CN108603230A - 基因表达的调节与蛋白质表达失调的筛选 - Google Patents

基因表达的调节与蛋白质表达失调的筛选 Download PDF

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Abstract

本公开包括利用无义介导的RNA衰变转换外显子(NSE)的激活剂或者阻遏剂调节蛋白质表达的组合物和方法。在一些实施方案中，本文还包括使用靶向转座元件的药剂调节蛋白质表达的组合物和方法。

Description

基因表达的调节与蛋白质表达失调的筛选
交叉引用
本申请要求于2015年10月9日提交的英国专利申请第1517937.7号以及于2016年8月31日提交的英国专利申请第1614744.9号的权益，其每个通过引用整体并入本文。
背景技术
ATM蛋白属于PI3/PI4-激酶家族，参与神经系统和免疫系统的发育。ATM蛋白激酶在DNA损伤时被激活并随后协调DNA修复机制。
发明内容
在某些实施方案中，本文描述了筛选对功能性ATM蛋白质缺陷和相关病症易感的个体的方法，选择用于治疗的个体的方法，用于治疗或预防与功能性ATM蛋白质缺陷相关的病症的方法，修饰对DNA损伤放疗和化疗的细胞易感性的方法，治疗癌症的方法以及相关的组合物和试剂盒。
在某些实施方案中，本文公开了筛选对功能性ATM蛋白质缺陷易感的个体的方法，其中所述筛选包括确定位于相对于人基因组的NSE(ATM内含子28中的隐蔽外显子)的3'剪接位点的位置-3处的非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在，其中非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在表明所述个体具有功能性ATM蛋白质缺陷或对其易感。在一些实施方案中，NSE包含序列tctacaggttggctgcatagaagaaaaag。
在一些实施方案中，NSE阻遏剂被布置为与序列agTCTACAGGTTGGCTGCATAGAAGAAAAAGgtagag；或tcttagTCTACAGGTTGGCTGCATAGAAGAAAAAGgtagag；或tctcagTCTACAGGTTGGCTGCATAGAAGAAAAAGgtagag内的NSE结合。在一些实施方案中，NSE阻遏剂被布置为结合ATM内含子28中的NSE或其5'或3'剪接位点。
在某些实施方案中，本文公开了一种选择个体进行治疗的方法，其中所述个体对功能性ATM蛋白质缺陷易感，所述方法包括确定位于相对于人类基因组的NSE(ATM内含子28中的隐蔽外显子)的3'剪接位点的-3位置的非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在，其中非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在表明个体具有功能性ATM蛋白质缺陷或对功能性ATM蛋白质缺陷易感，以及选择这样的个体用增加个体的功能性-ATM水平的药剂进行治疗。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用所述药剂以治疗所选个体。在一些实施方案中，所述药剂包含NSE阻遏剂。在一些实施方案中，NSE包含序列tctacaggttggctgcatagaagaaaaag。在一些实施方案中，NSE阻遏剂被布置为与序列agTCTACAGGTTGGCTGCATAGAAGAAAAAGgtagag；或tcttagTCTACAGGTTGGCTGCATAGAAGAAAAAGgtagag；或tctcagTCTACAGGTTGGCTGCATAGAAGAAAAAGgtagag内的NSE结合。在一些实施方案中，NSE阻遏剂被布置为结合ATM内含子28中的NSE或其5'或3'剪接位点。
在某些实施方案中，本文公开了治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括鉴定位于相对于人基因组的NSE(ATM内含子28中的隐蔽外显子)的3'剪接位点的-3位置的非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在，其中非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在表明个体具有功能性ATM蛋白质缺陷或对功能性ATM蛋白质缺陷易感，以及将药剂施用于该个体，其被布置为增加功能性ATM水平。在一些实施方案中，NSE包含序列tctacaggttggctgcatagaagaaaaag。在一些实施方案中，NSE阻遏剂被布置为与序列agTCTACAGGTTGGCTGCATAGAAGAAAAAGgtagag；或tcttagTCTACAGGTTGGCTGCATAGAAGAAAAAGgtagag；或tctcagTCTACAGGTTGGCTGCATAGAAGAAAAAGgtagag内的NSE结合。在一些实施方案中，NSE阻遏剂被布置为结合ATM内含子28中的NSE或其5'或3'剪接位点。
在某些实施方案中，本文公开了一种治疗或预防与功能性ATM蛋白质缺陷相关的病症的方法，包括给予被布置为增加功能性ATM蛋白质水平的NSE阻遏剂，其中该药剂被设置成结合到前体mRNA转录物的ATM内含子28中的NSE以减少在成熟RNA转录物中包含的NSE。在一些实施方案中，减少在成熟RNA转录物中包含的NSE提供了功能性ATM蛋白质表达的增加。在一些实施方案中，治疗或预防个体或个体风险人群中功能性-ATM蛋白质缺陷的方法用于治疗或预防与功能-ATM蛋白质缺陷相关的一种或多种症状。在一些实施方案中，该病症是共济失调-毛细血管扩张症；癌症；免疫缺陷；细胞放射易感性；或染色体不稳定性。在一些实施方案中，NSE包含序列tctacaggttggctgcatagaagaaaaag。在一些实施方案中，NSE阻遏剂被布置成与序列agTCTACAGGTTGGCTGCATAGAAGAAAAAGgtagag；或tcttagTCTACAGGTTGGCTGCATAGAAGAAAAAGgtagag；或tctcagTCTACAGGTTGGCTGCATAGAAGAAAAAGgtagag内的NSE结合。在一些实施方案中，NSE阻遏剂被布置为结合ATM内含子28中的NSE或其5'或3'剪接位点。
在某些实施方案中，本文公开了一种治疗或预防与个体中ATM表达失调有关的病症的方法，所述方法包括给予NSE激活剂，其中所述NSE激活剂被布置为通过结合ATM内含子28中的调控基序来增加ATM成熟RNA转录物中包含的NSE，任选地其中ATM内含子28中的调控基序与NSE竞争剪接体组分，并且进一步任选地其中这样的基序包含位于前体mRNA转录物的ATM内含子28中的NSE的3'处的24个核苷酸假外显子(PE)或与假外显子上游的U2AF65结合位点结合。
在某些实施方案中，本文公开了在个体中治疗或预防癌症的方法，其包括施用NSE激活剂，所述NSE激活剂被设置为增加癌细胞对DNA损伤剂的细胞毒性治疗如放疗的易感性，其中所述NSE激活剂被设置为通过与ATM内含子28中的调控基序结合来增加ATM成熟RNA转录物中包含的NSE，任选地其中ATM内含子28中的调控基序与NSE竞争剪接体组分，并进一步任选地其中这样的基序包含24个核苷酸的假外显子(PE)，位于前体mRNA转录物的ATM内含子28中的NSE的3'或与假外显子上游的U2AF65结合位点结合；并用细胞毒性疗法如放疗或化疗来治疗个体。在一些实施方案中，增加在成熟RNA转录物中包含的NSE提供了功能性ATM蛋白质表达的降低。在一些实施方案中，假外显子包含序列tcatcgaatacttttggaaataag。
在某些实施方案中，本文公开了增加细胞对DNA损伤剂的细胞毒性治疗如放射疗法或化学疗法的易感性的方法，其包括通过施用设置为通过与ATM内含子28中的基序结合来增加ATM成熟RNA转录物中包含的NSE的NSE激活剂药剂而减少ATM蛋白表达，任选地其中ATM内含子28中的调控基序与NSE竞争剪接体组分，并且进一步任选地其中此类基序包含位于前体mRNA转录物的ATM内含子28中的NSE 3'的24个核苷酸假外显子(PE)的或与假外显子上游的U2AF65结合位点结合。
在某些实施方案中，本文公开了一种定制个体、细胞或组织中功能性ATM表达的方法，包括施用本文所述的NSE激活剂和/或NSE阻遏剂。在一些实施方案中，NSE阻遏剂和/或NSE激活剂包含多核酸聚合物。在一些实施方案中，NSE阻遏剂和/或NSE激活剂是SSO(剪接转换寡核苷酸)。在一些实施方案中，NSE阻遏剂和/或NSE激活剂与适于将NSE阻遏剂和/或NSE激活剂递送至细胞的递送载体结合。在一些实施方案中，NSE阻遏剂包含：序列cuucuaugcagccaaccuguagacu的SSO(SSO-NSE3)或其核酸类似物；或序列accuuuuucuucuaugcagccaac的SSO(SSO-NSE5)或其核酸类似物；和/或NSE阻遏剂包含或由选自下组的任何一种SSO组成：aacauuucuauuuaguuaaaagc(SSO A11)；uuaguauuccuugacuuua(SSO A17)；gacugguaaauaauaaacauaauuc(SSO B2)；auauauuagagauacaucagcc(SSO B4)；和uuagagaaucauuuuaaauaagac(SSO AN3)或者它们的组合；或根据权利要求13至22中任一项所述的方法，其中所述NSE激活剂包含SSO PEkr/PEdel；和/或NSE激活剂包含或由选自下组的任何一种SSO组成：aacuuaaagguuauaucuc(SSOA2)；uauaaauacgaauaaaucga(SSO A4)；caacacgacauaaccaaa(SSO A9)；gguaugagaacuauagga(SSO A23)；gguaauaagugucacaaa(SSO A25)；guaucauacauuagaagg(SSO A26)；和uguggggugaccacagcuu(SSO B11)或者它们的组合。
在某些实施方案中，本文公开了使用rs609261和/或rs4988000基因分型来预测个体对与ATM失调相关的病症的治疗的反应。
在某些实施方案中，本文公开了包含本文所述的NSE阻遏剂和/或NSE激活剂的组合物。在一些实施方案中，组合物是药学上可接受的制剂。
在某些实施方案中，本文公开了一种治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括鉴定位于相对于人基因组的NSE(ATM内含子28中的隐蔽外显子)的3'剪接位点的-3位置的非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在，其中非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在表明该个体具有功能性-ATM蛋白质缺陷或对该功能性ATM蛋白质缺陷易感，并且将药剂施用于个体，其被布置用胸腺嘧啶残基替换非胸腺嘧啶变体残基rs609261。
在某些实施方案中，本文公开了治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括将位于相对于人类基因组的NSE(在ATM内含子28中的隐蔽外显子)的3'剪接位点的-3位置的非胸腺嘧啶变体残基rs609261替换为胸腺嘧啶残基。在一些实施方案中，替换非胸腺嘧啶变体残基rs609261包括向个体施用药剂，其被布置为用胸腺嘧啶残基替换非胸腺嘧啶变体残基rs609261。在一些实施方案中，用于替换非胸腺嘧啶残基的试剂是基因组编辑分子。在一些实施方案中，用于替换非胸腺嘧啶残基的试剂是CRISPR-Cas9或其功能等同物，以及布置成靶向rs609261的合适RNA分子。
在某些实施方案中，本文公开了一种治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括鉴定人类基因组rs4988000处鸟嘌呤变体残基的存在，其中在rs4988000处的鸟嘌呤变体残基指示个体具有ATM蛋白质缺陷，或对其易感，并且向个体施用药剂，其被布置成用腺嘌呤替换rs4988000处的鸟嘌呤变体残基。
在某些实施方案中，本文公开了治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括用腺嘌呤残基替换人类基因组的rs4988000处的鸟嘌呤变体残基；或通过结合SSO来阻断鸟嘌呤残基。在一些实施方案中，替换rs4988000处的鸟嘌呤变体残基包括向个体施用药剂，所述药剂被布置成用腺嘌呤残基替换rs4988000处的鸟嘌呤变体残基。在一些实施方案中，用于替换鸟嘌呤残基的药剂是基因组编辑分子。在一些实施方案中，用于替换鸟嘌呤残基的药剂是CRISPR-Cas9或其功能等同物，以及布置成靶向rs4988000的合适RNA分子。
在某些实施方案中，本文公开了筛选对功能性ATM蛋白质缺陷易感的个体或个体群体的方法，其中所述筛选包括确定人类基因组的rs4988000处存在鸟嘌呤变体残基，其中rs4988000处存在鸟嘌呤变体残基表明个体(或个体组)具有功能性ATM蛋白质缺陷或对功能性ATM蛋白质缺陷易感。
在某些实施方案中，本文公开了选择用于治疗或预防的个体或个体群体的方法，其中所述个体易于发生功能性ATM蛋白质缺陷，所述方法包括确定人类基因组rs4988000处的鸟嘌呤变体残基的存在，其中rs4988000处鸟嘌呤变体残基的存在表明个体具有功能性ATM蛋白缺陷或对功能性ATM蛋白缺陷易感，并选择此类个体以用增加个体中功能性ATM水平的药剂进行治疗。
在某些实施方案中，本文公开了一种治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括鉴定人类基因组的rs4988000处鸟嘌呤变体残基的存在，其中在rs4988000处存在鸟嘌呤变体残基指示个体具有功能性ATM蛋白质缺陷，或对功能性ATM蛋白质缺陷易感，并向个体施用药剂，其被设置为增加功能性ATM水平。在一些实施方案中，该方法组合以将CG单元型修饰为TA。在一些实施方案中，所述方法组合以鉴定个体中的CG单元型，并且任选地根据任何前述权利要求治疗或选择所述患者进行治疗。
在某些实施方案中，本文公开了修饰成熟RNA转录物中包含的NSE的调节的方法，所述方法包括插入或缺失与NSE竞争剪接体组分的NSE上游或下游的一个或多个剪接调控基序，所述调控基序包含隐蔽剪接位点或假外显子。
在某些实施方案中，本文公开了修饰功能蛋白质表达的调节的方法，其中功能蛋白质表达通过在编码蛋白质的基因的成熟RNA转录物中包含的NSE来调节，所述方法包括插入或缺失与NSE竞争剪接体组分的NSE上游或下游的一个或多个剪接调控基序，所述调控基序包含隐蔽剪接位点或假外显子。在一些实施方案中，一个或多个剪接调控基序的插入或缺失位于ATM内含子28的基因组DNA中。在一些实施方案中，插入一个或多个剪接调控基序引起成熟RNA转录物中包含的NSE的减少。在一些实施方案中，一个或多个剪接调控基序的缺失引起成熟RNA转录物中包含的NSE的增加。在一些实施方案中，一个或多个剪接调控基序的插入或缺失包括使用基因组编辑技术，例如CRISPR-Cas9。
在某些实施方案中，本文公开了包含一种或多种用于鉴定rs609261和/或rs4988000变体的寡核苷酸探针的试剂盒。在一些实施方案中，寡核苷酸探针是用于PCR扩增包含rs609261和/或rs4988000的核酸区域的引物。
在某些实施方案中，本文公开了包含编码NSE激活剂和/或NSE阻遏剂的核酸的载体。
在某些实施方案中，本文公开了筛选能够修饰基因表达调节的药剂的方法，其包括：鉴定限制功能性基因表达的无义介导的RNA衰变转换外显子(NSE)；鉴定与NSE竞争剪接体组分的NSE上游或下游的一个或多个剪接调控基序，所述调控基序包含隐蔽剪接位点或假外显子；用反义多核酸靶向一个或多个剪接调控基序，所述反义多核酸被布置为通过Watson-Crick碱基配对与剪接调控基序杂交；并确定在该基因的成熟RNA转录物中包含的NSE是否增加或减少。
在某些实施方案中，本文公开了调节基因表达的方法，其包括提供与剪接调控基序(例如隐蔽剪接位点或假外显子)结合的试剂，其与无义介导的RNA衰变转换外显子(NSE)竞争剪接体组分。
在某些实施方案中，本文公开了布置成与无义介导的RNA衰变转换外显子(NSE)竞争剪接体组分的基因剪接调控基序(例如隐蔽剪接位点或假外显子)结合的试剂，其中剪接调控基序控制将NSE包含在基因的成熟RNA转录物中。
在某些实施方案中，本文公开的是本文基本描述的方法、用途、组合物、载体或试剂，可选地参考附图。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入。
附图说明
图1A-图1C说明ATM内含子28中U2AF阻遏的隐蔽外显子的鉴定。图1A显示了隐蔽外显子(在此称为NMD-转换外显子的NSE)激活的示意图。NSE序列(上图)加框，星号表示rs609261，黑色矩形表示所示的反义寡核苷酸。下面的图中显示了来自U2AF35同种型(ab-)、U2AF35a(a-)、U2AF35b(b-)和对照(c)的RNAi-或SSO-介导的耗竭的RNA-Seq数据的基因组浏览器视图。靶向U2AF1外显子Ab和3以及U2AF35siRNA的3'ss的SSO如前所述。Y轴读取密度。在顶部用虚线示意性地示出NSE包含/排除。ATM外显子(灰色框)被编号。29-nt NSE在ATM mRNA中引入终止密码子。图1B显示了在独立消耗(下图)中通过RT-PCR验证NSE激活(上图)。图A中的箭头表示RT-PCR引物(ATM-F，ATM-R，图20)。右侧显示剪接产物，NSE转录物的百分比位于最上方。误差条表示两个转染实验的SD(***,p<0.0001,**,p<0.001)。图1C显示成熟转录物中的NSE包含与残余U2AF(r＝Pearson相关性)成反比。测定异源二聚体水平的估计值。
图2A-图2I显示了由rs609261修饰的NSE激活和ATM表达。在所示的群体中显示rs609261的等位基因频率(图2A)。图2B显示了示例性微小基因示意图。包含NSE和外显子29的ATM的Xhol/XbaI片段克隆在U2AF1外显子2和4(黑框)之间。用箭头表示用于扩增外源性转录物的RT-PCR引物(PL3和ATM-R，图20)。图2C显示外源前体mRNA中的rs609261依赖性NSE激活。用T(黑色)和C(灰色)微小基因瞬时转染缺失U2AF35或U2AF65的HEK293细胞。U2AF35和U2AF65siRNA的最终浓度分别为30nM和60nM。图2D说明鉴定在rs609261纯合的细胞系(星号)。NSE加框。图2E和图2F显示内源性转录物中NSE的等位基因特异性激活以剂量依赖性方式限制ATM的表达。内源性转录物的来源在底部，抗体在右边。培养物中siRNA的浓度是3nM、10nM和30nM。C1、C2、对照siRNA。通过GFP-质粒和荧光显微镜监测转染效率。图2G显示UPF1耗竭增加NSE激活(上图)并上调的同种型U2AFlc(下图)。U2AFlc同种型含有外显子Ab和3，并被NMD抑制。UPF1siRNA的最终浓度为7nM、20nM和60nM(SC＝加扰对照)。误差条是独立转染的SD。图2H显示耗竭U2AF相关蛋白和一部分异质核RNP的细胞中的NSE的包含水平。误差条表示两次转染的SD。免疫印迹显示在右边。U2AF35siRNA的最终浓度为25nM；剩余的siRNA为60nM(C＝对照)。图21显示PUF60的过表达诱导的NSE跳过。下面显示了免疫印迹，右边是抗体。
图3A-3D说明了靶向NSE的SSO恢复U2AF抑制的ATM表达。图3A和图3B显示在外源性ATM转录物(图3A)和内源性ATM转录物(图3B)中有效的SSO介导的NSE抑制。两个转染实验的平均NSE包含水平显示在右图中。图3C显示阻断接近NSE的SSO恢复ATM蛋白质水平。用靶向NSE 3'ss的SSO和对照SSO转染缺乏U2AF35的细胞和对照细胞(图1A和图20)。48小时后，将细胞暴露于电离辐射(IR，10Gy)并在1小时后收获。使用梯度SDS-PAGE分离细胞裂解物。Western印迹用右侧显示的抗体进行。图3D显示耗竭细胞中ATM表达SSO-NSE3的剂量依赖性重构。
图4A-图4H显示调节NSE激活的内含顺式元件和SSO的鉴定。图4A显示ATM内含子28中的两个假外显子的示意图。典型外显子(编号)显示为灰色框，NSE显示为白色框，PE显示为方格框。星号表示IVS28-159A>G替换的位置，导致A-T。在这个A-T情况中，NSE和PE都与干扰序列一起被包含在ATM mRNA中，因为NSE与PE分离的距离小于人内含子的最小尺寸。典型和异常转录物分别由前体mRNA上方和下方的虚线表示。中图显示耗竭了U2AF35同种型(ab-)和通过交联和免疫沉淀鉴定的U2AF65标签/高置信度结合位点(水平线/矩形)的细胞中NSE的RNA-Seq读数密度。底部显示通过Phylop(100VC)的100basewise脊椎动物保护。下图显示了C-微小基因中引入的突变(红色和下划线)。图4B显示野生型和突变的C微小基因的剪接模式。突变显示在图A中；RNA产物如右图所示。克隆PE delPPT/AG生产的最大产物含有缩短的假内含子(42nt)。图4C显示在(模拟)耗竭的HEK293细胞中NSE(泳道2、3、7和8)或PE(泳道4、5、9和10)中突变的C微小基因的剪接模式。突变位于底部和图21中的微小基因序列。剪接产物的示意图如右图所示。PE上方的发夹符号表示MIR茎环插入。图4D和图4E说明SSO诱导的假外显子转换。顶部显示转染的微小基因，右侧是剪接产物，底部是SSO。SSO序列在图20中。在图D-G中显示的SSO的最终浓度是3nM、10nM和30nM。图4F显示靶向PE的SSO诱导NSE的跳过。图4G显示在缺失时靶向激活NSE的序列的SSO(PEdelPPT/AG；图A和B)抑制PE。图4H显示NSE激活是单倍型依赖性的。底部显示了所示变体的微小基因单倍型。列表示平均包含的NSE，误差条为SD，星号表示统计学显著性差异，如图1B所示。
图5A-5G显示ATM信号传导的以外显子为中心的调控。图5A显示在MRN-ATM-CHEK2-CDC25-cdc2/细胞周期蛋白B途径中的U2AF-调节的基因和外显子水平表达变化(左图)。Log2fold和q值显示在括号中。RNA-Seq浏览器截图显示CHEK2和CDC25A基因的外显子使用；PCR验证凝胶位于右图。CHEK2外显子9是NMD转换外显子；外显子11编码部分激酶结构域。图9显示ATM信号传导通路中U2AF介导的表达变化的全部范围；U2AF介导的剪接调控的例子如图S3-S6所示。图5B显示在IR后U2AF35耗竭细胞中受损的ATM信号传导。HEK293细胞(模拟)耗尽U2AF35并在48小时后经受IR(10Gy)。在指定的时间点通过免疫印迹检查表达。右侧显示抗体。CHEK2外显子9的跳过水平位于底部；它们在对照(U2AF35+)和耗尽细胞(U2AF35-)中的测量在图5C中。图5D显示在UPF1耗尽细胞中包含CHEK2外显子9。UPF1siRNA的最终浓度(图20)为12.5nM、25nM、50nM和100nM。图5E显示通过SSO抑制CHEK2外显子9减少CHEK2水平并促进NSE的包含。靶向CHEK2外显子9的SSO的最终浓度是3nM、10nM和30nM。图5F显示用所示SSO转染HEK293细胞后包含的CHEK2外显子9。图5G显示缺乏SF3B1诱导CHEK2外显子9跳过，但不改变NSE激活。靶向SF3B1的每种siRNA的最终浓度是20nM。
图6显示在U2AF35中通过癌症相关突变恢复NSE抑制。在U2AF35中通过锌指1和2替换恢复U2AF35-依赖性NSE剪接C微小基因(上图)。所有的替换均在U2AFla构建体中进行(35a)。癌症相关突变(底部)被加框；剪接产物在右侧。下图显示了具有U2AF35和GFP抗体的免疫印迹(ex＝外源性；en＝内源性U2AF35)。
图7显示通过假外显子靶向的基于SSO的基因表达调节。典型外显子显示为灰色框，无义介导的RNA衰变(NMD)转换外显子为黑框，假外显子为白框。典型剪接用虚线表示。在RNA前体的下方显示与NMD外显子竞争的假剪接位点。SSO激活剂/阻遏剂分别由水平黑色/灰色条表示。为简单起见，未显示包含于成熟转录物中与NMD转换外显子竞争剪接体组分(如U2AF，异源核核糖核蛋白或富含丝氨酸/精氨酸的蛋白质)的剪接调控基序或二级结构。它们可以通过先前详细描述的计算方法预测(例如，Kralovicova,J.and Vorechovsky,I.(2007)Global control of aberrant splice site activation by auxiliarysplicing sequences:evidence for a gradient in exon and introndefinition.Nucleic Acids Res.,35,6399-6413和其中的参考文献)或通过实验方法确定，包括RNA交联和免疫沉淀，剪接底物的诱变和RNA折叠研究。
图8A-图8C显示SSO介导的NSE抑制增强ATM表达。图8A显示SSO-NSE3增加了总的和激活的ATM的表达。将HEK293细胞(模拟)耗竭U2A F35，与X印迹标记的CHEK2和SSO NSE3/对照(SSO-C)共转染，暴露于电离辐射(TR)并在30分钟后收获。用指定的抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。siRNA和SSO的最终浓度是30nM。表达CHEK2的质粒的量是30ng、90ng和270ng；加入来自空载体的DNA至终浓度为270ng/mL。Ex/enCHEK2，来自外源性和内源性CHEK2的信号，如D9C6抗体所检测到的。图8B和图8C显示通过靶向NMD转换外显子9(SSO CHEK2)的SSO增加外源性CHEK2的表达。恒定量的SSO CHEK2与增加量的Xpress-CHEK2和恒定量的GFP质粒共转染作为转染和上样对照(B)，反之亦然(C)。抗体在右边。
图9示出U2AF调节的功能性ATM交互作用的示例性图。U2AF调节的ATM信号传导网络由红色箭头/粉红色背景突出显示。在耗尽U2AF35的细胞中上调/下调的基因分别以红色/深绿色显示。显示出显著改变的外显子使用的基因以黄色显示。ATM信号图显示ATM相互作用蛋白(紫色)/蛋白质复合物(浅绿色)。箭头对应激活，T形边缘对应抑制和空心圆圈表示未知的调节。包含链接显示为绿色边缘。
图10A-10C显示在U2AF35耗尽的细胞中CDC25B和CDC25C的外显子使用。对照(ctr)和耗尽的(ab-)细胞中RNA-Seq数据的基因组浏览器视图(图10A和图10B中的左图)。PCR引物用箭头表示，差异使用的外显子用黑色矩形表示。RefSeq外显子注释显示在底部。使用从每个U2AF亚基和U2AF相关蛋白耗尽的细胞提取的RNA的RT-PCR验证RNA-Seq数据(图10A和图10B中的右图)。
图11A-11C显示在TTK、PINl和CDK1中U2AF调节的外显子使用。对照(ctr)和耗尽(ab-)细胞中的RNA-Seq数据的基因组浏览器视图(图11A，图11B的左图，和图11C)。PCR引物用箭头表示，差异使用的外显子用黑色矩形表示。RefSeq外显子注释显示在底部。使用从每个U2AF亚基和U2AF相关蛋白耗尽的细胞中提取的RNA的RT-PCR验证RNA-Seq数据(图11B中的右图)。
图12A-图12D显示在耗尽的细胞中RAD50和EZH2的RNA加工。对照(ctr)和耗尽的(ab-)细胞中RNA-Seq数据的基因组浏览器视图(图12A和图12B以及图12C和图12D中的左图)。PCR引物用箭头表示，差异使用的外显子用黑色矩形表示。RefSeq外显子注释显示在底部。使用从每个U2AF亚基和U2AF相关蛋白耗尽的细胞中提取的RNA，使用RT-PCR验证RNA-Seq数据(图12A和图12B的右图)。
图13A-图13B显示肽基脯氨酰异构酶PIN2和shelterin复合物的组分的U2AF35-控制的外显子使用。
图14A-图14D显示RARA融合伴侣的U2AF控制。
图15A-图15E显示正常组织和白血病细胞中的NSE激活。在19个人体组织中(图15A)和17个AML/CMML骨髓样品中(图15B)使用引物ATM-F和ATM-R(图1,图20)测量NSE包含水平。量化外显子包含。将平均值与未配对的t检验进行比较(图15C)。图15D和图15E显示淋巴母细胞系(顶部)中U2AF抑制的(图15D)和激活的(图15E)外显子包含水平。在指定温度下使细胞暴露于冷和热休克。ES，外显子跳过；EI，外显子包含。
图16A-图16B显示ATM内含子28中影响NSE激活的转座元件的鉴定。图16A显示内含子28中的转座元件的位置和NSE激活的示意图。典型外显子显示为灰色框，NSE显示为白色框，内含子以NSE为侧线，由虚线剪接。转座元件在主要转录物下方显示为水平白色矩形；UC，缺乏可识别的转座子的独特序列。它们的缺失编号为1-6，其对应于图B中的泳道号。RTPCR引物用黑色箭头表示。比例在顶部。NSE序列在下面的面板中被加框。缺乏有义Alu(Alu+)的构建体一再未能连接/繁殖并且未被检查。图16B显示反义Alu和MER51元件的缺失改变NSE激活。将野生型(WT)和突变的构建体(称为1-6)瞬时转染到耗尽了U2AF35的HEK293细胞(模拟物)中。NSE+/-，含有/不含NSE的RNA产物。列表示平均NSE包含(％)，误差条表示两个转染实验的SD。星号表示双尾P值<0.01(t检验)。
图17A-图17C显示激活或抑制NSE的内含SSO的鉴定。图17A显示内含子28中被测SSOs相对于转座元件的位置。有关图例，请参见图16A。图17B显示内含子28SSO的鉴定，其改变外源性转录物中的NSE激活。表2列出说明性SSO。“x”符号表示多个阴性对照，虚线表示平均NSE包含，误差条表示两个转染实验的SD。列表示平均包含水平，星号表示显著的P值。图17C显示靶向单链区域的SSO倾向于抑制内源性NSE。r，皮尔逊相关系数。P值在括号内。
图18A-图18B显示TMC-SA协助将SSO-NSE3递送至人细胞系导致NSE抑制。图18A显示在SSO-NSE3/TMC-SA纳米复合物的暴露下，NSE在HEK293细胞中的包含被抑制。N/P比为20、40和80(Sc＝具有相同修饰的加扰对照，M＝大小标记物)。误差条表示两个转染实验的SD。显示的比较结果的顶部显示了P值。图18B显示暴露于SSO-NSE3/TMC-SA复合物的VAVY细胞中的NSE抑制。
图19显示具有ATM内含子28的MER51共有序列中的反向重复序列(v，颠换；i，转换)。ATM MER51A中最稳定的反向重复序列加下划线并突出显示；嘌呤丰富的单链区域呈红色；最初描述的MER51家族的长末端重复同源性用斜体表示。对齐的片段对应于图16a所示的缺失4。MER51A共有序列处于反义方向。
图20显示示例性的合成DNA和RNA序列。
图21显示在NSE和PE中突变的剪接报告构建体的示例性序列。
图22显示NSE和PE中的辅助剪接元件。
图23显示涉及NMD的U2AF35调节的转录物的总结。
具体实施方式
插入序列或内含子被称为剪接体的大且高度动态的RNA-蛋白质复合物去除，该复合物协调初级转录物、小核RNA(snRNA)和大量蛋白质之间的复杂相互作用。剪接体以有序的方式在每个内含子上特异性组装，首先通过U1snRNA识别5'剪接位点(5'ss)或通过U2途径识别3'ss，其涉及将U2辅因子(U2AF)结合至3'ss区域以促进U2结合至分支点序列(BPS)。U2AF是由U2AF2编码的65-kD亚基(U2AF65)和U2AF1编码的35-kD亚基(U2AF35)组成的稳定异二聚体，U2AF65结合多聚嘧啶道(PPT)，U2AF35在3'ss与高度保守的AG二核苷酸相互作用并稳定U2AF65结合。除了BPS/PPT单位和3'ss/5'ss，精确剪接需要激活或抑制剪接位点识别的辅助序列或结构，称为内含子或外显子剪接增强子或沉默子。这些元件允许真正的剪接位点在具有相同序列但数量超过一个数量级的真实位点的高等真核生物基因组中大量过量的隐蔽或假位点中被识别。尽管它们通常具有调节功能，但它们激活或抑制的确切机制还不甚了解。
外显子组测序研究揭示了U2AF1/U2AF2和癌细胞中3'ss识别(SF3B1，ZRSR2，SF1，SF3A1，PRPF40B和SRSF2)中涉及的其他基因的体细胞突变的高度限制性模式，最显著的是骨髓增生异常综合征。这些基因编码在剪接体装配过程中经常相互作用的产物，表明共同途径在肿瘤发生中的存在，这进一步得到了与癌症相关突变的高度相互排斥的支持。在携带这些突变的白血病样品中进行的全基因组转录组分析检测到了mRNA前体剪接中的大量改变，然而，特定RNA加工缺陷与癌症发生或发展之间的关键联系仍然模糊不清，尽管这些靶点对于治疗调节具有很大的希望。这些RNA结合蛋白与DNA损伤反应(DDR)途径之间的相互联系仍有待充分表征。
传统(BPS/PPT/3'ss/5'ss)和辅助剪接基序中的突变通常引起异常剪接，例如外显子跳读或隐蔽外显子或剪接位点激活，并且显著影响人类发病率和死亡率。异常和替代性剪接模式都可能受外显子和内含子中天然DNA变异的影响，这在孟德尔遗传和复杂性状的遗传性中起着重要作用。然而，将等位基因或单倍型特异性RNA表达翻译为表型变异性以及内含子和外显子变体等位基因与反式作用因子之间的相互作用的分子机制在很大程度上是模糊的。
反义技术现在已经达到了重要的临床应用。例如，靶向ATM基因的反义剪接-转换寡核苷酸(SSO)已被用于修复共济失调-毛细血管扩张(A-T)中的剪接突变，并且成功地使ATM蛋白水平正常化(Du et al.,2011；Du et al.,2007)。
白血病和实体瘤的大部分显示ATM表达失调(例如，Stankovic等，1999；Starczynski等，2003)。ATM的化学阻遏剂(渥曼青霉素，CP-466722，KU-55933和KU60019)尚未达到临床试验，很大程度上是因为非特异性效应和/或高毒性，尽管KU-559403已显示出良好的生物利用度并可靠地赋予放射敏感性。
在一些情况下，需要以序列特异性方式上调或下调基因表达的能力。
在某些实施方案中，本文提供了筛选对功能性ATM蛋白质缺陷易感性的个体或个体群体的方法，其中所述筛选包括确定相对于人基因组的NSE(ATM内含子28中的隐蔽或无义介导的RNA衰变转换外显子)的3'剪接位点位于-3位置的非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在，其中非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在表明所述个体(或个体组)具有功能性-ATM蛋白质缺陷，或对功能性-ATM蛋白质缺陷易感。
术语“功能性ATM蛋白质缺陷”是指功能性的ATM蛋白质在个体、细胞或组织中的存在/表达减少。功能性ATM缺陷是ATM内含子28中功能性变体rs609261的结果，其改变ATM前体信使RNA(前体-mRNA)的RNA加工。在rs609261处的胞嘧啶等位基因与在该位置的胸腺嘧啶等位基因相比，导致在ATM mRNA中更高地包含无义介导的RNA衰变转换外显子(在此称为NSE)，比胸腺嘧啶等位基因更有效地限制ATM蛋白的表达。这种限制可以通过阻断在相同内含子中获得NSE或NSE调控序列的新型SSO来消除或调节，分别导致ATM蛋白的去阻遏或抑制。
在一些实施方案中，本文提供了选择用于治疗或预防的个体或个体群体的方法，其中所述个体易感于功能性-ATM蛋白质缺陷，所述方法包括确定相对于人基因组的NSE(ATM内含子28中的隐蔽外显子)的3'剪接位点位于-3位置处非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在，其中非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在表明个体具有功能性-ATM蛋白质缺陷，或对功能性-ATM蛋白质缺陷易感，并选择这样的个体用布置为增加个体的功能性ATM水平的药剂进行治疗。
根据本发明的另一个方面，提供了治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括鉴定相对于人基因组的NSE的3'剪接位点位处-3位的非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在，其中非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在表明个体具有功能性ATM蛋白质缺陷或对功能性ATM蛋白质缺陷易感，并且向个体施用布置为增加功能性ATM水平的药剂。
根据本发明的另一方面，提供了治疗或预防与功能性ATM蛋白质缺陷相关的病症的方法，其包括施用布置为增加功能性ATM蛋白质水平的NSE阻遏剂药剂，其中所述药剂被布置为结合前体mRNA转录物的ATM内含子28中的NSE或相同内含子中的NSE激活调控序列以减少在成熟转录物中包含的NSE。
根据本发明的另一方面，提供了治疗或预防与个体中ATM表达失调有关的病症的方法，其包括施用NSE激活剂，其中NSE激活剂被布置为通过与ATM内含子28中的NSE抑制调控基序结合增加在ATM成熟RNA转录物中包含的NSE。
ATM内含子28中的NSE抑制调控基序可以包含与NSE竞争剪接体组分的序列，例如位于前体mRNA转录物的ATM内含子28中NSE 3'或假外显子的U2AF65结合位点上游的24个核苷酸假外显子(PE)。
根据本发明的另一个方面，提供了治疗或预防个体中癌症的方法，包括施用NSE激活剂，所述NSE激活剂用于增加癌细胞对DNA损伤剂的易感性，所述DNA损伤剂诱导双链DNA断裂，例如放射疗法，其中通过结合ATM内含子28中的NSE调控基序来布置NSE激活剂以增加ATM成熟RNA中包含的NSE；并用造成双链断裂的DNA损伤剂治疗个体，如放疗或化疗。
根据本发明的另一个方面，提供了增加细胞对细胞毒性治疗如放射治疗的易感性的方法，其包括通过施用布置为通过结合ATM内含子28中的调控基序增加ATM成熟RNA转录物中NSE包含的NSE的NSE激活剂来降低ATM蛋白表达。
ATM内含子28中的调控基序可与NSE竞争剪接体组分，其中此类基序可包含位于前体mRNA转录物的ATM内含子28的NSE的3'处或假外显子的U2AF65结合位点上游的24个核苷酸假外显子(PE)。
根据本发明的另一个方面，提供了在个体、细胞或组织中调节功能性ATM表达的方法，包括施用本文所述的NSE-激活剂和/或NSE-阻遏剂。
根据本发明的另一方面，提供了rs609261基因分型用于预测个体对与ATM失调相关的病症的治疗的反应的用途。
根据本发明的另一方面，提供了包含本文中本发明的NSE阻遏剂的组合物。
根据本发明的另一个方面，提供了包含本发明的NSE激活剂的组合物。
根据本发明的另一个方面，提供了治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括鉴定相对于人基因组的NSE(ATM内含子28中的隐蔽外显子)3'剪接位点位于-3位的非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在，其中非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在表明个体具有功能性ATM蛋白质缺陷，或对功能性ATM蛋白质缺陷易感，和向所述个体施用被布置为用胸腺嘧啶残基替换非胸腺嘧啶变体残基rs609261的药剂。
根据本发明的另一个方面，提供了治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括将相对于人基因组的NSE(ATM内含子28中的隐蔽外显子)的3'剪接位点位于-3位的非胸腺嘧啶变体残基rs609261替换为胸腺嘧啶残基。
根据本发明的另一方面，提供了包含本发明的多核酸聚合物的载体。
根据本发明的另一方面，提供了治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括鉴定人基因组rs4988000处鸟嘌呤变体残基的存在，其中在rs4988000处存在鸟嘌呤变体残基指示个体具有功能性ATM蛋白缺陷，或对功能性ATM蛋白缺陷易感，并且向个体施用药剂，其被布置为用腺嘌呤替换rs4988000处的鸟嘌呤变体残基。
根据本发明的另一方面，提供了治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括用腺嘌呤残基替换人基因组的rs4988000处的鸟嘌呤变体残基。
根据本发明的第一方面，提供了筛选对功能性ATM蛋白质缺陷易感的个体或个体群体的方法，其中所述筛选包括确定人基因组rs4988000处的鸟嘌呤变体残基的存在，其中rs4988000处鸟嘌呤变体残基的存在表明个体(或个体组)具有功能性-ATM蛋白质缺陷，或对功能性-ATM蛋白质缺陷易感。
根据本发明的另一方面，提供了选择个体或个体群体以进行治疗或预防的方法，其中所述个体对于功能性ATM蛋白质缺陷易感，所述方法包括确定在人类基因组的rs4988000处鸟嘌呤变体残基的存在，其中rs4988000处鸟嘌呤变体残基的存在表明该个体具有功能性-ATM蛋白质缺陷，或对功能性-ATM蛋白质缺陷易感，并且选择该个体以用布置为增加个体中功能性ATM水平的药剂进行治疗。
根据本发明的另一方面，提供了治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括鉴定人基因组rs4988000处鸟嘌呤变体残基的存在，其中rs4988000处存在鸟嘌呤变体残基表明个体具有功能性ATM蛋白质缺陷，或对功能性ATM蛋白质缺陷易感，以及向个体施用布置为增加功能性ATM水平的药剂。
根据本发明的另一方面，提供了筛选能够修饰基因表达的调节的药剂或药剂组合的方法(图7)，其包括鉴定限制功能性基因表达的无义介导的RNA衰变转换外显子(NSE)；鉴定与NSE竞争剪接体组分的NSE上游或下游的一个或多个剪接调控基序，所述调控基序包含隐蔽剪接位点或假外显子；用反义多核酸靶向一个或多个剪接调控基序，所述反义多核酸被布置为通过Watson-Crick碱基配对与剪接调控基序杂交；并确定在该基因的成熟RNA转录物中包含的NSE是否增加或减少。
根据本发明的另一个方面，提供了调节基因表达的方法，其包括提供布置为与NSE剪接调控基序结合的药剂。
根据本发明的另一方面，提供了一种药剂，其被布置为与NSE的基因剪接调控基序结合，其中剪接调控基序控制在基因的成熟RNA转录物中包含的NSE。
根据本发明的另一方面，本文提供了治疗或预防由mRNA基因转录物中包含的NSE引起的疾病病理学的方法，其包括提供布置为结合基因NSE剪接调控基序的药剂，所述NSE剪接调控基序控制在该基因的成熟RNA转录物中包含的NSE。
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，这样的实施方案仅作为示例提供。本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换而不偏离本发明。应该理解的是，可以在实践本发明时采用在此描述的本发明实施方案的各种替换方案。意图是以下权利要求限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
确定可以使用技术人员可用的任何合适的测定或遗传分析。在一些情况下，使用基于核酸的技术如原位杂交和RT-PCR进行核酸水平的检测。测序技术可以包括下一代测序技术，例如Helicos True Single Molecule Sequencing(tSMS)(Harris TD et al，(2008)Science320：106-109)；454测序(Roche)(Margulies,M.等，2005，Nature，437,376-380)；SOLiD技术(Applied Biosystems)；SOLEXA测序(Illumina)；Pacific Biosciences的单分子实时(SMRT TM)技术；纳米孔测序(Soni GV和Meller A.(2007)Clin Chem 53：1996-2001)；半导体测序(Ion Torrent；Personal Genome Machine)；DNA纳米球测序；使用来自Dover Systems(Polonator)的技术进行测序，以及在测序前不需要扩增或以其他方式转化天然DNA的技术(例如，Pacific Biosciences和Helicos)，例如基于纳米孔的策略(例如，Oxford Nanopore，Genia Technologies和Nabsys)。测序技术还可以包括Sanger测序、Maxam-Gilbert测序、Shotgun测序、桥接PCR、基于质谱的测序、基于微流体的Sanger测序、基于显微镜的测序、RNAP测序或基于杂交的测序。
感兴趣的基因转录物的测序还可以包括扩增步骤。示例性的扩增方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)，基于核酸序列的扩增(NASBA)、自我维持的序列复制(3SR)、环介导的等温扩增(LAMP)、链替换扩增(SDA)、全基因组扩增、多重替换扩增、链替换扩增、依赖于解旋酶的扩增、切口酶扩增反应、重组聚合酶扩增、逆转录PCR、连接介导的PCR或甲基化特异性PCR。
可用于获得核酸序列的其他方法包括例如全基因组RNA表达阵列、酶联免疫吸附测定(ELISA)、基因组测序、从头测序、Pacific Biosciences SMRT测序、免疫组织化学(IHC)、免疫细胞化学(ICC)、质谱、串联质谱、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、原位杂交、荧光原位杂交(FISH)、显色原位杂交(CISH)、银原位杂交(SISH)、数字PCR(dPCR)、逆转录PCR、定量PCR(Q-PCR)、单标记qPCR、实时PCR、nCounter分析(Nanostring技术)、Western印迹、Southern印迹、SDS-PAGE、凝胶电泳和Northern印迹。
根据本发明的另一方面，提供了治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括鉴定相对于人基因组的NSE(ATM内含子28中的隐蔽外显子)的3'剪接位点位于-3位的非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在，其中非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在表明该个体具有功能性ATM蛋白质缺陷，或对于功能性ATM蛋白质缺陷易感，以及向该个体施用被布置为增加功能性ATM水平的药剂。
根据本发明的另一方面，提供了治疗或预防与功能性ATM蛋白质缺陷相关的病症的方法，其包括施用布置为增加功能性ATM蛋白质水平的NSE阻遏剂，其中所述药剂被布置为结合前体mRNA转录物的ATM内含子28中的NSE以减少在成熟RNA转录物中包含的NSE。
减少在成熟RNA转录物中包含的NSE可提供功能性ATM蛋白质表达的增加。
治疗或预防个体或个体风险人群中功能性ATM蛋白质缺陷的方法可以是治疗或预防与功能性ATM蛋白质缺陷相关的病症的方法。病症可以是以下任何症状：共济失调-毛细血管扩张症；小脑性共济失调；眼外肌血管扩张症；癌症；免疫缺陷；细胞放射敏感性；或染色体不稳定性。癌症可以包含淋巴母细胞白血病或淋巴瘤。在一个实施方案中，该病症是共济失调-毛细血管扩张症。在另一个实施方案中，该病症是癌症。癌症可以包括非霍奇金氏或霍奇金氏淋巴瘤。
在一个实施方案中，NSE包含序列tctacaggttggctgcatagaagaaaaag(SEQ ID NO：57)。NSE阻遏剂可以布置为在序列agTCTACAGGTTGGCTGCATAGAAGAAAAAGgtagag(SEQ ID NO：58)(侧翼插入序列的相应3'和5'剪接位点二核苷酸加下划线)内与NSE结合。NSE阻遏剂可以布置为在ATM内含子28中与NSE的5'或3'剪接位点结合。在另一个实施方案中，NSE阻遏剂被布置为结合ATM内含子28中NSE的3'剪接位点。在另一个实施方案中，NSE阻遏剂可以布置为在序列tcttagTCTACAGGTTGGCTGCATAGAAGAAAAAGgtagag(SEQ ID NO：59)(侧翼插入序列的相应3'和5'剪接位点二核苷酸加下划线)内与NSE结合。在另一个实施方案中，NSE阻遏剂可被布置为在序列tctcagTCTACAGGTTGGCTGCATAGAAGAAAAAGgtagag(SEQ ID NO：60)(侧翼插入序列的相应3'和5'剪接位点二核苷酸加下划线)内与NSE结合。
根据本发明的另一个方面，提供了治疗或预防个体中与ATM表达失调相关的病症的方法，其包括施用NSE激活剂，其中所述NSE激活剂被布置为通过与ATM内含子28中的剪接调控基序结合增加在ATM成熟RNA转录物中包含的NSE。
增加在成熟RNA转录物中包含的NSE可以降低功能性ATM蛋白表达。
根据本发明的另一个方面，提供了治疗或预防个体中癌症的方法，包括给予NSE激活剂，所述NSE激活剂被布置为增加癌症细胞对DNA损伤剂的细胞毒性治疗如放射疗法的易感性，其中NSE激活剂被布置为通过结合ATM内含子28中的剪接调控基序来增加ATM成熟RNA转录物中包含的NSE；以及用细胞毒性疗法如放疗或化疗来治疗个体。
化疗可以包含诱导双链DNA断裂的治疗剂。本领域技术人员将理解，有几种化疗/治疗剂能够诱导双链DNA断裂。在一个实施方案中，化疗剂可以包含博来霉素。
增加在成熟RNA转录物中包含的NSE可以降低功能性ATM蛋白表达。
放疗或化疗可以在施用药剂后进行。放疗或化疗可以在施用药剂后一天或更多天进行。放疗或化疗可以是施用药剂后一周或更多周进行。
在一个实施方案中，假外显子包含序列tcatcgaatacttttggaaataag。
根据本发明的另一个方面，提供了增加细胞对DNA损伤剂的细胞毒性治疗如放射疗法的易感性的方法，所述方法包括通过施用NSE激活剂来减少ATM蛋白表达，所述NSE激活剂被布置为通过与ATM内含子28中的NSE调控基序结合增加ATM成熟RNA转录物中包含的NSE。
在一个实施方案中，细胞是癌细胞。在另一个实施方案中，细胞是前癌细胞。
根据本发明的另一个方面，提供了在个体、细胞或组织中调节功能性ATM表达的方法，包括施用本文所述的NSE-激活剂和/或NSE-阻遏剂。
无义介导的mRNA衰变
无义介导的mRNA衰变(NMD)是存在于所有真核生物中的监视途径。其主要功能是通过消除含有提前终止密码子的mRNA转录物来减少基因表达错误。NMD靶向具有提前终止密码子的转录物，但也含有从许多内源基因表达的广泛的mRNA同种型，这表明NMD是主要调节剂，其推动细胞中稳态RNA水平的细调和粗调。
无义介导的RNA衰变转换外显子(NSE)是外显子或假外显子，如果包含在成熟RNA转录物中则激活NMD途径。包含在成熟转录物中的NSE下调基因表达。
隐蔽剪接位点(或假剪接位点)与真正的剪接位点具有相同的剪接识别序列，但不用于剪接反应。它们在人类基因组中的数量超过真正的剪接位点一个数量级，并且通常受到迄今为止知之甚少的分子机制的抑制。隐蔽5'剪接位点具有共有的NNN/GUNNNN或NNN/GCNNNN，其中N是任何核苷酸且/是外显子-内含子边界。隐蔽3'剪接位点具有共有的NAG/N。它们的激活受周围核苷酸的正面影响，这使得它们分别与真正剪接位点的最佳共有物更相似，即MAG/GURAGU和YAG/G，其中M是C或A，R是G或A，Y是C或U。
隐蔽(或假)外显子与真正的外显子具有相同的剪接识别序列，但不用于剪接反应。它们的数量超过真正的外显子一个数量级，并且通常受到迄今为止知之甚少的分子机制的抑制。
本领域技术人员可以使用公开可用的合适算法容易地鉴定剪接位点及其调控序列，例如列于Kralovicova,J.and Vorechovsky,I.(2007)Global control of aberrantsplice site activation by auxiliary splicing sequences:evidence for agradient in exon and intron definition.Nucleic Acids Res.,35,6399-6413(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2095810/pdf/gkm680.pdf)的算法。
隐蔽剪接位点或剪接调控序列可以与NSE的剪接位点竞争RNA结合蛋白，例如U2AF。在一个实施方案中，所述药剂可以与隐蔽剪接位点或剪接调控序列结合以防止RNA结合蛋白的结合，从而有利于利用NSE剪接位点。
在一个实施方案中，隐蔽剪接位点可以不包含NSE的5'或3'剪接位点。隐蔽剪接位点可以是NSE 5'剪接位点上游的至少10个核苷酸。隐蔽剪接位点可以是NSE 5'剪接位点上游的至少20个核苷酸。隐蔽剪接位点可以是NSE 5'剪接位点上游的至少50个核苷酸。隐蔽剪接位点可以是NSE 5'剪接位点上游的至少100个核苷酸。隐蔽剪接位点可以是NSE 5'剪接位点上游的至少200个核苷酸。
隐蔽剪接位点可以是NSE 3'剪接位点下游的至少10个核苷酸。隐蔽剪接位点可以是NSE 3'剪接位点下游的至少20个核苷酸。隐蔽剪接位点可以是NSE 3'剪接位点下游的至少50个核苷酸。隐蔽剪接位点可以是NSE 3'剪接位点下游的至少100个核苷酸。隐蔽剪接位点可以是NSE 3'剪接位点下游的至少200个核苷酸。
NSE阻遏剂和NSE激活剂
NSE阻遏剂和/或NSE激活剂可以包含多核酸聚合物。在一个实施方案中，NSE阻遏剂和/或NSE激活剂是SSO(剪接转换寡核苷酸)。
在其中NSE阻遏剂和/或NSE激活剂包含多核酸聚合物的实施方案中，除非另有说明，否则以下陈述可同样适用于NSE阻遏剂和NSE激活剂。多核酸聚合物的长度可以是约50个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约45个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约40个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约35个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约30个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约24个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约25个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约20个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约19个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约18个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约17个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约16个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约15个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约14个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约13个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约12个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约11个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约10个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以在约10至约50个核苷酸之间。多核酸聚合物的长度可以在约10至约45个核苷酸之间。多核酸聚合物的长度可以在约10至约40个核苷酸之间。多核酸聚合物的长度可以在约10至约35个核苷酸之间。多核酸聚合物的长度可以在约10至约30个核苷酸之间。多核酸聚合物的长度可以在约10至约25个核苷酸之间。多核酸聚合物的长度可以在约10至约20个核苷酸之间。多核酸聚合物的长度可以在约15至约25个核苷酸之间。多核酸聚合物的长度可以在约15至约30个核苷酸之间。多核酸聚合物的长度可以在约12至约30个核苷酸之间。
多核酸聚合物的序列可以与部分加工的mRNA转录物的靶序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％、99％或99.5％互补。多核酸聚合物的序列可以与前体mRNA转录物的靶序列100％互补。
多核酸聚合物的序列可以与前体mRNA转录物的靶序列具有4个或更少的错配。多核酸聚合物的序列可以与前体mRNA转录物的靶序列具有3个或更少的错配。多核酸聚合物的序列可以与前体mRNA转录物的靶序列具有2个或更少的错配。多核酸聚合物的序列可以与前体mRNA转录物的靶序列具有1个或更少的错配。
多核酸聚合物可以与前体mRNA转录物的靶序列特异性杂交。特异性可以是多核苷酸聚合物与前体mRNA转录物的靶序列的至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的序列互补性。杂交可以处于高度严格的杂交条件下。
多核苷酸聚合物可具有与表2或图20中所示序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的序列。多核酸聚合物可具有与表2或图20中所示的序列100％序列同一性的序列。在一些情况下，多核苷酸聚合物可具有与表2所示的序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的序列。在一些情况下，多核酸聚合物可具有与表2所示序列100％序列同一性的序列。
在一些情况下，多核苷酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的序列。在一些情况下，多核苷酸聚合物具有与选自SEQ IDNO：18-52的序列至少50％序列同一性的序列。在一些情况下，多核苷酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列至少60％序列同一性的序列。在一些情况下，多核酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列至少70％序列同一性的序列。在一些情况下，多核酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列至少80％序列同一性的序列。在一些情况下，多核酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列至少85％序列同一性的序列。在一些情况下，多核酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列至少90％序列同一性的序列。在一些情况下，多核酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列至少91％序列同一性的序列。在一些情况下，多核酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列至少92％序列同一性的序列。在一些情况下，多核酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列至少93％序列同一性的序列。在一些情况下，多核苷酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列至少94％序列同一性的序列。在一些情况下，多核苷酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列至少95％序列同一性的序列。在一些情况下，多核苷酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列至少96％序列同一性的序列。在一些情况下，多核苷酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列至少97％序列同一性的序列。在一些情况下，多核酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列至少98％序列同一性的序列。在一些情况下，多核苷酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列至少99％序列同一性的序列。在一些情况下，多核酸聚合物具有与选自SEQ IDNO：18-52的序列至少99.5％序列同一性的序列。在一些情况下，多核酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多核酸聚合物与转座元件内、转座元件上游或转座元件下游的基序杂交。在某些情况下，转座元件是Alu、MER51、UC或L4C。在一些情况下，转座元件是Alu(例如Alu-或Alu+)或MER51。在一些情况下，转座元件是Alu(例如Alu-或Alu+)。在其他情况下，转座元件是MER51。在一些情况下，多核酸聚合物与Alu(例如Alu-或Alu+)内的目标基序杂交。在其他情况下，多核酸聚合物与MER51下游的目标基序杂交。在一些情况下，多核苷酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多核酸聚合物与Alu(例如Alu-或Alu+)的上游或下游的目标基序杂交。在一些情况下，多核酸聚合物与Alu的上游的目标基序杂交。在一些情况下，目标基序为Alu上游的约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu上游的约5个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu上游的约10个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu上游的约20个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu上游的约30个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu上游的约40个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu上游的约50个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu上游的约80个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu上游的约100个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu上游的约150个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu上游的约200个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu上游的约300个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu上游的约500个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu上游的约800个或更多个碱基。在一些情况下，多核苷酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的序列。
在一些情况下，多核酸聚合物与Alu(例如Alu-或Alu+)下游的目标基序杂交。在一些情况下，目标基序是Alu下游的约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu下游的约5个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu下游的约10个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu下游的约20个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu下游的约30个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu下游的约40个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu下游的约50个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu下游的约80个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu下游的约100个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu下游的约150个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu下游的约200个或更多的碱基。在某些情况下，目标基序是Alu下游的约300个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu下游的约500个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是Alu下游的约800或更多个碱基。在一些情况下，多核苷酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多核酸聚合物与MER51上游或下游的目标基序杂交。在一些情况下，多核酸聚合物与MER51上游的目标基序杂交。在一些情况下，目标基序为MER51上游的约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51上游的约5个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51上游的约10个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51上游的约20个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51上游的约30个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51上游的约40个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51上游的约50个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51上游的约80个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51上游的约100个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51上游的约150个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51上游的约200个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51上游的约300或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51上游的约500个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51上游的约800或更多个碱基。在一些情况下，多核苷酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的序列。
在一些情况下，多核酸聚合物与MER51下游的目标基序杂交。在一些情况下，目标基序是MER51下游的约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51下游的约5个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51下游的约10个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51下游的约20个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51下游的约30个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51下游的约40个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51下游的约50个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51下游的约80个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51下游的约100个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51下游的约150个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51下游的约200个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51下游的约300个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51下游的约500个或更多个碱基。在某些情况下，目标基序是MER51下游的约800个或更多个碱基。在一些情况下，多核苷酸聚合物具有与选自SEQ ID NO：18-52的序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的序列。
在引用多核酸聚合物序列的情况下，本领域技术人员将理解，可以容忍一个或多个取代，任选地在该序列中可以容忍两个取代，从而使其保持与靶序列杂交的能力，或者其中取代在靶序列中的情况下被识别为靶序列的能力。对序列同一性的引用可以使用标准/默认参数通过BLAST序列比对(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)来确定。例如，该序列可以具有99％的同一性并且根据本发明仍然起作用。在其他实施方案中，该序列可以具有98％的同一性并且根据本发明仍然起作用。在另一个实施方案中，该序列可以具有95％的同一性并且根据本发明仍然起作用。
多核酸聚合物例如SSO可以包含RNA或DNA。多核酸聚合物例如SSO可以包含RNA。多核酸聚合物如SSO可以包含天然或合成或人工核苷酸类似物或与DNA或RNA具有等同的互补性碱基。多核酸聚合物例如SSO可以包含DNA、RNA和/或核苷酸类似物的组合。核苷酸类似物可以包含PNA或LNA。在另一个实施方案中，核酸如SSO可以包含PMO或由PMO组成。
在一些情况下，合成的或人工的核苷酸类似物或碱基可以包含在核糖部分、磷酸部分、核苷部分或其组合中的一个或多个处的修饰。例如，核苷酸碱基可以是任何天然存在的未修饰的核苷酸碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，或者与未修饰的核苷酸碱基足够相似以使其能够与存在于靶前体mRNA上的碱基形成氢键的任何合成或修饰的碱基。修饰的核苷酸碱基的实例包括但不限于次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。
有时，本文所述的多核酸聚合物还包含连接寡聚物组分的主链。术语“主链”和“寡聚物连接”可以互换使用并且指多核酸聚合物的单体之间的连接。在天然存在的寡核苷酸中，主链包含连接寡聚体的糖部分的3'-5'磷酸二酯键。本文所述的多核酸聚合物的主链或寡聚物连接可以包括(但不限于)硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷光硒酸酯、二硒代磷酸酯、硫代磷酰胺、phosphoraniladate、氨基磷酸酯等。参见例如LaPlanche et al.,NucleicAcids Res.14:9081(1986)；Stec et al.,J.Am.Chem.Soc.106:6077(1984),Stein etal.,Nucleic Acids Res.16:3209(1988),Zon et al.,Anti Cancer Drug Design 6:539(1991)；Zon et al.,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,pp.87-108(F.Eckstein,Ed.,Oxford University Press,Oxford England(1991))；Stec et al.,U.S.Pat.No.5,151,510；Uhlmann和Peyman,Chemical Reviews 90:543(1990)。
在多个实施方案中，多核苷酸聚合物主链的每个磷核苷酸间连接的立体化学是随机的。在实施方案中，多核苷酸聚合物主链的每个磷核苷酸间连接处的立体化学是受控的并且不是随机的。例如，美国专利申请第2014/0194610号“用于合成功能化核酸的方法”，在此通过引用并入，描述了以下方法：用于独立地选择核酸寡聚物中每个磷原子处的手性的旋向性。在实施方案中，本文所述的多核酸聚合物包含具有非随机的磷核苷酸间连接的多核酸聚合物。在实施方案中，用于本发明方法的组合物包含纯非对映异构体多核酸聚合物。在实施方案中，用于本发明方法的组合物包含多核酸聚合物，其具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、约100％、约90％至约100％、约91％至约100％、约92％至约100％、约93％至约100％、约94％至约100％、约95％至约100％、约96％至约100％、约97％至约100％、约98％至约100％、或约99％至约100％的非对映体纯度。
在多个实施方案中，多核酸聚合物在其磷核苷酸间连接处具有Rp和Sp构型的非随机混合物。例如，在反义寡核苷酸中可能需要Rp和Sp的混合物以实现良好活性和核酸酶稳定性之间的平衡(Wan,et al.,2014,“Synthesis,biophysical properties andbiological activity of second generation antisense oligonucleotidescontaining chiral phosphorothioate linkages,”Nucleic Acids Research 42(22):13456-13468,通过引用并入本文)。在实施方案中，本文所述的多核酸聚合物包含约5-100％Rp，至少约5％Rp，至少约10％Rp，至少约15％Rp，至少约20％Rp，至少约25％Rp，至少约30％Rp，至少约35％Rp，至少约40％Rp，至少约45％Rp，至少约50％Rp，至少约55％Rp，至少约60％Rp，至少约65％Rp，至少约70％Rp，至少约75％Rp，至少约80％Rp，至少约85％Rp，至少约90％Rp或至少约95％Rp，其余为Sp或约100％Rp。在实施方案中，本文所述的多核酸聚合物包含约10％至约100％的Rp，约15％至约100％的Rp，约20％至约100％的Rp，约25％至约100％的Rp，约30％约100％Rp，约35％至约100％Rp，约40％至约100％Rp，约45％至约100％Rp，约50％至约100％Rp，约55％至约100％Rp，约60％至约100％Rp，约65％至约100％Rp，约70％至约100％Rp，约75％至约100％Rp，约80％至约100％Rp，约85％至约100％Rp，约90％至约100％Rp或约95％至约100％Rp，约20％至约80％Rp，约25％至约75％Rp，约30％至约70％Rp，约40％至约60％Rp或约45％至约55％Rp，其余为Sp。
在实施方案中，本文所述的多核酸聚合物包含约5-100％Sp，至少约5％Sp，至少约10％Sp，至少约15％Sp，至少约20％Sp，至少约25％Sp，至少约30％Sp，至少约35％Sp，至少约40％Sp，至少约45％Sp，至少约50％Sp，至少约55％Sp，至少约60％Sp，至少约65％Sp，至少约70％Sp，至少约75％Sp，至少约80％Sp，至少约85％Sp，至少约90％Sp，或至少约95％Sp，其余为Rp或约100％Sp。在实施方案中，本文所述的多核酸聚合物包含约10％至约100％Sp，约15％至约100％Sp，约20％至约100％Sp，约25％至约100％Sp，约30％至约100％Sp，约35％至约100％Sp，约40％至约100％Sp，约45％至约100％Sp，约50％至约100％Sp，约55％至约100％Sp，约60％至约100％Sp，约65％至约100％Sp，约70％至约100％Sp，约75％至约100％Sp，约80％至约100％Sp，约85％至约100％Sp，约90％至约100％Sp或约95％至约100％Sp，约20％至约80％Sp，约25％至约75％Sp，约30％至约70％Sp，约40％至约60％Sp或约45％至约55％Sp，其余为Rp。
核苷酸类似物或人工核苷酸碱基可包含在核糖部分的2'羟基处具有修饰的核酸。修饰可以是2'-O-甲基修饰或2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)修饰。2'-O-甲基修饰可以将甲基添加到核糖部分的2'羟基上，而2'-O-甲氧基乙基修饰可以将甲氧基乙基添加到核糖部分的2'羟基上。以下说明腺苷分子的2'-O-甲基修饰和尿苷的2'-甲氧基乙基修饰的示例性化学结构。
在2'羟基上的另外修饰可以包括2'-O-氨基丙基糖构象，其可以涉及包含将胺基基团结合到2'氧上的丙基连接基的延伸的胺基团。该修饰可以通过从每个糖的胺基引入一个正电荷来中和磷酸酯衍生的寡核苷酸分子的总负电荷，并且因此可以由于其两性离子性质而改善细胞摄取特性。2'-O-氨丙基核苷亚磷酰胺的示例性化学结构如下所示。
在2'羟基上的另一修饰可以包括其中也可以涉及4'核糖位置的锁定的或桥接的核糖构象(例如锁定的核酸或LNA)。在该修饰中，结合在2'碳上的氧分子可以通过亚甲基与4'碳连接，从而形成2'-C、4'-C-氧-亚甲基连接的双环核糖核苷酸单体。以下举例说明LNA的化学结构的示例性图示。左侧的图示突出显示了LNA单体的化学连接。右侧的图示突出显示了LNA单体的呋喃糖环的锁定的3'-内切(3E)构象。
在2'羟基的进一步修饰可以包括乙烯核酸(ENA)，例如2'-4'-亚乙基桥接核酸，其将糖构象锁定为C3'-内糖折叠构象。ENA是还包含LNA的修饰核酸的桥接核酸类别的一部分。ENA和桥接核酸的示例性化学结构如下所示。
在2'羟基上的其它修饰可以包括2'-脱氧、T-脱氧-2'-氟、2'-O-氨丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)。
核苷酸类似物可进一步包含吗啉代、肽核酸(PNA)、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸、2'-氟N3-P5'-亚磷酰胺、1',5'-脱水己糖醇核酸(HNA)或其组合。吗啉代或磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸(PMO)包含合成分子，其结构通过偏离正常糖和磷酸盐结构模拟天然核酸结构。相反，五元核糖环可以被含有四个碳原子、一个氮原子和一个氧原子的六元吗啉代环取代。核糖单体可以通过磷酸二酰胺基团而不是磷酸酯基团连接。这些主链改变可以去除所有正电荷和负电荷，从而得到在没有细胞递送剂(例如带电寡核苷酸使用的那些)的帮助下进行可以穿过细胞膜的吗啉代中性分子。
肽核酸(PNA)不含糖环或磷酸酯键。相反，碱基可以被寡聚甘氨酸样分子连接并适当间隔，因此消除了主链电荷。
磷酸主链的修饰还可以包含甲基或硫醇修饰，例如甲基膦酸酯核苷酸。示例性的硫代膦酸酯核苷酸(左)和甲基膦酸酯核苷酸(右)如下所示。
此外，示例性的2'-氟N3-P5'-亚磷酰胺如下所示：
示例性己糖醇核酸(或1',5'-脱水己糖醇核酸(HNA))如下所示：
除了修饰核糖部分、磷酸酯主链和核苷之外，核苷酸类似物也可以通过例如在3'或5'末端进行修饰。例如，3'末端可以包含3'阳离子基团，或者通过在3'末端以3'-3'连接反转核苷。在另一种选择中，3'-末端可以用氨基烷基例如3'C 5-氨基烷基dT封闭。5'-末端可以用氨基烷基例如5'-O-烷基氨基取代基封闭。其他5'缀合物可抑制5'-3'核酸外切裂解。其他3'缀合物可抑制3'-5'外切核酸裂解。
除非另有说明，否则单链核酸(例如，前体mRNA转录物、寡核苷酸、SSO等)序列的左端是5'端和单链或双链核酸序列的左侧方向被称为5'方向。类似地，核酸序列(单链或双链)的右端或右侧方向是3'端或方向。通常，核酸中参考点5'的区域或序列称为“上游”，核酸中参考点3'的区域或序列称为“下游”。通常，mRNA的5'方向或末端是起始或起译密码子所在的位置，而3'末端或方向是终止密码子所在的位置。在一些方面，核酸中参考点上游的核苷酸可以由负数表示，而参考点下游的核苷酸可以由正数表示。例如，参考点(例如，mRNA中的外显子-外显子连接)可以被指定为“零”位点，并且与参考点直接相邻且在其上游的核苷酸被指定为例如“-1”，同时与参考点直接相邻且在其下游的核苷酸被指定为例如“+1”。
在一些情况下，当与天然多核酸聚合物比较时，本文所述的一种或多种人工核苷酸类似物对核酸酶具有抗性，所述核酸酶例如核糖核酸酶如核糖核酸酶H，脱氧核糖核酸酶如DNA酶，或核酸外切酶如5'-3'外切核酸酶和3'-5'外切核酸酶。在一些情况下，包含2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨丙基、2'-脱氧、T-脱氧-2'-氟、2'-O-氨丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲氨基丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)修饰、LNA、ENA、PNA、HNA、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸、2'-氟N3-P5'-亚磷酰胺或其组合的人工核苷酸类似物对核酸酶例如核糖核酸酶如核糖核酸酶H、脱氧核糖核酸酶如DNA酶或核酸外切酶如5'-3'外切核酸酶和3'-5'外切核酸酶具有抗性。2'-O-甲基修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'外切核酸酶或3'-5'外切核酸酶抗性)。2'O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如RNase H、DNase、5'-3'外切核酸酶或3'-5'外切核酸酶抗性)。2'-O-氨丙基修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'外切核酸酶或3'-5'外切核酸酶抗性)。2'-脱氧修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'外切核酸酶或3'-5'外切核酸酶抗性)。T-脱氧-2'-氟修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'外切核酸酶或3'-5'外切核酸酶抗性)。2'-O-氨丙基(2-O-AP)修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'外切核酸酶或3'-5'外切核酸酶抗性)。2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'外切核酸酶或3'-5'外切核酸酶抗性)。2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'外切核酸酶或3'-5'外切核酸酶抗性)。T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'外切核酸酶或3'-5'外切核酸酶抗性)。2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'外切核酸酶或3'-5'外切核酸酶抗性)。LNA修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'外切核酸酶或3'-5'外切核酸酶抗性)。ENA修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'外切核酸酶或3'-5'外切核酸酶抗性)。HNA修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'外切核酸酶或3'-5'外切核酸酶抗性)。吗啉代可以具有核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'外切核酸酶或3'-5'外切核酸酶抗性)。PNA可以对核酸酶具有抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'外切核酸酶或3'-5'外切核酸酶抗性)。甲基膦酸酯核苷酸修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'外切核酸酶或3'-5'外切核酸酶抗性)。硫代磷酸酯核苷酸修饰的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'外切核酸酶或3'-5'外切核酸酶抗性)。包含2'-氟N3-P5'-亚磷酰胺的多核酸聚合物可以具有核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'外切核酸酶或3'-5'外切核酸酶抗性)。
在一些情况下，相对于等同的天然多核苷酸聚合物，本文所述的一种或多种人工核苷酸类似物对其mRNA靶具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核酸聚合物，包含2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基、2'-脱氧、T-脱氧-2'-氟、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)修饰的、LNA、ENA、PNA、HNA、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸或2'-氟N3-P5'-亚磷酰胺的人工核苷酸类似物的一种或多种可以对其mRNA靶具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核酸聚合物，2'-O-甲基修饰的多核酸聚合物可以对它们的mRNA靶具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核酸聚合物，2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)修饰的多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核酸聚合物，2'-O-氨丙基修饰的多核酸聚合物可以对它们的mRNA靶具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核苷酸聚合物，2'-脱氧修饰的多核苷酸聚合物可以对它们的mRNA靶标具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核苷酸聚合物，T-脱氧-2'-氟修饰的多核苷酸聚合物可以对它们的mRNA靶标具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核酸聚合物，2'-O-氨丙基(2'-O-AP)修饰的多核酸聚合物可以对它们的mRNA靶具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核酸聚合物，2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)修饰的多核酸聚合物可以对其靶mRNA具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核酸聚合物，2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)修饰的多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核酸聚合物，T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)修饰的多核酸聚合物可以对它们的mRNA靶具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核酸聚合物，2'-O-N-甲基乙酰胺基(2-O-NMA)修饰的多核酸聚合物可以对它们的mRNA靶具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核酸聚合物，LNA修饰的多核酸聚合物可以对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核酸聚合物，ENA修饰的多核苷酸聚合物可以对它们的mRNA靶标具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核酸聚合物，PNA修饰的聚核苷酸聚合物可以对它们的mRNA靶具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核酸聚合物，HNA修饰的多核酸聚合物可以对其靶mRNA具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核酸聚合物，吗啉代修饰的多核酸聚合物可以对它们的mRNA靶具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核酸聚合物，甲基膦酸酯核苷酸修饰的聚核苷酸聚合物可以对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核酸聚合物，硫代膦酸酯核苷酸修饰的多核酸聚合物可以对其靶mRNA具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核酸聚合物，包含2'-氟N3-P5'-亚磷酰胺的多核酸聚合物可以对其mRNA靶具有增加的结合亲和力。可以用更低的Kd、更高的熔融温度(T m)或其组合来说明增加的亲和力。
在其他情况下，可以修饰本文所述的多核酸聚合物以增加其稳定性。在多核苷酸聚合物是RNA的实施方案中，可以对多核酸聚合物进行修饰以增加其稳定性。多核苷酸聚合物可以通过上述一种或多种修饰来修饰以增加其稳定性。多核酸聚合物可以在2'羟基位置修饰，例如通过2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨丙基、2'-脱氧、T-脱氧-2'-氟、2'-O-氨丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲氨基丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙酰胺基(2'-O-NMA)修饰或通过锁定或桥接核糖构象(例如LNA或ENA)。多核酸聚合物可以通过2'-O-甲基和/或2'-O-甲氧基乙基核糖被修饰。多核酸聚合物还可以包括吗啉代，PNA，HNA，甲基膦酸酯核苷酸，硫代膦酸酯核苷酸或2'-氟N3-P5'-亚磷酰胺以增加其稳定性。对于本领域技术人员来说，对RNA进行合适的修饰以增加递送稳定性是显而易见的。
本文所述的多核酸聚合物可以使用本领域已知的过程使用化学合成和/或酶促连接反应来构建。例如，可以使用天然存在的核苷酸或各种修饰的核苷酸来化学合成多核酸聚合物，所述修饰的核苷酸被设计成增加分子的生物稳定性或增加多核酸聚合物与靶核酸之间形成的双链体的物理稳定性。示例性方法可以包括在以下文献中描述的那些：US5,142,047、US5,185,444、WO2009099942或EP1579015。另外的示例性方法可以包括在以下文献中描述的那些：Griffey et al.,“2’-O-aminopropyl ribonucleotides:azwitterionic modification that enhances the exonuclease resistance andbiological activity of antisense oligonucleotides,”J.Med.Chem.39(26):5100-5109(1997))；Obika,et al.,“Synthesis of 2’-O,4’-C-methyleneuridine and-cytidine.Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3,-endo sugar puckering".Tetrahedron Letters38(50):8735(1997)；Koizumi,M.“ENA oligonucleotides astherapeutics”.Current opinion in molecular therapeutics8(2):144–149(2006)；和Abramova et al.,“Novel oligonucleotide analogues based on morpholinonucleoside subunits-antisense technologies:new chemical possibilities,”IndianJournal of Chemistry 48B:1721-1726(2009)。或者，多核酸聚合物可以使用其中多核酸聚合物已经以反义方向亚克隆到其中的表达载体进行生物学生产(即，从插入的多核酸聚合物转录的RNA将为感兴趣的靶多核酸聚合物的反义方向)。
多核酸聚合物可以与任何核酸分子例如另一种反义分子、肽、或其他化学物质结合以促进多核酸聚合物的递送和/或将核酸靶向特定组织、细胞类型或细胞发展阶段。多核酸聚合物可以与蛋白质或RNA结合。系接于多核酸聚合物的蛋白质可以包含剪接因子以增强、抑制或调节剪接和内含子移除。系接于多核酸聚合物的RNA可以包含适体或增强、抑制或调节剪接和内含子移除的任何结构。多核酸聚合物可以是分离的核酸。
多核酸聚合物可以与适于将多核酸聚合物递送至细胞的递送载体缀合或结合。细胞可以是特定的细胞类型或特定的发育阶段。递送载体也许能够位点特异性、组织特异性、细胞特异性或发育阶段特异性递送。例如，递送载体可以是细胞特异性病毒颗粒或其组分，或者，递送载体可以是细胞特异性抗体颗粒或其组分。多核酸聚合物可被靶向递送至胰腺中的β细胞。多核酸聚合物可以被靶向递送至胸腺细胞。多核酸聚合物可以被靶向递送至恶性细胞。多核酸聚合物可被靶向递送至恶化前细胞(已知在可预见的未来内发展成明显的恶性表型，例如白血病前期和骨髓增生异常综合征或组织病理学确定的癌前病变或病症)。
多核酸聚合物可以与基于纳米颗粒的递送载体缀合或结合。纳米颗粒可以是金属纳米颗粒，例如钪、钛、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、钇、锆、铌、钼、钌、铑、钯、银、镉、铪、钽、钨、铼、锇、铱、铂、金、钆、铝、镓、铟、锡、铊、铅、铋、镁、钙、锶、钡、锂、钠、钾、硼、硅、磷、锗、砷、锑及其组合、合金或氧化物。有时，纳米颗粒可以由聚合物材料制备。示例性聚合物材料包括但不限于聚(乙烯亚胺)(PEI)，聚(氰基丙烯酸烷基酯)，聚(酰氨基胺)树枝状聚合物(PAMAM)，聚(ε-己内酯)(PCL)，聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)或聚酯(聚(乳酸)(PLA))。有时可以用分子进一步涂覆纳米颗粒以附着功能元件。在一些情况下，涂层包含硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、羧甲基葡聚糖、海藻酸、果胶、角叉菜胶、岩藻依聚糖、琼胶胶原、卟啉、刺梧桐胶、结冷胶、黄原胶、透明质酸、葡糖胺、半乳糖胺、壳多糖(或壳聚糖)、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、溶菌酶、细胞色素C、核糖核酸酶、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、α-胰凝乳蛋白酶、聚赖氨酸、聚精氨酸、组蛋白、精蛋白、石墨烯、卵清蛋白或糊精或环糊精。纳米颗粒可以包括核或核和壳，如在核-壳纳米颗粒中。有时，纳米颗粒可具有小于约500nm、400nm、300nm、200nm或100nm的至少一个维度。
在一些实施方案中，可以用基于纳米颗粒的递送载体配制多核酸聚合物以递送至感兴趣的部位(例如恶性组织部位或具有失调的蛋白质表达的细胞)。在一些情况下，可以用基于纳米颗粒的递送载体配制多核酸聚合物以促进和/或实现穿过血脑屏障(BBB)的运输。
有时，多核酸聚合物缀合于本领域已知的物质以促进穿过血脑屏障的穿透或转运，例如转铁蛋白受体的抗体。在一些实施方案中，将多核酸聚合物与病毒载体连接，例如使化合物更有效或增加穿过血脑屏障的转运。在一些实施方案中，渗透性血脑屏障破裂通过输注糖类来辅助，糖类例如内消旋赤藓糖醇、木糖醇、D(+)半乳糖、D(+)乳糖、D(+)木糖、半乳糖醇、肌醇、L(-)果糖、D(-)甘露糖醇、D(+)葡萄糖、D(+)阿拉伯糖、D(-)阿拉伯糖、纤维二糖、D(+)麦芽糖、D(+)棉子糖、L(+)鼠李糖、D)蜜二糖、D(-)核糖、核糖醇、D(+)阿拉伯糖醇、L(-)阿拉伯糖醇、D(+)岩藻糖、L(-)岩藻糖、D(-)来苏糖、L(+)来苏糖和L(-)来苏糖或氨基酸，例如谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸和牛磺酸。用于增强血脑屏障渗透的方法和材料描述于例如美国专利号4,866,042、美国专利号6,294,520和美国专利号6,936,589，这些专利均通过引用并入本文。
在一个实施方案中，多核酸聚合物可以与化学分子(例如，基于非肽或核酸的分子)结合，例如药物。药物可以是小分子(例如，具有小于900Da的MW)。
在本发明的一个实施方案中，递送载体可以包含细胞穿透肽(CPP)。例如，多核酸聚合物可以与CPP结合或复合。本领域技术人员将理解，任何合适的CPP可以与多核酸聚合物缀合以帮助将多核酸聚合物递送至细胞和/或细胞内。此类CPP可以是由Boisguerin等，Advanced Drug Delivery Reviews(2015)描述的任何合适的CPP技术，其通过引用并入本文。Lochmann等人(European Journal of Organic Chemistry 58(2004)237-251)中也描述了用于与多核酸聚合物缀合的合适的递送载体，其通过引用并入本文。
CPP可以是富含精氨酸和/或赖氨酸的肽，例如，其中肽中的大部分残基是赖氨酸或精氨酸。CPP可以包含聚-L-赖氨酸(PLL)。或者，CPP可以包含聚精氨酸。合适的CPP可以选自Penetratin；R6-Penetratin；运输蛋白；寡精氨酸；F-3；B-肽；B-MSP；Pip肽，如Pip1，Pip2a，Pip2b，Pip5e，Pip5f，Pip5h，Pip5j；Pip5k，Pip51，Pip5m，Pip5n，Pip5o，Pip6a，Pip6b，Pip6c，Pip6d，Pip6e，Pip6f，Pip6g或Pip6h；序列PKKKRKV的肽；Penatratin；Lys4；SPACE；Tat；Tat-DRBD(dsRNA结合结构域)；(RXR)4；(RFF)3RXB；(KFF)3K；RgF2；T细胞来源的CPP；Pep-3；PEGpep-3；MPG-8；MPG-8-Chol；PepFect6；P5RHH；R15；和Chol-R9；或其功能性变体(例如参见Boisguerin等，Advanced Drug Delivery Reviews(2015))。
在一个实施方案中，CPP包含Pip肽或由Pip肽组成。Pip肽可以选自由Pip1、Pip2a、Pip2b、Pip5e、Pip5f、Pip5h、Pip5j；Pip5k、Pip51、Pip5m、Pip5n、Pip5o、Pip6a、Pip6b、Pip6c、Pip6d、Pip6e、Pip6f、Pip6g和Pip6组成的组。
在本发明的一个实施方案中，递送载体可以包含基于肽的纳米颗粒(PBN)，其中多个CPP(例如本文讨论的一种或多种合适的CPP)通过电荷相互作用与多核酸聚合物形成复合物。这种纳米颗粒的尺寸可以在约50nm和250nm之间。在一个实施方案中，纳米颗粒的尺寸可以是约70-200nm。在另一个实施方案中，纳米颗粒的尺寸可以是约70-110nm或125-200nm。
在一个实施方案中，多核酸聚合物可以与递送载体复合，例如通过离子键合。或者，多核酸聚合物可以与递送载体共价结合。缀合/结合方法描述于Lochmann等((EuropeanJournal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 58(2004)237-251)中，其通过引用并入本文)。例如，缀合方法可以包括将含有反应性基团(例如，-NH2或-SH2)的合适系链引入到多核酸聚合物中并且加入递送载体例如肽，其合成后作为活性中间体，随后在水性介质中进行缀合反应。另一种方法可以包括在单个固相支持物上以线性模式进行缀合。
递送载体和多核酸聚合物可以是硫醇和/或马来酰亚胺连接的，例如硫醇-马来酰亚胺连接的。多核酸聚合物和递送载体的缀合可以通过点击化学，例如待缀合的各个分子上的叠氮基或2'-O-炔丙基官能团和炔基的反应。在一个实施方案中，递送载体和多核酸聚合物可以通过硫醚桥连接。在另一个实施方案中，递送载体和多聚核酸聚合物可以通过二硫桥连接。技术人员将容易地鉴定合适的连接基团或用于多核酸聚合物与递送载体(例如肽)缀合的反应。
在一个实施方案中，NSE阻遏剂可以包含序列cuucuaugcagccaaccuguagacu(SSO-NSE3)(SEQ ID NO：53)的SSO或其核酸类似物。在一个实施方案中，NSE阻遏剂可以包含序列accuuuuucuucuaugcagccaac(SSO–NSE5)(SEQ ID NO:54)的SSO或其核酸类似物。技术人员将注意到NSE3(cuucuaugcagccaaccuguagacu)(SEQ ID NO：53)和NSE5(accuuuucucucucucacccaac)(SEQ ID NO：54)在序列上重叠。在一个实施方案中，NSE阻遏剂可以包含具有该重叠序列(即，accuuuuuuucuaugcagccaaccuguagacu)(SEQ ID NO：55)的序列的SSO或在其内的SSO。
在一个实施方案中，NSE阻遏物或激活剂包含选自以下的任何一种SSO或由其组成：
aacuuaaagguauauaucuc(SSO A2)(SEQ ID NO：18)；
uauaaauacgaauaaaucga(SSO A4)(SEQ ID NO：19)；
caacacgacauaaccaaa(SSO A9)(SEQ ID NO：21)；
aacauuucuauuuaguuaaaagc(SSO A1 1)(SEQ ID NO：23)；
uuaguauuccuugacuuua(SSO A17)(SEQ ID NO：26)；
gguaugagaacuauagga(SSO A23)(SEQ ID NO：32)；
gguaauaagugucacaaa(SSO A25)(SEQ ID NO：34)；
guaucauacauuagaagg(SSO A26)；
gacugguaaauaauaaacauaauuc(SSO B2)；
auauauuagagauacaucagcc(SSO B4)；
uguggggugaccacagcuu(SSO B11)；
uuagagaaucauuuuaaauaagac(SSO AN3)；和
cuguaaaagaaaauaga(PEkr)，
或其组合。
在另一个实施方案中，NSE激活剂包含选自以下的任何一种SSO或由其组成：
aacuuaaagguauauaucuc(SSO A2)(SEQ ID NO：18)；
uauaaauacgaauaaaucga(SSO A4)(SEQ ID NO：19)；
caacacgacauaaccaaa(SSO A9)(SEQ ID NO：21)；
gguaugagaacuauagga(SSO A23)(SEQ ID NO：32)；
gguaauaagugucacaaa(SSO A25)(SEQ ID NO：34)；
guaucauacauuagaagg(SSO A26)(SEQ ID NO：35)；
uguggggugaccacagcuu(SSO B1)(SEQ ID NO：45)；和
cuguaaaagaaaauaga(PEkr)(SEQ ID NO：56)，
或其组合。
NSE激活剂可以包含序列aacuuaaagguauauaucuc(SSO A2)(SEQ ID NO：18)的SSO或由其组成。NSE激活剂可以包含序列uauaaauacgaauaaaucga(SSO A4)(SEQ ID NO：19)的SSO或由其组成。NSE激活剂可包含序列caacacgacauaaccaaa(SSO A9)(SEQ ID NO：21)的SSO或由其组成。NSE激活剂可以包含序列gguaugagaacuauagga(SSO A23)(SEQ ID NO：32)的SSO或由其组成。NSE激活剂可以包含序列gguaauaagugucacaaa(SSO A25)(SEQ ID NO：34)的SSO或由其组成。NSE激活剂可以包含序列guaucauacauuAauag(SSO A26)(SEQ ID NO：35)的SSO或由其组成。NSE激活剂可以包含序列uguggggugaccacagcuu(SSO B11)(SEQ IDNO：45)的SSO或由其组成。
在一个实施方案中，NSE激活剂可以包含本文所述的SSO PEkr。在一个实施方案中，NSE激活剂可以包含序列CUGUAAAAGAAAAUAGA(PEkr)(SEQ ID NO：56)的SSO。PEkr也可以称为PEdel，应该理解这些术语是可以互换的。
在一个实施方案中，NSE阻遏剂包含选自以下的任何一种SSO或由其组成：
cuucuaugcagccaaccuguagacu(SSO-NSE3)(SEQ ID NO.53)；
accuuuuucuucuaucucagccaac(SSO-NSE5)(SEQ ID NO：54)；
aacauuucuauuuaguuaaaagc(SSO A1 1)(SEQ ID NO：23)；
uuaguauuccuugacuuua(SSO A17)(SEQ ID NO：26)；
gacugguaaauaauaaacauaauuc(SSO B2)(SEQ ID NO：37)；
auauauuagagauacaucagcc(SSO B4)(SEQ ID NO：39)；和uuagagaaucauuuuaaauaagac(SSO AN3)(SEQ ID NO：51)或其组合。
NSE阻遏剂可以包含序列cuucuaugcagccaaccuguagacu(SSO-NSE3)(SEQ ID NO：53)的SSO或由其组成。NSE阻遏剂可以包含序列accuuuuucuucuaugcagccaacSSO-SSE5(SEQID NO：54)的SSO或由其组成。NSE阻遏剂可以包含序列aacauuucuauuuaguuaaaagc(SSOA11)(SEQ ID NO：23)的SSO或由其组成。NSE阻遏剂可以包含序列uuaguauuccuugacuuua(SSO A17)(SEQ ID NO：26)的SSO或由其组成。NSE阻遏剂可以包含序列gacugguaaauaauaaacauaauuc(SSO B2)(SEQ ID NO：37)的SSO或由其组成。NSE阻遏剂可包含序列auauauuagagauacaucagcc(SSO B4)(SEQ ID NO：39)的SSO或由其组成。NSE阻遏剂可包含序列uuagagaaucauuuuaaauaagac(SSO AN3)(SEQ ID NO：51)的SSO或由其组成。
在一个实施方案中，NSE阻遏剂例如SSO可以被布置为与rs4988000处的鸟嘌呤变体残基结合。
技术人员将理解，可以提供和/或使用本文所述的两种或更多种SSO的组合用于治疗。例如，可以提供两种、三种、四种、五种或更多种NSE阻遏剂的组合或可以提供两种、三种、四种、五种或更多种NSE激活剂的组合。
当提到减少成熟RNA中包含的NSE时，减少可以是完全的，例如100％，或可以是部分的。这种减少可具有临床意义。减少/矫正可以是相对于未经治疗的个体中包含的NSE的水平，或相对于类似个体群体中包含的NSE的量。相对于平均个体或治疗前个体，该减少/矫正可以是包含的NSE减少至少10％。相对于平均个体或治疗前个体，减少可以是包含的NSE减少至少20％。相对于平均个体或治疗前个体，减少可以是包含的NSE减少至少40％。相对于平均个体或治疗前个体，减少可以是包含的NSE减少至少50％。相对于平均个体或治疗前个体，减少可以是包含的NSE减少至少60％。相对于平均个体或治疗前个体，减少可以是包含的NSE减少至少80％。相对于平均个体或治疗前个体，减少可以是包含的NSE减少至少90％。
当提到提高活性ATM蛋白水平时，增加可具有临床意义。该增加可以是相对于未经治疗的个体中的活性ATM蛋白水平或相对于相似个体群体中活性ATM蛋白的量。相对于平均个体或治疗前个体，增加可以是活性ATM蛋白增加至少10％。相对于平均个体或治疗前个体，增加可以是活性ATM蛋白增加至少20％。相对于平均个体或治疗前个体，增加可以是活性ATM蛋白增加至少40％。相对于平均个体或治疗前个体，增加可以是活性ATM蛋白质增加至少50％。相对于平均个体或治疗前个体，增加可以是活性ATM蛋白质增加至少80％。相对于平均个体或治疗前个体，增加可以是活性ATM蛋白增加至少100％。相对于平均个体或治疗前个体，增加可以是活性ATM蛋白增加至少200％。相对于平均个体或治疗前个体，增加可以是活性ATM蛋白增加至少500％。
术语活性ATM和功能性ATM可以在本文中互换使用。
根据本发明的另一方面，提供了rs609261基因分型用于预测个体对与ATM失调相关的病症的治疗的反应的用途。
与ATM失调相关的病症可以包括A-T或癌症。
在一个实施方案中，rs609261胞嘧啶残基的存在与更高的NSE激活、ATM对DNA双链断裂信号传导的有效响应较低、相对于相同位置的非胞嘧啶残基具有较高的癌症风险和较低的存活率相关。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含本发明的NSE阻遏剂的组合物。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含本发明的NSE激活剂的组合物。
在一个实施方案中，组合物是药学上可接受的制剂。
除了多核酸聚合物之外，组合物可以包含至少一种其他生物活性分子。生物活性分子可以是药物或前药。生物活性分子可以包含核酸或氨基酸。生物活性分子可以包含小分子(例如<900道尔顿的分子)。
在一些实施方案中，本文所述的药物制剂通过肠内施用途径、肠胃外施用途径或局部施用途径施用于个体。在一些情况下，本文所述的药物制剂通过肠内施用途径施用于个体。在其他情况下，本文所述的药物制剂通过肠胃外施用途径施用于个体。在其他情况下，本文所述的药物制剂通过局部施用途径施用于个体。
示例性给药途径包括但不限于肠胃外(例如静脉内，皮下，肌内，动脉内，颅内，脑内，脑室内，鞘内或玻璃体内)，口服，鼻内，脸颊内，局部，直肠，透粘膜或透皮给药途径。在一些情况下，本文描述的药物组合物被配制用于肠胃外(例如静脉内，皮下，肌内，动脉内，颅内，大脑内，脑室内，鞘内或玻璃体内)施用。在其他情况下，本文描述的药物组合物被配制用于口服给药。在其他情况下，本文描述的药物组合物被配制用于鼻内施用。
本文所述的药物制剂可以包括但不限于水性液体分散体，自乳化分散体，固溶体，脂质体分散体，气雾剂，固体剂型，粉剂，速释制剂，控释制剂，速溶制剂，片剂，胶囊，丸剂，延迟释放制剂，延长释放制剂，脉冲释放制剂，多颗粒制剂和速释和控释混合制剂。
药物制剂可以包括载体或载体材料，其可以包括制药学中任何常用的赋形剂，并应基于与本文公开的组合物的相容性和所需剂型的释放曲线特性来选择。示例性的载体材料包括例如粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂、稀释剂等。药学上相容的载体材料可以包括但不限于阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糖糊精、甘油、硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、胆固醇、胆固醇酯、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、氯化钠、磷酸三钙、磷酸二钾、纤维素和纤维素缀合物、糖硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶化淀粉等。脂质体可以包括空间稳定的脂质体，例如包含一种或多种特化脂质的脂质体。这些特化脂质可以产生循环寿命延长的脂质体。有时，空间稳定的脂质体可包含一种或多种糖脂或用一种或多种亲水性聚合物如聚乙二醇(PEG)部分衍生化。参见例如Remington：The Science and Practiceof Pharmacy，第十九版(Easton，Pa.:Mack Publishing Company，1995)；Hoover，John E.，Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania1975；Liberman、H.A.和Lachman，L.，Eds，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，New York，N.Y.，1980；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第七版(Lippincott Williams&Wilkins 1999)。
根据本发明的另一个方面，提供了治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括鉴定相对于人基因组的NSE(ATM内含子28中的隐蔽外显子)的3'剪接位点位于-3位的非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在，其中非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在表明该个体具有功能性ATM蛋白质缺陷或对于功能性ATM蛋白质缺陷易感，以及向个体施用被布置为用胸腺嘧啶残基替换非胸腺嘧啶变体残基rs609261的药剂。
根据本发明的另一个方面，提供了治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括将对于人基因组的NSE 3'剪接位点(ATM内含子28中的隐蔽外显子)位于-3位置的非胸腺嘧啶变体残基rs609261替换为胸腺嘧啶残基。
在一个实施方案中，替换非胸腺嘧啶变体残基rs609261可以包括向个体施用施用被布置为用胸腺嘧啶残基替换非胸腺嘧啶变体残基rs609261的药剂。
用于替换非胸腺嘧啶残基的药剂可以是基因组编辑分子如CRISPR-Cas9或其功能等同物，以及被布置为靶向rs609261的合适的RNA分子。
根据本发明的另一方面，提供了治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括鉴定人基因组rs4988000处鸟嘌呤变体残基的存在，其中在rs4988000处存在鸟嘌呤变体残基指示个体具有功能性ATM蛋白缺陷或对于功能性ATM蛋白缺陷易感，以及向个体施用药剂，其被布置为用腺嘌呤替换rs4988000处的鸟嘌呤变体残基。
根据本发明的另一方面，提供了治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括用腺嘌呤残基替换人基因组的rs4988000处的鸟嘌呤变体残基。
在一个实施方案中，替换rs4988000处的鸟嘌呤变体残基可包括向个体施用药剂，其被布置为用腺嘌呤残基替换rs4988000处的鸟嘌呤变体残基。
用于替换鸟嘌呤残基的药剂可以是基因组编辑分子如CRISPR-Cas9或其功能等同物，以及被布置为靶向rs4988000的合适的RNA分子。
根据本发明的第一方面，提供了筛选对功能性ATM蛋白质缺陷易感的个体或个体群体的方法，其中所述筛选包括确定人基因组rs4988000处的鸟嘌呤变体残基的存在，其中在rs4988000处存在鸟嘌呤变体残基表明个体(或个体组)具有功能性ATM蛋白质缺陷或对于功能性ATM蛋白质缺陷易感。
根据本发明的另一方面，提供了选择个体或个体群体以进行治疗或预防的方法，其中所述个体对于功能性ATM蛋白质缺陷易感，所述方法包括确定人基因组rs4988000处鸟嘌呤变体残基的存在，其中在rs4988000处存在鸟嘌呤变体残基表明个体具有功能性ATM蛋白质缺陷或对于功能性-ATM蛋白质缺陷易感，以及选择该个体以用被布置为增加个体中功能性ATM水平的药剂进行治疗。
根据本发明的另一方面，提供了治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括鉴定人基因组rs4988000处鸟嘌呤变体残基的存在，其中rs4988000处存在鸟嘌呤变体残基表明个体具有功能性ATM蛋白质缺陷或对于功能性ATM蛋白质缺陷易感，并向个体施用药剂，其被布置为增加功能性ATM水平。
本发明的方法可以包括阻断在rs4988000处的鸟嘌呤变体残基，例如使用SSO。
PE含有天然的DNA变体rs4988000(G/A)，这也影响NSE的识别(图4H)。在rs4988000处系统性突变的C和T微小基因的转染显示罕见的A等位基因减少在U2AF35耗尽和模拟物耗尽的细胞中每个前体mRNA上包含的NSE。因此，用腺嘌呤代替鸟嘌呤残基将减少包含的NSE，并增加功能性ATM蛋白的水平。
NSE包含最高是由高加索人中最常见的单倍型(CG)产生的，其次是单倍型CA>TG>TA(分别指的是tors609261和rs4988000)。因此，本发明的方法和组合物可以组合(同时或顺序地)使用以将CG单倍型修饰为CA、TG或TA。在一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于修饰CG单倍型为TA。在一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于将CA单倍型修饰为TG或TA。在一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于将CA单倍型修饰为TA。在一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于将TG单倍型修饰为TA。
本发明的方法和组合物也可以组合(同时地或顺序地)使用来鉴定个体中的CG单倍型，并且任选地根据本发明治疗或选择患者。本发明的方法和组合物还可以组合(同时或顺序地)使用来鉴定个体中的CA单倍型，并且任选地根据本发明治疗或选择患者。本发明的方法和组合物还可以组合(同时或顺序地)使用来鉴定个体中的TG单倍型，并且任选地根据本发明治疗或选择患者。
根据本发明的另一方面，提供了修饰成熟RNA转录物中NSE包含的调节的方法，所述方法包括插入或删除与NSE竞争剪接体组分的NSE上游或下游的一个或多个剪接调控基序，所述调控基序包含隐蔽剪接位点或假外显子。
根据本发明的另一方面，提供了修饰功能性蛋白质表达的调节的方法，其中所述功能性蛋白质表达通过在编码蛋白质的基因的成熟RNA转录物中包含NSE来调节，所述方法包括插入或删除与NSE竞争剪接体组分的NSE上游或下游的一个或多个剪接调控基序，所述调控基序包含隐蔽剪接位点或假外显子。
在一个实施方案中，一个或多个剪接调控基序的插入或删除位于ATM内含子28的基因组DNA中。
一个或多个剪接调控基序的插入可能导致成熟RNA转录物中包含的NSE减少。一个或多个剪接调控基序的缺失可能导致成熟RNA转录物中包含的NSE增加。
一个或多个剪接调控基序的插入或缺失可以包括使用基因组编辑技术，例如CRISPR-Cas9。CRISPR-Cas9可以提供适当的靶向RNA的分子。
根据本发明治疗或筛选的个体或细胞可以是哺乳动物。在一个实施方案中，个体是人。在一个实施方案中，细胞是人的。
本文提供了用于本文所述的一种或多种方法的试剂盒和制品。试剂盒可以含有一种或多种本文所述的多核酸聚合物。
根据本发明的另一方面，提供了一种试剂盒，其包含用于鉴定rs609261和/或rs4988000变体的一个或多个寡核苷酸探针。
本领域技术人员将熟悉用于探测遗传序列特征的存在或不存在的技术。例如，寡核苷酸探针可以包含用于PCR扩增包含rs609261和/或rs4988000的核酸区域的引物。在另一个实施方案中，寡核苷酸探针可以直接结合rs609261或rs4988000，其中结合可以是可检测的。探针的结合可以例如使用SERS或SERRS技术来检测。
试剂盒还可以包括被分隔以容纳一个或多个容器(例如小瓶、管等)的载体、包装或容器，每个容器包含独立元件之一，例如多核酸聚合物和药剂，用于本文所述的方法中。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料。
本文提供的制品包含包装材料。药物包装材料的例子包括但不限于瓶子、管子、袋子、容器、瓶子以及适用于选定制剂和预期给药和治疗方式的任何包装材料。
试剂盒通常包括标签，其中列出了内容和/或使用说明，以及包装说明书和使用说明。通常还会包含一组说明。
根据本发明的另一方面，提供了包含本发明的多核酸聚合物的载体。
载体可以包含病毒载体。病毒载体可以包含腺相关病毒载体。载体可以包含将多核酸聚合物靶向恶性细胞或特定细胞类型的任何病毒。
适应症
在一些情况下，本文所述的组合物和方法用于治疗遗传性疾病或病症，例如遗传性疾病。本文所述的组合物和方法可用于治疗遗传性疾病或病症，例如以蛋白质生产受损为特征的遗传性疾病。本文描述的组合物和方法可用于治疗遗传性疾病或病症，例如以缺陷性剪接为特征的遗传性疾病。
本文所述的组合物和方法还可以用于治疗遗传性疾病或病症，例如常染色体显性疾病、常染色体隐性疾病、X连锁显性疾病、X连锁隐性疾病、Y连锁疾病、线粒体疾病或多因子或多基因疾病。本文所述的组合物和方法可用于治疗常染色体显性疾病、常染色体隐性疾病、X连锁显性疾病、X连锁隐性疾病、Y连锁疾病、线粒体疾病或多因子或多基因疾病，其中疾病或病症的特征在于蛋白质生产受损。本文所述的组合物和方法也可用于治疗常染色体显性疾病、常染色体隐性疾病、X连锁显性疾病、X连锁隐性疾病、Y连锁疾病、线粒体疾病或多因子或多基因疾病，其中疾病或病症的特征在于缺陷性剪接。
与失调的ATM表达相关的病症可包括癌症。本文所述的组合物和方法可用于治疗癌症。在一个实施方案中，癌症包含乳腺癌。癌症可以是实体瘤或恶性血液病。实体肿瘤可以是肉瘤或癌。肉瘤可以是骨、软骨、脂肪肌肉、血管或造血组织的癌症。示例性肉瘤可包括肺泡横纹肌肉瘤、肺泡软组织肉瘤、成釉细胞瘤、血管肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、软组织的透明细胞肉瘤、去分化脂肪肉瘤、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、胚胎横纹肌肉瘤、上皮样纤维肉瘤、上皮样血管内皮瘤、上皮样肉瘤、成神经管细胞瘤、尤因肉瘤、肾外横纹肌样瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、巨细胞瘤、血管外皮细胞瘤、婴儿纤维肉瘤、炎性肌纤维母细胞瘤、卡波西肉瘤、骨平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、骨脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、骨恶性纤维组织细胞瘤、恶性间叶瘤、恶性周围神经鞘瘤、间叶性软骨肉瘤、粘液纤维肉瘤、粘液样脂肪肉瘤、粘液性炎性成纤维细胞肉瘤、血管周围上皮细胞分化的肿瘤、骨肉瘤、骨旁骨肉瘤、血管周围上皮细胞分化的肿瘤、骨膜骨肉瘤、多形性脂肪肉瘤、多形性横纹肌肉瘤、PNET/骨外尤因肉瘤、横纹肌肉瘤、圆细胞脂肪肉瘤、小细胞骨肉瘤、孤立性纤维瘤、滑膜肉瘤、毛细血管扩张性骨肉瘤。
癌可以是由上皮细胞发展而来的癌症。示例性的癌可以包括腺癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌、未分化癌、大细胞癌、小细胞癌、肛门癌、阑尾癌、胆管癌(即胆管细胞型肝癌)、膀胱癌、脑肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、未知原发癌(CUP)、食道癌、眼癌、输卵管癌、胃肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、成神经管细胞瘤、黑素瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺疾病、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌或外阴癌。造血系统恶性肿瘤是血液系统的恶性肿瘤、可以包括基于T细胞和基于B细胞的恶性肿瘤。示例性造血系统恶性肿瘤可以包括骨髓性白血病、骨髓增生性肿瘤、未另外指定的外周T细胞淋巴瘤(PTCL-NOS)、间变性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、母细胞NK细胞淋巴瘤、肠道病型T细胞淋巴瘤、肝脾γ-δT细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤、鼻NK/T细胞淋巴瘤、治疗相关性T细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、高风险CLL、非CLL/SLL淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病(PLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结节边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高级B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。
根据本发明的另一方面，提供了一种治疗或预防由前体mRNA基因转录物中的NSE包含引起的疾病病理学的方法，包括提供一种药剂，该药剂被布置为结合存在于前体mRNA基因转录物上的假外显子的隐蔽剪接位点，其中所述隐蔽剪接位点能够调节无义介导的RNA衰变转换外显子(NSE)到所述基因的成熟RNA转录物中的包含。
其中药剂与存在于前体mRNA基因转录物上的假外显子的隐蔽剪接位点的结合减少了NSE的包含。
该方法可以包括确定疾病病理是否由治疗前基因转录物中NSE包含引起的步骤。
技术人员将理解，在适当的情况下，本发明的一个实施方案或方面的可选特征可适用于本发明的其他实施方案或方面。
实施例
现在将参考附图仅以举例的方式更详细地描述本发明的实施方案。提供这些实施例仅用于说明的目的，而不是限制本文提供的权利要求的范围。
缩写
NSE：ATM内含子28中的无义介导的RNA衰变转换外显子
PE：位于ATM内含子28中NSE的3'处的24nt假外显子
NMD：无义介导的RNA衰变
A-T：共济失调毛细血管扩张症
ATM：共济失调毛细血管扩张症的基因缺陷
SSO：剪接转换寡核苷酸
DSB：双链DNA断裂
DDR：DNA损伤反应
MIR：全哺乳动物穿插重复
BPS：分支点序列
PPT：聚嘧啶束
IR：电离辐射
U2AF：U2小核核糖核蛋白的辅助因子
U2AF35：由U2AF1编码的U2AF的35kD亚基
U2AF65：由U2AF2编码的U2AF的65kD亚基
snRNA：小核RNA
实施例1
概要
表型多样性和对遗传性疾病的易感性受天然内含子变体的影响，但它们与RNA结合蛋白的相互作用在很大程度上是未知的。在这里，被扣留的ATM内含子中的单核苷酸多态性被显示在缺乏U2小核核糖核蛋白(U2AF)的辅助因子的细胞中获得功能性。每个U2AF亚基都是抑制ATM内含子28中无义介导的RNA衰变转换外显子(NSE)所需要的。在位于相对于NSE3'剪接位点的位置-3处的rs609261处存在胞嘧啶比存在胸腺嘧啶更高程度地激活NSE。在高加索人中占主导的胞嘧啶等位基因导致比胸腺嘧啶(亚洲人群中的主要等位基因)更有效地NSE介导的对ATM表达的抑制。NSE激活在白血病细胞中失调并且受到U2AF35残基34处的氨基酸同一性的影响。探索NSE与下游假外显子之间的竞争，鉴定了阻遏或激活NSE以调节ATM表达的剪接转换寡核苷酸(SSO)。使用RNA-Seq，显示在ATM信号传导通路中U2AF调节的外显子的使用以MRN/ATM-CHEK2-CDC25-cdc2/细胞周期蛋白B轴为中心，并且U2AF优先控制参与癌症相关融合体的转录物的RNA加工和染色体易位。这些结果揭示了3'剪接位点控制和对双链DNA断裂的ATM依赖性应答之间的重要联系，说明了内含子变体响应于RNA结合因子的功能可塑性，证明了SSO通过靶向内含子中的假剪接位点来修饰基因表达的多功能性，并可以解释癌症风险和生存的种族差异。
介绍
在这里，U2AF被证明可以抑制ATM基因中的无义介导的衰变(NMD)转换外显子(NSE)(共济失调-毛细血管扩张，A-T，突变的)并且鉴定了其他参与调节成熟转录物中包含的NSE的3'ss识别的蛋白质。此事件限制ATM表达的程度取决于位于内含子28深处的NSE3'ss共有序列中的常见C/T变体rs609261。还鉴定了控制NSE包含在成熟转录物中的内含子顺式元件和剪接转换寡核苷酸(SSO)，其通过靶向相同内含子中竞争性假外显子来调节NSE激活。使用RNA-Seq，接下来显示U2AF介导的DNA损伤应答(DDR)途径的调节集中在ATM-CHEK2-CDC25-cdc2/细胞周期蛋白B轴上，表明它与细胞对双链DNA断裂(DSB)的应答共同作用。最后，在癌症相关基因融合和染色体易位中证实U2AF调节转录物的优先参与。
结果
在ATM中U2AF抑制的隐蔽外显子的鉴定
最近已经表明，每个U2AF亚基的耗竭导致大量外显子的下调和上调，这些外显子主要交替剪接。当检测耗竭U2AF35的细胞中的全局RNA加工变化时，发现出乎意料地强烈激活未被RefSeq注释的隐蔽的29-nt ATM外显子(称为NSE，图1A)。NSE激活也在单独耗竭具有同种型特异性小干扰RNA(siRNA)和靶向3'ss交替剪接U2AF1外显子Ab和3的SSO(其分别编码同种型U2AF35b和U2AF35a)的每个U2AF35同种型中观察到(图1A)。使用RT-PCR验证RNA-Seq数据显示，在未处理的HEK293细胞中，NSE存在于-10-20％的聚腺苷酸化转录物中，与在淋巴母细胞系中观察到的水平相似。在耗尽-90％U2AF35的培养物中NSE包含水平增加到-75％，在耗尽-75％U2AF65的细胞中NSE包含水平增加到-50％(图1B)，这是siRNA剂量依赖性的并且与可用的U2AF异源二聚体的量呈负相关(图1C)，符合每个U2AF亚基对于NSE抑制的要求。对RNA-Seq数据的检测揭示了NSE周围内含子序列的保留(图1A)，表明内含子28被“扣留”并且可以在转录后被剪接。内含子28的保留水平既不受SSO-也不受siRNA-介导的U2AF35消耗的影响(图1A)，并且该基因中没有其他隐蔽外显子被激活到与NSE相同的程度。因此，NSE在以U2AF的以外显子为中心的ATM表达调控中起着关键作用。
NSE激活和rs609261修饰的ATM表达
NSE周围基因组序列的检查显示相对于NSE 3'ss的位置-3是多态的(rs609261，图2A)，其中胸腺嘧啶(T)在非洲和亚洲人群中占主导地位，胞嘧啶(C)在高加索人群中占主导地位(图2A)。这个位置的碱基识别对于通用外显子识别是重要的，CAG>TAG>AAG>GAG的外显子包含水平等级均位于真正的和U2AF35依赖的3'ss。为了证实NSE的使用是等位基因特异性的，在瞬时转染入人胚胎肾(HEK)293细胞后检查了在该位置含有C或T的两个报告构建体的剪接(图2B)。T构建体产生比C报道基因更低的NSE包含，在未处理的细胞和单独耗尽每个U2AF亚基的细胞中(图2C)。
为了测试等位基因特异性NSE的使用是否导致缺乏U2AF35的细胞中的差异蛋白质表达，首先将DNA从可用细胞系跨rs609261进行测序以获得每个等位基因纯合的可转染细胞。发现HEK293细胞对于C等位基因是纯合的并且HeLa细胞对于T等位基因是纯合的(图2D)。来自U2AF35耗尽的细胞和未经处理的对照的免疫印迹证实每个细胞系中的有效消耗，并且在C等位基因存在下比T等位基因存在下U2AF介导的ATM表达下降更多(图2E，F)。作为NMD途径关键组分的UPF1耗尽显示，在ATM成熟的RNA中NSE包含的剂量依赖性增加(图2G)。在耗尽细胞的免疫印迹上未检测到来自假定的截短的ATM的信号。
由于U2AF抑制和激活的外显子显示对U2AF相关蛋白的优先响应，HEK293细胞耗尽了PUF60和CAPERa，以及几种异质核RNP，包括hnRNP A1。PUF60在3'ss与富含尿苷的基序相互作用，并且hnRNP A1与含AG富含U的RNA上的U2AF异源二聚体形成三元复合物。PUF60或hnRNP Al的消耗增加了包含的NSE(图2H)，而PUF60过表达导致NSE跳过(图2I)。因此，在ATM内含子28深处的rs609261和群体依赖性NSE激活受U2AF、PUF60和hnRNP A1调控，证明了普通内含子多态性的功能如何随着促进3'ss识别的RNA结合蛋白的细胞水平而变化。
SSO抑制NSE促进ATM表达
为了测试缺乏U2AF的细胞中的NSE激活是否可以被抑制以恢复ATM表达，将C-等位基因报告构建体分别与靶向每个NSE剪接位点的SSO共转染(图1A)。在每个硫代磷酸酯键和2'-O-甲基核糖处修饰SSO并且被设计为避免NSE的PPT、稳定的Mfold预测的茎和rs609261。每个SSO在外源性(图3A)和内源性转录物(图3B)中均以剂量依赖性方式减少NSE的包含，靶向NSE 3'ss的SSO比以相同浓度桥接5'ss的SSO更有效。
接下来检查NSE 3'ss SSO是否可以增加暴露于电离辐射(IR)的细胞中的ATM蛋白表达和激活。在未暴露的和暴露于IR的细胞中，缺乏U2AF35的细胞中的低ATM表达被这种SSO部分地恢复(泳道1对2，5对6，图3C，泳道5-8对9-12，图8A)，并且这种增加是剂量依赖性的(图4D)。在IR之后，与未处理的细胞相比，在S1981处自动磷酸化的激活的ATM显示耗竭的细胞中的信号减少(泳道6对8，图3C，泳道1-4对5-8，图8A)。暴露于NSE 3'ss SSO略微增加也激活了ATM(泳道5-8vs 9-12，图8A，泳道5vs 6，图3C)。为了开始探索SSO介导的NSE抑制对ATM信号传导的推定作用，野生型CHEK2也在耗尽U2AF的(模拟)照射的细胞(模拟物)中过表达(图8A)。CHEK2是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在T68处响应DNA双链断裂(DSBs)而被ATM磷酸化。然而，与对照相比，缺乏U2AF的细胞具有显著较低的内源性CHEK2水平，其似乎没有被NSE 3'ss SSO改变(泳道1-4对比5-8对比9-12)，而外源CHEK2在暴露于IR的和未暴露的耗竭细胞中增加(泳道1-4对5-8，同样参见图5和图8B、C，下文进一步)。
总之，NSE激活被阻断接近NSE剪接位点但不支持RNase H切割的SSO有效抑制。更有效的SSO部分恢复了NSE介导的ATM抑制。
NMD转换外显子的激活受下游假外显子的影响
为了鉴定控制成熟转录物中NSE包含的内含子调控顺式元件，使用先前报告的A-T突变IVS28-159A>G。观察到这种突变激活NSE3'ss，同时抑制其5'ss并且促进下游5'ss，在mRNA中引入112-nt的隐蔽外显子。在此外显子内观察到最佳BPS/PPT基序之前存在强的3'ss共有序列，其可以结合U2AF并激活较小的24nt假外显子(称为PE；图4A)。在ATM中检查已发表的RNA交联/免疫沉淀数据显示NSE的上游和下游以及PE上游的U2AF65结合，表明NSE激活可能受PE 3'ss与NSE 3'ss处组装的部分生产性剪接体之间的竞争控制。这两个3'ss在哺乳动物中是保守的，但分开的距离小于人类内含子的最小尺寸，从空间上阻止了对NSE和PE的同时识别(图4A)。与这一假设相一致的是，C微小基因中引入的PE PPT/3'ss的缺失，其应通过减少U2AF与PE的结合来减轻NSE的抑制，从而增加了NSE的包含(图4B)。这种缺失也导致分离NSE和PE的内含子的保留，模拟A-T突变IVS28-159A>G的剪接模式。将内含子长度从59增加到79nt，从而克服了两个假-3'ss之间的距离不足所引起的空间位阻，也改善了NSE的包含并减少了内含子的保留(图4B)。
为了测试NSE失活是否会影响PE在mRNA中的包含，NSE 3'ss首先被消除。该突变激活了真正的NSE 3'ss下游的隐蔽的3'ss 7-nt(泳道1、2和6、7，图4C，图21)。这个隐蔽的3'ss显示对U2AF的需求减少。因为在此背景下延长NSE和PE之间的内含子长度未能激活PE(图4C，泳道3和8)、PE缺乏外显子剪接增强子并且具有次优BPS(图22)，将来自哺乳动物范围散布重复(MLR)的24nt茎环插入PE的中间。该MIR发夹通过末端RNA三联体中暴露的剪接增强子充当几乎通用的外显子定义模块。增大的PE在模拟耗尽的细胞中被强烈激活，但是在缺乏U2AF35的细胞中被NSE淘汰(泳道4和9)，表明NSE包含比PE更依赖于U2AF35。含有PE中的MLR插入和扩展内含子的构建体最终产生含有NSE和PE的mRNA(泳道5和10)。
内含SSO靶向竞争性假外显子来调节基因表达
接下来，MLR报告基因被用来测试NSE和PE SSO对外显子使用和ATM表达的影响。图4D显示NSE 3'ss SSO抑制含有NSE的转录物并上调具有PE的那些，而对于靶向PE中MIR增强子环的SSO发现了相反的作用。对于NSE和PE分离距离不足以同时包含在mRNA中的报告基因，观察到相同的模式(图4E)。这些结果表明，靶向PE和/或PE上游的U2AF65结合位点的SSO可能潜在地促进NSE包含并降低ATM表达，而NSE SSO应该具有相反的作用。这种方法将提供一个广泛的策略，通过基于反义的靶向竞争性假外显子来调节基因表达的任一方向，其中之一对基因调控至关重要。为了测试这个概念，检查了靶向PE 3'ss和5'ss的SSO。虽然每个PE SSO都会诱导NSE跳过，在外源性和内源性转录产物上(图4F)，靶向PE上游U2AF65结合位点的SSO(图4A)，即NSE抑制序列(构建体delPPT/AG，图4B)，MIR报告基因中PE包含减少和NSE略微增加(图4G)。相反，在5'方向延伸的较长寡核苷酸(SSO-PEBP，图20)没有显示任何作用。
PE含有天然的DNA变体rs4988000(G/A)，这也可能影响NSE的识别(图4H)。在rs4988000处系统性突变的C和T微小基因的转染显示罕见的A等位基因减少每个前体mRNA上的NSE包含，在U2AF35和模拟物耗尽的细胞中。因此，最高NSE含量是由高加索人中最常见的单倍型(CG)产生的，其次是单倍型CA>TG>TA。
总之，U2AF抑制的NSE的单倍型依赖性激活可以通过靶向竞争性假3'ss上游的U2AF65内含子结合位点的SSO进行修饰，潜在地提供了一种通过基于反义的靶向NMD转换外显子及其在内含子中的调控基序来操纵以外显子为中心的基因表达的一般方法。
在焦点处U2AF：DSB调控ATM信号传导
由于ATM是DDR途径中的关键顶端激酶，而NMD转换外显子通常调节编码蛋白质相互作用伴侣的基因，所以系统地表征了目前已知的ATM底物和ATM信号网络的其他成分的U2AF35诱导RNA加工变化。有趣的是，虽然参与DDR和细胞周期控制的含有U2AF35依赖性外显子的基因只有少量富集(FDR＝0.08)，但ATM-CHEK2-CDC25-CDC2/细胞周期蛋白B轴中的每个成分都显示RNA加工变化(图5A，图9)。此途径对于DSB的ATM信号传导至关重要。
首先，缺乏U2AF的细胞中ATM表达降低(图8)与CHEK2mRNA减少、CHEK2内含子10保留增加和外显子9和11跳过有关(图5A)。已知CHEK2底物的RNA加工变化仅限于调节细胞周期的基因(CDC25A，CDC25B，CDC25C和TTK；图5A，S3A-B，11A)并且在参与DNA修复(BRCA1/2，XRCC1，FOXM1，TRIM28)或p53信号传导(TP53，MDM4，CABIN1，STRAP，AATF)的基因中不明显。CHEK2第9外显子9跳过(预计会激活NMD)在IR后24小时仅稍微增加，并且并不导致早至IR30分钟后观察到的总CHEK2的下降(图5B和5C)。由于CHEK2外显子9包含仅在最高浓度的UPF1siRNA中增加(图5D)，将HEK293细胞用靶向其3'ss的SSO转染。这种处理诱导了外显子9的跳过并降低了CHEK2蛋白的表达，然而，它也增加了NSE激活(图5E)。相比之下，靶向NSE或PE的SSO对CHEK2外显子9包含没有任何影响(图5F)。在缺乏SF3B1的细胞中，外显子9跳过而非NSE显著增加(图5G)。为了解释与对照相比，缺乏U2AF35的细胞中CHEK2的外源表达增加的原因(图8A)，HEK293细胞与CHEK2-抑制SSO和CHEK2-表达质粒共转染(图8B和8C)。在U2AF-精通细胞中内源性CHEK2降低也与外源性CHEK2显著增加有关，表明总CHEK2蛋白在细胞内紧密稳态调节。
其次，U2AF是完全激活CDC25A外显子6所必需的(图5A)，其编码被CHEK2和CHEK1磷酸化的残基(S178)，促进14-3-3的结合。包含CDC25B和CDC25C的外显子3也需要U2AF35(图10A和10B)，证实了之前的微阵列数据。CDC25B外显子3编码多个磷酸化残基，包括由MAPKAP激酶2和pEg3磷酸化的B结构域残基S169。该同种型定位于中心体并在有丝分裂过程中积累。CDC25C外显子3编码由cdc2/细胞周期蛋白B磷酸化的T67作为自动扩增环的一部分。CDC25C中的磷酸化的T67产生被PIN1的WW结构域识别的结合位点，其持续激活U2AF-阻遏的NMD转换外显子(图11B)，可能改变这种丰富的肽基-脯氨酰异构酶的催化活性。最后，细胞周期蛋白B1和B2mRNA在缺乏U2AF35的细胞以及细胞周期蛋白B1相互作用蛋白(CCNBIIPI，也称为HEI10)中上调，尽管它们的RNA加工模式似乎没有改变(图11C)。细胞周期蛋白B上调与被扣留的CDK1内含子有关(图11C)，其可以在转录后被剪接。
由MRE11、RAD50和NBN组成的MRN复合物为ATM募集至DSB提供了便利。NBN在缺乏U2AF35的细胞中没有表现出明显的RNA加工变化，但是RAD50mRNA可能通过激活NMD转换外显子和/或额外的剪切变化而下调(图12A-C和图9)。最后的MRE11A外显子由于促进了大多数细胞类型中存在(但不存在于B细胞中)的耗尽细胞中的远端替换性聚腺苷酸化位点而被上调。DEXSeq分析没有检测到编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(ATR和PRKDQ)的磷脂酰肌醇3激酶样家族其他成员的转录物中显著的RNA加工变化，也没有观察到BRCA1/2、RNF168和ATM相互作用蛋白ATMIN中的。具有改变的外显子或基因表达的其他ATM相互作用伴侣包括RPS6、SRSF1和其他SR蛋白、EP300、RPA2、BLM、FANCD2和FANCI、PPP2R5C和PPP2R5D以及SMC3、粘连蛋白复合物的中心组分(图9)。
U2AF35的消耗与参与染色质修饰的基因/外显子的优先改变有关，其与ATM信号传导具有许多功能联系(图9)。例如，INO80染色质重塑复合物通过ATM磷酸化并且与检查点调节物(包括CHEK2)功能性连接。U2AF抑制含有54nt外显子的INO80C同种型，其编码在酵母Ies6同系物中不存在的肽，这对体内INO80功能是关键的并且可能改变与ACTR5和核小体结合的异源二聚体形成。包括ACTR5、ACTL6A和RUVL2B在内的耗尽细胞中INO80复合物的多个组分的表达发生改变。许多INO80亚基优先在端粒中定位，并且它们的突变导致端粒延长。需要U2AF将TERF1外显子7完全包含在mRNA中(图13A)，调节TRAF1(外显子7+)/PIN2(外显子7-)同种型的丰度，其是shelterin复合物的重要组分。外显子7编码多个磷酸化的丝氨酸残基，两种同种型可通过二聚化结构域进行异二聚化。ATM抑制促进TRF1与端粒的结合，而ATM介导的磷酸化损害TRF1与端粒DNA的相互作用。TRF1与端粒的关联也受到RAD50的负面调节。TRF1-相互作用的TIF2是另一种定位于核基质并由TINF2编码的shelterin蛋白。TIF2以至少两种由替代性剪接产生的同种型存在，称为TIN2S和TIN2L。TIN2L含有额外的NM结合结构域，并且与TIF2S(由保留的3'内含子形成长的3'非翻译区的转录物编码)相比更强烈地结合核基质。这种mRNA同种型被U2AF抑制(图13B)。
总的来说，这些结果表明MRN/ATM-CHEK2-CDC25-cdc2/细胞周期蛋白B轴位于U2AF35-介导的DDR控制的中心，尽管U2AF调节延伸到参与染色质修饰和端粒长度控制的另外的ATM底物。
U2AF优先控制参与白血病相关融合的转录物的RNA加工
CHEK2磷酸化PML(早幼粒细胞白血病)并且似乎需要PML用于随后的自磷酸化。U2AF35的消耗促进了使用PML的近端替换性聚腺苷酸化位点，导致上调最短的PML同种型，其缺乏编码核输出信号的最后一个外显子(图14A)。长和短的PML同种型具有不同的功能；例如，核PML同种型，但不是细胞质同种型，是IFNγ信号传导的正调节剂。最长的PML同种型的C端特异性地与AML1相互作用以增强AML1介导的转录，表明U2AF缺陷可能损害PML-AML1相互作用。PML也结合PIN1，并且这种相互作用以磷酸化依赖性方式促进PML降解。U2AF的消耗增加了PIN1NMD外显子(图11B)，潜在地限制了这种高度丰富的肽基-脯氨酰异构酶的表达，其与许多磷蛋白相互作用以调节有丝分裂，包括磷酸化的CDC25。
除PML外，U2AF35的消耗还上调其他RARA伴侣，包括NPM1(图14B)。该事件与促进近端聚腺苷酸化位点相关，因此增加了更短的、大概更稳定的转录物的丰度。BCOR的替代性剪接外显子，即形成BCOR-RARA融合蛋白并与几种组蛋白脱乙酰酶相互作用以增加BCL6转录抑制的BCL6共同抑制子也被下调(图14C)。
有趣的是，U2AF35敏感基因/外显子与1,187个参与癌症相关基因融合的基因和300个参与复发染色体易位的基因之间的重叠大于预期，对于差异使用的外显子的基因观察到的P值比在转录水平由Cufflinks牵连的那些更显著(表1)。类似地，在骨髓增生异常综合征中频繁突变的基因和在U2AF35消耗时差异表达的基因的共享显著高于预期(P<0.01，超几何测试)。因此，涉及癌症相关基因融合和染色体易位的转录物的RNA加工优先受到U2AF的调控。
为了测试NSE剪接中癌症相关的U2AF1突变的功能，用野生型和突变的U2AF35构建体进行重构实验，所述U2AF35构建体与C微小基因共转染进入消耗U2AF35的细胞(模拟物)中(图6)。NSE激活受到U2AF35同种型的相似程度的抑制，以及在锌指1结构域中含有S34替换的U2AF35a，这是癌症中最频繁突变的U2AF35残基。相比之下，只有部分恢复通过在第二个锌指结构域中替换Q 157来实现，其中这些突变较不频繁。其他S34突变未能完全重建该缺陷，包括S34T和用小氨基酸的替换，尽管在该位置(S34R)的大残基是有效的。因此，U2AF35的第34位残基的鉴定对于NSE识别是重要的。
最后，在六聚体引发的样品和聚腺苷酸化转录物中，在不同人类组织中检测到低水平的NSE激活(图15A)。白血病细胞中含有NSE的RNA的比例平均高于正常细胞，其中一些样品显示在正常组织中未观察到的非常高的水平(图15B和15C)，可能有助于减少先前在白血病和实体瘤中观察到的ATM表达。还检查了在裂解之前从在指定温度下暴露于冷和热休克的一组类淋巴母细胞系提取的聚腺苷酸化RNA中的NSE包含(图15D和15E)。有趣的是，通过将细胞暴露于42℃而非亚生理温度下，NSE似乎被激活的程度最小(图15D)，这表明在恶性细胞中的明显高的NSE包含水平是在患者样品储存期间遇到的冷休克不可能解释的情况。由于暴露于43℃的热应激的Jurkat细胞的蛋白质组分析显示包括U2AF35a在内的几种蛋白质的表达减少，这些结果进一步支持U2AF35作为特定的NSE阻遏剂。
讨论
这里描述的工作显著扩大了目前已知的RNA加工和DDR途径之间的联系(图5和9)。鉴定了对ATM表达至关重要的可选剪接-偶联NMD转换外显子(图1和3)，并检测了其在癌症风险中的重要性(图2、图6和图15)。内含子单倍型如何影响成熟转录物中该外显子的包含，并且还显示了其参与3'ss选择的RNA结合蛋白的细胞水平的功能依赖性(图2和4H)。最后，鉴定了SSO，其通过靶向其调控序列来调节该外显子的激活并提出一种新的反义策略来修饰基因表达。
U2AF是一种重要的3'ss识别复合物和替代性剪接的关键调节剂。除了扩大蛋白质-蛋白质相互作用外，替代性剪接已经发展到通过NMD微调定量基因表达，与缺乏该因子的细胞中许多NMD外显子的改变一致(图1、5和13)。由替代性剪接的外显子编码的肽在无序区域和翻译后修饰(PTM)位点富集，这是两种或更多种同种型之间动态和可逆切换所需的。相反，PTM调节许多剪接因子，包括参与NSE调节的蛋白质。这种复杂性代表了前面的一个明确的挑战，并且可以通过观察到的CHEK2外显子9靶向后NSE激活作为例证(图5E)。减少CHEK2表达可能会改变与其他激酶如CDK11的相互作用，CDK11以CHEK2依赖性方式在S737处组成型磷酸化，并与U2AF65和PUF60相互作用，从而形成控制NSE水平的调控环(图2H、I)。
这些结果表明，U2AF是DDR控制的一个组成部分，有助于微调其PTM网络，并受PTM本身的限制。在DNA损伤后显示S59处磷酸化增加的蛋白质中发现U2AF35。该丝氨酸残基仅出现在U2AF35a中，并被U2AF35b中的丙氨酸替换。U2AF35b的外源表达高于U2AF35a，并且U2AF35b的相对丰度在U2AF65消耗后增加，表明两种U2AF35同种型可能与U2AF65有差异性相互作用，并且在DDR中可能不具有相同的作用。然而，U2AF35和U2AF65调节的外显子存在很大的重叠，U2AF35消耗的细胞中发现的大部分但不是全部的RNA加工变化归因于U2AF异源二聚体的缺乏，包括NSE激活(图1C)。
与U2AF激活的外显子相比，U2AF-抑制的外显子具有独特的3'ss组织和对U2AF相关蛋白的响应，表明外显子抑制涉及直接RNA结合。这通过观察到的NSE在不经历NMD的外源性转录物上的激活和SSO诱导的NSE阻断得到支持(图2和4)。NSE在预测的BPS和3'ss之间缺少AG二核苷酸，其AG排斥区比平均长并且在BPS上游具有5个保守鸟嘌呤的异常延伸，可能有助于跨越3'ss的稳定的二级结构，这可能是抑制所需的。NSE和PE的富含腺嘌呤的3'部分在进化上比其5'部分更加保守(图4A)，考虑到腺嘌呤在结构化RNA中占据不配对位置的倾向，这潜在地提供重要的配体相互作用。有趣的是，灵长类NSE在位置-3处具有尿苷，并且比在该位置具有胞嘧啶的低等哺乳动物具有更长的PPT。虽然直接RNA结合似乎是U2AF对外显子抑制的最简单解释，但U2AF35的消耗导致涉及NMD的几种蛋白质的下调(表S4)，这可能有助于内源性转录物上的NSE激活。另外，U2AF65与TRF1的C-端或ATM信号传导网络的其他组件之间的物理相互作用也可能参与NSE调控。
除了U2AF1/U2AF2之外，还发现涉及3'ss选择的其他基因在癌症中发生突变。有趣的是，具有SF3B1突变的慢性淋巴细胞性白血病与ATM外显子46的隐蔽性3'ss激活相关，导致ATM截短。最近，由于癌症相关的SRSF2突变导致EZH2外显子剪接与受损的造血细胞分化有关，同样的NMD外显子在U2AF35消耗时也被上调(图12D)。这些外显子是否是白血病发生常见的3'ss识别途径的靶点仍有待确定。相反，NSE包含在SF3B1消耗的细胞中没有出现改变，这导致CHEK2外显子9几乎完全跳过(图5G)。
由于NSE激活可能限制正常细胞和癌细胞中的ATM表达(图1、2和15)，ATM是DDR途径中的限制因子，因此rs609261处的胞嘧啶不仅可以在(预)恶性细胞而且在种系中赋予相对于的ATM缺乏。ATM激酶活性似乎是A-T严重程度的良好预测因子，然而，A-T等位基因的多样性并没有完全解释临床症状的频谱。参与NSE激活的基因(图1、2)可能有助于A-T患者的临床异质性，特别是那些具有“漏”突变的患者。修饰NSE包含的天然变体(图2C-F和4H)也可能导致A-T甚至是A-T杂合子的表型复杂性，这些杂合子缺乏明显的临床特征，但可能表现出增加的放射敏感性和癌症风险，与ATM信号传导网络中U2AF调节的外显子使用的中心焦点一致(图9)。
这些结果预测，由于高加索人中rs609261处的C等位基因频率较高，高加索人的NSE激活平均效率高于亚洲人(图2A)。亚裔美国人对常见恶性肿瘤的死亡率比持续很长一段时间的高加索人的死亡率低。造血系统恶性肿瘤的风险也因民族而异，其发病率在白种人群中最高，包括与A-T有关的非霍奇金和霍奇金淋巴瘤。这种趋势在移民中仍然存在，并在后代中继续存在。虽然类淋巴母细胞白血病、淋巴瘤和其他癌症类型在亚洲人群和高加索人群中显示不同的发病率，但是在髓样白血病中未发现显著的年龄标准化发病率的种族差异，这在AT中似乎并不普遍，与淋巴恶性肿瘤或其他癌症不同。亚洲人癌症患者对细胞毒素疗法的反应优于高加索人患者，平均存活时间更长。据报告，亚洲癌症患者的某些基因融合的发病率低于高加索人，这可能反映了他们对DSB的反应能力。rs609261显示了与胶质瘤相关的Cochrane-Armitage测试中最低p值的ATM变体。rs2235006(ATM等位基因F582L)位于最小重组区域的rs609261上游约35kb处，与慢性淋巴细胞白血病的高风险(OR 11.2)相关。本研究对865个候选基因中的1467个编码非同义SNP进行了基因分型，并将编码ATM-BRCA2-CHEK2DDR轴的基因中的有牵连的变体作为最重要的风险路径。对九十多岁/百岁老人和年轻人对照的等位基因关联研究也暗示了ATM和长寿之间的关联。最后，还注意到在造血系统恶性肿瘤中经常改变的基因中的突变率也存在种族差异；例如，慢性淋巴细胞性白血病中的SF3B1突变在中国人中比在欧洲人群中较不频繁。
尽管这些考虑共同支持rs609261依赖性NSE激活在癌症风险和存活中的重要性，但U2AF和hnRNP Al依赖于NSE包含(图2H，S8B)证明它绝不是固定的。这些蛋白质从一种恶性肿瘤到另一种恶性肿瘤的可变表达模式意味着这种变体的“反复功能性”。具有这种属性的更多多态性位点可能在将来建立，不仅通过限制'毒'隐蔽外显子的能力来促进基因表达的个体间变异性，而且还可能导致复杂性状的'缺失遗传性'和全基因组关联研究失败，特别是癌症中。
尽管RNA-Seq是检测全转录组以应对DNA损伤的有力工具，但正确评估观察到的RNA加工改变的生物学和统计学意义的严格标准尚未实施。鉴于DEXSeq算法的高度严格性，不能排除对U2AF起反应的额外生物学重要RNA加工事件的存在。例如，CHEK1中的近端聚腺苷酸化位点上调，其与CLASP1中的24-nt和27-nt外显子的上调联合，将牵涉ATM凋亡途径。DEXSeq没有检测到这些事件，但看到了基因组浏览器并需要确认。细胞凋亡途径在骨髓增生异常综合征中具有特别的兴趣，所述综合征显示骨髓祖细胞对程序性细胞死亡的易感性，并且在更晚期但不是初始临床阶段发现涉及ATM信号传导的基因的失调。有趣的是，U2AF1突变也被发现在晚期更频繁，并与更短的生存相关。这项研究还强调了不完整的转录物注释的当前局限性以及检查RNA-Seq数据中隐蔽的外显子的重要性。因此，未来的RNA-Seq研究应该尝试全面检测与替代性剪接相关的NMD事件，而这种事件一直受到含终止密码子转录物不稳定性的阻碍。
最后，这项研究表明通过还增加ATM蛋白水平的SSO有效抑制ATM中的关键NMD转换外显子(图3A-D，图8)。它还揭示了NSE在相同内含子中的竞争性调控基序(图4A-C、H)，其可以作为SSO介导的基因表达调控的靶标进行探索(图4D-G)。这种方法可以与CRISPR-Cas9等基因组编辑相结合，以删除或引入微小基因研究所涉及的剪接调控基序或蛋白质结合位点(图4C)，并且还应该帮助我们找到有效的内含子SSO以及RNA加工的期望结果。寻找这种SSO比寻找靶向人类外显子的那些更具挑战性。例如，系统地覆盖SMN2外显子7的大多数SSO刺激外显子跳过，这是一种用于治疗脊髓性肌萎缩的事件，然而，-20％诱导了外显子包含。通过类比，只有10％的靶向INS内含子1的SSO发现了内含子剪接的期望刺激，而大多数未能显示出这种作用。提出的策略利用比低等生物体高得多的人辅助剪接序列的信息含量，并且应该由未来的全球前体mRNA折叠研究大大促进。例如，与有效阻断NSE 3'ss的SSO(SSO-NSE3，图3A、B)不同，部分重叠的仅延伸7-nt进入NSE的吗啉代未能抑制相同的3'ss以拯救突变IVS28-159A>G的剪接，尽管靶向U2AF结合位点(图4A)。与这些发现一致，这表明吗啉寡核苷酸可能阻止了对不负责外显子激活但负责外显子抑制的结构或基序的接近(图1A-C)。靶向或避免内含子中剪接因子的结合位点的基于反义的RNA加工激活剂或阻遏剂的施用可用于治疗性地形成NMD在癌细胞中的有益或有害后果。这种方法得到以下广泛认识的支持，即NMD主要用于跨广范围的转录物的调节功能，并且还可以促进产生截短多肽的NMD底物的翻译，这可以刺激抗肿瘤免疫。
材料与方法
质粒构建体
ATM微小基因通过将-0.9kb扩增子克隆到U2AF1构建体的XhoIIXbal位点来制备。表S1中显示了克隆引物。对完整插入序列进行测序以确认预期变化的身份并排除不需要的突变。还使用了PUF60表达载体。hnRNP Al构建体是Gideon Dreyfuss(University ofPennsylvania)的慷慨礼物。
细胞培养物和转染
细胞培养物在补充有10％(v/v)牛小牛血清(Life Technologies)的DMEM中的标准条件下维持。U2AF亚基和U2AF35同种型用小干扰RNA(siRNA)和剪接切换寡核苷酸(SSO)耗尽后，进行了时间进程实验，确定每个同种型的消耗水平。表S1中列出了寡(核糖)核苷酸和siRNA。根据制造商的建议使用jetPPJME(Polyplus)在6或12孔板中进行转染。第二次击中后48小时收集细胞，除了暴露于IR的那些细胞受到单次击中外。对于SF3B1消耗，将HEK293细胞暴露于siRNA混合物(S23850、S23852和S223598(Life Technologies))并在48小时后收获。
RNA-Seq
差异外显子使用的分析使用DEXSeq(v.1.12.1)，基于小于0.05的q值进行。用Cufflinks(v.2.1.1)分析样品组之间的差异基因和同种型表达，其使用每百万个读取度量的每千碱基外显子模型的片段来标准化读取。基于FDR调整的P-值(q<0.05)进行显著差异表达基因的选择。
NSE在人体组织和细胞系中的表达
含有来自19种不同组织的总RNA样品的FirstChoice人类总RNA测量面板购自LifeTechnologies。每个组织样品含有来自不同供体的RNA库。将类淋巴母细胞系暴露于冷休克和热休克。总RNA样品用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录转录酶(Promega)和随机六聚体或寡聚d(T)引物逆转录。使用图20所示的引物扩增cDNA样品。从随机选择的急性髓性白血病或慢性粒单核细胞白血病患者的骨髓样品的白细胞中提取的总RNA用随机六聚体引物逆转录。该研究得到了西南国家研究伦理服务(英国)委员会的批准。
剪接转换寡核苷酸
SSO被设计为最大化与单链区域的相互作用并避免由Mfold预测的二级结构。所有SSO均购自Eurofins，稀释于水中，其等分试样储存于-80℃。根据制造商的建议，使用jetPRFME(Polyplus)进行所有转染。
细胞培养物暴露于电离辐射
使用Gulmay Medical(X-Strahl)D3225Orthovoltage X射线系统，在室温下以0.63Gy/分钟的剂量速率在第一次击中后将(模拟)消耗的HEK293细胞暴露于IR48小时。实际剂量速率由恒定计监测。如图例所示收获细胞。
免疫印迹
针对ATM(D2E2)、ATM-pS1981(D6H9)、CHEK2(D9C6)和CHEK2pThr68(C13C1)的抗体购自Cell Signaling Technology,Inc.RBM39抗体购自Thermo Fisher Scientific(PA5-31103)。使用检测X-press标签的抗体、U2AF35、U2AF65和微管蛋白。用小鼠单克隆抗SAP155抗体(D138-3，MBL)进行SF3B1免疫印迹。制备细胞裂解物并进行免疫印迹。
表1.在涉及癌症相关基因融合和复发性染色体易位的基因中，U2AF35依赖性转录物比预期更为常见
1基因列表于2014年4月2日下载。2使用DEX-Seq和Cufflinks分别对23,263个基因进行RNA-Seq数据的外显子和基因水平分析。3重叠基因的数量除以从两个独立组中抽取的重叠基因的预期数量。表示因子>1表示比两个独立组的预期的更大的重叠，值<1表示重叠程度低于预期。P值由超几何测试得出。
实施例2-在ATM基因中靶向受调控的无义介导的RNA衰变转换外显子的反义野生型(microwalk)
概要
ATM是编码DNA损伤应答(DDR)途径的关键激酶的重要癌症易感基因。ATM缺乏导致共济失调毛细血管扩张症(A-T)，这是一种罕见的遗传综合征，表现出对淋巴恶性肿瘤的高度易感性。ATM表达受限于位于内含子28中的无义介导的RNA衰变(NMD)转换外显子(称为NSE)，其受剪接体严格控制。包含在成熟转录物中的NSE可以通过剪接转换寡核苷酸(SSO)来调节，但是它们在内含子中的最佳靶标是未知的，并且它们向淋巴样细胞的递送尚未被测试。在这里系统地寻找靶向内含子28的有效SSO来鉴定NSE激活剂和阻遏剂。这些反义化合物的发现通过内含子转座元件的片段缺失分析来辅助，揭示在消除长末端重复转座子MER51A后移除远处反义Alu和NSE激活时的NSE抑制。用基于壳聚糖的纳米颗粒对胚胎和类淋巴母细胞进行SSO递送时，NSE的高效抑制也被证明，这为NSE介导的癌症和A-T中ATM表达的调节开辟了可能性。综上所述，这些结果突显了转座元件在调节NMD转换外显子和内含SSO修饰基因表达的能力中的重要作用。
介绍
真核生物基因含有干扰序列或内含子，这些干扰序列或内含子需要被称为剪接体的大且高度动态的RNA蛋白复合物去除以确保准确的蛋白质合成。细胞需要过多的能量和时间才能完成至少四分之一人类基因组的内含子前体信使RNA(前体mRNA)的转录，并且还需要合成非编码RNA和>200种不同的剪接体蛋白以完成此任务。虽然曾经被视为“自私”或“垃圾”DNA，但内含子现在被认为是增强基因表达、调节替代性RNA加工、mRNA输出和RNA监视的真核基因的关键功能组分。它们也是新基因编码和调控序列和非编码RNA的重要来源，包括microRNA和环状RNA。它们的去除过程与转录、mRNA输出和翻译紧密结合，大多数人类内含子从前体mRNA共转录地消除，然而，它们作为核酸治疗靶标的潜力仅开始被释放。
剪接体以有序的方式在每个内含子上特异性组装，从U1小核RNP识别5'剪接位点(5'ss)或U2途径识别3'ss开始。除了传统的剪接位点识别序列(5'ss，分支点，聚嘧啶束和3'ss)之外，精确剪接需要激活或阻遏剪接位点的辅助序列或结构，称为内含子或外显子剪接增强子或沉默子。这些元件允许真正的剪接位点在真核生物基因组中具有相似序列但超过可信位点一个数量级的大量隐蔽或假位点中被识别。隐蔽剪接位点的激活可能产生翻译阅读框架中的可能导致遗传疾病的提前终止密码子(PTC)。这种转录物通常由NMD途径识别并下调。然而，隐蔽外显子和NMD在控制天然存在的转录物的表达和分化阶段特异性剪接转换中也具有重要作用，例如造血的末期阶段。此外，隐蔽剪接位点可允许非生产性或部分剪接体装配，其可与天然剪接位点竞争，促进其以单核苷酸分辨率的准确选择。因此激活限制基因表达和调节mRNA同种型库的这种“假外显子”(也称为“毒药”或“NMD转换”外显子)的隐蔽剪接位点可以为核酸治疗提供有趣的靶标，然而，利用这样的方法还处于起步阶段。
剪接转换寡核苷酸(SSO)是反义试剂，其通过结合剪接位点识别或调节序列，并与顺式和反式作用因子竞争其靶标来调节内含子剪接。已显示它们恢复异常RNA加工，修饰现有mRNA同种型的相对丰度或产生通常不被细胞正常表达的新型剪接变体。在临床前和临床开发中使用的大多数SSO已经靶向了外显子序列。功能性内含子SSO更难以识别，除非SSO阻止访问由致病突变激活的内含子隐蔽剪接位点。首先，尽管人类基因组中有丰富的内含子辅助剪接基序，但大部分内含子序列可能不影响RNA加工。另外，它们的识别在长内含子中是昂贵且低效的。旨在诱导外显子跳过的大多数外显子SSO通常具有期望的作用。例如，系统地覆盖SMN2外显子7的大多数SSO刺激外显子跳过，这是脊髓性肌萎缩的反义治疗的先决条件，然而，外显子包含增加了-20％。相比之下，只有-10％的靶向INS内含子1的SSO发现了内含子剪接的刺激，而大多数未能显示这种作用。通过全局前体mRNA折叠和紫外交联以及免疫沉淀研究可以促进有效SSO的识别，免疫沉淀研究确定了剪接体或外显子连接复合物的组分的结合位点。然而，这些结合位点可能并不反映最佳的反义靶标，其分辨率可能不足。因此，寻找对RNA加工具有预期效果的内含子SSO仍然具有挑战性。
RNA-Seq研究最近揭示了在U2小核RNP(U2AF)的辅助因子的每个亚基耗尽的细胞中在ATM内含子28深处NMD转换外显子(称为NSE)的激活。U2AF结合与内含子末端高度保守的3'ss AG二核苷酸连接的聚嘧啶束，这种结合促进U2募集到分支位点并形成套索内含子。然而，最近鉴定出在每个U2AF亚基(U2AF35和U2AF65)耗尽的细胞中激活的大量外显子并展现出明显的3'ss组织，表明U2AF抑制了典型和NMD转换外显子的子集，类似于越来越多的RNA结合蛋白发现的外显子抑制和激活活性。NSE水平响应于敲除涉及3'ss识别的其他剪接因子，并且分别受位于NSE本身和其3'ss中的两个天然DNA变体(rs4988000和rs609261)的影响。还已经确定了通过靶向NSE及其在相同内含子中的竞争性假外显子来调节ATM mRNA中NSE包含水平的SSO。ATM NSE为抗癌治疗提供了有趣且有希望的靶标，原因如下：(i)ATM激酶响应双链断裂而激活，动员具有广范围靶标的广泛信号网络，影响对DNA-损伤剂的细胞敏感性；(ii)ATM信号通路中U2AF调节的外显子使用集中在MRN/ATM-CHEK2-CDC25轴上，优先涉及与癌症相关基因融合和染色体易位有关的转录物；(iii)ATM NSE激活限制了缺乏每个U2AF亚基的细胞中的ATM表达。然而，最佳的NSE SSO是未知的，它们向淋巴细胞的递送尚未经过测试。
在本研究中，涵盖整个内含子28的SSO进行了系统筛选，并且确定了激活或抑制NSE并且可用作治疗策略中推定的基于NSE的ATM阻遏剂和激活剂的额外SSO。还确定了影响NSE包含的同一内含子中的远处转座元件。最后，还显示了使用基于壳聚糖的纳米粒子对SSO递送至胚胎和类淋巴母细胞系的有效NSE抑制。
材料和方法
质粒构建体
使用扩增引物ATM26和ATM27(表2)将含有完整ATM内含子28和侧翼外显子的报告基因构建体克隆入pCR3.1的HindIII/XbaI位点(Invitrogen)。缺失构建体(图16)通过用诱变引物进行重叠延伸PCR获得(表2)。通过将含有NSE和外显子29的～0.9kb扩增子克隆到U2AF1构建体的XhoJTXbaI位点来制备杂合ATM小基因。质粒在大肠杆菌(DH5α)中传播，用Gene JET Plasmid Miniprep试剂盒(ThermoScientific)提取质粒DNA。对完整插入物进行测序以确认预期变化的身份并排除不需要的突变。
剪接转换寡核苷酸(SSO)
为了测试具有内源性和外源性前体mRNA的SSO，设计SSO以避免内含子28中的转座元件。使用RepeatMasker在构建体的序列中确认转座子。SSO GC含量至少为24％(平均31％)，平均长度为-20nt。SSO全面覆盖了ATM内含子28(称为A、B和AN，图17)中的三个独特区域，避免了只有均聚束。SSO(Eurofins)在每个核糖处被2'-O-甲基修饰并且在每个末端连接处被硫代磷酸酯修饰以确保体外筛选足够的稳定性。SSO用双蒸水稀释并使用Nanodrop(ThermoScientific)定量。它们的标准化等分试样储存在-80℃。
PU值的确定
通过考虑短序列的所有可能的RNA结构，PU(未配对概率)值使用平衡分配函数估计RNA单链性，允许它们在每个核苷酸位置进行比较。较高的PU值表示RNA基序的较高单链性。如所述使用三个内含子区域及其30-nt侧翼作为输入来计算PU值。对SSO靶标每个位置的PU值进行平均并与SSO诱导的NSE包含水平相关。
硬脂酸三甲基壳聚糖的制备
KitoZyme(比利时)提供最初来源于双孢蘑菇超纯壳聚糖的三甲基壳聚糖。
纯化产物的数均分子量(Mn)为43.3±5.5kDa，多分散指数(Mw/Mn)为2.4±0.3，如通过凝胶渗透色谱在0.33M NaCH3COOH/0.28M CH3COOH洗脱液中以1mL/min流速测定。通过傅里叶变换红外光谱和1H-核磁共振光谱(1H NMR)确定的乙酰化和季铵化程度分别为11.1±0.9％和30.1±4.6％。用N-琥珀酰亚胺基硬脂酸酯(Santa Cruz BioTechnologies)对三甲基壳聚糖进行官能化，通过1H NMR确定最终替换度为2.1±0.6％(摩尔％)。
纳米复合物的形成
纳米复合物通过混合等体积(30μL)的SSO和聚合物溶液来制备。简而言之，将SSO在缓冲液A(20mM HEPES，pH 7.3,5％(w/v)葡萄糖)中稀释并补充1M Na2SO4至终浓度为50mM。将聚合物和SSO溶液都在60℃加热5分钟，然后以1,000rpm旋转混合15秒。如先前优化的那样制备了测试复合物，其中季铵化的胺(N)与磷酸根(P)的摩尔比为20、40和80，并且具有在110-130nm之间的流体动力学直径，N/P比率为20-80。在添加至240μL不含血清和抗生素的培养基(DMEM)之前，使复合物在室温下稳定30分钟。含壳聚糖的培养物中SSO的最终浓度为300nM。转染24小时后，加入300μL含血清/抗生素的培养基。24小时后收获细胞。
细胞培养物和转染。在补充有10％(v/v)牛小牛血清的DMEM中，将HEK293和类淋巴母细胞VAVY细胞维持在标准培养条件下。在转染前24小时将细胞接种在70％汇合处。根据制造商的推荐，使用jetPRIME(Polyplus)在12或24孔板中进行野生型和缺失构建体的转染。24小时后收获细胞用于总RNA提取。每种SSO用或不用50nM的全长ATM构建体转染，48小时后收获细胞用于RNA提取。
剪接产物分析。使用TRI-试剂(Ambion)分离RNA样品。用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取来自壳聚糖实验的总RNA样品。定量RNA并用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(Promega)和随机六聚体或寡聚(d)引物逆转录1μg总RNA。用引物PL4和ATM-F扩增外源cDNA样品，用引物ATM-F和ATM-R扩增内源产物(表2)。剪接的产物在琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶上分离并测量它们的信号强度。用Stat200(BioSoft，UK)进行统计分析。
表2.寡核苷酸引物
结果
靶向NSE的3'或5'ss的SSO以单倍型依赖性方式有效地抑制该外显子。为了便于鉴定激活NSE的最佳内含子SSO，首先制备具有整个ATM内含子28的剪接报道基因构建体(图16A)。使用HEK293DNA作为模板通过PCR获得构建体。内含子28的参考序列(hg19)是-3,100nt长，其与人平均内含子类似。转座元件占据内含子28的-64％，完全填充其中间部分，除了内含子和外显子侧翼的5'半部分中的-350nt区域(图16A)。质粒DNA测序揭示了转座元件的相同组织，没有任何额外的转座子拷贝。它还分别在rs4988000和rs609261处显示C和G等位基因，表明该构建体含有最容许NSE包含在ATM mRNA中的单倍型。转染到HEK293细胞中后，提取总RNA并在用载体引物PL4(表2)和外显子引物(图16A)扩增前进行逆转录。剪接产物的检查显示大多数转录物完全缺乏内含子序列(NSE-)，而-36％mRNA含有NSE(图16B，第1泳道)，比先前报告的杂合报告基因略高。
为了确定转座元件对NSE包含的重要性，使用重叠延伸PCR(缺失1-5，图16A)将来自内含子28的每个转座子单独地删除。内含子的大部分中间部分也与所有转座子一起被删除，使NSE及其上游序列保持完整(内含子的～75％，缺失6)。验证的突变构建体(其全部在rs4988000和rs609261具有与野生型构建体处相同的基因型)的转染显示大缺失促进含NSE的转录物(缺失6，图16B)。MER51元件的缺失使NSE包含程度增加较低。相反，反义Alu的缺失抑制NSE，而长穿插重复(缺失3和5)或独特内含子片段(缺失2)的缺失对NSE激活没有影响。在U2AF35的两次敲除后NSE包含水平的变异性要高得多，只有缺失6时NSE水平显著增加(图16B)，与NSE反应的主要压力分量一致。然后设计一系列SSO，靶向在基因组中具有独特序列(称为A、B和AN)的三个内含子区域，同时避免预测的NSE上游分支位点(图17A，表2)。每个SSO在每个核糖处用2'-O-乙基修饰和在每个末端连接处用硫代磷酸酯修饰，以确保它们的RNA酶H抗性和在瞬时转染中的足够稳定性。作为阳性和阴性对照，使用SSO-NSE3，其在阻断NSE 3'ss方面是高度有效的，并且一系列靶向其他基因(包括在HEK293细胞中未表达的INS和BTK)的杂交SSO和SSO通过RNA-Seq被证实。每个SSO分别用或不用野生型ATM构建体转染。
剪接产物的测量显示SSO-NSE3产生最有效的NSE抑制(图17B)。与对照相比，大约一半的受试SSO显著改变NSE包含水平，阻遏剂和激活剂SSO的数量相似。重复转染之间的Pearson相关系数非常显著，达到0.88(P<10-8)；然而，外源性和内源性NSE水平之间的总体相关性仅为0.35(P<0.01)。
图16中的实验显示NSE包含由转座子内外的远端剪接调控序列控制。实验确定的剪接增强子和沉默子的基序在其天然的前体mRNA背景下优先发生在单链区域，表明它们更易于被RNA结合蛋白或其他控制外显子选择的配体接近。优先将SSO定位到未配对区域可以改善对内含子SSO的搜索。为了测试这个假设，每个SSO诱导的NSE包含水平与它们的平均PU值相关(图17C)。这些值使用平衡分配函数来估计其RNA靶的单链性，其中信号传导的值越高，表示单链构象的可能性越高。有趣的是，具有较高平均PU值的SSO靶倾向于诱导外显子跳过，表明有效阻断距离外显子2kb的未配对相互作用可损害其激活。
上述实验确定了一小组内含子SSO，其在成熟的外源性和内源性转录物中激活NSE包含。由于NSE可以通过NMD限制ATM表达，因此激活剂和阻遏剂SSO可以作为可调基因特异性抑制剂。
通过NSE激活SSO的瞬时ATM抑制可通过抑制双链断裂信号传导途径和放射敏化而有利于癌症治疗。
为了测试ATM SSO是否可以递送到比HEK293细胞具有低得多的转染效率的细胞，使用了十八烷基化的三甲基化壳聚糖(TMC-SA)。壳聚糖是已知用于生物相容性、可生物降解性和低毒性以及免疫原性的D-葡糖胺和N-乙酰-D-葡糖胺的天然共聚物。当三甲基化时，壳聚糖获得永久性正电荷，改善其在中性pH下的溶解度。发现十八烷基化对于形成具有SSO的稳定纳米复合物以及其在HeLa/pLuc705系统中的转染活性是必需的，所述HeLa/pLuc705系统利用由突变的HBB1内含子中断的萤光素酶基因。
首先测试了TMC-SA是否可促进SSO-NSE3向HEK293细胞的递送。图18A显示与混杂的SSO相比暴露于SSO-NSE3-TMC纳米颗粒后NSE水平的下降。TMC-SA/SSO-NSE3(N/P)比率为20和40时，这种下降是显著的。当比较暴露于未复合的SSO-NSE3的细胞中的NSE包含时，NSE下降也是明显的，这与它们被这种高度转染的细胞系的显著摄取一致。然而，对于TMC-SA/SSO-NSE3，NSE水平的降低比在较低终浓度下用jetPrime将相同寡核苷酸转染至相同细胞系的效率低。对于类淋巴母细胞系，在暴露于TMC-SA/SSO-NSE3纳米复合物后还观察到显著的NSE抑制，而未复合的SSO-NSE3未能减少NSE(图18B)。总之，这些结果提供了第一个证据原则，即基于壳聚糖的内含子SSO递送系统可以抑制人类细胞中的NMD转换外显子。
讨论
这项工作展示了促进和抑制NMD转换外显子激活的转座元件的第一个例子(图16)。Alu序列本身具有通过3'ss或5'ss激活或辅助剪接基序进行外显化的倾向，这显著促进人类发病率。它们也可以通过外显缺失进行外显子化并导致遗传疾病，表明它们可以促进远端内含子序列在成熟转录物中的包含。这一点得到了Alus的更高分数的支持，Alus分布在替代性剪接外显子的侧翼，而不是分布在那些剪接组成型的外显子的侧翼。虽然这些远距离效应的确切机制尚不清楚，但这些富含GC的转录物的二级结构很可能起主要作用。
对于所有其他类别的转座元件已经显示突变诱导的外显子化，包括称为哺乳动物分散重复的更古老的短散布元件。在本研究中，与MER51A(中等重复频率的重复，家族51)具有最高相似性的内含子转座元件抑制NSE，作为抵消Alu介导的NSE激活的缓冲剂(图16A和16B)。ATM MER51相对富含GC(-44％)，这可在共转录折叠期间促进与富含GC的Alus的分子内相互作用。该元件含有多个反向重复序列，可能形成稳定的发夹，其含有可控制NSE包含的暴露的富含嘌呤的环(图19)。据估计，人类基因组中存在大约250,000个可识别MER序列的拷贝，并且在蛋白质编码基因的成熟转录物中发现了许多拷贝，这有助于蛋白质相互作用的多样性。还显示突变诱导的MER外显化事件引起Gitelman综合征。MER51的3'部分与逆转录病毒的长末端重复相似(图19)，其占引起疾病外显化的约15％。大多数MER的起源位于Alus传播之前哺乳动物穿插重复序列减少之后，这与哺乳动物的扩增相吻合，并且表明MER可提供对早期哺乳动物辐射的洞察。然而，MER介导的外显子激活的分子机制尚不清楚，需要进一步研究。总之，这些结果表明，长内含子中转座元件的相互作用可能影响许多NMD转换外显子的包含水平，从而微调基因表达。
在这项工作中，还鉴定了候选序列特异性ATM抑制剂，其通过促进对ATM表达关键的受调节的NMD转换外显子起作用(图17)。ATM抑制剂使癌细胞对诱导双链断裂的细胞毒性疗法易感，包括局部放疗，其是许多癌症类型的治疗方案的组成部分。尽管化学ATM抑制剂对癌症放射治疗显示出很大的希望，但它们不需要的药代动力学特征、高毒性或较差的功效阻碍了它们进入临床。相反，新鉴定的SSO靶向人类基因组中的独特序列，其作用机制是明确的，并且可以使用天然生物可降解化合物将其递送至细胞(图18)。此外，NSE激活和阻遏SSO的可用性提供了比化学抑制剂更准确地滴定基因表达的机会。本文所述的方法利用SSO介导的调节激活NMD的隐蔽外显子。这些外显子通常以非常低的水平存在于自然转录物中，但是它们的包含水平可以有效地上调以响应各种刺激。最近，NMD的基因特异性反义抑制使用靶向外显子连接复合物沉积位点的SSO，从而允许NMD抑制而不依赖于含有PTC的外显子的跳过。这两种方法，前者依靠内含子序列，后者依靠外显子靶标，可能在未来互补，扩大抑制NMD的反义策略的全部技能。
筛选中使用的SSO的平均长度接近独特靶标的最小值(表2)。较短的SSO比较长的SSO可能诱导更多的脱靶效应，这可能导致内源性和外源性NSE转录物包含水平之间的低相关性。除了可能的次优靶标特异性之外，内含子28剪接和NSE包含可受到外源转录物中不存在的相邻内含子的影响。另外，内含子28剪接可能不完全共转录，并且从不同启动子转录的RNA的折叠和折叠动力学可能是不同的，导致低相关性。尽管如此，这项研究清楚地证明了与低等生物体相比，人类基因组中SSO的候选内含子靶位点的丰富性，这与内含子辅助剪接序列的较高信息含量一致，低等生物体具有较少的具有较低的可变剪接调控潜力的内含子。虽然SSO-NSE3和其他SSO可抑制内源性含NSE的mRNA(图17B和17C)，相对丰度低至-1％的NMD转录物可促进mRNA消耗，但是如果它们的减少可以导致正常细胞中ATM蛋白水平的持续增加，则仍有待测试。这种方法可能有潜力缓解漏A-T等位基因以突变无关的方式的表型后果，尤其是在rs609261处携带C等位基因的纯合A-T患者中，这有助于NSE的3'ss识别。最后，基于壳聚糖的纳米颗粒已经显示穿透血脑屏障并在小脑中积累而不影响组织形态学，开启了将NSE阻遏剂和假定的ATM激活剂递送至神经细胞以改善AT的小脑症状的可能性。

Claims (161)

1.一种筛选对功能性ATM蛋白质缺陷易感的个体的方法，其中所述筛选包括确定位于相对于人个体基因组的NSE(ATM内含子28中的隐蔽外显子)的3'剪接位点的位置-3处的非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在，
其中所述非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在表明所述个体具有功能性ATM蛋白质缺陷或对功能性ATM蛋白质缺陷易感。
2.一种选择个体进行治疗的方法，其中所述个体对功能性ATM蛋白质缺陷易感，所述方法包括确定位于相对于人个体基因组的NSE(ATM内含子28中的隐蔽外显子)的3'剪接位点的位置-3处的非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在，其中所述非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在表明所述个体具有功能性ATM蛋白质缺陷或对功能性ATM蛋白质缺陷易感，
以及选择所述个体用药剂进行治疗，由此增加所述个体的功能性-ATM水平。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述药剂施用至所选择的个体，由此治疗所述个体。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述药剂包含NSE阻遏剂。
5.一种治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括鉴定位于相对于人个体基因组的NSE的3'剪接位点(ATM内含子28中的隐蔽外显子)的位置-3处的非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在，其中非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在表明所述个体具有功能性ATM蛋白质缺陷或对功能性ATM蛋白质缺陷易感，
以及将药剂施用于所述个体，其中所述药剂增加功能性ATM水平。
6.一种治疗或预防与功能性ATM蛋白质缺陷相关的病症的方法，包括向个体施用NSE阻遏剂，由此增加功能性ATM蛋白质水平，其中所述药剂结合前体-mRNA转录物的ATM内含子28中的NSE，由此减少在前体mRNA转录物的成熟RNA转录物中包含的NSE。
7.根据权利要求6所述的方法，其中减少在所述成熟RNA转录物中包含的所述NSE增加功能性ATM蛋白质的表达。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述方法用于治疗或预防与功能性ATM蛋白质缺陷相关的一种或多种症状。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述病症是共济失调-毛细血管扩张症、癌症、免疫缺陷、细胞放射敏感性或染色体不稳定性。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述NSE包含含有tctacaggttggctgcatagaagaaaaag的序列。
11.根据权利要求4至10中任一项所述的方法，其中所述NSE阻遏剂结合包含以下的序列内的NSE：
agTCTACAGGTTGGCTGCATAGAAGAAAAAGgtagag；或
tcttagTCTACAGGTTGGCTGCATAGAAGAAAAAGgtagag；或
tctcagTCTACAGGTTGGCTGCATAGAAGAAAAAGgtagag。
12.根据权利要求4至10中任一项所述的方法，其中所述NSE阻遏剂结合所述NSE或与所述NSE的ATM内含子28中的s5'或3'剪接位点结合。
13.一种治疗或预防个体中与ATM表达失调有关的病症的方法，其包括向所述个体施用NSE激活剂，其中所述NSE激活剂通过结合ATM内含子28中的调控基序或通过结合位于ATM前体mRNA转录物的ATM内含子28中的NSE的3'处的假外显子上游的U2AF65结合位点而增加在ATM成熟RNA转录物中包含的NSE。
14.一种治疗或预防个体中癌症的方法，其包括向所述个体施用NSE激活剂，其中所述NSE激活剂增加癌细胞对DNA损伤剂的细胞毒性疗法如放疗的易感性，其中所述NSE激活剂通过结合ATM内含子28中的调控基序或通过结合位于ATM前体mRNA转录物的ATM内含子28中的NSE的3'处的假外显子上游的U2AF65结合位点而增加在ATM成熟RNA转录物中包含的NSE，和
用所述细胞毒性疗法如放疗或化疗来治疗所述个体。
15.一种增加对DNA损伤剂的细胞毒性疗法如放疗或化疗的细胞易感性的方法，其包括通过施用NSE激活剂而减少ATM蛋白的表达，其中所述NSE激活剂通过结合ATM内含子28中的基序或通过结合位于ATM前体mRNA转录物的ATM内含子28中的NSE的3'处的假外显子上游的U2AF65结合位点而增加在ATM成熟RNA转录物中包含的NSE。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中增加在所述成熟RNA转录物中包含的所述NSE提供功能性ATM蛋白质表达的降低。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述假外显子包含序列tcatcgaatacttttggaaataag。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述ATM内含子28中的调控基序与所述NSE竞争剪接体组分。
19.根据权利要求13至18中任一项的方法，其中所述ATM内含子28中的调控基序包含位于所述前体mRNA转录物的ATM内含子28中的所述NSE的3'处的24个核苷酸的假外显子(PE)。
20.一种裁剪个体、细胞或组织中功能性ATM表达的方法，包括施用本文所述的NSE激活剂和/或NSE阻遏剂。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述NSE阻遏剂和/或NSE激活剂包含多核酸聚合物。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述NSE阻遏剂和/或NSE激活剂是SSO(剪接转换寡核苷酸)。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述NSE阻遏剂和/或NSE激活剂与适于将所述NSE阻遏剂和/或NSE激活剂递送至细胞的递送载体结合。
24.根据权利要求4至12或20至23中任一项所述的方法，其中所述NSE阻遏剂包含：序列cuucuaugcagccaaccuguagacu的SSO(SSO-NSE3)或其核酸类似物；或者
序列accuuuuucuucuaugcagccaac的SSO(SSO-NSE5)或其核酸类似物；和/或
所述NSE阻遏剂包含或由选自下组的任何一种SSO组成：aacauuucuauuuaguuaaaagc(SSO A11)；uuaguauuccuugacuuua(SSO A17)；gacugguaaauaauaaacauaauuc(SSO B2)；auauauuagagauacaucagcc(SSO B4)；和uuagagaaucauuuuaaauaagac(SSO AN3)或其组合。
25.根据权利要求13至19中任一项所述的方法，其中所述NSE激活剂包含SSO PEkr/PEdel；和/或
所述NSE激活剂包含或由选自下组的任何一种SSO组成：aacuuaaagguuauaucuc(SSOA2)；uauaaauacgaauaaaucga(SSO A4)；caacacgacauaaccaaa(SSO A9)；gguaugagaacuauagga(SSO A23)；gguaauaagugucacaaa(SSO A25)；guaucauacauuauagag(SSO A26)；和uguggggugaccacagcuu(SSO B11)，或其组合。
26.rs609261和/或rs4988000基因分型用于预测个体对与ATM失调相关病症的治疗的反应的用途。
27.组合物，包含本文所述的NSE阻遏剂和/或NSE激活剂。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述组合物是药学上可接受的制剂。
29.一种治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括鉴定位于相对于人个体基因组的NSE(ATM内含子28中的隐蔽外显子)的3'剪接位点的位置-3处的非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在，其中所述非胸腺嘧啶变体残基rs609261的存在表明所述个体具有功能性-ATM蛋白质缺陷或对功能性ATM蛋白质缺陷易感，
以及向个体施用药剂，其中所述药剂用胸腺嘧啶残基替换所述非胸腺嘧啶变体残基rs609261。
30.一种治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括用胸腺嘧啶残基替换位于相对于人个体基因组的NSE(ATM内含子28中的隐蔽外显子)的3'剪接位点的位置-3处的非胸腺嘧啶变体残基rs609261。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中替换所述非胸腺嘧啶变体残基rs609261包括向所述个体施用药剂，所述药剂被布置成用胸腺嘧啶残基替换所述非胸腺嘧啶变体残基rs609261。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中用于替换所述非胸腺嘧啶残基的所述药剂是基因组编辑分子。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的方法，其中用于替换所述非胸腺嘧啶残基的所述药剂是CRISPR-Cas9或其功能等同物，以及靶向rs609261的RNA分子。
34.一种治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括鉴定人个体基因组的rs4988000处鸟嘌呤变体残基的存在，其中所述rs4988000处的鸟嘌呤变体残基的存在表明所述个体具有功能-ATM蛋白质缺陷或对功能-ATM蛋白质缺陷易感，
以及向所述个体施用药剂，其中所述药剂用腺嘌呤替换rs4988000处的鸟嘌呤变体残基。
35.一种治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括用腺嘌呤残基替换人个体基因组的rs4988000处的鸟嘌呤变体残基或通过将SSO与所述rs4988000处的鸟嘌呤变体残基结合以阻断所述rs4988000处的鸟嘌呤变体残基。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中替换所述rs4988000处的鸟嘌呤变体残基包括向所述个体施用药剂，所述药剂被布置以用腺嘌呤残基替换所述rs4988000处的鸟嘌呤变体残基。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中用于替换所述鸟嘌呤残基的所述药剂为基因组编辑分子。
38.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中用于替换所述鸟嘌呤残基的所述药剂是CRISPR-Cas9或其功能等同物，以及靶向rs4988000的RNA分子。
39.一种筛选对功能性ATM蛋白质缺陷易感的个体或个体群体的方法，其中所述筛选包括确定人个体基因组的rs4988000处鸟嘌呤变体残基的存在，其中所述在rs4988000处鸟嘌呤变体残基的存在表明所述个体(或个体组)具有功能性-ATM蛋白质缺陷或对功能性-ATM蛋白质缺陷易感。
40.一种选择个体或个体群体进行治疗或预防的方法，其中所述个体对于功能性ATM蛋白质缺陷易感，所述方法包括确定人个体基因组的rs4988000处鸟嘌呤变体残基的存在，其中所述在rs4988000处鸟嘌呤变体残基的存在表明所述个体具有功能性ATM蛋白质缺陷或对功能性ATM蛋白质缺陷易感，
以及选择所述个体用增加所述个体中功能性ATM水平的药剂治疗。
41.一种治疗或预防个体中功能性ATM蛋白质缺陷的方法，所述方法包括鉴定人个体基因组的rs4988000处鸟嘌呤变体残基的存在，其中所述rs4988000处鸟嘌呤变体残基的存在表明所述个体具有功能-ATM蛋白质缺陷或对功能-ATM蛋白质缺陷易感，
以及向所述个体施用药剂，其中所述药剂增加功能性-ATM水平。
42.根据权利要求29-33中任一项以及权利要求34-38中任一项所述的方法，其联合将CG单倍型修饰为TA。
43.根据权利要求1和权利要求36的方法，其联合鉴定个体中的CG单倍型，并且任选地根据前述权利要求中任一项治疗或选择待治疗的个体。
44.一种修饰成熟RNA转录物中包含的NSE调节的方法，所述方法包括插入或剔除与所述NSE竞争剪接体组分的所述NSE的上游或下游的一个或多个剪接调控基序，所述一个或多个剪接调控基序包含隐蔽剪接位点或假外显子。
45.一种修饰功能性蛋白质表达调节的方法，其中通过在编码功能性蛋白质的基因的成熟RNA转录物中包含NSE来调节所述功能性蛋白质的表达，所述方法包括插入或剔除与所述NSE竞争剪接体组分的所述NSE的上游或下游的一个或多个剪接调控基序，所述一个或多个剪接调控基序包含隐蔽剪接位点或假外显子。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述一个或多个剪接调控基序的插入或剔除位于ATM内含子28的基因组DNA中。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剪接调控基序的插入引起在成熟RNA转录物中包含的NSE减少。
48.根据权利要求44至46中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剪接调控基序的剔除引起在成熟RNA转录物中包含的NSE增加。
49.根据权利要求44至48中任一项所述的方法，其中所述一个或多个剪接调控基序的插入或剔除包括使用基因组编辑技术，例如CRISPR-Cas9。
50.试剂盒，包含一个或多个用于鉴定rs609261和/或rs4988000变体的寡核苷酸探针。
51.根据权利要求50所述的试剂盒，其中所述一个或多个寡核苷酸探针是用于PCR扩增包含所述rs609261和/或rs4988000变体的核酸区域的引物。
52.载体，包含编码NSE激活剂和/或NSE阻遏剂的核酸。
53.一种筛选能够修饰基因表达调节的药剂的方法，包括：
鉴定限制功能性基因表达的无义介导的RNA衰变转换外显子(NSE)；
鉴定与所述NSE竞争剪接体组分的所述NSE的上游或下游的一个或多个剪接调控基序，所述一个或多个剪接调控基序包含隐蔽剪接位点或假外显子；
用反义多核酸靶向所述一个或多个剪接调控基序，所述反义多核酸包含通过沃森-克里克碱基配对与所述一个或多个剪接调控基序的剪接调控基序杂交的序列；和
确定在所述基因的成熟RNA转录物中包含的所述NSE是否增加或减少。
54.一种调节基因表达的方法，包括提供与剪接调控基序结合的药剂，所述剪接调控基序例如隐蔽剪接位点或假外显子，其与无义介导的RNA衰变转换外显子(NSE)竞争剪接体组分。
55.药剂，其结合基因剪接调控基序，例如隐蔽剪接位点或假外显子，所述基因剪接调控基序与无义介导的RNA衰变转换外显子(NSE)竞争剪接体组分，其中所述基因剪接调控基序控制所述基因的成熟RNA转录物中包含的NSE。
56.基本上如本文描述的方法、用途、组合物、载体或药剂，任选地参考附图。
57.一种调节蛋白质表达的方法，包括：
a)使分离的多核酸聚合物与个体的靶细胞接触；
b)将所述接触的多核苷酸聚合物与预处理的mRNA转录物上的目标基序杂交，其中所述接触的多核苷酸聚合物与所述目标基序的杂交促进或抑制无义介导的RNA衰变转换外显子(NSE)的激活；
c)加工所述预处理的mRNA转录物的mRNA转录物，其中所述NSE在所述mRNA转录物中存在或不存在；和
d)翻译步骤c)的所述加工的mRNA转录物，其中所述NSE的存在或不存在调节蛋白质的表达。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述蛋白质由所述加工的mRNA转录物表达。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述NSE的存在下调蛋白质的表达。
60.根据权利要求57所述的方法，其中所述NSE的不存在上调蛋白质的表达。
61.根据权利要求57所述的方法，其中所述多核酸聚合物与ATM内含子28内的基序杂交。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述基序是与所述NSE竞争剪接体组分的剪接调控基序。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述剪接调控基序包含隐蔽剪接位点或假外显子。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述假外显子是位于所述前体mRNA转录物的ATM内含子28中的NSE的3'处的24个核苷酸的假外显子。
65.根据权利要求62所述的方法，其中所述基序是U2AF65结合位点。
66.根据权利要求62所述的方法，其中所述基序是转座元件内、转座元件上游或转座元件下游的基序。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述转座元件是Alu或MER51。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述分离的多核酸聚合物与Alu内的目标基序杂交。
69.根据权利要求67所述的方法，其中所述分离的多核酸聚合物与Alu的上游或下游的目标基序杂交。
70.根据权利要求67所述的方法，其中所述分离的多核酸聚合物与MER51的下游的目标基序杂交。
71.根据权利要求57-70中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物的长度为约10至约50个核苷酸。
72.根据权利要求57-71中任一项所述的方法，其中所述分离的多核苷酸聚合物包含与选自SEQ ID NO：18-52的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。
73.一种调节蛋白质表达的方法，包括：
a)使分离的多核酸聚合物与个体的靶细胞接触；
b)使所述接触的多核苷酸聚合物与转座元件内的目标基序杂交，其中所述接触的多核苷酸聚合物与所述目标基序的杂交促进或抑制无义介导的RNA衰变转换外显子(NSE)的激活；
c)加工所述预处理的mRNA转录物的mRNA转录物，其中所述NSE在所述mRNA转录物中存在或不存在；和
d)翻译步骤c)的所述加工的mRNA转录物，其中所述NSE的存在或不存在调节蛋白质的表达。
74.一种调节蛋白质表达的方法，包括：
a)使分离的多核酸聚合物与个体的靶细胞接触；
b)将所述接触的多核酸聚合物与转座元件的上游或下游的目标基序杂交，其中所述接触的多核苷酸聚合物与所述目标基序的杂交促进或抑制无义介导的RNA衰变转换外显子(NSE)的激活；
c)加工所述预处理的mRNA转录物的mRNA转录物，其中所述NSE在所述mRNA转录物中存在或不存在；和
d)翻译步骤c)的所述加工的mRNA转录物，其中所述NSE的存在或不存在调节蛋白质的表达。
75.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述蛋白质由所述加工的mRNA转录物表达。
76.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述NSE的存在下调蛋白质的表达。
77.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述NSE的不存在上调蛋白质的表达。
78.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述转座元件是Alu或MER51。
79.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述分离的多核酸聚合物包含与选自SEQID NO：18-52的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。
80.根据权利要求73、74或79中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物的长度为约10至约50个核苷酸。
81.根据权利要求73所述的方法，其中所述分离的多核酸聚合物与Alu内的目标基序杂交。
82.根据权利要求74所述的方法，其中所述分离的多核酸聚合物与Alu的上游或下游的目标基序杂交。
83.根据权利要求74所述的方法，其中所述分离的多核酸聚合物与MER51的下游的目标基序杂交。
84.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述NSE的激活进一步诱导外显子跳过。
85.根据权利要求73、74或84中任一项所述的方法，其中所述NSE位于内含子28中。
86.根据权利要求73、74、84或85中任一项所述的方法，其中所述NSE调节ATM蛋白质的表达。
87.一种治疗或预防有需要的个体中与ATM表达失调相关的疾病或病症的方法，所述方法包括：
给所述个体施用药物组合物，所述药物组合物包含：
(i)无义介导的RNA衰变转换外显子(NSE)-激活剂，其与预处理的mRNA转录物相互作用以促进NSE被包含在加工的mRNA转录物中；和
(ii)药学上可接受的赋形剂和/或递送载体；
其中通过施用所述NSE激活剂在所述个体中治疗或预防所述与ATM表达失调相关的疾病或病症。
88.一种治疗或预防有需要的个体中与功能性ATM蛋白质缺陷相关的疾病或病症的方法，所述方法包括：
给所述个体施用药物组合物，所述药物组合物包含：
(i)无义介导的RNA衰变转换外显子(NSE)-阻遏剂，其与预处理的mRNA转录物相互作用以促进NSE不被包含在加工的mRNA转录物中；和
(ii)药学上可接受的赋形剂和/或递送载体；
其中通过施用所述NSE阻遏剂在所述个体中治疗或预防所述与功能性ATM蛋白质缺陷相关的疾病或病症。
89.根据权利要求87所述的方法，其中所述NSE激活剂是分离的多核酸聚合物。
90.根据权利要求88所述的方法，其中所述NSE阻遏剂是分离的多核酸聚合物。
91.根据权利要求89或90所述的方法，其中所述多核酸聚合物与ATM内含子28内的基序杂交。
92.根据权利要求89所述的方法，其中所述多核酸聚合物与剪接调控基序杂交，所述剪接调控基序与所述NSE竞争剪接体组分。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述剪接调控基序包含隐蔽剪接位点或假外显子。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述假外显子是位于所述前体mRNA转录物的ATM内含子28中的NSE的3'处的24个核苷酸的假外显子。
95.根据权利要求89所述的方法，其中所述多核酸聚合物与U2AF65结合位点杂交。
96.根据权利要求89或90所述的方法，其中所述多核酸聚合物与转座元件内、转座元件上游或转座元件下游的基序杂交。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述转座元件是Alu或MER51。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述分离的多核酸聚合物与Alu内的目标基序杂交。
99.根据权利要求97所述的方法，其中所述分离的多核酸聚合物与Alu的上游或下游的目标基序杂交。
100.根据权利要求97所述的方法，其中所述分离的多核酸聚合物与MER51的下游的目标基序杂交。
101.根据权利要求89-100中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物的长度为约10至约50个核苷酸。
102.根据权利要求89-101中任一项所述的方法，其中所述分离的多核酸聚合物包含与选自SEQ ID NO：18-52的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。
103.根据权利要求87所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
104.一种治疗或预防有需要的个体中疾病或病症的方法，所述方法包括：
向所述个体施用药物组合物，所述药物组合物包含：
(i)无义介导的RNA衰变转换外显子(NSE)-激活剂，其与预处理的mRNA转录物相互作用以促进NSE被包含在加工的mRNA转录物中；和
(ii)药学上可接受的赋形剂和/或递送载体；
其中通过施用所述NSE激活剂在个体中治疗或预防所述疾病或病症。
105.一种治疗或预防有需要的个体中疾病或病症的方法，所述方法包括：
向所述个体施用药物组合物，所述药物组合物包含：
(i)无义介导的RNA衰变转换外显子(NSE)-阻遏剂，其与预处理的mRNA转录物相互作用以促进NSE不被包含在加工的mRNA转录物中；和
(ii)药学上可接受的赋形剂和/或递送载体；
其中通过施用所述NSE-阻遏剂在所述个体中治疗或预防所述疾病或病症。
106.根据权利要求104所述的方法，其中所述NSE激活剂是分离的多核酸聚合物。
107.根据权利要求105所述的方法，其中所述NSE阻遏剂是分离的多核酸聚合物。
108.根据权利要求106或107所述的方法，其中所述多核酸聚合物与ATM内含子28内的基序杂交。
109.根据权利要求106所述的方法，其中所述多核酸聚合物与剪接调控基序杂交，所述剪接调控基序与所述NSE竞争剪接体组分。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述剪接调控基序包含隐蔽剪接位点或假外显子。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述假外显子是位于所述前体mRNA转录物的ATM内含子28中的NSE的3'处的24个核苷酸的假外显子。
112.根据权利要求108所述的方法，其中所述多核酸聚合物与U2AF65结合位点杂交。
113.根据权利要求106或107所述的方法，其中所述多核酸聚合物与转座元件内、转座元件上游或转座元件下游的基序杂交。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述转座元件是Alu或MER51。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述分离的多核酸聚合物与Alu内的目标基序杂交。
116.根据权利要求114所述的方法，其中所述分离的多核酸聚合物与Alu的上游或下游的目标基序杂交。
117.根据权利要求114所述的方法，其中所述分离的多核酸聚合物与MER51的下游的目标基序杂交。
118.根据权利要求104-117中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物的长度为约10至约50个核苷酸。
119.根据权利要求104-118中任一项所述的方法，其中所述分离的多核苷酸聚合物包含与选自SEQ ID NO：18-52的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。
120.根据权利要求104所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
121.根据权利要求104所述的方法，其中所述疾病或病症是与ATM表达失调相关的疾病或病症。
122.根据权利要求105所述的方法，其中所述疾病或病症是与功能性ATM蛋白质缺陷相关的疾病或病症。
123.根据权利要求57-122中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物在核苷部分、磷酸酯部分、5'末端、3'末端或其组合处被修饰。
124.根据权利要求57-123中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物包含人工核苷酸。
125.根据权利要求124所述的方法，其中人工核苷酸选自2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨丙基、2'-脱氧、T-脱氧-2'-氟、2'-O-氨丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲氨基丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)、2'-O-N-甲基乙酰胺基(2'-O-NMA)、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸和2'-氟N3-P5'-亚磷酰胺。
126.根据权利要求87、88、104或105所述的方法，其中所述递送载体包含基于纳米颗粒的递送载体。
127.一种调节蛋白质表达的方法，包括：
a)使分离的多核酸聚合物与个体的靶细胞接触；
b)使所述接触的多核苷酸聚合物与转座元件内的目标基序杂交，其中所述接触的多核酸聚合物与所述目标基序的杂交促进或抑制替代性剪接位点的激活；
c)加工所述预处理的mRNA转录物的mRNA转录物，其中所述替代性剪接位点在所述mRNA转录物中存在或不存在；和
d)翻译步骤c)的所述加工的mRNA转录物，其中所述替代性剪接位点的存在或不存在调节蛋白质的表达。
128.一种调节蛋白质表达的方法，包括：
a)使分离的多核酸聚合物与个体的靶细胞接触；
b)使所述接触的多核酸聚合物与转座元件的上游或下游的目标基序杂交，其中所述接触的多核苷酸聚合物与目标基序的杂交促进或抑制替代性剪接位点的激活；
c)加工所述预处理的mRNA转录物的mRNA转录物，其中所述替代性剪接位点在mRNA转录物中存在或不存在；和
d)翻译步骤c)的所述加工的mRNA转录物，其中所述替代性剪接位点的存在或不存在调节蛋白质的表达。
129.根据权利要求127或128所述的方法，其中所述转座元件位于所述预处理的mRNA转录物上。
130.一种调节蛋白质表达的方法，包括：
a)使分离的多核酸聚合物与个体的靶细胞接触；
b)使所述接触的多核酸聚合物与预处理的mRNA转录物上的目标基序杂交，其中所述接触的多核酸聚合物与目标基序的杂交促进或抑制替代性剪接位点的激活；
c)加工所述预处理的mRNA转录物的mRNA转录物，其中所述替代性剪接位点在所述mRNA转录物中存在或不存在；和
d)翻译步骤c)的所述加工的mRNA转录物，其中所述替代性剪接位点的存在或不存在调节蛋白质的表达。
131.根据权利要求130所述的方法，其中所述蛋白质由所述加工的mRNA转录物表达。
132.根据权利要求130所述的方法，其中所述NSE的存在下调蛋白质的表达。
133.根据权利要求130所述的方法，其中所述NSE的不存在上调蛋白质的表达。
134.根据权利要求130所述的方法，其中所述多核酸聚合物与ATM内含子28内的基序杂交。
135.根据权利要求134所述的方法，其中所述基序是与NSE竞争剪接体组分的剪接调控基序。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述剪接调控基序包含隐蔽剪接位点或假外显子。
137.根据权利要求136所述的方法，其中所述假外显子是位于所述前体mRNA转录物的ATM内含子28中的NSE的3'处的24个核苷酸的假外显子。
138.根据权利要求134所述的方法，其中所述基序是U2AF65结合位点。
139.根据权利要求134所述的方法，其中所述基序是转座元件内、转座元件上游或转座元件下游的基序。
140.根据权利要求139所述的方法，其中所述转座元件是Alu或MER51。
141.根据权利要求140所述的方法，其中所述分离的多核酸聚合物与Alu内的目标基序杂交。
142.根据权利要求140所述的方法，其中所述分离的多核酸聚合物与Alu的上游或下游的目标基序杂交。
143.根据权利要求140所述的方法，其中所述分离的多核酸聚合物与MER51的下游的目标基序杂交。
144.根据权利要求130-143中任一项所述的方法，其中所述多核酸聚合物的长度为约10至约50个核苷酸。
145.根据权利要求130-144中任一项所述的方法，其中所述分离的多核酸聚合物包含与选自SEQ ID NO：18-52的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。
146.一种药物组合物，其包含：
a)无义介导的RNA衰变转换外显子(NSE)-激活剂，其与预处理的mRNA转录物相互作用以促进NSE包含在加工的mRNA转录物中，或无义介导的RNA衰变转换外显子(NSE)-阻遏剂，其与预处理的mRNA转录物相互作用以促进NSE不包含在加工的mRNA转录物；和
b)药学上可接受的赋形剂和/或递送载体。
147.根据权利要求146所述的药物组合物，其中所述NSE激活剂是分离的多核酸聚合物。
148.根据权利要求147所述的药物组合物，其中所述NSE阻遏剂是分离的多核酸聚合物。
149.权利要求147或148的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与ATM内含子28内的基序杂交。
150.根据权利要求147所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与剪接调控基序杂交，所述剪接调控基序与所述NSE竞争剪接体组分。
151.根据权利要求150所述的药物组合物，其中所述剪接调控基序包含隐蔽剪接位点或假外显子。
152.根据权利要求151所述的药物组合物，其中所述假外显子是位于所述前体mRNA转录物的ATM内含子28中NSE 3'处的24个核苷酸的假外显子。
153.根据权利要求150所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物与U2AF65结合位点杂交。
154.根据权利要求147或148所述的药物组合物，其中所述多聚核酸聚合物与转座元件内、转座元件上游或转座元件下游的基序杂交。
155.根据权利要求154所述的药物组合物，其中所述转座元件是Alu或MER51。
156.根据权利要求154所述的药物组合物，其中所述分离的多聚核酸聚合物与Alu内的目标基序杂交。
157.根据权利要求154所述的药物组合物，其中所述分离的多核苷酸聚合物与Alu的上游或下游的目标基序杂交。
158.根据权利要求154所述的药物组合物，其中所述分离的多聚核酸聚合物与MER51的下游的目标基序杂交。
159.根据权利要求146-158中任一项所述的药物组合物，其中所述多核酸聚合物的长度为约10至约50个核苷酸。
160.根据权利要求146-159中任一项所述的药物组合物，其中所述分离的多核酸聚合物包含与选自SEQ ID NO：18-52的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。
161.一种细胞，其包含权利要求146-160中任一项所述的药物组合物。
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