CN107099594A - 一种用于检测端粒酶活性的引物组、试剂盒和检测方法 - Google Patents

一种用于检测端粒酶活性的引物组、试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测端粒酶活性的LAMP引物组、试剂盒和使用上述引物组或试剂盒对端粒酶活性进行非诊断目的的检测的方法。通过本发明上述引物组、试剂盒或所述方法可以通过环介导等温扩增技术对端粒酶活性进行快速、准确的检测。同时，本发明还对各引物的浓度和具有置换作用的DNA聚合酶的浓度进行优化，从而提高检测的灵敏度，能够检测低至80个HeLa细胞中提取的端粒酶的活性。

Description

一种用于检测端粒酶活性的引物组、试剂盒和检测方法
技术领域
本发明涉及环等温扩增技术领域，具体而言，涉及一种用于检测端粒 酶活性的引物组、试剂盒和检测方法。
背景技术
端粒是真核染色体末端的DNA蛋白复合物，它与染色体末端降解、 端粒融合、DNA损伤或端粒不恰当重组有着密切的关系。在脊椎动物中， 端粒是由TTAGGG六个碱基组成的DNA重复序列，正常细胞(永生细胞 除外，如造血细胞，生殖细胞等)通过不断增殖，染色体分裂，端粒逐渐 缩短，当染色体末端端粒缩短到一定程度时，导致染色体不稳定，细胞生存能力受损，直至细胞凋亡。
端粒酶是细胞中核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)反转录酶(reversetranscriptase，RT)，它能够阻止染色体分裂过程中端粒DNA的缩短，端 粒酶中自身RNA序列作为合成模板，与端粒DNA序列互补杂交后，由于 端粒酶具有反转录功能，使染色体末端的端粒DNA不断得到复制。
现代科学研究发现，端粒与端粒酶的活性与多种生命现象相关：(1) 肿瘤增殖：在正常细胞中端粒酶的活性极低，而在肿瘤细胞中，端粒酶的 活性表达高至85％以上，稳定染色体末端的端粒DNA，使得尽管细胞分裂 使得端粒缩短，也会在端粒酶的作用下重新延伸出完整的端粒DNA，使肿 瘤细胞可无限增殖。(2)运动员选材：运动员生长发育鉴定师运动员科学 选材的重要环节。生长发育通常使用的生物学年龄而非生活年龄，端粒的 缩短代表生物学年龄，因此，通过检测端粒长度可以对运动员进行选材， 避免单纯根据人的生活年龄来取舍运动员，大大提高运动员选材的科学性。 (3)运动组织损伤的修复：现代研究针对端粒酶能催化细胞永生的原理， 应用少量种子细胞经体外扩增后与生物材料复合，构建出新的组织或器官， 用于替代和修复病变、缺损的组织器官。因此，基于端粒酶的重要功能， 检测端粒酶的活性十分必要。
但端粒酶活性在正常细胞中很难被检测到，它一般在肿瘤或癌细胞中 被激活，即使在癌细胞中，端粒酶的活性表达也很低，因此，本领域亟待 建立一种高灵敏度的端粒酶活性检测方法。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于检测端粒酶活性的LAMP引物 组，所述引物组能够用于快速、准确、便捷地检测端粒酶活性。
本发明的第二目的在于提供一种用于检测端粒酶活性的试剂盒，所述 试剂盒能够用于快速、准确、便捷地检测端粒酶活性。
本发明的第三目的在于提供一种非诊断目的的端粒酶活性检测方法， 通过该方法可以快速、准确、便捷地检测端粒酶活性。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种用于检测端粒酶活性的LAMP引物组，所述引物组包括S-L-TS引 物、BIP引物和B3引物组成，其中所述S-L-TS引物、BIP引物和B3引物 的序列依次如SEQ ID NO：1～3所示。
本发明提供上述用于检测端粒酶活性的LAMP引物组，利用上述引物 组可以建立一种简单、快速、准确和灵敏的基于环介导等温扩增技术(LAMP)检测端粒酶活性的新方法，该LAMP检测端粒酶活性的原理如 图1所示：
上述引物组中的S-L-TS(Step-Loop-TS)引物，为5’端发夹结构的端 粒酶延伸反应引物，该引物在端粒酶的作用下进行延伸，生成含有多个端 粒重复序列B3c的延伸产物。
引物BIP的3'端B2部分与S-L-TS引物B2c部分完全匹配，B3与端粒 酶延伸产物重复序列B3c完全匹配，在具有链置换作用的DNA聚合酶的作 用下，BIP和B3的3'端均发生延伸反应，形成双茎环的DNA模板。
随后FIP的5'端F1c部分与双链F1完全匹配，3'端F2部分与单链环上 F2c完全匹配，引发链顶替DNA合成反应，生成了成环部分含有B2c序列 的茎环结构DNA序列，BIP的5'端B1c部分与双链B1完全匹配，3'端B2 部分与单链环上B2c完全匹配，继续引发链顶替DNA合成反应。产生更多 的环状DNA序列与引物FIP和BIP作用后，通过链顶替反应形成了多个茎 环结构和多环花椰菜式结构的LAMP终产物。
这种自动循环的反应能够重复持续的进行，形成DNA的指数扩增反 应，通过检测LAMP扩增结果从而检测端粒酶的活性。
在一些实施方式中，所述S-L-TS引物、BIP引物、B3引物和FIP引物 的摩尔比为3～7:100～400:30～70:100～400。
在一些实施方式中，所述S-L-TS引物、BIP引物、B3引物和FIP引物 的摩尔比为4～7:100～300:40～70:100～300。
在一些实施方式中，所述S-L-TS引物、BIP引物、B3引物和FIP引物 的摩尔比为4～6:150～250:40～60:150～250。
在一些实施方式中，所述S-L-TS引物、BIP引物、B3引物和FIP引物 的摩尔比为5:200:50:200。
本发明上述引物组对各引物的摩尔比进行限定，在该摩尔比范围内， LAMP反应的扩增信号强，同时样品与空白的POI差值也大，因此，采用 该LAMP探针组检测端粒酶活性，检测效果好，灵敏度高。
本发明还提供一种用于检测端粒酶活性的试剂盒，所述试剂盒包括上 述引物组，所述试剂盒还包括dNTPs、具有链置换作用的DNA聚合酶、甜 菜碱、端粒酶延伸反应缓冲液、LAMP反应缓冲液、显色剂或荧光指示剂 中的一种或多种。
本发明上述试剂盒包括前述引物组，因此，该试剂盒能够快速、准确 地检测端粒酶的活性，同时，试剂盒中还包括LAMP反应中所需的其他试 剂，不需要再另行配置，使得端粒酶活性的检测能够更便捷。
在一些实施方式中，所述具有链置换作用的DNA聚合酶为Bst DNA 聚合酶。
在一些实施方式中，所述端粒酶延伸反应缓冲液为含Mg2+，EGTA、 KCl和Tween20的Tris-HCl缓冲液，优选地，所述Tris-HCl缓冲液中Tris-HCl 为0mM、Mg2+为1.5mM、EGTA为1mM、KCl为70mM、Tween20为0.05％ (v/v)，pH8.3。
在一些实施方式中，所述LAMP反应缓冲液为1×ThermoPol反应缓冲 液。
在一些实施方式中，所述显色剂或荧光指示剂选自SYBR Green I、 SYBR gold、PicoGreen、Peko Green、EB、Genefinder、Calcein、EvaGreen、 碘化丙啶、钙黄绿素和羟基萘酚蓝。
本发明还涉及一种使用上述探针组或上述试剂盒对端粒酶活性进行非 诊断目的的检测的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)端粒酶延伸：将端粒酶提取液与S-L-TS引物混合，恒温孵育进 行端粒酶延伸反应，最后加热使端粒酶失活；
(2)配制含延伸产物、LAMP反应缓冲液、B3引物、BIP引物、FIP 引物、dNTPs和具有置换作用的DNA聚合酶的LAMP反应体系；
(3)将配制好的LAMP反应体系进行恒温扩增，反应过程中或反应 后检测反应体系中显色剂或荧光指示剂的颜色变化或荧光强度变化。
本发明上述方法为简单、快速的基于LAMP检测端粒酶活性的方法， 该方法不需要精确控温的热循环步骤，扩增效率高，操作简单，可以快速、 准确地实现端粒酶活性的检测，该方法可以检测低至从80个HeLa细胞 中提取的端粒酶的活性，极大降低对检测样品量的要求。
在一些实施方式中，所述S-L-TS引物、BIP引物、B3引物和FIP引 物的摩尔浓度分别为3～7nM、100～400nM、30～70nM和100～400nM，所 述DNA聚合酶为2～2.8U。
在一些实施方式中，所述S-L-TS引物、BIP引物、B3引物和FIP引 物的摩尔浓度分别为4～7nM、100～300nM、40～70nM和100～300nM，所 述DNA聚合酶为2～2.5U。
在一些实施方式中，所述S-L-TS引物、BIP引物、B3引物和FIP引物 的摩尔浓度分别为4～6nM、150～250nM、40～60nM和150～250nM，所述 DNA聚合酶为2.2～2.5U。
在一些实施方式中，所述S-L-TS引物、BIP引物、B3引物和FIP引物 的摩尔浓度为5nM、200nM、50nM和200nM。
在一些实施方式中，所述LAMP反应体系中还包括甜菜碱，优选地， 所述甜菜碱的浓度为0.5～2M，或0.5～1.5M，或1～1.5M，更优选地所述甜 菜碱的浓度为1M。
在一些实施方式中，所述LAMP反应体系中还包括荧光染料，优选 地，所述荧光染料为SYBR Green I。
在一些实施方式中，所述扩增温度的温度为50～60℃，优选为55℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)、本发明提供一种检测端粒酶活性的新型的引物组、试剂盒和方法， 上述引物组、试剂盒和方法基于环介导等温扩增技术，不需要精确控温的 热循环步骤，扩增效率高，操作简便，能够快速、准确、灵敏地检测端粒 酶的活性。
2)、本发明上述引物组、试剂盒和方法对引物和/或具有链置换作用的 DNA聚合酶的浓度进行优化，使得所述引物组、试剂盒和方法对端粒酶活 性的检测灵敏度更高，可检测低至80个HeLa细胞中提取的端粒酶的活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下 面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普 通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获 得其他的附图。
图1为；LAMP检测端粒酶活性原理示意图；
图2为：B3引物浓度对LAMP反应检测端粒酶活性的影响；
图3为：BIP和FIP引物浓度对LAMP反应检测端粒酶活性的影响；
图4为：Bst DNA聚合酶浓度对LAMP反应检测端粒酶活性的影响；
图5为：基于恒温扩增反应检测不同Hela细胞数中端粒酶活性的实时 荧光强度；
图6为：荧光强度曲线POI值与相应细胞个数的对数值的线性关系。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技 术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明 的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件 进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的 常规产品。
实施例1引物设计与合成
设计并合成如表1所示引物，表1所示引物均经聚丙烯酰胺电泳纯化， 其中S-L-TS引物由Integrated DNA Technologies,Inc.(IDT,美国)合成，其 余DNA序列由上海生物工程公司合成。
表1引物序列表
实施例2端粒酶提取
培养的Hela细胞计数后用冷的1×PBS洗涤3次，然后在4℃、2000 转/分离心10min。分离出的细胞加入适量的冷的1×CHAPS细 胞裂解缓冲液，调节细胞浓度至1×104cell/μL，在冰上放置30min，期间 震荡多次，然后在4℃，12000转/分离心30min。最终取出含有端粒酶的 上层溶液，放置在-80℃的超低温冰箱中保存。
其中，1×PBS缓冲溶液：137mmol/L NaCl,10mmol/L磷酸盐缓冲,2.7 mmol/L KCl,pH 7.4；
1×CHAPS细胞裂解缓冲液购于Millipore(美国)。
实施例3端粒酶延伸和LAMP反应
端粒酶延伸过程：取适量的端粒酶提取液，5nM S-L-TS引物，在端粒 酶延伸反应缓冲溶液中混合，终反应体积为20μL。该混合溶液在37℃孵 育20min进行端粒酶延伸反应，然后至90℃加热10min使端粒酶失活。
LAMP反应：Part A：1μL延伸产物溶液，0.8×ThermoPol反应缓冲 液，50nM B3引物，0.2μM BIP引物，0.2μM FIP引物，1M甜菜碱，200 μM dNTPs。Part B：0.2×ThermoPol反应缓冲液，0.4×SYBR Green I荧光染 料，2.4U Bst DNA聚合酶。总反应体积为10μL。混合后立即放到StepOne 实时定量PCR仪器中。55℃进行LAMP反应，每隔1min监测一次实时 荧光强度信号。
其中：端粒酶延伸反应缓冲溶液：20mM Tris-HCl，1.5mM MgC12· 6H2O，1mMEGTA，70mM KCl，0.05％Tween 20，200μM dNTPs，pH8.3；
1×ThermoPol反应缓冲液：20mM Tris-HCl，10mM KCl,10mM (NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100，pH 8.8；
dNTP Mixture(each 2.5mM)购于大连宝生物工程有限公司；
甜菜碱购于Sigma(美国)；
SYBR Green I核酸染料(20×)购于厦门致善生物科技有限公司；
Bst DNA聚合酶，大片段(10×ThermoPol Reaction buffer,8000U/mL)购 自于New England Biolabs(美国)；
StepOne实时定量PCR(Applied Biosystems，美国)。
实验例1检测条件的优化
1、优化B3引物浓度：参照实施例1～3检测从4000个HeLa细胞中提 取的端粒酶，区别仅在于B3、BIP、FIP和DNA聚合酶的浓度如表2所示。 不同B3引物浓度下，端粒酶活性实时荧光检测LAMP扩增结果如图2所 示，根据图2所示数据可知，B3引物的浓度为50nM时，样品与空白之间 的POI差值最大，因此，B3引物的最佳浓度为50nM。
表2不同实验组中B3、BIP、FIP和DNA聚合酶的浓度
2、优化BIP和FIP引物浓度：参照实施例1～3检测从4000个HeLa 细胞中提取的端粒酶，区别仅在于B3、BIP、FIP和DNA聚合酶的浓度如 表3所示。不同BIP和FIP引物浓度下，端粒酶活性实时荧光检测LAMP 扩增结果如图3所示，根据图3所示数据可知，当BIP和FIP引物浓度为 0.05μM时，由于BIP和FIP引物浓度太小，无扩增信号；当增加BIP和 FIP引物浓度为0.2μM时，样品与空白POI差值达到最大，继续增加引 物浓度后，空白和样品的POI差值逐渐减小。因此，选择BIP和FIP引物 的最佳浓度浓度分别为0.2μM。
表3不同实验组中B3、BIP、FIP和DNA聚合酶的浓度
3、2、优化Bst DNA聚合酶的浓度：参照实施例1～3检测从4000个 HeLa细胞中提取的端粒酶，区别仅在于B3、BIP、FIP和DNA聚合酶的浓 度如表3所示。在不同Bst DNA聚合酶浓度下，端粒酶活性实时荧光检测 LAMP扩增结果如图4所示。
根据图4所示数据可知，反应体系在55℃条件下恒温扩增，随着Bst DNA聚合酶浓度的增加，样品与空白信号出现的时间均缩短。当Bst DNA 聚合酶浓度增加至为2.4U时，样品与空白POI相差最大，继续增加Bst DNA 聚合酶浓度，样品与空白POI相差减小。所以，选择Bst DNA聚合酶的最 佳浓度为2.4U。
表4不同实验组中B3、BIP、FIP和DNA聚合酶的浓度
实验例2Hela细胞中端粒酶活性的测定
参照实施例1～3检测不同样品的端粒酶的活性，所述样品的具体信息 如表5所示。不同样品的荧光检测结果如图5所示，荧光强度曲线POI值 与相应的细胞个数的对数值的线性关系如表6所示。根据图5可知，对照 样品(Control)与空白产生的荧光曲线非常相近，与样品溶液(8000个Hela 细胞提取的端粒酶)产生的荧光曲线具有显著差别，证明该端粒酶活性检 测方法的可靠性。根据图6可知，荧光强度曲线POI值与相应的细胞个数 的对数值呈良好的线性关系，线性方程POI＝177.18-26.16lg A cell，线性相 关系数R＝0.9954，该方法可以检测低至80个Hela细胞中端粒酶的活性。
表5样品编号及样品详情
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非 对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域 的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案 进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改 或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范 围。
SEQUENCE LISTING
<110> 国家体育总局体育科学研究所
<120> -一种用于检测端粒酶的LAMP引物组、试剂盒和检测方法
<130> 2017.5.5
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
acaacgtcgt gactgggaaa accctttttg tgcgggcctc ttcgctatta ccgattaagt 60
tgtttcgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaagctt gcatgcctgc aggtcgactc 120
tagaggatcc ccgggtacgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa 180
caaatccgtc gagcagagtt 200
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cgactctaga ggatccccgg gtactttttg ttgtgtggaa ttgtgagcgg at 52
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
acaacgtcgt gactgggaaa accctttttg tgcgggcctc ttcgctatta c 51
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ctaaccctaa ccctaaccc 19

Claims (10)

1.一种用于检测端粒酶活性的LAMP引物组，其特征在于，所述引物组包括S-L-TS引物、BIP引物、B3引物和FIP引物，其中所述S-L-TS引物、BIP引物、B3引物和FIP引物的序列依次如SEQ ID NO：1～4所示。
2.根据权利要求1所述LAMP引物组，其特征在于，所述S-L-TS引物、BIP引物、B3引物和FIP引物的摩尔比为3～7:100～400:30～70:100～400。
3.一种用于检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～2任一项所述的引物组，所述试剂盒还包括dNTPs、具有链置换作用的DNA聚合酶、甜菜碱、端粒酶延伸反应缓冲液、LAMP反应缓冲液、显色剂或荧光指示剂中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述具有链置换作用的DNA聚合酶为BstDNA聚合酶。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述端粒酶延伸反应缓冲液为含Mg2+，EGTA、KCl和Tween20的Tris-HCl缓冲液。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应缓冲液为1×ThermoPol反应缓冲液。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述显色剂或荧光指示剂选自SYBRGreen I、SYBR gold、PicoGreen、Peko Green、EB、Genefinder、Calcein、EvaGreen、碘化丙啶、钙黄绿素和羟基萘酚蓝。
8.一种使用权利要求1～2任一项所述引物组或权利要求3～7任一项所述试剂盒对端粒酶活性进行非诊断目的的检测的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将端粒酶提取液与S-L-TS引物混合，恒温孵育进行端粒酶延伸反应，最后加热使端粒酶失活；
(2)配制包含延伸产物、LAMP反应缓冲液、B3引物、BIP引物、FIP引物、dNTPs和具有置换作用的DNA聚合酶的LAMP反应体系；
(3)将配制好的LAMP反应体系进行恒温扩增，反应过程中或反应后检测反应体系中显色剂或荧光指示剂的颜色变化或荧光强度变化。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述S-L-TS引物、BIP引物、B3引物和FIP引物的摩尔浓度分别为3～7nM、100～400nM、30～70nM和100～400nM，所述DNA聚合酶为2～2.8U。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增的温度为50～60℃，优选地，所述恒温扩增的温度为55℃。
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