KR101934548B1 - 실시간 pcr을 이용한 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 분석 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인삼뿌리썩음병을 유발하는 대표 원인균인 실린드로카폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans) 및 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani)에 특이적인 프라이머, 상기 프라이머를 포함하는 실시간 PCR 키트 및 상기 키트를 이용한 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출용 실시간 PCR 키트 및 이를 이용한 인삼뿌리썩음병 원인균 2종에 대한 동시다중 검출 방법은 특이도, 민감도 및 검출속도가 우수하므로, 인삼재배지 토양내 인삼뿌리썩음병 원인균 실시간 모니터링 및 인삼 재배적합 여부 진단에 매우 유용하다.

Description

실시간 PCR을 이용한 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 분석 방법 {Method for Multiplex Analysis of Cylindrocarpon destructans and Fusarium solani Using Real-time PCR}
본 발명은 인삼뿌리썩음병을 유발하는 대표 원인균인 실린드로카폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans) 및 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani)의 동시다중 검출에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상기 균에 특이적인 프라이머, 상기 프라이머를 포함하는 실시간 PCR 키트 및 상기 키트를 이용한 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출 방법에 관한 것이다.
인삼의 주 약리성분은 사포닌으로서 자양강장, 면역증강, 피로회복, 중추신경계 조절, 항스트레스, 항당뇨, 항종양활성 등의 우수한 효능이 밝혀짐에 따라 그 소비가 꾸준히 늘어날 것으로 전망된다.
그러나, 인삼은 다년생의 반음지성 식물이기 때문에 빛이 가장 중요한 생육제한요소이며, 높은 온도에서 생육이 저해되는 저온성 식물로서 고온 및 고광도에 약한 식물이다. 또한, 인삼은 상기 생육제한 요소 이외에 내병성이 약하고 효과적인 방제법이 적어 재배하기 어려운 식물로 평가되었다. 인삼은 4 ~ 6년 동안 동일 포장에서 장기간 재배를 하여야 하고, 수확한 후 다른 작물을 재배하지 않고 1 ~ 2년간 경작 예정지 관리 후 다시 인삼을 경작하는 연작방식 때문에 각종 병해에 의한 피해가 매우 크고 연작장해의 발생 가능성이 높은 식물이다.
인삼에서 연작장해를 일으키는 뿌리썩음병의 주요 병원균으로는 실린드로카 폰데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 라이조토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 보트리티스 시네레아(Botryis cinerea), 파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum), 피시움(Pythium sp .), 알타나리아 파낙스 (Alternaria panax)등 7종이 보고되어 있으며, 이런 병원균들이 단독으로 또는 복합적으로 작용하기 때문에 발생하는 것으로 알려져 있다. 최근 농업기술원 연구결과에 따르면 4년근 이상 인삼의 결주 원인은 지역과 병해 종류 및 발생 정도의 차이는 있지만 뿌리썩음병 35%, 잿빛곰팡이병 32%, 점무늬병 등이 15%를 차지하고 있다.
인삼뿌리썩음병은 병 진전이 더디게 나타나 초기 병 진단이 어렵고 식물체가 시드는 증상이 나타나도 이미 병이 뿌리에 만연되어 방제하기에는 늦은 경우가 대부분이다. 기존의 토양내 인삼뿌리썩음병균의 존재유무 파악은 주로 후벽포자 형태로 토양 내에 존재하는 상기 병원균에 대해 선택배지를 이용하여 생장을 유도한 후 형태적 특징 및 병원성 검정을 통한 종동정 방법으로 수행되어져 왔는데 이를 위하여 많은 시간과 인력이 소요되었다. 또한, 토양내에 존재하는 실린드로카폰 더스트럭턴스의 후벽포자는 발아율이 현저히 낮아 병원균의 검출이나 정확한 밀도측정이 곤란하고, 감염여부 판단의 정확도가 떨어진다는 문제점이 있었다.
이러한 문제점을 해결할 수 있는 병원균의 검출 및 종동정을 위하여 토양 또는 식물체에 존재하는 병원성 특성에 따른 인삼뿌리썩음병균 균주들에 대한 DNA를 각각 특이적으로 증폭할 수 있는 검출민감도가 높은 종 특이적 마커와 활용기법의 개발이 요구되어 왔다. 그러나, 현재까지 개발된 PCR 키트를 이용한 진단 방법으로는 거의 모두 한 종류 균의 감염여부만을 판독할 수 있을 뿐, 이들 균을 한꺼번에 다중 PCR 방법으로 진단할 수 있는 진단키트는 아직까지 개발되지 있다. 그 이유는 다수의 균을 한번의 다중 PCR 방법으로 검출하기 위해서는 그 PCR 시 각 사이클링 온도, 시간, 완충액의 조건 등이 일치하여야 하나 이러한 특정한 조건을 동시에 충족시키기에는 여러 가지 어려움이 있기 때문이다.
현재 인삼뿌리썩음병균 진단에 사용되고 있는 conventional PCR법은 전기영동을 통한 유전자 증폭 유무로 병증을 판단하기 때문에 시간이 오래 걸리고 cross-over 위험성이 높은 단점이 있는 반면, TaqManTM프로브 기반의 실시간 PCR법은 유전자의 증폭산물에 결합된 프로브로부터 방출되는 형광량을 실시간으로 측정하여 증폭산물의 증가량을 확인하는 방법으로 conventional PCR과 달리 전기영동이 필요 없어 실험결과를 신속하고 간편하게 해석할 수 있으며 검출 특이도와 민감도가 매우 높고 cross-over 위험성이 적으며 여러 종류의 프로브를 동시 사용하여 실시간 다중진단이 가능한 장점이 있다.
이에, 본 발명자들은 인삼뿌리썩음병균에 의한 병 피해를 사전에 방지하고 실시간으로 모니터링하기 위해서, 인삼 뿌리썩음병을 유발시키는 대표적인 원인균인 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니를 동시다중 진단할 수 있는 TaqManTM프로브 기반의 실시간 PCR 키트를 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 실린드로카폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans) 및 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani)를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트와 프로브를 포함하는 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출용 실시간 PCR 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니를 검출하고자 하는 시료로부터 유래한 주형 DNA와 상기 프라이머 세트를 혼합하여 PCR 증폭시킨 다음, 분석하여 시료에 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 존재 유무를 판단하는 단계를 포함하는 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 실린드로카폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans) 및 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani)의 동시다중 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 3 내지 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열에 특이적으로 결합하는 프로브;를 포함하는 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출용 실시간 PCR 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니를 검출하고자 하는 시료로부터 유래한 주형 DNA와 상기 프라이머 세트를 혼합하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 혼합물을 PCR 증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 PCR 산물을 분석하여 시료에 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 존재 유무를 판단하는 단계;를 포함하는 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출용 실시간 PCR 키트 및 이를 이용한 인삼뿌리썩음병 원인균 2종에 대한 동시다중 검출 방법은 특이도, 민감도 및 검출속도가 우수하므로, 인삼재배지 토양내 인삼뿌리썩음병 원인균 실시간 모니터링 및 인삼 재배적합 여부 진단에 매우 유용하다.
도 1은 실린드로카폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans )의 베타 튜블린 2 유전자내 보존부위에서 실린드로카폰 데스트럭탄스 특이적 프라이머 및 프로브 디자인에 대한 도식도이다.
도 2는 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani )의 베타 튜블린 2 유전자내 보존부위에서 푸사리움 솔라니 특이적 프라이머 및 프로브 디자인에 대한 도식도이다.
도 3은 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 2종류 타겟이 증폭될 때 서로 간의 저해를 최소화시킨 다중분석 조건 확립에 관한 것이다. (IC: internal control)
도 4는 확립된 실시간 PCR 조건 및 키트에 의해 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 민감도를 테스트한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 인삼뿌리썩음병의 주요 원인균인 실린드로카폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans) 및 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani)를 특이적으로 신속하게 동시다중 검출하고자 하였다. 이에, 실린드로카폰 데스트럭탄스의 베타-튜블린 2 유전자와 푸사리움 솔라니의 베타-튜블린 2 유전자의 conserved 부위에서 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니 각각에 대한 프라이머 및 프로브를 디자인 하였다. 그 다음, 제작된 프라이머와 프로브에 대한 In silico 분석평가 결과, NCBI에 등재된 FASTA에서 높은 검출률을 보이고 있으며 다른 strain에서 교차반응이 없었다. 이에, 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 2 종류 target이 증폭될 때 서로 간의 저해를 최소화시킨 조건을 확립하고, 분석적 민감도를 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일관점에서 서열번호 1의 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 실린드로카폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans) 및 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani)의 동시다중 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, "특이적"이라는 용어는 다른 병원균에 결합하지 않고 상기 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니 인삼뿌리썩음병의 균에만 특이적으로 결합하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 하기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하도록 설계된다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 따라 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "상보적(complementary)"은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적 (substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 3 내지 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 서열번호 2의 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 5 내지 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 3 내지 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 것이라면 특별히 제한하지 않으며, 서열번호 3 내지 서열번호 7의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 3 내지 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
서열번호 3 내지 4로 표시되는 염기서열은 본 발명의 일측면에 따른 실시예로서 제시되는 실린드로카폰 데스트럭탄스를 검출할 수 있는 프라이머의 염기서열을 나타낸다. 서열번호 3은 정방향(forward) 프라이머를 나타내며, 서열번호 4는 역방향(reverse) 프라이머를 나타낸다.
또한, 서열번호 5 내지 7로 표시되는 염기서열은 본 발명의 일측면에 따른 실시예로서 제시되는 푸사리움 솔라니를 검출할 수 있는 프라이머의 염기서열을 나타낸다. 서열번호 5 및 6은 정방향(forward) 프라이머를 나타내며, 서열번호 7은 역방향(reverse) 프라이머를 나타낸다.
본 발명에서 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1은 실린드로카폰 데스트럭탄스의 베타-튜블린 2 (β-tubulin 2) 유전자인 것이 바람직하며, 상기 서열번호 2는 푸사리움 솔라니의 베타-튜블린 2 (β-tubulin 2) 유전자인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 PCR에 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 실시간 PCR에 사용하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 용어 "PCR"은 표적 핵산을 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 의미한다.
본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 3 내지 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열에 특이적으로 결합하는 프로브;를 포함하는 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출용 실시간 PCR 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열에 특이적으로 결합하는 프로브는 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 서열번호 1은 실린드로카폰 데스트럭탄스의 베타-튜블린 2 (β-tubulin 2) 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 2의 염기서열에 특이적으로 결합하는 프로브는 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 서열번호 2는 푸사리움 솔라니의 베타-튜블린 2 (β-tubulin 2) 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브의 5' 말단에는 리포터 (Reporter)가 부착될 수 있으며, 형광을 나타내는 다른 형광 물질이 부착될 수 있으며, 이에 한정되지 아니한다. 예를 들면, 상기 리포터는 FAM, JOE, BHQ1, VIC, TAMRA, ROX, NED, HEX, TET, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), 텍사스 레드(Texas Red), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 프로브의 3' 말단에는 퀀쳐(Quencher)로서 블랙홀 퀀쳐-1(Black Hole Quencher-1, BHQ-1)이 부착되어 있을 수 있고, 퀀쳐로서 사용될 수 있는 다른 물질이 부착될 수 있으며, 이에 한정되지 아니한다. 예를 들면, 상기 퀀쳐는 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀀쳐(Blackberry Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 프라이머 세트 및 프로브는 실시간 PCR(real time polymerase chain reaction)에 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 동시다중 (multiplex) 실시간 PCR에 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "동시다중 (Multiplex) PCR" 이란 PCR에 사용되는 프라이머 두 세트 이상이 하나의 증폭 반응에 사용되는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 PCR을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공될 수 있다. PCR 반응에 필요한 성분들의 과량은, PCR 반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. 예를 들면, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus , Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP 혼합물 (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), Mg2 +와 같은 보조인자 및 완충용액으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있으며, PCR 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 제조되어 첨가될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니를 검출하고자 하는 시료로부터 유래한 주형 DNA와 상기 서열번호 1의 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머 및 상기 서열번호 2의 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머 프라이머 세트를 혼합하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 혼합물을 PCR 증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 PCR 산물을 분석하여 시료에 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 존재 유무를 판단하는 단계를 포함하는 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 시료는 통상적으로 인삼뿌리썩음병원균의 포함 여부의 식별이 필요한 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 바람직하게는 인삼(Panax ginseng) 또는 인삼재배 토양 시료일 수 있다.
상기 DNA 분리는 통상적으로 시료에서 제노믹 DNA(Genomic DNA, gDNA)를 분리하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 혼합물은 서열번호 8 및 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 프로브의 5' 말단에는 리포터 (Reporter)가 부착될 수 있으며, 형광을 나타내는 다른 형광 물질이 부착될 수 있으며, 이에 한정되지 아니한다. 예를 들면, 상기 리포터는 FAM, JOE, BHQ1, VIC, TAMRA, ROX, NED, HEX, TET, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), 텍사스 레드(Texas Red), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 프로브의 3' 말단에는 퀀쳐(Quencher)로서 블랙홀 퀀쳐-1(Black Hole Quencher-1, BHQ-1)이 부착되어 있을 수 있고, 퀀쳐로서 사용될 수 있는 다른 물질이 부착될 수 있으며, 이에 한정되지 아니한다. 예를 들면, 상기 퀀쳐는 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀀쳐(Blackberry Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 PCR은 실시간 PCR인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 동시다중 (multiplex) 실시간 PCR인 것이고, 상기 "동시다중 (Multiplex) PCR" 이란 PCR에 사용되는 프라이머 두 세트 이상이 하나의 증폭 반응에 사용되는 것을 의미한다.
또한, 상기 실시간 PCR은 상기의 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출용 실시간 PCR 키트를 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명은 보다 구체적으로, 서열번호 3 내지 7의 프라이머 세트 및 서열번호 8 및 9의 프로브를 포함하는 인삼뿌리썩음 병원균 2종을 동시에 검출하는 동시다중 (multiplex) PCR 방법일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 실시간 PCR은 50℃에서 2분; 95℃에서 10분; 및 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분을 40회 반복 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 동시다중 (multiplex) 실시간 PCR 방법에 있어서의 온도 및 시간은 인삼뿌리썩음 병원균인 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니를 동일한 조건에서 서로 다른 프라이머를 이용하여 동시에 검출하기 위한 최적의 조건일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 동시다중 (multiplex) 실시간 PCR 산물을 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다.
PCR 산물 분석은 통상적으로 PCR 산물을 분석하는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 단편 분석 (fragment analysis)를 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 PCR 산물의 크기 분석을 포함하는 단편 분석 (fragment analysis)를 수행할 수 있다. 상기 실시간 중합효소연쇄반응 (real time PCR)은 standard와 melt curve를 비교하여 식별 및 정량분석이 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 실린드로카폰 데스트럭탄스 또는 푸사리움 솔라니가 존재하는 경우 인삼뿌리썩음병으로 진단하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 동시다중 (multiplex) 실시간 PCR 방법을 이용하여 인삼뿌리썩음병의 병원균인 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 유무를 진단 및 예방할 수 있으며, 인삼뿌리썩음병이 발병되는 식물은 인삼에 한정되지 않으며, 또한 상기 병원균이 유발하는 식물병 및 토양에서의 상기 병원균의 유무를 진단하기 위하여서 이용될 수 있다.
[ 실시예 ]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 인삼뿌리썩음병균 및 DNA 준비
인삼뿌리썩음병원균 실린드로카폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans , CY8005)은 충청남도농업기술원 인삼약초연구소에서 분양받았으며, 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani )는 소득자원연구소 포장내 이병개체에서 순수 분리하여 사용하였다.
토양에서 DNA 추출은 공지의 방법 및 시판중인 키트를 사용할 수 있으며, 본 실시예에서는 ㈜코젠바이오텍의 추출 키트를 이용하여 진행하였다. DNA 추출 시 선행되어야 하는 lysis 단계에서 물리적인 방법인 beadbeating과 화학적인 방법인 SDS를 동시에 적용하여 cell lysis 효율을 극대화하였으며, 대량의 흙 시료 사용 가능과 추출 공정의 간소화를 통해 추출 시간을 단축하면서 토양에서 효과적으로 DNA를 추출할 수 있었다.
실시예 2: 프라이머 및 프로브 제작
2-1: 실린드로카폰 데스트럭탄스 ( Cylindrocarpon destructans )에 특이적인 프라이머 및 프로브
실린드로카폰 데스트럭탄스에 특이적 프라이머 및 프로브의 제작은 실린드로카폰 데스트럭탄스의 베타-튜블린 2 (beta tubulin 2) 유전자 (AM419083.1, 서열번호 10) 내 conserved 부위에서 도 1에 나타난 것과 같이 디자인하였다. PCR을 통해 증폭되는 서열은 78bp로, 서열번호 1로 표시하였다.
서열번호 실린드로카폰 데스트럭탄스 특이적 프라이머 및 프로브
3 Forward primer 5’- CTTCAACGATCCGACGTGC - 3’
4 Reverse primer 5’- GTCTGCCAGAAAGCAGCACC - 3’
8 Probe 5’FAMA- ATTCGCTAACGATGCGTGGATAGGGTAACC -BHQ1 3’
2-2: 푸사리움 솔라니 ( Fusarium solani ) 특이적인 프라이머 및 프로브
푸사리움 솔라니에 특이적 프라이머 및 프로브의 제작은 푸사리움 솔라니의 베타-튜블린 2 (beta tubulin 2) 유전자 (KU983876, 서열번호 11) 내 conserved 부위에서 도 2에 나타난 것과 같이 디자인하였다. 검출 효율을 높이기 위해 정방향 프라이머는 2개를 디자인하였다. PCR을 통해 증폭되는 서열은 109bp로, 서열번호 2로 표시하였다.
서열번호 푸사리움 솔라니에 특이적 프라이머 및 프로브
5 Forward primer 1 5’- GAAAGAGTGGGCGCCG - 3’
6 Forward primer 2 5’- GCGGAAAGAGTGAGCACCA - 3’
7 Reverse primer 5’- GAACTCTGACCTCCGAAAGCTC - 3’
9 Probe 5’JOET- TCAACATGGTTCCCTTCCCCCGTCT -BHQ1 3’
실시예 3: In silico 분석평가
상기 실시예 2에서 제작한 프라이머 및 프로브의 실시간 PCR에 대한 In silico 분석을 실시하였다. In silico 분석은 서열번호 1, 서열번호 2로 표시되는 PCR 증폭 서열을 이용하여 NCBI의 blast를 통해 검출되는 sequence 정보를 확보한 후, 제작된 프라이머 및 프로브와 결합유무를 비교하는 방식으로 분석하였다.
그 결과, NCBI에 등재된 FASTA에서 높은 검출률을 보이고 있으며 다른 strain에서 교차반응이 없는 것으로 확인되었다 (표 3).
Figure 112017077849692-pat00001
실시예 4 : 동시다중 (multiplex) PCR 조건 최적화
2 종류의 target이 동시에 증폭될 때, 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니 서로 간의 저해를 최소화시킨 PCR 조건을 확립하였다 (도 3). 실시간 PCR을 진행하여 Ct value 40 이하에서 검출되는 양상을 보일 때 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니가 시료에 존재한다고 분석하였다.
동시다중 (multiplex) 실시간 PCR 반응의 조성물은 하기 표 4와 같으며, 확립된 PCR 반응 조건은 하기 표 5에 나타냈다.
구성요소 사용량(㎕)
Primer.Probe Mix(C.des/F.sol) 5
2xReal-time PCR Master Mix 10
Template DNA 5
총 20
온도(℃) 시간 반복
50 2분 1
95 10분 1
95 15초 40
60 1분
실시예 5: 실시간 PCR을 이용한 검출민감도 평가
분석적 민감도를 테스트하기 위해, 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니 각각의 양성시료를 1.0 x 107copies/㎕로 제작하였다. 그 다음, 1.0 x 106copies/㎕ 에서 1.0 x 100copies/㎕까지 10배 단위로 연속 희석하여 테스트한 결과, 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 민감도는 모두 10 copies/㎕ 였다 (도 4).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> GyeongGi-Do <120> Method for Multiplex Analysis of Cylindrocarpon destructans and Fusarium solani Using Real-time PCR <130> P17-B131 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 78 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Cylindrocarpon destructans <400> 1 cttcaacgat ccgacgtgcg ggcattcgct aacgatgcgt ggatagggta accaaattgg 60 tgctgctttc tggcagac 78 <210> 2 <211> 109 <212> DNA <213> Fusarium sp. <400> 2 gaactctgac ctccgaaagc tcgccgtcaa catggttccc ttcccccgtc tgcacttctt 60 catggtcggc ttcgctcccc tgaccagccg cggcgcccac tctttccgc 109 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD-F <400> 3 cttcaacgat ccgacgtgc 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD-R <400> 4 gtctgccaga aagcagcacc 20 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FS-F1 <400> 5 gaaagagtgg gcgccg 16 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FS-F2 <400> 6 gcggaaagag tgagcacca 19 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FS-R <400> 7 gaactctgac ctccgaaagc tc 22 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD-P <400> 8 attcgctaac gatgcgtgga tagggtaacc 30 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FS-P <400> 9 tcaacatggt tcccttcccc cgtct 25 <210> 10 <211> 625 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Cylindrocarpon destructans <400> 10 aacatgcgtg agattgtaag ttgcttgcct cctgtggttg cccgctccca acgacgcgtt 60 ctgttacccg ctcgggcgag ctgcccctga ttctaccccg ctgcagcatt tccaccgcct 120 tcaggacaac aaagctcggg acttcaacca cgacgtgatt ttgggacaag atggctgacc 180 atgactttct tctgcaatat aggtccacct ccagaccggc cagtgcgtaa gtgcttcatc 240 ctcttcaacg atccgacgtg cgggcattcg ctaacgatgc gtggataggg taaccaaatt 300 ggtgctgctt tctggcagac catctctagc gagcacggtc tcgacagcaa tggtgtgtac 360 aacggtacct ccgagctgca gctcgagcgc atgagcgtct acttcaacga ggtacgtgaa 420 atctacccat ctgcccttat ccaggaggtg tcgaactcac accacgcagg cctctggcaa 480 caagtatgtc cctcgcgccg tcctcgtcga tctcgagccc ggtaccatgg acgctgtccg 540 tgccggtcct ttcggccagc tcttccgccc cgacaacttc gttttcggtc agtccggtgc 600 tggaaacaac tgggccaagg gtcac 625 <210> 11 <211> 1333 <212> DNA <213> Fusarium sp. <400> 11 aacatgcgtg agattgtaag tcctccccgc agtgctgttg ttgccgccgc gttgagcttg 60 tgcccctgat tctaccccgc taggcggcag ctcgtgcaac gcccggtagc tgcagcttca 120 tcatgatcac caactaacga gactttccaa ataggttcac ctccagaccg gtcagtgcgt 180 aagtatcgcg tcgcctcttt ttctggcggg atgctcataa tccgcagggt aaccaaattg 240 gtgctgcttt ctggcagacc atctctggcg agcatggcct cgacagcaat ggtgtctaca 300 atggcacctc tgagctccag ctcgagcgca tgagcgtcta cttcaacgag gtatgttgcc 360 cgaagactat accaaatata gctgacatct gtaggcctct ggcaacaagt acgtccctcg 420 cgccgtcctc gtcgatctcg agcccggtac catggacgcc gttcgtgctg gtcccttcgg 480 tcagctcttc cgtcccgaca acttcgtctt cggtcagtcc ggtgctggca acaactgggc 540 caagggtcac tacactgagg gtgccgagct cgtcgaccag gtcctcgacg tcgtccgccg 600 cgaggccgag ggctgcgact gccttcaggg cttccagatc acccactccc tgggtggtgg 660 taccggtgct ggcatgggta ctctgctcat ctccaagatt cgcgaggagt tccccgaccg 720 aatgatggcc accttctccg tcgttccctc tcccaaggtc tcggataccg tcgtcgagcc 780 ttacaacgct accctctcag tccaccagct ggtcgagaac tccgatgaga ccttctgcat 840 tgacaacgag gctctctacg acatttgcat gcgcaccctt aagctgtcca acccctcgta 900 cggcgatctc aactacctcg tctccgccgt catgtctggc gtcaccacct gcctccgatt 960 ccctggtcag ctgaactctg acctccgaaa gctcgccgtc aacatggttc ccttcccccg 1020 tctgcacttc ttcatggtcg gcttcgctcc cctgaccagc cgcggcgccc actctttccg 1080 cgctgtcagc gttcccgagc ttacccagca gatgttcgac cccaagaaca tgatggctgc 1140 ttctgacttc cgcaacggtc gctacctgac ctgctctgcc atcttgtaag ttttgttccc 1200 tccatgtcga gtaatcgcta acatttacca gccgtggccg tgtcgccatg aaggaggtcg 1260 aggaccagat gcgcaacgtc cagaacaaga actcgtccta cttcgtcgag tggattccca 1320 acaacatcca gaa 1333

Claims (17)

  1. 서열번호 3 내지 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 서열번호 1의 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머 및 서열번호 5 내지 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 서열번호 2의 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 실린드로카폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans) 및 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani)의 동시다중 검출용 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열은 실린드로카폰 데스트럭탄스의 베타-튜블린 2 유전자인 것을 특징으로 하는 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출용 프라이머 세트.
  5. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 2의 염기서열은 푸사리움 솔라니의 베타-튜블린 2 유전자인 것을 특징으로 하는 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출용 프라이머 세트.
  6. 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 PCR에 사용하는 것을 특징으로 하는 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출용 프라이머 세트.
  7. 서열번호 3 내지 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 및
    서열번호 8의 염기서열로 표시되는 서열번호 1의 염기서열에 특이적으로 결합하는 프로브 및 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 서열번호 2의 염기서열에 특이적으로 결합하는 프로브;를 포함하는 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출용 실시간 PCR 키트.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제7항에 있어서, 상기 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단이 FAM, JOE, BHQ1, VIC, TAMRA, ROX, NED , HEX 및 TET로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광 표지인자로 표지되는 것을 특징으로 하는 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출용 실시간 PCR 키트.
  11. 제7항에 있어서, DNA 중합효소, dNTP 혼합물 (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 및 완충용액으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출용 실시간 PCR 키트.
  12. (a) 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니를 검출하고자 하는 시료로부터 유래한 주형 DNA와 제1항의 프라이머 세트를 혼합하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 혼합물에 서열번호 8 및 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가하여 실시간 PCR 증폭시키는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 PCR 산물을 분석하여 시료에 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 존재 유무를 판단하는 단계;를 포함하는 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제12항에 있어서, 상기 실시간 PCR은 제7항의 키트를 이용하는 것을 특징으로 하는 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 (b) 단계의 실시간 PCR은 50℃에서 2분; 95℃에서 10분; 및 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분을 40회 반복;하는 것을 특징으로 하는 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출 방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 실린드로카폰 데스트럭탄스 또는 푸사리움 솔라니가 존재하는 경우 인삼뿌리썩음병으로 진단하는 것을 특징으로 하는 실린드로카폰 데스트럭탄스 및 푸사리움 솔라니의 동시다중 검출 방법.
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