JP2004503246A - C/EBPα発現のアンチセンスモジュレーション - Google Patents
C/EBPα発現のアンチセンスモジュレーション Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004503246A JP2004503246A JP2002510700A JP2002510700A JP2004503246A JP 2004503246 A JP2004503246 A JP 2004503246A JP 2002510700 A JP2002510700 A JP 2002510700A JP 2002510700 A JP2002510700 A JP 2002510700A JP 2004503246 A JP2004503246 A JP 2004503246A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- acid
- ebpα
- antisense
- oligonucleotide
- antisense compound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 title claims abstract description 77
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 43
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 157
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 107
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 52
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 51
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 49
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 11
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 16
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 14
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 9
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 5
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical group CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 claims description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 3
- 208000012239 Developmental disease Diseases 0.000 claims 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 claims 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 claims 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 claims 1
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 claims 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 claims 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 77
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 76
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 73
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 65
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 64
- -1 oligonucleotides Chemical class 0.000 description 63
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 54
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 42
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 42
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 41
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 38
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 35
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 34
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 34
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 33
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 31
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 28
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 27
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 27
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 26
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 24
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 24
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 24
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 23
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 23
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 21
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 230000006870 function Effects 0.000 description 20
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 19
- 239000002585 base Substances 0.000 description 19
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 18
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 18
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 17
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 17
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 17
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 16
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 16
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 16
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 15
- 238000011160 research Methods 0.000 description 15
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 14
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 14
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 13
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 13
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 13
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 12
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 12
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 12
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 12
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 12
- 101000945515 Homo sapiens CCAAT/enhancer-binding protein alpha Proteins 0.000 description 11
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 11
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 11
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 10
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 10
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 10
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000012552 review Methods 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101000945518 Mus musculus CCAAT/enhancer-binding protein alpha Proteins 0.000 description 9
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 9
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 9
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 9
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 9
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 9
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 9
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 9
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 9
- 125000004200 2-methoxyethyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 8
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 8
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 8
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 8
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 8
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical group C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 7
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 7
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 7
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 7
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 7
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 6
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 6
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 6
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 6
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 6
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 6
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 6
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 6
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 6
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YIMATHOGWXZHFX-WCTZXXKLSA-N (2r,3r,4r,5r)-5-(hydroxymethyl)-3-(2-methoxyethoxy)oxolane-2,4-diol Chemical compound COCCO[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H]1O YIMATHOGWXZHFX-WCTZXXKLSA-N 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical class CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 5
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 5
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 5
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 5
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 5
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 5
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 5
- 229940083542 sodium Drugs 0.000 description 5
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N (3beta,5beta,7alpha)-3,7-Dihydroxycholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)CC2 RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ABEXEQSGABRUHS-UHFFFAOYSA-N 16-methylheptadecyl 16-methylheptadecanoate Chemical compound CC(C)CCCCCCCCCCCCCCCOC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC(C)C ABEXEQSGABRUHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 4
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 4
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 4
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 4
- 241000764238 Isis Species 0.000 description 4
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 4
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 4
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 4
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N borane Chemical compound B UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000004064 cosurfactant Substances 0.000 description 4
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000005417 image-selected in vivo spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 238000012739 integrated shape imaging system Methods 0.000 description 4
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 4
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 4
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 4
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 4
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 4
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JUDOLRSMWHVKGX-UHFFFAOYSA-N 1,1-dioxo-1$l^{6},2-benzodithiol-3-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)SS(=O)(=O)C2=C1 JUDOLRSMWHVKGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LOSXTWDYAWERDB-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro(diphenyl)methyl]-2,3-dimethoxybenzene Chemical compound COC1=CC=CC(C(Cl)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1OC LOSXTWDYAWERDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 3
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 3
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 3
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 3
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 3
- 102000039106 EBP family Human genes 0.000 description 3
- 108091065819 EBP family Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 3
- 108010029869 Proto-Oncogene Proteins c-raf Proteins 0.000 description 3
- 102100033479 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 3
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 3
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 150000008051 alkyl sulfates Chemical class 0.000 description 3
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 3
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 3
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 3
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 3
- 229960003724 dimyristoylphosphatidylcholine Drugs 0.000 description 3
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 3
- 239000012156 elution solvent Substances 0.000 description 3
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 150000002191 fatty alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 3
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 3
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003961 penetration enhancing agent Substances 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 3
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 3
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 3
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N ribothymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 3
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 3
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 3
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 3
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 3
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- OQQOAWVKVDAJOI-UHFFFAOYSA-N (2-dodecanoyloxy-3-hydroxypropyl) dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OCC(CO)OC(=O)CCCCCCCCCCC OQQOAWVKVDAJOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WLLOAUCNUMYOQI-JAGXHNFQSA-N (2r,3r,3as,9ar)-3-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-7-methyl-2,3,3a,9a-tetrahydrofuro[1,2][1,3]oxazolo[3,4-a]pyrimidin-6-one Chemical compound O1C2=NC(=O)C(C)=CN2[C@H]2[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O2 WLLOAUCNUMYOQI-JAGXHNFQSA-N 0.000 description 2
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,7alpha,12alpha)-3,7,12-trihydroxy-cholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 1,2-di-O-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 0.000 description 2
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 description 2
- LVNGJLRDBYCPGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-distearoylphosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP([O-])(=O)OCC[NH3+])OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC LVNGJLRDBYCPGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIYWFOZZIZEEKJ-XVFCMESISA-N 1-[(2r,3r,4r,5r)-3-fluoro-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound F[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 UIYWFOZZIZEEKJ-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- NEVQCHBUJFYGQO-DNRKLUKYSA-N 1-[(2r,3r,4r,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-3-(2-methoxyethoxy)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound COCCO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 NEVQCHBUJFYGQO-DNRKLUKYSA-N 0.000 description 2
- OOAMPEWXTQNFAY-IYUNARRTSA-N 1-[(2r,3r,4r,5r)-5-[[tert-butyl(diphenyl)silyl]oxymethyl]-3-[2-(dimethylaminooxy)ethoxy]-4-hydroxyoxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C([C@@H]1[C@@H](O)[C@H]([C@@H](O1)N1C(NC(=O)C(C)=C1)=O)OCCON(C)C)O[Si](C(C)(C)C)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 OOAMPEWXTQNFAY-IYUNARRTSA-N 0.000 description 2
- JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro-(4-methoxyphenyl)-phenylmethyl]-4-methoxybenzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=CC=C1 JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AXTGDCSMTYGJND-UHFFFAOYSA-N 1-dodecylazepan-2-one Chemical compound CCCCCCCCCCCCN1CCCCCC1=O AXTGDCSMTYGJND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXUZARPLRQRNNX-DXTOWSMRSA-N 2-amino-9-[(2r,3r,4r,5r)-3-fluoro-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3h-purin-6-one Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1F UXUZARPLRQRNNX-DXTOWSMRSA-N 0.000 description 2
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 2
- IZHVBANLECCAGF-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3-(octadecanoyloxy)propyl octadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC IZHVBANLECCAGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CFMZSMGAMPBRBE-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyisoindole-1,3-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)N(O)C(=O)C2=C1 CFMZSMGAMPBRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WOKDXPHSIQRTJF-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3-[3-[3-[3-[3-[3-[3-(2,3-dihydroxypropoxy)-2-hydroxypropoxy]-2-hydroxypropoxy]-2-hydroxypropoxy]-2-hydroxypropoxy]-2-hydroxypropoxy]-2-hydroxypropoxy]-2-hydroxypropoxy]-2-hydroxypropoxy]propane-1,2-diol Chemical compound OCC(O)COCC(O)COCC(O)COCC(O)COCC(O)COCC(O)COCC(O)COCC(O)COCC(O)COCC(O)CO WOKDXPHSIQRTJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 5-Methylcytidine Natural products O=C1N=C(N)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LUCHPKXVUGJYGU-XLPZGREQSA-N 5-methyl-2'-deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 LUCHPKXVUGJYGU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 description 2
- UJBCLAXPPIDQEE-UHFFFAOYSA-N 5-prop-1-ynyl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CC#CC1=CNC(=O)NC1=O UJBCLAXPPIDQEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEHVGBZKEYRQSX-UHFFFAOYSA-N 7-deaza-adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1C=CN2 PEHVGBZKEYRQSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HCGHYQLFMPXSDU-UHFFFAOYSA-N 7-methyladenine Chemical compound C1=NC(N)=C2N(C)C=NC2=N1 HCGHYQLFMPXSDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004380 Cholic acid Substances 0.000 description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 2
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 2
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001066129 Homo sapiens Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 2
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000819572 Mus musculus Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- XGYUOGLHVKHRRK-SCFUHWHPSA-N O[C@@H]1[C@H](OP(O)(CCC#N)N(C(C)C)C(C)C)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=C(N)NC2=O)=C2N=C1 Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(CCC#N)N(C(C)C)C(C)C)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=C(N)NC2=O)=C2N=C1 XGYUOGLHVKHRRK-SCFUHWHPSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 2
- 101100272976 Panax ginseng CYP716A53v2 gene Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 101100269144 Rattus norvegicus Adam7 gene Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 2
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N Vidarabine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N 0.000 description 2
- LEBBDRXHHNYZIA-LDUWYPJVSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] n-[(z)-1,3-dihydroxyoctadec-4-en-2-yl]carbamate Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C/C(O)C(CO)NC(=O)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LEBBDRXHHNYZIA-LDUWYPJVSA-N 0.000 description 2
- JGJBTOUVZMRNGR-UHFFFAOYSA-N [(4-cyano-2-methylbutan-2-yl)-propan-2-ylamino]phosphonous acid Chemical compound C(#N)CCC(C)(C)N(P(O)O)C(C)C JGJBTOUVZMRNGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 2
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 2
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 2
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 2
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 2
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 2
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 2
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 2
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229910000085 borane Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N chenodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N 0.000 description 2
- 229960001091 chenodeoxycholic acid Drugs 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019416 cholic acid Nutrition 0.000 description 2
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 2
- 229960002471 cholic acid Drugs 0.000 description 2
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 2
- 229960004106 citric acid Drugs 0.000 description 2
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- HCAJEUSONLESMK-UHFFFAOYSA-N cyclohexylsulfamic acid Chemical compound OS(=O)(=O)NC1CCCCC1 HCAJEUSONLESMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 2
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 2
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 2
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 2
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 2
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 2
- 235000011087 fumaric acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 2
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 2
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 2
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 2
- 102000047486 human GAPDH Human genes 0.000 description 2
- 239000000416 hydrocolloid Substances 0.000 description 2
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N indomethacin Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 2
- 239000008011 inorganic excipient Substances 0.000 description 2
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 2
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 2
- XMGQYMWWDOXHJM-UHFFFAOYSA-N limonene Chemical compound CC(=C)C1CCC(C)=CC1 XMGQYMWWDOXHJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 2
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 2
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 2
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 2
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940099690 malic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 2
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 2
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XTEGVFVZDVNBPF-UHFFFAOYSA-N naphthalene-1,5-disulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(S(=O)(=O)O)=CC=CC2=C1S(O)(=O)=O XTEGVFVZDVNBPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 2
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 2
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000008012 organic excipient Substances 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940098695 palmitic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 2
- 229920000223 polyglycerol Polymers 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 2
- ZDYVRSLAEXCVBX-UHFFFAOYSA-N pyridinium p-toluenesulfonate Chemical compound C1=CC=[NH+]C=C1.CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 ZDYVRSLAEXCVBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N silicic acid Chemical compound O[Si](O)(O)O RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 2
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 2
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- IWQPOPSAISBUAH-VOVMJQHHSA-M sodium;2-[[(2z)-2-[(3r,4s,5s,8s,9s,10s,11r,13r,14s,16s)-16-acetyl-3,11-dihydroxy-4,8,10,14-tetramethyl-2,3,4,5,6,7,9,11,12,13,15,16-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-ylidene]-6-methylheptanoyl]amino]ethanesulfonate Chemical compound [Na+].C1C[C@@H](O)[C@@H](C)[C@@H]2CC[C@]3(C)[C@@]4(C)C[C@H](C(C)=O)/C(=C(C(=O)NCCS([O-])(=O)=O)/CCCC(C)C)[C@@H]4C[C@@H](O)[C@H]3[C@]21C IWQPOPSAISBUAH-VOVMJQHHSA-M 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 2
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000005987 sulfurization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N tioguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=S)C2=C1N=CN2 WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N triphenylphosphine Chemical compound C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N tristearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RUDATBOHQWOJDD-UZVSRGJWSA-N ursodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 RUDATBOHQWOJDD-UZVSRGJWSA-N 0.000 description 2
- 229960001661 ursodiol Drugs 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- NFLGAXVYCFJBMK-RKDXNWHRSA-N (+)-isomenthone Natural products CC(C)[C@H]1CC[C@@H](C)CC1=O NFLGAXVYCFJBMK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N (2R)-2-hydroxy-2-phenylacetic acid Chemical compound O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1.O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1 QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N 0.000 description 1
- ZGYYPTJWJBEXBC-QYYRPYCUSA-N (2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-fluoro-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1F ZGYYPTJWJBEXBC-QYYRPYCUSA-N 0.000 description 1
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical class OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- QGVQZRDQPDLHHV-DPAQBDIFSA-N (3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthrene-3-thiol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](S)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 QGVQZRDQPDLHHV-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 1
- NRWMBHYHFFGEEC-KTKRTIGZSA-N (9Z)-1-O-octadec-9-enyl glycerol Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(O)CO NRWMBHYHFFGEEC-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VDVMOGXIBBDZNI-DLEQIPTRSA-N (Z)-octadec-9-enoic acid propane-1,2,3-triol Chemical compound OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O VDVMOGXIBBDZNI-DLEQIPTRSA-N 0.000 description 1
- UWYVPFMHMJIBHE-OWOJBTEDSA-N (e)-2-hydroxybut-2-enedioic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(\O)C(O)=O UWYVPFMHMJIBHE-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- FFJCNSLCJOQHKM-CLFAGFIQSA-N (z)-1-[(z)-octadec-9-enoxy]octadec-9-ene Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC FFJCNSLCJOQHKM-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 1
- AVZIYOYFVVSTGQ-RBWRNIRVSA-N (z)-octadec-9-enoic acid;propane-1,2,3-triol Chemical compound OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O AVZIYOYFVVSTGQ-RBWRNIRVSA-N 0.000 description 1
- FJXSLZRUXGTLPF-HKIWRJGFSA-N (z)-octadec-9-enoic acid;propane-1,2,3-triol Chemical compound OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O FJXSLZRUXGTLPF-HKIWRJGFSA-N 0.000 description 1
- IIZBNUQFTQVTGU-PTTKHPGGSA-N (z)-octadec-9-enoic acid;propane-1,2,3-triol Chemical compound OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O IIZBNUQFTQVTGU-PTTKHPGGSA-N 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M .beta-Phenylacrylic acid Natural products [O-]C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M 0.000 description 1
- FYADHXFMURLYQI-UHFFFAOYSA-N 1,2,4-triazine Chemical class C1=CN=NC=N1 FYADHXFMURLYQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TUSDEZXZIZRFGC-UHFFFAOYSA-N 1-O-galloyl-3,6-(R)-HHDP-beta-D-glucose Natural products OC1C(O2)COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC1C(O)C2OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 TUSDEZXZIZRFGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GMZNBKCNDPRJTL-PRULPYPASA-N 1-[(2r,3r,4r,5r)-3-[2-(dimethylaminooxy)ethoxy]-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound CN(C)OCCO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 GMZNBKCNDPRJTL-PRULPYPASA-N 0.000 description 1
- OYEJRBXHENMLMA-PMHJDTQVSA-N 1-[(2r,3r,4r,5r)-5-[[tert-butyl(diphenyl)silyl]oxymethyl]-4-hydroxy-3-(2-hydroxyethoxy)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](OCCO)[C@H](O)[C@@H](CO[Si](C=2C=CC=CC=2)(C=2C=CC=CC=2)C(C)(C)C)O1 OYEJRBXHENMLMA-PMHJDTQVSA-N 0.000 description 1
- QPHRQMAYYMYWFW-FJGDRVTGSA-N 1-[(2r,3s,4r,5r)-3-fluoro-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O[C@]1(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 QPHRQMAYYMYWFW-FJGDRVTGSA-N 0.000 description 1
- WLXGQMVCYPUOLM-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxyethanesulfonic acid Chemical compound CC(O)S(O)(=O)=O WLXGQMVCYPUOLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZRNAYUHWVFMIP-KTKRTIGZSA-N 1-oleoylglycerol Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(O)CO RZRNAYUHWVFMIP-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- UHUHBFMZVCOEOV-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazo[4,5-c]pyridin-4-amine Chemical compound NC1=NC=CC2=C1N=CN2 UHUHBFMZVCOEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NOGFHTGYPKWWRX-UHFFFAOYSA-N 2,2,6,6-tetramethyloxan-4-one Chemical compound CC1(C)CC(=O)CC(C)(C)O1 NOGFHTGYPKWWRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSHACTSJHMKXTE-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminopropyl)-7h-purin-6-amine Chemical compound CC(N)CC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 QSHACTSJHMKXTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical group NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 2-METHOXYETHANOL Chemical compound COCCO XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YSAANLSYLSUVHB-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(dimethylamino)ethoxy]ethanol Chemical compound CN(C)CCOCCO YSAANLSYLSUVHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFVNOJDQRGSOEL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethyl octadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCCO RFVNOJDQRGSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PKRSYEPBQPFNRB-UHFFFAOYSA-N 2-phenoxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1OC1=CC=CC=C1 PKRSYEPBQPFNRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WLJVXDMOQOGPHL-PPJXEINESA-N 2-phenylacetic acid Chemical compound O[14C](=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-PPJXEINESA-N 0.000 description 1
- GXIURPTVHJPJLF-UWTATZPHSA-N 2-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC[C@H](C(O)=O)OP(O)(O)=O GXIURPTVHJPJLF-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OHXPGWPVLFPUSM-KLRNGDHRSA-N 3,7,12-trioxo-5beta-cholanic acid Chemical compound C1CC(=O)C[C@H]2CC(=O)[C@H]3[C@@H]4CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]4(C)C(=O)C[C@@H]3[C@]21C OHXPGWPVLFPUSM-KLRNGDHRSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCSXGCZMEPXKIW-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-4-[(4-methyl-2-nitrophenyl)diazenyl]-N-(3-nitrophenyl)naphthalene-2-carboxamide Chemical compound Cc1ccc(N=Nc2c(O)c(cc3ccccc23)C(=O)Nc2cccc(c2)[N+]([O-])=O)c(c1)[N+]([O-])=O MCSXGCZMEPXKIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASFAFOSQXBRFMV-LJQANCHMSA-N 3-n-(2-benzyl-1,3-dihydroxypropan-2-yl)-1-n-[(1r)-1-(4-fluorophenyl)ethyl]-5-[methyl(methylsulfonyl)amino]benzene-1,3-dicarboxamide Chemical compound N([C@H](C)C=1C=CC(F)=CC=1)C(=O)C(C=1)=CC(N(C)S(C)(=O)=O)=CC=1C(=O)NC(CO)(CO)CC1=CC=CC=C1 ASFAFOSQXBRFMV-LJQANCHMSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-REOHCLBHSA-N 3-phosphoglyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- YJCCSLGGODRWKK-NSCUHMNNSA-N 4-Acetamido-4'-isothiocyanostilbene-2,2'-disulphonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(NC(=O)C)=CC=C1\C=C\C1=CC=C(N=C=S)C=C1S(O)(=O)=O YJCCSLGGODRWKK-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 1
- XCUWBGFJIFKYQY-SGOXFDQRSA-N 4-amino-1-[(2r,3r,4r,5r)-3-fluoro-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1.O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 XCUWBGFJIFKYQY-SGOXFDQRSA-N 0.000 description 1
- WUBBRNOQWQTFEX-UHFFFAOYSA-N 4-aminosalicylic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C(O)=C1 WUBBRNOQWQTFEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940090248 4-hydroxybenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound SC=1C=CNC(=O)N=1 OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- IZZIWIAOVZOBLF-UHFFFAOYSA-N 5-methoxysalicylic acid Chemical compound COC1=CC=C(O)C(C(O)=O)=C1 IZZIWIAOVZOBLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CC1=CNC(=S)NC1=O ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KXBCLNRMQPRVTP-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1,5-dihydroimidazo[4,5-c]pyridin-4-one Chemical compound O=C1NC(N)=CC2=C1N=CN2 KXBCLNRMQPRVTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1h-pyrimidine-2-thione Chemical compound NC1=CC=NC(S)=N1 DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNNARSZPGNJZIX-UHFFFAOYSA-N 6-amino-5-prop-1-ynyl-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound CC#CC1=CNC(=O)N=C1N QNNARSZPGNJZIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOSIULRWFAEMFL-UHFFFAOYSA-N 7-deazaguanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1CC=N2 LOSIULRWFAEMFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRYKDUPGBWLLHO-UHFFFAOYSA-N 8-azaadenine Chemical compound NC1=NC=NC2=NNN=C12 HRYKDUPGBWLLHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-FJFJXFQQSA-N 9-beta-D-arabinofuranosylguanine Chemical compound C12=NC(N)=NC(O)=C2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-FJFJXFQQSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AQPPGUZEOPMCOG-DUGIGLDFSA-N B.[Si](C1=CC=CC=C1)(C1=CC=CC=C1)(C(C)(C)C)OC[C@@H]1[C@H]([C@H]([C@@H](O1)N1C(=O)NC(=O)C(=C1)C)OCCO)O Chemical compound B.[Si](C1=CC=CC=C1)(C1=CC=CC=C1)(C(C)(C)C)OC[C@@H]1[C@H]([C@H]([C@@H](O1)N1C(=O)NC(=O)C(=C1)C)OCCO)O AQPPGUZEOPMCOG-DUGIGLDFSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical class OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004255 Butylated hydroxyanisole Substances 0.000 description 1
- 239000004322 Butylated hydroxytoluene Substances 0.000 description 1
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUROTKWVJLEVPJ-UHFFFAOYSA-N C(C)(C)N(C(C)C)N1N=NN=[C-]1 Chemical compound C(C)(C)N(C(C)C)N1N=NN=[C-]1 MUROTKWVJLEVPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEUFWOSAZPUZST-UHFFFAOYSA-N CC(C)N(C(C)C)P(O)(O)OCCC#N Chemical compound CC(C)N(C(C)C)P(O)(O)OCCC#N UEUFWOSAZPUZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710186200 CCAAT/enhancer-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 102100034808 CCAAT/enhancer-binding protein alpha Human genes 0.000 description 1
- QYOVMAREBTZLBT-KTKRTIGZSA-N CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO QYOVMAREBTZLBT-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-SREVYHEPSA-N Cinnamic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-SREVYHEPSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- DSLZVSRJTYRBFB-LLEIAEIESA-N D-glucaric acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O DSLZVSRJTYRBFB-LLEIAEIESA-N 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N Dicyclohexylamine Chemical compound C1CCCCC1NC1CCCCC1 XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- NBGRQYOYNKEBQX-KGDXEMJRSA-N F.F.F.CCN(CC)CC.CN(C)OCCO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 Chemical compound F.F.F.CCN(CC)CC.CN(C)OCCO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 NBGRQYOYNKEBQX-KGDXEMJRSA-N 0.000 description 1
- 239000001263 FEMA 3042 Substances 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000039539 Fos family Human genes 0.000 description 1
- 108091067362 Fos family Proteins 0.000 description 1
- 229940123457 Free radical scavenger Drugs 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000058058 Glucose Transporter Type 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000042092 Glucose transporter family Human genes 0.000 description 1
- 108091052347 Glucose transporter family Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010007979 Glycocholic Acid Proteins 0.000 description 1
- 108010035713 Glycodeoxycholic Acid Proteins 0.000 description 1
- WVULKSPCQVQLCU-UHFFFAOYSA-N Glycodeoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(=O)NCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 WVULKSPCQVQLCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 229920002907 Guar gum Polymers 0.000 description 1
- 229920000569 Gum karaya Polymers 0.000 description 1
- 208000013016 Hypoglycemia Diseases 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000039537 Jun family Human genes 0.000 description 1
- 108091067369 Jun family Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000004166 Lanolin Substances 0.000 description 1
- 229920002884 Laureth 4 Polymers 0.000 description 1
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- NFLGAXVYCFJBMK-UHFFFAOYSA-N Menthone Chemical compound CC(C)C1CCC(C)CC1=O NFLGAXVYCFJBMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 238000006751 Mitsunobu reaction Methods 0.000 description 1
- 101100523539 Mus musculus Raf1 gene Proteins 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N N-methylglucamine Chemical compound CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 238000010934 O-alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- WTAYIFXKJBMZLY-XZABIIKCSA-N OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O Chemical compound OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O WTAYIFXKJBMZLY-XZABIIKCSA-N 0.000 description 1
- REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N Octadecylamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 229920002230 Pectic acid Polymers 0.000 description 1
- LRBQNJMCXXYXIU-PPKXGCFTSA-N Penta-digallate-beta-D-glucose Natural products OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)C(O)=C(O)C=2)O)=C1 LRBQNJMCXXYXIU-PPKXGCFTSA-N 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- 208000016012 Phenotypic abnormality Diseases 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical class OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002556 Polyethylene Glycol 300 Polymers 0.000 description 1
- 229920002565 Polyethylene Glycol 400 Polymers 0.000 description 1
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N R-2-phenyl-2-hydroxyacetic acid Natural products OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101150062264 Raf gene Proteins 0.000 description 1
- 101000945517 Rattus norvegicus CCAAT/enhancer-binding protein alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000945964 Rattus norvegicus CCAAT/enhancer-binding protein beta Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-O S-adenosyl-L-methionine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-O 0.000 description 1
- 108091006299 SLC2A2 Proteins 0.000 description 1
- ABBQHOQBGMUPJH-UHFFFAOYSA-M Sodium salicylate Chemical compound [Na+].OC1=CC=CC=C1C([O-])=O ABBQHOQBGMUPJH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HVUMOYIDDBPOLL-XWVZOOPGSA-N Sorbitan monostearate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O HVUMOYIDDBPOLL-XWVZOOPGSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-JAGXHNFQSA-N Spongothymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-JAGXHNFQSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000934878 Sterculia Species 0.000 description 1
- ULUAUXLGCMPNKK-UHFFFAOYSA-N Sulfobutanedioic acid Chemical class OC(=O)CC(C(O)=O)S(O)(=O)=O ULUAUXLGCMPNKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WBWWGRHZICKQGZ-UHFFFAOYSA-N Taurocholic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)C1(C)C(O)C2 WBWWGRHZICKQGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000534944 Thia Species 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- RLXCFCYWFYXTON-JTTSDREOSA-N [(3S,8S,9S,10R,13S,14S,17R)-3-hydroxy-10,13-dimethyl-17-[(2R)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-16-yl] N-hexylcarbamate Chemical group C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC(OC(=O)NCCCCCC)[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 RLXCFCYWFYXTON-JTTSDREOSA-N 0.000 description 1
- YKTSYUJCYHOUJP-UHFFFAOYSA-N [O--].[Al+3].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] Chemical compound [O--].[Al+3].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] YKTSYUJCYHOUJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004847 absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- XVIYCJDWYLJQBG-UHFFFAOYSA-N acetic acid;adamantane Chemical compound CC(O)=O.C1C(C2)CC3CC1CC2C3 XVIYCJDWYLJQBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001252 acrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229940023476 agar Drugs 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000005083 alkoxyalkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002877 alkyl aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000004996 alkyl benzenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 229940009868 aluminum magnesium silicate Drugs 0.000 description 1
- WMGSQTMJHBYJMQ-UHFFFAOYSA-N aluminum;magnesium;silicate Chemical compound [Mg+2].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] WMGSQTMJHBYJMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005122 aminoalkylamino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960004909 aminosalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002280 amphoteric surfactant Substances 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 229940031955 anhydrous lanolin Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001139 anti-pruritic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003908 antipruritic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-UHFFFAOYSA-N ara-adenosine Natural products Nc1ncnc2n(cnc12)C1OC(CO)C(O)C1O OIRDTQYFTABQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JEPAHPFDUXQBAO-FJFJXFQQSA-N arabinofuranosylguanine Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(NC(=N)N=C2O)=C2N[CH]1 JEPAHPFDUXQBAO-FJFJXFQQSA-N 0.000 description 1
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000013096 assay test Methods 0.000 description 1
- 239000003212 astringent agent Substances 0.000 description 1
- 229960000892 attapulgite Drugs 0.000 description 1
- CBHOOMGKXCMKIR-UHFFFAOYSA-N azane;methanol Chemical compound N.OC CBHOOMGKXCMKIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 235000013871 bee wax Nutrition 0.000 description 1
- 239000012166 beeswax Substances 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N benzathine Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNCCNCC1=CC=CC=C1 JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940092714 benzenesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960004365 benzoic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUMDYPCJJOFFON-UHFFFAOYSA-N beta-hydroxyethanesulfonic acid Natural products OCCS(O)(=O)=O SUMDYPCJJOFFON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008236 biological pathway Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 235000019282 butylated hydroxyanisole Nutrition 0.000 description 1
- 229940043253 butylated hydroxyanisole Drugs 0.000 description 1
- CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N butylated hydroxyanisole Chemical compound COC1=CC=C(O)C(C(C)(C)C)=C1.COC1=CC=C(O)C=C1C(C)(C)C CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010354 butylated hydroxytoluene Nutrition 0.000 description 1
- 229940095259 butylated hydroxytoluene Drugs 0.000 description 1
- 235000011132 calcium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- LDVVMCZRFWMZSG-UHFFFAOYSA-N captan Chemical compound C1C=CCC2C(=O)N(SC(Cl)(Cl)Cl)C(=O)C21 LDVVMCZRFWMZSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001733 carboxylic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920003086 cellulose ether Polymers 0.000 description 1
- 150000001783 ceramides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 description 1
- VDANGULDQQJODZ-UHFFFAOYSA-N chloroprocaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1Cl VDANGULDQQJODZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002023 chloroprocaine Drugs 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009816 chondrogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 235000013985 cinnamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930016911 cinnamic acid Natural products 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- HNEGQIOMVPPMNR-IHWYPQMZSA-N citraconic acid Chemical compound OC(=O)C(/C)=C\C(O)=O HNEGQIOMVPPMNR-IHWYPQMZSA-N 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 229940075614 colloidal silicon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 239000012059 conventional drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 239000012045 crude solution Substances 0.000 description 1
- 229940109275 cyclamate Drugs 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 1
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-M decanoate Chemical compound CCCCCCCCCC([O-])=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HABLENUWIZGESP-UHFFFAOYSA-N decanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCCCC(O)=O HABLENUWIZGESP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STORWMDPIHOSMF-UHFFFAOYSA-N decanoic acid;octanoic acid;propane-1,2,3-triol Chemical compound OCC(O)CO.CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCCCC(O)=O STORWMDPIHOSMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 229960002997 dehydrocholic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- SAIKDASRPDRSGZ-UHFFFAOYSA-O di(propan-2-yl)azanium;1,2,3-triaza-4-azanidacyclopenta-2,5-diene Chemical compound C1=NN=N[N-]1.CC(C)[NH2+]C(C)C SAIKDASRPDRSGZ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- GUJOJGAPFQRJSV-UHFFFAOYSA-N dialuminum;dioxosilane;oxygen(2-);hydrate Chemical compound O.[O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3].O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O GUJOJGAPFQRJSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001193 diclofenac sodium Drugs 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043237 diethanolamine Drugs 0.000 description 1
- FAMRKDQNMBBFBR-BQYQJAHWSA-N diethyl azodicarboxylate Substances CCOC(=O)\N=N\C(=O)OCC FAMRKDQNMBBFBR-BQYQJAHWSA-N 0.000 description 1
- RGLYKWWBQGJZGM-ISLYRVAYSA-N diethylstilbestrol Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(/CC)=C(\CC)C1=CC=C(O)C=C1 RGLYKWWBQGJZGM-ISLYRVAYSA-N 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N dimethyl(dioctadecyl)azanium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005160 dimyristoylphosphatidylglycerol Drugs 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- ROORDVPLFPIABK-UHFFFAOYSA-N diphenyl carbonate Chemical compound C=1C=CC=CC=1OC(=O)OC1=CC=CC=C1 ROORDVPLFPIABK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 1
- BPHQZTVXXXJVHI-AJQTZOPKSA-N ditetradecanoyl phosphatidylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@@H](O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC BPHQZTVXXXJVHI-AJQTZOPKSA-N 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N dithiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GTZOYNFRVVHLDZ-UHFFFAOYSA-N dodecane-1,1-diol Chemical group CCCCCCCCCCCC(O)O GTZOYNFRVVHLDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC([O-])=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009982 effect on human Effects 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 150000002081 enamines Chemical class 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940079360 enema for constipation Drugs 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- CHNUOJQWGUIOLD-NFZZJPOKSA-N epalrestat Chemical compound C=1C=CC=CC=1\C=C(/C)\C=C1/SC(=S)N(CC(O)=O)C1=O CHNUOJQWGUIOLD-NFZZJPOKSA-N 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- AFAXGSQYZLGZPG-UHFFFAOYSA-N ethanedisulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCS(O)(=O)=O AFAXGSQYZLGZPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;hexane Chemical compound CCCCCC.CCOC(C)=O OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAMRKDQNMBBFBR-UHFFFAOYSA-N ethyl n-ethoxycarbonyliminocarbamate Chemical compound CCOC(=O)N=NC(=O)OCC FAMRKDQNMBBFBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 150000002194 fatty esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- ODKNJVUHOIMIIZ-RRKCRQDMSA-N floxuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(F)=C1 ODKNJVUHOIMIIZ-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 1
- LRBQNJMCXXYXIU-QWKBTXIPSA-N gallotannic acid Chemical compound OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(=O)OC[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)C(O)=C(O)C=2)O)=C1 LRBQNJMCXXYXIU-QWKBTXIPSA-N 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- RZRNAYUHWVFMIP-HXUWFJFHSA-N glycerol monolinoleate Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@H](O)CO RZRNAYUHWVFMIP-HXUWFJFHSA-N 0.000 description 1
- 229940074049 glyceryl dilaurate Drugs 0.000 description 1
- 229940074045 glyceryl distearate Drugs 0.000 description 1
- 125000005908 glyceryl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003976 glyceryl group Polymers [H]C([*])([H])C(O[H])([H])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- RFDAIACWWDREDC-FRVQLJSFSA-N glycocholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 RFDAIACWWDREDC-FRVQLJSFSA-N 0.000 description 1
- WVULKSPCQVQLCU-BUXLTGKBSA-N glycodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 WVULKSPCQVQLCU-BUXLTGKBSA-N 0.000 description 1
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000004349 growth plate Anatomy 0.000 description 1
- 239000000665 guar gum Substances 0.000 description 1
- 235000010417 guar gum Nutrition 0.000 description 1
- 229960002154 guar gum Drugs 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- KWLMIXQRALPRBC-UHFFFAOYSA-L hectorite Chemical compound [Li+].[OH-].[OH-].[Na+].[Mg+2].O1[Si]2([O-])O[Si]1([O-])O[Si]([O-])(O1)O[Si]1([O-])O2 KWLMIXQRALPRBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000271 hectorite Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000006359 hepatoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 125000000592 heterocycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M hexadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QRMZSPFSDQBLIX-UHFFFAOYSA-N homovanillic acid Chemical compound COC1=CC(CC(O)=O)=CC=C1O QRMZSPFSDQBLIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 239000008172 hydrogenated vegetable oil Substances 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 229960000905 indomethacin Drugs 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910003480 inorganic solid Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002496 iodine Chemical class 0.000 description 1
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010494 karaya gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000231 karaya gum Substances 0.000 description 1
- 229940039371 karaya gum Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 229940039717 lanolin Drugs 0.000 description 1
- 235000019388 lanolin Nutrition 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 229940070765 laurate Drugs 0.000 description 1
- 229940062711 laureth-9 Drugs 0.000 description 1
- 239000008141 laxative Substances 0.000 description 1
- 229940125722 laxative agent Drugs 0.000 description 1
- 235000001510 limonene Nutrition 0.000 description 1
- 229940087305 limonene Drugs 0.000 description 1
- 229940049918 linoleate Drugs 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 230000031142 liver development Effects 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 229960005015 local anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000009115 maintenance therapy Methods 0.000 description 1
- 229960002510 mandelic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N mechlorethamine Chemical class ClCCN(C)CCCl HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004961 mechlorethamine Drugs 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 229930007503 menthone Natural products 0.000 description 1
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 150000004692 metal hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-UHFFFAOYSA-N methyl p-hydroxycinnamate Natural products OC(=O)C=CC1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006362 methylene amino carbonyl group Chemical group [H]N(C([*:2])=O)C([H])([H])[*:1] 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000001788 mono and diglycerides of fatty acids Substances 0.000 description 1
- HDZGCSFEDULWCS-UHFFFAOYSA-N monomethylhydrazine Chemical compound CNN HDZGCSFEDULWCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940074096 monoolein Drugs 0.000 description 1
- 229910052901 montmorillonite Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229940105132 myristate Drugs 0.000 description 1
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HLJZTLWDAQVZBU-YAMOITTJSA-N n-[9-[(2r,3r,4r,5r)-3-fluoro-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]purin-6-yl]benzamide Chemical compound F[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(NC(=O)C=3C=CC=CC=3)=C2N=C1 HLJZTLWDAQVZBU-YAMOITTJSA-N 0.000 description 1
- NZDWTKFDAUOODA-MMPOEDRJSA-N n-[9-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]purin-6-yl]benzamide Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(NC(=O)C=3C=CC=CC=3)=C2N=C1 NZDWTKFDAUOODA-MMPOEDRJSA-N 0.000 description 1
- YZMHQCWXYHARLS-UHFFFAOYSA-N naphthalene-1,2-disulfonic acid Chemical compound C1=CC=CC2=C(S(O)(=O)=O)C(S(=O)(=O)O)=CC=C21 YZMHQCWXYHARLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PSZYNBSKGUBXEH-UHFFFAOYSA-N naphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(S(=O)(=O)O)=CC=CC2=C1 PSZYNBSKGUBXEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KVBGVZZKJNLNJU-UHFFFAOYSA-N naphthalene-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=CC2=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C21 KVBGVZZKJNLNJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042880 natural phospholipid Drugs 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960005419 nitrogen Drugs 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 239000003883 ointment base Substances 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 239000003605 opacifier Substances 0.000 description 1
- 125000001181 organosilyl group Chemical group [SiH3]* 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 125000000913 palmityl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910052625 palygorskite Inorganic materials 0.000 description 1
- WLJNZVDCPSBLRP-UHFFFAOYSA-N pamoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC=3C4=CC=CC=C4C=C(C=3O)C(=O)O)=C(O)C(C(O)=O)=CC2=C1 WLJNZVDCPSBLRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- JLFNLZLINWHATN-UHFFFAOYSA-N pentaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCO JLFNLZLINWHATN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONTNXMBMXUNDBF-UHFFFAOYSA-N pentatriacontane-17,18,19-triol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)CCCCCCCCCCCCCCCC ONTNXMBMXUNDBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 239000008251 pharmaceutical emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000008255 pharmaceutical foam Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 238000010587 phase diagram Methods 0.000 description 1
- 229960002895 phenylbutazone Drugs 0.000 description 1
- VYMDGNCVAMGZFE-UHFFFAOYSA-N phenylbutazonum Chemical compound O=C1C(CCCC)C(=O)N(C=2C=CC=CC=2)N1C1=CC=CC=C1 VYMDGNCVAMGZFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008105 phosphatidylcholines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-M phosphinate Chemical compound [O-][PH2]=O ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RLOWWWKZYUNIDI-UHFFFAOYSA-N phosphinic chloride Chemical compound ClP=O RLOWWWKZYUNIDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005059 placental tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- ONJQDTZCDSESIW-UHFFFAOYSA-N polidocanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO ONJQDTZCDSESIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010318 polygalacturonic acid Substances 0.000 description 1
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- JFLRBGOBOJWPHI-UHFFFAOYSA-N pyridin-1-ium-1-sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)[N+]1=CC=CC=C1 JFLRBGOBOJWPHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRJJQCWNZGRKAU-UHFFFAOYSA-N pyridin-1-ium;fluoride Chemical compound F.C1=CC=NC=C1 GRJJQCWNZGRKAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003233 pyrroles Chemical class 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- LKUNXBRZDFMZOK-UHFFFAOYSA-N rac-1-monodecanoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO LKUNXBRZDFMZOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHBFNMLVSPCDGN-UHFFFAOYSA-N rac-1-monooctanoylglycerol Chemical compound CCCCCCCC(=O)OCC(O)CO GHBFNMLVSPCDGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000018406 regulation of metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 229960001860 salicylate Drugs 0.000 description 1
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M salicylate Chemical compound OC1=CC=CC=C1C([O-])=O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003873 salicylate salts Chemical class 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M sodium cholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- OABYVIYXWMZFFJ-ZUHYDKSRSA-M sodium glycocholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 OABYVIYXWMZFFJ-ZUHYDKSRSA-M 0.000 description 1
- VMSNAUAEKXEYGP-YEUHZSMFSA-M sodium glycodeoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 VMSNAUAEKXEYGP-YEUHZSMFSA-M 0.000 description 1
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 229960004025 sodium salicylate Drugs 0.000 description 1
- 229920003109 sodium starch glycolate Polymers 0.000 description 1
- 239000008109 sodium starch glycolate Substances 0.000 description 1
- 229940079832 sodium starch glycolate Drugs 0.000 description 1
- JAJWGJBVLPIOOH-IZYKLYLVSA-M sodium taurocholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 JAJWGJBVLPIOOH-IZYKLYLVSA-M 0.000 description 1
- 229940045946 sodium taurodeoxycholate Drugs 0.000 description 1
- FKJIJBSJQSMPTI-CAOXKPNISA-M sodium;(4r)-4-[(5s,8r,9s,10s,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-3,7,12-trioxo-1,2,4,5,6,8,9,11,14,15,16,17-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoate Chemical compound [Na+].C1CC(=O)C[C@H]2CC(=O)[C@H]3[C@@H]4CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]4(C)C(=O)C[C@@H]3[C@]21C FKJIJBSJQSMPTI-CAOXKPNISA-M 0.000 description 1
- JGMJQSFLQWGYMQ-UHFFFAOYSA-M sodium;2,6-dichloro-n-phenylaniline;acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O.ClC1=CC=CC(Cl)=C1NC1=CC=CC=C1 JGMJQSFLQWGYMQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- YXHRQQJFKOHLAP-FVCKGWAHSA-M sodium;2-[[(4r)-4-[(3r,5r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,12-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]ethanesulfonate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 YXHRQQJFKOHLAP-FVCKGWAHSA-M 0.000 description 1
- RMLUKZWYIKEASN-UHFFFAOYSA-M sodium;2-amino-9-(2-hydroxyethoxymethyl)purin-6-olate Chemical compound [Na+].O=C1[N-]C(N)=NC2=C1N=CN2COCCO RMLUKZWYIKEASN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000011076 sorbitan monostearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001587 sorbitan monostearate Substances 0.000 description 1
- 229940035048 sorbitan monostearate Drugs 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003445 sucroses Chemical class 0.000 description 1
- 125000000565 sulfonamide group Chemical group 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003871 sulfonates Chemical class 0.000 description 1
- 125000001273 sulfonato group Chemical group [O-]S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical group 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 235000015523 tannic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920002258 tannic acid Polymers 0.000 description 1
- 229940033123 tannic acid Drugs 0.000 description 1
- WBWWGRHZICKQGZ-GIHLXUJPSA-N taurocholic acid Chemical compound C([C@@H]1C[C@H]2O)[C@@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@H](O)C1 WBWWGRHZICKQGZ-GIHLXUJPSA-N 0.000 description 1
- NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N teniposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@@H](OC[C@H]4O3)C=3SC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N 0.000 description 1
- 229960001278 teniposide Drugs 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 235000007586 terpenes Nutrition 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- MHYGQXWCZAYSLJ-UHFFFAOYSA-N tert-butyl-chloro-diphenylsilane Chemical compound C=1C=CC=CC=1[Si](Cl)(C(C)(C)C)C1=CC=CC=C1 MHYGQXWCZAYSLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium fluoride Chemical compound [F-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC[14C](O)=O TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N 0.000 description 1
- JYKSTGLAIMQDRA-UHFFFAOYSA-N tetraglycerol Chemical compound OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO.OCC(O)CO JYKSTGLAIMQDRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- ZEMGGZBWXRYJHK-UHFFFAOYSA-N thiouracil Chemical compound O=C1C=CNC(=S)N1 ZEMGGZBWXRYJHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003087 tioguanine Drugs 0.000 description 1
- 230000025366 tissue development Effects 0.000 description 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 235000010487 tragacanth Nutrition 0.000 description 1
- 239000000196 tragacanth Substances 0.000 description 1
- 229940116362 tragacanth Drugs 0.000 description 1
- 230000037317 transdermal delivery Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 1
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-O triethylammonium ion Chemical compound CC[NH+](CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 125000002023 trifluoromethyl group Chemical group FC(F)(F)* 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IYGPXXORQKFXCZ-UHFFFAOYSA-N tris(2-methoxyethyl) borate Chemical compound COCCOB(OCCOC)OCCOC IYGPXXORQKFXCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 125000002948 undecyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 229960003636 vidarabine Drugs 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
- 239000008307 w/o/w-emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 229940124024 weight reducing agent Drugs 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/33—Chemical structure of the base
- C12N2310/334—Modified C
- C12N2310/3341—5-Methylcytosine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Obesity (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
C/EBPαの発現をモジュレートするためのアンチセンス化合物、組成物および方法を提供する。組成物は、C/EBPαをコードする核酸を標的とするアンチセンス化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。C/EBPα発現のモジュレーションおよびC/EBPαの発現と関連した疾病の治療のためにこれらの化合物を使用する方法を提供する。
Description
【0001】
発明の属する分野
本発明はC/EBPα発現をモジュレートするための組成物と方法を提供する。特に、本発明はヒトC/EBPαをコードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。そのようなオリゴヌクレオチドは、C/EBPαの発現をモジュレートすることが示された。
【0002】
発明の背景
転写因子は、細胞外シグナルから細胞内応答への経路を結びつける様に機能する、細胞内の一群の分子のことをいう。環境刺激の後すぐに、サイトゾル中に優勢に残存するこれらのタンパク質は核に移行し、そこでそれらは標的遺伝子のプロモーターエレメント中の特異的なDNA配列に対して結合し、そしてこれらの標的遺伝子の転写を活性化する。転写因子のファミリーの一つであるCCAAT/エンハンサー−結合タンパク質類(C/EBP)は、正常な組織発生および細胞機能、細胞増殖および細胞分化を調節する遺伝子の広範囲のパネルの発現を制御する。このファミリーの6個の構成分子がこれまでに同定され、それらのすべてが他のC/EBPファミリーの構成分子だけでなくNFkBおよびFos/Junファミリーの転写因子の構成分子とホモ−およびヘテロ−二量体を両方とも形成する(Lekstrom−Himes and Xanthopoulos, J. Biol. Chem., 1998, 273, 28545−28548)。C/EBPファミリーの構成分子のすべてが同様のモジュールタンパク質構造を有している一方で、発現レベルおよび組織分布は幅広く異なっており、様々な役割を導く(Lekstrom−Himes and Xanthopoulos, J. Biol. Chem., 1998, 273, 28545−28548)。
【0003】
第一の構成分子は、もともとラット肝臓核の可溶性抽出物から単離されたものである、C/EBPαであり、CEBPAおよび単にC/EBPとしても知られる(Graves et al., Cell, 1986, 44, 565−576;Johnson et al., Genes Dev., 1987, 1, 133−146)。組織分布および発生の発現パターンの研究から、C/EBPαがエネルギー代謝に関与する組織において主として見出され、脂質、コレステロール、およびその他のステロールを代謝する能力を有することが示された(Birkenmeier et al., Genes Dev., 1989, 3, 1146−1156)。発現の最高レベルは、肝臓、脂肪組織、および胎盤組織において見出され、一方でより低いレベルが、肺および小腸において見出された。
【0004】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)遺伝子のcAMP反応性の研究において、CrossonとRoeslerは、ヘパトーマ細胞中でラットC/EBPαまたはラットC/EBPβに対するアンチセンスRNAを安定的に発現するプラスミドを設計した(J. Biol. Chem., 2000, 275(8): 5804−5809)。C/EBPαmRNAに対するアンチセンスは、C/EBPαタンパク質レベルおよびcAMP反応性を減少させ、一方でC/EBPβに対するアンチセンスは、何ら効果がなかった。
【0005】
ラットにおける研究において、C/EBPαが脂肪細胞分化の制御に関与していることが示された(Samuelsson et al., Embo J., 1991, 10, 3787−3793;Shao and Lazar, J. Biol. Chem., 1997, 272, 21473−21478)。アンチセンスC/EBP RNAのベクター−指向性発現を使用して、著者らは、C/EBPα転写物の発現が減少することだけでなく細胞質トリグリセリド蓄積が減少することを示し、これは脂肪細胞分化におけるα異性体の必要性を示している(Lin and Lane, Genes Dev., 1992, 6, 533−544)。C/EBPαは、軟骨形成分化(Vidal et al., J. Endocrinol., 1997, 155, 433−441)、ろ胞発生および排卵(Piontkewitz et al., Dev. Biol., 1996, 179, 288−296)、肝臓におけるステロイド−誘導性細胞周期停止(Ramos et al., Mol. Cell. Biol., 1996, 16, 5288−5301)、およびグルコーストランスポーターであるGLUT2のプロモーター活性の調節(Kim and Ahn, Biochem. J., 1998, 336, 83−90)を制御することもまた示された。これは、脳損傷後の活性化されたミクログリア細胞中においても発現される(Walton et al., Brain Res. Mol. Brain Res., 1998, 61, 11−22)。
【0006】
これらの知見は、C/EBPαが代謝のホルモン性制御および顆粒球発生に関与することを示すヒトにおける研究によりさらにサポートされる(Radomska et al., Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 4301−4314;Roesler et al., J. Biol. Chem., 1998, 273, 14950−14957)。
【0007】
C/EBP−欠損マウスが、6種のC/EBPファミリーの構成分子のうち5種について作製され、そしてこれらはシステム−特異的な表現型異常について特徴づけられた。C/EBPαは、肝臓の最終分化を調節する一次シグナルであり、そしてC/EBPαを欠損するマウスは、肝臓構造および機能の深在性の障害を有し、そして大多数が低血糖のために出生後すぐに死亡する。さらに、C/EBPα遺伝子を欠損するマウスは、不十分な顆粒球形成(Zhang et al., J. Exp. Med., 1998, 188, 1173−1184)、肝臓発生(Timchenko et al., Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 7353−7361;Tomizawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998, 249, 1−5)および骨髄性前駆体の分化(Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1997, 94, 569−574)を示す。
【0008】
時期−特異的な発現レベルの変化に加えて、C/EBP構成分子はまた、αおよびβ異性体に関して、5’上流オープンリーディングフレームにおいて、選択的開始位置から生じる多数の異性体発現を引き起こす(Geballe and Morris, Trends Biochem. Sci., 1994, 19, 159−164;Lincoln et al., J. Biol. Chem., 1998, 273, 9552−9560)。定常状態レベルの様々な転写物のプールはまた、年齢およびストレス負荷の関数として変化する(Hsieh et al., Mol. Biol. Cell, 1998, 9, 1479−1494)。マウスにおいて、ある異性体の特定の転写物の発現は、他のC/EBP異性体の発現を制御することも示された(Burgess−Beusse et al., Hepatology, 1999, 29, 597−601)。
【0009】
C/EBPαは、細胞内で2種の異性体として生じ、一つは完全長の42−kDa型でありそしてもう一つはより短い30−kDa型である。より短い型は、完全長タンパク質と比較して、選択的なトランス活性化潜在性を示す(Lekstrom−Himes and Xanthopoulos, J. Biol. Chem., 1998, 273, 28545−28548)。全長ヒトC/EBPα遺伝子およびその発現のためのベクターのDNA配列が、US特許5,545,563およびPCT出願WO 94/20113中に開示される(Darlington et al., 1994;Darlington et al., 1996)。C/EBPα遺伝子をガンおよびその他の疾患を治療するための方法において使用することもまた、WO 94/20113中に開示される。C/EBPαアンチセンスアゴニストもまた、一般的に開示される。
【0010】
したがって、C/EBPα活性および/または発現の薬理学的モジュレーションは、病理学的症状において治療介入の適切なポイントである可能性がある。
現在のところ、C/EBPαの合成を効果的に阻害する既知の治療剤は存在せず、現在まで、C/EBPα機能をモジュレートすることを目的とした研究ストラテジーには、抗体、アンチセンス発現ベクター、およびマウスにおける遺伝子ノックアウトが関連してきた。しかしながら、これらのストラテジー治療プロトコルとして試験されておらず、そして結果としてC/EBPα機能を効果的に阻害することができる剤に対する長い間感じられてきた必要性は存在し続けている。
【0011】
アンチセンス技術は、特定の遺伝子産物の発現を減少させるための効果的な手段として生じてきており、そしてしたがって、数々のC/EBPα発現をモジュレートするための治療用途、診断用途、そして研究用途において、唯一有用なものであることが証明されるだろう。
【0012】
本発明は、C/EBPαの長い異性体および短い異性体の両方をモジュレートすることを含む、C/EBPα発現をモジュレートするための組成物および方法を提供する。
【0013】
発明の概要
本発明は、C/EBPαをコードする核酸を標的とし、そしてC/EBPαの発現をモジュレートする、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物およびその他の組成物もまた、提供する。さらに、細胞または組織中でC/EBPαの発現をモジュレートする方法であって、前記細胞または組織を、1またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物と接触させることを含む、前記方法を提供する。さらに、治療的または予防的有効量の1またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物を投与することにより、C/EBPαの発現と関連する疾患または症状を有するか、またはかかっている可能性があると疑われる動物、特にヒトを治療する方法を提供する。
【0014】
発明の詳細な説明
本発明は、C/EBPαをコードする核酸分子の機能をモジュレートする際に使用するための、究極的には産生されるC/EBPαの量をモジュレートする際に使用するための、オリゴマーアンチセンス化合物、とくにオリゴヌクレオチドを利用する。これは、C/EBPαをコードする1またはそれ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することにより達成される。本明細書中で使用する場合、用語“標的核酸”および“C/EBPαをコードする核酸”は、C/EBPαをコードするDNA、このようなDNAから転写されるRNA(プレ−mRNAおよびmRNAを含む)、およびこのようなRNAに由来するcDNAも含む。オリゴマー化合物のその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、核酸の正常な機能を妨害する。標的核酸の機能のそれに特異的にハイブリダイズする化合物によるこのモジュレーションは、一般的に“アンチセンス”といわれる。妨害すべきDNAの機能には、複製および転写が含まれる。妨害されるべきRNAの機能には、すべての生存に必要な機能、たとえばRNAのタンパク質翻訳部位への転移(translocation)、RNAからタンパク質への翻訳、1またはそれ以上のmRNA種を得るためのRNAのスプライシング、およびRNAに含まれる触媒活性またはRNAにより促進される触媒活性、が含まれる。標的核酸機能によるこのような妨害の全体的な効果は、C/EBPαの発現のモジュレーションである。本発明の文脈において、“モジュレーション”とは、遺伝子の発現における増加(刺激)または減少(阻害)のいずれかを意味する。本発明の文脈において、阻害は遺伝子発現のモジュレーションの好ましい形態であり、そしてmRNAは好ましい標的である。
【0015】
アンチセンスに対する特異的核酸を標的とすることが好ましい。特定の核酸に対してアンチセンス化合物を“標的化する”とは、本発明の文脈において、複数工程のプロセスである。プロセスは通常、その機能をモジュレートすべき核酸配列の同定からはじめる。たとえば、このことは、その発現が特定の症状または疾患状態と関連する細胞の遺伝子(あるいはその遺伝子から転写されるmRNA)、または感染性病原体に由来する核酸分子でありうる。本発明において、標的はC/EBPαをコードする核酸分子である。標的化のプロセスにはまた、アンチセンス相互作用のためにこの遺伝子内部に1または複数の部位を決定し、所望の効果、たとえばタンパク質の発現の検出またはモジュレーション、を結果として生じるようにすることを含む。本発明の文脈において、好ましい遺伝子内部部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)の翻訳開始コドンあるいは終止コドンを含む領域である。当該技術分野において既知であるように、翻訳開始コドンは、典型的には5’−AUG(転写されたmRNA分子において;対応するDNA分子においては5’−ATG)であるので、翻訳開始コドンはまた、“AUGコドン”、“スタートコドン”または“AUGスタートコドン”とも呼ばれる。少数の遺伝子は、RNA配列5’−GUG、5’−UUGまたは5’−CUGを有する翻訳開始コドンを有し、そして5’−AUA、5’−ACGおよび5’−CUGが、in vivoで機能することが示された。このように、それぞれの事例における開始アミノ酸は典型的にはメチオニン(真核細胞において)またはホルミルメチオニン(原核細胞において)であるにもかかわらず、用語“翻訳開始コドン”および“スタートコドン”は、多くのコドン配列を含むことができる。真核細胞の遺伝子および原核細胞の遺伝子は、2またはそれ以上の代わりのスタートコドンを有する場合があり、そのいずれもが好ましくは特定の細胞型または組織においてまたは特定の条件のセットのもとにおいて、翻訳開始のために利用することができる、ということも、当該技術分野において既知である。本発明の文脈において、“スタートコドン”および“翻訳開始コドン”は、そのようなコドンの1またはそれ以上の配列にかかわらず、in vivoで使用して、C/EBPαをコードする遺伝子から転写されるmRNA分子の翻訳を開始する、1またはそれ以上のコドンのことをいう。
【0016】
遺伝子の翻訳終止コドン(または“停止コドン”)は、3つの配列、すなわち、5’−UAA、5’−UAGおよび5’−UGA(対応するDNA配列は、それぞれ、5’−TAA、5’−TAGおよび5’−TGA)のうちの一つを有しうることも、当該技術分野において既知である。用語“スタートコドン領域”および“翻訳開始コドン領域”は、翻訳開始コドンからいずれかの方向(すなわち、5’または3’)に約25から約50の連続するヌクレオチドを含む、mRNAあるいは遺伝子の部分のことを言う。同様に、用語“停止コドン領域”および“翻訳終止コドン領域”は、翻訳終止コドンからいずれかの方向(すなわち、5’または3’)に約25から約50の連続するヌクレオチドを含む、mRNAまたは遺伝子の部分のことを言う。
【0017】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとのあいだの領域のことを言うと当該技術分野において知られているオープンリーディングフレーム(ORF)または“コード領域”はまた、効果的に標的化されうる領域でもある。その他の標的領域には、翻訳開始コドンから5’方向におけるmRNAの部分、そしてしたがってmRNAの5’キャップ部位と翻訳開始コドンとのあいだのヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むもの、のことをいうと当該技術分野において知られている5’非翻訳領域(5’UTR)、そして翻訳終止コドンから3’方向におけるmRNAの部分、そしてしたがってmRNAの翻訳終止コドンと3’末端とのあいだのヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むもの、のことをいうと当該技術分野において知られている3’非翻訳領域(3’UTR)、が含まれる。mRNAの5’キャップには5’−5’三リン酸結合を介して、mRNAの最も5’側の残基と結合するN7−メチル化グアノシン残基を含む。mRNAの5’キャップ領域は、5’キャップ構造それ自体だけでなく、キャップに隣接する最初の50ヌクレオチドも含むと考えられている。5’キャップ領域もまた、好ましい標的領域でありうる。
【0018】
いくつかの真核細胞mRNA転写物は直接的に翻訳されるが、多くは1またはそれ以上の“イントロン”として知られる領域を含有し、それらは翻訳される前に転写物から切り出される。残りの(そしてしたがって翻訳される)領域は、 “エクソン”として知られ、そして一緒にスプライシングされて連続的なmRNA配列を形成する。mRNAスプライス部位、すなわち、イントロン−エクソン結合もまた、好ましい標的領域である場合があり、そして特に異常なスプライシングが疾患に関与しているか、あるいは特定のmRNAスプライス産物の過剰産生が疾患に関与している状況において、特に有用である。再構成または欠損による異常な融合結合もまた、好ましい標的である。イントロンも有効である場合があり、そしてしたがって、たとえばDNAまたはプレ−mRNAを標的とするアンチセンス化合物のための標的領域が好ましい場合があることもまた、見出した。
【0019】
いったん1またはそれ以上の標的部位を同定したら、標的に対して十分に相補的な、すなわち、十分によくそして十分に特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドを選択し、所望の効果を得る。
【0020】
本発明の文脈において、“ハイブリダイゼーション”とは、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間のワトソン−クリック水素結合、フーグスティーン水素結合または逆フーグスティーン水素結合でありうる、水素結合を意味する。たとえば、アデニンおよびチミンは相補的な核塩基であり、水素結合を形成することを通じて対合する。本明細書中で使用する場合、“相補的”とは、2つのヌクレオチド間で正確に対合するための能力のことをいう。たとえば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドがDNAまたはRNA分子の同一の位置でヌクレオチドと水素結合することができる場合、オリゴヌクレオチドおよびDNAまたはRNAは、その位置において互いに相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチドおよびDNAまたはRNA は、それぞれの分子中での十分な数の対応する位置が、互いに水素結合することができるヌクレオチドにより占められている場合、互いに相補的である。したがって、“特異的にハイブリダイズ可能”および“相補的”は、安定でそして特異的な結合がオリゴヌクレオチドとDNAまたはRNA標的とのあいだで生じるような、十分な程度の相補性または正確な対合を示すために使用される用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の配列と100%の相同性がある必要はないことは、当該技術分野において理解されている。アンチセンス化合物は、標的DNAまたはRNA分子に対する化合物の結合が標的DNAまたはRNAの正常な機能を妨害して利用できないようにし、そして特異的な結合が所望される条件下、すなわち、in vivoアッセイまたは治療の場合には生理学的条件下、そしてin vitroアッセイの場合には、アッセイを行う条件下にて、非−標的配列に対するアンチセンス化合物の非−特異的結合を妨害するための十分な程度の相補性が存在する場合、特異的にハイブリダイズ可能である。
【0021】
アンチセンス化合物は、一般的に、研究用試薬および診断薬として使用される。たとえば、当業者はしばしば、正確な特異性により遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、特定遺伝子の機能を解明する。たとえば、アンチセンス化合物を使用して、生物学的経路の様々なメンバーの機能どうしを区別することもある。アンチセンスモジュレーションは、したがって、研究用途として使用された。
【0022】
アンチセンスの特異性および感受性も、治療用途として当業者に利用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、動物およびヒトにおける疾患状態を治療する際の治療部分として使用した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトに対して安全にそして効果的に投与され、そして多くの臨床試験が現在進行中である。したがって、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織および動物、特にヒトの治療のための治療計画において有用なものとして形成することができる、有用な治療様式でありうることが確立される。本発明の文脈において、用語“オリゴヌクレオチド”とは、リボ核酸(RNA)またはデオキシリボ核酸(DNA)のオリゴマーまたはポリマー、またはそれらの模倣体のことをいう。この用語には、天然に存在する核塩基、糖および共有ヌクレオシド間(バックボーン)結合、および同様に機能する非−天然に存在する部分を有するオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが含まれる。このような修飾されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、たとえば、細胞取り込みの亢進、核酸標的に対する親和性の亢進、そしてヌクレアーゼの存在下における安定性の増加などの望ましい特性のため、しばしば天然の型より好ましい。
【0023】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス化合物の好ましい形態である一方、本発明は、以下に記載するようなオリゴヌクレオチド模倣体(しかし、これらのものには限定されない)を含む、その他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明に従うアンチセンス化合物は、好ましくは、約8〜約30核塩基(すなわち、約8〜約30の連結したヌクレオシド)を含む。具体的な好ましいアンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは約12〜約25核塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。当該技術分野において知られているように、ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常はヘテロ環式塩基である。このようなヘテロ環式塩基の2つの最も一般的なクラスは、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含む、ヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドに対して、リン酸基は、糖の2’、3’または5’ヒドロキシル部分のいずれかに結合することができる。オリゴヌクレオチドを形成する際に、リン酸基が隣接するヌクレオシドと互いに共有結合し、直鎖ポリマー化合物を形成する。引き続いて、この直鎖ポリマー化合物のそれぞれの末端がさらに一緒になって、環状構造を形成することができるが、しかしながら、開環直鎖構造が一般的には好ましい。オリゴヌクレオチド構造中において、リン酸基とは、一般的には、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成するものと言われる。RNAおよびDNAの正常な結合またはバックボーンは、3’から5’のホスホジエステル結合である。
【0024】
本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例には、修飾バックボーンまたは非−天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書中で定義する場合、修飾バックボーンを有するオリゴヌクレオチドには、バックボーン中にリン原子を保持するものや、バックボーン中にリン原子を有さないものが含まれる。本明細書の目的のため、そして当該技術分野において時々参照される場合、そのヌクレオシド間バックボーン中にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであると考えることができる。
【0025】
好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンには、たとえば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3’−アミノホスホールアミデートおよびアミノアルキルホスホールアミデートを含むホスホールアミデート、チオノホスホールアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な3’−5’結合を有するボラノホスホネート、2’−5’結合したこれらの類似体、そしてヌクレオシドユニットの隣接する塩基対が、5’−3’に対して3’−5’または5’−2’に対して2’−5’に結合する、逆向きの極性を有するもの、が含まれる。様々な塩、混合塩、そして遊離酸型も含まれる。
【0026】
上述したリン−含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.: 3,687,808;4,469,863;4,476,301;5,023,243;5,177,196;5,188,897;5,264,423;5,276,019;5,278,302;5,286,717;5,321,131;5,399,676;5,405,939;5,453,496;5,455,233;5,466,677;5,476,925;5,519,126;5,536,821;5,541,306;5,550,111;5,563,253;5,571,799;5,587,361;および5,625,050が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そして参考文献としてそのそれぞれを本明細書中に援用する。
【0027】
リン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖アルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテロ原子そしてアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1またはそれ以上の短鎖へテロ原子またはヘテロ環式ヌクレオシド間結合により形成される、バックボーンを有する。これらには、モルホリノ結合(部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される);シロキサンバックボーン;スルフィド、スルホキシドおよびスルホンバックボーン;ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン;メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン;アルケン含有バックボーン;スルファメートバックボーン;メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノバックボーン;スルホネートおよびスルホンアミドバックボーン;アミドバックボーン;および混合N、O、SおよびCH2構成要素部分を有するその他のもの、を有するものが含まれる。
【0028】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.: 5,034,506;5,166,315;5,185,444;5,214,134;5,216,141;5,235,033;5,264,562;5,264,564;5,405,938;5,434,257;5,466,677;5,470,967;5,489,677;5,541,307;5,561,225;5,596,086;5,602,240;5,610,289;5,602,240;5,608,046;5,610,289;5,618,704;5,623,070;5,663,312;5,633,360;5,677,437;および5,677,439が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そして参考文献としてそのそれぞれを本明細書中に援用する。
【0029】
その他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体において、ヌクレオチドユニットの糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、バックボーンを、新規の基により置換する。塩基ユニットは、適した核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのための維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有すると示されたそのようなオリゴマー化合物の一つであるオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸(PNA)とも呼ばれている。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−バックボーンは、アミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンにより置換される。核塩基を保持し、そしてバックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.: 5,539,082;5,714,331;および5,719,262が含まれるが、これらだけには限定されず、そのそれぞれを本明細書中に参考文献として援用する。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsenら(Science, 1991, 254, 1497−1500)中に見出すことができる。
【0030】
本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエートバックボーンを有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子バックボーンを有するオリゴヌクレオシドであり、特に上述の米国特許5,489,677の−CH2−NH−O−CH2−、−CH2−N(CH3)−O−CH2−〔メチレン(メチルイミノ)またはMMIバックボーン〕、−CH2−O−N(CH3)−CH2−、−CH2−N(CH3)−N(CH3)−CH2−および−O−N(CH3)−CH2−CH2−〔ここで、天然のホスホジエステルバックボーンは−O−P−O−CH2−として示される〕そして上述の米国特許5,602,240のアミドバックボーンである。上述した米国特許5,034,506のモルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい。
【0031】
修飾オリゴヌクレオチドは、1またはそれ以上の置換糖部分も含有する。好ましいオリゴヌクレオチドは、2’位で以下のものの一つを含む:OH;F;O−、S−、またはN−アルキル;O−、S−、またはN−アルケニル;O−、S−またはN−アルキニル;またはO−アルキル−O−アルキル、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のC1〜C10アルキルまたはC2〜C10アルケニルおよびアルキニルでありうる。O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2、ここでnおよびmは1から約10である、が特に好ましい。その他の好ましいオリゴヌクレオチドは、2’位に以下のものの一つを含む:C1〜C10の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、O−アルカリールまたはO−アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、リポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬理特性を向上するための基、そして同様の特性を有するその他の置換基を含む。好ましい修飾には、2’−メトキシエトキシ(2’−O−CH2CH2OCH3、2’−O−(2−メトキシエチル)または2’−MOEとしても知られる)(Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486−504)、すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。さらに好ましい修飾には、2’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書の以下の実施例に記載する場合、2’−DMAOEとしても知られるO(CH2)2ON(CH3)2基、そして2’−ジメチルアミノエトキシエトキシ(当該技術分野において2’−O−ジメチルアミノエトキシエチルまたは2’−DMAEOEとしても知られる)、すなわち、本明細書中の以下の実施例において2’−O−CH2−O−CH2−N(CH2)2とも記載される、が含まれる。
【0032】
その他の好ましい修飾には、2’−メトキシ(2’−O−CH3)、2’−アミノプロポキシ(2’−OCH2CH2CH2NH2)および2’−フルオロ(2’−F)が含まれる。同様の修飾もまた、オリゴヌクレオチドのその他の位、特に3’末端ヌクレオチドまたは2’−5’結合オリゴヌクレオチド中の糖の3’位および5’末端ヌクレオチドの5’位において作製することもできる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有する場合もある。このような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.: 4,981,957;5,118,800;5,319,080;5,359,044;5,393,878;5,446,137;5,466,786;5,514,785;5,519,134;5,567,811;5,576,427;5,591,722;5,597,909;5,610,300;5,627,053;5,639,873;5,646,265;5,658,873;5,670,633;および5,700,920が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そしてそのそれぞれはその全体を参考文献として本明細書中に援用する。
【0033】
オリゴヌクレオチドには、核塩基(しばしば当該技術分野において単に“塩基”としても呼ばれる)修飾または置換も含まれうる。本明細書中に使用される場合、“非修飾”または“天然”核塩基には、プリン塩基、アデニン(A)およびグアニン(G)、そしてピリミジン塩基、チミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)が含まれる。修飾核塩基には、その他の合成および天然核塩基、たとえば5−メチルシトシン(5−me−C)、5−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6−メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2−プロピルおよびその他のアルキル誘導体、2−チオウラシル、2−チオチミンおよび2−チオシトシン、5−ハロウラシルおよびシトシン、5−プロピニルウラシルおよびシトシン、6−アゾのウラシル、シトシンおよびチミン、5−ウラシル(シュードウラシル)、4−チオウラシル、8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシルおよびその他の8−置換アデニンおよびグアニン、5−ハロ、特に5−ブロモ、5−トリフルオロメチルおよびその他の5−置換ウラシルおよびシトシン、7−メチルグアニンおよび7−メチルアデニン、8−アザグアニンおよび8−アザアデニン、7−デアザグアニンおよび7−デアザアデニンおよび3−デアザグアニンおよび3−デアザアデニンが含まれる。さらなる核塩基には、米国特許No. 3,687,808に開示されたもの、Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858−859、Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されたもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されたもの、そしてSanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289−302, Crooke, S.T. and Lebleu, B. , ed., CRC Press, 1993により開示されたもの、が含まれる。これらの核塩基の特定のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、2−アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシンを含む、5−置換ピリミジン、6−アザピリミジンおよびN−2、N−6およびO−6置換プリンが含まれる。5−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を0.6〜1.2℃増加させることが示され(Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276−278)、そして現在は好ましい塩基置換であり、2’−O−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合にさらにより特に好ましい。
【0034】
上述した修飾核塩基の特定のものおよびその他の修飾核塩基の調製を教示する代表的な米国特許には、上述したU.S. 3,687,808、およびU.S.: 4,845,205;5,130,302;5,134,066;5,175,273;5,367,066;5,432,272;5,457,187;5,459,255;5,484,908;5,502,177;5,525,711;5,552,540;5,587,469;5,594,121;5,596,091;5,614,617;および5,681,941が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そしてそのそれぞれは参考文献として本明細書中に援用し、そして米国特許5,750,692が含まれ、これは本出願により一般に所有されるものであり、そして参考文献として本明細書中に援用する。
【0035】
本発明のオリゴヌクレオチドのその他の修飾には、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを向上する、化学的にオリゴヌクレオチドに結合する1またはそれ以上の部分または複合体が含まれる。そのような部分には、脂質部分、たとえばコレステロール部分(Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553−6556)、コール酸(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053−1060)、チオエーテル、たとえば、ヘキシル−S−トリチルチオール(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306−309;Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765−2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533−538)、脂肪族鎖、たとえば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison−Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111−1118;Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327−330;Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49−54)、リン脂質、たとえば、ジ−ヘキサデシル−rac−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グリセロ−3−H−ホスホネート(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651−3654;Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777−3783)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleoside, 1995, 14, 969−973)、またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651−3654)、パルミチル部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229−237)、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923−937)が含まれるが、これらには限定されない。
【0036】
この様なオリゴヌクレオチド複合体の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.: 4,828,979;4,948,882;5,218,105;5,525,465;5,541,313;5,545,730;5,552,538;5,578,717, 5,580,731;5,580,731;5,591,584;5,109,124;5,118,802;5,138,045;5,414,077;5,486,603;5,512,439;5,578,718;5,608,046;4,587,044;4,605,735;4,667,025;4,762,779;4,789,737;4,824,941;4,835,263;4,876,335;4,904,582;4,958,013;5,082,830;5,112,963;5,214,136;5,082,830;5,112,963;5,214,136;5,245,022;5,254,469;5,258,506;5,262,536;5,272,250;5,292,873;5,317,098;5,371,241, 5,391,723;5,416,203, 5,451,463;5,510,475;5,512,667;5,514,785;5,565,552;5,567,810;5,574,142;5,585,481;5,587,371;5,595,726;5,597,696;5,599,923;5,599,928および5,688,941が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そしてそのそれぞれは参考文献として本明細書中に援用される。
【0037】
所定の化合物中のすべての位置を均一に修飾されることが必要とはされず、そして実際に、一つ以上の上述した修飾を、単一の化合物中あるいはオリゴヌクレオチド中の単一のヌクレオシドにおいても組み込むことができる。本発明には、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含まれる。本発明の文脈において、“キメラ”アンチセンス化合物または“キメラ”は、2つまたはそれ以上の化学的に特徴的な領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドであり、それぞれが少なくとも一つのモノマーユニット、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合にヌクレオチドから形成される。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも一つの領域を含有し、ここでオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに対して、増加したヌクレアーゼ分解耐性、増加した細胞取り込みおよび/または標的核酸に対する増加した結合親和性を付与するように、修飾される。オリゴヌクレオチドの追加の領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質として働くことができる。例を挙げると、RNase Hは、RNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する、細胞性のエンドヌクレアーゼである。RNase Hの活性化により、したがって、結果としてRNA標的の切断を引き起こし、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を非常に向上させる。結果として、キメラオリゴヌクレオチドを使用する場合に、同一の標的領域に対してハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドの場合と比較して、しばしばより短いオリゴヌクレオチドにより匹敵する結果を得ることができる。RNA標的の切断は、ゲル電気泳動により、そして必要な場合には当該技術分野において既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術により、日常的に検出することができる。
【0038】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、2つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび/または上述したオリゴヌクレオチド模倣体の混成の構造として形成することができる。このような化合物は、 当該技術分野においてハイブリッドまたはギャップマーとも呼ばれている。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.: 5,013,830;5,149,797;5,220,007;5,256,775;5,366,878;5,403,711;5,491,133;5,565,350;5,623,065;5,652,355;5,652,356;および5,700,922が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そしてそのそれぞれは全体として参考文献として本明細書中に援用される。
【0039】
本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、周知の固相合成技術を介して、容易にそして日常的に作製することができる。このような合成のための装置は、たとえばApplied Biosystems(Foster City, CA)を含むいくつかの供給者により販売されている。このような合成のための当該技術分野において既知のいずれかその他の手段を、追加的にまたは代替的に使用することができる。同様な技術を使用してホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製することは周知である。
【0040】
本発明のアンチセンス化合物は、in vitroで合成され、そして生物学的起源のアンチセンス組成物またはアンチセンス分子のin vivo合成を指向するように設計された遺伝子ベクター構築物を含まない。
【0041】
本発明の化合物を、取り込み、分布および/または吸収を助けるために、たとえば、リポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所またはその他の製剤として、混合し、カプセル化し、複合体化することができ、またはそうでなければ、その他の分子、分子構造、または化合物の混合物と結合させてもよい。そのような取り込み、分布および/または吸収を助ける製剤の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.: 5,108,921;5,354,844;5,416,016;5,459,127;5,521,291;5,543,158;5,547,932;5,583,020;5,591,721;4,426,330;4,534,899;5,013,556;5,108,921;5,213,804;5,227,170;5,264,221;5,356,633;5,395,619;5,416,016;5,417,978;5,462,854;5,469,854;5,512,295;5,527,528;5,534,259;5,543,152;5,556,948;5,580,575;および5,595,756が含まれるが、それらには限定されず、そのそれぞれを参考文献として本明細書中に援用する。
【0042】
本発明のアンチセンス化合物は、いずれかの医薬的に許容可能な塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物に投与する際にその生物学的に活性な代謝物または残留物を(直接的にまたは間接的に)提供することができるいずれか他の化合物を包含する。したがって、たとえば、開示から、プロドラッグおよび医薬的に許容可能な本発明の化合物の塩、そのプロドラッグの医薬的に許容可能な塩、およびその他の生物学的等価物も導き出される。
【0043】
用語“プロドラッグ”は、内在性の酵素またはその他の化学物質および/または条件の作用により、その体内または細胞内で活性化型(すなわち、薬物)に変換される、不活性型で調製される治療剤のことを示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ版は、GosselinらのWO 93/24510(1993年12月9日に発行)またはImbachらのWO 94/26764に開示された方法に従うSATE[(S−アセチル−2−チオエチル)ホスフェート]誘導体として調製される。
【0044】
用語“医薬的に許容可能な塩”とは、生理学的または医薬的に許容可能な本発明の化合物の塩:すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、そしてそれについての所望しない毒性効果を与えない塩のことをいう。
【0045】
医薬的に許容可能な塩基付加塩は、金属またはアミン、たとえばアルカリおよびアルカリ土類金属または有機アミンなどにより形成される。カチオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。適したアミンの例は、N,N’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、N−メチルグルカミン、およびプロカイン(たとえば、Berge et al., “Pharmaceutical Salts,” J. of Pharma Sci., 1977, 66, 1−19を参照)である。前記酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸型を十分な量の所望の塩基と接触させて、共有結合様式で塩を生成することにより、調製する。遊離酸型は、塩型を酸と接触させることにより、そして遊離酸を従来の様式で単離することにより、再生することができる。遊離酸型は、そのそれぞれの塩型とは、極性溶媒中への溶解性などの特定の生理学的特性においていくらか異なっているが、しかしそれ以外は、本発明の目的のためには、塩はそれらそれぞれの遊離酸と等価である。本明細書中で使用される場合、“医薬的な付加塩”には、本発明の組成物の構成要素の一つの酸型の医薬的に許容可能な塩が含まれる。これらには、アミンの有機酸塩または無機酸塩が含まれる。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩である。その他の適した医薬的に許容可能な塩は、当業者に周知であり、そして様々な無機酸および有機酸の塩基性塩が含まれ、たとえば、無機酸を有するものとしては、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸など;有機酸を有するものとしてはカルボン酸、スルホン酸、スルホ酸またはリン酸またはN−置換スルファミン酸、たとえば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、4−アミノサリチル酸、2−フェノキシ安息香酸、2−アセトキシ安息香酸、エンボン酸(embonic acid)、ニコチン酸またはイソニコチン酸;そしてアミノ酸を有するものとしては、本来はタンパク質の合成に関連する20個のα−アミノ酸、たとえばグルタミン酸、またはアスパラギン酸など、そしてまた、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−1,2−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−2−スルホン酸、ナフタレン−1,5−ジスルホン酸、2−または3−ホスホグリセリン酸、グルコース−6−ホスフェート、N−シクロヘキシルスルファミン酸(シクラメートの形成を伴う)を有するもの、またはその他の酸有機化合物、たとえば、アスコルビン酸などを有するものが含まれる。化合物の医薬的に許容可能な塩もまた、医薬的に許容可能なカチオンにより調製することができる。適した医薬的に許容可能なカチオンは、当業者に周知であり、そしてアルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび第四アンモニウムカチオンが含まれる。炭酸塩または炭酸水素塩もまた可能である。
【0046】
オリゴヌクレオチドについて、医薬的に許容可能な塩の好ましい例には、(a)ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミンなどのカチオンにより形成される塩;(b)無機酸、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などにより形成される酸付加塩;(c)有機酸、たとえば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などにより形成される塩;そして(d)塩素、臭素、およびヨウ素などの元素アニオンから形成される塩;が含まれるが、これらには限定されない。
【0047】
本発明のアンチセンス化合物は、診断薬、治療薬、予防薬、そして研究用試薬およびキットとして使用することができる。治療薬として、C/EBPαの発現をモジュレートすることにより治療することができる疾患または症状を有することが疑われる動物、好ましくはヒトを、本発明に従うアンチセンス化合物を投与することにより治療する。本発明の化合物を、有効量のアンチセンス化合物を適した医薬的に許容可能な希釈剤または担体に添加することにより、医薬組成物中で利用することができる。本発明のアンチセンス化合物および方法の使用はまた、予防的、たとえば、感染、炎症または腫瘍形成を予防しまたは遅延させるためにも有用である場合がある。
【0048】
これらの化合物がC/EBPαをコードする核酸に対してハイブリダイズし、この事実を探求するためにサンドイッチアッセイおよびその他のアッセイを容易に構築することができるため、本発明のアンチセンス化合物は、研究用としてそして診断薬として有用である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのC/EBPαをコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、当該技術分野において既知の手段により検出することができる。このような手段には、オリゴヌクレオチドに対する酵素の複合化、オリゴヌクレオチドの放射標識またはいずれかその他の適した検出手段を含むことができる。サンプル中のC/EBPαのレベルを検出するためのこの様な検出手段を使用するキットもまた、調製することができる。
【0049】
本発明にはまた、本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤が含まれる。本発明の医薬組成物は、局所治療または全身治療が所望されるかどうか、そして治療すべき領域に依存して、多数の方法により投与することができる。投与は、局所(眼を含み、および膣および直腸送達を含む粘膜に対するものを含む)、肺、たとえば、ネブライザーによるものを含む、粉末またはエアロゾルの吸入または吹き込みによるもの;気管内、鼻内、表皮、および経皮)、経口または非経口により行うことができる。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内の注射または注入;または頭蓋内、たとえば、くも膜下投与または脳室内投与が含まれる。少なくとも一つの2’−O−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与のために特に有用であると考えられている。
【0050】
局所投与のための医薬組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤、および粉剤が含まれうる。従来からの医薬的な担体、液体、粉末または油状基材、増粘剤などは、必要とされるかまたは所望される場合がある。コートしたコンドーム、手袋などもまた有用である。
【0051】
経口投与のための組成物および製剤には、粉末または顆粒、懸濁剤または水溶液または非水性媒体中溶液、カプセル、サシェ、または錠剤などが含まれる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が好ましい場合がある。
【0052】
非経口投与、くも膜下投与または脳室内投与のための組成物および製剤には、バッファー、希釈剤およびその他の適した添加物、たとえば浸透亢進剤、担体化合物、およびその他の医薬的に許容可能な担体または賦形剤もまた含有しうる、滅菌水溶液が含まれうる。
【0053】
本発明の医薬組成物には、溶液、エマルジョン、およびリポソーム含有製剤が含まれるが、これらには限定されない。これらの組成物は、既成液体、自己乳化性固体そして自己乳化性半固体が含まれる、様々な構成要素から生成することができるが、これらには限定されない。
【0054】
単位用量剤形中に容易に提供ことができる本発明の医薬製剤は、医薬業界において周知の従来技術にしたがって調製することができる。このような技術には、活性有効成分と1または複数の医薬的担体または1または複数の医薬的賦形剤とを組み合わせる工程が含まれる。一般的には、均質にそして緊密に、活性有効成分と液体担体または正確に分割した固体担体またはその両方と組み合わせ、その後必要とされる場合には生成物を成型することにより、製剤を調製する。
【0055】
本発明の組成物は、たとえば錠剤、カプセル、液体シロップ、軟ゲル、坐剤、および浣腸剤などの、しかしこれらには限定されない、多くの可能性のある用量剤形のいずれか中に製剤化することができる。本発明の組成物はまた、水性媒体、非水性媒体または混合媒体中の懸濁剤として製剤化することもできる。水性懸濁剤はさらに、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランを含む懸濁剤の粘度を上昇させる物質を含有してもよい。懸濁剤はまた、安定化剤を含有していてもよい。
【0056】
本発明の一態様において、医薬組成物を製剤化し、そして泡状物として使用することができる。医薬的な泡状物には、エマルジョン、マイクロエマルジョン、クリーム剤、ジェリー剤、およびリポソーム剤などの製剤を含むが、これらのものには限定されない。その性質において基本的に同様である一方、これらの製剤は、最終生成物の構成要素および密度において変化する。このような組成物および製剤の調製は、一般的に医薬および製剤の分野における当業者に知られており、そして本発明の組成物の製剤に対して適用することができる。
【0057】
エマルジョン
本発明の組成物は、エマルジョンとして調製しそして製剤化することができる。エマルジョンは、通常は直径0.1μmを超える液滴の形状で、一つの液体を別の液体中に分散させた典型的には不均質の系である(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199;Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245;Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335;Higuchi et al., in Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 301)。エマルジョンは、しばしば、互いに十分に混合され分散された2種の不混和性の液体相を含む二相システムである。一般的には、エマルジョンは、油中水型の種(w/o)または水中油型の種(o/w)のいずれかでありうる。液体相がバルクな油相中によく分離され微小滴として分散されている場合、得られた組成物を油中水型(w/o)エマルジョンと呼ぶ。あるいは、油相がバルクな液体相中によく分離され微小滴として分散されている場合、得られた組成物を水中油型(o/w)エマルジョンと呼ぶ。エマルジョンは、分散相と、液体相、油相のいずれか中に溶液としてあるいは別々の相としてそれ自体として存在していてもよい活性な薬物と、に加えて、さらに要素を包含していてもよい。乳化剤、安定化剤、色素、および抗酸化剤などの医薬的な賦形剤が、必要に応じてエマルジョン中に存在していてもよい。医薬的なエマルジョンは、たとえば、油中水中油型(o/w/o)および水中油中水型(w/o/w)エマルジョンの場合のような、2種以上の相を含む、マルチエマルジョンであってもよい。このような複合製剤は、しばしば、単なる2成分のエマルジョンでは得られない、特定の利点を提供する。o/wエマルジョンの個々の油滴が小さな水滴を含むマルチエマルジョンは、w/o/wエマルジョンを構成する。同様に、油性の連続相中に安定化された水の小球中に含まれる油滴のシステムは、o/w/oエマルジョンを提供する。
【0058】
エマルジョンは、熱力学的安定性をほとんど有さないかまたはまったく有さないことにより特徴付けられる。しばしば、エマルジョンの分散相または不連続相が、外部相または連続相中に十分に分散され、そして乳化剤の手段または製剤の粘性を介してこの形態に維持される。エマルジョンの相のいずれかは、エマルジョン−型軟膏基材およびクリームの場合の様に、半固体または個体であってもよい。エマルジョンを安定化するその他の手段には、エマルジョンのいずれかの相中に含まれてもよい、乳化剤を使用することが含まれる。乳化剤は、大きく4つのカテゴリーに分類される場合がある:合成サーファクタント、天然に存在する乳化剤、吸着基材、そして精密に分散された固体、である(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199)。
【0059】
合成サーファクタントは、界面活性剤としても知られているが、エマルジョンの製剤化において幅広い有用性が見出されており、そして文献においてもレビューされている(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199)。サーファクタントは、典型的には、両親媒性であり、そして親水性部分と疎水性部分とを含む。サーファクタントの疎水性の性質に対する親水性の性質の比率は、親水性/親油性バランス(HLB)と呼ばれ、そして製剤の調製においてサーファクタントを分類しそして選択する際の貴重なツールである。サーファクタントは、親水性基の性質に基づいて別のクラスに分類される場合がある:非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285)。
【0060】
エマルジョン製剤中で使用される天然に存在する乳化剤には、ラノリン、密ロウ、ホスファチド類、レシチンおよびアカシアが含まれる。吸着基材は、水を吸収して、w/oエマルジョンを形成するが、それでもそれらの半固体の硬さを維持するような、親水性特性を有し、たとえば無水ラノリンおよび親水性ワセリンがある。精密に分散された固体もまた、よい乳化剤として、特にサーファクタントと組み合わせて、そして粘着性の調製物中で使用された。これらには、重金属水酸化物;ベントナイト、アタパルガイト、ヘクトライト(hectorite)、カオリン、モンモリロン石、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなどの非膨張性クレー;色素;および炭素またはトリステアリン酸グリセリンなどの非極性固体;などの極性の無機固体が含まれる。
【0061】
非常に様々な非−乳化性物質もまた、エマルジョン製剤中に含まれ、そしてエマルジョンの特性に寄与する。これらには、脂質、油、ロウ、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、保水剤(humectants)、親水性コロイド、保存剤および抗酸化剤が含まれる(Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335;Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199)。
【0062】
親水性コロイドまたは親水コロイドには、多糖類(たとえば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラギーナン、グアルガム(guar gum)、インドゴム(karaya gum)、そしてトラガカント)、セルロース誘導体(たとえば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース)、そして合成ポリマー(たとえば、カルボマー(carbomers)、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー)などの、天然に存在するガムおよび合成のポリマーが含まれる。これらは、水中で分散しあるいは膨張して、強力な界面フィルムを分散相の滴の周囲に形成し、そして外部相の粘性を増大させることにより、エマルジョンを安定化させるコロイド溶液を形成する。
【0063】
エマルジョンはしばしば、微生物の増殖をすぐにサポートすることができる、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびホスファチドなどの多数の活性物質を含有するため、これらの製剤はしばしば保存剤を含む。エマルジョン製剤中に含まれる一般的に使用される保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第4アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、p−ヒドロキシ安息香酸のエステル、そしてホウ酸が含まれる。抗酸化剤もまた、一般的にエマルジョン製剤に添加して、製剤の変質を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル(alkyl gallates)、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤などのフリーラジカルスカベンジャー、およびクエン酸、酒石酸、およびレシチンなどの抗酸化剤シナージストであってもよい。
【0064】
外皮経路、経口経路、および非経口経路を介するエマルジョン製剤の使用およびそれらの製造のための方法は、文献中でレビューされてきた(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199)。経口送達のためのエマルジョン製剤は、製剤化が容易であり吸収および生物学的適合性の観点から効率的であるため、非常に幅広く使用されてきた(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245;Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199)。ミネラル油−ベースの緩下剤、油溶性ビタミンおよび高脂肪栄養調製物は、一般的に、o/wエマルジョンとして経口的に投与される物質に含まれる。
【0065】
本発明の一態様において、オリゴヌクレオチドと核酸の組成物は、マイクロエマルジョンとして製剤化される。マイクロエマルジョンは、水、油および単一の、光学的に等方性な、そして熱力学的に安定な液体溶液である両親媒性物質、のシステムとして定義されうる(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245)。典型的には、マイクロエマルジョンは、まず油を水溶性サーファクタント溶液中に分散させ、そしてついで一般的には中間鎖長アルコールである十分量の第4の構成要素を添加して、透明なシステムを形成することにより、調製されるシステムである。したがって、マイクロエマルジョンは、界面活性分子の界面フィルムにより安定化される2種の不混和性の液体の、熱力学的に安定で、等方性な、透明の分散物質としても記載された(Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185−215)。マイクロエマルジョンは、一般的には、油、水、サーファクタント、コサーファクタントおよび電解質を含む、3〜5種の構成要素を組み合わせることにより調製される。マイクロエマルジョンが油中水型(w/o)であるかあるいは水中油型(o/w)であるかは、使用される油およびサーファクタントの特性に依存し、そしてサーファクタント分子の構造のその極性頭部と炭化水素尾部の幾何学的な畳み込みに依存する(Schott, in Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 271)。
【0066】
相ダイアグラムを使用した現象学的アプローチが広く研究され、そしてマイクロエマルジョンを製剤化するための方法についての、当業者に対する、包括的な知識が得られた(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245;Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335)。従来のエマルジョンと比較して、マイクロエマルジョンは、自発的に形成される熱力学的に安定な小滴の製剤において、水−不溶性薬物を可溶化するという利点を提供する。
【0067】
マイクロエマルジョンの調製に使用されるサーファクタントには、イオン性サーファクタント、非−イオン性サーファクタント、Brij 96、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート(ML310)、テトラグリセロールモノオレエート(MO310)、ヘキサグリセロールモノオレエート(PO310)、ヘキサグリセロールペンタオレエート(PO500)、デカグリセロールモノカプレート(MCA750)、デカグリセロールモノオレエート(MO750)、デカグリセロールセクイオレエート(sequi oleate)(SO750)、デカグリセロールデカオレエート(DAO750)、が、単独であるいはコサーファクタントと組み合わせて含まれるが、これらには限定されない。コサーファクタントは、通常はエタノール、1−プロパノール、および1−ブタノールなどの短鎖アルコールであるが、サーファクタントフィルム中に浸透し、そして結果的にはサーファクタント分子のあいだで生成される空隙スペースのために不規則なフィルムを作製することにより、界面流動度を増大させるために働く。しかしながら、マイクロエマルジョンは、コサーファクタントを使用することなく調製することができ、そしてアルコールフリーの自己乳化マイクロエマルジョンシステムが当該技術分野において知られている。水相は、典型的には、水、薬物の水性溶液、グリセロール、PEG300、PEG400、ポリグリセロール、プロピレングリコールおよびエチレングリコールの誘導体であってもよいが、これらのものには限定されない。油相には、Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸エステル、中間鎖(C8−C12)モノ、ジ、およびトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリ糖化(glycolized)グリセリド、飽和ポリ糖化(glycolized)C8−C10グリセリド、植物油およびシリコーン油などの物質が含まれうるが、これらのものには限定されない。
【0068】
マイクロエマルジョンは、薬物溶解性および薬物の吸収亢進の観点から、特に興味深いものである。脂質ベースのマイクロエマルジョン(o/wおよびw/oの両方)は、ペプチドを含む薬物の経口生物学的適合性を亢進させると提唱された(Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385−1390;Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205)。マイクロエマルジョンは、薬物溶解性の向上、酵素的加水分解からの薬物の保護、膜流動度および膜透過性におけるサーファクタント−誘導性変化による薬物吸収の亢進の可能性、調製の容易性、固体用量剤形を超える経口投与の容易性、臨床的可能性の向上、および毒性の低減といった利点を提供する(Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385;Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138−143)。それらの構成要素を周囲温度において一緒にしておくと、しばしば、マイクロエマルジョンが自発的に形成される場合がある。このことは、易熱性(熱不安定性)薬物、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドを製剤化する際に、特に利点でありうる。マイクロエマルジョンは、美容用途および医薬用との両方において、活性構成要素の経皮的送達においても有効であった。本発明のマイクロエマルジョン組成物および製剤は、胃腸管からのオリゴヌクレオチドおよび核酸の全身性吸収の増加を促進し、および胃腸管、膣、口腔(buccal cavity)およびその他の投与領域中で、オリゴヌクレオチドおよび核酸の局所的細胞取り込みを向上させることができる。
【0069】
本発明のマイクロエマルジョンはまた、ソルビタンモノステアレート(Grill 3)、ラブラゾル(Labrasol)、および浸透亢進剤などの追加の構成要素および添加剤を含有して、製剤の特性を向上させ、そして本発明のオリゴヌクレオチドおよび核酸の吸収を亢進させることもできる。本発明のマイクロエマルジョン中で使用される浸透亢進剤は、5つの幅広いカテゴリーのうちの一つに属するものとして分類することができる:サーファクタント、脂肪酸、胆汁酸、キレート剤、および非−キレート非−サーファクタント(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92)。これらのクラスのそれぞれは、上述した。
【0070】
リポソーム
マイクロエマルジョン以外に、薬物の製剤化のために研究されそして使用された、多くの有機(organized)サーファクタント構造が存在する。これらには、単層、ミセル、二重層および小胞が含まれる。小胞、たとえばリポソーム、は、薬物送達の観点からそれらが提供する、その特異性および作用期間により、大きな興味をひきつけた。本明細書中で使用される場合、“リポソーム”という用語は、球状の1または複数の二重層中に配置された、両親媒性脂質からなる小胞を意味する。
【0071】
リポソームは、親油性物質から形成される膜および水性の内部を有する、単一ラメラ小胞またはマルチラメラ小胞である。水性部分には、送達すべき組成物が含有される。カチオン性リポソームは、細胞壁と融合することができるという利点を有する。非−カチオン性リポソームは、細胞壁とは効率的に融合することができないものの、マクロファージによりin vivoにおいて取り込まれる。
【0072】
無傷のほ乳動物皮膚を通過するために、脂質小胞は、適切な経皮的勾配の影響のもと、それぞれが直径50 nm未満であるような一連の微細な孔を通過しなければならない。したがって、高度に変形しやすくそしてそのような微細な孔を通過することができるリポソームを使用することが好ましい。
【0073】
リポソームのさらなる利点には、以下のものが含まれる;天然のリン脂質から得られたリポソームは、生物学的適合性であり、そして生体分解性なものである;リポソームは、幅広い水溶性薬物および脂質可溶性薬物を含むことができる;リポソームは、その内部コンパートメント中のカプセル化した薬物を代謝および分解から保護することができる(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245)。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要事項は、脂質表面荷電、小胞サイズ、そしてリポソームの水容積である。
【0074】
リポソームは、活性成分を作用部位に移送および送達するために有用である。リポソーム膜は、構造的に生体膜と類似しているため、リポソームを組織に使用する場合には、リポソームを細胞膜に溶け込ませるようにはじめる。リポソームと細胞の溶融が進行するにつれて、リポソーム内容物は、活性剤が作用することができる細胞中へ移る。
【0075】
リポソーム製剤は、多くの薬物についての送達様式として、幅広い研究の焦点である。局所投与のために、リポソームは、他の製剤を超えるいくつかの利点を提供するという証拠がますます多くなっている。このような利点には、投与された薬物の高い全身性吸収に関連した副作用の減少、所望される標的での投与された薬物の蓄積の増加、そして親水性および疎水性の両方の様々な薬物を皮膚中に投与する能力、が含まれる。
【0076】
いくつかの報告は、リポソームが高分子量DNAを含む薬剤を皮膚中に送達する能力について詳細に説明した。鎮痛剤、抗体、ホルモンおよび高分子量DNAを含む化合物を、皮膚に投与した。投与の多くは、結果として外皮の上部を標的とした。
【0077】
リポソームは、2つの幅広いクラスに分けられる。カチオン性リポソームは、マイナス(−)に荷電したDNA分子と相互作用して、安定な複合体を形成する、プラス(+)に荷電したリポソームである。プラスに荷電したDNA/リポソーム複合体は、マイナスに荷電した細胞表面に結合し、そしてエンドソーム中に内部化される。エンドソーム中の酸性pHにより、リポソームは破裂し、その内容物を細胞質中に放出する(Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980−985)。
【0078】
pH−感受性あるいはマイナスに荷電したリポソームは、DNAと複合体を形成するというよりは、DNAを捕捉する。DNAおよび脂質の両方が同様に荷電するため、複合体の形成ではなく反発(repulsion)が生じる。それにもかかわらず、いくつかのDNAは、これらのリポソームの水性内部中に捕捉される。pH−感受性リポソームを使用して、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするDNAを培養中の細胞単層に送達させた。外来性遺伝子の発現が、標的細胞中で検出された(Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269−274)。
【0079】
リポソーム組成物の1つの主要な型には、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。天然のリポソーム組成物は、たとえば、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)またはジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、一般的に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、一方でアニオン性フソジェニックな(fusogenic)リポソームは、主として、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)から形成される。リポソーム組成物の別の型は、たとえば、ダイズホスファチジルコリン(PC)、およびタマゴPCなどのPCから形成される。別の型は、リン脂質および/またはホスファチジルコリンおよび/またはコレステロールの混合物から形成される。
【0080】
いくつかの研究では、皮膚へのリポソーム薬剤製剤の局所投与が評価された。インターフェロンを含有するリポソームをモルモット皮膚に対して使用すると、結果として皮膚のヘルペス潰瘍が減少したが、その他の手段(たとえば溶液またはエマルジョン)を介してインターフェロンの送達をしても有効ではなかった(Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405−410)。さらに、別の研究は、水性システムを用いたインターフェロンの投与に対する、リポソーム製剤の一部として投与したインターフェロンの効率を試験し、そしてリポソーム製剤は水性投与よりも優れていると結論付けた(du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259−265).
薬物の皮膚への送達におけるその有用性を決定するために、非−イオン性リポソームシステム、特に、非−イオン性サーファクタントおよびコレステロールを含むシステムを調べた。NovasomeTM I(グリセリルジラウレート/コレステロール/ポリオキシエチレン−10−ステアリルエーテル)およびNovasomeTM II(グリセリルジステアレート/コレステロール/ポリオキシエチレン−10−ステアリルエーテル)を含む非−イオン性リポソーム製剤を使用して、シクロスポリン−Aをマウス皮膚の真皮中に送達した。結果から、このような非−イオン性リポソームシステムは、シクロスポリン−Aが皮膚の別の層中に沈着することを促進する際に効果的であることが示された(Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466)。
【0081】
リポソームには、“立体化学的に安定な”リポソームも含まれるが、この用語は本明細書中で使用される場合、1またはそれ以上の特殊な(specialized)脂質であって、リポソーム中に取り込まれた場合、そのような特殊な脂質を含まないリポソームと比較して、循環血中での寿命が長くなる脂質、を含むリポソームのことをいう。立体化学的に安定なリポソームの例は、リポソームの小胞−形成性脂質部分の一部分が、(A)モノシアロガングリオシドGM1などの1またはそれ以上の糖脂質を含むか、または(B)ポリエチレングリコール(PEG)部分などの1またはそれ以上の親水性ポリマーにより誘導体化されている、ものがある。いずれかの具体的な理論に縛られることを望むわけではないが、当該技術分野においては、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはPEG−誘導体化脂質を含有する少なくとも立体化学的に安定なリポソームについて、これらの立体化学的に安定なリポソームの循環系での半減期が増加しているのは、細網内皮系(RES)の細胞中への取り込みが減少したことに由来すると考えられている(Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42;Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765)。1またはそれ以上の糖脂質を含む様々なリポソームが、当該技術分野において既知である。Papahadjopoulosら(Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64)は、モノシアロガングリオシドGM1、硫酸ガラクトセレブロシドおよびホスファチジルイノシトールがリポソームの血中半減期を向上させる能力を報告した。これらの知見は、Gabizonら(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949)により述べられた。米国特許No. 4,837,028およびWO 88/04924は、両方ともAllenらによるものであるが、(1)スフィンゴミエリンおよび(2)ガングリオシドGM1または硫酸ガラクトセレブロシドエステル、を含むリポソームを開示する。米国特許No. 5,543,152(Webbら)は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。1,2−sn−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、WO 97/13499(Limら)中に開示されている。
【0082】
1またはそれ以上の親水性ポリマーにより誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその製造方法は、当該技術分野において既知である。Sunamotoら(Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778)は、PEG部分を含有する非イオン性界面活性剤、2C1215G、を含むリポソームを記載した。Illumら(FEBS Lett., 1984, 167, 79)は、ポリスチレン粒子のポリマーグリコールによる親水性コーティングが、血中半減期の顕著な増加を引き起こすことに注目した。ポリアルキレングリコール(たとえば、PEG)のカルボン酸(carboxylic)基の結合により修飾された合成リン脂質は、Searsにより記載されている(米国特許Nos. 4,426,330および4,534,899)。Klibanovら(FEBS Lett., 1990, 268, 235)は、PEGまたはステアリン酸PEGにより誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン(PE)を含むリポソームは、血液循環中での半減期が顕著に増加することを示す実験を記載した。Blumeら(Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91)は、そのような知見をその他のPEG−誘導体化リン脂質、たとえば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)およびPEGの組み合わせから形成されるDSPE−PEG、に拡張した。共有結合したPEG部分をその外側表面に有するリポソームは、Fisherに対する欧州特許No. EP 0 445 131 B1およびWO 90/04384中に記載される。PEGにより誘導体化された1〜20モル%のPEを含有するリポソーム組成物、およびその使用方法は、Woodleら(米国特許Nos. 5,013,556および5,356,633)およびMartinら(米国特許No. 5,213,804および欧州特許No. EP 0 496 813 B1)により記載される。多数のその他の脂質−ポリマー複合体を含むリポソームは、WO 91/05545および米国特許No. 5,225,212(両方ともMartinら)およびWO 94/20073(Zalipskyら)において記載される。PEG−修飾セラミド脂質を含むリポソームは、WO 96/10391(Choiら)に記載される。米国特許Nos. 5,540,935(Miyazakiら)および5,556,948(Tagawaら)は、その表面に対して官能基部分をさらに誘導体化することができる、PEG−含有リポソームを記載する。
【0083】
核酸を含む限定的な数のリポソームが当該技術分野において既知である。Thierryらに対するWO 96/40062は、高分子量の核酸をリポソーム中にカプセル化するための方法を開示する。Tagawaらに対する米国特許No. 5,264,221は、タンパク質−結合リポソームを開示し、そしてそのようなリポソームの内容物にはアンチセンスRNAが含まれうることを明らかにしている。Rahmanらに対する米国特許No. 5,665,710は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム中にカプセル化する特定の方法を記載する。Loveらに対するWO 97/04787は、raf遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソームを開示する。
【0084】
トランスファーソーム(transfersome)は、リポソームのさらに別の型であり、そして非常に変形可能な脂質集合物であり、薬物送達ビヒクルの魅力的な候補物である。トランスファーソームは、非常に変形可能であるため、小滴よりも小さな孔を介して容易に浸透することができる、脂質小滴として記載することができる。トランスファーソームは、それらを使用する環境に適応することができ、たとえばそれらは、自己−最適性(皮膚の孔の形状に適応する)であり、自己−修復性であり、しばしば断片化されることなくそれらの標的に到達し、そしてしばしば自己−負荷性(self−loading)である。トランスファーソームを作製するため、標準的なリポソーム組成物に対して、表面強力アクチベーター(edge−activators)、通常はサーファクタント、を添加することができる。トランスファーソームを使用して、皮膚に対して血清アルブミンを送達した。血清アルブミンのトランスファーソーム−媒介性送達は、血清アルブミンを含有する溶液を皮下に注入する方法と同様に効率的であることが示された。
【0085】
サーファクタントは、エマルジョン(マイクロエマルジョンを含む)およびリポソームなどの製剤において、幅広い用途が見いだされる。多くの様々なタイプのサーファクタントの特性を、天然のサーファクタントおよび合成のサーファクタントの両方ともについて分類しそしてランク付けする最も一般的な方法は、親水性/親油性バランス(HLB)の使用によるものである。親水性基(“ヘッド”としても知られる)の性質は、製剤に使用する様々なサーファクタントをカテゴリー化に対して最も有用な手段を提供する(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285)。
【0086】
サーファクタント分子がイオン化されていない場合、非イオン性サーファクタントとして分類される。非イオン性サーファクタントは、医薬生成物および化粧用生成物において幅広い用途を見いだされ、そして幅広いpH値にわたって使用することができる。一般的には、それらのHLB値は、その構造に依存して、2〜約18の範囲にわたる。非イオン性サーファクタントには、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、そしてエトキシ化(ethoxylated)エステルなどの非イオン性エステルが含まれる。脂肪アルコールエトキシ化物(ethoxylates)、プロポキシ化(propoxylated)アルコール、およびエトキシ化/プロポキシ化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレンサーファクタントは、非イオン性サーファクタントのクラスの最も一般的な構成物質である。
【0087】
サーファクタント分子が、水中に溶解しまたは分散させる場合に負(−)の荷電を有する場合、サーファクタントはアニオン性と分類される。アニオン性サーファクタントには、石けんなどのカルボン酸エステル、アシルラクチレート(lactylates)、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸塩およびエトキシ化アルキル硫酸塩などの硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホン酸エステル、アシルイセチオネート(isethionates)、アシルタウレート(taurates)およびスルホコハク酸塩などのスルホン酸エステル、およびホスフェートが含まれる。アニオン性サーファクタントのクラスの最も重要な構成物質は、アルキル硫酸塩および石けんである。
【0088】
サーファクタント分子が、水中に溶解されまたは分散される場合に正(+)の荷電を有する場合、サーファクタントはカチオン性と分類される。カチオン性サーファクタントには、第四アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが含まれる。第四アンモニウム塩は、このクラスの最も使用される構成物質である。
【0089】
サーファクタント分子が正(+)の荷電または負(−)の荷電のいずれをも有する能力を有する場合、サーファクタントは両性として分類される。両性サーファクタントには、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド類、N−アルキルベタイン類およびホスファチド類が含まれる。
【0090】
薬剤生成物、製剤およびエマルジョン中でのサーファクタントの使用は、以下にレビューされている(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285)。
【0091】
浸透亢進剤
一態様において、本発明は、様々な浸透亢進剤を使用して、核酸、特にオリゴヌクレオチドの、動物の皮膚に対する効率的な送達を達成する。ほとんどの薬剤は、イオン化型および非イオン化型の両方において溶液中に存在する。しかしながら、通常は、脂質可溶性あるいは親油性薬物のみが容易に細胞膜を通過する。非−親油性薬物でさえも、通過すべき膜を浸透亢進剤により処理される場合には、細胞膜を通過することができることを見出した。非−親油性薬物の細胞膜を通じた拡散を補助することに加えて、浸透亢進剤はまた、親油性薬物の透過性も向上させる。
【0092】
浸透亢進剤は、5つの幅広いカテゴリー、すなわち、サーファクタント、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、そして非−キレート非−サーファクタント、の一つに属するものとして分類することができる(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92)。浸透亢進剤の上述したクラスのそれぞれは、以下にさらに詳細に記載される。
【0093】
サーファクタント:本発明に関連して、サーファクタント(あるいは“表面−活性剤”)は、水溶液中に溶解した場合に、溶液の表面張力または水溶液と別の液体とのあいだの界面張力を減少する化学的単位であり、粘膜を介するオリゴヌクレオチドの吸収が亢進されるという結果を伴う。胆汁酸塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透亢進剤には、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−20−セチルエーテル(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92);およびFC−43などのパーフルオロ化学物質エマルジョン(Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252)が含まれる。
【0094】
脂肪酸:浸透亢進剤として機能する様々な脂肪酸およびその誘導体には、たとえば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸(n−デカン酸)、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン(1−モノオレイル−rac−グリセロール)、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール1−モノカプレート、1−ドデシルアザシクロヘプタン−2−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのC1−10アルキルエステル(たとえば、メチル、イソプロピルおよびt−ブチル)、およびそれらのモノ−およびジ−グリセリド(すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど)が含まれる(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92;Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1−33;El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651−654)。
【0095】
胆汁酸塩:胆汁の生理学的役割には、脂質および脂肪可溶性ビタミンの分散および吸収を促進することが含まれる(Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw−Hill, New York, 1996, pp. 934−935)。様々な天然の胆汁酸塩、およびその合成誘導体は、浸透亢進剤として機能する。このように、用語“胆汁酸塩”には、胆汁の天然に存在する構成成分のいずれかだけでなく、それらの合成誘導体のいずれかが含まれる。本発明の胆汁酸塩には、たとえば、コール酸(あるいはその医薬的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム)、デヒドロコール酸(デヒドロコール酸ナトリウム)、デオキシコール酸(デオキシコール酸ナトリウム)、グルココール酸(glucholic acid)(グルココール酸(glucholate)ナトリウム)、グリココール酸(グリココール酸ナトリウム)、グリコデオキシコール酸(グリコデオキシコール酸ナトリウム)、タウロコール酸(タウロコール酸ナトリウム)、タウロデオキシコール酸(タウロデオキシコール酸ナトリウム)、ケノデオキシコール酸(ケノデオキシコール酸ナトリウム)、ウルソデオキシコール酸(UDCA)、タウロ−24,25−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム(STDHF)、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル(POE)が含まれる(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92;Swinyard, Chapter 39 In: Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, pages 782−783;Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1−33;Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25;Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579−583)。
【0096】
キレート剤:本発明と関連して使用される場合、キレート剤は、それとともに複合体を形成することにより、金属イオンを溶液から取り除く化合物として定義することができ、粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収を向上させるという結果を伴う。本発明における浸透亢進剤としてのその使用に関して、キレート剤は、最も特性決定されたDNAヌクレアーゼがその触媒のために二価の金属イオンを必要としそしてしたがってキレート剤により阻害されることから、DNase阻害剤としても機能するという追加の利点を有する(Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315−339)。本発明のキレート剤には、エチレンジアミンテトラ酢酸ジナトリウム(EDTA)、クエン酸、サリチル酸塩(たとえば、サリチル酸ナトリウム、5−メトキシサリチル酸塩およびホモバニリン酸塩)、コラーゲンのN−アシル誘導体、ラウレス−9およびβ−ジケトンのN−アミノアシル誘導体(エナミン)が含まれるが、これらには限定されない(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92;Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1−33;Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43−51)。
【0097】
非−キレート非−サーファクタント:本明細書中で使用する場合、非−キレート非−サーファクタント浸透亢進性化合物は、キレート剤としてあるいはサーファクタントとしてわずかな活性しか示さないが、それにもかかわらず栄養粘膜を介してオリゴヌクレオチドの吸収を亢進する、化合物として定義することができる(Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1−33)。浸透亢進剤のこのクラスには、たとえば、不飽和環状ウレア、1−アルキル−および1−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92);およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非−ステロイド性抗炎症性薬剤(Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621−626)が含まれる。
【0098】
細胞レベルでオリゴヌクレオチドの取り込みを亢進する薬剤を、本発明の医薬組成物およびその他の組成物に添加することもできる。たとえば、リポフェクチンなどのカチオン性脂質(Junichi et al, 米国特許No. 5,705,188)、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジンなどのポリカチオン性分子(Lollo et al., PCT Application WO 97/30731)も、オリゴヌクレオチドの細胞性取り込みを亢進することが知られている。
【0099】
エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール、2−ピロールなどのピロール、アゾン(azone)、およびリモネンおよびメントンなどのテルペンを含むその他の薬剤を使用して、投与される核酸の浸透を亢進することができる。
【0100】
担体
本発明の特定の組成物は、製剤中に担体化合物も組み込む。本明細書中で使用する場合、“担体化合物”または“担体”は、不活性である(すなわち、それ自体生物学的活性を有さない)が、しかし、たとえば、生物学的に活性な核酸を分解しまたはその循環からの除去を促進することにより生物学的活性を有する核酸の生物学的利用性を減少するin vivoプロセスにより、核酸として認識される、核酸、またはその類似体のことをいうことができる。核酸と担体化合物(典型的には担体化合物を過剰量)の共投与により、おそらくは担体化合物と核酸との、一般的な受容体に対する競合により、結果として、肝臓、腎臓、またはその他の循環外レゼルボア中で回収される核酸の量の実質的な減少が引き起こされる。たとえば、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸あるいは4−アセトアミド−4’イソチオシアノ−スチルベン−2,2’−ジスルホン酸とともに共投与する場合、肝臓組織中での部分的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの回収を減少することができる(Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115−121;Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177−183)。
【0101】
賦形剤
担体化合物と対照的に、“医薬的な担体”または“賦形剤”は、医薬的に許容可能な溶媒、懸濁剤または動物に対して1またはそれ以上の核酸を送達するためのいずれかその他の医薬的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体であってもあるいは固体であってもよく、そして、想定した計画された様式の投与により、所定の医薬組成物の核酸およびその他の構成要素と組み合わせた場合、所望のバルク、粘度などを提供するように選択される。典型的な医薬的な担体には、結合剤(たとえば、α化コーンスターチ、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど);充填剤(たとえば、ラクトースおよびその他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリル酸またはリン酸水素カルシウムなど);潤滑剤(たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状シリコンジオキシド、ステアリン酸、金属性ステアリン酸、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど);崩壊剤(たとえば、スターチ、スターチグリコール酸ナトリウムなど);および湿潤剤(たとえば、ラウリル硫酸ナトリウムなど)が含まれるが、これらには限定されない。
【0102】
核酸と心身に有害には反応しない非−非経口性投与に適した医薬的に許容可能な有機賦形剤または無機賦形剤を使用して、本発明の組成物を製剤化することもできる。適した医薬的に許容可能な担体には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらには限定されない。
【0103】
核酸の局所投与のための製剤には、滅菌水溶液および非−滅菌水溶液、アルコールなどの一般的溶媒中での非−水溶液、または液体または固体油状基剤中の核酸の溶液が含まれてもよい。溶液には、バッファー、希釈剤およびその他の適した添加剤を含有してもよい。核酸と心身に有害には反応しない非−非経口性投与に適した医薬的に許容可能な有機賦形剤あるいは無機賦形剤を使用することができる。
【0104】
適した医薬的に許容可能な賦形剤には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらには限定されない。
【0105】
その他の構成要素
本発明の組成物にはさらに、医薬組成物中に従来から見出されるその他の補助剤構成要素を、当該技術分野で確立した使用レベルで含有することができる。このように、たとえば、組成物には、たとえば鎮痒薬、収斂剤、局所麻酔薬または抗炎症剤などの追加的で適合性な医薬的に活性な物質を含有することができ、または本発明の組成物の様々な用量剤形を物理的に製剤化する際に有用な追加の物質、たとえば色素、着香剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定化剤など、を含有することができる。しかしながら、このような物質は、添加される場合、本発明の組成物の構成要素の生物学的活性を過度に妨害すべきではない。製剤を滅菌することができ、そして所望の場合には、製剤の(1またはそれ以上の)核酸と心身に有害に相互作用しない補助剤、たとえば、潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、オスモル圧に影響を与える塩、バッファー、着色剤、着香料および/または芳香性物質などと混合することができる。
【0106】
水性懸濁液には、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランを含む、懸濁疫の粘度を増加する物質を含有することができる。懸濁疫には、安定化剤を含有してもよい。
【0107】
本発明の特定の態様は、(a)1またはそれ以上のアンチセンス化合物、および(b)非−アンチセンスメカニズムにより機能する1またはそれ以上のその他の化学療法剤、を含有する医薬組成物を提供する。このような化学療法剤の例には、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン(CA)、5−フルオロウラシル(5−FU)、フロキシウリジン(5−FUdR)、メトトレキセート(MTX)、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール(DES)などの抗ガン薬物を含むが、これらには限定されない(一般的には、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J., pages 1206−1228を参照)。非ステロイド性抗炎症性薬物およびコルチコステロイドを含む抗炎症性薬物(しかしこれらには限定されない)、およびリビビリン(ribivirin)、ビダラビン(vidarabine)、アシクロビルおよびガンシクロバーを含む抗ウィルス性薬物(しかしこれらには限定されない)を、本発明の組成物中に組み合わせることができる(一般的には、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J., pages 2499−2506 and 46−49, respectivelyを参照)。その他の非−アンチセンス化学療法剤も、本発明の範囲に含まれる。2つまたはそれ以上の組み合わせ化合物を、一緒にあるいは連続的に使用することができる。
【0108】
別の関連する態様において、本発明の組成物には第一の核酸を標的とする、1またはそれ以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第二の核酸標的を標的とする1またはそれ以上の追加のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを含有することができる。数多くのアンチセンス化合物の例が当該技術分野で知られている。2つまたはそれ以上の組み合わせ化合物を、一緒にあるいは連続的に使用することができる。
【0109】
治療用組成物の製剤化およびそれに引き続く投与は、当該技術分野の範囲内のものであると考えられる。用量は、治療すべき疾患状態の重症度および反応性に依存し、数日間から数ヶ月間持続する治療経過、あるいは治癒が得られるかまたは疾患の減退が得られるまでの治療経過を伴う。最適な用量スケジュールは、患者体内での薬物の蓄積を測定することから算出することができる。当業者であれば、最適用量、投与方法、および反復頻度を容易に決定することができる。最適な用量は、個々のオリゴヌクレオチドの比効力に依存して変更することができ、そして一般的には、in vitroおよびin vivo動物モデルにおいて効果的であることが見いだされるEC50に基づいて見積もることができる。一般的には、用量は、0.01 ug〜100 g/kg体重であり、そして1日、1週間、1ヶ月、あるいは1年に一度またはそれ以上与えることができ、あるいは2〜20年ごとに1度であってもよい。当業者は、体液あるいは組織における薬物の滞留時間および濃度に基づいて、投与のための反復頻度を容易に見積もることができる。継続的な治療により、患者に維持療法を受けさせて、疾患状態の再発を防止することが好ましく、ここでオリゴヌクレオチドは、1日に1回またはそれ以上〜20年間ごとに1回で、0.01 ug〜100 g/kg体重の範囲で、維持用量で投与する。
【0110】
本発明特定のその好ましい態様にしたがって、具体的に記載されるが、以下の実施例は、本発明の説明のためにのみ提供し、そして本発明を限定することを意図するものではない。
【0111】
【実施例】
実施例1
オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホールアミダイト
デオキシ及び2’−アルコキシアミダイト
2’−デオキシ及び2’−メトキシβ−シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトを販売元(例えば、Chemgenes, Needham MA またはGlen Research, Inc. Sterling VA)より購入した。他の2’−O−アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,506,351に記載の通り調製する。2’−アルコキシアミダイトを用いてオリゴヌクレオチドを合成するために、テトラゾール及び塩基のパルスデリバリー後の待機段階を360秒に増加した以外は、非修飾オリゴヌクレオチドのための標準サイクルを使用した。
【0112】
5−メチル−2’−デオキシシチジン(5−Me−C)ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、市販のホスホールアミダイト(Glen Research, Sterling VAまたはChemGenes, Needham MA)を用いて公表された方法〔Sanghvi ら、Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197−3203〕に従って合成した。
【0113】
2’−フルオロアミダイト
2’−フルオロデオキシアデノシンアミダイト
2’−フルオロオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される以前に記載の通り〔Kawasakiら、 J. Med. Chem., 1993, 36, 831−841〕、及び、アメリカ合衆国特許5,670,633に記載の通り合成した。簡潔には、保護されたヌクレオシドであるN6−ベンゾイル−2’−デオキシ−2’−フルオロアデノシンは、市販の9−β−D−アラビノフラノシルアデニンを出発物質として使用し、そして文献手法を修正して、2’−α−フルオロ原子を2’−β−トリチル基のSN2−置換により導入することより、合成した。このようにN6−ベンゾイル−9−β−D−アラビノフラノシルアデニンは中程度の収量で3’,5’−ジテトラヒドロピラニル(THP)中間体として選択的に保護した。THP及びN6−ベンゾイル基の脱保護は標準的な手法論を用いて成され、そして標準手法を用いて5’−ジメトキシトリチル−(DMT)及び5’−DMT−3’−ホスホールアミダイト中間体を得た。
【0114】
2’−フルオロデオキシグアノシン
2’−デオキシ−2’−フルオログアノシンの合成はテトライソプロピルジシロキサニル(TPDS)で保護した9−β−D−アラビノフラノシルグアニンを出発物質として用い、そして、中間体であるジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへの変換により成された。TPDS基の脱保護に続いて水酸基のTHPによる保護によりジイソブチリルジ−THP保護アラビノフラノシルグアニンを得た。選択的なO−脱アシル化及びトリフラート化に続き、フルオリドによる粗生成物の処理をし、その後THP基の脱保護をした。標準的な方法論を使用し、5’−DMT−及び5’−DMT−3’−ホスホールアミダイトを得た。
【0115】
2’−フルオロウリジン
2’−デオキシ−2’−フルオロウリジンの合成は、2,2’−アンヒドロ−1−β−D−アラビノフラノシルウラシルを70%フッ化水素−ピリジン(hydrogen fluoride−pyridine)で処理する、文献手法の修正により成された。標準的な手法を用いて5’−DMT及び5’−DMT−3’ホスホールアミダイトを得た。
【0116】
2’−フルオロデオキシシチジン
2’−デオキシ−2’−フルオロシチジンは2’−デオキシ−2’−フルオロウリジンのアミノ化を介して合成され、次に選択的な保護によりN4−ベンゾイル−2’−デオキシ−2’−フルオロシチジンを得た。標準的な手法を用いて、5’−DMT及び5’−DMT−3’ホスホールアミダイトを得た。
【0117】
2’−O−(2−メトキシエチル)修飾アミダイト
2’−O−メトキシエチル−置換ヌクレオシドアミダイトは、次の通り、あるいは、Martin, P.(Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486−504)の方法に従って調製した。
【0118】
2,2’−アンヒドロ〔1−(β−D−アラビノフラノシル)−5−メチルウリジン〕
5−メチルウリジン(Yamasa, Choshi, Japanにより市販され入手可能な、リボシルチミン)(72.0 g、0.279 M)、ジフェニルカーボネート(90.0 g、0.420 M)及び炭酸水素ナトリウム(2.0 g、0.024 M)をDMF(300 mL)に加えた。混合物を熱して攪拌しながら還流し、発生する二酸化炭素ガスを制御された方法で放出させた。1時間後、わずかに黒ずんだ溶液を、低圧下、濃縮した。得られたシロップを攪拌しながらジエチルエーテル(2.5 L)中に注いだ。産物はガム状物を形成した。エーテルをデカントし、そして、残渣を最小量のメタノール(約400 mL)に溶解した。溶液をフレッシュなエーテル(2.5 L)に注ぎ入れ、硬いガム状物を得た。エーテルをデカントし、ガム状物を減圧オーブンで乾燥させ(60℃、1 mm Hgで24時間)、得られた固体を砕いて淡い黄褐色の粉末にした(57 g、85%粗収率)。NMRスペクトルは、そのナトリウム塩としてフェノールが混じった(約5%)構造と一致した。その物質はさらに続く反応に用いられた(あるいはに酢酸エチル中のメタノールの勾配(10−25%)を利用したカラムクロマトグラフィーにより、さらに精製して融点222−4℃の白色の固体を得ることができる)。
【0119】
2’−O−メトキシエチル−5−メチルウリジン
2,2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン(195 g、0.81 M)、トリス(2−メトキシエチル)ホウ酸(231 g、0.98 M)及び2−メトキシエタノール(1.2 L)を、2 Lステンレススチール圧力容器に加え、160℃に予熱した油浴中に設置した。155−160℃で48時間熱した後、容器を開き、そして、溶液を蒸発させて乾燥させ、次にメタノール(200 mL)中で磨砕した。残渣を熱したアセトン(1 L)中に懸濁した。不溶の塩を濾過し、アセトン(150 mL)で洗浄し、そして、濾過物を蒸発させた。残渣を(280 g)をCH3CN(600 mL)に溶解させ、次に、蒸発させた。シリカゲルカラム(3 kg)を0.5%Et3NHを含むCH2Cl2/アセトン/MeOH(20:5:3)中に充填した。残渣をCH2Cl2(250 mL)中に溶解し、そして、シリカ(150 g)に吸着させた後、カラムにロードした。生成物は充填溶媒とともに溶出され、160 g(63%)の産物を得た。不純な分画をやり直すことにより、追加の物質を得た。
【0120】
2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルウリジン
2’−O−メトキシエチル−5−メチルウリジン(160 g、0.506 M)をピリジン(250 mL)と共に蒸発させ、次に、乾燥させた残渣をピリジン(1.3 L)に溶解した。ジメトキシトリチルクロリドの一番目のアリコート(94.3 g、0.278 M)を加え、そして、混合液を室温で1時間攪拌した。ジメトキシトリチルクロリドの二番目のアリコート(94.3 g、0.278 M)を加え、そして、反応液をさらに1時間攪拌した。メタノール(170 mL)を次に加え、反応を停止した。HPLCにより、約70%の産物の存在が示された。溶媒を蒸発させ、そして、CH3CN(200 mL)中で磨砕した。残渣をCHCl3(1.5 L)に溶解し、次に、2×500 mLの飽和NaHCO3及び2×500 mLの飽和NaClにより抽出した。有機層をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、そして、蒸発させた。275 gの残渣が得られた。残渣を3.5 kgシリカゲルカラムで精製し、充填し、そして、0.5%Et3NHを含むEtOAc/ヘキサン/アセトン(5:5:1)で溶出した。純粋な分画を蒸発させ、164 gの生成物を得た。さらに約20 gが不純な分画より得られ、全収量183 g(57%)を得た。
【0121】
3’−O−アセチル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルウリジン
2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルウリジン(106 g、0.167 M)、DMF/ピリジン(562 mLのDMFと188 mLのピリジンから調製された3:1の混合液750 mL)、及び、無水酢酸(24.38 mL、0.258 M)を混合し、そして、室温で24時間攪拌した。反応は、TLC試料にMeOHを添加し初めに急冷すること(quenching)によりTLCによりモニターした。TLCにより判断した反応の終了時に、MeOH(50 mL)を加え、混合物を35℃で蒸発させた。残渣をCHCl3(800 mL)に溶解し、次に、2×200 mLの飽和炭酸水素ナトリウム及び2×200 mLの飽和NaClにより抽出した。水層を200 mLのCHCl3で逆抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、蒸発させ、122 g(約90%生成物)の残渣を得た。残渣を3.5 kgシリカゲルカラムで精製し、そして、EtOAc/ヘキサン(4:1)で溶出した。純粋な生成物分画を蒸発させ、96 g(84%)を得た。後の分画より追加の1.5 gを回収した。
【0122】
3’−O−アセチル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチル−4−トリアゾールウリジン
はじめの溶液は、3’−O−アセチル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルウリジン(96 g、0.144 M)をCH3CN(700 mL)に溶かすことにより調製し、そして、とり置いた。トリエチルアミン(189 mL、1.44 M)をCH3CN(1 L)中トリアゾール(90 g、1.3 M)溶液に加えて、−5℃に冷却し、そして、オーバーヘッドスターラーを使用して0.5時間攪拌した。0−10℃に維持した攪拌溶液に、30分間、POCl3を滴下して加え、そして得られた混合液をさらに2時間攪拌した。はじめの溶液を後者の溶液に、45分間をかけて滴下して加えた。得られた反応混合物をコールドルームに一晩保存した。反応混合物から塩を濾過し、そして、溶液を蒸発させた。残渣をEtOAc(1 L)に溶解し、次に、不溶の固体を濾過により除去した。濾過物を1×300 mLのNaHCO3及び2×300 mLの飽和NaClで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、蒸発させた。残渣をEtOAc中で磨砕し、表題の化合物を得た。
【0123】
2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルシチジン
ジオキサン(500 mL)及びNH4OH(30 mL)中3’−O−アセチル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチル−4−トリアゾールウリジン(103 g、0.141 M)溶液を、室温で2時間攪拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残渣をMeOH(2×200 mL)と共沸させた。残渣をMeOH(300 mL)に溶解し、2リットルステンレススチール圧力容器に移した。NH3ガスで飽和させたMeOH(400 mL)を加え、その容器を100℃、2時間熱した(完全な変換がTLCにより示された)。容器の内容物を蒸発させて乾燥し、そして、残渣をEtOAc(500 mL)に溶解し、次に、飽和NaCl(200 mL)で1回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、溶媒を蒸発させて85 g(95%)の表題の化合物を得た。
【0124】
N4−ベンゾイル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルシチジン
2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチル−シチジン(85 g、0.134 M)をDMF(800 mL)に溶解し、次に、無水安息香酸(37.2 g、0.165 M)を攪拌しながら加えた。3時間攪拌後、反応が約95%終了したことをTLCが示した。溶媒を蒸発させ、そして、残渣をMeOH(200 mL)と共沸させた。残渣をCHCl3(700 mL)に溶解し、飽和NaHCO3(2×300 mL)及び飽和NaCl(2×300 mL)で抽出し、MgSO4で乾燥させ、次に、蒸発させて残渣(96 g)を得た。残渣を、溶出溶媒として0.5%Et3NHを含むEtOAc/ヘキサン(1:1)を使用して、1.5 kgシリカカラムでクロマトグラフィーにより分離した。純粋な生成物画分を蒸発させて、90 g(90%)の表題化合物を得た。
【0125】
N4−ベンゾイル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルシチジン−3’−アミダイト
N4−ベンゾイル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルシチジン(74 g、0.10 M)をCH2Cl2(1 L)に溶解した。テトラゾールジイソプロピルアミン(7.1 g)及び2−シアノエトキシ−テトラ−(イソプロピル)亜リン酸塩(40.5 mL、0.123 M)を窒素気体条件下、攪拌しながら加えた。得られた混合物は室温で20時間攪拌した(反応が95%終了したことをTLCが示した)。反応混合物を飽和NaHCO3(1×300 mL)及び飽和NaCl(3×300 mL)で抽出した。水層洗浄液をCH2Cl2(300 mL)で逆抽出し、次に抽出物を合わせ、MgSO4で乾燥させそして濃縮した。得られた残渣は、溶出溶媒としてEtOAc/ヘキサン(3:1)を使用して、1.5 kgシリカカラムでクロマトグラフィーにより分離した。純粋な分画を合わせて、90.6 g(87%)の表題化合物を得た。
【0126】
2’−O−(アミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイト及び2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイト
2’−(ジメチルアミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト
2’−(ジメチルアミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト[当該技術分野において2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイトとしても知られる]は次の段落で記載される通り、調製される。アデノシン、シチジン及びグアノシンヌクレオシドアミダイトは、環外のアミンがアデノシン及びシチジンの場合はベンゾイル基により保護され、また、グアノシンの場合はイソブチリルにより保護されることを除いては、チミジン(5−メチルウリジン)と同様に調製される。
【0127】
5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−O2−2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン
O2−2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン(Pro. Bio. Sint., Varese, Italy, 100.0 g、0.416 mmol)、ジメチルアミノピリジン(0.66 g、0.013 eq、0.0054 mmol)を、アルゴン気体条件下、周囲温度で、また、機械的に攪拌しながら、無水ピリジン(500 ml)に溶解した。tert−ブチルジフェニルクロロシラン(125.8 g、119.0 mL、1.1 eq、0.458 mmol)を一度に加えた。反応物は周囲温度で16時間攪拌した。TLC(Rf 0.22、酢酸エチル)により反応が終了したことが示された。溶液を減圧下、濃縮して濃厚な油状物にした。これを、ジクロロメタン(1 L)、及び、飽和炭酸水素ナトリウム(2×1 L)及びブライン(1 L)間で分配させた。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、減圧下、濃縮して濃厚な油状物にした。油を酢酸エチルとエチルエーテルの1:1の混合液(600 mL)に溶解し、次に、溶液を−10℃に冷却した。得られた結晶生成物は、濾過により集めて、エチルエーテル(3×200 mL)で洗浄し、さらに、乾燥して(40℃、1 mm Hg,、24 時間)、149 g(74.8%)の白色の固体にした。TLC及びNMRは純粋な生成物と一致した。
【0128】
5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−(2−ヒドロキシエチル)−5−メチルウリジン
2 Lステンレススチール、非攪拌圧力反応器にテトラヒドロフラン中のボラン(1.0 M、2.0 eq、622 mL)を加えた。換気フード内で、手動で攪拌しながらエチレングリコール(350 mL、過剰量)を、水素ガスの発生がおさまるまで、はじめは注意深く加えた。5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−O2−2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン(149 g、0.311 mol)及び炭酸水素ナトリウム(0.074 g、0.003 eq)を手動で攪拌しながら加えた。反応器を密閉し、そして、内部温度が160℃に達するまで油浴中で熱し、そして次に16時間維持した(圧力< 100 psig)。反応容器を周囲温度まで冷却し、そして、開けた。TLC(望ましい生成物はRf 0.67 及びara−T副生成物はRf 0.82、酢酸エチル)は約70%が生成物に変換したことを示した。さらに副生成物ができるのを避けるため、反応を停止し、減圧下(10から1 mm Hg)、湯浴中(40−100℃)で、エチレングリコールを除くために使われるより極度の条件で、濃縮した。[あるいは、一度低沸点溶媒がなくなったら、残りの溶液を酢酸エチルと水の間で分配し得る。生成物は有機相にあるだろう。]残渣をカラムクロマトグラフィー(2 kgシリカゲル、酢酸エチル−ヘキサン勾配1:1から4:1)により精製した。適切な分画を合わせ、除き、そして、乾燥させて、白色のカリカリ(crisp)した泡状物(84 g、50%)、混在した出発物質(17.4 g)、及び、純粋な再利用できる出発物質20 gを得た。出発物質、純度の低い回収した出発物質をもとにした収率は58%だった。TLC及びNMRは、99%の純度の生成物と一致した。
【0129】
2’−O−(〔2−フタルイミドオキシ)エチル〕−5’−t−ブチルジフェニルシリル−5−メチルウリジン
5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−(2−ヒドロキシエチル)−5−メチルウリジン(20 g、36.98 mmol)を、トリフェニルホスフィン(11.63 g、44.36 mmol)及びN−ヒドロキシフタルイミド(7.24 g、44.36 mmol)と混ぜた。その後、強い減圧条件下、40℃、2日間、P2O5で乾燥させた。反応混合液をアルゴンをフラッシュし(flushed)そして、無水THF(369.8 mL、Aldrich、確実に密閉させた瓶)を加えて、透明な液体を得た。ジエチルーアゾジカルボン酸塩(6.98 mL、44.36 mmol)を反応混合液に滴下して加えた。添加する速度は、生じる深い赤い色が次の滴を加える前にちょうど消えるように維持した。添加が終了した後、反応物を4時間攪拌した。その頃までに、TLCにより反応の終了が示された(酢酸エチル:ヘキサン、60:40)。減圧下、溶媒を蒸発させた。得られた残渣をフラッシュカラムにのせ、そして、酢酸エチル:ヘキサン(60:40)で溶出し、2’−O−(〔2−フタルイミドオキシ)エチル〕−5’−t−ブチルジフェニルシリル−5−メチルウリジンを白色の泡状物(21.819 g、86%)として得た。
【0130】
5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−〔(2−ホルムアドキシイミノオキシ)エチル〕−5−メチルウリジン
2’−O−(〔2−フタルイミドオキシ)エチル〕−5’−t−ブチルジフェニルシリル−5−メチルウリジン(3.1 g、4.5 mmol)を無水CH2Cl2(4.5 mL)に溶解し、そして、メチルヒドラジン(300 mL、4.64 mmol)を−10℃から0℃において滴下して加えた。1時間後、混合物を濾過し、濾過物を氷冷CH2Cl2で洗浄し、そして、合わせた有機相を水、ブラインで洗浄して、次に、無水Na2SO4で乾燥させた。溶液を濃縮して2’−O−(アミノオキシエチル)チミジンを得て、それを次にMeOH(67.5 mL)に溶解した。これにホルムアルデヒド(20%水溶液、w/w、1.1 eq.)を加え、そして、得られた混合物を1時間攪拌した。溶媒を減圧下で除き;残渣をクロマトグラフィーで分離して、5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−〔(2−ホルムアドキシイミノオキシ)エチル〕−5−メチルウリジンを白色の泡(1.95 g、78%)として得た。
【0131】
5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−〔N,N−ジチルアミノオキシエチル〕−5−メチルウリジン
5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−〔(2−ホルムアドキシイミノオキシ)エチル〕−5−メチルウリジン(1.77 g、3.12 mmol)を1 M p−トルエンスルホン酸ピリジニウム(PPTS)の溶液に溶解した。シアノホウ化水素ナトリウム(Sodium cyanoborohydride)(0.39 g、6.13 mmol)を、10℃、不活性気体条件下で、この溶液に加えた。反応混合物を10℃、10分間攪拌した。その後、反応容器を氷浴から取り出し、室温で2時間攪拌し、反応をTLCでモニターした(CH2Cl2中5%MeOH)。NaHCO3水溶液(5%、10 mL)を加え、そして、酢酸エチルで抽出した(2×20 mL)。酢酸エチル相を無水Na2SO4で乾燥させ、蒸発させて乾燥状態にした。残渣を、MeOH(30.6 mL)中の1 M PPTS溶液に溶解した。ホルムアルデヒド(20%w/w、30 mL、3.37 mmol)を加え、反応混合物を室温で10分間攪拌した。反応混合液を氷浴中で10℃に冷却し、シアノホウ化水素ナトリウム(0.39 g、6.13 mmol)を加え、そして、反応混合物を10℃、10分間攪拌した。10分後、反応混合液を氷浴から取り出し、そして、室温で2時間攪拌した。反応混合液に5%NaHCO3(25 mL)溶液を加え、そして、酢酸エチル(2×25 mL)で抽出した。酢酸エチル層を無水Na2SO4で乾燥させ、次に、蒸発させて乾燥状態にした。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、そして、CH2Cl2中5%MeOHで溶出し、5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−〔N,N−ジメチルアミノオキシエチル〕−5−メチルウリジンを白色の泡状物(14.6 g、80%)として得た。
【0132】
2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン
トリエチルアミントリヒドロフルオリド(3.91 mL、24.0 mmol)を無水THF及びトリエチルアミン(1.67 mL、12 mmol、無水KOHで維持)に溶解した。このトリエチルアミン−2HFの混合物を、次に、5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−〔N,N−ジメチルアミノオキシエチル〕−5−メチルウリジン(1.40 g、2.4 mmol)に加えて、そして、室温で24時間攪拌した。反応をTLC(CH2Cl2中5%MeOH)によりモニターした。溶媒を減圧下、取り除き、そして、残渣をフラッシュカラムにのせ、そして、CH2Cl2中10%MeOHで溶出して、2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン(766 mg、92.5%)を得た。
【0133】
5’−O−DMT−2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン
2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン(750 mg、2.17 mmol)を、強い減圧条件下、40℃で一晩、P2O5で乾燥させた。その後、無水ピリジン(20 mL)と共に蒸発させた。得られた残渣をアルゴン気体条件下、ピリジン(11 mL)に溶解した。4−ジメチルアミノピリジン(26.5 mg、2.60 mmol)、4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(880 mg、2.60 mmol)を混合液に加え、そして、反応混合物を室温で、出発物質の全量がなくなるまで攪拌した。ピリジンを減圧下取り除き、次に、残渣をクロマトグラフィーで分離し、そして、CH2Cl2中10%MeOH(ピリジンを数滴含む)で溶出し、5’−O−DMT−2’−O−(ジメチルアミノ−オキシエチル)−5−メチルウリジン(1.13 g、80%)を得た。
【0134】
5’−O−DMT−2’−O−(2−N,N−ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン−3’−〔(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホールアミダイト〕
5’−O−DMT−2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン(1.08 g、1.67 mmol)をトルエン(20 mL)と共に蒸発させる。残渣にN,N−ジイソプロピルアミンテトラゾニド(0.29 g、1.67 mmol)を加えて、次に、強い減圧条件下、40℃で一晩、P2O5で乾燥させた。その後、反応混合物を無水アセトニトリル(8.4 mL)に溶解し、そして、2−シアノエチル−N,N,N1,N1−テトライソプロピルホスホールアミダイト(2.12 mL、6.08 mmol)を加えた。反応混合物を周囲温度で4時間、不活性気体条件下で攪拌した。反応の進行を、TLC(ヘキサン:酢酸エチル 1:1)でモニターした。溶媒を蒸発させ、次に、残渣を酢酸エチル(70 mL)に溶解し、そして、5%NaHCO3水溶液(40 mL)で洗浄した。酢酸エチル層を無水Na2SO4で乾燥させ、また、濃縮した。得られた残渣をクロマトグラフィーにより分離し(溶出溶媒としては酢酸エチル)、5’−O−DMT−2’−O−(2−N,N−ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン−3’−〔(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホールアミダイト〕(1.04 g、74.9%)を泡状物として得た。
【0135】
2’−(アミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト
2’−(アミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト〔当該技術分野において、2’−O−(アミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイトとしても知られる〕は、次の段落で記載される通り、調製する。アデノシン、シチジン及びチミジンヌクレオシドアミダイトは同様に調製する。
【0136】
N2−イソブチリル−6−O−ジフェニルカルバモイル−2’−O−(2−エチルアセチル)−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)グアノシン−3’−〔(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホールアミダイト〕
2’−O−アミノオキシエチルグアノシン類似体は、ジアミノプリンリボシドの選択的2’−O−アルキル化により得ることができる。多様な重量のジアミノプリンリボシドは、Schering AG(Berlin)から購入することが可能であり、2’−O−(2−エチルアセチル)ジアミノプリンリボシドを、少量の3’−O−異性体と共に提供する。2’−O−(2−エチルアセチル)ジアミノプリンリボシドは、アデノシンデアミナーゼ処理により分解され、そして、2’−O−(2−エチルアセチル)グアノシンに変換され得る(McGee, D. P. C., Cook, P. D., Guinosso, C. J., WO 94/02501 A1 940203.)。標準的な保護の手法は2’−O−(2−エチルアセチル)−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)グアノシン及び2−N−イソブチリル−6−O−ジフェニルカルバモイル−2’−O−(2−エチルアセチル)−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)グアノシンを与えるに違いなく、それは、還元され、2−N−イソブチリル−6−O−ジフェニルカルバモイル−2’−O−(2−エチルアセチル)−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)グアノシンを提供し得る。前のように、水酸基はMitsunobu反応によってN−ヒドロキシフタルイミドにより置換することができ、そして、保護されたヌクレオシドは通常通り、ホスフィチル(phosphityl)化して、2−N−イソブチリル−6−O−ジフェニルカルバモイル−2’−O−(2−エチルアセチル)−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)グアノシン−3’−〔(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホールアミダイト〕を得ることができる。
【0137】
2’−ジメチルアミノエトキシエトキシ(2’−DMAEOE)ヌクレオシドアミダイト
2’−ジメチルアミノエトキシエトキシヌクレオシドアミダイト(当該技術分野において2’−O−ジメチルアミノエトキシエチル、即ち、2’−O−CH2−O−CH2−N(CH2)2、あるいは2’−DMAEOEヌクレオシドアミダイトとしても知られる)は、以下のように調製される。他のヌクレオシドアミダイトは同様に調製される。
【0138】
2’−O−〔2(2−N,N−ジメチルアミノエトキシ)エチル〕−5−メチルウリジン
100 mLボンベ中で、テトラヒドロフラン中のボラン(1 M、10 mL、10 mmol)の溶液に、2〔2−(ジメチルアミノ)エトキシ〕エタノール(Aldrich、6.66 g、50 mmol)を攪拌しながらゆっくりと加える。固体が溶解するにつれて水素ガスが発生する。O2−,2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン(1.2 g、5 mmol)、及び、炭酸水素ナトリウム(2.5 mg)を加え、そして、ボンベを密閉し、油浴中に入れ、そして、155℃にて、26時間加熱する。ボンベは室温まで冷却し、そして、開封する。粗溶液を濃縮し、そして、残渣を水(200 mL)およびヘキサン(200 mL)の間で分配した。過剰量のフェノールを、ヘキサン層中で抽出した。水層を酢酸エチル(3×200 mL)により抽出し、そして合わせた有機層を水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、濃縮する。残渣を、溶出溶媒としてメタノール/塩化メチレン1:20(2%トリエチルアミンを含む)を使用したシリカゲルカラムにかける。カラム分画が濃縮されるにつれて、無色の固体が形成され、集められて、表題の化合物を白色の固体として得る。
【0139】
5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−〔2(2−N,N−ジメチルアミノエトキシ)エチル)〕−5−メチルウリジン
無水ピリジン(8 mL)中0.5 g(1.3 mmol)の2’−O−〔2(2−N,N−ジメチルアミノ−エトキシ)エチル)〕−5−メチルウリジン溶液に、トリエチルアミン(0.36 mL)及びジメトキシトリチルクロリド(DMT−Cl、0.87 g、2 eq.)を加えて、そして、1時間攪拌する。反応混合物を水(200 mL)に注ぎいれ、そして、CH2Cl2(2×200 mL)で抽出する。合わせたCH2Cl2層を飽和NaHCO3溶液、続いて飽和NaCl溶液で洗浄し、次に、無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。溶媒の蒸発に続いて、MeOH:CH2Cl2:Et3N(20:1、v/v、1%トリエチルアミンを含む)を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより、表題化合物を得る。
【0140】
5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−〔2(2−N,N−ジメチルアミノエトキシ)エチル)〕−5−メチルウリジン−3’−O−(シアノエチル−N,N−ジイソプロピル)ホスホールアミダイト
ジイソプロピルアミノテトラゾリド(0.6 g)及び2−シアノエトキシ−N,N−ジイソプロピルホスホールアミダイト(1.1 mL、2 eq.)を、アルゴン気体条件下、CH2Cl2(20 mL)に溶解した5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−〔2(2−N,N−ジメチルアミノエトキシ)エチル)〕−5−メチルウリジン(2.17 g、3 mmol)に加える。反応混合液を一晩攪拌し、そして、溶媒を蒸発させる。得られた残渣を、酢酸エチルを溶出溶媒として用いるシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、表題の化合物を得る。
【0141】
実施例2
オリゴヌクレオチド合成
未置換及び置換ホスホジエステル(P=O)オリゴヌクレオチドを、自動DNAシンセサイザー(Applied Biosystems model 380B)で、ヨウ素による酸化を用いる標準的なホスホールアミダイト化学を使用して、合成する。
【0142】
亜リン酸塩結合の段階的チア化のため、標準的な酸化瓶を、アセトニトリル中0.2 M 3H−1,2−ベンゾジチオール−3−オン1,1−ジオキシド溶液に置き換えた以外は、ホスホロチオエート(P=S)は、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドのためと同様に合成される。チア化待機段階を68秒に増加し、そして、引き続いてキャッピング段階を行った。CPGカラムからの分離、及び、55℃で(18時間)濃縮された水酸化アンモニウム中の脱ブロック化した後、2.5倍量のエタノールで2回沈殿することにより、オリゴヌクレオチドを0.5 M NaCl溶液から精製した。ホスフィネートオリゴヌクレオチドを、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,508,270に記載の通り、調製する。
【0143】
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許4,469,863に記載の通り、調製する。
3’−デオキシ−3’−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,610,289あるいは5,625,050に記載の通り、調製する。
【0144】
ホスホールアミダイトオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,256,775あるいはアメリカ合衆国特許5,366,878に記載の通り、調製する。
【0145】
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、公開されたPCT出願PCT/US94/00902及びPCT/US93/06976(それぞれWO 94/17093及びWO 94/02499として公開)に記載の通り、調製する。
【0146】
3’−デオキシ−3’−アミノホスホールアミデートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,023,243に記載の通り、調製する。
【0147】
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、本明細書中に参考文献として援用されるアメリカ合衆国特許5,023,234に記載の通り、調製する。
ボランリン酸オリゴヌクレオチドは、共に本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,130,302及び5,177,198に記載の通り、調製する。
【0148】
実施例3
オリゴヌクレオシド合成
MMI結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド、MDH結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、及び、アミド−3結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、及び、アミド−4結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド、そして、例えば、MMIとP=OあるいはP=S結合とを換えたものを有する混合バックボーン化合物は、そのすべてが本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,602,240及び5,610,289,に記載の通り、調製する。
【0149】
ホルムアセタール及びチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,264,562及び5,264,564に記載の通り、調製する。
【0150】
エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,223,618に記載の通り、調製する。
実施例4
PNA合成
ペプチド核酸(PNAs)は、ペプチド核酸(PNA)に関する様々な方法:Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5−23のいずれかに従って、調製される。それらはまた、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,539,082、5,700,922,、及び、5,719,262に従ってもまた、調製され得る。
【0151】
実施例5
キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または、混合オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なる型でありうる。これらは、結合ヌクレオシドの“ギャップ”セグメントが結合ヌクレオシドの5’あるいは3’“ウィング”セグメントの間に位置する第一の型、及び、“ギャップ”セグメントがオリゴマー化合物の3’あるいは5’端のどちらかに位置する、第二の“オープンエンド”型を含む。第一の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において、“ギャップマー”あるいはギャップ化オリゴヌクレオチドとしても知られる。第二の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において、“ヘミマー”あるいは“ウィングマー”としても知られる。
【0152】
〔2’−O−Me〕−−〔2’−デオキシ〕−−〔2’−O−Me〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
2’−O−アルキルホスホロチオエートを有するキメラオリゴヌクレオチド及び2’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを、上記の通り、Applied Biosystems自動DNAシンセサイザーModel 380Bを使用して合成する。オリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーを用い、及び、DNA部分には2’−デオキシ−5’−ジメトキシトリチル−3’−O−ホスホールアミダイトを、そして、5’及び3’ウィングには5’−ジメトキシトリチル−2’−O−メチル−3’−O−ホスホールアミダイトを使用して、合成する。標準的な合成サイクルを、テトラゾール及び塩基のデリバリー後の待機段階を600秒に増加することにより修正し、RNAについては4回、2’−O−メチルについては2回繰り返した。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から解離し、そして、室温で一晩、3:1アンモニア/エタノール中で、リン酸基を脱保護し、その後、凍結乾燥により乾燥させる。その後、室温で24時間、メタノールアンモニア中で処理することによりすべての塩基を脱保護し、そして、試料を再び凍結乾燥により乾燥させる。ペレットをTHF中1 M TBAFに、室温で24時間懸濁し、2’位を脱保護する。次に、反応を1 M TEAAで停止し、そして次に試料をrotovacにより1/2量に減少させ、G25サイズ排除カラムにより脱塩する。回収したオリゴは次に、キャピラリー電気泳動により、また、質量分析により、収量について、また、純度について、分光光度的に分析される。
【0153】
〔2’−O−(2−メトキシエチル)〕−−〔2’−デオキシ〕−−〔2’−O−(メトキシエチル)〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
〔2’−O−(2−メトキシエチル)〕−−〔2’−デオキシ〕−−〔2’−O−(メトキシエチル)〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2’−O−(メトキシエチル)アミダイトを2’−O−メチルアミダイトに置き換えた2’−O−メチルキメラオリゴヌクレオチドのための上記の方法に従って、調製した。
【0154】
〔2’−O−(2−メトキシエチル)ホスホジエステル〕−−〔2’−デオキシホスホロチオエート〕−−〔2’−O−(2−メトキシエチル)ホスホジエステル〕キメラオリゴヌクレオチド
〔2’−O−(2−メトキシエチル)ホスホジエステル〕−−〔2’−デオキシホスホロチオエート〕−−〔2’−O−(2−メトキシエチル)ホスホジエステル〕キメラオリゴヌクレオチドは、2’−O−(メトキシエチル)アミダイトを2’−O−メチルアミダイトに置き換えた、2’−O−メチルキメラオリゴヌクレオチドについての上記の方法、キメラ構造のウィング部分中のホスホジエステルヌクレオチド間結合を作るためのヨウ素を用いる酸化、中央ギャップのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を作るための3,H−1,2ベンゾジチオール−3−オン1,1ジオキシド(Beaucage Reagent)を使用する硫化に従って、調製する。
【0155】
他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシド及び混合キメラオリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,623,065に従って合成される。
【0156】
実施例6
オリゴヌクレオチドの単離
制御孔ガラスカラム(Applied Biosystems)から分離し、そして、濃縮された水酸化アンモニウム中、55℃、18時間、脱ブロック化した後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドは、0.5 M NaClから2.5倍量のエタノールを用いた2回の沈殿により精製する。合成されたオリゴヌクレオチドは、変性ゲル上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析され、そして、少なくとも85%の全長物質であると判断された。合成により得られたホスホロチオエート及びホスホジエステル結合の相対的な量は、定期的に31P核磁気共鳴分光器により検査され、そして、いくつかの研究のため、オリゴヌクレオチドをChiangら(J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162−18171)により記載の通り、HPLCで精製した。HPLC精製産物を用いて得られた結果は、非HPLC精製産物から得られたものと同様だった。
【0157】
実施例7
オリゴヌクレオチド合成−96ウェルプレート型
オリゴヌクレオチドを、固相P(III)ホスホールアミダイト化学により、標準的な96ウェル型に同時に96配列を構築することができる自動シンセサイザーで合成した。ホスホロジエステルヌクレオチド間結合はヨウ素水溶液を用いる酸化によって得られた。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、無水アセトニトリル中3,H−1,2ベンゾジチオール−3−オン1,1ジオキシド(Beaucage Reagent)を使用した硫化により、生成した。標準的な塩基保護β−シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトは、商業販売者(例えば、PE−Applied Biosystems, Foster City, CAまたはPharmacia, Piscataway, NJ)から購入した。非標準ヌクレオシドは、既知の文献、あるいは、特許の方法の通り、合成する。それらは、塩基保護β−シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトとして使用される。
【0158】
オリゴヌクレオチドを支持体から解離し、そして、高温度(55−60℃)にて、12−16時間、濃縮NH4OHにより脱保護し、そして放出された生成物を次に減圧下で乾燥した。乾燥した生成物を次に滅菌水に再懸濁して、マスタープレートを得て、そこからすべての分析及び試験プレート試料をロボットピペッターを使用して希釈する。
【0159】
実施例8
オリゴヌクレオチド分析−96ウェルプレート型
各ウェルのオリゴヌクレオチドの濃度を、試料の希釈及びUV吸収分光器により調査した。個々の生成物の全長の完全性を、キャピラリー電気泳動(CE)により、96ウェル型(Beckman P/ACETM MDQ)で、あるいは、個々に調製した試料については、市販のCE器具(例えば、Beckman P/ACETM 5000, ABI 270)で、評価した。塩基及びバックボーン構成は、エレクトロスプレー質量分光計を使用する化合物の質量分析により、確かめられた。すべてのアッセイ検査プレートは、マスタープレートから、シングルあるいはマルチチャネルのロボットピペッターを使用して希釈した。プレートは、プレート上の化合物の少なくとも85%が、少なくとも全長の85%であれば、許容可能であると判断した。
【0160】
実施例9
細胞培養及びオリゴヌクレオチド処理
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の効果は、測定可能なレベルで標的核酸が存在する場合、様々な細胞タイプのいずれにおいても、試験することができる。これは、例えば、PCRあるいはノザンブロット分析を使って日常的に決定され得る。以下の6つの細胞タイプは説明するために提供されるが、標的が選択された細胞タイプ中において発現される場合には、他の細胞タイプを日常的に使用することができる。これは、当該技術分野において日常的な方法、たとえばノザンブロット解析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、あるいはRT−PCR、により容易に確認することができる。
【0161】
T−24細胞:
ヒト移行上皮細胞(transitional cell)膀胱癌細胞株T−24細胞はAmerican Type Culture Collection(ATCC)(Manassas, VA)より入手した。T−24細胞は、日常的に、10%ウシ胎児血清(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)、100 u/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)を加えた、完全McCoy’s 5A基本培地(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)で、培養した。細胞は、日常的に、それが90%コンフルエンスに達したら、トリプシン処理及び希釈により継代した。RT−PCR分析において使用するため、細胞を96ウェルプレート(Falcon−Primaria#3872)に7000細胞/ウェルの濃度でまいた。
【0162】
ノザンブロットあるいは他の分析のため、細胞を100 mmあるいは他の標準的な組織培養プレートにまき、そして、適切な量の培地及びオリゴヌクレオチドを使用して、同様の処理をすることができる。
【0163】
A549細胞:
ヒト肺癌細胞株A549は、American Type Culture Collection(ATCC)(Manassas, VA)より入手した。A549は、日常的に、10%ウシ胎児血清(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)、100 u/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)を加えた、DMEM基本培地(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)で培養した。細胞は、日常的に、それが90%コンフルエンスに達したら、トリプシン処理及び希釈により継代した。
【0164】
NHDF細胞:
ヒト新生児皮膚線維芽細胞(NHDF)は、Clonetics Corporation(Walkersville MD)より入手した。NHDFは日常的に、提供者により推奨される通り添加した線維芽細胞成長培地(Clonetics Corporation, Walkersville MD)で維持した。細胞は提供者により推奨される通り、10継代まで維持した。
【0165】
HEK細胞:
ヒト胎児ケラチノサイト(HEK)はClonetics Corporation(Walkersville MD)より入手した。HEK細胞は、日常的に、提供者により推奨される通り製剤化されたケラチノサイト成長培地(Clonetics Corporation, Walkersville MD)で維持した。細胞は、日常的に、提供者により推奨される通り、10継代まで維持した。
【0166】
HepG2細胞:
ヒト肝芽細胞腫細胞株HepG2を、American Type Culure Collection(Manassas、VA)から入手した。HepG2細胞は、10%ウシ胎児血清、非−必須アミノ酸、および1 mMピルビン酸ナトリウム(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)を添加したEagle’s MEM中で、日常的に培養した。細胞が90%コンフルエントに達したときに、細胞を、トリプシン処理および希釈により、日常的に継代した。細胞を、RT−PCR解析において使用するため、96−ウェルプレート(Falcon−Primaria#3872)中に、7000細胞/ウェルの濃度でまいた。
【0167】
ノザンブロットまたは他の解析のため、細胞を100 mm組織培養プレートまたはその他の標準的な組織培養プレートにまき、適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して、同様に処理することができる。
【0168】
3T3−L1細胞:
マウス胚脂肪細胞−様細胞株3T3−L1を、American Type Culure Collection(Manassas, VA)から入手した。3T3−L1細胞は、10%ウシ胎児血清(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)を添加したDMEM、高グルコース(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)中で、日常的に培養した。細胞が80%コンフルエントに達したときに、細胞を、トリプシン処理および希釈により、日常的に継代した。細胞を、RT−PCR解析において使用するため、96−ウェルプレート(Falcon−Primaria#3872)中に、4000細胞/ウェルの濃度でまいた。
【0169】
ノザンブロットまたは他の解析のため、細胞を100 mm組織培養プレートまたはその他の標準的な組織培養プレートにまき、適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して、同様に処理することができる。
【0170】
アンチセンス化合物の処理:
細胞が80%コンフルエンスに達したとき、オリゴヌクレオチドにより処理した。96ウェルプレートで生育した細胞について、ウェルを200μLのOPTI−MEMTM−1減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次に3.75μg/mL LIPOFECTINTM(Gibco BRL)及び望ましい濃度のオリゴヌクレオチドを含む、130μLのOPTI−MEMTM −1で処理した。4〜7時間処理後、培地をフレッシュな培地に交換した。オリゴヌクレオチド処理後16〜24時間後に細胞を回収した。
【0171】
使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株ごとに変化させる。特定の細胞株に対する最適オリゴヌクレオチド濃度を決定するため、細胞をある濃度範囲の陽性対照オリゴヌクレオチドにより処理する。ヒト細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、ヒトH−rasを標的とし、ホスホロチオエートバックボーンを有する2’−O−メトキシエチルギャップマー(2’−O−メトキシエチルは太字で示した)である、ISIS 13920、
【0172】
【化1】
【0173】
である。マウスまたはラット細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、マウスc−rafおよびラットc−rafの両方を標的とし、ホスホロチオエートバックボーンを有する2’−O−メトキシエチルギャップマー(2’−O−メトキシエチルは太字で示した)である、ISIS 15770、
【0174】
【化2】
【0175】
である。c−Ha−ras(ISIS 13920)mRNAまたはc−raf(ISIS 15770)mRNAの80%の阻害を引き起こす陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度を、その細胞株について引き続いて実験する際に利用する。80%の阻害が達成されない場合、H−rasまたはc−raf mRNAの60%の阻害を引き起こす陽性対照オリゴヌクレオチドの最低濃度を、その細胞株について引き続いて実験する際に、オリゴヌクレオチドスクリーニング濃度として利用する。60%の阻害が達成されない場合、その特定の細胞株はオリゴヌクレオチドトランスフェクション実験については適していないものと判断する。
【0176】
実施例10
C/EBPα発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
C/EBPα発現のアンチセンスモジュレーションは、当該技術分野において知られる様々な方法でアッセイすることができる。例えば、C/EBPα mRNAレベルは、例えばノザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、あるいは、リアルタイムPCR(RT−PCR)により、定量され得る。リアルタイム定量PCRが現在のところ好ましい。RNA分析は、全細胞内RNA、あるいは、ポリ(A)+ mRNAについて行うことができる。RNA単離の方法は、例えば、Ausubel, F.M. ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.1.1−4.2.9 及び4.5.1−4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993)に教示される。ノザンブロット分析は、当該技術分野においては、日常的な方法であり、また、例えば、Ausubel, F.M.ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.2.1−4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996)に教示される。リアルタイム定量(PCR)は、PE−Applied Biosystems(Foster City, CA)から入手可能な、市販のABI PRISMTM 7700 Sequence Detection Systemを使用することにより、都合よく成し遂げられ、そして、製造者の指示に従って使用される。定量的PCR解析の前に、測定される標的遺伝子に対して特異的なプライマー−プローブセットを、GAPDH増幅反応とともに“多重化される”能力について評価する。多重化において、標的遺伝子および内部標準遺伝子GAPDHの両方を、単一サンプル中で同時に増幅する。この解析において、非処理細胞から単離されるmRNAは、階段希釈される。それぞれの希釈物は、GAPDHのみまたは標的遺伝子のみに特異的なプライマー−プローブセットの存在下(“単一反応性(single−plexing)”)、もしくは両方に特異的なプライマー−プローブセットの存在下(多重性)において増幅させる。PCR増幅の後、GAPDHおよび標的mRNAシグナルの標準曲線を、希釈の関数として単一反応性サンプルおよび多重反応性サンプルの両方から作成する。多重反応性サンプルから作成されたGAPDHシグナルおよび標的シグナルの傾きおよび相関係数が、単一反応性サンプルから作成されたそれらの対応する値の10%以内に収まる場合には、その標的に対して特異的なプライマー−プローブセットは、多重性であるとみなされる。PCRの他の手法もまた、当該技術分野において、既知である。
【0177】
C/EBPαタンパク質レベルは、免疫沈降、ウエスタンブロット分析(イムノブロット)、ELISA、あるいは、蛍光活性化細胞分取器(FACS)といった、当該技術分野において既知である様々な手法により定量され得る。C/EBPαに対する抗体は同定され、そして、MSRSの抗体カタログ(Aerie Corporation, Birmingham, MI)といった、様々な供給者から入手することが可能であり、または、従来からの抗体作成方法により調製し得る。ポリクローナル抗血清の調製方法は、例えば、Ausubel, F.M.ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.12.1−11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997)に教示される。モノクローナル抗血清の調製方法は、例えば、Ausubel, F.M.ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.4.1−11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997)に教示される。
【0178】
免疫沈降方法は、当該技術分野において標準的であり、また、例えば、Ausubel, F.M. ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.16.1−10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998)において見いだすことができる。ウェスタンブロット(イムノブロット)分析は、当該技術分野において標準的であり、例えば、Ausubel, F.M.ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.8.1−10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1998)において見いだすことができる。酵素免疫吸着測定法(ELISA)は、当該技術分野において標準的であり、また、例えば、Ausubel, F.M. ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.2.1−11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991)において見つけることができる。
【0179】
実施例11
ポリ(A)+ mRNA単離
ポリ(A)+ mRNAは、Miuraら(Clin. Chem., 1996, 42, 1758−1764)に従って、単離された。ポリ(A)+ mRNA単離のための他の方法は、例えば、Ausubel, F.M.ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.5.1−4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993)に教示される。簡潔には、96ウェルプレート上で培養した細胞において、細胞から増殖培地を除き、そして、各ウェルを200μL冷PBSで洗浄した。60μL溶解バッファー(10 mM Tris−HCl、pH 7.6、1 mM EDTA、0.5 M NaCl、0.5%NP−40、20 mMバナジル−リボヌクレオシド複合体)を各ウェルに加え、プレートをゆっくり揺り動かし、そして次に、室温で5分間インキュベートした。溶解物55μLをオリゴd(T)をコートした96ウェルプレート(AGCT Inc., Irvine CA)に移した。プレートを、60分、室温でインキュベートし、洗浄バッファー(10 mM Tris−HCl pH 7.6、1 mM EDTA、0.3 M NaCl)200μLで3回洗浄した。最後の洗浄の後、プレートをペーパータオルに当てて、余分な洗浄バッファーを取り除き、そしてその後、5分間風乾した。70℃に前もって熱した、溶出バッファー(5 mM Tris−HCl pH 7.6)60μLを、各ウェルに加え、プレートを90℃ホットプレートで5分間インキュベートし、そして、次に溶出物を新しい96ウェルプレートに移した。
【0180】
100 mmあるいは他の標準的なプレートに培養した細胞は、適する容量のすべての溶液を用いて、同様に処理し得る。
実施例12
全RNA単離
全mRNAは、Qiagen Inc.(Valencia CA)より購入したRNEASY 96TMキット及びバッファーを用い、製造者の推薦する方法に従って単離した。簡潔には、96ウェルプレート上で培養した細胞において、増殖培地を細胞から除き、そして、各ウェルを200μL冷PBSで洗浄した。100μLのバッファーRLTを各ウェルに加え、そして、プレートを20秒間激しく揺り動かした。70%エタノール100μLを次に各ウェルに加え、内容物を3回上下にピペッティングして混ぜた。次に試料を排水回収トレイに合わせたQIAVACTMマニホルドに取り付け、そして減圧装置に取り付けた、RNEASY 96TMウェルプレートに移した。減圧は15秒間行われた。1 mLのバッファーRW1をRNEASY 96TMプレートの各ウェルに加え、そして、再び減圧を15秒間行った。その後、1 mLのバッファーRPEをRNEASY 96TMプレートの各ウェルの添加し、そして減圧を15秒間行った。バッファーRPE洗浄を次に繰り返し、さらに10分間減圧を行った。プレートをQIAVACTMマニホルドから取り外し、そしてペーパータオルにあてて乾燥させた。プレートを次に、1.2 mL回収チューブを含む、回収チューブラックに合わせたQIAVACTMマニホルドにもう一度取り付けた。RNAを次に各ウェル中の60μLの水をピペッティングすることにより溶出し、1分間インキュベートし、そして次に、30秒間減圧を行った。さらに60μLの水を用いて、溶出段階を繰り返した。
【0181】
繰り返しのピペッティング及び溶出段階を、QIAGEN Bio−Robot 9604(Qiagen, Inc., Valencia CA)を用いて、自動化することができる。本質的には、培養プレート上で細胞を溶解した後、プレートをロボットデッキに移し、そこで、ピペッティング、DNase処理、及び、溶出段階が実行される。
【0182】
実施例13
C/EBPα mRNAレベルのリアルタイム定量PCR分析
C/EBPα mRNAレベルの定量は、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(PE−Applied Biosystems, Foster City, CA)を製造者の指示に従って使用して、リアルタイム定量PCRにより決定された。これは、閉じられたチューブで、ゲルに基づいてなく、リアルタイムにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物のハイスループット定量ができる蛍光検出システムである。PCRが終了した後に、増幅産物が定量される標準的なPCRとは対照的に、リアルタイム定量PCR産物はそれが蓄積するに従って定量される。これは、PCR反応にフォワード及びリバースPCRプライマーの間に特異的にアニールし、そして2つの蛍光色素を含むオリゴヌクレオチドを含むことにより達せられる。レポーター色素(例えば、Operon Technologies Inc., Alameda, CA またはPE−Applied Biosystems, Foster City, CAのどちらかから入手可能なJOE、FAMあるいはVIC)は、プローブの5’端に結合し、そして、クエンチャー色素(例えば、Operon Technologies Inc., Alameda, CAまたはPE−Applied Biosystems, Foster City, CAのどちらかから入手可能なTAMRA)は、プローブの3’端に結合する。プローブ及び色素が完全なとき、レポーター色素の発光は3’クエンチャー色素の近接により消失される。増幅の間、プローブの標的配列へのアニーリングはTaqポリメラーゼの5’−エキソヌクレアーゼ活性により切断されうる基質を作り出す。PCR増幅サイクルの伸長相の間、Taqポリメラーゼによるプローブの切断はプローブの残りから(そしてつまりクエンチャー部分から)レポーター色素を放出し、そして、配列特異的な蛍光シグナルが生み出される。各サイクルで、さらなるレポーター色素分子はその対応するプローブから解離され、そして、蛍光強度は、ABI PRISMTM 7700 Sequence Detection Systemに組み込まれるレーザー光により、一定のインターバルでモニターされる。各アッセイにおいて、未処理の対照試料由来mRNAの希釈系列を含む、並行した一連の反応は、試験試料の、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の阻害パーセントを定量するのに用いられる、標準曲線を生み出す。
【0183】
PCR試薬はPE−Applied Biosystems(Foster City, CA)より入手した。RT−PCR反応は、25μLポリ(A)mRNA溶液を含む96ウェルプレートに、25μL PCRカクテル(1×TAQMANTM バッファーA、5.5 mM MgCl2、各300μMのdATP、dCTP及びdGTPを、600μMのdUTP、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び、プローブを各100 nM、20 U RNAseインヒビター、1.25 U AMPLITAQ GOLDTM及び12.5 U MuLV逆転写酵素)を加えることにより実行した。RT反応は48℃で30分のインキュベーションにより実行された。AMPLITAQ GOLDTMを活性化するために95℃にて10分間のインキュベーションした後、40サイクルの2段階PCRプロトコールを実行した:95℃15秒間(変性)続いて60℃1.5分間(アニーリング/伸長)。
【0184】
刊行物に記載された配列情報(本明細書中でSEQ ID NO:3として援用されるGenBankアクセッション番号U34070)を使用して、ヒトC/EBPαに対するプローブおよびプライマーを、ヒトC/EBPα配列にハイブリダイズするように設計した。
【0185】
ヒトC/EBPαについて、PCRプライマーは:
フォワードプライマー:TGTGCCTTGGAAATGCAAAC(SEQ ID NO: 4)、
リバースプライマー:CGGGAAGGAGGCAGGAA(SEQ ID NO: 5)、および
PCRプローブ:FAM−CACCGCTCCAATGCCTACTGAGTAGGG−TAMRA(SEQ ID NO: 6)、
であり、ここでFAM(PE−Applied Biosystems, Foster City, CA)は蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRA(PE−Applied Biosystems, Foster City, CA)はクエンチャー色素である。
【0186】
ヒトGAPDH用のPCRプライマーは:
フォワードプライマー:GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEQ ID NO: 7)
リバースプライマー:GAAGATGGTGATGGGATTTC(SEQ ID NO: 8)であり、及び
PCRプローブは:5’ JOE−CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC− TAMRA 3’(SEQ ID NO: 9)であり、JOE(PE−Applied Biosystems, Foster City, CA)は蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRA(PE−Applied Biosystems, Foster City, CA)はクエンチャー色素である。
【0187】
刊行物に記載された配列情報(本明細書中でSEQ ID NO:10として援用されるGenBankアクセッション番号M62362)を使用して、マウスC/EBPαに対するプローブおよびプライマーを、マウスC/EBPα配列にハイブリダイズするように設計した。マウスC/EBPαについて、PCRプライマーは:
フォワードプライマー:CGCAAGAGCCGAGATAAAGC(SEQ ID NO:11)、
リバースプライマー:CGGTCATTGTCACTGGTCAACT(SEQ ID NO: 12)、および
PCRプローブ:FAM−AACGTGGAGACGCAACAGAAGGTGCT−TAMRA(SEQ ID NO: 13)、
であり、ここでFAM(PE−Applied Biosystems, Foster City, CA)は蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRA(PE−Applied Biosystems, Foster City, CA)はクエンチャー色素である。マウスGAPDHについてPCRプライマーは:
フォワードプライマー:GGCAAATTCAACGGCACAGT(SEQ ID NO: 14)
リバースプライマー:GGGTCTCGCTCCTGGAAGCT(SEQ ID NO: 15)であり、及び
PCRプローブは:5’ JOE−AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC− TAMRA 3’(SEQ ID NO: 16)であり、JOE(PE−Applied Biosystems, Foster City, CA)は蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRA(PE−Applied Biosystems, Foster City, CA)はクエンチャー色素である。
【0188】
実施例14
C/EBPα mRNAレベルのノザンブロット分析
アンチセンス処理の18時間後、単層の細胞を冷PBSで2回洗浄し、そして、1 mL RNAZOLTM(TEL−TEST “B” Inc., Friendswood, TX)に溶解した。全RNAは製造者が推薦するプロトコルに従って調製した。MOPSバッファーシステム(AMRESCO, Inc. Solon, OH)を用い、1.1%ホルムアルデヒドを含む1.2%アガロースゲルによる電気泳動により、20マイクログラムの全RNAを分離した。Northern/Southern Transferバッファーシステム(TEL−TEST “B” Inc., Friendswood, TX)を使用して、一晩キャピラリートランスファーすることによって、RNAをゲルからHYBONDTM−N+ ナイロンメンブレン(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)に移した。RNAのトランスファーは、UV可視化により確認した。メンブレンをSTRATALINKERTM UV Crosslinker 2400(Stratagene, Inc, La Jolla, CA)を使用して、UV架橋により固定し、次いでQUICKHYBTMハイブリダイゼーション溶液(Stratagene, La Jolla, CA)を使用し、ストリンジェントな条件についての製造者の推奨を用いて、プローブ化した。ヒトC/EBPαを検出するため、ヒトC/EBPα特異的プローブを、フォワードプライマーTGTGCCTTGGAAATGCAAAC(SEQ ID NO: 4)およびリバースプライマーCGGGAAGGAGGCAGGAA(SEQ ID NO: 5)を使用したPCRにより調製した。ロード効率及びトランスファー効率における多様性を標準化するため、メンブレンをストリップ化し、そして、ヒトグリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)RNA(Clontech, Palo Alto, CA)についてプローブ化した。
【0189】
マウスC/EBPαを検出するため、マウスC/EBPα特異的プローブを、フォワードプライマーCGCAAGAGCCGAGATAAAGC(SEQ ID NO:11)およびリバースプライマーCGGTCATTGTCACTGGTCAACT(SEQ ID NO: 12)を使用したPCRにより調製した。ロード効率及びトランスファー効率における多様性を標準化するため、メンブレンをストリップ化し、そして、マウスグリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)RNA(Clontech, Palo Alto, CA)についてプローブ化した。
【0190】
PHOSPHORIMAGERTMおよびIMAGEQUANTTM Software V3.3(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)を用いて、ハイブリダイズしたメンブレンを可視化し、そして、定量した。データは未処理対照におけるGAPDHレベルに標準化した。
【0191】
実施例15
2’−MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトC/EBPαのアンチセンス阻害
本発明に従って、一連のオリゴヌクレオチドを、刊行物に記載された配列(本明細書中でSEQ ID NO: 3として援用されるGenBankアクセッション番号U34070)を用いて、ヒトC/EBPα RNAの異なる領域を標的とするように設計した。オリゴヌクレオチドは表1に示す。“標的部位”は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の最初(最も5’−端)のヌクレオチド番号を示す。表1中のすべての化合物は、両方の端(5’及び3’方向)を5−ヌクレオチドの“ウィング”によって挟まれた、10個の2’−デオキシヌクレオチドからなる中央“ギャップ”領域から構成される、長さが20ヌクレオチドの、キメラオリゴヌクレオチド(“ギャップマー”)である。ウィングは、2’−メトキシエチル(2’−MOE)ヌクレオチドからなる。ヌクレオシド間(バックボーン)結合はオリゴヌクレオチド全体にわたりホスホロチオエート(P=S)である。全てのシチジン残基は5−メチルシチジンである。化合物を、ヒトC/EBPα mRNAレベルに対するそれらの効果について、本明細書中の他の実施例に記載の通り、定量的リアルタイムPCRにより分析した。データは2回の実験からの平均である。存在する場合、“N.D.”は“データなし”を示す。
【0192】
【表1】
【0193】
【0194】
表1に示されるように、SEQ ID NO: 26、30、33、34、35、37、39、43、44、45、49、51、52、53、56、58、59、61、62、63、64、65、66、67、70、71、73、78、79、80、82、83、84、85、86、87、89および92は、このアッセイにおいて、少なくとも20%のヒトC/EBPαの発現の阻害が証明され、そして、それゆえ好ましい。
【0195】
実施例16
2’−MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるマウスC/EBPα発現のアンチセンス阻害
本発明に従って、刊行物に記載された配列(SEQ ID NO: 10として本明細書中に援用されるGenbankアクセッション番号M62362)を使用して、マウスC/EBPα RNAの異なる領域を標的とするように、2番目の一連のオリゴヌクレオチドが設計された。オリゴヌクレオチドは表2に示す。“標的部位”は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の最初(最も5’−端)のヌクレオチド番号を示す。表2中のすべての化合物は、両方の端(5’及び3’方向)を5−ヌクレオチドの“ウィング”によって挟まれた、10個の2’−デオキシヌクレオチドからなる中央“ギャップ”領域から構成される、長さが20ヌクレオチドの、キメラオリゴヌクレオチド(“ギャップマー”)である。ウィングは、2’−メトキシエチル(2’−MOE)ヌクレオチドからなる。ヌクレオシド間(バックボーン)結合はオリゴヌクレオチド全体にわたりホスホロチオエート(P=S)である。全てのシチジン残基は5−メチルシチジンである。化合物を、マウスC/EBPα mRNAレベルに対するそれらの効果について、本明細書中の他の実施例に記載の通り、定量的リアルタイムPCRにより分析した。データは、2つの実験からの平均である。存在する場合、“N.D.”は“データなし”を示す。
【0196】
【表2】
【0197】
【0198】
表2に示されるとおり、SEQ ID NO: 19、20、27、30、38、40、43、44、51、52、54、58、60、62、63、65、73および94は、この実験において、少なくとも20%のマウスC/EBPαの発現の阻害が証明され、そして、それゆえ好ましい。
【0199】
実施例17
C/EBPαタンパク質レベルのウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット(イムノブロット分析)は標準的な方法を用いて行われる。細胞をオリゴヌクレオチド処理の16−20時間後に回収し、PBSで1回洗浄し、Laemmliバッファー(100 ul/well)に懸濁し、5分間煮沸し、そして、16%SDS−PAGEゲルにロードする。ゲルを1.5時間、150 Vで泳動し、そして、ウエスタンブロットのために、メンブレンにトランスファーする。C/EBPαに対する適する第一抗体を、第一抗体の種に対する放射ラベルした、あるいは、蛍光ラベルした第二抗体とともに使用する。バンドをPHOSPHORIMAGERTM(Molecular Dynamics, Sunnyvale CA)を使用して、可視化する。
発明の属する分野
本発明はC/EBPα発現をモジュレートするための組成物と方法を提供する。特に、本発明はヒトC/EBPαをコードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。そのようなオリゴヌクレオチドは、C/EBPαの発現をモジュレートすることが示された。
【0002】
発明の背景
転写因子は、細胞外シグナルから細胞内応答への経路を結びつける様に機能する、細胞内の一群の分子のことをいう。環境刺激の後すぐに、サイトゾル中に優勢に残存するこれらのタンパク質は核に移行し、そこでそれらは標的遺伝子のプロモーターエレメント中の特異的なDNA配列に対して結合し、そしてこれらの標的遺伝子の転写を活性化する。転写因子のファミリーの一つであるCCAAT/エンハンサー−結合タンパク質類(C/EBP)は、正常な組織発生および細胞機能、細胞増殖および細胞分化を調節する遺伝子の広範囲のパネルの発現を制御する。このファミリーの6個の構成分子がこれまでに同定され、それらのすべてが他のC/EBPファミリーの構成分子だけでなくNFkBおよびFos/Junファミリーの転写因子の構成分子とホモ−およびヘテロ−二量体を両方とも形成する(Lekstrom−Himes and Xanthopoulos, J. Biol. Chem., 1998, 273, 28545−28548)。C/EBPファミリーの構成分子のすべてが同様のモジュールタンパク質構造を有している一方で、発現レベルおよび組織分布は幅広く異なっており、様々な役割を導く(Lekstrom−Himes and Xanthopoulos, J. Biol. Chem., 1998, 273, 28545−28548)。
【0003】
第一の構成分子は、もともとラット肝臓核の可溶性抽出物から単離されたものである、C/EBPαであり、CEBPAおよび単にC/EBPとしても知られる(Graves et al., Cell, 1986, 44, 565−576;Johnson et al., Genes Dev., 1987, 1, 133−146)。組織分布および発生の発現パターンの研究から、C/EBPαがエネルギー代謝に関与する組織において主として見出され、脂質、コレステロール、およびその他のステロールを代謝する能力を有することが示された(Birkenmeier et al., Genes Dev., 1989, 3, 1146−1156)。発現の最高レベルは、肝臓、脂肪組織、および胎盤組織において見出され、一方でより低いレベルが、肺および小腸において見出された。
【0004】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)遺伝子のcAMP反応性の研究において、CrossonとRoeslerは、ヘパトーマ細胞中でラットC/EBPαまたはラットC/EBPβに対するアンチセンスRNAを安定的に発現するプラスミドを設計した(J. Biol. Chem., 2000, 275(8): 5804−5809)。C/EBPαmRNAに対するアンチセンスは、C/EBPαタンパク質レベルおよびcAMP反応性を減少させ、一方でC/EBPβに対するアンチセンスは、何ら効果がなかった。
【0005】
ラットにおける研究において、C/EBPαが脂肪細胞分化の制御に関与していることが示された(Samuelsson et al., Embo J., 1991, 10, 3787−3793;Shao and Lazar, J. Biol. Chem., 1997, 272, 21473−21478)。アンチセンスC/EBP RNAのベクター−指向性発現を使用して、著者らは、C/EBPα転写物の発現が減少することだけでなく細胞質トリグリセリド蓄積が減少することを示し、これは脂肪細胞分化におけるα異性体の必要性を示している(Lin and Lane, Genes Dev., 1992, 6, 533−544)。C/EBPαは、軟骨形成分化(Vidal et al., J. Endocrinol., 1997, 155, 433−441)、ろ胞発生および排卵(Piontkewitz et al., Dev. Biol., 1996, 179, 288−296)、肝臓におけるステロイド−誘導性細胞周期停止(Ramos et al., Mol. Cell. Biol., 1996, 16, 5288−5301)、およびグルコーストランスポーターであるGLUT2のプロモーター活性の調節(Kim and Ahn, Biochem. J., 1998, 336, 83−90)を制御することもまた示された。これは、脳損傷後の活性化されたミクログリア細胞中においても発現される(Walton et al., Brain Res. Mol. Brain Res., 1998, 61, 11−22)。
【0006】
これらの知見は、C/EBPαが代謝のホルモン性制御および顆粒球発生に関与することを示すヒトにおける研究によりさらにサポートされる(Radomska et al., Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 4301−4314;Roesler et al., J. Biol. Chem., 1998, 273, 14950−14957)。
【0007】
C/EBP−欠損マウスが、6種のC/EBPファミリーの構成分子のうち5種について作製され、そしてこれらはシステム−特異的な表現型異常について特徴づけられた。C/EBPαは、肝臓の最終分化を調節する一次シグナルであり、そしてC/EBPαを欠損するマウスは、肝臓構造および機能の深在性の障害を有し、そして大多数が低血糖のために出生後すぐに死亡する。さらに、C/EBPα遺伝子を欠損するマウスは、不十分な顆粒球形成(Zhang et al., J. Exp. Med., 1998, 188, 1173−1184)、肝臓発生(Timchenko et al., Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 7353−7361;Tomizawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998, 249, 1−5)および骨髄性前駆体の分化(Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1997, 94, 569−574)を示す。
【0008】
時期−特異的な発現レベルの変化に加えて、C/EBP構成分子はまた、αおよびβ異性体に関して、5’上流オープンリーディングフレームにおいて、選択的開始位置から生じる多数の異性体発現を引き起こす(Geballe and Morris, Trends Biochem. Sci., 1994, 19, 159−164;Lincoln et al., J. Biol. Chem., 1998, 273, 9552−9560)。定常状態レベルの様々な転写物のプールはまた、年齢およびストレス負荷の関数として変化する(Hsieh et al., Mol. Biol. Cell, 1998, 9, 1479−1494)。マウスにおいて、ある異性体の特定の転写物の発現は、他のC/EBP異性体の発現を制御することも示された(Burgess−Beusse et al., Hepatology, 1999, 29, 597−601)。
【0009】
C/EBPαは、細胞内で2種の異性体として生じ、一つは完全長の42−kDa型でありそしてもう一つはより短い30−kDa型である。より短い型は、完全長タンパク質と比較して、選択的なトランス活性化潜在性を示す(Lekstrom−Himes and Xanthopoulos, J. Biol. Chem., 1998, 273, 28545−28548)。全長ヒトC/EBPα遺伝子およびその発現のためのベクターのDNA配列が、US特許5,545,563およびPCT出願WO 94/20113中に開示される(Darlington et al., 1994;Darlington et al., 1996)。C/EBPα遺伝子をガンおよびその他の疾患を治療するための方法において使用することもまた、WO 94/20113中に開示される。C/EBPαアンチセンスアゴニストもまた、一般的に開示される。
【0010】
したがって、C/EBPα活性および/または発現の薬理学的モジュレーションは、病理学的症状において治療介入の適切なポイントである可能性がある。
現在のところ、C/EBPαの合成を効果的に阻害する既知の治療剤は存在せず、現在まで、C/EBPα機能をモジュレートすることを目的とした研究ストラテジーには、抗体、アンチセンス発現ベクター、およびマウスにおける遺伝子ノックアウトが関連してきた。しかしながら、これらのストラテジー治療プロトコルとして試験されておらず、そして結果としてC/EBPα機能を効果的に阻害することができる剤に対する長い間感じられてきた必要性は存在し続けている。
【0011】
アンチセンス技術は、特定の遺伝子産物の発現を減少させるための効果的な手段として生じてきており、そしてしたがって、数々のC/EBPα発現をモジュレートするための治療用途、診断用途、そして研究用途において、唯一有用なものであることが証明されるだろう。
【0012】
本発明は、C/EBPαの長い異性体および短い異性体の両方をモジュレートすることを含む、C/EBPα発現をモジュレートするための組成物および方法を提供する。
【0013】
発明の概要
本発明は、C/EBPαをコードする核酸を標的とし、そしてC/EBPαの発現をモジュレートする、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物およびその他の組成物もまた、提供する。さらに、細胞または組織中でC/EBPαの発現をモジュレートする方法であって、前記細胞または組織を、1またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物と接触させることを含む、前記方法を提供する。さらに、治療的または予防的有効量の1またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物を投与することにより、C/EBPαの発現と関連する疾患または症状を有するか、またはかかっている可能性があると疑われる動物、特にヒトを治療する方法を提供する。
【0014】
発明の詳細な説明
本発明は、C/EBPαをコードする核酸分子の機能をモジュレートする際に使用するための、究極的には産生されるC/EBPαの量をモジュレートする際に使用するための、オリゴマーアンチセンス化合物、とくにオリゴヌクレオチドを利用する。これは、C/EBPαをコードする1またはそれ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することにより達成される。本明細書中で使用する場合、用語“標的核酸”および“C/EBPαをコードする核酸”は、C/EBPαをコードするDNA、このようなDNAから転写されるRNA(プレ−mRNAおよびmRNAを含む)、およびこのようなRNAに由来するcDNAも含む。オリゴマー化合物のその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、核酸の正常な機能を妨害する。標的核酸の機能のそれに特異的にハイブリダイズする化合物によるこのモジュレーションは、一般的に“アンチセンス”といわれる。妨害すべきDNAの機能には、複製および転写が含まれる。妨害されるべきRNAの機能には、すべての生存に必要な機能、たとえばRNAのタンパク質翻訳部位への転移(translocation)、RNAからタンパク質への翻訳、1またはそれ以上のmRNA種を得るためのRNAのスプライシング、およびRNAに含まれる触媒活性またはRNAにより促進される触媒活性、が含まれる。標的核酸機能によるこのような妨害の全体的な効果は、C/EBPαの発現のモジュレーションである。本発明の文脈において、“モジュレーション”とは、遺伝子の発現における増加(刺激)または減少(阻害)のいずれかを意味する。本発明の文脈において、阻害は遺伝子発現のモジュレーションの好ましい形態であり、そしてmRNAは好ましい標的である。
【0015】
アンチセンスに対する特異的核酸を標的とすることが好ましい。特定の核酸に対してアンチセンス化合物を“標的化する”とは、本発明の文脈において、複数工程のプロセスである。プロセスは通常、その機能をモジュレートすべき核酸配列の同定からはじめる。たとえば、このことは、その発現が特定の症状または疾患状態と関連する細胞の遺伝子(あるいはその遺伝子から転写されるmRNA)、または感染性病原体に由来する核酸分子でありうる。本発明において、標的はC/EBPαをコードする核酸分子である。標的化のプロセスにはまた、アンチセンス相互作用のためにこの遺伝子内部に1または複数の部位を決定し、所望の効果、たとえばタンパク質の発現の検出またはモジュレーション、を結果として生じるようにすることを含む。本発明の文脈において、好ましい遺伝子内部部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)の翻訳開始コドンあるいは終止コドンを含む領域である。当該技術分野において既知であるように、翻訳開始コドンは、典型的には5’−AUG(転写されたmRNA分子において;対応するDNA分子においては5’−ATG)であるので、翻訳開始コドンはまた、“AUGコドン”、“スタートコドン”または“AUGスタートコドン”とも呼ばれる。少数の遺伝子は、RNA配列5’−GUG、5’−UUGまたは5’−CUGを有する翻訳開始コドンを有し、そして5’−AUA、5’−ACGおよび5’−CUGが、in vivoで機能することが示された。このように、それぞれの事例における開始アミノ酸は典型的にはメチオニン(真核細胞において)またはホルミルメチオニン(原核細胞において)であるにもかかわらず、用語“翻訳開始コドン”および“スタートコドン”は、多くのコドン配列を含むことができる。真核細胞の遺伝子および原核細胞の遺伝子は、2またはそれ以上の代わりのスタートコドンを有する場合があり、そのいずれもが好ましくは特定の細胞型または組織においてまたは特定の条件のセットのもとにおいて、翻訳開始のために利用することができる、ということも、当該技術分野において既知である。本発明の文脈において、“スタートコドン”および“翻訳開始コドン”は、そのようなコドンの1またはそれ以上の配列にかかわらず、in vivoで使用して、C/EBPαをコードする遺伝子から転写されるmRNA分子の翻訳を開始する、1またはそれ以上のコドンのことをいう。
【0016】
遺伝子の翻訳終止コドン(または“停止コドン”)は、3つの配列、すなわち、5’−UAA、5’−UAGおよび5’−UGA(対応するDNA配列は、それぞれ、5’−TAA、5’−TAGおよび5’−TGA)のうちの一つを有しうることも、当該技術分野において既知である。用語“スタートコドン領域”および“翻訳開始コドン領域”は、翻訳開始コドンからいずれかの方向(すなわち、5’または3’)に約25から約50の連続するヌクレオチドを含む、mRNAあるいは遺伝子の部分のことを言う。同様に、用語“停止コドン領域”および“翻訳終止コドン領域”は、翻訳終止コドンからいずれかの方向(すなわち、5’または3’)に約25から約50の連続するヌクレオチドを含む、mRNAまたは遺伝子の部分のことを言う。
【0017】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとのあいだの領域のことを言うと当該技術分野において知られているオープンリーディングフレーム(ORF)または“コード領域”はまた、効果的に標的化されうる領域でもある。その他の標的領域には、翻訳開始コドンから5’方向におけるmRNAの部分、そしてしたがってmRNAの5’キャップ部位と翻訳開始コドンとのあいだのヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むもの、のことをいうと当該技術分野において知られている5’非翻訳領域(5’UTR)、そして翻訳終止コドンから3’方向におけるmRNAの部分、そしてしたがってmRNAの翻訳終止コドンと3’末端とのあいだのヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むもの、のことをいうと当該技術分野において知られている3’非翻訳領域(3’UTR)、が含まれる。mRNAの5’キャップには5’−5’三リン酸結合を介して、mRNAの最も5’側の残基と結合するN7−メチル化グアノシン残基を含む。mRNAの5’キャップ領域は、5’キャップ構造それ自体だけでなく、キャップに隣接する最初の50ヌクレオチドも含むと考えられている。5’キャップ領域もまた、好ましい標的領域でありうる。
【0018】
いくつかの真核細胞mRNA転写物は直接的に翻訳されるが、多くは1またはそれ以上の“イントロン”として知られる領域を含有し、それらは翻訳される前に転写物から切り出される。残りの(そしてしたがって翻訳される)領域は、 “エクソン”として知られ、そして一緒にスプライシングされて連続的なmRNA配列を形成する。mRNAスプライス部位、すなわち、イントロン−エクソン結合もまた、好ましい標的領域である場合があり、そして特に異常なスプライシングが疾患に関与しているか、あるいは特定のmRNAスプライス産物の過剰産生が疾患に関与している状況において、特に有用である。再構成または欠損による異常な融合結合もまた、好ましい標的である。イントロンも有効である場合があり、そしてしたがって、たとえばDNAまたはプレ−mRNAを標的とするアンチセンス化合物のための標的領域が好ましい場合があることもまた、見出した。
【0019】
いったん1またはそれ以上の標的部位を同定したら、標的に対して十分に相補的な、すなわち、十分によくそして十分に特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドを選択し、所望の効果を得る。
【0020】
本発明の文脈において、“ハイブリダイゼーション”とは、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間のワトソン−クリック水素結合、フーグスティーン水素結合または逆フーグスティーン水素結合でありうる、水素結合を意味する。たとえば、アデニンおよびチミンは相補的な核塩基であり、水素結合を形成することを通じて対合する。本明細書中で使用する場合、“相補的”とは、2つのヌクレオチド間で正確に対合するための能力のことをいう。たとえば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドがDNAまたはRNA分子の同一の位置でヌクレオチドと水素結合することができる場合、オリゴヌクレオチドおよびDNAまたはRNAは、その位置において互いに相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチドおよびDNAまたはRNA は、それぞれの分子中での十分な数の対応する位置が、互いに水素結合することができるヌクレオチドにより占められている場合、互いに相補的である。したがって、“特異的にハイブリダイズ可能”および“相補的”は、安定でそして特異的な結合がオリゴヌクレオチドとDNAまたはRNA標的とのあいだで生じるような、十分な程度の相補性または正確な対合を示すために使用される用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の配列と100%の相同性がある必要はないことは、当該技術分野において理解されている。アンチセンス化合物は、標的DNAまたはRNA分子に対する化合物の結合が標的DNAまたはRNAの正常な機能を妨害して利用できないようにし、そして特異的な結合が所望される条件下、すなわち、in vivoアッセイまたは治療の場合には生理学的条件下、そしてin vitroアッセイの場合には、アッセイを行う条件下にて、非−標的配列に対するアンチセンス化合物の非−特異的結合を妨害するための十分な程度の相補性が存在する場合、特異的にハイブリダイズ可能である。
【0021】
アンチセンス化合物は、一般的に、研究用試薬および診断薬として使用される。たとえば、当業者はしばしば、正確な特異性により遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、特定遺伝子の機能を解明する。たとえば、アンチセンス化合物を使用して、生物学的経路の様々なメンバーの機能どうしを区別することもある。アンチセンスモジュレーションは、したがって、研究用途として使用された。
【0022】
アンチセンスの特異性および感受性も、治療用途として当業者に利用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、動物およびヒトにおける疾患状態を治療する際の治療部分として使用した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトに対して安全にそして効果的に投与され、そして多くの臨床試験が現在進行中である。したがって、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織および動物、特にヒトの治療のための治療計画において有用なものとして形成することができる、有用な治療様式でありうることが確立される。本発明の文脈において、用語“オリゴヌクレオチド”とは、リボ核酸(RNA)またはデオキシリボ核酸(DNA)のオリゴマーまたはポリマー、またはそれらの模倣体のことをいう。この用語には、天然に存在する核塩基、糖および共有ヌクレオシド間(バックボーン)結合、および同様に機能する非−天然に存在する部分を有するオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが含まれる。このような修飾されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、たとえば、細胞取り込みの亢進、核酸標的に対する親和性の亢進、そしてヌクレアーゼの存在下における安定性の増加などの望ましい特性のため、しばしば天然の型より好ましい。
【0023】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス化合物の好ましい形態である一方、本発明は、以下に記載するようなオリゴヌクレオチド模倣体(しかし、これらのものには限定されない)を含む、その他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明に従うアンチセンス化合物は、好ましくは、約8〜約30核塩基(すなわち、約8〜約30の連結したヌクレオシド)を含む。具体的な好ましいアンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは約12〜約25核塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。当該技術分野において知られているように、ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常はヘテロ環式塩基である。このようなヘテロ環式塩基の2つの最も一般的なクラスは、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含む、ヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドに対して、リン酸基は、糖の2’、3’または5’ヒドロキシル部分のいずれかに結合することができる。オリゴヌクレオチドを形成する際に、リン酸基が隣接するヌクレオシドと互いに共有結合し、直鎖ポリマー化合物を形成する。引き続いて、この直鎖ポリマー化合物のそれぞれの末端がさらに一緒になって、環状構造を形成することができるが、しかしながら、開環直鎖構造が一般的には好ましい。オリゴヌクレオチド構造中において、リン酸基とは、一般的には、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成するものと言われる。RNAおよびDNAの正常な結合またはバックボーンは、3’から5’のホスホジエステル結合である。
【0024】
本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例には、修飾バックボーンまたは非−天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書中で定義する場合、修飾バックボーンを有するオリゴヌクレオチドには、バックボーン中にリン原子を保持するものや、バックボーン中にリン原子を有さないものが含まれる。本明細書の目的のため、そして当該技術分野において時々参照される場合、そのヌクレオシド間バックボーン中にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであると考えることができる。
【0025】
好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンには、たとえば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3’−アミノホスホールアミデートおよびアミノアルキルホスホールアミデートを含むホスホールアミデート、チオノホスホールアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な3’−5’結合を有するボラノホスホネート、2’−5’結合したこれらの類似体、そしてヌクレオシドユニットの隣接する塩基対が、5’−3’に対して3’−5’または5’−2’に対して2’−5’に結合する、逆向きの極性を有するもの、が含まれる。様々な塩、混合塩、そして遊離酸型も含まれる。
【0026】
上述したリン−含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.: 3,687,808;4,469,863;4,476,301;5,023,243;5,177,196;5,188,897;5,264,423;5,276,019;5,278,302;5,286,717;5,321,131;5,399,676;5,405,939;5,453,496;5,455,233;5,466,677;5,476,925;5,519,126;5,536,821;5,541,306;5,550,111;5,563,253;5,571,799;5,587,361;および5,625,050が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そして参考文献としてそのそれぞれを本明細書中に援用する。
【0027】
リン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖アルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテロ原子そしてアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1またはそれ以上の短鎖へテロ原子またはヘテロ環式ヌクレオシド間結合により形成される、バックボーンを有する。これらには、モルホリノ結合(部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される);シロキサンバックボーン;スルフィド、スルホキシドおよびスルホンバックボーン;ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン;メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン;アルケン含有バックボーン;スルファメートバックボーン;メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノバックボーン;スルホネートおよびスルホンアミドバックボーン;アミドバックボーン;および混合N、O、SおよびCH2構成要素部分を有するその他のもの、を有するものが含まれる。
【0028】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.: 5,034,506;5,166,315;5,185,444;5,214,134;5,216,141;5,235,033;5,264,562;5,264,564;5,405,938;5,434,257;5,466,677;5,470,967;5,489,677;5,541,307;5,561,225;5,596,086;5,602,240;5,610,289;5,602,240;5,608,046;5,610,289;5,618,704;5,623,070;5,663,312;5,633,360;5,677,437;および5,677,439が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そして参考文献としてそのそれぞれを本明細書中に援用する。
【0029】
その他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体において、ヌクレオチドユニットの糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、バックボーンを、新規の基により置換する。塩基ユニットは、適した核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのための維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有すると示されたそのようなオリゴマー化合物の一つであるオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸(PNA)とも呼ばれている。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−バックボーンは、アミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンにより置換される。核塩基を保持し、そしてバックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.: 5,539,082;5,714,331;および5,719,262が含まれるが、これらだけには限定されず、そのそれぞれを本明細書中に参考文献として援用する。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsenら(Science, 1991, 254, 1497−1500)中に見出すことができる。
【0030】
本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエートバックボーンを有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子バックボーンを有するオリゴヌクレオシドであり、特に上述の米国特許5,489,677の−CH2−NH−O−CH2−、−CH2−N(CH3)−O−CH2−〔メチレン(メチルイミノ)またはMMIバックボーン〕、−CH2−O−N(CH3)−CH2−、−CH2−N(CH3)−N(CH3)−CH2−および−O−N(CH3)−CH2−CH2−〔ここで、天然のホスホジエステルバックボーンは−O−P−O−CH2−として示される〕そして上述の米国特許5,602,240のアミドバックボーンである。上述した米国特許5,034,506のモルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい。
【0031】
修飾オリゴヌクレオチドは、1またはそれ以上の置換糖部分も含有する。好ましいオリゴヌクレオチドは、2’位で以下のものの一つを含む:OH;F;O−、S−、またはN−アルキル;O−、S−、またはN−アルケニル;O−、S−またはN−アルキニル;またはO−アルキル−O−アルキル、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のC1〜C10アルキルまたはC2〜C10アルケニルおよびアルキニルでありうる。O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2、ここでnおよびmは1から約10である、が特に好ましい。その他の好ましいオリゴヌクレオチドは、2’位に以下のものの一つを含む:C1〜C10の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、O−アルカリールまたはO−アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、リポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬理特性を向上するための基、そして同様の特性を有するその他の置換基を含む。好ましい修飾には、2’−メトキシエトキシ(2’−O−CH2CH2OCH3、2’−O−(2−メトキシエチル)または2’−MOEとしても知られる)(Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486−504)、すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。さらに好ましい修飾には、2’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書の以下の実施例に記載する場合、2’−DMAOEとしても知られるO(CH2)2ON(CH3)2基、そして2’−ジメチルアミノエトキシエトキシ(当該技術分野において2’−O−ジメチルアミノエトキシエチルまたは2’−DMAEOEとしても知られる)、すなわち、本明細書中の以下の実施例において2’−O−CH2−O−CH2−N(CH2)2とも記載される、が含まれる。
【0032】
その他の好ましい修飾には、2’−メトキシ(2’−O−CH3)、2’−アミノプロポキシ(2’−OCH2CH2CH2NH2)および2’−フルオロ(2’−F)が含まれる。同様の修飾もまた、オリゴヌクレオチドのその他の位、特に3’末端ヌクレオチドまたは2’−5’結合オリゴヌクレオチド中の糖の3’位および5’末端ヌクレオチドの5’位において作製することもできる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有する場合もある。このような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.: 4,981,957;5,118,800;5,319,080;5,359,044;5,393,878;5,446,137;5,466,786;5,514,785;5,519,134;5,567,811;5,576,427;5,591,722;5,597,909;5,610,300;5,627,053;5,639,873;5,646,265;5,658,873;5,670,633;および5,700,920が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そしてそのそれぞれはその全体を参考文献として本明細書中に援用する。
【0033】
オリゴヌクレオチドには、核塩基(しばしば当該技術分野において単に“塩基”としても呼ばれる)修飾または置換も含まれうる。本明細書中に使用される場合、“非修飾”または“天然”核塩基には、プリン塩基、アデニン(A)およびグアニン(G)、そしてピリミジン塩基、チミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)が含まれる。修飾核塩基には、その他の合成および天然核塩基、たとえば5−メチルシトシン(5−me−C)、5−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6−メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2−プロピルおよびその他のアルキル誘導体、2−チオウラシル、2−チオチミンおよび2−チオシトシン、5−ハロウラシルおよびシトシン、5−プロピニルウラシルおよびシトシン、6−アゾのウラシル、シトシンおよびチミン、5−ウラシル(シュードウラシル)、4−チオウラシル、8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシルおよびその他の8−置換アデニンおよびグアニン、5−ハロ、特に5−ブロモ、5−トリフルオロメチルおよびその他の5−置換ウラシルおよびシトシン、7−メチルグアニンおよび7−メチルアデニン、8−アザグアニンおよび8−アザアデニン、7−デアザグアニンおよび7−デアザアデニンおよび3−デアザグアニンおよび3−デアザアデニンが含まれる。さらなる核塩基には、米国特許No. 3,687,808に開示されたもの、Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858−859、Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されたもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されたもの、そしてSanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289−302, Crooke, S.T. and Lebleu, B. , ed., CRC Press, 1993により開示されたもの、が含まれる。これらの核塩基の特定のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、2−アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシンを含む、5−置換ピリミジン、6−アザピリミジンおよびN−2、N−6およびO−6置換プリンが含まれる。5−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を0.6〜1.2℃増加させることが示され(Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276−278)、そして現在は好ましい塩基置換であり、2’−O−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合にさらにより特に好ましい。
【0034】
上述した修飾核塩基の特定のものおよびその他の修飾核塩基の調製を教示する代表的な米国特許には、上述したU.S. 3,687,808、およびU.S.: 4,845,205;5,130,302;5,134,066;5,175,273;5,367,066;5,432,272;5,457,187;5,459,255;5,484,908;5,502,177;5,525,711;5,552,540;5,587,469;5,594,121;5,596,091;5,614,617;および5,681,941が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そしてそのそれぞれは参考文献として本明細書中に援用し、そして米国特許5,750,692が含まれ、これは本出願により一般に所有されるものであり、そして参考文献として本明細書中に援用する。
【0035】
本発明のオリゴヌクレオチドのその他の修飾には、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを向上する、化学的にオリゴヌクレオチドに結合する1またはそれ以上の部分または複合体が含まれる。そのような部分には、脂質部分、たとえばコレステロール部分(Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553−6556)、コール酸(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053−1060)、チオエーテル、たとえば、ヘキシル−S−トリチルチオール(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306−309;Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765−2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533−538)、脂肪族鎖、たとえば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison−Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111−1118;Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327−330;Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49−54)、リン脂質、たとえば、ジ−ヘキサデシル−rac−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グリセロ−3−H−ホスホネート(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651−3654;Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777−3783)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleoside, 1995, 14, 969−973)、またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651−3654)、パルミチル部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229−237)、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923−937)が含まれるが、これらには限定されない。
【0036】
この様なオリゴヌクレオチド複合体の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.: 4,828,979;4,948,882;5,218,105;5,525,465;5,541,313;5,545,730;5,552,538;5,578,717, 5,580,731;5,580,731;5,591,584;5,109,124;5,118,802;5,138,045;5,414,077;5,486,603;5,512,439;5,578,718;5,608,046;4,587,044;4,605,735;4,667,025;4,762,779;4,789,737;4,824,941;4,835,263;4,876,335;4,904,582;4,958,013;5,082,830;5,112,963;5,214,136;5,082,830;5,112,963;5,214,136;5,245,022;5,254,469;5,258,506;5,262,536;5,272,250;5,292,873;5,317,098;5,371,241, 5,391,723;5,416,203, 5,451,463;5,510,475;5,512,667;5,514,785;5,565,552;5,567,810;5,574,142;5,585,481;5,587,371;5,595,726;5,597,696;5,599,923;5,599,928および5,688,941が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そしてそのそれぞれは参考文献として本明細書中に援用される。
【0037】
所定の化合物中のすべての位置を均一に修飾されることが必要とはされず、そして実際に、一つ以上の上述した修飾を、単一の化合物中あるいはオリゴヌクレオチド中の単一のヌクレオシドにおいても組み込むことができる。本発明には、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含まれる。本発明の文脈において、“キメラ”アンチセンス化合物または“キメラ”は、2つまたはそれ以上の化学的に特徴的な領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドであり、それぞれが少なくとも一つのモノマーユニット、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合にヌクレオチドから形成される。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも一つの領域を含有し、ここでオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに対して、増加したヌクレアーゼ分解耐性、増加した細胞取り込みおよび/または標的核酸に対する増加した結合親和性を付与するように、修飾される。オリゴヌクレオチドの追加の領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質として働くことができる。例を挙げると、RNase Hは、RNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する、細胞性のエンドヌクレアーゼである。RNase Hの活性化により、したがって、結果としてRNA標的の切断を引き起こし、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を非常に向上させる。結果として、キメラオリゴヌクレオチドを使用する場合に、同一の標的領域に対してハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドの場合と比較して、しばしばより短いオリゴヌクレオチドにより匹敵する結果を得ることができる。RNA標的の切断は、ゲル電気泳動により、そして必要な場合には当該技術分野において既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術により、日常的に検出することができる。
【0038】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、2つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび/または上述したオリゴヌクレオチド模倣体の混成の構造として形成することができる。このような化合物は、 当該技術分野においてハイブリッドまたはギャップマーとも呼ばれている。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.: 5,013,830;5,149,797;5,220,007;5,256,775;5,366,878;5,403,711;5,491,133;5,565,350;5,623,065;5,652,355;5,652,356;および5,700,922が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そしてそのそれぞれは全体として参考文献として本明細書中に援用される。
【0039】
本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、周知の固相合成技術を介して、容易にそして日常的に作製することができる。このような合成のための装置は、たとえばApplied Biosystems(Foster City, CA)を含むいくつかの供給者により販売されている。このような合成のための当該技術分野において既知のいずれかその他の手段を、追加的にまたは代替的に使用することができる。同様な技術を使用してホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製することは周知である。
【0040】
本発明のアンチセンス化合物は、in vitroで合成され、そして生物学的起源のアンチセンス組成物またはアンチセンス分子のin vivo合成を指向するように設計された遺伝子ベクター構築物を含まない。
【0041】
本発明の化合物を、取り込み、分布および/または吸収を助けるために、たとえば、リポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所またはその他の製剤として、混合し、カプセル化し、複合体化することができ、またはそうでなければ、その他の分子、分子構造、または化合物の混合物と結合させてもよい。そのような取り込み、分布および/または吸収を助ける製剤の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.: 5,108,921;5,354,844;5,416,016;5,459,127;5,521,291;5,543,158;5,547,932;5,583,020;5,591,721;4,426,330;4,534,899;5,013,556;5,108,921;5,213,804;5,227,170;5,264,221;5,356,633;5,395,619;5,416,016;5,417,978;5,462,854;5,469,854;5,512,295;5,527,528;5,534,259;5,543,152;5,556,948;5,580,575;および5,595,756が含まれるが、それらには限定されず、そのそれぞれを参考文献として本明細書中に援用する。
【0042】
本発明のアンチセンス化合物は、いずれかの医薬的に許容可能な塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物に投与する際にその生物学的に活性な代謝物または残留物を(直接的にまたは間接的に)提供することができるいずれか他の化合物を包含する。したがって、たとえば、開示から、プロドラッグおよび医薬的に許容可能な本発明の化合物の塩、そのプロドラッグの医薬的に許容可能な塩、およびその他の生物学的等価物も導き出される。
【0043】
用語“プロドラッグ”は、内在性の酵素またはその他の化学物質および/または条件の作用により、その体内または細胞内で活性化型(すなわち、薬物)に変換される、不活性型で調製される治療剤のことを示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ版は、GosselinらのWO 93/24510(1993年12月9日に発行)またはImbachらのWO 94/26764に開示された方法に従うSATE[(S−アセチル−2−チオエチル)ホスフェート]誘導体として調製される。
【0044】
用語“医薬的に許容可能な塩”とは、生理学的または医薬的に許容可能な本発明の化合物の塩:すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、そしてそれについての所望しない毒性効果を与えない塩のことをいう。
【0045】
医薬的に許容可能な塩基付加塩は、金属またはアミン、たとえばアルカリおよびアルカリ土類金属または有機アミンなどにより形成される。カチオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。適したアミンの例は、N,N’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、N−メチルグルカミン、およびプロカイン(たとえば、Berge et al., “Pharmaceutical Salts,” J. of Pharma Sci., 1977, 66, 1−19を参照)である。前記酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸型を十分な量の所望の塩基と接触させて、共有結合様式で塩を生成することにより、調製する。遊離酸型は、塩型を酸と接触させることにより、そして遊離酸を従来の様式で単離することにより、再生することができる。遊離酸型は、そのそれぞれの塩型とは、極性溶媒中への溶解性などの特定の生理学的特性においていくらか異なっているが、しかしそれ以外は、本発明の目的のためには、塩はそれらそれぞれの遊離酸と等価である。本明細書中で使用される場合、“医薬的な付加塩”には、本発明の組成物の構成要素の一つの酸型の医薬的に許容可能な塩が含まれる。これらには、アミンの有機酸塩または無機酸塩が含まれる。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩である。その他の適した医薬的に許容可能な塩は、当業者に周知であり、そして様々な無機酸および有機酸の塩基性塩が含まれ、たとえば、無機酸を有するものとしては、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸など;有機酸を有するものとしてはカルボン酸、スルホン酸、スルホ酸またはリン酸またはN−置換スルファミン酸、たとえば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、4−アミノサリチル酸、2−フェノキシ安息香酸、2−アセトキシ安息香酸、エンボン酸(embonic acid)、ニコチン酸またはイソニコチン酸;そしてアミノ酸を有するものとしては、本来はタンパク質の合成に関連する20個のα−アミノ酸、たとえばグルタミン酸、またはアスパラギン酸など、そしてまた、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−1,2−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−2−スルホン酸、ナフタレン−1,5−ジスルホン酸、2−または3−ホスホグリセリン酸、グルコース−6−ホスフェート、N−シクロヘキシルスルファミン酸(シクラメートの形成を伴う)を有するもの、またはその他の酸有機化合物、たとえば、アスコルビン酸などを有するものが含まれる。化合物の医薬的に許容可能な塩もまた、医薬的に許容可能なカチオンにより調製することができる。適した医薬的に許容可能なカチオンは、当業者に周知であり、そしてアルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび第四アンモニウムカチオンが含まれる。炭酸塩または炭酸水素塩もまた可能である。
【0046】
オリゴヌクレオチドについて、医薬的に許容可能な塩の好ましい例には、(a)ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミンなどのカチオンにより形成される塩;(b)無機酸、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などにより形成される酸付加塩;(c)有機酸、たとえば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などにより形成される塩;そして(d)塩素、臭素、およびヨウ素などの元素アニオンから形成される塩;が含まれるが、これらには限定されない。
【0047】
本発明のアンチセンス化合物は、診断薬、治療薬、予防薬、そして研究用試薬およびキットとして使用することができる。治療薬として、C/EBPαの発現をモジュレートすることにより治療することができる疾患または症状を有することが疑われる動物、好ましくはヒトを、本発明に従うアンチセンス化合物を投与することにより治療する。本発明の化合物を、有効量のアンチセンス化合物を適した医薬的に許容可能な希釈剤または担体に添加することにより、医薬組成物中で利用することができる。本発明のアンチセンス化合物および方法の使用はまた、予防的、たとえば、感染、炎症または腫瘍形成を予防しまたは遅延させるためにも有用である場合がある。
【0048】
これらの化合物がC/EBPαをコードする核酸に対してハイブリダイズし、この事実を探求するためにサンドイッチアッセイおよびその他のアッセイを容易に構築することができるため、本発明のアンチセンス化合物は、研究用としてそして診断薬として有用である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのC/EBPαをコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、当該技術分野において既知の手段により検出することができる。このような手段には、オリゴヌクレオチドに対する酵素の複合化、オリゴヌクレオチドの放射標識またはいずれかその他の適した検出手段を含むことができる。サンプル中のC/EBPαのレベルを検出するためのこの様な検出手段を使用するキットもまた、調製することができる。
【0049】
本発明にはまた、本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤が含まれる。本発明の医薬組成物は、局所治療または全身治療が所望されるかどうか、そして治療すべき領域に依存して、多数の方法により投与することができる。投与は、局所(眼を含み、および膣および直腸送達を含む粘膜に対するものを含む)、肺、たとえば、ネブライザーによるものを含む、粉末またはエアロゾルの吸入または吹き込みによるもの;気管内、鼻内、表皮、および経皮)、経口または非経口により行うことができる。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内の注射または注入;または頭蓋内、たとえば、くも膜下投与または脳室内投与が含まれる。少なくとも一つの2’−O−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与のために特に有用であると考えられている。
【0050】
局所投与のための医薬組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤、および粉剤が含まれうる。従来からの医薬的な担体、液体、粉末または油状基材、増粘剤などは、必要とされるかまたは所望される場合がある。コートしたコンドーム、手袋などもまた有用である。
【0051】
経口投与のための組成物および製剤には、粉末または顆粒、懸濁剤または水溶液または非水性媒体中溶液、カプセル、サシェ、または錠剤などが含まれる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が好ましい場合がある。
【0052】
非経口投与、くも膜下投与または脳室内投与のための組成物および製剤には、バッファー、希釈剤およびその他の適した添加物、たとえば浸透亢進剤、担体化合物、およびその他の医薬的に許容可能な担体または賦形剤もまた含有しうる、滅菌水溶液が含まれうる。
【0053】
本発明の医薬組成物には、溶液、エマルジョン、およびリポソーム含有製剤が含まれるが、これらには限定されない。これらの組成物は、既成液体、自己乳化性固体そして自己乳化性半固体が含まれる、様々な構成要素から生成することができるが、これらには限定されない。
【0054】
単位用量剤形中に容易に提供ことができる本発明の医薬製剤は、医薬業界において周知の従来技術にしたがって調製することができる。このような技術には、活性有効成分と1または複数の医薬的担体または1または複数の医薬的賦形剤とを組み合わせる工程が含まれる。一般的には、均質にそして緊密に、活性有効成分と液体担体または正確に分割した固体担体またはその両方と組み合わせ、その後必要とされる場合には生成物を成型することにより、製剤を調製する。
【0055】
本発明の組成物は、たとえば錠剤、カプセル、液体シロップ、軟ゲル、坐剤、および浣腸剤などの、しかしこれらには限定されない、多くの可能性のある用量剤形のいずれか中に製剤化することができる。本発明の組成物はまた、水性媒体、非水性媒体または混合媒体中の懸濁剤として製剤化することもできる。水性懸濁剤はさらに、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランを含む懸濁剤の粘度を上昇させる物質を含有してもよい。懸濁剤はまた、安定化剤を含有していてもよい。
【0056】
本発明の一態様において、医薬組成物を製剤化し、そして泡状物として使用することができる。医薬的な泡状物には、エマルジョン、マイクロエマルジョン、クリーム剤、ジェリー剤、およびリポソーム剤などの製剤を含むが、これらのものには限定されない。その性質において基本的に同様である一方、これらの製剤は、最終生成物の構成要素および密度において変化する。このような組成物および製剤の調製は、一般的に医薬および製剤の分野における当業者に知られており、そして本発明の組成物の製剤に対して適用することができる。
【0057】
エマルジョン
本発明の組成物は、エマルジョンとして調製しそして製剤化することができる。エマルジョンは、通常は直径0.1μmを超える液滴の形状で、一つの液体を別の液体中に分散させた典型的には不均質の系である(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199;Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245;Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335;Higuchi et al., in Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 301)。エマルジョンは、しばしば、互いに十分に混合され分散された2種の不混和性の液体相を含む二相システムである。一般的には、エマルジョンは、油中水型の種(w/o)または水中油型の種(o/w)のいずれかでありうる。液体相がバルクな油相中によく分離され微小滴として分散されている場合、得られた組成物を油中水型(w/o)エマルジョンと呼ぶ。あるいは、油相がバルクな液体相中によく分離され微小滴として分散されている場合、得られた組成物を水中油型(o/w)エマルジョンと呼ぶ。エマルジョンは、分散相と、液体相、油相のいずれか中に溶液としてあるいは別々の相としてそれ自体として存在していてもよい活性な薬物と、に加えて、さらに要素を包含していてもよい。乳化剤、安定化剤、色素、および抗酸化剤などの医薬的な賦形剤が、必要に応じてエマルジョン中に存在していてもよい。医薬的なエマルジョンは、たとえば、油中水中油型(o/w/o)および水中油中水型(w/o/w)エマルジョンの場合のような、2種以上の相を含む、マルチエマルジョンであってもよい。このような複合製剤は、しばしば、単なる2成分のエマルジョンでは得られない、特定の利点を提供する。o/wエマルジョンの個々の油滴が小さな水滴を含むマルチエマルジョンは、w/o/wエマルジョンを構成する。同様に、油性の連続相中に安定化された水の小球中に含まれる油滴のシステムは、o/w/oエマルジョンを提供する。
【0058】
エマルジョンは、熱力学的安定性をほとんど有さないかまたはまったく有さないことにより特徴付けられる。しばしば、エマルジョンの分散相または不連続相が、外部相または連続相中に十分に分散され、そして乳化剤の手段または製剤の粘性を介してこの形態に維持される。エマルジョンの相のいずれかは、エマルジョン−型軟膏基材およびクリームの場合の様に、半固体または個体であってもよい。エマルジョンを安定化するその他の手段には、エマルジョンのいずれかの相中に含まれてもよい、乳化剤を使用することが含まれる。乳化剤は、大きく4つのカテゴリーに分類される場合がある:合成サーファクタント、天然に存在する乳化剤、吸着基材、そして精密に分散された固体、である(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199)。
【0059】
合成サーファクタントは、界面活性剤としても知られているが、エマルジョンの製剤化において幅広い有用性が見出されており、そして文献においてもレビューされている(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199)。サーファクタントは、典型的には、両親媒性であり、そして親水性部分と疎水性部分とを含む。サーファクタントの疎水性の性質に対する親水性の性質の比率は、親水性/親油性バランス(HLB)と呼ばれ、そして製剤の調製においてサーファクタントを分類しそして選択する際の貴重なツールである。サーファクタントは、親水性基の性質に基づいて別のクラスに分類される場合がある:非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285)。
【0060】
エマルジョン製剤中で使用される天然に存在する乳化剤には、ラノリン、密ロウ、ホスファチド類、レシチンおよびアカシアが含まれる。吸着基材は、水を吸収して、w/oエマルジョンを形成するが、それでもそれらの半固体の硬さを維持するような、親水性特性を有し、たとえば無水ラノリンおよび親水性ワセリンがある。精密に分散された固体もまた、よい乳化剤として、特にサーファクタントと組み合わせて、そして粘着性の調製物中で使用された。これらには、重金属水酸化物;ベントナイト、アタパルガイト、ヘクトライト(hectorite)、カオリン、モンモリロン石、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなどの非膨張性クレー;色素;および炭素またはトリステアリン酸グリセリンなどの非極性固体;などの極性の無機固体が含まれる。
【0061】
非常に様々な非−乳化性物質もまた、エマルジョン製剤中に含まれ、そしてエマルジョンの特性に寄与する。これらには、脂質、油、ロウ、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、保水剤(humectants)、親水性コロイド、保存剤および抗酸化剤が含まれる(Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335;Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199)。
【0062】
親水性コロイドまたは親水コロイドには、多糖類(たとえば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラギーナン、グアルガム(guar gum)、インドゴム(karaya gum)、そしてトラガカント)、セルロース誘導体(たとえば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース)、そして合成ポリマー(たとえば、カルボマー(carbomers)、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー)などの、天然に存在するガムおよび合成のポリマーが含まれる。これらは、水中で分散しあるいは膨張して、強力な界面フィルムを分散相の滴の周囲に形成し、そして外部相の粘性を増大させることにより、エマルジョンを安定化させるコロイド溶液を形成する。
【0063】
エマルジョンはしばしば、微生物の増殖をすぐにサポートすることができる、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびホスファチドなどの多数の活性物質を含有するため、これらの製剤はしばしば保存剤を含む。エマルジョン製剤中に含まれる一般的に使用される保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第4アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、p−ヒドロキシ安息香酸のエステル、そしてホウ酸が含まれる。抗酸化剤もまた、一般的にエマルジョン製剤に添加して、製剤の変質を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル(alkyl gallates)、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤などのフリーラジカルスカベンジャー、およびクエン酸、酒石酸、およびレシチンなどの抗酸化剤シナージストであってもよい。
【0064】
外皮経路、経口経路、および非経口経路を介するエマルジョン製剤の使用およびそれらの製造のための方法は、文献中でレビューされてきた(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199)。経口送達のためのエマルジョン製剤は、製剤化が容易であり吸収および生物学的適合性の観点から効率的であるため、非常に幅広く使用されてきた(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245;Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199)。ミネラル油−ベースの緩下剤、油溶性ビタミンおよび高脂肪栄養調製物は、一般的に、o/wエマルジョンとして経口的に投与される物質に含まれる。
【0065】
本発明の一態様において、オリゴヌクレオチドと核酸の組成物は、マイクロエマルジョンとして製剤化される。マイクロエマルジョンは、水、油および単一の、光学的に等方性な、そして熱力学的に安定な液体溶液である両親媒性物質、のシステムとして定義されうる(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245)。典型的には、マイクロエマルジョンは、まず油を水溶性サーファクタント溶液中に分散させ、そしてついで一般的には中間鎖長アルコールである十分量の第4の構成要素を添加して、透明なシステムを形成することにより、調製されるシステムである。したがって、マイクロエマルジョンは、界面活性分子の界面フィルムにより安定化される2種の不混和性の液体の、熱力学的に安定で、等方性な、透明の分散物質としても記載された(Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185−215)。マイクロエマルジョンは、一般的には、油、水、サーファクタント、コサーファクタントおよび電解質を含む、3〜5種の構成要素を組み合わせることにより調製される。マイクロエマルジョンが油中水型(w/o)であるかあるいは水中油型(o/w)であるかは、使用される油およびサーファクタントの特性に依存し、そしてサーファクタント分子の構造のその極性頭部と炭化水素尾部の幾何学的な畳み込みに依存する(Schott, in Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 271)。
【0066】
相ダイアグラムを使用した現象学的アプローチが広く研究され、そしてマイクロエマルジョンを製剤化するための方法についての、当業者に対する、包括的な知識が得られた(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245;Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335)。従来のエマルジョンと比較して、マイクロエマルジョンは、自発的に形成される熱力学的に安定な小滴の製剤において、水−不溶性薬物を可溶化するという利点を提供する。
【0067】
マイクロエマルジョンの調製に使用されるサーファクタントには、イオン性サーファクタント、非−イオン性サーファクタント、Brij 96、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート(ML310)、テトラグリセロールモノオレエート(MO310)、ヘキサグリセロールモノオレエート(PO310)、ヘキサグリセロールペンタオレエート(PO500)、デカグリセロールモノカプレート(MCA750)、デカグリセロールモノオレエート(MO750)、デカグリセロールセクイオレエート(sequi oleate)(SO750)、デカグリセロールデカオレエート(DAO750)、が、単独であるいはコサーファクタントと組み合わせて含まれるが、これらには限定されない。コサーファクタントは、通常はエタノール、1−プロパノール、および1−ブタノールなどの短鎖アルコールであるが、サーファクタントフィルム中に浸透し、そして結果的にはサーファクタント分子のあいだで生成される空隙スペースのために不規則なフィルムを作製することにより、界面流動度を増大させるために働く。しかしながら、マイクロエマルジョンは、コサーファクタントを使用することなく調製することができ、そしてアルコールフリーの自己乳化マイクロエマルジョンシステムが当該技術分野において知られている。水相は、典型的には、水、薬物の水性溶液、グリセロール、PEG300、PEG400、ポリグリセロール、プロピレングリコールおよびエチレングリコールの誘導体であってもよいが、これらのものには限定されない。油相には、Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸エステル、中間鎖(C8−C12)モノ、ジ、およびトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリ糖化(glycolized)グリセリド、飽和ポリ糖化(glycolized)C8−C10グリセリド、植物油およびシリコーン油などの物質が含まれうるが、これらのものには限定されない。
【0068】
マイクロエマルジョンは、薬物溶解性および薬物の吸収亢進の観点から、特に興味深いものである。脂質ベースのマイクロエマルジョン(o/wおよびw/oの両方)は、ペプチドを含む薬物の経口生物学的適合性を亢進させると提唱された(Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385−1390;Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205)。マイクロエマルジョンは、薬物溶解性の向上、酵素的加水分解からの薬物の保護、膜流動度および膜透過性におけるサーファクタント−誘導性変化による薬物吸収の亢進の可能性、調製の容易性、固体用量剤形を超える経口投与の容易性、臨床的可能性の向上、および毒性の低減といった利点を提供する(Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385;Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138−143)。それらの構成要素を周囲温度において一緒にしておくと、しばしば、マイクロエマルジョンが自発的に形成される場合がある。このことは、易熱性(熱不安定性)薬物、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドを製剤化する際に、特に利点でありうる。マイクロエマルジョンは、美容用途および医薬用との両方において、活性構成要素の経皮的送達においても有効であった。本発明のマイクロエマルジョン組成物および製剤は、胃腸管からのオリゴヌクレオチドおよび核酸の全身性吸収の増加を促進し、および胃腸管、膣、口腔(buccal cavity)およびその他の投与領域中で、オリゴヌクレオチドおよび核酸の局所的細胞取り込みを向上させることができる。
【0069】
本発明のマイクロエマルジョンはまた、ソルビタンモノステアレート(Grill 3)、ラブラゾル(Labrasol)、および浸透亢進剤などの追加の構成要素および添加剤を含有して、製剤の特性を向上させ、そして本発明のオリゴヌクレオチドおよび核酸の吸収を亢進させることもできる。本発明のマイクロエマルジョン中で使用される浸透亢進剤は、5つの幅広いカテゴリーのうちの一つに属するものとして分類することができる:サーファクタント、脂肪酸、胆汁酸、キレート剤、および非−キレート非−サーファクタント(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92)。これらのクラスのそれぞれは、上述した。
【0070】
リポソーム
マイクロエマルジョン以外に、薬物の製剤化のために研究されそして使用された、多くの有機(organized)サーファクタント構造が存在する。これらには、単層、ミセル、二重層および小胞が含まれる。小胞、たとえばリポソーム、は、薬物送達の観点からそれらが提供する、その特異性および作用期間により、大きな興味をひきつけた。本明細書中で使用される場合、“リポソーム”という用語は、球状の1または複数の二重層中に配置された、両親媒性脂質からなる小胞を意味する。
【0071】
リポソームは、親油性物質から形成される膜および水性の内部を有する、単一ラメラ小胞またはマルチラメラ小胞である。水性部分には、送達すべき組成物が含有される。カチオン性リポソームは、細胞壁と融合することができるという利点を有する。非−カチオン性リポソームは、細胞壁とは効率的に融合することができないものの、マクロファージによりin vivoにおいて取り込まれる。
【0072】
無傷のほ乳動物皮膚を通過するために、脂質小胞は、適切な経皮的勾配の影響のもと、それぞれが直径50 nm未満であるような一連の微細な孔を通過しなければならない。したがって、高度に変形しやすくそしてそのような微細な孔を通過することができるリポソームを使用することが好ましい。
【0073】
リポソームのさらなる利点には、以下のものが含まれる;天然のリン脂質から得られたリポソームは、生物学的適合性であり、そして生体分解性なものである;リポソームは、幅広い水溶性薬物および脂質可溶性薬物を含むことができる;リポソームは、その内部コンパートメント中のカプセル化した薬物を代謝および分解から保護することができる(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245)。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要事項は、脂質表面荷電、小胞サイズ、そしてリポソームの水容積である。
【0074】
リポソームは、活性成分を作用部位に移送および送達するために有用である。リポソーム膜は、構造的に生体膜と類似しているため、リポソームを組織に使用する場合には、リポソームを細胞膜に溶け込ませるようにはじめる。リポソームと細胞の溶融が進行するにつれて、リポソーム内容物は、活性剤が作用することができる細胞中へ移る。
【0075】
リポソーム製剤は、多くの薬物についての送達様式として、幅広い研究の焦点である。局所投与のために、リポソームは、他の製剤を超えるいくつかの利点を提供するという証拠がますます多くなっている。このような利点には、投与された薬物の高い全身性吸収に関連した副作用の減少、所望される標的での投与された薬物の蓄積の増加、そして親水性および疎水性の両方の様々な薬物を皮膚中に投与する能力、が含まれる。
【0076】
いくつかの報告は、リポソームが高分子量DNAを含む薬剤を皮膚中に送達する能力について詳細に説明した。鎮痛剤、抗体、ホルモンおよび高分子量DNAを含む化合物を、皮膚に投与した。投与の多くは、結果として外皮の上部を標的とした。
【0077】
リポソームは、2つの幅広いクラスに分けられる。カチオン性リポソームは、マイナス(−)に荷電したDNA分子と相互作用して、安定な複合体を形成する、プラス(+)に荷電したリポソームである。プラスに荷電したDNA/リポソーム複合体は、マイナスに荷電した細胞表面に結合し、そしてエンドソーム中に内部化される。エンドソーム中の酸性pHにより、リポソームは破裂し、その内容物を細胞質中に放出する(Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980−985)。
【0078】
pH−感受性あるいはマイナスに荷電したリポソームは、DNAと複合体を形成するというよりは、DNAを捕捉する。DNAおよび脂質の両方が同様に荷電するため、複合体の形成ではなく反発(repulsion)が生じる。それにもかかわらず、いくつかのDNAは、これらのリポソームの水性内部中に捕捉される。pH−感受性リポソームを使用して、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするDNAを培養中の細胞単層に送達させた。外来性遺伝子の発現が、標的細胞中で検出された(Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269−274)。
【0079】
リポソーム組成物の1つの主要な型には、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。天然のリポソーム組成物は、たとえば、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)またはジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、一般的に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、一方でアニオン性フソジェニックな(fusogenic)リポソームは、主として、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)から形成される。リポソーム組成物の別の型は、たとえば、ダイズホスファチジルコリン(PC)、およびタマゴPCなどのPCから形成される。別の型は、リン脂質および/またはホスファチジルコリンおよび/またはコレステロールの混合物から形成される。
【0080】
いくつかの研究では、皮膚へのリポソーム薬剤製剤の局所投与が評価された。インターフェロンを含有するリポソームをモルモット皮膚に対して使用すると、結果として皮膚のヘルペス潰瘍が減少したが、その他の手段(たとえば溶液またはエマルジョン)を介してインターフェロンの送達をしても有効ではなかった(Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405−410)。さらに、別の研究は、水性システムを用いたインターフェロンの投与に対する、リポソーム製剤の一部として投与したインターフェロンの効率を試験し、そしてリポソーム製剤は水性投与よりも優れていると結論付けた(du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259−265).
薬物の皮膚への送達におけるその有用性を決定するために、非−イオン性リポソームシステム、特に、非−イオン性サーファクタントおよびコレステロールを含むシステムを調べた。NovasomeTM I(グリセリルジラウレート/コレステロール/ポリオキシエチレン−10−ステアリルエーテル)およびNovasomeTM II(グリセリルジステアレート/コレステロール/ポリオキシエチレン−10−ステアリルエーテル)を含む非−イオン性リポソーム製剤を使用して、シクロスポリン−Aをマウス皮膚の真皮中に送達した。結果から、このような非−イオン性リポソームシステムは、シクロスポリン−Aが皮膚の別の層中に沈着することを促進する際に効果的であることが示された(Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466)。
【0081】
リポソームには、“立体化学的に安定な”リポソームも含まれるが、この用語は本明細書中で使用される場合、1またはそれ以上の特殊な(specialized)脂質であって、リポソーム中に取り込まれた場合、そのような特殊な脂質を含まないリポソームと比較して、循環血中での寿命が長くなる脂質、を含むリポソームのことをいう。立体化学的に安定なリポソームの例は、リポソームの小胞−形成性脂質部分の一部分が、(A)モノシアロガングリオシドGM1などの1またはそれ以上の糖脂質を含むか、または(B)ポリエチレングリコール(PEG)部分などの1またはそれ以上の親水性ポリマーにより誘導体化されている、ものがある。いずれかの具体的な理論に縛られることを望むわけではないが、当該技術分野においては、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはPEG−誘導体化脂質を含有する少なくとも立体化学的に安定なリポソームについて、これらの立体化学的に安定なリポソームの循環系での半減期が増加しているのは、細網内皮系(RES)の細胞中への取り込みが減少したことに由来すると考えられている(Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42;Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765)。1またはそれ以上の糖脂質を含む様々なリポソームが、当該技術分野において既知である。Papahadjopoulosら(Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64)は、モノシアロガングリオシドGM1、硫酸ガラクトセレブロシドおよびホスファチジルイノシトールがリポソームの血中半減期を向上させる能力を報告した。これらの知見は、Gabizonら(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949)により述べられた。米国特許No. 4,837,028およびWO 88/04924は、両方ともAllenらによるものであるが、(1)スフィンゴミエリンおよび(2)ガングリオシドGM1または硫酸ガラクトセレブロシドエステル、を含むリポソームを開示する。米国特許No. 5,543,152(Webbら)は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。1,2−sn−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、WO 97/13499(Limら)中に開示されている。
【0082】
1またはそれ以上の親水性ポリマーにより誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその製造方法は、当該技術分野において既知である。Sunamotoら(Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778)は、PEG部分を含有する非イオン性界面活性剤、2C1215G、を含むリポソームを記載した。Illumら(FEBS Lett., 1984, 167, 79)は、ポリスチレン粒子のポリマーグリコールによる親水性コーティングが、血中半減期の顕著な増加を引き起こすことに注目した。ポリアルキレングリコール(たとえば、PEG)のカルボン酸(carboxylic)基の結合により修飾された合成リン脂質は、Searsにより記載されている(米国特許Nos. 4,426,330および4,534,899)。Klibanovら(FEBS Lett., 1990, 268, 235)は、PEGまたはステアリン酸PEGにより誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン(PE)を含むリポソームは、血液循環中での半減期が顕著に増加することを示す実験を記載した。Blumeら(Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91)は、そのような知見をその他のPEG−誘導体化リン脂質、たとえば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)およびPEGの組み合わせから形成されるDSPE−PEG、に拡張した。共有結合したPEG部分をその外側表面に有するリポソームは、Fisherに対する欧州特許No. EP 0 445 131 B1およびWO 90/04384中に記載される。PEGにより誘導体化された1〜20モル%のPEを含有するリポソーム組成物、およびその使用方法は、Woodleら(米国特許Nos. 5,013,556および5,356,633)およびMartinら(米国特許No. 5,213,804および欧州特許No. EP 0 496 813 B1)により記載される。多数のその他の脂質−ポリマー複合体を含むリポソームは、WO 91/05545および米国特許No. 5,225,212(両方ともMartinら)およびWO 94/20073(Zalipskyら)において記載される。PEG−修飾セラミド脂質を含むリポソームは、WO 96/10391(Choiら)に記載される。米国特許Nos. 5,540,935(Miyazakiら)および5,556,948(Tagawaら)は、その表面に対して官能基部分をさらに誘導体化することができる、PEG−含有リポソームを記載する。
【0083】
核酸を含む限定的な数のリポソームが当該技術分野において既知である。Thierryらに対するWO 96/40062は、高分子量の核酸をリポソーム中にカプセル化するための方法を開示する。Tagawaらに対する米国特許No. 5,264,221は、タンパク質−結合リポソームを開示し、そしてそのようなリポソームの内容物にはアンチセンスRNAが含まれうることを明らかにしている。Rahmanらに対する米国特許No. 5,665,710は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム中にカプセル化する特定の方法を記載する。Loveらに対するWO 97/04787は、raf遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソームを開示する。
【0084】
トランスファーソーム(transfersome)は、リポソームのさらに別の型であり、そして非常に変形可能な脂質集合物であり、薬物送達ビヒクルの魅力的な候補物である。トランスファーソームは、非常に変形可能であるため、小滴よりも小さな孔を介して容易に浸透することができる、脂質小滴として記載することができる。トランスファーソームは、それらを使用する環境に適応することができ、たとえばそれらは、自己−最適性(皮膚の孔の形状に適応する)であり、自己−修復性であり、しばしば断片化されることなくそれらの標的に到達し、そしてしばしば自己−負荷性(self−loading)である。トランスファーソームを作製するため、標準的なリポソーム組成物に対して、表面強力アクチベーター(edge−activators)、通常はサーファクタント、を添加することができる。トランスファーソームを使用して、皮膚に対して血清アルブミンを送達した。血清アルブミンのトランスファーソーム−媒介性送達は、血清アルブミンを含有する溶液を皮下に注入する方法と同様に効率的であることが示された。
【0085】
サーファクタントは、エマルジョン(マイクロエマルジョンを含む)およびリポソームなどの製剤において、幅広い用途が見いだされる。多くの様々なタイプのサーファクタントの特性を、天然のサーファクタントおよび合成のサーファクタントの両方ともについて分類しそしてランク付けする最も一般的な方法は、親水性/親油性バランス(HLB)の使用によるものである。親水性基(“ヘッド”としても知られる)の性質は、製剤に使用する様々なサーファクタントをカテゴリー化に対して最も有用な手段を提供する(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285)。
【0086】
サーファクタント分子がイオン化されていない場合、非イオン性サーファクタントとして分類される。非イオン性サーファクタントは、医薬生成物および化粧用生成物において幅広い用途を見いだされ、そして幅広いpH値にわたって使用することができる。一般的には、それらのHLB値は、その構造に依存して、2〜約18の範囲にわたる。非イオン性サーファクタントには、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、そしてエトキシ化(ethoxylated)エステルなどの非イオン性エステルが含まれる。脂肪アルコールエトキシ化物(ethoxylates)、プロポキシ化(propoxylated)アルコール、およびエトキシ化/プロポキシ化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレンサーファクタントは、非イオン性サーファクタントのクラスの最も一般的な構成物質である。
【0087】
サーファクタント分子が、水中に溶解しまたは分散させる場合に負(−)の荷電を有する場合、サーファクタントはアニオン性と分類される。アニオン性サーファクタントには、石けんなどのカルボン酸エステル、アシルラクチレート(lactylates)、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸塩およびエトキシ化アルキル硫酸塩などの硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホン酸エステル、アシルイセチオネート(isethionates)、アシルタウレート(taurates)およびスルホコハク酸塩などのスルホン酸エステル、およびホスフェートが含まれる。アニオン性サーファクタントのクラスの最も重要な構成物質は、アルキル硫酸塩および石けんである。
【0088】
サーファクタント分子が、水中に溶解されまたは分散される場合に正(+)の荷電を有する場合、サーファクタントはカチオン性と分類される。カチオン性サーファクタントには、第四アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが含まれる。第四アンモニウム塩は、このクラスの最も使用される構成物質である。
【0089】
サーファクタント分子が正(+)の荷電または負(−)の荷電のいずれをも有する能力を有する場合、サーファクタントは両性として分類される。両性サーファクタントには、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド類、N−アルキルベタイン類およびホスファチド類が含まれる。
【0090】
薬剤生成物、製剤およびエマルジョン中でのサーファクタントの使用は、以下にレビューされている(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285)。
【0091】
浸透亢進剤
一態様において、本発明は、様々な浸透亢進剤を使用して、核酸、特にオリゴヌクレオチドの、動物の皮膚に対する効率的な送達を達成する。ほとんどの薬剤は、イオン化型および非イオン化型の両方において溶液中に存在する。しかしながら、通常は、脂質可溶性あるいは親油性薬物のみが容易に細胞膜を通過する。非−親油性薬物でさえも、通過すべき膜を浸透亢進剤により処理される場合には、細胞膜を通過することができることを見出した。非−親油性薬物の細胞膜を通じた拡散を補助することに加えて、浸透亢進剤はまた、親油性薬物の透過性も向上させる。
【0092】
浸透亢進剤は、5つの幅広いカテゴリー、すなわち、サーファクタント、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、そして非−キレート非−サーファクタント、の一つに属するものとして分類することができる(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92)。浸透亢進剤の上述したクラスのそれぞれは、以下にさらに詳細に記載される。
【0093】
サーファクタント:本発明に関連して、サーファクタント(あるいは“表面−活性剤”)は、水溶液中に溶解した場合に、溶液の表面張力または水溶液と別の液体とのあいだの界面張力を減少する化学的単位であり、粘膜を介するオリゴヌクレオチドの吸収が亢進されるという結果を伴う。胆汁酸塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透亢進剤には、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−20−セチルエーテル(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92);およびFC−43などのパーフルオロ化学物質エマルジョン(Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252)が含まれる。
【0094】
脂肪酸:浸透亢進剤として機能する様々な脂肪酸およびその誘導体には、たとえば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸(n−デカン酸)、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン(1−モノオレイル−rac−グリセロール)、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール1−モノカプレート、1−ドデシルアザシクロヘプタン−2−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのC1−10アルキルエステル(たとえば、メチル、イソプロピルおよびt−ブチル)、およびそれらのモノ−およびジ−グリセリド(すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど)が含まれる(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92;Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1−33;El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651−654)。
【0095】
胆汁酸塩:胆汁の生理学的役割には、脂質および脂肪可溶性ビタミンの分散および吸収を促進することが含まれる(Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw−Hill, New York, 1996, pp. 934−935)。様々な天然の胆汁酸塩、およびその合成誘導体は、浸透亢進剤として機能する。このように、用語“胆汁酸塩”には、胆汁の天然に存在する構成成分のいずれかだけでなく、それらの合成誘導体のいずれかが含まれる。本発明の胆汁酸塩には、たとえば、コール酸(あるいはその医薬的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム)、デヒドロコール酸(デヒドロコール酸ナトリウム)、デオキシコール酸(デオキシコール酸ナトリウム)、グルココール酸(glucholic acid)(グルココール酸(glucholate)ナトリウム)、グリココール酸(グリココール酸ナトリウム)、グリコデオキシコール酸(グリコデオキシコール酸ナトリウム)、タウロコール酸(タウロコール酸ナトリウム)、タウロデオキシコール酸(タウロデオキシコール酸ナトリウム)、ケノデオキシコール酸(ケノデオキシコール酸ナトリウム)、ウルソデオキシコール酸(UDCA)、タウロ−24,25−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム(STDHF)、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル(POE)が含まれる(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92;Swinyard, Chapter 39 In: Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, pages 782−783;Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1−33;Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25;Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579−583)。
【0096】
キレート剤:本発明と関連して使用される場合、キレート剤は、それとともに複合体を形成することにより、金属イオンを溶液から取り除く化合物として定義することができ、粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収を向上させるという結果を伴う。本発明における浸透亢進剤としてのその使用に関して、キレート剤は、最も特性決定されたDNAヌクレアーゼがその触媒のために二価の金属イオンを必要としそしてしたがってキレート剤により阻害されることから、DNase阻害剤としても機能するという追加の利点を有する(Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315−339)。本発明のキレート剤には、エチレンジアミンテトラ酢酸ジナトリウム(EDTA)、クエン酸、サリチル酸塩(たとえば、サリチル酸ナトリウム、5−メトキシサリチル酸塩およびホモバニリン酸塩)、コラーゲンのN−アシル誘導体、ラウレス−9およびβ−ジケトンのN−アミノアシル誘導体(エナミン)が含まれるが、これらには限定されない(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92;Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1−33;Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43−51)。
【0097】
非−キレート非−サーファクタント:本明細書中で使用する場合、非−キレート非−サーファクタント浸透亢進性化合物は、キレート剤としてあるいはサーファクタントとしてわずかな活性しか示さないが、それにもかかわらず栄養粘膜を介してオリゴヌクレオチドの吸収を亢進する、化合物として定義することができる(Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1−33)。浸透亢進剤のこのクラスには、たとえば、不飽和環状ウレア、1−アルキル−および1−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92);およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非−ステロイド性抗炎症性薬剤(Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621−626)が含まれる。
【0098】
細胞レベルでオリゴヌクレオチドの取り込みを亢進する薬剤を、本発明の医薬組成物およびその他の組成物に添加することもできる。たとえば、リポフェクチンなどのカチオン性脂質(Junichi et al, 米国特許No. 5,705,188)、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジンなどのポリカチオン性分子(Lollo et al., PCT Application WO 97/30731)も、オリゴヌクレオチドの細胞性取り込みを亢進することが知られている。
【0099】
エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール、2−ピロールなどのピロール、アゾン(azone)、およびリモネンおよびメントンなどのテルペンを含むその他の薬剤を使用して、投与される核酸の浸透を亢進することができる。
【0100】
担体
本発明の特定の組成物は、製剤中に担体化合物も組み込む。本明細書中で使用する場合、“担体化合物”または“担体”は、不活性である(すなわち、それ自体生物学的活性を有さない)が、しかし、たとえば、生物学的に活性な核酸を分解しまたはその循環からの除去を促進することにより生物学的活性を有する核酸の生物学的利用性を減少するin vivoプロセスにより、核酸として認識される、核酸、またはその類似体のことをいうことができる。核酸と担体化合物(典型的には担体化合物を過剰量)の共投与により、おそらくは担体化合物と核酸との、一般的な受容体に対する競合により、結果として、肝臓、腎臓、またはその他の循環外レゼルボア中で回収される核酸の量の実質的な減少が引き起こされる。たとえば、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸あるいは4−アセトアミド−4’イソチオシアノ−スチルベン−2,2’−ジスルホン酸とともに共投与する場合、肝臓組織中での部分的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの回収を減少することができる(Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115−121;Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177−183)。
【0101】
賦形剤
担体化合物と対照的に、“医薬的な担体”または“賦形剤”は、医薬的に許容可能な溶媒、懸濁剤または動物に対して1またはそれ以上の核酸を送達するためのいずれかその他の医薬的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体であってもあるいは固体であってもよく、そして、想定した計画された様式の投与により、所定の医薬組成物の核酸およびその他の構成要素と組み合わせた場合、所望のバルク、粘度などを提供するように選択される。典型的な医薬的な担体には、結合剤(たとえば、α化コーンスターチ、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど);充填剤(たとえば、ラクトースおよびその他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリル酸またはリン酸水素カルシウムなど);潤滑剤(たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状シリコンジオキシド、ステアリン酸、金属性ステアリン酸、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど);崩壊剤(たとえば、スターチ、スターチグリコール酸ナトリウムなど);および湿潤剤(たとえば、ラウリル硫酸ナトリウムなど)が含まれるが、これらには限定されない。
【0102】
核酸と心身に有害には反応しない非−非経口性投与に適した医薬的に許容可能な有機賦形剤または無機賦形剤を使用して、本発明の組成物を製剤化することもできる。適した医薬的に許容可能な担体には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらには限定されない。
【0103】
核酸の局所投与のための製剤には、滅菌水溶液および非−滅菌水溶液、アルコールなどの一般的溶媒中での非−水溶液、または液体または固体油状基剤中の核酸の溶液が含まれてもよい。溶液には、バッファー、希釈剤およびその他の適した添加剤を含有してもよい。核酸と心身に有害には反応しない非−非経口性投与に適した医薬的に許容可能な有機賦形剤あるいは無機賦形剤を使用することができる。
【0104】
適した医薬的に許容可能な賦形剤には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらには限定されない。
【0105】
その他の構成要素
本発明の組成物にはさらに、医薬組成物中に従来から見出されるその他の補助剤構成要素を、当該技術分野で確立した使用レベルで含有することができる。このように、たとえば、組成物には、たとえば鎮痒薬、収斂剤、局所麻酔薬または抗炎症剤などの追加的で適合性な医薬的に活性な物質を含有することができ、または本発明の組成物の様々な用量剤形を物理的に製剤化する際に有用な追加の物質、たとえば色素、着香剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定化剤など、を含有することができる。しかしながら、このような物質は、添加される場合、本発明の組成物の構成要素の生物学的活性を過度に妨害すべきではない。製剤を滅菌することができ、そして所望の場合には、製剤の(1またはそれ以上の)核酸と心身に有害に相互作用しない補助剤、たとえば、潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、オスモル圧に影響を与える塩、バッファー、着色剤、着香料および/または芳香性物質などと混合することができる。
【0106】
水性懸濁液には、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランを含む、懸濁疫の粘度を増加する物質を含有することができる。懸濁疫には、安定化剤を含有してもよい。
【0107】
本発明の特定の態様は、(a)1またはそれ以上のアンチセンス化合物、および(b)非−アンチセンスメカニズムにより機能する1またはそれ以上のその他の化学療法剤、を含有する医薬組成物を提供する。このような化学療法剤の例には、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン(CA)、5−フルオロウラシル(5−FU)、フロキシウリジン(5−FUdR)、メトトレキセート(MTX)、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール(DES)などの抗ガン薬物を含むが、これらには限定されない(一般的には、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J., pages 1206−1228を参照)。非ステロイド性抗炎症性薬物およびコルチコステロイドを含む抗炎症性薬物(しかしこれらには限定されない)、およびリビビリン(ribivirin)、ビダラビン(vidarabine)、アシクロビルおよびガンシクロバーを含む抗ウィルス性薬物(しかしこれらには限定されない)を、本発明の組成物中に組み合わせることができる(一般的には、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J., pages 2499−2506 and 46−49, respectivelyを参照)。その他の非−アンチセンス化学療法剤も、本発明の範囲に含まれる。2つまたはそれ以上の組み合わせ化合物を、一緒にあるいは連続的に使用することができる。
【0108】
別の関連する態様において、本発明の組成物には第一の核酸を標的とする、1またはそれ以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第二の核酸標的を標的とする1またはそれ以上の追加のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを含有することができる。数多くのアンチセンス化合物の例が当該技術分野で知られている。2つまたはそれ以上の組み合わせ化合物を、一緒にあるいは連続的に使用することができる。
【0109】
治療用組成物の製剤化およびそれに引き続く投与は、当該技術分野の範囲内のものであると考えられる。用量は、治療すべき疾患状態の重症度および反応性に依存し、数日間から数ヶ月間持続する治療経過、あるいは治癒が得られるかまたは疾患の減退が得られるまでの治療経過を伴う。最適な用量スケジュールは、患者体内での薬物の蓄積を測定することから算出することができる。当業者であれば、最適用量、投与方法、および反復頻度を容易に決定することができる。最適な用量は、個々のオリゴヌクレオチドの比効力に依存して変更することができ、そして一般的には、in vitroおよびin vivo動物モデルにおいて効果的であることが見いだされるEC50に基づいて見積もることができる。一般的には、用量は、0.01 ug〜100 g/kg体重であり、そして1日、1週間、1ヶ月、あるいは1年に一度またはそれ以上与えることができ、あるいは2〜20年ごとに1度であってもよい。当業者は、体液あるいは組織における薬物の滞留時間および濃度に基づいて、投与のための反復頻度を容易に見積もることができる。継続的な治療により、患者に維持療法を受けさせて、疾患状態の再発を防止することが好ましく、ここでオリゴヌクレオチドは、1日に1回またはそれ以上〜20年間ごとに1回で、0.01 ug〜100 g/kg体重の範囲で、維持用量で投与する。
【0110】
本発明特定のその好ましい態様にしたがって、具体的に記載されるが、以下の実施例は、本発明の説明のためにのみ提供し、そして本発明を限定することを意図するものではない。
【0111】
【実施例】
実施例1
オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホールアミダイト
デオキシ及び2’−アルコキシアミダイト
2’−デオキシ及び2’−メトキシβ−シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトを販売元(例えば、Chemgenes, Needham MA またはGlen Research, Inc. Sterling VA)より購入した。他の2’−O−アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,506,351に記載の通り調製する。2’−アルコキシアミダイトを用いてオリゴヌクレオチドを合成するために、テトラゾール及び塩基のパルスデリバリー後の待機段階を360秒に増加した以外は、非修飾オリゴヌクレオチドのための標準サイクルを使用した。
【0112】
5−メチル−2’−デオキシシチジン(5−Me−C)ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、市販のホスホールアミダイト(Glen Research, Sterling VAまたはChemGenes, Needham MA)を用いて公表された方法〔Sanghvi ら、Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197−3203〕に従って合成した。
【0113】
2’−フルオロアミダイト
2’−フルオロデオキシアデノシンアミダイト
2’−フルオロオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される以前に記載の通り〔Kawasakiら、 J. Med. Chem., 1993, 36, 831−841〕、及び、アメリカ合衆国特許5,670,633に記載の通り合成した。簡潔には、保護されたヌクレオシドであるN6−ベンゾイル−2’−デオキシ−2’−フルオロアデノシンは、市販の9−β−D−アラビノフラノシルアデニンを出発物質として使用し、そして文献手法を修正して、2’−α−フルオロ原子を2’−β−トリチル基のSN2−置換により導入することより、合成した。このようにN6−ベンゾイル−9−β−D−アラビノフラノシルアデニンは中程度の収量で3’,5’−ジテトラヒドロピラニル(THP)中間体として選択的に保護した。THP及びN6−ベンゾイル基の脱保護は標準的な手法論を用いて成され、そして標準手法を用いて5’−ジメトキシトリチル−(DMT)及び5’−DMT−3’−ホスホールアミダイト中間体を得た。
【0114】
2’−フルオロデオキシグアノシン
2’−デオキシ−2’−フルオログアノシンの合成はテトライソプロピルジシロキサニル(TPDS)で保護した9−β−D−アラビノフラノシルグアニンを出発物質として用い、そして、中間体であるジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへの変換により成された。TPDS基の脱保護に続いて水酸基のTHPによる保護によりジイソブチリルジ−THP保護アラビノフラノシルグアニンを得た。選択的なO−脱アシル化及びトリフラート化に続き、フルオリドによる粗生成物の処理をし、その後THP基の脱保護をした。標準的な方法論を使用し、5’−DMT−及び5’−DMT−3’−ホスホールアミダイトを得た。
【0115】
2’−フルオロウリジン
2’−デオキシ−2’−フルオロウリジンの合成は、2,2’−アンヒドロ−1−β−D−アラビノフラノシルウラシルを70%フッ化水素−ピリジン(hydrogen fluoride−pyridine)で処理する、文献手法の修正により成された。標準的な手法を用いて5’−DMT及び5’−DMT−3’ホスホールアミダイトを得た。
【0116】
2’−フルオロデオキシシチジン
2’−デオキシ−2’−フルオロシチジンは2’−デオキシ−2’−フルオロウリジンのアミノ化を介して合成され、次に選択的な保護によりN4−ベンゾイル−2’−デオキシ−2’−フルオロシチジンを得た。標準的な手法を用いて、5’−DMT及び5’−DMT−3’ホスホールアミダイトを得た。
【0117】
2’−O−(2−メトキシエチル)修飾アミダイト
2’−O−メトキシエチル−置換ヌクレオシドアミダイトは、次の通り、あるいは、Martin, P.(Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486−504)の方法に従って調製した。
【0118】
2,2’−アンヒドロ〔1−(β−D−アラビノフラノシル)−5−メチルウリジン〕
5−メチルウリジン(Yamasa, Choshi, Japanにより市販され入手可能な、リボシルチミン)(72.0 g、0.279 M)、ジフェニルカーボネート(90.0 g、0.420 M)及び炭酸水素ナトリウム(2.0 g、0.024 M)をDMF(300 mL)に加えた。混合物を熱して攪拌しながら還流し、発生する二酸化炭素ガスを制御された方法で放出させた。1時間後、わずかに黒ずんだ溶液を、低圧下、濃縮した。得られたシロップを攪拌しながらジエチルエーテル(2.5 L)中に注いだ。産物はガム状物を形成した。エーテルをデカントし、そして、残渣を最小量のメタノール(約400 mL)に溶解した。溶液をフレッシュなエーテル(2.5 L)に注ぎ入れ、硬いガム状物を得た。エーテルをデカントし、ガム状物を減圧オーブンで乾燥させ(60℃、1 mm Hgで24時間)、得られた固体を砕いて淡い黄褐色の粉末にした(57 g、85%粗収率)。NMRスペクトルは、そのナトリウム塩としてフェノールが混じった(約5%)構造と一致した。その物質はさらに続く反応に用いられた(あるいはに酢酸エチル中のメタノールの勾配(10−25%)を利用したカラムクロマトグラフィーにより、さらに精製して融点222−4℃の白色の固体を得ることができる)。
【0119】
2’−O−メトキシエチル−5−メチルウリジン
2,2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン(195 g、0.81 M)、トリス(2−メトキシエチル)ホウ酸(231 g、0.98 M)及び2−メトキシエタノール(1.2 L)を、2 Lステンレススチール圧力容器に加え、160℃に予熱した油浴中に設置した。155−160℃で48時間熱した後、容器を開き、そして、溶液を蒸発させて乾燥させ、次にメタノール(200 mL)中で磨砕した。残渣を熱したアセトン(1 L)中に懸濁した。不溶の塩を濾過し、アセトン(150 mL)で洗浄し、そして、濾過物を蒸発させた。残渣を(280 g)をCH3CN(600 mL)に溶解させ、次に、蒸発させた。シリカゲルカラム(3 kg)を0.5%Et3NHを含むCH2Cl2/アセトン/MeOH(20:5:3)中に充填した。残渣をCH2Cl2(250 mL)中に溶解し、そして、シリカ(150 g)に吸着させた後、カラムにロードした。生成物は充填溶媒とともに溶出され、160 g(63%)の産物を得た。不純な分画をやり直すことにより、追加の物質を得た。
【0120】
2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルウリジン
2’−O−メトキシエチル−5−メチルウリジン(160 g、0.506 M)をピリジン(250 mL)と共に蒸発させ、次に、乾燥させた残渣をピリジン(1.3 L)に溶解した。ジメトキシトリチルクロリドの一番目のアリコート(94.3 g、0.278 M)を加え、そして、混合液を室温で1時間攪拌した。ジメトキシトリチルクロリドの二番目のアリコート(94.3 g、0.278 M)を加え、そして、反応液をさらに1時間攪拌した。メタノール(170 mL)を次に加え、反応を停止した。HPLCにより、約70%の産物の存在が示された。溶媒を蒸発させ、そして、CH3CN(200 mL)中で磨砕した。残渣をCHCl3(1.5 L)に溶解し、次に、2×500 mLの飽和NaHCO3及び2×500 mLの飽和NaClにより抽出した。有機層をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、そして、蒸発させた。275 gの残渣が得られた。残渣を3.5 kgシリカゲルカラムで精製し、充填し、そして、0.5%Et3NHを含むEtOAc/ヘキサン/アセトン(5:5:1)で溶出した。純粋な分画を蒸発させ、164 gの生成物を得た。さらに約20 gが不純な分画より得られ、全収量183 g(57%)を得た。
【0121】
3’−O−アセチル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルウリジン
2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルウリジン(106 g、0.167 M)、DMF/ピリジン(562 mLのDMFと188 mLのピリジンから調製された3:1の混合液750 mL)、及び、無水酢酸(24.38 mL、0.258 M)を混合し、そして、室温で24時間攪拌した。反応は、TLC試料にMeOHを添加し初めに急冷すること(quenching)によりTLCによりモニターした。TLCにより判断した反応の終了時に、MeOH(50 mL)を加え、混合物を35℃で蒸発させた。残渣をCHCl3(800 mL)に溶解し、次に、2×200 mLの飽和炭酸水素ナトリウム及び2×200 mLの飽和NaClにより抽出した。水層を200 mLのCHCl3で逆抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、蒸発させ、122 g(約90%生成物)の残渣を得た。残渣を3.5 kgシリカゲルカラムで精製し、そして、EtOAc/ヘキサン(4:1)で溶出した。純粋な生成物分画を蒸発させ、96 g(84%)を得た。後の分画より追加の1.5 gを回収した。
【0122】
3’−O−アセチル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチル−4−トリアゾールウリジン
はじめの溶液は、3’−O−アセチル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルウリジン(96 g、0.144 M)をCH3CN(700 mL)に溶かすことにより調製し、そして、とり置いた。トリエチルアミン(189 mL、1.44 M)をCH3CN(1 L)中トリアゾール(90 g、1.3 M)溶液に加えて、−5℃に冷却し、そして、オーバーヘッドスターラーを使用して0.5時間攪拌した。0−10℃に維持した攪拌溶液に、30分間、POCl3を滴下して加え、そして得られた混合液をさらに2時間攪拌した。はじめの溶液を後者の溶液に、45分間をかけて滴下して加えた。得られた反応混合物をコールドルームに一晩保存した。反応混合物から塩を濾過し、そして、溶液を蒸発させた。残渣をEtOAc(1 L)に溶解し、次に、不溶の固体を濾過により除去した。濾過物を1×300 mLのNaHCO3及び2×300 mLの飽和NaClで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、蒸発させた。残渣をEtOAc中で磨砕し、表題の化合物を得た。
【0123】
2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルシチジン
ジオキサン(500 mL)及びNH4OH(30 mL)中3’−O−アセチル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチル−4−トリアゾールウリジン(103 g、0.141 M)溶液を、室温で2時間攪拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残渣をMeOH(2×200 mL)と共沸させた。残渣をMeOH(300 mL)に溶解し、2リットルステンレススチール圧力容器に移した。NH3ガスで飽和させたMeOH(400 mL)を加え、その容器を100℃、2時間熱した(完全な変換がTLCにより示された)。容器の内容物を蒸発させて乾燥し、そして、残渣をEtOAc(500 mL)に溶解し、次に、飽和NaCl(200 mL)で1回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、溶媒を蒸発させて85 g(95%)の表題の化合物を得た。
【0124】
N4−ベンゾイル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルシチジン
2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチル−シチジン(85 g、0.134 M)をDMF(800 mL)に溶解し、次に、無水安息香酸(37.2 g、0.165 M)を攪拌しながら加えた。3時間攪拌後、反応が約95%終了したことをTLCが示した。溶媒を蒸発させ、そして、残渣をMeOH(200 mL)と共沸させた。残渣をCHCl3(700 mL)に溶解し、飽和NaHCO3(2×300 mL)及び飽和NaCl(2×300 mL)で抽出し、MgSO4で乾燥させ、次に、蒸発させて残渣(96 g)を得た。残渣を、溶出溶媒として0.5%Et3NHを含むEtOAc/ヘキサン(1:1)を使用して、1.5 kgシリカカラムでクロマトグラフィーにより分離した。純粋な生成物画分を蒸発させて、90 g(90%)の表題化合物を得た。
【0125】
N4−ベンゾイル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルシチジン−3’−アミダイト
N4−ベンゾイル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルシチジン(74 g、0.10 M)をCH2Cl2(1 L)に溶解した。テトラゾールジイソプロピルアミン(7.1 g)及び2−シアノエトキシ−テトラ−(イソプロピル)亜リン酸塩(40.5 mL、0.123 M)を窒素気体条件下、攪拌しながら加えた。得られた混合物は室温で20時間攪拌した(反応が95%終了したことをTLCが示した)。反応混合物を飽和NaHCO3(1×300 mL)及び飽和NaCl(3×300 mL)で抽出した。水層洗浄液をCH2Cl2(300 mL)で逆抽出し、次に抽出物を合わせ、MgSO4で乾燥させそして濃縮した。得られた残渣は、溶出溶媒としてEtOAc/ヘキサン(3:1)を使用して、1.5 kgシリカカラムでクロマトグラフィーにより分離した。純粋な分画を合わせて、90.6 g(87%)の表題化合物を得た。
【0126】
2’−O−(アミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイト及び2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイト
2’−(ジメチルアミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト
2’−(ジメチルアミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト[当該技術分野において2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイトとしても知られる]は次の段落で記載される通り、調製される。アデノシン、シチジン及びグアノシンヌクレオシドアミダイトは、環外のアミンがアデノシン及びシチジンの場合はベンゾイル基により保護され、また、グアノシンの場合はイソブチリルにより保護されることを除いては、チミジン(5−メチルウリジン)と同様に調製される。
【0127】
5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−O2−2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン
O2−2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン(Pro. Bio. Sint., Varese, Italy, 100.0 g、0.416 mmol)、ジメチルアミノピリジン(0.66 g、0.013 eq、0.0054 mmol)を、アルゴン気体条件下、周囲温度で、また、機械的に攪拌しながら、無水ピリジン(500 ml)に溶解した。tert−ブチルジフェニルクロロシラン(125.8 g、119.0 mL、1.1 eq、0.458 mmol)を一度に加えた。反応物は周囲温度で16時間攪拌した。TLC(Rf 0.22、酢酸エチル)により反応が終了したことが示された。溶液を減圧下、濃縮して濃厚な油状物にした。これを、ジクロロメタン(1 L)、及び、飽和炭酸水素ナトリウム(2×1 L)及びブライン(1 L)間で分配させた。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、減圧下、濃縮して濃厚な油状物にした。油を酢酸エチルとエチルエーテルの1:1の混合液(600 mL)に溶解し、次に、溶液を−10℃に冷却した。得られた結晶生成物は、濾過により集めて、エチルエーテル(3×200 mL)で洗浄し、さらに、乾燥して(40℃、1 mm Hg,、24 時間)、149 g(74.8%)の白色の固体にした。TLC及びNMRは純粋な生成物と一致した。
【0128】
5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−(2−ヒドロキシエチル)−5−メチルウリジン
2 Lステンレススチール、非攪拌圧力反応器にテトラヒドロフラン中のボラン(1.0 M、2.0 eq、622 mL)を加えた。換気フード内で、手動で攪拌しながらエチレングリコール(350 mL、過剰量)を、水素ガスの発生がおさまるまで、はじめは注意深く加えた。5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−O2−2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン(149 g、0.311 mol)及び炭酸水素ナトリウム(0.074 g、0.003 eq)を手動で攪拌しながら加えた。反応器を密閉し、そして、内部温度が160℃に達するまで油浴中で熱し、そして次に16時間維持した(圧力< 100 psig)。反応容器を周囲温度まで冷却し、そして、開けた。TLC(望ましい生成物はRf 0.67 及びara−T副生成物はRf 0.82、酢酸エチル)は約70%が生成物に変換したことを示した。さらに副生成物ができるのを避けるため、反応を停止し、減圧下(10から1 mm Hg)、湯浴中(40−100℃)で、エチレングリコールを除くために使われるより極度の条件で、濃縮した。[あるいは、一度低沸点溶媒がなくなったら、残りの溶液を酢酸エチルと水の間で分配し得る。生成物は有機相にあるだろう。]残渣をカラムクロマトグラフィー(2 kgシリカゲル、酢酸エチル−ヘキサン勾配1:1から4:1)により精製した。適切な分画を合わせ、除き、そして、乾燥させて、白色のカリカリ(crisp)した泡状物(84 g、50%)、混在した出発物質(17.4 g)、及び、純粋な再利用できる出発物質20 gを得た。出発物質、純度の低い回収した出発物質をもとにした収率は58%だった。TLC及びNMRは、99%の純度の生成物と一致した。
【0129】
2’−O−(〔2−フタルイミドオキシ)エチル〕−5’−t−ブチルジフェニルシリル−5−メチルウリジン
5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−(2−ヒドロキシエチル)−5−メチルウリジン(20 g、36.98 mmol)を、トリフェニルホスフィン(11.63 g、44.36 mmol)及びN−ヒドロキシフタルイミド(7.24 g、44.36 mmol)と混ぜた。その後、強い減圧条件下、40℃、2日間、P2O5で乾燥させた。反応混合液をアルゴンをフラッシュし(flushed)そして、無水THF(369.8 mL、Aldrich、確実に密閉させた瓶)を加えて、透明な液体を得た。ジエチルーアゾジカルボン酸塩(6.98 mL、44.36 mmol)を反応混合液に滴下して加えた。添加する速度は、生じる深い赤い色が次の滴を加える前にちょうど消えるように維持した。添加が終了した後、反応物を4時間攪拌した。その頃までに、TLCにより反応の終了が示された(酢酸エチル:ヘキサン、60:40)。減圧下、溶媒を蒸発させた。得られた残渣をフラッシュカラムにのせ、そして、酢酸エチル:ヘキサン(60:40)で溶出し、2’−O−(〔2−フタルイミドオキシ)エチル〕−5’−t−ブチルジフェニルシリル−5−メチルウリジンを白色の泡状物(21.819 g、86%)として得た。
【0130】
5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−〔(2−ホルムアドキシイミノオキシ)エチル〕−5−メチルウリジン
2’−O−(〔2−フタルイミドオキシ)エチル〕−5’−t−ブチルジフェニルシリル−5−メチルウリジン(3.1 g、4.5 mmol)を無水CH2Cl2(4.5 mL)に溶解し、そして、メチルヒドラジン(300 mL、4.64 mmol)を−10℃から0℃において滴下して加えた。1時間後、混合物を濾過し、濾過物を氷冷CH2Cl2で洗浄し、そして、合わせた有機相を水、ブラインで洗浄して、次に、無水Na2SO4で乾燥させた。溶液を濃縮して2’−O−(アミノオキシエチル)チミジンを得て、それを次にMeOH(67.5 mL)に溶解した。これにホルムアルデヒド(20%水溶液、w/w、1.1 eq.)を加え、そして、得られた混合物を1時間攪拌した。溶媒を減圧下で除き;残渣をクロマトグラフィーで分離して、5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−〔(2−ホルムアドキシイミノオキシ)エチル〕−5−メチルウリジンを白色の泡(1.95 g、78%)として得た。
【0131】
5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−〔N,N−ジチルアミノオキシエチル〕−5−メチルウリジン
5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−〔(2−ホルムアドキシイミノオキシ)エチル〕−5−メチルウリジン(1.77 g、3.12 mmol)を1 M p−トルエンスルホン酸ピリジニウム(PPTS)の溶液に溶解した。シアノホウ化水素ナトリウム(Sodium cyanoborohydride)(0.39 g、6.13 mmol)を、10℃、不活性気体条件下で、この溶液に加えた。反応混合物を10℃、10分間攪拌した。その後、反応容器を氷浴から取り出し、室温で2時間攪拌し、反応をTLCでモニターした(CH2Cl2中5%MeOH)。NaHCO3水溶液(5%、10 mL)を加え、そして、酢酸エチルで抽出した(2×20 mL)。酢酸エチル相を無水Na2SO4で乾燥させ、蒸発させて乾燥状態にした。残渣を、MeOH(30.6 mL)中の1 M PPTS溶液に溶解した。ホルムアルデヒド(20%w/w、30 mL、3.37 mmol)を加え、反応混合物を室温で10分間攪拌した。反応混合液を氷浴中で10℃に冷却し、シアノホウ化水素ナトリウム(0.39 g、6.13 mmol)を加え、そして、反応混合物を10℃、10分間攪拌した。10分後、反応混合液を氷浴から取り出し、そして、室温で2時間攪拌した。反応混合液に5%NaHCO3(25 mL)溶液を加え、そして、酢酸エチル(2×25 mL)で抽出した。酢酸エチル層を無水Na2SO4で乾燥させ、次に、蒸発させて乾燥状態にした。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、そして、CH2Cl2中5%MeOHで溶出し、5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−〔N,N−ジメチルアミノオキシエチル〕−5−メチルウリジンを白色の泡状物(14.6 g、80%)として得た。
【0132】
2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン
トリエチルアミントリヒドロフルオリド(3.91 mL、24.0 mmol)を無水THF及びトリエチルアミン(1.67 mL、12 mmol、無水KOHで維持)に溶解した。このトリエチルアミン−2HFの混合物を、次に、5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−〔N,N−ジメチルアミノオキシエチル〕−5−メチルウリジン(1.40 g、2.4 mmol)に加えて、そして、室温で24時間攪拌した。反応をTLC(CH2Cl2中5%MeOH)によりモニターした。溶媒を減圧下、取り除き、そして、残渣をフラッシュカラムにのせ、そして、CH2Cl2中10%MeOHで溶出して、2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン(766 mg、92.5%)を得た。
【0133】
5’−O−DMT−2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン
2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン(750 mg、2.17 mmol)を、強い減圧条件下、40℃で一晩、P2O5で乾燥させた。その後、無水ピリジン(20 mL)と共に蒸発させた。得られた残渣をアルゴン気体条件下、ピリジン(11 mL)に溶解した。4−ジメチルアミノピリジン(26.5 mg、2.60 mmol)、4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(880 mg、2.60 mmol)を混合液に加え、そして、反応混合物を室温で、出発物質の全量がなくなるまで攪拌した。ピリジンを減圧下取り除き、次に、残渣をクロマトグラフィーで分離し、そして、CH2Cl2中10%MeOH(ピリジンを数滴含む)で溶出し、5’−O−DMT−2’−O−(ジメチルアミノ−オキシエチル)−5−メチルウリジン(1.13 g、80%)を得た。
【0134】
5’−O−DMT−2’−O−(2−N,N−ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン−3’−〔(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホールアミダイト〕
5’−O−DMT−2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン(1.08 g、1.67 mmol)をトルエン(20 mL)と共に蒸発させる。残渣にN,N−ジイソプロピルアミンテトラゾニド(0.29 g、1.67 mmol)を加えて、次に、強い減圧条件下、40℃で一晩、P2O5で乾燥させた。その後、反応混合物を無水アセトニトリル(8.4 mL)に溶解し、そして、2−シアノエチル−N,N,N1,N1−テトライソプロピルホスホールアミダイト(2.12 mL、6.08 mmol)を加えた。反応混合物を周囲温度で4時間、不活性気体条件下で攪拌した。反応の進行を、TLC(ヘキサン:酢酸エチル 1:1)でモニターした。溶媒を蒸発させ、次に、残渣を酢酸エチル(70 mL)に溶解し、そして、5%NaHCO3水溶液(40 mL)で洗浄した。酢酸エチル層を無水Na2SO4で乾燥させ、また、濃縮した。得られた残渣をクロマトグラフィーにより分離し(溶出溶媒としては酢酸エチル)、5’−O−DMT−2’−O−(2−N,N−ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン−3’−〔(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホールアミダイト〕(1.04 g、74.9%)を泡状物として得た。
【0135】
2’−(アミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト
2’−(アミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト〔当該技術分野において、2’−O−(アミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイトとしても知られる〕は、次の段落で記載される通り、調製する。アデノシン、シチジン及びチミジンヌクレオシドアミダイトは同様に調製する。
【0136】
N2−イソブチリル−6−O−ジフェニルカルバモイル−2’−O−(2−エチルアセチル)−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)グアノシン−3’−〔(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホールアミダイト〕
2’−O−アミノオキシエチルグアノシン類似体は、ジアミノプリンリボシドの選択的2’−O−アルキル化により得ることができる。多様な重量のジアミノプリンリボシドは、Schering AG(Berlin)から購入することが可能であり、2’−O−(2−エチルアセチル)ジアミノプリンリボシドを、少量の3’−O−異性体と共に提供する。2’−O−(2−エチルアセチル)ジアミノプリンリボシドは、アデノシンデアミナーゼ処理により分解され、そして、2’−O−(2−エチルアセチル)グアノシンに変換され得る(McGee, D. P. C., Cook, P. D., Guinosso, C. J., WO 94/02501 A1 940203.)。標準的な保護の手法は2’−O−(2−エチルアセチル)−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)グアノシン及び2−N−イソブチリル−6−O−ジフェニルカルバモイル−2’−O−(2−エチルアセチル)−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)グアノシンを与えるに違いなく、それは、還元され、2−N−イソブチリル−6−O−ジフェニルカルバモイル−2’−O−(2−エチルアセチル)−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)グアノシンを提供し得る。前のように、水酸基はMitsunobu反応によってN−ヒドロキシフタルイミドにより置換することができ、そして、保護されたヌクレオシドは通常通り、ホスフィチル(phosphityl)化して、2−N−イソブチリル−6−O−ジフェニルカルバモイル−2’−O−(2−エチルアセチル)−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)グアノシン−3’−〔(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホールアミダイト〕を得ることができる。
【0137】
2’−ジメチルアミノエトキシエトキシ(2’−DMAEOE)ヌクレオシドアミダイト
2’−ジメチルアミノエトキシエトキシヌクレオシドアミダイト(当該技術分野において2’−O−ジメチルアミノエトキシエチル、即ち、2’−O−CH2−O−CH2−N(CH2)2、あるいは2’−DMAEOEヌクレオシドアミダイトとしても知られる)は、以下のように調製される。他のヌクレオシドアミダイトは同様に調製される。
【0138】
2’−O−〔2(2−N,N−ジメチルアミノエトキシ)エチル〕−5−メチルウリジン
100 mLボンベ中で、テトラヒドロフラン中のボラン(1 M、10 mL、10 mmol)の溶液に、2〔2−(ジメチルアミノ)エトキシ〕エタノール(Aldrich、6.66 g、50 mmol)を攪拌しながらゆっくりと加える。固体が溶解するにつれて水素ガスが発生する。O2−,2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン(1.2 g、5 mmol)、及び、炭酸水素ナトリウム(2.5 mg)を加え、そして、ボンベを密閉し、油浴中に入れ、そして、155℃にて、26時間加熱する。ボンベは室温まで冷却し、そして、開封する。粗溶液を濃縮し、そして、残渣を水(200 mL)およびヘキサン(200 mL)の間で分配した。過剰量のフェノールを、ヘキサン層中で抽出した。水層を酢酸エチル(3×200 mL)により抽出し、そして合わせた有機層を水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、濃縮する。残渣を、溶出溶媒としてメタノール/塩化メチレン1:20(2%トリエチルアミンを含む)を使用したシリカゲルカラムにかける。カラム分画が濃縮されるにつれて、無色の固体が形成され、集められて、表題の化合物を白色の固体として得る。
【0139】
5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−〔2(2−N,N−ジメチルアミノエトキシ)エチル)〕−5−メチルウリジン
無水ピリジン(8 mL)中0.5 g(1.3 mmol)の2’−O−〔2(2−N,N−ジメチルアミノ−エトキシ)エチル)〕−5−メチルウリジン溶液に、トリエチルアミン(0.36 mL)及びジメトキシトリチルクロリド(DMT−Cl、0.87 g、2 eq.)を加えて、そして、1時間攪拌する。反応混合物を水(200 mL)に注ぎいれ、そして、CH2Cl2(2×200 mL)で抽出する。合わせたCH2Cl2層を飽和NaHCO3溶液、続いて飽和NaCl溶液で洗浄し、次に、無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。溶媒の蒸発に続いて、MeOH:CH2Cl2:Et3N(20:1、v/v、1%トリエチルアミンを含む)を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより、表題化合物を得る。
【0140】
5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−〔2(2−N,N−ジメチルアミノエトキシ)エチル)〕−5−メチルウリジン−3’−O−(シアノエチル−N,N−ジイソプロピル)ホスホールアミダイト
ジイソプロピルアミノテトラゾリド(0.6 g)及び2−シアノエトキシ−N,N−ジイソプロピルホスホールアミダイト(1.1 mL、2 eq.)を、アルゴン気体条件下、CH2Cl2(20 mL)に溶解した5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−〔2(2−N,N−ジメチルアミノエトキシ)エチル)〕−5−メチルウリジン(2.17 g、3 mmol)に加える。反応混合液を一晩攪拌し、そして、溶媒を蒸発させる。得られた残渣を、酢酸エチルを溶出溶媒として用いるシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、表題の化合物を得る。
【0141】
実施例2
オリゴヌクレオチド合成
未置換及び置換ホスホジエステル(P=O)オリゴヌクレオチドを、自動DNAシンセサイザー(Applied Biosystems model 380B)で、ヨウ素による酸化を用いる標準的なホスホールアミダイト化学を使用して、合成する。
【0142】
亜リン酸塩結合の段階的チア化のため、標準的な酸化瓶を、アセトニトリル中0.2 M 3H−1,2−ベンゾジチオール−3−オン1,1−ジオキシド溶液に置き換えた以外は、ホスホロチオエート(P=S)は、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドのためと同様に合成される。チア化待機段階を68秒に増加し、そして、引き続いてキャッピング段階を行った。CPGカラムからの分離、及び、55℃で(18時間)濃縮された水酸化アンモニウム中の脱ブロック化した後、2.5倍量のエタノールで2回沈殿することにより、オリゴヌクレオチドを0.5 M NaCl溶液から精製した。ホスフィネートオリゴヌクレオチドを、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,508,270に記載の通り、調製する。
【0143】
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許4,469,863に記載の通り、調製する。
3’−デオキシ−3’−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,610,289あるいは5,625,050に記載の通り、調製する。
【0144】
ホスホールアミダイトオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,256,775あるいはアメリカ合衆国特許5,366,878に記載の通り、調製する。
【0145】
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、公開されたPCT出願PCT/US94/00902及びPCT/US93/06976(それぞれWO 94/17093及びWO 94/02499として公開)に記載の通り、調製する。
【0146】
3’−デオキシ−3’−アミノホスホールアミデートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,023,243に記載の通り、調製する。
【0147】
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、本明細書中に参考文献として援用されるアメリカ合衆国特許5,023,234に記載の通り、調製する。
ボランリン酸オリゴヌクレオチドは、共に本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,130,302及び5,177,198に記載の通り、調製する。
【0148】
実施例3
オリゴヌクレオシド合成
MMI結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド、MDH結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、及び、アミド−3結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、及び、アミド−4結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド、そして、例えば、MMIとP=OあるいはP=S結合とを換えたものを有する混合バックボーン化合物は、そのすべてが本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,602,240及び5,610,289,に記載の通り、調製する。
【0149】
ホルムアセタール及びチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,264,562及び5,264,564に記載の通り、調製する。
【0150】
エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,223,618に記載の通り、調製する。
実施例4
PNA合成
ペプチド核酸(PNAs)は、ペプチド核酸(PNA)に関する様々な方法:Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5−23のいずれかに従って、調製される。それらはまた、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,539,082、5,700,922,、及び、5,719,262に従ってもまた、調製され得る。
【0151】
実施例5
キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または、混合オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なる型でありうる。これらは、結合ヌクレオシドの“ギャップ”セグメントが結合ヌクレオシドの5’あるいは3’“ウィング”セグメントの間に位置する第一の型、及び、“ギャップ”セグメントがオリゴマー化合物の3’あるいは5’端のどちらかに位置する、第二の“オープンエンド”型を含む。第一の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において、“ギャップマー”あるいはギャップ化オリゴヌクレオチドとしても知られる。第二の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において、“ヘミマー”あるいは“ウィングマー”としても知られる。
【0152】
〔2’−O−Me〕−−〔2’−デオキシ〕−−〔2’−O−Me〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
2’−O−アルキルホスホロチオエートを有するキメラオリゴヌクレオチド及び2’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを、上記の通り、Applied Biosystems自動DNAシンセサイザーModel 380Bを使用して合成する。オリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーを用い、及び、DNA部分には2’−デオキシ−5’−ジメトキシトリチル−3’−O−ホスホールアミダイトを、そして、5’及び3’ウィングには5’−ジメトキシトリチル−2’−O−メチル−3’−O−ホスホールアミダイトを使用して、合成する。標準的な合成サイクルを、テトラゾール及び塩基のデリバリー後の待機段階を600秒に増加することにより修正し、RNAについては4回、2’−O−メチルについては2回繰り返した。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から解離し、そして、室温で一晩、3:1アンモニア/エタノール中で、リン酸基を脱保護し、その後、凍結乾燥により乾燥させる。その後、室温で24時間、メタノールアンモニア中で処理することによりすべての塩基を脱保護し、そして、試料を再び凍結乾燥により乾燥させる。ペレットをTHF中1 M TBAFに、室温で24時間懸濁し、2’位を脱保護する。次に、反応を1 M TEAAで停止し、そして次に試料をrotovacにより1/2量に減少させ、G25サイズ排除カラムにより脱塩する。回収したオリゴは次に、キャピラリー電気泳動により、また、質量分析により、収量について、また、純度について、分光光度的に分析される。
【0153】
〔2’−O−(2−メトキシエチル)〕−−〔2’−デオキシ〕−−〔2’−O−(メトキシエチル)〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
〔2’−O−(2−メトキシエチル)〕−−〔2’−デオキシ〕−−〔2’−O−(メトキシエチル)〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2’−O−(メトキシエチル)アミダイトを2’−O−メチルアミダイトに置き換えた2’−O−メチルキメラオリゴヌクレオチドのための上記の方法に従って、調製した。
【0154】
〔2’−O−(2−メトキシエチル)ホスホジエステル〕−−〔2’−デオキシホスホロチオエート〕−−〔2’−O−(2−メトキシエチル)ホスホジエステル〕キメラオリゴヌクレオチド
〔2’−O−(2−メトキシエチル)ホスホジエステル〕−−〔2’−デオキシホスホロチオエート〕−−〔2’−O−(2−メトキシエチル)ホスホジエステル〕キメラオリゴヌクレオチドは、2’−O−(メトキシエチル)アミダイトを2’−O−メチルアミダイトに置き換えた、2’−O−メチルキメラオリゴヌクレオチドについての上記の方法、キメラ構造のウィング部分中のホスホジエステルヌクレオチド間結合を作るためのヨウ素を用いる酸化、中央ギャップのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を作るための3,H−1,2ベンゾジチオール−3−オン1,1ジオキシド(Beaucage Reagent)を使用する硫化に従って、調製する。
【0155】
他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシド及び混合キメラオリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,623,065に従って合成される。
【0156】
実施例6
オリゴヌクレオチドの単離
制御孔ガラスカラム(Applied Biosystems)から分離し、そして、濃縮された水酸化アンモニウム中、55℃、18時間、脱ブロック化した後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドは、0.5 M NaClから2.5倍量のエタノールを用いた2回の沈殿により精製する。合成されたオリゴヌクレオチドは、変性ゲル上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析され、そして、少なくとも85%の全長物質であると判断された。合成により得られたホスホロチオエート及びホスホジエステル結合の相対的な量は、定期的に31P核磁気共鳴分光器により検査され、そして、いくつかの研究のため、オリゴヌクレオチドをChiangら(J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162−18171)により記載の通り、HPLCで精製した。HPLC精製産物を用いて得られた結果は、非HPLC精製産物から得られたものと同様だった。
【0157】
実施例7
オリゴヌクレオチド合成−96ウェルプレート型
オリゴヌクレオチドを、固相P(III)ホスホールアミダイト化学により、標準的な96ウェル型に同時に96配列を構築することができる自動シンセサイザーで合成した。ホスホロジエステルヌクレオチド間結合はヨウ素水溶液を用いる酸化によって得られた。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、無水アセトニトリル中3,H−1,2ベンゾジチオール−3−オン1,1ジオキシド(Beaucage Reagent)を使用した硫化により、生成した。標準的な塩基保護β−シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトは、商業販売者(例えば、PE−Applied Biosystems, Foster City, CAまたはPharmacia, Piscataway, NJ)から購入した。非標準ヌクレオシドは、既知の文献、あるいは、特許の方法の通り、合成する。それらは、塩基保護β−シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトとして使用される。
【0158】
オリゴヌクレオチドを支持体から解離し、そして、高温度(55−60℃)にて、12−16時間、濃縮NH4OHにより脱保護し、そして放出された生成物を次に減圧下で乾燥した。乾燥した生成物を次に滅菌水に再懸濁して、マスタープレートを得て、そこからすべての分析及び試験プレート試料をロボットピペッターを使用して希釈する。
【0159】
実施例8
オリゴヌクレオチド分析−96ウェルプレート型
各ウェルのオリゴヌクレオチドの濃度を、試料の希釈及びUV吸収分光器により調査した。個々の生成物の全長の完全性を、キャピラリー電気泳動(CE)により、96ウェル型(Beckman P/ACETM MDQ)で、あるいは、個々に調製した試料については、市販のCE器具(例えば、Beckman P/ACETM 5000, ABI 270)で、評価した。塩基及びバックボーン構成は、エレクトロスプレー質量分光計を使用する化合物の質量分析により、確かめられた。すべてのアッセイ検査プレートは、マスタープレートから、シングルあるいはマルチチャネルのロボットピペッターを使用して希釈した。プレートは、プレート上の化合物の少なくとも85%が、少なくとも全長の85%であれば、許容可能であると判断した。
【0160】
実施例9
細胞培養及びオリゴヌクレオチド処理
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の効果は、測定可能なレベルで標的核酸が存在する場合、様々な細胞タイプのいずれにおいても、試験することができる。これは、例えば、PCRあるいはノザンブロット分析を使って日常的に決定され得る。以下の6つの細胞タイプは説明するために提供されるが、標的が選択された細胞タイプ中において発現される場合には、他の細胞タイプを日常的に使用することができる。これは、当該技術分野において日常的な方法、たとえばノザンブロット解析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、あるいはRT−PCR、により容易に確認することができる。
【0161】
T−24細胞:
ヒト移行上皮細胞(transitional cell)膀胱癌細胞株T−24細胞はAmerican Type Culture Collection(ATCC)(Manassas, VA)より入手した。T−24細胞は、日常的に、10%ウシ胎児血清(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)、100 u/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)を加えた、完全McCoy’s 5A基本培地(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)で、培養した。細胞は、日常的に、それが90%コンフルエンスに達したら、トリプシン処理及び希釈により継代した。RT−PCR分析において使用するため、細胞を96ウェルプレート(Falcon−Primaria#3872)に7000細胞/ウェルの濃度でまいた。
【0162】
ノザンブロットあるいは他の分析のため、細胞を100 mmあるいは他の標準的な組織培養プレートにまき、そして、適切な量の培地及びオリゴヌクレオチドを使用して、同様の処理をすることができる。
【0163】
A549細胞:
ヒト肺癌細胞株A549は、American Type Culture Collection(ATCC)(Manassas, VA)より入手した。A549は、日常的に、10%ウシ胎児血清(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)、100 u/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)を加えた、DMEM基本培地(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)で培養した。細胞は、日常的に、それが90%コンフルエンスに達したら、トリプシン処理及び希釈により継代した。
【0164】
NHDF細胞:
ヒト新生児皮膚線維芽細胞(NHDF)は、Clonetics Corporation(Walkersville MD)より入手した。NHDFは日常的に、提供者により推奨される通り添加した線維芽細胞成長培地(Clonetics Corporation, Walkersville MD)で維持した。細胞は提供者により推奨される通り、10継代まで維持した。
【0165】
HEK細胞:
ヒト胎児ケラチノサイト(HEK)はClonetics Corporation(Walkersville MD)より入手した。HEK細胞は、日常的に、提供者により推奨される通り製剤化されたケラチノサイト成長培地(Clonetics Corporation, Walkersville MD)で維持した。細胞は、日常的に、提供者により推奨される通り、10継代まで維持した。
【0166】
HepG2細胞:
ヒト肝芽細胞腫細胞株HepG2を、American Type Culure Collection(Manassas、VA)から入手した。HepG2細胞は、10%ウシ胎児血清、非−必須アミノ酸、および1 mMピルビン酸ナトリウム(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)を添加したEagle’s MEM中で、日常的に培養した。細胞が90%コンフルエントに達したときに、細胞を、トリプシン処理および希釈により、日常的に継代した。細胞を、RT−PCR解析において使用するため、96−ウェルプレート(Falcon−Primaria#3872)中に、7000細胞/ウェルの濃度でまいた。
【0167】
ノザンブロットまたは他の解析のため、細胞を100 mm組織培養プレートまたはその他の標準的な組織培養プレートにまき、適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して、同様に処理することができる。
【0168】
3T3−L1細胞:
マウス胚脂肪細胞−様細胞株3T3−L1を、American Type Culure Collection(Manassas, VA)から入手した。3T3−L1細胞は、10%ウシ胎児血清(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)を添加したDMEM、高グルコース(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)中で、日常的に培養した。細胞が80%コンフルエントに達したときに、細胞を、トリプシン処理および希釈により、日常的に継代した。細胞を、RT−PCR解析において使用するため、96−ウェルプレート(Falcon−Primaria#3872)中に、4000細胞/ウェルの濃度でまいた。
【0169】
ノザンブロットまたは他の解析のため、細胞を100 mm組織培養プレートまたはその他の標準的な組織培養プレートにまき、適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して、同様に処理することができる。
【0170】
アンチセンス化合物の処理:
細胞が80%コンフルエンスに達したとき、オリゴヌクレオチドにより処理した。96ウェルプレートで生育した細胞について、ウェルを200μLのOPTI−MEMTM−1減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次に3.75μg/mL LIPOFECTINTM(Gibco BRL)及び望ましい濃度のオリゴヌクレオチドを含む、130μLのOPTI−MEMTM −1で処理した。4〜7時間処理後、培地をフレッシュな培地に交換した。オリゴヌクレオチド処理後16〜24時間後に細胞を回収した。
【0171】
使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株ごとに変化させる。特定の細胞株に対する最適オリゴヌクレオチド濃度を決定するため、細胞をある濃度範囲の陽性対照オリゴヌクレオチドにより処理する。ヒト細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、ヒトH−rasを標的とし、ホスホロチオエートバックボーンを有する2’−O−メトキシエチルギャップマー(2’−O−メトキシエチルは太字で示した)である、ISIS 13920、
【0172】
【化1】
【0173】
である。マウスまたはラット細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、マウスc−rafおよびラットc−rafの両方を標的とし、ホスホロチオエートバックボーンを有する2’−O−メトキシエチルギャップマー(2’−O−メトキシエチルは太字で示した)である、ISIS 15770、
【0174】
【化2】
【0175】
である。c−Ha−ras(ISIS 13920)mRNAまたはc−raf(ISIS 15770)mRNAの80%の阻害を引き起こす陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度を、その細胞株について引き続いて実験する際に利用する。80%の阻害が達成されない場合、H−rasまたはc−raf mRNAの60%の阻害を引き起こす陽性対照オリゴヌクレオチドの最低濃度を、その細胞株について引き続いて実験する際に、オリゴヌクレオチドスクリーニング濃度として利用する。60%の阻害が達成されない場合、その特定の細胞株はオリゴヌクレオチドトランスフェクション実験については適していないものと判断する。
【0176】
実施例10
C/EBPα発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
C/EBPα発現のアンチセンスモジュレーションは、当該技術分野において知られる様々な方法でアッセイすることができる。例えば、C/EBPα mRNAレベルは、例えばノザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、あるいは、リアルタイムPCR(RT−PCR)により、定量され得る。リアルタイム定量PCRが現在のところ好ましい。RNA分析は、全細胞内RNA、あるいは、ポリ(A)+ mRNAについて行うことができる。RNA単離の方法は、例えば、Ausubel, F.M. ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.1.1−4.2.9 及び4.5.1−4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993)に教示される。ノザンブロット分析は、当該技術分野においては、日常的な方法であり、また、例えば、Ausubel, F.M.ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.2.1−4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996)に教示される。リアルタイム定量(PCR)は、PE−Applied Biosystems(Foster City, CA)から入手可能な、市販のABI PRISMTM 7700 Sequence Detection Systemを使用することにより、都合よく成し遂げられ、そして、製造者の指示に従って使用される。定量的PCR解析の前に、測定される標的遺伝子に対して特異的なプライマー−プローブセットを、GAPDH増幅反応とともに“多重化される”能力について評価する。多重化において、標的遺伝子および内部標準遺伝子GAPDHの両方を、単一サンプル中で同時に増幅する。この解析において、非処理細胞から単離されるmRNAは、階段希釈される。それぞれの希釈物は、GAPDHのみまたは標的遺伝子のみに特異的なプライマー−プローブセットの存在下(“単一反応性(single−plexing)”)、もしくは両方に特異的なプライマー−プローブセットの存在下(多重性)において増幅させる。PCR増幅の後、GAPDHおよび標的mRNAシグナルの標準曲線を、希釈の関数として単一反応性サンプルおよび多重反応性サンプルの両方から作成する。多重反応性サンプルから作成されたGAPDHシグナルおよび標的シグナルの傾きおよび相関係数が、単一反応性サンプルから作成されたそれらの対応する値の10%以内に収まる場合には、その標的に対して特異的なプライマー−プローブセットは、多重性であるとみなされる。PCRの他の手法もまた、当該技術分野において、既知である。
【0177】
C/EBPαタンパク質レベルは、免疫沈降、ウエスタンブロット分析(イムノブロット)、ELISA、あるいは、蛍光活性化細胞分取器(FACS)といった、当該技術分野において既知である様々な手法により定量され得る。C/EBPαに対する抗体は同定され、そして、MSRSの抗体カタログ(Aerie Corporation, Birmingham, MI)といった、様々な供給者から入手することが可能であり、または、従来からの抗体作成方法により調製し得る。ポリクローナル抗血清の調製方法は、例えば、Ausubel, F.M.ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.12.1−11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997)に教示される。モノクローナル抗血清の調製方法は、例えば、Ausubel, F.M.ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.4.1−11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997)に教示される。
【0178】
免疫沈降方法は、当該技術分野において標準的であり、また、例えば、Ausubel, F.M. ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.16.1−10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998)において見いだすことができる。ウェスタンブロット(イムノブロット)分析は、当該技術分野において標準的であり、例えば、Ausubel, F.M.ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.8.1−10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1998)において見いだすことができる。酵素免疫吸着測定法(ELISA)は、当該技術分野において標準的であり、また、例えば、Ausubel, F.M. ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.2.1−11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991)において見つけることができる。
【0179】
実施例11
ポリ(A)+ mRNA単離
ポリ(A)+ mRNAは、Miuraら(Clin. Chem., 1996, 42, 1758−1764)に従って、単離された。ポリ(A)+ mRNA単離のための他の方法は、例えば、Ausubel, F.M.ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.5.1−4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993)に教示される。簡潔には、96ウェルプレート上で培養した細胞において、細胞から増殖培地を除き、そして、各ウェルを200μL冷PBSで洗浄した。60μL溶解バッファー(10 mM Tris−HCl、pH 7.6、1 mM EDTA、0.5 M NaCl、0.5%NP−40、20 mMバナジル−リボヌクレオシド複合体)を各ウェルに加え、プレートをゆっくり揺り動かし、そして次に、室温で5分間インキュベートした。溶解物55μLをオリゴd(T)をコートした96ウェルプレート(AGCT Inc., Irvine CA)に移した。プレートを、60分、室温でインキュベートし、洗浄バッファー(10 mM Tris−HCl pH 7.6、1 mM EDTA、0.3 M NaCl)200μLで3回洗浄した。最後の洗浄の後、プレートをペーパータオルに当てて、余分な洗浄バッファーを取り除き、そしてその後、5分間風乾した。70℃に前もって熱した、溶出バッファー(5 mM Tris−HCl pH 7.6)60μLを、各ウェルに加え、プレートを90℃ホットプレートで5分間インキュベートし、そして、次に溶出物を新しい96ウェルプレートに移した。
【0180】
100 mmあるいは他の標準的なプレートに培養した細胞は、適する容量のすべての溶液を用いて、同様に処理し得る。
実施例12
全RNA単離
全mRNAは、Qiagen Inc.(Valencia CA)より購入したRNEASY 96TMキット及びバッファーを用い、製造者の推薦する方法に従って単離した。簡潔には、96ウェルプレート上で培養した細胞において、増殖培地を細胞から除き、そして、各ウェルを200μL冷PBSで洗浄した。100μLのバッファーRLTを各ウェルに加え、そして、プレートを20秒間激しく揺り動かした。70%エタノール100μLを次に各ウェルに加え、内容物を3回上下にピペッティングして混ぜた。次に試料を排水回収トレイに合わせたQIAVACTMマニホルドに取り付け、そして減圧装置に取り付けた、RNEASY 96TMウェルプレートに移した。減圧は15秒間行われた。1 mLのバッファーRW1をRNEASY 96TMプレートの各ウェルに加え、そして、再び減圧を15秒間行った。その後、1 mLのバッファーRPEをRNEASY 96TMプレートの各ウェルの添加し、そして減圧を15秒間行った。バッファーRPE洗浄を次に繰り返し、さらに10分間減圧を行った。プレートをQIAVACTMマニホルドから取り外し、そしてペーパータオルにあてて乾燥させた。プレートを次に、1.2 mL回収チューブを含む、回収チューブラックに合わせたQIAVACTMマニホルドにもう一度取り付けた。RNAを次に各ウェル中の60μLの水をピペッティングすることにより溶出し、1分間インキュベートし、そして次に、30秒間減圧を行った。さらに60μLの水を用いて、溶出段階を繰り返した。
【0181】
繰り返しのピペッティング及び溶出段階を、QIAGEN Bio−Robot 9604(Qiagen, Inc., Valencia CA)を用いて、自動化することができる。本質的には、培養プレート上で細胞を溶解した後、プレートをロボットデッキに移し、そこで、ピペッティング、DNase処理、及び、溶出段階が実行される。
【0182】
実施例13
C/EBPα mRNAレベルのリアルタイム定量PCR分析
C/EBPα mRNAレベルの定量は、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(PE−Applied Biosystems, Foster City, CA)を製造者の指示に従って使用して、リアルタイム定量PCRにより決定された。これは、閉じられたチューブで、ゲルに基づいてなく、リアルタイムにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物のハイスループット定量ができる蛍光検出システムである。PCRが終了した後に、増幅産物が定量される標準的なPCRとは対照的に、リアルタイム定量PCR産物はそれが蓄積するに従って定量される。これは、PCR反応にフォワード及びリバースPCRプライマーの間に特異的にアニールし、そして2つの蛍光色素を含むオリゴヌクレオチドを含むことにより達せられる。レポーター色素(例えば、Operon Technologies Inc., Alameda, CA またはPE−Applied Biosystems, Foster City, CAのどちらかから入手可能なJOE、FAMあるいはVIC)は、プローブの5’端に結合し、そして、クエンチャー色素(例えば、Operon Technologies Inc., Alameda, CAまたはPE−Applied Biosystems, Foster City, CAのどちらかから入手可能なTAMRA)は、プローブの3’端に結合する。プローブ及び色素が完全なとき、レポーター色素の発光は3’クエンチャー色素の近接により消失される。増幅の間、プローブの標的配列へのアニーリングはTaqポリメラーゼの5’−エキソヌクレアーゼ活性により切断されうる基質を作り出す。PCR増幅サイクルの伸長相の間、Taqポリメラーゼによるプローブの切断はプローブの残りから(そしてつまりクエンチャー部分から)レポーター色素を放出し、そして、配列特異的な蛍光シグナルが生み出される。各サイクルで、さらなるレポーター色素分子はその対応するプローブから解離され、そして、蛍光強度は、ABI PRISMTM 7700 Sequence Detection Systemに組み込まれるレーザー光により、一定のインターバルでモニターされる。各アッセイにおいて、未処理の対照試料由来mRNAの希釈系列を含む、並行した一連の反応は、試験試料の、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の阻害パーセントを定量するのに用いられる、標準曲線を生み出す。
【0183】
PCR試薬はPE−Applied Biosystems(Foster City, CA)より入手した。RT−PCR反応は、25μLポリ(A)mRNA溶液を含む96ウェルプレートに、25μL PCRカクテル(1×TAQMANTM バッファーA、5.5 mM MgCl2、各300μMのdATP、dCTP及びdGTPを、600μMのdUTP、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び、プローブを各100 nM、20 U RNAseインヒビター、1.25 U AMPLITAQ GOLDTM及び12.5 U MuLV逆転写酵素)を加えることにより実行した。RT反応は48℃で30分のインキュベーションにより実行された。AMPLITAQ GOLDTMを活性化するために95℃にて10分間のインキュベーションした後、40サイクルの2段階PCRプロトコールを実行した:95℃15秒間(変性)続いて60℃1.5分間(アニーリング/伸長)。
【0184】
刊行物に記載された配列情報(本明細書中でSEQ ID NO:3として援用されるGenBankアクセッション番号U34070)を使用して、ヒトC/EBPαに対するプローブおよびプライマーを、ヒトC/EBPα配列にハイブリダイズするように設計した。
【0185】
ヒトC/EBPαについて、PCRプライマーは:
フォワードプライマー:TGTGCCTTGGAAATGCAAAC(SEQ ID NO: 4)、
リバースプライマー:CGGGAAGGAGGCAGGAA(SEQ ID NO: 5)、および
PCRプローブ:FAM−CACCGCTCCAATGCCTACTGAGTAGGG−TAMRA(SEQ ID NO: 6)、
であり、ここでFAM(PE−Applied Biosystems, Foster City, CA)は蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRA(PE−Applied Biosystems, Foster City, CA)はクエンチャー色素である。
【0186】
ヒトGAPDH用のPCRプライマーは:
フォワードプライマー:GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEQ ID NO: 7)
リバースプライマー:GAAGATGGTGATGGGATTTC(SEQ ID NO: 8)であり、及び
PCRプローブは:5’ JOE−CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC− TAMRA 3’(SEQ ID NO: 9)であり、JOE(PE−Applied Biosystems, Foster City, CA)は蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRA(PE−Applied Biosystems, Foster City, CA)はクエンチャー色素である。
【0187】
刊行物に記載された配列情報(本明細書中でSEQ ID NO:10として援用されるGenBankアクセッション番号M62362)を使用して、マウスC/EBPαに対するプローブおよびプライマーを、マウスC/EBPα配列にハイブリダイズするように設計した。マウスC/EBPαについて、PCRプライマーは:
フォワードプライマー:CGCAAGAGCCGAGATAAAGC(SEQ ID NO:11)、
リバースプライマー:CGGTCATTGTCACTGGTCAACT(SEQ ID NO: 12)、および
PCRプローブ:FAM−AACGTGGAGACGCAACAGAAGGTGCT−TAMRA(SEQ ID NO: 13)、
であり、ここでFAM(PE−Applied Biosystems, Foster City, CA)は蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRA(PE−Applied Biosystems, Foster City, CA)はクエンチャー色素である。マウスGAPDHについてPCRプライマーは:
フォワードプライマー:GGCAAATTCAACGGCACAGT(SEQ ID NO: 14)
リバースプライマー:GGGTCTCGCTCCTGGAAGCT(SEQ ID NO: 15)であり、及び
PCRプローブは:5’ JOE−AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC− TAMRA 3’(SEQ ID NO: 16)であり、JOE(PE−Applied Biosystems, Foster City, CA)は蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRA(PE−Applied Biosystems, Foster City, CA)はクエンチャー色素である。
【0188】
実施例14
C/EBPα mRNAレベルのノザンブロット分析
アンチセンス処理の18時間後、単層の細胞を冷PBSで2回洗浄し、そして、1 mL RNAZOLTM(TEL−TEST “B” Inc., Friendswood, TX)に溶解した。全RNAは製造者が推薦するプロトコルに従って調製した。MOPSバッファーシステム(AMRESCO, Inc. Solon, OH)を用い、1.1%ホルムアルデヒドを含む1.2%アガロースゲルによる電気泳動により、20マイクログラムの全RNAを分離した。Northern/Southern Transferバッファーシステム(TEL−TEST “B” Inc., Friendswood, TX)を使用して、一晩キャピラリートランスファーすることによって、RNAをゲルからHYBONDTM−N+ ナイロンメンブレン(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)に移した。RNAのトランスファーは、UV可視化により確認した。メンブレンをSTRATALINKERTM UV Crosslinker 2400(Stratagene, Inc, La Jolla, CA)を使用して、UV架橋により固定し、次いでQUICKHYBTMハイブリダイゼーション溶液(Stratagene, La Jolla, CA)を使用し、ストリンジェントな条件についての製造者の推奨を用いて、プローブ化した。ヒトC/EBPαを検出するため、ヒトC/EBPα特異的プローブを、フォワードプライマーTGTGCCTTGGAAATGCAAAC(SEQ ID NO: 4)およびリバースプライマーCGGGAAGGAGGCAGGAA(SEQ ID NO: 5)を使用したPCRにより調製した。ロード効率及びトランスファー効率における多様性を標準化するため、メンブレンをストリップ化し、そして、ヒトグリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)RNA(Clontech, Palo Alto, CA)についてプローブ化した。
【0189】
マウスC/EBPαを検出するため、マウスC/EBPα特異的プローブを、フォワードプライマーCGCAAGAGCCGAGATAAAGC(SEQ ID NO:11)およびリバースプライマーCGGTCATTGTCACTGGTCAACT(SEQ ID NO: 12)を使用したPCRにより調製した。ロード効率及びトランスファー効率における多様性を標準化するため、メンブレンをストリップ化し、そして、マウスグリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)RNA(Clontech, Palo Alto, CA)についてプローブ化した。
【0190】
PHOSPHORIMAGERTMおよびIMAGEQUANTTM Software V3.3(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)を用いて、ハイブリダイズしたメンブレンを可視化し、そして、定量した。データは未処理対照におけるGAPDHレベルに標準化した。
【0191】
実施例15
2’−MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトC/EBPαのアンチセンス阻害
本発明に従って、一連のオリゴヌクレオチドを、刊行物に記載された配列(本明細書中でSEQ ID NO: 3として援用されるGenBankアクセッション番号U34070)を用いて、ヒトC/EBPα RNAの異なる領域を標的とするように設計した。オリゴヌクレオチドは表1に示す。“標的部位”は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の最初(最も5’−端)のヌクレオチド番号を示す。表1中のすべての化合物は、両方の端(5’及び3’方向)を5−ヌクレオチドの“ウィング”によって挟まれた、10個の2’−デオキシヌクレオチドからなる中央“ギャップ”領域から構成される、長さが20ヌクレオチドの、キメラオリゴヌクレオチド(“ギャップマー”)である。ウィングは、2’−メトキシエチル(2’−MOE)ヌクレオチドからなる。ヌクレオシド間(バックボーン)結合はオリゴヌクレオチド全体にわたりホスホロチオエート(P=S)である。全てのシチジン残基は5−メチルシチジンである。化合物を、ヒトC/EBPα mRNAレベルに対するそれらの効果について、本明細書中の他の実施例に記載の通り、定量的リアルタイムPCRにより分析した。データは2回の実験からの平均である。存在する場合、“N.D.”は“データなし”を示す。
【0192】
【表1】
【0193】
【0194】
表1に示されるように、SEQ ID NO: 26、30、33、34、35、37、39、43、44、45、49、51、52、53、56、58、59、61、62、63、64、65、66、67、70、71、73、78、79、80、82、83、84、85、86、87、89および92は、このアッセイにおいて、少なくとも20%のヒトC/EBPαの発現の阻害が証明され、そして、それゆえ好ましい。
【0195】
実施例16
2’−MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるマウスC/EBPα発現のアンチセンス阻害
本発明に従って、刊行物に記載された配列(SEQ ID NO: 10として本明細書中に援用されるGenbankアクセッション番号M62362)を使用して、マウスC/EBPα RNAの異なる領域を標的とするように、2番目の一連のオリゴヌクレオチドが設計された。オリゴヌクレオチドは表2に示す。“標的部位”は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の最初(最も5’−端)のヌクレオチド番号を示す。表2中のすべての化合物は、両方の端(5’及び3’方向)を5−ヌクレオチドの“ウィング”によって挟まれた、10個の2’−デオキシヌクレオチドからなる中央“ギャップ”領域から構成される、長さが20ヌクレオチドの、キメラオリゴヌクレオチド(“ギャップマー”)である。ウィングは、2’−メトキシエチル(2’−MOE)ヌクレオチドからなる。ヌクレオシド間(バックボーン)結合はオリゴヌクレオチド全体にわたりホスホロチオエート(P=S)である。全てのシチジン残基は5−メチルシチジンである。化合物を、マウスC/EBPα mRNAレベルに対するそれらの効果について、本明細書中の他の実施例に記載の通り、定量的リアルタイムPCRにより分析した。データは、2つの実験からの平均である。存在する場合、“N.D.”は“データなし”を示す。
【0196】
【表2】
【0197】
【0198】
表2に示されるとおり、SEQ ID NO: 19、20、27、30、38、40、43、44、51、52、54、58、60、62、63、65、73および94は、この実験において、少なくとも20%のマウスC/EBPαの発現の阻害が証明され、そして、それゆえ好ましい。
【0199】
実施例17
C/EBPαタンパク質レベルのウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット(イムノブロット分析)は標準的な方法を用いて行われる。細胞をオリゴヌクレオチド処理の16−20時間後に回収し、PBSで1回洗浄し、Laemmliバッファー(100 ul/well)に懸濁し、5分間煮沸し、そして、16%SDS−PAGEゲルにロードする。ゲルを1.5時間、150 Vで泳動し、そして、ウエスタンブロットのために、メンブレンにトランスファーする。C/EBPαに対する適する第一抗体を、第一抗体の種に対する放射ラベルした、あるいは、蛍光ラベルした第二抗体とともに使用する。バンドをPHOSPHORIMAGERTM(Molecular Dynamics, Sunnyvale CA)を使用して、可視化する。
Claims (20)
- C/EBPαをコードする核酸分子を標的とする長さ8〜30の核塩基のアンチセンス化合物であって、C/EBPαに特異的にハイブリダイズし、そしてその発現を阻害する、前記アンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO: 19、20、26、27、30、33、34、35、37、38、39、40、43、44、45、49、51、52、53、54、56、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、70、71、73、78、79、80、82、83、84、85、86、87、89、92または94を含む配列を有する、請求項2に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項2に記載のアンチセンス化合物。
- 修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項4に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも一つの修飾糖部分を含む、請求項2に記載のアンチセンス化合物。
- 修飾糖部分が2’−O−メトキシエチル糖部分である、請求項6に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾核塩基を含む、請求項2に記載のアンチセンス化合物。
- 修飾核塩基が5−メチルシトシンである、請求項8に記載のアンチセンス化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドである、請求項2に記載のアンチセンス化合物。
- 請求項1に記載のアンチセンス化合物および医薬的に許容可能な担体または希釈剤を含む、組成物。
- コロイド分散システムをさらに含む、請求項11に記載の組成物。
- アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項11に記載の組成物。
- 細胞または組織においてC/EBPαの発現を阻害する方法であって、前記細胞または組織と請求項1に記載のアンチセンス化合物とを接触させ、それによりC/EBPαの発現を阻害することを含む、前記方法。
- C/EBPαと関連する疾患または症状を有するヒトを治療する方法であって、前記動物に対して、治療的または予防的有効量の請求項1に記載のアンチセンス化合物を投与し、それによりC/EBPαの発現を阻害することを含む、前記方法。
- 疾患または症状が発生障害である、請求項15に記載の方法。
- 疾患または症状が糖尿病である、請求項15に記載の方法。
- 疾患または症状が肝臓障害である、請求項15に記載の方法。
- 疾患または症状が肥満である、請求項15に記載の方法。
- 疾患または症状が過剰増殖性障害である、請求項15に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US09/593,589 US6306655B1 (en) | 2000-06-13 | 2000-06-13 | Antisense inhibition of C/EBP alpha expression |
PCT/US2001/018803 WO2001096586A1 (en) | 2000-06-13 | 2001-06-11 | Antisense modulation of c/ebp alpha expression |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004503246A true JP2004503246A (ja) | 2004-02-05 |
JP2004503246A5 JP2004503246A5 (ja) | 2005-02-03 |
Family
ID=24375326
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002510700A Withdrawn JP2004503246A (ja) | 2000-06-13 | 2001-06-11 | C/EBPα発現のアンチセンスモジュレーション |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6306655B1 (ja) |
EP (1) | EP1290204A1 (ja) |
JP (1) | JP2004503246A (ja) |
AU (1) | AU2001268322A1 (ja) |
WO (1) | WO2001096586A1 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2022008404A (ja) * | 2013-11-22 | 2022-01-13 | ミナ セラピューティクス リミテッド | C/EBPα小分子活性化RNA組成物 |
JP2023015297A (ja) * | 2013-11-22 | 2023-01-31 | ミナ セラピューティクス リミテッド | C/EBPα小分子活性化RNA組成物 |
JP7525578B2 (ja) | 2013-11-22 | 2024-07-30 | ミナ セラピューティクス リミテッド | C/EBPα小分子活性化RNA組成物 |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7407943B2 (en) * | 2001-08-01 | 2008-08-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of apolipoprotein B expression |
PT2336318E (pt) * | 2002-11-13 | 2013-06-12 | Genzyme Corp | Modulação anti-sentido da expressão de apolipoproteína b |
CN101679979A (zh) | 2007-03-24 | 2010-03-24 | 基酶有限公司 | 施用与人载脂蛋白b互补的反义寡核苷酸 |
US10941399B2 (en) * | 2011-04-14 | 2021-03-09 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Methods and compositions for gene-specific demethylation by DNA methyltransferase (DNMT)-RNA interaction |
KR102195514B1 (ko) | 2011-06-21 | 2020-12-29 | 미나 테라퓨틱스 리미티드 | 알부민 생산 및 세포 증식 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5545563A (en) | 1993-03-04 | 1996-08-13 | Baylor College Of Medicine | Human C/EBP gene and vectors for its expression |
US5801154A (en) * | 1993-10-18 | 1998-09-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein |
-
2000
- 2000-06-13 US US09/593,589 patent/US6306655B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-06-11 EP EP01946246A patent/EP1290204A1/en not_active Withdrawn
- 2001-06-11 JP JP2002510700A patent/JP2004503246A/ja not_active Withdrawn
- 2001-06-11 WO PCT/US2001/018803 patent/WO2001096586A1/en not_active Application Discontinuation
- 2001-06-11 AU AU2001268322A patent/AU2001268322A1/en not_active Abandoned
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2022008404A (ja) * | 2013-11-22 | 2022-01-13 | ミナ セラピューティクス リミテッド | C/EBPα小分子活性化RNA組成物 |
JP2023015297A (ja) * | 2013-11-22 | 2023-01-31 | ミナ セラピューティクス リミテッド | C/EBPα小分子活性化RNA組成物 |
JP7525578B2 (ja) | 2013-11-22 | 2024-07-30 | ミナ セラピューティクス リミテッド | C/EBPα小分子活性化RNA組成物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1290204A1 (en) | 2003-03-12 |
US6306655B1 (en) | 2001-10-23 |
AU2001268322A1 (en) | 2001-12-24 |
WO2001096586A1 (en) | 2001-12-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4054192B2 (ja) | Ptp1b発現のアンチセンス阻害 | |
JP4397585B2 (ja) | クラスタリン発現のアンチセンスモジュレーション | |
AU770526B2 (en) | Antisense modulation of PI3K P85 expression | |
JP2003505351A (ja) | Mapキナーゼキナーゼ6発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2003520241A (ja) | Mekk2発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2004509619A (ja) | Flip−c発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2003503048A (ja) | Ship−2発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2003520586A (ja) | Smad7発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2003505027A (ja) | Pi3キナーゼp110デルタ発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2003520042A (ja) | 誘導性一酸化窒素シンターゼ発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2003505062A (ja) | Pten発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2003512070A (ja) | インテグリン−結合キナーゼ発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2003505063A (ja) | Mekk5発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2003520051A (ja) | Pepck−サイトゾル発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2003508089A (ja) | PI3キナーゼp110ベータ発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2003505092A (ja) | Shp−2発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2003520585A (ja) | ペルオキシソーム増殖因子−活性化受容体ガンマ発現のアンチセンスモジュレーション発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2003505026A (ja) | 肝臓グリコーゲンホスホリラーゼ発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2003525058A (ja) | E2f転写因子1発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2003531630A (ja) | Dna結合阻害剤−1発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2004503232A (ja) | C/EBPβ発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2003527085A (ja) | Pepck−ミトコンドリア発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2003518928A (ja) | Akt−3発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2003512079A (ja) | タンパク質キナーゼc−シータ発現のアンチセンスモジュレーション | |
JP2003520041A (ja) | グリコーゲンシンターゼキナーゼ3ベータ発現のアンチセンスモジュレーション |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20050204 |