CN103497997B - 一种用于端粒酶活性检测的量子点-核黄素分子信标 - Google Patents

一种用于端粒酶活性检测的量子点-核黄素分子信标 Download PDF

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Abstract

一种用于端粒酶活性检测的量子点-核黄素分子信标，包括核酸茎环结构，与核酸茎环结构5'端连接的荧光基团和与核酸茎环结构3'端连接的淬灭基团，其制备方法是：在半导体量子点水溶液中加入连接剂，加入核酸链在37℃孵育；再加入NaCl甲醇溶液，除去过量的连接剂，离心后沉淀重悬于去离子水中；加入核黄素水溶液进行反应即可。本发明的优点是：选用量子点和核黄素作为信标中荧光共振能量转移的供体和受体，使自由态的分子信标具有细胞染色和红外成像的能力；当信标分子一旦与靶点结合，量子点的荧光信号即被恢复；将人端粒酶逆转录酶设计为分子信标的靶点，利用其只在肿瘤细胞中高效表达的特点，使该分子信标具有癌症诊断的通用性。

Description

一种用于端粒酶活性检测的量子点-核黄素分子信标
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是一种用于端粒酶活性检测的量子点-核黄素分子信标。
背景技术
端粒酶活性是人类恶性肿瘤早期诊断的通用标志物，这是因为85-95%的各类恶性肿瘤组织中都存在端粒酶的阳性表达。癌细胞之所以能够突破寿命的限制，是因为它们可以合成具有活性的端粒酶，端粒酶能够对缩短的染色体末端进行修复，使癌细胞无限地分裂。因此可以采用端粒酶靶向探针进行肿瘤细胞的诊断和标识。近年发展起来的分子信标作为一种靶向检测探针，吸引了许多研究者的注意，分子信标是一种具有发夹结构的荧光核酸探针，自由状态时的分子信标呈发夹结构，此时由于荧光基团与淬灭基团靠得很近，荧光被淬灭；当与靶序列结合后，分子信标的空间构型发生改变，荧光恢复。
目前，人们对分子信标的结构做出了许多改进，使其在序列检测、病原体侦测、药物疗效监测、区分基因野生型和突变型、DNA-蛋白相互作用研究、定量聚合酶链扩增(PCR)、以及体外转录反应中的RNA实时检测等众多领域中得到应用。如中国专利CN1O2115784A公开了一种PCR荧光分子信标探针技术定量检测人类白细胞抗原B27基因的方法，淬灭基团为DABCYL,荧光基团为FAM，以HLA-B27基因为检测目标，实现了对HLA-B27基因的快速定量检测。中国专利CN102154474A也公开了一种用于肺癌诊断的分子信标复合物，包括磁性纳米微球以及吸附在磁性纳米微球上的分子信标，发光基团为Alexa488，淬灭基团为BHQI，该发明克服分子信标活体检测中的假阳性问题，对活细胞内miR-155进行检测，从而实现对肺癌的诊断与鉴别诊断。
我们已经知道人端粒酶主要包括三种成分：人端粒酶RNA成分（human telomerase RNA template，hTR）、人端粒酶催化亚单位（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）及端粒酶相关蛋白hTEPl（TPl／TLP1），其中hTERT是端粒酶活性的决定因素，其基因位于5号染色体短臂末端5p15.33的单拷贝基因，大小约3.5kb，其mRNA水平与端粒酶活性呈正相关。本发明采用量子点作为分子信标的荧光基团，设计了一种用于端粒酶活性检测的量子点-核黄素分子信标，它能与肿瘤细胞中的hTERT mRNA发生特异性结合，进而检测端粒酶的活性。本发明的基本思路是选用量子点和核黄素作为信标中荧光共振能量转移（FRET）的供体和受体，使自由态的分子信标不具有荧光信号，能用于细胞染色和成像，通过检测荧光信号可以追踪分子信标的准确位置；当信标与靶点结合时，信标中量子点的荧光信号恢复，癌变细胞就会出现闪烁的亮点，实现对肿瘤细胞成像和早期诊断。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术分析，提供一种操作简单、特异性强、灵敏度高的用于端粒酶活性检测的量子点-核黄素分子信标，而且其制备方法简单、操作方便，可用于端粒酶活性检测。
本发明的技术方案：
一种用于端粒酶活性检测的量子点-核黄素分子信标，包括核酸茎环结构，与核酸茎环结构5'端连接的荧光基团和与核酸茎环结构3'端连接的淬灭基团，所述核酸茎环结构的序列为5'ccgctggcca cgttcgtgcg g3'[No ID +101~+121]，5'gcgcggg gacccggcgg ctttccgcgc3'[No ID +154~+180]，5'gtggcc cagtgcctgg tgtgcgtgcc ctgggacgc3'[No ID +185~+220]，5'gtgaccgtgg tttctgtgtg gtgtcac3'[No ID +831~+857]，5'cg ccgagaccaa gcacttcctc tactcctcag gcg3'[No ID +1019~+1043]，5'gcttcctcag gaacaccaag aagttcatct ccctggggaa gc3'[No ID +1491~+1532]，5'ggtc tttcttttat gtcacggaga cc3'[No ID +1707~+1732]，5'ctctttttct accggaagag3' [No ID +1751~+1770]，5'ctgcg ggagctgtcg gaagcag3'[No ID +1826~+1847]，5'cgg cttttgttca gatgccg3'[No ID +2748~+2767]，5'ggtg cggcctgctg ctggataccc ggacc3'[No ID +2787~+2815]，5'gcagagc gactactcca gctatgc3' [No ID +2824~+2847]， 5'ccagtc tcaccttcaa ccgcggcttc aaggctgg3'[No ID +2865~+2898]，5'ctctgctac tccatcctga aagccaag3'[No ID +3122~+3148]，5'actcagga cagcccagacgcagctgagt3'[No ID +3283~+3301]，5' ctcc cggggacgac gctgactgcc ctggag3'[No ID +3317~+3350]，其中画线部分均为该核酸链中能形成环状结构的序列；所述荧光基团为TGA-ZnS:Mn2+、ZnS:Mn2+、CdSe或CdSe/CdS、CdSe/ZnSe、CdSe/ZnS、CdS/ZnS核壳结构的半导体量子点材料；所述淬灭基团为核黄素，其分子结构如图2所示，核酸的5’端连接一个荧光基团为半导体量子点，3’端连接一个淬灭基团为核黄素，其中与核黄素的链接有四个位点。
一种所述用于端粒酶活性检测的量子点-核黄素分子信标的制备，步骤如下：
1）在TGA-ZnS:Mn2+、ZnS:Mn2+、CdSe、CdSe/CdS、CdSe/ZnSe、CdSe/ZnS、CdS/ZnS核壳结构的半导体量子点水溶液中，加入6-马来酰亚胺基乙酸N-琥珀酸亚胺酯（EMCS）或双(硫代琥珀酰亚胺基)辛二酸酯钠盐（BS3）连接剂溶液，充分搅拌10-30min后，加入5’端巯基修饰后的核酸链，25-40℃温度下孵育2.5h，得到混合液；
2）在上述混合液中加入NaCl的甲醇溶液，除去过量的连接剂，离心后，沉淀重悬于去离子水中；
3）在上述沉淀重悬的去离子水中加入核黄素水溶液，25-40℃温度下反应2-12h，得到孵育液；
4）在上述孵育液中加入浓度为2ul 1×10−4mol/L的核酸链5'ggtctccgtgacataaaagaaagacc3'，25-40℃温度下反应2.5h，即可制得该量子点-核黄素分子信标。
所述半导体量子点水溶液的浓度为0.5-10mmol/L，连接剂溶液的浓度为0.5-10mg/mL，核酸链溶液的浓度为0.1×10−4-1×10−4mol/L；半导体量子点水溶液、连接剂溶液和核酸链溶液的体积比为3：1：0.0075。
所述核黄素水溶液的浓度为0.01-0.15mg/mL。
所述核黄素水溶液与半导体量子点水溶液的体积比为1：1。
本发明的优点是：
本发明所开发的量子点分子信标，是一种快速、高效的癌细胞端粒酶活性检测探针，它能从分子水平上对癌变细胞进行特异性荧光标记。当有靶序列存在时，分子信标的环序列与靶序列特异性结合，荧光分子与淬灭分子分开，产生可被检测的425nm荧光信号；当靶序列不存在时，分子信标呈“发夹”结构，茎部的荧光分子与淬灭分子接近至7-10nm，产生荧光共振能量转移（FRET），量子点发出的425nm荧光被淬灭分子吸收，此时检测不到量子点的荧光信号。该分子信标可以制备成生物制剂，配以简单的荧光显象装置，就能应用到临床诊断中。量子点分子信标是从癌变细胞生理学层面上进行检测，这使癌症诊断提前到了细胞水平，能争取更多的治疗时间，研究成果具有一定的社会效益。
附图说明
图1为本发明量子点-核黄素分子信标的分子构造图。
图2为实施例1中量子点-核黄素分子信标的荧光发射光谱。
图3为实施例2中量子点-核黄素分子信标的荧光发射光谱。
具体的实施方式
实施例1：
一种用于端粒酶活性检测的TGA-ZnS:Mn2+量子点-核黄素分子信标，如图1所示，包括核酸茎环结构5'gtgaccgtgg tttctgtgtg gtgtcac3'[No ID +831~+857]，（其中画线部分为该核酸链中能形成环状结构的序列），与核酸茎环结构5'端连接的荧光基团TGA-ZnS:Mn2+量子点。以及与核酸茎环结构3'端连接的淬灭基团核黄素，其中与核黄素的链接有四个位点。
所述用于端粒酶活性检测的TGA-ZnS:Mn2+量子点-核黄素分子信标的制备，步骤如下：
1）使用中国专利CN103242829A合成的TGA-ZnS:Mn2+，在600μL 浓度我2.5mmol/L的 TGA-ZnS:Mn2+量子点水溶液中，TGA-ZnS:Mn2+采用中国专利CN103242829A方法合成，加入200μL 浓度为0.5mg/mL 6-马来酰亚胺基乙酸N-琥珀酸亚胺酯连接剂溶液，充分搅拌10min后，加入1.5ul 1×10−4mol/L 5’端巯基修饰后的核酸链5'HS（C6）gtgaccgtgg tttctgtgtg gtgtcac3' [No ID +831~+857]，37℃孵育2.5h，得到混合液；
2）在上述混合液中加入浓度为0.055mol/L的 NaCl甲醇溶液，除去过量的连接剂，离心后，沉淀重悬于600ul去离子水中；
3）在上述沉淀重悬的去离子水中加入等体积量的浓度为0.1mg/mL的核黄素水溶液600uL，37℃孵育2h，得到孵育液；
4）在上述孵育液中加入浓度为3.5ul 1×10−4mol/L的靶核酸5'gtgacaccacacagaaaccacggtcac3'，37℃反应2.5h，即可制得该量子点-核黄素分子信标。
图2为实施例1中量子点-核黄素分子信标的荧光发射光谱，图中表明：TGA-ZnS:Mn2+量子点的荧光发射峰为425nm，分子信标处于游离态时，量子点的荧光相对强度从27降至10，这表明量子点与核黄素之间存在荧光共振能量转移现象，可以作为分子信标的能量供体和受体。当有靶序列存在时，分子信标的环序列与靶序列特异性结合，荧光分子与淬灭分子分开，荧光信号恢复，荧光相对强度从10升至17。
实施例2：
一种用于端粒酶活性检测的ZnS：Mn2+量子点-核黄素分子信标，如图1所示，包括核酸茎环结构5'ggtc tttcttttat gtcacggaga cc3'[No ID +1707~+1732]，（其中画线部分为该核酸链中能形成环状结构的序列），与核酸茎环结构5'端连接的荧光基团ZnS:Mn2+量子点。以及与核酸茎环结构3'端连接的淬灭基团核黄素，其中与核黄素的链接有四个位点。
所述用于端粒酶活性检测的ZnS：Mn2+量子点-核黄素分子信标的制备，步骤如下：
1）在600μL浓度为 8mmol/L ZnS量子点水溶液中，加入200μL浓度为 2mg/mL的双(硫代琥珀酰亚胺基)辛二酸酯钠盐，充分搅拌20min后，加入1.5uL浓度为0.5×10−4mol/L的 5’端巯基修饰后的核酸链:5'HS（C6）ggtc tttcttttat gtcacgg aga cc3' [No ID +1707~+1732]，30℃孵育2.5h，得到混合液；
2）在上述混合液中加入浓度为0.055mol/L的 NaCl甲醇溶液，除去过量的连接剂，离心后，沉淀重悬于600ul去离子水中；
3）在上述沉淀重悬的去离子水中加入等体积量的浓度为0.05mg/mL的核黄素水溶液600ul，37℃孵育4h，得到孵育液；
4）在上述孵育液中加入浓度为2ul 1×10−4mol/L的核酸链5'ggtctccgtgacataaaagaaagacc3'，25℃反应2.5h，即可制得该量子点-核黄素分子信标。
图3为实施例2中量子点-核黄素分子信标的荧光发射光谱，图中表明：ZnS:Mn2+量子点的荧光发射峰为425nm，分子信标处于游离态时，量子点与核黄素之间足够接近，存在荧光共振能量转移现象，量子点的荧光相对强度从27降至10。当有靶序列存在时，分子信标的环序列与靶序列特异性结合，荧光分子与淬灭分子分开，荧光信号恢复至17。

Claims (5)

1.一种用于端粒酶活性检测的量子点-核黄素分子信标，其特征在于：包括核酸茎环结构，与核酸茎环结构5'端连接的荧光基团和与核酸茎环结构3'端连接的淬灭基团，所述核酸茎环结构的序列为5'ggtctccgtgacataaaagaaagacc3'，其中画线部分为该核酸链中能形成环状结构的序列；所述荧光基团为TGA-ZnS:Mn2+、ZnS:Mn2+、CdSe或CdSe/CdS、CdSe/ZnSe、CdSe/ZnS、CdS/ZnS核壳结构的半导体量子点材料；所述淬灭基团为核黄素，其分子结构是核酸的5’端连接一个荧光基团为半导体量子点，3’端连接一个淬灭基团为核黄素，其中与核黄素的链接有四个位点。
2.一种如权利要求1所述用于端粒酶活性检测的量子点-核黄素分子信标的制备方法，其特征在于步骤如下：
1）在TGA-ZnS:Mn2+、ZnS:Mn2+、CdSe、CdSe/CdS、CdSe/ZnSe、CdSe/ZnS、CdS/ZnS核壳结构的半导体量子点水溶液中，加入6-马来酰亚胺基乙酸N-琥珀酸亚胺酯或双(硫代琥珀酰亚胺基)辛二酸酯钠盐连接剂溶液，充分搅拌10-30min后，加入5’端巯基修饰后的核酸链，25-40℃温度下孵育2.5h，得到混合液；
2）在上述混合液中加入NaCl的甲醇溶液，除去过量的连接剂，离心后，沉淀重悬于去离子水中；
3）在上述沉淀重悬的去离子水中加入核黄素水溶液，25-40℃温度下反应2-12h，得到孵育液；
4）在上述孵育液中加入浓度为2ul 1×10−4mol/L的核酸链5'ggtctccgtgacataaaagaaagacc3'，25-40℃温度下反应2.5h，即可制得该量子点-核黄素分子信标。
3.根据权利要求2所述用于端粒酶活性检测的量子点-核黄素分子信标的制备方法，其特征在于：所述半导体量子点水溶液的浓度为0.5-10mmol/L，连接剂溶液的浓度为0.5-10mg/mL，核酸链溶液的浓度为0.1×10−4-1×10−4mol/L；半导体量子点水溶液、连接剂溶液和核酸链溶液的体积比为3：1：0.0075。
4.根据权利要求2所述用于端粒酶活性检测的量子点-核黄素分子信标的制备方法，其特征在于：所述核黄素水溶液的浓度为0.01-0.15mg/mL。
5.根据权利要求2所述用于端粒酶活性检测的量子点-核黄素分子信标的制备方法，其特征在于：所述核黄素水溶液与半导体量子点水溶液的体积比为1：1。
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