CN106032532A - 一种小激活rna及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种小激活RNA，所述小激活RNA由包含25～30个核苷酸的正义序列和包含25～30个核苷酸的反义序列组成，所述反义序列中至少有80％的序列与所述正义序列形成互补；所述正义序列或反义序列中包含具有19～25个核苷酸的匹配片段，所述匹配片段至少有80％的序列与靶基因调控序列的片段互补。本发明的作为Dicer底物的小激活RNA能在转录和表观遗传水平激活基因表达，有效地模仿内源性双链小RNA的自然成熟过程，并有效提高RNA激活的效率。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及双链小RNA在RNA激活技术领域的应用。
背景技术
1998年Fire和Mello在线虫中发现了双链小RNA分子(dsRNA)能触发一种进化保守的基因表达沉默机制，该机制被称为RNA干扰(RNAi)，这种小RNA分子被称为小干扰RNA(siRNA)。由于siRNA能够特异性地沉默靶基因的表达，因而被认为非常有希望开发成新的治疗疾病的基因靶向药物。RNA干扰是通过内源性dsRNA分子或者是外源性导入siRNA而触发的。内源性的dsRNA是由更长的单链RNA在形成发卡型结构后被细胞内的一种称为Dicer的蛋白处理而成的。由细胞外将成熟的siRNA引入细胞也可以触发RNA干扰。这些成熟的dsRNA在细胞内被一种称为Argonaute(AGO)的蛋白装载，然后dsRNA引导AGO与细胞浆内序列互补的mRNA序列结合，AGO进而切割并降解mRNA，导致基因表达沉默。2006年Li等发现针对于基因调控序列如启动子的dsRNA能触发与RNA干扰完全相反的作用，即在基因转录及表观遗传水平增加基因表达，并命名该现象为RNA激活(RNAa)，将这种针对基因启动子的小RNA称为小激活RNA(smallactivating RNA,saRNA)。saRNA为小的双链RNA，长度为21个核苷(nt)，并在3’末端含有2个核苷酸的脱氧核糖核酸(DNA)突出。saRNA导入细胞后也需要AGO蛋白参与其作用，与AGO形成saRNA-AGO复合物，该复合物进入胞核后，结合到染色体上的靶位点，例如结合到基因的启动子区域，然后AGO蛋白募集其他蛋白如RNA聚合酶II，组蛋白修饰因子等形成RNA介导的转录激活复合物(RNA-induced transcriptional activation,RITA)，最终触发基因转录增加和表观遗传的活化。除了从细胞外导入，saRNA也存在于细胞内。典型的例子是长度为20-26个核苷酸的微小RNA(miRNA)。miRNA由基因组转录生成长度为80多到几千个核苷酸的原miRNA(primarymiRNA)。在经过Drosha/DGCR8复合物处理后，原miRNA成为长度为80核苷酸左右的miRNA前体(precursor miRNA)。前体miRNA经过Exportin5转运到胞浆，经过一种被称为Dicer的酶处理，而生成成熟的miRNA。这些miRNA也可以通过RNA激活机制参与基因表达调控。由于RNA激活能够有目的地激活基因表达，因此RNA激活可以被用作一种分子工具来研究基因功能，治疗各种疾病如癌症，及对细胞进行重新编程。
在申请号为US 60/671,666、授权专利号为8,877,721的美国专利申请，以及申请号为PCT/US2006/013559的专利申请中公开了一种将至少一种saRNA分子导入细胞核内来激活目的基因表达的方法。该saRNA分子包含一条和基因的非编码区互补的核糖核苷酸分子。saRNA结合的区域被选择用来激活基因的表达。在核糖核苷酸的3’端通常有两个突出碱基，且不和目的基因的非编码区互补，比如两个脱氧核糖核苷酸dTdT。核苷酸分子的互补区域大于14个碱基，少于21个碱基。saRNA分子是一种双链分子，它的第二条链和第一条链互补形成双链，在两条链的3’端至少有2个突出碱基。saRNA分子也可以以单链分子的形式存在，这种单链分子可以形成双链结构。这种单链核酸分子的第一部分区域由核糖核苷酸组成，并和目的基因的非编码区互补结合，第二部分区域和第一部分区域互补，形成双链结构。在这种单链核酸分子的3’端至少有两个突出碱基。但是，根据上述专利申请设计的saRNA分子存在以下问题：1)设计效率不高，按照上述saRNA设计规则设计saRNA的成功率仅为10％～20％；2)按照上述saRNA设计规则设计的saRNA对靶基因激活效果低下。
尽管RNA激活具有巨大的潜在用途，但目前对于很多基因的RNA激活存在效率低下的问题。一方面可能是因为saRNA需要进入胞核发挥作用；另一方面，也可能是现有技术设计的saRNA与内源性自然发生的saRNA的序列组成、化学结构等方面仍然有较大差别。
发明内容
针对目前saRNA在设计和应用中存在的saRNA设计成功率低以及RNA激活效率低下的问题，本申请提供了一种dsaRNA的设计方法，以提高RNA激活的效率，扩展RNA激活的用途。根据本发明的saRNA实质上为作为Dicer底物的saRNA(dicer substrate saRNA,dsaRNA)，为了与现有技术的saRNA相区分，本发明的发明人将其命名为Dicer底物saRNA，如无特别指明，在本发明中作为Dicer底物的saRNA以dsaRNA表示。
一种小激活RNA，其由包含25～30个核苷酸的正义序列和包含25～30个核苷酸的反义序列组成，所述反义序列中至少有80％的序列与所述正义序列互补；所述正义序列或反义序列包含具有19～25个核苷酸的匹配片段，所述匹配片段中至少有80％的序列与靶基因调控序列的靶位点匹配。应当理解，本发明所述的靶基因调控序列是指位于细胞核内的DNA上，对于基因转录启动或者延伸起增强作用，或者能通过表观遗传机制对基因转录起正性调控作用的DNA序列。
优选地，所述正义序列和/或反义序列还含有1-5个脱氧核糖核苷酸；优选地，所述正义序列和/或反义序列中位于3’末端的2个核苷酸为脱氧核糖核苷酸。发明人在研究中发现在正义序列和/或反义序列中加入脱氧核糖核苷酸可以增加dsaRNA对细胞内RNA酶降解的抵抗，增强其稳定性。
优选地，所述靶基因调控序列片段是靶基因启动子序列片段；优选地，所述靶基因启动子序列片段选自自靶基因转录起始点起上游前5000个碱基到自靶基因转录起始点起上游前一个碱基形成的启动子区域。申请人在研究中发现由于该区域含有基因转录所需的特定序列，包括RNA聚合酶或者转录因子结合位点，从而使针对该区域设计的dsaRNA具有更高的激活效率。
根据本发明的一个实施方案中，所述dsaRNA的靶基因为人基因p21；优选地，所述靶基因的靶位点序列选自SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:69。
在根据本发明的一个实施方案中，所述dsaRNA的正义序列和反义序列选自以下组合之一：
正义序列为SEQ ID NO:2，反义序列为SEQ ID NO:3；
正义序列为SEQ ID NO:4，反义序列为SEQ ID NO:5；
正义序列为SEQ ID NO:6，反义序列为SEQ ID NO:7；
正义序列为SEQ ID NO:8，反义序列为SEQ ID NO:9；
正义序列为SEQ ID NO:10，反义序列为SEQ ID NO:11；
正义序列为SEQ ID NO:12，反义序列为SEQ ID NO:13。
在根据本发明的一个实施方案中，所述靶基因为人胰-十二指肠同源盒基因PDX1；优选地，针对所述人胰-十二指肠同源盒基因PDX1的dsaRNA的正义序列和反义序列选自以下组合之一：
正义序列为SEQ ID NO:54，反义序列为SEQ ID NO:55；
正义序列为SEQ ID NO:56，反义序列为SEQ ID NO:57；
正义序列为SEQ ID NO:58，反义序列为SEQ ID NO:59；
正义序列为SEQ ID NO:60，反义序列为SEQ ID NO:61；
正义序列为SEQ ID NO:62，反义序列为SEQ ID NO:63。
在根据本发明的一个实施方案中，所述靶基因为人的基因NKX3.1；优选地，针对所述基因NKX3.1的小激活RNA的正义序列和反义序列选自以下组合之一：
正义序列为SEQ ID NO:70，反义序列为SEQ ID NO:71；
正义序列为SEQ ID NO:72，反义序列为SEQ ID NO:73；
正义序列为SEQ ID NO:74，反义序列为SEQ ID NO:75；
正义序列为SEQ ID NO:76，反义序列为SEQ ID NO:77；
正义序列为SEQ ID NO:78，反义序列为SEQ ID NO:79。
本发明进一步提供了上述的小激活RNA的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)由靶基因的启动子序列片段选取长度为19～25nt的序列作为靶位点；
2)合成与步骤1)所述的靶位点对应的核苷酸序列作为基础序列，在所述基础序列的两侧添加核苷酸至长度为25～30nt，得到正义序列；
3)合成长度为25～30nt的反义序列，并使所述反义序列中至少有80％的序列与步骤2)得到的正义序列互补；
4)将步骤2)得到的正义序列与步骤3)得到的反义序列以相同的摩尔数在RNA退火缓冲液中混合，加热至97℃，然后自然冷却至室温，即得到双链的小激活RNA。
在根据本发明的一个实施方案中，在步骤2)中，合成所述正义序列和/或反义序列时加入1～5个脱氧核糖核苷酸；优选地，所述正义序列和/或反义序列中位于3’末端的2个核苷酸为脱氧核糖核苷酸。
另一方面，根据本发明的小激活RNA可应用于制备增加靶基因表达的药物，优选为应用于制备抗肿瘤药物。
再一方面，本发明还提供一种增加靶基因表达的方法，该方法包括将根据本发明的作为Dicer底物的小激活RNA引入受试者的细胞。
又一方面，本发明还提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，该方法包括将根据本发明的作为Dicer底物的小激活RNA引入具有患有肿瘤风险和/或患有肿瘤的受试者的细胞；优选地，所述肿瘤选自膀胱癌、前列腺癌及肝癌。
本发明的发明人在研究中发现，细胞内存在内源性的双链小RNA，它们是从更长的单链RNA经过多步处理而生成的。这些处理过程需要多个RNA酶的参与。最后一步处理是包含27-70个核苷酸左右的具有发卡结构的RNA被一种称为Dicer酶的蛋白处理生成成熟的、包含21～22个核苷酸的双链小RNA。因此，本发明人在研究中发现通过设计并合成比现有技术中的21个核苷酸的saRNA更长的dsaRNA，当dsaRNA导入细胞后，申请人发现它们会被Dicer酶处理，生成了更自然saRNA，因而可以更有效地模仿内源性双链小RNA的自然成熟过程，并有效地提高了RNA激活的效率。
附图说明
图1a～b是根据本发明制备的dsaP21在p21基因启动子上的位置以及序列信息。其中，图1a显示dsaP21在人p21启动子区域的分布。图1b显示设计的dsaP21核酸双链序列信息(黑色加粗的碱基表示脱氧核糖核苷酸)。
图2是显示根据本发明制备的dsaRNA激活p21mRNA表达效果的条形图。
图3是显示根据本发明制备的dsaRNA激活p21mRNA表达效果的条形图。
图4是将根据本发明制备的dsaP21应用于抑制肿瘤细胞生长的效果的条形图，表明dsaRNA能有效抑制肿瘤细胞生长。
图5是将本发明制备的dsaP21转染PC-3细胞后抑制肿瘤细胞生长的细胞形态图，表明dsaRNA能有效抑制肿瘤细胞增殖。
图6是显示本发明制备的长度为23个核苷酸的核酸分子激活p21mRNA表达效果的条形图。
图7是显示本发明制备的长度为35个核苷酸的核酸分子激活p21mRNA表达效果的条形图。
图8是显示本发明制备的dsaPDX1激活非肿瘤相关基因PDX1mRNA表达效果的条形图。
图9是显示本发明制备的dsaNKX3.1激活前列腺癌细胞PC-3mRNA表达的效果条形图。
图10是将本发明制备的dsaNKX3.1转染PC-3细胞后抑制肿瘤细胞生长的细胞形态图，表明dsaRNA能有效抑制肿瘤细胞增殖。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，现结合附图和实施例进一步阐述本发明，应当理解，本发明的具体实施例仅是用于说明目的，而非对本发明的限制。
实施例1
材料和方法
1.Dicer底物saRNA(dsaRNA)的设计：
本发明的dsaRNA的靶位点的选择基于以下的原则：1.选取的靶序列为基因的正义序列；2.指导RNA链(guide RNA strand)的5’端和靶序列的3’端结合；3.靶序列的GC含量为40-65％；4.避免靶序列包含有4个及以上连续重复的碱基序列；5.靶序列的3’比5’端的热动力学稳定性低。6.选取的靶位点应该避免CpG岛以及高GC的区域。
在基因启动子区域，设计的靶位点的序列长度为19个到25个碱基。选取的基因启动子区域为转录起始位点上游5000个碱基到基因转录起始位点前一个碱基。
以p21基因为例，从ENSEMBL基因组数据库下载人p21(CDKN1A)启动子序列片段(SEQ ID NO:1)，从-1000位点到转录起始位点共1000碱基对(bp)。以该序列片段为模板，设计6个saRNA靶位点(如图1a所示)，每个靶位点的序列长度为25个碱基，具体命名如下：
dsaP21-1靶序列：SEQ ID NO:645’-GCTCCAGGTGCTTCTGGGAGAGGTG-3’
dsaP21-2靶序列：SEQ ID NO:655’-GTATTAATGTCATCCTCCTGATCTT-3’
dsaP21-3靶序列：SEQ ID NO:665’-CCTGGAGAGTGCCAACTCATTCTCC-3’
dsaP21-4靶序列：SEQ ID NO:675’-GGATCAGTGGGAATAGAGGTGATAT-3’
dsaP21-5靶序列：SEQ ID NO:685’-CCAGATTTGTGGCTCACTTCGTGGG-3’
dsaP21-6靶序列：SEQ ID NO:695’-TGCCAACTCATTCTCCAAGTAAAAA-3’。
根据上述靶位点合成dsaRNA正义序列和反义序列，正义序列前23个为核糖核苷酸，最后两个为脱氧核糖核苷酸，反义序列长度为27个核苷酸，全部为核糖核苷酸。靶位点的位置以及合成的dsaRNA正义序列和反义序列如图1a-图1b所示。设计的6条dsaRNA具体如下：dsaP21-1(正义序列：SEQ ID NO:2GCUCCAGGUG CUUCUGGGAG AGGtg；反义序列：SEQ IDNO:3CACGAGGUCC ACGAAGACCC UCUCCAC),dsaP21-2(正义序列：SEQ ID NO:4GUAUUAAUGU CAUCCUCCUG AUCtt；反义序列：SEQ IDNO:5UACAUAAUUA CAGUAGGAGG ACUAGAA)，dsaP21-3(正义序列：SEQ ID NO:6CCUGGAGAGU GCCAACUCAU UCUcc；反义序列：SEQ IDNO:7GAGGACCUCUCACGGUUGAG UAAGAGG),dsaP21-4(正义序列：SEQ ID NO:8GGAUCAGUGG GAAUAGAGGU GAUat；反义序列：SEQ IDNO:9UCCCUAGUCA CCCUUAUCUC CACUAUA)，dsaP21-5(正义序列：SEQ ID NO:10CCAGAUUUGU GGCUCACUUCGUGgg；反义序列：SEQ IDNO:11UCGGUCUAAA CACCGAGUGA AGCACCC)，dsaP21-6(正义序列：SEQ ID NO:12UGCCAACUCA UUCUCCAAGUAAAaa；反义序列：SEQ IDNO:13UCACGGUUGA GUAAGAGGUU CAUUUUU)；dsaControl:(正义序列：SEQ ID NO:14AGTCACUACU GAGUGACAGUAGAat；反义序列：SEQID NO:15AUUCUACUGU CACUCAGUAG UGACUGC)。
2.根据本发明的dsaRNA与常规设计的saRNA的RNA激活效率的比较
本申请的发明人同时设计了6个与上述dsaRNA相对应的长度为21个核苷酸的标准saRNA，其中正义序列和反义序列的末端两位均为脱氧核糖核苷酸，具体序列为：
saP21-1(正义序列：SEQ ID NO:16GCUCCAGGUGCUUCUGGGAGAdTdT；反义序列：SEQ ID NO:17UCUCCCAGAAGCACCUGGAGCdTdT)。saP21-2(正义序列：SEQ ID NO:18GUAUUAAUGUCAUCCUCCUGAdTdT；反义序列：SEQ ID NO:19UCAGGAGGAUGACAUUAAUACdTdT)。saP21-3(正义序列：SEQ ID NO:20CCUGGAGAGUGCCAACUCAUUdTdT；反义序列：SEQ ID NO:21AAUGAGUUGGCACUCUCCAGGdTdT)。saP21-4(正义序列：SEQ ID NO:22GGAUCAGUGGGAAUAGAGGUGdTdT；反义序列：SEQ ID NO:23CACCUCUAUUCCCACUGAUCCdTdT)。saP21-5(正义序列：SEQ ID NO:24CCAGAUUUGUGGCUCACUUCGdTdT；反义序列：SEQ ID NO:25CGAAGUGAGCCACAAAUCUGGdTdT)。saP21-6(正义序列：SEQ ID NO:26UGCCAACUCAUUCUCCAAGUAdTdT；反义序列：SEQ ID NO:27UACUUGGAGAAUGAGUUGGCAdTdT)。
3.dsaRNA及saRNA合成：
分别化学合成上述dsaRNA的单链，进行去盐纯化，然后分别将相同摩尔数的含有互补区域的两条单链(即正义序列和反义序列)加入同一RNA退火缓冲液中，加热到97℃，然后使溶液自然冷却到室温，即得到双链的dsaRNA。
4.细胞培养及转染：
取指数生长期人前列腺癌细胞株PC-3,用胰酶消化，然后悬浮在含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基内，以4x 105细胞/孔的密度种入6孔细胞培养板，其中培养基为2ml。取6.25μl浓度为20μM的dsaRNA,与243.5μl Opti-MEM培养基(购自Lifetech公司)混合，同时，用245μl Opti-MEM稀释5μl Lipofectamine RNAiMax(购自Lifetech公司)，将稀释后的dsaRNA与RNAiMax混合，室温放置20分钟。然后将转染混合液(500μl)加入6孔板的细胞中。混合均匀后，将细胞放入CO2培养箱，在37℃的5％CO2浓度下培养72-96小时。
5.细胞总RNA提取：
细胞总mRNA提取采用Qiagen公司RNeasy试剂盒进行。在细胞转染72-96小时后，移去培养基，加入1ml PBS缓冲液清洗细胞，然后加入350μlRTL缓冲液，收集细胞裂解液，加入等量70％乙醇，最后加入50μl DEPC处理水，离心收集RNA。所得RNA溶液采用Nanodrop仪测定其浓度。
6.cDNA合成：
取1μg RNA，加入DEPC处理水至10μl，加入1μl(0.5μg)Oligo-dT引物，70摄氏度孵育10分钟，转移至冰上，然后加入2.5μl RT反应缓冲液，1.0μl 25mM dNTP，0.5μl RNA酶抑制剂，加水至25μl。反应在45摄氏度进行1小时，然后70摄氏度10分钟。最后用去RNA酶水将所得cDNA溶解稀释至100μl。
7.mRNA表达分析：
mRNA表达分析用Power Sybrgreen qPCR混合液(购自Lifetech公司)及ABI 7500快速实时定量PCR扩增仪进行。取1μl cDNA产物，加入1μl0.67μM引物，3μl水，5μl Sybrgreen试剂。反应在PCR扩增仪中用标准程序进行。同时扩增GAPDH基因作为内部对照。正义引物为：SEQ ID NO:285’-ATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3’，反义引物为：SEQ ID NO:295’-TTCTCCATGGTGGTGAAGACG-3’。
8.细胞增殖分析：
细胞转染在96孔板进行。细胞增殖的检测采用Promega公司提供的CellTiterAQueous One Solution Cell Proliferation Assay试剂盒完成。在细胞转染后0-6天，每天进行一次细胞增殖分析，共6个时间点。分析前在培养基中加入20μl solution one试剂，然后在37摄氏度继续培养细胞30分钟，用酶标仪在490nm波长测量吸光值。
9.细胞形态分析：
将PC-3肿瘤细胞均匀接种在6孔板种，次日转染细胞，在转染后72小时在相差显微镜下观察并拍照记录。
结果
1.dsaRNA触发RNAa
为了评价dsaRNA的RNAa活性，用dsaRNA转染PC-3细胞，Mock和dsaControl作为对照，dsaControl的作为非特异性dsaRNA的对照，为一段不和细胞内任何基因序列互补的分子。。转染后72小时收集细胞，提取细胞总RNA，进行逆转录反应获得cDNA，用cDNA为模板，用人p21基因引物实时定量PCR扩增p21mRNA，同时扩增GAPDH作为内部对照。如图2所示，在设计的6个dsaRNA中，其中3个(dsaP21-4、dsaP21-5、dsaP21-6)能激活p21mRNA表达达到3倍以上。
为了比较dsaRNA与常规设计的saRNA的RNA激活功效，用saRNA转染PC-3细胞，Mock和dsaControl作为对照。转染后72小时收集细胞，按上述方法分析p21mRNA表达。如图3所示，在设计的6个saRNA中，只有2个(saP21-4)能激活p21mRNA表达，激活倍数为1.5～2.2倍。
2.dsaRNA抑制肿瘤细胞增殖
p21基因是重要的细胞周期负性调控基因，因此具有肿瘤抑制作用。为了评价p21dsaRNA对肿瘤细胞生长的影响，用p21dsaRNA转染PC-3细胞，在转染后72小时采用Promega公司CellTiterAQueous One Solution CellProliferation Assay试剂盒分析细胞活性。如图4所示，dsaP21-4，dsaP21-5，dsaP21-6能够显著降低PC-3细胞的存活率。而且这种效应是随着dsaRNA对p21基因的促进表达的能力相关联。
3.dsaRNA抑制肿瘤细胞生长
将PC-3细胞均匀地培养在6孔板中，将设计的靶向p21启动子不同位点的dsaRNA分别转染PC-3细胞，设置空白Mock对照组和dsaControl对照组，72小时后采用相差显微镜观察细胞。如图5所示，转染了dsaP21-4，dsaP21-5，dsaP21-6的实验组PC-3生长速度放缓，数目显著比对照组数目少。转染了dsaP21-4的实验组细胞数比转染了dsaP21-5的实验组细胞多，而比转染了dsaP21-6的实验组细胞数目少。说明dsaP21的抑制细胞生长的效应与dsaP21促进p21基因表达的能力紧密相关。dsaP21促进p21基因表达的能力越强，其抑制细胞生长的能力就越强。这些说明这种dsaP21是一种有效的抑制肿瘤细胞生长的抑制剂。
相比现有的技术，本发明证实了在Dicer酶的剪切的作用下，从活性saRNA得到的Dicer酶的底物saRNA分子(dsaRNA)可以显著提高靶基因的激活效率。现有的saRNA方法的方法是模拟dicer酶的产物，从而绕过了其与Dicer酶的相互作用。本专利设计出来的dsaRNAs能够提高RNA激活的效能，使靶DNA分子可以更容易和dsaRNA作用，从而更容易，更高效激活目的基因的表达。
实施例2
(一)短于25个核苷酸的saRNA的激活效率
针对p21基因启动子6个位点设计23个核苷酸长度的dsRNA。分别命名为：dsP21-1a，dsP21-2a，dsP21-3a，dsP21-4a，dsP21-5a，dsP21-6a。其序列为：dsP21-1a(正义序列：SEQ ID NO:30GCUCCAGGUGCUUCUGGGAGAGG，反义序列为：SEQ ID NO:31UCUCCCAGAAGCACCUGGAGCAC)；dsP21-2a(正义序列：SEQ ID NO:32GUAUUAAUGUCAUCCUCCUGATC，反义序列为：SEQ ID NO:33UCAGGAGGAUGACAUUAAUACAU)；dsP21-3a(正义序列：SEQ ID NO:34CCUGGAGAGUGCCAACUCAUUCU，反义序列为：SEQ ID NO:35AAUGAGUUGGCACUCUCCAGGAG)；dsP21-4a(正义序列为：SEQ ID NO:36GGAUCAGUGGGAAUAGAGGUGAT，反义序列为：SEQ ID NO:37CACCUCUAUUCCCACUGAUCCCT)；dsP21-5a(正义序列为：SEQ ID NO:38CCAGAUUUGUGGCUCACUUCGTG，反义序列为：SEQ ID NO:39CGAAGUGAGCCACAAAUCUGGCT)；dsP21-6a(正义序列为：SEQ ID NO:40UGCCAACUCAUUCUCCAAGUAAA，反义序列为：SEQ ID NO:41UACUUGGAGAAUGAGUUGGCACT)，其中正义序列的最后两个碱基为脱氧核糖核苷酸。结果表明，如图6所示，dsP21-3a，dsP21-5a，dsP21-6a虽然可以激活p21基因的表达，但其激活的效率明显较低。
(二)长于30个核苷酸的激活效率的效果
针对p21基因启动子6个位点设计35个核苷酸长度的dsRNA，分别命名为：dsP21-1b，dsP21-2b，dsP21-3b，dsP21-4b，dsP21-5b，dsP21-6b。其序列为：dsaP21-1b(正义序列：SEQ ID NO:42GUCUAGGUGCUCCAGGUGCUUCUGGGAGAGGUGAC，反义序列为：SEQ ID NO:43CACCUCUCCCAGAAGCACCUGGAGCACCUAGACAC)；dsaP21-2b(正义序列为：SEQ ID NO:44AUUUUUAUGUAUUAAUGUCA UCCUCCUGAUCUUTT，反义序列为：SEQ ID NO:45AAGAUCAGGAGGAUGACAUU AAUACAUAAAAAUTC)；dsaP21-3b(正义序列为：SEQ ID NO:46UGUGUCCUCCUGGAGAGUGCCAACUCAUUCUCCAA，反义序列为：SEQ ID NO:47GGAGAAUGAGUUGGCACUCUCCAGGAGGACACAGC)；dsaP21-4b(正义序列为：SEQ ID NO:48CUAGUGAGGGAUCAGUGGGAAUAGAGGUGAUAUTG，反义序列为：SEQ ID NO:49AUAUCACCUCUAUUCCCACUGAUCCCUCACUAGGT)；dsaP21-5b(正义序列为：SEQ ID NO:50AAAAAAAGCCAGAUUUGUGGCUCACUUCGUGGGGA，反义序列为：SEQ ID NO:51CCCACGAAGUGAGCCACAAAUCUGGCUUUUUUUAC)；dsaP21-6b(正义序列为：SEQ ID NO:52CUGGAGAGUGCCAACUCAUUCUCCAAGUAAAAAAA，反义序列为：SEQ ID NO:53UUUUUACUUGGAGAAUGAGUUGGCACUCUCCAGGA),其中正义序列最后两个为脱氧核糖核苷酸。
结果表明，如图7所示，dsP21-3b，dsP21-5b，dsP21-6b虽然可以激活p21基因的表达，但其激活的效率明显较低。
实施例3
根据本发明专利设计的dsaRNA具有高效激活胰-十二指肠同源盒基因(PDX1)的表达。PDX1基因是调节胰岛功能的重要基因，同时PDX1还可以促使非β细胞如肝细胞中的胰岛素基因表达，对治疗糖尿病具有重要的应用价值。我们在PDX1基因启动子区域设计了针对不同位点的dsaRNA。如下所示的序列中以小写黑体表示dsaRNA序列中的脱氧核糖核苷酸。dsaPDX1-1(正义序列为：SEQ ID NO:54CACACUAUGUCCAUUAUCAAAUA ta，反义序列为：SEQ ID NO:55UAUAUUUGAUAAUGGACAUAGUGUGUU)；dsaPDX1-2(正义序列为：SEQ ID NO:56CCGACAUCUUUGUGGCUGUGAACaa，反义序列为：SEQ ID NO:57UUGUUCACAGCCACAAAGAUGUCGGUU)；dsaPDX1-3(正义序列为：SEQ ID NO:58GACCUAGAGAGCUGGGUCUGCAAac，反义序列为：SEQ ID NO:59GUUUGCAGACCCAGCUCUCUAGGUCAG)；dsaPDX1-4(正义序列为：SEQ ID NO:60ACAACGAAUGCCAGAGUUUCGUGtg，反义序列为：SEQID NO:61CACACGAAACUCUGGCAUUCGUUGUGU)；dsaPDX1-5(正义序列为：SEQ ID NO:62GUACUUGCAGCACAUCCACAAGUaa，反义序列为：SEQ ID NO:63UUACUUGUGGAUGUGCUGCAAGUACUU)，其中正义序列最后两个碱基为脱氧核糖核苷酸。将设计的dsaPDX1分别转染HepG2细胞，使用的dsaPDX1RNA浓度为50nM，转染96小时后收集细胞，提取总RNA，然后检测PDX1基因的表达。实验结果表明，dsaPDX1-1，dsaPDX1-3,dsaPDX1-4可以高效的激活HepG2细胞中PDX1基因的表达(图8)。
实施例4
根据本发明专利设计的dsaRNA具有高效激活NKX3.1基因的表达。NKX3.1是前列腺特异性和雄激素调节基因。在人前列腺组织高度表达，是一种前列腺特异性肿瘤抑制因子，对前列腺癌的治疗具有重要的作用。本发明在NKX3.1启动子设计了针对不同位点的dsaRNA。如下所示的序列中以小写黑体表示dsaRNA序列中的脱氧核糖核苷酸。其中dsaNKX-1(正义序列为：SEQ ID NO:70GAGGAGAGCUGGAGAAGGAGAGGaa，反义序列为：SEQ ID NO:71UUCCUCUCCUUCUCCAGCUCUCCUCCC)；dsaPDX1-2(正义序列为：SEQ ID NO:72AGAGCUAACUGGACUGUUUGUCUtg，反义序列为：SEQ ID NO:73CAAGACAAACAGUCCAGUUAGCUCUUC)；dsaPDX1-3(正义序列为：SEQ ID NO:74CUGUAAUUGGCUCUGACGGUCCUga，反义序列为：SEQ ID NO:75UCAGGACCGUCAGAGCCAAUUACAGGG)；dsaPDX1-4(正义序列为：SEQ ID NO:76AGAGCACCCAGAACUCUCACGGUac，反义序列为：SEQ ID NO:77GUACCGUGAGAGUUCUGGGUGCUCUCU)；dsaPDX1-5(正义序列为：SEQ ID NO:78AGAUAUUGCAGAUCUGAGUUUGCac，反义序列为：SEQ ID NO:79GUGCAAACUCAGAUCUGCAAUAUCUAC)，其中正义序列最后两个碱基为脱氧核糖核苷酸。将设计的dsaNKX分别转染前列腺癌PC-3细胞，使用的dsaNKX RNA浓度为50nM，转染96小时后收集细胞，提取总RNA，然后检测NKX3.1基因的表达。实验结果表明，dsaNKX-1，dsaNKX-2，dsaNKX-3，dsaNKX-4，dsaNKX-5都可以高效的激活PC-3细胞中NKX3.1基因的表达，其中dsaNKX-1和dsaNKX-5激活的效果更明显(图9)，其能有效抑制PC-3细胞的增值(图10)。
尽管已经对本发明的具体实施方式进行了详细说明和描述，但应当认识到，本发明不受所述具体实施方式的限制。在不脱离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改进、修饰和变化，而这些改进、修饰和变化均在本发明的范围之内。
Claims (10)
1.一种小激活RNA，其特征在于，所述的小激活RNA由包含25～30个核苷酸的正义序列和包含25～30核苷酸的反义序列组成，所述反义序列中至少有80％的序列与所述正义序列形成互补；所述正义序列或反义序列中包含具有19～25个核苷酸的靶基因调控序列匹配片段，所述匹配片段至少有80％的序列与靶基因调控序列的靶位点匹配。
2.如权利要求1所述的小激活RNA，其特征在于，所述正义序列和/或反义序列中还含有1-5个脱氧核糖核苷酸；优选地，所述正义序列和/或反义序列中位于3’末端的2个核苷酸为脱氧核糖核苷酸。
3.如权利要求1或2所述的小激活RNA，其特征在于，所述靶基因调控序列片段是靶基因启动子序列片段；优选地，所述靶基因启动子序列片段为靶基因转录起始点上游5000个碱基到靶基因转录起始点前一个碱基形成的启动子区域。
4.如权利要求1～3中任一项所述的小激活RNA，其特征在于，所述靶基因为人基因p21；优选地，所述靶基因调控序列的靶位点序列选自SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:69中的一个。
5.如权利要求4所述的小激活RNA，其特征在于，所述小激活RNA的正义序列和反义序列选自以下组合之一：
正义序列为SEQ ID NO:2，反义序列为SEQ ID NO:3；
正义序列为SEQ ID NO:4，反义序列为SEQ ID NO:5；
正义序列为SEQ ID NO:6，反义序列为SEQ ID NO:7；
正义序列为SEQ ID NO:8，反义序列为SEQ ID NO:9；
正义序列为SEQ ID NO:10，反义序列为SEQ ID NO:11；或者，
正义序列为SEQ ID NO:12，反义序列为SEQ ID NO:13。
6.如权利要求1-3中任一项所述的小激活RNA，其特征在于，所述靶基因为人胰-十二指肠同源盒基因PDX1；优选地，针对所述人胰-十二指肠同源盒基因PDX1的小激活RNA的正义序列和反义序列选自以下组合之一：
正义序列为SEQ ID NO:54，反义序列为SEQ ID NO:55；
正义序列为SEQ ID NO:56，反义序列为SEQ ID NO:57；
正义序列为SEQ ID NO:58，反义序列为SEQ ID NO:59；
正义序列为SEQ ID NO:60，反义序列为SEQ ID NO:61；
正义序列为SEQ ID NO:62，反义序列为SEQ ID NO:63。
7.如权利要求1-3中任一项所述的小激活RNA，其特征在于，所述靶基因为人的基因NKX3.1；优选地，针对所述基因NKX3.1的小激活RNA的正义序列和反义序列选自以下组合之一：
正义序列为SEQ ID NO:70，反义序列为SEQ ID NO:71；
正义序列为SEQ ID NO:72，反义序列为SEQ ID NO:73；
正义序列为SEQ ID NO:74，反义序列为SEQ ID NO:75；
正义序列为SEQ ID NO:76，反义序列为SEQ ID NO:77；
正义序列为SEQ ID NO:78，反义序列为SEQ ID NO:79。
8.如权利要求1-7中任一项所述的小激活RNA的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)在靶基因的启动子序列片段选取包含19～25个碱基的序列作为靶位点；
2)合成与步骤1)所述的靶位点对应的RNA序列作为基础序列，在所述基础序列的一侧或两侧添加核苷酸至长度为25～30个核苷酸，得到正义序列；
3)合成长度为25～30nt的反义序列，并使所述反义序列至少有80％的序列与步骤2)得到的正义序列互补；
4)将步骤2)得到的正义序列与步骤3)得到的反义序列以相同的摩尔数在RNA退火缓冲液中混合，加热至97℃，然后自然冷却至室温，即得到双链的小激活RNA。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，合成所述正义序列和/或反义序列时加入至少一个脱氧核糖核苷酸，优选地，合成所述正义序列和/或反义序列时3’末端两个核苷酸为脱氧核糖核苷酸。
10.如权利要求1～6所述的小激活RNA在制备增加靶基因表达的药物中的应用，优选为在制备抗肿瘤药物中的应用；
优选地，所述肿瘤选自膀胱癌、前列腺癌、及肝癌。
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Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106599615A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-04-26 | 广东顺德中山大学卡内基梅隆大学国际联合研究院 | 一种预测miRNA靶基因的序列特征分析方法 |
| WO2019196883A1 (zh) * | 2018-04-10 | 2019-10-17 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 一种激活p21基因表达的方法 |
| CN110959042A (zh) * | 2018-04-10 | 2020-04-03 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 一种新型小激活rna |
| WO2020135677A1 (zh) * | 2018-12-29 | 2020-07-02 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 寡聚核酸分子及其应用 |
| WO2020151726A1 (zh) * | 2019-01-24 | 2020-07-30 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 用于皮肤护理的寡聚核酸 |
| WO2020221309A1 (zh) * | 2019-04-30 | 2020-11-05 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 寡聚核酸分子及其在急性间歇性卟啉症治疗中的应用 |
| WO2021000928A1 (zh) * | 2019-07-04 | 2021-01-07 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 激活atoh1基因的寡聚核酸分子及其应用 |
| WO2021052470A1 (zh) * | 2019-09-20 | 2021-03-25 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 用于治疗血小板减少症的核酸分子及其应用 |
| WO2021249064A1 (zh) * | 2020-06-10 | 2021-12-16 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 靶向mitf基因的核酸分子及其用途 |
| WO2022166815A1 (zh) * | 2021-02-07 | 2022-08-11 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 用于治疗增殖性玻璃体视网膜病变的双链核酸分子及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006113246A3 (en) * | 2005-04-15 | 2010-09-16 | The Regents Of The University Of California | Small activating rna molecules and methods of use |
| CN102803494A (zh) * | 2009-04-21 | 2012-11-28 | 巴斯夫植物科学有限公司 | Rna介导的植物中基因表达的诱导 |
| CN103842508A (zh) * | 2011-06-21 | 2014-06-04 | 米纳治疗有限公司 | 白蛋白产生和细胞增殖 |
| CN104114189A (zh) * | 2011-12-05 | 2014-10-22 | 菲吉尼克斯公司 | 用于治疗前列腺病的靶向en2、pax2和/或defb1 |
-
2015
- 2015-03-17 CN CN201510115335.2A patent/CN106032532A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006113246A3 (en) * | 2005-04-15 | 2010-09-16 | The Regents Of The University Of California | Small activating rna molecules and methods of use |
| CN102803494A (zh) * | 2009-04-21 | 2012-11-28 | 巴斯夫植物科学有限公司 | Rna介导的植物中基因表达的诱导 |
| CN103842508A (zh) * | 2011-06-21 | 2014-06-04 | 米纳治疗有限公司 | 白蛋白产生和细胞增殖 |
| CN104114189A (zh) * | 2011-12-05 | 2014-10-22 | 菲吉尼克斯公司 | 用于治疗前列腺病的靶向en2、pax2和/或defb1 |
Cited By (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106599615B (zh) * | 2016-11-30 | 2019-04-05 | 广东顺德中山大学卡内基梅隆大学国际联合研究院 | 一种预测miRNA靶基因的序列特征分析方法 |
| CN106599615A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-04-26 | 广东顺德中山大学卡内基梅隆大学国际联合研究院 | 一种预测miRNA靶基因的序列特征分析方法 |
| CN110959042B (zh) * | 2018-04-10 | 2022-10-18 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 一种新型小激活rna |
| WO2019196883A1 (zh) * | 2018-04-10 | 2019-10-17 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 一种激活p21基因表达的方法 |
| CN110678549A (zh) * | 2018-04-10 | 2020-01-10 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 一种激活p21基因表达的方法 |
| CN110959042A (zh) * | 2018-04-10 | 2020-04-03 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 一种新型小激活rna |
| CN113584027A (zh) * | 2018-04-10 | 2021-11-02 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 一种激活p21基因表达的方法 |
| CN112996913B (zh) * | 2018-12-29 | 2022-01-04 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 寡聚核酸分子及其应用 |
| CN112996913A (zh) * | 2018-12-29 | 2021-06-18 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 寡聚核酸分子及其应用 |
| WO2020135677A1 (zh) * | 2018-12-29 | 2020-07-02 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 寡聚核酸分子及其应用 |
| CN113039273B (zh) * | 2019-01-24 | 2022-12-06 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 用于皮肤护理的寡聚核酸 |
| WO2020151726A1 (zh) * | 2019-01-24 | 2020-07-30 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 用于皮肤护理的寡聚核酸 |
| CN113039273A (zh) * | 2019-01-24 | 2021-06-25 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 用于皮肤护理的寡聚核酸 |
| CN113260702A (zh) * | 2019-04-30 | 2021-08-13 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 寡聚核酸分子及其在急性间歇性卟啉症治疗中的应用 |
| WO2020221309A1 (zh) * | 2019-04-30 | 2020-11-05 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 寡聚核酸分子及其在急性间歇性卟啉症治疗中的应用 |
| WO2021000928A1 (zh) * | 2019-07-04 | 2021-01-07 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 激活atoh1基因的寡聚核酸分子及其应用 |
| WO2021052470A1 (zh) * | 2019-09-20 | 2021-03-25 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 用于治疗血小板减少症的核酸分子及其应用 |
| WO2021249064A1 (zh) * | 2020-06-10 | 2021-12-16 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 靶向mitf基因的核酸分子及其用途 |
| WO2022166815A1 (zh) * | 2021-02-07 | 2022-08-11 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 用于治疗增殖性玻璃体视网膜病变的双链核酸分子及其应用 |
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