JP2004509619A - Ｆｌｉｐ−ｃ発現のアンチセンスモジュレーション - Google Patents

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Abstract

ＦＬＩＰ−Ｃの発現をモジュレートするためのアンチセンス化合物、組成物および方法を提供する。組成物は、ＦＬＩＰ−Ｃをコードする核酸を標的とするアンチセンス化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。ＦＬＩＰ−Ｃ発現のモジュレーションおよびＦＬＩＰ−Ｃの発現と関連した疾病の治療のためにこれらの化合物を使用する方法を提供する。

Description

【０００１】
発明の属する分野
本発明はＦＬＩＰ−Ｃ発現をモジュレートするための組成物と方法を提供する。特に、本発明はヒトＦＬＩＰ−Ｃをコードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。そのようなオリゴヌクレオチドは、ＦＬＩＰ−Ｃの発現をモジュレートすることが示された。
【０００２】
発明の背景
アポトーシスまたはプログラム細胞死は、進化のあいだ強力に保存された天然に存在するプロセスであり、調節不能な細胞増殖を予防する。細胞自殺のこの形態は、過剰なまたは望まれない細胞を排除することにより、多細胞生物の発生および維持において重要な働きをしている。しかしながら、もしこのプロセスが間違って進んでしまうと、過剰なアポトーシスにより、アルツハイマー、パーキンソン、ＡＬＳ、色素性網膜炎、などの神経学的障害および血液細胞障害を含む、細胞の損失および変性性障害が引き起こされ、一方で、アポトーシスが不十分であると、癌、自己免疫障害、およびウィルス感染の発症が起こる（Ｋｏｎｏｐｌｅｖａ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．， １９９９， ４５７， ２１７−２３６）。
【０００３】
いくつかの刺激により、アポトーシスを誘導することができ、そして最近では、これらの刺激により活性化される細胞表面サイトカイン受容体、すなわちＴＮＦＲ−１およびＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−１）により媒介されるシグナル伝達経路の理解において大きな進展があった。
【０００４】
これらの受容体により引き起こされる経路には、カスパーゼとして知られる酵素ファミリーにより組織化されるタンパク質溶解性カスケードが関与する（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ， Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ．， １９９７， ５３， ４７８−４９０）。これまでに同定された最も上流のカスパーゼは、カスパーゼ８である（ＣＡＰ４、ＦＬＩＣＥ、ＭＡＣＨおよびＭｃｈ５としても知られる）。カスパーゼ８は、胎児脳を除く胎児組織および成人組織の両方において偏在的に発現し、そして過剰発現された場合にアポトーシスを誘導する（Ｍｕｚｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １９９６， ８５， ８１７−８２７）。
【０００５】
カスパーゼ８は、アダプタータンパク質であるＦＡＤＤと一緒になって、デスドメインとして知られる両方のタンパク質内部に含有される以前に同定されたタンパク質モチーフを介して、ＣＤ９５受容体と相互作用する（Ｍｕｚｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １９９６， ８５， ８１７−８２７）。ひとたび死−誘導性シグナル伝達性複合体（ＤＩＳＣ）が導入されると、カスパーゼ８は自己タンパク質溶解性切断を引き起こし、その後活性化される（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９８， ２７３， ４３４５−４３４９； Ｍｅｄｅｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｍｂｏ Ｊ．， １９９７， １６， ２７９４−２８０４； Ｍｕｚｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９８， ２７３， ２９２６−２９３０； Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ．， １９９６， ９３， １４４８６−１４４９１）。下流エフェクターカスパーゼ類は、いくつかのクラスのタンパク質基質を切断し、いくらかの冗長性を有することが示されたが、一方でカスパーゼ８などの上流カスパーゼ類は、受容体活性化の下流にあるカスパーゼ類を切断しそして活性化させる様に主として機能している。例外の一つは、細胞質性ホスホリパーゼＡ２である。カスパーゼ８は、この非−カスパーゼ前炎症性酵素を切断することもまた、示された（Ｌｕｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １９９８， ２５３， ９２−９８）。
【０００６】
カスパーゼ８は、いくつかの死受容体−非依存性経路によってもまた活性化することができることが、最近示された。カスパーゼ８は、ヒト白血病Ｔ−細胞株中でＣＤ９５受容体活性化が存在しない条件下で、抗癌剤により活性化することができることから、代わりのアポトーシス経路が存在することが示唆される（Ｂａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １９９９， ５９， ２０８３−２０９０； Ｗｅｓｓｅｌｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， １９９９， ９３， ３０５３−３０６３）。Ｍｅｄｅｍａらは、カスパーゼ８がＨｅＬａ細胞中のグランザイムＢにより切断され、そのことから別のＣＤ９５−非依存性アポトーシス経路であるパーフォリン−誘導性アポトーシスにそれが関与していることが示唆されるることもまた示した（Ｍｅｄｅｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９７， ２７， ３４９２−３４９８）。その他のＣＤ９５−非依存性経路には、一酸化窒素（Ｃｈｌｉｃｈｌｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， １９９８， ９１， ４３１１−４３２０）、チトクロームｃ（Ｋｕｗａｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９８， ２７３， １６５８９−１６５９４）、そしてセンダイウィルス（Ｂｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， １９９９， ７３， ７０２−７０８）により媒介されるものが含まれる。
【０００７】
カスパーゼ８は、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ−関連障害を含むいくつかの疾患において、可能性のある治療標的であることを意味する。それはＡＩＤＳウィルスＴａｔタンパク質により亢進調節されることが示された（Ｂａｒｔｚ ａｎｄ Ｅｍｅｒｍａｎ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， １９９９， ７３， １９５６−１９６３； Ｐｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ．， １９９７， ５３， ６０４−６１６）。
【０００８】
Ｍａｎｄｒｕｚｚａｔｏらは、カスパーゼ８遺伝子の変異型によりコードされる細胞傷害性Ｔリンパ球により認識される抗原を、頭部癌細胞および頸部癌細胞中で同定した。この変異は、腫瘍細胞中でのみ見いだされるものであり、停止コドンを改変し、それにより８８アミノ酸をタンパク質に付加し、カスパーゼの活性を低下させる（Ｍａｎｄｒｕｚｚａｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １９９７， １８６， ７８５−７９３）。
【０００９】
カスパーゼ８機能のモジュレーションは、様々な制御不能なアポトーシス性病理学的症状における可能性のある治療的標的を意味すると、現在のところ考えられている。
【００１０】
ＦＬＩＰ−ｃは、カスパーゼ８の天然のドミナントネガティブ調節因子である。それは、抗−アポトーシス性タンパク質として作用し、そしてしたがって、カスパーゼ活性化の調節における治療的介入の非常に特異的な手段であると考えられる。
【００１１】
ＦＬＩＰ−ｃの単離と特徴付けは、多数の研究者により行われ、そしてそのため、そのタンパク質はいくつかの名称を有する。ＦＬＩＰ−ｃは、ＦＬＩＰ（Ｉｒｍｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９９７， ３８８， １９０−１９５）、Ｃａｓｐｅｒ（Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， １９９７， ６， ７５１−７６３）、Ｉ−Ｆｌｉｃｅ（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９７， ２７２， １７２５５−１７２５７）、ＦＬＡＭＥ−１（Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９７， ２７２， １８５４２−１８５４５）、ＣＡＳＨ（Ｇｏｌｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９７， ２７２， １９６４１−１９６４４）、ＣＬＡＲＰ（Ｉｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ．， １９９７， ９４， １０７１７−１０７２２）、ＭＲＩＴ（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ．， １９９７， ９４， １１３３３−１１３３８）そしてＵｓｕｒｐｉｎ（Ｒａｓｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．， １９９８， ５， ２７１−２８８）としても知られている。ＦＬＩＰ−ｃをコードするポリヌクレオチドおよびポリペプチド、そのタンパク質に対する抗体、そして核酸および医薬的に許容可能な担体を含む組成物が、ＵＳ特許６，０３７，４６１およびその対応するＰＣＴ国際公開ＷＯ ９８／５２９６３中に開示される。ＦＬＩＰ−ｃをコードする組換え発現ベクターそして前記ベクターを含む宿主細胞もまた、開示される（Ａｌｎｅｍｒｉ， ２０００； Ａｌｎｅｍｒｉ， １９９８）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般的に開示される。ＦＬＩＰ−ｃをコードする組換えＤＮＡ分子およびそのフラグメント、並びに前記ＤＮＡをコードするベクター、前記ベクターを含有する宿主細胞、そしてＦＬＩＰ−ｃをコードするＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡは、ＰＣＴ国際公開ＷＯ ００／０３０２３に開示される。ＦＬＩＰ−ｃとカスパーゼ８との相互作用の阻害剤を同定する方法もまた、開示される（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。ＦＬＩＰ−ｃをコードするポリヌクレオチドおよびポリペプチドもまた、そのタンパク質に対する抗体およびアポトーシス阻害剤として使用するためのタンパク質を製造する方法とともにＰＣＴ国際公開ＷＯ ９８／４４１０３中に開示される（Ｋｒａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。
【００１２】
そのタンパク質は、細胞中で２種類の型、すなわちｍＲＮＡの選択的スプライシングに由来する短い型と長い型として見いだされる（Ｇｏｌｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９７， ２７２， １９６４１−１９６４４； Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ．， １９９７， ９４， １１３３３−１１３３８； Ｉｒｍｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９９７， ３８８， １９０−１９５； Ｒａｓｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．， １９９８， ５， ２７１−２８８； Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， １９９７， ６， ７５１−７６３）。ＦＬＩＰ−ｃの長い型は、アポトーシスに対する耐性を誘導するＢ細胞抗原受容体の架橋に際して、亢進調節される（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２０００， ３０， １５５−１６３）。その他の研究もまた、Ｆａｓ−媒介性アポトーシスに対する感受性の主要な決定因子としての、長い型のレベルに関係する（Ｔｅｐｐｅｒ ａｎｄ Ｓｅｌｄｉｎ， Ｂｌｏｏｄ， １９９９， ９４， １７２７−１７３７）。ＦＬＩＰ−ｃ発現ベクターでトランスフェクトすることによるトランスフォーム型ケラチノサイトでの長い型の異所性発現の結果、これらの細胞中でのＴＲＡＩＬ−媒介性アポトーシスに対する耐性が生じた（Ｌｅｖｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ２０００， ６０， ５５３−５５９）。
【００１３】
細胞中で、ＦＬＩＰ−ｃは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ）およびＦａｓにより開始される細胞死経路において役割を果たす（Ｓｃａｆｆｉｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９９， ２７４， １５４１−１５４８； Ｔｓｃｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９８， １０， ５５２−５５８中でレビューされる）。そうする際に、ＦＬＩＰ−ｃは、ＦＡＤＤ、カスパーゼ８、カスパーゼ３、Ｂｃｌ−２ファミリー構成分子、ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２を含む、いくつかのその他の細胞死経路タンパク質と相互作用する（Ｇｏｌｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９７， ２７２， １９６４１−１９６４４； Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ．， １９９７， ９４， １１３３３−１１３３８； Ｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９７， ２７２， １７２５５−１７２５７； Ｒａｓｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．， １９９８， ５， ２７１−２８８； Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， １９９７， ６， ７５１−７６３； Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９７， ２７２， １８５４２−１８５４５）。
【００１４】
ＦＬＩＰ−ｃの発現は、ほとんどの組織中で見いだされ、最も高いレベルは心臓、胎盤、脾臓、白血球、精巣および骨格筋において見いだされる（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９７， ２７２， １７２５５−１７２５７； Ｉｒｍｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９９７， ３８８， １９０−１９５）。発現は、患者の転移性の皮膚メラノーマ病変においても示されたが、周囲の正常皮膚においては発現しなかった。ＦＬＩＰ−ｃは、リンパ腫細胞株を細胞死受容体−誘導性アポトーシスに対して保護すること（Ｉｒｍｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９９７， ３８８， １９０−１９５）、そして単球およびマクロファージをＦａｓ−媒介性アポトーシスから保護することが示され、これらからＦＬＩＰ−ｃが炎症において主要な役割を果たしている可能性があることが示唆される（Ｐｅｒｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １９９９， １９０， １６７９−１６８８）。
【００１５】
さらに、ＦＬＩＰ−ｃ発現レベルは、バルーン血管形成術の後に内側平滑筋細胞（ｍｅｄｉａｌ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ）において下方調節され、そしてアテローム性動脈硬化プラーク中では存在しないことが示された。その結果として、ＦＬＩＰ−ｃは、アテローム動脈硬化の内膜の細胞野生存率を制御することを媒介する経路において役割を果たしていると、考えられている（Ｉｍａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．， ２０００， １５６， １２５−１３７）。血管壁の炎症、特にアテローム性動脈硬化性損傷および血管損傷に関連する症状を治療するための、そのような治療を必要とする被検体に対して有効量のＦＬＩＰ−ｃ分子を投与することを含む方法は、ＰＣＴ国際公開ＷＯ ９９／４２５７０に開示される（Ｗａｌｓｈ， １９９９）。ＦＬＩＰ−ｃポリペプチドをコードする単離された核酸分子またはそのフラグメントは、その相補物と同様に開示される。
【００１６】
Ｑｕｅらは、胆管癌細胞において、ＦＬＩＰ−ｃに対する相補的ＤＮＡを逆方向に安定的トランスフェクションすることによるＦＬＩＰ−ｃオリゴヌクレオチド処置により、ＦＬＩＰ−ｃタンパク質発現を９０％減少させ、そしてＦａｓ−媒介性アポトーシスを２倍まで増加させることを示したことから、ＦＬＩＰ−ｃの阻害が胆管癌の治療において補助となりうることが示唆される（Ｑｕｅ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， １９９９， ３０， １３９８−１４０４）。
【００１７】
現在のところ、ＦＬＩＰ−ｃの合成を効果的に阻害する治療剤は知られておらず、そして現在までのところ、ＦＬＩＰ−ｃ機能をモジュレートすることを目的としたストラテジーには、抗体、カスパーゼ阻害剤、オリゴヌクレオチド発現ベクター、および細胞死受容体などの上流部分をブロックする分子を使用することが含まれる。結果として、ＦＬＩＰ−ｃ機能を効果的に阻害することができる剤を求める長い間の必要性は未だに存在し続けている。
【００１８】
アンチセンス技術は、特定の遺伝子産物の発現を減少させるための効果的な手段として生み出され、そしてしたがって、ＦＬＩＰ−ｃ発現のモジュレーションのための、多数の治療用途、診断用途、および研究用途において唯一有用であることが証明される可能性がある。
【００１９】
本発明は、ＦＬＩＰ−ｃの長い型および短い型の両方をモジュレーションすることを含む、ＦＬＩＰ−ｃ発現をモジュレートするための組成物および方法を提供する。
発明の概要
本発明は、ＦＬＩＰ−Ｃをコードする核酸を標的とし、そしてＦＬＩＰ−Ｃの発現をモジュレートする、化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。本発明の化合物を含む医薬組成物およびその他の組成物もまた、提供する。さらに、細胞または組織中でＦＬＩＰ−Ｃの発現をモジュレートする方法であって、前記細胞または組織を、１またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物と接触させることを含む、前記方法を提供する。さらに、治療的または予防的有効量の１またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物を投与することにより、ＦＬＩＰ−Ｃの発現と関連する疾患または症状を有するか、またはかかっている可能性があると疑われる動物、特にヒトを治療する方法を提供する。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、ＦＬＩＰ−Ｃをコードする核酸分子の機能をモジュレートする際に使用するための、究極的には産生されるＦＬＩＰ−Ｃの量をモジュレートする際に使用するための、オリゴマー化合物、とくにアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用する。これは、ＦＬＩＰ−Ｃをコードする１またはそれ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することにより達成される。本明細書中で使用する場合、用語“標的核酸”および“ＦＬＩＰ−Ｃをコードする核酸”は、ＦＬＩＰ−ＣをコードするＤＮＡ、このようなＤＮＡから転写されるＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）、およびこのようなＲＮＡに由来するｃＤＮＡも含む。オリゴマー化合物のその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、核酸の正常な機能を妨害する。標的核酸の機能のそれに特異的にハイブリダイズする化合物によるこのモジュレーションは、一般的に“アンチセンス”といわれる。妨害すべきＤＮＡの機能には、複製および転写が含まれる。妨害されるべきＲＮＡの機能には、すべての生存に必要な機能、たとえばＲＮＡのタンパク質翻訳部位への転移（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）、ＲＮＡからタンパク質への翻訳、１またはそれ以上のｍＲＮＡ種を得るためのＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡに含まれる触媒活性またはＲＮＡにより促進される触媒活性、が含まれる。標的核酸機能によるこのような妨害の全体的な効果は、ＦＬＩＰ−Ｃの発現のモジュレーションである。本発明の文脈において、“モジュレーション”とは、遺伝子の発現における増加（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明の文脈において、阻害は遺伝子発現のモジュレーションの好ましい形態であり、そしてｍＲＮＡは好ましい標的である。
【００２１】
アンチセンスに対する特異的核酸を標的とすることが好ましい。特定の核酸に対してアンチセンス化合物を“標的化する”とは、本発明の文脈において、複数工程のプロセスである。プロセスは通常、その機能をモジュレートすべき核酸配列の同定からはじめる。たとえば、このことは、その発現が特定の症状または疾患状態と関連する細胞の遺伝子（あるいはその遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）、または感染性病原体に由来する核酸分子でありうる。本発明において、標的はＦＬＩＰ−Ｃをコードする核酸分子である。標的化のプロセスにはまた、アンチセンス相互作用のためにこの遺伝子内部に１または複数の部位を決定し、所望の効果、たとえばタンパク質の発現の検出またはモジュレーション、を結果として生じるようにすることを含む。本発明の文脈において、好ましい遺伝子内部部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンあるいは終止コドンを含む領域である。当該技術分野において既知であるように、翻訳開始コドンは、典型的には５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において；対応するＤＮＡ分子においては５’−ＡＴＧ）であるので、翻訳開始コドンはまた、“ＡＵＧコドン”、“スタートコドン”または“ＡＵＧスタートコドン”とも呼ばれる。少数の遺伝子は、ＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧまたは５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、そして５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧおよび５’−ＣＵＧが、ｉｎ ｖｉｖｏで機能することが示された。このように、それぞれの事例における開始アミノ酸は典型的にはメチオニン（真核細胞において）またはホルミルメチオニン（原核細胞において）であるにもかかわらず、用語“翻訳開始コドン”および“スタートコドン”は、多くのコドン配列を含むことができる。真核細胞の遺伝子および原核細胞の遺伝子は、２またはそれ以上の代わりのスタートコドンを有する場合があり、そのいずれもが好ましくは特定の細胞型または組織においてまたは特定の条件のセットのもとにおいて、翻訳開始のために利用することができる、ということも、当該技術分野において既知である。本発明の文脈において、“スタートコドン”および“翻訳開始コドン”は、そのようなコドンの１またはそれ以上の配列にかかわらず、ｉｎ ｖｉｖｏで使用して、ＦＬＩＰ−Ｃをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ分子の翻訳を開始する、１またはそれ以上のコドンのことをいう。
【００２２】
遺伝子の翻訳終止コドン（または“停止コドン”）は、３つの配列、すなわち、５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧおよび５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ、５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡ）のうちの一つを有しうることも、当該技術分野において既知である。用語“スタートコドン領域”および“翻訳開始コドン領域”は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）に約２５から約５０の連続するヌクレオチドを含む、ｍＲＮＡあるいは遺伝子の部分のことを言う。同様に、用語“停止コドン領域”および“翻訳終止コドン領域”は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）に約２５から約５０の連続するヌクレオチドを含む、ｍＲＮＡまたは遺伝子の部分のことを言う。
【００２３】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとのあいだの領域のことを言うと当該技術分野において知られているオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または“コード領域”はまた、効果的に標的化されうる領域でもある。その他の標的領域には、翻訳開始コドンから５’方向におけるｍＲＮＡの部分、そしてしたがってｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳開始コドンとのあいだのヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むもの、のことをいうと当該技術分野において知られている５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、そして翻訳終止コドンから３’方向におけるｍＲＮＡの部分、そしてしたがってｍＲＮＡの翻訳終止コドンと３’末端とのあいだのヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むもの、のことをいうと当該技術分野において知られている３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、が含まれる。ｍＲＮＡの５’キャップには５’−５’三リン酸結合を介して、ｍＲＮＡの最も５’側の残基と結合するＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造それ自体だけでなく、キャップに隣接する最初の５０ヌクレオチドも含むと考えられている。５’キャップ領域もまた、好ましい標的領域でありうる。
【００２４】
いくつかの真核細胞ｍＲＮＡ転写物は直接的に翻訳されるが、多くは１またはそれ以上の“イントロン”として知られる領域を含有し、それらは翻訳される前に転写物から切り出される。残りの（そしてしたがって翻訳される）領域は、 “エクソン”として知られ、そして一緒にスプライシングされて連続的なｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡスプライス部位、すなわち、イントロン−エクソン結合もまた、好ましい標的領域である場合があり、そして特に異常なスプライシングが疾患に関与しているか、あるいは特定のｍＲＮＡスプライス産物の過剰産生が疾患に関与している状況において、特に有用である。再構成または欠損による異常な融合結合もまた、好ましい標的である。イントロンも有効である場合があり、そしてしたがって、たとえばＤＮＡまたはプレ−ｍＲＮＡを標的とするアンチセンス化合物のための標的領域が好ましい場合があることもまた、見出した。
【００２５】
いったん１またはそれ以上の標的部位を同定したら、標的に対して十分に相補的な、すなわち、十分によくそして十分に特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドを選択し、所望の効果を得る。
【００２６】
本発明の文脈において、“ハイブリダイゼーション”とは、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間のワトソン−クリック水素結合、フーグスティーン水素結合または逆フーグスティーン水素結合でありうる、水素結合を意味する。たとえば、アデニンおよびチミンは相補的な核塩基であり、水素結合を形成することを通じて対合する。本明細書中で使用する場合、“相補的”とは、２つのヌクレオチド間で正確に対合するための能力のことをいう。たとえば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同一の位置でヌクレオチドと水素結合することができる場合、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、その位置において互いに相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡ は、それぞれの分子中での十分な数の対応する位置が、互いに水素結合することができるヌクレオチドにより占められている場合、互いに相補的である。したがって、“特異的にハイブリダイズ可能”および“相補的”は、安定でそして特異的な結合がオリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的とのあいだで生じるような、十分な程度の相補性または正確な対合を示すために使用される用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の配列と１００％の相同性がある必要はないことは、当該技術分野において理解されている。アンチセンス化合物は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子に対する化合物の結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨害して利用できないようにし、そして特異的な結合が所望される条件下、すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイまたは治療の場合には生理学的条件下、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合には、アッセイを行う条件下にて、非−標的配列に対するアンチセンス化合物の非−特異的結合を妨害するための十分な程度の相補性が存在する場合、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００２７】
標的にハイブリダイズしそして標的の発現を阻害する本発明のアンチセンスおよびその他の化合物が実験を通じて同定され、そしてこれらの化合物の配列は、本明細書中の以下において、本発明の好ましい態様として同定される。これらの好ましい配列が相補的である標的部位は、本明細書中の以下において“活性部位”と呼ばれ、そしてそのため、標的化のための好まし部位である。したがって、本発明の別の態様には、これらの活性部位に対してハイブリダイズする化合物を包含する。
【００２８】
アンチセンス化合物は、一般的に、研究用試薬および診断薬として使用される。たとえば、当業者はしばしば、正確な特異性により遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、特定遺伝子の機能を解明する。たとえば、アンチセンス化合物を使用して、生物学的経路の様々なメンバーの機能どうしを区別することもある。アンチセンスモジュレーションは、したがって、研究用途として使用された。
【００２９】
アンチセンスの特異性および感受性も、治療用途として当業者に利用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、動物およびヒトにおける疾患状態を治療する際の治療部分として使用した。リボザイムを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド薬は、ヒトに対して安全にそして効果的に投与され、そして多くの臨床試験が現在進行中である。したがって、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織および動物、特にヒトの治療のための治療計画において有用なものとして形成することができる、有用な治療様式でありうることが確立される。本発明の文脈において、用語“オリゴヌクレオチド”とは、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーまたはポリマー、またはそれらの模倣体のことをいう。この用語には、天然に存在する核塩基、糖および共有ヌクレオシド間（バックボーン）結合、および同様に機能する非−天然に存在する部分を有するオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが含まれる。このような修飾されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、たとえば、細胞取り込みの亢進、核酸標的に対する親和性の亢進、そしてヌクレアーゼの存在下における安定性の増加などの望ましい特性のため、しばしば天然の型より好ましい。
【００３０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス化合物の好ましい形態である一方、本発明は、以下に記載するようなオリゴヌクレオチド模倣体（しかし、これらのものには限定されない）を含む、その他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明に従うアンチセンス化合物は、好ましくは、約８〜約５０核塩基（すなわち、約８〜約５０の連結したヌクレオシド）を含む。具体的な好ましいアンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは約１２〜約３０核塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンス化合物には、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド（オリゴザイム）、およびその他の短い触媒ＲＮＡまたは標的核酸に対してハイブリダイズしそしてその発現をモジュレートする触媒性オリゴヌクレオチドが含まれる。
【００３１】
当該技術分野において知られているように、ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常はヘテロ環式塩基である。このようなヘテロ環式塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含む、ヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドに対して、リン酸基は、糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分のいずれかに結合することができる。オリゴヌクレオチドを形成する際に、リン酸基が隣接するヌクレオシドと互いに共有結合し、直鎖ポリマー化合物を形成する。引き続いて、この直鎖ポリマー化合物のそれぞれの末端がさらに一緒になって、環状構造を形成することができるが、しかしながら、開環直鎖構造が一般的には好ましい。オリゴヌクレオチド構造中において、リン酸基とは、一般的には、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成するものと言われる。ＲＮＡおよびＤＮＡの正常な結合またはバックボーンは、３’から５’のホスホジエステル結合である。
【００３２】
本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例には、修飾バックボーンまたは非−天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書中で定義する場合、修飾バックボーンを有するオリゴヌクレオチドには、バックボーン中にリン原子を保持するものや、バックボーン中にリン原子を有さないものが含まれる。本明細書の目的のため、そして当該技術分野において時々参照される場合、そのヌクレオシド間バックボーン中にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであると考えることができる。
【００３３】
好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンには、たとえば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホールアミデートおよびアミノアルキルホスホールアミデートを含むホスホールアミデート、チオノホスホールアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な３’−５’結合を有するセレノホスホネート（ｓｅｌｅｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）およびボラノホスホネート、２’−５’結合したこれらの類似体、そしてヌクレオシドユニットの隣接する塩基対が、５’−３’に対して３’−５’または５’−２’に対して２’−５’に結合する、１またはそれより多いヌクレオチド間結合は、３’−３’結合、５’−５’結合、または２’−２’結合である逆向きの極性を有するもの、が含まれる。好ましい逆向きの極性を有するオリゴヌクレオチドは、最も３’−側のヌクレオチド間結合に１つの３’−３’結合を含む、すなわち、脱塩基している可能性がある（核塩基が失われているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）１つの逆向きのヌクレオシド残基を含む。様々な塩、混合塩、そして遊離酸型も含まれる。
【００３４】
上述したリン−含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、Ｕ．Ｓ．： ３，６８７，８０８；４，４６９，８６３；４，４７６，３０１；５，０２３，２４３；５，１７７，１９６；５，１８８，８９７；５，２６４，４２３；５，２７６，０１９；５，２７８，３０２；５，２８６，７１７；５，３２１，１３１；５，３９９，６７６；５，４０５，９３９；５，４５３，４９６；５，４５５，２３３；５，４６６，６７７；５，４７６，９２５；５，５１９，１２６；５，５３６，８２１；５，５４１，３０６；５，５５０，１１１；５，５６３，２５３；５，５７１，７９９；５，５８７，３６１；５，１９４，５９９；５，５６５，５５５；５，５２７，８９９；５，７２１，２１８；５，６７２，６９７；および５，６２５，０５０が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そして参考文献としてそのそれぞれを本明細書中に援用する。
【００３５】
リン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖アルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテロ原子そしてアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１またはそれ以上の短鎖へテロ原子またはヘテロ環式ヌクレオシド間結合により形成される、バックボーンを有する。これらには、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシドおよびスルホンバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；リボアセチルバックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネートおよびスルホンアミドバックボーン；アミドバックボーン；および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を有するその他のもの、を有するものが含まれる。
【００３６】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、Ｕ．Ｓ．： ５，０３４，５０６；５，１６６，３１５；５，１８５，４４４；５，２１４，１３４；５，２１６，１４１；５，２３５，０３３；５，２６４，５６２；５，２６４，５６４；５，４０５，９３８；５，４３４，２５７；５，４６６，６７７；５，４７０，９６７；５，４８９，６７７；５，５４１，３０７；５，５６１，２２５；５，５９６，０８６；５，６０２，２４０；５，６１０，２８９；５，６０２，２４０；５，６０８，０４６；５，６１０，２８９；５，６１８，７０４；５，６２３，０７０；５，６６３，３１２；５，６３３，３６０；５，６７７，４３７；５，７９２，６０８；５，６４６，２６９；および５，６７７，４３９が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そして参考文献としてそのそれぞれを本明細書中に援用する。
【００３７】
その他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体において、ヌクレオチドユニットの糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、バックボーンを、新規の基により置換する。塩基ユニットは、適した核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのための維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有すると示されたそのようなオリゴマー化合物の一つであるオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）とも呼ばれている。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−バックボーンは、アミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンにより置換される。核塩基を保持し、そしてバックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、Ｕ．Ｓ．： ５，５３９，０８２；５，７１４，３３１；および５，７１９，２６２が含まれるが、これらだけには限定されず、そのそれぞれを本明細書中に参考文献として援用する。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９１， ２５４， １４９７−１５００）中に見出すことができる。
【００３８】
本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエートバックボーンを有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子バックボーンを有するオリゴヌクレオシドであり、特に上述の米国特許５，４８９，６７７の−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−〔メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩバックボーン〕、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−〔ここで、天然のホスホジエステルバックボーンは−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として示される〕そして上述の米国特許５，６０２，２４０のアミドバックボーンである。上述した米国特許５，０３４，５０６のモルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい。
【００３９】
修飾オリゴヌクレオチドは、１またはそれ以上の置換糖部分も含有する。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位で以下のものの一つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルでありうる。Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２、ここでｎおよびｍは１から約１０である、が特に好ましい。その他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のものの一つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、リポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬理特性を向上するための基、そして同様の特性を有するその他の置換基を含む。好ましい修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， １９９５， ７８， ４８６−５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。さらに好ましい修飾には、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書の以下の実施例に記載する場合、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、そして２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、本明細書中の以下の実施例において２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２とも記載される、が含まれる。
【００４０】
さらに好ましい修飾には、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’または４’炭素原子と結合し、それにより二環式糖部分を形成する、ロックされた（Ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）が含まれる。結合は、２’酸素原子および３’または４’炭素原子にブリッジするメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基（ここでｎは１または２である）であることが好ましい。ＬＮＡおよびその調製は、ＷＯ ９８／３９３５２およびＷＯ ９９／１４２２６中に記載される。
【００４１】
その他の好ましい修飾には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。２’−修飾は、アラビノ（上向き）位であってもリボ（下向き）位であってもよい。好ましい２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。同様の修飾もまた、オリゴヌクレオチドのその他の位、特に３’末端ヌクレオチドまたは２’−５’結合オリゴヌクレオチド中の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位において作製することもできる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有する場合もある。このような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、Ｕ．Ｓ．： ４，９８１，９５７；５，１１８，８００；５，３１９，０８０；５，３５９，０４４；５，３９３，８７８；５，４４６，１３７；５，４６６，７８６；５，５１４，７８５；５，５１９，１３４；５，５６７，８１１；５，５７６，４２７；５，５９１，７２２；５，５９７，９０９；５，６１０，３００；５，６２７，０５３；５，６３９，８７３；５，６４６，２６５；５，６５８，８７３；５，６７０，６３３；５，７９２，７４７；および５，７００，９２０が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そしてそのそれぞれはその全体を参考文献として本明細書中に援用する。
【００４２】
オリゴヌクレオチドには、核塩基（しばしば当該技術分野において単に“塩基”としても呼ばれる）修飾または置換も含まれうる。本明細書中に使用される場合、“非修飾”または“天然”核塩基には、プリン塩基、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、そしてピリミジン塩基、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核塩基には、その他の合成および天然核塩基、たとえば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびその他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基のその他のアルキニル誘導体、６−アゾのウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよびその他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよびその他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが含まれる。さらなる修飾核塩基には、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）などの三環性ピリミジン類、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などのＧ−クランプ類が含まれる。修飾核塩基には、プリン塩基またはピリミジン塩基が他のヘテロ環式基、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンなどにより置換されているものもまた含まれうる。さらなる核塩基には、米国特許Ｎｏ． ３，６８７，８０８に開示されたもの、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ｐａｇｅｓ ８５８−８５９、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ， Ｊ．Ｉ．， ｅｄ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９０に開示されたもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９１， ３０， ６１３に開示されたもの、そしてＳａｎｇｈｖｉ， Ｙ．Ｓ．， Ｃｈａｐｔｅｒ １５， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐａｇｅｓ ２８９−３０２， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ．Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ． ， ｅｄ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３により開示されたもの、が含まれる。これらの核塩基の特定のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示され（Ｓａｎｇｈｖｉ， Ｙ．Ｓ．， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ．Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ．， ｅｄｓ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９９３， ｐｐ． ２７６−２７８）、そして現在は好ましい塩基置換であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合にさらにより特に好ましい。
【００４３】
上述した修飾核塩基の特定のものおよびその他の修飾核塩基の調製を教示する代表的な米国特許には、上述したＵ．Ｓ． ３，６８７，８０８、およびＵ．Ｓ．： ４，８４５，２０５；５，１３０，３０２；５，１３４，０６６；５，１７５，２７３；５，３６７，０６６；５，４３２，２７２；５，４５７，１８７；５，４５９，２５５；５，４８４，９０８；５，５０２，１７７；５，５２５，７１１；５，５５２，５４０；５，５８７，４６９；５，５９４，１２１；５，５９６，０９１；５，６１４，６１７；５，６４５，９８５；５，８３０，６５３；５，７６３，５８８；６，００５，０９６および５，６８１，９４１が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そしてそのそれぞれは参考文献として本明細書中に援用し、そして米国特許５，７５０，６９２が含まれ、これは本出願により一般に所有されるものであり、そして参考文献として本明細書中に援用する。
【００４４】
本発明のオリゴヌクレオチドのその他の修飾には、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを向上する、化学的にオリゴヌクレオチドに結合する１またはそれ以上の部分または複合体が含まれる。本発明の化合物には、第一または第二ヒドロキシル基などの官能基に共有結合する抱合体基が含まれうる。本発明の抱合体基には、インターカレーター類、リポーター分子類、ポリアミン類、ポリアミド類、ポリエチレングリコール類、ポリエーテル類、オリゴマーの薬力学的特性を向上させる基、オリゴマーの薬物動態特性を向上させる基、が含まれる。代表的な抱合体基には、コレステロール類、脂質類、リン脂質類、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｎｅ）、アントラキノン（ａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ）、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン類、クマリン類、および色素類が含まれる。本発明の文脈において、薬理学的特性を向上させる基には、オリゴマー取り込みを向上させる基、分解に対するオリゴマー耐性を向上させる基、および／またはＲＮＡとの配列−特異的ハイブリダイゼーションを増強させる基、が含まれる。本発明の文脈において、薬物動態特性を向上させる基には、オリゴマー取り込み、分布、代謝、または排出を向上させる基、が含まれる。代表的な抱合体基は、１９９２年１０月２３日に出願され、その全体を参考文献として本明細書中に援用する、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６中に開示される。複合体部分には、脂質部分、たとえばコレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８９， ８６， ６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９４， ４， １０５３−１０６０）、チオエーテル、たとえば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９９２， ６６０， ３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９３， ３， ２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９２， ２０， ５３３−５３８）、脂肪族鎖、たとえば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １９９１， １０， １１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９０， ２５９， ３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， １９９３， ７５， ４９−５４）、リン脂質、たとえば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６， ３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９０， １８， ３７７７−３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ， １９９５， １４， ９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６， ３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９５， １２６４， ２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １９９６， ２７７， ９２３−９３７）が含まれるが、これらには限定されない。本発明のオリゴヌクレオチドは抱合体化されて、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗細菌剤または抗生物質などの薬剤物質を活性化することもまたできる。オリゴヌクレオチド−薬物抱合体およびその調製は、米国特許出願０９／３３４，１３０（１９９９年６月１５日に出願）中に記載されており、その全体を参考文献として本明細書中に援用する。
【００４５】
この様なオリゴヌクレオチド複合体の調製を教示する代表的な米国特許には、Ｕ．Ｓ．： ４，８２８，９７９；４，９４８，８８２；５，２１８，１０５；５，５２５，４６５；５，５４１，３１３；５，５４５，７３０；５，５５２，５３８；５，５７８，７１７， ５，５８０，７３１；５，５８０，７３１；５，５９１，５８４；５，１０９，１２４；５，１１８，８０２；５，１３８，０４５；５，４１４，０７７；５，４８６，６０３；５，５１２，４３９；５，５７８，７１８；５，６０８，０４６；４，５８７，０４４；４，６０５，７３５；４，６６７，０２５；４，７６２，７７９；４，７８９，７３７；４，８２４，９４１；４，８３５，２６３；４，８７６，３３５；４，９０４，５８２；４，９５８，０１３；５，０８２，８３０；５，１１２，９６３；５，２１４，１３６；５，０８２，８３０；５，１１２，９６３；５，２１４，１３６；５，２４５，０２２；５，２５４，４６９；５，２５８，５０６；５，２６２，５３６；５，２７２，２５０；５，２９２，８７３；５，３１７，０９８；５，３７１，２４１， ５，３９１，７２３；５，４１６，２０３， ５，４５１，４６３；５，５１０，４７５；５，５１２，６６７；５，５１４，７８５；５，５６５，５５２；５，５６７，８１０；５，５７４，１４２；５，５８５，４８１；５，５８７，３７１；５，５９５，７２６；５，５９７，６９６；５，５９９，９２３；５，５９９，９２８および５，６８８，９４１が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そしてそのそれぞれは参考文献として本明細書中に援用される。
【００４６】
所定の化合物中のすべての位置を均一に修飾されることが必要とはされず、そして実際に、一つ以上の上述した修飾を、単一の化合物中あるいはオリゴヌクレオチド中の単一のヌクレオシドにおいても組み込むことができる。本発明には、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含まれる。本発明の文脈において、“キメラ”アンチセンス化合物または“キメラ”は、２つまたはそれ以上の化学的に特徴的な領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドであり、それぞれが少なくとも一つのモノマーユニット、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合にヌクレオチドから形成される。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも一つの領域を含有し、ここでオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに対して、増加したヌクレアーゼ分解耐性、増加した細胞取り込みおよび／または標的核酸に対する増加した結合親和性を付与するように、修飾される。オリゴヌクレオチドの追加の領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質として働くことができる。例を挙げると、ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する、細胞性のエンドヌクレアーゼである。ＲＮａｓｅ Ｈの活性化により、したがって、結果としてＲＮＡ標的の切断を引き起こし、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を非常に向上させる。結果として、キメラオリゴヌクレオチドを使用する場合に、同一の標的領域に対してハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドの場合と比較して、しばしばより短いオリゴヌクレオチドにより匹敵する結果を得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動により、そして必要な場合には当該技術分野において既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術により、日常的に検出することができる。
【００４７】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、２つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／または上述したオリゴヌクレオチド模倣体の混成の構造として形成することができる。このような化合物は、 当該技術分野においてハイブリッドまたはギャップマーとも呼ばれている。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許には、Ｕ．Ｓ．： ５，０１３，８３０；５，１４９，７９７；５，２２０，００７；５，２５６，７７５；５，３６６，８７８；５，４０３，７１１；５，４９１，１３３；５，５６５，３５０；５，６２３，０６５；５，６５２，３５５；５，６５２，３５６；および５，７００，９２２が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そしてそのそれぞれは全体として参考文献として本明細書中に援用される。
【００４８】
本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、周知の固相合成技術を介して、容易にそして日常的に作製することができる。このような合成のための装置は、たとえばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を含むいくつかの供給者により販売されている。このような合成のための当該技術分野において既知のいずれかその他の手段を、追加的にまたは代替的に使用することができる。同様な技術を使用してホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製することは周知である。
【００４９】
本発明のアンチセンス化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成され、そして生物学的起源のアンチセンス組成物またはアンチセンス分子のｉｎ ｖｉｖｏ合成を指向するように設計された遺伝子ベクター構築物を含まない。
【００５０】
本発明の化合物を、取り込み、分布および／または吸収を助けるために、たとえば、リポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所またはその他の製剤として、混合し、カプセル化し、複合体化することができ、またはそうでなければ、その他の分子、分子構造、または化合物の混合物と結合させてもよい。そのような取り込み、分布および／または吸収を助ける製剤の調製を教示する代表的な米国特許には、Ｕ．Ｓ．： ５，１０８，９２１；５，３５４，８４４；５，４１６，０１６；５，４５９，１２７；５，５２１，２９１；５，５４３，１５８；５，５４７，９３２；５，５８３，０２０；５，５９１，７２１；４，４２６，３３０；４，５３４，８９９；５，０１３，５５６；５，１０８，９２１；５，２１３，８０４；５，２２７，１７０；５，２６４，２２１；５，３５６，６３３；５，３９５，６１９；５，４１６，０１６；５，４１７，９７８；５，４６２，８５４；５，４６９，８５４；５，５１２，２９５；５，５２７，５２８；５，５３４，２５９；５，５４３，１５２；５，５５６，９４８；５，５８０，５７５；および５，５９５，７５６が含まれるが、それらには限定されず、そのそれぞれを参考文献として本明細書中に援用する。
【００５１】
本発明のアンチセンス化合物は、いずれかの医薬的に許容可能な塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物に投与する際にその生物学的に活性な代謝物または残留物を（直接的にまたは間接的に）提供することができるいずれか他の化合物を包含する。したがって、たとえば、開示から、プロドラッグおよび医薬的に許容可能な本発明の化合物の塩、そのプロドラッグの医薬的に許容可能な塩、およびその他の生物学的等価物も導き出される。
【００５２】
用語“プロドラッグ”は、内在性の酵素またはその他の化学物質および／または条件の作用により、その体内または細胞内で活性化型（すなわち、薬物）に変換される、不活性型で調製される治療剤のことを示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ版は、ＧｏｓｓｅｌｉｎらのＷＯ ９３／２４５１０（１９９３年１２月９日に発行）またはＩｍｂａｃｈらのＷＯ ９４／２６７６４およびＵ．Ｓ． ５，７７０，７１３に開示された方法に従うＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート］誘導体として調製される。
【００５３】
用語“医薬的に許容可能な塩”とは、生理学的または医薬的に許容可能な本発明の化合物の塩：すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、そしてそれについての所望しない毒性効果を与えない塩のことをいう。
【００５４】
医薬的に許容可能な塩基付加塩は、金属またはアミン、たとえばアルカリおよびアルカリ土類金属または有機アミンなどにより形成される。カチオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。適したアミンの例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、およびプロカイン（たとえば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．， “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，” Ｊ． ｏｆ Ｐｈａｒｍａ Ｓｃｉ．， １９７７， ６６， １−１９を参照）である。前記酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸型を十分な量の所望の塩基と接触させて、共有結合様式で塩を生成することにより、調製する。遊離酸型は、塩型を酸と接触させることにより、そして遊離酸を従来の様式で単離することにより、再生することができる。遊離酸型は、そのそれぞれの塩型とは、極性溶媒中への溶解性などの特定の生理学的特性においていくらか異なっているが、しかしそれ以外は、本発明の目的のためには、塩はそれらそれぞれの遊離酸と等価である。本明細書中で使用される場合、“医薬的な付加塩”には、本発明の組成物の構成要素の一つの酸型の医薬的に許容可能な塩が含まれる。これらには、アミンの有機酸塩または無機酸塩が含まれる。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩である。その他の適した医薬的に許容可能な塩は、当業者に周知であり、そして様々な無機酸および有機酸の塩基性塩が含まれ、たとえば、無機酸を有するものとしては、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸など；有機酸を有するものとしてはカルボン酸、スルホン酸、スルホ酸またはリン酸またはＮ−置換スルファミン酸、たとえば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボン酸（ｅｍｂｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ニコチン酸またはイソニコチン酸；そしてアミノ酸を有するものとしては、本来はタンパク質の合成に関連する２０個のα−アミノ酸、たとえばグルタミン酸、またはアスパラギン酸など、そしてまた、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２−または３−ホスホグリセリン酸、グルコース−６−ホスフェート、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成を伴う）を有するもの、またはその他の酸有機化合物、たとえば、アスコルビン酸などを有するものが含まれる。化合物の医薬的に許容可能な塩もまた、医薬的に許容可能なカチオンにより調製することができる。適した医薬的に許容可能なカチオンは、当業者に周知であり、そしてアルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび第四アンモニウムカチオンが含まれる。炭酸塩または炭酸水素塩もまた可能である。
【００５５】
オリゴヌクレオチドについて、医薬的に許容可能な塩の好ましい例には、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミンなどのカチオンにより形成される塩；（ｂ）無機酸、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などにより形成される酸付加塩；（ｃ）有機酸、たとえば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などにより形成される塩；そして（ｄ）塩素、臭素、およびヨウ素などの元素アニオンから形成される塩；が含まれるが、これらには限定されない。
【００５６】
本発明のアンチセンス化合物は、診断薬、治療薬、予防薬、そして研究用試薬およびキットとして使用することができる。治療薬として、ＦＬＩＰ−Ｃの発現をモジュレートすることにより治療することができる疾患または症状を有することが疑われる動物、好ましくはヒトを、本発明に従うアンチセンス化合物を投与することにより治療する。本発明の化合物を、有効量のアンチセンス化合物を適した医薬的に許容可能な希釈剤または担体に添加することにより、医薬組成物中で利用することができる。本発明のアンチセンス化合物および方法の使用はまた、予防的、たとえば、感染、炎症または腫瘍形成を予防しまたは遅延させるためにも有用である場合がある。
【００５７】
これらの化合物がＦＬＩＰ−Ｃをコードする核酸に対してハイブリダイズし、この事実を探求するためにサンドイッチアッセイおよびその他のアッセイを容易に構築することができるため、本発明のアンチセンス化合物は、研究用としてそして診断薬として有用である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのＦＬＩＰ−Ｃをコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、当該技術分野において既知の手段により検出することができる。このような手段には、オリゴヌクレオチドに対する酵素の複合化、オリゴヌクレオチドの放射標識またはいずれかその他の適した検出手段を含むことができる。サンプル中のＦＬＩＰ−Ｃのレベルを検出するためのこの様な検出手段を使用するキットもまた、調製することができる。
【００５８】
本発明にはまた、本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤が含まれる。本発明の医薬組成物は、局所治療または全身治療が所望されるかどうか、そして治療すべき領域に依存して、多数の方法により投与することができる。投与は、局所（眼を含み、および膣および直腸送達を含む粘膜に対するものを含む）、肺、たとえば、ネブライザーによるものを含む、粉末またはエアロゾルの吸入または吹き込みによるもの；気管内、鼻内、表皮、および経皮）、経口または非経口により行うことができる。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内の注射または注入；または頭蓋内、たとえば、くも膜下投与または脳室内投与が含まれる。少なくとも一つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与のために特に有用であると考えられている。
【００５９】
局所投与のための医薬組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤、および粉剤が含まれうる。従来からの医薬的な担体、液体、粉末または油状基材、増粘剤などは、必要とされるかまたは所望される場合がある。コートしたコンドーム、手袋などもまた有用である。好ましい局所製剤には、本発明のオリゴヌクレオチドが脂質類、リポソーム類、脂肪酸類、脂肪酸エステル類、ステロイド類、キレート剤、および界面活性剤などの局所送達剤と組み合わされているものが含まれる。好ましい脂質類およびリポソーム類には、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＰＥ、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドは、リポソーム類、特にカチオン性リポソーム類、中にカプセル化されるか、またはそれと複合体形成され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、脂質類、特にカチオン性脂質類に対して複合体形成されうる。好ましい脂肪酸類およびエステル類には、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１−１０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリスチン酸（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍｙｒｉｓｔａｔｅ；ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、または医薬的に許容可能なそれらの塩が含まれるが、これらのものには限定されない。局所製剤は、１９９９年５月２０日に出願し、その全体を本明細書中に参考文献として援用する米国特許出願０９／３１５，２９８中に詳細に記載される。
【００６０】
経口投与のための組成物および製剤には、粉末または顆粒、ミクロ粒子、ナノ粒子、水中または非水性媒体中懸濁剤または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サシェ類、錠剤、またはミニ錠剤などが含まれる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が好ましい場合がある。好ましい経口製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドを１またはそれより多い浸透亢進剤、界面活性剤およびキレート剤と組み合わせて投与するものである。好ましい界面活性剤には、脂肪酸類および／またはそのエステル類または塩類、胆汁酸類および／またはその塩類が含まれる。好ましい胆汁酸類／塩類には、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシデートナトリウム、グリコジヒドロフシデートナトリウムが含まれる。好ましい脂肪酸類には、アラキドン酸、ウンデカン酸（ｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、または医薬的に許容可能なそれらの塩（例えば、ナトリウム）が含まれる。胆汁酸類／塩類と組み合わせた浸透亢進剤、例えば脂肪酸類／塩類の組み合わせもまた好ましい。特に好ましい組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらに、浸透亢進剤には、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドは、スプレー乾燥化粒子を含む顆粒形態で経口的に送達されても、または複合体形成されてミクロ粒子またはナノ粒子を形成してもよい。オリゴヌクレオチド複合体化剤には、ポリ−アミノ酸；ポリイミン類；ポリアクリレート類；ポリアルキルアクリレート類、ポリオキシエタン類、ポリアルキルシアノアクリレート類；カチオン化ゼラチン類、アルブミン類、スターチ類、アクリレート類、ポリエチレングリコール類（ＰＥＧ）およびスターチ類；ポリアルキルシアノアクリレート類；ＤＥＡＥ−誘導体化ポリイミン類、ポルラン類（ｐｏｌｌｕｌａｎｓ）、セルロース類、およびスターチ類が含まれる。特に好ましい複合体化剤には、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン類、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノ−メチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えばｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＤＬ−ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ；ＰＬＧＡ）、アルギナート、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。オリゴヌクレオチドおよびそれらの調製物のための経口製剤は、米国出願０８／８８６，８２９（１９９７年７月１日に出願）、０９／１０８，６７３（１９９８年７月１日に出願）， ０９／２５６，５１５（１９９９年２月２３日に出願）、０９／０８２，６２４（１９９８年５月２１日に出願）および０９／３１５，２９８（１９９９年５月２０日に出願）中に詳細に記載され、それらの全体を参考文献として本明細書中に参考文献として援用する。
【００６１】
非経口投与、くも膜下投与または脳室内投与のための組成物および製剤には、バッファー、希釈剤およびその他の適した添加物、たとえば浸透亢進剤、担体化合物、およびその他の医薬的に許容可能な担体または賦形剤もまた含有しうる、滅菌水溶液が含まれうる。
【００６２】
本発明の医薬組成物には、溶液、エマルジョン、およびリポソーム含有製剤が含まれるが、これらには限定されない。これらの組成物は、既成液体、自己乳化性固体そして自己乳化性半固体が含まれる、様々な構成要素から生成することができるが、これらには限定されない。
【００６３】
単位用量剤形中に容易に提供ことができる本発明の医薬製剤は、医薬業界において周知の従来技術にしたがって調製することができる。このような技術には、活性有効成分と１または複数の医薬的担体または１または複数の医薬的賦形剤とを組み合わせる工程が含まれる。一般的には、均質にそして緊密に、活性有効成分と液体担体または正確に分割した固体担体またはその両方と組み合わせ、その後必要とされる場合には生成物を成型することにより、製剤を調製する。
【００６４】
本発明の組成物は、たとえば錠剤、カプセル、ゲルカプセル類、液体シロップ、軟ゲル、坐剤、および浣腸剤などの、しかしこれらには限定されない、多くの可能性のある用量剤形のいずれか中に製剤化することができる。本発明の組成物はまた、水性媒体、非水性媒体または混合媒体中の懸濁剤として製剤化することもできる。水性懸濁剤はさらに、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む懸濁剤の粘度を上昇させる物質を含有してもよい。懸濁剤はまた、安定化剤を含有していてもよい。
【００６５】
本発明の一態様において、医薬組成物を製剤化し、そして泡状物として使用することができる。医薬的な泡状物には、エマルジョン、マイクロエマルジョン、クリーム剤、ジェリー剤、およびリポソーム剤などの製剤を含むが、これらのものには限定されない。その性質において基本的に同様である一方、これらの製剤は、最終生成物の構成要素および密度において変化する。このような組成物および製剤の調製は、一般的に医薬および製剤の分野における当業者に知られており、そして本発明の組成物の製剤に対して適用することができる。
【００６６】
エマルジョン
本発明の組成物は、エマルジョンとして調製しそして製剤化することができる。エマルジョンは、通常は直径０．１μｍを超える液滴の形状で、一つの液体を別の液体中に分散させた典型的には不均質の系である（Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９；Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， Ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐ． ３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９８５， ｐ． ３０１）。エマルジョンは、しばしば、互いに十分に混合され分散された２種の不混和性の液体相を含む二相システムである。一般的には、エマルジョンは、油中水型の種（ｗ／ｏ）または水中油型の種（ｏ／ｗ）のいずれかでありうる。液体相がバルクな油相中によく分離され微小滴として分散されている場合、得られた組成物を油中水型（ｗ／ｏ）エマルジョンと呼ぶ。あるいは、油相がバルクな液体相中によく分離され微小滴として分散されている場合、得られた組成物を水中油型（ｏ／ｗ）エマルジョンと呼ぶ。エマルジョンは、分散相と、液体相、油相のいずれか中に溶液としてあるいは別々の相としてそれ自体として存在していてもよい活性な薬物と、に加えて、さらに要素を包含していてもよい。乳化剤、安定化剤、色素、および抗酸化剤などの医薬的な賦形剤が、必要に応じてエマルジョン中に存在していてもよい。医薬的なエマルジョンは、たとえば、油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンの場合のような、２種以上の相を含む、マルチエマルジョンであってもよい。このような複合製剤は、しばしば、単なる２成分のエマルジョンでは得られない、特定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルジョンの個々の油滴が小さな水滴を含むマルチエマルジョンは、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを構成する。同様に、油性の連続相中に安定化された水の小球中に含まれる油滴のシステムは、ｏ／ｗ／ｏエマルジョンを提供する。
【００６７】
エマルジョンは、熱力学的安定性をほとんど有さないかまたはまったく有さないことにより特徴付けられる。しばしば、エマルジョンの分散相または不連続相が、外部相または連続相中に十分に分散され、そして乳化剤の手段または製剤の粘性を介してこの形態に維持される。エマルジョンの相のいずれかは、エマルジョン−型軟膏基材およびクリームの場合の様に、半固体または個体であってもよい。エマルジョンを安定化するその他の手段には、エマルジョンのいずれかの相中に含まれてもよい、乳化剤を使用することが含まれる。乳化剤は、大きく４つのカテゴリーに分類される場合がある：合成サーファクタント、天然に存在する乳化剤、吸着基材、そして精密に分散された固体、である（Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。
【００６８】
合成サーファクタントは、界面活性剤としても知られているが、エマルジョンの製剤化において幅広い有用性が見出されており、そして文献においてもレビューされている（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２８５； Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８８， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。サーファクタントは、典型的には、両親媒性であり、そして親水性部分と疎水性部分とを含む。サーファクタントの疎水性の性質に対する親水性の性質の比率は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と呼ばれ、そして製剤の調製においてサーファクタントを分類しそして選択する際の貴重なツールである。サーファクタントは、親水性基の性質に基づいて別のクラスに分類される場合がある：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．，　ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２８５）。
【００６９】
エマルジョン製剤中で使用される天然に存在する乳化剤には、ラノリン、密ロウ、ホスファチド類、レシチンおよびアカシアが含まれる。吸着基材は、水を吸収して、ｗ／ｏエマルジョンを形成するが、それでもそれらの半固体の硬さを維持するような、親水性特性を有し、たとえば無水ラノリンおよび親水性ワセリンがある。精密に分散された固体もまた、よい乳化剤として、特にサーファクタントと組み合わせて、そして粘着性の調製物中で使用された。これらには、重金属水酸化物；ベントナイト、アタパルガイト、ヘクトライト（ｈｅｃｔｏｒｉｔｅ）、カオリン、モンモリロン石、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなどの非膨張性クレー；色素；および炭素またはトリステアリン酸グリセリンなどの非極性固体；などの極性の無機固体が含まれる。
【００７０】
非常に様々な非−乳化性物質もまた、エマルジョン製剤中に含まれ、そしてエマルジョンの特性に寄与する。これらには、脂質、油、ロウ、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、保水剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔｓ）、親水性コロイド、保存剤および抗酸化剤が含まれる（Ｂｌｏｃｋ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．，　ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ３３５；Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。
【００７１】
親水性コロイドまたは親水コロイドには、多糖類（たとえば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラギーナン、グアルガム（ｇｕａｒ ｇｕｍ）、インドゴム（ｋａｒａｙａ ｇｕｍ）、そしてトラガカント）、セルロース誘導体（たとえば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、そして合成ポリマー（たとえば、カルボマー（ｃａｒｂｏｍｅｒｓ）、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）などの、天然に存在するガムおよび合成のポリマーが含まれる。これらは、水中で分散しあるいは膨張して、強力な界面フィルムを分散相の滴の周囲に形成し、そして外部相の粘性を増大させることにより、エマルジョンを安定化させるコロイド溶液を形成する。
【００７２】
エマルジョンはしばしば、微生物の増殖をすぐにサポートすることができる、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびホスファチドなどの多数の活性物質を含有するため、これらの製剤はしばしば保存剤を含む。エマルジョン製剤中に含まれる一般的に使用される保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第４アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、そしてホウ酸が含まれる。抗酸化剤もまた、一般的にエマルジョン製剤に添加して、製剤の変質を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル（ａｌｋｙｌ ｇａｌｌａｔｅｓ）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤などのフリーラジカルスカベンジャー、およびクエン酸、酒石酸、およびレシチンなどの抗酸化剤シナージストであってもよい。
【００７３】
外皮経路、経口経路、および非経口経路を介するエマルジョン製剤の使用およびそれらの製造のための方法は、文献中でレビューされてきた（Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。経口送達のためのエマルジョン製剤は、製剤化が容易であり吸収および生物学的適合性の観点から効率的であるため、非常に幅広く使用されてきた（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５；Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。ミネラル油−ベースの緩下剤、油溶性ビタミンおよび高脂肪栄養調製物は、一般的に、ｏ／ｗエマルジョンとして経口的に投与される物質に含まれる。
【００７４】
本発明の一態様において、オリゴヌクレオチドと核酸の組成物は、マイクロエマルジョンとして製剤化される。マイクロエマルジョンは、水、油および単一の、光学的に等方性な、そして熱力学的に安定な液体溶液である両親媒性物質、のシステムとして定義されうる（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．，　ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５）。典型的には、マイクロエマルジョンは、まず油を水溶性サーファクタント溶液中に分散させ、そしてついで一般的には中間鎖長アルコールである十分量の第４の構成要素を添加して、透明なシステムを形成することにより、調製されるシステムである。したがって、マイクロエマルジョンは、界面活性分子の界面フィルムにより安定化される２種の不混和性の液体の、熱力学的に安定で、等方性な、透明の分散物質としても記載された（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ， ｉｎ： Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ： Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｒｏｓｏｆｆ， Ｍ．， Ｅｄ．， １９８９， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐａｇｅｓ １８５−２１５）。マイクロエマルジョンは、一般的には、油、水、サーファクタント、コサーファクタントおよび電解質を含む、３〜５種の構成要素を組み合わせることにより調製される。マイクロエマルジョンが油中水型（ｗ／ｏ）であるかあるいは水中油型（ｏ／ｗ）であるかは、使用される油およびサーファクタントの特性に依存し、そしてサーファクタント分子の構造のその極性頭部と炭化水素尾部の幾何学的な畳み込みに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ， ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９８５， ｐ． ２７１）。
【００７５】
相ダイアグラムを使用した現象学的アプローチが広く研究され、そしてマイクロエマルジョンを製剤化するための方法についての、当業者に対する、包括的な知識が得られた（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５；Ｂｌｏｃｋ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ３３５）。従来のエマルジョンと比較して、マイクロエマルジョンは、自発的に形成される熱力学的に安定な小滴の製剤において、水−不溶性薬物を可溶化するという利点を提供する。
【００７６】
マイクロエマルジョンの調製に使用されるサーファクタントには、イオン性サーファクタント、非−イオン性サーファクタント、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセクイオレエート（ｓｅｑｕｉ ｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）、が、単独であるいはコサーファクタントと組み合わせて含まれるが、これらには限定されない。コサーファクタントは、通常はエタノール、１−プロパノール、および１−ブタノールなどの短鎖アルコールであるが、サーファクタントフィルム中に浸透し、そして結果的にはサーファクタント分子のあいだで生成される空隙スペースのために不規則なフィルムを作製することにより、界面流動度を増大させるために働く。しかしながら、マイクロエマルジョンは、コサーファクタントを使用することなく調製することができ、そしてアルコールフリーの自己乳化マイクロエマルジョンシステムが当該技術分野において知られている。水相は、典型的には、水、薬物の水性溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコールおよびエチレングリコールの誘導体であってもよいが、これらのものには限定されない。油相には、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中間鎖（Ｃ８−Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリ糖化（ｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）グリセリド、飽和ポリ糖化（ｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）Ｃ８−Ｃ１０グリセリド、植物油およびシリコーン油などの物質が含まれうるが、これらのものには限定されない。
【００７７】
マイクロエマルジョンは、薬物溶解性および薬物の吸収亢進の観点から、特に興味深いものである。脂質ベースのマイクロエマルジョン（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方）は、ペプチドを含む薬物の経口生物学的適合性を亢進させると提唱された（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９４， １１， １３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ， Ｍｅｔｈ． Ｆｉｎｄ． Ｅｘｐ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９９３， １３， ２０５）。マイクロエマルジョンは、薬物溶解性の向上、酵素的加水分解からの薬物の保護、膜流動度および膜透過性におけるサーファクタント−誘導性変化による薬物吸収の亢進の可能性、調製の容易性、固体用量剤形を超える経口投与の容易性、臨床的可能性の向上、および毒性の低減といった利点を提供する（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９４， １１， １３８５；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， １９９６， ８５， １３８−１４３）。それらの構成要素を周囲温度において一緒にしておくと、しばしば、マイクロエマルジョンが自発的に形成される場合がある。このことは、易熱性（熱不安定性）薬物、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドを製剤化する際に、特に利点でありうる。マイクロエマルジョンは、美容用途および医薬用との両方において、活性構成要素の経皮的送達においても有効であった。本発明のマイクロエマルジョン組成物および製剤は、胃腸管からのオリゴヌクレオチドおよび核酸の全身性吸収の増加を促進し、および胃腸管、膣、口腔（ｂｕｃｃａｌ ｃａｖｉｔｙ）およびその他の投与領域中で、オリゴヌクレオチドおよび核酸の局所的細胞取り込みを向上させることができる。
【００７８】
本発明のマイクロエマルジョンはまた、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、ラブラゾル（Ｌａｂｒａｓｏｌ）、および浸透亢進剤などの追加の構成要素および添加剤を含有して、製剤の特性を向上させ、そして本発明のオリゴヌクレオチドおよび核酸の吸収を亢進させることもできる。本発明のマイクロエマルジョン中で使用される浸透亢進剤は、５つの幅広いカテゴリーのうちの一つに属するものとして分類することができる：サーファクタント、脂肪酸、胆汁酸、キレート剤、および非−キレート非−サーファクタント（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ． ９２）。これらのクラスのそれぞれは、上述した。
【００７９】
リポソーム
マイクロエマルジョン以外に、薬物の製剤化のために研究されそして使用された、多くの有機（ｏｒｇａｎｉｚｅｄ）サーファクタント構造が存在する。これらには、単層、ミセル、二重層および小胞が含まれる。小胞、たとえばリポソーム、は、薬物送達の観点からそれらが提供する、その特異性および作用期間により、大きな興味をひきつけた。本明細書中で使用される場合、“リポソーム”という用語は、球状の１または複数の二重層中に配置された、両親媒性脂質からなる小胞を意味する。
【００８０】
リポソームは、親油性物質から形成される膜および水性の内部を有する、単一ラメラ小胞またはマルチラメラ小胞である。水性部分には、送達すべき組成物が含有される。カチオン性リポソームは、細胞壁と融合することができるという利点を有する。非−カチオン性リポソームは、細胞壁とは効率的に融合することができないものの、マクロファージによりｉｎ ｖｉｖｏにおいて取り込まれる。
【００８１】
無傷のほ乳動物皮膚を通過するために、脂質小胞は、適切な経皮的勾配の影響のもと、それぞれが直径５０ ｎｍ未満であるような一連の微細な孔を通過しなければならない。したがって、高度に変形しやすくそしてそのような微細な孔を通過することができるリポソームを使用することが好ましい。
【００８２】
リポソームのさらなる利点には、以下のものが含まれる；天然のリン脂質から得られたリポソームは、生物学的適合性であり、そして生体分解性なものである；リポソームは、幅広い水溶性薬物および脂質可溶性薬物を含むことができる；リポソームは、その内部コンパートメント中のカプセル化した薬物を代謝および分解から保護することができる（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．，　ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５）。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要事項は、脂質表面荷電、小胞サイズ、そしてリポソームの水容積である。
【００８３】
リポソームは、活性成分を作用部位に移送および送達するために有用である。リポソーム膜は、構造的に生体膜と類似しているため、リポソームを組織に使用する場合には、リポソームを細胞膜に溶け込ませるようにはじめる。リポソームと細胞の溶融が進行するにつれて、リポソーム内容物は、活性剤が作用することができる細胞中へ移る。
【００８４】
リポソーム製剤は、多くの薬物についての送達様式として、幅広い研究の焦点である。局所投与のために、リポソームは、他の製剤を超えるいくつかの利点を提供するという証拠がますます多くなっている。このような利点には、投与された薬物の高い全身性吸収に関連した副作用の減少、所望される標的での投与された薬物の蓄積の増加、そして親水性および疎水性の両方の様々な薬物を皮膚中に投与する能力、が含まれる。
【００８５】
いくつかの報告は、リポソームが高分子量ＤＮＡを含む薬剤を皮膚中に送達する能力について詳細に説明した。鎮痛剤、抗体、ホルモンおよび高分子量ＤＮＡを含む化合物を、皮膚に投与した。投与の多くは、結果として外皮の上部を標的とした。
【００８６】
リポソームは、２つの幅広いクラスに分けられる。カチオン性リポソームは、マイナス（−）に荷電したＤＮＡ分子と相互作用して、安定な複合体を形成する、プラス（＋）に荷電したリポソームである。プラスに荷電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、マイナスに荷電した細胞表面に結合し、そしてエンドソーム中に内部化される。エンドソーム中の酸性ｐＨにより、リポソームは破裂し、その内容物を細胞質中に放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １９８７， １４７， ９８０−９８５）。
【００８７】
ｐＨ−感受性あるいはマイナスに荷電したリポソームは、ＤＮＡと複合体を形成するというよりは、ＤＮＡを捕捉する。ＤＮＡおよび脂質の両方が同様に荷電するため、複合体の形成ではなく反発（ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ）が生じる。それにもかかわらず、いくつかのＤＮＡは、これらのリポソームの水性内部中に捕捉される。ｐＨ−感受性リポソームを使用して、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養中の細胞単層に送達させた。外来性遺伝子の発現が、標的細胞中で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， １９９２， １９， ２６９−２７４）。
【００８８】
リポソーム組成物の１つの主要な型には、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。天然のリポソーム組成物は、たとえば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、一般的に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、一方でアニオン性フソジェニックな（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）リポソームは、主として、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。リポソーム組成物の別の型は、たとえば、ダイズホスファチジルコリン（ＰＣ）、およびタマゴＰＣなどのＰＣから形成される。別の型は、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【００８９】
いくつかの研究では、皮膚へのリポソーム薬剤製剤の局所投与が評価された。インターフェロンを含有するリポソームをモルモット皮膚に対して使用すると、結果として皮膚のヘルペス潰瘍が減少したが、その他の手段（たとえば溶液またはエマルジョン）を介してインターフェロンの送達をしても有効ではなかった（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， １９９２， ２， ４０５−４１０）。さらに、別の研究は、水性システムを用いたインターフェロンの投与に対する、リポソーム製剤の一部として投与したインターフェロンの効率を試験し、そしてリポソーム製剤は水性投与よりも優れていると結論付けた（ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９２， １８， ２５９−２６５）．
薬物の皮膚への送達におけるその有用性を決定するために、非−イオン性リポソームシステム、特に、非−イオン性サーファクタントおよびコレステロールを含むシステムを調べた。ＮｏｖａｓｏｍｅＴＭ Ｉ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅＴＭ ＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非−イオン性リポソーム製剤を使用して、シクロスポリン−Ａをマウス皮膚の真皮中に送達した。結果から、このような非−イオン性リポソームシステムは、シクロスポリン−Ａが皮膚の別の層中に沈着することを促進する際に効果的であることが示された（Ｈｕ ｅｔ ａｌ． Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ． Ｓｃｉ．， １９９４， ４， ６， ４６６）。
【００９０】
リポソームには、“立体化学的に安定な”リポソームも含まれるが、この用語は本明細書中で使用される場合、１またはそれ以上の特殊な（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）脂質であって、リポソーム中に取り込まれた場合、そのような特殊な脂質を含まないリポソームと比較して、循環血中での寿命が長くなる脂質、を含むリポソームのことをいう。立体化学的に安定なリポソームの例は、リポソームの小胞−形成性脂質部分の一部分が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１またはそれ以上の糖脂質を含むか、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１またはそれ以上の親水性ポリマーにより誘導体化されている、ものがある。いずれかの具体的な理論に縛られることを望むわけではないが、当該技術分野においては、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ−誘導体化脂質を含有する少なくとも立体化学的に安定なリポソームについて、これらの立体化学的に安定なリポソームの循環系での半減期が増加しているのは、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞中への取り込みが減少したことに由来すると考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９８７， ２２３， ４２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９３， ５３， ３７６５）。１またはそれ以上の糖脂質を含む様々なリポソームが、当該技術分野において既知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９８７，　５０７， ６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシドおよびホスファチジルイノシトールがリポソームの血中半減期を向上させる能力を報告した。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９８８， ８５， ６９４９）により述べられた。米国特許Ｎｏ． ４，８３７，０２８およびＷＯ ８８／０４９２４は、両方ともＡｌｌｅｎらによるものであるが、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシドＧＭ１または硫酸ガラクトセレブロシドエステル、を含むリポソームを開示する。米国特許Ｎｏ． ５，５４３，１５２（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、ＷＯ ９７／１３４９９（Ｌｉｍら）中に開示されている。
【００９１】
１またはそれ以上の親水性ポリマーにより誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその製造方法は、当該技術分野において既知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｊｐｎ．， １９８０， ５３， ２７７８）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン性界面活性剤、２Ｃ１２１５Ｇ、を含むリポソームを記載した。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９８４， １６７， ７９）は、ポリスチレン粒子のポリマーグリコールによる親水性コーティングが、血中半減期の顕著な増加を引き起こすことに注目した。ポリアルキレングリコール（たとえば、ＰＥＧ）のカルボン酸（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ）基の結合により修飾された合成リン脂質は、Ｓｅａｒｓにより記載されている（米国特許Ｎｏｓ． ４，４２６，３３０および４，５３４，８９９）。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９０， ２６８， ２３５）は、ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＥＧにより誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームは、血液循環中での半減期が顕著に増加することを示す実験を記載した。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １９９０， １０２９， ９１）は、そのような知見をその他のＰＥＧ−誘導体化リン脂質、たとえば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）およびＰＥＧの組み合わせから形成されるＤＳＰＥ−ＰＥＧ、に拡張した。共有結合したＰＥＧ部分をその外側表面に有するリポソームは、Ｆｉｓｈｅｒに対する欧州特許Ｎｏ． ＥＰ ０ ４４５ １３１ Ｂ１およびＷＯ ９０／０４３８４中に記載される。ＰＥＧにより誘導体化された１〜２０モル％のＰＥを含有するリポソーム組成物、およびその使用方法は、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許Ｎｏｓ． ５，０１３，５５６および５，３５６，６３３）およびＭａｒｔｉｎら（米国特許Ｎｏ． ５，２１３，８０４および欧州特許Ｎｏ． ＥＰ ０ ４９６ ８１３ Ｂ１）により記載される。多数のその他の脂質−ポリマー複合体を含むリポソームは、ＷＯ ９１／０５５４５および米国特許Ｎｏ． ５，２２５，２１２（両方ともＭａｒｔｉｎら）およびＷＯ ９４／２００７３（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）において記載される。ＰＥＧ−修飾セラミド脂質を含むリポソームは、ＷＯ ９６／１０３９１（Ｃｈｏｉら）に記載される。米国特許Ｎｏｓ． ５，５４０，９３５（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および５，５５６，９４８（Ｔａｇａｗａら）は、その表面に対して官能基部分をさらに誘導体化することができる、ＰＥＧ−含有リポソームを記載する。
【００９２】
核酸を含む限定的な数のリポソームが当該技術分野において既知である。Ｔｈｉｅｒｒｙらに対するＷＯ ９６／４００６２は、高分子量の核酸をリポソーム中にカプセル化するための方法を開示する。Ｔａｇａｗａらに対する米国特許Ｎｏ． ５，２６４，２２１は、タンパク質−結合リポソームを開示し、そしてそのようなリポソームの内容物にはアンチセンスＲＮＡが含まれうることを明らかにしている。Ｒａｈｍａｎらに対する米国特許Ｎｏ． ５，６６５，７１０は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム中にカプセル化する特定の方法を記載する。Ｌｏｖｅらに対するＷＯ ９７／０４７８７は、ｒａｆ遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソームを開示する。
【００９３】
トランスファーソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）は、リポソームのさらに別の型であり、そして非常に変形可能な脂質集合物であり、薬物送達ビヒクルの魅力的な候補物である。トランスファーソームは、非常に変形可能であるため、小滴よりも小さな孔を介して容易に浸透することができる、脂質小滴として記載することができる。トランスファーソームは、それらを使用する環境に適応することができ、たとえばそれらは、自己−最適性（皮膚の孔の形状に適応する）であり、自己−修復性であり、しばしば断片化されることなくそれらの標的に到達し、そしてしばしば自己−負荷性（ｓｅｌｆ−ｌｏａｄｉｎｇ）である。トランスファーソームを作製するため、標準的なリポソーム組成物に対して、表面強力アクチベーター（ｅｄｇｅ−ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ）、通常はサーファクタント、を添加することができる。トランスファーソームを使用して、皮膚に対して血清アルブミンを送達した。血清アルブミンのトランスファーソーム−媒介性送達は、血清アルブミンを含有する溶液を皮下に注入する方法と同様に効率的であることが示された。
【００９４】
サーファクタントは、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）およびリポソームなどの製剤において、幅広い用途が見いだされる。多くの様々なタイプのサーファクタントの特性を、天然のサーファクタントおよび合成のサーファクタントの両方ともについて分類しそしてランク付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（“ヘッド”としても知られる）の性質は、製剤に使用する様々なサーファクタントをカテゴリー化に対して最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９８８， ｐ． ２８５）。
【００９５】
サーファクタント分子がイオン化されていない場合、非イオン性サーファクタントとして分類される。非イオン性サーファクタントは、医薬生成物および化粧用生成物において幅広い用途を見いだされ、そして幅広いｐＨ値にわたって使用することができる。一般的には、それらのＨＬＢ値は、その構造に依存して、２〜約１８の範囲にわたる。非イオン性サーファクタントには、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、そしてエトキシ化（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ）エステルなどの非イオン性エステルが含まれる。脂肪アルコールエトキシ化物（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｓ）、プロポキシ化（ｐｒｏｐｏｘｙｌａｔｅｄ）アルコール、およびエトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレンサーファクタントは、非イオン性サーファクタントのクラスの最も一般的な構成物質である。
【００９６】
サーファクタント分子が、水中に溶解しまたは分散させる場合に負（−）の荷電を有する場合、サーファクタントはアニオン性と分類される。アニオン性サーファクタントには、石けんなどのカルボン酸エステル、アシルラクチレート（ｌａｃｔｙｌａｔｅｓ）、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸塩およびエトキシ化アルキル硫酸塩などの硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホン酸エステル、アシルイセチオネート（ｉｓｅｔｈｉｏｎａｔｅｓ）、アシルタウレート（ｔａｕｒａｔｅｓ）およびスルホコハク酸塩などのスルホン酸エステル、およびホスフェートが含まれる。アニオン性サーファクタントのクラスの最も重要な構成物質は、アルキル硫酸塩および石けんである。
【００９７】
サーファクタント分子が、水中に溶解されまたは分散される場合に正（＋）の荷電を有する場合、サーファクタントはカチオン性と分類される。カチオン性サーファクタントには、第四アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが含まれる。第四アンモニウム塩は、このクラスの最も使用される構成物質である。
【００９８】
サーファクタント分子が正（＋）の荷電または負（−）の荷電のいずれをも有する能力を有する場合、サーファクタントは両性として分類される。両性サーファクタントには、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド類、Ｎ−アルキルベタイン類およびホスファチド類が含まれる。
【００９９】
薬剤生成物、製剤およびエマルジョン中でのサーファクタントの使用は、以下にレビューされている（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９８８， ｐ． ２８５）。
【０１００】
浸透亢進剤
一態様において、本発明は、様々な浸透亢進剤を使用して、核酸、特にオリゴヌクレオチドの、動物の皮膚に対する効率的な送達を達成する。ほとんどの薬剤は、イオン化型および非イオン化型の両方において溶液中に存在する。しかしながら、通常は、脂質可溶性あるいは親油性薬物のみが容易に細胞膜を通過する。非−親油性薬物でさえも、通過すべき膜を浸透亢進剤により処理される場合には、細胞膜を通過することができることを見出した。非−親油性薬物の細胞膜を通じた拡散を補助することに加えて、浸透亢進剤はまた、親油性薬物の透過性も向上させる。
【０１０１】
浸透亢進剤は、５つの幅広いカテゴリー、すなわち、サーファクタント、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、そして非−キレート非−サーファクタント、の一つに属するものとして分類することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ．９２）。浸透亢進剤の上述したクラスのそれぞれは、以下にさらに詳細に記載される。
【０１０２】
サーファクタント：本発明に関連して、サーファクタント（あるいは“表面−活性剤”）は、水溶液中に溶解した場合に、溶液の表面張力または水溶液と別の液体とのあいだの界面張力を減少する化学的単位であり、粘膜を介するオリゴヌクレオチドの吸収が亢進されるという結果を伴う。胆汁酸塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透亢進剤には、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ．９２）；およびＦＣ−４３などのパーフルオロ化学物質エマルジョン（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９８８， ４０， ２５２）が含まれる。
【０１０３】
脂肪酸：浸透亢進剤として機能する様々な脂肪酸およびその誘導体には、たとえば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１−１０アルキルエステル（たとえば、メチル、イソプロピルおよびｔ−ブチル）、およびそれらのモノ−およびジ−グリセリド（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が含まれる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １−３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９９２， ４４， ６５１−６５４）。
【０１０４】
胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割には、脂質および脂肪可溶性ビタミンの分散および吸収を促進することが含まれる（Ｂｒｕｎｔｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ： Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ９ｔｈ Ｅｄ．， Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ．， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９６， ｐｐ． ９３４−９３５）。様々な天然の胆汁酸塩、およびその合成誘導体は、浸透亢進剤として機能する。このように、用語“胆汁酸塩”には、胆汁の天然に存在する構成成分のいずれかだけでなく、それらの合成誘導体のいずれかが含まれる。本発明の胆汁酸塩には、たとえば、コール酸（あるいはその医薬的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルココール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（グルココール酸（ｇｌｕｃｈｏｌａｔｅ）ナトリウム）、グリココール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が含まれる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ， Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ： Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９９０， ｐａｇｅｓ ７８２−７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １９９２， ２６３， ２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， １９９０， ７９， ５７９−５８３）。
【０１０５】
キレート剤：本発明と関連して使用される場合、キレート剤は、それとともに複合体を形成することにより、金属イオンを溶液から取り除く化合物として定義することができ、粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収を向上させるという結果を伴う。本発明における浸透亢進剤としてのその使用に関して、キレート剤は、最も特性決定されたＤＮＡヌクレアーゼがその触媒のために二価の金属イオンを必要としそしてしたがってキレート剤により阻害されることから、ＤＮａｓｅ阻害剤としても機能するという追加の利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．， １９９３， ６１８， ３１５−３３９）。本発明のキレート剤には、エチレンジアミンテトラ酢酸ジナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（たとえば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸塩およびホモバニリン酸塩）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９およびβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が含まれるが、これらには限定されない（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐａｇｅ ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １−３３；Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．， １９９０， １４， ４３−５１）。
【０１０６】
非−キレート非−サーファクタント：本明細書中で使用する場合、非−キレート非−サーファクタント浸透亢進性化合物は、キレート剤としてあるいはサーファクタントとしてわずかな活性しか示さないが、それにもかかわらず栄養粘膜を介してオリゴヌクレオチドの吸収を亢進する、化合物として定義することができる（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １−３３）。浸透亢進剤のこのクラスには、たとえば、不飽和環状ウレア、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐａｇｅ ９２）；およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非−ステロイド性抗炎症性薬剤（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９８７， ３９， ６２１−６２６）が含まれる。
【０１０７】
細胞レベルでオリゴヌクレオチドの取り込みを亢進する薬剤を、本発明の医薬組成物およびその他の組成物に添加することもできる。たとえば、リポフェクチンなどのカチオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉ ｅｔ ａｌ， 米国特許Ｎｏ． ５，７０５，１８８）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジンなどのポリカチオン性分子（Ｌｏｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ９７／３０７３１）も、オリゴヌクレオチドの細胞性取り込みを亢進することが知られている。
【０１０８】
エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール、２−ピロールなどのピロール、アゾン（ａｚｏｎｅ）、およびリモネンおよびメントンなどのテルペンを含むその他の薬剤を使用して、投与される核酸の浸透を亢進することができる。
【０１０９】
担体
本発明の特定の組成物は、製剤中に担体化合物も組み込む。本明細書中で使用する場合、“担体化合物”または“担体”は、不活性である（すなわち、それ自体生物学的活性を有さない）が、しかし、たとえば、生物学的に活性な核酸を分解しまたはその循環からの除去を促進することにより生物学的活性を有する核酸の生物学的利用性を減少するｉｎ ｖｉｖｏプロセスにより、核酸として認識される、核酸、またはその類似体のことをいうことができる。核酸と担体化合物（典型的には担体化合物を過剰量）の共投与により、おそらくは担体化合物と核酸との、一般的な受容体に対する競合により、結果として、肝臓、腎臓、またはその他の循環外レゼルボア中で回収される核酸の量の実質的な減少が引き起こされる。たとえば、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸あるいは４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸とともに共投与する場合、肝臓組織中での部分的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの回収を減少することができる（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．， １９９５， ５， １１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．， １９９６， ６， １７７−１８３）。
【０１１０】
賦形剤
担体化合物と対照的に、“医薬的な担体”または“賦形剤”は、医薬的に許容可能な溶媒、懸濁剤または動物に対して１またはそれ以上の核酸を送達するためのいずれかその他の医薬的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体であってもあるいは固体であってもよく、そして、想定した計画された様式の投与により、所定の医薬組成物の核酸およびその他の構成要素と組み合わせた場合、所望のバルク、粘度などを提供するように選択される。典型的な医薬的な担体には、結合剤（たとえば、α化コーンスターチ、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（たとえば、ラクトースおよびその他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリル酸またはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状シリコンジオキシド、ステアリン酸、金属性ステアリン酸、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（たとえば、スターチ、スターチグリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（たとえば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が含まれるが、これらには限定されない。
【０１１１】
核酸と心身に有害には反応しない非−非経口性投与に適した医薬的に許容可能な有機賦形剤または無機賦形剤を使用して、本発明の組成物を製剤化することもできる。適した医薬的に許容可能な担体には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらには限定されない。
【０１１２】
核酸の局所投与のための製剤には、滅菌水溶液および非−滅菌水溶液、アルコールなどの一般的溶媒中での非−水溶液、または液体または固体油状基剤中の核酸の溶液が含まれてもよい。溶液には、バッファー、希釈剤およびその他の適した添加剤を含有してもよい。核酸と心身に有害には反応しない非−非経口性投与に適した医薬的に許容可能な有機賦形剤あるいは無機賦形剤を使用することができる。
【０１１３】
適した医薬的に許容可能な賦形剤には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらには限定されない。
【０１１４】
その他の構成要素
本発明の組成物にはさらに、医薬組成物中に従来から見出されるその他の補助剤構成要素を、当該技術分野で確立した使用レベルで含有することができる。このように、たとえば、組成物には、たとえば鎮痒薬、収斂剤、局所麻酔薬または抗炎症剤などの追加的で適合性な医薬的に活性な物質を含有することができ、または本発明の組成物の様々な用量剤形を物理的に製剤化する際に有用な追加の物質、たとえば色素、着香剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定化剤など、を含有することができる。しかしながら、このような物質は、添加される場合、本発明の組成物の構成要素の生物学的活性を過度に妨害すべきではない。製剤を滅菌することができ、そして所望の場合には、製剤の（１またはそれ以上の）核酸と心身に有害に相互作用しない補助剤、たとえば、潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、オスモル圧に影響を与える塩、バッファー、着色剤、着香料および／または芳香性物質などと混合することができる。
【０１１５】
水性懸濁液には、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む、懸濁疫の粘度を増加する物質を含有することができる。懸濁疫には、安定化剤を含有してもよい。
【０１１６】
本発明の特定の態様は、（ａ）１またはそれより多いオリゴヌクレオチド化合物、および（ｂ）非−オリゴヌクレオチド機構により機能する１またはそれより多いその他の化学療法剤を含有する医薬組成物を提供する。そのような化学療法剤の例としては、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マフォスファミド、イフォスファミド、シトシンアラビノシド、ｂｉｓ−クロロエチルニトロソウレア、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード、、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコフォルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホールアミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ジェムシタラビン、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）が含まれるが、これらに限定される訳ではない（一般的には、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， １５ｔｈ Ｅｄ． １９８７， ｐｐ． １２０６−１２２８， Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｒａｈｗａｙ， Ｎ．Ｊを参照）。本発明の化合物とともに使用した場合、そのような化学療法剤は、個々に使用しても（例えば、５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド）、連続的に使用しても（例えば５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチドをある期間与えた後、ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチドを与える）、あるいは１またはそれより多いその他のそのような化学療法剤と組み合わせて使用してもよい（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド、あるいは５−ＦＵ、放射線療法およびオリゴヌクレオチド）。非ステロイド性抗炎症性薬物およびコルチコステロイドを含む抗炎症性薬物（しかしこれらには限定されない）、およびリビビリン（ｒｉｂｉｖｉｒｉｎ）、ビダラビン（ｖｉｄａｒａｂｉｎｅ）、アシクロビルおよびガンシクロバーを含む抗ウィルス性薬物（しかしこれらには限定されない）を、本発明の組成物中に組み合わせることができる（一般的には、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， １５ｔｈ Ｅｄ．， Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９８７， Ｒａｈｗａｙ， Ｎ．Ｊ．， ｐａｇｅｓ ２４９９−２５０６ ａｎｄ ４６−４９， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙを参照）。その他の非−アンチセンス化学療法剤も、本発明の範囲に含まれる。２つまたはそれ以上の組み合わせ化合物を、一緒にあるいは連続的に使用することができる。
【０１１７】
別の関連する態様において、本発明の組成物には第一の核酸を標的とする、１またはそれ以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第二の核酸標的を標的とする１またはそれ以上の追加のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを含有することができる。数多くのアンチセンス化合物の例が当該技術分野で知られている。２つまたはそれ以上の組み合わせ化合物を、一緒にあるいは連続的に使用することができる。
【０１１８】
治療用組成物の製剤化およびそれに引き続く投与は、当該技術分野の範囲内のものであると考えられる。用量は、治療すべき疾患状態の重症度および反応性に依存し、数日間から数ヶ月間持続する治療経過、あるいは治癒が得られるかまたは疾患の減退が得られるまでの治療経過を伴う。最適な用量スケジュールは、患者体内での薬物の蓄積を測定することから算出することができる。当業者であれば、最適用量、投与方法、および反復頻度を容易に決定することができる。最適な用量は、個々のオリゴヌクレオチドの比効力に依存して変更することができ、そして一般的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいて効果的であることが見いだされるＥＣ５０に基づいて見積もることができる。一般的には、用量は、０．０１ ｕｇ〜１００ ｇ／ｋｇ体重であり、そして１日、１週間、１ヶ月、あるいは１年に一度またはそれ以上与えることができ、あるいは２〜２０年ごとに１度であってもよい。当業者は、体液あるいは組織における薬物の滞留時間および濃度に基づいて、投与のための反復頻度を容易に見積もることができる。継続的な治療により、患者に維持療法を受けさせて、疾患状態の再発を防止することが好ましく、ここでオリゴヌクレオチドは、１日に１回またはそれ以上〜２０年間ごとに１回で、０．０１ ｕｇ〜１００ ｇ／ｋｇ体重の範囲で、維持用量で投与する。
【０１１９】
本発明特定のその好ましい態様にしたがって、具体的に記載されるが、以下の実施例は、本発明を説明するためにのみ提供し、そして本発明を限定することを意図するものではない。
【０１２０】
【実施例】
実施例１
オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホールアミダイト
デオキシ及び２’−アルコキシアミダイト
２’−デオキシ及び２’−メトキシβ−シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトを販売元（例えば、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ， Ｎｅｅｄｈａｍ ＭＡ またはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ． Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡ）より購入した。他の２’−Ｏ−アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，５０６，３５１に記載の通り調製する。２’−アルコキシアミダイトを用いてオリゴヌクレオチドを合成するために、テトラゾール及び塩基のパルスデリバリー後の待機段階を３６０秒に増加した以外は、非修飾オリゴヌクレオチドのための標準サイクルを使用した。
【０１２１】
５−メチル−２’−デオキシシチジン（５−Ｍｅ−Ｃ）ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、市販のホスホールアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡまたはＣｈｅｍＧｅｎｅｓ， Ｎｅｅｄｈａｍ ＭＡ）を用いて公表された方法〔Ｓａｎｇｈｖｉ ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９３， ２１， ３１９７−３２０３〕に従って合成した。
【０１２２】
２’−フルオロアミダイト
２’−フルオロデオキシアデノシンアミダイト
２’−フルオロオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される以前に記載の通り〔Ｋａｗａｓａｋｉら、 Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， １９９３， ３６， ８３１−８４１〕、及び、アメリカ合衆国特許５，６７０，６３３に記載の通り合成した。簡潔には、保護されたヌクレオシドであるＮ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンは、市販の９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを出発物質として使用し、そして文献手法を修正して、２’−α−フルオロ原子を２’−β−トリチル基のＳＮ２−置換により導入することより、合成した。このようにＮ６−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンは中程度の収量で３’，５’−ジテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）中間体として選択的に保護した。ＴＨＰ及びＮ６−ベンゾイル基の脱保護は標準的な手法論を用いて成され、そして標準手法を用いて５’−ジメトキシトリチル−（ＤＭＴ）及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホールアミダイト中間体を得た。
【０１２３】
２’−フルオロデオキシグアノシン
２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンの合成はテトライソプロピルジシロキサニル（ＴＰＤＳ）で保護した９−β−Ｄ−アラビノフラノシルグアニンを出発物質として用い、そして、中間体であるジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへの変換により成された。ＴＰＤＳ基の脱保護に続いて水酸基のＴＨＰによる保護によりジイソブチリルジ−ＴＨＰ保護アラビノフラノシルグアニンを得た。選択的なＯ−脱アシル化及びトリフラート化に続き、フルオリドによる粗生成物の処理をし、その後ＴＨＰ基の脱保護をした。標準的な方法論を使用し、５’−ＤＭＴ−及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホールアミダイトを得た。
【０１２４】
２’−フルオロウリジン
２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンの合成は、２，２’−アンヒドロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルを７０％フッ化水素−ピリジン（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｆｌｕｏｒｉｄｅ−ｐｙｒｉｄｉｎｅ）で処理する、文献手法の修正により成された。標準的な手法を用いて５’−ＤＭＴ及び５’−ＤＭＴ−３’ホスホールアミダイトを得た。
【０１２５】
２’−フルオロデオキシシチジン
２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンは２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンのアミノ化を介して合成され、次に選択的な保護によりＮ４−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを得た。標準的な手法を用いて、５’−ＤＭＴ及び５’−ＤＭＴ−３’ホスホールアミダイトを得た。
【０１２６】
２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾アミダイト
２’−Ｏ−メトキシエチル−置換ヌクレオシドアミダイトは、次の通り、あるいは、Ｍａｒｔｉｎ， Ｐ．（Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ， １９９５， ７８， ４８６−５０４）の方法に従って調製した。
【０１２７】
２，２’−アンヒドロ〔１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン〕
５−メチルウリジン（Ｙａｍａｓａ， Ｃｈｏｓｈｉ， Ｊａｐａｎにより市販され入手可能な、リボシルチミン）（７２．０ ｇ、０．２７９ Ｍ）、ジフェニルカーボネート（９０．０ ｇ、０．４２０ Ｍ）及び炭酸水素ナトリウム（２．０ ｇ、０．０２４ Ｍ）をＤＭＦ（３００ ｍＬ）に加えた。混合物を熱して攪拌しながら還流し、発生する二酸化炭素ガスを制御された方法で放出させた。１時間後、わずかに黒ずんだ溶液を、低圧下、濃縮した。得られたシロップを攪拌しながらジエチルエーテル（２．５ Ｌ）中に注いだ。産物はガム状物を形成した。エーテルをデカントし、そして、残渣を最小量のメタノール（約４００ ｍＬ）に溶解した。溶液をフレッシュなエーテル（２．５ Ｌ）に注ぎ入れ、硬いガム状物を得た。エーテルをデカントし、ガム状物を減圧オーブンで乾燥させ（６０℃、１ ｍｍ Ｈｇで２４時間）、得られた固体を砕いて淡い黄褐色の粉末にした（５７ ｇ、８５％粗収率）。ＮＭＲスペクトルは、そのナトリウム塩としてフェノールが混じった（約５％）構造と一致した。その物質はさらに続く反応に用いられた（あるいはに酢酸エチル中のメタノールの勾配（１０−２５％）を利用したカラムクロマトグラフィーにより、さらに精製して融点２２２−４℃の白色の固体を得ることができる）。
【０１２８】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン
２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ ｇ、０．８１ Ｍ）、トリス（２−メトキシエチル）ホウ酸（２３１ ｇ、０．９８ Ｍ）及び２−メトキシエタノール（１．２ Ｌ）を、２ Ｌステンレススチール圧力容器に加え、１６０℃に予熱した油浴中に設置した。１５５−１６０℃で４８時間熱した後、容器を開き、そして、溶液を蒸発させて乾燥させ、次にメタノール（２００ ｍＬ）中で磨砕した。残渣を熱したアセトン（１ Ｌ）中に懸濁した。不溶の塩を濾過し、アセトン（１５０ ｍＬ）で洗浄し、そして、濾過物を蒸発させた。残渣を（２８０ ｇ）をＣＨ３ＣＮ（６００ ｍＬ）に溶解させ、次に、蒸発させた。シリカゲルカラム（３ ｋｇ）を０．５％Ｅｔ３ＮＨを含むＣＨ２Ｃｌ２／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）中に充填した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（２５０ ｍＬ）中に溶解し、そして、シリカ（１５０ ｇ）に吸着させた後、カラムにロードした。生成物は充填溶媒とともに溶出され、１６０ ｇ（６３％）の産物を得た。不純な分画をやり直すことにより、追加の物質を得た。
【０１２９】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ ｇ、０．５０６ Ｍ）をピリジン（２５０ ｍＬ）と共に蒸発させ、次に、乾燥させた残渣をピリジン（１．３ Ｌ）に溶解した。ジメトキシトリチルクロリドの一番目のアリコート（９４．３ ｇ、０．２７８ Ｍ）を加え、そして、混合液を室温で１時間攪拌した。ジメトキシトリチルクロリドの二番目のアリコート（９４．３ ｇ、０．２７８ Ｍ）を加え、そして、反応液をさらに１時間攪拌した。メタノール（１７０ ｍＬ）を次に加え、反応を停止した。ＨＰＬＣにより、約７０％の産物の存在が示された。溶媒を蒸発させ、そして、ＣＨ３ＣＮ（２００ ｍＬ）中で磨砕した。残渣をＣＨＣｌ３（１．５ Ｌ）に溶解し、次に、２×５００ ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３及び２×５００ ｍＬの飽和ＮａＣｌにより抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして、蒸発させた。２７５ ｇの残渣が得られた。残渣を３．５ ｋｇシリカゲルカラムで精製し、充填し、そして、０．５％Ｅｔ３ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）で溶出した。純粋な分画を蒸発させ、１６４ ｇの生成物を得た。さらに約２０ ｇが不純な分画より得られ、全収量１８３ ｇ（５７％）を得た。
【０１３０】
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１０６ ｇ、０．１６７ Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ ｍＬのＤＭＦと１８８ ｍＬのピリジンから調製された３：１の混合液７５０ ｍＬ）、及び、無水酢酸（２４．３８ ｍＬ、０．２５８ Ｍ）を混合し、そして、室温で２４時間攪拌した。反応は、ＴＬＣ試料にＭｅＯＨを添加し初めに急冷すること（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）によりＴＬＣによりモニターした。ＴＬＣにより判断した反応の終了時に、ＭｅＯＨ（５０ ｍＬ）を加え、混合物を３５℃で蒸発させた。残渣をＣＨＣｌ３（８００ ｍＬ）に溶解し、次に、２×２００ ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム及び２×２００ ｍＬの飽和ＮａＣｌにより抽出した。水層を２００ ｍＬのＣＨＣｌ３で逆抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、蒸発させ、１２２ ｇ（約９０％生成物）の残渣を得た。残渣を３．５ ｋｇシリカゲルカラムで精製し、そして、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）で溶出した。純粋な生成物分画を蒸発させ、９６ ｇ（８４％）を得た。後の分画より追加の１．５ ｇを回収した。
【０１３１】
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン
はじめの溶液は、３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ ｇ、０．１４４ Ｍ）をＣＨ３ＣＮ（７００ ｍＬ）に溶かすことにより調製し、そして、とり置いた。トリエチルアミン（１８９ ｍＬ、１．４４ Ｍ）をＣＨ３ＣＮ（１ Ｌ）中トリアゾール（９０ ｇ、１．３ Ｍ）溶液に加えて、−５℃に冷却し、そして、オーバーヘッドスターラーを使用して０．５時間攪拌した。０−１０℃に維持した攪拌溶液に、３０分間、ＰＯＣｌ３を滴下して加え、そして得られた混合液をさらに２時間攪拌した。はじめの溶液を後者の溶液に、４５分間をかけて滴下して加えた。得られた反応混合物をコールドルームに一晩保存した。反応混合物から塩を濾過し、そして、溶液を蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（１ Ｌ）に溶解し、次に、不溶の固体を濾過により除去した。濾過物を１×３００ ｍＬのＮａＨＣＯ３及び２×３００ ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ中で磨砕し、表題の化合物を得た。
【０１３２】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
ジオキサン（５００ ｍＬ）及びＮＨ４ＯＨ（３０ ｍＬ）中３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ ｇ、０．１４１ Ｍ）溶液を、室温で２時間攪拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（２×２００ ｍＬ）と共沸させた。残渣をＭｅＯＨ（３００ ｍＬ）に溶解し、２リットルステンレススチール圧力容器に移した。ＮＨ３ガスで飽和させたＭｅＯＨ（４００ ｍＬ）を加え、その容器を１００℃、２時間熱した（完全な変換がＴＬＣにより示された）。容器の内容物を蒸発させて乾燥し、そして、残渣をＥｔＯＡｃ（５００ ｍＬ）に溶解し、次に、飽和ＮａＣｌ（２００ ｍＬ）で１回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、溶媒を蒸発させて８５ ｇ（９５％）の表題の化合物を得た。
【０１３３】
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−シチジン（８５ ｇ、０．１３４ Ｍ）をＤＭＦ（８００ ｍＬ）に溶解し、次に、無水安息香酸（３７．２ ｇ、０．１６５ Ｍ）を攪拌しながら加えた。３時間攪拌後、反応が約９５％終了したことをＴＬＣが示した。溶媒を蒸発させ、そして、残渣をＭｅＯＨ（２００ ｍＬ）と共沸させた。残渣をＣＨＣｌ３（７００ ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３（２×３００ ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ（２×３００ ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、次に、蒸発させて残渣（９６ ｇ）を得た。残渣を、溶出溶媒として０．５％Ｅｔ３ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を使用して、１．５ ｋｇシリカカラムでクロマトグラフィーにより分離した。純粋な生成物画分を蒸発させて、９０ ｇ（９０％）の表題化合物を得た。
【０１３４】
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’−アミダイト
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（７４ ｇ、０．１０ Ｍ）をＣＨ２Ｃｌ２（１ Ｌ）に溶解した。テトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ ｇ）及び２−シアノエトキシ−テトラ−（イソプロピル）亜リン酸塩（４０．５ ｍＬ、０．１２３ Ｍ）を窒素気体条件下、攪拌しながら加えた。得られた混合物は室温で２０時間攪拌した（反応が９５％終了したことをＴＬＣが示した）。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（１×３００ ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ（３×３００ ｍＬ）で抽出した。水層洗浄液をＣＨ２Ｃｌ２（３００ ｍＬ）で逆抽出し、次に抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させそして濃縮した。得られた残渣は、溶出溶媒としてＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を使用して、１．５ ｋｇシリカカラムでクロマトグラフィーにより分離した。純粋な分画を合わせて、９０．６ ｇ（８７％）の表題化合物を得た。
【０１３５】
２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト及び２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト
２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト
２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト［当該技術分野において２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても知られる］は次の段落で記載される通り、調製される。アデノシン、シチジン及びグアノシンヌクレオシドアミダイトは、環外のアミンがアデノシン及びシチジンの場合はベンゾイル基により保護され、また、グアノシンの場合はイソブチリルにより保護されることを除いては、チミジン（５−メチルウリジン）と同様に調製される。
【０１３６】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン
Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（Ｐｒｏ． Ｂｉｏ． Ｓｉｎｔ．， Ｖａｒｅｓｅ， Ｉｔａｌｙ， １００．０ ｇ、０．４１６ ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（０．６６ ｇ、０．０１３ ｅｑ、０．００５４ ｍｍｏｌ）を、アルゴン気体条件下、周囲温度で、また、機械的に攪拌しながら、無水ピリジン（５００ ｍｌ）に溶解した。ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（１２５．８ ｇ、１１９．０ ｍＬ、１．１ ｅｑ、０．４５８ ｍｍｏｌ）を一度に加えた。反応物は周囲温度で１６時間攪拌した。ＴＬＣ（Ｒｆ ０．２２、酢酸エチル）により反応が終了したことが示された。溶液を減圧下、濃縮して濃厚な油状物にした。これを、ジクロロメタン（１ Ｌ）、及び、飽和炭酸水素ナトリウム（２×１ Ｌ）及びブライン（１ Ｌ）間で分配させた。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、減圧下、濃縮して濃厚な油状物にした。油を酢酸エチルとエチルエーテルの１：１の混合液（６００ ｍＬ）に溶解し、次に、溶液を−１０℃に冷却した。得られた結晶生成物は、濾過により集めて、エチルエーテル（３×２００ ｍＬ）で洗浄し、さらに、乾燥して（４０℃、１ ｍｍ Ｈｇ，、２４ 時間）、１４９ ｇ（７４．８％）の白色の固体にした。ＴＬＣ及びＮＭＲは純粋な生成物と一致した。
【０１３７】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン
２ Ｌステンレススチール、非攪拌圧力反応器にテトラヒドロフラン中のボラン（１．０ Ｍ、２．０ ｅｑ、６２２ ｍＬ）を加えた。換気フード内で、手動で攪拌しながらエチレングリコール（３５０ ｍＬ、過剰量）を、水素ガスの発生がおさまるまで、はじめは注意深く加えた。５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１４９ ｇ、０．３１１ ｍｏｌ）及び炭酸水素ナトリウム（０．０７４ ｇ、０．００３ ｅｑ）を手動で攪拌しながら加えた。反応器を密閉し、そして、内部温度が１６０℃に達するまで油浴中で熱し、そして次に１６時間維持した（圧力＜ １００ ｐｓｉｇ）。反応容器を周囲温度まで冷却し、そして、開けた。ＴＬＣ（望ましい生成物はＲｆ ０．６７ 及びａｒａ−Ｔ副生成物はＲｆ ０．８２、酢酸エチル）は約７０％が生成物に変換したことを示した。さらに副生成物ができるのを避けるため、反応を停止し、減圧下（１０から１ ｍｍ Ｈｇ）、湯浴中（４０−１００℃）で、エチレングリコールを除くために使われるより極度の条件で、濃縮した。［あるいは、一度低沸点溶媒がなくなったら、残りの溶液を酢酸エチルと水の間で分配し得る。生成物は有機相にあるだろう。］残渣をカラムクロマトグラフィー（２ ｋｇシリカゲル、酢酸エチル−ヘキサン勾配１：１から４：１）により精製した。適切な分画を合わせ、除き、そして、乾燥させて、白色のカリカリ（ｃｒｉｓｐ）した泡状物（８４ ｇ、５０％）、混在した出発物質（１７．４ ｇ）、及び、純粋な再利用できる出発物質２０ ｇを得た。出発物質、純度の低い回収した出発物質をもとにした収率は５８％だった。ＴＬＣ及びＮＭＲは、９９％の純度の生成物と一致した。
【０１３８】
２’−Ｏ−（〔２−フタルイミドオキシ）エチル〕−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン（２０ ｇ、３６．９８ ｍｍｏｌ）を、トリフェニルホスフィン（１１．６３ ｇ、４４．３６ ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシフタルイミド（７．２４ ｇ、４４．３６ ｍｍｏｌ）と混ぜた。その後、強い減圧条件下、４０℃、２日間、Ｐ２Ｏ５で乾燥させた。反応混合液をアルゴンをフラッシュし（ｆｌｕｓｈｅｄ）そして、無水ＴＨＦ（３６９．８ ｍＬ、Ａｌｄｒｉｃｈ、確実に密閉させた瓶）を加えて、透明な液体を得た。ジエチルーアゾジカルボン酸塩（６．９８ ｍＬ、４４．３６ ｍｍｏｌ）を反応混合液に滴下して加えた。添加する速度は、生じる深い赤い色が次の滴を加える前にちょうど消えるように維持した。添加が終了した後、反応物を４時間攪拌した。その頃までに、ＴＬＣにより反応の終了が示された（酢酸エチル：ヘキサン、６０：４０）。減圧下、溶媒を蒸発させた。得られた残渣をフラッシュカラムにのせ、そして、酢酸エチル：ヘキサン（６０：４０）で溶出し、２’−Ｏ−（〔２−フタルイミドオキシ）エチル〕−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジンを白色の泡状物（２１．８１９ ｇ、８６％）として得た。
【０１３９】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル〕−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−（〔２−フタルイミドオキシ）エチル〕−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン（３．１ ｇ、４．５ ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（４．５ ｍＬ）に溶解し、そして、メチルヒドラジン（３００ ｍＬ、４．６４ ｍｍｏｌ）を−１０℃から０℃において滴下して加えた。１時間後、混合物を濾過し、濾過物を氷冷ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、そして、合わせた有機相を水、ブラインで洗浄して、次に、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶液を濃縮して２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）チミジンを得て、それを次にＭｅＯＨ（６７．５ ｍＬ）に溶解した。これにホルムアルデヒド（２０％水溶液、ｗ／ｗ、１．１ ｅｑ．）を加え、そして、得られた混合物を１時間攪拌した。溶媒を減圧下で除き；残渣をクロマトグラフィーで分離して、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル〕−５−メチルウリジンを白色の泡（１．９５ ｇ、７８％）として得た。
【０１４０】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル〕−５−メチルウリジン
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル〕−５−メチルウリジン（１．７７ ｇ、３．１２ ｍｍｏｌ）を１ Ｍ ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）の溶液に溶解した。シアノホウ化水素ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）（０．３９ ｇ、６．１３ ｍｍｏｌ）を、１０℃、不活性気体条件下で、この溶液に加えた。反応混合物を１０℃、１０分間攪拌した。その後、反応容器を氷浴から取り出し、室温で２時間攪拌し、反応をＴＬＣでモニターした（ＣＨ２Ｃｌ２中５％ＭｅＯＨ）。ＮａＨＣＯ３水溶液（５％、１０ ｍＬ）を加え、そして、酢酸エチルで抽出した（２×２０ ｍＬ）。酢酸エチル相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥状態にした。残渣を、ＭｅＯＨ（３０．６ ｍＬ）中の１ Ｍ ＰＰＴＳ溶液に溶解した。ホルムアルデヒド（２０％ｗ／ｗ、３０ ｍＬ、３．３７ ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１０分間攪拌した。反応混合液を氷浴中で１０℃に冷却し、シアノホウ化水素ナトリウム（０．３９ ｇ、６．１３ ｍｍｏｌ）を加え、そして、反応混合物を１０℃、１０分間攪拌した。１０分後、反応混合液を氷浴から取り出し、そして、室温で２時間攪拌した。反応混合液に５％ＮａＨＣＯ３（２５ ｍＬ）溶液を加え、そして、酢酸エチル（２×２５ ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、次に、蒸発させて乾燥状態にした。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、そして、ＣＨ２Ｃｌ２中５％ＭｅＯＨで溶出し、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル〕−５−メチルウリジンを白色の泡状物（１４．６ ｇ、８０％）として得た。
【０１４１】
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
トリエチルアミントリヒドロフルオリド（３．９１ ｍＬ、２４．０ ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ及びトリエチルアミン（１．６７ ｍＬ、１２ ｍｍｏｌ、無水ＫＯＨで維持）に溶解した。このトリエチルアミン−２ＨＦの混合物を、次に、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル〕−５−メチルウリジン（１．４０ ｇ、２．４ ｍｍｏｌ）に加えて、そして、室温で２４時間攪拌した。反応をＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中５％ＭｅＯＨ）によりモニターした。溶媒を減圧下、取り除き、そして、残渣をフラッシュカラムにのせ、そして、ＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨで溶出して、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７６６ ｍｇ、９２．５％）を得た。
【０１４２】
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７５０ ｍｇ、２．１７ ｍｍｏｌ）を、強い減圧条件下、４０℃で一晩、Ｐ２Ｏ５で乾燥させた。その後、無水ピリジン（２０ ｍＬ）と共に蒸発させた。得られた残渣をアルゴン気体条件下、ピリジン（１１ ｍＬ）に溶解した。４−ジメチルアミノピリジン（２６．５ ｍｇ、２．６０ ｍｍｏｌ）、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（８８０ ｍｇ、２．６０ ｍｍｏｌ）を混合液に加え、そして、反応混合物を室温で、出発物質の全量がなくなるまで攪拌した。ピリジンを減圧下取り除き、次に、残渣をクロマトグラフィーで分離し、そして、ＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨ（ピリジンを数滴含む）で溶出し、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノ−オキシエチル）−５−メチルウリジン（１．１３ ｇ、８０％）を得た。
【０１４３】
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−〔（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホールアミダイト〕
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（１．０８ ｇ、１．６７ ｍｍｏｌ）をトルエン（２０ ｍＬ）と共に蒸発させる。残渣にＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミンテトラゾニド（０．２９ ｇ、１．６７ ｍｍｏｌ）を加えて、次に、強い減圧条件下、４０℃で一晩、Ｐ２Ｏ５で乾燥させた。その後、反応混合物を無水アセトニトリル（８．４ ｍＬ）に溶解し、そして、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ１−テトライソプロピルホスホールアミダイト（２．１２ ｍＬ、６．０８ ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を周囲温度で４時間、不活性気体条件下で攪拌した。反応の進行を、ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル １：１）でモニターした。溶媒を蒸発させ、次に、残渣を酢酸エチル（７０ ｍＬ）に溶解し、そして、５％ＮａＨＣＯ３水溶液（４０ ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、また、濃縮した。得られた残渣をクロマトグラフィーにより分離し（溶出溶媒としては酢酸エチル）、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−〔（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホールアミダイト〕（１．０４ ｇ、７４．９％）を泡状物として得た。
【０１４４】
２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト
２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト〔当該技術分野において、２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても知られる〕は、次の段落で記載される通り、調製する。アデノシン、シチジン及びチミジンヌクレオシドアミダイトは同様に調製する。
【０１４５】
Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−〔（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホールアミダイト〕
２’−Ｏ−アミノオキシエチルグアノシン類似体は、ジアミノプリンリボシドの選択的２’−Ｏ−アルキル化により得ることができる。多様な重量のジアミノプリンリボシドは、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ（Ｂｅｒｌｉｎ）から購入することが可能であり、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを、少量の３’−Ｏ−異性体と共に提供する。２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドは、アデノシンデアミナーゼ処理により分解され、そして、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）グアノシンに変換され得る（ＭｃＧｅｅ， Ｄ． Ｐ． Ｃ．， Ｃｏｏｋ， Ｐ． Ｄ．， Ｇｕｉｎｏｓｓｏ， Ｃ． Ｊ．， ＷＯ ９４／０２５０１ Ａ１ ９４０２０３．）。標準的な保護の手法は２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン及び２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを与えるに違いなく、それは、還元され、２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを提供し得る。前のように、水酸基はＭｉｔｓｕｎｏｂｕ反応によってＮ−ヒドロキシフタルイミドにより置換することができ、そして、保護されたヌクレオシドは通常通り、ホスフィチル（ｐｈｏｓｐｈｉｔｙｌ）化して、２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−〔（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホールアミダイト〕を得ることができる。
【０１４６】
２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオシドアミダイト
２’−ジメチルアミノエトキシエトキシヌクレオシドアミダイト（当該技術分野において２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル、即ち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２、あるいは２’−ＤＭＡＥＯＥヌクレオシドアミダイトとしても知られる）は、以下のように調製される。他のヌクレオシドアミダイトは同様に調製される。
【０１４７】
２’−Ｏ−〔２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル〕−５−メチルウリジン
１００ ｍＬボンベ中で、テトラヒドロフラン中のボラン（１ Ｍ、１０ ｍＬ、１０ ｍｍｏｌ）の溶液に、２〔２−（ジメチルアミノ）エトキシ〕エタノール（Ａｌｄｒｉｃｈ、６．６６ ｇ、５０ ｍｍｏｌ）を攪拌しながらゆっくりと加える。固体が溶解するにつれて水素ガスが発生する。Ｏ２−，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１．２ ｇ、５ ｍｍｏｌ）、及び、炭酸水素ナトリウム（２．５ ｍｇ）を加え、そして、ボンベを密閉し、油浴中に入れ、そして、１５５℃にて、２６時間加熱する。ボンベは室温まで冷却し、そして、開封する。粗溶液を濃縮し、そして、残渣を水（２００ ｍＬ）およびヘキサン（２００ ｍＬ）の間で分配した。過剰量のフェノールを、ヘキサン層中で抽出した。水層を酢酸エチル（３×２００ ｍＬ）により抽出し、そして合わせた有機層を水で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、濃縮する。残渣を、溶出溶媒としてメタノール／塩化メチレン１：２０（２％トリエチルアミンを含む）を使用したシリカゲルカラムにかける。カラム分画が濃縮されるにつれて、無色の固体が形成され、集められて、表題の化合物を白色の固体として得る。
【０１４８】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−〔２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）〕−５−メチルウリジン
無水ピリジン（８ ｍＬ）中０．５ ｇ（１．３ ｍｍｏｌ）の２’−Ｏ−〔２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−エトキシ）エチル）〕−５−メチルウリジン溶液に、トリエチルアミン（０．３６ ｍＬ）及びジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ、０．８７ ｇ、２ ｅｑ．）を加えて、そして、１時間攪拌する。反応混合物を水（２００ ｍＬ）に注ぎいれ、そして、ＣＨ２Ｃｌ２（２×２００ ｍＬ）で抽出する。合わせたＣＨ２Ｃｌ２層を飽和ＮａＨＣＯ３溶液、続いて飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、次に、無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。溶媒の蒸発に続いて、ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２：Ｅｔ３Ｎ（２０：１、ｖ／ｖ、１％トリエチルアミンを含む）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより、表題化合物を得る。
【０１４９】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−〔２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）〕−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホールアミダイト
ジイソプロピルアミノテトラゾリド（０．６ ｇ）及び２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホールアミダイト（１．１ ｍＬ、２ ｅｑ．）を、アルゴン気体条件下、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ ｍＬ）に溶解した５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−〔２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）〕−５−メチルウリジン（２．１７ ｇ、３ ｍｍｏｌ）に加える。反応混合液を一晩攪拌し、そして、溶媒を蒸発させる。得られた残渣を、酢酸エチルを溶出溶媒として用いるシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、表題の化合物を得る。
【０１５０】
実施例２
オリゴヌクレオチド合成
未置換及び置換ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドを、自動ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂ）で、ヨウ素による酸化を用いる標準的なホスホールアミダイト化学を使用して、合成する。
【０１５１】
亜リン酸塩結合の段階的チア化のため、標準的な酸化瓶を、アセトニトリル中０．２ Ｍ ３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド溶液に置き換えた以外は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）は、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドのためと同様に合成される。チア化待機段階を６８秒に増加し、そして、引き続いてキャッピング段階を行った。ＣＰＧカラムからの分離、及び、５５℃で（１８時間）濃縮された水酸化アンモニウム中の脱ブロック化した後、２．５倍量のエタノールで２回沈殿することにより、オリゴヌクレオチドを０．５ Ｍ ＮａＣｌ溶液から精製した。ホスフィネートオリゴヌクレオチドを、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，５０８，２７０に記載の通り、調製する。
【０１５２】
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許４，４６９，８６３に記載の通り、調製する。
３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，６１０，２８９あるいは５，６２５，０５０に記載の通り、調製する。
【０１５３】
ホスホールアミダイトオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，２５６，７７５あるいはアメリカ合衆国特許５，３６６，８７８に記載の通り、調製する。
【０１５４】
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２及びＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６（それぞれＷＯ ９４／１７０９３及びＷＯ ９４／０２４９９として公開）に記載の通り、調製する。
【０１５５】
３’−デオキシ−３’−アミノホスホールアミデートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，０２３，２４３に記載の通り、調製する。
【０１５６】
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、本明細書中に参考文献として援用されるアメリカ合衆国特許５，０２３，２３４に記載の通り、調製する。
ボランリン酸オリゴヌクレオチドは、共に本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，１３０，３０２及び５，１７７，１９８に記載の通り、調製する。
【０１５７】
実施例３
オリゴヌクレオシド合成
ＭＭＩ結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド、ＭＤＨ結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、及び、アミド−３結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、及び、アミド−４結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド、そして、例えば、ＭＭＩとＰ＝ＯあるいはＰ＝Ｓ結合とを換えたものを有する混合バックボーン化合物は、そのすべてが本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，３７８，８２５、５，３８６，０２３、５，４８９，６７７、５，６０２，２４０及び５，６１０，２８９，に記載の通り、調製する。
【０１５８】
ホルムアセタール及びチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，２６４，５６２及び５，２６４，５６４に記載の通り、調製する。
【０１５９】
エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，２２３，６１８に記載の通り、調製する。
実施例４
ＰＮＡ合成
ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に関する様々な方法：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９６， ４， ５−２３のいずれかに従って、調製される。それらはまた、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，５３９，０８２、５，７００，９２２，、及び、５，７１９，２６２に従ってもまた、調製され得る。
【０１６０】
実施例５
キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または、混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なる型でありうる。これらは、結合ヌクレオシドの“ギャップ”セグメントが結合ヌクレオシドの５’あるいは３’“ウィング”セグメントの間に位置する第一の型、及び、“ギャップ”セグメントがオリゴマー化合物の３’あるいは５’端のどちらかに位置する、第二の“オープンエンド”型を含む。第一の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において、“ギャップマー”あるいはギャップ化オリゴヌクレオチドとしても知られる。第二の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において、“ヘミマー”あるいは“ウィングマー”としても知られる。
【０１６１】
〔２’−Ｏ−Ｍｅ〕−−〔２’−デオキシ〕−−〔２’−Ｏ−Ｍｅ〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
２’−Ｏ−アルキルホスホロチオエートを有するキメラオリゴヌクレオチド及び２’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを、上記の通り、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動ＤＮＡシンセサイザーＭｏｄｅｌ ３８０Ｂを使用して合成する。オリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーを用い、及び、ＤＮＡ部分には２’−デオキシ−５’−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−ホスホールアミダイトを、そして、５’及び３’ウィングには５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホールアミダイトを使用して、合成する。標準的な合成サイクルを、テトラゾール及び塩基のデリバリー後の待機段階を６００秒に増加することにより修正し、ＲＮＡについては４回、２’−Ｏ−メチルについては２回繰り返した。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から解離し、そして、室温で一晩、３：１アンモニア／エタノール中で、リン酸基を脱保護し、その後、凍結乾燥により乾燥させる。その後、室温で２４時間、メタノールアンモニア中で処理することによりすべての塩基を脱保護し、そして、試料を再び凍結乾燥により乾燥させる。ペレットをＴＨＦ中１ Ｍ ＴＢＡＦに、室温で２４時間懸濁し、２’位を脱保護する。次に、反応を１ Ｍ ＴＥＡＡで停止し、そして次に試料をｒｏｔｏｖａｃにより１／２量に減少させ、Ｇ２５サイズ排除カラムにより脱塩する。回収したオリゴは次に、キャピラリー電気泳動により、また、質量分析により、収量について、また、純度について、分光光度的に分析される。
【０１６２】
〔２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）〕−−〔２’−デオキシ〕−−〔２’−Ｏ−（メトキシエチル）〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
〔２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）〕−−〔２’−デオキシ〕−−〔２’−Ｏ−（メトキシエチル）〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトを２’−Ｏ−メチルアミダイトに置き換えた２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドのための上記の方法に従って、調製した。
【０１６３】
〔２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル〕−−〔２’−デオキシホスホロチオエート〕−−〔２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル〕キメラオリゴヌクレオチド
〔２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル〕−−〔２’−デオキシホスホロチオエート〕−−〔２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル〕キメラオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトを２’−Ｏ−メチルアミダイトに置き換えた、２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドについての上記の方法、キメラ構造のウィング部分中のホスホジエステルヌクレオチド間結合を作るためのヨウ素を用いる酸化、中央ギャップのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を作るための３，Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ Ｒｅａｇｅｎｔ）を使用する硫化に従って、調製する。
【０１６４】
他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシド及び混合キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，６２３，０６５に従って合成される。
【０１６５】
実施例６
オリゴヌクレオチドの単離
制御孔ガラスカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から分離し、そして、濃縮された水酸化アンモニウム中、５５℃、１８時間、脱ブロック化した後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドは、０．５ Ｍ ＮａＣｌから２．５倍量のエタノールを用いた２回の沈殿により精製する。合成されたオリゴヌクレオチドは、変性ゲル上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析され、そして、少なくとも８５％の全長物質であると判断された。合成により得られたホスホロチオエート及びホスホジエステル結合の相対的な量は、定期的に３１Ｐ核磁気共鳴分光器により検査され、そして、いくつかの研究のため、オリゴヌクレオチドをＣｈｉａｎｇら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９１， ２６６， １８１６２−１８１７１）により記載の通り、ＨＰＬＣで精製した。ＨＰＬＣ精製産物を用いて得られた結果は、非ＨＰＬＣ精製産物から得られたものと同様だった。
【０１６６】
実施例７
オリゴヌクレオチド合成−９６ウェルプレート型
オリゴヌクレオチドを、固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホールアミダイト化学により、標準的な９６ウェル型に同時に９６配列を構築することができる自動シンセサイザーで合成した。ホスホロジエステルヌクレオチド間結合はヨウ素水溶液を用いる酸化によって得られた。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、無水アセトニトリル中３，Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ Ｒｅａｇｅｎｔ）を使用した硫化により、生成した。標準的な塩基保護β−シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトは、商業販売者（例えば、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡまたはＰｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）から購入した。非標準ヌクレオシドは、既知の文献、あるいは、特許の方法の通り、合成する。それらは、塩基保護β−シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトとして使用される。
【０１６７】
オリゴヌクレオチドを支持体から解離し、そして、高温度（５５−６０℃）にて、１２−１６時間、濃縮ＮＨ４ＯＨにより脱保護し、そして放出された生成物を次に減圧下で乾燥した。乾燥した生成物を次に滅菌水に再懸濁して、マスタープレートを得て、そこからすべての分析及び試験プレート試料をロボットピペッターを使用して希釈する。
【０１６８】
実施例８
オリゴヌクレオチド分析−９６ウェルプレート型
各ウェルのオリゴヌクレオチドの濃度を、試料の希釈及びＵＶ吸収分光器により調査した。個々の生成物の全長の完全性を、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）により、９６ウェル型（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥＴＭ ＭＤＱ）で、あるいは、個々に調製した試料については、市販のＣＥ器具（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥＴＭ ５０００， ＡＢＩ ２７０）で、評価した。塩基及びバックボーン構成は、エレクトロスプレー質量分光計を使用する化合物の質量分析により、確かめられた。すべてのアッセイ検査プレートは、マスタープレートから、シングルあるいはマルチチャネルのロボットピペッターを使用して希釈した。プレートは、プレート上の化合物の少なくとも８５％が、少なくとも全長の８５％であれば、許容可能であると判断した。
【０１６９】
実施例９
細胞培養及びオリゴヌクレオチド処理
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の効果は、測定可能なレベルで標的核酸が存在する場合、様々な細胞タイプのいずれにおいても、試験することができる。これは、例えば、ＰＣＲあるいはノザンブロット分析を使って日常的に決定され得る。以下の５つの細胞タイプは説明するために提供されるが、標的が選択された細胞タイプ中において発現される場合には、他の細胞タイプを日常的に使用することができる。これは、当該技術分野において日常的な方法、たとえばノザンブロット解析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、あるいはＲＴ−ＰＣＲ、により容易に確認することができる。
【０１７０】
Ｔ−２４細胞：
ヒト移行上皮細胞（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ）膀胱癌細胞株Ｔ−２４細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）より入手した。Ｔ−２４細胞は、日常的に、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）、１００ ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を加えた、完全ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ基本培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）で、培養した。細胞は、日常的に、それが９０％コンフルエンスに達したら、トリプシン処理及び希釈により継代した。ＲＴ−ＰＣＲ分析において使用するため、細胞を９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３８７２）に７０００細胞／ウェルの濃度でまいた。
【０１７１】
ノザンブロットあるいは他の分析のため、細胞を１００ ｍｍあるいは他の標準的な組織培養プレートにまき、そして、適切な量の培地及びオリゴヌクレオチドを使用して、同様の処理をすることができる。
【０１７２】
Ａ５４９細胞：
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）より入手した。Ａ５４９は、日常的に、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）、１００ ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を加えた、ＤＭＥＭ基本培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）で培養した。細胞は、日常的に、それが９０％コンフルエンスに達したら、トリプシン処理及び希釈により継代した。
【０１７３】
ＮＨＤＦ細胞：
ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ ＭＤ）より入手した。ＮＨＤＦは日常的に、提供者により推奨される通り添加した線維芽細胞成長培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ ＭＤ）で維持した。細胞は提供者により推奨される通り、１０継代まで維持した。
【０１７４】
ＨＥＫ細胞：
ヒト胎児ケラチノサイト（ＨＥＫ）はＣｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ ＭＤ）より入手した。ＨＥＫ細胞は、日常的に、提供者により推奨される通り製剤化されたケラチノサイト成長培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ ＭＤ）で維持した。細胞は、日常的に、提供者により推奨される通り、１０継代まで維持した。
【０１７５】
ｂ．ＥＮＤ細胞：
マウス脳内皮細胞株、ｂ．ＥＮＤを、Ｍａｘ Ｐｌａｎｋ研究所（Ｂａｄ Ｎａｕｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）のＤｒ． Ｗｅｒｎｅｒ Ｒｉｓａｕより入手した。ｂ．ＥＮＤ細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を添加したＤＭＥＭ、高グルコース（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）中で日常的に培養された。細胞が９０％コンフルエントに達した際に、細胞を、トリプシン処理と希釈により、日常的に継代した。細胞を、ＲＴ−ＰＣＲ解析において使用するため、３０００細胞／ウェルの濃度で９６−ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ ＃３８７２）中にまいた。
【０１７６】
ノザンブロットまたは他の解析のため、細胞を１００ ｍｍ組織培養プレートまたはその他の標準的な組織培養プレートにまき、適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して、同様に処理することができる。
【０１７７】
アンチセンス化合物の処理：
細胞が８０％コンフルエンスに達したとき、オリゴヌクレオチドにより処理した。９６ウェルプレートで生育した細胞について、ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ−１減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で一度洗浄し、次に３．７５μｇ／ｍＬ ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）及び望ましい濃度のオリゴヌクレオチドを含む、１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ −１で処理した。４〜７時間処理後、培地をフレッシュな培地に交換した。オリゴヌクレオチド処理後１６〜２４時間後に細胞を回収した。
【０１７８】
使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株ごとに変化させる。特定の細胞株に対する最適オリゴヌクレオチド濃度を決定するため、細胞をある濃度範囲の陽性対照オリゴヌクレオチドにより処理する。ヒト細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、ヒトＨ−ｒａｓを標的とし、ホスホロチオエートバックボーンを有する２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（２’−Ｏ−メトキシエチルは太字で示した）である、ＩＳＩＳ １３９２０、
【０１７９】
【化１】
Figure 2004509619
【０１８０】
である。マウスまたはラット細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、マウスｃ−ｒａｆおよびラットｃ−ｒａｆの両方を標的とし、ホスホロチオエートバックボーンを有する２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（２’−Ｏ−メトキシエチルは太字で示した）である、ＩＳＩＳ １５７７０、
【０１８１】
【化２】
Figure 2004509619
【０１８２】
である。ｃ−Ｈａ−ｒａｓ（ＩＳＩＳ １３９２０）ｍＲＮＡまたはｃ−ｒａｆ（ＩＳＩＳ １５７７０）ｍＲＮＡの８０％の阻害を引き起こす陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度を、その細胞株について引き続いて実験する際に利用する。８０％の阻害が達成されない場合、Ｈ−ｒａｓまたはｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡの６０％の阻害を引き起こす陽性対照オリゴヌクレオチドの最低濃度を、その細胞株について引き続いて実験する際に、オリゴヌクレオチドスクリーニング濃度として利用する。６０％の阻害が達成されない場合、その特定の細胞株はオリゴヌクレオチドトランスフェクション実験については適していないものと判断する。
【０１８３】
実施例１０
ＦＬＩＰ−Ｃ発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
ＦＬＩＰ−Ｃ発現のアンチセンスモジュレーションは、当該技術分野において知られる様々な方法でアッセイすることができる。例えば、ＦＬＩＰ−Ｃ ｍＲＮＡレベルは、例えばノザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、あるいは、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により、定量され得る。リアルタイム定量ＰＣＲが現在のところ好ましい。ＲＮＡ分析は、全細胞内ＲＮＡ、あるいは、ポリ（Ａ）＋ ｍＲＮＡについて行うことができる。ＲＮＡ単離の方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １， ｐｐ． ４．１．１−４．２．９ 及び４．５．１−４．５．３， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９３）に教示される。ノザンブロット分析は、当該技術分野においては、日常的な方法であり、また、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １， ｐｐ． ４．２．１−４．２．９， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９６）に教示される。リアルタイム定量（ＰＣＲ）は、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）から入手可能な、市販のＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用することにより、都合よく成し遂げられ、そして、製造者の指示に従って使用される。
【０１８４】
ＦＬＩＰ−Ｃタンパク質レベルは、免疫沈降、ウエスタンブロット分析（イムノブロット）、ＥＬＩＳＡ、あるいは、蛍光活性化細胞分取器（ＦＡＣＳ）といった、当該技術分野において既知である様々な手法により定量され得る。ＦＬＩＰ−Ｃに対する抗体は同定され、そして、ＭＳＲＳの抗体カタログ（Ａｅｒｉｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， ＭＩ）といった、様々な供給者から入手することが可能であり、または、従来からの抗体作成方法により調製し得る。ポリクローナル抗血清の調製方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐｐ． １１．１２．１−１１．１２．９， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９７）に教示される。モノクローナル抗血清の調製方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐｐ． １１．４．１−１１．１１．５， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９７）に教示される。
【０１８５】
免疫沈降方法は、当該技術分野において標準的であり、また、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐｐ． １０．１６．１−１０．１６．１１， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９８）において見いだすことができる。ウェスタンブロット（イムノブロット）分析は、当該技術分野において標準的であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐｐ． １０．８．１−１０．８．２１， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９８）において見いだすことができる。酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、当該技術分野において標準的であり、また、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐｐ． １１．２．１−１１．２．２２， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９１）において見つけることができる。
【０１８６】
実施例１１
ポリ（Ａ）＋ ｍＲＮＡ単離
ポリ（Ａ）＋ ｍＲＮＡは、Ｍｉｕｒａら（Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．， １９９６， ４２， １７５８−１７６４）に従って、単離された。ポリ（Ａ）＋ ｍＲＮＡ単離のための他の方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １， ｐｐ． ４．５．１−４．５．３， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９３）に教示される。簡潔には、９６ウェルプレート上で培養した細胞において、細胞から増殖培地を除き、そして、各ウェルを２００μＬ冷ＰＢＳで洗浄した。６０μＬ溶解バッファー（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．６、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、２０ ｍＭバナジル−リボヌクレオシド複合体）を各ウェルに加え、プレートをゆっくり揺り動かし、そして次に、室温で５分間インキュベートした。溶解物５５μＬをオリゴｄ（Ｔ）をコートした９６ウェルプレート（ＡＧＣＴ Ｉｎｃ．， Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）に移した。プレートを、６０分、室温でインキュベートし、洗浄バッファー（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．６、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３ Ｍ ＮａＣｌ）２００μＬで３回洗浄した。最後の洗浄の後、プレートをペーパータオルに当てて、余分な洗浄バッファーを取り除き、そしてその後、５分間風乾した。７０℃に前もって熱した、溶出バッファー（５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．６）６０μＬを、各ウェルに加え、プレートを９０℃ホットプレートで５分間インキュベートし、そして、次に溶出物を新しい９６ウェルプレートに移した。
【０１８７】
１００ ｍｍあるいは他の標準的なプレートに培養した細胞は、適する容量のすべての溶液を用いて、同様に処理し得る。
実施例１２
全ＲＮＡ単離
全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）より購入したＲＮＥＡＳＹ ９６ＴＭキット及びバッファーを用い、製造者の推薦する方法に従って単離した。簡潔には、９６ウェルプレート上で培養した細胞において、増殖培地を細胞から除き、そして、各ウェルを２００μＬ冷ＰＢＳで洗浄した。１００μＬのバッファーＲＬＴを各ウェルに加え、そして、プレートを２０秒間激しく揺り動かした。７０％エタノール１００μＬを次に各ウェルに加え、内容物を３回上下にピペッティングして混ぜた。次に試料を排水回収トレイに合わせたＱＩＡＶＡＣＴＭマニホルドに取り付け、そして減圧装置に取り付けた、ＲＮＥＡＳＹ ９６ＴＭウェルプレートに移した。減圧は１５秒間行われた。１ ｍＬのバッファーＲＷ１をＲＮＥＡＳＹ ９６ＴＭプレートの各ウェルに加え、そして、再び減圧を１５秒間行った。その後、１ ｍＬのバッファーＲＰＥをＲＮＥＡＳＹ ９６ＴＭプレートの各ウェルの添加し、そして減圧を１５秒間行った。バッファーＲＰＥ洗浄を次に繰り返し、さらに１０分間減圧を行った。プレートをＱＩＡＶＡＣＴＭマニホルドから取り外し、そしてペーパータオルにあてて乾燥させた。プレートを次に、１．２ ｍＬ回収チューブを含む、回収チューブラックに合わせたＱＩＡＶＡＣＴＭマニホルドにもう一度取り付けた。ＲＮＡを次に各ウェル中の６０μＬの水をピペッティングすることにより溶出し、１分間インキュベートし、そして次に、３０秒間減圧を行った。さらに６０μＬの水を用いて、溶出段階を繰り返した。
【０１８８】
繰り返しのピペッティング及び溶出段階を、ＱＩＡＧＥＮ Ｂｉｏ−Ｒｏｂｏｔ ９６０４（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）を用いて、自動化することができる。本質的には、培養プレート上で細胞を溶解した後、プレートをロボットデッキに移し、そこで、ピペッティング、ＤＮａｓｅ処理、及び、溶出段階が実行される。
【０１８９】
実施例１３
ＦＬＩＰ−Ｃ ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量ＰＣＲ分析
ＦＬＩＰ−Ｃ ｍＲＮＡレベルの定量は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を製造者の指示に従って使用して、リアルタイム定量ＰＣＲにより決定された。これは、閉じられたチューブで、ゲルに基づいてなく、リアルタイムにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物のハイスループット定量ができる蛍光検出システムである。ＰＣＲが終了した後に、増幅産物が定量される標準的なＰＣＲとは対照的に、リアルタイム定量ＰＣＲ産物はそれが蓄積するに従って定量される。これは、ＰＣＲ反応にフォワード及びリバースＰＣＲプライマーの間に特異的にアニールし、そして２つの蛍光色素を含むオリゴヌクレオチドを含むことにより達せられる。レポーター色素（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡ またはＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡのどちらかから入手可能なＪＯＥ、ＦＡＭあるいはＶＩＣ）は、プローブの５’端に結合し、そして、クエンチャー色素（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡまたはＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡのどちらかから入手可能なＴＡＭＲＡ）は、プローブの３’端に結合する。プローブ及び色素が完全なとき、レポーター色素の発光は３’クエンチャー色素の近接により消失される。増幅の間、プローブの標的配列へのアニーリングはＴａｑポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性により切断されうる基質を作り出す。ＰＣＲ増幅サイクルの伸長相の間、Ｔａｑポリメラーゼによるプローブの切断はプローブの残りから（そしてつまりクエンチャー部分から）レポーター色素を放出し、そして、配列特異的な蛍光シグナルが生み出される。各サイクルで、さらなるレポーター色素分子はその対応するプローブから解離され、そして、蛍光強度は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍに組み込まれるレーザー光により、一定のインターバルでモニターされる。各アッセイにおいて、未処理の対照試料由来ｍＲＮＡの希釈系列を含む、並行した一連の反応は、試験試料の、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の阻害パーセントを定量するのに用いられる、標準曲線を生み出す。
【０１９０】
定量的ＰＣＲ解析の前に、測定される標的遺伝子に対して特異的なプライマー−プローブセットを、ＧＡＰＤＨ増幅反応とともに“多重化される”能力について評価する。多重化において、標的遺伝子および内部標準遺伝子ＧＡＰＤＨの両方を、単一サンプル中で同時に増幅する。この解析において、非処理細胞から単離されるｍＲＮＡは、階段希釈される。それぞれの希釈物は、ＧＡＰＤＨのみまたは標的遺伝子のみに特異的なプライマー−プローブセットの存在下（“単一反応性（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｌｅｘｉｎｇ）”）、もしくは両方に特異的なプライマー−プローブセットの存在下（多重反応性性（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ））において増幅させる。ＰＣＲ増幅の後、ＧＡＰＤＨおよび標的ｍＲＮＡシグナルの標準曲線を、希釈の関数として単一反応性サンプルおよび多重反応性サンプルの両方から作成する。多重反応性サンプルから作成されたＧＡＰＤＨシグナルおよび標的シグナルの傾きおよび相関係数が、単一反応性サンプルから作成されたそれらの対応する値の１０％以内に収まる場合には、その標的に対して特異的なプライマー−プローブセットは、多重性であるとみなされる。ＰＣＲの他の手法もまた、当該技術分野において、既知である。
【０１９１】
ＰＣＲ試薬はＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）より入手した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、２５μＬ全ｍＲＮＡ溶液を含む９６ウェルプレートに、２５μＬ ＰＣＲカクテル（１×ＴＡＱＭＡＮＴＭ バッファーＡ、５．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、各３００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、６００μＭのｄＵＴＰ、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び、プローブを各１００ ｎＭ、２０ Ｕ ＲＮＡｓｅインヒビター、１．２５ Ｕ ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤＴＭ及び１２．５ Ｕ ＭｕＬＶ逆転写酵素）を加えることにより実行した。ＲＴ反応は４８℃で３０分のインキュベーションにより実行された。ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤＴＭを活性化するために９５℃にて１０分間のインキュベーションした後、４０サイクルの２段階ＰＣＲプロトコールを実行した：９５℃１５秒間（変性）続いて６０℃１．５分間（アニーリング／伸長）。
【０１９２】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより得られた遺伝子標的量は、発現が定常的な遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現レベルを使用するか、またはＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ． Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）を使用して全ＲＮＡを定量するかのいずれかにより正常化する。ＧＡＰＤＨ発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、標的と同時に多重的にまたは別個に定量する。全ＲＮＡを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社が販売するＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ ＲＮＡ定量試薬を使用して定量する。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭを使用してＲＮＡを定量する方法は、Ｊｏｎｅｓ， Ｌ．Ｊ．ら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９８， ２６５， ３６８−３７４）の中に教示される。
【０１９３】
このアッセイにおいて、１７５μＬのＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ標準試薬（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．５中で１：２８６５に希釈されたＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ試薬）を、２５μＬの精製された細胞ＲＮＡを含有する９６−ウェルプレート中にピペットで注入する。プレートを、４８０ ｎｍの励起波長および５２０ ｎｍの放射波長で、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ ４０００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で読み取る。
【０１９４】
刊行物に記載された配列情報（本明細書中でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３として援用されるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｙ１４０４１）を使用して、マウスＦＬＩＰ−Ｃに対するプローブおよびプライマーを、マウスＦＬＩＰ−Ｃ配列にハイブリダイズするように設計した。マウスＦＬＩＰ−Ｃについて、ＰＣＲプライマーは：
フォワードプライマー：ＧＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＣＣＧＴＴＧＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）、
リバースプライマー：ＡＧＣＣＧＴＡＡＣＣＧＣＣＡＡＧＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）、および
ＰＣＲプローブ：ＦＡＭ−ＣＣＡＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＡＴＧＡＴＡ−ＴＡＭＲＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）、
であり、ここでＦＡＭ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）は蛍光レポーター色素であり、そして、ＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）はクエンチャー色素である。マウスＧＡＰＤＨ用のＰＣＲプライマーは：
フォワードプライマー：ＧＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＡＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）
リバースプライマー：ＧＧＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）であり、及び
ＰＣＲプローブは：５’ ＪＯＥ−ＡＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＴＣＡＴＣ−ＴＡＭＲＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９）であり、ＪＯＥ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）は蛍光レポーター色素であり、そして、ＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）はクエンチャー色素である。
【０１９５】
刊行物に記載された配列情報（本明細書中でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０として援用されるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ９７０７５および本明細書中でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１として援用されるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ９７０７４）を使用して、ヒトＦＬＩＰ−Ｃに対するプローブおよびプライマーを、ヒトＦＬＩＰ−Ｃ配列にハイブリダイズするように設計した。ヒトＦＬＩＰ−Ｃについて、ＰＣＲプライマーは：
フォワードプライマー：ＴＧＴＧＣＣＧＧＧＡＴＧＴＴＧＣＴＡＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）、
リバースプライマー：ＣＡＧＣＴＴＡＣＣＴＣＴＴＴＣＣＣＧＴＡＡＡＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３）、および
ＰＣＲプローブ：ＦＡＭ−ＴＧＧＴＴＣＣＡＣＣＴＡＡＴＧＴＣＡＧＧＧＡＣＣＴＴＣＴＧ−ＴＡＭＲＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４）、であり、ここでＦＡＭ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）は蛍光レポーター色素であり、そして、ＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）はクエンチャー色素である。マウスＧＡＰＤＨについてＰＣＲプライマーは：
フォワードプライマー：ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５）
リバースプライマー：ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６）であり、及び
ＰＣＲプローブは：５’ ＪＯＥ−ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ−ＴＡＭＲＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７）であり、ＪＯＥ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）は蛍光レポーター色素であり、そして、ＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）はクエンチャー色素である。
【０１９６】
実施例１４
ＦＬＩＰ−Ｃ ｍＲＮＡレベルのノザンブロット分析
アンチセンス処理の１８時間後、単層の細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、そして、１ ｍＬ ＲＮＡＺＯＬＴＭ（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ “Ｂ” Ｉｎｃ．， Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ， ＴＸ）に溶解した。全ＲＮＡは製造者が推薦するプロトコルに従って調製した。ＭＯＰＳバッファーシステム（ＡＭＲＥＳＣＯ， Ｉｎｃ． Ｓｏｌｏｎ， ＯＨ）を用い、１．１％ホルムアルデヒドを含む１．２％アガロースゲルによる電気泳動により、２０マイクログラムの全ＲＮＡを分離した。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ／Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒバッファーシステム（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ “Ｂ” Ｉｎｃ．， Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ， ＴＸ）を使用して、一晩キャピラリートランスファーすることによって、ＲＮＡをゲルからＨＹＢＯＮＤＴＭ−Ｎ＋ ナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）に移した。ＲＮＡのトランスファーは、ＵＶ可視化により確認した。メンブレンをＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲＴＭ ＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ ２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｉｎｃ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を使用して、ＵＶ架橋により固定し、次いでＱＵＩＣＫＨＹＢＴＭハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を使用し、ストリンジェントな条件についての製造者の推奨を用いて、プローブ化した。
【０１９７】
マウスＦＬＩＰ−Ｃを検出するため、マウスＦＬＩＰ−Ｃ特異的プローブを、フォワードプライマーＧＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＣＣＧＴＴＧＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）およびリバースプライマーＡＧＣＣＧＴＡＡＣＣＧＣＣＡＡＧＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）を使用したＰＣＲにより調製した。ロード効率及びトランスファー効率における多様性を標準化するため、メンブレンをストリップ化し、そして、マウスグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）についてプローブ化した。
【０１９８】
ヒトＦＬＩＰ−Ｃを検出するため、ヒトＦＬＩＰ−Ｃ特異的プローブを、フォワードプライマーＡＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＴＣＡＴＣＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８）およびリバースプライマーＡＴＴＧＣＴＧＣＴＴＧＧＡＴＡＡＣＡＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９）を使用したＰＣＲにより調製した。ロード効率及びトランスファー効率における多様性を標準化するため、メンブレンをストリップ化し、そして、ヒトグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）についてプローブ化した。
【０１９９】
ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲＴＭおよびＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴＴＭ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ３．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を用いて、ハイブリダイズしたメンブレンを可視化し、そして、定量した。データは未処理対照におけるＧＡＰＤＨレベルに標準化した。
【０２００】
実施例１５
２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるマウスＦＬＩＰ−Ｃ発現のアンチセンス阻害
本発明に従って、一連のオリゴヌクレオチドを、刊行物に記載された配列（本明細書中でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３として援用されるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｙ１４０４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０として本明細書中で援用されるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ９７０７６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１として本明細書中で援用されるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｙ１４０４２、そしてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２として本明細書中で援用されるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＩ７４６７３８）を用いて、マウスＦＬＩＰ−Ｃ ＲＮＡの異なる領域を標的とするように設計した。オリゴヌクレオチドは表１に示す。“標的部位”は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の最初（最も５’−端）のヌクレオチド番号を示す。表１中のすべての化合物は、両方の端（５’及び３’方向）を５−ヌクレオチドの“ウィング”によって挟まれた、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央“ギャップ”領域から構成される、長さが２０ヌクレオチドの、キメラオリゴヌクレオチド（“ギャップマー”）である。ウィングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドからなる。ヌクレオシド間（バックボーン）結合はオリゴヌクレオチド全体にわたりホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全てのシチジン残基は５−メチルシチジンである。化合物を、マウスＦＬＩＰ−Ｃ ｍＲＮＡレベルに対するそれらの効果について、本明細書中の他の実施例に記載の通り、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。データは２回の実験からの平均である。存在する場合、“Ｎ．Ｄ．”は“データなし”を示す。
【０２０１】
【表１】
Figure 2004509619
【０２０２】
Figure 2004509619
【０２０３】
表１に示されるように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５５、５６、５７、５８、５９、６１、６２、６４、６５、６６、６７、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７７、７８、７９、８１、８２、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９９および１００は、このアッセイにおいて、少なくとも３０％のヒトＦＬＩＰ−Ｃの発現の阻害が証明され、そして、それゆえ好ましい。これらの好ましい配列が相補的である標的部位は、本明細書中で“活性部位”と呼ばれ、そしてしたがって、本発明の化合物による標的化のために好ましい。
【０２０４】
実施例１６
２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトＦＬＩＰ−Ｃ発現のアンチセンス阻害
本発明に従って、刊行物に記載された配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０として本明細書中に援用されるＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ９７０７５、そしてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１として本明細書中に援用されるＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ９７０７４）を使用して、マウスＦＬＩＰ−Ｃ ＲＮＡの異なる領域を標的とするように、２番目の一連のオリゴヌクレオチドが設計された。オリゴヌクレオチドは表２に示す。“標的部位”は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の最初（最も５’−端）のヌクレオチド番号を示す。表２中のすべての化合物は、両方の端（５’及び３’方向）を５−ヌクレオチドの“ウィング”によって挟まれた、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央“ギャップ”領域から構成される、長さが２０ヌクレオチドの、キメラオリゴヌクレオチド（“ギャップマー”）である。ウィングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドからなる。ヌクレオシド間（バックボーン）結合はオリゴヌクレオチド全体にわたりホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全てのシチジン残基は５−メチルシチジンである。化合物を、ヒトＦＬＩＰ−Ｃ ｍＲＮＡレベルに対するそれらの効果について、本明細書中の他の実施例に記載の通り、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。データは、２つの実験からの平均である。存在する場合、“Ｎ．Ｄ．”は“データなし”を示す。
【０２０５】
【表２】
Figure 2004509619
【０２０６】
表２に示されるとおり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０１、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１２１、１２６、および１２７は、このアッセイにおいて、少なくとも４０％のヒトＦＬＩＰ−Ｃの発現の阻害が証明され、そして、それゆえ好ましい。
【０２０７】
実施例１７
ＦＬＩＰ−Ｃタンパク質レベルのウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット（イムノブロット分析）は標準的な方法を用いて行われる。細胞をオリゴヌクレオチド処理の１６−２０時間後に回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉバッファー（１００ ｕｌ／ｗｅｌｌ）に懸濁し、５分間煮沸し、そして、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードする。ゲルを１．５時間、１５０ Ｖで泳動し、そして、ウエスタンブロットのために、メンブレンにトランスファーする。ＦＬＩＰ−Ｃに対する適する第一抗体を、第一抗体の種に対する放射ラベルした、あるいは、蛍光ラベルした第二抗体とともに使用する。バンドをＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）を使用して、可視化する。
【０２０８】
実施例１８
ＴＲＡＩＬ−感受性細胞株およびＴＲＡＩＬ−非感受性細胞株の、ＦＬＩＰ−ｃに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理後の、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）解析
ＦＡＣＳ解析を使用して、オリゴヌクレオチド処置後の細胞集団中でのアポトーシス細胞の相対量を決定した。細胞がアポトーシスを起こすため、１×Ｎ未満のＤＮＡ含有量を有する細胞数が増加する。このことは、細胞の遺伝子的物質の断片化が起こっていることを示し、このことはアポトーシスの誘導についての古典的なマーカーである。壊死を起こしている細胞は、この表現型を示さない。
【０２０９】
これらの実験において、ＨｅＬａ細胞およびＨＳ５７８Ｔ細胞を６ウェルディッシュのウェルあたり５×１０４細胞でまいた。これらの細胞を、オリゴヌクレオチドなしまたは３００ ｎＭのＩＳＩＳ １２８３２６（
【０２１０】
【化３】
Figure 2004509619
【０２１１】
太字で表した２’−Ｏ−メトキシエチル類を有する２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー；本明細書中ではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３２として援用する）により、または３００ ｎＭのＩＳＩＳ ２３２９６（ＦＬＩＰ−ｃアンチセンスオリゴヌクレオチド）により、トランスフェクトした。トランスフェクションの１日後、培地およびディッシュ上に残存する細胞をトリプシン処理および遠心分離により回収した。細胞ペレットをＰＢＳ中で洗浄し、そして７０％エタノールで４℃にて１時間固定した。細胞をＰＢＳ中で再び洗浄し、そして０．５ ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムにより染色し、それによりＤＮＡ含量を測定することができた。サンプルを少なくとも３０分後にＦＡＣＳによりアッセイした。
【０２１２】
実施例１９
ＦＬＩＰ−ｃのアンチセンス阻害のアポトーシスに対する効果
ＩＳＩＳ ２３２９６およびミスマッチ対照であるＩＳＩＳ １２８３２６を、ＨＳ５７８Ｔ細胞中でのアポトーシスに対するそれらの効果についてアッセイした。これらの細胞は、正常ではＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子−関連アポトーシス−誘導性リガンド）耐性である。このリガンドは、細胞中でカスパーゼカスケードを活性化させることによりアポトーシスを誘導することが知られている。１００ ｎｇ／ｍＬのＴＲＡＩＬ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）により処理されたかまたは未処理のままのいずれかの細胞を、３００ ｎＭ ＩＳＩＳ ２３２９６によりトランスフェクトし、そして一晩インキュベートした。細胞および培地を翌日に回収し、そしてＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング）により解析し、細胞周期のｓｕｂ Ｇ１期中の細胞の比率（アポトーシスの指標）を測定した。
【０２１３】
ＩＳＩＳ ２３２９６により処理した結果、１５％の細胞がアポトーシスを引き起こしているのに対して、ＴＲＡＩＬで処理した細胞では８％でありそして何の処理もされていない対照細胞では７％であった。しかしながら、ＩＳＩＳ ２３２９６およびＴＲＡＩＬの両方で処理した細胞においては、アポトーシスレベルは、実質的に３２％まで上昇した。これらの結果から、ＩＳＩＳ ２３２９６により処理することにより、ＨＳ５７８Ｔ細胞にアポトーシスを誘導することでき、そしてＴＲＡＩＬと組み合わせて処理することにより、さらにより高いレベルの細胞死を誘導することが確認される。
【０２１４】
実施例２０
ＦＬＩＰ−ｃのアンチセンス阻害により誘導されるアポトーシスに対する、カスパーゼ阻害剤の効果
同様の実験において、ＨＳ５７８Ｔ細胞をＩＳＩＳ ２３２９６および対照オリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ ２９８４８（２０−ｍｅｒのランダムオリゴヌクレオチド（ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ、ここでそれぞれのＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴの混合物である；本明細書中ではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３３として援用される））により処理し、そしてカスパーゼ阻害剤の存在下にてアポトーシスについてアッセイした。ＩＳＩＳ ２３２９６が実際に機能して、カスパーゼカスケードを活性化するならば、カスパーゼの阻害剤がＩＳＩＳ ２３２９６−誘導性アポトーシスをブロックするはずである。カスパーゼ阻害剤、すなわちカスパーゼ３の特異的阻害剤であるＤＥＶＤ−ｆｍｋ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とカスパーゼ８の特異的阻害剤であるＩＥＴＤ−ｆｍｋ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、を、ＩＳＩＳ ２３２９６と組み合わせて使用した。細胞を、３００ ｎＭのＩＳＩＳ ２３２９６または対照オリゴヌクレオチドのみにより、そしてカスパーゼ阻害剤と組み合わせて処理した。これらの結果を、ＴＲＡＩＬリガンドと組み合わせた同一の処理と比較した。
【０２１５】
カスパーゼ阻害剤は、実際にＩＳＩＳ ２３２９６−誘導性アポトーシスを減少させることができた。ＩＳＩＳ ２３２９６のみで処理した結果、２１％がアポトーシスを起こし、一方でＩＳＩＳ ２３２９６およびカスパーゼ８阻害剤で処理した結果、１４％がアポトーシスを起こし、ＩＳＩＳ ２３２９６およびカスパーゼ３阻害剤で処理した結果、１２％がアポトーシスを引き起こした。対照処理細胞は、ずっと低い７％のアポトーシスレベルを示した。
【０２１６】
ＴＲＡＩＬリガンドによりあらかじめ処理した細胞は、ＩＳＩＳ ２３２９６およびカスパーゼ阻害剤で処理した場合、アポトーシスレベルがずっと大きく減少することが示された。ＴＲＡＩＬとＩＳＩＳ ２３２９６の組み合わせ処理の結果、１４％がアポトーシスを起こし、一方でＴＲＡＩＬ処理の後にカスパーゼ阻害剤で処理すると、アポトーシスがさらに減少した（カスパーゼ８阻害剤処理細胞の５％がアポトーシスを起こし、そしてカスパーゼ３阻害剤処理細胞の１０％がアポトーシスを起こした）。これらの結果から、カスパーゼの阻害剤はＩＳＩＳ ２３２９６−誘導性アポトーシスおよびＩＳＩＳ ２３２９６＋ＴＲＡＩＬ−誘導性アポトーシスの両方ともを減少させることができるたことを示しており、そのことからＦＬＩＰ−ｃ発現のアンチセンス阻害はカスパーゼカスケードの活性化を引き起こしていることが示唆される。
【０２１７】
実施例２１
ＦＬＩＰ−ｃのアンチセンス阻害のカスパーゼ活性化に対する効果
ＩＳＩＳ ２３２９６および対照オリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ ２９８４８（２０−ｍｅｒのランダムオリゴヌクレオチド（ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ、ここでそれぞれのＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴの混合物である；本明細書中でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３３として援用される）を、ＨＳ５７８Ｔ細胞中でのカスパーゼの活性化について、本明細書中の他の実施例において記載したようにウェスタンブロッティングにより測定することによりアッセイした。細胞を３００ ｎＭのＩＳＩＳ ２３２９６によりトランスフェクトし、そして処理の１または２日後に回収した。等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動した後、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。使用した抗体には、カスパーゼ７およびカスパーゼ８に対するものが含まれた。
【０２１８】
ウェスタンブロッティングの結果、対照と比較して、カスパーゼ７レベルを６０％減少し、そしてカスパーゼ８レベルを完全に減少させることが示された。ブロット上でのこれらのバンドの消失から、それらが切断されることおよびそれらがそれらのそれぞれの抗体により認識することができなくなることが示され、そのことからＩＳＩＳ ２３２９６がこれらの細胞中でのカスパーゼカスケードを実際に活性化することが示唆される。

Claims (20)

  1. ＦＬＩＰ−Ｃをコードする核酸分子を標的とする長さ８〜５０の核塩基の化合物であって、ＦＬＩＰ−Ｃに特異的にハイブリダイズし、そしてその発現を阻害する、前記化合物。
  2. アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の化合物。
  3. アンチセンスオリゴヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５５、５６、５７、５８、５９、６１、６２、６４、６５、６６、６７、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７７、７８、７９、８１、８２、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９９、１００、１０１、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１２１、１２６、または１２７．を含む配列を有する、請求項２に記載の化合物。
  4. アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項２に記載の化合物。
  5. 修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項４に記載の化合物。
  6. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも一つの修飾糖部分を含む、請求項２に記載の化合物。
  7. 修飾糖部分が２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分である、請求項６に記載の化合物。
  8. アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾核塩基を含む、請求項２に記載の化合物。
  9. 修飾核塩基が５−メチルシトシンである、請求項８に記載の化合物。
  10. アンチセンスオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の化合物。
  11. ＦＬＩＰ−ｃをコードする核酸分子上の活性部位の少なくとも８−核塩基部分と特異的にハイブリダイズする、長さ８〜５０核塩基の化合物。
  12. 請求項１に記載の化合物および医薬的に許容可能な担体または希釈剤を含む、組成物。
  13. コロイド分散システムをさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
  14. 化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１２に記載の組成物。
  15. 細胞または組織においてＦＬＩＰ−Ｃの発現を阻害する方法であって、前記細胞または組織と請求項１に記載の化合物とを接触させ、それによりＦＬＩＰ−Ｃの発現を阻害することを含む、前記方法。
  16. ＦＬＩＰ−Ｃと関連する疾患または症状を有するヒトを治療する方法であって、前記動物に対して、治療的または予防的有効量の請求項１に記載の化合物を投与し、それによりＦＬＩＰ−Ｃの発現を阻害することを含む、前記方法。
  17. 細胞と請求項１に記載の化合物とを接触させ、それによりアポトーシスをモジュレートすることを含む、前記細胞中のアポトーシスをモジュレートする方法。
  18. カスパーゼが活性化される、請求項１７に記載の方法。
  19. 活性化されたカスパーゼがカスパーゼ８、カスパーゼ３またはカスパーゼ７である、請求項１８に記載の方法。
  20. ＦＬＩＰ−ｃが長い型のＦＬＩＰ−ｃである、請求項１に記載の化合物。
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