CN102690886A

CN102690886A - 一种快速检测端粒酶活性的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN102690886A
Application number: CN2012101907163A
Authority: CN
Inventors: 叶汝章; 张娟; 全利; 滕凌; 叶亚东; 朱文华; 潘鹂; 胡娟; 郝小江; 朱兆云; 路易斯伊格纳罗
Original assignee: YUNNAN LOUIS TRADITIONAL CHINESE MEDICINE MODERNIZATION ENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER
Current assignee: YUNNAN LOUIS TRADITIONAL CHINESE MEDICINE MODERNIZATION ENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER
Priority date: 2012-06-12
Filing date: 2012-06-12
Publication date: 2012-09-26

Abstract

本发明涉及一种快速检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于包括盒体，4个试剂管；所述的试剂管分别装有延伸反应混合物，标记的分子信标序列，ExoIII，1xNEBBuffer1。本试剂盒所需的仪器耗材价格低廉，具有用于大规模检测端粒酶活性的商业化潜力。

Description

一种快速检测端粒酶活性的试剂盒及其应用

背景技术

端粒（Telomere）是一段DNA重复序列，位于染色体末端，可以保持染色体的完整性。1990年，Harley等证实端粒的长度可以随着细胞分裂次数的增多而逐渐变短。这一发现在端粒和细胞衰老之间建立了紧密的联系。端粒重复序列的长度可能起着一种分子钟（molecular clock）的作用。不同年龄的人的体细胞的寿命明显不同，其端粒的长度也不相同。是随着年龄的增长而缩短。来自新生儿的体细胞可在体外传代培养80—90代，来自70岁老人的体细胞在体外只能传代培养20～30代，而且端粒的重复序列长度也缩短很多。

端粒酶（Telomerase）是细胞中负责端粒延长的一种酶，是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端。端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，端粒酶能延长缩短的端粒（缩短的端粒其细胞复制能力受限），从而增强体外细胞的增殖能力。

但是，在正常人体细胞中，端粒酶的活性受到相当严密的调控。实验证明，体细胞里没有端粒酶的活性，所以体细胞每分裂一次，端粒也就缩短一些。随着细胞不断地进行分裂，端粒的长度将越来越短，当达到一个临界长度时，细胞染色体会失去稳定性，使细胞不能再进行分裂而进入凋亡（apoptosis）。端粒的长度决定了细胞的寿命，因此可用丢失的端粒重复序列的长度来推测细胞有丝分裂的次数，所以端粒被称为分子钟或有丝分裂钟（mitotic clock）。端粒除了涉及到染色体稳定性，细胞的衰老和死亡外，还与肿瘤的发生密切相关。在人体内的各种细胞中，生殖细胞和干细胞染色体的末端比体细胞染色体的末端长出几千个碱基对，并且在这两类细胞里能检测到端粒酶的活性。除此之外，其他所有体细胞里都未测得端粒酶的活性。惟一的例外是来源于体细胞的恶性肿瘤细胞却又重新出现了端粒酶活性，发挥其合成端粒重复序列的功能，以补偿正常的端粒序列丢失，使端粒的重复序列不会达到导致细胞死亡的临界长度，从而获得细胞的“永生性”(immortality)。这样，恶性肿瘤细胞在体内或体外都能无限制地分裂增殖。

目前，检测端粒酶活性最常用的方法是基于PCR反应的端粒重复序列扩增法（telomeric repeat amplification protocol, TRAP）。以人类细胞为例，这种方法使用PCR反应扩增由端粒酶通过特定引物延长的6碱基重复序列（TTAGGG），使该重复序列的量达到能被检测到的程度，从而间接的测定端粒酶的活性。虽然这种方法被广泛应用，但是该方法仍然有其不可忽视的缺点：步骤相对复杂，耗时长，容易得到假阳性或假阴性结果等。基于以上原因，最近一些无需通过PCR反应扩增端粒重复序列而达到扩增检测信号目的的方法被开发出来，包括使用多价过核苷酸，纳米金颗粒，具有催化功能的分子信标等。但是这些技术都没有得到广泛的应用，可能的原因是这些技术的步骤仍然很复杂，与原来的TRAP方法比较，并不具备很大的优势。

发明内容

发明目的：

本专利涉及一种基于核酸外切酶III（exonuclease III）可以逐步移除双链DNA 3’ 平末端或3’ 缩进末端单个核苷酸的特性，测量样品细胞内端粒酶活性的方法。

一种快速检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于包括盒体，4个试剂管；所述的试剂管分别装有延伸反应混合物，标记的分子信标序列，ExoIII，1x NEB Buffer 1。

所述的反应混和物成分为：20 mM Tris-HCl，pH 8.3；1.5 mM MgCl₂；63 mM KCl；0.05% Tween 20(w/v)；1 mM EGTA；10 μM dATP；10 μM dGTP；10 μM dCTP；10 μM dUTP；300 nM延伸反应引物；0.1 mg/ml BSA；其中所述的延伸反应引物序列为：5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’；所述的标记的分子信标序列为：5’-（荧光基团）-TAG GGT TAC TAA CCC TAA CCC TAA CCC T-(淬灭基团)-AA CCC TAA CCT TT-3’，其中斜体字母代表锁核酸LNA。

所述的荧光基团包括：5’ 6-FAM、5’ TET、5’ HEX、5’ TAMRA、5’ CY5、中间6-FAM-dT、3’ 6-FAM、3’ TAMRA、中间TAMRA-dT、5’ ROX、3’ ROX、5’ Texas Red、5’ Cy3、中间Cy3、3’Cy3、3’Cy5、5’Cy5、5’Cy5.5、5’AMCA、3’AMCA、5’JOE、3’JOE、Alexa Fluor 488、5’ Methylene Blue、3’ Methylene Blue、FR610；所述的淬灭基团包括：3’ BHQ -1、3’ BHQ -2、3’ Dabcyl、5’ Dabcyl、3’ Eclipse。

一种快速检测端粒酶活性的试剂盒的应用，其特征在于按步骤实现：

A. 从细胞中提取含端粒酶的样品；

B. 在2 μL含端粒酶样品中分别加入48 μL延伸反应混合物，30℃孵育1 h，获得延伸产物；其中所述的延伸反应引物序列为：5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’；

C. 将上述延伸产物，分别添加含1x NEB Buffer 1，100 U ExoIII，2 μM 标记的分子信标序列，将反应混合物置于37 ℃ 2 h后，使用可见光分光光度计读取结果；其中所述的标记的分子信标序列为：5’-（荧光基团）-TAG GGT TAC TAA CCC TAA CCC TAA CCC T-(淬灭基团)-AA CCC TAA CCT TT-3’，其中斜体字母代表锁核酸LNA。

原理说明：

1、分子信标（MBs）与靶序列结合，产生检测信号的原理（图1）：

MBs是一种可特异识别核酸序列的发夹型茎环双标记寡核苷酸荧光探针，具有高特异性、高敏感性、操作简便、可用于定量分析等优点。两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。在复性温度下，因为模板存在时形成茎环结构双链解开，并与模板序列配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开，荧光基团被激发，因淬灭作用被解除，发出激发光子，从而可被检测器检测到。

2、通过exonuclease III（ExoIII）移除3’端单个核苷酸，达到荧光信号不断再生、增强的原理（图2）：

ExoIII具有从双链DNA的3′-OH末端降解生成5’-单核苷酸的3′→5′外切酶活性。该酶对双链DNA具有高度特异性，能降解平滑末端、3′缩进末端及有切口的DNA，但是不能降解3′-突出末端。利用ExoIII的特性，在与端粒酶延伸产物杂交并激活荧光基团后，MBs 3’端核苷酸被反应体系中的ExoIII逐步移除，最终使得被降解的MBs与靶序列分离，这使得靶序列能够重新与完整的MBs杂交，并激活其荧光基团。这种靶序列与MBs杂交-激活荧光基团-ExoIII降解MBs-靶序列与MBs分离的步骤不断循环，从而解决了靶序列与MBs只能以1：1的比例结合的局限性，使得荧光信号被极大的增强，直至能被检测器检测到。

有益效果：

1、本发明通过设计特异性引物，能够实现端粒酶的提取。

2、端粒酶是已知的恶性肿瘤特异性最强的生物标志物，其酶活性在肿瘤的早期诊断和预后评估中均具有很大的潜在价值。同时，在生殖细胞和造血干细胞等非肿瘤细胞中，也能检测出端粒酶活性，因而单凭端粒酶活性的有无难以区分正常细胞和肿瘤细胞。所以端粒酶活性的定量分析是癌症诊断和预防中重要的手段。本专利涉及的基于ExoIII 3’-5’ 外切酶活性的端粒酶检测方法，有步骤简单，耗时短，准确性高，成本低等特点，具有非常大的大规模及商业化应用潜力。

3、本发明的核心是利用核酸外切酶III（exoneclease III）可以逐步移除双链DNA 3’端的单个核苷酸，而对单链DNA无活性的特性，使得与端粒酶延伸序列特异结合的分子信标（molecμLar beacons，MBs）不断被激活-移除，然后新的MBs重新与目标序列结合-激活-移除，从而使MBs信号（荧光，显色反应等）被不断的扩增，达到能被检测到的程度。检测信号的强度直接反映了端粒酶延伸产物的多少，从而间接反映了细胞内端粒酶活性的强弱。该技术步骤简单，耗时短，并且避免了PCR反应带来的可能的假阳性或假阴性结果。另外，该技术

4、本试剂盒所需的仪器耗材价格低廉，具有用于大规模检测端粒酶活性的商业化潜力。

附图说明：

图1. 应用MBs对靶序列进行定量分析的原理。在无靶序列的情况下，MBs呈发夹型结构，其荧光基团在淬灭基团的作用下，不发射荧光；在与靶序列杂交后，MBs的荧光基团与淬灭基团分离，产生能够被检测到的荧光信号。

图2. 应用ExoIII的特性检测端粒酶活性的原理。1. MBs与靶序列，即端粒酶延伸产物杂交，产生荧光信号，并在其3’-OH端形成3’缩进末端，从而成为ExoIII外切酶活性的底物；2. 在ExoIII逐步移除MBs 3’-OH端的寡核苷酸后，MBs与延伸产物分离；分离后的延伸产物可以重新与完整的MBs结合，并重复之前的步骤，使得荧光信号得到增强。

图3. HeLa细胞端粒酶活性。从约8000个HeLa细胞中提取的样品中端粒酶活性所对应的荧光强度比空白对照（Lysis buffer）或灭活后的HeLa细胞样品对应的荧光信号强40%左右（P < 0.05）。

图4. 不同细胞中端粒酶活性检测结果。与空白对照（Lysis buffer）或已知无端粒酶活性的WI-38细胞所的信号强度相比，HeLa细胞或HeLa+WI-38细胞样品中信号强度显著增强（P < 0.05）。

图5. 使用传统TRAP法检测端粒酶活性结果。其中A为1-3泳道电泳，B为4-5电泳图；在空白对照（Lysis buffer）、灭活HeLa细胞及无端粒酶活性的WI-38细胞中（泳道2、3、5），没有观察到端粒酶延伸反应产生的端粒重复序列片段条带，而在已知有端粒酶活性的HeLa细胞或HeLa+WI-38细胞样品中（泳道1、4），可以观察到间接反应端粒酶活性的端粒重复片段条带。

图6为本发明示意图，其中5为盒体，1-4分别为第一至第四试剂管。

具体实施方式

ExoIII和NEB Buffer 1购自New England Biolabs公司，所有荧光集团/淬灭集团标记的MBs（LNA-DNA）及寡核苷酸引物由生工生物工程（上海）公司合成，由HPLC纯化，并由质谱测序。其中荧光基团为CAL Fluor Red 610（FR610），淬灭基团为black hole quencher（BHQ）。用于检测端粒酶活性的LNA-DNA嵌合体MB序列为：5’-（FR610）-TAG GGT TAC TAA CCC TAA CCC TAA CCC T-(BHQ)-AA CCC TAA CCT TT-3’（斜体字母代表锁核酸LNA）；端粒酶延伸反应引物为：5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’。肿瘤细胞（HeLa细胞株，购自ATCC）和人胚肺二倍体成纤维细胞（WI-38细胞株，购自ATCC）培养条件参照ATCC提供的培养方法。

实施例1.

一种快速检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于包括盒体5，4个试剂管；其中第一试剂管1装有延伸反应混合物，第二试剂管2装有标记的分子信标序列，第三试剂管3装有ExoIII，第四试剂管4装有1x NEB Buffer 1。

一种快速检测端粒酶活性的试剂盒的应用，按如下步骤实现：

一、细胞样品中端粒酶的提取

分别收集肿瘤细胞（HeLa细胞株，购自ATCC）和人胚肺二倍体成纤维细胞（WI-38细胞株，购自ATCC），离心后将细胞按200 μL/10⁶细胞的比例重新悬浮于裂解液（1x CHAPS Lysis buffer，ATCC）中，冰上静置30 min；之后于12000 g，4℃离心20 min；收集上清于-80℃保存，获得两种含端粒酶上清，即HeLa细胞端粒酶上清和WI-38细胞端粒酶上清。

二、端粒酶延伸反应

在2 μL（含总蛋白约5μg/μL）的两种含端粒酶待测上清样品中分别加入48 μL延伸反应混合物，30℃孵育1 h，获得延伸产物，即HeLa细胞延伸产物和WI-38细胞延伸产物；

其中延伸反应混合物成分为：20 mM Tris-HCl,pH 8.3；1.5 mM MgCl₂；63 mM KCl；0.05% Tween 20(w/v)；1 mM EGTA；10 μM dATP；10 μM dGTP；10 μM dCTP；10 μM dUTP；300 nM延伸反应引物，其中引物核苷酸序列为5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’；0.1 mg/ml BSA。

端粒酶活性检测

反应体系为50 μL，将上述延伸产物，分别添加含1x NEB Buffer 1，100 U ExoIII，2 μM 标记的分子信标序列；将反应混合物置于37 ℃ 2 h后，使用可见光分光光度计读取结果：λ_ex=590 nm，从HeLa细胞中提取的样品中端粒酶活性所对应的荧光强度比空白对照（Lysis buffer）或灭活后（即加热处理后灭活后）的HeLa细胞样品对应的荧光信号强40%左右（P < 0.05），见图3；

λ_em=610 nm，与空白对照（Lysis buffer）或已知无端粒酶活性的WI-38细胞所的信号强度相比，HeLa细胞或HeLa+WI-38细胞样品中信号强度显著增强（P < 0.05）见（图4）。

所述的分子信标序列为：5’-（荧光基团）-TAG GGT TAC TAA CCC TAA CCC TAA CCC T-(淬灭基团)-AA CCC TAA CCT TT-3’（斜体字母代表锁核酸LNA）；其中本例中的荧光基团为FR610，淬灭基团为3’BHQ-1。

电泳使用10%的non-denaturing PAGE胶，电泳条件为400 V，1.5 h。电泳完成后使用溴乙啶溶液染色，于紫外灯下观察结果；在空白对照（Lysis buffer）、灭活HeLa细胞及无端粒酶活性的WI-38细胞中（泳道2、3、5），没有观察到端粒酶延伸反应产生的端粒重复序列片段条带，而在已知有端粒酶活性的HeLa细胞或HeLa+WI-38细胞样品中（泳道1、4），可以观察到间接反应端粒酶活性的端粒重复片段条带（图5）

对比例：TRAP assay

该方法使用Trapeze Telomerase Detection Kit（Millipore）。

1. 在特定序列的引物TS Primer(5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’)存在的条件下，获得端粒酶延伸反应产物，并使用PCR扩增该延伸反应产物。

端粒酶基因延伸反应及后续PCR扩增延伸反应产物的反应混合物成分如下：

10x TRAP Reaction Buffer	5 μL
		50x dNTPs Mix	1 μL
TS Primer	1 μL
		TRAP Primer Mix	1 μL
Taq polymerase (5U/μL)	0.4 μL
		实施例1获得端粒酶提取上清	2 μL
dH₂O	39.6 μL

PCR反应条件为：30℃，30 min；33个循环（94℃，30 s；59℃，30 s；72℃，1 min）

2. 电泳分析PCR扩增产物

电泳使用10%的non-denaturing PAGE胶，电泳条件为400 V，1.5 h。电泳完成后使用溴乙啶溶液染色，于紫外灯下观察结果，（图5）。其中WI-38细胞株为人胚肺二倍体成纤维细胞，作为正常的体细胞，已被证明不含端粒酶活性，所以在这里作为阴性对照。

使用本专利涉及的基于ExoIII外切酶活性的端粒酶检测方法，我们观察到已知存在端粒酶活性的HeLa细胞样品所得到的荧光信号与作为阴性对照的空白Lysis buffer或WI-38细胞株相比，荧光信号有显著增强（图3、4）。另外，使用经热处理灭活的HeLa细胞作为对照，发现获得的荧光强度与使用空白Lysis buffer获得的荧光强度基本相同（图3），这就排除了其他因素的影响，证明使用正常HeLa细胞提取物所测得的荧光信号确实对应于其端粒酶活性。另外使用WI-38细胞和HeLa细胞混合提取物时，我们发现获得的信号强度与单独使用HeLa细胞提取物基本一致（图4），这也证明了该方法测定细胞端粒酶活性的准确性。相对应的，当使用传统的TRAP法检测端粒酶活性，HeLa细胞样品可以观察到代表端粒酶活性端粒重复序列条带（图5，泳道1），而这些条带在阴性对照中却观察不到（图5，泳道2、3、5）。这从侧面证明了本专利涉及的端粒酶检测方法所得结果是真实可靠的。

Claims

1.一种快速检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于包括盒体和4个试剂管；其中第一试剂管装有延伸反应混合物，第二试剂管装有标记的分子信标序列，第三试剂管装有ExoIII，第四试剂管装有1x NEB Buffer 1。

2.根据权利要求1所述的一种快速检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于所述的反应混和物成分为：20 mM Tris-HCl，pH 8.3；1.5 mM MgCl₂；63 mM KCl；0.05% Tween 20(w/v)；1 mM EGTA；10 μM dATP；10 μM dGTP；10 μM dCTP；10 μM dUTP；300 nM延伸反应引物；0.1 mg/ml BSA；其中所述的延伸反应引物序列为：5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’；所述的标记的分子信标序列为：5’-（荧光基团）-TAG GGT TAC TAA CCC TAA CCC TAA CCC T-(淬灭基团)-AA CCC TAA CCT TT-3’，其中斜体字母代表锁核酸LNA。

3.根据权利要求1所述的一种快速检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于所述的荧光基团包括：5’ 6-FAM、5’ TET、5’ HEX、5’ TAMRA、5’ CY5、中间6-FAM-dT、3’ 6-FAM、3’ TAMRA、中间TAMRA-dT、5’ ROX、3’ ROX、5’ Texas Red、5’ Cy3、中间Cy3、3’Cy3、3’Cy5、5’Cy5、5’Cy5.5、5’AMCA、3’AMCA、5’JOE、3’JOE、Alexa Fluor 488、5’ Methylene Blue、3’ Methylene Blue、FR610；所述的淬灭基团包括：3’ BHQ -1、3’ BHQ -2、3’ Dabcyl、5’ Dabcyl、3’ Eclipse。

4.根据权利要求1-3任意一种快速检测端粒酶活性的试剂盒的应用，其特征在于按步骤实现：

从细胞中提取含端粒酶的样品；

在2 μL含端粒酶样品中分别加入48 μL延伸反应混合物，30℃孵育1 h，获得延伸产物；其中所述的延伸反应引物序列为：5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’；

将上述延伸产物，分别添加含1x NEB Buffer 1，100 U ExoIII，2 μM 标记的分子信标序列，将反应混合物置于37 ℃ 2 h后，使用可见光分光光度计读取结果；其中所述的标记的分子信标序列为：5’-（荧光基团）-TAG GGT TAC TAA CCC TAA CCC TAA CCC T-(淬灭基团)-AA CCC TAA CCT TT-3’，其中斜体字母代表锁核酸LNA。