CN108359716A - 一种基于引物生成型滚环扩增技术的端粒酶活性检测方法 - Google Patents

一种基于引物生成型滚环扩增技术的端粒酶活性检测方法 Download PDF

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CN108359716A CN201810160144.1A CN201810160144A CN108359716A CN 108359716 A CN108359716 A CN 108359716A CN 201810160144 A CN201810160144 A CN 201810160144A CN 108359716 A CN108359716 A CN 108359716A
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张春阳
马飞
魏树花
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Abstract

本发明提供一种基于引物生成型滚环扩增(PG‑RCA)技术的端粒酶活性检测方法，设计一个探针，端粒酶存在时，探针3'端不断增加端粒(TTAGGG)n扩展，并与反向引物结合，在phi29 DNA聚合酶和Nb.BbvCI切割酶作用下启动SDA反应并生成RCA引物，RCA引物和圆形模板(CT)结合，在phi29 DNA聚合酶和Nb.BbvCI切割酶作用下触发线性RCA反应并生成新RCA引物，新RCA引物又与新CT结合，触发新一轮RCA反应，最终产生大量核酸扩增产物，被荧光染料SYBR Gold检测。该方法将检测信号两步放大具有超高的灵敏度，检测限低至3个Hela细胞，操作简单，无需繁琐的洗涤分离步骤。

Description

一种基于引物生成型滚环扩增技术的端粒酶活性检测方法
技术领域
本发明属于生物分析技术,特别涉及一种基于端粒触发链置换放大介导的引物生成型滚环扩增反应检测端粒酶活性的荧光方法。
背景技术
端粒是真核染色体末端的一种特殊结构，由串联重复(TTAGGG)n组成。在正常的体细胞中，端粒长度在每个细胞分裂过程中都逐渐缩短。一旦端粒被缩短到一个临界长度，细胞衰老、凋亡和老化就不可避免地发生。这种端粒长度的缩短可以被端粒酶通过增加重复序列(TTAGGG)n到端粒末端来阻断。大量的研究表明，在正常的人类细胞中端粒酶活性降低或缺失，但在几乎所有癌症细胞(超过85％)中被高度激活，如肺癌，肝癌，胃癌，和结肠直肠癌。因此，端粒酶被认为是早期癌症诊断的潜在生物标志物。此外，端粒酶也是治疗癌症的重要靶标，各种各样的抑制端粒酶活性的化合物已经被开发成抗癌药物。因此，端粒酶的有效检测对生物研究和生物医学应用都具有重要的意义。
现有方法中，基于聚合酶链反应(PCR)的端粒重复扩增方法(TRAP)是最常用的检测端粒酶活性的方法，但是程序耗时、放射性材料污染、不实用是其无法克服的缺点。近年来又开发了一些新的方法来检测端粒酶的活性，例如等温核酸扩增法，电化学分析法，电化学发光检测法和以及荧光分析法。等温核酸扩增方法大大提高了实验的简单性，但其检测灵敏度不高，在优化条件下，可以检测低至50个癌细胞中的端粒酶活性；电化学分析法中，有报道指出，Lin等开发了一种基于免标记的电化学阻抗法来检测端粒酶活性，该检出限能够测定1000HeLa细胞中端粒酶的活性；电化学发光检测技术集合了电化学方法与化学发光法两者的优点，Xu等研发的一种电化学发光分析方法来分析端粒酶的活性，可以达到最低检测313个HL-60癌细胞，之后Xu等优化了该方法又设计了一种新颖的双电位ECL信号检测方法，其检测最低100个HL细胞提取的端粒酶活性；荧光分析法中，Majerska等设计了一种新颖的不需要使用放射性材料和高纯度端粒酶样品的免PCR端粒酶分析法—一种基于等温循环链置换聚合反应的荧光分析法，最低可检测到40个HeLa细胞中的提取的端粒酶活性。由此可见，上述方法均存在灵敏度有限的问题，因此，开发一种新的方法用于快速检测、灵敏、特异性的检测端粒酶活性的方法是目前急需解决的问题。
发明内容
为了克服上述技术中存在的不足，本方法提供一种基于端粒酶触发链置换放大介导的引物生成型滚环扩增技术(PG-RCA)检测端粒酶活性的方法。本发明将高效率的恒温指数扩增方法和滚环扩增方法相结合，将检测信号进行了两步放大，具有超高的灵敏度，因此本方案可以实现高效、灵敏地检测端粒酶的活性，检测限低至3个Hela细胞，并可特异性地区分端粒酶和其它蛋白；另外，本发明通过一个特殊探针将滚环扩增的引物自动生成，无需再单独设计滚环扩增引物，操作简单；整个操作过程无需繁琐的洗涤、分离步骤。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一个DNA单链探针在引物生成型滚环扩增(PG-RCA)技术检测端粒酶活性中的应用，所述探针列SEQ ID NO.1为：5'-AAC TAT ACA ACC TAC TACCTC ACC TCA GCT ACA ATC CGT CGA GCA GAG TT-3'；
该探针3'端为端粒酶底物序列，5'端为RCA底物序列，中间包含切割酶识别位点。
本发明的第二个方面，提供一种基于引物生成型滚环扩增(PG-RCA)技术检测端粒酶活性的方法，步骤如下：
(1)待测端粒酶诱导的引物生成型滚环扩增反应：DNA单链探针中加入待测端粒酶、反向引物、三磷酸脱氧核糖核苷酸、DNA聚合酶和切割酶，圆形模板，SYBR Gold；
(2)在缓冲液中孵育；
(3)分光光度计检测。
本发明所述的引物生成型滚环扩增反应的原理是：本方法是基于端粒酶触发的引物生成型滚环扩增技术检测端粒酶的方法，首先设计一个探针，端粒酶(Telomerase)存在时，探针3'端不断增加端粒(TTAGGG)n不断扩展，扩展探针和反向引物特异性结合，在DNA聚合酶和切割酶作用下启动链置换扩增(SDA)反应，产生大量的RCA引物，RCA引物和圆形模板(CT)结合，在DNA聚合酶作用下触发线性滚环扩增(RCA)反应，生成长的单链DNA，这些单链DNA可与CT进一步结合，并在切割酶作用下被切割产生新的RCA引物，新的RCA引物又可以与新的CT结合，触发新一轮RCA反应，从而导致一个指数级PG-RCA反应，最终，产生了大量的核酸扩增产物，被核酸染料SYBR Gold所检测，发出荧光信号。
其中，所述探针序列SEQ ID NO.1为：5'-AAC TAT ACA ACC TAC TAC CTC ACC TCAGCT ACA ATC CGT CGA GCA GAG TT-3'
所述反向引物，其序列与扩展探针上的延伸序列(TTAGGG)n互补。
具体的，所述反向引物序列SEQ ID NO.2为：5'-CCC TTA CCC TTA CCC TTA CCCTAA-3'
所述圆形模板含有一个Nb.BbvCI切割酶的识别位点。
所述圆形模板序列SEQ ID NO.3为：5'-ATC TAT AGA CCT CAG CTC GTA CTA GCACAA ACT ATA CAA CCT ACT ACC TCA GAT GAG CTA-3'
优选的，所述DNA聚合酶为phi29DNA聚合酶，phi29DNA聚合酶具有连续合成和链置换性质，且具有高保真性，因此是DNA滚环扩增和多重置换扩增的理想工具。
优选的，所述切割酶为Nb.BbvCI切割酶。
优选的，所述孵育条件为在35℃下孵育120min。
优选的，采用荧光分光光度计对荧光信号进行检测分析。
本发明所述检测方法，关键点在于通过独特探针的设计，采用链置换反应使滚环扩增的引物自动生成，无需再单独设计，且检测信号实现了两步放大，具有超高的灵敏度，对端粒酶的检测下线可达3个Hela细胞。
本发明的第三个方面，提供一种基于引物生成型滚环扩增(PG-RCA)技术检测端粒酶活性的试剂盒，包括：20nmol/L探针：20nmol/L反向引物；10nmol/L的圆形模板；1U DNA聚合酶；0.2U切割酶；0.75mmol/L三磷酸脱氧核糖核苷酸；其中所述探针3'端为端粒酶底物序列，5'端为RCA底物序列，中间包含Nb.BbvCI切割酶识别位点；反向引物序列SEQ ID NO.2为，圆形模板序列SEQ ID NO.3为，
其中，本发明所述探针序列为：5'-AAC TAT ACA ACC TAC TAC CTC ACC TCA GCTACA ATC CGT CGA GCA GAG TT-3'
所述反向引物，其序列与扩展探针上的延伸序列(TTAGGG)n互补。
具体的，所述反向引物序列SEQ ID NO.2为：5'-CCC TTA CCC TTA CCC TTA CCCTAA-3'
所述圆形模板含有一个Nb.BbvCI切割酶的识别位点。
所述圆形模板序列SEQ ID NO.3为：5'-ATC TAT AGA CCT CAG CTC GTA CTA GCACAA ACT ATA CAA CCT ACT ACC TCA GAT GAG CTA-3'
优选的，所述DNA聚合酶为phi29DNA聚合酶。
优选的，所述切割酶为Nb.BbvCI切割酶。
优选的，所述试剂盒还包括反应缓冲液：20mmol/L Tris-HCl(pH 8.5),5mmol/L氯化镁，10mmol/L硫酸铵,20mmol/L氯化钾,1mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸，0.05％(v/v)吐温20；
优选的，所述试剂盒还包括1×SYBR Gold。
所述试剂盒在检测端粒酶活性中的应用。
本发明的有益效果
1、高灵敏度：本发明利用了高效率的恒温指数扩增方法和滚环扩增方法相结合，设计了一种新的基于端粒触发链置换放大介导的引物生成型滚环扩增反应检测端粒酶活性的荧光方法，将检测信号进行了两步放大，具有超高的灵敏度，因此本发明可以实现高效、灵敏地检测端粒酶的活性，检测限低至3个Hela细胞。
2、特异性好：本发明是基于端粒触发链置换放大介导的引物生成滚环扩增反应，整个反应是使用同一种具有链置换活性的聚合酶，因此反应的特异性很高。另外，本发明中的各反应条件也都进行了详细的优化。因此在扩增反应过程中，极少发生非特异性反应。
3、操作简单：由于本发明中的反应都是恒温扩增，因而不涉及变温步骤；而且该反应不涉及分离、洗涤步骤，操作简便。
附图说明
图1为端粒触发的引物生成型滚环扩增的一步等温扩增测定端粒酶的原理；
图2为端粒酶触发链置换放大介导的引物生成型滚环扩增反应的验证，(A)端粒酶提取物(曲线1)相对应的荧光发射光谱和无端粒酶(曲线2)的对照；(B)聚丙烯酰胺凝胶电泳对反应产物的分析；
图3(A)：不同浓度的端粒酶的荧光光谱变化；(B)：荧光强度在不同浓度端粒酶下的变化情况及其线性分析；
图4(A)不同细胞系中端粒酶提取物的荧光发射光谱；(B)不同细胞系的荧光强度变化；
图5：N，N'-重复(2,3-二羟基苯甲酰)-1-2-苯二胺(MST-312)抑制端粒酶活性的分析。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明特征及其它相关特征作进一步详细说明，以便于同行业技术人员的理解：
实验材料和仪器
细胞：正常细胞系(MRC-5)、子宫颈癌细胞系(Hela)、肺癌细胞系(A549)和胚胎肾细胞系(HEK293T)
以上细胞均购自中国科学院细胞库。
仪器：荧光光谱由Hitachi F-4500荧光计(日立有限公司，日本，东京)测量，其激发波长为495纳米，光谱记录在500纳米到700纳米之间。采用540纳米的荧光强度进行数据分析。
实施例1原理的实验验证
为了验证本发明的可行性，发明人对宫颈癌细胞(HeLa)中端粒酶活性进行检测，具体过程如下：
1.1细胞裂解缓冲液准备：
0.5％丙磺酸，1毫摩尔每升的氯化镁，1毫摩尔每升的乙二醇二乙醚二胺四乙酸，0.1毫摩尔每升的苯甲基磺酰氟，5毫摩尔每升的巯基乙醇，10％(质量/体积)甘油，10毫摩尔每升的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH 7.5)。
1.2细胞提取物准备：
人类子宫颈癌细胞(HeLa)培养基为含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)，放在含有5％二氧化碳，37摄氏度的培养箱中进行培养。待细胞长到对数生长期时，用胰酶将其消化下来，并用pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两遍。将细胞悬浮在200微升的裂解缓冲液中，于4度冰上裂解30分钟，然后在4度，12000转每分钟离心20分钟。最后，将上清液转移至干净的离心管中，备用。
1.3检测端粒酶
(1)整个反应在50微升溶液中，包含2微升端粒酶提取物,20纳摩尔每升的探针,20纳摩尔每升的反向引物,10纳摩尔每升的圆形模板,1×SYBR Gold,20毫摩尔每升的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH 8.5),5毫摩尔每升的氯化镁，10毫摩尔每升的硫酸铵,20毫摩尔每升的氯化钾,1毫摩尔每升的乙二醇二乙醚二胺四乙酸，0.05％(v/v)吐温20,0.75毫摩尔每升的三磷酸脱氧核糖核苷酸,1个单位的Phi29DNA聚合酶,和0.2U个单位的切割酶(Nb.BbvCI).在35摄氏度下孵育120分钟，荧光光谱由Hitachi F-4500荧光计测量，其激发波长为495纳米，光谱记录在500纳米到700纳米之间。采用540纳米的荧光强度进行数据分析。
(2)将20μL步骤(1)反应产物用超纯水稀释至50μL，用Hitachi F-4500荧光计测量在室温下进行荧光光谱的测定。其激发波长为495纳米，光谱记录在500纳米到700纳米之间。采用540纳米的荧光强度进行数据分析。
发明人对扩增反应产物进行了分析验证，结果如图2所示。我们首先监测荧光发射光谱，如图2A所示，在495纳米的激发下，端粒酶提取物的出现引起强烈的荧光发射，最大波长为540纳米(图2A，曲线1)，表明端粒酶引起高的信号放大。相反，如果没有端粒酶提取物(图2A，曲线2)，在对照组中只能检测到微弱的荧光信号，表明在没有端粒酶的情况下没有信号放大。端粒酶提取物的荧光强度比对照组高8.4倍，表明端粒酶触发的等温核酸扩增引起高的信号放大。通过对扩增产物(图2B)用2％琼脂凝胶电泳分析，进一步证实了这一结果。存在端粒酶提取物的情况下，可以观察到不同的波段(形如2B、lane 2)，表示端粒诱导的放大产物。相比之下，当端粒酶提取物不存在时，没有观察到明显的条带(形如2B、lane1)，以上结果证明端粒酶可以触发链置换放大介导的引物生成滚环扩增反应。
实施例2灵敏度实验
为了评估本方案检测端粒酶活性的灵敏度，发明人对其进行不同浓度的分析测定，结果如图3所示。为了评估其定量分析能力，我们对端粒酶的浓度取对数，观察到荧光强度与其浓度对数值在一定浓度范围内呈现出良好的线性关系，且检测限可达3个HeLa细胞。因此本技术方案具有超高的检测灵敏度。
实施例3在不同细胞系中端粒酶检测
为了证明在临床诊断中提出分析方法的潜在应用，发明人在不同细胞系中发现了端粒酶活性，包括正常细胞系(MRC-5)、子宫颈癌细胞系(Hela)、肺癌细胞系(A549)和胚胎肾细胞系(HEK293T)。如图4A所示，类似于带有热灭活细胞的对照组(图4A，曲线1)，没有明显的发射信号是由正常细胞株(图4A，曲线2)产生的，这是由于正常细胞中端粒酶活性的缺失造成的。相比之下，Hela(图4A、曲线3)、A549(图4A、曲线4)、HEK293T(图4A、曲线5)的荧光信号明显高于MRC-5细胞。具体来说，Hela、A549和HEK293T的荧光强度分别比MRC-5细胞(图4B)高出4.2、4.6和4.1倍，这与人类癌症细胞中端粒酶活性的发现相一致。这些结果表明，该试验可以成功地从肿瘤细胞株中分辨出正常的细胞株，在临床诊断应用中具有很大的潜力。
实施例4端粒酶抑制试验
为了检测本技术方案能否用于检测端粒酶的抑制剂，发明人用N，N'-重复(2,3-二羟基苯甲酰)-1-2-苯二胺(mst-312)作为模型抑制剂。如图5所示，随着N，N'-重复(2,3-二羟基苯甲酰)-1-2-苯二胺(mst-312)浓度从0增加到5微摩尔每升，端粒酶的相对活性显著降低。计算得到N，N'-重复(2,3-二羟基苯甲酰)-1-2-苯二胺(mst-312)的半抑制浓度(IC50，即将端粒酶的活性降低50％所需的抑制剂浓度)为0.75，这与所报告的半抑制浓度(IC50)为0.67是一致的。这些结果清晰地表明，我们所提出的检测方法可以成功应用于端粒酶抑制剂的筛选，为抗癌药物的开发提供了新的平台。
最后说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 一种基于引物生成型滚环扩增技术的端粒酶活性检测方法
<130> 2010
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aactatacaa cctactacct cacctcagct acaatccgtc gagcagagtt 50
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccttaccct tacccttacc ctaa 24
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atctatagac ctcagctcgt actagcacaa actatacaac ctactacctc agatgagcta 60

Claims (10)

1.一种探针在基于引物生成型滚环扩增技术检测端粒酶活性方法中的应用，其特征在于,所述探针序列为SEQ ID NO.1。
2.一种基于引物生成型滚环扩增技术检测端粒酶活性的方法，其特征在于,步骤如下：
(1)待测端粒酶诱导的引物生成型滚环扩增反应：DNA单链探针中加入待测端粒酶、反向引物，三磷酸脱氧核糖核苷酸、DNA聚合酶和切割酶，圆形模板，SYBR Gold，在缓冲液中孵育；
(2)分光光度计检测；
所述探针序列为SEQ ID NO.1，所述反向引物序列为SEQ ID NO.2，所述圆形模板序列为SEQ ID NO.3。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述引物序列SEQ ID NO.1 3'端为端粒酶底物序列，5'端为滚环扩增底物序列，中间包含切割酶识别位点。
4.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，DNA聚合酶为phi29 DNA聚合酶，所述切割酶为Nb.BbvCI切割酶；圆形模板含有一个Nb.BbvCI切割酶的识别位点。
5.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，缓冲液包括20mmol/LTris-HCl(pH 8.5),5mmol/L氯化镁，10mmol/L硫酸铵,20mmol/L氯化钾,1mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸，0.05％(v/v)吐温20；孵育条件为在35℃下孵育120min。
6.一种基于引物生成型滚环扩增(PG-RCA)技术检测端粒酶活性的试剂盒，包括：20nmol/L探针；20nmol/L反向引物；10nmol/L的圆形模板；1U DNA聚合酶；0.2U切割酶；0.75mmol/L三磷酸脱氧核糖核苷酸；所述探针序列为SEQ ID NO.1，所述反向引物序列为SEQ ID NO.2，所述圆形模板序列为SEQ ID NO.3。
7.如权利要求6所述的试剂盒,其特征在于，所述DNA聚合酶为phi29DNA聚合酶，所述切割酶为Nb.BbvCI切割酶。
8.如权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括：缓冲液，所述缓冲液包括20mmol/L Tris-HCl(pH 8.5)，5mmol/L氯化镁，10mmol/L硫酸铵，20mmol/L氯化钾，1mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸，0.05％(v/v)吐温20。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括1×SYBR Gold。
10.如权利要求8或9任一项所述的试剂盒在检测端粒酶活性中的应用。
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