키고, 분리된 이산화탄소가 제어된 방식으로 방출되도록 하였다. 1시간후, 약간 어두운 색의 용액이 감압하에서 농축되었다. 결과물 시럽을 디에틸에테르(2.5L)에 쏟아붓고 섞어주었다. 산물은 검(gum)을 만들었다. 에테르를 따라내고 잔류물은 최소한의 메탄올(ca. 400mL)에서 용해시켰다. 용액을 신선한 에테르(2.5L)에 부어서 응고된 검을 만들었다. 에테르를 따라내고 검은 진공오븐에서(1mmHg, 60℃에서 24시간동안) 건조시켜서 엷은 황갈색분말(57g, 85%)로 쪼개지는 고체를 내었다. NMR 스펙트럼은 나트륨염(ca. 5%)으로서 페놀로 염색시켰으며, 상기 구조와 일치하였다. 상기 물질을 다른 반응에 대해 사용하였다(또는 이는 하얀 고체(mp 222-4℃)를 내기 위하여 에틸 아세테이트(10-25%)에 메탄올을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 더욱 정제될 수 있다).
실시예 31 : 2'-O-메톡시에틸-5-메틸우리딘
2,2'-안히드로-5-메틸우리딘 (195g, 0.8,M), 트리스 (2-메톡시에틸)보레이트(231g, 0.98M) 및 2-메톡시에탄올 (1.2L)을 2L 스테인레스 스틸 압력 용기에 부가하고 160℃로 예열된 오일 배스에 놓았다. 155-160℃에서 48시간동안 가열한후, 용기를 열고 용액을 증발건조시키고, MeOH(200mL)로 세번째시켰다. 잔기는 뜨거운 아세톤(1L)에서 현탁시켰다. 불용성염을 여과시키고, 아세톤(150mL)으로 세척하여 여과증류시켰다. 잔기(280g)를 CH3CN(600mL)에 용해시키고 증발시켰다. 실리카 겔 칼럼(3㎏)은 0.5% Et3NH를 함유하는 CH2Cl2/아세톤/MeOH (20:5:3)에서 충전되었다. 잔기는 CH2Cl2(250mL)에 용해되어 칼럼에 입혀지기 전에 실리카(15g)로 흡수되었다. 생성물을 충전 용매로 추출하여 160g(63%)을 산출하였다. 불순물을 재작업함으로써 부가적 물질을 획득하였다.
실시예 32 : 2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸우리딘
2'-O-메톡시에틸-5-메틸우리딘 (160g, 0.506M)은 피리딘(250mL) 및 피리딘(1.3L)에 용해된 건조 잔기와 함께 증발되었다. 디메톡시트리틸 클로라이드 (94.3g, 0.278M)의 제 1 앨리컷을 부가하고, 혼합물은 상온에서 1시간동안 섞어주었다. 디메톡시트리틸 클로라이드 (94.3g, 0.278M)의 제 2 앨리컷을 부가하고, 한시간을 더 섞어주었다. 그리고 메탄올(170mL)을 부가하여 반응을 종결시켰다. HPLC는 약 70%의 산물이 있음을 보여 주었다. 용매를 증류시키고 CH3CN(200mL)으로 분쇄시켰다. 잔기는 CHCl3(1.5L)에 용해시키고 포화된 NaHCO32x500mL 및 포화된 NaCl 2x500mL로 추출하였다. 유기체상은 Na2SO4에 대해 건조시키고, 여과하여 증발시켰다. 잔기 275g을 획득하였다. 잔기를 3.5㎏ 실리카 겔 칼럼에서 정제시키고, 충전하여, 0.5% Et3NH를 함유하는 EtOAc/헥산/아세톤(5:5:1)으로 추출하였다. 순수 생성물 부분을 증발시켜서 산물 164g을 획득하였다. 총 183g (57%)을 산출한 불순 부분으로부터 부가적으로 약 20g을 획득하였다.
실시예 33: 3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸우리딘
2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸우리딘(106g, 0.167 M), DMF/피리딘 (DMF 562mL 및 피리딘 188mL로 제조된 3:1 혼합물 750mL) 및 아세틱 안히드라이드 (24.38mL, 0.258M)을 혼합하여 상온에서 24시간동안 섞어주었다. 반응을 tlc로 기록하였는데, MeOH을 tlc시료에 부가하여 처음으로 소멸(quenching)되는 것을 측정한다. tlc로 판단하여 반응이 종료하면, MeOH(50mL)를 부가하고 혼합물을 35℃에서 증발시켰다. 잔기를 CHCl3(800mL)에 용해시키고, 포화된 소듐 비카르보네이트 2x200mL 및 포화된 NaCl 2x200mL로 추출시켰다. 수분층은 CHCl3200mL로 재추출하였다. 결합된 유기체는 소듐 설페이트와 함께 증발건조시켜서 잔기 122g(약 90% 생성)을 산출하였다. 잔기를 3.5㎏ 실리카 겔 칼럼에서 정제시키고, EtOAc/헥산(4:1)을 이용하여 추출하였다. 순수생성물 부분을 증발시켜서 96g(84%)을 얻었다. 다음 부분에서 1.5g을 더 회수하였다.
실시예 34 : 3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸-4-트리아졸우리딘
3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸우리딘 (96g, 0.144M)을 CH3CN(700mL)에 용해시켜서 첫번째 용액을 제조하였다. 트리에틸아민 (189mL, 1.44M)을 CH3CN(1L)에 트리아졸(90g, 1.3M)이 용해된 용액에 부가시키고, -5℃로 냉각시켜서, 그리고 오버헤드 스터러(overhead stirrer)를 이용하여 0.5시간동안 섞어주었다. POCl3를 30분에 걸쳐서 소량씩 부가하여, 혼합용액을 0∼10℃로 유지시켰다. 첫번째 용액을 45분에 걸쳐서 소량씩 다음 용액에 부가하였다. 생성된 반응혼합물을 밤새동안 냉실(cold room)에 저장하였다. 반응 혼합물에서 염을 걸러내고, 용액을 증발시켰다. 잔기를 EtOAc(1L)에 용해시키고, 불용성 고체는 여과하여 제거하였다. 여과물은 NaHCO31x300mL 및 포화된 NaCl 2x300mL로 세척하여 소듐 설페이트와 함께 증발건조시켰다. 잔기는 상기 제목의 화합물을 산출하기 위하여 EtOAc로 분쇄하였다.
실시예 35 : 2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘
디옥산(500mL) 및 NH4OH(30mL)에 용해된 3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시-트리틸-5-메틸-4-트리아졸우리딘(103g, 0.141M) 용액을 상온에서 2시간동안 혼합시켰다. 디옥산 용액을 증발시키고 잔기는 MeOH(2x200mL)로 공비(azeotrope)시키고, 2L 스테인레스 스틸 압력용기로 옮겼다. NH3가스로 포화된 MeOH(400mL)를 부가하고 상기 용기를 2시간동안 100℃로 가열하였다(tlc가 완전한 전환을 나타냄). 용기내 내용물을 증발건조시키고, 잔기를 EtOAc(500mL)에 용해시켜서 포화 NaCl(200mL)로 한번 세척하였다. 유기체를 소듐설페이트로 건조시키고 용매는 증발시켜서 상기 제목의 화합물을 85g(95%) 획득하였다.
실시예 36 : N4-벤조일-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘
2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘 (85g, 0.134M)을 DMF(800mL)에 용해시키고 벤조익 안히드라이드 (37.2g, 0.165M)를 부가하여 혼합시켰다. 3시간동안 혼합한 후에, tlc는 반응이 약 95% 완료되었음을 나타내었다. 용매를 증발시키고 잔기는 MeOH (200mL)와 공비시켰다. 잔기를 CHCl3(700mL)에 용해시키고 포화 NaHCO3(2x300mL) 및 포화 NaCl(2x300mL)로 추출하였으며, MgSO4로 증발건조하여 잔기(96g)를 산출하였다. 잔기는 추출용매로 0.5% Et3NH를 함유하는 EtOAc/헥산(1:1)을 사용하여 1.5㎏ 실리카 칼럼에서 크로마토그래프를 나타내었다. 순수 산출물의 부분은 증발시켜 상기 제목의 화합물 90g(90%)을 획득하였다.
실시예 37 : N4-벤조일-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘-3'-아미디트
N4-벤조일-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘 (74g, 0.10M)을 CH2Cl2(1L)에 용해시켰다. 테트라졸 디이소프로필아민(7.1g) 및 2-시아노에톡시-테트라-(이소프로필)포스파이트 (40.5mL, 0.123 M)을 질소 기압하에서 부가하여 혼합하였다. 생성된 혼합물을 상온에서 20시간동안 혼합시켰다(tlc는 반응이 95% 완결됨을 나타냄). 반응 혼합물을 포화 NaHCO3(1x300mL) 및 포화 NaCl(3x300mL)로 추출하였다. 수용성 침전물은 CH2Cl2(300mL)로 재추출하였고, 추출물은 결합하여, MgSO4로 건조, 농축시켰다. 획득된 잔기는 추출용매로 EtOAc/헥산(3:1)을 사용하여 1.5㎏ 실리카 칼럼에 크로마토그래프를 나타내었다. 순수 산출물의 부분은 결합하여 상기 제목의 화합물 90.6g(87%)을 획득하였다.
서열 목록
(1) 일반적 정보 :
(ⅰ) 출원인 : 아이시스 파마슈티칼스, Inc. & 노바르티스 AG
(ⅱ) 발명의명칭 : 당-변형되어 갭(gap)이 형성된 올리고뉴클레오티드
(ⅲ) 염기서열의 수 : 32
(ⅳ) 서신 주소 :
(A) 주소 : 우드콕 워시번 커르쯔 맥키에위쯔 앤드 노리스
(B) 거리 : 원 리버티 플래이스-46트 플로어
(C) 도시 : 필라델피아
(D) 주 : PA
(E) 나라 : 미국
(F) 우편번호 : 19103
(ⅴ) 컴퓨터 가독 형태
(A) 매체 형태 : 3.5인치 디스크, 720kb 용량
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성
(C) 작동시스템 : PC-DOS/MS DOS
(D) 소프트웨어 : WordPerfect 5.1
(ⅵ) 현재 출원 자료 :
(A) 출원번호 : N/A
(B) 출원일 : 첨부
(C) 분류 : N/A
(ⅶ) 선행 출원 자료 :
(A) 출원번호 : 60,011,620
(B) 출원일 : 1996. 2. 14
(ⅷ) 대리인 정보 :
(A) 성명 : 조셉 루씨
(B) 등록번호 : 33,307
(C) 참고번호 :
(ⅸ) 원거리 통신 정보 :
(A) 전화 : (215)568-3100
(B) 팩스 : (215)568-3439
(2) 서열 1에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 길이 : 17 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태(Strandedness) : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
CCACACCGAC GGCGCCC
(2) 서열 2에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 20 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
CTTATATTCC GTCATCGCTC
(2) 서열 3에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 20 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
TCCGTCATCG CTCCTCAGGG
(2) 서열 4에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 20 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
AAAACGTCAG CCATGGTCCC
(2) 서열 5에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 18 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
TTCTCGCTGG TGAGTTTC
(2) 서열 6에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 17 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
TCTCGCTGGT GAGTTTC
(2) 서열 7에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 20 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부: 안티센스임
TCCCGCCTGT GACATGCATT
(2) 서열 8에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 20 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
TCCTCCTCCC CGCGGCGGGT
(2) 서열 9에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 20 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
CTCGCCCGCT CCTCCTCCCC
(2) 서열 10에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 20 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
TTCTCGCCCG CTCCTCCTCC
(2) 서열 11에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 20 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부: 안티센스임
TTCTCCTCCT CCCCTGGCAG
(2) 서열 12에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 20 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
CTGGCTTCTC CTCCTCCCCT
(2) 서열 13에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 20 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
CCTGCTGGCT TCTCCTCCTC
(2) 서열 14에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 20 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
TCTGGCGCTG CACCACTCTC
(2) 서열 15에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 47 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스 아님
ACATTATGCT AGCTTTTTGA GTAAACTTGT GGGGCAGGAG ACCCTGT
(2) 서열 16에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 29 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
GAGATCTGAA GCTTCTGGAT GGTCAGCGC
(2) 서열 17에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 35 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스 아님
GAGATCTGAA GCTTGAAGAC GCCAAAAACA TAAAG
(2) 서열 18에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 33 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
ACGCATCTGG CGCGCCGATA CCGTCGACCT CGA
(2) 서열 19에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 20 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
CGGGAGGCGG TCACATTCGG
(2) 서열 20에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 20 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
UAGGAGAUGC CUAAGGCUUU
(2) 서열 21에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 20 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
GCUAUGUCGA CACCCAAUUC
(2) 서열 22에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 18 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
CAUAGGAGAU GCCUAAGGCT
(2) 서열 23에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 21 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
GCGUUTGCTC TTCTTCUUGC G
(2) 서열 24에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 21 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
GCGUUUGCTC TTCTUCUUGC G
(2) 서열 25에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 20 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
GTACCACAAG GCCTTTCGCG
(2) 서열 26에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 20 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
GTGCTCATGG TGCACGGTCT
(2) 서열 27에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 20 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
UGCATCCCCC AGGCCACCAT
(2) 서열 28에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 16 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
GCGTTTTTTT TTTGCG
(2) 서열 29에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 19 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
CGCAAAAAAA AAAAAACGC
(2) 서열 30에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 20 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
AAAACGTCAG CCATGGTCCC
(2) 서열 31에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 20 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
CCCCAACCAC CTCTTGCTCC
(2) 서열 32에 대한 정보
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이 : 20 염기
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드형태 : 단일형
(D) 위상 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
GAGACCCTGA ACAGTTGATC
Claims (14)
- 선형 염기서열의 공유결합된 뉴클레오시드 단위로 이루어지는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드에 있어서,상기 염기서열은 2'-O-CH2-CH2-O-CH3당 부(moiety)를 함유하는 제 1 뉴클레오시드 하부염기서열 및 2'-데옥시 당 부를 함유하는 제 2 뉴클레오시드 하부염기서열로 이루어지고; 그리고상기 제 1 하부염기서열 및 제 2 하부염기서열의 뉴클레오시드 단위는 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 결합에 의해 공유결합되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 하부염기서열 및 제 2 하부염기서열의 상기 뉴클레오시드 단위는 포스포로티오에이트 결합에 의해 공유결합되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 하부염기서열의 상기 뉴클레오시드 단위는 포스포디에스테르 결합에 의해 공유결합되고, 상기 제 2 하부염기서열의 상기 뉴클레오시드 단위는 포스포로티오에이트 결합에 의해 공유결합되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 하부염기서열의 상기 뉴클레오시드 단위는 포스포로티오에이트 결합에 의해 공유결합되고, 상기 제 2 하부염기서열의 상기 뉴클레오시드 단위는 포스포디에스테르 결합에 의해 공유결합되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제 2 하부염기서열은 3 이상의 뉴클레오시드 단위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제 2 하부염기서열은 5 이상의 뉴클레오시드 단위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
- 제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 5 내지 50의 뉴클레오시드 단위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
- 제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 2'-O-CH2-CH2- O-CH3당 부를 함유하는 제 3 뉴클레오시드 하부염기서열을 더 포함하며, 상기 제 2 하부염기서열은 상기 제 1 하부염기서열 및 상기 제 3 하부염기서열 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
- 제 8 항에 있어서, 상기 제 1 하부염기서열, 제 2 하부염기서열 및 제 3 하부염기서열의 상기 뉴클레오시드 단위는 포스포로티오에이트 결합에 의해 공유결합되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
- 제 8 항에 있어서, 상기 제 1 하부염기서열 및 제 3 하부염기서열의 상기 뉴클레오시드 단위는 포스포디에스테르 결합에 의해 공유결합되고, 상기 제 2 하부염기서열의 상기 뉴클레오시드 단위는 포스포로티오에이트 결합에 의해 공유결합되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
- 제 8 항에 있어서, 상기 제 1 하부염기서열 및 제 3 하부염기서열의 상기 뉴클레오시드 단위는 포스포로티오에이트 결합에 의해 공유결합되고, 상기 제 2 하부염기서열의 상기 뉴클레오시드 단위는 포스포디에스테르 결합에 의해 공유결합되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
- 제 8 항에 있어서, 상기 제 2 하부염기서열은 3 이상의 뉴클레오시드 단위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
- 제 8 항에 있어서, 상기 제 2 하부염기서열은 5 이상의 뉴클레오시드 단위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
- 제 8 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 5 내지 50의 뉴클레오시드 단위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US1162096P | 1996-02-14 | 1996-02-14 | |
| US60/011,620 | 1996-02-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR19990082476A true KR19990082476A (ko) | 1999-11-25 |
Family
ID=21751248
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019980706209A KR19990082476A (ko) | 1996-02-14 | 1997-02-07 | 당-변형되어 갭이 형성된 올리고뉴클레오티드 |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6451991B1 (ko) |
| EP (1) | EP0882061B1 (ko) |
| JP (1) | JP4293636B2 (ko) |
| KR (1) | KR19990082476A (ko) |
| CN (1) | CN1214688A (ko) |
| AT (1) | ATE267207T1 (ko) |
| AU (1) | AU725262B2 (ko) |
| BR (1) | BR9707529A (ko) |
| CA (2) | CA2246229C (ko) |
| CZ (1) | CZ243498A3 (ko) |
| DE (1) | DE69729179T2 (ko) |
| DK (1) | DK0882061T3 (ko) |
| ES (1) | ES2221039T3 (ko) |
| HU (1) | HUP9901118A3 (ko) |
| IL (1) | IL125759A0 (ko) |
| NO (1) | NO983718L (ko) |
| NZ (1) | NZ331217A (ko) |
| PL (1) | PL328563A1 (ko) |
| SK (1) | SK109198A3 (ko) |
| TR (1) | TR199801581T2 (ko) |
| WO (1) | WO1997030067A1 (ko) |
| ZA (1) | ZA971208B (ko) |
Families Citing this family (121)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6346614B1 (en) * | 1992-07-23 | 2002-02-12 | Hybridon, Inc. | Hybrid oligonucleotide phosphorothioates |
| DE60037938T2 (de) | 1999-02-26 | 2009-01-29 | The University Of British Columbia, Vancouver | Antisense-therapie für trpm-2 |
| US7569551B2 (en) | 2000-02-25 | 2009-08-04 | The University Of British Columbia | Chemo- and radiation-sensitization of cancer by antisense TRPM-2 oligodeoxynucleotides |
| ES2336887T5 (es) | 2000-03-30 | 2019-03-06 | Whitehead Inst Biomedical Res | Mediadores de interferencia por ARN específicos de secuencias de ARN |
| EP1191097A1 (en) | 2000-09-21 | 2002-03-27 | Leids Universitair Medisch Centrum | Induction of exon skipping in eukaryotic cells |
| DK2813582T3 (en) | 2000-12-01 | 2017-07-31 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wss E V | Small RNA molecules that mediate RNA interference |
| US20030158143A1 (en) * | 2002-01-17 | 2003-08-21 | Martin Gleave | Bispecific antisense olignucleotides that inhibit IGFBP-2 and IGFBP-5 and methods of using same |
| AU2003225410A1 (en) | 2003-03-21 | 2004-10-11 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure |
| WO2005030260A1 (en) * | 2003-10-01 | 2005-04-07 | The University Of British Columbia | Bispecific oligonucleotide for the treatment of cns malignancies |
| KR101147147B1 (ko) | 2004-04-01 | 2012-05-25 | 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 | Ｒｎａ 간섭의 오프 타겟 효과 감소를 위한 변형된폴리뉴클레오타이드 |
| WO2005094899A1 (en) | 2004-04-02 | 2005-10-13 | The University Of British Columbia | Clusterin antisense therapy for treatment of cancer |
| USRE48960E1 (en) | 2004-06-28 | 2022-03-08 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| HUE028632T2 (en) | 2004-06-28 | 2016-12-28 | Univ Western Australia | To skip an antisense oligonucleotide exon and use it for procedures |
| US7935811B2 (en) | 2004-11-22 | 2011-05-03 | Dharmacon, Inc. | Apparatus and system having dry gene silencing compositions |
| US7923207B2 (en) | 2004-11-22 | 2011-04-12 | Dharmacon, Inc. | Apparatus and system having dry gene silencing pools |
| US20060166234A1 (en) | 2004-11-22 | 2006-07-27 | Barbara Robertson | Apparatus and system having dry control gene silencing compositions |
| US20080014198A1 (en) * | 2004-11-23 | 2008-01-17 | The University Of British Columbia | Treatment of Cancer With a Combination of an Agent that Perturbs the EGF Signaling Pathway and an Oligonucleotide that Reduces Clusterin Levels |
| WO2007087113A2 (en) | 2005-12-28 | 2007-08-02 | The Scripps Research Institute | Natural antisense and non-coding rna transcripts as drug targets |
| WO2007123391A1 (en) | 2006-04-20 | 2007-11-01 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Therapeutic intervention in a genetic disease in an individual by modifying expression of an aberrantly expressed gene. |
| EP1857548A1 (en) | 2006-05-19 | 2007-11-21 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Means and method for inducing exon-skipping |
| WO2007139943A2 (en) * | 2006-05-26 | 2007-12-06 | Ico Therapeutics Inc. | Therapeutic drug combinations and delivery systems comprising c-raf kinase antisense polynucleotides for treating ocular diseases and disorders |
| PL2049664T3 (pl) | 2006-08-11 | 2012-02-29 | Biomarin Tech Bv | Jednoniciowe oligonukleotydy komplementarne do powtarzalnych elementów do leczenia chorób genetycznych związanych z niestabilnością powtórzeń DNA |
| WO2008036825A2 (en) | 2006-09-22 | 2008-03-27 | Dharmacon, Inc. | Duplex oligonucleotide complexes and methods for gene silencing by rna interference |
| WO2009008727A2 (en) | 2007-07-12 | 2009-01-15 | Prosensa Technologies B.V. | Molecules for targeting compounds to various selected organs or tissues |
| USRE48468E1 (en) | 2007-10-26 | 2021-03-16 | Biomarin Technologies B.V. | Means and methods for counteracting muscle disorders |
| ES2564563T3 (es) | 2007-10-26 | 2016-03-23 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Medios y métodos para contrarrestar trastornos del músculo |
| JP2011510678A (ja) | 2008-02-08 | 2011-04-07 | プロセンサ ホールディング ビーブイ | Ｄｎａ反復不安定性関連遺伝性障害を治療するための方法及び手段 |
| US8188060B2 (en) | 2008-02-11 | 2012-05-29 | Dharmacon, Inc. | Duplex oligonucleotides with enhanced functionality in gene regulation |
| EP2119783A1 (en) | 2008-05-14 | 2009-11-18 | Prosensa Technologies B.V. | Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means |
| ES2727549T3 (es) | 2008-10-03 | 2019-10-17 | Curna Inc | Tratamiento de las enfermedades relacionadas con la apolipoproteína a1 por inhibición del transcrito antisentido natural a la apolipoproteína a1 |
| DK3133160T3 (en) | 2008-10-24 | 2019-04-01 | Sarepta Therapeutics Inc | EXON SKIP COMPOSITIONS FOR DMD |
| US8883752B2 (en) * | 2008-10-24 | 2014-11-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 5′ and 2′ BIS-substituted nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom |
| KR101840618B1 (ko) | 2008-12-04 | 2018-03-20 | 큐알엔에이, 인크. | 종양 억제 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 종양 억제 유전자 관련된 질환의 치료 |
| US8927511B2 (en) | 2008-12-04 | 2015-01-06 | Curna, Inc. | Treatment of vascular endothelial growth factor (VEGF) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to VEGF |
| MX2011005910A (es) | 2008-12-04 | 2011-06-17 | Opko Curna Llc | Tratamiento de enfermedades relacionadas con eritropoyetina (epo) mediante inhibicion del transcrito antisentido natural a eritropoyetina. |
| CN102387817B (zh) | 2009-02-12 | 2018-01-30 | 库尔纳公司 | 通过抑制针对脑衍生神经营养因子(bdnf)的天然反义转录物来治疗bdnf相关的疾病 |
| EP2408919B1 (en) | 2009-03-16 | 2017-10-18 | CuRNA, Inc. | Treatment of nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (nrf2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nrf2 |
| CA2755404C (en) | 2009-03-17 | 2020-03-24 | Joseph Collard | Treatment of delta-like 1 homolog (dlk1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlk1 |
| AU2010239779A1 (en) | 2009-04-24 | 2011-11-17 | Prosensa Technologies B.V. | Oligonucleotide comprising an inosine for treating DMD |
| CN102803492B (zh) | 2009-05-06 | 2016-06-29 | 库尔纳公司 | 通过抑制针对三重四脯氨酸(ttp)的天然反义转录物来治疗ttp相关疾病 |
| EP2427553A4 (en) | 2009-05-06 | 2012-11-07 | Opko Curna Llc | TREATMENT OF LIPID TRANSPORT AND METABOLISM-RELATED DISEASES BY INHIBITING THE NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT AGAINST A LIPID TRANSPORT AND METABOLIC TREATMENT |
| KR101742334B1 (ko) | 2009-05-08 | 2017-06-01 | 큐알엔에이, 인크. | Ｄｍｄ 패밀리에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 디스트로핀 패밀리 관련된 질환의 치료 |
| DK2432881T3 (en) | 2009-05-18 | 2018-02-26 | Curna Inc | TREATMENT OF REPROGRAMMING FACTOR-RELATED DISEASES BY INHIBITING NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPTS TO A REPROGRAMMING FACTOR |
| US8895527B2 (en) | 2009-05-22 | 2014-11-25 | Curna, Inc. | Treatment of transcription factor E3 (TFE3) and insulin receptor substrate 2(IRS2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to TFE3 |
| WO2010138806A2 (en) | 2009-05-28 | 2010-12-02 | Curna, Inc. | Treatment of antiviral gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an antiviral gene |
| KR101801404B1 (ko) | 2009-06-16 | 2017-12-20 | 큐알엔에이, 인크. | 콜라겐 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 콜라겐 유전자 관련된 질환의 치료 |
| US8951981B2 (en) | 2009-06-16 | 2015-02-10 | Curna, Inc. | Treatment of paraoxonase 1 (PON1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to PON1 |
| KR101807323B1 (ko) | 2009-06-24 | 2017-12-08 | 큐알엔에이, 인크. | Ｔｎｆｒ2에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 종양 괴사 인자 수용체 2(ｔｎｆｒ2) 관련된 질환의 치료 |
| CA2765815A1 (en) | 2009-06-26 | 2010-12-29 | Opko Curna, Llc | Treatment of down syndrome gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a down syndrome gene |
| EP2451969A2 (en) | 2009-07-07 | 2012-05-16 | University Of Southern California | Biomarkers for the early detection of autoimmune diseases |
| US20120252869A1 (en) | 2009-07-24 | 2012-10-04 | Opko Curna, Llc | Treatment of sirtuin (sirt) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a sirtuin (sirt) |
| ES2585360T3 (es) | 2009-08-05 | 2016-10-05 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con un gen de la insulina (INS) por inhibición de la transcripción antisentido natural en un gen de la insulina (INS) |
| CN104313027B (zh) | 2009-08-11 | 2018-11-20 | 库尔纳公司 | 通过抑制脂连蛋白(adipoq)的天然反义转录物治疗脂连蛋白(adipoq)相关疾病 |
| KR101805213B1 (ko) | 2009-08-21 | 2017-12-06 | 큐알엔에이, 인크. | Ｃｈｉｐ에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 “ｈｓｐ70-상호작용 단백질(ｃｈｉｐ)의 ｃ-말단” 관련된 질환의 치료 |
| JP5964232B2 (ja) | 2009-08-25 | 2016-08-03 | カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド | ‘ｉｑモチーフ含有ｇｔｐアーゼ活性化タンパク質’（ｉｑｇａｐ）に対する天然アンチセンス転写産物の阻害によるｉｑｇａｐ関連疾患の治療 |
| CA2775111C (en) | 2009-09-25 | 2019-12-31 | Opko Curna, Llc | Treatment of filaggrin (flg) related diseases by modulation of flg expression and activity |
| KR102239374B1 (ko) | 2009-11-12 | 2021-04-14 | 더 유니버시티 오브 웨스턴 오스트레일리아 | 안티센스 분자 및 이를 이용한 질환 치료방법 |
| CA2782366A1 (en) | 2009-12-16 | 2011-07-14 | Opko Curna, Llc | Treatment of membrane bound transcription factor peptidase, site 1 (mbtps1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to mbtps1 |
| CA2782373C (en) | 2009-12-23 | 2019-03-26 | Opko Curna, Llc | Treatment of hepatocyte growth factor (hgf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to hgf |
| EP2515947B1 (en) | 2009-12-23 | 2021-10-06 | CuRNA, Inc. | Treatment of uncoupling protein 2 (ucp2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ucp2 |
| EP2519634B1 (en) | 2009-12-29 | 2016-06-01 | CuRNA, Inc. | TREATMENT OF TUMOR PROTEIN 63 (p63) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO p63 |
| EP2519633B1 (en) | 2009-12-29 | 2017-10-25 | CuRNA, Inc. | Treatment of nuclear respiratory factor 1 (nrf1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nrf1 |
| DK2519632T3 (en) | 2009-12-31 | 2018-07-23 | Curna Inc | TREATMENT OF INSULIN RECEPTOR SUBSTRATE 2- (IRS2) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPTION TO IRS2 AND TRANSCRIPTION FACTOR E3 (TFE3) |
| JP5886757B2 (ja) | 2010-01-04 | 2016-03-16 | カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド | インターフェロン調節因子８（ｉｒｆ８）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるインターフェロン調節因子８（ｉｒｆ８）関連疾患の治療 |
| US8912157B2 (en) | 2010-01-06 | 2014-12-16 | Curna, Inc. | Treatment of pancreatic developmental gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a pancreatic developmental gene |
| US9200277B2 (en) | 2010-01-11 | 2015-12-01 | Curna, Inc. | Treatment of sex hormone binding globulin (SHBG) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to SHBG |
| DK2529015T3 (en) | 2010-01-25 | 2018-02-26 | Curna Inc | TREATMENT OF RNASE H1-RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO RNASE H1 |
| JP5976548B2 (ja) | 2010-02-22 | 2016-08-23 | カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド | Ｐｙｃｒ１に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるピロリン−５−カルボン酸レダクターゼ１（ｐｙｃｒ１）関連疾患の治療 |
| US9427429B2 (en) | 2010-03-01 | 2016-08-30 | Tau Therapeutics Llc | Cancer diagnosis and imaging |
| WO2011112516A1 (en) * | 2010-03-08 | 2011-09-15 | Ico Therapeutics Inc. | Treating and preventing hepatitis c virus infection using c-raf kinase antisense oligonucleotides |
| CA2795145C (en) | 2010-04-02 | 2019-01-22 | Curna, Inc. | Treatment of colony-stimulating factor 3 (csf3) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to csf3 |
| KR101900962B1 (ko) | 2010-04-09 | 2018-09-20 | 큐알엔에이, 인크. | 섬유아세포 성장 인자 21 (ｆｇｆ21)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 섬유아세포 성장 인자 21 (ｆｇｆ21) 관련된 질환의 치료 |
| KR101936011B1 (ko) | 2010-05-03 | 2019-01-07 | 큐알엔에이, 인크. | 시르투인 (sirt)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 시르투인 (sirt) 관련된 질환의 치료 |
| TWI531370B (zh) | 2010-05-14 | 2016-05-01 | 可娜公司 | 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病 |
| KR101902197B1 (ko) | 2010-05-26 | 2018-10-01 | 큐알엔에이, 인크. | 메티오닌 설폭시드 환원효소 a (msra)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 메티오닌 설폭시드 환원효소 a (msra) 관련된 질환의 치료 |
| WO2011150005A2 (en) | 2010-05-26 | 2011-12-01 | Opko Curna Llc | Treatment of atonal homolog 1 (atoh1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to atoh1 |
| WO2011163499A2 (en) | 2010-06-23 | 2011-12-29 | Opko Curna, Llc | Treatment of sodium channel, voltage-gated, alpha subunit (scna) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to scna |
| JP5998131B2 (ja) | 2010-07-14 | 2016-09-28 | カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド | Ｄｉｓｃｓｌａｒｇｅｈｏｍｏｌｏｇ（ｄｌｇ）ｄｌｇ１への天然アンチセンス転写物の阻害によるｄｌｇ関連疾患の治療 |
| KR101886457B1 (ko) | 2010-10-06 | 2018-08-07 | 큐알엔에이, 인크. | 시알리다아제 4 (neu4)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 neu4 관련된 질환의 치료 |
| JP6049623B2 (ja) | 2010-10-22 | 2016-12-21 | カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド | α‐Ｌ‐イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）への天然アンチセンス転写物の阻害によるＩＤＵＡ関連疾患の治療 |
| US9920317B2 (en) | 2010-11-12 | 2018-03-20 | The General Hospital Corporation | Polycomb-associated non-coding RNAs |
| AU2011325956B2 (en) | 2010-11-12 | 2016-07-14 | The General Hospital Corporation | Polycomb-associated non-coding RNAs |
| US10000752B2 (en) | 2010-11-18 | 2018-06-19 | Curna, Inc. | Antagonat compositions and methods of use |
| CA2818824A1 (en) | 2010-11-23 | 2012-05-31 | Joseph Collard | Treatment of nanog related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nanog |
| RU2620980C2 (ru) | 2011-06-09 | 2017-05-30 | Курна, Инк. | Лечение заболеваний, связанных с фратаксином (fxn), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта fxn |
| EA029151B1 (ru) | 2011-09-06 | 2018-02-28 | Курна, Инк. | ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С АЛЬФА-СУБЪЕДИНИЦАМИ ПОТЕНЦИАЛЗАВИСИМЫХ НАТРИЕВЫХ КАНАЛОВ (SCNxA), С ПОМОЩЬЮ МАЛЫХ МОЛЕКУЛ |
| US20130064814A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-14 | Lloyd S. Gray | Antagonists of products of the hs.459642 unigene cluster for the inhibition of proliferation, development or differentiation of stem cells including cancer stem cells |
| US9580708B2 (en) | 2011-09-14 | 2017-02-28 | Rana Therapeutics, Inc. | Multimeric oligonucleotides compounds |
| CA2862628C (en) | 2012-01-27 | 2021-08-24 | Prosensa Technologies B.V. | Rna modulating oligonucleotides with improved characteristics for the treatment of duchenne and becker muscular dystrophy |
| WO2013138374A2 (en) | 2012-03-15 | 2013-09-19 | Curna, Inc. | Treatment of brain derived neurotrophic factor (bdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to bdnf |
| WO2013173608A1 (en) | 2012-05-16 | 2013-11-21 | Rana Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating mecp2 expression |
| JP2015518710A (ja) | 2012-05-16 | 2015-07-06 | ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド | ヘモグロビン遺伝子ファミリー発現を調節するための組成物及び方法 |
| EA201492123A1 (ru) | 2012-05-16 | 2015-10-30 | Рана Терапьютикс, Инк. | Композиции и способы для модулирования экспрессии семейства генов smn |
| US10837014B2 (en) | 2012-05-16 | 2020-11-17 | Translate Bio Ma, Inc. | Compositions and methods for modulating SMN gene family expression |
| KR20160074368A (ko) | 2012-05-16 | 2016-06-28 | 라나 테라퓨틱스, 인크. | Utrn 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법 |
| CA2873766A1 (en) | 2012-05-16 | 2013-11-21 | Rana Therapeutics Inc. | Compositions and methods for modulating atp2a2 expression |
| AU2013315225B2 (en) | 2012-09-14 | 2018-11-08 | Translate Bio Ma, Inc. | Multimeric oligonucleotide compounds |
| WO2014100602A1 (en) | 2012-12-20 | 2014-06-26 | Hospital For Special Surgery | Treatment of egf-receptor dependent pathologies |
| CA2906209A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Exon skipping compositions for treating muscular dystrophy targeting the annealing site h44a (-07+15) |
| US9506058B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-11-29 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Compositions for treating muscular dystrophy |
| WO2015023941A1 (en) | 2013-08-16 | 2015-02-19 | Rana Therapeutics, Inc. | Oligonucleotides targeting euchromatin regions of genes |
| WO2015048531A1 (en) | 2013-09-26 | 2015-04-02 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Inhibition of sgk1 in the treatment of heart conditions |
| US10272058B2 (en) | 2014-03-20 | 2019-04-30 | Cymabay Therapeutics, Inc. | Treatment of intrahepatic cholestatic diseases |
| MX367478B (es) | 2014-03-20 | 2019-08-23 | Cymaby Therapeutics Inc | Tratamiento de enfermedades colestasicas intrahepaticas. |
| CA2944139C (en) | 2014-04-11 | 2020-11-03 | Cymabay Therapeutics, Inc. | Treatment of nafld and nash |
| GB201410693D0 (en) | 2014-06-16 | 2014-07-30 | Univ Southampton | Splicing modulation |
| AU2015327836B2 (en) | 2014-10-03 | 2021-07-01 | Cold Spring Harbor Laboratory | Targeted augmentation of nuclear gene output |
| CA2966044A1 (en) | 2014-10-30 | 2016-05-06 | The General Hospital Corporation | Methods for modulating atrx-dependent gene repression |
| US10758558B2 (en) | 2015-02-13 | 2020-09-01 | Translate Bio Ma, Inc. | Hybrid oligonucleotides and uses thereof |
| WO2016149455A2 (en) | 2015-03-17 | 2016-09-22 | The General Hospital Corporation | The rna interactome of polycomb repressive complex 1 (prc1) |
| WO2017060731A1 (en) | 2015-10-09 | 2017-04-13 | University Of Southampton | Modulation of gene expression and screening for deregulated protein expression |
| US11273218B2 (en) | 2015-10-22 | 2022-03-15 | Cavion, Inc. | Methods for treating Angelman syndrome and related disorders |
| US11096956B2 (en) | 2015-12-14 | 2021-08-24 | Stoke Therapeutics, Inc. | Antisense oligomers and uses thereof |
| EP3933041B1 (en) | 2015-12-14 | 2024-01-31 | Cold Spring Harbor Laboratory | Antisense oligomers for treatment of autosomal dominant retardation |
| JOP20200228A1 (ar) | 2015-12-21 | 2017-06-16 | Novartis Ag | تركيبات وطرق لخفض تعبير البروتين tau |
| CN110545806A (zh) | 2017-02-15 | 2019-12-06 | 卡维昂公司 | 钙通道抑制剂 |
| SG11201909960UA (en) | 2017-04-26 | 2019-11-28 | Cavion Inc | Methods for improving memory and cognition and for treating memory and cognitive disorders |
| CN107460219B (zh) * | 2017-07-24 | 2020-04-10 | 武汉大学 | 一种差异核酸酶切方法及其在LC-MS法检测mRNA内部修饰中的应用 |
| SI3673080T1 (sl) | 2017-08-25 | 2024-03-29 | Stoke Therapeutics, Inc. | Protismiselni oligomeri za zdravljenje bolezenskih stanj in bolezni |
| WO2020072773A1 (en) | 2018-10-03 | 2020-04-09 | Cavion, Inc. | Treating essential tremor using (r)-2-(4-isopropylphenyl)-n-(1-(5-(2,2,2-trifluoroethoxy)pyridin-2-yl)ethyl)acetamide |
| JP2023525799A (ja) | 2020-05-11 | 2023-06-19 | ストーク セラピューティクス，インク． | 状態及び疾患の治療のためのｏｐａ１アンチセンスオリゴマー |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3687808A (en) | 1969-08-14 | 1972-08-29 | Univ Leland Stanford Junior | Synthetic polynucleotides |
| DE3788914T2 (de) | 1986-09-08 | 1994-08-25 | Ajinomoto Kk | Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere. |
| EP0339842B1 (en) | 1988-04-27 | 1996-11-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Novel oligoribonucleotide derivatives and application thereof to antiviral agents |
| US5256775A (en) | 1989-06-05 | 1993-10-26 | Gilead Sciences, Inc. | Exonuclease-resistant oligonucleotides |
| US5149797A (en) | 1990-02-15 | 1992-09-22 | The Worcester Foundation For Experimental Biology | Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides |
| AU661662B2 (en) | 1990-08-13 | 1995-08-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
| WO1992022651A1 (en) | 1991-06-14 | 1992-12-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide inhibition of the ras gene |
| DE4216134A1 (de) * | 1991-06-20 | 1992-12-24 | Europ Lab Molekularbiolog | Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen |
| US5948898A (en) * | 1992-03-16 | 1999-09-07 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methoxyethoxy oligonucleotides for modulation of protein kinase C expression |
| CA2140428C (en) | 1992-07-23 | 2003-07-08 | Daniel Peter Claude Mcgee | Novel 2'-o-alkyl nucleosides and phosphoramidites processes for the preparation and uses thereof |
| US5652355A (en) | 1992-07-23 | 1997-07-29 | Worcester Foundation For Experimental Biology | Hybrid oligonucleotide phosphorothioates |
| TW244371B (ko) | 1992-07-23 | 1995-04-01 | Tri Clover Inc | |
| EP0626387B1 (de) * | 1993-05-12 | 1999-03-10 | Novartis AG | Nukleoside und Oligonukleotide mit 2'-Ethergruppen |
| US5627053A (en) * | 1994-03-29 | 1997-05-06 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid |
-
1997
- 1997-02-07 JP JP52941297A patent/JP4293636B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-07 SK SK1091-98A patent/SK109198A3/sk unknown
- 1997-02-07 AT AT97907581T patent/ATE267207T1/de active
- 1997-02-07 CZ CZ982434A patent/CZ243498A3/cs unknown
- 1997-02-07 CA CA2246229A patent/CA2246229C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-07 CA CA2749312A patent/CA2749312A1/en not_active Abandoned
- 1997-02-07 WO PCT/US1997/002043 patent/WO1997030067A1/en active IP Right Grant
- 1997-02-07 EP EP97907581A patent/EP0882061B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-07 DK DK97907581T patent/DK0882061T3/da active
- 1997-02-07 AU AU19552/97A patent/AU725262B2/en not_active Ceased
- 1997-02-07 TR TR1998/01581T patent/TR199801581T2/xx unknown
- 1997-02-07 HU HU9901118A patent/HUP9901118A3/hu unknown
- 1997-02-07 KR KR1019980706209A patent/KR19990082476A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-02-07 CN CN97193129A patent/CN1214688A/zh active Pending
- 1997-02-07 DE DE69729179T patent/DE69729179T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-07 NZ NZ331217A patent/NZ331217A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-02-07 BR BR9707529-9A patent/BR9707529A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-02-07 IL IL12575997A patent/IL125759A0/xx unknown
- 1997-02-07 ES ES97907581T patent/ES2221039T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-07 PL PL97328563A patent/PL328563A1/xx unknown
- 1997-02-11 US US08/802,331 patent/US6451991B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-13 ZA ZA9701208A patent/ZA971208B/xx unknown
-
1998
- 1998-08-13 NO NO983718A patent/NO983718L/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL328563A1 (en) | 1999-02-01 |
| BR9707529A (pt) | 2000-01-04 |
| SK109198A3 (en) | 1999-06-11 |
| EP0882061A4 (en) | 2000-12-13 |
| JP4293636B2 (ja) | 2009-07-08 |
| CA2246229A1 (en) | 1997-08-21 |
| CN1214688A (zh) | 1999-04-21 |
| TR199801581T2 (xx) | 1998-10-21 |
| JP2000504725A (ja) | 2000-04-18 |
| DE69729179T2 (de) | 2004-12-30 |
| NZ331217A (en) | 2000-02-28 |
| DK0882061T3 (da) | 2004-09-27 |
| CA2246229C (en) | 2011-08-23 |
| NO983718D0 (no) | 1998-08-13 |
| CZ243498A3 (cs) | 1999-09-15 |
| HUP9901118A3 (en) | 2000-06-28 |
| ES2221039T3 (es) | 2004-12-16 |
| ATE267207T1 (de) | 2004-06-15 |
| AU1955297A (en) | 1997-09-02 |
| HUP9901118A2 (hu) | 1999-07-28 |
| EP0882061A1 (en) | 1998-12-09 |
| IL125759A0 (en) | 1999-04-11 |
| CA2749312A1 (en) | 1997-08-21 |
| EP0882061B1 (en) | 2004-05-19 |
| US6451991B1 (en) | 2002-09-17 |
| AU725262B2 (en) | 2000-10-12 |
| DE69729179D1 (de) | 2004-06-24 |
| ZA971208B (en) | 1997-10-23 |
| WO1997030067A1 (en) | 1997-08-21 |
| NO983718L (no) | 1998-10-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR19990082476A (ko) | 당-변형되어 갭이 형성된 올리고뉴클레오티드 | |
| US5859221A (en) | 2'-modified oligonucleotides | |
| US5955589A (en) | Gapped 2' modified oligonucleotides | |
| US5872232A (en) | 2'-O-modified oligonucleotides | |
| US7015315B1 (en) | Gapped oligonucleotides | |
| US7138517B2 (en) | Sugar modified oligonucleotides | |
| US6005087A (en) | 2'-modified oligonucleotides | |
| CA2214535C (en) | Improved process for the synthesis of 2'-o-substituted pyrimidines and oligomeric compounds therefrom | |
| JP3787265B2 (ja) | ２’−ｏ−置換ピリミジンおよびそのオリゴマー化合物の合成の改良法 | |
| US5898031A (en) | Oligoribonucleotides for cleaving RNA | |
| AU661662B2 (en) | Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression | |
| US6172209B1 (en) | Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same | |
| DE69838449T2 (de) | Aminooxy-modifizierte oligonukleotide | |
| EP0734391A1 (en) | Pna-dna-pna chimeric macromolecules |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |