KR102195514B1 - 알부민 생산 및 세포 증식 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 알부민 생산을 상향조절하는 짧은 활성화 RNA (short activating RNA) 분자들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 알부민 생산을 상향조절하는 방법에 관한 것이고, 이러한 방법들은 알부민의 발현을 증가시킬 수 있는 짧은 활성화 RNA 분자들의 사용이 관여한다. 본 발명은 또한 과다증식성 장애 및/또는 저알부민혈증 (hypoalbuminemia)을 특징으로 하는 장애를 치료하거나 예방하는 것과 같은 치료법에서 짧은 활성화 RNA 분자들의 용도에 관한 것이다.

Description

알부민 생산 및 세포 증식{ALBUMIN PRODUCTION AND CELL PROLIFERATION}
본 발명은 알부민 생산을 상향조절하는 방법들에 관한 것이다. 본 방법들은 알부민의 발현을 증가시킬 수 있는 짧은 RNA 분자들의 사용이 관여한다. 본 발명은 또한 이러한 RNA 분자들의 설계 및 합성 그리고 저알부민혈증 또는 암을 치료하는 것과 같은 치료법에서 그들의 용도에 관한 것이다. 알부민 생산을 상향조절하여 세포 증식을 저해하는 방법들도 또한 제공된다. 따라서 본 명세서에서 개시된 주제 문제는 일반적으로 짧은 활성화 RNA (saRNA), 상세하게는 세포 증식에 영향을 주는 saRNA에 관한 것이다.
관심 있는 유전자의 상승-발현을 조절하는 현재까지의 방법들은 전형적으로, 숙주 게놈 내로 유전자의 여분의 사본들을 도입하는데 바이러스들을 사용하는 것에 의해 또는 표적 유전자의 여분의 사본들을 발현하는 플라스미드들을 도입하는 것에 의해 세포 내로 유전자의 여분의 사본들의 도입을 요구한다. 대조적으로, 본 발명은 유전자 발현, 상세하게 알부민 생산을 상향조절할 수 있는 짧은 활성화 RNA (short activating RNA) 분자들을 제공한다.
다양한 연구들은 짧은 활성화 RNA (saRNA)가 유전자의 프로모터 부위를 표적하고 유전자를 활성화할 수 있는 점을 가리킨다. 일정 연구들은 짧은 이중가닥 또는 단일가닥 RNA가 유전자의 프로모터 부위에서 매치 (match)를 찾아서 프로모터 부위와 결합하고 소위 "오프 (off)" 태그들을 제거하는 복합체를 형성하는 기작 (기작 A); 및 세포가 유전자를 침묵시키도록 단백질의 생산을 일정 방식으로 차단하는 프로모터 부위의 RNA 카피들을 생산하게 되고; 짧은 이중가닥 또는 단일가닥 RNA가 상기 RNA 카피들에 결합하여 이를 파괴하도록 매치를 찾는 또 다른 기작 (기작 B)을 제시하여 왔다. 이들 제시된 기작들은 (예를 들어, 하나 또는 가능하게는 둘 다라고 여겨짐), 예를 들어 단백질의 생산을 제공하도록 표적 유전자를 "온(on)"으로 켜지는 것을 유도한다. 도 1은 프로모터 부위, 코딩 영역 및 복합체를 형성할 수 있는 이중가닥 RNA의 측면에서 기작 A 110 (도면 부호 112 및 114) 및 기작 B 120 (도면 부호 122를 참조하라)을 도시하는 대략적 모식도들을 나타낸다 (예를 들어, 문헌[Holmes, B., "Turn genes on, turn diseases off", New Scientist, 2007년 4월 7일]을 참조하고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 통합된다).
RNA 간섭 (RNAi)은 표적 mRNA들의 서열-특이적 하향조절을 유발하는 중요한 유전자 조절 기작이다. RNAi는 RNAi 공정에서 작용하는 다양한 짧은 이중가닥 RNA (dsRNA) 분자들을 포괄하는 우산 같은 용어인 "간섭화 RNA (interfering RNA)" (iRNA)에 의해 매개된다.
외인성 dsRNA는 리보핵산분해효소 단백질 다이서 (Dicer)에 의해 각각의 3' 말단에 3' 초과 부분 (overhang)을 형성하는 여러 개의 쌍을 이루지 않은 염기들을 가진 19개 내지 25개 염기쌍들, 바람직하게는 21 내지 23개 염기쌍들의 이중가닥 단편들로 프로세싱될 수 있다. 바람직하게는, 각각의 3' 초과 부분은 길이가 1개 내지 3개, 더욱 바람직하게는 2개의 뉴클레오타이드들이다. 이들 짧은 이중가닥 단편들은 작은 간섭화 RNA (siRNA)라고 명명되고 이들 분자들은 표적 유전자들의 발현의 하향조절 (down-regulation)에 효과를 미친다. 그들의 기능의 규명 이래로, siRNA들은 특이적 유전자들을 하향조절하는 데 도구들로서 사용되어 왔다.
RNA-유도성 침묵화 복합체 (RISC)라고 불리는 단백질 복합체는 siRNA 가닥들의 하나를 통합하고 표적 mRNA들을 인식하도록 본 가닥을 안내자 (guide)로서 사용한다. 안내 (guide) RNA 및 mRNA 간의 상보성 (complementarity)에 의존하여, RISC는 이어서 mRNA의 번역 (translation)을 파괴하거나 저해한다. 완벽한 상보성은 mRNA 절단 및 파괴를 유도하고, 절단의 결과로서 mRNA는 단백질로 더 이상 번역될 수 없다. 부분적 상보성은 - 상세하게는 mRNA의 3' 미번역 영역 (UTR)에서 부위들과의 상보성 - 번역 저해를 유도한다.
최근에, RISC가 주로 전사후 (post transcription) 유전자들을 조절하더라도, RNAi는 유전자 전사 자체도 역시 조정할 수 있는 것으로 발견되어 왔다. 짧은 RNA들은 조절되는 RNA에 대해 센스 또는 안티센스이고 비-코딩 전사체들인 것으로 예상되는 파괴 전사체들을 표적하여 전사를 조절하는 것으로 여겨진다. RNA 표적화를 통한 이들 비-코딩 전사체들의 파괴는 RNA 표적의 특성에 의존하여 후생적 조절 양상들에 미치는 서로 다른 효과들을 가진다. 주어진 mRNA에 대해 센스인 ncRNA 표적들의 파괴는 해당 mRNA의 전사 억제 (repression)를 유도하는 한편, 주어진 mRNA에 대해 안티센스인 ncRNA 표적들의 파괴는 해당 mRNA의 전사적 활성화를 유도한다. 이러한 안티센스 전사체들을 표적하여, RNAi는 따라서 특이적 유전자들을 상향조절하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있는, 공개된 미국 특허출원 제2010/0210707 A1호 ('707 출원)는 saRNA의 사용을 위한 일정 기술학을 개시하고 있다. '707 출원은 saRNA 가닥의 상보성을 제공하고, 다음 순서로 해당하는 유전자의 전사에서 증가를 제공하도록 유전자의 핵산 서열의 비-코딩 영역의 선택을 기술하고 있다. 이러한 접근법은 "표적"이 연역적으로 (a priori) 알려진 것으로 추정한다. 또한, '707 출원은 명확하게 "saRNA들이 숨겨진 (cryptic) 프로모터 전사를 표적하지 않는 점"을 진술한다. 자세하게, '707 출원은 E-캐드헤린 (E-cadherin), p21 및 GAPDH의 발현이 유전자 특이적 프라이머 집합들을 사용하여 검출되었고; 숨겨진 전사체는 E-캐드헤린과 상보적인 프라이머들을 사용하여 전혀 검출되지 않았으며; 숨겨진 전사체는 p21 프로모터에서 전혀 증폭되지 않았던 점을 주목하고 있다.
'707 출원은 세포성 증식을 저해하는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자의 비-코딩 서열과 상보성의 5' 부위 및 비-코딩 서열과 비-상보적인 하나 이상의 뉴클레오타이드의 3' 말단 부위를 가진 적어도 첫 번째 리보핵산 가닥을 가진 saRNA 분자를 기술하고 있고, 여기에서 saRNA의 투여는 폴리펩타이드의 발현에서 증가 및 세포성 증식에서 감소를 제공한다. 명백하게 진술된 바와 같이, 언급된 폴리펩타이드 자체는 "세포성 증식을 저해한다".
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 다양한 기술학들, 기법들 등은 선택적으로 특이적 사전 지식 없이 saRNA를 제공할 수 있고, 이러한 saRNA는 세포 증식에 영향을 주도록 직접적 또는 간접적으로 투여될 수 있다. 다양한 실시예들에서, 세포 증식은 세포 증식을 저해하는 폴리펩타이드의 존재가 아닌 오히려 하나 이상의 폴레펩타이드들의 생산의 기작을 조절하여 영향을 받는다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 이러한 하나 이상의 폴리펩타이드들의 각각은 폴리펩타이드 분자 자체의 존재에 의해 세포 증식을 저해할 수 있거나 저해할 수 없다.
[특허문헌]
(특허문헌 1) 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있는 일정 참고문헌들.
[비특허문헌]
(비특허문헌 1)문헌[Akira, S., Isshiki, H., Sugita, T., Tanabe, O., Kinoshita, S., Nishio, Y., Nakajima, T., Hirano, T., and Kishimoto, T. (1990). A nuclear factor for IL-6 expression (NF-IL6) is a member of a C/EBP family. EMBO J 9, 1897-1906].
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(비특허문헌 31)문헌[Zhong, Z., Wen, Z., and Darnell, J.E., Jr. (1994). Stat3: a STAT family member activated by tyrosine phosphorylation in response to epidermal growth factor and interleukin-6. Science 264, 95-98].
본 발명자는 생체내 (in vivo)에서 또는 시험관내 (in vitro)에서 알부민 생산을 상향조절하는 새로운 방법을 제공하도록 착수하였다. 그는 알부민 생산을 상향조절하는 새로운 짧은 RNA들을 개발하였다. 이러한 상향조절 (up-regulation)은 알부민 생산에 관여하는 표적 유전자를 상향조절하여 달성된다. 이들 RNA들은 유전자 발현을 활성화하고, 이에 따라 그들은 짧은 활성화 RNA (saRNA)라고도 역시 불린다. 용어들 "짧은 RNA" 및 "saRNA"가 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
이론에 얽매이려고 하지 않더라도, 본 발명의 짧은 RNA 분자들은 상기 언급된 기작 A 및/또는 B를 통하여 작용할 수 있다. 본 발명의 짧은 RNA들은 표적 유전자의 부위에 안티센스인 표적 RNA 전사체의 siRNA-유사 절단을 유도하여 표적 유전자의 조정을 달성할 수 있다. 본 발명의 짧은 RNA들은 조절 크로마틴-변형화 단백질들의 고정단 (anchor)들로서 아르고노트 (Argonaute) 단백질들과의 복합체로도 역시 작용할 수 있을 것이다. saRNA의 작용 기작은 예를 들어 폴리콤 (Polycomb) 군 단백질들을 통하여 크로마틴 재모델화에 관여할 수 있다. 폴리콤 군 단백질들은 분명하게 프로모터-연관된 RNA들을 포함하는 ncRNA들과 직접적으로 상호작용할 수 있고, 이에 의해 프로모터들에게로 채용되고 침묵화 (silencing) 효과를 낸다. 따라서, saRNA들은 이러한 폴리콤-채용 ncRNA들과 간섭하여 프로모터들에서 폴리콤-수준들을 감소시키고 트리토락스 (Trithorax) 군 단백질들과 같은 "양성" 크로마틴 재모델화 복합체들이 양성 히스톤 표지들을 확립하도독 허용한다.
따라서, saRNA 분자들은 표적 안티센스 RNA 전사체의 하향조절을 통해 알부민 생산을 상향조절할 수 있다.
본 발명자는 적합한 RNA 표적 전사체들의 확인을 위한 또한 이들 saRNA의 설계를 위한 유리한 방법/알고리즘을 사용하였다. 따라서 본 발명자는 알부민 생산에 관여하는 표적 유전자들을 상향조절하기 위하여 숙주세포에서 표적 RNA 전사체들을 표적하는 새로운 짧은 RNA들을 제공하였다.
본 발명의 짧은 RNA들은 본 명세서에서 "알부민 생산을 상향조절하는" RNA들이라고도 역시 말한다. 본 발명의 saRNA들의 바람직한 특징들은 하기에 논의된다.
본 명세서에서 편의상 "표적 유전자"라고 말하는 "알부민 생산에 관여하는 표적 유전자"에 의하여, 활성화/상향조절될 때 증가된 알부민 생산을 유도하는 유전자를 의미한다. 알부민 생산은 특히, 실시예들에서 나타난 바와 같이 알부민 유전자를 상향조절하는 saRNA들 또는 CEBPA 유전자를 상향조절하는 saRNA들을 사용하여 상향조절될 수 있다. 따라서, 표적 유전자는 편의상 알부민을 코딩하는 유전자 ("알부민 유전자")일 수 있고, 이 경우에 saRNA는 직접적 효과를 가지는 것으로 말할 수 있다. 대안적으로, 표적 유전자는 즉각적으로 또는 궁극적으로 알부민 생산을 조절하는 인자를 코딩할 수 있고, 이 경우에 saRNA는 간접적 효과를 가지는 것으로 말할 수 있다. 이러한 인자는 예를 들어 전사인자일 수 있다. 바람직한 예들로는 CEBPA 및 HNF4알파를 포함한다.
알부민은 신체의 우점하는 혈청-결합 단백질이다. 이것은 여러 중요한 기능들을 가진다. 이것은 삼투압에 영향을 주어, 알부민이 정수압 (hydrostatic pressure)을 균형 맞추도록 충분한 콜로이드 삼투압을 더 이상 유지하지 못할 때 부종을 발생시킨다. 알부민은 빌리루빈, 지방산들, 금속들, 이온들, 호르몬들, 및 외인성 약물들을 포함하는, 다양한 물질들을 운반한다. 이것은 혈소판 기능에도 역시 영향을 준다.
CCAAT/인핸서 결합 단백질 알파 (CEBPA, C/EBP 알파라고도 알려짐)는 염기성 루이신 지퍼 부류의 단백질을 코딩하는 인트론-부족 유전자이다. CEBPA 단백질은 2개의 N-말단 트랜스활성화 도메인들, 염기성 DNA 결합 도메인 및 C-말단 루이신 지퍼 도메인으로 구성된다. CEBPA는 래트 간의 핵으로부터 처음으로 정제된 서열-특이적, DNA 결합 단백질이다. CEBPA의 결합 부위들은 CCAAT 박스들 및 인핸서 코아 상동성들을 포함한다. 이것은 mRNA 합성을 양성적으로 조절하도록 시스-조절성 DNA 서열들과 선택적으로 통합할 수 있다. 시스-조절성 서열들을 양성적으로 조절하는 그의 능력을 기초로 하여, CEBPA는 전사인사로서 분류된다.
CEBPA는 다양한 조직들에서 발현되고, 그들은 지방세포들 (adipocyte), 제Ⅱ형 폐포 세포들 및 간세포들을 포함하는 많은 세포 유형들의 분화에서 중요한 역할을 담당한다. 마우스에서, CEBPA는 지방, 간 및 폐 조직에서 가장 풍부하게 발견된다. CEBPA는 또한 최종적으로 분화된 간 실질 세포들에 제한된다. 간 세포들에서 CEBPA의 기능적 역할은 다넬 (Darnell) 등에 의해 보고되었고, 이는 그의 알파-1-안티트립신, 트랜스타이레틴 (transthyretin) 및 알부민의 조절을 보여준다. 또한 간 세포주 (HepG2)에서 기능적 CEBPA의 발현은 내인성 기질들의 대사에 관여하고, 해독화 (detoxification) 및 핵심 제노바이오틱들의 대사적 활성화에서 핵심 역할을 담당하는 모노옥시게나제들 슈퍼패밀리의 하나인 사이토크롬 P450의 증가된 수준들을 유도한다. CEBPA는 알부민 유전자의 프로모터 요소 상에서 그의 존재에 의해 입증된 바와 같이, 간 특이적 유전자들에서 생리학적으로 적절한 역할을 담당한다.
HNF4A (간세포 핵인자 4알파)는 여러 유전자들의 발현을 조절하는 핵 전사인자이다. 이것은 동종이량체로서 결합하고, 간, 신장 및 창자들의 발생에서 역할을 담당할 수 있다. HNF4A 돌연변이들은 단일유전자 상염색체 우성 인슐린-비의존성 제I형 당뇨병과 연관된다.
본 발명에 따른 알부민 생산의 상향조절은 단일 표적 유전자, 바람직하게는 상기에 논의된 표적 유전자들로부터 선택되는 것을 상향조절하여, 또는 2개 이상 또는 3개 이상의 서로 다른 표적 유전자들을 상향조절하여 달성될 수 있다. 바람직한 조합들은 알부민 유전자 및 CEBPA 유전자; 알부민 유전자 및 HNF4A 유전자; CEPBA 유전자 및 HNF4A 유전자; 또는 알부민 유전자, CEBPA 유전자 및 HNF4A 유전자의 상향조절이다. 임의의 특정한 표적 유전자의 상향조절은 단일한 saRNA (단일가닥 또는 이중가닥) 또는 2개 또는 3개의 서로 다른 saRNA (단일가닥 또는 이중가닥)의 조합을 사용하여 달성될 수 있다. 2개 또는 3개의 표적 유전자들이 상향조절될 때, 첫 번째 표적 유전자에 특이적인 하나 이상의 saRNA 및 두 번째 표적 유전자에 특이적인 하나 이상의 saRNA의 조합이 사용된다. 따라서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 이상의 서로 다른 saRNA들이 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 바람직하게, saRNA는 서열번호 5 내지 36의 서열을 포함하거나 이로 구성되는 첫 번째 가닥을 포함한다.
하기에 논의된 바와 같이, 많은 병태들은 저알부민혈증을 특징으로 하고, 이에 따라 이러한 병태들로 고생하는 환자들에서 알부민 수준들을 증가시킬 필요성이 존재한다. 따라서 본 발명은 이러한 병태들의 치료를 위한 새로운 치료적 접근법들을 제공한다.
놀랍게도, 본 발명자는 실시예들에서 나타난 바와 같이 과다증식성 세포에서 알부민 발현을 상향조절하는 것은 해당 세포의 증식을 저해하고 생체내에서 알부민 발현을 상향조절하는 것은 종양 발생 및 성장을 저해하는 점을 확인하였다. 이것은 과다증식성 장애들의 치료를 위한 새로운 치료적 접근법을 열어준다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 세포는 짧은 활성화 RNA의 투여에 의해 변형되고 이에 의해 생산이 세포 증식에 영향을 주는 분자의 생산을 증가시키도록 세포를 유도할 수 있다. 예로서, 간세포는 알부민의 생산을 증가시키도록 saRNA의 투여에 의해 변형된다. 다음 순서로, 간세포의 분열하는 (예를 들어, 증식하는) 능력은 부정적으로 영향을 받는다. 다른 말로 하면, 알부민의 생산에서 증가와 연관된 기작 또는 기작들은 처리된 간세포들에게 감소된 증식을 나타내도록 한다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, saRNA는 일차 간암과 같은 암의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 예를 들어, 간암에 관한 치료 또는 예방은 saRNA를 간경변을 가진 환자들에게 (예를 들어, 바이러스성 간염 또는 에탄올 중독으로 인함) 투여하여 일어날 수 있다.
예로서, 인간 간세포 암종 (HepG2) 세포주에서 세포 증식에 미치는 알부민 mRNA 전사체를 상향조절하는 효과를 탐색할 목적으로 시도들이 착수되었다. 시도들은 알부민에 표적된 합성 saRNA의 사용을 포함하였고, 이는 나노펙틴 (Nanofectin) 리소좀 방법을 사용하여 HepG2 내로 형질감염되었다. 이들 시도들의 경우에, 성공적인 형질감염은 HepG2 세포들에서 mRNA 수준들의 증가에 의해 측정되었다. 효과를 보여주기 위하여, 세포성 증식의 변화가 테트라졸리움 염, 4-[3-(4-요오도페닐)-2-(4-니트로페닐)-2H-5-테트라졸리오]-1,3-벤젠 디설포네이트 (WST-1) 증식 방법을 사용하여 측정되었다.
이들 시도들은 알부민 유전자의 프로모터 부위에 표적된 saRNA가 HepG2 세포들 내로 성공적으로 형질감염되는 것을 (예를 들어, 혼합 (scrambling)된 RNA 대조군으로 형질감염된 세포들과 비교될 때 알부민 mRNA 수준들이 증가되었던 바와 같음) 보여주는 결과들을 제공하였다. 이들 결과들은 세포 증식이 알부민 발현을 상향조절하도록 재프로그램화된 세포들에서만 현저하게 감소되었던 점을 보여주었다. 이러한 효과는 알부민을 발현하는 인간 세포주에서도 역시 관찰되었다. 또한, 알부민을 발현하지 않는 래트 간 섬유모세포들의 경우, 동일한 saRNA들로 이들 래트 세포들의 형질감염은 알부민 mRNA의 상향조절 또는 세포 증식의 변화를 유발하지 않았던 점이 주목된다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, HepG2 세포들에서 알부민 전사체들을 증진하는 것은 간접적으로 세포 증식을 억제한다. 전사인자들 p53, HNF4-α, CEBPA-α, 및 CEBPA-β가 알부민 발현 및 세포사멸의 유도로 가지게 되는 확립된 역할과 연관하여; 본 명세서에서 기술된 기법들, 기술학들 등은 알부민에 특이적인 saRNA 분자들로 간 암종을 표적하는 기회들을 제공한다. 보다 일반적으로는, 본 명세서에서 기술된 바와 같이, saRNA 분자들은 특이적으로 세포 증식을 감소시키도록 이에 의해 생산과 연관된 기작 또는 기작들이 세포 증식에 영향을 주는 하나 이상의 분자들의 생산을 증가시킬 수 있다. 세포 증식에서 감소는 다양한 병태들의 치료에 유리할 수 있다.
간세포들은 일반적으로 여러 생명 기능들의 유지에 중요한 것으로서 인식된다. 예를 들어, 그들은 탄수화물 및 지질 대사 및 외인성 및 내인성 화합물들의 해독화 (detoxification)를 조절할 수 있다. 알부민은 신체를 통한 입자들의 운반 및 혈액에서 혈청 콜로이드 삼투압의 보존에 중요한 전형적인 간-특이적 유전자이다. 알부민에 대한 유전자 (알부민 유전자)는 출생 이후 간에서 높게 발현되고, 그의 조절은 알부민 프로모터 요소와 결합하는 수많은 인자들에 의해 표시된 바와 같이 전사적으로 조절된다 (예를 들어, 문헌[Panduro et al., 1987; Tilghman and Belayew, 1982]을 참조하라). 알부민 프로모터에는 여러 시스-작용 (cis-acting) 요소들이 존재한다 (부위들 A 내지 F). B 및 D 부위들은 간-특이적 전사인자들이 이들 요소들과 결합하기 때문에 중요한 것으로 관찰되어 왔다 (예를 들어, 문헌[Maire et al., 1989]을 참조하라). HNF-1은 B 부위와 결합하는 것으로 확인되어 왔다 (예를 들어, 문헌[Courtois et al., 1988; Lichtsteiner and Schibler, 1989]을 참조하라). 전사인자들의 루이신 지퍼 단백질들에 속하는 C/EBP 패밀리의 구성원들은 알부민 프로모터의 D 부위들에서 상호작용하는 것으로 관찰되어 왔다 (예를 들어, 문헌[Descombes et al., 1990; Landschulz et al., 1988; Mueller et al., 1990]을 참조하라).
일반적으로, 여러 과정들이 알부민 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 생리학적 조건들 하에서, 세포외 삼투압 (oncotic pressure)이 HNF-1을 통해 알부민 유전자 발현을 조절하는 것으로 확인되어 왔다 (예를 들어, 문헌[Pietrangelo et al., 1992; Pietrangelo and Shafritz, 1994]을 참조하라). 간의 급성기 반응과 같은 병리학적 상태들 동안, 알부민 유전자 발현이 하향조절되는 것으로 관찰되어 왔다 (예를 들어, 문헌[Trautwein et al., 1994]을 참조하라). 최근 수년 동안, 급성기 (acute phase) 유전자들의 조절에서 관련성을 보여주었던 전사인자들이 클로닝되어 왔다. 이들은 STAT3, C/EBP-β, IL6-DBP, NF-IL6, LAP 또는 CRP2를 포함한다 (예를 들어, 문헌[Akira et al., 1990; Akira et al., 1994; Cao et al., 1991; Chang et al., 1990; Descombes et al., 1990; Poli et al., 1990; Williams et al., 1991; Zhong et al., 1994]을 참조하라). 전사인자의 C/EBP 패밀리는 특히 본 패밀리의 구성원들이 알부민 프로모터의 D 부위와 결합하고 또한 p53 및 HNF4-α를 통해 세포 주기 정지 (arrest)를 조절하기 때문에 적절하다 (예를 들어, 문헌[Barone et al., 1994; Buck et al., 1994; Johnson, 2005; Nagao et al., 1995]을 참조하라). HNF4-α 및 CEBP-α 둘 다는 간 기능 및 분화를 위해 결정적인 것으로 확인되었다 (예를 들어, 문헌[Hayhurst et al., 2001; Lee et al., 1997; Wang et al., 1995]을 참조하라). 일정 연구들은 종양 억제인자 p53의 과다발현에 의한 HNF4-α 및 CEBP 둘 다의 전사적 억제가 간에서 빈약한 간 분화와 상관되는 점이 관찰되어 왔다 (예를 들어, 문헌[Itoh et al., 2000; Nagao et al., 1995; Ng et al., 1995]을 참조하라). p53 수준들의 증가는 가능하게 CEBP-α 및 β 전사적 활성의 저해를 통하여 알부민 발현의 감소와 상관되는 것으로 확인되어 왔다 (예를 들어, 문헌[Kubicka et al., 1999]을 참조하라). 정상적 조건들에서 p53의 야생형 수준들은 매우 낮고, DNA 손상, 성장인자들의 금단 (withdrawal) 및 저산소증과 같은 세포성 스트레스에만 반응하여 증가된다 (예를 들어, 문헌[Prives, 1998]을 참조하라). p53 단백질 수준의 철저한 조절은 세포 주기의 차단 및 세포사멸의 유도를 방지하는 데 요구되는 것으로 확인되어 왔다.
알부민은 세포 증식에서 역할을 가지는 것으로 생각되지 않고, 즉 이것은 세포 주기에 관여하지 않고 세포 증식을 위해 요구되지 않으며, 또한 알부민의 정상적 수준들은 세포 증식에 영향을 주는 것으로 생각되지 않는다. 이것은 세포 증식에 관여하는 사이클린들 및 사이클린-의존성 키나제들과 같은 단백질들과 대조될 수 있다. 이론에 얽매이려고 하지 않더라도, 본 발명자는 알부민 생산을 상향조절하여, 세포의 자원들은 세포 증식으로부터 멀어지고 결론적으로 세포 증식은 늦어지거나 전부 정지한다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 예로서 알부민의 상향조절 (도 2 참조)은 세포 증식 및 성장을 제한하도록 p53 수준들이 감소되어 HNF4α, CEBPA-α 및 β의 전사에서 증가를 유도하는 정상적인 조건들로 역전하도록 세포들을 "속이는" 것일 수 있다 (예를 들어, 문헌[Maeda et al., 2002]을 참조하라). 시도들로부터 나온 증거는 saRNA에 의한 알부민의 상향조절이 현저하게 간암 세포주의 증식을 억제하는 점을 보여준다 (도 3 참조).
따라서, 한 가지 관점에서 본 발명은 알부민 생산을 상향조절하고 이에 의해 세포 증식을 저해하는 짧은 활성화 RNA를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 과다증식성 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
대안적으로 보면, 본 발명은 치료법에 사용되기 위한, 바람직하게는 과다증식성 장애를 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 알부민 생산을 상향조절하고 이에 의해 세포 증식을 저해하는 짧은 활성화 RNA를 제공한다.
세포 (시료), 조직 (시료), 기관 또는 대상을 알부민 생산을 상향조절하고 이에 의해 세포 증식을 저해하는 짧은 활성화 RNA와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 증식을 저해하는 시험관내, 생체외 (ex vivo) 또는 생체내 방법도 역시 제공된다.
알부민 생산을 상향조절하는 짧은 활성화 RNA를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 저알부민혈증을 특징으로 하는 병태를 가지는 대상을 치료하는 방법도 역시 제공된다.
대안적으로 보면, 본 발명은 치료법에 사용하기 위한, 바람직하게 저알부민혈증을 특징으로 하는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 알부민 생산을 상향조절하는 짧은 활성화 RNA를 제공한다.
세포 (시료), 조직 (시료), 기관 또는 대상을 알부민 생산을 상향조절하는 짧은 활성화 RNA와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에 의해 알부민 생산을 상향조절하는 시험관내, 생체외 또는 생체내 방법도 역시 제공된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 알부민 생산을 상향조절할 수 있는 saRNA를 제공한다. saRNA들의 선택적 특징들은 본 명세서의 다른 곳에서 기술된다.
본 발명의 saRNA들은 유리하게 이중 효과를 낼 수 있고, 즉 세포 증식을 저해하고 알부민 수준을 증가시킨다. 과다증식성 장애로 고생하는 대상에게 투여될 때, saRNA들은 과다증식성 세포들의 증식을 감소시킬 뿐만 아니라 그들은 간 기능을 개선하는 것과 같은 다양한 긍정적 성과들을 가질 수 있는 알부민 수준들을 증가시킨다. 저알부민혈증으로 고생하는 대상에게 투여될 때, saRNA들은 알부민 수준들을 증가시키고 이에 의해 저알부민혈증을 완화하며, 또한 과다증식성 장애의 발생을 예방하도록 돕는다. 많은 간 장애들, 상세하게 간경변은 저알부민혈증을 특징으로 하고, 상세하게는 미치료되는 경우 전형적으로 대상의 암을 발생시킬 위험성을 증가시킨다. 본 발명은 상세하게 이러한 간 장애들의 유리한 치료들로서, 저알부민혈증을 완화하고 암의 위험성을 감소시키는 치료들을 제공한다. 따라서 저알부민혈증 및 과다증식성 장애들을 특징으로 하는 병태들을 동시에 치료하는 saRNA들이 제공된다.
"알부민 생산을 상향조절할 수 있는"은 saRNA가 알부민을 생산하는 데 필요한 기작을 가지고, 바람직하게는 일정 알부민을 자연적으로 생산하는 세포 내에 있을 때 알부민 생산을 상향조절하는 것을 의미한다. 유리하게는, 알부민 생산을 상향조절하는 것은 세포 증식, 상세하게 과다증식 (hyperproliferation)을 저해하여, 상기 saRNA는 세포 증식, 상세하게 과다증식을 저해할 수 있다. "세포 증식을 저해할 수 있는"은 saRNA가 세포 증식에 필요한 기작을 가지는 세포 내에 있을 때 세포 증식을 저해하는 것을 의미한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 saRNA 분자를 포함하는 생체외 또는 시험관내 세포를 제공한다. 또 다른 관점에서, 본 발명은 알부민 생산이 본 명세서에서 개시된 방법에 의해 상향조절되었던 생체외 또는 시험관내 세포를 제공한다. 따라서, 이러한 세포는 본 명세서에서 개시된 방법에 의해 수득되거나 수득가능하다. 치료법, 바람직하게는 저알부민혈증을 특징으로 하는 병태의 치료에서 사용하기 위한 이러한 세포들도 역시 제공된다.
"과다증식성 세포"는 동등하고 건강한 세포 ("대조군"이라고도 말할 수 있음)의 증식 속도와 비교하여 비정상적으로 높은 속도로 증식하는 임의의 세포일 수 있다. "동등하고 건강한 (equivalent healthy)" 세포는 정상적인 건강한 상대방 세포이다. 따라서, 이것은, 예컨대 동일한 기관으로부터 나온, 비교대상 세포와 동일한 기능을 수행하는 동일한 유형의 세포이다. 예를 들어, 과다증식성 간세포의 증식은 건강한 간세포를 참조하여 평가되어야 하는 한편, 과다증식성 전립선 세포의 증식은 건강한 전립선 세포를 참조하여 평가되어야 한다.
증식의 "비정상적으로 높은" 속도에 의해, 과다증식성 세포들의 증식의 속도는 동등하고 건강한 (비-과다증식성) 세포들의 증식 속도와 비교 시 20, 30, 40% 이상, 또는 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75% 이상, 또는 80% 이상 증가되는 것을 의미한다. 증식의 "비정상적으로 높은" 속도는 동등하고 건강한 세포들의 증식 속도와 대비하여 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10의 팩터로, 또는 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50의 팩터로, 또는 적어도 60, 70, 80, 90, 100의 팩터로 증가되는 속도도 역시 말할 수 있다.
과다증식성 세포들의 예들로는 암성 세포들 (암종들, 육종들, 림프종들 및 모세포종을 포함함)을 포함한다. 이러한 암종 세포들은 비악성 (benign) 또는 악성 (malignant)일 수 있다. 과다증식성 세포들은 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 또는 건선과 같은 자가면역 병태로부터도 역시 유발될 수 있다. 과다증식성 세포들은 알레르기원과 접촉하게 되는 과다민감성 면역 체계를 가진 환자들 내에서 생길 수 있다. 과다민감성 면역 체계가 관여하는 이러한 병태들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 천식, 알레르기성 비염, 습진 (eczema) 및 알레르기성 과민증 (allergic anaphylaxis)과 같은 알레르기성 반응들을 포함한다.
용어 "과다증식성 세포"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 대부분의 세포들과 비교 시 자연적으로 더 높은 속도로 증식하지만 건강한 세포인 세포를 말하는 것이 아니다. 일생을 통하여 일정하게 분열하는 것으로 알려진 세포들의 예들로는 피부 세포들, 위창자관의 세포들, 혈액 세포들 및 골수 세포들이다. 그러나, 이러한 세포들이 그들의 건강한 상대방들보다 더 높은 속도로 증식할 때, 그들은 과다증식성이다.
"과다증식성 장애"는 상기에 정의된 바와 같은 과다증식성 세포들이 관여하는 임의의 장애일 수 있다. 과다증식성 장애들의 예들로는 암과 같은 신생물성 장애들, 건선성 관절염, 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환과 같은 위장 과다증식성 장애들, 건선을 포함하는 피부 장애들, 레이터 증후군 (Reiter's syndrome), 모공성 홍색비강진, 및 각질화 장애들의 과다증식성 변이체들을 포함한다.
암은 특정한 관심 있는 과다증식성 장애를 나타내고, 예컨대 고형 종양들 및 혈액학적 암들을 포함하는 모든 유형들의 암들이 포함된다. 대표적인 유형들의 암으로는 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 신장암, 담낭암, 간암, 두경부암, 편평세포 암종, 위창자암, 유방암, 전립선암, 고환암, 폐암, 비-소세포 폐암, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 백혈병 (급성 림프세포성 백혈병, 만성 림프세포성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 및 만성 골수성 백혈병과 같음), 뇌암 (예를 들어, 별아교세포종, 교모세포종, 속질모세포종), 신경모세포종, 육종들, 결장암, 직장암, 위암, 항문암, 방광암, 자궁내막암, 형질세포종, 림프종, 망막모세포종, 윌름 종양, 유잉 육종, 흑색종 및 기타 피부암들을 포함한다. 간암은 담관암종, 간모세포종, 혈관육종, 또는 간세포성 암종 (HCC)을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. HCC가 특히 흥미롭다.
바람직하게, 종양 발생 및/또는 성장이 저해된다. 바람직한 구현예에서, 고형 종양들이 치료된다. 또 다른 구현예에서, 전이가 예방된다.
"세포 증식의 저해" 또는 "감소된 증식"에 의해서 증식은 감소되거나 다같이 정지되는 것을 의미한다. 따라서,"증식을 감소시키는 것"은 "증식을 저해하는 것"의 한 가지 구현예이다. 세포의 증식은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드들로의 치료 이전에 상기 세포의 증식과 대비하거나 동등하고 미치료된 세포의 증식과 대비하여 본 발명의 올리고뉴클레오타이드들의 존재 시 20%, 30% 또는 40% 이상, 또는 바람직하게 45, 50, 55, 60, 65, 70 또는 75% 이상, 보다 더 바람직하게는 80, 90 또는 95% 이상 감소된다. 세포 증식이 과다증식성 세포들에서 저해되는 구현예들에서, "동등한" 세포도 역시 과다증식성 세포이다. 바람직한 구현예들에서, 증식은 동등하고 건강한 (비-과다증식성) 세포의 증식 속도와 비교가능한 속도로 감소된다. 대안적으로 보면, "세포 증식을 저해하는 것"의 바람직한 구현예는 과다증식의 저해, 또는 정상적인 건강한 수준의 증식에 도달하도록 세포 증식을 조정하는 것이다.
당업자라면 과다증식성 세포를 확인하는 방법을 전적으로 인식하고 있다. 동물 내의 과다증식성 세포들의 존재는 X-선들, MRI 또는 CT 스캔들과 같은 스캔들을 사용하여 확인가능할 수 있다. 또한 MTT, XTT, MTS 또는 WST-1 검정법들과 같은 세포 증식 검정법들을 사용하여 시료를 시험관내 배양하는 것을 통하여, 과다증식성 세포는 확인될 수 있거나, 세포들의 증식이 검정될 수 있다. 시험관내 세포 증식은 유동 세포측정법을 사용하여 역시 결정될 수 있다.
상기에 나열된 세포 증식 검정법들은 모두 동일한 원리에 의해 작용한다: 안정한 테트라졸리움 염이 절단되어 주로 세포 표면에서 일어나는 복합 세포성 기작에 의해 용해성 포르마잔을 형성한다. 이러한 생물환원 (bioreduction)은 생존 세포들에서 NAD(P)H의 당분해성 생산에 많이 의존한다. 따라서, 직접 형성된 포르마잔 염료의 양은 배양액에서 대사적으로 활성을 가진 세포들의 수와 상관된다. 조직 배양 플레이트에서 성장된 세포들은 약 0.5 내지 4시간 동안 시약과 배양된다. 이러한 배양 기간 이후에, 형성된 포르마잔 염료는 다중-웰 광학분석기 (엘라이자 리더)를 스캔하여 정량된다. 측정된 흡광도는 생존 세포들의 수와 직접적으로 상관된다.
종양 발생 또는 성장은 외부 측정기 (caliper)를 사용한 종양 크기의 측정, 예컨대 타원형 공식, 컴퓨터화 단층촬영법 (CT), 마이크로 CT, 양성자 방출 단층촬영법 (PET), 마이크로 PET, 자기 공명 영상화 (MRI), 면역조직화학법 및/또는 생물발광 영상화 (BLI) 또는 형광 영상화 (FLI)와 같은 광학적 영상화의 사용에 의한 종양 부피의 계산과 같은 하나 이상의 기지의 기법들을 사용하여 검정될 수 있다. 동물 연구들에서, 일단 동물이 희생되었던 경우라면 종양 부피는 물 대체 부피를 측정하여 결정될 수 있고 종양 무게는 측정기를 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 방법은 바람직하게 종양 부피를, 바람직하게 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90% 이상 감소시킨다. 바람직하게, 하나 이상의 새로운 종양들은 저해되고, 예컨대 본 발명에 따라 치료된 대상은 더 적고/거나 더 작은 종양들을 발생시킨다. "더 적은 종양들"에 의하여 그는 설정 기간 동안 동등한 대상보다 더 작은 수의 종양들을 발생시키는 것을 의미한다. 바람직하게, 그는 동등한 대조군 (미치료된) 대상보다 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상 더 적은 종양들을 발생시킨다. "더 작은" 종양들에 의하여 종양들은 동등한 대상의 종양들보다 무게 및/또는 부피에서 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90% 이상 더 작은 것을 의미한다.
설정 기간은 임의의 적합한 기간, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개월 또는 년들일 수 있다.
바람직하게, 암의 발병은 예방되거나 지연된다. 이것은 동등한 대조군 (미치료된) 대상을 참조하여 평가될 수 있다.
"동등한 대상"은 예컨대 유사한 연령, 성별 및 간 건강 또는 암 단계와 같은 건강의 대상, 또는 본 발명에 따른 치료 이전의 동일한 대상일 수 있다. 동등한 대상은 그가 본 발명에 따른 saRNA로의 치료를 받지 않은 점에서 "미치료"된다. 그러나, 본 발명의 saRNA로 치료된 대상이 동일하거나 동등한 통상적인 항암 치료를 받은 경우 그는 통상적인 항암 치료를 받을 수 있다.
알부민 발현은 당업자라면 잘 인식하고 있을 잘-확립된 기법들의 사용을 통하여 검정될 수 있다. 알부민을 코딩하는 메신저 RNA의 상향조절은 역전사효소 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR), 바람직하게 절반-정량적인 또는 정량적인 PCR (qRT-PCR)을 사용하여 결정될 수 있다. 본 방법은 정량적 분석을 위한 혼성화 리포터 탐침의 존재 시 실시간 증폭 회로들을 수행하기 이전에 분리된 mRNA를 cDNA로 역전사하는 것이 관여한다. 일부민 mRNA 발현은 또한 노던 블럿 분석을 사용하여 결정될 수 있다.
알부민 단백질 생산의 상향조절은 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA)을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 엘라이자는 어세이맥스(AssayMax) 알부민 ELISA 키트와 같은 샌드위치 엘라이자일 수 있다. 여기에서, 시료는 알부민에 특이적인 항체로 전-코팅되었던 마이크로플레이트에 적용된다. 임의의 비-알부민 단백질을 제거하는 세척 이후에, 남은 알부민은 또 다른 특이적 항체를 사용하여 샌드위치화 된다. 여분의 항체는 검출가능한 표지를 가지는 이차 항체가 적용되기 이전에 세척된다. 단백질 발현은 웨스턴 블럿 분석법 또는 단백질 질량 분광분석법를 사용하여 역시 결정될 수 있다.
"알부민 발현을 상향조절하는 것"에 의하여, 알부민 단백질의 발현은 saRNA 올리고뉴클레오타이드의 부재 시 알부민의 발현과 대비하여 본 발명의 saRNA 올리고뉴클레오타이드의 존재 시 20, 30, 40% 이상, 더욱 바람직하게는 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75% 이상, 보다 더 바람직하게는 80% 이상 증가된다. 또한 바람직한 구현예에서, 알부민 단백질의 발현은 saRNA 올리고뉴클레오타이드의 부재 시 알부민의 발현과 대비하여 본 발명의 saRNA 올리고뉴클레오타이드의 존재 시 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 팩터, 더욱 바람직하게는 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 이상의 팩터, 보다 더 바람직하게는 60, 70, 80, 90, 100 이상의 팩터만큼 증가된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상향조절은 혈청 알부민 단백질의 합성 및 그의 활성 형태로의 프로세싱 둘 다와 관련될 수 있다.
알부민 생산의 상향조절은 본 발명의 saRNA들로의 치료 이전에 테스트 세포에 의한 알부민 발현을 참조하여, 또는 동등한 미치료된 세포 (대조군)에 의한 알부민 발현을 참조하여 검정될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 방법들은 또한 알부민의 분비, 더욱 바람직하게는 알부민의 증가된 분비를 유도한다. 바람직하게, 세포내 알부민 수준들 및/또는 알부민의 혈청 수준들은 증가된다.
일정 구현예들에서, 본 발명의 방법들은 CEBPA 및/또는 HNF4A의 발현의 상향조절을 유도하지만, 다른 구현예들에서, 본 발명의 방법들은 CEBPA 및/또는 HNF4A의 하향조절을 유도한다.
일정 구현예들에서, 본 발명의 방법들은 α 태아단백질 및/또는 간세포 성장인자를 유도한다.
일정 구현예들에서, 본 명세서에서 개시된 방법들은 대상에게 saRNA의 투여 이전 및/또는 이후에 세포 증식을 검정하고/하거나 알부민 생산을 검정하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 방법들은 알부민 발현이 증가되고/거나 과다증식성 세포들, 예컨대 암 세포들의 증식이 본 발명에 따른 치료의 결과로서 감소되는 것을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
저알부민혈증은 혈액 혈청 내의 알부민이 불충분하거나 비정상적으로 낮은 병태이다. 저알부민혈증을 유발하는 병태들 및 저알부민혈증의 원인이 되는 병태들을 포함하는 저알부민혈증을 특징으로 하는 많은 병태들이 존재한다. 이러한 병태들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 B형 및 C형 간염과 같은 간 질환들, 간의 바이러스성 감염들, 지방간, 간경변 또는 알코올성 간염과 같은 알코올성 간 질환, 콩팥 증후군과 같은 과다 수준의 알부민을 배출되도록 초래하는 병태들, 메네트리에 (Menetrier) 질환, 혈장 소실을 통해 알부민을 상실하는 화상 환자들과 같은 장들을 통해 알부민의 소실을 초래하는 병태들, 그리고 부종과 같은 알부민의 재분포를 초래하는 병태들을 포함한다. 이러한 병태들은 본 발명의 saRNA 올리고뉴클레오타이드들에 의해 제공될 수 있는, 알부민의 증가된 수준들로부터 유익을 얻을 수 있다.
알부민의 불충분한 수준은 해당 동물에게 건강한 것으로 고려되는 수준들을 벗어나는 알부민의 수준으로 정의된다. 예를 들어, 인간들에서 알부민의 불충분한 수준은 38 g/L 또는 35 g/L 미만, 또는 심지어 32 또는 30 g/L 미만의 수준으로서 고려될 것이다.
따라서 간 질환 또는 약한 간 기능은 전형적으로 저알부민혈증을 특징으로 하고, 이에 따라 간 기능을 평가하는 것은 대상이 본 발명에 의해 제공되는 치료법으로부터 유익을 얻을 수 있는지 여부를 결정하는 데 유용할 수 있다. 간 기능 평가들은 특정한 치료의 성공을 결정하는 유용한 방식도 역시 제공할 수 있다.
본 발명의 치료들로부터 유익을 얻을 수 있는 병든 간을 진단하거나, 특정한 치료의 성공을 결정하는 데 사용될 수 있는 방법들은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 간 기능 테스트들은 동물로부터 획득된 혈액 시료를 분석하는 것을 통하여 수행될 수 있다. 이러한 간 기능 테스트들에서 정량될 단백질들은 빌리루빈, 아스파테이트 아미노전이효소 (AST), 알라닌 아미노전이효소 (ALT), 알칼라인 포스파타제 (ALP), 감마 글루타밀 트랜스펩티다제 (GGT), 전체 단백질 및 글로불린 단백질, 뿐만 아니라 혈청 알부민을 포함할 수 있다. 이들 단백질들은 "간 기능 마커들" 또는 "간 건강 마커들"이라고도 말할 수 있다. 인간들에서 상기 단백질의 건강한 범위들을 보여주는 도표는 하기와 같다.
Figure 112019108283309-pat00001
많은 상기 단백질들은 질환의 간-특이적 지시인자들이 아니다. 그러나, 올라간 GGT 단독은 보통 일정 형태의 간 질환을 가리킨다. 일정의 단백질 수준들이 조합으로 분석될 때, 그들은 특이적 간 질환들을 결정하는 정확한 수단일 수 있다. 예를 들어, 올라간 GGT, ALT의 감소 및 ALP의 감소는 조합으로 알코올성 간 질환 또는 지방간 질환의 지시일 수 있다. 올라간 GGT, 올라간 ALT 및 ALP의 감소는 조합으로 간염의 지시일 수 있지만, 지방간 질환의 지시일 수도 역시 있다.
일정 구현예들에서, 본 발명의 방법들은 간 질환을 진단하고/거나 대상이 본 발명의 saRNA 또는 세포로부터 유익을 얻을 수 있는 점을 진단하는 단계를 포함한다. 상기 단계는 이들 간 기능 테스트들의 하나 이상을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 방법들은 본 발명의 saRNA 또는 세포의 투여 이후에 간 기능을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 치료 이후에 상기 간 기능 마커들의 하나 이상의 개선이 결정된다.
예를 들어, 빌리루민, AST, ALT, ALP 및 GGT중 1개 이상은 1, 2, 3, 4 또는 5배 감소, 또는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90% 이상 증가를 나타낼 수 있다. 바람직하게, 이들 마커들의 적어도 2, 3, 4개 또는 모두는 이러한 감소를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 방법들은 바람직하게 20, 15, 10 또는 5 μmol/L 이하의 혈액 빌리루빈 농도; 45, 40, 30, 25, 20, 15, 10 또는 5 U/L 이하의 혈액 AST 농도; 45, 40, 30, 25, 20, 15, 10 또는 5 U/L 이하의 혈액 ALT 농도; 45, 40, 30, 25, 20, 15, 10 또는 5 U/L 이하의 혈액 GGT 농도; 및/또는 120, 100, 80, 70, 60, 50 또는 40 U/L 이하의 혈액 ALP 농도를 유도하지만, 바람직하게 30 U/L 이하이다.
본 발명의 방법들은 바람직하게 32, 34, 35, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 g/L 이상, 예컨대 38 내지 55, 40 내지 55, 42 내지 55, 45 내지 55 g/L의 혈액 알부민 농도를 유도한다.
본 발명에 따른 효과적인 치료들은 과다증식성 세포들 또는 저알부민혈증이 관여하는 경우라면 치료되고 있는 질환이 치유되는 것을 의미할 수 있다. 그러나, 효과적인 "치료"는 일시적 또는 영구적일 수 있는, 환자에게 유익이 되는 임의의 성과를 포괄한다. 치료는 내재된 병태에 영향을 줄 수 있고/거나, 이것은 증상들에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 순수한 증상적 완화도 역시 참작된다.
본 발명에 따른 예방은 본 발명의 saRNA 올리고뉴클레오타이드들 또는 세포들의 예방적 투여가 과다증식성 세포들 또는 알부민의 불충분한 수준을 특징으로 하는 병태를 예방하거나, 이의 위험성을 감소시키거나 발병을 지연하는 것을 의미한다. 이러한 예방적 투여는 과다증식성 세포들 또는 저알부민혈증을 특징으로 하는 병태를 발생시킬 위험성이 있는 환자들에게 사용될 수 있다. 예방적 투여는 환자의 일생 동안 효과적일 수 있다. 그러나, 예방적 투여도 역시 환자의 일생 동안, 또는 환자를 위험하게 하는 병태가 완화될 수 있을 때까지 반복되는 것이 필요할 수 있다.
본 발명의 방법들에서, 세포들은 본 발명의 짧은 RNA 분자와 접촉된다. 세포들은 시험관내, 예컨대 확립된 세포주 또는 대상으로부터 이전에 획득되었던 시료일 수 있거나, 그들은 대상에서 생체내일 수 있다. 짧은 RNA 분자들은 이러한 짧은 RNA들과 결합하는 임의의 적합한 전달 시약들을 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 세포들로 투여될 수 있다. 이러한 적합한 전달 시약들로는 마이러스 트랜지트 TKO 친지질성 (Mirus Transit TKO lipophilic) 시약; 리포펙틴 (lipofectin); 리포펙타민 (lipofectamine); 셀펙틴 (cellfectin); 또는 다중양이온들 (예를 들어, 폴리라이신), 바이러스-기초 입자들, 전기천공 덴드리머 (electroporation dendrimer)들 또는 리포좀들을 포함한다. 바람직한 전달 시약은 리포좀이다. 리포좀들을 제조하는 다양한 방법들이 알려져 있다.
또 다른 바람직한 전달 시약은 덴드리머 (dendrimer)이다. 덴드리머들은 문헌[Singha et al. (2011), Nucleic Acid Ther. 21:133]에 기술되어 있고, 그의 개시 전부가 본 명세서에서 참고문헌으로 통합된다. 덴드리머들은 규칙적이고 매우 분지된 거대분자들이다. 바람직하게, 덴드리머는 PAMAM 덴드리머들과 같은 다중양이온성 덴드리머이다. 이론에 얽매이려고 하지 않더라도, PAMAM 덴드리머들은 핵산 결합을 용이하게 하는 일차 아민기들을 그들의 표면 상에 보유하고, 핵산의 방출을 증진하는 삼차 아미노기들을 세포질에 포함한다.
세포들을 saRNA들과 접촉시키는 단계는 "형질감염 (transfection)"이라고도 역시 말할 수 있다.
특히 바람직하게, 이러한 짧은 RNA들을 피막화하는 리포좀들은, 예를 들어 구조의 표면에 결합된 옵소닌화 (opsonization)-저해 분체들을 가지게 되어 단핵성 대식세포 및 망상내피성 시스템들에 의한 제거를 피하도록 변형된다. 한 가지 구현예에서, 본 발명의 리포좀은 옵소닌화-저해 분체들 및 리간드 둘 다를 포함할 수 있다.
짧은 RNA들을 발현할 수 있는 재조합 플라스미드들은 직접적으로 또는 마이러스 트랜지트 TKO 친지질성 시약; 리포펙틴; 리포펙타민; 셀펙틴; 또는 다중양이온들 (예를 들어, 폴리라이신), 또는 리포좀들을 포함하는 적합한 전달 시약과 결합하여 역시 투여될 수 있다. 짧은 RNA를 발현하는 재조합 바이러스성 벡터들 및 이러한 벡터들을 세포로 전달하는 방법들은 당해 기술분야 내에 알려져 있다.
바람직하게 상기 접촉 단계는 한 번 이상, 매일 또는 2, 4 또는 5일마다 수행될 수도 있더라도 바람직하게 3일마다 수행된다. 접촉 단계는 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15일 이상 동안 수행되고, 약 6 또는 9일은 바람직하다. 수주 또는 수개월의 기간 동안 규칙적인 간격들로의 접촉 단계도 역시 참작된다.
본 명세서에서 개시된 방법들에서, 하나 이상의 표적 유전자가 상향조절되는 경우라면, 서로 다른 표적 유전자들을 상향조절하는 데 사용된 짧은 RNA들이 서로 다른 빈도들로 서로 다른 길이들의 시간 동안 투여될 수 있다. 사용될 특정한 투여 요법들은 당업자에 의해 바로 결정되어 그의 원하는 목적, 특정한 시작 세포 유형 및 전달 방법을 맞출 수 있다. 예로서, 본 발명의 짧은 RNA 분자들의 피코몰라 농도들이 사용될 수 있다.
본 발명의 짧은 RNA는 단독으로 또는 고려되고 있는 특정한 방법에서 효과를 가지는 것으로 알려진 다른 활성 제제와 조합으로 제공될 수 있다. 다른 활성 제제는 본 발명의 짧은 RNA와 동시에 (simultaneously), 별도로 (separately) 또는 연속적으로 (sequentially) 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 단일한 짧은 RNA, 본 발명의 2개 이상의 짧은 RNA들 또는 상기 짧은 RNA 및 다른 활성 물질의 조합을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명의 방법들은 바람직하게 세포들 또는 동물, 더욱 바람직하게는 포유동물, 예컨대 마우스, 래트, 원숭이, 개, 소, 양, 선택적으로 세포 또는 대상이 비-인간이더라도 가장 바람직하게는 인간 상에서 수행된다. 세포 또는 대상은 배아일 수 있지만 바람직하게는 어른이다.
본 발명들의 방법들은 본 발명의 saRNA와 접촉된 세포들의 집단 내의 모든 세포들에서 알부민 생산의 상향조절을 달성할 수 없고, 따라서 이를 달성할 필요가 없는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명의 방법에 적용되는, 예컨대 본 발명의 saRNA와 접촉되는 세포들의 집단으로부터, 바람직하게는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90% 이상 더 많은 알부민을 생산하도록 유도될 수 있고, 일정 구현예들에서는 그럼에도 알부민 생산이 세포들의 95 또는 99% 이상에서 상향조절된다.
시험관내 및 생체내 방법들은 (i) 간세포와 같은 알부민을 자연적으로 생산하는 세포; (ii) 줄기세포와 같은 알부민을 자연적으로 생산하는 세포로 분화될 잠재력을 가지는 세포; 또는 (iii) 체세포 비-간 세포와 같은 알부민을 정상적으로 생산하지 않는 세포를 사용하여 수행될 수 있다. 간세포들 또는 줄기세포들이 바람직하다. 줄기세포는 전능성 (totipotent), 다능성 (pluripotent) 또는 다분화능성 (multipotent), 예컨대 조혈 줄기세포들 (HSC), 중간엽 줄기세포들 (MSC) 또는 유도된 다능성 줄기세포들일 수 있다.
국제특허출원 제WO2005/059113호는 특히 유리한 유형의 다능성 줄기세포를 개시하고 있다. 이러한 줄기세포는 골수 및/또는 혈액 예컨대 말초 혈액으로부터, 또는 제대 또는 태반으로부터 채취된 물질로부터 직접적으로 분리될 수 있고, 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포들로 분화되는 독특한 능력을 가진다. 이들 세포들은 따라서 전능성이 아닌 경우라면, 분명하게 다능성 또는 다분화능성이다. 따라서, 국제특허출원 제WO2005/059113호에서 기술된 줄기세포들은 자가유래 (자가-대-자가) 방식으로 사용될 수 있는 조직 이식을 위한 세포들의 유용한 출처를 제공한다.
국제특허출원 제WO2005/059113호에서 개시된 세포들은 당해 기술분야에서 "전능세포 (OmniCyte)"로서 알려져 있다. 국제특허출원 제WO2005/059113호의 제안들은 그들의 전부가 본 명세서에서 참고문헌으로 통합된다. 전능세포들은 CD34+이고, 자가재생을 할 수 있고, 조혈 세포들을 포함하는 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포들로 분화할 수 있는 줄기세포들이다. 상기에 언급된 바와 같이, 그들은 골수 및/또는 혈액으로부터 직접적으로 분리될 수 있다. 또한 그들은 배양 과정 동안 플라스틱 (예컨대 표준 조직 배양 용기들의 플라스틱)과 부착하는 그들의 능력을 특징으로 한다. 적합한 용기들은 미국 뉴욕 코닝사에 의해 제조된 것들이다.
전능세포들은 또한 그들이 줄기세포들의 성장을 지지하는 공급 (feeder) 층들, 예컨대 (전형적으로 그들 자신의 심화 성장 또는 분열이 없이 중요한 대사물들을 공급하고 감마선 조사에 의해 불활성화된) 세포들을 요구하지 않는 점을 특징으로 할 수 있다.
전능세포들은 또한:
a) CD34+ 세포들을 위한 조직 또는 혈액 시료의 농축강화;
b) 시료를 고형 지지체와 접촉시키고 상기 고형 지지체와 부착하는 세포들을 수확하는 단계:
에 의해 수득가능한 것으로서 특징 분석될 수 있다.
적합한 조직 또는 혈액 시료들로는 골수, 말초 혈액, 제대 혈액 또는 조직, 태반 및 지방 흡입으로부터 획득된 시료들을 포함한다.
보다 상세하게, 그들은
조직 또는 혈액 시료 (바람직하게는 혈액 또는 골수 시료와 같은 조혈 조직)를 밀도 구배 분리로 시행하고;
낮은 밀도 세포들을 CD34에 대한 친화 리간드에 (바람직하게 상자성 비드들과 부착됨)에 노출시키고;
상기 CD34 리간드와 부착된 세포들을 회수하고;
CD34+ 소집단을 조직 배양 등급 플라스틱에 노출시키고;
플라스틱과 부착된 CD34+ 세포들을 회수하는
단계들에 의해 수득가능하다.
전능세포들은 바람직하게 어른이고, 이에 따라 비-태아이다.
전능세포들의 시료는 2004년 9월 24일자로 영국 에스피4 0제이쥐 살리스베리 포튼 다운에 있는 ECACC로 기탁번호 제04092401호 하에 기탁되었다. 기탁물은 마이어틀 고든 (Myrtle Gordon) 교수(영국 버크셔 알쥐42 5큐에이치 빈필드 스핀잉 휠 레인 윌로우 트리 카티지)에 의해 제조되었으며, 세포주에는 "줄기세포 전능세포 (Stem Cell OmniCyte)"라는 명칭이 주어졌다. 2012년 6월 14일에 마이어틀 고든 교수는 미나 테라퓨틱사 (Mina Therapeutics Limited)에게 임의의 및 모든 특허 출원들에서 기탁된 생물학적 물질을 다룰 권한을 주었고, 그녀는 규칙 33 EPC에 따라 일반인에게 입수가능한 기탁된 물질에 대한 확정되고 변경할 수 없는 동의를 주었다.
실시예들에서 시행된 바와 같이, 본 발명의 방법들은 알부민을 생산하는 세포들의 생성을 허용한다. 보다 상세하게, 그들은 미처리된 그들의 상대방들보다 더 많은 알부민을 생산하고, 이에 따라 그들은 알부민을 과다생산하거나 전형적으로 알부민을 생산하지 않지만 알부민을 생산하도록 유도되었던 세포들이다. 따라서, 심화 관점에서 알부민을 생산하거나 과다생산하는 세포가 제공된다. 세포는 본 명세서에서 개시된 방법들에 의해 수득가능하다. 바람직하게, 세포는 알부민을 생산하도록 전능세포와 같은 CD43+ 줄기세포를 유도하여 획득된다.
세포는 바람직하게 생체외이고, 예컨대 살아있는 유기체의 일부가 아니다. 선택적으로, 세포는 "시험관내" 또는 "분리된"이라고 말할 수 있다.
치료법에서 이러한 세포들의 사용들은 본 발명의 심화 관점을 나타낸다. 선택적으로, 본 발명의 세포들 및 본 발명의 saRNA는 본 명세서에서 개시된 치료법적 적용들과 조합으로 사용될 수 있다. "조합으로"는 별도의, 동시적 또는 연속적 투여를 포함한다.
대안적으로 보면, 본 발명은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 치료적 유효량의 알부민-생산 세포 및/또는 치료적 유효량의 saRNA를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다.
saRNA들은 표적 전사체에 상보적이 되도록 설계될 수 있고, 그들은 표적 안티센스 RNA 전사체를 하향조절하여 알부민 생산에 미치는 그들을 효과를 낼 수 있다.
표적 RNA 전사체는 바람직하게 표적 유전자의 전사 개시 부위 상류의 100, 80, 60, 40, 20 또는 10 kb 이하의 좌위, 또는 표적 유전자의 전사 종결 부위 하류의 100, 80, 60, 40, 20 또는 10 kb 이하의 좌위로부터 전사된다. 선택적으로, RNA 전사체들은 표적 유전자의 전사 개시 부위 상류의 1 kb 이하의 좌위, 또는 표적 유전자의 전사 종결 부위 하류의 1 kb 이하의 좌위로부터 전사된다. 선택적으로, RNA 전사체들은 표적 유전자의 전사 개시 부위 상류의 500, 250 또는 100개 이하의 뉴클레오타이드들의 좌위, 또는 표적 유전자의 전사 종결 부위 하류의 500, 250 또는 100개 이하의 뉴클레오타이드들의 좌위로부터 전사되고, 더욱 바람직하게 좌위는 표적 유전자의 전사 개시 부위의 상류 또는 하류로부터 500개 뉴클레오타이드 이하이다. 가장 바람직하게 표적 RNA 전사체는 표적 유전자의 전사 개시 부위의 상류의 500개 뉴클레오타이드들까지 또는 하류의 500개 뉴클레오타이드들까지의 좌위로부터 전사된다.
본 발명의 표적 RNA 전사체들의 맥락에서 용어 "[특정한 좌위]로부터 전사된다"는 "[특정한 좌위에서] 표적 RNA 전사체의 전사 개시 부위가 발견된다"를 의미한다. 바람직하게 표적 RNA 전사체의 전사 개시 부위 및 전사 종결 부위 둘 다는 별도로, 표적 유전자의 전사 개시 부위의 상류의 100 kb 이하 또는 표적 유전자의 전사 종결 부위의 하류의 100 kb 이하의 둘 중 하나에 위치된다. 표적 RNA 전사체가 전사되는 위치와 관련하여 상기에 기술된 바람직한 구현예들은 필요한 변경을 준용하여 (mutatis mutandis) 표적 유전자의 전사 종결 부위에 적용한다.
표적 RNA 전사체는 게놈 서열의 코딩 가닥과 상보적이고, 본 명세서에서 "게놈 서열"에 대한 임의의 언급은 "게놈 서열의 코딩 가닥"에 대한 약칭이다.
따라서, 표적 RNA 전사체들은 표적 유전자의 전사 개시 부위의 상류의 100, 80, 60, 40, 20 또는 10 kb 및 표적 유전자의 전사 종결 부위의 하류의 100, 80, 60, 40, 20 또는 10 kb 사이에 위치하는 게놈 서열에 안티센스인 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게, 표적 RNA 전사체들은 표적 유전자의 전사 개시 부위의 상류의 1 kb 및 표적 유전자의 전사 종결 부위의 하류의 1 kb 사이에 위치하는 게놈 서열에 안티센스인 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게, 표적 RNA 전사체들은 표적 유전자의 전사 개시 부위의 상류의 500, 250 또는 100개 뉴클레오타이드들 및 표적 유전자의 전사 종결 부위의 하류의 말단 500, 250 또는 100개 뉴클레오타이드들 사이에 위치하는 게놈 서열에 안티센스인 서열을 포함한다. 선택적으로, 표적 RNA 전사체는 표적 유전자의 코딩 영역을 포함하는 게놈 서열에 안티센스인 서열을 포함한다. 가장 바람직하게, 표적 전사체는 표적 유전자의 프로모터 부위와 중첩하는 게놈 서열에 안티센스인 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 표적 RNA 전사체는 바람직하게 프로모터 부위에 안티센스인 서열을 포함한다.
유전자들은 다수의 프로모터 부위들을 소유할 수 있고, 이 경우에 표적 RNA 전사체는 1개, 2개 이상의 프로모터 부위들과 중첩할 수 있다. 인용된 유전자 좌위의 온라인 데이타베이스는 유전자들의 프로모터 부위들을 확인하는 데 사용될 수 있다.
임의의 주어진 프로모터 부위의 경우, 프로모터 부위 전체가 중첩될 필요는 없고, 프로모터 부위 내의 소서열 (subsequence)이 표적 RNA 전사체에 의해 중첩되는 것으로 충분하고, 예컨대 중첩은 부분적 중첩일 수 있다. 유사하게, 전체 표적 RNA 전사체는 프로모터 부위 내의 서열에 안티센스일 필요는 없고, 표적 RNA 전사체가 단지 프로모터 부위에 안티센스인 서열을 포함하는 것이 필요하다.
표적 RNA 전사체 및 표적 유전자의 프로모터 부위 간의 중첩 부위는, 이것이 바람직하게 길이가 15개 이상의 뉴클레오타이드들, 더욱 바람직하게 25개 이상의 뉴클레오타이드들, 더욱 바람직하게 50개 이상의 뉴클레오타이드들, 더욱 바람직하게 75개 이상의 뉴클레오타이드들, 가장 바람직하게 100개 이상의 뉴클레오타이드들이 되더라도, 단일한 뉴클레오타이드 길이 정도로 짧아질 수 있다. 다음의 특이적 배열들의 각각은 용어 "중첩"의 범위 내에 속하도록 의도된다:
a) 표적 RNA 전사체 및 표적 유전자의 프로모터 부위는 길이가 일치하고 그들은 전체 길이들에 걸쳐서 중첩된다 (예를 들어, 그들은 상보적이다).
b) 표적 RNA 전사체는 표적 유전자의 프로모터 부위보다 더 짧고 표적 유전자의 프로모터 부위와 그의 전체 길이에 걸쳐서 중첩한다 (예를 들어, 이것은 표적 유전자의 프로모터 부위 내의 서열과 그의 전체 길이에 걸쳐서 상보적이다).
c) 표적 RNA 전사체는 표적 유전자의 프로모터 부위보다 더 길고 표적 유전자의 프로모터 부위는 이에 의해 전부 중첩되고, 예를 들어, 표적 유전자의 프로모터 부위는 그의 전체 길이에 걸쳐서 표적 RNA 전사체 내의 서열과 상보적이다).
d) 표적 RNA 전사체 및 표적 유전자의 프로모터 부위는 동일하거나 서로 다른 길이를 가지고 중첩 부위는 표적 RNA 전사체의 길이 및 표적 유전자의 프로모터 부위의 길이 둘 다보다 더 짧다.
"중첩"의 상기 정의는 본 명세서 전체를 통하여 다른 중첩하는 서열들의 기술에 필요한 변경을 준용하여 적용한다. 분명하게, 안티센스 RNA 전사체가 프로모터 부위가 아닌 표적 유전자의 부위와 중첩하는 것으로 기술된 경우라면, 전사체의 서열은 프로모터 부위 내가 아닌 해당 부위 내의 서열과 상보적이다.
바람직하게 RNA 전사체는 표적 유전자의 전사 개시 부위를 포함하는 게놈 서열에 안티센스인 서열을 포함한다. 다른 말로 하면, 바람직하게 표적 RNA 전사체는 표적 유전자의 전사 개시 부위와 중첩하는 서열을 포함한다.
표적 RNA 전사체는 바람직하게 1 kb 이상, 더욱 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 kb 이상, 예컨대 20, 25, 30, 35 또는 40 kb의 길이이다.
용어 "센스"는 본 발명의 맥락에서 핵산 서열을 기술하는 데 사용될 때 서열이 표적 유전자의 코딩 가닥 상의 서열과 동일성을 가지는 점을 의미한다. 용어 "안티센스"는 본 발명의 맥락에서 핵산 서열을 기술하는 데 사용될 때 서열이 표적 유전자의 코딩 가닥 상의 서열과 상보적인 점을 의미한다.
유전자의 "코딩 가닥 (coding strand)"은 유전자의 mRNA를 위한 코딩 서열을 포함하는 가닥을 이다. 유전자의 "주형 가닥 (template strand)"은 유전자의 mRNA를 위한 코딩 서열을 포함하지 않는 가닥이다.
바람직하게 표적 RNA 전사체는 표적 유전자의 코딩 가닥 상의 서열과 그의 전장을 따라 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상이 상보적인 서열을 포함한다.
본 발명은 이러한 표적 전사체들을 효과적으로 및 특이적으로 하향조절하는 saRNA 분자들을 제공한다. 이것은 표적 RNA 전사체 내의 서열과 높은 정도의 상보성을 가지는 saRNA 분자에 의해 달성될 수 있다. 짧은 RNA는 표적 RNA 전사체의 부위와 5개 이하, 바람직하게는 4개 또는 3개 이하, 더욱 바람직하게는 2개 이하, 보다 더 바람직하게는 1개 이하의 미스매치 (mismatch)를 가지고, 가장 바람직하게는 미스매치가 전혀 없을 것이다.
바람직하게, saRNA는 표적 전사체의 영역과 적어도 95, 98, 99 또는 100%의 상보성을 가지는 13개 이상의 뉴클레오타이드들의 서열을 포함한다. 바람직하게, 표적 전사체의 영역과 적어도 95, 98, 99 또는 100%의 상보성을 가지는 상기 서열은 길이가 적어도 15개 내지 20개, 예컨대 적어도 15, 16, 17, 18 또는 19개 뉴클레오타이드들, 바람직하게 18개 내지 22개 또는 19개 내지 21개, 가장 바람직하게는 정확하게 19개이다. 다른 곳에서 언급된 바와 같이, saRNA는 3' 미단 (tail)도 역시 포함할 수 있다.
한 가지 구현예에서, 본 발명의 짧은 RNA 분자들은 표적 전사체의 영역과 siRNA-유사 상보성을 가질 수 있고; 즉, saRNA 이중복합체 (duplex)에서 안내 가닥 (guide strand)의 5' 말단으로부터 뉴클레오타이드들 2개 내지 6개 및 표적 전사체의 영역 간의 100% 상보성을 가질 수 있다. 짧은 RNA의 다른 뉴클레오타이드들은 추가적으로 표적 전사체의 영역과 적어도 70, 80, 90, 95, 99 또는 100%의 상보성을 가질 수 있다. 예를 들어, 3' 말단까지의 7개 뉴클레오타이드들 (5' 말단으로부터 계산됨)은 표적 전사체의 영역과 적어도 70, 80, 90, 95, 99 또는 100%의 상보성을 가질 수 있다.
본 발명의 saRNA 분자들이 바람직하게 높은 정도의 상보성을 가지는 표적 RNA 전사체 내의 서열은 바람직하게 표적 유전자의 전사 개시 부위의 상류 또는 하류의 500개 뉴클레오타이드들까지인 게놈 서열에 안티센스이다. 바람직하게, 이것은 표적 유전자의 프로모터와 중첩한다.
당업자라면 saRNA가 알부민 생산을 상향조절하는 기작과는 상관없이, 표적 전사체를 참조하여 saRNA를 정의하는 것이 편리한 점을 이해하고 있다. 그러나, saRNA는 대안적으로 표적 유전자를 참조하여 정의될 수 있다. 표적 전사체는 표적 유전자의 코딩 가닥 상의 게놈 부위와 상보적이고, 다음 순서로 saRNA는 표적 전사체의 영역과 상보적이어서, saRNA는 표적 유전자의 코딩 가닥 상의 부위와 서열 동일성을 가지는 것으로서 정의될 수 있다. 표적 전사체를 참조한 saRNA의 정의의 측면에서 본 명세서에서 논의된 특징들 모두는 필요한 변경을 준용하여 표적 유전자를 참조한 saRNA의 정의에 적용하고, "표적 전사체"와의 "상보성"의 임의의 논의는 "게놈 서열"과의 "동일성"을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, saRNA는 바람직하게 표적 유전자의 전사 개시 부위를 둘러싸는 게놈 서열과 높은 동일성 백분율, 예컨대 75, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99, 바람직하게는 100% 동일성을 가진다. 게놈 서열이 TSS로부터 가질 수 있는 거리들이 상기에 논의된다. 게놈 서열은 TSS의 상류 또는 하류의 500개 뉴클레오타이드들까지인 것이 바람직하다. 가장 바람직하게, 이것은 표적 유전자의 프로모터와 중첩한다. 따라서, saRNA는 바람직하게 표적 유전자의 프로모터 부위와 중첩하는 서열과 서열 동일성을 가진다.
바람직하게 본 발명의 "짧은" RNA 분자들은 길이가 13개 뉴클레오타이드들부터 30개 뉴클레오타이드들까지, 바람직하게는 15개 또는 17개부터 30개 뉴클레오타이드들까지, 더욱 바람직하게는 길이가 16개 내지 25개의 뉴클레오타이드들, 보다 더 바람직하게는 길이가 17개 내지 21개의 뉴클레오타이드들, 가장 바람직하게는 길이가 19, 20, 21 또는 22개의 뉴클레오타이드들이다. 다른 말로 하면, 짧은 RNA 분자들은 상기에 논의된 길이의 첫 번째 가닥을 포함할 수 있다. 3' 미단이 존재하는 경우라면, 가닥은 더 길고, 바람직하게 3' 미단을 더한 19개 뉴클레오타이드들일 수 있다. 이는 바람직하게 UU 또는 UUU이다.
짧은 RNA 분자는 단일가닥 또는, 바람직하게 이중가닥일 수 있다. 이중가닥 분자들은 첫 번째 가닥 및 두 번째 가닥을 포함한다. 이중가닥이라면, 바람직하게 이중복합체의 각각의 가닥은 길이가 14개 이상, 더욱 바람직하게는 길이가 18개 이상, 예컨대 19, 20, 21 또는 22개의 뉴클레오타이드들이다. 바람직하게 이중복합체는 12개 이상, 더욱 바람직하게는 15개 이상, 더욱 바람직하게는 17개, 보다 더 바람직하게는 19개 이상의 뉴클레오타이드들의 길이에 걸쳐서 혼성화된다. 각각의 가닥은 길이가 정확하게 19개 뉴클레오타이드들일 수 있다. 3' 미단이 존재하는 경우라면, 가닥은 더 길고, 바람직하게 3' 미단을 더한 19개 뉴클레오타이드들일 수 있고, 이는 바람직하게 UU 또는 UUU이다.
바람직하게 이중복합체 길이는 30개 뉴클레오타이드들 이하이고, 이는 이러한 길이를 초과하는 이중복합체들이 인터페론 반응을 유도하는 증가된 위험성을 가질 수 있기 때문이다. dsRNA 이중복합체를 형성하는 가닥들은 동등한 또는 비동등한 길이들을 가질 수 있다.
가장 바람직하게 짧은 RNA 분자들은 짧은 간섭화 RNA (siRNA) 분자이다.
선택적으로 짧은 RNA 분자들은 3' 초과 부분들을 형성하는 각각의 가닥의 3' 말단에서 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드들 다수와 다같이 안정하게 쌍을 형성한 2개의 가닥들로 구성되는 dsRNA이다. 각각의 가닥의 3' 초과 부분을 형성하는 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드들의 수는 바람직하게는 1개 내지 5개의 뉴클레오타이드들, 더욱 바람직하게는 1개 내지 3개의 뉴클레오타이드들의 범위, 가장 바람직하게는 2개의 뉴클레오타이드들이다. 3' 초과 부분은 상기에 언급된 3' 미단으로 형성될 수 있고, 이에 따라 3' 미단은 3' 초과 부분일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 서열 상보성 또는 동일성에 대한 모든 참조들은 달리 특정하게 진술되지 않는 경우라면 짧은 RNA 분자들의 전장을 말한다.
짧은 RNA는 표적 RNA 전사체와 상보적이지 않은 매우 짧은 3' 또는 5' 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게, 이러한 서열은 3'이다. 상기 서열은 길이가 1 내지 5개, 바람직하게 2개 내지 3개, 예컨대 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드들일 수 있다. 이러한 비-상보적 서열은 "미단 (tail)"이라고 말할 수 있다. 따라서, 짧은 RNA는 바람직하게 (i) 표적 RNA의 부위와 95% 이상의 상보성을 가지는 서열; 및 (ii) 바람직하게 우라실 잔기들을 포함하거나 이들로 구성되는 1 내지 5개 뉴클레오타이드들의 3' 미단으로 구성된다. 짧은 RNA는 따라서 전형적으로, 존재하는 경우 3' 미단을 제외하고 그의 전장에 걸쳐서 표적 RNA 전사체의 부위와 상보성을 가질 것이다. 상기에 언급된 바와 같이, "표적 RNA 전사체와 상보적인" 대신에 saRNA가 적절한 게놈 서열의 코딩 가닥과 "동일성"을 가지는 것으로서 정의될 수 있다.
본 발명의 적합한 saRNA들의 바람직한 서열들은 표 2에서 제공된다. 따라서 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 및 36으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 구성되는 첫 번째 가닥을 가지는 짧은 RNA가 제공된다. 선택적으로, 짧은 RNA는 임의의 이들 서열들의 3' 말단에서 3' 미단을 포함할 수 있다.
Figure 112019108283309-pat00002
Figure 112019108283309-pat00003
단일가닥 짧은 RNA 분자들은 단지 첫 번째 가닥으로 구성되는 한편, 이중가닥 짧은 RNA 분자들은 두 번째 가닥도 역시 가진다. 짧은 RNA 분자들은 따라서 서열번호 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 및 35로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 구성되는 두 번째 가닥을 가질 수 있다.
서열번호 14의 서열을 가지는 첫 번째 가닥 및 서열번호 13의 서열을 가지는 두 번째 가닥을 가지는 짧은 RNA는 암을 치료하는 데 특히 효과적인 것으로 확인되었고, 이에 따라 이것이 특히 바람직하다.
표 2는 바람직한 쌍 형성들을 가리키고, 각각의 열은 바람직한 쌍 형성을 나타낸다. 따라서, 예를 들어 짧은 RNA은 바람직하게 서열번호 14의 서열을 포함하거나 이로 구성되는 선택적으로 3' 미단을 가진 첫 번째 가닥 및 서열번호 13의 서열을 포함하거나 이로 구성되는 선택적으로 3' 미단을 가진 두 번째 가닥을 가진다.
본 명세서에서 개시된 임의의 짧은 RNA 서열들은 이러한 3' 미단을 선택적으로 포함할 수 있다. 따라서, 표들에서 개시된 임의의 서열들은 이러한 3' 미단을 선택적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "RNA"는 하나 이상의 리보뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. "리보뉴클레오타이드"에 의하여 베타-D-리보-퓨라노스 분체의 2' 위치에서 하이드록실기를 가진 뉴클레오타이드를 의미한다. 용어들은 이중가닥 RNA, 단일가닥 RNA, 부분적으로 정제된 RNA와 같은 분리된 RNA, 필수적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합으로 생산된 RNA, 뿐만 아니라 하나 이상의 뉴클레오타이드들의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연적으로 생기는 RNA와 서로 달라지는 변경된 RNA를 포함한다. 이러한 변경들은 RNA의 말단으로 또는 내부적으로 예를 들어 RNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드들에서와 같은 비-뉴클레오타이드 물질의 첨가를 포함할 수 있다. 본 발명의 RNA 분자들에서 뉴클레오타이드들은 비-자연적으로 생기는 뉴클레오타이드들 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오타이드들 또는 데옥시뉴클레오타이드들과 같은 비-표준 뉴클레오타이드들도 역시 포함할 수 있다. 이들 변경된 RNA들은 유사체들 또는 자연적으로-생기는 RNA의 유사체들이라고 말할 수 있다.
용어 "이중가닥 RNA" 또는 "dsRNA"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 리보핵산 이중복합체라고 말한다.
용어 "짧은 간섭화 RNA" 또는 "siRNA"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 하나 이상의 표적 RNA 전사체의 서열-특이적 매개된 절단에 의해 RNAi를 통하여 유전자 발현을 조정할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 전형적으로 RNAi에서 RNA 전사체는 mRNA이고 이에 따라 이러한 표적의 절단은 유전자 발현의 하향조절을 유도한다. 그러나 본 발명에서, 표적 유전자의 상향조절 또는 하향조절은 관심 있는 표적 유전자에 각각 안티센스 또는 센스인 RNA 전사체들의 절단에 의해 달성될 수 있다.
"상보성" 및 "상보적"에 의하여, 첫 번째 핵산은 두 번째 핵산과 예를 들어 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 수소 결합을 형성할 수 있다. 상보성 백분율은 두 번째 핵산 서열과 수소 결합들을 형성할 수 있는 (예를 들어, 왓슨-크릭 염기쌍 형성) 핵산 분자에서 잔기들의 백분율을 가리킨다 (예를 들어, 10개 중의 5, 6, 7, 8, 9, 10개는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100% 상보적임).
"동일성", "동일한" 또는 "서열 동일성"에 의하여 첫 번째 핵산은 두 번째 핵산 서열과 서열에서 동일한 것을 의미한다. 동일성 백분율은 두 번째 핵산 서열과 동일한는 첫 번째 핵산 서열에서 잔기들의 백분율을 가리킨다 (예를 들어, 10개 중의 5, 6, 7, 8, 9, 10개는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100% 동일함).
서열 정렬들 및 동일성 백분율 또는 상보성 백분율 계산들은 이에 제한되는 것은 아니지만 라사르젠 (LASARGENE) 생물정보학 전산화 슈트의 메가얼라인 프로그램 (디엔에이스타사 (DNASTAR Inc.), 미국 위스콘신주 매디슨), 크러스탈 V 정렬 방법 (문헌[Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153]) 및 BLAST 2.0 프로그램들 슈트를 포함하는 당해 기술분야에서 알려진 임의의 방법 또는 도구를 사용하여 결정될 수 있다. BLAST 분석들을 수행하기 위한 소프트웨어는 공개적으로, 예컨대 국립 바이오테크놀로지 정보센터 (National Center for Biotechnology Information)를 통해 입수가능하다. 당업자라면 그의 원하는 목적에 적합하도록 이들 도구들의 매개변수들을 설정할 수 있을 것이다.
하나의 서열이 DNA 서열이고 다른 서열은 RNA 서열인 첫 번째 및 두 번째 핵산 서열의 동일성 또는 상보성을 평가할 때, RNA 서열들이 우라실을 포함하는 한편 DNA 서열은 대신에 티민을 포함할 것인 점을 고려해야 한다. 따라서, 이들 경우들에 서열 동일성을 평가할 때, 우라실 잔기는 티민 잔기와 동일한 것으로 고려되고, 상보성을 평가할 때 우라실 잔기는 아데닌 잔기와 상보적이고/수소 결합들을 형성할 수 있는 것으로 고려된다.
2개 이상의 서열들의 상보성 정도의 결정은 당해 기술분야에서 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게, 사용된 방법은 호스바흐 (Hossbach) 등의 상기 문헌에서 기술된 것이다. 본 방법에 따르면, 웹사이트[http://www.mpibpc.mpg.de/groups/luehrmann/siRNA]에서 접근가능한 펄 (Perl) 스크립트가 사용된다.
또한 짧은 RNA 분자들의 설계 및 분석을 위한 다양한 도구들은 잘 알려져 있고, 이는 당업자에게 표적 RNA 전사체의 효과적이고 특이적인 하향조절을 달성하는 이들 RNA 분자들을 결정하도록 허용한다. 확립된 방법들은, 예를 들어 쥐피부스트 (GPboost) 및 레이놀즈 알고리즘들 (PMID: 15201190, 14758366)을 포함한다. 또한, 표적 RNA의 효과적인 하향조절을 초래하는 짧은 RNA의 능력은 세포들에서 RNA 또는 단백질의 수준들을 측정하는 표준 기법들을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 짧은 RNA는 배양된 세포들로 전달될 수 있고, 표적 RNA의 수준들이 이에 제한되는 것은 아니지만 노던 블럿 또는 도트 블럿팅 기법들을 포함하는 기법들에 의해, 또는 정량적 RT-PCR에 의해 측정될 수 있다.
바람직하게 짧은 RNA들은 모티브들 aaaa, cccc, gggg, 또는 uuuu의 어느 것도 전혀 소유하지 않는다. 바람직하게 짧은 RNA들은 적어도 20% 및 75% 이하, 예컨대 20% 및 75% 사이, 바람직하게 20% 및 55% 사이 범위의 GC-백분율을 가진다. 상기 방법들의 짧은 RNA들은 이상적으로 열역학적으로 안정한 이중복합체들이고, 이 경우에 각각의 가닥의 GC 백분율은 적어도 25% 및 75% 이하, 예컨대 25% 내지 75%, 바람직하게 20% 내지 55%의 범위이다.
RNA들이 모티브들 aaaa, cccc, gggg 또는 uuuu를 소유하는지 여부를 결정하기 위한 및 분자들/가닥들의 GC 함량 백분율을 결정하기 위한 도구들 및 알고리즘들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 도구들은 문헌[Saetrom and Snove, (2004) Biochem Biophys Res Commun 321: 247-253] 및 문헌[Vert et al., (2006) BMC Bioinformatics 7: 520 (17페이지)]에서 기술되고 인용된 것들이다.
짧은 RNA들은 RISC 단백질 복합체 내로 도입되는 짧은 RNA 가닥과 제한된 수의 미스매치들을 가지는 비-표적 전사체들의 하향조절을 유도할 수 있다. 이것은 짧은 RNA 분자의 효율을 감소시키고 따라서 바람직하지 않다. 결론적으로, 짧은 RNA 분자들은 의도되지 않는 오프-표적 (off-target) 효과들을 방지하도록 의도된 표적이 아닌 전사체들과 제한된 상보성을 가져야 한다. 절단-기초 오프-표적 효과들을 가지는 짧은 RNA 후보의 가능성은 비-표적 RNA 서열들과 그의 상보성의 함수이고, 당해 기술분야에서 임의 기지의 방법에 의해 결정될 수 있다. 선택적으로, 간격이 없는 스미스-워터맨 방법 (문헌[TF Smith & MS Waterman (1981) Journal of molecular biology 147: 195-197])이 짧은 RNA의 잠재적인 오프-표적 전사체들을 확인하도록 앙상블 (Ensembl) (문헌[Flicek, P., et al. (2008) Ensembl 2008. Nucleic Acids Res 36: D 707-714]) 인간 트랜스크립톰 데이타베이스 (문헌[Snove, O., Jr., et al. (2004) Biochem Biophys Res Commun 325: 769-773])와 대비한 짧은 RNA 후보를 검색하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 짧은 RNA가 선택된 RNA 서열들의 집단, 예를 들어 진뱅크 (GenBank) 서열들의 선택에 대비하여 검색될 수 있고, 이는 앙상블 인간 트랜스크립톰 데이타베이스 전체를 포괄하지 않는다. 대안적으로 해밍 거리 측정 (Hamming distance measure)이 사용될 수 있다.
바람직하게, 짧은 RNA 분자들은 확인된 오프-표적 전사체들과 2개 이상의 미스매치들을 가진다. 대안적으로 보면, 바람직하게 짧은 RNA 분자들은 모든 잠재적인 오프-표적 전사체들과 2개 이상의 해밍 거리를 가진다. 짧은 RNA가 이중가닥인 경우라면, 바람직하게 둘 다의 가닥들은 이러한 요구를 만족시킨다.
선택적으로, 짧은 RNA 분자들은 기지의 매우 효과적인 표준 siRNA들과 공통적인 특징들을 가진다. 바람직하게, 짧은 RNA는, 또는 이중가닥인 경우라면 짧은 RNA의 하나 또는 둘 다의 가닥은 0.1 이상의 쥐피부스트 점수를 가진다. 쥐피부스트는 siRNA 효능의 기지의 유전적 프로그램화-기초 예측 시스템이고, siRNA 가닥들의 쥐피부스트 점수를 결정하는 데 사용된 방법들은 문헌["Predicting the efficacy of short oligonucleotides in antisense and RNAi experiments with boosted genetic programming", Pal Saetrom (2004) Bioinformatics 20(17): 3055-3063]에서 개시되어 있으며, 그의 내용은 본 명세서에서 참고문헌으로 통합된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 짧은 RNA 분자들은 매우 효과적인 siRNA들과 연관되는 특이적 서열 특징들을 소유한다. 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있는 레이놀즈의 문헌[Reynolds et al. (2004) Nature biotechnology 22(3): 326-330]에 의해 기술된 알고리즘은 짧은 RNA들이 충분한 이러한 유형의 특징들을 소유하는지 여부의 결정을 허용한다. 당업자라면 그의 특정한 목적을 위해 그의 한계점을 정의하고 개량할 수 있을 것이다.
선택적으로, 짧은 RNA 분자들은 매우 효과적인 siRNA들과 연관되는 양성자-특이적 서열 모티브들을 포함한다. siRNA 효능 예측 알고리즘들은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있고 매우-효과적인 siRNA들과 연관되는 모티브들은 문헌[Saetrom and Snove, (2004) Biochem Biophys Res Commun 321: 247-253]에서 논의되어 있고, 그의 내용은 본 명세서에서 참고문헌으로 통합된다.
바람직하게 짧은 RNA 분자는 세포의 RNAi 기구 내로 출입을 유도할 수 있거나 세포의 RNAi 기구 내로 출입 이전에 다이서에 의해 프로세싱될 수 있다. 짧은 RNA 분자는 세포의 RNAi 기구 내로 출입 이전에 다이서에 의해 프로세싱될 수 있는지 여부를 결정하는 방법들이 당해 기술분야에서, 예를 들어 문헌[Tiemann et al. (2010) RNA 16(6): 1275-1284] 및 문헌[Rose et al. (2005) Nucleic Acid Research 33(13): 4140-4156]에서 개시된 바와 같은 시험관내 다이서 검정법들이 잘 알려져 있다.
짧은 RNA 분자가 이중가닥인 경우 그리고 분자 내의 하나의 가닥만이 효과적으로 및 특이적으로 표적 RNA 전사체를 하향조절할 수 있는 경우라면, 바람직하게 해당 가닥은 RISC 내로 선호적으로 로딩된다. 하나의 가닥이 RISC 내로 선호적으로 로딩된 이중가닥 RNA 분자들의 설계는 당업자의 능력에 속한다. 예를 들어, 표적 RNA 전사체를 표적하는 짧은 RNA 분자의 가닥의 3' 말단은 다른 가닥의 5' 말단보다 열역학적으로 덜 안정하도록 제조되거나 선택될 수 있다. 바람직하게 이중복합체의 열역학적 말단 안정성에는 큰 차이가 존재하고, 표적 RNA 전사체를 표적하는 짧은 RNA 분자의 가닥의 5' 말단은 다른 가닥의 5' 말단보다 열역학적으로 덜 안정하다. 이중복합체의 열역학적 말단 안정성 (△△G)에서 차이의 절대적 수치는 당해 기술분야에서 표준인 임의의 방법에 따라 계산될 수 있다. 선택적으로, 이중복합체의 열역학적 말단 안정성에서 차이의 절대적 수치는 이중복합체의 말단에서 5개의 최종 뉴클레오타이드들을 고려하여 RNA 배수 (RNAfold)에 의해 계산된다 (문헌[Hofacker et al., (2003) Nucleic Acids Research Vol. 31, No. 13, pp 3429-3431]). 바람직하게 RNA 배수에 의해 계산된 바와 같이 이중복합체의 열역학적 말단 안정성에서 차이의 절대적 수치는 0 kcal/mol 이상, 더욱 바람직하게는 1 kcal/mol 이상, 더욱 바람직하게는 3 kcal/mol 이상이다.
상기에 기술된 것들과 같은 짧은 RNA 설계를 위한 많은 표준 도구들은 분자들의 이러한 성질을 평가하는 수단을 제공한다. 예를 들어, 이중가닥 분자들은 그들이 RNAi 기구 내로 다른 가닥을 넘어 하나의 가닥의 도입을 선호하는 열역학적 성질들을 가지는 경우라면 선택될 수 있다. 대안적으로, 하나의 가닥의 선호적인 로딩은 하나 이상의 뉴클레오타이드들이 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연적으로-생기는 RNA와 서로 달라지는 RNA를 포함하는 dsRNA들을 사용하여 달성될 수 있다.
세포에 존재하는 표적 RNA 전사체들을 결정하는 방법들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 관심 있는 유전자의 좌위 주변의 게놈 부위는 스프라이싱된 발현 서열 태그들에 대해 탐색될 수 있다. 발현된 서열 태그 또는 EST는 전사된 cDNA 서열의 짧은 소-서열이다. EST들의 공개 데이타베이스들은 당해 기술분야에서, 예를 들어 진뱅크 데이타베이스로 알려져 있다. 대안적으로, RNA를 확인하기 위한 잘 알려진 도구인 역전사효소 PCR (RT-PCR)이 잠재적인 표적 RNA 전사체를 확인하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 고 처리량 서열결정 또는 기타 이러한 방법들은 전체, 크기-분획된, 또는 기타 적합한 RNA들의 소집합들을 서열결정하는 데 사용될 수 있고, 관심 있는 부위로부터 기원하는 RNA 전사체들을 확인하는데 이러한 서열결정 라이브러리들을 사용한다. 대안적으로, 기지의 RNA 전사체들의 집단은 적합한 전사체들을 확인하도록 탐색될 수 있다. 당해 기술분야에서 알려진 임의의 RNA 전사체들의 데이타베이스, 예를 들어 캘리포니아 대학교 산타 크루즈 (UCSC)의 스프라이싱된 EST 트랙이 사용될 수 있다. 대안적으로 집단은 본 발명을 실행하는 당업자가 그 자신의 특정한 목적들을 위해 소유하는 집단으로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자가 특정한 세포 유형에서 발현되는 것으로 알려진 경우라면, 전사체들의 데이타베이스는 해당 세포 유형에서 존재하는 것으로 결정되었던 것들일 수 있다. 당업자는 그의 특정한 원하는 목적들을 위해 사용하도록 집단을 결정할 수 있을 것이다.
그러나, 본 발명의 목적을 위해 표적 유전자에 대해 안티센스인 임의의 RNA 전사체들의 양성 확인은 사실상 요구되지 않는다. 따라서, 상기 비-코딩 RNA 전사체 (예를 들어, 하향조절될 표적 전사체)의 존재는 결정될 필요가 없다. 본 발명자는 유전자의 전사 개시 부위를 둘러싸는 부위에 있는 유전자의 코딩 가닥의 뉴클레오타이드 서열이 획득되고, 예컨대 서열결정에 의해 결정되거나 데이타베이스 상에서 찾으며, 해당 부위와 역상보적인 RNA 서열이 결정된 경우라면, 해당 후자 서열과 상보적인 짧은 RNA 분자들이 표적 유전자를 상향조절하는 데 사용될 수 있는 점을 관찰하였다. 상보성 요구사항들은 본 명세서의 다른 곳에서 논의된다. 유전자의 전사 개시 부위를 둘러싸는 부위는 전사 개시 부위의 상류 또는 하류의 100, 200, 300, 400, 500, 800, 1000 또는 2000개 뉴클레오타이드들 사이에 위치하는 부위다.
따라서, saRNA 분자들은 상기에 설명된 원리들을 기초로 하여 설계될 수 있다. 일정 구현예들에서, 하기에 기술된 접근법이 실행될 수 있다.
예를 들어, 도 4는 방법 400의 블록 도면을 나타낸다. 방법 400에서, 선택 블록 400은 하나 이상의 짧은 활성화 RNA 분자들을 설계할 목적들을 위해 유전자의 유전자 서열을 선택하는 단계를 포함한다. 바람직한 유전자들은 본 명세서의 다른 곳에서 논의된다. 공급 블록 420에서, 방법 400은 표적 게놈 위치, 방향성 및 전사적 구조에 대한 정보와 같은 정보를 (예를 들어, 데이타베이스로부터) 제공하는 단계를 포함한다. 확인 블록 430에서, 비-코딩 RNA 전사체의 존재를 실제로 결정하는 것은 필요하지 않더라도, 하나 이상의 안티센스 전사체들의 확인이 일어난다 (예를 들어, 표적 유전자에 안티센스이고 이와 인접하는 전사체들에 대한 데이타를 탐색하는 단계). 공급 블록 440에서, 방법 400은 전사 개시 부위 (TSS) 주변의 경계 부위를 제공하는 단계를 포함한다. 예를 들어, TSS의 한 면 상의 많은 단위들 및 또 다른 면 상의 많은 단위들은 경계 영역으로서 제공될 수 있다. 설계 공정 시작 블록 450에서, 방법 400은 하나 이상의 saRNA들을 설계하는 단계를 용이하게 하도록 작용하는 컴퓨터-조력 공정을 시작할 수 있다. 이러한 공정은, 예를 들어 통계학적 기법들, 유전적 프로그램화 (GP) 기법들, 부스팅 기법들, 신경망 기법들, 숨겨진 마르코브 모델 (HMM) 기법들, 벡터 기계 (SVM) 기법들 등으로부터 선택되는 하나 이상의 기법들에 의존할 수 있다. 일반적으로, 이러한 기법들은 경계 TSS 부위가 입력으로서 제공될 때 하나 이상의 saRNA들을 설계하는 단계를 제공한다.
도 4의 예에서, 방법 400은 입력 블록 460도 역시 포함하고, 이는 하나 이상의 설계된 saRNA들을 입력하고 선택적으로 하나 이상의 saRNA들을 제작하는 하나 이상의 단계들을 요청하거나 활발하게 채용할 수 있다. 출력에 관하여, 블록 460은 정보를 디스플레이, 프린터, 메모리, 인터페이스 등으로 출력할 수 있다. 예를 들어, 블록 460은 망 인터페이스를 통해 망 (network)으로 정보를 출력하고, 분자들을 제작하도록 화학적 프로세싱을 위해 제작된 기계로 정보를 출력할 수 있다.
또한 다양한 장치들 412, 422, 432, 442, 452 및 462가 도 4에 나타나 있고, 이는 연관된 블록들 410, 420, 430, 440, 450 및 460의 하나 이상의 작용들을 수행하기 위한 지침들을 저장하도록 제작된 저장 매체일 수 있다. 예를 들어, 블록들 412, 422, 432, 442, 452 및 462는 프로세서- 또는 컴퓨터-실행가능한 지침들과 같은 정보를 포함하는 하나 이상의 컴퓨터-판독가능한 매체일 수 있다. 개별적으로 나타낼 때, 단일한 저장 매체는 블록들 412, 422, 432, 442, 452 및 462의 하나 이상을 위한 지침들을 포함할 수 있다. 저장 매치는 하드 드라이브, 광학 디스크, 메모리 (예를 들어, 메모리 카드) 등일 수 있다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 하나 이상의 컴퓨터-판독가능한 매체는 정보를 수용하고 (예를 들어, 블록 420에서와 같음), 안티센스 전사체들을 확인하고 (예를 들어, 블록 430에서와 같음), 전사 개시 부위를 위한 경계 영역을 확인하고 (예를 들어, 블록 440에서와 같음), saRNA 설계 공정의 시작을 요청하도록 (예를 들어, 블록 450에서와 같음) 전산화 시스템을 지시하는 컴퓨터-실행가능한 지침들을 포함할 수 있다. 이러한 하나 이상의 컴퓨터-판독가능한 매체는 선택적으로 하나 이상의 saRNA들을 설계하도록 전산화 시스템을 지시하는 지침들을 포함할 수 있다. 또한, 하나 이상의 컴퓨터-판독가능한 매체는 하나 이상의 설계된 saRNA들을 기록하거나 전달하도록 전산화 시스템을 지시하는 지침들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 saRNA들에 대한 정보는 저장 매체에 기록되고, 인터페이스 (예를 들어, 망 인터페이스) 등을 통해 전달될 수 있다. 이에 따라, 하나 이상의 saRNA들을 제작하도록 형성된 기계는 이러한 정보를 수용하고 연속적으로 이러한 하나 이상의 saRNA들을 제작할 수 있다 (예를 들어, 블록 460에서와 같음). 또 다른 예로서, 하나 이상의 saRNA들이 하나 이상의 출처로부터 입수가능한 시나리오를 고려하라. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 이러한 하나 이상의 출처들의 탐색은 하나 이상의 saRNA들을 확인하도록 일어날 수 있다 (예를 들어, 카탈로그, saRNA 은행 등을 고려하라).
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 다양한 시도들에서 인간 알부민을 위한 유전자 서열이 선택되었다 (예를 들어, 블록 410을 참조하라). 이러한 유전자 서열은 그의 특이적 활성을 위해 짧은 활성화 RNA 분자들을 설계하도록 선택되었고, 여기에서 4가지 매개변수들이 사용되었다: 1) UCSC RefSeq 데이타베이스로부터 얻은 유전자 주해들의 표적화; 2) 안티센스 RNA로부터 얻은 표적된 서열; 3) 안티센스 서열들의 프로모터 선택; 및 4) 후보 짧은 활성화 RNA들의 확인. 이어서, 표적의 게놈 위치, 방향성 및 전사 구조에 대한 정보의 다운로딩이 하나 이상의 입수가능한 데이타베이스들 (예를 들어, UCSC에서의 ReqSeq)로부터 일어났다.
이어서, UCSC 스프라이싱된 EST 트랙과 같은 기지의 판독 방향을 가진 RNA 전사체들의 데이타베이스가 주어지면, 표적 유전자에 안티센스이고 이와 인접하는 전사체들에 대한 데이타베이스를 탐색하는 단계가 일어난다 (예를 들어, 블록 430을 참조하라). 보다 상세하게, 공정은 (a) 표적의 프로모터 및 표적 mRNA의 5' 말단과 중첩하거나; (b) 표적 mRNA와 중첩하거나; (c) 표적의 전사 개시 부위 (TSS) 상류의 20 내지 100 kb 이상이거나; (d) 표적의 다중아데닐화 부위 하류의 20 내지 100 kb 이상인 안티센스 전사체들을 확인하는 단계를 포함하였다. 공정은 이들 4가지 판정기준을 단계적 필터들로서 사용하여 이것이 예를 들어 판정기준 (a)를 만족하는 안티센스 전사체들을 찾아낸 경우, 공정은 반드시 나머지 3가지 판정기준을 고려할 필요가 없다.
이어서, 표적의 전사 개시 부위 (TSS)를 기초로 하여, 공정은 예를 들어 TSS의 상류 및 하류의 고정된 크기 부위로부터 안티센스 게놈 서열을 다운로딩하는 단계를 포함할 수 있다. 다양한 시도들에서, 사용된 전형적인 부위 크기는 TSS의 상류 및 하류의 500 nts이었지만, 더 크거나 더 작은 크기들이 적합하게 실행될 수 있다 (예를 들어, 블록 440을 참조하라).
다운로딩에 이어서, 공정은 안티센스 표적 서열의 효과적이고 특이적인 하향조절을 주는 하나 이상의 siRNA들을 설계하는 단계를 포함할 수 있다 (예를 들어, 블록 450을 참조하라). 예를 들어, 공정은 (a) 효과적인 후보 siRNA들을 확인하도록 쥐피부스트와 같은 siRNA 설계 알고리즘을 사용하고; (b) aaaa, cccc, gggg, 또는 uuuu 모티브들 및 20% 이하 또는 55% 이상의 GC 함량을 가지는 모든 후보 siRNA들을 제거하고; (c) 모든 잠재적인 오프-표적 전사체들과 2개 이하의 해밍 거리를 가지는 모든 후보들을 제거하고; (d) 그들의 예측된 siRNA 녹다운 효능에 의해 선별된 주어진 수의 남은 비-중첩 siRNA들을 돌려보낼 수 있다. 이러한 예에서, 공정은 주어진 안티센스 표적 서열을 위해 많은 (예를 들어, 2개의 가장 높은 점수) saRNA들을 돌려보낼 수 있다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 하나 이상의 saRNA의 출력 및 제작이 이어졌다 (예를 들어, 블록 460을 참조하라).
본 발명의 saRNA들은 당업자에게 잘 알려진 표준 분자생물학 기법들을 사용하여 임의의 적합한 방법에 의해 예를 들어 합성적으로, 또는 세포들에서 발현에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, saRNA들은 당해 기술분야에서 알려져 있는 방법들을 사용하여 화학적으로 합성되거나 재조합으로 생산될 수 있다.
상기에서 언급된 바와 같이, saRNA들 및/또는 세포들은 치료적으로 사용될 수 있다. saRNA들 또는 세포들은 주사를 통해, 예컨대 정맥내로, 피하로, 근육내로 또는 표적 기관 내로 투여될 수 있다. 따라서, 주사는 전신적 또는 표적 부위, 예컨대 표적 기관, 바람직하게 전립선 또는 췌장도 역시 참작되더라도 간에서 또는 이의 내로 수행될 수 있다. 대안적으로, 투여는 경구로 또는 pr (직장으로) 수행될 수 있다. 간 내로 세포의 주사가 바람직하다.
본 발명의 짧은 RNA들 및/또는 세포들은 이를 필요로 하는 환자에게 당해 기술분야에서 알려진 임의의 수단 또는 전달 운반체에 의해, 예를 들어 나노입자들, 양이온성 지질들, 콜레스테롤 또는 α-토코페롤과 같은 지질들, 리포좀들 예컨대 양성 전하를 가진 양이온성 리포좀들, 폴리에틸렌이민과 같은 중합체들, 덴드리머들, 앱타머들를 통해, 또는 항체 결합체들로서 투여될 수 있다. 짧은 RNA들은 바이러스성 벡터 발현된 shRNA들 또는 miRNA 모방체들로서 역시 투여될 수 있다.
바람직하게, saRNA 또는 세포는 특이적 조직 또는 세포 유형, 예컨대 간의 세포들, 예컨대 간세포 (hepatocyte)로 saRNA 또는 세포를 표적시키는 분체와 연관되거나, 예컨대 복합되거나, 연결되거나, 이의 내부에 포함된다. 상기 분체는 상기 언급된 수단/전달 운반체들중 하나일 수 있다. 그러나, 표적화 전달은 약물들 또는 상세하게 saRNA들이 전신적 투여에 이어서 자연적으로 간으로 전달되기 때문에 사실상 요구될 수 없다.
앱타머 (aptamer)는 높은 선택성, 친화도 및 안정성을 가진 올리고뉴클레오타이드들 또는 펩타이드들이다. 그들은 특이적이고 안정한 삼차원적 형태들을 가정하고, 이에 의해 표적 분자들에 매우 특이적인 밀착된 결합을 제공한다. 임의의 특이적인 분자적 표적을 위해, 핵산 앱타머들은 핵산들의 순열적 라이브러리들로부터, 예컨대 지수적 농축에 의한 리간드들의 체계적 생성 (SELEX)이라고 불리는 기법에 의해 확인될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Tuerk C and Gold L: Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 1990, 249: 505-510]을 참조하라). 펩타이드 앱타머들은 예컨대 효모 이중 하이브리드 시스템을 사용하여 확인될 수 있다. 당업자라면 따라서 간 세포들과 같은 세포들을 표적하도록 본 발명의 saRNA들 또는 세포들을 전달하는 데 적합한 앱타머들을 설계할 수 있다. DNA 앱타머들, RNA 앱타머들 및 펩타이드 앱타머들이 참작된다. 간-특이적 앱타머들을 사용한 간으로의 본 발명의 짧은 RNA들의 투여는 특히 바람직하다.
또한 앱타머와 본 발명의 짧은 RNA의 결합체가 제공된다. 결합체는 직접적인 화학 결합 형성, 및 스트렙트아비딘과 같은 연결기를 통한 연결 등과 같은 2개 분체들을 연결하는 임의 기지의 방법을 사용하여 제작될 수 있다.
표적 세포 표면 수용체에 대한 항체들을 생성하는 방법들이 잘 알려져 있다. 본 발명의 saRNA 분자들은, 예를 들어 RNA 담체 단백질들을 사용하여 이러한 항체들과 부착될 수 있다. 이어서, 결과로 얻은 복합체는 대상에게 투여되고 수용체-매개성 세포내이입 (endocytosis)을 통해 표적 세포들에 의해 섭취될 수 있다. 본 발명의 세포들은 기지의 수단을 사용하여 이러한 항체들과 연결될 수 있다.
saRNA 또는 세포는 당해 기술분야에서 알려져 있는 방법들을 사용하여 리포좀들로 피막화될 수 있다. 리포좀들은 선택적으로 항체 또는 펩타이드와 같은 표적-세포 특이적 분체와 연관될 수 있다.
상기에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 분자들은 표적 유전자의 서열 분석을 기초로 하여 생성되고, 이들 짧은 핵산 분자들의 전달과 연관된 방법들 및 산물들은 본 발명의 심화 관점들이다. 따라서, 본 발명은 도 4 내지 도 9에서 모식적으로 설명될 수 있고 도 4 내지 도 9를 참조하여 하기에 논의되는, 방법들 및 컴퓨터-판독가능한 저장 매체 및 데이타 구조들을 포함하는 산물들도 역시 제공한다. 달리 진술되지 않는 경우라면, 본 발명의 방법들 및 산물들과 관련한 정의들, 기술내용 및 상기에 기술된 바람직한 구현예들은 하기에 논의된 관점들에 필요한 변경을 준용하여 적용한다.
다음의 실시예들은 본 발명을 도시하고 당업자에게 본 발명을 만들고 사용하도록 제시하려고 의도된다. 이들 실시예들은 임의의 방식으로라도 본 발명을 제한하려고 의도되지 않는다. 본 발명은 지금 다음의 실시예들 그리고 도표들 및 도면들에서 더 기술될 것이다.
본 명세서에서 기술된 다양한 방법들, 장치들, 어셈블리들, 시스템들, 배열들 등 및 그들의 동등물들의 더욱 완전한 이해는 첨부한 도면들에서 나타낸 예들과 연관하여 다룰 때 다음의 자세한 기술내용을 참조하여 가질 수 있다.
도 1은 일정 가능한 기작들 (기작 A 및 기작 B)의 도면을 나타낸 것이다.
도 2는 알부민의 상향조절을 보여주는 saRNA 형질감염된 HepG2 세포들에 대한 결과들의 일련의 좌표들을 나타낸 것이다. 알부민 PR1, PR2, PR3 및 PR4의 서열들의 경우 표 2를 참조하라.
도 3은 saRNA 형질감염에 이어서 HepG2 세포들에서 WST-1 증식 검정법 결과들의 일련의 좌표들을 나타낸 것이다. 알부민 PR1, PR2, PR3 및 PR4의 서열들의 경우 표 2를 참조하라.
도 4는 방법의 예의 블록 도면을 나타낸 것이다.
도 5는 장비 및 전산화 장치의 예들의 블록 도면을 나타낸 것이다.
도 6은 방법의 예의 블록 도면을 나타낸 것이다.
도 7은 방법의 예의 블록 도면을 나타낸 것이다.
도 8은 치료 계획의 예 및 기법들, 기술학들 등의 다른 예들의 블록 도면을 나타낸 것이다.
도 9는 하나 이상의 유형들의 세포들로 전달된 saRNA의 도면을 나타낸 것이다.
도 10은 간 세포들을 알부민 saRNA로 형질감염시키는 것의 시험관내 효과들을 나타낸 것이다 (실시예 2를 참조하라). 데이타는 3번의 독립적인 형질감염들로부터 나온 평균, SEM을 나타낸다. (A) 대조군 HepG2 세포들 대비한 알부민 특이적 saRNA로 형질감염된 HepG2 세포들을 비교하는 마우스 알부민 엘라이자 결과들. * = p(0.0136). (B) 대조군 HepG2 세포들 대비한 알부민 특이적 saRNA로 형질감염된 HepG2 세포들을 비교하는 알부민 mRNA의 qPCR 분석. ** = p(<0.003). (C) 대조군 래트 간 상피세포들 대비한 알부민 특이적 saRNA로 형질감염된 래트 간 상피세포들을 비교하는 알부민 mRNA의 qPCR 분석.
도 11은 HepG2 세포주를 대조군 대비 CEBPA saRNA 제작물들 AW1 및 AW2로 형질감염시키는 것의 효과들을 나타낸 것이다 (실시예 4를 참조하라). (A)는 CEBPA의 상대적 mRNA 전사체 수준들을 나타내고, (B)는 알부민의 상대적 mRNA 전사체 수준들을 나타내고, (C)는 알부민 발현 (ng/mL)을 나타내고, (D)는 HepG2 세포 생존도를 나타낸다.
도 12는 DU145 전립선암 상피세포주를 대조군 대비한 CEBPA saRNA 제작물들 AW1 및 AW2로 형질감염시키는 것의 효과들을 나타낸 것이다 (실시예 4를 참조하라). (A)는 CEBPA의 상대적 mRNA 전사체 수준들을 나타내고, (B)는 알부민의 상대적 mRNA 전사체 수준들을 나타내고, (C)는 HepG2 세포 생존도를 나타낸다.
도 13은 각각의 대조군, 또는 덴드리머 + 알부민 saRNA 군의 경우 꼬리 주사된 마우스 (n = 5)의 혈액 분석을 나타낸 것이다 (실시예 5를 참조하라). (A) 알부민, (B) 감마 글루타밀 트랜스펩티다제, (C) 알라닌 아미노전이효소 및 (D) 아스파테이트 아미노전이효소.
도 14는 대조군과 대비하여, 래트들로 AW1 saRNA의 투여 이후에 혈청 알부민 수준들을 나타낸 것이다. 실시예 6을 참조하라. AW1은 CEBPA를 표적한다 (서열들의 경우 표 2를 참조하라).
도 15는 래트로 AW1 및 AW2 (서열들의 경우 표 2를 참조하라) 투여의 데이타를 조합하고 래트들로 대조군 투여와 대비하여, 혈청 알부민에 관한 데이타 풀을 나타낸 것이다. 실시예 6을 참조하라.
도 16은 대조군과 대비하여 알부민 saRNA + 덴드리머로 투여된 마우스에서 조직 생검들로부터 얻은 전사체 수준의 정량적 분석을 나타낸 것이다. (A)는 α태아 단백질 (AFP)의 상대적 mRNA 전사체 수준들을 나타내고 (B)는 간세포 성장인자 (HGF)의 상대적 mRNA 전사체 수준들을 나타낸다.
표 2는 알부민 발현을 상향조절하기 위해 설계된 짧은 RNA 분자들을 나타낸다.
표 3은 알부민 발현을 상향조절하기 위해 설계된 짧은 RNA 분자들을 나타낸다.
보다 상세하게, 도 2는 알부민의 상향조절을 보여주도록 saRNA 형질감염된 HepG2 세포들에 관한 데이타의 좌표를 나타낸다. 도 2에서, (A)는 24웰 플레이트에서 2.5 × 105개 세포들/웰의 밀도로 도말되었던 HepG2 세포들로부터 얻은 결과들의 좌표를 나타낸다. saRNA의 4개 클론들은 사용된 알부민 유전자의 프로모터 부위들 (PR1, PR2, PR3 및 PR4)로 유도되었다. 세포들은 24 웰 플레이트에 도말에 이어서 150 ng의 saRNA로 0, 12 및 24시간에 형질감염되었고, 이어서 전체 RNA의 추출을 위해 수확되었다. mRNA 수준들의 RT-PCR 프로파일은 saRNA들로 형질감염된 세포들에서만 알부민 수준들의 증가를 보여주었다. 도 2에서, (B)는 2번의 독립적인 시도들에서 절반-정량적인 분석으로부터 얻은 결과들의 좌표를 나타내고 PR3 saRNA가 알부민 mRNA 수준에서 가장 현저한 증가를 가졌던 점을 보여준다 (158% +/ 5.7%). 도 3에 관하여, WST-1 증식 검정법으로부터 얻은 결과들은 saRNA 형질감염에 이어서 HepG2 세포들에서 관찰된다. HepG2 세포들은 1.5 × 105개 세포들/웰의 밀도로 24웰 플레이트에서 도말되었고 0, 12 및 24시간들에서 3번의 형질감염들이 이어졌다. 이어서 WST-1 시약이 Amax 450 nm에서 다중웰 리더로 분석 이전에 30분 동안 첨가되었다. 도 3에서, (A)는 대사적으로 활성을 가지고 증식하는 세포들을 지시하는 포르마잔 염료의 양을 나타내는 좌표이고, 이는 알부민으로 saRNA로 형질감염되었던 세포들에서만 강력하게 감소되었다. 도 3에서, (B)는 미형질감염된 세포들 대비 세포 생존도의 백분율을 나타내어 PR3 saRNA로 형질감염된 세포들이 세포 증식에서 가장 현저한 감소를 가졌던 점을 보여주는 좌표이다.
본 명세서에서 기술된 다양한 시도들의 자세한 사항에 관해, 상세하게 세포 배양에 관해, HepG2 세포들 (미국 타입 배양 수집기관)이 10% 우태아 혈청 (FCS) (미국 인비트로겐사 (Invitrogen)), 100 유닛/mL 페니실린, 0.1 mg/mL 스트렙토마이신, 2 mmol/L 글루타민 (미국 시그마사 (Sigma))가 보충된 RPMI-140 배지 (미국 시그마사)로 37℃에서 습윤화된 5% CO2 공기로 배양되었다.
화학적 프로세싱에 관해, 다양한 시도들의 경우 쌍을 형성한 올리고뉴클레오타이드들이 90℃에서 변성 단계에 이어서 50 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl 및 5 mM EDTA를 사용하여 어닐링되었고 상온으로 점진적인 어닐링 단계가 이어졌다.
절반 정량적인 rtPCR을 위한 전체 RNA의 분리 공정은 다양한 작동들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 모든 전체 RNA 추출은 RNAqueous-마이크로 키트 (영국 앰비온사 (Ambion))를 사용하여 (예를 들어, 제조사의 지침들에 따라) 수행될 수 있다. 다양한 시도들에 관해, 세포들은 가만히 원심분리되었고 용해 완충액 (영국 앰비온사)으로 출력 3번에 초음파 파쇄의 3번 펄스들이 이어졌다. 이어서, 세포 용출액들은 RNA 결합 컬럼을 통해 프로세싱되었고, 다수의 세척들 및 용출이 이어졌다. 분리된 전체 RNA는 나노드롭 2000 분광분석기에 의해 정량되었다. 500 ng의 전체 RNA는 일 단계 RT-PCR (독일 퀴아젠사 (Qiagen))을 (예를 들어, 제조사의 지침들에 따라) 사용하여 정량되었다. 알부민 및 로딩 대조군인 살림 (housekeeping) 유전자 액틴을 위한 발현은 그들의 프라이머 쌍들 각각을 사용하여 PCR에 의해 수행되었다: 알부민 - F: TCC AGC ACT GCC TGC GGT GA; R: TCC GTC ACG CAC TGG GAG GA; 이어서 95℃ - 45초; 55℃ - 45초; 61℃ - 45초에서 37회 사이클들. 액틴 - F: GAG AAA ATC TGG CAC CAC ACC; R: ATA CCC CTC GTA GAT GGG CAC; 이어서 95℃ - 5분; 60℃ - 30초; 70℃ - 45초; 72℃ - 10분에서 37회 사이클들. 산물들은 유브이피 비손워크스 엘에스 (UVP VisonWorks LS) (버전 6.2.)를 사용하여 반-정량적으로 3번 분석되었다.
본 명세서에서 기술된 시도들의 경우, 테트라졸리움 염, 4-[3-(4-요오도페닐)-2-(4-니트로페닐)-2H-5-테트라졸리오]-1,3-벤젠-디설포네이트 (WST-1)-증식 검정법이 사용되었다. 상세하게, HepG2 (1.5 × 105개 세포들/웰)이 96 웰 플레이트에 도말되었고, 10% 우태아 혈청 (FCS) (미국 인비트로겐사), 100 단위/mL 페니실린, 0.1 mg/mL 스트렙토마이신, 2 mmol/L 글루타민 (미국 시그마사)가 보충된 500 μL의 RPMI-140 배지 (미국 시그마사)로 배양되었고, 나노펙틴을 사용하여 (나노펙타민 (영국 PAA사)을 사용하는 150 μL의 MafA로 표적된 어닐링된 saRNA의 형질감염) (예를 들어, 제조사의 지침에 따라) 형질감염되었다. 상기 공정은 도말로부터 0시간, 12시간 및 24시간째 3번 반복되었다. 세포 증식 시약 WST-1 (영국 로슈 어플라이드 사이언스사 (Roche Applied Science)가 (예를 들어, 제조사의 지침들에 따라) 첨가되었다. 이어서 비색 검정법이 생존 세포들에서 미토콘드리아 숙시네이트-테트라졸리움 환원효소에 의한 테트라졸리움 염 WST-1의 포르마잔으로 절단을 허용하도록 30분 동안 배양되었다. 대사적으로 활성을 가진 증식하는 세포들의 수와 직접적으로 관련된 포르마잔 염료의 정량은 다중웰 플레이트 리더로 Amax 450nm에서 측정되었다. 시도들을 위해, 전부 3번의 독립적인 실험들이 검정되었다.
다음, 도 2 및 도 3에서 나타낸 바와 같이 saRNA 형질감염된 HepG2 세포들은 알부민의 상향조절을 보여주었고, WST-1 증식 검정법 결과들은 saRNA 형질감염에 이어서 HepG2 세포들에서 감소된 증식을 보여주었다.
도 5는 다양한 구성성분들을 포함할 수 있는 시스템 500 (예를 들어, 전산화 시스템)을 나타낸다. 도 5의 예에서, 시스템 500은 정보 510을 포함할 수 있고, 이는 프로세서 520 및 메모리 530으로, 예를 들어 망 인터페이스 540 또는 다른 인터페이스를 통해 제공될 수 있다. 나타난 바와 같이 CRM 블록 534는 하나 이상의 컴퓨터-판독가능한 매체를 포함할 수 있다. 이러한 매체 또는 매체들은 도 4의 하나 이상의 매체들일 수 있다 (예를 들어, 412, 422, 432, 442, 452 및 462). 또한 디스플레이 장치 550, 저장 장치 570 및 제조화 장치 590가 도 5에 나타나 있다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 제조화 장치 590은 하나 이상의 화학물질들 (예를 들어, 하나 이상의 탐침들, 선택적으로 효소들 등과 같은 하나 이상의 화학물질) 및 선택적으로 하나 이상의 화학물질들을 위한 용기들, 웰들 등을 포함할 수 있다.
도 5의 예에서, 시스템 500은 메모리 530과 작동적으로 연결된 하나 이상의 프로세서 520을 포함할 수 있고, 이는 하나 이상의 컴퓨터-판독가능한 (또는 프로세서-판독가능한) 저장 매체 534로부터 판독되는 지침들을 저장하도록 제작될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, CRM 534는 하나 이상의 프로세서들에 의한 실행 시 시스템 500을 도 4의 방법 400의 적어도 일부를 수행하도록 지시하는 지침들을 저장할 수 있다.
또한 망 인터페이스 540은 도 5의 예에서 나타나 있고, 이는 시스템 500으로 또는 이로부터 정보의 통신을 허용할 수 있다. 예를 들어, 지침들은 시스템 500으로 (예를 들어, 시작하기 작동, 종결하기 작동, 품질 관리, 업데이트 소프트웨어 지침들 등으로) 통신될 수 있다. 프로세서 520의 출력은 망 인터페이스 540을 통해 시스템 500으로부터 (예를 들어, 건강관리 제공자, 과학자, 데이타베이스, 제약물들의 제조자 등으로) 통신될 수 있다.
도 6은 방법 600의 블록 도면을 나타낸다. 언급된 바와 같이, saRNA는 일차간암과 같은 암의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 예를 들어, 간암에 관해, 치료 또는 예방은 간경변을 가진 환자들에게 (예를 들어, 바이러스성 간염 또는 알코올 중독으로 인함) saRNA를 투여하는 것에 의해 일어날 수 있다. 방법 600은 환자 병태를 진단하기 위한 진단 블록 610, saRNA를 제공하기 위한 공급 블록 620, 제공된 saRNA를 환자에게 투여하기 위한 투여 블록 630을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 이러한 작동들은 전체적으로 또는 부분적으로, 선택적으로 하나 이상의 컴퓨터-판독가능한 매체들 상에 저장된 지침들과 같은 지침들을 기초로 하여 작동하는 기계 또는 기계들을 통해 일어날 수 있다 (예를 들어, CRM 612, 622 및 632를 참조하라).
도 6의 방법 600은 도 4의 방법 400의 하나 이상의 블록과 연결하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 공급 블록 620은 도 4의 방법 400의 블록 450의 측면에서 기술된 바와 같이 설계하는 것을 포함할 수 있다.
진단 블록 610에 관해, 이것은 암성 세포들 611을 진단하는 단계, 전-암성 세포들 613을 진단하는 단계, 다른 위험 615를 진단하는 단계 또는 임의의 그들의 조합을 제공할 수 있다. 언급된 바와 같이, 소정의 병태들은 암에 대한 위험성들을 제시한다. 예를 들어, 환자 감염들, 환자 습관들, 환자 중독 등은 암에 대한 위험성들을 제시할 수 있다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 방법은 정보를 입력하는 단계, 적어도 부분적으로 정보를 기초로 하여 위험성을 평가하는 단계 및 유사한 상황에 놓인 환자 또는 환자들에게 RNA를 투여할지 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 투여 (예를 들어, 또는 투여들)는 예를 들어 암의 예방 또는 암의 치료를 위한 것일 수 있다.
도 7은 방법 700의 블록 도면을 나타낸다. 공급 블록 710에서, saRNA가 선택적으로 담체와 함께 제공된다. 예를 들어, 설계된 saRNA는 선택적으로 리포좀 또는 앱타머 또는 RNA 앱타머와 함께 간 외부로 전이되었던 간암과 같은 간암으로 전달될 수 있다. 투여 블록 720에서, saRNA (및 선택적으로 담체)는 환자 (예를 들어, 인간 대상)에게로 투여된다. 예로서, 간 종양들의 경우 설계된 saRNA는 전신 주사에 의해 또는 경피적 직접 주사에 의해 국소적으로 환자의 간에 도달하도록 투여될 수 있다. 간 종양 또는 다른 유형의 종양의 경우, 투여는 블록 725를 통한 안내 기법 (guidance technique)에 의해 안내될 수 있다. 안내 기법들은 초음파, 투시검사, MR, CT, 혈관내 전달의 개복술 또는 복강경 검사 등을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 투여는 경구적 전달을 통할 수 있다.
도 7의 예에서, 추가적인 치료법이 결정 블록 730에 의해 표시된 바와 같이 제공될 수 있다. 추가적인 치료법은 하나 이상의 다음의 치료법들, RF 절개술, 전자파 절개술, 선택적 방사성요법, 비가역적 전기천공, 고-집중 초음파, 경동맥 화학색전술 등으로부터 선택될 수 있다. 표시된 바와 같이, 결정 블록 730이 하나 이상의 추가적인 치료법들이 전달될 것이라고 결정한 경우라면, 방법 700은 추가적인 치료법 블록 740으로 들어간다. 결정 블록 730이 추가적인 치료법들은 전혀 전달되지 않을 것이라고 결정한 경우라면, 방법 700은 선택적 보류 (wait) 블록 735로 들어가고, 이어서 적절한 경우 투여 블록 720에서 계속된다. 예를 들어, saRNA를 환자에게 투여하는 치료법의 경우 (영차 방식이 아닌 경우), 용량은 일수 기간 동안 유효도에서 감소할 수 있다. 따라서, 보류 블록 735는 연속적 용량의 투여 이전에 보류 시간을 제공할 수 있다. 예로서, 용량들이 투여되는 곳에서, 용량은 한 주에 여러 번 환자에게 주어질 수 있다 (예를 들어, 예방 또는 치료를 위해 한 주에 2번 또는 3번 용량들). 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 하나 이상의 추가적인 치료법들은 saRNA의 연속적 용량들 간의 보류 시간을 결정하거나 변경하는 요소들을 제시할 수 있다.
또한 다양한 장치들 712, 722, 727, 732, 737 및 742가 도 7에 나타나 있고, 이는 연관된 블록들의 하나 이상의 작동들을 수행하기 위한 지침들을 저장하도록 제작된 저장 매체들일 수 있다. 예를 들어, 이들은 프로세서- 또는 컴퓨터-실행가능한 지침들과 같은 정보를 포함하는 하나 이상의 컴퓨터-판독가능한 매체들일 수 있다. 개별적으로 나타낼 때, 단일한 저장 매체는 하나 이상의 블록들을 위한 지침들을 포함할 수 있다. 저장 매체는 하드 드라이브, 광학 디스크, 메모리 (예를 들어, 메모리 카드) 등일 수 있다.
도 7은 치료 계획화 모듈 770도 역시 나타낸다. 도 7의 예에서, 모듈 770은 RNA 블록 772를 위한 역학, 화학요법 블록 774를 위한 역학, 방사선요법 블록 776을 위한 역학, 환자 정보 블록 778, 결정들 블록 780 및 출력 블록 782를 포함한다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, RNA는 투여된 경우 특정한 역학들을 가질 수 있고, 하나 이상의 다른 치료법들은 특정한 역학들을 가질 수 있다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, RNA (예를 들어, saRNA) 치료법 및 하나 이상의 다른 치료법들 간의 상승효과들을 위한 기회들이 존재한다. 도 7의 치료 계획화 모듈 770은 환자 또는 환자들을 위한 치료의 자동적 또는 상호작용적 계획화를 허용하는 전산화 시스템의 일부 (예를 들어, 컴퓨터-실행가능한 지침들의 형태)일 수 있다.
도 8은 도 7의 치료 계획화 모듈을 나타내고, 이는 그래프 사용자 인터페이스 (GUI) 811과 같이 그래프로 전시된 (예를 들어, 제공된) 치료 계획 810의 예와 함께, 다수의 소-모듈들로 만들어질 수 있다. 이에 따라, 소-모듈 782는 계획화 모듈 770과 상호작용하도록 사용자에 의한 입력을 제공하는 GUI를 형성하는 지침들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 사용자는 환자를 위한 치료 계획을 최적화하도록 치료법들의 용량 및 유형들을 선택하거나 조절할 수 있을 것이다 (예를 들어, 화학용량들 사이에 주어진 saRNA 용량들을 참조하라). 작동, 제거 등의 역학들이 계획화 동안 고려될 수 있다 (예를 들어, 소-모듈 역학들에 의해 제공된 바와 같음).
또한 도 8은 RNA 용량 812를 나타내고, 이는 saRNA 813 또는 mRNA 815일 수 있다. mRNA 용량 815에 관해, 이것은 예를 들어 폴리펩타이드들 (예를 들어, 알부민 또는 다른 폴리펩타이드)의 상향조절을 유도하는 앱타머 816 또는 유전자 치료법 817로 제공될 수 있다. 또한 도 8은 예로서 화학용량 822를 나타내고, 이는 느린 증식 세포들 823에 적합한 화학요법 또는 빠른 증식 세포들 825에 적합한 화학요법일 수 있다. 세포 주기 시간, S-기 지속기간 등과 같은 인자들은 화학요법의 유효도와 밀접한 것으로서 보고되어 왔다. 보다 상세하게, 세포 증식 역학은 화학요법의 전반적인 유효도에 관한 인자일 수 있다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, RNA (예를 들어, saRNA)의 용량 또는 용량들은 화학요법의 투여 이후, 이전 또는 이후 및 이전에 증식을 감소시키는 기작으로서 환자에게 (예를 들어, 종양 세포들 등으로) 투여될 수 있다. 화학요법은 넓은 범위의 용량들로 (예를 들어, 환자에게 독성 위험으로 인함) 전달될 수 있기 때문에, 화학용량들 사이에 기간을 둔 saRNA의 투여는 환자의 전반적인 치료를 최적화하도록 작용할 수 있다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 방법은 세포를 암성 또는 전-암성으로 돌아서기 이전에 세포에 의한 폴리펩타이드 (예를 들어, "자연적으로 분비되는")의 생산을 상향조절하도록 유도하는 saRNA를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 알부민은 다양한 세포들에 의해 (예를 들어, 이러한 세포들이 암성 또는 전-암성으로 돌아서기 이전에) 자연적으로 분비되는 폴리펩타이드이다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 방법은 미분화된 세포를 분화된 세포로 전환하도록 (예를 들어, 세포의 세포 행동을 분화된 세포의 더욱 특징적인 행동으로 이동하도록) 유도하는 saRNA를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
도 9는 분자 생산의 속도 및 세포 증식의 속도의 도시적 좌표들과 함께 정상 세포, 전암성 세포 및 암성 세포로 전달된 saRNA의 도면을 나타낸다. 표시된 바와 같이, saRNA는 하나 이상의 유형들의 세포들로 전달되고, 분자의 생산 속도에서 증가를 유도하고 세포 증식의 속도에서 감소를 유도할 수 있다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 짧은 활성화 RNA는 포유동물 세포에 의한 폴리펩타이드의 생산이 포유동물 세포의 증식 능력에 부정적으로 영향을 주는 포유동물 세포의 폴리펩타이드의 상향조절을 유도하도록 단위들의 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, (saRNA와 연관된) 폴리펩타이드는 그의 자연적인 상태에서 포유동물 세포의 자연적으로 분비된 폴리펩타이드일 수 있다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, (saRNA와 연관된) 폴리펩타이드는 알부민일 수 있다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, saRNA는 간세포를 위해 제공되거나 설계되거나 설계되고 제공된다. 더욱 일반적으로, saRNA는 정상적 세포, 전암성 세포, 암성 세포를 위해 제공되거나 설계되거나 설계되고 제공되고 이러한 세포들은 포유동물 세포들일 수 있다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 방법은 세포 유형의 과다한 증식을 특징으로 하는 병태를 가진 환자를 진단하는 단계; 및 세포 유형에 의한 폴리펩타이드의 생산을 상향조절하도록 짧은 활성화 RNA를 설계하는 단계를 포함할 수 있고, 여기에서 폴리펩타이드들의 상향조절된 생산은 세포 유형의 증식 능력에 부정적으로 영향을 준다. 이러한 방법은 짧은 활성화 RNA를 생산하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 방법은 설계된 짧은 활성화 RNA를 환자에게 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 진단 단계에 관해, 방법은 간암을 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기에서 언급된 바와 같이, 방법은 saRNA 치료법과 연관된 세포 유형을 표적하는 추가적인 치료법 (예를 들어, 비-saRNA 치료법)을 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 치료법은 화합요법, 방사선요법, RF 절개술 치료법, 전자파 절개술 치료법 또는 기타 치료법일 수 있다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 방법은 폴리펩타이드를 위한 코딩 영역을 가지는 유전자의 전사 개시 부위를 제공하는 데 반응하여 컴퓨터-판독가능한 저장 매체 상에 저장된 하나 이상의 지침들을 실행하여 saRNA를 설계하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 하나 이상의 컴퓨터-판독가능한 매체들은 알부민을 위한 코딩 영역을 가지는 유전자의 전사 개시 부위를 수용하고; 전사 개시 부위 주변의 경계 영역을 선택하고; 알부민의 생산을 상향조절하기 위한 saRNA 후보들에 관한 단위들의 스트링(string)들을 특징 분석하고; 하나 이상의 특징 분석된 단위들의 스트링들을 간암을 치료하도록 인간 대상에게 투여하는 saRNA 분자들의 제조를 위한 바람직한 후보들로서 출력하도록 전산화 시스템을 지시하는 컴퓨터-실행가능한 지침들을 포함할 수 있다.
본 발명의 심화 구현예들은 하기에 설명된다:
1. 포유동물 세포의 폴리펩타이드의 상향조절을 유도하는 단위들의 서열을 포함하는 짧은 활성화 RNA로서, 포유동물 세포에 의한 폴리펩타이드의 생산이 포유동물 세포의 증식 능력에 부정적으로 영향을 주는, 짧은 활성화 RNA.
2. 폴리펩타이드가 그의 자연적인 상태에서 포유동물 세포의 자연적으로 분비된 폴리펩타이드를 포함하는 구현예 1의 짧은 활성화 RNA.
3. 폴리펩타이드가 알부민을 포함하는 구현예 1의 짧은 활성화 RNA.
4. 포유동물 세포가 간세포를 포함하는 구현예 1의 짧은 활성화 RNA.
5. 포유동물 세포가 암 세포를 포함하는 구현예 1의 짧은 활성화 RNA.
6. 세포 유형의 과다한 증식을 특징으로 하는 병태를 가진 환자를 진단하는 단계; 및 세포 유형에 의한 폴리펩타이드의 생산을 상향조절하도록 짧은 활성화 RNA를 설계하는 단계를 포함하는 방법으로서, 폴리펩타이드들의 상향조절된 생산이 세포 유형의 증식 능력에 부정적으로 영향을 주는, 방법.
7. 짧은 활성화 RNA를 생산하는 단계를 더 포함하는 구현예 6의 방법.
8. 설계된 짧은 활성화 RNA를 환자에게 투여하는 단계를 더 포함하는 구현예 6의 방법.
9. 진단 단계가 간암을 진단하는 구현예 6의 방법.
10. 설계하는 단계가 폴리펩타이드를 위한 코딩 영역을 가지는 유전자의 전사 개시 부위를 제공하는 데 반응하여 컴퓨터-판독가능한 저장 매체 상에 저장된 하나 이상의 지침들을 실행하는 단계를 포함하는 구현예 6의 방법.
11. 세포 유형을 표적하는 추가적인 치료법을 투여하는 단계를 더 포함하는 구현예 6의 방법.
12. 추가적인 치료법이 화학요법, 방사선 요법, RF 절개술 치료법 및 전파 절개술 치료법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료법을 포함하는 구현예 11의 방법.
13. 알부민을 위한 코딩 영역을 가지는 유전자의 전사 개시 부위를 수용하고; 전사 개시 부위 주변의 경계 영역을 선택하고; 알부민의 생산을 상향조절하기 위한 saRNA 후보들에 관한 단위들의 스트링들을 특징 분석하고; 하나 이상의 특징 분석된 단위들의 스트링들을 간암을 치료하도록 인간 대상에게 투여하는 saRNA 분자들의 제조를 위한 바람직한 후보들로서 출력하도록 전산화 시스템을 지시하는 컴퓨터-실행가능한 지침들을 포함하는 하나 이상의 컴퓨터-판독가능한 매체들.
14. 짧은 활성화 RNA는 포유동물 세포에 의한 폴리펩타이드의 생산이 포유동물 세포의 증식 능력에 부정적으로 영향을 주는 포유동물 세포의 폴리펩타이드의 상향조절을 유도하도록 단위들의 서열을 포함한다.
기술학들, 기법들, 장치들, 에셈블리들, 시스템들, 방법들 등의 다양한 다른 예들도 역시 개시된다.
방법들, 장치들, 시스템들, 배열들 등의 일정 예들이 첨부된 도면들에서 도시되고 전술한 상세한 설명에 기술되었더라도, 개시된 예시적인 구현예들은 제한되지 않고, 또한 개시되고 다음의 청구범위들에 의해 정의된 사상으로부터 벗어나지 않고도 수많은 재배열들, 변형들 및 치환들을 할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
실시예
실시예 1 - 알부민 발현을 상향조절하기 위한 짧은 RNA들을 설계하는 단계
알부민 생산에 관여하는 유전자들의 유전자 서열들은 짧은 활성화 RNA 분자들을 그의 특이적 활성을 위해 설계하도록 선택되었다.
4가지의 매개변수들이 사용되었다: 1) UCSC RefSeq 데이타베이스로부터 얻은 유전자 주해들의 표적; 2) 안티센스 RNA로부터 얻은 표적된 서열; 3) 안티센스 서열들의 프로모터 선택; 및 4) 후보 짧은 활성화 RNA들의 확인.
첫째, 방법은 입수가능한 데이타베이스들 (UCSC에서의 ReqSeq)로부터 표적의 게놈 위치, 방향성 및 전사적 구조에 대한 정보를 다운로딩한다. 둘째, UCSC 스프라이싱된 EST 트랙과 같은 기지의 판독 방향을 가진 RNA 전사체들의 데이타베이스가 주어지면, 우리의 방법은 표적 유전자에 안티센스이고 이와 인접하는 전사체들을 위한 데이타베이스를 탐색한다. 보다 상세하게, 본 방법은 (a) 표적의 프로모터 및 표적 mRNA의 5' 말단과 중첩하거나; (b) 표적 mRNA와 중첩하거나; (c) 표적의 전사 개시 부위 (TSS) 상류의 20 내지 100 kb 이상이거나; (d) 표적의 다중아데닐화 부위 하류의 20 내지 100 kb 이상인 안티센스 전사체들을 확인하는 단계를 포함하였다. 본 방법은 이들 4가지 판정기준을 단계적 필터들로서 사용하여 이것이 예를 들어 판정기준 (a)를 만족하는 안티센스 전사체들을 찾아내는 경우, 방법은 반드시 나머지 3가지 판정기준을 고려하지 않는다. 셋째, 표적의 TSS를 기초로 하여, 방법은 TSS의 상류 및 하류의 고정된 크기 부위로부터 안티센스 게놈 서열을 다운로딩한다. 방법에 의해 사용된 전형적인 부위 크기는 TSS의 상류 및 하류의 500 nts이었지만, 더 크거나 더 작은 크기들도 역시 사용될 수 있다. 넷째, 방법은 안티센스 표적 서열의 효과적이고 특이적인 하향조절을 주는 siRNA들을 설계한다. 방법 (a)는 효과적인 후보 siRNA들을 확인하도록 쥐피부스트와 같은 siRNA 설계 알고리즘을 사용하고; (b) aaaa, cccc, gggg, 또는 uuuu 모티브들 및 20% 이하 또는 55% 이상의 GC 함량을 가지는 모든 후보 siRNA들을 제거하고; (c) 모든 잠재적인 오프-표적 전사체들로 2개 이하의 해밍 거리를 가지는 모든 후보들을 제거하고; (d) 그들의 예측된 siRNA 녹다운 효능에 의해 선별된 주어진 수의 남은 비-중첩 siRNA들을 돌려보낸다. 본 방법은 주어진 안티센스 표적 서열을 위한 가장 높은 점수를 받은 2개의 saRNA들을 돌려보낸다.
90℃에서 변성 단계에 이어서, 쌍을 형성한 saRNA 올리고뉴클레오타이드들이 50 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl 및 5 mM EDTA를 사용하여 어닐링되었다.
실시예 2 - 알부민 saRNA로의 형질감염을 통한 알부민 발현의 상향조절
재료 및 방법
실시예 1에서 기술된 바와 같이 설계된 25 nM의 어닐링된 알부민 saRNA가 제조사의 지침들에 따라 나노펙타민 (영국 PAA사)을 사용하여 세포의 단일층 상에 형질감염되었다. 본 공정은 3번 반복되었다. 본 연구를 위해 사용된 saRNA의 서열들은 표 2에 나타낸 바와 같이 인간 알부민 PR2 (서열번호 7 및 서열번호 8), 인간 알부민 PR3 (서열번호 9 및 서열번호 10) 및 인간 알부민 PR4 (서열번호 11 및 서열번호 12)이다. 무작위 혼합된 RNA 분자가 대조군으로서 사용되었다.
형질감염 이후에, 전체 RNA의 분리가 제조사의 지침들에 따라 RNAqueous-마이크로 키트 (영국 앰비온사)를 사용하여 수행되었다. 간략하게, 세포들은 가만히 원심분리되었고 용해 완충액 (영국 앰비온사)으로 출력 3번에서 초음파 파쇄의 3번 펄스들이 이어졌다. 이어서, 세포 용출액들은 RNA 결합 컬럼을 통하여 프로세싱되었고, 다수의 세척들 및 용출이 이어졌다. 분리된 전체 RNA는 나노드롭 2000 분광분석기에 의해 정량되었다. 500 ng의 전체 추출된 RNA는 게놈 DNA의 제거를 위해 가공되었고, 퀴아젠사로부터 나온 콴티텍 (QuantiTect, 등록상표) 역전사 키트를 사용하는 역전사가 이어졌다.
분리된 RNA 추출물들은 정량적 역전사효소 (qRT-PCR)를 사용하여 분석되었다. 간략하게, 추출물들은 첫 번째 가닥 cDNA 합성 키트 (퀴아젠사)를 사용하여 역전사되었다. 이어서, cDNA가 퀴아젠사로부터 나온 콴티패스트 (QuantiFast, 등록상표) SYBR (등록상표) 그린 PCR 키트를 사용한 정량적 분석을 위해 증폭되었다. 증폭은 시료 당 25 μL의 전체 부피를 가지고 95℃에서 15초 및 60℃에서 45초로의 40번 사이클들로 어플라이드 바이오시스템사의 7900HT FAST-실시간 시스템을 사용하여 수행되었다. 이어서, 증폭된 산물들은 어플라이드 바이오시스템사 RQ 매니저 1.2.1을 사용하여 분석되었다. 5번의 독립적인 실험들이 정량적 분석을 위해 3벌로 증폭되었다. 스튜던트- T 테스트가 99% 신뢰도 범위들에서 수행되었다.
알부민 생산은 알부민 엘라이자의 사용을 통하여 세포들 내에서 결정되었다. 간략하게, 세포들은 차콜 제거처리된 FCS의 존재 시 페놀-레드 없는 RPMI 배지에서 성장되었다. 8시간, 16시간 및 24시간에서 3벌의 saRNA 형질감염들에 이어서, 배양 배지가 제조사의 지침들에 따라 전체 알부민 엘라이자 (어세이 맥스, 알부민 ELISA, 미국 어세이 프로사 (Assay Pro))를 위해 수집되었다.
결과
알부민 생산에 미치는 알부민 saRNA 올리고뉴클레오타이드들에 의한 형질감염의 효과들은 도 2에 도시되어 있다. mRNA 수준들의 RT-PCR 프로파일은 saRNA들로 형질감염된 세포들에서만 알부민 수준들의 증가를 보여주었다.
도 10은 알부민 mRNA의 유의한 증가가 형질감염된 HepG2 세포주 (도 10B) 및 래트 간 상피세포들 (도 10C)에서 대조군과 비교 시 검출되었고, 이어서 이것이 형질감염된 세포주들에서 알부민 생산의 유의한 증가를 (도 10A, HepG2의 경우에만 데이타 도시) 유도하는 것을 나타낸다.
실시예 3 - 알부민 saRNA로의 형질감염을 통한 세포들의 증식의 저해
HepG2 세포들 및 래트 간 상피세포들이 도 2에 기술된 바와 같이 알부민 saRNA들로 형질감염되었고, 예컨대 동일한 saRNA들이 실시예 2에서와 같이 본 실시예에서 사용되었다. 래트 간 상피세포들 및 HepG2 세포들 내의 각각의 세포 증식은 WST-1 증식 검정법을 사용하여 측정되었다. 간략하게, 세포 증식 시약 테트라졸리움 염, 4-[3-(4-요오도페닐)-2-(4-니트로페닐)-2H-5-테트라졸리오]-1,3-벤젠 디설포네이트 (영국 로슈 어플라이드 사이언스사)가 (예를 들어, 제조사의 지침들에 따라) 첨가되었다. 이어서, 비색 검정이 생존 세포들에서 미토콘드리아 숙시네이트-테트라졸리움 환원효소에 의한 테트라졸리움 염 WST-1의 포르마잔으로의 절단을 허용하도록 30분 동안 배양되었다. 대사적으로 활성을 가진 증식하는 세포들의 수와 직접적으로 관련된 포르마잔 염료의 정량은 다중웰 플레이트 리더로 Amax 450nm에서 측정되었다.
세포 증식 및 생존도는 각각의 saRNA들에 의해 유의하게 저해되었다. HepG2 세포주로 획득된 결과들은 도 3에 나타나 있다.
실시예 4 - CEBPA saRNA로의 형질감염을 통한 시험관내 알부민의 상향조절 및 세포 증식의 저해
다음의 CEBPA로 표적하는 saRNA 이중복합체들 (센스/안티센스)이 본 연구들 위해 사용되었다:
AW1 센스 가닥: CGGUCAUUGUCACUGGUCA (서열번호 13)
AW1 안티센스 가닥: UGACCAGUGACAAUGACCG (서열번호 14)
AW2 센스 가닥: AGCUGAAAGGAUUCAUCCU (서열번호 15)
AW2 안티센스 가닥: AGGAUGAAUCCUUUCAGCU (서열번호 16)
CEBPA의 3' UTR 프로모터 부위를 표적하는 합성 saRNA 이중복합체들 (상기)이 리포좀 방법 (나노펙틴)을 사용하여 세포주들 또는 일차 CD34+ 세포들 (전능세포들) 둘 중 하나 내로 형질감염되었다. CEBPA 및 알부민의 전사체 수준들에서 변화들은 qPCR에 의해 정량적으로 측정되었다. 추가적으로, 세포성 증식에서 변화들도 테트라졸리움 염, 4-[3-(4-요오도페닐)-2-(4-니트로페닐)-2H-5-테트라졸리오]-1,3-벤젠 디설포네이트 (WST-1) 검정법을 사용하여 측정되었다.
HepG2 세포들에서 CEBPA의 발현은 다른 배양된 인간 간세포들과 비교될 때 더 낮기 때문에, HepG2 세포들은 AW1 및 AW2를 형질감염시키는 것의 효과들을 조사하는 데 사용되었다. 48시간의 배양 기간 동안 형질감염의 3번 용량들에 이어서, HepG2 세포들이 수확되었고 mRNA 분석을 위해 분석되었다. CEBPA의 mRNA 수준들에서 유의한 변화들은 배양 기간 동안 전혀 관찰되지 않았다 (도 11A). 이것은 CEBPA가 배양의 초기 단계들 동안 조기 및 신속한 붕괴를 보여주기 때문에 놀랍지 않다. 대조적으로, 알부민의 mRNA 전사체 수준들에서 증가가 관찰되었다 (도 11B). mRNA에서 알부민 증가도 역시 그의 단백질로의 번역을 반영하는지를 검증하기 위하여, 기능적 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA)이 수행되었다. saRNA 형질감염된 세포들은 외인성 알부민의 임의의 출처를 게거하도록 무혈청/숯 제거된 배지에서 배양되었다. AW1 또는 AW2 둘 중 하나의 존재 시 48시간 배양 기간에 이어서, 세포 배양 배지가 분리되었고 시판되는 키트를 사용하여 인간 알부민의 검출을 위해 프로세싱되었다. 알부민 발현의 유의한 증가는 미형질감염된 세포들과 비교될 때 saRNA로 형질감염된 세포들에서 검출되었다 (도 11C). 우리는 형질감염된 HepG2 세포들에서 WST-1 증식 검정법도 역시 수행하였다. 세포 증식의 감소가 관찰되었다 (도 11D).
우리는 다음 AW1 또는 AW2가 비-간 세포들, 즉 전립선암 상피세포주 (DU145) (도 12) 및 건강한 어른 조혈성 CD34 세포주에서 알부민 전사체의 양성 조절 또는 번역을 성공적으로 유도하는지를 결정하였다. 이들 세포주들은 상기에 기술된 바와 같이 48시간의 기간 동안 3번의 용량들에 이어서 AW1 및 AW2로 형질감염되었다. 이어서, 세포들은이 수확되었고 CEBPA 및 알부민의 전사체 수준들에 대해 분석되었다. 전립선암 세포주는 AW1과 대비하여 AW2로 형질감염될 때 CEBPA 전사체 수준에서 강한 증가를 보여주었고 (도 12A), 둘 다의 형질감염들은 알부민 전사체 수준들에서 유의한 증가를 유도하였다 (도 12B). WST1 검정법도 역시 수행되었다. DU145의 성장은 CEBPA로의 형질감염에 이어서 유의하게 감소되었다 (도 12C).
AW1 및 AW2는 CD34+ 줄기세포들에서 알부민 생산도 역시 상향조절하였지만, CD34 세포들의 증식은 AW1 및 AW2 saRNA 제작물들에 의해 영향을 받지 않았다 (데이타 미도시).
본 발명자는 CEBPA에 특이적인 saRNA AW1 및 AW2로의 형질감염이 인간 간세포 암종 계열 및 전립선암 상피 세포주에서 알부민 전사체 수준 및 단백질 발현을 상향조절하는 능력을 가지는 점을 성공적으로 확립하여 왔다. 또한, 알부민 단백질 발현에서 이러한 증가는 세포 증식에서 감소를 유도한다. 대조적으로, 건강한 CD34 세포들의 CEBPA에 특이적인 saRNA AW1 및 AW2로의 형질감염은 세포 증식에 영향을 주지 않고, 세포 증식에 미치는 효과가 암 세포들에 특이적인 점을 제시한다.
실시예 5 - 마우스 간에서 알부민 saRNA로의 형질감염을 통한 생체내 알부민의 상향조절
10마리의 수컷 C57Bl6/J, 8주령 마우스들이 실험에 사용되었다 (대조군 N = 5). 승인이 연구소 및 지역 규제기관들로부터 획득되었고 모든 절차들은 확립된 국가 규정들을 따랐다.
알부민 saRNA 올리고뉴클레오타이드들은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 개발되었다. 마우스 알부민 PR2 (서열번호 39 및 서열번호 40)는, 표 3에서 나타난 바와 같이 본 연구를 위해 선택되었다. 올리고뉴클레오타이드들은 100 μL의 무-RNase/Dnase H2O로 재구성되었고; 50 μL의 복합체 A 및 50 μL의 복합체 B (인비보펩타민 (InvivoFectamine), 미국 캘리포니아 인비트로겐사 (Invitrogen))가 혼합되었고, 50℃에서 30분 동안 배양되었고, 꼬리 정맥 주사들에 사용되었다. 대조군 동물들은 동일한 부피의 PBS로 주사되었던 한편 양성 대조군 동물은 요소 7에 대한 siRNA를 수여받았으며, 전부 5마리의 대조군 및 5마리의 실험 동물들이 주사되었다.
투여 이후, 전체 RNA가 분리되었다. 냉동된 조직 절편들은 트리졸을 포함하는 섬광분석 (scintillation) 바이알들 내로 넣었고 30초 동안 균질화되었다. 이어서, 균질물은 추가 2분의 균질화를 위해 팔콘 튜브들로 옮겨졌다. 이어서, 클로로포름이 이것에 첨가되었고 볼텍스 처리에 의해 혼합되었으며 4℃에서 12,000 rpm으로 15분 동안 원심분리 단계가 이어졌다. 이어서, 수용성 상부 층이 깨끗한 마이크로원심분리 튜브 내로 옮겨졌고 RNA가 5 mg/mL의 선형 아크릴아마이드 (앰비온사) 및 이소프로판올을 사용하여 하룻밤 동안 -20℃에서 침전되었다. RNA는 4℃에서 12,000 rpm으로 15분 동안 원심분리에 의해 펠렛화되었고 얼음 상의 차가운 70% 에탄올로 세척되었다. RNA는 다시 4℃에서 7,500 rpm으로 5분 동안 펠렛화되었다. 상청액은 바로 제거되었고, RNA 펠렛은 공기 건조가 허용되었다. RNA는 바이오분석기 (Bioanalyser)를 사용하는 RNA 특성의 즉각적인 분석을 위해 핵산분해효소 없는 물에 용해되었다.
분리된 RNA는 실시예 2에 기술된 바와 같이 qRT-PCR을 사용하여 분석되었다. 알부민 생산은 실시예 2에서 기술된 바와 같은 알부민 엘라이자를 사용하여 결정되었다.
도 13A는 덴드리머 전달 운반체를 사용한 알부민 saRNA 올리고뉴클레오타이드들의 마우스로의 투여가 혈액 순환 내에서 알부민의 유의한 증가를 유도하는 점을 나타낸다.
알부민 saRNA의 투여는 간 기능 마커들 감마 글루타밀 트랜스펩티다제 (도 13B), 알라닌 아미노전이효소 (도 13C) 및 아스파테이트 아미노전이효소 (도 13D) 또는 빌리루빈에 따른 전반적 간 기능에 미치는 해로운 효과들을 전혀 가지지 않았다 (데이타 미도시). 또한, 알부민 saRNA는 α태아단백질 (도 16A) 및 간세포 성장인자 (도 16B)를 코딩하는 유전자들의 mRNA 발현을 하향조절할 수 없었다. 이들 단백질들 둘 다는 간세포 증식과 연관되기 때문에, saRNA에 의한 이들 유전자들의 하향조절은 그들이 생체내에서 증식을 저해할 수 있는 점을 제시한다.
마우스 간들의 면역조직화학은 간 세엽들의 구조가 보존되었고, 유의한 문맥 염증 또는 섬유증이 존재하지 않았고, 담즙관들, 중앙 세정맥들 및 굴들이 현저하지 않았으며, 계란형 세포 증식의 중심이 존재하지 않았고, 간염성 괴사염증 활성의 명확한 중심이 존재하지 않았으며, 컵퍼 (Kuppfer) 세포들의 활성화, 적어도 형태에 의해 검출가능한 것이 존재하지 않았고, 혈관 또는 내피의 변경들이 존재하지 않았으며, 가역적 세포 손상, 예컨대 풍선 팽창 또는 지방증의 징후들이 존재하지 않았고 증가된 간세포성 증식, 예컨대 분열들, 비후된 판들, 핵 군집을 제시하는 관찰들이 전혀 존재하지 않았던 점을 보여주었다. 요약하면, 간의 형태는 알부민 saRNA 올리고뉴클레오타이드들의 투여에 의해 거의 변화되지 않고 그대로 유지되었다.
실시예 6 - 간경변 간들을 가진 래트들에서 CEBPA saRNA로의 형질감염을 통한 혈청 알부민의 상향조절
알부민을 증가하는 CEBPA saRNA 제작물들의 능력은 병든 동물들, 즉 간경변 간들을 가진 래트들 상에서 평가되었다.
알부민 생산에 미치는 AW1 (서열번호 13 및 서열번호 14) 및 AW2 (서열번호 15 및 서열번호 16)의 생체내 효과들을 평가하기 위하여, 간경변 간들을 가진 래트들에게 AW1 및 AW2 제작물들이 투여되었고 알부민 엘라이자가 실시예 2에서 기술된 바와 같이 사용되었다.
AW1 제작물의 투여는 혈청 알부민의 유의한 증가를 유도하였다 (p = 0.0288) (도 14). AW1 및 AW2 데이타를 함께 풀 처리하는 것은 알부민 생산의 증가가 보다 더 유의한 점 (p = 0.0172)을 보여준다 (도 15, 여기에서 풀 처리된 AW1 및 AW2는 "CEBPA"로 표지된다). 이것은 알부민 생산에 미치는 CEBPA saRNA 제작물들의 효과들이 병든 동물들에서 생체내 관찰될 수 있는 점을 나타낸다.
실시예 7 - 래트 종양 모델에서 CEBPA saRNA들로의 형질감염을 통한 종양 발생 및 성장의 저해
20마리의 래트들이 간경변을 유도하도록 사염화탄소 (CCl4)로 처리되었다. 래트들은 40 mL/L의 농도에서 4주 동안 주당 두 번씩 0.2 mL/100g 체중의 CCl4로 처리되었다.
이어서, 그들은 2가지 군들로 무작위로 나뉘었다. 대조군은 꼬리 정맥에 식염수로 주사되었다. 실험군은 CEBPA: AW1 (서열번호 13 및 서열번호 14) 또는 AW2 (서열번호 15 및 서열번호 16)를 상향조절하여 알부민을 상향조절하는 ssRNA의 3번 주사들로 1, 3 및 5일에 주사되었다. 모든 동물들은 saRNA 주사 이후 2주째 희생되었다.
saRNA로 처리된 래트들은 유의하게 더 적은 수의 종양들을 가졌고, 종양들은 대조군 (식염수-처리된) 래트들과 대비하여 더 작았다. 게다가, 종양 발생들의 발병은 saRNA 처리된 군에서 더 늦었다. AW1은 종양 발생 및 성장을 저해하는 데 특히 효과적이었다.
실시예 8 - 동물 종양 모델에서 알부민-상향조절하는 saRNA들로의 형질감염을 통한 종양 발생 및 성장의 저해
실시예 6 또는 7에서 기술된 실험은 간암을 가지도록 화학적으로 유도되었던 마우스들로 반복된다. 간암은 유전자독성 발암원인 DEN을 사용하여 유도된다. DEN은 전형적으로 단일한 복강내 주사 (5 μg/g 체중)의해 12 및 15일령 사이의 마우스들에게 투여된다. 이러한 프로토콜을 사용하여 100%의 B6C3F1 수컷 마우스들은 DEN의 복강내 주사 이후 평균 상 44주째에 HCC들을 발생시킨다. 이어서, 표 2에 나타낸 saRNA들이 투여되고 알부민 발현이 실시예 6에서 기술된 바와 같이 검정된다.
종양 직경들은 디지탈 측정기들로 측정되고, mm3의 종양 부피는 수학식: 부피 = (너비)2 × 길이/2에 의해 계산된다. 종양 발생 및 성장은 대조군 마우스와 대비하여 처리된 마우스들의 종양 부피를 결정하여 분석된다.
실시예 9 - 인간 종양 이종이식을 가진 마우스에서 알부민-상향조절하는 saRNA들로의 형질감염을 통한 암세포 증식의 저해
인간 간 종양 세포들이 시험관내에서 배양되고, 세척되고, 누드 마우스들 (4 내지 6주령)의 하부 측면 내로 피하로 주사된다 (3.0 ×106개 세포들). 표 2에서 나타낸 saRNA들을 사용한 치료법은 종양들이 약 50 내지 60 mm3의 평균 부피에 도달하고 1 내지 3주 이후에 시작된다. 종양 직경들은 디지탈 측정기들로 측정되고, mm3의 종양 부피는 수학식: 부피 = (너비)2 × 길이/2에 의해 계산된다.
saRNA 투여 및 알부민 발현 검정법들은 실시예 6에서 기술된 바와 같이 수행된다. 종양 발생 및 성장은 대조군 마우스와 대비하여 처리된 마우스들의 종양 부피를 결정하여 분석된다.
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Claims (18)

  1. 표적 유전자의 발현을 상향조절하는 합성 짧은 활성화 RNA (saRNA)로서, 상기 표적 유전자가 HNF4a이고, 상기 saRNA가 이중 가닥이고 서열번호 26, 28, 30, 32, 34 및 36으로부터 선택되는 서열을 가지는 안티센스 가닥을 포함하는, 합성 짧은 활성화 RNA.
  2. 제1항에 있어서, 상기 짧은 활성화 RNA가 서열번호 25, 27, 29, 31, 33 및 35로부터 선택되는 서열을 가지는 센스 가닥을 포함하는, 짧은 활성화 RNA.
  3. 제1항에 있어서, 상기 짧은 활성화 RNA가 이중 가닥이고 서열번호 30을 가지는 안티센스 가닥 및 서열번호 29를 가지는 센스 가닥을 포함하는, 짧은 활성화 RNA.
  4. 제1항에 있어서, 상기 짧은 활성화 RNA의 각각의 가닥이 3' 말단에 3' 돌출 부분을 형성하는 쌍을 이루지 않은 다수의 뉴클레오타이드들을 포함하는, 짧은 활성화 RNA.
  5. 제4항에 있어서, 상기 3' 돌출 부분이 UU 또는 UUU인, 짧은 활성화 RNA.
  6. 제1항의 saRNA로 세포를 형질감염시킴을 포함하는, 세포에서 HNF4a인 표적 유전자의 발현을 상향조절하는 시험관내 방법.
  7. 과다증식성 질환, 또는 저알부민혈증을 특징으로 하는 장애를 치료하는데 사용하기 위한, 제1항의 saRNA를 포함하는 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 과다증식성 질환이 간암 또는 전립선암인, 약제학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 저알부민혈증을 특징으로 하는 장애가 간경변, 간염 또는 부종인, 약제학적 조성물.
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