KR101891352B1 - 간세포 성장 인자(ｈｇｆ)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 ｈｇｆ 관련 질환의 치료 - Google Patents

간세포 성장 인자(ｈｇｆ)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 ｈｇｆ 관련 질환의 치료 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특히 간세포 성장 인자(HGF)의 천연 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 표적화하여 간세포 성장 인자(HGF)의 발현 및/또는 기능을 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 규명 및 HGF의 발현과 관련된 질병 및 질환을 치료하는데 사용하는 이의 용도에 관한 것이다.

Description

간세포 성장 인자(ＨＧＦ)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 ＨＧＦ 관련 질환의 치료{TREATMENT OF HEPATOCYTE GROWTH FACTOR (HGF) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO HGF}
관련 출원에 관한 교차 참조
본 출원은 이의 전문이 참고문헌으로서 여기에 포함되어 있는 미국 특허 가출원 제61/289,647호(출원일: 2009년 12월 23일)의 우선권을 주장한다.
발명의 기술분야
본 발명의 실시형태는 간세포 증식인자(Hepatocyte Growth Factor: HGF) 및 관련 분자의 발현 및/또는 기능을 조절하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
DNA-RNA 및 RNA-RNA 혼성화(hybridization)는 DNA 복제, 전사 및 번역을 포함하는 핵산 기능의 여러 측면에 중요하다. 혼성화는 또한 특정 핵산을 검출하거나 또는 이의 발현을 변경하는 다양한 기술에도 중요하다. 예를 들면 안티센스 뉴클레오타이드는 표적 RNA로 혼성화됨으로써 유전자 발현을 방해하여 RNA 스플라이싱, 전사, 번역 및 복제를 방해한다. 안티센스 DNA는 DNA-RNA 혼성물(hybrid)이 대부분의 세포 타입에 존재하는 활성, 즉 리보뉴클레아제 H에 의한 분해용 기질의 역할을 하는 부가된 특성이 있다. 안티센스 분자는 올리고데옥시뉴클레오타이드(oligodeoxynucleotide: ODN)가 그러하듯이 세포로 운반될 수 있거나 또는 RNA 분자로서 내재 유전자로부터 발현될 수 있다. 최근에 FDA는 안티센스가 치료적 효용이 있다는 것을 반영한 안티센스 약제, 즉 VITRAVENE(상표명)(거대세포 바이러스 망막염 치료용)을 승인했다.
본 요약은 본 발명의 특성 및 물질을 간단하게 나타내는 본 발명을 요약하기 위해 제공된다. 이것은 특허청구범위의 범주 또는 의미를 제한하거나 또는 해석하기 위해 사용되지 않는 것을 조건으로 제출된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 상응하는 센스 유전자의 상향조절을 야기하는 천연 안티센스 전사체의 어느 영역에 표적화되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(들)를 사용해서 천연 안티센스 전사체의 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 또한 천연 안티센스 전사체의 억제는 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 생각되는 siRNA, 리보자임 및 저분자에 의해 획득될 수 있다는 것도 여기에서 고려되었다.
일 실시형태는 생체 내 또는 시험관 내에서 환자 세포 또는 조직의 HGF 폴리뉴클레오타이드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 길이가 5 내지 30개의 뉴클레오타이드인 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 상기 세포 또는 조직의 접촉 단계를 포함하며, 상기 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호: 2의 뉴클레오타이드 1 내지 514, 서열 번호: 3의 뉴클레오타이드 1 내지 936 또는 서열 번호: 4의 뉴클레오타이드 1 내지 1075 내의 5 내지 30개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 역 상보 서열에 대한 적어도 50%의 서열 동일성이 있어 생체 내 또는 시험관 내의 환자 세포 또는 조직에서의 HGF 폴리뉴클레오타이드의 기능 및/또는 발현을 조절할 수 있다.
일 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 HGF 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면, 서열 번호: 2 내지 4로 제시된 뉴클레오타이드, 및 이의 어느 변이체, 대립 유전자, 동족체, 돌연변이체, 유도체, 단편 및 상보적 서열의 천연 안티센스 서열을 표적화 한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 예는 서열 번호: 5 내지 12로 설정된다.
또 다른 실시형태는 생체 내 또는 시험관 내의 환자 세포 또는 조직에서 HGF 폴리뉴클레오타이드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 길이가 5 내지 30개인 뉴클레오타이드의 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 상기 세포 또는 조직을 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 올리고뉴클레오타이드는 HGF 폴리뉴클레오타이드의 안티센스의 역 상보 서열에 대해 적어도 50%의 서열 동일성이 있어 생체 내 또는 시험관 내의 환자 세포 또는 조직에서 HGF 폴리뉴클레오타이드의 기능 및/또는 발현을 조절할 수 있다.
또 다른 실시형태는 생체 내 또는 시험관 내의 환자 세포 또는 조직에서 HGF 폴리뉴클레오타이드의 기능 및/또는 발현을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 길이가 5 내지 30개의 뉴클레오타이드인 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 상기 세포 또는 조직의 접촉 단계를 포함하며, 상기 올리고뉴클레오타이드는 HGF 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 적어도 50%의 서열 동일성이 있어 생체 내 또는 시험관 내의 환자 세포 또는 조직에서의 HGF 폴리뉴클레오타이드의 기능 및/또는 발현을 조절할 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 센스 및/또는 안티센스 HGF 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형 또는 치환된 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 결합을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 변형된 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 펩타이드 핵산, 2'-O-메틸, 플루오로- 또는 탄소, 메틸렌 또는 기타 잠금 핵산(locked nucleic acid: LNA) 분자를 포함하는 변형된 염기를 포함한다. 바람직하게는, 상기 변형된 뉴클레오타이드는 α-L-LNA를 포함하는 잠금 핵산 분자이다.
일 실시형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 피하, 근육 내, 정맥 내 또는 복강 내로 환자에게 투여된다.
일 실시형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 약학적 조성물로 투여된다. 치료 요법은 안티센스 화합물을 환자에게 적어도 한 번 투여하는 단계를 포함하며; 그러나, 이러한 치료는 일정 기간 동안 복수로 투여하는 것을 포함하도록 변형시킬 수 있다. 이러한 치료는 하나 이상의 다른 타입의 요법과 조합시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 리포솜 내에 캡슐화하거나 또는 담체 분자(예를 들면, 콜레스테롤, TAT 펩타이드)에 부착한다.
다른 측면은 하기에 기재하였다.
도 1은 대조군과 비교해서, 리포펙타민 2000을 사용해서 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드로 CHP212 세포를 처리한 후에 HGF mRNA에서의 배수 변화 + 표준 편차를 나타내는 실시간 PCR 결과의 그래프이다. 실시간 PCR 결과는 CHP212 세포 중의 HGF mRNA 수준이 HGF 안티센스로 설계된 올리고 중의 하나로 처리한 후 48 시간에 현저하게 증가한 것을 보여준다. 바는 각각 서열 번호: 5 내지 12로 처리된 샘플에 상응하는 CUR-0679, CUR-0680, CUR-0673 내지 CUR-0678를 나타낸다.
서열 목록 설명 - 서열 번호: 1: 호모 사피엔스 간세포 성장 인자(헤마포이에틴 A; 살포 요인)(HGF), 전사 변이체 5, mRNA. (NCBI 등록 번호: NM_001010934); 서열 번호: 2: 천연 HGF 안티센스 서열 Hs.677861; 서열 번호: 3: 천연 HGF 안티센스 서열 AL546825; 서열 번호: 4: 천연 HGF 안티센스 서열 BX356413; 서열 번호: 5 내지 12: 안티센스 올리고뉴클레오타이드. *는 포스포티오에이트 결합을 나타낸다.
본 발명의 몇몇 측면은 설명을 위한 사례 응용을 참조해서 하기에 기재하였다. 다수의 특이적 세부 사항, 관계 및 방법은 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위해 설정한 것이 이해되어야 한다. 그러나 당업자는 본 발명이 하나 이상의 특이적 세부 사항 없이 또는 다른 방법으로 실행될 수 있다는 것을 용이하게 인지할 것이다. 본 발명은 몇몇 활성이 상이한 순서 및/또는 다른 활성 또는 사건과 동시에 발생할 수 있으므로 사건 또는 활성의 순서에 제한받지 않다. 또한, 본 발명에 따른 방법론을 실행하기 위해 모든 활성 또는 사건을 설명할 필요는 없다.
여기서 기재하는 모든 유전자, 유전자 명칭 및 유전자 생성물은 여기서 기재하는 조성물 및 방법이 응용가능한 어느 종으로부터의 동족체에 상응하도록 의도된다. 따라서, 상기 용어는 이에 제한되지 않지만 인간 및 쥐로부터의 유전자 또는 유전자 생성물을 포함한다. 특정 종으로부터의 유전자 또는 유전자 생성물을 밝히는 경우, 이러한 밝혀진 사실은 단지 예인 것으로 의도되며, 맥락 중에 명백하게 나타내지 않았다면 제한으로서 해석하지 않는다. 따라서, 예를 들면, 여기서 기재하는 유전자에 있어서 포유류 핵산 및 아미노산 서열과 관련된 몇몇 실시형태는 이에 제한되지는 않지만, 다른 포유류, 어류, 양서류, 파충류 및 조류를 포함하는 기타 동물로부터의 동족 및/또는 이종상동성 유전자 및 유전자 생성물을 포함하는 것으로 의도된다. 일 실시형태에서, 유전자 또는 핵산 서열은 인간이다.
정의
여기서 사용되는 전문 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 목적이며, 본 발명을 제한하려는 의도는 없다. 여기서 사용하는 것과 같이, 단수 용어는 맥락에서 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 용어, "포함하는(including)", "포함하다(includes)", "갖는(having)", "갖다(has)", "같이(with)", 또는 이의 변형은 상세한 설명 및/또는 특허청구범위에 사용되는 결과로 이러한 용어는 용어 "포함하는(comprising)"과 유사한 방식으로 광의의 것으로 의도된다.
용어 "약(about)" 또는 "대략(approximately)"은 값을 측정하거나 또는 결정하는 방법, 즉 측정 시스템의 제한사항에 따라 일부 달라지는 것으로서, 당업자에 의해 결정되는 특정 값에 대한 허용가능한 실수 범위 내에 있는 것을 의미한다. 예를 들면, "약"은 당업계에서 실행할 때 1 또는 1 보다 큰 표준 편차 내에 있는 것을 의미할 수 있다. 대안적으로 "약"은 주어진 값 중 20%까지, 바람직하게는 10%까지, 보다 바람직하게는 5%까지, 가장 바람직하게는 1%까지의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정에 관해서 상기 용어는 중요도 순서 내, 바람직하게는 값 중 5배 내, 보다 바람직하게는 20배 내에 있는 것을 의미할 수 있다. 응용 및 특허청구범위에서 특정 값을 기재하는 경우 다르게 설명하지 않는 한 특정 값에 대한 허용가능한 실수 범위 내에 있는 것으로 의미되는 "약"으로 추정되어야 한다.
여기서 사용되는 것과 같이, 용어 "mRNA"는 더 자세하게 설명할 수 있는 어느 추가의 전사체 및 표적 유전자의 현재 공지된 mRNA 전사체(들)를 의미한다.
"안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide)" 또는 "안티센스 화합물(antisense compound)"은 또 다른 RNA 또는 DNA(표적 RNA, DNA)에 결합하는 RNA 또는 DNA 분자를 의미한다. 예를 들면, RNA 올리고뉴클레오타이드라면 이는 RNA-RNA 상호작용에 의해서 또 다른 RNA 표적에 결합하며, 표적 RNA의 활성을 변경시킨다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 특정 폴리뉴클레오타이드의 발현 및/또는 기능을 상향조절 또는 하향조절할 수 있다. 이러한 정의는 치료적, 진단적 또는 다른 관점으로부터 유용한 어느 외래 RNA 또는 DNA 분자를 포함하는 것을 의미한다. 이러한 분자는 예를 들면 안티센스 RNA 또는 DNA 분자, 간섭 RNA(RNAi), 마이크로 RNA, 유인 RNA 분자, siRNA, 효소 RNA, 치료적 편집 RNA, 작용제 및 길항제 RNA, 안티센스 올리고머 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 외부 가이드 서열(EGS) 올리고뉴클레오타이드, 선택 스플라이싱, 프라이머, 프로브, 표적 핵산 중 적어도 일부에 혼성화되는 다른 올리고머 화합물을 포함한다. 예를 들면, 이러한 화합물은 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적 단일-가닥 또는 원형 올리고머 화합물의 형태로 도입될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA)의 올리고머 또는 폴리머, 또는 이의 유사물질을 나타낸다. 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 또한 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 이의 치환 및 알파-아노머 형태, 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid: PNA), 잠금 핵산(LNA), 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 등을 포함하는 천연 및/또는 변형 모노머 또는 결합의 직쇄 또는 원형 올리고머를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 염기 쌍의 왓슨 크릭형, 염기 쌍의 Hooegsteen 또는 역 Hooegsteen형, 등과 같은 모노머 대 모노머 상호작용의 규칙적인 패턴에 의한 표적 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 "키메라"(chimeric)일 수 있으며, 즉 여러 영역으로 구성될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "키메라" 화합물은 두 개 이상의 화학적 영역, 예를 들면 DNA 영역(들), RNA 영역(들), PNA 영역(들) 등을 포함하는 올리고뉴클레오타이드이다. 각 화학적 영역은 적어도 하나의 모노머 유닛, 즉 올리고뉴클레오타이드 화합물의 경우에 하나의 뉴클레오타이드로 구성된다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 통상적으로 적어도 하나의 영역을 포함하며, 상기 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 목적하는 특성을 나타내기 위해서 변형된다. 올리고뉴클레오타이드의 목적하는 특성은 이에 제한되지는 않지만 예를 들면 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 저항성, 증가된 세포 흡수량 및/또는 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화성을 포함한다. 본 발명의 키메라 올리고뉴클레오타이드는 두 개 이상의 올리고뉴클레오타이드, 변형된 올리고뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 및/또는 상기에서 기재한 올리고뉴클레오타이드 유사체의 혼합 구조물로서 형성될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 즉 천연 DNA의 경우에서처럼 연속으로 모노머가 연결되거나 또는 스페이서를 통해 연결되는 경우에 "레지스터"(register)로 연결될 수 있는 영역으로 구성될 수 있다. 상기 스페이서는 영역 사이의 공유 "브리지"(bridge)로 구성되며, 바람직한 경우에 약 100개의 탄소 원자를 초과하지 않는 길이를 갖는 것으로 의도된다. 스페이서는 여러 기능성을 수행할 수 있으며, 예를 들면 양성 또는 음성 전하를 갖고, 특이적 핵산 결합 특성(인터칼레이터, 글로브 바인더, 독성, 플루오로포르스 등)을 수행하며, 친유성이고, 예를 들면 알파-나선을 유도하는 펩타이드를 함유하는 알라닌과 같은 특수한 이차 구조를 유도할 수 있다.
여기서 사용하는 것과 같이 "HGF" 및 "간세포 성장 인자"는 모든 군 멤버, 돌연변이체, 대립유전자, 단편, 종, 코딩 및 비코딩 서열, 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오타이드 가닥 등을 포함한다.
여기서 사용하는 것과 같이, 단어 간세포 성장 인자, HGF, F-TCF, 헤파토포에이틴-A, HGFB, HPTA, 살포 요인, SF는 간행물에서 동일한 것으로 생각하며, 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
여기서 사용하는 것과 같이, 용어 "에 특이적인 올리고뉴클레오타이드"(oligonucleotide specific for) 또는 "을 표적화하는 올리고뉴클레오타이드"(oligonucleotide which targets)는 (i) 표적 유전자 중 일부와 안정한 착체를 형성할 수 있거나 또는 (ii) 표적 유전자의 mRNA 전사체 중 일부와 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있는 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다. 상기 착체 및 듀플렉스의 안정성은 이론적 계산 및/또는 시험관 내 분석으로 결정할 수 있다. 혼성화 착체 및 듀플렉스의 안정성을 측정하기 위한 대표적인 분석법은 하기 실시예에 기재하였다.
여기서 사용하는 것과 같이, 용어 "표적 핵산(target nucleic acid)"은 DNA, 상기 DNA로부터 전사된 RNA[전-mRNA(premRNA) 및 mRNA를 포함함] 및 또한 상기 RNA, 코딩, 비코딩 서열, 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오타이드로부터 유래된 cDNA를 포함한다. 이의 표적 핵산으로 올리고머 화합물을 특이적으로 혼성화하는 것은 핵산의 정상적인 기능을 방해한다. 이에 특이적으로 혼성화되는 화합물에 의한 표적 핵산의 기능의 이러한 조절은 일반적으로 "안티센스"라고 한다. 방해받는 DNA 기능은 예를 들면 복제 및 전사를 포함한다. 방해받는 RNA의 기능은 생명 유지에 필요한 모든 기능, 예컨대 예를 들면 단백질 번역 부위로의 RNA의 전좌, RNA로부터의 단백질의 번역, 하나 이상의 mRNA 종을 수득하기 위한 RNA의 스플라이싱 및 RNA에 의해서 촉진되거나 또는 RNA에 관여할 수 있는 촉매적 활성을 포함한다. 이러한 표적 핵산 기능의 방해에 의한 전체적인 영향은 암호화된 생성물 또는 올리고뉴클레오타이드 발현의 조절이다.
RNA 간섭, 즉 "RNAi"는 이들의 "표적" 핵산 서열에 서열-특이적 상동관계를 갖는 이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자에 의해 매개된다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 매개자는 5-25개의 뉴클레오타이드의 "짧은 간섭(small interfering)" RNA 듀플렉스(siRNA)이다. 상기 siRNA는 다이서(Dicer)라고 공지된 RNase에 의한 dsRNA의 처리로부터 유래된다. siRNA 듀플렉스 생성물은 RISC[RNA 유도 사일런싱 착체(RNA Induced Silencing Complex)]라고 하는 다-단백질 siRNA 착체로 모인다. 어느 특정 이론에 의해 연결되는 것을 바라지 않지만, 다음에 RISC는 siRNA 듀플렉스가 촉매적 방식의 분열을 매개하기 위한 서열-특이적 방식으로 상호 작용하는 표적 핵산(적당한 mRNA)으로 유도되는 것으로 믿어진다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 짧은 간섭 RNA는 합성될 수 있으며, 당 업에 잘 공지되어 있으며, 당업자에게 친숙한 절차에 따라 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 짧은 간섭 RNA는 약 1 내지 약 50개의 뉴클레오타이드(nt)를 포함하는 것이 적당하다. 실시형태를 제한하지 않는 예로서, siRNA는 약 5 내지 약 40개의 nt, 약 5 내지 약 30개의 nt, 약 10 내지 약 30개의 nt, 약 15 내지 약 25개의 nt 또는 약 20 내지 25개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
적당한 올리고뉴클레오타이드의 선별은 자동으로 핵산 서열을 정렬하고, 동일성 또는 상동 관계 영역을 나타내는 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써 쉬워진다. 이러한 프로그램은 예를 들면 데이터베이스, 예컨대 GenBank를 탐색하거나, PCR 생성물을 시퀀싱하여 수득된 핵산 서열을 비교하기 위해 사용된다. 다양한 종으로부터의 핵산 서열을 비교하면 종 사이의 적당한 동일성 정도를 나타내는 핵산 서열을 선별할 수 있다. 시퀀싱되지 않은 유전자의 경우에, 서던 블럿(Southern blot)을 실행하여 표적 종과 다른 종의 유전자 사이의 동일성 정도를 결정할 수 있다. 당 업에 잘 공지되어 있는 것과 같은 엄격한 정도를 다양하게 변화시켜 서던 블럿을 실행함으로써 근사치의 동일성을 측정할 수 있다.
이러한 절차로 다른 종에서의 상응하는 핵산 서열에 대한 상보성 정도가 낮고 제어되는 피험체에서의 표적 핵산 서열에 대한 상보성 정도가 높은 올리고뉴클레오타이드를 선별할 수 있다. 당업자는 본 발명에서 사용하기 위한 유전자의 적당한 영역을 선별하는데 상당한 재량이 있다는 것을 인식할 것이다.
"효소적 RNA(enzymatic RNA)"는 효소적 활성을 갖는 RNA 분자를 의미한다[Cech, (1988) J. American . Med . Assoc. 260, 3030-3035]. 효소적 핵산(리보자임)은 첫 번째로 표적 RNA에 결합함으로써 활성을 갖는다. 이러한 결합은 표적 RNA를 분열시키는 활성을 갖는 분자의 효소적 부분에 매우 근접하게 유지되는 효소적 핵산의 표적 결합 부분을 통해서 일어난다. 따라서, 상기 효소적 핵산은 첫 번째로 인지한 다음에 염기 쌍을 통해 표적 RNA에 결합하고, 정확한 부위에 결합하면 표적 RNA를 효소적으로 절단하는 활성을 갖는다.
"유인 RNA"(decoy RNA)는 리간드에 있어서의 천연 결합 도메인을 흉내 내는 RNA 분자를 의미한다. 따라서 이러한 유인 RNA는 특이적 리간드의 결합에 있어서의 천연 결합 표적과 경쟁한다. 예를 들면, HIV 전사촉진 반응(TAR) RNA의 과-발현은 "유인"(decoy)으로서 활성이 있을 수 있으며, HIV tat 단백질과 효과적으로 결합하여 HIV RNA에서 암호화된 TAR 서열로의 결합으로부터 이를 보호할 수 있다고 알려져 있다. 상기는 특이적 예라는 것을 의미한다. 당업자는 이것이 하나의 예지만 다른 실시형태도 당 업에 일반적으로 공지되어 있는 기술을 사용해서 용이하게 만들 수 있다는 것을 인식할 것이다.
여기서 사용하는 것과 같이, 용어 "모노머"는 통상적으로 몇몇 모노머 단위, 예를 들면 약 3-4 내지 약 수백만의 모노머 단위의 크기 범위인 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위해 포스포다이에스터 결합 또는 이의 유사체에 의해 연결된 모노머를 나타낸다. 포스포다이에스터 결합의 유사체는 하기를 포함한다: 하기에 보다 상세하게 기재되어 있는 것과 같은, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 메틸포스포르네이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포라미데이트 등.
용어 "뉴클레오타이드"는 비자연적으로 발생하는 뉴클레오타이드뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 이전에 "비-자연적 발생"(non-naturally occurring)으로 생각되었던 다양한 뉴클레오타이드가 이후에 자연에서 확인되었다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, "뉴클레오타이드"는 공지되어 있는 퓨린 및 피리미딘 이종고리-함유 분자뿐만 아니라 이의 이종고리식 유사체 및 호변체를 포함한다. 뉴클레오타이드의 다른 타입의 실례가 되는 예는 아데닌, 구아닌, 티민, 사이토신, 유라실, 퓨린, 크산틴, 다이아미노퓨린, 8-옥소-N6-메틸아데닌, 7-데아자크산틴, 7-데아자구아닌, N4,N4-에타노사이토신, N6,N6-에타노-2,6-다이아미노퓨린, 5-메틸사이토신, 5-(C3-C6)-알키닐사이토신, 5-플루오로유라실, 5-브로모유라실, 슈도아이소사이토신, 2-하이드록시-5-메틸-4-트리아졸로피리딘, 아이소사이토신, 아이소구아닌, 이노신 및 Benner 등의 미국 특허 제5,432,272호에 기재된 "비-자연적 발생" 뉴클레오타이드를 함유하는 분자이다. 용어 "뉴클레오타이드"는 이러한 예 각각 모두 및 모두뿐만 아니라 이의 유사체 및 호변체를 포함하는 것으로 의도된다. 특히 흥미로운 뉴클레오타이드는 인간에서의 치료적 및 진단적 응용과 관련해서 자연 발생적 뉴클레오타이드로 생각되는 아데닌, 구아닌, 티민, 사이토신 및 유라실을 함유하는 것이다. 뉴클레오타이드는 예를 들면 Kornberg 및 Baker의 DNA Replication의 이차 개정판(Freeman, San Francisco, 1992)에 기재되어 있는 천연 2'-데옥시 및 2'-하이드록실 당뿐만 아니라 이의 유사체를 포함한다.
뉴클레오타이드와 관련한 "유사체"(analogs)는 변형된 염기 부분 및/또는 변형된 당 부분을 갖는 합성 뉴클레오타이드[예를 들면 Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Freier & Altmann, (1997) Nucl . Acid . Res., 25(22), 4429- 4443, Toulme J.J., (2001) Nature Biotechnology 19:17-18; Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139; Freier S. M., (1997) Nucleic Acid Research, 25:4429-4443, Uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213, Herdewin P., (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev ., 10:297-310에 일반적으로 기재된 것 참조]; 2'-O, 3`-C-연결형[3.2.0] 바이사이클로아라비노뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 유사체는 예를 들면 듀플렉스 또는 트리플렉스 안정성, 특이성 등과 같은 결합 특성을 강화시키기 위해 설계된 합성 뉴클레오타이드를 포함한다.
여기서 사용하는 것과 같이, "혼성화"는 올리고머 화합물의 실질적으로 상보적 가닥의 쌍을 의미한다. 쌍의 하나의 메커니즘은 올리고머 화합물 가닥의 상보적 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 염기(뉴클레오타이드) 사이의 Hooegsteen 또는 역 Hooegsteen 수소 결합, 즉 왓슨 크릭 결합일 수 있는 수소 결합이 포함된다. 예를 들면, 아데닌 및 티민은 수소 결합의 형성을 통해서 쌍을 이루는 상보적 뉴클레오타이드이다. 혼성화는 환경을 다양하게 변화시켜 발생시킬 수 있다.
안티센스 화합물은 표적 핵산에 화합물이 결합되어 있는 경우 기능 및/또는 활성을 조절하기 위해 표적 핵산의 정상적인 기능을 방해하는 "특이적 혼성화"(specifically hybridizable)가 가능하며, 특이적 결합을 목적하는 조건, 즉 치료적 처치 또는 생체 내 분석의 경우에 생리적 조건 및 시험관 내 분석의 경우에 분석을 실행하는 조건 하에서 비-표적 핵산 서열에 안티센스 화합물을 비-특이적으로 결합하는 것을 피하기 위해 효과적인 정도의 상보성이 존재한다.
여기서 사용하는 것과 같이, 구절 "엄격한 혼성화 조건"(stringent hybridization conditions) 또는 "엄격한 조건"은 아주 적은 수의 다른 서열은 아니지만 이의 표적 서열에 본 발명의 화합물이 혼성화되는 조건을 나타낸다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 본 발명의 맥락 및 여러 환경에서 다를 것이다. 올리고머 화합물이 표적 서열에 혼성화되는 "엄격한 조건"은 이들을 조사하는 분석 및 올리고머 화합물의 특성 및 조성물에 의해서 결정된다. 일반적으로, 엄격한 혼성화 조건은 무기 양이온, 예컨대 Na++ 또는 K++(즉 낮은 이온 강도)를 갖는 염의 낮은 농도(<0.15M), 20℃-25℃보다 높은 온도, 올리고머 화합물:표적 서열 착체의 Tm 미만 및 변성제, 예컨대 포름아마이드, 다이메틸포름아마이드, 다이메틸 설폭사이드 또는 디터전트 소디움 도데실 설페이트(SDS)의 존재를 포함한다. 예를 들면, 혼성화 비율은 각 1% 포름아마이드에 있어서 1.1% 감소한다. 엄격함이 높은 혼성화 조건의 예는 60℃에서 30분 동안의 0.1X 소디움 클로라이드-소디움 시트레이트 완충액(SSC)/0.1%(w/v) SDS이다.
여기서 사용하는 것과 같은, "상보적"(complementary)은 하나 또는 두 개의 올리고머 가닥 상에 두 개의 뉴클레오타이드 사이에서 정확하게 쌍을 이루는 능력을 나타낸다. 예를 들면 안티센스 화합물의 특정 위치에서의 뉴클레오염기가 DNA, RNA 또는 올리고뉴클레오타이드 분자로 존재하는 표적 핵산의 특정 위치에서 뉴클레오염기와 수소 결합을 할 수 있다면, 다음에 올리고뉴클레오타이드와 표적 핵산 사이의 수소 결합의 위치는 상보적 위치라고 간주된다. 올리고머 화합물 및 추가의 DNA, RNA 또는 올리고뉴클레오타이드 분자는 각 분자에서 충분한 수의 상보적 위치가 서로 수소 결합할 수 있는 뉴클레오타이드에 의해서 채워지는 경우 서로 상보적이다. 따라서, "특이적으로 혼성가능한" 및 "상보적"이라는 용어는 안정하고 특이적인 결합이 올리고머 화합물 및 표적 핵산 사이에서 이루어지도록 효과적인 수의 뉴클레오타이드 상의 상보성 또는 정확하게 쌍을 이루는 효과적인 정도를 나타내기 위해 사용된다.
올리고머 화합물의 서열은 특이적으로 혼성가능한 이의 표적 핵산의 것과 100% 상보적일 필요는 없다는 것이 당 업에 알려져 있다. 또한, 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 세그먼트 상에서 혼성화될 수 있어 간섭 또는 인접한 세그먼트가 혼성화 반응(예를 들면, 루프 구조, 미스매치 또는 헤어핀 구조)에 관여하지 않을 수 있다. 본 발명의 올리고머 화합물은 이들이 표적화하는 표적 핵산 서열 내의 표적 영역에 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 85% 또는 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99% 서열 상보성을 포함한다. 예를 들면 안티센스 화합물의 20개 뉴클레오타이드 중 18개가 표적 영역에 상보적이며, 이에 따라서 특이적으로 혼성화하는 안티센스 화합물은 90% 상보성을 나타낼 것이다. 이러한 예에서, 남아있는 비상보적 뉴클레오타이드는 상보적 뉴클레오타이드가 산재되어 있거나 또는 클러스터화될 수 있으며, 서로 또는 상보적 뉴클레오타이드에 근접하게 위치할 필요가 없다. 보통은 표적 핵산과 완벽하게 상보적인 두 개의 영역 옆에 위치하는 4(네 개)개의 비상보적 뉴클레오타이드를 갖는 길이가 18개 뉴클레오타이드인 안티센스 화합물은 표적 핵산과 전체적으로 77.8% 상보성을 가질 것이며, 이에 따라서 본 발명의 범주에 들어갈 것이다. 표적 핵산의 영역과의 안티센스 화합물의 상보성 퍼센트는 당 업에 공지되어 있는 BLAST 프로그램(기본적인 로컬 정렬 서치 툴) 및 PowerBLAST 프로그램을 사용해서 일상적으로 결정할 수 있다. 퍼센트 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 예를 들면 Smith와 Waterman[Adv . Appl . Math., (1981) 2, 482-489]의 알고리즘을 사용하는 디폴트 설정을 사용하는 Gap 프로그램[위스콘신 서열 분석 패키징(Wisconsin Sequence Analysis Package), 유닉스 용 버젼 8, 위스콘신주의 매디슨시에 소재하는 대학연구단지의 유전 컴퓨터 그룹]에 의해서 측정할 수 있다.
여기서 기재하는 것과 같이, 용어 "열 용융점(Tm)"은 규정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에서 표적 서열에 대한 올리고뉴클레오타이드 상보성 중 50%가 표적 서열과 평형 상태에서 혼성화되는 온도를 나타낸다. 통상적으로 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 적어도 약 0.01 내지 0.1 M Na 이온 농도(또는 다른 염)이며, 온도가 짧은 올리고뉴클레오타이드(예를 들면 10개 내지 50개의 뉴클레오타이드)에 있어서 적어도 약 30℃인 조건이 될 것이다. 엄격한 조건은 또한 불안정화제, 예컨대 포름아마이드를 첨가하여 획득될 수도 있다.
여기서 사용하는 것과 같이, "조절"(modulation)은 유전자 발현의 증가(자극) 또는 감소(억제)를 의미한다.
폴리뉴클레오타이드 서열의 맥락에 사용되는 경우 용어 "변이체"(variant)는 야생형 유전자와 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 정의는 또한 예를 들면 "대립유전자"(allelic), "스플라이스"(splice), "종"(species) 또는 "다형성"(polymorphic) 변이체를 포함할 수도 있다. 스플라이스 변이체는 참고 분자와 현저한 동일성을 가질 수 있지만, 일반적으로 mRNA 프로세싱 중 엑손의 대체 스플라이싱 때문에 크거나 또는 작은 수의 폴리뉴클레오타이드를 갖는다. 상응하는 폴리펩타이드는 추가적인 기능성 도메인을 포함하거나 또는 도메인이 없을 수 있다. 종 변이체는 하나의 종에서 또 다른 종으로 다양한 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 본 발명에서 특별하게 유용한 것은 야생형 유전자 생성물의 변이체이다. 변이체는 핵산 서열 중의 적어도 하나의 돌연변이로부터 수득될 수 있으며, 변경된 mRNA 또는 구조 또는 기능이 변경되거나 또는 변경되지 않을 수 있는 폴리펩타이드가 야기될 수 있다. 어느 주어진 천연 또는 재조합 유전자는 없거나, 하나 또는 많은 대립유전자 형태를 가질 수 있다. 변이체를 생기게 하는 통상적인 돌연변이적 변화는 일반적으로 뉴클레오타이드의 자연적인 결손, 첨가 또는 치환에 속한다. 이러한 타입의 변화 각각은 단독으로 발생하거나 또는 다른 변화, 즉 주어진 서열 중의 하나 이상의 횟수와 조합해서 발생할 수 있다.
수득된 폴리펩타이드는 일반적으로 서로 관련된 현저한 아미노산 동일성을 가질 것이다. 다형성 변이체는 주어진 종 각각 사이의 특정 유전자의 폴리뉴클레오타이드 서열의 변이이다. 또한 다형성 변이체는 "단일 뉴클레오타이드 다형(SNP)" 또는 폴리뉴클레오타이드 서열이 하나의 염기에 의해서 변화하는 단일 염기 돌연변이를 포함할 수 있다. SNP가 존재하는 것은 예를 들면 민감성 대 저항성인 질병 상태에 있어서의 경향을 갖는 특정 집단을 나타낼 수 있다.
유도적 폴리뉴클레오타이드는 화학적 변형, 예를 들면 알킬, 아실 또는 아미노 기에 의한 수소의 대체가 이루어지는 핵산을 포함한다. 유도체, 예를 들면 유도적 올리고뉴클레오타이드는 비-자연적-발생 부분, 예컨대 변경된 당 부분 또는 당 사이의 연결 부위를 포함할 수 있다. 이들 중에서 대표적인 것은 포스포로티오에이트 및 당 업에 공지되어 있는 종을 함유하는 기타 황이다. 유도적 핵산은 또한 방사성 뉴클레오타이드, 효소, 형광 제제, 화학적 발광 제제, 발색 제제, 기질, 보조 인자, 억제제, 자성 입자 등을 포함하는 라벨을 함유할 수도 있다.
"유도적"(derivative) 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 예를 들면 당화, 페길화, 인산화, 황산화, 환원/알킬화, 아실화, 화학적 커플링 또는 순한 포르말린 처리에 의해 변형된 것이다. 유도체는 또한 이에 제한되지는 않지만 방사성 동위 원소, 형광물질 및 효소 라벨을 포함하는 간접적으로 또는 직접적으로 검출가능한 라벨을 함유하도록 변형될 수 있다.
여기서 사용하는 것과 같이, 용어 "동물" 또는 "환자"는 예를 들면, 인간, 양, 엘크, 사슴, 뮬사슴, 밍크, 포유류, 원숭이, 말, 소, 돼지, 염소, 개, 고양이, 생쥐, 쥐, 조류, 닭, 파충류, 어류, 곤충 및 거미류를 포함하는 것을 의미한다.
"포유류"는 통상적으로 의료 치료 중인 온혈 포유류(예를 들면 인간 및 가축)를 포함한다. 예로는 단지 인간뿐만 아니라 고양이, 개, 말, 소 및 인간을 포함한다.
"치료하는" 또는 "치료"는 포유류에서의 질병 상태의 치료를 포함하며, (a) 포유류에서 발생하는 것으로부터 질병 상태의 예방, 특히 상기 포유류가 이러한 질병 상태에 취약하지만 아직 이러한 질병이 발병했다고 진단되지 않은 경우의 예방; (b) 예를 들면 이의 발병을 저지하는 것과 같은 질병 상태의 억제; 및/또는 (c) 질병 상태의 경감, 예를 들면 목적하는 종료점에 도달할 때까지 질병 상태의 퇴보를 야기하는 것을 포함한다. 또한 치료하는 것은 질병 증상의 개선(예를 들면, 고통 또는 불편의 감소)을 포함하며, 이러한 개선은 직접적으로 질병에 영향을 미칠 수 있거나 또는 미치지 않을 수 있다(예를 들면, 원인, 전염, 표출 등).
여기서 사용하는 것과 같이, "암"은 이에 제한하지는 않지만 하기를 포함하는 포유류에서 발견되는 모든 타입의 암 또는 신생 또는 악성 종양을 나타낸다: 백혈병, 림프종, 흑색종, 상피성 암 및 육종. 상기 암은 그 자체로 암의 악성 세포를 포함하는 조직 또는 "종양"으로서 나타난다. 종양의 예로는 육종 및 상피성 암, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 하기를 포함한다: 섬유 육종, 점액 육종, 지방 육종, 연골 육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관 육종, 내피 육종, 림프관 육종, 림프관 내피 육종, 혈액막종, 중피종, 유윙종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평상피상, 기저 세포암, 선암, 땀샘암, 피지샘암, 유두암, 유두상선암, 낭종암, 수양암, 기관지원성암종, 신세포암, 간종양, 담도암, 융모암종, 정상피종, 태생성 암종, 윌름즈 종양, 자궁경부암, 고환종양, 폐암, 폐소세포암, 담낭암, 상피암, 신경교종, 성상 세포종, 수모 세포종, 두개 인두종, 뇌질 피복 세포증, 송과체종, 혈관모 세포종, 청신경종, 희돌기교종, 수막종, 흑색종, 신경아 세포종 및 망막아종. 본 발명에 따라 기재된 조성물로 치료할 수 있는 추가적인 암은 이에 제한하지는 않지만 예를 들면 호지킨 병, 비호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신경아 세포종, 유방암, 난소암, 폐암, 횡문근육종, 원발성 혈소판증가증, 원발성 고분자글로불린혈증, 소세포성 폐암, 원발성 뇌종양, 위암, 결장암, 악성 췌장 인슐린종, 악성 암양종, 비뇨 방광 암, 위암, 전암성 병변, 고환암, 림프종, 갑상선 암, 신경아 세포종, 식도암, 비뇨 생식기관 암, 악성 고칼슘혈증, 자궁경부암, 자궁내막암, 부신피질 암 및 전립선 암을 포함한다.
"신경학상 질병 또는 질환"(neurological disease or disorder)은 신경계 및/또는 시각계의 어느 질병 또는 질환을 나타낸다. "신경학상 질병 또는 질환"은 중추 신경계(뇌, 뇌간 및 소뇌), 말초 신경계(뇌신경을 포함함) 및 자율 신경계(중추 및 말초 신경계 둘 다에 위치하는 부분)와 관련되는 질병 또는 질환을 포함한다. 신경학상 질환의 예로는 이에 제한하지는 않지만, 두통, 인사불성 및 혼수상태, 치매, 발작, 수면 장애, 정신적 외상, 감염, 신생물, 뇌안과학적 장애, 운동 장애, 탈수질환, 척수 장애, 및 말초 신경, 근육 및 신경근 접합부의 질환을 포함한다. 중독 및 정신 질환은 이에 제한되지는 않지만 신경학적 질환의 정의에도 포함되는 조울증 및 정신 분열증을 포함한다. 하기는 본 발명에 따른 조성물 및 방법을 사용하여 치료할 수 있는 몇몇 신경학적 질환, 증상, 사인 및 증후의 목록이다: 간질성 실어증; 급성 파종성 뇌척수염; 부신피질이영양증; 노인성 황반 변성; 뇌량의 무발생증; 실인증; 에이카르디 증후군; 알렉산더 병; 알퍼스 병; 교대성편마비; 혈관성 치매; 근위축성 측삭경화증; 무뇌증; 엔젤맨 증후군; 혈관종증; 산소결핍; 실어; 운동 불능; 거미막 낭종; 거미막염; 아놀드-키아리 기형; 동정맥 기형; 아스퍼거 증후군; 모세혈관확장; 주의력결핍 과잉행동장애; 자폐증; 자율신경 실조증; 요통; 바텐 병; 베체트 병; 벨씨 마비; 양성 본태성 안검경련증; 양성 국소 근위축증; 특발성 두개강내고압증; 빈스완거 병; 안검 경련증; 색소 실조증; 상완 신경총 손상; 뇌농량; 뇌 손상; 뇌종양(다형성아교모세포종을 포함함); 척추 종양; 브라운 세카르 증후군; 카나반 병; 수근관 증후군; 작열통; 중추성 통증 증후군; 중심부 뇌교수초 용해증; 뇌질환; 뇌동맥류; 뇌동맥 경화증; 뇌 수축; 뇌 거대증; 뇌성 마비; 샤르코-마린-투스 병; 화학요법-유도 신경 장애 및 신경병적 통증; 키아리 증후군; 무도병; 만성 염증성 탈수초화 다발성 신경병증; 만성 통증; 복합 부위 통증 증후군; 코핀-로리 증후군; 식물 인간을 포함한 혼수 상태; 선천성 얼굴 양측마비 증후군; 피질 기저핵 변성; 관자 동맥염; 조기유합증; 크로이츠펠트-야콥병; 누적 외상성 질환; 쿠싱 증후군; 거대 세포 봉입체 질환; 사이토메갈로바이러스 감염; 춤추는 눈-춤추는 발 증후군; 댄디-워커 증후군; 다우슨 질병; 데 모지르 증후군; 데제린-클룸프케 마비; 치매; 피부 근염; 당뇨병적 신경 장애; 미만성 경화증; 자율 신경 장애; 서자 장애; 난독증; 실조; 초기 유아성 간질성 뇌병증; 공터기안 증후군; 뇌염; 뇌류; 뇌상차 신경성 혈관종증; 간질; 어브 마비; 본태성 진전; 파브리병; 파흐르 증후군(Fahr's syndrome); 실신; 유전성 강직성 대마비; 발열 뇌졸증; 피셔 증후군; 프리드라이히 실조증; 전두 관자 치매 및 다른 "타우병증"; 고셰 병; 거스트만 증후군; 거대세포 동맥염; 거대세포 함유 질병; 구형 세포 대뇌피질 위축증; 갈렝 바레 증후군; HTLV-1-관련 골수 장애; 할러포르덴-슈파츠병; 두뇌 손상; 두통; 반측성 안면 경련증; 유전성 강직성 대마비; 유전성 다발신경염성 실조; 이성 대상 포진; 대상 포진; 히라야마 증후군; HIV관련 치매 및 신경 장애(또는 AIDS의 신경학적 징후); 전전뇌증; 헌팅톤 병 및 다른 폴리글루타민 반복 질병; 물무뇌증; 뇌수종; 고코티솔혈증; 저산소증; 면역-매개 뇌척수염; 봉입체 근염; 색소 실조증; 유아성 피탄산 저장 질병; 영아형 레프숨병; 영아 연축; 염증성 근병증; 대뇌 낭종; 대뇌 고혈압; 주버트 증후군; 컨스-세이어 증후군; 케네디 병; 클리펠-파일 증후군; 크라베병; 쿠겔베르그-웰란더병; 쿠루병; 라포라 병; 람베르트-이튼 근무력 증후군; 란다우-클레프너 증후군; 외측연수(발렌버그) 증후군; 학습 장애; 리씨 증후군; 레녹스-가스토 증후군; 레시-니한 증후군; 대뇌백질 위축증; 루이소체 치매; 활택뇌증; 고정 증후군; 루게릭 병(즉, 운동 신경 질환 또는 근위축성 측색 경화증); 요추 디스크 질환; 라임 병-신경학적 후유증; 마카도 조셉병; 대뇌증; 거대뇌증; 멜커슨 로젠탈 증후군; 메니에르병; 수막염; 멘케스병; 이염성 백질 이영양증; 소두증; 편두통; 밀러 피셔 증후군; 소중풍; 사립체 근병증; 뫼비우스 증후군; 단일사지 근육위축증; 운동 뉴우론 장애; 모야모야병; 뮤코다당증; 다발경색 치매; 다병소성 운동신경병증; 다발성 경화증 및 다른 탈수초 질환; 자세성 저혈압이 있는 다계통 위축증; p 근 이영양증; 중증 근무력증; 수초탈락성 미만성 경화증; 영아 중 근간대성 뇌증; 간대성 근경련증; 근병증; 선천적 근경직증; 수면 발작; 신경 섬유종증; 신경 이완성 악성 증후군; AIDS의 신경학적 징후; 낭창의 신경학적 후유증; 신경근긴장증; 신경 세로이드 리포푸스신증; 신경 이주 이상; 니만-픽 병; 오설리번-맥레오드 증후군(O'Sullivan-McLeod syndrome); 후두 신경통; 잠혈 척추후만증 연쇄; 오타하라 증후군; 올리브교 소뇌 위축증; 안구간대경련-근간대경련 증후군; 시신경염; 기립성 저혈압; 과사용 증후군; 이상 감각; 신경 퇴화 질환 또는 질병[파킨슨 병, 헌팅턴 병, 알쯔하이머 병, 근위축성 측삭경화증(ALS), 치매, 다발성 경화증 및 다른 신경 세포 사멸과 관련된 질환 및 질병]; 선천성 이상근긴장증; 방종양성 질환; 발작 공격; 패리-롬버그 병; 펠리제우스-메르츠바흐병; 주기 마비; 말초신경병증; 신경병성 통증 및 신경 통증; 식물 인간; 전반적 발달장애; 광반사 재채기; 피탄산 저장 질병; 픽병; 신경 압박; 뇌하수체 종양; 다발성근염; 공뇌증; 회색질 척수염 후증후군; 대상포진 후 신경통; 감염성후의 뇌염; 자세성 저혈압; 프라더-윌리 증후군; 원발성 측삭 경화증; 프리온 병; 진행성 반얼굴 위축; 진행 다초점 백질 뇌증; 진행성 경화 폴리오디스트로피; 진행성 핵상 마비; 가뇌종양; 람세이-헌트 증후군(타입 I 및 II); 라스무센 뇌염; 반사성 교감신경 이영양증 증후군; 레프숨병; 반복적 움직임에 따른 병; 반복사용 긴장성 손상 증후군; 하지 불안 증후군; 레트로바이러스-관련 골수 장애; 레트 증후군; 라이증후군; 세인트 바이터스 춤; 샌드호프병; 쉴더병; 뇌갈림증; 중격-시신경 형성장애; 흔들린 아이 증후군; 대상 포진; 샤이-드래거 증후군; 쇼그렌 증후군; 수면 무호흡; 소토스 증후군; 경련; 척추 파열; 척수 손상; 척추 종양; 척추 근육 위축; 강직인간 증후군; 발작; 스터지 웨버 증후군; 아급성 경화성 범뇌염; 피질하 동맥경화성 뇌증; 시덴함 무도병; 실신; 척수 공동증; 지발성 안면 마비; 테이-삭스병; 일시적 동맥염; 구속성 척수 증후군; 톰슨 병; 흉곽출구 증후군; 동통성 틱; 토트 마비; 뚜렛 증후군; 일과성 뇌허혈 발작; 전염성 해면 상뇌증; 횡단 척수염; 외상성 뇌손상; 진전; 삼차 신경통; 열대 경직 하반신 마비; 결절 경화; 혈관성 치매(다발경색 치매); 일시적 동맥염을 포함하는 혈관염; 폰 힙펠-린도우병; 발렌버그 증후군; 베르드니히-호프만 병; 웨스트 증후군; 목뼈의 골절; 윌리엄스 증후군; 윌슨병; 및 젤웨거 증후군.
심혈관 질환 또는 질병은 심장의 재관류에 의해 야기되거나 또는 빈혈을 야기할 수 있는 질환을 포함한다. 예로는 이에 제한하지는 않지만 아테로마성 동맥 경화증, 관상 동맥 질환, 육아종성 심근염, 만성 심근염(비-육아종성), 원발성 비대 심근증, 말초 동맥 질환(PAD), 말초 혈관 질병, 정맥혈전색전증, 폐색전증, 발작, 협심증, 심근경색, 심장 마비에 의한 심혈관 조직 손상, 심장 우회에 의해 야기되는 심혈관 조직 손상, 심장성 쇼크, 및 당업자에 의해 공지되어 있거나 또는 심장 또는 맥관 구조에 대한 조직 손상, 특히 이에 제한되지는 않지만 GH 활성화와 관련된 조직 손상 또는 이의 기능 장애와 관련이 있는 관련 질환을 포함한다. CVS 질환은 이에 제한되지는 않지만 아테로마성 동맥 경화증, 육아종성 심근염, 심근 경색, 심장 판막 심장병에 대한 제2의 심근 섬유증, 경색 없는 심근 섬유증, 원발성 비대 심근증 및 만성 심근염(비-육아종)을 포함한다.
폴리뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드 조성물 및 분자
표적: 일 실시형태에서, 표적은 HGF와 관련된 센스 및/또는 안티센스 비코딩 및/또는 코딩 서열을 제한 없이 포함하는, 간세포 성장 인자(HGF)의 핵산 서열을 포함한다.
간세포 성장 인자(HGF)는 세포 증식, 세포 운동성, 형태발생 및 혈관생성을 조절하는 본래 간엽-유래 인자로서 기재된 다기능 사이토카인이다. 간세포 성장 인자는 6개의 도메인(핑커, 크링글 1, 크링글 2, 크링글 3, 크링글 4 및 세린 프로테아제 도메인)을 갖는 구조의 증식 인자를 나타낸다. HGF의 단편은 더 적은 도메인을 갖는 HGF를 구성하며, HGF의 변이체는 몇몇 반복된 HGF 도메인을 가질 수 있고; HGF 수용체를 결합하는 이들 각각의 능력을 여전히 보유한다면 상기 둘 다가 포함된다. 용어 "간세포 성장 인자" 및 "HGF"는 인간("huHGF") 및 어느 비-인간 포유류 종으로부터의 간세포 성장 인자이며, 특히 쥐 HGF이다. 여기서 사용하는 것으로서의 용어는 성숙 형태(mature form), 예비 형태(pre form), 예비-전 형태(pre-pro form) 및 전 형태(pro form)를 포함하며, 천연 공급처로부터 정제되고, 화학적으로 합성 또는 재조합적으로 생성된다. 인간 HGF는 cDNA 서열에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 HGF 군 멤버와 연관된 질병 또는 질환을 예방 또는 치료하기 위해 사용된다. 안티센스 화합물을 사용해서 수득되는 줄기 세포로부터 재생되는 세포/조직으로 치료할 수 있는 대표적인 간세포 성장 인자(HGF) 매개 질병 또는 질환은 하기를 포함한다: 국소빈혈성 질병(예를 들면, 국소빈혈성 심장질병 및 말초 혈관 질병), 동맥 질병 또는 질환, 혈관평활근 세포의 비정상적 증식과 주로 관련되는 방해에 의해 야기되는 질병 또는 질환[예를 들면, 경피경혈관 심장동맥 확장술(PTCA) 이후의 재발협착증, 동맥 경화증, 불충분한 말초 순환 등], 심혈관 질병 또는 질환(예를 들면, 심근 경색증, 심근증, 말초 혈관 협착, 심부전, 등), 신경학적 질병 또는 질환(예를 들면, 신경 변성, 말초 신경 장애, 당뇨병적 신경 장애, 신경독 유래 병변, 수술에 의한 신경 세포 손상, 감염에 의한 신경 세포의 병변, 간질, 머리 외상, 치매, 알쯔하이머 타입의 노인성 치매, 뇌졸증, 뇌경색, 근위축성 측삭경화증, 파킨슨 병, 알쯔하이머 병, 헌팅톤 병 및 신경 세포 종양 등), 암, 종양, 세포 증식 질환, 면역(예컨대 자가 면역) 질환, 혈관 생성-관련 질환, 간 경화증, 비알콜성 지방간 질병, 신장 질병 또는 질환, 신장 섬유증, 횡문근변성, 불충분한 상피 세포 성장과 관련된 질병 또는 질환, 폐 질환 또는 질병, 위장 손상, 뇌신경 질병, 연골 질병, 동맥 질환, 폐 섬유증, 연골 손상, 간 질환 또는 질병, 혈액 응고 장애, 혈장 저단백증 또는 상처, 아데노신 탈아미노효소 결핍, 염증성 창자 병(예를 들면, 궤양성 대장염, 크론병, 괴사성 장염, 심각한 급성 위장염, 만성 위장염, 콜레라, 장의 만성적 감염), 장에 영향을 주는 면역성 질병 또는 질환, 장에 영향을 주는 면역결핍 증후군, AIDS, 농포투성 섬유증, 섬유증, 감소된 콜라게나아제 활성과 관련된 질병 또는 질환(예를 들면, 골화석증 등), 섬유아 세포-유래 교원 섬유 매트릭스의 초과 생성인 특징인 섬유증 질환[예를 들면, 동맥 경화증, 만성 위장염, 진피 켈로이드 형성, 진행성 전신성 경화증(PSS), 간 섬유증, 폐 섬유증, 쓸개 섬유증, 만성 이식 편대 숙주 반응, 경피증(국소 및 전신), 페이로니병, 음경 섬유증, 방광경을 사용한 시험 이후의 요도 협착증, 수술 후 내부 융착, 골수 섬유증, 특발성 후복막강 섬유증], 혈우병, 피부 질환 또는 질병[예를 들면, 상처, 독두병(대머리), 피부 궤양, 욕창(침대앓이), 반흔(켈로이드), 아토피성 피부염, 또는 자가 치아 이식술 및 교차 이식을 포함하는 피부 이식 수술이 뒤따르는 피부 손상].
본 발명의 실시형태에서, 치료 및/또는 미용 요법, 및 관련된 맞춤 치료를 피부 치료가 필요한 질병의 발병 위험 또는 피부 치료가 필요한 피험체에게 제공된다. 진단은 예를 들면 피험체의 HGF 상태를 기본으로 이루어질 수 있다. 예컨대 피부와 같은 주어진 조직에서의 환자의 HGF 발현 수준은 예를 들면 PCR 또는 항체-기본 검출 방법을 사용하여 조직을 분석함으로써 여기 다른 곳에서 기재하고 당업자에게 공지되어 있는 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태는 예를 들면 피부에서 HGF의 발현을 상향조절하기 위해 HGF 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 미용적 응용 및/또는 피부 치료를 위한 조성물을 제공한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 예는 서열 번호: 3 내지 6으로 제시된다. 여기에 참고문헌으로서 포함되어 있는 미국 특허 제7,544,497호(발명의 명칭: "Compositions for manipulating the lifespan and stress response of cells and organisms")에는 이의 기질을 위한 HGF 단백질의 Km을 감소시킴으로써 HGF 활성을 조절하는 제제 용의 잠재적인 미용 용도를 기재하고 있다. 실시형태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 세포의 생체 내로 처리하여 세포 수명을 증가시키거나 또는 세포 자멸을 예방한다. 예를 들면, 여기서 기재하는 것과 같이 피부, 예를 들면 상피 세포를 치료하여 노화, 예를 들면 주름 생성으로부터 피부를 보호할 수 있다. 하나의 대표적인 실시형태에서, 여기서 기재하는 것과 같은 HGF 안티센스 화합물을 포함하는 약학적 또는 미용적 조성물과 피부를 접촉시킨다. 대표적인 피부병 또는 피부 질환은 염증, 태양 손상 또는 자연적 노화에 의해 야기되거나 또는 이와 관련된 질병 또는 질환을 포함한다. 예를 들면, 조성물은 접촉성 피부염(자극성 접촉 피부염 및 알레르기성 접촉 피부염을 포함함), 아토피성 피부염(알레르기성 습진이라고도 함), 광선 각화증, 각질화 장애(습진을 포함함), 표피 수포증(천포창을 포함함), 박락성 피부염, 지루성 피부염, 홍반(다형 홍반 및 결절성 홍반을 포함함), 태양 또는 기타 광 공급원에 의해 야기되는 손상, 원판상 홍반성 루푸스, 피부 근염, 피부 암 및 자연적인 노화의 영향을 치료 또는 예방하는데 유용성이 확인되었다.
본 발명의 실시형태에서, 예를 들면 두피에서 HGF 발현을 상향조절하기 위한 HGF 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물은 안드로젠 수용체 시그날링을 억제하여 안드로젠 탈모증(탈모)을 예방한다. 실시형태에서, 탈모증을 앓고 있는 환자는 국소 또는 전신 제제를 투여한다.
일 실시형태에서, 여기서 기재하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 국소 약물 투여에 일반적으로 적당한 국소 담체(topical carrier)를 함유하고, 당 업에 공지된 상기 물질을 포함하는 국소 제제에 포함된다. 상기 국소 담체는 목적하는 형태, 예를 들면 연고, 로션, 크림, 마이크로에멀전, 겔, 오일, 용액 등의 조성물을 제공하기 위해 선택될 수 있으며, 자연 발생 또는 합성 원료로 구성될 수 있다. 선택된 담체는 국소 제제의 활성제 또는 다른 성분에 악영향을 주지 않는 것이 바람직하다. 여기서 사용하기 적당한 국소 담체의 예로는 물, 알콜 및 다른 비독성 유기 용매, 글리세린, 미네랄 오일, 실리콘, 페트롤리움 젤리, 라놀린, 지방산, 식물성 오일, 파라벤, 왁스 등이 포함된다. 제제는 무색, 무취 연고, 로션, 크림, 마이크로에멀전 및 겔일 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 페트롤리움 또는 다른 페트롤리움 유도체를 기본으로 하는 것이 통상적인 반고형 제제가 일반적인 연고에 포함될 수 있다. 당업자가 이해할 수 있는 것으로서 사용되는 특수 연고 기제는 최적의 약물 운반용으로 제공되는 것이며, 바람직하게는 또한 다른 목적하는 특성, 예를 들면 피부 연화 등을 위해 제공되는 것이다. 다른 담체 또는 비히클(vehicle)과 함께 연고 기제는 불활성, 안정, 비-자극 및 비-민감성 이여야 한다. 레밍톤 약제학(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Pub. Co.)에서 설명하고 있는 것과 같이, 연고 기제는 네 개의 부류로 나뉠 수 있다: 기름 기제(oleaginous bases); 유화 기제(emulsifiable bases); 에멀전 기제(emulsion bases); 및 수용성 기제(water-soluble bases). 기름 연고 기제는 예를 들면 식물성 오일, 동물로부터 수득된 지방 및 페트롤리움으로부터 수득된 반고형 탄화수소를 포함한다. 흡수성 연고 기제라고도 공지되어 있는 유화 연고 기제는 물을 아주 소량 함유하거나 물이 거의 없으며, 예를 들면 하이드록시스테아린 설페이트, 무수 라놀린 및 친수성 페트롤리움을 포함한다. 에멀전 연고 기제는 유중수형(W/O) 에멀전 또는 수중유형(O/W) 에멀전이며, 예를 들면 세틸 알콜, 글리세릴 모노스테아레이트, 라놀린 및 스테아르산을 포함한다. 대표적인 수용성 연고 기제는 분자량을 다양하게 하여 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로부터 제조된다(예를 들면 상기 레밍톤의 약제학 참조).
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상적으로 액상 또는 반액상 제제이며, 일반적으로 마찰 없이 피부 표면에 도포할 수 있는 제제인 로션에 포함될 수 있으며, 활성 제제를 포함하는 고형 입자는 물 또는 알콜 기제에 존재한다. 로션은 일반적으로 고형물의 현탁물이며, 수중유형 타입의 액상 기름 에멀전을 포함할 수 있다. 로션은 보다 유동성 조성물을 도포하는 것이 용이하므로 넓은 체표면을 치료하기 위한 바람직한 제제이다. 일반적으로 로션 중의 불용성 물질은 잘게 나누는 것이 필요하다. 로션은 통상적으로 피부와 접촉하는 활성 제제를 보유하고 위치시키기에 유용한 화합물, 예를 들면 메틸셀룰로스, 소디움 카복시메틸셀룰로스 등뿐만 아니라 보다 넓게 분산시키기 위한 현탁 제제를 함유할 것이다. 본 발명의 방법과 함께 사용하는 대표적인 로션 제제는 Beiersdorf, Inc.(코네티컷주의 노르워크시에 소재)에서 상품명 Aquaphor(상표명)으로 수득될 수 있는 친수성 페트롤리움과 혼합한 프로필렌 글리콜을 함유한다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 점성 액상 또는 반고형 에멀전이면서 수중유형 또는 유중수형인 크림으로 포함될 수 있다. 크림 기제는 수세성(water-washable)이며, 오일 상, 유화제 및 수성 상을 함유한다. 상기 오일 상은 일반적으로 페트롤리움 및 지방 알콜, 예컨대 세틸 또는 스테아릴 알콜로 구성되며; 상기 수성 상은 일반적으로 필수적이지는 않지만 부피가 상기 오일 상을 초과하며, 일반적으로 습윤제를 함유한다. 상기 레밍톤의 약제학에서 설명하는 것과 같이 크림 제제에서의 상기 유화제는 일반적으로 비이온성, 음이온성, 양이온성 또는 양쪽성 계면 활성제이다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 계면 활성제 분자의 계면 막에 의해 안정화되는, 오일 및 물과 같은 두 개의 비혼성 액체의 열역학적으로 안정하고 이방성으로 투명한 분산물이 일반적인 마이크로에멀전으로 포함될 수 있다[Encyclopedia of Pharmaceutical Technology (New York: Marcel Dekker, 1992), volume 9]. 마이크로에멀전의 제제를 위해, 계면 활성제(유화제), 보조-계면 활성제(보조-유화제), 오일 상 및 수 상이 필요하다. 적당한 계면 활성제는 크림 제제에 통상적으로 사용되는 유화제와 같은 에멀전의 제제에 유용한 어느 계면 활성제를 포함한다. 상기 보조-계면 활성제(또는 "보조-유화제")는 일반적으로 폴리글리세롤 유도체, 글리세롤 유도체 및 지방 알콜로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 유화제/보조-유화제 결합물은 일반적으로 필요하지는 않지만 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 글리세롤 모노스테아레이트 및 폴리옥시에틸렌 스테아레이트; 폴리에틸렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜 팔미토스테아레이트; 및 카프릴 및 카프르 트라이글리세라이드 및 올레오일 마크로골글리세라이드. 상기 수 상은 물뿐만 아니라 또한 통상적으로 완충액, 글루코스, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 바람직하게는 저분자 중량 폴리에틸렌 글리콜(예를 들면, PEG 300 및 PEG 400), 및/또는 글리세롤, 등을 포함하며, 반면에 상기 오일 상은 일반적으로 예를 들면 지방산 에스터, 변형된 식물성 오일, 실리콘 오일, 모노-, 다이- 및 트라이글리세라이드의 혼합물, PEG의 모노- 및 다이-에스터(예를 들면, 올레오일 마크로골글리세라이드) 등을 포함할 것이다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 담체 액체 전반에 걸쳐 실질적으로 균일하게 분포된 큰 유기 분자(단일 상 겔) 또는 작은 무기 입자(2-상 시스템)로 구성되는 현탁물로 구성되는 반고형 시스템이 일반적인 겔 제제로 포함될 수 있다. 단일 상 겔은 예를 들면 활성 제제, 담체 액체 및 적당한 겔화 제제, 예컨대 트라가칸트(2 내지 5%), 소디움 알지네이트(2-10%), 젤라틴(2-15%), 메틸셀룰로스(3-5%), 소디움 카복시메틸셀룰로스(2-5%), 카르보머(0.3-5%) 또는 폴리비닐 알콜(10-20%)을 함께 결합시키고, 특유의 반고형 생성물이 수득될 때까지 혼합하여 제조될 수 있다. 다른 적당한 겔화 제제는 메틸하이드록시셀룰로스, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌, 하이드록시에틸셀룰로스 및 젤라틴을 포함한다. 겔은 일반적으로 수성 담체 액체를 이용하지만 알콜 및 오일도 또한 담체 액체로서 사용할 수 있다.
당 업에 공지되어 있는 다양한 첨가제가 제제, 예를 들면 국소 제제에 포함될 수 있다. 첨가제의 예로는 이에 제한되지는 않지만 용해제, 피부 침투 개선제, 유백제, 보존제(예를 들면, 항산화제), 겔화제, 완충제, 계면 활성제(특히 비이온성 및 양쪽성 계면 활성제), 유화제, 피부 연화제, 증점제, 안정화제, 습윤제, 색료, 향제 등이 포함된다. 유화제, 습윤제 및 보존제와 함께 안정화제 및/또는 피투 침투 개선제를 포함하는 것이 특히 바람직하다. 최적의 국소 제제는 대략 하기를 포함한다: 제제의 하기 이외 나머지를 구성하는 활성 제제 및 담체(예를 들면, 물)와 함께, 2 중량% 내지 60 중량%, 바람직하게는 2 중량% 내지 50 중량%의 안정화제 및/또는 피부 침투 개선제; 2 중량% 내지 50 중량%, 바람직하게는 2 중량% 내지 20 중량%의 유화제; 2 중량% 내지 20 중량%의 습윤제; 및 0.01 중량% 내지 0.2 중량%의 보존제.
피부 침투 개선제는 온전한 피부의 알맞은 크기 영역을 통과하도록 하기 위해 치료량의 활성 제제의 통과를 용이하게 한다. 적당한 개선제는 당 업에 잘 공지되어 있으며, 예를 들면 하기를 포함한다: 저급 알칸올, 예컨대 메탄올, 에탄올 및 2-프로판올; 알킬 메틸 설폭사이드, 예컨대 다이메틸설폭사이드(DMSO), 데실메틸설폭사이드(C10 MSO) 및 테트라데실메틸 설폭사이드; 피롤리돈, 예컨대 2-피롤리돈, N-메틸-2-피롤리돈 및 N-(-하이드록시에틸)피롤리돈; 유레아; N,N-다이에틸-m-톨루아미드; C2-C6 알칸다이올; 각종 용매, 예컨대 다이메틸 포름아마이드(DMF), N,N-다이메틸아세타미드(DMA) 및 테트라하이드로푸르푸릴 알콜; 및 1-치환형 아자사이클로헵탄-2-온, 특히 1-n-도데실시클아자사이클로헵탄-2-온(라우로카프람; 버지니아주의 리치몬드시에 소재 Whitby Research Incorporated로부터 상품명 Azone(상표명)으로 이용가능함).
안정화제의 예로는 이에 제한되지는 않지만 하기를 포함한다: 친수성 에스터, 예컨대 다이에틸렌 글리콜 모노에틸 에터(에톡시다이글리콜, Transcutol(상표명)로 시판되는 것을 이용가능함) 및 다이에틸렌 글리콜 모노에틸 에터 올레이트(Soficutol(상표명)로 시판되는 것을 이용가능함); 폴리에틸렌 캐스터 오일 유도체, 예컨대 폴리옥시 35 캐스터 오일, 폴리옥시 40 수소첨가 캐스터 오일, 등; 폴리에틸렌 글리콜, 특히 저분자량 폴리에틸렌 글리콜, 예컨대 PEG 300 및 PEG 400, 및 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 예컨대 PEG-8 카프릴/카프로 글리세라이드(Labrasol(상표명)로 시판되는 것을 이용가능함); 알킬 메틸 설폭사이드, 예컨대 DMSO; 피롤리돈, 예컨대 2-피롤리돈 및 N-메틸-2-피롤리돈; 및 DMA. 많은 안정화제가 또한 흡수 개선제로서 활성이 있을 수 있다. 단일 안정화제는 제제로 포함될 수 있으며, 안정화제 혼합물이 이에 포함될 수도 있다.
적당한 유화제 및 보조-유화제는 제한 없이 마이크로에멀전 제제에 대해서 기재한 유화제 및 보조-유화제를 포함한다. 습윤제는 예를 들면 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 아이소프로필 미리스테이트, 폴리프로필렌 글리콜-2(PPG-2) 미리스틸 에터 프로피오네이트 등을 포함한다.
다른 활성 제제도 또한 제제, 예를 들면 다른 항-염증성 제제, 진통제, 항균제, 항진균제, 항생물질, 비타민, 항산화제, 및 이에 제한되지는 않지만 안트라닐레이트, 벤조페논(특히 벤조페논-3), 장뇌 유도체, 신나메이트(예를 들면, 옥틸 메톡시신나메이트), 다이벤조일 메탄(예를 들면, 부틸 메톡시다이벤조일 메탄), p-아미노벤조산(PABA) 및 이의 유도체, 및 살리실레이트(예를 들면, 옥틸 살리실레이트)를 포함하는 자외선 차단 제제에서 일반적으로 확인되는 자외선 방지제에 포함될 수도 있다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 HGF의 조절은 운동 강화 및 보디 빌딩을 위해 이를 필요로 하는 환자에게서 수행된다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 HGF의 조절은 이를 필요로 하는 환자에게서 수행하여 표준 대조군과 비교해서 HGF 비정상적 발현, 기능, 활성과 관련된 어느 질병 또는 질환을 예방 또는 치료한다.
일 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 제한 없이 비코딩 영역을 포함하는 HGF의 폴리뉴클레오타이드에 특이적이다. 상기 HGF 표적은 HGF의 변이체; SNP를 포함하는 HGF의 돌연변이체; HGF의 비코딩 서열; 대립유전자, 단편 등을 포함한다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 RNA 분자이다.
본 발명의 실시형태에 따르면, 표적 핵산 분자는 HGF 폴리뉴클레오타이드 단독에 제한되지 않으며, HGF의 아이소형, 수용체, 유사체, 비-코딩 영역 등 중 어느 것으로 확대된다.
일 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 제한 없이 이의 변이체, 대립유전자, 동족체, 돌연변이체, 유도체, 단편 및 이의 상보적인 서열을 포함하는 HGF 표적의 천연 안티센스 서열(코딩 및 비-코딩 영역에 대한 천연 안티센스)을 표적화 한다. 바람직하게 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 RNA 또는 DNA 분자이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 올리고머 화합물은 또한 다른 염기가 화합물 중의 뉴클레오타이드 위치 중 하나 이상에 존재하는 변이체를 포함한다. 예를 들면, 첫 번째 뉴클레오타이드가 아데닌이라면, 상기 위치에 티미딘, 구아노신, 시티딘 또는 다른 천연 또는 비천연 뉴클레오타이드를 함유하는 변이체를 생성할 수 있다. 상기는 안티센스 화합물의 위치 중 어느 곳이든지 실행할 수 있다. 다음에 이러한 화합물은 표적 핵산 발현을 억제하는 이들의 능력을 측정하기 위해서 여기서 기재하는 방법을 사용하여 시험한다.
몇몇 실시형태에서, 안티센스 화합물과 표적 사이의 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 50% 내지 약 60%이다. 몇몇 실시형태에서, 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 60% 내지 약 70%이다. 몇몇 실시형태에서, 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 70% 내지 약 80%이다. 몇몇 실시형태에서, 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 80% 내지 약 90%이다. 몇몇 실시형태에서, 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%이다.
안티센스 화합물은 표적 핵산에 화합물이 결합하여 활성을 손실시키는 표적 핵산의 정상 기능을 방해하는 경우에 특이적으로 혼성화될 수 있으며, 특이적 결합을 목적하는 조건 하에서 비-표적 핵산 서열로의 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 피하기 충분한 정도의 상보성이 존재한다. 이러한 조건은 즉 치료적 처리 또는 생체 내 분석의 경우에는 생리학적 조건, 및 분석이 시험관 내 분석이 경우 실행되는 조건을 포함한다.
DNA, RNA, 키메라, 치환 등이든지 안티센스 화합물은 표적 DNA 또는 RNA 분자로 화합물의 결합으로 표적 DNA 또는 RNA의 정상 기능을 방해하여 유용성을 상실하는 경우에 특이적으로 혼성화될 수 있으며, 특이적 결합을 목적하는 조건, 즉 생체 내 분석 또는 치료적 처치의 경우에는 생리학적 조건 및 시험관 내 분석의 경우 분석을 실행하는 조건하에서 비-표적 서열로의 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 피하기 충분한 정도의 상보성이 존재한다.
일 실시형태에서, 서열 번호: 2 내지 4 등으로 제시되는 서열 중 하나 이상으로 예를 들면 PCR, 혼성화 등을 사용해서 확인되고 확장된 안티센스 서열을 제한 없이 포함하는 HGF의 표적화로 HGF의 발현 또는 기능을 조절한다. 일 실시형태에서, 발현 또는 기능은 대조군과 비교해서 상향 조절된다. 일 실시형태에서, 발현 또는 기능은 대조군과 비교해서 하향 조절된다.
일 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면 PCR, 혼성화 등을 사용해서 확인되고 확장되는 안티센스 서열을 포함하는 서열 번호: 5 내지 12로 제시되는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드, 짧거나 또는 긴 단편, 변형된 결합 등을 포함할 수 있다. 변형된 결합 또는 뉴클레오타이드 간의 결합의 예로는 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트 등을 포함한다. 일 실시형태에서, 뉴클레오타이드는 포스포러스 유도체를 포함한다. 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오타이드 중 당 또는 당 유사 부분에 부착될 수 있는 포스포러스 유도체(또는 변형된 포스페이트 기)는 모노포스페이트, 다이포스페이트, 트라이포스페이트, 알킬포스페이트, 알칸포스페이트, 포스포로티오에이드 등일 수 있다. 상기에서 언급한 포스페이트 유사체의 제조, 이들의 뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드로의 포함 그 자체도 또한 공지되어 있으므로 여기서 기재할 필요는 없다.
안티센스의 특이성 및 민감성은 또한 치료적 용도를 위해 당업자에 의해 이용된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 동물 및 사람의 질병 상태의 치료에서 치료적 성분으로서 이용되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 인간에 안전하고 효과적으로 투여되며, 다수의 임상 시험이 현재 진행 중이다. 따라서 올리고뉴클레오타이드는 세포, 조직 및 동물, 특히 인간의 치료를 위한 치료 요법에 유용하도록 구성될 수 있는 유용한 치료적 양상일 수 있다는 것이 인정된다.
본 발명의 실시형태에서, 올리고머 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산 분자에 결합하며, 표적 유전자에 의해 암호화되는 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다. 방해받는 DNA 기능은 예를 들면 복제 및 전사를 포함한다. 방해받는 RNA의 기능은 모든 필수적인 기능, 예컨대 예를 들면 단백질 번역 부위로의 RNA의 전좌, RNA로부터 단백질의 번역, 하나 이상의 mRNA 종을 수득하기 위한 RNA의 스플라이싱 및 RNA에 의해 촉진되거나 또는 RNA에 관여할 수 있는 촉매적 활성을 포함한다. 기능은 목적하는 기능에 따라 상향 조절 또는 억제될 수 있다.
안티센스 화합물은 안티센스 올리고머 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 외부 가이드 서열(EGS) 올리고뉴클레오타이드, 대체 스플라이서, 프라이머, 프로브 및 표적 핵산 중 적어도 일부에 혼성화되는 다른 올리고머 화합물을 포함한다. 보통 이러한 화합물은 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적 단일-가닥 또는 원형 올리고머 화합물의 형태로 도입될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 특정 핵산 분자로의 안티센스 화합물의 표적화는 다단계 공정일 수 있다. 이러한 공정은 일반적으로 기능이 조절되는 표적 핵산의 확인으로 시작된다. 이러한 표적 핵산은 예를 들면 발현이 특정 질병 또는 질환 상태, 또는 감염원으로부터의 핵산 분자와 연관이 있는 세포 유전자(또는 유전자로부터 전사된 mRNA)일 수 있다. 본 발명에서, 표적 핵산은 간세포 성장 인자(HGF)를 암호화한다.
표적화 과정은 일반적으로 목적하는 효과, 예를 들면 발현 조절이 수득되도록 발생되는 안티센스 상호작용에 대한 표적 핵산 내에서의 적어도 하나의 표적 영역, 세그먼트 또는 부위에서의 확인을 포함한다. 본 발명의 내용에서, 용어 "영역(region)"은 적어도 하나의 확인가능한 구조, 기능 또는 특성을 갖는 표적 핵산의 일부로서 규정한다. 표적 핵산의 영역 내에서는 세그먼트이다. "세그먼트(segments)"는 표적 핵산 내의 더 작거나 또는 서브-부분으로 규정한다. 본 발명에서 사용하는 것과 같은 "부위(sites)"는 표적 핵산 내의 위치로 규정한다.
일 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 간세포 성장 인자(HGF)의 천연 안티센스 서열에 결합하며, HGF(서열 번호: 1)의 발현 및/또는 기능을 조절한다. 안티센스 서열의 예로는 서열 번호: 2 내지 12를 포함한다.
일 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 간세포 성장 인자(HGF) 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 세그먼트에 결합하며, HGF의 발현 및/또는 기능을 조절한다. 상기 세그먼트는 HGF 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오타이드의 적어도 5개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 HGF의 천연 안티센스 서열에 특이적이며, HGF의 천연 안티센스 서열로의 올리고뉴클레오타이드의 결합으로 HGF의 발현 및/또는 기능이 조절된다.
일 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 화합물은 예를 들면 PCR, 혼성화 등을 사용하여 확인 및 확장된 안티센스 서열, 즉 서열 번호: 5 내지 12로 제시되는 서열을 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드, 짧거나 또는 긴 단편, 변형된 결합 등을 포함할 수 있다. 변형된 결합 또는 뉴클레오타이드 간의 결합의 예로는 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트 등을 포함한다. 일 실시형태에서, 뉴클레오타이드는 포스포러스 유도체를 포함한다. 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오타이드 중의 당 또는 당 유사 부분에 부착될 수 있는 포스포러스 유도체(또는 변형된 포스페이트 기)는 모노포스페이트, 다이포스페이트, 트라이포스페이트, 알킬포스페이트, 알칸포스페이트, 포스포로티오에이트 등일 수 있다. 상기에서 언급한 포스페이트 유사체의 제조 및 이들의 뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드로의 포함 그 자체도 또한 공지되어 있어 여기서 기재할 필요는 없다.
당 업에 공지되어 있는 것과 같이 번역 개시 코돈(translation initiation codon)은 통상적으로 5'-AUG(전사된 mRNA 분자 중; 상응하는 DNA 분자 중에서는 5'-ATG)이므로, 번역 개시 코돈은 또한 "AUG 코돈", "시작 코돈(start codon)" 또는 "AUG 시작 코돈"이라고도 한다. 소수의 유전자는 RNA 서열 5'-GUG, 5'-UUG 또는 5'-CUG를 갖는 번역 개시 코돈을 가지며; 5'-AUA, 5'-ACG 및 5'-CUG는 생체 내에서 작용하는 것으로 확인되었다. 따라서, 용어 "번역 개시 코돈" 및 "시작 코돈"은 비록 각각의 경우에 개시 아미노산이 통상적으로 메티오닌(진핵생물에서) 또는 포르밀메티오닌(원핵생물에서)인데도 불구하고 많은 코돈 서열을 포함할 수 있다. 진핵생물 및 원핵생물 유전자는 두 개 이상의 대체 시작 코돈을 가질 수 있으며, 이 중 어느 하나는 우선적으로 특정 세포 타입 또는 조직에서, 또는 조건의 특정 설정 하에 번역 개시에 이용될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "시작 코돈" 및 "번역 개시 코돈"은 이러한 코돈의 서열(들)에 관계없이 간세포 성장 인자(HGF)를 암호화하는 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역을 개시하기 위해 생체 내에서 사용되는 코돈 또는 코돈들을 나타낸다. 유전자의 번역 종결 코돈(translation termination codon)[또는 "정지 코돈"(stop codon)]은 세 개의 서열, 즉 5'-UAA, 5'-UAG 및 5'-UGA(상응하는 DNA 서열은 각각 5'-TAA, 5'-TAG 및 5'-TGA임) 중 하나를 가질 수 있다.
용어 "시작 코돈 영역" 및 "번역 개시 코돈 영역"은 번역 개시 코돈으로부터의 어느 방향(즉, 5' 또는 3')으로든지 약 25개 내지 약 50개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 또는 mRNA의 일부를 나타낸다. 유사하게, 용어 "정지 코돈 영역" 및 "번역 종결 코돈 영역"은 번역 종결 코돈으로부터의 어느 방향(즉, 5' 또는 3')으로든지 약 25개 내지 약 50개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 또는 mRNA의 일부를 나타낸다. 그 결과, "시작 코돈 영역"(또는 "번역 개시 코돈 영역") 및 "정지 코돈 영역"(또는 "번역 종결 코돈 영역")은 본 발명의 안티센스 화합물로 효과적으로 표적화될 수 있는 모든 영역이다.
번역 개시 코돈 및 번역 종결 코돈 사이의 영역을 나타내는 것으로 당 업에 공지되어 있는 열린 해독틀(open reading frame, ORF) 또는 "코딩 영역(coding region)"은 또한 효과적으로 표적화될 수 있는 영역이다. 본 발명의 맥락에서, 표적화된 영역은 유전자의 열린 해독틀(ORF)의 번역 종결 코돈 또는 번역 개시 코돈을 포함하는 유전자 내 영역이다.
또 다른 표적 영역은 번역 개시 코돈으로부터의 5' 방향으로 mRNA의 일부를 나타내므로 mRNA의 번역 개시 코돈 및 5' 캡 부위 사이의 뉴클레오타이드(또는 유전자 상에서의 상응하는 뉴클레오타이드)를 포함하는 것으로 당 업에 공지된 5' 비번역 영역(5'UTR)을 포함한다. 또 다른 표적 영역은 번역 종결 코돈으로부터 3' 방향으로 mRNA의 일부를 나타내므로 mRNA의 3' 말단 및 번역 종결 코돈 사이의 뉴클레오타이드(또는 유전자 상에서의 상응하는 뉴클레오타이드)를 포함하는 것으로 당 업에 공지되어 있는 3' 비번역 영역(3'UTR)을 포함한다. mRNA의 5' 캡 부위는 5'-5' 트라이포스페이트 결합을 통해서 mRNA의 5'-최대 잔기에 결합되는 N7-메틸화 구아노신 잔기를 포함한다. mRNA의 5' 캡 영역은 캡 부위에 인접한 첫 번째 50개 뉴클레오타이드뿐만 아니라 5' 캡 구조 그 자체를 포함하는 것으로 간주된다. 본 발명의 또 다른 표적 영역은 5' 캡 영역이다.
몇몇 진핵 mRNA 전사체가 직접적으로 번역되는데도 불구하고, 많은 것이 번역되기 이전에 전사체로부터 잘리는 "인트론"(intron)으로 공지된 하나 이상의 영역을 함유한다. 남아있는(및 이에 따라 번역되는) 영역을 "엑손"(exons)이라고 하며, 함께 스플라이싱되어 연속 mRNA 서열을 형성한다. 일 실시형태에서, 표적화 스플라이스 부위(targeting splice sites), 즉 인트론-엑손 연결지점 또는 엑손-인트론 연결지점은 특히 이상 스플라이싱이 질병과 연루되거나 또는 특정 스플라이스 생성물의 과생성이 질병과 연루되는 상황에 유용하다. 재배열 또는 삭제에 의한 이상 융합 연결지점은 표적 부위의 또 다른 실시형태이다. 여러 유전자 공급처로부터의 두 개(또는 그 이상)의 mRNA 스플라이싱 과정에 따라 생성되는 mRNA 전사체는 "융합 전사체(fusion transcripts)"로 공지되어 있다. 인트론은 예를 들면 DNA 또는 예비-mRNA에 표적화된 안티센스 화합물을 사용해서 효과적으로 표적화될 수 있다.
일 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 폴리뉴클레오타이드의 코딩 및/또는 비-코딩 영역에 결합하며, 표적 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
일 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 천연 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 결합하며, 표적 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
일 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 센스 폴리뉴클레오타이드에 결합하며, 표적 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
대체 RNA 전사체는 DNA의 동일한 게놈 영역으로부터 생성될 수 있다. 이러한 대체 전사체는 일반적으로 "변이체(variants)"로 공지되어 있다. 보다 특히, "예비-mRNA 변이체(pre-mRNA variants)"는 이들의 시작 또는 정지 위치에서 동일한 게놈 DNA로부터 생성되는 다른 전사체와는 상이하며, 인트론 및 엑손 서열을 둘 다 함유하는 동일한 게놈 DNA로부터 생성되는 전사체이다.
스플라이싱 중 하나 이상의 엑손 또는 인트론 영역 또는 이의 일부의 절제시에, 예비-mRNA 변이체는 작은 "mRNA 변이체"를 생성한다. 이에 따라, mRNA 변이체는 예비-mRNA 변이체로 처리되며, 각각의 독특한 예비-mRNA 변이체는 항상 스플라이싱의 결과로서 독특한 mRNA 변이체를 생성해야 한다. 이러한 mRNA 변이체는 또한 "대체 스플라이스 변이체(alternative splice variants)"라고도 공지되어 있다. 예비-mRNA 변이체가 스플라이싱이 일어나지 않으면, 예비-mRNA 변이체는 mRNA 변이체와 동일하다.
변이체는 전사를 시작하거나 또는 정지하기 위한 대체 신호를 사용해서 생성될 수 있다. 예비-mRNA 및 mRNA는 하나 이상의 시작 코돈 또는 정지 코돈을 포함할 수 있다. 대안 시작 코돈을 사용하는 mRNA 또는 예비-mRNA로부터 유래되는 변이체는 예비-mRNA 또는 mRNA의 "대체 시작 변이체"로 공지되어 있다. 대체 정지 코돈을 사용하는 이러한 전사체는 예비-mRNA 또는 mRNA의 "대체 정지 변이체"로 공지되어 있다. 대체 정지 변이체의 하나의 특이적 타입은 생성된 복수의 전사체는 전사 조작에 의해 "폴리A 정지 신호(polyA stop signals)" 중 하나의 대체 선별로부터 수득되어 독특한 폴리A 부위에서 종결되는 전사체를 생성하는 "폴리A 변이체(polyA variant)"이다. 본 발명의 맥락에서 여기서 기재된 변이체 타입은 또한 표적 핵산 실시형태이다.
안티센스 화합물이 혼성화되는 표적 핵산 상의 위치는 활성 안티센스 화합물이 표적화되는 표적 영역의 적어도 5-뉴클레오타이드 길이 부분으로서 규정한다.
특정의 대표적인 표적 세그먼트의 특이적 서열을 여기에 제시하였지만, 당업자는 이것이 본 발명의 범주 내의 특정 실시형태를 예시하고 설명하는 것으로 인식할 것이다. 추가적인 표적 세그먼트는 여기서 밝힌 내용을 고려해서 당업자에 의해 용이하게 확인가능하다.
예시적으로 바람직한 표적 세그먼트 내로부터 선별된 적어도 다섯(5) 개의 연속 뉴클레오타이드의 스트레치(stretch)를 포함하는 길이가 5-100개의 뉴클레오타이드인 표적 세그먼트도 또한 표적화에 적당할 것으로 생각된다.
표적 세그먼트는 예시적으로 바람직한 표적 세그먼트 중 하나의 5'-말단으로부터 적어도 5개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열을 포함할 수 있다(나머지 뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA가 약 5개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드를 함유할 때까지 연속되며, 표적 세그먼트의 5'-말단의 바로 업스트림에서 출발하는 동일한 DNA 또는 RNA의 연속 스트레치임). 유사하게 바람직한 표적 세그먼트는 예시적으로 바람직한 표적 세그먼트 중 하나의 3'-말단으로부터 적어도 5개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열에 의해 나타낸다(나머지 뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA가 약 5개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드를 함유할 때까지 연속되며, 표적 세그먼트의 3'-말단의 바로 다운스트림에서 출발하는 동일한 DNA 또는 RNA의 연속 스트레치임). 여기서 예시하는 표적 세그먼트가 준비된 당업자는 지나친 실험을 하지 않고도 추가의 바람직한 표적 세그먼트를 확인할 수 있을 것이다.
하나 이상의 표적 영역, 세그먼트 또는 부위가 확인되면, 안티센스 화합물은 표적에 효과적으로 상보적인, 즉 목적하는 효과를 내기 위해 효과적으로 잘 혼성화되며, 충분한 특이성을 갖는 것으로 선택된다.
본 발명의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 특정 표적의 안티센스 가닥에 결합된다. 올리고뉴클레오타이드는 길이가 적어도 5개인 뉴클레오타이드이며, 합성되어 각 올리고뉴클레오타이드가 중복된 서열을 표적화하여 올리고뉴클레오타이드가 표적 폴리뉴클레오타이드의 전체 길이를 다루도록 합성될 수 있다. 표적은 또한 비 코딩 영역뿐만 아니라 코딩 영역도 포함한다.
일 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 특이적 핵산을 표적화하는 것이 바람직하다. 특정 핵산으로의 안티센스 화합물의 표적화는 다단계 과정이다. 상기 과정은 일반적으로 기능을 조절하기 위한 핵산 서열의 확인으로 시작된다. 상기는 예를 들면 발현이 특정 질병 또는 질환 상태, 또는 비 코딩 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 예를 들면 비 코딩 RNA(ncRNA)와 연관되는 세포 유전자(또는 상기 유전자로부터 전사된 mRNA)일 수 있다.
RNA는 하기와 같이 분류될 수 있다: (1) 단백질로 번역되는 메신저 RNA(mRNA) 및 (2) 비-단백질-코딩 RNA(ncRNA). ncRNA는 마이크로RNA, 안티센스 전사체 및 고밀도의 정지 코돈을 함유하며 어느 넓은 "열린 해독틀"이 없는 다른 전사 단위(TU)를 포함한다. 많은 ncRNA가 단백질-코딩 자리의 3' 비번역 영역(3'UTR)에서 개시 부위로부터 시작되는 것으로 나타난다. ncRNA는 흔히 드물며, FANTOM 콘소시엄에 의해 시퀀싱되는 ncRNA 중 적어도 반은 폴리아데닐화되는 것으로 보이지 않는다. 많은 연구자가 명백한 이유로 세포질로 전해지고 처리되는 폴리아데닐화 mRNA에 초점을 맞춘다. 최근에는 비-폴리아데닐화 핵 RNA의 세트가 매우 클 수 있으며, 이러한 많은 전사체는 소위 유전자간 영역으로부터 유발될 수 있다는 것이 확인되었다. ncRNA가 유전자 발현을 조절할 수 있는 메커니즘은 표적 전사체와 쌍을 이루는 염기에 의한 것이다. 염기 쌍에 의해 기능을 하는 RNA는 하기와 같이 나눌 수 있다: (1) 동일한 유전자 위치이지만 활성이 있는 때 RNA에 반대 가닥에서 암호화되어 이들의 표적에 대해 완벽한 상보성을 나타내는 시스-암호화 RNA 및 (2) 활성이 있는 RNA와는 다른 염색체 위치에서 암호화되며, 일반적으로 이들의 표적과 잠재적으로 완벽한 염기-쌍을 나타내지 않는 트랜스-암호화 RNA.
이론에 의해 연결되는 것을 바라지 않지만, 여기서 기재하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 안티센스 폴리뉴클레오타이드의 변화로 상응하는 센스 메신저 RNA의 발현을 바꿀 수 있다. 그러나, 이러한 조절은 불일치될 수 있거나(안티센스 넉다운으로 메신저 RNA가 증가함) 또는 일치될 수 있다(안티센스 넉다운으로 수반되는 메신저 RNA가 감소함). 이러한 경우에, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 전사체의 중복 또는 비-중복 부분에 표적화되어 이의 넉다운 또는 제거가 이루어질 수 있다. 코딩뿐만 아니라 비-코딩 안티센스는 동일한 방식으로 표적화될 수 있으며, 어느 하나의 카테고리는 상응하는 센스 전사체를 조절할 수 있다(일치 또는 불일치 방식으로). 표적에 대항해서 사용하기 위한 신규의 올리고뉴클레오타이드를 확인하기 위해 이용되는 전략은 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 안티센스 RNA 전사체의 넉다운 또는 목적하는 표적을 조절하는 어느 다른 방식을 기본으로 할 수 있다.
전략 1: 불일치 조절의 경우, 안티센스 전사체의 넉 다운으로 종래(센스) 유전자의 발현을 증가시킨다. 공지되거나 추정되는 약물 표적에 있어서 후자의 유전자를 암호화해야 하며, 다음에 이의 안티센스 상대의 넉다운은 수용체 작용제 또는 효소 자극제의 활성을 생각할 수 있는 바대로 흉내 낼 수 있다.
전략 2: 일치 조절의 경우, 부수적으로 인티센스 및 센스 전사체 둘 다를 넉다운시켜 종래(센스) 유전자 발현의 상호협력적 감소를 획득할 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 넉다운을 획득하기 위해 사용한다면 이러한 전략은 센스 전사체에 표적화되는 하나의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 적용하고, 및 또 다른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 상응하는 안티센스 전사체 또는 중복 센스 및 안티센스 전사체를 동시에 표적화하는 단일의 효과적 대칭 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 적용하기 위해서 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 안티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 외부 가이드 서열(EGS) 올리고뉴클레오타이드, siRNA 화합물, 단일- 또는 이중-가닥 RNA 간섭(RNAi) 화합물, 예컨대 siRNA 화합물, 및 표적 핵산의 적어도 일부분에 혼성화되고, 이의 기능을 조절하는 다른 올리고머 화합물을 포함한다. 보통 이들은 DNA, RNA, DNA-유사, RNA-유사 또는 이의 혼합물일 수 있거나, 또는 이들 중 하나 이상의 모방체(mimetics)일 수 있다. 이러한 화합물은 단일-가닥, 이중-가닥, 원형 또는 헤어핀 올리고머 화합물일 수 있으며, 구조 요소, 예컨대 내부 또는 말단 버글스(bulges), 미스매치 또는 루프를 함유할 수 있다. 안티센스 화합물은 일상적으로 직쇄형으로 제조되지만, 원형 및/또는 분지쇄형으로 결합 또는 그렇지 않으면 제조될 수도 있다. 안티센스 화합물은 구조체, 예컨대 예를 들면, 완전하게 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물을 형성하고 혼성화하기 위해 충분한 자체-상보성을 갖는 단일 가닥 또는 전체 또는 부분적 이중-가닥 화합물을 형성하기 위해 혼성화된 두 개의 가닥을 포함할 수 있다. 상기 두 개의 가닥은 내부로 연결되어 3' 또는 5' 말단이 없어질 수 있거나 또는 연결되어 연속 헤어핀 구조 또는 루프를 형성할 수 있다. 상기 헤어핀 구조는 5' 또는 3' 말단 상에 오버행(overhang)을 함유하여 단일 가닥 특성을 확장시킬 수 있다. 이중 가닥 화합물은 선택적으로 말단에 오버행을 포함할 수 있다. 추가의 변형은 말단, 선택된 뉴클레오타이드 위치, 당 위치 중 하나 또는 뉴클레오타이드 간의 결합 중 하나에 부착된 컨쥬게이트 기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 두 개의 가닥은 비-핵산 부분 또는 연결 기(linker group)를 통해 연결될 수 있다. 단지 하나의 가닥으로부터 형성되는 경우, dsRNA는 듀플렉스를 형성하기 위해서 두 번 되돌아가는 자체-상보성 헤어핀-타입 분자 형태를 취할 수 있다. 따라서, dsRNA는 완전하거나 또는 부분적으로 이중 가닥일 수 있다. 유전자 발현의 특수한 조절은 형질전환 세포 주에서의 dsRNA 헤어핀의 안정한 발현에 의해서 획득될 수 있지만 몇몇 실시형태에서는 유전자 발현 또는 기능이 상향 조절된다. 듀플렉스를 형성하기 위해 두 번 되돌아가는 자체-상보성 헤어핀-타입 분자 형태를 취하는 단일 가닥 또는 두 개의 가닥으로부터 형성되는 경우, 두 개의 가닥(또는 단일 가닥의 듀플렉스-형성 영역)은 왓슨-크릭 방식으로의 염기 쌍인 상보적 RNA 가닥이다.
시스템에 도입되면, 본 발명의 화합물은 표적 핵산의 분열 또는 다른 변형에 영향을 주기 위해 하나 이상의 효소 또는 구조 단백질의 활성을 끌어낼 수 있으며, 또는 선점-기본 메커니즘(occupancy-based mechanisms)을 통해 작동할 수 있다. 일반적으로, 핵산(올리고뉴클레오타이드를 포함함)은 "DNA-유사"(즉, 일반적으로 하나 이상의 2'-데옥시 당을 가지며, 일반적으로 U 염기보다 T 염기를 가짐) 또는 "RNA-유사"(즉, 일반적으로 하나 이상의 2'-하이드록실 또는 2'-변형 당을 가지며, 일반적으로 T 염기보다 U 염기를 가짐)로 기재될 수 있다. 핵산 나선은 하나 이상의 구조 타입을 취할 수 있으며, 가장 일반적으로 A- 및 B-형태이다. 일반적으로 B-형태-유사 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드는 "DNA-유사"이며, A-형태-유사 구조를 갖는 것은 "RNA-유사"이다. 몇몇 (키메라) 실시형태에서, 안티센스 화합물은 A- 및 B-형태 영역을 둘 다 함유할 수 있다.
일 실시형태에서, 목적하는 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 화합물은 하기 중 적어도 하나를 포함한다: 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 키메라 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 변형된 결합을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 간섭 RNA(RNAi), 짧은 간섭 RNA(siRNA); 마이크로, 간섭 RNA(miRNA); 짧고 일시적인 RNA(stRNA); 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA); 짧은 RNA-유도 유전자 활성(RNAa); 짧은 활성화 RNA(saRNA) 또는 이의 결합물.
dsRNA는 또한 유전자 발현, "짧은 RNA-유도 유전자 활성화"라고 하는 메커니즘 또는 RNAa를 활성화시킬 수 있다. dsRNA 표적화 유전자 프로모터는 관련 유전자의 가능성이 있는 전사 활성화를 유도한다. RNAa는 "짧은 활성화 RNA(saRNA)"라고 하는 합성 dsRNA를 사용해서 인간 세포에서 입증되었다. 현재 RNAa는 다른 생물체에서 보존되는지의 여부는 알려져 있지 않다.
짧은 이중-가닥 RNA(dsRNA), 예컨대 짧은 간섭 RNA(siRNA) 및 마이크로RNA(miRNA)는 RNA 간섭(RNAi)으로 공지되어 있는 진화상 보존된 메커니즘의 트리거(trigger)인 것으로 확인되었다. RNAi는 언제나 전사를 억제시키기 위한 염색질을 개조하고, 상보적 mRNA를 분해하고, 또는 단백질 번역을 차단하여 유전자 스플라이싱을 유도한다. 그러나 하기의 실시예 부분에서 상세하게 기재한 경우 올리고뉴클레오타이드는 간세포 성장 인자(HGF) 폴리뉴클레오타이드 및 이의 암호화된 생성물의 기능 및/또는 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다. dsRNA는 또한 짧은 활성화 RNA(saRNA)로서 활성을 가질 수 있다. 이론과 연결되는 것을 바라지 않지만, 유전자 프로모터에서 서열을 표적화함으로써 saRNA는 dsRNA-유도 전사 활성화(RNAa)로서 나타내는 현상에서 표적 유전자 발현을 유도할 수 있다.
추가의 실시형태에서, 여기서 확인된 "바람직한 표적 세그먼트(preferred target segments)"는 간세포 성장 인자(HGF) 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 추가의 화합물을 선별하는데 이용할 수 있다. "조절자(modulators)"는 바람직한 표적 세그먼트에 상보적인 적어도 5-뉴클레오타이드 부분을 포함하며 HGF를 암호화하는 핵산 분자의 발현을 감소 또는 증가시키는 화합물이다. 상기 선별 방법은 하나 이상의 후보 조절자와 HGF의 천연 안티센스 또는 센스 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 핵산 분자의 바람직한 표적 세그먼트를 접촉시키는 단계, 및 예를 들면 서열 번호: 5 내지 12인 HGF 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 핵산 분자의 발현을 감소 또는 증가시키는 하나 이상의 후보 조절자를 선택하는 단계를 포함한다. 상기 후보 조절자 또는 조절자들이 HGF 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 핵산 분자의 발현을 조절(예를 들면 감소 또는 증가)시킬 수 있는 것으로 확인되면 다음에 상기 조절자는 본 발명에 따른 연구, 진단 또는 치료 제제로서 사용하거나 또는 HGF 폴리뉴클레오타이드의 기능의 추가적 조사 연구에 이용될 수 있다.
천연 안티센스 서열의 표적화로 표적 유전자, 예를 들면 HGF 유전자(예를 들면 등록 번호 NM_001010934)의 기능을 조절하는 것이 바람직하다. 일 실시형태에서, 표적은 HGF 유전자의 안티센스 폴리뉴클레오타이드이다. 일 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 HGF 폴리뉴클레오타이드(예를 들면 등록 번호 NM_001010934)의 센스 및/또는 천연 안티센스 서열, 이의 변이체, 대립유전자, 아이소형, 동족체, 돌연변이체, 유도체, 단편 및 이의 상보적인 서열을 표적화한다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 분자이며, 표적은 안티센스 및/또는 센스 HGF 폴리뉴클레오타이드의 코딩 및 비코딩 영역을 포함한다.
본 발명의 바람직한 표적 세그먼트는 안정화 이중-가닥(듀플렉스화) 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위해 본 발명의 이들의 각각의 상보적인 안티센스 화합물과 결합시킬 수도 있다.
이러한 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 부분은 안티센스 메커니즘을 통해 처리되는 RNA뿐만 아니라 번역을 조절하고, 표적 발현을 조절하는 것으로 당 업에서 확인되었다. 또한, 이중-가닥 부분은 화학적으로 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 이러한 이중-가닥 부분은 표적에 듀플렉스 안티센스 가닥의 전통적인 혼성화에 의해 표적을 억제하여 표적의 효소적 분해를 촉발시킬 수 있는 것으로 확인되었다.
일 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 간세포 성장 인자(HGF) 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 등록 번호 NM_001010934), 이의 변이체, 대립유전자, 아이소형, 동족체, 돌연변이체, 유도체, 단편 및 이의 상보적인 서열을 표적화한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 분자이다.
본 발명의 실시형태에 따르면 표적 핵산 분자는 HGF 단독에만 제한되지 않으며, HGF 분자의 아이소형, 수용체, 동족체 등 중 어느 것으로 확장된다.
일 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면 서열 번호: 2 내지 4로 제시되는 폴리뉴클레오타이드, 및 이의 어느 변이체, 대립유전자, 동족체, 돌연변이체, 유도체, 단편 및 이에 상보적인 서열과 같은 HGF 폴리뉴클레오타이드의 천연 안티센스 서열을 표적화한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 예는 서열 번호: 5 내지 12로 제시된다.
일 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 제한 없이 HGF 폴리뉴클레오타이드와 관련된 비코딩 센스 및/또는 안티센스 서열을 포함하는 HGF 안티센스의 핵산 서열에 상보적이거나 또는 결합하며, HGF 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
일 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호: 2 내지 4로 제시되는 HGF 천연 안티센스의 핵산 서열에 상보적이거나 또는 결합하고, HGF 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
일 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호: 5 내지 12의 적어도 5개의 연속 뉴클레오타이드의 서열을 포함하며, HGF 분자의 발현 및/또는 기능을 조절한다.
폴리뉴클레오타이드 표적은 이의 군 멤버, 즉 HGF의 변이체; SNP를 포함하는 HGF의 돌연변이체; HGF의 비코딩 서열; HGF의 대립유전자; 종 변이체, 단편 등을 포함하는 HGF를 포함한다. 바람직하게 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 분자이다.
일 실시형태에서, HGF 폴리뉴클레오타이드를 표적화하는 올리고뉴클레오타이드는 하기를 포함한다: 안티센스 RNA, 간섭 RNA(RNAi), 짧은 간섭 RNA(siRNA); 마이크로 간섭 RNA(miRNA); 짧고 일시적인 RNA(stRNA); 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA); 짧은 RNA-유도 유전자 활성화(RNAa); 또는 짧은 활성화 RNA(saRNA).
일 실시형태에서, 예를 들면 서열 번호: 2 내지 4인 간세포 성장 인자(HGF) 폴리뉴클레오타이드의 표적화로 이러한 표적의 발현 또는 기능이 조절된다. 일 실시형태에서, 발현 또는 기능은 대조군과 비교해서 상향 조절된다. 일 실시형태에서, 발현 또는 기능은 대조군에 비해 하향 조절된다.
일 실시형태에서, 안티센스 화합물은 서열 번호: 5 내지 12로 제시되는 서열을 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드, 짧거나 또는 긴 단편, 변형된 결합 등을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 서열 번호: 5 내지 12는 하나 이상의 LNA 뉴클레오타이드를 포함한다.
목적하는 표적 핵산 조절은 당 업에 공지되어 있는 몇몇 방법으로 실행시킬 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 등인 효소적 핵산 분자(예를 들면, 리보자임)는 뉴클레오타이드 염기 서열-특이적 방식으로 다른 별개의 핵산 분자를 반복적으로 분열시키는 능력을 포함하는 하나 이상의 다양한 반응을 촉진시킬 수 있는 핵산 분자이다. 이러한 효소적 핵산 분자는 예를 들면 사실상 어느 RNA 전사체를 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
이들의 서열-특이성 때문에, 트랜스-분열 효소적 핵산 분자(trans-cleaving enzymatic nucleic acid molecules)는 인간 질병의 치료 제제로서 가망이 있다[Usman & McSwiggen, (1995) Ann. Rep. Med. Chem. 30, 285-294; Christoffersen and Marr, (1995) J. Med. Chem. 38, 2023-2037]. 효소적 핵산 분자는 세포 RNA의 백그라운드 내에서 특이적 RNA 표적을 분열시키도록 설계될 수 있다. 이러한 분열 반응은 mRNA 비-기능성이 되도록 하며, 상기 RNA로부터의 단백질 발현을 없앤다. 이러한 방식에서, 질병 상태와 관련된 단백질의 합성은 선택적으로 억제될 수 있다.
일반적으로, RNA 분열 활성을 갖는 효소적 핵산은 표적 RNA에 우선 결합함으로써 활성을 갖는다. 이러한 결합은 표적 RNA를 분열시키는 분자의 효소적 부분에 매우 근접하게 유지되는 효소적 핵산의 표적 결합 부분을 통해서 발생한다. 따라서, 효소적 핵산은 상보적 염기 쌍을 통해서 표적 RNA를 우선 인지한 다음에 결합하며, 올바른 부위에 결합하면 효소적으로 표적 RNA를 절단하는 활성이 있다. 이러한 표적 RNA의 전략적 분열은 암호화된 단백질의 합성을 지시하는 이의 능력을 파괴할 것이다. 효소적 핵산이 이의 RNA 표적에 결합하고, 이를 분열시킨 이후에, 상기 RNA로부터 방출되어 또 다른 표적을 탐색하고, 반복적으로 새로운 표적에 결합하고, 이를 분열시킬 수 있다.
몇몇 접근법, 예컨대 시험관 내 선별(진화) 전략[Orgel, (1979) Proc. R. Soc. London, B 205, 435]은 다양한 반응, 예컨대 포스포다이에스터 결합 및 아미드 결합의 분열 및 라이게이션을 촉진시킬 수 있는 새로운 핵산 촉매를 발달시키기 위해서 사용되었다.
촉매 활성에 최적인 리보자임 개발은 유전자 발현을 조절하는 목적용으로 RNA-분열 리보자임을 이용하는 어느 전략에 크게 기여할 것이다. 해머헤드 라보자임은 예를 들면 Mg2+ 보조인자의 포화(10mM) 농도 존재하에 약 1/분의 촉매속도(kcat)로 작용한다. 인공 "RNA 라이게이즈" 리보자임은 약 100/분의 비율로 상응하는 자체-변형 반응을 촉진하는 것으로 확인되었다. 또한, DNA로 구성되는 기질 결합 팔을 갖는 특정 변형 해머헤드 리보자임은 100/분에 가까운 복수의 전환율로 RNA 분열을 촉진시킨다. 마지막으로, 특정 뉴클레오타이드 유사체로 해머헤드의 촉매 코어 내의 특이적 잔기를 대체하면 촉매율이 10배 만큼 크게 개선된 변형된 리보자임이 수득된다. 이러한 발견으로 리보자임은 대부분의 천연 자체-분열 리보자임에 의해 시험관 내에서 나타나는 것보다 현저하게 큰 촉매율로 화학 변화(chemical transformations)를 촉진할 수 있다는 것이 증명된다. 다음에 특정 자체 분열 리보자임의 구조는 최적화되어 최대 촉매 활성을 나타낼 수 있거나 또는 전체적인 신규의 RNA 모티프는 RNA 포스포다이에스터 분열에 현저하게 빠른 속도를 나타내도록 제조될 수 있을 가능성이 있다.
"해머헤드"(hammerhead) 모델에 맞는 RNA 촉매에 의한 RNA 기질의 분자 간 분열은 1987년에 처음 확인되었다[Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600]. RNA 촉매가 회복되었으며, 많은 RNA 분자와 반응하여 확실한 촉매라는 것이 증명되었다.
"해머헤드" 모티프를 기본으로 설계된 촉매 RNA는 표적 서열과 필수적으로 염기 쌍을 유지하기 위해 촉매 RNA에서 적당하게 염기를 변화시켜 특이적 표적 서열을 분열시키기 위해 사용되었다. 상기에서 "해머헤드" 모델에 따라 설계된 촉매 RNA가 생체 내 특이적 기질 RNA를 분열시킬 가능성이 있다는 것을 나타내고, 특이적 표적 서열을 분열시키기 위해 촉매 RNA를 사용하였다.
RNA 간섭(RNAi)은 포유류 및 포유류 세포에서 유전자 발현을 조절하기 위한 강력한 방법이 되었다. 이러한 접근법은 siRNA로 처리되는 짧은 헤어핀 RNA에 대한 코딩 서열 및 발현 플라즈미드 또는 바이러스를 사용해서 RNA 자체 또는 DNA로서 짧은 간섭 RNA(siRNA)를 운반해야 한다. 이러한 시스템은 유전자 발현에 조절되고 조직 특이적 프로모터를 사용할 수 있도록 하며 활성이 있는 세포질로 예비-siRNA가 효율적으로 이송될 수 있다.
일 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 화합물은 리보핵산(RNA) 및/또는 데옥시리보핵산(DNA)의 폴리머 또는 올리고머 또는 이의 모방체, 키메라, 유사체 또는 동족체를 포함한다. 상기 용어는 유사하게 작용하는 비-자연 발생 부분을 갖는 올리고뉴클레오타이드뿐만 아니라 자연적 발생 뉴클레오타이드, 당 및 뉴클레오타이드(백본) 간의 공유 결합으로 구성되는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 변형 또는 치환된 올리고뉴클레오타이드는 흔히 목적하는 특성, 예컨대 예를 들면 강화된 세포 흡수량, 강화된 표적 핵산에 대한 친화도 및 뉴클레아제의 존재하에 증가된 안정성 때문에 자연 형태 이상의 것이 요구된다.
본 발명에 따르면, 올리고뉴클레오타이드 또는 "안티센스 화합물"은 안티센스 올리고뉴클레오타이드(예를 들면, 이의 RNA, DNA, 모방체, 키메라, 유사체 또는 동족체), 리보자임, 외부 가이드 서열(EGS) 올리고뉴클레오타이드, siRNA 화합물, 단일- 또는 이중-가닥 RNA 간섭(RNAi) 화합물, 예컨대 siRNA 화합물, saRNA, aRNA 및 표적 핵산의 적어도 일부분에 혼성화되고, 이의 기능을 조절하는 다른 올리고머 화합물을 포함한다. 보통, 이들은 이의 DNA, RNA, DNA-유사, RNA-유사 또는 이의 혼합물일 수 있으며, 또는 이들 중 하나 이상의 모방체일 수 있다. 이러한 화합물은 단일-가닥, 이중-가닥, 원형 또는 헤어핀 올리고머 화합물일 수 있으며, 구조 요소, 예컨대 내부 또는 말단 버글스, 미스매치 또는 루프를 함유할 수 있다. 안티센스 화합물은 일상적으로 직쇄형으로 제조되지만, 원형 및/또는 분지쇄형으로 결합되거나 또는 그렇지 않으면 이로 제조될 수 있다. 안티센스 화합물은 구조체, 예컨대 예를 들면 완전하게 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물을 형성하고 혼성화시키기 위해 충분한 자기-상보성으로 전체적 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물 또는 단일 가닥을 형성하기 위해 혼성화된 두 개의 가닥을 포함할 수 있다. 상기 두 개의 가닥은 내부로 연결되어 3' 또는 5' 말단이 없어질 수 있거나 또는 연속 헤어핀 구조 또는 루프를 형성하기 위해 연결될 수 있다. 상기 헤어핀 구조는 단일 가닥 특성의 확장을 생성하는 5' 또는 3' 말단 상에 오버행을 함유할 수 있다. 이러한 이중 가닥 화합물은 선택적으로 말단 상에 오버행을 포함할 수 있다. 추가 변형은 말단, 선별된 뉴클레오타이드 위치, 당 위치 중 하나 또는 뉴클레오타이드 간의 결합 중 하나에 부착되는 컨쥬게이트 기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 두 개의 가닥은 비-핵산 부분 또는 연결 기를 통해 연결될 수 있다. 단지 하나의 가닥으로부터 형성되는 경우, dsRNA는 듀플렉스를 형성하기 위해 두 번 되돌아가는 자기-상보적 헤어핀-타입 분자 형태를 취할 수 있다. 따라서, dsRNA는 완전하게 또는 부분적으로 이중 가닥일 수 있다. 유전자 발현의 특이적 조절은 형질전환 세포 주에서 dsRNA 헤어핀의 안정한 발현에 의해 획득될 수 있다. 듀플렉스를 형성하기 위해 두 번 되돌아가는 자기-상보적 헤어핀-타입 분자 형태를 취하는 단일 가닥 또는 두 개의 가닥으로부터 형성되는 경우 두 개의 가닥(또는 단일 가닥의 듀플렉스-형성 부위)은 왓슨-크릭 방식으로 염기가 쌍을 이루는 상보적 RNA 가닥이다.
시스템에 도입되면, 본 발명의 화합물은 표적 핵산의 분열 또는 다른 변형에 영향을 주기 위해 하나 이상의 효소 또는 구조 단백질의 활성을 끌어낼 수 있으며, 또는 선점-기본 메커니즘을 통해 작동할 수 있다. 일반적으로, 핵산(올리고뉴클레오타이드를 포함함)은 "DNA-유사"(즉, 일반적으로 하나 이상의 2'-데옥시 당을 가지며, 일반적으로 U 염기보다 T 염기를 가짐) 또는 "RNA-유사"(즉, 일반적으로 하나 이상의 2'-하이드록실 또는 2'-변형 당을 가지며, 일반적으로 T 염기보다 U 염기를 가짐)로 기재될 수 있다. 핵산 나선은 하나 이상의 구조 타입을 취할 수 있으며, 가장 일반적으로 A- 및 B-형태이다. 일반적으로 B-형태-유사 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드는 "DNA-유사"이며, A-형태-유사 구조를 갖는 것은 "RNA-유사"이다. 몇몇 (키메라) 실시형태에서, 안티센스 화합물은 A- 및 B-형태 영역을 둘 다 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 안티센스 화합물은 길이가 약 5개 내지 약 80개의 뉴클레오타이드(즉 약 5개 내지 약 80개로 결합된 뉴클레오타이드)의 안티센스 부분을 포함할 수 있다. 이는 안티센스 화합물의 일부분 또는 안티센스 가닥의 길이를 나타낸다. 다른 말로 하면, 본 발명의 단일-가닥 안티센스 화합물은 5개 내지 약 80개의 뉴클레오타이드를 포함하며, 본 발명의 이중-가닥 안티센스 화합물(예컨대 예를 들면, dsRNA)은 길이가 5개 내지 약 80개의 뉴클레오타이드의 부분 또는 센스 및 안티센스 가닥을 포함한다. 당업자는 상기 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개의 뉴클레오타이드, 또는 상기 내의 임의의 범위의 안티센스 부분이 될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 길이가 10개 내지 50개의 뉴클레오타이드의 안티센스 부분을 갖는다. 당업자는 상기 길이가 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오타이드, 또는 상기 내에서의 어느 범위의 안티센스 부분을 갖는 올리고뉴클레오타이드가 포함된다는 것을 알 수 있을 것이다. 몇몇 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 길이가 15개의 뉴클레오타이드이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 안티센스 또는 올리고뉴클레오타이드 화합물은 길이가 12개 또는 13개 내지 30개의 뉴클레오타이드의 안티센스 부분을 갖는다. 당업자는 상기 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오타이드, 또는 상기 내의 어느 범위를 갖는 안티센스 부분을 갖는 안티센스 화합물이 포함된다는 것을 알 수 있을 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 올리고머 화합물은 또한 여러 염기가 화합물 중의 하나 이상의 뉴클레오타이드 위치에 존재하는 변이체를 포함한다. 예를 들면, 첫 번째 뉴클레오타이드가 아데노신이라면, 변이체는 상기 위치에 티미딘, 구아노신 또는 시티딘을 함유하도록 생성될 수 있다. 상기는 안티센스 또는 dsRNA 화합물의 위치 중 어느 것이든지 실행될 수 있다. 다음에 이러한 화합물은 여기서 기재하는 방법을 사용하여 시험하여 표적 핵산의 발현을 억제하는 이들의 능력을 측정한다.
몇몇 실시형태에서, 안티센스 화합물과 표적 사이의 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 40% 내지 약 60%이다. 몇몇 실시형태에서, 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 60% 내지 약 70%이다. 몇몇 실시형태에서, 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 70% 내지 약 80%이다. 몇몇 실시형태에서, 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 80% 내지 약 90%이다. 몇몇 실시형태에서, 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%이다.
일 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 예를 들면, 서열 번호: 2 내지 12로 제시되는 핵산 분자는 하나 이상의 치환 또는 변형을 포함한다. 일 실시형태에서, 뉴클레오타이드는 잠금 핵산(LNA)으로 치환된다.
일 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호: 1 내지 4로 제시되는 서열 및 HGF와 관련된 코딩 및/또는 비-코딩 서열의 센스 및/또는 안티센스인 핵산 분자의 하나 이상의 영역을 표적화한다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 서열 번호: 1 내지 4의 중복 영역으로 표적화된다.
본 발명의 특정 바람직한 올리고뉴클레오타이드는 키메라 올리고뉴클레오타이드이다. "키메라 올리고뉴클레오타이드" 또는 "키메라"는 본 발명의 맥락에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드로 각각 구성되는 두 개 이상의 화학적으로 별개의 영역을 함유하는 올리고뉴클레오타이드이다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 통상적으로 하나 이상의 유리한 특성(예컨대 예를 들면 증가된 뉴클레아제 저항성, 증가된 세포로의 흡수량, 증가된 표적으로의 결합 친화도)을 부여하는 변형된 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 영역 및 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 혼성물을 분열시킬 수 있는 효소에 대한 기질인 영역을 함유한다. 한 예로서, RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 분열시키는 세포 엔도뉴클레아제이다. 따라서 RNase H의 활성화로 RNA 표적이 분열되어 유전자 발현의 안티센스 조절의 효율성을 크기 강화시킨다. 그 결과, 비교가능한 결과가 보통 동일한 표적 영역에 혼성화되는 포스포로티오에이트 데옥시올리고뉴클레오타이드와 비교해서, 키메라 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 경우 짧은 올리고뉴클레오타이드로 수득될 수 있다. RNA 표적의 분열은 일상적으로 겔 전기영동법 및 필요하다면 당 업에 공지되어 있는 관련된 핵산 혼성화 기술에 의해서 검출될 수 있다. 일 실시형태에서, 키메라 올리고뉴클레오타이드는 표적 결합 친화도를 증가시키도록 변형된 적어도 하나의 영역, 및 일반적으로 RNAse H에 대한 기질로서 활성이 있는 영역을 포함한다. 이의 표적(이러한 경우에, ras를 암호화하는 핵산)에 대한 올리고뉴클레오타이드의 친화도는 올리고뉴클레오타이드 및 표적이 분리되는 온도인 올리고뉴클레오타이드/표적 쌍의 Tm을 측정하여 결정하는 것이 일상적이며, 상기 분리는 분광 분석법으로 검출된다. Tm이 높아지면, 표적으로의 올리고뉴클레오타이드의 친화도가 더 커진다.
본 발명의 키메라 안티센스 화합물은 상기에서 기재한 것과 같은 두 개 이상의 올리고뉴클레오타이드, 변형된 올리고뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드 모방체의 복합 구조체로서 형성될 수 있다. 이러한 화합물은 또한 혼성물 또는 갭머(gapmers)로서 당 업에 알려져 있다. 이러한 혼성 구조체의 제조를 기재하는 대표적인 미국 특허는 이에 제한되지는 않지만, 미국 특허 번호 제5,013,830호; 제5,149,797호; 제5,220,007호; 제5,256,775호; 제5,366,878호; 제5,403,711호; 제5,491,133호; 제5,565,350호; 제5,623,065호; 제5,652,355호; 제5,652,356호; 및 제5,700,922호를 포함하며, 상기 각각은 참고로서 여기에 포함된다.
일 실시형태에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드의 영역은 당의 2' 위치, 가장 바람직하게는 2'-O알킬, 2'-O-알킬-O-알킬 또는 2'-플루오로-변형 뉴클레오타이드에서 변형된 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, RNA 변형은 RNA의 3' 말단에서 피리미딘의 리보스, 무염기 잔기 또는 역 염기 상의 2'-플루오로, 2'-아미노 및 2' O-메틸 변형을 포함한다. 이러한 변형은 올리고뉴클레오타이드로 포함되는 것이 일상적이며, 이러한 올리고뉴클레오타이드는 주어진 표적에 대항하는 2'-데옥시올리고뉴클레오타이드 보다 더 높은 Tm(즉 더 높은 표적 결합 친화도)을 갖는 것으로 확인되었다. 이러한 증가된 친화도의 효과로 유전자 발현의 RNAi 올리고뉴클레오타이드 억제를 크게 강화시킨다. RNAse H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 분열시키는 세포 엔도뉴클레아제이며; 이에 따라 상기 효소의 활성화로 RNA 표적이 분열되어 RNAi 억제 효율성을 크게 강화시킬 수 있다. RNA 표적의 분열은 겔 전기영동법으로 확인될 수 있는 것이 일반적이다. 일 실시형태에서, 키메라 올리고뉴클레오타이드는 또한 뉴클레아제 저항성을 강화시키기 위해 변형된다. 세포는 핵산을 분해시킬 수 있는 다양한 엑소- 및 엔도-뉴클레아제를 함유한다. 다수의 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 변형은 천연 올리고데옥시뉴클레오타이드보다 뉴클레아제 분해에 보다 저항성 있게 포함되는 올리고뉴클레오타이드를 만드는 것으로 확인되었다. 뉴클레아제 저항성은 세포 추출물 또는 분리된 뉴클레아제 용액으로 올리고뉴클레오타이드를 배양하고, 일반적으로 겔 전기영동법으로 시간에 따라 남아 있는 온전한 올리고뉴클레오타이드의 정도를 측정하여 확인하는 것이 일반적이다. 이들의 뉴클레아제 저항성이 강화되도록 변형된 올리고뉴클레오타이드는 비변형 올리고뉴클레오타이드보다 더 긴 시간 동안 온전하게 생존한다. 다양한 올리고뉴클레오타이드 변형은 뉴클레아제 저항성을 부여하거나 또는 강화시키는 것으로 확인되었다. 적어도 하나의 포스포로티오에이트 변형을 함유하는 올리고뉴클레오타이드는 현재 가장 바람직하다. 몇몇 경우에, 표적 결합 친화도를 강화시키는 올리고뉴클레오타이드 변형은 또한 뉴클레아제 저항성을 독립적으로 강화시킬 수도 있다.
본 발명을 위해 계획된 몇몇 바람직한 올리고뉴클레오타이드의 특이적 예로는 변형된 백본, 예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포트라이에스터, 메틸 포스포네이트, 짧은 사슬 알킬 또는 사이클로알킬 당 간 결합 또는 짧은 사슬 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 당 간 결합을 포함하는 것을 포함한다. 포스포로티오에이트 백본을 갖는 올리고뉴클레오타이드 및 헤테로원자 백본, 특히 CH2--NH--O--CH2, CH, --N(CH3)--O--CH2[메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 백본으로 알려져 있음], CH2--O--N (CH3)--CH2, CH2--N (CH3)--N (CH3)--CH2 및 O--N (CH3)--CH2--CH2 백본을 갖는 것이 가장 바람직하며, 상기 천연 포스포다이에스터 백본은 O--P--O--CH로 나타낸다. De Mesmaeker 등(1995) Acc. Chem. Res. 28:366-374에서 기재하는 아미드 백본도 또한 바람직하다. 또한 모폴리노 백본 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드도 바람직하다(Summerton 및 Weller, 미국 특허 제5,034,506호). 다른 실시형태에서, 예컨대 펩타이드 핵산(PNA) 백본, 즉 올리고뉴클레오타이드의 포스포다이에스터 백본은 폴리아미드 백본으로 대체되며, 상기 뉴클레오타이드는 폴리아미드 백본의 아자 질소 원자에 간접적으로 또는 직접적으로 결합되어 있다. 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 치환형 당 부분을 포함할 수도 있다. 바람직한 올리고뉴클레오타이드는 2' 위치에 하기 중 하나를 포함한다: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 OCH3, OCH3 O(CH2)n CH3, O(CH2)nNH2 또는 O(CH2)nCH3(여기서 n은 1 내지 약 10임); C1 내지 C10 저급 알킬, 알콕시알콕시, 치환형 저급 알킬, 알카릴 또는 아랄킬; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O--, S-- 또는 N-알킬; O--, S-- 또는 N-알케닐; SOCH3; SO2 CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; 헤테로사이클로알킬; 헤테로사이클로알카릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환형 실일; RNA 분열 기(cleaving group); 지시 기(reporter group); 인터칼레이터(intercalator); 올리고뉴클레오타이드의 약물동력학적 특성을 개선시키는 기; 또는 올리고뉴클레오타이드의 약역학적 특성을 개선시키는 기 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환체. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시[2'-O-CH2 CH2 OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸)로도 알려져 있음]를 포함한다. 다른 바람직한 변형은 2'-메톡시(2'-O--CH3), 2'-프로폭시(2'-OCH2 CH2CH3) 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. 유사한 변형은 또한 올리고뉴클레오타이드 상의 다른 위치, 특히 5' 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치 및 3' 말단 뉴클레오타이드 상의 당의 3' 위치에서 이루어질 수도 있다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 당 모방체, 예컨대 펜토푸라노실 기를 대신해서 사이클로부틸을 가질 수도 있다.
올리고뉴클레오타이드는 또한 추가적으로 또는 대안적으로 뉴클레오염기(흔히 당 업에서는 "염기"라고 함) 변형 또는 치환을 포함할 수도 있다. 여기서 사용하는 것과 같이, "비변형"(unmodified) 또는 "천연"(natural) 뉴클레오타이드는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 사이토신(C) 및 유라실(U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오타이드는 단지 드물게 또는 일시적으로 천연 핵산, 예를 들면, 하이포크산틴, 6-메틸아데닌, 5-Me 피리미딘, 특히 5-메틸사이토신(또한 5-메틸-2'데옥시사이토신이라고도 하며, 흔히 당 업에서는 5-Me-C로 나타냄), 5-하이드록시메틸사이토신(HMC), 글리코실 HMC 및 젠토바이오실 HMC뿐만 아니라 합성 뉴클레오타이드, 예를 들면 2-아미노아데닌, 2-(메틸아미노)아데닌, 2-(아미다졸일알킬)아데닌, 2-(아미노알킬아미노)아데닌 또는 다른 헤테로치환형 알킬아데닌, 2-티오유라실, 2-티오티민, 5-브로모유라실, 5-하이드록시메틸유라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌 및 2,6-다이아미노퓨린에서 발견되는 뉴클레오타이드를 포함한다. 당 업에 공지되어 있는 "공통"(universal) 염기, 예를 들면 이노신이 포함될 수 있다. 5-Me-C 치환은 0.6-1.2℃에 의해서 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것으로 확인되었으며, 현재는 바람직한 염기 치환이다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 변형은 올리고뉴클레오타이드의 활성 또는 세포 흡수량을 강화시키는 하나 이상의 부분 또는 컨쥬게이트를 올리고뉴클레오타이드에 화학적으로 연결시키는 단계를 포함한다. 이러한 부분은 이에 제한되지는 않지만 지질 부분, 예컨대 콜레스테롤 부분, 콜레스테릴 부분, 지방족 사슬, 예를 들면 도데칸디올 도는 운데실 잔기, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 또는 아다만탄 아세트산을 포함한다. 친유성 부분을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 및 상기 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 방법은 당 업, 예를 들면 미국 특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호에 공지되어 있다.
주어진 올리고뉴클레오타이드에서의 모든 위치에서 균일하게 변형될 필요는 없으며, 실제로 상기에서 언급한 변형 중 하나 이상이 단일 올리고뉴클레오타이드 또는 심지어 올리고뉴클레오타이드 내의 단일 뉴클레오사이드 내에 포함될 수 있다. 본 발명은 또한 상기에서 규정한 것과 같이 키메라 올리고뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 이에 제한되지는 않지만 무염기 뉴클레오타이드, 폴리에터, 폴리아민, 폴리아미드, 펩타이드, 카보하이드레이트, 지질 또는 폴리하이드로카본 화합물을 포함하는 또 다른 부분과 컨쥬게이트된다. 당업자는 이러한 분자가 당, 염기 또는 포스페이트 기 상의 몇몇 위치에 핵산 분자를 포함하는 어느 뉴클레오타이드 중 하나 이상에 연결될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 종래에 일정하게 고체 상 합성의 잘 공지되어 있는 기술을 통해 제조될 수 있다. 이러한 합성 장비는 Applied Biosystems를 포함하는 몇몇 판매처에 의해 시판된다. 이러한 합성을 위한 임의의 또 다른 방법도 또한 사용될 수 있으며; 올리고뉴클레오타이드의 실제 합성은 당업자의 재능 내에 있다. 또한 다른 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체를 제조하기 위해 유사한 기술을 사용하는 것도 잘 공지되어 있다. 또한 유사한 기술 및 상업적으로 이용가능한 변형된 아미디트 및 다공성 유리(controlled-pore glass, CPG) 생성물, 예컨대 바이오틴, 플루오레세인, 아크리딘 또는 소랄렌-변형 아미디트 및/또는 CPG(버지니아주의 스터링시에 소재하는 Glen Research로부터 이용가능함)를 사용하여 형광으로 라벨링되고, 바이오틴화 또는 다른 변형된 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 콜레스테롤-변형 올리고뉴클레오타이드를 합성할 수 있다는 것도 또한 잘 공지되어 있다.
본 발명에 따르면, 변형의 용도, 예컨대 LNA 모노머를 잠재성, 특이성 및 활성의 지속성을 강화시키고, 올리고뉴클레오타이드의 투여 경로를 넓히는데 사용하는 용도는 현재의 화학, 예컨대 MOE, ANA, FANA, PS 등을 포함한다. 상기는 LNA 모노머에 의해 현재의 올리고뉴클레오타이드에서 몇몇 모노머를 치환함으로써 획득될 수 있다. LNA 변형 올리고뉴클레오타이드는 모 화합물과 유사한 크기를 가질 수 있거나 또는 더 크거나 또는 바람직하게는 더 작을 수 있다. 이러한 LNA-변형 올리고뉴클레오타이드는 약 70% 미만, 보다 바람직하게는 약 60% 미만, 가장 바람직하게는 약 50% 미만의 LNA 모노머를 함유하며, 이들의 크기는 약 5개 내지 25개의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 약 12개 내지 20개의 뉴클레오타이드인 것이 바람직하다.
바람직하게 변형된 올리고뉴클레오타이드 백본은 이에 제한되지는 않지만 하기를 포함한다: 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포트라이에스터, 아미노알킬포스포트라이에스터, 3'알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트를 포함하는 포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트라이에스터, 및 이의 정상 3'-5' 결합, 2'-5' 결합 유사체를 갖는 보라노포스페이트, 및 역 극성을 갖는 것(뉴클레오사이드 단위의 근접한 쌍은 3'-5' 내지 5'-3' 또는 2'-5' 내지 5'-2'로 연결됨). 다양한 염, 혼합 염 및 유리 산 형태가 또한 포함된다.
결합을 함유하는 상기 포스포러스의 제조가 기재된 대표적인 미국 특허는 이에 제한되지는 않지만 미국 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,196호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 및 제5,625,050호를 포함하며, 상기 각각은 여기에 참고문헌으로서 포함된다.
여기에 포스포러스 원자를 포함하지 않는 바람직하게 변형된 올리고뉴클레오타이드는 짧은 사슬 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드 간의 결합, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드 간의 결합, 또는 하나 이상의 짧은 사슬 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오사이드 간의 결합에 의해 형성되는 백본을 갖는다. 상기는 몰포리노 결합(뉴클레오사이드의 당 부분으로부터 일 부분이 형성됨); 실록산 백본; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 설파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 설포네이트 및 설폰아미드 백본; 아미드 백본을 갖는 것; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 다른 것을 포함한다.
상기 올리고뉴클레오타이드의 제조를 기재하는 대표적인 미국 특허는 이에 제한되지는 않지만 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,264, 562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,610,289호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 및 제5,677,439호를 포함하며, 상기 각각은 참고문헌으로서 여기에 포함된다.
다른 바람직한 올리고뉴클레오타이드 모방체에서, 뉴클레오타이드 단위의 당 및 뉴클레오타이드 간의 결합, 즉 백본 둘 다는 신규의 기로 대체된다. 염기 단위는 적당한 핵산 표적 화합물로 혼성화하기 위해 유지된다. 이러한 하나의 올리고머 화합물, 즉 탁월한 혼성화 특성을 갖는 것으로 확인된 올리고뉴클레오타이드 모방체는 펩타이드 핵산(PNA)로 나타낸다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오타이드의 당-백본은 아미드 함유 백본, 특히 아미노에틸글리신 백본으로 대체된다. 뉴클레오염기는 보유되며, 백본의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 간접적으로 또는 직접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 기재하는 대표적인 미국 특허는 이에 제한되지 않지만 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호를 포함하며, 상기 각각은 참고문헌으로서 여기에 포함된다. PNA 화합물의 추가의 기재는 Nielsen 등(1991) Science 254, 1497-1500에서 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 포스포로티오에이트 백본을 갖는 올리고뉴클레오타이드 및 헤테로원자 백본, 및 특히 -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-[메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 백본으로 공지되어 있음], -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2N(CH3)-N(CH3)CH2- 및 -O-N(CH3)-CH2-CH2-를 갖는 올리고뉴클레오타이드에서 천연 포스포다이에스터 백본은 상기 참고문헌인 미국 특허 제5,489,677호의 -O-P-O-CH2- 및 상기 참고문헌인 미국 특허 제5,602,240호의 아미드 백본으로 나타낸다. 또한 상기 참고문헌인 미국 특허 제5,034,506호의 몰포리노 백본 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드도 바람직하다.
변형된 올리고뉴클레오타이드는 또한 하나 이상의 치환형 당 부분을 함유할 수도 있다. 바람직한 올리고뉴클레오타이드는 2' 위치에 하기 중 하나를 포함한다: OH; F; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O 알킬-O-알킬(상기 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환 또는 비치환형 C 내지 CO 또는 치환 또는 비치환형 C2 내지 CO 알케닐 및 알키닐일 수 있음). 특히 바람직한 것은 O(CH2)nOmCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 및 O(CH2nON(CH2)nCH3)2이며, 여기서 n 및 m은 1 내지 약 10일 수 있다. 다른 바람직한 올리고뉴클레오타이드는 2' 위치에 하기 중 하나를 포함한다: C 내지 CO, (저급 알킬, 치환형 저급 알킬, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클알킬, 헤테로사이클알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환형 실일, RNA 분열 기, 지시 기, 인터칼레이트, 올리고뉴클레오타이드의 약물동력학적 특성을 개선시키는 기; 또는 올리고뉴클레오타이드의 약역학적 특성을 개선시키는 기 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환체. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시[2'-O-CH2CH2OCH3, 또는 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로 공지되어 있음], 즉 알콕시알콕시 기를 포함한다. 추가로 바람직한 변형은 2'-다이메틸아미노옥시에톡시, 즉 하기 실시예에서 기재한 것과 같이 2'-DMAOE로도 공지되어 있는 O(CH2)2ON(CH3)2 기 및 2'-다이메틸아미노에톡시에톡시(또한 당 업에는 2'-O-다이메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로도 공지되어 있음), 즉 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2를 포함한다.
다른 바람직한 변형은 2'-메톡시(2'-O CH3), 2'-아미노프로폭시(2'-O CH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. 유사한 변형이 또한 올리고뉴클레오타이드 상의 다른 위치, 특히 3'-말단 뉴클레오타이드 상 또는 2'-5' 연결 올리고뉴클레오타이드 중의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치에서 이루어질 수도 있다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 펜토퓨라노실 당을 대신해서 사이클로부틸 부분과 같은 당 모방체를 가질 수도 있다. 이러한 변형된 당 구조의 제조를 기재하는 대표적인 미국 특허는 이에 제한되지 않지만 미국 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 및 제5,700,920호를 포함하며, 상기 각각은 참고문헌으로서 여기에 포함된다.
올리고뉴클레오타이드는 또한 뉴클레오염기(흔히 당 업에서는 간단하게 "염기"라고 함) 변형 또는 치환을 포함할 수도 있다. 여기서 사용하는 것과 같이, "비변형" 또는 "천연" 뉴클레오타이드는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기 티민(T), 사이토신(C) 및 유라실(U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오타이드는 다른 합성 및 천연 뉴클레오타이드, 예컨대 5-메틸사이토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸, 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-프로필, 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-티오유라실, 2-티오티민 및 2-티오사이토신, 5-할로유라실 및 사이토신, 5-프로피닐 유라실 및 사이토신, 6-아조 유라실, 사이토신 및 티민, 5-유라실(슈도-유라실), 4-티오유라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환형 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트라이플루오로메틸 및 다른 5-치환형 유라실 및 사이토신, 7-메틸쿠아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다.
추가로, 뉴클레오타이드는 미국 특허 제3,687,808호에 기재되어 있는 것, 'The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering', 페이지 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990에 기재되어 있는 것, Englisch 등의 'Angewandle Chemie, International Edition', 1991, 30, 페이지 613에 기재되어 있는 것 및 Sanghvi, Y.S., 15장, 'Antisense Research and Applications', 페이지 289-302, Crooke, S.T. 및 Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993에 기재되어 있는 것을 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드 중 몇몇은 특히 본 발명의 올리고머 화합물의 결합 친화도를 증가시키는데 유용하다. 상기는 5-치환형 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환형 퓨린(2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐유라실 및 5-프로피닐사이토신을 포함함)을 포함한다. 5-메틸사이토신 치환은 0.6-1.2℃에 의해 핵산 듀플렉스 안정성이 증가하는 것으로 확인되었으며(Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. 및 Lebleu, B., eds, 'Antisense Research and Applications', CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), 현재 보다 특히 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 결합하는 경우에 바람직한 염기 치환이다.
상기에서 언급한 변형 뉴클레오타이드뿐만 아니라 다른 변형 뉴클레오타이드의 제조를 기재하는 대표적인 미국 특허는 이에 제한되지는 않지만 미국 특허 제3,687,808호뿐만 아니라 제4,845,205호; 제5,130,302호; 제5,134,066호; 제5,175, 273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,750,692호 및 제5,681,941호를 포함하며, 상기 각각은 참고문헌으로 여기에 포함된다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 변형은 올리고뉴클레오타이드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수량을 강화시키는 하나 이상의 부분 또는 컨쥬게이트를 올리고뉴클레오타이드에 화학적으로 연결시키는 단계를 포함한다.
이러한 부분은 이에 제한되지는 않지만 지질 부분, 예컨대 콜레스테롤 부분, 콜산, 티오에터, 예를 들면 헥실-S-트라이틸티오, 티오콜레스테롤, 지방족 사슬, 예를 들면 도데칸다이올 또는 운데실 잔기, 포스포리피드, 예를 들면, 다이-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트라이에틸암모늄 1,2-다이-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 부분, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-t 옥시콜레스테롤 부분을 포함한다.
이러한 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 제조를 기재한 대표적인 미국 특허는 이제 제한되지는 않지만, 미국 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호, 제5,580,731호; 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082, 830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호, 제5,391, 723호; 제5,416,203호, 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 제5,688,941호를 포함하며, 상기 각각은 참고문헌으로서 여기에 포함된다.
약물 발견: 본 발명의 화합물은 또한 약물 발견 및 표적 검증 영역에도 적용될 수 있다. 본 발명은 간세포 성장 인자(HGF) 폴리뉴클레오타이드 및 질병 상태, 표현형 또는 질환 상태 사이에 존재하는 상관관계를 설명하기 위한 약물 발견 노력으로 여기서 규정하는 바람직한 표적 세그먼트 및 화합물의 용도를 포함한다. 이러한 방법은 본 발명의 화합물로 샘플, 조직, 세포 또는 생물체를 접촉시키는 단계, 치료 후 언젠가 핵산 또는 HGF 폴리뉴클레오타이드 및/또는 관련된 표현형 또는 화학적 종점의 단백질 수준을 측정하는 단계 및 선택적으로 본 발명의 추가의 화합물로 처리된 샘플 또는 비-처리 샘플에 대한 측정값을 비교하는 단계를 포함하는 HGF 폴리뉴클레오타이드를 검출 또는 조절하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 표적 검증 과정을 위해 공지되어 있지 않은 유전자의 기능을 측정하거나 또는 특정 질병, 질환 상태 또는 표현형의 치료 또는 예방을 위해 표적으로서 특정 유전자 생성물을 유용성을 측정하기 위한 다른 실험과 결합하거나 또는 동시에 실행할 수도 있다.
유전자 발현의 상향 조절 또는 억제 평가:
숙주 세포 또는 생물체로의 외인성 핵산의 전이는 세포 또는 생물체 중의 핵산의 존재를 직접 검출하여 평가할 수 있다. 이러한 검출은 당 업에 공지되어 있는 몇몇 방법으로 획득될 수 있다. 예를 들면, 외인성 핵산의 존재는 핵산과 관련된 뉴클레오타이드 서열을 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 사용해서 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술 또는 서던 블럿에 의해 검출될 수 있다. 외인성 핵산의 발현은 또한 유전자 발현 분석을 포함하는 종래의 방법을 사용하여 측정될 수도 있다. 예를 들면, 외인성 핵산으로부터 생성되는 mRNA는 노던 블럿 및 역 전사 PCR(RT-PCT)을 사용해서 검출 및 정량화될 수 있다.
외인성 핵산으로부터의 RNA의 발현은 효소적 활성 또는 지시 단백질 활성을 측정하여 검출할 수도 있다. 예를 들면, 안티센스 조절 활성은 외인성 핵산이 효과기 RNA를 생성한다는 것의 표시로 표적 핵산 발현의 감소 또는 증가로서 간접적으로 측정될 수 있다. 서열 보존을 기본으로, 프라이머는 표적 유전자의 코딩 영역을 증폭시키기 위해 설계 및 사용될 수 있다. 처음에, 각 유전자로부터 가장 높게 발현된 코딩 영역은 어느 코딩 또는 비 코딩 영역이 사용될 수 있는데도 불구하고, 모델 대조군 유전자를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 각 대조군 유전자는 지시 코딩 영역과 이의 폴리(A) 신호 사이에 각 코딩 영역을 삽입시켜 집결시킨다. 이러한 플라즈미드는 3' 비-코딩 영역 중의 잠재적 RNAi 표적과 유전자의 위쪽 부분에 지시 유전자로 mRNA를 생성한다. 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효율성은 지시 유전자의 조절에 의해서 분석할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 지시 유전자는 아세토하이드록시산 합성효소(AHAS), 알칼리 포스파타아제(AP), 베타 갈락토시다아제(LacZ), 베타 글루코로니다아제(GUS), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), 그린 형광 단백질(GFP), 레드 형광 단백질(RFP), 옐로 형광 단백질(YFP), 시안 형광 단백질(CFP), 호르세라디시 퍼옥시다아제(HRP), 루시퍼라아제(Luc), 노팔린 합성효소(NOS), 옥토파인 합성효소(OCS) 및 이의 유도체를 포함한다. 다수의 선택가능한 마커는 앰피실린, 블레오마이신, 클로람페니콜, 젠타마이신, 하이그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 메톡트렉세이트, 포스피노트리신, 푸로마이신 및 테트라사이클린에 대한 저항성을 주는 것으로 이용가능하다. 지시 유전자의 조절을 결정하는 방법은 당 업에 잘 공지되어 있으며, 이에 제한되지는 않지만 형광 방법(예를 들면, 형광 분광법, 형광 활성 세포 분류기(FACS), 형광 현미경), 항생물질 저항성 측정을 포함한다.
HGF 단백질 및 mRNA 발현은 당업자에 공지되고, 그렇지 않으면 여기에 기재된 방법을 사용하여 분석할 수 있다. 예를 들면, 면역 분석, 예컨대 ELISA는 단백질 수준을 측정하기 위해 사용할 수 있다. HGF ELISA 분석 키트는 예를 들면 R&D Systems(미네소타주의 미네아폴리스시에 소재)로부터 시판되는 것을 이용할 수 있다.
실시형태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용해서 처리된 샘플(예를 들면 생체 내 또는 시험관 내의 세포 또는 조직) 중의 HGF 발현(예를 들면, mRNA 또는 단백질)은 대조군 샘플에서의 HGF 발현과 비교해서 평가한다. 예를 들면, 단백질 또는 핵산의 발현은 모의-처리(mock-treated) 또는 비처리 샘플의 것과 당업자에 공지된 방법을 사용해서 비교할 수 있다. 대안적으로, 대조 안티센스 올리고뉴클레오타이드(예를 들면 변경 또는 상이한 서열을 갖는 것)를 처리한 샘플과의 비교는 목적하는 정보에 따라 다르게 할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 처리 대 비처리 샘플에서 HGF 단백질 또는 핵산의 발현 차이는 처리 샘플 대 비처리 샘플에서 여러 핵산[연구자에 의해서 적당하다고 간주되는 어느 표준, 예를 들면 관리 유전자(housekeeping gene)]의 발현 차이와 비교할 수 있다.
관찰된 차이는 목적하는, 예를 들면 대조군과의 비교에 사용하기 위한 비율 또는 일부 형태로 발현될 수 있다. 실시형태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 처리된 샘플에서 HGF mRNA 또는 단백질 수준은 비처리 샘플 또는 대조군 핵산으로 처리된 샘플에 대해서 약 1.25배 내지 약 10배 이상 증가 또는 감소한다. 실시형태에서, HGF mRNA 또는 단백질 수준은 적어도 약 1.25배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5-배, 적어도 약 1.6-배, 적어도 약 1.7-배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9배, 적어도 약 9.5배 또는 적어도 약 10배 이상까지 증가 또는 감소한다.
키트 , 연구 시약, 진단법 및 치료법
본 발명의 화합물은 진단, 치료 및 예방용, 및 연구 시약 및 키트 성분으로서 이용할 수 있다. 또한, 정교한 특이성으로 유전자 발현을 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 흔히 특정 유전자의 기능을 설명하거나 또는 다양한 수의 생물학적 경로 기능 사이를 구별하기 위해 당업자에 의해 사용된다.
키트 및 진단법, 및 다양한 생물학적 시스템으로의 용도에 있어서, 본 발명의 화합물은 단독 또는 다른 화합물 또는 치료법과 결합해서 세포 및 조직 내에서 발현되는 유전자의 전체적인 보완 또는 일부의 발현 패턴을 설명하기 위해 차이 및/또는 결합 분석 연구의 방식으로서 유용한다.
여기서 사용하는 것과 같이, 용어 "생물학적 시스템" 또는 "시스템"은 발현되는 어느 생물체, 세포, 세포 배양물 또는 조직으로 규정하거나, 또는 간세포 성장 인자(HGF) 유전자의 생성물을 발현하기에 능숙하게 형성된다. 상기는 이에 제한되지는 않지만 인간, 형질전환 동물, 세포, 세포 배양물, 조직, 이종이식물, 이식물 및 이의 결합물을 포함한다.
비 제한적인 실시예로서, 하나 이상의 안티센스 화합물로 처리된 세포 또는 조직 내의 발현 패턴은 안티센스 화합물로 처리되지 않은 대조군 세포 또는 조직과 비교하며, 생성되는 패턴은 이들이 예를 들면 시험되는 유전자의 질병 관련, 시그날링 경로, 세포 위치, 발현 수준, 크기, 구조 또는 기능과 관련되므로 유전자 발현의 수준 차이에 대해서 분석된다. 이러한 분석 연구는 자극 또는 비자극 세포 상에서 발현 패턴에 영향을 주는 다른 화합물이 존재하거나 또는 존재하지 않는 하에 실행될 수 있다.
당 업에 공지되어 있는 유전자 발현 분석 방법의 예로는 DNA 분석 또는 마이크로 분석, SAGE(유전자 발현의 일련 분석), READS(분해된 cDNA의 제한 효소 증폭), TOGA(총 유전자 발현 분석), 단백질 분석 및 프로테오믹스, 발현된 서열 tag(EST) 시퀀싱, 마이너스 RNA 핑거프린팅(subtractive RNA fingerprinting, SuRF), 마이너스 클로닝(subtractive cloning), 차이 디스플레이(differential display, DD), 비교 게놈 혼성화, FISH(형광 인시추 혼성화) 기술 및 질량 분광법을 포함한다.
본 발명의 화합물은 화합물이 간세포 성장 인자(HGF)를 암호화하는 핵산에 혼성화되므로 연고 및 진단법에 유용하다. 예를 들면, 효과적인 HGF 조절자가 되도록 여기서 기재하는 것과 같이 상기 조건 하 및 상기 효율성으로 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드는 각각 유전자 증폭 또는 검출에 유리한 조건 하에서 효과적인 프라이머 또는 프로브이다. 이러한 프라이머 및 프로브는 HGF의 추가 연구에 사용하거나 또는 검출하기 위한 상기 핵산 분자의 증폭 및 HGF를 암호화하는 핵산 분자의 특이적 검출을 수득하는 방법에 유용하다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 특히 프라이머 및 프로브의 HGF를 암호화하는 핵산으로의 혼성화는 당 업에 공지되어 있는 방법으로 검출할 수 있다. 이러한 방식은 올리고뉴클레오타이드에 효소의 컨쥬게이션, 올리고뉴클레오타이드의 방사선 식별, 또는 어느 다른 적당한 검출 방법을 포함할 수 있다. 샘플에서 HGF의 수준을 검출하기 위한 상기 검출방식을 사용하는 키트도 또한 제조할 수 있다.
안티센스의 특이성 및 민감성은 또한 치료적 용도로 당업자에 의해 이용된다. 안티센스 화합물은 인간을 포함하는 동물에서 질병 상태의 치료에 치료 부분으로서 이용된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 약물은 인간에게 안전하고 효과적으로 투여되며, 다수의 임상 시험도 현재 진행중이다. 따라서 안티센스 화합물은 세포, 조직 및 동물, 특히 인간의 치료에 치료 요법으로 유용하도록 구성될 수 있는 유용한 치료적 양상일 수 있다는 것이 수립되었다.
치료법을 위해, HGF 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절함으로써 치료할 수 있는 질병 또는 질환이 있는 것으로 의심되는 동물, 바람직하게는 인간에게 본 발명에 따른 안티센스 화합물을 투여하여 치료한다. 예를 들면, 하나의 비-제한적 실시형태에서, 방법은 치료학적으로 효과적인 양의 HGF 조절자를 치료를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 HGF 조절자는 HGF 단백질의 발현을 효과적으로 조절하거나 또는 HGF 활성을 효과적으로 조절한다. 일 실시형태에서, 동물에서 HGF의 활성 또는 발현은 대조군과 비교해서 약 10%까지 억제된다. 바람직하게는, 동물에서 HGF의 활성 또는 발현은 약 30%까지 억제된다. 보다 바람직하게는, 동물에서 HGF의 활성 또는 발현은 50% 이상까지 억제된다. 따라서, 올리고머 화합물은 대조군과 비교해서 적어도 10%, 적어도 50%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%까지 간세포 성장 인자(HGF) mRNA의 발현을 조절한다.
일 실시형태에서, 동물에서 간세포 성장 인자(HGF)의 활성 또는 발현은 대조군과 비교해서 약 10%까지 증가한다. 바람직하게는, 동물에서 HGF의 활성 또는 발현은 약 30%까지 증가한다. 보다 바람직하게는, 동물에서 HGF의 활성 또는 발현은 50% 이상까지 증가한다. 따라서, 올리고머 화합물은 대조군과 비교해서 적어도 10%, 적어도 50%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%까지 HGF mRNA의 발현을 조절한다.
예를 들면, 간세포 성장 인자(HGF)의 발현의 감소는 혈청, 혈액, 지방 조직, 간 또는 동물의 어느 다른 체액, 조직 또는 기관에서 측정될 수 있다. 바람직하게는, 분석되는 상기 유액, 조직 또는 기관 내에 함유된 세포는 HGF 펩타이드 및/또는 HGF 단백질 자체를 암호화하는 핵산 분자를 함유한다.
본 발명의 화합물은 적당한 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체에 유효량의 화합물을 첨가함으로써 약학적 조성물에 이용할 수 있다. 본 발명의 화합물 및 방법의 용도도 또한 병을 예방하는 것으로 유용할 수 있다.
컨쥬게이트
본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 변형은 올리고뉴클레오타이드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수량을 강화시키는 하나 이상의 부분 또는 컨쥬게이트를 올리고뉴클레오타이드에 화학적으로 연결하는 단계를 포함한다. 이러한 부분 또는 컨쥬게이트는 관능 기, 예컨대 일차 또는 이차 하이드록실 기에 공유적으로 결합되는 컨쥬게이트 기를 포함할 수 있다. 본 발명의 컨쥬게이트 기는 인터칼레이터, 지시 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에터, 올리고머의 약역학적 특성을 강화시키는 기, 및 올리고머의 약물동력학적 특성을 강화시키는 기를 포함한다. 통상적인 컨쥬게이트 기는 콜레스테롤, 지질, 포스포리피드, 바이오틴, 페나진, 폴레이트, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 코우마린 및 염료를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 약역학적 특성을 강화시키는 기는 흡수량을 개선시키고, 분해에 대한 저항성을 강화시키거나/시키고 표적 핵산으로 서열-특이적 혼성화를 강화시키는 기를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 약물 동력학적 특성을 강화시키는 기는 본 발명의 화합물의 흡수량, 분포, 대사 또는 분비를 개선시키는 기를 포함한다. 대표적인 컨쥬게이트 기는 1992년 10월 23일 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/US92/09196 및 미국 특허 제6,287,860호에 기재되어 있으며, 상기는 여기에 참고문헌으로 포함된다. 컨쥬게이트 부분은 이에 제한되지 않지만 지질 부분, 예컨대 콜레스테롤 부분, 콜산, 티오에터, 예를 들면 헥실-5-트라이틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 사슬, 예를 들면 도데칸다이올 또는 운데실 잔기, 포스포리피드, 예를 들면 다이-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트라이에틸암모니움 1,2-다이-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 부분, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 부분을 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 또한 활성 약제 물질, 예를 들면 아스피린, 와파린, 페닐부타존, 이부프로펜, 슈프로펜, 펜부펜, 케토프로펜, (S)-(+)-프라노프로펜, 카프로펜, 단실사르코신, 2,3,5-트라이아이오도벤조산, 플루페나믹산, 폴린산, 벤조티아다이아지드, 클로로티아지드, 다이아제핀, 인도메티신, 바르비투레이트, 세팔로스포린, 설파 제, 당뇨병치료제, 항균제 또는 항생제에 컨쥬게이트될 수 있다.
상기 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 제조를 기재하는 대표적인 미국 특허는 이에 제한되지는 않지만 미국 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호, 제5,580,731호; 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호, 제5,391,723호; 제5,416,203호, 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 5,688,941호를 포함한다.
제제화
본 발명의 화합물은 또한 흡수율, 분포 및/또는 흡수에 도움을 주기 위해 다른 분자, 분자 구조체 또는 화합물, 예를 들면 리포좀, 수용체-표적화 분자, 경구, 직장, 국소 또는 다른 제제의 혼합물을 혼합하거나, 캡슐화하거나, 컨쥬게이트하거나 또는 그렇지 않으면 관련될 수 있다. 이러한 흡수율, 분포 및/또는 흡수-관련 제제의 제조를 기재하는 대표적인 미국 특허는 이에 제한되지 않지만 미국 특허 제5,108,921호; 제5,354,844호; 제5,416,016호; 제5,459,127호; 제5,521,291호; 제5,543,165호; 제5,547,932호; 제5,583,020호; 제5,591,721호; 제4,426,330호; 제4,534,899호; 제5,013,556호; 제5,108,921호; 제5,213,804호; 제5,227,170호; 제5,264,221호; 제5,356,633호; 제5,395,619호; 제5,416,016호; 제5,417,978호; 제5,462,854호; 제5,469,854호; 제5,512,295호; 제5,527,528호; 제5,534,259호; 제5,543,152호; 제5,556,948호; 제5,580,575호; 및 제5,595,756호를 포함하며, 상기 각각은 참고문헌으로 여기에 포함된다.
비록 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 발현 및/또는 기능을 조절하기 위해서 벡터의 맥락에서 투여될 필요는 없지만, 본 발명의 실시형태는 목적하는 경우 유도될 수 있는 강한 구성 프로모터 활성 또는 프로모터 활성을 보유하며, 프로모터, 혼성 프로모터 유전자 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 발현을 위해 구성되는 발현 벡터에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 적당한 핵산 운반 시스템으로 상기에서 언급한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 중 적어도 하나를 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 시스템은 폴리뉴클레오타이드에 실시가능하게 연결된 비-바이러스성 벡터를 포함한다. 이러한 비-바이러스 벡터의 예로는 올리고뉴클레오타이드 단독(예를 들면, 서열 번호: 5 내지 12 중 어느 하나 이상) 또는 적당한 단백질, 폴리사카라이드 또는 지질 제제와 결합해서 포함된다.
추가적으로 적당한 핵산 운반 시스템은 바이러스 벡터, 통상적으로는 아데노바이러스, 아데노바이러스-관련 바이러스(AAV), 헬퍼-의존성 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 일본-리포좀의 적혈구 응집 반응 바이러스(HVJ) 착체 중 적어도 하나로부터의 서열을 포함한다. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 실시가능하게 연결된 강한 진핵세포 프로모터를 포함한다.
추가적으로 바람직한 벡터는 바이러스 벡터, 융합 단백질 및 화학적 컨쥬게이트를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 몰로니 설치류 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia viruses) 및 HIV계 바이러스를 포함한다. 하나의 바람직한 HIV계 바이러스 벡터는 적어도 두 개의 벡터를 포함하며, gag 및 pol 유전자는 HIV 게놈으로부터 유래되며, env 유전자는 또 다른 바이러스로부터 유래된다. DNA 바이러스 벡터가 바람직하다. 상기 벡터는 폭스 벡터, 예컨대 오르토폭스 또는 아비폭스 벡터, 포진바이러스 벡터, 예컨대 단순 포진 I 바이러스(HSV) 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-관련 바이러스 벡터를 포함한다.
본 발명의 안티센스 화합물은 어느 약학적으로 허용가능한 염, 에스터 또는 상기 에스터의 염, 또는 인간을 포함하는 동물에 투여시 생물학적인 활성 대사를 (직접적으로 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 어느 다른 화합물, 또는 이의 잔기를 포함한다.
용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 본 발명의 화합물의 생리학적 및 약학적으로 허용가능한 염; 즉 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하며, 목적하지 않는 이의 독성 효과는 부여하지 않는 염을 나타낸다. 올리고뉴클레오타이드에 있어서, 약물학적으로 허용가능한 염의 바람직한 예 및 이들의 용도는 추가로 참고문헌으로서 여기에 포함되어 있는 미국 특허 제6,287,860호에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 안티센스 화합물을 포함하는 약학적 조성물 및 제제를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 국소 또는 전신 치료를 목적하는 지의 여부 및 처리 영역에 따라 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면 분무기에 의한 것을 포함하는 분말 또는 에어로졸의 흡입법 또는 흡입제에 의해 국소(안구를 포함하며, 질 및 직장 운반을 포함하는 점액 막으로), 폐; 기관 내, 비강 내, 상피 및 경피), 경구 또는 장관 외일 수 있다. 장관 외 투여는 정맥 내, 동맥 내, 피하, 복강 내 또는 근육 내 주입 또는 투입; 또는 두개 내, 예를 들면 척추 강 내 또는 심실 내 투여를 포함한다.
중추 신경계 중의 조직 치료에 있어서, 투여는 예를 들면 뇌척수액으로의 주입 또는 투입에 의해 이루어질 수 있다. 안티센스 RNA의 뇌척수액으로의 투여는 예를 들면 이의 전문에 참고문헌으로서 여기에 포함되어 있는 미국 특허 출원 공개 제2007/0117772호(발명의 명칭: "Methods for slowing familial ALS disease progression")에 기재되어 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 중추 신경계 중의 세포에 투여되는 것으로 간주되는 경우에, 투여는 혈뇌 장벽을 가로질러 대상 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 투과를 촉진시킬 수 있는 하나 이상의 제제와 함께 이루어질 수 있다. 주입은 예를 들면 내비 피질 또는 해마 속으로 이루어질 수 있다. 근육 조직에서 운동 신경으로 아데노바이러스 벡터의 투여에 의한 신경 영양 인자의 운반은 예를 들면 참고문헌으로 여기에 포함된 미국 특허 제6,632,427호(발명의 명칭: "Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons")에 기재되어 있다. 뇌, 예를 들면 선조체, 시상, 해마 또는 흑색질로의 직접적인 벡터의 운반은 당 업에 공지되어 있으며, 예를 들면 참고문헌으로서 여기에 포함된 미국 특허 제6,756,523호(발명의 명칭: "Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain")에 기재되어 있다. 투여는 서방 제제의 투여 또는 느린 속도의 주입으로서 일정 기간에 걸쳐 이루어지거나 또는 주입과 같이 신속하게 이루어질 수 있다.
대상 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 또한 목적하는 약학적 또는 약물 동력학적 특성을 제공하는 제제와 결합 또는 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 트랜스페린 수용체에 항체와 같은 혈뇌 장벽을 통한 운송 또는 투과를 촉진하기 위해 당 업에 공지되어 있는 어느 물질과 커플링될 수 있으며, 정맥 주입으로 투여될 수 있다. 안티센스 화합물은 예를 들면 혈뇌 장벽을 통해 안티센스 화합물의 수송을 증가시키거나/증가시키고 보다 효과적으로 안티센스 화합물을 제조하는 바이러스 벡터와 연결될 수 있다. 삼투 혈뇌 장벽 분열은 또한 예를 들면 이에 제한하지는 않지만 메조 에리트리톨, 자일리톨, D(+) 갈락토스, D(+) 락토스, D(+) 크실로스, 둘시톨(dulcitol), 미오-이노시톨, L(-) 프록토스, D(-) 만니톨, D(+) 글루코스, D(+) 아라비노스, D(-) 아라비노스, 셀바이오스, D(+) 말토스, D(+) 라피노스, L(+) 람노스, D(+) 멜리바이오스, D(-) 리보스, 아도니톨, D(+) 아라비톨, L(-) 아라비톨, D(+) 푸코스, L(-) 푸코스, D(-) 릭소스, L(+) 릭소스 및 L(-) 릭소스를 포함하는 당의 투입, 또는 이에 제한되지는 않지만 글루타민, 리신, 아르기닌, 아스파라진, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 티로신, 발린 및 타우린을 포함하는 아미노산의 투입에 의해 이루어질 수도 있다. 혈뇌 장벽 투과를 강화시키는 방법 및 재료는 예를 들면 이의 전문이 참고문헌으로서 모두 여기에 포함되어 있는 미국 특허 제4,866,042호(발명의 명칭: "Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier"), 제6,294,520호(발명의 명칭: "Material for passage through the blood-brain barrier") 및 제6,936,589호(발명의 명칭: "Parenteral delivery systems")에 기재되어 있다.
대상 안티센스 화합물은 흡수융, 분포 및/또는 흡수에 도움을 주는, 다른 분자, 분자 구조체, 또는 화합물, 예를 들면 리포좀, 수용체-표적화 분자, 경구, 직장, 국소 또는 다른 제제와 혼합, 캡슐화, 컨쥬게이트화 또는 그렇지 않으면 이와 관련된 것일 수 있다. 예를 들면, 양이온 지질은 올리고뉴클레오타이드 흡수율을 촉진하기 위한 제제에 포함될 수 있다. 흡수율을 촉진하는 것으로 확인된 하나의 상기 조성물은 LIPOFECTIN(메릴렌드주 베세다 소재인 GIBCO-BRL에서 이용가능함)이다.
적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 경구 투여에 특히 유용하다고 믿어진다. 국소 투여를 위한 약학적 조성물 및 제제는 경피 패치, 연고, 로션, 겔, 드롭, 좌제, 스프레이, 액상 및 분말을 포함할 수 있다. 종래의 약학적 담체, 수성, 분말 또는 오일계, 증점제 등이 필요하거나 또는 바람직할 수 있다. 코팅된 콘돔(Coated condoms), 글로브 등도 또한 유용할 수 있다.
유닛 제형으로 알맞게 존재할 수 있는 본 발명의 약학적 제제는 약학 산업에 잘 공지되어 있는 종래 기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 기술은 약학적 담체(들) 또는 부형제(들)와 활성 성분을 조합하는 단계를 포함한다. 일반적으로 제제는 액상 담체 또는 미세하게 분리된 고상 담체, 또는 둘 다와 활성 성분을 균일하고 밀집하게 조합한 다음에 필요하다면 생성물로 성형하여 제조된다.
본 발명의 조성물은 여러 가능한 제형, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 정제, 캡슐, 겔 캡슐, 액상 시럽, 연화 겔, 좌제 및 관장제로 제제화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 수성, 비-수성 또는 혼합 매체의 현탁물로 제제화될 수도 있다. 수성 현탁액은 추가로 예를 들면 소디움 카복시메틸셀룰로스, 솔비톨 및/또는 텍스트란을 포함하는 현탁물의 점도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 상기 현탁물은 또한 안정화제를 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 이에 제한되지는 않지만 용액, 에멀전, 폼(foams) 및 리포좀-함유 제제를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물 및 제제는 하나 이상의 투과 강화제, 담체, 부형제 또는 다른 활성 또는 비활성 성분을 포함할 수 있다.
에멀전은 통상적으로 직경이 일반적으로 0.1㎛를 초과하는 입자 형태로 또 다른 것에 분산된 하나의 액상의 불균일계이다. 에멀전은 분산 상, 및 수 상, 오일 상 또는 별개의 상 그 자체로 용액으로서 존재할 수 있는 활성 약물에 더해서 추가의 성분을 함유할 수 있다. 마이크로에멀전은 본 발명의 실시형태에 포함된다. 에멀전 및 이들의 용도는 당 업에 잘 공지되어 있으며, 추가로 미국 특허 제6,287,860호에 기재되어 있다.
본 발명의 제제는 리포좀 제제를 포함한다. 본 발명에 사용하는 것과 같이, 용어 "리포좀"(liposome)은 구형의 이중 층 또는 이중 층으로 배열된 양친매성 지질로 구성된 베시클을 의미한다. 리포좀은 운반되는 조성물을 함유하는 수성 계면(aqueous interior) 및 친유성 물질로부터 형성된 막을 갖는 단일박막(unilamellar) 또는 다중박막(multilamellar) 소포이다. 양이온 리포좀은 안정한 착체를 형성하기 위해 음전하가 부가된 DNA 분자와 상호작용하는 것으로 믿어지는 양전하가 부가된 리포좀이다. pH-민감성 또는 음전하가 부가된 리포좀은 이와의 착체 보다는 DNA를 옭아매는 것으로 믿어진다. 양이온 및 비양이온 리포좀 둘 다는 DNA를 세포에 운반하기 위해 사용된다.
리포좀은 또한 여기서 사용하는 것으로서 하나 이상의 특화된 지질을 포함하는 리포좀인 "입체적으로 안정된" 리포좀을 포함한다. 리포좀에 포함되는 경우 이러한 특화된 지질로 상기 특화된 지질이 없는 리포좀에 비례해서 강화된 순환 수명을 갖는 리포좀이 얻어진다. 입체 구조로 안정된 리포좀의 예로는 리포좀의 소포-형성 지질 부분 중 일부가 하나 이상의 글리코리피드를 포함하거나 또는 하나 이상의 친수성 폴리머, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 부분으로 피복된 것이 포함된다. 리포좀 및 이의 용도는 또한 미국 특허 제6,287,860호에 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물 및 제제는 또한 계면 활성제를 포함할 수 있다. 약제 생성물, 제제 및 에멀전에서의 계면 활성제의 용도는 당 업에 잘 공지되어 있다. 계면 활성제 및 이들의 용도는 또한 참고문헌으로 여기에 포함된 미국 특허 제6,287,860호에 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 핵산, 특히 올리고뉴클레오타이드의 효과적인 운반에 영향을 주기 위해 다양한 침투율 개선제(penetration enhancer)를 이용한다. 세포 막을 가로지르는 비-친유성 약제의 확산에 도움을 주는 것에 더해서, 침튜율 개선제는 또한 친유성 약제의 투과율을 강화시킨다. 침투율 개선제는 다섯 개의 넓은 범주, 즉 계면 활성제, 지방산, 담즙산 염, 킬레이팅 제 및 비-킬레이팅 비계면 활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다. 침투율 개선제 및 이의 용도는 참고문헌으로 여기에 포함된 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기재되어 있다.
당업자는 제제를 이들의 의도하는 용도, 즉 투여 경로에 따라서 일상적으로 설계된다는 것을 알고 있다.
국소 투여용으로 바람직한 제제는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드가 국소 운반 약제, 예컨대 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스터, 스테로이드, 킬레이팅 제제 및 계면 활성제와의 혼합물인 것을 포함한다. 바람직한 지질 및 리포좀은 천연(예를 들면 다이올레오일-포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 다이미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 다이스테아로일포스파티딜 콜린) 음성(예를 들면, 다이미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온(예를 들면 다이올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 다이올레오일-포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)을 포함한다.
국소 또는 기타 투여에 있어서, 본 발멸의 올리고뉴클레오타이드는 리포좀 내에 캡슐화될 수 있거나 또는 이에 착제, 특히 양이온 리포좀을 형성할 수 있다. 대안적으로, 올리고뉴클레오타이드는 지질, 특히 양이온 지질에 착화될 수 있다. 바람직한 지방산 및 이의 에스터, 약학적으로 허용가능한 염 및 이의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기재되어 있다.
경구 투여에 있어서의 조성물 및 제제는 분말 또는 과립, 마이크로미립자, 나노미립자, 물 또는 비-수성 매체 중의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 겔 캡슐, 사치(sachets), 정제 또는 미니정제를 포함한다. 증점제, 착향료, 희석제, 유화제, 분산제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 바람직한 경구 제제는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 하나 이상의 침투율 개선제, 계면활성제 및 킬레이터와 함께 투여되는 것이다. 바람직한 계면 활성제는 지방산 및/또는 이의 에스터 또는 염, 담즙산 및/또는 이의 염을 포함한다. 바람직한 담즙산/염 및 지방산 및 이들의 용도는 참고문헌으로서 여기에 포함된 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기재되어 있다. 또한 침투율 개선제, 예를 들면 담즙산/염과 조합한 지방산/염의 결합물이 바람직하다. 특히 바람직한 결합물은 UDCA, 카르프산 및 라우르산의 소디움 염이다. 추가의 침투율 개선제는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에터를 포함한다. 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에터를 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 분무형 건조 입자를 포함하는 과립 형태를 경구로 운반할 수 있거나 또는 마이크로 또는 나노입자를 형성하기 위해 착화될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 착화 제제 및 이들의 용도는 참고문헌으로 여기에 포함되어 있는 미국 특허 제6,287,860호에 기재되어 있다. 비경구, 척추 강내 또는 심실 내용 조성물 및 제제는 완충액, 희석제, 및 다른 적당한 첨가제, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 침투율 개선제, 담체 화합물 및 다른 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유할 수도 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태는 비-안티센스 메커니즘에 의해 작용하는 하나 이상의 화학치료 제제 및 하나 이상의 올리고머 화합물을 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 각 화학치료 제제의 예로는 이에 제한되지는 않지만 암 화학치료 약물, 예컨대 다우노루비신, 다우노마이신, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 아이다루비신, 에소루비신, 블레오마이신, 마포스파마이드, 아이포스파마이드, 사이토신 아라비노사이드, 바이스클로로에틸-니트로수레아, 부설판, 미토마이신 C, 액티노마이신 D, 미트라마이신, 프레드니손, 하이드록시프로게스테론, 테스토스테론, 타목시펜, 다카르바진, 프로카르바진, 헥사메틸멜라민, 펜타메틸멜라민, 미톡산트론, 암사크린, 클로람부실, 메틸사이클로헥실니트로수레아(methylcyclohexylnitrosurea), 질소 머스타드, 멜팔란(melphalan), 사이클로포스파마이드, 6-머컵토퓨린, 6-티오구아닌, 시스타라빈, 5-아자시티딘, 하이드록시유레아, 데옥시포르마이신, 4-하이드록시퍼옥시사이클로-포스포라미드, 5-플루오로유라실(5-FU), 5-플루오로데옥시유리딘(5-FUdR), 메토트렉세이트(MTX), 콜치신, 탁솔, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드(VP-16), 트리메트렉세이트, 아이리노테칸, 토포테칸, 겜시타빈, 테니포사이드, 시스플라틴 및 다이에틸스틸베스트롤(DES)을 포함한다. 본 발명의 화합물을 사용하는 경우, 상기 화학치료 제제는 개별적으로(예를 들면 5-FU 및 올리고뉴클레오타이드), 연속적으로(예를 들면, 일정 기간 동안 5-FU 및 올리고뉴클레오타이드 및 이후에 MTX 및 올리고뉴클레오타이드) 또는 하나 이상의 다른 화학치료 제제(예를 들면 5-FU, MTX 및 올리고뉴클레오타이드, 또는 5-FU, 방사선치료 및 올리고뉴클레오타이드)와 결합해서 사용될 수 있다. 이에 제한되지는 않지만 비스테로이드 항-염증성 제제 및 코르티코스테롤를 포함하는 항-염증성 약제 및 이에 제한되지는 않지만 리비비린, 비다라빈, 아사이클로비르 및 간시클로비르(ganciclovir)를 포함하는 항바이러스 제제도 또한 본 발명의 조성물에 결합할 수 있다. 안티센스 화합물 및 다른 비-안티센스 약제의 결합물도 또한 본 발명의 범주 내이다. 두 개 이상의 결합된 화합물을 함께 또는 연속적으로 사용할 수 있다.
또 다른 관련 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 안티센스 화합물, 특히 첫 번째 핵산에 표적화되는 올리고뉴클레오타이드 및 두 번째 핵산 표적에 표적화된 하나 이상의 추가 안티센스 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들면, 상기 첫 번째 표적은 간세포 성장 인자(HGF)의 특정 안티센스 서열일 수 있으며, 두 번째 표적은 또 다른 뉴클레오타이드 서열로부터의 영역일 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 동일한 간세포 성장 인자(HGF) 핵산 표적의 여러 영역에 표적화되는 두 개 이상의 안티센스 화합물을 함유할 수 있다. 안티센스 화합물의 다 수의 예를 여기서 예시하며, 다른 것은 당 업에 공지된 적당한 화합물 중에서 선별할 수 있다. 두 개 이상의 결합 화합물은 함께 또는 연속적으로 사용될 수 있다.
약물 주입:
치료 조성물의 제제 및 이들의 이후 투여(약품 주입)는 당 업의 기술 내에 있는 것으로 믿어진다. 약물 주입은 며칠에서 몇 달의 치료 지속 기간의 흐름에 따라 또는 치료가 되거나 또는 질병 상태의 감소가 획득될 때까지 치료할 질병 상태의 심각성 및 민감성에 따라 달라진다. 최적의 약물 주입 스케줄은 환자 신체 중의 약물 축적을 측정하여 계산할 수 있다. 당업자는 최적 투여량, 투여 주입 방법론 및 반복 비율을 용이하게 결정할 수 있다. 최적의 약물 투입은 개개 올리고뉴클레오타이드의 상대적인 잠재성에 따라 달라질 것이며, 일반적으로는 동물 모델에서 생체 내 및 시험관 내에 효과적인 EC50을 기본으로 설정될 수 있다. 일반적으로, 약물 주입은 체중 1 kg 당 0.01 ㎍ 내지 100 g이며, 일 회 이상 매일, 매주, 매달 또는 매년 또는 심지어 2 내지 20년에 한 번으로 주어질 수 있다. 당업자는 체액 또는 조직에서의 약물의 측정된 잔류 시간 및 농도를 기본으로 약물 주입의 반복 비율을 용이하게 설정할 수 있다. 성공적인 치료 이후에, 질병 상태의 재발을 예방하기 위해 환자는 유지 요법을 실행하는 것이 바람직할 수 있으며, 올리고뉴클레오타이드는 체중 1 kg 당 0.01 ㎍ 내지 100 g의 범위로 매일 일 회 이상 내지 20년에 한 번 유지 요법으로 투여된다.
실시형태에서, 환자에게 투여량을 적어도 약 1, 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 25, 적어도 약 30, 적어도 약 35, 적어도 약 40, 적어도 약 45, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90 또는 적어도 약 100 ㎎/㎏ 체중으로 처리한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 특정 주입 투여량은 예를 들면 이의 전문이 참고문헌으로 여기에 포함되어 있는 미국 특허 제7,563,884호(발명의 명칭: "Antisense modulation of PTP1B expression")에 기재되어 있다.
본 발명의 다양한 실시형태는 상기에서 기재하였지만, 이들은 단지 예시적인 것으로 나타낸 것이며, 이제 제한되지 않는다는 것으로 이해해야 한다. 기재된 실시형태는 본 발명의 정신 또는 범주를 벗어나지 않고 여기에 기재한 것에 따라 다 수의 변화를 실행할 수 있다. 따라서, 본 발명의 범주 및 폭은 상기에 기재된 실시형태 중 어느 것에 의해 제한되지 않아야 한다.
여기서 언급한 모든 문서는 참고문헌으로 여기에 포함된다. 본 명세서에서 인용된 모든 간행물 및 특허 문서는 마치 각각의 개별적 간행물 또는 특허 문서가 개별적으로 나타낸 것처럼 동일한 내용에 대한 모든 목적에 있어서 참고문헌으로서 포함된다. 상기 문서에서 다양한 참고문헌의 인용에 의해 출원인은 어느 특정 참고문헌이 본 발명에 대한 "종래 문헌"이라는 것을 인정하지 않는다. 본 발명의 조성물 및 방법의 실시형태는 하기 실시예로 나타낸다.
실시예
하기의 비-제한적 실시예는 본 발명의 선택된 실시형태를 나타내기 위한 것이다. 나타낸 성분 요소의 비율 및 대체의 변화는 당업자에게 명백할 것이며, 본 발명의 실시형태의 범주 내에 있다는 것이 명백할 것이다.
실시예 1: HGF 폴리뉴클레오타이드의 센스 가닥 및/또는 간세포 성장 인자( HGF )에 대한 핵산 분자 안티센스에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 설계
상기에서 지시한 것과 같이, 용어 "에 특이적인 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide specific for)" 또는 "올리고뉴클레오타이드 표적(oligonucleotide targets)"은 (i) 표적 유전자의 일부분과 안정한 착체를 형성할 수 있거나 또는 (ii) 표적화 유전자의 mRNA 전사체의 일부분과 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있는 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다.
적당한 올리고뉴클레오타이드의 선별은 핵산 서열을 자동으로 배열하고, 동일성 또는 상동성의 영역을 나타내는 컴퓨터 프로그램을 사용해서 촉진된다. 이러한 프로그램은 예를 들면 GenBank와 같은 데어타베이스의 탐색 또는 PCR 생성물의 시퀀싱에 의해서 수득되는 핵산 서열을 비교하기 위해서 사용된다. 다양한 종으로부터의 핵산 서열의 비교로 종 사이의 적당의 동일성 정도를 나타내는 핵산 서열을 선별할 수 있다. 시퀀싱되지 않은 유전자의 경우에는 서던 블럿을 실행해서 표적 종 및 다른 종에서의 유전자 사이의 동일성 정도를 결정할 수 있다. 당 업에 잘 공지되어 있는 것과 같이 엄격의 정도를 다양화하여 서던 블럿을 실행하여 대략적인 동일성을 측정할 수 있다. 이러한 절차로 제어되는 피험체에서의 표적 핵산 서열에 대한 상보성 정도가 높고, 다른 종에서 상응하는 핵산 서열의 상보성 정도가 낮은 올리고뉴클레오타이드를 선별할 수 있다. 당업자는 본 발명에 사용하기 위한 유전자의 적당한 영역을 선별하는 것이 상당히 자유롭다는 것을 인식할 것이다.
인티센스 화합물은 기능 및/또는 활성을 조절하기 위해 표적 핵산의 정상 기능을 표적 핵산에 대한 화합물의 결합으로 방해하는 경우 "특이적으로 혼성화가 가능(specifically hybridizable)"하며, 특이적 결합을 목적하는 조건, 즉 생체 내 분석 또는 치료 요법의 경우에 생리학적 조건 및 시험관 내 분석의 경우에 분석을 실행하는 조건 하에서 비-표적 핵산 서열에 대한 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 피하기 위해 효과적인 정도의 상보성이 존재한다.
여기서 기재하는 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 특성은 당 업에 공지되어 있는 것과 같이 시험관 내에서 하나 이상의 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 여기서 기재하는 올리고뉴클레오타이드의 특성은 용융 곡선 분석을 이용해서 잠재적인 약물 분자 및 표적 천연 안티센스 사이의 결합 강도를 결정하여 수득될 수 있다.
표적 천연 안티센스 및 잠재적인 약물 분자(Molecule) 사이의 결합 강도는 분자 간 상호작용의 강도를 측정하는 설정된 방법, 예를 들면 용융 곡선 분석을 사용해서 평가할 수 있다.
용융 곡선 분석은 천연 안티센스/분자 착체에 대해 이중-가닥에서 단일-가닥 형태의 신속한 전이가 발생하는 온도를 측정한다. 상기 온도는 두 개의 분자 사이의 상호작용 강도의 확실한 측정으로서 광범위하게 인정된다.
용융 곡선 분석은 실제 천연 안티센스 RNA 분자의 cDNA 복제 또는 상기 분자의 결합 부위에 상응하는 합성 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드를 사용해서 실행할 수 있다. 상기 분석을 실행하기 위해 필요한 모든 시약을 함유하는 다중 키트를 이용할 수 있다(예를 들면, Applied Biosystems Inc.사의 MeltDoctor kit). 이러한 키트는 이중 가닥 DNA(dsDNA) 결합 염료(예컨대 ABI HRM 염료, SYBR Green, SYTO 등) 중 하나를 함유하는 적당한 완충 용액을 포함한다. dsDNA 염료의 특성은 이들이 자유로운 형태로 거의 형광을 방출하지 않지만, dsDNA에 결합하는 경우에는 형광성이 높다는 것이다.
상기 분석을 실행하기 위해서, cDNA 또는 상응하는 올리고뉴클레오타이드를 특정 제조자의 프로토콜로 규정된 농도로 분자와 혼합한다. 상기 혼합물을 95℃에서 가열하여 모든 예비-형성 dsDNA 착체를 해리시키고, 다음에 서서히 상온 또는 DNA 분자를 담금질하기 위해 키트 제조자에 의해 규정된 다른 저온으로 서서히 냉각시킨다. 다음에 새롭게 형성된 착체를 반응에 의해 생성된 형광의 양에 대한 동시에 연속적으로 수집된 데이터로 95℃로 서서히 가열한다. 형광 강도는 반응에서 존재하는 dsDNA의 양에 역으로 비례한다. 데이터는 상기 키트(예를 들면, ABI의 StepOne Plus Real Time PCR System 또는 lightTyper 기구, 영국 루이스 소재 Roche Diagnostics)와 양립할 수 있는 실시간 PCR 기구를 사용해서 수집할 수 있다.
용융 피크는 적당한 소프트웨어[예를 들면, LightTyper(Roche) 또는 SDS Dissociation Curve, ABI]를 사용해서 온도(x-축)에 대한 온도[y-축 상의 -d(형광성))/dT]에 대한 형광성의 네가티브 유도를 플로팅하여 작성한다. 데이터는 dsDNA 착체에서 단일 가닥 분자로의 신속 전이 온도를 규명하기 위해 분석한다. 상기 온도를 Tm이라 하고, 두 개의 분자 사이의 상호작용의 강도에 정비례한다. 통상적으로 Tm은 40℃를 초과할 것이다.
실시예 2: HGF 폴리뉴클레오타이드의 조절
안티센스 올리고뉴클레오타이드로 CHP212 세포 처리
ATCC로부터의 CHP212 세포(카탈로그 번호 CRL-2273)를 37℃ 및 5% CO2에서 성장 배지[MEM/F12(ATCC 카탈로그 번호 30-2003 및 Mediatech 카탈로그 번호 10-080-CV) + 10% FBS(Mediatech 카탈로그 번호 MT35-011-CV) + 페니실린/스트렙토마이신(Mediatech 카탈로그 번호 MT30-002-C1)]에서 성장시킨다. 실험 하루 전에 세포를 6 웰 플레이트에 1.5 × 105/ml 밀도로 다시 깔고, 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 실험하는 날, 6 웰 플레이트의 배지를 새로운 성장 배지로 바꾼다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 20uM 농도로 희석한다. 상기 용액 2㎕를 상온에서 20분 동안 400㎕ Opti-MEM 배지(Gibco 카탈로그 번호 31985-070) 및 4㎕ 리포펙타민 2000(Invitrogen 카탈로그 번호 11668019)로 배양하고, 6 웰 플레이트의 각 웰에 CHP212 세포를 도포한다. 올리고뉴클레오타이드 용액 대신에 물 2㎕를 포함하는 유사한 혼합물을 트랜스펙션되지 않은 대조군(mock-transfected control)용으로 사용하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 배양한지 3-18시간 후에 배지를 새로운 성장 배지로 바꾼다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 첨가한 후 48 시간에 배지를 제거하고, 제조자의 지시에 따라 Promega로부터의 SV 총 RNA 분리 시스템(카탈로그 번호 Z3105) 또는 Qiagen으로부터의 RNeasy 총 RNA 분리 키트(카탈로그 번호 74181)를 사용해서 세포로부터 RNA를 추출하였다. RNA 600ng을 Thermo Scientific로부터의 Verso cDNA 키트(카탈로그 번호 AB1453B) 또는 고용량 cDNA 역전사 키트(카탈로그 번호 4368813)를 사용해서 실행되는 역 전사 반응에 첨가하였다(매뉴스크립트에 따라 상기가 올바른지 확인하십시요, 확인한 다음 남기면 우리는 제조자의 프로토콜에 기재한 것으로서 상호교환적으로 사용함). 상기 역 전사 반응으로부터의 cDNA를 사용하여 ABI Taqman 유전자 발현 믹스(카탈로그 번호 4369510) 및 ABI에서 설계한 프라이머/프로브(Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: 캘리포니아주의 포스터 시티시에 소재하는 Applied Biosystems Inc.의 Hs00300159_ml)에 의해 유전자 발현을 모니터링하였다. 하기 PCR 사이클을 사용하였다: 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, (15초 동안 95℃, 1분 동안 60℃)를 40 사이클[(Applied Biosystems사)StepOne Plus Real Time PCR 기계를 사용함]. 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 처리한 후 유전자 발현의 배수 변화는 처리된 샘플 및 트랜스펙션되지 않은 샘플 사이의 18S-표준화 dCt 값의 차이를 기본으로 계산하였다.
결과: 실시간 PCR 결과로 CHP212 세포에서 HGF mRNA의 수준이 HGF 안티센스 BX356413에 대해 설계된 세 개의 올리고로 처리한 후 48시간에 현저하게 증가한 것을 알 수 있다(도 1).
비록 본 발명이 하나 이상의 구현에 대해 기재되고 나타냈지만, 본 명세서 및 첨부된 도면을 판독 및 이해하면 당업자에 의해 균등한 변화 및 변형이 이루어질 것이다. 또한, 본 발명의 특정 특성이 단지 몇몇 구형 중 하나에 대해서 기재되었지만, 이러한 특성은 어느 주어진 또는 특정 응용에서의 이점 및 목적할 수 있는 것으로서 다른 구형의 하나 이상의 다른 특성과 결합될 수 있다.
본 명세서의 요약으로 독자들은 기술적인 설명의 특성을 쉽게 알아낼 수 있을 것이다. 하기 특허청구범위의 범주 또는 의리를 제한하거나 또는 해석하기 위해 사용되지 않았다는 것을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> OPKO CuRNA, LLC <120> TREATMENT OF HEPATOCYTE GROWTH FACTOR (HGF) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO HGF <130> WO 2011/079261 A2 <140> PCT/US2010/061996 <141> 2010-12-23 <150> US61/289647 <151> 2009-12-23 <160> 12 <170> PatentIn version 1.71 <210> 1 <211> 2079 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <308> NM_001010934 <309> 2010-11-14 <313> (1)..(2079) <400> 1 gggagttcag acctagatct ttccagttaa tcacacaaca aacttagctc atcgcaataa 60 aaagcagctc agagccgact ggctctttta ggcactgact ccgaacagga ttctttcacc 120 caggcatctc ctccagaggg atccgccagc ccgtccagca gcaccatgtg ggtgaccaaa 180 ctcctgccag ccctgctgct gcagcatgtc ctcctgcatc tcctcctgct ccccatcgcc 240 atcccctatg cagagggaca aaggaaaaga agaaatacaa ttcatgaatt caaaaaatca 300 gcaaagacta ccctaatcaa aatagatcca gcactgaaga taaaaaccaa aaaagtgaat 360 actgcagacc aatgtgctaa tagatgtact aggaataaag gacttccatt cacttgcaag 420 gcttttgttt ttgataaagc aagaaaacaa tgcctctggt tccccttcaa tagcatgtca 480 agtggagtga aaaaagaatt 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aaagtatagt catttatttc tcctagtaaa tgttcccttg ttataatgaa caatggtttc 60 attgttcatg atttactaga aaggcaacaa atttgaaact ggttataaac atataatctg 120 tttctaacca tatcattttt aagcagttct aaaaactcag taaacagtaa acattttctc 180 ttcttttcag aaataaaatc tcagagcaag gtgtataaca cttgcatttc aatacatatt 240 tatgttccat acttacagca tgcattttcc tacatatcaa aggacatttc actatcattg 300 aactcatttc atcttttgcc acacacagca ttccacaatc ccacagccct gaagcttgga 360 gaacatgtct ctcacattca aaatctaact aaactaacag tttaacagct tgtctatgta 420 aaatagggat aggaacattg ccaagccgaa ataacagttg cctcacaaat gaaatgtcca 480 agctcgtaaa gtcacaaact ntgaccttta ggct 514 <210> 3 <211> 936 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (748)..(748) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (898)..(898) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (918)..(918) <223> n is a, c, g, or t <400> 3 aaaagaaaac aatgaanagn gtantaggga acagaatatg atatggaatg gaaagtaaga 60 atttacaaac agagatggaa ctggctgtag cacataaagt caaggatttc aaattcacta 120 acaacagaaa acaaatcctt ctctgtgaca attagctaac agtagccttt actttttatg 180 tgataaatat caacctaata ttaaatgaat atttatggag gaaatatttt taaaaatatt 240 tggttaataa caaataggta agatatctta gtataaaact tggacagcat tccagtagtc 300 cccctcccca aatactccaa aatcctaata attttctaac agagtttcat ccatgtttca 360 cttagatttt tggaaattta gagtttctga cagaactgaa aaatccggct attcagtagc 420 cagataacta agaaaaatga aaccacatac aatgctgaaa tggttactct tccatcttgt 480 cagccattca gttttccact gcaaaagtaa ggacaatgcc cttttatgct gtgagaagag 540 ctgaaaacat agacatggac ttaaggtgcc tgccttcaag acagtttggt ggtctccatt 600 gctttgatct cttcagatcc tattctgaat ggtactcagt tccagcctac gtgtcacatt 660 tgattctagg cacattttca ccaaaatgtg catggggtca agcttccagt gatcccttct 720 tatattgtat tatcttctgg gtccatanac ccttgtcaca ccacttcatg atagtttgga 780 cagaatttct gtggaagcag gtgctggttg aatagaatta acattgctaa tgaaaggcta 840 agcttcattc aactcctttc aggtgccaca cagtagtaga ttttgaggta tgtgagcnca 900 agacagtagg taagtaancc tctctttcac tttccc 936 <210> 4 <211> 1075 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (443)..(443) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (453)..(454) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (939)..(939) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (993)..(993) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1012)..(1013) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1017)..(1017) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1020)..(1021) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1027)..(1027) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1039)..(1039) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1043)..(1043) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1052)..(1052) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1058)..(1058) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1067)..(1067) <223> n is a, c, g, or t <400> 4 cagacactgt tcacaatagt cccatataat aggtactttt attataaaat attgcaaata 60 caaatatgag tcctaagtgg gtttggtaac ttgcccaagg tacttaaaag tgatgggtct 120 ggcattctta ggaagtctgg attgaagttc ttaaccacta cgctcttggt agttaagatt 180 tttctaaaat agtatactaa ctgtgtctgt gtatactcaa tcatataggc acctctacat 240 ttttatgttt gcatatttga taaacttaaa aatatgtaaa atattatttt gtaagcatgt 300 taaaaaaaag aataaaaacc tttacatgtt ttgtaaaaga attttacagt gtgaaaatga 360 tttatacagt ctctgcagtt atataaataa taagaactca aatcttctaa agataaatat 420 tatcaccctt tcaccaggga ganaatgtaa acnnatcctg gctataaata ttagttagaa 480 aaatgacact gtaaaaatct ttattaaaat taatttgtgg tatacattga aataaaatga 540 tttatctgca atagtattta atcaaatact agtaaccccc tcaagtcttt caacagcaca 600 ttacttttag tttaaaaata ttagttgaaa aaattttttg aaaacttgta aattattaga 660 gtcctggctc ccttggtttg tgattataaa tgaaatcaca gtgccttgag atactatagg 720 gcatttcact cttaaccatg catatgtgct agatagagct gctgtgattt ttaaaaatct 780 ggaaatctgt agaggaagca aaataacttg ttttagaagg cagataattg cctttttcct 840 tcttcctaca ccattatata ttctatgagc ctccattagt cttaaccata gagacttaac 900 aaaaacatag tgctataaaa ctgtacttag aaaaataana atcttttaat aatttttaaa 960 tatttttgta tggcattctc tggaaaagta ggngtggttc ttttagtatt annttgngcn 1020 ntgccancct tatatgggna agngaggaca tngggaanaa ttaattngac gggct 1075 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 5 gcttggcaat gttcctatcc c 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 6 agggctgtgg gattgtgga 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 7 ctacagccag ttccatctct 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <400> 8 gtcttgngct cacatacctc 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or t <400> 9 gtttacattn tctccctggt g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 10 gcttcctcta cagatttcca g 21 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 11 atgccagacc catcacttt 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 12 accaagggag ccaggactct 20

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  17. 간세포 성장 인자(Hepatocyte Growth Factor: HGF) 유전자의 천연 안티센스 서열인 서열 번호: 1 내지 4에 상보적인 길이가 5개 내지 30개인 뉴클레오타이드인 합성 올리고뉴클레오타이드에 있어서, 상기 합성 올리고뉴클레오타이드는 서열 번호: 5 내지 12에서 제시된 서열중 하나로 구성되며, 정상 대조군과 비교하여 생체내 또는 시험관내에서 상기 HGF 유전자의 기능 또는 발현 또는 기능 및 발현을 상향조절하는 것을 특징으로 하는 합성 올리고뉴클레오타이드.
  18. 제17항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 최소한 하나의 변형된 슈가 모이어티, 최소한 하나의 변형된 뉴클레오시드간 링키지, 최소한 하나의 변형된 뉴클레오타이드 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 올리고뉴클레오타이드.
  19. 제18항에 있어서, 하나 이상의 변형은 포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포르아미데이트, 카르바메이트, 카르보네이트, 포스페이트 트리에스테르, 아세타마이데이트, 카르복시메틸 에스테르, 및 이의 조합으로부터 선택된 최소한 하나의 변형된 뉴클레오시드간 링키지를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 올리고뉴클레오타이드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 간의 결합의 백본을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 올리고뉴클레오타이드.
  21. 제18항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 펩타이드 핵산, 잠금 핵산(LNA) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 올리고뉴클레오타이드.
  22. 제17항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 복수의 변형을 포함하며, 상기 변형은 포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 포스포로다이티오에이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포라미데이트, 카바메이트, 카보네이트, 포스페이트 트라이에스터, 아세타미데이트, 카복시메틸 에스터 및 이의 결합물로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 올리고뉴클레오타이드.
  23. 제17항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 복수의 변형을 포함하며, 상기 변형은 펩타이드 핵산, 잠금 핵산(LNA) 및 이의 결합물로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 올리고뉴클레오타이드.
  24. 제17항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 2'-O-메톡시에틸 변형된 당 부분, 2'-메톡시 변형된 당 부분, 2'-O-알킬 변형된 당 부분, 이환 당 부분 및 이의 결합물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 변형된 당 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 올리고뉴클레오타이드.
  25. 제17항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 복수의 변형을 포함하며, 상기 변형은 2'-O-메톡시에틸 변형된 당 부분, 2'-메톡시 변형된 당 부분, 2'-O-알킬 변형된 당 부분, 이환 당 부분 및 이의 결합물로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 당 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 올리고뉴클레오타이드.
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  30. 청구항 제18항에 따른 간세포 성장 인자(HGF) 폴리뉴클레오타이드에 특이적인 합성 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, HGF 폴리뉴클레오타이드와 관련된 질환 치료용 조성물에 있어서, 상기 HGF 폴리뉴클레오타이드와 관련된 질환은 간암, 간 종양, 간경화, 비-알코올성 지방간 질환 또는 간 섬유증에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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  34. 제30항에 있어서, 상기 하나 이상의 변형은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 펩타이드 핵산, 잠금 핵산(LNA) 분자 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
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