CN111671913B - 一种量子点-小核酸偶联物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，公开了一种量子点‑小核酸偶联物及其用途。通过化学键偶联小核酸和量子点，能够提高小核酸的稳定性，增强细胞对小核酸的提取，提升小核酸对目标基因的调节能力，同时具有示踪小核酸的潜力。本发明的量子点‑小核酸具有治疗肿瘤、神经退行性疾病的用途。

Description

一种量子点-小核酸偶联物及其用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种量子点-小核酸偶联物的制备及其用途。
背景技术
小核酸，包括小干扰RNA，小激活RNA，反义寡核苷酸，微核糖核酸microRNA等，能够参与相关基因的调控表达，具有广泛的生物学功能，能够用于肿瘤、心血管、糖尿病、神经退行性以及感染性疾病等诸多疾病的治疗。但是由于小核酸带有较强的负电不易被细胞或组织摄取，并且极易降解，因此直接应用裸小核酸导致体外基因调控效率低，体内治疗相关疾病难度较大。研究发现，量子点能够增强细胞对小核酸的摄取，进而提高其基因调控的效率。并且，量子点自身具有独特的光学性质，能够实时示踪小核酸与细胞的相互作用以及细胞内的一系列过程。然而，目前量子点主要通过静电吸附的原理递送小核酸，静电吸附相对容易解离，增强细胞摄取的能力和示踪过程并不稳定，仍有优化的空间。
因此，现有技术存在的问题是：通过静电吸附形成的量子点-小核酸混合物质量不可控，混合物自身的不稳定性导致增强细胞摄取的能力和示踪过程并不稳定，需要进一步优化。
量子点与抗体共价偶联方法，包括表面羧基化量子点与抗体氨基酸残基的氨基偶联、表面氨基化量子点通过交联剂琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯(SMCC)与抗体氨基酸氨基的巯基偶联、酰肼化的量子点与高碘酸氧化、生成醛基的抗体偶联等。目前存在的问题主要是量子点-抗体偶联物的稳定性和纯化。如何控制量子点、抗体及催化剂之间的比例，得到稳定性好的目标量子点-抗体偶联物。此外，量子点-抗体偶联物反应体系，产物和原料性质类似，分离纯化效率不高，影响产物的质量、稳定性以及后续使用。量子点-小核酸反应可控性好，纯化相对简单，具有比较大的优势。
发明内容
为了克服背景技术中的问题，提供一种量子点-小核酸偶联物及其用途，本发明通过将小核酸与量子点通过化学键连接形成偶合物，优于目前采用的静电吸附方式，增强小核酸稳定性的同时，提升细胞对小核酸摄取的能力和示踪过程的稳定性。本发明针对这一问题，设计化学反应通过化学键偶联量子点与小核酸，难点在于反应条件的控制，维持量子点的荧光性质以及小核酸的完整性，使得到的量子点与小核酸偶联物既能发挥量子点的示踪能力又能发挥小核酸的基因调控作用。
为了实现上述目的，本发明是按照以下方式实现的：
一种量子点-小核酸偶联物，表面功能化的量子点与小核酸通过化学反应偶联得到量子点-小核酸偶联物。
所述的化学反应，包括羧基化量子点与氨基化的小核酸通过酰胺反应连接形成量子点-小核酸偶联物。
炔基功能化的量子点与叠氮化的小核酸通过加成反应连接形成量子点-小核酸偶联物。
马来酰亚胺功能化的量子点与巯基化的小核酸通过加成反应连接形成量子点-小核酸偶联物。
氨基化量子点与羧基化的小核酸通过酰胺反应连接形成量子点-小核酸偶联物。
叠氮化的量子点与叠炔基功能化的小核酸通过加成反应连接形成量子点-小核酸偶联物。
巯基化的量子点与马来酰亚胺功能化的小核酸通过加成反应连接形成量子点-小核酸偶联物等。
小核酸的碱基对数目≤100。
小核酸的3’或5’末端是功能化的。
小核酸的3’或5’末端的功能化基团为羟基、羧基、氨基、巯基、炔基、马来酰亚胺、叠氮基团任意一种。
量子点-小核酸偶联物的制备方法包括，
步骤1.取需反应的量子点与对应的小核酸，量子点与小核酸的摩尔比为1:100；
步骤2.加入催化剂，在4摄氏度、避光条件下搅拌反应过夜；
步骤3.离心去掉沉淀，超滤分离，纯化得目的物量子点-小核酸偶联物。
量子点-小核酸用于疾病的诊疗。
量子点-小核酸具有治疗肿瘤、神经退行性疾病的用途。
本发明的有益效果：
(1)化学反应所得量子点-小核酸偶联物能够增强细胞对小核酸的吸收，实现对小核酸的有效递送并发挥其干扰或激活目标基因，从而使量子点-小核酸偶联物具有用于疾病治疗的潜力。原癌基因激活导致恶性肿瘤的发生发展，通过siRNA干扰或抑制相应的原癌基因，可以达到抑制恶性肿瘤发生发展的目的；抑癌基因失活也会因其抑制肿瘤的功能发生障碍，从而导致恶性肿瘤的发生发展，通过saRNA激活抑癌基因，使其表达相应的产物发挥其抑制肿瘤的作用，也能达到抑制恶性肿瘤发生发展的目的；神经退行性疾病患者常出现基因的异常扩增导致疾病的发生，针对特异扩增的基因设计反义寡核苷酸ASO，ASO能够诱导RNA酶特异性地降解相应的信使RNA从而缓解疾病的症状，改善患者生存质量，达到治疗神经退行性疾病的目的。
(2)抗体耦合量子点与本发明相比存在以下区别：本发明需要无RNase或DNase的反应条件；功能化基团，本发明各组分引入的反应基团是人为可控的，抗体耦合量子点功能基团主要来自抗体所含的氨基酸残基；作用机制，本发明可增强细胞对小核酸的摄取，用于探索小核酸在细胞内的分布及与靶点的作用机制，抗体耦合量子点主要用于研究或示踪抗体与细胞膜表面的结合；本发明中小核酸由磷酸二酯键链接各碱基，分子量约10-50kDa，免疫原性较弱，抗体通过肽键链接各氨基酸，分子量约150kDa，免疫原性较强。总体上来讲，本发明反应条件更加严格，但人为可控，用途较广，且预期的不良反应较少，优于抗体耦合量子点：其反应条件相对简单，主要是用抗体本身的氨基酸残基进行耦合反应，用途有限，预期不良反应较多。
附图说明
图1为本发明实施例1中QD-CO-NH-siSPNS2的荧光发射光谱最大发射波长示意图；
图2为本发明实施例1提供的QD-CO-NH-siSPN2能够有效抑制目标基因表达示意图；
图3为本发明实施例2提供的QD-NH-CO-saCEBPA的紫外吸收光谱图；
图4为本发明实施例2提供的QD-NH-CO-saCEBPA能够有效上调目标基因的表达示意图；
图5为本发明实施例3提供的QD-Mal-SH-SAO的紫外吸收光谱图；
图6为本发明实施例3提供的QD-Mal-SH-ASO能够有效抑制目标基因的表达示意图；
图7为本发明的制备流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚、明白，下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
如图7所示，量子点-小核酸偶联物制备方法，包括如下步骤：量子点与小核酸在避光、适当催化剂和温度条件下反应后，分离、纯化得目标产物量子点-小核酸偶联物。
实施例1
取羧基化量子点(QD-COOH)与氨基化靶向SPNS2基因的小干扰RNA(siSPNS-NH2)，QD-COOH与siSPNS2-NH2摩尔比1:100，在催化剂作用下，4摄氏度、避光搅拌反应过夜，离心去掉沉淀后，超滤分离、纯化得量子点-小核酸偶联物(QD-CO-NH-siSPNS2)，荧光发射光谱、紫外吸收光谱、凝胶阻滞实验评价QD-CO-NH-siSPNS2的理化性质，并使用偶联物转染细胞评价其对目标基因的抑制情况。
如图1-图2所示，QD-CO-NH-siSPNS2的荧光发射光谱及对目标基因的干扰情况，图1示出了QD-CO-NH-siSPNS2的荧光发射光谱最大发射波长在653.7nm，图2中QD-CO-NH-siSPNS2处理组的目标蛋白表达对比siSPNS2处理组，明显下调，说明QD-CO-NH-siSPNS2能够增加细胞的摄取，从而达到干扰目标基因SPNS2表达的目的，具有用于抗肿瘤及转移诊疗的潜力。
实施例2
取氨基化量子点(QD-NH2)与羧基化靶向CEBPA基因的小激活RNA(saCEBPA-COOH)，QD-NH2与saCEBPA-COOH摩尔比1:100，在催化剂作用下，4摄氏度、避光搅拌反应过夜，离心去掉沉淀后，超滤分离、纯化得量子点-小核酸偶联物(QD-NH-saCEBPA),荧光发射光谱、紫外吸收光谱、凝胶阻滞实验评价QD-NH-CO-saCEBPA的理化性质，并使用偶联物转染细胞，评价其目标基因的调控作用。
如图3-图4所示，QD-NH-CO-saCEBPA的紫外吸收图谱及对目标基因的上调情况，图3中QD-NH-CO-saCEBPA的紫外吸收光谱，最大吸收峰在260nm左右，图4中QD-NH-CO-saCEBPA处理组的目标蛋白明显上调对比saCEBPA处理组，表明QD-NH-CO-saCEBPA能够增加细胞的摄取，从而达到激活目标基因CEBPA表达的目的，具有用于抗肿瘤的潜力。
实施例3
取马来酰亚胺功能化量子点(QD-Mal)与巯基化靶向C9orf72基因的反义寡核苷酸(ASO-SH),QD-Mal与ASO-SH摩尔比1:100，在催化剂作用下，4摄氏度、避光搅拌反应过夜，离心去掉沉淀后，超滤分离、纯化得量子点-小核酸偶联物(QD-Mal-SH-ASO),荧光发射光谱、紫外吸收光谱、凝胶阻滞实验评价QD-Mal-SH-ASO的理化性质，并使用偶联物转染细胞，评价其对目标基因的调控作用。
图5-图6所示，QD-Mal-SH-ASO的荧光发射光谱及对目标基因的调控作用抢矿，图5为QD-Mal-SH-ASO的紫外吸收光谱，最大吸收峰在260nm左右，图6中QD-Mal-SH-ASO处理组的目标蛋白表达对比ASO处理组，明显下调，说明QD-Mal-SH-ASO能够增加细胞的摄取，从而达到干扰目标基因表达的目的，具有用于肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆(一种神经退行性病变)疾病诊疗的潜力。
最后说明的是，以上所述为本发明的优选实施方式，尽管通过上述优选实施例，已经对本发明进行了详细的说明，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种改变，而不偏离本发明的权利要求书所要求的的范围。

Claims (1)

1.一种量子点-小核酸偶联物，其特征在于，量子点与小核酸通过化学反应制得，小核酸的碱基对数目≤100，小核酸的3’或5’末端是功能化的；
取氨基化量子点QD-NH2与羧基化靶向CEBPA基因的小激活RNA，saCEBPA-COOH，QD-NH2与saCEBPA-COOH摩尔比1:100，在催化剂作用下，4摄氏度、避光搅拌反应过夜，离心去掉沉淀后，超滤分离、纯化得量子点-小核酸偶联物QD-NH-saCEBPA；
取马来酰亚胺功能化量子点QD-Mal与巯基化靶向C9orf72基因的反义寡核苷酸ASO-SH,QD-Mal与ASO-SH摩尔比1:100，在催化剂作用下，4摄氏度、避光搅拌反应过夜，离心去掉沉淀后，超滤分离、纯化得量子点-小核酸偶联物QD-Mal-SH-ASO。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP2723862B1 (en) * 2011-06-21 2018-09-19 MiNA Therapeutics Limited Albumin production and cell proliferation
CA2889596C (en) * 2012-11-15 2022-08-23 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugates
CN103207166B (zh) * 2012-12-25 2015-06-03 西安交通大学 用于快速检测atp的荧光共振体系的制备方法
CN103497997B (zh) * 2013-09-29 2015-04-15 天津理工大学 一种用于端粒酶活性检测的量子点-核黄素分子信标
CN104313148A (zh) * 2014-10-19 2015-01-28 天津理工大学 一种Cd体材量子点分子信标及其制备方法
CN105463025B (zh) * 2015-11-26 2019-10-15 广西医科大学 一种生物活化量子点纳米载体用于rna干扰的技术方法
CN106929508B (zh) * 2017-02-17 2020-08-21 张灏 一种激活PTPRO基因表达的saRNA及其转运载体
CN110257051B (zh) * 2019-06-10 2020-08-25 武汉大学 一种基于点击化学的dna功能化量子点的制备方法及其在生物标记与检测中的应用

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