ES2221039T3 - Oligonucleotidos abiertos modificados con azucar. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LA SINTESIS Y UTILIZACION DE OLIGONUCLEOTIDOS PARA PROMOVER LA ACTIVIDAD DE LA RNASA H DE RUPTURA DE HEBRA EN UNA HEBRA OPUESTA. LA INVENCION INCLUYE OLIGONUCLEOTIDOS, ALGUNAS DE CUYAS SUBUNIDADES INCLUYEN UN SUSTITUYENTE QUE POTENCIA LA HIBRIDACION DEL OLIGONUCLEOTIDO CON UNA HEBRA COMPLEMENTARIA DE ACIDO NUCLEICO, Y AL MENOS ALGUNAS DE LAS SUBUNIDADES DE NUCLEOSIDO DE LOS OLIGONUCLEOTIDOS INCLUYEN FRACCIONES DE AZUCAR 2'' - DESOXI - ERITRO - PENTOFURANOSILO.

Description

Oligonucleótidos abiertos modificados con azúcar.

Campo de la invención

La presente invención se dirige a la síntesis y uso de oligonucleótidos para provocar actividad ARNasa para el desdoblamiento de la cadena en una cadena opuesta. En la invención se incluyen oligonucleótidos en los que al menos algunas de las unidades de nucleósido de los oligonucleótidos se funcionalizan para ser nucleasa resistentes, al menos alguna de las unidades de nucleósido de los oligonucleótidos incluyen un sustituyente que potencia la hibridación del oligonucleótido a una cadena complementaria de ácido nucleico, y al menos tres unidades de nucleósido consecutivas de los oligonucleótidos incluyen mitades de azúcar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo. Los oligonucleótidos son útiles en terapia, diagnóstico y como reactivos de investigación.

Antecedentes de la invención

Se sabe que los oligonucleótidos se hibridan con moléculas de ADN o ARN de cadena sencilla. La hibridación es la unión del hidrógeno del par de bases de secuencia específica de bases nucleicas de los oligonucleótidos a bases nucleicas del ADN o ARN objetivo. Se dice que dichos pares de bases nucleicas son complementarios uno de otro.

En la determinación del alcance de la hibridación de un oligonucleótido a un ácido nucleico complementario, la capacidad relativa de un oligonucleótido para unirse al ácido nucleico complementario se puede comparar determinando la temperatura de fusión de un complejo de hibridación en concreto. La temperatura de fusión (T_{m}), una propiedad física característica de hélices dobles, denota la temperatura (en grados centígrados) a la que el 50% de formas helicoidales (hibridadas) frente a espirales (no hibridadas) están presentes. La T_{m} se mide usando un espectro ultravioleta para determinar la formación y descomposición (fusión) del complejo de hibridación. La acumulación de bases que ocurre durante la hibridación, va acompañada de una reducción de la absorción ultravioleta (hipocromatismo). Consecuentemente, una reducción de la absorción ultravioleta indica una T_{m} mayor. Cuanto mayor la Tm, mayor será la fuerza de las uniones entre las cadenas.

Los oligonucleótidos se pueden usar para efectuar el desdoblamiento enzimático de un ARN objetivo usando la enzima intracelular, ARNasa H. Se cree que el mecanismo de dicho desdoblamiento por ARNasa requiere que un 2'-desoxiribofuranosil oligonucleótido se hibride con un ARN objetivo. El dúplex ADN-ARN resultante activa la enzima ARNasa H y la enzima activada desdobla la cadena de ARN. El desdoblamiento de la cadena de ARN destruye el funcionamiento normal del ARN. Se cree que los oligonucleótidos de fósforotioato operan por medio de este tipo de mecanismo. Sin embargo, para que un oligonucleótido de ADN sea útil para la activación celular de la ARNasa H, preferentemente el oligonucleótido es razonablemente estable para nucleasas con objeto de sobrevivir en células por un periodo de tiempo suficiente para la activación de la ARNasa H. Para usos no celulares, como el uso de oligonucleótidos como reactivos de investigación, la estabilidad de dicha nucleasa puede no ser necesaria.

Diversas publicaciones describen la interacción de la ARNasa H y oligonucleótidos. De interés particular son: (1) Dagle y col., Nucleic Acids Research, 1990, 18, 4751; (2) Dagle y col., Antisense Research And Development, 1991, 1, 11; (3) Eder y col., J. Biol. Chem., 1991, 266, 6472; y (4) Dagle y col., Nucleic Acids Research, 1991, 19, 1805. Según estas publicaciones, los oligonucleótidos de ADN que tienen ambas uniones fosfodiéster internucleósido no modificadas y uniones fósforotioato internucleósido modificadas son sustrato para la ARNasa H celular. Como son sustratos, activan el desdoblamiento del ARN objetivo mediante ARNasa H. Sin embargo, los autores también remarcaron que en embriones de Xenopus, tanto las uniones fosfodiéster como las uniones fósforotioato también están sometidas a degradación exonucleasa. Dicha degradación nucleasa va en detrimento porque consume rápidamente el oligonucleótido disponible para la activación de la ARNasa H.

Como se describe en las referencias (1), (2) y (4), para estabilizar oligonucleótidos contra la degradación nucleasa mientras se sigue aportando la activación de la ARNasa H, se construyeron 2'-desoxi oligonucleótidos que tienen una sección corta de nucleósidos unidos mediante fosfodiéster situados entre las secciones de las uniones fósforoamidato, alquil fosfonato o fosfotriéster. Mientras se estabilizaron los oligonucleótidos que contenían fosforoamidato contra exonucleasas, en la referencia (4) los autores destacaron que cada enlace fósforoamidato dio como resultado una pérdida de 1,6ºC en el valor de T_{m} medido de los oligonucleótidos que contenían fósforoamidato. Tal disminución en el valor de T_{m} es indicativa de una disminución en la hibridación entre el oligonucleótido y su cadena objetivo.

Otros autores han comentado sobre el efecto que puede tener dicha pérdida de hibridación entre un oligonucleótido y su cadena objetivo. Saison-Behmoaras y col. (EMBO Journal, 1991, 10, 1111) observaron que incluso aunque un oligonucleótido podría ser un sustrato para la ARNasa H, la eficiencia de desdoblamiento de la ARNasa H era baja por la débil hibridación al ARNm. Los autores también destacaron que la inclusión de una sustitución de acridina en el extremo 3' del oligonucleótido protegía al oligonucleótido de las exonucleasas.

La Patente de EEUU 5.013.830, publicada el 7 de mayo de 1991, presenta oligómeros mezclados que contienen un oligómero de ARN, o un derivado del mismo, conjugado con un oligómero de ADN mediante un enlace fosfodiéster. Los oligómeros de ARN también llevan sustituyentes 2'-O-alquilo. Sin embargo, siendo fosfodiésteres, los oligómeros son susceptibles de desdoblamiento por nucleasa.

La solicitud de Patente Europea 339.842, presentada el 13 de abril de 1989, presenta oligonucleótidos de fósforotioato 2'-O-sustituidos, incluyendo derivados de fósforotioato de 2'-O-metilribooligonucleótido. La solicitudmencionada anteriormente también presenta oligonucleótidos de 2'-O-metil fosfodiéster que carecen de resistencia a nucleasa.

La Patente de EEUU 5.149.797, publicada el 22 de septiembre de 1992, presenta oligonucleótidos fosfato de sostén mezclados que incluyen una porción interna de desoxinucleótidos unidos mediante enlaces fosfodiéster, y flanqueada a cada lado por una porción de secuencias de ADN o ARN modificadas. Las secuencias flanqueadoras incluyen enlaces metil fosfonato, fósforomorfolidato, fósforopiperazidato o fósforoamidato.

La Patente de EEUU 5.256.775, publicada el 26 de octubre de 1993, describe oligonucleótidos mezclados que incorporan uniones fósforoamidato y fósforotioato o uniones fósforoditioato.

La solicitud de Patente Europea 626.387, presentada el 3 de mayo de 1994, presenta nucleósidos y oligonucleótidos con un gran número de sustituyentes 2'-éter potenciales. Se dice que los oligonucleótidos tienen una resistencia nucleasa marcada.

Stein y Cheng (Science, 1993, 261, 1004) discuten el uso potencial de 2'-desoxi oligonucleótidos de fósforotioato resistentes a nucleasa como inhibidores de la replicación viral.

Mientras se ha reconocido que el desdoblamiento de una cadena de ARN objetivo usando un oligonucleótido y ARNasa H sería útil, la resistencia a nucleasa del oligonucleótido y la fidelidad de la hibridación son de gran importancia en el desarrollo de terapias oligonucleótidas. En concordancia, sigue habiendo una necesidad que se siente desde hace mucho tiempo de procedimientos y materiales que podrían activar la ARNasa H mientras mantienen o mejoran de forma concurrente las propiedades de hibridación y aportan resistencia nucleasa. Dichos oligonucleótidos también se desean como reactivos en investigación y agentes de diagnóstico.

Resumen de la invención

De acuerdo con una realización de esta invención se proporcionan oligonucleótidos formados de una secuencia de unidades de nucleósido. Los oligonucleótidos incorporan al menos una unidad de nucleósido que se funcionaliza para incrementar la resistencia nucleasa de los oligonucleótidos. Además, al menos algunas de las unidades de nucleósido de los oligonucleótidos se funcionalizan con un grupo sustituyente para aumentar la afinidad de unión de los oligonucleótidos para ARN objetivo, y al menos tres unidades de nucleósido consecutivas tienen mitades de azúcar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo.

En oligonucleótidos de la presente invención, las unidades de nucleósido que se funcionalizan para aumentar la afinidad de unión incluyen un grupo 2'-sustituyente.

Los oligonucleótidos de la presente invención incluyen unidades de nucleósido conectadas mediante enlaces fósforo cargados seleccionadas de un grupo formado por enlaces fosfodiéster y fósforotioato.

Los oligonucleótidos de la presente invención incluyen una pluralidad de unidades de nucleósido unidas que llevan grupos sustituyentes que incrementan la afinidad de unión del oligonucleótido a una cadena complementaria de ácido nucleico. La secuencia del oligonucleótido se divide en una primera subsecuencia de nucleósidos, una segunda subsecuencia de nucleósidos y una tercera subsecuencia de nucleósidos, teniendo la primera subsecuencia restos de azúcar 2'-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{3}, teniendo la segunda subsecuencia tres o más restos de azúcar consecutivas de 2'-desoxi-eritro-pentofurasonil, y teniendo la tercera subsecuencia teniendo restos de azúcar 2'-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{3}, en las que al menos una de dichas subsecuencias primera y tercera está formada por más de un resto de azúcar 2'-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{3}. Dicha segunda subsecuencia tiene al menos tres unidades de nucleósido, y más preferentemente, tiene al menos cinco unidades de nucleósido. La segunda subsecuencia se sitúa entre las subsecuencias primera y tercera. Dichos oligonucleótidos de la presente invención también se conocen como "quimeras", o "quiméricos" u oligonucleótidos "abiertos".

En más oligonucleótidos preferentes de la invención, las unidades de nucleósido que llevan sustituyentes que incrementan la afinidad de unión se localizan en uno o ambos de los extremos 3' ó 5' del oligonucleótido. Puede haber hasta aproximadamente ocho unidades de nucleósido que se sustituyen con grupos sustituyente. Preferentemente, al menos cinco unidades de nucleósido llevan mitades de azúcar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosil.

Las unidades de nucleósido de los oligonucleótidos de la presente invención están formadas por bases nucleicas unidas a mitades de azúcar 2'-sustituidas y 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo mediante enlaces fósforo como enlaces fosfodiéster y fósforotioato. Las bases nucleicas preferentes de la invención incluyen purinas y pirimidinas como adenina, guanina, citosina, uridina, y timina, al igual que otras bases nucleicas sintéticas y naturales como xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, amino, tiol, tioalquil, hidroxil y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-trifluorometil y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, y 7-metilguanina. Más purinas y pirimidinas incluyen aquellas presentadas en la Patente de Estados Unidos Nº 3.687.808, aquellas presentadas en la Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, y aquellas presentadas por Englisch y col., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613.

La invención también aporta procedimientos para tratar un organismo que tiene una enfermedad caracterizada por la producción no deseada de una proteína. Estos procedimientos incluyen poner en contacto el organismo con un oligonucleótido que tiene una secuencia de unidades de nucleósido capaces de hibridarse específicamente con una cadena complementaria de ácido nucleico con al menos una de las unidades de nucleósido estando funcionalizada para incrementar la resistencia nucleasa del oligonucleótido a nucleasas, con un grupo sustituyente allí situado para incrementar la afinidad de unión del oligonucleótido a la cadena complementaria de ácido nucleico, y con un gran número de las unidades de nucleósido teniendo mitades de azúcar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo.

También de acuerdo con la siguiente invención existen composiciones que incluyen una cantidad farmacéuticamente efectiva de un oligonucleótido que tiene una secuencia de unidades de nucleósido capaces de hibridarse específicamente con una cadena complementaria de ácido nucleico que tiene al menos una de las unidades de nucleósido funcionalizada para incrementar la resistencia nucleasa del oligonucleótido a nucleasas, en el que una pluralidad de las unidades de nucleósido tienen un grupo sustituyente allí situado para incrementar la afinidad de unión del oligonucleótido a la cadena complementaria de ácido nucleico, y en el que una pluralidad de unidades de nucleósido tienen mitades de azúcar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo. Las composiciones también incluyen un disolvente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

También según esta invención existen procedimientos para la modificación in vitro de un ácido nucleico de secuencia específica, incluyendo el poner en contacto una solución prueba que contiene una enzima ARNasa H y dicho ácido nucleico con un oligonucleótido que tiene una secuencia de unidades de nucleósido capaces de hibridarse específicamente a una cadena complementaria del ácido nucleico, donde al menos una de las unidades de nucleósido se funcionaliza para incrementar la resistencia nucleasa del oligonucleótido a nucleasas, donde una pluralidad de las unidades de nucleósido tienen un grupo sustituyente allí situado para incrementar la afinidad de unión del oligonucleótido a la cadena complementaria de ácido nucleico, y donde una pluralidad de las unidades de nucleósido tienen mitades de azúcar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo.

También existen procedimientos para estimular simultáneamente la hibridación y la activación de la enzima ARNasa en un organismo que incluye el poner en contacto el organismo con un oligonucleótido que tiene una secuencia de unidades de nucleósido capaces de hibridarse específicamente a una cadena complementaria de ácido nucleico, donde al menos una de las unidades de nucleósido se funcionaliza para incrementar la resistencia nucleasa del oligonucleótido a nucleasas, donde una pluralidad de las unidades de nucleósido tienen un grupo sustituyente allí situado para incrementar la afinidad de unión del oligonucleótido a la cadena complementaria de ácido nucleico, y donde una pluralidad de las unidades de nucleósido tiene mitades de azúcar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo.

La invención también aporta procedimientos de diagnóstico para detectar la presencia o ausencia de moléculas de ARN anormales, o la expresión anormal o inapropiada de moléculas de ARN normales en organismos o células.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico lineal que muestra la actividad de respuesta a dosis de oligonucleótidos de la invención y un compuesto de referencia.

La Figura 2 es un gráfico de barras que muestra la actividad de respuesta a dosis de oligonucleótidos de la invención y compuestos de referencia.

La Figura 3 es un gráfico de barras que muestra los efectos de diversos oligonucleótidos quiméricos de 2'-O-metilo en niveles de ARNm de PKC-\alpha. Las barras sombreadas representan la transcripción de 8,5 kb, y las barras lisas representan la transcripción de 4,0 kb.

La Figura 4 es un gráfico de barras que muestra los efectos de diversos oligonucleótidos quiméricos de 2'-O-metilo y 2'-O-propilo en niveles de ARNm de PKC-\alpha. Las barras sombreadas representan la transcripción de 8,5 kb, y las barras lisas representan la transcripción de 4,0 kb.

La Figura 5 es un gráfico de barras que muestra los efectos de oligonucleótidos quiméricos 2'-O-metilo y 2'-O-propilo adicionales en niveles de ARNm de PKC-\alpha. Las barras sombreadas representan la transcripción de 8,5 kb, y las barras lisas representan la transcripción de 4,0 kb.

Las Figuras 6a y 6b son gráfico de líneas que muestran el efecto de oligonucleótidos 2' metoxietoxi modificados que tienen la SEC ID Nº:30 en niveles de ARNm de PKC-\alpha en células A549. La Figura 6a muestra el efecto de ISIS 9605 comparado con el compuesto desoxifósforotioato, ISIS 3521. La Figura 6b muestra el efecto de ISIS 9606 comparado con el compuesto desoxifósforotioato, ISIS 3521.

La Figura 7a y 7b son gráficos de líneas que muestran los efectos de oligonucleótidos que tienen la SEC ID Nº:30 en el crecimiento en los injertos heterólogos del tumor del carcinoma de colon humano (Colo 205) en ratones desnudos. La Figura 7a muestra el efecto del compuesto desoxifósforotioato, ISIS 3521. La Figura 7b muestra el efecto del compuesto 2' metoxietoxi modificado, ISIS 12723.

Las Figuras 8a y 8b son gráficos de líneas que muestran el efecto de ISIS 5132 (Figura 6a) y CGP 69845, una versión 2'-metoxietoxi (2'-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{3}) de la misma secuencia (Figura 6b), en el crecimiento de los injertos heterólogos del tumor de pulmón A549 en ratones desnudos.

La Figura 9 es un gráfico de líneas que muestra concentraciones de plasma de ratón de un compuesto control y dos compuestos de la invención. Se determinó la concentración de plasma se ploteó frente al tiempo.

La Figura 10 es un gráfico de barras tridimensional que muestra la distribución de un compuesto control entre varios tejidos en el ratón. Los tejidos específicos se muestran en un eje, el tiempo en un segundo eje y el porcentaje de dosis en un tercer eje. El compuesto se administró mediante inyección intravenosa.

La Figura 11 es un gráfico de barras tridimensional que muestra la distribución de un compuesto de la invención entre varios tejidos en ratón. Los tejidos específicos se muestran en un eje, el tiempo en un segundo eje y el porcentaje de dosis en un tercer eje. El compuesto se administró mediante inyección intravenosa.

La Figura 12 es un gráfico de barras tridimensional que muestra la distribución de otro compuesto de la invención entre diversos tejidos en ratón. Los tejidos específicos se muestran en un eje, el tiempo en un segundo eje y el porcentaje de dosis en el tercer eje. El compuesto se administró mediante inyección intravenosa.

Descripción detallada de la invención

Según los objetos de esta invención, se aportan nuevos oligonucleótidos que tienen resistencia nucleasa incrementada, afinidad de unión con cadenas complementarias de ácidos nucleicos incrementada y que son sustratos para ARNasa H. Los oligonucleótidos de la invención se reúnen de una pluralidad de unidades de nucleósido. Cada oligonucleótido de la invención incluye al menos una unidad de nucleósido que se funcionaliza para incrementar la resistencia nucleasa del oligonucleótido. Además, al menos algunas de las unidades de nucleósido llevan un grupo sustituyente que incrementa la afinidad de unión del oligonucleótido por una cadena complementaria de ácido nucleico. Adicionalmente, al menos tres unidades de nucleósido consecutivas están formadas por mitades de azúcar 2'-desoxi-eritro-pentafuranosilo.

Junto con las indicaciones anteriores, cada unidad de nucleósido de un oligonucleótido de la invención, alternativamente denominado "nucleósido" o "subunidad", puede ser una mitad "natural" o "sintética". Así, en el contexto de esta invención, el término "oligonucleótido" hace referencia a un oligómero formado de una pluralidad de unidades de nucleósido unidas. Las unidades de nucleósido se juntan mediante enlaces fósforo como enlaces fosfodiéster o fósforotioato. Las unidades de nucleósido están formadas de bases nucleicas naturales o no naturales y mitades de pentofuranosil azúcar. Así, el término "oligonucleótido" efectivamente incluye especies naturales o especies sintéticas formadas a partir de unidades de nucleósido naturales.

Los oligonucleótidos de la invención también pueden incluir subunidades modificadas. Las modificaciones pueden ocurrir en la porción de base nucleica de un nucleósido, en la porción de azúcar de un nucleósido o en el enlace que une un nucleósido al siguiente.

Se sabe que en la presente invención la afinidad de unión de oligonucleótidos de la presente invención se puede incrementar incorporando grupos sustituyentes en las unidades de nucleósido de los oligonucleótidos. Los grupos sustituyentes son grupos 2' sustituyentes, esto es, grupos sustituyentes localizados en la posición 2' de las mitades de pentafuranosil azúcar de las unidades de nucleósido de los oligonucleótidos de la presente invención. El grupo sustituyente es un sustituyente de polietilén glicol de la fórmula (-O-CH_{2}-CH_{2})_{n}-O-alquilo, en el que n=1 y alquilo=CH_{3}.

También se puede incrementar la afinidad de unión mediante el uso de ciertas bases nucleicas modificadas en las unidades de nucleósido que forman los oligonucleótidos de la invención. Dichas bases nucleicas modificadas pueden incluir pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se espera que otras bases de pirimidina y purina modificadas incrementen la afinidad de unión de oligonucleótidos a una cadena complementaria de ácido nucleico.

El uso de grupos 2'-sustituyentes incrementa la afinidad de unión de los oligonucleótidos sustituidos de la presente invención. Un estudio publicado (Synthesis and Biophysical Studies of 2'-dRIBO-F Modified Oligonucleotides, Conference on Nucleic Acid Therapeutics, Clearwater, FL, 13 de enero de 1991), informó de un incremento en la afinidad de unión de 1,6ºC por unidad de nucleósido sustituida de un oligonucleótido fosfodiéster 15-mero que tiene grupos 2'-fluoro sustituyentes en cinco de las unidades de nucleósido del oligonucleótido. Cuando 11 de las unidades de nucleósido del oligonucleótido llevan grupos 2'-fluoro sustituyentes, la afinidad de unión se incrementó a 1,8ºC por unidad de nucleósido sustituida.

En el estudio antes mencionado, el oligonucleótido fosfodiéster 15-mero se derivó al correspondiente análogo de fósforotioato. Cuando se comparó el oligonucleótido fosfodiéster 15-mero con su análogo de fósforotioato, el análogo de fósforotioato tenía una afinidad de unión de sólo aproximadamente el 66% de la del oligonucleótido fosfodiéster 15-mero. Dicho de otro modo, se perdió afinidad de unión al derivar el oligonucleótido a su análogo de fósforotioato. Sin embargo, cuando se localizaron 2'-fluoro sustituyentes en 11 de los nucleósidos del oligonucleótido de fósforotioato 15-mero, la afinidad de unión de los grupos 2'-sustituyentes más que sobrepasaron la disminución notada al derivar el oligonucleótido 15-mero a su análogo de fósforotioato. En este compuesto, esto es, el oligonucleótido de fósforotioato 15-mero que tiene 11 unidades de nucleósido sustituidas con grupos 2'-fluoro sustituyentes, la afinidad de unión se incrementó a 2,5ºC por grupo sustituyente. En este estudio no se hizo ningún intento de incluir una secuencia de unidades de nucleósido consecutivas apropiada teniendo mitades de azúcar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo que permitirían el desdoblamiento enzimático de ARNasa H de un ARN objetivo complementario al oligonucleótido del estudio.

Con objeto de permitir el desdoblamiento enzimático por ARNasa H de un ARN objetivo, un oligonucleótido de la invención debe incluir un segmento o subsecuencia del mismo que es un segmento tipo ADN. Dicho de otro modo, al menos tres subunidades de nucleósido consecutivas de la segunda subsecuencia de nucleósidos de los oligonucleótidos de la invención debe tener mitades de azúcar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo. Es necesaria una subsecuencia que tenga al menos tres subunidades de nucleósido que contienen 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo unidas consecutivamente con objeto de permitir la actividad ARNasa H durante la hibridación con un oligonucleótido de la invención con un ARN objetivo. Es particularmente preferente el uso de al menos cinco subunidades de nucleósido consecutivas que contienen 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo.

El mecanismo de acción de la ARNasa H es el reconocimiento del dúplex ADN-ARN seguido del desdoblamiento de la cadena de ARN de este dúplex. Como se indica en el apartado "Antecedentes de la invención" anterior, otros expertos en la técnica han usado cadenas de ADN modificadas para proporcionar estabilidad nucleasa a la cadena de ADN. Para hacer esto han usado enlaces fósforo modificados que proporcionan estabilidad nucleasa incrementada pero restan de las propiedades de hibridación.

La presente invención identifica ciertos criterios que se deben cumplir para que la ARNasa H reconozca y permita el desdoblamiento de oligonucleótidos. El primero de ellos es que el oligonucleótido en el sitio de desdoblamiento debe tener sus unidades de nucleósido conectadas mediante un enlace de fósforo que lleva una carga negativa. Adicionalmente, la mitad de azúcar de los nucleósidos en el sitio de desdoblamiento debe ser una mitad de azúcar \beta-pentofuranosilo y también debe estar en formación 2' endo. Los únicos nucleósidos que cumplen estos criterios son los \beta-nucleósidos de 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo conectados mediante enlaces fosfodiéster, fósforotioato y fósforoditioato.

Para usar en la preparación de dichas unidades estructurales, las bases nucleicas adecuadas incluyen purinas y pirimidinas como adenina, guanina, citosina, uridina, y timina, al igual que otras bases nucleicas sintéticas y naturales como xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, amino, tiol, tioalquil, hidroxil y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-trifluorometil y otros uracilos y citosinas 5-sustituidas, 7-metilguanina. Más purinas y pirimidinas incluyen aquellas presentadas en la Patente de Estados Unidos Nº 3.687.808, aquellas presentadas en la Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, y aquellas presentadas por Englisch y col., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613.

La primera y tercera subsecuencias de nucleósidos de los oligonucleótidos de la presente invención contienen una modificación metoxietoxi (-OCH_{2}CH_{2}OCH_{3}) en la posición 2' de al menos un nucleósido. Se ha demostrado que esta modificación incrementa tanto la afinidad del oligonucleótido por su objetivo como la resistencia nucleasa del oligonucleótido. Los oligonucleótidos según esta invención preferentemente están formados por aproximadamente 5 a aproximadamente 50 unidades de nucleósido. En el contexto de esta invención se entiende que esto engloba oligómeros no naturales como se han descrito en la presente memoria descriptiva con anterioridad, teniendo de 5 a 50 unidades de nucleósido. Es más preferente que los oligonucleótidos de la presente invención estén formados por aproximadamente 15 a aproximadamente 25 unidades de nucleósido. Como se apreciará, una "unidad de nucleósido" es una combinación de base nucleica y azúcar convenientemente unidas a subunidades adyacentes mediante enlaces de fósforo. El término "subunidad" se usa de manera intercambiable con el término "unidad de nucleósido". Para provocar una respuesta ARNasa H, como se especifica arriba, dentro de todo el largo de esta secuencia del oligonucleótido será una subsecuencia mayor de tres, pero preferentemente cinco o más, unidades de nucleósido que contienen 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo unidas consecutivamente.

La subsecuencia de nucleósido que contiene 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo se incorpora al oligonucleótido de tal forma que dentro del oligonucleótido se localizan otras subsecuencias de nucleósido que contienen pentofuranosilo 2'-sustituido en cualquiera de los lados de la subsecuencia de nucleósidos que contiene 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo. En tal construcción, la subsecuencia de nucleósidos que contiene 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo también se denomina "región central" y las subsecuencias de nucleósidos que contienen pentofuranosilo 2'-sustitutido se denominan "regiones flanqueadoras".

El resto de unidades de nucleósido incluye cada una un grupo 2'-sustituyente para la afinidad de unión incrementada, y la subsecuencia de nucleósidos que contiene 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo se localiza entre una primera subsecuencia de unidades de nucleósido que tienen grupos 2'-sustituyentes y una segunda subsecuencia de unidades de nucleósido que tienen grupos 2'-sustituyentes.

Los oligonucleótidos usados de acuerdo con esta invención pueden formarse convenientemente y de manera rutinaria mediante una técnica bien conocida de síntesis en fase sólida. [Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504.] El equipo para dicha síntesis lo venden varios vendedores, incluyendo Applied Biosystems. También se puede usar cualquier otro medio para dicha síntesis. La síntesis actual de los oligonucleótidos está bien dentro de los talentos de aquellos expertos en la técnica. También se conoce bien el uso de técnicas similares para preparar otros oligonucleótidos como los fósforotioatos y derivados alquilados. También se conoce bien el uso de técnicas similares y amiditas modificadas disponibles comercialmente y productos de cristal de porosidad controlada (CPG) como biotina, fluoresceína, acridina o amidites de psoralina modificada y/o CPG (disponibles en Glen Research, Sterling VA) para sintetizar oligonucleótidos conjugados marcados con fluorescente, biotinilados u otros.

Los compuestos de la invención se pueden usar como reactivos y kits de diagnóstico, terapéuticos y de investigación. Se pueden usar en composiciones farmacéuticas añadiendo una cantidad efectiva de un oligonucleótido de la invención a un disolvente o vehículo adecuado farmacéuticamente aceptable. Además se pueden usar para tratar organismos que tienen una enfermedad caracterizada por la producción no deseada de una proteína. Se puede poner en contacto el organismo con un oligonucleótido de la invención que tiene una secuencia capaz de hibridarse específicamente con una cadena de ácido nucleico objetivo que codifica la proteína no deseada.

Se cree que la formulación de composiciones terapéuticas y su administración subsecuente está dentro de la habilidad de aquellos expertos en la técnica. En general, para terapia, se administra un oligonucleótido a un paciente que necesita dicha terapia según la invención, normalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en dosis que oscilan de 0,01 \mug a 100 g por kg de peso corporal dependiendo de la edad del paciente y la gravedad del estado de la enfermedad que se está tratando. Además, el régimen de tratamiento puede durar un periodo de tiempo que variará dependiendo de la naturaleza de la enfermedad en particular, su gravedad y la condición general del paciente, y se puede extender de una vez al día a una vez cada 20 años. Después del tratamiento, se monitoriza al paciente para detectar cambios en su estado y para aliviar los síntomas de la enfermedad. La dosis del oligonucleótido se puede incrementar en caso de que el paciente no responda significativamente a niveles de dosificación habituales, o la dosis se puede disminuir si se observa una mejora de los síntomas de la enfermedad, o si se ha cortado la enfermedad.

En algunos casos puede resultar más efectivo tratar al paciente con un oligonucleótido de la invención en conjunción con otras modalidades terapéuticas tradicionales. Por ejemplo, se puede administrar a un paciente al que se está tratando de SIDA un oligonucleótido en conjunción con AZT, o se puede tratar a un paciente con ateroesclerosis con un oligonucleótido de la invención después de la angioplastia para prevenir la reoclusión de las arterias tratadas.

Después de un tratamiento satisfactorio, puede resultar deseable que el paciente realice una terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia de la enfermedad, en la que se administra el oligonucleótido al paciente en dosis de mantenimiento, oscilando de 0,01 \mug a 100 g por kg de peso corporal, de una o más veces al día, a una vez cada 20 años.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de varias formas dependiendo de que se desee un tratamiento local o sistémico y del área a tratar. La administración puede ser tópica (incluyendo oftálmica, vaginal, rectal, intranasal, transdérmica), oral o parenteral. La administración parenteral incluye infusión intravenosa con gotero, inyección subcutánea, intraperitoneal o intramuscular, o administración intratecal o intraventricular.

Las formulaciones para la administración tópica pueden incluir parches, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, sprays, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables los vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosas, espesantes y otros. También pueden ser útiles los condones revestidos, guantes y otros.

Las composiciones para la administración oral incluyen polvos o gránulos, suspensiones o disoluciones en agua o medios no acuosos, comprimidos, sobrecitos o tabletas. Los espesantes, agentes aromatizantes, disolventes, emusificadores, ayudas de dispersión o enlazadores pueden ser deseables.

Las composiciones para la administración intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, disolventes y otros aditivos adecuados.

Las formulaciones para la administración parenteral pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, disolventes y otros aditivos adecuados.

La dosis depende de la gravedad y receptividad de la enfermedad al tratamiento, durando el tratamiento desde varios días a varios meses, o hasta que se haga una cura o se consiga una disminución del estado de la enfermedad. Se pueden calcular las pautas de dosificación óptimas por la medición de la acumulación de medicamento en el cuerpo del paciente. Personas con habilidad normal pueden determinar fácilmente las dosis óptimas, metodologías de dosificación y tasas de repetición. Las dosis óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los oligonucleótidos individuales, y generalmente se pueden estimar basándose en el EC_{50} encontrado para ser efectivo en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosificación va de 0,01 \mug a 100 g por kg de peso corporal, y se puede administrar una o más veces al día, semanalmente, mensualmente o anualmente, o incluso una vez cada 2 a 20 años.

Dicho tratamiento terapéutico se puede practicar en una diversidad de organismos oscilando de organismos procariotas y eucariotas unicelulares a organismos eucariotas pluricelulares. Cualquier organismo que usa transcripción ADN-ARN o traducción ARN-proteína como parte fundamental de su maquinaria hereditaria, metabólica o celular es susceptible a dicho tratamiento terapéutico y/o profiláctico. Aparentemente, se pueden tratar diversos organismos como bacterias, levaduras, protozoos, algas, plantas y formas animales más elevadas, incluyendo animales de sangre caliente, de esta manera. Además, como cada una de las células de eucariotas pluricelulares también incluyen tanto transcripción ADN-ARN como traducción ARN-proteína como parte integral de su actividad celular, dichas terapias y/o diagnósticos también se pueden practicar en dichas poblaciones celulares. También, muchas de las organelas, por ejemplo, mitocondrias y cloroplastos, de células eucariotas también incluyen mecanismos de transcripción y traducción. Como tales, las células únicas, poblaciones celulares u organelas también se pueden incluir en la definición de organismos capaces de ser tratados con los oligonucleótidos terapéuticos o de diagnóstico de la invención. Como se usa en la presente memoria descriptiva, terapéuticos debe incluir la erradicación de una enfermedad, el matar a un organismo, por ejemplo, infección bacteriana, protozoica u otros, o el control del crecimiento o expresión celular aberrante o no deseable.

En el contexto de esta invención, "hibridación" significará la unión con hidrógeno, que puede ser unión con hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertida, entre bases nucleicas complementarias. Por ejemplo, la adenina y la timina son bases nucleicas complementarias que se emparejan mediante la formación de uniones de hidrógeno. "Complementaria" e "hibridable específicamente", como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a la complementariedad de secuencia entre dos ácidos nucleicos que contienen unidades de nucleósido, siendo un ácido nucleico un oligonucleótido y el otro ácido nucleico una molécula de ADN o ARN objetivo. Por ejemplo, si una base nucleica en una posición determinada de un oligonucleótido es capaz de realizar uniones de hidrógeno con una base nucleica en la misma posición de una molécula de ADN o ARN, entonces se considera que el oligonucleótido y la moléculas de ADN o ARN son complementarias una de otra en esa posición. El oligonucleótido y la molécula de ADN o ARN son complementarias una de otra cuando un número suficiente de posiciones correspondientes en cada molécula están ocupadas por bases nucleicas que se pueden unir con hidrógeno una a la otra. Así, "hibridable específicamente" y "complementaria" son términos que se usan para indicar un grado suficiente de complementariedad tal que la unión estable y específica tiene lugar entre el oligonucleótido y la molécula de ADN o ARN objetivo. Se entiende que un oligonucleótido no tiene que ser 100% complementario con su secuencia de ADN objetivo para ser hibridable específicamente. Un oligonucleótido es hibridable específicamente cuando la unión del oligonucleótido a la molécula de ADN o ARN objetivo interfiere con la función normal del ADN o ARN objetivo para causar una pérdida de utilidad, y existe un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del oligonucleótido a secuencias no objetivo en condiciones en que se desea una unión específica, esto es, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, o en el caso de ensayos in vitro, en las condiciones en que se realizan los ensayos.

Con el objeto de ilustrar, se han usado los compuestos de la invención en un sistema de fusión ras-luciferasa usando transactivación ras-luciferasa. Como se describe en la Publicación Internacional Número WO 92/22651, publicada el 23 de diciembre de 1992 y asignada comúnmente con esta solicitud, los oncogenes ras son miembros de una familia de genes que codifican proteínas relacionadas que están localizadas en la cara interna de la membrana plasmática. Se ha demostrado que las proteínas ras se conservan bien en el nivel de aminoácido, para unir GTP con elevada afinidad y especifidad, y para poseer actividad GTPasa. Aunque se desconoce la función celular de los productos del gen ras, sus propiedades bioquímicas, junto con su homología de secuencia significativa con una clase de proteínas transductoras de señal, conocidas como proteínas de unión de GTP, o proteínas G, sugieren que los productos del gen ras tienen un papel fundamental en funciones reguladoras celulares básicas relacionadas con la transducción de señales extracelulares a través de las membranas plasmáticas.

Se han identificado tres genes ras en el genoma de mamíferos, denominados H-ras, K-ras, y N-ras. Los genes ras de mamíferos adquieren propiedades inductoras de la transformación mediante mutaciones de punto único dentro de sus secuencias codificadoras. Se han localizado mutaciones en oncogenes ras naturales en los codones 12, 13 y 61. La mutación ras activadora detectada más comúnmente encontrada en tumores humanos está en el codón 12 del gen H-ras en el que un cambio de base de GGC a GTC tiene como resultado una sustitución glicina-a-valina en el dominio regulador GTPasa del producto de la proteína ras. Se piensa que este cambio de un solo aminoácido anula el control normal de la función de la proteína ras, por lo cual se convierte una proteína celular regulada normalmente en una que está activa continuamente. Se cree que dicha desregulación de la función de la proteína ras normal es responsable de la transformación de crecimiento normal a maligno.

Los oligonucleótidos de la presente invención también se han usado para modular la expresión del gen raf, un gen celular presente de forma natural que ocasionalmente se convierte en una forma activada que está implicada en la proliferación celular anormal y en la formación de tumores.

Los oligonucleótidos de la presente invención también son específicamente hibridables con ácidos nucleicos relacionados con la proteína quinasa C (PKC). Se ha visto que estos oligonucleótidos modulan la expresión de PKC.

Los siguientes ejemplos, ejemplos comparativos y procedimientos ilustran la presente invención y no se pretende que limiten la misma.

Síntesis de oligonucleótidos

Se sintetizaron oligonucleótidos no sustituidos y sustituidos en un sintetizador de ADN automático (Applied Biosystems modelo 380B) usando química de fósforoamidita estándar con oxidación por yodo. Para oligonucleótidos de fósforotioato, se sustituyó la botella de oxidación estándar por solución 0,2 M de 3H-1,2-benzoditiol-3-ona, 1,1-dióxido en acetonitrilo para la etapa de tiación acertada de los enlaces fosfito. Se incrementó la etapa de espera de la tiación a 68 segundos y después se realizó la etapa de encapsulado. Después del desdoblamiento de la columna CPG y el desbloqueo en hidróxido de amonio concentrado a 55ºC (18 h), se purificaron los oligonucleótidos precipitando dos veces con 2,5 volúmenes de etanol de una solución de ClNa 0,5 M. Se completó la electroforesis en gel analítica en acrilamida al 20%, urea 8 M, tampón Tris-borato 454 mM, pH=7,0. Se determinó que los oligonucleótidos y fósforotioatos, basándose en electroforesis en gel de poliacrilamida, eran mayores que el 80% del material de longitud total.

Ejemplo comparativo 1

Oligonucleótidos que tienen regiones 2'-sustituidas flanqueando la región 2'-desoxi fósforotioato central

Se preparó un ARN 15-mero objetivo de la secuencia 5'GCGTTTTTTTTTTGCG 3' (ID SEC Nº:28) de la manera normal en el secuenciador de ADN usando protocolos de ARN. Se preparó una serie de oligonucleótidos de fósforotioato complementarios que tenían unidades de nucleósido 2'-sustituidos en regiones que flanquean una región 2'-desoxi usando precursores de nucleósidos 2'-sustituidos preparados por procedimientos de bibliografía conocida, esto es, 2'-O-metilo, o por procedimiento de la Publicación Internacional Número WO 92/03568, publicada el 5 de marzo de 1992. Los nucleósidos 2'-sustituidos se añadieron como sus 5'-O-dimetoxitritil-3'-fósforoamiditas de la manera normal en el sintetizador de ADN. Los oligonucleótidos complementarios tienen la secuencia de 5' CGC AAA AAA AAA AAA ACG C 3' (ID SEC Nº:29). El sustituyente 2' estaba situado en las regiones CGC y CG de estos oligonucleótidos. Como ejemplos comparativos, se usaron los siguientes 2'-O-sustituyentes: 2'-fluoro; 2'-O-metilo; 2'-O-propilo; 2'-O-alilo; 2'-O-aminopropoxi; 2'-O-(metoxietoxietilo), 2'-O-imidazolbutoxi y 2'-O-imidazolpropoxi.

Ensamblaje del gen indicador ras-luciferasa

Los genes informadores ras-luciferasa descritos en este estudio se unieron usando tecnología PCR. Se sintetizaron iniciadores de oligonucleótido para su uso como iniciadores de la clonación PCR de regiones 5' de exón 1 de los genes H-ras humanos tanto mutantes (codón 12) como no mutantes (tipo salvaje). Se compraron patrones del gen H-ras de la Colección de Cultivos de Tipo Americano (ATCC números 41000 y 41001) en Bethesda, MD. Los iniciadores PCR de oligonucleótidos \alm{2}5'-ACA-TTA-TGC-TAG-CTT-TTT-GAG-TAA-ACT-TGT-GGG-GCA-GGA-GAC-CCT-GT-3' (sentido) (ID SEC Nº:15), y 5'-GAG-ATC-TGA-AGC-TTC-TGG-ATG-GTC-AGC-GC-3' (antisentido) (ID SEC Nº:16), se usaron en reacciones PCR estándares usando genes H-ras mutantes y no mutantes como patrones. Se espera que estos iniciadores produzcan un producto de ADN de 145 pares de bases que corresponden a las secuencias
-53 a +65 (relativos al sitio de iniciación de la traducción) de H-ras normal y mutante, flanqueado por los sitios de endonucleasa de restricción NheI y HindIII. El producto PCR se purificó en gel, se precipitó, se lavó y se resuspendió en agua usando procedimientos estándares.

Se diseñaron iniciadores PCR para la clonación del gen de la luciferasa de P. pyralis (luciérnaga) tales que el producto PCR codificaría la proteína luciferasa total con la excepción del residuo de metionina amino-terminal, que sería reemplazado con dos aminoácidos, un residuo de lisina amino-terminal seguido de un residuo de leucina. Los iniciadores PCR de oligonucleótido usados para la clonación del gen de la luciferasa eran 5'-GAG-ATC-TGA-AGC-TTG-AAG-ACG-CCA-AAA-ACA-TAA-AG-3' (sentido) (ID SEC Nº:17), y 5'-ACG-CAT-CTG-GCG-CGC-CGA-TAC-CGT-CGA-CCT-CGA-3'(antisentido) (ID SEC Nº:18), \alm{2} se usaron en reacciones PCR estándares usando un plásmido disponible comercialmente (pT3/T7-Luc) (Clontech), conteniendo el gen indicador de la luciferasa, como patrón. Se esperaba que estos iniciadores produjeran un producto de aproximadamente 1,9 kb correspondiente al gen de la luciferasa, flanqueado por los sitios endonucleasa de restricción HindIII y BssHII. Este fragmento se purificó en gel, se precipitó, se lavó y se resuspendió en agua usando procedimientos estándares.

Para completar el ensamblaje del gen indicador de fusión de ras-luciferasa, se digirieron los productos PCR de ras y luciferasa con las endonucleasas de restricción apropiadas y se clonaron mediante unión en tres partes a un vector de expresión que contenía el promotor MMTV del virus del tumor mamario de ratón inducible por esteroides usando las endonucleasas de restricción NheI, HindIII y BssHII. El clon resultante dio como resultado la inserción de secuencias 5' de H-ras (-53 a +65) fusionadas en marco con el gen de la luciferasa de luciérnaga. El vector de expresión resultante codifica un producto de fusión de ras-luciferasa que se expresa bajo el control del promotor MMTV inducible por esteroides.

Transfección de células con ADN plásmido

Se realizaron transfecciones como se describe en Greenberg (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., eds., John Wiley e hijos, NY), con las siguientes modificaciones: se cubrieron células HeLa en recipientes de 60 mm a 5 x 10^{5} células/recipiente. Se añadió un total de 10 \mug de ADN a cada recipiente, de los cuales 9 \mug eran de plásmido informador de ras-luciferasa y 1 \mug era un vector expresando el receptor de glucocorticoide de rata bajo el control del promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) constitutivo. Se retiraron los coprecipitados de fosfato cálcico-ADN después de 16-20 horas mediante lavado con solución salina tampón Tris [Tris-Cl 50 mM (pH 7,5), ClNa 150 mM] que contenía EGTA. Luego se añadió medio fresco con un suplemento de suero bovino fetal al 10% añadido a las células. En este momento, las células se pretrataron con oligonucleótidos antisentido antes de la activación de la expresión del gen indicador por dexametasona.

Tratamiento oligonucleótido de células

Inmediatamente después de la transfección del plásmido, las células se lavaron tres veces con Opti-MEM (GIBCO), y se precalentaron a 37ºC. Se añadieron 2 ml de Opti-MEM que contenían 10 \mug/ml de cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N,-trimetilamonio (DOTMA) (Bethesda Research Labs, Gaithersburg, MD) a cada recipiente y los oligonucleótidos se añadieron directamente y se incubaron durante 4 horas a 37ºC. Luego se retiró el Opti-MEM y se sustituyó con el medio de cultivo celular adecuado que contenía oligonucleótido. En este momento, se activó la expresión del gen indicador mediante el tratamiento de las células con dexametasona hasta una concentración final de 0,2 \muM. Las células se cultivaron durante 12-16 horas tras el tratamiento con esteroides.

Ensayos con luciferasa

Se extrajo luciferasa de células mediante lisis con el detergente Triton X-100, como se describe en Greenberg (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., eds., John Wiley e Hijos, NY). Se usó un luminímetro Dynatech ML1000 para medir el pico de luminiscencia al añadir luciferina (Sigma) a 625 \muM. Para cada extracto, se realizaron ensayos con luciferasa múltiples veces, usando diferentes cantidades de extracto para asegurarse que los datos se recogían en el intervalo lineal del ensayo.

Ejemplo comparativo 2

Inhibición del oligonucleótido antisentido de la expresión del gen de ras-luciferasa

Se examinaron una serie de oligonucleótidos de fósforotioato dirigidos a la mutación del punto del codón-12 de H-ras activado usando el sistema del gen indicador de ras-luciferasa descrito en los ejemplos anteriores. Estas series comprendían una secuencia básica y análogos de esa secuencia básica. La secuencia básica tenía actividad conocida como se expone en la Publicación Internacional Número WO 92/22651 identificada arriba. En ambos, la secuencia básica y sus análogos, cada una de las unidades de nucleósido incorporaba enlaces fósforotioato para aportar resistencia nucleasa. Cada uno de los análogos incorporaba unidades de nucleósido que contenían sustituyentes 2'-O-metilo y mitades de azúcar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo. En los análogos, una subsecuencia de las subunidades que contenían azúcar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo estaba flanqueada en ambos extremos por subsecuencias de subunidades 2'-O-metilo sustituidas. Los análogos diferían uno de otro con respecto a la longitud de la subsecuencia de nucleósidos que contenían azúcar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo. Las subsecuencias de nucleósido 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo estaban centradas en la mutación del punto de la mutación del punto del codón-12 del ras activado.

Las secuencias de oligonucleótidos, los números de referencia de las secuencias y los números ID de la secuencia (todos son análogos de fósforotioato) se muestran en la Tabla 1. En esta tabla, aquellos nucleósidos identificados con "M" contienen 2'-O-metil sustituyente y los nucleósidos identificados con "d" son nucleósidos de 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo.

TABLA 1 Oligonucleótidos P=S 2'-O-metil quiméricos

1

La Figura 1 muestra los datos de respuesta a dosis en los que las células se trataron con los oligonucleótidos de fósforotioato de la Tabla 1. El oligonucleótido 2570 se dirige a la mutación del punto del codón-12 del ARN H-ras mutante (activado). Los otros nucleósidos tienen sustituyentes 2'-O-metilo allí para incrementar la afinidad de unión con secciones de varias longitudes de nucleósidos de 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo interespaciados. El oligonucleótido de control es un oligonucleótido de fósforotioato 20-mero aleatorio. Los resultados se expresan como porcentaje de actividad luciferasa en células transfectadas no tratadas con oligonucleótido. Como muestra la figura, el tratamiento de células con concentraciones crecientes de oligonucleótido 2570 tuvo como resultado la inhibición dependiente de la dosis de la actividad de la ras-luciferasa en células que expresan la forma mutante de ras-luciferasa. El oligonucleótido 2570 presenta una selectividad de aproximadamente tres veces hacia la forma mutante de ras-luciferasa en comparación con la forma normal.

Como también se observa en la Figura 1, cada uno de los oligonucleótidos 3980, 3985 y 3984 exhibieron mayor inhibición de la actividad ras-luciferasa que lo hizo el oligonucleótido 2570. La mayor inhibición la presentó el oligonucleótido 3985 que tiene una subsecuencia 7-mero de nucleósidos 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo. El oligonucleótido 3980, que tiene una subsecuencia 5-mero de unidades de nucleósido 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo, exhibió la siguiente mayor inhibición seguido del oligonucleótido 3984, que tiene una subsecuencia 9-mero de unidades de nucleósido 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo.

La Figura 2 muestra resultados similares a los de la Figura 1, excepto que tiene la forma de gráfico de barras. También se ve en la Figura 2 la actividad del oligonucleótido 3975 y del oligonucleótido 3979. Estos oligonucleótidos tienen subsecuencias de unidades de nucleósido 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo de nucleósidos 1 y 3 en longitud, respectivamente. Como resulta evidente de la Figura 2, ninguno de los oligonucleótidos mostró actividad significativa. Se observó una actividad mensurable para el oligonucleótido 3979, que tiene la subsecuencia desoxi 3-mero, a la mayor concentración de dosis.

Los incrementos en la actividad de los oligonucleótidos 3980, 3985 y 3984 en comparación con el oligonucleótido 2570 se atribuye al incremento en la afinidad de unión impartida a estos compuestos por los 2'-O-metil sustituyentes localizados en los compuestos y por la activación ARNasa H impartida a estos compuestos por la incorporación de una subsecuencia de nucleósidos de 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo dentro de la secuencia principal de los nucleósidos. En contraste con los compuestos activos de la invención, es interesante indicar que secuencias idénticas a aquellas de los oligonucleótidos 2570, 3980, 3985 y 3984 activos, pero con enlaces fosfodiéster en vez de enlaces fósforotioato de los oligonucleótidos activos de la invención no mostraron actividad. Esto se atribuye a los compuestos fosfodiéster que son sustratos para nucleasas que degradan compuestos fosfodiéster, previniéndoles así de activar potencialmente la ARNasa H.

Otras modificaciones de azúcar: Se han examinado los efectos de otras modificaciones de azúcar 2' aparte de 2'-O-metil sustituyentes en actividad antisentido en oligonucleótidos quiméricos. Estas modificaciones se enumeran en la Tabla 2, junto con los valores de T_{m} obtenidos cuando oligonucleótidos 17-mero que tienen nucleósido 2'-modificados flanqueando una subsecuencia desoxi 7-mero (o abertura desoxi 7-mero) se hibridaron con un complemento de oligoribonucleótido 25-mero como se describe en el Ejemplo 8. Se observó una relación para estos oligonucleótidos entre la longitud alquilo en la posición 2' y T_{m}. Al incrementar la longitud del alquilo, T_{m} disminuyó. El oligonucleótido 2'-fluoro quimérico mostró la mayor T_{m} de las series.

TABLA 2

Correlación de T_{m} con la Actividad Antisentido 17-mero 2'-modificado con abertura 7-desoxi CCACACCGACGGCGCCC(ID SEC Nº:1)

2

Se examinó la actividad antisentido de estos oligonucleótidos 2' modificados contra H-ras usando el ensayo con gen indicador de transactivación descrito en el Ejemplo 9. Todos estos compuestos quiméricos 2' modificados inhibieron la expresión ras, con el compuesto abierto 2'-fluoro 7-mero siendo el más activo. También era activo un oligonucleótido quimérico 2'-fluoro con una abertura desoxi central 5-mero.

Se compararon oligonucleótidos de fósforotioato quiméricos que tenían la ID SEC Nº:1 con subsecuencias 2'-O-propilo flanqueando una subsecuencia desoxi 5-mero o 7-mero con oligonucleótidos quiméricos 2'-O-metilo. Se inhibió la expresión de ras en células T24 con oligonucleótidos quiméricos tanto con 2'-O-metilo como con 2'-O-propilo con una abertura desoxi 7-mero y un sostén de fósforotioato uniforme. Cuando se disminuyó la abertura desoxi a 5 nucleósidos, sólo el oligonucleótido con 2'-O-metilo inhibió la expresión ras.

Inhibición de oligonucleótidos antisentido de la expresión del gen H-ras en células cancerígenas: Se examinaron dos oligonucleótidos de fósforotioato (2502, 2503) comlementarios con la región AUG ras como se describe en el Ejemplo 10, junto con oligonucleótidos quiméricos (4998, 5122) con la misma secuencia y subsecuencias desoxi 7-mero flanqueadas por subsecuencias de 2'-O-metilo. Estos oligonucleótidos quiméricos se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3

Oligonucleótidos de fósforotioato quiméricos con terminaciones 2'-O-metilo (en negrita y subrayado y abertura desoxi central) (AUG objetivo)

3

El compuesto 2503 inhibió la expresión ras en células T24 en un 71%, y el compuesto quimérico (4998) inhibió el ARNm ras aún más (84% de inhibición). El compuesto 2502, también complementario de la región AUG, disminuyó los niveles de ARN ras en un 26% y la versión quimérica de este oligonucleótido (5122) demostró un 15% de inhibición. También se incluyeron en este ensayo dos oligonucleótidos dirigidos al codón-12 mutante. EL compuesto 2570 (ID SEC Nº:1) disminuyó el ARN ras un 82% y la versión quimérica 2'-O-metilo de este oligonucleótido con una subsecuencia desoxi 7-mero (3985) disminuyó el ARN ras un 95%.

Los oligonucleótidos 2570 y 2503 también se examinaron para determinar sus efectos en la expresión ras de células HeLa, que tienen un codón-12 H-ras de tipo salvaje (esto es, no activado). Mientras que estos dos oligonucleótidos inhibían la expresión ras en células T24 (habiendo activado el codón-12), sólo el oligonucleótido (2503) hibridable específicamente con AUG ras inhibía la expresión ras en células HeLa. El oligonucleótido 2570 (ID SEC Nº:1), específicamente hibridable con el codón-12 activado, no inhibía la expresión ras en células HeLa, porque estas células carecen del codón-12 objetivo activado.

El oligonucleótido 2570, un oligonucleótido de fósforotioato 17-mero complementario con la región codón-12 del H-ras activado, se examinó por la inhibición de la expresión ras (como se describe en el Ejemplo 8) en células T24 junto con los oligonucleótidos 2'-O-metil sustituidos de fósforotioato quiméricos 3980, 3985 y 3984, que tienen la misma secuencia que 2570 y tienen secuencias desoxi de las unidades de nucleósido 5, 7 y 9, respectivamente (se muestran en la Tabla 1). El oligonucleótido 2'-desoxi uniforme 2570 y los tres oligonucleótidos quiméricos disminuyeron los niveles de ARNm ras en células T24. Los compuestos 3985 (abertura desoxi 7-mero) y 3984 (abertura desoxi 9-mero) disminuyeron el ARNm ras un 81%; el compuesto 3980 (abertura desoxi 5-mero) disminuyó el ARNm ras un 61%. Los oligonucleótidos quiméricos que tienen esta secuencia, pero que tienen nucleósidos 2'-fluoro sustituidos flanqueando una subsecuencia desoxi 5-mero (4689) o desoxi 7-mero (4690), inhibieron la expresión del ARNm ras en células T24, prefiriéndose la subsecuencia desoxi 7-mero (82% de inhibición, frente al 63% de inhibición para la quimera 2'-fluoro con la subsecuencia desoxi 5-mero).

Inhibición oligonucleótida antisentido de la proliferación de células cancerígenas: Se examinaron tres oligonucleótidos 17-mero con la misma secuencia (ID SEC Nº:1), complementarias de la región codón-12 del ras activado, por sus efectos en la proliferación de la célula cancerígena T24 como se describe en el Ejemplo 11. El oligonucleótido 3985 es un fósforotioato uniforme que tiene una subsecuencia desoxi 7-mero flanqueada por nucleósidos 2'-O-metil sustituidos, y el 4690 es un fósforotioato uniforme que tiene una subsecuencia desoxi 7-mero (abertura) flanqueada por nucleósidos 2'-fluoro sustituidos (C^{F}C^{F}A^{F} C^{F}A^{F}C_{d} C_{d}G_{d}A_{d} C_{d}G_{d}G_{d} C^{F}G^{F}C^{F} C^{F}C^{F}, ID SEC Nº:1, los nucleósidos identificados con "F" contienen un sustituyente 2'-flúor y los nucleósidos identificados con "d" son nucleósidos de 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo). Los efectos de estos oligonucleótidos en la proliferación de células cancerígenas se correlacionaron bien con sus efectos en la expresión de ARNm ras que muestra el análisis de manchas de Northern: el oligonucleótido 2570 inhibió la proliferación celular un 61%, el oligonucleótido quimérico 2'-O-metilo 3985 inhibió la proliferación celular un 82%, y el análogo 2'-fluoro quimérico inhibió la proliferación celular un 93%.

En estudios de respuesta a dosis de estos oligonucleótidos en la proliferación celular, se mostró que la inhibición dependía de la dosis en el intervalo de 25 nM a 100 nM. Los valores de IC_{50} de 44 nM, 61 nM y 98 nM se podían asignar a los oligonucleótidos 4690, 3985 y 2570, respectivamente. El oligonucleótido control aleatorio no tenía ningún efecto a las dosis probadas.

El efecto de ISIS 2570 en la proliferación celular era específico para el tipo de célula. La inhibición de la proliferación de células T24 mediante este oligonucleótido era cuatro veces mayor que la inhibición de células HeLa con el mismo oligonucleótido (concentración de oligonucleótido de 100 nM). ISIS 2570 se dirige al codón-12 ras activado (mutante), que está presente en T24 pero no lo está en células HeLa, que tienen el codón-12 de tipo salvaje.

Oligonucleótidos modificados de sostén quiméricos: Los oligonucleótidos discutidos en ejemplos previos tenían elementos principales de fósforotioato uniformes. Los oligonucleótidos quiméricos 2' modificados discutidos arriba no son activos en sostenes de fosfodiéster uniformes. Se sintetizó un oligonucleótido quimérico (ISIS 4226) con regiones 2'-O-metil sustituidas flanqueando una abertura desoxi 5-mero, teniendo la región de abertura enlaces P=S y las regiones flanqueadoras enlaces P=O. También se hizo otro oligonucleótido quimérico (ISIS 4223) con un sostén P=O en el gap y P=S en regiones flanqueadoras. Estos oligonucleótidos se muestran en la Tabla 4.

También se sintetizaron oligonucleótidos con unidades de nucleósido 2'-desoxi uniformes. Estos oligonucleótidos tienen enlaces fósforotioato con un único enlace fosfodiéster (ISIS 4248), o dos enlaces fosfodiéster (ISIS 4546), o tres enlaces fosfodiéster (ISIS 4551), o cuatro enlaces fosfodiéster (ISIS 4593), o cinco enlaces fosfodiéster (ISIS 4606) o diez enlaces fosfodiéster (ISIS 4241) en la región central de la molécula. Estos oligonucleótidos también se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4

Oligonucleótidos de sostén quiméricos (P=S, P=O) con ramas 2'-O-metilo (en negrita y subrayado) y abertura desoxi central (enlaces de sostén indicados por s(P=S) o por o (P=O))

4

Se incubaron oligonucleótidos en extractos celulares HeLa crudos a 37ºC para determinar su sensibilidad a la degradación nucleasa como se describe en Dignam y col., Nucleic Acids Res., 1983, 11, 1475-1489. El oligonucleótido (4233) con una región central de fosfodiéster 5-mero regiones flanqueadoras sustituidas con fósforotioato/2'-O-metilo tenían un T_{1/2} de 7 horas. El oligonucleótido con una región central de fósforotioato 5-mero y las regiones flanqueadoras sustituidas con fósforotioato/2'-O-metilo tenían un T_{1/2} de 30 horas. En el grupo de oligonucleótidos con 1 a 10 enlaces fosfodiéster diéster, el oligonucleótido (4248) con un único enlace fosfodiéster era estable a nucleasas igual que lo era el oligonucleótido de fósforotioato uniforme, ISIS 2570, sin mostrar ninguna degradación tras 5 horas en extracto celular HeLa. Los oligonucleótidos con regiones centrales fosfodiéster 2-mero, 3-mero y 4-mero tenían T_{1/2} de aproximadamente 5,5 horas, 3,75 horas, y 3,2 horas, respectivamente, y oligonucleótidos con regiones centrales fosfodiéster 5-mero o 10-mero tenían T_{1/2} de 1,75 horas y 0,9 horas, respectivamente.

Actividad antisentido de oligonucleótidos modificados de sostén quiméricos: No se requiere un sostén de fósforotioato uniforme para la actividad antisentido. Se examinaron ISIS 4226 e ISIS 4233 en el sistema informador de ras-luciferasa por el efecto en la expresión ras junto con ISIS 2570 (fósforotioato uniforme/desoxi uniforme), ISIS 3980 (fósforotioato uniforme, regiones flanqueadoras 2'-O-metilo con región central desoxi) e ISIS 3961 (fosfodiéster uniforme, regiones flanqueadoras 2'-O-metilo con región central desoxi). Todos los oligonucleótidos que tenían una región central P=S (esto es, nucleasa resistente) inhibían la expresión ras. También se ensayaron por su actividad los dos oligonucleótidos 2'-desoxi uniformes con enlaces fósforotioato que contenían bien 1 enlace fosfodiéster (ISIS 4248) o bien 10 enlaces fosfodiéster (ISIS 4241) en el centro de la molécula. El oligonucleótido que contenía un único P=O era igual de activo que el oligonucleótido que contenía todos los enlaces fósforotioato (oligonucleótido P=S uniforme), mientras que el mismo oligonucleótido con 10 enlaces P=O era completamente inactivo.

Se hicieron oligonucleótidos de fósforotioato quiméricos de ID SEC Nº:1, con un sostén de fósforotioato en la región central desoxi 7-mero (abertura) y enlaces fosfodiéster en las regiones flanqueadoras, que estaban sustituidas con 2'-O-metilo o 2'-O-propilo. El oligonucleótido con regiones flanqueadoras fosfodiéster sustituidas con 2'-O-propilo era capaz de inhibir la expresión ras.

Curvas de fusión

Se midieron las curvas de absorbancia frente a temperatura a 260 nm usando un espectrofotómetro Gilford 260 acoplada con un ordenador IBM y un espectrofotómetro Gilford Response II. El tampón contenía Na^{+} 100 mM, fosfato 10 mM y EDTA 0,1 mM, pH 7. La concentración de oligonucleótido era de 4 \muM cada cadena determinada por la absorbancia a 85ºC y los coeficientes de extinción calculados según Puglisi y Tinoco, Methods in Enzymol., 1989, 180, 304-325. Se obtuvieron los valores de T_{m}, energías libres de la formación de dúplex y las constantes de asociación de ajustes de datos a un modelo en dos estados con líneas de base inclinadas lineares. Petersheim, M. y Turner, D.H., Biochemistry, 1983, 22, 256-263. Los parámetros presentados son medias de al menos tres experimentos. Para algunos oligonucleótidos, también se obtuvieron energías libres de formación de dúplex de gráficos de T_{m}^{-1} frente a log_{10} (concentración). Borer, P.N., Dengler, B., Tinoco, I., Jr., y Uhlenbeck, O.C., J. Mol. Biol., 1974, 86, 843-853.

Sistema del gen indicador de la transactivación ras

El plásmido de expresión pSV2-oli, que contenía un ADNc de H-ras activado (codón-12, GGC\rightarrowGTC) insertado bajo control del promotor SV40 constitutivo, fue un regalo del Dr. Bruno Tocque (Rhone-Poulenc Sante, Vitry, Francia). Este plásmido se usó como patrón para construir, mediante PCR, un plásmido de expresión H-ras bajo la regulación del promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV) inducible por esteroides. Para obtener secuencias codificadoras H-ras, se amplificó la región codificadora de 570 bp del gen H-ras mediante PCR. Los iniciadores PCR se diseñaron con sitios endonucleasa de restricción únicos en sus regiones 5' para facilitar la clonación. El producto de PCR con la región codificadora del oncogen mutante del codón-12 del H-ras se purificó en gel, se digirió, y se volvió a purificar en gel antes de la clonación. Esta construcción se completó clonando el inserto en el plásmido de expresión pMAMneo (Clontech Laboratories, CA).

El gen indicador de respuesta ras pRDO53 se usó para detectar la expresión ras. Owen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1990, 87, 3866-3870.

Análisis de manchas Northern de la expresión ras in vivo

Se obtuvo la línea de células cancerígenas de vejiga urinaria humana T24 de la Colección de Cultivos de Tipo Americano (Rockville MD). Se cultivaron células en medio McCoy 5A con L-glutamina (Gibco BRL, Gaithersburg MD), suplementado con suero fetal de ternera inactivado con calor al 10% y 50 U/ml de penicilina y de estreptomicina. Se inocularon las células en placas de 100 mm. Cuando alcanzaron una confluencia del 70%, se trataron con oligonucleótido. Se lavaron las placas con 10 ml de PBS precalentado y 5 ml de medio de suero reducido de Opti-MEM con 2,5 \mul de DOTMA. Luego se añadió oligonucleótido a la concentración deseada. Tras 4 horas de tratamiento, se reemplazó el medio con medio McCoy. Se cultivaron células 48 horas después del tratamiento oligonucleótido y se aisló ARN usando un procedimiento de purificación con ClCs estándar. Kingston, R.E., en Current Protocols in Molecular Biology, (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman y K. Strahl, eds.), John Wiley e Hijos, NY.

Se obtuvo la línea de células de carcinoma epiteloide humano HeLa 229 de la Colección de Cultivos Tipo Americano (Bethesda, MD). Las células HeLa se mantuvieron como monocapa en placas con 6 pozos en medio Dulbecco Modified Eagle (DMEM) con un suplemento de suero fetal bovino al 10% y 100 U/ml de penicilina. El tratamiento con oligonucleótido y el aislamiento de ARN fueron esencialmente como se describe arriba para las células T24.

Hibridación Northern: Se sometieron 10 \mug de cada ARN por electroforesis en un gel de agarosa/formaldehído al 1,2% y se transfirió durante la noche a una membrana de nailon GeneBind 45 (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) usando procedimientos estándar. Kingston, R.E., en Current Protocols in Molecular Biology, (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman y K. Strahl, eds.), John Wiley e Hijos, NY. El ARN se reticuló con UV a la membrana. Se sintetizaron sondas marcadas con ^{32}P de doble cadena usando el Inicio un kit de marcaje de Genes (Promega, Madison WY). La sonda ras era un fragmento SalI-NheI de un clon de ADNc del ARNm H-ras activado (mutante) con una mutación GGC-a-GTC en el codón-12. La sonda control era G3PDH. Se prehibridaron las manchas durante 15 minutos a 68ºC con la solución de hibridación QuickHyb (Stratagene, La Jolla, CA). Se añadió la sonda radioactiva desnaturalizada al calor (2,5 x 10^{6} cuentas/2 ml de solución de hibridación) mezclada con 100 \mul de 10 mg/ml de ADN de esperma de salmón y se hibridó la membrana durante 1 hora a 68ºC. Se lavaron las manchas dos veces durante 15 minutos a temperatura ambiente en 2x SSC/SDS al 0,1% y una vez durante 30 minutos a 60ºC con 0,1xSSC/SDS al 0,1%. Las manchas se autoradiografiaron y se cuantificó la intensidad de la señal usando un ImageQuant PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Las manchas Northern se hibridaron primero con la sonda ras, luego se destiló hirviendo durante 15 minutos en 0,1xSSC/SDS al 0,1% y se volvieron a hibridar con la sonda control G\cdotPDH para comprobar la carga correcta de muestras.

Inhibición oligonucleótida antisentido de proliferación de células cancerígenas

Se cultivaron células y se trataron con oligonucleótido esencialmente como se describe en el Ejemplo 10. Se inocularon células en placas de 60 mm y se trataron con oligonucleótido en presencia de DOTMA cuando alcanzaron una confluencia del 70%. Experimento en el curso del tiempo: El día 1, se trataron las células con una única dosis de oligonucleótido a una concentración final de 100 nM. El medio de crecimiento se cambió una vez el día 3 y se contaron las células cada día durante 5 días, usando una cámara de recuento. Experimento de respuesta a la dosis: Se añadieron varias concentraciones de oligonucleótido (10, 25, 50, 100 ó 250 nM) a las células y se cultivaron las células y se contaron 3 días después. Se examinaron los oligonucleótidos 2570, 3985 y 4690 por sus efectos en la proliferación de células cancerígenas T24.

Ejemplo comparativo 3

Inhibición de la expresión de ARNm de PKC-\alpha mediante oligonucleótidos 2'-O-metilo quiméricos (con abertura desoxi)

Se sintetizaron oligonucleótidos con la ID SEC Nº:4 como oligonucleótidos quiméricos de fósforotioato uniformes que tienen una región central desoxi o desoxi abertura de diversas longitudes flanqueados por subsecuencias 2'-O-metil sustituidas. Se examinaron estos oligonucleótidos (concentración de 500 nM) por sus efectos sobre los niveles de ARNm de PKC-\alpha mediante análisis de manchas Northern. Las aberturas desoxi de 8 nucleósidos o más dieron una reducción máxima de los niveles de ARNm de PKC-\alpha (ambos transcritos) en todos los casos. Estos oligonucléotidos redujeron el ARNm de PKC-\alpha aproximadamente un 83% con una longitud de abertura desoxi de 4 nucleósidos, y dieron una reducción casi completa de ARNm de PKC-\alpha con una longitud de abertura desoxi de 6 o más nucleósidos.

Los oligonucleótidos quiméricos sustituidos con 2'-O-metilo con aberturas 4-mero o 6-mero tienen un IC_{50} para la reducción de ARNm de PKC-\alpha (concentración de oligonucleótido necesaria para producir una reducción del 50% en los niveles de ARNm de PKC-\alpha) de 200 nM a 250 nM, como hizo el oligonucleótido desoxi uniforme (todos son fósforotioatos uniformes). El oligonucleótido quimérico sustituido con 2'-O-metilo con una abertura desoxi 8-mero tenía un IC_{50} de aproximadamente 85 nM.

Se compararon varias variaciones de este oligonucleótido quimérico (ID SEC Nº:4) para ver su capacidad de disminuir los niveles de ARNm de PKC-\alpha. Estos oligonucleótidos se muestran en la Tabla 5.

TABLA 5

Oligonucleótidos P=S 2'-O-metil/desoxi quiméricos 2'-O-metilo en negrita y subrayado; s= enlace P=S, o= enlace P=O

5

El efecto de estos oligonucleótidos en los niveles de ARNm de PKC-\alpha se muestra en la Figura 3. Los oligonucleótidos 7008, 3522 y 5352 muestran reducción de ARNm de PKC-\alpha, siendo el 5352 el más activo.

Se sintetizó una serie de oligonucleótidos quiméricos de 2'-O-propilo con la ID SEC Nº:4. Estos oligonucleótidos se muestran en la Tabla 6.

\newpage

TABLA 6

Oligonucleótidos P=S 2'-O-propil/desoxi quiméricos 2'-O-propilo en negrita y subrayado; s= enlace P=S, o= enlace P=O

6

Estos oligonucleótidos quiméricos 2'-O-propil sustituidos se compararon con los oligonucleótidos quiméricos 2'-O-metil sustituidos. Los oligonucleótidos 7273 y 7294 eran más activos que sus contrapartidas 2'-O-metilo para reducir los niveles de ARNm de PKC-\alpha. Esto se muestra en las Figuras 4 y 5.

Ejemplo comparativo 4

Oligonucleótidos adicionales que disminuyen la expresión del ARNm de PKC-\alpha

Se diseñaron y sintetizaron oligonucleótidos de fósforotioato adicionales dirigidos a la región no traducida 3' de PKC-\alpha humano. Estas secuencias se muestran en la Tabla 7.

TABLA 7

Oligonucleótidos P=S 2'-O-propil/desoxi quiméricos dirigidos a 3'-UTR de PKC-\alpha 2'-O-propilo en negrita y subrayado; s= enlace P=S, o= enlace P=O

7

Los oligonucleótidos 6632, 6653, 7082 y 7083 son los más activos para reducir los niveles de ARNm de PKC-\alpha.

Ejemplo 1 Efecto de oligonucleótidos con ID SEC Nº:30 sobre los niveles de ARNm de PKC-\alpha

Se trataron células A549 con oligonucleótidos de fósforotioato a 500 nM durante 4 horas en presencia de los lípidos catiónicos DOTMA/DOPE (DOPE=1,2-di([cis]-9-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), se lavaron y se dejó que se recuperaran durante 20 horas adicionales. Se extrajo el ARN total y se resolvieron 20 \mug de cada en geles al 1,2% y se transfirieron a membranas de nailon. Estas manchas se sondaron con una sonda de PKC-\alpha radiomarcada ^{32}P y luego se descargaron y resondaron con una sonda de G3PDH radiomarcada para confirmar la igualdad en la carga de ARN. Cada oligonucleótido [3520(ID SEC Nº:31), 3521 (ID SEC Nº:30), 3522 (ID SEC Nº:4) y 3527 (ID SEC Nº:32)] se usó por duplicado. Se examinaron las dos transcripciones de PKC-\alpha mayores (8,5 kb y 4,0 kb) y se cuantificaron con un PhosphorImage (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA). ISIS 3521 (ID SEC Nº:30) dio aproximadamente una reducción del 80% del transcrito más pequeño y más de un 90% de reducción del transcrito mayor.

Se sintetizaron dos oligonucleótidos con la ID SEC Nº:30 y una región central desoxi 8-mero flanqueada a cada lado por nucleósidos con la modificación 2'-OCH_{2}CH_{2}OCH_{3}. Para facilitar la síntesis, el último nucleósido era un desoxinucleósido. Estos compuestos, que se muestran en la Tabla 8, difieren en que uno de ellos, ISIS 9606, tiene un sostén de fósforotioato uniforme mientras que el otro, ISIS 9605, tiene un sostén de fósforotioato en la región central (enlace de sostén 7-14) y un sostén de fosfodiéster en las regiones flanqueadoras. Estos oligonucleótidos se examinaron por su capacidad de inhibir la expresión del ARNm de PKC-\alpha en células A549, en comparación con el compuesto de fósforotioato, ISIS 3521. Los resultados se muestran en las Figuras 6a y 6b. Se calcularon las IC_{50} (concentración de oligonucleótido que produce un 50% de inhibición) para los tres compuestos. El compuesto de fósforotioato, ISIS 3521, mostró una IC_{50} de aproximadamente 170 nM. Los dos compuestos metoxietoxi, ISIS 9605 y 9606, mostraron una IC_{50} de aproximadamente 25 nM. Este incremento de potencia de 6 a 7 veces con la modificación metoxietoxi era una indicación de actividad sorprendente. Se prefieren los compuestos metoxietoxi 9605 y 9606 por su IC_{50} extremadamente baja.

TABLA 8 Oligonucleótidos con la ID SEC Nº:30

8

\hskip1.95cm

2'-OCH_{2}CH_{2}CH_{3} en negrita y subrayado

\hskip1.95cm

s= enlace (P=S) fósforotioato

\hskip1.95cm

o= enlace (P=O) fosfodiéster Ejemplo 2 Efecto del oligonucleótido 2'-metoxietoxi ISIS 12723 sobre el crecimiento de los tumores de colon Colo-205 humanos en ratones desnudos

Se establecieron injertos heterólogos de carcinoma de colon Colo-205 humano subcutáneo en ratones desnudos mediante inyección de 5 x 10^{6} células Colo-205 bajo la piel. Se trataron los ratones con ISIS 12723 (ID SEC Nº:30), un oligonucleótido con una región central desoxi 8-mero flanqueada en cada lado por subsecuencias 6-mero con una modificación 2'-OCH_{2}CH_{2}CH_{3}, un sostén de fósforotioato en la región central (enlaces de sostén 7-14) y un sostén de fosfodiéster en las regiones flanqueadoras, o ISIS 3521 (ID SEC Nº:30), fósforotioato desoxi uniforme, administrado de forma intravenosa una vez al día a una dosis de 0,006, 0,06, 0,6 ó 6,0 mg/kg. En este estudio, ISIS 12723 inhibió el crecimiento del tumor en más del 95% en comparación con controles placebo salinos (Figura 7b), e ISIS 3521 inhibió el crecimiento del tumor en más del 83% en comparación con controles (Figura 7a). Por lo tanto, se prefiere el compuesto metoxietoxi, ISIS 12723.

Ejemplo comparativo 5

Inhibición de la expresión de c-raf mediante oligonucleótidos quiméricos

Se diseñaron oligonucleótidos quiméricos con la ID SEC Nº:7 usando la secuencia HUMRAFR de c-raf de Genbank (número Genbank x03484), se sintetizaron y examinaron para la inhibición de la expresión de ARNm de c-raf en células de carcinoma de vejiga T24 usando un ensayo de manchas Northern. Estos oligonucleótidos quiméricos tienen regiones centrales "abiertas" de 6, 8 ó 10 desoxi nucleósidos flanqueados por dos regiones de nucleósidos modificados con 2'-O-metilo, y se muestran en la Tabla 9. Los sostenes eran uniformemente fósforotioatos. En un análisis de manchas Northern, como se describe en el Ejemplo 20, los tres oligonucleótidos (ISIS 6720, abertura desoxi 6-mero; ISIS 6717, abertura desoxi 8-mero; ISIS 6729, abertura desoxi 10-mero) mostraron más del 70% de inhibición de la expresión de ARNm de c-raf en células T24. Se prefieren estos oligonucleótidos. El oligonucleótido con una abertura desoxi 8-mero (6717) mostró más del 90% de inhibición y es más preferente.

\newpage

TABLA 9

Oligonucleótidos "abiertos" desoxi P=S 2'-O-metil quiméricos 2'-O-metilo en negrita y subrayado

9

Se sintetizaron oligonucleótidos quiméricos adicionales con una o más regiones de modificación 2'-O-metilo y sostenes de fósforotioato uniformes. Estos se muestran en la Tabla 10. Todos son fósforotioatos; las regiones en negrita y subrayadas indican regiones modificadas 2'-O-metilo.

TABLA 10 Oligonucleótidos de c-raf P=S 2'-O-metil quiméricos

10

Cuando se probó su capacidad para inhibir el ARNm c-raf mediante análisis de manchas Northern, ISIS 7848, 7849, 7851, 7856, 7855, 7854, 7847, y 7853 dieron más del 70% de inhibición y por lo tanto se prefieren. De estos, 7851, 7855, 7847 y 7853 dieron más del 90% de inhibición y son más preferentes.

Se prepararon y examinaron oligonucleótidos quiméricos adicionales con varias modificaciones 2'. Estos se muestran en la Tabla 11. Todos son fósforotioatos; en negrita y subrayado indica regiones modificadas 2'.

TABLA 11 Oligonucleótidos de c-raf P=S 2'-modificados quiméricos

11

De estos, se prefieren los oligonucleótidos 6720, 6717, 6729, 9720 y 9058. Se prefieren más los oligonucleótidos 6717, 6729, 9720 y 9058.

Ejemplo 3 Efecto de oligonucleótidos 2'-metoxietoxi con ID SEC Nº:7 sobre la expresión de ARNm de c-raf

Se sintetizaron dos oligonucleótidos con la ID SEC Nº:7 y una subsecuencia de 8 unidades de nucleósido central con mitades de azúcar de 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo flanqueadas a cada lado por subsecuencias de 6 unidades de nucleósido con modificaciones 2'-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{3}. Estos compuestos difieren en que uno de ellos, ISIS 10755 (también conocido como CIBA 1440) tiene un sostén de fósforotioato uniforme; el otro, ISIS 10754 (también conocido como CIBA 1439 o CGP 69845) tiene enlaces fósforotioato en la región central (enlaces 7-14) y enlaces fosfodiéster en las regiones flanqueadoras. Se probó la capacidad de estos oligonucleótidos de inhibir la expresión de ARNm de c-raf en células T24. Se calcularon las IC_{50} (concentración de oligonucleótidos que produce una inhibición del 50%) y se muestran en la Tabla 12 junto con los datos de T_{m}, mostrando la afinidad de estos oligonucleótidos por su complemento. Se prefieren tanto ISIS 10755 como 10754 por su IC_{50} extremadamente baja. Los oligonucleótidos usados según esta invención se pueden hacer de forma conveniente y rutinaria mediante la técnica bien conocida de síntesis en fase sólida. (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504). Diversos vendedores disponen del equipamiento para dicha síntesis, incluyendo Applied Biosystems. También se puede usar cualquier otro medio para dicha síntesis; la presente síntesis de los oligonucleótidos está dentro del las habilidades de aquellos expertos en la técnica.

TABLA 12 Actividad antisentido en células T24 y T_{m}

12

Ejemplo 4 Efecto de ISIS 5132 y CGP 69845 en tumores de adenocarcinoma de pulmón humano A549

Se establecieron xenográficos de adenocarcinoma de pulmón A549 humano subcutáneo en ratones desnudos Balb/c machos y se trataron con ISIS 5132 (ID SEC Nº:7) o la versión metoxietoxi (2'-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{3}) de la ID SEC Nº:7 (CGP 69845), ambos administrados a diario mediante inyección intravenosa a dosis que oscilan de 0,006 a 6,0 mg/kg. ISIS 5132 disminuyó el tamaño del tumor a todas las dosis de una forma dependiente de la dosis, como se muestra en las Figuras 6a y 6b. El oligonucleótido metoxietoxi (2'-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{3}), CGP 69845, tenía efectos similares a ISIS 5132 a las dosis más bajas y efectos inhibidores incluso mayores que ISIS 5132 a una dosis de 6,0 mg/kg.

Ejemplo 5 Xenográficos A549

Se implantaron 5 x 10^{6} células A549 de forma subcutánea en el muslo interno de ratones desnudos. Se administraron oligonucleótidos (ISIS 5132 y CGP 69845, también conocido como ISIS 10754) suspendidos en solución salina una vez al día mediante inyección intravenosa a dosis que oscilaban entre 0,006 y 6,0 mg/kg. Se midieron los tumores resultantes los días 9, 12, 17 y 21 y se calcularon los volúmenes de tumor.

Análisis de manchas Northern de la inhibición de la expresión de ARNm de c-raf

Se obtuvo la línea de células cancerígenas de vejiga urinaria humana T24 de la Colección de Cultivos de Tipo Americano (Rockville MD). Se cultivaron células en medio McCoy 5A con L-glutamina (Gibco BRL, Gaithersburg MD), añadiendo un suplemento de suero de ternera fetal inactivado con calor al 10% y 50 U/ml de penicilina y estreptomicina. Se inocularon las células en placas de 100 mm. Cuando alcanzaron una confluencia del 70%, se trataron con oligonucleótido. Las placas se lavaron con 10 ml de PBS precalentado y 5 ml de medio de suero reducido Opti-MEM con 2,5 \mul de DOTMA. Luego se añadió oligonucleótido con lipofectina a la concentración deseada. Tras 4 horas de tratamiento, el medio se sustituyó con medio McCoy. Las células se cultivaron 24 a 72 horas tras el tratamiento con oligonucleótido y se aisló el ARN usando un procedimiento de purificación con ClCs estándar. Kingston, R.E., en Current Protocols in Molecular Biology, (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman y K. Strahl, eds.), John Wiley e Hijos, NY. El ARN total se aisló mediante centrifugación de lisados celulares sobre un cojín de ClCs. Las muestras de ARN se sometieron a electroforesis con geles de agarosa-formaldehído al 1,2% y se transfirieron a membranas de hibridación mediante difusión capilar durante un periodo de 12-14 horas. El ARN se reticuló a la membrana mediante exposición a luz UV en un Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA) y se hibridó a una sonda de ADNc de c-raf marcada con ^{32}P elegida al azar (obtenida de ATCC) o una sonda G3PDH como control. Se cuantificó el ARN usando un Phosphorimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

Ejemplo comparativo 6

Inhibición oligonucleótida de la expresión del gen rev

Los oligonucleótidos quiméricos usados en este ensayo se muestran en la Tabla 13 abajo.

TABLA 13

Oligonucleótidos P=S 2'-O-propil/desoxi quiméricos dirigidos al gen rev VIH 2'-O-propilo en negrita y subrayado; s= enlace P=S, o= enlace P=O

13

Transfección y ensayo con luciferasa: Se mantuvieron células 3T3 en DMEM con glucosa, L-glutamina, piruvato sódico y suero bovino fetal al 10% (GIBCO). Para todos los experimentos, las células se cultivaron la noche anterior a 75.000 células/pozo en placas con 6 pozos (Falcon). Se realizaron las transfecciones usando el procedimiento CaPO_{4} estándar. Para cada grupo de replicantes, se precipitaron 15 \mug/ml de plásmido pSG5/rev, 18 \mug/ml de pHIVenu-luc y 2 \mug/ml de Rep 6, y se echaron 200 \mul de esto en cada pozo. Se permitió que el precipitado se incubara en células durante 7 horas a 37ºC. Luego se aspiró el medio, se lavaron las células una vez con PBS, y se añadió medio completo fresco para la incubación durante la noche. Después de la incubación, se retiró el medio, se lavaron las células con 2 ml de Opti-MEM (GIBCO) y 1 ml de Opti-MEM con 2,5 \mug/ml de Lipofectina (GIBCO-BRL) y se añadió el oligonucleótido. La mezcla se incubó durante 4 horas a 37ºC, siendo aspirado en dicho punto de las células y se añadió medio completo. Dos horas después de este tratamiento, se añadieron 0,2 \muM/ml de dexametasona (Sigma) a todos los pozos para permitir la inducción del promotor MMTV de pVIHenu-luc.

El ensayo con luciferasa se realizó 24 horas después, de la siguiente manera: Se lavaron los pozos dos veces con PBS y se cultivaron las células mediante raspado en 200 \mul de tampón lisis (Triton al 1%, glicilglicina 25 mM, pH 7,8, SO_{4}Mg 15 mM, EGTA 4 mM y DTT 1 mM). El lisado se clarificó mediante microfuga durante 5 minutos a 11.500 rpm en frío. Luego se combinaron 100 \mul del lisado en una placa de microvaloración con 50 \mul de tampón de ensayo (glicilglicina 25 mM, pH 7,8, SO_{4}Mg 15 mM, EGTA 4 mM, fosfato potásico 15 mM, pH 7,8, DTT 1 mM y ATP 7,5 mM). Se realizó la detección de Luc usando un lector luminiscente de microvaloración (Dynatech Laboratories). Las reacciones se iniciaron mediante inyección 50 \mul de solución de luciferasa 1x (Sigma). La solución 1x se diluyó en tampón de luciferina (glicilclicina 25 mM, pH 7,8, SO_{4}Mg 15 mM, EGTA 4 mM y DTT 10 mM) antes de su uso de un almacén 10x (luciferina 10 mM en DTT 10 mM). Se contaron las muestras durante 20 segundos. La cinética de la emisión de luz de luc de luciérnaga se caracteriza por un periodo de impulso luminoso que dura unos pocos segundos seguido de un periodo de menor intensidad de emisión de luz que dura varios minutos.

Síntesis de ARN de Rev y RRE (elemento de respuesta a Rev): pSG%-Rev contiene el gen Rev adyacente al promotor T7. Se usó el pSG5/Rev linearizado BgIII como patrón de ADN para la transcripción con ARN polimerasa T7. Se produjo un patrón para la producción de ARN RRE mediante PCR. Para la síntesis de ARN, se usaron patrones de ADN de 0,2 a 1,0 mg/ml, con 5 mM cada uno de ATP, CTP y GTP, 0,5 mM de UTP, 10 mM de DTT, 40 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 6 mM de Cl_{2}Mg, 4 mM de Espermidina, 500 U/ml de ARNsina a 20 U/\mul, 92,5 MBg/ml (2500 \muCi/ml) de \alpha ^{32}P UTP a 370 MBg/ml (10 mCi/ml) y 1000 U/ml de ARN polimerasa T7. La reacción se incubó durante 1 hora a 37ºC. La reacción de transcripción se finalizó añadiendo tampón de carga de formamida y se pasó por un gel de poliacrilamida desnaturalizante que contenía urea 8 M. El ARN se eluyó del gel según el procedimiento de Schwartz y col. (Gene, 1990, 88, 197).

Ejemplo comparativo 7

Inmunoensayo para el examen antiviral

Se cultivaron células NHDF en placas de cultivo de 96 pozos con una densidad de 15.000 células/pozo en FGM (medio de crecimiento de fibroblastos) libre de suero. Las monocapas establecidas se pretrataron con el oligonucleótido durante la noche en FGM antes de la infección. Tras el pretratamiento, las células se aclararon tres veces con FGM fresco precalentado, y se añadió virus en 100 \mul de FGM/pozo para conseguir un MOI de 0,05 PFU/célula. Después de 2 horas de incubación a 37ºC, se retiró el virus y se añadió medio fresco (100 \mul/pozo) que contenía el oligonucleótido. El medio se intercambió 2 días después de la infección con medio fresco que contenía el oligonucleótido, y 6 días después de la infección, las células se fijaron en etanol absoluto y se secaron en preparación para tinción de anticuerpos. Se usó un protocolo modificado para algunos ensayos en los que al FGM se añadió un suplemento de bajos niveles de FBS (0,2%), y se acortó el periodo de incubación tras la infección de 6 días a 3 días. El ensayo más corto eliminaba la necesidad de intercambiar el medio 2 días después de la infección. Los dos ensayos producían valores comparables para concentraciones efectivas del 50% (EC_{50}).

Las células fijadas se bloquearon en una solución de PBS que contenía seroalbúmina bovina al 2% (BSA), y se añadió anticuerpo monoclonal de ratón (1H10, comercializado por Eisai Co., Ltd., Japón) en una dilución 1:2000 en BSA PBS-1%. El anticuerpo 1H10 reconoce un polipéptido HCMV tardío abundante de aproximadamente 65 kDa de tamaño. La detección del anticuerpo monoclonal unido se facilitó con \beta-galactosidasa emparejada con estreptavidina de inmunoglobulina G abd anti-ratón de cabra biotinilada (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD). Se usó \beta-D-galactopiranósido rojo de clorofenol como sustrato para la \beta-galactosidasa, y se determinó la actividad midiendo la densidad óptica a 575 nm de pozos individuales con un lector de microplaca Biotex modelo EL312e.

Los oligonucleótidos usados en este ensayo se muestran en la Tabla 14 abajo.

TABLA 14

Inhibición de replicación CMV mediante oligonucleótidos P=S 2'-O-metil quiméricos 2'-O-metilo en negrita y subrayado

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Ejemplo comparativo 8

Evaluación de los oligonucleótidos 270 y 330 en un Ensayo de Proteínas H8Ad17 de HCV (Virus de la hepatitis C)

Se desarrolló un ensayo de manchas Western usando suero anti-HCV policlonal humano purificado de afinidad e IgG anti-humana de cabra ^{125}I-conjugada en lugar de los ensayos ELISA usados anteriormente para evaluar los efectos de oligonucleótidos en niveles de proteína nuclear de HCV. Se cultivaron placas con seis pozos con células H8 a 3,5 x 10^{5} células/pozo. Las células se cultivaron durante la noche. Las células se trataron con oligonucleótido en Opti-MEM con 5 \mug/ml de lipofectina durante 4 horas. Las células se alimentaron con 2 ml de medio H8 y se permitió que se recuperaran durante la noche. Para cultivar células, éstas se lavaron una vez con 2 ml de PBS, se lisaron en 100 \mul de tampón Laemmli y se cultivaron mediante raspado. Para la electroforesis, se hirvieron los lisados celulares, y se cargaron 10-14 \mul de lisado celular en cada calle de un gel de pliacrilamida al 16%. Tras la electroforesis, las proteínas se transfirieron mediante electroforesis a la membrana PVDF. La membrana se bloqueó en PBS con suero de cabra al 2% y Tween-20 al 0,3%,, y se incubó durante la noche con anticuerpo primario (anticuerpo 2243 anti-núcleo humano y anticuerpo anti-G3PDH de conejo). La membrana se lavó 5 x 5 minutos en tampón, luego se incubó con anticuerpos secundarios durante 4-8 horas (^{125}I conjugado de cabra anti-humano, e ^{125}I conjugado de cabra anti-conejo). La membrana se lavó 5 x 5 minutos en tampón, se selló en plástico y se expuso en un cassette PhosphorImager durante la noche. Se cuantificaron las bandas en el PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA), normalizadas a niveles de expresión de G3PDH, y los resultados se representaron como porcentaje de células no tratadas de control.

Los oligonucleótidos evaluados mediante este ensayo de manchas Western se muestran en la Tabla 15. En las secuencias mostradas, las mayúsculas representan la secuencia base, las minúsculas (o ó s) representan enlaces internucleósido, bien fosfodiéster (P=O) o bien fósforotioato (P=S), respectivamente. 2'-O-propilo en negrita y subrayado. * = 2'-O-butilimidazol. + = 2'-O-propilamina.

TABLA 15

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Síntesis de 2,6-Diamino-9-(2'-O-octadecil-\beta-D-ribofuranosil)purina

2,6-Diamino-9-(\beta-D-ribofuranosil)purina (50 g, 180 mmol) e hidruro sódico (7 g) en DMF (1 l) se calentaron hasta hervir durante 2 h. Se añadió iodooctadecano (100 g) a 150ºC y se dejó enfriar hasta RT. El solvente se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice. El producto se eluyó con MeOH/CH_{2}Cl_{2} al 5%. Las fracciones apropiadas se evaporaron para producir el producto (11 g). RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 0,84 (t, 3, CH_{2}); 1,22 (m, 32, O-CH_{2}-CH_{2}-(CH_{2})_{16}); 1,86 (m, 2, O-CH_{2}CH_{2}); 3,25 (m, 2, O-CH_{2}); 3,93 (d, 1, 4'H), 4,25 (m, 1, 3'H); 4,38 (t, 1, 2'H); 5,08 (d, 1, 3'-OH); 5,48 (t, 1, 5'-OH); 5,75 (s, 2, 6-NH_{2}); 5,84 (d, 1, 1'-H); 6,8 (s, 2, 2-NH_{2}); y 7,95 (s, 1, 8-H).

Síntesis de 2'-O-Octadecilguanosina

Se trató 2,6-Diamino-9-(2'-O-octadecil-\beta-D-ribofuranosil) purina (10 g) en tampón fosfato sódico 0,1 M (50 ml, pH 7,4), tampón tris 0,1 M (1000 ml, pH 7,4) y DMSO (1000 ml) con adenosín desaminasa (1,5 g) a RT. En los días 3, 5 y 7 se añadió una alícuota adicional (500 mg, 880 mg y 200 mg, respectivamente) de adenosín desaminasa. La reacción se agitó durante un total de 9 días y la purificación por cromatografía en gel de sílice produjo el producto (2 g). Se recristalizó una muestra analítica de MeOH RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 0,84 (t, 3, CH_{3}), 1,22 [s, 32, O-CH_{2}-CH_{2}-(CH_{2})_{16}], 5,07 (m, 2, 3'-OH y 5'-OH); 5,78 (d, 1, 1'-H); 6,43 (s, 2, NH_{2}), 7,97 (s, 1, 8-H) y 10,64 (s, 1, NH_{2}). Anal. Calcul. para C_{26}H_{49}N_{5}O_{5}: C, 62,80; H, 9,16; N, 12,95. Encontrado: C, 62,54; H, 9,18; N, 12,95.

Síntesis de N^{2}-isobutiril-2'-O-octadecilguanosina

Se enfrió 2'-O-octadecilguanosina (1,9 g) en piridina (150 ml) en un baño de hielo, y se trató con cloruro de trimetilsililo (2 g, 5 eq) y cloruro de isobutirilo (2 g, 5 eq). La mezcla de reacción se agitó durante 4 horas, tiempo durante el cual se dejó enfriar a temperatura ambiente. La solución se enfrió, se añadió agua (10 ml) y se agitó durante 30 minutos más. Se añadió hidróxido de amonio concentrado (10 ml) y la solución se concentró in vacuo. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (eluído con MeOH/EtOAc al 3%) para producir 1,2 g de producto. RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 0,85 (t, 3, CH_{3}), 1,15 (m, 38, O-CH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{16}, CH(CH_{3})_{2}), 2,77 (m, 1, CH(CH_{3})_{2}), 4,25 (m, 2, 2'-H y 3'-H); 5,08 (t, 1, 5'-OH), 5,12 (d, 1, 3'-OH), 5,87 (d, 1, 1'-H), 8,27 (s, 1, 8-H), 11,68 (s, 1, NH_{2}) y 12,08 (s, 1, NH_{2}). Anal. Calcul. para C_{32}H_{55}N_{5}O_{6}: C, 63,47; H, 9,09; N, 11,57. Encontrado: C, 63,53; H, 9,20; N, 11,52. Antes de incorporar este producto a un oligonucleótido, se convirtió a N^{2}-isobutiril-5'-dimetoxitritil-2'-O-octadecilguanosina y luego a fósforoamidita según el procedimiento descrito en la Publicación Internacional Número WO 94/02501, publicada el 3 de febrero de 1994.

Ensayo de diagnóstico para la detección de la sobreexpresión de ARNm

Se radiomarcan oligonucleótidos tras la síntesis mediante marcado con ^{32}P en el extremo 5' con polinucleótido quinasa. Sambrook y col. ["Molecular Cloning. A Laboratory Manual." Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Volumen 2, págs. 11.31-11.32]. El oligonucleótido radiomarcado de pone en contacto con muestras de tejido o célula sospechosos de expresión de ARNm en exceso, como una muestra de un paciente, en condiciones en las que la hibridación específica puede ocurrir, y la muestra se lava para retirar el oligonucleótido no unido. Se mantiene un control similar en el que el oligonucleótido radiomarcado se pone en contacto con una muestra celular o tisular normal en condiciones que permiten la hibridación específica, y la muestra se lava para retirar el oligonucleótido no unido. La radioactividad restante en la muestra indica oligonucleótido unido y se cuantifica usando un contador de escintilación u otros medios rutinarios. La comparación de la radioactividad que queda en las muestras de células normales y enfermas indica sobreexpresión del ARNm de interés.

Los oligonucleótidos radiomarcados de la invención también son útiles en autoradiografía. Las secciones tisulares se tratan con olinucleótido radiomarcado y se lavan como se describe arriba, luego se exponen a emulsión fotográfica según procedimientos de autorradiografía estándares. También se mantiene un control con muestra de tejido o célula normal. La emulsión, cuando se desarrolla, produce una imagen de granos plateados sobre las regiones que sobreexpresan el ARNm, que se cuantifica. La cantidad de sobreexpresión de ARNm se determina mediante comparación de los granos plateados observados con células normales y enfermas.

Ensayos análogos para la detección fluorescente de la expresión de ARNm usan oligonucleótidos de la invención que están marcados con fluoresceína u otras etiquetas fluorescentes. Los oligonucleótidos de ADN marcados se sintetizan en un sintetizador de ADN automático (Applied Biosystems modelo 380B) usando química de fósforoamidita estándar con oxidación por iodo. Las fósforoamiditas de \beta-cianoetildiisopropilo se compran a Applied Biosystems (Foster City, CA). Las amiditas marcadas con fluoresceína se compran a Glen Research (Sterling, VA). La incubación de oligonucleótido y muestra biológica se realiza como se describe para oligonucleótidos radiomarcados excepto que en vez de contador de escintilación, se usa un microscopio de fluorescencia para detectar la fluorescencia. La comparación de la fluorescencia observada en muestras de células normales y enfermas permite la detección de la sobreexpresión de ARNm.

Detección de la expresión anormal de ARNm

Se incubaron muestras de tejidos o células sospechosos de expresar ARNm anormal con un primer oligonucleótido marcado con ^{32}P o fluoresceína que se dirige al ARNm de tipo salvaje (normal). Se incuba una muestra idéntica de células o tejidos con un segundo oligonucleótido marcado que se dirige al ARNm anormal, en condiciones en las que puede ocurrir hibridación específica, y la muestra se lava para retirar el oligonucleótido no unido. El marcaje que permanece en la muestra indica oligonucleótido unido y se puede cuantificar usando un contador de escintilación, fluorímetro, u otros medios rutinarios. La presencia de ARNm anormal se indica si se observa unión en el caso de la segunda pero no de la primera muestra.

También se puede usar el doble marcaje con los oligonucleótidos y procedimientos de la invención para detectar específicamente el ARNm anormal. Se incuba una muestra única de tejido con un oligonucleótido marcado con ^{32}P que se dirige a ARNm de tipo salvaje, y un segundo oligonucleótido marcado con fluoresceína que se dirige al ARNm anormal, en condiciones en que puede ocurrir la hibridación específica. La muestra se lava para retirar el oligonucleótido no unido y los marcajes se detectan contando con escintilación y fluorimetría. La presencia de ARNm anormal se indica si la muestra no se une al oligonucleótido marcado con ^{32}P (esto es, no es radioactiva) pero retiene el marcado fluorescente (esto es, es fluorescente).

Ejemplo comparativo 9

Ingestión de plasma y distribución de tejido de oligonucleótidos en ratones

Se prepararon los siguientes oligonucleótidos:

UsGsCsAsTsCsCsCsCsCsAsGsGsCsCsAsCsCsAsT, ID SEC Nº:27

UsGsCsAsTsCsCsCsCsAsGsGsCsCsAsCsCsAsT , ID SEC Nº:27

UsGsCsAsTsCs CCCCAGG CsCsAsCsCsAsT , ID SEC Nº:27

en los que negrita y subrayado indica un sustituyente 2'-O-propilo, "s" indica un enlace fósforotioato y la ausencia de "s" indica un enlace fosfodiéster en los nucleótidos respectivos. El primer oligonucleótido se identifica como ISIS 3082, el segundo como ISIS 9045, y el tercero como ISIS 9046 en las Figuras 9, 10, 11 y 12. Los oligonucleótidos se tritiaron por el procedimiento de Graham y col., Nuc. Acids. Res., 1993, 16, 3737-3743.

Animales y procedimiento experimental: para cada oligonucleótido estudiado, se asignaron aleatoriamente veinte ratones Balb/c machos (Charles River), que pesaban 25 g, a uno de los cuatro grupos de tratamiento. Tras una semana de aclimatación, los ratones recibieron una única inyección en la vena de la cola de oligonucleótido radiomarcado con ^{3}H (aproximadamente 750 nmoles/kg; oscilando de 4,6 - 6,3 MBg/kg (124-170 \muCi/kg)) administrado en tampón fosfato salino, pH 7,0. La concentración de oligonucleótido en la solución dosificadora era aproximadamente 60 \muM. Se recogió un sangrado retro-orbital (a 0,25, 0,5, 2, ó 4 horas post dosis) y un sangrado terminal (1, 3, 8 ó 24 horas tras la dosis) de cada grupo. Se recogió el sangrado terminal mediante punción cardiaca después de la anestesia con quetamina/xilazina. Se reservó una alícuota de cada muestra de sangre para determinar la radioactividad y la sangre sobrante se transfirió a un tubo recolector cubierto con EDTA y se centrifugó para obtener plasma. Se recogió orina y heces a intervalos (0-4, 4-8 y 8-24 horas) del grupo finalizado a las 24 horas.

Al finalizar, se recogieron el hígado, los riñones, bazo, pulmones, corazón, cerebro, muestra de músculo esquelético, porción del intestino delgado, muestra de piel, páncreas, hueso (ambos fémures conteniendo médula) y dos nodos linfáticos de cada ratón y se pesaron. Se pesaron las heces, luego se homogenizaron 1:1 con agua destilada usando un homogenizador Brinkman Polytron (Westbury, NY). El homogenizado de plasma, tejidos, orina y heces se dividió para el análisis de radioactividad mediante combustión y para la determinación de contenido de oligonucleótido intacto. Todas las muestras se congelaron inmediatamente en hielo seco tras la recolección y se almacenaron a -80ºC hasta el análisis.

Análisis de radioactividad en plasma, tejido, y excrementos: se pesaron muestras de plasma y orina directamente en viales de escintilación y se analizaron directamente mediante recuento por escintilación líquido tras la adición de 15 ml de BetaBlend (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA). Todas las otras muestras (tejidos, sangre y heces homogeneizadas) se pesaron a barcos de combustión y se oxidaron en un oxidante de Biological Materials (Modelo OX-100; R. J. Harvey Instrument Corp., Hillsdale, NJ). El ^{3}H_{2}O se recogió en 20 ml de mezcla, compuesta de 15 ml de BetaBlend y 5 ml de Cocktail de Tritio Harvey (R. J. Harvey Instrument Corp., Hillsdale, NJ). Se determinó la eficiencia de la combustión diariamente mediante la combustión de muestras ancladas con una solución de manitol ^{3}H y que oscilan entre 73,9 -
88,3%. Se realizó el recuento por escintilación líquida usando un Sistema de Escintilación Líquido Beckman LS 9800 o LS 6500 (Beckman Instruments, Fullerton, CA). Se contaron las muestras durante 10 minutos con corrección por enfriamiento rápido automático. Se corrigieron los valores de desintegración por minuto para la eficiencia del procedimiento de combustión.

Análisis de datos: la radioactividad de las muestras se expresó como desintegraciones por minuto por gramo de muestra. Estos valores se dividieron por la actividad específica del radiomarcado para expresar los datos en nanomoles-equivalentes de oligonucleótido total por gramo de muestra, luego convertido en porcentaje de dosis administrada por órgano o tejido. Si se asume una densidad de tejido de 1 g/ml, los datos de nmol/g se convirtieron a una concentración de \muM total. Para calcular la concentración de oligonucleótido intacto en plasma, hígado o riñón en cada punto de tiempo, las concentraciones en \muM totales medias se dividieron por el porcentaje de oligonucleótido intacto en la solución dosificadora (82-97%), luego se multiplicaron por el porcentaje medio de oligonucleótido intacto en cada punto de tiempo como se determina por CGE o HPLC. Estos datos se usaron luego para el cálculo de vidas medias tisulares mediante regresión linear y para comparar la farmacocinética del plasma de los diferentes oligonucleótidos modificados. Los parámetros farmacocinéticos se determinaron usando PCNONLIN 4,0 (Statistical Consultants, Inc., Apex, NC). Tras el examen de los datos, se seleccionó una entrada de bolus de un compartimento, modelo de salida de primer orden (modelo librería 1) para su uso.

El resultado de los exámenes de la ingesta de plasma animal y distribución de tejidos se ilustran gráficamente en las Figuras 9, 10, 11 y 12. Como se ve en la Figura 9, la concentración de plasma de cada uno de los oligonucleótidos examinados disminuye de los niveles de la primera inyección a valores más bajos durante el periodo de prueba de 24 horas. Las concentraciones de plasma de los oligonucleótidos de la invención se mantuvieron a niveles equivalentes a aquellos del fósforotioato portador de no conjugado. Todos los compuestos de la prueba se llevaron del plasma a los tejidos como se muestra en las Figuras 10, 11 y 12. Los compuestos de la invención tenían diferente distribución entre los diversos tejidos. La Figura 10 muestra el modelo de distribución para el oligonucleótido de control, identificado como ISIS 3082, un oligonucleótido de fósforotioato. La Figura 11 muestra el modelo de distribución para un primer compuesto de la invención, un oligonucleótido, identificado como ISIS 9045, que tiene un sustituyente 2' en cada nucleósido. La Figura 12 muestra el modelo de distribución para otro compuesto de la invención, un oligonucleótido "abierto", identificado como ISIS 9046, que tiene un sustituyente 2' y enlaces fosfodiéster en cada nucleósido en secciones "flanqueadoras" del oligonucleótido y nucleósidos de fósforotioato 2'-desoxi en una región central o abierta.

2,2'-Anhidro-[1-(\beta-D-arabinofuranosil)-5-metiluridina]

Se añadieron 5-metiluridina (ribosiltimina, disponible comercialmente a través de Yamasa, Choshi, Japón) (72,0 g, 0,279 M), carbonato de difenilo (90,0 g, 0,420 M) y bicarbonato sódico (2,0 g, 0,024 M) a DMF (300 ml). La mezcla se calentó hasta reflujo, agitando, permitiendo que el gas de dióxido de carbono desprendido se liberara de manera controlada. Tras 1 hora, la solución un poco oscurecida se concentró a presión reducida. El sirope resultante se echó en dietiléter (2,5 l), agitando. El producto formó una goma. El éter se decantó y el residuo se disolvió en una cantidad mínima de metanol (ca. 400 ml). La solución se vertió en éter fresco (2,5 l) para conseguir una goma espesa. El éter se decantó y la goma se secó en un horno al vacío (60ºC a 133 Pa (1 mm Hg) durante 24 horas) para dar un sólido que se trituró hasta obtener un polvo ligeramente coloreado (57 g, 85% producción cruda). El espectro NMR era consistente con la estructura, contaminado con fenol como su sal sódica (ca. 5%). El material se usó como para otras reacciones (o se puede purificar más mediante cromatografía en columna usando un gradiente de metanol en acetato de etilo (10-25%) para dar un sólido blanco, mp 222-4ºC).

2'-O-metoxietil-5-metiluridina

Se añadieron 2,2'-anhidro-5-metiluridina (195 g, 0,81 M), borato tris (2-metoxietilo) (231 g, 0,98 M) y 2-metoxietanol (1,2 l) a un recipiente a presión de acero inoxidable de 2 l y se puso en un baño de aceite precalentado a 160ºC. Tras el calentamiento durante 48 horas a 155-160ºC, se abrió el recipiente y la solución se evaporó hasta secarse y se trituró con MeOH (200 ml). El residuo se suspendió en acetona caliente (1 l). Se filtraron las sales insolubles, se lavaron con acetona (150 ml) y se evaporó el filtrado. El residuo (280 g) se disolvió en CH_{3}CN (600 ml) y se evaporó. Se empaquetó una columna de gel de sílice (3 kg) en CH_{2}Cl_{2}/acetona/MeOH (20:5:3) que contenía Et_{3}NH al 0,5%. El residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (250 ml) y se absorbió a sílice (150 g) antes de cargarlo en la columna. El producto se eluyó con el solvente de empaquetado para dar 160 g (63%) de producto. Se obtuvo material adicional volviendo a trabajar fracciones impuras.

2'-O-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina

Se coevaporó 2'-O-metoxietil-5-metiluridina (160 g, 0,506 M) con piridina (250 ml) y el residuo seco se disolvió en piridina (1,3 l). Se añadió una primera alícuota de cloruro de dimetoxitritilo (94,3 g, 0,278 M) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una hora. Se añadió una segunda alícuota de cloruro de dimetoxitritilo (94,3 g, 0,278 M) y la reacción se agitó durante una hora adicional. Luego se añadió metanol (170 ml) para parar la reacción. HPLC mostró la presencia de aproximadamente el 70% del producto. El disolvente se evaporó y trituró con CH_{3}CN (200 ml). El residuo se disolvió en CHCl_{3} (1,5 l) y se extrajo con 2x500 ml de NaHCO_{3} saturado y 2x500 ml de ClNa saturado. La fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se evaporó. Se obtuvieron 275 g de residuo. El residuo se purificó en una columna de gel de sílice de 3,5 kg, se empaquetó y se eluyó con EtOAc/Hexano/Acetona (5:5:1)que contenía Et_{3}NH al 0,5%. Las fracciones puras se evaporaron para dar 164 g de producto. Aproximadamente se obtuvieron 20 g adicionales de las fracciones impuras para dar una producción total de 183 g (57%).

3'-O-Acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina

2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina (106 g, 0,167 M), DMF/piridina (750 ml de una mezcla 3:1 preparada de 562 ml de DMF y 188 ml de piridina) y anhídrido acético (24, 38 ml, 0,258 M) se combinaron y agitaron a temperatura ambiente durante 24 horas. La reacción se monitorizó mediante TLC enfriando rápidamente primero la muestra TLC con la adición de MeOH. Al completarse la reacción, según TLC, se añadió MeOH (50 ml) y la mezcla se evaporó a 35ºC. El residuo se disolvió en CHCl_{3} (800 ml) y se extrajo con 2x200 ml de bicarbonato sódico saturado y 2x200 ml de ClNa saturado. Las capas de agua se retroextrajeron con 200 ml de Cl_{3}CH. Los compuestos orgánicos combinados se secaron con sulfato sódico y se evaporaron para dar 122 g de residuo (aproximadamente 90% de producto). El residuo se purificó en una columna de gel de sílice de 3,5 kg y se eluyó usando EtOAc/Hexano (4:1). Se evaporaron fracciones de producto puras para producir 96 g (84%). Se recuperó 1,5 g adicionales de fracciones posteriores.

3'-O-Acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metil-4-triazoleuridina.

Se preparó una primera solución disolviendo 3'-O-acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina (96 g, 0,144 M) en CH_{3}CN (700 ml) y se dejó aparte. Se añadió trietilamina (189 ml, 1,44 M) a una solución de triazol (90 g, 1,3 M) en CH_{3}CN (1 l), se enfrió a -5ºC y se removió durante 0,5 horas usando un agitador sobrecargado. Se añadió POCl_{3} a gotas, durante un período de 30 minutos, a la solución agitada mantenida a 0-10ºC, y la mezcla resultante se removió durante 2 horas más. La primera solución se añadió a gotas, durante un periodo de 45 minutos, a la última solución. La mezcla de reacción resultante se almacenó durante la noche en una habitación fría. La sales se filtraron de la mezcla de reacción y la solución se evaporó. El residuo se disolvió en EtOAc (1 l) y los sólidos insolubles se retiraron mediante filtración. El filtrado se lavó con 1x300 ml de NaHCO_{3} y 2x300 ml de ClNa saturado, secado sobre sulfato sódico y evaporado. El residuo se trituró con EtOAc para dar el compuesto titular.

2'-O-metoxietil-5'-dimetoxitritil-5-metilcitidina

Se agitó una solución de 3'-O-acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metil-4-triazoleuridina (103 g, 0,141 M) en dioxano (500 ml) y NH_{4}OH (30 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La solución de dioxano se evaporó y el residuo se azeotropó con MeOH (2x200 ml). El residuo se disolvió en MeOH (300 ml) y se transfirió a un recipiente a presión de acero inoxidable de 2 l. Se añadió MeOH (400 ml) saturado con gas de NH_{3} y se calentó el recipiente a 100ºC durante 2 horas (TLC mostró conversión completa). Se evaporaron los contenidos del recipiente hasta el secado y el residuo se disolvió en EtOAc (500 ml) y se lavó una vez con ClNa saturado (200 ml). Los compuestos orgánicos se secaron sobre sulfato sódico y el disolvente se evaporó para dar 85 g (95%) del compuesto titular.

N^{4}-Benzoil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina

Se disolvió 2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina (85 g, 0,134 M) en DMF (800 ml) y se añadió anhídrido benzoico (37,2 g, 0,165 M) agitando. Tras agitar durante 3 horas, TLC mostró que la reacción estaba completa aproximadamente el 95%. Se evaporó el disolvente y el residuo se azeotropó con MeOH (200 ml). El residuo se disolvió en CHCl_{3} (700 ml) y se extrajo con NaHCO_{3} saturado (2x300 ml) y ClNa saturado (2x300 ml), se secó sobre SO_{4}Mg y se evaporó para dar un residuo (96 g). El residuo se cromatografió en una columna de sílice de 1,5 kg usando EtOAc/Hexano (1:1) que contenía Et_{3}NH al 0,5% como disolvente de elución. Las fracciones de producto puras se evaporaron para dar 90 g (90%) del compuesto titular.

N^{4}-Benzoil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina-3'-amidita

Se disolvió N^{4}-benzoil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina (74 g, 0,10 M) en CH_{2}Cl_{2} (1 l). Se añadieron tetrazol diisopropilamina (7,1 g) y 2-cianoetoxi-tetra(isopropil)fosfito (40,5 ml, 0,123 M) agitando, en una atmósfera de nitrógeno. La mezcla resultante se agitó durante 20 horas a temperatura ambiente (TLC mostró que la reacción era completa al 95%). La mezcla de reacción se extrajo con HCO_{3}Na saturado (1x300 ml) y ClNa saturado (3x300 ml). Los lavados acuosos se retroextrajeron con Cl_{2}CH_{2} (300 ml), y los extractos se combinaron, se secaron sobre SO_{4}Mg y se concentraron. El residuo obtenido se cromatografió en una columna de sílice de 1,5 kg usando EtOAc/Hexano (3:1) como disolvente de elución. Las fracciones puras se combinaron para dar 90,6 g (87%) del compuesto titular.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: ISIS Pharmaceuticals, Inc. & Novartis AG

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Oligonucleótidos Abiertos Modificados con Azúcar

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 32

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DOMICILIO PARA LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Woodcock Washburn Kurtz Mackiewicz & Norris

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: One Liberty Place - Planta 46

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Filadelfia

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: PA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EEUU

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 19103

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMATO LEGIBLE DE ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO MEDIO: disco de 3,5'', 720 Kb

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: WordPerfect 5.1

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: N/A

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO: Adjunta

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN: N/A

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 60.011.620

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO: 14 de febrero de 1996

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Joseph Lucci

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 33.307

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 215-568-3100

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: 215-568-3439

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACACCGAC GGCGCCC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTATATTCC GTCATCGCTC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCGTCATCG CTCCTCAGGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAACGTCAG CCATGGTCCC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCTCGCTGG TGAGTTTC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTCGCTGGT GAGTTTC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCCGCCTGT GACATGCATT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCTCCTCCC CGCGGCGGGT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCGCCCGCT CCTCCTCCCC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCTCGCCCG CTCCTCCTCC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCTCCTCCT CCCCTGGCAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGGCTTCTC CTCCTCCCCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGCTGGCT TCTCCTCCTC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTGGCGCTG CACCACTCTC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACATTATGCT AGCTTTTTGA GTAAACTTGT GGGGCAGGAG ACCCTGT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGATCTGAA GCTTCTGGAT GGTCAGCGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGATCTGAA GCTTGAAGAC GCCAAAAACA TAAAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGCATCTGG CGCGCCGATA CCGTCGACCT CGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGGAGGCGG TCACATTCGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

UAGGAGAUGC CUAAGGCUUU

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCUAUGUCGA CACCCAAUUC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAUAGGAGAU GCCUAAGGCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGUUTGCTC TTCTTCUUGC G

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGUUUGCTC TTCTUCUUGC G

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTACCACAAG GCCTTTCGCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGCTCATGG TGCACGGTCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

UGCATCCCCC AGGCCACCAT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGTTTTTTT TTTGCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCAAAAAAA AAAAAACGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTCTCGCTG GTGAGTTTCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCCAACCAC CTCTTGCTCC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGACCCTGA ACAGTTGATC

\hfill

Claims (6)

1. Un oligonucleótido hibridable específicamente con ADN o ARN que comprende una secuencia lineal de unidades de nucleósido unidas covalentemente, en el que:

dicha secuencia comprende una primera subsecuencia de nucleósidos que tiene restos de azúcar 2'-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{3}, una segunda subsecuencia de nucleósidos que tiene tres o más restos de azúcar 2'-desoxi-eritro-pentofuranosilo consecutivas, y una tercera subsecuencia de nucleósidos que tiene restos de azúcar 2'-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{3}, en la que dicha segunda subsecuencia se sitúa entre dichas subsecuencias primera y tercera, y al menos una de dichas subsecuencias primera y tercera comprende más de un resto de azúcar 2'-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{3}, y

las unidades de nucleósido de dichas subsecuencias primera, segunda y tercera están unidas de forma covalente mediante enlaces fosfodiéster o fósforotioato.

2. El oligonucleótido de la reivindicación 1, en el que dichas unidades de nucleósido de dichas subsecuencias primera, segunda y tercera están unidas de forma covalente mediante enlaces fósforotioato.

3. El oligonucleótido de la reivindicación 1, en el que dichas unidades de nucleósido de dichas subsecuencias primera y tercera están unidas de forma covalente mediante enlaces fosfodiéster y dichas unidades de nucleósido de dicha subsecuencia segunda están unidas de forma covalente mediante enlaces fósforotioato.

4. El oligonucleótido de la reivindicación 1, en el que dichas unidades de nucleósido de dichas subsecuencias primera y tercera están unidas de forma covalente mediante enlaces fósforotioato y dichas unidades de nucleósido de dicha subsecuencia segunda están unidas de forma covalente mediante enlaces fosfodiéster.

5. El oligonucleótido de la reivindicación 1, en el que dicha subsecuencia segunda comprende al menos cinco unidades de nucleósido.

6. El oligonucleótido de la reivindicación 1 que tiene de 5 a 50 unidades de nucleósido.