CN105525010B - 一种茎环结构组合探针及其应用 - Google Patents

一种茎环结构组合探针及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种茎环结构组合探针及其应用，该探针由两个具有茎环结构的DNA序列组成，探针I和探针II从5′端到3′端依次为茎环区、检测物识别区，其可用于端粒酶活性、RNA和DNA检测及端粒酶抑制剂筛选，检测物为端粒酶，探针I检测物识别区是端粒酶底物序列，探针Ⅱ检测物识别区是与端粒酶延伸序列中8～40个碱基互补的序列；检测物为RNA或DNA，探针I检测物识别区是与待测RNA或DNA的邻近3′端8～40个碱基互补的序列，探针II检测物识别区是与待测RNA或DNA的邻近5′端8～40个碱基相同的序列。本发明组合探针不需要荧光标记和放射性元素标记，其特有的颈环结构为核酸扩增反应提供了特异性的扩增模板，实现了恒温下信号快速放大，具有高的灵敏度和扩增效率。

Description

一种茎环结构组合探针及其应用
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种具有茎环结构的组合探针，以及该组合探针在端粒酶活性检测及RNA和DNA定量检测中的应用。
背景技术
端粒酶(Telomerase)是一种使端粒延伸的反转录DNA合成酶，是由RNA和蛋白质组成的核糖核酸-蛋白质复合物。端粒酶弥补了因每次细胞分裂而逐渐缩短的端粒长度。但是端粒酶的活性在正常体细胞中受到相当严密的调控，所以端粒酶活性在正常的人体细胞中受到抑制，但在肿瘤细胞中被激活，与癌细胞的不断增殖密切相关。所以检测端粒酶的活性，可以实现对癌症的诊断，同时以端粒酶为靶标分子，研究有效的端粒酶活性抑制剂，对开发抗癌药物具有重要意义。传统的检测端粒酶的方法主要是基于PCR扩增技术的端粒重复放大的方法(Telomeric Repeat Amplification protocol，TRAP)。该方法在经过PCR扩增后进行电泳分离和检测，可以检测到几个癌细胞中端粒酶的活性，但是操作比较繁琐，而且电泳分析不能达到定量分析的结果。更为重要的是在筛选端粒酶活性抑制剂实验过程中，这些抑制剂也可能抑制PCR扩增反应中DNA聚合酶的活性，所以TRAP方法不适于端粒酶抑制剂的筛选检测。随后发展起来的端粒酶检测方法是放射性同位素标记后的成像分析，该方法存在放射性污染，对人体和环境有一定的危害，由此大大增加了操作的复杂性，限制了该方法的应用。所以人们一直在努力研究建立端粒酶活性检测方法。如表面等离子体共振、电化学分析、量子点荧光共振能量转移、端粒酶诱导生成金属纳米线、具有催化性能的分子信标、PPI生物发光等。但是这些方法由于缺乏有效的DNA扩增信号放大过程，导致这些方法的灵敏度都达不到TRAP的水平。因此，考虑到抗癌药物筛选工作量大以及检测成本等各方面的需要，理想的端粒酶活性检测方法应摆脱放射性污染的缺点，且需满足检测快速、操作简便、选择性好、灵敏度高、可靠、普适、经济等特点。
RNA和DNA是生命体重要的遗传物质，RNA和DNA的表达水平与癌症发展密切相关，可以作为癌症早期诊断的标志物，对特定序列RNA和DNA进行准确、灵敏检测对于RNA和DNA生物功能的研究和癌症早期诊断都具有十分重要的意义。RNA和DNA的分析方法主要为杂交反应的检测方法。其中Southern印迹杂交方法需要经过电泳分离，结合放射性同位素标记或酶标记利用放射自显影或酶反应显色实现RNA和DNA的定量分析。该方法存在放射性危害，对人体造成伤害，且检测信号无法实时监测等弊端，需要复杂的操作步骤才能实现信号的读出。分子信标(Molecular Beacon，简称MB)探针技术以发夹结构存在，其茎部双链两端分别标记荧光基团和猝灭基团，无目标RNA或DNA存在时，MB以发夹结构存在，荧光猝灭。目标RNA或DNA存在时会与MB杂交产生目标RNA或DNA的特异性荧光信号，该分子信标检测方法已经获得了广泛应用。但需要指出的是该方法缺乏信号放大机制，使得检测灵敏度受到了很大的限制，并且分子信标需要双标记，价格昂贵。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有端粒酶活性检测及RNA和DNA定量检测存在的问题，提供一种成本低廉、灵敏度高、选择性好的茎环结构组合探针，以及该组合探针在端粒酶活性检测及RNA和DNA定量检测中的应用。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：该组合探针由两个具有茎环结构的DNA序列组成，其中探针I和探针II从5′端到3′端依次为茎环区、检测物识别区，所述的检测物为端粒酶、RNA或DNA，探针I和探针II的茎环区的碱基序列相同或不同，其中当检测物为端粒酶时，所述探针I的检测物识别区是端粒酶底物序列，探针II的检测物识别区是与端粒酶延伸序列中8～40个碱基互补的序列；当检测物为RNA或DNA时，所述探针I的检测物识别区是与待测RNA或DNA的邻近3′端8～40个碱基互补的序列，探针II的检测物识别区是与待测RNA或DNA的邻近5′端8～40个碱基相同的序列。
上述的茎环区的茎的长度优选为5～18个配对的碱基序列，茎环区的环的长度优选为15～35个碱基序列。
上述的检测物为端粒酶时，探针I的检测物识别区是端粒酶底物序列，优选探针II的检测物识别区是与端粒酶延伸序列中15～25个碱基互补的序列。
上述的检测物为RNA或DNA时，优选探针I的检测物识别区是与待测RNA或DNA的邻近3′端15～25个碱基互补的序列，优选探针II的检测物识别区是与待测RNA或DNA的邻近5′端15～25个碱基相同的序列。
本发明茎环结构组合探针在检测端粒酶活性中的应用，具体检测方法为：将检测物识别区为端粒酶底物序列的探针I加入待测端粒酶中进行反转录反应，反应完后加入检测物识别区是与端粒酶延伸序列中8～40个碱基互补的序列的探针II，在Bst DNA聚合酶的作用下进行环介导的等温核酸扩增反应，并加入SYBR Green I荧光染料，实时检测荧光信号，根据实时荧光曲线的最大拐点所对应的时间即可确定端粒酶的活性高低，时间越长说明端粒酶活性越低，时间越短说明端粒酶活性越高。
本发明茎环结构组合探针在定量检测RNA或DNA中的应用，具体检测方法为：将检测物识别区是与待测RNA或DNA的邻近3′端8～40个碱基互补的序列的探针I加入不同浓度的待测RNA或DNA标准样品中，并加入顶替引物A，在BstDNA聚合酶的作用下进行延伸顶替反应，反应结束后加入检测物识别区是与RNA或DNA的邻近5′端8～40个碱基相同的序列的探针II和顶替引物B，进行延伸顶替反应和环介导的等温核酸扩增反应，并加入SYBR Green I荧光染料，实时检测荧光信号，绘制浓度与实时荧光强度的最大拐点对应时间的标准曲线；按照上述方法测试待测RNA或DNA样品的实时荧光强度最大拐点对应的时间，结合标准曲线即可确定待测样品中RNA或DNA的含量。
上述的顶替引物A是与待测RNA或DNA中5～30个碱基互补的序列，且该5～30个碱基与待测RNA或DNA中与探针I检测识别区互补部分的3′端邻近；所述的顶替引物B是与待测RNA或DNA中5～30个碱基相同的序列，且该5～30个碱基与待测RNA或DNA中与探针II检测识别区相同部分的5′端邻近。
本发明茎环结构组合探针在端粒酶抑制剂筛选中的应用，具体方法与端粒酶活性检测方法相同，只需在制备端粒酶延伸产物时加入端粒酶抑制剂。
本发明的有益效果如下：
1、本发明组合探针不需要荧光标记和放射性元素标记，该探针特有的颈环结构为下一步核酸扩增反应提供了特异性的扩增模板，克服了传统放射性标记存在的放射性危害和大多数核酸扩增反应中非特异性扩增的发生。
2、本发明组合探针用于端粒酶活性分析操作极为简便，只需将癌细胞经过裂解就可以得到含有端粒酶的细胞裂解液，直接用于端粒酶底物的反转录延伸反应，不需要复杂的分离提纯过程，大大提高了该方法操作的简便性，在普通的生物实验室即可完成，克服了现有端粒酶活性检测方法步骤繁琐、成本较高、灵敏度低和选择性低等缺点，可以有效地检测到单个癌细胞中端粒酶的活性，应用前景广阔。
3、本发明组合探针可通过实时荧光分析法进行端粒酶活性检测，而荧光分析方法非常适用于与一些自动化仪器相结合进行高通量检测，因此在高通量端粒酶抑制剂的筛选中也展现出了巨大的应用潜力。
4、本发明组合探针对癌细胞中RNA和DNA也可以进行良好的定量检测，克服了升降温过程耗时的缺点，实现了恒温条件下的信号快速放大，具有高的灵敏度和扩增效率。
5、本发明组合探针还可通过终点荧光检测、共振光散射检测、凝胶电泳检测等分析方法进行端粒酶活性及RNA和DNA的定量检测。
附图说明
图1是实施例1中茎环结构组合探针检测端粒酶的原理示意图。
图2是荧光强度随着端粒酶浓度变化的实时荧光曲线图。
图3是不同浓度抑制剂对端粒酶活性抑制的实时荧光曲线图。
图4是实施例2中茎环结构组合探针检测mRNA的原理示意图。
图5是荧光强度随着mRNA浓度变化的实时荧光曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
针对端粒酶底物序列5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′，设计合成具有茎环结构的探针I和探针II，探针I的碱基序列为5′-CGACAGCAGAGGATTTGTTGTGTGGAAGTGTGAGCGGATTTTCCTCTGCTGTCGTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3′(由宝生物工程(大连)有限公司提供)；探针II的碱基序列为5′-ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACTTCAGTCACGACGATTTTCCCTAACCCTAACCCTAACCC-3′(由宝生物工程(大连)有限公司提供)。
采用上述探针I和探针II检测宫颈癌细胞(Hela)中的端粒酶活性，具体方法如下：
将培养的Hela细胞从培养基中消化离心分离，用冷的D-PBS缓冲溶液(10mmol/L磷酸盐，0.1mol/L NaCl，pH 7.4)洗涤离心3次，然后以2000转/分离心5min。洗涤后的细胞加入冷的D-PBS缓冲溶液中，调节细胞浓度为100cell/μL。分别向100个(3组)、10个(5组)和1个(10组)Hela细胞中加入1μL预冷的CHAPS细胞裂解缓冲溶液，在冰上放置30分钟，得到不同浓度的Hela细胞裂解液，其中10个Hela细胞和1个Hela细胞是利用显微操作系统取出。
在200μL离心管中分别加入1.8μL水、0.5μL端粒酶反转录延伸反应缓冲溶液(200mmol/L Tris-HCl，15mmol/L MgCl2，630mmol/L KCl，10mmol/L EGTA，0.5％吐温-20，pH＝8.3，25℃)、1.0μL 2.5mmol/L脱氧核苷三磷酸(dNTP)水溶液、0.5μL 2μmol/L探针I水溶液、0.2μL 40unit/μL RNase抑制剂、1.0μL不同浓度的Hela细胞裂解液，混合均匀后立即放到PCR仪中37℃反应30分钟，得到端粒酶延伸产物。向端粒酶延伸产物中加入2.0μL5mol/L甜菜碱水溶液、0.5μL Bst DNA聚合酶缓冲溶液(200mmol/L Tris-HCl，100mmol/LKCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/L MgSO4，1％曲拉通X-100，pH＝8.8，25℃)、0.5μL2.5mmol/L dNTP、0.4μL 20μmol/L FIP(CGACAGCAGAGGATTTGTTGTGTGGAAGTGTGAGCGGA，由宝生物工程(大连)有限公司提供)、0.4μL 20μmol/L BIP(ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCAC，由宝生物工程(大连)有限公司提供)、0.5μL2μmol/L探针II水溶液、0.2μL SYBR Green I(4×)荧光染料、0.5μL 8unit/μL Bst DNA聚合酶，混匀后立刻放到Step One实时定量PCR系统中(Applied Biosystems，美国)，在65℃下进行环介导的等温核酸扩增反应(LAMP反应)，每隔1分钟监测一次实时荧光强度信号。同时做空白对比试验。检测原理如图1所示，检测结果见图2。
从图2中可以看出，随着Hela细胞个数的增加LAMP反应速度逐渐加快，也就是说随着端粒酶浓度的增加，端粒酶延伸产物浓度逐渐增加，在Hela细胞裂解液不需要分离提纯的前提下基于LAMP反应即可以检测到低至1个Hela细胞中端粒酶的活性，同时当不加入Hela细胞时，没有非特异性扩增信号产生。该结果表明本发明方法可以用于特异性地检测端粒酶活性并且灵敏度较高。
实施例2
实施例1的茎环结构组合探针在端粒酶抑制剂筛选中的应用，具体方法如下：
在实施例1的检测宫颈癌细胞(Hela)中端粒酶活性方法中，制备端粒酶延伸产物时加入端粒酶抑制剂3′-叠氮-3′脱氧胸苷(AZT)，端粒酶抑制剂最终浓度分别为0mmol/L、2mmol/L、5mmol/L、10mmol/L，其他步骤与实施例1相同，结果见图3。从图3中可以看出，在固定端粒酶浓度(100个Hela细胞)情况下，随着3′-叠氮-3′脱氧胸苷浓度的加大，LAMP反应速度会逐渐减慢，表明抑制剂3′-叠氮-3′脱氧胸苷浓度的增加会逐渐抑制端粒酶的活性，导致端粒酶延伸产物逐渐减少，扩增速度减慢。该结果表明本发明方法能够应用于端粒酶抑制剂的筛选。
实施例3
针对人端粒逆转录酶mRNA(human telomerase reverse transcriptase，hTERT；Accession No：NM_198254.1)的5号和6号外显子剪接位点附近的mRNA片段序列5′-GCGUGUGCGGGCCCAGGACCCGCCGCCUGAGCUGUACUUUGUCAAGGACAGGCUCACGGAGGUCAUCGCCAGCAUCAUCAA-3′(由Integrated DNA Technologies公司合成)，设计合成具有茎环结构的探针I和探针II，探针I的碱基序列为5′-CGACAGCAGAGGATTTGTTGTGTGGAAGTGTGAGCGGATTTTCCTCTGCTGTCGTTTTCCGTGAGCCTGTCCTTGACA-3′(由宝生物工程(大连)有限公司提供)；探针II的碱基序列为5′-ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACTTTTCAGTCACGACGATTTTTCCCGCCGCCTGAGCTGTA-3′(由宝生物工程(大连)有限公司提供)。
采用上述探针I和探针II定量检测mRNA的方法如下：
在200μL离心管中分别加入1.5μL水、0.5μL Bst DNA聚合酶缓冲溶液(200mmol/LTris-HCl，100mmol/L KCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/LMgSO4，1％曲拉通X-100，pH＝8.8，25℃)、0.5μL 2.5mmol/L dNTP水溶液、0.2μL 1μmol/L探针I水溶液、0.1μL 200nmol/L顶替引物A(序列为：5′-TGATGATGCTGGCGATGACC-3′，由宝生物工程(大连)有限公司提供)水溶液、0.2μL 40unit/μL RNase抑制剂、0.2μL 8unit/μL Bst DNA聚合酶、1.0μL不同浓度mRNA片段水溶液，混合均匀后放到PCR仪中60℃反应20分钟，得到反转录产物。向反转录产物中加入2.0μL 5mol/L甜菜碱水溶液、0.5μL Bst DNA聚合酶缓冲溶液、0.5μL 2.5mmol/LdNTP、0.2μL 40μmol/L LAMP扩增引物FIP(序列为：5′-CGACAGCAGAGGATTTGTTGTGTGGAAGTGTGAGCGGA-3′，由宝生物工程(大连)有限公司提供)水溶液、0.4μL 20μmol/L LAMP扩增引物BIP(序列为：5′-ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCAC-3′，由宝生物工程(大连)有限公司提供)水溶液、0.4μL 2μmol/L探针II水溶液、0.1μL 200nmol/L顶替引物B(序列为：CGTGTGCGGGCCCA，由宝生物工程(大连)有限公司提供)水溶液、0.2μL SYBR Green I(4×)荧光染料、0.4μL8unit/μLBst DNA聚合酶、0.6μL水，混匀后立刻放到Step One实时定量PCR系统中，在60℃下进行LAMP反应，每隔1分钟监测一次实时荧光强度信号。同时做空白对比试验。检测原理如图4所示，检测结果见图5。
从图5中可以看出，随着mRNA片段浓度的降低，实时荧光强度曲线到达扩增平台期的时间逐渐增大，且不同浓度梯度之间可以相互区分，此结果表明本发明方法可以用于定量检测mRNA。同理本发明茎环结构组合探针也可以用于其他RNA以及DNA的定量检测。

Claims (2)

1.一种采用茎环结构组合探针检测端粒酶活性的方法，其特征在于：将探针I加入待测端粒酶中进行反转录反应，反应完后加入探针II，在Bst DNA聚合酶的作用下进行环介导的等温核酸扩增反应，并加入SYBR Green I荧光染料，实时检测荧光信号，根据实时荧光曲线的最大拐点所对应的时间即可确定端粒酶的活性高低，时间越长说明端粒酶活性越低，时间越短说明端粒酶活性越高；
上述的探针I和探针II从5′端到3′端依次为茎环区、检测物识别区，探针I的检测物识别区是端粒酶底物序列5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′，探针II的检测物识别区是与端粒酶延伸序列中8～40个碱基互补的序列，探针I和探针II的茎环区的碱基序列相同或不同；
上述的茎环区的茎的长度为5～18个配对的碱基序列，茎环区的环的长度为15～35个碱基序列。
2.根据权利要求1所述的采用茎环结构组合探针检测端粒酶活性的方法，其特征在于：所述探针II的检测物识别区是与端粒酶延伸序列中15～25个碱基互补的序列。
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