CN110333217A - 一种新型的双光谱跷跷板式比率探针及构建方法 - Google Patents
一种新型的双光谱跷跷板式比率探针及构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110333217A CN110333217A CN201910483993.5A CN201910483993A CN110333217A CN 110333217 A CN110333217 A CN 110333217A CN 201910483993 A CN201910483993 A CN 201910483993A CN 110333217 A CN110333217 A CN 110333217A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- mcf
- solution
- probe
- novel double
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 85
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 claims abstract description 25
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000009514 concussion Effects 0.000 claims abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 71
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 45
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 21
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 15
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 13
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 13
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 claims description 10
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 10
- 229910004042 HAuCl4 Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 claims description 9
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 claims description 9
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 8
- 238000004416 surface enhanced Raman spectroscopy Methods 0.000 claims description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 7
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 claims description 6
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 6
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 5
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- FDWREHZXQUYJFJ-UHFFFAOYSA-M gold monochloride Chemical compound [Cl-].[Au+] FDWREHZXQUYJFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 claims description 3
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 claims description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002242 deionisation method Methods 0.000 claims 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 11
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 210000003739 neck Anatomy 0.000 description 4
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 4
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 3
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100032244 Dynein axonemal heavy chain 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100032245 Dynein axonemal heavy chain 2 Human genes 0.000 description 2
- 101001016198 Homo sapiens Dynein axonemal heavy chain 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001016199 Homo sapiens Dynein axonemal heavy chain 2 Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000001237 Raman spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 1
- RJHLTVSLYWWTEF-UHFFFAOYSA-K gold trichloride Chemical compound Cl[Au](Cl)Cl RJHLTVSLYWWTEF-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
- G01N21/6458—Fluorescence microscopy
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/65—Raman scattering
- G01N21/658—Raman scattering enhancement Raman, e.g. surface plasmons
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6432—Quenching
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于探针构建及应用技术领域，公开了一种新型的双光谱跷跷板式比率探针及构建方法，将发夹DNA H1链加热，并用冰浴冷却；加入AuNPs溶液和已退火的H1，震荡；然后将混合物离心，弃去上清液，加入已退火的发夹DNA H2溶液冲散并反应；反应后在激光激发下测量Rox和Cy3的拉曼信号验证SR探针是否构建成功。本发明构建了一种新型的双光谱“跷跷板”式比率探针(SR)，采用Rox和Cy3两种标记物，在单个活细胞内实现了端粒酶的检测与成像分析；在细胞内端粒酶存在下，前体DNA链生长，Rox从靠近纳米金的状态变为远离，而Cy3从远离变为靠近。
Description
技术领域
本发明属于探针构建及应用技术领域，尤其涉及一种新型的双光谱跷跷板式比率探针及构建方法。
背景技术
目前，最接近的现有技术：
近年来，已经使用各种灵敏度高、准确性好的分析方法用来检测端粒酶的活性，例如基于聚合酶链式反应(PCR)的端粒重复扩增放大(TRAP)策略、比色法、表面等离子体共振(SPR)、酶刻蚀法、聚集诱导发光(AIE)、即时检验方法(Point ofCare)、荧光方法、表面增强拉曼散射(SERS)方法等。如夏凡团队使用一种标记有AIE染料的生物探针检测细胞内的端粒酶活性；金燕团队通过读取反应产生的气体压力来检测端粒酶活性；胥传来团队使用上转换纳米颗粒的荧光强度来检测端粒酶的活性。虽然这些方法都成功的检测了细胞内的端粒酶活性，但是由于细胞内复杂的环境干扰和高背景信号的影响，设计更好的端粒酶活性检测方法仍然是一个挑战。
为减小细胞内复杂环境所带来的背景干扰，近年来人们提出了一种比率型荧光探针，通过目标响应信号和静态参比信号的比例值对目标物进行检测。但这种比率型荧光探针的灵敏度不够高，很难用于活细胞内低丰度端粒酶活性的检测。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)现有技术比率型荧光探针，通过目标响应信号和静态参比信号的比例值对目标物进行检测。但这种比率型荧光探针的灵敏度不够高，很难用于活细胞内低丰度端粒酶活性的检测。
现有技术没有构建一种新型的双光谱“跷跷板”式比率探针(SR)，采用Rox和Cy3两种标记物，在单个活细胞内不能实现端粒酶的检测与成像分析。(很难实现单个活细胞内端粒酶的高灵敏检测与成像分析。)
(2)SR探针可同时用于荧光成像和表面增强拉曼散射光谱检测，具有双光谱检测功能。其中荧光成像可用于探针的动力学摄取及端粒酶与SR探针相互作用的直观、迅速观测；而拉曼光谱可用于单个细胞内端粒酶活性的高灵敏度检测。
解决上述技术问题的难度：
(1)提高比率型探针的灵敏度。现有比率型探针的参比荧光强度基本是固定的，导致检测灵敏度不够高。
(2)单个活细胞内端粒酶活性的高灵敏检测与成像分析。单细胞内的端粒酶活性较低，需要极大的提高探针的灵敏度。
(3)活细胞的快速成像与检测。细胞脱离培养箱环境，存活概率会大大降低，构建的探针需要跟细胞快速、特异性作用，提高按测效率。
解决上述技术问题的意义：端粒酶是一种核糖核蛋白，在正常细胞内端粒酶活性表达很低，在每一次细胞周期内，位于染色体末端的端粒都会缩短。但在某些端粒酶活性表达高的细胞中，端粒酶通过产生重复序列阻止染色体上的端粒缩短，使得细胞无限增殖并且不会凋亡，细胞最终成为癌细胞。因此，对端粒酶活性的检测在肿瘤诊断、监测和治疗方面具有重要意义。
本发明设计了一种双光谱“跷跷板”比率型拉曼探针(SR)，对MCF-7细胞内的端粒酶进行了成像和定量分析。利用荧光和SERS的优势，研究了细胞内端粒酶与SR探针的动力学反应，SR探针在细胞内定位。收集双信号变化强度信号，并通过双信号强度的比值法我们成功地测定了单细胞中端粒酶的含量。该方法具有以下优势：双信号动态变化输出可以提高检测方法的准确性，避免出现假阳性分析结果；与单比例探针相比。SR探针可以放大拉曼信号，减少背景信号以提高灵敏度并且克服了单比例探针方法中复杂环境的干扰。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新型的双光谱跷跷板式比率探针及构建方法。
本发明是这样实现的，一种新型的双光谱跷跷板式比率探针的构建方法，所述新型的双光谱跷跷板式比率探针的构建方法包括：
步骤一，将1μM，50μL的发夹DNAH1链在95℃水浴下加热5min，并用冰浴冷却。在干净的10mL小烧杯中加入1mLAuNPs溶液和已退火的H1，在37℃的振荡器中震荡24h。
步骤二，将混合物在12000rpm条件下离心30min，弃去上清液，加入1μM，50μL的已退火的发夹DNAH2溶液冲散并反应2h。反应后在633nm激光激发下测量Rox和Cy3的拉曼信号验证SR探针是否构建成功。
进一步，步骤一中，将1μM，50μL的发夹DNA H1链在95℃水浴下加热5min前需进行金纳米粒子的合成。具体包括：
在合成金纳米粒子之前，玻璃容器、磁子都要用浓硝酸浸泡24h，用次去离子水清洗以除去多余的硝酸，并置于真空干燥箱内烘干备用。
称取1.0000g氯金酸固体，并用二次水定容至100mL容量瓶中，配制1％的HAuCl4溶液。取1mL 1％的HAuCl4溶液，用二次水定容至100mL容量瓶中，配制0.01％的HAuCl4溶液。称取0.0565g柠檬酸钠，用5mL二次水溶解，构建1％的柠檬酸钠溶液，以备使用。
步骤二中，将100mL 0.01％的HAuCl4溶液倒入三颈圆底烧瓶中，加入磁子，打开搅拌加热开关，并接通冷凝水回流。当HAuCl4溶液中出现连续均匀的气泡时，加入1.5mL 1％的柠檬酸钠溶液，溶液由淡黄色迅速变为深黑色，最后逐渐变成清澈的酒红色，继续加热30min并保持避光，停止加热后，继续搅拌并回流至溶液温度冷却至室温，将冷却好的金纳米粒子胶体倒入棕色广口瓶中，于4℃冰箱上层保存。
本发明的另一目的在于提供一种新型的双光谱跷跷板式比率探针。
本发明的另一目的在于提供一种所述的新型的双光谱跷跷板式比率探针在与端粒酶作用的SERS检测中的应用，所述应用方法包括：
取1μL端粒酶稀释液和5μL dNTPs加入到SR探针溶液中，使端粒酶与H2上的端粒酶引物链在37℃反应2h。取1μL混合溶液滴在洗净的金片上，用633nm的激光激发。所述金片应用时，需进行处理，包括：取400μL氨水、400μL双氧水和2000μL二次水混合在95℃水浴10min，并用二次水清洗，洗耳球吹干。
本发明的另一目的在于提供一种所述的新型的双光谱跷跷板式比率探针在MCF-7细胞的荧光成像中的应用，所述应用方法包括：
第一步，MCF-7细胞培养，使用RPMI 1640培养液对MCF-7细胞进行培养，在37℃温度下含有湿润气体的培养箱中进行培养。所述RPMI 1640培养液为10％的FBS、1％的青霉素-链霉素。
第二步，细胞摄取SR探针，首先将MCF-7细胞传代并将其滴加在共聚焦培养皿中培育24h。随后将MCF-7细胞用PBS溶液清洗三次，将SR探针用2mL无血清培养液冲散，每隔1h时间向培养皿中加入0.5mLSR探针混合溶液，孵育MCF-7细胞4h。
第三步，MCF-7细胞的荧光成像，MCF-7细胞和SR探针反应4h后，用PBS溶液清洗细胞三次，防止细胞外多余的SR探针增加荧光背景信号。共聚焦激光显微镜进行细胞成像，用514nm的氩气激光激发Rox和Cy3分子，在540nm到590nm范围内收集Cy3的荧光发射。在600nm到640nm范围内收集Rox的荧光发射。
本发明的另一目的在于提供一种所述的新型的双光谱跷跷板式比率探针在MCF-7细胞的拉曼成像中的应用，所述应用方法包括：
第I步，MCF-7细胞培养，使用RPMI 1640培养液对MCF-7细胞进行培养，在37℃温度下含有湿润气体的培养箱中进行培养。所述RPMI 1640培养液为10％的FBS、1％的青霉素-链霉素。
第II步，细胞摄取SR探针，首先将MCF-7细胞传代并将其滴加在共聚焦培养皿中培育24h。随后将MCF-7细胞用PBS溶液清洗三次，将SR探针用2mL无血清培养液冲散，每隔1h时间向培养皿中加入0.5mLSR探针混合溶液，孵育MCF-7细胞4h。
第III步，MCF-7细胞的拉曼成像，MCF-7细胞和SR探针反应4h后，将生长在金片上的MCF-7细胞用雷尼绍拉曼光谱仪进行成像，使用激光强度为10％，波长为633nm的氦氖激光照射MCF-7细胞，拉曼信号的检测从0cm-1到2000cm-1范围收集。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明构建了一种新型的双光谱“跷跷板”式比率探针(SR)，采用Rox和Cy3两种标记物，在单个活细胞内实现了端粒酶的检测与成像分析。在细胞内端粒酶存在下，前体DNA链生长，Rox从靠近纳米金的状态变为远离，而Cy3从远离变为靠近。为方便测试细胞内端粒酶的活性，采用表面增强拉曼技术(SERS)，标记物靠近纳米金时，拉曼信号被增强，而当标记物远离纳米金时，拉曼强度大大减小，在该实验中，当端粒酶存在时，Rox的拉曼信号由强变弱，而Cy3的拉曼信号由弱变强，因此拉曼强度比值ICy3/IRox随着端粒酶活性的增加而迅速增大，可以检测极少量的端粒酶活性。为方便表征端粒酶在细胞内的分布情况，采用更直观的荧光共聚焦技术，标记物靠近纳米金时，由于荧光共振能量转移作用(FRET)，其荧光被猝灭，标记物远离纳米金时，荧光信号恢复，因此细胞内端粒酶存越多，Rox的荧光信号越强，Cy3的荧光信号越弱。
附图说明
图1是本发明实施例提供的新型的双光谱跷跷板式比率探针的构建方法流程图。
图2是本发明实施例提供的新型的双光谱跷跷板式比率探针的构建方法原理图。
图3是本发明实施例提供的探针的跷跷板模式示意图。
图4是本发明实施例提供的端粒酶检测拉曼光谱实验可行性分析图。图中：(a)AuNPs；(b)SR探针+端粒酶；(c)SR探针。
图5是本发明实施例提供的肿瘤细胞内端粒酶检测的荧光成像图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
现有技术比率型荧光探针，通过目标响应信号和静态参比信号的比例值对目标物进行检测。但这种比率型荧光探针的灵敏度不够高，很难用于活细胞内低丰度端粒酶活性的检测。现有技术没有构建一种新型的双光谱“跷跷板”式比率探针(SR)，采用Rox和Cy3两种标记物，在单个活细胞内不能实现端粒酶的检测与成像分析。(很难实现单个活细胞内端粒酶的高灵敏检测与成像分析。)
为解决上述问题，下面结合具体方案对本发明作详细描述。
如图1所述，本发明实施例提供的新型的双光谱跷跷板式比率探针的构建方法包括：
S101，金纳米粒子的合成。
S102，“跷跷板”式比率(SR)探针的构建。
S103，SR探针与端粒酶作用的SERS检测。
S104，MCF-7细胞培养。
S105，细胞摄取SR探针。
S106，MCF-7细胞的荧光成像。
S107，MCF-7细胞的拉曼成像。
步骤S101中，AuNPs的合成使用的是Turkevitch设计的柠檬酸钠一步还原的方法，柠檬酸钠会将氯金酸中的Au3+还原成Au单质，Au单质进行团聚和生长，而柠檬酸钠会控制AuNPs的进一步团聚。通过控制柠檬酸钠和氯金酸的体积比例可以合成不同粒径的金纳米粒子。
由于胶体很容易受环境因素的影响产生沉淀和聚集，因此，在合成金纳米粒子之前，实验所需的玻璃容器(三颈圆底烧瓶、容量瓶、球形冷凝管、广口瓶)、磁子都要用浓硝酸浸泡24h，用大量的二次去离子水清洗以除去多余的硝酸，并置于真空干燥箱内烘干备用。
称取1.0000g氯金酸固体，并用二次水定容至100mL容量瓶中，配制1％的HAuCl4溶液。取1mL 1％的HAuCl4溶液，用二次水定容至100mL容量瓶中，配制0.01％的HAuCl4溶液进行实验。称取0.0565g柠檬酸钠，用5mL二次水溶解，构建1％的柠檬酸钠溶液，以备实验使用。
三颈圆底烧瓶和球形冷凝管装置搭好，将100mL 0.01％的HAuCl4溶液倒入三颈圆底烧瓶中，加入磁子，打开搅拌加热开关，并接通冷凝水回流。当HAuCl4溶液中出现连续均匀的气泡时，准确加入1.5mL 1％的柠檬酸钠溶液，溶液由淡黄色迅速变为深黑色，最后逐渐变成清澈的酒红色，继续加热30min并保持避光(防止新合成的金纳米粒子分解)，停止加热后，继续搅拌并回流至溶液温度冷却至室温，将冷却好的金纳米粒子胶体倒入棕色广口瓶中，于4℃冰箱上层保存。
步骤S102中，构建SR探针时，为了防止发夹链碱基错配，需要将发夹DNAH1链(1μM，50μL)在95℃水浴下加热5min，并用冰浴冷却。在干净的10mL小烧杯中加入1mLAuNPs溶液和已退火的H1(1μM，50μL)，在37℃的振荡器中震荡24h。然后将混合物在12000rpm条件下离心30min，弃去上清液，加入已退火的发夹DNAH2(1μM，50μL)溶液冲散并反应2h。反应后在633nm激光激发下测量Rox和Cy3的拉曼信号验证SR探针是否构建成功。
步骤S103中，取1μL端粒酶稀释液和5μL dNTPs加入到SR探针溶液中，使端粒酶与H2上的端粒酶引物链在37℃反应2h。取1μL混合溶液滴在洗净的金片上(取400μL氨水、400μL双氧水和2000μL二次水混合在95℃水浴10min，并用二次水清洗，洗耳球吹干)，用50倍短焦拉曼镜头观察，用633nm的激光激发。
步骤S104中，使用RPMI 1640培养液(10％的FBS、1％的青霉素-链霉素)对MCF-7细胞进行培养，在37℃温度下含有湿润气体的培养箱(5％的二氧化碳和95％的空气)中进行培养。
S105，细胞摄取SR探针。
步骤S105中，首先将MCF-7细胞传代并将其滴加在共聚焦培养皿中培育24h。随后将MCF-7细胞用PBS溶液清洗三次，将SR探针用2mL无血清培养液(防止血清和纳米粒子的非特异性反应)冲散，每隔1h时间向培养皿中加入0.5mLSR探针混合溶液，孵育MCF-7细胞4h。
S106，MCF-7细胞的荧光成像。
步骤S106中，MCF-7细胞和SR探针反应4h后，用PBS溶液清洗细胞三次，防止细胞外多余的SR探针增加荧光背景信号。共聚焦激光显微镜进行细胞成像，用514nm的氩气激光激发Rox和Cy3分子，在540nm到590nm范围内收集Cy3的荧光发射。在600nm到640nm范围内收集Rox的荧光发射。
步骤S107中，MCF-7细胞和SR探针反应4h后，将生长在金片上的MCF-7细胞用雷尼绍拉曼光谱仪进行成像，使用激光强度为10％，波长为633nm的氦氖激光照射MCF-7细胞，拉曼信号的检测从0cm-1到2000cm-1范围收集。
下面结合实验对本发明作进一步描述。
图2是本发明实施例提供的新型的双光谱跷跷板式比率探针的构建方法原理。图3是本发明实施例提供的探针的跷跷板模式。图4是本发明实施例提供的端粒酶检测拉曼光谱实验可行性分析。图中：(a)AuNPs；(b)SR探针+端粒酶；(c)SR探针。图5是本发明实施例提供的肿瘤细胞内端粒酶检测的荧光成像。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种新型的双光谱跷跷板式比率探针的构建方法，其特征在于，所述新型的双光谱跷跷板式比率探针的构建方法包括：
步骤一，将发夹DNA H1链加热，并用冰浴冷却；加入AuNPs溶液和已退火的H1，震荡；
步骤二，将混合物离心，弃去上清液，加入已退火的发夹DNA H2溶液冲散并反应；反应后在激光激发下测量Rox和Cy3的拉曼信号验证SR探针是否构建成功。
2.如权利要求1所述的新型的双光谱跷跷板式比率探针的构建方法，其特征在于，步骤一中，将1μM，50μL的发夹DNA H1链在95℃水浴下加热5min，并用冰浴冷却；在干净的10mL小烧杯中加入1mL AuNPs溶液和已退火的H1，在37℃的振荡器中震荡24h。
3.如权利要求2所述的新型的双光谱跷跷板式比率探针的构建方法，其特征在于，将1μM，50μL的发夹DNA H1链在95℃水浴下加热5min前需进行金纳米粒子的合成；包括：
第一步，在合成金纳米粒子之前，玻璃容器、磁子都要用浓硝酸浸泡24h，用二次去离子水清洗以除去多余的硝酸，并置于干燥箱内烘干备用；
第二步，称取1.0000g氯金酸固体，并用二次水定容至100mL容量瓶中，配制1％的HAuCl4溶液；取1mL 1％的HAuCl4溶液，用二次水定容至100mL容量瓶中，配制0.01％的HAuCl4溶液；称取0.0565g柠檬酸钠，用5mL二次水溶解，配制1％的柠檬酸钠溶液，以备使用。
4.如权利要求3所述的新型的双光谱跷跷板式比率探针的构建方法，其特征在于，进行第二步后，还需进行：将100mL 0.01％的HAuCl4溶液倒入三颈圆底烧瓶中，加入磁子，打开搅拌加热开关，并接通冷凝水回流；当HAuCl4溶液中出现连续均匀的气泡时，加入1.5mL1％的柠檬酸钠溶液，溶液由淡黄色迅速变为深黑色，最后逐渐变成清澈的酒红色，继续加热30min并保持避光，停止加热后，继续搅拌并回流至溶液温度冷却至室温，将冷却好的金纳米粒子胶体倒入棕色广口瓶中，于4℃冰箱上层保存。
5.如权利要求1所述的新型的双光谱跷跷板式比率探针的构建方法，其特征在于，步骤二中，将混合物在12000rpm条件下离心30min，弃去上清液，加入1μM，50μL的已退火的发夹DNA H2溶液冲散并反应2h；反应后在633nm激光激发下测量Rox和Cy3的拉曼信号。
6.一种如权利要求1所述新型的双光谱跷跷板式比率探针的构建方法构建的新型的双光谱跷跷板式比率探针。
7.一种如权利要求6所述的新型的双光谱跷跷板式比率探针在与端粒酶作用的SERS检测中的应用，其特征在于，所述应用方法包括：
取1μL端粒酶稀释液和5μL dNTPs加入到SR探针溶液中，使端粒酶与H2上的端粒酶引物链在37℃反应2h；取1μL混合溶液滴在洗净的金片上，用633nm的激光激发。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，金片应用时，需进行处理，具体包括：取400μL氨水、400μL双氧水和2000μL二次水混合在95℃水浴10min，并用二次水清洗，洗耳球吹干。
9.一种如权利要求6所述的新型的双光谱跷跷板式比率探针在MCF-7细胞的荧光成像中的应用，其特征在于，所述应用方法包括：
第一步，MCF-7细胞培养，使用RPMI 1640培养液对MCF-7细胞进行培养，在37℃温度下含有湿润气体的培养箱中进行培养；所述RPMI 1640培养液为10％的FBS、1％的青霉素-链霉素；
第二步，细胞摄取SR探针，首先将MCF-7细胞传代并将其滴加在共聚焦培养皿中培育24h；随后将MCF-7细胞用PBS溶液清洗三次，将SR探针用2mL无血清培养液冲散，每隔1h时间向培养皿中加入0.5mLSR探针混合溶液，孵育MCF-7细胞4h；
第三步，MCF-7细胞的荧光成像，MCF-7细胞和SR探针反应4h后，用PBS溶液清洗细胞三次，防止细胞外多余的SR探针增加荧光背景信号；共聚焦激光显微镜进行细胞成像，用514nm的氩气激光激发Rox和Cy3分子，在540nm到590nm范围内收集Cy3的荧光发射；在600nm到640nm范围内收集Rox的荧光发射。
10.一种如权利要求6所述的新型的双光谱跷跷板式比率探针在MCF-7细胞的拉曼成像中的应用，其特征在于，所述应用方法包括：
第I步，MCF-7细胞培养，使用RPMI 1640培养液对MCF-7细胞进行培养，在37℃温度下含有湿润气体的培养箱中进行培养；所述RPMI 1640培养液为10％的FBS、1％的青霉素-链霉素；
第II步，细胞摄取SR探针，首先将MCF-7细胞传代并将其滴加在共聚焦培养皿中培育24h；随后将MCF-7细胞用PBS溶液清洗三次，将SR探针用2mL无血清培养液冲散，每隔1h时间向培养皿中加入0.5mLSR探针混合溶液，孵育MCF-7细胞4h；
第III步，MCF-7细胞的拉曼成像，MCF-7细胞和SR探针反应4h后，将生长在金片上的MCF-7细胞用雷尼绍拉曼光谱仪进行成像，使用激光强度为10％，波长为633nm的氦氖激光照射MCF-7细胞，拉曼信号的检测从0cm-1到2000cm-1范围收集。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910483993.5A CN110333217A (zh) | 2019-06-05 | 2019-06-05 | 一种新型的双光谱跷跷板式比率探针及构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910483993.5A CN110333217A (zh) | 2019-06-05 | 2019-06-05 | 一种新型的双光谱跷跷板式比率探针及构建方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110333217A true CN110333217A (zh) | 2019-10-15 |
Family
ID=68140217
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910483993.5A Pending CN110333217A (zh) | 2019-06-05 | 2019-06-05 | 一种新型的双光谱跷跷板式比率探针及构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110333217A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008520963A (ja) * | 2004-11-16 | 2008-06-19 | シーナ・キャンサー・ダイアグノスティクス・リミテッド | サンプル中の分析物を検出する方法 |
| CN102690886A (zh) * | 2012-06-12 | 2012-09-26 | 云南路易斯中药现代化工程技术研究中心 | 一种快速检测端粒酶活性的试剂盒及其应用 |
| CN103993078A (zh) * | 2014-05-09 | 2014-08-20 | 南京大学 | 一种对细胞内端粒酶活性原位成像的纳米探针及其制备方法 |
| US20170152549A1 (en) * | 2014-05-28 | 2017-06-01 | University Of Houston System | Nanoporous gold and silver nanoparticles and substrates for molecular and biomolecular sensing |
| CN109439318A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-03-08 | 中国科学院合肥物质科学研究院 | 一种比率型粘性耀斑荧光探针及其制备方法和应用 |
-
2019
- 2019-06-05 CN CN201910483993.5A patent/CN110333217A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008520963A (ja) * | 2004-11-16 | 2008-06-19 | シーナ・キャンサー・ダイアグノスティクス・リミテッド | サンプル中の分析物を検出する方法 |
| CN102690886A (zh) * | 2012-06-12 | 2012-09-26 | 云南路易斯中药现代化工程技术研究中心 | 一种快速检测端粒酶活性的试剂盒及其应用 |
| CN103993078A (zh) * | 2014-05-09 | 2014-08-20 | 南京大学 | 一种对细胞内端粒酶活性原位成像的纳米探针及其制备方法 |
| US20170152549A1 (en) * | 2014-05-28 | 2017-06-01 | University Of Houston System | Nanoporous gold and silver nanoparticles and substrates for molecular and biomolecular sensing |
| CN109439318A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-03-08 | 中国科学院合肥物质科学研究院 | 一种比率型粘性耀斑荧光探针及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LIGUANG XU ET AL.，: "Multigaps Embedded Nanoassemblies Enhance In Situ Raman Spectroscopy for Intracellular Telomerase Activity Sensing", 《ADVANCED FUNCTIONAL MATERIALS》 * |
| NA ZHANG ET AL.，: "A Dual-Signal Twinkling Probe for Fluorescence-SERS Dual Spectrum Imaging and Detection of miRNA in Single Living Cell via Absolute Value Coupling of Reciprocal Signals", 《ACS SENSORS》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dai et al. | Near-infrared triggered strand displacement amplification for MicroRNA quantitative detection in single living cells | |
| Wang et al. | Dye‐sensitized downconversion nanoprobes with emission beyond 1500 nm for ratiometric visualization of cancer redox state | |
| Kang et al. | A near-infrared fluorescent probe for ratiometric imaging peroxynitrite in Parkinson's disease model | |
| CN110982513B (zh) | 一种荧光碳点的制备方法及其在细胞成像中的应用 | |
| CN103881708B (zh) | 一步溶剂热法制备硼掺杂碳量子点的方法及其应用 | |
| CN110455764A (zh) | 肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测方法 | |
| CN106008342A (zh) | 一种检测细胞溶酶体内甲醛的荧光探针及其制备方法 | |
| Lu et al. | Colorimetric and fluorescent dual-mode sensing of alkaline phosphatase activity in L-02 cells and its application in living cell imaging based on in-situ growth of silver nanoparticles on graphene quantum dots | |
| CN109628557A (zh) | 双重信号增强纸基生物传感器在miRNA检测中的应用 | |
| CN107881218A (zh) | 一种用于端粒酶活性检测的球形核酸荧光探针及其制备方法和用途 | |
| CN104297307B (zh) | 基于茎环结构探针的电化学传感器及其制备方法 | |
| CN105802611A (zh) | 一种比率型纳米硅量子点荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN105158221A (zh) | 一种用于检测微核糖核酸的荧光传感器的制备方法及应用 | |
| CN107988351A (zh) | 一种环状dna在正义rna的检测、成像及基因治疗中的应用 | |
| Lin et al. | Real-time tracing the changes in the intracellular pH value during apoptosis by near-infrared ratiometric fluorescence imaging | |
| CN109115845A (zh) | 基于PEFC的自供能miRNA生物传感器及其应用 | |
| CN105154065B (zh) | 一种快速专一性识别羟基自由基的荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN112444505B (zh) | 一种基于双激发比率型上转换荧光探针的胞内检测方法 | |
| CN110205130B (zh) | 上转换纳米探针 | |
| Yang et al. | Advances in electrochemiluminescence for single-cell analysis | |
| Yuan et al. | A ratiometric fluorescence probe for selective and sensitive detection of leucine aminopeptidase in lysosome | |
| CN108069413A (zh) | 一种制备红绿光双发射碳点的方法及应用 | |
| CN110333217A (zh) | 一种新型的双光谱跷跷板式比率探针及构建方法 | |
| CN108918620A (zh) | 基于磷化钴纳米线对单双链dna吸附差异性的光电化学dna检测方法 | |
| Zhan et al. | Quantifying H2O2 by ratiometric fluorescence sensor platform of N-GQDs/rhodamine B in the presence of thioglycolic acid under the catalysis of Fe3+ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 266061 Songling Road, Laoshan District, Qingdao, Shandong Province, No. 99 Applicant after: Qingdao University Of Science And Technology Address before: School of chemistry and molecular engineering, Qingdao University of science and technology, No.53, Zhengzhou road, Shibei District, Qingdao, Shandong 266042 Applicant before: Qingdao University Of Science And Technology |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191015 |