ES2903394T3 - Composiciones para el tratamiento de la retinitis pigmentosa 13 - Google Patents

Composiciones para el tratamiento de la retinitis pigmentosa 13

Info

Publication number
ES2903394T3
ES2903394T3 ES16876606T ES16876606T ES2903394T3 ES 2903394 T3 ES2903394 T3 ES 2903394T3 ES 16876606 T ES16876606 T ES 16876606T ES 16876606 T ES16876606 T ES 16876606T ES 2903394 T3 ES2903394 T3 ES 2903394T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
mrna
protein
cases
prpf8
prpf3
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16876606T
Other languages
English (en)
Inventor
Isabel Aznarez
Huw M Nash
Adrian Krainer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cold Spring Harbor Laboratory
Stoke Therapeutics Inc
Original Assignee
Cold Spring Harbor Laboratory
Stoke Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cold Spring Harbor Laboratory, Stoke Therapeutics Inc filed Critical Cold Spring Harbor Laboratory
Application granted granted Critical
Publication of ES2903394T3 publication Critical patent/ES2903394T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un oligómero antisentido (ASO) o un vector viral que codifica un ASO, en donde el ASO comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID números: 351-353, 355, 357-360, 404, 9 y 410.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones para el tratamiento de la retinitis pigmentosa 13
La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden oligonucleótidos antisentido (ASO) y a composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de la retinitis pigmentosa 13 (RP13).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La retinitis pigmentosa (RP) describe un grupo de enfermedades que tienen fenotipos clínicos similares y están asociadas con causas genéticamente heterogéneas. La RP se manifiesta con frecuencia como una pérdida de la visión nocturna y puede progresar hasta ceguera periférica, lo que resulta en una visión de túnel. A medida que avanza el trastorno, los sujetos pueden perder una parte significativa de sus fotorreceptores, antes de experimentar pérdida de agudeza visual y, finalmente, pueden experimentar ceguera completa. Los genes PRPF3, PRPF8, PRPF31 y PAP1 asociados a RP están implicados en el ensamblaje de espliceosomas. Aunque se han estudiado extensamente las propiedades funcionales de varios genes asociados a RP, las correlaciones genotipo-fenotipo no son comprendidas completamente. Sin embargo, se sabe que las mutaciones que causan enfermedades en los genes PRPF3, PRPF8, PRPF31 y PAP1 tienen un patrón dominante de herencia (Berger et al., 2010, Progress in Retinal Eye Research 29, 335-375).
RESUMEN
La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden ASOs como se establece en las reivindicaciones, y a composiciones farmacéuticas para uso en el tratamiento de la retinitis pigmentosa, como se establece en las reivindicaciones. Otro material descrito en el presente documento está para ayudar al experto en la comprensión y la práctica de la invención. Para evitar dudas, se observa que la presente invención en el presente documento, no se extiende a métodos de tratamiento del cuerpo humano. También para evitar dudas, se observa que la presente invención no se extiende al uso de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la retinitis pigmentosa 18 (RP18). En el presente documento se divulgan métodos para tratar la retinitis pigmentosa 18 (RP18) o la retinitis pigmentosa 13 (RP13) en un sujeto que lo necesita, aumentando la expresión de una proteína objetivo o ARN funcional por las células del sujeto, en donde las células tienen un pre-mARN que contiene intrón retenido (pre-mARN con RIC), comprendiendo el pre-mARN con RIC un intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de empalme 5', un exón que flanquea el sitio de empalme 3', y en donde el pre-mARN con RIC codifica la proteína objetivo o ARN funcional, comprendiendo el método la puesta en contacto de las células del sujeto con un oligómero antisentido (ASO) complementario a una porción dirigida del pre-ARN de RIC que codifica la proteína objetivo o ARN funcional, mediante el cual el intrón retenido se empalma constitutivamente al RIC pre-ARN que codifica la proteína objetivo o ARN funcional, aumentando así el nivel de ARNm que codifica la proteína objetivo o ARN funcional, y aumentando la expresión de la proteína objetivo o ARN funcional en las células del sujeto.
También se divulgan en este documento métodos para aumentar la expresión de una proteína objetivo, en donde la proteína objetivo es PRPF3 o PRPF8, por células que tienen un pre-mARN que contiene intrón retenido (pre-mARN con RIC), comprendiendo el pre-mARN con RIC un intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de empalme 5' del intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de empalme 3' del intrón retenido, y en donde el pre-ARNm con RIC codifica la proteína PRPF3 o PRPF8, comprendiendo el método la puesta en contacto de las células con un oligómero antisentido (ASO) complementario a una porción dirigida del pre-ARNm con RIC que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8, por lo que el intrón retenido se empalma constitutivamente del pre-ARNm con RIC que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8, aumentando así el nivel de ARNm que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8, y aumentando la expresión de la proteína PRPF3 o PRPF8 en las células.
En algunos casos de cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, cuando el método es un método para tratar RP18, la proteína objetivo es PRPF3. En algunos casos de cualquiera de los métodos antes mencionados, cuando el método es un método para el tratamiento de RP13, la proteína objetivo es PRPF8. En algunos casos, la proteína objetivo o el ARN funcional es una proteína compensadora o un ARN funcional compensador que aumenta o reemplaza funcionalmente una proteína objetivo o ARN funcional que es deficiente en cantidad o actividad en el sujeto. En algunos casos, las células están en o de un sujeto que tiene una afección causada por una cantidad o actividad deficiente de la proteína PRPF3 o PRPF8.
En algunos casos de cualquiera de los métodos antes mencionados, la cantidad deficiente de la proteína objetivo es causada por la haploinsuficiencia de la proteína objetivo, en donde el sujeto tiene un primer alelo que codifica una proteína objetivo funcional, y un segundo alelo del cual la proteína objetivo no es producida, o un segundo alelo que codifica una proteína objetivo no funcional, y en donde el oligómero antisentido se une a una porción dirigida de un pre-ARNm con RIC transcrito a partir del primer alelo. En algunos casos, el sujeto tiene una afección causada por un trastorno resultante de una deficiencia en la cantidad o función de la proteína objetivo, en donde el sujeto tiene (a) un primer alelo mutante a partir del cual (i) la proteína objetivo es producida en un nivel reducido en comparación con la producción a partir de un alelo de tipo silvestre, (ii) la proteína objetivo es producida en una forma que tiene una función reducida en comparación con una proteína de tipo silvestre equivalente, o (iii) la proteína objetivo no es producida, y (b) un segundo alelo mutante a partir del cual (i) la proteína objetivo es producida a un nivel reducido en comparación con la producción de un alelo de tipo silvestre, (ii) la proteína objetivo es producida en una forma que tiene una función reducida en comparación con una proteína de tipo silvestre equivalente , o (iii) la proteína objetivo no es producida, y en donde cuando el sujeto tiene un primer alelo mutante a(iii), el segundo alelo mutante es b(i) o b(ii), y en donde cuando el sujeto tiene un segundo alelo mutante alelo mutante b(iii), el primer alelo mutante es a(i) o a(ii), y en donde el RIC el pre-ARNm es transcrito a partir del primer alelo mutante que es a(i) o a(ii), y/o del segundo alelo que es b(i) o b(ii). En algunos casos, la proteína objetivo es producida en una forma que tiene una función reducida en comparación con la proteína equivalente de tipo silvestre. En algunos casos, la proteína objetivo es producida en una forma que es completamente funcional en comparación con la proteína equivalente de tipo silvestre.
En algunos casos de cualquiera de los métodos antes mencionados, la porción objetivo del pre-ARNm con RIC está en el intrón retenido dentro de la región 6 en relación con el sitio de empalme 5' del intrón retenido a -16 en relación con el sitio de empalme 3' del intrón retenido. En algunos casos, la porción objetivo del pre-ARNm con RIC está en el intrón retenido dentro de la región 498 respecto al sitio de empalme 5' del intrón retenido a -496 respecto al sitio de empalme 3' del intrón retenido. En algunos casos, la porción objetivo del pre-ARNm con RIC está en el intrón retenido dentro de la región 498 respecto al sitio de empalme 5' del intrón retenido a -496 respecto al sitio de empalme 3' del intrón retenido.
En algunos casos de cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, la proteína objetivo es PRPF3. En algunos casos, la porción objetivo del pre-ARNm con RIC comprende una secuencia que es al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a una cualquiera de las SEQ ID NO 5-323. En algunos casos, la porción objetivo del pre-ARNm con RIC comprende una secuencia con al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con una región que comprende al menos 8 ácidos nucleicos contiguos de SEQ ID NO 447 o SEQ ID NO 446. En algunos casos, el ASO comprende una secuencia con al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO 5-323. En algunos casos, el pre-ARNm con RIC comprende una secuencia con al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 3. En algunos casos, el pre-ARNm con RIC está codificado por una secuencia genética con al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 1.
En algunos casos, la proteína objetivo es PRPF8. En algunos casos, la porción objetivo del pre-ARNm con RIC está en el intrón retenido dentro de la región 156 en relación con el sitio de empalme 5' del intrón retenido a -156 respecto al sitio de empalme 3' del intrón retenido. En algunos casos, la porción objetivo del pre-ARNm con RIC comprende una secuencia que es al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a una cualquiera de las SEQ ID NO 324-445. En algunos casos, la porción objetivo del pre-ARNm con RIC comprende una secuencia con al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con una región que comprende al menos 8 ácidos nucleicos contiguos de SEQ ID NO 448. En algunos casos, el ASO comprende una secuencia con al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO 234-445. En algunos casos, el pre-ARNm con RIC comprende una secuencia con al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 4. En algunos casos, el pre-ARNm con RIC está codificado por una secuencia genética con al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 2.
En algunos casos de cualquiera de los métodos antes mencionados, la porción objetivo del pre-ARNm con RIC está en el intrón retenido dentro de: (a) la región 6 a 100 respecto al sitio de empalme 5' del intrón retenido; o (b) la región -16 a -100 respecto al sitio de empalme 3' del intrón retenido. En algunos casos, el oligómero antisentido se dirige a una porción del pre-ARNm con RIC que se encuentra dentro de la región de aproximadamente 100 nucleótidos aguas abajo del sitio de empalme 5' del al menos un intrón retenido, hasta aproximadamente 100 nucleótidos aguas arriba del sitio de empalme 3' del al menos un intrón retenido. En algunos casos, la porción objetivo del pre-ARNm con RIC es el intrón retenido dentro de: (a) la región 2e a -4e en el exón que flanquea el sitio de empalme 5' del intrón retenido; o (b) la región 2e a - 4e en el exón que flanquea el sitio de empalme 3' del intrón retenido.
En algunos casos de uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, el oligómero antisentido no aumenta la cantidad de la proteína objetivo o el ARN funcional modulando el empalme alternativo de pre-ARNm transcrito a partir de un gen que codifica el ARN funcional o la proteína objetivo. En algunos casos, el oligómero antisentido no aumenta la cantidad de proteína objetivo o ARN funcional modulando el empalme aberrante resultante de la mutación del gen que codifica la proteína objetivo o el ARN funcional. En algunos casos, el pre-mARN con RIC es producido por empalme parcial de un pre-mARN de longitud completa o empalme parcial de un pre-mARN de tipo silvestre. En algunos casos, el ARNm que codifica la proteína objetivo o el ARN funcional es un ARNm maduro de longitud completa o un ARNm maduro de tipo silvestre. En algunos casos, la proteína objetivo producida es una proteína de longitud completa o una proteína de tipo silvestre. En algunos casos, la cantidad total de ARNm que codifica la proteína objetivo o a Rn funcional producido en la célula en contacto con el oligómero antisentido aumenta aproximadamente 1.1 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 1.5 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 10 veces. veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 4 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 1.1 a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 1.1 a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 1.1 a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 1.1 a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 1.1 a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 4 a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 4 a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 4 a aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 1.1 veces, al menos aproximadamente 1.5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2.5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 3.5 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, o al menos aproximadamente 10 veces, en comparación con la cantidad total de ARNm que codifica la proteína objetivo o el ARN funcional producido en una célula de control. En algunos casos, la cantidad total de proteína objetivo producida por la célula en contacto con el oligómero antisentido aumenta aproximadamente 1.1 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 1.5 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 4 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 1.1 a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 1.1 a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 1.1 a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 1.1 a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 1.1 a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 4 a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 4 a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 4 a aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 1.1 veces, al menos aproximadamente 1.5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2.5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 3.5 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, o al menos aproximadamente 10 veces, en comparación con la cantidad total de proteína objetivo producida por una célula de control.
En algunos casos de cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, el oligómero antisentido comprende una modificación de la cadena principal que comprende un enlace fosforotioato o un enlace fosforodiamidato. En algunos casos, el oligómero antisentido comprende un fosforodiamidato morfolino, un ácido nucleico bloqueado, un ácido nucleico peptídico, un fragmento 2'-O-metilo, 2'-fluoro o 2'-O-metoxietilo. En algunos casos, el oligómero antisentido compende al menos un fragmento de azúcar modificado. En algunos casos, cada fragmento de azúcar es un fragmento de azúcar modificado. En algunos casos, el oligómero antisentido consiste en 8 a 50 nucleobases, 8 a 40 nucleobases, 8 a 35 nucleobases, 8 a 30 nucleobases, 8 a 25 nucleobases, 8 a 20 nucleobases, 8 a 15 nucleobases, 9 a 50 nucleobases, 9 a 40 nucleobases, 9 a 35 nucleobases, 9 a 30 nucleobases, 9 a 25 nucleobases, 9 a 20 nucleobases, 9 a 15 nucleobases, 10 a 50 nucleobases, 10 a 40 nucleobases, 10 a 35 nucleobases, 10 a 30 nucleobases, 10 a 25 nucleobases, 10 a 20 nucleobases, 10 a 15 nucleobases, 11 a 50 nucleobases, 11 a 40 nucleobases, 11 a 35 nucleobases, 11 a 30 nucleobases, 11 a 25 nucleobases, 11 a 20 nucleobases, 11 a 15 nucleobases, 12 a 50 nucleobases, 12 a 40 nucleobases, 12 a 35 nucleobases, 12 a 30 nucleobases, 12 a 25 nucleobases, 12 a 20 nucleobases o 12 a 15 nucleobases. En algunos casos, el oligómero antisentido es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 %, complementario a la porción objetivo del pre-ARNm con RIC que codifica la proteína.
En algunos casos de cualquiera de los métodos antes mencionados, la célula comprende una población de los premARN con RIC transcripciones del gen que codifica la proteína objetivo o el ARN funcional, en donde la población de los pre-mARN con RIC comprende dos o más intrones retenidos, y en donde el oligómero antisentido se une al intrón retenido más abundante en la población de los pre-ARNm con RIC. En algunos casos, la unión del oligómero antisentido al intrón retenido más abundante induce el empalme de los dos o más intrones retenidos de la población de los pre-ARNm con RIC para producir ARNm que codifica la proteína objetivo o ARN funcional. En algunos casos, la célula comprende una población de los pre-mARN con RIC transcripciones a partir del gen que codifica la proteína objetivo o el ARN funcional, en donde la población de los pre-mARN con RIC comprende dos o más intrones retenidos, y en donde el oligómero antisentido se une al segundo intrón retenido más abundante en la población de los pre-ARNm con RIC. En algunos casos, la unión del oligómero antisentido al segundo intrón retenido más abundante induce el empalme de los dos o más intrones retenidos de la población de los pre-ARNm con RIC para producir ARNm que codifica la proteína objetivo o ARN funcional. En algunos casos, la afección es una enfermedad o trastorno. En algunos casos, la enfermedad o trastorno es RP18 o RP13. En algunos casos, la proteína objetivo y el pre-ARNm con RIC están codificados por el gen PRPF3 o el gen PRPF8. En algunos casos, el método comprende además la evaluación de la expresión de proteína. En algunos casos, el sujeto es un ser humano. En algunos casos, el sujeto es un animal no humano. En algunos casos, el sujeto es un feto, un embrión o un niño. En algunos casos, las células están ex vivo. En algunos casos, el oligómero antisentido es administrado mediante inyección intravítrea, inyección subretiniana, aplicación tópica, implante, inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, inyección subcutánea o inyección intravenosa del sujeto. En algunos casos, los nucleótidos 9 en -3e a -1e del exón que flanquea el sitio de empalme 5' y 1 a 6 del intrón retenido, son idénticos a la secuencia de tipo silvestre correspondiente. En algunos casos, los nucleótidos 16 en -15 a -1 del intrón retenido y 1e del exón que flanquea el sitio de empalme 3' son idénticos a la secuencia de tipo silvestre correspondiente.
En el presente documento se divulgan, en algunos casos, oligómeros antisentido como se usan en los métodos descritos en el presente documento. En algunos casos, el oligómero antisentido comprende una secuencia con al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO 5-445.
También se divulgan en el presente documento, en algunos casos, composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los oligómeros antisentido mencionados anteriormente y un excipiente.
En el presente documento, en algunos casos, se divulgan métodos para el tratamiento de un sujeto que lo necesita, mediante la administración de cualquiera de las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente mediante inyección intravítrea, inyección subretiniana, aplicación tópica, implante, inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, inyección subcutánea o inyección intravenosa.
En el presente documento, en algunos casos, se divulgan composiciones que comprenden un oligómero antisentido para su uso en un método para el aumento de la expresión de una proteína objetivo o un ARN funcional por las células para el tratamiento de RP18 o RP13 en un sujeto que lo necesita, asociado con una proteína deficiente o ARN funcional deficiente, en donde la proteína deficiente o el ARN funcional deficiente es deficiente en cantidad o actividad en el sujeto, en donde el oligómero antisentido mejora el empalme constitutivo de un pre-mARN que contiene intrón retenido (pre-mARN con RIC) que codifica la proteína objetivo o el ARN funcional, en donde la proteína objetivo es: la proteína deficiente; o una proteína compensadora que aumenta o reemplaza funcionalmente a la proteína deficiente en el sujeto; y en donde la función del ARN es: el ARN deficiente; o un ARN funcional compensador que aumenta o reemplaza funcionalmente el ARN funcional deficiente en el sujeto; en donde el pre-ARNm con RIC comprende un intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de empalme 5' y un exón que flanquea el sitio de empalme 3', y en donde el intrón retenido se empalma al pre-ARNm con RIC que codifica la proteína objetivo o el ARN funcional, aumentando así la producción o actividad de la proteína objetivo o el ARN funcional en el sujeto.
En el presente documento, en algunos casos, se divulgan composiciones que comprenden un oligómero antisentido para uso en un método de tratamiento de una afección asociada con la proteína PRPF3 o PRPF8 en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método la etapa de aumento de la expresión de la proteína PRPF3 o PRPF8 por las células del sujeto, en donde las células tienen un pre-mARN que contiene intrón retenido (pre-mARN con RIC) que comprende un intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de empalme 5' del intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de empalme 3' del intrón retenido, y en donde el pre-ARNm con RIC codifica la proteína PRPF3 o PRpF8, comprendiendo el método la puesta en contacto de las células con el oligómero antisentido, mediante el cual el intrón retenido se empalma constitutivamente con las transcripciones de pre-ARNm con RIC que codifican la proteína PRPF3 o PRPF8, aumentando con ello el nivel de ARNm que codifica la proteína PRPF3 o PRpF8, y aumentando la expresión de la proteína PRPF3 o PRPF8, en las células del sujeto. En algunos casos, la proteína objetivo PRPF3 está codificada por la secuencia en NM_004698 o PRPF8 o codificada por la secuencia en NM_006445. En algunos casos, la afección es una enfermedad o trastorno. En algunos casos, la enfermedad o trastorno es RP18 o RP13. En algunos casos, la proteína objetivo y el pre-ARNm con RIC están codificados por el gen PRPF3 o PRPF8. En algunos casos, el oligómero antisentido se dirige a una porción del pre-ARNm con RIC que está en el intrón retenido dentro de la región 6 en relación con el sitio de empalme 5' del intrón retenido a -16 en relación con el sitio de empalme 3' del intrón retenido intrón. En algunos casos, la porción objetivo del pre-ARNm con RIC está en el intrón retenido dentro de la región 498 respecto al sitio de empalme 5' del intrón retenido a -496 respecto al sitio de empalme 3' del intrón retenido. En algunos casos, la proteína objetivo es PRPF3. En algunos casos, la porción objetivo del pre-ARNm con RIC está en el intrón retenido dentro de la región 498 respecto al sitio de empalme 5' del intrón retenido a -496 respecto al sitio de empalme 3' del intrón retenido. En algunos casos, la porción objetivo del pre-ARNm con RIC comprende una secuencia que es al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a cualquiera de las SEQ ID NO 5-323 . En algunos casos, la porción objetivo del pre-ARNm con RIC comprende una secuencia con al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con una región que comprende al menos 8 ácidos nucleicos contiguos de SEQ ID NO 447 o SEQ ID NO 446. En algunos casos, el ASO comprende una secuencia con al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO 5-323. En algunos casos, el pre-ARNm con RIC comprende una secuencia con al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 3. En algunos casos, el pre-ARNm con RIC está codificado por una secuencia genética con al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 1. En algunos casos, la proteína objetivo es PRPF8. En algunos casos, la porción objetivo del pre-ARNm con RIC está en el intrón retenido dentro de la región 156 en relación con el sitio de empalme 5' del intrón retenido a -156 respecto al sitio de empalme 3' del intrón retenido. En algunos casos, la porción objetivo del pre-ARNm con RIC comprende una secuencia que es al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % complementaria a una cualquiera de las SEQ ID NO 324­ 445. En algunos casos, la porción objetivo del pre-ARNm con RIC comprende una secuencia con al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con una región que comprende al menos 8 ácidos nucleicos contiguos de SEQ ID NO 448. En algunos casos, el ASO comprende una secuencia con al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO 234-445. En algunos casos, el pre-ARNm con RIC comprende una secuencia con al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 4. En algunos casos, el pre-ARNm con RIC está codificado por una secuencia genética con al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 2. En algunos casos, el oligómero antisentido se dirige a una porción del pre-ARNm con RIC que se encuentra en el intrón retenido dentro de: (a) la región 6 a 100 respecto al sitio de empalme 5' del intrón retenido; o (b) la región -16 a -100 respecto al sitio de empalme 3' del intrón retenido. En algunos casos, el oligómero antisentido se dirige a una porción del pre-ARNm con RlC que se encuentra dentro de la región aproximadamente 100 nucleótidos aguas abajo del sitio de empalme 5' del al menos un intrón retenido, hasta aproximadamente 100 nucleótidos aguas arriba del sitio de empalme 3' del al menos un intrón retenido. En algunos casos, la porción objetivo del pre-ARNm con RIC se encuentra dentro de: (a) la región 2e a -4e en el exón que flanquea el sitio de empalme 5' del intrón retenido; o (b) la región 2e a -4e en el exón que flanquea el sitio de empalme 3' del intrón retenido.
En algunos casos de cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente, el oligómero antisentido no aumenta la cantidad de proteína objetivo o ARN funcional modulando el empalme alternativo del pre-ARNm transcrito a partir de un gen que codifica la proteína objetivo o ARN funcional. En algunos casos, el oligómero antisentido no aumenta la cantidad de ARN funcional o proteína funcional, modulando el empalme aberrante resultante de la mutación del gen que codifica la proteína objetivo o ARN funcional. En algunos casos, el pre-mARN con RIC fue producido por empalme parcial de un pre-mARN de longitud completa o un pre-mARN de tipo silvestre. En algunos casos, el ARNm que codifica la proteína objetivo o el ARN funcional es un ARNm maduro de longitud completa o un ARNm maduro de tipo silvestre. En algunos casos, la proteína objetivo producida es una proteína de longitud completa o una proteína de tipo silvestre. En algunos casos, el intrón retenido es un intrón limitante de la velocidad. En algunos casos, el intrón retenido es el intrón retenido más abundante en el pre-ARNm con RIC. En algunos casos, el intrón retenido es el segundo intrón retenido más abundante en el pre-ARNm con RIC.
En algunos casos de cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente, el oligómero antisentido comprende una modificación de la cadena principal que comprende un enlace fosforotioato o un enlace fosforodiamidato. En algunos casos, el oligómero antisentido es un oligonucleótido antisentido. En algunos casos, el oligómero antisentido comprende un fosforodiamidato morfolino, un ácido nucleico bloqueado, un ácido nucleico peptídico, un fragmento 2'-O-metilo, 2'-fluoro o 2'-O-metoxietilo. En algunos casos, el oligómero antisentido comprende al menos un fragmento de azúcar modificado. En algunos casos, cada fragmento de azúcar es un fragmento de azúcar modificado. En algunos casos, el oligómero antisentido consiste en 8 a 50 nucleobases, 8 a 40 nucleobases, 8 a 35 nucleobases, 8 a 30 nucleobases, 8 a 25 nucleobases, 8 a 20 nucleobases, 8 a 15 nucleobases, 9 a 50 nucleobases, 9 a 40 nucleobases, 9 a 35 nucleobases, 9 a 30 nucleobases, 9 a 25 nucleobases, 9 a 20 nucleobases, 9 a 15 nucleobases, 10 a 50 nucleobases, 10 a 40 nucleobases, 10 a 35 nucleobases, 10 a 30 nucleobases, 10 a 25 nucleobases, 10 a 20 nucleobases, 10 a 15 nucleobases, 12 a 50 nucleobases, 12 a 40 nucleobases, 12 a 35 nucleobases, 12 a 30 nucleobases, 12 a 25 nucleobases, 12 a 20 nucleobases o 12 a 15 nucleobases. En algunos casos, el oligómero antisentido es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o es 100 % complementario a la porción objetivo del pre-ARNm con RIC que codifica la proteína.
En el presente documento, en algunos casos, se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden el oligómero antisentido de cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente y un excipiente.
En el presente documento, en algunos casos, se divulgan métodos para el tratamiento de un sujeto que lo necesita, mediante la administración de cualquiera de las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente mediante inyección intravítrea, inyección subretiniana, aplicación tópica, implante, inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, inyección subcutánea o inyección intravenosa al sujeto.
En el presente documento, en algunos casos, se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden: un oligómero antisentido que se hibrida a una secuencia objetivo de una transcripción de ARNm de PRPF3 deficiente, en donde la transcripción de ARNm de PRPF3 deficiente comprende un intrón retenido, en donde el oligómero antisentido induce el empalme del intrón retenido de la transcripción de ARNm de PRPF3 deficiente; y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, la transcripción de ARNm de PRPF3 deficiente es una transcripción de pre-ARNm con RIC de PRPF3. En algunos casos, la parte dirigida de la transcripción de pre-ARNm con RIC de PRPF3 está en el intrón retenido dentro de la región 500, respecto al sitio de empalme 5' del intrón retenido a -500 respecto al sitio de empalme 3' del intrón retenido. En algunos casos, la transcripción de pre-ARNm con RIC de PRPF3 está codificado por una secuencia genética con al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia para SEC ID NO: 1. En algunos casos, la transcripción de pre-ARNm con RIC de PRPF3 comprende una secuencia con al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con cualquiera de SEC ID NO: 3-4. En algunos casos, el oligómero antisentido comprende una modificación de la cadena principal que comprende un enlace fosforotioato o un enlace fosforodiamidato. En algunos casos, el oligómero antisentido es un oligonucleótido antisentido. En algunos casos, el oligómero antisentido comprende un fosforodiamidato morfolino, un ácido nucleico bloqueado, un ácido nucleico peptídico, un fragmento 2'-O-metilo, 2'-Fluoro o 2'-O-metoxietilo. En algunos casos, el oligómero antisentido comprende al menos un fragmento de azúcar modificado. En algunos casos, el oligómero antisentido comprende de 8 a 50 nucleobases, 8 a 40 nucleobases, 8 a 35 nucleobases, 8 a 30 nucleobases, 8 a 25 nucleobases, 8 a 20 nucleobases, 8 a 15 nucleobases, 9 a 50 nucleobases, 9 a 40 nucleobases, 9 a 35 nucleobases, 9 a 30 nucleobases, 9 a 25 nucleobases, 9 a 20 nucleobases, 9 a 15 nucleobases, 10 a 50 nucleobases, 10 a 40 nucleobases, 10 a 35 nucleobases, 10 a 30 nucleobases, 10 a 25 nucleobases, 10 a 20 nucleobases, 10 a 15 nucleobases, 11 a 50 nucleobases, 11 a 40 nucleobases, 11 a 35 nucleobases, 11 a 30 nucleobases, 11 a 25 nucleobases, 11 a 20 nucleobases, 11 a 15 nucleobases, 12 a 50 nucleobases, 12 a 40 nucleobases, 12 a 35 nucleobases, 12 a 30 nucleobases, 12 a 25 nucleobases, 12 a 20 nucleobases o 12 a 15 nucleobases. En algunos casos, el oligómero antisentido es al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o es 100 % complementario a una porción objetivo de la transcripción de pre-ARNm con RIC de PRPF3. En algunos casos, la porción objetivo de la transcripción de pre-ARNm con RIC de PRPF3 está dentro de una secuencia seleccionada de las SEC ID NO: 446-447. En algunos casos, el oligómero antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 5-323. En algunos casos, el oligómero antisentido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEQ ID NO: 5-323. En algunos casos, la composición farmacéutica es formulada para inyección intratecal, inyección intracerebroventricular, inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, inyección subcutánea o inyección intravenosa.
En el presente documento, en algunos casos, se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden: un oligómero antisentido que se hibrida a una secuencia objetivo de una transcripción de ARNm de PRPF8 deficiente, en donde la transcripción de ARNm de PRPF8 deficiente comprende un intrón retenido, en donde el oligómero antisentido induce el empalme del intrón retenido de la transcripción de ARNm de PRPF8 deficiente; y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, la transcripción de ARNm de PRPF8 deficiente es una transcripción de pre-ARNm con RIC de PRPF8. En algunos casos, la porción dirigida de la transcripción de pre-ARNm con RIC PRPF8 está en el intrón retenido dentro de la región 500 respecto al sitio de empalme 5' del intrón retenido a -500 respecto al sitio de empalme 3' del intrón retenido. En algunos casos, la transcripción de pre-ARNm con RIC PRPF8 está codificada por una secuencia genética con al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia para SEC ID NO: 2. En algunos casos, la transcripción de pre-ARNm con RIC PRPF8 comprende una secuencia con al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con cualquiera de SEC ID NO: 3-4. En algunos casos, el oligómero antisentido comprende una modificación de la cadena principal que comprende un enlace fosforotioato o un enlace fosforodiamidato. En algunos casos, el oligómero antisentido es un oligonucleótido antisentido. En algunos casos, el oligómero antisentido comprende un fosforodiamidato morfolino, un ácido nucleico bloqueado, un ácido nucleico peptídico, un fragmento 2'-O-metilo, 2'-fluoro o 2'-O-metoxietilo. En algunos casos, el oligómero antisentido comprende al menos un fragmento de azúcar modificado. En algunos casos, el oligómero antisentido comprende de 8 a 50 nucleobases, 8 a 40 nucleobases, 8 a 35 nucleobases, 8 a 30 nucleobases, 8 a 25 nucleobases, 8 a 20 nucleobases, 8 a 15 nucleobases, 9 a 50 nucleobases, 9 a 40 nucleobases, 9 a 35 nucleobases, 9 a 30 nucleobases, 9 a 25 nucleobases, 9 a 20 nucleobases, 9 a 15 nucleobases, 10 a 50 nucleobases, 10 a 40 nucleobases, 10 a 35 nucleobases, 10 a 30 nucleobases, 10 a 25 nucleobases, 10 a 20 nucleobases, 10 a 15 nucleobases, 11 a 50 nucleobases, 11 a 40 nucleobases, 11 a 35 nucleobases, 11 a 30 nucleobases, 11 a 25 nucleobases, 11 a 20 nucleobases, 11 a 15 nucleobases, 12 a 50 nucleobases, 12 a 40 nucleobases, 12 a 35 nucleobases, 12 a 30 nucleobases, 12 a 25 nucleobases, 12 a 20 nucleobases o 12 a 15 nucleobases. En algunos casos, el oligómero antisentido es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o es 100 % complementario a una porción objetivo de la transcripción de pre-ARNm con RIC PRPF8. En algunos casos, la porción objetivo de la transcripción de pre-ARNm con RIC PRPF8 está dentro de una secuencia seleccionada de las SEC ID NO: 448. En algunos casos, el oligómero antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 324-445. En algunos casos, el oligómero antisentido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEQ ID NO: 324-445. En algunos casos, la composición farmacéutica es formulada para inyección intravítrea, inyección subretiniana, aplicación tópica, implante, inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, inyección subcutánea o inyección intravenosa.
En el presente documento, en algunos casos, se divulgan métodos para la inducción del procesamiento de una transcripción de ARNm de PRPF3 deficiente, para facilitar la eliminación de un intrón retenido para producir una transcripción de ARNm de PRPF3 completamente procesada, que codifica una forma funcional de una proteína PRPF3, comprendiendo el método: (a) puesta en contacto de un oligómero antisentido con una célula objetivo de un sujeto; (b) hibridación del oligómero antisentido a la transcripción de ARNm de PRPF3 deficiente, en donde la transcripción de ARNm de PRPF3 deficiente es capaz de codificar la forma funcional de una proteína PRPF3 y comprende al menos un intrón retenido; (c) eliminación del al menos un intrón retenido de la transcripción de ARNm de PRPF3 deficiente, para producir la transcripción de ARNm de PRPF3 completamente procesada, que codifica la forma funcional de la proteína PRPF3; y (d) traducción de la forma funcional de la proteína PRPF3 de la transcripción de ARNm de PRPF3 completamente procesada. En algunos casos, el intrón retenido es un intrón retenido completo. En algunos casos, la transcripción de ARNm de PRPF3 deficiente es una transcripción de pre-ARNm con RIC de PRPF3.
En el presente documento, en algunos casos, se divulgan métodos para el tratamiento de un sujeto que tiene una afección causada por una cantidad o actividad deficiente de la proteína PRPF3, que comprenden la administración al sujeto de un oligómero antisentido, que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 % , 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 5-323.
En el presente documento, en algunos casos, se divulgan métodos para la inducción del procesamiento de una transcripción de ARNm de PRPF8 deficiente, para facilitar la eliminación de un intrón retenido para producir una transcripción de ARNm de PRPF8 completamente procesada, que codifica una forma funcional de una proteína PRPF8, comprendiendo el método: (a) puesta en contacto de un oligómero antisentido con una célula objetivo de un sujeto; (b) hibridación del oligómero antisentido a la transcripción de ARNm de PRPF8 deficiente, en donde la transcripción de ARNm de PRPF8 deficiente es capaz de codificar la forma funcional de una proteína PRPF8, y comprende al menos un intrón retenido; (c) eliminación del al menos un intrón retenido de la transcripción de ARNm de PRPF8 deficiente, para producir la transcripción de ARNm de PRPF8 completamente procesada, que codifica la forma funcional de la proteína PRPF8; y (d) traducción de la forma funcional de la proteína PRPF8 de la transcripción de ARNm de PRPF8 completamente procesada. En algunos casos, el intrón retenido es un intrón retenido completo. En algunos casos, la transcripción de ARNm de PRPF8 deficiente es una transcripción de pre-ARNm con RIC de PRPF8.
En el presente documento, en algunos casos, se divulgan métodos para el tratamiento de un sujeto que tiene una afección causada por una cantidad o actividad deficiente de la proteína PRPF8, que comprenden la administración al sujeto de un oligómero antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 % , 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 324-445.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las características novedosas de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características de la presente divulgación haciendo referencia a los siguientes dibujos ilustrativos.
FIG. 1 ilustra una representación esquemática de una transcripción ejemplar de pre-ARNm que contiene intrón retenido (RIC). La secuencia de consenso del sitio de empalme 5' es indicada con letras subrayadas (las letras son nucleótidos; mayúsculas: parte exónica y minúsculas: parte intrónica) de - 3e a -1e y 1 a 6 (los números marcados con "e" son números exónicos y no etiquetados son intrónicos). La secuencia de consenso del sitio de empalme 3' es indicada con letras subrayadas (las letras son nucleótidos; mayúsculas: parte exónica y minúsculas: parte intrónica) de -15 a -1 y 1e (los números marcados con "e" son exónicos y los números sin marcar son intrónicos ). Las regiones objetivo intrónicas para el cribado de ASO comprenden los nucleótidos 6 respecto al sitio de empalme 5' del intrón retenido (flecha a la izquierda) a -16 respecto al sitio de empalme 3' del intrón retenido (flecha a la derecha). Hay casos en que las regiones objetivo intrónicas para el cribado de ASO comprenden los nucleótidos 6 a 100 en relación con el sitio de empalme 5' del intrón retenido y de -16 a -100 respecto al sitio de empalme 3' del intrón retenido. Las regiones objetivo exónicas comprenden los nucleótidos 2e a -4e en el exón que flanquea el sitio de empalme 5' del intrón retenido y de 2e a -4e en el exón que flanquea el sitio de empalme 3' del intrón retenido. "n" o "N" indican cualquier nucleótido, "y" denota pirimidina. Las secuencias mostradas representan secuencias consenso para sitios de empalme de mamíferos y no es necesario que los intrones y exones individuales coincidan con las secuencias consenso en cada posición.
FIG. 2A ilustra una representación ejemplar del enfoque de Aumento Dirigido de la Producción de Genes nucleares (TANGO). La FIG. 2A muestra una célula dividida en compartimentos nuclear y citoplasmático. En el núcleo, una transcripción de pre-ARNm de un gen objetivo, que consiste en exones (rectángulos) e intrones (líneas de conexión), soporta empalme para generar un ARNm, y este ARNm es exportado al citoplasma y es traducido en la proteína objetivo. Para este gen objetivo, el empalme del intrón 1 es ineficaz y un pre-ARNm que contiene intrón retenido (RIC) se acumula principalmente en el núcleo y, si se exporta al citoplasma, se degrada, lo que conduce a la falta de producción de proteína objetivo.
FIG. 2B ilustra una representación esquemática ejemplar del enfoque de Aumento Dirigido de la Producción de Genes Nucleares (TANGO). La FIG. 2B muestra un ejemplo de la misma célula que en la FIG. 2A, dividida en compartimentos nuclear y citoplasmático. El tratamiento con un oligómero antisentido (ASO) promueve el empalme del intrón 1 y da como resultado un aumento del ARNm, que a su vez se traduce en niveles más altos de proteína objetivo.
FIG. 3 representa la retención de intrones en el gen PRPF3 con detalle del intrón 12. Se muestra la identificación de eventos de retención de intrones en el gen PRPF3, que usa secuenciación de ARN (ARNseq), visualizado en el navegador del genoma UCSC. El panel superior muestra la densidad de lectura correspondiente a la transcripción de PRPF3 expresada en células ARPE-19 (epiteliales de retina) y localizada en la fracción citoplásmica (arriba) o nuclear (abajo). En la parte inferior de este panel, se muestra a escala una representación gráfica del gen PRPF3. La densidad de lectura se muestra como picos. La densidad de lectura más alta corresponde a los exones (cajas negras), mientras no se observan lecturas para la mayoría de los intrones (líneas con puntas de flecha) en ninguna de las fracciones celulares. Se detecta una mayor densidad de lectura para el intrón 12 (indicado por la flecha) en la fracción nuclear, en comparación con la fracción citoplásmica, lo que indica que la eficiencia de empalme del intrón 12 es baja, lo que da como resultado la retención del intrón. El intrón retenido que contiene las transcripciones de pre-ARNm es retenido en el núcleo y no es exportado al citoplasma. En el panel inferior se muestra en detalle la densidad de lectura del intrón 12 en las células epiteliales renales.
FIG. 4 ilustra una representación gráfica del recorrido de ASO realizada por secuencias de direccionamiento de IVS 12 PRPF3inmediatamente aguas abajo del sitio de empalme 5' o aguas arriba del sitio de empalme 3' usando 2'-O-Me ASO, se muestra la cadena principal de PS. Los ASOs fueron diseñados para cubrir estas regiones cambiando 5 nucleótidos a la vez (con la excepción de ASO P3-IVS12 28). La estructura exón-intrón de PRPF3 está dibujada a escala.
FIG. 5 representa la retención de intrones en el gen PRPF3 con intrón 13. Se identificó la retención de intrones en el gen PRPF3 mediante secuenciación de ARN (ARNseq), visualizado en el navegador del genoma UCSC, como se describe en el presente documento en los Ejemplos. La densidad de lectura del intrón 13 en las células ARPE-19 es mostrada en detalle en el panel inferior.
FIG. 6 ilustra una representación gráfica del recorrido ASO realizado para las secuencias de direccionamiento de IVS 13 PRPF3 inmediatamente aguas abajo del sitio de empalme 5' o aguas arriba del sitio de empalme 3' usando ASO 2'-O-Me, se muestra la cadena principal de PS. Los ASOs fueron diseñados para cubrir estas regiones cambiando 5 nucleótidos a la vez (con la excepción de ASO P3-IVS13 15, P3-IVS13 31 y P3-IVS13-47). La estructura exón-intrón de PRPF3 está dibujada a escala.
FIG. 7 representa la retención de intrones en el gen PRPF8 gen con detalle del intrón 31. Se muestra la identificación de eventos de retención de intrones en el gen PRPF8 usando secuenciación de ARN (ARNseq), visualizado en el navegador del genoma UCSC. El panel superior muestra la densidad de lectura correspondiente a la transcripción de PRPF8 expresada en células ARPE-19 (epiteliales de retina) y localizada en la fracción citoplásmica (arriba) o nuclear (abajo). En la parte inferior de este panel, se muestra a escala una representación gráfica del gen PRPF8. La densidad de lectura es mostrada como picos. La densidad de lectura más alta corresponde a los exones (cajas negras), mientras no se observan lecturas para la mayoría de los intrones (líneas con puntas de flecha) en ninguna de las fracciones celulares. Se detecta una mayor densidad de lectura para el intrón 31 (indicado por la flecha) en la fracción nuclear, en comparación con la fracción citoplásmica, lo que indica que la eficiencia de empalme del intrón 31 es baja, lo cual da como resultado la retención del intrón. El intrón retenido que contiene las transcripciones de pre-ARNm es retenido en el núcleo y no es exportado al citoplasma. La densidad de lectura del intrón 31 en las células epiteliales renales es mostrada en detalle en el panel inferior.
FIG. 8 ilustra una representación gráfica del recorrido de ASO realizado para las secuencias de direccionamiento de IVS 31 de PRPF8, inmediatamente aguas abajo del sitio de empalme 5' o aguas arriba del sitio de empalme 3' usando 2'-O-Me ASO, se muestra la cadena principal PS. Los ASOs fueron diseñados para cubrir estas regiones cambiando 5 nucleótidos a la vez. La estructura exón-intrón de PRPF8 está dibujada a escala.
FIG. 9 representa un esquema de RefSeq Genes para PRPF3, correspondiente a NM_004698. Se muestra el Porcentaje de Retención de Intrones (PIR) del intrón encerrado en un círculo.
FIG. 10 representa un gráfico ejemplar que muestra el cambio promedio (n = 3) veces en los niveles de expresión de ARNm de PRPF3 sin intrón 12, en células ARPE-19 tratadas durante 24 horas con 80 nM de los ASOs indicados sobre células tratadas de forma simulada. Los datos están normalizados a la expresión RPL32.
FIG. 11 representa un esquema de RefSeq Genes para PRPF3, correspondiente a NM_004698. Se muestra el Porcentaje de Retención de Intrones (PIR) del intrón encerrado en un círculo.
FIG. 12 representa un gráfico ejemplar que muestra el cambio promedio (n = 3) veces en los niveles de expresión de ARNm de PRPF3 sin intrón 13, en células ARPE-19 tratadas durante 24 horas con 80 nM de los ASOs indicados, sobre las células tratadas de forma simulada. Los datos están normalizados a la expresión RPL32.
FIG. 13 representa un esquema de RefSeq Genes para PRPF8, correspondiente a NM_006445. Se muestra el Porcentaje de Retención de Intrones (PIR) del intrón encerrado en un círculo.
FIG. 14 representa un gráfico ejemplar que muestra el cambio promedio (n = 3) veces en los niveles de expresión de ARNm de PRPF8 sin intrón 31, en células ARPE-19 tratadas durante 24 horas con 80 nM de los ASOs indicados sobre células tratadas de forma simulada. Los datos están normalizados a la expresión RPL32.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Los intrones individuales en las transcripciones primarias de genes que codifican proteínas que tienen más de un intrón, son empalmados de la transcripción primaria, con diferentes eficiencias. En la mayoría de los casos, solo el ARNm completamente empalmado es exportado a través de los poros nucleares para su posterior traducción en el citoplasma. Las transcripciones sin empalmar y parcialmente empalmadas son detectables en el núcleo. En general, se piensa que la acumulación nuclear de transcripciones que no están completamente empalmadas, es un mecanismo para prevenir la acumulación en el citoplasma de ARNm potencialmente perjudiciales que pueden ser traducidas a proteínas. Para algunos genes, el empalme del intrón menos eficiente es un paso postranscripcional limitante de la velocidad en la expresión génica, antes de la traducción en el citoplasma.
En el núcleo de células humanas se han descubierto niveles sustanciales de transcripciones parcialmente empalmadas de los genes PRPF3 y PRPF8 que codifican la proteína PRPF3 deficiente en RP18, y la proteína PRPF8, deficiente en RP13, respectivamente. Estas especies de pre-ARNm de PRPF3 y PRPF8 comprenden al menos un intrón retenido. En el presente documento se divulgan composiciones y métodos para sobrerregular el empalme de uno o más intrones PRPF3 o PRPF8 retenidos, que limitan la velocidad de las etapas nucleares de la expresión génica, para aumentar la producción en estado estable de ARNm maduro completamente empalmado y, por lo tanto, los niveles de proteína PRPF3 o PRPF8 traducidos, respectivamente. Estas composiciones y métodos utilizan oligómeros antisentido (ASO) que promueven el empalme constitutivo en un sitio de empalme de intrón de un pre-ARNm PRPF3 o PRPF8 que contiene intrón retenido, que se acumula en el núcleo. Por tanto, la proteína PRPF3 o PRPF8 se incrementa usando los métodos de la divulgación para tratar una condición causada por la deficiencia de proteína PRPF3 o PRPF8. En otros casos, los métodos de la divulgación son utilizados para aumentar la producción de PRPF3 o PRPF8 para tratar una afección en un sujeto que lo necesita. Hay casos en que el sujeto tiene una condición en la que PRPF3 o PRPF8 no es necesariamente deficiente en relación con el tipo silvestre, pero donde no obstante un aumento en PRPF3 o PRPF8 mitiga la condición. En algunos casos, la condición es causada por una haploinsuficiencia de PRPF3 o PRPF8.
Retinitis pigmentosa
La retinitis pigmentosa (RP) describe un grupo debilitante de trastornos oculares, incluido el RP18, causados por una deficiencia en la proteína PRPF3, y el RP13, causado por una deficiencia en la proteína PRPF8. Los sujetos que tienen RP experimentan pérdida de la visión nocturna en la fase inicial del trastorno. Con el tiempo, comienza a producirse pérdida de visión, lo que finalmente conduce a una visión de túnel. Esta pérdida de visión puede ser atribuida a una disfunción en el sistema de fotorreceptores de bastón. A medida que avanza el trastorno, el paciente afectado puede perder una parte significativa de sus fotorreceptores de cono, antes de experimentar una pérdida de agudeza visual (Berger et al., 2010).
Se estima que la prevalencia general de las enfermedades por RP es de aproximadamente 1:3500. La mutación de más de 40 genes ha sido correlacionada con la incidencia de la enfermedad por RP, a través de tres patrones de herencia: autosómico dominante, autosómico recesivo y ligado al cromosoma X. Los genes que han sido implicados en el progreso de las enfermedades por RP pueden ser agrupados en cinco categorías principales: i) fototransducción, ii) metabolismo retiniano, iii) desarrollo y mantenimiento de tejidos, iv) estructura celular y v) empalme. Los genes que comprenden la categoría de empalme (PRPF3, PRPF8, PRP31 y PAP1) son responsables del ensamblaje del complejo proteico de espliceosoma, que es responsable de la eliminación de las secuencias intrónicas del pre-ARNm. Los estudios han sugerido que el progreso de al menos algunos casos de RP se debe a una haploinsuficiencia, lo que significa que la presencia de un solo alelo disfuncional da como resultado una expresión disminuida de la proteína correspondiente (Berger et al., 2010).
PRPF3
El gen PRPF3, que abarca 16 exones y está ubicado en 1 q21.1, codifica la proteína del factor 3 de procesamiento pre-ARNm (PRPF3). La secuencia de ARNm canónica de PRPF3 está establecida en la Secuencia de Referencia de NCBI: NM_004698. PRPF3 es una proteína de 682 aminoácidos y 77 kD que participa en el ensamblaje del espliceosoma. La disfunción de PRPF3 ha estado involucrada en el progreso de RP 18. Se ha especulado que un elemento de empalme específico de la retina puede interactuar con PRPF3 y generar el fenotipo específico del fotorreceptor de bastón.
Se ha demostrado que las mutaciones de sentido erróneo P493S y T494M en PRPF3 muestran el fenotipo RP18, vinculando la disfunción de PRPF3 con el fenotipo RP 18 (Berger et al., 2010). RP18 y el gen PRPF3 son divulgados, por ejemplo, por OMIM # 601414 (Online Mendelian Inheritance in Man, Johns Hopkins University, 1966-2015).
PRPF8
El gen PRPF8, que abarca 42 exones y está ubicado en 17p13.3, codifica la proteína del factor 8 de procesamiento pre-ARNm (PRPF8). La secuencia de ARNm canónica de PRPF8 está establecida en la Secuencia de Referencia de NCBI: NM_ 006445. PRPF8 es una proteína de 220 kD y 2334 aminoácidos que está involucrada en el ensamblaje del espliceosoma. La disfunción de PRPF8 ha estado involucrada en el progreso de RP13. Se encontró que los mutantes H2309P, H2309R, R2310K, P2301T, F2304L, R2310G y F2314L de PRPF8 dan como resultado el fenotipo clínico de RP13, que vincula la disfunción de PRPF8 con RP13 (Berger et al., 2010). Los genes RP13 y el RP8 están descritos, por ejemplo, por OMIM # 600059 (Online Mendelian Inheritance in Man, Johns Hopkins University, 1966­ 2015).
Intrón retenido que contiene pre-mARN (Pre-ARNm con RIC)
Los métodos de la presente divulgación explotan la presencia de pre-mARN que contiene intrón retenido (pre-mARN con RIC) transcrito de los genes PRPF3 o la PRPF8 en el núcleo celular. El empalme de las especies de pre-ARNm con RIC identificadas para producir ARNm maduro, completamente empalmado, es inducido utilizando ASOs que estimulan el empalme de los intrones retenidos. El ARNm maduro resultante puede ser exportado al citoplasma y traducido, aumentando así la cantidad de proteína PRPF3 o proteína PRPF8 en las células del paciente y aliviando los síntomas de RP18 o RP13, respectivamente. Este método, que se describe más adelante, es conocido como Aumento Dirigido de la Producción de Genes Nucleares (TANGO).
Transcripciones nucleares PRPF3
Como se describe en el presente documento en los ejemplos, se analizó el gen PRPF3 para detectar eventos de retención de intrones, y se observó retención de intrones, por ejemplo, intrones 12 y 13. La secuenciación de ARN (ARNseq), visualizada en el navegador del genoma UCSC, mostró transcripciones de PRPF3 expresadas en células ARPE-19 y localizadas en la fracción citoplásmica o nuclear. En ambas fracciones, no se observaron lecturas para la mayoría de los intrones. Sin embargo, se detectó una mayor densidad de lectura para los intrones 12 y 13 en la fracción nuclear en comparación con la fracción citoplásmica, lo que indica que la eficiencia de empalme de los intrones 12 y 13 es baja, lo que da como resultado la retención de intrones. Los intrones retenidos que contienen las transcripciones de pre-ARNm se acumulan principalmente en el núcleo y no son traducidos en la proteína PRPF3. La densidad de lectura para los intrones 12 y 13 indicó un 26 % y un 33 % de retención de intrones, respectivamente. El valor porcentual de retención de intrón (PIR) para el intrón 12 fue obtenido tomando el promedio de cuatro valores (37, 35, 16 y 15). El valor PIR para el intrón 13 fue obtenido de manera similar, tomando el promedio de los cuatro valores 34, 33, 34 y 31. Cada valor fue determinado en células ARPE-19 (epitelial retiniana pigmentada) utilizando uno de cuatro algoritmos diferentes.
En algunos casos, el número de intrones de PRPF3 corresponde a la secuencia de ARNm en NM_004698. En algunos casos, la porción objetivo del pre-ARNm con RIC PRPF3 está en el intrón 12 y/o 13. En algunos casos, la hibridación de un ASO a la porción objetivo de un pre-ARNm con RIC PRPF3 da como resultado un mejor empalme en el sitio de empalme (sitio de empalme 5' o sitio de empalme 3') de al menos uno de los intrones PRPF3 12 o 13 retenidos y posteriormente aumenta la producción de proteína PRPF3. Se entiende que la numeración de intrones puede cambiar en referencia a una secuencia de isoformas de PRPF3 diferente. Un experto en la técnica puede determinar el número de intrón correspondiente en cualquier isoforma de PRPF3, basándose en una secuencia de intrón proporcionada en este documento o usando el número de intrón proporcionado en referencia a la secuencia de ARNm en NM_004698. Un experto en la técnica también puede determinar las secuencias de exones de flanqueo en cualquier isoforma de PRPF3 para el direccionamiento usando los métodos de la divulgación, basándose en una secuencia de intrón proporcionada en este documento o usando el número de intrón proporcionado en referencia a la secuencia de ARNm en NM_004698. En algunos casos, las composiciones y métodos de la presente divulgación son utilizados para aumentar la expresión de cualquier isoforma PRPF3 conocida, por ejemplo, como se describe en la base de datos NCBI Gene ID en Gene ID 9129 (repositorio NCBI de información biológica y científica, operado por National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, 8600 Rockville Pike, Bethesda, MD e Eu U 20894).
En algunos casos, la numeración del intrón PRPF8 corresponde a la secuencia de ARNm en NM_006445. En algunos casos, la porción objetivo del pre-ARNm con RIC PRPF8 está en el intrón 31. La hibridación de un ASO a la porción objetivo del pre-ARNm con RIC da como resultado un empalme mejorado en el sitio de empalme (sitio de empalme 5' o sitio de empalme 3') de al menos uno de los intrones 31 PRPF8 retenidos y posteriormente aumenta la producción de proteína PRPF8. Se entiende que la numeración de intrones puede cambiar en referencia a una secuencia de isoformas de PRPF8 diferente. Un experto en la técnica puede determinar el número de intrón correspondiente en cualquier isoforma de PRPF8, basándose en una secuencia de intrón proporcionada en este documento o usando el número de intrón proporcionado en referencia a la secuencia de ARNm en NM_006445. Un experto en la técnica también puede determinar las secuencias de exones que flanquean en cualquier isoforma de PRPF8, para el direccionamiento usando los métodos de la divulgación, basándose en una secuencia de intrón proporcionada en este documento o usando el número de intrón proporcionado en referencia a la secuencia de ARNm en NM_006445. Las composiciones y métodos de la presente invención son utilizados para aumentar la expresión de cualquier isoforma PRPF8 conocida, por ejemplo, como se describe en la base de datos NCBI Gene ID en Gene ID 10594 (depósito NCBI de información biológica y científica).
PRPF3
En algunos casos, los ASOs divulgados en este documento se dirigen a un pre-ARNm con RIC transcrito a partir de una secuencia genómica de PRPF3 (un pre-ARNm con RIC de PRPF3). En algunos casos, la secuencia genómica de PRPF3 es SEQ ID NO: 1. En algunos casos, el pre-ARNm con RIC de PRPF3 es la SEC ID NO: 3.
PRPF3: intrón 12 retenido
En algunos casos, la transcripción de pre-ARNm con RIC de PRPF3 comprende el intrón 12 retenido. En algunos casos, cuando la transcripción de pre-ARNm con RIC de PRPF3 comprende el intrón 12 retenido, los ASOs divulgados en el presente documento se dirigen a la SEC ID NO: 447. En algunos casos, cuando la transcripción de pre-ARNm con RIC de PRPF3 comprende el intrón 12 retenido, el ASO tiene una secuencia de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NO: 5-239. En algunos casos, los ASOs se dirigen a una secuencia de pre-ARNm con RIC de PRPF3.
En algunos casos, el ASO se dirige al exón 12 del pre-ARNm con RIC de PRPF3 que comprende un intrón 12 retenido. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del exón 12 aguas arriba (o 5') del sitio de empalme 5' de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 que comprende un intrón 12 retenido. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia de exón aproximadamente 4 a aproximadamente 94 nucleótidos corriente arriba (o 5') del sitio de empalme 5' de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 que comprende un intrón 12 retenido. En algunos casos, el ASO tiene una secuencia de acuerdo con una cualquiera de las s Eq ID NO: 5-23.
En algunos casos, el ASO se dirige al intrón 12 en un pre-ARNm con RIC de PRPF3, que comprende un intrón retenido 12. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del intrón 12 aguas abajo (o 3') del sitio de empalme 5' de un pre-ARNm con RIC de PRPF3, que comprende un intrón 12 retenido. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del intrón 12 aproximadamente 6 a aproximadamente 498 nucleótidos corriente abajo (o 3') del sitio de empalme 5' de un pre-ARNm con RIC de PRPF3, que comprende un intrón 12 retenido. En algunos casos, el ASO tiene una secuencia de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NO: 24-121.
En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del intrón 12 corriente arriba (o 5') del sitio de empalme 3' de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 que comprende un intrón 12 retenido. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del intrón 12 de aproximadamente 16 a aproximadamente 496 nucleótidos corriente arriba (o 5') del sitio de empalme 3' de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 que comprende el intrón 12 retenido. En algunos casos, el ASO tiene una secuencia de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NO: 122-218.
En algunos casos, el ASO se dirige al exón 13 en un pre-ARNm con RIC de PRPF3 que comprende un intrón 12 retenido. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del exón 13 aguas abajo (o 3') del sitio de empalme 3' de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 que comprende un intrón 12 retenido. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del exón 13 de aproximadamente 2 a aproximadamente 102 nucleótidos corriente abajo (o 3') del sitio de empalme 3' de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 que comprende un intrón 12 retenido. En algunos casos, el ASO tiene una secuencia de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NO: 219-239.
PRPF3: intrón 13 retenido
En algunos casos, la transcripción de pre-ARNm con RIC de PRPF3 comprende el intrón 13 retenido. En algunos casos, cuando la transcripción de pre-ARNm con RIC de PRPF3 comprende el intrón 13 retenido, los ASOs divulgados en el presente documento se dirigen a la SEC ID NO: 446. En algunos casos, cuando la transcripción de pre-ARNm con RIC de PRPF3 comprende el intrón 13 retenido, el ASO tiene una secuencia de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NO: 240-323. En algunos casos, los ASOs se dirigen a una secuencia de pre-ARNm con RIC de PRPF3.
En algunos casos, el ASO se dirige al exón 13 del pre-ARNm con RIC de PRPF3 que comprende un intrón 13 retenido. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del exón 13 corriente arriba (o 5') del sitio de empalme 5' de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 que comprende un intrón 13 retenido. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia de exón de aproximadamente 4 a aproximadamente 99 nucleótidos corriente arriba (o 5') del sitio de empalme 5' de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 que comprende un intrón 13 retenido. En algunos casos, el ASO tiene una secuencia de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NO: 240-259.
En algunos casos, el ASO se dirige al intrón 13 en un pre-ARNm con RIC de PRPF3 que comprende un intrón 13 retenido. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del intrón 13 aguas abajo (o 3') del sitio de empalme 5' de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 que comprende un intrón 13 retenido. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del intrón 13 de aproximadamente 6 a aproximadamente 146 nucleótidos corriente abajo (o 3') del sitio de empalme 5' de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 que comprende un intrón 13 retenido. En algunos casos, el ASO tiene una secuencia de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NO: 260-286.
En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del intrón 13 corriente arriba (o 5') del sitio de empalme 3' de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 que comprende un intrón 13 retenido. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del intrón 13 de aproximadamente 16 a aproximadamente 146 nucleótidos corriente arriba (o 5') del sitio de empalme 3' de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 que comprende el intrón 13 retenido. En algunos casos, el ASO tiene una secuencia de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NO: 287-310.
En algunos casos, el ASO se dirige al exón 14 en un pre-ARNm con RIC de PRPF3 que comprende un intrón 13 retenido. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del exón 14 aguas abajo (o 3') del sitio de empalme 3' de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 que comprende un intrón 13 retenido. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del exón 14 de aproximadamente 2 a aproximadamente 67 nucleótidos corriente abajo (o 3') del sitio de empalme 3' de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 que comprende un intrón 13 retenido. En algunos casos, el ASO tiene una secuencia de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NO: 311-323.
PRPF8
En algunos casos, los ASOs divulgados en el presente documento se dirigen a un pre-ARNm con RIC transcrito a partir de una secuencia genómica de PRPF8 (un pre-ARNm con RIC PRPF8). En algunos casos, la secuencia genómica de PRPF8 es SEQ ID NO. 2. En algunos casos, el pre-ARNm con RIC PRPF8 es SEQ ID NO. 4.
PRPF8: intrón 31 retenido
En algunos casos, la transcripción de pre-ARNm con RIC PRPF8 comprende el intrón 31 retenido. En algunos casos, cuando la transcripción de pre-ARNm con RIC PRPF8 comprende el intrón 31 retenido, los ASOs divulgados en el presente documento se dirigen a la SEC ID NO: 448. En algunos casos, cuando la transcripción de pre-ARNm con RIC PRPF8 comprende el intrón 31 retenido, el ASO tiene una secuencia de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NO: 324-445. En algunos casos, los ASOs se dirigen a una secuencia de pre-ARNm con RIC PRPF8.
En algunos casos, el ASO se dirige al exón 31 del pre-ARNm con RIC PRPF8 que comprende un intrón 31 retenido. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del exón 31 corriente arriba (o 5') del sitio de empalme 5' de un pre-ARNm con RIC PRPF8 que comprende un intrón 31 retenido. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia de exón de aproximadamente 4 a aproximadamente 144 nucleótidos corriente arriba (o 5') del sitio de empalme 5' de un pre-ARNm con RIC PRPF8 que comprende un intrón 31 retenido. En algunos casos, el ASO tiene una secuencia de acuerdo con un cualquiera de las SEQ ID NO: 324-350.
En algunos casos, el ASO se dirige al intrón 31 en un pre-ARNm con RIC de PRPF8 que comprende un intrón 31 retenido. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del intrón 31 aguas abajo (o 3') del sitio de empalme 5' de un pre-ARNm con RIC PRPF8 que comprende un intrón 31 retenido. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del intrón 31 de aproximadamente 6 a aproximadamente 156 nucleótidos corriente abajo (o 3') del sitio de empalme 5' de un pre-ARNm con RIC PRPF8 que comprende un intrón 31 retenido. En algunos casos, el ASO tiene una secuencia de acuerdo con una cualquiera de las s Eq ID NO: 351-381.
En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del intrón 31 corriente arriba (o 5') del sitio de empalme 3' de un pre-ARNm con RIC PRPF8 que comprende un intrón 31 retenido. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del intrón 31 de aproximadamente 16 a aproximadamente 156 nucleótidos corriente arriba (o 5') del sitio de empalme 3' de un pre-ARNm con RIC de PRPF8 que comprende el intrón 31 retenido. En algunos casos, el ASO tiene una secuencia de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NO: 382-410.
En algunos casos, el ASO se dirige al exón 32 en un pre-ARNm con RIC PRPF8 que comprende un intrón 31 retenido. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del exón 32 corriente abajo (o 3') del sitio de empalme 3' de un pre-ARNm con RIC PRPF8 que comprende un intrón 31 retenido. En algunos casos, el ASO se dirige a una secuencia del exón 32 de aproximadamente 2 a aproximadamente 172 nucleótidos corriente abajo (o 3') del sitio de empalme 3' de un pre-ARNm con RIC PRPF8 que comprende un intrón 31 retenido. En algunos casos, el ASO tiene una secuencia de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NO: 411-445.
Expresión de proteínas
Como se describió anteriormente, las mutaciones PRPF3 y PRPF8 en las enfermedades de la RP se extienden a través de toda la proteína. En algunos casos, los métodos descritos en este documento son utilizados para aumentar la producción de una proteína PRPF3 funcional. En otros casos, los métodos descritos en este documento son utilizados para aumentar la producción de una proteína PRPF8 funcional. En otros casos, los métodos descritos en este documento son utilizados para aumentar la producción de una proteína PRPF3 funcional o una proteína PRPF8. Como se usa en este documento, el término "funcional" se refiere a la cantidad de actividad o función de una proteína PRPF3 o PRPF8 que es necesaria para eliminar uno o más síntomas de una enfermedad por RP. En algunos casos, los métodos son utilizados para aumentar la producción de una proteína PRPF3 parcialmente funcional. En otros casos, los métodos son utilizados para aumentar la producción de una proteína PRPF8 parcialmente funcional. En otros casos, los métodos son utilizados para aumentar la producción de una proteína PRpF3 o PRPF8 parcialmente funcional. Como se usa en este documento, el término "parcialmente funcional" se refiere a cualquier cantidad de actividad o función de la proteína PRPF3 o PRPF8 que sea menor que la cantidad de actividad o función que es necesaria para eliminar o prevenir uno cualquiera o más síntomas de una enfermedad. En algunos casos, una proteína o ARN parcialmente funcional tendrá al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % menos de actividad respecto a la proteína o ARN completamente funcional.
Hay casos en que el método es un método para aumentar la expresión de la proteína PRPF3 por las células de un sujeto que tiene un pre-ARNm con RIC que codifica la proteína PRPF3, en donde el sujeto tiene una enfermedad de RP causada por una cantidad deficiente de actividad de la proteína PRPF3, y en donde la cantidad deficiente de la proteína PRPF3 es causada por la haploinsuficiencia de la proteína PRPF3. En tal caso, el sujeto tiene un primer alelo que codifica una proteína PRPF3 funcional y un segundo alelo a partir del cual no se produce la proteína PRPF3. En otro caso de este tipo, el sujeto tiene un primer alelo que codifica una proteína PRPF3 funcional y un segundo alelo que codifica una proteína PRPF3 no funcional. En otro caso de este tipo, el sujeto tiene un primer alelo que codifica una proteína PRPF3 funcional y un segundo alelo que codifica una proteína PRPF3 parcialmente funcional. En cualquiera de estos casos, el oligómero antisentido se une a una porción dirigida del pre-mARN con RIC transcrito del primer alelo (que codifica la proteína PRPF3 funcional), induciendo así el empalme constitutivo del intrón retenido del pre-mARN con RIC y provocando un aumento del nivel de ARNm maduro que codifica la proteína PRPF3 funcional y un aumento de la expresión de la proteína PRPF3 en las células del sujeto.
En algunos casos, el método es un método para aumentar la expresión de la proteína PRPF8 por las células de un sujeto que tiene un pre-ARNm con RIC que codifica la proteína PRPF8, en donde el sujeto tiene una enfermedad de RP causada por una cantidad o actividad deficiente de la proteína PRPF8, y en donde la cantidad deficiente de la proteína PRPF8 es causada por la haploinsuficiencia de la proteína PRPF8. En tal caso, el sujeto tiene un primer alelo que codifica una proteína PRPF8 funcional y un segundo alelo a partir del cual no es producida la proteína PRPF8. En otro caso de este tipo, el sujeto tiene un primer alelo que codifica una proteína PRPF8 funcional y un segundo alelo que codifica una proteína PRPF8 no funcional. En otro caso de este tipo, el sujeto tiene un primer alelo que codifica una proteína PRPF8 funcional y un segundo alelo que codifica una proteína PRPF8 parcialmente funcional. En cualquiera de estos casos, el oligómero antisentido se une a una porción dirigida del pre-mARN con RIC transcrito a partir del primer alelo (que codifica la proteína PRPF8 funcional), induciendo así el empalme constitutivo del intrón retenido del pre-mARN con RIC y provocando un aumento del nivel de ARNm maduro que codifica la proteína PRPF8 funcional y aumento de la expresión de la proteína PRPF8 en las células del sujeto.
En algunos casos, el sujeto tiene un primer alelo que codifica una proteína PRPF3 funcional y un segundo alelo que codifica una proteína PRPF3 parcialmente funcional, y el oligómero antisentido se une a una porción dirigida del premARN con RIC transcrito del primer alelo (que codifica proteína funcional PRPF3) o una porción dirigida del pre-mARN con RIC transcrito del segundo alelo (que codifica la proteína PRPF3 parcialmente funcional), induciendo así el empalme constitutivo del intrón retenido del pre-mARN con RIC y provocando un aumento en el nivel de ARNm maduro que codifica la proteína PRPF3 y un aumento en la expresión de la proteína PRPF3 funcional o parcialmente funcional en las células del sujeto.
En otros casos, el sujeto tiene un primer alelo que codifica una proteína PRPF8 funcional y un segundo alelo que codifica una proteína PRPF8 parcialmente funcional, y el oligómero antisentido se une a una porción dirigida del premARN con RIC transcrito del primer alelo (que codifica proteína funcional PRPF8) o una porción dirigida del pre-mARN con RIC transcrita del segundo alelo (que codifica la proteína PRPF8 parcialmente funcional), induciendo así el empalme constitutivo del intrón retenido del pre-mARN con RIC y provocando un aumento en el nivel de ARNm maduro que codifica la proteína PRPF8 y un aumento en la expresión de la proteína PRPF8 funcional o parcialmente funcional en las células del sujeto.
En casos relacionados, el método es un método de uso de un ASO para aumentar la expresión de una proteína o ARN funcional. En algunos casos, se usa un ASO para aumentar la expresión de la proteína PRPF3 en las células de un sujeto que tiene un pre-ARNm con RIC que codifica la proteína PRPF3, en donde el sujeto tiene una deficiencia, por ejemplo, RP18, en la cantidad o función de una proteína PRPF3.
En otros casos relacionados, el método es un método de usar un ASO para aumentar la expresión de una proteína o ARN funcional. Hay casos en que se usa un ASO para aumentar la expresión de la proteína PRPF8 en células de un sujeto que tiene un pre-ARNm con RIC que codifica la proteína PRPF8, en donde el sujeto tiene una deficiencia, por ejemplo, RP13, en la cantidad o función de una proteína PRPF8.
Hay casos en que la transcripción de pre-ARNm con RIC que codifica la proteína que es causante de la enfermedad están dirigida por los ASOs descritos en este documento. En algunos casos, una transcripción de pre-ARNm con RIC que codifica una proteína que no es causante de la enfermedad, es dirigida por los ASOs. Por ejemplo, una enfermedad que es el resultado de una mutación o deficiencia de una primera proteína en una ruta particular, puede ser mejorada dirigiendo un pre-ARNm con RIC que codifica una segunda proteína, aumentando así la producción de la segunda proteína. En algunos casos, la función de la segunda proteína es capaz de compensar la mutación o deficiencia de la primera proteína (que es la causa de la enfermedad o afección).
Hay casos en que el sujeto tiene:
a. un primer alelo mutante del cual
i) la proteína PRPF3 es producida a un nivel reducido, en comparación con la producción de un alelo de tipo silvestre, ii) la proteína PRPF3 es producida en una forma que tiene una función reducida en comparación con una proteína equivalente de tipo silvestre, o
iii) no se produce la proteína PRPF3 o el ARN funcional; y
b. un segundo alelo mutante del cual
i) la proteína PRPF3 es producida a un nivel reducido en comparación con la producción de un alelo de tipo silvestre, ii) la proteína PRPF3 es producida en una forma que tiene una función reducida en comparación con una proteína equivalente de tipo silvestre, o
iii) no se produce la proteína PRPF3, y
en donde el pre-ARNm con RIC es transcrito a partir del primer alelo y/o el segundo alelo. En estos casos, el ASO se une a una porción dirigida del pre-mARN con RIC transcrito del primer alelo o del segundo alelo, induciendo así el empalme constitutivo del intrón retenido del pre-mARN con RIC, y provocando un aumento en el nivel de ARNm que codifica la proteína PRPF3 y un aumento en la expresión de la proteína objetivo o ARN funcional en las células del sujeto. En estos casos, la proteína objetivo o el ARN funcional que tiene un aumento en el nivel de expresión, resultante del empalme constitutivo del intrón retenido del pre-ARNm con RIC, está en una forma que tiene una función reducida en comparación con la proteína equivalente de tipo silvestre (parcialmente funcional), o tiene una función completa en comparación con la proteína de tipo silvestre equivalente (completamente funcional).
Hay casos en que el sujeto tiene:
a. un primer alelo mutante del cual
i) la proteína PRPF8 es producida a un nivel reducido en comparación con la producción de un alelo de tipo silvestre, ii) la proteína PRPF8 es producida en una forma que tiene una función reducida en comparación con una proteína equivalente de tipo silvestre, o
iii) no se produce la proteína PRPF8 o el ARN funcional; y
b. un segundo alelo mutante del cual
iv) la proteína PRPF8 es producida a un nivel reducido en comparación con la producción de un alelo de tipo silvestre, v) la proteína PRPF8 es producida en una forma que tiene una función reducida en comparación con una proteína equivalente de tipo silvestre, o
vi) no se produce la proteína PRPF8, y
en donde el pre-ARNm con RIC es transcrito a partir del primer alelo y/o el segundo alelo. En estos casos, el ASO se une a una porción dirigida del pre-mARN con RIC transcrito del primer alelo o del segundo alelo, induciendo así el empalme constitutivo del intrón retenido del pre-mARN con RIC, y provocando un aumento en el nivel de ARNm que codifica la proteína PRPF8 y un aumento en la expresión de la proteína objetivo o ARN funcional en las células del sujeto. En estos casos, la proteína objetivo o el ARN funcional que tiene un aumento en el nivel de expresión resultante del empalme constitutivo del intrón retenido del pre-ARNm con RIC, está en una forma que tiene una función reducida en comparación con la proteína equivalente de tipo silvestre (parcialmente funcional), o que tiene una función completa en comparación con la proteína de tipo silvestre equivalente (completamente funcional).
Hay casos en que el nivel de ARNm que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8 aumenta de 1.1 a 10 veces, en comparación con la cantidad de ARNm que codifica PRPF3 o PRPF8 que es producida en una célula de control, por ejemplo, una que no se trata con el oligómero antisentido o una que se trata con un oligómero antisentido que no se une a la porción objetivo del pre-ARNm de PRPF3 o PRPF8 con RiC.
Hay casos en que la afección causada por una cantidad o actividad deficiente de la proteína PRPF3 o PRPF8 no es una afección causada por un empalme alternativo o aberrante del intrón retenido al que se dirige el ASO. Hay casos en que la afección causada por una cantidad o actividad deficiente de la proteína PRPF3 o PRPF8 no es una afección causada por un empalme alternativo o aberrante de cualquier intrón retenido en un pre-ARNm con RIC que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8.
En algunos casos, un sujeto tratado usando los métodos de la divulgación expresa una proteína PRPF3 o PRPF8 parcialmente funcional de un alelo, en donde la proteína PRPF3 o PRPF8 parcialmente funcional es causada por una mutación de cambio de marco, una mutación sin sentido, una mutación de sentido equivocado o una eliminación parcial del gen. Hay casos en que un sujeto tratado usando los métodos de la divulgación expresa una proteína PRPF3 o PRPF8 no funcional de un alelo, en donde la proteína PRPF3 o PRPF8 no funcional es causada por una mutación de cambio de marco, una mutación sin sentido, una mutación de sentido equivocado, una eliminación parcial del gen, en un alelo. Hay casos en que un sujeto tratado usando los métodos de la divulgación tiene una eliminación del gen completo PRPF3 o PRPF8, en un alelo.
En algunos casos, el sujeto tiene una mutación de sentido equivocado PRPF3 seleccionada entre P493S y T494M. En otros casos, el sujeto tiene una mutación de sentido equivocado PRPF8 seleccionada entre H2309P, H2309R, R2310K, P2301T, F2304L, R2310G y F2314L. Hay casos en que un sujeto que tiene cualquier mutación conocida en la técnica y descrita en la literatura, por ejemplo, por McKie et al 2001 mencionado anteriormente, es tratado usando los métodos y composiciones de la presente divulgación.
Uso de TANGO para aumentar la expresión de proteínas
Como se describió anteriormente, en algunos casos, el Aumento Dirigido de la Producción de Genes Nucleares (TANGO) es usado en los métodos de la divulgación para aumentar la expresión de una proteína PRPF3 o PRPF8. En estos casos, un pre-ARNm (pre-ARNm con RIC) que contiene intrón retenido que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8 está presente en el núcleo de una célula. Las células que tienen un pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 que comprende un intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de empalme 5' y un exón que flanquea el sitio de empalme 3', que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8, son puestos en contacto con oligómeros antisentido (ASO) que son complementarios a una porción dirigida del pre-ARNm con RIC. La hibridación de los ASOs con la porción objetivo del pre-ARNm con RIC da como resultado un empalme mejorado en el sitio de empalme (sitio de empalme 5' o sitio de empalme 3') del intrón retenido y posteriormente aumenta la producción de proteína objetivo.
Los términos "pre-ARNm" y "transcripción de pre-ARNm" pueden ser usados indistintamente y se refieren a cualquier especie de pre-ARNm que contiene al menos un intrón. En algunos casos, las transcripciones de pre-mARN o premARN comprenden una tapa de 5'-7-metilguanosina y/o una cola de poli-A. En algunos casos, las transcripciones de pre-mARN o pre-mARN comprenden tanto una tapa de 5'-7-metilguanosina como una cola de poli-A. En algunos casos, la transcripción de pre-ARNm no comprende una tapa de 5'-7-metilguanosina y/o una cola de poli-A. Una transcripción de pre-ARNm es una molécula de ARN mensajero (ARNm) no productiva si no es traducida en una proteína (o es transportada al citoplasma desde el núcleo).
Como se usa en el presente documento, un "pre-ARNm que contiene intrón retenido" ("pre-ARNm con RIC") es una transcripción de pre-ARNm que contiene al menos un intrón retenido. El pre-ARNm con RIC contiene un intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de empalme 5' del intrón retenido, un exón que flanquea el sitio de empalme 3' del intrón retenido y codifica la proteína objetivo. Se entiende que un "pre-ARNm con RIC que codifica una proteína objetivo" codifica la proteína objetivo cuando está completamente empalmado. Un "intrón retenido" es cualquier intrón que está presente en una transcripción de pre-ARNm cuando uno o más intrones, como un intrón adyacente, codificado por el mismo gen, se han empalmado de la misma transcripción de pre-ARNm. En algunos casos, el intrón retenido es el intrón más abundante en el pre-ARNm con RIC que codifica la proteína objetivo. Hay casos en que el intrón retenido es el intrón más abundante en una población de pre-mARNs con RIC transcritos del gen que codifica la proteína objetivo en una célula, en donde la población de pre-mARN con RIC comprende dos o más intrones retenidos. Hay casos en que un oligómero antisentido dirigido al intrón más abundante en la población de pre-ARNm con RIC que codifican la proteína objetivo, induce el empalme de dos o más intrones retenidos en la población, incluido el intrón retenido al que se dirige o se une el oligómero antisentido . En algunos casos, de ese modo se produce un ARNm maduro que codifica la proteína objetivo. Los términos "ARNm maduro" y "ARNm completamente empalmado" se usan indistintamente en el presente documento para describir un ARNm completamente procesado que codifica una proteína objetivo (por ejemplo, ARNm que se exporta desde el núcleo al citoplasma y se traduce en proteína objetivo) o un ARN funcional completamente procesado. El término "ARNm productivo" puede ser usado también para describir un ARNm completamente procesado que codifica una proteína objetivo. En algunos casos, la región objetivo se encuentra en un intrón retenido, que es el intrón más abundante en un pre-ARNm con RIC que codifica la proteína PRPF3 y/o PRPF8. En algunos casos, el intrón más retenido en un pre-ARNm con RIC que codifica la proteína PRPF3, es el intrón 12. En algunos casos, el intrón más retenido en un pre-ARNm con RIC que codifica la proteína PRPF3 es el intrón 13. En algunos casos, el intrón más retenido en un pre-ARNm con RIC que codifica la proteína PRPF8 es el intrón 31.
Hay casos en que un intrón retenido es un intrón que se identifica como un intrón retenido, basándose en una determinación de al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 % , al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 45 %, o al menos aproximadamente el 50 % de retención. Hay casos en que un intrón retenido es un intrón que se identifica como un intrón retenido basado en una determinación de aproximadamente 5 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 95 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 85 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 75 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 65 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 65 % , aproximadamente 5 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 55 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 45 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 35 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 30 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 25 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 20 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 15 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 95 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 85 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 75 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 65 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 65 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 55 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 45 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 40 %, aproximadamentel 10 % a aproximadamentel 35 %, aproximadamentel 10 % a aproximadamentel 30 %, aproximadamentel 10 % a aproximadamentel 25 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %, aproximadamente 15 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 15 % a aproximadamente 95 %, aproximadamente 15 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 15 % a aproximadamente 85 %, aproximadamente 15 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 15 % a aproximadamente 75 %, aproximadamente 15 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 15 % a aproximadamente 65 %, aproximadamente 15 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 15 % a aproximadamente 65 %, aproximadamente 15 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 15 % a aproximadamente 55 %, aproximadamente 15 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 15 % a aproximadamente 45 %, aproximadamente 15 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 15 % a aproximadamente 35 %, aproximadamente 15 % a aproximadamente 30 %, aproximadamente 15 % a aproximadamente 25 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 100 % aproximadamente 20 % a aproximadamente 95 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 85 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 75 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 65 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 65 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 55 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 45 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 35 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 30 %, aproximadamente 25 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 25 % a aproximadamente 95 %, aproximadamente 25 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 25 % a aproximadamente 85 %, aproximadamente 25 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 25 % a aproximadamente 75 %, aproximadamente 25 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 25 % a aproximadamente 65 %, aproximadamente 25 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 25 % a aproximadamente 65 %, aproximadamente 25 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 25 % a aproximadamente 55 %, aproximadamente 25 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 25 % a aproximadamente 45 %, aproximadamente 25 % a aproximadamente 40 % o aproximadamente 25 % a aproximadamente 35 % de retención. Los datos ENCODE (descritos por, por ejemplo, Tilgner, et al., 2012, "Deep sequencing of subcellular RNA fractions shows splicing to be predominantly cotranscriptional in the human genome but inefficient for IncRNAs," Genome Research 22(9): 1616-25) pueden ser utilizados para ayudar a identificar los intrones retenidos.
Como se usa en este documento, el término "comprender" o variaciones del mismo tales como "comprende" o "que comprende" deben ser leídas para indicar la inclusión de cualquier característica mencionada (por ejemplo en el caso de un oligómero antisentido, una secuencia de nucleobase definida) pero no la exclusión de ninguna otra característica. Por lo tanto, como se usa en este documento, el término "que comprende" es inclusivo y no excluye características adicionales no citadas (por ejemplo en el caso de un oligómero antisentido, la presencia de nucleobases adicionales no citadas).
En los casos de cualquiera de las composiciones y métodos proporcionados en el presente documento, "que comprende" puede ser reemplazado por "que consiste esencialmente en" o "que consiste en". La frase "que consiste esencialmente en" es usada en este documento para requerir la(s) característica(s) especificada(s) (por ejemplo. secuencia de nucleobase) así como aquellas que no afectan materialmente el carácter o función de la presente divulgación. Como se usa en este documento, el término "consistente" es usado para indicar la presencia de la característica mencionada (por ejemplo. secuencia de nucleobase) sola (de modo que en el caso de un oligómero antisentido que consiste en una secuencia de nucleobase especificada, se excluye la presencia de nucleobases adicionales no mencionadas).
En algunos casos, la región objetivo se encuentra en un intrón retenido, que es el segundo intrón más abundante en una población de pre-ARNm con RIC que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8. Por ejemplo, el segundo intrón retenido más abundante puede ser el objetivo en lugar del intrón retenido más abundante, debido a la singularidad de la secuencia de nucleótidos del segundo intrón retenido más abundante, la facilidad del diseño de ASO para dirigirse a una secuencia de nucleótidos particular y/o cantidad de aumento en la producción de proteínas resultante de dirigirse al intrón con un ASO. Hay casos en que el intrón retenido es el segundo intrón más abundante en una población de pre-mARN con RIC transcrito del gen que codifica la proteína objetivo en una célula, en donde la población de premARN con RIC comprende dos o más intrones retenidos. Hay casos en que un oligómero antisentido dirigido al segundo intrón más abundante en la población de los pre-ARNm con RIC que codifican la proteína objetivo induce el empalme de dos o más intrones retenidos en la población, incluido el intrón retenido al que se dirige o se une al oligómero antisentido. En algunos casos, de ese modo es producido ARN completamente empalmado (maduro) que codifica la proteína objetivo. En algunos casos, el segundo intrón retenido más abundante en una población de pre-ARNm con RIC que codifica la proteína PRPF3, es el intrón 12. En algunos casos, el segundo intrón retenido más abundante en una población de pre-ARNm con RIC que codifica la proteína PRPF3, es el intrón 13.
Hay casos en que un ASO es complementario a una región objetivo que se encuentra dentro de un intrón no retenido en un pre-ARNm con RIC. Hay casos en que la porción objetivo del pre-ARNm con RIC está dentro de: la región 6 a 100 respecto al sitio de empalme 5' del intrón no retenido; o la región -16 a -100 respecto al sitio de empalme 3' del intrón no retenido. Hay casos en que la porción dirigida del pre-ARNm con RIC está dentro de la región 100 en relación con el sitio de empalme 5' del intrón no retenido, a - 100 en relación con el sitio de empalme 3' del intrón no retenido. Como se usa para identificar la ubicación de una región o secuencia, se entiende que "dentro" incluye los residuos en las posiciones mencionadas. Por ejemplo, una región de 6 a 100 incluye los residuos en las posiciones 6 y 100. En algunos casos, de ese modo es producido ARN completamente empalmado (maduro) que codifica la proteína objetivo.
En algunos casos, el intrón retenido del pre-ARNm con RIC es un intrón empalmado de manera ineficaz. Como se usa en este documento, "empalmado de manera ineficaz" puede referirse a una frecuencia relativamente baja de empalme en un sitio de empalme adyacente al intrón retenido (sitio de empalme 5' o sitio de empalme 3'), en comparación con la frecuencia de empalme en otro sitio de empalme en el pre-ARNm con RIC. El término "empalmado de manera ineficaz" también puede referirse a la velocidad relativa o cinética de empalme en un sitio de empalme, en donde un intrón "empalmado de manera ineficaz" puede ser empalmado o eliminado a una velocidad más lenta en comparación con otro intrón en un pre-ARNm con RlC .
Hay casos en que la secuencia de 9 nucleótidos en -3e a -1e del exón que flanquea el sitio de empalme 5' y 1 a 6 del intrón retenido, es idéntica a la secuencia de tipo silvestre correspondiente. Hay casos en que la secuencia de 16 nucleótidos en -15 a -1 del intrón retenido y 1e del exón que flanquea el sitio de empalme 3', es idéntica a la secuencia de tipo silvestre correspondiente. Como se usa en este documento, la "secuencia de tipo silvestre" se refiere a la secuencia de nucleótidos para el gen PRPF3 o PRPF8 en el genoma de referencia publicado depositado en el repositorio de información biológica y científica del NCBI. Como se usa en este documento, la "secuencia PRPF3 de tipo silvestre" se refiere a la secuencia canónica disponible en NCBI Gene ID 9129. Como se usa en este documento, la "secuencia PRPF8 de tipo silvestre" se refiere a la secuencia canónica disponible en NCBI Gene ID 10594. También se usa en el presente documento, una posición de nucleótido distinguida con una "e" indica que el nucleótido está presente en la secuencia de un exón. (porejemplo, el exón que flanquea el sitio de empalme 5' o el exón que flanquea el sitio de empalme 3').
Los métodos implican la puesta en contacto de las células con un ASO que es complementario a una porción de un pre-ARNm que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8, lo que da como resultado un aumento de la expresión de la proteína PRpF3 o PRPF8, respectivamente. Como se usa en el presente documento, "poner en contacto" o administrar células, se refiere a cualquier método para proporcionar un ASO en proximidad inmediata con las células de manera que interactúen el ASO y las células. Una célula que se pone en contacto con un ASO tomará o transportará los ASOs a la célula. El método implica la puesta en contacto de una célula asociada con una afección o una enfermedad o célula relevante para una afección o enfermedad, con cualquiera de los ASOs descritos en el presente documento. En algunos casos, el ASO puede ser modificado o unido (por ejemplo, unido de modo covalente) a otra molécula para dirigir el ASO a un tipo de célula, mejorar el contacto entre el ASO y la célula asociada con afección o enfermedad o célula relevante para la afección o enfermedad, o mejorar la absorción del ASO.
Como se usa en este documento, el término "aumento de la producción de proteína" o "aumento de la expresión de una proteína objetivo" significa el aumento de la cantidad de proteína que se traduce de un ARNm en una célula. Una "proteína objetivo" puede ser cualquier proteína para la que se desea una mayor expresión/producción.
Hay casos en que la puesta en contacto con una célula que expresa un pre-mARN con RIC de PRPF3 o PRPF8, con un ASO que es complementario a una porción objetivo de la transcripción de pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8, da como resultado un aumento medible en la cantidad de la proteína PRPF3 o PRPF8 (por ejemplo, una proteína objetivo) codificada por el pre-ARNm. Los métodos para medir o detectar la producción de una proteína serán evidentes para un experto en la técnica, e incluyen cualquier método conocido, por ejemplo, electrotransferencia, citometría de flujo, microscopía de inmunofluorescencia y ELISA.
Hay casos en que la puesta en contacto de las células con un ASO que es complementario a una porción objetivo de una transcripción de pre-ARNm con RIC de PRPF3 y/o PRPF8, da como resultado un aumento en la cantidad de proteína PRPF3 y/o PRPF8 producida, em al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o 1000 %, en comparación con la cantidad de proteína producida por una célula en ausencia de ASO/ausencia de tratamiento. Hay casos en que la cantidad total de proteína PRPF3 o PRPF8 producida por la célula con la que se puso en contacto el oligómero antisentido aumenta aproximadamente 1.1 a aproximadamente 10 veces aproximadamente 1.5 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 10 veces aproximadamente 3 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 4 a aproximadamente 10 veces aproximadamente 1.1 a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 1.1 a aproximadamente 6 veces aproximadamente 1.1 a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 1.1 a aproximadamente 8 veces aproximadamente 1.1 a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 5 veces aproximadamente 2 a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 4 a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 4 a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 4 a aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 1.1 veces, al menos aproximadamente 1.5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2.5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 3.5 veces, al menos aproximadamente 4 veces, en al menos aproximadamente 5 veces, o al menos aproximadamente 10 veces, en comparación con la cantidad de proteína objetivo producida por un compuesto de control. Un compuesto de control puede ser, por ejemplo, un oligonucleótido que no es complementario a la porción objetivo del pre-ARNm con RIC.
En algunos casos, la puesta en contacto de las células con un ASO que es complementario a una porción objetivo de una transcripción de pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8, da como resultado un aumento en la cantidad de ARNm que codifica PRPF3 o PRPF8, incluido el ARNm maduro que codifica la proteína objetivo. En algunos casos, la cantidad de ARNm que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8, o el ARNm maduro que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8, aumenta en al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o 1000 %, en comparación con la cantidad de proteína producida por una célula en ausencia de ASO/ausencia de tratamiento. Hay casos en que la cantidad total de ARNm que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8, o el ARNm maduro que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8 producida en la célula con la que se puso en contacto el oligómero antisentido aumenta en aproximadamente 1.1 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 1.5 a aproximadamente 10, aproximadamente 2 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 4 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 1.1 a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 1.1 a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 1.1 a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 1.1 a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 1.1 a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 2 a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 4 a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 4 a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 4 a aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 1.1 veces, al menos aproximadamente 1.5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2.5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 3.5 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, o al menos aproximadamente 10 veces, en comparación con la cantidad de ARN maduro producido en una célula no tratada, por ejemplo, una célula no tratada o una célula tratada con un compuesto de control. Un compuesto de control puede ser, por ejemplo, un oligonucleótido que no es complementario a la porción objetivo del pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 .
Empalme constitutivo de un intrón retenido a partir de un pre-ARNm con RIC
Los métodos y las composiciones de oligonucleótidos antisentido proporcionados en este documento son útiles para aumentar la expresión de la proteína PRPF3 o PRPF8 en las células, por ejemplo, en un sujeto que tiene RP causada por una deficiencia en la cantidad o actividad de la proteína PRPF3 o PRPF8, aumentando el nivel de ARNm que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8, o el ARNm maduro que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8. En particular, los métodos y composiciones descritos en este documento inducen el empalme constitutivo de un intrón retenido de una transcripción de pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8, aumentando así el nivel de ARNm que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8, o el ARNm maduro que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8 y aumentando la expresión de la proteína PRPF3 o PRPF8.
El empalme constitutivo de un intrón retenido de un pre-ARNm con RIC elimina correctamente el intrón retenido del pre-ARNm con RIC, en donde el intrón retenido tiene secuencias de empalme de tipo silvestre. El empalme constitutivo, como se usa en este documento, no incluye el empalme de un intrón retenido de un pre-ARNm RIC transcrito de un gen o alelo que tiene una mutación que causa un empalme alternativo o un empalme aberrante de un pre-ARNm transcrito del gen o alelo. Por ejemplo, el empalme constitutivo de un intrón retenido, como es inducido usando los métodos y los oligonucleótidos antisentido proporcionados en este documento, no corrige el empalme aberrante ni influye en el empalme alternativo de un pre-ARNm, para dar como resultado un aumento de la expresión de una proteína objetivo o ARN funcional.
En algunos casos, el empalme constitutivo elimina correctamente un intrón retenido de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8, en donde el pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 es transcrito a partir de un gen o alelo de tipo silvestre, o un gen o alelo polimórfico, que codifica una proteína objetivo completamente funcional o ARN funcional, y en donde el gen o alelo no tiene una mutación que cause empalme alternativo o empalme aberrante del intrón retenido.
En algunos casos, el empalme constitutivo de un intrón retenido de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8 elimina correctamente un intrón retenido de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8, en donde el pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 es transcrito a partir de un gen o alelo a partir del cual el gen objetivo o el ARN funcional es producido a un nivel reducido, en comparación con la producción a partir de un alelo de tipo silvestre, y en donde el gen o alelo no tiene una mutación que provoque un empalme alternativo o empalme aberrante del intrón retenido. En estos casos, la eliminación correcta del intrón retenido y empalmado constitutivamente da como resultado la producción de proteína objetivo o ARN funcional que es funcional cuando se compara con una proteína de tipo silvestre equivalente o ARN funcional.
En otros casos, el empalme constitutivo elimina correctamente un intrón retenido de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8, en donde el pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 es transcrito a partir de un gen o alelo que codifica una proteína objetivo o ARN funcional producido en una forma que tiene una función reducida en comparación con una proteína de tipo silvestre equivalente o ARN funcional, y donde el gen o alelo no tiene una mutación que provoque un empalme alternativo o un empalme aberrante del intrón retenido. En estos casos, la eliminación correcta del intrón retenido y empalmado constitutivamente da como resultado la producción de proteína objetivo parcialmente funcional, o ARN funcional que es parcialmente funcional, cuando se compara con una proteína de tipo silvestre equivalente o ARN funcional.
La "eliminación correcta" del intrón retenido por empalme constitutivo se refiere a la eliminación de todo el intrón, sin eliminar ninguna parte de un exón.
En algunos casos, un oligómero antisentido como se describe en este documento o usado en cualquier método descrito en este documento, no aumenta la cantidad de ARNm que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8 o la cantidad de proteína PRPF3 o PRPF8, modulando el empalme alternativo o el empalme aberrante de un pre-ARNm transcrito del gen PRPF3 o PRPF8. La modulación del empalme alternativo o empalme aberrante puede ser medida utilizando cualquier método conocido para analizar la secuencia y la longitud de las especies de ARN. por ejemplo, por RT-PCR y usando métodos descritos en otras partes de este documento y en la literatura. En algunos casos, la modulación del empalme alternativo o aberrante es determinada basándose en un aumento o disminución en la cantidad de especies empalmadas de interés, de al menos un 10 % o 1.1 veces. En algunos casos, la modulación se determina en base a un aumento o disminución a un nivel que es al menos del 10 % al 100 % o de 1.1 a 10 veces, como se describe en este documento, respecto a la determinación de un aumento en el ARNm que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8 en los métodos de la divulgación.
Hay casos en que el método es un método en donde el pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 fue producido por empalme parcial de un pre-ARNm de PRPF3 o PRPF8 de tipo silvestre. Hay casos en que el método es un método en donde el pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 fue producido mediante el empalme parcial de un pre-ARNm de PRPF3 o PRPF8 de tipo silvestre de longitud completa. Hay casos en que el pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 fue producido mediante el empalme parcial de un pre-ARNm de PRPF3 o PRPF8 de longitud completa. En estos casos, un pre-ARNm de PRPF3 o PRPF8 puede tener un polimorfismo en un sitio de empalme del intrón retenido, que no perjudica el empalme correcto del intrón retenido, en comparación con el empalme del intrón retenido que tiene la secuencia del sitio de empalme de tipo silvestre.
En algunos casos, el ARNm que codifica la proteína PRPF3 o PRPF8 es un ARNm maduro de longitud completa o un ARNm maduro de tipo silvestre. En estos casos, un ARNm maduro de longitud completa puede tener un polimorfismo que no afecta la actividad de la proteína objetivo o el ARN funcional codificado por el ARNm maduro, en comparación con la actividad de la proteína PRPF3 o PRPF8 codificada por el ARNm maduro de tipo silvestre.
Oligómeros antisentido
Un aspecto de la presente divulgación es una composición que comprende oligómeros antisentido que mejora el empalme al unirse a una porción objetivo de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8. Como se usa en el presente documento, los términos "ASO" y "oligómero antisentido" se usan indistintamente y se refieren a un oligómero tal como un polinucleótido, que comprende nucleobases, que se hibrida con una secuencia de ácido nucleico objetivo. (por ejemplo, a pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8) por emparejamiento de bases de Watson-Crick o emparejamiento de bases de oscilación (GU). El ASO puede tener una secuencia exacta complementaria a la secuencia objetivo o casi complementaria (por ejemplo, suficiente complementariedad para unir la secuencia objetivo y mejorar el empalme en un sitio de empalme). Los ASOs están diseñados para que se unan (hibriden) a un ácido nucleico objetivo (por ejemplo, una porción dirigida de una transcripción de pre-ARNm) y permanezcan hibridadas bajo condiciones fisiológicas. Típicamente, si se hibridan con un sitio distinto de la secuencia de ácido nucleico pretendida (dirigida), se hibridan con un número limitado de secuencias que no son un ácido nucleico objetivo (con unos pocos sitios distintos de un ácido nucleico objetivo). El diseño de un ASO puede tener en cuenta la ocurrencia de la secuencia de ácido nucleico de la porción objetivo de la transcripción de pre-mARN o una secuencia de ácido nucleico suficientemente similar en otras ubicaciones en el genoma o pre-mARN o transcriptoma celular, de modo que la probabilidad de que el ASO vinculará otros sitios y causará efectos "fuera del objetivo", es limitada. Cualquier oligómero antisentido conocido en la técnica, por ejemplo en la solicitud PCT No. PCT/US2014/054151, publicada como WO 2015/035091, titulada "Reducing Nonsense-Mediated mRNA Decay", puede ser utilizada para practicar los métodos descritos en el presente documento.
En algunos casos, los ASOs "se hibridan específicamente" o son "específicos" de un ácido nucleico objetivo o una porción objetivo de un pre-ARNm con RIC. Típicamente, tal hibridación ocurre con una T m sustancialmente mayor que 37 °C, preferiblemente al menos 50 °C, y típicamente entre 60 °C y aproximadamente 90 °C. Tal hibridación corresponde preferiblemente a condiciones rigurosas de hibridación. A una fuerza iónica y un pH dados, la Tm es la temperatura a la que el 50 % de una secuencia objetivo se hibrida con un oligonucleótido complementario.
Los oligómeros, tales como oligonucleótidos, son "complementarios" entre sí cuando la hibridación ocurre en una configuración antiparalela entre dos polinucleótidos monocatenarios. Un polinucleótido de doble hebra puede ser "complementario" de otro polinucleótido, si puede producirse la hibridación entre una de las hebras del primer polinucleótido y el segundo. La complementariedad (el grado en que un polinucleótido es complementario con otro) es cuantificable en términos de la proporción (por ejemplo, el porcentaje) de bases en hebras opuestas de los que se espera formen enlaces de hidrógeno entre sí, de acuerdo con las reglas generalmente aceptadas de emparejamiento de bases. No se necesita que la secuencia de un oligómero antisentido (ASO) sea 100 % complementaria a la de su ácido nucleico objetivo para hibridar. En ciertos casos, los ASOs pueden comprender al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % de complementariedad de secuencia con una región objetivo, dentro de la secuencia de ácido nucleico objetivo a la que se dirigen. Por ejemplo, un ASO en donde 18 de 20 nucleobases del compuesto oligomérico son complementarias a una región objetivo y, por lo tanto, se hibridarían específicamente, representaría un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden ser agrupadas o intercaladas con nucleobases complementarias y no es necesario que sean contiguas entre sí o con nucleobases complementarias. El porcentaje de complementariedad de un ASO con una región de un ácido nucleico objetivo puede ser determinado de forma rutinaria usando programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineación local) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul y col., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410.; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656).
No se necesita que un ASO hibride con todas las nucleobases en una secuencia objetivo, y las nucleobases con las que hibrida pueden ser contiguas o no contiguas. Los ASOs pueden hibridar sobre uno o más segmentos de una transcripción de pre-ARNm, de modo que los segmentos intermedios o adyacentes no estén involucrados en el evento de hibridación. (por ejemplo, se puede formar una estructura de bucle o una estructura de horquilla). En ciertos casos, un ASO se hibrida con nucleobases no contiguas en una transcripción de pre-ARNm objetivo. Por ejemplo, un ASO puede hibridar con nucleobases en una transcripción de pre-ARNm, que están separados por una o más nucleobase (s) con las que el ASO no hibrida.
Los ASOs descritos en este documento comprenden nucleobases que son complementarias a las nucleobases presentes en una porción objetivo de un pre-ARNm con RIC. El término ASO incluye oligonucleótidos y cualquier otra molécula oligomérica que comprenda nucleobases capaces de hibridar con una nucleobase complementaria en un ARNm objetivo, pero no comprenda un fragmento de azúcar, tal como un ácido nucleico peptídico (PNA). Los ASOs pueden comprender nucleótidos de origen natural, análogos de nucleótidos, nucleótidos modificados o cualquier combinación de dos o tres de los anteriores. El término "nucleótidos de origen natural" incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y/o que tienen una cadena principal modificada. En algunos casos, todos los nucleótidos del ASO son nucleótidos modificados. Las modificaciones químicas de los ASOs o componentes de los ASOs que son compatibles con los métodos y composiciones descritos en este documento, serán evidentes para un experto en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Patente de Estados Unidos No. 8,258,109 B2, Patente de Estados Unidos No. 5,656,612, Publicación de patente de EE. UU. Núm. 2012/0190728, y Dias y Stein, Mol. Cancer Ther. 2002, 1, 347-355.
La nucleobase de un ASO puede ser cualquier nucleobase que ocurre de modo natural, no modificada, como adenina, guanina, citosina, timina y uracilo, o cualquier nucleobase sintética o modificada que sea lo suficientemente similar a una nucleobase no modificada, de modo que sea capaz de formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase. presente en un pre-ARNm objetivo. Los ejemplos de nucleobases modificadas incluyen, sin limitación, hipoxantina, xantina, 7-metilguanina, 5,6-dihidrouracilo, 5-metilcitosina y 5-hidroximetoilcitosina.
Los ASOs descritos en el presente documento también comprenden una estructura principal que conecta los componentes de un oligómero. Los términos "estructura de la cadena principal" y "enlaces oligoméricos" pueden ser usados indistintamente, y se refieren a la conexión entre los monómeros del ASO. En los oligonucleótidos que ocurren de modo natural, la cadena principal comprende un enlace fosfodiéster 3'-5' que conecta restos de azúcar del oligómero. La estructura de la cadena principal o los enlaces oligoméricos de los ASOs divulgados en este documento pueden incluir (pero no se limitan a) fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenato, fosforodiselenato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforamidato y similares. Ver, por ejemplo, LaPlanche et al., Nucleic Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein et al., Nucleic Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al., Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford Inglaterra (1991)); Stec et al., Pat. De EEUU No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990). En algunos casos, la estructura principal del ASO no contiene fósforo sino que contiene enlaces peptídicos, por ejemplo, en un ácido nucleico peptídico (PNA), o grupos de enlace que incluyen carbamato, amidas y grupos hidrocarbonados lineales y cíclicos. En algunos casos, la modificación de la cadena principal es un enlace fosfotioato. En algunos casos, la modificación de la cadena principal es un enlace fosforamidato.
En algunos casos, la estereoquímica en cada uno de los enlaces internucleotídicos de fósforo de la cadena principal de ASO es aleatoria. En algunos casos, la estereoquímica en cada uno de los enlaces internucleotídicos de fósforo de la cadena principal de ASO está controlada y no es aleatoria. Por ejemplo, la patente de EE.UU. App. Pub. Núm.
2014/0194610, " Methods for the Synthesis of Functionalized Nucleic Acids,", incorporada aquí como referencia, describe métodos para seleccionar independientemente la asimetría de la quiralidad en cada átomo de fósforo en un oligómero de ácido nucleico. Un ASO usado en los métodos de la divulgación, incluyendo, pero sin limitarse a, cualquiera de los ASOs establecidos en este documento en la Tabla 1, comprende un ASO que tiene enlaces internucleotídicos de fósforo que no son aleatorios. Una composición usada en los métodos de la divulgación comprende un ASO diastereoisomérico puro. Hay casos en que una composición usada en los métodos de la divulgación comprende un ASO que tiene una pureza diastereoisomérica de al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 91 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 %, aproximadamente 100 %, aproximadamente 90 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 91 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 92 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 93 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 94 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 95 % a aproximadamente 100 %,
aproximadamente 96 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 97 % a aproximadamente 100 %,
aproximadamente 98 % a aproximadamente 100 %, o aproximadamente 99 % a aproximadamente 100 %.
En algunos casos, el ASO tiene una mezcla no aleatoria de configuraciones Rp y Sp en sus enlaces internucleotídicos
de fósforo. Por ejemplo, se ha sugerido que se requiere una mezcla de Rp y Sp en oligonucleótidos antisentido para
lograr un equilibrio entre buena actividad y estabilidad de nucleasa (Wan, et al., 2014, "Synthesis, biophysical
properties and biological activity of second generation antisense oligonucleotides containing chiral phosphorothioate
linkages," Nucleic Acids Research 42(22): 13456-13468, incorporado en este documento como referencia). Hay casos
en que un ASO usado en los métodos de la divulgación, incluyendo, pero sin limitarse a, cualquiera de los ASOs
establecidos aquí en la Tabla 1, comprende aproximadamente 5-100 % de Rp, al menos aproximadamente 5 % de
Rp, al menos aproximadamente 10 % de Rp, al menos aproximadamente el 15 % de Rp, al menos aproximadamente
el 20 % de Rp, al menos aproximadamente el 25 % de Rp, al menos aproximadamente el 30 % de Rp, al menos
aproximadamente el 35 % de Rp, al menos aproximadamente el 40 % de Rp, al menos aproximadamente el 45 % de
Rp, al menos aproximadamente el 50 % de Rp, al menos aproximadamente el 55 % de Rp, al menos aproximadamente
el 60 % de Rp, al menos aproximadamente el 65 % de Rp, al menos aproximadamente el 70 % de Rp, al menos
aproximadamente el 75 % de Rp, al menos aproximadamente el 80 % de Rp , al menos aproximadamente el 85 % de
Rp, al menos aproximadamente el 90 % de Rp, o al menos aproximadamente el 95 % de Rp, con el restante de Sp, o
aproximadamente el 100 % de Rp. Hay casos en que un a So usado en los métodos de la divulgación, incluyendo,
pero sin limitarse a, cualquiera de los ASOs establecidos en este documento en la Tabla 1, comprende
aproximadamente 10 % a aproximadamente 100 % de Rp, aproximadamente 15 % a aproximadamente 100 % de Rp,
de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 100 % de Rp, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente
el 100 % de Rp, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 100 % de Rp, de aproximadamente el 35 % a
aproximadamente el 100 % de Rp, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 100 % de Rp, de
aproximadamente el 45 % a aproximadamente 100 % de Rp, aproximadamente 50 % a aproximadamente 100 % de
Rp, aproximadamente 55 % a aproximadamente 100 % de Rp, aproximadamente 60 % a aproximadamente 100 % de
Rp, aproximadamente 65 % a aproximadamente 100 % de Rp, aproximadamente 70 % a aproximadamente 100 % de
Rp, aproximadamente 75 % a aproximadamente 100 % de Rp, aproximadamente 80 % a aproximadamente 100 % de
Rp, aproximadamente 85 % a aproximadamente 100 % de Rp, aproximadamente 90 % a aproximadamente 100 % de
Rp, o aproximadamente 95 % a aproximadamente 100 % de Rp, aproximadamente 20 % a aproximadamente 80 %
de Rp, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 75 % de Rp, de aproximadamente el 30 % a
aproximadamente el 70 % de Rp, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 60 % de Rp, o de
aproximadamente el 45 % a aproximadamente el 55 % de Rp, con el remanente de Sp.
Hay casos en que un ASO utilizado en los métodos de la divulgación, que incluye, pero sin limitarse a, cualquiera de
los ASOs establecidos en la presente memoria en la Tabla 1, comprende aproximadamente 5-100 % de Sp, al menos
aproximadamente 5 % de Sp, al menos aproximadamente 10 % de Sp, al menos aproximadamente 15 % de Sp, al
menos aproximadamente 20 % de Sp, al menos aproximadamente 25 % de Sp, al menos aproximadamente 30 % de
Sp, al menos aproximadamente 35 % de Sp, al menos aproximadamente 40 % de Sp, al menos aproximadamente 45
% de Sp, al menos aproximadamente 50 % de Sp, al menos aproximadamente 55 % de Sp, al menos
aproximadamente 60 % de Sp, al menos aproximadamente 65 % de Sp, al menos aproximadamente 70 % de Sp, al
menos aproximadamente 75 % de Sp, al menos aproximadamente 80 % de Sp , al menos aproximadamente el 85 %
de Sp, al menos aproximadamente el 90 % de Sp, o al menos aproximadamente el 95 % de Sp, con el restante de Rp,
o aproximadamente el 100 % de Sp. Hay casos en que un ASO usado en los métodos de la divulgación, que incluye,
de Sp de Sp de Sp de Sp de Sp de Sp de Sp
Figure imgf000022_0001
de Sp
Cualquiera de los ASOs descritos en el presente documento puede contener un fragmento de azúcar que comprende
ribosa o desoxirribosa, tal como está presente en los nucleótidos que ocurren de modo natural, o un fragmento de
azúcar modificado o análogo de azúcar, incluido un anillo de morfolina. Los ejemplos no limitantes de restos de azúcar
modificados incluyen sustituciones en 2' tales como 2'-O-metilo (2'-O-Me), 2'-O-metoxietilo (2'MOE), 2'-O-aminoetilo,
2' F; N3 '-> P5' fosforamidato, 2' dimetilaminooxietoxi, 2' dimetilaminoetoxietoxi, 2'-guanidinidio, etil 2'-O-guanidinio,
azúcares modificados con carbamato y azúcares modificados bicíclicos. En algunos casos, la modificación del
fragmento de azúcar se selecciona entre 2'-O-Me, 2'F y 2'MOE. En algunos casos, la modificación del fragmento de
azúcar es un enlace puente adicional, como en un ácido nucleico bloqueado (LNA). En algunos casos, el análogo de
azúcar contiene un anillo de morfolina, como el fosforodiamidato morfolino (PMO). En algunos casos, el fragmento de azúcar comprende una modificación con ribofuranosilo o 2'desoxirribofuranosilo. En algunos casos, el fragmento de azúcar comprende modificaciones con 2'O-metiloxietilo (cMOE) restringidas en 2'4'. En algunos casos, el fragmento de azúcar comprende modificaciones con 2'-O etil BNA restringidas con cEt 2',4'. En algunos casos, el fragmento de azúcar comprende modificaciones con tricicloADN (tcADN). En algunos casos, el fragmento de azúcar comprende modificaciones con ácido etileno nucleico (ENA). En algunos casos, el fragmento de azúcar comprende modificaciones con MCE. Se conocen modificaciones en la técnica y se describen en la literatura, por ejemplo, por Jarver, et al., 2014, "A Chemical View of Oligonucleotides for Exon Skipping and Related Drug Applications," Nucleic Acid Therapeutics 24(1): 37-47.
En algunos ejemplos, cada monómero del ASO es modificado de la misma manera, por ejemplo, cada enlace de la cadena principal del ASO comprende un enlace fosforotioato o cada fragmento de azúcar ribosa comprende una modificación 2'O-metilo. Tales modificaciones que están presentes en cada uno de los componentes monoméricos de un ASO se denominan "modificaciones uniformes". En algunos ejemplos, se puede desear una combinación de diferentes modificaciones, por ejemplo, un ASO puede comprender una combinación de enlaces fosforodiamidato y fragmentos de azúcar que comprenden anillos de morfolina (morfolinos). Las combinaciones de diferentes modificaciones de un ASO son denominadas "modificaciones mixtas" o "químicas mixtas".
En algunos casos, el ASO comprende una o más modificaciones de la cadena principal. En algunos casos, el ASO comprende una o más modificaciones de fragmentos de azúcar. En algunos casos, el ASO comprende una o más modificaciones de la cadena principal y una o más modificaciones de fragmento de azúcar. En algunos casos, el ASO comprende modificaciones 2'MOE y una cadena principal de fosforotioato. En algunos casos, el ASO comprende un fosforodiamidato morfolino (PMO). En algunos casos, el ASO comprende un ácido nucleico peptídico (PNA). Cualquiera de los ASOs o cualquier componente de un ASO (por ejemplo, una nucleobase, fragmento de azúcar, cadena principal) descritos en el presente documento pueden modificarse para lograr las propiedades o actividades deseadas del ASO o reducir las propiedades o actividades no deseadas del ASO. Por ejemplo, un ASO o uno o más componentes de cualquier ASO pueden ser modificados para mejorar la afinidad de unión a una secuencia objetivo en una transcripción de pre-ARNm; reducir la unión a cualquier secuencia no objetivo; reducir la degradación por nucleasas celulares (es decir, RNasa H); mejorar la captación del ASO en una célula y/o en el núcleo de una célula; alterar la farmacocinética o la farmacodinamia del ASO; y modular la semivida del ASO.
En algunos casos, los ASOs están compuestos por nucleótidos modificados con 2'-O- (2-metoxietil) (MOE) fosforotioato. Los ASOs compuestos por tales nucleótidos son especialmente adecuados para los métodos divulgados en el presente documento; se ha demostrado que los oligómeros que tienen tales modificaciones tienen una resistencia significativamente mejorada a la degradación por nucleasas y una mayor biodisponibilidad, haciéndolos adecuados, por ejemplo, para la administración oral en algunos casos descritos en el presente documento. Ver por ejemplo, Geary y col., J Pharmacol Exp Ther. 2001; 296 (3): 890-7; Geary y col., J Pharmacol Exp Ther. 2001; 296 (3): 898-904.
Los expertos en la técnica conocerán métodos para la síntesis de ASO. Alternativa o adicionalmente, los ASOs pueden ser obtenidos de una fuente comercial.
A menos que se especifique lo contrario, el extremo izquierdo del ácido nucleico monocatenario (por ejemplo, transcripción de pre-ARNm, oligonucleótido, ASO, etc.) es el extremo 5' y la dirección izquierda de las secuencias de ácido nucleico monocatenario o bicatenario se denomina dirección 5'. De manera similar, el extremo o dirección de la derecha de una secuencia de ácido nucleico (monocatenario o bicatenario) es el extremo o dirección 3'. Generalmente, una región o secuencia que está en 5' respecto a un punto de referencia en un ácido nucleico se denomina "corriente arriba" y una región o secuencia que está en 3' respecto a un punto de referencia en un ácido nucleico es denominada "corriente abajo". Generalmente, la dirección o el extremo 5' de un ARNm es donde se ubica el codón de inicio o de partida, mientras que el extremo o la dirección 3' es donde se ubica el codón de terminación. En algunos aspectos, los nucleótidos que están corriente arriba de un punto de referencia en un ácido nucleico pueden ser designados con un número negativo, mientras los nucleótidos que están corriente abajo de un punto de referencia pueden ser designados con un número positivo. Por ejemplo, un punto de referencia (por ejemplo, una unión exón-exón en el ARNm) puede ser designado como el sitio "cero", y un nucleótido que está directamente adyacente y corriente arriba del punto de referencia es designado como "menos uno", por ejemplo, "-1", mientras un nucleótido que está directamente adyacente y aguas abajo del punto de referencia es designado "más uno", por ejemplo, "+1."
En otros casos, los ASOs son complementarios (y se unen a) una porción objetivo de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 que está aguas abajo (en la dirección 3') del sitio de empalme 5' del intrón retenido en un pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 (por ejemplo, la dirección designada por números positivos en relación con el sitio de empalme 5') (Figura 1). En algunos casos, los ASOs son complementarios a una porción dirigida del pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 que está dentro de la región 6 a 100 respecto al sitio de empalme 5' del intrón retenido. En algunos casos, el ASO no es complementario de los nucleótidos 1 a 5 en relación con el sitio de empalme 5' (los primeros cinco nucleótidos ubicados corriente abajo del sitio de empalme 5'). En algunos casos, los ASOs pueden ser complementarios a una porción objetivo de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8, que está dentro de la región entre los nucleótidos 6 y 50, en relación con el sitio de empalme 5' del intrón retenido. En algunos aspectos, los ASOs son complementarios a una porción objetivo que se encuentra dentro de la región 6 a 90, 6 a 80, 6 a 70, 6 a 60, 6 a 50, 6 a 40, 6 a 30 o 6 a 20 relativa al sitio de empalme 5' del intrón retenido.
En algunos casos, los ASOs son complementarios a una región objetivo de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 que está aguas arriba (5' relativo) del sitio de empalme 3' del intrón retenido en un pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 (por ejemplo, en la dirección designada por números negativos) (Figura 1). En algunos casos, los ASOs son complementarios a una porción objetivo del pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 que está dentro de la región -16 a -100 en relación con el sitio de empalme 3' del intrón retenido. En algunos casos, el ASO no es complementario de los nucleótidos -1 a -15 en relación con el sitio de empalme 3' (los primeros 15 nucleótidos ubicados corriente arriba del sitio de empalme 3'). En algunos casos, los ASOs son complementarios a una porción objetivo del pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 que está dentro de la región -16 a -50 con relación al sitio de empalme 3' del intrón retenido. En algunos aspectos, los ASOs son complementarios a una porción objetivo que se encuentra dentro de la región -16 a -90, -16 a -80, -16 a -70, -16 a -60, -16 a -50, -16 a -40, o -16 a -30 respecto al sitio de empalme 3' del intrón retenido.
Hay casos en que la porción objetivo del pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 está dentro de la región 100 respecto al sitio de empalme 5' del intrón retenido a -100 respecto al sitio de empalme 3' del intrón retenido.
En algunos casos, los ASOs son complementarios a una porción objetivo de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 que está dentro del exón que flanquea el sitio de empalme 5' (corriente arriba) del intrón retenido (Figura 1). En algunos casos, los ASOs son complementarios a una porción objetivo del pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 que está dentro de la región 2e a -4e en el exón que flanquea el sitio de empalme 5' del intrón retenido. En algunos casos, los ASOs no son complementarios de los nucleótidos -1e a -3e en relación con el sitio de empalme 5' del intrón retenido. En algunos casos, los ASOs son complementarios a una porción objetivo del pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 que se encuentra dentro de la región -4e a -100e, -4e a -90e, -4e a -80e, -4e a -70e, -4e a -60e, -4e a -50e, -4 a -40e , -4e a -30e, o -4e a -20e respecto al sitio de empalme 5' del intrón retenido.
En algunos casos, los ASOs son complementarios a una porción objetivo de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 que está dentro del exón que flanquea el sitio de empalme 3' (corriente abajo) del intrón retenido (Figura 1). En algunos casos, los ASOs son complementarios a una porción objetivo del pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 que está dentro de la región 2e a -4e en el exón que flanquea el sitio de empalme 3' del intrón retenido. En algunos casos, los ASOs no son complementarios del nucleótido 1e en relación con el sitio de empalme 3' del intrón retenido. En algunos casos, los ASOs son complementarios a una porción objetivo de la pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 que se encuentra dentro de la región 2e a 100e, 2e a 90e, 2e a 80e, 2e a 70e, 2e a 60e, 2e a 50e, 2e a 40e, 2e a 30e, o 2 a 20e en relación con el 3' sitio de empalme del intrón retenido. Los ASOs pueden tener cualquier longitud adecuada para la unión específica y la mejora eficaz del empalme. En algunos casos, los ASOs consisten en 8 a 50 nucleobases. Por ejemplo, el ASO puede ser de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45 o 50 nucleobases de longitud. En algunos casos, los ASOs consisten en más de 50 nucleobases. En algunos casos, el ASO es de 8 a 50 nucleobases, 8 a 40 nucleobases, 8 a 35 nucleobases, 8 a 30 nucleobases, 8 a 25 nucleobases, 8 a 20 nucleobases, 8 a 15 nucleobases, 9 a 50 nucleobases, 9 a 40 nucleobases, 9 a 35 nucleobases, 9 a 30 nucleobases, 9 a 25 nucleobases, 9 a 20 nucleobases, 9 a 15 nucleobases, 10 a 50 nucleobases, 10 a 40 nucleobases, 10 a 35 nucleobases, 10 a 30 nucleobases, 10 a 25 nucleobases, 10 a 20 nucleobases, 10 a 15 nucleobases, 11 a 50 nucleobases, 11 a 40 nucleobases, 11 a 35 nucleobases, 11 a 30 nucleobases, 11 a 25 nucleobases, 11 a 20 nucleobases, 11 a 15 nucleobases, 12 a 50 nucleobases, 12 a 40 nucleobases, 12 a 35 nucleobases, 12 a 30 nucleobases, 12 a 25 nucleobases, 12 a 20 nucleobases, 12 a 15 nucleobases, 13 a 50 nucleobases, 13 a 40 nucleobases, 13 a 35 nucleobases, 13 a 30 nucleobases, 13 a 25 nucleobases, 13 a 20 nucleobases, 14 a 50 nucleobases, 14 a 40 nucleobases, 14 a 35 nucleobases, 14 a 30 nucleobases bases, 14 a 25 nucleobases, 14 a 20 nucleobases, 15 a 50 nucleobases, 15 a 40 nucleobases, 15 a 35 nucleobases, 15 a 30 nucleobases, 15 a 25 nucleobases, 15 a 20 nucleobases, 20 a 50 nucleobases, 20 a 40 nucleobases, 20 a 35 nucleobases, 20 a 30 nucleobases, 20 a 25 nucleobases, 25 a 50 nucleobases, 25 a 40 nucleobases, 25 a 35 nucleobases o 25 a 30 nucleobases de longitud. En algunos casos, los ASOs tienen 18 nucleótidos de longitud. En algunos casos, los ASOs tienen una longitud de 15 nucleótidos. En algunos casos, los ASOs tienen una longitud de 25 nucleótidos.
En algunos casos, se usan dos o más ASO con diferentes químicas pero complementarios a la misma porción objetivo del pre-ARNm con RIC. En algunos casos, se usan dos o más ASO que son complementarios a diferentes porciones dirigidas del pre-ARNm con RIC.
Hay casos en que los oligonucleótidos antisentido de la divulgación están unidos químicamente a uno o más fragmentos o conjugados, por ejemplo, un fragmento de direccionamiento u otro conjugado que mejora la actividad o captación celular del oligonucleótido. Dichos fragmentos incluyen, pero no se limitan a, un fragmento lipídico, por ejemplo, como un fragmento de colesterol, un fragmento de colesterilo, una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecanodiol o undecilo, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o ácido adamantano acético. En la literatura publicada se han descrito oligonucleótidos que comprenden fragmentos lipofílicos y métodos de preparación. Hay casos en que el oligonucleótido antisentido se conjuga con un fragmento que incluye, pero no se limita a, un nucleótido abásico, un poliéter, una poliamina, una poliamida, un péptido, un carbohidrato, por ejemplo, N-acetilgalactosamina (GalNAc), N-Ac-Glucosamina (GluNAc) o manosa (por ejemplo, manosa-6-fosfato), un lípido o un compuesto de polihidrocarburo. Los conjugados pueden unirse a uno o más de cualesquier nucleótidos que comprenden el oligonucleótido antisentido en cualquiera de varias posiciones en el azúcar, base o grupo fosfato, como se entiende en la técnica y se describe en la literatura, por ejemplo, usando un enlazador. Los enlazadores pueden incluir un enlazador ramificado bivalente o trivalente. Hay casos en que el conjugado se une al extremo 3' del oligonucleótido antisentido. Por ejemplo, en la patente de EE.UU. N° 8,450,467, "Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides". Se describen métodos para preparar conjugados de oligonucleótidos.
En algunos casos, el ácido nucleico al que se dirigirá un ASO es un pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8 expresado en una célula, como una célula eucariota. En algunos casos, el término "célula" puede referirse a una población de células. En algunos casos, la célula está en un sujeto. En algunos casos, la célula se aísla de un sujeto. En algunos casos, la célula es ex vivo. En algunos casos, la célula es una célula o línea celular relevante para una enfermedad o afección. En algunos casos, la célula está in vitro (por ejemplo, en cultivo celular).
Composiciones farmacéuticas
Las composiciones o formulaciones farmacéuticas que comprenden el oligonucleótido antisentido de las composiciones descritas y para su uso en cualquiera de los métodos descritos, pueden ser preparadas de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica y descritas en la literatura publicada. Hay casos en que una composición o formulación farmacéutica para el tratamiento de un sujeto, comprende una cantidad eficaz de cualquier oligómero antisentido como se describe anteriormente, o una sal, solvato, hidrato o éster farmacéuticamente aceptable del mismo, y un diluyente farmacéuticamente aceptable. El oligómero antisentido de una formulación farmacéutica puede comprender además un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las sales farmacéuticamente aceptables son adecuadas para uso en contacto con tejidos humanos y de animales inferiores, sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica, etc. indebidas, y son proporcionales a una relación beneficio/riesgo razonable. (Ver, por ejemplo, SM Berge, et al., J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977), incorporado aquí como referencia para este propósito. Las sales pueden ser preparadas in situ durante el aislamiento final y la purificación de los compuestos, o por separado haciendo reaccionar la función de base libre con un ácido orgánico adecuado. Los ejemplos de sales de adición de ácido no tóxicas y farmacéuticamente aceptables son las sales de un grupo amino formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico o con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico o mediante el uso de otras metodologías documentadas como el intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato hexanoato, yodhidrato, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3- fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluensulfonato, undecanoato, sales de valerato y similares. Las sales representativas de metales alcalinos o alcalinotérreos incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen, cuando sea apropiado, cationes de amonio, amonio cuaternario y amina no tóxicas formadas usando iones contrarios tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, alquilsulfonatos inferiores y arilsulfonato.
En algunos casos, las composiciones se formulan en cualquiera de las muchas formas de dosificación posibles, tales como, pero no limitadas a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios y enemas. En algunos casos, las composiciones son formuladas como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes. Hay casos en que una formulación o composición farmacéutica de la presente divulgación incluye, pero no se limita a, una solución, emulsión, microemulsión, espuma o formulación que contiene liposomas (por ejemplo, liposomas catiónicos o no catiónicos).
La composición o formulación farmacéutica de la presente divulgación puede comprender uno o más potenciadores de la penetración, vehículos, excipientes u otros ingredientes activos o inactivos, según sea apropiado, y bien conocidos por los expertos en la técnica o descritos en la literatura publicada. En algunos casos, los liposomas también incluyen liposomas estabilizados estéricamente, por ejemplo, liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados. Estos lípidos especializados dan como resultado liposomas con una mayor vida útil de circulación. Hay casos en que un liposoma estabilizado estéricamente comprende uno o más glicolípidos o está transformado en derivado con uno o más polímeros hidrofílicos, tales como un fragmento de polietilenglicol (PEG). En algunos casos, se incluye un tensioactivo en la formulación o composición farmacéutica. El uso de tensioactivos en productos, formulaciones y emulsiones de fármacos es bien conocido en la técnica. En algunos casos, la presente divulgación emplea un potenciador de la penetración para efectuar la administración eficaz del oligonucleótido antisentido, por ejemplo, para ayudar a la difusión a través de las membranas celulares y/o mejorar la permeabilidad de un fármaco lipofílico. En algunos casos, el potenciador de la penetración es un tensioactivo, ácido graso, sal biliar, agente quelante o tensioactivo no quelante.
En algunos casos, la formulación farmacéutica comprende múltiples oligonucleótidos antisentido. Hay casos en que el oligonucleótido antisentido es administrado en combinación con otro fármaco o agente terapéutico. Hay casos en que el oligonucleótido antisentido es administrado con uno o más agentes capaces de promover la penetración del oligonucleótido antisentido sujeto a través de la barrera hematoencefálica, mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la entrega de agentes mediante la administración de un vector de adenovirus a las neuronas motoras en el tejido muscular se describe en la patente de EE.UU. N° 6,632,427, "Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons", incorporada en este documento como referencia. La entrega de vectores directamente al cerebro, por ejemplo, el cuerpo estriado, el tálamo, el hipocampo o la sustancia negra, es descrita, por ejemplo, en Patente de EE.UU. N° 6,756,523, " Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain", incorporado en este documento como referencia.
En algunos casos, los oligonucleótidos antisentido están enlazados o conjugados con agentes que proporcionan propiedades farmacéuticas o farmacodinámicas deseables. Hay casos en que el oligonucleótido antisentido se acopla a una sustancia, conocida en la técnica por promover la penetración o el transporte a través de la barrera hematoencefálica, por ejemplo, un anticuerpo al receptor de transferrina. En algunos casos, el oligonucleótido antisentido se enlaza con un vector viral, por ejemplo, para hacer que el compuesto antisentido sea más eficaz o aumentar el transporte a través de la barrera hematoencefálica. Hay casos en que la interrupción de la barrera hematoencefálica osmótica es asistida por la infusión de azúcares, por ejemplo, mesoeritritol, xilitol, D (+) galactosa, D (+) lactosa, D (+) xilosa, dulcitol, mioinositol, L (-) fructosa, D (-) manitol, D (+) glucosa, D (+) arabinosa, D (-) arabinosa, celobiosa, D (+) maltosa, D (+) rafinosa, L (+) ramnosa, D (+) melibiosa, D (-) ribosa, adonitol, D (+) arabitol, L (-) arabitol, D (+) fucosa, L (-) fucosa, D (-) lixosa, L (+) lixosa y L (-) lixosa, o aminoácidos, por ejemplo, glutamina, lisina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glicina, histidina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, tirosina, valina y taurina. Los métodos y materiales para mejorar la penetración de la barrera hematoencefálica son descritos, por ejemplo, en patente de EE.UU. N° 4,866,042, "Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier", patente de EE.UU. N° 6,294,520, " Material for passage through the blood-brain barrier", y patente de EE.UU. N° 6,936,589, " Parenteral delivery systems", cada uno de ellos incorporado en este documento como referencia.
Hay casos en que los oligonucleótidos antisentido de la divulgación se unen químicamente a uno o más fragmentos o conjugados, por ejemplo, un fragmento de direccionamiento u otro conjugado que potencia la actividad o captación celular del oligonucleótido. Dichos fragmentos incluyen, pero no se limitan a, un fragmento de lípido, por ejemplo, como un fragmento de colesterol, un fragmento de colesterilo, una cadena alifática, por ejemplo, fragmentos de dodecanodiol o undecilo, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o ácido adamantano acético. En la literatura publicada se han descrito oligonucleótidos que comprenden fragmentos lipofílicos y métodos de preparación. Hay casos en que el oligonucleótido antisentido esta conjugado con un fragmento que incluye, pero no está limitado a, un nucleótido abásico, un poliéter, una poliamina, una poliamida, un péptido, un carbohidrato, por ejemplo, N-acetilgalactosamina (GalNAc), N-Ac-glucosamina (GluNAc) o manosa (por ejemplo, manosa-6-fosfato), un lípido o un compuesto de polihidrocarburo. Los conjugados pueden unirse a uno o más de cualesquiera nucleótidos que comprenden el oligonucleótido antisentido en cualquiera de varias posiciones en el azúcar, base o grupo fosfato, como se entiende en la técnica y se describe en la literatura, por ejemplo, usando un enlazador. Los enlazadores pueden incluir un enlazador ramificado bivalente o trivalente. Hay casos en que el conjugado se une al extremo 3' del oligonucleótido antisentido. Los métodos para la preparación de conjugados de oligonucleótidos son descritos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N° 8,450,467, "Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides".
Tratamiento de sujetos
Cualquiera de las composiciones proporcionadas en este documento puede ser administrada a un individuo. "Individuo" puede ser usado indistintamente con "sujeto" o "paciente". Un individuo puede ser un mamífero, por ejemplo un ser humano o un animal como un primate no humano, un roedor, un conejo, una rata, un ratón, un caballo, un burro, una cabra, un gato, un perro, una vaca, un cerdo o una oveja. En algunos casos, el individuo es un ser humano. En algunos casos, el individuo es un feto, un embrión o un niño. En otros casos, el individuo puede ser otro organismo eucariota, como una planta. En algunos casos, las composiciones proporcionadas en este documento se administran a una célula. ex vivo.
En algunos casos, las composiciones proporcionadas en este documento son administradas a un individuo como método para tratar una enfermedad o trastorno. En algunos casos, el individuo tiene una enfermedad genética, como cualquiera de las enfermedades descritas en este documento. En algunos casos, el individuo corre el riesgo de tener la enfermedad, tal como cualquiera de las enfermedades descritas en este documento. En algunos casos, el individuo presenta un riesgo aumentado de tener una enfermedad o trastorno causado por una cantidad insuficiente de una proteína o una actividad insuficiente de una proteína. Si un individuo presenta "un riesgo aumentado" de tener una enfermedad o trastorno causado por una cantidad insuficiente de una proteína o una actividad insuficiente de una proteína, el método implica un tratamiento preventivo o profiláctico. Por ejemplo, un individuo puede presentar un riesgo aumentado de tener tal enfermedad o trastorno debido a los antecedentes familiares de la enfermedad.
Típicamente, las personas con un riesgo aumentado de padecer dicha enfermedad o trastorno se benefician del tratamiento profiláctico (por ejemplo, al prevenir o retrasar la aparición o progresión de la enfermedad o trastorno).
Las rutas adecuadas para la administración de ASO de la presente divulgación pueden variar dependiendo del tipo de célula a la que se desee entregar los ASOs. El ojo es el tejido más significativamente afectado en RP13 y RP18. Por tanto, un a So de la presente divulgación puede ser administrado a un sujeto mediante inyección intravítrea, mediante inyección subretiniana o mediante aplicación tópica en el ojo. Hay casos en que un ASO de la presente divulgación es administrado a un sujeto mediante un implante, por ejemplo, un fármaco encapsulado implantado en el ojo. En algunos casos, las células RPE tratadas ex vivo con un ASO de la presente divulgación se implantan en el ojo, por ejemplo, en forma encapsulada. Hay casos en que la terapia es administrada junto con los tratamientos existentes para la RP, por ejemplo, acetazolamida oral, bloqueadores de los canales de calcio, luteína o zeaxantina, ácido valproico oral o un agente inmunosupresor. Hay casos en que los ASOs se administran por vía parenteral. Hay casos en que los ASOs de la presente divulgación se administran a un sujeto por vía oral, mediante inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, inyección subcutánea o inyección intravenosa. En algunos casos, un feto se trata en el útero, por ejemplo, administrando la composición de ASO al feto directa o indirectamente (por ejemplo, a través de la madre).
Hay casos en que los sujetos tratados usando los métodos y composiciones se evalúan para mejorar su condición usando cualquier método conocido y descrito en la técnica.
Métodos para la identificación de ASO adicionales que mejoran el empalme
También dentro del alcance de la presente divulgación están los métodos para la identificación (determinación) de ASO adicionales que mejoran el empalme de un pre-ARNm con RIC de PRPF3 o PRPF8, específicamente en el intrón objetivo. Los ASOs que se hibridan específicamente con diferentes nucleótidos dentro de la región objetivo del pre-ARNm pueden ser discriminados para la identificación (determinación) de los ASOs que mejoran la velocidad y/o extensión de empalme del intrón objetivo. En algunos casos, el ASO puede bloquear o interferir con el sitio o sitios de unión de un represor/silenciador de empalme. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para identificar (determinar) un ASO que, cuando se hibrida con la región objetivo del intrón, da como resultado el efecto deseado (porejemplo, aumento de la producción de ARN funcional, de proteína o de empalme). Estos métodos también pueden ser usados para identificar ASO que mejoran el empalme del intrón retenido al unirse a una región objetivo en un exón que flanquea el intrón retenido, o en un intrón no retenido. A continuación se proporciona un ejemplo de un método que puede ser usado.
Puede realizarse una ronda de selección, denominada "recorrido" de ASO, utilizando ASO que han sido diseñados para hibridar con una región objetivo de un pre-ARNm. Por ejemplo, los ASOs utilizados en el recorrido de ASO pueden ser colocados en mosaico cada 5 nucleótidos, desde aproximadamente 100 nucleótidos corriente arriba del sitio de empalme 5' del intrón retenido (por ejemplo, una porción de la secuencia del exón ubicada corriente arriba del intrón objetivo/retenido) hasta aproximadamente 100 nucleótidos corriente abajo del sitio de empalme 5' del intrón objetivo/retenido y/o de aproximadamente 100 nucleótidos corriente arriba del sitio de empalme 3' del intrón retenido a aproximadamente 100 nucleótidos corriente abajo del sitio de empalme 3' del intrón objetivo/retenido (por ejemplo, una parte de la secuencia del exón ubicada corriente abajo del intrón objetivo/retenido). Por ejemplo, puede diseñarse un primer ASO de 15 nucleótidos de longitud para hibridar específicamente a los nucleótidos 6 a 20 respecto al sitio de empalme 5' del intrón objetivo/retenido. Un segundo ASO está diseñado para hibridar específicamente con los nucleótidos 11 a 25 en relación con el sitio de empalme 5' del intrón objetivo/retenido. Los ASOs están diseñados como tales, que abarcan la región objetivo del pre-ARNm. Hay casos en que los ASOs pueden ser colocados en mosaico de modo más cercano, por ejemplo, cada 1, 2, 3 o 4 nucleótidos. Además, los ASOs pueden ser colocados en mosaico desde 100 nucleótidos corriente abajo del sitio de empalme 5', hasta 100 nucleótidos corriente arriba del sitio de empalme 3'.
Se entregan uno o más ASO, o un ASO de control (un ASO con una secuencia codificada, secuencia de la que no se espera que hibride con la región objetivo), por ejemplo, por transfección, en una línea celular relevante para la enfermedad, que expresa el pre-ARNm (por ejemplo, el pre-ARNm con RIC descrito en otra parte del presente documento). Los efectos de inducción de empalme de cada uno de los ASOs pueden ser evaluados mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante transcriptasa inversa (RT) -PCR utilizando cebadores que abarcan la unión de empalme, como se describe en este documento (ver "Identificación de eventos de retención de intrones"). Una reducción o ausencia del producto de RT-PCR producido usando los cebadores que abarcan la unión de empalme en células tratadas con ASO, en comparación con las células tratadas con ASO de control, indica que se ha mejorado el empalme del intrón objetivo. En algunos casos, la eficacia de empalme, la relación de pre-ARNm empalmado y no empalmado, la velocidad de empalme o la extensión del empalme, pueden mejorar usando los ASOs divulgados en el presente documento. También puede evaluarse la cantidad de proteína o ARN funcional codificada por el pre-ARNm objetivo, para determinar si cada ASO logró el efecto deseado (por ejemplo, aumento de la producción de proteínas). Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para evaluar y/o cuantificar la producción de proteínas, tal como transferencia Western, citometría de flujo, microscopía de inmunofluorescencia y ELISA.
Puede realizarse una segunda ronda de selección, denominada "micro-recorrido" de ASO utilizando ASO que han sido diseñados para hibridar con una región objetivo de un pre-ARNm. Los ASOs utilizados en el micro-recorrido de ASO son colocados en mosaico cada 1 nucleótido, para refinar aún más la secuencia de ácidos nucleotídicos del pre-ARNm, que cuando se hibridan con un ASO da como resultado un empalme mejorado.
Las regiones definidas por los ASOs que promueven el empalme del intrón objetivo son exploradas con mayor detalle por medio de un "micro-recorrido" de ASO, que involucra a So espaciados en pasos de 1 nt, así como ASO más largos, típicamente 18-25 nt.
Como se describió anteriormente para el recorrido de ASO, el micro-recorrido de ASO se realiza entregando uno o más ASO, o un ASO de control (un ASO con una secuencia codificada, secuencia de la que no se espera que hibride con la región objetivo), por ejemplo mediante transfección, en una línea celular relevante para la enfermedad, que expresa el pre-ARNm objetivo. Los efectos de inducción de empalme de cada uno de los ASOs pueden ser evaluados mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante transcriptasa inversa (RT) -PCR utilizando cebadores que abarcan la unión de empalme, como se describe en este documento (ver "Identificación de eventos de retención de intrones"). Una reducción o ausencia del producto de RT-PCR producido usando los cebadores que abarcan la unión de empalme en células tratadas con ASO, en comparación con las células tratadas con ASO de control, indica que se ha mejorado el empalme del intrón objetivo. En algunos casos, la eficacia de empalme, la relación de pre-ARNm empalmado y no empalmado, la velocidad de empalme o la extensión del empalme, pueden mejorar usando los ASOs descritos en el presente documento. La cantidad de proteína o ARN funcional codificada por el pre-ARNm objetivo también puede ser evaluada para determinar si cada ASO logró el efecto deseado (por ejemplo, aumento de la producción de proteína). Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para la evaluación y/o cuantificación de la producción de proteínas, tal como transferencia Western, citometría de flujo, microscopía de inmunofluorescencia y ELISA.
Pueden probarse en vivo los ASOs que, cuando se hibridan con una región de un pre-ARNm, dan como resultado un empalme mejorado y una mayor producción de proteínas, utilizando modelos animales, por ejemplo, modelos de ratones transgénicos en los que se ha incorporado el gen humano de longitud completa o en modelos de enfermedad en ratones humanizados. Las rutas adecuadas para la administración de ASOs pueden variar, dependiendo de la enfermedad y/o los tipos de células a las que se desea entregar los ASOs. Los ASOs pueden ser administrados, por ejemplo, mediante inyección intravítrea, mediante inyección subretiniana, mediante aplicación tópica en el ojo o mediante un fármaco encapsulado implantado en el ojo. Después de la administración, pueden evaluarse las células, tejidos y/u órganos de los animales modelo, para determinar el efecto del tratamiento con ASO, por ejemplo, evaluando el empalme (eficiencia, velocidad, extensión) y la producción de proteínas mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en este documento. Los modelos animales también pueden ser cualquier indicación fenotípica o conductual de la enfermedad o de la gravedad de la enfermedad.
EJEMPLOS
La presente divulgación será ilustrada más específicamente mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1: Identificación de eventos de retención de intrones en las transcripciones de PRPF3 por ARNseq usando secuenciación de próxima generación
Se llevó a cabo la secuenciación de escopeta del transcriptoma, utilizando la secuenciación de próxima generación para revelar una instantánea de las transcripciones producidas por el gen de PRPF3, para identificar eventos de retención de intrones. Para este propósito, se aisló el ARN poliA de fracciones nucleares y citoplásmicas de células ARPE-19 (epiteliales retinianas) y se construyeron bibliotecas de ADNc utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARNm trenzado TruSeq de Illumina. Las bibliotecas fueron secuenciadas en pares, lo que dio como resultado lecturas de 100 nucleótidos, de las que se levantaron mapas al genoma humano (febrero de 2009, ensamblaje GRCh37/hg19). En la Figura 3 se muestran los resultados de la secuenciación para PRPF3. Brevemente, la Figura 3 muestra las lecturas a las que se levantó mapa, visualizadas usando el navegador de genoma UCSC (operado por UCSC Genome Informatics Group (Center for Biomolecular Science & Engineering, University of California, Santa Cruz, 1156 High Street, Santa Cruz, CA 95064) y descritas, por ejemplo, por Rosenbloom, et al., 2015, "The UCSC Genome Browser database: 2015 update," Nucleic Acids Research 43, emisión de base de datos, doi: 10,1093/nar/gku1177) y la cobertura y el número de lecturas pueden ser inferidos mediante las señales de pico. La altura de los picos indica el nivel de expresión dado por la densidad de las lecturas en una región en particular. El navegador del genoma de UCSC (debajo de las señales de lectura) proporciona una representación esquemática de PRPF3 (dibujada a escala), para que los picos puedan coincidir con regiones exónicas e intrónicas PRPF3. Con base en este despliegue, se identificaron 2 intrones en PRPF3 (12 y 13, indicados por flechas, correspondientes a NM_004698: intrón 12 y NM_004698; intrón 13, respectivamente) y 1 intrón en PRPF8 (31, indicados por la flecha, correspondiente a NM_006445, intrón 31) (Figura 7) que tienen una alta densidad de lectura en la fracción nuclear de las células ARPE-19, pero tienen lecturas muy bajas o nulas en la fracción citoplásmica de estas células (como se muestra para el intrón 12 en el diagrama inferior de la Figura 3, 13 en el diagrama inferior de la Figura 5 y para los intrones 31 en el diagrama inferior de la Figura 5). Esto indica que estos intrones son retenidos y que el intrón-12 y el intrón-13, y las transcripciones que contiene el intrón-31 permanecen en el núcleo, y sugiere que estos pre-ARNm con RIC de PRPF3 y PRPF8 retenidos, respectivamente, no son productivos, ya que no se exportan al citoplasma.
Ejemplo 2: Diseño de recorrido con ASO d irig ido a un intrón retenido
Se diseñó un recorrido ASO para apuntar al intrón 12 de PRPF3 utilizando el método descrito en este documento (FIG.
4). Una región inmediatamente aguas abajo del intrón 12, que abarca los nucleótidos 6 a 498 del sitio de empalme 5' y una región inmediatamente aguas arriba del intrón 12 que abarca los nucleótidos -16 a -496 del intrón del sitio de empalme 3', fueron dirigidas con 2'-O-Me ARN, cadena principal de PS, ASOs de 18-meros desplazados en intervalos de 5 nucleótidos (con la excepción de ASO P3-IVS1228).
Se diseñó un recorrido ASO para apuntar al intrón 13 de PRPF3 utilizando el método descrito en este documento (FIG.
6). Una región inmediatamente aguas abajo del intrón 13, que abarca los nucleótidos 6 a 146 del sitio de empalme 5' y una región inmediatamente aguas arriba del intrón 13 que abarca los nucleótidos -16 a -146 del intrón del sitio de empalme 3', fueron dirigidas con 2'-O-Me ARN, cadena principal de PS, ASOs de 18-meros desplazados en intervalos de 5 nucleótidos (con la excepción de los ASOs P3-IVS13+15, P3-IVS13+31 y P3-IVS13-47).
Se diseñó un recorrido ASO para apuntar al intrón 31 de PRPF8 utilizando el método descrito en este documento (FIG.
8). Una región inmediatamente aguas abajo del intrón 31, que abarca los nucleótidos 6 a 156 del sitio de empalme 5' y una región inmediatamente aguas arriba del intrón 31 que abarca los nucleótidos -16 a -156 del intrón del sitio de empalme 3', fueron dirigidas con 2'-O-Me ARN, cadena principal de PS, ASOs de 18-meros desplazados en intervalos de 5 nucleótidos.
La Tabla 1 enumera los ASOs ejemplares que se diseñaron y sus secuencias objetivo.
Tabla 1
Figure imgf000029_0001
Ejemplo 3: Eficiencia de empalme mejorada a través de la orientación al ASO del intrón 12 de PRPF3 aumenta los niveles de transcripción
Para determinar si se podía lograr un aumento en la eficiencia de empalme de intrones del gen objetivo con los ASOs, se utilizó el método descrito en el presente documento. Las células ARPE-19, una línea celular del epitelio retiniano humano (American Type Culture Collection (ATCC), EE. UU.) fueron transfectadas de forma simulada o se transfectaron con los ASOs dirigidos que se describen en la Tabla 1. Las células fueron transfectadas usando reactivo de transfección Lipofectamine RNAiMax (Thermo Fisher) de acuerdo con las especificaciones del proveedor. Brevemente, se inocularon los ASOs en placas de cultivo de tejidos de 96 pozos y se combinaron con RNAiMax diluido en Opti-MEM. Se separaron las células usando tripsina y se suspendieron nuevamente en medio completo, y se añadieron aproximadamente 25,000 células a la mezcla de transfección de ASO. Los experimentos de transfección fueron llevados a cabo en placas por triplicado. La concentración final de ASO fue 80 nM. Se cambió el medio 6 h después de la transfección y las células fueron cosechadas a las 24 h, usando el reactivo de lisis Cells-to-Ct, suplementado con ADNsa (Thermo Fisher), de acuerdo con las especificaciones del proveedor. Se generó ADNc con reactivos Cells-to-Ct RT (Thermo Fisher) de acuerdo con las especificaciones del proveedor. Para cuantificar la cantidad de empalme en el intrón de interés, se llevó a cabo una PCR cuantitativa utilizando ensayos Taqman con sondas que abarcan la unión exón-exón correspondiente (Thermo Fisher). Los ensayos Taqman fueron llevados a cabo de acuerdo con las especificaciones del proveedor, en un sistema de PCR QuantStudio 7 Flex Real-Time (Thermo Fisher). Los valores del ensayo de genes objetivo fueron normalizados a RPL32 (deltaCt) y se compararon emparejadas las placas con muestras de transfección simulada (delta-delta Ct), generando un cambio de múltiplo sobre la cuantificación simulada (2 A - (delta-deltaCt). Se representa gráficamente el cambio de múltiplo promedio sobre la simulación de las tres réplicas de placa (FIG. 10). Se identificaron varios ASOs que aumentaron la expresión del gen objetivo, como se muestra en la FIG. 10, lo que implica un aumento en el empalme en ese intrón objetivo. Junto con los datos completos del transcriptoma que confirman la retención del intrón objetivo (FIG. 9), estos resultados confirman que los ASOs pueden mejorar la eficiencia de empalme de un intrón limitador de velocidad.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende un oligómero antisentido (ASO) o un vector viral que codifica un ASO, en donde el ASO comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID números: 351-353, 355, 357-360, 404, 409 y 410.
2. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de la retinitis pigmentosa 13 (RP13) en un sujeto.
3. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de la retinitis pigmentosa 13 (RP13) en un sujeto, en donde la composición farmacéutica comprende un ASO o un vector viral que codifica un ASO, en donde el ASO es complementario a al menos 8 ácidos nucleicos contiguos de SEQ ID NO: 448, o de una secuencia con al menos 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 448, ubicado dentro de un pre-ARNm que contiene intrón retenido (pre-ARNm con RIC) que codifica la proteína PRPF8, y en donde el ASO aumenta el nivel de expresión de la proteína PRPF8 en las células.
4. Una composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la porción objetivo del pre-ARNm con RIC está dentro de la región 6 respecto al sitio de empalme 5' del intrón retenido y a -16 respecto al sitio de empalme 3' del intrón retenido.
5. Una composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, en donde el pre-ARNm con RIC comprende una secuencia con al menos 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4.
6. Una composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde el ASO comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 351-353, 355, 357-360, 404, 409 y 410.
7. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 o una composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde el ASO comprende una modificación de la cadena principal que comprende un enlace fosforotioato o un enlace fosforodiamidato; o un fragmento de azúcar modificado o un análogo de azúcar, que opcionalmente comprende un fosforodiamidato morfolino, un ácido nucleico bloqueado, un ácido nucleico peptídico, un fragmento 2'-O-metilo, un fragmento 2'-fluoro o un fragmento 2'-O-metoxietilo.
8. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 o una composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en la que el ASO consiste en 8 a 50 nucleobases.
9. Una composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en donde la proteína PRPF8 es deficiente en cantidad en el sujeto que va a ser tratado.
10. Una composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en donde la proteína PRPF8 tiene una actividad deficiente en el sujeto que va a ser tratado.
11. Una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en donde la proteína PRPF8 es deficiente en cantidad o actividad en el sujeto que va a ser tratado, y la cantidad deficiente de la proteína PRPF8 es causada por la haploinsuficiencia de la proteína PRPF8, en donde el sujeto tiene un primer alelo que codifica una proteína PRPF8 funcional, y un segundo alelo a partir del cual no se produce la proteína PRPF8, o un segundo alelo que codifica una proteína PRPF8 no funcional, y en donde el ASO se une a una porción dirigida de un pre-ARNm con RIC transcrito del primer alelo.
12. Una composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, en la que el ASO se administra mediante inyección intratecal, inyección intracerebroventricular, inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, inyección subcutánea o inyección intravenosa del sujeto.
ES16876606T 2015-12-14 2016-12-14 Composiciones para el tratamiento de la retinitis pigmentosa 13 Active ES2903394T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562267261P 2015-12-14 2015-12-14
PCT/US2016/066684 WO2017106364A2 (en) 2015-12-14 2016-12-14 Compositions and methods for treatment of retinitis pigmentosa 18 and retinitis pigmentosa 13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2903394T3 true ES2903394T3 (es) 2022-04-01

Family

ID=59057547

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16876606T Active ES2903394T3 (es) 2015-12-14 2016-12-14 Composiciones para el tratamiento de la retinitis pigmentosa 13

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP3390642B1 (es)
JP (2) JP7054675B2 (es)
CA (1) CA3005254A1 (es)
ES (1) ES2903394T3 (es)
WO (1) WO2017106364A2 (es)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201410693D0 (en) 2014-06-16 2014-07-30 Univ Southampton Splicing modulation
AU2015327836B2 (en) 2014-10-03 2021-07-01 Cold Spring Harbor Laboratory Targeted augmentation of nuclear gene output
KR20220105174A (ko) 2015-10-09 2022-07-26 유니버시티 오브 사우스앰톤 유전자 발현의 조절 및 탈조절된 단백질 발현의 스크리닝
CN109312343B (zh) 2015-12-14 2022-09-27 冷泉港实验室 用于治疗常染色体显性精神发育迟滞5型和Dravet综合征的反义寡聚体
US11096956B2 (en) 2015-12-14 2021-08-24 Stoke Therapeutics, Inc. Antisense oligomers and uses thereof
CA3013797A1 (en) 2016-03-09 2017-09-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for inhibiting pmp22 expression
RU2021133626A (ru) 2017-01-23 2022-01-31 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Варианты hsd17b13 и их применения
KR20190139869A (ko) 2017-04-11 2019-12-18 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 하이드록시스테로이드 (17-베타) 탈수소효소(hsd17b) 패밀리의 구성원의 조절인자의 활성도를 스크리닝하기 위한 검정
RS65031B1 (sr) 2017-08-25 2024-02-29 Stoke Therapeutics Inc Antisens oligomeri za lečenje stanja i bolesti
JP7434151B2 (ja) 2017-10-11 2024-02-20 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｐｎｐｌａ３ ｉ１４８ｍの変異を発現している患者の肝疾患の治療におけるｈｓｄ１７ｂ１３の阻害
WO2020132558A1 (en) * 2018-12-21 2020-06-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for reducing pmp22 expression
WO2021231107A1 (en) 2020-05-11 2021-11-18 Stoke Therapeutics, Inc. Opa1 antisense oligomers for treatment of conditions and diseases

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4866042A (en) 1987-11-18 1989-09-12 Neuwelt Edward A Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier
US6294520B1 (en) 1989-03-27 2001-09-25 Albert T. Naito Material for passage through the blood-brain barrier
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
EP0669987B1 (en) 1992-09-25 2008-08-13 Aventis Pharma S.A. Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system, particularly in brain
US5656612A (en) 1994-05-31 1997-08-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of raf gene expression
FR2727867B1 (fr) 1994-12-13 1997-01-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux
US6936589B2 (en) 2001-09-28 2005-08-30 Albert T. Naito Parenteral delivery systems
WO2007047913A2 (en) 2005-10-20 2007-04-26 Isis Pharmaceuticals, Inc Compositions and methods for modulation of lmna expression
CA2910760C (en) 2007-12-04 2019-07-09 Muthiah Manoharan Targeting lipids
CN116440150A (zh) 2009-06-17 2023-07-18 冷泉港实验室 用于在对象中调节smn2剪接的组合物和方法
DK2734208T3 (en) 2011-07-19 2017-06-19 Wave Life Sciences Ltd PROCEDURES FOR SYNTHESIS OF FUNCTIONALIZED NUCLEIC ACIDS
CN104004826B (zh) * 2013-01-07 2016-03-02 赵晨 突变的基因prpf4在制备遗传性视网膜疾病诊断试剂中的应用
US10647983B2 (en) 2013-09-04 2020-05-12 Cold Spring Harbor Laboratory Reducing nonsense-mediated mRNA decay

Also Published As

Publication number Publication date
EP3390642A2 (en) 2018-10-24
WO2017106364A2 (en) 2017-06-22
EP3390642A4 (en) 2019-06-26
JP2019500347A (ja) 2019-01-10
EP3390642B1 (en) 2021-11-24
JP7054675B2 (ja) 2022-04-14
JP2022088621A (ja) 2022-06-14
CA3005254A1 (en) 2017-06-22
WO2017106364A3 (en) 2017-07-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2903394T3 (es) Composiciones para el tratamiento de la retinitis pigmentosa 13
US20210108208A1 (en) Targeted augmentation of nuclear gene output
ES2882500T3 (es) Oligómeros antisentido para el tratamiento del síndrome de Dravet
JP2024045199A (ja) 状態および疾患の処置のためのアンチセンスオリゴマー
WO2017106283A1 (en) Compositions and methods for treatment of liver diseases
WO2017106292A1 (en) Compositions and methods for treatment of kidney diseases
WO2017106210A1 (en) Antisense oligomers for treatment of alagille syndrome
WO2017106375A1 (en) Antisense oligomers for treatment of tuberous sclerosis complex
JP2018538287A (ja) 多発性嚢胞腎の処置のためのアンチセンスオリゴマー
US20240117353A1 (en) Compositions for treatment of conditions and diseases associated with polycystin expression
WO2022271699A2 (en) Antisense oligomers for treatment of non-sense mediated rna decay based conditions and diseases